HOST RANGE, HOST RESISTANCE, AND POPULATION STRUCTURE OF   PHYTOPHTHORA CAPSICI      By       Lina M. Quesada                            A DISSERTATION      Submitted to  Michigan State University  in partial fulfillment of the requirements  for the degree of      DOCTOR OF PHILOSOPHY      Plant Pathology      2010  ABSTRACT      HOST RANGE, HOST RESISTANCE, AND POPULATION STRUCTURE OF   PHYTOPHTHORA CAPSICI     By    Lina M. Quesada    Phytophthora capsici is a destructive soilborne pathogen worldwide.  P. capsici has a  broad host range that includes members of more than twenty plant families that contain  many economically important vegetable crops.  Some vegetable growers in Michigan plant  conifers for the Christmas tree market in fields infested with P. capsici.  To determine the  susceptibility of Fraser fir to P. capsici, stems or roots of seedlings were inoculated with  each of 4 P. capsici isolates and incubated in growth chambers.  In addition, Fraser fir  seedlings were planted in two commercial fields naturally infested with P. capsici.  All P.  capsici isolates tested incited disease in the seedlings regardless of incubation temperature  or inoculation method.  Seedlings (72%) planted in P. capsici‐infested fields developed  disease symptoms and died.  Identification was confirmed by species‐specific direct colony  Polymerase chain reaction.  This study suggests that planting Fraser fir in fields infested  with P. capsici could result in infection and that adjustments in current rotational schemes  are needed.  Phytophthora capsici causes root, crown, and fruit rot of tomato, a major vegetable  crop grown worldwide.  One objective of this study was to screen tomato varieties and wild  relatives of tomato for resistance to P. capsici.  Four P. capsici isolates were individually  used to inoculate 6‐week‐old seedlings of 42 tomato varieties and wild relatives in a  greenhouse.  Plants were evaluated daily for wilting and death.  All P. capsici isolates tested  caused disease in seedlings but some isolates were more pathogenic than others.  A wild  relative of cultivated tomato, Solanum habrochaites accession LA407, was resistant to all P.  capsici isolates tested.  Moderate resistance to all isolates was identified in the host  genotypes Ha7998, Fla7600, Jolly Elf, and Talladega.  Amplified fragment length  polymorphisms of tomato genotypes showed a lack of correlation between genetic clusters  and susceptibility to P. capsici, indicating that resistance is distributed in several tomato  lineages.  The results of this study create a baseline for future development of tomato  varieties resistant to P. capsici.  Phytophthora capsici Leonian is a destructive soilborne pathogen that can infect  economically important solanaceous, cucurbitaceous, fabaceous, and other crops in the  United States and worldwide.  The objective of this study was to investigate the genetic  structure of P. capsici isolates assigned to predefined host, geographical, mefenoxam  sensitivity and mating type categories. Isolates from 6 continents, 21 countries, 18 United  States (U.S) states, and 26 host species were genotyped for four mitochondrial and six  nuclear loci.  Bayesian clustering analysis revealed population structure by host,  geographic origin and mefenoxam sensitivity with clusters occurring more or less  frequently in particular categories.  Our findings of genetic structuring in P. capsici  populations highlight the importance of including isolates from all detected clusters that  represent the genetic variation in P. capsici for development of diagnostic tools, fungicides,  and host resistance.  This study provides an initial map of global population structure of P.  capsici but continued genotyping of isolates will be necessary to expand our knowledge of  genetic variation in this important plant pathogen.                    To my husband Jarrod, my parents Alba Luz and Hernando, and my brother Juan Diego for  their constant support and love.                           iv ACKNOWLEDGEMENTS    Many thanks to Dr. Mary Hausbeck for being a great advisor, funding my research,  allowing me to complete my program in her lab and creating opportunities for me to  become a better scientist.    Thanks to all members of the Hausbeck Lab for helpful discussions about my work,  for technical assistance and for never letting me forget the bigger picture, especially to  Melissa Mercier, Jayme Olsen, Halli Gutting, Amy Lebeis, Justin Passmore, Leah Granke, and  Bryan Webster.  I thank the members of my committee, Drs. Robin Buell, Jim Smith, and Ray  Hammerschmidt, for their encouragement, guidance, technical help and critical analysis of  my work.  Sincere thanks to all the people that have mentored me throughout my scientific  career, which gave me the passion, knowledge and experience to become the scientist I am  today and that continue to inspire me to be better every day.  Thanks to Drs. Mary  Hausbeck (MSU), Silvia Restrepo (LAMFU), Sophien Kamoun and Jorunn Bos (OSU), Daniel  Matute (UChicago), and Maria Caridad Cepero (CIMIC).   Last but not least, I thank my husband, my family, my friends and my lovely pets for  their love, encouragement, and support.  v TABLE OF CONTENTS    LIST OF TABLES..........................................................................................................................................................vii   LIST OF FIGURES.........................................................................................................................................................ix   CHAPTER I: LITERATURE REVIEW.....................................................................................................................1 Life Cycle......................................................................................................................................................................1 Host Range..................................................................................................................................................................3 Management ..............................................................................................................................................................7 Host Resistance and Pathogen Populations ...............................................................................................8 References ............................................................................................................................................................... 11   CHAPTER II: SUSCEPTIBILITY OF FRASER FIR TO PHYTOPHTHORA CAPSICI............................ 19 Abstract..................................................................................................................................................................... 19 Introduction............................................................................................................................................................ 20 Methods..................................................................................................................................................................... 21 Results ....................................................................................................................................................................... 29 Discussion ................................................................................................................................................................ 38 References ............................................................................................................................................................... 43   CHAPTER III: RESISTANCE IN TOMATO AND WILD RELATIVES TO CROWN AND ROOT ROT  CAUSED BY PHYTOPHTHORA CAPSICI ............................................................................................................ 47 Abstract..................................................................................................................................................................... 47 Introduction............................................................................................................................................................ 48 Methods..................................................................................................................................................................... 49 Results ....................................................................................................................................................................... 58 Discussion ................................................................................................................................................................ 64 References ............................................................................................................................................................... 71   CHAPTER IV: INVESTIGATING THE GENETIC STRUCTURE OF PHYTOPHTHORA CAPSICI  POPULATIONS ............................................................................................................................................................ 78 Abstract..................................................................................................................................................................... 78 Introduction............................................................................................................................................................ 79 Methods..................................................................................................................................................................... 82 Results .................................................................................................................................................................... 101 Discussion ............................................................................................................................................................. 121 References ............................................................................................................................................................ 135     vi LIST OF TABLES    Table 1.1: Known hosts for P. capsici, diseases and distribution.  Modified from the  list of hosts stated by Erwin and Ribeiro (18). ...............................................................................3   Table 2.1.  Soil and air temperatures of two commercial fields in Michigan naturally  infested with Phytophthora capsici during the months from June to November, 2007. ............................................................................................................................................................................. 26   Table 2.2.  Effects of inoculum, pathogen isolate, incubation temperature, and  inoculation method on the area under the disease progress curve (AUDPC) values  for disease incidence on Fraser fir seedlings caused by Phytophthora capsici. ........... 31   Table 2.3. Incidence of Phytophthora capsici and isolates obtained from different  parts of the symptomatic Fraser fir seedlings sampled from naturally infested fields  and both planting dates........................................................................................................................... 36   Table 2.4. Mating type and mefenoxam sensitivity of Phytophthora capsici isolates  from symptomatic Fraser fir seedlings grown in two commercial fields in Michigan  naturally infested with Phytophthora capsici. .............................................................................. 37   Table 3.1.  Disease reaction and mean AUDPC of three experiments in which tomato  varieties and wild relatives were screened for resistance to Phytophthora capsici. . 50   Table 3.2.  Air temperature and relative humidity in the greenhouse during each of  the three replicated experiments in which tomato plants were screened for  resistance to Phytophthora capsici..................................................................................................... 52   Table 3.4.  Probability (P) values for significance of differences in plant height  between inoculated plants and their corresponding controls for tomato genotypes  resistant and moderately resistant to Phytophthora capsici................................................. 62   Table 4.1.  Isolates of P. capsici sensu stricto (SS) and sensu lato (SL) used in this  study. ................................................................................................................................................................ 83   Table 4.2.  Mitochondrial and nuclear genes analyzed in P. capsici SS and SL. ............ 98   Table 4.3.  Polymorphism types for analyzed mitochondrial and nuclear genes in P.  capsici SS...................................................................................................................................................... 102   Table 4.4.  Diversity estimates, neutrality tests and recombination for mitochondrial  and nuclear genes analyzed in P. capsici SS................................................................................ 103   Table 4.5.  Minimum, average and maximum genetic differentiation estimates of  mitochondrial and nuclear genes for P. capsici SL and SS with isolates grouped in  predefined host categories. ................................................................................................................ 107 vii Table 4.6. Minimum, average and maximum diversity estimates of mitochondrial  and nuclear genes for P. capsici SL and SS with isolates grouped in predefined host  categories. ................................................................................................................................................... 108   Table 4.7.  Minimum, average and maximum genetic differentiation estimates of  mitochondrial and nuclear genes for P. capsici SL and SS with isolates grouped in  predefined geographic categories................................................................................................... 113   Table 4.8.  Minimum, average and maximum diversity estimates of mitochondrial  and nuclear genes for P. capsici SL and SS with isolates grouped in predefined  geographic categories. .......................................................................................................................... 114   Table 4.9.  Minimum, average and maximum genetic differentiation estimates of  mitochondrial and nuclear genes for P. capsici SL and SS with isolates grouped in  predefined mating type, mefenoxam sensitivity and species categories..................... 117   Table 4.10.  Minimum, average and maximum diversity estimates of mitochondrial  and nuclear genes for P. capsici SL and SS with isolates grouped in predefined  mating type, mefenoxam sensitivity and species categories. ............................................ 118   viii LIST OF FIGURES    Figure 1.1: Phytophthora capsici life cyle.  For interpretation of the references to  color in this and all other Figures, the reader is referred to the electronic version of  this dissertation. ............................................................................................................................................2    Figure 2.1.  Symptoms of Phytophthora capsici root rot on Fraser fir.  A, Normal  appearance of the foliage of a control seedling.  B, Bronzing of needles starting in the  lower part of the seedling that progresses upward to the rest of the foliage.  C,  Complete bronzing of all the foliage of the seedling. ................................................................ 30    Figure 2.2.  Progression of disease caused by Phytophthora capsici in inoculated  Fraser fir seedlings.  Points represent mean values of 8 replicates with the standard  deviation.  A‐B, Comparison of inoculation of P. capsici OP97 onto unwounded  (none) or wounded (1 or 3 mm wounds) stem and grown at A, 20°C, and B, 25°C.  C‐ D, comparison of inoculations of 4 isolates of P. capsici onto C, unwounded or D,  wounded (1 mm) stems and grown at 25°C.  E, comparison of rates of P. capsici  OP97‐infested millet seeds inserted into the growing media near the stem and  concentrations of P. capsici OP97 zoospore suspension poured into the growing  media near the stem and grown at 25°C.  F‐G, comparison of inoculum of 4 isolates  of P. capsici prepared as F, 2 g infested millet seed and G, 4 g infested millet seed  inserted into the potting media near the stem and grown at 25°C.................................... 33    Figure 2.3.  Polymerase chain reaction (PCR) confirmation of isolate identification  with P. capsici specific primers.  M, 100 bp ladder, with uppermost band 1,000 bp.  1,  2, 3, 4, PCR product of direct colony PCR of isolates obtained from different  symptomatic seedlings sampled in the field experiment.  5, PCR product from DNA  extracted from mycelium of P. capsici OP97.  6, PCR product from DNA extracted  from mycelium of P. capsici SP98.  7, negative control where water was added to the  PCR reaction instead of mycelium or DNA..................................................................................... 38    Figure 3.1. Symptoms of Phytophthora capsici root rot on tomato and wilting scale  used in plant evaluations.  A, 0= no symptoms, healthy plant.  B, 1= 1‐30% wilting.   C, 2= 31‐50% wilting.   D, 3= 51‐70% wilting.  E, 4= 71‐90% wilting.  F, 5= more than  90% wilting or dead plant.  G, Stem canker.  H, Water soaked lesions in the stem,  rotted crown, and rotted and discolored roots.  I, Secondary roots.  J, Girlding.  K,  Damping off.  L, Stunting......................................................................................................................... 59    Figure 3.2.  Amplified fragment length polymorphism distance tree of tomato  varieties and wild relatives screened for resistance to P. capsici.  Susceptibility to P.  capsici 12889, OP97, SP98 and SFF3 (S, susceptible, M, moderately resistant, R,  resistant), tomato species (SPP: Sl, Solanum lycopersicon, Sp, S. pinpinelifolium, Spe,  S. pennellii, Sh, S. habrochaites), and type of variety (TYP: F, fresh market, P,  processing, W, wild) are indicated for each variety.  A, B, C, D, E, F, G, correspond to  similarity groups obtained in UPGMA clustering analysis..................................................... 63  ix Figure 4.1.  Genetic structure of P. capsici SS with isolates grouped by the following  predefined categories: host (A host type, B host family, C host species), mefenoxam  sensitivity (D), mating type (E) and of P. capsici SL by species (F).  Each isolate is  represented by a thin bar, often partitioned into colored segments each  representing the individual’s proportionate genetic membership in a given Kth  cluster.  Cluster colors are indicated in (F) and correspond to: dark red‐one, purple‐ two, yellow‐three, light green‐four, dark blue‐five, aqua‐six, dark green‐seven, light  blue‐eight, pink‐nine, gray‐ten, pink‐eleven.............................................................................. 105    Figure 4.2.  Genetic structure of P. capsici SS with isolates grouped by predefined  geographic (A hemisphere, B continent, C country group, D country, E U.S. state)  categories.  Geographic origin abbreviations correspond to U.S.: United States, CA:  California, MI: Michigan, NJ: New Jersey, NY: New York, SC: South Carolina, TN:  Tennessee.  Each isolate is represented by a thin bar, often partitioned into colored  segments each representing the individual’s proportionate genetic membership in a  given Kth cluster.  Cluster colors are indicated in Figure1F............................................... 110    Figure 4.3.  Haplotype genealogies of P. capsici SL mitochondrial (A Cox1) and  nuclear (B EF‐1α) genes.  One mitochondrial and one nuclear gene are shown as  examples.  Other genes are not shown but presented similar topologies.  The lines in  the network represent possible paths of evolution.  The haplotype with the highest  probability to be ancestral is indicated by a square, other haplotypes are displayed  as ovals.  The empty dots represent missing or extant haplotypes.  Bold lines  indicate haplotypes that contain P. capsici SS isolates and isolates from clusters 10  or 11.  Dashed lines indicate haplotypes that contain isolates from cluster 10.   Double‐line haplotypes indicate haplotypes that contain isolates from cluster 11.   Dotted lines indicate haplotypes that contain both cluster 10 and 11 isolates. ....... 121        x CHAPTER I: LITERATURE REVIEW      Phytophthora capsici is an important plant pathogen worldwide, affecting several  crops in many countries (6, 18, 29, 30, 35) including the United States (U.S.). The genus  Phytophthora is located within the Kingdom Stramenopila, Phylum Oomycota, Class  Oomycetes, Order Peronosporales, Family Phythiaceae (3, 18). There are more than 60  species in the genus Phytophthora and most of them are devastating plant pathogens (18,  27). Oomycetes such as P. capsici are evolutionarily distant from fungi and close to algae  and plants (7). However, the basic biology, the growth habit and plant tissue colonization of  oomycetes is similar to that of true fungi and many researchers clasified them as fungi in  the past (53, 66).  Nonetheless, it is now clear that characteristics such as cell walls  composed primarily of β‐glucan, a diploid state throughout most of their life cycle, and the  inability to produce sterols, make Oomycetes distinct from fungi (18).    Life Cycle    Phytophthora capsici reproduces both asexually and sexually (Figure 1.1).  Asexual  reproduction occurs by zoospores, which are produced in conspicuously papillate  sporangia.  Sexual reproduction involves two compatibility types (CT), called A1 and A2,  that produce amphigynous oospores when they come into contact (30).  The thallus is  composed of coenocytic mycelia that give rise to lemon‐shaped sporangia (1).  When  sporangia come in contact with water they release 20‐40 zoospores, which have tropism  for the plant roots.  The inoculum may come into contact with the roots by movement from  root to root in the soil, by movement down rows with surface water, and rain or irrigation  splash that takes the inoculum to above‐ground plant parts (73).  After zoospores make  1 contact with the plant surface, they encyst and germinate, producing germ tubes (9, 31).   The penetration of the germ tube into the host can occur directly with the help of  macerating enzymes or through natural openings such as stomata (42, 85).  The mycelium  then grows inside the plant tissue and forms haustoria to obtain nutrients from the host  cells (Figure 1.1) (18).    Figure 1.1: Phytophthora capsici life cyle.  For interpretation of the references to color in  this and all other Figures, the reader is referred to the electronic version of this  dissertation.      2 Oospores (Figure 1.1), which are important survival structures (46), overwinter and  persist for long periods of time (5 years or more) in soil (30).  Sexual reproduction results  in genetic variation due to recombination, leading to an increased chance of generating  genotypes that may have characteristics such as fungicide resistance or higher levels of  virulence.  Sexual reproduction likely impacts management and must be considered when  developing control strategies (30, 50).     Host Range    Phytophthora spp. infect a wide range of plants including dicot and monocot species;  cultivated crops, ornamentals and native plants can be affected (40).  Some species of  Phytophthora, such as P. infestans, are associated with specific plant species and have a  narrow and defined host range.  Others, such as P. capsici, have a broad host range  including members of very diverse and phylogenetically distant plant families such as  solanaceous, cucurbit and leguminous crops (18).  The diseases caused by P. capsici include  damping off, foliar blights, fruit rot, root and stem rot (18).  Table 1.1 lists some of the  reported hosts and diseases worldwide.     Table 1.1: Known hosts for P. capsici, diseases and distribution.  Modified from the list of  hosts stated by Erwin and Ribeiro (18).    Host Disease Distribution and source Aloaceae Aloe sp. (Aloe) Root rot Taiwan (32). Apiaceae Daucus carota  Root rot U.S. (78). (Carrot) Araceae Anthurium  Spathe blight Hawai (5). andreanum  (Flamingo lily)   3 Table 1.1 (cont’d)    Asteraceae Carthamus tinctorius  (Safflower) Cosmos sp. (Cosmos) Brassicaceae Brassica oleracea  var. botrytis  (Cauliflower) Brassica rapa  (Turnip) Raphanus sativus  (Radish) Cactaceae Opuntia ficus­indica  (Indian Fig) Caryophyllaceae Dianthus barbatus  (Carnation) Chenopodiaceae Beta vulgaris (Beet) B. vulgaris var. cicla  (Swiss‐chard) Chenopodium  amaranticolor  (Spinach) Spinacia oleracea  (Spinach) Cucurbitaceae Bryonia dioica (Red  bryony, wild hop) Citrullus. sp. (Melon) C. lanatus  (Watermelon)  Cucumis melo  (Cantaloupe,  Honeydew melon)  Cucumis sativus  (Cucumber)  Cucurbita maxima  (Blue Hubbard  squash)  C. pepo (Yellow  squash, zucchini)    Root rot U.S. (69). Taiwan (32). Root rot U.S. (69). Damping‐off U.S. (76). Root rot U.S. (69).  Cladode rot Italy (14). Taiwan (32). Damping‐off Damping‐off U.S. (76). U.S. (76). Root rot U.S. (69). Damping‐off U.S. (76). Root rot Italy (14). Collar rot Brown fruit rot;  vine and leaf wilt  Fruit rot;  postharvest decay  France (12), Spain (82).  Japan (43), U.S. (48).  Fruit rot  U.S. (48), Korea (45), Taiwan (32).  Wilt and basal  stem rot  U.S. (48), Argentina (64), Italy (61),  Japan (38).  Leaf and stem  blight    U.S. (81).  4 U.S. (77).    Table 1.1 (cont’d)    Ebenaceae  Diospyros kaki  (Persimmon)  Ericaceae  Enkianthus  quinquefolius   Fabaceae  Medicago sativa  (Alfalfa)  Phaseolus sp.  P. lunatus (Butter  bean, civet bean,  lima bean)  P. vulgaris var.   humilis (Snap beans)  Pisum sativum (Pea)  Vicia faba  (Broadbean)  Geraniaceae  Geranium  carolinianum  (Carolina geranium)  Lauraceae  Persea americana  (Avocado)  Liliaceae  Allium cepa (Onion)  Linaceae  Linum sp. (Flax)  Malvaceae  Abelmoschus  esculentus (Okra)  Albutilon theophrasti  (Velvet‐leaf)  Gossypium hirsutum  (Cotton)  Moraceae  Ficus carica (Fig)  Orchidaceae  Vanilla planifolia  (Vanilla)              Fruit rot        Italy (14).        Taiwan (32).    Root rot    U.S. (69).    Root rot  Taiwan (32).  Argentina (21), U.S. (15).    Unites States (24).  Root rot  Root rot  U.S. (13).  U.S. (69).        U.S. (20).    Root rot    U.S. (77).        Root rot    Root rot    Taiwan (32).    U.S. (69).    U.S. (69).  Damping‐off  U.S. (76).  Root rot; boll rot  U.S. (69).    Fruit rot    Root rot    Japan (44).    French Polynesia (60).              5 Table 1.1 (cont’d)    Piperaceae  Piper betle (Betle)  P. nigrum (Black  pepper)  Portulacaceae  Portulaca oleracea  (Common purslane)  Proteaceae  Leucospermum  (Pincushion flower)  Macadamia  integrifolia  (Macadamia nut)  M. ternifolia  (Macadamia nut)  Rosaceae  Crataegus  oxyacantha  (Hawthorne)  Malus pumila  (Apple)  Prunus persica  (Peach)  Rutaceae  Citrus spp. (Citrus)  Solanaceae  Capsicum annuum  (Red or sweet  pepper)  C. annuum var.  grossum (Bell or  green pepper)  Datura stramonium  (Jimson weed)  Solanum  lycopersicon  (Tomato)  Nicotiana glutinosa  (Tobacco)            Foot rot  Foot rot        Thailand (79), Taiwan (32).  Thailand (79).        U.S. (20).    Stem and root rot    U.S. (83).  Raceme blight  U.S. (49).  Raceme blight  U.S. (49).    Fruit rot    Italy (14).  Fruit rot  U.S. (78).  Seedling wilt; stem  canker    Root rot    Root and fruit rot;  stem blight      Seedling damping  off  Root rot  U.S. (77).  Wilt  Italy (14).    U.S. (84).    U.S. (56), Italy (14), Puerto Rico (80),  Argentina (58), Venezuela (57), Brazil  (16), Japan (44), Bolivia (8), Spain (4),  Iran (17), Serbia (2), Taiwan (11).  Argentina (26), Korea (45), China (33).  U.S. (78).  Fruit rot; root and  U.S. (48), Rusia (63), Venezuela (57),  crown rot; seedling  Japan (44), Korea (45), Taiwan (32).  damping off  Root rot  U.S. (70).          6 Table 1.1 (cont’d)    S. americanum  (American black  nightshade)  S. carolinense  (Carolina  horsenettle)  S. marginatum  S. melongena  (Eggplant)  Solanum nigrum  (Black nightshade)  Sterculiaceae  Theobroma cacao  (Cocoa)              U.S. (20).    U.S. (20).  Fruit rot  Italy (14).  Brown rot; fruit rot  Italy (14), Argentina (21), Venezuela  (65), Japan (41), Korea (45), Taiwan  (32).    U.S. (20).    Black pod    Brazil and Cameroon (86).          Management     Numerous efforts have been made worldwide towards the control of diseases  caused by Phytophthora spp., but these oomycete pathogens still cause significant losses.  Phytophthora spp. have caused billions of dollars in damage to many crops in the U.S. (52).   One species, P. infestans, has been historically recognized for its devastating role in the Irish  potato famine and it still constitutes an enormous threat to food security (27).  The recommended control strategies for P. capsici include choosing well drained  sites, rotating crops and using fungicides, fumigants and resistant varieties (68).  Water is  important in the pathogen life cycle and planting in well drained fields and using proper  irrigation, raised beds and black plastic mulch is recommended (68).  Crop rotation is one  of the main strategies for managing P. capsici; however, this strategy has been limited by  the long‐term survival of oospores in the soil and plant material (52).  Historically, growers  have mostly relied on fungicides for the control of P. capsici.  The most commonly used  7 product is mefenoxam, but resistance to this fungicide has been documented in P. capsici  populations (30).  Chemical control can be very expensive because of the required frequent  applications. Hence, growers whose fields are infected with Phytophthora have to manage  the losses caused by the pathogen and also the cost of the fungicides (27, 28).  Fungicides  can have non‐target effects on the biology of the pathogen, such as inducing oospore  formation and changes in mating type, as observed in P. infestans (28).  It is desirable to  develop new control strategies that reduce growers’ reliance on fungicides.    Host Resistance and Pathogen Populations    A desired control method for Phytophthora spp., and P. capsici in particular, is the  use of resistant varieties (23, 39).  However, to guarantee the success of strategies  including crop rotation, host resistance and chemical control, it is necessary to have  detailed knowledge of pathogen populations and evolution (71).  Nevertheless, little is  known about the genetic diversity and population genetics of Phytophthora spp. (27).    Tolerance has been identified in cucumber (23), pumpkin (54), and tomato (10, 37)  but no sources of high or complete resistance have been identified.  Some pepper varieties  show complete resistance to P. capsici; nonetheless, they are not widely used by growers  due to their lack of commercially appealing characteristics (19).  Other pepper varieties  such as ‘Paladin’ have resistance to crown rot caused by P. capsici and good horticultural  traits, and are grown in P. capsici‐infested fields.  Identifying new sources of resistance to P.  capsici to use in breeding programs for commercially important hosts is needed.   There is considerable diversity in host‐specific pathogenicity. Some isolates are  more virulent to certain cultivars or families of plants (18), and distinct physiological races  of P. capsici have been reported (25, 36, 54, 62, 67, 74).  In a differential pathogenicity  8 study, P. capsici isolates were grouped into 13 classes according to their ability to infect  different plant species (74).  Significant differences in virulence and pathogen‐host  interactions of P. capsici isolates from pumpkin and pepper have been reported (36, 54).  In  another study of host specificity, Ristaino characterized the morphological variation in field  isolates to determine if there were differences between isolates infecting cucurbit and  solanaceous hosts (67).  The morphological characters observed showed a continuous  rather than a discrete distribution within populations according to host type (67).  Ristaino  concluded that genetic and phenotypic characterization of the isolates would be necessary  to delimit groups within the species (67).   Host specificity can be established because of differential fitness of individuals when  associated with particular host species (72).  Fitness will determine the contribution of an  individual to the gene pool of the next generation, leading to the establishment of a genetic  group of isolates more successful in a particular host (72).  Suassuna et al. reported these  events of host specialization in P. infestans; two genetic groups are established in Brazil due  to differences in fitness of isolates associated with potato and tomato (72).  Host  differentiation in P. infestans has also been reported in Peru in isolates infecting cultivated  potato and wild solanaceous hosts (22).  It is important to determine what isolates are  virulent to which crop or family of plants because a widely used control method is crop  rotation.  Many growers use crop rotation between solanaceous and cucurbit plants (68).  A  genetic study to determine if some isolates or populations have host preference infecting  cucurbit plants more frequently than solanaceous plants, would help increase the efficiency  of crop rotation as a control method.   9 Genetic variation, sexual reproduction in the field and differences in virulence and  fungicide resistance among isolates of P. capsici has been reported in several vegetable  growing regions (34, 51, 55, 75).  Studies of population spatial distribution in P. capsici are  required to establish control measures regarding the movement of plant material.  The  dispersal of the pathogen may occur because of the movement of P. capsici on infected  plants or oospores on soil or dry plant parts.  It is important to distinguish what isolates  are present in a certain region and which are not, to avoid the introduction of plant tissue  infected with isolates that can generate big epidemics by increasing genetic variability and  consequently, the probability to generate more virulent strains.  Some apparent hybrids of  plant pathogens have been identified in nature and it has been seen that they present a  wider host range than the species that originated them (47).  A pathogen like P. capsici with a mixed type of reproduction has an increased chance  of overcoming host resistance and chemical control.  New genotypes are created through  recombination during sexual reproduction, and then advantageous alleles can be selected  and established in populations by asexual reproduction (59).  To effectively control P.  capsici, future research should aim to establish the population structure of this pathogen in  particular regions or hosts, identify new sources of host resistance, and identify new  products for chemical control.  The objective of this dissertation was to determine the  susceptibility of Fraser Fir to P. capsici, identify sources of resistance in tomato and wild  relatives to crown and root rot caused by P. capsici, and investigate the global population  structure of this important plant pathogen.      10                                       References                              11 References    1.    2.    3.    4.    5.    6.    7.    8.    9.    10.    11.    12.    13.  Alconero, R., and Santiago, A.  1977.  Characteristics of asexual sporulation in  Phytophthora palmivora and Phytophthora parasitica nicotianae.  Phytopathology  62:993‐997.  Aleksic, Z., Aleksic, D., and Miladinovic, Z.  1975.  Bolesti paprike i mogucnosti  njihovog suzbijanja gajenjem otpornih sorti (Diseases of pepper and the possibilities  of their control by cultivating resistant varieties).  Agron. Glas. 37:73‐82 (In Slavic).  Alexopoulos, C. H., Mims, C. W., and Blackwell, M.  1996.  Introductory Mycology.   John Wiley and Sons, Inc., New York.  Alfaro‐Moreno, A., and Vegh, I.  1971.  La 'tristeza' o 'seca' del pimiento producido  por Phytophthora capsici Leonian (Tristeza or seca of Capsicum caused by  Phytophthora capsici Leonian).  Ann. Inst. Nac. Investnes Agrar. Ser. Prot. Veg. 1:9‐42  (In Spanish).  Aragaki, M., and Uchida, J. Y.  1980.  Foliar stage of Phytophthora blight of  macadamia.  Plant Dis. 64:483‐484.  Babadoost, M.  2000.  Outbreak of Phytophthora foliar blight and fruit rot in  processing pumpkin fields in Illinois.  Plant Dis. 84:1345.  Baldauf, S. L.  2003.  The deep roots of eukaryotes.  Science 300:1703–1706.  Bell, F. H., and Alandia, B. S.  1957.  Diseases of temperate climate crops in Bolivia.   Plant Dis. Rep. 41:646‐649.  Bernhardt, E. A., and Grogan, R. G.  1982.  Effect of soil matric potential on the  formation and indirect germination of sporangia of Phytophthora parasitica,  Phytophthora capsici and Phytophthora cryptogea rots of tomatoes, Lycopersicon  esculentum.  Phytopathology 72:507‐511.  Bolkan, H. A.  1985.  A technique to evaluate tomatoes for resistance to  Phytophthora root rot in the greenhouse.  Plant Dis. 69:708‐709.  Chang, H. S.  1988.  Phytophthora species associated with strawberry fruit rot in  Taiwan.  Bot. Bull. Acad. Sin. 29:61‐67.  Clerjeau, M.  1973.  A new collar rot disease of melon caused by Phytophthora  nicotianae Br. de H. var. parasitica (Dastur) Waterh. and Phytophthora capsici  Leonian.  Seances Acad. Agr. Fr. 59:54‐58.  Critopoulos, P. D.  1955.  Foot rot of tomato incited by Phytophthora capsici.  Bull.  Torrey Bot. Club 82:168‐182.  12   14.    15.    16.    17.    18.    19.    20.    21.    22.    23.    24.    25.    Curzi, M.  1927.  L'eziologia della 'cancrena pedale' del Capsicum annuum (The  etiology of foot rot of Capsicum annuum).  Riv. Patol. Veg. 17:1‐19 (In Italian).  Davidson, C. R., Carroll, R. B., Evans, T. A., Mulrooney, R. P., and Kim, S. H.  2002.   First report of Phytophthora capsici infecting Lima Bean (Phaseolus lunatus) in the  Mid‐Atlantic region.  Plant Dis. 86:1049‐1052.  Do Amaral, J. F.  1952.  Requeima‐do‐pimentao (Chili blight).  Biologico 18:160‐161  (In Portuguese).  Ershad, D.  1971.  Beitrag zur Kenntnis der Phytophthora Arte in Iran und ihrer  Phytopathologischen Bedeutung (Contribution to the knowledge of Phytophthora  species in Iran and their phytopathogenic importance).  Mitt. Biol. Bundesanst. Land.  u. Forstw. 140:84.  Erwin, D. C., and Ribeiro, O. K.  1996.  Phytophthora diseases worldwide. APS Press,  St. Paul, MN.  Foster, J. M., and Hausbeck, M. K.  2010.  Resistance of pepper to Phytophthora  crown, root, and fruit rot is affected by isolate virulence.  Plant Dis. 94:24‐30.  French‐Monar, R. D., Jones, J. B., and Roberts, P. D.  2006.  Characterization of  Phytophthora capsici associated with roots of weeds on Florida vegetable farms.   Plant Dis. 90:345‐350.  Frezzi, M. J.  1950.  Las especies de Phytopthora en la Argentina (The species of  Phytophthora in Argentina).  Rev. Invest. Agric. Buenos Aires 4:47‐133 (In Spanish).  Garry, G., Forbes, G. A., Salas, A., Santa Cruz, M., Perez, W. G., and Nelson, R. J.  2005.   Genetic diversity and host differentiation among isolates of Phytophthora infestans  from cultivated potato and wild solanaceous hosts in Peru.  Plant Pathol. 54:740‐ 748.  Gevens, A. J., Ando, K., Lamour, K. H., Grumet, R., and Hausbeck, M. K.  2006.  A  detached cucumber fruit method to screen for resistance to Phytophthora capsici  and effect of fruit age on susceptibility to infection.  Plant Dis. 90:1276‐1282.  Gevens, A. J., and Hausbeck, M. K.  2003.  Phytophthora capsici in irrigation water and  osilation of P.capsici from snap beans in Michigan.  Vegetable crop advisory team  alert.  Gil Ortega, R., Palazón Español, C., and Cuartero Zueco, J.  1995.  Interactions in the  pepper‐Phytophthora capsici system.  Plant Breed. 114:74‐77.  13 26.    27.    28.    29.    30.    31.    32.    33.    34.    35.    36.    37.    38.    39.  Godoy, E. F.  1940.  El 'mildew' o 'tizon' del pimiento producido por la Phytophthora  capsici en la Republica Argentina (The 'mildew' or 'blight' of chili produced by  Phytopthora capsici in the Argentine Republic).  Rev. Fac. Agron. Univ. Nac. La Plata  24:235‐280 (In Spanish).  Goodwin, S. B.  1997.  The population genetics of Phytophthora.  Phytopathology  87:462‐473.  Groves, C. T., and Ristaino, J. B.  2000.  Commercial fungicide formulations induce in  vitro oospore formation and phenotypic change in mating type in Phytophthora  infestans.  Phytopathology 90:1201‐1208.  Hausbeck, M. K.  2004.  Phytophthora lessons learned: Irrigation water and snap  beans.  The Vegetable Growers News 38:2829.  Hausbeck, M. K., and Lamour, K. H.  2004.  Phytophthora capsici on vegetable crops:  research progress and management challenges. Plant Dis. 88:1292‐1303.  Hickman, C. J.  1970.  Biology of Phytophthora zoospores.  Phytopathology 60:1128‐ 1135.  Ho, H. H.  1990.  Taiwan Phytophthora.  Bot. Bull. Acad. Sin. 31:89‐106.  Ho, H. H., Yu, Y. N., Zhuang, W. Y., and Liang, Z. R.  1983.  Mating types of  heterothallic species of Phytophthora in China Acta Mycol. Sin. 2:187‐191.  Hwang, B. K., Arthur, W. A., and Heitefuss, R.  1991.  Restriction fragment length  polymorphisms of mitochondrial DNA among Phytophthora capsici isolates from  pepper (Capsicum annuum).  System. Appl. Microbiol. 14:111‐116.  Hwang, B. K., and Kim, C. H.  1995.  Phytophthora blight of pepper and its control in  Korea. Plant Dis. 79:221‐227.  Hwang, B. K., Kim, Y. J., and Kim, C. H.  1996.  Differential interactions of  Phytophthora capsici isolates with pepper genotypes at various growth stages.  Eur.  J. Plant Pathol. 102:311‐316.  Hwang, J. S., and Hwang, B. K.  1993.  Quantitative evaluation of resistance of Korean  tomato cultivars to isolates of Phytophthora capsici from different geographic areas.   Plant Dis. 77:1256‐1259.  Kamjaipai, W., and Ui, T.  1978.  Mating types of Phytophthora capsici Leonian, the  causal fungus of pumpkin rot in Hokkaido.  Ann. Phytopatol. Soc. Jpn. 44:440‐446.  Kamoun, S.  2001.  Nonhost resistance to Phytophthora: novel prospects for a  classical problem.  Curr. Opin. Plant Biol. 4:295‐300.  14   40.    41.    42.    43.    44.    45.    46.    47.    48.    49.    50.    51.    52.  Kamoun, S.  2003.  Molecular genetics of pathogenic oomycetes.  Eukariot. Cell  2:191‐199.  Katsura, K.  1958.  A Phytophthora rot of watermelon caused by Phytophthora  drechsleri.  Sci. Rept. Saikyo Univ. Agric. 10:77‐85.  Katsura, K., and Miyazaki, S.  1960.  Leaf penetration by Phytophthora capsici  Leonian.  Sci. Rept. Kyoto Prefect. Univ. Agr. 12:65‐70.  Katsura, K., and Tokura, R.  1954.  Studies on Phytophthora disease of economic  plants (VII). A brown rot of watermelon caused by Phytophthora capsici Leonian.   Sci. Rept. Saikyo Univ. Agric. 6:38‐48 (In Japanese).  Katsura, K., and Tokura, R.  1955.  Studies on Phytophthora disease of economic  plants (VIII), a brown rot of eggplants caused by Phytophthora capsici Leonian.  Pages 167‐172 (In Japanese).  Kim, B. S., Lee, E. K., and Chung, B. K.  1975.  An investigation on the brown rot of  eggplant caused by Phytophthora capsici Leonian.  Korean J. Plant Prot. 14:77‐79 (In  Korean).  Ko, W.  1988.  Hormonal heterothallism and homothallism in Phytophthora.  Annu.  Rev. Phytopathol. 26:57‐73.  Kohn, L. M.  2005.  Mechanisms of fungal speciation.  Annu. Rev. Phytopathol.  43:279‐308.  Kreutzer, W. A., Bodine, E. W., and Durrell, L. W.  1940.  Cucurbit diseases and rot of  tomato fruit caused by Phytophthora capsici.  Phytopathology 30:972‐976.  Kunimoto, R. K., Aragaki, M., Hunter, J. E., and Ko, W. H.  1976.  Phytophthora capsici,  corrected name for the cause of Phytopthhora blight of macadamia racemes.   Phytopathology 66:546‐548.  Lamour, K. H., and Hausbeck, M. K.  2001.  The dynamics of mefenoxam insensitivity  in a recombining population of Phytophthora capsici characterized with amplified  fragment length polymorphism markers. Phytopathology 91:553‐557.  Lamour, K. H., and Hausbeck, M. K.  2002.  The spatiotemporal genetic structure of  Phytophthora capsici in Michigan and implications for disease management.   Phytopathology 92:681‐684.  Lamour, K. H., and Hausbeck, M. K.  2003.  Effect of crop rotation on the survival of  Phytophthora capsici in Michigan. Plant Dis. 87:841‐845.    15 53.    54.    55.    56.    57.    58.    59.    60.    61.    62.    63.    64.    65.  Latijnhouwers, M., de Wit, P. J., and Govers, F.  2003.  Oomycetes and fungi: similar  weaponry to attack plants.  Trends Microbiol. 11:462‐469.  Lee, B. K., Kim, B. S., Chang, S. W., and Hwang, B. K.  2001.  Agressiveness to pumpkin  cultivars of isolates of Phytopththora capsici from pumpkin and pepper.  Plant Dis.  85:497‐500.  Lee, S. B., White, T. J., and Taylor, J. W.  1993.  Detection of Phytophthora species by  oligonucleotide hybridization to amplified ribosomal DNA spacers.  Phytopathology  83:177‐181.  Leonian, L. H.  1922.  Stem and fruit blight of chiles caused by Phytophthora capsici  sp.  Phytopathology 12:401‐408.  Malaguti, G., and Pontis‐Videla, R. E.  1950.  El tizon o 'mildew' del pimiento en  Venezuela ('Blight' or 'mildew' of pimiento pepper in Venezuela).  Agric. Venez.  14:4‐5 (In Spanish).  Marchionatto, J. B.  1938.  Argentine Repubilc researches on the pepper diseases at  Salta and Jujuy.  Intl. Bull. Plant Prot. 12:169‐170.  McDonald, B. A., and Linde, C.  2002.  Pathogen population genetics, evolutionary  potential and durable resistance.  Annu. Rev. Phytopathol. 40:349‐379.  Mu, L., and Tsao, P. H.  1987.  Identities of Phytopthora isolates causing vanilla blight  and root rot in French Polynesia.  Phytopathology 77:1704.  Noviello, C., Cristinzio, G., and Aloj, B.  1977.  Una grave malattia della zucca in  Campania (A serious disease of squash in Campania).  Ann. Fac. Sci. Agrar. Univ.  Stud. Napoli Portici 11:11‐22 (In Italian).  Oelke, L. M., and Bosland, P. W.  2003.  Differentiation of race specific resistance to  Phytophthora root rot and foliar blight in Capsicum annuum.  J. Am. Soc. Hortic. Sci.  128:213‐218.  Osnitzkaya, E. A.  1949.  Phytophthora of tomatoes in protected soil.  Orchard  Kitchen Garden 2:62‐64.  Pontis, R. E.  1945.  Phytophthora capsici en frutos de zapatillo de ronco  (Phytophthora capsici on squash fruits).  Rev. Argent. Agron. 12:17‐21 (In Spanish).  Pontis, R. E., and Rodriguez‐Landaeta, A.  1953.  Una podredumbre de los frutos de  la berenjena (Solanum melongena L.) en Venezuela causada por Phytophthora  capsici (Fruit rot of eggplant in Venezuela caused by Phytophthora capsici Leonian).   Agron. Trop. 3:117‐119 (In Spanish).    16 66.    67.    68.    69.    70.    71.    72.    73.    74.    75.    76.    77.    Randall, T. A., Dwyer, R. A., Huitema, E., Beyer, K., Cvitanich, C., Kelkar, H., Fong, A. M.  V. A., Gates, K., Roberts, S. J., Yatzkan, E., Gaffney, T., Law, M., Testa, A., Torto‐Alalibo,  T., Zhang, M., Zheng, L., Mueller, E., Windass, J., Binder, A., Birch, P. R. J., Gisi, U.,  Govers, F., Gow, N. A., Mauch, F., van West, P., Waugh, M. E., Yu, J., Boller, T., Kamoun,  S., Lam, S. T., and Judelson, H. S.  2005.  Large‐scale gene discovery in the oomycete  Phytophthora infestans reveals likely components of phytopathogenicity shared with  true fungi.  MPMI 18:229‐243.  Ristaino, J. B.  1990.  Intraspecific variation among isolates of Phytopthora capsici  from pepper and cucurbit fields in North Carolina.  Phytopathology 80:1253‐1259.  Ristaino, J. B., and Johnston, S. A.  1999.  Ecologically based approaches to  management of Phytophthora blight on bell pepper.  Plant Dis. 83:1080‐1089.  Satour, M. M., and Butler, E. E.  1967.  A root and crown rot of tomato caused by  Phytophthora capsici and P.parasitica.  Phytopathology 57:510‐515.  Satour, M. M., and Butler, E. E.  1968.  Comparative morphological and physiological  studies of the progenies from intraspecific matings of Phytophthora capsici.   Phytopathology 58:183‐192.  Silvar, C., Merino, F., and Díaz, J.  2006.  Diversity of Phytophthora capsici in  Northwest Spain: analysis of virulence, metalaxyl response, and molecular  characterization.  Plant Dis. 90:1135‐1142.  Suassuna, N. D., Maffia, L. A., and Mizubuti, E. S. G.  2004.  Agressiveness and host  specificity of Brazilian isolates of Phytophthora infestans.  Plant Pathol. 53:405‐413.  Sujkowski, L. S., Parra, G., Gumpertz, M. L., and Ristaino, J. B.  2000.  Temporal  dynamics of Phytopthora blight on bell pepper in relation to the mechanisms of  dispersal of primary inoculum of Phytopthora capsici in soil.  Phytopathology  90:148‐156.  Tamietti, G., and Valentino, D.  2001.  Physiological characterization of a population  of Phytophthora capsici Leon. from Northern Italy.  J. Plant Pathol. 83:1101.  Tian, D., and Babadoost, M.  2003.  Genetic variation among isolates of Phytophthora  capsici from Illinois.  Phytopathology 93:S84   Tian, D., and Babadoost, M.  2004.  Host range of Phytophthora capsici from pumpkin  and pathogenicity of isolates.  Plant Dis. 88:485‐489.  Tompkins, C. M., and Tucker, C. M.  1937.  Phytophthora rot of honeydew melon J.  Agric. Res 54:933‐944.  17 78.    79.    80.    81.    82.    83.    84.    85.    86.            Tompkins, C. M., and Tucker, C. M.  1941.  Root rot of pepper and pumpkin caused by  Phytophthora capsici.  J. Agric. Res 63:417‐426.  Tsao, P. H., and Tummakate, A.  1977.  The identity of a Phytophthora species from  black pepper in Thailand.  Mycologia 69:631‐637.  Tucker, C. M.  1928.  Report of the plant pathologist.  Puerto Rico Agric. Exp. Stn.  1927:25‐27.  Tucker, C. M.  1936.  Work of the Agricultural Experimental Station. Report of the  Director for the year 1935. Page 100.  Tuset‐Barrachina, J. J.  1977.  Contribución al conocimiento del género Phytophthora  De Bary en España (Contribution to the knowledge of the genus Phytophthora De  Bary in Spain).  Ann. Inst. Nac. Invest. Agrar. Prot. Veg. 7:11‐106 (In Spanish).  Uchida, J. Y., and Aragaki, M.  1979.  New diseases caused by Phytophthora species.   Phytophthora Newsl. 7:39‐40.  Wiant, J. S., and Tucker, C. M.  1940.  A rot of winter queen watermelons caused by  Phytophthora capsici.  J. Agric. Res 60:73‐88.  Yoshikawa, M., Tsukadaira, T., Masago, H., and Minoura, S.  1977.  A non‐pectolytic  protein from Phytophthora capsici that macerates plant tissue.  Physiol. Plant Pathol.  11:61‐70.  Zentmyer, G. A., Kaosiri, T., and Idosu, G.  1977.  Taxonomic variants in the  Phytophthora palmivora complex.  Trans. Br. Mycol. Soc. 69:329‐332.  18 CHAPTER II: SUSCEPTIBILITY OF FRASER FIR TO PHYTOPHTHORA CAPSICI    Abstract    Quesada‐Ocampo, L. M., Fulbright, D. W., and Hausbeck, M. K.  2009.  Susceptibility of Fraser  Fir to Phytophthora capsici. Plant Disease 93: 135‐141.     Phytophthora cinnamomi, P. drechsleri, P. citricola and P. cactorum limit Fraser fir  production, whereas P. capsici affects solanaceous, cucurbitaceous, and fabaceous crops.   Some vegetable growers in Michigan plant conifers for the Christmas tree market in fields  infested with P. capsici.  To determine the susceptibility of Fraser fir to P. capsici, stems (no  wound or 1‐ or 3‐mm‐diameter wound) or roots (2 or 4 g of infested millet seed or 2 or 5 x  103 zoospores/ml of a zoospore suspension) of seedlings were inoculated with each of 4 P.  capsici isolates and incubated in growth chambers (20°C or 25°C).  In addition, Fraser fir  seedlings were planted in two commercial fields naturally infested with P. capsici.  All P.  capsici isolates tested incited disease in the seedlings regardless of incubation temperature  or inoculation method.  Seedlings (72%) planted in P. capsici‐infested fields developed  disease symptoms and died.  Most of the P. capsici isolates obtained from the Fraser fir  seedlings infected while in the field were recovered from root tissue.  Identification was  confirmed by species‐specific direct colony Polymerase chain reaction.  The pathogen was  successfully recovered from stems of all stem‐inoculated seedlings, and from roots and  stems of all root‐inoculated seedlings; the phenotype of the recovered isolate matched the  phenotype of the inoculum.  This study suggests that planting Fraser fir in fields infested  with P. capsici could result in infection and that adjustments in current rotational schemes  are needed.    19 Introduction    Each year approximately 33 to 36 million Christmas trees are produced in North  America with an estimated farm gate value of $462 million (5).  Michigan ranks third in the  production of Christmas trees, with 17,000 hectares and an annual value of $4 million (2,  5).  Nationally, the most common species used in plantations include Douglas fir  (Pseudotsuga sp.), Fraser fir (Abies fraseri), Noble fir (A. procera), and Balsam fir (A.  balsamea) (5).  With its natural Christmas tree shape and excellent postharvest quality,  Fraser fir is one of the most valued trees in the Christmas tree industry (5), rapidly  becoming the most popular tree among growers in Michigan.  In 2005, 3,000 hectares were  planted to Fraser fir in Michigan (2).   Phytophthora root rot and shoot blight can limit the production and marketability of  Fraser fir (5, 6), as reported in North Carolina (3) and Michigan (1).  With the exception of  Michigan, Phytophthora cinnamomi (11) is typically the causal organism.  However, P.  drechsleri (4), P. citricola (35) and P. cactorum (1) have also been associated with root rot  and shoot blight symptoms in Fraser fir and other Abies and conifer species grown for  Christmas trees (1, 4, 13, 14, 21, 30).  Plant death ranging from 30% to 75% can occur  when conditions are favorable (5).  Fraser fir is especially susceptible to P. cinnamomi and  other Phytophthora species; symptoms including characteristic reddish‐brown needles  develop rapidly and most trees die in 4 to 5 weeks (5, 6, 17).    To prevent Phytophthora root rot and shoot blight in Christmas trees, it is important  that growers plant pathogen‐free seedlings into well‐drained fields without a history of  root rot organisms (3).  In some growing regions, uninfested fields are becoming  increasingly scarce, limiting the expansion of production (5).  Michigan vegetable growers  20 are diversifying their crops and including Fraser fir plantings in soils infested with  Phytophthora capsici Leonian.  Phytophthora capsici has a broad host range including  solanaceous, cucurbitaceous and fabaceous crops (8).  Crop rotation is used to manage P.  capsici, but this strategy is limited by the long‐term survival of oospores in soil (27) and an  increasing list of P. capsici‐susceptible hosts (10).  The objective of this study was to  determine whether P. capsici is pathogenic to Fraser fir.  Specifically we sought to  determine the following: (i) whether or not incubation temperature, inoculation method, or  P. capsici isolates influence infection and disease development, and (ii) whether or not  Fraser fir seedlings could become infected when planted in a field naturally infested with P.  capsici.  A preliminary report of these findings has been published (32).    Methods    Isolate selection, maintenance and inoculum preparation.  P. capsici isolates  collected in Michigan from infected cucurbitaceous and solanaceous crops were selected  from the culture collection maintained in the laboratory of Dr. Hausbeck at Michigan State  University (MSU).  They were phenotypically characterized according to mating type (MT)  and sensitivity to the fungicide mefenoxam (24).  Isolate OP97 (A1 MT) was isolated from  pickling cucumber and SP98 (A2 MT) from pumpkin, and both are sensitive to mefenoxam.   Isolate SFF3 (A2 MT) originates from pickling cucumber and isolate 12889 (A1 MT) was  obtained from pepper; both are insensitive to mefenoxam.   Actively growing cultures of each isolate were obtained by transferring agar plugs  from long‐term stock cultures (stored at 20°C in sterile microcentrifuge tubes with 1 ml of  sterile water and one sterile hemp seed) onto V8 juice agar (16 g agar, 3 g CaCO3, 160 ml  21 unfiltered V8 juice and 840 ml distilled water).  Cultures were maintained at room  temperature (21 + 2°C) under fluorescent light.  To ensure that isolates were virulent,  cucumber fruits were inoculated with each isolate.  Cucumbers were washed with water,  disinfected for 5 min in a 5% sodium hypochlorite solution and dried at room temperature.   A small superficial wound was made with a sterile needle in the center of each cucumber.   Agar plugs (7 mm diameter) from the margins of actively growing colonies were placed  upside down on top of the wound.  A sterile microcentrifuge tube (with the cap removed)  was placed over each agar plug and fixed to the fruit with petroleum jelly.  Control  cucumbers were inoculated as described above using a sterile 7‐mm‐diameter plug of V8  agar.  Cucumbers were placed in aluminum trays with wet paper towels and covered with  plastic wrap to maintain high relative humidity.  Trays were incubated at room  temperature (21 + 2°C).  Symptomatic cucumber tissue (5 mm) was excised and  transferred to V8 juice agar and maintained under the same conditions described above.   Clean cultures of each isolate were obtained from the infected cucumber tissue.  Bare‐root Fraser fir seedlings were purchased from a nursery in Holland, MI that obtained  the seed from Roan Mountain, NC (lat. 36°09'N, long. 82°05'W).  Seedlings were grown in a  greenhouse and then transplanted into a field nursery bed for one growing season at the  nursery in Holland.  Seedlings used in all experiments were 0.15 to 0.3 m in height with 6‐  to 10‐mm diameter stems and grown in 3‐liter pots containing soilless medium (Baccto  Professional Planting Mix, Michigan Peat Company, Houston, TX).   Three types of inoculum were prepared and included agar plugs, a zoospore  suspension, and infested millet seed.  Agar plugs (7 mm diameter) of actively growing P.  capsici containing mycelium and sporangia were used for stem inoculations.  Zoospore  22 inoculum was prepared by pouring 20 ml sterile distilled water into a Petri plate with  actively growing and sporulating P. capsici on V8 agar.  The plates were moved to a 4°C  environment for 30 min and then returned to 25°C for 30 min to trigger zoospore release.   The number of zoospores in a 1‐ml aliquot of the suspension was determined by using a  hemacytometer.  To facilitate counting, zoospores were first encysted by spinning the  suspension at full speed on a vortex mixer for 1 min.  Inoculum concentration was adjusted  to 2 x 103 and 5 x 103 zoospores/ml.  Viability was confirmed after mixing with a vortex by  transferring drops of zoospore suspension onto V8 agar and observing colony growth.  P.  capsici‐infested millet seed was also prepared.  Millet seed (100 g) was mixed with  asparginine (0.08 g) and water (72 ml) in a 500‐ml Erlenmeyer flask.  The flask was capped  with aluminum foil and autoclaved twice consecutively.  The flask was shaken to  homogenize the mixture.  The seeds were inoculated with four 7‐mm‐diameter agar plugs  from an actively growing P. capsici V8 culture.  The inoculated millet seeds were incubated  at room temperature (21 + 2°C) under constant fluorescent light for four weeks.   Stem inoculation.  Three different methods were used to inoculate each of four  Fraser fir seedlings using isolate OP97.  Inoculations without wounding involved placing an  agar mycelial plug on the stem 2 cm above ground level and covering the plug with  parafilm to retain moisture.  A second inoculation method included making a small wound  (1‐mm diameter) in the stem (2 cm above ground level) using a sterile syringe needle,  placing the agar mycelial plug over the wound and covering the plug with parafilm.  A third  inoculation method included making a larger wound (3‐mm diameter) in the stem (2 cm  above ground level) using a sterile cork borer, placing the agar plug over the wound and  covering the plug with parafilm.  As a control, four seedlings were each inoculated using the  23 three inoculation methods as previously described, and sterile 7‐mm‐diameter V8 agar  plugs.  The inoculated and control seedlings were placed in a randomized arrangement in  each of two growth chambers maintained at 20 or 25°C with fluorescent lighting (14/10  day/night photoperiod and 95 mE of light intensity).  Seedlings were watered once a week  if the soil was dry.  This experiment was conducted twice.   Additional studies were conducted using a small wound inoculation method or no  wounding.  Four isolates of P. capsici (OP97, SFF3, SP98, and 12889) were used as  inoculum with four replicate plants used per isolate.  Four control plants were inoculated  using V8 agar plugs.  The seedlings were placed randomized in a growth chamber at 25°C  and maintained and watered as previously described.  This experiment was conducted  twice.   Root inoculation.  Roots were inoculated by dispensing 10 ml of a suspension  containing 2 x 103 or 5 x 103 zoospores/ml on the soil surface at the base of each seedling  or by mixing the soil with 2 g or 4 g of infested millet seed.  Approximately 50 g of soil  surrounding the stem was removed, mixed with the millet seed and replaced around the  stem.  Four Fraser fir seedlings were inoculated with P. capsici OP97, and four control  seedlings were inoculated with sterile distilled water or millet seed inoculated with sterile  V8 agar plugs.  The seedlings were placed in a randomized arrangement in a growth  chamber at 25°C and maintained and watered as previously described.  This experiment  was conducted twice.   Millet seed infested with one of four isolates of P. capsici (OP97, SFF3, SP98, and  12889) was used to inoculate seedlings after transplanting as previously described.  Four  replicate seedlings were used per isolate.  Four control plants were inoculated with millet  24 seed with sterile V8 agar plugs.  The seedlings were placed randomized in a growth  chamber at 25°C and maintained and watered as previously described.  This experiment  was conducted twice.   Disease assessment and data analysis.  Disease assessment was initiated one  week following inoculation and continued at weekly intervals for two months or until all  seedlings were dead.  Disease progression was recorded for each seedling as the  percentage of branches with bronze coloration and the area under the disease progress  curve (AUDPC) calculated.  The AUDPC values were averaged and used for all statistical  analyses and their residuals followed the assumptions of all statistical tests performed.   The experiment was arranged in a split‐plot with whole plots in a randomized complete  block design.  Data were subjected to analysis of variance using the PROC MIXED procedure  of SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC) and multiple comparisons among the means were  conducted using t‐tests (LSD) when effects were found to be statistically significant at 0.05  levels.   Field experiment.  In 2007, seedlings were planted in two commercial fields in  Michigan known to be infested with P. capsici.  Previously, the fields had been cropped  primarily to cucurbits, including summer and winter squash and cucumber that had  become infected by P. capsici.  Field 1 was located in Cass County and had sandy loam soil,  and Field 2 was located in Oceana County and had Benona sand soil.  The study was  conducted in each field from 29 June to 31 August and repeated from 2 September to 9  November 2007.  Soil and air temperatures were obtained from the Michigan Automated  Weather Network (MAWN) for the Lawton Station located 14.5 km away from Field 1 and  from the Hart Station located 8 km away from Field 2 (Table 2.1).  25 Table 2.1.  Soil and air temperatures of two commercial fields in Michigan naturally  infested with Phytophthora capsici during the months from June to November, 2007.    Air temperature (°C)  Soil temperature (°C)  Field  Months  Average  Minimum  Maximum  Average  Minimum  Maximum  1  Jun ‐ Aug  21.6  3.9    35.0  24.3  19.2    29.4    Sep ‐ Nov  12.3  ‐8.2    32.6  15.8  12.6    19.0  2  Jun ‐ Aug  19.9  1.6    33.2  26.1  18.5    33.7    Sep ‐ Nov  10.9  ‐8.4    32.1  13.3  8.3    18.2    One hundred and fifty Fraser fir seedlings were planted in each field with 0.6 m  spacing between seedlings within a row and centered in 10 beds that were 18 m long and  0.6 m wide with spacing of 1.5 m between beds.  Yellow squash, a known P. capsici‐ susceptible host, was established in the plant beds between the Fraser fir seedlings.  Each  row contained approximately 15 Fraser fir and yellow squash seedlings.  Eight  asymptomatic or 8 symptomatic Fraser fir seedlings were sampled randomly from each  field every week for 9 weeks, beginning one week after planting.  When symptoms were  not observed, only asymptomatic seedlings were collected and sampled.  Toward the end of  the study when symptoms were observed in most of the planted seedlings, only  symptomatic seedlings were collected.  Yellow squash showing crown rot was also  sampled.  The incidence of P. capsici recovered from each tissue type (root, stem, branch  and needle) was determined for Fraser fir.  The incidence of P. capsici from each tissue type  was used for all statistical analyses and their residuals followed the assumptions of all  statistical tests performed.  The experiment was arranged in a split‐plot with whole plots in  a randomized complete block design.  Data were subjected to analysis of variance using the  PROC MIXED and PROC GLIMMIX procedures of SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC) and  26 multiple comparisons among the means were conducted using t‐tests (LSD) when effects  were found to be statistically significant at 0.05 levels.   Pathogen isolation.  Control and inoculated seedlings from the growth chamber  experiments were washed with water to remove the soilless growing medium particles and  other debris, dipped into 70% ethanol for 1 min to surface disinfest all tissues and air‐ dried.  The washing and surface sterilization step was accomplished prior to making an  incision in the sample to avoid exposing the tissues inside and potentially compromising  the success of pathogen isolation.  Tissue from root, stem, branch and needle were excised  and cut in half with a sterile scalpel and plated onto BARP‐(benomyl, ampicillin, rifampicin,  and pentachloronitrobenzene) amended, unclarified V8 agar (27).  This technique  facilitated the growth of the pathogen from the infected tissue into the growth media.  The  same procedure was used to isolate P. capsici from asymptomatic and symptomatic Fraser  fir and yellow squash seedlings planted in the field.   Cultures that were suspected to be P. capsici based on morphological characteristics  were transferred to new BARP plates.  Axenic cultures were incubated for 7 days on V8  agar with continual fluorescent lighting under ambient laboratory conditions (21 ± 2°C).   Cultures were positively identified as P. capsici based on morphological characteristics  described by Waterhouse (37).  Isolates obtained from seedlings in the growth chambers  were characterized for MT and mefenoxam resistance as previously described (24) to  compare the phenotype of the isolate obtained with the original inoculum.  Isolates  obtained from the field were also characterized for MT and mefenoxam resistance.   Molecular confirmation of field isolates.  Field isolates suspected to be P. capsici  and positively identified by morphological characteristics were further confirmed by direct  27 colony polymerase chain reaction (PCR) (23).  Mycelium was prepared by inoculating 1‐ml  aliquots of cucumber extract amended with antibiotics in sterile 1.5 ml‐microcentrifuge  tubes.  Cucumber extract was prepared by blending 2 kg of fresh cucumbers in 1 liter of  water, filtering through cheesecloth, centrifuging the juice at 15,550 x g for 20 min and  transferring the supernatant to a clean flask.  The supernatant was autoclaved and the top  layer of the extract was aspirated into a new flask without transferring any precipitate  from the bottom.  Antibiotics (50 ppm vancomycin, 25 ppm pimaricin and 50 ppm  ampicillin) were added to the extract and it was stored in 50‐ml falcon tubes for later use.   Cultures were grown overnight on a shaker at room temperature (21 ± 2°C) under constant  fluorescent light.  Cultures were centrifuged at 21,130 x g for 2 min and the supernatant  was removed.  Mycelium was rinsed 3 times with 1 ml sterile water, centrifuged at 21,130 x  g rpm for 1 min and the supernatant was removed in each washing step.  A small amount of  mycelium was transferred to PCR tubes and macerated with a sterile micropipette tip.  The  PCR mix was directly added to the mycelium.  Two specific primers for P. capsici were used for PCR: one forward primer (CAPFW;  5´TTTAGTTGGGGGTCTTGTACC3´), and one reverse primer (CAPRV2;  5´TACGGTTCACCAGCCCATCA3´) that were designed by Silvar et al. (36).  Direct colony PCR  reactions were performed in a total volume of 25 µl containing mycelium, 2.5 µl 10X PCR  reaction buffer (Invitrogen, Carlsbad, CA), 14.3 µl sterile water, 1 µl 10 µM MgCl2  (Invitrogen, Carlsbad, CA), 4 µl 1.25 mM dNTP mix (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1 µl each  primer 10 µM (MSU Macromolecular Structure Facility, East Lansing, MI), and 0.2 µl Taq  DNA polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA).  The PCR reaction was performed in a  programmable Eppendorf mastercycler ep systems thermal cycler (Eppendorf, Westbury,  28 NY) starting with 5 min denaturation at 95°C to release DNA from mycelium, followed by  30 cycles at 95°C for 30 s, annealing at 56°C for 30 s, and extension at 72°C for 60 s, with a  final extension step of 5 min at 72°C.  PCR products were analyzed by electrophoresis in  1% (w/v) agarose gel in 1X Tris‐acetate‐EDTA buffer (29), stained with ethidium bromide  (5 µg/ml) for visualization and compared to a 100 bp ladder (Invitrogen, Carlsbad, CA).  A  control with extracted DNA was used to ensure that detection of the pathogen was possible  using direct colony PCR.     Results     All Fraser fir seedlings inoculated with P. capsici developed symptoms and died;  wounding was not required.  The first disease symptoms occurred approximately 2 weeks  after inoculation.  Overall disease symptoms included reddish‐brown foliage or bronzing  and needle death that began in the lower portion of the seedling and progressed upwards  until all of the foliage exhibited symptoms; dark, discolored and rotted roots along with  seedling death were also observed (Figure 2.1).                   29 Figure 2.1.  Symptoms of Phytophthora capsici root rot on Fraser fir.  A, Normal appearance  of the foliage of a control seedling.  B, Bronzing of needles starting in the lower part of the  seedling that progresses upward to the rest of the foliage.  C, Complete bronzing of all the  foliage of the seedling.      Significant differences occurred among the stem inoculation methods (ANOVA,  P=0.0081, Table 2.2).  Wounded seedlings developed symptoms sooner than  unnonwounded seedlings (Figure 2.2A and B) when inoculated with P. capsici OP97  according to AUDPC data.  There was not a significant difference in disease resulting from  the 1‐ and 3‐mm‐diameter wounds.  However, they were both different from the  inoculation method without wounding.    Although seedlings incubated at 20°C died 3 to 4 weeks later than seedlings  incubated at 25°C (Figure 2.2A and B), AUDPC means did not differ significantly between  incubation temperatures (ANOVA, P=0.5644, Table 2.2).  Interaction effects were not found  between temperature and the inoculation method (ANOVA, P=0.2568, Table 2.2).  An  incubation temperature of 25°C was used in subsequent growth chamber experiments.   30 Table 2.2.  Effects of inoculum, pathogen isolate, incubation temperature, and inoculation  method on the area under the disease progress curve (AUDPC) values for disease incidence  on Fraser fir seedlings caused by Phytophthora capsici.     Treatment main effect (P value)  AUDPC meana  Stem inoculation using OP97    Temperature (0.5644)      20°C      25°C    Inoculation method (0.0081)      No wound      1‐mm wound      3‐mm wound    Temperature x inoculation method (0.2568)  Stem inoculation using one of four isolates    Inoculation method (0.0138)      No wound      1‐mm wound    Isolate (0.4847)      OP97      SP98      SFF3      12889    Inoculation method x isolate (0.4617)  Soil infestation using OP97    Inoculation method (0.0168)      2 x 103 zoospores/ml      5 x 103 zoospores/ml      2 g of infested millet seed      4 g of infested millet seed  Soil infestation using one of four isolates    Inoculation method (0.9603)      2 g of infested millet seed      4 g of infested millet seed    Isolate (0.1974)      OP97      SP98      SFF3      12889    Inoculation method x isolate (0.9802)            219.3 a  290.7 a  196.8 a  322.5   b  245.7   b                  239.6 a  293.9   b     249.5 a  279.5 a  266.9 a  271.3 a        61.3 a  101.9 a      375.3   b  380.8   b      285.7 a  281.3 a     205.8 a  322.8 a  314.1 a  291.4 a     a Means within a column for each treatment main effect followed by the same letter are not  significantly different (LSD).    31     Significant differences were observed among the methods used to infest the soil  (ANOVA, P=0.0168, Table 2.2).  According to AUDPC data, a zoospore suspension was  significantly less effective than using infested millet seed.  Most of the seedlings (97%)  inoculated with millet seed became infected and died (Figure 2.2E).  In contrast, 87% of the  seedlings inoculated with a zoospore suspension became infected as determined by  pathogen isolation at the conclusion of the experiment, but only 2% died (a maximum of  26.8% showed symptoms).  The suspension containing a low (2 x 103/ml) or high (5 x  103/ml) zoospore concentration was significantly different from soil infestation using 2 or  4 g of millet seed (Table 2.2).  Seedlings inoculated using millet seed died 4 to 6 weeks after  inoculation, similar to that observed for the stem inoculation experiments.  No significant  differences were found among zoospore concentrations or millet seed quantities used for  soil infestation (Table 2.2).   When four P. capsici isolates (OP97, SP98, SFF3 or 12889) were used to inoculate  wounded (1‐mm diameter) or unwounded seedling stems, significant differences among  the isolates were not observed (ANOVA, P=0.4847, Table 2.2).  Similarly, significant  differences were not found among P. capsici isolates (ANOVA, P=0.1974, Table 2.2) when  infested millet was used as inoculum.  All isolates were capable of producing disease and  death in seedlings regardless of whether they were inoculated via the stem (Figure 2.2C  and D) or soil infestation (Figure 2.2F and G) method.  There were significant differences  between the no wound and 1‐mm diameter wound stem inoculation methods according to  AUDPC data (ANOVA, P=0.0138, Table 2.2), as observed in the previous experiment for  isolate OP97.  No interaction effects were found between the isolate and the agar plug  32 inoculation method (ANOVA, P=0.4617) or the infested millet inoculation method (ANOVA,  P=0.9802) (Table 2.2).  No significant differences were observed between the two millet  seed quantities (ANOVA, P=0.9603, Table 2.2) used to infest the soil.   Figure 2.2.  Progression of disease caused by Phytophthora capsici in inoculated Fraser fir  seedlings.  Points represent mean values of 8 replicates with the standard deviation.  A‐B,  Comparison of inoculation of P. capsici OP97 onto unwounded (none) or wounded (1 or 3  mm wounds) stem and grown at A, 20°C, and B, 25°C.  C‐D, comparison of inoculations of 4  isolates of P. capsici onto C, unwounded or D, wounded (1 mm) stems and grown at 25°C.   E, comparison of rates of P. capsici OP97‐infested millet seeds inserted into the growing  media near the stem and concentrations of P. capsici OP97 zoospore suspension poured  into the growing media near the stem and grown at 25°C.  F‐G, comparison of inoculum of 4  isolates of P. capsici prepared as F, 2 g infested millet seed and G, 4 g infested millet seed  inserted into the potting media near the stem and grown at 25°C.                    33 Figure 2.2 (cont’d)      The pathogen was isolated only from inoculated symptomatic seedlings in all  growth chamber experiments.  The phenotype (MT and mefenoxam resistance) was  34 confirmed and matched the phenotype of the isolate used as inoculum.  The control  seedlings remained asymptomatic.  Over 70% of the total number of seedlings planted in both fields naturally infested  with P. capsici developed disease symptoms and died.  Root rot symptoms were observed  approximately 2 to 3 weeks after planting in fields 1 and 2 at both planting times.  Foliar  disease symptoms included bronzing and death of the needles similar to that observed on  inoculated plants in the growth chamber experiments.  There was not a significant  difference in seedling death due to variability between the field sites (ANOVA, P=0.4678) or  the planting times (ANOVA, P=0.5277).  Seedlings died quickly 3 to 5 weeks after planting  in the first field experiment; temperatures were higher in the first experiment relative to  the second field experiment (Table 2.1).  In the second experiment, Fraser fir seedlings died  4 to 6 weeks after planting.  All yellow squash seedlings died 4 to 5 weeks after planting in  both experiments and planting times and all isolations made from roots and stems were  positive for P. capsici growth.  Growth of P. capsici was observed in all isolations from  symptomatic Fraser fir seedlings (Table 2.3), but significant differences in pathogen  incidence were found among different plant parts (PROC GLIMMIX, P <0.0001).  Field 1  yielded a total of 84 P. capsici isolates for both planting times (Table 2.3) obtained from  Fraser fir root (87%) and stem (13%) tissue (Table 2.3).  Field 2 yielded a total of 87 P.  capsici isolates for both planting times (Table 2.3) obtained from root (90%) and stem  (10%) tissue (Table 2.3).      35 Table 2.3. Incidence of Phytophthora capsici and isolates obtained from different parts of  the symptomatic Fraser fir seedlings sampled from naturally infested fields and both  planting dates.    Total  Isolates  Symptomatic  number  obtaineda (%)  Incidence of P. capsicib (%)  seedlings  of  Root  Stem  Root  Stem  Branch  Needle  Field  sampled  isolates  1  144  84  73 (87)  11 (13)  83 (57)  53 (37)  8 (6)  0 (0)  2  144  87  78 (90)  9 (10)  80 (55)  55 (38)  9 (7)  0 (0)  aAs determined by axenic pathogen isolation at the conclusion of the experiment.   bAs determined by the total number of tissue pieces that presented P. capsici growth.      There was not a significant difference in the number of isolates obtained from roots  or stems due to variability between the field sites (ANOVA, P=0.3440 and P=0.2271,  respectively) or the planting times (ANOVA, P=0.3390 and P=0.3733 respectively).   Although the branches and needles exhibited bronzing in both fields (Figure 2.1), the  pathogen was not easily recovered from branches and was never recovered from the  needles.  The majority of the P. capsici isolates collected were sensitive to the fungicide  mefenoxam and approximately 50% was of the A2 MT (Table 2.4).  Clean cultures were  obtained from 60% of the original cultures obtained directly from Fraser fir tissue.  The  pathogen was not isolated from tissue of asymptomatic Fraser fir seedlings.    36 Table 2.4. Mating type and mefenoxam sensitivity of Phytophthora capsici isolates from  symptomatic Fraser fir seedlings grown in two commercial fields in Michigan naturally  infested with Phytophthora capsici.    Total  Mefenoxam sensitivityb (%)  Total  number of  MTa  Field  (%)  isolates  I  IS  S  1  84  A1  3 (3.6)  4 (4.7)  32 (38.0)  39 (46.3)      A2  10 (12.0)  4 (4.7)  31 (37.0)  45 (53.7)  2  87  A1  29 (33.3)  2 (2.3)  11 (12.6)  42 (48.2)      A2  13 (15.0)  4 (4.6)  28 (32.2)  45 (51.8)  Total  171    55 (32.0)  14 (8.0)  102 (60.0)  171  aIndicates mating type (A1 or A2) of isolate.    bIndicates isolate sensitivity to the fungicide mefenoxam:  insensitive (I), intermediately  sensitive (IS), and sensitive (S).      P. capsici was positively identified based on morphological characteristics and was  confirmed by direct colony PCR amplification with P. capsici‐specific primers.  The PCR  product obtained for all isolates had the expected size of 594 bp (36) when compared to  the 100 bp ladder (Figure 2.3).  Direct colony and control DNA PCR reactions produced the  expected band for positive identification of P. capsici (Figure 2.3).  Other organisms that  were isolated from symptomatic and asymptomatic seedlings included Pythium spp.,  Alternaria spp., and Fusarium spp.  Pythium spp. were particularly common from root and  stem tissue isolations and Alternaria spp. were commonly obtained from branch and  needle tissue.                        37 Figure 2.3.  Polymerase chain reaction (PCR) confirmation of isolate identification with P.  capsici specific primers.  M, 100 bp ladder, with uppermost band 1,000 bp.  1, 2, 3, 4, PCR  product of direct colony PCR of isolates obtained from different symptomatic seedlings  sampled in the field experiment.  5, PCR product from DNA extracted from mycelium of P.  capsici OP97.  6, PCR product from DNA extracted from mycelium of P. capsici SP98.  7,  negative control where water was added to the PCR reaction instead of mycelium or DNA.    Discussion    Phytophthora root rot and blight incited by P. cinnamomi (11), P. drechsleri (4), P.  citricola (35), or P. cactorum (1) causes needles and branches of Fraser fir to turn reddish‐ brown in color (5).  Similar symptoms were observed in seedlings infected with P. capsici.   A wound was not required for infection; however, wounding significantly increased disease  incidence.  All P. capsici isolates tested incited disease in the seedlings regardless of  temperature (20 or 25°C) or inoculation method, indicating that P. capsici can infect Fraser  fir.  Most of the P. capsici isolates obtained from the Fraser fir seedlings infected while in  the field were recovered from root tissue.  In addition, the pathogen was successfully  recovered from stems of all stem‐inoculated seedlings, and from roots and stems of all  root‐inoculated seedlings; the phenotype of the recovered isolate always matched the  phenotype of the inoculum.    In our study, P. capsici was more difficult to recover from Fraser fir seedlings than  from the yellow squash.  Phytophthora capsici can be difficult to isolate from certain tissue  38 types such as mature pepper stems, but readily isolated from symptomatic pepper fruits  (M. K. Hausbeck, unpublished data).  Other Phytophthora spp. are not readily isolated from  the fibrous tissue of asparagus crowns and fern (9, 34) or the woody tissue of oak (7) or  various ornamentals (12).  Direct colony PCR was a fast and reliable way to verify the identity of P. capsici  isolated from plant tissue and allowed the processing of a high number of isolates by  eliminating the DNA extraction step (Figure 2.3).  Other organisms that were isolated from  both symptomatic and asymptomatic Fraser fir seedlings included Pythium spp., Alternaria  spp., and Fusarium spp.  Pythium spp. were particularly common from root and stem tissue  and Alternaria spp. from branch and needle tissue.  Alternaria spp. are among the most  common needle phylloplane fungi and are commonly isolated from needles of other  Pinaceae members (31).  Fraser fir seedlings planted in the P. capsici‐infested fields died quickly in the first  experiment that was conducted during a time of relatively high temperatures compared to  the second experiment.  However, there was no significant difference in seedling death  between fields at different planting times and when inoculated plants were incubated in  growth chambers at 25°C or 20°C there was no significant difference in disease.  The  minimum, optimum, and maximum temperatures for growth of P. capsici are 10°C, 28°C,  and >35°C, respectively (8).  The temperatures used in the growth chamber experiments  are close to the optimum temperature for P. capsici growth, in the first field experiment the  average soil temperature was also close to the optimum growth temperature for P. capsici.   In the second field experiment, the average soil temperature was close to the minimun  growth temperature for P. capsici.  Since Fraser fir is sensitive to sustained high  39 temperatures (day temperatures >30°C) (16), the relatively high temperatures in the first  field experiment may have stressed the seedlings, increasing their susceptibility to P.  capsici.  Fraser fir naturally occurs on highly acidic soils (pH 3.5) at elevations between  1100 and 2000 m (16, 18) in the Appalachian Mountains (33) where temperatures range  from ‐12 to 26°C depending on the season (16, 28).  Day temperatures of 22 to 27°C and  night temperatures of 13 to 19°C appear optimum for producing containerized Fraser fir  (16).    Once soils become infested with P. capsici, oospores allow overwintering and  persistence of the pathogen for several years (15, 27).  Oospores form when both mating  types come into contact; fields in Michigan infested with P. capsici have been found to have  both mating types present (24, 26).  Oospores in soil and plant debris are considered  primary inoculum (15), which may directly infect the plant or develop a sporangium that is  capable of releasing 20 to 40 motile zoospores when water is present.  Mycelium can  develop on host tissue under favorable conditions, forming secondary inoculum  (sporangia, zoospores) that can be produced repeatedly during the growing season (8).   The agar plugs and millet seed used as inoculum in the growth chamber experiments  contained mycelium and sporangia, and since only single P. capsici isolates were used,  sexual reproduction was prevented.  The zoospore suspension did not contain other  inoculum types.  In the field experiment, the Fraser fir seedlings could have been exposed  to oospores, mycelium, sporangia, and/or zoospores since both P. capsici mating types  were found and sexual reproduction was possible.  In the growth chamber experiments, the  zoospore inoculum did not appear to be as effective as the other inoculum types used in  our study.  Viability of the zoospore suspension was checked after mixing with a vortex and  40 it was found to be satisfactory; however, it is possible that the zoospores did not remain  viable.  This is possibly because the zoospore inoculum did not have an associated food  base, as did the agar plugs and millet seed inoculum.  The agar plug and millet seed  inoculum could produce new growth to infect the seedlings when conditions were  favorable.   There were no significant differences in plant death among the P. capsici isolates  used as inoculum.  The P. capsici isolates from seedlings planted into P. capsici‐infested  fields exhibited variation in mating type and resistance to mefenoxam.  Field populations of  P. capsici from solanaceous and cucurbitaceous hosts are reported to have variation in  virulence and other phenotypic characteristics (19, 20).  Historically, Field 2 has had P.  capsici populations that were primarily sensitive to mefenoxam (M. K. Hausbeck,  unpublished data); however, in the present study we recovered 42 isolates that were fully  insensitive to the fungicide.  Field 1 has a history of a heterogeneous P. capsici population  with sensitive and insensitive isolates (M. K. Hausbeck, unpublished data), which was also  found in this study.  The recovery of A1 and A2 mating types in a ratio close to 1:1 from the  seedlings is expected from Michigan vegetable fields (26) and suggests that sexual  recombination is possible.  Genetic diversity is likely being maintained within field  populations and there is an increased chance of generating diverse genotypes with new  traits such as mefenoxam resistance or increased virulence.   Planting Fraser fir for Christmas tree production is increasing in the northern Great  Lakes region due to its desirable traits of foliage color, shape, fragrance and excellent  needle retention (33).  It is important to use locally or regionally developed guidelines to  grow Fraser fir because of the specific environmental conditions they require for good  41 performance.  Christmas tree growers in Michigan perceive Fraser fir to be more sensitive  to soil conditions, more likely to experience nutrient disorders, and more responsive to  fertilization than other Christmas tree species, restricting production to only optimum sites  (33).   The number of fields historically used for vegetable production in Michigan that  have become infested with P. capsici is raising (25, 26) and growers are planting Fraser fir  as a rotational crop.  Infested acreage and urban pressure is increasing across vegetable  production areas in Michigan, limiting growers’ ability to avoid the pathogen (15).  P.  capsici has been documented in many vegetable production regions (15) and Michigan  grows over 33,000 hectares of susceptible crops (22).  Other species of Phytophthora are  known to occur on Fraser fir in Michigan, such as P. cactorum (1) and P. citricola (Fulbright,  unpublished data).  However, only P. capsici was recovered from the infested field sites,  probably because they were historically cropped to vegetables, not woody ornamentals.  With the identification of Fraser fir as a newly recognized host for P. capsici, it is  important to further characterize the disease on Christmas trees for the development of  appropriate crop rotation strategies.  The present study of P. capsici on Fraser fir indicates  that adjustments in current rotational schemes are needed as planting Fraser fir in fields  infested with P. capsici could result in infection and should be avoided.     42                                       References    43 References    1.    2.    3.    4.    5.    6.    7.    8.    9.    10.    11.    12.  Adams, G. C., and Bielenin, A. J.  1988.  First report of Phytophthora cactorum and P.  citricola causing crown rot of fir species in Michigan.  Plant Dis. 72:79.  Anonymous.  2006.  Nursery and Christmas Trees 2004‐2005.  National Agricultural  Statistics Service.  Online publication.  Benson, D. M., and Grand, L. F.  2000.  Incidence of Phytophthora root rot of Fraser  fir in North Carolina and sensitivity of isolates of Phytophthora cinnamomi to  metalaxyl.  Plant Dis. 84:661‐664.  Benson, D. M., Grand, L. F., and Suggs, E. G.  1976.  Root rot of Fraser fir caused by  Phytophthora drechsleri.  Plant Dis. Rep. 60:238‐240.  Chastagner, G. A., and Benson, D. M.  2000.  The Christmas tree: traditions,  production, and diseases.  Plant Health Progress doi: 10.1094/PHP‐2000‐1013‐01‐ RV.  Online publication.  Chastagner, G. A., Riley, K. L., and Hamm, P. B.  1990.  Susceptibility of Abies spp. to  seven Phytophthora spp.  Phytopathology 80:887.  Davidson, J. M., Werres, S., Garbelotto, M., Hansen, E. M., and Rizzo, D. M.  2003.   Sudden oak death and associated diseases caused by Phytophthora ramorum.  Plant  Health Progress doi: 10.1094/PHP‐2003‐0707‐01‐DG.  Online publication.  Erwin, D. C., and Ribeiro, O. K.  1996.  Phytophthora diseases worldwide.  American  Phytopathological Society Press, St. Paul, MN.  Falloon, P. G., and Grogan, R. G.  1988.  Isolation, distribution, pathogenicity and  identification of Phytophthora spp. on asparagus in California.  Plant Dis. 72:495‐ 497.  Gevens, A. J., and Hausbeck, M. K.  2004.  Phytophthora capsici isolated from snap  bean is pathogenic to cucumber fruit and soybean.  Phytopathology 95:S162.  Grand, L. F., and Lapp, N. A.  1974.  Phytophthora cinnamomi root rot of Fraser fir in  North Carolina.  Plant Dis. 58:318‐320.  Hahn, R., and Werres, S.  1997.  Development of a dot immunobinding assay to  detect Phytophthora spp. in naturally dark‐rooted woody plants.  Ann. Appl. Biol.  130:453‐466.        44 13.    14.    15.    16.    17.    18.    19.    20.    21.    22.    23.    24.    25.    26.  Hamm, P. B., and Hansen, E. M.  1982.  Pathogenicity of Phytophthora species to  Pacific Northwest conifers.  Eur. J. For. Pathol. 12:167‐174.  Hamm, P. B., and Hansen, E. M..  1987.  Identification of Phytophthora spp. known to  attack conifers in the Pacific Northwest.  Northwest Sci. 61:103‐109.  Hausbeck, M. K., and Lamour, K. H.  2004.  Phytophthora capsici on vegetable crops:  research progress and management challenges.  Plant Dis. 88:1292‐1303.  Hinesley, L. E.  1981.  Initial growth of Fraser fir seedlings at different day/night  temperatures.  Forest Sci. 27:545‐550.  Hinesley, L. E., Parker, K. C., and Benson, D. M.  2000.  Evaluations of seedlings of  Fraser, Momi, and Siberian fir for resistance to Phytophthora cinnamomi.   HortScience 35:87‐88.  Hinesley, L. E., and Saltveit, M. E. J.  1980.  Ethylene adversely affects Fraser fir  planting stock in cold storage.  Southern J. Appl. Forestry 4:188‐189.  Hwang, B. K., and Kim, C. H.  1995.  Phytophthora blight of pepper and its control in  Korea.  Plant Dis. 79:221‐227.  Islam, S. Z., Babadoost, M., and Lambert, K. N.  2004.  Characterization of  Phytophthora capsici isolates from processing pumpkin in Illinois.  Plant Dis. 89:191‐ 197.  Kenerley, C., and Bruck, R. I.  1981.  Phytophthora root rot of Balsam fir and Norway  spruce in North Carolina.  Plant Dis. 65:614‐615.  Kleweno, D. D.  2007.  Michigan 2006‐2007 highlights.  Michigan Department of  Agriculture, Lansing.  Online publication.  Kong, P., Hong, C., Richardson, P. A., and Gallegly, M. E.  2003.  Single‐strand‐ conformation polymorphism of ribosomal DNA for rapid species identification in  genus Phytophthora.  Fungal Genet. Biol. 39:238‐249.  Lamour, K. H., and Hausbeck, M. K.  2000.  Mefenoxam insensitivity and the sexual  stage of Phytophthora capsici in Michigan cucurbit fields.  Phytopathology 90:396‐ 400.  Lamour, K. H., and Hausbeck, M. K.  2001.  Investigating the spatiotemporal genetic  structure of Phytophthora capsici in Michigan.  Phytopathology 91:973‐980.  Lamour, K. H., and Hausbeck, M. K.  2001.  The dynamics of mefenoxam insensitivity  in a recombining population of Phytophthora capsici characterized with amplified  fragment length polymorphism markers.  Phytopathology 91:553‐557.  45   27.    28.    29.    30.    31.    32.    33.    34.    35.    36.    37.        Lamour, K. H., and Hausbeck, M. K.  2003.  Effect of crop rotation on the survival of  Phytophthora capsici in Michigan.  Plant Dis. 87:841‐845.  Leffler, R. J.  1981.  Estimating average temperatures on Appalachian summits.  J.  Appl. Meteorol. 20:637‐642.  Maniatis, T., Fritsch, E. F., and Sambrook, J.  1982.  Molecular cloning: a laboratory  manual.  Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.  McCain, A. H., and Scharpf, R. F.  1986.  Phytophthora shoot blight and canker  disease of Abies spp.  Plant Dis. 70:1036‐1037.  Miller, J. D., Strongman, D., and Whitney, N. J.  1985.  Observations on fungi  associated with spruce budworm infested balsam fir needles.  Can. J. Forest Res.  15:896‐901.  Quesada‐Ocampo, L. M., Fulbright, D. W., and Hausbeck, M. K.  2007.  Susceptibility of  Fraser fir to Phytophthora capsici.  Phytopathology 97:S95.  Rothstein, D. E., and Lisuzzo, N. J.  2006.  Optimal nutrition and diagnosis for Abies  fraseri Christmas trees in Michigan.  NJAF 23:106‐113.  Saude, C., Hurtado‐Gonzalez, O. P., Lamour, K. H., and Hausbeck, M. K.  2008.   Occurrence and characterization of Phytophthora sp. pathogenic to asparagus  (Asparagus officinalis) in Michigan.  Phytopathology 98:1075‐1083.  Shew, H. D., and Benson, D. M.  1982.  Fraser fir root rot induced by Phytophthora  citricola.  Plant Dis. 65:688‐689.  Silvar, C., Duncan, J. M., Cooke, D. E. L., Williams, N. A., Diaz, J., and Merino, F.  2005.   Development of specific PCR primers for identification and detection of  Phytophthora capsici Leon.  Eur. J. Plant Pathol. 112:43‐52.  Waterhouse, G. M.  1963.  Key to the Species of Phytophthora de Bary.   Commonwealth Mycological Society, Kew, Surrey, UK.        46 CHAPTER III: RESISTANCE IN TOMATO AND WILD RELATIVES TO CROWN AND ROOT  ROT CAUSED BY PHYTOPHTHORA CAPSICI    Abstract    Quesada‐Ocampo, L. M., and Hausbeck, M. K.  2010.  Resistance in Tomato and Wild  Relatives to Crown and Root Rot Caused by Phytophthora capsici. Phytopathology 100: 619‐ 627.       Phytophthora capsici causes root, crown, and fruit rot of tomato, a major vegetable  crop grown worldwide.  The objective of this study was to screen tomato varieties and wild  relatives of tomato for resistance to P. capsici.  Four P. capsici isolates were individually  used to inoculate 6‐week‐old seedlings (1 g P. capsici‐infested millet seed/10 g soilless  medium) of 42 tomato varieties and wild relatives of tomato in a greenhouse.  Plants were  evaluated daily for wilting and death.  All P. capsici isolates tested caused disease in  seedlings but some isolates were more pathogenic than others.  A wild relative of cultivated  tomato, Solanum habrochaites accession LA407, was resistant to all P. capsici isolates  tested.  Moderate resistance to all isolates was identified in the host genotypes Ha7998,  Fla7600, Jolly Elf, and Talladega.  P. capsici was frequently recovered from root and crown  tissue of symptomatic inoculated seedlings but not from leaf tissue, asymptomatic or  control plants.  The phenotype of the recovered isolate matched the phenotype of the  inoculum.  Pathogen presence was confirmed in resistant and moderately resistant tomato  genotypes by species‐specific polymerase chain reaction of DNA from infected crown and  root tissue.  Amplified fragment length polymorphisms of tomato genotypes showed a lack  of correlation between genetic clusters and susceptibility to P. capsici, indicating that  resistance is distributed in several tomato lineages.  The results of this study create a  baseline for future development of tomato varieties resistant to P. capsici.    47 Introduction    Tomato (Solanum lycopersicon L.) is a major vegetable crop grown worldwide.  Each  year,  between  160,000  to  280,000 hectares  of  processing  and  fresh  market  tomatoes  are  planted  in  the  United  States  with  an  approximate  value  of  $2  billion  (2).    Phytophthora  capsici  Leonian  is  a  destructive  soilborne pathogen with a broad host  range that  includes  solanaceous,  cucurbitaceous  and  fabaceous  crops  (9).    On  tomato,  the  pathogen  causes  root,  crown  and  fruit  rot  (28,  54),  all  of  which  have  been  reported  in  several  regions  including Michigan (18, 32), California (4, 8, 54), Colorado (28) and Florida (52).    In Michigan, tomatoes are grown for fresh market and processing.  Fresh market  production utilizes plastic‐covered raised beds, trickle irrigation and trellising to hold the  plants upright; these management practices also limit disease caused by P. capsici (M. K.  Hausbeck, unpublished data).  Fresh market tomatoes are harvested by hand and have a  higher profit margin than processing tomatoes.  Since processing tomatoes are  mechanically harvested and have a lower profit margin, plants are grown on flat ground  where fruit typically come into direct contact with the soil.  The growing system used by  processing tomato growers is more conducive to P. capsici infection than the fresh market  system.  In Michigan, crop rotation and fungicide applications are commonly used to  manage P. capsici.  The success of crop rotation is limited by the long‐term survival of  oospores in the soil (32) and the number and diversity of susceptible hosts (15, 45).   Applications of the commonly used fungicide mefenoxam may not protect susceptible  crops from resistant P. capsici populations, which have been documented throughout the  U.S. (30, 31, 33, 43).  Host resistance should be a key component of a disease management  strategy for P. capsici on tomato.  Regrettably, only a few moderately resistant tomato  48 cultivars are available with commercially acceptable horticultural traits (4, 20).  More  sources of resistance from commercial varieties and/or wild species need to be identified.   Breeders use wild Solanum species as sources of genes controlling traits of economic  importance such as fruit characteristics, nutritional content, and general disease resistance  (49).  Identifying sources of resistant tomato germplasm would aid in the development of  cultivars suitable for production in P. capsici­infested fields.   The objective of this study was to determine whether different varieties of Solanum  lycopersicon L., S. pimpinellifolium, S. pennellii and/or S. habrochaites show resistance to P.  capsici.   Specifically,  we  sought  to  determine: (i) whether or not commercial tomatoes or  tomato  wild  relatives could be  used  as  a source of  resistance  to P.  capsici, (ii) whether or  not  infection and  disease  development were  influenced  by the P. capsici isolates selected,  and  (iii)  the  association  between  lineages  of  the  varieties  and  resistance  to  P.  capsici.    A  preliminary report of these findings has been published (46).      Methods  Tomato varieties and wild relatives.  Forty‐two varieties of tomatoes and wild  relatives (referred collectively as host genotypes) were selected, which included varieties  for fresh market (17 varieties), and processing (17 varieties), breeding lines (1 variety),  and 3 wild species (7 accessions) provided by either Dr. D. Francis (The Ohio State  University), Redgold, Inc. (Elwood, IN) or Seedway, LLC. (Hall, NY, Table 3.1).  Seeds were  planted in 72‐square cell plastic flats with cell depth of 5.7 cm and cell width of 4 cm  (Hummert International, Earth City, MO), containing potting soilless media (Baccto  Professional Planting Mix, Michigan Peat Company, Houston, TX) and a top layer of medium  grade vermiculite (Hummert International).  Plugs were grown in a greenhouse at MSU for  49 4 weeks, under approximately 14‐hr day illumination.  They were transferred into 2.5‐liter  square plastic pots (Hummert International) containing the same potting soilless media  once they reached an approximate height of 8 cm and developed three or four true leaves.   Plants were allowed to recover from transplant stress for two weeks prior to inoculation.   For the duration of the experiment, plants were fertilized weekly with 200 ppm of Peter’s  20‐20‐20 water‐soluble fertilizer (The Scotts Company, Marysville, OH) and irrigated as  needed to maintain adequate moisture for plant growth and P. capsici disease development.   Air temperature and relative humidity data (Table 3.2) were collected hourly with a  Watchdog data logger 450 series (Spectrum Technologies, Inc., East‐Plainfield, IL).    Table 3.1.  Disease reaction and mean AUDPC of three experiments in which tomato  varieties and wild relatives were screened for resistance to Phytophthora capsici.     AUDPC mean   Disease reactionc  a, b  Accessions 12889  OP97  SP98  SFF3  12889  OP97  SP98  SFF3  Sl, P  S  M  S  R  114  39.4  114  0  88 331Sl, P  S  S  R  R  112  114  0  0  401Sl, P  S  M  S  R  116  13.1  116  0  611Sl, P  S  S  S  R  117  118  116  0  818Sl, P  S  S  S  S  110  115  114  116  7983Sl, P  S  S  S  R  123  107  126  0  9704Sl, P  S  R  S  R  113  0  116  0  BHN444Sl, FM  S  M  S  R  116  18.8  113  0  BHN591Sl, FM  S  R  S  R  118  0  114  0  E6203Sl, P  S  S  S  R  119  115  117  0  Fla7600Sl, FM  M  R  R  R  45.4  0  0  0  Florida47Sl, FM  S  S  M  R  115  119  22.9  0  Florida91Sl, FM  S  M  M  R  110  35.6  20  0  Ha7998Sl, W  M  R  M  R  37.9  0  20  0  Hunt100Sl, P  S  S  R  R  122  120  0  0  Jolly ElfSl, FM  M  M  M  R  30.4  25.9  18  0  50 Table 3.1 (cont’d)    LA1269Sp, W      S      S      S      S      107      111      56.8      105  LA1589Sp, W  S  S  S  S  104  110  112  119  LA407Sh, W  RC  S  RC  S  RA  S  R  0  0  0  0  S  131  130  130  126  M82Sl, P  S  S  S  S  114  105  113  117  Mountain fresh plusSl, FM  S  R  R  R  110  0  0  0  Mountain springSl, FM  S  R  S  R  110  0  118  0  NC23ESl, FM  S  M  R  117  115  21.8  0  OH8245Sl, P  S  SB  S  S  R  115  122  51  0  OH88119Sl, P  SB  S  S  R  109  120  106  0  OH9241Sl, P  SB  S  S  S  116  110  117  120  OH9242Sl, P  S  S  S  S  122  117  117  120  Peto95‐43Sl, P  S  S  S  S  119  122  121  118  PI114490Sl, W  S  S  R  R  122  120  0  0  PI128216Sp, W  S  S  S  R  121  122  109  0  PI365914Sp, W  SB  S  R  R  112  114  0  0  Plum crimsonSl, FM  SB  S  M  R  113  120  45.2  0  Rio GrandeSl, FM  S  S  S  S  115  118  120  116  SebringSl, FM  S  S  S  R  116  115  118  0  SunbeamSl, FM  S  S  S  R  112  115  57.8  0  SunleaperSl, FM  S  S  S  M  74.7  118  114  26.7  SunomaSl, FM  S  S  S  R  107  117  112  0  Super sweet 100Sl, FM  S  R  R  R  71.6  0  0  0  TalladegaSl, FM  M  M  M  R  44.4  29.4  38.2  0  TR12Sl, P  S  S  S  S  117  108  111  119  TSH4Sl, P  Total  SB    S  R  R  115  115  0  0        103  81.3  71.8  28.6  LA716Spe, W  a Species of the accession. Sl, Solanum lycopersicon; Sp, S. pimpinellifolium; Spe, S. pennellii;  Sh, S. habrochaites.  b Type of the accession. P, processing; FM, fresh market; W, wild.  c Disease reaction. S, susceptible; M, moderately resistant; R, resistant.  Tissue types from  which P. capsici was recovered in the accession.  P. capsici was recovered from root and  crown tissue unless otherwise noted.  A, roots; B, roots, crown and secondary stems; C, P.  capsici not recovered.  51   Table 3.2.  Air temperature and relative humidity in the greenhouse during each of the  three replicated experiments in which tomato plants were screened for resistance to  Phytophthora capsici.      Air temperature (°C)    Relative humidity (%)  Experiment    Average  Minimum  Maximum    Average  Minimum  Maximum  1    18  8  28    75  50  100  2    19  2  36    83  63  103  3    18  1  35    77  64  90    Isolate selection and maintenance.  Phytophthora capsici isolates originating from  diseased cucurbitaceous and solanaceous crops in Michigan were selected from the culture  collection maintained in the laboratory of Dr. Hausbeck at MSU.  The selected isolates have  shown high virulence (defined as the degree of damage caused to a host by a pathogen) and  pathogenicity (defined as the capacity of a pathogen to cause disease on a host genotype) in  different hosts (12, 14, 45, 53).  Isolates were phenotypically characterized according to  mating type (MT) and sensitivity to mefenoxam, an oomycete‐specific fungicide (30).   Isolates OP97 (A1 MT) and SP98 (A2 MT), from pickling cucumber and pumpkin,  respectively, were sensitive to mefenoxam, whereas isolates SFF3 (A2 MT) and 12889 (A1  MT) from pickling cucumber and pepper, respectively, were insensitive.    Agar plugs from long‐term stock cultures (stored at 20°C in sterilized  microcentrifuge tubes containing 1 ml of sterile water and one sterile hemp seed) of each  isolate were transferred onto unclarified V8 juice agar (UCV8, 16 g agar, 3 g CaCO3, 160 ml  unfiltered V8 juice and 840 ml distilled water) to obtain actively growing cultures, which  were maintained at room temperature (21 + 2°C) under constant fluorescent lighting.  To  ensure that isolates could cause disease, cucumber fruits were disinfected for 5 min in a  5% sodium hypochlorite solution, dried at room temperature, and inoculated with each P.  52 capsici isolate.  A small, superficial wound was made with a sterile needle in the center of  each cucumber.  Agar plugs (7 mm diameter) from the margins of actively growing P.  capsici colonies were placed topside down over each wound.  Sterile, capless  microcentrifuge tubes were placed over each agar plug and were attached to the fruit with  a ring of petroleum jelly.  Control cucumbers were inoculated as described above using a  sterile 7‐mm‐diameter plug of V8 agar.  Cucumbers were placed in aluminum trays  containing wet paper towels and covered with plastic wrap to maintain high relative  humidity and incubated at room temperature (21 + 2°C).  Symptomatic cucumber tissue  (0.5 cm) was excised and transferred to UCV8 and maintained under the same culture  conditions as described above.  Axenic cultures of each isolate were obtained from the  infected cucumber tissue and these were transferred to new UCV8 plates weekly until use.  Inoculum preparation and root inoculation.  Phytophthora capsici‐infested millet  seed was prepared as inoculum.  Millet seed (100 g) was mixed with L‐asparagine (0.08 g)  and water (72 ml) in a 500‐ml Erlenmeyer flask, capped with aluminum foil, autoclaved for  two consecutive cycles and shaken to homogenize the mixture.  The sterilized millet seed  was inoculated with four 7‐mm‐diameter agar plugs from actively growing P. capsici  cultures.  The inoculated millet seed was incubated at room temperature under constant  fluorescent lighting for four weeks.   Inoculation of the plants was achieved by carefully inserting 1 g of millet seed  infested with one of four P. capsici isolates (OP97, SFF3, SP98, and 12889) directly into the  soilless media adjacent to each plant crown, avoiding root or crown injury.  For each  isolate, five replicate plants of each tomato genotype were inoculated.   Five additional  53 control plants of each tomato genotype were inoculated with uninfested millet seed  containing sterile V8 agar plugs.  This experiment was conducted three times.   Disease assessment.  Disease assessment was conducted daily for five weeks and  was initiated one day following inoculation.  Disease progression was recorded for each  plant using the following scale: 0= no symptoms, 1= 1‐30% wilting, 2= 31‐50% wilting, 3=  51‐70% wilting, 4= 71‐90% wilting, and 5= more than 90% wilting or dead plant (Figure  3.1).  The area under the disease progress curve (AUDPC) was calculated by inserting the  disease score into the equation by Shaner and Finney (56) to describe the cumulative plant  susceptibility throughout the experiments.  The percentage of death and the incidence of P.  capsici recovered from roots, crowns, secondary stems (equivalent of branches in a woody  plant) and leaves were determined.  The plant height was measured at the end of the  experiment for host genotypes that appeared resistant based on AUDPC values.  Tomato  genotypes were considered to be resistant to P. capsici if disease, caused by the four  isolates used in our study, did not result in serious damage to the plants as indicated by  mean AUDPC values of three replicated experiments.  Resistant, moderately resistant and  susceptible genotypes to each P. capsici isolate included those with mean AUDPC values  less than 10, between 10 and 50, and higher than 50, respectively.  Pathogen isolation.  Control and inoculated plants were gently rinsed to remove  the soilless medium and other residues, dipped into 5% sodium hypochlorite for 1 min to  surface disinfest, rinsed with sterile water and air‐dried.  Three sections of root, crown,  secondary stem and leaf tissue were excised from each plant and plated onto BARP‐ (benomyl, ampicillin, rifampicin, and pentachloronitrobenzene) amended UCV8 (32) under  sterile conditions.    54 Colonies suspected to be P. capsici were transferred to new BARP‐amended UCV8  plates.  Axenic cultures were incubated for 7 days on UCV8 with constant fluorescent  lighting under ambient laboratory conditions (21 ± 2°C).  Cultures were positively  identified as P. capsici based on morphological characteristics described by Waterhouse  (65).  Isolates were characterized for compatibility type and mefenoxam resistance as  previously described (30) to compare the phenotype of the isolate obtained to the original  inoculum.   DNA extraction and molecular confirmation of infection.  Samples of root and  crown tissue from inoculated resistant and moderately resistant tomato genotypes were  collected at the end of the experiment, gently rinsed to remove the soilless medium and  other residues, dipped into 5% sodium hypochlorite for 1 min to surface disinfect, rinsed  with sterile water, air‐dried and ground in liquid nitrogen.  Genomic DNA was extracted  from approximately 1 g of ground tissue using the DNeasy DNA extraction kit (Qiagen,  Valencia, CA) according to the manufacturer’s instructions.  DNA was quantified using the  NanoDrop ND 1000 spectrophotometer and NanoDrop 2.4.7c software (NanoDrop  Technologies Inc., Wilmington, DE).  Two specific primers for P. capsici were used for PCR:  one forward primer (CAPFW; 5´TTTAGTTGGGGGTCTTGTACC3´), and one reverse primer  (CAPRV2; 5´TACGGTTCACCAGCCCATCA3´) (57). Reactions were performed in a total  volume of 25 µl and contained 1ul DNA, 5 µl 5X PCR reaction buffer, 1.25 µl 25 µM MgCl2,  0.5 µl 10 µM dNTP mix, 0.7 µl Taq DNA polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1 µl each 10  µM primer (MSU Macromolecular Structure Facility, East Lansing, MI), and 14.6 µl sterile  water.  The PCR reaction was performed in a programmable thermal cycler (Eppendorf,  Westbury, NY) starting with 3 min denaturation at 94°C, followed by 45 cycles at 94°C for  55 30 s, annealing at 56°C for 30 s, and extension at 72°C for 60 s, with a final extension step of  10 min at 72°C.  PCR products were analyzed by electrophoresis in 2% (w/v) agarose gel in  0.5X Tris‐borate‐EDTA buffer (35), stained with ethidium bromide (5 µg/ml) for  visualization and compared to a 100 bp ladder (Invitrogen) to determine amplicon size.   Controls with P. capsici DNA and tomato DNA were included.  AFLP analysis.  Samples (1 g) of 4‐week‐old healthy tomato tissue were collected  and ground in liquid nitrogen.  Genomic DNA was extracted and quantified as described  above.  All PCR reactions were performed with a programmable thermal cycler  (Eppendorf). Approximately 500 ng of DNA was subjected to a restriction/ligation reaction,  preselective amplification, and selective amplifications using the AFLP kit for regular plant  genomes (Applied Biosystems, Foster City, CA) according to the manufacturer’s  instructions.  Selective amplifications with the selective primers MseI‐CAA and EcoRI‐ACA,  and MseI‐CAA and EcoRI‐AAG were performed.  Selective PCR products were purified with  ExoSAP‐IT (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA) following the manufacturers’ instructions.   Products labeled with different colored dyes were analyzed at the Michigan State  University Research Technology Support Facility (RTSF) using the ABI PRISM 3130 Genetic  Analyzer and compared to a 500‐carboxy‐X‐rhodamine (ROX) size standard (Applied  Biosystems) following the manufacturer’s instructions.  Results were prepared for analysis  by the RTSF in the form of electropherograms using GeneScan 3.1 analysis software  (Applied Biosystems).  AFLP fragments were scored manually as present (1) or absent (0)  using PeakScanner 1.0 (Applied Biosystems).  Only DNA labeled fragments with a size equal  to or larger than 70 bp were scored to obtain a binary character matrix.  Once fragments of  appropriate size were identified, only labeled fragments with a fluorescence signal equal to  56 or higher than 300 relative fluorescence units (rtf) in at least one variety were scored for  presence or absence in the rest of the varieties.  The binary matrix, consisting of combined  data of both primer sets, was analyzed to generate an unweighted pair‐group method with  arithmetic mean (UPGMA) distance tree and a pairwise genetic distance matrix using  PAUP*4.0b10 (61).      Statistical analyses.  All statistical analyses were performed using the SAS  statistical package version 9.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC).  The experiment was arranged  in a split‐plot with experiment as a blocking factor, isolates as whole plots and host  genotypes as sub plots arranged in a randomized complete block design.  The AUDPC,  incidence, and plant height values of the three replicated experiments were used for  statistical analyses.  AUDPC data from control plants were removed from the data set prior  to statistical analyses since no infection occurred and no symptoms developed.  AUDPC and  plant height data were normalized by square root transformation, and the residuals  followed the assumptions of all statistical tests performed.  The percent death was not  included for statistical analysis because the residuals did not follow the assumptions  required for statistical tests.  Data were subjected to analysis of variance (ANOVA) using  the PROC MIXED, PROC GLM and PROC GLIMMIX procedures of SAS.  Correlation between  UPGMA cluster (defined by the genetic distance matrix) and resistance to P. capsici was  determined using the PROC CORR procedure.  Multiple comparisons among the means  were conducted using t‐tests (LSD) when effects were found to be statistically significant at  P=0.05 in ANOVA.          57 Results    Initial disease symptoms occurred within 4 days following inoculation in susceptible  and some moderately resistant tomato genotypes for each P. capsici isolate.  In susceptible  genotypes, wilting was observed in the lower leaves within the first week and progressed  upward until the entire plant wilted.  External, dark discoloration of the crowns and crown  rot were observed on some plants and the root system was often discolored.  Subsequently,  stem cankers and girdling developed, and some plants shriveled at the soil level (Figure  3.1).  Brown, water‐soaked lesions were visible on roots and crowns of symptomatic plants  within 6 days.  Plant death was observed as early as 7 to 8 days following inoculation in  some host genotypes, but was not visible until 4 weeks after inoculation for others.   Moderately resistant varieties showed mild wilting 7 to 8 days following inoculation but  quickly recovered.  Some plants continued to grow and maintain healthy tops by  regenerating an extensive number of secondary roots (Figure 3.1).  Resistant genotypes did  not show wilting after inoculation or production of secondary roots.  Some resistant and  moderately resistant host genotypes also presented significant stunting.  Disease severity differed significantly depending on the interaction effects between  isolate and tomato genotype (ANOVA, P<0.0001).  Responses to individual isolates varied  from no symptoms to 100% wilting and death of inoculated plants.  Isolate 12889 was  more pathogenic on tomato genotypes than other isolates used in plant inoculations  according to trends in AUDPC (Table 3.1).  Interaction effects were not found between  repeated experiments and isolate (ANOVA, P=0.5178).  Effects due to differences between  experiments were not significant (ANOVA, P=0.2926).  Only one of the genotypes (LA407)  did not show wilting or any other symptoms other than stunting following inoculation with  58 the four different P. capsici isolates (Table 3.1).  Four of the host genotypes (Fla7600,  Ha7998, Jolly Elf and Talladega) developed moderate symptoms with <12% plant death  (Table 3.1).  LA716 was the most susceptible genotype in our study; exhibiting the highest  AUDPC values and 100% plant death (Table 3.1).    Figure 3.1. Symptoms of Phytophthora capsici root rot on tomato and wilting scale used in  plant evaluations.  A, 0= no symptoms, healthy plant.  B, 1= 1‐30% wilting.  C, 2= 31‐50%  wilting.   D, 3= 51‐70% wilting.  E, 4= 71‐90% wilting.  F, 5= more than 90% wilting or dead  plant.  G, Stem canker.  H, Water soaked lesions in the stem, rotted crown, and rotted and  discolored roots.  I, Secondary roots.  J, Girlding.  K, Damping off.  L, Stunting.  59 The pathogen was isolated from all surviving susceptible, moderately resistant and  resistant genotypes at the end of the experiment and from plants that died over the course  of the experiment.  P. capsici was isolated from symptomatic plants of the moderately  resistant genotypes Fla7600, Ha7998, Jolly Elf and Talladega, and from the roots of the  resistant genotype LA407 (Table 3.1).  P. capsici‐infection in the moderately resistant and  resistant genotypes was confirmed by performing P. capsici‐specific PCR of DNA from  surface‐sterilized, inoculated root and crown tissue to confirm that the very low recovery  of P. capsici from LA407 by culturing techniques was not due to an escape.  All P. capsici‐ inoculated moderately resistant and resistant genotypes were positive for presence of P.  capsici in root or crown tissue.  Significant differences in pathogen incidence were found  among different plant parts (PROC GLIMMIX and LSD, P<0.0001).  Interaction effects were  found between the isolate used and tomato genotype for incidence data (ANOVA,  P<0.0001).  Interaction effects were not found between experiments and isolate (ANOVA,  P=0.9994).  Effects due to differences between repeated experiments were not significant  (ANOVA, P=0.9442).  Although the secondary stems and leaves exhibited wilting in all  experiments, the pathogen was rarely recovered from secondary stems and never  recovered from leaves (Table 3.3).  The phenotype (mating type and mefenoxam  resistance) of recovered isolates was confirmed and matched the phenotype of the isolate  used as inoculum (data not shown).  The control plants remained asymptomatic and the  pathogen was not isolated from any control plant tissue.  Clean cultures were obtained  from 94% of the original cultures isolated from tomato tissue.   Stunting was observed in several tomato genotypes including some of the  moderately resistant and resistant candidates (Figure 3.1L).  Plant height was measured for  60 surviving inoculated moderately resistant and resistant genotypes and the corresponding  control plants for those host genotypes at the end of the experiment.  Generally, plants  inoculated with one of the four P. capsici isolates were significantly shorter than the  corresponding control plants, although the interaction between isolate and tomato  genotype was significant (ANOVA, P<0.0001).  Pairwise comparisons between each tomato  genotype inoculated with a particular isolate and the corresponding control plant indicated  that genotypes Fla7600 and Jolly Elf did not show significant differences in plant height  regardless of isolate (LSD P>0.05, Table 3.4).  Interaction effects were not found between  repeated experiments and isolate (ANOVA, P=0.5478).  Effects due to differences between  experiments were not significant (ANOVA, P=0.0600).  The MseI‐CAA and EcoRI‐ACA, and MseI‐CAA and EcoRI‐AAG primer pairs yielded a  total of 104 and 120 AFLP markers, respectively.  Of the total 224 AFLP markers obtained,  126 corresponded to labeled fragments with a size equal to or larger than 70 bp and a  signal equal to or higher than 300 rtf that were scored for presence and absence in the  tomato genotypes and included in the analyses.  Four of these markers were polymorphic  only among Solanum species (2% of interspecific polymorphism), 31 markers had variation  among Solanum species and S. lycopersicon varieties (14% of inter and intraspecific  polymorphism), 11 markers were polymorphic only for S. lycopersicon varieties (5% of  intraspecific polymorphism), and the other 80 markers were present in all tomato  genotypes (79% monomorphic).  Seven similarity groups, including four main clusters (A,  B, C, and F) and three clades formed by single genotypes (D, E, and G) with >80% similarity,  were obtained after genetic distance analysis of the AFLP data (Figure 3.2).  The UPGMA  tree topology did not indicate a subdivision of clusters based on susceptibility to P. capsici.   61 Statistical analysis found no significant correlation between cluster and susceptibility to P.  capsici (P>0.05). Table 3.3.  Incidence of Phytophthora capsici isolates obtained from  different parts of the symptomatic tomato plants sampled in each of three replicated  experiments.    Trial  1  2  3  Plants  sampled  Number of  isolates  570  583  579  910  903  890   Isolatesa (%)  Incidenceb (%)  R  C  R  C  S  L  470 (51.6) 440 (48.4) 488 (50.7) 471 (48.8) 5 (0.5) 0 (0)  458 (50.7) 445 (49.3) 483 (50)  479 (49.6) 4 (0.4) 0 (0)  459 (51.6) 431 (48.4) 488 (51.3) 458 (48.1) 6 (0.6) 0 (0)  aIsolates obtained as determined by axenic pathogen isolation at the conclusion of the  experiment.  R, root.  C, crown.  bIncidence of P. capsici as determined by observation of growth of the pathogen isolated  from plant tissue. R, root.  C, crown.  S, secondary stem.  L, leaf.      Table 3.4.  Probability (P) values for significance of differences in plant height between  inoculated plants and their corresponding controls for tomato genotypes resistant and  moderately resistant to Phytophthora capsici.       P value*  Variety    12889    OP97    SP98    SFF3  Fla7600    0.8164    0.5798    0.0744    0.5324  Ha7998    0.0093*    0.0004*    <0.0001*    <0.0001*  LA407    0.0402*    0.0048*    <0.0001*    <0.0001*  Jolly Elf    0.0745    0.1681    0.1567    0.5653  Talladega    <0.0001*    0.0327*    0.0002*    0.8062  * Means significantly different from the control (LSD); analyses included data from three  experiments    62 Figure 3.2.  Amplified fragment length polymorphism distance tree of tomato varieties and  wild relatives screened for resistance to P. capsici.  Susceptibility to P. capsici 12889, OP97,  SP98 and SFF3 (S, susceptible, M, moderately resistant, R, resistant), tomato species (SPP:  Sl, Solanum lycopersicon, Sp, S. pinpinelifolium, Spe, S. pennellii, Sh, S. habrochaites), and  type of variety (TYP: F, fresh market, P, processing, W, wild) are indicated for each variety.   A, B, C, D, E, F, G, correspond to similarity groups obtained in UPGMA clustering analysis.    63     Discussion  Early infections by P. capsici on tomato cause plant damping‐off, whereas later  infections cause root and crown rot on mature plants (21).  Phytophthora root rot results  in wilting with brown‐to‐black cankers on the lower stems, blackening of the vascular  tissue, and root rot (29), which may initiate the development of secondary roots (4).   Infected plants may become stunted and wilted (21), as they did in our study.  Plants  showing quantitative resistance to Phytophthora root rot have been reported to develop  and maintain healthy canopies by regenerating an extensive number of secondary roots, a  response that is most likely polygenic (4).  In this experiment, several host genotypes  produced secondary roots that emerged just above a stem canker or crown rot lesion but  many of them still died possibly because the response was not fast enough.  The  moderately resistant genotypes Talladega and Jolly Elf produced secondary roots in some  cases and maintained healthy canopies throughout the duration of the experiment.  The  resistant variety LA407 did not show this response.  Symptoms developed more slowly on  the moderately resistant genotypes Fla7600, Ha7998, Jolly Elf, and Talladega than on the  other genotypes tested.  In general, the response of moderately resistant tomato genotypes  to Phytophthora root and crown rot was quantitative rather than qualitative, as observed  in the P. capsici­pepper interaction (26).  In some cases such as the resistant genotype  LA407 or the susceptible genotype LA716 the response is more qualitative since there  appeared to be no disease in LA407 plants but all LA716 plants died.    The success of greenhouse screening depends on the plant’s age and resistance  level, inoculum quality/quantity, inoculation technique, and post inoculation  environmental conditions.  These factors may influence quantitative responses such as  64 resistance to P. capsici.  For this study, environmental conditions in the greenhouse were  not always ideal for plant and pathogen growth due to low minimum air temperatures (1‐ 2°C) and high maximum air temperatures (35‐36°C) in experiments 2 and 3.  The  minimum, optimum, and maximum temperatures for growth of P. capsici are 10°C, 28°C,  and >35°C, respectively (9).  Tomato plants prefer warmer temperatures (18‐ 26°C) for  normal plant development, growth and fruit set (24), and become sensitive to biotic and  abiotic stress at temperatures below 10°C or above 35°C (24).  Nonetheless, environmental  conditions did not seem to alter disease development and average air temperatures were  suitable for plant and pathogen growth.  Furthermore, there were no statistically  significant interactions with experiment so any effects on disease development appear to  have been constant across isolates and host genotypes.     Resistance to P. capsici under greenhouse conditions may differ from the responses  observed under field conditions due to the quantitative nature of the trait.  The soilless  medium used in this study may have influenced resistance to P. capsici, and the responses  observed in the greenhouse may not be consistent in the field depending on soil type, soil  microbial community composition, pH and other factors.  Other studies on P. capsici (27)  and other soilborne pathogens (16, 39) have shown variable results, with observations of  increased or decreased disease severity depending on the soil type, soilless substrates, or  treatments used.  To our knowledge, none of these studies have determined the influence  of soilless medium on P. capsici.  However, if soilless medium‐effects on P. capsici exist, they  were consistent throughout the experiments and did not appear to inhibit disease  development.  65 The type and quantity of inoculum used can also affect disease severity in  greenhouse and field studies (14, 15, 45).  The millet seed inoculation technique was  effective for establishing P. capsici infection on susceptible tomato genotypes in the  greenhouse, as has been reported in previous studies with other host plants (12, 45).  The  millet seed inoculum for our experiments contained only mycelia and sporangia, while  Michigan fields infested with P. capsici have been found to contain oospores (30, 31).   Oospores allow the pathogen to overwinter, may persist for years (18, 32), and are primary  inocula (18).  For our experiments, we used P. capsici propagules that constitute secondary  inocula and cause tomato field epidemics (21).  Studies replicating our greenhouse  experiment in P. capsici‐infested fields would help establish the influence of inoculum type  on disease severity as well as the transferability of greenhouse results to field conditions.  All P. capsici isolates tested caused disease on some plants, although there was a  significant isolate by tomato genotype interaction.  Isolate 12889 produced symptoms in  more host genotypes, followed by OP97, SP98 and SFF3, respectively.  When these isolates  were tested on pepper in an earlier study (15), 12889 was also found to be the most  pathogenic, however no differences were detected when the isolates were tested on  cucumber fruit (14) and Fraser fir (45).  As early as 1972, field populations of P. capsici  from solanaceous and cucurbitaceous hosts were shown to differ in pathogenicity (44),  other reports of this variation have been published for several hosts (5, 26, 40, 41, 48, 50),  including tomato where an interaction between host and isolate was also reported (17, 20).   It has been suggested in previous studies that P. capsici isolates obtained from the  Solanaceae have increased pathogenicity on solanaceous hosts compared to isolates  obtained from Cucurbits (19, 34, 50).  Further studies that include more isolates are  66 needed to clarify if P. capsici 12889 has increased pathogenicity in tomato and pepper  genotypes because it was isolated from another solanaceaous host or if the pathogenicity is  due to an isolate‐specific effect.   The differences in pathogenicity found between these Michigan isolates have  significant implications for local plant breeding programs.  Breeding for resistance in  pepper against P. capsici has been challenging due to the diversity of pathogen populations,  the existence of different physiological races within P. capsici in the United States (40, 64),  and the various complex modes of inheritance of resistance reported for pepper (47).   Similarly, for tomato, studies are needed to characterize P. capsici populations, define races  that infect tomato, and determine their spatial structure in order to intelligently deploy  tomato resistance in Michigan.  Nonetheless, in this study, tomato genotypes LA407,  Fla7600, Ha7998, Jolly Elf and Talladega showed high or moderate resistance to all of the  isolates used and could be used as a starting point to find resistance to Michigan P. capsici  isolates.  Our data indicated that the four isolates tested probably represent different races.   Nonetheless, the tomato genotypes should be tested against a larger number of isolates,  particularly those coming from tomato to better understand this interaction, and to  eventually develop a system with host differentials for identifying races, as has been  described for pepper (63).  No resistant control was used in our study because, to the best  of our knowledge, there is no standard tomato resistant to P. capsici.  When screening  pepper varieties for resistance to P. capsici, the Chi‐square test has been used to determine  relative resistance of pepper lines by comparison to standard resistant peppers such as  CM334 (63).  Our experiments identified the resistant genotype LA407; thus, a similar  67 approach to the one used in the P capsici‐pepper interaction can now be applied to future P.  capsici‐tomato interaction studies.  Significant differences in pathogen incidence were found among different plant  parts, possibly indicating that more than one mechanism of host resistance may be  involved.  In pepper, it has been observed that resistance to P. capsici is due to different  genetic controls depending on tissue type (62, 64).  In our study, the pathogen was  successfully recovered from roots and crowns of all symptomatic, root‐inoculated  seedlings.  Phytophthora capsici can be difficult to isolate from certain tissue types such as  mature pepper stems (M. K. Hausbeck, unpublished data), asparagus (55) or Fraser fir  tissue (45), but was easily isolated from symptomatic tomato plants in our experiments.   However, PCR was useful because it confirmed that the inability to detect P. capsici in  LA407 using culture techniques was not due to an escape.  In previous studies, PCR was  able to detect false negatives after a lack of P. capsici detection by culturing techniques in  pepper plants when symptoms and signs where not obvious (51).  Genotypes Ha7998 and  Talladega were both stunted as a result of P. capsici infection; yet, when Talladega was  inoculated with SFF3, the least pathogenic isolate in our study, the plants did not show  stunting.  Stunting in resistant and moderately resistant genotypes indicates that the  pathogen was directly limiting plant growth.  However, it is not known if stunting would  occur in nature on a resistant genotype or was the result of the relatively axenic conditions  of the experiment.   Wild species of tomato can be a valuable source of economically important traits,  including resistance to diverse pathogens for the improvement of cultivated tomato crops  (10).  In our study, we found that Solanum habrochaites LA407 was resistant to the four P.  68 capsici isolates used.  Interestingly, LA407 was resistant to bacterial canker caused by  Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) (13, 25) and early blight caused by  Alternaria solani (11).  Other genotypes of Solanum habrochaites were resistant to late  blight caused by Phytophthora infestans (6, 7), whitefly infestations (38), whitefly‐ transmitted geminivirus (36), and Bemisia argentifolli (38).  This wild species can be  crossed with S. lycopersicon to generate progeny with relative ease (6, 7, 13), making the  species a good candidate for improving tomato disease resistance.   When screening for economically important traits, breeders have performed host  samplings under the assumption that taxonomically related plants, or those found in  geographic proximity, are likely to share desirable characteristics such as disease  resistance (22, 23, 58).  The third objective of our study was to determine if resistance to P.  capsici could be found in diverse tomato lineages or if it was only associated with one or  more particular clades.  If a breeder can use taxonomic or geographic information to  identify the most likely sources of valuable traits, then the efficiency of the search may be  improved (22).  To determine the relatedness of the tomato genotypes used in this study,  we relied on AFLP analysis.  AFLP analysis is an appropriate tool to detect polymorphisms  in tomato and establish genetic diversity and relatedness among tomato genotypes (42,  60).  The obtained UPGMA tree topology agreed with clustering analysis of previous studies  (1, 37, 42, 60) and the statistical analysis found no correlation between UPGMA clade and  resistance to the pathogen isolates used in this study, indicating that the tree topology  obtained cannot be reliably used to predict where additional sources of P. capsici resistance  may be found.  Resistance to isolate SFF3 seems to be more widespread across tomato  lineages than for the other P. capsici isolates used in our experiment.  Spooner et al. (59)  69 also found that resistance to Phytophthora infestans was not associated with lineages of  wild potatoes.  Our results suggests that tomato germplasm needs to be screened for  resistance to diverse P. capsici isolates until other methods, such as marker‐assisted  selection, are developed to identify resistant genotypes.  The association between P. capsici  resistance and geographic origin of tomato genotypes was not analyzed in this study  because the origin of most varieties is unknown.  Information of geographic origin is only  available for LA407 that comes from Ecuador; Ha7998 that comes from Hawaii; and  LA1269, LA1589, and LA716 that come from Peru.  More accessions of the wild species  used in this study need to be included in future experiments to establish if the responses  observed occur in other accessions of the same species, and to determine if the lack of  association between resistance to P. capsici and AFLP‐clades is due to the low number of  Solanum accessions tested or to genetic effects.   P. capsici has been documented in many vegetable production regions in Michigan  (18), a state that grows over 33,000 hectares of susceptible crops (3).  In Michigan, a  grower’s ability to grow vegetables in uninfested land is diminished due to a general  reduction in farmland caused by urban sprawl and an increase in the number of P. capsici‐ infested fields.  In addition, fungicide resistance, an increasing list of susceptible hosts, and  the phasing‐out of methyl bromide treatments make cost‐effective management of P.  capsici difficult.  Disease management strategies that reduce fungicide use without  increasing disease related losses, such as host resistance, are needed.       70                                       References  71 References   1.    2.    3.    4.    5.    6.    7.    8.    9.    10.    11.    12.    Alvarez, A. E., van de Wiel, C. C. M., Smulders, M. J. M., and Vosman, B.  2001.  Use of  microsatellites to evaluate genetic diversity and species relationships in the genus  Lycopersicon.  Theor. Appl. Genet. 103:1283‐1292.  Anonymous.  2008.  National Statistics: Tomatoes United States Department of  Agriculture.  National Agricultural Statistics Service.  Online publication.  Anonymous.  2009.  National Statistics: Michigan Data ‐ Vegetables United States  Department of Agriculture.  National Agricultural Statistics Service.  Online  publication.  Bolkan, H. A.  1985.  A technique to evaluate tomatoes for resistance to  Phytophthora root rot in the greenhouse.  Plant Dis. 69:708‐709.  Bowers, J. H., and Mitchell, D. J.  1989.  Variability in virulence of oospore inoculum  of Phytophthora capsici and the relationship of the density of oospores in soil to  plant mortality.  Phytopathology 79:1166.  Brower, D. J., Jones, E. S., and St. Clair, D.  2004.  QTL analysis of quantitative  resistance to Phytophthora infestans (late blight) in tomato and comparisons with  potato.  Genome 47:475‐492.  Brower, D. J., and St. Clair, D. A.  2004.  Fine mapping of three quantitative trait loci  for late blight resistance in tomato using near isogenic lines (NILs) and sub‐NILs.   Theor. Appl. Genet. 108:628‐638.  Critopoulos, P. D.  1955.  Foot rot of tomato incited by Phytophthora capsici.  Bull.  Torrey Bot. Club 82:168‐182.  Erwin, D. C., and Ribeiro, O. K.  1996.  Phytophthora diseases worldwide. APS Press,  St. Paul, MN.  Eshed, Y., and Zamir, D.  1995.  An introgression line population of Lycopersicon  pennellii in the cultivated tomato enables the identification and fine mapping of  yield‐associated QTL.  Genetics 141:1147‐1162.  Foolad, M. R., Ntahimpera, N., Christ, B. J., and Lin, G. Y.  2000.  Comparison of field,  greenhouse, and detached‐leaflet evaluations of tomato germ plasm for early blight  resistance.  Plant Dis. 84:967‐972.  Foster, J. M., and Hausbeck, M. K.  2010.  Resistance of pepper to Phytophthora  crown, root, and fruit rot is affected by isolate virulence.  Plant Dis. 94:24‐30.  72 13.    14.    15.    16.    17.    18.    19.    20.    21.    22.    23.    24.  Francis, D. M., Kabelka, E., Bell, J., Franchino, B., and St. Clair, D.  2001.  Resistance to  bacterial canker in tomato (Lycopersicon hirsutum LA407) and its progeny derived  from crosses to L. esculentum.  Plant Dis. 85:1171‐1176.  Gevens, A. J., Ando, K., Lamour, K. H., Grumet, R., and Hausbeck, M. K.  2006.  A  detached cucumber fruit method to screen for resistance to Phytophthora capsici  and effect of fruit age on susceptibility to infection.  Plant Dis. 90:1276‐1282.  Gevens, A. J., Donahoo, R. S., Lamour, K., and Hausbeck, M. K.  2008.  Characterization  of Phytophthora capsici causing foliar and pod blight of snap beans in Michigan.   Plant Dis. 92:201‐209.  Gullino, M. L., and Garibaldi, A.  1994.  Influence of soilless cultivation on soilborne  diseases.  Acta Hort. 361:341‐354.  Hartman, H., and Huang, Y. H.  1993.  Pathogenicity and virulence of Phytophthora  capsici isolates from Taiwan on tomatoes and other selected hosts.  Plant Dis.  77:588‐591.  Hausbeck, M. K., and Lamour, K. H.  2004.  Phytophthora capsici on vegetable crops:  research progress and management challenges. Plant Dis. 88:1292‐1303.  Hwang, B. K., Kim, Y. J., and Kim, C. H.  1996.  Differential interactions of  Phytophthora capsici isolates with pepper genotypes at various growth stages.  Eur.  J. Plant Pathol. 102:311‐316.  Hwang, J. S., and Hwang, B. K.  1993.  Quantitative evaluation of resistance of Korean  tomato cultivars to isolates of Phytophthora capsici from different geographic areas.   Plant Dis. 77:1256‐1259.  Ioannou, N., and Grogan, R. G.  1984.  Control of Phytophthora root rot of processing  tomato with ethazol and metalaxyl.  Plant Dis. 68:429‐435.  Jansky, S. H., Simon, R., and Spooner, D. M.  2006.  A test of taxonomic predictivity:  resistance to white mold in wild relatives of cultivated potato.  Crop Sci. 46:2561‐ 2570.  Jansky, S. H., Simon, R., and Spooner, D. M.  2008.  A test of taxonomic predictivity:  resistance to early blight in wild relatives of cultivated potato.  Phytopathology  98:680‐687.  Jones, J. B.  1999.  Tomato plant culture in the field, greenhouse and home garden.   CRC Press LLC, Boca Raton.    73 25.    26.    27.    28.    29.    30.    31.    32.    33.    34.    35.    36.    37.  Kabelka, E., Franchino, B., and Francis, D. M.  2002.  Two loci from Lycopersicon  hirsutum LA407 confer resistance to strains of Clavibacter michiganensis supsp.  michiganensis.  Phytopathology 92:504‐510.  Kim, E. S., and Hwang, B. K.  1992.  Virulence to Korean pepper cultivars of isolates  of Phytophthora capsici from different geographic areas.  Plant Dis. 76:486‐489.  Kim, K., Nemec, S., and Musson, G.  1997.  Effects of compost and soil amendments  on soil microflora and Phytophthora root and crown rot of bell pepper.  Crop Prot.  16:165‐172.  Kreutzer, W. A., Bodine, E. W., and Durrell, L. W.  1940.  Cucurbit diseases and rot of  tomato fruit caused by Phytophthora capsici.  Phytopathology 30:972‐976.  Labuschagne, N., Thompson, A. H., and Botha, W. J.  2003.  First report of stem and  root rot of tomato caused by Phytophthora capsici in South Africa.  Plant Dis.  87:1540.  Lamour, K. H., and Hausbeck, M. K.  2000.  Mefenoxam insensitivity and the sexual  stage of Phytophthora capsici in Michigan cucurbit fields. Phytopathology 90:396‐ 400.  Lamour, K. H., and Hausbeck, M. K.  2001.  The dynamics of mefenoxam insensitivity  in a recombining population of Phytophthora capsici characterized with amplified  fragment length polymorphism markers. Phytopathology 91:553‐557.  Lamour, K. H., and Hausbeck, M. K.  2003.  Effect of crop rotation on the survival of  Phytophthora capsici in Michigan. Plant Dis. 87:841‐845.  Lamour, K. H., and Hausbeck, M. K.  2003.  Susceptibility of mefenoxam‐treated  cucurbits to isolates of Phytophthora capsici sensitive and insensitive to mefenoxam.   Plant Dis. 87:920‐922.  Lee, B. K., Kim, B. S., Chang, S. W., and Hwang, B. K.  2001.  Agressiveness to pumpkin  cultivars of isolates of Phytopththora capsici from pumpkin and pepper.  Plant Dis.  85:497‐500.  Maniatis, T., Fritsch, E. F., and Sambrook, J.  1982.  Molecular cloning: a laboratory  manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.  Martins Santana, F., da Graça Ribeiro, S., Willians Moita, A., Moreira, D., and de Brito  Giordano, L.  2001.  Sources of resistance in Lycopersicon spp. to a bipartite whitefly‐ transmitted geminivirus from Brazil.  Euphytica 122 (1):45‐51.  Miller, J. D., and Tanksley, S. D.  1990.  RFLP analysis of phylogenetic relationships  and genetic variation in the genus Lycopersicon.  Theor. Appl. Genet. 80:437‐448.  74   38.    39.    40.    41.    42.    43.    44.    45.    46.    47.    48.    49.  Muigai, S. G., Schuster, D. J., Snyder, J. C., Scott, J. W., Bassett, M. J., and McAuslane, H.  J.  2002.  Mechanisms of resistance in Lycopersicon germplasm to the whitefly  Bemisia argentifolii.  Phytoparasitica 30:347‐360.  Noble, R., and Coventry, E.  2005.  Suppression of soil‐borne plant diseases with  composts: A review.  Biocontrol Sci. and Techn. 15:3‐20.  Oelke, L. M., and Bosland, P. W.  2003.  Differentiation of race specific resistance to  Phytophthora root rot and foliar blight in Capsicum annuum.  J. Am. Soc. Hortic. Sci.  128:213‐218.  Palloix, A., Daubeze, A. M., and Pochard, E.  1988.  Phytophthora root rot of pepper.  Influence of host genotype and pathogen strain on the inoculum‐density severity  relationships.  J. Phytopathol. 123:25‐33.  Park, Y. H., West, M. A. L., and St. Clair, D. A.  2004.  Evaluation of AFLPs for  germplasm fingerprinting and assessment of genetic diversity in cultivars of tomato  (Lycopersicon esculentum L.).  Genome 47:510‐518.  Parra, G., and Ristaino, J. B.  2001.  Resistance to mefenoxam and metalaxyl among  field isolates of Phytopththora capsici causing Phytophthora blight of bell pepper.   Plant Dis. 85:1069‐1075.  Polach, F. J., and Webster, R. K.  1972.  Identification of strains and inheritance of  pathogenicity in Phytophthora capsici.  Phytopathology 62:20‐26.  Quesada‐Ocampo, L. M., Fulbright, D. W., and Hausbeck, M. K.  2009.  Susceptibility of  Fraser fir to Phytophthora capsici.  Plant Dis. 93:135‐141.  Quesada‐Ocampo, L. M., and Hausbeck, M. K.  2009.  Resistance in tomato and wild  relatives to Phytophthora capsici.  Phytopathology 99:S106.  Quirin, E. A., Ogundiwin, E. A., Prince, J. P., Mazourek, M., Briggs, M. O., Chlanda, T. S.,  Kim, K.‐T., Falise, M., Kang, B.‐C., and Jahn, M. M.  2005.  Development of sequence  characterized amplified region (SCAR) primers for the detection of Phyto.5.2, a  major QTL for resistance to Phytophthora capsici Leon. in pepper.  Theor. Appl.  Genet. 110:605‐612.  Reifschneider, F. J. B., Adalberto, C. C. F., and Arildo, M. R.  1986.  Factors affecting  expression of resistance in pepper (Capsicum annuum) to blight caused by  Phytophthora capsici in screening trials.  Plant Pathol. 35:451‐456.  Rick, C. M., and Yoder, J. I.  1988.  Classical and molecular genetics of tomato:  highlights and perspectives.  Ann. Rev. Genet. 22:281‐300.    75 50.    51.    52.    53.    54.    55.    56.    57.    58.    59.    60.    61.  Ristaino, J. B.  1990.  Intraspecific variation among isolates of Phytopthora capsici  from pepper and cucurbit fields in North Carolina.  Phytopathology 80:1253‐1259.  Ristaino, J. B., Madritch, M., Trout, C. L., and Parra, G.  1998.  PCR amplification of  ribosomal DNA for species identification in the plant pathogen genus Phytophthora.   Appl. Environ. Microbiol. 64:948‐954.  Roberts, P. D., French‐Monar, R. D., Hoffine, M. S., Seijo, T. E., and McGovern, R. J.   2005.  Survival and recovery of Phytophthora capsici and oomycetes in tailwater and  soil from vegetable fields in Florida.  Ann. Appl. Biol. 146:351‐359.  Sacristan, S., and Garcia‐Arenal, F.  2008.  The evolution of virulence and  pathogenicity in plant pathogen populations.  Mol. Plant Pathol. 9 (3):369‐384.  Satour, M. M., and Butler, E. E.  1967.  A root and crown rot of tomato caused by  Phytophthora capsici and P.parasitica.  Phytopathology 57:510‐515.  Saude, C., Hurtado‐Gonzalez, O. P., Lamour, K. H., and Hausbeck, M. K. 2008.  Occurrence and characterization of Phytophthora sp. pathogenic to asparagus  (Asparagus officinalis) in Michigan. Phytopathology 98:1075‐1083.  Shaner, G., and Finney, R. E.  1977.  The effect of nitrogen fertilization on the  expression of slow‐mildewing resistance in Knox wheat.  Phytopathology 67:1051‐ 1056.  Silvar, C., Duncan, J. M., Cooke, D. E. L., Williams, N. A., Diaz, J., and Merino, F.  2005.   Development of specific PCR primers for identification and detection of  Phytophthora capsici Leon. Eur. J. Plant Pathol. 112:43‐52.  Spooner, D. M., Hetterscheid, W. L. A., van den Berg, R. G., and Brandenburg, W.   2003.  Plant nomenclature and taxonomy: An horticultural and agronomic  perspective.  Hortic. Rev. (Am. Soc. Hortic. Sci.) 28:1‐60.  Spooner, D. M., Jensky, S. H., and Simon, R.  2009.  Test of taxonomic and  biogeographic predictivity: resistance to disease and insect pests in wild relatives of  cultivated potato.  Crop Sci. 49:1367‐1376.  Spooner, D. M., Peralta, I. E., and Knapp, S.  2005.  Comparison of AFLPs with other  markers for phylogenetic inference in wild tomatoes [Solanum L. section  Lycopersicon (Mill.) Wettst.].  Taxon 54:43‐61.  Swofford, D. L.  1996.  PAUP*: Phylogenetic Analysis Using Parsimony (and Other  Methods).  4.0.  Sinauer Associates, Sunderland, MA.    76 62.    63.    64.    65.  Sy, O., Bosland, P. W., and Steiner, R.  2005.  Inheritance of Phytophthora stem blight  resistance as compared to Phytophthora root rot and Phytophtora foliar blight in  Capsicum annuum L.  J. Am. Soc. Hortic. Sci. 130:75‐78.  Sy, O., Steiner, R., and Bosland, P. W.  2008.  Recombinant inbred line differential  identifies race‐specific resistance to Phytophthora root rot in Capsicum annuum.   Phytopathology 98:867‐870.  Walker, S. J., and Bosland, P. W.  1999.  Inheritance of Phytopthora root rot and foliar  blight resistance in pepper.  J. Am. Soc. Hortic. Sci. 124:14‐18.  Waterhouse, G. M.  1963.  Key to the Species of Phytophthora de Bary.   Commonwealth Mycological Society, Kew, Surrey, UK.        77 CHAPTER IV: INVESTIGATING THE GENETIC STRUCTURE OF PHYTOPHTHORA CAPSICI  POPULATIONS    Abstract    Phytophthora capsici Leonian is a destructive soilborne pathogen that infects  economically important solanaceous, cucurbitaceous, fabaceous, and other crops in the  United States and worldwide.  The objective of this study was to investigate the genetic  structure of 255 P. capsici isolates assigned to predefined host, geographical, mefenoxam  sensitivity and mating type categories. Isolates from six continents, 21 countries, 19 U.S.  states, and 26 host species were genotyped for four mitochondrial and six nuclear loci.   Bayesian clustering analysis revealed some population structure by host, geographic origin  and mefenoxam sensitivity with some clusters occurring more or less frequently in  particular categories.  Bayesian clustering, split networks, and statistical parsimony  genealogies also detected the presence of non‐P. capsici individuals in our sample  corresponding to P. tropicalis and isolates of a distinct cluster closely related to P. capsici  and P. tropicalis.  Our findings of genetic structuring in P. capsici populations highlight the  importance of including isolates from all detected clusters that represent the genetic  variation in P. capsici for development of diagnostic tools, fungicides, and host resistance.   The population structure detected will also impact the design and interpretation of  association studies in P. capsici.  This study provides an initial map of global population  structure of P. capsici but continued genotyping of isolates will be necessary to expand our  knowledge of genetic variation in this important plant pathogen.  78 Introduction    Phytophthora capsici Leonian is a destructive soilborne pathogen that is distributed  worldwide.  It can infect a broad range of hosts including economically important  solanaceous, cucurbitaceous and fabaceous crops in the United States (U. S.) (28, 33, 34,  84).  P. capsici also causes disease on tropical hosts such as cacao (Theobroma cacao),  rubber (Hevea brasiliensis), macadamia (Macadamia integrifolia), papaya (Carica papaya),  black pepper (Piper nigrum) (22) and rocoto pepper (Capsicum pubescens) (49), and  additional hosts continue to be identified (34, 83, 84).   P. capsici is a diploid oomycete that is heterothallic (22).  Hence, sexual  reproduction occurs when the A1 and A2 mating types (MTs) come together to produce  oospores (59).  It is common in vegetable‐producing regions in the U.S. for both MTs to be  present (44, 57, 88).  The success of crop rotation as a management strategy is limited by  the long‐term survival of oospores in the soil (60), and the number and diversity of  susceptible hosts (22).  Chemical control of P. capsici with mefenoxam, a commonly used  fungicide, may not protect susceptible crops from resistant pathogen populations, which  have been documented throughout the U.S. (57, 59, 61, 78).    Developing resistant varieties for economically important hosts has been  challenging due to the diversity of pathogen populations and the existence of different  physiological races within P. capsici in the U.S. (73, 108).  Host varieties that show  resistance in one region may not perform well in another region (28).  Also, P. capsici  isolates that show low or medium virulence on one particular host may show increased  virulence on a different host (28).  As early as 1972, field populations of P. capsici from  solanaceous and cucurbitaceous hosts were shown to differ in virulence (80).  In previous  79 studies when P. capsici isolates 12889, OP97, SP98, and SFF3 from Michigan were used to  inoculate cucumber fruit (33) and Fraser fir (83), differences in virulence were not  observed.  In contrast, studies on pepper (28) and tomato (84) with these same isolates  have indicated significant differences in virulence and pathogenicity, respectively.  Other  reports of variation in virulence and pathogenicity among P. capsici isolates have been  published for several hosts (13, 55, 73, 75, 86, 87); however, the genetic basis of these  differences is unknown.  The differences found between P. capsici isolates have significant  implications for breeding for resistant hosts since developed varieties should be effective  against local pathogen populations.  Isolates used in host resistance screenings should  incorporate the genetic, phenotypic, and physiological diversity of P. capsici.  However, the  global genetic variation of P. capsici populations is still poorly understood.    A detailed knowledge of the population structure and distribution of genetic  variation of P. capsici is needed to understand the genetic composition of isolates that occur  in particular hosts or regions to develop and intelligently deploy host resistance.   Characterizing P. capsici populations for fungicide resistance is also important to establish  if a product will provide effective chemical control against local isolates.  Populations of P.  capsici have been previously studied within states in the U.S. (30, 58, 103, 109), and in  countries where this pathogen causes significant losses (65, 95).  Such investigations have  provided information about local genetic diversity of isolates and the importance of  recombination in maintaining genetic variability (58, 59).  Some experiments have also  used P. capsici intra‐ and inter‐specific data to determine whether P. capsici and P.  tropicalis, a sibling species, truly constitute separate species (12, 19, 69, 117) but there is  still controversy about the evolutionary relationships between these pathogens (12).   80 Establishing the population structure of P. capsici would help in understanding the genetic  variation of this pathogen and better define the species, which will impact the development  of species‐specific molecular diagnostic tools.  Other studies have analyzed P. capsici intra‐ specific data using traditional phylogenetic methods and have established a correlation  between phylogenetic cluster and host type, where isolates from woody perennials will  group together and separate from isolates obtained from vegetable crops (12, 19).  Studies  including worldwide samples to examine the global population structure and distribution  of genetic variation in P. capsici by geography and host are still lacking.    Most studies of plant pathogen diversity are based on sampling from predefined  “populations”, referred to as categories in this paper.  These categories are usually defined  by host, geography or physiology and may not reflect underlying genetic relationships.   Bayesian clustering can be applied to assign individuals in a sample to subpopulations,  referred to as clusters in this paper, based on their distinct allele frequencies (82).  This  method has been successfully used to visualize overall patterns of genetic structure in  several species (9, 24, 26, 29, 54, 90, 102).  Nonetheless, Bayesian clustering has not been  as extensively used to detect population structure in plant pathogens and explore the  distribution of genotypes in different regions or hosts, which may have implications for  disease management.  In this study we used Bayesian clustering and other methods to  investigate the genetic structure of global P. capsici populations.  Specifically we sought to:  (i) establish if we could detect population structure in the sample, (ii) determine whether  the predefined grouping of P. capsici isolates in host, geography, mefenoxam sensitivity and  mating type categories show direct correspondence with inferred genetic clusters, and (iii)  examine the distribution of genotypes from each cluster within the predefined categories.   81 Clustering analysis of P. capsici isolates revealed some population structure by host,  geographic origin and mefenoxam sensitivity with some clusters occurring more or less  frequently in particular categories but showed no direct correspondence between any of  the predefined categories and the number of inferred clusters.  Bayesian clustering, split  networks, and statistical parsimony genealogies also detected the presence of non‐P.  capsici individuals in our sample corresponding to P. tropicalis and isolates of a distinct  cluster closely related to P. capsici and P. tropicalis.    Methods    Isolate selection, maintenance and phenotypic characterization.  A total of 255  P. capsici isolates originating from diverse hosts throughout the world were obtained from  colleagues or selected from the culture collection maintained in the laboratory of Dr.  Hausbeck at Michigan State University (MSU) (Table 4.1). Type cultures for P. capsici 13691  (ATCC.64531, Italy 1927) and 13692 (ATCC.15399, New Mexico 1727), and P. tropicalis  13602 (ATCC.76651, Hawaii 2001) were included in the analysis.  Actively growing, single‐ spore cultures were obtained from long‐term stock cultures as previously described (83).   Agar plugs from actively growing cultures of each isolate were transferred to 50 ml‐ centrifuge tubes containing 30 ml of unclarified V8 juice broth (UCV8B; 3 g CaCO3, 160 ml  unfiltered V8 juice and 840 ml distilled water), which were maintained at room  temperature (21 ± 2°C) under constant fluorescent lighting and shaking (0.03 x g) to obtain  agar‐free tissue for DNA extraction.  Isolates were characterized according to mating type  (MT), and sensitivity to mefenoxam as previously described (57).  P. capsici was confirmed  82 using morphological characteristics according to the Phytophthora spp. key by Waterhouse  (110).    Table 4.1.  Isolates of P. capsici sensu stricto (SS) and sensu lato (SL) used in this study.    Isolate  Origina  Host  101  US, MI  Cucumis sativus  A1  S  102  US, MI  C. sativus  A2  I  135  US, MI  C. sativus  A2  IS  455  US, MI  C. sativus  A1  S  1177  US, MI  C. sativus  A2  S  9790  US, MI  A1  IS  9964  US, MI  A1  S  10044  US, MI  C. annuum  A2  S  10193  US, MI  Phaseolus  vulgaris  A1  S  10213  US, MI  P. vulgaris  A1  I  10251  US, MI  P. vulgaris  A1  S  10412  US, MI  C. sativus  A2  I  10858  US, MI  P. vulgaris  A1  S  11348  US, MI  C. sativus  A2  S  11457  US, MI  C. annuum  A1  IS  11469  US, MI  C. annuum  A2  IS  11478  US, MI  P. vulgaris  A1  I  11571  US, MI  Cucurbita pepo  A2  S  Capsicum  annuum  Cucurbita  maxima  MTb  MSc  83 Haplotypesd  1‐1‐1‐1‐1‐2,1‐2‐2,1‐ 1,4‐1 1‐1‐1‐1‐1,5‐4,1‐7,4‐1‐ 1‐2 1‐1‐1‐1‐1‐1,11‐9,2‐1‐ 3,1‐5,1 1‐1‐1‐1‐1,5‐10,1‐2‐1‐ 1‐5,2 1‐1‐1‐1‐1‐17,1‐2,6‐1‐ 1,4‐1 1‐1‐1‐1‐1‐11,1‐2‐1‐1‐ 1,3 1‐1‐1‐1‐1‐1,23‐2‐1‐1‐ 1 1‐1‐1‐1‐1,4‐29,1‐4,3‐ 2,1‐3‐1,2 1‐1‐1‐1‐1‐24,1‐7,4‐1‐ 1,3‐3 1‐1‐1‐1‐1‐24,42‐2,4‐1‐ 1‐1 1‐1‐1‐1‐1‐30,1‐2,4‐1‐ 1,4‐1,3 1‐1‐1‐1‐1,8‐3,1‐2,15‐ 2,1‐1,4‐1,2 1‐1‐1‐1‐1‐3,1‐2,4‐1‐ 2,24‐3 1‐1‐1‐1‐1‐11,1‐2,9‐ 2,1‐1,2‐1,2 1‐1‐5‐1‐4,2‐3,1‐2,7‐ 1,3‐1‐50,51 1‐1‐1‐1‐9‐2,1‐6,3‐1‐1‐ 2,3 1‐1‐9‐1‐9‐30,1‐2,7‐1‐ 1‐1,17 1‐1‐1‐1‐1‐3,1‐9‐2,1‐ 1,3‐1 Source  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  Table 4.1 (cont’d)                  11780  US, MI  C. sativus  A2  IS  11783  US, MI  C. sativus  A2  I  11861  US, MI  C. pepo  A2  IS  11885  US, MI  C. pepo  A1  I  11923  US, MI  C. pepo  A1  I  12017  US, MI  C. pepo  A2  S  12162  US, MI  C. maxima  A2  S  12328  US, MI  C. annuum  A1  IS  12842  US, MI  C. annuum  A2  S  12889  US, MI  C. annuum  A1  I  13199  US, KY  C. maxima  A1  S  13200  US, KY  Cucurbita sp.  A2  S  13201  US, KY  C. pepo  A2  S  13202  US, NY  C. maxima  A2  S  13203  US, NY  C. annuum  A1  S  13204  US, NY  C. annuum  A1  S  13205  US, NY  C. maxima  A2  S  13206  US, NY  C. maxima  A1  S  13207  US, CA  C. annuum  A2  S  13208  US, CA  Solanum  lycopersicon  A2  S  13209  US, SC  C. pepo  A2  S  13210  US, SC  C. pepo  A2  S  84     1‐1‐1‐1‐1,4‐11,1‐7,4‐ 1‐1‐1,5 1‐1‐1‐1‐1,4‐11,1‐7,4‐ 1‐1‐55,56 1‐1‐1‐1‐1‐2,1‐2,15‐1‐ 1‐3 1‐1‐1‐1‐1‐2,1‐2,4‐2,1‐ 1‐3 1‐1‐1‐1‐1‐2,1‐6,3‐1‐1‐ 3 1‐1‐1‐1‐1‐5,1‐2,7‐2,1‐ 1‐1 1‐1‐1‐1‐1,4‐11,1‐ 25,32‐2,1‐1‐5,2 1‐1‐1‐1‐4,5‐2,1‐7,4‐1‐ 1‐1,5 1‐1‐1‐1‐4,5‐17,1‐6,5‐ 1‐1‐1 1‐1‐1‐1‐1‐2,1‐7,4‐1,3‐ 1‐3 1‐1‐1‐1‐1,2‐18,1‐15,3‐ 6‐1,2‐4,35 1‐1‐1‐1‐1,4‐2,12‐1,11‐ 2,1‐1‐3,42 1‐1‐1‐1‐4,5‐2,12‐ 19,11‐2,1‐1‐3,42 1‐1‐1‐1‐9‐3,1‐4,3‐2,1‐ 1‐14,6 1‐1‐1‐1‐1‐16,1‐4‐8‐ 3,7‐1 1‐1‐1‐1‐1‐16,1‐4‐8‐ 3,7‐1 1‐1‐1‐1‐2‐31,6‐1,3‐ 2,6‐10,3‐1,11 1‐1‐1‐1‐1‐3,1‐4‐2,1‐ 1,3‐3 1‐1‐1‐1‐1‐10,1‐1,8‐2‐ 1,9‐2,25 1‐1‐1‐1‐2,18‐2,1‐1,8‐ 3‐1‐1,43 1‐1‐1‐1‐1,5‐16,1‐1,20‐ 2,1‐1,11‐1,5 1‐1‐1‐1‐1,5‐16,1‐1,20‐ 2,1‐1,11‐1,5     M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  K. W.  Seebold  K. W.  Seebold  K. W.  Seebold  C. D. Smart  C. D. Smart  C. D. Smart  C. D. Smart  C. D. Smart  C. L.  Blomquist  C. L.  Blomquist  A. P.  Keinath  A. P.  Keinath  Table 4.1 (cont’d)                  13211  US, SC  C. pepo  A2  S  13212  US, SC  C. pepo  A2  S  13213  US, SC  C. pepo  A2  S  13214  US, SC  C. pepo  A2  S  13215  US, SC  C. pepo  A2  S  13216  US, SC  C. pepo  A2  S  13217  US, SC  C. pepo  A2  S  13218  US, SC  Cucurbita  moschata  A1  S  13219  US, SC  C. moschata  A1  S  13220  US, SC  C. moschata  A1  S  13221  US, SC  C. annuum  A1  S  13222  US, SC  C. annuum  A1  S  13223  US, SC  C. annuum  A2  S  13224  US, SC  C. annuum  A2  S  13225  US, SC  C. annuum  A2  I  13226  US, SC  C. annuum  A2  I  13227  US, SC  C. annuum  A2  I  13228  US, SC  C. annuum  A1  I  13229  US, SC  C. annuum  A1  IS  13230  US, SC  C. annuum  A1  S  13231  US, SC  C. annuum  A1  S  13232  US, SC  C. annuum  A1  S  85     1‐1‐1‐1‐1,5‐16,1‐1,20‐ 2,1‐1,11‐1,5 1‐1‐1‐1‐1,2‐14,12‐ 5,33‐2,1‐1,11‐39,2 1‐1‐1‐1‐7,2‐14,1‐5,10‐ 2,1‐3,2‐1,68 1‐1‐1‐1‐1,5‐43,1‐5,10‐ 2,1‐3,2‐4,2 1‐1‐1‐1‐1,19‐14,1‐ 5,10‐2,1‐3,2‐4,35 1‐1‐1‐1‐1,5‐14,1‐1,20‐ 2,1‐1,11‐1,5 1‐1‐1‐1‐1,5‐14,1‐5,10‐ 2,1‐3,2‐35,7 1‐1‐7‐1‐14,15‐1,25‐ 2,6‐2,1‐1,2‐44,45 1‐1‐7‐1‐14,15‐1,25‐ 2,6‐1‐1,2‐44,45 1‐1‐1‐1‐1,19‐4,1‐2,6‐ 2,1‐3,2‐7,69 1‐1‐1‐1‐6‐8,1‐13,16‐2‐ 2‐46,21 1‐1‐1‐1‐15,12‐8,1‐ 13,16‐2‐2‐46,21 2‐1‐1‐1‐2‐3,1‐13,16‐ 2,1‐2‐19,70 1‐1‐1‐1‐6‐1,23‐1,8‐1‐ 2‐9,5 1‐1‐1‐1‐6‐4,1‐34,16‐2‐ 2‐24,21 1‐1‐1‐1‐23,14‐4,1‐1,3‐ 2,4‐1,2‐1,71 1‐1‐1‐1‐6‐4,1‐13,16‐2‐ 2‐24,21 1‐1‐1‐1‐7,18‐4,1‐7,4‐ 2,6‐10,2‐1,72 1‐1‐1‐1‐1‐2,1‐4,3‐2,1‐ 1,13‐1,11 1‐1‐1‐1‐27,13‐2,1‐2,9‐ 2,4‐1,2‐7,73 1‐1‐1‐1‐4,5‐8,1‐5,19‐ 1‐2‐24,21 1‐1‐1‐1‐6‐8,1‐13,16‐2‐ 2‐74,21     A. P.  Keinath  A. P.  Keinath  A. P.  Keinath  A. P.  Keinath  A. P.  Keinath  A. P.  Keinath  A. P.  Keinath  A. P.  Keinath  A. P.  Keinath  A. P.  Keinath  A. P.  Keinath  A. P.  Keinath  A. P.  Keinath  A. P.  Keinath  A. P.  Keinath  A. P.  Keinath  A. P.  Keinath  A. P.  Keinath  A. P.  Keinath  A. P.  Keinath  A. P.  Keinath  A. P.  Keinath  Table 4.1 (cont’d)                  13233  US, LA  C. annuum  A1  S  13234  US, AR  C. annuum  A2  S  13235  US, AR  C. annuum  A2  S  13236  US, AR  C. annuum  A2  S  13237  US, AR  C. annuum  A2  S  13238  US, TX  C. annuum  A2  S  13239  US, TX  C. maxima  A2  S  13240  US, TX  C. maxima  A2  S  13243  US, NC  C. maxima  A1  S  13244  US, NC  C. moschata  A1  S  13245  US, NC  C. maxima  A1  S  13246  US, NC  C. maxima  A1  S  13247  US, NC  C. maxima  A1  S  13248  US, NC  C. maxima  A1  S  13249  US, NC  C. maxima  A1  S  13334  US, MA  C. annuum  A1  S  13336  US, MA  C. moschata  A2  S  13338  US, MA  C. moschata  A2  S  13339  US, MA  C. moschata  A1  S  13340  France  Cucumis melo  A1  S  13341  France  C. annuum  A1  S  13342  Mexico  C. annuum  A1  S  86     1‐1‐1‐1‐2‐2,1‐4,8‐2‐ 35,2‐3,75 1‐1‐1‐1‐20‐4,1‐23,14‐ 3‐1,2‐2,76 1‐1‐1‐1‐28,2‐18,1‐ 6,17‐18,3‐1‐1 1‐1‐2‐1‐2‐4,1‐15,1‐ 10,3‐1‐7 1‐1‐2‐1‐2‐4,1‐15,1‐ 10,3‐1‐7 4‐1‐5‐1‐2‐44,1‐1‐ 19,20‐21,36‐7,33  1‐1‐1‐1‐10,2‐32,15‐ 6,4‐1‐1,2‐1,4 1‐1‐1‐1‐1,2‐32,15‐6‐1‐ 1,2‐1,26 1‐1‐1‐1‐1‐2,1‐3‐2,1‐ 1,13‐1,11 1‐1‐1‐1‐1‐1‐11‐2,1‐ 1,13‐1,11 1‐1‐1‐1‐1‐1‐3‐2,1‐ 1,13‐1,11 1‐1‐1‐1‐1‐1‐4,21‐2,1‐ 1,37‐1,27 1‐1‐1‐1‐1,2‐4,1‐9,3‐ 2.1‐1,2‐3,7 1‐1‐1‐1‐1‐1‐21,3‐1‐ 1,13‐1,11 1‐1‐1‐1‐1‐1‐3,11‐1‐ 1,13‐1,11 1‐1‐1‐1‐1‐18,1‐2,35‐ 1,21‐1,18‐1,43 1‐1‐1‐1‐1‐10,1‐12,36‐ 1‐1,3‐1,5 1‐1‐1‐1‐1‐5,1‐27,22‐1‐ 1,3‐9,17 1‐1‐1‐1‐1‐29,1‐27,22‐ 2,1‐1,38‐5,2 1‐1‐4‐2‐3,11‐17,1‐5‐ 7,1‐8,2‐47,4 1‐1‐4‐2‐3‐17,1‐5‐7,1‐ 8,2‐47,4 1‐1‐1‐1‐1,29‐5,6‐3‐ 1,3‐2‐6     D. M. Ferrin  M. E.  Matheron  M. E.  Matheron  M. E.  Matheron  M. E.  Matheron  T. Isakeit  T. Isakeit  T. Isakeit  K. L. Ivors  K. L. Ivors  K. L. Ivors  K. L. Ivors  K. L. Ivors  K. L. Ivors  K. L. Ivors  R. L. Wick  R. L. Wick  R. L. Wick  R. L. Wick  F.  Panabieres  F.  Panabieres  F.  Panabieres  Table 4.1 (cont’d)      13343  13344      Teobroma  Cameroon  cacao  Citrullus  US, GA  lanatus          A1  S  A1  S  13345  US, GA  C. lanatus  A1  S  13346  US, GA  C. lanatus  A1  S  13347  US, GA  C. pepo  A1  S  13348  US, CA  S. lycopersicon  A2  S  13349  US, MI  C. maxima  A2  S  13350  Spain  C. annuum  A1  S  13351  US, NY  Solanum  melongena  A1  S  13352  US, NY  S. melongena  A1  S  13353  US, NY  S. melongena  A1  S  13354  US, NY  S. melongena  A1  S  13355  US, NY  S. melongena  A1  S  13356  US, NY  S. melongena  A1  S  13357  US, NY  S. melongena  A1  S  13358  US, NY  S. melongena  A1  S  13359  US, NY  S. melongena  A1  S  13360  US, NY  S. melongena  A1  S  13361  Mexico  T. cacao  A1  S  13362  Mexico  T. cacao  A1  I  13363  Mexico  T. cacao  A1  S  A1  S  13364  Guatemala  Piper nigrum  87     3‐1‐2‐1‐2‐1,33‐1‐5‐5‐ 10 1‐1‐1‐1‐1‐15,26‐1,8‐ 1,3‐3‐2,25 1‐1‐1‐1‐1‐15,26‐1,8‐ 1,3‐3‐2,25 1‐1‐1‐1‐1‐15,26‐1,8‐ 1,3‐3‐2,25 1‐1‐1‐1‐1‐45,21‐26,3‐ 2,3‐2,11‐5,14 1‐1‐1‐1‐1‐3,1‐2,9‐2,1‐ 1,4‐1,2 1‐1‐1‐1‐1‐2,1‐2‐1‐1‐1 1‐1‐1‐1‐1‐9,1‐14,10‐ 2,1‐1,4‐37,14 1‐1‐1‐1‐1,2‐27,6‐2,6‐ 2,4‐3,7‐1,4 1‐1‐1‐1‐1,2‐1‐1‐2,4‐ 1,19‐1,12 1‐1‐1‐1‐1,2‐1‐1‐2,4‐ 3,7‐1,12 1‐1‐1‐1‐1,2‐1‐1‐2,4‐ 3,7‐1,12 1‐1‐1‐1‐1,7‐6,13‐1‐ 2,4‐3,7‐1,12 1‐1‐1‐1‐1,7‐6,13‐1‐ 2,4‐3,7‐1,12 1‐1‐1‐1‐1,7‐6,13‐1‐ 2,4‐3,7‐1,12 1‐1‐1‐1‐1,7‐1,13‐1‐ 2,4‐3,7‐1,12 1‐1‐1‐1‐1,7‐6,13‐1‐ 2,4‐3,7‐1,12 1‐1‐1‐1‐1,7‐1,13‐1‐ 2,4‐3,7‐1,12 3‐1‐2‐1‐2‐9,1‐7,4‐ 14,5‐5‐1,4 3‐1‐2‐1‐2‐9,1‐7,4‐ 14,5‐5‐1,4 1‐1‐2‐1‐2‐9,1‐17,12‐ 2,15‐5‐1,4 3‐1‐2‐1‐2‐12,25‐1‐2‐ 5‐36     F.  Panabieres  P. Ji  P. Ji  P. Ji  P. Ji  B. J.  Aegerter  M. K.  Hausbeck  M. E.  Candela  C. D. Smart  C. D. Smart  C. D. Smart  C. D. Smart  C. D. Smart  C. D. Smart  C. D. Smart  C. D. Smart  C. D. Smart  C. D. Smart  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  Table 4.1 (cont’d)                  13365  Mexico  T. cacao  A2  S  13366  Brazil  T. cacao  A1  S  13367  Brazil  T. cacao  A2  S  13368  Brazil  T. cacao  A2  S  13370  Cameroon  T. cacao  A1  S  13371  Cameroon  T. cacao  A1  S  13377  Mexico  T. cacao  A1  S  13378  US, CA  C. annuum  A1  S  13379  US, CA  C. annuum  A1  S  13380  France  C. annuum  A1  S  13381  France  C. annuum  A1  S  13382  Yugoslaviae  C. annuum  A1  S  13383  France  S. melongena  A1  S  13384  India  P. nigrum  A2  S  13385  US, HI  Macadamia  integrifolia  A2  S  13386  US, CA  S. lycopersicon  A2  S  13387  US, CA  S. lycopersicon  A1  S  13388  US, CA  S. lycopersicon  A2  S  13389  Mexico  C. annuum  A1  S  13390  Mexico  C. annuum  A2  S  88     9‐4‐11‐3‐30,33‐63,64‐ 37‐22‐39‐10Pt 13‐2‐8‐7‐21‐65,66‐ 39,24‐25,26‐41,42‐ 10c11 6‐2‐8‐7‐22,21‐46‐24‐ 16‐22,23‐81c11 6‐2‐8‐4‐22,21‐47,46‐ 24‐16,17‐22,23‐1,2c11 3‐1‐2‐1‐2‐1,33‐1‐5‐5‐ 10 3‐1‐2‐1‐2‐19,48‐1‐5‐ 5‐10 9‐4‐11‐3‐30,31‐67,68‐ 37‐22‐39‐80Pt 1‐1‐1‐1‐1‐34,1‐1,8‐ 1,3‐1,3‐4,2 1‐1‐1‐1‐1‐34,1‐1,8‐ 1,3‐1,3‐4,2 1‐1‐1‐1‐3‐8,1‐5,1‐2,6‐ 14,6‐15,2 1‐1‐4‐1‐3‐8,1‐5,1‐2,6‐ 14,6‐15,2 1‐1‐1‐1‐3‐4,1‐5,10‐ 2,10‐1,2‐77,6 1‐1‐1‐1‐3‐4,1‐5,10‐ 2,10‐1,2‐16,6 9‐4‐11‐3‐30,31‐61‐ 37‐22‐40‐79,85Pt 10‐4‐12‐6‐30,31‐59‐ 37‐22‐39‐79,86Pt 1‐1‐1‐1‐1,2‐7,1‐1,8‐3‐ 1,2‐1,2 1‐1‐1‐1‐2‐7,1‐1,8‐3‐ 1,2‐1,2 1‐1‐1‐1‐2‐7,1‐1,8‐3‐ 1,2‐1,2 1‐1‐1‐1‐1,10‐5,6‐3‐ 1,3‐2‐6 1‐1‐1‐1‐1,10‐5,6‐3‐ 1,3‐2‐6     K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  Table 4.1 (cont’d)                  13391  Chile  C. annuum  A2  S  13392  US, CA  S. lycopersicon  A1  S  13393  Indonesia  P. nigrum  A2  S  13394  Indonesia  P. nigrum  A2  S  13395  Brazil  C. moschata  A1  S  13396  US, CA  C. annuum  A1  S  13397  US, HI  M. integrifolia  A2  S  13398  Mexico  T. cacao  A2  S  13401  US, CA  C. lanatus  A2  S  13402  US, CA  S. lycopersicon  A2  S  13403  US, CA  C. annuum  A1  S  13405  Mexico  S. lycopersicon  A2  S  13407  Norway  C. sativus  A2  S  13408  Norway  C. sativus  A2  S  13409  Norway  C. sativus  A2  S  13410  Chile  S. lycopersicon  A2  S  13411  Chile  S. lycopersicon  A2  S  13412  US, TN  C. pepo  A1  S  13413  US, TN  C. pepo  A1  S  13414  US, TN  C. pepo  A2  S  13415  US, TN  C. pepo  A2  S  13416  US, TN  C. pepo  A2  S  89     1‐1‐1‐1‐1,8‐2,21‐12,1‐ 2‐4,2‐22,4 1‐1‐1‐1‐2‐7,1‐1,8‐3‐ 1,2‐1,2 1‐1‐1‐1‐1‐49,50‐2‐2,1‐ 16,4‐23,5 4‐1‐3‐1‐1‐5,1‐2‐1‐ 3,16‐1 1‐1‐1‐1‐1‐14,51‐5,18‐ 2‐1‐48,49 1‐1‐1‐1‐1‐7,1‐1,8‐2‐ 1,3‐1,2 2‐1‐2‐2‐1‐35,52‐1‐2,1‐ 9,2‐28 9‐4‐12‐3‐34,35‐69,70‐ 1‐22‐39‐78,80Pt 7‐1‐3‐1‐1,7‐2,1‐6,1‐ 2,1‐1,2‐2,29 1‐1‐1‐1‐2‐7,1‐1,8‐3‐ 1,2‐1,2 1‐1‐1‐1‐1‐7,1‐1,8‐2‐ 1,3‐4,2 1‐1‐1‐1‐1,10‐5,1‐3‐ 1,3‐2‐6 1‐1‐1‐1‐1‐20,1‐3,11‐ 2,1‐3,4‐23,3 1‐1‐1‐1‐1‐36,19‐3,11‐ 2,11‐3,4‐23,5 1‐1‐1‐1‐1‐36,19‐3,11‐ 2,11‐3,4‐1,29 1‐1‐1‐1‐1,8‐2,21‐12,1‐ 2‐4,2‐22,4 1‐1‐1‐1‐1,8‐2,21‐12,1‐ 2‐4,2‐22,4 1‐1‐1‐1‐1‐2,1‐2‐2,1‐ 1,4‐1 1‐1‐1‐1‐1‐2,1‐2‐2,1‐ 1,4‐1 1‐1‐1‐1‐1‐2,1‐2‐2,1‐ 1,4‐1 1‐1‐1‐1‐1‐2,1‐2‐2,1‐ 1,4‐1 1‐1‐1‐1‐1‐2,1‐2‐2,1‐ 1,4‐1     K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  M. L.  Herrero  M. L.  Herrero  M. L.  Herrero  E. Chavez  E. Chavez  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  Table 4.1 (cont’d)                  13423  US, MI  C. pepo  A1  S  13435  US, TN  C. pepo  A1  S  13436  US, TN  C. pepo  A1  IS  13437  US, TN  C. pepo  A2  S  13438  US, TN  C. pepo  A2  S  13439  US, TN  C. pepo  A2  I  13440  US, TN  C. pepo  A2  IS  13441  US, TN  C. pepo  A1  S  13455  France  C. annuum  A1  S  13456  US, MI  C. melo  A1  S  13457  US, MI  C. melo  A1  S  13471  US, MI  C. annuum  A2  I  13479  Spain  C. annuum  A1  S  13500  US, CA  C. maxima  A1  S  13501  US, MI  Hedera helix  A1  S  13588  US, MI  C. moschata  A1  S  13602  US, HI  M. integrifolia  A1  S  13603  US, HI  Carica papaya  A2  S  13604  US, HI  Anthurium  andraeanum  A2  I  13606  Australia  Annona  squamosa  A1  S  13607  Australia  Mandevilla sp.  A1  S  90     1‐1‐1‐1‐1,8‐5,53‐7‐ 2,1‐1‐1 1‐1‐1‐1‐1‐2,1‐2‐2,1‐ 1,4‐1 1‐1‐1‐1‐1‐2,1‐2‐2,1‐ 1,4‐1 1‐1‐1‐1‐1‐2,1‐2‐2,1‐ 1,4‐1 1‐1‐1‐1‐1‐2,1‐2‐2,1‐ 1,4‐1 1‐1‐1‐1‐1‐2,1‐2‐2,1‐ 1,4‐1 1‐1‐1‐1‐1‐2,1‐2‐2,1‐ 1,4‐1 1‐1‐1‐1‐1‐2,1‐2‐2,1‐ 1,4‐1 2‐1‐4‐2‐3‐35,37‐5,1‐ 12,13‐25,2‐8 4‐1‐5‐1‐1,8‐38,19‐2,4‐ 2,1‐1‐3 8‐1‐6‐1‐1‐5,1‐2,28‐1‐ 3,16‐1 1‐1‐1‐1‐1,8‐20,6‐2,7‐ 1,3‐1‐1,17 1‐1‐1‐1‐1‐9,1‐14,10‐ 2,1‐3,4‐37,23 1‐1‐1‐1‐16,7‐22,1‐11‐ 2,1‐3,11‐22,2 1‐5‐13‐9‐30,36‐71,72‐ 38‐23‐43,44‐82c11 1‐1‐1‐1‐1,5‐19,23‐2,4‐ 1‐1,3‐2 12‐4‐12‐8‐32‐73,74‐ 37,40‐24‐40‐87,88Pt 10‐4‐11‐6‐30,31‐59‐ 37‐22‐39‐79,83Pt 10‐4‐1‐6‐6,23‐2,54‐ 37‐22‐39‐79,83Pt 9‐4‐14‐3‐30,31‐60,62‐ 37‐22‐39,40‐84,3Pt 11‐4‐12‐3‐30‐60,62‐ 37‐22‐39‐78Pt     M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  S. Werres  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  A. Lacasa  B. J.  Aegerter  M. K.  Hausbeck  M. K.  Hausbeck  ATCC  J. Y. Uchida  J. Y. Uchida  B. McNeil  B. McNeil  Table 4.1 (cont’d)          Annona  reticulata          A2  S  13608  Australia  13609  Australia  A. reticulata  A2  S  13610  Australia  Fatsia japonica  A1  S  13611  Spain  C. annuum  A1  IS  13612  Spain  C. annuum  A1  IS  13613  US, DE  Phaseolus  lunatus  A1  I  13614  US, DE  P. lunatus  A1  S  13615  US, DE  C. annuum  A1  I  13616  US, FL  S. melongena  A1  S  13617  US, FL  C. annuum  A1  S  13618  US, FL  C. annuum  A2  S  13619  US, FL  C. lanatus  A1  S  13620  Italy  C. annuum  A1  S  13621  Italy  C. annuum  A2  S  13622  Italy  C. annuum  A2  S  13623  Italy  C. annuum  A2  S  13624  Italy  C. annuum  A1  S  13626  Italy  C. annuum  A1  S  13628  Italy  C. annuum  A1  S  13632  Italy  C. annuum  A1  S  13633  Italy  C. annuum  A2  S  91     11‐1‐12‐1‐30‐59,75‐ 37‐22‐39‐78Pt 11‐4‐11‐3‐30‐76,77‐ 37‐22‐39‐78Pt 12‐4‐15‐8‐30‐60,78‐ 37‐22‐39‐1,27Pt 1‐1‐1‐1‐2‐9,1‐14,10‐1‐ 1,4‐14 1‐1‐1‐1‐1‐9,1‐14,10‐ 2,1‐1,4‐14 1‐1‐1‐1‐1,2‐2,1‐2,6‐ 2,1‐19,7‐1,52 1‐4‐1‐1‐1,2‐2,1‐37‐ 2,1‐39‐79,89Pt 4‐1‐5‐1‐1‐3,1‐37‐2,1‐ 45,46‐84,3 2‐1‐1‐1‐1‐28,1‐3,11‐2‐ 3,26‐18,17 2‐1‐1‐1‐1‐28,1‐2,4‐1‐ 1‐18,17 2‐1‐1‐1‐1‐8,39‐7,4‐1‐ 4,20‐18,17 2‐1‐1‐1‐1,5‐28,1‐7,4‐ 1‐4,20‐38,3 1‐1‐3‐2‐3,11‐3,1‐13,5‐ 2,3‐8,12‐1,38 1‐1‐1‐2‐2‐4,39‐6,14‐1‐ 8,12‐13,2 1‐1‐1‐2‐12‐10,1‐ 12,29‐2,3‐14,2‐54,11 1‐1‐3‐2‐3,11‐3,1‐13,5‐ 2,11‐8,12‐16 1‐1‐1‐2‐24,12‐3,1‐ 14,10‐2,1‐1,15‐15,5 1‐1‐1‐2‐1,2‐3,1‐13,5‐ 2,1‐8,12‐8 2‐1‐4‐2‐2‐10,1‐5,10‐ 2,2‐1‐8 2‐1‐4‐2‐3,2‐10,1‐5,10‐ 2‐8,12‐15,13 2‐1‐4‐2‐3,11‐3,1‐5,10‐ 12,7‐1,14‐15,13     B. McNeil  B. McNeil  B. McNeil  J. Diaz  J. Diaz  G. Majeau  G. Majeau  G. Majeau  A. J. Gevens  A. J. Gevens  A. J. Gevens  A. J. Gevens  R. B. Kung  R. B. Kung  G. Tamietti  G. Tamietti  G. Tamietti  G. Tamietti  G. Tamietti  G. Tamietti  G. Tamietti  Table 4.1 (cont’d)                  13634  Italy  C. annuum  A1  S  13635  Italy  C. pepo  A1  S  13636  Italy  C. pepo  A1  S  13638  Taiwan  C. annuum  A2  S  13639  Taiwan  C. annuum  A1  S  13640  Taiwan  C. annuum  A1  S  13641  Taiwan  C. annuum  A1  S  13642  Taiwan  C. annuum  A2  S  13643  Taiwan  C. annuum  A2  S  13644  US, CA  C. annuum  A2  S  13645  US, CA  C. annuum  A2  S  13647  US, CA  C. annuum  A2  S  13649  US, CA  C. annuum  A1  S  13650  US, CA  C. annuum  A1  S  13651  US, CA  C. annuum  A1  S  13652  US, CA  C. annuum  A2  S  13653  US, NM  C. annuum  A1  S  13654  Mexico  C. annuum  A2  S  13655  US, FL  C. annuum  A2  IS  13656  US, NM  C. annuum  A2  S  13657  Mexico  C. annuum  A2  S  13658  Italy  C. annuum  A1  S  92     1‐1‐1‐2‐1‐7,1‐5,10‐ 1,3‐1,2‐13,2 1‐1‐3‐2‐3‐8,1‐5,11‐7‐ 15‐13,11 1‐1‐3‐2‐3‐8,1‐1,11‐ 2,1‐15‐9,18 1‐1‐1‐1‐1,17‐8,1‐2,18‐ 3‐1‐1,9 1‐1‐1‐1‐4,5‐10,1‐2,9‐ 2,10‐1,6‐1,27 5‐1‐2‐1‐1‐2,1‐2,1‐2,3‐ 1‐1 1‐1‐1‐1‐1,5‐3,1‐2,9‐ 2,3‐1,6‐1,2 1‐1‐1‐1‐1,17‐1,55‐6,5‐ 3‐1,6‐1,9 1‐1‐1‐1‐6,10‐4,1‐6,5‐ 3‐1,10‐1,9 1‐1‐1‐1‐1‐7,1‐1,8‐1‐1‐ 30,31 1‐1‐3‐1‐1‐7,1‐4,25‐1‐ 3,27‐30,31 1‐1‐1‐1‐1‐31,15‐7,4‐3‐ 1‐18 2‐1‐4‐2‐1‐18,1‐8,3‐1‐ 9,2‐28,24 1‐1‐1‐1‐1‐40,1‐9,19‐1‐ 1,3‐19,26 1‐1‐2‐1‐1‐56,37‐1,19‐ 4,1‐9,28‐30,31 1‐1‐1‐1‐1,2‐10,1‐26,1‐ 2,4‐1,9‐19,25 1‐1‐1‐1‐1‐20,1‐6,1‐8‐ 10,2‐4,2 1‐1‐1‐1‐1‐5,1‐6,1‐2,8‐ 29,2‐57,7 2‐1‐3‐2‐1‐27,12‐15,3‐ 6,1‐8,12‐77,7 4‐1‐5‐1‐2‐24,6‐1‐3‐ 4,21‐58,7 1‐1‐1‐1‐1,4‐40,1‐3‐ 2,1‐1,4‐1,39 2‐1‐3‐2‐3‐16,1‐17,5‐ 2,3‐8,14‐15,13     G. Tamietti  G. Tamietti  G. Tamietti  T. C. Wang  T. C. Wang  T. C. Wang  T. C. Wang  T. C. Wang  T. C. Wang  J. P. Prince  J. P. Prince  J. P. Prince  J. P. Prince  J. P. Prince  J. P. Prince  N. Kabir  N. Kabir  N. Kabir  N. Kabir  N. Kabir  N. Kabir  N. Kabir  Table 4.1 (cont’d)                  13659  Mexico  C. annuum  A2  S  13660  Korea  C. annuum  A1  S  13661  China  C. annuum  A2  S  13662  Thailand  C. annuum  A1  S  13663  US, FL  C. annuum  A1  S  13664  Taiwan  S. melongena  A1  S  13665  Taiwan  C. annuum  A2  S  13666  Taiwan  C. annuum  A1  S  13667  Taiwan  C. annuum  A2  S  13668  Taiwan  S. lycopersicon  A1  S  13669  Taiwan  S. lycopersicon  A2  S  13670  Taiwan  Piper betle  A1  I  13671  Taiwan  P. betle  A2  IS  13672  Taiwan  C. maxima  A1  S  13673  Taiwan  C. maxima  A2  S  13674  US, OH  C. pepo  A1  A  13675  US, OH  C. annuum  A2  S  13676  US, OH  C. annuum  A2  S  13677  US, OH  C. moschata  A2  S  13678  US, OH  C. maxima  A2  S  13689  US, OK  C. lanatus  A1  S  13690  China  C. annuum  A2  S  93     1‐1‐1‐1‐2‐27,1‐30,31‐ 2,1‐2‐22,4 1‐1‐1‐1‐2‐9,1‐21,3‐ 2,3‐1,3‐1 1‐1‐3‐1‐1,4‐17,1‐9,5‐ 2,3‐1,4‐1,26 1‐1‐1‐1‐1,13‐4,1‐ 18,22‐3‐1‐9,1 1‐1‐1‐2‐1,2‐2,1‐23,1‐ 6,11‐2,6‐1,2 1‐1‐1‐1‐1‐3,1‐15,3‐2‐ 6,30‐2 1‐1‐1‐1‐1‐29,6‐2,9‐ 2,3‐1,6‐9,32 1‐1‐1‐1‐1‐20,1‐2,9‐ 2,3‐1,6‐9,32 1‐1‐1‐1‐1‐4,1‐2,9‐2,3‐ 1‐1,9 1‐1‐1‐1‐1,4‐3,12‐2,9‐ 2,3‐1,6‐1 1‐1‐1‐1‐16,3‐4,1‐6,5‐ 1‐1,10‐1 1‐1‐1‐1‐4,2‐3,1‐2,17‐ 5,3‐31,5‐59,10 1‐1‐1‐1‐4,2‐3,1‐2,17‐ 5,3‐5,32‐1,27 1‐3‐1‐3‐1‐3,1‐9,3‐2‐ 1,1‐1,2 1‐1‐1‐1‐1‐10,1‐6,18‐ 2,1‐1,6‐9,60 1‐1‐1‐1‐1,4‐2,1‐1‐2,1‐ 1,3‐1,26 1‐1‐1‐1‐1‐3,1‐1,3‐2,1‐ 1,3‐1 1‐1‐1‐1‐1‐3,1‐1,3‐2,1‐ 1,3‐1,11 1‐1‐1‐1‐1‐3,1‐1,3‐2,1‐ 1,16‐1,27 1‐1‐1‐1‐1‐2,1‐4,3‐9‐ 1,3‐16 1‐1‐1‐1‐1,2‐2,1‐7,4‐9‐ 4,6‐24,61 1‐1‐1‐1‐2‐1,57‐5,3‐1‐ 1,4‐19,2     N. Kabir  N. Kabir  N. Kabir  N. Kabir  N. Kabir  P. J. Ann  P. J. Ann  P. J. Ann  P. J. Ann  P. J. Ann  P. J. Ann  P. J. Ann  P. J. Ann  P. J. Ann  P. J. Ann  S. Miller  S. Miller  S. Miller  S. Miller  S. Miller  J. P.  Damicone  J. Hao  Table 4.1 (cont’d)                  13691  Italy  C. annuum  A1  S  13692  US, NM  C. annuum  A1  S  13693  Uruguay  C. annuum  A2  S  13694  Uruguay  C. annuum  A2  S  13695  Uruguay  C. annuum  A2  S  13696  Japan  Solanum  muricatum  A2  S  13697  Japan  C. lanatus  A2  S  13698  Japan  C. maxima  A2  S  13699  Japan  C. annuum  A2  S  13700  Japan  C. annuum  A2  S  13704  US, NJ  Phaseolus  limensis  A2  S  13705  US, NJ  C. maxima  A2  S  13706  US, NJ  C. maxima  A2  IS  13707  US, NJ  P. limensis  A2  IS  13708  US, NJ  C. maxima  A2  IS  13709  US, NJ  P. lunatus  A2  S  13710  US, NJ  P. lunatus  A2  S  13711  US, NJ  P. lunatus  A1  S  13712  Peru  Capsicum  pubescens  A2  S  13713  Peru  C. pubescens  A2  S  13714  Peru  C. pubescens  A2  S  94     1‐1‐3‐2‐1,25‐4,1‐23,1‐ 7,13‐8,4‐16,62 1‐1‐10‐1‐1,2‐38,1‐2‐ 2,1‐1,33‐32,63 1‐1‐1‐1‐1,2‐5,1‐6,1‐ 7,3‐1,17‐19,13 1‐1‐1‐1‐1,13‐5,1‐6,1‐ 7,3‐1,17‐19,13 1‐1‐1‐1‐1,2‐5,1‐6,5‐ 7,3‐1,17‐64,8 5‐1‐2‐1‐1,2‐9,1‐2,6‐ 2,1‐1‐8 5‐1‐2‐1‐1,2‐7,1‐2,6‐ 2,1‐10‐8 5‐1‐2‐1‐1,2‐11,58‐2,5‐ 2,3‐1‐1,29 1‐1‐1‐1‐1,2‐11,12‐6,5‐ 10,3‐3,9‐6,33 1‐1‐1‐1‐1,2‐11,12‐6,5‐ 10,3‐34,9‐6,33 1‐1‐1‐1‐1,2‐41,4‐6,1‐ 2,6‐2‐40,41 1‐1‐1‐5‐1,2‐41,4‐6,1‐ 2,6‐2‐40,41 1‐1‐1‐1‐1,2‐3,1‐7,4‐1‐ 1,3‐3,34 1‐1‐1‐1‐1,2‐3,1‐7,4‐1‐ 1,3‐3,34 1‐1‐1‐1‐26,2‐3,1‐7,4‐ 1‐1,3‐3,34 1‐1‐6‐1‐2‐5,1‐1,3‐2,1‐ 1‐65,66 1‐1‐1‐1‐1,4‐2,54‐1‐2‐ 1,18‐1,67 1‐1‐1‐1‐4,2‐18,1‐3,11‐ 2,4‐18,3‐1 1‐1‐1‐1‐1,4‐22,1‐12,1‐ 2‐4,2‐20 1‐1‐1‐1‐1,4‐22,1‐12,1‐ 2‐4,2‐20 1‐1‐1‐1‐1,4‐22,1‐12,1‐ 2‐4,2‐20     ATCC  ATCC  R. Bernal  R. Bernal  R. Bernal  S. Uemtsu  S. Uemtsu  S. Uemtsu  S. Uemtsu  S. Uemtsu  N. Gregory  N. Gregory  N. Gregory  N. Gregory  N. Gregory  N. Gregory  N. Gregory  N. Gregory  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  K. H.  Lamour  a Geographical origin. US: United States, AR: Arizona, CA: California, DE: Delaware, FL:  Florida, GA: Georgia, HI: Hawaii, KY: Kentucky, LA: Louisiana, MA: Massachusetts, MI:  Michigan, NJ: New Jersey, NM: New Mexico, NY: New York, NC: North Carolina, OH: Ohio,  OK: Oklahoma, SC: South Carolina, TN: Tennessee, TX: Texas.  b Mating type (A1 or A2) of an isolate.  c I: insensitive, IS: intermediately insensitive, S: sensitive.  d Each number represents the haplotype number for both alleles per gene in the following  order: Cox1‐Cox2‐Nad1‐Nad5‐βTub‐EF1A‐Enolase‐HSP90‐TigA‐Ura3. Genotype phase is  unknown.  All isolates are P. capsici SS unless otherwise indicated.  Pt, P. tropicalis and c11,  cluster 11.    DNA extraction.  Contents of UCV8B‐centrifuge tubes with actively growing mycelia  were vacuum‐filtered through one layer of Whatman grade 1 filter paper.  Tissue remaining  on the filter paper was transferred to a mortar using a toothpick, and ground with a pestle  in liquid nitrogen.  All implements were previously sterilized.  Genomic DNA was extracted  from approximately 1 g of ground tissue using the DNeasy Plant Minikit (Qiagen, Valencia,  CA) according to the manufacturer’s instructions.  DNA was quantified using the NanoDrop  ND 1000 spectrophotometer and NanoDrop 2.4.7c software (NanoDrop Technologies Inc.,  Wilmington, DE).  DNA integrity was analyzed by electrophoresis in 2% (w/v) agarose gel  in 0.5X Tris‐borate‐EDTA buffer (67), stained with ethidium bromide (5 µg/ml) for  visualization.  Primer design, DNA amplification and sequencing. Genomic regions to be used  as a source of single nucleotide polymorphism (SNP) markers in P. capsici were identified  in GenBank (Table 4.2). Selected regions were previously used in oomycete coalescence,  genetic diversity and phylogenetic studies (10, 19, 38, 76).  P. capsici sequences from  GenBank were input into Primer3 (91) for primer design using default settings.  Four  regions of the mitochondrial genome (Cox 1, Cox 2, Nad 1, and Nad 5) and six nuclear genes  95 (β‐Tubulin, EF‐1α, Enolase, HSP90, Tig A, and Ura 3) were amplified by polymerase chain  reaction (PCR).  PCR was performed in a total volume of 25 µl and contained 1ul 5 ng/µl  DNA, 5 µl 5X PCR reaction buffer (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1.25 µl 25 µM MgCl2  (Invitrogen), 0.5 µl 10 µM dNTP mix (Invitrogen), 1 µl each 10 µM primer (MSU  Macromolecular Structure Facility, East Lansing, MI), 0.7 µl Platinum Taq DNA polymerase  (Invitrogen), and 14.6 µl sterile water.  The PCR was performed in a programmable  Eppendorf mastercycler ep systems thermal cycler (Eppendorf, Westbury, NY) starting  with 3 min denaturation at 94°C, followed by 45 cycles at 94°C for 30 s, annealing at 56°C  for 30 s, and extension at 72°C for 60 s, with a final extension step of 10 min at 72°C.  PCR  products were analyzed by electrophoresis in 2% (w/v) agarose gel in 0.5X Tris‐borate‐ EDTA buffer (67), stained with ethidium bromide (5 µg/ml) for visualization and compared  to a 100 bp ladder (Invitrogen).  Controls with no P. capsici DNA were included.    PCR products were purified using ExoSAP‐IT (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA)  following the manufacturer’s instructions.  Cycle sequencing reactions (1 µl purified PCR  product, 3 µl primer, 8 µl sterile water) were done twice directly from the clean PCR  products at the Michigan State University Research Technology Support Facility (East  Lansing, MI) using the ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystem, Foster City,  CA).  A subset of samples with heterozygote positions (40%) determined from sequence  analysis were resolved into haplotypes by cloning the corresponding PCR product using the  pGEM‐T Easy Vector System (Promega, San Luis Obispo, CA) and Subcloning Efficiency  DH5α Competent Cells (Invitrogen) following the manufacturer’s instructions.  Cloned PCR  products were purified using the QIAquick PCR purification kit (Qiagen) following the  96 manufacturer’s instructions, and amplified and sequenced as described above.  Obtained  haplotypes were confirmed by using PHASE (96) as implemented in DnaSPv5 (64) by  running simulations with 5,000 iterations.  In all cases the inferred haplotype with cloning  and direct sequencing data matched the haplotypes obtained using PHASE.  Haplotypes of  remaining samples with heterozygote positions were inferred with PHASE.  97 Table 4.2.  Mitochondrial and nuclear genes analyzed in P. capsici SS and SL.    Product  Sequence  Primer  Primer sequence  (bp)  (bp)  Cox1‐F  5’GGTGCACCTGATATGGCTTT3’  425  355  Cox1‐R  5’ACAGGATCACCTCCACCTGA3’      Cox2‐F   5’CCAGCAACTCCTGTAATGGAA3’  540  365  Cox2‐R  5’TTGATTTAAACGGCCAGGAC3’      5’CAAAGAAGAAGAGGACCTAATGTTG3 Nad1‐F  579  430  ’  Nad2‐R  5’TAATGCAAAACCCATTGCAG3’      Nad5‐F  5’GCTATGGAAGGTCCTACACCA3’  341  245  Nad5‐R  5’GCATGGATTACTGCACCTGA3’      β‐Tub‐F  5’GGTCAGTGCGGTAACCAGAT3’  597  505  β‐Tub‐R  5’ GTACAGGGCCTCGTTATCCA3’      EF‐1α‐F  5’GACATTGCCCTGTGGAAGTT3’  568  450  EF‐1α‐R  5’CAGGCTTGATGACACCAGTC3’      Enolase‐F  5’CGTGAAGAACGTGAACGAGA3’  647  435  Enolase‐R  5’CCGAGATCTTCTCCGACTCC3’      HSP90‐F  5’GCCGATCTCATCAACAACCT3’  542  465  HSP90‐R  5’CTTCTGCGAGTTCAGGTGGT3’      TigA‐F  5’TCAACACTGCCAAAATTCCA3’  516  420  TigA‐R  5’CAGCGTCAGAGGAGACCTTC3’      Ura3‐F  5’GGCTTTCGACCAGCTGAAT3’  570  500  Ura3‐R  5’AGCGTGAAGTCACCGAACTT3’        Source  AY129166.1    DQ365739.1    DQ361203    AY423326.1    EF495258.1    EU079545.1    EU080622.1    EU079547.1    EU080625.1    EF617399.1      Sequence analysis.  Manual editing of base calls and sequence alignment were  performed using Lasergene SeqMan Pro version 8.0 (DNASTAR Inc., Madison, WI).  The  alignment was exported as a FASTA file and imported into MacClade (66) to produce a  NEXUS file required for subsequent analyses.  The two haplotypes within sequences  containing heterozygote sites were inferred by haplotype subtraction (38) according to  data from direct and cloned‐PCR product sequencing or by using PHASE as described  above.  Sequences from mitochondrial and nuclear loci were analyzed individually and  collapsed into unique haplotypes using DnaSPv5.  Haplotypes found for each gene were  98 deposited in GenBank under accession numbers HQ388837 to HQ389193.  Haplotype  sequences were compared to sequence data publicly available by using nucleotide BLAST  (1, 2) to determine that data corresponded to the P. capsici target genes.  BLAST analyses  indicated that some P. capsici isolates corresponded to P. tropicalis and to another group of  isolates with some genes showing high similarity to P. capsici and others to P. tropicalis.   These isolates are referred to in this paper as intermediate.  Two separate data sets were  created for subsequent analysis to account for the presence of isolates that did not have  high genetic similarity to P. capsici in all sequenced genes, P. capsici sensu stricto (SS),  which included isolates with all gene sequences having high similarity to only P. capsici,  and P. capsici sensu lato (SL), which included all isolates. Base substitutions in SS were  classified as phylogenetically informative or uninformative, transitions or transversions,  and synonymous or non‐synonymous substitutions using DnaSPv5.  DNA sequence variability, neutrality tests, recombination and genealogies.   Polymorphism, neutrality and recombination analyses were performed for each gene and  all SS isolates using the program DnaSPv5.  Polymorphism estimates were also calculated  for SS isolates grouped in geographic (hemisphere, continent, country, U.S. state, and U.S. or  not), host (vegetable crop or not, host family, and host species), mefenoxam resistance and  mating type categories.  Polymorphism analysis was also performed for SL isolates grouped  in a species (P. capsici or not) category.  Previous work used five individuals as the  minimum needed for population genetics studies in Phytophthora ramorum (40).  We chose  to include only categories with at least eight individuals in SS for analyses.  Sequence  diversity estimates and statistics including the number of polymorphisms (s) and  haplotypes (h), haplotype diversity (Hd) (71), Tajima's π (99), the average number of  99 pairwise nucleotide differences (k) (99), and Watterson's theta (θw) per sequence (111)  were calculated.  Sequence variation in each gene for all SS isolates was tested for  deviations from neutrality by using Fu and Li's D and F, and Tajima's D (31, 100).  The  recombination parameter (R) per gene (47), and minimum number of recombination  events (RM) (48) were also estimated for each gene and all SS isolates.  The split network  method implemented in SplitsTree v. 4b06 (50) was used to visualize incompatibilities in  SL haplotypes by generating a NeighborNet network based on uncorrected P distances.   Network support was assessed by running 10,000 bootstrap replicates.  Statistical‐ parsimony genealogies for haplotypes in SL were generated using TCS v. 1.13 (16).    Population subdivision analysis.  Population subdivision was assessed with the  model‐based Bayesian clustering algorithm implemented in Structure 2.3X (82).  The  values for burnin, chain replication and lambda were set at 300,000, 100,000 and 1,  respectively, based on results obtained in preliminary analyses.  The optimal number of  populations (K) was determined by comparing posterior distribution likelihoods among  three independent runs of K=1 to K=40 using the established parameters.  Data included all  loci individually coded as haplotypes and were analyzed under the admixture model with  correlated allele frequencies and without previous population information.  Population  structure figures with prior population information, obtained from the defined geographic,  host, mefenoxam sensitivity and mating type categories for SS, and species category for SL  and sorted by Q, were generated using the Population Sorting Tool (PST) a graphic editing  program created in R (85) to visualize the distribution of clusters in predefined categories  (J. J. Morrice, unpublished data).  Genetic differentiation indexes (FST) were calculated for  SS data grouped by geographic, host, mefenoxam sensitivity and mating type categories;  100 and for SL for a species category using DnaSPv5.  Statistical significance was determined  for each index by running 5,000 permutations (α=0.05).    Results    Haplotype sequences were compared to publicly available P. capsici sequences in  Genbank through BLAST (data not shown) and several isolates that were not as similar as  expected to P. capsici were found.  Some isolates showed higher similarity to P. tropicalis  than to P. capsici across all genes analyzed.  Interestingly, other isolates showed higher  similarity to P. tropicalis than to P. capsici in some genes, but had higher similarity to P.  capsici than to P. tropicalis in others (intermediate genotypes).  P. tropicalis and  intermediate isolates were included in the SL data set and excluded from SS for further  analyses.   All genes were polymorphic but nuclear genes were more variable than  mitochondrial genes as indicated by polymorphism analysis (Table 4.3) and diversity  estimates (Table 4.4). The total number of polymorphisms detected for all SS genes was  120.  In general, all nuclear genes presented medium to high values of R and RM.  Fu and  Li’s D and F indicated a significant deviation from neutrality in Nad5, and Fu and Li’s D  showed a deviation in TigA (Table 4.4).  Unique haplotypes occurred in all genes and their  frequency range was between 20 (Nad1) and 40% (TigA) (data not shown).    101 Table 4.3.  Polymorphism types for analyzed mitochondrial and nuclear genes in P. capsici  SS.    Target DNA  PIa  Sb  NSc  TSd  TVe  Sites with three variantsf  Mitochondrial              Cox1  2  4  0  2  1  1  Cox2  0  0  1  0  1  0  Nad1  3  7  0  6  1  0  Nad5  0  5  1  6  0  0  Subtotal  5  16  2  14  3  1  Nuclear              β‐Tubulin  8  9  1  9  1  0  EF‐1α  17  16  3  16  3  0  Enolase  12  11  2  11  2  0  HSP90  8  7  5  8  4  0  TigA  15  17  1  16  2  0  Ura3  26  22  7  23  6  0  Subtotal  86  82  19  83  18  0  Total  91  98  21  97  21  1  a PI, parsimony informative sites  b S, synonymous changes  c NS, replacement changes  d TS, transitions  e TV, transversions  f Polymorphisms not following the infinite‐sites model.  102 Table 4.4.  Diversity estimates, neutrality tests and recombination for mitochondrial and  nuclear genes analyzed in P. capsici SS.    Recombination    Diversity estimatesa  Neutralityc  estimatesb  Target  T  D  F  π  θw  s (%)  h  Hd  k  R  RM  DNA  Mitochondrial                      Cox1  4 (1)  7  0.23  0  0.83  0.38  0  0  ‐1.02  0.96  0.34  2  Cox2  3  0.07  0  0.33  0.07  0  0  ‐1.03  ‐1.26  ‐1.4  (0.5)  7  Nad1  9  0.33  0  1.16  0.64  0  0  ‐0.93  ‐0.81  ‐1.01  (1.6)  6  Nad5  4  0.18  0  0.99  0.20  0  0  ‐1.58  ‐4.22*  ‐3.94*  (2.4)  Nuclear                        B‐ 10 (2)  27  0.68  0  1.48  2.67  1.3  5  1.69  0.41  1.08  Tubulin  19  EF1A  56  0.82  0  2.82  3.10  14.4  7  0.24  ‐0.49  0.47  (4.2)  Enolase  13 (3)  35  0.91  0  1.93  2.46  43.1  6  0.6  1.42  1.35  12  HSP90  19  0.73  0  1.78  1.28  16.2  4  ‐0.06  1.37  0.74  (2.6)  18  TigA  36  0.81  0  2.67  2.89  25.5  6  0.19  1.64*  1.28  (4.3)  29  Ura3  77  0.90  0.01  4.31  5.22  18  13  0.55  1.52  1.34  (5.8)  a s: number of polymorphisms, h: number of haplotypes, Hd: haplotype diversity, π:  nucleotide diversity, θw: Watterson’s theta estimator per gene from sequence, k: average  number of nucleotide differences.  b R: recombination parameter, RM: minimum number of recombination events.  c T, Tajima’s D.  D, Fu and Li’s D.  F, Fu and Li’s F.  *, significant at 0.05.    The SS structure analysis detected significant population structure by host,  geography and mefenoxam sensitivity where some clusters occurred more frequently in  some categories than others.  However, the analysis showed no direct correspondence  between groupings of P. capsici isolates in the predefined categories (host, geography,  mating type and mefenoxam sensitivity), and inferred genetic clusters.  High likelihoods in  103 SS were observed when the number of clusters was set to nine (K=9, lnP= ‐5926; K=8, lnP=  ‐6001; K=10, lnP= ‐6028) (Figure 4.1F). Individual ancestry coefficients were highly  consistent across replicate runs.  The bar plots indicated that some isolates are highly  admixed, while others belong mostly to one particular cluster.  Isolates belonging to  clusters one and seven presented fewer admixtures than individuals from other clusters.   The type culture of P. capsici from New Mexico (year 1727) had membership  predominantly in cluster three and partial membership in clusters four and eight, which  was similar to cluster membership for current New Mexico samples.  The type culture from  Italy (year 1927) had membership mostly in cluster six and partial membership in clusters  two and four, which was similar to cluster membership for current Italy samples.                            104 Figure 4.1.  Genetic structure of P. capsici SS with isolates grouped by the following  predefined categories: host (A host type, B host family, C host species), mefenoxam  sensitivity (D), mating type (E) and of P. capsici SL by species (F).  Each isolate is  represented by a thin bar, often partitioned into colored segments each representing the  individual’s proportionate genetic membership in a given Kth cluster.  Cluster colors are  indicated in (F) and correspond to: dark red‐one, purple‐two, yellow‐three, light green‐ four, dark blue‐five, aqua‐six, dark green‐seven, light blue‐eight, pink‐nine, gray‐ten, pink‐ eleven.   105 Population structure was detected when the data was analyzed using the host  categories as prior population information (Figure 4.1A‐C).  Isolates from vegetable hosts  contained representatives from all clusters, but genotypes belonging to cluster one  occurred more frequently in non‐vegetable than in vegetable hosts (Figure 4.1A). FST  estimates indicated moderate differentiation between isolates from vegetable and non‐ vegetable hosts (Table 4.5).  Diversity estimates for isolates from non‐vegetable hosts were  higher than from vegetable hosts (Table 4.6).  Cucurbitaceous hosts presented individuals  from all clusters, except for cluster two that was only sampled from solanaceous hosts  (Figure 4.1B) and was mostly associated to C. annuum, C. pubescens and S. lycopersicon  (Figure 4.1C).  Solanaceous hosts presented members from all clusters.  The Fabaceae had  genotypes from clusters four, five, seven and eight. FST values indicated low differentiation  among isolates from hosts in the Fabaceae, Cucurbitaceae and Solanaceae (Table 4.5). The  highest and lowest diversity estimates of isolates grouped by host family were observed for  isolates from the Solanaceae and Cucurbitaceae, respectively (Table 4.6).  The pattern of  cluster occurrence among cucurbit species was more similar than among solanaceous  species.  C. annuum contained members from all clusters except for clusters one and seven,  while S. melongena included several isolates belonging mostly to cluster seven.  FST  estimates detected low differentiation among isolates from cucurbitaceous species, but  moderate to high differentiation between isolates from cucurbitaceous and solanaceous  species and among isolates from solanaceous species (Table 4.5).  The highest and lowest  diversity estimates of isolates grouped by host species were observed for isolates from C.  annuum and C. sativus, respectively (Table 4.6).  106 Table 4.5.  Minimum, average and maximum genetic differentiation estimates of  mitochondrial and nuclear genes for P. capsici SL and SS with isolates grouped in  predefined host categories.    Category          Fsta  Host Type  Vegetable    Non‐ 0,0    vegetable    0.12*,0.18*      0.47*,0.36*    Host  Cucurbitaceae  Fabaceae  Family  Fabaceae  0,0      0.01,0.03      0.02,0.09*    Solanaceae  0,0  0,0    0.02,0.04  0.04,0.03    0.04,0.09*  0.08*,0.06*  Host  C. annuum  C. maxima  Species  C. maxima  0,0      0.05*,0.03      0.08*,0.06*    C. moschata  0,0  0,0    0.1*,0.04  0.02,0.02    0.17*,0.09*  0.08*,0.07*  C. pepo  0,0  0,0    0.06*,0.05*  0,0.03    0.09*,0.14*  0.01,0.09*  C. sativus  0,0  0,0    0.1*,0.08*  0,0.05*    0.17*,0.2*  0,0.15*  S.  0,0.02  0,0  lycopersicon    0.1*,0.05*  0,0.1*    0.17*,0.1*  0,0.26*  S.  0,0.01  0,0.01  melongena    0.08*,0.15*  0,0.18*    0.17*,0.32*  0,0.37*                                                                    C.  C. pepo  moschata                          0,0    0.03,0.02    0.09*,0.05*    0,0  0,0  0.03,0.03  0.02,0.03  0.11*,0.06*  0.03,0.07*  0,0  0,0                          C.  S.  sativus  lycopersicon                                                  0,0    0.03,0.14*  0.02,0.13*  0,0.17*  0.11*,0.33*  0.03,0.37*  0,0.44*  0,0.08*  0,0.06*  0,0.12*      0,0.05*  0.03,0.2*  0.02,0.19*  0,0.28*  0.11*,0.49*  0.03,0.39*  0,0.56*  0,0.22*  0,0.59*  a The reported values correspond to minimum, average (in bold), and maximum values for  mitochondrial (before comma) and nuclear genes (after comma). *, significant at 0.05.      107 Table 4.6. Minimum, average and maximum diversity estimates of mitochondrial and  nuclear genes for P. capsici SL and SS with isolates grouped in predefined host categories.     Category  Isolates  Diversity estimatesa  π    Hd    θw    k      SL  SS        M  N  M  N  M  N  M  N  Host Type                      Vegetable  226  224  0  0.67  0  0  0.17  1.5  0  1.16        0.16  0.8  0  0  0.79  2.4  0.27  2.88        0.28  0.91  0  0.01  1.17  4.19  0.56  5.24  Non‐vegetable  29  12  0  0.5  0  0  0.33  1.34  0  2.1        0.34  0.72  0  0  0.77  2.5  0.5  2.88        0.68  0.88  0  0  1.32  4.02  0.95  3.98  Host Family                      Cucurbitaceae  87  87  0.02  0.5  0  0  0  0  0.02  0.79        0.12  0.72  0  0  0  0  0.19  2.56        0.22  0.88  0  0.01  0  0  0.37  4.85  Fabaceae  13  12  0  0.59  0  0  0  0  0  0.89        0.12  0.76  0  0  0  0  0.16  2.76        0.382  0.88  0  0.01  0  0  0.5  5.23  Solanaceae  126  125  0  0.76  0  0  0  0  0  1.39        0.19  0.83  0  0  0  0  0.33  3.03        0.33  0.93  0  0.01  0  0  0.68  5.42  Host Species                      C. annuum  97  96  0  0.76  0  0  0.19  1.37  0  1.44        0.23  0.84  0  0  0.71  2.28  0.39  3.09        0.39  0.95  0  0.01  0.97  3.94  0.83  5.75  C. maxima  22  22  0.09  0.56  0  0  0.27  1.38  0.09  0.98        0.09  0.73  0  0  0.62  2.34  0.21  2.7        0.09  0.88  0  0.01  1.1  3.91  0.36  5.12  C. moschata  10  10  0  0.51  0  0  0.35  0.28  0  0.51        0.09  0.74  0  0  0.35  2.39  0.09  2.86        0.35  0.95  0  0.01  0.35  5.64  0.36  6.79  C. pepo  32  32  0  0.47  0  0  0.25  0.85  0  0.66        0.06  0.66  0  0  0.25  2.08  0.06  2.22        0.12  0.8  0  0  0.25  3.38  0.12  3.67  C. sativus  12  12  0  0.37  0  0  0  0.54  0  0.55        0  0.66  0  0  0  1.74  0  2.17        0  0.85  0  0  0  3.48  0  4.17  S. lycopersicon  12  12  0  0.59  0  0  0  0.54  0  0.99        0  0.74  0  0  0  2.05  0  2.57        0  0.83  0  0  0  3.75  0  3.75  S. melongena  13  13  0  0.53  0  0  0.64  0.52  0  0.58        0.04  0.66  0  0  0.64  2.01  0.08  2.07        0.15  0.75  0  0  0.64  3.67  0.31  3.28  108 a The reported values correspond to minimum, average (in bold), and maximum value for  diversity estimates in nuclear and mitochondrial genes.  N: nuclear, M: mitochondrial.    When geography categories were used as prior population information in the  cluster analysis, some population structure was revealed (Figure 4.2A‐E). Isolates from the  Northern hemisphere were represented in all clusters while isolates from the Southern  hemisphere contained less cluster diversity (Figure 4.2A).  FST estimates indicated  moderate differentiation between isolates from the Northern and Southern hemispheres  (Table 4.7).  Diversity estimates for isolates from the Northern hemisphere were higher  than those obtained for isolates from the Southern hemisphere (Table 4.8).  North America  contained genotypes from all clusters and isolates belonging to cluster five were only found  in this continent (Figure 4.2B).  The U.S. contained isolates from all clusters, except for  cluster one, which was associated with Guatemala and Mexico (Figure 4.2D).   Mexico  presented isolates from clusters four and eight in addition to those from cluster one.   Isolates belonging to cluster two were present only in North and South America.  South  America only presented individuals from clusters two (Chile and Peru), four (Uruguay), and  eight (Brazil).  Individuals from cluster six were primarily sampled in Europe.  Europe  presented isolates from clusters four (Yugoslavia), six (France and Italy), eight (Norway  and Spain) and nine (Italy).  Members from cluster three were only found in North America  and Asia, and both continents had the highest diversity of cluster occurrence.  Isolates from  Asia were present in clusters one (Japan and Taiwan), three (Taiwan, Thailand, and  Indonesia), four (Japan and Taiwan), seven (Taiwan) and eight (China).    109 Figure 4.2.  Genetic structure of P. capsici SS with isolates grouped by predefined  geographic (A hemisphere, B continent, C country group, D country, E U.S. state) categories.   Geographic origin abbreviations correspond to U.S.: United States, CA: California, MI:  Michigan, NJ: New Jersey, NY: New York, SC: South Carolina, TN: Tennessee.  Each isolate is  represented by a thin bar, often partitioned into colored segments each representing the  individual’s proportionate genetic membership in a given Kth cluster.  Cluster colors are  indicated in Figure1F.    110 High genetic differentiation was detected between isolates from Europe and from all  other continents according to FST values (Table 4.7).  Moderate to high genetic  differentiation occurred among isolates from North America, South America and Asia.  The  highest and lowest diversity estimates of isolates grouped by continent were observed in  Europe and South America, respectively (Table 4.8).  FST values showed high genetic  differentiation between isolates from Italy and from all other countries and between  isolates from Mexico and Taiwan (Table 4.7).  Moderate differentiation was observed  between isolates from the U.S and Mexico and isolates from the U.S. and Taiwan (Table 4.7).   When isolates were grouped by country, isolates from Italy and Taiwan showed the highest  and lowest diversity estimates, respectively (Table 4.8).   Genotypes from clusters five, seven and nine were mostly sampled in the U.S., while  isolates from clusters one and six were primarily found outside the U.S. (non‐U.S.) (Figure  4.2C). FST estimates indicated moderate differentiation between isolates from the U.S. and  non‐U.S. regions (Table 4.7).  Diversity estimates for non‐U.S. isolates were higher than  those obtained for U.S. isolates (Table 4.8).  Michigan, North Carolina, New York and Ohio;  Arizona, New Mexico and Texas; and California and Georgia presented similar patterns of  cluster occurrence (Figure 4.2E). California, South Carolina and New Jersey presented more  diversity of cluster occurrence than other states.  Isolates from California showed high  differentiation with isolates from New York and moderate differentiation with isolates  from New Jersey and South Carolina according to FST values (Table 4.7).  New Jersey  isolates presented low genetic differentiation with isolates from New York and South  Carolina (Table 4.7).  Michigan and Massachusetts contained a high number of isolates  111 from cluster three compared to other states.  Tennessee only had isolates from cluster  seven.  FST estimates indicated moderate to high differentiation between isolates from  Michigan and from all other states and isolates from Tennessee and from all other states  (Table 4.7).  The highest and lowest diversity estimates of isolates grouped by U.S. state  were observed in New Jersey and Tennessee, respectively (Table 4.8).  South Carolina was  the only state with members from cluster two, which was also found in South America.  FST  values detected moderate to high differentiation between isolates from South Carolina and  New York and low differentiation between isolates from South Carolina and New Jersey  (Table 4.7).  Genotypes from cluster six that were mostly sampled in Europe were also  found within the U.S. in California, Hawaii and Florida.  Individuals from clusters three  (California, Massachusetts, Michigan, North Carolina, New Mexico, and Ohio), five (Florida,  Michigan, North Carolina, New Jersey, New York, Ohio, Oklahoma and South Carolina), eight  (California, Georgia, Kentucky, Massachusetts, New Jersey and South Carolina) and four  (Arizona, Kentucky, North Carolina, New Jersey, New Mexico, New York, South Carolina and  Texas) were sampled across multiple states.  Isolates from cluster nine were found in states  south of Kentucky (California, Georgia, and Texas).  Individuals from cluster five were  mostly detected in states east of Texas and isolates from cluster seven were found in states  east of Arizona and north of Georgia (Michigan, New York, Ohio, and Tennessee).     112 Table 4.7.  Minimum, average and maximum genetic differentiation estimates of  mitochondrial and nuclear genes for P. capsici SL and SS with isolates grouped in  predefined geographic categories.            Categorya  Fstb  Hemisphere  Northern          Southern  0,0.01            0.04,0.05*            0.07*,0.1*          Continent  Asia  Europe  North America      Europe  0,0            0.16*,0.11*            0.48*,0.24*          North America  0,0  0,0          0.02,0.04  0.19*,0.09*          0.05*,0.13*  0.54*,0.17*        South America  0,0  0,0.01  0,0.01        0.07*,0.13*  0.27*,0.13*  0.03,0.08*        0.16*,0.25*  0.59*,0.21*  0.07*,0.15*      Country  Italy  Mexico  Taiwan      Mexico  0,0.01            0.3*,0.11*            1*,0.23*          Taiwan  0,0  0,0          0.32*,0.16*  0.03,0.15*          0.8*,0.3*  0.12*,0.26*        U.S.  0,0  0,0  0,0        0.34*,0.12*  0.04,0.09*  0,0.08*        0.97*,0.3*  0.1*,0.2*  0.01,0.17*      Country group  U.S.          Non‐U.S.  0,0            0.06*,0.04            0.12*,0.08*          U.S. State  CA  MI  NJ  NY  SC  MI  0,0.06*            0,0.17*            0,0.4*          NJ  0,0  0,0          0.01,0.08*  0.01,0.16*          0.03,0.17*  0.02,0.35*        NY  0,0  0,0.12*  0,0.02        0.03,0.13*  0.02,0.29*  0,0.1*        0.1*,0.26*  0.05*,0.47*  0,0.22*      SC  0,0.02  0,0.05*  0,0  0,0.03      0.02,0.11*  0.01,0.19*  0,0.06*  0.01,0.15*    113 Table 4.7 (cont’d)            0.09*,0.23*  0.05*,0.32*  TN  0,0.06*  0,0    0.03,0.31*  0.02,0.21*    0.1*,0.73*  0.05*,0.4*      0.01,0.11*  0,0  0,0.2*  0,0.51*      0.04,0.39*  0,0.15*  0,0.39*  0,0.86*        0,0  0.01,0.24*  0.04,0.5*  a Geographic origin, U.S.: United States, CA: California, MI: Michigan, NJ: New Jersey, NY:  New York, SC: South Carolina, TN: Tennessee.   b The reported values correspond to minimum, average (in bold), and maximum values for  mitochondrial (before comma) and nuclear genes (after comma). *, significant at 0.05.    Table 4.8.  Minimum, average and maximum diversity estimates of mitochondrial and  nuclear genes for P. capsici SL and SS with isolates grouped in predefined geographic  categories.     Isolates  Categorya  Diversity estimatesb  π    Hd    θw    k      SL  SS        M  N  M  N  M  N  M  N  Hemisphere                      Northern  235  224  0  0.68  0  0  0.17  1.5  0  1.29        0.19  0.81  0  0  0.79  2.5  0.32  2.94        0.34  0.91  0  0.01  1.17  4.19  0.66  5.18  Southern  20  12  0  0.59  0  0  0.33  1.07  0  1.07        0.08  0.76  0  0  0.33  2.1  0.08  2.65        0.17  0.91  0  0.01  0.33  4.28  0.17  4.83  Continent                      Asia  28  27  0.07  0.67  0  0  0.256  1.32  0.07  1.41        0.21  0.77  0  0  0.65  2.45  0.4  2.66        0.38  0.84  0  0  1.04  4.83  0.62  3.6  Europe  28  28  0  0.74  0  0  0.26  1.52  0  1.52        0.36  0.83  0  0  0.51  2.32  0.6  2.88        0.63  0.95  0  0.01  0.77  3.92  1.29  4.84  North America  178  168  0  0.63  0  0  0.35  1.41  0  1.1        0.12  0.78  0  0  0.76  2.42  0.22  2.84        0.26  0.89  0  0.01  1.23  3.91  0.54  5.25  South America  13  10  0  0.49  0  0  0  0.85  0  1.07        0  0.74  0  0  0  1.97  0  2.57        0  0.88  0  0  0  4.23  0  4.7  Country                      Italy  14  14  0  0.75  0  0  0.63  1.28  0  1.49        0.28  0.83  0  0  0.78  2.36  0.52  2.73        0.69  0.91  0  0  0.94  3.85  1.22  4.03  Mexico  13  10  0  0.63  0  0  0.35  1.69  0  2.1        0.21  0.76  0  0  0.53  2.3  0.32  3.14  114 Table 4.8 (cont’d)      Taiwan      U.S.      Country group  U.S.      Non‐U.S.      U.S. State  CA      MI      NJ      NY      SC      TN          16      164        164      91        21      35      8      15      24      12            16      157        157      79        21      34      8      15      24      12          0.47  0.12  0.12  0.12  0  0.11  0.21    0  0.11  0.21  0.02  0.32  0.52    0  0.16  0.35  0  0.08  0.22  0  0.12  0.25  0  0  0  0  0.06  0.16  0  0  0      0.85  0.67  0.73  0.84  0.61  0.77  0.89    0.61  0.77  0.89  0.76  0.85  0.95    0.54  0.73  0.87  0.33  0.59  0.8  0.69  0.79  0.91  0.55  0.67  0.77  0.55  0.78  0.94  0  0.26  0.52      0  0  0  0  0  0  0    0  0  0  0  0  0    0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0      0.01  0  0  0  0  0  0.01    0  0  0.01  0  0  0.01    0  0  0  0  0  0  0  0  0.01  0  0  0  0  0  0.01  0  0  0      0.71  0.3  0.68  1.21  0.35  0.71  1.24    0.35  0.71  1.24  0.2  0.71  1.01    0.28  0.56  0.83  0.49  0.73  0.98  0.38  0.58  0.77  0  0  0  0.27  0.4  0.54  0  0  0      3.66  1.49  1.78  1.99  1.42  2.34  3.95    1.42  2.34  3.95  1.6  2.51  4.43    0.7  2.01  3.25  0.42  1.6  2.5  0.9  2.36  4.82  1.01  1.85  4.04  0.67  2.21  4.28  0.27  0.71  1.34      0.93  0.12  0.28  0.5  0  0.19  0.42    0  0.19  0.42  0.02  0.5  0.97    0  0.24  0.6  0  0.17  0.5  0  0.19  0.5  0  0  0  0  0.08  0.17  0  0  0      5.07  1.5  2.16  2.71  1.03  2.77  5.2    1.03  2.77  5.2  1.73  3.12  5.06    0.99  2.65  3.96  0.34  1.96  4.24  1.08  2.93  5.8  0.76  2.14  3.5  0.64  3.17  7.3  0  0.7  2.61  a For geographic origin coding refer to table 5.  b The reported values correspond to minimum, average (in bold), and maximum value for  diversity estimates in nuclear and mitochondrial genes.  N: nuclear, M: mitochondrial.    Some structure was identified in isolates intermediately sensitive and insensitive to  mefenoxam (Figure 4.1D).  The category sensitive to mefenoxam contained individuals  from all clusters.  The categories insensitive to mefenoxam and intermediately sensitive to  115 mefenoxam did not contain isolates from cluster nine.  FST values showed low to moderate  genetic differentiation between sensitive and intermediately sensitive isolates and  sensitive and insensitive isolates (Table 4.9).  Genetic differentiation was very low between  insensitive and intermediately sensitive isolate (Table 4.9).  The highest diversity estimates  were found for isolates sensitive to mefenoxam (Table 4.10).  Diversity estimates for  intermediately sensitive and insensitive isolates were comparable to each other (Table  4.10).  Isolates insensitive and intermediately sensitive to mefenoxam were mostly found  in North America, except for one isolate from Taiwan that was insensitive to mefenoxam;  and one from Taiwan and two from Spain that were intermediately sensitive to the  fungicide.  Isolates sensitive to mefenoxam were collected from many different regions of  the world and hosts (Table 4.1).  P. capsici solates insensitive and intermediately sensitive  to mefenoxam originated from hosts belonging to the Cucurbitaceae, Fabaceae, Piperaceae,  Solanaceae, and Sterculiaceae.    No evident population structure was detected when the data were analyzed using  mating type (Figure 4.1E) as prior population information. Both mating types contained  individuals from all clusters.  FST values indicated very low genetic differentiation between  A1 and A2 isolates (Table 4.9).  Diversity estimates for A1 isolates were higher than those  obtained for A2 isolates (Table 4.10).  Mating type distribution in the total sample and in  countries including Brazil, Mexico, Taiwan, and the U.S. was approximately 1:1 (A1: 134,  A2: 121 for the total sample, Table 4.1).  Countries (Cameroon, Chile, China, France,  Guatemala, Japan, Korea, Norway, Peru, Spain, Thailand, Uruguay, and the former  Yugoslavia) and continents (Africa) with lower sampled isolates (<8) showed a prevalence  116 of one mating type over the other.  Other countries and continents with good sampling (>8)  presented an increased number of A2 (South America) or A1 isolates (Europe, Italy).   Isolates obtained from cucurbitaceous and solanaceous hosts also presented a 1:1  distribution of mating types.  Isolates originating from other host families presented  deviations from the 1:1 mating type distribution.     Table 4.9.  Minimum, average and maximum genetic differentiation estimates of  mitochondrial and nuclear genes for P. capsici SL and SS with isolates grouped in  predefined mating type, mefenoxam sensitivity and species categories.      Categorya  Fstb  Mating Type  A1    A2  0,0      0.01,0.01      0.02,0.02    Mefenoxam Sensitivity  S  IS  IS  0,0      0,0.05*      0,0.09*    I  0,0  0,0    0.03,0.03  0,0.01    0.08*,0.1*  0,0.04  Species  P. capsici    Not P. capsici  0.48*,0.35*      0.55*,0.54*      0.63*,0.71*    a For mefenoxam sensitivity coding refer to table 6.  b The reported values correspond to minimum, average (in bold), and maximum values for  mitochondrial (before comma) and nuclear genes (after comma). *, significant at 0.05.            117 Table 4.10.  Minimum, average and maximum diversity estimates of mitochondrial and  nuclear genes for P. capsici SL and SS with isolates grouped in predefined mating type,  mefenoxam sensitivity and species categories.     Isolates  Diversity estimatesb  Categorya  π    θw    k      SL  SS  Hd          M  N  M  N  M  N  M  N  Mating Type                      A1  73  64  0.01  0.67  0  0  0.18  1.64  0.01  1.4        0.22  0.81  0  0  0.83  2.54  0.37  2.99        0.39  0.91  0  0.01  1.29  4.43  0.79  5.36  A2  76  66  0  0.68  0  0  0.38  1.5  0  2.46        0.15  0.78  0  0  0.69  2.31  0.23  3.18        0.26  0.91  0  0.01  0.95  4.18  0.47  5.07  Mefenoxam                      Sensitivity  S  218  201  0.01  0.67  0  0  0.17  1.52  0.01  1.32        0.2  0.81  0  0  0.76  2.51  0.33  2.93        0.35  0.9  0  0.01  1.02  4.1  0.68  5.04  IS  17  17  0  0.41  0  0  0.29  1.47  0  0.7        0.11  0.68  0  0  0.59  2.4  0.2  2.75        0.23  0.86  0  0.01  0.89  4.16  0.45  5.70  I  19  17  0  0.66  0  0  0.29  1.71  0  1.34        0.09  0.77  0  0  0.59  2.53  0.12  2.81        0.23  0.86  0  0.01  0.89  5.13  0.35  5.96  Species                      Not P. capsici  19  0  0.52  0.4  0  0  1.43  1.66  0.97  1.46        0.77  0.72  0  0.01  2.79  7.02  3.3  7.06        0.89  0.97  0.01  0.02  4.86  10.95  6.06  10.32  a For mefenoxam sensitivity coding refer to table 6.  b The reported values correspond to minimum, average (in bold), and maximum value for  diversity estimates in nuclear and mitochondrial genes.  N: nuclear, M: mitochondrial.    When the structure of the SL data was analyzed, eleven clusters (K=11, lnP= ‐6580;  K=10, lnP= ‐6787; K=12, lnP= ‐6659) were detected, two more that were detected in SS  (Figure 4.1F). Individual ancestry coefficients were highly consistent across replicate runs,  as was observed for SS.  Isolates belonging to cluster 10 presented some admixture with SS  clusters and genotypes from cluster 11 showed no admixture.  More admixture was  118 observed in clusters generated from the SS group.  When the data were analyzed using the  categories P. capsici, intermediate, and P. tropicalis as prior population information, no  genetic clustering directly corresponding to the categories was observed.  However, some  structure was observed in each category.  The P. capsici category contained the same  clusters detected in SS and no individuals from clusters 10 and 11.  The intermediate group  presented isolates from clusters 10, 11 and some admixed individuals with partial  membership in SS clusters and cluster 10.  The P. tropicalis group only contained genotypes  from cluster 10 that showed very little admixture and included the type culture of P.  tropicalis.  Isolates from cluster 10 originated from Mexico, India, Australia, and Hawaii  from tropical hosts and from Delaware from lima bean.  Isolates from cluster 11 presented  no admixture and corresponded to intermediate isolates from Brazil and Michigan  obtained from cacao and English Ivy (Hedera helix), respectively.  Morphological  characteristics of all isolates were consistent with the description of P. capsici included in  the Phytophthora spp. key by Waterhouse (110).   The highest values of genetic differentiation observed in this study occurred  between P. capsici and non‐P. capsisi isolates (Table 4.9).  Diversity estimates for P. capsici  isolates were lower than those obtained for non‐P. capsici isolates (Tables 4.4 and 4.10).   HSP90 presented deviations from neutrality for non‐P. capsici isolates (Table 4.7).  The  NeighborNet networks for genes HSP90, TigA, EF‐1α, β‐Tubulin, Ura3, and Cox1, showed  three groups of haplotypes with moderate (>65) to high bootstrap support (>90).  The  three groups presented several incompatibilities within each group, but few or no  incompatibilities among groups depending on the gene (data not shown). These groups  were not contradicted by the other genealogies but grouping of isolates had less resolution.   119 Isolates belonging to the first group of haplotypes corresponded to P. capsici SS, while  isolates belonging to the second and third groups of haplotypes included genotypes from  clusters 10 and 11, respectively.  For P. capsici SS isolates, no distinctive groups of  haplotypes with high bootstrap support were consistently observed in all or most  networks.  Networks overall indicated significant incompatibility within nuclear genes, and  the highest number of incompatibilities was observed in Ura3.  The mitochondrial genes  presented a few incompatibilities, and Cox2 showed no networking.  Statistical parsimony  haplotype genealogies for SL presented a similar topology to the NeighborNet networks  (Figure 4.3). P. capsici SS haplotypes appeared to be very closely related to each other with  only one or two missing haplotypes separating sampled haplotypes.  Haplotypes from  clusters 10 and 11 were more distantly related to P. capsici SS with two or more missing  haplotypes separating both clades, which was supported by all genealogies.  All genealogies  except TigA presented some P. capsici SS haplotypes that included one or two alleles of  isolates from clusters 10 and 11.  In some genealogies, several haplotypes corresponding to  clusters 10 or 11 were grouped together and separated from each other and from P. capsici  by at least one missing haplotype (Cox1, Cox2, Nad1, EF‐1α, TigA).  Some SS haplotypes  were frequently sampled and found throughout the world on diverse hosts, while other  haplotypes sampled at lower frequencies originated from specific states, countries,  continents and hosts (Table 4.1).                120 Figure 4.3.  Haplotype genealogies of P. capsici SL mitochondrial (A Cox1) and nuclear (B  EF‐1α) genes.  One mitochondrial and one nuclear gene are shown as examples.  Other  genes are not shown but presented similar topologies.  The lines in the network represent  possible paths of evolution.  The haplotype with the highest probability to be ancestral is  indicated by a square, other haplotypes are displayed as ovals.  The empty dots represent  missing or extant haplotypes.  Bold lines indicate haplotypes that contain P. capsici SS  isolates and isolates from clusters 10 or 11.  Dashed lines indicate haplotypes that contain  isolates from cluster 10.  Double‐line haplotypes indicate haplotypes that contain isolates  from cluster 11.  Dotted lines indicate haplotypes that contain both cluster 10 and 11  isolates.        Discussion  Phytophthora capsici is an economically important plant pathogen with a wide  geographic and host range, as reflected by the sampling in this study.  To detect population  structure and determine whether predefined categories based on host, geography,  mefenoxam sensitivity or mating type reflect genetic relationships among P. capsici  isolates, we sequenced ten genes from 255 individuals to perform population structure  121 analyses.  Bayesian clustering of isolates identified nine and eleven major genetically  distinct clusters in SS and SL, respectively.  Clustering analysis revealed some population  structure by host, geographic origin and mefenoxam sensitivity in SS and by species in SL  with some clusters occurring more or less frequently in particular categories.  However, it  showed no direct correspondence between any of the predefined categories and the  number of inferred clusters.  Pairwise FST comparisons and genetic diversity estimates  among predefined host, geography, mefenoxam sensitivity, mating type and species  categories were consistent with the distribution of genetic variation detected by Bayesian  clustering and provided additional information on the generic variability within and  between categories.  When isolates were grouped by host, differences in frequency of occurrence of  certain clusters in particular hosts were observed.  Isolates from cluster one occurred more  frequently in non‐vegetable hosts (cacao and black pepper) than in vegetable hosts.  A  previous study in P. capsici found temperate isolates from vegetable hosts (Solanaceae,  Cucurbitaceae and Fabaceae) to be grouped together in the same clade, while tropical  isolates appeared to have different genetic lineages (12)  in agreement with our findings.   Nonetheless, that study did not determine if isolates corresponded only to P. capsici or if P.  tropicalis was present in their sample, so it is not possible to determine if P. capsici sensu  stricto isolates were truly associated with tropical (non‐vegetable) hosts, or if isolates from  tropical hosts corresponded only to P. tropicalis and isolates assigned to cluster 11.  Work  by Donahoo and Lamour detected phylogenetic clustering of P. capsici sensu stricto isolates  from tropical hosts (non‐vegetable) in a separated but closely‐related clade from isolates  from vegetable hosts (19), which further supports our findings of genetic differentiation  122 between these categories.  Tropical hosts of P. capsici have more woody tissue if compared  to hosts from Cucurbitaceae, Solanaceae and Fabaceae.  In previous studies it has been  observed that P. capsici is difficult to recover from woody tissue of Fraser fir (83), oak (18)  and various ornamentals (42).  It is possible that isolates from different P. capsici clusters  are not equally adapted to woody or herbaceous tissue, and this could result in isolates  from a specific cluster such as cluster one occurring more frequently in woody hosts.  A  similar adaptation could be the cause of the almost exclusive association of cluster two  with the Solanaceae.  Despite the large sampling in the Cucurbitaceae (N=87), no isolates  belonging predominately to cluster two were found in hosts from this family.  As with the  woody hosts it is possible that isolates from cluster two are not able to infect Cucurbitaceae  as frequently as Solanaceae.   Evidence of clustering should not be taken as evidence of physiological races or  pathotypes since we did not associate virulence data with the genetic clusters in the  current study.  We only associated occurrence of clusters in a host.  Differences in virulence  and pathogenicity have been reported between isolates occurring in Solanaceae and  Cucurbitaceae (28, 62, 80, 84, 87), but the genetic basis of these differences is unknown.   Our current knowledge of differences in virulence of P. capsici isolates only includes a few  individuals that have been commonly used in host susceptibility experiments and  resistance screenings (28, 33, 83, 84).  Isolates 101 (known in the literature as OP97), 455  (known as SFF3), 12889, and 13349 (known as SP98) belong mostly to clusters seven,  three, five, and seven, respectively.  These isolates have been used in experiments with  Fraser fir (83), asparagus (L.M. Rodriguez‐Salamanca and M.K. Hausbeck, unpublished  data), cucumber (33), summer and winter squashes (21), tomato (84) and pepper (28).   123 However, no virulence or pathogenicity data are currently available for a large number of  individuals from different clusters.  Experiments that associate virulence and pathogenicity  to particular clusters are needed to determine if cluster membership may be used to  predict the occurrence of certain isolates in particular hosts and the virulence of the  isolates.  If such an association is found, cluster information could be applied to determine  the most likely sources of virulent strains, which could be used for robust disease  screenings in the search for resistant cultivars.  Developing economical and high‐ throughput diagnostic markers for each P. capsici cluster would be key for this purpose.   Nevertheless, the differences in cluster occurrence by host of origin found in this study  have significant implications for the development of resistant varieties.  Breeding programs  should include isolates that represent the genetic diversity of the pathogen in resistance  screenings.  Isolates obtained from hosts belonging to the Cucurbitaceae and Solanaceae  are commonly used in host resistance screenings (28, 84), but this study suggests that  inclusion of isolates from tropical hosts that show high genetic variation is necessary to  capture the genetic diversity of P. capsici.    Several studies examining samples of P. capsici isolates from different geographic  locations worldwide have been published; however, clear detection of distinct subgroups in  P. capsici based on geographic origin through phylogenetic methods remains elusive (12,  19, 27, 117).  Some geographic structure was detected in our study.  Some clusters  occurred in all continents (four and eight), others were only present in select continents  (two in North and South America), or were more frequently sampled in certain continents  (six in Europe and three in North America and Asia) and countries (five, seven and nine in  the U.S.).  North America and Asia presented a more diverse occurrence of clusters  124 compared to other regions.  The high diversity of P. capsici clusters found in the U.S. may  challenge local breeding efforts.  Breeding programs usually have a regional focus where  resistance for local pathogen populations is incorporated into host varieties.  Breeders  working in areas with lower genetic diversity of the pathogen may have a higher chance of  identifying resistant varieties to local P. capsici populations (49).  P. capsici populations  with high levels of genetic variation are likely to adapt more rapidly to resistant hosts than  populations with little genetic variation (49, 56).  In our study, regions including Cameroon,  Chile, Peru, France, Italy, Norway, Spain, Uruguay, and Tennessee presented a predominant  cluster.  The absence of other clusters is probably due to our sampling, but clonal P. capsici  populations have been identified in Argentina (36) and Peru (49) in more robust sampling  efforts.  Local population studies with intensive sampling are needed to characterize and  determine the spatial genetic structure of P. capsici populations on a smaller scale than  examined in the present work.  Information on the geographic distribution of genetic  variation may be used to decide how best to deploy host resistance to achieve control and  how to select isolates to be used as inoculum in resistance screenings.  Our results suggest  that it is necessary to use isolates from diverse geographic locations to represent the range  of genetic diversity observed in this pathogen.  Our sampling efforts could be improved  upon in future studies and additional isolates from all continents, countries and states will  be needed to determine whether additional clusters exist.  However, establishing the  spatial distribution of the nine P. capsici clusters detected in this study provides an initial  map of global population structure that will help in isolate selection for resistance  screening and will guide future sampling to expand our knowledge of P. capsici population  structure.  125 P. capsici is water‐dispersed within fields and can be introduced into new fields  through infected plant material or infested soil, tools and irrigation water (35, 44).  Wind‐ dispersal is not an important mechanism for large‐scale movement of P. capsici (41) and  human activity likely plays a role in genetic structuring of populations.  Migration of few  individuals per generation is sufficient to keep FST values at 0.1 or less (43).  The observed  FST values between several regions suggest that movement among locations is rare but  historical information indicates it is possible.  It has been suggested that P. capsici was  introduced to the U.S. through contaminated pepper seed that entered New Mexico (1918)  (63) and Florida (1932) (112) since some of the earliest reports of this pathogen in the U.S.  come from those states (56).  Since a type culture of P. capsici from New Mexico was  included in this study and had membership mostly in cluster three and partial membership  in clusters four and eight, we know those clusters were present in New Mexico since 1937.   Present samples from New Mexico also had membership in those clusters indicating that  cluster variation is maintained within populations but information about the genetic  diversity of those isolates is not available since our sample was less than eight isolates.   Genetic diversity estimates for New Jersey, South Carolina and California isolates were  higher than for other states, which could be due to the longer presence of P. capsici in these  states compared with Tennessee, New York and Michigan.  P. capsici was first found in  California around 1927‐1930 (104, 105) after reports from New Mexico (1918) (63) and  Italy (1927) (17, 106) but before it was seen in Colorado (1931) (11, 92), Florida (1932)  (112), Arizona (1933) (14), Greece (1933) (93), New York (1935) (114), Chile (1936)  (113), Argentina (1940) (37), Michigan (1997) (44), and Illinois (1999) (7).  It is estimated  126 that P. capsici became economically important in New Jersey around 1970 (8, 77) and in  South Carolina in 1994 (A. P. Keinath, unpublished data) but this pathogen had probably  been present both states for a few years.  Moderate to low genetic variation was detected in  Tennessee, New York and Michigan isolates that could account for the more recent  incidence of P. capsici in fields of these states.  P. capsici was first found in New York around  1935 infecting watermelons that came from Colorado in a New York City market (114).  It  was not seen again in 1937 and 1938 (114) but has only recently (late 1990s) become  economically important in New York (20).  P. capsici was found in Michigan in 1997 in  processing tomato fields that were established around 1940 with transplants from Georgia  (44).  Historically, P. capsici has not been a concern in Tennessee; nonetheless, isolates  have been recently (2000s) recovered from vegetable hosts (56).  Having accurate historical records of plant pathogen occurrence and maintaining  carefully cataloged isolate collections are essential tools to determine the role humans are  playing in shaping the current global genetic structure of P. capsici populations, which has  been suggested in previous work including local Michigan and New York populations (15,  58).  Nonetheless, global‐scale or inter‐U.S. sate migration events in P. capsici have not been  studied.  The type culture from Italy (year 1927) had membership mostly in cluster six and  partial membership in clusters two and four, indicating that members of those clusters  have been present in Italy since 1927 as reflected by the other Italian samples.  Italian  samples presented high levels of genetic variation that could be reflecting the long‐term  presence of P. capsici in Italy and subsequent diversification of isolates.  Members of cluster  six that were mostly sampled in Europe and specifically in Italy, were also found in Hawaii,  California and Florida.  It is possible that those U.S. isolates belonging to cluster six were  127 introduced into the U.S. from Europe.  Similarly, isolates from cluster two that were only  sampled in solanaceous hosts of South Carolina, Chile and Peru could have been introduced  into the U.S. from South America.  Our analysis does not allow answering these questions  but it does provide a global framework to formulate such hypotheses.  Evolutionary studies  with appropriate markers are needed to determine migration pathways of P. capsici as has  been done with other pathogens (38, 40).  Such studies will provide valuable information  for regulatory measures and may also identify the center of origin of P. capsici, which could  guide samplings of resistant germplasm.   Some structure was detected in isolates grouped by mefenoxam sensitivity, where  sensitive isolates contained members from all clusters but intermediately sensitive and  insensitive isolates did not contain members from cluster nine.  Isolates from Spain,  Taiwan, Mexico and the U.S. were found to be intermediately sensitive or insensitive to  mefenoxam.  Other studies have found isolates insensitive to mefenoxam in Italy (79) and  the U.S. (30, 44).  Isolates sensitive to mefenoxam were sampled from more regions and  hosts than isolates intermediately sensitive or insensitive to mefenoxam.  Continued  characterization of P. capsici populations for mefenoxam insensitivity will help determine  whether mefenoxam is still an effective control method in a particular field or if using other  products is needed.   No structure was detected when isolates were grouped by mating type and all  clusters were sampled in A1 and A2 isolates.  A previous study also found no correlation  between RFLP lineages and mating type in isolates from New Mexico, Europe and Korea  (51).  Regions with lower sampling showed the prevalence of only one mating type, while  regions with higher sampling contained both A1 and A2 isolates.  Only A1 P. capsici isolates  128 have been found in Spain (45), Bulgaria (52), China (98), and Argentina (36) and only A2  isolates in Peru (49) according to previous reports.  Spain, China and Peru also had one  dominant mating type in our sampling but few individuals were obtained from these  countries and additional sampling may detect the other mating type.  Reports of P. capsici  isolates from Brazil (68), Canada (3), Mexico (25), Italy (101), South Africa (70), Taiwan  (94) and the U.S. (15, 44, 87, 109) indicate the presence of both mating types.  Our study  also found both mating types present in Brazil, Mexico, Taiwan, Italy and the U.S.  Some  regions followed the 1:1 ratio reported in other studies (58) but others were skewed  toward one mating type.  Since recombination via sexual reproduction generates high  genetic variability in P. capsici that may result in isolates with increased virulence or  fungicide resistance, it is important to know the distribution of mating types in different  regions.  If only one mating type is present in a field, country or state, efforts should be  directed to avoid the introduction of the other mating type so the long‐term efficacy of  control methods such as host resistance and fungicides is not reduced.  High genetic diversity has been previously reported for P. capsici (53, 58, 95).   Individuals with partial membership in several clusters and unique haplotypes reported  here (20‐40%) and in previous studies (70‐90%) (58, 59) are consistent with sexual  reproduction in P. capsici (39).  While admixture could be due to factors such as ancestral  polymorphism, at least some admixture is likely a result of recombination, as indicated by  recombination estimates for nuclear genes (97), incompatibilities observed in the  NeighborNet networks, and extensive networking in statistical parsimony genealogies.   Although these findings are unsurprising in light of previous studies (57‐59), the  implications of these results for choosing the best method to analyze populations of P.  129 capsici are significant.  Traditional phylogenetic methods have been used to study  intraspecific population data of P. capsici (12, 19, 117) even though recombination occurs  frequently.  Yet such methods are only appropriate under the assumption that  recombination does not occur (81, 115).  If recombination occurs frequently in the plant  pathogen of interest, methods such as Bayesian clustering, split networks and statistical  parsimony that allow for recombination events should be used (6, 81).  Bayesian clustering  allows for the reconstruction of ancestral population structure and subsequent admixture  in highly recombining species without subjective definitions of population groups or  categories (115) and constitutes a useful tool to study population structure in P. capsici.   Characterization of genetic structure of P. capsici SS populations revealed moderate  but significant population structure by host, geography and mefenoxam sensitivity.   Beyond the direct application of this knowledge in breeding efforts and development of  fungicides, the detection of population structure in P. capsici has implications in using  association genetics to identify the genetic basis of phenotypes of importance.  Association  studies have been performed to identify the genetic basis of disease in humans (32) and  agronomic traits in plants (46).  They have also been successfully used to determine the  role of particular genes as virulence and avirulence determinants in plant pathogens such  as Phytophthora infestans (5) and Magnaporthe oryzae (116).  Association studies could  help uncover the genetic bases of traits such as pathogenicity, virulence or fungicide  resistance in P. capsici.  Nevertheless, even weak population structure obscures the  discovery of functionally important variation using association genetics.  Since the clusters  identified are somewhat structured, stratification of P. capsici by geography, host and  mefenoxam sensitivity will be important to control for on association analysis of  130 phenotypic traits of interest.  Studies investigating the genetic structure of P. capsici  populations by host or by mefenoxam sensitivity nested within geography will be key to  select appropriate individuals for association studies in P. capsici.  Bayesian clustering analysis, split decomposition networks and statistical  parsimony genealogies detected the presence of non‐P. capsici isolates in our sample.   Isolates from cluster 10 corresponded to P. tropicalis and isolates from cluster 11  corresponded to isolates from Brazil and cacao, and Michigan and English Ivy that were  closely related to P. capsici and P. tropicalis but formed a distinct group in our analyses.   Preliminary comparisons of morphology between P. capsici and non‐P. capsici isolates in  this study revealed significant differences in some characteristics but most isolates were  not readily differentiated by morphology (L. L. Granke et al., unpublished data).   Morphological and genetic differences between P. tropicalis and P. capsici have been  documented in previous studies (4, 19, 69, 74, 117) but there is still some debate regarding  the appropriateness of designating P. tropicalis as a distinct species (12).  Previous studies have used phylogenetic methods to analyze worldwide collections  of isolates (69, 74).  However, because of the low resolution provided by the markers used,  little intra‐specific information of lineage‐geography or lineage‐host associations was  gathered.  Such methods did prove useful in identifying non‐P. capsici isolates in the sample  as observed in our study.  Oudemans and Coffey also found P. tropicalis isolates (CAP2) to  be separated from P. capsici sensu stricto (CAP1) (74).  An advantage of the methods used  in our study over phylogenetic methods previously used is the ability to characterize  admixture between P. capsici and P. tropicalis.  Several studies have detected the separation  of P. capsici and P. tropicalis but no evidence of admixture between them was previously  131 found (19, 69, 74, 117).  Clustering analysis in our study indicates that even though P.  tropicalis is found as a distinct cluster from P. capsici, some admixture has occurred  between the species.  The observed admixture could be due to ancestral polymorphism or  recent recombination events given that is possible to obtain inter‐specific progeny in the  lab (19) but no hybrids have been characterized from nature.  With more samples and  using several linked markers it may be possible to detect introgression events or recent  gene flow between both species and determine the existence of natural hybrids (23, 72,  107).      Isolates from cluster 11 appear separated from P. capsici and P. tropicalis in the  networks and genealogies and show no admixture in the structure analysis.  The lack of  admixture in cluster 11 could be due to the few isolates we have in that cluster (three from  Brazil and cacao and one from Michigan and English Ivy).  With more samples, it is possible  that admixture will be detected revealing that cluster 11 corresponds to P. tropicalis or P.  capsici.  However, taking into consideration the genealogies and networks that support the  separation of haplotypes in three distinct groups, it is also possible that cluster 11  corresponds to a distinct phylogenetic species.  Oudemans and Coffey also found in their P.  capsici study a third distinct clade (CAP3) that contained isolates from Brazil and cacao  (74) that likely correspond to cluster 11.  Isolates from Brazil and cacao also formed a  separate clade in other studies (12, 19).  Detection of isolates from cluster 11 seems to be  possible by combining information from several markers.  In the study by Donahoo and  Lamour these isolates appear on the same clade with a few P. capsici isolates in an ITS‐ based phylogeny, but separation of such isolates was observed in other phylogenies based  on AFLPs and nuclear genes in the same study (19).  This is not surprising since haplotypes  132 of cluster 11 showed high similarity to P. capsici in some genes, while other genomic  regions were more similar to P. tropicalis according to BLAST.  Since the structure analysis  uses multilocus genotypes and allelic frequencies for clustering, we believe that it  constitutes a valuable tool that could complement phylogenetic studies by providing  information of population membership and admixture to aid in the delimitation of  phylogenetic species in highly recombining pathogens.  However, to truly define if there are  genetic barriers to mating among P. capsici, P. tropicalis and isolates in cluster 11,  comparisons of a wide range of inter and intra‐cluster crosses between isolates from  diverse origins is needed.    Isolates used in this study were obtained from colleagues around the world and  from our P. capsici collection.  Large numbers of isolates could not be obtained from several  localities and most isolates come from common vegetable hosts.  Isolates from tropical  hosts were less represented and no samples from wild hosts or weeds were obtained.   Finding non‐P. capsici isolates in our sample was unexpected so the number of isolates  sampled for clusters 10 and 11 was low for a population‐based study.  Sparse sampling is  common in plant pathogen worldwide population studies.  One example is work done by  Goss et al. in Phytophthora ramorum populations (40).  Nonetheless, Bayesian clustering  analysis can yield valuable information about the population structure of plant pathogen  populations.  The number and type of markers used can affect the analysis.  Loci included in  our study were highly informative as indicated by polymorphism, recombination and  diversity analysis, and we were able to detect clustering in our samples with the ten genes  used.  Previous studies have shown that for clustering to be robust less than 40 markers  and as low as seven markers (82) can be used if they are highly informative, but using at  133 least 50 markers is preferred (89).  Obviously, structure can only be detected in the  samples being analyzed.  More clusters likely exist in P. capsici since apparent structure  may be underestimated when using sparse sampling and few markers (89).  Future studies  with uniform global sampling and hundreds of markers could determine whether  additional genetic clusters are present in P. capsici.  The approach used in this study could  be applied to other plant pathogens where using a large number of markers is not feasible  due to high costs or scarce genomic resources available, given that the markers used are  highly informative.  P. capsici is a diverse and highly recombining species of economic importance.  Our  findings of genetic structuring in P. capsici populations coupled with observations of  differences in virulence of particular isolates when inoculated in diverse hosts (28, 33, 83,  84), highlights the importance of selecting isolates from diverse hosts and geographic  origin for breeding programs.  When developing diagnostic tools, fungicides, and resistant  host varieties, representative isolates from all genetic clusters should be used to account  for global genetic diversity.  This investigation of genetic structure of P. capsici populations  may be used to guide isolate selection to improve efficacy of breeding programs.   Continued genotyping of P. capsici will be necessary to track the diversification of inferred  clusters and to identify new ones.  134                                       References          135 References    1.    2.    3.    4.    5.    6.    7.    8.    9.    10.    11.    12.    Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., and Lipman, D. J.  1990.  Basic local  alignment search tool.  J. Mol. Biol. 215:403 ‐ 410.  Altschul, S. F., Madden, T. L., Schaffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., and  Lipman, D. J.  1997.  Gapped BLAST and PSI‐BLAST: a new generation of protein  database search programs.  Nucl. Acids Res. 25:3389‐3402.  Anderson, T. R., and Garton, R.  2000.  First report of blight of field peppers caused  by Phytophthora capsici in Ontario.  Plant Dis. 84:705.  Aragaki, M., and Uchida, J. Y.  2001.  Morphological distinctions between  Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov.  Mycologia 93:137‐145.  Armstrong, M. R., Whisson, S. C., Pritchard, L., Bos, J. I. B., Venter, E., Avrova, A. O.,  Rehmany, A. P., Böhme, U., Brooks, K., Cherevach, I., Hamlin, N., White, B., Fraser,  A., Lord, A., Quail, M. A., Churcher, C., Hall, N., Berriman, M., Huang, S., Kamoun, S.,  Beynon, J. L., and Birch, P. R. J.  2005.  An ancestral oomycete locus contains late  blight avirulence gene Avr3a, encoding a protein that is recognized in the host  cytoplasm.  PNAS 102:7766‐7771.  Awadalla, P.  2002.  The evolutionary genomics of pathogen recombination.  Nature  Rev. Genet. 4:50‐60.  Babadoost, M.  2000.  Outbreak of Phytophthora foliar blight and fruit rot in  processing pumpkin fields in Illinois.  Plant Dis. 84:1345.  Barksdale, T. H., Papavizas, G. C., and Johnston, S. A.  1984.  Resistance to foliar blight  and crown rot of pepper caused by Phytophthora capsici.  Plant Dis. 68:506‐509.  Bergl, R. A., and Vigilant, L.  2007.  Genetic analysis reveals population structure and  recent migration within the highly fragmented range of the Cross River gorilla  (Gorilla gorilla diehli).  Mol. Ecol. 16:501‐516.  Blair, J. E., Coffey, M. D., Park, S.‐Y., Geiser, D. M., and Kang, S.  2008.  A multi‐locus  phylogeny for Phytophthora utilizing markers derived from complete genome  sequences.  Fungal Genet. Biol. 45:266‐277.  Bodine, E. W.  1935.  Blight of peppers.  Colo. Expt. Sta. Press Bull. 85:6.  Bowers, J. H., Martin, F. N., Tooley, P. W., and Luz, E. D. M. N.  2007.  Genetic and  morphological diversity of temperate and tropical isolates of Phytophthora capsici.   Phytopathology 97:492‐503.  136 13.    14.    15.    16.    17.    18.    19.    20.    21.    22.    23.    24.    25.  Bowers, J. H., and Mitchell, D. J.  1989.  Variability in virulence of oospore inoculum  of Phytophthora capsici and the relationship of the density of oospores in soil to  plant mortality.  Phytopathology 79:1166.  Brown, J. G., and Evans, M. N.  1933.  A Phytophthora rot of watermelon.  Ariz. Agr.  Expt. Sta. Tech. Bull. 51:45‐65.  Camp, A. R., Milgroom, M. G., Meitz, J. C., McLeod, A., Fry, W. E., McGrath, M. T., and  Smart, C. D.  2010.  Phytophthora capsici in New York State: Resistance to  mefenoxam and population structure.  Phytopathology 100:S20.  Clement, M., Posada, D., and Crandall, K.  2000.  TCS: a computer program to  estimate gene genealogies.  Mol. Ecol. 9 (10):1657‐1660.  Curzi, M.  1927.  L'eziologia della 'cancrena pedale' del Capsicum annuum (The  etiology of foot rot of Capsicum annuum).  Riv. Patol. Veg. 17:1‐19 (In Italian).  Davidson, J. M., Werres, S., Garbelotto, M., Hansen, E. M., and Rizzo, D. M.  2003.   Sudden oak death and associated diseases caused by Phytophthora ramorum. Plant  Health Progress doi: 10.1094/PHP‐2003‐0707‐01‐DG.  Donahoo, R. S., and Lamour, K. H.  2008.  Interspecific hybridization and apomixis  between Phytophthora capsici and Phytophthora tropicalis.  Mycologia 100:911‐920.  Dunn, A. R., Milgroom, M. G., Meitz, J. C., McLeod, A., Fry, W. E., McGrath, M. T.,  Dillard, H. R., and Smart, C. D.  2010.  Population structure and resistance to  mefenoxam of Phytophthora capsici in New York State.  Plant Dis. 94:1461‐1468.  Enzenbacher, T. B., and Hausbeck, M. K.  2010.  Isolates of Phytophthora capsici differ  in their ability to cause disease in cucurbit fruits.  Phytopathology 100:S34.  Erwin, D. C., and Ribeiro, O. K.  1996.  Phytophthora diseases worldwide. APS Press,  St. Paul, MN.  Falush, D., Stephens, M., and Pritchard, J. K.  2007.  Inference of population structure  using multilocus genotype data: dominant markers and null alleles.  Mol. Ecol. Notes  7:574‐578.  Falush, D., Wirth, T., Linz, B., Pritchard, J. K., Stephens, M., Kidd, M., Blaser, M. J.,  Graham, D. Y., Vacher, S., Perez‐Perez, G. I., Yamaoka, Y., Megraud, F., Otto, K.,  Reichard, U., Katzowitsch, E., Wang, X., Achtman, M., and Suerbaum, S.  2003.  Traces  of human migrations in Helicobacter pylori populations.  Science 299:1582‐1585.  Fernandez‐Pavia, S. P., Rodriguez‐Alvarado, G., and Sanchez‐Yanez, J. M.  2003.   Buckeye rot of tomato caused by Phytophthora capsici in Michoacan, Mexico.  Plant  Dis. 87:872.  137   26.    27.    28.    29.    30.    31.    32.    33.    34.    35.    36.    37.  Fonseca, D. M., Keyghobadi, N., Malcolm, C. A., Mehmet, C., Schaffner, F., Mogi, M.,  Fleischer, R. C., and Wilkerson, R. C.  2004.  Emerging vectors in the Culex pipiens  complex.  Science 303:1535‐1538.  Forster, H., Oudemans, P., and Coffey, M. D.  1989.  Mitochondrial and nuclear DNA  diversity within six species of Phytophthora.  Exp. Mycology 14:18‐31.  Foster, J. M., and Hausbeck, M. K.  2010.  Resistance of pepper to Phytophthora  crown, root, and fruit rot is affected by isolate virulence.  Plant Dis. 94:24‐30.  Francois, O., Blum, M. G. B., Jakobsson, M., and Rosenberg, N. A.  2008.  Demographic  history of European populations of Arabidopsis thaliana.  PLoS Genet 4:e10000075.  French‐Monar, R. D., Jones, J. B., and Roberts, P. D.  2006.  Characterization of  Phytophthora capsici associated with roots of weeds on Florida vegetable farms.   Plant Dis. 90:345‐350.  Fu, Y. X., and Li, W. H.  1993.  Statistical tests of neutrality of mutations.  Genetics  133:693‐709.  Garcia‐Barcelo, M.‐M., Tang, C. S.‐m., Ngan, E. S.‐w., Lui, V. C.‐h., Chen, Y., So, M.‐t.,  Leon, T. Y.‐y., Miao, X.‐p., Shum, C. K.‐y., Liu, F.‐q., Yeung, M.‐y., Yuan, Z.‐w., Guo, W.‐ h., Liu, L., Sun, X.‐b., Huang, L.‐m., Tou, J.‐f., Song, Y.‐q., Chan, D., Cheung, K. M. C.,  Wong, K. K.‐y., Cherny, S. S., Sham, P.‐c., and Tam, P. K.‐h.  2009.  Genome‐wide  association study identifies NRG1 as a susceptibility locus for Hirschsprung's  disease.  PNAS 106:2694‐2699.  Gevens, A. J., Ando, K., Lamour, K. H., Grumet, R., and Hausbeck, M. K.  2006.  A  detached cucumber fruit method to screen for resistance to Phytophthora capsici  and effect of fruit age on susceptibility to infection.  Plant Dis. 90:1276‐1282.  Gevens, A. J., Donahoo, R. S., Lamour, K., and Hausbeck, M. K.  2008.  Characterization  of Phytophthora capsici causing foliar and pod blight of snap beans in Michigan.   Plant Dis. 92:201‐209.  Gevens, A. J., Donahoo, R. S., Lamour, K. H., and Hausbeck, M. K.  2007.   Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water.   Phytopathology 97:421‐428.  Gobena, D. J., Roig, J., Hulvey, J., and Lamour, K.  2010.  Genetic diversity of the  vegetable pathogen Phytophthora capsici in Argentina.  Phytopathology 100:S41.  Godoy, E. F.  1940.  El 'mildew' o 'tizon' del pimiento producido por la Phytophthora  capsici en la Republica Argentina (The 'mildew' or 'blight' of chili produced by  138   38.    39.    40.    41.    42.    43.    44.    45.    46.    47.    48.  Phytopthora capsici in the Argentine Republic).  Rev. Fac. Agron. Univ. Nac. La Plata  24:235‐280 (In Spanish).  Gomez‐Alpizar, L., Carbone, I., and Ristaino, J. B.  2007.  An Andean origin of  Phytophthora infestans inferred from mitochondrial and nuclear gene genealogies.   PNAS 104:3306‐3311.  Goodwin, S. B.  1997.  The population genetics of Phytophthora.  Phytopathology  87:462‐473.  Goss, E. M., Larsen, M., Chastagner, G. A., Givens, D. R., and Grunwald, N. J.  2009.   Population genetic analysis infers migration pathways of Phytophthora ramorum in  US nurseries.  PLoS Pathogens 5:e10000583.  Granke, L. L., Windstam, S. T., Hoch, H. C., Smart, C. D., and Hausbeck, M. K.  2009.   Dispersal and movement mechanisms of Phytophthora capsici sporangia.   Phytopathology 99:1258‐1264.  Hahn, R., and Werres, S.  1997.  Development of a dot immunobinding assay to  detect Phytophthora spp. in naturally dark‐rooted woody plants. Ann. Appl. Biol.  130:453‐466.  Hartl, D. L., and Clark, A. G.  1997.  Principles of population genetics.  Sinauer  Associates, Inc., Sunderland, MA.  Hausbeck, M. K., and Lamour, K. H.  2004.  Phytophthora capsici on vegetable crops:  research progress and management challenges. Plant Dis. 88:1292‐1303.  Heiser, C. B., and Smith, P. G.  1953.  The cultivated Capsicum pepper.  Econ. Bot.  7:214‐227.  Huang, X., Wei, X., Sang, T., Zhao, Q., Feng, Q., Zhao, Y., Li, C., Zhu, C., Lu, T., Zhang, Z.,  Li, M., Fan, D., Guo, Y., Wang, A., Wang, L., Deng, L., Li, W., Lu, Y., Weng, Q., Liu, K.,  Huang, T., Zhou, T., Jing, Y., Li, W., Lin, Z., Buckler, E. S., Qian, Q., Zhang, Q.‐F., Li, J., and  Han, B.  2010.  Genome‐wide association studies of 14 agronomic traits in rice  landraces.  Nat. Genet. 42:961‐967.  Hudson, R. R.  1987.  Estimating the recombination parameter of a finite population  model without selection.  Genet. Res. 50:245‐250.  Hudson, R. R., and Kaplan, N. L.  1985.  Statistical properties of the number of  recombination events in the history of a sample of DNA sequences.  Genetics  111:147‐164.    139 49.    50.    51.    52.    53.    54.    55.    56.    57.    58.    59.    60.    61.  Hurtado‐Gonzáles, O., Aragon‐Caballero, L., Apaza‐Tapia, W., Donahoo, R., and  Lamour, K.  2008.  Survival and spread of Phytophthora capsici in coastal Peru.   Phytopathology 98 (6):688‐694.  Huson, D. H., and Bryant, D.  2006.  Application of phylogenetic networks in  evolutionary studies.  Mol. Biol. Evol. 23:254‐267.  Hwang, B. K., Arthur, W. A., and Heitefuss, R.  1991.  Restriction fragment length  polymorphisms of mitochondrial DNA among Phytophthora capsici isolates from  pepper (Capsicum annuum).  System. Appl. Microbiol. 14:111‐116.  Ilieva, S., and Vintanov, M.  1980.  Cultural, morphological, and physiological  characteristics of Phytophthora capsici in sweet peppers.  Gradinarska‐i‐Lozarska‐ Nauka 17:61‐68.  Jackson, K., Yin, J., Csinos, A., Scherm, H., and Ji, P.  2010.  Diversity of Phytophthora  capsici from vegetable crops in Georgia.  Phytopathology 100:S55.  Keller, S. R., Olson, M. S., Silim, S., Schroeder, W., and Tiffin, P.  2010.  Genomic  diversity, population structure, and migration following rapind range expansion in  the Balsam Poplar, Populus balsamifera.  Mol. Ecol. 19:1212‐1226.  Kim, E. S., and Hwang, B. K.  1992.  Virulence to Korean pepper cultivars of isolates  of Phytophthora capsici from different geographic areas.  Plant Dis. 76:486‐489.  Lamour, K.  2009.  Phytophthora capsici: Sex, selection, and the wealth of variation.   John Wiley & Sons, Inc.  Lamour, K. H., and Hausbeck, M. K.  2000.  Mefenoxam insensitivity and the sexual  stage of Phytophthora capsici in Michigan cucurbit fields. Phytopathology 90:396‐ 400.  Lamour, K. H., and Hausbeck, M. K.  2001.  Investigating the spatiotemporal genetic  structure of Phytophthora capsici in Michigan.  Phytopathology 91:973‐980.  Lamour, K. H., and Hausbeck, M. K.  2001.  The dynamics of mefenoxam insensitivity  in a recombining population of Phytophthora capsici characterized with amplified  fragment length polymorphism markers. Phytopathology 91:553‐557.  Lamour, K. H., and Hausbeck, M. K.  2003.  Effect of crop rotation on the survival of  Phytophthora capsici in Michigan. Plant Dis. 87:841‐845.  Lamour, K. H., and Hausbeck, M. K.  2003.  Susceptibility of mefenoxam‐treated  cucurbits to isolates of Phytophthora capsici sensitive and insensitive to mefenoxam.   Plant Dis. 87:920‐922.    140 62.    63.    64.    65.    66.    67.    68.    69.    70.    71.    72.    73.  Lee, B. K., Kim, B. S., Chang, S. W., and Hwang, B. K.  2001.  Agressiveness to pumpkin  cultivars of isolates of Phytopththora capsici from pumpkin and pepper.  Plant Dis.  85:497‐500.  Leonian, L. H.  1922.  Stem and fruit blight of chiles caused by Phytophthora capsici  sp.  Phytopathology 12:401‐408.  Librado, P., and Rozas, J.  2009.  DnaSP v5: a software for comprehensive analysis of  DNA polymorphism data.  Bioinformatics 25:1451‐1452.  Luz, E. D. M. N., Cerqueira, A. O., Faleiro, F. G., Dantas Neto, A., Matsuoka, K., and  Marques, J. R. B.  2003.  Diversidade genetica de isolados de Phytophthora capsici de  diferentes hospedeiros com base em marcadores RAPD patogenicidade e  morfologia.  Fitopatol. Bras. 28:559‐564.  Maddison, W. P., and Maddison, D. R.  2002.  MacClade: analysis of phylogeny and  character evolution.  4.06 OSX. Sunderland, MA.  Maniatis, T., Fritsch, E. F., and Sambrook, J.  1982.  Molecular cloning: a laboratory  manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.  Matsuoka, K., Luz, E. D. M. N., Faleiro, F. G., Cerqueira, A. O., Dantas Neto, A., and  Marques, J. R. B.  2003.  Genetic diversity of Phytophthora capsici isolates from  diferent hosts based on RAPD markers, pathogenicity and morphology.  Fitopatol.  Bras. 28:559‐564.  Mchau, G. R. A., and Coffey, M. D.  1995.  Evidence for the existence of two  subpopulations in Phytophthora capsici and a redescription of the species.  Mycol.  Res. 99:89‐102.  Meitz, J. C., Linde, C., Thompson, A. H., Langenhoven, S., and McLeod, A.  2010.   Phytophthora capsici on vegetable hosts in South Africa: distribution, host range and  genetic diversity.  Australas. Plant Path. 39:431‐439.  Nei, M.  1987.  Molecular evolutionary genetics.  Columbia University Press, New  York.  Nielsen, E. E., Hansen, M. M., Ruzzante, D. E., Meldrup, D., and Grønkjær, P.  2003.   Evidence of a hybrid‐zone in Atlantic cod (Gadus morhua) in the Baltic and the  Danish Belt Sea revealed by individual admixture analysis.  Molecular Ecology  12:1497‐1508.  Oelke, L. M., and Bosland, P. W.  2003.  Differentiation of race specific resistance to  Phytophthora root rot and foliar blight in Capsicum annuum.  J. Am. Soc. Hortic. Sci.  128:213‐218.    141 74.    75.    76.    77.    78.    79.    80.    81.    82.    83.    84.    85.    Oudemans, P., and Coffey, M. D.  1991.  A revised systematics of twelve papillate  Phytophthora species based on isozyme analysis.  Mycol. Res. 95:1025‐1046.  Palloix, A., Daubeze, A. M., and Pochard, E.  1988.  Phytophthora root rot of pepper.  Influence of host genotype and pathogen strain on the inoculum‐density severity  relationships.  J. Phytopathol. 123:25‐33.  Park, J., Park, B., Veeraraghavan, N., Jung, K., Lee, Y.‐H., Blair, J. E., Geiser, D. M., Isard,  S., Mansfield, M. A., Nikolaeva, E., Park, S.‐Y., Russo, J., Kim, S., H., Greene, M., Ivors, K.  L., Balci, Y., Peiman, M., Erwin, D. C., Coffey, M. D., Rossman, A., Farr, D., Cline, E.,  Grunwald, N. J., Luster, D. G., Schrandt, J., Martin, F., Ribeiro, O. K., Makalowska, I.,  and Kang, S.  2008.  Phytophthora database: a forensic database supporting the  identification and monitoring of Phytophthora.  Plant Dis. 92:966‐972.  Parra, G., and Ristaino, J. B.  1998.  Insensitivity to Ridomil Gold (Mefenoxam) found  among field isolates of Phytophthora capsici causing Phytophthora blight on bell  pepper in North Carolina and New Jersey.  Plant Dis. 82:711.  Parra, G., and Ristaino, J. B.  2001.  Resistance to mefenoxam and metalaxyl among  field isolates of Phytopththora capsici causing Phytophthora blight of bell pepper.   Plant Dis. 85:1069‐1075.  Pennisi, A. M., Agosteo, G. E., Cacciola, S. O., Pane, A., and Faedda, R.  1998.   Insensitivity to metalaxyl among isolates of Phytophthora capsici causing root rot  and crown rot of pepper in Southern Italy.  Plant Dis. 82:1283.  Polach, F. J., and Webster, R. K.  1972.  Identification of strains and inheritance of  pathogenicity in Phytophthora capsici.  Phytopathology 62:20‐26.  Posada, D., and Crandall, K. A.  2001.  Intraspecific gene genealogies: trees grafting  into networks.  Trends Ecol. Evol. 16:37‐45.  Pritchard, J. K., Stephens, M., and Donnelly, P.  2000.  Inference of population  structure using multilocus genotypic data.  Genetics 155:945‐959.  Quesada‐Ocampo, L. M., Fulbright, D. W., and Hausbeck, M. K.  2009.  Susceptibility of  Fraser fir to Phytophthora capsici.  Plant Dis. 93:135‐141.  Quesada‐Ocampo, L. M., and Hausbeck, M. K.  2010.  Resistance in tomato and wild  relatives to crown and root rot caused by Phytophthora capsici.  Phytopathology 100  (6):619‐627.  R‐Development‐Core‐Team.  2008.  R: A language and environment for statistical  computing.   R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria.  142 86.    87.    88.    89.    90.    91.    92.    93.    94.    95.    96.    97.    98.    99.  Reifschneider, F. J. B., Adalberto, C. C. F., and Arildo, M. R.  1986.  Factors affecting  expression of resistance in pepper (Capsicum annuum) to blight caused by  Phytophthora capsici in screening trials.  Plant Pathol. 35:451‐456.  Ristaino, J. B.  1990.  Intraspecific variation among isolates of Phytopthora capsici  from pepper and cucurbit fields in North Carolina.  Phytopathology 80:1253‐1259.  Ristaino, J. B., and Johnston, S. A.  1999.  Ecologically based approaches to  management of Phytophthora blight on bell pepper.  Plant Dis. 83:1080‐1089.  Rosenberg, N. A., Mahajan, S., Ramachandran, S., Zhao, C., Pritchard, J. K., and  Feldman, M. W.  2005.  Clines, clusters, and the effect of study design on the  inference of human population structure.  PLoS Genet 1:e70.  Rosenberg, N. A., Pritchard, J. K., Weber, J. L., Cann, H. M., Kidd, K. K., Zhivotovsky, L.  A., and Feldman, M. W.  2002.  The genetic structure of human populations.  Science  298:2381‐2385.  Rozen, S., and Skaletsky, H. J.  2000.  Primer3 on the WWW for general users and for  biologist programmers.  Humana Press, Totowa, NJ.  Sandsten, E. P.  1939.  Director's annual report.  Fifty‐second fiscal year, 1938‐1939.  Page 63.  Sarejanni, J. A.  1936.  La pourriture du collet des solanees cultivees et la  classification du gene Phytophthora.  Inst. Phytopath. Benaki Ann. 2:35‐52.  Sheu, Z. M., Chen, J. R., and Wang, T. C.  2009.  First report of the A2 mating type of  Phytophthora capsici infecting peppers (Capsicum annuum) in Taiwan.  Plant Dis.  93:548.  Silvar, C., Merino, F., and Díaz, J.  2006.  Diversity of Phytophthora capsici in  Northwest Spain: analysis of virulence, metalaxyl response, and molecular  characterization.  Plant Dis. 90:1135‐1142.  Stephens, M., Smith, N. J., and Donnelly, P.  2001.  A new statistical method for  haplotype reconstruction from population data.  Am. J. Hum. Genet. 68:978‐989.  Stumpf, M. P. H., and McVean, G. A. T.  2003.  Estimating recombination rates from  population‐genetic data.  Nature Rev. Genet. 4:959‐967.  Sun, W. X., Jia, Y. J., O'Neil, N. R., Feng, B. Z., and Zhang, X. G.  2008.  Genetic diversity  in Phytophthora capsici from eastern China.  Can. J. Plant Pathol. 30:414‐424.  Tajima, F.  1983.  Evolutionary relationship of DNA sequences in finite populations.   Genetics 105:437‐460.  143   100.  Tajima, F.  1989.  Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by  DNA Polymorphism.  Genetics 123:585‐595.    101.  Tamietti, G., and Valentino, D.  2001.  Physiological characterization of a population  of Phytophthora capsici Leon. from Northern Italy.  J. Plant Pathol. 83:1101.    102.  Tatarenkov, A., Gao, H., Mackiewicz, M., Taylor, D. S., Turner, B. J., and Avise, J. C.   2007.  Strong population structure despite evidence of recent migration in a selfing  hermaphroditic vertebrate, the mangrove killifish (Kryptolebias marmoratus).  Mol.  Ecol. 16:2701‐2711.    103.  Tian, D., and Babadoost, M.  2003.  Genetic variation among isolates of Phytophthora  capsici from Illinois.  Phytopathology 93:S84     104.  Tompkins, C. M., and Tucker, C. M.  1937.  Phytophthora rot of honeydew melon J.  Agric. Res 54:933‐944.    105.  Tompkins, C. M., and Tucker, C. M.  1941.  Root rot of pepper and pumpkin caused by  Phytophthora capsici.  J. Agric. Res 63:417‐426.    106.  Tucker, C. M.  1931.  Taxonomy of the genus Phytophthora de Bary.  Mo. Agr. Expt.  Sta. Res. Bul. 153:208.    107.  VÄHÄ, J.‐P., and Primmer, C. R.  2006.  Efficiency of model‐based Bayesian methods  for detecting hybrid individuals under different hybridization scenarios and with  different numbers of loci.  Molecular Ecology 15:63‐72.    108.  Walker, S. J., and Bosland, P. W.  1999.  Inheritance of Phytopthora root rot and foliar  blight resistance in pepper.  J. Am. Soc. Hortic. Sci. 124:14‐18.    109.  Wang, Z., Langston, D. B., Csinos, A. S., Gitaitis, R. D., Walcott, R. R., and Ji, P.  2009.   Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat  markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in  southern Georgia.  Appl. Environ. Microbiol. 75:5467‐5473.    110.  Waterhouse, G. M.  1963.  Key to the Species of Phytophthora de Bary.   Commonwealth Mycological Society, Kew, Surrey, UK.    111.  Watterson, G. A.  1975.  On the number of segregating sites in genetical models  without recombination.  Theor. Popul. Biol. 7:256‐276.    112.  Weber, G. F.  1932.  Blight of peppers in Florida caused by Phytophthora capsici.   Phytopathology 22:775‐780.    144 113.  Wiant, J. S.  1937.  Investigations of the market diseases of cantaloups and honey  dew and honey ball melons.  U. S. Dept. Agr. Tech. Bul. 573:48.    114.  Wiant, J. S., and Tucker, C. M.  1940.  A rot of winter queen watermelons caused by  Phytophthora capsici.  J. Agric. Res 60:73‐88.    115.  Wilson, D. J., Falush, D., and McVean, G.  2005.  Germs, genomes and genelogies.   Trends Ecol. Evol. 20:39‐45.    116.  Yoshida, K., Saitoh, H., Fujisawa, S., Kanzaki, H., Matsumura, H., Yoshida, K., Tosa, Y.,  Chuma, I., Takano, Y., Win, J., Kamoun, S., and Terauchi, R.  2009.  Association  genetics reveals three novel avirulence genes from the rice blast fungal pathogen  Magnaporthe oryzae.  Plant Cell 21:1573‐1591.    117.  Zhang, Z. G., Zhang, J. Y., Zheng, X. B., Yang, Y. W., and Ko, W. H.  2004.  Molecular  distinctions between Phytophthora capsici and Ph. tropicalis based on ITS sequences  of ribosomal DNA.  J. Phytopath. 152:358‐364.            145