ON   E NTOMOPATHOGENIC   N EMATODES   ( RHABDITIDA:   STEINERNEMATIDAE   A ND   H ETERORHABDITIDAE):   A   P OTENTIAL   REARING   H OST,   B LACK   S OLDIER   F LY   H ERMETIA   I LLUCENS   ( L.)   (DIPTERA:   S TRATIOMYIDAE)   A ND   C OMPATIBILITY   W ITH   A   P REDATORY   BEETLE,   D ALOTIA   C ORIARIA   ( KRAATZ)   ( COLEOPTERA:   S TAPHYLINIDAE)   By   Joseph  S.  Tourtois               A  THESIS   Submitted  to   Michigan  State  University   in  partial  fulfillment  of  the  requirments   for  the  degree  of   Entomology  –  Master  of  Science   2014         ABSTRACT   ON   E NTOMOPATHOGENIC   N EMATODES   ( RHABDITIDA:   STEINERNEMATIDAE   A ND   H ETERORHABDITIDAE):   A   P OTENTIAL   REARING   H OST,   B LACK   S OLDIER   F LY   H ERMETIA   I LLUCENS   ( L.)   (DIPTERA:   S TRATIOMYIDAE)   A ND   C OMPATIBILITY   W ITH   A   P REDATORY   BEETLE,   D ALOTIA   C ORIARIA   ( KRAATZ)   ( COLEOPTERA:   S TAPHYLINIDAE)   By   Joseph  S.  Tourtois   Entomopathogenic  nematodes  (Rhabditida:  Steinernematidae  and   Heterorhabditidae)  are  soil-­‐dwelling  insect  parasitic  round  worms  used  in  augmentative   biological  control  to  manage  western  flower  thrips  Frankliniella  occidentalis  (Pergande)   (Thysanoptera:  Thripidae)  and  fungus  gnats  Bradysis  spp.  (Diptera:  Sciaridae)  in   greenhouses.  Reducing  production  costs  is  one  way  of  increasing  their  adoption  by   growers.  Black  soldier  fly  larvae  Hermetia  illucens  (L.)  (Diptera:  Stratiomyidae)  are   evaluated  as  a  potential  nematode  rearing  host.  They  are  not  highly  susceptible  to   entomopathogenic  nematodes;  however,  damaging  the  cuticle  before  and  after   infection  increases  mortality  rate,  infection  rate,  nematode  entry,  and  nematode   emergence.  Even  with  modification,  black  soldier  fly  larvae  produce  only  10%  of  the   nematodes  produced  on  the  standard  rearing  host  Galleria  mellonella  (L.)  (Lepidoptera:   Pyralidae).  The  soil-­‐dwelling  predatory  rove  beetle  Dalotia  coriaria  (Kraatz)  (Coleoptera:   Staphylinidae)  is  also  used  to  manage  populations  of  western  flower  thrips  and  fungus   gnats.  Its  compatibility  with  entomopathogenic  nematodes  is  evaluated  in  a  laboratory   bioassay.  Dalotia  coriaria  appears  to  be  most  compatible  with  Steinernema  feltiae   (Filipjev)  (Rhabditida:  Steinernematidae).   ACKNOWLEDGEMENTS     I  thank  my  major  professor  Dr.  Matthew  Grieshop  for  all  of  his   encouragement  and  advice  over  the  past  four  years  I  spent  in  the  Organic  Pest   Management  Laboratory.  I  thank  my  committee  members  Dr.  Zsofia  Szendrei  and   Dr.  John  Biernbaum  for  their  guidance  and  approval.  I  am  grateful  for  Dr.  Anne   Nielsen,  Nate  Walton,  Pete  Nelson,  and  Dr.  David  Shapiro-­‐Ilan.  They  provided   support  in  rearing  and  working  with  entomopathogenic  nematodes.  I  appreciate   Morgan  Burnette,  Yvonne  Millar,  Paul  Owen-­‐Smith,  Mirijam  Garske,  and  other   numerous  undergraduate  students  who  spent  countless  hours  counting  nematodes,   dissecting  black  soldier  fly,  and  assessing  insect  mortality.  Without  their  hard  work,   this  project  would  not  have  been  finished  in  a  timely  manner.  I  also  thank  Brad   Baughman  and  Emily  Pochubay  for  being  excellent  role  models.  Lastly,  I  need  to   thank  my  wife  Krys  Tourtois  for  all  of  her  support  and  understanding.         iii   TABLE  OF  CONTENTS     LIST  OF  TABLES  ...............................................................................................................  VI   LIST  OF  FIGURES  ...........................................................................................................  VII   CHAPTER  1.   LITERATURE  REVIEW  .......................................................................  1   Biological  Control  ..................................................................................................................  1   Augmentative  Biological  Control  .....................................................................................  2   Limitations  to  application  of  augmentative  biological  control  .............................  4   Economics  ...............................................................................................................................................  4   Intraguild  Predation  ...........................................................................................................................  5   Compatibility  with  other  management  strategies  ................................................................  6   Entomopathogenic  Nematodes  and  D.  coriaria  in  biological  control  ..................  6   Entomopathogenic  Nematodes  ........................................................................................  7   Biology  ......................................................................................................................................................  7   Life  Cycle  ...............................................................................................................................................  11   Applications  .........................................................................................................................................  12   Rearing  ...................................................................................................................................................  13   In  vivo  rearing  ..................................................................................................................................  13   In  vitro  rearing  .................................................................................................................................  14   Alternative  Rearing  Host  ................................................................................................................  14   Black  Soldier  Fly  .................................................................................................................  15   Biology  ....................................................................................................................................................  15   History  ....................................................................................................................................................  16   Potential  Benefits  ..............................................................................................................................  16   Potential  Limitations  ........................................................................................................................  17   Dalotia  coriaria  (Kraatz)  (Coleoptera:  Staphylinidae)  ..........................................  18   History  ....................................................................................................................................................  18   Biology  ....................................................................................................................................................  18   Life  Cycle  ...............................................................................................................................................  19   Feeding  habits  .....................................................................................................................................  19   Rearing  ...................................................................................................................................................  20   Compatibility  with  nematodes  .....................................................................................................  21   Thesis  Objectives  ................................................................................................................  22   CHAPTER  2.   EXPLORING  THE  USE  OF  BLACK  SOLDIER  FLY  HERMETIA  ILLUCENS   (L.)  (DIPTERA:  STRATIOMYIDAE)  AS  AN  IN  VIVO  ENTOMOPATHOGENIC  NEMATODE   REARING  HOST  ........................................................................................................  23   Introduction  .........................................................................................................................  23     iv   Methods  and  Materials  .....................................................................................................  26   Black  Soldier  Fly  colony  ..................................................................................................................  26   Entomopathogenic  Nematode  colonies  ...................................................................................  27   Experiment  1a  –  black  soldier  fly  susceptibility  by  larval  stage  ...................................  28   Experiment  1b  –  black  soldier  fly  susceptibility  at  pupal  stage  ....................................  29   Statistical  Analysis  ............................................................................................................................  30   Experiment  2  –effect  of  larval  injury  on  nematode  infection  .........................................  30   Statistical  Analysis  ............................................................................................................................  32   Experiment  3  –  nematode  production  in  black  soldier  fly  ..............................................  32   Statistical  Analysis  ............................................................................................................................  34   Results  ...................................................................................................................................  36   Experiment  1a  –  black  soldier  fly  susceptibility  by  larval  stage  ...................................  36   Experiment  1b  –  black  soldier  fly  susceptibility  at  pupal  stage  ....................................  38   Experiment  2  –  effect  of  larval  injury  on  nematode  infection  ........................................  40   Experiment  3  –  nematode  production  .....................................................................................  45   Discussion  .............................................................................................................................  50   CHAPTER  3.   SUSCEPTIBILITY  OF  DALOTIA  CORIARIA  (KRAATZ)  (COLEOPTERA:   STAPHYLINIDAE)  TO  ENTOMOPATHOGENIC  NEMATODES.  .....................................  55   Introduction  .........................................................................................................................  55   Methods  and  Materials  .....................................................................................................  59   Insect  and  Nematode  Culture:  ......................................................................................................  60   Experimental  Methods:  ...................................................................................................................  61   Statistical  Analysis  ............................................................................................................................  62   Results  ...................................................................................................................................  64   Beetle  Mortality  ..................................................................................................................................  64   Presence  of  nematodes  in  cadavers  ...........................................................................................  67   Discussion  .............................................................................................................................  68   CHAPTER  4.   SYNTHESIS  AND  CONCLUSIONS  .......................................................  73   Black  Soldier  Fly  as  a  Rearing  Host  ..............................................................................  73   Dalotia  coriaria  Susceptibility  to  Entomopathogenic  Nematodes  .....................  76   Conclusions  ..........................................................................................................................  77   APPENDIX  ..........................................................................................................................  78   BIBLIOGRAPHY  ................................................................................................................  81           v   LIST  OF  TABLES       Table  2-­‐1.  Mean  ±  SEM  adult  nematodes  recovered  from  four  black  soldier  fly   instars  (n=25  per  treatment  combination)  in  susceptibility  bioassay.  Infective   juveniles  (100)  applied  per  host  at  20°C.  None  of  the  negative  controls  were   infected.  Data  not  shown  for  G.  mellonella.  Amounts  with  different  letters  indicate   statistical  difference  within  nematode  treatment  (Kruskal-­‐Wallis,  p  <  0.05).  ns  =  no   statistical  difference.  ..............................................................................................................................  37   Table  3-­‐1.  Model  selection  based  on  AIC  values  using  the  step  function  in  R  3.1.1.  ..  63         vi   LIST  OF  FIGURES       Figure  1-­‐1.  Life  cycle  of  entomopathogenic  nematodes.  See  text  for  details  .................  10   Figure  2-­‐1.  Abbott’s  corrected  mortality  for  black  soldier  fly  larvae.  Nematodes   applied  at  100  infective  juveniles  per  host  at  20°C.  Mortality  for  the  second  instar  is   from  day  7  since  there  was  high  mortality  on  day  8  in  the  control.  G.  mellonella   mortality  was  >95%  for  all  nematode  species  and  24  ±  10%  for  the  control  on  day  5   (data  not  shown).  Bars  with  different  letters  indicate  statistical  difference  within   nematode  treatment  (ANOVA,  Tukey  HSD,  p  <  0.05).  NS  =  no  statistical  difference.  35   Figure  2-­‐2.  Survival  curves  for  injured  (dotted  line)  and  non-­‐injured  (solid  line)  fifth   instar  black  soldier  fly  for  each  nematode  species:  A)  H.  bacteriophora,  B)  S.   carpocapsae,  C)  S.  feltiae,  D)  S.  riobrave,  and  E)  control  (no  nematodes).  Infective   juveniles  (1000)  applied  per  host  at  25°C.  All  G.  mellonella  treated  with  nematodes   were  dead  on  day  2  and  only  5  G.  mellonella  died  in  the  control  treatment  (data  not   shown).  Asterisk  (*)  denotes  significant  difference  (p  <  0.05).  n.s.  =  not  statistically   different.  ......................................................................................................................................................  39   Figure  2-­‐3.  Percent  fifth  instar  black  soldier  fly  infected  with  entomopathogenic   nematodes  (n=40).  Infective  juveniles  (1000)  applied  per  host  at  25°C.  Asterisk  (*)   denotes  significant  difference  (p  <  0.05).  .....................................................................................  41   Figure  2-­‐4.  Mean  number  of  entomopathogenic  nematodes  (first  generation  adults   and  juveniles)  recovered  from  fifth  instar  black  soldier  fly  cadavers.  Data  not  shown   for  G.  mellonella.  Infective  juveniles  (1000)  applied  per  host  at  25°C.  Numbers   within  the  bars  indicate  number  of  infected  larvae  (max=40).  Asterisk  (*)  denotes   significant  difference  (P  <  0.05).  .......................................................................................................  42   Figure  2-­‐5.  Survival  curves  for  injured  (dotted  line)  and  non-­‐injured  (solid  line)  fifth   instar  black  soldier  fly  before  nematode  application  for  each  nematode  species:  A)   H.  bacteriophora,  B)  S.  carpocapsae,  C)  S.  feltiae,  D)  S.  riobrave,  and  E)  control  (no   nematodes).  Infective  juveniles  (1000)  applied  per  host  at  25°C.  All  G.  mellonella   treated  with  nematodes  were  dead  on  day  2  and  none  died  in  the  control  treatment   (data  not  shown).  Asterisk  (*)  denotes  significant  difference  (p  <  0.05)  for  injury   treatments,  n.s.  =  not  statistically  different.  Plots  with  different  letters  are   significantly  different  (p  <  0.05).  ......................................................................................................  44   Figure  2-­‐6.  Mean  number  of  infective  juveniles  harvested  from  fifth  instar  black   soldier  fly  and  G.  mellonella.  no  =  non-­‐injured,  post  =  damaged  as  a  cadavers,  pre  =   larva  injured  before  nematode  application,  and  p+p  =  pre  and  post.  Bars  labeled     vii   with  different  letters  are  significantly  different,  ANOVA,  Tukey  HSD,  α  =  0.05,  n.s.  =   not  significantly  different.  ....................................................................................................................  47   Figure  3-­‐1.  Percent  mortality  of  D.  coriaria  on  Day  4.  H.  bac  =  H.  bacteriophora,  S.   carp  =  S.  carpocapsae,  S.  felt  =  S.  feltiae,  S.  rio  =  S.  riobrave.  Bars  with  different  letters   are  significantly  different  (p  <  0.05).  ..............................................................................................  65   Figure  3-­‐2.  Percent  dead  D.  coriaria  with  confirmed  nematodes.  H.  bac  =  H.   bacteriophora,  S.  carp  =  S.  carpocapsae,  S.  felt  =  S.  feltiae,  S.  rio  =  S.  riobrave.  Within   each  nematode  group,  bars  with  different  lowercase  letters  are  significantly   different  (p  <  0.05).  For  each  rate  across  nematode  species,  bars  with  different   uppercase  letters  are  significantly  different  (p  <  0.05).  .........................................................  66     viii   Chapter  1. Literature  Review   Biological  Control   Biological  control  is  the  practice  of  using  living  organisms  to  suppress  the   population  or  impact  of  a  pest  organism  (Eilenberg  et  al.  2001).  A  pest  is  any   organism  that  causes  direct  harm  to  humans  or  economic  loses  to  human  endeavors   (Hajek  2004).  The  living  organisms  used  to  suppress  the  pest  organism  are   collectively  referred  to  as  biological  control  agents  or  natural  enemies  (Hajek  2004).   The  goal  of  biological  control  in  Integrated  Pest  Management  (IPM)  is  to  minimize   the  use  of  pesticides  and  harmful  effects  on  the  environment  and  human  health   (Eilenberg  et  al.  2001;  Hajek  2004;  Heinz  et  al.  2004).  Biological  control  is  a   proactive  ecological  approach  employing  knowledge  of  food-­‐web  relationships  to   manage  pest  populations.  When  successful,  biological  control  can  provide  stable  and   continuous  pest  management  (Hajek  2004;  Vincent  et  al.  2007).     There  are  three  main  types  of  biological  control:  classical,  conservation,  and   augmentative  (Hajek  2004;  Lazarovits  et  al.  2007).  Classical  biological  control  is   most  commonly  employed  against  invasive  plant  and  animal  pest  species  and  is   when  exotic  natural  enemies  are  introduced  to  manage  the  invasive  pest   (Caltagirone  1981;  Eilenberg  et  al.  2001).  Some  authors  refer  to  classical  biological   control  as  inoculation  biological  control  since  a  natural  enemy  is  being  established   in  a  new  location  (van  Lenteren  2012).  Conservation  biological  control  is  the   management  or  manipulation  of  the  environment  to  support  and  maintain  higher   populations  of  natural  enemies  or  increase  their  effectiveness  (Barbosa  1998;   Eilenberg  et  al.  2001).  Augmentative  biological  control  is  when  natural  enemies  are     1   mass  reared  and  then  released  into  a  cropping  system,  often  multiple  times  during   the  growing  season  (Collier  and  Van  Steenwyk  2004;  van  Lenteren  2012).     Farmers  may  adopt  biological  control  for  many  reasons  including:  consumer   demand  for  pesticide  free  foods  (Magnusson  and  Cranfield  2005),  a  desire  to   provide  a  safer  worker  environment  (Bailey  et  al.  2009),  environmental   stewardship  (Bailey  et  al.  2009;  Kogan  1998),  or  a  smaller  pesticide  tool  kit  due  to   increased  government  regulation  (Heinz  et  al.  2004).  Another  reason  growers  adopt   biological  control  is  that  pest  populations  have  developed  resistance  to  the  available   pesticides  (Jensen  2000;  Shipp  et  al.  2007;  Zhao  et  al.  1995).  In  cases  where   pesticide  resistance  has  not  yet  developed,  the  efficacy,  predictability,  and  cost  of   natural  enemies  are  the  main  issues  affecting  implementation  of  biological  control   (Heinz  et  al.  2004).     Augmentative  Biological  Control   Augmentative  biological  control  is  divided  into  two  subcategories:  — inoculation  and  inundation—  that  describe  the  manner  in  which  natural  enemies   are  released  (Hajek  2004).  Inoculation  biological  control  is  the  release  of  a  natural   enemy  into  a  system  with  the  expectation  that  it  will  reproduce  to  provide  control  of   a  target  population  (Eilenberg  et  al.  2001).  An  example  of  inoculation  is  the  release   of  predatory  rove  beetles  in  a  greenhouse  with  the  expectation  that  they  will   establish  and  future  releases  are  not  required  (Bennison  et  al.  2009;  Bennison  et  al.   2008).  Inundation  biological  control  is  where  a  large  quantity  of  natural  enemies  are   released  to  target  a  pest  population  with  little  expectation  of  reproduction   (Eilenberg  et  al.  2001).  An  example  of  inundation  biological  control  is  the  mass     2   release  of  2.5  billion  entomopathogenic  nematodes  per  hectare  to  target  soil-­‐ dwelling  pests  (Barbercheck  2004).  Entomopathogenic  nematodes  naturally  occur   in  the  soil,  but  it  is  assumed  that  there  are  rarely  enough  to  provide  economic   control  (Stuart  et  al.  2006).  In  either  case,  the  goal  of  releasing  natural  enemies  is  to   augment  the  natural  population  to  obtain  sufficient  biological  control  (Hajek  2004).     One  of  the  earliest  examples  of  augmentative  biological  control  is  the  mass   production  and  release  of  the  parasitoid  Encarsia  formosa  Gahan  (Hymenoptera:   Aphelinidae)  to  control  the  greenhouse  whitefly  Trialeurodes  vaporariorum   Westwood  (Hemiptera:  Aleyrodidae)  in  Canadian  greenhouses  (Shipp  et  al.  2007).   After  the  invention  of  DDT  and  other  chemical  pesticides,  rearing  of  E.  formosa  was   suspended.  Then  in  the  1970s  with  a  rise  in  insecticide  resistance,  interest  in   biological  control  was  reinvigorated  (Shipp  et  al.  2007).  Since  then  the  number  of   natural  enemies  that  are  mass  produced  for  use  in  augmentative  biological  control   has  increased,  most  noticeably  in  the  1980s  and  1990s  (van  Lenteren  2012).  What   was  once  a  cottage  industry  producing  only  a  handful  of  natural  enemies  now   produces  230  species  at  a  commercial  professional  industry  level  (van  Lenteren   2012).     Greenhouse  growers  who  use  biological  control  typically  use  augmentative   biological  control  with  an  emphasis  on  inundation  of  pest  populations.  Greenhouses   provide  ideal  conditions  for  rapid  insect  population  growth  due  to  high   temperatures  and  relative  humidity  (Van  Lenteren  and  Woets  1988).  Greenhouses   are  also  isolated,  semi-­‐enclosed  spaces  with  vents  that  open  and  close  throughout   the  day  to  regulate  temperature  (Lindquist  and  Short  2004).  These  are  ideal     3   conditions  to  use  augmentative  biological  control  –  natural  enemies  are  lacking  and   conditions  are  optimal  for  prey  build  up.   Limitations  to  application  of  augmentative  biological  control   Economics   Augmentative  biological  control  is  dependent  upon  the  availability  of  mass-­‐ reared  natural  enemies  (van  Lenteren  2012;  Warner  and  Getz  2008).  The  mass   reared  natural  enemy  industry  is  still  quiet  small  with  an  estimated  $25-­‐30  million   wholesale  income  in  North  America  in  2005-­‐2007  compared  to  the  $3.1  billion   pesticide  industry  in  2001  (Warner  and  Getz  2008).  Worldwide,  there  are  230   natural  enemy  species  that  are  produced  and  sold  on  a  commercial  scale  worth   $394  million  (€300  million)  (Cock  et  al.  2010;  van  Lenteren  2012).  Hymenopterans   account  for  over  half  of  the  species  (120  species),  followed  by  Acari  (30  species),   Coleoptera  (28  species),  Heteroptera  (19  species),  Nematoda  (10  species),   Neuroptera  (8  species),  Diptera  (8  species),  Thysanoptera  (6  species),  and  1  species   of  Mollusca  and  Chilopoda  each  (van  Lenteren  2012).  Many  new  species  were   brought  onto  the  market  during  the  1990s  following  a  decade  of  research  in  mass-­‐ rearing  insects  and  augmentative  biological  control  (van  Lenteren  2012;  Warner   and  Getz  2008).  Since  that  time  only  a  relatively  small  number  of  new  natural   enemy  species  have  been  brought  to  the  market  (e.g.  Dalotia  coriaria  (Kraatz)   (Coleoptera:  Staphylinidae))  (van  Lenteren  2012).     The  companies  that  produce  natural  enemies  generally  consist  of  between  1   to  10  employees  with  only  5  companies  employing  more  than  10  people  (van   Lenteren  2012).  These  companies  are  also  interdependent,  organized  in     4   associations  by  continent.  One  result  of  this  is  that  natural  enemies  are  often  bought   and  repackaged  by  producers  and  distributor  before  the  end-­‐consumer  receives   them  (Warner  and  Getz  2008).  This  relative  scarcity  of  biological  control  providers   and  repackaging  of  biological  control  products  can  lead  to  high  prices.     Van  Lenteren  (2012)  makes  the  argument  that  biological  control  is  more   economically  viable  than  chemical  pest  management.  Even  though  there  are  fewer   insects  than  synthetic  chemical  compounds  to  test  for  pest  management,  the  success   ratio  for  finding  an  effective  natural  enemy  is  higher,  1:10  vs.  1:  140,000  –  especially   given  the  governmental  regulator  restrictions  and  testing  costs  for  developing  new   chemical  pesticides.  Even  through  the  price  of  pesticides  are  becoming  more   expensive,  it  is  still  cheaper  for  farmers  to  use  pesticides  than  purchase  commercial   natural  enemies  from  an  insectary.  As  an  example,  entomopathogenic  nematodes   cost  from  $200-­‐300/application/hectare  whereas  a  single  pesticide  application  may   cost  as  little  as  $40/hectare.     Intraguild  Predation   A  potential  limitation  to  augmentative  biological  control  is  intraguild   predation,  which  occurs  when  two  or  more  natural  enemies  feed  upon  or  negatively   interact  each  other  in  a  non-­‐competitive  fashion  (Polis  et  al.  1989).  Intraguild   predation  can  be  either  bidirectional  or  unidirectional.  Bidirectional  predation   occurs  when  two  predators  consume  each  other.  For  an  example,  the  predatory  mite   Hypoaspis  aculeifer  (Canestrini)  (Mesostigmata:  Laelapidae)  preys  on  the  first   instars  of  D.  coriaria  and  D.  coriaria  predates  on  the  eggs  and  early  developmental   stages  of  the  predatory  mite  (Jandricic  et  al.  2006).  Unidirectional  intraguild     5   predation  occurs  when  a  predator  eats  another,  but  the  second  predator  does  not   prey  on  the  first.  Two  examples  of  unidirectional  intraguild  predation  are  when  the   two  soil  predators,  Stratiolaelaps  miles  (Berlese)  (Mesostigmata:  Laelapidae)  and  D.   coriaria  feed  on  the  foliar  predatory  mite  Neoseiulus  cucumeris  Oudemans   (Phytoseiidae)  when  placed  on  the  soil  surface  (Pochubay  and  Grieshop  2012).     Compatibility  with  other  management  strategies   Biological  control  is  often  not  compatible  with  pesticides  (Hajek  2004).  The   active  ingredients  in  pesticides  often  kill  not  only  the  pests  but  the  predators  and   parasites  are  well  (Cloyd  and  Bethke  2011;  Hassan  and  Veire  2004).  Imidacloprid   and  beniocarb  are  toxic  to  multiple  stages  of  D.  coriaria  and  insect  growth   regulators  are  toxic  to  third  instars  (Jandricic  et  al.  2006;  Cloyd  et  al.  2009).  Many   pesticides  have  been  tested  for  compatibility  to  entomopathogenic  nematodes  –   some  are  toxic  others  are  not  (Rovesti  et  al.  1988;  Rovesti  and  Deseö  1990;  Rovesti   and  Deseo  1991).  One  way  to  integrate  pesticides  and  biological  control  is  to   separate  the  organism  temporally  and  spatially  from  pesticide  applications  (Hassan   and  Veire  2004).     Entomopathogenic  Nematodes  and  D.  coriaria  in  biological  control       Both  entomopathogenic  nematodes  and  D.  coriaria  are  promising   augmentative  biological  control  agents  that  have  seen  some  use  in  greenhouse  and   small  scale  agriculture.  Both  natural  enemies  can  be  used  to  manage  western  flower   thrips  Frankliniella  occidentalis  (Pergande)  (Thysanoptera:  Thripidae)  and  fungus   gnats  Bradysis  spp.  (Diptera:  Sciaridae)  populations.  A  rearing-­‐release  system  has   been  developed  for  D.  coriaria  for  use  in  greenhouses  and  nurseries.  One  possible     6   way  to  expand  natural  enemy  use  is  to  provide  framers  with  the  knowledge  to  rear   their  own  biological  control  organisms  and  how  these  organisms  interact  with  each   other.     Since  the  typical  application  rate  of  entomopathogenic  nematodes  is  2.5   billion  infective  juveniles  (IJ)  per  hectare,  their  use  in  augmentative  biological   control  is  dependent  on  mass  production  (Barbercheck  2004;  Shapiro-­‐Ilan  et  al.   2002b).  Entomopathogenic  nematodes  can  be  reared  in  vivo  on  Galleria  mellonella   (L.)  (Lepidoptera:  Pyralidae)  or  Tenebrio  molitor  L.  (Coleoptera:  Tenebrionidae)   (Shapiro-­‐Ilan  et  al.  2002a;  Shapiro-­‐Ilan  and  Gaugler  2002).  These  insects  have   limited  uses  other  than  as  rearing  hosts.  Framers  would  benefit  from  an  alternative   rearing  host  that  has  multiple  on-­‐farm  uses.     Dalotia  coriaria  and  entomopathogenic  nematodes  are  two  soil-­‐dwelling   organisms  used  in  augmentative  biological  control  programs  to  manage  greenhouse   pests.  Current  information  about  the  interactions  between  these  two  is  lacking.   Possible  negative  interactions  could  lead  to  less  successful  biological  control.     The  simple  life  cycle  and  wide  host  range  make  entomopathogenic   nematodes  easily  adaptable  rearing  in  vivo.  Dalotia  coriaria  is  a  fierce  predator.  Both   natural  enemies  are  conducive  to  augmentative  biological  control.     Entomopathogenic  Nematodes     Biology   Entomopathogenic  nematodes  have  been  used  in  augmentative  biological   control  as  a  biopesticide  since  the  1930s  (Glaser  et  al.  1935).  In  order  for   entomopathogenic  nematode  to  be  successful  in  managing  a  pest  population,  they     7   are  applied  at  rates  of  2.5  billion  entomopathogenic  nematodes  per  hectare   (Barbercheck  2004).  This  requires  rearing  them  en  mass.  In  vitro  rearing  systems   have  been  developed  but  require  large  capital  investments  and  a  strong  supporting   market  (Shapiro-­‐Ilan  et  al.  2014).  In  vivo  rearing  of  entomopathogenic  nematodes   with  an  insect  host  is  feasible  at  the  cottage  industry  scale.  The  greater  wax  moth   Galleria  mellonella  is  the  most  commonly  used  rearing  host  while  the  yellow   mealworm  T.  molitor  has  also  been  used  in  some  systems  (Shapiro-­‐Ilan  et  al.  2002a;   Shapiro-­‐Ilan  and  Gaugler  2002).     Entomopathogenic  nematodes  are  soil-­‐dwelling  round  worms  that  infect  and   rapidly  kill  insect  hosts  with  the  aid  of  bacterial  partners  (Dillman  et  al.  2012).  As  of   2012,  there  are  15  described  species  of  Heterorhabditis,  63  described  species  of   Steinernema,  and  three  species  in  the  family  Rhabditidae  (Zhang  et  al.  2012).  There   is  disagreement  in  the  literature  about  whether  the  last  three  species  belong  to  the   genus  Heterorhabditidoides  or  Oscheius  (Ye  et  al.  2010;  Liu  et  al.  2012;  Zhang  et  al.   2012).  Each  nematode  species  has  a  symbiotic  bacteria  species,  i.e.  Heterorhabditis   bacteriophora  Poinar  (Rhabditida:  Heterorhabditidae)  and  Photorhabdus   luminescens  (Thomas  and  Poinar)  (Enterobacteriales:  Enterobacteriaceae),   Steinernema  carpocapsae  (Weiser)  (Rhabditida:  Steinernematidae)  and  Xenorhabdus   nematophila  (Thomas  and  Poinar).  The  bacteria  aid  in  breakdown  of  the  host  into  a   nutrient  soup,  and  the  nematodes  vector  the  bacteria  from  one  host  to  the  next.     G.  Steiner  described  the  first  entomopathogenic  nematode  Steinernema   (=Aplectana)  kraussei  (Rhabditida:  Steinernematidae)  in  1923  (Poinar  and  Grewal   2012).  In  1929,  S.  (=Neoplectana)  glaseri  (Steiner)  was  the  second     8   entomopathogenic  nematode  to  be  described  (Steiner  1929).  Throughout  the  1930s,   it  was  the  first  nematode  to  be  tested  in  augmentative  biological  control  programs   against  the  Japanese  beetle  Popillia  japonica  Newman  (Coleoptera:  Scarabaeidae)   (Glaser  1932;  Glaser  et  al.  1935;  Glaser  1940).  Researchers  at  the  time  had  not  yet   established  the  symbiotic  relationship  between  the  nematode  and  bacteria  and  the   colonies  were  lost  (Poinar  and  Grewal  2012).  Renewed  interested  in   entomopathogenic  nematodes  was  sparked  when  S.  carpocapsae  was  isolated  from   codling  moth  Cydia  pomonella  (L.)  (Lepidoptera:  Tortricidae)  in  two  separate   locations  in  1955  (Dutky  and  Hough  1955).  For  many  years  the  nematode  isolate  in   Eastern  United  States  was  referred  to  as  the  DD-­‐136  strain,  and  the  nematode  from   Europe  was  referred  to  as  Neoplacenta  carpocapsae.  In  1967,  Poinar  established   that  these  two  populations  were  conspecifics  (Poinar  1967).  Poinar  started  a  new   family  of  entomopathogenic  nematodes  when  he  discovered  and  described  H.   bacteriophora  in  1975  (Poinar  1975a).  Today,  there  are  78  identified  species  of   entomopathogenic  nematodes  in  three  families:  Steinernematidea,   Heterorhabditidae,  and  Rhabditidae  (Zhang  et  al.  2012).  Only  nine  species  are  mass-­‐ produced  on  a  commercial  scale,  –  four  Heterorhabditis  and  five  Steinernema  (van   Lenteren  2012).         9     Figure  1-­‐1.  Life  cycle  of  entomopathogenic  nematodes.  See  text  for  details         10   Life  Cycle     The  life  cycle  of  entomopathogenic  nematodes  consists  of:  eggs,  four  juvenile   stages,  and  an  adult  stage.  Immature  stages  of  nematodes  are  referred  to  as   juveniles  so  as  not  to  be  confused  with  the  immature  stage  of  insects  known  as   larvae.  Most  of  the  nematode  life  cycle  occurs  within  a  host.  The  third  stage  infective   juvenile  (or  dauer  juvenile)  is  the  only  stage  that  is  found  outside  of  a  host  and  does   not  feed.  This  stage  vectors  the  symbiotic  bacteria  and  infects  new  hosts.  To  protect   itself  in  the  environment,  the  infective  juvenile  continues  to  wear  the  cuticle  of  the   second  stage  as  an  extra  sheath  (Kaya  and  Gaugler  1993).  Infective  juveniles  enter   insect  hosts  through  natural  openings  –  mouth,  anus,  and  spiracles  (Kaya  and   Gaugler  1993).     Some  Heterorhabditis  have  a  dorsal  tooth  and  can  penetrate  through  insect   integument  (Bedding  and  Molyneux  1982).  On  the  way  into  the  host  the  infective   juvenile  sheds  the  sheath.  Once  inside  the  insect  haemocoel,  the  symbiotic  bacteria   are  released  from  the  infective  juvenile.  Photorhabdus  spp.  bacteria  leave  their   Heterorhabditis  spp.  vector  by  the  mouth  (Adams  et  al.  2006;  Ciche  and  Ensign   2003);  whereas  Xenorhabdus  spp.  bacteria  leave  their  Steinernema  spp.  vector  by  the   anal  opening  (Martens  et  al.  2003;  Poinar  1966).  Together  the  nematode-­‐bacteria   complex  overcome  the  host’s  immune  system  and  kill  it  within  24-­‐48  h  (Kaya  and   Gaugler  1993)  and  proceed  to  release  enzymes  that  breakdown  the  host  into  a   nutrient  soup.  Bacteria  multiply  as  the  host  is  digested  and  nematodes  complete   their  development  feeding  on  the  bacteria  and  digested  host.  Within  2-­‐4  d,  the   founding  nematodes  reach  the  adult  stage.       11   Steinernematids  are  male  and  female;  whereas  the  founding  nematodes  of   Heterorhabditids  are  hermaphroditic  (Poinar  1975b).  Progeny  in  the  following   generations  within  the  same  host  can  be  hermaphroditic  or  amphimictic  (Strauch  et   al.  1994).  The  nematodes  proceed  through  one  to  three  generations  dependent   upon  the  size  of  the  host  (Kaya  and  Gaugler  1993).  When  host  resources  are   depleted  and  the  nematodes  reach  a  certain  density,  juveniles  develop  into  infective   juveniles,  store  symbiotic  bacteria  in  their  intestinal  cavity  and  emerge  from  the   cadaver  by  the  thousands  in  search  of  a  new  host  (Kaya  and  Gaugler  1993).   Applications   Entomopathogenic  nematodes  are  used  as  a  bio-­‐insecticide  in  a  limited   number  of  agriculture  systems,  including  turfgrass,  greenhouse  and  nursery,   mushrooms,  and  a  handful  of  field  crops  and  orchards  (Grewal  et  al.  2005).   Turfgrass  grass  was  the  earliest  system  to  adopt  the  use  of  nematodes  to  control   Japanese  beetles  (Glaser  et  al.  1935).  White  grubs  (Coleoptera:  Scarabaeidae)  feed   on  the  roots  of  many  grasses  and  are  considered  the  most  damaging  insect  pests  of   turfgrass    (Jackson  1992).  A  great  deal  of  research  has  gone  into  the  control  of  white   grubs  with  the  use  of  nematodes.   Another  benefit  of  using  entomopathogenic  nematodes  is  that  they  can  be   applied  using  traditional  spray  equipment  (Grewal  et  al.  2005).  Beneficial   nematodes  are  often  applied  at  high  rates  –  2.5  billion  IJ/hectare  in  an  aqueous   solution  (Barbercheck  2004).  Because  of  these  two  characteristics  of  application  (i.e.   high  numbers  of  infective  juveniles  and  applied  by  tradition  equipment),  they  are   often  thought  of  as  a  biopesticide  even  though  they  are  not  regulated  by  the  EPA.     12   Rearing   Entomopathogenic  nematodes  can  be  reared  with  a  host  insect  (i.e.  in  vivo)   or  without  a  host  (i.e.  in  vitro).  Either  way  the  nematodes  need  to  be  reared  with   their  symbiotic  bacteria  to  produce  infective  juveniles  that  are  effective  as  biological   control  organisms  over  multiple  generations  (Han  and  Ehlers  2000).     In  vivo  rearing   The  most  common  in  vivo  rearing  host  for  entomopathogenic  nematodes  is   the  mature  larvae  of  the  highly  susceptible  greater  wax  moth  G.  mellonella.  Another   rearing  host  is  the  yellow  mealworm  T.  molitor  (Shapiro-­‐Ilan  et  al.  2002a;  Shapiro-­‐ Ilan  and  Gaugler  2002).  In  vivo  rearing  capitalizes  on  the  biology  of  the  nematode-­‐ bacteria  complex  and  is  performed  in  a  system  of  trays  of  shelves  (Shapiro-­‐Ilan  et  al.   2014).     The  production  of  infective  juveniles  from  one  host  is  about  50,000  to   200,000  IJ  per  G.  mellonella  larva  depending  on  nematode  species  (Dutky  et  al.   1964;  Selvan  et  al.  1993).  Rearing  entomopathogenic  nematodes  in  vivo  is  typically   done  at  small  scales  (i.e.  laboratory  colonies  and  cottage  industry)  (Shapiro-­‐Ilan  et   al.  2014).  Galleria  mellonella  and  infective  juveniles  in  aqueous  solution  are  placed   onto  a  piece  of  Whatman  filter  paper  inside  an  inverted  Petri  dish.  The  infection   rates  range  from  20-­‐100  infective  juveniles  per  G.  mellonella  larva  (Selvan  et  al.   1993).  For  other  hosts  —such  as  the  yellow  mealworm—  the  infective  rate  is  much   higher,  400-­‐800  IJ/host  (Shapiro-­‐Ilan  et  al.  2008).  G.  mellonella  typically  die  within   1-­‐2  d  of  infection  and  change  color.  G.  mellonella  infected  with  Steinernema  spp.   typically  become  a  gray,  brown,  or  beige  color  and  hosts  infected  with     13   Heterorhabitis  spp.  typically  turn  a  brick  red  to  orange  color.  About  7-­‐10  d  after  host   death,  cadavers  are  transferred  to  a  White  trap  (White  1927).  The  Petri  dish  holding   the  cadavers  is  placed  in  a  larger  Petri  dish  and  water  is  added  surrounding  the   smaller  dish.  As  the  infective  juveniles  emerge  from  the  host  cadaver,  they  travel   over  the  filter  paper,  up-­‐and-­‐over  the  Petri  dish  edges,  and  into  the  surrounding   water.  This  allows  the  nematodes  to  be  easily  harvested  and  stored  in  an  aqueous   solution.  The  optimal  temperature  for  rearing  nematodes  in  vivo  is  25°  C  and  75-­‐ 100%  relative  humidity  (Grewal  et  al.  1994b).     In  vitro  rearing   Rearing  nematodes  in  vitro  first  requires  the  establishment  of  symbiotic   bacteria  and  nematodes  in  separate  pure  cultures,  then  inoculating  a  medium  with   the  bacteria  and  nematodes,  which  requires  high  startup  capital  to  purchase   fermentation  tanks  (Shapiro-­‐Ilan  et  al.  2012).  In  vitro  rearing  of  nematodes  comes  in   two  forms  –  solid  and  liquid.  There  are  four  major  steps  to  in  vitro  solid  rearing:   preparing  the  solid  media,  inoculating  with  symbiotic  bacteria,  inoculation  with   axenic  nematodes,  and  finally  harvesting.  The  solid  medium  is  a  crumbled  or   shredded  polyether  polyurethane  sponge  that  is  coated  with  a  homogenate  growth   medium  of  various  animal  parts,  grain  products,  or  yeast  extracts  (Bedding  1981;   Gaugler  and  Han  2002;  Shapiro-­‐Ilan  et  al.  2012).     Alternative  Rearing  Host   Cost  is  one  of  the  main  reasons  why  more  growers  do  not  adopt   entomopathogenic  nematodes  in  augmentative  biological  control  programs  (Grewal     14   et  al.  2005;  Shapiro-­‐Ilan  et  al.  2014).  Reducing  the  cost  of  the  rearing  host  and   related  production  practices  is  one  way  to  potentially  increase  grower  adoption.   Galleria  mellonella  costs  about  $0.04  -­‐  $0.07  per  larva  at  bait-­‐and-­‐tackle  shops  and   pet  stores.  Criteria  to  selecting  an  alternative  host  include:  negligible  to  no  cost  to   rear,  highly  susceptible,  and  large  body  size.  Black  soldier  fly  larvae  Hermetia   illucens  (L.)  (Diptera:  Stratiomyidae)  has  the  potential  to  be  an  ideal  alternative   rearing  host.  Black  soldier  flies  are  reared  on  farm  wastes,  allowing  for  nutrient   cycling  (Newton  et  al.  2005;  Sheppard  et  al.  1994).  Mature  larvae  are  about  two-­‐ thirds  the  mass  of  G.  mellonella.  Thus,  the  susceptibility  to  entomopathogenic   nematodes  is  a  question  that  needs  to  be  addressed.   Black  Soldier  Fly   Biology   Hermetia  illucens  is  a  hypermetamorphosic  insect;  the  last  instar  is   morphologically  unlike  the  earlier  instars.  The  life  cycle  begins  with  adult  female   flies  laying  eggs  in  dry  cracks  and  crevices  above  food  sources  (Booth  and  Sheppard   1984).  Larvae  hatch  from  the  eggs,  fall  to  the  food  source,  and  feed  gregariously   (Bradley  1930).  Larvae  develop  through  six  instars  within  three  weeks  (May  1961;   Tomberlin  et  al.  2009).  The  sixth  instar  differs  from  the  previous  instars  and  is   known  as  a  prepupa  (Sheppard  et  al.  1994).  The  mouthparts  are  reduced  and   immobilized  into  a  hook;  the  ocelli  are  more  prominent;  and  the  cuticle  is  darker   covered  in  more  pubescence  and  lacking  the  ventral  spicules  (May  1961).  The   prepupa  is  a  non-­‐feeding,  wandering  stage  that  searches  for  dry  substrates  for     15   pupation  (Newton  et  al.  2005;  Sheppard  et  al.  1994).  Adults  live  for  about  10-­‐14  d   and  do  not  feed  (Tomberlin  et  al.  2002).   History   Since  the  beginning  of  the  20th  century,  authors  have  reported  the   appearance  of  black  soldier  flies  in  beehives  (Copello  1926),  latrines  and  privies   (Johannsen  1922;  Bradley  1930),  animal  manures  (Furman  et  al.  1959),  carrion,  and   various  other  decaying  organic  matter  (May  1961).  Sheppard  et  al.  (1983)  explored   the  use  of  black  soldier  fly  larvae  to  manage  house  fly  populations  and  the  large   volumes  of  manure  produced  on  poultry  farms.  Newton  et  al.  (1977)  determined   that  black  soldier  fly  meal  is  a  good  dietary  supplement  for  swine.  Forensic   entomologist  have  also  been  interested  in  using  black  soldier  fly  to  determine   postmortem  interval  (Lord  et  al.  1994;  Pujol-­‐Luz  et  al.  2008).  Most  recently,  the   medical  field  has  taken  an  interest  in  them  to  looking  for  new  antimicrobial   substances  (Choi  et  al.  2012;  Park  et  al.  2014).     Potential  Benefits   Black  soldier  fly  are  a  powerful  nutrient  management  tool,  allowing  nutrients   to  be  cycled  multiple  times.  Young  larvae  feed  on  organic  farm  and  food  wastes.   Mature  larvae  can  be  feed  to  livestock  such  as  swine,  poultry,  and  fish  (Newton  et  al.   2005;  Sheppard  et  al.  1994).  Compost  resulting  from  the  rearing  process  can  be   used  as  a  soil  amendment  (Newton  et  al.  2005;  Sheppard  et  al.  1994).  A  small   number  of  larvae  could  be  diverted  from  livestock  feed  to  rear  entomopathogenic   nematodes.       16   Presently,  on  farm  rearing  of  entomopathogenic  nematodes  relies  on   purchased  or  reared  G.  mellonella,  requiring  additional  investments  of  money   and/or  on-­‐farm  labor.    Diet  requirements  for  G.  mellonella  include  honey,  wheat   bran  and  dogfood  —items  that  are  rarely  produced  on  farm.  In  contrast,  black   soldier  flies  are  reared  on  farm  wastes.  Rearing  entomopathogenic  nematodes  on   black  soldier  fly  larvae  would  thus  add  a  tertiary  on-­‐farm  use  for  black  soldier  fly,   making  flies  even  more  attractive  for  small  farm  and  greenhouse  operations.  A  free,   ready  supply  of  entomopathogenic  nematode  rearing  hosts  could  also  increase  the   availability  of  this  relatively  underutilized  form  of  augmentative  biological  control   for  small-­‐scale  farmers.       Potential  Limitations   Some  potential  limitations  of  using  black  soldier  fly  as  a  rearing  host  are   morphological  and  immunological.  Black  soldier  fly  larvae  are  amphipneustic;  two   anterior  spiracles  are  located  on  the  first  thoracic  segment  and  two  posterior   spiracles  are  located  inside  pouch  on  the  last  abdominal  segment.  This  is  a  reduced   amount  of  spiracles  compared  to  the  highly  susceptible  G.  mellonella,  which  is   peripnuestic  with  nine  spiracles  on  each  side.  The  lower  number  of  spiracles  means   fewer  entry  points  for  entomopathogenic  nematodes.  The  larvae  of  Stratiomyidae   also  incorporate  calcium  carbonate  into  their  cuticle  (Johannsen  1922).  This  gives   the  cuticle  a  shagreened  pattern  of  hexagons  and  makes  the  cuticle  thick  and  tough   yet  flexible  (Newton  et  al.  1977).  For  nematodes  such  as  H.  bacteriophora  which   likes  to  enter  its  host  not  by  natural  openings  but  puncturing  a  hole  through  the   integument,  the  shagreened  cuticle  of  the  black  soldier  fly  may  inhibit  entry     17   (Bedding  and  Molyneux  1982).  Due  to  their  life  history  with  decaying  organic   matter,  black  soldier  flies  have  a  well-­‐developed  immune  system  and  strong   responses  to  non-­‐self  organisms  (Choi  et  al.  2012;  Park  et  al.  2014).  The  morphology   and  immune  system  of  the  black  soldier  fly  larvae  may  limit  its  use  as  an   entomopathogenic  rearing  host.   Dalotia  coriaria  (Kraatz)  (Coleoptera:  Staphylinidae)   History   In  the  early  1980s,  D.  coriaria  was  discovered  preying  upon  Stelidota   geminate  (Say)  (Nitidulidae)  in  a  laboratory  colony  (Miller  and  Williams  1983).   However,  it  was  not  until  the  21st  century  that  its  potential  as  a  biological  control   organism  in  greenhouses  was  explored  (Carney  et  al.  2002).  It  is  one  of  the  few  new   organisms  biological  control  companies  have  added  to  the  market  since  the  1990s   (van  Lenteren  2012).  Today,  Dalotia  coriaria  is  sold  for  the  management  of  western   flower  thrips,  fungus  gnats,  and  shore  flies  Scatella  stagnalis  (Fallen)  (Diptera:   Ephydridae).  The  knowledge  of  interactions  between  D.  coriaria  and   entomopathogenic  nematodes  is  lacking.   Biology   Dalotia  coriaria  is  a  small  (3-­‐4  mm),  highly  mobile,  soil-­‐dwelling  polyphagous   predator.  Larvae  are  a  pale  yellow  to  cream  color;  and  the  adults  are  a  glossy,  dark   color  (Miller  and  Williams  1983).  Body  posture  is  typically  S-­‐shaped  with  their   heads  pointed  down  and  their  abdomens  upturned.  Both  the  larvae  and  adults  are     18   fiercely  polyphagous  –  feeding  on  several  greenhouse  pests  including  western   flower  thrips,  fungus  gnats,  and  shore  flies  (Carney  et  al.  2002;  Jandricic  et  al.  2006).     Life  Cycle     Dalotia  coriaria  is  a  holometabolous  insect  with  four  life  stages:  egg,  larva,   pupae,  and  adult.  Adult  females  lay  eggs  in  the  soil  and  larvae  hatch  2  to  3  d  later   (Echegaray  and  Cloyd  2013;  Miller  and  Williams  1983).  Larvae  develop  through   three  instars  in  about  7  d  (range  4.5  to  11  d)  (Echegaray  and  Cloyd  2013;  Miller  and   Williams  1983).  The  third  instar  spins  a  cocoon  of  silk  strains  and  soil  particles   before  pupation  (Miller  and  Williams  1983).  Adults  emerge  5  to  8  d  later  (Echegaray   and  Cloyd  2013;  Miller  and  Williams  1983).  The  development  time  from  egg  to  adult   is  about  2.5  to  3  w  (Carney  et  al.  2002;  Echegaray  and  Cloyd  2013;  Miller  and   Williams  1983).  Adults  beetles  live  for  4  to  12  w  (Echegaray  and  Cloyd  2013).   Females  can  lay  up  to  14  eggs  a  day  with  a  mean  fecundity  of  90  eggs  during  their   life  (Echegaray  and  Cloyd  2013).     Feeding  habits   Dalotia  coriaria  has  been  reported  feeding  on  a  variety  of  organisms.  Miller   and  Williams  (1983)  recorded  D.  coriaria  feeding  on  the  eggs  of  Musca  domestica  L.   (Diptera:  Muscidae)  and  several  Nitidulid  species.  Messelink  and  Van  Wensveen   (2002)  reported  D.  coriaria  feeding  on  the  eggs  and  first  larval  stages  of  Duponchelia   fovealis  Zeller  (Lepidoptera:  Pyralidae),  a  widespread  pest  in  Dutch  greenhouses  as   well  as  collembolans  but  not  woodlice  or  millipedes.  Adult  D.  coriaria  have  been   shown  to  consume  as  many  as  95  second  instar  thrips,  78  thrips  pupae,  154  fungus     19   gnat  eggs,  and  150  first  instar  fungus  gnats  within  24  h  (Carney  et  al.  2002).  Third   instar  beetles  can  consume  an  equally  impressive  100  eggs  and  100  first  instar   fungus  gnats  in  a  24  h  period  (Carney  et  al.  2002).  In  a  laboratory  bioassay,  one   adult  rove  beetle  can  consume  68  –  78%  of  the  second  and  third  instar  fungus  gnats   presented  to  them  in  Petri  dishes  within  24  h  (Echegaray  Wilson  2012).   Rearing   Dalotia  coriaria  has  been  reared  on  a  variety  of  artificial  diets  under  various   conditions.  Carney  et  al  (2002)  first  reared  D.  coriaria  on  trout  food  in  coconut  fiber   (coir).  They  tried  multiple  artificial  diets  including  raw  and  cooked  ground  beef,  cat   and  dog  food,  and  trout  food.  Dalotia  coriaria  preformed  equally  well  on  all  food   substrates,  but  the  authors  decided  that  a  commercialized  trout  food  was  the  easiest   to  use.  Others  have  reared  D.  coriaria  on  turkey  feed  (Bennison  et  al.  2009;  Bennison   et  al.  2008)and  oatmeal  (Birken  and  Cloyd  2007).  Dalotia  coriaria  has  been  reared   at  multiple  temperatures  ranging  from  20-­‐25°C,  relative  humidity  ranging  from  30-­‐ 90%  and  different  photoperiods  ranging  from:  no  light,  12:12  h,  16:8  h  and  seasonal   cycles.     Bennison  et  al.  (2008)  developed  a  rearing-­‐release  system  for  D.  coriaria.   Rearing  containers  were  3  L  plastic  boxes  half  filled  with  moistened  coir  and   vermiculite  (50:50  mixture)  and  snap  on  lids  with  two  ventilation  holes.  Initial   populations  were  started  with  60  adults  and  fed  with  2.5  g  of  turkey  feed  every  3-­‐4   d.  Turkey  feed  was  mixed  into  the  coir  and  vermiculite  to  prevent  fungal  growth.   Beetle  populations  increased  20-­‐fold  in  23  d.  Beetles  reared  in  these  containers     20   could  be  deployed  in  cropping  systems  and  were  reported  to  disperse  up  to  30  m   within  a  week  (Bennison  et  al.  2009).   Authors  have  reported  several  problems  when  rearing  D.  coriaria.  The  most   noted  is  that  the  immature  stages  are  cannibalistic,  especially  the  third  instars,   which  feed  on  the  younger  instars  when  rearing  containers  are  over  crowded   (Carney  et  al.  2002;  Echegaray  and  Cloyd  2013;  Miller  and  Williams  1983).  Authors   have  also  noted  the  presence  of  mites  that  appeared  detrimental  to  D.  coriaria   colonies  (Carney  et  al.  2002;  Echegaray  Wilson  2012).  Carney  et  al.  (2002)   described  a  phoretic  deutronymph  resembling  Rhizoglyphus  spp.  (Astigmata:   Acaridae)  that  restricted  the  mobility,  feeding,  and  mating  of  the  beetles.  Echegaray   (2012)  observed  mites  (unknown  species)  feeding  on  multiple  stages  of  the  beetle   (eggs,  larvae,  and  adults).  However,  not  all  mites  present  in  D.  coriaria  colonies  are  a   cause  for  concern.  Birken  and  Cloyd  (2007)  observed  the  presence  of  an  astigmatid   mite  Sancassania  aff.  sphaerogaster  (Acaria:  Acaridae)  in  their  rove  beetle  colonies   and  thought  it  likely  that  D.  coriaria  was  feeding  on  the  mites  since  D.  coriaria  is  a   generalist  predator.     Compatibility  with  nematodes   Dalotia  coriaria  and  entomopathogenic  nematodes  are  both  soil-­‐dwelling   organisms  used  as  biological  control  agents  to  manage  the  same  pests,  i.e.  thrips,   fungus  gnats,  and  shore  flies.  Both  could  be  applied  at  the  same  time  in   augmentative  biological  control  programs  and  come  into  contact  with  each  other.  A   single  study  has  tested  the  compatibility  of  the  predatory  beetle  with  only  one   species  of  nematode,  Steinernema  feltiae  (Filipjev)  (Rhabditida:  Steinernematidae)     21   (Jandricic  et  al.  2006).  Adult  D.  coriaria  was  not  susceptible  to  S.  feltiae  but  third   instar  mortality  was  dose  dependent.  Mortality  at  the  highest  dose  rate  of  50  IJ/cm2   was  27%,  which  was  significantly  greater  than  the  two  lower  rates  and  control   (Jandricic  et  al.  2006).   Thesis  Objectives     The  development  of  adequate  rearing  techniques  has  been  a  consistent   challenge  for  the  development  of  augmentative  biological  control  programs.  This  is   especially  true  for  growers  that  wish  to  rear  biological  control  organisms  in  cases   where  specific  natural  enemies  cannot  be  sourced  reliably  from  commercial   insectaries.  Intraguild  predation  and  other  negative  interactions  are  another  area   where  research  is  needed.     The  goals  of  my  thesis  project  were  to:  1.  Determine  if  black  soldier  fly  could   be  used  as  mass  rearing  host  for  four  common  entomopathogenic  nematodes  and  2.   Test  the  compatibility  of  entomopathogenic  nematodes  with  another  soil-­‐dwelling   biological  control  organism  D.  coriaria.         22   Chapter  2. Exploring  the  use  of  black  soldier  fly  Hermetia   illucens  (L.)  (Diptera:  Stratiomyidae)  as  an  in  vivo   entomopathogenic  nematode  rearing  host   Introduction   Entomopathogenic  nematodes  have  been  used  in  biological  control  of  insect   pests  for  many  years  in  multiple  agricultural  systems  including:  turfgrass,   greenhouses,  nurseries,  mushrooms,  and  orchards  (Grewal  et  al.  2005).  However,   nematodes  have  not  seen  widespread  adoption  in  any  of  these  systems.  One  of  the   factors  limiting  the  use  of  nematodes  is  high  production  costs  (Grewal  et  al.  2005;   Shapiro-­‐Ilan  et  al.  2014).   Entomopathogenic  nematodes  are  reared  either  in  large  scale  in  vitro   cultures  or  small  scale  in  vivo  operations.  Rearing  nematodes  in  vitro  first  requires   the  establishment  of  the  symbiotic  bacteria  and  nematodes  in  separate  pure   cultures,  then  inoculating  a  medium  with  the  bacteria  and  nematodes,  which   requires  high  startup  capital  to  purchase  fermentation  tanks  (Shapiro-­‐Ilan  et  al.   2014).  In  vivo  production  requires  the  use  of  insect  hosts,  since  entomopathogenic   nematodes  are  obligate  parasites  of  insects.  The  free-­‐living  stage  known  as  infective   juveniles  (or  dauer  larvae)  enter  insect  hosts  through  natural  openings  –  mouth,   anus,  and  spiracles.  Inside  the  insect  heomcel,  the  juvenile  nematodes  release  their   symbiotic  bacteria  and  kill  the  host  within  24-­‐48  h.  Nematodes  complete  their   development  within  the  host,  proceeding  through  one  to  three  generations.  When   host  resources  are  depleted,  thousands  of  infective  juveniles  emerge  from  the     23   cadaver  in  search  of  a  new  host  (Kaya  and  Gaugler  1993).  In  vivo  production  of   nematodes  is  often  done  on  a  small  scale  suitable  for  cottage  industry  or  niche   markets  (Shapiro-­‐Ilan  et  al.  2014).     The  most  commonly  used  hosts  for  rearing  nematodes  in  vivo  are  mature   larvae  of  the  greater  wax  moth,  Galleria  mellonella  (L.)  (Lepidoptera:  Pyralidae)  and   the  yellow  mealworm,  Tenebrio  molitor  L.  (Coleoptera:  Tenebrionidae)  (Shapiro-­‐ Ilan  et  al.  2002a;  Shapiro-­‐Ilan  and  Gaugler  2002).  Farmers  can  purchase  wax  worms   at  local  bait-­‐and-­‐tackle  shops  or  both  at  pet  stores.  However  they  represent  an   additional  cost  to  the  farmer  without  providing  any  services  beyond  a  rearing  host.   Black  soldier  fly  Hermetia  illucens  (L.)  (Diptera:  Stratiomyidae),  larvae  have  a   history  of  on-­‐farm  use  and  may  serve  as  an  alternative  entomopathogenic  nematode   host.     Black  soldier  fly  larvae  are  detritivores  and  have  several  agriculture  uses   including:  manure  management  (Sheppard  et  al.  1994),  house  fly  suppression   (Sheppard  1983;  Bradley  and  Sheppard  1984),  composting  (Newby  1997),  and   livestock  feed  (Newton  et  al.  1977;  Newton  et  al.  2005).  The  black  soldier  fly  life   cycle  begins  with  adult  female  flies  laying  eggs  in  dry  cracks  and  crevices  above  food   sources  (Booth  and  Sheppard  1984).  Larvae  hatch  from  the  eggs  and  feed  on  various   manures  –  chicken,  swine,  dairy  (Sheppard  et  al.  1994;  Newton  et  al.  2005;  Myers  et   al.  2008),  carrion  (Tomberlin  et  al.  2005),  coffee  grounds  (Lardé  1990),  and  rotting   vegetation  (Newby  1997).  Larvae  develop  through  six  instars  within  three  weeks   (Tomberlin  et  al.  2009).  The  last  instar  is  an  non-­‐feeding  wandering  stage  known  as   a  prepupa  (Sheppard  et  al.  1994).  They  are  easily  collected  from  feeding  containers     24   as  they  seek  out  dry  substrates  for  pupation  (Newton  et  al.  2005;  Sheppard  et  al.   1994).  Adults  live  for  about  10-­‐14  d  and  do  not  feed  (Tomberlin  et  al.  2002).     Black  soldier  fly  are  a  potentially  powerful  nutrient  management  tool   allowing  nutrients  to  be  cycled  multiple  times  —feed  larvae  organic  farm  wastes   then  feed  reared  larvae  to  livestock  (Newton  et  al.  2005;  Sheppard  et  al.  1994).  A   small  number  of  larvae  could  be  diverted  from  livestock  feed  to  rear   entomopathogenic  nematodes.  Nematodes  could  then  be  used  to  control  various   insect  pests  (e.g.  fungus  gnats,  thrips,  weevils,  white  grubs,  etc.)  (Grewal  et  al.  2005).   The  goal  of  this  research  was  to  determine  the  feasibility  of  using  black  soldier  fly  as   an  entomopathogenic  nematode  rearing  host.     In  preliminary  experiments  infective  juveniles  emerged  from  only  a  few   black  soldier  fly  cadavers  (Tourtois  and  Grieshop,  unpublished  data);  however,   upon  dissecting  the  cadavers  thousands  of  dead  juveniles  were  found  inside  the   cadaver.  The  tough,  calcium  carbonate-­‐studded  larval  cuticle  may  be  presenting  a   two-­‐fold  problem  to  the  infective  juveniles  entering  and  leaving  the  host  (Johannsen   1922;  Newton  et  al.  1977).  Black  soldier  fly  larvae  have  fewer  spiracles  than  G.   mellonella,  thus  less  natural  openings  for  nematodes  to  enter  and  exit.  Based  on   preliminary  results,  injuring  the  black  soldier  fly  larvae  greatly  increased  the   infectivity  of  Steinernema  feltiae  (Filipjev)  (Rhabditida:  Steinernematidae)  (Tourtois   and  Grieshop,  unpublished  data).   The  first  objective  was  to  determine  which  instars  of  black  soldier  fly  are   susceptible  to  four  commonly  available  species  of  entomopathogenic  nematodes;   Heterorhabitis  bacteriophora  Poinar  (Rhabditida:  Heterorhbditidae),  Steinernema     25   carpocapsae  (Weiser)  (Rhabditida:  Steinernematidae),  S.  feltiae  (Filipjev),  and  S.   riobrave  Cabanillas,  Poinar  &  Raulston.  The  second  objective  was  to  determine  if   injuring  the  black  soldier  fly  changed  the  infectivity  of  entomopathogenic   nematodes.  The  third  objective  was  to  determine  if  damaging  the  cadavers  affects   the  number  of  infective  juvenile  nematodes  that  emerge.     Methods  and  Materials     Black  Soldier  Fly  colony   Black  soldier  fly  larvae  were  original  obtained  from  a  commercial  source   (Compost  Mania,  North  Carolina).  Larvae  were  reared  in  batches  of  300  individuals   in  946  ml  plastic  deli  containers  (WNA,  Chattanooga,  TN).  The  deli  containers  were   covered  with  a  brown  paper  towel  held  in  place  with  a  rubber  band.  Larvae  were   fed  10  g  of  Gainesville  house  fly  diet  (5:3:2  ratio  of  wheat  bran,  alfalfa  meal  and   cornmeal)  (Hogsette  1992)  and  17  ml  of  water,  5  days  a  week  (Tomberlin  et  al.   2002).  In  2013,  Larvae  were  reared  in  a  growth  chamber  at  25.5  ±  3.8°C,  79  ±  12.1%   RH,  and  in  the  dark  (0:24,  light:  dark).  Rearing  containers  were  place  in  aluminum   baking  pans  (49  by  30  by  7.5  cm,  GFS,  Grand  Rapids,  MI)  to  catch  escapees.  In  2014,   larvae  were  reared  in  an  insectary  room  at  25.6  ±  1.1°C  and  44  ±  15.9%  RH.  An   additional  aluminum-­‐baking  pan  was  placed  over  rearing  containers  to  block  light.   Feeding  stopped  when  >50%  of  the  larvae  had  molted  to  prepupa.  Rearing   containers  remained  in  the  growth  chamber  or  insectary  for  an  additional  week  or   until  larvae  started  to  pupate.     Prepupae  along  with  digested  food  were  dumped  into  one  of  two  aluminum   baking  pans  (30  by  23.5  by  6  cm,  GFS,  Grand  Rapids,  MI)  in  a  screened  cage  (60  by     26   60  by  60  cm,  BioQuip,  Rancho  Dominguez,  CA)  in  a  greenhouse  (24.9  ±  3.8°C,  35.8  ±   15.8%  RH,  and  natural  light  cycle).  Prepupae  pupated  in  the  baking  pans  and   emerged  as  adults.  No  food  was  provided  to  the  adults.  Water  was  misted  onto  the   top  of  the  screen  cage  with  a  mist  nozzle  at  least  once  a  day,  several  times  a  week.   Deli  containers  with  1  cm  diameter  cardboard  rolls  suspended  above  wet   Gainesville  fly  diet  (30  g  diet  mixed  with  75ml  of  water)  was  included  in  the  cage  for   adult  females  to  lay  eggs  (Sheppard  et  al.  2002).     Entomopathogenic  Nematode  colonies   Heterorhabditis  bacteriophora  Oswego  strain  was  obtained  from  Anne   Nielsen,  Rutgers  Agriculture  Research  and  Extension  Center,  Bridgeton,  NJ.   Steinernema  carpocapsae  and  S.  feltiae  were  obtained  from  BeckerUnderwood   (Ames,  IA).  Steinernema  riobrave  355  strain  was  obtained  from  David  Shapior-­‐Illan,   USDA-­‐ARS,  Byron,  GA.  The  four  nematode  species  were  reared  on  the  host  G.   mellonella  in  inverted  Petri  dishes  (Kaya  and  Stock  1997).  Galleria  mellonella  was   purchased  from  a  local  bait  shop  and  a  pet  store.  Approximately  100  infective   juveniles  in  500  μl  of  water  were  applied  to  five  G.  mellonella  on  filter  paper  in  one   Petri  dish.  One  week  later,  infected  cadavers  were  transferred  to  a  White  trap   (White  1927).  Harvested  infective  juveniles  were  stored  in  tissue  culture  flasks  in   laboratory  drawers  at  ambient  room  temperature.  Each  nematode  species  was   stored  in  a  separate  cabinet  drawer  under  24  h  dark  conditions.  All  infective   juveniles  used  in  the  experiments  described  below  were  less  than  14  days  old.     27   Experiment  1a  –  black  soldier  fly  susceptibility  by  larval  stage   A  5x5  two-­‐way  factorial  experiment  was  set-­‐up  to  test  the  susceptibility  of   black  soldier  fly  instars  to  multiple  species  of  entomopathogenic  nematodes.  The   levels  of  the  first  factor  were  multiple  instars  (2,  4,  5,  6)  of  black  soldier  fly  plus  the   positive  control  –late  instar  G.  mellonella.  The  levels  of  the  second  factor  were  four   species  of  nematodes  (H.  bacteriophora,  S.  carpocapsae,  S.  feltiae,  and  S.  riobrave)   plus  a  negative  control  –water  without  nematodes.  There  was  a  total  of  25   treatment  combinations.     Fourth  through  sixth  instars  were  refrigerated  at  9.9  ±  2.4°C  and  84.9  ±   12.0%  RH  for  11  d  until  second  instars  arrived.  Larvae  were  separated  from  feed  by   dumping  the  contents  of  a  rearing  container  out  onto  a  cafeteria  tray  and  picking   larvae  out  by  hand.  They  were  washed  by  placing  them  into  #5  soil  sieve,   submerging  in  tub  of  tap  water,  and  swirling  around  to  wash  away  pieces  of  wheat   bran.  Larvae  were  transferred  on  to  brown  paper  towel  to  dry.  Larvae  were   distributed  to  inverted  60  mm  diameter  Petri  dish  containing  one  piece  of  No.  1   Whatman  filter  paper,  one  larva  per  dish.  Using  a  micropipette,  100  infective   juveniles  in  500  μl  of  deionized  water  were  applied  to  the  filter  paper.  A  total  of  25   replicates  were  arranged  on  five  cafeteria  trays  (block)  with  five  replicates  of  each   treatment  combination  on  every  tray.  Each  block  was  a  shelf  in  the  growth  chamber   (20.4  ±  0.6°C,  70.4  ±  10.4%  RH,  no  light,  model  I-­‐35L,  Percival,  Perry,  IA).  A  HOBO®   data  logger  (model  U23-­‐001,  Onset  Computer  Corporation,  Bourne,  MA)  was  used  to   verify  the  environmental  conditions  in  the  growth  chamber.     28   Insect  mortality  was  assessed  daily  for  8  d.  It  was  difficult  to  assess  black   soldier  fly  larvae  mortality  because  they  did  not  immediately  respond  to  handling   even  when  they  were  alive.  If  a  larva  was  actively  crawling  about  the  Petri  dish   arena,  then  it  was  recorded  as  alive.  If  the  larva  was  not  active,  the  bottom  of  the   inverted  Petri  dish  was  used  to  roll  the  larva  over  onto  its  dorsal  side  and  gently   pressed  down.  If  the  larva  responded  by  rolling  back  over  onto  its  ventral  side,  then   it  was  recorded  as  alive.  If  the  larva  did  not  respond  to  manipulation  and  felt  soft   when  squeezed,  it  was  recorded  as  dead.  If  we  were  not  certain  that  the  larva  was   dead,  it  was  recorded  as  alive.     On  the  eighth  day,  any  insect  that  was  not  actively  moving  about  its  Petri  dish   arena  was  selected  and  frozen  at  -­‐20°C  for  later  dissection.  At  least  one  insect  from   each  treatment  and  block  combination  was  selected.  To  estimate  the  number  of   founding  nematodes,  cadavers  were  dissected  in  deionized  water  under  a  dissecting   microscope.     Experiment  1b  –  black  soldier  fly  susceptibility  at  pupal  stage   Black  soldier  fly  pupae  were  not  available  at  the  same  time  as  the  larvae;   therefore,  a  separate  experiment  was  set-­‐up  to  test  the  susceptible  of  the  pupal   stage  to  entomopathogenic  nematodes.  A  simpler  2x5  factorial  experiment  was  set-­‐ up.  The  levels  of  the  first  factor  were  black  soldier  fly  pupae  and  the  positive  control   –G.  mellonella.  The  levels  of  the  second  factor  were  four  species  of  nematodes  (H.   bacteriophora,  S.  carpocapsae,  S.  feltiae,  and  S.  riobrave)  plus  a  negative  control  – water  without  nematodes.  There  was  a  total  of  10  treatment  combinations.       29   Statistical  Analysis     All  statistical  analyses  were  performed  in  the  R  statistical  language  (version   3.1.1,  R  Core  Team  2014).  Galleria  mellonella  was  excluded  from  all  statistical   analyses  since  they  were  only  included  in  the  experiment  design  to  verify  that  the   nematodes  were  indeed  infective.  Insect  mortality  was  corrected  using  Abbott’s   formula  (Abbott  1925).  Any  values  calculated  as  less  than  zero,  were  entered  as   zero.  Due  to  high  mortality  in  the  control  treatment  on  day  8,  mortality  for  the   second  instars  was  compared  using  mortality  from  day  7.  Mortality  was  calculated   as  a  proportion  for  each  block.  Data  was  transformed  by  taking  the  arcsine  of  the   square  root  to  fit  ANOVA  assumptions  of  normality  and  variance  and  analyzed  using   a  two-­‐way  ANOVA  model.  Tukey  HSD  was  used  to  separate  means,  p-­‐value  <  0.05.   Percent  infected  hosts  and  the  number  of  nematodes  per  host  were  analyzed  using   Kruskal-­‐Wallis  test  since  data  did  not  meet  assumptions  of  normality.     Experiment  2  –effect  of  larval  injury  on  nematode  infection   Based  on  the  results  from  the  previous  experiment,  fifth  instars  were   selected  for  all  following  experiments.  A  3x5  two-­‐way  factorial  experiment  was  set-­‐ up  to  test  whether  injuring  the  black  soldier  fly  larvae  affects  nematode  infectivity.   The  levels  of  the  first  factor  where  injured  black  soldier  fly  larvae,  non-­‐injured  black   soldier  fly  larvae,  and  the  positive  control  G.  mellonella.  The  levels  of  the  second   factor  were  four  species  of  entomopathogenic  nematodes  (H.  bacteriophora,  S.   carpocapsae,  S  feltiae,  and  S.  riobrave)  plus  a  negative  water  control.  There  were  a   total  of  15  treatment  combinations.  Five  replicates  of  each  treatment  were   represented  in  each  of  eight  blocks  for  a  total  of  40  replicates  for  each  treatment.     30   The  experiment  took  place  in  a  growth  chamber  (24.7  ±  0.8°C,  96.0  ±  4.8%  RH,  no   light,  model  I-­‐41VL,  Percival,  Perry,  IA)  and  blocked  by  space  (two  blocks  per  shelf).   HOBO®  data  loggers  (model  U23-­‐001,  Onset  Computer  Corporation,  Bourne,  MA)   were  used  to  verify  the  environmental  conditions  in  the  growth  chamber.   Petri  dish  infection  arenas  were  prepared  by  inserting  60  mm  diameter  No.  1   Whatman  filter  paper  circles  into  60  mm  diameter  inverted  Petri  dishes.  Infective   juveniles  (1000)  were  applied  to  the  filter  paper  in  500  μl.  Negative  controls   received  just  500  μl  of  water.  Meanwhile,  black  soldier  fly  larvae  were  separated   from  feeding  material  and  washed  in  a  tub  of  lukewarm  tap  water.  Under  a   dissecting  microscope,  a  size  0  insect  pin  was  used  to  puncture  two  holes  in  the   cuticle  on  the  ventral  lateral  edges  of  nine  segments  –  the  mesothorax,  metathorax,   and  first  seven  abdominal  segments.  A  total  of  18  holes  were  punctured  into  each   larva.  After  the  puncturing  operation,  larvae  were  immediately  transferred  onto  the   prepared  Petri  dishes.  Insect  pins  were  sterilized  by  boiling  in  water  for  1  min  and   storing  in  80%  ethanol.  Non-­‐injured  larvae  and  G.  mellonella  were  placed  into   appropriate  Petri  dishes  at  the  same  time.  One  block  of  replicates  was  completed   before  proceeding  onto  the  next  block.     Insect  mortality  was  assessed  as  described  above  in  experiment  1.  Any  larvae   that  were  alive  and  previously  recorded  as  dead  were  revaluated  daily.  On  the  fifth   day  of  mortality  assessment,  all  dead  individuals  plus  at  least  one  replicate  from   each  control  block  was  frozen  (-­‐20°C)  to  arrest  nematode  development  until   dissection.     31   Cadavers  were  washed  in  water  to  remove  exterior  nematodes  and  dissected   in  Ringers  solution  (Kaya  and  Stock  1997)  under  a  dissecting  microscope.   Nematodes  were  counted.  Negative  controls  were  dissected  to  verify  a  lack  of   nematode  contamination.   Statistical  Analysis   Survival  analysis  of  the  black  soldier  fly  was  completed  using  Cox   proportional  hazard  function  in  R  statistical  language  (version  3.1.1,  R  Core  Team   2014).  Factors  included  in  the  model  were  injury  treatment,  nematode  species,  and   the  two-­‐way  interaction  term.  Blocking  was  not  significant.  A  logistic  regression  was   used  to  test  the  effect  of  injury  treatment  and  nematode  species  on  the  number  of   infected  larvae.  The  number  of  nematodes  recovered  from  cadavers  was  log(1+x)   transform  to  meet  normality  assumptions  and  compared  among  treatments  in  a   two-­‐way  ANOVA.  Tukey  HSD  was  used  for  mean  separation  with  α  =  0.05.  Galleria   mellonella  were  excluded  from  all  analyses.   Experiment  3  –  nematode  production  in  black  soldier  fly   A  5x5  two-­‐way  factorial  experiment  was  conducted  to  test  the  following   objectives:  (1)  determine  if  damaging  the  black  soldier  fly  cadavers  one  week  post-­‐ infection  affects  infective  juvenile  emergence  and  (2)  compare  the  number  of   infective  juveniles  that  emerge  from  black  soldier  fly  versus  G.  mellonella.  The  five   levels  of  the  first  factor  were  non-­‐injured  larvae,  larvae  injured  prior  to  nematode   application,  cadavers  injured  after  infection,  larvae  injured  both  before  and  after   infection,  and  non-­‐injured  G.  mellonella.  Henceforth,  injury  that  occurred     32   immediately  before  nematode  application  will  be  referred  to  as  pre-­‐infection  injury;   damaged  done  to  the  cadavers  one  week  after  the  start  date  will  be  referred  to  as   post-­‐infection  injury;  the  combination  of  both  treatments  will  be  referred  to  as   pre+post-­‐infection  injury.  The  five  levels  of  the  second  factor  were  the  four   nematode  species  (H.  bacteriophora,  S.  carpocapsae,  S  feltiae,  and  S.  riobrave)  and   water  as  a  negative  control.  There  was  a  total  of  25  treatments.   Larvae  (25  per  treatment)  were  weighed.  Fifth  instar  black  soldier  fly  were   injured  as  described  in  experiment  2.  Larvae  were  placed  individually  on  a  piece  of   filter  paper  in  an  inverted  60  mm  diameter  petri  dish  with  1000  infective  juveniles   and  held  in  a  growth  chamber  (24.8  ±  0.2°C,  92.0  ±  13.5%  RH,  no  light,  model  I-­‐ 41VL,  Percival,  Perry,  IA).  HOBO®  data  loggers  (models  U23-­‐001  and  UA-­‐002-­‐08,   Onset  Computer  Corporation,  Bourne,  MA)  were  used  to  verify  the  environmental   conditions  in  the  growth  chamber.   Insect  mortality  was  assessed  daily  for  5  d.  On  day  seven,  black  soldier  fly   cadavers  were  damaged  in  the  post-­‐infection  injury  treatments  with  an  insect  pin.   They  were  damaged  in  the  same  manner  as  the  larvae  were  as  described  in   experiment  2.  At  this  time,  all  cadavers  were  transferred  to  a  White  trap  to  collect   emerging  juveniles  (White  1927).  White  traps  were  checked  daily  for  juveniles.  On   the  first  day  that  juveniles  appeared  in  the  White  trap,  they  were  harvested  into  30   ml  tissue  culture  flasks  (Corning  Inc.,  Tewksbury,  MA).  Subsequent  harvesting   occurred  every  other  day  until  no  more  juveniles  were  present  in  the  White  trap  or   the  end  date  of  the  experiment.  Cadavers  were  collected  and  frozen  three  days  after   juveniles  were  no  longer  emerging  from  the  cadaver  or  at  the  end  of  the  experiment,     33   which  was  28  d  from  the  start  date  (i.e.  cadavers  were  observed  for  three  weeks  for   infective  juveniles).   Tissue  culture  flasks  were  filled  to  the  30  ml  fill  mark  and  laid  down  on  an   orbital  shaker  (model  S500,  VWR,  Radnor,  PA)  at  speed  2  for  at  least  10  sec  to   uniformly  suspend  nematodes  in  water.  Six  subsamples  (50  –  3000  μl)  were   transferred  to  60  mm  Petri  dishes  with  a  micropipette.  Infective  juveniles  were   counted  under  a  dissecting  microscope.   Statistical  Analysis   Survival  analysis  of  the  black  soldier  fly  was  tested  using  Cox  proportional   hazard  function  in  the  survival  package  version  2.37-­‐7  of  R  3.1.1  (R  Core  Team   2014;  Therneau  2000).  The  factors  included  in  the  model  were  injury  treatment,   nematode  species,  and  the  two-­‐way  interaction  term.  A  two-­‐way  ANOVA  to  compare   the  number  of  harvested  juveniles  from  black  soldier  fly  and  G.  mellonella.   Nematode  harvest  data  was  standardized  to  facilitate  direct  comparison  among   individuals  of  different  mass  by  dividing  the  harvested  juveniles  by  the  mass  of  the   host.  Data  were  transformed  (log(1+x))  to  meet  model  requirements  of  normality   and  homoscedasticity  and  fitted  to  a  two-­‐way  factorial  ANOVA  consisting  of  injury   treatment,  nematodes  species,  and  the  two-­‐way  interaction  term.  Tukey’s  HSD  was   used  to  separate  treatment  means  with  a  critical  value  =  0.05.           34     Figure  2-­‐1.  Abbott’s  corrected  mortality  for  black  soldier  fly  larvae.  Nematodes   applied  at  100  infective  juveniles  per  host  at  20°C.  Mortality  for  the  second  instar  is   from  day  7  since  there  was  high  mortality  on  day  8  in  the  control.  G.  mellonella   mortality  was  >95%  for  all  nematode  species  and  24  ±  10%  for  the  control  on  day  5   (data  not  shown).  Bars  with  different  letters  indicate  statistical  difference  within   nematode  treatment  (ANOVA,  Tukey  HSD,  p  <  0.05).  NS  =  no  statistical  difference.         35   Results   Experiment  1a  –  black  soldier  fly  susceptibility  by  larval  stage   Black  soldier  fly  mortality  was  stage-­‐dependent  (F  =  20.994,  df  =  3,  p-­‐value  <   0.001)  and  there  was  an  interaction  between  nematode  species  and  black  soldier  fly   instar  (F  =  2.217,  df  =9,  p-­‐value  =  0.032).  Mortality  was  not  significantly  different   among  instars  when  infected  with  H.  bacteriophora  or  S.  feltiae  (Fig.  2-­‐1).  Second   instars  (92%  ±  5%  SEM)  and  74%  ±  11%  SEM  of  fourth  instars  were  killed  by  S.   carpocapsae,  which  was  significantly  more  than  fifth  and  sixth  instars,  13%  ±  8%   SEM  and  17%  ±  8%  SEM,  respectively  (Fig.  2-­‐1).  Of  the  larvae  treated  with  S.   riobrave,  71%  ±  8%  SEM  of  the  second  instars  and  69%  ±  12%  SEM  of  the  fourth   instars  died,  which  was  significantly  more  than  sixth  instars  (8%  ±  5%  SEM),  but  not   significantly  different  than  fifth  instars  (53%  ±  9%)  (Fig.  2-­‐1).  Second  instars  were   most  susceptible  to  S.  carpocapsae  (92%  ±  5%  SEM),  intermediate  susceptible  to  S.   feltiae  and  S.  riobrave  (57%  ±  15%  SEM  and  71%  ±  8%  SEM,  respectively),  and  less   susceptible  to  H.  bacteriophora  (28%  ±  10%  SEM).  Fourth  through  sixth  instar   susceptibility  did  not  vary  by  nematode  species.           36   Table  2-­‐1.  Mean  ±  SEM  adult  nematodes  recovered  from  four  black  soldier  fly   instars  (n=25  per  treatment  combination)  in  susceptibility  bioassay.  Infective   juveniles  (100)  applied  per  host  at  20°C.  None  of  the  negative  controls  were   infected.  Data  not  shown  for  G.  mellonella.  Amounts  with  different  letters  indicate   statistical  difference  within  nematode  treatment  (Kruskal-­‐Wallis,  p  <  0.05).  ns  =  no   statistical  difference.           37   Nematodes  were  only  recovered  from  a  few  black  soldier  fly  cadavers  (Table   2-­‐1).  No  H.  bacteriophora  nematodes  were  recovered  from  the  second  instars.   Nematodes  were  found  in  the  fourth  through  sixth  instars,  but  the  mean  was  four  or   less  nematodes  from  one  or  two  cadavers.  For  S.  carpocapsae,  an  average  of  six   nematodes  were  recovered  from  eight  second  instars,  which  was  significantly  more   than  the  two  nematodes  recovered  from  three  fourth-­‐instars  and  two  sixth-­‐instars.   No  S.  carpocapsae  nematodes  were  recovered  from  fifth  instars.  For  S.  feltiae,  only   one  nematode  was  recovered  from  three  second  instars,  two  nematodes  from  one   fourth  instar,  and  a  mean  of  1.7  nematodes  from  three  sixth  instars.  No  nematodes   were  found  in  the  fifth  instars.  A  mean  of  five  S.  riobrave  were  recovered  from  three   second  instars,  which  was  not  significantly  different  from  the  one  nematode  in  one   fourth  instar  and  one  nematode  each  in  two  fifth  instars.  No  nematodes  were   recovered  from  sixth  instars.  Heterorhabditis  bacteriophora  infected  56%  of  G.   mellonella,  S.  carpocapsae  infected  96%,  S.  feltiae  infected  48%,  and  S.  riobrave   infected  72%  of  the  G.  mellonella.  No  nematodes  were  recovered  from  the  untreated   controls.   Experiment  1b  –  black  soldier  fly  susceptibility  at  pupal  stage   Nematodes  were  not  recovered  from  any  pupae.  Pupae  (18%)  completed   metamorphosis  and  emerged  as  adults.           38   Figure  2-­‐2.  Survival  curves  for  injured  (dotted  line)  and  non-­‐injured  (solid  line)  fifth   instar  black  soldier  fly  for  each  nematode  species:  A)  H.  bacteriophora,  B)  S.   carpocapsae,  C)  S.  feltiae,  D)  S.  riobrave,  and  E)  control  (no  nematodes).  Infective   juveniles  (1000)  applied  per  host  at  25°C.  All  G.  mellonella  treated  with  nematodes   were  dead  on  day  2  and  only  5  G.  mellonella  died  in  the  control  treatment  (data  not   shown).  Asterisk  (*)  denotes  significant  difference  (p  <  0.05).  n.s.  =  not  statistically   different.         39   Experiment  2  –  effect  of  larval  injury  on  nematode  infection   Insect  mortality  was  significantly  affected  by  injury  treatment  and  nematode   species  (χ2  =  37.2,  df  =  1,  p  <  0.001,  χ2  =  443.8,  df  =  4,  p  <  0.001,  respectively).   Injuring  the  larvae  did  not  consistently  increase  infection  by  nematode  species  (χ2  =   113.2,  df  =  4,  p  <  0.001).  Injuring  the  black  soldier  fly  larvae  increased  the  mortality   rate  when  Steinernema  spp.  was  applied  but  not  H.  bacteriophora  (Fig.  2-­‐2).  For  H.   bacteriophora,  the  injured  larvae  did  not  die  any  faster  than  the  non-­‐injured  larvae   (Fig.  2-­‐2A)  (χ2  =  3.5,  df  =  1,  p  =  0.06).  On  day  5,  all  of  the  injured  larvae  and  all  but   one  non-­‐injured  larvae  were  dead  (Fig.  2-­‐2A).  For  S.  carpocapsae,  all  of  the  injured   larvae  were  dead  by  day  2  whereas  only  five  of  the  non-­‐injured  larvae  were  dead   (Fig.  2-­‐2B)  (χ2  =  78.6,  df  =  1,  p  <  0.001).  On  day  5,  32  of  the  non-­‐injured  larvae  were   dead  (Fig.  2-­‐2B).  A  similar  pattern  was  observed  for  S.  feltiae.  Only  one  injured  larva   was  still  alive  on  day  2  whereas  30  non-­‐injured  larvae  were  still  alive  (Fig.  2-­‐2C)  (χ2   =  65.4,  df  =  1,  p  <  0.001).  All  but  two  non-­‐injured  larvae  died  by  day  5  (Fig.  2C).  For   S.  riobrave,  31  injured  larvae  and  five  non-­‐injured  larvae  were  dead  on  day  2  and  40   injured  larvae  and  39  non-­‐injured  larvae  were  dead  on  day  5  (Fig.  2-­‐2D)  (χ2  =  38.3,   df  =  1,  p  <  0.001).  Only  two  injured  larvae  and  none  of  the  non-­‐injured  larvae  died   by  the  fifth  day  in  the  untreated  control  (Fig.  2-­‐2E)  (χ2  =  2,  df  =  1,  p  =  0.155).  All  of   the  G.  mellonella  treated  with  nematodes  were  dead  on  day  2,  and  only  five  G.   mellonella  died  in  the  untreated  control.         40   Figure  2-­‐3.  Percent  fifth  instar  black  soldier  fly  infected  with  entomopathogenic   nematodes  (n=40).  Infective  juveniles  (1000)  applied  per  host  at  25°C.  Asterisk  (*)   denotes  significant  difference  (p  <  0.05).           41     Figure  2-­‐4.  Mean  number  of  entomopathogenic  nematodes  (first  generation  adults   and  juveniles)  recovered  from  fifth  instar  black  soldier  fly  cadavers.  Data  not  shown   for  G.  mellonella.  Infective  juveniles  (1000)  applied  per  host  at  25°C.  Numbers   within  the  bars  indicate  number  of  infected  larvae  (max=40).  Asterisk  (*)  denotes   significant  difference  (P  <  0.05).         42   Injuring  the  larvae  significantly  increased  larval  infection  by  nematodes  from   84%  to  97%  (p  <  0.001)  (Fig.  2-­‐3).  Five  days  post  infection  6.3%,  1.3%,  8.8%,  and   84%  of  non-­‐injured  larvae  treated  with  nematodes  were:  alive,  alive  with   nematodes,  dead  without  nematodes,  and  dead  with  nematodes,  respectively.  Five   days  post  infection  3.1%  and  96.9%  of  injured  larvae  treated  with  nematodes  were:   dead  without  nematodes  or  dead  with  nematodes,  respectively.  Infection  rate  did   not  differ  by  nematode  species  (p  =  0.76).  The  interaction  term  was  not  significant   (p  =  0.14).     Neither  the  main  effects  of  injury  nor  nematode  species  were  significant  for   the  number  of  nematodes  found  in  the  infected  larvae  (F  =  1.12,  df  =  1,  p  =  0.29  and   F  =  1.95,  df  =  3,  p  =  0.12,  respectively),  however,  a  significant  interaction  was   detected  (F  =  5.47,  df  =  3,  p  =  0.001).  Injuring  the  larvae  increased  the  number  of   recovered  nematodes  only  for  S.  carpocapsae,  but  not  for  any  of  the  other  nematode   species  (p  =  0.047)  (Fig.  2-­‐4).  Blocking  was  significant  and  retained  in  the  model.   Not  all  of  the  G.  mellonella  were  dissected,  but  at  least  one  from  each  block  was   dissected  to  verify  nematode  infection.  All  of  the  G.  mellonella  that  were  treated  with   nematodes  were  infected.  None  of  the  dissected  G.  mellonella  from  the  negative   control  (n=13)  were  infected.         43     Figure  2-­‐5.  Survival  curves  for  injured  (dotted  line)  and  non-­‐injured  (solid  line)  fifth   instar  black  soldier  fly  before  nematode  application  for  each  nematode  species:  A)   H.  bacteriophora,  B)  S.  carpocapsae,  C)  S.  feltiae,  D)  S.  riobrave,  and  E)  control  (no   nematodes).  Infective  juveniles  (1000)  applied  per  host  at  25°C.  All  G.  mellonella   treated  with  nematodes  were  dead  on  day  2  and  none  died  in  the  control  treatment   (data  not  shown).  Asterisk  (*)  denotes  significant  difference  (p  <  0.05)  for  injury   treatments,  n.s.  =  not  statistically  different.  Plots  with  different  letters  are   significantly  different  (p  <  0.05).       44   Experiment  3  –  nematode  production   Injuring  the  fifth  instar  black  soldier  fly  in  this  experiment  showed  the  same   mortality  response  as  in  the  previous  experiment.  Injuring  the  black  soldier  fly  was   significant  (χ2  =  85.4,  df  =  3,  p-­‐value  <  0.001).  The  nematode  species  also  had  a   significant  effect  on  mortality  (χ2  =  493.2,  df  =  4,  p-­‐value  <  0.001).  The  two-­‐way   interaction  term  was  also  found  to  be  significant  (χ2  =  124.5,  df  =  12,  p-­‐value  <   0.001).     As  expected,  the  survival  rate  of  the  non-­‐injured  larvae  (42%,  95%  CI  [34%,   51%])  did  not  significantly  differ  from  the  larvae  injured  post-­‐infection  (38%,  95%   CI  [31%,  48%]).  Likewise,  the  larvae  injured  pre-­‐infection  (19%),  95%  CI  [13%,   28%])  did  not  survive  longer  than  the  larvae  injured  pre+post-­‐infection  (21%,  95%   CI  [15%,  29%]).  The  larvae  injured  pre-­‐infection  and  pre+post-­‐infection  died   significantly  sooner  than  the  larvae  not  injured  before  infection  (i.e.  post-­‐infection   and  non-­‐injured  larvae).  This  response  was  consistent  with  the  pre-­‐infection  injury   experiment  (Experiment  2).   For  the  negative  control,  only  2%  of  the  injured  and  2%  of  the  non-­‐injured   larvae  died  (Fig.  2-­‐5E).  This  is  significantly  different  from  all  of  the  nematode   treatments  (95%  CI  [95%,  100%]).  Only  4%  (95%  CI  [1.5%,  10.4%])  of  the  larvae   survived  when  treated  with  H.  bacteriophora  (Fig.  2-­‐5A)  and  injury  significantly   decreased  their  survival  (χ2  =  25,  df  =  1,  p-­‐value  <  0.001).  In  contrast,  19%  (95%  CI   [12.7%,  28.5%])  of  larvae  survived  when  treated  with  S.  carpocapsae,  significantly   more  than  those  treat  with  H.  bacteriophora  (Fig.  2-­‐5B).  Furthermore,  all  of  the   injured  larvae  treated  with  S.  carpocapsae  died  within  the  first  24  h,  while  only  one     45   non-­‐injured  larva  died  within  24  h.  By  day  5,  62%  of  the  non-­‐injured  larvae  treated   with  S.  carpocapsae  died,  significantly  fewer  than  the  injured  larvae  (χ2  =  95.1,  df  =   1,  p-­‐value  <  0.001).  Sixteen  percent  (95%  CI  [10.2%,  25.1%])  of  the  larvae  treated   with  S.  feltiae  survived  until  day  5  (Fig.  2-­‐5C).  This  is  not  significantly  different  from   H.  bacteriophora  or  S.  carpocapsae.  Within  the  first  48  h,  100%  of  the  injured  larvae   treated  with  S.  feltiae  died,  but  only  three  non-­‐injured  larvae  died.  By  day  5,  only   32%  of  the  non-­‐injured  larvae  treated  with  S.  feltiae  died,  significantly  fewer  than   the  injured  larvae  (χ2  =  96.4,  df  =  1,  p-­‐value  <  0.001)  (Fig.  2-­‐5C).  For  larvae  treated   with  S.  riobrave,  the  survival  rate  was  13%  (95%  CI  [7.8%,  21.6%]),  which  was  not   significantly  different  from  any  of  the  other  nematode  species  (Fig.  2-­‐5D).  On  day  2   only  24%  of  the  non-­‐injured  larvae  treated  with  S.  riobrave  died,  whereas  98%  of   the  injured  larvae  died.  Even  by  day  5,  only  76%  non-­‐injured  larvae  treated  with  S.   riobrave  died.  The  survival  curve  of  the  non-­‐injured  larvae  treated  with  S.  riobrave   was  significantly  different  from  the  injured  larvae  (χ2  =  67.9,  df  =  1,  p-­‐value  <  0.001)   (Fig.  2-­‐5).  As  expected,  100%  of  G.  mellonella  treated  with  nematodes  died  within  48   h  while  no  G.  mellonella  died  in  the  negative  control.     Galleria  mellonella  were  0.14  grams  heavier  than  black  soldier  fly  (F  =  637.2,   df  =  4,  p  <0.001).  The  mass  of  the  black  soldier  fly  was  not  different  among  injury   treatments.  The  mean  mass  of  black  soldier  fly  larvae  was  0.171  g  with  a  range  of   0.121  –  0.248  g.  The  mean  mass  of  G.  mellonella  was  0.311  g  with  a  range  of  0.262-­‐   0.401  g.           46     Figure  2-­‐6.  Mean  number  of  infective  juveniles  harvested  from  fifth  instar  black   soldier  fly  and  G.  mellonella.  no  =  non-­‐injured,  post  =  damaged  as  a  cadavers,  pre  =   larva  injured  before  nematode  application,  and  p+p  =  pre  and  post.  Bars  labeled   with  different  letters  are  significantly  different,  ANOVA,  Tukey  HSD,  α  =  0.05,  n.s.  =   not  significantly  different.           47   The  main  effect  of  host  injury  treatment  significantly  affected  the  amount  of   nematodes  that  were  harvested  (F  =  75.8,  df  =  4,  p  <0.001).  At  least  10  times  more   nematodes  were  produced  per  gram  of  G.  mellonella  than  black  soldier  fly  (p  <   0.001)  (Fig.  2-­‐6).  Injuring  fifth  instar  black  soldier  fly  post-­‐infection  but  not  pre-­‐ infection  greatly  increase  nematode  harvest.  The  post-­‐infection  injury  increased  the   nematode  harvest  by  a  factor  of  3.2  compared  to  no  injury  (p  =  0.048)  and  by  a   factor  of  2.7  compared  to  pre-­‐infection  injury  (p  =  0.058).  The  pre+post-­‐infection   injury  increase  nematode  harvest  by  a  factor  of  4.1  compared  to  no  injury  (p  =   0.011)  and  by  a  factor  of  3.5  compared  to  the  pre-­‐infection  injury  (p  =  0.011).  The   pre+post-­‐infection  injury  treatment  was  not  significantly  different  from  the  post-­‐ infection  injury  treatment  (p  =  0.99),  nor  was  the  pre-­‐infection  injury  treatment   different  from  no  injury  (p  =  0.99).   The  main  effect  of  nematode  species  was  significant  (F  =  6.5,  df  =  3,  p   <0.001).  More  H.  bacteriophora  juveniles  were  harvested  than  all  three  Steinernema   spp.  for  three  of  the  four  injury  treatments  (p  ≤  0.04)  (Fig.  2-­‐6).  None  of  the   Steinernema  spp.  were  significantly  different  from  each  other  (p  ≥  0.47).     The  two-­‐way  interaction  term  between  injury  treatment  and  nematode   species  was  significant  (F  =  9.2,  df  =  12,  p  <0.001).  The  amounts  of  nematodes  are   reported  in  infective  juveniles  per  gram  of  host.  The  harvested  nematodes  (<  30,000   per  gram  of  fifth  instar  black  soldier  fly)  from  the  no-­‐,  pre-­‐,  and  post-­‐infection  injury   treatments  did  not  differ  by  nematode  species  (Fig.  2-­‐6).  Heterorhabditis   bacteriophora  (91,084  ±  23,592)  and  59,585  ±  23,679  S.  carpocapsae  from  the   pre+post-­‐infection  injury  treatment  were  not  significantly  different  for  each  other     48   (p  =  1)(Fig.  2-­‐6).  They  were  significantly  greater  than  S.  feltiae  (68  ±  23)  and  S.   riobrave  (308  ±  224)  (p  <  0.001).  The  nematode  species  that  was  harvested  the  most   from  G.  mellonella  was  H.  bacteriophora  (941,884  ±  60,963).  This  was  significantly   different  from  S.  carpocapsae  (116,247  ±  41,167)  (p  <  0.001)  and  S.  feltiae  (137,666   ±  28,984)  (p  <  0.01),  but  not  S.  riobrave  (296,713  ±  42,467)  (p  =  0.88)  (Fig.  2-­‐6).   From  the  non-­‐injured  black  soldier  fly,  7,835  ±  5119  H.  bacteriophora  were   harvested.  Neither  the  pre-­‐infection  injury  nor  the  post-­‐infection  injury  treatments   significantly  altered  the  nematode  harvest  (1,948  ±  890  and  28,302  ±  16,848,   respectively)  (p  ≥  0.84)  (Fig.  2-­‐6).  The  pre+post-­‐infection  injury  treatment   significantly  increased  the  amount  of  harvested  nematodes  (91,084  ±  23,592)  over   the  single  injury  treatments  and  the  non-­‐injury  treatment    (p  ≤  0.023)  (Fig.  2-­‐6).   Galleria  mellonella  produced  180  times  more  H.  bacteriophora  than  any  of  the  black   soldier  fly  injury  treatments  (p  <  0.001)  (Fig.  2-­‐6).   There  were  116,247  ±  41,167  S.  carpocapsae  produced  on  G.  mellonella.  A   similar  amount  (59,585  ±  23,679)  of  nematodes  was  harvested  from  the  pre+post-­‐ infection  injury  treatment  to  the  black  soldier  fly  (p  =  0.99).  The  pre-­‐infection,  post-­‐ infection,  and  no  injury  treatments  are  not  significantly  different  from  each  other  (p   >  0.85),  but  they  all  were  significantly  less  than  the  pre+post-­‐infection  injury   treatment  (p  ≤  0.098)  (Fig.  2-­‐6).   Galleria  mellonella  produced  100  times  more  S.  feltiae  per  g  of  host  than  any   of  the  black  soldier  fly  injury  treatments  (p  <  0.001).  None  of  the  injury  treatments   increased  S.  feltiae  harvest.  (p  ≥  0.93)  (Fig.  2-­‐6).     49   The  smallest  number  of  S.  riobrave  were  harvested  from  the  pre+post-­‐ infection  injury  treatment  (308  ±  224).  This  was  not  significantly  different  from  the   pre-­‐infection  (411  ±  136)  or  no  injury  (658  ±  178)  treatments  (p  ≥  0.15),  but  it  was   significantly  less  than  the  post-­‐infection  injury  treatment  (10,706  ±  5,  897)  (p  =   0.022).  The  post-­‐infection  injury  treatment  was  not  significantly  greater  than  the   pre-­‐infection  or  the  no  injury  treatments  (p  ≥  0.73).  There  was  500  times  more  S.   riobrave  harvested  from  G.  mellonella  than  any  of  the  black  soldier  fly  injury   treatments  (p  <  0.001).     Discussion   The  primary  goal  of  this  research  project  was  to  assess  the  feasibility  of  using   black  soldier  fly  larvae  as  a  rearing  host  for  entomopathogenic  nematodes  and   whether  physical  modification  of  larvae  could  improve  host  quality.  The  appeal  of   using  black  soldier  fly  as  a  rearing  host  is  that  it  has  on-­‐farm  uses  —including   composting  and  livestock  feed  (Lardé  1990;  Newby  1997;  Newton  et  al.  1977;   Newton  et  al.  2005;  St-­‐Hilaire  et  al.  2007),  whereas  the  traditional  nematode  rearing   hosts  do  not.  The  major  conclusion  of  the  study  was  black  soldier  fly  were  not   susceptible  to  entomopathogenic  nematodes  (Fig.  2-­‐1).  Host  modification  improved   infection  rates,  but  it  did  not  sufficiently  improve  host  quality  to  use  this  insect  as  a   rearing  host.  While  this  project  did  not  develop  a  new  nematode  rearing  host,  it  did   raise  some  interesting  questions  regarding  the  biology  of  black  soldier  fly  and  the   foraging  strategies  of  entomopathogenic  nematodes.     Black  soldier  fly’s  tough  cuticle  may  prevent  entry  by  invading  infective   juveniles  as  well  as  egress  by  infective  juveniles  resulting  from  previous  infection.     50   Injuring  black  soldier  fly  larvae  before  nematode  application  increased  their   mortality  (Figs.  2-­‐2  and  2-­‐5)  and  infection  rates  (Fig.  2-­‐3).  Surprisingly,  these   increases  did  not  lead  to  increases  in  the  number  of  infective  juveniles  harvested   from  black  soldier  fly  larvae  exposed  to  Steinernema  spp.  (Fig.  2-­‐6).  Post-­‐infection   injury  of  black  soldier  fly  larvae  increased  the  amount  of  H.  bacteriophora  and  S.   carpocapsae  harvested  (Fig.  2-­‐6).  Thus,  compromising  the  black  solder  fly  larval   cuticle  varies  the  effect  of  entomopathogenic  nematode  reproduction  by  species.   Few  published  studies  have  reported  the  response  of  entomopathogenic   nematodes  to  injured  hosts.  In  a  study  with  pink  bollworm  Pectinophora  gossypiella   (Saunders)  (Lepidoptera:  Gelechiidae),  the  pupae  were  not  infected  by  S.   carpocapsae  unless  the  cuticle  was  punctured  (Lindegren  et  al.  1993;  Henneberry  et   al.  1995).  In  the  case  of  the  present  study,  injuring  the  black  soldier  fly  larvae  was   not  necessary  for  nematode  entry;  however,  it  greatly  increased  nematode  entry  for   S.  carpocapsae.     One  possible  explanation  for  why  host  injury  was  not  beneficial  to  H.   bacteriophora  (Figs.  2-­‐2  and  2-­‐5)  is  the  presence  of  a  dorsal  tooth  on  the  infective   juveniles  (Bedding  and  Molyneux  1982).  The  dorsal  tooth  aids  them  in  entering  a   host’s  hemocel  by  creating  an  entrance  hole  through  the  insect  integument  (Bedding   and  Molyneux  1982).  However,  Bedding  and  Molyneux  (1982)  also  photographed   that  multiple  nematodes  entered  the  same  hole.  This  is  a  bit  paradoxical  as  it   suggests  that  H.  bacteriophora  should  be  pre-­‐adapted  to  utilizing  wounds  as  entry   points.       51   Mortality  of  black  soldier  fly  was  stage-­‐dependent  with  the  earlier  instars   more  susceptible  than  later  instars  and  pupae  entirely  resistant  to  infection.  Other   researchers  have  reported  this  trend  in  a  variety  of  insects.  For  example,  100  day-­‐ old  Diaprepes  abbreviatus  (L.)  (Coleoptera:  Curculionidae)  larvae  were  less   susceptible  than  50-­‐day-­‐old  or  younger  larvae  to  infection  by  H.  bacteriophora,  H.   indica  Poinar  et  al.,  and  S.  riobrave  (Shapiro  et  al.  1999).  First  instar  fall  armyworm   Spodoptera  frugiperda  (J.  E.  Smith)  (Lepidoptera:  Noctuidae)  were  more  susceptible   than  later  instars  and  pupae  to  S.  carpocapsae  Mexican  strain  (Fuxa  et  al.  1988).   Larger  S.  littoralis  Boisduval  larvae  were  less  susceptible  than  smaller  larvae  to  S.   carpocapsae  All  and  Mexican  strain,  S.  glaseri  (Steiner),  and  H.  bacteriophora  HP88   strain  (Glazer  1992).  Third  instar  Liriomyza  trifolii  (Diptera:  Agromyzidae)  was  less   susceptible  to  S.  carpocapsae  than  second  instars  (LeBeck  et  al.  1993).     One  hypothesis  for  this  phenomenon  is  that  later  instars  have  a  more   developed  immune  system  (Kaya  1990).  Physical  evidence  of  an  immune  response   was  observed  in  some  of  the  black  soldier  fly  larvae  with  the  inside  of  the  larvae   taking  on  a  gray  appearance  —an  indication  of  activation  of  melatonin  to   encapsulate  the  nematode-­‐bacteria  complex  (Dunphy  and  Thurston  1990).  A  formal   conclusion  on  immune  response  would  require  a  more  detailed  study.     Dissections  of  infected  black  soldier  fly  larva  showed  that  10%  or  less  of  the   nematodes  applied  actually  entered  the  larvae  (Fig.  2-­‐4).  Other  authors  report   higher  rates  of  nematode  recovery  (40  to  45%)  from  G.  mellonella  (Fan  and   Hominick  1991;  Grewal  et  al.  1994a),  but  recovery  rates  are  rarely  reported  higher     52   than  45%.  Hominick  and  Reid  (1990)  suggested  a  “phased-­‐infectivity”  hypothesis  to   explain  this  phenomenon.     The  “Phased  Infectivity”  hypothesis  posits  that  some  infective  juveniles  have   an  innate  non-­‐infectious  period  and  delay  their  infectiousness  by  entering  a   dormant  period  (Campbell  et  al.  1999;  Hominick  and  Reid  1990).  An  alternative   hypothesis  for  phased  infectivity  is  that  nematodes  make  infection  decisions  based   on  measures  of  expected  host  quality.  Campbell  et  al.  (1999)  provide  evidence   against  the  phase-­‐infective  hypothesis  for  S.  carpocapsae,  S.  feltiae,  and  S.  glaseri  and   instead  conclude  that  perceived  phase-­‐infectivity  is  a  function  of  the  number  of   hosts  presented  to  a  given  population  of  infective  juveniles.  In  contrast,  the  same   experiment  provides  support  for  the  phase  infectivity  hypothesis  for  H.   bacteriophora.  In  the  present  study  more  S.  carpocapsae  and  S.  feltiae  juveniles   infected  the  more  susceptible  host.  Steinernema  carpocapsae  (20%,  11%,  and  5%)   and  16%,  9%,  and  6%  of  S.  feltiae  infected  G.  mellonella,  injured  and  non-­‐injured   black  soldier  fly,  respectively  (Fig.  2-­‐4).  Likewise,  29%,  7.5%,  and  10%  of  the  H.   bacteriophora  responded  to  G.  mellonella,  injured  and  non-­‐injured  black  soldier  fly,   respectively  (Fig.  2-­‐4).  Since  fewer  juveniles  responded  to  the  black  soldier  fly  than   G.  mellonella,  this  suggests  that  S.  carpocapsae,  S.  feltiae,  and  H.  bacteriophora  may   be  waiting  for  a  more  suitable  host,  i.e.  infectiousness  is  host  dependent.  In  contrast,   similar  amounts  of  S.  riobrave  (11%,  9%,  and  9%)  infected  G.  mellonella,  injured  and   non-­‐injured  black  soldier  fly,  respectively.  Thus,  the  results  from  our  trial  further   support  Campbell  et  al.’s  conclusions  for  S.  carpocapsae  and  S.  feltiae  but  not  H.   bacteriophora  and  suggest  that  S.  riobrave  may  demonstrate  phase  infectivity.       53   Intraspecific  competition  may  explain  the  relatively  low  production  of  the   Steinernematids  on  G.  mellonella  (Fig.  2-­‐6).  Selvan  et  al.  (1993)  demonstrated  that   nematode  production  increases  as  the  number  of  founding  nematode  increases  up   to  about  100  nematodes  per  host,  after  which  production  falls  more  severely  for  S.   carpocapsae  than  H.  bacteriophora.  In  vivo  production  of  S.  carpocapsae  and  H.   bacteriophora  on  G.  mellonella  is  approximately  200,000  infective  juveniles  per  host   (Dutky  et  al.  1964;  Flanders  et  al.  1996;  Selvan  et  al.  1993).  In  the  present  study,   942,000  H.  bacteriophora  and  only  116,000  S.  carpocapsae  infective  juveniles  per   gram  of  host  were  produced  in  G.  mellonella  (Fig.  2-­‐6).  These  results  may  indicate   that  S.  carpocapsae  and  the  two  other  Steinernema  spp.  are  more  sensitive  to   intraspecific  competition  than  H.  bacteriophora.     In  conclusion,  through  the  life  history  in  the  soil,  black  soldier  fly  larvae  may   have  developed  morphological  –thick  cuticle  and  fewer  spiracles—and   immunological  adaptations  to  prevent  infection  from  entomopathogenic  nematodes.   Higher  mortality  of  the  injured  black  soldier  fly  larvae  was  correlated  with   Steinernema  spp.,  but  not  H.  bacteriophora.  The  success  of  rearing  S.  carpocapsae  and   H.  bacteriophora  on  black  soldier  fly  larvae  can  be  increased  by  pre  and  post   infection  injury.  Steinernema  carpocapsae,  S.  feltiae,  and  H.  bacteriophora  may  be   better  at  searching  for  susceptible  hosts  than  S.  riobrave.             54   Chapter  3. Susceptibility  of  Dalotia  coriaria  (Kraatz)   (Coleoptera:  Staphylinidae)  to  entomopathogenic   nematodes.     Introduction   Dalotia  coriaria  (Kraatz)  (Coleoptera:  Staphylinidae)  and  entomopathogenic   nematodes  are  two  soil-­‐dwelling  biological  control  agents  used  to  manage  common   greenhouse  pests  including:  thrips,  fungus  gnats,  and  shore  flies.  The  use  of   biological  control  in  greenhouses  has  become  more  desirable  due  to  the   development  of  pesticide  resistance  in  pest  populations  (Shipp  et  al.  2007).  Growers   often  use  multiple  natural  enemies  to  achieve  economic  control  but  knowledge  of   interactions  among  natural  enemies  is  lacking.     Western  flower  thrips,  Frankliniella  occidentalis  (Pergande)  (Thysanoptera:   Thripidae)  is  a  major  pest  of  vegetable  production  and  floriculture  in  greenhouses   and  nurseries  (Jensen  2000;  Reitz  2009).  Due  to  their  cryptic  behaviors  (eggs  laid  in   plant  tissue,  pupation  occurs  in  the  soil,  and  feeding  on  developing  tissues)  and  their   resistance  to  many  insecticides,  biological  control  has  become  increasingly   important  to  successful  western  flower  thrips  management  programs  (Jensen  2000;   Reitz  2009;  Xu  et  al.  2006;  Manners  et  al.  2013).  Both  entomopathogenic  nematodes   and  D.  coriaria  are  employed  to  target  the  soil-­‐dwelling  stage  of  western  flower   thrips  (i.e.  prepupae  and  pupae).     Fungus  gnats  Bradysis  spp.  (Diptera:  Sciaridae)  are  also  major  pests  in   greenhouses.  Fungus  gnat  larvae  feed  on  many  plant  roots.  Nematodes  and  D.     55   coriaria  are  recommended  soil-­‐dwelling  biological  control  agents  to  target  this  pest.   Five  species  of  Heterorhabditis  and  four  species  of  Steinernema  have  been  tested  for   controlling  fungus  gnats  (Gouge  and  Hague  1995;  Harris  et  al.  1995;  Jagdale  et  al.   2007).  Steinernema  feltiae  is  often  the  leading  performer  in  controlling  fungus  gnats.   Both  larval  and  adult  D.  coriaria  feed  on  fungus  gnat  eggs  and  larvae  (Carney  et  al.   2002).   Dalotia  coriaria  is  a  small  (3-­‐4  mm),  highly  mobile,  soil-­‐dwelling  polyphagous   predator.  Larvae  are  a  pale  yellow  to  cream  color;  and  the  adults  are  a  glossy,  dark   color  (Miller  and  Williams  1983).  The  body  posture  of  the  adults  is  typically  S-­‐ shaped  with  their  heads  pointed  down  and  their  abdomens  upturned.  Both  the   larvae  and  adults  are  polyphagous  –  feeding  on  multiple  life  stages  of  mites  and   other  insects  (Miller  and  Williams  1983;  Carney  et  al.  2002;  Jandricic  et  al.  2006).     Adult  D.  coriaria  are  veracious  predators  and  have  been  shown  to  consume   as  many  as  95  second  instar  thrips,  78  thrips  pupae,  154  fungus  gnat  eggs,  or  150   first  instar  fungus  gnats  within  24  h  (Carney  et  al.  2002).  Third  instar  beetles  can   consume  an  equally  impressive  100  eggs  and  100  first  instar  fungus  gnats  in  a  24  h   period  (Carney  et  al.  2002).  In  a  laboratory  bioassay,  one  adult  rove  beetle  can   consume  68  –  78%  of  the  second  and  third  instar  fungus  gnats  presented  to  them  in   Petri  dishes  within  24  h  (Echegaray  Wilson  2012).   In  a  screened  greenhouse  trial  with  Impatiens  (L.)  (Ericales:  Balsaminaceae),   D.  coriaria  reduced  western  flower  thrips  populations  by  53  –  82%  (Bennison  et  al.   2008).  On  caged  Gerbera  jamesonii  (Bolus  ex  Hook)  (Asterales:  Asteraceae)  and   Chrysanthemums  spp.  (Asterales:  Asteraceae),  D.  coriaria  did  not  reduce  western     56   flower  thrips  populations  (Manners  et  al.  2013).  In  a  field  experiment  with  five  or   10  adult  rove  beetles  per  caged  parsley  Petroselinum  crispum  (Mill.)  Nyman  ex  A.  W.   Hill  (Apiales:  Apiaceae)  pot,  there  were  75%  and  85%  fewer  fungus  gnat  adults  on   yellow  sticky  cards  compared  to  the  control  over  a  22  d  period  (Bennison  et  al.   2008).  In  a  follow-­‐up  experiment,  two  adult  rove  beetles  reduced  the  number  of   fungus  gnats  on  yellow  sticky  cards  by  48%  (Bennison  et  al.  2009).     Entomopathogenic  nematodes  in  the  families  Heterorhabditidae  and   Steinernematidae  are  soil-­‐dwelling  round  worms  that  are  obligate  parasites  of   insects.  Infective  juveniles  (IJ)  (or  dauer  larvae)  enter  insect  hosts  through  natural   openings  –  mouth,  anus,  and  spiracles.  Inside  the  insect  haemocoel,  the  juvenile   nematodes  release  their  symbiotic  bacteria  and  kill  the  host  within  24-­‐48  h.   Nematodes  complete  their  development  within  the  host,  proceeding  through  one  to   three  generations.  When  host  resources  are  depleted,  thousands  of  infective   juveniles  emerge  from  the  cadaver  in  search  of  a  new  host  (Kaya  and  Gaugler  1993).   Heterorhabditis  bacteriophora  Poinar  (Rhabditida:  Heterorhbditidae),  Steinernema   carpocapsae  (Weiser)  (Rhabditida:  Steinernematidae),  S.  feltiae  (Filipjev),  and  S.   riobrave  Cabanillas  et  al.  are  four  commonly  available  entomopathogenic   nematodes.   Heterorhabditis  bacteriophora,  S.  feltiae,  and  S.  carpocapsae  can  infect  >  50%   of  second  instar  thrips  and  prepupae  and  11%  -­‐  54.5%  of  the  pupae  (Ebssa  et  al.   2001).  Heterorhabditis  (12  strains)  and  16  strains  of  Steinernema  have  been   screened  for  infectivity  in  western  flower  thrips  in  several  laboratory  studies   (Chyzik  et  al.  1996;  Ebssa  et  al.  2001;  Premachandra  et  al.  2004;  Ebssa  et  al.  2004).     57   Thrips  mortality  ranged  from  0%  -­‐  75%.  Chyzik  et  al.  (1996)  found  that  H.   bacteriophora  HP88  was  the  most  effective  at  reducing  western  flower  thrips   populations  by  39%.  Ebssa  et  al.  (2001)  reported  >  50%  thrips  prepupae  mortality   for  several  nematode  strains.  They  chose  H.  bacteriophora  HK3,  S.  feltiae  Sylt,  and  S.   carpocapsae  DD136  as  the  strain  that  caused  the  highest  mortality  for  each  species.   Premachandra  et  al.  (2003)  chose  H.  bacteriophora  HK3  and  S.  feltiae  Nemaplus®  as   the  most  effective  nematodes.  Ebssa  et  al.  (2004)  identified  H.  indica  Poinar,   Karunakar  &  David  and  S.  bicornutum  Tallosi,  Peters  &  Ehlers  as  the  nematode   species  from  each  genus  for  causing  the  highest  western  flower  thrips  mortality.   Thus,  multiple  nematode  species  and  strains  in  both  genera  can  be  used  for  thrips   management.     Entomopathogenic  nematode  host  searching  strategy  is  generally  considered   to  be  on  a  continuum  from  cruiser  to  ambusher  (Kaya  and  Gaugler  1993;  Lewis  et  al.   2006).  Cruisers  such  as  H.  bacteriophora  move  through  the  soil  in  search  of  a  host   (Baweja  and  Sehgal  1997).  Ambushers  like  S.  carpocapsae,  perform  a  behavior   known  as  nictitating,  where  they  elevate  95%  of  their  body  and  wave  back  and   forth,  waiting  for  a  host  to  pass  by  (Campbell  and  Gaugler  1993).  Nematodes  such  as   S.  feltiae  and  S.  riobrave  are  intermediate  in  their  search  strategy  and  display  both   behaviors  (Grewal  et  al.  1994a).  Ambushers  are  often  applied  to  target  mobile  hosts   and  cruisers  are  often  applied  to  target  stationary  hosts.  Thus  it  is  possible  that,  D.   coriaria,  which  is  highly  mobile,  may  more  likely  be  infected  by  an  ambusher,  S.   carpocapsae,  than  the  cruiser,  H.  bacteriophora.     58   Dalotia  coriaria  and  entomopathogenic  nematodes  are  both  soil-­‐dwelling   organisms  used  as  biological  control  agents  to  manage  the  same  pests,  i.e.  wester   flower  thrips,  fungus  gnats,  and  shore  flies;  therefore,  both  could  be  applied  at  the   same  time  and  come  into  contact  with  each  other.  To  date  a  single  study  has  tested   the  compatibility  of  the  predatory  beetle  with  only  one  species  of  nematode,  S.   feltiae  (Jandricic  et  al.  2006).  Biological  control  companies  recommend  the  use  of  S.   feltiae  to  control  both  thrips  and  fungus  gnats;  however,  other  nematode  species   have  also  been  shown  to  be  effective  against  western  flower  thrips.  A  handful  of   laboratory  studies  screened  multiple  nematode  species  against  western  flower   thrips  and  found  that  nematode  species  such  as  H.  bacteriophora,  H.  indica,  and  S.   bicornutum  killed  similar  numbers  or  more  thrips  prepupae  than  S.  feltiae  (Chyzik   et  al.  1996;  Ebssa  et  al.  2004;  Ebssa  et  al.  2001;  Premachandra  et  al.  2004).  Jandricic   et  al.  (2006)  showed  that  S.  feltiae  is  capable  of  infecting  third  instar  D.  coriaria  in  a   laboratory  bioassay,  but  only  16%  of  the  mortality  confirmed  nematode  infection  at   the  highest  dose  –  50  infective  juveniles  (IJ)/cm2.  In  a  microcosm  bioassay,  100   IJ/cm2  caused  25%  mortality  of  third  instars  (Jandricic  et  al.  2006).  The  objective  of   this  study  was  to  determine  the  susceptibility  of  D.  coriaria  third  instars  and  adults   to  four  commonly  used  species  of  entomopathogenic  nematodes:  H.  bacteriophora,   S.  carpocapsae,  S.  feltiae,  and  S.  riobrave.   Methods  and  Materials   A  4x3x2  factorial  experiment  was  conducted  to  test  the  pathogenicity  of  four   nematode  species  –  H.  bacteriophora,  S.  carpocapsae,  S.  feltiae,  and  S.  riobrave  –  at   multiple  doses  –  one-­‐half,  one,  and  two  times  the  recommended  rate  of  application     59   (BeckerUnderwood  2013)–  for  two  life  stages  of  D.  coriaria  —third  instar  and  adult.   There  were  24  treatments  plus  two  controls  –  adult  and  third  instar  beetles  without   nematodes.   Insect  and  Nematode  Culture:     Laboratory  colonies  of  D.  coriaria  were  established  with  beetles  purchased   from  BioBest  (Leamington,  Ontario)  and  Syngenta  (Little  Clacton,  England).  Beetles   used  for  this  study  were  either  laboratory  reared  or  purchased  from  IPM   Laboratories  Inc.  (Locke,  New  York).  Laboratory  colonies  were  reared  in  two   different  plastic  containers.  One  plastic  container  type  was  a  9.4  L  capacity  from   Rubbermaid,  (High  Point,  NC).  Two  ventilation  holes  (dia  7.62  cm)  were  drilled  into   the  lid  and  covered  with  bridal  veil.  The  other  plastic  container  was  a  2.25  L   rectangle  box  from  Ziploc  (Racine,  WI).  Two  ventilation  holes  (dia  2.54  cm)  were   drilled  into  the  lid  and  covered  with  bridal  veil.  Both  containers  contained  grounded   coconut  husk  (coir)  (Canna  Continental,  Los  Angeles,  CA)  and  vermiculite  (Good   Earth  Horticulture,  Inc.  Lancaster,  NY)  (50:50  ratio)  as  a  substrate.  The  larger   container  held  6  L  of  substrate,  and  the  smaller  container  held  1  L  of  substrate.   Containers  were  kept  on  a  laboratory  bench  under  ambient  conditions  (22.0  ±  0.9   °C,  47.9  ±  18.4  %RH)  near  windows  and  subjected  to  the  natural  light  cycle.  Certified   organic  chicken  feed  (HiLo  Acres,  Portland  MI)  was  added  to  each  container  on  a   weekly  schedule  –  15  ml  to  the  smaller  and  30  ml  to  the  larger  containers.  Chicken   feed  was  mixed  into  the  media  and  water  was  added  as  needed  to  maintain   moisture  (Bennison  et  al.  2009;  Bennison  et  al.  2008).       60   Heterorhabditis  bacteriophora  Oswego  strain  was  obtained  from  a  laboratory   culture  (Anne  Nielsen,  Rutgers  Agriculture  Research  and  Extension  Center,   Bridgeton,  NJ).  Steinernema  carpocapsae  and  S.  feltiae  were  obtained  from   BeckerUnderwood  (Ames,  IA).  Steinernema  riobrave  355  strain  was  obtained  from   David  Shapiro-­‐Illan,  USDA-­‐ARS,  Byron,  GA.  The  four  nematode  species  were  reared   on  late  instar  Galleria  mellonella  (L.)  (Lepidoptera:  Pyralidae)  in  laboratory  colonies.   Five  G.  mellonella  were  placed  on  filter  paper  in  an  inverted  Petri  dish  and  infected   with  500  infective  juveniles  (IJ)  in  aqueous  solution  (Kaya  and  Stock  1997).   Infective  juveniles  were  harvested  using  a  White  trap  (White  1927)  and  stored  in   600  ml  tissue  culture  flasks  with  vented  cap  (Corning  Inc.,  Tewksbury,  MA)  in  the   dark,  under  ambient  laboratory  conditions.     Experimental  Methods:     The  test  arena  consisted  of  a  1.7  ml  microcentrifuge  tube  (Denville  Scientific   Inc.,  South  Plainfield,  NJ)  with  a  hole  (approx.  0.045  mm)  in  the  lid  to  allow  air   exchange  (Ramos-­‐Rodríguez  et  al.  2006).  A  piece  of  No.  1  Whatman  filter  paper  (dia   55  mm)  was  cut  into  eight  equal  radial  slices.  A  slice  was  inserted  into  each  tube  to   provide  a  substrate  for  nematodes  and  to  help  regulate  relative  humidity.  One  grain   of  organic  rolled  oats  was  also  added  to  each  tube  as  supplemental  food  for  the   beetles.  Infective  juveniles  were  applied  in  aqueous  solution  (50  μl)  to  the  filter   paper  and  one  beetle  was  added  per  tube  (Ramos-­‐Rodríguez  et  al.  2006).     The  recommended  rate  of  nematode  application  is  100  IJ/cm2  for  western   flower  thrips  management  (BeckerUnderwood  2013)  and  the  cap  of  the   microcentrifuge  tubes  used  in  the  experiment  were  approximately  1  cm2.  Thus,  one-­‐   61   half,  one,  and  two  times  the  recommended  rate  was  calculated  at  50,  100,  200   IJ/cm2.  Infective  juveniles  were  used  within  14  d  of  harvest  from  laboratory   colonies.   Experimental  timing  was  determined  by  beetle  availability.  From  June  to   August  2014,  two  to  four  replicates  were  set-­‐up  and  run  at  a  time,  until  20  replicates   were  completed.  Nematode  viability  was  assessed  for  each  run  by  infecting  G.   mellonella.  For  each  nematode  species,  eight  G.  mellonella  were  placed  in  an  inverted   9  cm  Petri  dish  with  160  infective  juveniles.  Arenas  and  Petri  dishes  were  placed  in   a  growth  chamber  set  at  24.4  ±  0.3  °C,  92.7  ±  15.2%  RH,  with  24  h  darkness.  Beetle   mortality  was  assessed  daily  for  4  d  and  on  the  fourth  day,  all  tubes  were  placed  in   the  freezer  (-­‐20°C).  Dead  beetles  were  later  dissected  to  check  for  the  presence  of   nematodes.   Statistical  Analysis     The  last  four  replicates  of  beetles  exposed  to  H.  bacteriophora  were  excluded   from  the  analysis  because  the  G.  mellonella  were  poorly  infected  (i.e.  <  88%   infection).  Three  replicates  each  of  adult  and  larval  beetles  in  the  control  were   excluded  from  the  analysis  since  holes  were  not  punctured  into  the  lid  of  the   microcentrifuge  tubes.  Lastly,  one  entire  block  was  excluded  from  analysis  since   nematodes  were  found  in  the  dead  beetles  in  the  control  treatments.     Survival  analysis  was  tested  with  Cox’s  proportional  hazard  function  using   PROC  PHREG  in  SAS  9.3  (SAS  Institute  Inc.  2008;  Therneau  2000).  Beetle  mortality   was  modeled  by  insect  stage,  nematode  species,  dose  rate,  and  interaction  terms.   Terms  with  a  p-­‐value  >  0.15  were  dropped  from  the  model.  A  logistic  regression  was     62   performed  using  the  R  statistical  language  (version  3.1.1,  R  Core  Team  2014)  to   compare  the  number  of  infected  beetles  per  treatment.  Beetle  infection  was   modeled  by  insect  stage,  nematode  species,  dose  rate,  and  interaction  terms.  The   step  function  was  used  to  select  a  reduced  model  based  on  the  lowest  AIC  value   (Table  3-­‐1).  Multiple  comparisons  of  the  slopes  were  conducted  using  the  contrast   package  (Kuhn  2013).         Table  3-­‐1.  Model  selection  based  on  AIC  values  using  the  step  function  in  R  3.1.1.             63   Results   Beetle  Mortality   Third  instar  D.  coriaria  are  approximately  three  times  more  susceptible  to   the  nematodes  than  the  adults  (χ2  =  77.54,  df  =  1,  p  <  0.001).  In  the  control,  there   was  17%  adult  beetle  mortality  and  43%  mortality  for  the  third  instars  (Fig.  3-­‐1).   The  main  effect  of  nematode  species  was  significant  (χ2  =  13.54,  df  =  4,  p  =  0.009).   The  dosage  rate  of  the  nematodes  was  not  significant  (χ2  =  5.16,  df  =  2,  p  =  0.076).   Mortality  for  D.  coriaria  adults  and  third  instars  treated  with  S.  feltiae  and  H.   bacteriophora  was  not  significantly  different  than  the  control  (χ2  =  0.03,  df  =  1,  p  =   0.873  and  χ2  =  2.084,  df  =  1,  p  =  0.149,  respectively)  (Fig.  3-­‐1).  Mortality  for  D.   coriaria  adults  (26%)  and  third  instars  (77%)  treated  with  S.  carpocapsae  was   significantly  higher  than  the  control  (Fig.  3-­‐1)  (χ2  =  6.24,  df  =  1,  p  =  0.013)  and  S.   feltiae  (χ2  =  7.06,  df  =  1,  p  =  0.008),  but  not  H.  bacteriophora  (χ2  =  1.22,  df  =  1,  p  =   0.269).  Mortality  for  D.  coriaria  adults  (34%)  and  third  instars  (77%)  treated  with  S.   riobrave  was  significantly  higher  than  the  control  (Fig.  3-­‐1)  (χ2  =  6.38,  df  =  1,  p  =   0.012)  and  S.  feltiae  (χ2  =  7.09,  df  =  1,  p  =  0.008),  but  not  significantly  different  than   H.  bacteriophora  (χ2  =  1.18,  df  =  1,  p  =  0.278)  or  S.  carpocapsae  (χ2  =  0.002,  df  =  1,  p  =   0.965).  None  of  the  interaction  terms  were  significant.     64     Figure  3-­‐1.  Percent  mortality  of  D.  coriaria  on  Day  4.  H.  bac  =  H.  bacteriophora,  S.   carp  =  S.  carpocapsae,  S.  felt  =  S.  feltiae,  S.  rio  =  S.  riobrave.  Bars  with  different  letters   are  significantly  different  (p  <  0.05).       65   Figure  3-­‐2.  Percent  dead  D.  coriaria  with  confirmed  nematodes.  H.  bac  =  H.   bacteriophora,  S.  carp  =  S.  carpocapsae,  S.  felt  =  S.  feltiae,  S.  rio  =  S.  riobrave.  Within   each  nematode  group,  bars  with  different  lowercase  letters  are  significantly   different  (p  <  0.05).  For  each  rate  across  nematode  species,  bars  with  different   uppercase  letters  are  significantly  different  (p  <  0.05).         66     Presence  of  nematodes  in  cadavers   Not  all  of  the  dead  beetles  contained  nematodes.  Even  though  third  instar   mortality  was  higher  in  the  presence  of  entomopathogenic  nematodes  than  adult   mortality,  a  similar  number  of  nematodes  were  recovered  from  both  third  instars   and  adults  (χ2  =  237,  df  =  197,  p  =  0.121).  The  main  effects  of  nematode  species  and   dose  were  significant  for  the  number  of  nematodes  recovered  from  adults  and  third   instars  (χ2  =  246,  df  =  200,  p  =  0.025  and  χ2  =  240,  df  =  198,  p  =  0.046,  respectively).   The  two-­‐way  interaction  term  for  nematodes  species  and  rate  was  also  significant   (χ2  =  223,  df  =  191,  p  =  0.028).  There  was  an  increasing  dosage  effect  for  S.  feltiae   and  H.  bacteriophora  but  not  S.  carpocapsae  and  S.  riobrave.  Nematodes  were   recovered  from  0%,  18%,  and  40%  of  the  adult  and  larval  beetles  that  died  after   being  treated  with  S.  feltiae  at  the  low,  intermediate,  and  high  rates,  respectively,   with  significantly  more  nematodes  recovered  at  the  high  rate  relative  to  the  low  rate   (t  =  2.13,  df  =  191,  p  =  0.034)  (Fig.  3-­‐2).  For  H.  bacteriophora,  nematodes  were  found   in  7%,  8%,  and  47%  of  the  dead  adult  and  larval  beetles  treated  at  the  low,   intermediate,  and  high  rates,  respectively,  with  significantly  more  nematodes   recovered  from  the  high  rate  relative  to  the  low  and  intermediate  rates  (t  =  2.13,  df   =  191,  p  =  0.034  and  t  =  1.98,  df  =  191,  p  =  0.049,  respectively)  (Fig.  3-­‐2).  For  the  S.   carpocapsae  treatment,  nematodes  were  found  in  39%,  41%,  and  36%  of  the  dead   adult  and  larval  beetles  treated  at  the  low,  intermediate,  and  high  rates,   respectively,  without  any  significant  differences  between  rates  (Fig.  3-­‐2).  For  the  S.   riobrave  treatment,  nematodes  were  found  in  42%,  31%,  and  48%  of  the  dead  adult     67   and  larval  beetles  treated  at  the  low,  intermediate,  and  high  rates,  respectively,   without  any  significant  differences  between  rates  (Fig.  3-­‐2).   Discussion   Entomopathogenic  nematodes  and  D.  coriaria  are  soil-­‐dwelling  biological   control  organisms  that  could  come  into  contact  with  each  other,  especially  when   used  as  augmentative  biological  control  tactics.  A  previous  study  tested  the   laboratory  susceptibility  of  D.  coriaria  to  only  one  nematode,  S.  feltiae,  and   concluded  that  third  instar  mortality  is  dose  dependent  but  not  adult  beetle   mortality  (Jandricic  et  al.  2006).  The  four  nematode  species  tested  in  the  present   study  were  able  to  infect  third  instar  and  adult  D.  coriaria  with  varying  success,  but   only  S.  carpocapsae  and  S.  riobrave  significantly  increased  mortality  (Fig.  3-­‐1).  Adult   beetles  were  less  susceptible  than  third  instars,  a  pattern  seen  in  other  beetle  hosts.   Dalotia  coriaria  adults  and  third  instars  were  less  susceptible  to  S.  feltiae  than  the   other  three  species.  Thus,  S.  feltiae  appears  to  be  a  good  candidate  to  use  with  D.   coriaria  in  biological  control  programs  of  greenhouse  pests.   In  their  laboratory  studies,  Jandricic  et  al.  (2006)  showed  that  adult  D.   coriaria  was  not  susceptible  to  S.  feltiae  but  third  instar  mortality  was  dose   dependent.  Mortality  at  the  highest  dose  rate  of  50  IJ/cm2  was  27%,  which  was   significantly  greater  than  the  two  lower  rates  and  control  (Jandricic  et  al.  2006).  In   contrast  the  present  study  did  not  show  a  dosage  effect  for  the  mortality.  This   inconsistency  may  be  due  to  the  higher  doses  tested.  In  Jandricic  et  al.  (2006),  third   instars  were  treated  with  12  IJ/cm2,  25  IJ/cm2,  and  50  IJ/cm2.  Whereas,  in  this     68   study,  the  doses  were  50  IJ/cm2,  100  IJ/cm2,  and  200  IJ/cm2  and  resulted  in  higher   mortality,  74%,  47%,  and  58%  for  each  dose  respectively.     Third  instars  were  two  to  four  times  more  likely  to  die  than  the  adults  (Fig.  3-­‐ 1).  For  both  phytophagous  and  predatory  beetles,  adults  are  typically  less   susceptible  to  nematode  infection,  but  not  always  (Doucet  et  al.  1999).  Adult  carrot   weevil  Listronotus  oregonensis  (LeConte)  (Coleoptera:  Curculionidae)  is  less   susceptible  to  H.  heliothidis  (Khan,  Brooks,  and  Hirschmann),  S.  bibionis  (Steiner),   and  S.  carpocapsae  DD-­‐136  than  third  instars  (Belair  and  Boivin  1985).  Adult  lesser   mealworm  Alphitobius  diaperinus  (Panzer)  (Coleoptera:  Tenebrionidae)  is  less   susceptible  to  S.  carpocapsae  DD-­‐136  than  late  instars,  but  not  H.  heliothidis  or  S.   glaseri  (Steiner)(Geden  et  al.  1985).  Larvae  of  the  confused  flour  beetle  Tribolium   confusum  du  Val  (Coleoptera:  Tenebrionidae)  are  generally  more  susceptible  to  S.   feltiae  than  the  adults  (Athanassiou  et  al.  2008).  Multiple  adult  predatory  beetles   including  Philonthus  sp.  (Coleoptera:  Staphylinidae)  were  less  susceptible  to  H.   bacteriophora  and  S.  carpocapsae  than  last  instars  (Georgis  et  al.  1991).  It  is  not   known  why  adults  are  generally  less  susceptible  than  larvae,  but  it  could  be  due  to   cuticle  thickness,  morphological  differences  in  body  openings,  or  behavior  (Georgis   et  al.  1991).   Insect  mortality  due  to  entomopathogenic  nematodes  is  correlated  with   behavior  and  morphology  of  both  the  host  and  nematode  (Campbell  and  Gaugler   1993;  Lewis  et  al.  1996).  Infective  juveniles  that  cruise  are  better  adopted  to  search   for  sedentary  hosts;  whereas,  ambushers  are  better  adopted  to  search  for  mobile   hosts  at  the  soil  surface.  Spiracles  smaller  than  infective  juvenile  body  width     69   (Henneberry  et  al.  1995)  or  fitted  with  sieve  plates  restrict  nematodes  entry   (Koppenhöfer  et  al.  2007).  In  the  present  study,  neither  search  strategy  nor  size   correlates  with  beetle  mortality.  Aspects  of  beetle  movement  behavior  could  explain   their  susceptibility  to  nematodes.     If  infective  juvenile  foraging  strategy  was  a  significant  factor  in  causing  D.   coriaria  mortality  then  there  would  be  higher  susceptibility  to  an  ambusher  than  a   cruiser  because  D.  coriaria  is  highly  mobile  in  both  the  larval  and  adult  stages.  Of  the   nematodes  assayed,  H.  bacteriophora  is  a  cruiser  and  is  more  effective  at  finding   sedentary  hosts  (Campbell  and  Gaugler  1993);  S.  carpocapsae  is  an  ambusher  and  is   more  effective  at  finding  a  mobile  hosts  (Campbell  and  Gaugler  1993).  Steinernema   feltiae  and  S.  riobrave  both  exhibit  an  intermediate  behavior  in  the  search   continuum  (Grewal  et  al.  1994a;  Millar  and  Barbercheck  2001).  The  observed   mortality  pattern  is  not  consistent  with  nematode  foraging  behavior.  Mortality   caused  by  the  ambusher  S.  carpocapsae  was  not  significantly  greater  than  the   mortality  from  the  cruiser  H.  bacteriophora  (Figs.  3-­‐1).  Mortality  from  S.  feltiae  and   S.  riobrave,  the  intermediates,  was  lower  than  cruiser  and  higher  than  the  ambusher,   respectively,  not  in  between  them.  Thus,  the  results  do  not  support  the  hypothesis   that  nematode  foraging  behavior  explains  D.  coriaria  susceptibility.  This  pattern   holds  for  both  the  mortality  data  and  frequency  of  nematode  establishment.   If  D.  coriaria  mortality  could  be  explained  by  the  size  of  the  infective  juvenile,   then  D.  coriaria  would  likely  be  more  susceptible  to  the  narrowest  nematodes.  The   observed  mortality  does  not  correlate  to  infective  juvenile  size.  The  infective   juvenile  with  the  greatest  width  is  S.  riobrave  at  28  microns  (Cabanillas  et  al.  1994).     70   With  a  mean  body  width  of  26  microns,  S.  feltiae  is  the  second  largest  infective   juvenile  (Poinar  1990).  Followed  by  S.  carpocapsae  at  25  microns  and  H.   bacteriophora  at  23  microns  (Poinar  1990).  Dalotia  coriaria  showed  higher   susceptibility  to  S.  riobrave  and  S.  carpocapsae  even  though  H.  bacteriophora  is  the   narrowest  nematode  (Figs.  3-­‐1).  Thus,  the  size  of  natural  openings  did  not  prevent   or  allow  certain  nematode  species  entry  into  the  host.  The  size  of  the  beetle   spiracles,  anal,  and  oral  openings  is  unknown.   Dalotia  coriaria  may  be  a  poor  host  due  to  its  relative  size  to  nematodes.   Nematodes  need  a  host  that  is  large  enough  to  provide  sufficient  resources  for   reproduction.  Dalotia  coriaria  is  only  3-­‐4  mm  long  and  provides  much  less   resources  than  G.  mellonella,  12-­‐20  mm  in  length.  From  the  perspective  of  the  beetle,   the  nematodes  are  likely  large  enough  –  14%  to  28%  the  size  of  the  beetle  –to  be   perceived.  Dalotia  coriaria  may  have  developed  behaviors  to  avoid  or  groom   nematodes  before  they  can  enter.     In  conclusion,  D.  coriaria  appears  to  be  most  likely  compatible  with   applications  of  S.  feltiae  and  H.  bacteriophora.  These  nematodes  did  not  cause   significantly  higher  morality  than  the  control,  and  established  in  <  20%  of  the   beetles  at  or  below  the  recommended  rate.  The  biological  control  organisms  S.   feltiae  and  D.  coriaria  could  be  applied  at  the  same  time  to  manage  greenhouse  pests   such  as  fungus  gnats  and  western  flower  thrips.  However,  this  laboratory  study  set-­‐ up  a  worse  case  scenario  for  the  potential  host;  a  homogeneous  habitat  with  limited   potential  refuges  from  foraging  nematodes.  The  two-­‐dimensional  piece  of  vertical   filter  paper  provided  a  simple  environment  for  the  infective  juveniles  to  search.     71   Since,  cruising  nematodes  can  find  hosts  more  effectively  in  a  three-­‐dimensional   space  than  a  two-­‐dimensional  space  (Grewal  et  al.  1994a),  these  results  should  be   confirmed  in  experiments  that  provide  or  approximate  field  conditions.             72   Chapter  4. Synthesis  and  Conclusions   My  thesis  research  project  had  two  major  objectives:  1.  Determine  whether   black  soldier  fly  Hermetia  illucens  (L.)  (Diptera:  Stratiomyidae)  could  be  used  in  an   entomopathogenic  nematode  rearing  system  and  2.  Determine  if  entomopathogenic   nematodes  are  compatible  with  Dalotia  coriaria  (Kraatz)  (Coleoptera:   Staphylinidae),  when  used  as  an  augmentative  natural  enemy  for  management  of   western  flower  Frankliniella  occidentalis  (Pergande)  (Thysanoptera:  Thripidae)  and   fungus  gnats  Bradysis  spp.  (Diptera:  Sciaridae).  In  addition  to  satisfying  my   objectives,  this  research  has  raised  some  interesting  and  important  questions  for   entomopathogenic  nematode  ecology  and  behavior.   Black  Soldier  Fly  as  a  Rearing  Host   My  research  demonstrated  that  black  soldier  fly  is  not  an  ideal  host  for   rearing  entomopathogenic  nematodes  (Rhabditida:  Steinernematidae  and   Heterorhabditidae)  due  to  low  susceptibility  to  infection  and  low  production   (Tourtois,  2014a).  While  modification  of  black  soldier  fly  by  puncturing  the   integument  did  increase  mortality,  nematode  entry,  and  nematode  production,  it  did   not  increase  nematode  production  to  a  level  comparable  to  that  observed  in  the   greater  wax  moth  larva  Galleria  mellonella  (L.)  (Lepidoptera:  Pyralidae).  Although   black  soldier  fly  larvae  were  not  found  to  be  a  suitable  alternative  host  for  rearing   entomopathogenic  nematodes,  some  interesting  new  questions  arose  from  this   study  about  host  entry  and  preference.  The  thick  cuticle,  few  spiracles,  and  robust   immune  system  are  likely  characteristics  of  black  soldier  fly  larvae  that  limit  the     73   success  of  entomopathogenic  nematode  entry  and  establishment.  The  presence  of  a   dorsal  tooth  on  the  infective  juveniles  of  H.  bacteriophora  may  determine  how  the   nematode  interacts  with  wounded  hosts.  Entomopathogenic  nematodes  given  the   choice  may  prefer  to  infect  more  suitable  hosts  than  black  soldier  fly.     Three  characteristics  of  black  soldier  fly  larvae  –  thick  cuticle,  few  spiracles,   and  robust  immune  system  –  may  make  them  a  less  suitable  host.  Like  all   stratiomyids,  black  soldier  fly  larvae  incorporate  calcium  carbonate  into  their   cuticle  making  the  cuticle  thick  and  tough  (Johannsen  1922).  Similar  to  most   dipteran  larvae,  black  soldier  fly  larvae  have  a  reduced  number  of  spiracles.  They   are  amphipnuestic  with  two  anterior  spiracles  on  the  prothorax  and  two  posterior   spiracles  inside  a  pocket  (Barros-­‐Cordeiro  et  al.  2014).  With  fewer  spiracles,  they   have  fewer  entry  sites  than  G.  mellonella,  which  is  a  caterpillar  with  18  spiracles.   Soil-­‐borne  pathogens  are  commonly  associated  with  soils  and  decaying  matter   (Baker  1968).  Black  soldier  flies  have  a  life  history  with  multiple  forms  of  decaying   organic  materials  and  may  have  developed  a  robust  immune  system  to  deal  with   these  conditions  (Choi  et  al.  2012;  Park  et  al.  2014).  Damaging  the  cuticle  is  one  way   to  overcome  the  physical  barrier  and  lack  of  spiracles  to  allow  nematode  entry.   Based  on  my  research,  injuring  the  black  soldier  fly  benefited  the  two  genera   of  entomopathogenic  nematodes,  Steinernema  and  Heterorhabditis,  in  different   ways.  Infective  juvenile  morphology  could  determine  how  they  enter  wounded   hosts.  The  lack  of  increased  mortality  for  the  injured  black  soldier  fly  suggests  that   Heterorhabditis  bacteriophora  Poinar  (Rhabditida:  Heterorhabditidae)  did  not  enter   through  the  punctured  wounds  or  at  the  very  least  did  not  directly  benefit  from  the     74   punctures.  Infective  juveniles  of  H.  bacteriophora  and  other  Heterorhabditis  spp.   have  a  dorsal  tooth  and  can  penetrate  directly  through  the  cuticle  into  the  hemocoel   (Bedding  and  Molyneux  1982;  Nguyen  et  al.  2006;  Nguyen  et  al.  2004;  Poinar  Jr  et  al.   1987).  Steinernema  carpocapsae  (Weiser)  (Rhabditida:  Steinernematidae),  S.  feltiae   (Filipjev)  and  S.  riobrave  Cabanillas,  Poinar  &  Raulston  caused  higher  mortality  of   the  injured  black  soldier  fly  larvae.  More  S.  carpocapsae  were  recovered  from  the   injured  larvae  than  the  non-­‐injured  larvae  suggesting  that  they  entered  through  the   wounds.  In  a  study  performed  by  Henneberry  et  al.  (1995),  S.  carpocapsae  entered   pink  bollworm  Pectinophora  gossypiella  (Saunders)  (Lepidoptera:  Gelechiidae)   pupae  through  artificial  wounds.  Most  Steinernema  spp.  are  not  equipped  with  a   dorsal  tooth.  The  presence  of  a  dorsal  tooth  may  determine  how  an  infective   juvenile  enters  a  wounded  host.  Steinernema  spp.  may  be  opportunists  that  take   advantage  of  wounds.     Given  the  fact  that  black  soldier  fly  appear  well  adapted  to  avoid  infection  by   entomopathogenic  nematodes  an  interesting  question  is:  “would  entomopathogenic   nematodes  even  try  infecting  black  soldier  fly  in  a  natural  setting?”  This  question   would  be  best  addressed  in  a  choice  trial  comparing  infective  juvenile  nematode   response  to  either  a  highly  susceptible  host  (e.g.  G.  mellonella)  or  black  soldier  fly   larvae.  Entomopathogenic  nematodes  respond  to  plant  root  and  host  volatiles   (Hiltpold  et  al.  2011;  Lewis  et  al.  1995)  but  whether  it  is  possible  for  them  to   determine  the  potential  susceptibility  of  a  host  from  a  distance  is  not  well   understood.  Most  current  work  on  nematode  foraging  has  focused  on  host  cues   (Grewal  et  al.  1994a;  Lewis  et  al.  1996;  Lewis  et  al.  1992)  but  how  this  affects  host     75   preference  is  another  aspect  of  entomopathogenic  nematode  ecology  that  has  not   been  well  researched.     Dalotia  coriaria  Susceptibility  to  Entomopathogenic  Nematodes   Dalotia  coriaria  vary  in  their  susceptibility  to  entomopathogenic  nematodes   by  species.  They  were  least  susceptible  to  S.  feltiae  and  H.  bacteriophora.  Neither   infective  juvenile  search  strategy  nor  size  correlated  with  beetle  susceptibility.  The   nematodes  accounted  for  <  35%  of  the  beetle  mortality.  Entomopathogenic   nematodes  may  have  an  evolutionary  history  to  avoid  relatively  smaller  hosts  since   they  provide  fewer  resources  for  reproduction.  Nematodes  were  recovered  from   45%  or  less  of  the  dead  beetles.  When  trying  to  enter  the  beetle  through  the  mouth,   the  mandibles  may  crush  and  damage  the  nematode  (Gaugler  and  Molloy  1981).  The   nematodes  may  survive  long  enough  to  deliver  the  bacteria  to  the  hemocoel  to  kill   the  host,  but  perish  soon  afterwards.  These  negative  intraguild  interactions  could  be   detrimental  to  augmentative  biological  control  programs  incorporating  these  two   organisms.  Confirming  the  laboratory  results  under  field  conditions  is  needed  to   provide  a  definitive  description  of  the  intraguild  interactions  between  D.  coriaria   and  entomopathogenic  nematodes.     Entomopathogenic  nematode  host  preference  as  it  relates  to  other  guild   members  would  be  valuable  information  when  managing  multiple  pests  (e.g.   western  flower  thrips  and  fungus  gnats)  in  greenhouses.  Steinernema  feltiae,  the   ideal  host  to  manage  fungus  gnats  (Gouge  and  Hague  1995;  Harris  et  al.  1995;   Jagdale  et  al.  2007)  may  prefer  to  infect  fungus  gnats  over  western  flower  thrips  and   a  second  nematodes  species  such  H.  bacteriophora  may  need  to  be  included  in  the     76   augmentative  biological  control  program.  Likewise,  when  employing  a  predator   such  as  D.  coriaria  to  manage  fungus  gnats  host  preference  could  be  pertinent.   Steinernema  feltiae  may  prefer  to  infect  the  predator  to  the  target  host,  fungus  gnats.     Conclusions   Black  soldier  fly  are  not  recommended  for  entomopathogenic  nematode   rearing  compared  to  the  highly  susceptible  host  G.  mellonella.  Wounding  the  black   soldier  fly  larvae  was  not  enough  to  overcome  reduced  nematode  production   relative  to  G.  mellonella.  The  thick  cuticle  and  few  spiracles  may  be  physical   adaptations  of  the  black  soldier  fly  to  limit  pathogen  entry.  Steinernema  carpocapsae   but  not  H.  bacteriophora  may  exploit  wounded  insects.  Dalotia  coriaria  is  likely   more  compatible  with  S.  feltiae  and  H.  bacteriophora,  than  S.  carpocapsae,  or  S.   riobrave.  Host  suitability  is  likely  predicated  by  host  preference.         77                       APPENDIX     78   APPENDIX     RECORD   O F   D EPOSITION   O F   V OUCHER   S PECIMENS     The  specimens  listed  below  have  been  deposited  in  the  named  museum  as  samples  of  those   species  or  other  taxa,  which  were  used  in  this  research.  Voucher  recognition  labels  bearing   the  voucher  number  have  been  attached  or  included  in  fluid  preserved  specimens.       Voucher  Number:  ________2014-­‐8_______       Author  and  Title  of  thesis:  Joseph  S.  Tourtois   On  entomopathogenic  nematodes  (Rhabditida:  Steinernematidae  and  Heterorhabditidae):   a  potential  rearing  host,  black  soldier  fly  Hermetia  illucens  (L.)  (Diptera:  Stratiomyidae)   and  compatibility  with  a  predatory  beetle,  Dalotia  coriaria  (Kraatz)  (Coleoptera:   Staphylinidae)     Museum(s)  where  deposited:   Albert  J.  Cook  Arthropod  Research  Collection,  Michigan  State  University  (MSU)     Specimens:     Family   Genus-­‐Species   Life  Stage     Quantity  Preservation     Staphylinidae   Dalotia  coriaria   adult   6   pointed     Staphylinidae   Dalotia  coriaria   adult   7   alcohol     Staphylinidae   Dalotia  coriaria   larva   7   alcohol     Pyralidae   Galleria  mellonella   larva   5   alcohol     Stratiomyidae   Hermetia  illucens   adult   8   pinned     Stratiomyidae   Hermetia  illucens   6th  instar   6   alcohol     Stratiomyidae   Hermetia  illucens   5th  instar   6   alcohol     Stratiomyidae   Hermetia  illucens   2nd  instar   10   alcohol           79   Family   Heterorhabditidae     Heterorhabditidae     Steinernematidae     Steinernematidae     Steinernematidae     Steinernematidae     Steinernematidae     Steinernematidae     Steinernematidae     Steinernematidae     Steinernematidae     Genus-­‐Species   Life  Stage     Quantity  Preservation   Heterorhabditis  bacteriophora   infective  juvenile   5   picture   Heterorhabditis  bacteriophora   adult   5   picture   Steinernema  carpocapsae   infective  juvenile   5   picture   Steinernema  carpocapsae   adult  female   5   picture   Steinernema  carpocapsae   adult  male   5   picture   Steinernema  feltiae   infective  juvenile   5   picture   Steinernema  feltiae   adult  female   5   picture   Steinernema  feltiae   adult  male   5   picture   Steinernema  riobrave   infective  juvenile   5   picture   Steinernema  riobrave   adult  female   5   picture   Steinernema  riobrave   adult  male   5   picture     80                       BIBLIOGRAPHY         81   BIBLIOGRAPHY     Abbott  WS  (1925)  A  Method  of  Computing  the  Effectiveness  of  an  Insecticide.   Journal  of  Economic  Entomology  18:265–267.   Adams  BJ,  Fodor  A,  Koppenhöfer  HS,  et  al.  (2006)  Biodiversity  and  systematics  of   nematode–bacterium  entomopathogens.  Biological  Control  37:32–49.  doi:   10.1016/j.biocontrol.2005.11.008   Athanassiou  CG,  Palyvos  NE,  Kakouli-­‐Duarte  T  (2008)  Insecticidal  effect  of   Steinernema  feltiae  (Filipjev)  (Nematoda:  Steinernematidae)  against   Tribolium  confusum  du  Val  (Coleoptera:  Tenebrionidae)  and  Ephestia   kuehniella  (Zeller)  (Lepidoptera:  Pyralidae)  in  stored  wheat.  Journal  of   Stored  Products  Research  44:52–57.  doi:  10.1016/j.jspr.2007.04.002   Bailey  AS,  Bertaglia  M,  Fraser  IM,  et  al.  (2009)  Integrated  pest  management   portfolios  in  UK  arable  farming:  results  of  a  farmer  survey.  Pest  management   science  65:1030–1039.   Baker  R  (1968)  Mechanisms  of  Biological  Control  of  Soil-­‐Borne  Pathogens.  Annual   Review  of  Phytopathology  6:263–294.  doi:   10.1146/annurev.py.06.090168.001403   Barbercheck  ME  (2004)  Entomopathogenic  nematodes  in  biological  control.     Barbosa  P  (1998)  Conservation  Biological  Control.  Academic  Press,  San  Diego   Barros-­‐Cordeiro  KB,  Bao  SN,  Pujol-­‐Luz  JR  (2014)  Intra-­‐Puparial  Development  of  the   Black  Soldier-­‐fly,  Hermetia  illucens.  J  Insect  Sci.  doi:  10.1673/031.014.83   Baweja  V,  Sehgal  SS  (1997)  Potential  of  Heterorhabditis  bacteriophora  Poinar   (Nematoda,  Heterorhabditidae)  in  parasitizing  Spodoptera  litura  Fabricius  in   response  to  malathion  treatment.  Acta  Parasitoligica  42:168–172.   BeckerUnderwood  (2013)  Nemasys®  Advanced  Biocontrol  for  Fungus  Gnats  and   Western  Flower  thrips  in  Greenhouse  Growing  Operations.     Bedding  RA  (1981)  Low  Cost  in  Vitro  Mass  Production  of  Neoaplectana  and   Heterorhabditis  Species  (Nematoda)  for  Field  Control  of  Insect  Pests.   Nematologica  27:109–114.  doi:  10.1163/187529281X00115   Bedding  RA,  Molyneux  AS  (1982)  Penetration  of  Insect  Cuticle  By  Infective  Juveniles   of  Heterorhabditis  Spp.  (Heterorhabditidae:  Nematoda).  Nematologica   28:354–359.  doi:  10.1163/187529282X00402     82   Belair  G,  Boivin  G  (1985)  Susceptibility  of  the  Carrot  Weevil  (Coleoptera:   Curculinidae)  to  Steinernema  feltiae,  S.  bibionis,  and  Hetorhabditidis.  Journal   of  Nematology  17:pp.  363–366.   Bennison  J,  Croft  P,  Maher  H,  Maulden  K  (2009)  Protected  herbs,  ornamentals  and   celery:  development  of  an  on-­‐nursery  rearing  system  for  Atheta  coriaria  for   reduced  cost  biological  control  of  sciarid  and  shore  flies.     Bennison  J,  Maulden  K,  Maher  H,  Tomiczek  M  (2008)  Development  of  a  grower   rearing-­‐release  system  for  Atheta  coriaria,  for  low  cost  biological  control  of   ground-­‐dwelling  pest  life  stages.  IOBC/wprs  Bulletin  32:   Birken  EM,  Cloyd  RA  (2007)  Food  preference  of  the  rove  beetle,  Atheta  coriaria   Kraatz  (Coleoptera:  Staphylinidae)  under  laboratory  conditions.  Insect   Science  14:53–56.  doi:  10.1111/j.1744-­‐7917.2007.00125.x   Booth  DC,  Sheppard  C  (1984)  Oviposition  of  the  black  soldier  fly,  Hermetia  illucens   (Diptera:  Stratiomyidae):  eggs,  masses,  timing,  and  site  characteristics.   Environmental  entomology  13:421–423.   Bradley  GH  (1930)  Hermetia  illucens  L.  A  Pest  of  sanitary  Privies  in  Louisiana.   Journal  of  Economic  Entomology  23:1012–1013  pp.   Bradley  SW,  Sheppard  DC  (1984)  House  fly  oviposition  inhibition  by  larvae  of   Hermetia  illucens,  the  black  soldier  fly.  Journal  of  chemical  ecology  10:853– 859.   Cabanillas  HE,  Poinar  GO,  Raulston  JR  (1994)  Steinernema  riobravis  n.  sp.   (Rhabditida:  Steinernematidae)  from  Texas.  Fundamental  Applications  in   Nematology  17:pp.  123–131.   Caltagirone  LE  (1981)  Landmark  Examples  in  Classical  Biological  Control.  Annual   Review  of  Entomology  26:213–232.  doi:   10.1146/annurev.en.26.010181.001241   Campbell  JF,  Gaugler  R  (1993)  Nictation  Behavior  and  It’s  Ecological  Implications  in   the  Host  Search  Strategies  of  Entomopathogenic  Nematodes   (Heterorhabditidae  and  Steinernematidae).  Behavior  126:pp.  155–169.   Campbell  JF,  Koppenhofer  AM,  Kaya  HK,  Chinnasri  B  (1999)  Are  there  temporarily   non-­‐infectious  dauer  stages  in  entomopathogenic  nematode  populations:  a   test  of  the  phased  infectivity  hypothesis.  Parasitology  118:499–508.  doi:  null   Carney  VA,  Diamond  JC,  Murphy  GD,  Marshall  D  (2002)  The  potential  of  Atheta   coriaria  Kraatz  (Coleoptera:  Staphylinidae),  as  a  biological  control  agent  for   use  in  greenhouse  crops.  IOBC  WPRS  BULLETIN  25:37–40.     83   Choi  W-­‐H,  Yun  J-­‐H,  Chu  J-­‐P,  Chu  K-­‐B  (2012)  Antibacterial  effect  of  extracts  of   Hermetia  illucens  (Diptera:  Stratiomyidae)  larvae  against  Gram-­‐negative   bacteria.  Entomological  Research  42:219–226.  doi:  10.1111/j.1748-­‐ 5967.2012.00465.x   Chyzik  R,  Glazer  I,  Klein  M  (1996)  Virulence  and  efficacy  of  different   entomopathogenic  nematode  species  against  western  flower  thrips   (Frankliniella  occidentalis).  Phytoparasitica  24:103–110.   Ciche  TA,  Ensign  JC  (2003)  For  the  Insect  Pathogen  Photorhabdus  luminescens,   Which  End  of  a  Nematode  Is  Out?  Appl  Environ  Microbiol  69:1890–1897.  doi:   10.1128/AEM.69.4.1890-­‐1897.2003   Cloyd  RA,  Bethke  JA  (2011)  Impact  of  neonicotinoid  insecticides  on  natural  enemies   in  greenhouse  and  interiorscape  environments.  Pest  Management  Science   67:3–9.   Cloyd  RA,  Timmons  NR,  Goebel  JM,  Kemp  KE  (2009)  Effect  of  pesticides  on  adult   rove  beetle  Atheta  coriaria  (Coleoptera:  Staphylinidae)  survival  in  growing   medium.  Journal  of  economic  entomology  102:1750–1758.   Cock  MJ,  van  Lenteren  JC,  Brodeur  J,  et  al.  (2010)  Do  new  Access  and  Benefit  Sharing   procedures  under  the  Convention  on  Biological  Diversity  threaten  the  future   of  biological  control?  BioControl  55:199–218.   Collier  T,  Van  Steenwyk  R  (2004)  A  critical  evaluation  of  augmentative  biological   control.  Biological  Control  31:245–256.  doi:   10.1016/j.biocontrol.2004.05.001   Copello  A  (1926)  Biologia  de  Hermetia  illucens  Latr.  Rev  Soc  Entomol  Argentina   1:23–7.   Dillman  AR,  Chaston  JM,  Adams  BJ,  et  al.  (2012)  An  Entomopathogenic  Nematode  by   Any  Other  Name.  PLoS  Pathog.  doi:  10.1371/journal.ppat.1002527   Doucet  M,  Bertolotti  M,  giayetto  A,  Mirands  M  (1999)  Host  range,  Specificity,  and   Virulence  of  Steinernema  feltiae,  Steinernema  rarum,  and  Heterorhabditis   bacteriophora  (Steinernematidae  and  Heterorhabditidae)  from  Argentina.   Journal  of  Invertebrate  Pathology  73:pp.  237–242.   Dunphy  GB,  Thurston  GS  (1990)  Insect  Immunity.  Entomopathogenic  Nematodes  in   Biological  Control.  CRC  Press,  Inc.,  Boca  Raton,  Florida,  pp  301–326   Dutky  SR,  Hough  WS  (1955)  Note  on  a  Parasitic  Nematode  from  Codling  Moth   Larvae,  Carpocapsea  pomenella  (Lepidoptera,  Olethreutidae).  Proc  Ent  Soc   Wash  57:pp.  244.     84   Dutky  SR,  Thompson  JV,  Cantwell  GE  (1964)  A  Technique  for  the  Mass  Propagation   of  the  DD-­‐136  Nematode.  Journal  of  Insect  Pathology  6:417–422.   Ebssa  L,  Borgemeister  C,  Berndt  O,  Poehling  H-­‐M  (2001)  Efficacy  of   Entomopathogenic  Nematodes  against  Soil-­‐Dwelling  Life  Stages  of  Western   Flower  Thrips,  Frankliniella  occidentalis  (Thysanoptera:  Thripidae).  Journal   of  Invertebrate  Pathology  78:119–127.  doi:  10.1006/jipa.2001.5051   Ebssa  L,  Borgemeister  C,  Poehling  H-­‐M  (2004)  Effectiveness  of  different   species/strains  of  entomopathogenic  nematodes  for  control  of  western   flower  thrips  (Frankliniella  occidentalis)  at  various  concentrations,  host   densities,  and  temperatures.  Biological  Control  29:145–154.  doi:   10.1016/S1049-­‐9644(03)00132-­‐4   Echegaray  ER,  Cloyd  RA  (2013)  Life  History  Characteristics  of  the  Rove  Beetle,   Dalotia  coriaria  (Coleoptera:  Staphylinidae)  under  Laboratory  Conditions.   Journal  of  the  Kansas  Entomological  Society  86:145–154.   Echegaray  Wilson  ER  (2012)  Life  cycle  of  the  rove  beetle,  Atheta  coriaria   (Kraatz)(Coleoptera:  Staphylinidae)  and  suitability  as  a  biological  control   agent  against  the  fungus  gnat,  Bradysia  sp.  nr.  coprophila  (Lintner).  Kansas   State  University   Eilenberg  J,  Hajek  A,  Lomer  C  (2001)  Suggestions  for  unifying  the  terminology  in   biological  control.  BioControl  46:387–400.   Fan  X,  Hominick  WM  (1991)  Efficiency  of  the  Galleria  (wax  moth)  baiting  technique   for  recovering  infective  stages  of  entomopathogenic  rhabditids   (Steinernematidae  and  Heterorhabditidae)  from  sand  and  soil.  Revue   Nématol  14:381–387.   Flanders  KL,  MILLER  JM,  SHIELDS  EJ  (1996)  In  Vivo  Production  of  Heterorhabditis   bacteriophora  “Oswego”  (Rhabditida:  Heterorhabditidae),  a  Potential   Biological  Control  Agent  for  Soil-­‐Inhabiting  Insects  in  Temperate  Regions.   Journal  of  Economic  Entomology  89:373–380.   Furman  DP,  Young  RD,  Catts  EP  (1959)  Hermetia  illucens  (Linnaeus)  as  a  Factor  in   the  Natural  Control  of  Musca  domestica  Linnaeus.  Journal  of  Economic   Entomology  52:917–921.   Fuxa  JR,  Richter  AR,  Agudelo-­‐Silva  F  (1988)  Effect  of  Host  Age  and  Nematode  Strain   on  Susceptibility  of  Spodoptera  frugiperda  to  Steinernema  feltiae.  Journal  of   Nematology  20:pp.  91–95.   Gaugler  R,  Han  R  (2002)  Production  Technology.  Entomopathogenic  Nematology       85   Gaugler  R,  Molloy  D  (1981)  Instar  Susceptibility  of  Simulium  vittatum  (Diptera:   Simuliidae)  to  the  Entomogenous  nematode  Neoaplectana  carpocapsae.   Journal  of  Nematology  13:pp.  1–5.   Geden  CJ,  Axtell  RC,  Brooks  WM  (1985)  Susceptibility  of  the  lesser  mealworm,   Alphitobius  diaperinus  (Coleoptera:  Tenebrionidae)  to  the  entomogenous   nematodes  Steinernema  feltiae,  S.  glaseri  (Steinernematidae)  and   Heterorhabditis  heliothidis  (Heterorhabditidae).  J  Entomol  Sci  20:331–339.   Georgis  R,  Kaya  HK,  Gaugler  R  (1991)  Effect  of  Steinernematid  and  Heterorhabditid   Nematodes  (RhabditidaL  Steinernematidae  and  Heterorhabditidae)  on   Nontarget  Arthropods.  Environmental  Entomology  20:pp.  815–822.   Glaser  RW  (1932)  Studies  on  Neoaplectana  glaseri,  a  Nematode  Parasite  of  the   Japanese  Beetle  (Popillia  japonica).  NJ  Dept  of  Agric  No.  211:pp.  3–34.   Glaser  RW  (1940)  Continued  culture  of  a  nematode  parasitic  in  the  Japanese  beetle.   Journal  of  Experimental  Zoology  84:pp.  1–12.   Glaser  RW,  Farrell  CC,  Gowen  JW  (1935)  Field  Experiments  with  the  Japanese  Beetle   and  Its  Nematode  Parasite.  Journal  of  the  New  York  Entomological  Society   43:345–371.   Glazer  I  (1992)  Invasion  rate  as  a  measure  of  infectivity  of  steinernematid  and   heterorhabditid  nematodes  to  insects.  Journal  of  Invertebrate  Pathology   59:90–94.  doi:  10.1016/0022-­‐2011(92)90116-­‐L   Gouge  DH,  Hague  NGM  (1995)  Glasshouse  control  of  fungus  gnats,  Bradysia   paupera,  on  fuchsias  by  Steinernema  feltiae.  Fundamental  Applications  in   Nematology  18:pp.  77–80.   Grewal  PS,  Ehlers  R-­‐U,  Shapiro-­‐Ilan  DI  (2005)  Nematodes  as  Biocontrol  Agents.   CABI,  Cambridge,  MA   Grewal  PS,  Lewis  EE,  Gaugler  R,  Campbell  JF  (1994a)  Host  finding  behaviour  as  a   predictor  of  foraging  strategy  in  entomopathogenic  nematodes.  Parasitology   108:207–215.  doi:  10.1017/S003118200006830X   Grewal  PS,  Selvan  S,  Gaugler  R  (1994b)  Thermal  Adaptation  of  Entomopathogenic   Nematodes:  Niche  Breadth  for  Infection,  Establishment,  and  Reproduction.   Journal  of  Thermal  Biology  19:pp.  245–253.   Hajek  A  (2004)  Natural  Enemies:  An  Introduction  to  Biological  Control,  First.   Cambridge  University  Press   Han  R,  Ehlers  R-­‐U  (2000)  Pathogenicity,  Development,  and  Reproduction  of   Heterorhabditis  bacteriophora  and  Steinernema  carpocapsae  under  Axenic     86   in  Vivo  Conditions.  Journal  of  Invertebrate  Pathology  75:55–58.  doi:   10.1006/jipa.1999.4900   Harris  MA,  Oetting  RD,  Gardner  WA  (1995)  Use  of  Entomopathogenic  Nematodes   and  a  New  Monitoring  Technique  for  Control  of  Fungus  Gnats,  Bradysia   coprophila  (Diptera:  Sciaridae),  in  Floriculture.  Biological  Control  5:412–418.   doi:  10.1006/bcon.1995.1049   Hassan  SA,  Veire  MV  de  (2004)  Compatibility  of  Pesticides  with  Biological  Control   Agents.  Biocontrol  in  Protected  Culture.  Ball  Publishing,  Batavia,  Illinois,  pp   129–147   Heinz  KM,  Driesche  RG  van,  Parrella  MP  (2004)  Biocontrol  in  Protected  Culture.  Ball   Publishing,  Batavia,  Illinois   Henneberry  TJ,  Lindegren  JE,  Jech  LF,  Burke  RA  (1995)  Pink  Bollworm   (Lepidoptera:  Gelechiidae),  Cabbage  Looper,  and  Beet  Army  worm   (Lepidoptera:  Noctuidae)  Pupal  Susceptibility  to  Steinernematid  Nematodes   (Rhabditida:  Steinernematidae).  Journal  of  Economic  Entomology  88:835– 839.   Hiltpold  I,  Erb  M,  Robert  CA,  Turlings  TC  (2011)  Systemic  root  signalling  in  a   belowground,  volatile-­‐mediated  tritrophic  interaction.  Plant,  cell  &   environment  34:1267–1275.   Hogsette  JA  (1992)  New  diets  for  production  of  house  flies  and  stable  flies  (Diptera:   Muscidae)  in  the  laboratory.  Journal  of  economic  entomology  85:2291–2294.   Hominick  WM,  Reid  AP  (1990)  Perspectives  on  Entomopathogenic  Nematology.   Entomopathogenic  Nematodes  in  Biological  Control.  CRC  Press,  Inc.,  Boca   Raton,  pp  327–348   Jagdale  GB,  Casey  ML,  Cañas  L,  Grewal  PS  (2007)  Effect  of  entomopathogenic   nematode  species,  split  application  and  potting  medium  on  the  control  of  the   fungus  gnat,  Bradysia  difformis  (Diptera:  Sciaridae),  in  the  greenhouse  at   alternating  cold  and  warm  temperatures.  Biological  Control  43:23–30.   Jandricic  S,  Scott-­‐Dupree  CD,  Broadbent  AB,  et  al.  (2006)  Compatibility  of  Atheta   coriaria  with  other  biological  control  agents  and  reduced-­‐risk  insecticides   used  in  greenhouse  floriculture  integrated  pest  management  programs  for   fungus  gnats.  The  Canadian  Entomologist  138:712–722.   Jensen  SE  (2000)  Insecticide  resistance  in  the  western  flower  thrips,  Frankliniella   occidentalis.  Integrated  Pest  Management  Reviews  5:131–146.   Johannsen  OA  (1922)  Stratiomyiid  Larvæ  and  Puparia  of  the  North  Eastern  States.   Journal  of  the  New  York  Entomological  Society  30:141–153.     87   Kaya  HK,  Gaugler  R  (1993)  Entomopathogenic  Nematodes.  Annual  Review  of   Entomology  38:181–206.  doi:  10.1146/annurev.en.38.010193.001145   Kaya  HK,  Stock  SP  (1997)  Techniques  in  insect  nematology.  Manual  of  Techniques  in   Insect  Pathology  Chapter  6:pp.  281–324.   Kogan  M  (1998)  Integrated  Pest  Management:  Historical  Perspectives  and   Contemporary  Developments.  Annual  Review  of  Entomology  43:243–270.   doi:  10.1146/annurev.ento.43.1.243   Koppenhöfer  AM,  Grewal  PS,  Fuzy  EM  (2007)  Differences  in  penetration  routes  and   establishment  rates  of  four  entomopathogenic  nematode  species  into  four   white  grub  species.  Journal  of  Invertebrate  Pathology  94:184–195.  doi:   10.1016/j.jip.2006.10.005   Kuhn  M  (2013)  contrast:  A  collection  of  contrast  methods.     Lardé  G  (1990)  Recycling  of  coffee  pulp  by  Hermetia  illucens  (Diptera:   Stratiomyidae)  larvae.  Biological  Wastes  33:307–310.  doi:  10.1016/0269-­‐ 7483(90)90134-­‐E   Lazarovits  G,  Goettel  MS,  Vincent  C  (2007)  Adventures  in  Biocontrol.  Biological   Control:A  Global  Perspective:  Case  Studies  from  Around  the  World     LeBeck  LM,  Gaugler  R,  Kaya  HK,  et  al.  (1993)  Host  Stage  Suitability  of  the  Leafminer   Liriomyza  trifolii  (Diptera:  Agromyzidae)  to  the  Entomopathogenic   Nematode  Steinernema  carpocapsae  (Rhabditida:  Steinernematidae).  Journal   of  Invertebrate  Pathology  62:58–63.  doi:  10.1006/jipa.1993.1074   Van  Lenteren  JC  (2012)  The  state  of  commercial  augmentative  biological  control:   plenty  of  natural  enemies,  but  a  frustrating  lack  of  uptake.  BioControl  57:1– 20.  doi:  10.1007/s10526-­‐011-­‐9395-­‐1   Van  Lenteren  JC,  Woets  J  van  (1988)  Biological  and  integrated  pest  control  in   greenhouses.  Annual  review  of  Entomology  33:239–269.   Lewis  EE,  Campbell  J,  Griffin  C,  et  al.  (2006)  Behavioral  ecology  of   entomopathogenic  nematodes.  Biological  Control  38:66–79.  doi:   10.1016/j.biocontrol.2005.11.007   Lewis  EE,  Gaugler  R,  Harrison  R  (1992)  Entomopathogenic  Nematode  Host  Finding:   Response  to  Host  Contact  Cues  by  Cruise  and  Ambush  Foragers.  Parasitology   105:pp.  309–315.   Lewis  EE,  Ricci  M,  Gaugler  R  (1996)  Host  recognition  behaviour  predicts  host   suitability  in  the  entomopathogenic  nematode  Steinernema  carpocapsae     88   (Rhabditida:  Steinernematidae).  Parasitology  113:573–579.  doi:   10.1017/S0031182000067627   Lewis  E,  Grewal  P,  Gaugler  R  (1995)  Hierarchical  order  of  host  cues  in  parasite   foraging  strategies.  Parasitology  110:207–213.   Lindegren  JE,  Meyer  KF,  Henneberry  TJ,  et  al.  (1993)  Susceptibility  of  Pink  Bollworm   (Lepidoptera:  Gelechiidae)  Soil  Associated  Stages  to  the  Entomopathogenic   Nematode  Steinernema  carpocapsae  (Rhabditida:  Steinernematidae).   Southwestern  Entomologist  18:pp.  113–120.   Lindquist  RK,  Short  TL  (2004)  Effects  of  Greenhouse  Structure  and  Function  on   Biological  Control.  Biocontrol  in  Protected  Culture.  Ball  Publishing,  Batavia,   Illinois,  pp  37–54   Liu  Q-­‐Z,  Mráček  Z,  Zhang  L-­‐J,  et  al.  (2012)  Re-­‐description  of  Oscheius   chongmingensis  (Zhang  et  al.,  2008)  (Nematoda:  Rhabditidae)  and  its   entomopathogenicity.  Nematology  14:139–149.  doi:   10.1163/138855411X580777   Lord  WD,  Lee  Goff  M,  Adkins  TR,  Haskell  NH  (1994)  The  black  soldier  fly  Hermetia   illucens  (Diptera:  Stratiomyidae)  as  a  potential  measure  of  human   postmortem  interval:  observations  and  case  histories.  Journal  of  Forensic   Sciences  39:215–215.   Magnusson  E,  Cranfield  J  a.  L  (2005)  Consumer  Demand  for  Pesticide  Free  Food   Products  in  Canada:  A  Probit  Analysis.  Canadian  Journal  of  Agricultural   Economics/Revue  canadienne  d’agroeconomie  53:67–81.  doi:   10.1111/j.1744-­‐7976.2005.00354.x   Manners  AG,  Dembowski  BR,  Healey  MA  (2013)  Biological  control  of  western  flower   thrips,  Frankliniella  occidentalis  (Pergande)  (Thysanoptera:  Thripidae),  in   gerberas,  chrysanthemums  and  roses.  Australian  Journal  of  Entomology   52:246–258.  doi:  10.1111/aen.12020   Martens  EC,  Heungens  K,  Goodrich-­‐Blair  H  (2003)  Early  colonization  events  in  the   mutualistic  association  between  Steinernema  carpocapsae  nematodes  and   Xenorhabdus  nematophila  bacteria.  J  Bacteriol  185:3147–3154.   May  BM  (1961)  The  occurrence  in  New  Zealand  and  the  life-­‐history  of  the  soldier  fly   Hermetia  illucens  (L.)(Diptera:  Stratiomyidae).  NZ  J  Sci  4:55–65.   Millar  LC,  Barbercheck  ME  (2001)  Interaction  between  Endemic  and  Introduced   Entomopathogenic  Nematodes  in  Conventional-­‐Till  and  No-­‐Till  Corn.   Biological  Control  22:235–245.  doi:  10.1006/bcon.2001.0978     89   Miller  KV,  Williams  RN  (1983)  Biology  and  host  preference  of  Atheta  coriaria   (Coleoptera:  Staphylinidae),  an  egg  predator  of  Nitidulidae  and  Muscidae.   Annals  of  the  Entomological  Society  of  America  76:158–161.   Myers  HM,  Tomberlin  JK,  Lambert  BD,  Kattes  D  (2008)  Development  of  Black   Soldier  Fly  (Diptera:  Stratiomyidae)  Larvae  Fed  Dairy  Manure.   Environmental  Entomology  37:11–15.  doi:  10.1603/0046-­‐ 225X(2008)37[11:DOBSFD]2.0.CO;2   Newby  R  (1997)  Use  of  Soldier  Fly  Larvae  in  Organic  Waste  Management.     Newton  GL,  Booram  CV,  Barker  RW,  Hale  OM  (1977)  Dried  Hermetia  illucens  larvae   meal  as  a  supplement  for  swine.  Journal  of  Animal  Science  44:395–400.   Newton  L,  Sheppard  C,  Watson  DW,  et  al.  (2005)  Using  the  black  soldier  fly,   Hermetia  illucens,  as  a  value-­‐added  tool  for  the  management  of  swine   manure.  Animal  and  Poultry  Waste  Management  Center,  North  Carolina  State   University,  Raleigh,  NC  17.   Nguyen  KB,  Sharpiro-­‐Ilan  DI,  Stuart  RJ,  et  al.  (2004)  Heterorhabditis  mexicana  n.   sp.(Rhabditida:  Heterorhabditidae)  from  Tamaulipas,  Mexico,  and   morphological  studies  of  the  bursa  ofHeterorhabditis  spp.  Nematology   6:231–244.   Nguyen  KB,  Ugur  Gozel,  Heather  S.  Koppenhofer  (2006)  Heterorhabditis  floridensis   n.  sp.(Rhabditida:  Heterorhabditidae)  from  Florida.  Zootaxa  1177:1–19.   Park  S-­‐I,  Chang  BS,  Yoe  SM  (2014)  Detection  of  antimicrobial  substances  from  larvae   of  the  black  soldier  fly,  Hermetia  illucens  (Diptera:  Stratiomyidae).   Entomological  Research  44:58–64.  doi:  10.1111/1748-­‐5967.12050   Pochubay  EA,  Grieshop  MJ  (2012)  Intraguild  predation  of  Neoseiulus  cucumeris  by   Stratiolaelaps  miles  and  Atheta  coriaria  in  greenhouse  open  rearing  systems.   Biological  Control  63:195–200.  doi:  10.1016/j.biocontrol.2012.08.003   Poinar  GO  (1975a)  Description  and  Biology  of  a  New  Insect  Parasitic  Rhabditoid,   Heterorhabditis  Bacteriophora  N.  Gen.,  N.  Sp.  (Rhabditida;  Heterorhabditidae   N.  Fam.).  Nematologica  21:463–470.  doi:  10.1163/187529275X00239   Poinar  GO  (1975b)  Description  and  Biology  of  a  New  Insect  Parasitic  Rhabditoid,   Heterorhabditis  Bacteriophora  N.  Gen.,  N.  Sp.  (Rhabditida;  Heterorhabditidae   N.  Fam.).  Nematologica  21:463–470.  doi:  10.1163/187529275X00239   Poinar  GO  (1990)  Taxonomy  and  Biology  of  Steinernematidae  and   Heterorhabditidae.  Entomopathogenic  Nematodes  in  Biological  Control.  CRC   Press,  Inc.,  Boca  Raton,  pp  23–62     90   Poinar  GO  (1967)  Description  and  Taxonomic  Position  of  the  DD-­‐136  Nematode   (Steinernematidae,  Rhabdtioidea)  and  Its  Relationship  to  Neoaplectana   carpocapsae  Weiser.  Pro  Helminth  Soc  of  Wash  34:pp.  199–209.   Poinar  GO  (1966)  The  presence  of  Achromobacter  nematophilus  in  the  infective   stage  of  a  Neoaplectana  sp.  (Steinernematidae:  Nematoda).  Nematologica   12:pp.  105–108.   Poinar  GO,  Grewal  PS  (2012)  History  of  Entomopathogenic  Nematology.  J  Nematol   44:153–161.   Poinar  Jr  GO,  Jackson  T,  Klein  M  (1987)  Heterorhabditis  megidis  sp.   n.(Heterorhabditidae:  Rhabditida),  parasitic  in  the  Japanese  beetle,  Popillia   japonica  (Scarabaeidae:  Coleoptera).  Proceedings  of  the  Helminthological   Society  of  Washington  54:53–59.   Polis  GA,  Myers  CA,  Holt  RD  (1989)  The  ecology  and  evolution  of  intraguild   predation:  potential  competitors  that  eat  each  other.  Annual  review  of   ecology  and  systematics  297–330.   Premachandra  WTSD,  Borgemeister  C,  Berndt  O,  et  al.  (2004)  Combined  releases  of   entomopathogenic  nematodes  and  the  predatory  mite  Hypoaspis  aculeifer  to   control  soil-­‐dwelling  stages  of  western  flower  thrips  Frankliniella   occidentalis.  Biocontrol  48:529–541.   Pujol-­‐Luz  JR,  Francez  PA  da  C,  Ururahy-­‐Rodrigues  A,  Constantino  R  (2008)  The   Black  Soldier-­‐fly,  Hermetia  illucens  (Diptera,  Stratiomyidae),  Used  to   Estimate  the  Postmortem  Interval  in  a  Case  in  Amapá  State,  Brazil*.  Journal   of  forensic  sciences  53:476–478.   Ramos-­‐Rodríguez  O,  Campbell  JF,  Ramaswamy  SB  (2006)  Pathogenicity  of  three   species  of  entomopathogenic  nematodes  to  some  major  stored-­‐product   insect  pests.  Journal  of  Stored  Products  Research  42:241–252.  doi:   10.1016/j.jspr.2004.08.004   R  Core  Team  (2014)  R:  A  language  and  environment  for  statistical  computing.  The  R   Foundation  for  Statisitical  Computing,  Vienna,  Austria   Reitz  SR  (2009)  Biology  and  Ecology  of  the  Western  Flower  Thrips  (Thysanoptera:   Thripidae):  The  Making  of  a  Pest.  Florida  Entomologist  92:7–13.  doi:   10.1653/024.092.0102   Rovesti  L,  Deseö  KV  (1990)  Compatibility  of  Chemical  Pesticides  With  the   Entomopathogenic  Nematodes,  Steinernema  Carpocapsae  Weiser  and  S.   Feltiae  Filipjev  (Nematoda:  Steinernematidae).  Nematologica  36:237–245.   doi:  10.1163/002925990X00202     91   Rovesti  L,  Deseo  KV  (1991)  Compatibility  of  Pesticides  with  the  Entomopathogenic   Nematode,  Heterorhabditis  heliothidis.  Nematologica  37:pp.  113–122.   Rovesti  L,  Heinzpeter  EW,  Tagliente  F,  Deseo  KV  (1988)  Compatibility  of  Pesticides   with  the  Entomopathogenic  Nematode  Heterorhabditis  bacteriophora  Poinar   (Nematoda:  Heterorhabditidae).  Nematologica  34:pp.  462–476.   SAS  Institute  Inc.  (2008)  SAS/STAT  9.2  User’s  Guide.  SAS  Institute  Inc.,  Cary,  NC,   USA   Selvan  S,  Campbell  JF,  Gaugler  R  (1993)  Density-­‐Dependent  Effects  on   Entomopathogenic  Nematodes  (Heterorhabditidae  and  Steinernematidae)   within  an  Insect  Host.  Journal  of  Invertebrate  Pathology  62:278–284.  doi:   10.1006/jipa.1993.1113   Shapiro  DI,  Cate  JR,  Pena  J,  et  al.  (1999)  Effects  of  Temperature  and  Host  Age  on   Suppression  of  Diaprepes  abbreviatus  (Coleoptera:  Curculionidae)  by   Entomopathogenic  Nematodes.  Journal  of  Economic  Entomology  92:1086– 1092.   Shapiro-­‐Ilan  DI,  Gaugler  R  (2002)  Production  technology  for  entomopathogenic   nematodes  and  their  bacterial  symbionts.  Journal  of  Industrial  Microbiology   and  Biotechnology  28:137–146.   Shapiro-­‐Ilan  DI,  Gaugler  R,  Tedders  WL,  et  al.  (2002a)  Optimization  of  inoculation   for  in  vivo  production  of  entomopathogenic  nematodes.  Journal  of   nematology  34:343.   Shapiro-­‐Ilan  DI,  Gouge  DW,  Koppenhöfer  AM  (2002b)  Factors  Affecting  Commercial   Success:  Case  Studies  in  Cotton,  Turf  and  Citrus.  Entomopathogenic   Nematology  333–355.   Shapiro-­‐Ilan  DI,  Han  R,  Dolinksi  C  (2012)  Entomopathogenic  Nematode  Production   and  Application  Technology.  J  Nematol  44:206–217.   Shapiro-­‐Ilan  DI,  Han  R,  Qiu  X  (2014)  Chapter  10  -­‐  Production  of  Entomopathogenic   Nematodes.  In:  Morales-­‐Ramos  JA,  Rojas  MG,  Shapiro-­‐Ilan  DI  (eds)  Mass   Production  of  Beneficial  Organisms.  Academic  Press,  San  Diego,  pp  321–355   Shapiro-­‐Ilan  D,  Rojas  MG,  Morales-­‐Ramos  JA,  et  al.  (2008)  Effects  of  host  nutrition   on  virulence  and  fitness  of  entomopathogenic  nematodes:  Lipid-­‐  and  protein-­‐ based  supplements  in  Tenebrio  molitor  diets.  J  Nematol  40:13–19.   Sheppard  C  (1983)  House  Fly  and  Lesser  Fly  Control  Utilizing  the  Black  Soldier  Fly   in  Manure  Management  Systems  for  Caged  Laying  Hens.  Environmental   Entomology  12:1439–1442.     92   Sheppard  DC,  Newton  GL,  Thompson  SA,  Savage  S  (1994)  A  value  added  manure   management  system  using  the  black  soldier  fly.  Bioresource  Technology   50:275–279.  doi:  10.1016/0960-­‐8524(94)90102-­‐3   Sheppard  DC,  Tomberlin  JK,  Joyce  JA,  et  al.  (2002)  Rearing  methods  for  the  black   soldier  fly  (Diptera:  Stratiomyidae).  Journal  of  medical  entomology  39:695– 698.   Shipp  L,  Elliott  D,  Gillespie  D,  Brodeur  J  (2007)  From  Chemical  to  Biological  Control   in  Canadian  Greenhouse  Crops.  Biological  Control:  A  Global  Perspective:  Case   Studies  from  Around  the  World.  CABI  Publishing,  Cambridge,  MA,  USA,  pp   118–127   Steiner  G  (1929)  Zoology-­‐Neoaplectana  glaseri,  n.g.,  n.  sp.  (Oxyuridae),  a  new  nemic   parasite  of  the  Japanese  beetle  (Popillia  japonica  Newm.).  Journal  of  the   Washington  Academy  of  Sciences  19:pp.  436–440.   St-­‐Hilaire  S,  Cranfill  K,  McGuire  MA,  et  al.  (2007)  Fish  Offal  Recycling  by  the  Black   Soldier  Fly  Produces  a  Foodstuff  High  in  Omega-­‐3  Fatty  Acids.  Journal  of  the   World  Aquaculture  Society  38:309–313.   Strauch  O,  Stoessel  S,  Ehlers  R-­‐U  (1994)  Culture  conditions  define  automictic  or   amphimictic  reproduction  in  entomopathogenic  rhabditid  nematodes  of  the   genus  Heterorhabditis.  Fundamental  and  Applied  Nematology  17:575–582.   Stuart  RJ,  Barbercheck  ME,  Grewal  PS,  et  al.  (2006)  Population  biology  of   entomopathogenic  nematodes:  Concepts,  issues,  and  models.  Biological   Control  38:80–102.  doi:  10.1016/j.biocontrol.2005.09.019   Therneau  TM  (2000)  Modeling  Survival  Data:  Extending  the  Cox  Model.  Springer   Science  &  Business  Media   Tomberlin  JK,  Adler  PH,  Myers  HM  (2009)  Development  of  the  black  soldier  fly   (Diptera:  Stratiomyidae)  in  relation  to  temperature.  Environmental   entomology  38:930–934.   Tomberlin  JK,  Sheppard  DC,  Joyce  JA  (2002)  Selected  life-­‐history  traits  of  black   soldier  flies  (Diptera:  Stratiomyidae)  reared  on  three  artificial  diets.  Annals   of  the  Entomological  Society  of  America  95:379–386.   Tomberlin  JK,  Sheppard  DC,  Joyce  JA  (2005)  Black  soldier  fly  (Diptera:   Stratiomyidae)  colonization  of  pig  carrion  in  South  Georgia.  J  Forensic  Sci   50:152–153.   Vincent  C,  Goettel  MS,  Lazarovits  G  (2007)  Biological  Control :  A  Global  Perspective :   Case  Studies  from  Around  the  World.  CABI  Publishing,  Wallingford,  Oxon,   GBR     93   Warner  KD,  Getz  C  (2008)  A  socio-­‐economic  analysis  of  the  North  American   commercial  natural  enemy  industry  and  implications  for  augmentative   biological  control.  Biological  control  45:1–10.   White  GF  (1927)  A  Method  for  Obtaining  Infective  Nematode  Larvae  from  Cultures.   Science  66:pp.  302–303.   Xu  X,  Borgemeister  C,  Poehling  H-­‐M  (2006)  Interactions  in  the  biological  control  of   western  flower  thrips  Frankliniella  occidentalis  (Pergande)  and  two-­‐spotted   spider  mite  Tetranychus  urticae  Koch  by  the  predatory  bug  Orius  insidiosus   Say  on  beans.  Biological  Control  36:57–64.  doi:   10.1016/j.biocontrol.2005.07.019   Ye  W,  Torres-­‐Barragan  A,  Cardoza  YJ  (2010)  Oscheius  carolinensis  n.  sp.(Nematoda:   Rhabditidae),  a  potential  entomopathogenic  nematode  from  vermicompost.   Nematology  12:121–135.   Zhang  KY,  Liu  XH,  Tan  J,  et  al.  (2012)  Heterorhabditidoides  rugaoensis  n.  sp.   (Rhabditida:  Rhabditidae),  a  Novel  Highly  Pathogenic  Entomopathogenic   Nematode  Member  of  Rhabditidae.  J  Nematol  44:348–360.   Zhao  G,  Wei  Liu,  John  M.  Brown,  Charles  O.  Knowles  (1995)  Insecticide  Resistance  in   Field  and  Laboratory  Strains  of  Western  Flower  Thrips  (Thysanoptera:   Thripidae).  Journal  of  Economic  Entomology  88:1164–1170.       94