MATING  SYSTEM  AND  THE  EVOLUTION  OF  STAMEN  MORPHOLOGY  IN  THE   MUSTARD  FAMILY  (BRASSICACEAE)     By     Anne  Michelle  Royer                           A  DISSERTATION     Submitted  to   Michigan  State  University   in  partial  fulfillment  of  the  requirements   for  the  degree  of     Plant  Biology  –  Doctor  of  Philosophy   Ecology,  Evolutionary  Biology  and  Behavior  –  Dual  Major     2014     ABSTRACT     MATING  SYSTEM  AND  THE  EVOLUTION  OF  STAMEN  MORPHOLOGY  IN  THE   MUSTARD  FAMILY  (BRASSICACEAE)     By     Anne  Michelle  Royer     Biotic  diversity  is  characterized  by  patterns  of  both  divergence  and   similarity.  Both  natural  selection  and  constraint  may  operate  to  conserve  a  trait   across  related  species,  depending  on  the  ecology  of  the  species.  My  dissertation   investigates  the  roles  of  these  evolutionary  forces  in  maintaining  a  family-­‐diagnostic   stamen  morphology.  Flowers  in  the  Brassicaceae  (mustard  plant  family)  are   characterized  by  four  long  and  two  short  stamens  within  a  flower  (Zomlefer  1994).   Although  found  in  >95%  of  the  genera  in  the  family  (Endress  1992),  the  reason(s)   for  the  widespread  conservation  of  this  morphology  are  not  known.   Existing  adaptive  hypotheses  for  the  evolution  and  the  maintenance  of   tetradynamy  address  how  the  trait  could  increase  fitness  for  outcrossing  species.   While  there  is  some  evidence  that  tetradynamy  is  adaptive  in  self-­‐incompatible   members  of  the  Brassicaceae  (e.g.  Kudo  2003;  Conner  et  al.  2009),  how  it  functions   is  not  clear.  Additionally,  there  have  been  multiple  independent  losses  of  self-­‐ incompatibility  in  the  family  (Lloyd  1965;  Mable  et  al.  2005),  followed  in  some  cases   by  the  evolution  of  high  self-­‐pollination  rates  (Preston  1986).  In  these  highly  selfing   species,  the  maintenance  of  short  stamens,  which  general  appear  too  short  to   pollinate  the  stigma  within  a  flower  (Müller  1961),  is  particularly  mysterious.       My  dissertation  unites  approaches  from  evolution,  ecology,  and  genetics  to   understand  the  maintenance  of  short  stamens  in  the  Brassicaceae  across  the  full   range  of  mating  systems.  I  investigate  the  function  and  morphology  of  short  stamens   in  three  species:  the  obligately  outcrossing  wild  radish  (Raphanus  raphanistrum),   the  highly  selfing  model  plant  Arabidopsis  thaliana,  and  A.  thaliana’s  sister  species,   A.  lyrata,  which  includes  both  outcrossing  and  selfing  populations.   In  the  outcrossing  species  Raphanus  raphanistrum,  I  used  experimental   manipulations  in  arrays  exposed  to  pollination  in  the  field  to  show  that  having  more   stamens  increases  male  fitness,  and  female  fitness  is  also  affected  by  stamen   treatment.  There  were  some  indications  that  short  stamens  were  more  attractive  to   pollinators  at  high  overall  pollinator  visitation  rates.       In  the  highly  selfing  model  plant  Arabidopsis  thaliana,  I  showed  that  short   stamens  do  not  significantly  increase  fitness.  I  found  many  populations,  particularly   near  the  southern  end  of  the  geographic  range,  have  partially  lost  the  short  stamens.   Genetic  mapping  revealed  three  QTL  controlling  the  number  of  short  stamens,  with   strong  epistasis  greatly  reducing  their  individual  effects.  Ongoing  evolutionary  loss   of  non-­‐adaptive  short  stamens  in  Arabidopsis  thaliana  may  be  slowed  by  gene   interactions,  low  genetic  variance  in  the  north,  and  an  inbreeding  mating  system.       Finally,  I  investigated  the  evolution  of  floral  morphology  in  selfing  and   outcrossing  populations  of  the  mixed-­‐mating  Arabidopsis  lyrata.  I  found  that  while   relative  investment  in  female  fitness  has  increased  as  predicted  in  selfing   populations,  predicted  changes  in  size  and  evolution  of  short  stamens  have  not  yet   occurred.  This  may  be  consistent  with  recent  evolution  of  selfing,  continued   facilitation  of  pollination  by  insects,  and/or  constraint  on  the  evolution  of  short   stamens.                                           For  Toby,  who  taught  me  I’m  capable  of  things  I  wouldn’t  have  believed  possible,   and  Matt,  who  supported  and  loved  me  unconditionally.     iv   ACKNOWLEDGMENTS       I’m  grateful  first  to  Jeff  Conner  for  his  tireless  dedication  as  an  advisor.  He   has  been  an  exceptional  editor,  an  encouraging  mentor,  and  an  inspiration  with  his   continuing  enthusiasm  for  the  unfolding  questions  being  pursued  in  his  lab.  He   always  made  sure  I  had  what  I  needed  to  do  the  work  I  wanted  to  do,  and  I  rarely   had  to  wait  to  get  requested  feedback.       My  other  three  committee  members  have  also  played  essential  roles  in  my   development.  Doug  Schemske  hosted  me  in  his  lab  as  a  new  graduate  student  on   campus,  eventually  supporting  me  in  ongoing  collaborations  with  his  lab  that  have   been  some  of  my  most  productive  projects.  I’ve  benefitted  immeasurably  from  the   time  he’s  spent  pushing  me  to  think  harder  and  follow  my  dreams.  Jen  Lau  offered   me  support  and  mentoring  at  KBS,  especially  since  our  sons  were  born  and  in  the   last  year  when  Jeff  was  on  sabbatical.  Ian  Dworkin  also  offered  an  important  unique   perspective  on  my  research,  with  particular  contributions  to  the  genetic  mapping   section  and  several  of  the  future  directions  that  will  hopefully  develop  in  the  next   few  years.     Financial  support  for  the  work  in  this  dissertation  came  from  NSF  grants  to   Jeff  and  Doug  and  MSU  funds  to  me,  particularly  KBS  Lauff  and  Porter  funds.  The   BEACON  and  GK-­‐12  programs  supported  me  for  several  years  and  helped  me   achieve  my  goals  of  integrating  teaching  and  research.  Thanks  to  Tom  Getty  for   involving  me  in  both  programs  and  being  the  most  encouraging  faculty  member  at   KBS.  Louise  Mead  at  BEACON  was  also  a  key  mentor  in  my  education  pursuits,  and   my  students  2008-­‐2014  have  inspired  and  motivated  me.     v     Jeff’s  excellence  as  an  advisor  includes  his  ability  to  bring  together  a  great   group  of  people.  I  was  lucky  to  spend  much  of  my  time  at  KBS  with  my  lab-­‐sister   Raffica  LaRosa  (a  comrade  in  good  times  and  bad,  research  and  personal  life)  and   lab  manager  extraordinaire  Cindy  Mills,  who  served  as  a  sounding  board  and   compatriot  in  years  of  counting  stamens  and  running  gels.  Other  characters  that   have  also  played  important  parts  in  my  time  in  the  Conner  lab  include  Sam   Slowinski  (2009  REU  and  coauthor  on  my  radish  work),  “younger”  labmates  Sam   Perez  and  Amanda  Charbonneau,  2013  REU  Marvin  Osborne,  who  counted  many   pollen  grains,  and  a  long  list  of  other  summer  undergraduates  Jeff  supported  to  help   me  with  my  work  over  the  years.     My  colleagues  at  Kellogg  Biological  Station  made  it  a  fantastic  place  to  work   through  their  enthusiasm  for  scientific  discussions,  side  projects,  and  all  other  kinds   of  fun.  In  no  particular  order,  I’m  particularly  indebted  to  Colin  Kremer,  Mike  Grillo,   Todd  Robinson,  Lauren  Kinsman,  Emily  Grman,  Rachel  Prunier,  Idelle  Cooper,  Liz   Schultheis,  Kane  Keller,  Casey  terHorst,  and  Tomomi  Suwa.  Amanda  Posto  at   Indiana  University  was  also  an  influential  friend  and  collaborator.       On  a  personal  level,  I  want  to  thank  my  yoga  teacher  Karina  Mirsky  and  the   community  at  Sangha  Yoga  in  Kalamazoo  for  getting  me  through  grad  school   happier  and  healthier  than  I  was  when  I  started.  Finally,  I’m  grateful  to  my  family  for   believing  in  me  and  supporting  me  in  so  many  ways.                 vi   TABLE  OF  CONTENTS         LIST  OF  TABLES                     LIST  OF  FIGURES                     CHAPTER  1                       INTRODUCTION                   Background                     Organization  of  Dissertation                               CHAPTER  2                     STAMEN  FUNCTION  IN  WILD  RADISH  DEPENDS  ON  POLLINATOR                         VISITATION  RATE                     Introduction                     Methods                       Field  experiment                   Male  and  female  fitness  estimates               Analysis                   Results                       Slow  release  hypothesis                 Trait  specialization  –  long  stamen  attraction  hypothesis       Discussion                     Acknowledgements                   CHAPTER  3                     ONGOING  LOSS  OF  A  CONSERVED  TRAIT:  LACK  OF  FUNCTION,                             LATITUDINAL  PATTERNS,  AND  GENETIC  CONSTRAINTS         Introduction                       Methods                     Results                     Discussion                     Acknowledgements                   CHAPTER  4                     EARLY  EVOLUTION  OF  SELFING  IN  ARABIDOPSIS  LYRATA  INCLUDES                       CHANGES  IN  SEX  ALLOCATION  BUT  NOT  FLOWER  SIZE           Introduction                     Methods                       Field  common  garden                 Greenhouse  common  garden               Floral  measurements               Results                     Discussion                     vii   ix   x   1   1   1   2     5   5   5   9   9   12   14   15   15   21   23   29   30   30   30   32   33   39   40   42   42   42   47   48   49   51   53   63       Acknowledgements                 CHAPTER  5                   SUMMARY  AND  FUTURE  DIRECTIONS             Summary                   Future  Directions                 APPENDIX                     Growth  conditions  for  Arabidopsis  thaliana         Experiment:  function  of  A.  thaliana  short  stamens  in  selfing     Geographic  variation  in  A.  thaliana  short  stamen  production     QTL  mapping                   A.  thaliana  candidate  gene  search             LITERATURE  CITED                   viii     65           66   66   66   66               69   70   71   78   78   92     93   LIST  OF  TABLES         Table  1.  Insect  visitors  observed  visiting  experimental  plants.       17     Table  2.  Effects  of  stamen  treatment  and  pollinator  visitation  rate  on  male                             and  female  fitness.                   18     Table  3.  Effects  of  stamen  treatment  and  overall  pollinator  visitation  rate                                     on  visits  to  individual  plants.               22     Table  4.  Arabidopsis  lyrata  populations  and  sampling  scheme         45     Table  5.  Models  of  trait  differences  between  populations  and  mating                                             systems                       54     Table  6.  Models  testing  for  increased  variance  in  short  stamen  length  with                           shift  to  self-­‐pollination                   60     Table  7.  Accessions  included  in  the  study  of  geographic  variation  in  short                     stamen  production                     70     Table  8.  Testing  function  of  short  stamens             75     Table  9.  Plants,  lines,  and  flowers  sampled  for  QTL  analysis         78     Table  10.  Locations  and  95%  credible  intervals  for  main-­‐effect  QTL  peaks     86     Table  11.  Significance  of  main  effects  and  interactions           87     Table  12.  Number  that  fall  within  QTL  for  stamen  loss  in  Arabidopsis                                 thaliana                     88     Table  13.  Details  for  candidate  genes               89     Table  14.  Results  of  three  models  in  R/qtl               90         ix   LIST  OF  FIGURES         Figure  1.  Experimental  stamen  removal  treatments  applied  to  flowers.     10     Figure  2.  Male  fitness  of  2  vs.  4-­‐staminate  treatments  over  varying                                   pollinator  visitation  rates.                 16     Figure  3.  Male  fitness  of  with  different  stamen  treatments  over  varying                 pollinator  visitation  rates.                 19     Figure  4.  Female  fitness  by  treatment             20     Figure  5.  Square-­‐root  transformed  pollinator  visitation  rates  of  different       treatments  over  varying  overall  pollinator  visitation         24       Figure  6.  Female  fitness  of  with  different  stamen  treatments  over  varying       pollinator  visitation  rates                 26     Figure  7.  Effect  of  stamen  removal  on  per-­‐flower  seed  set       31     Figure  8.  Geographic  trends  in  short  stamen  number         34     Figure  9.  Main  effects  of  QTL               36     Figure  10.  Epistasis  imposes  evolutionary  constraint  on  short  stamen  loss     37     Figure  11.  Arabidopsis  lyrata  flower  preserved  in  alcohol,  with  linear               measurements  marked                   44     Figure  12.  Self-­‐pollinating  populations  produce  more  ovules  per  flower     55     Figure  13.  Self-­‐pollinating  populations  produce  less  pollen,  and  short                                   stamen  anthers  produce  more  pollen  than  long  stamen  anthers       56     Figure  14.  Pollen:ovule  ratio  is  lower  in  selfing  populations         57     Figure  15.  Greater  herkogamy  in  selfing  populations  in  the  field  is  due  to                         longer  pistils                       59     Figure  16.  Distribution  of  seed  set  in  stamen  removal  treatments       74     Figure  17.  Main-­‐effect  QTL  using  stepwise  analysis  on  the  complete             untransformed  data  with  no  epistasis  in  R/qtl               81       x   Figure  18.  Epistasis  results  in  reduced  short  stamen  loss         82     Figure  19.  Epistasis  results  in  fewer  effective  paths  to  evolution  of  stamen                               loss  by  natural  selection                   83     Figure  20.  Distribution  of  mean  short  stamen  production  in  the                                         recombinant  inbred  lines                   84         xi   CHAPTER  1     INTRODUCTION   Background   Biotic  diversity  is  characterized  by  patterns  of  both  divergence  and   similarity.    In  closely  related  organisms,  similarity  due  to  conserved  traits  can  be  the   result  of  current  adaptation  or  constrained  evolution  of  an  ancestral  trait.    From   compound  flowers  in  the  sunflower  family  to  reduced  wing  number  in  flies,   conserved  traits  are  a  ubiquitous  feature  of  life  on  earth,  but  it  can  be  challenging  to   discern  whether  these  traits  are  adaptive  or  simply  relics  of  a  shared  evolutionary   past.  Both  selection  and  constraint  may  be  operating  to  conserve  a  trait  across   related  species,  depending  on  the  ecology  of  the  species.  My  dissertation   investigates  the  roles  of  selection  and  constraint  in  maintaining  a  family-­‐diagnostic   stamen  morphology.  Flowers  in  the  Brassicaceae  (mustard  plant  family)  are   characterized  by  tetradynamy  (having  four  long  and  two  short  stamens  within  a   flower)  (Zomlefer  1994).  Although  it  is  found  in  >95%  of  the  genera  in  the  family   (Endress  1992),  the  reason(s)  for  the  widespread  conservation  of  tetradynamy  are   not  known.   Existing  adaptive  hypotheses  for  the  evolution  and  the  maintenance  of   tetradynamy  address  how  the  trait  could  increase  fitness  for  outcrossing  species.   While  there  is  some  evidence  that  tetradynamy  is  adaptive  in  self-­‐incompatible   members  of  the  Brassicaceae  (e.g.  Kudo  2003;  Conner  et  al.  2009),  even  in  these   exclusively  outcrossing  species,  the  function  of  tetradynamy  is  not  clear.  Although   self-­‐incompatibility  is  widespread  in  the  family,  there  have  been  multiple     1   independent  losses  of  self-­‐incompatibility  (Lloyd  1965;  Mable  et  al.  2005)  followed   in  some  cases  by  the  evolution  of  high  self-­‐pollination  rates  (Preston  1986).  In  these   highly  selfing  species,  the  maintenance  of  short  stamens,  which  general  appear  too   short  to  pollinate  the  stigma  within  a  flower  (Müller  1961),  is  particularly   mysterious.       My  dissertation  unites  approaches  from  evolution,  ecology,  and  genetics  to   understand  the  maintenance  of  short  stamens  in  the  Brassicaceae  across  the  full   range  of  mating  systems.  I  investigate  the  function  and  morphology  of  short  stamens   in  three  species:  the  obligately  outcrossing  wild  radish  (Raphanus  raphanistrum),   the  highly  selfing  model  plant  Arabidopsis  thaliana,  and  A.  thaliana’s  sister  species,   A.  lyrata,  which  includes  both  outcrossing  and  selfing  populations.   Organization  of  the  dissertation     Chapter  2:  In  collaboration  with  Jeffrey  Conner  and  Sam  Slowinski,  I   investigated  how  the  function  of  tetradynamy  changes  with  frequency  of  pollinator   visitation  in  the  self-­‐incompatible  wild  radish  (Raphanus  raphanistrum).  We  applied   stamen  removal  treatments  to  plants  that  were  placed  in  the  field  on  days  with  a   range  of  pollinator  visitation  frequencies.  This  allowed  us  to  separate  the  effects  of   short  stamens  alone,  long  stamens  alone,  within-­‐flower  dimorphism,  and  pollinator   abundance.  We  assessed  both  seeds  produced  per  flower  and  seeds  sired  per  flower   to  determine  if  selection  acted  differently  through  male  and  female  fitness.  We   found  no  single  treatment  consistently  performed  best,  but  both  female  and  male   fitness  were  significantly  affected  by  interactions  between  stamen  treatment  and   pollinator  visitation  rate.  Long  stamens  appear  to  serve  an  important  role  in     2   attracting  pollinators  when  floral  visitors  are  relatively  rare.  There  were  trends   suggesting  a  function  for  short  and  dimorphic  stamens  at  visitation  rates  higher   than  those  observed  in  our  experiment.     Chapter  3:  In  collaboration  with  Jeffrey  Conner  and  Douglas  Schemske,  I   tested  the  function  of  short  stamens  in  the  self-­‐pollinating  species  Arabidopsis   thaliana,  described  the  frequency  and  distribution  of  short  stamen  loss  in  the  native   range,  and  investigated  the  genetic  architecture  of  short  stamen  loss.  We  found  that   short  stamens  do  not  significantly  increase  selfed  seed  set.  Elimination  of  these   apparently  nonfunctional  organs  is  possible,  as  our  common  garden  study  showed   that  many  populations,  particularly  near  the  southern  end  of  the  geographic  range,   have  partially  lost  the  short  stamens;  this  coincides  with  a  previously  described   cline  in  genetic  variance,  with  greater  variance  in  the  south.  Genetic  mapping   revealed  three  QTL  controlling  the  number  of  short  stamens,  and  strong  epistasis   that  reduces  the  number  of  effective  pathways  for  stamen  loss.  These  results   suggest  that  evolutionary  loss  of  non-­‐adaptive  short  stamens  in  Arabidopsis  thaliana   is  underway,  but  may  be  slowed  by  gene  interactions,  an  inbreeding  mating  system,   and  low  genetic  variance  or  correlations  with  traits  that  vary  adaptively  with   latitude.       Chapter  4:    Loss  of  self-­‐incompatibility  in  some  Great  Lakes  populations  of   Arabidopsis  lyrata  has  led  to  variation  in  mating  system  from  self-­‐incompatible  to   highly  selfing.  I  used  this  natural  variation  to  test  general  expectations  for  floral   evolution  with  mating  system  shifts  as  well  as  specific  predictions  for  changes  in   investment  in  short  stamens  in  the  Brassicaceae.  I  explored  the  evolution  of  floral     3   morphology  with  mating  system  shift  by  measuring  floral  morphology  and  counting   pollen  grains  from  two  highly  selfing  and  five  outcrossing  populations.    I  found  that   sex  allocation  shifted  as  predicted  with  the  evolution  of  selfing;  selfing  populations   produce  less  pollen  and  more  ovules  per  flower,  resulting  in  a  decreased   pollen:ovule  ratio.  The  decrease  in  floral  size  that  generally  accompanies  the   evolution  of  self-­‐pollination  is  not  apparent  in  A.  lyrata.  Close  inspection  of  flowers   of  both  selfing  and  outcrossing  populations  showed  that  contact  between  short   anthers  and  receptive  stigmas  is  extremely  rare.  This  suggests  that,  as  in  sister   species  A.  thaliana,  short  stamens  are  unlikely  to  contribute  to  selfed  seed  in  A.   lyrata.  However,  there  were  no  indications  of  a  reduction  in  investment  in  short   stamens  in  selfing  populations  (no  flowers  lacking  short  stamens  or  greater   reduction  in  pollen  production  in  short  stamen  anthers  relative  to  long  stamen   anthers)  or  relaxed  selection  on  short  stamen  position  (no  difference  in  variance  in   stamen  length  between  selfing  and  outcrossing  populations).         4   CHAPTER  2   STAMEN  FUNCTION  IN  WILD  RADISH  DEPENDS  ON  POLLINATOR  VISITATION   RATE   Introduction   The  diversity  of  floral  morphology  has  been  of  interest  to  evolutionary   biologists  since  Darwin  (Darwin,  C.H.  1862,  1876,  1877;  Barrett  2010),  with  many   studies  aiming  to  understand  the  function  of  these  reproductive  traits  (Harder  and   Johnson  2009).  Insect  pollination  may  have  played  a  large  role  in  the  rapid  radiation   of  angiosperms  (Grimaldi  1999;  Friedman  2009),  with  ~87%  of  the  >350,000  extant   flowering  plant  species  pollinated  by  animals  (Ollerton  et  al.  2011).  For  these   species,  understanding  interactions  with  pollinators  is  critical  to  gaining  insight  into   the  evolution  of  their  floral  traits.     Though  rarely  the  most  conspicuous  floral  trait,  stamens  exhibit   morphological  variation  to  rival  any  other  floral  structure.    Two  examples  with   adaptive  hypotheses  are  the  precise  delivery  system  offered  by  pollinia,  which   evolved  independently  in  orchids  and  milkweeds,  and  the  reduced  pollen  waste  in   poricidal  buzz-­‐pollinated  anthers,  which  are  found  in  65  different  angiosperm   families  (De  Luca  and  Vallejo-­‐Marín  2013).  Heteranthery,  having  different  anther   forms  within  a  single  flower,  has  also  evolved  independently  multiple  times  and   exists  in  at  least  16  families  of  flowering  plants  (Vallejo-­‐Marin  et  al.  2010).  This  can   take  several  forms,  including  feeding  versus  pollinating  anthers  that  differ  in  size,   color,  and  position  (Vallejo-­‐Marin  et  al.  2010);  stamens  of  different  heights     5   coordinated  with  styles  of  different  heights  (heterostyly)(Barrett  1992);  and   stamens  of  different  heights  with  constant  style  height.     The  tetradynamous  stamen  condition,  with  a  single  style  height  but  each   flower  having  four  long  stamens  and  two  short  stamens,  is  a  form  of  heteranthery   diagnostic  for  the  Brassicaceae  (the  mustard  family).  The  condition  is  largely   conserved  across  this  large  and  diverse  family,  and  may  be  maintained  by  natural   selection  or  constraint.  All  studies  of  tetradynamy  have  been  in  Raphanus   raphanistrum  (wild  radish)  and  the  closely  related  Brassica  rapa  (canola).  In  these   outcrossing  members  of  the  mustard  family,  results  indicate  that  the  trait  is   adaptive  (at  least  in  some  circumstances)  (e.g.  Kudo  2003;  Conner  et  al.  2009),  but   how  it  functions  is  unclear.  There  are  three  non-­‐mutually  exclusive  hypotheses  for   how  heteranthery  may  increase  plant  fitness:  division  of  labor,  slow  release  of   pollen,  and  trait  specialization.     The  division  of  labor  hypothesis  classifies  anthers  as  “feeding”  or   “pollinating”  structures,  and  dates  back  to  Fritz  Müller,  one  of  Darwin’s   contemporaries  (Müller  1883).  Under  this  hypothesis,  pollinators  forage  primarily   on  short  anthers.  This  positions  their  bodies  to  more  efficiently  pick  up  pollen  from   the  long  anthers  and/or  deposit  it  on  the  stigma.  There  is  solid  support  for  this   mechanism  in  members  of  the  Melastomataceae  (Luo  et  al.  2008)and  Solanaceae   (Vallejo-­‐Marin  et  al.  2009).  However,  there  are  several  reasons  to  doubt  the   applicability  of  the  positioning  hypothesis  to  the  Brassicaceae.  Poricidal  anthers  and   lack  of  nectar  characterize  most  heterantherous  taxa,  but  not  the  Brassicaceae   (Vallejo-­‐Marin  et  al.  2010).  In  both  species  with  good  evidence  of  separate  feeding     6   and  pollinating  anthers,  the  feeding  stamens  are  longer,  with  anthers  that  are   darker,  larger,  and  produce  more  pollen  (Luo  et  al.  2008;  Vallejo-­‐Marin  et  al.  2009).   Wild  radish  differs  from  this  syndrome  in  many  respects.  In  addition  to  abundant   nectar  production  and  easily  accessible  pollen  with  no  color  difference  between   anther  types,  the  short  rather  than  long  anthers  are  larger  with  more  pollen,  and   pollen  feeders  remove  less  pollen  per  visit  from  short  than  long  anthers  (Conner  et   al.  1995).  Because  the  classic  division  of  labor  hypothesis  is  unlikely  to  apply  to   tetradynamy,  we  focus  instead  on  the  slow  release  and  trait  specialization   hypotheses.     The  slow  release  of  pollen  hypothesis  for  the  maintenance  of  tetradynamy   posits  that  both  long  and  short  stamens  primarily  produce  pollen  for  export,  but   they  optimize  male  fitness  at  different  pollinator  visitation  rates.  Theory  shows  that   quick  release  of  pollen  is  adaptive  when  pollinators  are  rare,  whereas  slow  release   of  pollen  increases  the  number  of  seeds  sired  when  pollinator  visitation  rates  are   high  (Harder  and  Thomson  1989).  Previous  work  indicates  that  in  R.  raphanistrum,   fewer  pollen  grains  are  removed  per  visit  from  short  than  long  stamens  (Conner  et   al.  1995),  from  experimentally  manipulated  flowers  with  both  long  and  short   stamens  compared  to  flowers  with  only  long  stamens  (Conner  et  al.  2003),  and  from   flowers  with  naturally  greater  difference  in  anther  heights.  It  is  clear  that   tetradynamy  slows  pollen  release;  it  has  not  been  established  whether  this   mechanism  results  in  increased  fitness  (although  Conner  et  al.  [2003]  did  find   stabilizing  selection  on  dimorphism  across  three  years).       7   Finally,  the  trait  specialization  hypothesis  posits  that  traits  may  be   adaptations  to  a  subset  of  interacting  species  (Sahli  and  Conner  2011);  in   tetradynamy,  this  could  mean  that  long  anthers  increase  plant  fitness  when   interacting  with  one  pollinator  type,  and  short  stamens  function  best  with  another   pollinator  type.  Combining  selection  from  these  disparate  pollinator  groups  could   result  in  net  selection  to  maintain  tetradynamy  in  the  generalist  R.  raphanistrum.   From  a  trait  specialization  perspective,  short  stamens,  which  are  inserted  in  the   floral  tube  directly  above  the  nectaries,  may  be  adaptations  for  nectar-­‐feeding   pollinators.    For  pollinators  that  consume  pollen,  stamens  can  serve  an  important  role  in   attracting  visitors  to  the  flower  (e.g.  Lunau  2000;  Luo  et  al.  2008).  Syrphid  flies,   which  are  common  and  effective  pollinators  of  R.  raphanistrum  (Sahli  and  Conner   2007),  have  been  shown  to  make  more  frequent  and  lengthier  visits  to  Brassica  rapa   flowers  that  have  more  anthers  in  an  anther  removal  experiment  (Golding  et  al.   1999).  In  R.  raphanistrum,  flowers  artificially  selected  to  have  less  dimorphism   (which  results  in  more  visible  short  stamens)  receive  more  and  longer  visits  from   bees  (Sapir  et  al,  in  prep).  Pollen-­‐feeding  insects  make  the  majority  of  visits  in   nearly  all  studies  of  R.  raphanistrum  pollination  (Conner  et  al.  2009),  so  it  is   plausible  that  the  role  of  long  stamens  in  pollinator  attraction  results  in  higher  plant   fitness.   We  tested  the  slow  release  hypothesis  and  the  role  of  long  stamens  in   attraction  using  stamen  removal  experiments,  pollinator  observations,  and     8   measures  of  male  and  female  fitness  across  a  range  of  pollinator  visitation  rates  in   wild  radish  Raphanus  raphanistrum,  (Brassicaceae).     Methods   Field  experiment   In  2009,  we  grew  104  Raphanus  raphanistrum  using  seed  collected  from  a   wild  population  near  Binghamton,  NY  (Conner  and  Via  1993).    Each  plant  in  our   study  was  grown  from  a  seed  collected  from  a  unique  field  maternal  plant.    In  early   June,  we  sowed  4-­‐7  seeds  in  10cm  pots  with  MetroMix  potting  soil  and  ½  tsp   Osmocote  Plus  15-­‐9-­‐12  fertilizer  (Scott’s  Company  LLC)  in  a  pollinator-­‐free   greenhouse  at  Kellogg  Biological  Station  (KBS).    They  were  grown  with  16-­‐hour,   24°C  days  and  8-­‐hour,  20°C  nights.    Seedlings  were  thinned  to  one  plant  per  pot  at   the  two-­‐adult-­‐leaf  stage.   We  randomly  assigned  96  plants  to  one  of  four  arrays  of  24  plants  each.     Throughout  the  experiment,  the  other  eight  plants  (1-­‐3  per  array)  were  used  as   substitutes  for  plants  without  enough  flowers.    On  the  morning  an  array  was  taken   into  the  field,  each  plant  was  assigned  one  of  four  stamen  treatments  in  a  stratified   random  design  (Figure  1):  two  short  stamens  (2S),  two  long  stamens  (2L),  two  long   stamens  and  two  short  stamens  (2L2S),  and  four  long  stamens  (4L).  Plants  were   reduced  to  12  flowers  each  spaced  as  evenly  as  possible  across  the  available  display.   There  were  a  few  accidental  deviations  from  the  intended  flower  number  of  12,   which  were  noted  during  pollinator  observations.  All  fitness  measures  were   adjusted  to  a  per-­‐flower  basis  to  correct  for  this  small  variation  in  flower  number.   Each  flower  received  the  plant’s  assigned  treatment  by  plucking  anthers  just  below       9     Unmanipulated,R.#raphanistrum,flower, pis2l, short,stamens, 4L,, ! ! long,stamens, 2L2S, X! X! X! 2L, !X! ! ! X! ! X! X! 2S, , ! X! !X! X! !X! X!   Figure  1.  Experimental  stamen  removal  treatments  applied  to  flowers.  Long   stamens  are  represented  by  black  circles  with  white  dots,  shorts  stamens  by  white   circles  with  black  dots.  All  of  the  flowers  of  each  plant  placed  in  the  field  were  given   one  of  four  stamen  removal  treatments:  Four  long  (4L;  both  short  stamens   removed),  2  long  2  short  (2L2S;  two  long  stamens  removed),  two  long  (2L;  two  long   and  both  short  stamens  removed),  or  two  short  (2S;  all  four  long  stamens  removed).       10   their  attachment  to  the  filaments  with  fine  forceps.    To  control  for  disruption  caused   by  anther  removal,  the  forceps  were  also  placed  briefly  on  the  filament  below  each   anther  that  was  not  removed.    Flowers  were  marked  with  a  small  piece  of  colored   tape  on  the  pedicel  indicating  the  date  and  treatment.     Only  one  array  was  used  on  any  given  field  day.    Between  July  17th  and   August  27th,  three  of  the  arrays  went  in  the  field  four  times,  and  one  went  out  three   times  for  a  total  of  15  field  days.  Because  wild  radish  flowers  last  for  only  two  days   (Conner,  pers.  obs.),  and  an  average  of  84%  of  the  pollen  was  removed  from  intact   flowers  in  one  hour  in  a  previous  study  (Rush  et  al.  1995)  each  flower  was  only   exposed  to  pollination  on  a  single  day.    The  arrays  went  out  in  succession;  one  array   was  used  per  day,  after  which  the  plants  were  returned  to  the  greenhouse  for  at   least  seven  days  to  allow  any  fruits  to  begin  forming  undisturbed  (mean  =  12.92   days,  s.d.  =  4.56).  Arrays  were  not  set  up  on  rainy  or  windy  days,  as  pollinators  are   less  active  under  those  conditions  (Kevan  and  Baker  1983).   Each  array  of  24  plants  was  randomly  divided  into  eight  treatment  groups  of   three  plants  each.    Each  treatment  group  cycled  through  a  staggered  rotation  of  the   four  stamen  treatments.    Thus,  while  there  were  six  plants  per  treatment  each  day,   the  plants  in  each  treatment  group  and  the  order  in  which  the  eight  groups   experienced  treatments  varied.    This  meant  that  there  was  no  bias  among  treatment   groups  due  to  previous  treatments.  Each  plant  in  the  first  three  arrays  experienced   all  four  stamen  removal  treatments,  except  for  a  few  plants  that  were  replaced   because  they  had  less  that  12  flowers.       11   In  the  morning,  as  soon  as  flower  treatments  had  been  applied,  the  array  was   placed  in  an  old  field  with  no  naturally  occurring  R.  raphanistrum  and  a  variety  of   abundant  pollinator  taxa  known  to  visit  R.  raphanistrum  (Sahli  and  Conner  2007).     Plants  were  randomly  assigned  locations  1m  apart  in  a  six-­‐by-­‐four-­‐plant  grid.     Locations  were  held  constant  across  all  15  field  days;  but  the  placement  of  plants   within  these  locations  was  re-­‐randomized  on  each  field  day.     We  collected  data  on  visits  to  flowers  each  day  immediately  after  plants  were   placed  in  the  field.  We  aimed  to  observe  each  plant  every  day,  but  occasionally   weather  or  lack  of  personnel  interfered.    We  observed  8-­‐24  plants  per  day  (mean   20.47,  standard  deviation  5.99)  for  10  minutes  each,  giving  a  total  of  3070  minutes   of  pollinator  observations.    For  each  observation,  we  recorded  the  number  of   pollinators  that  visited  the  plant  and  identified  them  to  functional  group   (lepidopterans,  small  bees,  large  bees,  small  syrphid  flies,  large  syrphids,  and  other).     An  insect  was  required  to  contact  stamens  and/or  stigma  on  at  least  one  flower  to   count  as  a  pollinator.    Visiting  multiple  flowers  on  the  same  plant  consecutively  was   scored  as  one  visit,  but  leaving  the  plant  and  returning  was  recorded  as  two  visits.     For  a  subset  of  visitors,  we  also  recorded  the  total  number  of  flowers  probed  during   a  plant  visig,  how  long  each  floral  visit  lasted,  and  whether  the  insect  nectared.  We   collected  detailed  accounts  of  visits  from  230  individual  insects,  with  2-­‐43  detailed   visits  recorded  per  day  (mean  14.33,  SD  11.89).       Male  and  female  fitness  estimates   Tissue  samples  were  collected  from  each  plant  used  in  the  field  and  frozen  at   -­‐80°  C  for  genotyping.    All  fruits  were  removed  when  mature  and  seeds  were     12   counted  to  estimate  female  fitness.  Seed  set  was  unusually  and  inexplicably  low  for   7/17,  so  that  day  was  excluded  from  all  fitness  analyses  (pollinator  visitation  data   from  7/17  were  included).     To  estimate  male  fitness,  we  performed  paternity  analysis  on  1256  offspring,   with  mean  89.7  (SD  5.5)  offspring  per  field  day  and  3.8  (SD  1.2)  offspring  per  plant   per  field  day.  Seeds  were  sown  in  4cm  square  wells  in  72-­‐well  trays  with  MetroMix   and  two  tablespoons  of  Osmocote  per  tray.  Offspring  tissue  samples  were  collected   and  stored  at  -­‐80°  C.    Parent  and  offspring  DNA  was  extracted  using  MP  Biomedical’s   FastDNA  kit  and  the  FastPrep  instrument  (Carlsbad,  CA).    They  were  then  genotyped   at  four  microsatellite  loci  (Bn35d,  BRMS005,  Na14E08,  Ra2E11;   radish.plantbiology.msu.edu)  using  the  PCR  protocol  described  in  Sahli  et  al.  (2008).     We  scored  alleles  using  FMBIO  Analysis  8.0  (Hitachi  Software  Engineering  1991)   and  binned  them  with  Allelogram  2.2  (Manaster  2010).        Parent  genotypes  at  all  four  loci  were  confirmed  on  at  least  two  independent   gels,  with  one  exception.  One  locus  from  one  parent  had  persistent  errors  in  gels  and   was  inferred  from  the  offspring  using  the  program  GERUD  2.0  (Jones  2005).  After   excluding  one  offspring  from  this  maternal  plant  because  of  an  incompatible   genotype,  GERUD  was  able  to  infer  the  parental  genotype  from  the  remaining  12   offspring.   Paternity  analysis  was  performed  using  the  program  Cervus  3.0  (Kalinowski   et  al.  2007).    For  the  allele  frequency  analysis,  we  used  a  minimum  expected   frequency  of  5  with  a  Yates  correction  when  df=1  and  Bonferroni  correction  to   evaluate  significance.  We  simulated  10,000  offspring  genotypes  with  proportion  loci     13   typed  set  at  0.95  and  proportion  mistyped  at  0.01.  Offspring  with  fewer  than  two   loci  genotyped  were  excluded  from  the  analysis.  We  were  able  to  determine   paternity  with  80%  confidence  for  938  of  the  1256  offspring;  these  938  were  used   to  estimate  male  fitness.     Analysis   To  test  the  effects  of  stamen  treatment  and  pollination  visitation  rate  on   fitness,  we  used  ANCOVA  including  treatment,  mean  pollination  visitation  rate  for   each  field  day  (continuous),  and  interaction  between  treatment  and  pollination   visitation  rate  as  fixed  effects;  plant  ID  was  included  as  a  random  effect.  Formally,   this  model  is     w  ~  β0    +  βt  +  βp  +  βtxp  +  ε     β0  ~  N(β0i,  σ2β0)     Where  w  is  fitness  (seeds  produced  or  sired  per  flower,  both  relativized  by  the  mean   across  the  entire  experiment),  0  is  the  intercept,  t  is  the  stamen  removal  treatment,   p  is  the  mean  number  of  pollinator  visits  per  flower  per  hour,  and  i  is  the  individual   plant.  We  used  Tukey’s  Least  Square  Mean  Honestly  Significant  Difference  test  to   determine  differences  between  treatment  means.     The  same  model  was  used  for  male  fitness  (seeds  sired  per  flower)  and   female  fitness  (seeds  produced  per  flower),  both  of  which  produced  normally   distributed  residuals.  The  effect  of  total  stamen  number  on  fitness  was  tested  with     14   the  same  model,  but  with  treatments  categorized  as  four  stamens  (2L2S  &  4L)  or   two  stamens  (2S  &  2L).  To  test  the  effect  of  stamen  dimorphism,  the  model  was  run   with  only  the  treatments  with  four  stamens  (4L,  2L2S).  The  effect  of  long  vs.  short   stamens  was  isolated  by  running  the  model  with  only  the  two  staminate  treatments   (2S,  2L)   To  look  at  whether  pollinators  visited  treatment  at  different  rates,  we  used   ANCOVA  with  the  same  model  described  above,  with  w  as  visits  per  flower  per  hour   to  each  plant.  Heteroscedastic  residuals  were  ameliorated  by  square  root   transforming  visitation  rate.     All  analyses  were  performed  in  JMP  10.0.0.   Results   We  observed  a  total  of  261  insects  visiting  flowers.  Most  of  the  visits  were   from  flies  and  bees,  with  cabbage  butterflies  making  up  almost  all  the  rest  (Table  1).   Consistent  with  expectations,  treatments  with  more  stamens  had  higher  male   fitness  (Table  2,  Figure  2).   Slow  release  hypothesis   If  the  presence  of  short  stamens  increases  seed  siring  success  by  slowing  the   release  of  pollen  when  pollinators  are  abundant,  then  the  fitness  effects  of  short     stamens  will  depend  on  pollinator  visitation  rate.  At  low  rates  of  visitation,  flowers   with  more  long  stamens  should  sire  more  seeds  (2L  fathers  more  seed  than  2S;  4L   fathers  more  seed  than  2L2S).  At  high  rates  of  visitation,  we  expect  the  opposite,   with  the  dimorphic  treatment  (2L2S)  performing  best.         15   resid m no 2 vs. pollinator visitation rate per flower per hour trt stam# 2 r2#=)0.02) p#=)0.0496# 1.0 resid m no 2 Male)fitness)(seeds)sired)per)flower)) 4 r2#=)0.008) p#=)0.2593# 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 -0.2 -0.4 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 pollinator visitation rate per flower per hour 1.0 1.2 1.4 1.6 Pollinator)visita,on)rate)(visits)per)flower)per)hour))  Figure  2.  Male  fitness  of  2  vs.  4-­‐staminate  treatments  over  varying  pollinator   visitation  rates.  Fitness  relativized  by  the  mean  across  the  entire  experiment.   Residuals  of  a  model  including  only  Plant  ID.   16     Table  1.  Insect  visitors  observed  visiting  experimental  plants.  A  grand  total  of  261  insects  were  observed  visiting  flowers.   They  were  identified  to  the  lowest  taxonomic  category  possible  without  disturbing  their  behavior.  Percentages  are  reported,   with  raw  numbers  in  parentheses.             Bees   S  bee   33  %  (86)   Honey  bee   5%  (13)   Megachilid   2%  (5)   Bombus   6%  (15)   Total   46%  (119)   Flies   Butterflies   S  syrphid   7%  (18)   Pieris   11%  (28)   M  syrphid   17%  (45)       L  syrphid   16%  (42)       Muscid   0.4%  (1)       Total   40%  (106)   Total   11%  (28)   17   Other   Wasp   1%  (2)   Beetle   2%  (6)           Total   3%  (8)   Table  2.  Effects  of  stamen  treatment  and  pollinator  visitation  rate  on  male  and   female  fitness.  Treatments  were  modeled  three  different  ways  for  both  male  and   female  fitness,  designated  on  the  left  side  of  the  table  in  bold:  all  four  treatments   (4L,  2L2S,  2L,  2S),  treatments  with  two  stamens  compared  to  treatments  with  four   (4L  and  2L2S  vs.  2L  and  2S),  dimorphic  compared  to  monomorphic  (2L2S  vs  4L)  and   long  vs.  short  (2S  vs.  2L).  *Effects  significant  at  p  <  0.05.     Male fitness Female fitness (seeds sired per (seeds per flower) flower) All treatments Stamen treatment Pollinator visitation rate Stamen trt*pollinator rate df 3 1 3 F 3.58 2.46 2.71 p 0.0145* 0.1177 0.0453* df 3 1 3 F 12.66 0.01 2 p <0.0001* 0.9406 0.1136 Two vs. four stamens Stamen treatment Pollinator visitation rate Stamen trt*pollinator rate 1 1 1 4.9 2.31 5.96 0.0279* 0.1291 0.0152* 1 1 1 35.15 0.003 5.43 <0.0001* 0.9568 0.0204* 2L2S vs. 4L Stamen treatment Pollinator visitation rate Stamen trt*pollinator rate 1 1 1 6.68 0.44 0.86 0.0119* 0.5061 0.355 1 1 1 0.12 1.59 0.03 0.7329 0.2091 0.86 Two short vs. 2 long Stamen treatment Pollinator visitation rate Stamen trt*pollinator rate 1 1 1 1.31 9.75 4.03 0.2557 0.0027* 0.0489* 1 1 1 4.81 2.86 0.12 0.0308* 0.0926 0.7351     18   resid m no 2 vs. pollinator visitation rate per flower per hour Treatment resid m no 2 Male)fitness)(seeds)sired)per)flower)) 2L 1.0 2L2S r2#=)0.03) p#=)0.14# 2S r2#=)0.002) p#=)0.64# 4L r2#=)0.02) p#=)0.21# r2#=)0.02) p#=)0.26# 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 -0.2 -0.4 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 pollinator visitation rate per flower per hour Pollinator)visita,on)rate)(visits)per)flower)per)hour)) Figure  3.  Male  fitness  of  with  different  stamen  treatments  over  varying   pollinator  visitation  rates.  Fitness  relativized  by  the  mean  across  the  entire   experiment.  Residuals  of  a  model  including  only  plant  ID.       19     Female&fitness&(seeds&sired&per&flower)& seeds mothered per flower Mean(seeds mothered per flower) vs. Treatment A" 3.5 B" AB" AB" 2S 4L 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 2L 2L2S Treatment   Figure  4.  Female  fitness  by  treatment.  Bars  indicate  1SEM.  Shared  letters  indicate   lack  of  significant  difference  according  to  Tukey  HSD  test.         20   Contrary  to  predictions  for  the  slow  release  hypothesis,  we  found  a   significant  interaction  between  treatment  and  pollinator  visitation  rate  only  for  the   comparison  of  two  vs.  four  stamens,  and  there  was  no  difference  between  male   fitness  for  2L2S  and  4L  (Table  2,  Figure  3).  Stamen  treatment  did  have  significant   effects  on  female  fitness,  suggesting  that  the  slow  release  hypothesis  is  not  acting   alone,  if  at  all  (Table  2,  Figure  4).   Trait  specialization  –  long  stamen  attraction  hypothesis   If  stamens  increase  fitness  by  attracting  pollinators  to  the  flowers,  we  expect   higher  visitation  rates  to  treatments  with  more  stamens  (more  visits  to  2L2S  &  4L   than  2S  and  2L).  Because  long  stamens  are  more  visible  and  accessible,  we  also   would  expect  higher  visitation  rates  to  treatments  with  long  than  short  stamens   (more  visits  to  4L  than  2L2S,  and  more  visits  to  2L  than  2S.)     These  predictions  should  result  in  matching  patterns  for  male  and  female   fitness  at  low  visitation,  that  is,  higher  fitness  in  treatments  with  higher  visitation.  If   pollination  is  sufficient  to  fertilize  all  ovules,  we  expect  an  asymptote  of  seeds  per   fruit  at  high  visitation.  Male  fitness  at  high  visitation  is  likely  to  be  dictated  by   gamete  number,  so  treatments  with  four  stamens  should  outperform  those  with     two.  Because  short  stamens  have  more  pollen,  our  detailed  prediction  for  male   fitness  at  high  visitation  would  be     2L  <  2S  <<  4L  <  2L2S.     We  found  no  main  effect  of  stamen  removal  treatment  on  pollinator   visitation  rate  to  flowers  of  each  treatment  (Table  3).  This  suggests  a  lack  of  support   for  the  attraction  hypothesis.  However,  there  is  a  significant  interaction  with  overall       21   Table  3.  Effects  of  stamen  treatment  and  overall  pollinator  visitation  rate  on   visits  to  individual  plants.  Overall  pollinator  visitation  rate  is  the  average  across   all  plants  on  a  give  field  day;  visits  to  individual  plants  were  always  strongly   influenced  by  this.  Visit  number  per  flower  per  hour,  square  root  transformed.   Model  was  run  with  and  without  the  highest  pollinator  visitation  day.  *Effects   significant  at  p  <  0.05.   High visitation day All days included excluded       All treatments Stamen treatment Pollinator visitation rate Stamen trt*pollinator rate df 3 1 3 F 0.45 91.94 2.00 p 0.7191 <0.0001* 0.1137 df 3 1 3 F 0.36 66.07 0.96 p 0.7848 <0.0001* 0.4101 Two vs. four stamens Stamen treatment Pollinator visitation rate Stamen trt*pollinator rate 1 1 1 1.08 92.55 0.12 0.2992 <0.0001* 0.7294 1 1 1 1.15 68.19 0.56 0.2843 <0.0001* 0.4532 2L2S vs. 4L Stamen treatment Pollinator visitation rate Stamen trt*pollinator rate 1 1 1 0.005 42.30 0.08 0.9448 <0.0001* 0.7741 1 1 1 0.02 32.28 0.67 0.9016 <0.0001* 0.4151 Two short vs. 2 long Stamen treatment Pollinator visitation rate Stamen trt*pollinator rate 1 1 1 0.31 41.35 5.03 0.5798 <0.0001* 0.0264* 1 1 1 0.0139 27.31 0.80 0.9065 <0.0001* 0.3735   22   visitation  across  days  for  the  2L  vs  2S  treatment  comparison  (Table  3);  as  overall   visitation  rate  increases,  visits  to  the  2S  treatment  increase  faster  than  visits  to  the   2L  treatment  (Figure  5).  Although  it  is  not  significant,  the  same  trend  exists  in  the   2L2S  vs.  4L  comparison,  with  higher  visitation  to  the  dimorphic  than  the   monomorphic  treatment  at  high  overall  visitation  rates  (Figure  5).  Both  patterns  are   consistent  with  long  stamens  attracting  pollinators  at  low  visitation  frequencies.   There  were  considerably  more  visitors  per  flower  on  our  highest  visitation  day  than   any  other,  so  we  also  tried  eliminating  it  from  the  analyses.  When  we  do  this,  the   significant  interactions  between  per-­‐treatment  visitation  and  overall  visitation   disappear  (Table  3).   Discussion   Support  for  the  slow-­‐release  hypothesis  was  weak.  This  may  be  because  it  is   predicted  to  operate  at  high  pollinator  visitation,  but  the  visitation  rates  we   observed  are  low  for  R.  raphanistrum  (0.6  –  3  visits  per  hour,  Conner,  unpublished   data;  2-­‐6  visits  per  hour,  Rush  et  al  [1995];  up  to  9.5  visits  per  hour,  Young  and   Stanton  [1990]).  Because  it  predicts  no  effect  on  female  fitness  but  female  fitness     effects  were  found,  we  can  conclude  that  it  certainly  does  not  operate  alone.  It  is   also  possible  that  the  slow-­‐release  model  does  not  apply  to  R.  raphanistrum;  while   Thomson  and  Harder  (1989)  does  not  include  simultaneous  vs.  staggered  flower   opening  in  the  model,  later  work  incorporating  variation  in  stigma  presentation   time  shows  that  when  flowers  open  simultaneously,  rapid  release  of  pollen  is   adaptive  at  high  pollinator  visitation  (Stanton  1994).  Wild  radish  often  has  a  few   flowers  open  throughout  the  day,  but  most  open  together  in  the  early  morning       23   square root # visits %Square%root%visits%per%plant%(per%flower%per%hour)% square root # visits vs. day means poll visit per flower per hour 2.5 2L *% Treatment 2L2S 2S *% 4L 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 0.0 0.4 0.8 day means poll visit per flower per hour 1.2 1.6 Mean%pollinator%visits%to%en.re%array%(per%flower%per%hour)% Figure  5.  Square-­‐root  transformed  pollinator  visitation  rates  of  different   treatments  over  varying  overall  pollinator  visitation.  Slopes  of  the  2L  and  2S   treatments  are  significantly  different  from  each  other  (Table  3);  the  only  other   pairwise  comparison  made,  2L2S  vs  4L,  was  not  significant.             24     (Stanton  1994,  personal  observation),  throwing  the  relevance  of  the  slow-­‐release   hypothesis  into  question.  Regardless,  experiments  at  higher  pollinator  visitation   rates  would  be  necessary  to  convincingly  test  this  hypothesis.   Rather  than  playing  a  consistent  role  in  pollinator  attraction,  the   contribution  of  stamens  to  bringing  floral  visitors  in  depends  on  overall  visitation   rate,  with  trends  of  treatments  with  more  long  stamens  garnering  more  visits  when   fewer  pollinators  were  around.  Both  male  and  female  fitness  of  the  two-­‐staminate   treatments  increased  with  more  visitation,  suggesting  that  at  low  visitation   pollinators  may  be  more  likely  to  visit  the  more  rewarding  four-­‐staminate   treatments.  Female  fitness  in  the  2L  treatment  increased  more  rapidly  with  higher   visitation  rates  than  in  the  2S  treatment  (Figure  6),  which  would  be  consistent  with   the  more  apparent,  and  more  easily  accessed,  long  stamens  attracting  pollinators.  At   these  low  pollinator  visitation  rates,  attraction  may  be  one  of  the  primary  functions   of  anthers;  at  higher  rates,  the  slow-­‐release  function  could  also  come  into  play.     Having  more  flowers  increases  pollinator  visitation  in  radish  (Conner  and   Rush  1996),  so  one  likely  reason  for  the  low  visitation  rates  we  observed  is  reduced     display.  The  labor-­‐intensive  stamen  removal  treatments  meant  we  could  only   include  12  flowers  per  plant,  whereas  unmanipulated  wild  radish  can  easily  produce   over  50  flowers  at  a  time,  and  sometimes  up  to  several  hundred  (Conner  and  Rush   1996).  Having  relatively  few  plants  would  have  exacerbated  this.  Because  the  arrays   were  only  exposed  to  pollinators  for  a  few  hours  at  a  time,  per  flower  total  visitation   was  also  lower  than  normal;  in  the  wild,  flowers  are  generally  open  for  two  days   (Young  and  Stanton  1990).         25   resid f no 2 vs. pollinator visitation rate per flower per hour Treatment Female)fitness)(seeds)produced)per)flower)) resid f no 2 5 2L r2#=)0.06) p#=)0.04*# 4 2L2S r2#=)0.005) p#=)0.51# 2S 2 r #=)0.03) p#=)0.10# 4L 2 r #=)0.05) p#=)0.04*# 3 2 1 0 -1 -2 -3 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 0.0 0.4 0.8 pollinator visitation rate per flower per hour 1.2 1.6 Pollinator)visita,on)rate)(visits)per)flower)per)hour)) Figure  6.  Female  fitness  of  with  different  stamen  treatments  over  varying   pollinator  visitation  rates.  Fitness  relativized  by  the  mean  across  the  entire   experiment.  Residuals  of  a  model  including  only  plant  ID.           26     Although  visitation  rates  this  low  would  not  be  expected  over  an  entire   season,  cold  or  rainy  weather  could  easily  result  in  low  visitation  for  a  subset  of  the   flowers  produced  in  a  year.  Certainly  some  flowers  will  experience  a  low-­‐visitation   environment,  and  our  results  give  insight  into  how  stamens  function  on  those  days.   It  makes  sense  for  the  plants  to  evolve  strategies  that  work  across  a  range  of   visitation  rates.  Normal,  high  visitation  rates  to  R.  raphanistrum  result  in  rapid   depletion  of  pollen  (Young  and  Stanton  1990;  Rush  et  al.  1995).  Under  these   circumstances,  we  expect  seed  set  to  not  be  pollen-­‐limited  (Burd  1994).   Accordingly,  variation  in  floral  morphology  has  generally  been  found  to  have  no   effect  on  female  fitness  (Stanton  et  al.  1986;  Young  and  Stanton  1990;  Conner  et  al.   1996),  although  Conner  et  al  (1996)  did  find  selection  through  female  fitness  to   increase  flower  size  in  one  year,  and  Pfennig  and  Conner  (1997)  found  weak  pollen   limitation  of  fruit  set.  Because  variation  in  visitation  rate  clearly  influences  how   stamens  function,  and  most  studies  have  studied  effects  at  high  visitation  rates,  this   study  fills  an  important  gap  in  our  understanding  of  how  variation  in  interspecific   interactions  affects  adaptation.   Optimal  foraging  theory,  which  makes  predictions  about  how  animals  change   their  feeding  behavior  to  maximize  net  energy  gain  (Schoener  1971;  Sih  and   Christensen  2001),  may  offer  an  explanation  for  increasing  visitation  to  flowers  with   fewer  stamens  at  high  overall  visitation  rates.  When  pollinators  are  few,  pollen  will   be  more  abundant;  this  low-­‐competition  environment  is  thus  analogous  to  high   “prey”  abundance.  Optimal  foraging  models  predict  predators  will  prioritize  the   most  profitable  prey  under  these  circumstances  (i.e.,  pollinators  will  visit  flowers     27   with  the  most  pollen.)  As  prey  becomes  less  abundant  (in  this  case,  because  more   foraging  pollinators  are  around),  pollinators  are  expected  to  begin  spending  more   time  visiting  less  profitable  flowers  (i.e.,  ones  with  fewer  stamens)  (Schoener  1971;   Sih  and  Christensen  2001).  This  certainly  applies  to  pollinators;  for  example,  it  has   been  shown  that  bumblebees  expand  foraging  to  less-­‐rewarding  plant  species  when   the  bees  are  at  high  density  (Fontaine  et  al.  2008).  When  visiting  wild  radish,   honeybees  change  their  floral  size  preference  with  variation  in  visitation  rate,   shifting  to  visit  smaller  (presumably  less-­‐visited)  flowers  when  more  bees  are   around  (Young  and  Stanton  1990).     The  comparison  between  the  2L2S  and  4L  treatments,  or  the  dimorphic  and   monomorphic  treatments,  is  arguably  the  most  relevant  for  understanding  the   evolution  of  tetradynamy  from  the  ancestral  monomorphic  condition.  Female   fitness  was  the  only  fitness  component  that  differed  significantly  between  these  two   treatments,  and  the  result  seems  nonsensical  (relative  fitness  for  the  ancestral  4L   treatment  decreased  with  increasing  visitation).  The  trends  across  all  three  fitness   components  support  2L2S  outperforming  4L  at  high  visitation  –  slightly  more  visits,   higher  female  fitness,  slightly  higher  male  fitness.     It  is  clear  that  pollinator  visitation  rate  matters  for  understanding  the   function  of  tetradynamy.  Our  data  suggest  that  at  the  low  pollinator  visitation  rates   that  occurred  throughout  this  study,  stamens  function  to  attract  pollinators.  Male   fitness  is  the  most  likely  fitness  component  to  show  significant  effects  on  fitness  at   high  visitation,  and  the  slow-­‐release  hypothesis  may  operate  under  those   conditions.  Most  of  our  observations  were  made  immediately  after  plants  had  been     28   placed  in  the  field,  so  it  is  also  possible  that  pollinator  behavior  changed  throughout   the  day  as  pollen  was  depleted.  This  could  explain  some  of  the  lack  of  agreement   between  pollinator  visitation  and  plant  fitness  data.  In  the  future,  experiments  with   higher  visitation  rates,  longer  plant  exposure,  and  observations  spread  over  the   exposure  time  may  yield  clearer  insights  into  the  function  of  tetradynamy  and  how   it  interacts  with  pollinator  visitation  rate.     Acknowledgements     Cindy  Mills  helped  with  greenhouse  and  molecular  work.  Many   undergraduates  assisted  with  application  of  stamen  removal  treatments  and  setting   up  field  arrays.  This  work  was  supported  by  grants  from  the  Kellogg  Biological   Station’s  G.H.  Lauff  fund  and  T.  Wayne  &  Katherine  Porter  fund.                     29   CHAPTER  3   ONGOING  LOSS  OF  A  CONSERVED  TRAIT:  LACK  OF  FUNCTION,  LATITUDINAL   PATTERNS,  AND  GENETIC  CONSTRAINTS   Introduction   While  evolutionary  biologists  often  focus  on  adaptive  traits,  Darwin   recognized  that  traits  being  diminished  or  lost  under  relaxed  selection  is  also  a   dominant  theme  in  evolution  (Darwin,  C.H.  1859).  This  often  occurs  after  a  shift  in   ecology  renders  formerly  adaptive  traits  nonfunctional  (Fong  et  al.  1995),  such  as   during  colonization  of  a  new  environment  (e.g.  loss  of  eyes  in  cave  dwelling  fish   (Yoshizawa  et  al.  2012)  and  armor  in  freshwater  sticklebacks  (Le  Rouzic  et  al.   2011)).  However,  retention  of  nonfunctional  traits  is  also  common  (Lahti  et  al.   2009),  including  feeding  structures  in  larvae  with  no  digestive  tract  (Pernet  2003),   retinal  circadian  rhythms  in  blind  cave  fish  (Espinasa  and  Jeffery  2006),  and  anti-­‐ rattlesnake  behaviors  in  ground  squirrel  populations  isolated  from  the  predator  for   >70,000  years  (long  enough  to  lose  venom  resistance)  (Coss  1999).  Natural   selection  acts  to  reduce  or  eliminate  costly  traits,  but  a  loss  of  function  alone  does   not  make  trait  elimination  inevitable.  Loss  of  a  costly  nonfunctional  trait  could  be   slowed  by  low  genetic  variance  or  epistasis  (Mezey  and  Houle  2005;  Futuyma   2010),  or  nonfunctional  traits  that  require  few  resources  may  degrade  only  slowly   through  mutation  accumulation  (Lahti  et  al.  2009).  The  best-­‐understood  examples   of  nonfunctional  trait  evolution,  cavefish  eyes  and  freshwater  stickleback  armor,   both  find  trait  loss  is  accelerated  by  selection  (Le  Rouzic  et  al.  2011;  Yoshizawa  et  al.           30   A)! Mean'seed'produc0on'per'fruit' B)! 35# B# 30# B# 25# 20# 15# 10# A# median#0# A# median#26# median#0# median#30.5# 5# 0# !5# none################short#only###########long#only################all# Stamen'treatment'   Figure  7.  Effect  of  stamen  removal  on  per-­‐flower  seed  set.    A)  A.  thaliana  flower   showing  the  pollen  from  the  short  stamen  deposited  on  the  side  of  the  pistil  rather   than  the  stigma.  (Source:  Jürgen  Berger/Max  Planck  Institute  for  Developmental   Biology,  Tübingen,  Germany).  B)  Least  square  means  ±  2SEM,  from  a  model   including  stamen  removal  treatment,  with  population  and  plant  nested  in   population  as  random  effects.    Shared  letters  above  the  bars  indicate  lack  of   significant  difference  according  to  a  Tukey  HSD  test.  There  were  32-­‐33  flowers  per   treatment.       31     2012).  Understanding  the  mechanisms  maintaining  nonfunctional  traits  requires   studies  of  similar  depth  in  systems  where  evolutionary  loss  is  slowed  or  stopped.     We  present  an  example  of  ongoing  and  constrained  loss  of  a  nonfunctional   trait  in  a  model  organism:  the  shift  to  self-­‐pollination  in  Arabidopsis  thaliana  has   caused  some  of  the  plant’s  stamens  to  lose  their  pollination  function.  We   demonstrate  the  lack  of  function  of  the  trait,  report  a  latitudinal  cline  of  partial  loss   in  the  native  range,  and  describe  how  the  genetic  architecture  may  constrain  loss.   The  combination  of  a  trait  that  is  easy  to  manipulate  and  a  model  organism  with   abundant  genetic  resources  has  allowed  us  an  unusually  detailed  glimpse  of  trait   loss  in  progress.   Methods   Arabidopsis  thaliana  is  a  member  of  the  Brassicaceae,  a  family  in  which  almost   all  of  the  >3700  species  have  flowers  with  four  long  stamens  and  two  short  stamens   (Figure  7a).  Adaptive  hypotheses  for  the  production  of  short  stamens  in  outcrossing   species  have  some  support  (Conner  et  al.  2003),  but  A.  thaliana  is  highly  (97-­‐99%)   self-­‐pollinating  (e.g.  (Abbott  and  Gomes  1989;  Platt  et  al.  2010)).  Because  the   anthers  of  short  stamens  remain  below  the  level  of  the  stigma  throughout  floral   development  (Müller  1961;  Smyth  et  al.  1990),  they  seem  unlikely  to  deposit  pollen   on  the  stigma  and  thus  contribute  to  selfed  seed  set  (Figure  7a).       To  test  whether  short  stamens  in  A.  thaliana  are  functional,  we  compared   seed  set  across  four  stamen  treatments:  all  six  removed,  only  long  or  only  short   stamens  removed,  or  all  stamens  intact  but  buds  probed  with  forceps  to  control  for     32   stamen  manipulations  (Figure  7b).  Each  treatment  was  performed  on  at  least  one   bud  per  plant,  with  all  four  treatments  performed  on  adjacent  buds.  Plants  from  six   accessions  from  Finland,  Germany,  Kazakhstan,  and  Sweden  were  used  (Table  7).  If   long  stamens  alone  are  responsible  for  seed  set  in  A.  thaliana,  we  would  expect  seed   set  in  intact  flowers  and  those  with  short  stamens  removed  to  be  equally  high.   Conversely,  we  would  expect  seed  set  in  completely  emasculated  flowers  and  those   with  long  stamens  removed  to  be  equally  low.  The  results  supported  these   predictions  (Figure  7b);  short  stamens  do  not  contribute  significantly  to  seed  set.     A  trait  that  loses  its  primary  function  may  still  be  adaptive  if  it  increases  the   organism’s  fitness  in  some  other  way  (Lahti  et  al.  2009).  “Staminodes”  (stamens  that   have  evolved  loss  of  pollination  function,  usually  producing  no  pollen)  with   alternative  functions  are  widespread  in  angiosperms,  occurring  in  nearly  a  third  of   families,  but  universally  have  roles  in  facilitating  outcrossing  via  insect  pollinators   (Walker-­‐Larsen  and  Harder  2000).  For  the  selfing  A.  thaliana,  we  might  expect   selection  to  reduce  investment  in  ineffective  short  stamens,  reallocating  resources   such  as  lipids  and  proteins  abundant  in  pollen  (Evans  et  al.  1991)  to  other  functions.   One  way  to  do  that  is  by  eliminating  short  stamens  altogether.   Results   To  determine  if  short  stamen  loss  is  common  in  A.  thaliana  and  to  test  for   geographic  trends,  we  sampled  flowers  from  ten  plants  from  each  of  45  populations   of  A.  thaliana  chosen  as  evenly  as  possible  from  latitudinal  and  longitudinal  bands   across  the  native  range  (30  populations  in  each  of  the  bands,  with  15  shared   between  the  longitudinal  and  latitudinal  sample).  Up  to  five  matrilines  per       33   Popula'on)Mean)Short)Stamen)Produc'on) A)! 2" 1.8" 1.6" 1.4" 1.2" 1" r"="0.65" p"<"0.0001" " 0.8" 0.6" 0.4" 0.2" 0" 35" 45" 50" La'tude)(°N)) 55" 60" 65" 2" Popula'on)Mean)Short)Stamen)Produc'on) B)! 40" 1.8" 1.6" 1.4" 1.2" 1" 0.8" r"=")0.33" p#="0.08# " 0.6" 0.4" 0.2" 0" )10" 0" 10" 20" 30" 40" Longitude)(°E)) 50" 60" 70" 80"   Figure  8.  Geographic  trends  in  short  stamen  number.  Correlations  between   stamen  number  and  a)  latitude,  or  b)  longitude.  Each  point  is  a  population  mean.   Removal  of  the  longitudinal  outlier  at  73.1°E  increases  the  correlation  between   stamen  number  and  longitude  to  r  =  -­‐0.39,  p  =  0.04.         34   population  were  grown  (mean  =  2.67),  for  a  total  of  119  matrilines  (Table  7).  One   flower  was  sampled  from  each  plant  every  2-­‐3  days  for  an  average  of  6  flowers  per     plant  (2570  total  flowers),  with  13-­‐117  flowers  sampled  per  population  (mean  56.6,   SD  22.0).  We  examined  the  correlations  between  short  stamen  loss  and  latitude  and   longitude,  using  the  subset  of  30  populations  for  each.  Population  mean  short   stamen  production  varied  from  0.49  to  1.96  across  the  native  range  of  Arabidopsis   thaliana.  Individual  plants  that  exhibited  short  stamen  loss  typically  produced  three   different  flower  morphs,  with  zero,  one,  or  two  short  stamens.  Interestingly,   population  mean  stamen  number  is  positively  correlated  with  latitude  (Figure  8a).   The  correlation  with  longitude,  with  stamen  production  decreasing  toward  the  east,   is  much  weaker  and  not  statistically  significant  (Figure  8b).  Short  stamen  loss  is   most  advanced  in  the  south,  but  is  incomplete  even  in  populations  where  it  is  most   common.       To  understand  the  genetics  of  short  stamen  loss,  we  mapped  quantitative   trait  loci  (QTL)  involved  in  loss  using  a  set  of  recombinant  inbred  lines  (RILs)   produced  using  parents  from  the  latitudinal  extremes  of  A.  thaliana’s  native  range,   Sweden  and  Italy  (Agren  et  al.  2013).  Each  RIL  was  genotyped  at  348  SNP  markers   spaced  every  ~1  cM  across  the  genome.  Short  stamen  number  was  scored  on  one  to   seven  flowers  (mean  =  3)  from  one  to  seven    (mean  =  4.78)  plants  from  each  of  519   RILs,  for  a  total  of  7435  flowers,  plus  502  flowers  from  the  southern  and  224  from   the  northern  parents  (Table  9).  The  southern  parent  involved  in  the  mapping   population  produced  about  one  short  stamen  on  average  (range  0  to  2,  mean  =   0.93),  whereas  the  northern  parent  nearly  always  produced  two  short  stamens       35     2$ PVE$=$28.0! PVE$=$7.0! PVE$=$2.7! Short$Stamen$Number$ $ 1.9$ 1.8$ 1.7$ 1.6$ Swedish$allele$(A,B,C)$ Italian$allele$(a,b,c)$ 1.5$ 1.4$ 0.5$ 1$ QTL$A$ (chromosome$5)$ 1.5$ 2$ QTL$B$ (chromosome$3)$ 2.5$ 3$ QTL$C$ 3.5$ (chromosome$1)$   Figure  9.  Main  effects  of  QTL.  Results  from  stepwise  analysis  with  full,   untransformed  data  in  R/qtl.  QTL  arranged  in  order  of  effect  size/percent  variance   explained  (PVE).  Bars  indicate  2  SEM.  All  three  are  significant  at  p  <  0.0001.         36     2.0 A B phenotype additive prediction C 1.8 aBC aBc abc aBC abC abc E ABC abc aBc ABc ABC abc D ABC 2.0 Abc 1.2 ABc 1.4 ABC Short stamen number 1.6 F 1.8 1.6 abc abC AbC ABC abc Abc AbC 1.2 ABC 1.4 Genotypes - possible sequences of loss allele accumulation Figure  10.  Epistasis  imposes  evolutionary  constraint  on  short  stamen  loss.  All   possible  sequences  of  accumulating  loss  alleles  are  shown,  illustrating  that  epistasis   slows  loss  of  short  stamens  relative  to  the  additive  prediction.  Dashes  show  the   additive  prediction,  diamonds  show  the  actual  phenotype.  Lowercase  letters   indicate  the  Italian  genotype;  uppercase  the  Swedish  genotype.  Arrows  show  which   QTL  is  transitioning  from  Swedish  to  Italian  in  each  step.  Steps  that  result  in  a   significant  difference  according  to  Tukey’s  HSD  test  are  indicated  by  a  black  arrow;   white  arrows  indicate  non-­‐significant  steps.  In  five  of  the  six  intermediate  genotypes   between  the  all-­‐Swedish  (ABC)  and  the  all-­‐Italian  (abc),  the  additive  expectation  for   short  stamen  number  is  lower  than  the  actual  phenotype.  In  four  of  the  six  scenarios   (a,  b,  d,  and  e),  the  first  step  results  in  little  or  no  short  stamen  loss;  in  only  one   scenario  (c)  does  each  step  produce  a  significant  drop  in  short  stamen  number.  The   additive  prediction  was  made  by  subtracting  the  main  effect  sizes  (difference   between  Swedish  and  Italian  in  Figure  9)  from  the  mean  short  stamen  production   with  the  Swedish  genotype  at  all  3  QTL  (ABC).    Bars  indicate  2  SEM.         37     (range  0  to  2,  mean  1.96).  The  RILs  were  grown  in  growth  chambers  mimicking   conditions  in  Italy;  the  parent  phenotypes  did  not  change  significantly  in  a  similar   experiment  mimicking  Swedish  temperatures.       We  found  three  significant  main-­‐effect  QTL  for  short  stamen  loss  (one  each   on  chromosomes  1,  3,  and  5;  Figures  9,  17),  one  significant  epistatic  interaction,  and   a  second  nearly  significant  epistatic  interaction  (Figures  10  and  18,  Tables  10  and   11).  In  both  interactions,  epistasis  decreased  short  stamen  loss;  the  stamen-­‐loss   alleles  on  chromosomes  1  and  3  only  have  a  significant  phenotypic  effect  in  the   presence  of  the  stamen-­‐loss  allele  on  chromosome  5  (Figures  10  and  19).  This   pattern  of  epistasis  would  slow  stamen  loss  by  decreasing  the  loss  produced  relative   to  the  additive  prediction  and  limiting  the  number  of  paths  with  significant  stamen   loss  at  each  allele  replacement  (Figures  10,  19).     Temporal  differences  in  development,  with  long  stamens  initiating  at  the   beginning  of  stage  5  of  floral  development  and  short  stamens  initiating  later  (Smyth   et  al.  1990),  create  an  opportunity  for  heterochrony  in  gene  expression  to  cause  loss   of  the  short  stamens.  We  identified  1388  genes  expressed  in  stamens  under  the   Bayes  95%  credible  interval  for  each  QTL  (Table  10,  12),  including  25  candidate   genes  with  published  evidence  of  involvement  in  stamen  development  (Table  13).   Of  the  candidates,  21  are  associated  with  the  jasmonic  acid  (JA)  and/or  gibberellic   acid  (GA)  pathways  (Table  13).  These  two  pathways  are  known  to  interact  in   stamen  development  (reviewed  in  Alvarez-­‐Buylla  et  al.  2010  p.  -­‐),  and  changes  in   their  regulation  could  be  the  mechanism  of  epistasis.         38     Discussion   Given  the  lack  of  short  stamen  function  we  describe,  evolutionary  elimination   of  the  trait  is  predicted.  The  fact  that  loss  is  universally  incomplete  suggests  that  the   process  of  elimination  either  started  recently  or  is  constrained.    The  pattern  of   epistasis  between  stamen-­‐loss  loci  reduces  the  phenotypic  effect  of  single  loci  alone   (Figure  10),  while  high  homozygosity  resulting  from  selfing  reduces  the  effective   recombination  rate,  slowing  the  rate  at  which  stamen-­‐loss  alleles  at  different  loci   are  brought  together.  Thus  the  shift  to  selfing  that  made  short  stamens   nonfunctional  may  be  slowing  their  loss.     The  latitudinal  cline  in  short  stamen  production  could  be  created  by   differential  selection  or  constraint.  Direct  selection  favoring  short  stamen   production  in  the  north  seems  unlikely,  because  short  stamens  are  predicted  to   increase  fitness  only  when  outcrossing  rates  and  pollinator  visitation  are  high   (Harder  and  Thomson  1989;  Conner  et  al.  2003).  Small  pockets  of  increased   outcrossing  have  been  reported  in  the  species  (e.g.  14.5%  (Bomblies  et  al.)),  but   even  these  rates  are  too  low  to  suggest  high  pollinator  visitation;  direct   observations  of  pollinators  suggest  that  7%  or  fewer  of  all  flowers  are  visited   (Hoffmann  et  al.  2003;  Lundemo  2010).     Potential  constraint  creating  the  latitudinal  cline  could  be  due  to  indirect   selection  and/or  low  genetic  variance.  Many  traits  vary  adaptively  over  latitude  (e.g.   flowering  time  (Stinchcombe  et  al.  2004)  and  cold  tolerance  (Zhen  and  Ungerer   2008)  in  A.  thaliana).  A  genetic  correlation  with  such  a  trait  could  constrain  stamen   loss  in  the  north.  Postglacial  population  dynamics  are  another  possible  source  of     39   constraint;  as  with  many  species  (Comes  and  Kadereit  1998),  A.  thaliana  shows   reduced  genetic  variation  in  the  north  consistent  with  founder  events  during   postglacial  recolonization  (Beck  et  al.  2008;  Lewandowska-­‐Sabat  et  al.  2010).   Recent  results  of  a  reciprocal  transplant  conducted  with  the  same  set  of  A.  thaliana   RILs  found  southern  alleles  at  several  fitness  QTL  were  adaptive  in  the  north,  but   not  vice  versa  (Agren  et  al.  2013).  Although  none  of  the  QTL  identified  as  involved  in   latitudinal  adaptation  are  near  the  stamen  loss  QTL,  it  confirms  that  constraint  in   the  north  is  found  in  adaptive  traits  for  A.  thaliana.     Although  neutral  loss  through  the  accumulation  of  mutations  is  possible,  the   latitudinal  cline  is  opposite  what  would  be  expected  under  that  scenario.  Founder   effects  can  accelerate  loss  of  a  neutral  vestigial  trait  through  drift  (e.g.(Daehler  and   Strong  1997))  ,  so  we  would  expect  at  least  some  populations  in  the  northern  part  of   the  range  to  lose  short  stamens  more  quickly.   We  conclude  that  evolutionary  loss  of  nonfunctional  short  stamens  is   currently  underway  in  Arabidopsis  thaliana.  Loss  is  widespread  but  incomplete,  and   may  be  constrained  by  epistatic  genetic  architecture  and  high  selfing  rates.  The   latitudinal  cline  in  stamen  loss  is  more  likely  due  to  a  cline  in  genetic  variance   and/or  genetic  correlations  with  locally  adapted  traits  rather  than  latitudinal   differences  in  direct  selection  on  short  stamens.     Acknowledgements:    We  thank  James  Beck  for  providing  seeds,  Chris  Oakley  for   assistance  with  R/qtl,  Emily  Dittmar  for  coordinating  the  RIL  growout,  Mark   Hammond  and  Cindy  Mills  for  lab  assistance,  Mike  Grillo  for  advice  on  identifying   candidate  genes,  Raffica  LaRosa  for  assistance  in  the  lab  and  editing,  Colin  Kremer     40   for  assistance  with  R,  and  Sam  Perez  and  many  undergrads  for  phenotyping   thousands  of  flowers.  Keith  Karoly  planted  the  seed  of  this  project  by  mentioning   that  A.  thaliana  should  have  lost  the  short  stamens.  This  manuscript  was  improved   by  comments  from  Ian  Dworkin.  Supported  by  grants  from  the  Kellogg  Biological   Station’s  G.H.  Lauff  fund  to  A.M.  Royer,  NSF  DEB  1022202  to  D.  Schemske  and  NSF   DEB  0919452  to  J.K.  Conner.                           41   CHAPTER  4   EARLY  EVOLUTION  OF  SELFING  IN  ARABIDOPSIS  LYRATA  INCLUDES  CHANGES  IN   SEX  ALLOCATION  BUT  NOT  FLOWER  SIZE   Introduction     The  evolution  of  self-­‐pollination  from  outcrossing,  one  of  the  most  common   transitions  in  flowering  plants  (Stebbins  1957;  Barrett  2002),  is  associated  with  a   suite  of  trait  changes  known  the  “selfing  syndrome”  (Darwin,  C.H.  1876;  Ornduff   1969;  Sicard  and  Lenhard  2011).    A  switch  to  self-­‐pollination  generally  involves   shifting  resources  away  from  attracting  pollinators  and  increasing  investment  in   female  fitness  compared  to  male  fitness  (Charlesworth  and  Charlesworth  1981).  It   includes  less  nectar,  less  scent,  smaller  flowers,  reduced  herkogamy  (distance   between  anthers  and  stigma)  and  a  diminished  pollen-­‐to-­‐ovule  (P/O)  ratio  relative   to  outcrossing  plants  (e.g.  Lloyd  1965;  Ritland  and  Ritland  1989;  Goodwillie  and   Ness  2005).  The  replicated  evolution  of  this  selfing  syndrome  offers  opportunities  to   study  the  evolutionary  and  ecological  basis  of  these  trait  shifts.   The  selfing  syndrome  does  not  necessarily  evolve  in  the  same  way  in  every   case;  ovule  counts  and  the  evolutionary  timing  of  flower  reduction  are  two   examples.  While  a  reduction  in  pollen  production  is  largely  responsible  for  the   lower  P/O  ratio  in  selfing  plants  (Darwin,  C.H.  1876;  Ornduff  1969),  changes  in   ovule  number  are  variable.  Ovule  production  increases  in  many  selfing  taxa  along   with  decreases  in  pollen  count  (Mione  and  Anderson  1992;  Delesalle  et  al.  2008;   Mazer  et  al.  2009).  However,  ovule  counts  may  also  decrease,  reducing  the  effect  of   pollen  decrease  on  the  P/O  ratio  (Ritland  and  Ritland  1989).  Similarly,  while  small     42   flowers  are  a  constant  feature  of  the  selfing  syndrome,  they  may  evolve  together   with  the  shift  in  mating  system  (as  a  reduction  in  overall  flower  size  decreases   herkogamy)  (Guerrant  1989;  Elle  and  Carney  2003),  or  gradually  after  selfing   becomes  established  because  selection  favors  reduced  investment  in  showy  flowers   (Charnov  1982;  Bodbyl  Roels  and  Kelly  2011).     There  have  been  many  independent  transitions  to  self-­‐pollination  in  the   mustard  family  (Brassicaceae)  (e.g.  Lloyd  1965;  Mable  et  al.  2005;  Foxe  et  al.  2009).   These  species  display  the  selfing  syndrome  described  above,  but  possess  an   additional  family-­‐specific  trait  that  may  be  affected  by  a  mating  system  shift.  The   Brassicaceae  are  characterized  by  tetradynamous  stamens:  four  long  and  two  short   stamens  within  a  flower  (Figure  11)(Endress  1992;  Zomlefer  1994).  Although  the   reason  for  widespread  conservation  of  this  trait  is  not  known,  all  of  the  current   adaptive  hypotheses  center  on  a  function  for  outcrossing  (Golding  et  al.  1999;   Conner  et  al.  2003,  2009;  Kudo  2003)  .  In  the  model  mustard  Arabidopsis  thaliana,   short  stamens  are  too  short  to  reach  the  stigma  (Müller  1961)  and  do  not  contribute   significantly  to  selfed  seed  (Chapter  3).  Therefore,  we  might  expect  that  for   mustards,  the  selfing  syndrome  would  include  a  greater  reduction  in  investment  in   short  stamens  relative  to  long  stamens,  and  relaxed  selection  on  short  stamen   length  due  to  loss  of  function.   Arabidopsis  lyrata  (Brassicaceae),  A.  thaliana’s  sister  species,  is  an  excellent   system  for  testing  how  the  investment  in  short  stamens  changes  during  mating   system  shifts.    Throughout  most  of  its  circumpolar  distribution,  A.  lyrata  exhibits  the   sporophytic  self-­‐incompatibility  typical  of  the  mustard  family  (Mable  et  al.  2003).    In     43     Figure  11.  Arabidopsis  lyrata  flower  preserved  in  alcohol,  with  linear   measurements  marked.  1)  Petal  width,  2)  petal  length,  3)  sepal  height,  4)  sepal   length,  5)  pistil  height,  6)  long  anther  length,  7)  long  stamen  height,  8)  short  anther   length,  9)  short  stamen  height,  10).  Calipers  set  at  2mm  for  scale.  The  horizontal  line   was  used  as  a  common  baseline  for  height  measurements;  it  was  set  at  the  short   stamen  attachment  point,  perpendicular  to  the  pistil.  Lines  were  placed  and   measurements  made  with  ImageJ.         44   Table  4.  Arabidopsis  lyrata  populations  and  sampling  scheme.    The  Saugatuck   population  was  only  grown  in  the  greenhouse.  A.  OR  =  outcrossing  rate,  %SC  =   percentage  of  the  population  that  is  self-­‐compatible.  Mating  system  estimates  for   IDU,  PIN,  RON,  and  BP  are  from  Mable  et  al  (2005);  estimates  for  BP,  PIN,  and  PP  are   from  Mable  et  al  (2007).  Both  studies  used  controlled  self-­‐pollinations  to  estimate   self-­‐compatibility  and  multilocus  microsatellite  genotypes  of  individuals  grown   from  field-­‐collected  seed  to  estimate  outcrossing  rates.  MS  =  binned  population   mating  system,  outcrossing  or  selfing;  Field  =  number  of  plants  sampled  from  the   field  common  garden;  GH  =  number  of  plants  sampled  from  the  greenhouse   common  garden.  B.  Mean  (sd)  sample  sizes  in  the  common  garden  experiments,  not   including  flowers  sampled  for  pollen  counts.  C.  Number  of  plants  in  the  greenhouse   study  that  were  the  result  of  self-­‐pollinations  (self),  outcrossing  after  early   emasculation  (outcross  [early]),  and  outcrossing  after  late  emasculation   (outcross[late]).  The  plants  sampled  for  populations  not  included  in  this  table  were   all  the  result  of  outcrossing  after  late  emasculation.     A.               Population   OR   %SC   Ludington  State  Park,  MI  (LUD)   1.0   .07   Saugatuck  State  Park,  MI  (SAU)   .97   .24   Indiana  Dunes  National  Lakeshore,  IN  (IDU)   .91   .31   Bruce  Peninsula  National  Park,  ON  (BP)   .88   .03   Pinery  Provincial  Park,  ON  (PIN)   .84   .06   Rondeau  Provincial  Park,  ON  (RON)   .21   .97   Point  Pelee  National  Park,  ON  (PP)   .02   1     B.     Field   GH   Populations   6   7   Maternal  lines  per  population   7.67  (0.82)   5.43  (1.72)   Plants  per  maternal  line   6.5  (1.15)   6.16  (1.87)   Plants  per  population   50  (5.9)   38.4  (16.5)   Flowers  per  plant   1   2.7  (0.6)   Plants   299   269   Flowers   299   723   C.     Population   Self   Outcross  (early)   Outcross  (late)   PP   10   6   17   RON   8   17   21   BP   NA   17   17   IDU   NA   21   72         45     MS   Field   GH   Out   56   28   Out     21   Out   53   66   Out   40   51   Out   46   24   Self   53   46   Self   52   33                                     the  Great  Lakes  region  of  North  America,  however,  some  populations  have  evolved  a   loss  of  self-­‐incompatibility;  populations  vary  in  frequency  of  self-­‐compatibility  and   show  roughly  corresponding  inbreeding  rates  (Mable  et  al.  2005;  Mable  and  Adam   2007;  Willi  and  Maattanen  2010)  (e.g.  Table  4).  Populations  with  high  frequency  of   self-­‐compatibility  have  evolved  autogamous  selfing,  the  ability  to  pollinate  within  a   flower  without  the  assistance  of  pollinators  (Mable  et  al.  2005).  This  range  of  mating   systems  in  natural  populations  presents  an  opportunity  to  examine  the  evolution  of   the  selfing  syndrome  at  the  earliest  possible  stage.   This  study  investigates  how  A.  lyrata  floral  morphology  is  evolving  in   response  to  shifts  in  mating  system.  I  first  assessed  whether  short  stamens  contact   the  stigma  in  one  self-­‐incompatible  and  one  highly-­‐selfing  population  of  A.  lyrata.  I   then  quantified  differences  in  floral  morphology  between  selfing  and  outcrossing   populations  using  two  common  garden  studies  (one  in  the  greenhouse,  one  in  the   field).  I  measured  the  number  of  pollen  grains  and  ovules  produced,  width  of  petals,   and  length  of  petals,  sepals,  pistils,  stamens  (long  and  short),  and  anthers  (long  and   short).  These  measures  were  used  to  estimate  flower  size,  herkogamy,  and   allocation  to  male  and  female  reproduction  in  seven  populations  that  span  the  range   from  self-­‐incompatible  to  highly  selfing.  The  predictions  are  divided  into  general   ones,  which  would  apply  to  any  group  of  flowering  plants,  and  specific  ones  dealing   with  tetradynamy.   My  general  predictions  are  that  selfing  populations  will  exhibit  decreased   P/O  ratio,  decreased  flower  size,  petal  reduction  that  is  stronger  that  the  reduction   in  overall  flower  size,  and  decreased  anther-­‐stigma  herkogamy.  The  mustard-­‐   46   specific  predictions  are  a  greater  reduction  in  short-­‐stamen  pollen  grain  numbers   compared  to  long-­‐stamen,  and  increased  variance  in  short  stamen  length  due  to   relaxed  selection  on  short  anther  position.   Methods   To  assess  function  of  short  stamens  in  Arabidopsis  lyrata,  I  sampled  one   healthy  inflorescence  from  nine  individuals  of  a  highly  selfing  population  (Rondeau,   which  has  been  observed  to  produce  autogamously  selfed  seed  (Mable  et  al.  2005))   and  nine  individuals  of  a  largely  self-­‐incompatible  population  (Saugatuck).  Seeds   collected  from  the  populations  were  sown  directly  into  4”  square  pots  with   MetroMix  potting  soil  and  ½  tsp  Osmocote  Plus  15-­‐9-­‐12  fertilizer  (Scott’s  Company   LLC).  They  were  grown  in  the  greenhouse  at  Michigan  State  University  (MSU)’s   Kellogg  Biological  Station  (KBS)  in  Hickory  Corners,  MI.   I  dissected  each  flower  or  bud  on  the  inflorescence  from  the  most  mature   (lowest)  flower  that  still  retained  its  anthers  to  one  unopened  bud  beyond  the  last   one  that  had  a  dehisced  anther.  A  total  of  58  flowers  were  sampled  (mean  3.2,  SD  1.0   per  plant).    For  each  one,  I  assessed  whether  the  stigma  appeared  to  be  receptive   (papillae  visible  and  appear  damp),  whether  the  long  and  short  anthers  were   dehisced,  and  whether  they  were  contacting  the  stigma  (i.e.,  whether  they  were   capable  of  autogamous  selfing).     To  examine  changes  in  floral  morphology  with  shifts  in  mating  system,   flowers  were  collected  from  two  highly  selfing  and  five  primarily  outcrossing  Great   Lakes  populations  of  A.  lyrata  grown  in  two  randomized  common  garden   experiments  (Table  4),  allowing  me  to  evaluate  evolved  differences  in  outcrossing     47   vs.  selfing  populations.  In  2012  I  sampled  six  populations  in  a  field  common  garden   at  KBS.  In  2013  I  sampled  seven  populations  (the  same  six  as  2012,  with  one   additional  population)  in  a  greenhouse  common  garden  experiment  on  MSU’s  main   campus  in  East  Lansing,  Michigan.     Field  common  garden   Germination  of  seeds  for  the  2012  field  common  garden  was  begun  on   9/9/11.  Field-­‐collected  seeds  were  sterilized  in  30%  bleach  solution  with  0.001%   Triton  X  100  surfactant  for  ten  minutes,  washed  twice  with  sterilized  water,   suspended  in  0.1%  agar,  and  sown  on  a  100mm  X  15  mm  petri  dish  with  agar   (Phytoblend,  Caisson  Laboratories  Inc.).  Petri  dishes  were  filled  with  20mL  of  0.8%   Agar  with  2.31%  Gamborg’s  B-­‐5  basal  medium  and  autoclaved  after  the  media  set.   Sown  plates  were  wrapped  in  Parafilm  and  stratified  for  four  days  at  6.5°C.  Six  of  the   38  plates  were  contaminated,  and  those  seeds  were  transferred  to  soil  before   germination.  Stratified  seeds  were  incubated  at  22°C  with  16  hours  days  at  100  PAR   for  4-­‐8  days.  Seedlings  were  then  transplanted  into  2  inch  square  pots  filled  with   soil-­‐less  potting  media  (Suremix  Perlite,  Michigan  Grower  Products  Inc.)  The   seedlings  were  grown  in  chambers  at  22°C  with  16  hours  days  at  100  PAR  for  10-­‐14   days.  On  October  7th,  they  were  transported  to  KBS,  where  they  were  moved  daily   between  the  field  and  greenhouse  to  harden  off  for  11  days.       The  transplant  site  was  field  soil  covered  with  a  layer  of  black  weed  barrier,   with  9  cm  diameter  circular  holes  every  30.5  cm  in  a  grid  oriented  to  the  cardinal   directions.  A  soil  plug  corer  (Sod  Plugger,  Hummert  International)  was  used  to   create  a  hole  for  each  plant  by  removing  field  soil  (round  plug  of  7.5  cm  diameter     48   and  7.5  cm  depth).    The  soil  was  saved,  passed  through  a  soil  shredder,  and  mixed  to   create  a  homogeneous,  well-­‐aerated  soil  used  for  backfilling  during  transplanting.   The  seedlings  were  transplanted  into  6  rows,  with  rows  oriented  East/West,  on   October  18th.  Each  plant  was  given  a  unique,  randomly  assigned  ID  number  and   location.  Seedling  deaths  within  a  week  of  transplant  were  attributed  to  transplant   shock  and  replaced  with  extra  plants  that  had  been  kept  outside  in  pots.     Of  the  plants  that  survived  the  winter  and  flowered  in  2012,  I  randomly   selected  two  plants  per  maternal  line  for  full  fruit  and  flower  counting  and  sampled   all  the  remaining  plants  (Table  4B).    A  single  fully  opened  flower,  the  most  recently   opened  on  its  inflorescence,  was  collected  from  each  of  the  remaining  plants  (299   plants,  mean  50  per  population  [Table  4])  on  two  consecutive  days  (5/10-­‐11).     Flowers  were  placed  in  1ml  microcentrifuge  tubes  which  were  then  filled  with  75%   ethanol  to  preserve  the  flowers.   Greenhouse  common  garden   The  2013  greenhouse  common  garden  study  included  seven  populations  –   the  same  six  as  the  2012  study,  with  one  additional  outcrossing  population.  Plants   for  this  study  were  grown  from  seeds  resulting  from  controlled  crosses  within   populations,  both  self-­‐pollination  and  crosses  between  different  individuals  within  a   population.  Seeds  were  produced  by  first  emasculating  flowers,  then  pollinating   when  they  became  receptive.  Most  flowers  for  outcrossed  seed  were  emasculated  in   the  bud  just  before  the  flowers  opened;  in  four  of  the  populations,  flowers  for  selfed   seed  and  a  subset  of  the  outcrossed  seed  were  emasculated  at  an  earlier  bud  stage   (no  visible  petals).  For  outcrossed  seeds,  pooled  pollen  from  at  least  two  plants  from     49   at  least  four  different,  non-­‐maternal  lines  from  the  same  population  was  used.  For   selfed  seeds,  flowers  were  pollinated  with  pooled  pollen  from  at  least  three  flowers   on  the  same  plant.  For  the  two  selfing  populations,  plants  that  were  the  result  of   both  selfing  and  outcrossing  were  used  (Table  4C);  data  for  selfed  plants  of   outcrossing  populations  were  excluded  from  all  analyses.     Seeds  were  sown  on  9/21/12  using  the  same  protocol  described  above  for   the  2012  field  study,  then  stratified  for  one  week  at  4°C.  Seeds  were  germinated  and   grown  at  22°C  for  17  days.  Low  germination  limited  the  replication  of  some  lines.     Healthy  seedlings  were  transplanted  into  3  inch  plastic  pots  filled  with  Sure-­‐mix   perlite  potting  medium  (Michigan  Grower  Products,  Inc.,  Galesburg,  MI).  They  were   then  moved  to  a  growth  chamber  (22°C,  16h  days,  150  PAR)  and  sub-­‐irrigated  as   needed  with  0.5X  Hoagland’s  solution.  Plants  that  died  from  transplant  shock  within   a  few  days  were  replaced  with  seedlings  if  available.  After  two  weeks  (10/29/12)  of   growth,  the  plants  were  vernalized  for  10  weeks  (4°C,  10h  days,  75  PAR).  They  were   then  moved  into  a  greenhouse  set  at  20°C  (although  temperatures  fluctuated   depending  on  the  weather).  Supplemental  lighting  was  16h  days  under  sodium   vapor  lamps.  The  plants  were  sub-­‐irrigated  with  water  with  100  ppm  N  Plantex  18-­‐ 9-­‐18  pH  reducer  fertilizer  (Plant  Products  Co.  Ltd.,  Brampton,  ON).   Once  plants  flowered,  up  to  three  of  the  most  recently  opened  flowers  per   plant  were  collected  in  75%  alcohol  as  described  above  (for  full  sampling  scheme,   see  Table  4B).  Plants  in  this  study  had  been  flowering  longer  and  were  more   stressed  (dry  and  thrips-­‐infested)  than  those  in  2012  field  common  garden,  so  there   were  not  always  three  healthy  flowers.  If  there  was  a  fourth  healthy  flower,  it  was     50   used  for  pollen  collection.  I  collected  two  long  anthers  in  one  vial  and  two  short   anthers  from  the  same  flower  in  a  second  vial,  sampling  a  total  of  177  flowers;  mean   25.21  (SD  13.42)  per  population.  Pollen  was  counted  using  a  Coulter  counter   according  to  the  protocol  in  Rush  et  al.  (1995)  and  reported  as  number  of  grains   produced  per  anther.   Floral  measurements   Two  sepals  and  two  petals  were  removed  from  preserved  flowers  to  expose   the  pistil  and  stamens  before  photographing  them  to  measure  floral  traits,  using   ImageJ  1.43u  (Schneider  et  al.  2012)  (Figure  11).  I  measured  the  lengths  of  a  short   stamen,  short  anther,  long  stamen,  long  anther,  sepal,  pistil,  and  both  length  and   width  of  a  petal.  I  also  measured  the  longest  axis  of  a  short  anther,  long  anther,  and   sepal.  After  measurements  on  the  photos  were  complete,  ovules  were  counted  on   the  same  flowers  by  removing  the  pistil  and  gently  squashing  the  pistil  with  a  cover   slip  on  a  glass  slide  with  a  drop  of  blue  food  coloring  for  contrast.         Analyses:  Flower  size  was  estimated  as  PC1  from  a  principal  component   analysis  including  length  of  short  stamen,  long  stamen,  pistil,  petal,  sepal,  and  both   length  and  width  of  the  petal.  The  amount  of  petal  displayed  to  pollinators  is   determined  by  how  wide  the  petal  is  and  how  much  of  it  is  claw  (base  of  petal)  vs.   limb  (the  outer,  showy  part  of  the  petal).  Sepal  length  was  used  as  a  proxy  for  claw   length,  so  petal  display  size  was  estimated  by  subtracting  sepal  length  from  petal   length  and  multiplying  by  petal  width  ([petal  length  –  sepal  length]  *  petal  width).   To  estimate  pollen:ovule  ratios,  I  first  calculated  total  pollen  per  flower  by   multiplying  the  per-­‐anther  pollen  counts  by  the  number  of  each  anther  type  and     51   adding  them  together  (pollen  per  short  anther  *2  +  pollen  per  long  anther  *4).  I  then   divided  total  pollen  per  flower  by  the  mean  ovule  count  from  the  flowers  sampled   on  the  same  plant.     For  the  field  study,  I  tested  whether  PC1,  ovule  count,  herkogamy  (measured   as  pistil  length  –  long  stamen  length),  long  stamen  length,  short  stamen  length,  pistil   length,  and  petal  display  changed  with  mating  system  using  linear  models  including   mating  system  and  population  nested  in  mating  system  as  fixed  effects.  Pistil,  long   stamen  length,  and  short  stamen  length  were  included  to  understand  how  those  two   traits  individually  might  contribute  to  differences  in  herkogamy.     For  the  greenhouse  study,  I  used  the  same  models  with  the  addition  of  plant   nested  in  population  nested  in  mating  system  as  a  random  effect  because  I  sampled   multiple  flowers  per  plant.  Pollen-­‐ovule  ratios  were  natural  log  transformed  to   eliminate  heteroscedasticity  in  the  model  residuals,  and  analyzed  with  a  linear   model  including  mating  system  and  population  nested  in  mating  system  as  fixed   effects.     While  long  stamens  are  expected  to  evolve  closer  contact  between  anther   and  pistil  in  selfing  populations,  short  stamens  are  likely  to  experience  relaxed   selection  on  position  if  they  are  not  contributing  to  seed  set.  To  assess  the  likelihood   of  short  stamens  contributed  to  selfed  seed,  in  addition  to  the  two-­‐population  bud   dissection  study,  I  inspected  the  distribution  of  short  stamen  herkogamy  across   both  common  garden  studies  for  evidence  of  contact  between  short  anthers  and   stigmas.  To  test  for  an  increase  in  variance  of  short  stamen  length  with  a  shift  to   selfing,  I  used  AIC  values  to  compare  the  performance  of  a  model  including  mating     52   system  as  a  fixed  effect  and  population  to  a  model  with  population,  mating  system,   and  different  variances  for  selfing  and  outcrossing  populations.  For  the  greenhouse   population,  I  ran  additional  models  that  also  included  individual  plant  as  a  random   effect.  The  mixed-­‐effects  models  were  run  in  R  (R  Core  Team  2012)  using  the  nlme   package  (Pinheiro,  J.  et  al.  2013).   To  test  for  decreased  pollen  production  overall  in  selfing  populations,  and  in   short  relative  to  long  anthers,  pollen  counts  were  analyzed  with  a  model  including   mating  system,  stamen  length,  mating  system*stamen  length  interaction,  and   population  nested  in  mating  system  as  fixed  effects.   For  all  variables,  means  across  populations  were  compared  using  Tukey’s   HSD  test.  Because  I  had  multiple  preserved  flowers  per  plant  from  the  greenhouse   study  but  not  from  the  field,  the  two  data  sets  required  different  models  and  were   analyzed  separately.  All  models  were  also  run  with  and  without  the  BP  population,   which  is  categorized  as  outcrossing  (Table  4)  but  appeared  to  have  a  selfing   phenotype  for  many  traits.    With  the  exception  of  short-­‐stamen  length  variance   models,  all  analyses  were  performed  in  JMP  10.0.0  (SAS  Institute  2012).   Results   In  the  seven  A.  lyrata  populations  investigated,  investment  in  both  female   and  male  function  changes  as  predicted  with  a  shift  to  selfing.  Ovule  production   increases  in  populations  that  self  at  high  rates  relative  to  outcrossing  populations   (Table  5,  Figure  12),  while  selfing  populations  have  less  pollen  on  the  anthers  of   both  long  stamens  and  short  stamens  (Table  5,  Figure  13).  The  P/O  ratio  drops   accordingly   53   Table  5.  Models  of  trait  differences  between  populations  and  mating  systems.  Pop(ms)  indicates  population  nested  in   mating  system,  (ms)  indicates  mating  system,  (sl)  indicates  stamen  length.  The  pollen  count  and  P/O  ratio  sections  for  the  field   common  garden  are  blank  because  pollen  was  not  collected  from  that  experiment.  Plant  ID  was  included  as  a  random  effect  in   the  greenhouse  common  garden  models,  but  for  simplicity  the  results  are  not  reported  here.  Significant  results  (p  <0.05)  are  in   bold,  except  population.   Trait r2 0.81 Greenhouse common garden N df F p 626 ms 1 10.08 0.002 pop(ms) 5 25.55 <0.0001 Pollen count 0.15 312 ms pop(ms) sl sl * ms 1 5 1 1 6.08 5.37 17.18 0.008 0.01 <0.0001 <0.0001 0.9285 Pollen:ovule ratio 0.18 176 ms pop(ms) 1 5 3.10 7.35 0.08 <0.0001 0.08 144 ms pop(ms) 1 4 8.13 1.51 0.005 0.20 Ovule number r2 0.29 Field common garden N df F 295 ms 1 7.21 pop(ms) 4 26.6 Pollen:ovule ratio (no BP)     p 0.008 <0.0001 NA Petal display 0.30 262 ms pop(ms) 1 4 2.21 26.7 0.14 <0.0001 0.60 585 ms pop(ms) 1 5 0.19 13.6 0.67 <0.0001 Petal display (no BP) 0.20 229 ms pop(ms) 1 3 1.24 17.88 0.27 <0.0001 0.56 498 ms pop(ms) 1 4 5.34 3.87 0.02 0.005 Flower size 0.19 256 ms pop(ms) 1 4 0.52 14.56 0.47 <0.0001 0.60 586 ms pop(ms) 1 5 0.49 10.88 0.48 <0.0001 Flower size (no BP) 0.18 223 ms pop(ms) 1 3 0.08 16.24 0.78 <0.0001 0.58 499 ms pop(ms) 1 4 4.32 8.87 0.039 <0.0001 54   Table 5 (cont’d)   Trait Long stamen - pistil 0.17 Field common garden 297 ms 1 52.11 pop(ms) 4 1.31 <0.0001 0.27 0.70 Greenhouse common garden 629 ms 1 0.67 pop(ms) 5 3.49 Pistil 0.16 297 ms pop(ms) 1 4 27.55 7.90 <0.0001 <0.0001 0.57 639 ms pop(ms) 1 5 0.002 2.55 0.97 0.03 Long stamen 0.15 297 ms pop(ms) 1 4 0.12 13.20 0.73 <0.0001 0.59 629 ms pop(ms) 1 5 0.84 7.56 0.36 <0.0001 55   0.41 0.005 Outcrossing" Selfing" Ovule"produc;on"per"flower" A" 45" 40" 35" 30" 25" 20" 15" 10" 5" 0" B" 45" 40" 35" 30" 25" 20" 15" 10" 5" 0" B" A" A" LUD" B" A" A" IDU" BP" PIN" RON" PP" D" A" AB" A" BC" CD" AB" LUD" SAU" IDU" BP" PIN" RON" PP" p"="0.008" *" OUT" SELF" p"="0.002" *" OUT" SELF" Popula;on"""""""""""""""""""""""""Ma;ng"system"   Figure  12.  Self-­‐pollinating  populations  produce  more  ovules  per   flower.  LS  means  ±  2SEM.  A)  Field  common  garden  study.  B)   Greenhouse  common  garden  study.  Populations  are  ordered  left  to   right  from  highest  to  lowest  outcrossing  rate.  Letters  indicate   differences  between  populations  according  to  Tukey’s  HSD  test.  The   last  two  bars  compare  the  selfing  and  outcrossing  populations,  with  an   asterisk  indicating  a  difference  significant  at  p  <  0.05.   56   Pollen"produc.on"(per"anther)" Outcrossing" Selfing" 12000" 10000" AB" A" ABC" ABC" 8000" BC" C" C" p"<"0.0001" p"<"0.0001" *" *" 6000" 4000" 2000" 0" Popula.on"""""""""""""""Ma.ng"system""""Stamen"type"   Figure  13.  Self-­‐pollinating  populations  produce  less  pollen,  and  short  stamen  anthers  produce  more  pollen  than  long   stamen  anthers.  LS  means  ±  2SEM.  There  was  no  significant  mating  system  by  stamen  type  interaction.  Data  from  the   greenhouse  common  garden  study.  Populations  are  ordered  left  to  right  from  highest  to  lowest  outcrossing  rate.  Letters   indicate  differences  between  populations  according  to  Tukey’s  HSD  test.  The  last  two  bars  compare  the  selfing  and  outcrossing   populations,  with  an  asterisk  indicating  a  difference  significant  at  p  <  0.05.       57   Pollen:ovule"ra9o" 2500" 2000" A" Outcrossing" Selfing" A" A" A" p"="0.08" AB" 1500" AB" B" 1000" 500" 0" LUD" SAU" IDU" BP" PIN" RON" PP" OUT" SELF" Popula9on"""""""""""""""""""""""""Ma9ng"system"   Figure  14.  Pollen:ovule  ratio  is  lower  in  selfing  populations.  LS  means  ±  2SEM;   marginal  result  becomes  highly  significant  when  BP  population  is  excluded.  Populations   are  ordered  left  to  right  from  highest  to  lowest  outcrossing  rate.  Letters  indicate   differences  between  populations  according  to  Tukey’s  HSD  test.  The  last  two  bars  compare   the  selfing  and  outcrossing  populations,  with  the  p-­‐value  indicating  a  lack  of  statistically   significant  difference.       58   with  a  shift  to  selfing,  although  the  very  low  ratio  of  the  BP  population  makes  this  shift   borderline  statistically  significant  (Table  5,  Figure  14).     I  found  no  decrease  in  flower  size  in  the  common  garden  studies  with  a  shift  to   selfing  –  either  overall  size,  measured  as  PC1,  or  petal  display  size  (Table  5).  Principal   component  one  (PC1)  was  a  good  estimate  of  flower  size,  explaining  71.8%  of  the  variance   in  flower  size  in  the  greenhouse  and  63.4%  in  the  field.  Loadings  for  all  traits  were  between   0.75  –  0.91  in  the  greenhouse  0.64  –  0.89  in  the  field.     There  is  no  support  for  decreased  herkogamy  in  selfing  populations.  There  were   differences  in  herkogamy  between  mating  systems  opposite  the  predicted  direction  in  the   field,  but  not  in  the  greenhouse  (Table  5,  Figure  15).  Selfing  populations  grown  in  the  field   had  greater  herkogamy  than  outcrossing  populations,  with  long  stamen  anthers  below  the   stigmas;  outcrossing  populations  had  little  herkogamy.  This  was  due  to  selfing  populations   in  the  field  having  longer  pistils  than  outcrossing  populations.  Long  stamen  length  did  not   differ  between  mating  systems  (Table  5,  Figure  15).     In  the  study  looking  for  contact  between  short  anthers  and  stigmas  in  inflorescences   from  nine  individuals  from  a  selfing  and  an  outcrossing  population,  no  flower  at  any   developmental  stage  in  either  population  population  ever  had  a  short  stamen  that  was   dehisced  and  in  contact  with  the  stigma.  In  the  common  garden  studies,  my  measure  of   short  stamen  herkogamy  indicated  a  possibility  of  overlap  between  short  anthers  and   stigma  in  only  six  of  1018  flowers  measured  (<0.6%).  This  makes  autogamous  selfing  via   short  stamens  unlikely.  These  results  strengthen  my  expectation  of  seeing  reduced   investment  in  short  stamens  and  increased  variance  in  their  length,  as  a  lack  of  function   should  release  any  stabilizing  selection  on  their  position.       59   Long"stamen"herkogamy" A" B" 0.3" 0.2" 0.1" 0" B" p"<"0.0001" *" A" A" LUD" A" IDU" A" BP" PIN" RON" PP" OUT" SELF" 50.1" 50.2" Outcrossing" Selfing" 50.3" B" PisFl"length" 4.2" A" A" 4" 3.8" B" 3.6" B" p"<0.0001" A" *" B" 3.4" 3.2" 3" LUD" IDU" BP" PIN" RON" PP" OUT" SELF" Long"stamen"length" C" 4.2" A" 4" 3.8" 3.6" B" B" p"="0.73" B" B" B" 3.4" 3.2" 3" LUD" IDU" BP" PIN" RON" PP" OUT" SELF" PopulaFon"""""""""""""""""""""""""MaFng"system"   Figure  15.  Greater  herkogamy  in  selfing  populations  in  the  field  is  due  to  longer   pistils.  LS  means  (mm)  ±  2SEM,  only  showing  results  from  the  field  common  garden  study.   A)  Herkogamy  (long  stamen  length  –  pistil  length),  B)  pistil  length,  C)  long  anther  length.   Populations  are  ordered  left  to  right  from  highest  to  lowest  outcrossing  rate.  Letters   indicate  differences  between  populations  according  to  Tukey’s  HSD  test.  The  last  two  bars   compare  the  selfing  and  outcrossing  populations,  with  an  asterisk  indicating  a  difference   significant  at  p  <  0.05.     60   Table  6.  Models  testing  for  increased  variance  in  short  stamen  length  with  shift  to   self-­‐pollination.  A.  Models  explaining  variation  in  short  stamen  length  with  and  without   taking  variance  by  mating  system  into  account  were  compared  using  AIC;  dAIC  is  (model   AIC)  –  (best  model  AIC).  Lower  AIC  values  indicate  a  better  model,  so  dAIC  of  0  is  the  best   model  fit.  All  models  included  mating  system  (ms)  as  a  fixed  effect  and  population  (pop)  as   a  random  effect.  For  the  greenhouse  common  garden,  which  included  multiple  flowers   sampled  per  plant,  I  also  fit  a  model  with  plant  ID.  Comparing  those  base  models  to  ones   including  variance  by  mating  system  (ms  variance)  shows  that  taking  variance  by  mating   system  into  account  does  not  improve  model  fit.  This  indicates  no  significant  difference  in   short  stamen  length  variance  between  mating  systems.  B.  Estimates  of  variance  in  short   stamen  length  between  mating  systems.  There  is  no  significant  difference  between   variance  in  outcrossing  and  selfing  populations.         A.     field common greenhouse common garden garden model AIC dAIC df AIC dAIC df ms + pop 276.86 0 4 373.41 70.94 4 ms + pop + ms variance 278.79 1.93 5 375.39 72.92 5 ms + pop + plant 305.43 1.61 5 ms + pop +plant + ms variance 303.82 0 5       B.   variance selfing outcrossing field common garden 0.121 0.140 greenhouse, individual not in model 0.100 0.102 greenhouse, individual in model 0.069 0.061       61   However,  I  found  no  evidence  for  either  decreased  pollen  production  on  short   anthers  or  greater  variance  in  length  of  short  stamens.  The  lack  of  significant  interaction   between  stamen  length  and  mating  system  in  the  pollen  count  models  indicates  there  was   no  decrease  in  pollen  production  in  the  short  stamen  anthers  relative  to  long  stamen   anthers  of  selfing  populations  relative  to  outcrossing  populations  (Table  5).  Models   including  a  difference  in  short  stamen  length  variance  between  mating  systems  did  not  fit   better  than  those  without  the  variance  effect  (Table  6),  indicating  that  variance  did  not   change  with  a  shift  to  selfing.  In  fact,  for  models  without  individual  plant  in  them,  mean   variance  in  short  stamen  length  was  nonsignificantly  greater  in  outcrossing  populations   (Table  6).       The  Bruce  Peninsula  population  (BP),  categorized  as  outcrossing,  was  unusual  in   several  respects.  The  floral  morphology  fit  the  predictions  for  a  selfing  rather  than   outcrossing  population  for  ovule  count,  pollen  production,  P/O  ratio,  and  the  size  of   flowers  (including  petal  display)  (Table  5,  Figures  12-­‐14),  although  removing  it  from  the   models  only  changed  the  results  for  mating  system  for  flower  and  petal  display  size,  and   only  for  the  greenhouse  study  (Table  5).  However,  selfing  and  outcrossing  populations  can   exist  close  together,  and  are  in  fact  known  to  at  this  particular  site  (Foxe  et  al.  2010),  so   reassessing  outcrossing  rate  for  this  sample  may  be  useful.   Variation  in  floral  morphology  between  populations  was  substantial  in  both  the  field   and  common  garden  studies  (Table  5).  Although  not  all  traits  differed  with  mating  system,   every  trait  tested  differed  significantly  between  populations  (with  the  exception  of  long   stamen  herkogamy  in  the  field  common  garden  and  the  P/O  ratio).         62   Discussion   Populations  of  Arabidopsis  lyrata  with  high  selfing  rates  exhibit  only  a  subset  of  the   selfing  syndrome,  indicating  which  traits  are  evolving  first  in  this  early  stage  of  the  mating   system  shift.  As  predicted,  selfing  A.  lyrata  have  sex  allocation  shifted  toward  female   reproduction;  the  pollen/ovule  ratio  is  reduced  due  to  both  decreased  investment  in  male   fitness  (less  pollen)  and  increased  investment  in  female  fitness  (more  ovules)  (Table  5).     However,  they  show  no  reduction  in  flower  size  (Table  5),  and  herkogamy  in  selfers  is   either  unchanged  or  shifted  to  greater  separation  between  anthers  and  stigma  in  selfing   species,  counter  to  predictions  (Table  5,  Figure  15).   One  possible  explanation  for  increased  herkogamy  in  the  selfing  populations  is  early   pollination  followed  by  expansion  of  the  pistil  as  ovules  begin  to  mature.  A.  lyrata’s  sister   species,  the  highly  selfing  A.  thaliana,  is  known  to  self  in  the  bud.  Because  the  ovaries   comprise  most  of  the  pistils  of  many  mustards  (including  Arabidopsis  spp.),  the  pistils  may   grow  rapidly  after  fertilization  (this  is  certainly  true  in  Raphanus  raphanistrum;  JK  Conner,   personal  communication).  This  may  not  have  been  observed  in  the  greenhouse  plants   because  they  were  sampled  when  older  and  more  stressed,  possibly  leading  to  fertilized   ovules  not  developing.  Future  studies  should  measure  herkogamy  earlier,  ideally  before   anthers  dehisce,  to  eliminate  this  possibility.   Lack  of  contact  between  the  short  stamens  and  stigma  suggests  that,  as  in  sister   species  A.  thaliana  (Chapter  1),  short  stamens  are  unlikely  to  contribute  to  autogamously   selfed  seed  in  A.  lyrata.  In  spite  of  this,  there  is  no  evidence  that  selfing  populations  are   reducing  investment  in  short  stamens  more  than  long  stamens.  Both  stamen  types  have   equally  diminished  pollen  production  relative  to  outcrossing  populations  (Table  5,  Figure     63   13).  There  is  also  no  support  for  increased  variance  in  short  stamen  length  (Table  6).  This   may  point  toward  constraint  on  independent  evolution  of  short  stamens,  as  in  A.  thaliana   (Chapter  1).  Alternatively,  as  with  other  traits  that  do  not  conform  to  the  selfing  syndrome,   it  could  indicate  that  short  stamens  maintain  adaptive  function  in  relatively  rare   outcrossing  events  or  for  insect-­‐mediated  self-­‐pollination  within  a  plant  (geitonogamy),  or   that  selection  to  eliminate  the  trait  is  weak  because  it  requires  few  resources.     The  relative  frequency  of  geitonogamous  vs.  autogamous  selfing  in  A.  lyrata   populations  is  currently  unknown.  Although  the  reduced  P/O  ratios  in  selfing  populations   suggest  that  autogamous  selfing  is  shaping  the  evolution  of  floral  morphology,  persistence   of  low  levels  of  self-­‐incompatibility  in  these  populations  means  not  all  plants  are  capable  of   even  geitonogamous  selfing.  Among  self-­‐compatible  plants,  not  all  are  capable  of   autogamous  selfing  (Mable  and  Adam  2007),  and  even  those  that  can  self  within  a  flower   do  not  do  so  consistently  (Mable,  personal  communication;  personal  observation.)     The  geographic  distribution  of  selfing  populations  supports  the  idea  that  selfing  may   have  evolved  through  geitonogamy.  Populations  with  low  outcrossing  rates  are  found  on   the  edges  of  the  species  range,  where  low  genetic  diversity  due  to  range  expansion,   exacerbated  in  some  cases  by  small  population  size,  can  cause  selection  for  the  loss  of  self-­‐ incompatibility  (Griffin  and  Willi  2014).  Thus,  the  evolution  of  selfing  in  A.  lyrata  is  likely   not  related  to  a  stressful  environment  or  lack  of  pollinators,  both  of  which  would  be   expected  to  cause  selection  for  smaller  flowers.  Geitonogamy  contributes  significantly  to   pollination  in  many  other  selfing  plant  species  (Goodwillie  et  al.  2005);  if  this  is  true  in  A   lyrata,  a  reduction  in  flower  size  could  be  maladaptive  even  in  the  most  highly  selfing     64   populations.  Future  studies  quantifying  autogamous  selfing  rates  will  be  critical  for   understanding  the  evolution  of  floral  morphology  in  A.  lyrata.     Inspecting  the  floral  morphology  of  selfing  A.  lyrata  populations  shows  us  that  these   plants  have  only  traveled  a  short  way  down  the  path  to  autogamous  selfing.  They  are   allocating  less  to  male  and  more  to  female  fitness,  but  meet  none  of  the  other  criteria  of  the   selfing  syndrome.  As  an  example  of  the  evolution  of  selfing  in  progress,  it  is  clear  that  in   this  case  reduced  flowers  would  be  a  possible  eventual  result,  not  a  cause,  of  a  shift  in   mating  system.  Further  work  on  the  mechanisms  of  self-­‐pollination  in  this  species  would   shed  light  on  why  the  flowers  of  selfing  A.  lyrata  populations  have  not  yet  evolved  the  full   selfing  syndrome.       Acknowledgments   Jeff  Conner  gave  advice  from  conception  through  writing.  Raffica  LaRosa   commented  on  the  manuscript.  Emily  Dittmar,  Nick  Batora,  and  Chris  Oakley  grew  the   2012  outdoor  common  garden  plants  from  seed  to  transplant  stage.  Mark  Hammond   coordinated  the  field  transplant.  Chris  Oakley  and  Jon  Spoelhof    allowed  me  to  sample   flowers  from  the  2013  greenhouse  common  garden  experiment.  Doug  Schemske  included   me  in  collaborative  experiments  in  his  lab,  including  advice  and  materials.  Shawn  Szabo   and  Marvin  Osborne  assisted  in  the  lab.  Colin  Kremer  helped  with  statistical  analysis  in  R.   This  work  was  supported  by  grants  from  the  Kellogg  Biological  Station’s  G.H.  Lauff  fund   and  T.  Wayne  &  Kathryn  Porter  fund.             65   CHAPTER  5   SUMMARY  AND  FUTURE  DIRECTIONS   Summary     My  dissertation  addresses  the  evolution  of  tetradynamy  across  the  range  of  mating   systems,  with  a  focus  on  the  function  and  evolution  of  short  stamens.  I  confirmed  in   Chapter  2  that  tetradynamy  is  adaptive  for  outcrossing  via  pollinators,  and  discovered  that   the  function  of  the  trait  is  affected  by  pollinator  visitation  frequency.    In  Chapter  3,  I  show   that  tetradynamy  is  not  adaptive  for  autogamous  selfing,  and  in  particular  the  short   stamens  appear  to  be  nonfunctional.  It  appears  that  constraint,  in  the  form  of  epistasis  and   possibly  low  genetic  variance  or  genetic  correlations,  exacerbated  by  inbreeding,  is  slowing   the  evolutionary  elimination  of  short  stamens  in  the  model  plant  Arabidopsis  thaliana.  I   explored  investment  in  short  stamens  in  populations  that  have  recently  evolved  selfing  in   Chapter  4.  I  found  that,  as  I  expected  from  my  results  in  sister  species  A.  thaliana,  selfing   populations  of  A.  lyrata  have  not  detectably  reduced  investment  in  their  newly   nonfunctional  short  stamens.  By  studying  the  function  and  evolution  of  short  stamens   across  a  range  of  mating  systems,  I  have  been  able  to  illustrate  that  while  tetradynamy  is   almost  certainly  maintained  by  natural  selection  in  outcrossing  species,  it  is  nonfunctional   in  autogamous  selfers  and  its  evolutionary  loss  is  likely  constrained.       Future  directions     While  previous  work  has  established  the  adaptiveness  of  tetradynamy,  discovering   how  the  trait  functions  has  proven  a  tremendous  challenge.  The  insight  that  pollinator   visitation  rate  impacts  function  is  a  step  forward,  but  there  are  several  clear  next  steps  to   take  in  exploring  how  mustard  stamens  work.  Sahli  and  Conner  (2011)  showed  that     66   different  pollinator  taxa  differ  in  the  selection  they  exert  on  dimorphism.  I  have  data  on   community  composition  for  the  field  days  in  Chapter  2;  looking  at  whether  selection  varies   with  pollinators  present  may  be  a  first  step.  Blending  Sahli  and  Conner’s  approach  of   focusing  on  individual  pollinator  taxa  with  the  experimental  manipulations  in  Chapter  2,   and  perhaps  adding  variation  in  overall  visitation  rate,  could  help  further  flesh  out  the   possibilities  of  the  trait  specialization  hypothesis.  In  order  to  understand  how  different   pollinators  together  could  favor  tetradynamy,  we  particularly  need  data  on  how  nectar  vs.   pollen  feeders  interact  with  short  or  long  stamens  in  isolation.  Less  ambitious  experiments   that  would  still  further  our  understanding  could  include  detailed  observations  of  pollinator   interactions  with  flowers.  These  could  be  combined  with  experiments  using  different   colors  of  fluorescent  dyes  on  short  and  long  stamens,  observing  where  the  powder  lands  on   pollinators  and  how  much  of  it  is  transferred  to  subsequently  visited  flowers.  There  is   certainly  abundant  material  for  further  work  in  understanding  how  tetradynamy  functions   in  outcrossing.     Because  of  the  model  system  status  of  Arabidopsis  thaliana,  the  future  directions   suggested  by  Chapter  3  are  particularly  expansive.  We  hope  to  both  deepen  and  broaden   this  work.  To  go  deeper,  we  have  explored  knockout  lines  for  candidate  genes,  and  are   seeking  funding  to  identify  the  genes  or  even  specific  mutations  responsible  for  short   stamen  loss.  To  broaden  in  the  short  term,  we  are  pursuing  QTL  mapping  in  independent   sets  of  RILs  to  establish  whether  short  stamen  loss  has  evolved  through  different  pathways.   One  set  of  lines  will  be  planted  in  July  2014,  with  several  more  candidate  sets  available  as   we  have  the  resources  to  allocate.  Long  term,  I  would  like  to  investigate  short  stamen   function  and  loss  in  other  highly  selfing  members  of  the  Brassicaceae.  There  is  at  least  one     67   other  species,  Cardamine  hirsuta,  which  shows  a  remarkably  similar  pattern  of  short   stamen  loss,  including  interpopulation  variation  (Matsuhashi  et  al.  2012).  Exploring  the   function  of  short  stamens  and  genetic  architecture  of  their  production  in  additional  species   would  help  us  understand  if  our  results  are  general.     The  conclusions  I  could  draw  in  Chapter  4  are  limited  in  part  by  the  low  sample  size   of  selfing  populations,  but  also  by  treating  mating  system  as  a  categorical  variable  when,  in   Great  Lakes  populations  of  A.  lyrata,  it  is  clearly  continuous.  Ideally,  I  would  like  to  set  up  a   common  garden  sampling  all  known  self-­‐compatible  populations  of  A.  lyrata  and  balance   the  design  with  a  random  sample  of  self-­‐incompatible  populations.  Data  on  pollination   biology  in  natural  populations  is  also  much-­‐needed;  while  several  European  labs  are  doing   excellent  work  on  the  evolution  of  self-­‐incompatibility  in  the  species,  field  observations  are   lacking.  For  understanding  the  evolution  of  the  selfing  syndrome,  we  need  to  know  how   much  of  self-­‐pollination  is  geitonogamous,  i.e.  whether  selfing  is  a  response  to  lack  of   pollinators  or  low  diversity  in  SI  alleles.         68                         APPENDIX         69   Growth  conditions  for  Arabidopsis  thaliana     Except  where  specified,  plants  for  the  geographic  variation  observational  study  and   stamen  removal  experiments  were  grown  in  growth  chambers  under  the  conditions   described  below  either  at  Michigan  State  University’s  main  campus  in  East  Lansing,   Michigan  (MSU),  or  at  Michigan  State  University’s  Kellogg  Biological  Station  in  Hickory   Corners,  Michigan  (KBS).  Most  seeds  were  obtained  from  the  Arabidopsis  Biological   Resource  Center  (abrc.osu.edu).  Collections  in  Sweden  and  Italy  were  made  by  D.   Schemske,  and  Ukrainian  collections  were  from  J.  Beck  (Wichita  State  University).     MSU  growth  conditions:  seeds  were  sterilized  in  30%  bleach  solution  with  0.001%   Triton  X  100  surfactant  for  ten  minutes,  washed  twice  with  sterilized  water,  suspended  in   0.1%  agar,  and  sown  on  a  100mm  X  15  mm  petri  dish  with  agar  (Phytoblend,  Caisson   Laboratories  Inc.).  Petri  dishes  were  filled  with  20mL  of  0.8%  Agar  with  2.31%  Gamborg’s   B-­‐5  basal  medium  and  autoclaved  after  the  media  set.  Sown  plates  were  wrapped  in   Parafilm,  stratified  in  the  dark  for  four  days  at  5˚C,  then  moved  to  22˚C  with  16-­‐hour  days   with  ~100-­‐  150  µEinsteins  photosynthetically  active  radiation  (PAR).  Once  the  first  true   leaves  formed,  seedlings  were  transplanted  to  2”  square  pots  with  Suremix  “Perlite”  soil-­‐ less  media.  Plants  were  bottom-­‐watered  with  ½  strength  Hoagland’s  Nutrient  solution;  soil   was  allowed  to  dry  down  between  watering.  Plants  were  kept  at  22˚C  with  16-­‐hour  days   and  ~100-­‐  150  µEinsteins  PAR  for  3  weeks  until  rosettes  were  formed,  and  then  vernalized   for  ~8  weeks  at  6˚C  with  10-­‐hour  days  and  ~50  µEinsteins  PAR  to  promote  flowering.  The   plants  were  then  moved  to  22˚C  with  16-­‐hour  days  with  ~100-­‐  150  µEinsteins  PAR  for  the   duration  of  the  study.     70   KBS  growth  conditions:  3-­‐10  seeds  were  direct-­‐seeded  into  2”  square  pots  with   MetroMix  growing  mix  (Sun  Gro).  Seeds  were  then  stratified  in  the  dark  at  6˚C  for  four   days,  followed  by  five  weeks  at  22˚C  with  16-­‐hour  days.  After  germination,  seedlings  were   thinned  to  a  single  plant  and  pot  locations  were  randomized.  Plants  were  vernalized  for  10   weeks  at  6˚C  with  10-­‐hour  days.  Conditions  were  then  changed  to  22˚C  with  14-­‐hour  days   for  flowering.  Pots  were  bottom-­‐watered  with  deionized  water  and  allowed  to  dry  down   between  watering.     Experiment:  function  of  A.  thaliana  short  stamens  in  selfing     The  four  stamen  removal  treatments  (removing  all  stamens,  removing  no  stamens   but  probing  inside  the  bud,  removing  short  only,  or  removing  long  only)  were  performed   before  anther  dehiscence  in  unopened  buds  using  fine  forceps  under  a  dissecting   microscope.  Pedicels  were  painted  with  unique  colors  indicating  the  treatment  applied.   There  was  an  additional  control  treatment  that  included  painting  the  pedicel  but  no  other   interference  with  the  flower.   Because  we  only  used  flowers  with  two  short  stamens,  populations  with  high  short  stamen   production  were  utilized  to  guarantee  all  treatments  could  be  performed.  In  2007,  the   stamen  removal  treatments  described  above  were  performed  on  18  plants  grown  at  MSU   from  two  Swedish  populations  (originally  collected  by  D.  Schemske  near  the  towns  of   Rödåsen  and  Skuleberget).  In  2011,  I  repeated  the  experiment  on  2-­‐4  individuals  from  each   of  five  populations  grown  at  KBS  (total  16  plants)  sampled  from  across  Europe  (Table  7);   these  plants  were  placed  in  the  field  after  stamen  removal  until  the  manipulated  flowers   senesced  to  see  if  short  stamens  functioned  in  a  more  natural  environment,  then  returned   to  a  growth  chamber  to  mature  any  developing  fruits.  Resulting  seeds  were  counted.  Seed     71   Table  7.  Accessions  included  in  the  study  of  geographic  variation  in  short  stamen  production.  Includes  accessions  in   studies  of  short  stamen  function  (indicated  with  an  asterisk  next  to  the  code)  and  parents  of  the  recombinant  inbred  lines   (Rodasen  [Sweden]  and  Belmonte  [Italy]).  Except  where  noted,  stock  numbers  are  those  used  by  the  Arabidopsis  Biological   Resource  Center  (abrc.osu.edu).  Beck  and  Schemske  lines  were  collected  by  James  Beck  and  D.  Schemske.  Locations  were   taken  from  the  name  of  the  line  and/or  the  nearest  location  to  the  lat/long  coordinates  provided  to  identify  the  lines.  In  cases   where  the  two  disagreed,  the  coordinates  took  precedence.  When  coordinates  were  unavailable,  the  named  location  of   collection  was  used  to  find  them.  An  “X”  to  the  left  of  the  latitudinal  or  longitudinal  coordinates  indicates  that  accession  was   included  in  the  corresponding  sampling  band  of  the  native  range.       Codes     Gr   Uod     An     Br   Lp2   Sap   Zdr,  Bor   Pu2     Tamm*   Location   Austria   Graz   Uod   Belgium   Antwerp   Czech  Republic   Brno   Lipovec   Slapy   Zdarec/Borky   Prudka,  Croatia   Finland   Tammisari   #  Lines   Stock  Numbers       5   1198,  1200,  1202,  1204,   1206   2   22612  -­‐  13       2   946,  22626         1   22628   2   22594  -­‐  95   1   6854   4   22588  -­‐  91   2   22592  -­‐  93       2   22604  -­‐  05         72   Latitude       X   47.1  N         X         X   X   X   X   X     X   X   14.53  E           X   4.3  E         X   16.37  E   X   16.39  E     X   14.4  E   X   16.27  E     18.07  E           23.26  E   48.07  N     51.3  N     49.12  N   49.22  N   49.8  N   49.38  N   42.38  N     59.58  N   Longitude         15.4  E   Stam  #     1.6   1.27     1.14     0.49   1.29   1.11   1.14   1.21     1.78   Table  7  (cont’d)     Codes   Location   #  Lines     France     Cen   Caen   1   Gy   La  Miniere   1   Rennes   Rennes   5     Germany     Bay   Bayreuth   2   Bd,  Sp   Berlin   2   Dr   Dresden   1   Ei*   Eifel   4   Er   Erlangen   1   Ga   Gabelstein   2   Got   Göttingen   5   Je*   Jena   1   Krot   Krottensee   3   Nd   Niederzenz   2   No   Nossen   1   Ste   Stendal   1   Wt   Wietze   5     Italy     NA   Belmonte   5   NA   Bolsena   5   Ct   Catania   1   Pa   Palermo   3     Kazakhstan     KZ*   Karagundy   5     Netherlands     Nok   Noordwijk   4     Poland     La   Landsberg/Gorzów   3   Wa   Warsaw   1     Stock  Numbers     1066   22631   22269,  22271  -­‐  72,  22610  -­‐  11     954,  22633   962,  1530   1114   1126,  1128,  1130,  22616   1142   1182,  22634   22608  -­‐  09,  22308  -­‐  10   1246   3886  -­‐  88   1390,  22619     1394   1536   1604,  1606,  1608,  1610,  22637     Schemske  1,  2,  4,  12,  13   Schemske  3,  11,  15,  17,  18   22639   1438,  1440,  1442     22442  -­‐  44,  22606  -­‐  07     1398  1400  1402  22643       1298,  1302   22644   73   Latitude           49.2  N     49  N     48.5  N           X   49  N     X   52.5  N     X   51  N       50.3  N     X   49.59  N       50.3  N     51.32  N   X   50.9  N     X   49.6  N       51  N     X   51.05  N   X   52.6  N     52.3  N           X   42.12  N   X   42.65  N   X   37.3  N     X   38.1  N             49.5  N             52.3  N           X   52.5  N     X   52.23  N   Longitude           X   0.35  W     X   2  E   X   1.41  W       X   11  E   X   13.4  E   X   13.75  E   X   6.3  E   X   11.04  E   X   8  E   X   9.55  E   X   11.6  E   X   11.6  E   X   10  E   X   13.3  E   X   11.85  E   X   9.3  E         12.48  E     12  E     15  E     13.4  E       X   73.1  E       X   4  E       X   15.5  E   X   21  E   Stam  #     1.71   1.41   1.02     1.57   1.2   1.67   1.44   1.24   1.22   1.92   1.68   1.38   1.31   1.03   1.47   1.53     1.35   1.07   0.68   1.32     1.15     1.9     1.8   1.54   Table  7  (cont’d)     Codes   Location     Russia   Ws   Wassilewskija     Sweden   Fab   Fäberget   Lov   Lövvik   Omo2   Östra  Möcklö   NA*   Rodasen   NA*   Skuleberget   Spr1   Sprattleboda   M3385S,   Stockholm   M7943S,   St   Var2   Vårhallarna     Ukraine   En-­‐D   Donetsk   Koch   Kocherov   NA   Veselinovka,  Kyiv   Oblast           #  Lines     1     2   2   2   5   5   2   3   2     1   5   5   Stock  Numbers     22623     22576  -­‐  77   22574  -­‐  75   22584  -­‐  85   Schemske  1,  5,  9,  47,  51   Schemske  4,  20,  27,  28,  36   22582  -­‐  83   3111,  3114,  1534   Latitude         52.5  N   X   63.01  N   X   62.48  N   X   56.12  N   X   56.12  N   X   62.8  N   X   63.05  N   X   56.32  N   X   59.2  N   22580  -­‐  81     920   22823  -­‐  27   Beck  794  (1-­‐5)   X           74                   Longitude       X   30  E     18.19  E     18.05  E     15.18  E     15.18  E     18.2  E     18.22  E     14.29  E       18.4  E   55.33  N     14.2  E           48  N     X   37.8  E   50.36  N   X   29.96  E   50.26  N   X   31.5  E   Stam  #     1.12   1.86   1.79   1.17   1.17   1.96   1.74   1.79   1.62   1.43     0.76   1.11   1.27   unmanipulated 30 untouched) Frequency) A)! 25 20 15 10 5 removed none 0 0 4 8 12 0 4 0 4 0 4 8 12 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 30 probed) Frequency)) B)! 25 20 15 10 5 removed short 0 8 12 16 30 Frequency)) removed)shorts) C)! 25 20 15 10 5 removed long 0 8 12 16 30 25 removed)longs) Frequency)) D)! 20 15 10 5 removed all 0 30 removed)all) Frequency)) E)! 25 20 15 10 5 0 Seed)set)per)fruit)   Figure  16.  Distribution  of  seed  set  in  stamen  removal  treatments.   Treatments  are  depicted  in  cartoons  to  the  right  of  histograms;  d)  was  a   control  with  flowers  probed  with  forceps,  whereas  e)  was  an   unmanipulated  control.  Increasing  frequency  of  flowers  with  zero  seed   set  from  a-­‐b  and  b-­‐c  is  consistent  with  a  side  effect  of  greater  disruption   of  the  flower  from  probing  and  short-­‐stamen-­‐removal.  The  increase  in   flowers  with  zero  seed  set  from  c-­‐d  is  not  likely  due  to  damage,  because   long  stamens  are  easier  to  remove  without  disruption  to  the  flower   than  short  ones.       75   Table  8.  Testing  function  of  short  stamens.  Treatment  was  highly  significant  (F  =  42.37,   p  <0.0001,  N  =  157).  Flowers  in  the  “no  stamens  removed”  treatment  were  probed  with  the   forceps,  and  flowers  in  the  “unmanipulated”  treatment  were  untouched.  For  Tukey’s  HSD,  a   shared  letter  indicates  no  significant  difference.       Treatment   Least  Square   1  SE   Tukey’s  HSD   N   Mean   All  stamens  removed   0.25   3.42   A   33   Long  stamens  removed   2.60   3.43   A   32   Short  stamens  removed   21.18   3.43   B   32   No  stamens  removed   25.04   3.42   B/C   33   Unmanipulated   29.69   3.54   C   27           76   set  was  analyzed  in  JMP  version  10.0.0  (SAS  Institute  2012)  with  a  model  including   treatment  as  a  fixed  effect,  population  as  a  random  effect,  and  plant  ID  as  a  random  effect   nested  in  population.  Formally,  this  is:   γ ~ β0 γ ~ β0 + β t + ε   2 β0 β ~ N(β0 p , σ ) βi ~ N(β0 pi , σ 2β 0 ) Where  γ  is  the  number  of  seeds  produced  in  a  single  fruit,  0  is  the  intercept,  t  is  the   treatment,  p  is  the  population,  and  i  is  the  individual  plant  nested  in  population.  Differences   between  treatment  means  were  tested  using  a  Tukey  HSD  test  (Table  8).     We  initially  included  year  and  the  year-­‐by-­‐treatment  interaction  in  the  model  for   seed  set  in  the  stamen  removal  experiments,  but  there  was  no  significant  effect  of   environment  (indicating  no  increase  in  function  in  the  field  vs.  growth  chamber),  so  we  left   them  out  of  the  final  model.  We  tried  to  control  for  bud  damage  during  stamen  removal  by   including  a  control  in  which  buds  were  probed  but  not  manipulated  further,  and  this   treatment  did  show  an  increase  in  fruits  with  seed  set  of  zero  (likely  due  to  damage)   compared  to  a  completely  unmanipulated  treatment  (Fig.  16).  However,  the  control   treatment  was  likely  not  aggressive  enough  to  mimic  damage  levels  short  stamen  removal.     The  position  of  short  stamens  deeper  in  the  buds  makes  it  likely  that  short  stamen  removal   will  either  disrupt  long  anther  position  (reducing  contact  with  the  stigma)  or  that  the  pistil   itself  will  be  damaged.  Evidence  for  this  comes  from  the  greater  number  of  flowers  with   zero  seed  set  in  the  short-­‐stamen-­‐removal  treatment  compared  to  the  manipulated  control   (Fig.  16).  Four  flowers  had  unusually  high  seed  set  (≥  24)  in  the  long-­‐  and  all-­‐stamens-­‐   77   removed  treatments  (Fig.  16).  These  were  likely  the  result  of  accidental  pollinations;  three   of  the  four  (including  the  highest  in  both  treatments)  occurred  in  growth  chambers,  where   no  potential  insect  pollinators  were  present.    They  were  left  in  the  analysis  as  we  had  no  a   priori  reason  to  eliminate  them.     Geographic  variation  in  A.  thaliana    short  stamen  production     Plants  were  grown  at  KBS  with  populations  interspersed  in  trays.  Tray  positions  in   growth  chambers  were  rotated  weekly  to  minimize  position  effects.  Replicate  plants  for   each  line  were  divided  evenly  in  two  blocks  grown  under  identical  conditions  two  months   apart.  Flowers  were  preserved  in  70%  ethanol  for  later  stamen  counts  using  a  dissecting   microscope.  Short  stamen  number  was  used  in  the  analysis  because  a  reduction  in  total   stamen  count  is  nearly  always  due  to  loss  of  short  stamens  (only  31  of  the  2570  flowers   examined,  or  1.2%,  produced  fewer  than  four  long  stamens,  compared  to  1496,  or  58.2%,   producing  fewer  than  two  short  stamens).  Correlations  between  stamen  production  and   longitude  and  latitude  were  performed  in  JMP  10.0.0  (SAS  Institute  2012).   QTL  mapping   Seeds  were  sown  in  sterilized  petri  dishes  on  media  consisting  of  Gambog’s  B-­‐5  nutrient   mix,  Bacto  Agar,  and  ultrapure  water.  They  were  stratified  at  4°C  for  five  days  and  then   moved  to  22°C  with  16-­‐hour  days  for  8-­‐10  days.  Seedlings  were  then  transferred  to  soil  in   tubes  and  returned  to  the  growth  chambers  for  8  days.  Of  the  seedlings  that  survived   transplant,  six  per  RIL  and  20  of  each  parental  line  were  transferred  to  growth  chambers   programmed  to  mimic  the  temperature  fluctuations  encountered  during  the  Arabidopsis   thaliana  growing  season  in  Italy  (Dittmar  et  al,  unpublished).  Plants  were  randomized  to   positions  in  six  trays  divided  between  two  growth  chambers,  with  each  tray  divided  into       78   Table  9.  Plants,  lines,  and  flowers  sampled  for  QTL  analysis.  The  multiple  parent  lines   are  all  descended  by  selfing  from  the  two  individuals  used  to  produce  the  RILs.  Fewer   Swedish  parents  were  sampled  because  they  flowered  late  and  completed  flowering   quickly.     Type  of  lines   Total   Total  #   Total  #   Mean   Mean  flowers   #  lines   plants   flowers   plants  per   per  plant   line  (SD)   (SD)   RILs   519   2468   7435   4.76  (1.35)   3.01  (0.30)   Italian  parent   10   168   502   16.8  (1.03)   2.99  (0.15)   Swedish  parent   10   74   224   7.40  (2.01)   3.03  (0.37)           79   four  sections:  long  side  of  the  perimeter,  short  side  of  the  perimeter,  inner  circle,  and   center.  Plants  were  randomized  across  the  six  trays  and  sections  within  trays,  and  trays   were  rotated  randomly  within  and  between  chambers  every  three  days  until  flowering   began.  Trays  were  watered  as  needed  with  deionized  water  and  ½-­‐strength  Hoagland’s   solution.     On  the  day  of  flower  collection,  we  collected  the  three  most  recently  opened  flowers   on  plants  with  at  least  10  open  flowers.  If  there  were  fewer  than  three  healthy  open   flowers,  we  took  whatever  was  available;  if  the  plant  was  near  finishing  flowering  but  still   healthy,  we  took  the  entire  flowering  end  of  the  inflorescence,  occasionally  resulting  in   more  than  three  flowers  sampled  per  plant.  There  is  a  small  but  significant  effect  of  flower   rank,  with  later  flowers  producing  more  short  stamens,  but  even  for  late  flowers  the  large   difference  in  production  between  the  Italian  and  Swedish  RIL  parents  is  preserved,  so   variation  in  rank  of  flowers  collected  should  not  bias  the  results.  Flowers  were  stored  in   70%  ethanol.  In  total,  we  collected  and  scored  8161  flowers  from  519  RILs  plus  the  parents   (Table  9).  Stamens  were  counted  under  a  dissecting  microscope.  Stamen  number  averaged   across  flowers  and  individual  plants  for  each  RIL  was  used  for  the  QTL  analysis.     To  assess  position  effects  on  stamen  production  and  variation  between  and  within   RILs,  we  partitioned  variance  with  a  random-­‐effects  model  in  JMP  version  10.0.0  (SAS   Institute  2012)  that  included  RIL,  individual  plant  nested  in  RIL,  tray,  and  position  nested   in  tray.  Formally  this  is:     80   γ ~ β0 + ε β0 ~ N(β0r , σ 2β 0 ) β p ~ N(β0 pr , σ 2β 0 )   βt ~ N(β0t , σ 2β 0 ) βu ~ N(β0tu , σ 2β 0 )   Where  γ  is  the  number  of  short  stamens  produced  in  a  single  flower,  r  is  the  RIL,  p  is   the  individual  plant,  t  is  the  tray,  and  u  is  the  position  nested  in  tray.  Variance  between  RILs   was  substantial  (36.16%),  indicating  a  strong  genetic  component  controlling  the  trait.  The   small  variance  between  plants  within  RILs  (0.04%)  was  consistent  with  this.    Most  of  the   variance  in  stamen  production  was  among  flowers  within  individual  plants  (60.49%),   reflecting  high  within-­‐plant  plasticity  -­‐  plants  with  stamen  loss  produced  all  three  flower   types,  with  0,  1  and  2  stamens.  Because  we  sampled  consecutive  flowers,  we  may  have   even  underestimated  the  within-­‐plant  variance.  Growth  chamber  position  effects  on   stamen  production  were  minimal  (2.18%  for  tray  and  1.14%  for  position  within  the  tray).   This  suggests  that  while  mean  short  stamen  production  is  strongly  genetically  controlled,  it   is  poorly  canalized,  resulting  in  common  production  of  multiple  flower  morphs  on  a  single   plant.  This  lack  of  buffering  in  response  to  minor  environmental  variation  suggests  a  trait   in  the  early  stages  of  loss.         The  skewed  distribution  of  stamen  loss  is  the  RILs  is  consistent  with  epistasis:  a   disproportionate  fraction  of  the  lines  had  no  variation  in  short  stamen  production,  with  all   flowers  producing  both  stamens  (Fig.  20).  In  lines  with  heterozygosity  this  could  indicate           81   stepwise_stamenqtl_full_untransformed_LodProfile 5@7.7 40 lod 30 20 3@19.7 10 1@74.4 0 1 3 Chromosome 5   Figure  17.  Main-­‐effect  QTL  using  stepwise  analysis  on  the  complete  untransformed   data  with  no  epistasis  in  R/qtl.  The  numbers  above  the  peaks  give  the  chromosome   location  for  peaks  that  cross  the  threshold  for  significance  (e.g.  1@74.4  =  peak  at  74.4  cM   on  chromosome  1).  The  LOD  threshold  (2.62),  designated  by  a  horizontal  dotted  line,  was   estimated  by  permutation  for  5%  significance.     82   Mean Short Stamen Number 2$ 1.9$ 2$ p<0.0001$$ $" 1.9$ 1.8$ 1.8$ 1.7$ 1.7$ 1.6$ 1.6$ 1.5$ 1.5$ QTL A allele 1.4$ produc2on$ loss$ 1.3$ 1.2$ loss p$=$0.077$$" 1.4$ 1.3$ production QTL B allele 1.2$ QTL A allele produc2on$ loss$ loss production QTL C allele   Figure  18.  Epistasis  results  in  reduced  short  stamen  loss.  Epistatic  interactions   between  QTL  A  and  QTL  C,  and  between  QTL  A  and  QTL  C;  p-­‐values  are  from  the  ANOVA   testing  for  all  possible  interactions  between  the  two  loci.  Error  bars  are  ±2  SEM.       83   2.0 0 c bc 1.6 a 1.4 Short Stamen Number 1.8 b ac ab 1.2 abc     Figure  19.  Epistasis  results  in  fewer  effective  paths  to  evolution  of  stamen  loss  by   natural  selection.  Starting  with  the  all-­‐Swedish  genotype  (0),  which  produces  the  most   short  stamens,  this  illustrates  the  phenotypes  of  the  12  possible  transitions  to   accumulating  the  Italian  genotype  at  all  three  QTL.  Dotted  lines  indicate  transitions  that  do   not  result  in  a  significant  decrease  in  short  stamen  number  (determined  using  Tukey’s  HSD   test  on  epistasis  ANOVA  results).  Five  of  the  12  transitions  do  not  result  in  significant  loss   of  short  stamens,  and  only  one  path  has  a  significant  reduction  at  each  step  (0  -­‐>  a  -­‐>  ac  -­‐>   abc,  corresponding  to  the  upper  right  panel  of  Fig.  3b).     84   Swedish"parent" 1.95"(0.02)" 180" 160" Number'of'RILs' 140" 120" 100" 80" 60" Italian"parent" 0.92"(0.05)" 40" 20" 0" 0.4")"0.59" 0.6")"0.79" 0.8")"0.99" 1.0")"1.19" 1.2")"1.39" 1.4")"1.59" 1.6")"1.79" 1.8")"1.99" RIL'Mean'Short'Stamen'Number' 2"   Figure  20.  Distribution  of  mean  short  stamen  production  in  the  recombinant  inbred   lines.  RIL  parent  means  are  depicted  as  stars,  with  1  SEM  in  parentheses.  The  left  skew  of   the  distribution  hints  at  the  epistasis  uncovered  in  the  QTL  analysis.   85       dominance,  but  because  the  RILs  are  nearly  completely  homozygous,  it  can  only  be   caused  by  epistasis.   The  main-­‐effect  QTL  analyses  were  carried  out  in  R/qtl  (Broman  et  al.  2003)   (Figure  17).  We  performed  Haley-­‐Knott  regression  with  10,000  permutations  to  set   a  LOD  threshold,  followed  by  automated  stepwise  analyses  (Broman  et  al.  2003)   without  epistasis,  with  alpha  set  at  0.05.  We  tested  for  epistasis  between  the  main-­‐ effect  QTL  with  an  ANOVA  in  JMP  (SAS  Institute  2012)  based  on  RIL  genotypes  at   the  marker  closest  to  the  QTL  peaks.  The  model  included  all  QTL  and  all  possible   interactions  between  them  (Table  11).  Formally,  this  model  is:     γ ~ β0 + β a + βb + βc + β axb + β axc + βbxc + β axbxc   Where  γ  is  the  mean  number  of  short  stamens  produced  in  a  RIL,  a  is  the  effect  of   the  stamen-­‐loss  allele  at  QTL1,  b  is  the  effect  of  the  stamen-­‐loss  allele  at  QTL3,  and  c   is  the  effect  of  the  stamen-­‐loss  allele  at  QTL5.   The  distribution  of  stamen  number  was  highly  skewed  (stamen  loss  is  relatively   rare  in  the  RILs,  Figure  20)  and  could  not  be  normalized  through  transformation.   Because  the  automated  stepwise  procedure  in  stepwiseqtl  is  sensitive  to  non-­‐ normal  residuals,  we  analyzed  the  untransformed  data  and  then  made  two  new,   complementary  versions  of  the  dataset:  one  binary  (lines  coded  as  loss  vs.  no  loss),   and  one  quantile-­‐normalized,  including  only  lines  with  stamen  loss  and  analyzed   them  the  same  way  (Broman  et  al.  2003).  The  analyses  identify  the  same  three   main-­‐effect  QTL:  one  each  on  chromosomes  1,  3,  and  5  (Fig.  3,  Tables  12,       86   Table  10.  Locations  and  95%  credible  intervals  for  main-­‐effect  QTL  peaks.  QTL   are  designated  by  chromosome  number.  QTL  from  R/qtl  and  QTL  Cartographer   (Cart)  are  similar;  the  peaks  from  QTL  Cartographer  fall  near  or  within  the   confidence  intervals  for  the  peaks  in  the  R/qtl  analysis.  R/qtl  peaks,  and  Bayes  95%   credible  intervals  were  calculated  using  the  full,  untransformed  data;  kb  locations   are  based  on  the  AGI  map.  Percent  variance  explained  for  R/qtl  was  calculated  using   the  LOD  scores  from  the  Haley-­‐Knott  regression  (Broman  and  Sen,  2009).     QTL   R/qtl  peaks   Bayes  95%     Bayes  95%   QTL  Cart  peaks   (PVE)   credible  interval   credible  interval   (PVE)   (cM)   (kb)   1   74.4  cM  (2.7%)   58.6  –  83.8  cM   21,551  –  30,246   80  cM  (2.6%)   3   16.5  cM  (7.0%)   15.6  –  19.7  cM   7,329  –  8,201   26  cM  (7.8%)   5   7.7  cM  (28.4%)   6.7  –  7.7  cM   2,408  –  2,986   10  cM  (27.9%)     87   Table  11.  Significance  of  main  effects  and  interactions.  From  analyses  in  R/qtl   using  the  full  untransformed  data;  main  effects  are  from  the  R/qtl  stepwise  model   without  epistasis,  interactions  are  from  ANOVA  including  main  effects  and  all   possible  interactions  in  JMP.       QTL  location   1  SE   F   p   Chromosome  1   0.01   19.51   <0.0001   Chromosome  3   0.01   58.51   <0.0001   Chromosome  5   0.01   98.37   <0.0001   Epistasis:  1*3   0.01   0.10   0.75   Epistasis:  1*5   0.01   3.14   0.08   Epistasis:  3*5   0.01   35.29   <0.0001   Epistasis:  1*3*5   0.01   1.41   0.24           88   Table  12.  Number  that  fall  within  QTL  for  stamen  loss  in  Arabidopsis  thaliana.   Candidates  are  known  to  be  expressed  in  stamens  and  are  also  implicated  in  stamen   production  in  publications.  “Total  loci”  column  includes  all  known  genes  within  the   Bayes  95%  credible  interval  for  the  QTL,  including  candidates  and  non-­‐candidates   expressed  in  stamens.     Chromosome  of  QTL   Total  loci   Expressed  in   Candidate stamens   s   1   2278   1171   22   3   182   117   2   5   176   100   1       89   Table  13.  Details  for  candidate  genes.  Locus  designations  are  from  TAIR.  The  four   candidates  not  known  to  be  involved  in  the  GA  and/or  JA  pathways  are  italicized;  the   genes  on  the  third  and  fifth  chromosome  QTL  are  bold.     Location  (kb)   QTL   locus   function   22,772-­‐22,775   1   AT1G61680     JA-­‐induced   1   AT1G62990     23,337-­‐23,341   JA-­‐induced,  downregulated  by  DELLAs   1   AT1G66140     24,620-­‐24,622   upregulated  by  DELLAs   1   AT1G66350       24,748-­‐24,750   DELLA  protein,  opposed  by  GA   25,391-­‐25,394   1   AT1G67730     transcription  upregulated  by  JA     JAG,  works  with  NUB  to  regulate  stamen   1   AT1G68480   25,684-­‐25,686   development   1   AT1G68690     25,789-­‐25,792   JA-­‐induced   1   AT1G69490     26,122-­‐26,123   regulated  by  BRAHMA   1   AT1G70940     26,743-­‐26,746   PIN3,  some  mutants  have  no  stamens   1   AT1G73870     27,779-­‐27,781   upregulated  by  DELLAs   1   AT1G74430     27,975-­‐27,977   JA-­‐induced   1   AT1G74670     28,053-­‐28,054   upregulated  by  DELLAs   1   AT1G75750     28,441-­‐28,442   upregulated  by  DELLAs   28,499-­‐28,501   1   AT1G75900     downregulated  by  DELLAs     ASK1,  interacts  with  UFO  to  affect  B   1   AT1G75950     28,517-­‐28,518   genes   1   AT1G76240   28,603-­‐28,604   downregulated  by  DELLAs   1   AT1G76410     28,669-­‐28,670   JA-­‐induced   1   AT1G76890     28,873-­‐28,875   JA-­‐induced   1   AT1G77450     29,100-­‐29,101   JA-­‐repressed   1   AT1G77590   29,148-­‐29,152   JA-­‐induced   1   AT1G78440     29,512-­‐29,513   downregulated  by  DELLAs   3   AT3G22060     7,771-­‐7,772   upregulated  by  DELLAs   3   AT3G22800   8,063-­‐8,065   downregulated  by  DELLAs     initiates  /regulates  JA  response  in   5   AT5G08750     2,852-­‐2,855   stamens     90   Table  14.  Results  of  three  models  in  R/qtl.  Higher  pLOD  indicates  higher  maximum-­‐likelihood  estimated  model  explanatory   power.  The  peaks  are  in  cM.  “Effect”  is  the  effects  size  (2SE)  per-­‐allele,  so  is  half  the  difference  between  the  two  homozygotes   from  different  parents.  Effect  size  for  the  binary  model  cannot  be  compared  to  the  others  due  to  the  binary  phenotype  and  lack   of  multiple  QTL.       Data   QTL1   QTL3   QTL5       95%   95%     95%   pLOD       peak     CI   effect     LOD   peak     CI   effect     LOD   peak     CI   effect     LOD   full  untrans-­‐ formed   45.25 7   no  6  transformed   27.40 5   binary       74.4   68.4-­‐ 80.9   0.05   (0.02)       74.4   68.4-­‐ 79.6   0.06   (0.02)   NA   NA   12.74       NA   19.7   16.5-­‐ 22.3   0.08   (0.02)   4.1   16.5   15.6-­‐ 22.3   0.10   (0.02)   9.2   6.6   NA   NA   NA   NA   NA   6   4.8       91   12   7.7   7.5-­‐ 8.5   0.17   (0.02)   42.3   6.7-­‐ 8.5   2.6-­‐ 8.6   0.15   (0.02)   26.1   .-­‐1.0   (0.28)   15.2   14).  The  QTL  on  chromosome  5  has  the  largest  effect  in  all  three  analyses,  and  is   the  only  QTL  in  the  binary  analysis.  The  analysis  in  QTL  Cartographer  found  the   same  three  QTL  in  nearby  locations  on  the  same  chromosomes  with  comparable   effect  sizes  (Table  10).   Because  there  was  some  variation  in  the  number  of  plants  sampled  per  line   (Table  9),  we  excluded  the  37  lines  with  fewer  than  three  plants  sampled  and  reran   the  analysis  as  described  above  on  untransformed  RIL  means.  The  main  results   were  unchanged.   While  there  is  some  segregation  distortion  in  this  set  of  recombinant  inbred   lines,  it  is  most  substantial  on  chromosome  4  (which  does  not  include  a  QTL  for   short  stamen  loss  in  our  main  analysis),  and  with  our  large  sample  size  it  is  not   substantial  enough  to  affect  the  QTL  mapping  at  regardless  (Agren  et  al.  2013).     A.  thaliana    candidate  gene  search     To  investigate  possible  biological  mechanisms  underlying  both  the  main  effect   QTL  and  epistasis,  candidate  genes  were  identified  using  the  TAIR  Gene  Search   (www.arabidopsis.org).  Twenty-­‐two  of  the  candidates  were  in  the  broad  QTL  on   chromosome  1,  two  in  the  chromosome  3  QTL  and  one  in  the  chromosome  5  QTL.     92                         LITERATURE  CITED     93   LITERATURE  CITED     Abbott,  R.  J.,  and  M.  F.  Gomes.  1989.  Population  genetic  structure  and  outcrossing   rate  of  Arabidopsis  thaliana  (L)  Heyhn.  Heredity  62:411–418.   Agren,  J.,  C.  G.  Oakley,  J.  K.  McKay,  J.  T.  Lovell,  and  D.  W.  Schemske.  2013.  Genetic   mapping  of  adaptation  reveals  fitness  tradeoffs  in  Arabidopsis  thaliana.  Proc.  Natl.   Acad.  Sci.  U.  S.  A.  110:21077–21082.   Alvarez-­‐Buylla,  E.  R.,  M.  Benítez,  A.  Corvera-­‐Poiré,  Á.  C.  Cador,  S.  de  Folter,  A.  G.  de   Buen,  A.  Garay-­‐Arroyo,  B.  Garciá-­‐Ponce,  F.  JaimesMiranda,  R.  V.  Pérez-­‐Ruiz,  A.   Piñeyro-­‐Nelson,  and  S.-­‐C.  Y.E.  2010.  Flower  Development.  in  The  Arabidopsis  Book.   The  American  Society  of  Plant  Biologists,  Rockville,  MD.   Barrett,  S.  C.  H.  2010.  Darwin’s  legacy:  the  forms,  function  and  sexual  diversity  of   flowers.  Philos.  Trans.  R.  Soc.  B  Biol.  Sci.  365:351–368.   Barrett,  S.  C.  H.  1992.  Heterostylous  genetic  polymorphisms:  model  systems  for   evolutionary  analysis.  Pp.  1–39  in  Evolution  and  Function  of  Heterostyly.  Springer-­‐ Verlag,  New  York.   Barrett,  S.  C.  H.  2002.  The  evolution  of  plant  sexual  diversity.  Nat.  Rev.  Genet.  3:274– 284.   Beck,  J.  B.,  H.  Schmuths,  and  B.  A.  Schaal.  2008.  Native  range  genetic  variation  in   Arabidopsis  thaliana  is  strongly  geographically  structured  and  reflects  Pleistocene   glacial  dynamics.  Mol.  Ecol.  17:902–915.   Bodbyl  Roels,  S.  A.,  and  J.  K.  Kelly.  2011.  Rapid  Evolution  Caused  by  Pollinator  Loss   in  Mimulus  Guttatus.  Evolution  65:2541–2552.   Bomblies,  K.,  L.  Yant,  R.  A.  Laitinen,  S.-­‐T.  Kim,  J.  D.  Hollister,  N.  Warthmann,  J.  Fitz,   and  D.  Weigel.  Local-­‐Scale  Patterns  of  Genetic  Variability,  Outcrossing,  and  Spatial   Structure  in  Natural  Stands  of  Arabidopsis  thaliana.  Plos  Genet.  6.   Broman,  K.  W.,  H.  Wu,  S.  Sen,  and  G.  A.  Churchill.  2003.  R/qtl:  QTL  mapping  in   experimental  crosses.  Bioinformatics  19:889–890.   Burd,  M.  1994.  Bateman  Principle  and  Plant  Reproduction  -­‐  the  Role  of  Pollen   Limitation.  Bot.  Rev.  60:83–139.   Charlesworth,  D.,  and  B.  Charlesworth.  1981.  Allocation  of  resources  to  male  and   female  functions  in  hermaphrodites.  Biol.  J.  Linn.  Soc.  15:57–74.   Charnov,  E.  L.  1982.  The  theory  of  sex  allocation.  Princeton  University  Press,   Princeton,  N.J.     94   Comes,  H.  P.,  and  J.  W.  Kadereit.  1998.  The  effect  of  quaternary  climatic  changes  on   plant  distribution  and  evolution.  Trends  Plant  Sci.  3:432–438.   Conner,  J.  K.,  R.  Davis,  and  S.  Rush.  1995.  The  effect  of  wild  radish  floral  morphology   on  pollination  efficiency  by  4  taxa  of  pollinators.  Oecologia  104:234–245.   Conner,  J.  K.,  A.  M.  Rice,  C.  Stewart,  and  M.  T.  Morgan.  2003.  Patterns  and   mechanisms  of  selection  on  a  family-­‐diagnostic  trait:  Evidence  from  experimental   manipulation  and  lifetime  fitness  selection  gradients.  Evolution  57:480–486.   Conner,  J.  K.,  and  S.  Rush.  1996.  Effects  of  flower  size  and  number  on  pollinator   visitation  to  wild  radish,  Raphanus  raphanistrum.  Oecologia  105:509–516.   Conner,  J.  K.,  S.  Rush,  and  P.  Jennetten.  1996.  Measurements  of  natural  selection  on   floral  traits  in  wild  radish  (Raphanus  raphanistrum)  .1.  Selection  through  lifetime   female  fitness.  Evolution  50:1127–1136.   Conner,  J.  K.,  H.  F.  Sahli,  and  K.  Karoly.  2009.  Tests  of  adaptation:  functional  studies   of  pollen  removal  and  estimates  of  natural  selection  on  anther  position  in  wild   radish.  Ann.  Bot.  103:1547–1556.   Conner,  J.,  and  S.  Via.  1993.  Patterns  of  phenotypic  and  genetic  correlations  among   morphological  and  life-­‐history  traits  in  wild  radish,  Raphanus  raphanistrum.   Evolution  47:704–711.   Coss,  R.  G.  1999.  Effects  of  relaxed  natural  selection  on  the  evolution  of  behavior.  Pp.   180–208  in  S.  A.  Foster  and  J.  A.  Endler,  eds.  Geographic  variation  in  behavior:   Perspectives  on  evolutionary  mechanisms.  Oxford  University  Press.   Daehler,  C.  C.,  and  D.  R.  Strong.  1997.  Reduced  herbivore  resistance  in  introduced   smooth  cordgrass  (Spartina  alterniflora)  after  a  century  of  herbivore-­‐free  growth.   Oecologia  110:99–108.   Darwin,  C.H.  1859.  On  the  Origin  of  Species  by  Means  of  Natural  Selection,  or  the   Preservation  of  Favoured  Races  in  the  Struggle  for  Life.  John  Murray,  London.   Darwin,  C.H.  1862.  On  the  Various  Contrivances  by  which  British  and  Foreign   Orchids  are  Fertilized  by  Insects.  Murray,  London.   Darwin,  C.H.  1877.  The  different  forms  of  flowers  on  plants  of  the  same  species.  John   Murray,  London,  UK.   Darwin,  C.H.  1876.  The  effects  of  cross  and  self  fertilization  in  the  vegetable   kingdom.  John  Murray,  London.   De  Luca,  P.  A.,  and  M.  Vallejo-­‐Marín.  2013.  What’s  the  “buzz”  about?  The  ecology  and   evolutionary  significance  of  buzz-­‐pollination.  Curr.  Opin.  Plant  Biol.  16:429–435.     95   Delesalle,  V.  A.,  S.  J.  Mazer,  and  H.  Paz.  2008.  Temporal  variation  in  the  pollen:ovule   ratios  of  Clarkia  (Onagraceae)  taxa  with  contrasting  mating  systems:  field   populations.  J.  Evol.  Biol.  21:310–323.   Elle,  E.,  and  R.  Carney.  2003.  Reproductive  assurance  varies  with  flower  size  in   Collinsia  parviflora  (Scrophulariaceae).  Am.  J.  Bot.  90:888–896.   Endress,  P.  K.  1992.  Evolution  and  floral  diversity  -­‐  the  phylogenetic  surroundings  of   Arabidopsis  and  Antirrhinum.  Int.  J.  Plant  Sci.  153:S106–S122.   Espinasa,  L.,  and  W.  R.  Jeffery.  2006.  Conservation  of  retinal  circadian  rhythms   during  cavefish  eye  degeneration.  Evol.  Dev.  8:16–22.   Evans,  D.  E.,  P.  E.  Taylor,  M.  B.  Singh,  and  R.  B.  Knox.  1991.  Quantitative  analysis  of   lipids  and  protein  from  the  pollen  of  Brassica  napus  L.  Plant  Sci.  73:117–126.   Fong,  D.  W.,  T.  C.  Kane,  and  D.  C.  Culver.  1995.  Vestigialization  and  loss  of   nonfunctional  characters.  Annu.  Rev.  Ecol.  Syst.  26:249–268.   Fontaine,  C.,  C.  L.  Collin,  and  I.  Dajoz.  2008.  Generalist  foraging  of  pollinators:  diet   expansion  at  high  density.  J.  Ecol.  96:1002–1010.   Foxe,  J.  P.,  T.  Slotte,  E.  A.  Stahl,  B.  Neuffer,  H.  Hurka,  and  S.  I.  Wright.  2009.  Recent   speciation  associated  with  the  evolution  of  selfing  in  Capsella.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.   106:5241–5245.   Foxe,  J.  P.,  M.  Stift,  A.  Tedder,  A.  Haudry,  S.  I.  Wright,  and  B.  K.  Mable.  2010.   Reconstructing  origins  of  loss  of  self-­‐incompatibility  and  selfing  in  North  American   Arabidopsis  lyrata:  a  population  genetic  context.  Evolution  64:3495–3510.   Friedman,  W.  E.  2009.  The  meaning  of  Darwin’s  “abominable  mystery.”  Am.  J.  Bot.   96:5–21.   Futuyma,  D.  J.  2010.  Evolutionary  constraint  and  ecological  consequences.  Evolution   64:1865–1884.   Golding,  Y.  C.,  M.  S.  Sullivan,  and  J.  P.  Sutherland.  1999.  Visits  to  manipulated  flowers   by  Episyrphus  balteatus  (Diptera :  Syrphidae):  Partitioning  the  signals  of  petals  and   anthers.  J.  Insect  Behav.  12:39–45.   Goodwillie,  C.,  S.  Kalisz,  and  C.  G.  Eckert.  2005.  The  evolutionary  enigma  of  mixed   mating  systems  in  plants:  Occurrence,  theoretical  explanations,  and  empirical   evidence.  Annu.  Rev.  Ecol.  Evol.  Syst.  36:47–79.   Goodwillie,  C.,  and  J.  M.  Ness.  2005.  Correlated  evolution  in  floral  morphology  and   the  timing  of  self-­‐compatibility  in  Leptosiphon  jepsonii  (Polemoniaceae).  Int.  J.  Plant   Sci.  166:741–751.     96   Griffin,  P.  C.,  and  Y.  Willi.  2014.  Evolutionary  shifts  to  self-­‐fertilisation  restricted  to   geographic  range  margins  in  North  American  Arabidopsis  lyrata.  Ecol.  Lett.  17:484– 490.   Grimaldi,  D.  1999.  The  co-­‐radiations  of  pollinating  insects  and  angiosperms  in  the   Cretaceous.  Ann.  Mo.  Bot.  Gard.  86:373–406.   Guerrant,  E.  O.  1989.  Early  maturity,  small  flowers  and  autogamy:  a  developmental   connection.  Evol.  Ecol.  Plants  61:84.   Harder,  L.  D.,  and  S.  D.  Johnson.  2009.  Darwin’s  beautiful  contrivances:  evolutionary   and  functional  evidence  for  floral  adaptation.  New  Phytol.  183:530–545.   Harder,  L.  D.,  and  J.  D.  Thomson.  1989.  Evolutionary  options  for  maximizing  pollen   dispersal  of  animal-­‐pollinated  plants.  Am.  Nat.  133:323–344.   Hitachi  Software  Engineering,  C.,  Ltd.  1991.  FMBIO  Analysis.  Hitachi  Software   Engineering,  Co.,  Ltd.   Hoffmann,  M.  H.,  M.  Bremer,  K.  Schneider,  F.  Burger,  E.  Stolle,  and  G.  Moritz.  2003.   Flower  visitors  in  a  natural  population  of  Arabidopsis  thaliana.  Plant  Biol.  5:491– 494.   Jones,  A.  G.  2005.  Gerud  2.0:  a  computer  program  for  the  reconstruction  of  parental   genotypes  from  half-­‐sib  progeny  arrays  with  known  or  unknown  parents.  Mol.  Ecol.   Notes  5:708–711.   Kalinowski,  S.  T.,  M.  L.  Taper,  and  T.  C.  Marshall.  2007.  Revising  how  the  computer   program  CERVUS  accommodates  genotyping  error  increases  success  in  paternity   assignment.  Mol.  Ecol.  16:1099–1106.   Kevan,  P.,  and  H.  Baker.  1983.  Insects  as  Flower  Visitors  and  Pollinators.  Annu.  Rev.   Entomol.  28:407–453.   Kudo,  G.  2003.  Anther  arrangement  influences  pollen  deposition  and  removal  in   hermaphrodite  flowers.  Funct.  Ecol.  17:349–355.   Lahti,  D.  C.,  N.  A.  Johnson,  B.  C.  Ajie,  S.  P.  Otto,  A.  P.  Hendry,  D.  T.  Blumstein,  R.  G.   Coss,  K.  Donohue,  and  S.  A.  Foster.  2009.  Relaxed  selection  in  the  wild.  Trends  Ecol.   Evol.  24:487–496.   Le  Rouzic,  A.,  K.  Østbye,  T.  O.  Klepaker,  T.  F.  Hansen,  L.  Bernatchez,  D.  Schluter,  and   L.  A.  Vøllestad.  2011.  Strong  and  consistent  natural  selection  associated  with  armour   reduction  in  sticklebacks.  Mol.  Ecol.  20:2483–2493.     97   Lewandowska-­‐Sabat,  A.  M.,  S.  Fjellheim,  and  O.  A.  Rognli.  2010.  Extremely  low   genetic  variability  and  highly  structured  local  populations  of  Arabidopsis  thaliana  at   higher  latitudes.  Mol.  Ecol.  19:4753–4764.   Lloyd,  D.  G.  1965.  Evolution  of  self-­‐compatibility  and  racial  differentiation  in   Leavenworthia  (Cruciferae).  Contrib.  Gray  Herb.  Harv.  Univ.  3–134.   Lunau.  2000.  The  ecology  and  evolution  of  visual  pollen  signals.  Plant  Syst.  Evol.   222:89–111.   Lundemo,  S.  2010.  Molecular  studies  of  genetic  structuring  and  demography  in   Arabidopsis  from  northern  Europe.  Norwegian  University  of  Science  and   Technology,  Trondheim,  Norway.   Luo,  Z.,  D.  Zhang,  and  S.  S.  Renner.  2008.  Why  two  kinds  of  stamens  in  buzz-­‐ pollinated  flowers?  Experimental  support  for  Darwin’s  division-­‐of-­‐labour   hypothesis.  Funct.  Ecol.  22:794–800.   Mable,  B.  K.,  and  A.  Adam.  2007.  Patterns  of  genetic  diversity  in  outcrossing  and   selfing  populations  of  Arabidopsis  lyrata.  Mol.  Ecol.  16:3565–3580.   Mable,  B.  K.,  A.  V.  Robertson,  S.  Dart,  C.  Di  Berardo,  and  L.  Witham.  2005.  Breakdown   of  self-­‐incompatibility  in  the  perennial  Arabidopsis  lyrata  (Brassicaceae)  and  its   genetic  consequences.  Evolution  59:1437–1448.   Mable,  B.  K.,  M.  H.  Schierup,  and  D.  Charlesworth.  2003.  Estimating  the  number,   frequency,  and  dominance  of  S-­‐alleles  in  a  natural  population  of  Arabidopsis  lyrata   (Brassicaceae)  with  sporophytic  control  of  self-­‐incompatibility.  Heredity  90:422– 431.   Manaster,  C.  2010.  Allelogram:  a  program  for  normalizing  and  binning  microsatellite   genotypes.   Matsuhashi,  S.,  S.  Sakai,  and  H.  Kudoh.  2012.  Temperature-­‐dependent  fluctuation  of   stamen  number  in  Cardamine  hirsuta.  Int.  J.  Plant  Sci.  173:391–398.   Mazer,  S.  J.,  L.  S.  Dudley,  V.  A.  Delesalle,  H.  Paz,  and  P.  Galusky.  2009.  Stability  of   pollen-­‐ovule  ratios  in  pollinator-­‐dependent  versus  autogamous  Clarkia  sister  taxa:   testing  evolutionary  predictions.  New  Phytol.  183:630–648.   Mezey,  J.  G.,  and  D.  Houle.  2005.  The  dimensionality  of  genetic  variation  for  wing   shape  in  Drosophila  melanogaster.  Evolution  59:1027–1038.   Mione,  T.,  and  G.  J.  Anderson.  1992.  Pollen-­‐Ovule  Ratios  and  Breeding  System   Evolution  in  Solanum  Section  Basarthrum  (Solanaceae).  Am.  J.  Bot.  79:279–287.     98   Müller,  A.  1961.  Zur  Charakterisierung  der  Blüten  und  Infloreszenzen  von   Arabidopsis  thaliana  (L.)  Heynh.  Kulturpflanze  9:264–393.   Müller,  F.  1883.  Two  Kinds  of  Stamens  with  Different  Functions  in  the  Same  Flower.   Nature  27:364–365.   Ollerton,  J.,  R.  Winfree,  and  S.  Tarrant.  2011.  How  many  flowering  plants  are   pollinated  by  animals?  Oikos  120:321–326.   Ornduff,  R.  1969.  Reproductive  Biology  in  Relation  to  Systematics.  Taxon  18:121– 133.   Pernet,  B.  2003.  Persistent  Ancestral  Feeding  Structures  in  Nonfeeding  Annelid   Larvae.  Biol.  Bull.  205:295–307.   Pinheiro,  J.,  Bates,  D.,  DebRoy,  S.,  Sarkar,  D.,  and  R  Development  Core  Team.  2013.   nlme:  Linear  and  nonlinear  mixed  effects  models.   Platt,  A.,  M.  Horton,  Y.  S.  Huang,  Y.  Li,  A.  E.  Anastasio,  N.  W.  Mulyati,  J.  Agren,  O.   Bossdorf,  D.  Byers,  K.  Donohue,  M.  Dunning,  E.  B.  Holub,  A.  Hudson,  V.  Le  Corre,  O.   Loudet,  F.  Roux,  N.  Warthmann,  D.  Weigel,  L.  Rivero,  R.  Scholl,  M.  Nordborg,  J.   Bergelson,  and  J.  O.  Borevitz.  2010.  The  scale  of  population  structure  in  Arabidopsis   thaliana.  Plos  Genet.  6.   Preston,  R.  E.  1986.  Pollen-­‐ovule  ratios  in  the  Cruciferae.  Am.  J.  Bot.  73:1732–1740.   R  Core  Team.  2012.  R:  A  language  and  environment  for  statistical  computing.  R   Foundation  for  Statistical  Computing,  Vienna,  Austria.   Ritland,  C.,  and  K.  Ritland.  1989.  Variation  of  Sex  Allocation  Among  Eight  Taxa  of  the   Mimulus  guttatus  Species  Complex  (Scrophulariaceae).  Am.  J.  Bot.  76:1731.   Rush,  S.,  J.  K.  Conner,  and  P.  Jennetten.  1995.  The  effects  of  natural  variation  in   pollinator  visitation  on  rates  of  pollen  removal  in  wild  radish,  Raphanus   raphanistrum  (Brassicaceae).  Am.  J.  Bot.  82:1522–1526.   Sahli,  H.  F.,  and  J.  K.  Conner.  2011.  Testing  for  conflicting  and  nonadditive  selection:   floral  adaptation  to  multiple  pollinators  through  male  and  female  fitness.  Evol.  Int.  J.   Org.  Evol.  65:1457–1473.   Sahli,  H.  F.,  and  J.  K.  Conner.  2007.  Visitation,  effectiveness,  and  efficiency  of  15   genera  of  visitors  to  wild  radish,  Raphanus  raphanismum  (Brassicaceae).  Am.  J.  Bot.   94:203–209.   Sahli,  H.  F.,  J.  K.  Conner,  F.  H.  Shaw,  S.  Howe,  and  A.  Lale.  2008.  Adaptive   Differentiation  of  Quantitative  Traits  in  the  Globally  Distributed  Weed,  Wild  Radish   (Raphanus  raphanistrum).  Genetics  180:945–955.     99   SAS  Institute,  I.  2012.  JMP,  version  10.0.0.  SAS  Institute,  Inc,  Cary,  NC.   Schneider,  C.  A.,  W.  S.  Rasband,  and  K.  W.  Eliceiri.  2012.  NIH  Image  to  ImageJ:  25   years  of  image  analysis.  Nat.  Methods  9:671–675.   Schoener,  T.  W.  1971.  Theory  of  Feeding  Strategies.  Annu.  Rev.  Ecol.  Syst.  2:369– 404.   Sicard,  A.,  and  M.  Lenhard.  2011.  The  selfing  syndrome:  a  model  for  studying  the   genetic  and  evolutionary  basis  of  morphological  adaptation  in  plants.  Ann.  Bot.   107:1433–1443.   Sih,  A.,  and  B.  Christensen.  2001.  Optimal  diet  theory:  when  does  it  work,  and  when   and  why  does  it  fail?  Anim.  Behav.  61:379–390.   Smyth,  D.  R.,  J.  L.  Bowman,  and  E.  M.  Meyerowitz.  1990.  Early  flower  development  in   Arabidopsis.  Plant  Cell  2:755–767.   Stanton,  M.  L.  1994.  Male-­‐male  competition  during  pollination  in  plant  populations.   Am.  Nat.  144:S40–S68.   Stanton,  M.  L.,  A.  A.  Snow,  and  S.  N.  Handel.  1986.  Floral  Evolution:  Attractiveness  to   Pollinators  Increases  Male  Fitness.  Science  232:1625–1627.   Stebbins,  G.  L.  1957.  Self  Fertilization  and  Population  Variability  in  the  Higher   Plants.  Am.  Nat.  91:337–354.   Stinchcombe,  J.  R.,  C.  Weinig,  M.  Ungerer,  K.  M.  Olsen,  C.  Mays,  S.  S.  Halldorsdottir,  M.   D.  Purugganan,  and  J.  Schmitt.  2004.  A  latitudinal  cline  in  flowering  time  in   Arabidopsis  thaliana  modulated  by  the  flowering  time  gene  FRIGIDA.  Proc.  Natl.   Acad.  Sci.  U.  S.  A.  101:4712–4717.   Vallejo-­‐Marin,  M.,  E.  M.  Da  Silva,  R.  D.  Sargent,  and  S.  C.  H.  Barrett.  2010.  Trait   correlates  and  functional  significance  of  heteranthery  in  flowering  plants.  New   Phytol.  188:418–425.   Vallejo-­‐Marin,  M.,  J.  S.  Manson,  J.  D.  Thomson,  and  S.  C.  H.  Barrett.  2009.  Division  of   labour  within  flowers:  heteranthery,  a  floral  strategy  to  reconcile  contrasting  pollen   fates.  J.  Evol.  Biol.  22:828–839.   Walker-­‐Larsen,  J.,  and  L.  D.  Harder.  2000.  The  evolution  of  staminodes  in   angiosperms:  Patterns  of  stamen  reduction,  loss,  and  functional  re-­‐invention.  Am.  J.   Bot.  87:1367–1384.   Willi,  Y.,  and  K.  Maattanen.  2010.  Evolutionary  dynamics  of  mating  system  shifts  in   Arabidopsis  lyrata.  J.  Evol.  Biol.  23:2123–2131.     100   Yoshizawa,  M.,  Y.  Yamamoto,  K.  E.  O’Quin,  and  W.  R.  Jeffery.  2012.  Evolution  of  an   adaptive  behavior  and  its  sensory  receptors  promotes  eye  regression  in  blind   cavefish.  BMC  Biol.  10.   Young,  H.  J.,  and  M.  L.  Stanton.  1990.  Influences  of  Floral  Variation  on  Pollen   Removal  and  Seed  Production  in  Wild  Radish.  Ecology  71:536–547.   Zhen,  Y.,  and  M.  C.  Ungerer.  2008.  Clinal  variation  in  freezing  tolerance  among   natural  accessions  of  Arabidopsis  thaliana.  New  Phytol.  177:419–427.   Zomlefer,  W.  B.  1994.  Guide  to  Flowering  Plant  Families.  University  of  North   Carolina  Press,  Chapel  Hill,  NC.         101