‘ 3 ’ X w , v " ’ 4 ‘ 1 . ‘ I n b é é g , . . n ' w a “ 4 ? 3 / , h u h a ‘ l ‘ j f l x . A . ‘ v . . J , ( I - f - l ‘ } ; } - , , m u fi z ‘ d ’ v « 1 1 5 ; . » . r : 3 9 m é r q fl f fi l y ’ f ~ g ' J ' ‘ 1 * _ , a § " " | 7 . ‘ l " ” A . " k - 7 4 ~ " 0 % fi x ; é fi “ i u ‘ w i m f f ‘ 1 ‘ . w , u . ” a 1 . 1 ! , n g “ f i ‘ m x g ‘ w z fi N M ' 3 . " 3 L A . ‘ ~ V 1 7 4 J ‘ . l ' ~ 3 4 V f ' _ . t ‘ , " 4 u 7 1 5 ' , 4 ' , v i f “ ’ ) . { w u . . ‘ - u . m 1 $ 3 3 3 ! " “ < 3 \ : I " ‘ 5 5 } ~ r “ x ‘ d z $ : ‘ . fi j ~ . g g . Q i i fl o y ; “ 3 3 ; , ” f f - v " ’ X L . ‘ . x l n " J . . - . 7 9 ? f ' v * 5 ' 5 1 5 5 H p } 1 3 ' v . . r 5 . . N 4 . ‘ 4 . , r ' x 1 . » , 2 . 1 . : i ' p ‘ J a - r ' « m a g m a ; . . m , a ? “ , J ? 9 J " 1 ’ 3 . v 7 7 ' ‘ ' ' ‘ fi r fi . J ‘ , . 5 - " 3 7 3 , . L i p . x g i f g fi ' r ; . l ’ a ? ‘ ‘ , " I n : . - I “ 3 " ! ‘ 4 ‘ ’ , . 1 4 ¢ ! I . . A - " - 4 . : 4 4 m : \ H O W 6 7 ‘ M ' l l ‘ l l l l l l l l m m N u l l 1 « l \ L l ! ” A R V M l 3 1 2 9 3 0 0 6 0 E \ i \ ( ‘ ) \ l \ l 5 1 M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y T h i s i s t o c e r t i f y t h a t t h e d i s s e r t a t i o n e n t i t l e d F U N C T I O N A L A N D B I O C H E M I C A L A B N O R M A L I T I E S I N B A S S E T H O U N D H E R E D I T A R Y T H R O M B O P A T H Y p r e s e n t e d b y M a r y F r a n c e s M c C o n n e l l h a s b e e n a c c e p t e d t o w a r d s f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r P h o D o d e g r e e i n P a t h O l o g Y M a j o r p r o f e s s o r D a t e 1 1 — 0 3 — 8 9 M S U i s a n A f fi r m a t i w A c t i o n / E q u a l O p p o r t u n i t y I n s t i t u t i o n 0 - 1 2 7 7 1 L O _ P T ‘ _ A D C V _ A E O _ A N D _ I I T E R _ F E I _ T N D U E _ R _ S U N r e _ E B t u _ O r X n _ t n o _ o o _ D r e r _ A m b e _ T o f v o _ E t e r e . h o — D t o — n c e h - U o E e c m — o k . — t u — — f D r o — m — A y o — T u E r r e c o r d D U . E J _ # — - — - - . M S U t o A n A f fi r m a t i v e A c t i o n / E q u a l O p p o _ ; # _ _ _ F _ _ _ ’ t u n i t y I n s t i t u t i o n _ \ r H . _ I B R A R I E S ‘ \ M ] i ‘ l ‘ 5 0 5 1 6 F U N C T I O N A L A N D B I O C H E M I C A L A B N O R M A L I T I E S I N B A S S E T H O U N D H E R E D I T A R Y T H R O N B O P A T H Y V O L U M E I B y M a r y F r a n c e s M c C o n n e l l A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l f i l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y D e p a r t m e n t o f P a t h o l o g y ' \ ! J ‘ J Q J ( { Q r ‘ . d I l A ) ) A B S T R A C T F U N C T I O N A L A N D B I O C H E M I C A L A B N O R M A L I T I E S I N B A S S E T R O U N D H E R E D I T A R Y T H R O M B O P A T H Y B y M a r y F r a n c e s M c C o n n e l l B a s s e t h o u n d h e r e d i t a r y t h r o m b o p a t h y i s a n a u t o s o m a l r e c e s s i v e d e f e c t i n d o g s i n w h i c h t h e r e i s a t h r o m b a s t h e n i a - l i k e h e m o r r h a g i c d i a t h e s i s , b u t n o r m a l m e m b r a n e G P I I b - I I I a c o n t e n t a n d b i n d i n g o f 1 2 5 I - l a b e l l e d f i b r i n o g e n . I n t h i s s t u d y , t h e r e w a s n o r m a l s h a p e c h a n g e , b u t f a i l u r e o f p r i m a r y a g g r e g a t i o n i n r e s p o n s e t o A D P , P A P a n d A 2 3 1 8 7 . A f f e c t e d p l a t e l e t s a g g r e g a t e d i n r e s p o n s e t o t h r o m b i n , p h o r b o l e s t e r a n d d i t h i o t h r e i t o l . T h e r a t e o f t h r o m b i n - i n d u c e d a g g r e g a t i o n w a s v e r y s l o w a n d a g g r e g a t i o n w a s m o r e s e n s i t i v e t o i n h i b i t i o n b y a s p i r i n t h a n c o n t r o l p l a t e l e t s . I n t h e a b s e n c e o f p r i m a r y a g g r e g a t i o n , A D P i n d u c e d d e n s e g r a n u l e s e c r e t i o n w h i c h w a s m o r e r a p i d t h a n c o n t r o l p l a t e l e t s a n d s e n s i t i v e t o i n h i b i t i o n b y a s p i r i n . H i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f P A P a n d t h r o m b i n i n d u c e d s e c r e t i o n w h i c h w a s m o r e s e n s i t i v e t h a n c o n t r o l p l a t e l e t s t o i n h i b i t i o n b y a s p i r i n . A 2 3 1 8 7 a n d l o w e r c o n c e n t r a t i o n s o f P A F d i d n o t i n d u c e s e c r e t i o n b y a f f e c t e d p l a t e l e t s . T h e 2 0 a n d 4 7 k D a p r o t e i n s w e r e p h o s p h o r y l a t e d i n a f f e c t e d p l a t e l e t s a c t i v a t e d b y P A F , A 2 3 1 8 7 , t h r o m b i n a n d P M A u n d e r n o n - a g g r e g a t i n g c o n d i t i o n s . T h e r e w a s a m a r k e d d e c r e a s e i n t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f a 6 5 k D a b a n d c o m p a r e d t o c o n t r o l p l a t e l e t s . T h e i d e n t i t y , f u n c t i o n a n d s i g n i f i c a n c e o f t h i s p r o t e i n i s n o t k n o w n , b u t m a y b e o f m a j o r i m p o r t a n c e i n t h e p a t h o g e n e s i s o f t h e d e f e c t . R e s t i n g T s z c o n c e n t r a t i o n s w e r e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r i n a f f e c t e d t h a n i n c o n t r o l p l a t e l e t r i c h p l a s m a . A g o n i s t s w h i c h i n d u c e d A T P r e l e a s e f r o m a f f e c t e d p l a t e l e t s a l s o i n d u c e d s i g n i f i c a n t l y g r e a t e r T s z p r o d u c t i o n f r o m a f f e c t e d p l a t e l e t s t h a n c o n t r o l s ( A D P , P A F , t h r o m b i n ) . W h e n s t i m u l a t e d b y a g o n i s t s w h i c h d i d n o t i n d u c e a g g r e g a t i o n o r A T P s e c r e t i o n , a f f e c t e d p l a t e l e t s p r o d u c e d n o T s z ( 0 . 1 p H P A F ) o r s i g n i f i c a n t l y l e s s T s z ( A 2 3 1 8 7 ) t h a n c o n t r o l p l a t e l e t s . W h e n a f f e c t e d p l a t e l e t s w e r e s t i m u l a t e d b y t h r o m b i n , a g g r e g a t i o n w a s a s s o c i a t e d w i t h T s z p r o d u c t i o n a n d t h e e x t e n t o f a g g r e g a t i o n w a s p r o p o r t i o n a l t o t h e a m o u n t o f T s z p r o d u c e d . P r o d u c t i o n o f T s z i n r e s p o n s e t o a r a c h i d o n i c a c i d w a s s i m i l a r i n b o t h g r o u p s o f p l a t e l e t s . N e i t h e r g r o u p p r o d u c e d T s z i n r e s p o n s e t o s t i m u l a t i o n b y p h o r b o l e s t e r . T h e s e r e s u l t s d o n o t f i t a n y d e s c r i b e d g e n e t i c o r a c q u i r e d p l a t e l e t d e f e c t o r a n y s i t u a t i o n c r e a t e d i n v i t r o a n d c a n n o t b e e x p l a i n e d u s i n g c u r r e n t k n o w l e d g e o f p l a t e l e t f u n c t i o n . C o p y r i g h t b y M A R Y F R A N C E S M C C O N N E L L 1 9 8 9 A C K N O W L E D G E M E N T S I w i s h t o e x p r e s s m y a p p r e c i a t i o n a n d t h a n k s t o t h e m e m b e r s o f m y g r a d u a t e c o m m i t t e e , D r s . T h o m a s C . B e l l , D o u g l a s W . E s t r y , W i l l i a m L . S m i t h a n d J a n v e r D . K r e h b i e l , f o r t h e i r g u i d a n c e a n d s u p p o r t . I c a n n o t t h a n k m y h u s b a n d , P e t e r G r a y , e n o u g h f o r h i s s u p p o r t a n d t o l e r a n c e . I w o u l d a l s o l i k e t o t h a n k M r . a n d M r s . F r a n k a n d V i r g i n i a K o v a l i c o f “ S t o n y b l u f f B a s s e t s " f o r t h e i r c o - o p e r a t i o n a n d e n c o u r a g e m e n t . L a s t l y , I w o u l d l i k e t o a c k n o w l e d g e t h e e n d l e s s g o o d - w i l l a n d c o - o p e r a t i o n o f B e r t h a , B u s t e r , B u t t o n , H o m e r , K e W p i e , L a c e y , L i l l y , M a x , P e p p e r , P i p p i n , S p a r r o w , S q u i r e a n d S u g a r . W i t h o u t t h e m , t h e r e w o u l d h a v e b e e n n o p r o j e c t . T A B L E O F C O N T E N T S I N T R O D U C T I O N C H A P T E R 1 : L I T E R A T U R E R E V I E W M E G A K A R Y O P O I E S I S A N D P L A T E L E T P R O D U C T I O N . M e g a k a r y o p o i e s i s M e g a k a r y o c y t i c G r a n u l e s a n d O r g a n e l l e s P l a t e l e t F o r m a t i o n R e g u l a t i o n o f T h r o m b o p o i e s i s P L A T E L E T S T R U C T U R E A N D H E R I T A B L E D I S O R D E R S . T h e P l a t e l e t M e m b r a n e S y s t e m s . T h e P l a t e l e t S o l - g e l Z o n e . A c t i n a n d M y o s i n F i l a m e n t s . T h e M e m b r a n e S k e l e t o n T h e M i c r o t u b u l e C o i l . P r o t e i n s A s s o c i a t e d w i t h t h e C y t o s k e l e t o n T h e P l a t e l e t O r g a n e l l e Z o n e . P l a t e l e t E n e r g y M e t a b o l i s m . S e c r e t a b l e S t o r a g e G r a n u l e s T h e P e r i p h e r a l Z o n e . T h e S u b m e m b r a n o u s Z o n e . T h e U n i t M e m b r a n e T h e G l y c o c a l y x . v i 1 0 1 0 l l 1 2 1 3 1 4 1 5 2 0 2 0 2 1 2 6 2 6 2 7 2 8 P L A T E L E T M E M B R A N E G L Y C O P R O T E I N S A N D H E R I T A B L E D I S O R D E R S G l y c o p r o t e i n I b . G l y c o p r o t e i n I I b - I I I a . G l y c o p r o t e i n I a . G l y c o p r o t e i n s I V , I X , V , I c - I I a a n d G N P - 1 4 0 . T H E B A S I C P L A T E L E T R E S P O N S E A d h e s i o n S h a p e C h a n g e A g g r e g a t i o n . T h e R e l e a s e R e s p o n s e P l a t e l e t A g o n i s t s . S I G N A L T R A N S D U C T I O N M E C H A N I S M S . P h o s p h o i n o s i t i d e H y d r o l y s i s . G T P - b i n d i n g R e g u l a t o r y P r o t e i n s . G T P - b i n d i n g R e g u l a t o r y P r o t e i n C o n t r o l o f P h o s p h o l i p a s e C . P l a t e l e t P h o s p h o l i p a s e C A c t i v i t y . T h e G e n e r a t i o n a n d F u n c t i o n o f I n o s i t o l P h o s p h a t e s T h e G e n e r a t i o n a n d F u n c t i o n o f l , 2 - D i a c y l g l y c e r o l . P h o s p h a t i d i c A c i d a n d L y s o p h o s p h a t i d i c A c i d . T h e G e n e r a t i o n a n d F u n c t i o n o f C y c l i c A M P . T h e G e n e r a t i o n a n d F u n c t i o n o f C y c l i c G M P . T H E R O L E O F C A L C I U M I N C E L L U L A R P R O C E S S E S P l a t e l e t s a n d S u r f a c e - b o u n d C a 2 + I n t r a c e l l u l a r C a 2 + P o o l s S e q u e s t r a t i o n o f C a fl ' i n t o I n t e r n a l S t o r a g e S i t e s A c t i v e P r o m o t i o n o f C a 2 + E f f l u x A c r o s s t h e P l a s m a M e m b r a n e . v i i 2 8 2 9 3 1 3 5 3 6 3 7 3 8 4 O 4 1 4 3 4 5 4 6 4 6 5 0 5 4 5 7 5 9 6 2 6 3 6 4 6 8 6 9 6 9 7 O 7 1 7 2 L i m i t a t i o n o f C a 2 + I n f l u x A c r o s s t h e P l a s m a M e m b r a n e I n t r a c y t o p l a s m i c C a 2 + F l u x e s D u r i n g P l a t e l e t A c t i v a t i o n R e l e a s e o f C a 2 + f r o m t h e D e n s e T u b u l a r S y s t e m R e l e a s e o f C a 2 + f r o m M e m b r a n e S t o r a g e S i t e s I n f l u x o f C a 2 + f r o m t h e E x t e r n a l M e d i u m C a 2 + - d e p e n d e n t E v e n t s i n P l a t e l e t A c t i v a t i o n M y o s i n L i g h t C h a i n P h o s p h o r y l a t i o n . A c t i v a t i o n o f P h o s p h o l i p a s e A 2 A c t i v a t i o n o f C a 2 + - d e p e n d e n t P r o t e a s e C a l c i u m I o n o p h o r e s T H E R O L E O F 1 , 2 - D I A C Y L G L Y C E R O L A N D P R O T E I N K I N A S E C I N C E L L U L A R P R O C E S S E S P r o t e i n K i n a s e C T h e 4 7 k D a P l a t e l e t S u b s t r a t e o f P r o t e i n K i n a s e C . A c t i v a t i o n o f P r o t e i n K i n a s e C b y D i a c y l g l y c e r o l s a n d P h o r b o l E s t e r s . T h e R o l e o f P r o t e i n K i n a s e C i n P l a t e l e t A c t i v a t i o n . T H E R O L E o r N a + / H + E X C H A N G E I N C E L L U L A R P R O C E S S E S N a + / H + E x c h a n g e a n d C e l l A c t i v a t i o n W e a k P l a t e l e t A g o n i s t s a n d N a " / H + E x c h a n g e N a " / l - l + E x c h a n g e a n d A r a c h i d o n i c A c i d M o b i l i z a t i o n N a ‘ i / l ' l + E x c h a n g e , F i b r i n o g e n B i n d i n g a n d t h e a z - A d r e n e r g i c R e c e p t o r P l a t e l e t A c t i v a t i n g F a c t o r a n d N a " / H + E x c h a n g e C a l c i u m I o n o p h o r e s a n d N a + / l - l + E x c h a n g e T h r o m b i n a n d N a " / H + E x c h a n g e v i i i 7 3 7 4 7 5 7 6 7 7 7 8 7 9 8 0 8 2 8 3 8 4 8 4 8 6 8 8 9 0 9 4 9 5 9 7 . 1 0 0 . 1 0 2 . 1 0 3 1 0 4 1 0 4 T H E R E L A T I O N S H I P O F S E C O N D M E S S E N G E R S T O P L A T E L E T F U N C T I O N . S h a p e C h a n g e S e c r e t i o n o f G r a n u l e C o n t e n t s . A g g r e g a t i o n . B A S S E T H O U N D H E R E D I T A R Y T H R O M B O P A T H Y . C H A P T E R I I : S T A T E M E N T O F T H E P R O B L E M C H A P T E R I I I : P L A T E L E T A G G R E G A T I O N , D E N S E G R A N U L E S E C R E T I O N A N D T R A N S M I S S I O N E L E C T R O N M I C R O S C O P Y . I N T R O D U C T I O N . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S E x p e r i m e n t a l D e s i g n . R e a g e n t s P l a t e l e t I s o l a t i o n P l a t e l e t A g g r e g a t i o n S t u d i e s A T P S e c r e t i o n S t u d i e s . T r a n s m i s s i o n E l e c t r o n m i c r o s c o p y . S t a t i s t i c a l A n a l y s i s R E S U L T S A d e n o s i n e D i p h o s p h a t e . P l a t e l e t A c t i v a t i n g F a c t o r T h r o m b i n P h o r b o l M y r i s t a t e A c e t a t e . C a l c i u m I o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 D i t h i o t h r e i t o l D I S C U S S I O N . i x . 1 0 5 . 1 0 6 . 1 0 7 . 1 1 1 1 1 2 . 1 1 9 1 2 4 . 1 2 4 . 1 3 0 1 3 0 1 3 1 . 1 3 2 . 1 3 4 . 1 3 5 . 1 3 6 . 1 3 6 . 1 3 7 . 1 3 8 . 1 4 3 . 1 6 0 . 1 7 5 . 1 8 6 . 2 0 3 . 2 0 4 C H A P T E R I V : P H O S P H O R Y L A T I O N O F P L A T E L E T P R O T E I N S I N T R O D U C T I O N . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S E x p e r i m e n t a l D e s i g n . R e a g e n t s P r e p a r a t i o n o f S u s p e n s i o n s o f L a b e l l e d P l a t e l e t s I n c u b a t i o n s a n d S o d i u m D o d e c y l S u l f a t e — P o l y a c r y l a m i d e E l e c t r o p h o r e s i s R E S U L T S A d e n o s i n e D i p h o s p h a t e . P l a t e l e t A c t i v a t i n g F a c t o r T h r o m b i n P h o r b o l M y r i s t a t e A c e t a t e . C a l c i u m I o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 D I S C U S S I O N . C H A P T E R V : M E A S U R E M E N T O F T H R O M B O X A N E B 2 P R O D U C T I O N I N T R O D U C T I O N . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S E x p e r i m e n t a l D e s i g n . R e a g e n t s P r e p a r a t i o n o f P l a t e l e t s a n d T h r o m b o x a n e S a m p l e s R a d i o i m m u n o a s s a y f o r T h r o m b o x a n e B 2 S t a t i s t i c a l A n a l y s i s . 2 1 9 . 2 1 9 . 2 2 4 . 2 2 4 . 2 2 4 . 2 2 5 2 2 6 2 2 8 2 2 8 2 4 1 2 5 3 2 6 5 2 7 7 2 8 9 2 9 9 2 9 9 3 0 4 3 0 4 3 0 6 3 0 7 3 0 9 3 1 1 R E S U L T S R e s t i n g a n d B a s e l i n e V a l u e s . A d e n o s i n e D i p h o s p h a t e . P l a t e l e t A c t i v a t i n g F a c t o r T h r o m b i n P h o r b o l M y r i s t a t e A c e t a t e . C a l c i u m I o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 A r a c h i d o n i c A c i d D I S C U S S I O N . C H A P T E R V I : S U M M A R Y A N D C O N C L U S I O N S . L I S T O F R E F E R E N C E S x i 3 1 2 3 1 2 3 1 4 3 1 8 3 2 5 3 3 7 3 4 0 3 4 7 3 5 4 3 6 6 3 7 4 Z l b l T a b l e L I S T O F T A B L E S M a x i m u m a g g r e g a t i o n ( % ) , s l o p e , A T P s e c r e t i o n ( p M ) a n d t i m e t o m a x i m u m A T P s e c r e t i o n ( m i n u t e s ) o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 0 p M A D P i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f 1 . 0 m M a s p i r i n . D e n s e g r a n u l e A T P s e c r e t i o n ( p M ) a n d t i m e t o p e a k s e c r e t i o n ( m i n u t e s ) o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y P A F M a x i m u m a g g r e g a t i o n ( % ) , s l o p e , A T P s e c r e t i o n ( p M ) a n d t i m e t o m a x i m u m s e c r e t i o n ( m i n u t e s ) o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 0 . 1 p M P A F i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f 1 . 0 m M a s p i r i n . . M a x i m u m a g g r e g a t i o n ( % ) , s l o p e , A T P s e c r e t i o n ( p M ) a n d t i m e t o m a x i m u m s e c r e t i o n ( m i n u t e s ) o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 . 0 p M P A F i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f 1 . 0 m M a s p i r i n . . . . T i m e ( m i n u t e s ) t a k e n b y c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y t h r o m b i n t o r e a c h m a x i m u m a g g r e g a t i o n D e n s e g r a n u l e A T P s e c r e t i o n ( p M ) a n d t i m e t o p e a k s e c r e t i o n ( m i n u t e s ) b y c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y t h r o m b i n M a x i m u m a g g r e g a t i o n ( % ) , s l o p e , t i m e t o m a x i m u m a g g r e g a t i o n ( m i n u t e s ) , A T P s e c r e t i o n ( u M ) a n d t i m e t o m a x i m u m s e c r e t i o n ( m i n u t e s ) o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 3 U / m l t h r o m b i n i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f 1 . 0 m M a s p i r i n . . M a x i m u m a g g r e g a t i o n ( % ) , s l o p e , t i m e t o m a x i m u m a g g r e g a t i o n ( m i n u t e s ) , A T P s e c r e t i o n ( p M ) a n d t i m e t o m a x i m u m s e c r e t i o n ( m i n u t e s ) o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l — f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 1 U / m l t h r o m b i n i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f 1 . 0 m M a s p i r i n . . . . . x i i P a g e . 1 4 2 . 1 4 7 . 1 5 8 . 1 5 9 . 1 6 1 . 1 7 0 . 1 7 2 . 1 7 3 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 0 2 1 M a x i m u m a g g r e g a t i o n ( % ) , s l o p e , t i m e t o m a x i m u m a g g r e g a t i o n ( m i n u t e s ) , A T P s e c r e t i o n ( p M ) a n d t i m e t o m a x i m u m s e c r e t i o n ( m i n u t e s ) o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 0 5 U / m l t h r o m b i n i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f 1 . 0 m M a s p i r i n . T i m e t a k e n ( m i n u t e s ) b y c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y P M A t o r e a c h m a x i m u m a g g r e g a t i o n D e n s e g r a n u l e A T P s e c r e t i o n ( p M ) a n d t i m e t o r e a c h p e a k s e c r e t i o n ( m i n u t e s ) b y c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y P M A M a x i m u m a g g r e g a t i o n ( % ) , s l o p e , t i m e t o m a x i m u m a g g r e g a t i o n ( m i n u t e s ) , A T P s e c r e t e d ( p M ) a n d t i m e t o m a x i m u m s e c r e t i o n ( m i n u t e s ) o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 3 . 0 p M P M A i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f 1 . 0 m M a s p i r i n . . . . D e n s e g r a n u l e A T P s e c r e t i o n ( p M ) a n d t i m e t o r e a c h p e a k s e c r e t i o n ( m i n u t e s ) b y c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y t h e c a l c i u m i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 M a x i m u m a g g r e g a t i o n ( % ) , s l o p e , A T P s e c r e t i o n ( p M ) a n d t i m e t o m a x i m u m s e c r e t i o n ( m i n u t e s ) o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 2 0 p M A 2 3 1 8 7 i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f 1 . 0 m M a s p i r i n M a x i m u m a g g r e g a t i o n ( % ) , s l o p e , A T P s e c r e t i o n ( p M ) a n d t i m e t o m a x i m u m s e c r e t i o n ( m i n u t e s ) o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 5 p M A 2 3 1 8 7 i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f 1 . 0 m M a s p i r i n . M a x i m u m p e r c e n t a g g r e g a t i o n a n d s l o p e o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a e x p o s e d t o d i t h i o t h r e i t o l ( D T T ) . . . . . . A g o n i s t c o n c e n t r a t i o n s a n d t i m e s a t w h i c h T x 2 w a s m e a s u r e d T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n n o n - s t i r r e d a n d s t i r r e d n o n - s t i m u l a t e d c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s u s p e n s i o n s T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 0 p M A D P T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 0 . 1 p M P A F T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 . 0 p M P A F x i i i . 1 7 4 1 7 8 1 8 4 . 1 8 5 . 1 9 0 . 2 0 1 . 2 0 2 . 2 0 3 . 3 0 5 3 1 3 . 3 1 5 3 1 9 3 2 2 2 2 2 3 2 4 2 5 2 6 2 7 2 8 2 9 3 0 T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 0 5 U / m l t h r o m b i n T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 1 U / m l t h r o m b i n T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 3 U / m l t h r o m b i n T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 3 . 0 p M P M A T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 5 p M A 2 3 1 8 7 T x B 2 c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 2 0 p M A 2 3 1 8 7 T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 0 . 5 m M a r a c h i d o n i c a c i d . . . . . . . . . . . . . . . . T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 . 0 m M a r a c h i d o n i c a c i d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S u m m a r y o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t a g g r e g a t i o n , d e n s e g r a n u l e A T P s e c r e t i o n , T s z g e n e r a t i o n a n d 2 0 a n d 4 7 k D a p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n ( c o n t r o l / a f f e c t e d ) x i v . 3 2 6 . 3 3 0 . 3 3 4 . 3 3 7 . 3 4 1 . 3 4 4 . 3 4 8 . 3 5 1 . 3 6 8 F i g u r e 9 a 9 b 1 0 a L I S T O F F I G U R E S S i m p l i f i e d f o r m u l a s o f t h e p h o s p h o i n o s i t i d e s 3 0 9 T h e m e t a b o l i c p a t h w a y s o f t h e i n o s i t o l - c o n t a i n i n g l i p i d s a o g . . . . . D o s e r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e m a x i m u m p e r c e n t a g g r e g a t i o n o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y A D P D o s e r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e m a x i m u m s l o p e o f t h e a g g r e g a t i o n c u r v e s o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y A D P T y p i c a l a g g r e g a t i o n c u r v e s f o r c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 0 p M A D P D o s e r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e m a x i m u m p e r c e n t a g g r e g a t i o n o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y P A F D o s e r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e m a x i m u m s l o p e o f t h e a g g r e g a t i o n c u r v e s o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y P A F T y p i c a l a g g r e g a t i o n c u r v e s f o r c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 . 0 p M P A F T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f s t i r r e d c o n t r o l p l a t e l e t r i c h p l a s m a p r i o r t o t h e a d d i t i o n o f a g o n i s t ( X 1 1 , 2 5 0 ) T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f s t i r r e d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a p r i o r t o t h e a d d i t i o n o f a g o n i s t ( X 1 1 , 2 5 0 ) . . . . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f c o n t r o l p l a t e l e t r i c h p l a s m a o n e m i n u t e a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 1 p M P A F ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e c h a n g e d s h a p e , c e n t r a l i z e d t h e i r g r a n u l e s a n d s t a r t e d t o a g g r e g a t e X V P a g e 4 7 5 0 . 1 3 9 . 1 3 9 . 1 4 1 . 1 4 4 1 4 4 1 4 6 . 1 4 8 1 4 8 . 1 5 0 1 0 b 1 1 a 1 1 b 1 2 a 1 2 b 1 3 a 1 3 b 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 a T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a o n e m i n u t e a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 1 p M P A F ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e c h a n g e d s h a p e a n d c e n t r a l i z e d t h e i r g r a n u l e s , b u t h a v e n o t a g g r e g a t e d T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f c o n t r o l p l a t e l e t r i c h p l a s m a f i v e m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 1 p M P A F ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e a g g r e g a t e d f u l l y T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a f i v e m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 1 p M P A F ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e c h a n g e d s h a p e , b u t h a v e n o t r e l e a s e d t h e i r g r a n u l e c o n t e n t s o r a g g r e g a t e d T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f c o n t r o l p l a t e l e t r i c h p l a s m a o n e m i n u t e a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 . 0 p M P A F ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e a l m o s t f u l l y a g g r e g a t e d T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a o n e m i n u t e a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 . 0 p M P A F ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e c h a n g e d s h a p e a n d c e n t r a l i z e d t h e i r g r a n u l e s , b u t h a v e n o t a g g r e g a t e d T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f c o n t r o l p l a t e l e t r i c h p l a s m a f i v e m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 . 0 p M P A F ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e a g g r e g a t e d f u l l y T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a f i v e m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 . 0 p M P A F ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e c h a n g e d s h a p e a n d s e c r e t e d s o m e o f t h e i r g r a n u l e s , b u t h a v e n o t a g g r e g a t e d D o s e r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e m a x i m u m p e r c e n t a g g r e g a t i o n o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y t h r o m b i n . . . D o s e r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e m a x i m u m s l o p e o f t h e a g g r e g a t i o n c u r v e s o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y t h r o m b i n D o s e r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e t i m e t a k e n ( m i n u t e s ) b y c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s t o r e a c h m a x i m u m p e r c e n t a g g r e g a t i o n w h e n s t i m u l a t e d b y t h r o m b i n T y p i c a l a g g r e g a t i o n c u r v e s f o r c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 3 U / m l t h r o m b i n T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f c o n t r o l g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s 3 0 s e c o n d s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 3 U / m l t h r o m b i n ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e c h a n g e d s h a p e , c e n t r a l i z e d t h e i r g r a n u l e s a n d s t a r t e d t o a g g r e g a t e x v i 1 5 0 . 1 5 2 1 5 2 . 1 5 4 . 1 5 4 1 5 6 1 5 6 . 1 6 2 . 1 6 2 . 1 6 4 . 1 6 5 . 1 6 6 a a n a a n a a a a s T p c T p c ( ( T p T ( ( p D o b r l e X X r l e X l r l r X o f y s n t 1 n s t 1 s n n 1 1 s c e A m s r 1 s 1 m r s 1 m s 1 m o 2 m a a , m a , a m a , m r a , n 3 i l i 2 l 2 i 2 i e 2 t 1 . . o d o d o . . o n i o e i o ) ) e i n i n ) ) o l s i t t 5 s t 5 i s s t s 5 5 r 8 s w z w s 0 0 z e s s e 0 0 7 p o n m n m n m n m s a e h T e h n T e n T e n n T d i t i t i i e n l u e h l u h e l u h l u h c e i e t e i e t e e t e u a t e c r c e r c e c e e r f t p t s p t s p t s s v p f r g l r g l r l r l e e a o r a o a r a o a a o a a c s n f a t n f a t n f t n f t t m t e n m t e n m t f e m t e e i e u i l e u i l e l i e o d l c r l c e r e l c r c e r r e a p a v p v p a v p a v m l h e d a d h a e h d e h d e e a d g d g d d x t r t e r t e r r t p t o t t o t s s o t t s s o s l s g h g h g h g h h a r e h o r e h o r e h r e h e t a r a a a r a a a a e . . o i g n o i n g o i a o i a i f t o f t r o r f t g f t g m r i t i e e t i g i g u i c o a o g g c o r a o r m c o n c f n c a a o n e f n e h n h f h t t p n g f g o a t e o a e e e p t o a e o a r f n c f n d d f t r c f t r l o g t g . o e t e c a 3 e 3 l 3 e e 3 l d d e e s . d d . d . d . n m p 0 p 0 0 f f 0 t a s l s p u l u p a h u l u h u a l l p l a s t M a a M a t l M a M l g t . . e t p e y p t y g i l P P e P e e l e P r m e M l M , . , . e M l M e u t A e A t A e A g l t t a a h c h c n r r t t i r i r i e c i c i o d h h 1 8 b 1 9 a 1 9 b 2 0 2 1 2 2 2 3 2 4 a 2 4 b 2 5 a 2 5 b 2 6 T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s 3 0 s e c o n d s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 3 U / m l t h r o m b i n ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e c h a n g e d s h a p e a n d c e n t r a l i z e d t h e i r g r a n u l e s , b u t h a v e n o t a g g r e g a t e d T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f c o n t r o l g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s e i g h t m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 3 U / m l t h r o m b i n ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e a g g r e g a t e d f u l l y . . . . . . . . . . . . . . . . . . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s e i g h t m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 3 U / m l t h r o m b i n ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e a g g r e g a t e d f u l l y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D o s e r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e m a x i m u m p e r c e n t a g g r e g a t i o n o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y P M A D o s e r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e m a x i m u m s l o p e o f t h e a g g r e g a t i o n c u r v e s o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y P M A D o s e r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e t i m e t a k e n ( m i n u t e s ) b y c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a t o r e a c h m a x i m u m p e r c e n t a g g r e g a t i o n w h e n s t i m u l a t e d b y P M A T y p i c a l a g g r e g a t i o n c u r v e s f o r c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 3 . 0 p M P M A x v i i . 1 6 6 . 1 6 8 . 1 6 8 . 1 7 6 . 1 7 6 . 1 7 8 . 1 7 9 . 1 8 0 . 1 8 0 . 1 8 2 . 1 8 2 . 1 8 7 2 7 2 8 2 9 a 2 9 b 3 0 a 3 0 b 3 1 a 3 1 b 3 2 a 3 2 b 3 3 D o s e r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e m a x i m u m s l o p e o f t h e a g g r e g a t i o n c u r v e s o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y A 2 3 1 8 7 T y p i c a l a g g r e g a t i o n c u r v e s f o r c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 2 0 p M A 2 3 1 8 7 T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f c o n t r o l g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s o n e m i n u t e a f t e r t h e a d d i t i o n o f 7 . 5 p M A 2 3 1 8 7 ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e c h a n g e d s h a p e , c e n t r a l i z e d t h e i r g r a n u l e s a n d s t a r t e d t o a g g r e g a t e T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s o n e m i n u t e a f t e r t h e a d d i t i o n o f 7 . 5 p M A 2 3 1 8 7 ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e c h a n g e d s h a p e a n d c e n t r a l i z e d t h e i r g r a n u l e s , b u t h a v e n o t s t a r t e d t o a g g r e g a t e T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f c o n t r o l g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s i x m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 7 . 5 p M A 2 3 1 8 7 ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e a g g r e g a t e d f u l l y T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s i x m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 7 . 5 p M A 2 3 1 8 7 ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e c h a n g e d s h a p e a n d t h e r e i s s o m e c e n t r a l i z a t i o n o f g r a n u l e s , b u t t h e y h a v e n o t a g g r e g a t e d T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f c o n t r o l g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s o n e m i n u t e a f t e r t h e a d d i t i o n o f 2 0 p M A 2 3 1 8 7 ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e c h a n g e d s h a p e , c e n t r a l i z e d t h e i r g r a n u l e s a n d s t a r t e d t o a g g r e g a t e T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s o n e m i n u t e a f t e r t h e a d d i t i o n o f 2 0 p M A 2 3 1 8 7 ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e u n d e r g o n e s o m e s h a p e c h a n g e a n d g r a n u l e c e n t r a l i z a t i o n , b u t h a v e n o t a g g r e g a t e d . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f c o n t r o l g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s t h r e e m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 2 0 p M A 2 3 1 8 7 ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e u n d e r g o n e l y s i s . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s t h r e e m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 2 0 p M A 2 3 1 8 7 ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e u n d e r g o n e l y s i s . A g g r e g o m e t e r r e c o r d i n g c o r r e s p o n d i n g t o t h e t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h s o f a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 2 0 p M A 2 3 1 8 7 ( F i g u r e s 3 1 b a n d 3 2 b ) x v i i i . 1 8 7 . 1 8 9 . 1 9 2 . 1 9 2 . 1 9 4 . 1 9 4 . 1 9 6 . 1 9 6 . 1 9 8 . 1 9 8 . 2 0 0 3 4 a 3 4 b 3 5 a 3 5 b 3 6 a 3 6 b 3 7 a 3 7 b 3 8 3 9 4 0 4 1 a 4 1 b A u t o r a d i o g r a p h o f c o n t r o l . 3 ? P - 1 a b e l l e d p l a t e l e t s a c t i v a t e d b y 1 0 p M A D P , s o l u b i l i z e d a t v a r i o u s t i m e s a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . . . . . . . . . . . . . . . . . . A u t o r a d i o g r a p h o f a f f e c t e d 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s a c t i v a t e d b y 1 0 p M A D P , s o l u b i l i z e d a t v a r i o u s t i m e s a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . . . . . . . . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f r e s t i n g c o n t r o l 3 2 ‘ P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . . . . . . . . . . . . . . . . . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f r e s t i n g a f f e c t e d 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . . . . . . . . . . . . . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f c o n t r o l 3 ? ? - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d 3 0 s e c o n d s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 0 p M A D P a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f a f f e c t e d 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d 3 0 s e c o n d s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 0 p H A D P a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f c o n t r o l 3 2 P - 1 a b e 1 1 e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d f i v e m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 0 p H A D P a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f a f f e c t e d 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d f i v e m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 0 u M A D P a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E P h o s p h o r y l a t i o n ( c p m ) o f t h e 2 0 k D a p r o t e i n b a n d o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 0 p M A D P a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . . . . . . . . . . . . . . . . P h o s p h o r y l a t i o n ( c p m ) o f t h e 4 7 k D a p r o t e i n b a n d o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d 3 Z P — l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 0 p M A D P a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . . . . . . . . . . . . . . . . P h o s p h o r y l a t i o n ( c p m ) o f t h e 6 5 k D a p r o t e i n b a n d o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 0 p M A D P a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . . . . . . . . . . . . . . . . A u t o r a d i o g r a p h o f c o n t r o l : ” P - 1 a b e l l e d p l a t e l e t s a c t i v a t e d b y 0 . 1 p M P A F , s o l u b i l i z e d a t v a r i o u s t i m e s a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . . . . A u t o r a d i o g r a p h o f a f f e c t e d 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s a c t i v a t e d b y 0 . 1 p M P A F , s o l u b i l i z e d a t v a r i o u s t i m e s a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . . . . x i x . 2 3 0 . 2 3 0 . 2 3 2 . 2 3 2 . 2 3 4 . 2 3 4 . 2 3 6 . 2 3 6 . 2 3 8 . 2 3 8 . 2 4 0 . 2 4 2 . 2 4 2 6 6 6 7 6 8 6 9 7 0 7 1 7 2 7 3 7 4 7 5 7 6 7 7 7 8 7 9 P h o s p h o r y l a t i o n ( c p m ) o f t h e 2 0 k D a p r o t e i n b a n d o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d : ” P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 . 0 p M A 2 3 1 8 7 a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . . . . . . . . . . . . . . . P h o s p h o r y l a t i o n ( c p m ) o f t h e 4 7 k D a p r o t e i n b a n d o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d : ” P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 . 0 p M A 2 3 1 8 7 a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . . . . . . . . . . . . . . P h o s p h o r y l a t i o n ( c p m ) o f t h e 6 5 k D a p r o t e i n b a n d o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d : ” P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 . 0 p M A 2 3 1 8 7 a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . . . . . . . . . . . . . . . . . . T s z c o n c e n t r a t i o n i n n o n - s t i r r e d ( 0 m i n u t e ) a n d s t i r r e d ( 0 . 5 , 5 . 5 a n d 1 2 . 5 m i n u t e s ) c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a a t 3 7 . 5 ° C T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 0 p M A D P I n c r e a s e i n T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) a b o v e t h e b a s e l i n e i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 0 p M A D P . T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 0 . 1 p M P A F I n c r e a s e i n T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) a b o v e t h e b a s e l i n e i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 0 . 1 p M P A F T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 . 0 p M P A F I n c r e a s e i n T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) a b o v e t h e b a s e l i n e i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 . 0 u M P A F T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 0 5 U / m l t h r o m b i n I n c r e a s e i n T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) a b o v e t h e b a s e l i n e i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 0 5 U / m l t h r o m b i n T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 1 U / m l t h r o m b i n I n c r e a s e i n T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) a b o v e t h e b a s e l i n e i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 1 U / m l t h r o m b i n x x i i i . 2 8 6 . 2 8 6 . 2 8 8 . 3 1 4 . 3 1 6 . 3 1 6 . 3 2 0 . 3 2 0 . 3 2 3 . 3 2 3 . 3 2 7 . 3 2 7 . 3 3 1 . 3 3 1 8 0 8 1 8 2 8 3 8 4 8 5 8 6 8 7 8 8 8 9 9 0 9 1 9 2 T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 3 U / m l t h r o m b i n I n c r e a s e i n T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) a b o v e t h e b a s e l i n e i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 3 U / m l t h r o m b i n T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d . p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 3 . 0 p M P M A I n c r e a s e i n T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) a b o v e t h e b a s e l i n e i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 3 . 0 p M P M A T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 5 p M A 2 3 1 8 7 I n c r e a s e i n T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) a b o v e t h e b a s e l i n e i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 5 u M A 2 3 1 8 7 T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 2 0 p M A 2 3 1 8 7 I n c r e a s e i n T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) a b o v e t h e b a s e l i n e i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 2 0 p M A 2 3 1 8 7 T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 0 . 5 m M a r a c h i d o n i c a c i d . . . . . . . . . . . . . . . I n c r e a s e i n T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) a b o v e t h e b a s e l i n e i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 0 . 5 m M a r a c h i d o n i c a c i d T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 . 0 m M a r a c h i d o n i c a c i d . . . . . . . . . . . . . . . I n c r e a s e i n T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) a b o v e t h e b a s e l i n e i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 . 0 m M a r a c h i d o n i c a c i d H y p o t h e t i c a l m o d e l o f p l a t e l e t a c t i v a t i o n i n c l u d i n g t h o s e p a t h w a y s i n v e s t i g a t e d i n t h i s s t u d y x x i v . 3 3 5 3 3 5 . 3 3 8 . 3 3 8 3 4 2 3 4 2 . 3 4 5 3 4 5 . 3 4 9 . 3 4 9 . 3 5 2 . 3 5 2 . 3 7 3 A T P . C 3 2 + D A G . G M P . G P ( l ) I P . ( 1 , 4 ) I P 2 ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 P A F . P A G E P I P I P . P I P z P M A . S D S . M . T s z L I S T O F A B B R E V I A T I O N S a d e n o s i n e d i p h o s p h a t e a d e n o s i n e m o n o p h o s p h a t e a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e i o n i z e d c a l c i u m 1 , 2 - d i a c y l g 1 y c e r o l g u a n o s i n e m o n o p h o s p h a t e g l y c o p r o t e i n i n o s i t o l 1 - p h o s p h a t e i n o s i t o l 1 , 4 - b i s p h o s p h a t e i n o s i t o l 1 , 4 , 5 - t r i s p h o s p h a t e p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l m o n o p h o s p h a t e p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l b i s p h o s p h a t e p h o r b o l m y r i s t a t e a c e t a t e s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e t h r o m b o x a n e A 2 t h r o m b o x a n e B 2 X X V I N T R O D U C T I O N C u r r e n t k n o w l e d g e o f p l a t e l e t f u n c t i o n a n d b i o c h e m i s t r y h a s b e e n g a i n e d p r i m a r i l y f r o m i n v e s t i g a t i o n o f t h e r o l e o f p l a t e l e t s i n h e m o s t a s i s . M u c h o f t h e m o t i v a t i o n f o r t h i s a r e a o f r e s e a r c h i s p r o v i d e d b y t h e i m p o r t a n c e o f p l a t e l e t s i n t h e p a t h o g e n e s i s o f a t h e r o s c l e r o s i s a n d t h r o m b o s i s , w h i c h a r e m a j o r c a u s e s o f d e a t h i n W e s t e r n s o c i e t i e s . H e r e d i t a r y d i s o r d e r s o f p l a t e l e t f u n c t i o n h a v e c o n t r i b u t e d g r e a t l y t o k n o w l e d g e o f p l a t e l e t s t r u c t u r e , f u n c t i o n a n d t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e m . B o t h h u m a n a n d a n i m a l h e r e d i t a r y m o d e l s o f p l a t e l e t d y s f u n c t i o n a p p e a r s p o n t a n e o u s l y , a r e r e a d i l y r e c o g n i z e d a n d a r e a b l e t o b e c h a r a c t e r i z e d i n v i t r o . P l a t e l e t s a r e p a r t i c u l a r l y p o p u l a r t o o l s f o r c e l l b i o l o g y r e s e a r c h b e c a u s e t h e y a r e r e a d i l y a c c e s s i b l e f o r s t u d y , h a v e r e c e p t o r s l i n k e d t o s i g n a l t r a n s d u c t i o n s y s t e m s a n d t h e m e a s u r a b l e r e s p o n s e s o f a g g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n . T h e e x i s t e n c e o f a h e m o r r h a g i c d i a t h e s i s i n B a s s e t h o u n d s w a s f i r s t o b s e r v e d b y a v e t e r i n a r i a n i n p r i v a t e p r a c t i c e i n t h e l a t e 1 9 7 0 ' s . T h i s o b s e r v a t i o n l e a d t o t h e e x a m i n a t i o n o f p l a t e l e t f u n c t i o n i n a p o p u l a t i o n o f i n b r e d B a s s e t h o u n d s i n M i c h i g a n . T h i s s c r e e n i n g p r o c e s s i d e n t i f i e d a s m a l l s u b p o p u l a t i o n o f t h e s e c l o s e l y r e l a t e d B a s s e t h o u n d s w i t h a s e v e r e a g g r e g a t i o n d y s f u n c t i o n a s s o c i a t e d w i t h a b l e e d i n g d i a t h e s i s . T h e s e a n i m a l s w e r e a s s u m e d t o b e h o m o z y g o u s f o r a h e r e d i t a r y t h r o m b o p a t h y w i t h a n a p p a r e n t a u t o s o m a l p a t t e r n o f 2 i n h e r i t a n c e . T h e r e w a s c o n s i d e r a b l e v a r i a t i o n i n t h e r a n g e o f r e s p o n s e s t o t h e a g o n i s t s u s e d w i t h i n t h e r e m a i n i n g p o p u l a t i o n . T h e s i g n i f i c a n c e , i f a n y , o f t h i s i s n o t k n o w n , b u t i t i s p o s s i b l e t h a t a n i m a l s w i t h i n t e r m e d i a t e r e s p o n s e s a r e h e t e r o z y g o u s f o r t h e d e f e c t . T h e i n i t i a l i n v e s t i g a t i o n o f B a s s e t h o u n d h e r e d i t a r y t h r o m b o p a t h y i n c l u d e d e x a m i n a t i o n o f t h e c l i n i c a l a s p e c t s a n d g e n e t i c s o f t h e d i s o r d e r . T h e s e r e s u l t s , p l u s p l a t e l e t f u n c t i o n s t u d i e s , i d e n t i f i e d a p l a t e l e t d y s f u n c t i o n w i t h m a n y o f t h e f u n c t i o n a l c h a r a c t e r i s t i c s o f h u m a n G l a n z m a n n ' s t h r o m b a s t h e n i a . I n t h i s d i s o r d e r , m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n I I b - I I I a ( G P I I b - I I I a ) c o n t e n t i s r e d u c e d o r a b s e n t . A s G P I I b - I I I a h a s b e e n i d e n t i f i e d a s t h e f i b r i n o g e n r e c e p t o r o n p l a t e l e t s , t h e f u n c t i o n a l d i s o r d e r i n G l a n z m a n n ' s t h r o m b a s t h e n i a i s t h e r e s u l t o f t h e i n a b i l i t y o f p l a t e l e t s t o b i n d s u f f i c i e n t f i b r i n o g e n t o s u p p o r t a g g r e g a t i o n . H o w e v e r , t h e m e m b r a n e G P l l b - l l l a c o n t e n t o f p l a t e l e t s f r o m a f f e c t e d B a s s e t h o u n d h e r e d i t a r y t h r o m b o p a t h y d o g s w a s s h o w n t o b e n o r m a l w h e n e x a m i n e d b y t w o - d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s . S i m i l a r l y , b i n d i n g o f 1 ‘ 2 5 ’ I - l a b e l l e d f i b r i n o g e n w a s n o r m a l , e v e n t h o u g h t h e a g o n i s t u s e d t o i n i t i a t e b i n d i n g d i d n o t i n d u c e p l a t e l e t a g g r e g a t i o n . W h i l e t h e r e s u l t s o f t h e s e s t u d i e s r u l e d o u t m a n y k n o w n p r i m a r y d e f e c t s o f p l a t e l e t f u n c t i o n , a d e f i n i t i v e c o n c l u s i o n a s t o t h e p a t h o g e n e s i s o f t h e d e f e c t c o u l d n o t b e m a d e f r o m t h e m . T h e b e h a v i o r o f a f f e c t e d p l a t e l e t s s u g g e s t e d t h a t t h e c o m p l e x p l a t e l e t s t i m u l u s - r e s p o n s e c o u p l i n g s y s t e m w a s u n a b l e t o c o n v e r t t h e e x t e r n a l s i g n a l o f a g o n i s t s i n t o t h e n o r m a l s e q u e n c e a n d t i m i n g o f e v e n t s , i e . s h a p e c h a n g e , s e c r e t i o n o f g r a n u l e c o n t e n t s a n d a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s , a n d 3 a g g r e g a t i o n . T h i s a b n o r m a l b e h a v i o r f o c u s e d a t t e n t i o n o n t h e s t i m u l u s - r e s p o n s e c o u p l i n g m e c h a n i s m a s a l o g i c a l a r e a f o r f u r t h e r s t u d y . A t t h e b e g i n n i n g o f t h i s s t u d y , i t w a s h y p o t h e s i z e d t h a t t h e r e w a s a d e f e c t i n t h e s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y i n a f f e c t e d p l a t e l e t s , b u t , g i v e n t h e l a c k o f i n f o r m a t i o n a v a i l a b l e a t t h e t i m e , i t w a s n o t p o s s i b l e t o p r o p o s e a m o r e s p e c i f i c h y p o t h e s i s . T h e i n f o r m a t i o n t h a t w a s a v a i l a b l e w a s r e s t r i c t e d p r i m a r i l y t o t h e m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s o f r e s t i n g p l a t e l e t s a n d t h e r e s p o n s e s o f a f f e c t e d p l a t e l e t s t o a s i n g l e a g o n i s t , a d e n o s i n e d i p h o s p h a t e . T h e r e f o r e , a l o g i c a l s t a r t i n g p o i n t w a s t o e x a m i n e t h e r e s p o n s e o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d c a n i n e p l a t e l e t s t o a w i d e r r a n g e o f p h y s i o l o g i c a n d n o n - p h y s i o l o g i c a g o n i s t s . O n c e t h i s w a s c o m p l e t e d , s o m e a s p e c t s o f t h e s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y w e r e e x a m i n e d i n a a t t e m p t t o i d e n t i f y a s p e c i f i c a r e a o f d i f f e r e n c e b e t w e e n a f f e c t e d a n d c o n t r o l p l a t e l e t s . W h i l e a g r e a t d e a l h a s b e e n l e a r n e d i n t h e c o u r s e o f t h i s s t u d y , t h e p r e c i s e p a t h o g e n e s i s o f B a s s e t h o u n d h e r e d i t a r y t h r o m b o p a t h y h a s n o t b e e n i d e n t i f i e d . G i v e n t h e c o m p l e x i t y o f t h e p r o b l e m , s u c h a r e s u l t i s n o t s u r p r i s i n g . H o w e v e r , c o n s i d e r a b l y m o r e i s n o w k n o w n a b o u t t h e b i o c h e m i c a l n a t u r e o f t h e d e f e c t . T h e r e s u l t s o f t h i s i n v e s t i g a t i o n i n d i c a t e s e v e r a l p a t h s a l o n g w h i c h f u t u r e i n v e s t i g a t i o n o f t h i s d e f e c t s h o u l d b e d i r e c t e d , a n d t h e i n f o r m a t i o n o b t a i n e d f r o m s u c h s t u d i e s h a s t h e p o t e n t i a l t o a d d t o o u r k n o w l e d g e o f t h e d e t a i l e d m e c h a n i s m s i n v o l v e d i n p l a t e l e t f u n c t i o n . p l a t e l e t s u r f a c e . T h e a c t i v a t e d r e c e p t o r t r a n s m i t s t h e m e s s a g e a c r o s s C H A P T E R I : L I T E R A T U R E R E V I E W P l a t e l e t s a r e t h e s m a l l e s t c i r c u l a t i n g c e l l s i n m a m m a l s a n d a r e p i v o t a l f o r n o r m a l h e m o s t a s i s . T h e f o r m a t i o n o f a h e m o s t a t i c p l u g r e p r e s e n t s o n e t h e e a r l i e s t r e s p o n s e s t o b l o o d v e s s e l i n j u r y a n d a n y b r e a k i n t h e c o n t i n u i t y o f a v e s s e l w a l l e l i c i t s a n i n s t a n t a n e o u s r e s p o n s e f r o m p l a t e l e t s t h a t c o m e i n t o c o n t a c t w i t h t h e z o n e o f i n j u r y . T h e p r o c e s s o f h e m o s t a s i s i n v o l v e s r a p i d a d h e s i o n o f p l a t e l e t s t o t h e e x p o s e d s u b e n d o t h e l i u m f o l l o w e d b y p l a t e l e t - t o - p l a t e l e t a d h e s i o n ( a g g r e g a t i o n ) a n d t h e f o r m a t i o n o f a p r i m a r y h e m o s t a t i c p l u g . T h e c o n v e r s i o n o f s o l u b l e f i b r i n o g e n t o a n i n s o l u b l e f i b r i n p o l y m e r w h i c h e n m e s h e s t h e p l a t e l e t t h r o m b u s c o m p l e t e s t h e f o r m a t i o n o f a s e c o n d a r y h e m o s t a t i c p l u g . T h e f o r m a t i o n o f a p r i m a r y h e m o s t a t i c p l u g b y p l a t e l e t s i n v o l v e s s e v e r a l d i s t i n c t s t e p s k n o w n a s t h e p l a t e l e t r e s p o n s e : a d h e s i o n , s h a p e c h a n g e , a g g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n o f g r a n u l e c o n t e n t s a n d a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s . T h e s e r e s p o n s e s c a n b e e l i c i t e d i n v i v g a n d i n v i t r o b y a w i d e r a n g e o f s t i m u l a t i n g a g e n t s a n d h a v e b e e n s t u d i e d e x t e n s i v e l y i n 1 1 : 1 2 i n s u s p e n s i o n s o f p l a t e l e t s . A l t h o u g h p l a t e l e t s t i m u l i a n d r e s p o n s e s a r e q u i t e v a r i e d , t h e p r o c e s s o f p l a t e l e t a c t i v a t i o n a p p e a r s t o i n v o l v e a l i m i t e d n u m b e r o f p a t h w a y s o r m e c h a n i s m s . C o m m o n t o a l l p h y s i o l o g i c a l s t i m u l i i s t h e i r b i n d i n g t o s p e c i f i c r e c e p t o r s o n t h e 5 t h e p l a s m a m e m b r a n e b y G T P - b i n d i n g r e g u l a t o r y p r o t e i n s w h i c h c o n t r o l t h e f u n c t i o n o f s p e c i f i c e f f e c t o r s y s t e m s s u c h a s p h o s p h o l i p a s e C - i n d u c e d i n o s i t o l p h o s p h o l i p i d h y d r o l y s i s . T h e e f f e c t o r s y s t e m s c o n t r o l t h e g e n e r a t i o n o f s e c o n d m e s s e n g e r s w h i c h t r i g g e r p h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e s b y c h a n g e s i n e n z y m a t i c a c t i v i t i e s a n d p h o s p h o r y l a t i o n a n d s t r u c t u r a l p r o p e r t i e s o f p r o t e i n s . T h i s p r o c e s s o f p l a t e l e t a c t i v a t i o n i s h i g h l y r e g u l a t e d a n d a m p l i f i c a t i o n o r i n h i b i t i o n c a n o c c u r a t e a c h s t e p i n t h e p r o c e s s . A l t h o u g h k n o w l e d g e a n d u n d e r s t a n d i n g o f t h i s a r e a h a v e i n c r e a s e d c o n s i d e r a b l y o v e r t h e l a s t t e n y e a r s , t h e r e a r e m a n y u n a n s w e r e d q u e s t i o n s a b o u t t h e m e c h a n i s m s a n d c o n t r o l o f p l a t e l e t a c t i v a t i o n . W h e n c o m p a r e d t o h u m a n p l a t e l e t s , r e l a t i v e l y l i t t l e i s k n o w n a b o u t t h e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f c a n i n e p l a t e l e t s . H o w e v e r , t h e l i m i t e d a m o u n t o f i n f o r m a t i o n p u b l i s h e d a n d t h e r e s u l t s o f t h i s s t u d y i n d i c a t e t h a t t h e y a r e v e r y s i m i l a r t o h u m a n p l a t e l e t s . I n t h i s r e v i e w , f e a t u r e s w h i c h c h a r a c t e r i z e h u m a n p l a t e l e t s w i l l b e a s s u m e d t o a l s o c h a r a c t e r i z e c a n i n e p l a t e l e t s . S o m e u n i q u e f e a t u r e s o f c a n i n e p l a t e l e t s h a v e b e e n o b s e r v e d , b u t t h e s e a r e n o t c o m m o n a n d w i l l b e d e s c r i b e d a s a n e x c e p t i o n a l f e a t u r e w h e r e r e l e v a n t . M E G A R A R Y O P O I E S I S A N D P L A T E L E T P R O D U C T I O N M e g a k a r y o p o i e s i s T h e p r o c e s s b y w h i c h a p l u r i p o t e n t h e m a t o p o i e t i c s t e m c e l l b e c o m e s c o m m i t t e d t o m e g a k a r y o c y t e d e v e l o p m e n t i s n o t c l e a r . T h e m o r e d i f f e r e n t i a t e d , c o m m i t t e d m e g a k a r y o c y t e s t e m c e l l i s d e f i n e d b y i t s a b i l i t y t o g i v e r i s e t o c o l o n i e s o f m a t u r e m e g a k a r y o c y t e s . T h e s e 6 c o m m i t t e d s t e m c e l l s a r e d e f i n e d f u n c t i o n a l l y a s c o l o n y - f o r m i n g u n i t - m e g a k a r y o c y t e ( C P U - M e g ) a n d a r e n o t i d e n t i f i a b l e m o r p h o l o g i c a l l y , c y t o c h e m i c a l l y o r i m m u n o l o g i c a l l y . 3 1 9 T h e e a r l i e s t c o m m i t t e d c e l l r e c o g n i z a b l e i n W r i g h t - s t a i n e d m a r r o w s m e a r s i s t h e m e g a k a r y o b l a s t . ” 2 5 M e g a k a r y o c y t e s a r e t h e l a r g e s t o f t h e h e m a t o p o i e t i c c e l l s i n t h e b o n e m a r r o w a n d a r e u n i q u e l y c h a r a c t e r i z e d b y t h e i r s i z e a n d h e t e r o g e n e i t y . T h e D N A c o n t e n t o f m e g a k a r y o c y t e s i s v e r y v a r i a b l e w i t h m o s t c e l l s h a v i n g p l o i d y v a l u e s b e t w e e n 8 a n d 6 4 N . 3 1 9 T h e r e i s e v i d e n c e t h a t ' m e g a k a r y o c y t e s w i t h h i g h e r p l o i d y v a l u e s p r o d u c e l a r g e r p l a t e l e t s w i t h g r e a t e r h e m o s t a t i c e f f i c i e n c y } : l M i t o t i c a m p l i f i c a t i o n o c c u r s a t t h e l e v e l o f t h e m e g a k a r y o c y t e p r e c u r s o r c e l l s a n d t h e m e g a k a r y o b l a s t d o e s n o t u n d e r g o c e l l d i v i s i o n } : 1 9 H o w e v e r , t h e m e g a k a r y o b l a s t d o e s u n d e r g o e n d o m i t o s i s i n w h i c h t h e r e i s m i t o t i c d i v i s i o n o f t h e n u c l e u s w i t h o u t d i v i s i o n o f t h e c y t o p l a s m t o p r o d u c e c e l l s w i t h a m u l t i l o b e d n u c l e u s a n d a p o l y p l o i d D N A c o n t e n t o f 4 t o 6 4 N . P r o m e g a k a r y o c y t e s h a v e m o r e t h a n f o u r d i s t i n c t n u c l e i a n d l e s s b a s o p h i l i c , m o r e a b u n d a n t c y t o p l a s m t h a n m e g a k a r y o b l a s t s . A s t h e c e l l m a t u r e s , t h e n u c l e u s b e c o m e s m o r e l o b u l a t e d , t h e n u c l e a r c h r o m a t i n m o r e c o n d e n s e d a n d t h e c y t o p l a s m m o r e a b u n d a n t a n d g r a n u l a r . M e g a k a r y o c y t e s h a v e a s i n g l e m u l t i - l o b e d n u c l e u s a n d a b u n d a n t , p a l e - s t a i n i n g c y t o p l a s m c o n t a i n i n g s m a l l a z u r o p h i l i c g r a n u l e s . 2 2 5 M e g a k a r y o c y t i c G r a n u l e s a n d O r g a n e l l e s T h e a l p h a g r a n u l e s r e p r e s e n t t h e l a r g e s t c l a s s o f g r a n u l e s i n m e g a k a r y o c y t e s a n d p l a t e l e t s a n d p r o b a b l y a r i s e i n t h e G o l g i 6 2 a p p a r a t u s . P l a t e l e t p r o t e i n s t h a t h a v e b e e n s h o w n t o b e s y n t h e s i z e d 7 b y m e g a k a r y o c y t e s i n c l u d e p l a t e l e t f a c t o r 4 , f a c t o r V I I I : v o n W i l l e b r a n d f a c t o r , f a c t o r V , f i b r i n o g e n a n d t h r o m b o s p o n d i n . O f t h e s e , f i b r i n o g e n , t h r o m b o s p o n d i n a n d f a c t o r V I I I : v o n W i l l e b r a n d f a c t o r h a v e b e e n l o c a l i z e d t o t h e a l p h a g r a n u l e s o f m e g a k a r y o c y t e s . P l a t e l e t s c o n t a i n a n o t h e r c l a s s o f g r a n u l e s d i s t i n c t f r o m a l p h a g r a n u l e s a n d 6 2 T h e s e d e n s e b o d i e s c h a r a c t e r i z e d b y a h i g h l y o s m i o p h i l i c c o r e . a p p e a r t o r e p r e s e n t s t o r a g e s i t e s f o r t h e n o n - m e t a b o l i c p o o l o f a d e n i n e n u c l e o t i d e s , s e r o t o n i n a n d c a l c i u m . ’ 5 2 A l t h o u g h d e n s e b o d i e s i n m e g a k a r y o c y t e s a r e n o t r e a d i l y v i s u a l i z e d , m e g a k a r y o c y t e s h a v e b e e n s h o w n t o s t o r e e x o g e n o u s S — h y d r o x y t r y p t a m i n e i n o r g a n e l l e s t h a t r e p r e s e n t t h e p r e c u r s o r s o f d e n s e b o d i e s . 6 2 E l e c t r o n m i c r o s c o p i c s t u d i e s h a v e s u g g e s t e d t h a t d e n s e b o d y m a t u r a t i o n o c c u r s v e r y l a t e i n m e g a k a r y o c y t e m a t u r a t i o n . A t h i r d d i s t i n c t t y p e o f g r a n u l e o r i g i n a t e s i n t h e G o l g i a p p a r a t u s a n d c o n t a i n s a r y l s u l f a t a s e a n d a c i d 6 2 p h o s p h a t a s e . T h e s e l y s o s o m a l g r a n u l e s h a v e b e e n i d e n t i f i e d i n b o t h m e g a k a r y o c y t e s a n d p l a t e l e t s . T h e r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m a n d f r e e r i b o s o m e s a r e w e l l d e v e l o p e d b y t h e m e g a k a r y o b l a s t s t a g e . 8 2 T w o e n z y m e s , p l a t e l e t p e r o x i d a s e a n d g l u c o s e - 6 - p h o s p h a t a s e , a r e p r e s e n t i n t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m . T h e y a r e a l s o p r e s e n t i n t h e d e n s e t u b u l a r s y s t e m o f p l a t e l e t s w h i c h i n d i c a t e s t h a t t h e d e n s e t u b u l a r s y s t e m i s d e r i v e d f r o m m e g a k a r y o c y t e s m o o t h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m . “ ” A s m o o t h m e m b r a n e s y s t e m c a l l e d t h e m e m b r a n e d e m a r c a t i o n s y s t e m c a n b e i d e n t i f i e d i n t h e c y t o p l a s m o f m e g a k a r y o b l a s t s . 6 2 T h e c a v i t i e s o f t h e m e m b r a n e d e m a r c a t i o n s y s t e m a r e c o n t i n u o u s w i t h t h e e x t r a c e l l u l a r s p a c e , b u t t h e o r i g i n o f t h i s s y s t e m i s n o t c l e a r . A l t h o u g h i t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t t h e m e m b r a n e 8 d e m a r c a t i o n s y s t e m p l a y s a r o l e i n p l a t e l e t r e l e a s e b y d e l i n e a t i n g p l a t e l e t b o u n d a r i e s , t h i s p r o p o s a l h a s n o t b e e n u n i v e r s a l l y a c c e p t e d . 2 9 ° P l a t e l e t F o r m a t i o n T h e m e c h a n i s m b y w h i c h p l a t e l e t s a r e u l t i m a t e l y f o r m e d f r o m m a t u r e m e g a k a r y o c y t e s a n d r e l e a s e d i n t o t h e c i r c u l a t i o n i s n o t c l e a r . T h e t h r e e m a j o r t h e o r i e s f o r p l a t e l e t f o r m a t i o n a r e : ( l ) c y t o p l a s m i c b u d d i n g ; ( 2 ) c y t o p l a s m i c d i s s o l u t i o n ; a n d ( 3 ) p s e u d o p o d f o r m a t i o n . 2 9 0 A l t h o u g h c y t o p l a s m i c b u d d i n g o f m e g a k a r y o c y t e s h a s b e e n o b s e r v e d b y s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y , t h e s e b l e b s d o n o t c o n t a i n o r g a n e l l e s a n d s e e m u n l i k e l y t o b e a m a j o r s o u r c e o f p l a t e l e t s . M e g a k a r y o c y t e s i n 2 1 : 1 9 h a v e b e e n o b s e r v e d t o u n d e r g o d i s s o l u t i o n i n t o s m a l l f r a g m e n t s w i t h o u t p s e u d o p o d i a f o r m a t i o n , b u t t h e r e i s l i t t l e e v i d e n c e t h a t t h i s i s s i g n i f i c a n t 1 n _ x i x g . T h e f o r m a t i o n o f p s e u d o p o d i a b y m e g a k a r y o c y t e s h a s b e e n o b s e r v e d i n a n d o u t s i d e m a r r o w i n _ y i t r g . T h e e x t e n s i o n o f l a r g e p s e u d o p o d i a c o n t a i n i n g a f u l l c o m p l e m e n t o f c y t o p l a s m i c o r g a n e l l e s t h r o u g h t h e e n d o t h e l i u m h a s b e e n d e s c r i b e d , b u t t h e r e i s n o t y e t d e f i n i t e p r o o f o f f r a g m e n t a t i o n o f p s e u d o p o d i a a s t h e m a j o r m e c h a n i s m o f p l a t e l e t f o r m a t i o n . I n a d d i t i o n , s i n c e m e g a k a r y o c y t e s c a n m i g r a t e a c r o s s t h e v e s s e l w a l l , t h e p s e u d o p o d i a m a y r e p r e s e n t t h e f i r s t s t e p i n m o v e m e n t i n t o t h e s i n u s o i d s . A f o u r t h p o s s i b l e m e c h a n i s m o f p l a t e l e t f o r m a t i o n i s f r a g m e n t a t i o n o f m e g a k a r y o c y t e s w h i c h b e c o m e t r a p p e d i n t h e p u l m o n a r y c a p i l l a r i e s . T h e e x t e n t t o w h i c h t h e s e m e g a k a r y o c y t e s c o n t r i b u t e t o t h e m a i n t e n a n c e o f t h e c i r c u l a t i n g p l a t e l e t p o p u l a t i o n r e m a i n s u n c l e a r . R e g u l a t i o n o f T h r o m b o p o i e s i s T h r o m b o p o i e s i s i s r e g u l a t e d b y a h u m e r a l m e c h a n i s m i n w h i c h p r o d u c t i o n o f p l a t e l e t s f r o m m e g a k a r y o c y t e s i s r e s p o n s i v e t o t h e n u m b e r o r _ m a s s o f c i r c u l a t i n g p l a t e l e t s . 1 9 ‘ A c u t e s e v e r e t h r o m b o c y t o p e n i a c a u s e s a n i n c r e a s e i n s i z e , p l o i d y , n u m b e r a n d r a t e o f m a t u r a t i o n o f m a r r o w m e g a k a r y o c y t e s a n d a c c e l e r a t e d p l a t e l e t p r o d u c t i o n . T h e r a t e a n d m a g n i t u d e o f t h e r e s p o n s e i s p r o p o r t i o n a l t o t h e d e g r e e o f t h r o m b o c y t o p e n i a . A t h r o m b o p o i e s i s - s t i m u l a t i n g a c t i v i t y ( t h r o m b o p o i e t i n ) h a s b e e n d e m o n s t r a t e d i n t h e p l a s m a o f t h r o m b o c y t o p e n i c a n i m a l s . A l t h o u g h t h r o m b o p o i e t i n a l t e r s p l a t e l e t p r o d u c t i o n t h r o u g h e f f e c t s o n m e g a k a r y o c y t e s , i t s m o d e o f a c t i o n r e m a i n s u n k n o w n . U n l i k e m e g a k a r y o c y t e s , t h e C P U - M e g i s r e l a t i v e l y i n s e n s i t i v e t o v a r i a t i o n s i n t h e c i r c u l a t i n g p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n , w i t h m a i n t e n a n c e o f p l a t e l e t - p r o d u c i n g c a p a c i t y b e i n g t h e i r m a j o r f u n c t i o n r a t h e r t h a n m a i n t e n a n c e o f c i r c u l a t i n g p l a t e l e t n u m b e r s . 3 1 9 T h e C P U - M e g r e q u i r e t h e p r e s e n c e o f s t i m u l a t o r s k n o w n c o l l e c t i v e l y a s m e g a k a r y o c y t e c o l o n y - s t i m u l a t i n g f a c t o r s ( M e g - C S F ) i n o r d e r t o g e n e r a t e c o l o n i e s o f m e g a k a r y o c y t e s i n _ g i t ; g . “ “ A n o t h e r g r o w t h - p r o m o t i n g a c t i v i t y w h i c h p o t e n t i a t e s t h e n u m b e r o f d e t e c t a b l e m e g a k a r y o c y t e c o l o n i e s i n t h e p r e s e n c e o f M e g - C S F h a s b e e n r e c o g n i z e d a n d c a l l e d m e g a k a r y o c y t e p o t e n t i a t o r ( M e g - P o t ) . O t h e r f a c t o r s t h a t s t i m u l a t e m e g a k a r y o p o i e s i s a n d t h r o m b o p o i e s i s i n c l u d e i n t e r l e u k i n - 3 , e r y t h r o p o i e t i n , t h r o m b o p o i e s i s s t i m u l a t i n g f a c t o r , g r a n u l o c y t e - m a c r o p h a g e c o l o n y s t i m u l a t i n g f a c t o r a n d m e g a k a r y o c y t e s t i m u l a t i n g f a c t o r . “ “ H o w e v e r , 1 0 t h e h u m o r a l r e g u l a t i o n o f m e g a k a r y o p o i e s i s a n d t h r o m b o p o i e s i s u n d e r c o n d i t i o n s o f n o r m a l t h r o m b o p o i e s i s a n d i n v i v o i s s t i l l p o o r l y u n d e r s t o o d . P L A T E L E T S T R U C T U R E A N D H E R I T A B L E D I S O R D E R S C i r c u l a t i n g p l a t e l e t s a r e d i s c o i d , a n u c l e a t e c e l l s w h i c h c o n t a i n a l a r g e n u m b e r o f s e c r e t o r y g r a n u l e s . H u m a n p l a t e l e t s a r e s m a l l e l l i p s o i d s , 0 . 5 - 1 . 0 p t h i c k a n d 1 . 5 - 2 . 5 p i n d i a m e t e r w h i c h c i r c u l a t e i n t h e b l o o d f o r f o u r t o t e n d a y s . 2 ° 7 " ‘ 6 7 T h e m e a n p l a t e l e t v o l u m e f o r t h e h u m a n a n d d o g i s s i m i l a r ( 7 . 6 - 8 . 3 f l ) . 2 2 6 R e c e n t s t u d i e s o n t h e m e a n s u r v i v a l o f 1 1 1 I n o x i n e - o r 5 1 C r - l a b e l l e d c a n i n e p l a t e l e t s h a v e i n d i c a t e d t h a t t h e y h a v e a s l i g h t l y s h o r t e r m e a n s u r v i v a l t i m e o f a p p r o x i m a t e l y f o u r t o s e v e n d a y s . ” ” P l a t e l e t c o n s u m p t i o n o c c u r s a s t h e r e s u l t o f n o r m a l a g i n g a s w e l l a s u t i l i z a t i o n i n t h e h e m o s t a t i c p r o c e s s . A s p l a t e l e t s a g e , t h e y u n d e r g o p h y s i c a l a n d b i o c h e m i c a l c h a n g e s w h i c h i d e n t i f y t h e m f o r r e m o v a l f r o m t h e c i r c u l a t i o n b y t h e m o n o n u c l e a r p h a g o c y t i c s y s t e m i n t h e s p l e e n , l i v e r a n d b o n e m a r r o w . T h e r e s t i n g p l a t e l e t c a n b e d i v i d e d i n t o f o u r f u n c t i o n a l z o n e s : ( 1 ) t h e m e m b r a n e s y s t e m s ; ( 2 ) t h e s o l - g e l z o n e ; ( 3 ) t h e o r g a n e l l e z o n e ; a n d ( 4 ) t h e p e r i p h e r a l z o n e . 5 0 8 1 . T h e P l a t e l e t M e m b r a n e S y s t e m s T h e d e n s e t u b u l a r s y s t e m a n d t h e o p e n c a n a l i c u l a r s y s t e m f o r m s p e c i a l i z e d m e m b r a n e s y s t e m s w i t h i n p l a t e l e t s . fl “ C l o s e a s s o c i a t i o n 1 1 b e t w e e n t h e t w o s y s t e m s h a s b e e n n o t e d , b u t t h e y a r e n o t i n d i r e c t c o m m u n i c a t i o n . T h e o p e n c a n a l i c u l a r s y s t e m i s c o m p o s e d o f t o r t u o u s , t u b u l a r i n v a g i n a t i o n s o f t h e p l a s m a m e m b r a n e w h i c h g i v e t h e p l a t e l e t a s p o n g e - l i k e s t r u c t u r e . B e c a u s e t h e o p e n c a n a l i c u l a r s y s t e m i s c o n t i n u o u s w i t h t h e p l a t e l e t s u r f a c e , a l m o s t t h e e n t i r e i n t e r i o r o f t h e c e l l c o m m u n i c a t e s w i t h t h e e x t r a c e l l u l a r e n v i r o n m e n t . I t i s v e r y l i k e l y t h a t a c t i v a t e d p l a t e l e t s e m p t y t h e i r s t o r a g e g r a n u l e c o n t e n t s i n t o t h e o p e n c a n a l i c u l a r s y s t e m d u r i n g s e c r e t i o n . fl ” T h e d e n s e t u b u l a r s y s t e m i s a n i n t e r n a l m e m b r a n e s y s t e m t h a t d o e s n o t c o m m u n i c a t e w i t h t h e o p e n c a n a l i c u l a r s y s t e m o r e x t r a c e l l u l a r s p a c e . “ " I t i s c o m p o s e d o f r e s i d u a l s m o o t h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m d e r i v e d f r o m t h e r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m o f t h e m e g a k a r y o c y t e . R e s t i n g p l a t e l e t s m a i n t a i n a l o w c y t O p l a s m i c f r e e i o n i z e d c a l c i u m ( C a m U c o n c e n t r a t i o n a n d a s t e e p p l a s m a m e m b r a n e c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t p a r t l y b y s e q u e s t e r i n g C a 2 + w i t h i n t h e d e n s e t u b u l a r s y s t e m . 5 1 P l a t e l e t s c o n t a i n a C a y ¥ A T P a s e t h a t i s l o c a l i z e d i n i n t e r n a l m e m b r a n e s t h o u g h t t o a r i s e f r o m t h e d e n s e t u b u l a r s y s t e m . u z ' 3 2 5 T h e d e n s e t u b u l a r s y s t e m i s a l s o t h e m a j o r l o c a t i o n o f c y c l o o x y g e n a s e a n d t h r o m b o x a n e s y n t h e t a s e a c t i v i t i e s i n p 1 a t e 1 e t s . 5 9 J 5 ‘ 2 . T h e P l a t e l e t S o l - g e l Z o n e T h e s e c o n d f u n c t i o n a l z o n e i s t h e s o l - g e l z o n e w h i c h i s t h e m a t r i x o f t h e p l a t e l e t c y t o p l a s m . I t c o n t a i n s t h e c y t o s k e l e t o n t h a t s u p p o r t s t h e d i s c o i d s h a p e o f r e s t i n g p l a t e l e t s a n d p r o v i d e s t h e c o n t r a c t i l e s y s t e m i n v o l v e d i n s h a p e c h a n g e , i n t e r n a l c o n t r a c t i o n a n d s e c r e t i o n . T h e 1 2 c y t o s k e l e t o n o f t h e p l a t e l e t c o n s i s t s o f : ( i ) a c t i n a n d m y o s i n f i l a m e n t s ; ( i i ) a m e m b r a n e s k e l e t o n ; ( i i i ) m i c r o t u b u l e s ; a n d ( i v ) a v a r i e t y o f a s s o c i a t e d p r o t e i n s . 1 5 ° ( i ) A c t i n a n d M y o s i n F i l a m e n t s A c t i n i s t h e m a j o r p l a t e l e t p r o t e i n a n d h a s b e e n e s t i m a t e d t o c o n s t i t u t e 1 5 t o 2 0 % o f t h e t o t a l p r o t e i n . 1 5 0 I n a d d i t i o n , m a n y o f t h e o t h e r m a j o r p l a t e l e t p r o t e i n s a r e t h o s e w h i c h c a n b i n d t o a c t i n f i l a m e n t s . T h e s e i n c l u d e a c t i n - b i n d i n g p r o t e i n , P 2 3 5 , a n d m y o s i n . A c t i n m o n o m e r s a r e s l i g h t l y a s y m m e t r i c , g l o b u l a r m o l e c u l e s ( M , ' - 4 2 k D a ) w h i c h c a n b e i n d u c e d t o p o l y m e r i z e i n a n o n c o v a l e n t i n t e r a c t i o n t o f o r m f i l a m e n t s g r e a t e r t h a n 1 p m l o n g a n d 5 t o 6 n m w i d e . 3 ‘ 5 7 ' 3 9 1 D u r i n g p o l y m e r i z a t i o n , m o n o m e r s a r e a d d e d r a p i d l y t o a n u c l e u s o f t h r e e o r m o r e m o n o m e r s . B e c a u s e t h e m o l e c u l e i s a s y m m e t r i c , t h e g r o w i n g f i l a m e n t h a s p o l a r i t y w i t h t h e t w o e n d s b e i n g d e f i n e d a s t h e b a r b e d a n d p o i n t e d e n d s . A l t h o u g h m o n o m e r s a r e a d d e d a n d r e m o v e d f r o m b o t h e n d s o f a f i l a m e n t , t h e y a r e a d d e d m u c h m o r e r a p i d l y a t t h e b a r b e d e n d a n d r e m o v e d m o r e r a p i d l y a t t h e p o i n t e d e n d . T h i s p r o c e s s h a s b e e n d e s c r i b e d a s " t r e a d m i l l i n g " a n d w i l l c o n t i n u e u n l e s s o n e o r b o t h e n d s o f t h e a c t i n f i l a m e n t a r e b l o c k e d b y a " c a p p i n g p r o t e i n " . S i m i l a r l y , p o l y m e r i z a t i o n w i l l s t o p o n c e t h e c o n c e n t r a t i o n o f f r e e m o n o m e r s i n a s o l u t i o n d r o p s b e l o w a c r i t i c a l l e v e l . 5 0 1 I n n o n - s t i m u l a t e d p l a t e l e t s , 4 0 t o 5 0 % o f a c t i n i s i n t h e f i l a m e n t o u s f o r m . 1 3 W h e n a c t i n f i l a m e n t s i n t e r a c t w i t h m y o s i n f i l a m e n t s , t h e i o n i z e d m a g n e s i u m - d e p e n d e n t A T P a s e ( n g l A T P a s e ) a c t i v i t y o f t h e m y o s i n i s s t i m u l a t e d a n d a c o n t r a c t i l e f o r c e g e n e r a t e d } : 5 9 M y o s i n c o n s i s t s o f t w o h e a v y c h a i n s o f ' M L - 2 0 0 k D a , t w o l i g h t c h a i n s o f M r - 2 0 k D a a n d t w o l i g h t c h a i n s o f M r ' - 1 6 k D a . T h e l i g h t c h a i n s a r e a s s o c i a t e d w i t h t h e g l o b u l a r h e a d s o f t h e t w o h e a v y c h a i n s w h i c h a l s o c o n t a i n t h e a c t i n - b i n d i n g s i t e s a n d a c t i n - a c t i v a t a b l e A T P a s e . P l a t e l e t m y o s i n p o l y m e r i z e s i n t o s h o r t b i p o l a r f i l a m e n t s i n s o l u t i o n , a l t h o u g h t h i s h a s n o t b e e n d e m o n s t r a t e d i n i n t a c t p l a t e l e t s . A t p h y s i o l o g i c a l n g l A T P c o n c e n t r a t i o n s , m y o s i n d o e s n o t p o l y m e r i z e u n l e s s t h e 2 0 k D a l i g h t c h a i n s a r e p h o s p h o r y l a t e d . ‘ 3 1 P h o s p h o r y l a t i o n a l s o c o n v e r t s m y o s i n i n t o a f o r m t h a t c a n i n t e r a c t w i t h a c t i n a n d a c t i v a t e i t s M g a i A T P a s e a c t i v i t y . 2 I n t h e r e s t i n g p l a t e l e t , m y o s i n i s i n t h e m o n o m e r i c f o r m . D u r i n g p l a t e l e t a c t i v a t i o n , t h e m y o s i n l i g h t c h a i n k i n a s e i s a c t i v a t e d a n d t h e m y o s i n l i g h t c h a i n p h o s p h o r y l a t e d , p r e s u m a b l y a l l o w i n g m y o s i n p o l y m e r i z a t i o n , b i n d i n g o f a c t i n f i l a m e n t s a n d a c t i v a t i o n o f t h e n g l A T P a s e . C o n v e r s e l y , d e p h o s p h o r y l a t i o n r e v e r s e s t h i s p r o c e s s . “ 3 ( i i ) T h e M e m b r a n e S k e l e t o n T h e s e c o n d m a j o r c o m p o n e n t o f t h e p l a t e l e t c y t o s k e l e t o n i s t h e m e m b r a n e s k e l e t o n . T h i s i s c o m p o s e d o f s h o r t a c t i n f i l a m e n t s w h i c h m a k e u p a s e c o n d p o o l o f a c t i n f i l a m e n t s d i s t i n c t f r o m t h e c y t o p l a s m i c c o n t r a c t i l e p o o l d e s c r i b e d a b o v e . ” 5 1 T h e s h o r t a c t i n f i l a m e n t s a r e c r o s s - l i n k e d b y a c t i n - b i n d i n g p r o t e i n a n d a r e l 4 r e s i s t a n t t o C a B Z i n d u c e d d e p o l y m e r i z a t i o n . T h e m e m b r a n e s k e l e t o n f o r m s a l i n i n g t o t h e p l a s m a m e m b r a n e t h a t s t a b i l i z e s t h e l i p i d b i l a y e r , d e t e r m i n e s t h e c o n t o u r s o f t h e m e m b r a n e a n d i s l i n k e d t o t h e p l a s m a m e m b r a n e , p r i m a r i l y t h r o u g h a c t i n - b i n d i n g p r o t e i n b o u n d t o t h e g l y c o p r o t e i n I b - I X ( G P I b - I X ) c o m p l e x . ” 8 L i n k a g e o f t h e m e m b r a n e c y t o s k e l e t o n t o C P I b — I X d e t e r m i n e s t h e o r g a n i z a t i o n o f t h e G P I b - I X c o m p l e x w i t h i n t h e m e m b r a n e a n d m a i n t a i n s i t i n a s u i t a b l e p o s i t i o n f o r b i n d i n g t o v o n W i l l e b r a n d f a c t o r a t t h e s i t e o f v e s s e l i n j u r y . T h e m e m b r a n e s k e l e t o n i s a l s o l i n k e d t o G P I a , G P I I a a n d a g l y c o p r o t e i n o f M , - 2 5 0 k D a o n t h e p l a s m a m e m b r a n e . “ ‘ 5 ' u s D u r i n g p l a t e l e t a g g r e g a t i o n , t h e C a Z I - d e p e n d e n t p r o t e a s e i s a c t i v a t e d a n d h y d r o l y s e s a c t i n - b i n d i n g p r o t e i n . 1 " 7 ' “ 8 T h i s r e l e a s e s t h e m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s f r o m t h e m e m b r a n e c y t o s k e l e t o n a n d m a y p r o v i d e a m e c h a n i s m f o r r e g u l a t i n g t h e i n t e r a c t i o n o f a c t i n f i l a m e n t s w i t h t h e p l a s m a m e m b r a n e . ( i i i ) T h e M i c r o t u b u l e C o i l T h e t h i r d c o m p o n e n t o f t h e c y t o s k e l e t o n i s t h e m i c r o t u b u l e c o i l w h i c h l i e s a t t h e p e r i p h e r y o f t h e p l a t e l e t j u s t i n t e r n a l t o t h e m e m b r a n e c y t o s k e l e t o n . I t i s c o m p o s e d o f t u b u l i n p o l y m e r i z e d i n t o a s i n g l e l o n g c o i l w h i c h s u p p o r t s t h e d i s c o i d s h a p e o f r e s t i n g p l a t e l e t s . 1 2 5 ' 3 ‘ 5 D u r i n g a c t i v a t i o n o f p l a t e l e t s b y a n a g g r e g a t i n g a g e n t , t h e m i c r o t u b u l e c o i l b e c o m e s c o n s t r i c t e d i n t o a t i g h t r i n g a r o u n d t h e c e n t r a l i z i n g g r a n u l e s . O p i n i o n s d i f f e r o n w h e t h e r o r n o t t h e m i c r o t u b u l e c o i l b r e a k s d o w n a n d r e f o r m s d u r i n g p l a t e l e t a c t i v a t i o n . 1 5 ( i v ) P r o t e i n s A s s o c i a t e d w i t h t h e C y t o s k e l e t o n P r o f i l i n a n d g e l s o l i n a r e p r o t e i n s t h a t r e g u l a t e t h e p o l y m e r i z a t i o n o f a c t i n i n p l a t e l e t s a n d m a n y o t h e r c e l l t y p e s . P r o f i l i n f o r m s a 1 : 1 c o m p l e x w i t h a c t i n m o n o m e r s a n d i n h i b i t s a c t i n p o l y m e r i z a t i o n . I n p l a t e l e t s , m o n o m e r i c a c t i n i s a s s o c i a t e d e n t i r e l y w i t h p r o f i l i n , b u t d i s s o c i a t e s d u r i n g p l a t e l e t a c t i v a t i o n , a l l o w i n g p o l y m e r i z a t i o n o f t h e m o n o m e r s . 3 1 1 W h e n t h e c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n r e a c h e s 1 . 0 p M o r h i g h e r , g e l s o l i n b i n d s t o a c t i n f i l a m e n t s a n d c a u s e s t h e m t o f r a g m e n t i n t o s h o r t f i l a m e n t s . 5 2 2 ' 5 2 3 T h e g e l s o l i n r e m a i n s a t t a c h e d a t t h e b a r b e d e n d o f t h e f i l a m e n t f r a g m e n t s a n d p r e v e n t s t h e a d d i t i o n o f a c t i n m o n o m e r s t o t h e s e e n d s . P 2 3 5 , v i n c u l i n , a - a c t i n i n , s p e c t r i n a n d a c t i n - b i n d i n g p r o t e i n a r e t h e m a j o r p r o t e i n s t h a t m a y l i n k a c t i n f i l a m e n t s t o m e m b r a n e s . P 2 3 5 h a s b e e n s h o w n t o b e s i m i l a r t o t a l i n w h i c h i s a c y t o s k e l e t a l p r o t e i n t h a t b i n d s t o v i n c u l i n a n d a l s o b i n d s b u n d l e s o f a c t i n f i l a m e n t s t o t h e c y t o p l a s m i c d o m a i n o f t h e f i b r o n e c t i n r e c e p t o r i n f i b r o b l a s t s a n d s m o o t h m u s c l e c e l l s . ” ' 3 6 7 B u n d l e s o f a c t i n f i l a m e n t s h a v e b e e n s h o w n t o b e a s s o c i a t e d w i t h t h e c y t o p l a s m i c d o m a i n o f t h e m e m b r a n e G P I I b - I I I a c o m p l e x i n a c t i v a t e d p l a t e l e t s . “ ” I t h a s n o t b e e n p r o v e n , b u t P 2 3 5 m a y p l a y a r o l e i n l i n k i n g a c t i n f i l a m e n t s t o G P I I b - I I I a . H u m a n p l a t e l e t P 2 3 5 h a s b e e n p u r i f i e d t o a p p a r e n t h o m o g e n e i t y a n d f o u n d t o b e a d i m e r w i t h t w o s u b u n i t s o f M , ' - 2 3 5 k D a t h a t a r e r a p i d l y d e g r a d e d b y t h e C a z + - d e p e n d e n t p r o t e a s e t o a s t a b l e f r a g m e n t o f M r - 2 0 0 k D a . " " 3 1 6 V i n c u l i n h a s b e e n p u r i f i e d f r o m p l a t e l e t s , b u t i t s r o l e i n t h e p l a t e l e t c y t o s k e l e t o n i s n o t c l e a r . B a s e d o n s t u d i e s i n o t h e r c e l l t y p e s , i t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t v i n c u l i n m a y f u n c t i o n a s a l i n k b e t w e e n a c t i n a n d P 2 3 5 / t a l i n . 1 5 ° a - A c t i n i n i s c o n c e n t r a t e d j u s t b e n e a t h t h e p l a s m a m e m b r a n e i n r e s t i n g p l a t e l e t s a n d i n t h e f i l o p o d i a i n a c t i v a t e d p l a t e l e t s . n " 2 7 3 " ' 5 9 I t c r o s s - l i n k s o r g e l s a c t i n f i l a m e n t s , s t i m u l a t e s t h e a c t i v i t y o f a c t o m y o s i n , a n d m a y a c t a s a l i n k b e t w e e n a c t i n f i l a m e n t s a n d t h e p l a s m a m e m b r a n e . 2 7 2 S p e c t r i n i s m a j o r c o m p o n e n t o f t h e c y t o s k e l e t o n i n r e d b l o o d c e l l s w h e r e i t f o r m s a s u b m e m b r a n o u s n e t w o r k t h a t f u n c t i o n s i n t h e m a i n t e n a n c e o f c e l l s h a p e a n d s t r u c t u r e . “ A l t h o u g h s p e c t r i n h a s b e e n i d e n t i f i e d i n p l a t e l e t s , i t i s p r e s e n t i n v e r y s m a l l a m o u n t s a n d i t s s i g n i f i c a n c e i s n o t u n d e r s t o o d . ” 9 A c t i n - b i n d i n g p r o t e i n h a s b e e n p u r i f i e d f r o m p l a t e l e t s a n d s h o w n t o b e a s s o c i a t e d w i t h t h e m e m b r a n e s k e l e t o n t h a t i s a t t a c h e d t o m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s . “ ' 6 I t i s p r o p o s e d t h a t i t s m a j o r f u n c t i o n i n p l a t e l e t s i s t o c r o s s - l i n k a c t i n f i l a m e n t s o f t h e m e m b r a n e s k e l e t o n , s i m i l a r t o t h e f u n c t i o n o f s p e c t r i n i n r e d b l o o d c e l l s . D u r i n g p l a t e l e t a c t i v a t i o n , i t i s h y d r o l y s e d b y t h e e n d o g e n o u s C a Z I - d e p e n d e n t p r o t e a s e , w h i c h m a y p r o v i d e a m e a n s b y w h i c h C a 2 + c o u l d r e g u l a t e s t i m u l u s - i n d u c e d c y t o s k e l e t a l c h a n g e s . 1 M O t h e r f u n c t i o n s o f a c t i n - b i n d i n g p r o t e i n a r e t h e n u c l e a t i o n o f p u r i f i e d a c t i n a n d t h e c r o s s - l i n k i n g o f a c t i n f i l a m e n t s i n t o n e t w o r k s . “ a 1 7 I t a p p e a r s t h a t t h e t h r e e m a j o r p r o t e i n s i n v o l v e d i n o r g a n i z i n g a c t i n f i l a m e n t s i n t o t h e i r c h a r a c t e r i s t i c t h r e e - d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e i n r e s t i n g a n d a c t i v a t e d p l a t e l e t s a r e a c t i n - b i n d i n g p r o t e i n , a - a c t i n i n a n d m y o s i n . T h e s e i n t e r a c t i o n s a r e r e g u l a t e d f u r t h e r b y t r o p o m y o s i n a n d c a l d e s m o n . 1 5 0 T r o p o m y o s i n i n p l a t e l e t s m a y p r e v e n t t h e b i n d i n g o f m y o s i n t o a c t i n f i l a m e n t s i n l o c a l i z e d a r e a s , a l l o w i n g t h e d e v e l o p m e n t o f a c t o m y o s i n c o n t r a c t i l e a c t i v i t y o n l y i n s p e c i f i c a r e a s o f t h e a c t i v a t e d c e l l . T r o p o m y o s i n h a s a l s o b e e n r e p o r t e d t o i n h i b i t t h e b i n d i n g o f a c t i n - b i n d i n g p r o t e i n , s p e c t r i n a n d a - a c t i n i n t o a c t i n f i l a m e n t s i n a d d i t i o n t o i n h i b i t i n g t h e a b i l i t y o f g e l s o l i n t o d e p o l y m e r i z e a c t i n f i l a m e n t s . 3 9 6 T h u s , t r o p o m y o s i n m a y h a v e a s t a b i l i z i n g e f f e c t o n a c t i n f i l a m e n t s i n d e f i n e d a r e a s o f t h e c e l l . C a l d e s m o n h a s b e e n d e t e c t e d i n p l a t e l e t s a n d f o u n d t o b i n d t o a c t i n f i l a m e n t s i n t h e a b s e n c e o f c a l c i u m . 1 1 7 H o w e v e r , i n t h e p r e s e n c e o f c a l c i u m i t i s r e l e a s e d f r o m a c t i n a n d b i n d s t o c a l m o d u l i n , w h i c h s u g g e s t s t h a t i t m a y h a v e a r o l e i n r e g u l a t i n g t h e a v a i l a b i l i t y o f a c t i n f i l a m e n t s f o r b i n d i n g t o o t h e r p r o t e i n s s u c h a s m y o s i n . N o n - s t i m u l a t e d p l a t e l e t s c o n t a i n a n e x t e n s i v e n e t w o r k o f f i l a m e n t s c o n t a i n i n g 4 0 t o 5 0 % o f t h e t o t a l p l a t e l e t a c t i n . T h e r e m a i n i n g a c t i n i s i n t h e m o n o m e r i c f o r m , c a p p e d b y p r o f i l i n w h i c h p r e v e n t s p o l y m e r i z a t i o n . T h e a c t i n f i l a m e n t s a r e c o n t a i n e d i n t w o p o o l s , t h e s h o r t f i l a m e n t s o f t h e m e m b r a n e s k e l e t o n a n d t h e c y t o p l a s m i c n e t w o r k . T h e c y t o p l a s m i c l o n g a c t i n f i l a m e n t s m a k e u p a t h r e e - d i m e n s i o n a l n e t w o r k t h a t i s r e g u l a t e d b y i t s i n t e r a c t i o n w i t h p r o t e i n s s u c h a s a c t i n - b i n d i n g p r o t e i n , a - a c t i n i n a n d t r o p o m y o s i n . U n d e r r e s t i n g 1 8 c o n d i t i o n s , t h e a c t i n f i l a m e n t s p l a y a s t r u c t u r a l r o l e b y m a i n t a i n i n g t h e d i s c o i d s h a p e o f t h e c e l l a n d t h e r a n d o m d i s t r i b u t i o n o f t h e o r g a n e l l e s t h r o u g h o u t t h e c y t o p l a s m . M y o s i n i n t h e r e s t i n g p l a t e l e t i s u n i f o r m l y d i s t r i b u t e d t h r o u g h o u t t h e c y t o p l a s m . T h e m e m b r a n e s k e l e t o n i n t h e r e s t i n g p l a t e l e t a l s o c o n t r i b u t e s t o t h e m a i n t e n a n c e o f p l a t e l e t s h a p e a s w e l l a s p l a y i n g a n i m p o r t a n t r o l e i n s t a b i l i z i n g t h e p l a s m a m e m b r a n e a n d i n c r e a s i n g i t s r e s i s t a n c e t o s h e a r f o r c e s . 1 5 1 T h e m e m b r a n e s k e l e t o n m a y a l s o r e g u l a t e t h e d i s t r i b u t i o n , a n d p o s s i b l y t h e p r o p e r t i e s , o f g l y c o p r o t e i n s w i t h i n t h e p l a s m a m e m b r a n e . P r e l i m i n a r y e v i d e n c e s u g g e s t s t h a t t h e m e m b r a n e s k e l e t o n m a y r e g u l a t e t h e d i s t r i b u t i o n o f G P I b - I X i n t h e p l a s m a m e m b r a n e a n d t h e a b i l i t y o f t h e G P I b c o m p o n e n t o f t h e c o m p l e x t o b i n d t o v o n W i l l e b r a n d f a c t o r . T h e a t t a c h m e n t o f G P I b - I X t o t h e m e m b r a n e s k e l e t o n m a y h e l p t h e a d h e r e n t p l a t e l e t t o r e s i s t t h e s h e a r f o r c e s t o w h i c h i t i s s u b j e c t e d . W h e n p l a t e l e t s a r e a c t i v a t e d , t h e r e i s a r a p i d i n c r e a s e i n a c t i n p o l y m e r i z a t i o n . 1 5 ° T h e c a p p i n g p r o t e i n s o f t h e b a r b e d e n d a r e r e l e a s e d a n d p o l y m e r i z a t i o n c o n t i n u e s u n t i l 7 0 t o 8 0 % o f t h e a c t i n i s p o l y m e r i z e d . T h e e x a c t m e a n s b y w h i c h t h e s e a c t i v a t i o n - i n d u c e d c h a n g e s a r e c o n t r o l l e d a r e n o t k n o w n . T h e f u n c t i o n o f t h e c y t o p l a s m i c a c t i n f i l a m e n t s i s d e t e r m i n e d b y t h e i r a s s o c i a t i o n w i t h p r o t e i n s s u c h a s a - a c t i n i n , t r o p o m y o s i n a n d a c t i n - b i n d i n g p r o t e i n . T h e y m a y b e o r g a n i z e d i n t o l o o s e n e t w o r k s o f f i l a m e n t s a t t h e p e r i p h e r y , r i n g s o f f i l a m e n t s w h i c h c o n s t r i c t a r o u n d c e n t r a l i z i n g g r a n u l e s o r b u n d l e s w i t h i n t h e d e v e l o p i n g f i l o p o d i a . 1 9 M y o s i n b e c o m e s c o n c e n t r a t e d a r o u n d t h e c e n t r a l i z e d g r a n u l e s o f a c t i v a t e d p l a t e l e t s . A s t h e c y t o p l a s m i c C a a ' c o n c e n t r a t i o n i n c r e a s e s d u r i n g p l a t e l e t a c t i v a t i o n , t h e 2 0 k D a m y o s i n l i g h t c h a i n i s p h o s p h o r y l a t e d b y t h e C a 2 + - d e p e n d e n t m y o s i n l i g h t c h a i n k i n a s e a n d t h e m y o s i n b e c o m e s a l m o s t c o m p l e t e l y a s s o c i a t e d w i t h t h e c y t o p l a s m i c a c t i n f i l a m e n t s . ” 3 T h u s , m y o s i n a p p e a r s t o b e a s s o c i a t e d m a i n l y w i t h t h e c e n t r a l i z i n g a c t i n f i l a m e n t s r a t h e r t h a n t h e b u n d l e s i n t h e f i l o p o d i a . T h i s a s s o c i a t i o n m a y b e r e s p o n s i b l e f o r g e n e r a t i n g t h e c o n t r a c t i l e a c t i v i t y n e c e s s a r y f o r t h e s e c r e t i o n o f g r a n u l e c o n t e n t s . “ ’ 3 ' 1 ‘ 5 3 T h e r e i s a l s o e v i d e n c e t h a t t h e a s s o c i a t i o n o f m y o s i n w i t h a c t i n f i l a m e n t s m a y b e i n v o l v e d i n t h e i n i t i a l s h a p e c h a n g e r e s p o n s e o f p l a t e l e t s t o m o s t a g o n i s t s . 1 0 7 C l o t r e t r a c t i o n h a s b e e n p r o p o s e d t o d e p e n d o n t h e a t t a c h m e n t o f a c t i n f i l a m e n t s t o t h e i n t e r n a l d o m a i n o f G P I I b - I I I a a n d t h e a t t a c h m e n t o f f i b r i n c l o t s t o t h e e x t e r n a l d o m a i n o f G P I I b - I I I a . 8 9 C l o t r e t r a c t i o n o c c u r s a s t h e a c t i n - m y o s i n i n t e r a c t i o n i n t h e c e l l t e n d s t o p u l l t h e f i l a m e n t s i n t h e f i l o p o d i a b a c k i n t o t h e c e l l . T h e m e m b r a n e s k e l e t o n r e m a i n s a s s o c i a t e d w i t h t h e p l a s m a m e m b r a n e d u r i n g a c t i v a t i o n a n d m a y b e i n v o l v e d i n p l a t e l e t s h a p e c h a n g e . A f t e r a g g r e g a t i o n h a s o c c u r r e d , t h e m e m b r a n e s k e l e t o n i s d i s r u p t e d b y a c t i v a t i o n o f t h e C a y - d e p e n d e n t p r o t e a s e w h i c h h y d r o l y s e s a c t i n - b i n d i n g p r o t e i n . T h i s r e l e a s e s t h e m e m b r a n e s k e l e t o n f r o m i t s m e m b r a n e a t t a c h m e n t s i t e s a n d m a y b e a p r e r e q u i s i t e f o r t h e a s s o c i a t i o n o f c y t o p l a s m i c a c t i n f i l a m e n t s i n t h e f i l o p o d i a w i t h t h e G P I I b - I I I a c o m p l e x d u r i n g a g g r e g a t i o n . 3 8 5 W i t h t h e r e l e a s e o f G P I b - I X f r o m i t s a t t a c h m e n t t o t h e m e m b r a n e s k e l e t o n , G P I b l o s e s i t s a b i l i t y t o b i n d t o v o n W i l l e b r a n d f a c t o r . 2 0 U n l i k e G P I b - I X a n d s o m e o t h e r m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s , G P I I b - I I I a d o e s n o t a s s o c i a t e w i t h t h e m e m b r a n e s k e l e t o n , b u t w i t h t h e c y t o p l a s m i c a c t i n f i l a m e n t s o f t h e c y t o s k e l e t o n . T h e a s s o c i a t i o n o f G P I I b - I I I a w i t h a c t i n f i l a m e n t s o n l y o c c u r s w h e n a g g r e g a t i o n t a k e s p l a c e ; i t d o e s n o t o c c u r i f f i b r i n o g e n b i n d s t o t h e e x t r a c e l l u l a r d o m a i n o f G P I I b - I I I a b u t a g g r e g a t i o n i s p r e v e n t e d . 3 8 5 ' 5 0 3 I t i s l i k e l y t h a t t h e a b i l i t y o f p l a t e l e t s t o s p r e a d d e p e n d s o n d i s r u p t i o n o f t h e m e m b r a n e c y t o s k e l e t o n w h i c h i n t u r n i s d e p e n d e n t o n t h e a b i l i t y t o a g g r e g a t e a n d a c t i v a t e t h e C a Z I - d e p e n d e n t p r o t e a s e . 1 5 0 ' 5 0 2 T h e r e f o r e , t h e r e a r e t w o m a j o r c y t o s k e l e t a l c h a n g e s w h i c h a r e d e p e n d e n t o n t h e o c c u r r e n c e o f a g g r e g a t i o n : ( l ) t h e a c t i v a t i o n o f t h e C a 2 + - d e p e n d e n t p r o t e a s e w h i c h d e t a c h e s t h e m e m b r a n e s k e l e t o n f r o m t h e p l a s m a m e m b r a n e ; a n d ( 2 ) t h e a s s o c i a t i o n o f G P I I b - I I I a w i t h c y t o p l a s m i c a c t i n f i l a m e n t s . 3 . T h e P l a t e l e t O r g a n e l l e Z o n e T h e t h i r d f u n c t i o n a l z o n e i n t h e p l a t e l e t i s t h e o r g a n e l l e z o n e . T h i s c o n t a i n s g r a n u l e s , e l e c t r o n d e n s e b o d i e s , p e r o x i s o m e s , l y s o s o m e s , g l y c o g e n g r a n u l e s a n d m i t o c h o n d r i a r a n d o m l y d i s p e r s e d i n t h e c y t o p l a s m . ( i ) P l a t e l e t E n e r g y M e t a b o l i s m A l t h o u g h p l a t e l e t s a r e a n u c l e a t e a n d h a v e m i n i m a l a b i l i t y t o s y n t h e s i z e p r o t e i n s , t h e y d o u s e l a r g e a m o u n t s o f e n e r g y i n t h e e x e c u t i o n o f a g o n i s t - i n d u c e d r e s p o n s e s a n d h a v e a w e l l d e v e l o p e d g l y c o l y t i c s y s t e m f o r A T P p r o d u c t i o n . “ “ T h e y c o n t a i n l a r g e s t o r e s o f g l y c o g e n t h a t a r e u t i l i z e d o n e n e r g y d e m a n d a s w e l l a s 2 1 m i t o c h o n d r i a . T h e a v a i l a b i l i t y o f A T P i s e s s e n t i a l f o r p l a t e l e t r e s p o n s e s a n d r e s p o n s e s a r e g r e a t l y i n h i b i t e d i f g l y c o l y s i s o r o x i d a t i v e m e t a b o l i s m i s b l o c k e d , o r i f p l a t e l e t s a r e d e p r i v e d o f g l u c o s e . G l u c o s e m e t a b o l i s m a p p e a r s t o b e t h e m a j o r s o u r c e f o r A T P , b u t o x i d a t i o n o f f a t t y a c i d s a n d a m i n o a c i d s a l s o p r o b a b l y p l a y a n i m p o r t a n t r o l e . ( i i ) S e c r e t a b l e S t o r a g e G r a n u l e s P l a t e l e t s c o n t a i n t h r e e d i s t i n g u i s h a b l e t y p e s o f s e c r e t a b l e s t o r a g e g r a n u l e s : d e n s e g r a n u l e s , a l p h a g r a n u l e s a n d l y s o s o m a l g r a n u l e s . 2 0 1 T h e d e n s e g r a n u l e s o r d e n s e b o d i e s a r e d e n s e i n t h r e e r e s p e c t s : t h e y a r e e l e c t r o n d e n s e , t h e y a r e t h e m o s t o s m i o p h i l i c p l a t e l e t g r a n u l e s a n d t h e y h a v e t h e h i g h e s t s p e c i f i c w e i g h t o f a n y p l a t e l e t o r g a n e l l e . T h e y a r e 2 5 0 t o 3 0 0 n m i n d i a m e t e r a n d s t o r e n u c l e o t i d e s , m e t a l i o n s a n d s e r o t o n i n . W h i l e a l l s p e c i e s s t u d i e d c o n t a i n h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f a d e n o s i n e d i p h o s p h a t e ( A D P ) , a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e ( A T P ) a n d s e r o t o n i n , t h e d i v a l e n t c a t i o n c o n t e n t ( C a 2 + a n d / o r M g ” ) d i f f e r s b e t w e e n s p e c i e s . 3 2 ° H u m a n p l a t e l e t s h a v e a l m o s t e x c l u s i v e l y C a ” ; w h e r e a s m o s t o t h e r s p e c i e s , i n c l u d i n g t h e d o g , h a v e b o t h C a 2 + a n d M g ” . D e n s e g r a n u l e s a l s o c o n t a i n s m a l l e r a m o u n t s o f i n o r g a n i c o r t h o p h o s p h a t e P 1 , i n o r g a n i c p y r o p h o s p h a t e P P 1 , g u a n o s i n e d i p h o s p h a t e ( G D P ) , g u a n o s i n e t r i p h o s p h a t e ( G T P ) a n d c a t e l c h o l a m i n e s . T h e c o n c e n t r a t i o n s o f a d e n i n e n u c l e o t i d e s a n d d i v a l e n t c a t i o n s a r e e x t r e m e l y h i g h a n d t h e g r a n u l e s w o u l d b e o s m o t i c a l l y u n s t a b l e i f t h e s e c o m p o n e n t s w e r e f r e e i n s o l u t i o n . 2 2 I n s t e a d , t h e a d e n i n e n u c l e o t i d e s a n d t h e d i v a l e n t c a t i o n s e x i s t i n l a r g e , i n s o l u b l e c o m p l e x e s 2 5 t o 3 0 k D a i n s i z e i n w h i c h t h e p u r i n e r i n g s o f t h e n u c l e o t i d e s a r e s t a c k e d o n t o p o f e a c h o t h e r a n d p r o b a b l y l i n k e d t o g e t h e r b y r i n g i n t e r a c t i o n s a n d b r i d g e s o f d i v a l e n t c a t i o n s . E x c e p t f o r s e r o t o n i n , t h e d e n s e g r a n u l e c o n t e n t s a r e a l m o s t u n e x c h a n g e a b l e w i t h t h e i r c y t O p l a s m i c c o u n t e r p a r t s . T h e n u c l e o t i d e s e x c h a n g e v e r y s l o w l y w i t h t h e c y t o p l a s m i c p o o l a n d d o 0 5 n o t p a r t i c i p a t e i n e n e r g y m e t a b o l i s m . 2 S e r o t o n i n i s f r e e l y e x c h a n g e a b l e w i t h e x t r a c e l l u l a r s e r o t o n i n . m ” T h e t r a n s p o r t a c r o s s t h e p l a s m a a n d g r a n u l e m e m b r a n e s i s d r i v e n b y a p H g r a d i e n t c r e a t e d b y a n A T P - r e q u i r i n g p r o t o n p u m p i n t h e g r a n u l e m e m b r a n e . T h e u n c h a r g e d s e r o t o n i n c r o s s e s t h e g r a n u l e m e m b r a n e a n d i s p r o t o n a t e d , c r e a t i n g a d o w n h i l l g r a d i e n t a c r o s s t h e g r a n u l e m e m b r a n e . T h e d e n s e g r a n u l e c o n t e n t s a r e s e c r e t e d d u r i n g p l a t e l e t a c t i v a t i o n i n r e s p o n s e t o a p p r o p r i a t e s t i m u l i . A l t h o u g h t h e p r e c i s e m e c h a n i s m b y w h i c h t h i s t a k e s p l a c e i s n o t k n o w n , t h e m o s t w i d e l y h e l d t h e o r y i s t h a t s e c r e t o r y g r a n u l e s c e n t r a l i z e a n d t h e i r c o n t e n t s a r e r e l e a s e d i n t o t h e o p e n c a n a l i c u l a r s y s t e m b y e x o c y t o s i s . 5 ‘ ” A l t e r n a t i v e l y , t h e y m a y m o v e t o t h e p e r i p h e r y o f t h e c e l l w h e r e t h e y u n d e r g o t r a n s i t i o n t o p a r t i c i p a t e i n t h e f o r m a t i o n o f m e m b r a n e - a s s o C i a t e d m u l t i v e s i c u l a r s t r u c t u r e s w h i c h u n d e r g o d i s s o l u t i o n a n d r e l e a s e t h e i r g r a n u l e c o n t e n t s t o t h e e n v i r o n m e n t . 3 8 ° 2 3 T h e m o s t a b u n d a n t o r g a n e l l e s e e n i n t h e p l a t e l e t c y t o p l a s m i s t h e a l p h a g r a n u l e w h i c h m a y o u t n u m b e r t h e d e n s e g r a n u l e s o r a m I n t r a n s m i s s i o n l y s o s o m e s b y a s m u c h a s t e n t o o n e . e l e c t r o n m i c r o g r a p h s , t h e y a p p e a r a s r o u n d o r o v a l v e s i c l e s 3 0 0 t o 5 0 0 n m a c r o s s w i t h a c e n t r a l e l e c t r o n - d e n s e n u c l e o i d s u r r o u n d e d b y a l e s s d e n s e p e r i p h e r a l z o n e . T h e a l p h a g r a n u l e s c o n t a i n t h r e e g r o u p s o f s e c r e t a b l e p r o t e i n s : ( 1 ) p l a t e l e t - s p e c i f i c p r o t e i n s ( p l a t e l e t f a c t o r 4 , p l a t e l e t d e r i v e d g r o w t h f a c t o r , B - t h r o m b o g l o b u l i n ) ; ( 2 ) c o a g u l a t i o n f a c t o r s ( f i b r i n o g e n , f a c t o r V , f a c t o r V I I I - v a n W i l l e b r a n d f a c t o r ) ; a n d ( 3 ) o t h e r p r o t e i n s ( t h r o m b o s p o n d i n , f i b r o n e c t i n , a l b u m i n , a - z - p l a s m i n i n h i b i t o r , h i s t i d i n e - r i c h g l y c o p r o t e i n , h i g h m o l e c u l a r w e i g h t k i n i n o g e n , a l - a n t i - t r y p s i n , c z z - m a c r o g l o b u l i n ) . " ~ ‘ 5 7 T h e c o a g u l a t i o n f a c t o r s a n d o t h e r n o n - p l a t e l e t - s p e c i f i c p r o t e i n s d o n o t d i f f e r f r o m t h e i r p l a s m a c o u n t e r p a r t s , a l t h o u g h p r o t e o l y t i c c l e a v a g e m a y o c c u r d u r i n g o r j u s t a f t e r s e c r e t i o n . P l a t e l e t f a c t o r 4 i s a l o w m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n t h a t i s s e c r e t e d f r o m p l a t e l e t s i n a c o m p l e x w i t h a h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e o g l y c a n c a r r i e r . 2 0 8 W h e n e x p o s e d t o h e p a r i n , t h e c a r r i e r i s d i s s o c i a t e d a n d t h e p l a t e l e t f a c t o r 4 e x e r t s i t s h e p a r i n - n e u t r a l i z i n g a c t i v i t y . P l a t e l e t - d e r i v e d g r o w t h f a c t o r i s a p o t e n t m i t o g e n t h a t i s a b l e t o s t i m u l a t e g r o w t h o f f i b r o b l a s t s , s m o o t h m u s c l e c e l l a n d g l i a l c e l l s . " 1 5 " " 1 ‘ 5 T h e p r o l i f e r a t i v e r e s p o n s e s c h a r a c t e r i s t i c o f w o u n d r e p a i r a r e t h o u g h t t o b e a t t r i b u t e d a t l e a s t i n p a r t t o p l a t e l e t - d e r i v e d g r o w t h f a c t o r . T h e p l a t e l e t 2 4 p l u g f o r m e d a t t h e s i t e o f v e s s e l i n j u r y i n a w o u n d s e c r e t e s p l a t e l e t - d e r i v e d g r o w t h f a c t o r w h i c h m a y a c t i v e l y s t i m u l a t e n e i g h b o r i n g c e l l s t o p r o l i f e r a t e . B - T h r o m b o g l o b u l i n i s p r o b a b l y t h e c l e a v a g e p r o d u c t o f p l a t e l e t b a s i c p r o t e i n . I t h a s a l o w a f f i n i t y f o r h e p a r i n a n d i s a p o t e n t c h e m o t a c t i c a g e n t f o r f i b r o b l a s t s . P l a t e l e t f i b r i n o g e n c o n s t i t u t e s a p p r o x i m a t e l y 8 % o f t o t a l p l a t e l e t p r o t e i n . I t d o e s n o t d i f f e r f r o m p l a s m a f i b r i n o g e n w i t h r e s p e c t t o s i z e , c l o t t a b i l i t y , a f f i n i t y f o r t h e a c t i v a t e d p l a t e l e t f i b r i n o g e n r e c e p t o r o r t h e c a p a c i t y t o s u p p o r t p l a t e l e t a g g r e g a t i o n . ” 5 6 T h r o m b o s p o n d i n i s a h i g h m o l e c u l a r w e i g h t m u l t i f u n c t i o n a l p r o t e i n w h i c h i s a b l e t o i n t e r a c t s p e c i f i c a l l y w i t h m a c r o m o l e c u l e s i m p o r t a n t i n h e m o s t a s i s s u c h a s f i b r i n o g e n , c o l l a g e n a n d h e p a r i n . 2 8 3 " ‘ 8 7 I t p r o m o t e s t h e a g g r e g a t i o n o f b o t h n o n - s t i m u l a t e d a n d s t i m u l a t e d p l a t e l e t s , b u t b y d i f f e r e n t p l a t e l e t s u r f a c e - r e c e p t o r m e c h a n i s m s . T h e p r o p o s e d m e c h a n i s m s f o r s e c r e t i o n o f a l p h a g r a n u l e c o n t e n t s a r e t h e s a m e a s f o r d e n s e g r a n u l e s , a l t h o u g h i t h a s a l s o b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e a l p h a g r a n u l e s m a y f u s e t o g e t h e r b e f o r e e x o c y t o s i s o f a m u l t i - a l p h a - g r a n u l e c o m p l e x . “ 5 6 T h e r e l e a s e o f a l p h a g r a n u l e p r o t e i n s b y a c t i v a t e d p l a t e l e t s i s t h o u g h t t o p l a y a r o l e i n n o r m a l h e m o s t a s i s b y p r o v i d i n g a l o c a l i z e d a r e a o f i n c r e a s e d c o n c e n t r a t i o n o f t h e s e p r o t e i n s , b u t t h e i r p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n h a s n o t y e t b e e n c l e a r l y d e f i n e d . L y s o s o m e s h a v e a s i m i l a r a p p e a r a n c e t o s m a l l a l p h a g r a n u l e s , b u t c a n b e d i f f e r e n t i a t e d b y h i s t o c h e m i c a l t e c h n i q u e s . 2 ° " " ‘ 6 7 T h e y 2 5 c o n t a i n a c i d h y d r o l y s e s w h i c h a r e e n z y m e s w i t h o p t i m a l a c t i v i t y i n t h e p H r a n g e 3 . 5 t o 5 . 5 . T h e s e i n c l u d e a c i d p r o t e a s e s , a c i d g l y c o s i d a s e s , a c i d p h o s p h a t a s e s a n d a r y l s u l f a t a s e s . P l a t e l e t l y s o s o m e s a l s o c o n t a i n p h o s p h o l i p a s e A 1 a n d a h e p a r i n - d e g r a d i n g e n z y m e . I n c o n t r a s t t o t h e d e n s e a n d a l p h a g r a n u l e s , r e l e a s e o f l y s o s o m a l g r a n u l e c o n t e n t s i s p a r t i a l a n d s l o w , e v e n i n r e s p o n s e t o a m a x i m a l s t i m u l u s . D i f f e r e n t p r o p o r t i o n s o f e a c h g r o u p o f a c i d h y d r o l a s e s a r e r e l e a s e d . T h e m e c h a n i s m o f e x o c y t o s i s o f p l a t e l e t l y s o s o m a l c o n t e n t s a n d t h e i r f u n c t i o n i s n o t k n o w n . A l t h o u g h p l a t e l e t s c a n e n g u l f b a c t e r i a , t h e y d o n o t h a v e t h e a b i l i t y t o p h a g o c y t o s e o r e n d o c y t o s e e x t r a c e l l u l a r m a t e r i a l t o d e s t r o y i t . " " 3 2 B a s e d o n t h i s , t h e a c i d h y d r o l a s e - c o n t a i n i n g v e s i c l e s o f p l a t e l e t s a r e n o t t r u e l y s o s o m e s w h i c h c a n f u s e w i t h p h a g o s o m e s t o d e s t r o y t h e p h a g o c y t o s e d m a t e r i a l . H o w e v e r , t h e r e l e a s e d l y s o s o m a l e n z y m e s m a y p l a y a r o l e i n t h e c l e a r i n g o f t h r o m b i , n e u t r a l i z a t i o n o f h e p a r i n a n d t h e i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e . T h e t e r m s t o r a g e p o o l d e f i c i e n c y e n c o m p a s s e s p a t i e n t s w i t h a h e t e r o g e n o u s g r o u p o f d e f i c i e n c i e s i n t h e p l a t e l e t c o n t e n t s o f d e n s e a n d / o r a l p h a g r a n u l e s / “ 3 2 ' 5 ” T h i s g r o u p o f d i s o r d e r s i s c h a r a c t e r i z e d b y a b n o r m a l i t i e s i n p l a t e l e t a g g r e g a t i o n i n d u c e d b y A D P , e p i n e p h r i n e a n d c o l l a g e n . A m i l d t o m o d e r a t e b l e e d i n g d i a t h e s i s a s s o c i a t e d w i t h d e f i c i e n c y o f t h e d e n s e g r a n u l e c o n t e n t s h a s b e e n d e s c r i b e d i n h u m a n p l a t e l e t s a s w e l l a s s e v e r a l a n i m a l s p e c i e s . ” " ’ 0 2 T h e s e c o n d w a v e o f a g g r e g a t i o n i n r e s p o n s e t o A D P a n d e p i n e p h r i n e i s a b s e n t a n d t h e r e s p o n s e t o c o l l a g e n a b s e n t o r m a r k e d l y i m p a i r e d . T h e p l a t e l e t s h a v e a m a r k e d d e c r e a s e i n d e n s e g r a n u l e s a n d t h e t o t a l p l a t e l e t a n d g r a n u l e 2 6 d e n s e g r a n u l e c o n t e n t s a r e d e c r e a s e d . 2 ° ° ' 2 0 1 D e n s e g r a n u l e d e f i c i e n c i e s a r e a s s o c i a t e d w i t h d e f e c t s i n s k i n p i g m e n t a t i o n i n o t h e r i n h e r i t e d d i s o r d e r s s u c h a s C h e d i a k - H i g a s h i s y n d r o m e , H e r m a n s k y - P u d l a k s y n d r o m e a n d t h e W i s k o t t - A l d r i c h s y n d r o m e w h i c h s u g g e s t s t h a t t h e t w o t y p e s o f g r a n u l e s m a y b e i n t e r r e l a t e d i n t e r m s o f g e n e t i c c o n t r o l . T h e a l p h a g r a n u l e c o n t e n t m a y b e d e c r e a s e d i n s o m e c a s e s o f d e n s e g r a n u l e d e f i c i e n c y , o r a l p h a g r a n u l e d e f i c i e n c y m a y e x i s t a s a n i s o l a t e d d e f e c t . T h e g r a y p l a t e l e t s y n d r o m e i s a r a r e i n h e r i t e d d i s o r d e r i n w h i c h t h e p l a t e l e t s h a v e a n i s o l a t e d a b s e n c e o f a l p h a g r a n u l e c o n t e n t s . T h e p l a t e l e t a g g r e g a t i o n r e s p o n s e s t o c o l l a g e n , t h r o m b i n a n d p e r h a p s A D P a r e i m p a i r e d , b u t t h e e x a c t m e c h a n i s m o f t h e p l a t e l e t d y s f u n c t i o n i s u n k n o w n . H o w e v e r , i t d o e s s u g g e s t t h a t t h e s e c r e t e d a l p h a g r a n u l e p r o t e i n s p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n n o r m a l h e m o s t a s i s . 4 . T h e P e r i p h e r a l Z o n e T h e f i r s t t h r e e f u n c t i o n a l z o n e s o f t h e p l a t e l e t , t h e m e m b r a n e s y s t e m , t h e s o l - g e l z o n e a n d t h e p l a t e l e t o r g a n e l l e s , h a v e n o w b e e n d i s c u s s e d . T h e f o u r t h f u n c t i o n a l z o n e i n t h e p l a t e l e t i s t h e p e r i p h e r a l z o n e w h i c h c o n t a i n s : ( 1 ) t h e s u b m e m b r a n o u s z o n e ; ( 2 ) t h e u n i t m e m b r a n e ; a n d ( i i i ) t h e g l y c o c a l y x . ( i ) T h e S u b m e m b r a n o u s Z o n e T h e s u b m e m b r a n o u s z o n e l i e s i m m e d i a t e l y b e n e a t h t h e u n i t m e m b r a n e a n d i s t h e f u n c t i o n a l a r e a w h e r e s i g n a l s f r o m t h e c e l l e x t e r i o r a r e t r a n s l a t e d i n t o t h e c h e m i c a l m e s s a g e s a n d p h y s i c a l 2 7 e v e n t s n e c e s s a r y f o r p l a t e l e t a c t i v a t i o n . I t i s l i n k e d t o t h e u n i t m e m b r a n e a n d t h e g l y c o c a l y x b y t h e t r a n s m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s . ( i i ) T h e U n i t M e m b r a n e T h e m i d d l e l a y e r o f t h e p e r i p h e r a l z o n e i s a t y p i c a l u n i t m e m b r a n e w h i c h f u n c t i o n s t o e s t a b l i s h a p e r m e a b i l i t y b a r r i e r a n d p r o v i d e a m a t r i x i n w h i c h m e m b r a n e p r o t e i n s a r e e m b e d d e d . 1 0 3 T h e a b i l i t y o f m e m b r a n e p h o s p h o l i p i d s t o a s s e m b l e i n t o a f l u i d b i l a y e r d e p e n d s o n t h e p r e s e n c e o f a h y d r o p h i l i c h e a d g r o u p r e g i o n a n d a h y d r o p h o b i c t a i l r e g i o n . T h e h y d r o p h i l i c h e a d g r o u p s t e n d t o o r i e n t a t e t o w a r d s t h e a q u e o u s e n v i r o n m e n t i n t h e c y t o p l a s m o r t h e c e l l e x t e r i o r , w h i l e t h e h y d r o p h o b i c t a i l s o r i e n t a t e t o w a r d t h e n o n - a q u e o u s i n s i d e o f t h e b i l a y e r . A t p h y s i o l o g i c a l t e m p e r a t u r e s , m o s t m e m b r a n e l i p i d s a r e f l u i d . T h i s i s a n i m p o r t a n t r e q u i r e m e n t f o r n o r m a l m e m b r a n e f u n c t i o n . M o s t l i p i d b i l a y e r s a r e a s y m m e t r i c w i t h t h e n e g a t i v e l y - c h a r g e d p h o s p h a t i d y l s e r i n e a n d p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l m o r e o f t e n l o c a t e d o n t h e i n n e r l e a f l e t a n d p h o s p h a t i d y l c h o l i n e m o r e o f t e n l o c a t e d i n t h e o u t e r l e a f l e t o f t h e m e m b r a n e . T h e p l a t e l e t l i p i d b i l a y e r a l s o e x t e n d s t h r o u g h t h e m u l t i p l e c h a n n e l s o f t h e o p e n c a n a l i c u l a r s y s t e m . A s y m m e t r y o f t h e l i p i d b i l a y e r m e a n s t h a t p h o s p h a t i d y l s e r i n e a n d p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l a r e a c c e s s i b l e t o c y t o p l a s m i c p h o s p h o l i p a s e s d u r i n g p l a t e l e t a c t i v a t i o n . M o s t o f t h e m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s a r e i n t e g r a l a n d 2 8 c a n n o t b e s e p a r a t e d f r o m t h e l i p i d b i l a y e r w i t h o u t t h e u s e o f d e t e r g e n t s . H o w e v e r , b e c a u s e l i p i d b i l a y e r s a r e f l u i d , m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s a r e a b l e t o m o v e l a t e r a l l y w i t h i n t h e m e m b r a n e . T h e g l y c o p r o t e i n s a r e a l s o a s y m m e t r i c w i t h t h e c a r b o h y d r a t e m o i e t y f o u n d e x c l u s i v e l y a t t h e e x t e r n a l s u r f a c e o f t h e b i l a y e r . T h e c a r b o h y d r a t e m o i e t i e s h e l p t h e p r o t e i n t o i n t e r a c t w i t h t h e a q u e o u s e n v i r o n m e n t , a s w e l l a s f u n c t i o n a s l e c t i n s a n d p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n c e l l r e c o g n i t i o n . ( i i i ) T h e G l y c o c a l y x I t i s t h e e x t e r i o r c o m p o n e n t o f t h e m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s t h a t m a k e s u p t h e t h i r d a n d o u t e r m o s t l a y e r o f t h e p e r i p h e r a l z o n e , t h e g l y c o c a l y x . T h e c h e m i c a l c o n s t i t u e n t s o f t h e g l y c o c a l y x p r o v i d e t h e r e c e p t o r s f o r s t i m u l i t r i g g e r i n g p l a t e l e t a c t i v a t i o n a n d t h e s u b s t r a t e s n e c e s s a r y f o r a d h e s i o n a n d a g g r e g a t i o n t o o c c u r . P L A T E L E T M E M B R A N E G L Y C O P R O T E I N S A N D H E R I T A B L E D I S O R D E R S T h e m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s a r e o f m a j o r i m p o r t a n c e i n p l a t e l e t 3 8 6 , 4 8 3 f u n c t i o n . T h e s e f u n c t i o n s i n c l u d e m e d i a t i o n o f a d h e s i o n a n d a g g r e g a t i o n , f o r m a t i o n o f r e c e p t o r s f o r e x t r a c e l l u l a r l i g a n d s , r e c o g n i t i o n o f e x t e r n a l p h e n o m e n a a n d b i n d i n g o f c o m p l e m e n t . G l y c o p r o t e i n s a l s o h a v e a r o l e i n m e m b r a n e t r a n s p o r t , a n t i - p r o t e a s e a c t i v i t y , s t a b i l i z a t i o n o f t h e p l a t e l e t s u r f a c e a n d t h e g e n e r a t i o n o f a n t i g e n i c s p e c i f i c i t y a n d c e l l s u r f a c e c h a r g e . T h e m e m b r a n e 2 9 g l y c o p r o t e i n s k n o w n t o m e d i a t e p l a t e l e t a d h e s i o n a n d a g g r e g a t i o n a r e G P I b , G P I I b - I I I a c o m p l e x , G P I a , a n d G P V . G l y c o p r o t e i n I b G l y c o p r o t e i n I b p l a y s a m a j o r r o l e i n p r i m a r y h e m o s t a s i s b y f u n c t i o n i n g a s t h e s u r f a c e r e c e p t o r t h a t m e d i a t e s t h e a t t a c h m e n t o f p l a t e l e t s t o e x p o s e d s u b e n d o t h e l i u m v i a t h e a t t a c h m e n t o f v o n W i l l e b r a n d f a c t o r . T h i s a t t a c h m e n t o c c u r s p r i m a r i l y a t t h e h i g h s h e a r r a t e s t h a t a r e f o u n d i n s m a l l b l o o d v e s s e l s . T h e e x a c t m e c h a n i s m b y w h i c h v o n W i l l e b r a n d f a c t o r b i n d s t o p l a t e l e t s i s n o t c l e a r , b u t i t s e e m s p r o b a b l e t h a t t h e b i n d i n g o f v o n W i l l e b r a n d f a c t o r t o s u b e n d o t h e l i a l c o l l a g e n i n d u c e s a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e t h a t e n a b l e s i t t o b i n d t o G P I b . B i n d i n g o f v o n W i l l e b r a n d f a c t o r i n i t s e l f i s s u f f i c i e n t t o i n d u c e p l a t e l e t a c t i v a t i o n a n d s e c r e t i o n w h i c h i s o f m a j o r i m p o r t a n c e i n r e c r u i t i n g o t h e r p l a t e l e t s t o t h e s i t e o f v e s s e l i n j u r y . G l y c o p r o t e i n I b i s a t w o - c h a i n i n t e g r a l m e m b r a n e s i a l o g l y c o p r o t e i n ( M r s z 1 7 0 k D a ) t h a t a c t s a s a r e c e p t o r f o r v o n W i l l e b r a n d f a c t o r o n p l a t e l e t s . 3 3 . 8 ¢ . 1 7 7 B o t h t h e a - a n d B - s u b u n i t s a r e g l y c o s y l a t e d , b u t m u c h o f t h e b o u n d c a r b o h y d r a t e i s l o c a t e d o n t h e l a r g e r a - s u b u n i t . T h e B - s u b u n i t s p a n s t h e m e m b r a n e a n d i s p h o s p h o r y l a t e d o n i t s c y t o p l a s m i c s e g m e n t . $ 1 9 G l y c o p r o t e i n I b i s t i g h t l y c o m p l e x e d w i t h i n t h e p l a t e l e t m e m b r a n e t o a g l y c o p r o t e i n o f M r - 1 7 - 2 2 k D a w h i c h h a s b e e n i d e n t i f i e d a s G P I X . 3 3 I t a l s o i n t e r a c t s w i t h a c y t o s k e l e t a l p r o t e i n , a c t i n - b i n d i n g p r o t e i n , w h i c h l i n k s i t t o t h e m e m b r a n e s k e l e t o n . ” 8 T h e C a ” - 3 0 d e p e n d e n t p l a t e l e t p r o t e a s e c l e a v e s t h e a - c h a i n o f G P I b t o r e l e a s e a h i g h m o l e c u l a r w e i g h t ( M , - 1 4 0 k D a ) g l y c o p e p t i d e c a l l e d g l y c o c a l i c i n . 5 0 9 T h r o m b i n a l s o b i n d s t o t h e a - c h a i n o f G P I b . ” a H o w e v e r , t h e s i g n i f i c a n c e o f t h i s i n t h r o m b i n - i n d u c e d p l a t e l e t a c t i v a t i o n i s n o t c l e a r a s e v i d e n c e s u g g e s t s t h a t o t h e r r e c e p t o r s f o r t h r o m b i n m a y a l s o b e i n v o l v e d . 3 2 3 B e r n a r d - S o u l i e r s y n d r o m e i s a r a r e , a u t o s o m a l r e c e s s i v e b l e e d i n g d i s o r d e r i n w h i c h p l a t e l e t s l a c k , o r h a v e a s e v e r e d e f i c i e n c y o f , t h e G P I b - I X c o m p l e x a n d G P V . " " ' 1 5 3 ' 3 3 8 T h e h e m o s t a t i c d e f i c i e n c y i s t h e r e s u l t o f t h e i n a b i l i t y o f t h e p l a t e l e t s t o a d h e r e t o e x p o s e d s u b e n d o t h e l i u m . T h e r e s p o n s e o f B e r n a r d - S o u l i e r p l a t e l e t s i s d e l a y e d a n d l e s s s e n s i t i v e t o l o w e r d o s e s o f t h r o m b i n , s u g g e s t i n g t h a t t h e b i n d i n g o f t h r o m b i n t o G P I b c o n t r i b u t e s t o , b u t i s n o t e s s e n t i a l f o r t h e r e s p o n s e o f p l a t e l e t s t o t h r o m b i n . G l y c o p r o t e i n V i s a l s o d e f i c i e n t i n B e r n a r d - S o u l i e r p l a t e l e t s , b u t i t s r e l a t i o n s h i p t o t h e G P I b - X c o m p l e x i s n o t k n o w n . B e r n a r d - S o u l i e r p l a t e l e t s a g g r e g a t e n o r m a l l y 1 n _ 1 1 ; 1 9 i n r e s p o n s e t o a g o n i s t s s u c h a s A D P a n d f i b r i n o g e n b i n d i n g t o t h e G P I I b - I I I a c o m p l e x i s n o r m a l . B e r n a r d - S o u l i e r p l a t e l e t s h a v e b e e n s h o w n t o b i n d 1 2 5 I - v o n W i l l e b r a n d f a c t o r i n a m a n n e r t h a t i s s p e c i f i c , s a t u r a b l e a n d r e v e r s i b l e w h e n a c t i V a t e d b y t h r o m b i n , A D P o r A D P + e p i n e p h r i n e . “ w T h i s i n d i c a t e s t h a t p l a t e l e t s h a v e a t l e a s t o n e o t h e r b i n d i n g s i t e f o r v o n W i l l e b r a n d f a c t o r o t h e r t h a n G P I b , o n e o f w h i c h h a s b e e n i d e n t i f i e d a s G P I I b - I I I a . 3 1 G l y c o p r o t e i n I I b - I I I a G l y c o p r o t e i n I I b - I I I a c o m p l e x e s a r e m a j o r c o m p o n e n t s o f t h e p l a t e l e t p l a s m a m e m b r a n e . 3 6 6 ' 8 ‘ T h e y a r e d i s t r i b u t e d a s C a z l - d e p e n d e n t h e t e r o d i m e r c o m p l e x e s a n d f u n c t i o n a s t h e m a i n r e c e p t o r f o r f i b r i n o g e n a n d o t h e r p r o t e i n s i m p o r t a n t i n p l a t e l e t a g g r e g a t i o n . G l y c o p r o t e i n I I b ( M L - 1 4 5 k D a ) i s c o m p o s e d t w o d i s u l f i d e - l i n k e d a - a n d B - s u b u n i t s . G l y c o p r o t e i n I I I a i s a s i n g l e p o l y p e p t i d e c h a i n ( M r - 9 5 k D a ) w h i c h i s c r o s s - l i n k e d b y i n t r a c h a i n d i s u l f i d e b o n d s . R e d u c t i o n o f t h e d i s u l f i d e b o n d s i n c r e a s e s t h e a p p a r e n t m o l e c u l a r w e i g h t t o 1 1 4 k D a . S e q u e n c i n g s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t G P I I b a n d G P I I I a a r e t h e p r o d u c t s o f s e p a r a t e g e n e s a n d t h e a - a n d B - s u b u n i t s a r e s y n t h e s i z e d a s a c o m m o n p r e c u r s o r t h a t i s t h e n c l e a v e d t o g i v e t h e m a t u r e t w o - c h a i n m o l e c u l e l i n k e d b y d i s u l f i d e b r i d g e s . ‘ 5 1 ' 1 1 9 B o t h g l y c o p r o t e i n s h a v e t h e m a j o r i t y o f t h e i r s t r u c t u r e e x p o s e d o n t h e e x t e r i o r s u r f a c e o f t h e p l a t e l e t a n d r e l a t i v e l y l i t t l e b u r i e d i n t h e m e m b r a n e f n ' G l y c o p r o t e i n 1 1 b i s a s s o c i a t e d w i t h t h e m e m b r a n e v i a t h e B - s u b u n i t a n d c o n t a i n s a n u m b e r o f C a Z I - b i n d i n g d o m a i n s s i m i l a r t o t h o s e o n c a l m o d u l i n . G l y c o p r o t e i n I I I a h a s a m e m b r a n e - c r o s s i n g d o m a i n n e a r t h e C - t e r m i n a l a n d a s h o r t c y t o p l a s m i c s e g m e n t . I n n o n - s t i m u l a t e d p l a t e l e t s a t 3 7 ° C , t h e G P I I b - I l l a c o m p l e x c a n b e d i s s o c i a t e d r e v e r s i b l y b y s h o r t ( < 1 0 m i n u t e s ) i n c u b a t i o n s w i t h e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t a t e ( E D T A ) , w h i l e l o n g e r i n c u b a t i o n s c a u s e d i r r e v e r s i b l e d i s s o c i a t i o n . 1 3 8 I n c o n t r a s t , t h e h e t e r o d i m e r i s n o t d i s s o c i a t e d w i t h E D T A a t r o o m t e m p e r a t u r e o r 4 9 C . T h e c o m p l e x e d f o r m i s n e c e s s a r y f o r t h e e x p r e s s i o n o f f i b r i n o g e n r e c e p t o r s , t h e p l a t e l e t f i b r i n o g e n r e c e p t o r , 3 7 5 - 3 3 1 3 2 d i s s o c i a t e d p r o t e i n s d o n o t b i n d f i b r i n o g e n . T h e p r e s e n c e o f t h e G P I I b - I l l a c o m p l e x o n t h e r e s t i n g p l a t e l e t h a s b e e n e s t a b l i s h e d b y t h e u s e o f m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a g a i n s t G P I I b - I l l a c o m p l e x w h i c h b i n d e q u a l l y w e l l t o r e s t i n g a n d s t i m u l a t e d , p l a t e l e t s . 3 1 3 ” ° T h e G P I I b - I l l a c o m p l e x i s t h e p r e d o m i n a n t f o r m o f t h e s e g l y c o p r o t e i n s i n i n t a c t p l a t e l e t s a n d m o r e c o m p l e x i s e x p o s e d o n t h e s u r f a c e d u r i n g p l a t e l e t a c t i v a t i o n . T h i s m a y b e t h e e f f e c t o f i n c r e a s e d e x p o s u r e o f t h e s u r f a c e - c o n n e c t e d o p e n c a n a l i c u l a r s y s t e m d u r i n g a c t i v a t i o n o r m a y r e p r e s e n t G P I I b - I I I a f r o m t h e a l p h a g r a n u l e m e m b r a n e s t h a t h a s f u s e d w i t h t h e p l a s m a m e m b r a n e a f t e r s e c r e t i o n h a s o c c u r r e d . 1 5 ° ' 5 1 ° T h e G P I I b - I l l a c o m p l e x h a s b e e n d e m o n s t r a t e d t o f u n c t i o n a s t h e P l a t e l e t s f r o m p a t i e n t s w i t h t h e g e n e t i c b l e e d i n g d i s o r d e r G l a n z m a n n ' s t h r o m b a s t h e n i a l a c k o r a r e d e f i c i e n t i n G P I I b - I I I a a n d d o n o t b i n d f i b r i n o g e n o r a g g r e g a t e . 9 ° S e v e r a l m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s d i r e c t e d a g a i n s t G P I I b a n d / o r G P I I I a b l o c k f i b r i n o g e n b i n d i n g a n d p l a t e l e t a g g r e g a t i o n . 9 1 1 2 5 I - l a b e l l e d f i b r i n o g e n h a s a l s o b e e n s h o w n t o b i n d t o G P I I b - I l l a i n c r o s s e d - i m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s a n d b y p h o t o a f f i n i t y l a b e l l i n g H 3 ° J 5 ° P l a t e l e t s p o s s e s s t w o h i g h a n d s i x l o w a f f i n i t y b i n d i n g s i t e s f o r C a 2 + o n t h e i r s u r f a c e w h i c h a r e i n v o l v e d i n G P I I b - I I I a c o m p l e x f o r m a t i o n a n d t h e b i n d i n g o f a d h e s i v e p r o t e i n s . 5 3 E x t r a c e l l u l a r C a 2 + e x i s t s i n r a p i d e q u i l i b r i u m w i t h C a a ' b o u n d t o t h e s u r f a c e a n d i t i s t h o u g h t t h a t t h e r e q u i r e m e n t o f d i v a l e n t c a t i o n s f o r a g g r e g a t i o n a n d C a y ' f o r G P I I b - I l l a c o m p l e x f o r m a t i o n m a y r e f l e c t a r e q u i r e m e n t f o r m e m b r a n e - b o u n d c a ” : E v e n i n t h e p r e s e n c e o f d i v a l e n t c a t i o n s , t h e 3 3 G P I I b - I l l a c o m p l e x o f r e s t i n g p l a t e l e t s d o e s n o t b i n d f i b r i n o g e n . E x p o s u r e o f t h e f i b r i n o g e n r e c e p t o r o n t h e s u r f a c e o f a c t i v a t e d p l a t e l e t s m a y d e p e n d o n c h a n g e s i n t h e c o n f o r m a t i o n o f G P I I b — I l l a a n d / o r c h a n g e s i n t h e m i c r o e n v i r o n m e n t a r o u n d t h e c o m p l e x e s . C h a n g e s i n t h e c o n f o r m a t i o n o f G P I I b - I l l a h a v e b e e n s h o w n t o t a k e p l a c e d u r i n g p l a t e l e t a c t i v a t i o n b y d e v e l o p m e n t o f m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s t h a t b i n d t o t h e G P I I b - I l l a c o m p l e x o f a c t i v a t e d , b u t n o t r e s t i n g p l a t e l e t s . 9 2 ” 3 6 H o w e v e r , t h e m e a n s b y w h i c h f i b r i n o g e n r e c e p t o r e x p r e s s i o n i s i n d u c e d i n p l a t e l e t s r e m a i n s u n c l e a r . T w o r o u t e s i n v o l v i n g i n t r a c e l l u l a r m e s s e n g e r s h a v e b e e n d e m o n s t r a t e d , o n e d e p e n d e n t o n p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s a n d t h e o t h e r a c t i v a t e d b y h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n a n d i n d e p e n d e n t o f p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s . " 3 8 W h i l e b i n d i n g o f f i b r i n o g e n t o G P I I a - I I I a i s e s s e n t i a l f o r a g g r e g a t i o n t o o c c u r , i t a l o n e i s n o t s u f f i c i e n t t o i n d u c e a g g r e g a t i o n . I n o n e s t u d y , a g g r e g a t i o n a n d t h e r e l e a s e r e a c t i o n w e r e c o m p l e t e l y a b o l i s h e d b y t h e c o m b i n a t i o n o f t w o m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s , e v e n a l t h o u g h f i b r i n o g e n b i n d i n g w a s n o r m a l . 3 5 5 T h i s d e m o n s t r a t e s t h a t f i b r i n o g e n b i n d i n g t o t h e p l a t e l e t s u r f a c e a l o n e i s n o t s u f f i c i e n t t o s u p p o r t p l a t e l e t a g g r e g a t i o n a n d t h a t a n a d d i t i o n a l p o s t - f i b r i n o g e n - b i n d i n g e v e n t i s r e q u i r e d . T h e G P I I b - I l l a c o m p l e x i s a m e m b e r o f a f a m i l y o f p r o t e i n s w h i c h f u n c t i o n a s r e c e p t o r s f o r a d h e s i v e p r o t e i n s i n c l u d i n g f i b r i n o g e n , f i b r o n e c t i n a n d v o n W i l l e b r a n d f a c t o r . 1 5 7 ' 3 9 9 F i b r i n o g e n , f i b r o n e c t i n a n d v o n W i l l e b r a n d f a c t o r a l l c o n t a i n t h e p e p t i d e s e q u e n c e A r g - G l y - A s p w h i c h i s i m p o r t a n t i n a d h e s i v e i n t e r a c t i o n s . P l a t e l e t G P I I b - I I I a 3 4 f u n c t i o n s a s a r e c e p t o r f o r t h e A r g - G l y - A s p s e q u e n c e , a l t h o u g h b i n d i n g o f f i b r i n o g e n a n d f i b r o n e c t i n m a y r e q u i r e r e c o g n i t i o n o f a d d i t i o n a l i n f o r m a t i o n f o r o p t i m a l b i n d i n g . T h e b i n d i n g o f f i b r i n o g e n , f i b r o n e c t i n o r v o n W i l l e b r a n d f a c t o r t o G P I I b - I I I a r e q u i r e s a g o n i s t a c t i v a t i o n w h e r e a s t h e b i n d i n g o f t h e A r g - G l y - A s p t r i p e p t i d e d o e s n o t . A l t h o u g h f i b r i n o g e n , f i b r o n e c t i n a n d v o n W i l l e b r a n d f a c t o r e a c h b i n d t o _ G P I I b - I l l a , f i b r i n o g e n i s m u c h m o r e a b u n d a n t i n p l a s m a a n d b i n d s p r e f e r e n t i a l l y w h e n p l a t e l e t s a r e a c t i v a t e d i n t h e p r e s e n c e o f a m i x t u r e o f a d h e s i v e p r o t e i n s . T h e r e f o r e , c r o s s - l i n k i n g o f p l a t e l e t s b y f i b r i n o g e n r e m a i n s t h e m o s t l i k e l y m o d e l o f p l a t e l e t a g g r e g a t i o n . I t i s p o s s i b l e t h a t s e c r e t e d f i b r o n e c t i n , v o n W i l l e b r a n d f a c t o r a n d t h r o m b o s p o n d i n h e l p t o c o n s o l i d a t e t h r o m b u s f o r m a t i o n . G l a n z m a n n ' s t h r o m b a s t h e n i a i s a n a u t o s o m a l r e c e s s i v e b l e e d i n g d i s o r d e r i n w h i c h t h e r e i s a d e f i c i e n c y o r a l t e r e d f u n c t i o n o f t h e p l a t e l e t G P I I b - I l l a c o m p l e x . ° " 1 5 3 ' 3 z ° I t i s c h a r a c t e r i z e d b y t h e a b s e n c e o f a g g r e g a t i o n i n r e s p o n s e t o a l l p h y s i o l o g i c a g o n i s t s . F u n c t i o n a l h e t e r o g e n e i t y o c c u r s i n G l a n z m a n n ' s t h r o m b a s t h e n i a a n d t h e d i s o r d e r i s d i v i d e d i n t o t w o b a s i c s u b g r o u p s . T y p e I p l a t e l e t s c o m p l e t e l y l a c k o r c o n t a i n o n l y t r a c e s o f G P I I b - I I I a a n d d o n o t s u p p o r t c l o t r e t r a c t i o n . S t i m u l a t e d p l a t e l e t s f a i l t o b i n d d e t e c t a b l e a m o u n t s o f f i b r i n o g e n , v o n W i l l e b r a n d f a c t o r o r f i b r o n e c t i n . H o w e v e r , p l a t e l e t a d h e s i o n t o t h e s u b e n d o t h e l i u m a n d b i n d i n g o f v o n W i l l e b r a n d f a c t o r t o G P I b i s n o r m a l . T h e h e m o r r h a g i c t e n d e n c y a r i s e s f r o m f a i l u r e o f t h r o m b u s f o r m a t i o n i n v i v g a s t h e r e s u l t o f t h e i n a b i l i t y o f p l a t e l e t s t o a g g r e g a t e t o e a c h o t h e r a f t e r a d h e s i o n t o t h e s u b e n d o t h e l i u m h a s o c c u r r e d . T y p e I I p l a t e l e t s c o n t a i n g r e a t l y r e d u c e d a m o u n t s o f G P I I b - 3 5 1 1 1 a a n d s u p p o r t s o m e d e g r e e o f c l o t r e t r a c t i o n . T h e c l i n i c a l a n d p l a t e l e t a b n o r m a l i t i e s a r e t h e s a m e a s f o r T y p e I G l a n z m a n n ' s t h r o m b a s t h e n i a . M o r e r e c e n t l y , c a s e s h a v e b e e n r e p o r t e d w h e r e t h e G P I I b - I I I a c o n t e n t o f t h e p l a t e l e t s i s n o r m a l , b u t e x p r e s s i o n o f t h e f u n c t i o n a l f i b r i n o g e n r e c e p t o r i s a b n o r m a l a n d t h e y f a i l t o b i n d f i b r i n o g e n o r a g g r e g a t e i n r e s p o n s e t o a g o n i s t s . 3 6 5 G l y c o p r o t e i n I a M e m b r a n e G P I a i s a l a r g e s i n g l e c h a i n g l y c o s y l a t e d g l y c o p r o t e i n ( M r l - 1 5 3 k D a n o n - r e d u c e d , 1 6 7 k D a r e d u c e d ) t h a t s p a n s t h e p l a t e l e t m e m b r a n e . ° ‘ T h e f u n c t i o n o f G P I a i s n o t c l e a r , b u t i t m a y f u n c t i o n a s a r e c e p t o r f o r c o l l a g e n . A g e n e t i c d e f i c i e n c y o f G P I a h a s b e e n r e p o r t e d a n d f o u n d t o b e a s s o c i a t e d w i t h d e f e c t i v e a g g r e g a t i o n i n r e s p o n s e t o c o l l a g e n . 2 " 6 ' 3 5 6 A d h e r e n c e o f t h e s e p l a t e l e t s t o s u b e n d o t h e l i u m i n a f l o w i n g b l o o d s t r e a m i s d e f e c t i v e , p a r t l y d u e t o a n i n a b i l i t y t o s p r e a d a f t e r t h e i n i t i a l a d h e s i o n v i a v o n W i l l e b r a n d f a c t o r h a d o c c u r r e d . A l t e r n a t i v e l y , G P I a m a y r e p r e s e n t t h e b i n d i n g s i t e f o r a c o f a c t o r o f c o l l a g e n - m e d i a t e d a d h e s i o n s u c h a s f i b r o n e c t i n . R e c e n t l y , i t h a s b e e n r e p o r t e d t h a t w h a t h a s b e e n r e f e r r e d t o a s G P I a i s i n f a c t t w o p r o t e i n s w i t h d i f f e r e n t p r o p e r t i e s . m m G l y c o p r o t e i n I a w a s r e p o r t e d t o b e p o o r l y e x p r e s s e d i n r e s t i n g p l a t e l e t s r e l a t i v e t o s t i m u l a t e d p l a t e l e t s . T w o - d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s s e p a r a t e d t h e G P I a i n t o t w o d i f f e r e n t p r o t e i n s o f t h e s a m e m o l e c u l a r m a s s . O n e o f t h e s e g l y c o p r o t e i n s w a s o n l y e x p o s e d o n t h e p l a t e l e t s u r f a c e a f t e r a c t i v a t i o n a n d w a s a l s o p r e s e n t i n t h e s u p e r n a t a n t w i t h o t h e r g r a n u l e c o n t e n t s . I t w a s f o u n d t o b e s t r o n g l y a s s o c i a t e d w i t h t h e 3 6 c y t o s k e l e t o n . B o t h p r o t e i n s d e s c r i b e d a s G P I a a r e i n v o l v e d i n c o l l a g e n - i n d u c e d a c t i v a t i o n , b u t i t i s t h e a c t i v a t i o n - d e p e n d e n t G P I a w h i c h h a s b e e n d e s c r i b e d i n g e n e t i c d e f i c i e n c i e s . 2 " 6 ' 3 2 6 G l y c o p r o t e i n s I V , I X , V , I c - I I a a n d G M P - 1 4 0 O t h e r i d e n t i f i e d , b u t l e s s w e l l - c h a r a c t e r i z e d , g l y c o p r o t e i n s i n c l u d e G P I V , G P I X , G P V a n d G P I c - I I a . G l y c o p r o t e i n I V i s a s i n g l e c h a i n p o l y p e p t i d e ( M r t - 8 8 k D a ) w h i c h m a y a c t a s t h e t h r o m b o s p o n d i n r e c e p t o r o n p l a t e l e t s . 1 0 G l y c o p r o t e i n I X i s a s m a l l ( M , - ' 1 7 - 2 2 k D a ) s u r f a c e g l y c o p r o t e i n p r e s e n t i n t h e p l a t e l e t p l a s m a m e m b r a n e i n a 1 : 1 n o n - c o v a l e n t c o m p l e x w i t h G P I b . " 1 8 T h e f u n c t i o n o f G P I X i s u n k n o w n a n d i t s e f f e c t , i f a n y , o n t h e f u n c t i o n o f G P I b i s a l s o u n k n o w n . G l y c o p r o t e i n V i s a s i a l o g l y c o p r o t e i n ( M r i - 8 2 k D a ) t h a t i s t h e p r i m e c a n d i d a t e f o r t h e p r o t e o l y t i c s u b s t r a t e o f t h r o m b i n o n p l a t e l e t s . 5 m ' I t i s r e a d i l y c l e a v e d b y p r o t e a s e s , i n c l u d i n g t h r o m b i n , t o r e l e a s e a 6 9 k D a w a t e r - s o l u b l e p i e c e ( G P V n ) . 5 2 8 A l t h o u g h i t i s c l e a v e d b y t h r o m b i n , i t d o e s n o t a p p e a r t o b e t h e t h r o m b i n r e c e p t o r a n d a d e f i n i t i v e r o l e f o r G P V h a s n o t y e t b e e n f o u n d . I t i s a l s o d e f i c i e n t i n t h e B e r n a r d - S o u l i e r s y n d r o m e . T h e G P I c - I I a c o m p l e x c o n s i s t s o f t w o p r o t e i n s o f M r - 1 6 0 a n d 1 3 8 k D a ( n o n - r e d u c e d ) w h i c h a r e p r e s e n t a s a h e t e r o d i m e r o n n o r m a l a n d G l a n z m a n n ' s t h r o m b a s t h e n i a p l a t e l e t s . 3 8 7 I t h a s b e e n f o u n d t o m e d i a t e t h e a d h e s i o n o f p l a t e l e t s t o f i b r o n e c t i n - c o a t e d s u r f a c e s a n d t h e r e f o r e r e p r e s e n t s a f u n c t i o n a l f i b r o n e c t i n r e c e p t o r . A s f i b r o n e c t i n i s a c h i e f c o m p o n e n t o f t h e s u b e n d o t h e l i a l m a t r i x , G P I c - I I a m a y p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e a d h e s i o n o f p l a t e l e t s t o t h e s u b e n d o t h e l i u m a t t h e s i t e o f b l o o d v e s s e l i n j u r y . 3 7 A n i n t e g r a l m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n , G M P - 1 4 0 , t h a t i s l o c a t e d i n s e c r e t o r y s t o r a g e g r a n u l e s h a s b e e n d e s c r i b e d i n p l a t e l e t s a n d v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s . 2 3 5 " 3 2 1 I n p l a t e l e t s , G M P - 1 4 0 i s l o c a t e d i n t h e a - g r a n u l e m e m b r a n e w h e r e i t i s a h e a v i l y g l y c o s y l a t e d p r o t e i n w i t h a l a r g e c y t o p l a s m i c d o m a i n . I t r e d i s t r i b u t e s t o t h e p l a s m a m e m b r a n e d u r i n g d e g r a n u l a t i o n a n d i s o n l y d e t e c t a b l e o n t h e p l a s m a m e m b r a n e a f t e r t h e s e c r e t o r y r e s p o n s e . T h e f u n c t i o n o f G M P - 1 4 0 i s n o t k n o w n , b u t i t s s t r u c t u r e i s c o m p a t i b l e w i t h a r e c e p t o r f u n c t i o n . O t h e r g l y c o p r o t e i n s i n t h e p l a s m a m e m b r a n e a c t a s r e c e p t o r s f o r e x t e r n a l l i g a n d s , b u t t h e y a r e o f t e n q u a n t i t a t i v e l y m i n o r g l y c o p r o t e i n s w h i c h h a v e o n l y b e e n c h a r a c t e r i z e d b y t h e i r i n t e r a c t i o n w i t h t h e l i g a n d . T H E B A S I C P L A T E L E T R E S P O N S E T h e f o r m a t i o n o f a p l a t e l e t p l u g i n r e s p o n s e t o b l o o d v e s s e l i n j u r y i n v o l v e s s e v e r a l s t e p s k n o w n a s t h e b a s i c p l a t e l e t r e s p o n s e : t h e a d h e s i o n o f p l a t e l e t s t o s i t e s o f v a s c u l a r i n j u r y , s h a p e c h a n g e , a g g r e g a t i o n o f o t h e r p l a t e l e t s o n t h e a d h e r e n t l a y e r a n d s e c r e t i o n o f g r a n u l e c o n t e n t s a n d l i b e r a t i o n o f a r a c h i d o n a t e w h i c h a i d i n t h e r e c r u i t m e n t o f a d d i t i o n a l p l a t e l e t s . 2 “ ’ " ‘ 3 5 " ' 6 7 T h e r e v e r s i b l e r e s p o n s e s o f a d h e s i o n , s h a p e c h a n g e a n d p r i m a r y a g g r e g a t i o n a r e p r o b a b l y i n v o l v e d i n t h e r e p a i r o f v e r y s m a l l d e f e c t s a n d m a i n t e n a n c e o f t h e v a s c u l a r s y s t e m . T h e r e l e a s e r e a c t i o n a n d s e c o n d a r y a g g r e g a t i o n a r e i r r e v e r s i b l e r e s p o n s e s i n v o l v e d i n t h e h e m o s t a t i c f u n c t i o n o f p l a t e l e t s a n d t h e i n i t i a t i o n o f t h r o m b o s i s . 3 8 A d h e s i o n R e s t i n g p l a t e l e t s t e n d t o a d h e r e t o a l m o s t a n y f o r e i g n s u r f a c e t o w h i c h t h e y a r e e x p o s e d . 3 7 2 I n t h e a b s e n c e o f c o l l a g e n f i b r i l s o r o t h e r p l a t e l e t s t i m u l a n t s , t h e s e p l a t e l e t s m a y n o t b e a c t i v a t e d a n d m a y r e m a i n a d h e r e d t o t h e s u r f a c e o r d e t a c h , a l t h o u g h s o m e d e g r e e o f a c t i v a t i o n f r e q u e n t l y o c c u r s . I n c o n t r a s t , a d h e r e n c e o f p l a t e l e t s t o e x p o s e d s u b e n d o t h e l i u m w i t h i n t h e v a s c u l a r s y s t e m a t h i g h f l o w a n d s h e a r r a t e s i s a c c o m p a n i e d b y f u r t h e r a c t i v a t i o n o f t h e p l a t e l e t s a n d i n i t i a t i o n o f t h e h e m o s t a t i c p r o c e s s . 1 8 K n o w l e d g e o f t h e p r o c e s s o f a d h e s i o n h a s b e e n g r e a t l y a i d e d b y s t u d y o f t w o c o n g e n i t a l b l e e d i n g d i s o r d e r s , B e r n a r d - S o u l i e r s y n d r o m e a n d v o n W i l l e b r a n d ' s d i s e a s e . I n b o t h o f t h e s e , t h e r e i s a m a r k e d d e c r e a s e i n t h e a b i l i t y o f p l a t e l e t s t o a d h e r e t o s u b e n d o t h e l i u m . 1 5 3 ' “ 2 S i n c e B e r n a r d - S o u l i e r p l a t e l e t s l a c k G P I b , i t i s a s s u m e d t h a t G P I b p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n p l a t e l e t a d h e s i o n . ‘ 1 9 A s i m i l a r d e f e c t i n a d h e s i o n i s i n d u c e d b y m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s t o G P I b . P l a t e l e t s i n v o n W i l l e b r a n d d i s e a s e c o n t a i n n o r m a l G P I b , b u t d o n o t a d h e r e n o r m a l l y u n l e s s e x o g e n o u s v o n W i l l e b r a n d f a c t o r i s a d d e d . T h e a d h e s i o n d e f e c t c a n b e r e p r o d u c e d b y i n c u b a t i o n w i t h a m o n o c l o n a l a n t i b o d y t o v o n W i l l e b r a n d f a c t o r . 2 1 3 T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t b o t h v o n W i l l e b r a n d f a c t o r a n d G P I b a r e n e c e s s a r y f o r n o r m a l p l a t e l e t a d h e s i o n . T h e r o l e o f v o n W i l l e b r a n d f a c t o r i n p l a t e l e t a d h e s i o n i s m a d e m o r e c o m p l e x b y i t s a b i l i t y t o b i n d t o b o t h G P I b a n d G P I I b - 1 1 1 a . A s d e s c r i b e d a b o v e , i t s e e m s p r o b a b l e t h a t b i n d i n g o f v o n W i l l e b r a n d f a c t o r t o s u b e n d o t h e l i a l f i b r i l l a r c o l l a g e n , o r p o s s i b l y o t h e r 3 9 s u b e n d o t h e l i a l m a c r o m o l e c u l e s , i n d u c e s a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e t h a t e n a b l e s i t t o b i n d t o G P I b . T h i s i n d u c e s p l a t e l e t a c t i v a t i o n a n d s e c r e t i o n w h i c h i s o f m a j o r i m p o r t a n c e i n r e c r u i t i n g o t h e r p l a t e l e t s t o t h e s i t e o f v e s s e l i n j u r y . T h e i d e n t i t y o f t h e s u b e n d o t h e l i a l m o l e c u l e ( s ) r e c o g n i z e d b y p l a t e l e t s h a s n o t b e e n p o s i t i v e l y i d e n t i f i e d , a l t h o u g h f i b r i l l a r c o l l a g e n i s t h e m o s t p r o b a b l e c a n d i d a t e . F i b r i l l a r c o l l a g e n s i n t h e b l o o d v e s s e l w a l l a r e t h e m o s t t h r o m b o g e n i c o f t h e v e s s e l w a l l m a c r o m o l e c u l e s . T h e m a i n c o l l a g e n o u s s p e c i e s o f t h e v e s s e l w a l l a r e t y p e I a n d t y p e I I I , b o t h o f w h i c h a r e s t r o n g i n d u c e r s o f p l a t e l e t a g g r e g a t i o n . 3 8 6 N o n - c o l l a g e n o u s m i c r o f i b r i l s h a v e a l s o b e e n s h o w n t o i n t e r a c t w i t h p l a t e l e t s t o i n d u c e a g g r e g a t i o n t h a t i s d e p e n d e n t o n t h e p r e s e n c e o f G P I b a n d v o n W i l l e b r a n d f a c t o r . 1 2 8 ' 2 8 6 G l y c o p r o t e i n I a h a s b e e n i d e n t i f i e d a s a p r o b a b l e c o l l a g e n r e c e p t o r i n p l a t e l e t s a n d i t s c o n g e n i t a l a b s e n c e i s a s s o c i a t e d w i t h t h e f a i l u r e o f c o l l a g e n - i n d u c e d a g g r e g a t i o n a n d a d h e s i o n . 2 " 6 ' 3 5 6 V o n W i l l e b r a n d f a c t o r h a s a l s o b e e n r e p o r t e d t o m e d i a t e c o l l a g e n - p l a t e l e t i n t e r a c t i o n . 3 “ I t w a s p r o p o s e d t h a t v o n W i l l e b r a n d f a c t o r b i n d s t o c o l l a g e n w h i c h t h e n i n t e r a c t s w i t h i t s p l a t e l e t r e c e p t o r , p r o b a b l y G P I a . A c t i v a t i o n o f p l a t e l e t s a n d e x p o s u r e o f G P I I b - I I I a w i t h b i n d i n g o f v o n W i l l e b r a n d f a c t o r t o G P I I b - I I I a t h e n f o l l o w s . T h e i n i t i a l p h a s e o f a d h e s i o n i s t h e c o n t a c t p h a s e . T h i s i s f o l l o w e d b y t h e s p r e a d i n g p h a s e i n w h i c h t h e r e i s g r e a t e r m e m b r a n e c o n t a c t b e t w e e n t h e p l a t e l e t a n d t h e s u r f a c e . T h e p r o c e s s o f a d h e s i o n c a u s e s a c t i v a t i o n i n m u c h t h e s a m e w a y a s a s t r o n g a g o n i s t d o e s . A t h r e e - s t e p m o d e l f o r p l a t e l e t a d h e s i o n h a s b e e n p r o p o s e d . 3 8 6 T h e f i r s t s t e p i s 4 0 t h e b i n d i n g o f v o n W i l l e b r a n d f a c t o r t o t h e s u b e n d o t h e l i u m . T h e s e c o n d s t e p , p l a t e l e t c o n t a c t , o c c u r s w h e n v o n W i l l e b r a n d f a c t o r b i n d s t o G P I b . T h e t h i r d s t e p , p l a t e l e t s p r e a d i n g a n d t h r o m b u s f o r m a t i o n , i s d e p e n d e n t u p o n v o n W i l l e b r a n d f a c t o r b i n d i n g t o G P I I b - I l l a a f t e r c o l l a g e n h a s b o u n d t o G P I a . A s t h i s s t e p i s n o t i n h i b i t e d b y f i b r i n o g e n , i t i s p o s s i b l e t h a t r e l e a s e d p l a t e l e t v o n W i l l e b r a n d f a c t o r h a s a h i g h e r a f f i n i t y f o r G P I I b - I I I a t h a n p l a s m a v o n W i l l e b r a n d f a c t o r . S h a p e C h a n g e T h e f i r s t a c t i v e r e s p o n s e o f p l a t e l e t s t o s t i m u l i i s s h a p e c h a n g e . 2 0 7 T h e y u n d e r g o a r a p i d c h a n g e i n s h a p e f r o m s m o o t h , d i s c o i d c e l l s t o b e c o m e r e l a t i v e l y s p h e r i c a l w i t h l o n g p s e u d o p o d s a s w e l l a s b l u n t e r p r o t r u s i o n s . 5 ° “ T h i s r e s p o n s e i s v e r y r a p i d , r e q u i r e s m e t a b o l i c e n e r g y a n d i s i n d e p e n d e n t o f e x t e r n a l C a m ’ a n d f i b r i n o g e n . S h a p e C h a n g e i s a s s o c i a t e d w i t h t h e p o l y m e r i z a t i o n o f c y t o p l a s m i c a c t i n a n d , p o s s i b l y , b r e a k d o w n o f t h e m i c r o t u b u l e b a n d . T h e i n t e r n a l o r g a n e l l e s , i n c l u d i n g t h e g r a n u l e s , a r e m o v e d t o w a r d s t h e c e n t e r o f t h e c e l l a s t h e c i r c u m f e r e n t i a l b a n d o f m i c r o t u b u l e s a n d f i l a m e n t o u s m a t r i x o f t h e s o l - g e l z o n e c o n s t r i c t . I n f u l l y a c t i v a t e d c e l l s , t h e o r g a n e l l e s a r e c l u m p e d t o g e t h e r i n t h e c e n t e r o f t h e c e l l , s u r r o u n d e d b y a r i n g o f m i c r o t u b u l e s a n d f i l a m e n t s . S h a p e c h a n g e c a n a l s o b e i n d u c e d b y e x p o s u r e t o l o w t e m p e r a t u r e s o r a n t i m i t o t i c a g e n t s s u c h a s v i n c r i s t i n e . I n t h e s e c i r c u m s t a n c e s , t h e s h a p e c h a n g e i s i n d u c e d b y b r e a k d o w n o f t h e m i c r o t u b u l e r i n g a n d t h e r e i s n o c e n t r a l i z a t i o n o f t h e o r g a n e l l e s . 4 1 A g g r e g a t i o n T h e n e x t r e s p o n s e o f p l a t e l e t s t o s t i m u l i i s a g g r e g a t i o n . A g g r e g a t i o n r e q u i r e s f i b r i n o g e n , e x p o s u r e o f f i b r i n o g e n r e c e p t o r s o n t h e p l a t e l e t s u r f a c e , e x t r a c e l l u l a r C a ” a n d / o r M g 2 + a n d p l a t e l e t t o p l a t e l e t c o l l i s i o n . F i b r i n o g e n b i n d s t o G P I I b - I l l a o n l y a f t e r t h e c e l l h a s b e e n a c t i v a t e d b y a n a g o n i s t . I t a p p e a r s t h a t p l a t e l e t a c t i v a t i o n i s a s s o c i a t e d w i t h a c h a n g e i n t h e G P I I b - I I I a c o m p l e x , p r o b a b l y c o n f o r m a t i o n a l i n n a t u r e , t h a t r e s u l t s i n t h e e x p o s u r e o f f i b r i n o g e n b i n d i n g s i t e s t h a t h a d n o t b e e n f u n c t i o n a l i n t h e r e s t i n g s t a t e . 9 1 " " 3 6 T h e b i n d i n g o f f i b r i n o g e n t o i t s r e c e p t o r i s s p e c i f i c , s a t u r a b l e a n d ‘ n o t a f f e c t e d b y t e m p e r a t u r e s o v e r t h e r a n g e l O - 3 7 ° C b u t i s i n h i b i t e d b y c h e l a t i o n o f C a 2 + a n d / o r M g ” , m e t a b o l i c i n h i b i t o r s , p r o s t a g l a n d i n E 1 o r a n a c i d i c p H o f < 6 . 5 . 3 8 1 T h e m e a n s b y w h i c h f i b r i n o g e n s u p p o r t s p l a t e l e t - t o - p l a t e l e t a g g r e g a t i o n i s s t i l l n o t c o n c l u s i v e l y p r o v e n . T h e m o s t w i d e l y a c c e p t e d t h e o r y i s t h a t f i b r i n o g e n , b y v i r t u e o f i t s d i m e r i c s t r u c t u r e , i s a b l e t o b r i d g e b e t w e e n t h e f i b r i n o g e n r e c e p t o r s o n t w o a d j a c e n t p l a t e l e t s . ° ° I n s u p p o r t o f t h i s t h e o r y i s t h e i n h i b i t i o n o f a g g r e g a t i o n a t v e r y h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f f i b r i n o g e n . 3 8 1 I n a n o t h e r s t u d y , f i b r i n o g e n - l a b e l l e d c o l l o i d a l g o l d w a s u s e d i n c o n j u n c t i o n w i t h p l a t e l e t w h o l e m o u n t p r e p a r a t i o n s t o d i r e c t l y v i s u a l i z e t h e p l a t e l e t r e c e p t o r . “ “ O n s t i m u l a t e d p l a t e l e t s w i t h m a x i m a l b i n d i n g o f f i b r i n o g e n , t h e r e w a s r e d i s t r i b u t i o n o f t h e f i b r i n o g e n r e c e p t o r s t o w a r d t h e c e n t r a l r e g i o n o f t h e c e l l a f t e r b i n d i n g . T h i s c o u l d p r o v i d e a m e c h a n i s m w h e r e b y p l a t e l e t s c o u l d b e d r a w n c l o s e r t o g e t h e r d u r i n g a g g r e g a t i o n . 4 2 I t h a s a l s o b e e n p r o p o s e d t h a t t h e A D P r e c e p t o r p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e b i n d i n g o f f i b r i n o g e n i n r e s p o n s e t o a r a n g e o f a g o n i s t s . 9 3 ‘ T h e p u t a t i v e A D P r e c e p t o r t h a t m e d i a t e s s h a p e c h a n g e a n d a g g r e g a t i o n i s a 1 0 0 k D a m e m b r a n e p r o t e i n l o c a t e d c l o s e t o G P I I b - I l l a a n d w h i c h i n t e r f e r e s w i t h f i b r i n o g e n b i n d i n g . B i n d i n g o f A D P t o t h e 1 0 0 k D a r e c e p t o r p r o d u c e s a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s u c h t h a t i t n o l o n g e r i n t e r f e r e s w i t h t h e b i n d i n g o f f i b r i n o g e n t o G P I I b - I l l a . T h i s c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e c a n b e m i m i c k e d b y p a r t i a l p r o t e o l y s i s o f t h e 1 0 0 k D a p r o t e i n b y c h y m o t r y p s i n o r h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n . “ “ A l t h o u g h f i b r i n o g e n b i n d i n g i s e s s e n t i a l f o r a g g r e g a t i o n t o o c c u r , b i n d i n g o f f i b r i n o g e n i n i t s e l f i s n o t s u f f i c i e n t t o c a u s e a g g r e g a t i o n . F o r e x a m p l e , p l a t e l e t s c h i l l e d t o 4 9 0 b i n d f i b r i n o g e n , b u t d o n o t a g g r e g a t e u n t i l r e w a r m e d . 3 8 0 P l a t e l e t s f i x e d a f t e r s t i m u l a t i o n w i t h A D P b i n d f i b r i n o g e n , b u t d o n o t a g g r e g a t e . T h e s e f i n d i n g s s u g g e s t t h a t m e m b r a n e f l u i d i t y m a y a l s o c o n t r i b u t e t o t h e a b i l i t y o f p l a t e l e t s t o a g g r e g a t e . A r o l e f o r u n i d e n t i f i e d p o s t - f i b r i n o g e n e v e n t s i n a g g r e g a t i o n i s i n d i c a t e d b y t h e i n h i b i t i o n o f a g g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n b y t w o m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s t o G P I I b - I I I a ( A P 3 a n d T a b ) w h i c h d o n o t i n h i b i t f i b r i n o g e n b i n d i n g . “ ” I n a d d i t i o n , p l a t e l e t s t i m u l a t i o n b y a n a g o n i s t i s n o t a l w a y s n e c e s s a r y t o e x p o s e f i b r i n o g e n r e c e p t o r s a n d a l l o w f i b r i n o g e n b i n d i n g . A s d e s c r i b e d a b o v e , i n c u b a t i o n o f p l a t e l e t s a t 4 9 C i n d u c e s f i b r i n o g e n b i n d i n g . I n c u b a t i o n o f p l a t e l e t s w i t h c h y m o t r y p s i n o r d i t h i o t h r e i t o l i n d u c e s f i b r i n o g e n r e c e p t o r e x p o s u r e a n d a g g r e g a t i o n i f s t i r r e d i n t h e p r e s e n c e o f f i b r i n o g e n . 3 5 7 ' 5 3 ° W i t h c h y m o t r y p s i n , 4 3 t h i s i s l i k e l y m e d i a t e d b y p r o t e o l y s i s o f t h e G P I I b - I I I a c o m p l e x i t s e l f o r t h e e n v i r o n m e n t a r o u n d i t . D i t h i o t h r e i t o l i s a r e d u c i n g a g e n t w h i c h p r o b a b l y i n d u c e s f i b r i n o g e n r e c e p t o r e x p o s u r e b y r e d u c t i o n o f m e m b r a n e d i s u l f i d e b o n d s . I n d u c t i o n o f f i b r i n o g e n r e c e p t o r s b y c o l d , c h y m o t r y p s i n o r d i t h i o t h r e i t o l i s n o t i n h i b i t e d b y m e t a b o l i c i n h i b i t o r s , a n t i c y t o s k e l e t a l a g e n t s o r i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f c y c l i c A M P a n d d o e s n o t r e q u i r e t h e c o n t i n u e d p r e s e n c e o f t h e a g e n t . I n _ g i t r g , t w o b a s i c t y p e s o f a g g r e g a t i o n r e s p o n s e s c a n b e i d e n t i f i e d . T h e f i r s t i s p r i m a r y a g g r e g a t i o n w i t h o u t t h e r e l e a s e r e a c t i o n a n d t h e s e c o n d i s s e c o n d a r y , i r r e v e r s i b l e a g g r e g a t i o n a c c o m p a n i e d b y r e l e a s e . A d h e s i o n , s h a p e c h a n g e a n d b i n d i n g o f f i b r i n o g e n a r e a l l p o t e n t i a l l y r e v e r s i b l e p r o c e s s e s . R e v e r s i b l e p r i m a r y a g g r e g a t i o n i s i n d u c e d b y l o w c o n c e n t r a t i o n s o f a g o n i s t s a n d t h e a g g r e g a t i o n a n d d i s a g g r e g a t i o n o f p l a t e l e t s i s a s s o c i a t e d w i t h f i b r i n o g e n b i n d i n g t o a n d d i s s o c i a t i n g f r o m i t s r e c e p t o r . H o w e v e r , i f t h e s t i m u l u s i s s u f f i c i e n t l y s t r o n g , t h e p r i m a r y r e v e r s i b l e a g g r e g a t i o n r e s p o n s e i s f o l l o w e d b y t h e p l a t e l e t r e l e a s e r e s p o n s e a n d s e c o n d a r y i r r e v e r s i b l e a g g r e g a t i o n . “ ° " 6 7 F o r m o s t a g o n i s t s , s e c o n d a r y a g g r e g a t i o n i s a c o n s e q u e n c e o f t h e r e l e a s e r e a c t i o n . T h e R e l e a s e R e s p o n s e T h e p l a t e l e t r e l e a s e r e s p o n s e i n c l u d e s s e c r e t i o n o f g r a n u l e c o n t e n t s a n d t h e l i b e r a t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d f r o m m e m b r a n e p h o s p h o l i p i d s . ” 9 S e c r e t i o n o f a l p h a a n d d e n s e g r a n u l e c o n t e n t s m a y b e i n d u c e d b y a l l k n o w n p h y s i o l o g i c p l a t e l e t a g o n i s t s . L y s o s o m a l s e c r e t i o n o c c u r s o n l y 4 4 i n r e s p o n s e t o s t r o n g a g o n i s t s s u c h a s h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n o r c o l l a g e n . T h e m e c h a n i s m s o f g r a n u l e r e l e a s e h a v e b e e n d i s c u s s e d e a r l i e r a n d i n c l u d e f u s i o n o f t h e g r a n u l e m e m b r a n e w i t h t h e m e m b r a n e o f t h e o p e n c a n a l i c u l a r s y s t e m a n d f o r m a t i o n o f m u l t i v e s i c u l a r s t r u c t u r e s a t t h e p l a s m a m e m b r a n e w h i c h d i s s o l v e t o r e l e a s e t h e g r a n u l e c o n t e n t s t o t h e e n v i r o n m e n t . ” 8 ' 5 0 7 P h y s i o l o g i c a l l y , A D P i s t h e m o s t i m p o r t a n t s u b s t a n c e s e c r e t e d f r o m t h e p l a t e l e t g r a n u l e s b e c a u s e o f t h e p o s i t i v e f e e d b a c k a n d a m p l i f i c a t i o n r o l e i t p l a y s i n p l a t e l e t a c t i v a t i o n b y a g o n i s t s o f w e a k o r i n t e r m e d i a t e s t r e n g t h . 2 0 7 T h e p l a t e l e t r e l e a s e r e a c t i o n i n c l u d e s t h e f o r m a t i o n o f a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s , p r i m a r i l y t h e e n d o p e r o x i d e s a n d t h r o m b o x a n e A 2 ( T x A z ) . L i k e A D P , t h e t h r o m b o x a n e m e t a b o l i t e s p l a y a m a j o r r o l e i n t h e a m p l i f i c a t i o n o f t h e p l a t e l e t r e s p o n s e b y a g o n i s t s o f w e a k o r i n t e r m e d i a t e s t r e n g t h . T h e r e f o r e a m a j o r c o n t r i b u t i o n o f t h e r e l e a s e r e s p o n s e i s t o a m p l i f y t h e r e s p o n s e o f t h e p l a t e l e t t o t h e i n i t i a l s t i m u l u s b y p o s i t i v e f e e d - b a c k l o o p s . H o w e v e r , p o s i t i v e f e e d - b a c k l o o p s a r e n o t i n v o l v e d i n t h e p r i m a r y a n d r e v e r s i b l e p l a t e l e t r e s p o n s e s o f a d h e s i o n , s h a p e c h a n g e a n d p r i m a r y a g g r e g a t i o n . B o t h A D P a n d t h e a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s b i n d t o s p e c i f i c r e c e p t o r s o n t h e p l a t e l e t s u r f a c e t o c a u s e f u r t h e r a c t i v a t i o n o f p l a t e l e t s . T h e e f f e c t o f e a c h o f t h e s e t w o l o o p s c a n b e s t u d i e d b y t h e u s e o f d r u g s w h i c h s e l e c t i v e l y e l i m i n a t e t h e c o n t r i b u t i o n o f e i t h e r l o o p t o p l a t e l e t r e s p o n s e s . T h e A D P - s c a v e n g i n g e n z y m e s ( a p y r a s e , c r e a t i n e p h o s p h o k i n a s e ) o r A D P - r e c e p t o r b l o c k e r s [ A T P , a d e n o s i n e m o n o p h o s p h a t e ( A M P ) ] c a n b e u s e d t o b l o c k t h e e f f e c t s o f A D P . T h e p r o d u c t i o n o f 4 5 e n d o p e r o x i d e s a n d T x A z c a n b e b l o c k e d b y i n c u b a t i o n o f p l a t e l e t s w i t h a c e t y l s a l i c y l i c a c i d ( a s p i r i n ) o r o t h e r r e l a t e d n o n - s t e r o i d a l a n t i - i n f l a m m a t o r y d r u g s w h i c h b l o c k t h e c y c l o o x y g e n a s e c o m p o n e n t o f p r o s t a g l a n d i n e n d o p e r o x i d e s y n t h a s e . 3 3 " " 1 7 P l a t e l e t A g o n i s t s A g o n i s t s a r e c l a s s i f i e d a s " w e a k " , " i n t e r m e d i a t e " o r " s t r o n g " d e p e n d i n g o n t h e i r a b i l i t y t o i n d u c e t h e r e l e a s e r e s p o n s e a n d i r r e v e r s i b l e a g g r e g a t i o n . 8 ° ' “ ' 9 ' 5 3 1 W e a k a g o n i s t s s u c h a s A D P o r e p i n e p h r i n e , c a n n o t i n d u c e i r r e v e r s i b l e a g g r e g a t i o n i n t h e a b s e n c e o f r e l e a s e d A D P o r a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s . S e c r e t i o n o f g r a n u l e c o n t e n t s i n r e s p o n s e t o t h e s e w e a k a g o n i s t s o c c u r s o n l y i n a s s o c i a t i o n w i t h i r r e v e r s i b l e a g g r e g a t i o n a n d i s a b o l i s h e d b y t r e a t m e n t w i t h a g e n t s w h i c h i n h i b i t p r o d u c t i o n o f e n d o p e r o x i d e s a n d T x A z . I n c o n t r a s t , s t r o n g a g o n i s t s ( h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n a n d c o l l a g e n ) c a n i n d u c e i r r e v e r s i b l e a g g r e g a t i o n i n t h e a b s e n c e o f t h e r e l e a s e r e s p o n s e a n d s e c r e t i o n i s n o t d e p e n d e n t o n a g g r e g a t i o n . A g o n i s t s w i t h i n t e r m e d i a t e p o t e n c y [ p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r ( P A F ) , v a s o p r e s s i n , p r o s t a g l a n d i n a n d e n d o p e r o x i d e a n a l o g u e s ] c a n i n d u c e s e c r e t i o n i n d e p e n d e n t l y o f p r i o r a g g r e g a t i o n a n d c y c l o o x y g e n a s e a c t i v i t y , b u t a g g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n a r e i n h i b i t e d i f A D P i s r e m o v e d a n d c y c l o o x y g e n a s e i n h i b i t e d . L o w c o n c e n t r a t i o n s o f s t r o n g a n d i n t e r m e d i a t e a g o n i s t s a c t a s w e a k a g o n i s t s . 4 6 S I G N A L T R A N S D U C T I O N M E C H A N I S M S P h y s i o l o g i c p l a t e l e t a g o n i s t s b i n d t o s p e c i f i c r e c e p t o r s o n t h e p l a t e l e t m e m b r a n e a n d d o n o t c r o s s t h e m e m b r a n e . T h e r e f o r e , t h e y m u s t t r a n s m i t t h e i r s i g n a l a c r o s s t h e p l a s m a m e m b r a n e t o t h e c e l l i n t e r i o r w h e r e i t c a n b e t r a n s l a t e d i n t o i n s t r u c t i o n s f o r t h e p h y s i c a l c h a n g e s o f s h a p e c h a n g e , a g g r e g a t i o n a n d r e l e a s e . I n t h e p l a t e l e t , a s i n m a n y o t h e r c e l l t y p e s , t h e b i n d i n g o f a n a g o n i s t t o i t s r e c e p t o r r e s u l t s i n t h e p r o d u c t i o n o f s e c o n d m e s s e n g e r m o l e c u l e s w h i c h i n i t i a t e a l a r g e n u m b e r o f i n t r a c e l l u l a r e v e n t s . T h e r e a r e t w o m a j o r s e c o n d m e s s e n g e r s y s t e m s , b o t h o f w h i c h f u n c t i o n i n p l a t e l e t s . T h e f i r s t i s t h e h y d r o l y s i s o f m e m b r a n e p h o s p h o i n o s i t i d e s t o g e n e r a t e t w o m a i n s e c o n d m e s s e n g e r s , 1 , 2 - d i a c y l g l y c e r o l ( D A G ) a n d i n o s i t o l 1 , 4 , 5 - t r i s p h o s p h a t e [ ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 ] . A r a c h i d o n i c a c i d i s a l s o r e l e a s e d a s . a c o n s e q u e n c e o f p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s a n d i s o x y g e n a t e d t o f o r m a d d i t i o n a l m e d i a t o r s . T h e s e c o n d s y s t e m i s t h e c y c l i c A M P s y s t e m i n w h i c h r e c e p t o r - i n d u c e d s t i m u l a t i o n o r i n h i b i t i o n o f a d e n y l a t e c y c l a s e c o n t r o l s t h e i n t r a c e l l u l a r l e v e l o f c y c l i c A M P . P h o s p h o i n o s i t i d e H y d r o l y s i s P h o s p h o i n o s i t i d e s a r e t h e t h r e e a n i o n i c g l y c e r o p h o s p h o l i p i d s t h a t c o n t a i n i n o s i t o l i n t h e i r h e a d g r o u p s . 5 3 a n 3 0 5 ' 3 3 1 " 3 3 T h e s e a c i d i c p h o s p h o l i p i d s t e n d t o b e l o c a t e d o n t h e i n n e r l e a f l e t o f m e m b r a n e s a n d c o n s t i t u t e o n l y 2 t o 1 2 % o f t h e t o t a l l i p i d i n c e l l m e m b r a n e s . A m i n o r i t y o f t h e p h o s p h o i n o s i t i d e s c o n t a i n a d d i t i o n a l p h o s p h a t e g r o u p s a s m o n o e s t e r s . P h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 4 - m o n o p h o s p h a t e ( P I P ) h a s a 4 7 p h o s p h a t e g r o u p i n t h e 4 p o s i t i o n o f t h e i n o s i t o l r i n g a n d p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 4 , 5 - b i s p h o s p h a t e ( P I P z ) h a s p h o s p h a t e g r o u p s i n t h e 4 a n d 5 p o s i t i o n s o f t h e i n o s i t o l r i n g . S i m p l i f i e d f o r m u l a s o f t h e p h o s p h o i n o s i t i d e s a r e i l l u s t r a t e d i n F i g u r e l . u v v v v ' w c n z F A : ” " 3 ” “ F M \ / V V W \ I 6 H 2 F l z | fl H “ , 2 - u L ” a “ - P I - P V N F V N A / V C H Z F A Z C H v v v v v w " 0 3 2 - c u z — n - ' r - “ 4 . 2 0 9 0 3 2 ' F i g u r e 1 . S i m p l i f i e d f o r m u l a s o f t h e p h o s p h o i n o s i t i d e s . 3 ° T h e s e p o l y p h o s p h o i n o s i t i d e s a r e i n d y n a m i c e q u i l i b r i u m w i t h e a c h o t h e r a n d t h e i r p a r e n t m o l e c u l e , p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l ( P I ) . T h e y a r e c o n s t a n t l y b e i n g f o r m e d f r o m P 1 b y s p e c i f i c k i n a s e s a n d d e g r a d e d b a c k t o P I b y s p e c i f i c p h o s p h o m o n o e s t e r a s e s a n d a r e i n e q u i l i b r i u m w i t h e a c h o t h e r i n a n e n d l e s s " f u t i l e c y c l e " . 3 0 9 A l t h o u g h t h e y a r e n o t d i r e c t l y i n v o l v e d i n t h e a g o n i s t - i n d u c e d s t i m u l a t i o n o f p h o s p h o i n o s i t i d e m e t a b o l i s m , t h e s e k i n a s e s a n d p h o s p h o m o n o e s t e r a s e s a r e n e v e r t h e l e s s v e r y i m p o r t a n t . F i r s t l y , t h e y a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e r a p i d t u r n o v e r 4 8 o f t h e m o n o e s t e r i f i e d p h o s p h a t e g r o u p s o n t h e p h o s p h o i n o s i t i d e s , a n d s e c o n d l y , t h e y p r o v i d e t h e m e m b r a n e w i t h t h e a p p r o p r i a t e p h o s p h o i n o s i t i d e d i s t r i b u t i o n w h i c h i s r e q u i r e d f o r f u l l c e l l r e s p o n s i v e n e s s . T h e l o c a t i o n o f t h e s e s p e c i f i c e n z y m e s c o r r e l a t e s w i t h t h e l o c a t i o n o f t h e p h o s p h o i n o s i t i d e s . T h e s y n t h e s i s o f P I f r o m f r e e i n o s i t o l p l u s c y t i d i n e d i p h o s p h a t e - d i a c y l g l y c e r o l v i a t h e a c t i v i t y o f P I s y n t h a s e t a k e s p l a c e p r e d o m i n a n t l y i n i n t r a c e l l u l a r m e m b r a n e s s u c h a s t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m o r p l a t e l e t d e n s e t u b u l a r s y s t e m . 1 9 1 ' 2 n " ‘ 3 3 I n c o n t r a s t , t h e p o l y p h o s p h o i n o s i t i d e s a r e c o n s i d e r e d t o b e s i t u a t e d o n t h e c y t o p l a s m i c s i d e o f t h e p l a s m a m e m b r a n e a n d t h e M g Z I - d e p e n d e n t P I a n d P I P k i n a s e s a r e l o c a t e d i n o r a s s o c i a t e d w i t h t h e p l a s m a m e m b r a n e . T h e p h o s p h o m o n o e s t e r a s e s t h a t d e g r a d e t h e p o l y p h o s p h o i n o s i t i d e s a r e M g 2 + - d e p e n d e n t c y t o p l a s m i c e n z y m e s . T r a n s p o r t p r o t e i n s f o r P I h a v e b e e n f o u n d i n t h e c y t o s o l o f s e v e r a l c e l l t y p e s , i n c l u d i n g p l a t e l e t s , a n d m a y p r o v i d e t h e i n t r a c e l l u l a r t r a n s p o r t f o r P I f o r m e d i n t h e m e m b r a n e s o f t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m o r t h e d e n s e t u b u l a r s y s t e m ” : 2 I n m o s t m a m m a l i a n c e l l s , t h e p r e d o m i n a n t p h o s p h o i n o s i t i d e i s P I , f o l l o w e d b y l e s s e r q u a n t i t i e s o f P I P a n d P I P Z . F o r e x a m p l e , i n t h e h u m a n p l a t e l e t , P I , P I P a n d P I P z r e p r e s e n t a p p r o x i m a t e l y 5 , 1 a n d 0 . 3 % , r e s p e c t i v e l y , o f t h e t o t a l m e m b r a n e p h o s p h o l i p i d . z “ " F a t t y a c i d a n a l y s i s o f t h e i n o s i t o l - c o n t a i n i n g p h o s p h o l i p i d s h a s r e v e a l e d t h a t t h e y h a v e a r a t h e r u n i q u e f a t t y a c i d c o m p o s i t i o n . 3 0 1 T h e s n - l - p o s i t i o n o f t h e g l y c e r o l b a c k b o n e i s p r e d o m i n a n t l y o c c u p i e d b y s t e a r i c a c i d a n d t h e s n - 2 - p o s i t i o n o c c u p i e d b y a r a c h i d o n i c a c i d . T h e p r e d o m i n a n c e o f 4 9 a r a c h i d o n i c a c i d i n a p o s i t i o n w h e r e i t c a n b e c l e a v e d b y p h o s p h o l i p a s e A 2 i s o f m a j o r s i g n i f i c a n c e b e c a u s e o f t h e i m p o r t a n c e o f a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s i n p l a t e l e t r e s p o n s e s . T h e l - s t e a r o y l 2 - a r a c h i d o n o y l s p e c i e s r e p r e s e n t s 7 1 m o l p e r c e n t o f t h e P I i n h u m a n p l a t e l e t s c o m p a r e d t o 4 7 m o l p e r c e n t o f p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e a n d 1 0 m o l p e r c e n t o f p h o s p h a t i d y l c h o l i n e . 3 0 1 A s i m i l a r p r e d o m i n a n c e o f t h e l - s t e a r o y l 2 - a r a c h i d o n o y l s p e c i e s w a s f o u n d i n p u r i f i e d P I , P I P a n d P I P z f r o m h u m a n p l a t e l e t m e m b r a n e s . ” l o T r a c e r s t u d i e s u s i n g g l y c e r o l - “ C a n d o r t h o p h o s p h a t e - ” P i n d i c a t e d t h a t n e w l y s y n t h e s i z e d s p e c i e s o f P I c o u l d n o t a c c o u n t f o r t h e p r e d o m i n a n c e o f 1 - s t e a r o y 1 2 - a r a c h i d o n o y l s p e c i e s . 2 0 9 I t i s l i k e l y t h a t a p p r o x i m a t e l y h a l f t h e 1 - s t e a r o y l 2 - a r a c h i d o n o y l s p e c i e s a r e g e n e r a t e d b y w a y o f d e a c y l a t i o n - r e a c y l a t i o n p a t h w a y s . T h e a c y l - C o A : l y s o ( 1 a c y l ) P I t r a n s f e r a s e i n h u m a n p l a t e l e t m i c r o s o m e s e x h i b i t s a s e l e c t i v i t y t o w a r d s a r a c h i d o n y l C o A u z “ ’ T h e r e f o r e , t h e f a t t y a c i d i n t h e s n - 2 p o s i t i o n o n t h e g l y c e r o l b a c k b o n e w o u l d b e r e m o v e d b y a p h o s p h o l i p a s e A 2 a n d t h e p o s i t i o n p r e f e r e n t i a l l y f i l l e d b y a r a c h i d o n i c a c i d . T h e p h o s p h o i n o s i t i d e s s e r v e a s i n t r a m e m b r a n o u s s t o r a g e f o r m s o f m e s s e n g e r m o l e c u l e s t h a t c a n b e ” r e l e a s e d " o r g e n e r a t e d i n r e s p o n s e t o a n a g o n i s t b i n d i n g t o i t s s p e c i f i c r e c e p t o r . 2 “ " 3 0 5 T h e p h o s p h o i n o s i t i d e s b r e a k d o w n r a p i d l y i n r e s p o n s e t o t h e o c c u p a n c y o f s p e c i f i c r e c e p t o r s b y v a r i o u s h o r m o n e s , n e u r o t r a n s m i t t e r s , g r o w t h f a c t o r s a n d o t h e r s t i m u l a n t s . R e c e p t o r o c c u p a n c y i n i t i a t e s p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s b y a p h o s p h o i n o s i t i d e - s p e c i f i c p h o s p h o d i e s t e r a s e , p h o s p h o l i p a s e C , w h i c h c l e a v e s t h e p h o s p h o d i e s t e r 5 0 b o n d b e t w e e n t h e s n - 3 p o s i t i o n c a r b o n o f t h e g l y c e r o l b a c k b o n e a n d t h e i n o s i t o l h e a d g r o u p . T h i s g e n e r a t e s D A G f r o m e a c h o f t h e p h o s p h o i n o s i t i d e s p l u s t h e c o r r e s p o n d i n g i n o s i t o l p h o s p h a t e . T h u s , c l e a v a g e b y p h o s p h o l i p a s e C o f P I , P I P a n d P I P Z g e n e r a t e s i n o s i t o l 1 - p h o s p h a t e [ ( 1 ) 1 P ] , i n o s i t o l 1 , 4 — b i s p h o s p h a t e [ ( 1 , 4 ) I P 2 ] a n d ( l , 4 , 5 ) I P 3 r e s p e c t i v e l y . 3 0 9 ' 3 0 5 T h e D A G c a n b e p h o s p h o r y l a t e d i n t h e s n - 3 p o s i t i o n t o y i e l d p h o s p h a t i d i c a c i d . T h i s c a n b e c o n v e r t e d t o c y t i d i n e d i p h o s p h a t e - d i a c y l g l y c e r o l w h i c h i s r e c y c l e d t o P I v i a t h e a d d i t i o n o f i n o s i t o l . A s i m p l i f i e d v e r s i o n o f t h e m e t a b o l i c p a t h w a y s o f t h e i n o s i t o l - c o n t a i n i n g l i p i d s i s i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 2 . P l a s e B o P l - P z — — — — > I F ; " 9 4 1 l P l - P — — — - — - > W ; + 0 6 " ' % l 1 M P P I E ; ; ; — — r ” I P I n o s i t o l M c n P - n a / < C I P F i g u r e 2 . T h e m e t a b o l i c p a t h w a y s o f t h e i n o s i t o l - c o n t a i n i n g l i p i d s . 3 0 9 G T P - b i n d i n g R e g u l a t o r y P r o t e i n s P h o s p h o l i p a s e C i n p l a t e l e t s s p e c i f i c a l l y h y d r o l y s e s i n o s i t o l - c o n t a i n i n g p h o s p h o l i p i d s a n d i s p r e s e n t i n m e m b r a n e s a n d k n o w n f u n c t i o n 6 0 . 1 6 3 , 2 9 2 , 3 5 2 5 1 c y t o p l a s m . 2 3 ' 2 " " " ’ 9 5 ' 3 0 8 ' 3 1 5 ' " 1 1 ' M 2 T h e s t i m u l a t i o n o f i t s a c t i v i t y b y g u a n i n e n u c l e o t i d e s s u g g e s t s t h a t p h o s p h o l i p a s e C i s r e g u l a t e d b y a G T P - b i n d i n g r e g u l a t o r y p r o t e i n ( G o r N p r o t e i n ) . “ L I L 2 5 T h e G p r o t e i n s a r e a g r o w i n g f a m i l y o f c l o s e l y r e l a t e d r e g u l a t o r y p r o t e i n s , a l t h o u g h a t t h i s t i m e o n l y t h r e e o f t h e m h a v e b o t h a d e f i n e d s t r u c t u r e a n d a T h e y a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e t r a n s m i s s i o n o f i n f o r m a t i o n f r o m m a n y m e m b r a n e - b o u n d r e c e p t o r s t o t h e i r i n t r a c e l l u l a r e f f e c t o r s . I n g e n e r a l , G p r o t e i n s r e g u l a t e t h e a c t i v i t y o f s p e c i f i c e f f e c t o r s s u c h a s e n z y m e s o r i o n c h a n n e l s i n t h e p l a s m a m e m b r a n e . T h e G p r o t e i n s y s t e m o p e r a t e s f o r a w i d e r a n g e o f c e l l f u n c t i o n s i n c l u d i n g v i s i o n , o l f a c t i o n , c o n t r o l o f c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d c e l l u l a r r e g u l a t i o n b y a h o s t o f h o r m o n e s , n e u r o t r a n s m i t t e r s a n d s t i m u l a n t s . T h e G p r o t e i n s h a v e s e v e r a l c o m m o n p r o p e r t i e s i n c l u d i n g a n o l i g o m e r i c s t r u c t u r e , G T P - b i n d i n g a c t i v i t i e s a n d G T P a s e a c t i v i t i e s . 1 6 3 ' 2 " 2 A l l h a v e a c o m m o n h e t e r o t r i m e r i c s t r u c t u r e w i t h t h e t h r e e p r o t e i n s u b u n i t s b e i n g d e s i g n a t e d a , B a n d Y , i n o r d e r o f d e c r e a s i n g m a s s . T h e d i f f e r e n t G p r o t e i n s h a v e q u i t e a l o t o f s t r u c t u r a l s i m i l a r i t y , a l t h o u g h t h e i r a m i n o a c i d s e q u e n c e s d i f f e r a n d s p e c i f i c a n t i b o d i e s c a n d i f f e r e n t i a t e b e t w e e n t h e m . T h e a - s u b u n i t s a p p e a r t o b e d i f f e r e n t f o r e a c h t y p e o f G p r o t e i n t h a t h a s s o f a r b e e n i d e n t i f i e d . ‘ " " ' 1 6 3 T h e y h a v e a p p a r e n t m o l e c u l a r w e i g h t s o f 3 9 t o 5 1 k D a b y s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( S D S - P A G E ) a n d c o n t a i n t h e s i t e s f o r g u a n i n e n u c l e o t i d e b i n d i n g a n d h y d r o l y s i s a n d p o s s i b l y t h e s i t e s f o r i n t e r a c t i o n w i t h r e c e p t o r s a n d e f f e c t o r s . T h e B — s u b u n i t s a r e v e r y s i m i l a r w i t h a p p a r e n t m o l e c u l a r w e i g h t s o f 3 5 o r 3 6 k D a . T h e Y - 5 2 s u b u n i t s u s u a l l y h a v e m o l e c u l a r w e i g h t s o f 8 t o 1 0 k D a , b u t t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e y - s u b u n i t s o f t h e d i f f e r e n t G p r o t e i n s i s n o t y e t c l e a r , p a r t l y b e c a u s e t h e y a r e d i f f i c u l t t o s e p a r a t e f r o m t h e B - s u b u n i t s u n d e r n o n - d e n a t u r i n g c o n d i t i o n s . T h e B - Y c o m p l e x m a y f u n c t i o n p a r t l y t o a n c h o r t h e i n t a c t G p r o t e i n t o t h e p l a s m a m e m b r a n e . 2 9 7 T h e i n a c t i v e s t a t e o f a n i n d i v i d u a l G p r o t e i n i s t h e o l i g o m e r w i t h G D P b o u n d t o t h e a - s u b u n i t ( G D P - a B Y ) . U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , t h e r a t e o f d i s s o c i a t i o n o f G D P f r o m t h e c o m p l e x i s e x t r e m e l y s l o w . W h e n i t i s s o l u b i l i z e d f r o m m e m b r a n e s , G D P - a B Y b e h a v e s a s a m o n o m e r o f a p p r o x i m a t e l y 1 0 0 k D a . " 6 6 W h e n a n a g o n i s t b i n d s t o i t s r e c e p t o r , i n t e r a c t i o n o f t h e G p r o t e i n w i t h t h e a g o n i s t - r e c e p t o r c o m p l e x p r o m o t e s d i s s o c i a t i o n o f G D P f r o m t h e a - s u b u n i t a n d p e r m i t s t h e b i n d i n g o f G T P , w h i c h i s t h e m o r e p r e v a l e n t c e l l u l a r g u a n i n e n u c l e o t i d e . T h e b i n d i n g o f G T P a l t e r s t h e a - s u b u n i t i n s o m e w a y , p o s s i b l y c o n f o r m a t i o n a l , s u c h t h a t i t d i s s o c i a t e s f r o m t h e c o m p l e x . I t a l s o c a u s e s a d e c r e a s e i n a f f i n i t y o f t h e a g o n i s t f o r i t s r e c e p t o r . I t i s t h e d i s s o c i a t e d a - G T P s u b u n i t t h a t a c t i v a t e s t h e n e x t s t a g e i n t h e c o m m u n i c a t i o n p a t h w a y i n w h i c h t h e f u n c t i o n o f a n e f f e c t o r , s u c h a s p h o s p h o l i p a s e C , i s m o d u l a t e d . T h e m e c h a n i s m b y w h i c h t h i s m o d u l a t i o n o c c u r s i s n o t k n o w n . T h e e f f e c t i s t e r m i n a t e d b y t h e s l o w h y d r o l y s i s o f t h e G T P t o G D P b y t h e i n t r i n s i c G T P a s e a c t i v i t y o f t h e a - s u b u n i t . T h i s l e a d s t o r e a s s o c i a t i o n o f a - G D P w i t h t h e B Y - d i m e r a n d c e s s a t i o n o f t h e s i g n a l . T h e r o l e p l a y e d b y t h e B Y - d i m e r m a y b e c o n s i d e r a b l y m o r e i m p o r t a n t t h a n e a r l i e r s t u d i e s s u g g e s t e d a n d i t i s p o s s i b l e t h a t , a t l e a s t i n s o m e c a s e s , t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e G p r o t e i n a n d t h e e f f e c t o r i s m e d i a t e d b y t h e E Y - d i m e r . 2 ‘ 3 5 3 T h e t h r e e G p r o t e i n s t h a t h a v e b e e n i s o l a t e d , a n d i n w h i c h s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n h a v e b e e n d e f i n e d , a r e C . a n d C 1 o f t h e a d e n y l a t e c y c l a s e s y s t e m a n d t r a n s d u c i n . 2 9 2 G . i s i n v o l v e d i n t h e t r a n s d u c t i o n o f i n f o r m a t i o n l e a d i n g t o t h e e l e v a t i o n o f c y c l i c A M P l e v e l s w h e r e a s G 1 i s i n v o l v e d i n t h e i n h i b i t i o n o f a d e n y l a t e c y c l a s e b y h o r m o n e s . A l t h o u g h t h e i r a — s u b u n i t s d i f f e r , a m i n o a c i d s e q u e n c e a n a l y s i s s h o w s t h a t t h e E - a n d Y - s u b u n i t s a r e i d e n t i c a l . I n p l a t e l e t s , t h e G T P - a c o m p l e x o f G 1 i s a w e a k i n h i b i t o r o f a d e n y l a t e c y c l a s e a n d t h e B - Y d i m e r a s t r o n g i n h i b i t o r . “ 3 A n o t h e r p o s s i b l e f u n c t i o n f o r G 1 m a y b e t o s t i m u l a t e N a I / H I e x c h a n g e w h i c h l e a d s t o c y t o p l a s m i c a l k a l i n i z a t i o n a n d a c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e A 2 . " ‘ I n v e r t e b r a t e r e t i n a l r o d c e l l s , a c t i v a t i o n b y l i g h t o f r h o d o p s i n s t i m u l a t e s c y c l i c G M P p h o s p h o d i e s t e r a s e a c t i v i t y t h r o u g h a G p r o t e i n c a l l e d t r a n s d u c i n . T h i s p h o t o l y s i s o f r h o d o p s i n b y l i g h t l e a d s t o a d e c r e a s e i n t h e c o n c e n t r a t i o n o f c y c l i c G M P a n d s u b s e q u e n t h y p e r p o l a r i z a t i o n . I n v e s t i g a t i o n o f G p r o t e i n s h a s b e e n a i d e d g r e a t l y b y t h e a b i l i t y o f G T P a n d G D P a n a l o g u e s a n d c e r t a i n b a c t e r i a l t o x i n s t o a l t e r G p r o t e i n f u n c t i o n . 6 0 B e c a u s e n o r m a l c e l l s a r e i m p e r m e a b l e t o t h e s e c o m p o u n d s , a n a l o g u e s o f G T P a n d G D P a r e u s e d i n i s o l a t e d m e m b r a n e s o r i n c e l l s w h i c h h a v e b e e n p e r m e a b l i z e d . N o r m a l p l a t e l e t s a r e a l s o i m p e r m e a b l e t o c h o l e r a a n d p e r t u s s i s t o x i n . ? ’ 1 7 " ' 8 9 C o m m o n l y u s e d m e t h o d s o f p e r m e a b i l i z i n g c e l l s a r e e x p o s u r e t o l o w c o n c e n t r a t i o n s o f d e t e r g e n t s s u c h a s s a p o n i n o r r e p e t i t i v e h i g h - v o l t a g e e l e c t r i c a l d i s c h a r g e . I n t h e a b s e n c e o f a g o n i s t s , n o n - h y d r o l y z a b l e a n a l o g u e s o f G T P , s u c h a s C p p ( N H ) p o r G T P Y S , p e r s i s t a t t h e G T P b i n d i n g s i t e a n d c a u s e p r o l o n g e d a c t i v a t i o n o f G p r o t e i n s . A n a l o g u e s o f G D P , s u c h a s G D P E S , i n h i b i t p r o t e i n 1 6 . 2 5 . 8 7 . 1 s s , 3 3 5 5 4 a c t i v a t i o n . C h o l e r a o r p e r t u s s i s t o x i n t r a n s f e r t h e A D P - r i b o s y l m o i e t y o f N A D t o t h e a - s u b u n i t s o f s o m e i n t a c t o l i g o m e r i c G p r o t e i n s . C h o l e r a t o x i n A D P - r i b o s y l a t e s t h e a - s u b u n i t o f G 3 w h i c h i n h i b i t s i t s i n t r i n s i c G T P a s e a c t i v i t y a n d c a u s e s p e r s i s t e n t a c t i v a t i o n o f a d e n y l a t e c y c l a s e . P e r t u s s i s t o x i n A D P - r i b o s y l a t e s t h e a - s u b u n i t s o f G 1 a n d t r a n s d u c i n w h i c h u n c o u p l e s t h e m f r o m t h e i r r e c e p t o r s a n d b l o c k s t h e e f f e c t o f a g o n i s t - b i n d i n g . B o t h G . a n d G , a r e p r e s e n t i n p l a t e l e t s . T h e G , t h a t i s c o u p l e d t o a c t i v a t i o n o f p l a t e l e t a d e n y l a t e c y c l a s e c o n t a i n s a n a - s u b u n i t o f 4 5 k D a w h i c h i s A D P - r i b o s y l a t e d b y c h o l e r a t o x i n . T h e G 1 s u b u n i t t h a t i s c o u p l e d t o i n h i b i t i o n o f a d e n y l a t e c y c l a s e h a s a n a - s u b u n i t o f 4 1 k D a ( o n ) w h i c h i s A D P - r i b o s y l a t e d b y p e r t u s s i s t o x i n . 5 ° ' 1 7 3 G T P - b i n d i n g R e g u l a t o r y P r o t e i n C o n t r o l o f P h o s p h o l i p a s e C T h e r e i s c o n s i d e r a b l e e v i d e n c e t h a t t h e a b i l i t y o f h o r m o n e s o r a g o n i s t s t o a c t i v a t e p h o s p h o l i p a s e C i s m e d i a t e d b y a G T h i s G p r o t e i n i s u s u a l l y i d e n t i f i e d a s G p ' w h i c h r e f e r s t o i t s e f f e c t o n t h e p h o s p h o d i e s t e r a s e p h o s p h o l i p a s e C . G p h a s n o t b e e n u n e q u i v o c a l l y i d e n t i f i e d , b u t a r o l e f o r C D i s b e l i e v e d t o e x i s t i n a c e l l w h e n t h e f o l l o w i n g c r i t e r i a c a n b e d e m o n s t r a t e d i n p e r m e a b l i z e d c e l l s a n d / o r i s o l a t e d m e m b r a n e s : ( 1 ) g u a n i n e n u c l e o t i d e s s t i m u l a t e P I P Q h y d r o l y s i s a n d / o r t h e p r o d u c t i o n o f ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 o r D A G ; ( 2 ) g u a n i n e n u c l e o t i d e s m i m i c t h e f u n c t i o n a l e f f e c t s o f a g o n i s t s k n o w n t o s t i m u l a t e h y d r o l y s i s o f t h e p h o s p h o i n o s i t i d e s ; ( 3 ) e x o g e n o u s G T P e n h a n c e s t h e a b i l i t y o f a g o n i s t s t o c a u s e p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s ; 5 5 ( 4 ) p e r t u s s i s t o x i n o r G D P a n a l o g u e s i n h i b i t a g o n i s t - i n d u c e d p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s o r p r o c e s s e s w h i c h d e p e n d o n t h e p r o d u c t s o f p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s ; a n d ( 5 ) i n h i b i t i o n o f t h e a g o n i s t - i n d u c e d e f f e c t s o f p e r t u s s i s t o x i n c o r r e l a t e s w i t h A D P - r i b o s y l a t i o n o f C p r o t e i n s . 5 ° T h e g r o w i n g l i s t o f t i s s u e s i n w h i c h G p a p p e a r s t o e x i s t s u g g e s t s t h a t r e g u l a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e C b y a G p r o t e i n i s a w i d e s p r e a d p h e n o m e n o n . H o w e v e r , s o m e o f t h e p r o p e r t i e s o f G p d i f f e r f r o m t i s s u e t o t i s s u e . T h e t i s s u e s s t u d i e d s o f a r a r e d i v i d e d i n t o t w o g r o u p s ; t h o s e i n w h i c h p e r t u s s i s t o x i n i n h i b i t s p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s a n d t h o s e i n w h i c h i t d o e s n o t . T h i s i s q u i t e d i f f e r e n t t o t h e e f f e c t s o f G , a n d G , o n a d e n y l a t e c y c l a s e w h i c h a r e c o n s i s t e n t f r o m c e l l t o c e l l . E v i d e n c e f o r G p r o t e i n i n v o l v e m e n t i n t h e c o n t r o l o f p h o s p h o l i p a s e C i n p l a t e l e t s h a s c o m e f r o m s t u d i e s o n p e r m e a b i l i z e d p l a t e l e t s , i s o l a t e d p l a t e l e t m e m b r a n e s a n d s o l u b i l i z e d p h o s p h o l i p a s e C . 1 7 ' 5 5 ' 1 8 7 ' 1 8 8 ' 2 1 6 ' 2 5 5 ' 3 7 0 I n t h e e a r l i e r s t u d i e s , e l e c t r o - p e r m e a b i l i z e d p l a t e l e t s i n w h i c h t h e e x t r a c e l l u l a r a n d i n t r a c e l l u l a r C a 2 + ( 1 . 1 8 7 ' 1 8 8 S e c r e t i o n o f s e r o t o n i n c o n c e n t r a t i o n s a r e e q u a l w e r e u s e o c c u r r e d w h e n t h e f r e e C a a ' c o n c e n t r a t i o n w a s r a i s e d f r o m 1 . 0 p H t o 1 0 p M . N o n - h y d r o l y z a b l e G T P a n a l o g u e s d r a m a t i c a l l y r e d u c e d t h e C a 2 + c o n c e n t r a t i o n r e q u i r e d t o i n d u c e s e c r e t i o n t o a s l o w a s 0 . 1 ' u M . T h i s s u g g e s t s t h a t g u a n i n e n u c l e o t i d e s c a n l o w e r t h e C a y ' c o n c e n t r a t i o n t h r e s h o l d t o t h e r a n g e p r e s e n t i n t h e i n t a c t c e l l a t t h e t i m e o f 3 4 a c t i v a t i o n . 2 I t w a s a l s o d e m o n s t r a t e d t h a t G T P i n c r e a s e d t h r o m b i n - i n d u c e d [ 3 H ] D A G f o r m a t i o n a n d t h a t G T P Y S c o u l d s t i m u l a t e a s m u c h 5 6 [ 3 H ] D A G f o r m a t i o n a s t h r o m b i n . S i m i l a r s t u d i e s i n i s o l a t e d p l a t e l e t m e m b r a n e s c o n c l u d e d t h a t a G p r o t e i n m e d i a t e d t h r o m b i n - i n d u c e d 1 7 - 2 1 5 ' 3 7 0 I n s o n i c a t e d p l a t e l e t s , m o s t o f p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s . t h e p h o s p h o l i p a s e C a c t i v i t y i s f o u n d i n t h e s u p e r n a t a n t . ” 2 U s i n g s u p e r n a t a n t a s a s o u r c e o f s o l u b l e p h o s p h o l i p a s e C a n d l i p i d v e s i c l e s w i t h r a d i o l a b e l l e d p h o s p h o i n o s i t i d e s a s s u b s t r a t e , G T P a n a l o g u e s s t i m u l a t e d p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s . 1 1 5 I n s a p o n i n — p e r m e a b l i z e d p l a t e l e t s , n o n - h y d r o l y z a b l e G T P a n a l o g u e s r e p r o d u c e d t h e e f f e c t s o f t h r o m b i n b y c a u s i n g D A G f o r m a t i o n , C a 2 + r e l e a s e f r o m t h e d e n s e t u b u l a r s y s t e m a n d s e r o t o n i n s e c r e t i o n . 5 6 I n t h e s a m e s t u d y , t h e G D P a n a l o g u e G D P B S a n d p e r t u s s i s t o x i n i n h i b i t e d t h e a b i l i t y o f t h r o m b i n t o i n d u c e t h e s e e v e n t s . H o w e v e r , i n c r e a s i n g t h e t h r o m b i n c o n c e n t r a t i o n o v e r c a m e t h e e f f e c t s o f G D P B S o n s e c r e t i o n w i t h o u t r e s t o r i n g D A G f o r m a t i o n . I t w a s c o n c l u d e d t h a t a G p r o t e i n s e n s i t i v e t o i n h i b i t i o n b y p e r t u s s i s t o x i n c o u p l e s t h r o m b i n r e c e p t o r s t o t h e p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s p a t h w a y i n p l a t e l e t s . H o w e v e r , a p a t h w a y f o r t h r o m b i n - i n d u c e d s e c r e t i o n a l s o e x i s t s t h a t i s i n d e p e n d e n t o f p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s . T h e i d e n t i t y o f t h i s a d d i t i o n a l p a t h w a y ( s ) i s ( a r e ) n o t k n o w n . I n a d d i t i o n t o t h r o m b i n , t h r e e o t h e r p l a t e l e t a g o n i s t s a p p e a r t o h a v e r e c e p t o r s t h a t c a u s e G - p r o t e i n - c o n t r o l l e d p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s . T h e s e a r e P A F , v a s o p r e s s i n a n d t h r o m b o x a n e a n a l o g u e s s u c h a s U 4 6 6 l 9 a n d U 4 4 0 6 9 . 2 1 " 2 1 5 E a c h o f t h e s e a g o n i s t s h a s b e e n s h o w n t o b i n d t o s p e c i f i c r e c e p t o r s o n t h e p l a t e l e t s u r f a c e , s t i m u l a t e G T P a s e a c t i v i t y a n d t o c a u s e p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s . I t w a s o b s e r v e d t h a t 5 7 p e r t u s s i s t o x i n d i d n o t a f f e c t p l a t e l e t r e s p o n s e s t o a l l a g o n i s t s t o t h e s a m e d e g r e e . T h e G T P a s e a c t i v i t y i n t h r o m b i n - s t i m u l a t e d p l a t e l e t s w a s p a r t i a l l y i n h i b i t e d b y p r e i n c u b a t i o n w i t h p e r t u s s i s t o x i n . ” ” ’ I n c o n t r a s t , t h e i n c r e a s e i n G T P a s e a c t i v i t y m e a s u r e d i n p l a t e l e t s a c t i v a t e d b y P A F , v a s o p r e s s i n a n d U 4 6 6 0 9 w a s n o t a f f e c t e d , w h i c h s u g g e s t e d t h a t t h e C p i n v o l v e d w i t h t h e s e a g o n i s t s i s p e r t u s s i s t o x i n - r e s i s t a n t . I n a n o t h e r s t u d y , t h e e f f e c t o f p e r t u s s i s t o x i n o n p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s a n d [ 3 2 P ] A D P - r i b o s y l a t i o n o f a n i n s a p o n i n - p e r m e a b i l i z e d p l a t e l e t s w e r e e x a m i n e d . 5 9 T h r o m b i n , w h i c h e l i c i t e d r e s p o n s e s m e d i a t e d b y b o t h C , a n d G P , d e c r e a s e d r a d i o l a b e l l i n g b y m o r e ‘ t h a n 9 0 % . E p i n e p h r i n e e l i c i t e d r e s p o n s e s m e d i a t e d b y G , , n o t G p ’ w h e r e a s v a s o p r e s s i n a n d P A F e l i c i t e d r e s p o n s e s m e d i a t e d b y G P , n o t G 1 . B o t h d e c r e a s e d r a d i o l a b e l l i n g b y 5 0 % . T h e t h r o m b o x a n e m i m e t i c U 4 6 6 1 9 h a d n o e f f e c t o n A D P - r i b o s y l a t i o n , e v e n a l t h o u g h i t s t i m u l a t e s G T P a s e a c t i v i t y . I t w a s c o n c l u d e d t h a t : ( 1 ) i n p l a t e l e t s a s i n g l e p e r t u s s i s t o x i n - s e n s i t i v e , ( a n - c o n t a i n i n g G p r o t e i n m a y b e i n v o l v e d i n t h e r e g u l a t i o n o f b o t h a d e n y l a t e c y c l a s e a n d p h o s p h o l i p a s e C ; o r ( 2 ) p l a t e l e t a n i s c o m p o s e d o f e q u a l a m o u n t s o f t h e [ 3 2 P ] A D P - r i b o s y l a t e d a - s u b u n i t s o f C 1 a n d G p . 5 9 ' 6 ° P l a t e l e t P h o s p h o l i p a s e C A c t i v i t y T h e c o n t r i b u t i o n o f e a c h o f t h e c y t o p l a s m i c a n d m e m b r a n e - b o u n d p o o l s o f p h o s p h o l i p a s e C i n p l a t e l e t s t o h y d r o l y s i s o f t h e p h o s p h o i n o s i t i d e s i n r e s p o n s e t o a g o n i s t s i s n o t k n o w n a t t h i s s t a g e . A l t h o u g h m e m b r a n e a n d c y t o p l a s m i c p h o s p h o l i p a s e C h a v e b e e n p a r t i a l l y p u r i f i e d , t h e r e i s n o t y e t a g r e e m e n t o v e r t h e i n t r a c e l l u l a r d i s t r i b u t i o n , n u m b e r o f f o r m s a S o n i s t - i n d u c e d a c t i v a t i o n } : l a 5 8 a n d m o l e c u l a r m a s s o f p l a t e l e t p h o s p h o l i p a s e c . 2 3 ' 2 ‘ ” 2 9 5 I t h a s b e e n s u g g e s t e d , b u t n o t p r o v e n , t h a t m o s t o f t h e e n z y m e a c t i v i t y f o r t h e h y d r o l y s i s o f P I ( a n d P I P a n d P I P Z ) i s l o c a t e d i n t h e c y t o s o l a n d i s C a 2 + - d e p e n d e n t , r e q u i r i n g m i l l i m o l a r c o n c e n t r a t i o n s o f C a 2 + t o o b t a i n m a x i m a l h y d r o l y s i s o f P I . 2 $ 1 ‘ A t l o w e r , m i c r o m o l a r , C a 2 + c o n c e n t r a t i o n s , t h e e n z y m e p r e f e r e n t i a l l y h y d r o l y s e s t h e p o l y p h o s p h o i n o s i t i d e s P I P z a n d P I P . T h e r e s t o f t h e p h o s p h o l i p a s e C a c t i v i t y i s a s s o c i a t e d w i t h t h e m e m b r a n e a n d s h o w s a p r e f e r e n t i a l h y d r o l y s i s o f P I P z w i t h m a x i m a l a c t i v i t y a t 4 . 0 p M C a 2 + . “ A l t h o u g h t h e c y t o p l a s m i c C a y ’ c o n c e n t r a t i o n a n d p h o s p h o l i p i d C o m p o s i t i o n m a y i n f l u e n c e t h e r e l a t i v e r a t e o f h y d r o l y s i s , a s i n g l e p h o s p h o l i p a s e C c a n a c c o u n t f o r t h e h y d r o l y s i s o f a l l t h r e e p h o s p h o i n o s i t i d e s s e e n i n W i t h i n f i v e s e c o n d s o f p l a t e l e t s t i m u l a t i o n b y t h r o m b i n , P A F , A D P , a r a c h i d o n i c a c i d o r t h r o m b o x a n e m i m e t i c s , a r a p i d d e c r e a s e i n P I P Z i s m e a s u r e d . " " " ‘ 1 " 5 3 ' 3 1 8 " ' 1 3 ' “ ' 0 ' " 9 2 T h e e x t e n t o f t h e d e c r e a s e v a r i e s b e t w e e n d i f f e r e n t a g o n i s t s a n d s p e c i e s , b u t i t i s a l w a y s t r a n s i e n t . L e v e l s o f P I P z r e t u r n t o n o r m a l o r i n c r e a s e a b o v e c o n t r o l b a s e l i n e v a l u e s a p p r o x i m a t e l y 1 0 s e c o n d s a f t e r t h e a d d i t i o n o f a g o n i s t . T h e d e c r e a s e i n P I P z c o u l d b e t h e r e s u l t o f p h o s p h o l i p a s e C - i n d u c e d h y d r o l y s i s , r e d u c e d p h o s p h o r y l a t i o n o f P I P b y P I P k i n a s e , o r i n c r e a s e d d e p h o s p h o r y l a t i o n o f P I P z ' b y p h o s p h o m o n o e s t e r a s e . T h e s i m u l t a n e o u s i n c r e a s e i n p r o d u c t i o n o f i n o s i t o l p h o s p h a t e s , i n p a r t i c u l a r ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 , p r o v i d e s e v i d e n c e t h a t p h o s p h o l i p a s e C - m e d i a t e d h y d r o l y s i s i s t h e m a j o r c a u s e o f t h e m e a s u r e d d e c r e a s e i n P I P z . " " 1 ° " " ‘ 1 " " " " 5 5 9 I t i s g e n e r a l l y a s s u m e d t h a t , a f t e r t h e b i n d i n g o f a n a g o n i s t t o i t s r e c e p t o r o n t h e p l a t e l e t m e m b r a n e , p h o s p h o l i p a s e C i n i t i a l l y h y d r o l y s e s t h e p o l y p h o s p h o i n o s i t i d e s , P I P a n d P I P z , a n d l a t e r d e g r a d e s P I . 3 ° ’ " 5 1 3 T h e p r e f e r e n t i a l h y d r o l y s i s o f t h e p o l y p h o s p h o i n o s i t i d e s a t l o w C a 2 + c o n c e n t r a t i o n s i s c o n s i s t e n t w i t h t h e r o l e o f ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 a s a s e c o n d m e s s e n g e r t h a t t r i g g e r s a r i s e i n c y t o p l a s m i c C a y h T h e r e f o r e , a g o n i s t - i n d u c e d s t i m u l a t i o n l e a d s d i r e c t l y t o P I P z h y d r o l y s i s a n d t h e g e n e r a t i o n o f s m a l l a m o u n t s o f D A G a n d ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 . T h e ( l , 4 , 5 ) I P 3 r a i s e s c y t o p l a s m i c C a b ' w h i c h i n i t i a t e s t h e b r e a k d o w n o f P I b y p h o s p h o l i p a s e C . T h e b u l k o f P I b r e a k d o w n a n d g e n e r a t i o n o f D A G a n d ( 1 ) 1 P t h a t o c c u r s i n t h r o m b i n - s t i m u l a t e d p l a t e l e t s h a s b e e n s h o w n t o o c c u r v i a d i r e c t p h o s p h o l i p a s e C h y d r o l y s i s o f P I r a t h e r t h a n v i a c o n v e r s i o n o f P 1 t o P I P z . ‘ ° 1 ' 5 “ A s t h e a m o u n t o f P I h y d r o l y s e d i s t e n t i m e s g r e a t e r t h a n t h a t o f P I P Z , t h e p r o d u c t i o n o f ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 a n d D A G a r e v i r t u a l l y s e p a r a t e e v e n t s w i t h m u c h m o r e D A G b e i n g p r o d u c e d t h a n ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 . 3 ° ‘ T h e G e n e r a t i o n a n d F u n c t i o n o f t h e I n o s i t o l P h o s p h a t e s T h e f o r m a t i o n a n d m e t a b o l i s m o f ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 i n p l a t e l e t s i s e x t r e m e l y r a p i d . T h e 1 P 3 i s o m e r i n i t i a l l y f o r m e d i s ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 w h i c h i s r a p i d l y c o n v e r t e d t o e i t h e r i n o s i t o l 1 , 4 - b i s p h o s p h a t e ( 1 , 4 - I P 2 ) b y a s p e c i f i c S - p h o s p h o m o n o e s t e r a s e o r t o i n o s i t o l 1 , 3 , 4 , 5 - t e t r a k i s p h o s p h a t e [ ( 1 , 3 , 4 , 5 ) I P . ] b y a s p e c i f i c 3 - k i n a s e . 9 ‘ 5 " ° 8 ' 1 0 9 D e g r a d a t i o n o f t h e ( l , 3 , 4 , 5 ) I P , ' b y t h e S - p h o s p h o m o n o e s t e r a s e r e s u l t s i n t h e f o r m a t i o n o f ( 1 , 3 , 4 ) I P 3 . T h e f u r t h e r m e t a b o l i s m o f t h e i n o s i t o l p h o s p h a t e s i s v e r y 3 0 5 , 4 4 9 c o m p l e x . T h e e n z y m e s i n v o l v e d d i f f e r i n M g 2 + r e q u i r e m e n t s a n d 6 0 s e n s i t i v i t y t o l i t h i u m a n d t h e r e a r e a l t e r n a t i v e d e g r a d a t i o n p a t h s f o r s o m e o f t h e i n o s i t o l p o l y p h o s p h a t e s . U l t i m a t e l y , t h e i n o s i t o l p o l y p h o s p h a t e s a r e d e g r a d e d t o i s o m e r s o f i n o s i t o l p h o s p h a t e w h i c h a r e f u r t h e r d e p h o s p h o r y l a t e d t o i n o s i t o l t h a t i s a v a i l a b l e f o r r e c y c l i n g . I n a d d i t i o n t o i n o s i t o l p o l y p h o s p h a t e s , t h r o m b i n - s t i m u l a t e d p l a t e l e t s a l s o g e n e r a t e c y c l i c i n o s i t o l p o l y p h o s p h a t e s . ” : n ‘ I n a n o t h e r s t u d y , b o t h i n o s i t o l 1 : 2 - c y c l i c 4 - b i s p h o s p h a t e [ ( 1 : 2 - c y c l i c , 4 ) I P 2 ] a n d i n o s i t o l 1 : 2 - c y c l i c 4 , 5 - t r i s p h o s p h a t e [ ( 1 : 2 - c y c l i c , 4 , 5 ) I P 3 ] w e r e g e n e r a t e d f r o m v e s i c l e s c o n t a i n i n g p h o s p h o i n o s i t i d e a n d p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e b y p h o s p h o l i p a s e C . ” 5 B o t h t h e n o n - c y c l i c ( l , 4 , 5 ) I P 3 a n d t h e ( l : 2 - c y c l i c , 4 , 5 ) I P 3 , b u t n o t t h e ( 1 : 2 - c y c l i c , 4 ) I P 2 , w e r e a b l e t o r e l e a s e “ C a 2 + f r o m p e r m e a b i l i z e d p l a t e l e t s i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r . T h i s s u g g e s t s t h a t ( 1 : 2 - c y c l i c , 4 , 5 ) I P 3 a s w e l l a s ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 , m a y f u n c t i o n a s a s e c o n d m e s s e n g e r i n p l a t e l e t s . T h e ( l : 2 - c y c l i c , 4 , 5 ) I P 3 i s n o t a s u b s t r a t e f o r t h e 3 - k i n a s e a n d i s o n l y s l o w l y d e p h o s p h o r y l a t e d b y t h e S - p h o s p h o m o n o e s t e r a s e . 3 9 8 ' 5 1 5 I f f o r m e d 1 1 1 1 . 1 1 9 . i t m i g h t c a u s e p e r s i s t e n t a c t i v a t i o n o f C a 2 + m o b i l i z a t i o n . H o w e v e r , t h e r o l e , i f a n y , o f t h e c y c l i c p o l y p h o s p h a t e s i n p l a t e l e t a c t i v a t i o n i s n o t c l e a r a t t h i s t i m e . T h e c y c l i c p r o d u c t s a r e a l s o m e t a b o l i z e d b a c k t o i n o s i t o l a n d r e c y c l e d . T h e ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 t h a t i s g e n e r a t e d b y t h e p h o s p h o l i p a s e C - m e d i a t e d h y d r o l y s i s o f P I P z i s a w a t e r - s o l u b l e m o l e c u l e t h a t i s r e l e a s e d i n t o t h e c y t o p l a s m . I t h a s b e e n s h o w n t h a t ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 m o b i l i z e s s e q u e s t e r e d C a 2 + f r o m t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m a n d m e m b r a n e v e s i c l e s f r o m m a n y c e l l t y p e s , i n c l u d i n g p 1 a t e l e t s . 3 ' 1 2 " " " 5 1 5 I n o s i t o l 1 : 2 - c y c l i c , 4 , 5 - 6 1 t r i s p h o s p h a t e a n d ( 1 , 3 , 4 ) I P 3 a l s o m o b i l i z e C a 2 + , b u t ( 1 , 3 , 4 ) I P 3 h a s o n l y o n e t e n t h t h e p o t e n c y o f ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 a n d ( 1 : 2 - c y c l i c , 4 , 5 ) I P 3 . 6 7 ' 2 2 1 ' 5 1 5 T h e m e c h a n i s m b y w h i c h ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 m o b i l i z e s C a 2 + f r o m i n t r a c e l l u l a r s t o r e s n o t b e e n e l u c i d a t e d , b u t i t i s p o s t u l a t e d t h a t i t a c t i v a t e s a C a 2 + c h a n n e l i n t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m b y a l i g a n d - b i n d i n g r e a c t i o n s ! “ 3 6 9 S p e c i f i c b i n d i n g s i t e s f o r ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 h a v e b e e n d e m o n s t r a t e d b y s p e c i f i c b i n d i n g o f r a d i o l a b e l l e d ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 t o m e m b r a n e s . 1 6 6 ' ‘ 6 ‘ I n p l a t e l e t s , a m o n o c l o n a l a n t i b o d y t o ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 w a s f o u n d t o b l o c k t h e r e l e a s e o f C a 2 + f r o m m e m b r a n e v e s i c l e s b y ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 . 3 7 o R e c e n t l y , ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 r e c e p t o r s h a v e b e e n c h a r a c t e r i z e d i n n e u t r o p h i l s , h e p a t i c p l a s m a m e m b r a n e s a n d r a t b r a i n . 1 5 7 " ‘ 7 1 I t h a s a l s o b e e n d e m o n s t r a t e d t h a t ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 c a n r e l e a s e C a 2 + f r o m p l a t e l e t p l a s m a m e m b r a n e v e s i c l e s , w h i c h s u g g e s t s t h a t ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 m a y a l s o b e a b l e t o t r a n s l o c a t e C a 2 + a c r o s s t h e p l a s m a m e m b r a n e . ‘ ° 5 I n o s i t o l 1 , 2 , 4 , 5 - t e t r a k i s p h o s p h a t e m a y a l s o f u n c t i o n t o a l l o w a n i n f l u x o f e x t r a c e l l u l a r C a 2 + . 2 2 2 ' 2 2 3 H o w e v e r , i t s f u n c t i o n i n p l a t e l e t s i s n o t k n o w n . W h e n ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 i s a d d e d t o s a p o n i n - p e r m e a b l i z e d c e l l s , T x A z p r o d u c t i o n , p h o s p h o l i p a s e C a c t i v a t i o n , p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n , s e c r e t i o n a n d a g g r e g a t i o n o c c u r . 1 3 " ° ° H o w e v e r , a l l o f t h e s e e v e n t s , e x c e p t C a 2 + m o b i l i z a t i o n , a r e b l o c k e d b y c y c l o o x y g e n a s e i n h i b i t o r s . T h i s i n d i c a t e s t h a t p l a t e l e t a c t i v a t i o n b y ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 i s i n i t i a t e d b y C a ” m o b i l i z a t i o n w h i c h a c t i v a t e s p h o s p h o l i p a s e A 2 . T h e t h r o m b o x a n e a n d e n d o p e r o x i d e s t h a t a r e s u b s e q u e n t l y g e n e r a t e d i n d u c e a c t i v a t i o n b y b i n d i n g t o s p e c i f i c r e c e p t o r s o n t h e p l a t e l e t m e m b r a n e . T h e C a 2 + m o b i l i z a t i o n i n d u c e d b y ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 i s , i n i t s e l f , n o t s u f f i c i e n t t o i n d u c e s e c r e t i o n o r a g g r e g a t i o n o f p e r m e a b i l i z e d p l a t e l e t s . 6 2 T h e G e n e r a t i o n a n d F u n c t i o n o f 1 , 2 - D i a c y l g l y c e r o l T h e ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 - m e d i a t e d r e l e a s e o f s e q u e s t e r e d C a 2 + f r o m t h e d e n s e t u b u l a r s y s t e m a l l o w s p h o s p h o l i p a s e C t o h y d r o l y z e P I a n d g e n e r a t e t h e b u l k o f D A G m e a s u r e d u p o n c e l l a c t i v a t i o n . W i t h i n f i v e s e c o n d s o f e x p o s u r e t o t h r o m b i n , p l a t e l e t s g e n e r a t e D A G . “ m P r o d u c t i o n i s t r a n s i e n t , p e a k i n g a t a p p r o x i m a t e l y 1 5 s e c o n d s a n d t h e n d e c r e a s i n g . C o n c o m i t a n t w i t h D A G p r o d u c t i o n i s a d e c r e a s e i n P I . 1 , 2 - D i a c y l g l y c e r o l i s a n e u t r a l l i p i d w h i c h r e m a i n s w i t h i n t h e m e m b r a n e a n d i s r a p i d l y p h o s p h o r y l a t e d t o p h o s p h a t i d i c a c i d b y 1 , 2 - d i a c y l g l y c e r o l k i n a s e . ‘ 3 ' “ ' 2 7 6 T h e m a j o r f u n c t i o n o f D A G i s t o a c t i v a t e p r o t e i n k i n a s e C w h i c h i s a C a ” 3 a n d p h o s p h o l i p i d - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e u b i q u i t o u s i n t i s s u e s a n d o r g a n s . 3 m % 3 5 1 1 , 2 - D i a c y l g l y c e r o l i s e n r i c h e d i n s t e a r i c a n d a r a c h i d o n i c a c i d s a n d m a y f u n c t i o n a s a s o u r c e o f a r a c h i d o n i c a c i d d u r i n g p l a t e l e t a c t i v a t i o n . T h e D A G s e c o n d m e s s e n g e r s i g n a l i s t r a n s i e n t a n d r a p i d l y a t t e n u a t e d v i a t w o d i f f e r e n t p a t h w a y s . ‘ 3 T h e m a j o r i t y o f D A G i s p h o s p h o r y l a t e d b y 1 , 2 - d i a c y l g l y c e r o l k i n a s e t o p h o s p h a t i d i c a c i d w h i c h i s e n r i c h e d i n a r a c h i d o n i c a c i d a t t h e s n - 2 p o s i t i o n . T h e a r a c h i d o n i c a c i d c a n b e c l e a v e d f r o m t h i s p o s i t i o n b y t h e a c t i o n o f a p a r t i c u l a t e p h o s p h o l i p a s e A q ‘ w h 1 C h a p p e a r s t o a c t s e l e c t i v e l y u p o n p h o s p h a t i d i c a c i d . 3 9 T h e r e m a i n i n g D A G i s d e g r a d e d b y t h e s e q u e n t i a l a c t i o n o f d i a c y l g l y c e r o l a n d m o n o a c y l g l y c e r o l l i p a s e s . z 7 " ‘ z A r a c h i d o n i c a c i d i s c l e a v e d f r o m t h e 2 - m o n o a c y l g l y c e r o l b y t h e a c t i o n o f m o n o a c y l g l y c e r o l l i p a s e . T h e a r a c h i d o n i c a c i d r e l e a s e d f r o m D A G i s t h e n a v a i l a b l e f o r e i c o s a n o i d f o r m a t i o n a n d a m p l i f i c a t i o n o f p l a t e l e t a c t i v a t i o n . 6 3 P h o s p h a t i d i c A c i d a n d L y s o p h o s p h a t i d i c A c i d B o t h p h o s p h a t i d i c a c i d a n d l y s o p h o s p h a t i d i c a c i d a r e a b l e t o t r a n s l o c a t e C a z “ a c r o s s m e m b r a n e s S L R J L L E L Q - H o w e v e r , w h e t h e r o r n o t e i t h e r h a s a n y p h y s i o l o g i c a l s i g n i f i c a n c e a s a s e c o n d m e s s e n g e r i s n o t k n o w n . P h o s p h a t i d i c a c i d i n c r e a s e s t h e p e r m e a b i l i t y o f m u l t i l a m e l l a r l i p o s o m e s f o r C a “ ) b u t h a s b e e n s h o w n t o b e u n a b l e t o a f f e c t t r a n s l o c a t i o n o f C a 2 + a c r o s s p u r e p h o s p h a t i d y l c h o l i n e m e m b r a n e s . 1 9 9 " 3 l ' T h e a d d i t i o n o f o l e o y l a c e t y l g l y c e r o l t o p e r m e a b i l i z e d p l a t e l e t s c a u s e s t h e m o b i l i z a t i o n o f C a 2 + f r o m t h e p l a t e l e t d e n s e t u b u l a r s y s t e m . 5 7 T h i s e f f e c t w a s d e p e n d e n t o n t h e c o n v e r s i o n o f o l e o y l a c e t y l g l y c e r o l t o i t s p h o s p h a t i d i c a c i d a n d / o r l y s o p h o s p h a t i d i c a c i d , b u t i n d e p e n d e n t o f a r a c h i d o n i c a c i d m e t a b o l i s m o r p r o t e i n k i n a s e C a c t i v a t i o n . I t w a s s u g g e s t e d t h a t D A G m e t a b o l i t e s m i g h t a u g m e n t c h a n g e s i n C a 2 + h o m e o s t a s i s c a u s e d b y ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 i n p l a t e l e t a c t i v a t i o n . P h o s p h a t i d i c a c i d a d d e d e x o g e n o u s l y t o p l a t e l e t s d o e s n o t e x e r t a n y e f f e c t , p r o b a b l y b e c a u s e i t c a n n o t p h y s i c a l l y r e a c h a s i t e a t w h i c h i t m i g h t h a v e a n t . ” e f f e c T h e r o l e o f p h o s p h a t i d i c a c i d i n p h y s i o l o g i c p l a t e l e t a c t i v a t i o n r e m a i n s u n k n o w n . L y s o p h o s p h a t i d i c a c i d f o r m e d b y d e a c y l a t i o n o f p h o s p h a t i d i c a c i d i s f o r m e d i n s m a l l a m o u n t s i n s t i m u l a t e d p l a t e l e t s a n d m a y b e r e l e a s e d t o t h e e x t e r n a l m e d i u m . 3 " ' 2 7 8 L y s o p h o s p h a t i d i c a c i d a d d e d t o i n t a c t p l a t e l e t s i n d u c e s s h a p e c h a n g e , s e c r e t i o n a n d a g g r e g a t i o n . 8 3 4 5 ‘ I t i s a l s o a b l e t o m o b i l i z e C a 2 + f r o m C a Z I - l o a d e d m e m b r a n e v e s i c l e s a n d h a s b e e n r e p o r t e d t o f u n c t i o n a s a n i o n o p h o r e m . ” ‘ " 5 6 I t i s s u g g e s t e d t h a t l y s o p h o s p h a t i d i c a c i d - i n d u c e d p l a t e l e t a c t i v a t i o n 6 4 i n v o l v e s a n i n i t i a l m o b i l i z a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r C a 2 + w i t h s u b s e q u e n t a c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e A 2 a n d f o r m a t i o n o f a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s w h i c h a c t i v a t e p h o s p h o l i p a s e C a n d i n d u c e t h e p l a t e l e t 4 9 7 r e s p o n s e . T h e a c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e C b y l y s o p h o s p h a t i d i c a c i d i s b l o c k e d b y i n h i b i t o r s o f c y c l o o x y g e n a s e . T h e G e n e r a t i o n a n d F u n c t i o n o f C y c l i c A M P T h e r o l e o f t h e c y c l i c A M P s e c o n d m e s s e n g e r s y s t e m i n p l a t e l e t s i s n o t a s w e l l - d e f i n e d a s t h a t o f t h e i n o s i t o l l i p i d s y s t e m . T h e c o n t r o l o f a d e n y l a t e c y c l a s e i s m e d i a t e d b y b i n d i n g o f a g o n i s t s t o a d r e n e r g i c r e c e p t o r s o n t h e p l a t e l e t m e m b r a n e . H u m a n p l a t e l e t s p o s s e s s b o t h 8 2 - a d r e n e r g i c r e c e p t o r s ( 6 0 s i t e s / p l a t e l e t ) w h i c h s t i m u l a t e a d e n y l a t e c y c l a s e a n d a z - a d r e n e r g i c r e c e p t o r s ( 1 5 0 - 4 5 0 s i t e s / p l a t e l e t ) w h i c h i n h i b i t a d e n y l a t e c y c l a s e . 1 ' 1 7 5 ' 2 2 ° ' z " T h e d e n s i t y o f e a c h o f t h e s e r e c e p t o r s o n p l a t e l e t s v a r i e s b e t w e e n s p e c i e s a n d d e t e r m i n e s t h e e f f e c t o f e p i n e p h r i n e o n a d e n y l a t e c y c l a s e a n d p l a t e l e t f u n c t i o n . z " ° T h e a 2 - a d r e n e r g i c r e c e p t o r f r o m h u m a n p l a t e l e t s h a s b e e n p u r i f i e d a n d c h a r a c t e r i z e d a s a s i n g l e g l y c o p r o t e i n o f M , - 6 4 k D a . 3 5 " ‘ ° ‘ T h e g e n e t h a t c o d e s f o r t h e h u m a n p l a t e l e t e t a - a d r e n e r g i c r e c e p t o r h a s a l s o b e e n c l o n e d a n d s e q u e n c e d . 2 5 7 L e s s i s k n o w n a b o u t t h e p l a t e l e t B z - a d r e n e r g i c r e c e p t o r t h a n t h e e t a - a d r e n e r g i c r e c e p t o r . I t i s w e a k l y c o u p l e d t o t h e a d e n y l a t e c y c l a s e s y s t e m a n d h a s a n i n h i b i t o r y a c t i o n o f q u e s t i o n a b l e s i g n i f i c a n c e . 5 1 5 I n c o n t r a s t t o m a n y c e l l s y s t e m s , e l e v a t i o n o f c y c l i c A M P i n p l a t e l e t s i s i n h i b i t o r y t o p l a t e l e t a c t i v a t i o n . 2 7 " 3 3 3 C y c l i c A M P i s 6 5 p r o d u c e d f r o m A T P b y a d e n y l a t e c y c l a s e a n d i s d e g r a d e d b y c y c l i c A M P p h o s p h o d i e s t e r a s e . T h e r e f o r e , a g e n t s w h i c h e i t h e r s t i m u l a t e a d e n y l a t e c y c l a s e o r i n h i b i t c y c l i c A M P p h o s p h o d i e s t e r a s e w i l l i n c r e a s e t h e i n t r a c e l l u l a r l e v e l s o f c y c l i c A M P a n d i n h i b i t p l a t e l e t f u n c t i o n . A c t i v a t o r s o f a d e n y l a t e c y c l a s e i n c l u d e p r o s t a c y c l i n , p r o s t a g l a n d i n D 2 , p r o s t a g l a n d i n E 1 , i s o p r e n a l i n e a n d a d e n o s i n e . “ 5 7 P r o s t a c y c l i n i s p r o d u c e d f r o m a r a c h i d o n i c a c i d i n e n d o t h e l i a l c e l l s , b i n d s t o s p e c i f i c r e c e p t o r s o n t h e p l a t e l e t m e m b r a n e a n d i n c r e a s e s i n t r a c e l l u l a r c y c l i c A M P b y a c t i v a t i o n o f a d e n y l a t e c y c l a s e . 3 3 3 " 8 6 I t i s t h e m o s t p o t e n t e n d o g e n o u s i n h i b i t o r o f p l a t e l e t r e s p o n s e s . A g e n t s t h a t h a v e b e e n 4 d e m o n s t r a t e d t o i n h i b i t c y c l i c A M P p h o s p h o d i e s t e r a s e i n c l u d e p a p a v e r i n e , d i p y r i d a m o l e a n d t h e m e t h y l x a n t h i n e s . T h e m e c h a n i s m b y w h i c h c y c l i c A M P i n h i b i t s p l a t e l e t f u n c t i o n i s n o t c l e a r , b u t a m a j o r e f f e c t o f c y c l i c A M P s e e m s t o b e t h e s u p p r e s s i o n o f 2 3 I t h a s b e e n s h o w n t o b e a b l e t h e g e n e r a t i o n o f s e c o n d m e s s e n g e r s . ‘ t o i n h i b i t t h e i n c r e a s e i n i n t r a c y t o p l a s m i c C a y ' c o n c e n t r a t i o n d u e t o b o t h C a 2 + i n f l u x a n d r e l e a s e f r o m i n t e r n a l s t o r e s i n r e s p o n s e t o p h y s i o l o g i c a l a g o n i s t s . ‘ 5 " " ° 9 I t a l s o e n h a n c e s t h e s e q u e s t r a t i o n o f C a l i i n t o i n t e r n a l s t o r a g e s i t e s / ‘ 5 3 ! “ I n c o n t r a s t , i t d o e s n o t i n h i b i t t h e r i s e i n C a 2 + e v o k e d b y c a l c i u m i o n o p h o r e s . " 2 3 I t a l s o i n h i b i t s a g o n i s t - i n d u c e d h y d r o l y s i s o f i n o s i t o l l i p i d s . 2 7 7 T h e r e i s s o m e e v i d e n c e t h a t t h e i n h i b i t i o n o f s e c o n d m e s s e n g e r g e n e r a t i o n o c c u r s b y i n h i b i t i o n o f p h o s p h o l i p a s e C , b u t t h e m e c h a n i s m i s n o t k n o w n . 2 5 " ‘ 1 ° C y c l i c A M P i s k n o w n t o m o d u l a t e t h e a c t i v i t y o f a s p e c i f i c c y c l i c A M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e . T h i s k i n a s e p h o s p h o r y l a t e s , a n d p e r t u s s i s t o x i n , 2 1 ‘ . z a o 6 6 t h e r e f o r e r e g u l a t e s , a n u m b e r o f e n z y m e s a n d p r o t e i n s . I n c r e a s e d i n t r a c e l l u l a r c y c l i c A M P i s a s s o c i a t e d w i t h e n h a n c e d p h o s p h o r y l a t i o n o f s e v e r a l p r o t e i n s , t h e t w o m o s t p r o m i n e n t o f w h i c h h a v e m o l e c u l a r w e i g h t s o f a p p r o x i m a t e l y 2 2 a n d 2 4 k D a . 1 3 5 T h e C a 2 + - A T P a s e a c t i v i t y a n d C a S I ‘ t r a n s p o r t a c r o s s p l a t e l e t i n t e r n a l m e m b r a n e s a r e s t i m u l a t e d b y c y c l i c A M P - d e p e n d e n t k i n a s e , p r o b a b l y v i a p h o s p h o r y l a t i o n o f a 2 2 k D a p r o t e i n s i m i l a r t o p h o s p h o l a m b a n o f c a r d i a c m u s c l e . ‘ T h i s p r o t e i n i n p l a t e l e t s h a s b e e n c a l l e d t h r o m b o l a m b a n a n d h a s b e e n f o u n d t o b e c o v a l e n t l y b o u n d t o t h e C a z + - A T P a s e . 1 3 5 " 1 3 6 A c t i v a t i o n o f a z - a d r e n e r g i c r e c e p t o r s i n t h e p r e s e n c e o f G T P o r b y s t a b l e g u a n i n e n u c l e o t i d e s l e a d s t o t h r e e d i f f e r e n t e v e n t s : ( 1 ) i n h i b i t i o n o f a d e n y l a t e c y c l a s e ; ( 2 ) c o n v e r s i o n o f t h e a z - a d r e n e r g i c r e c e p t o r b i n d i n g s i t e f r o m h i g h t o l o w a f f i n i t y ; a n d ( 3 ) s t i m u l a t i o n o f G T P a s e a c t i v i t y . 7 ' 7 ° ' 1 9 6 ' 2 2 7 ' 3 3 0 O n l y a b r i e f i n t e r a c t i o n b e t w e e n l i g a n d a n d r e c e p t o r i s n e c e s s a r y t o i n d u c e a p e r s i s t e n t i n h i b i t i o n o f a d e n y l a t e c y c l a s e i n i n t a c t p l a t e l e t s . 2 9 9 T h e i n h i b i t i o n o f a d e n y l a t e c y c l a s e i s G T P - d e p e n d e n t , m e d i a t e d t h r o u g h G 1 a n d i n h i b i t e d b y A d d i t i o n o f s t a b l e g u a n i n e n u c l e o t i d e s t o p l a t e l e t m e m b r a n e s c o n v e r t s t h e h i g h a f f i n i t y s t a t e o f t h e r e c e p t o r f o r a g o n i s t s t o t h e l o w a f f i n i t y s t a t e . 1 9 6 ' 3 2 9 T h e h i g h a f f i n i t y s t a t e o f t h e r e c e p t o r s e e m s t o r e p r e s e n t t h e a z - a d r e n e r g i c r e c e p t o r c o u p l e d t o t h e G 1 p r o t e i n . U p o n a c t i v a t i o n , t h e G 1 d i s s o c i a t e s i n t o i t s s u b u n i t s a n d i s u n c o u p l e d f r o m t h e r e c e p t o r , c o n v e r t i n g i t t o t h e l o w - a f f i n i t y s t a t e . 3 2 9 , 4 5 1 I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e h i g h a f f i n i t y f o r m o f t h e r e c e p t o r c a n n o t e x i s t i n t h e r e s t i n g c e l l b e c a u s e o f t h e h i g h l e v e l s o f G T P . I n s t e a d , b i n d i n g o f a g o n i s t t o t h e r e c e p t o r i n d u c e s t h e h i g h 6 7 a f f i n i t y s t a t e i n w h i c h G 1 i s c o u p l e d t o t h e r e c e p t o r a n d a b l e t o m o d u l a t e a d e n y l a t e c y c l a s e a c t i v i t y . 3 3 ° ' “ 5 1 T h i s h i g h a f f i n i t y s t a t e c a n n o t b e i n d u c e d b y a z - a d r e n e r g i c a n t a g o n i s t s . H o w e v e r , r e c e n t w o r k i n w h i c h t h e e n d o g e n o u s G 1 c o - p u r i f i e d w i t h t h e a z - a d r e n e r g i c r e c e p t o r h a s i n d i c a t e d t h a t r e s t i n g p l a t e l e t s m a y c o n t a i n h i g h a f f i n i t y s t a t e a z - a d r e n e r g i c r e c e p t o r s . 7 ° " " 9 0 E p i n e p h r i n e a d d e d t o h u m a n p l a t e l e t r i c h p l a s m a h a s t w o s e p a r a t e e f f e c t s : ( 1 ) i t i n d u c e s a g g r e g a t i o n ; a n d ( 2 ) i t i n h i b i t s a d e n y l a t e c y c l a s e . E p i n e p h r i n e a l s o p o t e n t i a t e s a g g r e g a t i o n b y o t h e r a g o n i s t s . A l t h o u g h t h e r e i s e v i d e n c e t h a t a g g r e g a t i o n a n d i n h i b i t i o n o f a d e n y l a t e c y c l a s e a r e b o t h m e d i a t e d b y a s i n g l e a z - a d r e n e r g i c r e c e p t o r , t h e y a r e s e p a r a t e a n d i n d e p e n d e n t e v e n t s . E p i n e p h r i n e i n d u c e s p r i m a r y a g g r e g a t i o n a n d a n i n c r e a s e , n o t a d e c r e a s e , i n c y c l i c A M P l e v e l s . 1 8 2 T h e p o t e n t i a t i o n o f a g g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n b y e p i n e p h r i n e i s n o t m i m i c k e d b y i n h i b i t o r s o f a d e n y l a t e c y c l a s e . ” ' 5 I t h a s b e e n d e m o n s t r a t e d t h a t h u m a n p l a t e l e t s h a v e a n a z - a d r e n e r g i c r e c e p t o r r e s e r v e , w i t h o n l y 1 0 % o f r e c e p t o r s n e e d i n g t o b e o c c u p i e d t o e l i c i t a 5 0 % i n h i b i t i o n o f a d e n y l a t e c y c l a s e . 2 8 7 P l a t e l e t s f r o m p a t i e n t s w i t h a f a m i l i a l d e f e c t i n w h i c h t h e r e i s a p r o n o u n c e d r e d u c t i o n i n t h e n u m b e r o f p l a t e l e t a z - a d r e n e r g i c r e c e p t o r s h a v e i m p a i r e d e p i n e p h r i n e - i n d u c e d a g g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n r e s p o n s e s , b u t n o r m a l i n h i b i t i o n o f a d e n y l a t e c y c l a s e . ‘ 0 3 I t w a s c o n c l u d e d t h a t f e w e r p l a t e l e t r e c e p t o r s a r e r e q u i r e d f o r e p i n e p h r i n e - i n d u c e d i n h i b i t i o n o f a d e n y l a t e c y c l a s e t h a n f o r p l a t e l e t a g g r e g a t i o n . A d i f f e r e n c e i n t h e m e a n s b y w h i c h a z - a d r e n e r g i c r e c e p t o r s i n d u c e a g g r e g a t i o n a n d i n h i b i t i o n o f a d e n y l a t e c y c l a s e i s a l s o s u g g e s t e d b y t h e s t i m u l u s - s p e c i f i c d e s e n s i t i z a t i o n o f 6 8 p l a t e l e t s e x p o s e d t o e p i n e p h r i n e . E x p o s u r e o f p l a t e l e t s t o e p i n e p h r i n e f o r s h o r t p e r i o d s o f 5 - 3 0 m i n u t e s d e s e n s i t i z e s t h e a b i l i t y o f a z - a d r e n e r g i c r e c e p t o r s t o b o t h i n i t i a t e a n d p o t e n t i a t e a g g r e g a t i o n , b u t d o e s n o t a f f e c t t h e i r a b i l i t y t o i n h i b i t a d e n y l a t e c y c l a s e f “ ° T h e G e n e r a t i o n a n d F u n c t i o n o f C y c l i c G M P I n p a r a l l e l t o t h e c y c l i c A M P s y s t e m , c y c l i c G M P i s p r o d u c e d a n d d e g r a d e d b y g u a n o s i n e c y c l a s e a n d c y c l i c G M P p h o s p h o d i e s t e r a s e r e s p e c t i v e l y . S t i m u l a t i o n o f p l a t e l e t s b y t h r o m b i n i n d u c e s a n e l e v a t i o n i n i n t r a c e l l u l a r c y c l i c G M P , b u t i t i s n o t a p p a r e n t i f i t i s s e r v i n g a s t i m u l a t o r y o r i n h i b i t o r y r o l e . “ “ H o w e v e r , e v i d e n c e s u g g e s t s t h a t c y c l i c G M P i s a n e g a t i v e r a t h e r t h a n p o s i t i v e s t i m u l u s i n p l a t e l e t s . T h e e f f e c t s o f e x o g e n o u s c y c l i c G M P o n p l a t e l e t f u n c t i o n h a v e b e e n e x a m i n e d u s i n g a s t a b l e a n a l o g u e . A g g r e g a t i o n , s e c r e t i o n , ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 p r o d u c t i o n a n d t h e r i s e i n i n t r a c y t o p l a s m i c C a 2 + w e r e i n h i b i t e d i n t h r o m b i n - s t i m u l a t e d p l a t e l e t s . & “ ' W h e n g u a n y l a t e c y c l a s e w a s s t i m u l a t e d b y i n c u b a t i o n w i t h s i n 1 t o i n c r e a s e c y c l i c G M P l e v e l s , a g g r e g a t i o n a n d s e r o t o n i n r e l e a s e i n r e s p o n s e t o t h r o m b i n w e r e i n h i b i t e d s l i g h t l y a n d C a fl ’ i n f l u x f r o m t h e e x t e r n a l m e d i u m w a s i n h i b i t e d m a r k e d l y . “ m I t w a s c o n c l u d e d t h a t e f f e c t s o n p h o s p h o l i p a s e C a c t i v a t i o n w e r e s e c o n d a r y t o i n h i b i t i o n o f t h e C a h ' i n f l u x . 6 9 T H E R O L E O F C A L C I U M I N C E L L U L A R P R O C E S S E S C a l c i u m p l a y s a c e n t r a l r o l e i n b o t h r e s t i n g a n d s t i m u l a t e d p l a t e l e t s . E x t r a c e l l u l a r C a 2 + e x i s t s i n r a p i d e q u i l i b r i u m w i t h C a 2 + b o u n d t o t h e p l a t e l e t s u r f a c e a n d a t l e a s t p a r t o f t h e r e q u i r e m e n t o f e x t r a c e l l u l a r C a 2 + f o r p l a t e l e t f u n c t i o n s s u c h a s f i b r i n o g e n b i n d i n g t o G P I I b - I I I a m a y r e f l e c t a r e q u i r e m e n t f o r s u r f a c e - b o u n d C a 2 + . 5 3 P l a t e l e t s p o s s e s s t w o e x c h a n g e a b l e C a 2 + p o o l s . 5 0 O n e i s a s l o w l y e x c h a n g e a b l e C a 2 + p o o l r e p r e s e n t i n g 5 4 % o f e x c h a n g e a b l e C a 2 + t h a t i s p r e s u m a b l y i n t r a c e l l u l a r b e c a u s e i t i s n o t a f f e c t e d b y i n c u b a t i o n w i t h e t h y l e n e g l y c o l t e t r a a c e t i c a c i d ( E G T A ) . T h e o t h e r r e p r e s e n t s 4 6 % o f e x c h a n g e a b l e C a 2 + a n d i s a r a p i d l y e x c h a n g e a b l e p o o l w h i c h i s l i k e l y t o b e s u r f a c e - b o u n d b e c a u s e i t i s r e m o v e d b y E G T A . P l a t e l e t s a n d S u r f a c e - b o u n d C a 2 + W h e n p l a t e l e t s a r e e x p o s e d t o a g o n i s t s , t h e a m o u n t o f s u r f a c e - b o u n d C a 2 + i n c r e a s e s d u e a n i n c r e a s e i n t h e n u m b e r o f b i n d i n g s i t e s . T h e r a t e o f e x c h a n g e i n t o t h e i n t r a c e l l u l a r p o o l a l s o i n c r e a s e s . I t h a s b e e n d e t e r m i n e d t h a t G P I I b a n d G P I I I a r e p r e s e n t t h e m a j o r C a Z I - b i n d i n g g l y c o p r o t e i n s o n n o n - s t i m u l a t e d p l a t e l e t s w h i l e n e i t h e r o f t h e s e g l y c o p r o t e i n s o r G P I b r e p r e s e n t s t h e n e w C a 2 + - b i n d i n g s i t e s i n d u c e d o n s t i m u l a t e d p l a t e l e t s s " 3 R e m o v a l o f t h e C a 2 + f r o m t h e p l a t e l e t s u r f a c e i n h i b i t s p l a t e l e t f u n c t i o n , e v e n i n t h e p r e s e n c e o f 1 . 0 m M M g “ . T h i s s u g g e s t s t h a t b i n d i n g o f e x t r a c e l l u l a r C a 2 + t o G P I I b a n d G P I I I a , a n d p o s s i b l y o t h e r m e m b r a n e p r o t e i n s , o n s t i m u l a t e d p l a t e l e t s i s e s s e n t i a l f o r m a x i m a l p l a t e l e t r e s p o n s e s t o A D P a n d e p i n e p h r i n e . T h e r e f o r e t h e 7 0 r e q u i r e m e n t f o r e x t r a c e l l u l a r C a 2 + m a y r e p r e s e n t a r e q u i r e m e n t f o r s u r f a c e - b o u n d C a 2 + . I n t r a c e l l u l a r C a 2 + P o o l s T h e e x c h a n g e a b l e i n t r a c e l l u l a r C a 2 + p o o l c o n s i s t s o f a m o r e r a p i d l y e x c h a n g i n g p o o l ( t 3 - 1 7 m i n u t e s ) t h a t c o r r e s p o n d s t o t h e c y t o p l a s m i c p o o l o f C a 2 + a n d a s l o w l y e x c h a n g i n g p o o l ( t k - 3 0 0 m i n u t e s ) t h a t c o r r e s p o n d s t o t h e d e n s e t u b u l a r s y s t e m a n d m i t o c h o n d r i a . “ T h e c y t o p l a s m i c C a 2 + p o o l i s n o t a f f e c t e d b y c h a n g e s i n t h e e x t r a c e l l u l a r C a 2 + c o n c e n t r a t i o n a n d i s m a i n t a i n e d a t 0 . 1 A M a s m e a s u r e d b y t h e f l u o r e s c e n t i n d i c a t o r q u i n 2 . " ° 7 T h e m o r e s l o w l y e x c h a n g i n g p o o l v a r i e s w i t h c h a n g e s i n t h e e x t r a c e l l u l a r C a “ c o n c e n t r a t i o n . I n m o s t c e l l t y p e s , t h e m a i n t e n a n c e o f t h e c y t o p l a s m i c C a 2 + c o n c e n t r a t i o n b e l o w t h a t o f t h e e x t e r n a l m e d i u m i s a c c o m p l i s h e d b y : ( i ) s e q u e s t r a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r C a 2 + w i t h i n i n t e r n a l s t o r a g e s i t e s s u c h a s t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m a n d m i t o c h o n d r i a ; ( i i ) a c t i v e p r o m o t i o n o f C a 2 + e f f l u x ; a n d ( i i i ) l i m i t i n g C a 2 + i n f l u x . I n p l a t e l e t s , t h e b e s t c h a r a c t e r i z e d o f t h e s e i s t h e s e q u e s t r a t i o n o f C a 2 + i n t o a n i n t r a c e l l u l a r s t o r a g e s i t e w h i c h a p p e a r s t o b e p r i m a r i l y t h e d e n s e t u b u l a r s y s t e m , a s t r u c t u r e d e r i v e d f r o m t h e m e g a k a r y o c y t e e n d o p l a s m i c 5 1 T h e m e c h a n i s m s t h a t m e d i a t e C a 2 + i n f l u x a n d e f f l u x a c r o s s r e t i c u l u m . t h e p l a s m a m e m b r a n e a r e n o t a s w e l l - c h a r a c t e r i z e d , b u t o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t i n f l u x o c c u r s t h r o u g h s p e c i f i c c h a n n e l s i n t h e p l a s m a m e m b r a n e a n d C a 2 + e f f l u x o c c u r s v i a a n u n d e f i n e d e n e r g y - d e p e n d e n t p r o c e s s . 5 1 ' 5 2 7 1 ( i ) S e q u e s t r a t i o n o f C a 2 + i n t o I n t e r n a l S t o r a g e S i t e s M e m b r a n e C a Z I - A T P a s e s a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e e n e r g y - d e p e n d e n t t r a n s p o r t o f C a 2 + a c r o s s m e m b r a n e b a r r i e r s a g a i n s t c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t s . T h e s e q u e s t r a t i o n o f C a 2 + i n t o t h e d e n s e t u b u l a r s y s t e m i s s t i m u l a t e d b y C a 2 + a n d A T P a n d r e q u i r e s t h e p r e s e n c e o f M g ” . A C a Z I - A T P a s e r e s p o n s i b l e f o r t h e s e q u e s t r a t i o n o f C a 2 + i n t o t h e d e n s e t u b u l a r s y s t e m h a s b e e n i d e n t i f i e d i n p l a t e l e t d e n s e t u b u l a r s y s t e m m e m b r a n e s . 1 ' 3 8 ' 3 2 5 I t h a s b e e n p u r i f i e d a n d c h a r a c t e r i z e d a n d f o u n d t o b e a p o l y p e p t i d e o f M r - 1 0 0 k D a t h a t i s i m m u n o c h e m i c a l l y r e l a t e d t o t h e C a 2 + p u m p f r o m m u s c l e s a r c o p l a s m i c r e t i c u l u m . 1 1 2 A m o n o c l o n a l a n t i b o d y t o a 1 0 0 k D a p r o t e i n h a s b e e n s h o w n t o g r e a t l y i n h i b i t C a 2 + u p t a k e i n t o p l a t e l e t i n t r a c e l l u l a r v e s i c l e s a n d t h e d e n s e t u b u l a r s y s t e m o f p l a t e l e t s p e r m e a b i l i z e d w i t h s a p o n i n . 1 6 9 ' 1 7 0 T h e a n t i b o d y d i d n o t a f f e c t t h e ( l , 4 , 5 ) I P 3 - i n d u c e d r e l e a s e o f p r e - s t o r e d C a ” i n e i t h e r p e r m e a b i l i z e d p l a t e l e t s o r m e m b r a n e v e s i c l e s . I t w a s c o n c l u d e d f r o m t h i s s t u d y t h a t t h e a n t i b o d y b o u n d o n l y t o t h e t r a n s l o c a t i n g c h a n n e l p r o t e i n a s s o c i a t e d w i t h t h e C a 2 + - A T P a s e a n d n o t t o c a l c i u m c h a n n e l s r e s p o n s i v e t o ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 . T h e e n e r g y - d e p e n d e n t C a 2 + t r a n s p o r t i n t o t h e d e n s e t u b u l a r s y s t e m c o n s u m e s o n e m o l e c u l e o f A T P f o r e a c h t w o m o l e c u l e s o f C a 2 + t r a n s p o r t e d a n d p r o c e e d s t h r o u g h o n e o r m o r e p h o s p h o r y l a t e d i n t e r m e d i a t e s . 1 1 3 I t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t t h i s p h o s p h o r y l a t i o n o f a s e r i e s o f i n t e r m e d i a t e s i s a s s o c i a t e d w i t h a t r a n s m e m b r a n e d e c r e a s e i n a f f i n i t y f o r C a “ s u c h t h a t t h e f r e e i o n c a n 7 2 1 6 8 D u r i n g e v e n t u a l l y b e l i b e r a t e d i n t o t h e i n t r a v e s i c u l a r s p a c e . C a 2 + u p t a k e , t w o m a j o r p o l y p e p t i d e s o f 9 0 k D a a n d 9 5 k D a a r e s l o w l y , b u t p r o g r e s s i v e l y , p h o s p h o r y l a t e d . A s d i s c u s s e d e a r l i e r , t h e u p t a k e o f C a 2 + i n t o t h e d e n s e t u b u l a r s y s t e m i s k n o w n t o b e r e g u l a t e d , a t l e a s t i n p a r t , b y t h e c y c l i c A M P l e v e l s i n t h e c e l l . A c t i v a t i o n o f t h e c y c l i c A M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e p h o s p h o r y l a t e s a 2 2 k D a p r o t e i n ( t h r o m b o l a m b a n ) t h a t s t i m u l a t e s t h e a c t i v i t y o f t h e C a 2 + - A T P a s e a n d C a 2 + u p t a k e . I n t h e a b s e n c e o f c y c l i c A M P , c a l m o d u l i n m a y a l s o s t i m u l a t e s C a 2 + u p t a k e . " 2 7 T h e r e f o r e , s i m i l a r t o c a r d i a c m u s c l e c e l l s , t h e p l a t e l e t C a 2 + - A T P a s e a c t i v i t y m a y b e u n d e r t h e d u a l c o n t r o l o f c y c l i c A M P a n d c a l m o d u l i n . ( i i ) A c t i v e P r o m o t i o n o f C a 2 + E f f l u x A c r o s s t h e P l a s m a M e m b r a n e T h e s e c o n d m e a n s b y w h i c h t h e c y t o p l a s m i c C a 2 + c o n c e n t r a t i o n i s m a i n t a i n e d a t a l o w e r c o n c e n t r a t i o n t h a n i n t h e s u r r o u n d i n g m e d i u m i s b y a c t i v e C a 2 + e f f l u x f r o m t h e c e l l . I n m o s t c e l l t y p e s , C a 2 + e f f l u x i s m e d i a t e d b y e i t h e r a C a Z I - A T P a s e o r b y a N a " - C a 2 + e x c h a n g e r i n t h e p l a s m a m e m b r a n e . I n p l a t e l e t s , t h e A T P - d e p e n d e n t C a y - a c c u m u l a t i n g a c t i v i t y h a s b e e n r e p o r t e d t o b e a l m o s t e x c l u s i v e l y a s s o c i a t e d w i t h t h e i n t e r n a l m e m b r a n e s . 1 ' 5 8 ' 3 2 5 H o w e v e r , r e c e n t r e p o r t s d e s c r i b e a C a z + - a c t i v a t e d A T P a s e ” 2 ' 1 ” A N a I - C a 2 + e x c h a n g e r a s s o c i a t e d w i t h t h e p l a s m a m e m b r a n e . w h i c h m e d i a t e s ” C a z " u p t a k e i n e x c h a n g e f o r i n t r a v e s i c u l a r N a + h a s b e e n d e s c r i b e d i n h u m a n p l a t e l e t p l a s m a m e m b r a n e v e s i c l e s . " ' 0 5 W h i l e c h a n g e s i n t h e p l a s m a m e m b r a n e N a + g r a d i e n t h a v e b e e n s h o w n 7 3 t o a f f e c t C a y ' h o m e o s t a s i s i n r e s t i n g p l a t e l e t s , t h e r e s u l t s o f t h e s e s t u d i e s a l s o i n d i c a t e t h a t i s u n l i k e l y t h a t d i r e c t e x c h a n g e o f e x t r a c e l l u l a r N a + f o r i n t r a c e l l u l a r C a 2 + i s a m a j o r c o n t r i b u t i o n t o C a 2 + e f f l u x . " ’ 2 T h e r e f o r e , s o m e o t h e r m e c h a n i s m ( s ) m u s t a l s o b e i n v o l v e d i n C a a ’ e f f l u x f r o m p l a t e l e t s , b u t h a s n o t b e e n c l e a r l y i d e n t i f i e d a s y e t . ( i i i ) L i m i t a t i o n o f C a 2 + I n f l u x A c r o s s t h e P l a s m a M e m b r a n e L i m i t a t i o n o f i n f l u x a c r o s s t h e p l a s m a m e m b r a n e i s t h e t h i r d m e a n s b y w h i c h t h e i n t r a c y t o p l a s m i c C a 2 + c o n c e n t r a t i o n i s m a i n t a i n e d a t 1 . 0 p M . V e r y l i t t l e i s k n o w n a b o u t C a 2 + i n f l u x i n t o p l a t e l e t s , a l t h o u g h p r e s u m a b l y i t r e p r e s e n t s p a s s i v e C a 2 + m o v e m e n t d o w n t h e p l a s m a m e m b r a n e g r a d i e n t . T h e r a t e o f C a 2 + e x c h a n g e h a s b e e n i n v e s t i g a t e d i n G l a n z m a n n ' s t h r o m b a s t h e n i a a n d E G T A - t r e a t e d p l a t e l e t s a s w e l l n o r m a l p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y a r a n g e o f a g o n i s t s i n t h e p r e s e n c e o f m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s t o G P I I b - I I I a . 5 " 3 ° " F r o m t h e s e s t u d i e s i t w a s c o n c l u d e d t h a t : ( l ) i n t a c t G P I I b - I I I a c o m p l e x m a y b e n e c e s s a r y f o r m a i n t e n a n c e o f t h e r e l a t i v e l y s l o w i n f l u x o f C a 2 + i n r e s t i n g p l a t e l e t s , b u t n o t f o r t h e v e r y r a p i d i n f l u x t h a t o c c u r s d u r i n g a c t i v a t i o n ; a n d ( 2 ) C a 2 + i n f l u x i n r e s p o n s e t o w e a k a g o n i s t s o c c u r s p r e d o m i n a n t l y v i a a c h a n n e l t h a t i s v e r y c l o s e t o , b u t s e p a r a t e f r o m , t h e G P I I b - I I I a c o m p l e x . 7 4 I n t r a c y t o p l a s m i c C a 2 + F l u x e s D u r i n g P l a t e l e t A c t i v a t i o n F l u x e s i n t h e c y t o p l a s m i c f r e e C a 2 + l e v e l s i n r e s p o n s e t o a g o n i s t s a r e m o s t c o m m o n l y m e a s u r e d i n p l a t e l e t s b y t h e f l u o r e s c e n t C a 2 + c h e l a t o r s q u i n 2 a n d f u r a - 2 a n d t h e p h o t o p r o t e i n a e q u o r i n . 8 6 B o t h q u i n 2 a n d f u r s - 2 m e a s u r e t h e " a v e r a g e " f r e e C a 2 + t h r o u g h o u t t h e c y t o p l a s m , c o m p a r e d t o a e q u o r i n w h i c h i s p r e s u m e d t o m e a s u r e m o r e l o c a l i z e d a r e a s o f i n c r e a s e d c y t o p l a s m i c f r e e C a 2 + , p o s s i b l y c l o s e t o t h e p l a s m a m e m b r a n e . T h e m e a s u r e d C a 2 + f l u x i n t h e a b s e n c e o f e x t e r n a l C a 2 + i s a r e f l e c t i o n o f t h e m o b i l i z a t i o n o f C a 2 + f r o m i n t r a c e l l u l a r s t o r e s . I n t h e a b s e n c e o f e x t e r n a l C a “ , t h e r e i s a r a p i d a n d t r a n s i e n t i n c r e a s e i n c y t o p l a s m i c C a 2 + a s m e a s u r e d b y q u i n 2 o r f u r a - 2 i n r e s p o n s e t o s t i m u l a t i o n b y t h r o m b i n , A D P , P A F , a r a c h i d o n i c a c i d , U 4 6 6 1 9 , v a s o p r e s s i n a n d c a l c i u m i o n o p h o r e s . 1 3 7 ' 1 7 3 ' 3 0 0 ' 3 9 3 " ° 7 " 8 3 U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , c o l l a g e n h a s b e e n r e p o r t e d t o b o t h e l i c i t a n d n o t e l i c i t a C a 2 + p e a k f r o m a s p i r i n - t r e a t e d p l a t e l e t s . ° ' 3 ' " ° " 0 8 C o l l a g e n d o e s m o b i l i z e i n t r a c e l l u l a r C a 2 + w h e n m e a s u r e d b y a e q u o r i n . ‘ ° 5 P h o r b o l e s t e r d o e s n o t e l i c i t a C a 2 + p e a k w h e n m e a s u r e d w i t h q u i n 2 o r f u r s - 2 , b u t a o a , 4 9 a d o e s w i t h a e q u o r i n . E p i n e p h r i n e d o e s n o t i n d u c e a C a ” p e a k i n t h e a b s e n c e o f e x t e r n a l C a 2 + w h e n m e a s u r e d b y q u i n 2 , f u r s - 2 o r a e q u o r i n . ‘ 9 5 T h e r e a r e t h r e e p o s s i b l e s o u r c e s f o r t h e r a p i d a n d t r a n s i e n t i n c r e a s e i n p l a t e l e t c y t o p l a s m i c C a m ' t h a t o c c u r s i n r e s p o n s e t o t h e b i n d i n g o f a n a g o n i s t t o i t s e x t e r n a l r e c e p t o r o n t h e p l a t e l e t p l a s m a m e m b r a n e : ( 1 ) r e l e a s e o f C a 2 + f r o m t h e d e n s e t u b u l a r s y s t e m ; ( i i ) r e l e a s e o f C a 2 + 7 5 f r o m i n t e r n a l s t o r a g e s i t e s i n t h e m e m b r a n e s ; a n d ( i i i ) e n t r a n c e o f C a 2 + i n t o t h e p l a t e l e t f r o m t h e e x t e r n a l m e d i u m . ( 1 ) R e l e a s e o f C a “ + f r o m t h e D e n s e T u b u l a r S y s t e m T h e m a j o r i n t e r n a l s t o r a g e s i t e f o r r e l e a s e d C a 2 + i n p l a t e l e t s i s t h e d e n s e t u b u l a r s y s t e m . T h e h y d r o l y s i s o f P I P ; b y p h o s p h o l i p a s e C g e n e r a t e s t h e w a t e r - s o l u b l e ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 m o l e c u l e w h i c h h a s b e e n s h o w n t o p r o m o t e t h e r e l e a s e o f C a 2 + f r o m n o n - m i t o c h o n d r i a l s t o r e s i n a v a r i e t y o f c e l l t y p e s . 3 5 ' 3 7 1 I n s t u d i e s u s i n g b o t h v e s i c l e s p r e p a r e d f r o m p l a t e l e t i n t r a c e l l u l a r m e m b r a n e s a n d i n t a c t s a p o n i n - p e r m e a b i l i z e d p l a t e l e t s , ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 2 + . 1 2 ' 5 5 H a l f - m a x i m a l C a 2 + r e l e a s e i n d u c e d r a p i d r e l e a s e o f C a o c c u r r e d a t 1 . 0 u M ( l , 4 , 5 ) I P 3 , w h i c h i s c o m p a t i b l e w i t h t h e a m o u n t o f ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 p r o d u c e d d u r i n g p l a t e l e t a c t i v a t i o n . ” ‘ T h e ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 - m e d i a t e d r e l e a s e i s n o t a f f e c t e d b y N a + o r C a 2 + , b u t i s p o t e n t i a t e d b y i n c r e a s e s i n p H . ” A s d i s c u s s e d e a r l i e r , t h e m e c h a n i s m b y w h i c h ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 m o b i l i z e s C a 2 + f r o m i n t r a c e l l u l a r s t o r e s h a s n o t b e e n i d e n t i f i e d , b u t i t i s p o s t u l a t e d t h a t i t a c t i v a t e s a C a 2 + c h a n n e l b y a l i g a n d - b i n d i n g r e a c t i o n . 5 5 ' 3 ‘ 5 9 R a p i d t e r m i n a t i o n o f t h e ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 s i g n a l i s o f g r e a t i m p o r t a n c e i n t h e c o n t r o l o f C a 2 + r e l e a s e f r o m i n t e r n a l s t o r e s . D e p h o s p h o r y l a t i o n o f ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 a n d ( 1 : 2 - c y c l i c , 4 , 5 ) I P 3 b y a 5 - p h o s p h o m o n o e s t e r a s e i s o n e m e a n s b y w h i c h t h e C a z + - m o b i l i z i n g s i g n a l m a y b e t e r m i n a t e d . 9 8 I t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t t h e 5 - p h o s p h o m o n o e s t e r a s e i s t h e 4 7 k D a p r o t e i n p h o s p h o r y l a t e d b y 7 6 p r o t e i n k i n a s e C d u r i n g p l a t e l e t a c t i v a t i o n . 9 7 P u r i f i e d 5 - p h o s p h o m o n o e s t e r a s e h a s b e e n s h o w n t o b e a c t i v a t e d b y p h o s p h o r y l a t i o n b y p r o t e i n k i n a s e C . I t i s p r o p o s e d t h a t t h e i n i t i a l ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 - m e d i a t e d C a 2 + r e l e a s e a l l o w s p h o s p h o l i p a s e C t o h y d r o l y z e P 1 t o g e n e r a t e t h e D A G t h a t a c t i v a t e s p r o t e i n k i n a s e C , w h i c h i n t u r n t e r m i n a t e s t h e C a 2 + s i g n a l b y a c t i v a t i n g t h e 5 - p h o s p h o m o n o e s t e r a s e . A l t e r n a t i v e l y , ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 m a y b e p h o s p h o r y l a t e d b y a s p e c i f i c 3 - k i n a s e t o ( 1 , 3 , 4 , 5 ) I P , , . 9 8 T h e 3 - k i n a s e h a s b e e n p a r t i a l l y p u r i f i e d a n d i s a c t i v a t e d b y t h e C a z + - c a l m o d u l i n c o m p l e x . n ° " ' 2 2 I t i s p r o p o s e d t h a t t h e C a 2 + m o b i l i z e d f r o m t h e d e n s e t u b u l a r s y s t e m f o r m s a c o m p l e x w i t h c a l m o d u l i n a n d t h e G a b i - c a l m o d u l i n c o m p l e x t h e n s t i m u l a t e s t h e c o n v e r s i o n o f ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 , t o ( 1 , 3 , 4 , 5 ) I P , , . R e c e n t s t u d i e s s u g g e s t t h a t ( 1 , 3 , 4 , 5 ) I P , , m i g h t m o d u l a t e t h e e n t r y o f C a 2 + f r o m t h e e x t r a c e l l u l a r e n v i r o n m e n t . 2 2 2 T h e ( 1 , 3 , 4 , 5 ) I P , m o l e c u l e i s a l s o d e p h o s p h o r y l a t e d b y t h e 5 - p h o s p h o m o n o e s t e r a s e t o f o r m ( 1 , 3 , 4 ) I P 3 w h i c h i s t h e m a j o r f o r m o f 1 P 3 f o u n d i n h u m a n p l a t e l e t s . 1 ° “ ( i i ) R e l e a s e o f C a 2 + f r o m M e m b r a n e S t o r a g e S i t e s T h e s e c o n d i n t e r n a l s t o r a g e s i t e f o r C a 2 + a n d p o s s i b l e s o u r c e o f r e l e a s e d C a 2 + a r e t h e m e m b r a n e s t h e m s e l v e s . T h e a f f i n i t y o f t h e P I P Z m o l e c u l e f o r C a 2 + m a y p r o v i d e a m e m b r a n e - b o u n d C a 2 + s t o r e w h i c h r e l e a s e s C a 2 + t o t h e c y t o p l a s m w h e n P I P z i s h y d r o l y z e d b y p h o s p h o l i p a s e C d u r i n g p l a t e l e t a c t i v a t i o n . ‘ 5 5 I t i s n o t k n o w n i f v a s o p r e s s i n . 1 7 4 . 1 7 5 . 3 0 0 . 3 9 3 , 4 0 7 , 4 2 4 7 7 t h i s s o u r c e m a k e s a s i g n i f i c a n t c o n t r i b u t i o n t o t h e r e l e a s e o f C a ” f r o m i n t e r n a l s t o r e s i n r e s p o n s e t o p l a t e l e t a g o n i s t s . I t i s p o s s i b l e t h a t t h e d i v a l e n t c a t i o n b i n d i n g s i t e s o n P I P Z a r e s a t u r a t e d w i t h M 2 + w h i c h i s p r e s e n t i n h i g h c o n c e n t r a t i o n s i n t h e p l a t e l e t c y t o p l a s m . T h e r e l e a s e o f m e m b r a n e - b o u n d C a ? + , a s m e a s u r e d b y a d e c r e a s e i n c h l o r t e t r a c y c l i n e f l u o r e s c e n c e , i n p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y t h r o m b i n o r a r a c h i d o n i c a c i d d o e s c o r r e s p o n d c l o s e l y t o t h e b r e a k d o w n o f P I P ; a n d m a y b e s u f f i c i e n t t o a c c o u n t f o r t h e i n c r e a s e i n c y t o p l a s m i c C a 2 + . 5 3 ' 1 3 2 ' 2 8 ‘ ( i i i ) I n f l u x o f C a 2 + f r o m t h e E x t e r n a l M e d i u m T h e t h i r d s o u r c e o f t h e e l e v a t e d c y t o p l a s m i c C a 2 + i s i n f l u x f r o m t h e e x t e r n a l m e d i u m . T h e c o n t r i b u t i o n o f C a 2 + i n f l u x f r o m t h e e x t e r n a l m e d i u m t o t h e c y t o p l a s m i c C a 2 + r i s e i n r e s p o n s e t o a n a g o n i s t c a n b e d e t e r m i n e d b y m e a s u r i n g C a 2 + p e a k s i n t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f e x t e r n a l C a ” . T h e m a x i m a l C a 2 + p e a k m e a s u r e d b y q u i n 2 o r f u r s - 2 f l u o r e s c e n c e i s m u c h g r e a t e r i n t h e p r e s e n c e o f e x t e r n a l C a 2 + w h e n p l a t e l e t s a r e s t i m u l a t e d w i t h t h r o m b i n , c o l l a g e n , A D P , P A F , 0 4 4 6 1 9 , c a l c i u m i o n o p h o r e o r N o t o n l y i s t h e c y t o p l a s m i c C a 2 + r i s e m u c h g r e a t e r i n t h e p r e s e n c e o f e x t e r n a l C a 2 + , i t i s a l s o p r o l o n g e d . T h e a b i l i t y o f M n 2 + t o q u e n c h q u i n 2 f l u o r e s c e n c e a n d t h e b u f f e r i n g c a p a c i t y o f q u i n 2 w e r e u t i l i z e d t o e s t a b l i s h t h a t C a 2 + i n f l u x o c c u r s d u r i n g p l a t e l e t a c t i v a t i o n . “ “ 1 7 5 7 8 T h e t w o m a j o r p a t h w a y s f o r C a 2 + e n t r y i n t o c e l l s a r e v o l t a g e - d e p e n d e n t c h a n n e l s a n d r e c e p t o r - o p e r a t e d c h a n n e l s . S t u d i e s o f t h e e f f e c t s o f i n h i b i t o r s o f v o l t a g e - d e p e n d e n t c h a n n e l s o n p l a t e l e t C a 2 + f l u x e s a n d e x a m i n a t i o n o f p l a t e l e t s f o r b i n d i n g s i t e s f o r t h e s e a g e n t s s u g g e s t t h a t C a 2 + e n t r y o c c u r s v i a a p a t h w a y o t h e r t h a n p o t e n t i a l - s e n s i t i v e c h a n n e l s . 3 7 3 P l a t e l e t s a r e p r e s u m e d t o p o s s e s s r e c e p t o r - o p e r a t e d d i v a l e n t c a t i o n c h a n n e l s . 1 7 5 V e r y l i t t l e i s k n o w n a b o u t t h e r e g u l a t i o n o f C a 2 + c h a n n e l s i n p l a t e l e t s . S t i m u l a t e d p l a t e l e t s v e r y r a p i d l y p r o d u c e ( 1 , 3 , 4 , 5 ) I P , w h i c h h a s b e e n d e m o n s t r a t e d t o e f f e c t C a 2 + i n f l u x i n o t h e r c e l l t y p e s . I t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t C a 2 + m o b i l i z e d f r o m i n t e r n a l s t o r e s b y ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 e n h a n c e s t h e f o r m a t i o n o f C a z + / c a 1 m o d u l i n w h i c h a c t i v a t e s , t h e 3 - k i n a s e . T h i s e n z y m e p h o s p h o r y l a t e s ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 t o ( 1 , 3 , 4 , 5 ) I P , w h i c h c a u s e s t h e s e c o n d p h a s e o f C a 2 + m o b i l i z a t i o n f r o m t h e e x t r a c e l l u l a r p o o l . “ 2 T h i s w o u l d e x p l a i n w h y t h e C a 2 + s i g n a l i s r e l a t i v e l y p r o l o n g e d i n t h e p r e s e n c e o f e x t e r n a l C a ” . C H I - D e p e n d e n t E v e n t s i n P l a t e l e t A c t i v a t i o n T h e p l a t e l e t p r o t e i n s r e g u l a t e d b y C a 2 + d i r e c t l y o r v i a b i n d i n g t o c a l m o d u l i n i n c l u d e m y o s i n l i g h t c h a i n k i n a s e , p h o s p h o l i p a s e A 2 , C a 2 + - d e p e n d e n t n e u t r a l p r o t e a s e s , t h e C a Z I - A T P a s e a n d c y t o s k e l e t a l p r o t e i n s . T h e l a t t e r t w o h a v e a l r e a d y b e e n d i s c u s s e d . T h e i n t r a c e l l u l a r C a 2 + - b i n d i n g r e g u l a t o r p r o t e i n c a l m o d u l i n h a s b e e n c h a r a c t e r i z e d i n p l a t e l e t s a n d f o u n d t o b e p r e s e n t i n h i g h c o n c e n t r a t i o n s . 5 2 5 7 9 C a l m o d u l i n i s a l o w m o l e c u l a r w e i g h t ( M , = - 1 7 k D a ) a c t i v a t o r p r o t e i n w h o s e a b i l i t y t o a c t i v a t e i s d e p e n d e n t u p o n t h e b i n d i n g o f C a m ' a t m i c r o m o l a r o r h i g h e r C a 2 + c o n c e n t r a t i o n s . ” T h e C a 2 + / c a l m o d u l i n c o m p l e x f o r m e d w h e n c a m i s r e l e a s e d i n a c t i v a t e d p l a t e l e t s i n t e r a c t s w i t h v a r i o u s c a l m o d u l i n - b i n d i n g p r o t e i n s t o p r o p a g a t e t h e 0 8 3 + s i g n a l t o a . n u m b e r o f p l a t e l e t e n z y m e s a n d s t r u c t u r a l p r o t e i n s . " 9 3 T e n d i s t i n c t c a l m o d u l i n - b i n d i n g p r o t e i n s h a v e b e e n o b s e r v e d i n p l a t e l e t s . T h e s e i n c l u d e m y o s i n l i g h t c h a i n k i n a s e , c a l m o d u l i n - d e p e n d e n t p h o s p h a t a s e , p h o s p h o r y l a s e k i n a s e , c y c l i c n u c l e o t i d e p h o s p h o d i e s t e r a s e a n d c a l d e s m o n , b u t t h e r e m a i n i n g p r o t e i n s h a v e n o t b e e n i d e n t i f i e d . ( 1 ) M y o s i n L i g h t C h a i n P h o s p h o r y l a t i o n P l a t e l e t s t i m u l a t i o n l e a d s t o t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f a 2 0 k D a , p r o t e i n t h a t h a s b e e n i d e n t i f i e d a s t h e m y o s i n l i g h t c h a i n . 2 ' 1 0 6 T h e b i n d i n g o f C a m ' t o c a l m o d u l i n i n t h e s t i m u l a t e d p l a t e l e t l e a d s t o t h e a s s o c i a t i o n o f t h e C a y l c a l m o d u l i n c o m p l e x w i t h t h e m y o s i n l i g h t c h a i n k i n a s e w h i c h i s t h e n a c t i v a t e d . M y o s i n p h o s p h o r y l a t i o n r e s u l t s i n i n c r e a s e d a c t i n - a c t i v a t e d A T P a s e a c t i v i t y , t h e a s s o c i a t i o n o f m y o s i n w i t h t h e c y t o s k e l e t o n a n d t h e a s s e m b l y o f m y o s i n i n t o f i l a m e n t s . W h e n i n t r a c e l l u l a r c y c l i c A M P l e v e l s a r e e l e v a t e d , t h e c y c l i c A M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e i s a c t i v a t e d a n d c a n p h o s p h o r y l a t e t h e m y o s i n l i g h t c h a i n k i n a s e . 9 9 I n t h e p r e s e n c e o f C a m 3 c a l m o d u l i n c o m p l e x , p h o s p h o r y l a t i o n b y t h e c y c l i c A M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e h a s n o e f f e c t , b u t i n t h e a b s e n c e o f C a y l c a l m o d u l i n t h e p h o s p h o r y l a t i o n m a r k e d l y d e c r e a s e s t h e a c t i v i t y o f t h e m y o s i n l i g h t c h a i n k i n a s e a n d i t s a f f i n i t y f o r 8 0 c a l m o d u l i n . T h i s m a y e x p l a i n t h e c y c l i c A M P - i n d u c e d i n h i b i t i o n o f m y o s i n l i g h t c h a i n p h o s p h o r y l a t i o n , b u t n o t t h e r e v e r s a l o f p h o s p h o r y l a t i o n t h a t o c c u r s w h e n a d e n y l a t e c y c l a s e s t i m u l a t o r s a r e a d d e d a f t e r s t i m u l a t i o n o f p l a t e l e t s . ( i i ) A c t i v a t i o n o f P h o s p h o l i p a s e A 2 T h e a c t i v e h y d r o l y s i s o f m e m b r a n e p h o s p h o l i p i d s b y C a ? + - d e p e n d e n t p h o s p h o l i p a s e A 2 r e l e a s e s a r a c h i d o n i c a c i d w h i c h i s c o n v e r t e d v i a t h e c y c l o o x y g e n a s e c o m p l e x t o p r o s t a g l a n d i n s , i n c l u d i n g T x A Q w h i c h i s a p o t e n t p o t e n t i a t o r o f p l a t e l e t a g g r e g a t i o n . 2 2 ° W e a k a g o n i s t s s u c h a s A D P , e p i n e p h r i n e a n d l o w c o n c e n t r a t i o n s o f P A F a n d t h r o m b i n a l l s h a r e t h e r e q u i r e m e n t t h a t a r a c h i d o n i c a c i d m u s t b e l i b e r a t e d a n d m e t a b o l i z e d t o e n d o p e r o x i d e s a n d T x A z f o r i r r e v e r s i b l e a g g r e g a t i o n a n d d e n s e g r a n u l e s e c r e t i o n t o o c c u r . S t a b l e p r o s t a g l a n d i n e n d o p e r o x i d e a n a l o g u e s , l i k e e n d o p e r o x i d e s a n d T x A z , b i n d t o s p e c i f i c r e c e p t o r s o n t h e p l a t e l e t s u r f a c e , s t i m u l a t e p h o s p h o l i p a s e C a n d p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s a n d t h e p l a t e l e t r e s p o n s e s o f s h a p e c h a n g e , a g g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n . “ 5 T w o o f t h e t h r e e m a j o r r o u t e s f o r a r a c h i d o n a t e l i b e r a t i o n f r o m p l a t e l e t m e m b r a n e s h a v e b e e n d i s c u s s e d e a r l i e r : p h o s p h o l i p a s e C - m e d i a t e d r e l e a s e o f d i a c y l g l y c e r o l f r o m p h o s p h o i n o s i t i d e s f o l l o w e d b y s e q u e n t i a l a c t i v a t i o n o f d i a c y l - a n d m o n o a c y l g l y c e r o l l i p a s e s , a n d p h o s p h o r y l a t i o n o f d i a c y l g l y c e r o l t o p h o s p h a t i d i c a c i d a n d t h e a c t i v a t i o n o f a p h o s p h a t i d i c a c i d - s p e c i f i c , C a 2 + - d e p e n d e n t 8 1 p h o s p h o l i p a s e A 2 . T h e t h i r d p a t h w a y i s t h e d i r e c t d e a c y l a t i o n o f p h o s p h o l i p i d s , p a r t i c u l a r l y p h o s p h a t i d y l c h o l i n e a n d p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e , b y a C a 2 + o d e p e n d e n t p h o s p h o l i p a s e A 2 . T h e p r o p o r t i o n o f a r a c h i d o n a t e d e r i v e d f r o m e a c h o f t h e s e i s u n c l e a r , b u t t h e m a j o r i t y a p p e a r s t o b e d e r i v e d f r o m t h e a c t i o n o f p h o s p h o l i p a s e A 2 o n m e m b r a n e p h o s p h o l i p i d s . I t h a s b e e n e s t i m a t e d t h a t a m a x i m u m o f 1 5 % o f a r a c h i d o n i c a c i d l i b e r a t e d i s d e r i v e d f r o m p h o s p h o i n o s i t i d e s . 3 0 2 ' 3 1 7 P h o s p h o l i p a s e A 2 c l e a v e s a r a c h i d o n i c a c i d f r o m t h e 2 - p o s i t i o n o f p h o s p h a t i d y l c h o l i n e , p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e a n d , t o a l e s s e r e x t e n t , p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l . T h e p h o s p h o l i p a s e A 2 a c t i v i t y m e a s u r e d i n p l a t e l e t h o m o g e n a t e s i n e a r l i e r s t u d i e s a p p e a r e d t o b e i n s u f f i c i e n t t o a c c o u n t f o r t h e a g o n i s t - i n d u c e d r e l e a s e o f a r a c h i d o n a t e . 2 7 H o w e v e r , i t h a s n o w b e e n d e m o n s t r a t e d t h a t t h e a c t i v i t y o f p h o s p h o l i p a s e A 2 i n h u m a n p l a t e l e t h o m o g e n a t e s i s m u c h h i g h e r t h a n p r e v i o u s l y t h o u g h t b e c a u s e i t s a c t i v i t y i s m a r k e d l y i n h i b i t e d b y u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s p r e s e n t i n t h e h o m o g e n a t e . 1 m 2 ° P h o s p h o l i p a s e A 2 a c t i v i t y h a s b e e n i d e n t i f i e d i n b o t h t h e c y t o p l a s m i c a n d m e m b r a n e f r a c t i o n s o f p l a t e l e t h o m o g e n a t e s . 1 ° J 5 2 T h i s i s s i m i l a r t o m o s t c e l l t y p e s w h e r e m e m b r a n e - b o u n d f o r m s o f p h o s p h o l i p a s e A 2 a r e C a Z I - d e p e n d e n t w i t h p H o p t i m a i n t h e n e u t r a l t o b a s i c r a n g e a n d t h o s e i n t h e c y t o p l a s m i c o r l y s o s o m a l c o m p a r t m e n t s a r e C a a l i n d e p e n d e n t a n d a r e o p t i m a l l y a c t i v e i n t h e 0 . a c i d r a n g e . " 3 I t i s p o s s i b l e t h a t s t i m u l a t i o n o f p l a t e l e t s r e g U I a t e p h o s p h o l i p a s e A 2 a c t i v i t y . 1 - " " " " 3 . 3 " ' 9 8 2 i n d u c e s r e d i s t r i b u t i o n o f p h o s p h o l i p a s e A 2 l e a d i n g t o a n i n c r e a s e i n t h e m e m b r a n e - b o u n d C a y - d e p e n d e n t e n z y m e . P r e s u m a b l y , a s s o c i a t i o n w i t h m e m b r a n e s c o u l d b e c a u s e d b y a n i n c r e a s e i n c y t o p l a s m i c C a 2 + . 2 6 2 A l t h o u g h i t i s f r e q u e n t l y a s s u m e d t h a t a m a j o r c o n t r o l l i n g f a c t o r i n t h e l i b e r a t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d b y p h o s p h o l i p a s e A 2 i s t h e i n t r a c e l l u l a r C a 2 + c o n c e n t r a t i o n , t h e c o n t r o l o f p h o s p h o l i p a s e A ; m a y b e m o r e c o m p l e x . P h o s p h o l i p a s e A 2 i s a C a ” - d e p e n d e n t e n z y m e w h i c h c a n b e a c t i v a t e d b y e l e v a t e d C a 2 + c o n c e n t r a t i o n s , b u t t h i s d o e s n o t n e c e s s a r i l y m e a n i t i s C a 2 + - c o n t r o l l e d . 2 2 ° T h e r e i s n o w s u b s t a n t i a l e v i d e n c e t h a t G p r o t e i n s I t i s p r o p o s e d t h a t d i s t i n c t G p r o t e i n s m o d u l a t e t h e a c t i v i t i e s o f p h o s p h o l i p a s e C a n d p h o s p h o l i p a s e A 2 . S i n c e p h o s p h o l i p a s e A 2 i s a C a 2 + - d e p e n d e n t e n z y m e w h i c h r e s p o n d s t o i n c r e a s e d l e v e l s o f C a 2 + , G p r o t e i n s m a y m o d u l a t e i t s a c t i v i t y b y e i t h e r o p e n i n g C a z “ c h a n n e l s o r b y ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 - i n d u c e d r e l e a s e o f C a 2 + f r o m i n t r a c e l l u l a r s t o r e s . 1 5 ' 2 2 ° ( i i i ) A c t i v a t i o n o f C a y - d e p e n d e n t P r o t e a s e T w o f o r m s o f C a z + - d e p e n d e n t p r o t e a s e , o r c a l p a i n s , h a v e b e e n i d e n t i f i e d i n p l a t e l e t s : c a l p a i n I w h i c h r e q u i r e s 5 - 5 0 u M C a 2 + a n d c a l p a i n I I w h i c h r e q u i r e s m i l l i m o l a r c o n c e n t r a t i o n s o f C a 2 + f o r a c t i v a t i o n . 3 ° " ‘ 2 5 M o r e r e c e n t l y , a s i n g l e C a z + - d e p e n d e n t p r o t e a s e f r o m h u m a n p l a t e l e t s h a s b e e n p u r i f i e d t o n e a r h o m o g e n e i t y . ” 5 T h e p r o t e a s e c o n s i s t e d o f t w o p o l y p e p t i d e c h a i n s o f M r - 7 4 k D a 8 3 a n d M , - 2 8 k D a a n d w a s f u l l y a c t i v e a t 0 . 0 6 M C a 2 + . T h e C a ” - d e p e n d e n t p r o t e a s e h a s b e e n s h o w n t o b e a c t i v a t e d w h e n p l a t e l e t s a r e i n d u c e d t o a g g r e g a t e b y t h e a d d i t i o n o f t h r o m b i n , c o l l a g e n o r t h e c a l c i u m i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 . “ 5 W h e n a g g r e g a t i o n i s p r e v e n t e d , t h e C a y - d e p e n d e n t p r o t e a s e i s n o t a c t i v a t e d . T h e m a j o r s u b s t r a t e s f o r C a Z I - d e p e n d e n t p r o t e a s e i n t h e p l a t e l e t t h a t h a v e b e e n i d e n t i f i e d a r e c y t o s k e l e t a l p r o t e i n s ( a c t i n - b i n d i n g p r o t e i n , a - a c t i n i n , P 2 3 5 / t a l i n a n d s p e c t r i n ) a n d G P I b a n d G P V . 1 " ' “ 8 ' 1 5 ° ' 3 8 " T h e e f f e c t o f p r o t e o l y s i s o n t h e s e p r o t e i n s w a s d i s c u s s e d e a r l i e r . T h e C a 2 + - d e p e n d e n t p r o t e a s e c a n a l s o i r r e v e r s i b l y a c t i v a t e p r o t e i n k i n a s e C , p a r t i c u l a r l y t h e m e m b r a n e - b o u n d f o r m . T h e r o l e o f p r o t e o l y t i c a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C i s n o t y e t k n o w n . C a l c i u m I o n o p h o r e s D i v a l e n t i o n o p h o r e s s u c h a s A 2 3 1 8 7 o r i o n o m y c i n f a c i l i t a t e t h e m o v e m e n t o f d i v a l e n t c a t i o n s s u c h a s C a 2 + a c r o s s m e m b r a n e s . T h e c a l c i u m i o n o p h o r e s a r e n o n - p h y s i o l o g i c p l a t e l e t a g o n i s t s w h i c h i n d u c e s h a p e c h a n g e , a g g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n . 1 2 9 ' 3 1 2 T h e y d o n o t b i n d t o m e m b r a n e r e c e p t o r s a n d d o n o t a c t i v a t e p h o s p h o l i p a s e C t o h y d r o l y s e t h e p h o s p h o i n o s i t i d e s . “ ” 1 2 " “ 1 3 I n s t e a d , t h e y p e n e t r a t e m e m b r a n e s a n d d i r e c t l y m o b i l i z e C a 2 + f r o m i n t e r n a l s t o r e s . T h e r e s p o n s e s o f p l a t e l e t s , e x c e p t f o r a g g r e g a t i o n , a r e i n d e p e n d e n t o f e x t e r n a l C a ” . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e y m o b i l i z e C a 2 + f r o m i n t e r n a l s t o r e s r a t h e r t h a n f r o m t h e e x t e r n a l m e d i u m . ” 2 T h e i n c r e a s e i n c y t o p l a s m i c C a 2 + c o n c e n t r a t i o n a c t i v a t e s p h o s p h o l i p a s e A 2 w h i c h r e l e a s e s a r a c h i d o n i c a c i d f r o m m e m b r a n e p h o s p h o l i p i d s . T h e T x A z a n d e n d o p e r o x i d e s f o r m e d 8 4 a c t i v a t e p h o s p h o l i p a s e C a n d s t i m u l a t e t h e f o r m a t i o n o f t h e i n o s i t o l l i p i d s e c o n d m e s s e n g e r s . I n t h e p r e s e n c e o f c y c l o o x y g e n a s e i n h i b i t o r s , p h o s p h o l i p a s e C i s n o t a c t i v a t e d a n d t h e s e s e c o n d m e s s e n g e r s a r e n o t d . “ ” H o w e v e r , u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , i n t h e a b s e n c e o f p r o d u c e p h o s p h o l i p a s e C a c t i v a t i o n , A 2 3 1 8 7 c a n i n d u c e p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 a n d 4 7 k D a p r o t e i n s . 2 8 1 T h i s s u g g e s t s t h a t t h e i n c r e a s e i n C a 2 + a l o n e i s s u f f i c i e n t t o a c t i v a t e t h e m y o s i n l i g h t c h a i n k i n a s e a n d p r o t e i n k i n a s e C . R e l a t i v e l y h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f A 2 3 1 8 7 a l s o d e p l e t e t h e p o l y p h o s p h o i n o s i t i d e s i n a s p i r i n - t r e a t e d p l a t e l e t s , p r e s u m a b l y b y s t i m u l a t i o n o f t h e p h o s p h o m o n o e s t e r a s e s . T H E R O L E O F D I A C Y L G L X C E R O L A N D P R O T E I N K I N A S E C I N C E L L U L A R P R O C E S S E S P r o t e i n R i n a s e C T h e m a j o r f u n c t i o n o f D A G i s t o a c t i v a t e p r o t e i n k i n a s e C w h i c h i s a C a ” 3 a n d p h o s p h o l i p i d - d e p e n d e n t e n z y m e t h a t i s u b i q u i t o u s i n t i s s u e s 3 5 0 ' 3 5 1 C u r r e n t l y , s e v e n s u b s p e c i e s o f p r o t e i n k i n a s e C h a v e a n d o r g a n s . b e e n i d e n t i f i e d i n m a m m a l i a n t i s s u e s " ) : 3 6 2 P r o t e i n k i n a s e C i s c o m p o s e d o f a s i n g l e p o l y p e p t i d e c h a i n o f M , ' - 7 7 - 8 0 k D a a n d t h e p r e s e n c e o f C a 2 + a n d p h o s p h a t i d y l s e r i n e i s e s s e n t i a l f o r i t s a c t i v a t i o n . 2 5 ° ' 3 6 ° T h e p r e f e r e n t i a l l o c a t i o n o f p h o s p h a t i d y l s e r i n e i n t h e i n n e r l e a f l e t o f t h e p l a s m a m e m b r a n e m a y p l a y a r o l e i n t h e a c t i v i t y o f t h e e n z y m e . 1 , 2 - D i a c y l g l y c e r o l d r a m a t i c a l l y i n c r e a s e s t h e a f f i n i t y o f p r o t e i n k i n a s e C f o r G a y ' s u c h t h a t i t c a n b e a c t i v a t e d a t t h e c y t o p l a s m i c C a 2 + l e v e l s p r e s e n t i n t h e r e s t i n g c e l l . " " 3 7 " ' 7 7 T h e t r a n s i e n t p r o d u c t i o n o f D A G i n a c t i v a t e d p l a t e l e t s i s a l w a y s a s s o c i a t e d 8 5 w i t h a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C f ” P r o t e i n k i n a s e C , p a r t i c u l a r l y t h e m e m b r a n e - b o u n d f o r m , c a n a l s o b e a c t i v a t e d i r r e v e r s i b l y b y 2 5 1 ' 3 ‘ 2 ' 3 5 1 T h e C a 2 + - d e p e n d e n t p r o t e a s e s p l i t s p r o t e i n k i n a s e p r o t e o l y s i s . G i n t o t w o f r a g m e n t s . T h e 3 2 k D a h y d r o p h o b i c d o m a i n c o n t a i n s t h e b i n d i n g s i t e s f o r C a ” ) p h o s p h o l i p i d a n d d i a c y l g l y c e r o l w h i l e t h e 5 1 k D a h y d r o p h i l i c d o m a i n c o n t a i n s t h e c a t a l y t i c s i t e r e s p o n s i b l e f o r p h o s p h o r y l a t i n g s e r i n e a n d t h r e o n i n e r e s i d u e s o n t a r g e t p r o t e i n s . A l t h o u g h p r o t e o l y t i c c o n v e r s i o n o f p r o t e i n k i n a s e G i n t o a C a ” 3 a n d p h o s p h o l i p i d - i n d e p e n d e n t i r r e v e r s i b l y a c t i v a t e d e n z y m e o c c u r s i n p l a t e l e t s a c t i v a t e d b y p h o r b o l e s t e r , t h e r o l e o f p r o t e o l y t i c a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C b y p h y s i o l o g i c a g o n i s t s i s n o t k n o w n . I n m o s t t i s s u e s , p r o t e i n k i n a s e C i s r e c o v e r e d m a i n l y f r o m t h e s o l u b l e f r a c t i o n i n a n i n a c t i v e f o r m a n d i s a p p a r e n t l y t r a n s l o c a t e d t o t h e m e m b r a n e i n a C a 2 + - d e p e n d e n t f a s h i o n w h e n t h e c e l l i s s t i m u l a t e d . 2 6 1 ' 5 1 7 I f p l a t e l e t s a r e l y s e d i n t h e p r e s e n c e o f C a 2 + c h e l a t o r s , t h e p r o t e i n k i n a s e C i s f o u n d i n t h e c y t o s o l , w h e r e a s i f t h e y a r e l y s e d i n t h e p r e s e n c e o f C a 2 + a n d p r o t e a s e i n h i b i t o r s , t h e p r o t e i n k i n a s e C i s b o u n d t o t h e m e m b r a n e . W h e n p l a t e l e t s a r e a c t i v a t e d , C a 2 + a n d D A G m a y a c t t o g e t h e r i n b i n d i n g p r o t e i n k i n a s e C t o “ 5 ' 5 1 7 T h e m o b i l i z a t i o n o f C a 2 + i s a s s o c i a t e d w i t h a n t h e m e m b r a n e . i n c r e a s e i n t h e n u m b e r o f b i n d i n g s i t e s f o r p h o r b o l e s t e r s o n i n t a c t p l a t e l e t s w h i c h m a y b e a r e f l e c t i o n o f t r a n s l o c a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C f r o m t h e c y t o s o l t o t h e p l a t e l e t m e m b r a n e . " 8 1 8 6 T h e 4 7 k D a P l a t e l e t S u b s t r a t e o f P r o t e i n K i n a s e C I n p l a t e l e t s , t h e m a j o r s u b s t r a t e f o r p r o t e i n k i n a s e C i s a 4 7 k D a , c y t o p l a s m i c p r o t e i n w h i c h c o m p r i s e s 0 . 6 5 % o f t o t a l p l a t e l e t 2 9 8 , 4 8 5 p r o t e i n . I t h a s b e e n p u r i f i e d a n d f o u n d t o n o r m a l l y e x i s t a s a m o n o m e r . ‘ 8 5 T w o - d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s o f p r o t e i n s f r o m r e s t i n g p l a t e l e t s l a b e l l e d w i t h 3 2 P d e m o n s t r a t e d t h a t t h e 4 7 k D a p r o t e i n c o n s i s t s o f t w o o r t h r e e m a j o r f o r m s t h a t i n c o r p o r a t e v e r y l i t t l e ‘ ” P . A f t e r a c t i v a t i o n o f p l a t e l e t s b y t h r o m b i n , t h e r e a r e s e v e n t o n i n e m a j o r h i g h l y p h o s p h o r y l a t e d f o r m s c o n t a i n i n g 8 3 % p h o s p h o s e r i n e a n d 1 7 % p h o s p h o t h r e o n i n e . I t i s n o t k n o w n a t t h i s t i m e w h e t h e r t h e m i c r o h e t e r o g e n e i t y o f t h e 4 7 k D a p r o t e i n i s t h e r e s u l t o f p o s t - t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n o r b e c a u s e t h e y a r e i s o f o r m s . A l t h o u g h t h e f u n c t i o n o f t h e 4 7 k D a p r o t e i n i s n o t k n o w n w i t h a n y c e r t a i n t y , p o s s i b i l i t i e s i n c l u d e a l i p o c o r t i n a n d t h e 5 - 9 7 , 4 8 5 p h o s p h o m o n o e s t e r a s e T h e l i p o c o r t i n s a r e a g r o u p o f p r o t e i n s t h a t h a v e b e e n r e p o r t e d t o i n h i b i t p h o s p h o l i p a s e A g ‘ b y d i r e c t i n t e r a c t i o n w i t h t h e e n z y m e . “ 2 I t h a s b e e n r e p o r t e d t h a t t h e 4 7 k D a s u b s t r a t e o f p r o t e i n k i n a s e C i n p l a t e l e t s i s a l i p o c o r t i n w h o s e i n h i b i t o r y a c t i v i t y i s s u p p r e s s e d b y p h o s p h o r y l a t i o n b y p r o t e i n k i n a s e C . " 8 5 M o r e r e c e n t w o r k h a s e s t a b l i s h e d t h a t a g o n i s t - i n d u c e d p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 4 7 k D a s u b s t r a t e b y p r o t e i n k i n a s e C d o e s n o t n e c e s s a r i l y a c t i v a t e p h o s p h o l i p a s e A 2 a n d c a u s e l i b e r a t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d . 1 0 2 I n a d d i t i o n , l i p o c o r t i n s a r e p h o s p h o r y l a t e d b y t y r o s i n e k i n a s e s o n t y r o s i n e r e s i d u e s w h e r e a s p r o t e i n k i n a s e C p h o s p h o r y l a t e s p r o t e i n s i n 6 4 s e r i n e a n d t h r e o n i n e r e s i d u e s . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e 4 7 8 7 k D a p r o t e i n i s u n l i k e l y t o b e l i p o c o r t i n . R e c e n t e v i d e n c e h a s s u g g e s t e d t h a t t h e i n v i t r g i n h i b i t i o n o f p h o s p h o l i p a s e A 1 b y l i p o c o r t i n i s d u e t o s e q u e s t r a t i o n o f t h e p h o s p h o l i p i d s u b s t r a t e b y t h e i n h i b i t o r r a t h e r t h a n a d i r e c t i n t e r a c t i o n w i t h t h e p h o s p h o l i p a s e . 1 1 1 T h i s r a i s e s q u e s t i o n s a b o u t t h e p h y s i o l o g i c a l s i g n i f i c a n c e o f t h e i n h i b i t i o n o f p h o s p h o l i p a s e A 2 b y t h e s e p r o t e i n s . I t a p p e a r s u n l i k e l y t h a t l i p o c o r t i n i s t h e 4 7 k D a s u b s t r a t e . T h e 5 - p h o s p h o m o n o e s t e r a s e c o n t r i b u t e s t o t h e t e r m i n a t i o n o f t h e C a 2 + s i g n a l b y h y d r o l y z i n g t h e 5 - p h o s p h a t e f r o m ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 , ( 1 : 2 - c y c l i c , 4 , 5 ) I P 3 a n d ( 1 , 3 , 4 , 5 ) I P , t o f o r m p r o d u c t s t h a t d o n o t m o b i l i z e 0 0 . ” . 9 ‘ 3 ' 9 ‘ 3 I n o n e s t u d y , p u r i f i e d S - p h o s p h o m o n o e s t e r a s e c o - m i g r a t e d w i t h t h e 4 7 k D a p r o t e i n o n S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l s . ” W h e n t h e t w o p r o t e i n s w e r e d i g e s t e d w i t h p r o t e a s e s , t h e r e s u l t i n g p h o s p h o r y l a t e d p e p t i d e m a p s w e r e s i m i l a r . I t w a s c o n c l u d e d t h a t t h e 4 7 k D a p r o t e i n a n d 5 - p h o s p h o m o n o e s t e r a s e a r e t h e s a m e p r o t e i n . P r o t e i n k i n a s e C p h o s p h o r y l a t e s , a n d t h e r e b y i n c r e a s e s , t h e a c t i v i t y o f t h e 5 - p h o s p h o m o n o e s t e r a s e w h i c h w o u l d t e r m i n a t e t h e C a Z I - m o b i l i z i n g s i g n a l . T h i s i s c o m p a t i b l e w i t h t h e g e n e r a l r o l e o f p r o t e i n k i n a s e C a s a r e g u l a t o r o f c e l l u l a r a c t i v a t i o n . I t i s a l s o c o m p a t i b l e w i t h t h e a b i l i t y o f p r e t r e a t m e n t w i t h p h o r b o l e s t e r t o c a u s e d i m i n i s h e d C a 2 + m o b i l i z a t i o n a n d d e c r e a s e d ( l , 4 , 5 ) I P 3 p r o d u c t i o n i n r e s p o n s e t o 3 0 0 , 3 8 9 , 4 1 4 , 5 2 6 a g o n i s t s . I n c o n t r a s t , C a 2 + m o b i l i z a t i o n i n r e s p o n s e t o c a l c i u m i o n o p h o r e i s n o t a f f e c t e d b y p r e t r e a t m e n t w i t h p h o r b o l e s t e r . 5 2 ° 8 8 R e c e n t l y , t h e 4 7 k D a s u b s t r a t e h a s b e e n c l o n e d f r o m a h u m a n 8 8 S e a r c h e s o f c u r r e n t d a t a b a s e s d i d p r o m y e l o c y t i c l e u k e m i a c e l l l i n e . “ n o t r e v e a l a n y s t r i k i n g s i m i l a r i t i e s b e t w e e n t h e 4 7 k D a p r o t e i n a n d a n y k n o w n s e q u e n c e s . I t w a s n o t s i m i l a r t o t h e h u m a n l i p o c o r t i n s e q u e n c e . I n t h i s s a m e p u b l i c a t i o n , r e f e r e n c e w a s m a d e t o w o r k i n p r o g r e s s i n w h i c h t h e S - p h o s p h o m o n o e s t e r a s e c o u l d b e p a r t i a l l y s e p a r a t e d f r o m t h e 4 7 k D a p r o t e i n k i n a s e C s u b s t r a t e . A c t i v a t i o n o f P r o t e i n K i n a s e C b y D i a c y l g l y c e r o l s a n d P h o r b o l E s t e r s T h e e f f e c t o f D A G c a n b e m i m i c k e d b y c h e m i c a l l y m o d i f i e d s n - l , 2 - d i a c y l g l y c e r o l s s u c h a s l - o l e o y l - 2 - a c e t y l g l y c e r o l w h i c h , w h e n a d d e d t o i n t a c t p l a t e l e t s , i n t e r c a l a t e i n t o t h e m e m b r a n e b i l a y e r a n d a c t i v a t e p r o t e i n k i n a s e C . 2 3 8 L i k e D A G , t h e y a r e r a p i d l y m e t a b o l i z e d t o t h e c o r r e s p o n d i n g p h o s p h a t i d i c a c i d . 1 , 2 - D i a c y l g 1 y c e r o l c a n a l s o b e s u b s t i t u t e d f o r b y t u m o r - p r o m o t i n g p h o r b o l e s t e r s s u c h a s p h o r b o l m y r i s t a t e a c e t a t e a n d 1 2 - O - t e t r a d e c a n o y l p h o r b o l - l 3 - a c e t a t e . T h e s e h a v e a s i m i l a r s t r u c t u r e t o D A G a n d a r e a b l e t o i n c r e a s e t h e a f f i n i t y o f p r o t e i n k i n a s e C f o r C a “ } r e s u l t i n g i n f u l l a c t i v a t i o n o f t h e e n z y m e a t p h y s i o l o g i c a l C a 2 + 1 e v e l s . 7 3 ' 7 ‘ I n c o n t r a s t t o D A G a n d c h e m i c a l l y m o d i f i e d d i a c y l g l y c e r o l s , p h o r b o l e s t e r s a c t i v a t e p r o t e i n k i n a s e C p e r m a n e n t l y . T h e a d d i t i o n o f p h o r b o l e s t e r s o r b i o a c t i v e d i a c y l g l y c e r o l s t o p l a t e l e t r i c h p l a s m a i n d u c e s a s l o w a g g r e g a t i o n r e s p o n s e a n d d e l a y e d d e n s e g r a n u l e s e c r e t i o n w i t h o u t c a u s i n g p l a t e l e t s h a p e c h a n g e . " ‘ 2 9 P h o r b o l e s t e r s o r d i a c y l g l y c e r o l s d o n o t i n d u c e i n o s i t o l p h o s p h o l i p i d 8 9 h y d r o l y s i s , a r a c h i d o n i c a c i d r e l e a s e o r f o r m a t i o n o f a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s a n d d o n o t e v o k e a r i s e i n c y t o p l a s m i c C a m ' t h a t i s d e t e c t a b l e b y q u i n 2 o r f u r a - 2 . 7 8 ' 2 7 9 ' 3 ‘ 1 " ° 8 ' “ ° H o w e v e r , t h e y d o i n d u c e a C a y ' r i s e t h a t i s d e t e c t a b l e b y a e q u o r i n . T h i s s u g g e s t s t h a t l o c a l C a 2 + f l u x e s b e n e a t h t h e m e m b r a n e m a y o c c u r , b u t n o t a n i n c r e a s e i n t h e 1 2 " “ 9 " B i o a c t i v e o v e r a l l a v e r a g e c y t o p l a s m i c C a y ’ c o n c e n t r a t i o n . d i a c y l g l y c e r o l s i n d u c e a m a x i m a l a n d r e v e r s i b l e p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 4 7 k D a p r o t e i n , w h e r e a s p h o r b o l e s t e r s i n d u c e a n i r r e v e r s i b l e 7 3 , 2 3 8 p h o s p h o r y l a t i o n . T h e s l o w s e c r e t i o n b y p h o r b o l e s t e r - s t i m u l a t e d p l a t e l e t s m a y b e a c c o u n t e d f o r b y t h e f a i l u r e o f d e v e l o p m e n t o f a c o n t r a c t i l e s k e l e t o n . 7 2 P h o r b o l e s t e r - s t i m u l a t e d p l a t e l e t s d e v e l o p a p s e u d o p o d a l c y t o s k e l e t o n c o n t a i n i n g a c t i n f i l a m e n t s b u n d l e d w i t h a - a c t i n i n a n d a c t i n - b i n d i n g p r o t e i n , b u t n o t t h e c o n t r a c t i l e c o m p o n e n t o f a c t i n f i l a m e n t s c o m b i n e d w i t h m y o s i n w h i c h p r o b a b l y i s t h e m e a n s b y w h i c h s e c r e t i o n o c c u r s . T h e r e a r e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e a c t i o n s o f p h o r b o l e s t e r s a n d b i o a c t i v e d i a c y l g l y c e r o l s s u c h a s 1 - o l e o y l - 2 - a c e t y 1 g l y c e r o l . T h e a g g r e g a t i o n a n d p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 4 7 k D a p r o t e i n i n d u c e d b y 1 - o l e o y l - 2 - a c e t y l g l y c e r o l i s i n h i b i t e d b y a p y r a s e t o a m u c h g r e a t e r e x t e n t t h a n t h a t o f p h o r b o l e s t e r . 1 1 T h i s i n d i c a t e s t h a t r e l e a s e d A D P p l a y s a s i g n i f i c a n t r o l e i n t h e i n d u c t i o n o f t h e r e s p o n s e s t o l - o l e o y l - 2 - a c e t y l g l y c e r o l . l - O l e o y l - Z - a c e t y l g 1 y c e r o l h a s b e e n s h o w n t o r e l e a s e i n t r a c e l l u l a r s t o r e s o f C a z + i n p e r m e a b i l i z e d p l a t e l e t s . 5 7 T h i s r e s p o n s e w a s n o t i n h i b i t e d b y a s p i r i n o r r e p r o d u c e d b y p h o r b o l e s t e r , b u t w a s c o n s i d e r a b l y s l o w e r t h a n t h e r e l e a s e o f C a w ' i n d u c e d b y e x o g e n o u s ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 . I t ‘ w a s c o n c l u d e d t h a t t h e C a fl ’ r e l e a s e i n d u c e d 9 0 b y l - o l e o y l - Z - a c e t y l g l y c e r o l w a s a c t u a l l y d u e t o i t s c o n v e r s i o n t o p h o s p h a t i d i c a c i d a n d / o r l y s o p h o s p h a t i d i c a c i d . H o w e v e r , t h i s C a 2 + m o b i l i z a t i o n d o e s n o t a p p e a r t o b e d e t e c t a b l e b y q u i n 2 , p o s s i b l y b e c a u s e o f t h e h i g h b u f f e r i n g c a p a c i t y o f q u i n 2 . ” 8 T h e C a f + 1 r i s e t h a t i s d e t e c t e d b y a e q u o r i n i s n o t g r e a t l y a f f e c t e d b y r e m o v a l o f e x t r a c e l l u l a r C a ” ; w h i c h s u p p o r t s t h e t h e o r y t h a t l - o l e o y l - 2 - a c e t y l g l y c e r o l c a n m o b i l i z e i n t r a c e l l u l a r C a f h d g ‘ T h e R o l e o f . P r o t e i n K i n a s e C i n P l a t e l e t A c t i v a t i o n T h e a b i l i t y o f p h o r b o l e s t e r s t o m i m i c t h e e f f e c t o f D A G o n p r o t e i n k i n a s e C h a s b e e n u s e d w i d e l y t o i n v e s t i g a t e t h e r o l e o f p r o t e i n k i n a s e C i n p l a t e l e t a c t i v a t i o n . O n e o f t h e l i m i t a t i o n s o f t h e u s e o f p h o r b o l e s t e r s i s t h a t t h e y a c t i v a t e p r o t e i n k i n a s e C i r r e v e r s i b l y , w h i c h p r e s u m a b l y h a s v e r y d i f f e r e n t e f f e c t s t o t h e t r a n s i e n t p r o d u c t i o n o f e n d o g e n o u s D A G a n d a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C b y p h y s i o l o g i c a g o n i s t s . T h e r e s u l t s o f t h e s e s t u d i e s a r e s o m e w h a t c o n f u s i n g a n d o f t e n c o n f l i c t i n g . O n o n e h a n d , a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C i s s y n e r g i s t i c w i t h C a 2 + m o b i l i z a t i o n i n p l a t e l e t a c t i v a t i o n . O n t h e o t h e r h a n d , t h e r e a r e m a n y r e p o r t s o f n e g a t i v e f e e d b a c k o n m a n y a s p e c t s o f p l a t e l e t a c t i v a t i o n b y p r o t e i n k i n a s e C . I f s u b t h r e s h o l d c o n c e n t r a t i o n s o f p h o r b o l e s t e r a r e a d d e d t o p l a t e l e t s w i t h s u b t h r e s h o l d c o n c e n t r a t i o n s o f c a l c i u m i o n o p h o r e , r a p i d p l a t e l e t a g g r e g a t i o n a n d r e l e a s e o c c u r s . 2 3 ° ' 2 7 9 S i m i l a r l y , s u b t h r e s h o l d c o n c e n t r a t i o n s o f p h o r b o l e s t e r a n d t h r o m b i n a r e s y n e r g i s t i c i n i n d u c i n g p l a t e l e t r e s p o n s e s . 5 2 1 P h o r b o l e s t e r o r d i a c y l g l y c e r o l a l s o 9 1 e n h a n c e s a r a c h i d o n i c a c i d r e l e a s e i n r e s p o n s e t o c a l c i u m i o n o p h o r e , e v e n i n a s p i r i n - t r e a t e d p l a t e l e t s . 1 7 2 A g o n i s t s w h i c h m o b i l i z e C a 2 + h a v e a p o t e n t i a t i n g e f f e c t o n t h e a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e 0 . 2 3 “ “ T h e s e r e s u l t s h a v e b e e n i n t e r p r e t e d a s i n d i c a t i n g t h a t e i t h e r 4 7 k D a p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n o r C a 2 + m o b i l i z a t i o n a l o n e i s n e c e s s a r y , b u t n o t s u f f i c i e n t b y i t s e l f , f o r t h e i n d u c t i o n o f p l a t e l e t a c t i v a t i o n . B o t h a r e s y n e r g i s t i c i n c a u s i n g t h e f u l l c e l l u l a r r e s p o n s e o f a g g r e g a t i o n a n d r e l e a s e . T h e r e a r e n u m e r o u s r e p o r t s o f i n h i b i t o r y o r d e s e n s i t i z i n g e f f e c t s o f p r o t e i n k i n a s e C a c t i v a t i o n o n p l a t e l e t a c t i v a t i o n i n d u c e d b y a w i d e r a n g e o f a g o n i s t s . T h e m o s t c o m m o n l y r e p o r t e d i n h i b i t o r y e f f e c t o f p h o r b o l e s t e r s i s o n t h e m o b i l i z a t i o n o f C a y ' b y t h r o m b i n , a r a c h i d o n i c 1 0 1 , 2 6 4 , 3 0 0 , 3 8 9 , 5 2 4 a c i d , A D P , P A F o r v a s o p r e s s i n . W h e r e m e a s u r e d , t h e i n h i b i t i o n o f C a 2 + m o b i l i z a t i o n w a s a c c o m p a n i e d b y a n i n h i b i t i o n o f d e n s e g r a n u l e c o n t e n t s e c r e t i o n . 1 ° 1 ' 2 ‘ 5 2 - 3 8 9 S i m i l a r l y , p r e i n c u b a t i o n w i t h p h o r b o l e s t e r o r d i a c y l g l y c e r o l i s r e p o r t e d t o i n h i b i t p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s a s m e a s u r e d b y p r o d u c t i o n o f p h o s p h a t i d i c a c i d a n d i n o s i t o l p h o s p h a t e s i n r e s p o n s e t o t h r o m b i n , P A F o r c o l l a g e n . “ ' “ ‘ 9 8 S u r p r i s i n g l y , a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C s t i m u l a t e s t h e a c c u m u l a t i o n o f p o l y p h o s p h o i n o s i t i d e s . 1 7 1 " ’ 9 8 W h e t h e r o r n o t t h i s r e f l e c t s d i r e c t p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e p o l y p h o s p h o i n o s i t i d e s b y p r o t e i n k i n a s e C o r a n e f f e c t o n t h e s p e c i f i c k i n a s e s a n d / o r p h o s p h o m o n o e s t e r a s e s i s n o t k n o w n . T h e r e l a t i o n s h i p , i f a n y , b e t w e e n t h i s a c c u m u l a t i o n a n d t h e i n h i b i t i o n o f p o l y p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s h a s n o t b e e n i d e n t i f i e d . t t k p e a g g h i h f g h r r a I n e f o o a a n t a e n r n n e s c i b u u t c f e t s o l l h o f t l e e e n e C o r t p u s e e o b t u a s t o h h e r r t c t c c t e f r e r e , n o a i t t t p p m s i , t c n e s s s i o w h b i n n o o t s e r x D h i . a s h o o A n i i n b b a P w o b i , o n e n l n t C l e r y o e e o e m d l e f n p i - s o a i l e y a t r t n a n n h m s h e e g h i a p r b r p e a b i t e o n h n i i r p m - r c a t o i r b i i e i o e a r e e s i n n e o n n d s o - . t x d e o n t m r u a b c r ” o e c n y a f a t d s t t W l f m h e p e o o t h e o w s p d a o d h d w h e n r r n o r t m t o t i p l o m t p t h a n i s b r h o t l e s h e o e e o n , x i i l a e s o a n c c p e f n c a t t r e c a e u i e P s n b o v r t n A d f e a a i i o F t d , t C c o t r . i h n h m i o o a g p e a n n p r t r d o l e n e e i w o p a i f o i f s e i s o n n t m n c t r h p a d a u e t a s t e r b n e w o w a d d d a p h o e o s n i d r i n a o s e b n u n e n o d , a e i k t h h e w e e s t w s l 9 2 T h e r e h a v e a l s o b e e n r e p o r t s o f p o t e n t i a t i o n o f p l a t e l e t s e c r e t i o n b y 1 0 1 , 2 6 4 , 4 4 7 I t a p p e a r s s h o r t e r p r e i n c u b a t i o n t i m e s w i t h p h o r b o l e s t e r s . t h a t t h e r a t e a n d e x t e n t o f p r o t e i n k i n a s e C a c t i v a t i o n i n d u c e d b y p h o r b o l e s t e r s o r b i o a c t i v e d i a c y l g l y c e r o l s b e f o r e a d d i t i o n o f t h e s e c o n d a g o n i s t d e t e r m i n e w h e t h e r p l a t e l e t a c t i v a t i o n i s t o b e i n h i b i t e d o r p o t e n t i a t e d . I n o n e s t u d y , p h o r b o l e s t e r s a d d e d t o a s p i r i n - t r e a t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a 5 o r 1 5 s e c o n d s b e f o r e e p i n e p h r i n e , A D P , p r o s t a g l a n d i n e n d o p e r o x i d e a n a l o g u e , c o l l a g e n , P A F o r v a s o p r e s s i n p o t e n t i a t e d t h e r a t e a n d e x t e n t o f a g g r e g a t i o n a n d A T P s e c r e t i o n . “ 7 A t l o w e r c o n c e n t r a t i o n s o f t h e s e c o n d a g o n i s t , o n l y a g g r e g a t i o n w a s p o t e n t i a t e d , n o t s e c r e t i o n . S i m i l a r r e s u l t s , a l t h o u g h l e s s p r o n o u n c e d , w e r e o b t a i n e d w i t h p r e i n c u b a t i o n p e r i o d s o f u p t o 1 2 m i n u t e s a n d i n w a s h e d p l a t e l e t s . T h e e x c e p t i o n w a s e p i n e p h r i n e w h i c h w a s p o t e n t i a t e d a t a l l c o n c e n t r a t i o n s a n d f o r a l l i n c u b a t i o n p e r i o d s . T h e s y n e r g i s m c o r r e l a t e d w i t h p o t e n t i a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C a c t i v a t i o n a s m e a s u r e d b y 4 7 k D a p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n . H o w e v e r , b o t h p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e m y o s i n l i g h t c h a i n a n d C a m ' f l u x e s w e r e r e d u c e d . T h i s s u g g e s t s 9 3 e s t e r . W h e n c y c l o o x y g e n a s e w a s b l o c k e d b y i n d o m e t h a c i n , t h r o m b o x a n e p r o d u c t i o n a n d s e c r e t i o n i n r e s p o n s e t o w e a k a g o n i s t s w e r e a b o l i s h e d , b u t , i f t h e p l a t e l e t s w e r e p r e i n c u b a t e d w i t h p h o r b o l e s t e r , s e c r e t i o n w a s e n h a n c e d . A p p a r e n t l y , i n h i b i t i o n o f e n d o g e n o u s t h r o m b o x a n e s y n t h e s i s a l l o w s p o t e n t i a t i o n o f s e c r e t i o n b y s y n e r g i s m b e t w e e n p h o r b o l e s t e r s a n d t h e w e a k " t h r o m b o x a n e - d e p e n d e n t " a g o n i s t s . T r e a t m e n t o f i n t a c t p l a t e l e t s w i t h p h o r b o l e s t e r s h a s b e e n r e p o r t e d t o r e d u c e t h e a d e n y l a t e c y c l a s e i n h i b i t i o n i n m e m b r a n e s f r o m t h e p l a t e l e t s i n d u c e d b y G T P a n d i n h i b i t o r y a g o n i s t s ( t h r o m b i n a n d e p i n e p h r i n e ) v i a a s p e c i f i c a l t e r a t i o n i n t h e G i - m e d i a t e d s i g n a l t r a n s d u c t i o n t o a d e n y l a t e c y c l a s e . z “ ' T h e f r e e 4 1 k D a a - s u b u n i t o f t h e i n h i b i t o r y G p r o t e i n , G , , i s a s u b s t r a t e f o r p r o t e i n k i n a s e C . z " " " 9 6 T h i s p h o s p h o r y l a t i o n i s i n h i b i t e d b y t h e a d d i t i o n o f f r e e E - s u b u n i t . T h u s , o n l y t h e f r e e s u b u n i t , n o t o l i g o m e r i c G 1 , s e r v e s a s a s u b s t r a t e f o r p r o t e i n k i n a s e C . F r o m t h e s e f i n d i n g s , i t w a s p r o p o s e d t h a t t h e f u n c t i o n a l s t a t e o f t h e i n h i b i t o r y c o u p l i n g c o m p o n e n t f o r a d e n y l a t e c y c l a s e i s c o n t r o l l e d b y p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e a - s u b u n i t b y p r o t e i n k i n a s e C . I n a m o r e r e c e n t s t u d y i n i n t a c t p l a t e l e t s , t h e p r e d o m i n a n t e f f e c t o f p h o r b o l e s t e r o n a d e n y l a t e c y c l a s e a c t i v i t y w a s f o u n d t o b e i n h i b i t o r y . $ u ’ T h e d e g r e e o f i n h i b i t i o n d e p e n d e d o n t h e a c t i v a t o r o f a d e n y l a t e c y c l a s e u s e d . T h e e f f e c t s o f p r o s t a g l a n d i n D 2 a n d f o r s k o l i n w e r e i n h i b i t e d a n d t h e e f f e c t s o f p r o s t a g l a n d i n E l ‘ w e r e i n i t i a l l y i n h i b i t e d a n d l a t e r e n h a n c e d . T h e i n h i b i t i o n b y e p i n e p h r i n e a n d h i g h t h r o m b i n c o n c e n t r a t i o n s o f t h e c y c l i c A M P a c c u m u l a t i o n i n d u c e d b y 9 4 p r o s t a g l a n d i n E l ' w a s a t t e n u a t e d b y p h o r b o l e s t e r , b u t t h e e f f e c t o f A D P w a s l i t t l e a f f e c t e d . I t w a s c o n c l u d e d t h a t , i n t h e i n t a c t p l a t e l e t , t h e m a j o r e f f e c t s o f p r o t e i n k i n a s e C a r e i n h i b i t o r y , w h i c h s u g g e s t s t h a t t h e e n z y m e h a s e f f e c t s o t h e r t h a n i n a c t i v a t i o n o f G 1 . T h e r o l e o f p r o t e i n k i n a s e C i n p l a t e l e t a c t i v a t i o n i s c o m p l e x a n d f a r f r o m c l e a r . T h e m a s s o f c o n f l i c t i n g d a t a i s a l s o a r e f l e c t i o n o f t h e v e r y v a r i a b l e c o n d i t i o n s u s e d i n d i f f e r e n t s t u d i e s , i n c l u d i n g i n t a c t p l a t e l e t s v e r s u s m e m b r a n e p r e p a r a t i o n s a n d t h e t i m e o f p r e i n c u b a t i o n w i t h p h o r b o l e s t e r . H o w e v e r , p r o t e i n k i n a s e C a c t i v a t i o n d o e s a p p e a r t o b e a p o s i t i v e s i g n a l f o r p l a t e l e t a g g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n w h i l e s u p p r e s s i n g s i g n a l t r a n s d u c t i o n b e t w e e n t h e m e m b r a n e r e c e p t o r a n d p h o s p h o l i p a s e C . T H E R O L E o r N a t / I I + E X C H A N G E I N C E L L U L A R P R O C E S S E S O v e r t h e l a s t f e w y e a r s , c o n s i d e r a b l e e v i d e n c e i m p l i c a t i n g N a f / H + e x c h a n g e i n p l a t e l e t a c t i v a t i o n h a s a c c u m u l a t e d , p a r t i c u l a r l y i n r e s p o n s e t o w e a k a g o n i s t s . T h e r e g u l a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r p H i s a n e c e s s a r y f u n c t i o n o f a l l c e l l s . C e l l s h a v e a l a r g e i n s i d e - n e g a t i v e m e m b r a n e p o t e n t i a l , t h e r e f o r e , p a s s i v e m o v e m e n t o f H I a c r o s s t h e p l a s m a m e m b r a n e w o u l d c r e a t e a v e r y a c i d i n t r a c e l l u l a r e n v i r o n m e n t t h a t i s n o t c o m p a t i b l e w i t h n o r m a l m e t a b o l i c f u n c t i o n . " 3 2 E a c h c e l l m u s t h a v e a n e f f i c i e n t m e c h a n i s m f o r e x t r u d i n g H + a g a i n s t a c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t i n t o t h e e x t r a c e l l u l a r e n v i r o n m e n t . I n m a n y c e l l t y p e s , i n c l u d i n g p l a t e l e t s , a c t i v e H + s e c r e t i o n i s a c c o m p l i s h e d b y N ' a I / H + 1 1 . 2 9 3 c o u n t e r t r a n s p o r T h e r e a r e t h r e e m a j o r f u n c t i o n s o f t h e N ’ a I / H + 9 5 e x c h a n g e r o r a n t i p o r t e r : ( l ) r e g u l a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r p H a n d t h e m e t a b o l i c p r o c e s s e s t h a t a r e d e p e n d e n t o n p H ; ( 2 ) p r o v i s i o n o f a m e c h a n i s m o f c e l l e n t r y f o r N a I ' w h i c h s e r v e s a n i m p o r t a n t r o l e i n d e t e r m i n i n g t h e d i s t r i b u t i o n o f w a t e r b e t w e e n t h e c e l l a n d t h e e x t r a c e l l u l a r s p a c e ; a n d ( 3 ) n e t t r a n s p o r t a t i o n o f s o l u t e s b e t w e e n e x t r a c e l l u l a r f l u i d a n d a t r a n s c e l l u l a r s p a c e , s u c h a s i n t e s t i n a l o r r e n a l t u b u l a r l u m i n a . ‘ 3 2 S i n c e t h e s t o i c h i o m e t r y o f N a I / H I e x c h a n g e i s o n e - f o r - o n e , t h e e x c h a n g e r i s e l e c t r i c a l l y n e u t r a l a n d i n s e n s i t i v e t o m a n i p u l a t i o n o f t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l . 1 5 " ‘ 5 ‘ T h e d r i v i n g f o r c e i s g e n e r a t e d b y t h e N a I / K I . A T P a s e w h i c h b u i l d s u p a n i n w a r d l y d i r e c t e d N a I g r a d i e n t . T h e e x c h a n g e r i s f a i r l y s p e c i f i c w i t h 1 4 7 b e i n g t h e o n l y c a t i o n t h a t c a n r e p l a c e N a I . T h e N a fl fl f ' e x c h a n g e r c a n b e i n h i b i t e d b y a m i l o r i d e , a p o t a s s i u m - s p a r i n g d i u r e t i c , a n d i t s a n a l o g u e s a s w e l l a s c o m p e t i t i v e l y b y L i + . A m i l o r i d e a n d i t s a n a l o g u e s a r e u s e d w i d e l y i n t h e i n v e s t i g a t i o n o f t h e r o l e o f N a U Q F ' e x c h a n g e i n c e l l p r o c e s s e s . N a fl n F ' E x c h a n g e a n d C e l l A c t i v a t i o n I n m a n y n o n - s t i m u l a t e d n o n — e p i t h e l i a l c e l l s , t h e e x c h a n g e r a p p e a r s t o b e n e a r l y q u i e s c e n t w h e n t h e c y t o p l a s m i c p H i s i n t h e p h y s i o l o g i c a l r a n g e , b u t i t c a n b e a c t i v a t e d b y v a r i e t y o f s t i m u l i i n c l u d i n g h o r m o n e s , g r o w t h f a c t o r s , t u m o r p r o m o t e r s a n d h y p e r t o n i c s h r i n k i n g . “ “ T h e b i o l o g i c a l a c t i o n s o f m o s t o f t h e a g e n t s t h a t a c t i v a t e t h e e x c h a n g e r a r e k n o w n t o b e m e d i a t e d b y p r o t e i n k i n a s e s . T h e r e f o r e , i t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t s t i m u l a t i o n o f t h e e x c h a n g e r m a y b e m e d i a t e d b y 9 6 p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e e x c h a n g e r o r o f a r e g u l a t o r y p r o t e i n . T h i s h y p o t h e s i s h a s n o t b e e n p r o v e n . I n c o n t r a s t , p a r a t h y r o i d h o r m o n e a n d c y c l i c A M P d i m i n i s h t h e a c t i v i t y o f t h e e x c h a n g e r . T h e t e r m " a c t i v a t i o n o f N a I / H + e x c h a n g e " i s o f t e n u s e d t o d e s c r i b e t h e i n c r e a s e i n p H t h a t o c c u r s w h e n c e l l s a r e s t i m u l a t e d b y s p e c i f i c a g o n i s t s , a l t h o u g h t h e e x c h a n g e r i s n o t d o r m a n t i n r e s t i n g c e l l s . 1 & “ “ 5 “ W h e n r e s t i n g p l a t e l e t s a r e t r e a t e d w i t h a m i l o r i d e a n a l o g u e s t o i n h i b i t t h e e x c h a n g e r , t h e i n t e r n a l p H ( p H , ) d e c r e a s e s b y a b o u t 0 . 0 5 u n i t s w i t h i n e i g h t m i n u t e s , i n d i c a t i n g t h a t t h e e x c h a n g e r n o r m a l l y f u n c t i o n s t o c o n t i n u o u s l y r e m o v e m e t a b o l i c a l l y g e n e r a t e d p r o t o n s c r ’ : Z 7 S t i m u l a t i o n o f p l a t e l e t s b y t h r o m b i n h a s b e e n r e p o r t e d t o c a u s e a b i p h a s i c c h a n g e i n p H 1 w i t h a r a p i d d e c r e a s e o f 0 . 0 1 - 0 . 0 5 f r o m a r e s t i n g l e v e l o f 7 . 0 9 u n i t s f o l l o w e d a f t e r 1 0 - 1 5 s e c o n d s b y a s u s t a i n e d r i s e o f 0 . 1 - 0 . 1 5 2 1 2 , 5 2 7 u n i t s . T h i s e f f e c t w a s p r e v e n t e d b y i n c u b a t i o n w i t h a m i l o r i d e o r i t s a n a l o g u e s . A c t i v a t o r s o f p r o t e i n k i n a s e C s u c h a s p h o r b o l e s t e r s i n c r e a s e p H 1 a n d e n h a n c e t h e e f f e c t o f o t h e r p l a t e l e t s t i m u l i a n d t h e r e c o v e r y f r o m a n a c i d l o a d . " 5 3 ' 5 2 1 A l t h o u g h t h e m e c h a n i s m b y w h i c h p r o t e i n k i n a s e C a l t e r s t h e e x c h a n g e r ' s p r o p e r t i e s a r e n o t y e t k n o w n , i t i s l i k e l y t h a t e i t h e r p r o t e i n k i n a s e C o r o n e o f i t s p h o s p h o r y l a t e d d e r i v a t i v e s a f f e c t s t h e r e g u l a t o r y s i t e o f t h e e x c h a n g e r . T h e r e i s a l s o e v i d e n c e t h a t C a z + m o b i l i z a t i o n a n d N a + / H + e x c h a n g e a r e r e l a t e d , a l t h o u g h w h i c h o n e a f f e c t s t h e o t h e r i s n o t c l e a r . C o n c u r r e n t a n a l y s i s o f c h a n g e s i n p H , a n d c y t o p l a s m i c C a 2 + i n p l a t e l e t s s t i m u l a t e d 9 7 b y h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n i n d i c a t e t h a t C a 2 + m o b i l i z a t i o n p r e c e d e s t h e c y t o p l a s m i c a l k a l i n i z a t i o n . 5 2 7 I n a d d i t i o n , t h e c a l c i u m i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 t r i g g e r s a p r o t o n e f f l u x i n a s p i r i n - t r e a t e d p l a t e l e t s t h a t i s i n h i b i t e d b y a m i l o r i d e . T h e r e i s a l s o e v i d e n c e i n f a v o r o f a n e f f e c t o f t h e e x c h a n g e r o n C a 2 + t r a n s l o c a t i o n . R e m o v a l o f N a + f r o m t h e e x t r a c e l l u l a r m e d i u m i n h i b i t s N a n fl r ' e x c h a n g e a n d a l m o s t c o m p l e t e l y a b o l i s h e s C a 2 + m o b i l i z a t i o n f r o m i n t e r n a l s t o r a g e s i t e s a n d g r e a t l y r e d u c e s C a m ' i n f l u x , a l t h o u g h p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s i s n o t a f f e c t e d . ‘ 5 1 " 5 2 I t h a s a l s o b e e n d e m o n s t r a t e d t h a t t h e ( l , 4 , 5 ) I P 3 - m e d i a t e d r e l e a s e o f C a m ' f r o m i n t r a c e l l u l a r s t o r e s i n p e r m e a b i l i z e d p l a t e l e t s i s p H - d e p e n d e n t w i t h i n c r e a s e d p H p o t e n t i a t i n g r e l e a s e , e s p e c i a l l y a t l o w c o n c e n t r a t i o n s o f ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 . : 5 5 A l t h o u g h i t a p p e a r s t h a t c y t o p l a s m i c a l k a l i n i z a t i o n i s a n i m p o r t a n t s t e p i n p l a t e l e t a c t i v a t i o n , a n a r t i f i c i a l i n c r e a s e i n p H 1 d o e s n o t a f f e c t C a 2 + t r a n s l o c a t i o n o r i n i t i a t e p l a t e l e t a g g r e g a t i o n . " " ’ 1 " b s z I t a p p e a r s t h a t t h e r o l e o f c y t o p l a s m i c a l k a l i n i z a t i o n i s i n t h e e n h a n c e m e n t o f t h e s i g n a l p r o c e s s i n g i n d u c e d b y p l a t e l e t a g o n i s t s . W h i l e t h e g r e a t e s t i n c r e a s e i n p H , i s s e e n w i t h s t r o n g a c t i v a t i o n o f p l a t e l e t s , s u c h a s w i t h h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n , t h e e n h a n c e m e n t o f s i g n a l p r o c e s s i n g b y a l k a l i n i z a t i o n b e c o m e s r e l e v a n t w h e n p l a t e l e t s a r e w e a k l y a c t i v a t e d . W e a k P l a t e l e t A g o n i s t s a n d N a U fl F ' E x c h a n g e T h e r o l e o f N a U fl F ' e x c h a n g e i n a c t i v a t i o n o f p l a t e l e t s b y t h e w e a k a g o n i s t s i s a n a r e a i n w h i c h t h e r e h a s b e e n c o n s i d e r a b l e i n t e r e s t o v e r d e p e n d e n t a n d N a I - d e p e n d e n t m a n n e r . " ' 1 ° ° ' 2 2 ° ' 5 1 1 9 8 t h e l a s t f e w y e a r s . W e a k a g o n i s t s a r e t h o s e w h o s e s e c o n d a r y a g g r e g a t o r y a n d s e c r e t o r y e f f e c t s a r e d e p e n d e n t u p o n f o r m a t i o n o f a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s a n d i n h i b i t e d b y a s p i r i n a n d o t h e r c y c l o o x y g e n a s e i n h i b i t o r s . I f i n s u f f i c i e n t a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s a r e p r o d u c e d , a g g r e g a t i o n i s r e v e r s i b l e a n d s e c r e t i o n a b s e n t o r m a r k e d l y i n h i b i t e d . T h e s i g n a l s p r o d u c e d b y t h e s e a g o n i s t s a r e s m a l l a n d h a r d e r t o d e t e c t ; t h e r e f o r e , r e l a t i v e l y l i t t l e i s k n o w n a b o u t t h e i r s i g n a l t r a n s d u c t i o n . I n a d d i t i o n , s y n e r g i s m b e t w e e n d i f f e r e n t w e a k a g o n i s t s i s a n i m p o r t a n t m e c h a n i s m o f p l a t e l e t a c t i v a t i o n , p o s s i b l y v i a m u l t i p l e e f f e c t o r m e c h a n i s m s . I t i s a l s o d i f f i c u l t t o s e p a r a t e t h e i n i t i a l s i g n a l f r o m t h a t p r o d u c e d a s a r e s u l t o f p o s i t i v e f e e d b a c k l o o p s . M o s t , i f n o t a l l , w e a k a g o n i s t s d e c r e a s e t h e c y c l i c A M P c o n t e n t o f p l a t e l e t s . H o w e v e r , a d e c r e a s e i n c y c l i c A M P p r o d u c t i o n i s n o t t h e m a j o r s i g n a l l i n g m e c h a n i s m u s e d b y t h e s e a g o n i s t s t o i n d u c e p l a t e l e t a g g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n . T h e m a i n m e a n s b y w h i c h t h i s e f f e c t o f w e a k a g o n i s t s i s d e t e c t e d i n i n t a c t c e l l s i s t h e i r a b i l i t y t o i n h i b i t t h e c y c l i c A M P i n c r e a s e i n d u c e d b y p r o s t a g l a n d i n E 1 o r f o r s k o l i n . I n b r o k e n c e l l p r e p a r a t i o n s , e p i n e p h r i n e , A D P , P A F a n d l o w c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n h a v e b e e n s h o w n t o i n h i b i t a d e n y l a t e c y c l a s e i n a G T P - T h e d e c r e a s e i n c y c l i c A M P c a n b e s e p a r a t e d f r o m t h e s i g n a l w h i c h m e d i a t e s a g g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n . E x p o s u r e o f p l a t e l e t s t o a l o w c o n c e n t r a t i o n o f e p i n e p h r i n e d e s e n s i t i z e s t h e m t o t h e a g g r e g a t o r y e f f e c t o f s u b s e q u e n t e x p o s u r e t o h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f e p i n e p h r i n e , b u t d o e s n o t a f f e c t t h e a b i l i t y o f e p i n e p h r i n e t o i n h i b i t a d e n y l a t e c y c l a s e . “ m S i m i l a r l y , r e m o v a l o f 9 9 e x t r a c e l l u l a r N a + d o e s n o t a l t e r t h e a b i l i t y o f e p i n e p h r i n e t o i n h i b i t a d e n y l a t e c y c l a s e , b u t i t d o e s p r e v e n t a g g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n i n r e s p o n s e t o e p i n e p h r i n e , A D P a n d l o w c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n n g “ T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t e i t h e r a g g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n a r e c o n t r o l l e d b y e v e n t s d i s t a l t o c y c l i c A M P p r o d u c t i o n , o r t h a t t h e t w o p r o c e s s e s a r e m e d i a t e d b y t w o s e p a r a t e s i g n a l l i n g p a t h w a y s . A l t h o u g h t h e s e p a t h s m a y b e s e p a r a t e , t h e y a r e s t i l l c o n n e c t e d f u n c t i o n a l l y i n t h a t a n e l e v a t i o n i n c y c l i c A M P l e v e l s i n h i b i t s e p i n e p h r i n e - i n d u c e d p l a t e l e t a c t i v a t i o n . 2 3 2 M o n o v a l e n t c a t i o n s , p r e f e r a b l y N a + , a s w e l l a s G T P , a r e n e c e s s a r y f o r t h e e p i n e p h r i n e - i n d u c e d i n h i b i t i o n o f t h e i n c r e a s e i n c y c l i c A M P l e v e l s i n d u c e d b y p r o s t a g l a n d i n E 1 i n p l a t e l e t m e m b r a n e s . z z ° T h i s r e q u i r e m e n t f o r N a I a p p l i e s t o a l l a g e n t s t h a t a r e a b l e t o i n h i b i t a d e n y l a t e c y c l a s e . I n a s t u d y i n w h i c h p l a t e l e t s w e r e a c t i v a t e d i n N a I - f r e e e x t r a c e l l u l a r m e d i u m , t h e r e w a s c o m p l e t e i n h i b i t i o n o f s e c o n d a r y a g g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n i n r e s p o n s e t o w e a k a g o n i s t s . " 7 8 P r i m a r y a g g r e g a t i o n , a n d t h e r e f o r e a g o n i s t b i n d i n g a n d f i b r i n o g e n b i n d i n g w e r e n o t a f f e c t e d . T h e e f f e c t o f c h a n g i n g t h e N a I c o n c e n t r a t i o n o n t h e r e s p o n s e s o f ' p l a t e l e t s t o w e a k a g o n i s t s i s c o n s i s t e n t w i t h a r o l e f o r N ' a I / H + e x c h a n g e i n p l a t e l e t a c t i v a t i o n . T o e x a m i n e t h i s t h e o r y , N a l / H + e x c h a n g e h a s b e e n b l o c k e d b y t h r e e d i f f e r e n t m a n i p u l a t i o n s : ( 1 ) p r e p a r a t i o n o f p l a t e l e t s i n N a I - f r e e b u f f e r ; ( 2 ) i n c r e a s e d e x t r a c e l l u l a r H I c o n c e n t r a t i o n b y d e c r e a s i n g t h e p H o f t h e s u s p e n d i n g b u f f e r f r o m 7 . 3 5 t o 6 . 9 5 ; a n d ( 3 ) a d d i t i o n o f t h e a m i l o r i d e a n a l o g u e 1 0 0 e t h y l i s o p r o p y l a m i l o r i d e t o d i r e c t l y i n h i b i t t h e N a I / H + e x c h a n g e r . “ ” T h e s e m a n i p u l a t i o n s c a u s e d c o m p l e t e i n h i b i t i o n o f s e c o n d a r y a g g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n i n r e s p o n s e t o e p i n e p h r i n e , A D P o r l o w c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n . T h e r e f o r e , t h e r e s p o n s e s e l i m i n a t e d b y r e m o v a l o f e x t r a p l a t e l e t N a + a r e t h e s a m e a s t h o s e e l i m i n a t e d b y t r e a t i n g p l a t e l e t s w i t h a c y c l o o x y g e n a s e i n h i b i t o r , s u g g e s t i n g a s t r o n g l i n k b e t w e e n t h e p r e s e n c e o f e x t r a c e l l u l a r N a + a n d t h e o p e r a t i o n o f p l a t e l e t f u n c t i o n m e d i a t e d b y t h e c y c l o o x y g e n a s e p a t h w a y . 9 5 N a fl fl F ' E x c h a n g e a n d A r a c h i d o n i c A c i d M o b i l i z a t i o n S u b s e q u e n t s t u d i e s p r o v i d e d e v i d e n c e t h a t i n h i b i t i o n o f N a U fl F ' e x c h a n g e b y a n y o f t h e a b o v e m a n i p u l a t i o n s i n h i b i t s m o b i l i z a t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d i n r e s p o n s e t o t h e s e w e a k a g o n i s t s . “ m T h e c o n v e r s i o n o f e x o g e n o u s a r a c h i d o n i c a c i d t o T X A a ‘ w a s n o t a f f e c t e d . E p i n e p h r i n e h a s b e e n r e p o r t e d t o b e a u n i q u e p l a t e l e t a g o n i s t i n t h a t i t d o e s n o t i n d u c e s h a p e c h a n g e , r e q u i r e s e x t r a c e l l u l a r d i v a l e n t c a t i o n s a n d d o e s n o t d i r e c t l y a c t i v a t e p h o s p h o l i p a s e C . “ “ T h e a c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e C b y e p i n e p h r i n e i s t o t a l l y d e p e n d e n t u p o n r e l e a s e d A D P a n d a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s . W h e n N a I / H + e x c h a n g e , o r c y c l o o x y g e n a s e , w a s b l o c k e d , t h e a c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e C i n r e s p o n s e t o e p i n e p h r i n e , a n d A D P , w a s a l s o c o m p l e t e l y b l o c k e d . “ " T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e s e a g o n i s t s a c t i v a t e p h o s p h o l i p a s e C s e c o n d a r y t o a c t i v a t i o n o f N a U G F ' e x c h a n g e a n d m o b i l i z a t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d . I t w a s p r o p o s e d t h a t b l o c k a d e o f N a U O F ' e x c h a n g e w o u l d b l o c k e p i n e p h r i n e - i n d u c e d m o b i l i z a t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d w h i c h w o u l d i n t u r n p r e v e n t p h o s p h o l i p a s e C a c t i v a t i o n . I n h i b i t o r s o f N a fl fl r ' e x c h a n g e o r 1 0 1 c y c l o o x y g e n a s e h a v e n o e f f e c t o n t h e a c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e C b y h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n o r t h e e n d o p e r o x i d e a n a l o g u e U 4 6 6 1 9 , i n d i c a t i n g t h a t t h e s e i n h i b i t o r s d o n o t a f f e c t p h o s p h o l i p a s e C i t s e l f . ‘ 7 ‘ T h e t e c h n i q u e o f g a s c h r o m a t o g r a p h y / m a s s s p e c t r o m e t r y h a s b e e n u s e d t o a s s e s s t h e m o b i l i z a t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d i n r e s p o n s e t o e p i n e p h r i n e i n t h e p r e s e n c e o f a s p e c i f i c i n h i b i t o r o f p h o s p h o l i p a s e C . ‘ " " " ' 7 6 I n t h e s e e x p e r i m e n t s , a v e r y s m a l l p o o l o f a r a c h i d o n i c a c i d m o b i l i z e d i n r e s p o n s e t o e p i n e p h r i n e w a s d e t e c t e d . T h i s m o b i l i z a t i o n c o u l d b e b l o c k e d b y e t h y l i s o p r o p y l a m i l o r i d e , r e m o v a l o f e x t r a p l a t e l e t N a I o r r e d u c t i o n o f e x t r a p l a t e l e t p H . F r o m t h i s , i t w a s p o s t u l a t e d t h a t a p h o s p h o l i p a s e A g c o n t r o l l e d b y N a U O F ' e x c h a n g e m i g h t e x i s t . T h i s w a s s u p p o r t e d b y t h e f i n d i n g t h a t l y s o p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l p r o d u c t i o n i n r e s p o n s e t o e p i n e p h r i n e a n d A D P w a s n o t a f f e c t e d b y t h r o m b o x a n e r e c e p t o r a n t a g o n i s t s , b u t w a s i n h i b i t e d b y p e r t u r b a n t s o f N a I / H " e x c h a n g e . " 7 3 " ‘ 7 B I n h i b i t i o n o f N a + / H + e x c h a n g e d e c r e a s e d l y s o p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l p r o d u c t i o n i n r e s p o n s e t o h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n a n d c o m p l e t e l y i n h i b i t e d p r o d u c t i o n i n r e s p o n s e t o l o w c o n c e n t r a t i o n s . E p i n e p h r i n e a l s o c a u s e d a r a p i d d e c r e a s e i n m e m b r a n e - b o u n d C a ? + . a s m e a s u r e d b y c h l o r t e t r a c y c l i n e f l u o r e s c e n c e , w h i c h s u g g e s t s t h a t e p i n e p h r i n e i s a b l e t o m o b i l i z e a s m a l l p o o l o f l o c a l C a 2 + . " 7 3 T h e a c t i v a t i o n o f N a I / H + e x c h a n g e m a y p r o v i d e l o c a l i z e d C a z + m o b i l i z a t i o n p l u s a n a l k a l i n e e n v i r o n m e n t , b o t h o f w h i c h a r e c o n d u c i v e t o a c t i v a t i o n 3 8 o f p h o s p h o l i p a s e A 2 . P l a t e l e t p h o s p h o l i p a s e A 2 h a s a p H o p t i m u m o f 1 0 2 8 . 0 , a n d , a t t h i s p H , e n z y m a t i c a c t i v i t y c a n b e d e t e c t e d a t l o w e r C a 2 + c o n c e n t r a t i o n s . " 7 8 T h e s m a l l p o o l o f m o b i l i z e d a r a c h i d o n i c a c i d i s c o n v e r t e d t o T x A Q w h i c h a c t i v a t e s p h o s p h o l i p a s e C w h e n i t b i n d s t o t h e T X A Q / P G H Z r e c e p t o r . P h o s p h o l i p a s e C a c t i v a t i o n l e a d s t o m o b i l i z a t i o n o f m u c h l a r g e r p o o l s o f a r a c h i d o n i c a c i d w h i c h a r e d e t e c t a b l e b y m e a s u r e m e n t o f ' 3 H - a r a c h i d o n i c a c i d r e l e a s e o r b y r a d i o i m m u n o a s s a y f o r T s z . S t r o n g a g o n i s t s , s u c h a s h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n , a c t i v a t e p h o s p h o l i p a s e C m o r e d i r e c t l y a n d d o n o t n e e d p r i o r f o r m a t i o n o f c y c l o o x y g e n a s e p r o d u c t s o r a c t i v a t i o n o f N ' a I / H + e x c h a n g e . N a I / H + E x C h a n g e , F i b r i n o g e n B i n d i n g a n d t h e a z m A d r e n e r g i c R e c e p t o r I n a n o t h e r s t u d y , t h e a b i l i t y o f e p i n e p h r i n e t o a c t i v a t e p h o s p h o l i p a s e C w a s f o u n d t o b e b l o c k e d c o m p l e t e l y b y i n h i b i t o r s o f t h e a z - a d r e n e r g i c r e c e p t o r , c y c l o o x y g e n a s e , p h o s p h o l i p a s e A 2 , N a I / H + e x c h a n g e o r f i b r i n o g e n b i n d i n g t o G P I I b - I l l a a n d b y r e m o v a l o f f i b r i n o g e n . ” I n a d d i t i o n , t h e c y t o p l a s m i c a l k a l i n i z a t i o n w h i c h w a s m e a s u r e d i n r e s p o n s e t o e p i n e p h r i n e w a s i n h i b i t e d b y e t h y l i s o p r o p y l a m i l o r i d e o r b y a n a n t i b o d y t h a t p r e v e n t s f i b r i n o g e n i n t e r a c t i o n w i t h G P I I b - I I I a . I t w a s p r o p o s e d t h a t e p i n e p h r i n e p r o m o t e s e x p o s u r e o f G P I I b - I l l a s i t e s f o r f i b r i n o g e n b i n d i n g w h i c h l e a d s t o c y t o p l a s m i c a l k a l i n i z a t i o n b y a c t i v a t i o n o f N a I / H I e x c h a n g e . T h i s , i n c o n j u n c t i o n w i t h l o c a l s h i f t s i n C a “ ; p r o m o t e s l o w - l e v e l a c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e A 2 . T h e r e l e a s e d a r a c h i d o n i c a c i d i s c o n v e r t e d t o c y c l o o x y g e n a s e p r o d u c t s w h i c h , p o t e n t i a t e d b y e p i n e p h r i n e , a c t i v a t e p h o s p h o l i p a s e C . 1 0 3 T h e r e i s c o n s i d e r a b l e e v i d e n c e t h a t a z - a d r e n e r g i c r e c e p t o r s m a y b e v e r y c l o s e l y l i n k e d t o t h e N a I / H I e x c h a n g e m e c h a n i s m , i f n o t t h e m s e l v e s p a r t o f t h e m e c h a n i s m . A g e n t s s u c h a s a m i l o r i d e a n a l o g u e s , N a I o r H + , w h i c h i n t e r a c t w i t h N a U O F ' e x c h a n g e r s a l l a f f e c t a z - a d r e n e r g i c r e c e p t o r 2 2 9 , 2 9 1 , 3 2 9 , 3 6 4 a f f i n i t y f o r a g o n i s t s . T h e a z - a d r e n e r g i c r e c e p t o r i t s e l f m a y p l a y a d u a l r o l e a s b o t h r e c e p t o r a n d i o n - t r a n s p o r t e r . P l a t e l e t A c t i v a t i n g F a c t o r a n d N a fl n F ’ E x c h a n g e P l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r s h a r e s s o m e o f t h e f e a t u r e s o f w e a k p l a t e l e t a g o n i s t s . V i g o r o u s a g g r e g a t i o n i s i n h i b i t e d b y c y c l o o x y g e n a s e i n h i b i t o r s a n d t h r o m b o x a n e a n t a g o n i s t s a n d i t e l i c i t s a G T P - d e p e n d e n t a n d N a I - m o d u l a t e d i n h i b i t i o n o f a d e n y l a t e c y c l a s e . " 7 5 " " ’ 1 1 T h e r e i s h o w e v e r , c o n s i d e r a b l e v a r i a t i o n i n o p i n i o n c o n c e r n i n g t h e r o l e o f a r a c h i d o n i c a c i d m e t a b o l i t e s i n P A F - i n d u c e d a g g r e g a t i o n . A t l o w c o n c e n t r a t i o n s o f P A F i t a c t s a s a w e a k a g o n i s t , b u t a t h i g h c o n c e n t r a t i o n s i t i s l e s s d e p e n d e n t o n a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s . W h i l e a t h r o m b o x a n e a n t a g o n i s t c o m p l e t e l y i n h i b i t s d e n s e g r a n u l e s e c r e t i o n , e t h y l i s o p r o p y l a m i l o r i d e c a u s e s p a r t i a l i n h i b i t i o n o f r e l e a s e . " 7 6 T h i s s u g g e s t s t h a t P A F m a y u t i l i z e t w o s e p a r a t e p a t h w a y s t o e l i c i t f u l l p l a t e l e t a c t i v a t i o n w i t h i n h i b i t i o n o f N ' a I / H + e x c h a n g e n o t c a u s i n g c o m p l e t e b l o c k a d e o f a r a c h i d o n i c a c i d r e l e a s e i n r e s p o n s e t o h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f P A F . 1 0 4 C a l c i u m I o n o p h o r e s a n d N a U fl F ' E x c h a n g e A c t i v a t i o n o f p l a t e l e t s b y t h e c a l c i u m i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 h a s b e e n s h o w n . t o a c t i v a t e N a I / H I e x c h a n g e i n a d d i t i o n t o m o b i l i z i n g i n t r a c e l l u l a r C a 2 + s t o r e s . ‘ 5 ° T h e r e l e a s e o f p r o t o n s m e d i a t e d b y t h e a c c e l e r a t e d N a fi fl r ' e x c h a n g e w a s m a r k e d l y i n h i b i t e d b y a m i l o r i d e o r d e c r e a s i n g t h e N a + i n t h e m e d i u m . A g g r e g a t i o n o f p l a t e l e t r i c h p l a s m a b y 2 0 u M A 2 3 1 8 7 w a s c o m p l e t e l y i n h i b i t e d b y i n h i b i t i o n o f N a I / H + e x c h a n g e . A l t h o u g h i n h i b i t i o n o f a g g r e g a t i o n i n r e s p o n s e t o v e r y h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f A 2 3 1 8 7 ( 4 0 p M ) a p p e a r e d t o b e o n l y p a r t i a l , a t t h i s c o n c e n t r a t i o n c e l l l y s i s m a y o c c u r . T h e r e l e a s e o f a r a c h i d o n i c a c i d o r m e a s u r e m e n t o f T x 2 p r o d u c t i o n w a s n o t m e a s u r e d , t h e r e f o r e i t i s n o t k n o w n i f i n h i b i t i o n o f N a U fl F e x c h a n g e a f f e c t s t h e a c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e A q ' b y A 2 3 1 8 7 . A s a g g r e g a t i o n i n r e s p o n s e t o A 2 3 1 8 7 i s t o t a l l y d e p e n d e n t u p o n f o r m a t i o n o f a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s , f a i l u r e t o g e n e r a t e t h e s e m a y e x p l a i n t h e c o m p l e t e i n h i b i t i o n o f a g g r e g a t i o n . A l t e r n a t i v e l y , c y t o p l a s m i c a l k a l i n i z a t i o n m a y b e e s s e n t i a l f o r a g g r e g a t i o n t o o c c u r , p o s s i b l y b y p H - d e p e n d e n t e f f e c t s o n t h e c y t o s k e l e t o n . 2 “ T h r o m b i n a n d N a n fl F ’ E x c h a n g e T h r o m b i n a c c e l e r a t e s N a fl fl f ' e x c h a n g e a n d b l o c k a d e o f t h i s e x c h a n g e i n h i b i t s p l a t e l e t r e s p o n s e s t o l o w e r , b u t n o t h i g h , c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n . H o w e v e r , t h e m e c h a n i s m b y w h i c h t h r o m b i n s t i m u l a t e s N a U O F ' e x c h a n g e i s n o t k n o w n . A t l o w c o n c e n t r a t i o n s , t h r o m b i n a c t s a s a w e a k a g o n i s t a n d c a n o n l y a c t i v a t e p h o s p h o l i p a s e C s e c o n d a r y t o a c t i v a t i o n 1 0 5 o f N E E / H i e x c h a n g e a n d m o b i l i z a t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d . H i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n a c t i v a t e p h o s p h o l i p a s e C d i r e c t l y a n d a g g r e g a t i o n i s n o t d e p e n d e n t u p o n N a n fl r ' e x c h a n g e o r a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s . I t i s p r o b a b l e t h a t t h e p r o d u c t i o n o f D A G a n d a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C e n h a n c e s o r m e d i a t e s a c c e l e r a t i o n o f N a I / H + e x c h a n g e . T h e t h r o m b i n - i n d u c e d a c t i v a t i o n o f N a I / H I e x c h a n g e i n h a m s t e r f i b r o b l a s t s h a s b e e n d e m o n s t r a t e d t o b e a t l e a s t p a r t l y m e d i a t e d b y t h e a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C . ’ " A c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C b y a d d i t i o n o f p h o r b o l e s t e r t o p l a t e l e t s h a s b e e n s h o w n t o e v o k e N a + - d e p e n d e n t a l k a l i n i z a t i o n . ” 3 T h e r e s p o n s e s o f t h r o m b i n , a n d p o s s i b l y P A F , i n d i c a t e t h a t t h e r e a r e a t l e a s t t w o w a y s i n w h i c h p l a t e l e t a g o n i s t s c a n a c c e l e r a t e N a n fl f ' e x c h a n g e : ( 1 ) a p a t h w a y u s e d b y w e a k a g o n i s t s w h i c h l i e s c l o s e t o t h e r e c e p t o r s t h e m s e l v e s , i s e n h a n c e d b y f i b r i n o g e n o c c u p a n c y o f G P I I b - I l l a a n d i s p r o b a b l y i n d e p e n d e n t o f p r o t e i n k i n a s e C ; a n d ( 2 ) s e c o n d a r y t o p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s , D A G p r o d u c t i o n a n d p r o t e i n k i n a s e C a c t i v a t i o n . T H E R E L A T I O N S H I P O F S E C O N D M E S S E N G E R S T O P L A T E L E T F U N C T I O N A l t h o u g h q u i t e a l o t i s k n o w n a b o u t t h e f o r m a t i o n o f s e c o n d m e s s e n g e r s a n d t h e i r b i o c h e m i c a l f u n c t i o n s i n p l a t e l e t s , r e l a t i v e l y l i t t l e i s k n o w n a b o u t t h e i r r e l a t i o n s h i p t o t h e p h y s i c a l e v e n t s o f s h a p e c h a n g e , a g g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n o f g r a n u l e c o n t e n t s . M a n y e v e n t s o c c u r c o n c u r r e n t l y d u r i n g p l a t e l e t a c t i v a t i o n , m a k i n g i t v e r y d i f f i c u l t t o e s t a b l i s h c a u s e - a n d - e f f e c t r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n t h e m . a s p i r i n - t r e a t e d p l a t e l e t s , 1 0 8 . 4 4 8 1 0 6 A w i d e r a n g e o f p l a t e l e t a g o n i s t s s t i m u l a t e p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s b y p h o s p h o l i p a s e C i n p l a t e l e t s . T h e s e a g o n i s t s i n c l u d e t h r o m b i n , c o l l a g e n , P A F , v a s o p r e s s i n , a r a c h i d o n i c a c i d , a n d e n d o p e r o x i d e a n d t h r o m b o x a n e a n a l o g u e s . " ° " 1 ' 2 3 9 " 1 3 ' “ 1 ' “ 3 ' “ " W h e t h e r o r n o t A D P s t i m u l a t e s p h o s p h o l i p a s e C i s n o t c l e a r , b u t r e c e n t w o r k s u g g e s t s t h a t A D P c a n g e n e r a t e ( l , 4 , 5 ) I P 3 a n d p h o s p h a t i d i c a c i d i n A s d i s c u s s e d a b o v e , e p i n e p h r i n e d o e s n o t a c t i v a t e p h o s p h o l i p a s e C d i r e c t l y , b u t i n d i r e c t l y a c t i v a t e s p h o s p h o l i p a s e C v i a c y c l o o x y g e n a s e p r o d u c t s . S h a p e C h a n g e A l l a g o n i s t s t h a t i n d u c e d i r e c t h y d r o l y s i s o f p h o s p h o i n o s i t i d e s b y p h o s p h o l i p a s e C i n d u c e s h a p e c h a n g e . E p i n e p h r i n e d o e s n o t i n d u c e s h a p e c h a n g e t h a t i s d e t e c t a b l e o n a n a g g r e g o m e t e r t r a c i n g . B o t h p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s a n d s h a p e c h a n g e a r e i n d e p e n d e n t o f e x t r a c e l l u l a r C a 2 + a n d M g 2 + a n d a r e n o t b l o c k e d b y c a l m o d u l i n a n t a g o n i s t s , i n h i b i t o r s o f a r a c h i d o n i c a c i d r e l e a s e o r c y c l o o x y g e n a s e i n h i b i t o r s . 3 1 ° " " 1 " “ S h a p e c h a n g e i s a l s o a s s o c i a t e d w i t h t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 k D a m y o s i n l i g h t c h a i n . 1 0 7 B e c a u s e m y o s i n p h o s p h o r y l a t i o n i s v e r y r a p i d a n d p r e c e d e s t h e o n s e t o f s h a p e c h a n g e , i t m a y p l a y a r o l e i n t h e i n i t i a t i o n o f s h a p e c h a n g e . 1 1 6 M y o s i n l i g h t c h a i n p h o s p h o r y l a t i o n i s r e g u l a t e d a t l e a s t i n p a r t b y C a ” ) w h i c h m a y a l s o p l a y a r o l e i n t h e i n d u c t i o n o f s h a p e c h a n g e . H o w e v e r , m y o s i n p h o s p h o r y l a t i o n m a y o c c u r a t n e a r r e s t i n g l e v e l s o f c y t o p l a s m i c C a y ' u n d e r s o m e c i r c u m s t a n c e s , 1 0 7 s u c h a s i n t h e a b s e n c e o f e x t e r n a l C a E I U U B T h e p h y s i o l o g i c a l s i g n i f i c a n c e o f t h i s i s n o t k n o w n , b u t i t d o e s s u g g e s t t h a t C a ? + . a n d c a l m o d u l i n m a y n o t b e t h e o n l y m e a n s b y w h i c h m y o s i n l i g h t c h a i n k i n a s e i s r e g u l a t e d . A n i n c r e a s e i n c y t o p l a s m i c C a 9 + . a l o n e d o e s n o t i n d u c e s h a p e c h a n g e b y p h y s i o l o g i c a g o n i s t s . “ 7 A l t h o u g h m y o s i n p h o s p h o r y l a t i o n i s r e v e r s i b l e , s h a p e c h a n g e i n d u c e d u n d e r t h e s e c i r c u m s t a n c e s i s i r r e v e r s i b l e , i n d i c a t i n g t h a t m y o s i n p h o s p h o r y l a t i o n m a y b e r e q u i r e d f o r t h e i n i t i a l c h a n g e i n p l a t e l e t s h a p e , b u t i s n o t n e c e s s a r y f o r m a i n t e n a n c e o f t h e c h a n g e . 1 0 7 T h e r e i s n o e v i d e n c e l i n k i n g a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C a n d p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 4 7 k D a p r o t e i n t o s h a p e c h a n g e . P h o r b o l e s t e r s o r d i a c y l g l y c e r o l i n d u c e m a x i m a l a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C w i t h o u t i n d u c i n g s h a p e c h a n g e t h a t i s d e t e c t a b l e o n a n a g g r e g a t i o n t r a c i n g . 5 2 9 T r e a t m e n t o f p l a t e l e t s w i t h p h o r b o l e s t e r s i n d u c e s t h e e x t e n s i o n o f p s e u d o p o d s , b u t d o e s n o t i n d u c e s p h e r a t i o n . P h o r b o l e s t e r - s t i m u l a t e d p l a t e l e t s d e v e l o p a p s e u d o p o d a l c y t o s k e l e t o n c o n t a i n i n g b u n d l e s o f a c t i n f i l a m e n t s , b u t n o t t h e c o n t r a c t i l e c o m p o n e n t o f a c t i n f i l a m e n t s c o m b i n e d w i t h m y o s i n . 7 2 S e c r e t i o n o f G r a n u l e C o n t e n t s A g o n i s t s s u c h a s h i g h c o n c e n t r a t i o n o f t h r o m b i n , c o l l a g e n , A 2 3 1 8 7 , P A F , v a s o p r e s s i n a n d e n d o p e r o x i d e a n a l o g u e s c a n i n d u c e p l a t e l e t s e c r e t i o n i n d e p e n d e n t l y o f e x t r a c e l l u l a r C a fl ' a n d i n t h e a b s e n c e o f 4 4 1 , 4 4 8 a g g r e g a t i o n . T h e d e n s e g r a n u l e s e c r e t i o n i n d u c e d b y w e a k a g o n i s t s s u c h a s A D P a n d e p i n e p h r i n e i s d e p e n d e n t u p o n e x t r a c e l l u l a r 1 0 8 C a 2 + a n d M g 2 + a n d t h e s e c o n d a r y a g g r e g a t i o n i n d u c e d b y a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s . S e c r e t i o n o n l y o c c u r s i n r e s p o n s e t o A D P i n m e d i u m t h a t i s l o w i n C a 2 + a n d h i g h i n M g “ , s u c h a s i n c i t r a t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a . 3 ‘ 3 T h e r e i s a s t r o n g r e l a t i o n s h i p b e t w e e n p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s a n d s e c r e t i o n o f d e n s e g r a n u l e c o n t e n t s f r o m p l a t e l e t s . T h e p h o s p h o l i p a s e C a c t i v a t i o n a s s o c i a t e d w i t h s h a p e c h a n g e m a y b e s e p a r a t e d f r o m t h e p h o s p h o l i p a s e C a c t i v a t i o n a s s o c i a t e d w i t h s e c r e t i o n . “ " T h e i n o s i t o l l i p i d h y d r o l y s i s a s s o c i a t e d w i t h s e c r e t i o n i s q u a n t i t a t i v e l y g r e a t e r t h a n t h a t a s s o c i a t e d w i t h s h a p e c h a n g e , w i t h t h e e x t e n t o f s e c r e t i o n b e i n g g e n e r a l l y p r o p o r t i o n a l t o t h e e x t e n t o f p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s . S t r o n g a g o n i s t s s u c h a s h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n i n d u c e g r e a t e r a c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e C a n d r e l e a s e o f d e n s e g r a n u l e c o n t e n t s t h a n w e a k e r a g o n i s t s . 2 7 ° ' “ 3 T h e p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s a s s o c i a t e d w i t h s e c r e t i o n b y w e a k o r i n t e r m e d i a t e a g o n i s t s m a y b e p a r t l y o r e n t i r e l y m e d i a t e d b y a c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e C b y a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s o r r e l e a s e d A D P . “ “ H o w e v e r , t h e r e a r e c i r c u m s t a n c e s u n d e r w h i c h s e c r e t i o n m a y o c c u r i n t h e a b s e n c e o f p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s . I n o n e s t u d y u s i n g p e r m e a b i l i z e d p l a t e l e t s i n t h e p r e s e n c e o f h i g h ( 1 . 0 m M ) c o n c e n t r a t i o n s o f c a ” ; t h r o m b i n i n d u c e d s e c r e t i o n w i t h o u t p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s 8 0 o r p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n . 2 I n a n o t h e r s t u d y , t h r o m b i n w a s u n a b l e t o a c t i v a t e p h o s p h o l i p a s e C , m o b i l i z e i n t r a c e l l u l a r C a u ’ a n d c a u s e s e c r e t i o n i n p l a t e l e t s i n h i b i t e d w i t h G D P E S w h i c h i n h i b i t s G p r o t e i n 5 6 f u n c t i o n . H o w e v e r , i n c r e a s i n g t h e t h r o m b i n c o n c e n t r a t i o n c o u l d o v e r c o m e t h e i n h i b i t i o n o f s e c r e t i o n , b u t n o t t h e i n h i b i t i o n o f 1 0 9 p h o s p h o l i p a s e C a c t i v a t i o n . T h e s e f i n d i n g s i n d i c a t e t h a t t h e r e m u s t b e a p a t h w a y f o r t h r o m b i n - i n d u c e d s e c r e t i o n t h a t i s i n d e p e n d e n t o f p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s . S e c r e t i o n i s v e r y l i k e l y i n i t i a t e d b y a n i n c r e a s e i n t h e c y t o p l a s m i c C a m ' c o n c e n t r a t i o n . I f p l a t e l e t s a r e p e r m e a b i l i z e d b y e x p o s u r e t o s a p o n i n o r a n i n t e n s e e l e c t r i c f i e l d , t h e i n t r a - a n d e x t r a c e l l u l a r C a 2 + c o n c e n t r a t i o n s e q u i l i b r a t e . U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s i t h a s b e e n f o u n d t h a t r e l e a s e o f d e n s e g r a n u l e c o n t e n t s c a n b e i n d u c e d b y a n i n c r e a s e i n t h e C a 2 + c o n c e n t r a t i o n i n t h e m e d i u m , w i t h h a l f - m a x i m a l r e l e a s e o c c u r r i n g a t 1 - 1 0 p M f r e e C a 2 + . 5 ’ 5 " 2 5 3 T h i s C a 2 + s e n s i t i v i t y i n p e r m e a b i l i z e d p l a t e l e t s i s g r e a t l y e n h a n c e d b y t h e a d d i t i o n o f t h r o m b i n , G T P a n a l o g u e s , p h o r b o l e s t e r o r d i a c y l g l y c e r o l . 1 ° 6 ' m ° ' 2 5 6 T h e d o s e - r e s p o n s e c u r v e f o r C a m ¥ i n d u c e d s e c r e t i o n i s s h i f t e d t o t h e l e f t a n d t h e h a l f - m a x i m a l s t i m u l a t o r y d o s e d e c r e a s e s t o 0 . 5 p H , w h i c h i s w i t h i n t h e c y t o p l a s m i c C a a ' r a n g e r e a c h e d d u r i n g s t i m u l a t i o n b y p h y s i o l o g i c a g o n i s t s . A g o n i s t s s u c h a s A D P o r e p i n e p h r i n e w h i c h c a u s e l i t t l e o r n o a c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e C a n d p r o t e i n k i n a s e C d o n o t e n h a n c e t h e C a 2 + s e n s i t i v i t y o f s e c r e t i o n . ” 5 T h u s i t a p p e a r s l i k e l y t h a t t h e i n c r e a s e i n c y t o p l a s m i c C a m ' a n d a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C a c t s y n e r g i s t i c a l l y t o m e d i a t e s e c r e t i o n . M y o s i n l i g h t c h a i n p h o s p h o r y l a t i o n i s f u r t h e r i n c r e a s e d d u r i n g s e c r e t i o n a n d m a y b e r e s p o n s i b l e f o r i n d u c i n g s e c r e t i o n . 1 8 5 ' 3 6 3 P h o s p h o r y l a t i o n o f m y o s i n l i g h t c h a i n i n c r e a s e s t h e a c t i v i t y o f a c t i n - a c t i v a t e d m y o s i n A T P a s e a n d t h e r e s u l t a n t c o n t r a c t i o n p r e s u m a b l y m e d i a t e s t h e s e c r e t i o n o f g r a n u l e c o n t e n t s . T h e c a l m o d u l i n a n t a g o n i s t 8 P h i n g o s i n e a n d s t a u r o s p o r i n e . 1 7 ° - 5 ° ° 1 1 0 t r i f l u o p e r a z i n e h a s b e e n s h o w n t o i n h i b i t p l a t e l e t a g g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n i n r e s p o n s e t o t h r o m b i n , t r y p s i n , c o l l a g e n , e p i n e p h r i n e , A 2 3 1 8 7 a n d a r a c h i d o n i c a c i d . “ 3 3 T r i f l u o p e r a z i n e a l s o i n h i b i t e d t h r o m b i n - i n d u c e d p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 a n d 4 7 k D a p r o t e i n s . H o w e v e r , t r i f l u o p e r a z i n e h a s a l s o b e e n s h o w n t o b e a b l e t o i n h i b i t s e c r e t i o n w i t h o u t s i g n i f i c a n t l y i n h i b i t i n g m y o s i n l i g h t c h a i n 0 3 p h o s p h o r y l a t i o n . 2 I t m a y b e t h a t t h e C a y - d e p e n d e n t m y o s i n p h o s p h o r y l a t i o n i s e s s e n t i a l f o r s e c r e t i o n , b u t d o e s n o t r e g u l a t e t h e r e s p o n s e . “ 8 P h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 a n d 4 7 k D a p r o t e i n s a r e p r o b a b l y b o t h i m p o r t a n t s t e p s i n s e c r e t i o n . S e c r e t i o n o f d e n s e g r a n u l e c o n t e n t s a n d p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 4 7 k D a p r o t e i n h a v e b e e n c l o s e l y l i n k e d i n s e v e r a l s t u d i e s . 1 8 3 - 1 3 5 ' 3 5 3 v 3 5 3 P r o t e i n k i n a s e C a c t i v a t i o n a l o n e i s n o t s u f f i c i e n t t o i n d u c e s e c r e t i o n , b u t w h e n c o m b i n e d w i t h a n i n c r e a s e i n c y t o p l a s m i c C a 2 + , s e c r e t i o n c a n b e t r i ‘ g g e r e d . 2 3 8 ' 2 7 9 T h e s y n e r g i s t i c a c t i o n s o f C a 2 + m o b i l i z a t i o n a n d p h o r b o l e s t e r - i n d u c e d a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C a r e a s s o c i a t e d w i t h p o t e n t i a t i o n o f s e c r e t i o n a n d a g g r e g a t i o n . u s T h e r o l e o f p r o t e i n k i n a s e C a c t i v a t i o n i n s e c r e t i o n h a s b e e n i n v e s t i g a t e d b y t h e u s e o f i n h i b i t o r s o f p r o t e i n k i n a s e C s u c h a s T h e s e s t u d i e s s u g g e s t t h a t p r o t e i n k i n a s e C i s a p o s i t i v e s i g n a l f o r s e c r e t i o n a n d s e c o n d a r y a g g r e g a t i o n , b u t s o m e c a u t i o n n e e d s t o b e u s e d i n t h e i n t e r p r e t a t i o n o f t h e r e s u l t s o f t h e s e s t u d i e s b e c a u s e o f t h e l a c k o f s p e c i f i c i t y o f a v a i l a b l e i n h i b i t o r s o f p r o t e i n k i n a s e C . P r e i n c u b a t i o n w i t h 1 1 1 s p h i n g o s i n e r e s u l t e d i n t h e i n h i b i t i o n o f p l a t e l e t s e c r e t i o n a n d s e c o n d a r y a g g r e g a t i o n i n r e s p o n s e t o A D P , Y - t h r o m b i n , c o l l a g e n , a r a c h i d o n i c a c i d a n d P A F . 1 7 8 T h i s i n h i b i t i o n w a s o v e r c o m e b y t h e a d d i t i o n o f p h o r b o l e s t e r , w h i c h s u g g e s t s t h a t i t w a s t h e r e s u l t o f i n h i b i t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C . T h e i n i t i a l s h a p e c h a n g e a n d p r i m a r y p h a s e o f a g g r e g a t i o n w e r e n o t a f f e c t e d . H i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f a g o n i s t s i n d u c e d i r r e v e r s i b l e a g g r e g a t i o n a n d p a r t i a l s e c r e t i o n i n t h e p r e s e n c e o f s p h i n g o s i n e , s u g g e s t i n g t h e e x i s t e n c e o f p r o t e i n k i n a s e C - i n d e p e n d e n t p a t h w a y s f o r p l a t e l e t a g g r e g a t i o n . S t a u r o s p o r i n e f u l l y i n h i b i t e d p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 4 7 k D a p r o t e i n , b u t a l s o i n h i b i t e d p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 k D a m y o s i n l i g h t c h a i n . 5 0 0 T h i s w a s a s s o c i a t e d w i t h i n h i b i t i o n o f t h r o m b i n - i n d u c e d s e c r e t i o n a n d s l o w i n g o f t h e a g g r e g a t i o n r e s p o n s e . A c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e C m e a s u r e d b y p h o s p h a t i d i c a c i d a n d i n o s i t o l p h o s p h a t e p r o d u c t i o n w a s n o t a f f e c t e d . A g g r e g a t i o n A g g r e g a t i o n i s d e p e n d e n t u p o n t h e p r e s e n c e o f e i t h e r e x t r a c e l l u l a r C a 2 + o r M g 2 + f o r t h e b i n d i n g o f f i b r i n o g e n t o i t s r e c e p t o r i n a d d i t i o n t o t h e r e q u i r e m e n t f o r m e m b r a n e - b o u n d C a a ' f O r t h e i n t e g r i t y o f t h e G P I I b - I l l a c o m p l e x . T h e r o l e o f c y t o p l a s m i c C a a fi i f a n y , i n t h e e x p o s u r e o f f i b r i n o g e n r e c e p t o r s a n d a g g r e g a t i o n i s n o t k n o w n . A g g r e g a t i o n c a n b e o b s e r v e d i n t h e a b s e n c e o f p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s , s u c h a s t h e p r i m a r y a g g r e g a t i o n r e s p o n s e o f e p i n e p h r i n e a n d a g g r e g a t i o n i n d u c e d b y p h o r b o l e s t e r . P h o r b o l e s t e r s a l s o e n h a n c e f i b r i n o g e n b i n d i n g w h i c h s u g g e s t s t h a t a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C i s i n v o l v e d i n t h e e x p o s u r e o f f i b r i n o g e n r e c e p t o r s a n d 1 1 2 3 5 8 , 4 3 8 a g g r e g a t i o n . T h e a b i l i t y o f e p i n e p h r i n e t o i n d u c e f i b r i n o g e n b i n d i n g a n d p r i m a r y a g g r e g a t i o n i n d i c a t e s t h a t t h e r e a r e a l s o m e c h a n i s m s t h a t a r e i n d e p e n d e n t o f p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n . “ ” A h y p o t h e t i c a l m o d e l f o r p l a t e l e t a c t i v a t i o n i n v o l v i n g t w o m a j o r s t e p s h a s b e e n p r o p o s e d b y S i e s s . “ 9 T h e f i r s t s t e p i s t h e f o r m a t i o n o f ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 , C a 2 + m o b i l i z a t i o n a n d m y o s i n l i g h t c h a i n k i n a s e p h o s p h o r y l a t i o n . T h e s e e v e n t s c a u s e s h a p e c h a n g e . I n t h e s e c o n d s t e p , m o b i l i z a t i o n o f C a m ' p r i m e s p r o t e i n k i n a s e C f o r a c t i v a t i o n b y D A G f o r m e d f r o m h y d r o l y s i s o f P I . P r o t e i n k i n a s e C a c t i v a t i o n i s r e l a t e d t o p l a t e l e t a g g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n . A l t h o u g h t h i s s c h e m e f i t s f o r s o m e a g o n i s t s , i t s t i l l l e a v e s m a n y q u e s t i o n s u n a n s w e r e d . B A S S E T R O U N D H E R E D I T A R Y T H R O M B O P A T H Y T h e s t u d y o f i n h e r i t e d p l a t e l e t d i s o r d e r s h a s c o n t r i b u t e d g r e a t l y t o t h e k n o w l e d g e o f n o r m a l p l a t e l e t f u n c t i o n . I n h e r i t e d a b n o r m a l i t i e s o f t h e m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s s u c h a s G l a n z m a n n ' s t h r o m b a s t h e n i a ( d e f i c i e n c y o f G P I I b - I I I a ) a n d B e r n a r d - S o u l i e r s y n d r o m e ( d e f i c i e n c y o f G P I b / I X a n d G P V ) h a v e a l r e a d y b e e n d i s c u s s e d . T h e s e s y n d r o m e s h a v e b e e n i n v a l u a b l e i n d e f i n i n g t h e n o r m a l s t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l r o l e s o f t h e s e g l y c o p r o t e i n s . T h e i n h e r i t e d a b n o r m a l i t i e s i n v o l v i n g p l a t e l e t g r a n u l e s h a v e a l s o b e e n b r i e f l y d i s c u s s e d . T h e s e p l a t e l e t a b n o r m a l i t i e s a r e u s u a l l y p a r t o f a g e n e t i c d e f e c t w h i c h a f f e c t s m a n y t i s s u e s a n d o r g a n s . T h e r e a r e n u m e r o u s o t h e r c o n g e n i t a l p l a t e l e t d e f e c t s d e s c r i b e d , m o s t o f w h i c h a r e s p o r a d i c a n d n o t y e t w e l l u n d e r s t o o d . T h e y i n c l u d e a b n o r m a l i t i e s o f a d h e s i o n , s e c r e t i o n , 1 1 3 t h r o m b o x a n e p r o d u c t i o n , C a 2 + m o b i l i z a t i o n , g l y c o p r o t e i n s , s p e c i f i c a g o n i s t r e c e p t o r s , e n z y m e s a n d p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l m e t a b o l i s m 1 2 0 , 1 2 1 , 1 8 0 , 2 0 6 , 2 5 8 , 2 6 9 , 2 7 0 . 2 7 1 , 4 0 0 , 4 0 1 , 4 0 2 , 4 0 3 , 4 7 9 B a s s e t h o u n d h e r e d i t a r y t h r o m b o p a t h y i s a n i n h e r i t e d p l a t e l e t d i s o r d e r i n p u r e b r e d B a s s e t h o u n d s . T o t h i s d a t e , n o s i m i l a r d i s o r d e r o f h u m a n o r o t h e r a n i m a l s p e c i e s p l a t e l e t s h a s b e e n d e s c r i b e d . T h e d i s e a s e w a s f i r s t i d e n t i f i e d i n t h e 1 9 7 0 ' s a f t e r a v e t e r i n a r i a n r e q u e s t e d h e l p w i t h t h e p r o b l e m o f h e m o r r h a g i c d i a t h e s e s i n B a s s e t h o u n d s . I n t h e i n i t i a l i n v e s t i g a t i o n , a f f e c t e d d o g s w e r e f o u n d t o h a v e p r o l o n g e d b l e e d i n g t i m e s a n d c o m p l e t e f a i l u r e o f p r i m a r y a g g r e g a t i o n i n r e s p o n s e t o a l l c o n c e n t r a t i o n s o f A D P u s e d . 2 9 ' 2 3 6 T e s t i n g o f 9 2 r e l a t e d B a s s e t h o u n d s i n M i c h i g a n s u g g e s t e d a n a u t o s o m a l r e c e s s i v e i n h e r i t a n c e p a t t e r n . 2 9 I n a m o r e d e t a i l e d i n v e s t i g a t i o n o f 4 5 o f t h e s e d o g s , B a s s e t h o u n d h e r e d i t a r y t h r o m b o p a t h y w a s f o u n d t o h a v e m a n y f e a t u r e s i n c o m m o n w i t h G l a n z m a n n ' s t h r o m b a s t h e n i a o f m a n . 2 9 T h e s e i n c l u d e d p r o l o n g e d b l e e d i n g t i m e s , n o r m a l c o a g u l a t i o n p a r a m e t e r s a n d v o n W i l l e b r a n d f a c t o r l e v e l s , u n a l t e r e d p l a t e l e t n u m b e r s , n o r m a l m o r p h o l o g y b y l i g h t m i c r o s c o p y a n d t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y a n d f a i l u r e o f p r i m a r y a g g r e g a t i o n i n r e s p o n s e t o A D P . O n e m a j o r d i f f e r e n c e b e t w e e n B a s s e t h o u n d t h r o m b o p a t h y a n d G l a n z m a n n ' s t h r o m b a s t h e n i a i s t h e n o r m a l c l o t r e t r a c t i o n s e e n i n B a s s e t h o u n d h e r e d i t a r y t h r o m b o p a t h y . A l l a f f e c t e d d o g s h a d a m o d e r a t e l y s e v e r e h e m o r r h a g i c d i a t h e s i s t y p i c a l o f d e f e c t i v e p l a t e l e t f u n c t i o n w i t h e a s y b r u i s i n g , p e t e c h i a t i o n , m u c o s a l h e m o r r h a g e s a n d e x c e s s i v e b l e e d i n g a s s o c i a t e d w i t h s h e d d i n g o f d e c i d u o u s t e e t h a n d 1 1 4 e s t r o u s c y c l e s . P r i m a r y a g g r e g a t i o n i n r e s p o n s e t o a l l c o n c e n t r a t i o n s o f A D P a n d c o l l a g e n w a s c o m p l e t e l y a b s e n t . I t w a s f o u n d t h a t a n i m a l s w i t h a b n o r m a l r e s p o n s e s c o u l d b e d i v i d e d i n t o t w o g r o u p s . T h e r e w e r e t h o s e d e s c r i b e d a b o v e w i t h c o m p l e t e f a i l u r e o f p r i m a r y a g g r e g a t i o n i n r e s p o n s e t o A D P . T h e r e w a s a l s o a g r o u p o f d o g s w h o a g g r e g a t e d i n r e s p o n s e t o c o l l a g e n , b u t w h o s e a g g r e g a t i o n r e s p o n s e t o A D P w a s w e a k e r b o t h i n r a t e a n d e x t e n t t h a n t h o s e d o g s t h a t w e r e c l a s s i f i e d a s n o r m a l . T h i s g r o u p w e r e a s s u m e d , b u t n o t p r o v e n , t o b e h e t e r o z y g o t e s . T h e e x a c t s t a t u s o f d o g s w i t h s u b n o r m a l a g g r e g a t i o n r e s p o n s e s t o A D P r e m a i n s t o b e c l a r i f i e d . E a r l i e r i n v e s t i g a t i o n i n t o t h e n a t u r e o f t h e d e f e c t i n B a s s e t h o u n d h e r e d i t a r y t h r o m b o p a t h y w a s b a s e d o n t h e h y p o t h e s i s t h a t t h e d e f e c t m a y b e a m o d e l f o r G l a n z m a n n ' s t h r o m b a s t h e n i a i n h u m a n p l a t e l e t s . T h i s w o r k i n c l u d e d i n v e s t i g a t i o n o f t h e a g g r e g a t i o n a n d d e n s e g r a n u l e A T P s e c r e t i o n p a t t e r n s o f a f f e c t e d p l a t e l e t s i n r e s p o n s e t o A D P , e x a m i n a t i o n o f t h e m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n c o n t e n t a n d i n v e s t i g a t i o n o f t h e a b i l i t y o f a f f e c t e d p l a t e l e t s t o b i n d f i b r i n o g e n . I n a d d i t i o n t o t h e f a i l u r e o f p r i m a r y a g g r e g a t i o n , a f f e c t e d p l a t e l e t s a l s o e x h i b i t a b n o r m a l d e n s e g r a n u l e A T P s e c r e t i o n i n r e s p o n s e t o A D P . ” 7 R e l e a s e o f A T P i n . r e s p o n s e t o 1 0 “ M A D P o c c u r r e d a p p r o x i m a t e l y s i x t i m e s m o r e r a p i d l y t h a n f r o m c o n t r o l c a n i n e p l a t e l e t s , b u t t h e q u a n t i t y o f A T P r e l e a s e d d i d n o t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y . T h e a g g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n d e f e c t i n r e s p o n s e t o A D P w a s c o n f i r m e d b y t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y . 1 1 5 T h r e e d i f f e r e n t t e c h n i q u e s w e r e u s e d t o c o m p a r e t h e G P I I b - I l l a c o n t e n t o f c o n t r o l c a n i n e a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s : ( l ) c r o s s e d i m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s ; ( 2 ) n o n r e d u c e d - r e d u c e d t w o - d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s ; a n d ( 3 ) O ' F a r r e l l t w o - d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s . ” a I n t h e c r o s s e d i m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s p r o c e d u r e , t h e c a n i n e G P I I b - I l l a c r o s s - r e a c t e d w i t h t h e A P - 2 m o n o c l o n a l a n t i b o d y a n d a c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e a n t i - h u m a n p l a t e l e t a n t i b o d y . A l l t h r e e m e t h o d s d e t e c t e d n o r m a l q u a n t i t i e s o f G P I I b - I l l a a n d n o o t h e r g l y c o p r o t e i n d i f f e r e n c e s . A m i n o r d i f f e r e n c e i n a s m a l l c l u s t e r o f l o w m o l e c u l a r w e i g h t l i p i d a n d / o r s i a l o g l y c o p r o t e i n c o n s t i t u e n t s w a s d e t e c t e d o n t h e O ' F a r r e l l t w o - d i m e n s i o n a l g e l s . T h e s i g n i f i c a n c e o f t h i s d i f f e r e n c e i s n o t k n o w n . A l t h o u g h a f f e c t e d p l a t e l e t s w e r e s h o w n t o h a v e n o r m a l G P I I b - I l l a c o n t e n t , t h i s d i d n o t i n d i c a t e i f t h e c o m p l e x i s f u n c t i o n a l a n d a b l e t o b i n d f i b r i n o g e n . R e c e n t l y , t h e r e h a v e b e e n r e p o r t s o f c a s e s o f G l a n z m a n n ' s t h r o m b a s t h e n i a i n w h i c h t h e G P I I b - I l l a c o n t e n t i s n o r m a l , b u t t h e c o m p l e x i s n o t f u n c t i o n a l . 3 ° 5 " ° ° T h e a b i l i t y o f a f f e c t e d p l a t e l e t G P I I b - I l l a t o b i n d f i b r i n o g e n w a s e x a m i n e d b y m e a s u r i n g t h e i r a b i l i t y t o b i n d b o t h l i q u i d a n d s o l i d p h a s e f i b r i n o g e n . W h e n a f f e c t e d p l a t e l e t s w e r e a c t i v a t e d w i t h A D P i n t h e p r e s e n c e o f l i q u i d p h a s e 1 2 5 ’ I - f i b r i n o g e n , a f f e c t e d p l a t e l e t s b o u n d l a b e l l e d f i b r i n o g e n t o t h e s a m e e x t e n t a s c o n t r o l c a n i n e a n d h u m a n p l a t e l e t s . 3 7 6 F i b r i n o g e n b i n d i n g w a s a l s o e x a m i n e d d i r e c t l y b y s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y u t i l i z i n g c o l l o i d a l g o l d p r o b e s . “ ” U s i n g A D P - i n d u c e d a d h e s i o n a n d s p r e a d i n g , a f f e c t e d p l a t e l e t s w e r e l a b e l l e d w i t h 1 1 6 e i t h e r a l b u m i n - g o l d , f i b r i n o g e n - g o l d o r f i b r i n o g e n - g o l d w i t h b l o c k i n g u n l a b e l e d f i b r i n o g e n . P l a t e l e t s f r o m h u m a n s a n d n o r m a l u n r e l a t e d d o g s w e r e u s e d a s c o n t r o l s i n a c o m p a r a t i v e s t u d y . T h e s u r f a c e l a b e l l i n g o f f i b r i n o g e n r e c e p t o r s s e e n i n a f f e c t e d d o g s w a s i d e n t i c a l t o c o n t r o l c a n i n e a n d s i m i l a r t o h u m a n p l a t e l e t s . T h e b i n d i n g i n a l l g r o u p s w a s b l o c k e d b y p h y s i o l o g i c c o n c e n t r a t i o n s o f u n l a b e l l e d f i b r i n o g e n . T h e s e r e s u l t s c l e a r l y d e m o n s t r a t e d t h a t a f f e c t e d p l a t e l e t s a r e a b l e t o b i n d f i b r i n o g e n i n r e s p o n s e t o A D P , e v e n a l t h o u g h t h e r e i s f a i l u r e o f p r i m a r y a g g r e g a t i o n . T h e s e r e s u l t s a r e i n c o n f l i c t w i t h t h e w o r k o f C a t a l f a m o e t a l . 7 5 i n w h i c h i t w a s r e p o r t e d t h a t a f f e c t e d p l a t e l e t s e x p r e s s e d f i b r i n o g e n b i n d i n g s i t e s o n l y w h e n a c t i v a t e d b y t h r o m b i n , n o t w h e n a c t i v a t e d b y A D P . T h e f i b r i n o g e n b i n d i n g t e s t u t i l i z e d i n t h e i r e x p e r i m e n t s w a s t h e f i b r i n o g e n - c o a t e d b e a d m e t h o d w h i c h d e p e n d s o n b e a d a g g l u t i n a t i o n a f t e r t h e a d d i t i o n o f p l a t e l e t s . 9 0 T h i s m e t h o d g a v e n e g a t i v e r e s u l t s w i t h a f f e c t e d p l a t e l e t s f o r a l l a g o n i s t s t h a t f a i l e d t o i n d u c e a g g r e g a t i o n . T h i s m e t h o d w a s o r i g i n a l l y d e v i s e d t o e x a m i n e t h r o m b a s t h e n i c p l a t e l e t s f o r G P I I b — I l l a a n d t h e a b i l i t y t o b i n d f i b r i n o g e n . A s t h r o m b a s t h e n i c p l a t e l e t s l a c k G P I I b - 1 1 1 a , t h e y c a n n o t b i n d f i b r i n o g e n o r a g g r e g a t e a n d t h e r e f o r e d o n o t a g g l u t i n a t e t h e c o a t e d b e a d s . I f p l a t e l e t s a r e a b l e t o b i n d t o f i b r i n o g e n o n t h e b e a d s , b u t a r e u n a b l e t o a g g r e g a t e i s s e e m s p r o b a b l e t h a t t h e b e a d s w o u l d n o t a g g l u t i n a t e a s t h e r e i s n o p l a t e l e t - t o - p l a t e l e t b i n d i n g . T h i s i s c o m p a t i b l e w i t h t h e n e g a t i v e r e s u l t s f o r a g o n i s t s w h i c h d o n o t i n d u c e a g g r e g a t i o n a n d t h e p o s i t i v e r e s u l t f o r t h r o m b i n , w h i c h w a s a b l e t o a g g r e g a t e a f f e c t e d p l a t e l e t s . I f t h i s i s s o , t h e b e a d a g g l u t i n a t i o n t e s t i s a t e s t o f f i b r i n o g e n 1 1 7 b i n d i n g a n d a g g r e g a t i o n r a t h e r t h a n a s p e c i f i c t e s t f o r f i b r i n o g e n b i n d i n g . T h i s c o u l d e x p l a i n t h e d i s c r e p a n c y b e t w e e n t h e s e t w o s t u d i e s . B e c a u s e p l a t e l e t a d h e s i o n i s d e f e c t i v e i n G l a n z m a n n ' s t h r o m b a s t h e n i a , t h e a d h e s i o n o f a f f e c t e d p l a t e l e t s w a s i n v e s t i g a t e d . $ ” A f f e c t e d p l a t e l e t s h a v e b e e n s h o w n t o h a v e n o r m a l p l a s m a a n d p l a t e l e t f i b r i n o g e n a n d p l a s m a v o n W i l l e b r a n d ' s f a c t o r l e v e l s . 2 & 7 5 T h e l e v e l s o f t h e o t h e r a d h e s i v e p r o t e i n s t h r o m b o s p o n d i n a n d f i b r o n e c t i n h a v e n o t b e e n e x a m i n e d . C o n t a c t r e a c t i v i t y o f a f f e c t e d p l a t e l e t s w a s s t u d i e d b y w h o l e m o u n t e l e c t r o n m i c r o s c o p y . & “ A f f e c t e d p l a t e l e t s a t t a c h e d p o o r l y t o a f o r m v a r s u b s t r a t e a n d c o n t a c t - i n d u c e d s h a p e c h a n g e w a s i n h i b i t e d c o m p a r e d t o c o n t r o l p l a t e l e t s . T h e a d d i t i o n o f A D P t o a f f e c t e d p l a t e l e t s i n d u c e d a l m o s t a f o u r - f o l d i n c r e a s e i n t h e n u m b e r o f s p r e a d f o r m s a n d a f i v e - f o l d i n c r e a s e i n a d h e r e n t a f f e c t e d p l a t e l e t s , b u t d i d n o t c a u s e a g g r e g a t e f o r m a t i o n . I t h a s a l s o b e e n r e p o r t e d t h a t a f f e c t e d p l a t e l e t s h a v e b a s a l i n t r a c e l l u l a r c y c l i c A M P l e v e l s e l e v a t e d 3 0 - 9 0 % o v e r c o n t r o l s d u e t o i m p a i r e d r e g u l a t i o n o f c y c l i c A M P p h o s p h o d i e s t e r a s e a c t i v i t y / ' 7 ' “ 8 W h e n a f f e c t e d p l a t e l e t s w e r e i n c u b a t e d w i t h f o r s k o l i n , w h i c h d i r e c t l y a c t i v a t e s a d e n y l a t e c y c l a s e , t h e c y c l i c A M P l e v e l s e l e v a t e d f u r t h e r a n d d i d n o t r e t u r n t o b a s a l l e v e l s . T h i s e l e v a t i o n w a s i n h i b i t e d b y e p i n e p h r i n e a n d a u g m e n t e d b y p r o s t a c y c l i n fl n ' T h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e c y t o p l a s m i c c y c l i c A M P p h o s p h o d i e s t e r a s e a c t i v i t i e s o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s , a l t h o u g h b o t h w e r e h i g h e r t h a n h u m a n p l a t e l e t s . A f f e c t e d p l a t e l e t s w e r e a l s o f o u n d t o b e m o r e s e n s i t i v e t o t h e i n h i b i t o r y e f f e c t s o f f o r s k o l i n a n d M I X , a c o m p e t i t i v e 1 1 8 i n h i b i t o r o f c y c l i c A M P p h o s p h o d i e s t e r a s e . " 8 T h e c o n c e n t r a t i o n s o f f o r s k o l i n o r M I X r e q u i r e d t o i n h i b i t Y - t h r o m b i n - i n d u c e d a g g r e g a t i o n w e r e s i g n i f i c a n t l y l e s s t h a n t h a t r e q u i r e d t o i n h i b i t c o n t r o l p l a t e l e t a g g r e g a t i o n . F r o m t h e s e t w o s t u d i e s i t w a s c o n c l u d e d t h a t a f f e c t e d p l a t e l e t s h a v e f u n c t i o n a l l y i n t a c t G 1 a n d G . p r o t e i n s a n d c y c l i c A M P p h o s p h o d i e s t e r a s e w i t h i m p a i r e d r e g u l a t i o n o f t h e c y c l i c A M P p h o s p h o d i e s t e r a s e . I t i s a p p a r e n t t h a t B a s s e t h o u n d h e r e d i t a r y t h r o m b o p a t h y i s n o t a m o d e l f o r G l a n z m a n n ' s t h r o m b a s t h e n i a a n d r e p r e s e n t s a n e w a n d u n i q u e p l a t e l e t d e f e c t . A l o g i c a l a p p r o a c h t o i d e n t i f y i n g t h e d e f e c t i s t o e x p a n d t h e r a n g e o f p h y s i o l o g i c a n d n o n - p h y s i o l o g i c a g o n i s t s u s e d t o i n v e s t i g a t e t h e a g g r e g a t i o n d e f e c t t o s e e i f t h i s p r o v i d e s a n y d i r e c t i o n f o r f u r t h e r s t u d y . W h i l e t h i s p r o j e c t w a s b e i n g u n d e r t a k e n , s o m e s i m i l a r w o r k w a s p u b l i s h e d . 7 5 I n t h i s s t u d y , a f f e c t e d p l a t e l e t s a g g r e g a t e d i n r e s p o n s e t o t h r o m b i n a n d h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f c a l c i u m i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 , b u t f a i l e d t o a g g r e g a t e i n r e s p o n s e t o A D P , s o d i u m a r a c h i d o n a t e a n d c o l l a g e n . T h e s e r e s u l t s i m p l y t h a t a f f e c t e d p l a t e l e t s a r e c a p a b l e o f b i n d i n g f i b r i n o g e n a n d a g g r e g a t i n g , i f t h e s i g n a l t r a n s d u c t i o n s y s t e m c a n c a r r y t h e a p p r o p r i a t e i n f o r m a t i o n t o t h e c e l l . I t i s p r o p o s e d t h a t a f f e c t e d p l a t e l e t s h a v e a d e f e c t i n e i t h e r t h e s e c o n d m e s s e n g e r s y s t e m s o r i n t h e r e g u l a t i o n o f t h e s e s y s t e m s . W h i l e t h i s c o v e r s a v e r y b r o a d a r e a , i t i s h o p e d t h a t t h e r e s u l t s o f t h e s e s t u d i e s w i l l n a r r o w t h e f i e l d a n d i d e n t i f y a n a r e a t h a t c a n b e i n v e s t i g a t e d i n m o r e d e t a i l . C H A P T E R I I : S T A T E M E N T O F T H E P R O B L E M L i k e m o s t s u c h e n d e a v o r s , t h i s d i s s e r t a t i o n i s a s t u d y t h a t d o e s n o t b e g i n e x a c t l y a t t h e b e g i n n i n g , o r e n d a t t h e e n d . T h e v e r y b e g i n n i n g i s t h e c l i n i c a l r e s e a r c h t h a t m a d e i t p o s s i b l e t o i d e n t i f y t h e e x i s t e n c e o f t h e p l a t e l e t p r o b l e m . T h e e n d m a y b e t h e i d e n t i f i c a t i o n o f t h e B a s s e t h o u n d h e r e d i t a r y t h r o m b o p a t h y g e n e , i t s p r o d u c t , a n d t h e r o l e o f t h i s p r o d u c t i n t h e c o n t r o l o f p l a t e l e t r e s p o n s e s . T h e m i d d l e o f t h e s t u d y i s t h e i d e n t i f i c a t i o n o f t h e p r e c i s e p a t h w a y o r e n z y m e s y s t e m t h a t i s d e f e c t i v e . I t i s t h i s m i d d l e a r e a t h a t w a s t h e f o c u s o f t h i s d i s s e r t a t i o n s t u d y , w i t h t h e a i m b e i n g t o i d e n t i f y t h e b i o c h e m i c a l n a t u r e o f t h e d e f e c t i n B a s s e t h o u n d h e r e d i t a r y t h r o m b o p a t h y . T h e e x p e r i m e n t s p l a n n e d t o i n v e s t i g a t e t h i s d e f e c t w e r e n o t w i t h o u t p r e c e d e n t . B e c a u s e o f t h e h i g h f r e q u e n c y o f f a t a l i t i e s a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o t h r o m b o s i s i n h u m a n s , i t i s i m p o r t a n t t o d e t e r m i n e t h e r o l e t h a t p l a t e l e t s p l a y i n t h e p a t h o g e n e s i s o f t h i s d i s e a s e . T h e c l a s s i c t h e o r y o f t h e r o l e o f p l a t e l e t s i n t h r o m b u s f o r m a t i o n h a s b e e n c o n s t r u c t e d p r i n c i p a l l y f r o m o b s e r v a t i o n s o f n o r m a l p l a t e l e t f u n c t i o n . I n v e s t i g a t i o n o f c o n g e n i t a l p l a t e l e t d e f e c t s h a s r e v e a l e d u n e x p e c t e d r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n t h e v a r i o u s e v e n t s t h a t o c c u r d u r i n g p l a t e l e t a c t i v a t i o n . T h e s e " e x p e r i m e n t s o f n a t u r e " h a v e c o n t r i b u t e d g r e a t l y b e c a u s e t h e y f o r c e s c i e n t i f i c r e c o n c i l i a t i o n b e t w e e n d a t a o b t a i n e d f r o m g e n e t i c a l l y d e f e c t i v e p l a t e l e t s a n d t h a t o b t a i n e d b y i n v e s t i g a t i o n a n d 1 1 9 1 2 0 m a n i p u l a t i o n o f n o r m a l p l a t e l e t s . H e r e d i t a r y d e f e c t s i n m a n f r e q u e n t l y e v o l v e a s t h e c o n s e q u e n c e o f f a m i l i a l c o n s a n g u i n i t y . A s i m i l a r o r i g i n i s r e s p o n s i b l e f o r a n i m a l m o d e l s o f h e m o r r h a g i c d i s e a s e . A l t h o u g h t h e r e e x i s t e d o n l y a n a r r o w d a t a b a s e a t t h e s t a r t o f t h i s i n v e s t i g a t i o n , t h e r e w a s a m p l e e v i d e n c e o f a h e m o r r h a g i c d i a t h e s i s a s s o c i a t e d w i t h h e r e d i t a r y B a s s e t h o u n d t h r o m b o p a t h y . T h e h e r i t a b i l i t y , c l i n i c a l s i g n s , p r o l o n g e d b l e e d i n g t i m e s a n d p r e s e n c e o f a n a g g r e g a t i o n d e f e c t w i t h a b n o r m a l g r a n u l e r e l e a s e a n d n o r m a l f i b r i n o g e n b i n d i n g h a d a l l b e e n e s t a b l i s h e d p r i o r t o t h e o n s e t o f t h e s e s t u d i e s . S i n c e t h e r e w a s n o w s u b s t a n t i a l a n d c o n v i n c i n g e v i d e n c e f o r n o r m a l f i b r i n o g e n b i n d i n g b y a f f e c t e d p l a t e l e t s , f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n o f t h i s a r e a w a s u n l i k e l y t o i d e n t i f y t h e d e f e c t . I n t h e i n i t i a l i n v e s t i g a t i o n o f B a s s e t h o u n d h e r e d i t a r y t h r o m b o p a t h y , a d e n o s i n e d i p h o s p h a t e ( A D P ) w a s t h e o n l y a g o n i s t w h i c h h a d b e e n m e t h o d i c a l l y i n v e s t i g a t e d w i t h r e s p e c t t o a g g r e g a t i o n , d e n s e g r a n u l e r e l e a s e a n d f i b r i n o g e n b i n d i n g . C o m p a r i s o n o f t h e s e r e s u l t s w i t h t h o s e o f n o r m a l c a n i n e p l a t e l e t s d i d n o t r e v e a l a n o b v i o u s l o c a t i o n o f t h e d e f e c t i n a f f e c t e d p l a t e l e t s . T h e r e f o r e , i t w a s j u d g e d t h a t a b r o a d e r k n o w l e d g e o f t h e a g g r e g a t i o n a n d d e n s e g r a n u l e s e c r e t i o n p a t t e r n s o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d c a n i n e p l a t e l e t s c o u l d b e a n i m p o r t a n t i n i t i a l s t e p i n l o c a l i z i n g t h e a r e a o f i n v e s t i g a t i o n . T h u s , t h e f i r s t s t u d y i n v o l v e d a c o m p l e t e r e v i e w a n d e x t e n s i o n o f t h e a g g r e g a t i o n s t u d i e s t h a t h a d b e e n d o n e p r e v i o u s l y . 1 2 1 T h e c h o i c e o f a g o n i s t s f o r a l l t h e s t u d i e s w a s b a s e d p r i m a r i l y o n t h e a b i l i t y o f t h e v a r i o u s a g o n i s t s t o a c t i v a t e p l a t e l e t s a t d i f f e r e n t p o i n t s i n t h e p r o p o s e d p a t h w a y o f e v e n t s t h a t o c c u r s d u r i n g a c t i v a t i o n . T h e n o n - p h y s i o l o g i c a g o n i s t p h o r b o l m y r i s t a t e a c e t a t e d i r e c t l y a c t i v a t e s p r o t e i n k i n a s e C a n d t h e r e f o r e b y p a s s e s p h o s p h o l i p a s e C - d e p e n d e n t i n o s i t o l l i p i d h y d r o l y s i s . S i m i l a r l y , h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f t h e p h y s i o l o g i c a g o n i s t , t h r o m b i n , a r e a l s o p r o p o s e d t o b e a b l e t o a c t i v a t e p l a t e l e t s i n d e p e n d e n t l y o f i n o s i t o l l i p i d m e t a b o l i s m . I n c o n t r a s t , t h e w e a k a g o n i s t s A D P , l o w c o n c e n t r a t i o n s o f p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r ( P A F ) a n d t h r o m b i n r e q u i r e t h e r e l e a s e o f d e n s e g r a n u l e A T P a n d a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s f o r i r r e v e r s i b l e a g g r e g a t i o n t o o c c u r . T h e n o n - p h y s i o l o g i c a g o n i s t c a l c i u m i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 i s d e p e n d e n t u p o n t h e f o r m a t i o n o f a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s f o r a c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e C a n d i n o s i t o l l i p i d h y d r o l y s i s t o o c c u r . F a c t o r s s u c h a s a v a i l a b i l i t y a n d k n o w l e d g e o f t h e r e s p o n s e s o f c a n i n e p l a t e l e t s b a s e d o n r e p o r t s i n t h e l i t e r a t u r e a n d p r e l i m i n a r y s t u d i e s d o n e i n o u r l a b o r a t o r y w e r e a l s o t a k e n i n t o c o n s i d e r a t i o n i n t h e c h o i c e o f a g o n i s t s . T h e a r e a s o f i n v e s t i g a t i o n f o r t h e s e c o n d a n d t h i r d s t u d i e s w e r e c h o s e n b e c a u s e t h e y b o t h e x a m i n e t h e g e n e r a t i o n o f s e c o n d m e s s e n g e r s b y p l a t e l e t s i n r e s p o n s e t o a r a n g e o f a g o n i s t s . P h o s p h o r y l a t i o n o f p l a t e l e t p r o t e i n s i n r e s p o n s e t o p h y s i o l o g i c a g o n i s t s i s d e p e n d e n t u p o n t h e g e n e r a t i o n o f t h e s e c o n d m e s s e n g e r s 1 , 2 - d i a c y l g l y c e r o l a n d 1 , 4 , 5 - i n o s i t o l t r i s p h o s p h a t e . A l t h o u g h t h i s d o e s n o t d i r e c t l y m e a s u r e t h e p r o d u c t i o n o f t h e s e s e c o n d m e s s e n g e r s , p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 a n d 4 7 k D a p r o t e i n s i n r e s p o n s e t o p h y s i o l o g i c a g o n i s t s i n d i c a t e s t h a t t h e y 1 2 2 a r e b e i n g p r o d u c e d . I t w a s a n t i c i p a t e d t h a t t h e r e w o u l d b e a d e f e c t i n t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f o n e , o r b o t h , o f t h e s e p r o t e i n s i n a f f e c t e d p l a t e l e t s . T h e a g g r e g a t i o n o f a f f e c t e d p l a t e l e t s b y p h o r b o l e s t e r a n d h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n a n d f a i l u r e o f a g g r e g a t i o n i n r e s p o n s e t o A D P a n d P A P s u g g e s t e d t h a t t h e d e f e c t w a s l o c a t e d p r i o r t o a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C a n d p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 4 7 k D a p r o t e i n . B e c a u s e o f t h e n o r m a l s h a p e c h a n g e , o c c u r r e n c e o f g r a n u l e s e c r e t i o n a n d g e n e r a t i o n o f a c o n t r a c t i l e f o r c e , d e f e c t i v e p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 k D a m y o s i n l i g h t c h a i n w a s c o n s i d e r e d u n l i k e l y . T h e m e a s u r e m e n t o f t h r o m b o x a n e B 2 i s a d i r e c t i n d i c a t i o n o f t h e p r o d u c t i o n o f t h r o m b o x a n e A 2 ( T x A z ) b y p l a t e l e t s . T h r o m b o x a n e A 2 i s a n i m p o r t a n t s e c o n d m e s s e n g e r w h i c h i s e s s e n t i a l f o r i r r e v e r s i b l e a g g r e g a t i o n o f p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y w e a k , b u t p h y s i o l o g i c a l l y i m p o r t a n t , a g o n i s t s s u c h a s A D P a n d l o w e r c o n c e n t r a t i o n s o f P A F a n d t h r o m b i n . T h e c o m p l e t e f a i l u r e o f a g g r e g a t i o n i n r e s p o n s e t o t h e w e a k a g o n i s t A D P s u g g e s t e d t h a t T x A . 2 p r o d u c t i o n w o u l d n o t o c c u r , a s t h e p r o d u c t i o n o f T x A z i n r e s p o n s e t o w e a k a g o n i s t s i s d e p e n d e n t u p o n p r i m a r y a g g r e g a t i o n . H o w e v e r , t h e a b i l i t y o f a s p i r i n t o i n h i b i t t h e A D P - i n d u c e d s e c r e t i o n o f d e n s e g r a n u l e c o n t e n t s f r o m a f f e c t e d p l a t e l e t s i n d i c a t e d t h a t a f f e c t e d p l a t e l e t s w e r e a b l e t o p r o d u C e T x A z i n t h e a b s e n c e o f p r i m a r y a g g r e g a t i o n . I n c o n c l u S i o n , i t w a s h y p o t h e s i z e d t h a t a f f e c t e d p l a t e l e t s h a d a d e f e c t i n t h e g e n e r a t i o n o f s e c o n d m e s s e n g e r s a n d t r a n s d u c t i o n o f s i g n a l s f r o m t h e e x t e r i o r t o t h e i n t e r i o r o f t h e c e l l . B e c a u s e 1 2 3 a f f e c t e d p l a t e l e t s b o u n d f i b r i n o g e n i n t h e a b s e n c e o f a g g r e g a t i o n , i t w a s a s s u m e d t h a t t h e d e f e c t i n v o l v e s a p o s t - f i b r i n o g e n b i n d i n g p r o c e s s , b u t i t w a s n o t p o s s i b l e t o b e m o r e s p e c i f i c g i v e n t h e d a t a a v a i l a b l e a t t h e s t a r t o f t h e s t u d y . C H A P T E R I I I : P L A T E L E T A G G R E G A T I O N , D E N S E G R A N U L E S E C R E T I O N A N D T R A N S M I S S I O N E L E C T R O N M I C R O S C O P Y I N T R O D U C T I O N P l a t e l e t a g g r e g a t i o n i s a c r i t i c a l s t e p i n n o r m a l h e m o s t a s i s . D a m a g e t o t h e v a s c u l a r e n d o t h e l i u m a n d e x p o s u r e o f t h e s u b e n d o t h e l i u m m u s t l e a d r a p i d l y t o t h e f o r m a t i o n o f a h e m o s t a t i c p l a t e l e t p l u g a n d p r e v e n t i o n o f f u r t h e r b l o o d l o s s . T h i s p r o c e s s i n v o l v e s s e v e r a l d i s t i n c t s t e p s k n o w n a s t h e p l a t e l e t r e s p o n s e : t h e a d h e s i o n o f p l a t e l e t s t o s i t e s o f v a s c u l a r i n j u r y , s h a p e c h a n g e , a g g r e g a t i o n o f o t h e r p l a t e l e t s o n t h e a d h e r e n t l a y e r a n d s e c r e t i o n o f g r a n u l e c o n t e n t s a n d l i b e r a t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d w h i c h a i d s i n t h e r e c r u i t m e n t o f a d d i t i o n a l p l a t e l e t s . A c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m o n t h e s u r f a c e o f t h e p l a t e l e t s a n d t h e f o r m a t i o n o f a m e s h w o r k o f f i b r i n c o n s o l i d a t e s t h e p l a t e l e t p l u g a n d c o m p l e t e s t h e h e m o s t a t i c p r o c e s s 2 8 8 , 4 3 5 , 4 6 7 V o n W i l l e b r a n d f a c t o r i s e s s e n t i a l i n t h e a d h e s i o n o f p l a t e l e t s t o e x p o s e d s u b e n d o t h e l i u m . " 2 1 W h e n s u b e n d o t h e l i a l c o m p o n e n t s s u c h a s c o l l a g e n a n d h e p a r i n - l i k e g l y c o s a m i n o g l y c a n s a r e e x p o s e d i n v e s s e l i n j u r y , v o n W i l l e b r a n d f a c t o r b i n d s t o t h e s e c o m p o n e n t s a n d a t t h e s a m e t i m e b i n d s t o t h e g l y c o p r o t e i n I b ( G P I b ) o f t h e p l a t e l e t m e m b r a n e . T h i s r e s u l t s i n a m o n o l a y e r o f p l a t e l e t s c o v e r i n g t h e i n j u r e d a r e a . 1 2 4 1 2 5 T h e b i n d i n g o f v o n W i l l e b r a n d f a c t o r t o G P I b r e s u l t s i n p l a t e l e t a c t i v a t i o n a n d r e c r u i t m e n t o f f u r t h e r p l a t e l e t s t o t h e s i t e o f i n j u r y . W h e n p l a t e l e t s a r e s t i m u l a t e d , t h e y u n d e r g o a r a p i d c h a n g e i n s h a p e f r o m s m o o t h , d i s c o i d c e l l s t o s p h e r e s w i t h p s e u d o p o d s . “ S 7 T h i s r e s p o n s e i s v e r y r a p i d , r e q u i r e s m e t a b o l i c e n e r g y a n d i s i n d e p e n d e n t o f e x t e r n a l C a 2 + . S t i m u l a t i o n o f p l a t e l e t s a l s o l e a d s t o t h e i n d u c t i o n o f s p e c i f i c f i b r i n o g e n r e c e p t o r s o n t h e p l a t e l e t s u r f a c e . T h e f i b r i n o g e n r e c e p t o r i s t h e i n t e g r a l m e m b r a n e G P I I b - I I I a c o m p l e x w h i c h , i n a c t i v a t e d p l a t e l e t s , f o r m s a C a 2 + - d e p e n d e n t h e t e r o d i m e r c a p a b l e o f b i n d i n g f i b r i n o g e n . 1 5 ° ' 3 " " " ' 3 E 5 B i n d i n g o f f i b r i n o g e n t o p l a t e l e t s i s e s s e n t i a l f o r a g g r e g a t i o n a n d i s c l o s e l y c o r r e l a t e d t o p l a t e l e t a g g r e g a b i l i t y . 3 7 9 ' ” 1 F i b r i n o g e n h a s a d i m e r i c s t r u c t u r e a n d i s t h o u g h t t o f o r m b r i d g e s b e t w e e n r e c e p t o r s o n a d j a c e n t p l a t e l e t s . A l t h o u g h s h a p e c h a n g e a n d f i b r i n o g e n b i n d i n g b o t h o c c u r v e r y e a r l y i n p l a t e l e t a c t i v a t i o n , t h e y a r e i n d e p e n d e n t p r o c e s s e s . A g g r e g a t i o n o c c u r s w h e n s p h e r i c a l p l a t e l e t s w i t h e x p o s e d f i b r i n o g e n r e c e p t o r s a r e b r o u g h t i n t o c l o s e c o n t a c t i n t h e p r e s e n c e o f f i b r i n o g e n a n d C a 2 + a n d / o r M g ” . A d h e s i o n , s h a p e c h a n g e a n d b i n d i n g o f f i b r i n o g e n a r e a l l p o t e n t i a l l y r e v e r s i b l e p r o c e s s e s . H o w e v e r , i f t h e s t i m u l u s i s s u f f i c i e n t l y s t r o n g , t h e r e v e r s i b l e p r i m a r y a g g r e g a t i o n i s f o l l o w e d b y s e c o n d a r y i r r e v e r s i b l e a g g r e g a t i o n a n d t h e p l a t e l e t r e l e a s e r e s p o n s e . " " ° " " 5 7 T h e p l a t e l e t r e l e a s e r e s p o n s e e n c O m p a s s e s s e c r e t i o n o f g r a n u l e c o n t e n t s a n d t h e l i b e r a t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d . S e c r e t i o n o f a l p h a a n d d e n s e g r a n u l e c o n t e n t s m a y b e i n d u c e d b y a l l k n o w n p h y s i o l o g i c p l a t e l e t a g o n i s t s . L y s o s o m a l s e c r e t i o n o c c u r s o n l y i n r e s p o n s e t o a s t r o n g 1 2 6 a g o n i s t s u c h a s h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n . D e n s e g r a n u l e s c o n t a i n i o n s a n d l o w m o l e c u l a r w e i g h t c o m p o u n d s : C a ? + , i n o r g a n i c o r t h o p h o s p h a t e a n d p y r o p h o s p h a t e , a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e ( A T P ) , a d e n o s i n e d i p h o s p h a t e ( A D P ) , s e r o t o n i n a n d l o w c o n c e n t r a t i o n s o f c a t e c h o l a m i n e s . A l p h a g r a n u l e s c o n t a i n m a n y p r o t e i n s , i n c l u d i n g f i b r i n o g e n , v o n W i l l e b r a n d f a c t o r , t h r o m b o s p o n d i n , f i b r o n e c t i n , p l a t e l e t - d e r i v e d g r o w t h f a c t o r , B - t h r o m b o g l o b u l i n a n d p l a t e l e t f a c t o r 4 e 2 ° L “ 6 7 A r a c h i d o n i c a c i d m a y b e l i b e r a t e d f r o m m e m b r a n e p h o s p h o l i p i d s b y t h e h y d r o l y t i c a c t i o n o f p h o s p h o l i p a s e s a n d l i p a s e s , a n d t h e n o x y g e n a t e d b y t h e c y c l o o x y g e n a s e p a t h w a y t o e n d o p e r o x i d e s ( p r o s t a g l a n d i n G 2 , p r o s t a g l a n d i n H 2 ) a n d t h r o m b o x a n e A 2 . T h e s e a r a c h i d o n i c a c i d p r o d u c t s a r e p o t e n t p l a t e l e t s a g o n i s t s w h i c h , a l o n g w i t h d e n s e g r a n u l e A D P a n d s e r o t o n i n , a c t t o r e c r u i t f u r t h e r p l a t e l e t s i n t o t h e a g g r e g a t e . T h e f o r m a t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d m e t a b o l i t e s i s a l w a y s a s s o c i a t e d w i t h s e c r e t i o n o f d e n s e a n d a l p h a g r a n u l e c o n t e n t s . T h e s e c r e t i o n r e s p o n s e p r o v i d e s a l o c a l i z e d h i g h c o n c e n t r a t i o n o f a g o n i s t s , C a a ’ a n d a d h e s i v e p r o t e i n s o n t h e s u r f a c e o f t h e g r o w i n g h e m o s t a t i c p l a t e l e t p l u g . P l a t e l e t a g g r e g a t i o n i s g e n e r a l l y s t u d i e d i n g y i t z g u s i n g a n o p t i c a l a g g r e g o m e t e r i n w h i c h a g o n i s t s a r e a d d e d t o s t i r r e d p l a t e l e t s u s p e n s i o n s a n d t h e c h a n g e s i n l i g h t t r a n s m i s s i o n r e c o r d e d / ‘ 5 ’ 5 2 0 I n s u s p e n s i o n , t h e f i r s t r e s p o n s e o f p l a t e l e t s t o m o s t a g o n i s t s i s s h a p e c h a n g e . A s p l a t e l e t s c h a n g e f r o m d i s c o i d t o s p h e r o i d , t h e r e i s a s m a l l d e c r e a s e i n l i g h t t r a n s m i s s i o n t h r o u g h t h e s u s p e n s i o n . A l l p l a t e l e t a g o n i s t s , e x c e p t e p i n e p h r i n e a n d p h o r b o l e s t e r s , i n d u c e p l a t e l e t s h a p e 1 2 7 c h a n g e . P r i m a r y a g g r e g a t i o n i s r e v e r s i b l e a n d n o t a s s o c i a t e d w i t h s e c r e t i o n o f g r a n u l e c o n t e n t s o r a r a c h i d o n i c a c i d m e t a b o l i t e s . I f t h e a g o n i s t i s p r e s e n t i n h i g h e n o u g h c o n c e n t r a t i o n , p r i m a r y a g g r e g a t i o n w i l l b e f o l l o w e d b y s e c o n d a r y i r r e v e r s i b l e a g g r e g a t i b n w h i c h i s m a i n l y t h e r e s u l t o f t h e r e l e a s e r e a c t i o n . A s t h e p l a t e l e t s a g g r e g a t e , t h e r e i s a n i n c r e a s e i n l i g h t t r a n s m i s s i o n t h r o u g h t h e s u s p e n s i o n . O p t i c a l a g g r e g o m e t r y i s n o t a v e r y s e n s i t i v e m e a n s o f d e t e c t i n g t h e i n i t i a l p h a s e o f a g g r e g a t i o n . I t d o e s n o t d e t e c t a g g r e g a t e s o f l e s s t h a n a p p r o x i m a t e l y s e v e n p l a t e l e t s a n d t h e c h a n g e i n o p t i c a l d e n s i t y i s n o t d e t e c t a b l e u n t i l 8 0 % o f s i n g l e p l a t e l e t s h a v e a g g r e g a t e d . T h e i n i t i a l s t a g e s o f p l a t e l e t a g g r e g a t i o n a r e b e t t e r m e a s u r e d b y c o u n t i n g t h e d i s a p p e a r a n c e o f s i n g l e p l a t e l e t s . ‘ 8 ‘ A g o n i s t s a r e c l a s s i f i e d a s " w e a k " , " i n t e r m e d i a t e " o r " s t r o n g ” d e p e n d i n g o n t h e i r a b i l i t y t o i n d u c e t h e r e l e a s e r e s p o n s e a n d i r r e v e r s i b l e a g g r e g a t i o n . ° ° ' “ ° ' 5 3 1 W e a k a g o n i s t s ( A D P a n d e p i n e p h r i n e ) c a n n o t i n d u c e i r r e v e r s i b l e a g g r e g a t i o n i n t h e a b s e n c e o f t h e r e l e a s e r e s p o n s e o r c y c l o o x y g e n a s e a c t i v i t y . S e c r e t i o n i n r e s p o n s e t o t h e s e w e a k a g o n i s t s o c c u r s o n l y i n a s s o c i a t i o n w i t h a g g r e g a t i o n a n d i s a b o l i s h e d b y t r e a t m e n t w i t h a g e n t s w h i c h i n h i b i t c y c l o o x y g e n a s e . I n c o n t r a s t , s t r o n g a g o n i s t s ( h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n a n d c o l l a g e n ) c a n i n d u c e i r r e v e r s i b l e a g g r e g a t i o n i n t h e a b s e n c e o f t h e r e l e a s e r e s p o n s e a n d s e c r e t i o n i s n o t d e p e n d e n t o n a g g r e g a t i o n . A g o n i s t s w i t h i n t e r m e d i a t e p o t e n c y [ p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r ( P A F ) , v a s o p r e s s i n , p r o s t a g l a n d i n a n d e n d o p e r o x i d e a n a l o g u e s ] c a n i n d u c e s e c r e t i o n i n d e p e n d e n t l y o f p r i o r a g g r e g a t i o n a n d c y c l o o x y g e n a s e a c t i v i t y , b u t a g g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n a r e i n h i b i t e d i f A D P i s r e m o v e d 1 2 8 a n d c y c l o o x y g e n a s e i n h i b i t e d . L o w c o n c e n t r a t i o n s o f s t r o n g a n d i n t e r m e d i a t e a g o n i s t s a c t a s w e a k a g o n i s t s . 1 n _ x i § ; g , d e n s e g r a n u l e A T P o r s e r o t o n i n s e c r e t i o n c a n r e a d i l y b e m e a s u r e d . T h e m o s t c o m m o n l y u s e d a s s a y f o r d e t e c t i o n o f s e c r e t e d A T P 1 3 0 , 5 2 0 i s t h e f i r e f l y l u c i f e r i n - l u c i f e r a s e r e a c t i o n . T h e m e a s u r e m e n t o f t h e A T P c o n t e n t o f a s a m p l e d e p e n d s o n t h e r e a c t i o n : l u c i f e r i n + A T P + 0 2 “ “ 3 " " : ” ‘ 2 ; A M P + P P + C 0 2 + o x y l u c i f e r i n + l i g h t T h e l i g h t o u t p u t i s d i r e c t l y p r o p o r t i o n a l t o t h e A T P c o n c e n t r a t i o n a n d c a n b e d e t e c t e d b y a p h o t o m u l t i p l i e r t u b e t o g i v e a c o n t i n u o u s m e a s u r e m e n t o f A T P s e c r e t i o n o n a c h a r t r e c o r d e r . S e r o t o n i n s e c r e t i o n c a n b e m e a s u r e d d i s c o n t i n u o u s l y b y p r e l a b e l l i n g p l a t e l e t s w i t h r a d i o a c t i v e s e r o t o n i n a n d m e a s u r i n g t h e r a d i o a c t i v i t y i n t h e s u p e r n a t a n t a t t h e c o m p l e t i o n o f a g g r e g a t i o n . R e u p t a k e o f t h e s e c r e t e d s e r o t o n i n m u s t b e p r e v e n t e d b y t h e a d d i t i o n o f i m i p r a m i n e . T h e s u s p e n s i o n s m o s t c o m m o n l y u s e d t o s t u d y p l a t e l e t f u n c t i o n i n _ 1 1 £ ; g a r e p l a t e l e t r i c h p l a s m a , w a s h e d p l a t e l e t s a n d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s . B l o o d f o r t h e p r e p a r a t i o n o f p l a t e l e t r i c h p l a s m a i s u s u a l l y a n t i - c o a g u l a t e d w i t h t r i s o d i u m c i t r a t e t o r e d u c e t h e c o n c e n t r a t i o n o f C a a ’ s u f f i c i e n t l y t o p r e v e n t c o a g u l a t i o n w i t h o u t i n h i b i t i n g p l a t e l e t a g g r e g a t i o n . T h e a d v a n t a g e o f u s i n g p l a t e l e t r i c h p l a s m a i s t h a t i t r e q u i r e s m i n i m a l m a n i p u l a t i o n o f t h e p l a t e l e t s a n d s u p p l i e s t h e f i b r i n o g e n n e e d e d b y w e a k a g o n i s t s . H o w e v e r , t h e l o w c o n c e n t r a t i o n o f C a a ' d o e s c r e a t e a n o n - p h y s i o l o g i c a l s i t u a t i o n a n d 1 2 9 p o t e n t i a l a r t i f a c t s . F o r e x a m p l e , A D P - i n d u c e d s e c r e t i o n o n l y o c c u r s i n a l o w - C a 2 + m e d i u m , n o t a t p h y s i o l o g i c a l C a 2 + c o n c e n t r a t i o n s . “ 3 F o r s t u d i e s o f p l a t e l e t a c t i v a t i o n b y t h r o m b i n , i t i s e s s e n t i a l t o t r a n s f e r t h e p l a t e l e t s f r o m p l a s m a t o a b u f f e r e d b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n t o p r e v e n t t h e f o r m a t i o n o f a f i b r i n c l o t w h e n t h e t h r o m b i n i s a d d e d . P l a t e l e t s m a y b e w a s h e d , b u t t h i s i n v o l v e s m u l t i p l e c e n t r i f u g a t i o n s , a n d v e r y c a r e f u l h a n d l i n g i s r e q u i r e d t o m i n i m i z e a c t i v a t i o n a n d d a m a g e o f p l a t e l e t s . A n a l t e r n a t i v e i s t o g e l - f i l t e r t h e p l a t e l e t s o v e r a S e p h a r o s e c o l u m n . A m o r p h o l o g i c s t u d y i n w h i c h t r a n s m i s s i o n a n d s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y w e r e u s e d t o c o m p a r e t h e m e t h o d s c o n c l u d e d t h a t g e l - f i l t r a t i o n a p p e a r e d l e s s h a r m f u l t h a n w a s h i n g . 1 6 5 A l l m e t h o d s o f p l a t e l e t p r e p a r a t i o n f o r f u n c t i o n a l s t u d i e s r e q u i r e a r e s t p e r i o d a f t e r p r e p a r a t i o n t o a l l o w t h e p l a t e l e t s t o r e c o v e r . I n t h e i n v e s t i g a t i o n o f t h e p l a t e l e t d e f e c t i n B a s s e t h o u n d h e r e d i t a r y t h r o m b o p a t h y d e s c r i b e d i n t h e p r e c e d i n g c h a p t e r , A D P w a s t h e o n l y a g o n i s t u s e d t o s t i m u l a t e t h e p l a t e l e t s . A t t h e c o n c l u s i o n o f t h e s t u d y , t h e r e w a s n o c l e a r i n d i c a t i o n o f t h e l o c a t i o n o f t h e d e f e c t . T h e r e f o r e , i t w a s f e l t t h a t a b r o a d e r k n o w l e d g e o f t h e a g g r e g a t i o n a n d d e n s e g r a n u l e A T P s e c r e t i o n r e s p o n s e s o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d c a n i n e p l a t e l e t s m i g h t h e l p t o l o c a l i z e t h e a r e a t o b e i n v e s t i g a t e d . I n t h i s s t u d y , a r a n g e o f a g o n i s t s [ A D P , P A F , t h r o m b i n , c a l c i u m i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 , p h o r b o l m y r i s t a t e a c e t a t e ( P M A ) a n d d i t h i o t h r e i t o l ] w e r e u s e d t o i n v e s t i g a t e a g g r e g a t i o n a n d d e n s e g r a n u l e s e c r e t i o n o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s i n e i t h e r p l a t e l e t r i c h p l a s m a o r g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s . T h e e f f e c t o f i n h i b i t i o n o f c y c l o o x y g e n a s e b y a s p i r i n 1 3 0 ( a c e t y l s a l i c y l i c a c i d ) o n t h e r e s p o n s e s o f p l a t e l e t s t o t h e s e a g o n i s t s w a s i n v e s t i g a t e d i n b o t h g r o u p s . T h e a g g r e g a t i o n s t u d i e s w e r e c o u p l e d t o t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y f o r t h r o m b i n , P A F , P M A a n d A 2 3 1 8 7 . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S E x p e r i m e n t a l D e s i g n T h r e e c o n t r o l B a s s e t h o u n d s ( t w o f e m a l e s a n d o n e m a l e ) w e r e u s e d t o e s t a b l i s h d o s e - r e s p o n s e c u r v e s f o r c o n t r o l c a n i n e p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y t h e a b o v e a g o n i s t s . O f t h e a g o n i s t s l i s t e d a b o v e , A D P i s t h e o n l y a g o n i s t t h a t h a s b e e n c o m m o n l y u s e d t o s t i m u l a t e c a n i n e p l a t e l e t s . F o u r a f f e c t e d B a s s e t H o u n d s ( t h r e e f e m a l e a n d o n e m a l e ) w e r e u s e d t o i n v e s t i g a t e t h e r e s p o n s e s o f a f f e c t e d p l a t e l e t s . D u r i n g t h e s t u d y , t h e c o n t r o l m a l e B a s s e t h o u n d d i e d ( a c u t e d e a t h d u e t o a g a s t r i c t o r s i o n ) a n d w a s r e p l a c e d b y a n o t h e r c o n t r o l m a l e B a s s e t h o u n d o n l o a n o n a p a r t - t i m e b a s i s f r o m a b r e e d e r . L a t e r , a n o t h e r c o n t r o l f e m a l e B a s s e t h o u n d w a s o b t a i n e d a n d a d d e d t o t h i s s t u d y . A l l d o g s u s e d i n t h e s t u d y w e r e h o u s e d w i t h i n t h e V e t e r i n a r y C l i n i c a l C e n t e r a t M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y , f e d a r e g u l a r d i e t o f d r y k i b b l e a n d e x e r c i s e d r e g u l a r l y . O n c e d o s e - r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e p e r c e n t a g e m a x i m u m a g g r e g a t i o n a n d m a x i m u m s l o p e h a d b e e n e s t a b l i s h e d f o r e a c h a g o n i s t i n t h e c o n t r o l g r o u p , d e n s e g r a n u l e A T P s e c r e t i o n i n r e s p o n s e t o s e l e c t e d c o n c e n t r a t i o n s o f e a c h a g o n i s t w a s m e a s u r e d . F r o m t h e s e r e s u l t s , c o n c e n t r a t i o n s o f a g o n i s t s w e r e s e l e c t e d f o r t h e m e a s u r e m e n t o f a g g r e g a t i o n a n d d e n s e g r a n u l e A T P s e c r e t i o n i n t h e a f f e c t e d g r o u p . 1 3 1 R e a g e n t s S o d i u m s a l t s o f A D P a n d A T P w e r e p u r c h a s e d f r o m t h e S i g m a C h e m i c a l C o m p a n y , ( S t . L o u i s , M O ) a n d s t o c k s o l u t i o n s o f 2 . 6 m M a n d 1 . 0 m M r e s p e c t i v e l y i n 2 0 m M T r i s - s a l i n e f r o z e n a t - 2 0 ° C . D i t h i o t h r e i t o l w a s p u r c h a s e d f r o m B o e h r i n g e r M a n n h e i m B i o c h e m i c a l s ( I n d i a n a p o l i s , I N ) . P l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r w a s p u r c h a s e d f r o m C a l b i o c h e m B i o c h e m i c a l s ( S a n D i e g o , C A ) a n d a 1 . 0 m g / m l s t o c k s o l u t i o n i n e t h a n o l s t o r e d a t - Z O W C . T h e c a l c i u m i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 w a s p u r c h a s e d f r o m t h e S i g m a C h e m i c a l C o m p a n y a n d a 4 . 1 6 m M s t o c k s o l u t i o n i n e t h a n o l s t o r e d a t - 2 0 3 C . P h o r b o l - l Z - m y r i s t a t e - l 3 - a c e t a t e a n d 4 - a - p h o r b o l w e r e p u r c h a s e d f r o m t h e S i g m a C h e m i c a l C o m p a n y a n d C a l b i o c h e m B i o c h e m i c a l s a n d 1 . 5 6 m M s t o c k i n D M S O o r e t h a n o l s t o r e d a t - 2 0 ° C . A c e t y l s a l i c y l i c a c i d ( a s p i r i n ) w a s p u r c h a s e d f r o m t h e S i g m a C h e m i c a l C o m p a n y a n d f r e s h 1 . 0 M s t o c k s o l u t i o n i n e t h a n o l p r e p a r e d a t t h e t i m e o f u s e . T h r o m b i n a n d S e p h a r o s e 4 B w e r e p u r c h a s e d f r o m t h e S i g m a C h e m i c a l C o m p a n y . C h r o n o - L u m e N o . 3 9 5 l u c i f e r i n - l u c i f e r a s e r e a g e n t w a s p u r c h a s e d f r o m t h e C h r o n o - L o g C o r p o r a t i o n ( H a v e r t o w n , P A ) . A l l o t h e r c h e m i c a l s w e r e o f r e a g e n t g r a d e . S t o c k s o l u t i o n s w e r e d i l u t e d a s n e c e s s a r y a t t h e t i m e o f u s e a n d k e p t o n i c e . R e a g e n t s w e r e d i l u t e d t o t h e r e q u i r e d c o n c e n t r a t i o n w i t h e i t h e r 0 . 9 % w / v N a C l , ( A D P a n d d i t h i o t h r e i t o l ) , d i s t i l l e d w a t e r ( t h r o m b i n a n d C h r o n o - l u m e ) o r b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n ( P A F , A 2 3 1 8 7 , P M A a n d 4 - o c - p h o r b o l ) c o n t a i n i n g 1 3 6 m M N a C l , 5 . 4 m M K C l , 0 . 4 4 m M K H Z P O “ 0 . 3 4 m M N a Q H P O , a n d 5 . 6 m M g l u c o s e , p H 7 . 4 . C a l c i u m i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 w a s d i l u t e d a n d v o r t e x - m i x e d i m m e d i a t e l y p r i o r t o u s e . F i n a l 1 3 2 c o n c e n t r a t i o n s o f e t h a n o l o r D M S O d i d n o t e x c e e d 0 . 5 % v / v . B e c a u s e t h i s s t u d y w a s c o n d u c t e d o v e r a l o n g p e r i o d o f t i m e , m o r e t h a n o n e l o t n u m b e r o f e a c h r e a g e n t w a s u s e d , a d d i n g a n u n a v o i d a b l e s o u r c e o f v a r i a t i o n . P l a t e l e t I s o l a t i o n I f u n a c c e p t a b l e v a r i a b i l i t y i n r e s u l t s i s t o b e a v o i d e d , c a n i n e p l a t e l e t s m u s t b e c o l l e c t e d w i t h g r e a t c a r e f r o m l a r g e v e s s e l s i n d o g s t h a t a r e n o t e x c i t e d , m e d i c a t e d o r i l l . 2 9 E v e n u n d e r o p t i m a l c o n d i t i o n s , t h e r e i s c o n s i d e r a b l e v a r i a t i o n i n t h e r e s p o n s e s o f a n i n d i v i d u a l a n i m a l o v e r a p e r i o d o f t i m e . F o r t h e p r e p a r a t i o n o f p l a t e l e t r i c h p l a s m a , b l o o d w a s c o l l e c t e d f r o m t h e j u g u l a r v e i n t h r o u g h a n 1 8 - g a u g e n e e d l e i n t o a p l a s t i c s y r i n g e c o n t a i n i n g 1 . 0 m l o f 3 . 2 % w / v N a g c i t r a t e f o r e a c h 9 . 0 m l s o f b l o o d t o b e c o l l e c t e d . I f t h e c o l l e c t i o n w a s i n t e r r u p t e d i n a n y w a y , t h e s a m p l e w a s d i s c a r d e d a n d a s e c o n d c o l l e c t i o n m a d e . P o l y e t h y l e n e o r p o l y p r o p y l e n e l a b w a r e w a s u s e d i n a l l p l a t e l e t i s o l a t i o n p r o c e d u r e s . T h e b l o o d w a s t r a n s f e r r e d t o t u b e s a n d t h e p l a t e l e t r i c h p l a s m a s e p a r a t e d b y r e p e a t e d c e n t r i f u g a t i o n s a t 1 , 3 2 4 x g f o r 9 0 s e c o n d s w i t h r e m o v a l o f a s m a l l v o l u m e o f p l a t e l e t r i c h p l a s m a a f t e r e a c h c e n t r i f u g a t i o n . D u r i n g t h e p e r i o d o f t h i s s t u d y , i t w a s o b s e r v e d t h a t a f f e c t e d p l a t e l e t s s e d i m e n t m o r e r a p i d l y d u r i n g c e n t r i f u g a t i o n t h a n c o n t r o l p l a t e l e t s a n d a n i m p r o v e d y i e l d o f a f f e c t e d p l a t e l e t s c o u l d b e o b t a i n e d b y c e n t r i f u g i n g f o r 6 0 s e c o n d p e r i o d s r a t h e r t h a n 9 0 s e c o n d s . A f t e r r e m o v a l o f t h e p l a t e l e t r i c h p l a s m a , t h e b l o o d w a s c e n t r i f u g e d a t 1 3 3 1 , 3 2 4 x g f o r 1 3 m i n u t e s t o p r e p a r e p l a t e l e t p o o r p l a s m a . T h e p l a t e l e t s i n t h e p l a t e l e t r i c h p l a s m a w e r e c o u n t e d m a n u a l l y u s i n g a U n o p e t t e a n d N e u b a u e r h e m o c y t o m e t e r . T h e a u t o l o g o u s p l a t e l e t p o o r p l a s m a w a s u s e d t o a d j u s t t h e p l a t e l e t c o u n t o f t h e p l a t e l e t r i c h p l a s m a t o 3 . 0 x 1 0 8 / m l . T h e p l a t e l e t r i c h p l a s m a w a s a l i q u o t e d i n t o a g g r e g o m e t e r c u v e t t e s , c o v e r e d w i t h p a r a f i l m a n d a l l o w e d t o r e s t a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r a t l e a s t 3 0 m i n u t e s b e f o r e a g g r e g a t i o n . W h e n p l a t e l e t s w e r e t o b e i n c u b a t e d w i t h a s p i r i n t o i n h i b i t c y c l o o x y g e n a s e , i t w a s a d d e d t o t h e p l a t e l e t r i c h p l a s m a a t a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 1 . 0 m M b e f o r e t h e p l a t e l e t r i c h p l a s m a w a s a l i q u o t e d a n d a l l o w e d t o r e s t . F o r t h e p r e p a r a t i o n o f g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s , b l o o d w a s c o l l e c t e d i n t o 3 . 8 % w / v N a g c i t r a t e a n d t h e p l a t e l e t r i c h p l a s m a s e p a r a t e d b y c e n t r i f u g a t i o n , a s d e s c r i b e d a b o v e . P r o s t a g l a n d i n E 1 * w a s a d d e d f r o m f r e s h 1 . 0 m M s t o c k i n e t h a n o l t o a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 1 . 0 “ M t o m i n i m i z e p l a t e l e t a c t i v a t i o n d u r i n g t h e s u b s e q u e n t c e n t r i f u g a t i o n a n d g e l - f i l t r a t i o n . A f t e r a 1 0 m i n u t e i n c u b a t i o n a t r o o m t e m p e r a t u r e , t h e p l a t e l e t r i c h p l a s m a w a s c e n t r i f u g e d a t 8 0 0 x g f o r 1 5 m i n u t e s , t h e s u p e r n a t a n t d i s c a r d e d a n d t h e p l a t e l e t p e l l e t g e n t l y r e s u s p e n d e d i n 1 . 0 m 1 o f H E P E S - T y r o d e ' s - a l b u m i n b u f f e r ( H T A ) c o n t a i n i n g 1 3 0 m M N a C l , 2 . 6 m M K C l , 0 . 4 2 m M N a H z P O h 5 . 5 m M d e x t r o s e , 0 . 0 1 m M H E P E S a n d 3 . 0 m g / m l b o v i n e s e r u m a l b u m i n , p H 7 . 2 . 1 7 9 T h e p l a t e l e t s u s p e n s i o n w a s a p p l i e d t o a p o l y e t h y l e n e c o l u m n ( 1 0 m l b e d v o l u m e ) f i l l e d w i t h S e p h a r o s e 4 B a n d e q u i l i b r a t e d w i t h H T A a t r o o m t e m p e r a t u r e . P l a t e l e t s c a m e t h r o u g h i n t h e v o i d v o l u m e a n d w e r e d e t e c t e d v i s u a l l y . T w o t o t h r e e m i l l i l i t e r s o f g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s w e r e c o l l e c t e d a n d t h e 1 3 4 p l a t e l e t c o u n t a d j u s t e d t o 3 . 0 x 1 0 8 c e l l s / m 1 w i t h H T A . C a C l z a n d M g C l z ' w e r e a d d e d t o f i n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 1 . 0 m M a n d 0 . 8 m M r e s p e c t i v e l y . T h e M g C l z ' w a s o m i t t e d w h e n t h e p l a t e l e t s w e r e t o b e u s e d f o r A T P s e c r e t i o n s t u d i e s a s t h e C h r o n o - L u m e r e a g e n t c o n t a i n s 1 0 m M M g S O , . T h e g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s w e r e t r a n s f e r r e d t o a g g r e g a t i o n c u v e t t e s , c o v e r e d w i t h p a r a f i l m a n d a l l o w e d t o r e s t f o r 3 0 m i n u t e s . A s p i r i n - t r e a t e d p l a t e l e t s w e r e p r e p a r e d a s d e s c r i b e d f o r p l a t e l e t r i c h p l a s m a . P l a t e l e t A g g r e g a t i o n S t u d i e s T h e a g g r e g a t i o n s t u d i e s w e r e p e r f o r m e d i n a L u m i - a g g r e g o m e t e r ( C h r o n o - l o g C o r p o r a t i o n , H a v e r t o w n , P A . ) a t 3 7 . 5 ° C w i t h i n f o u r h o u r s o f c o l l e c t i o n . A g g r e g a t i o n c u v e t t e s c o n t a i n i n g 0 . 5 m 1 o f p l a t e l e t r i c h p l a s m a o r g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s w e r e a l l o w e d t o e q u i l i b r a t e f o r a t l e a s t f o u r m i n u t e s a t 3 7 . 5 ° C b e f o r e b e i n g p l a c e d i n t h e a g g r e g o m e t e r . A f t e r b e i n g s t i r r e d a t 9 0 0 r p m f o r a p p r o x i m a t e l y 0 . 5 m i n u t e s , 2 0 p l o f a g o n i s t w a s a d d e d . R e s u l t s w e r e r e c o r d e d o n a d u a l - p e n H o u s t o n O m n i s c r i b e C h a r t r e c o r d e r ( H o u s t o n I n s t r u m e n t D i v i s i o n o f B a u s c h a n d L o m b e I n c . , A u s t i n , T X . ) . Z e r o a g g r e g a t i o n w a s d e f i n e d a s a f a i l u r e t o r e c o r d a n i n c r e a s e i n l i g h t t r a n s m i s s i o n a b o v e t h e z e r o b a s e l i n e w h e n t h e s a m p l e w a s a l l o w e d t o s t i r i n t h e a g g r e g o m e t e r f o r f i v e m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f a g o n i s t . U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , t h e s l o p e o r r a t e o f a g g r e g a t i o n w a s a l s o d e f i n e d a s z e r o . T h e t i m e t o m a x i m u m a g g r e g a t i o n u n d e r t h e s e c i r c u m s t a n c e s w a s d e s i g n a t e d N A ( ” n o t a p p l i c a b l e " ) , a s a t i m e c o u l d n o t b e a s s i g n e d t o a n e v e n t w h i c h d i d n o t o c c u r . A g g r e g a t i o n r e s u l t s r e c o r d e d i n t h e p r e s e n c e o f t h e C h r o n o - L u m e 1 3 5 r e a g e n t w e r e n o t i n c l u d e d i n t h i s s t u d y b e c a u s e o f t h e p o t e n t i a t i n g e f f e c t o f C h r o n o - L u m e o n p l a t e l e t a g g r e g a t i o n . “ “ T h i s p o t e n t i a t i o n w a s f r e q u e n t l y o b s e r v e d , p a r t i c u l a r l y a t l o w c o n c e n t r a t i o n s o f a g o n i s t . A T P S e c r e t i o n S t u d i e s S t o r a g e p o o l a d e n i n e n u c l e o t i d e s e c r e t i o n w a s m o n i t o r e d i n t h e L u m i - a g g r e g o m e t e r w h i c h s i m u l t a n e o u s l y m e a s u r e s p l a t e l e t a g g r e g a t i o n a n d A T P s e c r e t i o n a s d e t e c t e d b y t h e f i r e f l y - l u c i f e r a s e s y s t e m . A g g r e g o m e t e r c u v e t t e s c o n t a i n i n g 0 . 4 5 m l o f p l a t e l e t r i c h p l a s m a o r g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s w e r e a l l o w e d t o e q u i l i b r a t e a t 3 7 . 5 ° C f o r a t l e a s t f o u r m i n u t e s . T h e C h r o n o - L u m e l u c i f e r i n - l u c i f e r a s e r e a g e n t ( 5 0 p 1 ) w a s a d d e d i m m e d i a t e l y p r i o r t o t h e a d d i t i o n o f 2 0 p 1 o f a g o n i s t t o m i n i m i z e t h e p o t e n t i a t i n g e f f e c t o f t h e C h r o n o - L u m e o n p l a t e l e t a g g r e g a t i o n . m " I m m e d i a t e l y a f t e r t h e A T P s e c r e t i o n t r a c i n g o n t h e r e c o r d e r h a d p e a k e d , a s t a n d a r d s o l u t i o n o f A T P , f i n a l c o n c e n t r a t i o n 2 . 0 “ M o r 4 . 0 “ M w a s a d d e d t o q u a n t i t a t e t h e A T P s e c r e t i o n . I f n o m e a s u r a b l e s e c r e t i o n h a d o c c u r r e d w i t h i n f i v e m i n u t e s o f t h e a d d i t i o n o f a g o n i s t , s e c r e t i o n w a s d e f i n e d a s z e r o . T h e t i m e t o m a x i m u m s e c r e t i o n u n d e r t h e s e c i r c u m s t a n c e s w a s d e s i g n a t e d N A ( " n o t a p p l i c a b l e " ) a s a t i m e c o u l d n o t b e a s s i g n e d t o a n e v e n t w h i c h d i d n o t o c c u r . T h e e x c e p t i o n t o t h i s r u l e w a s s e c r e t i o n i n r e s p o n s e t o P M A w h i c h i s v e r y s l o w a n d d o e s n o t o c c u r u n t i l a g g r e g a t i o n i s a l m o s t c o m p l e t e . 1 3 6 T r a n s m i s s i o n E l e c t r o n m i c r o s c o p y P l a t e l e t r i c h p l a s m a o r g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s w e r e p r e p a r e d f o r a g g r e g a t i o n , a s d e s c r i b e d a b o v e . B e f o r e , o r a t v a r i o u s t i m e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f a g o n i s t , 0 . 5 m l o f 0 . 1 % g l u t a r a l d e h y d e i n 0 . 1 M s o d i u m c a c o d y l a t e b u f f e r , p H 7 . 4 w a s a d d e d a n d t h e s a m p l e a l l o w e d t o s t i r f o r o n e m i n u t e . T h e s a m p l e s w e r e t h e n c e n t r i f u g e d a t 1 2 , 8 0 0 x g f o r 2 0 s e c o n d s , t h e s u p e r n a t a n t d i s c a r d e d a n d 1 . 0 m 1 o f 3 . 0 % g l u t a r a l d e h y d e i n 0 . 1 M s o d i u m c a c o d y l a t e , p H 7 . 4 a d d e d . T h e s p e c i m e n s w e r e a l l o w e d t o f i x f o r t h r e e t o s i x h o u r s a n d t h e n t h e g l u t a r a l d e h y d e w a s r e p l a c e d b y 0 . 1 M s o d i u m c a c o d y l a t e , p H 7 . 4 a n d t h e s a m p l e p r o c e s s e d f o r e l e c t r o n m i c r o s c o p y a s d e s c r i b e d b y M a t t s o n e t . a l . 3 1 1 3 S t a t i s t i c a l A n a l y s i s r A l l r e s u l t s w e r e e n t e r e d i n t o a s t a t i s t i c s a n d g r a p h i c s p r o g r a m ( S t a t g r a p h i c s , S T S C , R o c k v i l l e , M D ) . B e c a u s e t h e r e h a d n o t b e e n e q u a l a c c e s s t o a l l d o g s , p a r t i c u l a r l y i n t h e c o n t r o l g r o u p , t h e n u m b e r o f r e p e t i t i o n s f o r e a c h d o g w a s n o t e q u a l . T o a v o i d u n n e c e s s a r y b i a s t o w a r d s t h e r e s u l t s o f i n d i v i d u a l d o g s w h i c h h a d b e e n a v a i l a b l e m o r e f r e q u e n t l y , t h e a v e r a g e f o r e a c h d o g w a s c a l c u l a t e d a n d t h e n u s e d a s t h e r e p r e s e n t a t i v e v a l u e f o r t h a t a n i m a l . A l t h o u g h i t w o u l d h a v e b e e n d e s i r a b l e t o u s e d i s t r i b u t i o n - f r e e n o n - p a r a m e t r i c t e s t s , i t w a s f o u n d t h a t t h e s e w e r e n o t e f f e c t i v e f o r t h e v e r y s m a l l s a m p l e s i z e s i n v o l v e d . T h e r e f o r e , s t a n d a r d p a r a m e t r i c t e s t s f o r t h e c o m p a r i s o n o f t w o s a m p l e s w e r e u s e d . C o n t r o l a n d a f f e c t e d d a t a w e r e c o m p a r e d u s i n g t h e t - t e s t f o r i n d e p e n d e n t s a m p l e s a n d p r e - a n d p o s t - a s p i r i n s a m p l e s w e r e c o m p a r e d 1 3 7 u s i n g t h e t - t e s t f o r p a i r e d s a m p l e s . T h e a r c s i n t r a n s f o r m a t i o n w a s a p p l i e d t o t h e p e r c e n t a g g r e g a t i o n d a t a b e f o r e a n a l y s i s . A l t h o u g h d a t a f o r t h e m e a s u r e m e n t o f s l o p e i s n o t u s u a l l y n o r m a l l y d i s t r i b u t e d , t h e r e i s n o t r a n s f o r m a t i o n a v a i l a b l e . T h e u s e o f p a r a m e t r i c t e s t s o n t h e s e v e r y s m a l l s a m p l e s i z e s p r o d u c e s a v e r y c o n s e r v a t i v e a n a l y s i s . S a m p l e s f r o m t h e a f f e c t e d g r o u p w h i c h h a d a v e r a g e a n d s t a n d a r d d e v i a t i o n v a l u e s o f z e r o v i o l a t e t h e r e q u i r e m e n t o f p a r a m e t r i c t e s t s f o r e q u a l v a r i a n c e s . T h e r e f o r e , s o m e c a u t i o n s h o u l d b e e x e r c i s e d i n t h e i n t e r p r e t a t i o n o f t h e s t a t i s t i c a l a n a l y s i s o f t h e r e s u l t s a n d e x a m i n a t i o n o f t h e d a t a i t s e l f m a y b e o f m o r e u s e . R E S U L T S R e s u l t s f o r e a c h a g o n i s t a r e p r e s e n t e d s e p a r a t e l y . A l l a g o n i s t c o n c e n t r a t i o n s a r e t h e f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f a g o n i s t i n t h e p l a t e l e t r i c h p l a s m a o r g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s . T h e p e r c e n t a g g r e g a t i o n i s t h e p e r c e n t i n c r e a s e i n l i g h t t r a n s m i s s i o n t h r o u g h t h e s t i r r e d p l a t e l e t s i n t h e a g g r e g o m e t e r c u v e t t e t h a t o c c u r s d u r i n g p l a t e l e t a g g r e g a t i o n , w i t h t h e m a x i m u m b e i n g 1 0 0 % . T h e m a x i m u m s l o p e o f t h e a g g r e g a t i o n c u r v e i s a n i n d i c a t i o n o f t h e r a t e o f a g g r e g a t i o n . W h e r e a p p r o p r i a t e , t h e t i m e t a k e n t o r e a c h m a x i m u m a g g r e g a t i o n i s p r e s e n t e d . D e n s e g r a n u l e s e c r e t i o n i s d e s c r i b e d b y t h e a m o u n t o f A T P i n p M m e a s u r e d a t t h e p e a k o f t h e s e c r e t i o n c u r v e a n d t h e t i m e i n m i n u t e s t a k e n t o r e a c h t h a t p e a k . 1 3 8 A d e n o s i n e D i p h o s p h a t e P l a t e l e t r i c h p l a s m a w a s u s e d f o r a l l a g g r e g a t i o n a n d A T P s e c r e t i o n s t u d i e s i n r e s p o n s e t o A D P . A l l c o n c e n t r a t i o n s o f A D P u s e d c a u s e d r a p i d s h a p e c h a n g e , s e e n a s a n i n i t i a l d e c r e a s e i n l i g h t t r a n s m i s s i o n o n t h e a g g r e g a t i o n c u r v e , o f b o t h c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s . H o w e v e r , i n a f f e c t e d p l a t e l e t s , t h e r e w a s c o m p l e t e f a i l u r e o f p r i m a r y a g g r e g a t i o n i n r e s p o n s e t o a n y c o n c e n t r a t i o n o f A D P u s e d . T h e d o s e r e s p o n s e c u r v e s f o r a g g r e g a t i o n a n d s l o p e a r e i l l u s t r a t e d i n F i g u r e s 3 a n d 4 r e s p e c t i v e l y . W h i l e l o w c o n c e n t r a t i o n s o f A D P s u c h a s 2 . 0 u M i n d u c e d a r a n g e o f r e s p o n s e s f r o m r e v e r s i b l e p r i m a r y t o i r r e v e r s i b l e s e c o n d a r y a g g r e g a t i o n o f c o n t r o l p l a t e l e t s , c o n c e n t r a t i o n s o f 4 . 0 “ M o r h i g h e r i n d u c e d i r r e v e r s i b l e a g g r e g a t i o n i n f o u r o f t h e f i v e c o n t r o l d o g s . T h e r e s p o n s e o f t h e f i f t h c o n t r o l d o g t o 4 . 0 u M A D P v a r i e d f r o m i r r e v e r s i b l e t o r e v e r s i b l e a g g r e g a t i o n . T y p i c a l a g g r e g a t i o n c u r v e s f o r c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 1 0 p M A D P a r e i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 5 . 1 3 9 F i g u r e 3 . D o s e r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e m a x i m u m p e r c e n t a g g r e g a t i o n o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y A D P . F i g u r e 4 . D o s e r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e m a x i m u m s l o p e o f t h e a g g r e g a t i o n c u r v e s o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y A D P . I I T T T T I I I T I I T W [ I n o i t T a g e I I I I r I I i u u l u u l n u l n u l [ u g I g A 2 m u m i x I I I T I I I T I U T l l a l M l l I I I I I ' I I T T I ] I I I T I O I I I ‘ I I I Q I I I I l T I l u ! l l I n i l n u l u u l n u l i u i l u u l u u j n e n p o \ U I I l I ~ S m u m i I I O I I I M I I I x I $ a M ] l l l l T T T I r I l l l l i fi I l n i l l n n l n n l n n l n I I I I I I I J 1 0 6 9 0 e a 7 9 6 O 5 9 4 a 3 9 2 0 1 0 O i l 1 4 0 I I I ! U I r T I [ I U I T T ] T T T r t T I r U r fi r r r T — I F I T T I T T ‘ I I T T I I I I I ] ~ r - C o n t r o l A ' 4 ~ A f t e c t e d I J A B I L L I I R L R L L I l l J L l l l l l L l l l l J l l L J J J l l l l l l l l L l l l l l L l a 1 2 3 4 5 6 7 ' 3 9 1 0 A D P ( u M ) I I ' I T T U T I F I I I U U I F T U ' [ I U T I I r V U I r U — I e r I I I I ] I T U U ‘ I r I U T # a fi A fi “ - * - C o n t r o l ° * - A f f e c t e d I l l l l l l l l l l l L I A I A I I I I L L L I J L I A L L J I J I R I l l l l l l l l l l l e l O l 2 3 4 5 6 7 8 9 1 8 A D P ( u M ) n o i s s i m s n a r T t h g i L % 1 4 1 1 0 0 ' 1 - C o n t r o l A f f e c t e d 1 m i n F i g u r e 5 . T y p i c a l a g g r e g a t i o n c u r v e s f o r c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 0 u M A D P . S e c r e t i o n o f d e n s e g r a n u l e A T P b y c o n t r o l c a n i n e p l a t e l e t s h a d a t y p i c a l p a t t e r n w h i c h r e a c h e d a p e a k a n a v e r a g e o f 2 . 2 m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 0 p M A D P . I n c o n t r a s t , t h e a f f e c t e d p l a t e l e t s h a d a r a p i d b u r s t o f A T P s e c r e t i o n w h i c h p e a k e d a n a v e r a g e o f 0 . 4 m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 0 p M A D P . C o n t r o l p l a t e l e t s s e c r e t e d s i g n i f i c a n t l y m o r e A T P t h a n a f f e c t e d p l a t e l e t s . S e c r e t i o n o f A T P b y a f f e c t e d p l a t e l e t s o c c u r r e d i n t h e c o m p l e t e a b s e n c e o f a g g r e g a t i o n . 1 4 2 C o n t r o l p l a t e l e t s i n c u b a t e d w i t h 1 . 0 m M a s p i r i n s h o w e d a s i g n i f i c a n t r e d u c t i o n i n t h e e x t e n t a n d r a t e o f a g g r e g a t i o n w h e n s t i m u l a t e d b y 1 0 p M A D P . A f f e c t e d p l a t e l e t s d i d n o t a g g r e g a t e i n r e s p o n s e t o 1 0 p M A D P i n t h e a b s e n c e o r p r e s e n c e o f a s p i r i n . D e n s e g r a n u l e A T P s e c r e t i o n f r o m b o t h c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s w a s a l m o s t c o m p l e t e l y i n h i b i t e d b y a s p i r i n . A s u m m a r y o f t h e a g g r e g a t i o n a n d A T P s e c r e t i o n r e s u l t s i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f a s p i r i n a r e p r e s e n t e d i n T a b l e l . T a b l e 1 . M a x i m u m a g g r e g a t i o n ( % ) , s l o p e , A T P s e c r e t i o n ( p M ) a n d t i m e t o m a x i m u m A T P s e c r e t i o n ( m i n u t e s ) o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 0 p M A D P i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f 1 . 0 m M a s p i r i n . 1 . 0 m M A s p i r i n C o n t r o l A f f e c t e d A g g r e g a t i o n - 8 0 . 3 i 4 . 7 ( 5 ) 0 ( 4 ) * + 3 4 8 i 1 2 7 ( 4 ) ’ 0 ( 4 y S l o p e - 6 . 8 i 1 . 5 ( 5 0 ( 4 ) * + 4 . 8 i 0 . 9 ( 1 0 * o ( 4 ) * A T P p M - 3 5 _ 0 . 7 ( 5 ) 2 . 1 i 0 . 5 ( 4 ) * + 0 4 0 . t 0 . 0 7 m y 0 . 3 6 i 0 . 0 5 ( 1 0 ' T i m e t o M a x ? S e c r e t i o n - 2 2 i 0 4 ( 5 ) 0 . 4 1 i 0 . 0 3 ( 4 ) * + 0 . 1 0 + 0 ( 4 V 0 . 1 1 i 0 . 0 1 ( 4 ) ' V a l u e s - m e a n i S D , ( n ) - n u m b e r o f s a m p l e s , * - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l p l a t e l e t s ( p < 0 . 0 5 ) , # - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m n o n - a s p i r i n - t r e a t e d p l a t e l e t s ( p < 0 . 0 5 ) . 1 4 3 P l a t e l e t A c t i v a t i n g F a c t o r C o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s i n p l a t e l e t r i c h p l a s m a r a p i d l y c h a n g e d s h a p e i n r e s p o n s e t o a l l c o n c e n t r a t i o n s o f P A F u s e d . A l l c o n t r o l p l a t e l e t s a g g r e g a t e d i r r e v e r s i b l y t o c o n c e n t r a t i o n s o f 0 . 5 p M o r h i g h e r , a l t h o u g h a b i p h a s i c r e s p o n s e w a s f r e q u e n t l y s e e n a t t h e l o w e r c o n c e n t r a t i o n s . T h e r e s p o n s e s o f c o n t r o l p l a t e l e t s t o c o n c e n t r a t i o n s o f P A F l e s s t h a n 0 . 5 p M v a r i e d c o n s i d e r a b l y b e t w e e n i n d i v i d u a l s a n d r a n g e d f r o m i r r e v e r s i b l e t o r e v e r s i b l e a g g r e g a t i o n . A l t h o u g h a f f e c t e d p l a t e l e t s d i d n o t a g g r e g a t e i n r e s p o n s e t o l e v e l s o f P A F t h a t c a u s e d r a p i d a n d i r r e v e r s i b l e a g g r e g a t i o n o f c o n t r o l p l a t e l e t s , a t v e r y h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f P A F ( 5 . 0 a n d 1 0 u M ) t h e r e w a s a n i n c o n s i s t e n t , m o d e r a t e i n c r e a s e i n l i g h t t r a n s m i s s i o n r e c o r d e d . W h e n t h e c u v e t t e w a s r e m o v e d f r o m t h e a g g r e g o m e t e r , i t w a s s e e n t o c o n t a i n a f i n e , b u t v i s i b l e , s u s p e n s i o n . T h e d o s e r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e a g g r e g a t i o n a n d s l o p e o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e s 6 a n d 7 . T y p i c a l a g g r e g a t i o n c u r v e s a r e i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 8 . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b t a i n e d f o r g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y P A F . 1 4 4 F i g u r e 6 . D o s e r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e m a x i m u m p e r c e n t a g g r e g a t i o n o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y P A F . F i g u r e 7 . D o s e r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e m a x i m u m s l o p e o f t h e a g g r e g a t i o n c u r v e s o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y P A F . W I I I ‘ I T T I I I I n I o i t a g e I I l l I l I r r I g g A 2 l l l I T l I I m I u m i I I I I x T a M e p o l S m u m i x a M T I I I I I T I I I I I I I - — - - — - r P — p F h h - - t ' _ - I I I I I I J L t - ‘ t i _ r r — - — — l L ‘ I 1 o o - I ! 0 } " I . l . l 8 1 I . l n u l u u l u L L J n I I I I I I I I I I L I I I u j l n u l n n l n n l a - e 1 e . J I - _ - - - 1 1 - l 7 P — i i — - - I . I ] I I I I . I . . . . I . I I l - “ + I - - C A n f t e r c o t l e d o f " I I f ] I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 1 i j I I F ! I 1 . . . fi . l . l . . . l . . . 1 . . . . . . L . . L . . . I 2 . l . 3 . . . . l I l ' 4 ' P l . . 1 ‘ 5 A F ( u 1 M ) . j M l 6 u - u ' — - " J 8 " " " " " L . l I ' 9 " 1 ' 0 0 - - ‘ ] l I I 8 1 " " " ‘ l l I . . . . . I l " ! 7 w e 9 0 s o 7 0 6 8 5 0 4 0 s o 2 0 1 8 1 2 r - 1 8 1 4 5 I I I T I ' I I I I ‘ I I I I I I I I I I I I I I I I ’ T I I I I I I I I I I I T I I I I I I I I I I I - * - C o n t r o l _ v ° ~ ° A f f e c t e d l l l J L l I A I A J L A R L I I R L L L L A R I l l l l l l l + l l l l l L J l l l e l l l l l l l 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 8 P A F ( u N ) n o i s s i m s n a r T t h g i L % 1 4 6 1 0 0 - T C o n t r o l A f f e c t e d t - — - 4 T 1 m i n F i g u r e 8 . T y p i c a l a g g r e g a t i o n c u r v e s f o r c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 . 0 p M P A F . B o t h c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s s e c r e t e d A T P i n r e s p o n s e t o c o n c e n t r a t i o n s o f P A F o f 0 . 5 p M o r h i g h e r . A t 0 . 1 p M , p l a t e l e t s f r o m t h r e e o f f o u r c o n t r o l d o g s a g g r e g a t e d a n d s e c r e t e d A T P , w h i l e o n e d i d n o t a g g r e g a t e a n d d i d n o t s e c r e t e A T P . P l a t e l e t s f r o m a l l f o u r a f f e c t e d d o g s d i d n o t s e c r e t e a n y A T P i n r e s p o n s e t o 0 . 1 p M P A F . T h e s e r e s u l t s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 2 . 1 4 7 T a b l e 2 . D e n s e g r a n u l e A T P s e c r e t i o n ( p M ) a n d t i m e t o p e a k s e c r e t i o n ( m i n u t e s ) o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y P A F . P A F A T P ( p H ) S e c r e t e d T i m e t o M a x ? S e c r e t i o n ( p M ) C o n t r o l A f f e c t e d C o n t r o l A f f e c t e d 0 . 1 2 . 6 i 1 . 7 ( 4 ) O ( 4 ) * 1 . 6 i 0 . 2 1 ( 3 ) N A 0 . 5 4 . 7 i 2 . 8 ( 3 ) 1 . 2 i 0 . 9 ( 3 ) 0 . 9 6 i 0 . 2 2 ( 3 ) 0 . 6 8 t 0 . 2 0 ( 3 ) 1 . 0 5 . 1 i 1 . 3 ( 5 ) 4 . 2 i 0 . 6 ( 4 ) 0 . 5 7 i 0 . 3 0 ( 5 ) 0 . 3 7 i 0 . 0 4 ( 4 ) 5 . 0 5 . 6 i 1 . 8 ( 4 ) 5 . 6 i 0 . 4 ( 2 ) 0 . 3 3 i 0 . 1 3 ( 4 ) 0 . 1 8 i 0 . 0 4 ( 2 ) 1 0 6 . 2 i 2 . 0 ( 4 ) 8 . 0 i 1 . 9 ( 3 ) 0 . 2 1 i 0 . 0 6 ( 4 ) 0 . 1 3 i 0 . 0 6 ( 3 ) V a l u e s - m e a n i S D , ( n ) - n u m b e r o f s a m p l e s , N A - ” n o t a p p l i c a b l e " , * - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l p l a t e l e t s ( p < 0 . 0 5 ) . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h s o f r e s t i n g c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a a r e s h o w n i n F i g u r e s 9 a a n d 9 b . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h s o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s a f t e r s t i m u l a t i o n b y 0 . 1 u M P A F a r e s h o w n i n F i g u r e s 1 0 a , 1 0 b , 1 1 a , a n d 1 1 b , a n d 1 . 0 p M P A F i n F i g u r e s 1 2 a , 1 2 b , 1 3 a , a n d 1 3 b . T h e s e e l e c t r o n m i c r o g r a p h s c o n f i r m t h e r a p i d s h a p e c h a n g e a n d t h e a b s e n c e o f a g g r e g a t i o n o f a f f e c t e d p l a t e l e t s c o n s i s t e n t w i t h t h e a g g r e g o m e t e r t r a c i n g s . 1 4 8 F i g u r e 9 a . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f s t i r r e d c o n t r o l p l a t e l e t r i c h p l a s m a p r i o r t o t h e a d d i t i o n o f a g o n i s t ( X 1 1 , 2 5 0 ) . F i g u r e 9 b . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f s t i r r e d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a p r i o r t o t h e a d d i t i o n o f a g o n i s t ( X 1 1 , 2 5 0 ) . 1 5 0 F i g u r e 1 0 a . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f c o n t r o l p l a t e l e t r i c h p l a s m a o n e m i n u t e a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 1 p M P A F ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e c h a n g e d s h a p e , c e n t r a l i z e d t h e i r g r a n u l e s a n d s t a r t e d t o a g g r e g a t e . F i g u r e 1 0 b . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a o n e m i n u t e a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 1 p M P A F ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e c h a n g e d s h a p e a n d c e n t r a l i z e d t h e i r g r a n u l e s , b u t h a v e n o t a g g r e g a t e d . 1 5 1 1 5 2 F i g u r e 1 1 a . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f c o n t r o l p l a t e l e t r i c h p l a s m a f i v e m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 1 p M P A F ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e a g g r e g a t e d f u l l y . F i g u r e 1 1 b . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a f i v e m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 1 p M P A F ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e ‘ p l a t e l e t s h a v e c h a n g e d s h a p e , b u t h a v e n o t r e l e a s e d t h e i r g r a n u l e ‘ c o n t e n t s o r a g g r e g a t e d . H u w 1 5 4 F i g u r e 1 2 a . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f c o n t r o l p l a t e l e t r i c h p l a s m a o n e m i n u t e a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 . 0 p M P A F ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e a l m o s t f u l l y a g g r e g a t e d . F i g u r e 1 2 b . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a o n e m i n u t e a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 . 0 p M P A F ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e c h a n g e d s h a p e a n d c e n t r a l i z e d t h e i r g r a n u l e s , b u t h a v e n o t a g g r e g a t e d . 1 5 5 1 5 6 F i g u r e 1 3 a . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f c o n t r o l p l a t e l e t r i c h p l a s m a f i v e m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 . 0 p M P A F ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e a g g r e g a t e d f u l l y . F i g u r e 1 3 b . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a f i v e m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 . 0 p M P A F ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e c h a n g e d s h a p e a n d s e c r e t e d s o m e o f t h e i r g r a n u l e s , b u t h a v e n o t a g g r e g a t e d . 1 5 8 I n a d d i t i o n a l s t u d i e s , p l a t e l e t r i c h p l a s m a w a s t r e a t e d w i t h 1 . 0 m M a s p i r i n a n d s t i m u l a t e d w i t h 0 . 1 o r 1 . 0 p M P A F . T h e p e r c e n t a g g r e g a t i o n , m a x i m u m s l o p e , m a x i m u m A T P s e c r e t i o n ( p H ) a n d t i m e t o m a x i m u m s e c r e t i o n ( m i n u t e s ) w e r e m e a s u r e d a n d c o m p a r e d t o r e s u l t s O b t a i n e d i n t h e a b s e n c e o f a s p i r i n . R e s u l t s a r e s h o w n i n T a b l e s 3 a n d 4 . T a b l e 3 . M a x i m u m a g g r e g a t i o n ( % ) , s l o p e , A T P s e c r e t i o n ( p M ) a n d t i m e t o m a x i m u m s e c r e t i o n ( m i n u t e s ) o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 0 . 1 p M P A F i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f 1 . 0 m M a s p i r i n . 1 . 0 m M A s p i r i n C o n t r o l A f f e c t e d % A g g r e g a t i o n - 5 3 . 3 i 4 0 . 1 ( 4 ) 0 ( 4 ) * + 4 1 . 0 i 3 3 2 ( 4 ) o ( 1 0 * S l a p e - 4 . 8 i 3 . 4 ( 4 ) 0 ( 4 ) : : + 4 . 3 i 2 . 2 ( 4 ) 0 ( 4 ) * A T P p M - 2 . 6 i 1 . 7 ( 4 ) 0 ( 4 ) ' + 0 . 6 6 i 0 . 8 6 ( 4 ) 0 ( 4 ) * T i m e t o M a x ? S e c r e t i o n - 1 . 6 i 0 . 2 ( 3 ) N A + 1 . 8 i 0 . 2 ( 2 ) N A V a l u e s - m e a n i S D , ( n ) - n u m b e r o f s a m p l e s , N A - " n o t a p p l i c a b l e " , * - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l p l a t e l e t s ( p < 0 . 0 5 ) . 1 5 9 T a b l e 4 . M a x i m u m a g g r e g a t i o n ( % ) , s l o p e , A T P s e c r e t i o n ( p M ) a n d t i m e t o m a x i m u m s e c r e t i o n ( m i n u t e s ) o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 . 0 p M P A F i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f 1 . 0 m M a s p i r i n . 1 . 0 m M A s p i r i n C o n t r o l A f f e c t e d % A g g r e g a t i o n - 8 0 . 8 a : 7 . 0 ( 5 ) 5 . 9 1 5 . 9 ( 4 ) * + 8 2 . 1 i 1 3 . 0 ( 4 ) 0 a t ) “ S l o p e - 9 . 2 1 1 . 5 ( 5 ) 0 . 3 4 i 0 . 3 5 ( 4 ) * + 8 . 4 i 2 . 1 ( 4 ) o ( 4 ) * A T P p M - 5 . 1 : 1 3 ( 5 ) 4 2 i 0 6 ( 4 ) + 3 4 : 0 8 ( 4 ) * 1 1 ¢ 0 6 ( 4 ) * * T i m e t o M a x ? S e c r e t i o n - 0 . 5 7 i 0 . 3 0 ( 5 ) 0 . 3 7 t 0 . 0 4 ( 4 ) + 0 . 6 8 i 0 . 1 6 ( 4 ) 0 . 4 5 i 0 . 0 4 ( 4 ) * V a l u e s - m e a n 1 S D , ( n ) - n u m b e r o f s a m p l e s , * - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l p l a t e l e t s ( p < 0 . 0 5 ) , # - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m n o n - a s p i r i n - t r e a t e d p l a t e l e t s ( p < 0 . 0 5 ) . A g g r e g a t i o n o f c o n t r o l p l a t e l e t s b y e i t h e r c o n c e n t r a t i o n o f P A F w a s n o t s i g n i f i c a n t l y a f f e c t e d b y a s p i r i n . S e c r e t i o n f r o m c o n t r o l p l a t e l e t s i n r e s p o n s e t o 0 . 1 p M P A F w a s i n h i b i t e d , b u t n o t s i g n i f i c a n t l y . S e c r e t i o n o f A T P f r o m c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s w a s s i g n i f i c a n t l y i n h i b i t e d b y a s p i r i n a t 1 . 0 p M P A F . T h e i n h i b i t i o n o f A T P s e c r e t i o n b y a f f e c t e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 1 . 0 p M P A F w a s g r e a t e r t h a n t h a t o f c o n t r o l p l a t e l e t s . T h e p o s t - a s p i r i n A T P c o n c e n t r a t i o n f o r a f f e c t e d p l a t e l e t s w a s 2 6 . 2 % o f t h e p r e - a s p i r i n v a l u e , c o m p a r e d t o 6 6 . 7 % f o r c o n t r o l p l a t e l e t s . 1 6 0 T h r o m b i n T h r o m b i n i s a p o t e n t p h y s i o l o g i c a g o n i s t t h a t c a u s e s r a p i d s h a p e c h a n g e , a g g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n o f g r a n u l e c o n t e n t s o f c o n t r o l g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s i n t h e a b s e n c e o f e x o g e n o u s f i b r i n o g e n . I n t e r e s t i n g l y , a l t h o u g h a f f e c t e d p l a t e l e t s f a i l e d t o a g g r e g a t e i n r e s p o n s e t o t h e p h y s i o l o g i c a l a g o n i s t s A D P a n d P A F , t h e y a g g r e g a t e d f u l l y i n r e s p o n s e t o c o n c e n t r a t i o n s o f 0 . 2 U / m l t h r o m b i n o r h i g h e r . H o w e v e r , t h e i n i t i a l r a t e o f a g g r e g a t i o n o f a f f e c t e d p l a t e l e t s ( a s i n d i c a t e d b y t h e m a x i m u m s l o p e ) w a s s i g n i f i c a n t l y s l o w e r t h a n t h a t o f c o n t r o l s a n d t h e y t o o k s i g n i f i c a n t l y l o n g e r t o r e a c h m a x i m u m a g g r e g a t i o n ( T a b l e 5 ) . D o s e - r e s p o n s e c u r v e s f o r a g g r e g a t i o n , m a x i m u m s l o p e a n d t i m e t o r e a c h m a x i m u m a g g r e g a t i o n a r e s h o w n i n F i g u r e s 1 4 , 1 5 a n d 1 6 a n d t y p i c a l a g g r e g a t i o n c u r v e s i n F i g u r e 1 7 . T h e r e w a s c o n s i d e r a b l e i n d i v i d u a l v a r i a t i o n i n t h e r e s p o n s e o f t h e c o n t r o l d o g s t o c o n c e n t r a t i o n s o f l e s s t h a n 0 . 1 U / m l , a l t h o u g h t h e r e s p o n s e s w e r e c o n s i s t e n t f o r e a c h d o g . 1 6 1 T a b l e 5 . T i m e ( m i n u t e s ) t a k e n b y c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y t h r o m b i n t o r e a c h m a x i m u m a g g r e g a t i o n . T h r o m b i n ( U / m l ) C o n t r o l A f f e c t e d 0 . 0 5 6 . 0 i 0 . 7 ( 3 ) N A 0 . 1 6 . 5 1 0 . 9 ( 5 ) 1 1 . 8 i 1 . 3 ( 3 ) * 0 . 2 7 . 5 i 1 . 0 ( 4 ) 1 1 . 6 1 1 . 0 ( 3 ) * 0 3 6 . 5 i 1 0 ( 5 ) 9 . 3 t 1 . 3 ( 4 ) * 0 4 7 . 5 i 0 6 ( 4 ) 9 . 7 i 0 . 4 ( 3 ) * 0 6 7 . 7 i 1 1 ( A ) 1 0 . 2 i 0 . 2 ( 3 ) * 0 . 8 7 . 1 i 1 . 3 ( 4 ) 1 0 . 3 t 0 . 4 ( 3 ) * 1 . 0 7 . 8 i 1 . 4 ( 4 ) 1 0 . 3 i 0 . 6 ( 3 ) * V a l u e s - m e a n i S D , ( n ) - n u m b e r o f s a m p l e s , N A - " n o t a p p l i c a b l e " , * - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l p l a t e l e t s ( p < 0 . 0 5 ) . 1 6 2 F i g u r e 1 4 . D o s e r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e m a x i m u m p e r c e n t a g g r e g a t i o n o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y t h r o m b i n . F i g u r e 1 5 . D o s e r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e m a x i m u m s l o p e o f t h e a g g r e g a t i o n c u r v e s o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y t h r o m b i n . l l l l l l l l l l l l l l l n o i l t a l l l g l e r g l l i l g l A l l l 2 l m u m i x I I Y T T I I I a I M I I I l l l l l l l l l l e p o l S m u m i x a M l l l l l l l l l l l [ l l l l l l l l l l l l l l l I l l I l l l l l l l l l l l l l l l l l l l I l l 1 8 8 9 8 8 8 7 8 6 8 5 8 4 a 3 8 2 8 1 8 1 6 3 [ I ' l l ] I I I I l I I I I I ’ I Y T T I T I T I I I ' l l l ' f l r l i l l l l I I I I I I I Y — - . - C o n t r o l ' m - a f f e c t e d A u 1 . l . . . . l . . . . l . . I I A L I A I I A I I I . . l . . . . l . . . 1 . . . . l 8 8 . 4 8 . 5 8 . 6 8 . 8 8 . 9 T h r o m b i n ( U / m l ) 8 . 1 8 . 2 8 . 3 8 . 7 I l l l l l l I I I I T I I I I I l l l l l I I I I I I I I I I I T I I I I I I I I I I I I l I I I [ I T I I I l r ‘ I T I T r T Y j ’ I I I I I I I I I [ I I I I I I I I I I I I I T T T I I T C o n t r o l - w - R ¥ f e c t e d l L J l l l - l ‘ l l l I I ; l l l L l J l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l [ I ' l l j l l l l l l l l l l l l l j l l l l l I l l l l l l l l l . . . . . . . - . l . . . 8 . 3 8 . 4 8 . 5 8 . 6 8 . 7 8 . 8 T h r o m b i n ( U / m l ) 1 6 4 I I I T I I U I I I ’ I I I T V I U I I Y I T U ' I I U I I I I T I W T I T I U I I Y U T I ‘ I F I j T I 1 4 : ‘ ' 2 : 0 . ' : m L r L ' g 1 3 : 1 - + * C o n t r o l : . S : n H e c t e d : E 1 2 — n T v : . . . . . . . _ c C I . 9 . 1 1 : - ' : 4 , ; : I : 3 ‘ 1 0 E 1 . . . . . . . . . . . . . 1 _ : ‘ - I I I e . . . . . . " g P ' 0 ' " . " ‘ < = 9 : ' ' 7 . E : v 2 a - - . . . 8 : - . 1 X " - 1 7 : - . 1 o _ - 4 ) E . L . . 0 F " u . — E 6 : i : " - 4 F - : 3 5 " ' . 4 l l l L l l l 1 1 1 1 1 l l l l L L L j ' l L l l l l l J l l l l l L 1 + l l l l l l l l l l L l L l 8 8 . 1 8 . 2 8 . 3 8 . 4 8 . 5 8 . 6 8 . 7 8 . 8 8 . 9 1 T h r o m b i n ( U / m l ) F i g u r e 1 6 . T i m e t a k e n ( m i n u t e s ) b y c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s t o r e a c h m a x i m u m p e r c e n t a g g r e g a t i o n w h e n s t i m u l a t e d b y t h r o m b i n . ' n o i s s i m s n a % r T t h g i L O 1 6 5 1 0 0 T ” A f f e c t e d C o n t r o l l I I 1 m i n F i g u r e 1 7 . T y p i c a l a g g r e g a t i o n c u r v e s f o r c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 3 U / m l t h r o m b i n . T o f u r t h e r i n v e s t i g a t e t h e d i f f e r e n t i n i t i a l r a t e s o f a g g r e g a t i o n i n t h e t w o g r o u p s , a g g r e g a t i o n s t u d i e s w e r e c o u p l e d t o t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( F i g u r e s 1 8 a , 1 8 b , 1 9 a a n d 1 9 b ) . T h i r t y s e c o n d s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 3 U / m l t h r o m b i n , c o n t r o l p l a t e l e t s h a d c h a n g e d s h a p e , c e n t r a l i z e d t h e i r g r a n u l e s a n d w e r e s t a r t i n g t o a g g r e g a t e . I n c o n t r a s t , a f f e c t e d p l a t e l e t s h a d c h a n g e d s h a p e a n d c e n t r a l i z e d t h e i r g r a n u l e s , b u t t h e r e w a s n o e v i d e n c e o f a g g r e g a t i o n . B y e i g h t m i n u t e s , b o t h c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s w e r e f u l l y a g g r e g a t e d a n d t h e r e i s n o a p p a r e n t m o r p h o l o g i c a l d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o g r o u p s . 1 6 6 F i g u r e 1 8 a . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f c o n t r o l g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s 3 0 s e c o n d s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 3 U / m l t h r o m b i n ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e c h a n g e d s h a p e , c e n t r a l i z e d t h e i r g r a n u l e s a n d s t a r t e d t o a g g r e g a t e . F i g u r e 1 8 b . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s 3 0 s e c o n d s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 3 U / m l t h r o m b i n ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e c h a n g e d s h a p e a n d c e n t r a l i z e d t h e i r g r a n u l e s , b u t h a v e n o t a g g r e g a t e d . a . . . . . . . . l \ . . . w - A n i a ” . . . V H 5 . . . 1 9 4 1 , , , . a . , _ . A . “ 5 . . . . . . . . v « Q u a . . . , , ~ . . I s . 1 . . . - o . n : 1 6 8 F i g u r e 1 9 a . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f c o n t r o l g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s e i g h t m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 3 U / m l t h r o m b i n ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e a g g r e g a t e d f u l l y . F i g u r e 1 9 b . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s e i g h t m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 3 U / m l t h r o m b i n ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e a g g r e g a t e d f u l l y . 1 6 9 1 7 0 B o t h c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s r e l e a s e d A T P i n r e s p o n s e t o a l l c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n u s e d . E v e n v e r y l o w c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n ( 0 . 0 5 U / m l ) c a u s e d t h e p l a t e l e t s o f s o m e a f f e c t e d i n d i v i d u a l s t o r e l e a s e a s m a l l q u a n t i t y o f A T P , a l t h o u g h a g g r e g a t i o n d i d n o t o c c u r . T h e r e w e r e n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e t w o g r o u p s i n e i t h e r t h e a m o u n t o f A T P r e l e a s e d o r t h e t i m e t o m a x i m u m s e c r e t i o n . T h e r e s u l t s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 6 . T a b l e 6 . D e n s e g r a n u l e A T P s e c r e t i o n ( p M ) a n d t i m e t o p e a k s e c r e t i o n ( m i n u t e s ) b y c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y t h r o m b i n . T h r o m b i n A T P S e c r e t e d T i m e t o ‘ u a x F S e c r e t i o n ( U / m l ) C o n t r o l A f f e c t e d C o n t r o l A f f e c t e d 0 . 0 5 1 . 4 i 1 . 2 ( 4 ) 0 . 5 7 i 0 . 7 4 ( 3 ) 3 . 5 t 1 . 0 ( 4 ) 3 . 6 i 0 . 5 ( 2 ) 0 . 1 2 . 9 i 0 . 6 ( 5 ) 1 . 8 i 1 . 6 ( 4 ) 2 . 7 i 0 . 5 ( 5 ) 3 . 7 i 1 . 3 ( 3 ) 0 . 2 4 . 1 i 0 . 3 ( 4 ) 2 . 8 i 2 . 4 ( 3 ) 1 . 8 i 0 . 7 ( 4 ) 2 . 0 i 1 . 1 ( 3 ) 0 . 3 5 . 0 i 0 . 9 ( 5 ) 4 . 5 i 0 . 4 ( 4 ) 1 . 1 i 0 . 5 ( 5 ) 1 . 4 i 0 . 6 ( 4 ) 0 4 5 . 1 i 0 5 ( 5 ) 5 . 0 i 0 . 6 ( 3 ) 1 . 1 i 0 . 5 ( 4 ) 1 . 4 i 0 . 2 ( 3 ) 0 6 4 . 8 i 0 6 ( 4 ) 4 . 9 i 0 . 3 ( 3 ) 0 . 9 i 0 . 1 ( 4 ) 1 . 1 i 0 . 4 ( 3 ) 0 . 8 4 . 8 i 1 . 0 ( 4 ) 5 . 7 i 0 . 7 ( 3 ) 1 . 1 i 0 . 5 ( 4 ) 0 . 6 0 i 0 . 1 0 ( 3 ) 1 . 0 5 . 4 i 0 . 8 ( 4 ) 5 . 9 i 1 . 2 ( 3 ) 0 . 6 5 i 0 . 0 6 ( 4 ) 0 . 5 7 i 0 . 2 1 ( 3 ) V a l u e s - m e a n i S D , ( n ) - n u m b e r o f s a m p l e s . 1 7 1 W h e n g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s w e r e i n c u b a t e d w i t h 1 . 0 m M a s p i r i n a n d s t i m u l a t e d b y 0 . 3 U / m l t h r o m b i n , t h e e x t e n t a n d r a t e o f a g g r e g a t i o n o f c o n t r o l p l a t e l e t s w e r e s l i g h t l y , b u t n o t s i g n i f i c a n t l y , i n h i b i t e d . I n c o n t r a s t , t h e e x t e n t a n d r a t e o f m a x i m u m a g g r e g a t i o n o f a f f e c t e d p l a t e l e t s w e r e i n h i b i t e d s i g n i f i c a n t l y w h i l e t h e t i m e t o m a x i m u m a g g r e g a t i o n w a s m a r k e d l y a n d s i g n i f i c a n t l y p r o l o n g e d . T h e s e c r e t i o n o f A T P f r o m c o n t r o l g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d w i t h 0 . 3 U / m l t h r o m b i n w a s s l i g h t l y , b u t s i g n i f i c a n t l y , i n h i b i t e d b y 1 . 0 m M a s p i r i n w h i l e t h e i n h i b i t i o n o f s e c r e t i o n f r o m a f f e c t e d p l a t e l e t s w a s a l s o i n h i b i t e d s l i g h t l y , a l t h o u g h n o t s i g n i f i c a n t l y . A s p i r i n p r o l o n g e d t h e t i m e t o m a x i m u m s e c r e t i o n i n b o t h g r o u p s , a l t h o u g h t h e c h a n g e w a s s i g n i f i c a n t o n l y i n t h e a f f e c t e d g r o u p . T h e e f f e c t s o f a s p i r i n o n t h e r e s p o n s e s o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s t o 0 . 3 U / m l t h r o m b i n a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 7 . T a b l e 7 . 1 7 2 M a x i m u m a g g r e g a t i o n ( % ) , s l o p e , t i m e t o m a x i m u m a g g r e g a t i o n ( m i n u t e s ) , A T P s e c r e t i o n ( p M ) a n d t i m e t o m a x i m u m s e c r e t i o n ( m i n u t e s ) o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 3 U / m l t h r o m b i n i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f 1 . 0 m M a s p i r i n . 1 . 0 m M A s p i r i n C o n t r o l A f f e c t e d % A g g r e g a t i o n - 8 i 6 . 0 ( 5 ) 8 2 7 i 4 . 4 ( 4 ) + 7 i 3 . 0 ( 3 ) 5 7 1 i 1 0 . 0 ( 4 ) " S l o p e - 5 . 9 i 0 5 ( 5 ) 1 . 7 i 0 . 4 ( 4 ) * + 5 . 4 t 0 4 ( 3 ) 0 . 8 4 + 0 . 5 3 ( 4 ) " T i m e t o M a x ? A g g r e g n + 6 . 5 i 1 . 0 ( 5 ) 9 . 3 i 1 . 3 ( 4 ) . - 6 . 4 i 1 . 0 ( 3 ) 1 4 . 0 i 3 3 ( 4 ) " A T P p H - 5 . 0 i 0 . 9 ( 5 ) 4 . 5 i 0 . 4 ( 4 ) + 3 . 8 i 0 . 7 ( 3 ) ' 3 . 8 i : 0 . 3 ( 4 ) ' T i m e t o M a x ? S e c r e t i o n - 1 . 1 i 0 . 5 ( 5 ) 1 . 4 i 0 . 6 ( 4 ) + 1 . 9 i 0 . 7 ( 3 ) 2 . 0 i 0 . 6 ( 4 ) * V a l u e s - m e a n i S D , ( n ) - n u m b e r o f s a m p l e s , d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l p l a t e l e t s ( p < 0 . 0 5 ) , d i f f e r e n t f r o m n o n - a s p i r i n - t r e a t e d p l a t e l e t s * - s i g n i f i c a n t l y # - s i g n i f i c a n t l y ( p < 0 . 0 5 ) . 1 7 3 T h e e x t e n t a n d r a t e o f a g g r e g a t i o n o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 1 U / m l o f t h r o m b i n w a s i n h i b i t e d s l i g h t l y , b u t n o t s i g n i f i c a n t l y , b y 1 . 0 m M a s p i r i n . A l t h o u g h t h e e f f e c t o f a s p i r i n o n c o n t r o l p l a t e l e t s w a s n o t s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t , i t s h o u l d b e n o t e d t h a t t h e v a r i a b l e r e s p o n s e o f a f f e c t e d p l a t e l e t s t o 0 . 1 U / m l t h r o m b i n w a s c o m p l e t e l y e l i m i n a t e d b y a s p i r i n . A l l a f f e c t e d p l a t e l e t s f a i l e d t o a g g r e g a t e i n r e s p o n s e t o 0 . 1 U / m l t h r o m b i n a f t e r i n c u b a t i o n w i t h a s p i r i n . A l t h o u g h s e c r e t i o n o f A T P w a s s l i g h t l y i n h i b i t e d b y a s p i r i n i n b o t h g r o u p s , t h e s e c h a n g e s w e r e n o t s i g n i f i c a n t . T h e e f f e c t s o f a s p i r i n o n t h e r e s p o n s e s o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 1 U / m l t h r o m b i n a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 8 . T a b l e 8 . M a x i m u m a g g r e g a t i o n ( % ) , s l o p e , t i m e t o m a x i m u m a g g r e g a t i o n ( m i n u t e s ) , A T P s e c r e t i o n ( M M ) a n d t i m e t o m a x i m u m s e c r e t i o n ( m i n u t e s ) o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 1 U / m l t h r o m b i n i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f 1 . 0 m M a s p i r i n . 1 . 0 m M A s p i r i n C o n t r o l A f f e c t e d % A g g r e g a t i o n - 6 9 . 3 i 2 6 . 1 ( 5 ) 1 4 . 8 i 2 1 . 4 ( 4 ) * + 4 5 . 4 1 3 2 . 3 ( 3 ) 0 ( 4 ) * S l o p e - 5 . 1 i 2 . 4 ( 5 ) 0 . 2 8 i 0 . 3 9 ( 4 ) * + 3 . 3 i 2 . 6 ( 3 ) 0 ( 4 ) * T i m e t o M a x " A g g r e g " + 6 . 5 i 0 . 9 ( 5 ) 1 1 . 8 i 1 . 3 ( 2 ) * - 5 9 i 1 . 1 ( 3 ) N A A T P p M - 2 . 9 i 0 . 6 ( 5 ) 1 . 8 i 1 . 6 ( 4 ) + 2 . 4 i 0 . 9 ( 3 ) 0 . 9 5 i 1 . 2 4 ( 4 ) T i m e t o M a x ? S e c r e t i o n - 2 . 7 i 0 . 5 ( 5 ) 3 . 7 i 1 . 3 ( 3 ) + 3 . 1 i 1 . 2 ( 3 ) 3 . 4 i 0 . 2 ( 2 ) V a l u e s - m e a n i S D , ( n ) - n u m b e r o f s a m p l e s , N A - " n o t a p p l i c a b l e " , * - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l p l a t e l e t s ( p < 0 . 0 5 ) . T ( o t a m f h b i r l n c o e u o m e t 9 i . s r n t n b ) o , l i a A a M n x T n t i P d h m e u s a m e f a c f b g n a r e s g e c e g t t n r i e c e o d e a g a ( t e n i p l d o M - ) n f p i r ( a l e % n t s ) d e e , r n s i d e t e c l m o e p o p l f e , t a o t 1 e . i a e t m l 0 m x m t e i s M m u t s a o m t s m i s m a e u r x c l i i r a m e t n . i p u t e m i d o a n b g y g ( r 0 m e . i g 0 n a u 5 t t i e U o / s n m ) l 1 7 4 1 . 0 m M A s p i r i n C o n t r o l A f f e c t e d 8 A g g r e g a t i o n - 2 8 . 4 i 3 4 . 8 ( 5 ) o ( 4 ) * + 1 9 . 6 i 3 4 . 0 ( 3 ) 0 ( 1 0 * S l o p e - 1 . 5 i 1 . 9 ( 5 ) 0 ( 4 ) * + 1 . 1 i 1 . 9 ( 3 ) 0 ( 4 ) * T i m e t o M a x ? A g g r e g n + 6 . 0 i 0 . 7 ( 3 ) N A - 5 . 5 i 0 ( 1 ) N A A T P u M - 1 . 4 i 1 . 2 ( 4 ) 0 . 5 7 t 0 . 7 4 ( 3 ) . + 0 . 2 i 0 . 1 7 ( 3 ) 0 . 0 9 i 0 . 1 8 ( 2 ) T i m e t o M a x ? S e c r e t i o n - 3 . 5 t 1 0 ( 4 ) 3 6 i 0 . 5 ( 2 ) + 5 . 0 i l 3 ( 2 ) 2 4 i 3 . 4 ( 2 ) V a l u e s - m e a n i S D , ( n ) - n u m b e r o f s a m p l e s , N A - " n o t a p p l i c a b l e " , * - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l p l a t e l e t s ( p < 0 . 0 5 ) . A l t h o u g h t h e e x t e n t a n d r a t e o f a g g r e g a t i o n o f c o n t r o l p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 0 5 U / m l t h r o m b i n w e r e i n h i b i t e d b y a s p i r i n , t h i s w a s n o t s i g n i f i c a n t . A t t h i s c o n c e n t r a t i o n t h e r e w a s m a r k e d i n d i v i d u a l v a r i a t i o n i n t h e r e s p o n s e s o f t h e c o n t r o l d o g s , c r e a t i n g a l a r g e s t a n d a r d d e v i a t i o n i n b o t h t h e n o n - a n d a s p i r i n - t r e a t e d g r o u p s . T h e a f f e c t e d p l a t e l e t s d i d n o t a g g r e g a t e i n r e s p o n s e t o t h i s c o n c e n t r a t i o n o f t h r o m b i n . S e c r e t i o n o f A T P f r o m c o n t r o l p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 0 5 U / m l t h r o m b i n w a s r e d u c e d b y t r e a t m e n t w i t h a s p i r i n a n d t h e t i m e t o m a x i m u m s e c r e t i o n p r o l o n g e d , b u t n e i t h e r i f t h e s e c h a n g e s w e r e 1 7 5 s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t . T h e s m a l l a m o u n t o f A T P s e c r e t i o n b y a f f e c t e d p l a t e l e t s i n r e s p o n s e t o 0 . 0 5 U / m l t h r o m b i n w a s f u r t h e r r e d u c e d b y t r e a t m e n t w i t h a s p i r i n . T h e e f f e c t s o f a s p i r i n o n t h e r e s p o n s e s o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 1 U / m l t h r o m b i n a r e s u m m a r i z e d a b o v e i n T a b l e 9 . P h o r b o l M y r i s t a t e A c e t a t e P h o r b o l m y r i s t a t e a c e t a t e i s a n o n - p h y s i o l o g i c p l a t e l e t a g o n i s t w h i c h a g g r e g a t e s p l a t e l e t s i n a m a n n e r t h a t i s d e p e n d e n t o n i o n i z e d c a l c i u m a n d b i n d i n g o f f i b r i n o g e n , b u t i n d e p e n d e n t o f c y c l o o x y g e n a s e p r o d u c t s 3 4 1 , 4 3 8 , 5 2 9 C o n t r o l c a n i n e p l a t e l e t s i n p l a t e l e t r i c h p l a s m a d i d n o t c h a n g e s h a p e , b u t a g g r e g a t e d s l o w l y a n d i r r e v e r s i b l y i n r e s p o n s e t o c o n c e n t r a t i o n s o f P M A o f 0 . 2 5 p M o r h i g h e r . T h e a f f e c t e d p l a t e l e t s a l s o a g g r e g a t e d i r r e v e r s i b l y , a l t h o u g h m o r e s l o w l y t h a n c o n t r o l p l a t e l e t s . D o s e r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e p e r c e n t a g g r e g a t i o n , m a x i m u m s l o p e a n d t i m e t o m a x i m u m a g g r e g a t i o n a r e s h o w n i n F i g u r e s 2 0 , 2 1 a n d 2 2 . A f f e c t e d p l a t e l e t s t o o k l o n g e r t o r e a c h m a x i m u m a g g r e g a t i o n i n r e s p o n s e t o a l l c o n c e n t r a t i o n s o f P M A u s e d , a l t h o u g h t h e d i f f e r e n c e w a s s i g n i f i c a n t o n l y i n r e s p o n s e t o 1 . 0 a n d 3 . 0 p M P M A ( T a b l e 1 0 ) . T y p i c a l a g g r e g a t i o n c u r v e s a r e i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 2 3 . 4 - a - P h o r b o l i s a n i n a c t i v e a n a l o g u e o f P M A . N e i t h e r c o n t r o l o r a f f e c t e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 4 - « - p h o r b o l c h a n g e d s h a p e , a g g r e g a t e d o r r e l e a s e d a n y g r a n u l e c o n t e n t s . 1 7 6 F i g u r e 2 0 . D o s e r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e m a x i m u m p e r c e n t a g g r e g a t i o n o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y P M A . F i g u r e 2 1 . D o s e r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e m a x i m u m s l o p e o f t h e a g g r e g a t i o n c u r v e s o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y P M A . 1 I I 1 1 I 4 1 1 1 1 1 1 1 1 1 l n l u n l u n l n u [ 1 1 1 1 I I U I I I I I I I I I I I I I ' n o i t a g e r I g g A 2 m I I T ' I I I I I u I ” I m i x ' 1 a I I M e p o l S m u m i x a M I I I I I l l I I T F I I h 8 8 . 5 1 1 ' I T U I I I I T I I I I I U a l l a n a . l 5 2 2 . 5 3 3 . 5 4 P M A ( u M ) I I I T U I T U T U l e I I I I I T U ' I V l U I - n a n l n n n m l a a n n l a e n j [ 1 4 : 1 1 1 n l l u i l u u l l l u l l n l u l l l u l l l l l u ! ! ! ] 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 7 I U I U I r U I I ’ I I I fi t r ' 6 ‘ 1 I I U U U U I F U I r r U I I I I T I U U ' ' F v 1 8 8 9 8 8 8 7 8 6 8 5 8 - * - C o n t r o l - ~ - A f i e c t e d 4 8 3 8 2 8 1 8 _ L l l l l l l I . l l l . l 1 l l 1 l l l L l l l A L l I l l 1 I 1 l l I i I l l A l 1 . 8 1 . 6 1 . 4 1 . 2 , . . . . J . 8 . 8 8 . 6 - * - C o n t r o l J 9 - 4 - ~ - A f f e c t e d 8 . 2 e l I l I ' I I [ ' 1 I I I T I I I T I I I I I F I I I I I I I I I I I I I I I l l l 1 1 . 5 2 2 . 5 3 3 . 5 - 4 P M A ( u M ) A " . s . p m O 5 E I . E 3 . F § fl U 2 , 3 c . ‘ 5 . w 5 - 1 8 1 l _ 1 1 6 4 2 8 9 6 - ' ' . - r _ ” I " - — _ - , _ - " I _ - ' t I 8 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I l 1 ' . 1 l l . , . . - L 4 k i l 8 l . 5 L l 1 1 . A 5 1 1 N n l 2 ( Q P I I I I I I - - * ~ - - C A I o f I n f t e I r c I I — I I I I I T r I ~ o t l e d . L L ‘ J . 5 2 a M ) L 1 L l 1 1 1 4 a 3 3 . 5 l 4 I u : _ . . . . : 1 _ - . _ “ _ ~ : . - : . - 1 d — - 1 7 8 F i g u r e 2 2 . D o s e r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e t i m e t a k e n ( m i n u t e s ) b y c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a t o r e a c h m a x i m u m p e r c e n t a g g r e g a t i o n w h e n s t i m u l a t e d b y P M A . T a b l e 1 0 . T i m e t a k e n ( m i n u t e s ) b y c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y P M A t o r e a c h m a x i m u m a g g r e g a t i o n . P M A ( p M ) C o n t r o l A f f e c t e d 1 . 0 9 . 8 i 1 . 3 ( 3 ) 1 4 . 9 i 2 . 1 ( 2 ) * 1 . 5 1 2 . 7 i 2 . 2 ( 4 ) 1 4 . 1 i 2 . 0 ( 3 ) 3 . 0 9 . 9 i 1 . 2 ( 5 ) 1 2 . 0 i 1 . 1 ( 4 ) * 3 . 7 5 9 . 6 i 1 . 6 ( 4 ) 1 1 . 3 i 0 . 5 ( 3 ) V a l u e s - m e a n i S D , ( n ) - n u m b e r o f s a m p l e s , * = s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l p l a t e l e t s ( p < 0 . 0 5 ) . n o i s s i m s n a r T t h g i L o / ° 1 7 9 1 0 0 _ A f f e c t e d C o n t r o l I I 1 m i n F i g u r e 2 3 . T y p i c a l a g g r e g a t i o n c u r v e s f o r c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 3 . 0 p M P M A . T h e a g g r e g a t i o n s t u d i e s w e r e c o u p l e d t o t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y w i t h r e p r e s e n t a t i v e r e s u l t s b e i n g s h o w n i n F i g u r e s 2 4 a , 2 4 b , 2 5 a a n d 2 5 b . T h e r e w a s n o a p p a r e n t s h a p e c h a n g e o r a g g r e g a t i o n o f p l a t e l e t s i n e i t h e r g r o u p t w o m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 3 . 0 p M P M A . B y t e n m i n u t e s , a g g r e g a t i o n o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s a p p e a r e d c o m p l e t e . B o t h c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s a p p e a r e d v a c u o l a t e d . 1 8 0 F i g u r e 2 4 a . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f c o n t r o l p l a t e l e t r i c h p l a s m a t w o m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 3 . 0 u M P M A ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e n o t c h a n g e d s h a p e , c e n t r a l i z e d t h e i r g r a n u l e s o r a g g r e g a t e d . F i g u r e 2 4 b . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a t w o m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 3 . 0 p M P M A ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e n o t c h a n g e d s h a p e , c e n t r a l i z e d t h e i r g r a n u l e s o r a g g r e g a t e d . 1 8 1 1 8 2 F i g u r e 2 5 a . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f c o n t r o l p l a t e l e t r i c h p l a s m a t e n m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 3 . 0 p M P M A ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e a g g r e g a t e d f u l l y . F i g u r e 2 5 b . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a t e n m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 3 . 0 p M P M A ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e a g g r e g a t e d f u l l y . r . _ _ - e — _ ~ m m : 1 8 4 S e c r e t i o n o f d e n s e g r a n u l e c o n t e n t s f r o m c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s i n r e s p o n s e t o P M A w a s v e r y s l o w , o c c u r r i n g w h e n a g g r e g a t i o n w a s n e a r o r a t i t s m a x i m u m o n t h e a g g r e g o m e t e r t r a c i n g . A f f e c t e d p l a t e l e t s a g g r e g a t e d m o r e s l o w l y t h a n c o n t r o l p l a t e l e t s a n d a l s o s e c r e t e d m o r e s l o w l y , a l t h o u g h t h i s w a s o n l y s i g n i f i c a n t i n r e s p o n s e t o 3 . 0 u M P M A . O v e r a l l , t h e r e l e a s e r e s p o n s e o f b o t h g r o u p s o f p l a t e l e t s w a s l e s s c o n s i s t e n t , b o t h i n t h e a m o u n t o f A T P a n d t h e t i m e t o r e a c h p e a k s e c r e t i o n , t h a n t h e r e s p o n s e s o f t h e a g o n i s t s d i s c u s s e d a b o v e . T h e l u m i n e s c e n c e c h a n n e l g a i n w a s s e t c o n s i d e r a b l y h i g h e r t h a n f o r o t h e r a g o n i s t s b e c a u s e t h e l u c i f e r i n — l u c i f e r a s e s u b s t r a t e - e n z y m e s y s t e m h a s a t e m p e r a t u r e o p t i m u m o f 2 3 ° C a n d i s s t e a d i l y i n a c t i v a t e d a t 3 7 . 5 ° C , r e d u c i n g t h e s e n s i t i v i t y o f t h e A T P d e t e c t i o n s y s t e m b y t h e t i m e P M A - s t i m u l a t e d s e c r e t i o n o c c u r r e d . 1 6 5 A t h i g h g a i n s e t t i n g s t h e r e w a s m o r e b a c k g r o u n d n o i s e a n d v a r i a t i o n i n t h e r e s u l t s . R e s u l t s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 1 1 . T a b l e 1 1 . D e n s e g r a n u l e A T P s e c r e t i o n ( u M ) a n d t i m e t o r e a c h p e a k s e c r e t i o n ( m i n u t e s ) b y c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y P M A . P M A A T P S e c r e t e d T i m e t o H e x ? S e c r e t i o n ( p H ) C o n t r o l A f f e c t e d C o n t r o l A f f e c t e d 1 . 5 1 . 4 i 0 . 7 ( 4 ) 1 . 4 i 1 . 0 ( 3 ) 9 . 7 i 2 . 5 ( 4 ) 9 . 0 i 3 . 1 ( 3 ) 3 . 0 1 . 8 i 0 . 6 ( 5 ) 2 . 5 i 0 . 9 ( 4 ) 7 . 9 i 1 . 1 ( 5 ) 1 0 . 7 i 1 . 2 ( 4 ) * 3 . 7 5 3 . 1 i 1 . 6 ( 3 ) 2 . 0 i 0 . 9 ( 3 ) 8 . 4 i 1 . 3 ( 3 ) 1 0 . 4 i 0 . 8 ( 3 ) V a l u e s - m e a n i S D , ( n ) - n u m b e r o f s a m p l e s , * - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l p l a t e l e t s ( p < 0 . 0 5 ) . 1 8 5 N e i t h e r t h e e x t e n t , r a t e o r t i m e t o r e a c h m a x i m u m a g g r e g a t i o n o f c o n t r o l o r a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d w i t h 3 . 0 p M P M A w a s a f f e c t e d b y 1 . 0 m M a s p i r i n ( T a b l e 1 2 ) . T h i s w a s n o t u n e x p e c t e d , a s i t h a s b e e n r e p o r t e d t h a t P M A - i n d u c e d a g g r e g a t i o n o f p l a t e l e t s i s 3 4 1 , 5 2 9 i n d e p e n d e n t o f c y c l o o x y g e n a s e p r o d u c t s . H o w e v e r , t h e s e c r e t i o n o f A T P w a s s l i g h t l y , b u t s i g n i f i c a n t l y , i n h i b i t e d b y a s p i r i n i n c o n t r o l p l a t e l e t s . T h e r e a l s i g n i f i c a n c e o f t h i s c h a n g e i s d o u b t f u l . T a b l e 1 2 . M a x i m u m a g g r e g a t i o n ( % ) , s l o p e , t i m e t o m a x i m u m a g g r e g a t i o n ( m i n u t e s ) , A T P s e c r e t e d ( p M ) a n d t i m e t o m a x i m u m s e c r e t i o n ( m i n u t e s ) o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 3 . 0 M M P M A i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f 1 . 0 m M a s p i r i n . 1 . 0 m M A s p i r i n C o n t r o l A f f e c t e d 8 A g g r e g a t i o n - 8 0 . 0 i 7 . 3 ( 5 ) 8 0 . 0 i 3 2 ( 4 ) + 8 0 . 5 i 1 4 . 7 ( 4 ) 8 4 . 8 i 1 2 . 1 ( 4 ) S l o p e - 1 . 4 i 0 . 4 ( 5 ) 1 2 i 0 . 1 ( 4 ) + 1 3 i 0 . 2 ( 4 ) 1 2 i 0 . 2 ( 4 ) T i m e t o M a x ? A g g r e g ? + 9 . 9 i 1 . 2 ( 5 ) 1 2 . 0 i 1 . 1 ( 4 ) * - 1 0 . 1 i 1 . 7 ( 4 ) 1 2 . 5 i 2 . 2 ( 4 ) A T P “ M - 1 . 8 i 0 . 6 ( 5 ) 2 . 5 i 0 . 9 ( 4 ) + 2 . 2 i 1 . 3 ( 4 ) 1 . 6 i 0 . 5 ( 4 ) T i m e t o M a x ? S e c r e t i o n - 7 . 9 i 1 . 1 ( 5 ) 1 0 . 7 i 1 . 2 ( 4 ) * + 9 . 2 i 1 . 3 ( 4 ) * 1 1 . 0 i 0 . 9 ( 4 ) V a l u e s - m e a n i S D , ( n ) - n u m b e r o f s a m p l e s , * - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l p l a t e l e t s ( p < 0 . 0 5 ) , # - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m n o n - a s p i r i n - t r e a t e d p l a t e l e t s ( p < 0 . 0 5 ) . 1 8 6 C a l c i u m I o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 C a l c i u m i o n o p h o r e s s u c h a s A 2 3 1 8 7 a r e n o n - p h y s i o l o g i c a g o n i s t s w h i c h a c t i v a t e p l a t e l e t s b y t h e i r a b i l i t y t o m o b i l i z e c a l c i u m a c r o s s m e m b r a n e s , i n c r e a s e i n t r a c y t o p l a s m i c c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n s a n d g e n e r a t e e n d o p e r o x i d e s ( p r o s t a g l a n d i n G a a n d p r o s t a g l a n d i n H 2 ) a n d t h r o m b o x a n e A 2 . A f f e c t e d p l a t e l e t s c h a n g e d s h a p e , b u t d i d n o t a g g r e g a t e i n r e s p o n s e t o A 2 3 1 8 7 . I n c o n t r o l p l a t e l e t r i c h p l a s m a , A 2 3 1 8 7 c a u s e d s h a p e c h a n g e , a g g r e g a t i o n a n d d e n s e g r a n u l e A T P s e c r e t i o n . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b t a i n e d i n c o n t r o l g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s i n t h e a b s e n c e o f a d d e d e x o g e n o u s f i b r i n o g e n . I t w a s o b s e r v e d t h a t o c c a s i o n a l l y A 2 3 1 8 7 w o u l d f a i l t o e l i c i t a g g r e g a t i o n i n a c u v e t t e , e v e n a l t h o u g h t h e r e s t o f t h e s a m p l e f r o m t h e i n d i v i d u a l a g g r e g a t e d f u l l y . T h i s o c c u r r e d m o r e f r e q u e n t l y a t l o w e r c o n c e n t r a t i o n s o f A 2 3 1 8 7 a n d a c c o u n t s f o r t h e l a r g e r s t a n d a r d d e v i a t i o n s s e e n w i t h t h i s a g o n i s t . D o s e - r e s p o n s e c u r v e s f o r a g g r e g a t i o n a n d m a x i m u m s l o p e o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s i n p l a t e l e t r i c h p l a s m a a r e s h o w n i n F i g u r e s 2 6 a n d 2 7 r e s p e c t i v e l y a n d r e p r e s e n t a t i v e a g g r e g a t i o n c u r v e s i n F i g u r e 2 8 . 1 8 7 F i g u r e 2 6 . D o s e r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e m a x i m u m p e r c e n t a g g r e g a t i o n o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y A 2 3 1 8 7 . F i g u r e 2 7 . D o s e r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e m a x i m u m s l o p e o f t h e a g g r e g a t i o n c u r v e s o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y A 2 3 1 8 7 . I I T 0 0 Y I I I 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 I I I I 0 T n 0 o i T I I [ t I V a 0 I g e N I I I r I g 0 g O A 2 m I I I I I I 0 M I I I u 0 I A I m i x a N 0 M N 0 I I I I I W I I I I I I H 0 I 1 1 1 1 1 1 [ l l l L L l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l 1 1 1 1 1 1 1 I 1 I I 0 O 1 1 1 0 I I I I I I \ I I I I N I O [ I I I e I I p I U o I l I S m « 5 u m i x a M A ( N I T [ I I I I I I I I I I I I l I ‘ ' 0 I l I r [ 0 l i 1 i i # A i l i i i i l l i i i l l n i l n i i l i i i i L i I n l u n l 9 2 3 1 8 7 ( u M ) 1 8 1 5 L _ : o n e . . . 2 8 l o 1 4 3 + e s . - C o n t r o l A f f e c t e d ‘ 9 2 3 1 8 7 ( u M ) 1 8 1 5 2 8 p ' i — . — 0 I P C o n t r o l A f f e c t e d O O O O O I C O I I O O O I - O q 1 8 8 n o i s s i m s n a r T t h g i L % 1 8 9 1 0 0 1 - C o n t r o l . . _ . _ — - — w * ~ — — — A f f e c t e d F i g u r e 2 8 . T y p i c a l a g g r e g a t i o n c u r v e s f o r c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 2 0 p M A 2 3 1 8 7 . C o n t r o l p l a t e l e t s i n p l a t e l e t r i c h p l a s m a r e l e a s e d A T P i n r e s p o n s e t o a l l c o n c e n t r a t i o n s o f A 2 3 1 8 7 u s e d . S e c r e t i o n o f A T P f r o m a f f e c t e d p l a t e l e t s e i t h e r d i d n o t o c c u r o r w a s g r e a t l y r e d u c e d c o m p a r e d t o c o n t r o l s . T h e s e r e s u l t s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 1 3 . 1 9 0 T a b l e 1 3 . D e n s e g r a n u l e A T P s e c r e t i o n ( u M ) a n d t i m e t o r e a c h p e a k s e c r e t i o n ( m i n u t e s ) b y c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y t h e c a l c i u m i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 . A 2 3 1 8 7 A T P S e c r e t e d T i m e t o M a x ? S e c r e t i o n ( 0 M ) C o n t r o l A f f e c t e d C o n t r o l A f f e c t e d 1 0 3 . 6 i 1 . 9 ( 3 ) N D 2 . 1 i 0 . 5 ( 3 ) N D 1 5 4 . 3 i 0 . 9 ( 5 ) 0 . 2 1 i 0 . 0 8 ( 4 ) * 2 . 8 i 1 . 2 ( 5 ) 1 . 4 i 0 . 6 ( 4 ) 2 0 4 . 7 i 0 . 3 ( 5 ) 0 . 2 7 i 0 . 1 3 ( 4 ) * 1 . 9 i 0 . 3 ( 5 ) 1 . 0 i 0 . 4 ( 4 ) * V a l u e s - m e a n i S D , ( n ) - n u m b e r o f s a m p l e s , N D - ” n o t d o n e " , * - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l p l a t e l e t s ( p < 0 . 0 5 ) . F i g u r e s 2 9 a , 2 9 b , 3 0 a a n d 3 0 b s h o w t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h s o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s o n e a n d s i x m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 7 . 5 p M A 2 3 1 8 7 . G e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s , r a t h e r t h a n p l a t e l e t r i c h p l a s m a , w e r e u s e d i n t h i s s t u d y t o d e m o n s t r a t e t h e l y t i c e f f e c t o f a h i g h e f f e c t i v e c o n c e n t r a t i o n o f A 2 3 1 8 7 i n b u f f e r w i t h a l o w p r o t e i n c o n t e n t . A t o n e m i n u t e , c o n t r o l p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 7 . 5 u M A 2 3 1 8 7 h a d c h a n g e d s h a p e , c e n t r a l i z e d t h e i r g r a n u l e s a n d w e r e s t a r t i n g t o a g g r e g a t e . T h e a f f e c t e d p l a t e l e t s a t t h i s t i m e h a d a l s o c h a n g e d s h a p e a n d c e n t r a l i z e d t h e i r g r a n u l e s , b u t t h e r e w a s n o e v i d e n c e o f a g g r e g a t i o n . B y s i x m i n u t e s , c o n t r o l p l a t e l e t s h a d c o m p l e t e l y a g g r e g a t e d . A f f e c t e d p l a t e l e t s h a d n o t a g g r e g a t e d , b u t s t i l l s h o w e d 1 9 1 s h a p e c h a n g e a n d s o m e g r a n u l e c e n t r a l i z a t i o n . L y s i s w a s n o t a p p a r e n t m o r p h o l o g i c a l l y a t t h i s t i m e . W h e n t h e s e c t i o n s o f a f f e c t e d p l a t e l e t s w e r e s c a n n e d , a s i n g l e s m a l l a g g r e g a t e w a s f o u n d . I n s o m e a r e a s i t d i d a p p e a r t h a t t h e r e w a s p o s s i b l y s o m e c o n t a c t o r a g g r e g a t i o n b e t w e e n g r o u p s o f t w o o r t h r e e a f f e c t e d p l a t e l e t s . T h i s w o u l d n o t b e d e t e c t a b l e b y o p t i c a l p l a t e l e t a g g r e g o m e t r y . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h s o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s e x p o s e d t o 2 0 p M A 2 3 1 8 7 s h o w e d r a p i d l y s i s a n d s l o w e r o n s e t o f l y s i s a s t h e i o n o p h o r e c o n c e n t r a t i o n w a s d e c r e a s e d t o 1 0 p M . F i g u r e s 3 1 a , 3 1 b , 3 2 a a n d 3 2 b s h o w t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h s o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s o n e a n d t h r e e m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 2 0 p M A 2 3 1 8 7 . F i g u r e 3 3 s h o w s t h e c o r r e s p o n d i n g a g g r e g o m e t e r t r a c i n g . 1 9 2 F i g u r e 2 9 a . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f c o n t r o l g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s o n e m i n u t e a f t e r t h e a d d i t i o n o f 7 . 5 p M A 2 3 1 8 7 ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e c h a n g e d s h a p e , c e n t r a l i z e d t h e i r g r a n u l e s a n d s t a r t e d t o a g g r e g a t e . F i g u r e 2 9 b . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s o n e m i n u t e a f t e r t h e a d d i t i o n o f 7 . 5 u M A 2 3 1 8 7 ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e c h a n g e d s h a p e a n d c e n t r a l i z e d t h e i r g r a n u l e s , b u t h a v e n o t s t a r t e d t o a g g r e g a t e 1 9 3 _ fi — v — v 1 9 4 F i g u r e 3 0 a . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f c o n t r o l g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s i x m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 7 . 5 p M A 2 3 1 8 7 ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e a g g r e g a t e d f u l l y . F i g u r e 3 0 b . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d ' p l a t e l e t s s i x m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 7 . 5 p M A 2 3 1 8 7 ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e c h a n g e d s h a p e a n d t h e r e i s s o m e c e n t r a l i z a t i o n o f g r a n u l e s , b u t t h e y h a v e n o t a g g r e g a t e d . 1 9 5 1 9 6 F i g u r e 3 1 a . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f c o n t r o l g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s o n e m i n u t e a f t e r t h e a d d i t i o n o f 2 0 p M A 2 3 1 8 7 ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e c h a n g e d s h a p e , c e n t r a l i z e d t h e i r g r a n u l e s a n d s t a r t e d t o a g g r e g a t e . F i g u r e 3 1 b . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s o n e m i n u t e a f t e r t h e a d d i t i o n o f 2 0 p M A 2 3 1 8 7 ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e u n d e r g o n e s o m e s h a p e c h a n g e a n d g r a n u l e c e n t r a l i z a t i o n , b u t h a v e n o t a g g r e g a t e d . 1 9 7 1 9 8 F i g u r e 3 2 a . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f c o n t r o l g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s t h r e e m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 2 0 p M A 2 3 1 8 7 ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e u n d e r g o n e l y s i s . F i g u r e 3 2 b . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s t h r e e m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 2 0 p M A 2 3 1 8 7 ( X 1 1 , 2 5 0 ) . T h e p l a t e l e t s h a v e u n d e r g o n e l y s i s . 1 9 9 1 9 , 1 1 . , e ' v ‘ ‘ s fi g g i ‘ é £ 3 8 8 : 4 6 A 7 n o i s s i m s n a r T t h g i L % 2 0 0 1 0 0 W " I 1 m i n F i g u r e 3 3 . A g g r e g o m e t e r r e c o r d i n g c o r r e s p o n d i n g t o t h e t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h s o f a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 2 0 p M A 2 3 1 8 7 ( F i g u r e s 3 1 b a n d 3 2 b ) . W h e n c o n t r o l p l a t e l e t r i c h p l a s m a w a s t r e a t e d w i t h 1 . 0 m M a s p i r i n p r i o r t o a c t i v a t i o n w i t h 2 0 p M A 2 3 1 8 7 , t h e r e w a s m o d e r a t e , b u t n o t s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t , i n h i b i t i o n o f t h e p e r c e n t a g g r e g a t i o n . T h e r a t e o f a g g r e g a t i o n o f c o n t r o l p l a t e l e t s a n d a m o u n t o f A T P s e c r e t e d w e r e s i g n i f i c a n t l y i n h i b i t e d w h i l e t h e t i m e t o m a x i m u m s e c r e t i o n w a s s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d . A l t h o u g h s i m i l a r c h a n g e s o c c u r r e d i n a s p i r i n - t r e a t e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 1 5 p M A 2 3 1 8 7 , t h e y w e r e n o t s i g n i f i c a n t . T h e s e r e s u l t s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e s 1 4 a n d 1 5 . 2 0 1 T a b l e 1 4 . M a x i m u m a g g r e g a t i o n ( % ) , s l o p e , A T P s e c r e t i o n ( u M ) a n d t i m e t o m a x i m u m s e c r e t i o n ( m i n u t e s ) o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 2 0 p M A 2 3 1 8 7 i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f 1 . 0 m M a s p i r i n . 1 . 0 m M A s p i r i n C o n t r o l A f f e c t e d 8 A g g r e g a t i o n - 6 8 . 8 r 7 . 8 ( 5 ) 0 ( 4 ) * + 3 9 . 1 i 2 5 . 8 ( 4 ) 0 ( 4 ) * S l o p e - 6 . 3 r 1 . 4 ( 5 ) 0 ( 4 ) * + 2 . 7 t 2 . 2 ( 4 ) ' 0 ( 4 ) * A T P a n - 4 . 7 r 0 . 3 ( 5 ) 0 . 2 7 r 0 . 1 3 ( 4 ) ‘ + 2 . 7 r 0 . 4 ( 4 ) ' 0 . 0 8 r 0 1 0 ( 4 ) * T i m e t o M a x ? S e c r e t i o n - 1 . 9 r 0 . 3 ( 5 ) 1 0 r 0 . 4 ( 4 ) “ + 2 . 9 r 0 . 6 ( 4 ) ' 1 3 r 0 . 2 ( 2 ) * V a l u e s - m e a n f S D , ( n ) - n u m b e r o f s a m p l e s , * - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l p l a t e l e t s ( p < 0 . 0 5 ) , # - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m n o n - a s p i r i n - t r e a t e d p l a t e l e t s ( p < 0 . 0 5 ) . 2 0 2 T a b l e 1 5 . M a x i m u m a g g r e g a t i o n ( % ) , s l o p e , A T P s e c r e t i o n ( p M ) a n d t i m e t o m a x i m u m s e c r e t i o n ( m i n u t e s ) o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 5 u M A 2 3 1 8 7 i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f 1 . 0 m M a s p i r i n . 1 . 0 m M A s p i r i n C o n t r o l A f f e c t e d % A g g r e g a t i o n - 6 1 . 5 i 1 0 . 1 ( 4 ) O ( 4 ) ' + 3 5 . 9 r 2 1 . 2 ( 3 ) 0 ( 4 ) * S l o p e - 5 . 4 i 1 . 4 ( 4 ) 0 ( 4 ) * + 2 . 2 r 1 . 2 ( 3 ) 0 ( 4 ) “ A T P . 8 4 - 4 . 3 i 0 . 9 ( 5 ) 0 . 2 1 i 0 . 0 8 ( 4 ) * + 2 l r 0 9 ( 3 ) 0 . 0 6 r 0 . 0 8 ( 4 ) * T i m e t o M a x ? S e c r e t i o n - 2 8 i 1 . 2 ( 5 ) 1 . 4 i 0 . 6 ( 4 ) + 3 0 i 0 . 1 ( 3 ) 1 . 5 1 + . 0 ( 2 ) * V a l u e s - m e a n i S D , ( n ) - n u m b e r o f s a m p l e s , * - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l p l a t e l e t s ( p < 0 . 0 5 ) . 2 0 3 D i t h i o t h r e i t o l D i t h i o t h r e i t o l i s a r e d u c i n g a g e n t w h i c h c a u s e s p l a t e l e t a g g r e g a t i o n n o t a s s o c i a t e d w i t h s h a p e c h a n g e o r s e c r e t i o n o f g r a n u l e c o n t e n t s . P l a t e l e t s t r e a t e d w i t h d i t h i o t h r e i t o l d o b i n d 1 2 5 I - l a b e l e d f i b r i n o g e n . T h u s , i t a p p e a r s t h a t d i t h i o t h r e i t o l e x p o s e s t h e f i b r i n o g e n r e c e p t o r G P I I b - I l l a , e n a b l i n g t h e p l a t e l e t s t o b i n d f i b r i n o g e n a n d a g g r e g a t e . C o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s i n p l a t e l e t r i c h p l a s m a s h o w e d a s l o w b u t i r r e v e r s i b l e i n c r e a s e i n l i g h t t r a n s m i s s i o n o n t h e a g g r e g o m e t e r r e c o r d i n g . T h e s e r e s u l t s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 1 6 . A s h a s b e e n r e p o r t e d f o r h u m a n p l a t e l e t s , d i t h i o t h r e i t o l ( 5 . 0 a n d 1 0 m M ) d i d n o t c a u s e t h e s e c r e t i o n o f d e n s e g r a n u l e c o n t e n t s i n e i t h e r g r o u p . “ 3 0 T a b l e 1 6 . M a x i m u m p e r c e n t a g g r e g a t i o n a n d s l o p e o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a e x p o s e d t o d i t h i o t h r e i t o l ( D T T ) . D T T 8 A g g r e g a t i o n M a x i m u m S l o p e ( m M ) C o n t r o l A f f e c t e d C o n t r o l A f f e c t e d 1 . 4 2 0 ( 2 ) N D 0 ( 2 ) N D 1 . 6 7 1 7 . 8 i 6 . 2 ( 3 ) N D 0 . 2 3 i 0 . 0 6 ( 3 ) N D 2 . 0 2 2 . 1 i 7 . 0 ( 3 ) N D 0 . 3 3 i 0 . 1 5 ( 3 ) N D 5 . 0 3 3 . 1 i 4 . 0 ( 3 ) 3 5 . 5 i 1 3 . 4 ( 3 ) 0 . 7 8 i 0 . 1 3 ( 3 ) 0 . 7 3 i 0 . 4 0 ( 3 ) 6 . 6 5 3 3 . 1 i 3 . 6 ( 5 ) N D 0 . 7 7 i 0 . 0 6 ( 3 ) N D 1 0 2 9 . 4 i 2 . 8 ( 3 ) 4 6 . 2 i 9 . 6 ( 3 ) * 0 . 9 0 i 0 . 2 6 ( 3 ) 1 . 1 i 0 . 2 ( 3 ) V a l u e s - m e a n i S D , ( n ) - n u m b e r o f s a m p l e s , N D - " n o t d o n e " , * - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t t o c o n t r o l p l a t e l e t s ( p < 0 . 0 5 ) . 2 0 4 D I S C U S S I O N T h e r e s p o n s e o f a f f e c t e d B a s s e t h o u n d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y A D P c o n s i s t e d o f c o m p l e t e f a i l u r e o f p r i m a r y a g g r e g a t i o n t h a t w a s a c c o m p a n i e d b y c o n c u r r e n t s e c r e t i o n o f d e n s e g r a n u l e A T P . S e c r e t i o n o c c u r r e d f i v e t o s i x t i m e s m o r e r a p i d l y t h a n i n c o n t r o l p l a t e l e t s . I n a n e a r l i e r s t u d y , t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h s o f a f f e c t e d p l a t e l e t s a c t i v a t e d w i t h A D P v e r i f i e d t h e f a i l u r e o f a g g r e g a t i o n a n d 7 7 e a r l y s e c r e t i o n . 3 T h e m o r p h o l o g y o f r e s t i n g a f f e c t e d p l a t e l e t s w a s n o r m a l . T h e s e f i n d i n g s c o n f i r m a n d a d d d e t a i l t o d a t a r e p o r t e d b y o t h e r w o r k e r s . 7 5 W h e n A D P i s u s e d t o a c t i v a t e h u m a n o r c o n t r o l c a n i n e p l a t e l e t s , i t a c t s a s a w e a k a g o n i s t . ° ° ' 2 6 3 I t c a n n o t c a u s e i r r e v e r s i b l e s e c o n d a r y a g g r e g a t i o n o f p l a t e l e t s u n l e s s t h e s e c r e t i o n r e s p o n s e o c c u r s . T h e s e c r e t i o n r e s p o n s e i s a g g r e g a t i o n - d e p e n d e n t a n d d o e s n o t o c c u r i n t h e a b s e n c e o f p r i m a r y a g g r e g a t i o n . S e c r e t i o n o c c u r s w e l l a f t e r a g g r e g a t i o n h a s s t a r t e d , r e g a r d l e s s o f t h e c o n c e n t r a t i o n o f A D P u s e d , a n d i s i n h i b i t e d b y i n h i b i t o r s o f c y c l o o x y g e n a s e . C o n t r o l c a n i n e p l a t e l e t s r e s p o n d e d t o 1 0 u M A D P i n t h i s f a s h i o n . S e c r e t i o n o f d e n s e g r a n u l e c o n t e n t s p e a k e d a p p r o x i m a t e l y t w o m i n u t e s a f t e r t h e o n s e t o f a g g r e g a t i o n a n d w a s a l m o s t c o m p l e t e l y i n h i b i t e d b y a s p i r i n . T h e r e s p o n s e o f a f f e c t e d p l a t e l e t s t o A D P d o e s n o t f i t t h a t o f a w e a k a g o n i s t i n t h a t s e c r e t i o n o f d e n s e g r a n u l e c o n t e n t s o c c u r r e d i n t h e a b s e n c e o f p r i m a r y a g g r e g a t i o n . H o w e v e r , A T P s e c r e t i o n w a s a l m o s t c o m p l e t e l y i n h i b i t e d b y a s p i r i n , s u g g e s t i n g t h a t A T P s e c r e t i o n f r o m a f f e c t e d p l a t e l e t s i s t h e r e s u l t o f p r o d u c t i o n o f a r a c h i d o n a t e e d t i w o y e n a h c e T s h s i c l c i h u s o r b s e r o i i l s r x r b t i t e y e e e g u d g s d d h d y e p t a f n o b l f . a n o y y t r s s e e e r a r D s h s e e p u p d n v n i e r o m i u s e f a r c e i n c u e n t s n d c g b , . o p r a n l a t t a a n i r t l u T o P t o e l h n r h l l e e i o e r w m u c s t e i s a g a e t . r n h w h c y i e r a I e e t t s n r a e a g i r g p r 0 n o a v 1 l e . n o s M l P t e A i e p r D n w v o e F a p e i r b t b u P s e s l t A c s p i r i n , w a s r e g a t i o n . 3 1 0 a t e e n g h r n s g e e g e s e e t i r i g x s o g e r s m a t n i t e i i 1 l i n . f n a o t 0 i r n c t o h u a t o f w e M n a t a P s m l h n g d F t g e A y o r o i r s t e u s e e g t m a i d u c t l i i n l e o n d . 2 0 5 m e t a b o l i t e s i n t h e a b s e n c e o f p r i m a r y a g g r e g a t i o n . T h i s s i t u a t i o n h a s n o t b e e n d e s c r i b e d b e f o r e a n d c a n n o t b e e x p l a i n e d b y c u r r e n t k n o w l e d g e . H o w e v e r , i t d o e s s u g g e s t t h a t t h e r e m a y b e a n e v e n t o r e v e n t s o t h e r t h a n p r i m a r y a g g r e g a t i o n t h a t i n i t i a t e s e c r e t i o n o f a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s , s e c r e t i o n o f d e n s e g r a n u l e c o n t e n t s a n d i r r e v e r s i b l e a g g r e g a t i o n i n r e s p o n s e t o a w e a k a g o n i s t s s u c h a s A D P . A l t h o u g h t h e r e h a v e b e e n c o n f l i c t i n g r e p o r t s a b o u t t h e e f f e c t o f c y c l o o x y g e n a s e i n h i b i t o r s o n P A F , i t i s n o w g e n e r a l l y c o n s i d e r e d t o b e a n a g o n i s t o f i n t e r m e d i a t e s t r e n g t h . 7 7 ' 1 " “ 3 1 0 ' “ 7 o P l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r c a n i n d u c e s e c r e t i o n i n t h e a b s e n c e o f t h e f o r m a t i o n o f a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s , b u t t h e r e s p o n s e i s i n h i b i t e d , p a r t i c u l a r l y i n r e s p o n s e t o l o w e r c o n c e n t r a t i o n s o f P A F . T h e e f f e c t o f c y c l o o x y g e n a s e i n h i b i t o r s o n P A F - i n d u c e d a g g r e g a t i o n i s v a r i a b l e : i n h i b i t i o n o f a g g r e g a t i o n v a r i e s f r o m n o a p p a r e n t i n h i b i t i o n i n r e s p o n s e t o h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f P A F t o p a r t i a l r e v e r s a l i n r e s p o n s e t o l o w e r c o n c e n t r a t i o n s . R e m o v a l o f e x t r a c e l l u l a r A D P f r o m t h e m e d i u m w i t h a p y r a s e o r c r e a t i n e p h o s p h a t e / c r e a t i n i n e p h o s p h o k i n a s e i n h i b i t s i r r e v e r s i b l e a g g r e g a t i o n . N e i t h e r r e m o v a l o f A D P o r i n h i b i t i o n o f s u r f a c T a p h t i e e r l i p a l s e v e p r s e t n , r y a o w l p e r s e t m r h a o e t l u i e s l g s t h i i n m t o u h c f l r i t h e a s a t s e w e d e a s p b i l y n n a o e i . t t l 1 l 0 g s e t h t t p a M t s t i u r P s c A t a h F i n t m w a h i a l a s s l t y s s c i c s o o s o n m i m p g e n s l a e t g n e f i u h g l w y t e i i n n n h a n t . l c e e i a a i t f b T i f i o e t h e n c e i e o s d b r y e t d m a b l e 2 0 6 T h e i n h i b i t i o n o f s e c r e t i o n i n r e s p o n s e t o 0 . 1 p M P A F w a s n o t s i g n i f i c a n t , b u t t h e s e r e s u l t s w e r e s t r o n g l y i n f l u e n c e d b y t h e o n e c o n t r o l d o g w h i c h d i d n o t a g g r e g a t e o r r e l e a s e A T P i n r e s p o n s e t o t h i s c o n c e n t r a t i o n o f P A F . E x a m i n a t i o n o f t h e i n d i v i d u a l r e s u l t s i n d i c a t e s t h a t a s p i r i n c o m p l e t e l y o r m a r k e d l y i n h i b i t e d A T P s e c r e t i o n i n r e s p o n s e t o 0 . 1 p M P A F . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t : ( l ) s e c r e t i o n i n r e s p o n s e t o P A F i s m o r e d e p e n d e n t t h a n a g g r e g a t i o n o n t h e p r o d u c t i o n o f a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s ; a n d ( 2 ) i n h i b i t i o n o f a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e p r o d u c t i o n d o e s n o t s i g n i f i c a n t l y a f f e c t e i t h e r p r i m a r y o r s e c o n d a r y a g g r e g a t i o n i n r e s p o n s e t o t h e c o n c e n t r a t i o n s o f P A F u s e d . P l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r d i d n o t c a u s e a f f e c t e d p l a t e l e t s t o a g g r e g a t e . T h e s l i g h t t o m o d e r a t e i n c r e a s e i n l i g h t t r a n s m i s s i o n t h a t o c c u r r e d w h e n a f f e c t e d p l a t e l e t s w e r e s t i m u l a t e d b y h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f P A F ( 5 . 0 a n d 1 0 u M ) m a y r e p r e s e n t t r u e a g g r e g a t i o n , o r i t m a y r e f l e c t p l a t e l e t a g g l u t i n a t i o n . T h e r e c o r d e r t r a c i n g g e n e r a t e d w a s n o t t h a t o f a r e v e r s i b l e p r i m a r y a g g r e g a t i o n , b u t a m o r e g r a d u a l i n c r e a s e i n l i g h t t r a n s m i s s i o n s i m i l a r t o t h a t s e e n w i t h d i t h i o t h r e i t o l . P l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r i s a h y d r o p h o b i c m o l e c u l e w h i c h i s a b l e t o i n t e r a c t w i t h a n d p e n e t r a t e t h e p l a t e l e t m e m b r a n e . I t m a y b e t h a t , i n t h e a b s e n c e o f a g g r e g a t i o n , h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f P A F a l t e r t h e t o o c c u r . 2 0 7 m a r k e d i n h i b i t i o n b y a s p i r i n o f A T P s e c r e t i o n f r o m a f f e c t e d p l a t e l e t s c o m p a r e d t o c o n t r o l s s t i m u l a t e d b y 1 . 0 u M P A F s u g g e s t s t h a t a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s m a y p l a y a m o r e i m p o r t a n t r o l e i n i n d u c i n g s e c r e t i o n i n a f f e c t e d p l a t e l e t s . T h i s d i f f e r e n c e s e e m s u n l i k e l y t o b e r e l a t e d t o e f f e c t s o f r e l e a s e d A D P o n s e c r e t i o n , a s n e i t h e r c o n t r o l n o r a f f e c t e d a s p i r i n - t r e a t e d p l a t e l e t s r e l e a s e d A T P i n r e s p o n s e t o A D P . H o w e v e r , r e l e a s e d A D P m a y c o n t r i b u t e t o t h e a g g r e g a t i o n r e s p o n s e o f c o n t r o l a s p i r i n - t r e a t e d p l a t e l e t s . W h i l e A T P s e c r e t i o n f r o m c o n t r o l p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 1 p M P A F w a s m a r k e d l y r e d u c e d b y a s p i r i n , a f f e c t e d p l a t e l e t s f a i l e d t o s e c r e t e i n t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f a s p i r i n . I f t h e f o r m a t i o n o f a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s i s a l w a y s a c c o m p a n i e d b y t h e s e c r e t i o n o f d e n s e a n d a l p h a g r a n u l e c o n t e n t s , i t c a n b e p r o p o s e d t h a t a f f e c t e d p l a t e l e t s f a i l t o l i b e r a t e a r a c h i d o n i c a c i d a n d / o r m e t a b o l i z e a r a c h i d o n i c a c i d t o e n d o p e r o x i d e s a n d t h r o m b o x a n e i n r e s p o n s e t o 0 . 1 p M P A F . A s i m i l a r a s s u m p t i o n c o u l d b e m a d e f o r t h e c o n t r o l d o g w h i c h d i d n o t a g g r e g a t e o r s e c r e t e i n r e s p o n s e t o 0 . 1 p M P A F . I t i s p r e s u m e d t h a t t h i s d i f f e r e n c e i n t h e c o n t r o l p o p u l a t i o n i s a r e f l e c t i o n o f i n d i v i d u a l v a r i a t i o n i n t h e s e n s i t i v i t y t o P A F , a s h a s b e e n r e p o r t e d i n m a n . 7 7 T h e r e s u l t s f r o m t h i s s t u d y i n d i c a t e t h a t P A F i s a n a g o n i s t o f i n t e r m e d i a t e s t r e n g t h . W h e n u s e d a t a l o w c o n c e n t r a t i o n s u c h a s 0 . 1 u M , s e c r e t i o n a n d , t o a l e s s e r e x t e n t , a g g r e g a t i o n a r e i n h i b i t e d b y a s p i r i n . T h e e f f e c t s o f r e l e a s e d A D P w e r e n o t e x a m i n e d i n t h i s s t u d y , b u t r e l e a s e d A D P m a y c o n t r i b u t e t o t h e a g g r e g a t i o n r e s p o n s e o f a s p i r i n - 2 0 8 t r e a t e d p l a t e l e t s . A t t h e h i g h e r c o n c e n t r a t i o n o f 1 . 0 p M , a s p i r i n p a r t i a l l y i n h i b i t s t h e s e c r e t i o n r e s p o n s e , b u t d o e s n o t i n h i b i t a g g r e g a t i o n . T h e r e s p o n s e o f a f f e c t e d p l a t e l e t s t o P A F i s s i m i l a r t o t h e i r r e s p o n s e t o A D P . B o t h a g o n i s t s f a i l t o i n i t i a t e p r i m a r y a g g r e g a t i o n , a l t h o u g h h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f P A F d o c a u s e s o m e i n c r e a s e i n l i g h t t r a n s m i s s i o n . S e c r e t i o n o f d e n s e g r a n u l e c o n t e n t s i s m a r k e d l y i n h i b i t e d b y t r e a t m e n t w i t h a s p i r i n w h i c h i n d i c a t e s t h a t s e c r e t i o n i s d e p e n d e n t u p o n t h e f o r m a t i o n o f a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s . T h e s e m e t a b o l i t e s a r e f o r m e d i n t h e a b s e n c e o f p r i m a r y a g g r e g a t i o n . T h e g r e a t e r s e n s i t i v i t y o f a f f e c t e d p l a t e l e t s t o t h e i n h i b i t o r y e f f e c t s o f a s p i r i n s u g g e s t t h a t a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s m a y p l a y a m o r e i m p o r t a n t r o l e i n t h e s e c r e t o r y r e s p o n s e o f a f f e c t e d t h a n c o n t r o l p l a t e l e t s . T h r o m b i n i s a s t r o n g a g o n i s t w h i c h c a n i n d u c e i r r e v e r s i b l e a g g r e g a t i o n i n t h e a b s e n c e o f t h e r e l e a s e r e s p o n s e . S e c r e t i o n i s n o t d e p e n d e n t o n a g g r e g a t i o n . H o w e v e r , t h e e x a c t m e c h a n i s m o f t h r o m b i n - i n d u c e d p l a t e l e t a c t i v a t i o n i s n o t k n o w n . T h r o m b i n h a s a t l e a s t t w o m e c h a n i s m s o f a c t i o n . O n e i s a h o r m o n e - l i k e b i n d i n g t o G P I b o n t h e p l a t e l e t m e m b r a n e . B i n d i n g t o t h i s h i g h a f f i n i t y b i n d i n g s i t e i s e s s e n t i a l f o r p l a t e l e t a c t i v a t i o n b y l o w c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n . 1 8 1 T h r o m b i n i s a l s o a s e r i n e p r o t e a s e w h i c h s p e c i f i c a l l y c l e a v e s G P V o n t h e p l a t e l e t s u r f a c e t o r e l e a s e a h y d r o l y t i c f r a g m e n t . 3 8 3 H o w e v e r , t h e r o l e o f t h e p r o t e o l y t i c a c t i v i t y o f t h r o m b i n i n p l a t e l e t a c t i v a t i o n i s n o t k n o w n . B e r n a r d - S o u l i e r p l a t e l e t s t h a t l a c k G P I b , G P V a n d G P I X a r e l e s s s e n s i t i v e t o l o w c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n , b u t r e s p o n d a l m o s t 2 0 9 n o r m a l l y t o h i g h c o n c e n t r a t i o n s . S i m i l a r l y , p l a t e l e t s t h a t h a v e b e e n t r e a t e d w i t h e x o g e n o u s p r o t e a s e s s u c h a s C a 2 + - d e p e n d e n t p r o t e a s e o r c h y m o t r y p s i n t o r e m o v e G P I b a n d G P V f r o m t h e p l a t e l e t s u r f a c e a r e s t i l l a b l e t o r e s p o n d t o t h r o m b i n . T h e r e i s a d e l a y i n t h e o n s e t o f t h e a g g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n r e s p o n s e , b u t t h e e x t e n t o f a g g r e g a t i o n i s n o t s i g n i f i c a n t l y a l t e r e d . 3 2 2 T h i s s u g g e s t s t h a t G P I b a n d G P V m a y n o t b e e s s e n t i a l f o r t h e i n d u c t i o n o f t h e r e s p o n s e o f p l a t e l e t s t o t h r o m b i n , b u t m a y p l a y a r o l e i n a c c e l e r a t i n g o r a m p l i f y i n g i t . A f t e r a d e l a y o f o n e t o t h r e e m i n u t e s , a f f e c t e d p l a t e l e t s a g g r e g a t e d m a x i m a l l y i n r e s p o n s e t o c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n o f 0 . 2 U / m l o r h i g h e r . A t c o n c e n t r a t i o n s o f l e s s t h a n 0 . 2 U / m l , a g g r e g a t i o n w a s e i t h e r m i n i m a l o r h a d n o t s t a r t e d w i t h i n f i v e m i n u t e s o f t h e a d d i t i o n o f t h e t h r o m b i n . F r o m t h i s i t c a n b e c o n c l u d e d t h a t , a l t h o u g h a f f e c t e d p l a t e l e t s d o a g g r e g a t e i n r e s p o n s e t o t h r o m b i n , t h e i r r e s p o n s e i s d i f f e r e n t f r o m t h a t o f t h e c o n t r o l g r o u p i n a t l e a s t t w o w a y s . F i r s t l y , a f f e c t e d p l a t e l e t s a r e l e s s s e n s i t i v e t o l o w e r c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n t h a n c o n t r o l p l a t e l e t s . S e c o n d l y , t h e d e l a y e d o n s e t , d e c r e a s e d r a t e o f a g g r e g a t i o n a n d i n c r e a s e d t i m e t o r e a c h m a x i m u m a g g r e g a t i o n c o m p a r e d t o c o n t r o l s i m p l i e s t h a t t h e m e c h a n i s m s o f a c t i v a t i o n b y t h r o m b i n m a y b e d i f f e r e n t i n t h e t w o g r o u p s . A l t h o u g h t h e r a t e o f a g g r e g a t i o n w a s s i g n i f i c a n t l y l e s s i n t h e a f f e c t e d p l a t e l e t s , t h e a m o u n t a n d r a t e o f A T P r e l e a s e w a s n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h a t o f c o n t r o l p l a t e l e t s . E v e n w h e n a g g r e g a t i o n f a i l e d t o o c c u r w i t h i n f i v e m i n u t e s o f t h e a d d i t i o n o f 0 . 0 5 U / m l o f t h r o m b i n , a f f e c t e d p l a t e l e t s s t i l l s e c r e t e d a s m a l l a m o u n t o f 2 1 0 A T P . A s t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h r o m b i n w a s d e c r e a s e d , t h e a m o u n t o f A T P s e c r e t e d d e c r e a s e d a n d t h e t i m e t o m a x i m u m s e c r e t i o n i n c r e a s e d i n b o t h g r o u p s . H o w e v e r , a t c o n c e n t r a t i o n s o f 0 . 2 U / m l o r l e s s , t h e s e c h a n g e s i n t h e a f f e c t e d g r o u p a p p e a r e d t o b e a m p l i f i e d c o m p a r e d t o t h e c o n t r o l g r o u p . T h e s e c r e t i o n r e s u l t s f o r b o t h g r o u p s a r e c o m p a t i b l e w i t h t h r o m b i n ' s f u n c t i o n a s a s t r o n g a g o n i s t w h i c h i s c a p a b l e o f i n d u c i n g s e c r e t i o n i n t h e a b s e n c e o f a g g r e g a t i o n . W h e n p l a t e l e t s w e r e i n c u b a t e d w i t h 1 . 0 m M a s p i r i n b e f o r e b e i n g s t i m u l a t e d w i t h 0 . 3 U / m l t h r o m b i n , a c o n c e n t r a t i o n t h a t i s g e n e r a l l y c o n s i d e r e d t o b e h i g h , i t w a s e x p e c t e d t h a t i t w o u l d h a v e n o e f f e c t o n a g g r e g a t i o n o r s e c r e t i o n , a t l e a s t i n t h e c o n t r o l g r o u p . T h e r e w a s h o w e v e r a s l i g h t , b u t s i g n i f i c a n t , r e d u c t i o n i n t h e a m o u n t o f A T P s e c r e t e d b y c o n t r o l p l a t e l e t s . T h e o v e r a l l a g g r e g a t i o n r e s p o n s e w a s r e d u c e d s l i g h t l y , a l t h o u g h n o t s i g n i f i c a n t l y . I n c o n t r a s t , a s p i r i n s i g n i f i c a n t l y i n h i b i t e d b o t h t h e e x t e n t a n d r a t e o f t h e a g g r e g a t i o n r e s p o n s e o f a f f e c t e d p l a t e l e t s a n d c a u s e d a d r a m a t i c i n c r e a s e i n t h e t i m e t a k e n t o r e a c h m a x i m u m a g g r e g a t i o n . T h e a m o u n t o f A T P s e c r e t e d w a s s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d a n d t h e t i m e t a k e n t o r e a c h m a x i m u m s e c r e t i o n - s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d . T h i s i n d i c a t e s t h a t a m a j o r d i f f e r e n c e b e t w e e n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s i n t h e i r r e s p o n s e s t o t h r o m b i n i s t h e m u c h g r e a t e r d e p e n d e n c e o f a f f e c t e d p l a t e l e t s o n t h e p r o d u c t i o n o f a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s . A l t h o u g h t h e m e a n v a l u e s f o r p e r c e n t a g g r e g a t i o n , s l o p e , t i m e t o m a x i m u m a g g r e g a t i o n , A T P r e l e a s e d a n d t i m e t o m a x i m u m s e c r e t i o n w e r e r e d u c e d i n a s p i r i n - t r e a t e d c o n t r o l p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 2 1 1 0 . 1 o r 0 . 0 5 U / m l t h r o m b i n , t h e s e r e d u c t i o n s w e r e n o t s i g n i f i c a n t . T w o o f t h e f o u r a f f e c t e d d o g s a g g r e g a t e d w e a k l y i n r e s p o n s e t o 0 . 1 U / m l t h r o m b i n . T h i s a g g r e g a t i o n w a s c o m p l e t e l y i n h i b i t e d b y a s p i r i n . A l t h o u g h t h e r e d u c t i o n i n A T P s e c r e t i o n i n a s p i r i n - t r e a t e d a f f e c t e d p l a t e l e t s w a s n o t s i g n i f i c a n t , t h e g r o u p i n c l u d e d o n e d o g w h i c h d i d n o t r e l e a s e i n t h e a b s e n c e o r p r e s e n c e o f a s p i r i n . E x a m i n a t i o n o f t h e i n d i v i d u a l r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t a s p i r i n m a r k e d l y i n h i b i t e d A T P s e c r e t i o n b y a f f e c t e d p l a t e l e t s . A f f e c t e d d o g s d i d n o t a g g r e g a t e i n r e s p o n s e t o 0 . 0 5 U / m l t h r o m b i n i n t h e a b s e n c e o r p r e s e n c e o f a s p i r i n . T h e s m a l l a m o u n t o f A T P s e c r e t i o n w a s f u r t h e r r e d u c e d i n t h e p r e s e n c e o f a s p i r i n . T h e l a c k o f s i g n i f i c a n t e f f e c t o f a s p i r i n o n c o n t r o l p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y t h e l o w e r c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n w a s n o t e x p e c t e d . T h e r e w a s m a r k e d i n d i v i d u a l v a r i a t i o n i n t h e a g g r e g a t i o n r e s p o n s e t o 0 . 1 a n d 0 . 0 5 U / m l t h r o m b i n w h i c h m a d e e s t a b l i s h i n g s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s d i f f i c u l t . I t s e e m s u n l i k e l y t h a t t h e t h r o m b i n c o n c e n t r a t i o n w a s n o t l o w e n o u g h a s o n l y t h r e e o f f i v e c o n t r o l d o g s a g g r e g a t e d a t t h i s c o n c e n t r a t i o n a n d n o c o n t r o l d o g s a g g r e g a t e d i n r e s p o n s e t o 0 . 0 2 5 U / m l t h r o m b i n . I n c o n t r a s t , a f f e c t e d p l a t e l e t s a p p e a r e d t o b e m o r e s e n s i t i v e t h a n c o n t r o l p l a t e l e t s t o t h e e f f e c t s o f a s p i r i n w h e n s t i m u l a t e d b y t h r o m b i n . S i m i l a r t o A D P - a n d P A F - s t i m u l a t e d a f f e c t e d p l a t e l e t s , t h e p r o d u c t i o n o f a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s a p p e a r s t o p l a y a m o r e i m p o r t a n t r o l e i n t h e r e s p o n s e s o f a f f e c t e d p l a t e l e t s t o t h r o m b i n t h a n i n c o n t r o l p l a t e l e t s . 2 1 2 T u m o r - p r o m o t i n g p h o r b o l e s t e r s s u c h a s P M A a r e n o n - p h y s i o l o g i c a g o n i s t s w h i c h a r e a b l e t o a g g r e g a t e p l a t e l e t s i r r e v e r s i b l y a n d c a u s e d e n s e g r a n u l e s e c r e t i o n . P h o r b o l e s t e r s a r e a b l e t o s u b s t i t u t e f o r 1 , 2 - d i a c y l g 1 y c e r o l i n a c t i v a t i o n o f t h e C a m 3 p h o s p h o l i p i d d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e C . 1 , 2 - D i a c y l g l y c e r o 1 s h a r p l y i n c r e a s e s t h e a f f i n i t y o f t h e e n z y m e f o r C a y ' a s w e l l a s f o r p h o s p h o l i p i d a n d t h u s i n i t i a t e s i t s 2 + 7 3 , 7 4 , 3 6 1 a c t i v a t i o n a t p h y s i o l o g i c a l C a c o n c e n t r a t i o n s . H o w e v e r , i t i s n o t k n o w n h o w t h i s , o r o t h e r e f f e c t s o f P M A , c a u s e p l a t e l e t a c t i v a t i o n a n d a g g r e g a t i o n s 7 ‘ I n c o n t r a s t t o 1 , 2 - d i a c y l g l y c e r o l w h i c h i s f o r m e d t r a n s i e n t l y d u r i n g p l a t e l e t a c t i v a t i o n a n d a c t i v a t e s p r o t e i n k i n a s e C i n a r e v e r s i b l e m a n n e r , p h o r b o l e s t e r - m e d i a t e d a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C i s s u s t a i n e d a n d n o t a c c o m p a n i e d b y p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l t u r n o v e r o r f o r m a t i o n o f a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s . P r o t e i n k i n a s e C p h o s p h o r y l a t e s m u l t i p l e p l a t e l e t p r o t e i n s , t h e m o s t w e l l - r e c o g n i z e d o f w h i c h i s a b a n d w i t h a m o l e c u l a r w e i g h t o f 4 7 k D a . 2 3 ° ' 2 7 9 T h e r e l a t i o n s h i p o f t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e s e p r o t e i n s t o s p e c i f i c e v e n t s i n p l a t e l e t a c t i v a t i o n i s n o t k n o w n . T h e a g g r e g a t i o n o f p l a t e l e t s b y p h o r b o l e s t e r s i s d e p e n d e n t o n t h e p r e s e n c e o f C a z ’ a n d t h e b i n d i n g o f f i b r i n o g e n , b u t i s i n d e p e n d e n t o f t h e f o r m a t i o n o f a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s a n d i n h i b i t e d b y a g e n t s w h i c h i n c r e a s e i n t r a c e l l u l a r c y c l i c A M P l e v e l s . 3 " 1 " ' 3 8 ' 5 2 9 T h e r o l e o f s e c r e t e d A D P i n p h o r b o l e s t e r - i n d u c e d p l a t e l e t a c t i v a t i o n i s l e s s c l e a r . I t h a s b e e n r e p o r t e d t h a t t h e e a r l y , v e r y s l o w p h a s e o f p h o r b o l e s t e r - i n d u c e d a g g r e g a t i o n i s i n d e p e n d e n t o f s e c r e t e d A D P , b u t t h e m o r e r a p i d p h a s e w h i c h f o l l o w s i s A D P - - d e p e n d e n t . " ’ 2 9 A t v e r y l o w c o n c e n t r a t i o n s o f p h o r b o l e s t e r , t h i s r a p i d p h a s e d o e s n o t o c c u r a n d a g g r e g a t i o n i s n o t 2 1 3 a f f e c t e d b y t h e p r e s e n c e o f A D P s c a v e n g e r s i n t h e m e d i u m . A g g r e g a t i o n i n r e s p o n s e t o v e r y h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f p h o r b o l e s t e r i s a l s o n o t a f f e c t e d b y A D P s c a v e n g e r s . T h e r e f o r e , r e l e a s e d A D P a p p e a r s t o a f f e c t t h e r a t e o f a g g r e g a t i o n p r o d u c e d b y i n t e r m e d i a t e c o n c e n t r a t i o n s o f p h o r b o l e s t e r . S e c r e t i o n o f d e n s e g r a n u l e c o n t e n t s o c c u r s m a i n l y d u r i n g t h e l a t t e r p a r t o f t h e s t e e p p h a s e o f a g g r e g a t i o n . A s p i r i n h a s b e e n r e p o r t e d t o h a v e s i m i l a r e f f e c t s t o A D P - s c a v e n g i n g e n z y m e s , a l t h o u g h i t h a s s i n c e b e e n r e p o r t e d t h a t p h o r b o l - e s t e r i n d u c e d a g g r e g a t i o n i s n o t i n h i b i t e d b y c y c l o o x y g e n a s e i n h i b i t o r s a n d i s n o t a c c o m p a n i e d b y t h e g e n e r a t i o n o f a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s . 3 M T h e a g g r e g a t i o n o f c o n t r o l p l a t e l e t s w a s v e r y s i m i l a r t o t h a t d e s c r i b e d f o r h u m a n p l a t e l e t s , e x c e p t t h a t t h e c o n c e n t r a t i o n s o f P M A r e q u i r e d w e r e c o n s i d e r a b l y h i g h e r ? 2 9 A t c o n c e n t r a t i o n s j u s t a b o v e t h e t h r e s h o l d f o r a g g r e g a t i o n ( 2 0 . 2 5 u M ) , a g g r e g a t i o n o f c o n t r o l p l a t e l e t s p r o c e e d e d s l o w l y , w i t h o u t a r a p i d p h a s e . A t h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s , t h e i n i t i a l s l o w p h a s e w a s f o l l o w e d b y a m o r e r a p i d p h a s e . A f f e c t e d p l a t e l e t s a l s o a g g r e g a t e d f u l l y a n d f o l l o w e d t h e s a m e g e n e r a l p a t t e r n , b u t w e r e s l i g h t l y l e s s s e n s i t i v e t o l o w e r c o n c e n t r a t i o n s o f P M A , h a d a s l o w e r m a x i m u m r a t e o f a g g r e g a t i o n a n d t o o k l o n g e r t o r e a c h m a x i m u m a g g r e g a t i o n . A l t h o u g h a f f e c t e d p l a t e l e t s t o o k l o n g e r t o r e a c h m a x i m u m a g g r e g a t i o n i n r e s p o n s e t o a l l c o n c e n t r a t i o n s o f P M A u s e d , t h e d i f f e r e n c e w a s s i g n i f i c a n t o n l y f o r 1 . 0 a n d 3 . 0 p H . T h e v a c u o l a t e d a p p e a r a n c e o f P M A - t r e a t e d p l a t e l e t s i n t h e t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h s i s d u e t o t h e s w e l l i n g o f g r a n u l e s a n d t h e i r f u s i o n w i t h d i l a t e d c h a n n e l s o f t h e o p e n c a n a l i c u l a r s y s t e m s " 0 8 S e c r e t i o n o f A T P i n b o t h g r o u p s w a s v a r i a b l e b u t o c c u r r e d a t t h e t i m e o f , o r 2 1 4 s l i g h t l y a f t e r , m a x i m u m a g g r e g a t i o n . T h e s l o w e r r e s p o n s e o f a f f e c t e d p l a t e l e t s m a y r e f l e c t a n i n a b i l i t y t o r e s p o n d o r b e a m p l i f i e d b y s e c r e t e d A D P . T h e m a x i m u m e x t e n t a n d r a t e o f a g g r e g a t i o n i n r e s p o n s e t o 3 . 0 p M P M A w e r e n o t s i g n i f i c a n t l y a f f e c t e d b y 1 . 0 m M a s p i r i n i n e i t h e r g r o u p . T h e t i m e t o m a x i m u m s e c r e t i o n w a s s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d b y a s p i r i n i n c o n t r o l p l a t e l e t s , b u t t h e a m o u n t o f A T P w a s n o t a f f e c t e d . I n a f f e c t e d p l a t e l e t s , t h e a m o u n t o f A T P w a s s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d b y a s p i r i n , b u t t h e t i m e t o m a x i m u m s e c r e t i o n w a s n o t a l t e r e d . I t i s d i f f i c u l t t o a s s i g n a r e a l s i g n i f i c a n c e t o t h e s e e f f e c t s o f a s p i r i n i n v i e w o f t h e v a r i a b i l i t y o f t h e s e c r e t i o n o f A T P b y P M A . I n c o n c l u s i o n , t h e a g g r e g a t i o n o f a f f e c t e d p l a t e l e t s b y P M A i n d i c a t e s : ( 1 ) a f f e c t e d p l a t e l e t s v e r y p r o b a b l y h a v e p r o t e i n k i n a s e C t h a t i s a b l e t o b e a c t i v a t e d b y p h o r b o l e s t e r s ; ( 2 ) a n d t h e a s - y e t u n i d e n t i f i e d p a t h w a y i n v o l v e d i n p l a t e l e t a c t i v a t i o n b y p h o r b o l e s t e r s i s i n t a c t i n a f f e c t e d p l a t e l e t s . T h e c a l c i u m i o n o p h o r e s ( A 2 3 1 8 7 a n d i o n o m y c i n ) a r e n o n — p h y s i o l o g i c p l a t e l e t a g o n i s t s t h a t a r e a b l e t o i n d u c e t h e s a m e r a n g e o f r e s p o n s e s a s p h y s i o l o g i c a g o n i s t s : s h a p e c h a n g e , t h e r e l e a s e r e a c t i o n a n d 1 2 9 . 1 3 1 . 3 1 2 . 5 0 5 a g g r e g a t i o n . T h e y a r e a b l e t o c r o s s t h e p l a s m a m e m b r a n e a n d d i r e c t l y m o b i l i z e C a m ' f r o m i n t r a c e l l u l a r s t o r e s a n d i n c r e a s e t h e i n t r a c y t o p l a s m i c C a y ' c o n c e n t r a t i o n . T h i s a c t i v a t e s p h o s p h o l i p a s e A 2 t o r e l e a s e a r a c h i d o n i c a c i d w h i c h i s m e t a b o l i z e d t o e n d o p e r o x i d e s a n d 2 7 5 t h r o m b o x a n e A 2 . H i g h c o n c e n t r a t i o n s o f A 2 3 1 8 7 a r e a b l e t o a c t i v a t e 2 1 5 t h e p h o s p h o m o n o e s t e r a t i c b r e a k d o w n o f t h e p o l y p h o s p h o i n o s i t i d e s . 2 8 1 T h e c a l c i u m i o n o p h o r e s d o n o t b i n d t o r e c e p t o r s , o r d i r e c t l y i n d u c e p h o s p h o l i p a s e C a c t i v a t i o n , i n o s i t o l l i p i d h y d r o l y s i s a n d f o r m a t i o n o f 1 , 2 - d i a c y l g l y c e r o l , p h o s p h a t i d i c a c i d o r i n o s i t o l p h o s p h a t e s . A c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e C a n d s t i m u l a t i o n o f t h e s e e v e n t s i n i o n o p h o r e - a c t i v a t e d p l a t e l e t s i s t h e r e s u l t o f e n d o p e r o x i d e a n d t h r o m b o x a n e p r o d u c t i o n a n d i s b l o c k e d b y c y c l o o x y g e n a s e i n h i b i t o r s . 2 3 1 " 1 3 H o w e v e r , e v e n i n t h e p r e s e n c e o f c y c l o o x y g e n a s e i n h i b i t o r s a n d a b s e n c e o f p h o s p h o l i p a s e C a c t i v a t i o n , t h e A 2 3 1 8 7 - i n d u c e d i n c r e a s e i n c y t o p l a s m i c C a a ' c o n c e n t r a t i o n i s a b l e t o s t i m u l a t e p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 4 7 k D a s u b s t r a t e o f p r o t e i n k i n a s e C a n d t h e 2 0 k D a s u b s t r a t e o f m y o s i n l i g h t c h a i n k i n a s e . 2 8 1 A l t h o u g h c y c l o o x y g e n a s e i n h i b i t o r s b l o c k a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i s m , p l a t e l e t a c t i v a t i o n i n d u c e d b y A 2 3 1 8 7 i s n o t c o m p l e t e l y b l o c k e d . ” ” A t l o w e r c o n c e n t r a t i o n s o f A 2 3 1 8 7 , s e c r e t i o n o f d e n s e g r a n u l e c o n t e n t s i s d e p e n d e n t u p o n f o r m a t i o n o f c y c l o o x y g e n a s e p r o d u c t s a n d t h e p r e s e n c e o f A D P . “ ” H i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f i o n o p h o r e o v e r c o m e t h i s i n h i b i t i o n . C o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s a n d p l a t e l e t s i n p l a t e l e t r i c h p l a s m a c h a n g e d s h a p e i n r e s p o n s e t o t h e c o n c e n t r a t i o n s o f A 2 3 1 8 7 u s e d . S h a p e c h a n g e i n c o n t r o l p l a t e l e t s w a s f o l l o w e d b y a d o s e - d e p e n d e n t a g g r e g a t i o n a n d r e l e a s e o f A T P . A f f e c t e d p l a t e l e t s d i d n o t a g g r e g a t e a n d r e l e a s e d o n l y 4 - 6 % o f t h e a m o u n t o f A T P r e l e a s e d b y c o n t r o l p l a t e l e t s . W h e n c o n t r o l p l a t e l e t r i c h p l a s m a w a s s t i m u l a t e d b y 1 5 o r 2 0 p M A 2 3 1 8 7 i n t h e p r e s e n c e o f 1 . 0 m M a s p i r i n , t h e e x t e n t a n d r a t e o f 2 1 6 a g g r e g a t i o n w e r e r e d u c e d . O n l y t h e r e d u c t i o n i n t h e r a t e o f a g g r e g a t i o n i n r e s p o n s e t o 2 0 u M A 2 3 1 8 7 w a s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t . T h e a m o u n t o f A T P s e c r e t e d i n r e s p o n s e t o 2 0 p M A 2 3 1 8 7 w a s s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d a n d t h e t i m e t o m a x i m u m s e c r e t i o n s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d i n a s p i r i n - t r e a t e d p l a t e l e t s . A l t h o u g h a s p i r i n a l s o r e d u c e d t h e e x t e n t a n d r a t e o f a g g r e g a t i o n o f p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 1 5 u M A 2 3 1 8 7 , t h e d e c r e a s e w a s n o t s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t . T r e a t m e n t w i t h a s p i r i n f u r t h e r r e d u c e d t h e s m a l l a m o u n t o f A T P s e c r e t e d b y a f f e c t e d p l a t e l e t s . B e c a u s e A 2 3 1 8 7 b i n d s s t r o n g l y t o a l b u m i n , t h e c o n c e n t r a t i o n n e e d e d t o a c t i v a t e p l a t e l e t s w i t h o u t c a u s i n g s i g n i f i c a n t c e l l l y s i s d e p e n d s o n t h e a l b u m i n c o n t e n t o f t h e m e d i u m . C o n c e n t r a t i o n s o f 3 0 p M i n p l a t e l e t r i c h p l a s m a a n d 8 . 0 “ M i n g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s ( 0 . 2 % a l b u m i n ) a r e t h e h i g h e s t c o n c e n t r a t i o n s o f A 2 3 1 8 7 t h a t d o n o t c a u s e m o r e t h a n 2 % c e l l l y s i s . 2 0 2 A f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s i n a b u f f e r c o n t a i n i n g 0 . 3 % a l b u m i n w e r e r a p i d l y l y s e d b y 2 0 p M A 2 3 1 8 7 . T h e c u r v e g e n e r a t e d b y t h i s l y s i s w a s n o t u n l i k e a n a g g r e g a t i o n t r a c i n g , b u t l a c k e d t h e n o r m a l o s c i l l a t i o n s g e n e r a t e d b y t h e s h a p e o f t h e p l a t e l e t s ( P a g e 2 0 0 ) . W h e n t h e c u v e t t e w a s r e m o v e d f r o m t h e a g g r e g o m e t e r , t h e c o n t e n t s w e r e c l e a r , w i t h n o v i s i b l e a g g r e g a t e f o r m a t i o n o r t u r b i d i t y . F r o m t h i s , i t i s c o n c l u d e d t h a t t h e a g g r e g a t i o n o f a f f e c t e d B a s s e t h o u n d h e r e d i t a r y t h r o m b o p a t h y g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s b y 4 0 p M A 2 3 1 8 7 t h a t w a s r e p o r t e d b y C a t a l f a m o e t a l . 7 i fl ? c a n b e a t t r i b u t e d t o p l a t e l e t l y s i s . A f f e c t e d p l a t e l e t s d o n o t h a v e a n a g g r e g a t i o n r e s p o n s e t h a t i s d e t e c t a b l e b y o p t i c a l p l a t e l e t a g g r e g o m e t r y w h e n s t i m u l a t e d b y n o n - l y t i c c o n c e n t r a t i o n s o f A 2 3 1 8 7 . 2 1 7 T h e f a i l u r e o f a f f e c t e d p l a t e l e t s t o a g g r e g a t e o r s e c r e t e n o r m a l l y i n r e s p o n s e t o A 2 3 1 8 7 w o u l d s u g g e s t t h a t a r a c h i d o n i c a c i d m i g h t n o t b e m o b i l i z e d o r m e t a b o l i z e d i n r e s p o n s e t o A 2 3 1 8 7 . I t i s a l s o p o s s i b l e t h a t A 2 3 1 8 7 f a i l s t o m o b i l i z e C a ” ’ i n . a f f e c t e d p l a t e l e t s . H o w e v e r , t h e n o r m a l s h a p e c h a n g e a n d c e n t r a l i z a t i o n o f g r a n u l e s w o u l d s u g g e s t t h a t C b ? + i s a b l e t o b e m o b i l i z e d . P r e l i m i n a r y w o r k w i t h t h e C a ? + i n d i c a t o r s a e q u o r i n a n d f u r s - 2 a l s o d e m o n s t r a t e t h a t C a y ' m m b i l i z a t i o n o c c u r s i n a f f e c t e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y A 2 3 1 8 7 . " 8 2 A f a i l u r e o f r e l e a s e o r m e t a b o l i s m o f a r a c h i d o n i c a c i d w o u l d b e i n c o n t r a s t t o t h e r e s p o n s e o f a f f e c t e d p l a t e l e t s t o o t h e r a g o n i s t s s u c h a s t h r o m b i n , P A F a n d A D P w h e r e a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s s e e m t o p l a y a m o r e i m p o r t a n t r o l e t h a n i n c o n t r o l p l a t e l e t s . D i t h i o t h r e i t o l i s a r e d u c i n g a g e n t w h i c h , i n t h e p r e s e n c e o f f i b r i n o g e n , c a u s e s p l a t e l e t a g g r e g a t i o n t h a t i s n o t a s s o c i a t e d w i t h s h a p e c h a n g e o r s e c r e t i o n o f g r a n u l e c o n t e n t s . " ’ : 3 0 T h e a g g r e g a t i o n i s n o t i n h i b i t e d b y m e t a b o l i c i n h i b i t o r s o r p r o s t a g l a n d i n E 1 , b u t i s i n h i b i t e d a t p H 6 . 5 o r t h e p r e s e n c e o f E D T A . I n t h e p r e s e n c e o f d i t h i o t h r e i t o l , f i b r i n o g e n a n d C a fl fi s t i r r e d p l a t e l e t s w i l l b i n d f i b r i n o g e n a n d a g g r e g a t e . T h e m e c h a n i s m b y w h i c h d i t h i o t h r e i t o l i n d u c e s f i b r i n o g e n b i n d i n g i s p o o r l y u n d e r s t o o d , b u t i t i s t h o u g h t t h a t r e d u c t i o n o f m e m b r a n e d i s u l f i d e b o n d s m a y b e i n v o l v e d . 3 8 1 T h e a b i l i t y o f p l a t e l e t s t o a g g r e g a t e i n r e s p o n s e t o d i t h i o t h r e i t o l d e p e n d s p r i m a r i l y o n t h e i r a b i l i t y t o b i n d f i b r i n o g e n . T h e r e f o r e , t h e a b i l i t y o f a f f e c t e d p l a t e l e t s t o a g g r e g a t e n o r m a l l y i n r e s p o n s e t o d i t h i o t h r e i t o l i n d i c a t e s t h a t a f f e c t e d p l a t e l e t s a r e a b l e t o b i n d f i b r i n o g e n . 2 1 8 I n c o n c l u s i o n , t h e p a t t e r n s o f a g g r e g a t i o n a n d d e n s e g r a n u l e s e c r e t i o n o f a f f e c t e d p l a t e l e t s d o n o t f i t a n y d e s c r i b e d g e n e t i c o r a c q u i r e d p l a t e l e t d e f e c t o r a n y s i t u a t i o n c r e a t e d i n _ 1 1 £ ; g . T h e y a p p a r e n t l y h a v e t h e a b i l i t y t o a g g r e g a t e , i f t h e a p p r o p r i a t e s t i m u l u s i s p r o v i d e d . H o w e v e r , i t a p p e a r s t h a t e i t h e r t h e p a t h w a y ( s ) i n v o l v e d i n t r a n s m i t t i n g t h e s i g n a l f r o m t h e a g o n i s t a t t h e c e l l m e m b r a n e t o t h e c e l l i n t e r i o r i s ( a r e ) d e f e c t i v e , o r t h a t t h e s i g n a l i s t r a n s m i t t e d t o t h e c e l l i n t e r i o r b u t i s u n a b l e t o b e c o n v e r t e d t o t h e n o r m a l s e q u e n c e o f c e l l u l a r e v e n t s . A l t e r n a t i v e l y , t h e p a t h w a y ( s ) m a y b e i n t a c t , b u t t h e m e c h a n i s m s w h i c h c o n t r o l t h e p a t h w a y ( s ) i s ( a r e ) d e f e c t i v e . T h e a b i l i t y o f a f f e c t e d p l a t e l e t s t o a g g r e g a t e i n r e s p o n s e t o p h o r b o l e s t e r a n d h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n i n d i c a t e s t h a t a t l e a s t o n e p a t h w a y o f p l a t e l e t a c t i v a t i o n i s f u n c t i o n a l . » : 3 2 ‘ : i x ( n . ‘ l ' a ‘ L ‘ P t i t { - A B A ‘ . ~ . . l f u ' d ‘ o ‘ v J \ _ . ‘ ) r . ‘ l ‘ w , n - ‘ ‘ w “ A . » 3 . n : 3 c - x a s . . 1 . _ . . . ~ . r - ~ . . “ L - n o n a « . 2 ‘ , “ , ; r r . n I ” . | _ _ g i g ; ; I A ‘ n ' ? - » v . . " V X 6 2 1 2 “ ! I ” 3 ‘ , . A “ a w a r u s : ‘ 1 3 ‘ ' . ‘ , 1 . a , “ ‘ 5 - a t ) : f " . 5 ' $ 3 ? . ; $ ‘ i . I “ A ‘ l N J l a ; 4 i x . “ i ; ‘ w a § 9 § £ \ ¢ “ ~ a s i « t . 1 ’ 9 “ } : y x 1 Q , - r ’ i fi f ‘ k g é a fi f ' E K I ‘ C E . ” E : 5 ” 3 1 2 % r a ; ‘ H a A . I . 3 ! W a fi i fi y g fi ” r V . 1 1 " 1 , I , , _ 1 ~ . . . 3 x i ) . 3 U ‘ . _ U ‘ , ~ ’ ~ ' " , ' ¥ " " 1 v ‘ . " _ . “ ' v ‘ . A , ‘ v ‘ g ( ‘ 0 ' 1 1 “ ' . ‘ l w ‘ . ‘ ? . “ ' d . - ’ ; L ‘ 2 ; . , 7 » . M ‘ ’ . ‘ - / ‘ 4 : 5 2 " , m v 4 . . ' 5 3 1 % » . W “ ? . v o ‘ * 4 , r ‘ “ g t ‘ . . r 1 “ , . . ' \ . I o ’ ' 4 ' - . . ‘ . ‘ I E S ‘ N , p ‘ ' ‘ I f ‘ n 5 “ . ; ~ - 1 & 4 ; W } 1 i ; “ “ " 3 5 ' 3 “ 5 “ h r a w - - . 7 3 5 5 } . " W ‘ ‘ F ‘ é i ‘ l A . m ? 2 5 % - m i x “ fi r fi w w y p fl , 1 , r . a I , 1 4 1 “ K O " p i ; M ” a “ 7 - l ( 9 m u m u . m . : . . H . H . . I . I . . I . r . . y . B . . / . ( . . g . w . . o . w . . w . / . . I t L E E R E R Y M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y P L A C E N R E T U R N B O X t o m o v e t h i s c h e c k o u t f r o m y o u r r e c o r d . T O A V O I D F I N E S M a n o n O f b a t o n d d . d u o . F T _ = D A T E D U E D A T E D U E D A T E D U E a . “ M S U I . A n A fi m d i v e A d a n / E q u a l O p p o n u n i t y l n d i t u t l o n F U N C T I O N A L A N D B I O C H E M I C A L A B N O R M A L I T I E S I N B A S S E T H O U N D H E R E D I T A R Y T H R O H B O P A T H Y V O L U M E I I B y M a r y F r a n c e s M c C o n n e l l A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o H i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l f i l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y D e p a r t m e n t o f P a t h o l o g y 3 x * 4 0 0 ( ( 3 ' ) 1 C H A P T E R I V : P H O S P H O R Y L A T I O N O F P L A T E L E T P R O T E I N S I N T R O D U C T I O N M a n y e x t r a c e l l u l a r s i g n a l s s u c h a s p h y s i o l o g i c a l p l a t e l e t a g o n i s t s d o n o t p e r m e a t e t h e p l a s m a m e m b r a n e . I n s t e a d , t h e y i n t e r a c t w i t h r e c e p t o r s a t t h e c e l l s u r f a c e w h i c h t h e n r e l a y t h e s i g n a l t o t h e i n t e r i o r o f t h e c e l l v i a t h e p r o d u c t i o n o f a l i m i t e d r a n g e o f s e c o n d m e s s e n g e r s . 3 5 ' 3 ” T h e s e s e c o n d m e s s e n g e r s i n c l u d e c y c l i c a d e n o s i n e m o n o p h o s p h a t e ( c y c l i c A M P ) a n d c y c l i c g u a n o s i n e m o n o p h o s p h a t e ( c y c l i c G M P ) . S e c o n d m e s s e n g e r m o l e c u l e s d e r i v e d f r o m t h e p h o s p h o i n o s i t i d e s i n c l u d e 1 , 2 - d i a c y 1 g l y c e r o l ( D A G ) , 1 , 4 , 5 - i n o s i t o l t r i s p h o s p h a t e [ ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 ] a n d m e t a b o l i t e s o f a r a c h i d o n i c a c i d . T h e i r p r o d u c t i o n i s i n i t i a t e d b y s p e c i f i c a g o n i s t s , t h e y a r e p o t e n t a c t i v a t o r s o f o t h e r c e l l u l a r r e a c t i o n s a n d t h e y a r e r a p i d l y d e g r a d e d t o i n a c t i v e c o m p o u n d s . M a n y e i c o s a n o i d s d e r i v e d f r o m a r a c h i d o n i c a c i d h a v e t h e s e p r o p e r t i e s o f s e c o n d m e s s e n g e r s , a l t h o u g h t h e y t e n d t o a c t u p o n n e i g h b o r i n g c e l l s r a t h e r t h a n i n t r a c e l l u l a r l y . 3 0 3 O n c e f o r m e d , m e s s e n g e r s e v o k e a w i d e r a n g e o f i n t r a c e l l u l a r a n d c e l l - t o - c e l l r e a c t i o n s w h i c h c o l l e c t i v e l y m a k e u p a s p e c i f i c p h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e . C o v a l e n t m o d i f i c a t i o n o f k e y r e g u l a t o r y p r o t e i n s b y r e v e r s i b l e p h o s p h o r y l a t i o n - d e p h o s p h o r y l a t i o n i s a w i d e l y - u s e d m e c h a n i s m i n t h e c o n t r o l o f c e l l u l a r p r o c e s s e s s u c h a s s e c r e t i o n , c o n t r a c t i l i t y , 2 1 9 2 2 0 p r o t e i n s y n t h e s i s , c e l l g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n . " 3 9 W h i l e a l a r g e n u m b e r o f p h o s p h o p r o t e i n s c a n b e d e m o n s t r a t e d i n m a n y c e l l t y p e s , i n c l u d i n g p l a t e l e t s , t h e f u n c t i o n o f r e l a t i v e l y f e w o f t h e s e i s m o d i f i e d b y r e v e r s i b l e p h o s p h o r y l a t i o n . R e v e r s i b l e p h o s p h o r y l a t i o n s a r e c a t a l y z e d b y p r o t e i n k i n a s e s a n d p h o s p h a t a s e s w h i c h a r e s e l e c t i v e f o r e i t h e r s e r i n e / t h r e o n i n e o r t y r o s i n e r e s i d u e s . A s i n g l e p r o t e i n m a y b e p h o s p h o r y l a t e d a t m u l t i p l e s i t e s b y d i f f e r e n t p r o t e i n k i n a s e s w i t h d i f f e r i n g e f f e c t s o n b i o l o g i c a l a c t i v i t y . T h u s , t h e p h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e o f a c e l l d e p e n d s n o t o n l y o n t h e p r e s e n c e o f t h e a p p r o p r i a t e a g o n i s t b i n d i n g t o i t s c e l l s u r f a c e r e c e p t o r , b u t a l s o o n t h e t y p e a n d d i s t r i b u t i o n o f p r o t e i n k i n a s e s , p h o s p h o p r o t e i n p h o s p h a t a s e s a n d t h e i r c e l l u l a r t a r g e t s . I n t h i s w a y , a s i g n a l t r a n s d u c t i o n s y s t e m o f s e c o n d m e s s e n g e r s c o m m o n t o m a n y c e l l t y p e s i s a b l e t o e l i c i t u n i q u e b i o l o g i c a l r e s p o n s e s i n d i f f e r e n t c e l l t y p e s . H o w e v e r , t h e p r e c i s e m e a n s b y w h i c h t h e r e a c t i o n s i n v o k e d b y s e c o n d m e s s e n g e r m o l e c u l e s i n d u c e s p e c i f i c c e l l u l a r r e s p o n s e s s u c h a s p l a t e l e t a g g r e g a t i o n a n d t h e r e l e a s e r e s p o n s e a r e n o t c l e a r . S t i m u l a t i o n o f p l a t e l e t s b y t h r o m b i n , c o l l a g e n , P A F , A 2 3 1 8 7 , s e r o t o n i n , a r a c h i d o n i c a c i d a n d e n d o p e r o x i d e a n a l o g u e s l e a d s t o t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f a r a n g e o f p r o t e i n s . P h o s p h o r y l a t i o n i n r e s p o n s e t o a g o n i s t s i s p r o m i n e n t i n t w o o f t h e s e p r o t e i n b a n d s . O n e i s a 2 0 k D a p r o t e i n t h a t h a s b e e n i d e n t i f i e d a s t h e 2 0 k D a m y o s i n l i g h t c h a i n . 1 0 6 T h e o t h e r i s a 4 7 k D a c y t o p l a s m i c p r o t e i n w h i c h h a s n o t b e e n p o s i t i v e l y i d e n t i f i e d . 1 8 3 P h o s p h o r y l a t i o n o f t h e s e p r o t e i n s h a s n o t b e e n r e p o r t e d f o r c a n i n e p l a t e l e t s . 2 2 1 P h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 k D a m y o s i n l i g h t c h a i n i s p r e c e d e d b y c e r t a i n c e l l u l a r e v e n t s . E n d o g e n o u s C a m ' i s r e l e a s e d f r o m t h e d e n s e t u b u l a r s y s t e m b y t h e a c t i o n o f t h e s e c o n d m e s s e n g e r ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 ‘ w h i c h i s c l e a v e d f r o m p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l b i s p h o s p h a t e b y p h o s p h o l i p a s e 6 . 1 2 ' 5 5 " 5 ° T h e C a 2 + t h a t i s r e l e a s e d b y ( 1 , 4 , 5 ) I P 3 c a n s e r v e a s a t r i g g e r f o r s u b s e q u e n t e v e n t s , i n c l u d i n g t h e a c t i v a t i o n o f C a 2 + - d e p e n d e n t e n z y m e s s u c h a s t h e C a 2 + - c a 1 m o d u l i n - d e p e n d e n t m y o s i n l i g h t c h a i n k i n a s e . 1 8 9 W h e n f o u r m o l e c u l e s o f C a y ’ b i n d t o c a l m o d u l i n , t h e c o m p l e x i s a b l e t o b i n d t o m y o s i n l i g h t c h a i n k i n a s e a n d a c t i v a t e i t . M y o s i n c o m p r i s e s a p p r o x i m a t e l y 1 2 % o f p l a t e l e t p r o t e i n a n d c o n s i s t s o f t w o h e a v y c h a i n s o f M , - 2 0 0 k D a , t w o l i g h t c h a i n s o f M , - - 2 0 k D a a n d t w o l i g h t c h a i n s o f M , - 1 6 k D a . 1 5 ° P h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 k D a m y o s i n l i g h t c h a i n r e s u l t s i n p o l y m e r i z a t i o n o f m y o s i n i n t o f i l a m e n t s , i n t e r a c t i o n w i t h a c t i n , a 6 - t o — 1 0 - f o l d i n c r e a s e i n i t s A T P a s e a c t i v i t y a n d t h e a s s o c i a t i o n o f m y o s i n w i t h t h e p l a t e l e t c y t o s k e l e t o n . T h e r e i s e v i d e n c e t h a t e l e v a t i o n o f i n t r a c y t o p l a s m i c C a y ’ l e v e l s a n d m y o s i n . p h o s p h o r y l a t i o n i s a s s o c i a t e d w i t h p l a t e l e t s h a p e c h a n g e a n d t h e s e c r e t i o n o f p l a t e l e t g r a n u l e c o n t e n t s . 1 ° 5 ' 1 ° 7 ' 1 ° 5 " 3 5 9 T h e p r o p e r t i e s o f p h o s p h o r y l a t e d m y o s i n m a y c a u s e t h e f o l d i n g o f t h e p l a t e l e t s u r f a c e m e m b r a n e a n d t h e c o n t r a c t i l e w a v e c e n t r a l i z i n g t h e s e c r e t o r y g r a n u l e s s e e n d u r i n g s h a p e c h a n g e . D u r i n g g r a n u l e s e c r e t i o n , m y o s i n p h o s p h o r y l a t i o n i s f u r t h e r i n c r e a s e d . P h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 4 7 k D a p l a t e l e t p r o t e i n i s m e d i a t e d b y t h e C a 2 + - a n d p h o s p h o l i p i d - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e 6 . 2 1 9 I n t h e r e s t i n g p l a t e l e t , p r o t e i n k i n a s e C i s p r e s e n t i n a n i n a c t i v e f o r m i n t h e c y t o s o l . D u r i n g p l a t e l e t a c t i v a t i o n , p r o t e i n k i n a s e C b i n d s t o t h e 2 2 2 i n n e r l e a f l e t o f t h e p l a t e l e t m e m b r a n e . A l t h o u g h n o r m a l l y a l m o s t a b s e n t f r o m p l a t e l e t m e m b r a n e s , D A G i s t r a n s i e n t l y p r o d u c e d i n t h e m e m b r a n e w h e n p l a t e l e t s a r e a c t i v a t e d . A s m a l l a m o u n t o f D A G d r a m a t i c a l l y i n c r e a s e s t h e a p p a r e n t a f f i n i t y o f p r o t e i n k i n a s e C f o r C a ” , f u l l y a c t i v a t i n g t h e e n z y m e w i t h o u t a n y c h a n g e i n t h e 6 ° P h o r b o l e s t e r s a r e a b l e t o i n t r a c y t o p l a s m i c C a 2 + c o n c e n t r a t i o n . 3 s u b s t i t u t e f o r D A G i n t h e a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e 0 . 7 3 I n c o n t r a s t t o D A G w h i c h i s f o r m e d t r a n s i e n t l y d u r i n g p l a t e l e t a c t i v a t i o n a n d a c t i v a t e s p r o t e i n k i n a s e C i n a r e v e r s i b l e m a n n e r , p h o r b o l e s t e r - m e d i a t e d a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C i s s u s t a i n e d . P r o t e i n k i n a s e C h a s a b r o a d s u b s t r a t e s p e c i f i c i t y , p h o s p h o r y l a t i n g t h e s e r i n e a n d t h r e o n i n e r e s i d u e s o f m a n y e n d o g e n o u s p r o t e i n s i n m o s t t i s s u e s . T h e 4 7 k D a s u b s t r a t e i n p l a t e l e t s h a s b e e n p u r i f i e d , b u t i t s f u n c t i o n h a s n o t b e e n p o s i t i v e l y i d e n t i f i e d ; i t i s m o s t l i k e l y t h e 1 P 3 5 ‘ - p h o s p h o m o n o e s t e r a s e w h i c h i s p h o s p h o r y l a t e d a n d a c t i v a t e d b y p r o t e i n k i n a s e 0 ° 7 3 " A n o t h e r l e s s l i k e l y p o s s i b i l i t y i s l i p o c o r t i n w h i c h , i n t h e n o n - p h o s p h o r y l a t e d s t a t e , e x e r t s a n i n h i b i t o r y e f f e c t o n p h o s p h o l i p a s e A 2 . ‘ 8 5 T h e b i n d i n g o f f i b r i n o g e n a n d a g g r e g a t i o n o f p l a t e l e t s b y p h o r b o l e s t e r s u g g e s t s t h a t p r o t e i n k i n a s e C d o e s p l a y a r o l e i n t h e i n d u c t i o n o f f i b r i n o g e n r e c e p t o r s . " 3 8 I t i s u n l i k e l y t h a t p r o t e i n k i n a s e C h a s a s p e c i f i c r o l e i n t h e i n d u c t i o n o f p l a t e l e t s h a p e c h a n g e . T h e f a c t t h a t p h o r b o l e s t e r i s a b l e t o s u b s t i t u t e f o r D A G i n t h e a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C a n d a c t i v a t e p l a t e l e t s w i t h o u t c a u s i n g s h a p e c h a n g e p r o v i d e s e v i d e n c e a g a i n s t s u c h a r o l e . 5 2 9 O n t h e o t h e r h a n d , s e v e r a l 2 2 3 s t u d i e s s u g g e s t t h a t p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 4 7 k D a p r o t e i n i s a n i m p o r t a n t i n t e r m e d i a t e s t e p i n s e c r e t i o n , b u t i t h a s a l s o b e e n s h o w n t h a t d e n s e g r a n u l e s e c r e t i o n m a y b e i n h i b i t e d b y l o w c o n c e n t r a t i o n s o f c h l o r p r o m a z i n e w i t h o u t i n h i b i t i n g p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 4 7 k D a p r o t e i n . 1 8 3 ' 3 6 ° ' “ ' 3 I n p e r m e a b i l i z e d p l a t e l e t s i n w h i c h t h e i n t r a c e l l u l a r C a 2 + c o n c e n t r a t i o n c a n b e c o n t r o l l e d , h i g h e r C a 2 + c o n c e n t r a t i o n s a r e r e q u i r e d f o r o p t i m a l s e c r e t i o n t h a n f o r o p t i m a l p h o s p h o r y l a t i o n o f b o t h t h e 4 7 a n d 2 0 k D a p r o t e i n s . “ 3 H o w e v e r , i t h a s a l s o b e e n s h o w n t h a t a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C , p l u s a n i n c r e a s e i n c y t o p l a s m i c C a z fl c a n t r i g g e r s e c r e t i o n . 2 3 8 ' 2 7 9 T h e r e f o r e , t h e r o l e o f p r o t e i n k i n a s e C a c t i v a t i o n i n p l a t e l e t s e c r e t i o n i s n o t c l e a r . T h e p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 4 7 k D a p r o t e i n b y p r o t e i n k i n a s e C o c c u r s d u r i n g p r i m a r y r e v e r s i b l e a g g r e g a t i o n i n d u c e d b y m a n y p l a t e l e t s t i m u l i , b u t w h e t h e r t h e r e l a t i o n s h i p i s c a u s a l o r c o i n c i d e n t a l i s n o t k n o w n . B e c a u s e a f f e c t e d B a s s e t h o u n d p l a t e l e t s h a d s h o w n a u n i q u e p a t t e r n o f r e s p o n s e s t o a g o n i s t s , i t w a s l o g i c a l t o t r y t o r e l a t e t h e e v e n t s o f s h a p e c h a n g e , a g g r e g a t i o n a n d r e l e a s e t o t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 a n d 4 7 k D a p r o t e i n s . T h e a g o n i s t s u s e d w e r e a d e n o s i n e d i p h o s p h a t e ( A D P ) , p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r ( P A F ) , t h r o m b i n , c a l c i u m i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 a n d p h o r b o l m y r i s t a t e a c e t a t e ( P M A ) . T h i s g r o u p o f a g o n i s t s c o n t a i n s w e a k ( A D P ) , i n t e r m e d i a t e ( P A P ) a n d s t r o n g ( t h r o m b i n ) p h y s i o l o g i c a g o n i s t s , a s w e l l a s t h e n o n - p h y s i o l o g i c a g o n i s t s A 2 3 1 8 7 a n d P M A w h i c h d i r e c t l y e l e v a t e i n t r a c y t o p l a s m i c C a 2 + a n d a c t i v a t e p r o t e i n k i n a s e C , r e s p e c t i v e l y . 2 2 4 I t w a s a n t i c i p a t e d t h a t t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 a n d / o r 4 7 k D a p r o t e i n s w o u l d b e a b s e n t o r r e d u c e d c o m p a r e d t o t h a t o f c o n t r o l p l a t e l e t s . I n p a r t i c u l a r , i t w a s p r e d i c t e d t h a t t h e 4 7 k D a p r o t e i n w o u l d b e p h o s p h o r y l a t e d i n r e s p o n s e t o P M A , a n d p o s s i b l y t h r o m b i n , b u t n o t i n r e s p o n s e t o a g o n i s t s w h i c h f a i l e d t o e l i c i t p r i m a r y a g g r e g a t i o n ( A D P , P A F o r A 2 3 1 8 7 ) . I t w a s h o p e d t h a t a d i f f e r e n c e i n t h e p o s t - a c t i v a t i o n p h o s p h o r y l a t i o n p a t t e r n s o f t h e t w o g r o u p s o f p l a t e l e t s w o u l d i d e n t i f y t h e d e f e c t i v e p a t h w a y i n B a s s e t h o u n d h e r e d i t a r y t h r o m b o p a t h y . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S E x p e r i m e n t a l D e s i g n T h e s a m e g r o u p s o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d d o g s d e s c r i b e d i n t h e p r e v i o u s c h a p t e r w e r e u s e d i n t h i s s t u d y ( P a g e 1 3 0 ) . R e a g e n t s T h r o m b i n , A D P , P A F , P M A a n d A 2 3 1 8 7 w e r e p u r c h a s e d , s t o r e d a n d p r e p a r e d a s d e s c r i b e d i n t h e p r e v i o u s c h a p t e r ( P a g e 1 3 1 ) . S o d i u m d o d e c y l s u l f a t e ( S D S ) , a c r y l a m i d e , b i s - a c r y l a m i d e , T E M E D a n d a m m o n i u m p e r s u l f a t e w e r e p u r c h a s e d f r o m B i o r a d ( R i c h m o n d , C A ) . M o l e c u l a r w e i g h t s t a n d a r d s w e r e p u r c h a s e d f r o m P h a r m a c i a ( P i s c a t a w a y , N J ) . B r o m p h e n o l b l u e , C o o m a s s i e B r i l l i a n t B l u e R 2 5 0 , T r i s , g l y c i n e a n d 2 - m e r c a p t o e t h a n o l w e r e p u r c h a s e d f r o m t h e S i g m a C h e m i c a l C o . ( S t . L o u i s , M O ) . C a r r i e r - f r e e C n P ) p h o s p h a t e a s o r t h o p h o s p h o r i c a c i d i n 2 2 5 H C l - f r e e w a t e r w a s p u r c h a s e d f r o m N e w E n g l a n d N u c l e a r ( B o s t o n , M A ) A l l o t h e r c h e m i c a l s w e r e o f r e a g e n t q u a l i t y . P r e p a r a t i o n o f S u s p e n s i o n s o f L a b e l l e d P l a t e l e t s T h i s p r o c e d u r e w a s c a r r i e d o u t b a s e d o n t h e m e t h o d d e s c r i b e d b y F o x a n d P h i l l i p s . ” 3 S a m p l e s w e r e a l w a y s c o l l e c t e d a s a p a i r ( c o n t r o l a n d a f f e c t e d ) a n d w e r e r u n i n p a r a l l e l t h r o u g h o u t t h e w h o l e p r o c e d u r e . F o r a l l w o r k i n v o l v i n g 3 2 F , p l e x i g l a s s p r o t e c t i v e s h i e l d i n g , t e s t t u b e b l o c k s a n d s t o r a g e c o n t a i n e r s w e r e u s e d . B l o o d w a s c o l l e c t e d f r o m t h e j u g u l a r v e i n i n t o a p l a s t i c s y r i n g e c o n t a i n i n g 3 . 2 % N 8 3 c i t r a t e a t a r a t i o o f 9 : 1 . T h e b l o o d w a s t r a n s f e r r e d t o p l a s t i c t u b e s a n d t h e p l a t e l e t r i c h p l a s m a s e p a r a t e d b y r e p e a t e d c e n t r i f u g a t i o n s a t 1 3 2 4 x g f o r 6 0 s e c o n d s . T h e p l a t e l e t r i c h p l a s m a w a s t h e n c e n t r i f u g e d a t 7 3 0 x g f o r 1 0 m i n u t e s t o s e d i m e n t t h e p l a t e l e t s . T h e p l a t e l e t p e l l e t w a s w a s h e d t w i c e b y r e s u s p e n s i o n i n a b u f f e r c o n t a i n i n g 1 2 0 m M N a C l , 1 3 m M N a a c i t r a t e , a n d 3 0 m M d e x t r o s e , p H 7 . 0 ( b u f f e r A ) . T h e p l a t e l e t s w e r e c o u n t e d m a n u a l l y w i t h a U n o p e t t e a n d N e u b a u e r h e m o c y t o m e t e r a f t e r t h e f i r s t w a s h a n d r e s u s p e n d e d t o a f i n a l c o u n t o f 2 . 0 x 1 0 9 / m l a f t e r t h e s e c o n d w a s h i n a b u f f e r c o n t a i n i n g 1 5 0 m M N a C l , 1 0 m M - H E P E S , a n d 1 . 0 m M E D T A , p H 7 . 4 ( b u f f e r B ) . C a r r i e r - f r e e 3 2 P - p h o s p h a t e , a p p r o x i m a t e l y 0 . 4 m C i / m l , w a s a d d e d a n d t h e p l a t e l e t s u s p e n s i o n i n c u b a t e d a t 3 7 ° C f o r 6 0 m i n u t e s . T h e p l a t e l e t s w e r e t h e n s e p a r a t e d f r o m e x c e s s r a d i o l a b e l b y c e n t r i f u g a t i o n a t 8 5 5 x g f o r 1 2 m i n u t e s , r e s u s p e n d e d i n t o b u f f e r B 2 2 6 w i t h o u t 3 2 I ” a n d c o u n t e d m a n u a l l y . T h e y w e r e c e n t r i f u g e d a g a i n a n d r e s u s p e n d e d a t a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 3 . 5 x 1 0 8 / m 1 i n a b u f f e r c o n t a i n i n g 1 3 8 m M N a C l , 2 . 9 m M K C l , 1 2 m M N a H C O a , 0 . 3 6 m M N a z P O . , 5 . 5 m M g l u c o s e a n d 1 . 0 m M E D T A , p H 7 . 4 ( b u f f e r C ) . T h i s p l a t e l e t s u s p e n s i o n w a s d i v i d e d i n t o 0 . 4 m l a l i q u o t s i n 1 . 5 m l E p p e n d o r f c e n t r i f u g e t u b e s a n d a l l o w e d t o r e s t a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 3 0 m i n u t e s . I n a n a l t e r n a t i v e p r o c e d u r e t r i e d l a t e r i n t h e p r o j e c t , t h e p l a t e l e t s w e r e s e p a r a t e d f r o m e x c e s s r a d i o l a b e l b y g e l - f i l t r a t i o n i n t o b u f f e r C , c o u n t e d m a n u a l l y a n d f u r t h e r d i l u t e d t o 3 . 5 x 1 0 8 / m l . T h i s p r o c e d u r e w a s f o u n d t o w o r k w e l l a n d h a d t h e a d d e d a d v a n t a g e o f i n v o l v i n g c o n s i d e r a b l y l e s s r a d i a t i o n e x p o s u r e . I n c u b a t i o n s a n d S o d i u m D o d e c y l S u l f a t e - P o l y a c r y l a m i d e E l e c t r o p h o r e s i s A l i q u o t s o f t h e p l a t e l e t s u s p e n s i o n w e r e i n c u b a t e d a t r o o m t e m p e r a t u r e w i t h s a l i n e o r v a r i o u s a g o n i s t s ( t h r o m b i n , P A F , A D P , A 2 3 1 8 7 , o r P M A ) . A f t e r 5 s e c o n d s , 1 5 s e c o n d s , 3 0 s e c o n d s , 1 m i n u t e , 2 m i n u t e s , 5 m i n u t e s o r 1 0 m i n u t e s , t h e i n c u b a t i o n w a s t e r m i n a t e d b y t h e a d d i t i o n o f a n e q u a l v o l u m e o f s o l u b i l i z a t i o n b u f f e r c o n t a i n i n g 4 . 0 % w / v S D S , 1 0 % v / v 2 - m e r c a p t o e t h a n o l , 2 0 % v / v g l y c e r o l , 0 . 0 0 4 % w / v b r o m p h e n o l b l u e , a n d 1 2 5 m M T r i s H C l , p H 6 . 8 , a n d t h e s a m p l e i n c u b a t e d a t 7 8 ° C f o r 1 5 m i n u t e s . S a m p l e s w e r e e l e c t r o p h o r e s e d a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f L a e m m l i 2 6 7 t h r o u g h s l a b g e l s i n a B i o r a d P r o t e a n I I e l e c t r o p h o r e s i s a p p a r a t u s ( B i o r a d , R i c h m o n d , C A ) . P o l y a c r y l a m i d e r e s o l v i n g g e l s ( 1 . 5 m m t h i c k ) c o n t a i n i n g 1 1 % T a c r y l a m i d e , 0 . 1 % S D S , 0 . 3 7 5 M T r i s ( p H 8 . 8 ) a n d 2 2 7 p o l y m e r i z e d w i t h 0 . 0 5 % f r e s h a m m o n i u m p e r s u l f a t e a n d T E M E D w e r e p o u r e d . A f t e r p o l y m e r i z a t i o n , s t a c k i n g g e l s c o n t a i n i n g 3 % T a c r y l a m i d e , 0 . 1 % S D S , 0 . 1 2 5 M T r i s ( p H 6 . 8 ) a n d p o l y m e r i z e d w i t h 0 . 0 5 % a m m o n i u m p e r s u l f a t e a n d T E M E D w e r e p o u r e d o n t o p o f t h e r e s o l v i n g g e l s . T h e s e w e r e r e f r i g e r a t e d o v e r n i g h t f o r u s e t h e n e x t d a y . L a n e s w e r e l o a d e d w i t h 2 0 0 p 1 o f s a m p l e o r 1 0 p l o f l o w m o l e c u l a r w e i g h t s t a n d a r d a n d e l e c t r o p h o r e s e d a t 5 0 m A u n t i l t h e b r o m p h e n o l b l u e m a r k e r e n t e r e d t h e r e s o l v i n g g e l , t h e n a t 6 0 m A u n t i l t h e m a r k e r r e a c h e d a p p r o x i m a t e l y o n e c e n t i m e t e r f r o m t h e b o t t o m o f t h e g e l . T h e r u n n i n g b u f f e r c o n t a i n e d 0 . 1 9 2 M g l y c i n e , 0 . 1 % S D S a n d 0 . 0 2 5 M T r i s , p H 8 . 3 . T h e g e l s w e r e t h e n s t a i n e d w i t h 0 . 1 % w / v C o o m a s s i e b r i l l i a n t b l u e R 2 5 0 i n 1 0 % g l a c i a l a c e t i c a c i d a n d 5 0 % m e t h a n o l f o r a p p r o x i m a t e l y 1 . 5 h o u r s a n d d e s t a i n e d i n 1 0 % m e t h a n o l a n d 1 0 % g l a c i a l a c e t i c a c i d f o r 3 6 - 4 8 h o u r s . F o r a u t o r a d i o g r a p h s , l a b e l l e d g e l s w e r e d r i e d o n t o p o r o u s c e l l o p h a n e i n a s l a b g e l d r i e r a n d t h e n p h o t o g r a p h e d . G e l s w e r e e x p o s e d o n K o d a k X - O M A T A R f i l m a t - 8 0 9 0 f o r 5 - 2 4 h o u r s i n a c a s s e t t e w i t h i n t e n s i f y i n g s c r e e n s a n d t h e f i l m d e v e l o p e d i n K o d a k G B X d e v e l o p e r . A p p r o p r i a t e s e c t i o n s o f t h e d r i e d g e l w e r e c u t o u t a n d c o u n t e d f o r C e r e n k o v r a d i a t i o n i n a B e c k m a n L S 9 0 0 0 l i q u i d s c i n t i l l a t i o n c o u n t e r . 1 9 0 U n l a b e l l e d g e l s d r i e d b e t w e e n t w o l a y e r s o f p o r o u s c e l l o p h a n e a n d a u t o r a d i o g r a p h s w e r e s c a n n e d d e n s i o m e t r i c a l l y o n a G i l f o r d R e s p o n s e 1 1 s p e c t r o p h o t o m e t e r . 2 2 8 R E S U L T S A l l a g o n i s t c o n c e n t r a t i o n s a r e t h e f i n a l c o n c e n t r a t i o n i n t h e p l a t e l e t i n c u b a t i o n m i x t u r e . R e s u l t s f o r e a c h a g o n i s t a r e p r e s e n t e d s e p a r a t e l y a n d a r e b a s e d o n a r e p r e s e n t a t i v e p a i r o f g e l s f o r t h a t a g o n i s t . P a i r s o f g e l s w e r e s e l e c t e d o n t h e b a s i s o f q u a l i t y a n d r e s o l u t i o n o f t h e o r i g i n a l g e l s a n d a u t o r a d i o g r a p h s a s w e l l a s e q u a l i t y o f r a d i o a c t i v e i n t e n s i t y . A l t h o u g h p a i r s w e r e l o a d e d e q u a l l y , t h e r e w a s s t i l l s o m e v a r i a t i o n i n t h e r a d i o a c t i v e i n t e n s i t y o f s o m e p a i r s . I t w a s f o u n d t h a t t h e c o u n t s p e r m i n u t e o f t h e 0 l a n e f o r t h e 4 7 k D a p r o t e i n w a s t h e b e s t i n d i c a t o r t h a t a p a i r o f g e l s w e r e w e l l - m a t c h e d . T h e a b s o r b a n c e m e a s u r e d o n d e n s i o m e t r i c s c a n n i n g o f p e a k s t h a t w e r e n o t a f f e c t e d b y a c t i v a t i o n a l s o i n d i c a t e d t h a t t h e p a i r s w e r e w e l l - m a t c h e d . D e n s i o m e t r i c s c a n s o f u n l a b e l l e d 1 1 % T d r i e d g e l s o f s o l u b i l i z e d n o n - a c t i v a t e d c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s d i d n o t i n d i c a t e a n y d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e t w o g r o u p s . H o w e v e r , b e c a u s e t h e r e w e r e v e r y l a r g e n u m b e r s o f b a n d s , d i f f e r e n c e s i n m i n o r b a n d s w o u l d n o t l i k e l y b e d e t e c t e d . A d e n o s i n e D i p h o s p h a t e U n d e r t h e n o n - a g g r e g a t i n g c o n d i t i o n s u s e d i n t h i s s t u d y ( n o n - s t i r r e d , w i t h 1 . 0 m M E D T A a n d n o e x o g e n o u s f i b r i n o g e n i n t h e m e d i u m ) n e i t h e r c o n t r o l o r a f f e c t e d p l a t e l e t s s i g n i f i c a n t l y p h o s p h o r y l a t e d t h e 2 0 o r 4 7 k D a p r o t e i n s i n r e s p o n s e t o 1 0 p M A D P . F i g u r e s 3 4 a a n d 3 4 b c o n t a i n a p a i r o f a u t o r a d i o g r a p h s i n w h i c h t h e p l a t e l e t s w e r e s t i m u l a t e d w i t h 2 2 9 0 . 9 % N a C l ( 0 l a n e ) o r 1 0 p M A D P a n d t h e r e a c t i o n s t o p p e d a t 5 , 1 5 a n d 3 0 s e c o n d s a n d 1 , 2 , 5 a n d 1 0 m i n u t e s . D e n s i o m e t r i c s c a n s o f t h e s e a u t o r a d i o g r a p h s a r e s h o w n i n F i g u r e s 3 5 a , 3 5 b , 3 6 a , 3 6 b , 3 7 a a n d 3 7 b . T h e 0 , 3 0 s e c o n d s a n d 5 m i n u t e l a n e s w e r e s e l e c t e d a s b e i n g t e m p o r a l l y r e p r e s e n t a t i v e s c a n s o f e a r l y a n d l a t e a c t i v a t i o n . T h e a p p r o p r i a t e b a n d s w e r e c u t o u t o f t h e l a b e l l e d g e l s a n d c o u n t e d b y C e r e n k o v c o u n t i n g . T h e s e r e s u l t s a r e s h o w n i n F i g u r e s 3 8 , 3 9 a n d 4 0 . A l t h o u g h t h e r e a p p e a r e d t o b e a s l i g h t i n c r e a s e i n t h e a b s o r b a n c e o f t h e 2 0 a n d 4 7 k D a p r o t e i n p e a k s o n t h e d e n s i o m e t r i c s c a n s o f a f f e c t e d p l a t e l e t s a t 3 0 s e c o n d s a n d 5 m i n u t e s ( F i g u r e s 3 6 a n d 3 7 ) , t h i s w a s n o t s u p p o r t e d b y c o u n t i n g t h e r a d i o a c t i v i t y o f t h e s e c t i o n s c u t o u t f r o m t h e g e l s ( F i g u r e s 3 8 a n d 3 9 ) . T h e 0 l a n e , b e i n g a n o u t s i d e l a n e , w a s w i d e r a n d s l i g h t l y l e s s d e n s e c o m p a r e d t o t h e i n n e r l a n e s . T h e 2 0 k D a b a n d o f t h e a f f e c t e d p l a t e l e t s w a s s l i g h t l y l e s s i n t e n s e l y l a b e l l e d t h a n t h a t o f c o n t r o l p l a t e l e t s . T h e r e w a s a l s o a n o t i c e a b l e d i f f e r e n c e i n t h e d e n s i t y b e t w e e n c o n t r o l a n d a f f e c t e d a u t o r a d i o g r a p h s o f a b a n d o f a p p r o x i m a t e l y 6 5 k D a . T h i s i s a p p a r e n t o n t h e a u t o r a d i o g r a p h s a n d d e n s i o m e t r i c s c a n s a n d i s r e f l e c t e d i n a l o w e r c o u n t s p e r m i n u t e f o r t h a t b a n d f r o m t h e a f f e c t e d g e l ( F i g u r e s 3 4 , 3 5 , 4 0 ) . T h i s d i f f e r e n c e w a s a p p a r e n t i n t h e 0 l a n e a n d d i d n o t a p p e a r t o b e a f f e c t e d b y s t i m u l a t i o n b y A D P . 2 3 0 F i g u r e 3 4 a . A u t o r a d i o g r a p h o f c o n t r o l 1 n P - 1 a b e l l e d p l a t e l e t s a c t i v a t e d b y 1 0 p M A D P , s o l u b i l i z e d a t v a r i o u s t i m e s a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . F i g u r e 3 4 b . A u t o r a d i o g r a p h o f a f f e c t e d z n P - l a b e l l e d p l a t e l e t s a c t i v a t e d b y 1 0 p M A D P , s o l u b i l i z e d a t v a r i o u s t i m e s a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . 2 3 1 1 0 5 3 0 5 1 m 2 m 5 m 1 0 m 5 5 k D a a D k 3 0 2 0 . 1 2 0 1 0 5 3 0 5 1 m 2 m 5 m 1 0 m 5 5 3 0 2 0 . 1 2 0 — 2 3 2 F i g u r e 3 5 a . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f r e s t i n g c o n t r o l 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . F i g u r e 3 5 b . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f r e s t i n g a f f e c t e d 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . 2 3 3 3 . 0 0 1 ' C o n t r o l 0 U U 2 c _ . . m g 2 0 k D a ‘ 2 c 9 J L . x . ' 0 . 1 0 l l l 7 3 . 0 0 1 1 1 l A f f e c t e d 0 _ 4 7 k D a _ N v 6 5 k D a ‘ 7 2 C . . . v _ M o w m 2 0 k D a C . . V - ‘ 0 . 2 0 I I I 1 0 . 0 9 0 H I L L I M E T E R S 1 1 0 . 0 0 0 2 3 4 F i g u r e 3 6 a . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f c o n t r o l 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d 3 0 s e c o n d s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 0 p M A D P a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . F i g u r e 3 6 b . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f a f f e c t e d 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d 3 0 s e c o n d s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 0 p M A D P a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . E C N G B R O S B A 2 3 5 4 . 0 0 A B S O R B Q N C E C o n t r o l 3 0 $ e c 2 0 k D e - 0 . 1 0 0 . 0 0 0 I I l 1 M I L L I M E T E R S 1 1 0 . 0 0 0 3 . 0 0 A f f e c t e d 3 0 s e c 4 7 k D a 6 5 k D a V 2 0 k D a . ~ / \ - 0 . 1 0 0 . 0 0 0 I l I M I L L I M E T E R S 1 1 0 . 0 0 0 2 3 6 F i g u r e 3 7 a . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f c o n t r o l 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d 5 m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 0 p M A D P a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . F i g u r e 3 7 b . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f a f f e c t e d 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d 5 m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 0 p M A D P a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . 2 3 7 4 . 0 0 ‘ L ' ' 4 C o n t r o l 5 m i n u 4 7 R D . 6 5 R D . 3 , _ I I m I — o r a 2 0 k c . a n C . . V _ . v a f / A ‘ 9 - 0 3 “ M I I l I ” 0 . 0 0 0 M L L W E T E R S 1 1 0 . 0 0 0 3 . 0 0 ‘ J ' A f f e c t e d 5 m i n 1 . . m U z c d a n . . g 2 0 n o . ‘ n m 5 V " 0 . 0 5 I I I 1 0 . 0 0 0 " H U N T E R S 1 1 0 . 0 0 0 2 3 8 F i g u r e 3 8 . P h o s p h o r y l a t i o n ( c p m ) o f t h e 2 0 k D a p r o t e i n b a n d o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d : n T - l a b e l l e d . p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 0 p M A D P a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . F i g u r e 3 9 . P h o s p h o r y l a t i o n ( c p m ) o f t h e 4 7 k D a p r o t e i n b a n d o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d : n P - l a b e l l e d . p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 0 p M A D P a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . l l l l l l l l l l l I I I I I I I I l J e t u l l l l n l i l M l l r l e l p s t n u o C e t u n l l l l l l l j l l l l l l l l l l l I l l l l l l l l l l l i l M l r r l e r p s t n u o C l l l l l j I ’ l I T l I l l l l [ l J I I L l L I L I l I I I I l I I I I l I I I I l n u l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l I l l l l l l l i J 6 0 5 5 5 0 4 5 4 0 3 5 3 0 2 5 2 0 8 5 8 0 7 5 7 0 6 5 6 0 5 5 5 0 2 3 9 j l l l l l T l l l l l l l l l r l l l l l l l l l l l l l ' l l T l l l l l r l l l l l l l l l r I - - C o n t r o l - + " n ¥ + e c t e d 4 1 2 1 + l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l a l l l l l l l l I l l l l l l l l l l - n b . O l - fi T i m e ( m i n u t e s ) 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 l T l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l e I ' l l l l l l - * - C o n t r o l - + " A f f e c t e d [ a l l a I l l l l l a a l l l a a a l l a a l l l a s l l l l l ‘ l l l l l a l l l l l l l l a l l 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 T i m e ( m i n u t e s ) l I I I I l n I I I I I I I l l n l l n l l l n u l n u l u n l n n l n n l u I I l 2 4 0 T l l l l l l l l l T T l r l [ l l l l ' l l l l l l l l l ' l l l l l l l r l l l l l l l l r 1 0 0 9 5 - * - C o n t r o l ' + ° A f f e c t e d 9 0 8 5 8 0 7 5 7 0 6 5 6 0 C o u n t s p e r M i n u t e 5 5 5 0 l n l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l ' l l l T I 4 5 T i m e ( m i n u t e s ) F i g u r e 4 0 . P h o s p h o r y l a t i o n ( c p m ) o f t h e 6 5 k D a p r o t e i n b a n d o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 0 p M A D P a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . 2 4 1 P l a t e l e t A c t i v a t i n g F a c t o r C o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 1 . 0 p M o r 0 . 1 p M P A F u n d e r n o n - a g g r e g a t i n g c o n d i t i o n s r a p i d l y p h o s p h o r y l a t e d t h e 2 0 a n d 4 7 k D a p r o t e i n s . T h e r e s p o n s e s o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s t o b o t h c o n c e n t r a t i o n s o f P A F w e r e s i m i l a r a n d o n l y r e s u l t s f r o m p l a t e l e t s i n c u b a t e d w i t h 0 . 1 u M P A F a r e i l l u s t r a t e d . F i g u r e s 4 1 a a n d 4 1 b s h o w a p a i r o f a u t o r a d i o g r a p h s i n w h i c h t h e p l a t e l e t s w e r e s t i m u l a t e d w i t h 0 . 9 % N a C l ( 0 l a n e ) o r 0 . 1 p M P A P a n d t h e r e a c t i o n s t o p p e d a t 5 , 1 5 a n d 3 0 s e c o n d s a n d 1 , 2 , 5 a n d 1 0 m i n u t e s . D e n s i o m e t r i c s c a n s o f t h e 0 , 2 0 s e c o n d s a n d 5 m i n u t e l a n e s o f t h e s e a u t o r a d i o g r a p h s a r e s h o w n i n F i g u r e s 4 2 a , 4 2 b , 4 3 a , 4 3 b , 4 4 a a n d 4 4 b . T h e a p p r o p r i a t e b a n d s w e r e c u t o u t o f t h e l a b e l l e d g e l s a n d c o u n t e d b y C e r e n k o v c o u n t i n g . T h e s e r e s u l t s a r e s h o w n i n F i g u r e s 4 5 , 4 6 a n d 4 7 . P h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 a n d 4 7 k D a p r o t e i n s w a s v i s i b l e o n t h e a u t o r a d i o g r a p h s b y f i v e s e c o n d s a n d h a d p e a k e d b y o n e m i n u t e , d e c r e a s i n g s l i g h t l y a f t e r t h a t t i m e ( F i g u r e s 4 1 a n d 4 5 ) . T h e p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 a n d 4 7 k D a p r o t e i n s o f t h e a f f e c t e d p l a t e l e t s d e c l i n e d a l i t t l e m o r e r a p i d l y t h a n c o n t r o l s , b u t t h e s i g n i f i c a n c e o f t h i s , i f a n y , i s n o t k n o w n . T h e r e w a s a m a r k e d d e c r e a s e i n t h e r a d i o a c t i v e i n t e n s i t y o f t h e 6 5 k D a b a n d o f a f f e c t e d p l a t e l e t s t h a t w a s a p p a r e n t o n t h e a u t o r a d i o g r a p h s , s c a n s a n d b y c o u n t i n g ( F i g u r e s 4 1 , 4 2 a n d 4 7 ) . T h e r e w a s n o o b v i o u s p a t t e r n o f p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 6 5 k D a b a n d i n r e s p o n s e t o 0 . 1 p M P A F , a l t h o u g h t h e r e w a s a s l i g h t i n c r e a s e i n p h o s p h o r y l a t i o n w i t h i n o n e m i n u t e w h i c h t h e n d e c r e a s e d . S o m e i n c r e a s e d p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 6 5 k D a b a n d w a s s e e n i n o t h e r g e l s i n w h i c h p l a t e l e t s w e r e a c t i v a t e d b y 0 . 1 p M P A F , b u t i t w a s n o t a c o n s i s t e n t o c c u r r e n c e a n d i s o f u n k n o w n s i g n i f i c a n c e . 2 4 2 F i g u r e 4 1 a . A u t o r a d i o g r a p h o f c o n t r o l : ” P - l a b e l l e d p l a t e l e t s a c t i v a t e d b y 0 . 1 p M P A F , s o l u b i l i z e d a t v a r i o u s t i m e s a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . F i g u r e 4 1 b . A u t o r a d i o g r a p h o f a f f e c t e d : ” P - l a b e l l e d p l a t e l e t s a c t i v a t e d b y 0 . 1 p M P A F , s o l u b i l i z e d a t v a r i o u s t i m e s a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . 2 4 3 — 3 0 2 0 — - N . . . - . _ — 2 0 . 1 — 1 4 . 4 O s 1 m 2 m 5 m 1 0 m 6 5 — ~ s l l i l l s _ . — 3 0 2 0 — H ‘ - — _ . — 2 0 . 1 — — 1 4 . 4 2 4 4 F i g u r e 4 2 a . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f r e s t i n g c o n t r o l 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . F i g u r e 4 2 b . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f r e s t i n g a f f e c t e d 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . E C N I ‘ - J f B R O S B A E C N A B R O S B A 2 4 5 3 . 0 0 . 1 C o n t r o l 0 2 0 k D a 4 7 k D a v * f a A w ” ) — . 6 5 k D a V - 0 . 0 2 “ 0 . 0 0 0 M I L L I M E T E R S 1 1 0 . 0 0 0 - 0 . 0 1 “ A f f e c t e d 0 2 0 k D a 0 . 0 0 0 I I M I L L I M E T E R S 1 1 0 . 0 0 0 2 4 6 F i g u r e 4 3 a . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f c o n t r o l 3 Z I P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d 3 0 s e c o n d s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 1 u M P A F a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . F i g u r e 4 3 b . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f a f f e c t e d 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d 3 0 s e c o n d s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 1 p M P A F a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . ‘ ‘ ' r o n t o l 3 0 5 c c 4 7 R D - 9 6 5 R D - V " D ' V C 0 3 V I ‘ e d 3 0 5 e c 4 7 § I 1 t A f f e c 2 0 k D a 9 4 . 0 0 D 5 4 S o m m d J : “ 0 . 0 5 4 . 0 . 1 . . . . ' 7 : 0 . . I " ‘ 2 ’ m ‘ c : 8 m c L . - - _ _ I — I ‘ D a 6 5 D a k V k E - 0 0 0 1 0 “ . P 0 0 A 0 I M I I L L I M E T — I R S 1 1 0 . 0 0 0 2 4 7 2 4 8 F i g u r e 4 4 a . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f c o n t r o l 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d f i v e m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 1 p M P A F a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . F i g u r e 4 4 b . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f a f f e c t e d 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d f i v e m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 1 p M P A F a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . E C N A 4 B R O S B A 6 5 k D a P 2 4 9 4 . 0 0 L ' ' ‘ C o n t r o l 5 m i n . 4 ‘ 7 R D . L - N V U G S H h E m ' * § _ a : 3 , 2 0 n o . a n C ' U - 0 . 0 2 ‘ l ' t ‘ I I I I 3 . 0 0 L L l ' A f f e c t e d 5 m i n 4 7 k D a 2 0 H h ' I N ’ 0 - 0 5 I I 1 T 0 . 0 0 0 M I L L I M E T E R S 1 1 0 . 0 0 0 l 2 5 0 F i g u r e 4 5 . P h o s p h o r y l a t i o n ( c p m ) o f t h e 2 0 k D a p r o t e i n b a n d o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d : n P - 1 a b e 1 1 e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 1 p M P A F a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . F i g u r e 4 6 . P h o s p h o r y l a t i o n ( c p m ) o f t h e 4 7 k D a p r o t e i n b a n d o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d ‘ n P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 1 “ M P A F a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . l l l l l ' l l l l ' l l l l l l l l l l l l l l l l I I I I l J I I L l I I I I l I I I I l I I I I l fi I l I — I l I l l l I l I l I r l r l l f l l l l l I I I T I I l I I I I I I I I I J l u u I l I T I I l l l f l e l t u n i M r e p l l l l l I W I I I I W s I t n u o C I T I I I I T T I I I I I T I I ” " I u u l n u l u n l u n l I L I I l I I I I l I I L I l L I I I l I I u l C o u n t s p e r M i n u t e 1 1 0 1 0 0 9 0 8 0 7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 2 7 5 2 5 0 2 2 5 2 0 0 1 7 5 1 5 0 1 2 5 1 0 0 7 5 5 0 2 5 2 5 1 — ' 7 I r l l I I I l I l r l l l l l l l l T l l l l l I l l l l l T l l l l T l l l I l e l I r l ' l I r - * - C o n t r o l - + " A f f e c t e d l e l l l l l l l l e l l l l l A l l L l l l l l L L L l l l l L L l l l L l L L J L I I L L J L T i m e ( m i n u t e s ) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 [ r l l l l l l l r l l r l l I T T l l [ l r r T r l l l l r r l T l ' l l l r l l l l l l l l T ‘ l I # : ° 3 . - * - C o n t r o l ' ' - + " A f f e c t e d l l l l L l . [ L i l L A L R I L A I L I L L I I I J L I A I A L R I l l l l l l l l l l l l l l l I 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 T i m e ( m i n u t e s ) 2 5 2 I l l r T l l l l l 1 l l l l I l l l l I l l l l l l l l l I l l l l l l l l T T fi — l l l l l l l I 1 2 0 : - - ; 1 1 0 : - J E a P d 1 8 0 r 1 I — - l 0 ' - . . H I I : 5 9 0 E " ' : c F . - e ' . : I I I E 8 0 : - C o n t r o l - L - 2 2 t - + " A f f e c t e d - m 7 0 E , j 4 : _ _ . ‘ g - O . : ‘ 3 6 9 E ' _ i 4 - . . . . . . . . . . t t : . . . . . . . . . . . . + . . : 5 0 r : . . . . . . . . . t : + . . . . . . . . . z - + - - - - - - - - 4 8 : T . . . . . . . — : t : " + : 3 8 l a m a J L 4 1 a i a n 1 L 4 a l L i l — L I A a c a l L A J A l A 1 1 1 L A L 1 L A 1 1 — 0 l 2 3 4 5 6 7 8 ' 9 1 0 T i m e ( m i n u t e s ) F i g u r e 4 7 . P h o s p h o r y l a t i o n ( c p m ) o f t h e 6 5 k D a p r o t e i n b a n d o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d . 3 ? P - 1 a b e 1 1 e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 1 p M P A F a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A C E . 2 5 3 T h r o m b i n C o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 3 U / m l t h r o m b i n u n d e r n o n - a g g r e g a t i n g c o n d i t i o n s r a p i d l y p h o s p h o r y l a t e d t h e 2 0 a n d 4 7 k D a p r o t e i n s . F i g u r e s 4 8 a a n d 4 8 b s h o w a p a i r o f a u t o r a d i o g r a p h s i n w h i c h t h e p l a t e l e t s w e r e s t i m u l a t e d w i t h 0 . 9 % N a C l ( 0 l a n e ) o r 0 . 3 U / m l t h r o m b i n a n d t h e r e a c t i o n s t o p p e d a t 5 , 1 5 a n d 3 0 s e c o n d s a n d l , 2 , 5 a n d 1 0 m i n u t e s . D e n s i o m e t r i c s c a n s o f t h e 0 , 3 0 s e c o n d s a n d f i v e m i n u t e s l a n e s o f t h e s e a u t o r a d i o g r a p h s a r e s h o w n i n F i g u r e s 4 9 a , 4 0 b , 5 0 a , 5 0 b , 5 1 a a n d 5 1 b . T h e a p p r o p r i a t e b a n d s w e r e c u t o u t o f t h e l a b e l l e d g e l s a n d c o u n t e d b y C e r e n k o v c o u n t i n g . T h e s e r e s u l t s a r e s h o w n i n F i g u r e s 5 2 , 5 3 a n d 5 4 . B o t h c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s r e a c h e d p e a k p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 a n d 4 7 k D a b a n d s w i t h i n t w o m i n u t e s , b u t a f f e c t e d p l a t e l e t s d i d n o t p h o s p h o r y l a t e e i t h e r b a n d q u i t e a s w e l l a s c o n t r o l p l a t e l e t s ( F i g u r e s 5 2 a n d 5 3 ) . T h e r e w a s a v i s i b l e d i f f e r e n c e i n t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 6 5 k D a b a n d i n t h e 0 l a n e , b u t i t w a s p u s h e d f u r t h e r d o w n i n t o t h e g e l a f t e r t h r o m b i n - i n d u c e d a c t i v a t i o n b y a h e a v y p r o t e i n b a n d m i g r a t i n g i m m e d i a t e l y a b o v e t h e 6 5 k D a b a n d . T h i s b a n d w a s p r e s e n t o n t h e s t a i n e d g e l s , b u t n o t p h o s p h o r y l a t e d a n d i s l i k e l y t h e 6 9 . 5 k D a h y d r o l y t i c f r a g m e n t g l y c o p r o t e i n ‘ m n t h a t i s c l e a v e d f r o m s u r f a c e m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n V b y t h r o m b i n . ” 3 ' 5 2 8 I n b o t h g r o u p s , t h e r e w a s a n i n c r e a s e i n p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 6 5 k D a p r o t e i n i n r e s p o n s e t o a c t i v a t i o n b y t h r o m b i n ( F i g u r e 5 4 ) . T h e 0 t i m e c o u n t s p e r m i n u t e s v a l u e f o r t h e c o n t r o l w a s n o t a v a i l a b l e . T h i s i n c r e a s e i n p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 6 5 k D a p r o t e i n b a n d w a s a c o n s i s t e n t o c c u r r e n c e i n o t h e r g e l s i n w h i c h c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s w e r e i n c u b a t e d w i t h t h r o m b i n . 2 5 4 F i g u r e 4 8 a . A u t o r a d i o g r a p h o f c o n t r o l : ” P - l a b e l l e d p l a t e l e t s a c t i v a t e d b y 0 . 3 U / m l t h r o m b i n , s o l u b i l i z e d a t v a r i o u s t i m e s a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . F i g u r e 4 8 b . A u t o r a d i o g r a p h o f a f f e c t e d ‘ ” P - 1 a b e l l e d p l a t e l e t s a c t i v a t e d b y 0 . 3 U / m l t h r o m b i n , s o l u b i l i z e d a t v a r i o u s t i m e s a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . 2 5 5 0 5 5 1 0 5 3 0 5 1 m 2 m 5 m 1 0 m k D a k D a — 9 4 . - l _ | | l g g ! - . — 3 0 2 0 — ~ ~ - ' - ' — ‘ 2 0 . 1 0 5 5 1 0 5 3 0 s 1 m 2 m 5 m 1 0 m k D a k D a — - 9 4 6 5 — - — 6 7 4 7 — . ' _ " T . — 4 3 — 3 0 2 0 — , — 2 0 . 1 2 5 6 F i g u r e 4 9 a . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f r e s t i n g c o n t r o l 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . F i g u r e 4 9 b . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f r e s t i n g a f f e c t e d 3 2 P - l a ‘ b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . 2 5 7 4 . 0 0 1 l L l C o n t r o l 0 . . / C I " g 4 7 k D a \ l d : _ 6 5 k D a \ / b m a n m V ] l < 1 : I l , l 2 0 k D a ‘ l ) \ I V . ' l a x / ' I J ’ T ’ A L - fl u - a - h — V ' I T — d ” ! 0 . 0 0 0 M I L L I M E T E R S 1 1 0 . 0 0 0 4 . 0 0 1 L ' L A f f e c t e d 0 L I J U E 4 7 k D a m I I I L C 0 ! O 2 6 5 k D a C d 2 0 k D a T — V ’ 0 - 0 1 I I 1 I 0 . 0 0 0 M I L L I M E T E R S 1 1 0 . 0 0 0 2 5 8 F i g u r e 5 0 a . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f c o n t r o l 3 2 P — l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d 3 0 s e c o n d s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 3 U / m l t h r o m b i n a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . F i g u r e 5 0 b . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f a f f e c t e d 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d 3 0 s e c o n d s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 3 U / m l t h r o m b i n a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . 4 . 0 0 w o z ¢ : 8 m c C o n t r o . ‘ 2 0 k D a V ~ 0 . 0 1 0 ' 0 ” 4 . 0 0 A f f e c t l l , ' e 3 0 5 0 c d 3 0 $ e c fi w u z m o c o m m a r : * 0 . 0 5 0 " . 0 0 0 1 l 6 5 s z V 4 7 k D a V 1 I T D E a M I L L I M E 4 7 k f I I S L 1 R I 1 I — 1 1 0 . 0 0 0 b — I — 1 1 0 . 0 0 0 2 5 9 M I L L I M E T E R S . 2 6 0 F i g u r e 5 1 a . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f c o n t r o l 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d f i v e m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 3 U / m l t h r o m b i n a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A C E . F i g u r e 5 1 b . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f a f f e c t e d 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d f i v e m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 3 U / m l t h r o m b i n a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . 2 6 1 4 . 0 0 1 J | _ C o n t r o l 5 m i n ‘ 7 k D a ' 6 5 k D a V V L u 0 2 g - ‘ 2 0 k D a f — é “ : a , V m a : 0 . 0 0 I I l 4 . 0 0 1 1 1 A f f e c t e d 5 m i n 4 7 k D a - * _ I 6 5 k D a ‘ 6 3 I ' z ' ‘ \ a : a : “ \ p f I ! l o 2 0 k D a \ m m C v r \ “ 0 . 0 1 I a I 0 . 0 0 0 1 1 0 . 0 0 0 M I L L I M E T E R S 2 6 2 F i g u r e 5 2 . P h o s p h o r y l a t i o n ( c p m ) o f t h e 2 0 k D a p r o t e i n b a n d o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d z n P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 3 U / m l t h r o m b i n a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . F i g u r e 5 3 . P h o s p h o r y l a t i o n ( c p m ) o f t h e 4 7 k D a p r o t e i n b a n d o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d : ” P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 3 U / m l t h r o m b i n a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . ' U t r t r i I I U I I U I V I V I U r I I U I f ' U V U U T T I I I I I I U I I U I I I r I I I U ' 1 1 1 I 1 l 1 1 L 4 1 1 1 L 1 1 1 1 4 1 L 1 1 1 1 1 1 1 4 1 [ l l l I I I T Y I l l r l l j l l l l l l I I j I I I I I I I I I I — I I I T I I T F I I I I I T I I T 1 I l r r T l T l I l I l C o u n t s p e r M i n u t e C o u n t s p e r H i n u t e 4 0 0 3 5 0 3 0 0 2 5 0 2 0 0 1 5 0 1 0 0 8 4 0 7 6 0 6 8 0 6 0 0 5 2 0 4 4 0 3 6 0 2 8 0 2 0 0 2 6 3 - * - C o n t r o l " + ' n + + e c t e d 4 : — p y - P ~ p p I n - l l l l l l l l l l l l l l l l L J l l l l l l l L L L l A I J l l 0 u N . ( A 4 5 6 7 8 9 1 0 T i m e ( m i n u t e s ) I ' T V V I I U I U I U I U ' [ I U F I ' I U U I Y U I U V ' I I I I I T r r T I r r ' F I V I U U ] 4 ; J U J l i l l l i l l l l l l l l l l l l l l l i l l l i l J l - * - C o n t r o l " + - n ¥ ¥ e c t e d . l l l L l l l L l l l l l A I L L A L I A A I J J L U I I I A l l l l l l l l l l l l l L L L L l 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 T i m e ( m i n u t e s ) * . Z : ‘ o ‘ g - 5 5 2 g 5 5 4 4 3 3 2 2 8 3 8 3 8 3 8 3 1 3 0 0 0 0 0 9 0 0 0 E 3 : : — : E : E T V Y I ' I I I ' r r ' t : E r _ : - : 3 _ — - - _ - . . u A l + - 5 ' I : - l 4 0 4 ' n n n . + l l ~ + - . . . n l 2 Y 1 I T j ' F V V . . . . . . . . L ; A n 1 . . . 1 . 1 . 3 I . 4 Y r T Y I I I I . . . + _ . . . . . . 1 ; . n . 1 A L L ] 5 U . l I . 6 i ' r r l ' I I f ] I I - ~ 0 + - ° C A o i n f t e . . . . . . . . . . . . . . L L J A I . l 8 . . . . . . . . L l L l . l 7 T n T I T ' ' 7 1 - “ - — . j L J . : " ? 1 3 - I 2 - I 3 1 E 2 . n 4 . l 0 1 r c o t . . . l e . d . . . . . . . 1 n L 1 9 2 6 4 T i m e ( m i n u t e s ) F i g u r e 5 4 . P h o s p h o r y l a t i o n ( c p m ) o f t h e 6 5 k D a p r o t e i n b a n d o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d : ” P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 3 U / m l t h r o m b i n a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . 2 6 S P h o r b o l H y r i s t a t e A c e t a t e C o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 3 . 0 p M P M A u n d e r n o n - a g g r e g a t i n g c o n d i t i o n s s l o w l y p h o s p h o r y l a t e d t h e 2 0 k D a p r o t e i n a n d r a p i d l y p h o s p h o r y l a t e d t h e 4 7 k D a p r o t e i n . F i g u r e s 5 5 a a n d 5 5 b s h o w a p a i r o f a u t o r a d i o g r a p h s i n w h i c h t h e p l a t e l e t s w e r e s t i m u l a t e d w i t h 9 % N a C l ( 0 l a n e ) o r 3 . 0 p M P M A a n d t h e r e a c t i o n s t o p p e d a t 5 , 1 5 a n d 3 0 s e c o n d s a n d 1 , 2 , 5 a n d 1 0 m i n u t e s . D e n s i o m e t r i c s c a n s o f t h e 0 , 3 0 s e c o n d a n d f i v e m i n u t e l a n e s o f t h e s e a u t o r a d i o g r a p h s a r e s h o w n i n F i g u r e s 5 6 a , 5 6 b , 5 7 a , 5 7 b , 5 8 a a n d 5 8 b . T h e a p p r o p r i a t e b a n d s w e r e c u t o u t o f t h e l a b e l l e d g e l s a n d c o u n t e d b y C e r e n k o v c o u n t i n g . T h e s e r e s u l t s a r e s h o w n i n F i g u r e s 5 9 , 6 0 a n d 6 1 . C o n t r o l p l a t e l e t s s l o w l y p h o s p h o r y l a t e d t h e 2 0 k D a p r o t e i n , r e a c h i n g a m a x i m u m 1 0 m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f P M A . C o n t r o l p l a t e l e t c o u n t s p e r m i n u t e v a l u e s w e r e n o t a v a i l a b l e f o r t h e 5 s e c o n d a n d 1 m i n u t e i n c u b a t i o n t i m e s . A f f e c t e d p l a t e l e t s a l s o p h o s p h o r y l a t e d t h e 2 0 k D a p r o t e i n s l o w l y , a l t h o u g h t o a s l i g h t l y l e s s e r e x t e n t t h a n c o n t r o l s ( F i g u r e s 5 5 , 5 6 , 5 7 , 5 8 a n d 5 9 ) . T h e r e d i d n o t a p p e a r t o b e a n y d i f f e r e n c e i n t h e p a t t e r n o r e x t e n t o f p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 4 7 k D a p r o t e i n b e t w e e n t h e t w o g r o u p s ( F i g u r e s 5 5 , S 6 , 5 8 a n d 6 0 ) . A l t h o u g h t h e 6 5 k D a b a n d w a s p h o s p h o r y l a t e d t o a l e s s e r e x t e n t i n a f f e c t e d p l a t e l e t s c o m p a r e d t o c o n t r o l s , i n b o t h g r o u p s t h e r e a p p e a r e d t o b e a t i m e - d e p e n d e n t p h o s p h o r y l a t i o n o f t h i s b a n d i n r e s p o n s e t o 3 . 0 p M P M A ( F i g u r e s 5 5 , 5 6 , 5 7 a n d 6 1 ) . T h i s o c c u r r e d i n t h e o t h e r g e l s i n w h i c h p l a t e l e t s w e r e s t i m u l a t e d b y P M A . 2 6 6 F i g u r e 5 5 a . A u t o r a d i o g r a p h o f c o n t r o l . 3 z P - 1 a b e l l e d p l a t e l e t s a c t i v a t e d b y 3 . 0 p M P M A , s o l u b i l i z e d a t v a r i o u s t i m e s a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . F i g u r e 5 5 b . A u t o r a d i o g r a p h o f a f f e c t e d z fl P - l a b e l l e d p l a t e l e t s a c t i v a t e d b y 3 . 0 p M P M A , s o l u b i l i z e d a t v a r i o u s t i m e s a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . 2 6 7 k D a 1 m 2 m 5 m 1 0 m 1 0 5 3 0 5 5 5 0 4 9 _ — 6 7 — 4 3 — 3 0 ' — 2 0 . 1 2 0 1 m 2 m 5 m 1 0 m 1 0 5 3 0 5 5 5 0 k D a — 9 4 — 6 7 — 4 3 7 . 4 3 0 — 2 0 . 1 I - — o 2 0 — 2 6 8 F i g u r e 5 6 a . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f r e s t i n g c o n t r o l 3 2 P - 1 a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . F i g u r e 5 6 b . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f r e s t i n g a f f e c t e d 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . 2 6 9 3 . 0 0 l I l 1 C o n t r o l 0 U U z , G d 4 7 k D e , a n m 0 V I a n C ‘ 0 - 1 0 I I I I f 3 . ” L l I I A f f e c t e d 0 8 4 7 K B z ' 6 5 t o . g - I ‘ m V o 2 c 2 0 k D a V V 0 . 0 0 0 1 0 5 . 0 0 0 M I L L I N E T E R S 2 7 0 F i g u r e 5 7 a . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f c o n t r o l 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d 3 0 s e c o n d s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 3 . 0 p M P M A a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . F i g u r e 5 7 b . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f a f f e c t e d 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d 3 0 s e c o n d s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 3 . 0 “ M P M A a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . 2 7 1 4 . 0 0 l I I I C o n t r o l 3 O S e c 4 7 k D a V 8 6 5 k D a 2 g ‘ 1 ' I — M o W 2 0 k D a m C I ' - 0 . 0 5 , j I 0 . 0 0 0 M L U M E T E R S 1 0 5 . 0 0 0 4 . 0 0 1 ' ' P A f f e c t e d 3 0 s e c 4 7 k D a V I l l 0 2 6 5 m . 4 : . . _ 3 2 a V m 2 0 k D a C d v I - " 9 - 1 0 ‘ r — ‘ k ‘ I I I I 2 7 2 F i g u r e 5 8 a . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f c o n t r o l a z P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d f i v e m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 3 . 0 p M P M A a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . F i g u r e 5 8 b . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f a f f e c t e d a z P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d f i v e m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 3 . 0 p M P M A a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . 4 . 0 0 1 C o n t r o l 5 m m . . . 8 z 3 I 8 m a ! ) : ‘ 0 . 0 5 d 4 . 0 0 _ ‘ 0 0 ' - - ° ° ° I I : , I U g n a oI m C 1 - 0 . 2 0 k a D e d 5 m i n A f f k c t e 2 0 D a k V I L L I I M I L L I M E T E I I 7 ‘ k D a * S I I 4 7 I R D a k V D e G S k V r I l e 6 5 V I _ _ - t t 1 0 5 - 0 0 0 2 7 3 2 7 4 F i g u r e 5 9 . P h o s p h o r y l a t i o n ( c p m ) o f t h e 2 0 k D a p r o t e i n b a n d o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a f t e r t h e a d d i t i o n o f 3 . 0 u M P M A a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . F i g u r e 6 0 . P h o s p h o r y l a t i o n ( c p m ) o f t h e 4 7 k D a p r o t e i n b a n d o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a f t e r t h e a d d i t i o n o f 3 . 0 p H P M A a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . [ I I U I I V T I F T I I I U ] l 0 l [ l I l I l I L T l 1 I l U l L l l l l l l 2 l l l 3 I I I I I r r I I F I F U I l l T U T I l 4 i I e t u n i M r e p s t n u o C ] I I I I ] I U T I I I I I I I W I I I I r I I I I I I I I I I ! ] n I I I T I I I I H I I I e I t I u I n I i M r e p s t n u o C I I I I I I I I I I I H I I I H I I I I I I [ T T I T I U I I T ' U I T T I I T T ' I l l ' l I [ T I U T T l m l l l l l l l l 5 l l L l l 6 l 7 l l l l l l l l l 8 l l l l l 9 l 1 0 e ( m i n T I r F I Y u ' t e s ) T r I I U Y T I I I I r I Y I I U I T ' I T I l l l l l l L l l j l l l l i J l L l l l l e l l l l l l l i l l l l l l l L l l n l l l n n l n n l n l u l u l J [ I I I l l u n l m 1 1 l l l I l 1 0 l l l l l I l l l l l l l l 2 3 4 l i T L l l l l 5 m e ( m i l n l u l l l 6 t e s ) l l l l l 7 l l l l l l l l l l l l l l 8 9 l 1 8 4 5 0 4 0 0 3 5 0 3 0 0 2 5 0 2 0 0 1 5 0 1 0 0 5 0 1 0 0 0 9 0 0 8 0 0 7 0 0 6 0 0 5 0 0 4 0 0 3 0 0 2 0 0 2 7 5 . . . . . . . . . . . + _ , g - * - C o n t r o l ” + 9 . - + ~ A f f e c t e d - * - C o n t r o l - + " A f f e c t e d 2 7 6 7 0 8 — [ r I U U I T T f r l I T I F T U U I I I I T I U I r Y I I [ I I I I I I I I I I T I f I — [ I l i l r — ' 1 » I L . 6 0 0 - 1 ° ’ - 1 4 5 ' - - I £ 9 5 0 0 - 3 1 L " - - C o n t r o l - g - - + - ¢ I f f e c t e d 3 . ‘ 2 4 0 0 ~ . 3 C . . . . I g _ o - I 3 0 0 - . 1 " . . “ + . I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I + . - l - + . . . . . . . . . + . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - + , + . - - ' . ' * ' . ‘ 1 2 0 0 — + [ A l l l l l l l l l l l l l l l k l l l L J l l l J l l l I J J A I L A A A I I A l l l l l I A l l 0 1 2 3 4 s 6 7 8 9 1 0 T i m e ( m i n u t e s ) F i g u r e 6 1 . P h o s p h o r y l a t i o n ( c p m ) o f t h e 6 5 k D a p r o t e i n b a n d o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d : ” ? - 1 a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a f t e r t h e a d d i t i o n o f 3 . 0 p M P M A a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . 2 7 7 C a l c i u m I o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 C o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 1 . 0 “ M A 2 3 1 8 7 u n d e r n o n - a g g r e g a t i n g c o n d i t i o n s r a p i d l y p h o s p h o r y l a t e d t h e 2 0 k D a p r o t e i n a n d m o r e s l o w l y p h o s p h o r y l a t e d t h e 4 7 k D a p r o t e i n . F i g u r e s 6 2 a a n d 6 2 b s h o w a p a i r o f a u t o r a d i o g r a p h s i n w h i c h t h e p l a t e l e t s w e r e s t i m u l a t e d w i t h 0 . 9 % N a C l ( 0 l a n e ) o r 1 . 0 p M A 2 3 1 8 7 a n d t h e r e a c t i o n s t o p p e d a t 5 , 1 5 a n d 3 0 s e c o n d s a n d l , 2 , 5 a n d 1 0 m i n u t e s . D e n s i o m e t r i c s c a n s o f t h e 0 , 3 0 s e c o n d a n d f i v e m i n u t e s l a n e s o f t h e s e a u t o r a d i o g r a p h s a r e s h o w n i n F i g u r e s 6 3 a , 6 3 b , 6 4 a , 6 4 b , 6 5 a a n d 6 5 b . T h e a p p r o p r i a t e b a n d s w e r e c u t o u t o f t h e l a b e l l e d g e l s a n d c o u n t e d b y C e r e n k o v c o u n t i n g . T h e s e r e s u l t s a r e s h o w n i n F i g u r e s 6 6 , 6 7 a n d 6 8 . B o t h g r o u p s p h o s p h o r y l a t e d t h e 2 0 k D a p r o t e i n b a n d r a p i d l y , w i t h m a x i m u m p h o s p h o r y l a t i o n o c c u r r i n g 0 . 5 t o 2 m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f A 2 3 1 8 7 ( F i g u r e s 6 2 , 6 3 , 6 4 , 6 5 a n d 6 6 ) . T h e 4 7 k D a p r o t e i n w a s p h o s p h o r y l a t e d i n b o t h g r o u p s , a l t h o u g h m o r e s l o w l y t h a n t h e 2 0 k D a b a n d , w i t h m a x i m u m p h o s p h o r y l a t i o n o c c u r r i n g a t f i v e m i n u t e s ( F i g u r e s 6 2 , 6 3 , 6 4 , 6 5 a n d 6 7 ) . T h e d e g r e e o f p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 a n d 4 7 k D a p r o t e i n s i n a f f e c t e d p l a t e l e t s i s s l i g h t l y l e s s t h a n t h a t o f c o n t r o l p l a t e l e t s . T h i s w a s a l s o s e e n i n o t h e r g e l s i n w h i c h t h e p l a t e l e t s w e r e a c t i v a t e d b y A 2 3 1 8 7 . B a s e l i n e p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 6 5 k D a b a n d w a s m a r k e d l y l e s s i n t e n s e i n a f f e c t e d p l a t e l e t s c o m p a r e d t o c o n t r o l s . P h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 6 5 k D a b a n d d i d n o t a p p e a r t o b e a f f e c t e d s i g n i f i c a n t l y b y A 2 3 1 8 7 i n e i t h e r g r o u p ( F i g u r e s 6 2 , 6 3 , 6 4 , 6 5 a n d 6 8 ) . 2 7 8 F i g u r e 6 2 a . A u t o r a d i o g r a p h o f c o n t r o l . 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s a c t i v a t e d b y 1 . 0 p M A 2 3 1 8 7 , s o l u b i l i z e d a t v a r i o u s t i m e s a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . F i g u r e 6 2 b . A u t o r a d i o g r a p h o f a f f e c t e d : n P - l a b e l l e d p l a t e l e t s a c t i v a t e d b y 1 . 0 p M A 2 3 1 8 7 , s o l u b i l i z e d a t v a r i o u s t i m e s a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . 2 0 _ “ N “ 1 . . . u u - D ’ ~ ‘ — » _ 2 0 . 1 2 7 9 0 5 5 1 0 5 3 0 5 1 m 2 m 5 m 1 0 m k D a k D a — 9 4 — 6 7 6 5 — 4 7 _ — 4 3 — 3 0 2 0 ‘ 4 ‘ ‘ — . - " — 2 0 . 1 0 5 5 1 0 5 3 0 5 1 m 2 m 5 m 1 0 m k D a — 9 4 k D a . " " “ _ 6 5 — 4 7 — 4 3 ' — 3 0 2 8 0 F i g u r e 6 3 a . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f r e s t i n g c o n t r o l 3 2 P — l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . F i g u r e 6 3 b . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f r e s t i n g a f f e c t e d 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . 2 8 1 3 0 0 1 L L C o n t r o l 0 l l ] ‘ 2 ’ g _ , ‘ 7 k D a 6 5 k D a _ S I n 6 V o n C . 4 2 0 k 0 . _ V - 9 . 0 1 — I — . z _ / \ ~ “ I ~ r " ‘ * l 1 0 . 0 0 0 M I L L I H E T E R S 1 0 5 . 0 0 0 3 0 0 ‘ I I A f f e c t e d 0 L I J U 2 4 7 R D - 3 : - _ g ' 6 5 R D . 2 a : V d 2 0 k D a + - V — 0 . 0 1 “ M . I I 2 8 2 F i g u r e 6 4 a . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f c o n t r o l 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d 3 0 s e c o n d s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 . 0 p M A 2 3 1 8 7 a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . F i g u r e 6 4 b . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f a f f e c t e d 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d 3 0 s e c o n d s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 . 0 M M A 2 3 1 8 7 a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . 7 " . _ 3 . 0 0 I I U i a ( o I a c I n : : Z 5 0 0 I J : n L U 2 d 2 a o C 2 0 0 0 . . - 0 3 . “ 0 l 1 o r l 3 0 5 e c n D t a C o k V 2 0 ‘ l ' 4 7 k 0 V 6 5 k D a V L L l M E T E S I R L 4 7 k 0 . d 3 0 $ e c J 0 0 0 A f f e c t 2 0 k D a ‘ I ‘ e I M I I ' I _ . . ” 5 ' 0 ” 6 5 R O I : I - I R S I 1 5 1 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 M I L L I M E T E 2 8 3 2 8 4 F i g u r e 6 5 a . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f c o n t r o l 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d f i v e m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 . 0 p M A 2 3 1 8 7 a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . F i g u r e 6 5 b . D e n s i o m e t r i c s c a n o f a n a u t o r a d i o g r a p h o f a f f e c t e d 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d f i v e m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 . 0 p M A 2 3 1 8 7 a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . 2 8 5 1 0 5 . 0 0 0 3 . 0 0 I I I 4 7 k D a C o n t r o l 5 m i n V 7 6 5 k D a " m V o E m " 2 0 k D a " ' o z 3 , V m a : " 1 I " - 0 . 0 2 I I I ° - ° ° ° M I L L I M E T E R S 3 . 0 0 I I I 4 7 k D a A f f e c t e d 5 m i n Q I I I 0 6 5 k D a z c d . g " 0 V « I m c — 0 . 0 2 J I I I 0 . 0 0 0 M I L L I M E T E R S 1 0 5 . 0 0 0 2 8 6 F i g u r e 6 6 . P h o s p h o r y l a t i o n ( c p m ) o f t h e 2 0 k D a p r o t e i n b a n d o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d : ” P - 1 a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 . 0 p M A 2 3 1 8 7 a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . F i g u r e 6 7 . P h o s p h o r y l a t i o n ( c p m ) o f t h e 4 7 k D a p r o t e i n b a n d o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d : ” ? - 1 a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 . 0 p M A 2 3 1 8 7 a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . l n n l n n l n l I l n n l n n l n n l n n l n n l u n l m I l n I l l l l f l l l l l l l l l l l l l l l e t l u l l n l i M r e p s t n u l l l l l f l l l l l l l l l l o l l I l l l l l l l l l ] l l I l l C e t u n i M r e p s t n u o C 1 4 0 1 3 0 1 2 0 1 1 0 1 0 0 9 0 8 0 7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 5 0 2 2 0 1 9 0 1 6 0 1 3 0 1 0 0 7 0 2 8 7 I I I I I I I I I I I I I I I I U I V I I I F U I I I I I I I I I I I I I I l l l l t l l l I r v _ . _ C o n t r o l - + - A f f e c t e d T i m e ( m i n u t e s ) I I I I I | ' l l l l [ V I I I I I I I I Y I I I I I l l T l l l l l l l ' l l l l l l ' l ‘ l I l ’ ' : - ' - C o n t r o l ' ‘ - l - - + - A f f e c t e d — — A l I A l I n e ' - l - . I . . I l l I . l . - l 0 1 2 : 5 4 s 6 7 8 9 1 0 T i m e ( m i n u t e s ) r T l l l l l l l T ‘ l l l T l l l l l l J l l l l l l l l [ J l l l l l l l l l l l l l r l l fl l I l l l l L l L l l l l l l l l l l l l l 1 2 0 1 1 0 o 1 0 0 ' 0 ’ s . S . I : 9 8 L m A m 8 0 ‘ J c s o ‘ 3 7 0 6 0 5 0 F i g u r e 6 8 . 2 8 8 I l [ V I I I I V I I I I I I I V V I I I U ' I Y I I I I V I I V I I I I V I U I V I I V I I - - C o n t r o l - + - A f f e c t e d f + 0 2 % ‘ 3 ' + l n _ . 1 4 l J . A A I n . . . l . . n n L n L n . l - . . . l i n t n l ; a . . l n . n . G 1 2 3 4 5 6 7 8 9 T i m e ( m i n u t e s ) P h o s p h o r y l a t i o n ( c p m ) o f t h e 6 5 k D a p r o t e i n b a n d o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d 3 2 P - l a b e l l e d p l a t e l e t s s o l u b i l i z e d a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 . 0 p M A 2 3 1 8 7 a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . 2 8 9 D I S C U S S I O N S t r o n g a g o n i s t s a n d t h o s e o f i n t e r m e d i a t e s t r e n g t h a r e a b l e t o m e d i a t e t h e r e l e a s e r e s p o n s e f r o m h u m a n p l a t e l e t s a n d s t i m u l a t e t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 k D a m y o s i n l i g h t c h a i n a n d 4 7 k D a p r o t e i n i n t h e a b s e n c e o f a g g r e g a t i o n . T h e s e a g o n i s t s i n c l u d e t h r o m b i n , P A F a n d c a l c i u m i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 . 1 ‘ 3 ' 1 8 3 ' 2 5 2 ' 2 7 7 ' 2 3 1 A w e a k a g o n i s t s u c h a s A D P d o e s n o t i n d u c e p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 a n d 4 7 k D a p r o t e i n s i n n o r m a l h u m a n p l a t e l e t s u n d e r n o n - s t i r r e d , n o n - a g g r e g a t i n g c o n d i t i o n s i n w h i c h r e l e a s e o f g r a n u l e c o n t e n t s a n d a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s d o e s n o t o c c u r . 1 " 3 ' 1 8 3 N e i t h e r c o n t r o l o r a f f e c t e d c a n i n e p l a t e l e t s p h o s p h o r y l a t e d t h e 2 0 k D a p r o t e i n u n d e r n o n - a g g r e g a t i n g c o n d i t i o n s . T h i s s u g g e s t s , b u t d o e s n o t p r o v e , t h a t t h e m e c h a n i s m o f a c t i v a t i o n o f c a n i n e p l a t e l e t s i n r e s p o n s e t o A D P i s s i m i l a r t o t h a t o f h u m a n p l a t e l e t s . A l t h o u g h a f f e c t e d p l a t e l e t s i n p l a t e l e t r i c h p l a s m a s e c r e t e d e n s e g r a n u l e c o n t e n t s i n t h e a b s e n c e o f p r i m a r y a g g r e g a t i o n , t h e i r b e h a v i o r i n r e s p o n s e t o A D P i s s t i l l a p p a r e n t l y g o v e r n e d b y t h e s a m e f a c t o r s t h a t i n f l u e n c e n o r m a l p l a t e l e t s . T h e b a s e l i n e d e g r e e o f : ” P i n c o r p o r a t i o n i n t o t h e 2 0 k D a p r o t e i n o f a f f e c t e d p l a t e l e t s i n t h e 0 l a n e w a s l e s s t h a n t h a t o f c o n t r o l p l a t e l e t s w h i l e t h a t o f t h e 4 7 k D a p r o t e i n w a s s i m i l a r . P l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r c a u s e s r a p i d p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 a n d 4 7 k D a p r o t e i n s i n h u m a n p l a t e l e t s , e v e n i n t h e a b s e n c e o f r e l e a s e d A D P o r a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s . 2 5 2 ' 2 7 7 P h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 k D a p r o t e i n i n b o t h c o n t r o l a n d a f f e c t e d c a n i n e p l a t e l e t s w a s v e r y r a p i d , p h o s p h o r y l a t i o n , w a s l e s s t h a n t h a t o f c o n t r o l p l a t e l e t s , a l t h o u g h t h e 2 9 0 p e a k i n g w i t h i n 3 0 s e c o n d s o f t h e a d d i t i o n o f 1 . 0 p M o r 0 . 1 M M P A F . B a s e l i n e i n c o r p o r a t i o n o f i n P i n t o t h e 2 0 k D a b a n d w a s s l i g h t l y l e s s i n a f f e c t e d c o m p a r e d t o c o n t r o l p l a t e l e t s , b u t t h e p e r c e n t a g e i n c r e a s e a b o v e b a s e l i n e a n d r a t e s o f d e p h o s p h o r y l a t i o n w e r e s i m i l a r i n m o s t g e l s . P h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 4 7 k D a p r o t e i n w a s a l s o v e r y r a p i d i n b o t h c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s , p e a k i n g i n o n e m i n u t e o r l e s s . B a s e l i n e i n c o r p o r a t i o n o f z n P w a s s i m i l a r i n b o t h g r o u p s . P h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 k D a p r o t e i n c o r r e l a t e d w e l l t o t h e s h a p e c h a n g e s e e n i n p l a t e l e t r i c h p l a s m a i n b o t h g r o u p s . H o w e v e r , i t i s d i f f i c u l t t o r e l a t e i t t o t h e f a i l u r e o f d e n s e g r a n u l e s e c r e t i o n f r o m a f f e c t e d p l a t e l e t s i n r e s p o n s e t o 0 . 1 p H P A F a s t h e e f f e c t i v e c o n c e n t r a t i o n o f P A F i n a n a l b u m i n - f r e e b u f f e r i s h i g h e r t h a n i n p l a s m a . I n a l a t e r s t u d y , i t w a s f o u n d t h a t 0 . 1 u M P A F i n a p r o t e i n - f r e e b u f f e r h a s a p p r o x i m a t e l y t h e s a m e e f f e c t a s 1 . 0 p M P A F i n p l a t e l e t r i c h p l a s m a . T h e l a c k o f s i g n i f i c a n t a g g r e g a t i o n o f a f f e c t e d p l a t e l e t s i n r e s p o n s e t o P A F d o e s n o t a p p e a r t o b e r e l a t e d t o a n i n a b i l i t y t o p h o s p h o r y l a t e t h e 2 0 o r 4 7 k D a p r o t e i n s . T h r o m b i n h a s b e e n r e p o r t e d t o c a u s e p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 a n d 4 7 k D a p r o t e i n s i n h u m a n p l a t e l e t s w i t h i n 3 0 t o 6 0 s e c o n d s u n d e r t h e n o n - a g g r e g a t i n g c o n d i t i o n s u s e d i n t h i s s t u d y . ” ’ 3 T h i s i s v e r y s i m i l a r t o t h e r e s p o n s e o f c o n t r o l c a n i n e p l a t e l e t s w h i c h r e a c h e d p e a k p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 k D a b a n d w i t h i n t w o m i n u t e s o f t h e a d d i t i o n o f 0 . 3 U / m l t h r o m b i n . A f f e c t e d p l a t e l e t s a l s o p h o s p h o r y l a t e d t h e 2 0 k D a b a n d a t t h e s a m e i n i t i a l r a t e a s c o n t r o l p l a t e l e t s . T h e b a s e l i n e d e g r e e o f i n c o r p o r a t i o n o f : u P i n t o t h e 2 0 k D a p r o t e i n , a s w e l l a s p e a k 2 9 1 p e r c e n t a g e i n c r e a s e i n p h o s p h o r y l a t i o n a b o v e t h e b a s e l i n e l e v e l w a s s i m i l a r i n b o t h g r o u p s . T h e i n i t i a l r a t e o f p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 4 7 k D a p r o t e i n i n a f f e c t e d p l a t e l e t s w a s s i m i l a r t o c o n t r o l s , b u t d i d n o t r e a c h a s h i g h a p e a k . T h i s w a s a t r e n d s e e n i n m o s t , b u t n o t a l l p a i r s o f g e l s . T h e s i m i l a r i n i t i a l r a t e o f p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 k D a p r o t e i n i n b o t h g r o u p s c o r r e l a t e s w e l l w i t h t h e o c c u r r e n c e o f s h a p e c h a n g e a n d s i m i l a r r a t e o f d e n s e g r a n u l e s e c r e t i o n f r o m b o t h g r o u p s o f p l a t e l e t s . T h e m a r k e d l y s l o w e r i n i t i a l r a t e o f a g g r e g a t i o n o f a f f e c t e d p l a t e l e t s d o e s n o t a p p e a r t o b e t h e d i r e c t l y r e l a t e d t o a n a b n o r m a l r a t e o f p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 o r 4 7 k D a p r o t e i n s . A c t i v a t i o n o f h u m a n p l a t e l e t s i n d u c e d b y P M A i s a s s o c i a t e d w i t h s l o w p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 k D a m y o s i n l i g h t c h a i n t h a t i s m e d i a t e d m a i n l y t h r o u g h p r o t e i n k i n a s e 0 . 2 “ 5 ' 3 ‘ 5 T h e s i t e p h o s p h o r y l a t e d i n t h e m y o s i n l i g h t c h a i n i s d i s t i n c t f r o m t h a t p h o s p h o r y l a t e d b y t h e m y o s i n l i g h t c h a i n k i n a s e . “ m T h e r e i s a l s o s o m e e a r l y r e v e r s i b l e p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 k D a p r o t e i n b y m y o s i n l i g h t c h a i n k i n a s e i n F H A - s t i m u l a t e d p l a t e l e t s f w 5 E n d o g e n o u s 1 , 2 - d i a c y 1 g l y c e r o l p r o d u c e d b y t h r o m b i n - s t i m u l a t e d p l a t e l e t s d o e s n o t p h o s p h o r y l a t e t h e 2 0 k D a b a n d a t t h e s i t e p h o s p h o r y l a t e d b y P M A - s t i m u l a t e d p r o t e i n k i n a s e C . M 6 T h e r e f o r e t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 k D a p r o t e i n b y p r o t e i n k i n a s e C i n P M A - s t i m u l a t e d p l a t e l e t s m a y n o t h a v e a n y p h y s i o l o g i c a l s i g n i f i c a n c e . B o t h c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 3 . 0 p M P M A s l o w l y p h o s p h o r y l a t e d t h e 2 0 k D a b a n d w i t h p e a k p h o s p h o r y l a t i o n o c c u r r i n g a t f i v e t o 1 0 m i n u t e s , a l t h o u g h a f f e c t e d p l a t e l e t s i n c o r p o r a t e d l e s s 3 2 P i n t o t h e 2 0 k D a b a n d t h a n c o n t r o l s . B a s e l i n e 3 2 F i n c o r p o r a t i o n i n t o t h e 2 0 k D a b a n d w a s s i m i l a r i n b o t h g r o u p s , b u t t h e 2 9 2 r a d i o a c t i v i t y c o u n t e d f o r t h e 0 l a n e o f a f f e c t e d p l a t e l e t s w a s c o n s i d e r a b l y h i g h e r t h a n a t 5 , 1 5 , 3 0 a n d 6 0 s e c o n d s , s u g g e s t i n g t h a t t h e v a l i d i t y o f t h e 0 v a l u e w a s q u e s t i o n a b l e . T h e r e m a y h a v e b e e n s o m e r a d i o a c t i v e c o n t a m i n a t i o n o f t h e s c i n t i l l a t i o n v i a l . P h o r b o l e s t e r s a r e a b l e t o s u b s t i t u t e f o r 1 , 2 - d i a c y l g l y c e r o l c a u s i n g i r r e v e r s i b l e a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C a n d p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 4 7 k D a p r o t e i n . 7 3 M a x i m a l p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 4 7 k D a p r o t e i n b y e x o g e n o u s a c t i v a t o r s o f p r o t e i n k i n a s e C i n h u m a n p l a t e l e t s i s n o t r e l a t e d t o t h e o n s e t o f a g g r e g a t i o n o r d e n s e g r a n u l e r e l e a s e . 2 7 ° ' “ ’ 9 C o n t r o l a n d a f f e c t e d c a n i n e p l a t e l e t s r a p i d l y a n d e x t e n s i v e l y p h o s p h o r y l a t e d t h e 4 7 k D a p r o t e i n . T h e r a t e o f p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 4 7 k D a b a n d d i d n o t c o r r e l a t e w i t h t h e s p e e d o f o n s e t o f a g g r e g a t i o n o r d e n s e g r a n u l e s e c r e t i o n i n e i t h e r g r o u p , h a v i n g p e a k e d m a n y m i n u t e s b e f o r e a g g r e g a t i o n o r s e c r e t i o n w a s s e e n i n p l a t e l e t r i c h p l a s m a . I n s o m e g e l s , t h e 4 7 k D a p r o t e i n w a s p h o s p h o r y l a t e d t o a l e s s e r d e g r e e i n a f f e c t e d p l a t e l e t s , b u t t h i s w a s n o t a c o n s i s t e n t f i n d i n g . T h e c a l c i u m i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 h a s b e e n r e p o r t e d t o s t i m u l a t e p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 a n d 4 7 k D a p r o t e i n s i n t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f 1 . 0 m M l i l G T A . 1 8 3 ' 2 8 1 B o t h c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s r a p i d l y p h o s p h o r y l a t e d t h e 2 0 k D a p r o t e i n , r e a c h i n g p e a k p h o s p h o r y l a t i o n w i t h i n t w o m i n u t e s o f t h e a d d i t i o n o f 1 . 0 p M A 2 3 1 8 7 . A l t h o u g h b a s e l i n e i n c o r p o r a t i o n o f fi n P i n t o t h e 2 0 k D a b a n d o f a f f e c t e d p l a t e l e t s w a s s l i g h t l y l e s s t h a n t h a t o f c o n t r o l s , t h e p e r c e n t a g e i n c r e a s e a b o v e b a s e l i n e p h o s p h o r y l a t i o n w a s s i m i l a r , o r h i g h e r , t h a n t h a t o f c o n t r o l s . T h e r a t e o f d e p h o s p h o r y l a t i o n f o r t h e t w o g r o u p s w a s 2 9 3 a l s o v e r y s i m i l a r . P h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 k D a p r o t e i n c o r r e l a t e d w i t h t h e o c c u r r e n c e o f s h a p e c h a n g e i n b o t h g r o u p s , b u t t h e r e d i d n o t a p p e a r t o b e a r e l a t i o n s h i p b e t w e e n p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 k D a m y o s i n l i g h t c h a i n a n d d e n s e g r a n u l e s e c r e t i o n i n a f f e c t e d p l a t e l e t s . I n s p i t e o f s i m i l a r p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 k D a p r o t e i n i n b o t h g r o u p s , a f f e c t e d p l a t e l e t s s e c r e t e d o n l y 4 t o 6 % t h e a m o u n t o f d e n s e g r a n u l e A T P s e c r e t e d b y c o n t r o l p l a t e l e t s . A l t h o u g h a c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e C b y A 2 3 1 8 7 i s d e p e n d e n t u p o n f o r m a t i o n o f a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s , i t h a s b e e n r e p o r t e d t h a t A 2 3 1 8 7 i n d u c e s p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 4 7 k D a p r o t e i n i n t h e a b s e n c e o f 8 1 T h e i n c r e a s e i n i n t r a c e l l u l a r C a 2 + i s p h o s p h o l i p a s e C a c t i v a t i o n . 2 t h o u g h t t o a c t i v a t e p r o t e i n k i n a s e C w i t h o u t t h e f o r m a t i o n o f d i a c y l g l y c e r o l . I t h a s a l s o b e e n r e p o r t e d t h a t t h e c a l c i u m i o n o p h o r e i o n o m y c i n d i d n o t p h o s p h o r y l a t e t h e 4 7 k D a p r o t e i n u n d e r c o n d i t i o n s i n w h i c h p h o s p h o l i p a s e C w a s n o t a c t i v a t e d . “ ” ’ B o t h c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s p h o s p h o r y l a t e d t h e 4 7 k D a p r o t e i n w i t h a n i n i t i a l r a p i d r a t e o f p h o s p h o r y l a t i o n w h i c h p e a k e d w i t h i n f i v e m i n u t e s o f t h e a d d i t i o n o f A 2 3 1 8 7 . H o w e v e r , t h i s a l o n e d o e s n o t i n d i c a t e t h a t p h o s p h o l i p a s e C w a s a c t i v a t e d a n d 1 , 2 - d i a c y l g l y c e r o l p r o d u c e d , t h e p h o s p h o r y l a t i o n m a y h a v e b e e n t h e d i r e c t r e s u l t o f t h e i n c r e a s e i n i n t r a c y t o p l a s m i c C a 2 + c o n c e n t r a t i o n . T h e f a i l u r e o f a f f e c t e d p l a t e l e t s t o a g g r e g a t e o r s e c r e t e d e n s e g r a n u l e c o n t e n t s d o e s n o t a p p e a r t o b e r e l a t e d t o a n i n a b i l i t y t o p h o s p h o r y l a t e t h e 4 7 k D a p r o t e i n . A f f e c t e d p l a t e l e t s p h o s p h o r y l a t e d t h e 2 0 k D a p r o t e i n i n r e s p o n s e t o a l l a g o n i s t s t h a t s t i m u l a t e d p h o s p h o r y l a t i o n i n c o n t r o l p l a t e l e t s . 2 9 4 T h i s i n d i c a t e s t h a t t h e e n z y m e a n d s u b s t r a t e a r e p r e s e n t a n d f u n c t i o n a l a n d t h a t t h e i n t r a c y t o p l a s m i c C a a ' c o n c e n t r a t i o n h a s b e e n e l e v a t e d s u f f i c i e n t l y i n r e s p o n s e t o t h e a g o n i s t f o r a c t i v a t i o n o f t h e e n z y m e . A d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o g r o u p s w a s a s l i g h t d e c r e a s e i n b a s e l i n e i n c o r p o r a t i o n o f ‘ ” P i n t o t h e 2 0 k D a b a n d o f a f f e c t e d p l a t e l e t s w h e n c o m p a r e d t o c o n t r o l s , a l t h o u g h i n d i v i d u a l v a r i a t i o n o b l i t e r a t e d t h e d i f f e r e n c e i n s o m e p a i r s . T h e i n c o r p o r a t i o n o f ‘ ” ? i n t o m o s t o t h e r p h o s p h o p r o t e i n s , a s m e a s u r e d b y t h e b a s e l i n e r a d i o a c t i v i t y o f t h e 4 7 k D a b a n d a n d t h e a b s o r b a n c e o f p r o m i n e n t b a n d s o n d e n s i o m e t r i c s c a n s o f a u t o r a d i o g r a p h s , w a s s i m i l a r i n b o t h g r o u p s . T h i s s u g g e s t s t h a t e i t h e r a f f e c t e d p l a t e l e t s d o n o t c o n t a i n a s m u c h m y o s i n l i g h t c h a i n a s c o n t r o l p l a t e l e t s , o r t h a t ‘ ” ? i s n o t i n c o r p o r a t e d i n t o i t a s w e l l a s i n c o n t r o l s . I t m i g h t a l s o b e r e l a t e d t o t h e l a c k o f C d ” ' i n . t h e e x t e r n a l m e d i u m i f t h e r e i s a n y d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o g r o u p s i n t h e w a y i n w h i c h t h e y h a n d l e C a f h A f f e c t e d p l a t e l e t s a l s o p h o s p h o r y l a t e d t h e 4 7 k D a p r o t e i n i n r e s p o n s e t o a l l a g o n i s t s t h a t s t i m u l a t e d p h o s p h o r y l a t i o n i n c o n t r o l p l a t e l e t s . T h i s d i d n o t a p p e a r t o b e c o r r e l a t e d t o t h e o c c u r r e n c e o f a g g r e g a t i o n ( t h r o m b i n , P M A ) o r t h e f a i l u r e o f a g g r e g a t i o n ( P A F , A 2 3 1 8 7 ) . S i m i l a r l y , p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 4 7 k D a p r o t e i n d i d n o t a p p e a r t o b e c o r r e l a t e d t o t h e o c c u r r e n c e o f d e n s e g r a n u l e s e c r e t i o n ( P A F , t h r o m b i n , P M A ) o r t h e f a i l u r e o f s e c r e t i o n ( A 2 3 1 8 7 ) . T h e a f f e c t e d p l a t e l e t s p h o s p h o r y l a t e d t h e 2 0 a n d 4 7 k D a p r o t e i n s u n d e r t h e s a m e c i r c u m s t a n c e s a s c o n t r o l p l a t e l e t s . T h e r e w a s , h o w e v e r , a t e n d e n c y f o r t h e a f f e c t e d p l a t e l e t p r o t e i n s t o p h o s p h o r y l a t e l e s s 2 9 5 e x t e n s i v e l y a n d / o r d e p h o s p h o r y l a t e m o r e r a p i d l y . T h e s i g n i f i c a n c e o f t h e d i f f e r e n c e i s n o t c l e a r , b u t c o u l d b e r e l a t e d t o t h e l a c k o f e x t e r n a l C d ” ’ i n . t h e m e d i u m i f a f f e c t e d p l a t e l e t s a r e i n s o m e w a y m o r e d e p e n d e n t t h a n c o n t r o l p l a t e l e t s u p o n t h e i n f l u x o f e x t e r n a l C a z f t X I m a i n t a i n C a 2 + - d e p e n d e n t p r o c e s s e s . P r e l i m i n a r y w o r k u s i n g t h e c a l c i u m i n d i c a t o r F u r a 2 i n d i c a t e d t h a t t h e i n t r a c y t o p l a s m i c C a 2 + f l u x e s i n r e s p o n s e t o 1 . 0 p H a n d 0 . 0 1 p H P A F , 0 . 2 5 U / m l a n d 0 . 0 1 U / m l t h r o m b i n , 1 0 p H a n d 2 . 0 p M A D P a n d 2 . 0 p H a n d 5 . 0 “ M i o n o m y c i n w e r e s i g n i f i c a n t l y l e s s t h a n t h a t o f c o n t r o l s w h e n t h e e x t e r n a l m e d i u m c o n t a i n e d 1 . 0 m M E G T A . T h e r e w a s n o d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o g r o u p s w h e n P M A w a s t h e a g o n i s t . W h e n t h e e x t e r n a l m e d i u m c o n t a i n e d 1 . 0 m M C a ” ) t h e C a 2 + f l u x e s w e r e e i t h e r n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t b e t w e e n t h e t w o g r o u p s , o r s i g n i f i c a n t l y h i g h e r i n t h e a f f e c t e d p l a t e l e t s . A l t h o u g h t h e r e w e r e a l w a y s s o m e m i n o r d i f f e r e n c e s b e t w e e n p a i r s o f a u t o r a d i o g r a p h s a n d d e n s i o m e t r i c s c a n s , a d i f f e r e n c e t h a t w a s c o n s i s t e n t a n d r e a d i l y a p p a r e n t w a s a m a r k e d d e c r e a s e i n t h e i n t e n s i t y o f p h o s p h o r y l a t i o n o f a b a n d o f a p p r o x i m a t e l y 6 5 k D a i n a f f e c t e d p l a t e l e t s r e l a t i v e t o t h e c o n t r o l s b o t h b e f o r e a n d a f t e r a g o n i s t s t i m u l a t i o n . T h i s w a s s u f f i c i e n t l y o b v i o u s t o m a k e a l l a u t o r a d i o g r a p h s o f a f f e c t e d p l a t e l e t s i d e n t i f i a b l e . I n c u b a t i o n w i t h A D P , P A F o r A 2 3 1 8 7 d i d n o t h a v e a n y i d e n t i f i a b l e o r c o n s i s t e n t e f f e c t o n p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 6 5 k D a b a n d . I n c u b a t i o n w i t h t h r o m b i n o r P M A c a u s e d a t i m e - d e p e n d e n t p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 6 5 k D a b a n d t h a t , w h i l e n o t d r a m a t i c , w a s c o n s i s t e n t . I t i s i n t e r e s t i n g t o n o t e t h a t t h e 6 5 k D a b a n d w a s o n l y p h o s p h o r y l a t e d i n r e s p o n s e t o t h e t w o a g o n i s t s t h a t a r e a l s o c a p a b l e o f a g g r e g a t i n g a f f e c t e d p l a t e l e t s . i d e n t i f i e d . 5 9 - 1 3 i - 1 7 3 . 2 8 2 . u 9 2 9 6 I t i s n o t p o s s i b l e t o d e t e r m i n e o n 1 1 % T g e l s a n d a u t o r a d i o g r a p h s w h e t h e r t h e 6 5 k D a b a n d o n t h e a u t o r a d i o g r a p h s i s a s i n g l e b a n d o r a c l u s t e r o f b a n d s t h a t m i g r a t e c l o s e l y t o g e t h e r . A d e c r e a s e i n i n t e n s i t y o n a u t o r a d i o g r a p h s m a y b e t h e r e s u l t o f a m i s s i n g p r o t e i n b a n d i n t h e g e l , o r f a i l u r e t o p h o s p h o r y l a t e a b a n d t h a t i s t h e r e . T h e r e w a s n o i d e n t i f i a b l e d i f f e r e n c e b e t w e e n C o o m a s s i e b l u e - s t a i n e d 1 1 % T g e l s o f a f f e c t e d a n d c o n t r o l p l a t e l e t s o n v i s u a l e x a m i n a t i o n a n d d e n s i o m e t r i c s c a n s o f t h e 6 5 k D a a r e a . F u t u r e w o r k w i l l u t i l i z e t w o - d i m e n s i o n a l a n d l o w e r % T g e l s a n d a u t o r a d i o g r a p h s t o m o r e c l o s e l y e x a m i n e t h e 6 5 k D a a r e a . T h e i d e n t i t y o f t h i s b a n d a n d t h e f u n c t i o n a l s i g n i f i c a n c e o f t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o g r o u p s i s o p e n t o s p e c u l a t i o n . A g r o u p o f s l o w l y p h o s p h o r y l a t i n g p r o t e i n s o f 6 5 , 4 1 , 3 5 - 3 6 a n d 2 1 k D a i n P H A - s t i m u l a t e d p l a t e l e t s h a s b e e n d e s c r i b e d . “ “ T h e t i m e c o u r s e f o r t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e s e p r o t e i n s a n d t h e d o s e - r e s p o n s e f o r P M A c o r r e s p o n d e d c l o s e l y t o t h e t i m e c o u r s e a n d d o s e - r e s p o n s e f o r e n h a n c e m e n t o f a r a c h i d o n i c a c i d r e l e a s e b y P M A . T h e s e s l o w l y p h o s p h o r y l a t i n g p r o t e i n s h a v e n o t b e e n c l e a r l y i d e n t i f i e d , a l t h o u g h t h e 4 1 k D a a n d 3 5 - 3 6 k D a p r o t e i n s h a v e p r o b a b l y b e e n T h e 4 1 k D a p r o t e i n c o - m i g r a t e s w i t h a 4 1 k D a p r o t e i n t h a t i s A D P - r i b o s y l a t e d b y p e r t u s s i s t o x i n . I t i s p r o b a b l y t h e a - s u b u n i t o f t h e i n h i b i t o r y g u a n i n e n u c l e o t i d e b i n d i n g p r o t e i n G 1 t h a t i s l i n k e d t o a d e n y l a t e c y c l a s e , a n d p o s s i b l y p h o s p h o l i p a s e C . 5 9 ' 1 3 " 1 7 3 ' 2 8 2 I t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t t h e a - s u b u n i t o f t h e i n h i b i t o r y g u a n i n e n u c l e o t i d e 2 9 7 b i n d i n g p r o t e i n o f a d e n y l a t e c y c l a s e m a y b e a p h y s i o l o g i c a l s u b s t r a t e f o r p r o t e i n k i n a s e C w h i c h c o n t r o l s i t s f u n c t i o n a l s t a t u s . ” " P h o s p h o r y l a t i o n o f a n a p p r o x i m a t e l y 4 0 - 4 1 k D a b a n d t h a t m i g r a t e d i m m e d i a t e l y b e l o w t h e 4 7 k D a b a n d w a s o b s e r v e d o n s o m e a u t o r a d i o g r a p h s o f g e l s o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s e x p o s e d t o P M A , P A F o r t h r o m b i n . T h e b a n d w a s m o r e a p p a r e n t o n a u t o r a d i o g r a p h s t h a t w e r e u n d e r - e x p o s e d f o r t h e 4 7 k D a b a n d . T h e 3 5 - 3 6 k D a p r o t e i n h a s a p I s i m i l a r t o t h a t o f l i p o c o r t i n w h i c h i s p h o s p h o r y l a t e d i n p l a t e l e t s b y a n u n i d e n t i f i e d k i n a s e . 1 3 " “ ° L i p o c o r t i n p u r i f i e d f r o m b o v i n e l u n g h a s b e e n s h o w n t o b e p h o s p h o r y l a t e d 4 1 . 1 1 . 1 1 . 9 1 2 b y p r o t e i n k i n a s e 0 . “ 9 P h o s p h o r y l a t i o n o f t h i s b a n d w a s n o t i d e n t i f i e d i n t h i s s t u d y . T h e a z - a d r e n e r g i c r e c e p t o r o f h u m a n p l a t e l e t s i s a 6 4 k D a g l y c o p r o t e i n t h a t h a s b e e n c h a r a c t e r i z e d a n d p u r i f i e d t o a p p a r e n t Q h o m o g e n e i t y . “ J A l t h o u g h r e g u l a t i o n o f a 1 - a n d B z m a d r e n e r g i c r e c e p t o r s i n s m o o t h m u s c l e c e l l s b y p h o s p h o r y l a t i o n h a s b e e n r e p o r t e d , n o i n f o r m a t i o n i s a v a i l a b l e r e g a r d i n g p h o s p h o r y l a t i o n o f a z - a d r e n e r g i c 6 9 , 2 8 5 r e c e p t o r s . T h e a z - a d r e n e r g i c r e c e p t o r m a y a l s o b e v e r y c l o s e l y l i n k e d t o t h e N a fl fl r e x c h a n g e s y s t e m , i f i t i s n o t i t s e l f p a r t o f t h e i o n t r a n s p o r t s y s t e m . ” 6 I f t h e r e c e p t o r d o e s p l a y a d u a l r o l e a s b o t h r e c e p t o r a n d i o n - t r a n s p o r t e r , a n y d e f e c t i n t h e r e c e p t o r i t s e l f o r t h e c o n t r o l o f i t s f u n c t i o n w o u l d h a v e a m a j o r e f f e c t o n p l a t e l e t a c t i v a t i o n , p a r t i c u l a r l y i n r e s p o n s e t o w e a k a g o n i s t s . O p e r a t i o n o f N a U Q V ' e x c h a n g e i s e s s e n t i a l f o r t h e a c t i v a t i o n o f t h e p l a t e l e t r e l e a s e r e s p o n s e b y w e a k a g o n i s t s . 2 9 8 A l e s s l i k e l y c a n d i d a t e f o r t h e 6 5 k D a b a n d i s a 6 1 k D a m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n w h i c h h a s b e e n i d e n t i f i e d i n h u m a n p l a t e l e t s . 2 6 0 T h i s p r o t e i n s p e c i f i c a l l y i n t e r a c t s t h r o u g h i t s e x t r a c e l l u l a r d o m a i n w i t h i n s o l u b l e c o l l a g e n a n d i s p o s s i b l y a n i m p o r t a n t c o m p o n e n t o f t h e i n i t i a l p l a t e l e t - m a t r i x a d h e s i o n p r o c e s s w h i c h l e a d s t o p l a t e l e t a c t i v a t i o n i n v i v o . T h i s s t u d y h a s d e t e r m i n e d t h a t a f f e c t e d p l a t e l e t s h a v e s i m i l a r p h o s p h o r y l a t i o n p a t t e r n s o f t h e t w o m a j o r p r o t e i n s p h o s p h o r y l a t e d i n c o n t r o l p l a t e l e t s i n r e s p o n s e t o v a r i o u s a g o n i s t s . A l t h o u g h p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 k D a m y o s i n l i g h t c h a i n c o r r e l a t e d w e l l w i t h p l a t e l e t s h a p e c h a n g e i n b o t h g r o u p s , t h e r e d i d n o t a p p e a r t o b e a n y c o n s i s t e n t r e l a t i o n s h i p b e t w e e n p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 a n d 4 7 k D a p r o t e i n s a n d s e c r e t i o n o f d e n s e g r a n u l e c o n t e n t s o r a g g r e g a t i o n . A m a j o r f i n d i n g , d e c r e a s e d p h o s p h o r y l a t i o n o f a n u n i d e n t i f i e d 6 5 k D a b a n d i n a f f e c t e d p l a t e l e t s , i s o f u n k n o w n f u n c t i o n a l s i g n i f i c a n c e . C H A P T E R V : M E A S U R E M E N T O F T H R O M B O X A N E B z P R O D U C T I O N I N T R O D U C T I O N P l a t e l e t s r e s p o n d t o C a y l m o b i l i z i n g s t i m u l a t o r y a g o n i s t s b y r a p i d l y h y d r o l y s i n g m e m b r a n e p h o s p h o l i p i d s t o g e n e r a t e a v a r i e t y o f i n t r a c e l l u l a r a n d e x t r a c e l l u l a r m e s s e n g e r s . T h e a c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e C l e a d s t o t h e t r a n s i e n t a c c u m u l a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r i n o s i t o l 1 , 4 , 5 - t r i s p h o s p h a t e a n d l , 2 - d i a c y l g l y c e r o l w h i c h i n c r e a s e t h e i n t r a c y t o p l a s m i c C a a ' c o n c e n t r a t i o n a n d a c t i v a t e p r o t e i n k i n a s e C r e s p e c t i v e l y . B o t h b r a n c h e s o f t h i s C a 2 + - m e s s e n g e r s y s t e m m a y a c t s y n e r g i s t i c a l l y t o i n i t i a t e t h e p l a t e l e t r e s p o n s e s o f s h a p e c h a n g e , a g g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n . A c t i v a t e d p l a t e l e t s a l s o p r o d u c e f r e e a r a c h i d o n i c a c i d , t h e p r e c u r s o r f o r t h r o m b o x a n e A 2 ( T x A z ) a n d o t h e r e i c o s a n o i d s . T h e s e a r e a b l e t o l e a v e t h e c e l l a n d f u n c t i o n a s i n t e r c e l l u l a r m e s s e n g e r s . T h e e i c o s a n o i d s a r e a g r o u p o f c h e m i c a l c o m p o u n d s w h i c h i n c l u d e s t h e 2 0 - c a r b o n f a t t y a c i d s a n d t h e i r n u m e r o u s o x y g e n a t e d m e t a b o l i t e s . 2 5 8 ' 3 3 7 " ' 6 2 A r a c h i d o n i c a c i d i s t h e m o s t c o m m o n f a t t y a c i d p r e s e n t i n t h e p h o s p h o l i p i d s o f m a m m a l i a n c e l l s a n d , w i t h i t s d e r i v a t i v e s , m a k e s u p t h e m o s t i m p o r t a n t e i c o s a n o i d g r o u p . T h e e i c o s a n o i d s a r e p o t e n t l o c a l h o r m o n e s o r a u t o c o i d s . T h e y a r e n o t s t o r e d , b u t a r e f o r m e d r a p i d l y i n r e s p o n s e t o c e r t a i n s t i m u l i , e x e r t 2 9 9 3 0 0 t h e i r b i o l o g i c e f f e c t a n d a r e t h e n r a p i d l y d e g r a d e d . T h e t w o m a i n r o u t e s o f m e t a b o l i s m o f a r a c h i d o n i c a c i d a r e : ( l ) t h e c y c l o o x y g e n a s e e n z y m e s y s t e m w h i c h p r o d u c e s p r o s t a g l a n d i n s a n d t h r o m b o x a n e ; a n d ( 2 ) t h e l i p o x y g e n a s e e n z y m e s y s t e m w h i c h p r o d u c e s h y d r o x y a n d h y d r o p e r o x y f a t t y a c i d s a n d l e u k o t r i e n e s . A l t h o u g h p l a t e l e t s d o m e t a b o l i z e a r a c h i d o n a t e v i a t h e l i p o x y g e n a s e p a t h w a y , t h e y d o n o t g e n e r a t e l e u k o t r i e n e s a n d t h e b i o l o g i c a l s i g n i f i c a n c e o f t h e 1 2 - h y d r o x y - e i c o s a t e t r a e n o i c a c i d ( l Z - H E T E ) p r o d u c e d b y p l a t e l e t s i s n o t c l e a r . 2 6 8 ' 3 3 7 I n c o n t r a s t , a r a c h i d o n i c a c i d a n d i t s o x y g e n a t e d m e t a b o l i t e s a r e o f m a j o r i m p o r t a n c e i n t h e n o r m a l f u n c t i o n o f p l a t e l e t s . W e a k p h y s i o l o g i c a g o n i s t s s u c h a s a d e n o s i n e d i p h o s p h a t e ( A D P ) , e p i n e p h r i n e a n d l o w c o n c e n t r a t i o n s o f p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r ( P A P ) a n d t h r o m b i n a l l s h a r e t h e r e q u i r e m e n t t h a t a r a c h i d o n i c a c i d m u s t b e l i b e r a t e d a n d m e t a b o l i z e d t o T x A z f o r i r r e v e r s i b l e a g g r e g a t i o n a n d d e n s e g r a n u l e s e c r e t i o n t o o c c u r . W h e n t h e c a l c i u m i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 o r e x o g e n o u s 1 , 4 , 5 - i n o s i t o l t r i s p h o s p h a t e i s u s e d t o s t i m u l a t e p l a t e l e t s , t h e a c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e C i s t o t a l l y d e p e n d e n t o n t h e f o r m a t i o n o f T x A 2 . 5 ° " 1 3 S i n c e t h e l e v e l o f f r e e a r a c h i d o n i c a c i d i n p l a t e l e t s i s m a i n t a i n e d a t a v e r y l o w l e v e l r e l a t i v e t o i t s e s t e r i f i e d l e v e l , t h e s y n t h e s i s o f p r o s t a g l a n d i n s a n d t h r o m b o x a n e r e q u i r e s t h e l i b e r a t i o n o f a r a c h i d o n a t e f r o m m e m b r a n e p h o s p h o l i p i d s . 2 2 ° " 6 9 T h e b u l k o f a r a c h i d o n a t e i s e s t e r i f i e d i n t h e s n - 2 p o s i t i o n o f g l y c e r o p h o s p h o l i p i d s a n d t h e l e v e l o f f r e e a r a c h i d o n i c a c i d r e p r e s e n t s a b a l a n c e b e t w e e n t h e l i b e r a t i o n o f t h e a c i d b y h y d r o l y s i s a n d i t s r e e s t e r i f i c a t i o n b y a c y l t r a n s f e r a s e s . 3 0 1 T h e b a l a n c e i s w e i g h t e d t o w a r d e s t e r i f i c a t i o n b e c a u s e o f t h e h i g h a f f i n i t y o f t h e a c y l t r a n s f e r a s e f o r t h e i n t e r m e d i a t e a r a c h i d o n o y l - C o A , p a r t i c u l a r l y i f t h e a c c e p t o r i s l y s o p h o s p h a t i d y l i n o s i t i d e . T h i s p r e f e r e n c e p r o b a b l y e x p l a i n s t h e v e r y h i g h a r a c h i d o n a t e c o n t e n t o f t h e p h o s p h o i n o s i t i d e s . T h r e e m a j o r r o u t e s f o r a r a c h i d o n a t e l i b e r a t i o n f r o m p l a t e l e t m e m b r a n e s h a v e b e e n p r o p o s e d : ( 1 ) d i r e c t d e a c y l a t i o n o f p h o s p h o l i p i d s , p a r t i c u l a r l y p h o s p h a t i d y l c h o l i n e a n d p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e , b y a C a Z I - d e p e n d e n t p h o s p h o l i p a s e A 2 ; ( 2 ) p h o s p h o l i p a s e C - m e d i a t e d r e l e a s e o f l , 2 - d i a c y l g l y c e r o l f r o m p h o s p h o i n o s i t i d e s f o l l o w e d b y t h e s e q u e n t i a l a c t i v a t i o n o f d i a c y l - a n d m o n o a c y l g l y c e r o l l i p a s e s ; a n d ( 3 ) p h o s p h o r y l a t i o n o f l , 2 - d i a c y 1 g l y c e r o l t o p h o s p h a t i d i c a c i d a n d t h e a c t i v a t i o n o f a p h o s p h a t i d i c a c i d - s p e c i f i c , C a y - d e p e n d e n t p h o s p h o l i p a s e A 2 . ° 1 ' 2 1 ° ' 3 ° 2 ' 3 9 2 ' 3 9 7 T h e p r o p o r t i o n o f a r a c h i d o n a t e d e r i v e d f r o m e a c h o f t h e s e i s u n c l e a r , b u t t h e m a j o r i t y a p p e a r s t o b e d e r i v e d f r o m t h e a c t i o n o f p h o s p h o l i p a s e A 2 o n m e m b r a n e p h o s p h o l i p i d s . A r a c h i d o n i c a c i d m a y b e c o n v e r t e d t o p r o s t a g l a n d i n H z i n t w o s e p a r a t e s t e p s c a t a l y z e d b y p r o s t a g l a n d i n e n d o p e r o x i d e s y n t h a s e . : " " 1 " “ 5 2 " " ’ 9 T h e c y c l o o x y g e n a s e a n d h y d r o p e r o x i d a s e a c t i v i t i e s b o t h r e s i d e i n a s i n g l e p r o t e i n w i t h a p u r i f i e d m o l e c u l a r w e i g h t o f 7 0 - 7 2 k D a . T h e c y c l o o x y g e n a s e a c t i v i t y o f p r o s t a g l a n d i n e n d o p e r o x i d e s y n t h a s e i n s e r t s t w o m o l e c u l e s o f o x y g e n i n t o a r a c h i d o n a t e t o y i e l d t h e e n d o p e r o x i d e p r o s t a g l a n d i n 6 ; , w h i c h i s t h e n r e d u c e d b y t h e h y d r o p e r o x i d a s e t o t h e e n d o p e r o x i d e p r o s t a g l a n d i n H 2 . I n p l a t e l e t s , t h e p r i n c i p l e m e t a b o l i t e o f p r o s t a g l a n d i n H 2 i s T x A . 2 w h i c h i s f o r m e d b y t h e a c t i o n o f 3 0 2 t h r o m b o x a n e A s y n t h a s e a s s o c i a t e d w i t h t h e d e n s e t u b u l e m e m b r a n e s . T h r o m b o x a n e A 2 i s v e r y u n s t a b l e ( t p - 3 0 s e c o n d s i n a q u e o u s s o l u t i o n ) a n d s p o n t a n e o u s l y h y d r o l y s e s t o i t s s t a b l e , b u t i n a c t i v e m e t a b o l i t e , t h r o m b o x a n e 3 2 ( T s z ) . A l t e r n a t i v e m a j o r m e t a b o l i t e s a r e t h e l 7 - c a r b o n l Z L - h y d r o x y - S , 8 , 1 0 - h e p t a d e c a t r i e n o i c a c i d ( H H T ) a n d t h e 3 - c a r b o n f r a g m e n t m a l o n d i a l d e h y d e . I n p l a t e l e t s , m i n u t e a m o u n t s o f t h e e n d o p e r o x i d e s a r e c o n v e r t e d n o n - e n z y m a t i c a l l y t o p r o s t a g l a n d i n E 2 , p r o s t a g l a n d i n D 2 a n d p r o s t a g l a n d i n P a p W h e n a r a c h i d o n i c a c i d i s a d d e d e x o g e n o u s l y o r l i b e r a t e d e n d o g e n o u s l y f r o m p l a t e l e t s i n r e s p o n s e t o a s t i m u l u s , i t i s c o n v e r t e d b y p r o s t a g l a n d i n e n d o p e r o x i d e s y n t h a s e t o t h e e n d o p e r o x i d e s p r o s t a g l a n d i n O z a n d p r o s t a g l a n d i n H 2 a n d b y t h r o m b o x a n e A s y n t h a s e t o T x A z . P l a t e l e t s a p p a r e n t l y p o s s e s s o n e t y p e o f r e c e p t o r t h a t m e d i a t e s t h e e f f e c t s o f b o t h t h e e n d o p e r o x i d e s a n d T x A z . 6 5 ' 3 w ' " 2 9 B e c a u s e t h e e n d o p e r o x i d e s a n d T x A z a r e e x t r e m e l y l a b i l e , v a r i o u s s t a b l e a n a l o g u e s h a v e b e e n s y n t h e s i z e d a n d u s e d t o i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t s o f t h e s e c o m p o u n d s o n p l a t e l e t s . L i k e e n d o p e r o x i d e s a n d T x A z , s t a b l e p r o s t a g l a n d i n e n d o p e r o x i d e a n a l o g u e s b i n d t o s p e c i f i c r e c e p t o r s o n t h e p l a t e l e t s u r f a c e . T h i s i n d u c e s a c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e C a n d p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s , w h i c h i n i t i a t e s t h e p l a t e l e t r e s p o n s e s o f s h a p e c h a n g e , a g g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n . ” 5 I r r e v e r s i b l e i n h i b i t i o n o f p l a t e l e t c y c l o o x y g e n a s e b y a c e t y l s a l i c y l i c a c i d ( a s p i r i n ) p r e v e n t s s e c o n d a r y a g g r e g a t i o n a n d g r a n u l e s e c r e t i o n i n r e s p o n s e t o w e a k a g o n i s t s s u c h a s A D P a n d l o w c o n c e n t r a t i o n s o f P A F , A 2 3 1 8 7 a n d t h r o m b i n . T h e s e c r e t i o n o f d e n s e g r a n u l e c o n t e n t s f r o m 3 0 3 c o n t r o l a n d a f f e c t e d c a n i n e p l a t e l e t s h a s b e e n s h o w n t o b e i n h i b i t e d b y i n c u b a t i o n w i t h a s p i r i n . T h i s s u g g e s t s t h a t b o t h g r o u p s a r e a b l e t o s y n t h e s i z e T x A z , b u t d o e s n o t g i v e a n y i n f o r m a t i o n o n t h e q u a n t i t y o r r a t e o f T x A 2 p r o d u c t i o n . I n h i b i t i o n o f d e n s e g r a n u l e r e l e a s e f r o m a f f e c t e d p l a t e l e t s a p p e a r e d t o b e m o r e s e n s i t i v e t o t h e e f f e c t s o f a s p i r i n t h a n c o n t r o l p l a t e l e t s . T h e a b n o r m a l l y r a p i d r e l e a s e o f d e n s e g r a n u l e a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e ( A T P ) f r o m a f f e c t e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y A D P w a s m a r k e d l y i n h i b i t e d b y a s p i r i n , w h i c h s u g g e s t s a r e l a t i o n s h i p b e t w e e n T x A 2 p r o d u c t i o n a n d t h i s a b n o r m a l r a t e o f p r o d u c t i o n . M e a s u r e m e n t o f T x A Q p r o d u c t i o n b y c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s w a s i n d i c a t e d t o e x a m i n e t h e r e l a t i o n s h i p , i f a n y , b e t w e e n t h e r e s p o n s e s o f b o t h g r o u p s a n d T x A z p r o d u c t i o n . B e c a u s e o f t h e i n s t a b i l i t y o f T x A z , b i o a s s a y i s t h e o n l y w a y t h a t T x A z i t s e l f c a n b e a s s a y e d . “ 5 2 T h r o m b o x a n e A 2 i s p o t e n t v a s o c o n s t r i c t o r a n d t h i s p r o p e r t y c a n b e u s e d i n a b i o a s s a y . A l t h o u g h l a c k o f s p e c i f i c i t y l i m i t s t h e u s e t h e b i o a s s a y , i t d o e s p r o v i d e i n f o r m a t i o n a b o u t t h e k i n e t i c s o r f o r m a t i o n a n d d i s a p p e a r a n c e o f t h e c o m p o u n d . T h e a l t e r n a t i v e i s t o m e a s u r e T s z , t h e s t a b l e m e t a b o l i t e o f T x A z . T h i s p r o v i d e s m o r e i n f o r m a t i o n o n t h e t o t a l t h r o m b o x a n e p r o d u c t i o n , b u t l e s s i n f o r m a t i o n o n t h e k i n e t i c s o f p r o d u c t i o n . T h e v a s t m a j o r i t y o f q u a n t i t a t i v e s t u d i e s i n t h i s a r e a m e a s u r e T x z ‘ b y r a d i o i m m u n o a s s a y . 3 0 4 M A T E R I A L S A N D M E T H O D S E x p e r i m e n t a l D e s i g n T h e c o n t r o l g r o u p c o n s i s t e d o f t h e t w o r e s i d e n t B a s s e t h o u n d s ( f e m a l e ) a n d o n e m a l e B a s s e t h o u n d . T h e m a l e w a s o n l o a n f r o m a b r e e d e r a n d w a s a v a i l a b l e f o r m o s t , b u t n o t a l l , o f t h i s p r o j e c t . I n t h e l a s t p a r t o f t h i s p r o j e c t , a n o r m a l L a b r a d o r x H u s k y f e m a l e w i t h n o r m a l a g g r e g a t i o n r e s p o n s e s w a s u s e d a n d f o u n d t o h a v e v e r y s i m i l a r r e s p o n s e s t o t h e c o n t r o l B a s s e t s . T h e a f f e c t e d g r o u p c o n s i s t e d o f f o u r ( 3 f e m a l e a n d 1 m a l e ) B a s s e t h o u n d s t h a t h a v e b e e n u s e d t h r o u g h o u t t h e p r o j e c t . B a s e l i n e s a m p l e s w e r e o b t a i n e d b y s t i r r i n g p l a t e l e t r i c h p l a s m a o r g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s a t 3 7 . 5 ° C i n t h e a g g r e g o m e t e r f o r a p p r o x i m a t e l y 3 0 s e c o n d s p r i o r t o t h e a d d i t i o n o f 2 0 p l o f 0 . 9 % w / v N a C l . T h i s m e a s u r e d t h e a p p r o x i m a t e c o n c e n t r a t i o n o f T x 2 p r e s e n t i n t h e c u v e t t e a t t h e t i m e o f a d d i t i o n o f a n a g o n i s t . T w o s a m p l e t i m e s w e r e s e l e c t e d b a s e d o n t h e a g g r e g a t i o n r e s p o n s e s o f c o n t r o l p l a t e l e t s , o n e r e p r e s e n t i n g t h e i n i t i a l s t a g e s o f a g g r e g a t i o n a n d t h e o t h e r r e p r e s e n t i n g c o m p l e t e o r n e a r - c o m p l e t e a g g r e g a t i o n . A t h i r d s a m p l e t i m e w a s a d d e d f o r 0 . 1 a n d 0 . 3 U / m l t h r o m b i n b e c a u s e o f t h e p r o l o n g e d a g g r e g a t i o n r e s p o n s e o f a f f e c t e d p l a t e l e t s t o t h i s a g o n i s t . T h e a g o n i s t s a n d c o n c e n t r a t i o n s s e l e c t e d a s w e l l a s t h e t i m e a t w h i c h T s z l e v e l s w e r e m e a s u r e d a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 1 7 . 3 0 5 T a b l e 1 7 . A g o n i s t c o n c e n t r a t i o n s a n d t i m e s a t w h i c h T s z w a s m e a s u r e d . M e d i u m A g o n i s t C o n c e n t r a t i o n T i m e ( m i n u t e s ) P R P A D P 1 0 p H 0 , 1 & 5 P R P P A F 0 . 1 p H 0 , 1 & 5 1 . 0 p M 0 , l & 5 P R P A 2 3 1 8 7 1 5 p H 0 , l & 5 2 0 p H 0 , l & 5 P R P P M A 3 . 0 p M 0 , 5 a 1 2 P R P A r a c h i d o n i c a c i d . 0 . 5 m M 0 , 1 & 5 1 . 0 m M 0 , l & 5 O F F T h r o m b i n 0 . 0 5 U / m l 0 , l & 5 0 . 1 U / m l 0 , 1 , 5 & 1 0 0 . 3 U / m l 0 , 1 , 5 & 1 0 P R P - p l a t e l e t r i c h p l a s m a , G F P - g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s T h e i n i t i a l r e s u l t s o f t h i s s t u d y i n d i c a t e d t h a t i t w o u l d b e u s e f u l t o m e a s u r e t r u e " r e s t i n g ” T s z l e v e l s i n n o n - s t i r r e d s a m p l e s a s w e l l a s e x a m i n e t h e e f f e c t o f s t i r r i n g i n t h e a b s e n c e o f a n a g o n i s t . T o o b t a i n r e s t i n g T s z l e v e l s , 2 0 p l o f 0 . 9 % w / v N a C l w a s a d d e d t o n o n - s t i r r e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s a m p l e s a t r o o m t e m p e r a t u r e o r 3 7 ° C . T o e x a m i n e t h e e f f e c t o f s t i r r i n g o n T x 2 p r o d u c t i o n , p l a t e l e t r i c h p l a s m a w a s a l l o w e d t o s t i r i n t h e a g g r e g o m e t e r c u v e t t e f o r o n e , f i v e o r t w e l v e m i n u t e s b e f o r e t h e a d d i t i o n o f 2 0 p l o f N a C l . A l l a g o n i s t s , e x c e p t a r a c h i d o n i c a c i d , w e r e u s e d o n t w o o r m o r e s e p a r a t e o c c a s i o n s i n e a c h d o g . A r a c h i d o n i c a c i d w a s u s e d o n c e w i t h 3 0 6 e a c h d o g . T h e o t h e r e x c e p t i o n w a s t h e m a l e c o n t r o l d o g w h i c h w a s n o t a v a i l a b l e f o r a s e c o n d s a m p l e c o l l e c t i o n f o r a l l a g o n i s t s . E a c h s a m p l e w a s a s s a y e d a t l e a s t t w i c e a n d t h e a v e r a g e u s e d a s t h e r e s p o n s e o f t h a t i n d i v i d u a l f o r t h a t c o l l e c t i o n . F o r e x a m p l e , n - 8 f o r m o s t o f t h e a f f e c t e d r e s u l t s r e p r e s e n t s e i g h t a v e r a g e v a l u e s f r o m f o u r d o g s w h i c h h a d e a c h b e e n s a m p l e d o n t w o s e p a r a t e o c c a s i o n s . F o r e a c h c o l l e c t i o n f r o m e a c h d o g , e i t h e r o n e o r t w o b a s e l i n e s a m p l e s , a s d e f i n e d a b o v e , w e r e m e a s u r e d . T h e a v e r a g e b a s e l i n e v a l u e f o r e a c h i n d i v i d u a l w a s u s e d t o c a l c u l a t e t h e i n c r e a s e a b o v e b a s e l i n e i n r e s p o n s e t o a n a g o n i s t f o r t h a t i n d i v i d u a l f o r t h a t c o l l e c t i o n . T h e r e w a s c o n s i d e r a b l e v a r i a t i o n i n t h e s a m e d o g f r o m o n e c o l l e c t i o n t o a n o t h e r , a s w e l l a s i n d i v i d u a l v a r i a t i o n i n t h e r e s p o n s e t o d i f f e r e n t a g o n i s t s . R e a g e n t s T h r o m b i n , A D P , P A F , p h o r b o l m y r i s t a t e a c e t a t e ( P M A ) a n d c a l c i u m i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 w e r e p u r c h a s e d , s t o r e d a n d p r e p a r e d a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( P a g e 1 3 1 ) . A r a c h i d o n i c a c i d w a s p u r c h a s e d f r o m t h e S i g m a C h e m i c a l C o . ( S t . L o u i s , M O ) , r e c o n s t i t u t e d i n h e x a n e ( 5 0 m g / m l ) a n d s t o r e d a t - 2 0 ° C i n a 1 . 0 m 1 v o l u m e t r i c f l a s k . A t t h e t i m e o f u s e , t h e r e q u i r e d a m o u n t w a s r e m o v e d , d r i e d u n d e r n i t r o g e n , t h e n r e c o n s t i t u t e d i n 0 . 1 M T r i s , p H 8 . 0 a n d k e p t o n i c e . A n t i - t h r o m b o x a n e B z * w a s p u r c h a s e d f r o m A d v a n c e d M a g n e t i c s ( C a m b r i d g e , M A ) a n d s t o r e d a t - 2 0 ° C u n t i l r e c o n s t i t u t e d i n 0 . 1 M p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e , p H 7 . 4 , c o n t a i n i n g 0 . 5 % g e l a t i n ( P B S G ) . S t a n d a r d T x 2 w a s p u r c h a s e d f r o m A d v a n c e d M a g n e t i c s , d i s s o l v e d i n e t h a n o l ( 1 . 0 m g / m l ) a n d s t o r e d a t - 2 0 “ C . T h i s s t o c k w a s t h e n f u r t h e r d i l u t e d t o 1 0 0 0 n g / m l i n P B S G a n d 3 0 7 a l i q u o t s f r o z e n a t - 7 0 W 1 . 3 H - l a b e l l e d T s z t r a c e w a s p u r c h a s e d f r o m N e w E n g l a n d N u c l e a r a n d d i l u t e d t o a t o t a l v o l u m e o f 1 . 0 m l i n d i s t i l l e d w a t e r z a c e t o n i t r i l e a t a r a t i o o f 9 : 1 a n d s t o r e d a t ~ 2 0 W 3 . R I A - S o l v e I I s c i n t i l l a t i o n f l u i d w a s p u r c h a s e d f r o m R e s e a r c h P r o d u c t s I n c . ( M t . P r o s p e c t , I L ) . D e x t r a n T - 7 0 w a s p u r c h a s e d f r o m P h a r m a c i a ( P i s c a t a w a y , N J ) a n d c h a r c o a l ( N o r i t A ) f r o m S i g m a C h e m i c a l C o . ( S t . L o u i s , M O ) . A l l o t h e r c h e m i c a l s w e r e o f r e a g e n t g r a d e . P r e p a r a t i o n o f P l a t e l e t s a n d T h r o m b o x a n e S a m p l e s P l a t e l e t s w e r e c o l l e c t e d a n d p r e p a r e d f o r a g g r e g a t i o n a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( P a g e s 1 3 2 - 1 3 4 ) . B r i e f l y , b l o o d f o r t h e p r e p a r a t i o n o f p l a t e l e t r i c h p l a s m a w a s c o l l e c t e d f r o m f a s t e d d o g s v i a a n 1 8 g a u g e n e e d l e i n t o 3 . 2 % N a g c i t r a t e a t a r a t i o o f 9 : 1 . P l a t e l e t r i c h p l a s m a w a s p r e p a r e d b y c e n t r i f u g a t i o n a n d t h e p l a t e l e t c o u n t s t a n d a r d i z e d t o 3 . 0 x l O fi fl m l ' w i t h a u t o l o g o u s p l a t e l e t p o o r p l a s m a . A l l p l a t e l e t c o u n t s w e r e d o n e m a n u a l l y u s i n g a U n o p e t t e a n d h e m o c y t o m e t e r . P l a t e l e t s w e r e a l l o w e d t o r e s t f o r a t l e a s t 3 0 m i n u t e s b e f o r e s t a r t i n g a g g r e g a t i o n s . B l o o d f o r t h e p r e p a r a t i o n o f g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s w a s c o l l e c t e d v i a a n 1 8 g a u g e n e e d l e i n t o 3 . 8 % N a 3 c i t r a t e a t a r a t i o o f 9 : 1 . P l a t e l e t r i c h p l a s m a w a s p r e p a r e d , 1 . 0 p M P G E 1 a d d e d , a n d t h e p l a t e l e t r i c h p l a s m a a l l o w e d t o r e s t f o r 1 0 m i n u t e s b e f o r e c e n t r i f u g a t i o n a t 8 0 0 x g f o r 1 5 m i n u t e s . T h e s u p e r n a t a n t w a s d i s c a r d e d a n d t h e p l a t e l e t p e l l e t g e n t l y r e s u s p e n d e d i n 1 . 0 m l o f C a 2 + - M g 2 + - f r e e H E P E S - T y r o d e s c o n t a i n i n g 0 . 3 % b o v i n e s e r u m a l b u m i n ( H T A ) . T h e p l a t e l e t s w e r e t h e n g e l - f i l t e r e d o v e r a S e p h a r o s e A B c o l u m n e q u i l i b r a t e d w i t h H T A , c o u n t e d a n d d i l u t e d 3 0 8 t o 3 . 0 x l O a / m l w i t h H T A . 1 . 0 m M C 3 0 1 ; a n d 0 . 8 m M M g C 1 2 w e r e a d d e d a n d t h e p l a t e l e t s a l l o w e d t o r e s t f o r a t l e a s t 3 0 m i n u t e s b e f o r e s t a r t i n g a g g r e g a t i o n s . T h e m a j o r i t y o f a g g r e g a t i o n s f o r t h e c o l l e c t i o n o f t h r o m b o x a n e s a m p l e s w e r e d o n e i n a L u m i - a g g r e g o m e t e r ( C h r o n o l o g C o r p o r a t i o n , H a v e r t o w n , P A ) . A g g r e g a t i o n s f o r t h e f i r s t c o l l e c t i o n f r o m e a c h d o g w e r e d o n e i n a P l a t e l e t I o n i z e d C a l c i u m A g g r e g o m e t e r ( P I C A , C h r o n o l o g C o r p o r a t i o n , H a v e r t o w n , P A ) b e c a u s e t h e L u m i - a g g r e g o m e t e r w a s n o t a v a i l a b l e . F o r t h e c o l l e c t i o n o f s a m p l e s f o r T s z r a d i o i m m u n o a s s a y , p l a t e l e t r i c h p l a s m a o r g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s w e r e s t i r r e d a t 3 7 . 5 ° C i n t h e a g g r e g o m e t e r f o r a p p r o x i m a t e l y 3 0 s e c o n d s p r i o r t o t h e a d d i t i o n o f 2 0 p l o f 0 . 9 % w / v N a C l o r a g o n i s t . A t t h e p r e d e t e r m i n e d t i m e , t h e c o n t e n t s o f t h e c u v e t t e w e r e i m m e d i a t e l y t r a n s f e r r e d t o a n E p p e n d o r f t u b e a n d c e n t r i f u g e d a t 1 1 , 6 0 0 x g f o r 1 . 5 m i n u t e s . T h e s u p e r n a t a n t w a s i m m e d i a t e l y r e m o v e d , d i v i d e d i n t o a l i q u o t s a n d s t o r e d a t - 7 0 W 3 . B a s e l i n e a n d s t i r r e d s a m p l e s w i t h o u t a g o n i s t w e r e p r e p a r e d i n t h e s a m e w a y . N o n - s t i r r e d s a m p l e s w e r e p r e p a r e d i n t h e s a m e f a s h i o n , w i t h o u t b e i n g s t i r r e d i n t h e a g g r e g o m e t e r . 3 0 9 R a d i o i m m u n o a s s a y f o r T h r o m b o x a n e 8 2 R a d i o i m m u n o a s s a y ( R I A ) i s a u s e f u l m e t h o d f o r d e t e r m i n i n g r e l a t i v e l y s m a l l q u a n t i t i e s ( p g - n g ) o f s u b s t a n c e s i n b i o l o g i c f l u i d s . T h e m e t h o d u s e d h e r e t o m e a s u r e T x 2 w a s a d a p t e d f r o m t h e p r o c e d u r e d e s c r i b e d . b y F i t z p a t r i c k . ” 0 I t i s b a s e d o n t h e p r i n c i p l e o f c o m p e t i t i v e b i n d i n g : t h e u n l a b e l l e d T s z i n t h e s a m p l e o r s t a n d a r d c o m p e t e s w i t h 3 M - l a b e l l e d T s z ( " t r a c e " ) f o r b i n d i n g s i t e s o n a s p e c i f i c a n t i b o d y ( A b ) . T h e t r a c e w a s d i l u t e d i n P B S G t o a c o n c e n t r a t i o n t h a t g a v e a t o t a l c o u n t o f 5 0 0 0 - 5 5 0 0 c p m i n 1 0 0 p 1 . T h e a n t i b o d y w a s r e c o n s t i t u t e d i n t h e v o l u m e o f P B S G t h a t g a v e a n a n t i b o d y c o n c e n t r a t i o n i n 1 0 0 p 1 t h a t b o u n d 5 0 % ( A S - 5 2 % ) o f t h e t r a c e i n t h e a b s e n c e o f a n y u n l a b e l l e d T s z . T h i s w a s e s t a b l i s h e d b y u s i n g s e r i a l d i l u t i o n s o f a n t i b o d y w i t h a f i x e d c o n c e n t r a t i o n o f t r a c e . F r e s h P B S G w a s m a d e e a c h d a y f r o m g e l a t i n a n d s t o c k 0 . 1 M P B S c o n t a i n i n g 1 . 5 m M s o d i u m a z i d e , p H 7 . 4 . B e c a u s e a l l t u b e s i n t h e a s s a y m u s t c o n t a i n t h e s a m e p r o p o r t i o n o f p l a s m a a n d / o r b u f f e r , c h a r c o a l - s t r i p p e d p l a s m a t h a t i s f r e e o f T s z * w a s p r e p a r e d f o r d i l u t i n g s t a n d a r d a n d s a m p l e s w h e n p l a s m a s a m p l e s w e r e b e i n g a s s a y e d . C h a r c o a l - s t r i p p e d p l a s m a w a s p r e p a r e d b y t r e a t i n g a d o g w i t h a s p i r i n d a i l y f o r 1 0 d a y s b e f o r e c o l l e c t i n g a p p r o x i m a t e l y 1 5 0 m l s o f b l o o d . T h e p l a s m a w a s s e p a r a t e d a n d i n c u b a t e d i n a n i c e - b a t h f o r 3 0 m i n u t e s b e f o r e t h e a d d i t i o n o f 0 . 1 v o l u m e o f i c e - c o l d c o n c e n t r a t e d d e x t r a n - c o a t e d c h a r c o a l c o n t a i n i n g 1 . 5 g m N o r i t A c h a r c o a l a n d 0 . 1 5 g m D e x t r a n T - 7 0 i n 7 5 m l s o f 0 . 1 M P B S . A f t e r 1 1 i 1 m i n u t e s , t h e t u b e s w e r e c e n t r i f u g e d a t 1 3 0 0 x g f o r 2 0 m i n u t e s a t 0 ° C t o s e p a r a t e t h e 3 1 0 c h a r c o a l a n d a n y T s z f r o m t h e p l a s m a . T h e s u p e r n a t a n t c h a r c o a l - s t r i p p e d p l a s m a w a s a l i q u o t e d a n d s t o r e d a t - 7 0 ° C . F o r p l a s m a s a m p l e s , t h e p r o p o r t i o n o f p l a s m a t o b u f f e r i n a l l t u b e s w a s k e p t c o n s t a n t b y i n i t i a l l y d i l u t i n g a l l s a m p l e s i n H T A t o t h e l o w e s t d i l u t i o n u s e d i n t h e a s s a y , f o r e x a m p l e 1 / 5 . M e d i u m c o n t a i n i n g 1 / 5 c h a r c o a l - s t r i p p e d p l a s m a t o H T A w a s t h e n u s e d i n a l l f u r t h e r d i l u t i o n s o f s a m p l e s . T h e s t a n d a r d c u r v e w a s s e t u p b y f u r t h e r d i l u t i n g t h e 1 0 0 0 n g / m l T s z s t o c k i n e i t h e r m e d i u m ( f o r p l a s m a s a m p l e s ) o r H T A ( f o r g e l - f i l t e r e d s a m p l e s ) t o g i v e a s t a n d a r d c u r v e c o n t a i n i n g 9 d u p l i c a t e p o i n t s f r o m 3 . 0 5 p g / l O O p l t o 7 8 0 . 0 p g / l O O p l . T o t a l c o u n t ( T C ) , m a x i m u m b i n d i n g ( B o ) a n d n o n - s p e c i f i c b i n d i n g ( N S B ) t u b e s a l s o c o n t a i n e d t h e s a m e p r o p o r t i o n o f m e d i u m o r H T A . D u p l i c a t e t u b e s f o r e a c h s t a n d a r d ( 1 0 0 p 1 e a c h o f s t a n d a r d , t r a c e a n d A b ) , s a m p l e ( 1 0 0 p 1 e a c h o f d i l u t e d s a m p l e , t r a c e a n d A b ) , T C a n d N S B ( 1 0 0 p 1 e a c h o f m e d i u m / E T A , t r a c e a n d P B S G ) a n d f o u r t u b e s f o r B o ( 1 0 0 p l e a c h o f m e d i u m / E T A , t r a c e a n d A b ) w e r e i n c u b a t e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r o n e h o u r t h e n a t 4 9 C f o r 2 0 - 2 4 h o u r s . T h e t u b e s w e r e t h e n i n c u b a t e d i n a n i c e - b a t h f o r o n e h o u r b e f o r e t h e a d d i t i o n t o e a c h t u b e o f 1 . 0 m l o f i c e - c o l d d e x t r a n - c o a t e d c h a r c o a l c o n t a i n i n g 0 . 5 % w / v c h a r c o a l a n d 0 . 0 5 % w / v D e x t r a n T - 7 0 i n 0 . 1 M P B S . A f t e r a n i n c u b a t i o n o f p r e c i s e l y 1 1 i 1 m i n u t e s , t h e t u b e s w e r e c e n t r i f u g e d a t 1 3 0 0 x g f o r 2 0 m i n u t e s a t 0 ° C t o s e p a r a t e t h e c h a r c o a l a n d a n y u n b o u n d T s z f r o m t h e b o u n d T s z ( l a b e l l e d a n d u n l a b e l l e d ) w h i c h r e m a i n e d i n t h e s u p e r n a t a n t . A l i q u o t s ( 1 . 0 m l ) o f t h e s u p e r n a t a n t w e r e a d d e d t o s c i n t i l l a t i o n v i a l s c o n t a i n i n g 1 0 m l s o f R I A - S o l v e 1 1 a n d c o u n t e d i n a 3 1 1 B e c k m a n L S 9 0 0 0 c o u n t e r f o r f i v e m i n u t e s u s i n g t h e l o g i t t r a n s f o r m a t i o n i n t h e R I A d a t a r e d u c t i o n p r o g r a m . T h e s a m p l e s w e r e d i l u t e d s u c h t h a t t h e y f e l l o n t h e s t r a i g h t p a r t o f a % b o u n d v e r s u s 1 n s t a n d a r d c o n c e n t r a t i o n c u r v e . T h e c o r r e c t d i l u t i o n s w e r e f o u n d b y t r i a l a n d e r r o r . V a l u e s w h i c h d i d n o t f a l l o n t h e s t r a i g h t p a r t o f t h e s t a n d a r d c u r v e w e r e d i s c a r d e d b e c a u s e o f p o o r p r e c i s i o n . T h e f o l l o w i n g p a r a m e t e r s p r o v i d e d b y t h e R I A d a t a r e d u c t i o n p r o g r a m w e r e r e c o r d e d f o r e a c h r u n : t o t a l c o u n t T C ( c p m ) , n o n - s p e c i f i c b i n d i n g N S B ( c p m ) , m a x i m u m b i n d i n g B o ( c p m ) , % b o u n d f o r e a c h s t a n d a r d p o i n t , s l o p e , i n t e r c e p t , c o r r e l a t i o n ( r ) , % N S B / T C , % B o / T C , p i p e t t i n g p r e c i s i o n % , c o n c e n t r a t i o n a t 9 5 % B o , a n d c o n c e n t r a t i o n a t 5 0 % B o . A n y r u n i n w h i c h t h e s e d e v i a t e d f r o m t h e e x p e c t e d r a n g e w a s d i s c a r d e d . S t a t i s t i c a l A n a l y s i s R e s u l t s w e r e e n t e r e d i n t o a s t a t i s t i c s a n d g r a p h i c s p r o g r a m ( S t a t g r a p h i c s , S T S C , R o c k v i l l e , M D . ) W h e n n o r m a l d i s t r i b u t i o n p l o t s w e r e r u n o n s a m p l e g r o u p s m a n y , b u t n o t a l l , g r o u p s w e r e n o r m a l l y d i s t r i b u t e d . F o r t h i s r e a s o n , a s w e l l a s t h e r e l a t i v e l y s m a l l s a m p l e s i z e s i n v o l v e d , t h e c o n t r o l a n d a f f e c t e d g r o u p s w e r e c o m p a r e d u s i n g t h e M a n n - W h i t n e y n o n - p a r a m e t r i c t e s t f o r i n d e p e n d e n t s a m p l e s , p < 0 . 0 5 . F o r c o m p a r i s o n w i t h i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d g r o u p s o f T x 2 p r o d u c t i o n a t t h e s e l e c t e d t i m e p o i n t s , a o n e - w a y a n a l y s i s o f v a r i a n c e u s i n g T u k e y ' s t e s t ( p < 0 . 0 5 ) f o r m u l t i p l e c o m p a r i s o n s w a s u s e d . A l t h o u g h t h i s i s a p a r a m e t r i c t e s t , r e a s o n a b l e d e p a r t u r e s f r o m n o r m a l i t y d o n o t a f f e c t t h e v a l i d i t y o f t h e r e s u l t s . 3 1 2 R E S U L T S R e s t i n g a n d B a s e l i n e V a l u e s B a s e l i n e T s z c o n c e n t r a t i o n s o b t a i n e d b y s t i r r i n g p l a t e l e t r i c h p l a s m a i n t h e a g g r e g o m e t e r f o r 0 . 5 m i n u t e b e f o r e t h e a d d i t i o n o f 2 0 p l 0 . 9 % w / v N a C l w e r e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r i n t h e a f f e c t e d g r o u p t h a n i n t h e c o n t r o l g r o u p . - T h e P I C A a g g r e g o m e t e r w a s u s e d f o r t h e f i r s t g r o u p o f p l a t e l e t r i c h p l a s m a s a m p l e s c o l l e c t e d f r o m b o t h g r o u p s a n d t h e L u m i - a g g r e g o m e t e r u s e d f o r t h e r e m a i n d e r o f t h e s t u d y . T h e o r e t i c a l l y , t h e s e t w o m a c h i n e s s h o u l d g i v e i d e n t i c a l r e s u l t s , b u t a d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o m a c h i n e s w a s n o t e d i n t h e b a s e l i n e T x B : c o n c e n t r a t i o n s i n t h e a f f e c t e d g r o u p . W i t h i n t h e a f f e c t e d g r o u p , t h e b a s e l i n e T s z c o n c e n t r a t i o n s m e a s u r e d i n p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i r r e d i n t h e P I C A a g g r e g o m e t e r w e r e h i g h e r t h a n t h o s e s t i r r e d i n t h e L u m i - a g g r e g o m e t e r . T h e r e w a s n o d i f f e r e n c e i n T s z c o n c e n t r a t i o n s m e a s u r e d i n r e s p o n s e t o t h e a g o n i s t s u s e d . T h e b a s e l i n e T s z c o n c e n t r a t i o n s m e a s u r e d i n t h e L u m i - a g g r e g o m e t e r w e r e s t i l l s i g n i f i c a n t l y h i g h e r i n t h e a f f e c t e d g r o u p t h a n i n t h e c o n t r o l g r o u p a n d r e s u l t s f r o m t h e t w o m a c h i n e s h a v e b e e n p o o l e d t o g e t h e r i n t h e o n e g r o u p . T h e c o n t r o l g r o u p w a s n o t a f f e c t e d b y t h e a g g r e g o m e t e r u s e d . L a t e r i n t h e s t u d y , T x 2 p r o d u c t i o n i n p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i r r e d f o r 0 . 5 , 5 . 5 a n d 1 2 . 5 m i n u t e s a n d i n n o n - s t i r r e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d 3 7 . 5 ° C w a s m e a s u r e d . T h e s e r e s u l t s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 1 8 a n d F i g u r e 6 9 . I t s h o u l d b e n o t e d t h a t t h e s t i r r e d 0 . 5 m i n u t e s a m p l e i s t h e s a m e a s t h a t r e f e r r e d t o a s t h e 3 1 3 b a s e l i n e s a m p l e t h r o u g h o u t t h e r e s t o f t h e s t u d y . T h e a f f e c t e d g r o u p h a d s i g n i f i c a n t l y h i g h e r T s z c o n c e n t r a t i o n s a t a l l t i m e s m e a s u r e d e x c e p t 5 . 5 m i n u t e s , b u t w i t h i n e a c h g r o u p t h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t e f f e c t o f s t i r r i n g . T h r o m b o x a n e B 2 p r o d u c t i o n i s e x p r e s s e d i n n g / m l o f p l a t e l e t s u s p e n s i o n i n w h i c h t h e c o n c e n t r a t i o n w a s 3 . 0 x l o p / m l . I n c o n t r a s t , t h e b a s e l i n e T s z c o n c e n t r a t i o n i n g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s w a s h i g h e r t h a n t h e b a s e l i n e l e v e l i n p l a t e l e t r i c h p l a s m a i n b o t h g r o u p s a n d d i d n o t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y b e t w e e n t h e t w o g r o u p s . T a b l e 1 8 . T x 3 2 c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n n o n - s t i r r e d a n d s t i r r e d n o n - s t i m u l a t e d c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s u s p e n s i o n s . C o n t r o l A f f e c t e d T s z ( n g / m l ) T s z ( n g / m l ) P l a t e l e t r i c h p l a s m a N o n - s t i r r e d ( r o o m t e m p e r a t u r e ) 0 . 3 2 i 0 . 1 8 ( 4 ) 4 . 4 9 i 2 . 2 4 ( 4 ) . N o n - s t i r r e d ( 3 7 ° C ) 1 . 2 6 i 0 . 5 5 ( 4 ) 6 . 1 6 i 1 . 3 8 ( 4 ) . 0 . 5 m i n u t e ( b a s e l i n e ) 1 . 3 1 i 0 . 9 8 ( 1 9 ) 9 . 2 0 i 3 . 8 7 ( 2 8 ) . 5 . 5 m i n u t e s 2 . 2 1 i 2 . 5 8 ( 4 ) 1 1 . 5 5 i 7 . 9 7 ( 4 ) 1 2 . 5 m i n u t e s 1 . 3 3 i 0 . 4 9 ( 4 ) 7 . 4 9 i 1 . 5 1 ( 4 ) * G e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s 0 . 5 m i n u t e ( b a s e l i n e ) 1 6 . 1 2 i 2 . 7 3 ( 1 5 ) 1 5 . 3 0 i 2 . 1 4 ( 2 0 ) V a l u e s - m e a n 1 S D , ( n ) - n u m b e r o f s a m p l e s , * - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l v a l u e ( p < 0 . 0 5 ) . ] I I r [ [ I I I r I I I I I r ) I l I m I / g n ( I ' I I ) I G [ Z l B I x T 1 \ O [ T r 1 8 4 f 1 1 1 1 L 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 * l 1 r n I n ) h [ l I J I l T l 9 I 1 l I l I I [ l L l 3 1 4 [ U I U I ' I I U T I U I r V T U T U U I Y F T U I I I U V ' I ‘ I U ' I ' 1 ' [ I U U T ' T U F Y ‘ I F F T T r Y r T T l U U U T I T 2 0 1 8 1 6 - * - C o n t r o l - ~ - A f f e c t e d 1 4 1 2 1 B { W — i l l l l l l l l l l l l j l j l l 1 1 1 [ l l l l l l l l l l l l l l l j l l l i l l g l u l a l a m u l a a a a l a a l l l 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 T i m e ( m i n u t e s ) i — - . , - _ — 4 * F i g u r e 6 9 . T s z c o n c e n t r a t i o n i n n o n - s t i r r e d ( 0 m i n u t e ) a n d s t i r r e d ( 0 . 5 , 5 . 5 a n d 1 2 . 5 m i n u t e s ) c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a a t 3 7 . 5 ° C . * - c o n t r o l a n d a f f e c t e d g r o u p s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t , ( p < 0 . 0 5 ) . A d e n o s i n e D i p h o s p h a t e A l t h o u g h a f f e c t e d p l a t e l e t s f a i l e d t o a g g r e g a t e i n r e s p o n s e t o 1 0 p M A D P , t h e y p r o d u c e d s i g n i f i c a n t l y m o r e T s z t h a n c o n t r o l p l a t e l e t s u n d e r t h e s a m e c o n d i t i o n s . W i t h i n t h e c o n t r o l g r o u p , t h e T s z c o n c e n t r a t i o n s m e a s u r e d a n d t h e e l e v a t i o n a b o v e b a s e l i n e i n r e s p o n s e t o 1 0 p M A D P w e r e s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d a t f i v e m i n u t e s , b u t n o t a t o n e m i n u t e . I n c o n t r a s t , t h e T s z c o n c e n t r a t i o n s m e a s u r e d a n d t h e e l e v a t i o n a b o v e 3 1 5 b a s e l i n e o f t h e a f f e c t e d g r o u p w e r e s i g n i f i c a n t l y e l e v a t e d a t b o t h o n e a n d f i v e m i n u t e s . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e a f f e c t e d p l a t e l e t s w e r e a b l e t o p r o d u c e g r e a t e r a m o u n t s o f T x 2 m o r e r a p i d l y t h a n c o n t r o l p l a t e l e t s . T h e s e r e s u l t s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 1 9 a n d F i g u r e s 7 0 a n d 7 1 . T a b l e 1 9 . T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 0 p M A D P . P o s t - A g o n i s t C o n t r o l A f f e c t e d ( m i n u t e s ) T s z ( n g / m l ) T s z ( n g / m l ) B a s e l i n e 0 1 . 3 1 : t 0 . 9 8 ( 1 9 ) 9 . 2 0 i 3 . 8 7 ( 2 8 ) * m 2 m e a s u r e d 1 2 . 2 9 i 0 . 5 4 ( 5 ) 3 7 . 9 7 ' 1 : 2 1 . 9 1 ( 8 ) " 5 4 . 5 8 i : 2 . 3 9 ( 5 ) ' 3 8 . 6 1 i 1 6 . 7 2 ( 8 ) " I n c r e a s e a b o v e 0 O O b a s e l i n e 1 0 . 9 2 i 0 . 6 6 ( 5 ) 2 7 . 2 4 i 2 0 . 4 1 ( 8 ) " 5 3 . 1 2 i 2 . 5 1 ( 5 ) ' 2 7 . 8 7 1 1 6 . 0 6 ( 8 ) " V a l u e s - m e a n i S D , ( n ) - n u m b e r o f s a m p l e s , * - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l v a l u e ( p < 0 . 0 5 ) , # - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m b a s e l i n e ( p < 0 . 0 5 ) . 3 1 6 F i g u r e 7 0 . T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 0 p M A D P . * - c o n t r o l a n d a f f e c t e d g r o u p s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t , ( p < 0 . 0 5 ) . F i g u r e 7 1 . I n c r e a s e i n T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) a b o v e t h e b a s e l i n e i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 0 p M A D P . * - c o n t r o l a n d a f f e c t e d g r o u p s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t , ( p < 0 . 0 5 ) . . q . ‘ 0 ] G - D H I I I I ! ) U G I I I I I ~ D [ - 0 I ‘ : 1 . — . 1 1 * ; 1 1 1 1 1 1 1 1 l I . I 1 ) l m / g I I m A I ( ( 0 I I Z B I X T I D I N C 0 . ' I I I * I ¢ - l — P . 4 0 1 H 0 , I s — T I I T [ O - - ' - O H . q _ I — » l « : 1 ! . U 6 I I I I | I A I 0 I I I I A 0 I T T I I 4 ! 0 U I I I I I A D ( ( I ) l m I / r g T : n 1 ( N 0 Z B I I I I r I N D I x I T I I I ! I H U I I r I D I H C I I I I 1 I 0 I I I I " : ! L [ M O 1 1 1 1 1 1 ‘ 1 1 1 1 1 I 1 I v — I l I — p 1 1 - - " U l c . — l n u l * u 4 u l n u l n u l 1 1 1 . 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 % 1 1 1 l n n o — L l i u — h n T i m e ( m i n u t e s ) I n I l 2 T i m e I ~ — O I ( m i n u t e s ) I I — . - ' - C o n t r o l A f f e c t e d I C o n t r o l a f f e c t e d 3 1 7 3 1 8 P l a t e l e t A c t i v a t i n g F a c t o r P r o d u c t i o n o f T s z ‘ w a s m e a s u r e d i n r e s p o n s e t o 1 . 0 a n d 0 . 1 p M P A F b e c a u s e t h e a g g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n r e s p o n s e s o f a f f e c t e d p l a t e l e t s t o t h e s e t w o c o n c e n t r a t i o n s w e r e q u i t e d i f f e r e n t . T h e r e w a s r a p i d s e c r e t i o n o f d e n s e g r a n u l e A T P i n r e s p o n s e t o 1 . 0 p M P A F , b u t f a i l u r e o f s e c r e t i o n i n r e s p o n s e t o 0 . 1 p M . I n c o n t r a s t , p l a t e l e t s f r o m t h e c o n t r o l s u s e d i n t h i s s t u d y s e c r e t e d i n r e s p o n s e t o b o t h c o n c e n t r a t i o n s . I n t e r e s t i n g l y , t h e o c c u r r e n c e o f d e n s e g r a n u l e s e c r e t i o n c o r r e l a t e d w i t h t h e p r o d u c t i o n o f T s z . W h e n c o n t r o l p l a t e l e t s w e r e s t i m u l a t e d b y 0 . 1 p M P A F , T x 2 p r o d u c t i o n m e a s u r e d w a s s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d a b o v e b a s e l i n e c o n c e n t r a t i o n a t o n e m i n u t e w i t h a s l i g h t , f u r t h e r i n c r e a s e b y f i v e m i n u t e s . W h e n t h e i n c r e a s e a b o v e b a s e l i n e w a s e x a m i n e d , t h e c o n t r o l g r o u p T x B Z w a s s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d b y f i v e m i n u t e s , b u t n o t a t o n e m i n u t e . T s z p r o d u c t i o n b y t h e a f f e c t e d g r o u p w a s n o t s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d w h e n e i t h e r t h e c o n c e n t r a t i o n m e a s u r e d o r t h e i n c r e a s e a b o v e b a s e l i n e w e r e a n a l y z e d . T h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n t h e c o n c e n t r a t i o n s m e a s u r e d b e t w e e n t h e t w o g r o u p s a t o n e a n d f i v e m i n u t e s , b u t t h e e l e v a t i o n s a b o v e b a s e l i n e w e r e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r i n t h e c o n t r o l g r o u p . T h e s e r e s u l t s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 2 0 a n d F i g u r e s 7 2 a n d 7 3 . 3 1 9 T a b l e 2 0 . T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 0 . 1 p M P A F . P o s t - A g o n i s t C o n t r o l A f f e c t e d ( m i n u t e s ) T s z ( n g / m l ) T x B , ( n g / m l ) B a s e l i n e 0 1 . 3 1 1 0 . 9 8 ( 1 9 ) 9 . 2 0 i 3 . 8 7 ( 2 8 ) * ' 1 ‘ s z m e a s u r e d 1 1 3 . 7 4 i 1 3 . 0 2 ( 5 ) ' 1 2 . 4 7 i 3 . 1 1 ( 8 ) 5 1 8 . 1 5 i 9 . 4 5 ( 5 ) ' 9 . 6 2 i 1 . 1 4 ( 8 ) I n c r e a s e a b o v e 0 O O b a s e l i n e 1 1 2 . 3 4 i 1 3 . 0 5 ( 5 ) 1 . 7 3 . + . 1 . 9 3 ( 8 ) * 5 1 6 . 8 4 a 9 . 5 9 ( 5 ) ' 1 . 0 4 . + _ 1 . 6 1 ( 8 ) " V a l u e s - m e a n i S D , ( n ) - n u m b e r o f s a m p l e s , * - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l v a l u e ( p < 0 . 0 5 ) , # - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m b a s e l i n e ( p < 0 . 0 5 ) . 3 2 0 F i g u r e 7 2 . T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 0 . 1 p M P A F . * - c o n t r o l a n d a f f e c t e d g r o u p s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t , ( p < 0 . 0 5 ) . F i g u r e 7 3 . I n c r e a s e i n T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) a b o v e t h e b a s e l i n e i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 0 . 1 p M P A F . * - c o n t r o l a n d a f f e c t e d g r o u p s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t , ( p < 0 . 0 5 ) . A ( 0 T I I I ! N U I I I I I N Q I I I ) l m / T g I n ! ( H U I Y Z I B x T I I - H O I * T I T I 1 0 I * ] I I I [ Q A ( 0 V I I | N 0 I I T I I N G I I I ) I 1 I m 1 H 0 I / g m I I ( I I Z I H 0 B T 1 1 1 1 1 1 4 1 1 1 ] 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 [ 1 1 1 1 1 ] 1 * 1 5 1 T 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 r L 1 1 L 1 c 1 — o 1 x T | 0 0 T I I [ I T l I I ‘ T l l I [ 1 — 1 [ 1 1 1 4 T i m e ( m i n u t e s ) * P . C o n t r o l A f f e c t e d T i m e ( m i n u t e s ) - . — 0 . . C o n t r o l A f f e c t e d I a s ! A J ' 7 ' V — _ ‘ 3 2 1 3 2 2 B o t h c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 1 . 0 p M P A F h a d s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d T x 2 p r o d u c t i o n a t o n e a n d f i v e m i n u t e s w h e n b o t h t h e c o n c e n t r a t i o n m e a s u r e d a n d i n c r e a s e a b o v e b a s e l i n e w e r e a n a l y z e d . W i t h i n b o t h g r o u p s , t h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e o n e a n d f i v e m i n u t e c o n c e n t r a t i o n s . H o w e v e r , t h e a f f e c t e d g r o u p p r o d u c e d s i g n i f i c a n t l y m o r e T s z t h a n t h e c o n t r o l g r o u p a t b o t h o n e a n d f i v e m i n u t e s . T h e s e r e s u l t s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 2 1 a n d F i g u r e s 7 4 a n d 7 5 . T a b l e 2 1 . T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 . 0 p M P A F . P o s t - A g o n i s t C o n t r o l A f f e c t e d ( m i n u t e s ) T s z ( n g / m l ) T s z ( n g / m l ) B a s e l i n e 0 1 . 3 1 r 0 . 9 8 ( 1 9 ) 9 . 2 0 r 3 . 8 7 ( 2 8 ) " m 2 m e a s u r e d 1 2 9 . 7 2 1 1 0 . 5 5 ( 5 ) ' 9 3 . 8 3 r 4 4 . 5 2 ( 8 ) " 5 3 5 . 5 9 : 1 6 . 9 8 ( 5 ) ' 8 3 . 0 6 1 4 7 . 1 2 ( 8 ) " I n c r e a s e a b o v e 0 0 O b a s e l i n e 1 2 8 . 3 1 i 1 0 . 6 7 ( 5 ) 1 " 8 3 . 1 0 1 4 1 . 9 1 ( 8 ) " 5 3 4 . 1 8 . 4 : 1 7 . 0 7 ( 5 ) 4 ‘ 7 2 . 3 2 i 4 4 . 9 6 ( 8 ) " V a l u e s - m e a n i S D , ( n ) - n u m b e r o f s a m p l e s , * - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l v a l u e ( p < 0 . 0 5 ) , # - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m b a s e l i n e ( p < 0 . 0 5 ) . 3 2 3 F i g u r e 7 4 . T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 . 0 p M P A F . * - c o n t r o l a n d a f f e c t e d g r o u p s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t , ( p < 0 . 0 5 ) . F i g u r e 7 5 . I n c r e a s e i n T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) a b o v e t h e b a s e l i n e i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 . 0 p M P A F . * - c o n t r o l a n d a f f e c t e d g r o u p s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t , ( p < 0 . 0 5 ) . ) l m / g m ( 2 B x T 1 8 8 — - ) l m / g m ( Z B x T T i m e ( m i n u t e s ) T - - * ~ - - C A o f n f t e r c o t l e d } 4 ’ T i m e ( m i n u t e s ) 1 4 B 1 2 B 1 9 9 S B 6 8 a . I 1 2 8 : — 3 2 4 * - * - C o n t r o l ‘ ' e - A f f e c t e d 1 2 3 4 5 A a . 3 2 5 T h r o m b i n I n c o n t r a s t t o p l a t e l e t r i c h p l a s m a , t h e b a s e l i n e T s z p r o d u c t i o n f o r g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s w a s n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t b e t w e e n t h e t w o g r o u p s . T h r o m b o x a n e B 2 p r o d u c t i o n i n r e s p o n s e t o 0 . 0 5 U / m l t h r o m b i n w a s v e r y v a r i a b l e f r o m o n e i n d i v i d u a l t o t h e o t h e r , b u t t h e o c c u r r e n c e o f p l a t e l e t a g g r e g a t i o n w a s a s s o c i a t e d w i t h T s z p r o d u c t i o n . T h e m a j o r i t y o f t i m e s , a g g r e g a t i o n d i d n o t o c c u r w i t h t h i s c o n c e n t r a t i o n o f t h r o m b i n a n d T x 2 p r o d u c t i o n w a s m i n i m a l . I t w a s n o t e d t h a t o n t h e o n e o c c a s i o n t h a t a n a f f e c t e d d o g h a d a g g r e g a t e d m e a s u r a b l y b y f i v e m i n u t e s ( 1 0 . 7 % ) , t h e i n c r e a s e a b o v e b a s e l i n e T s z p r o d u c t i o n w a s 1 4 4 . 2 5 n g / m l . I n c o n t r a s t , s t r o n g e r a g g r e g a t i o n r e s p o n s e s ( 6 9 . 8 % a n d 1 9 . 3 % ) o f c o n t r o l p l a t e l e t s w e r e a s s o c i a t e d w i t h m u c h s m a l l e r i n c r e a s e s a b o v e b a s e l i n e i n T s z p r o d u c t i o n o f 1 6 . 4 6 a n d 1 1 . 6 3 n g / m l r e s p e c t i v e l y . B o t h t h e l e v e l s m e a s u r e d a n d t h e i n c r e a s e a b o v e b a s e l i n e w e r e s i g n i f i c a n t l y g r e a t e r i n t h e a f f e c t e d g r o u p a t o n e m i n u t e . B e c a u s e o f t h e g r e a t i n d i v i d u a l v a r i a t i o n a n d l a r g e s t a n d a r d d e v i a t i o n s , i t i s d i f f i c u l t t o m a k e a n y g e n e r a l i n t e r p r e t a t i o n s f r o m t h e d a t a t h a t i s s u m m a r i z e d i n T a b l e 2 2 a n d F i g u r e s 7 6 a n d 7 7 . H o w e v e r , i t d o e s a p p e a r t h a t a g g r e g a t i o n b y a f f e c t e d p l a t e l e t s i n r e s p o n s e t o 0 . 0 5 U / m l t h r o m b i n i s a s s o c i a t e d w i t h g r e a t e r T s z f o r m a t i o n t h a n i n c o n t r o l p l a t e l e t s . 3 2 6 T a b l e 2 2 . T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 0 5 U / m l t h r o m b i n . P o s t - A g o n i s t C o n t r o l A f f e c t e d ( m i n u t e s ) T s z ( n g / m l ) T s z ( m g / m l ) B a s e l i n e 0 1 6 . 1 2 s 2 . 7 3 ( 1 5 ) 1 5 . 3 0 i 2 . 1 4 ( 2 0 ) T s z m e a s u r e d 1 1 7 . 7 7 s 4 . 4 6 ( 6 ) 3 8 . 8 0 1 3 3 . 5 7 ( 8 ) * 5 2 2 . 1 7 : 8 . 0 4 ( 6 ) ' 3 7 . 3 8 s 4 8 . 5 4 ( 8 ) I n c r e a s e a b o v e 0 0 0 b a s e l i n e 1 1 . 7 6 r . 2 . 5 4 ( 6 ) 2 3 . 1 3 1 3 4 . 4 5 ( 8 ) ‘ 5 5 . 8 5 r 6 . 6 7 ( 6 ) 2 1 . 7 1 x 4 9 . 5 9 ( 8 ) V a l u e s - m e a n i S D , ( n ) - n u m b e r o f s a m p l e s , * - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l v a l u e ( p < 0 . 0 5 ) , # - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m b a s e l i n e ( p < 0 . 0 5 ) . 3 2 7 F i g u r e 7 6 . T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 0 5 U / m l t h r o m b i n . * - c o n t r o l a n d a f f e c t e d g r o u p s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t , ( p < 0 . 0 5 ) . F i g u r e 7 7 . I n c r e a s e i n T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) a b o v e t h e b a s e l i n e i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 0 5 U / m l t h r o m b i n . * - c o n t r o l a n d a f f e c t e d g r o u p s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t , ( p < 0 . 0 5 ) . T O T ‘ 0 O C 0 T I F I T I l I I \ 0 I I I I I \ I O 0 V I ) W | l m / g n ( Z B U 0 I T W T I I I A 0 T T I “ 0 T x I T [ I I 0 T N T I I I ” 0 I I I Y I 0 T I I I I D 0 ] I I I I G I 0 V I I I I I I N I 0 I T I I O 0 I I T I I I U 0 I A 0 I T I I T I U I 0 N I I I I I “ I 0 I I T I 0 I T T I I I I T ” I T I T T I * I J — ‘ A A v v V A _ | 7 ‘ 1 1 A v * 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ‘ — A 1 1 1 1 1 1 1 1 A r 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 . 1 1 1 1 I i 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 k v 1 1 1 1 1 r 1 1 1 1 1 1 1 r 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 l l T i m e ( m i n u t e s ) T x B 2 ( n g / m l ) P l — . — 0 I C o n t r o l A f f e c t e d I - I T i m e ( m i n u t e s ) - I L — - I - . — 0 . 0 C o n t r o l A f f e c t e d 3 2 8 3 2 9 W h e n c o n t r o l p l a t e l e t s w e r e s t i m u l a t e d b y 0 . 1 U / m l t h r o m b i n , T s z p r o d u c t i o n w a s q u i t e v a r i a b l e . A l l c o n t r o l s a g g r e g a t e d i n r e s p o n s e t o 0 . 1 U / m l t h r o m b i n w i t h a g g r e g a t i o n b e i n g c o m p l e t e , o r n e a r c o m p l e t i o n , b y f i v e m i n u t e s . T h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e p e r c e n t a g g r e g a t i o n m e a s u r e d a t f i v e m i n u t e s a n d t h e i n c r e a s e i n T s z p r o d u c t i o n a b o v e b a s e l i n e ( r - 0 . 4 8 b y r e g r e s s i o n a n a l y s i s ) . A f f e c t e d p l a t e l e t s w e r e v a r i a b l e i n t h e i r r e s p o n s e t o 0 . 1 U / m l t h r o m b i n a n d d i d n o t a l w a y s a g g r e g a t e . E v e n w h e n t h e y d i d a g g r e g a t e , t h e r e s p o n s e w a s f a r f r o m c o m p l e t e a t f i v e m i n u t e s b e c a u s e o f t h e i n i t i a l v e r y s l o w r a t e o f a g g r e g a t i o n o f a f f e c t e d p l a t e l e t s . T h r o m b o x a n e B 2 p r o d u c t i o n b y a f f e c t e d p l a t e l e t s w a s a l s o v e r y v a r i a b l e , b u t t h e r e w a s a s i g n i f i c a n t p o s i t i v e c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e p e r c e n t a g g r e g a t i o n m e a s u r e d a t f i v e m i n u t e s a n d t h e a m o u n t o f T s z p r o d u c e d ( r - 0 . 9 0 b y r e g r e s s i o n a n a l y s i s ) . I n c o n t r a s t t o 0 . 0 5 U / m l t h r o m b i n , a f f e c t e d p l a t e l e t s w h i c h h a d n o t a g g r e g a t e d b y f i v e m i n u t e s ( 5 / 1 2 ) s t i l l p r o d u c e d q u i t e l a r g e a m o u n t s o f T s z ( 2 1 . 8 9 - 8 9 . 8 8 n g / m l ) . B e c a u s e o f t h e v a r i a b l e o c c u r r e n c e a n d s l o w o n s e t o f a g g r e g a t i o n o f a f f e c t e d p l a t e l e t s a n d a p p a r e n t r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e q u a n t i t y o f T s z p r o d u c e d a n d t h e e x t e n t o f a g g r e g a t i o n , T s z p r o d u c t i o n a t 1 0 m i n u t e s w a s m e a s u r e d i n b o t h g r o u p s . T h e i n c r e a s e i n T x 2 p r o d u c t i o n a b o v e b a s e l i n e a t 1 0 m i n u t e s i n t h e c o n t r o l g r o u p w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n a t f i v e m i n u t e s . T h e r e s p o n s e o f t h e a f f e c t e d g r o u p w a s v e r y v a r i a b l e w i t h o n l y 1 / 4 d o g s r e s p o n d i n g w i t h m e a s u r a b l e a g g r e g a t i o n . I n t h i s i n d i v i d u a l , t h e i n c r e a s e a b o v e b a s e l i n e T s z w a s 3 2 5 . 0 5 n g / m l a t f i v e m i n u t e s ( 3 5 . 0 % a g g r e g a t i o n ) a n d 2 4 0 . 6 4 a t 1 0 3 3 0 m i n u t e s ( 6 4 . 0 % a g g r e g a t i o n ) . A t o n e m i n u t e , a f f e c t e d p l a t e l e t s p r o d u c e d s i g n i f i c a n t l y m o r e T s z t h a n t h e c o n t r o l s , b u t t h e r e w a s n o d i f f e r e n c e a t t h e o t h e r t i m e s m e a s u r e d . H o w e v e r , i n s p i t e o f t h e s i m i l a r T s z p r o d u c t i o n , t h e r e w a s a m a r k e d d i f f e r e n c e i n t h e a g g r e g a t i o n r e s p o n s e s o f t h e t w o g r o u p s . T h e s e r e s u l t s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 2 3 a n d F i g u r e s 7 8 a n d 7 9 . T a b l e 2 3 . T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 1 U / m l t h r o m b i n . P o s t - A g o n i s t C o n t r o l A f f e c t e d ( m i n u t e s ) T s z ( n g / m l ) T s z ( n g / m l ) B a s e l i n e 0 1 6 . 1 2 i 2 . 7 3 ( 1 5 ) 1 5 . 3 0 t . 2 . 1 4 ( 2 0 ) m s , m e a s u r e d 1 4 3 . 8 0 1 2 3 . 8 6 ( 6 ) " 1 1 5 . 7 3 1 ‘ 7 4 . 0 2 ( 8 ) " 5 6 9 . 6 3 1 3 5 . 4 8 ( 9 ) * 1 4 5 . 6 2 1 1 1 1 . 3 3 ( l 2 ) ' 1 0 1 1 2 . 3 2 : 1 2 . 2 5 ( 3 ) * ' * 8 9 0 . 0 1 1 1 0 5 . 5 0 ( 4 ) I n c r e a s e a b o v e 0 0 0 b a s e l i n e 1 2 7 . 3 8 1 2 2 . 6 5 ( 6 ) 1 0 0 . 0 6 1 7 4 . 3 3 ( 8 ) * 5 5 3 . 4 3 1 3 5 . 2 6 ( 9 ) 1 " 1 3 0 . 5 6 1 1 1 1 . 2 8 ( 1 2 ) ' 1 0 9 6 . 5 8 i 1 2 . 4 2 ( 3 ) * 7 6 . 1 7 s 1 0 5 . 5 2 ( 4 ) V a l u e s - m e a n i S D , ( n ) - n u m b e r o f s a m p l e s , * - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l v a l u e , # - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m b a s e l i n e ( p < 0 . 0 5 ) , @ - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m " 5 m i n u t e s " ( p < 0 . 0 5 ) . 3 3 1 F i g u r e 7 8 . T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 1 U / m l t h r o m b i n . * - c o n t r o l a n d a f f e c t e d g r o u p s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t , ( p < 0 . 0 5 ) . F i g u r e 7 9 . I n c r e a s e i n T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) a b o v e t h e b a s e l i n e i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 1 U / m l t h r o m b i n . * - c o n t r o l a n d a f f e c t e d g r o u p s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t , ( p < 0 . 0 5 ) . j T — T T T I j T — T T I f I U Y I r T I I I T I F r I U I T I l T F r F I U I j I I I T I I T T I T j I I I T I T — r r I l I ) I l m / g n ( Z B x T ) l m I T I T I T I ] T I I I j T T I I [ I I I T I I T T T I I I W [ I I T I / T g n ( I I T 2 I B x T I I I T I I I I I I I I [ I T Y U I I F I I I I j T I I [ T T V T I V I I F I I V U I I Y I T T ' I I I I I U I Y T I F T I I I 1 1 1 1 1 1 1 1 l l l i l i l l l l i L l i i L i i i i i l l l l l l l 8 J 1 l L l l l 2 l l L l l 3 l L l l l l l l l 4 i T m e ( 5 L m L l l l i n u t e l s 6 ) l l l l l l l l l l 7 l l l l l 8 j J a L l 9 l 1 8 3 8 8 2 5 8 2 8 8 1 5 8 1 8 8 5 8 2 5 8 2 8 8 1 5 8 1 8 8 5 8 3 3 2 ‘ - * - C o n t r o l 1 - ~ - A f f e c t e d L L L l l l L l l l l J 4 l t h l l l I L L L I I L I L I I P L A L A I A I I L L I I I L J L A L I 1 4 4 1 1 1 1 1 1 1 1 L 1 1 1 ] I i i l l i l l l l l i i i l l i l i L 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 8 T i m e ( m i n u t e s ) 7 . . C o n t r o l - ~ - A f f e c t e d A I \ n r s ' s a I s . . e . s . ' e e a ' e l r T 3 3 3 B o t h c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s a g g r e g a t e d a n d p r o d u c e d T s z i n r e s p o n s e t o 0 . 3 U / m l t h r o m b i n . A f f e c t e d p l a t e l e t s p r o d u c e d s i g n i f i c a n t l y m o r e T s z t h a n c o n t r o l s b o t h o n e a n d f i v e m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f a g o n i s t . I n c o n t r a s t t o 0 . 1 U / m l t h r o m b i n , t h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t r e l a t i o n s h i p b e t w e e n p e r c e n t a g g r e g a t i o n a t f i v e m i n u t e s a n d T x 2 p r o d u c t i o n b y a f f e c t e d p l a t e l e t s ( r - 0 . 5 1 b y r e g r e s s i o n a n a l y s i s ) . N e i t h e r g r o u p p r o d u c e d s i g n i f i c a n t l y m o r e T s z a t 1 0 m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 3 U / m l t h r o m b i n t h a n t h e y h a d a t f i v e m i n u t e s . W h i l e t h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n T s z p r o d u c t i o n b y a f f e c t e d p l a t e l e t s a t o n e , f i v e o r 1 0 m i n u t e s , c o n t r o l p l a t e l e t s p r o d u c e d m o r e T s z a t f i v e a n d 1 0 m i n u t e s t h a n t h e y h a d a t o n e m i n u t e . T h e s e r e s u l t s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 2 4 a n d F i g u r e s 8 0 a n d 8 1 . 3 3 4 T a b l e 2 4 . T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 3 U / m l t h r o m b i n . P o s t - A g o n i s t C o n t r o l A f f e c t e d ( m i n u t e s ) T s z ( n g / m l ) T s z ( n g / m l ) B a s e l i n e 0 1 6 . 1 2 i 2 . 7 3 ( 1 5 ) 1 5 . 3 0 i 2 . 1 4 ( 2 0 ) ' 1 s z m e a s u r e d 1 1 3 0 . 8 5 r 4 6 . 7 6 ( 6 ) * 3 3 1 . 6 9 r 1 2 1 . 5 5 ( 8 ) " 5 2 3 8 . 3 7 r 1 0 2 . 2 6 ( 9 ) “ 4 4 1 . 4 4 3 : 1 3 8 . 2 5 ( 1 2 ) " 1 0 2 8 0 . 4 5 r 5 . 9 8 ( 3 ) “ w 4 7 6 . 6 4 r 1 9 4 . 5 2 ( 4 ) ' I n c r e a s e a b o v e 0 0 0 b a s e l i n e 1 1 1 4 . 4 3 1 4 5 . 6 0 ( 6 ) " 3 1 6 . 0 2 s 1 2 0 . 4 0 ( 8 ) " 5 2 2 2 . 1 4 1 1 0 1 . 9 6 ( 9 ) “ 4 2 6 . 3 9 s 1 3 8 . 0 1 ( 1 2 ) " 1 0 2 6 4 . 7 2 1 6 . 4 7 ( 3 ) “ 4 6 2 . 7 4 1 1 9 4 . 2 1 ( 4 ) ' V a l u e s - m e a n i S D , ( n ) - n u m b e r o f s a m p l e s , * - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l v a l u e ( p < 0 . 0 5 ) , # - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m b a s e l i n e ( p < 0 . 0 5 ) , @ - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m " 1 m i n u t e " ( p < 0 . 0 5 ) . 3 3 5 F i g u r e 8 0 . T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 3 U / m l t h r o m b i n . * - c o n t r o l a n d a f f e c t e d g r o u p s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t , ( p < 0 . 0 5 ) . F i g u r e 8 1 . I n c r e a s e i n T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) a b o v e t h e b a s e l i n e i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 3 U / m l t h r o m b i n . * - c o n t r o l a n d a f f e c t e d g r o u p s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t , ( p < 0 . 0 5 ) . r I T T I I I T 1 1 1 1 1 4 1 I 1 T 1 I 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4 1 1 1 1 1 ] 1 1 1 l l 1 1 1 1 [ r l T ‘ . ) T l m / g m ( 2 B x T ) l I I I I T T T [ I T I I I T T I T T T I F T ] I T T T I T I I I ] I T T m T / g m ( 2 B x I T T W I T T T T I I T I T I I T T T I [ 3 8 8 2 8 1 1 3 1 8 8 7 8 8 6 E 1 8 5 8 8 4 8 8 3 3 6 [ T I T I I T T T T ' I I I I I I T T I I I I T T I T T I T r T I T I I I I Y T I I I I T I T I T I - * - C o n t r o l ' 4 ' A f f e c t e d I L A l l L L L L L I L L I l L L A l l L l l l l l l l l l 1 1 1 1 l f l l l l l l L L l L l l 1 1 1 L l l 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 8 T i m e ( m i n u t e s ) I T I I F T T T T T I Y T T T I T T F T I T ' I Y T I I T T T I T I I T ] T T T Y I Y I ' T I T T T Y T " — . ( - ' . ‘ _ ( 1 ! d C o n t r o l I ' “ ' A f f e c t e d * : ' 4 ! - q I * . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J . I V I I . . . . . . . . . . . . . . . . Z . . . . . . . — 1 . . . . . . - + . . . . d . I . . ‘ b d J . J - F f . — ( - — F ' P - _ / J q I [ L I L L I I L L I I I I I I l l l l l l l l l l l l L J l l l l l l l l l l l l l l l l ‘ l [ I l l 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 8 T i m e ( m i n u t e s ) 3 3 7 P h o r b o l M y r i s t a t e A c e t a t e B o t h c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s a g g r e g a t e d f u l l y a n d i r r e v e r s i b l y i n r e s p o n s e t o 3 . 0 p M P M A , b u t t h e r e w a s n o i n c r e a s e i n T x 2 p r o d u c t i o n b y e i t h e r g r o u p f i v e o r 1 2 m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f a g o n i s t . I n t e r e s t i n g l y , t h e T s z c o n c e n t r a t i o n s m e a s u r e d f o r t h e a f f e c t e d g r o u p a t b o t h f i v e a n d 1 2 m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f P M A w e r e s i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a n b a s e l i n e c o n c e n t r a t i o n a n d w e r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e c o n t r o l c o n c e n t r a t i o n s f o r t h e s e t i m e s . T h e s e r e s u l t s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 2 5 a n d F i g u r e s 8 2 a n d 8 3 . T a b l e 2 5 . T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 3 . 0 p M P M A . P o s t - A g o n i s t C o n t r o l A f f e c t e d ( m i n u t e s ) T s z ( n g / m l ) T s z ( n g / m l ) B a s e l i n e 0 1 . 3 1 r 0 . 9 8 ( 1 9 ) 9 . 2 0 r 3 . 8 7 ( 2 8 ) * 1 x 8 , m e a s u r e d 1 1 . 1 5 r 0 . 6 1 ( 5 ) 1 . 2 5 r 0 . 6 1 ( 8 ) ' 5 1 . 6 1 r 0 . 4 5 ( 5 ) 1 . 5 4 r 0 . 7 5 ( 8 ) * I n c r e a s e a b o v e 0 0 4 O b a s e l i n e 5 0 . 1 6 r 0 . 3 5 ( 5 ) 0 ( 8 ) 1 2 0 . 2 8 r 0 . 4 4 ( 5 ) 0 ( 8 ) V a l u e s - m e a n f S D , ( n ) - n u m b e r o f s a m p l e s , * - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l v a l u e ( p < 0 . 0 5 ) , # - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m b a s e l i n e ( p < 0 . 0 5 ) . 3 3 8 F i g u r e 8 2 . T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 3 . 0 p M P M A . * - c o n t r o l a n d a f f e c t e d g r o u p s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t , ( p < 0 . 0 5 ) . F i g u r e 8 3 . I n c r e a s e i n T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) a b o v e t h e b a s e l i n e i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 3 . 0 p M P M A . * - c o n t r o l a n d a f f e c t e d g r o u p s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t , ( p < 0 . 0 5 ) . ] r l I I T T I I I ) I l m I / I g m ( E B X I T j I T T T T T I 7 1 1 1 1 I I I I I I I I T I T T I T I I I I I I I T ) l m I / g n ( Z B T I I I I T T T T x I T I T I I I T m I T I I I ] 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 J 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4 1 2 1 8 8 . 8 8 . ? 8 . 6 8 . 5 8 . 4 9 . 3 8 . 2 3 3 9 { F I T T I T T T I I T T I I l I T T T T T T T Y r I r T T T T T T T T I r T I l l l r l ‘ I T I I r I T I I T I I T U T - * - C o n t r o l ' w ' A f f e c t e d l L l L L l l l l l l L l l l l l l l l l L L L J l l l L l L l l l l ' l l l l ‘ l l l l l l l l J l l l l l l l l l l l 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 8 1 1 1 2 T i m e ( m i n u t e s ) ' [ T i r r ‘ I T I T U [ T T T F I T I T T I I T r T I Y T T T I U I T I I T T T T I T T I I I I I I T I I I F I I T I I T I ’ - * - C o n t r o l ° ~ ° A f f e c t e d l l l l l L J L l l l L l l l l l l l l l l l l l l l l l l L l l l l L L J l l l l l l l l l l l L R I I I I I I I L I I 8 1 2 3 4 5 i 6 7 8 9 1 8 1 1 1 2 T i m e ( m i n u t e s ) 3 4 0 C a l c i u m I o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 C o n t r o l p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 1 5 o r 2 0 p M A 2 3 1 8 7 a g g r e g a t e d a n d p r o d u c e d l a r g e a m o u n t s o f T s z . A l t h o u g h 2 0 p M A 2 3 1 8 7 s t i m u l a t e d g r e a t e r T x 2 p r o d u c t i o n t h a n 1 5 p M A 2 3 1 8 7 , t h e r e s p o n s e s w e r e q u a l i t a t i v e l y s i m i l a r . B o t h t h e c o n c e n t r a t i o n s m e a s u r e d a n d t h e i n c r e a s e a b o v e b a s e l i n e w e r e s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d a t o n e m i n u t e a n d h a d f u r t h e r i n c r e a s e d b y f i v e m i n u t e s . A f f e c t e d p l a t e l e t s d i d n o t a g g r e g a t e i n r e s p o n s e t o 1 5 o r 2 0 p M A 2 3 1 8 7 . A l t h o u g h T x 2 p r o d u c t i o n b y a f f e c t e d p l a t e l e t s w a s s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d b y o n e m i n u t e , b o t h t h e c o n c e n t r a t i o n m e a s u r e d a n d t h e i n c r e a s e a b o v e b a s e l i n e w e r e s i g n i f i c a n t l y l e s s t h a n t h a t m e a s u r e d f o r t h e c o n t r o l g r o u p . A t f i v e m i n u t e s , t h e c o n c e n t r a t i o n m e a s u r e d a n d i n c r e a s e a b o v e b a s e l i n e w e r e l e s s t h a n t h a t m e a s u r e d a t o n e m i n u t e a n d w e r e n o t s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d o v e r t h e b a s e l i n e l e v e l . T h r o m b o x a n e B 2 p r o d u c t i o n b y a f f e c t e d p l a t e l e t s w a s s l i g h t l y g r e a t e r i n r e s p o n s e t o 2 0 p M A 2 3 1 8 7 t h a n 1 5 p M , b u t i t w a s s t i l l s i g n i f i c a n t l y l e s s t h a n t h a t o f c o n t r o l p l a t e l e t s . T h e s e r e s u l t s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e s 2 6 a n d 2 7 a n d F i g u r e s 8 4 , 8 5 , 8 6 a n d 8 7 . 3 4 1 T a b l e 2 6 . T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 5 p M A 2 3 1 8 7 . P o s t - A g o n i s t C o n t r o l A f f e c t e d ( m i n u t e s ) T s z ( n g / m l ) T s z ( n g / m l ) B a s e l i n e 0 1 . 3 1 r 0 . 9 8 ( 1 9 ) 9 . 2 0 r 3 . 8 7 ( 2 8 ) * ' 1 s z m e a s u r e d 1 1 7 9 . 9 0 r 3 4 . 1 1 ( 5 ) * 4 6 . 7 9 i 9 . 6 6 ( 8 ) " 5 3 0 6 . 5 5 r 1 6 5 . 7 0 ( 5 ) 1 " a 1 2 . 8 0 r 3 . 7 8 ( 8 ) * I n c r e a s e a b o v e 0 0 0 b a s e l i n e 1 1 7 8 . 1 9 : 3 2 . 7 8 ( 5 ) 1 " 4 0 . 6 1 i 9 . 0 8 ( 8 ) ” 5 3 0 4 . 9 0 : 1 1 6 5 . 0 1 ( 5 ) 1 9 6 . 6 2 r 3 . 3 3 ( 8 ) * V a l u e s - m e a n f S D , ( n ) - n u m b e r o f s a m p l e s , * - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l v a l u e ( p < 0 . 0 5 ) , # - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m b a s e l i n e ( p < 0 . 0 5 ) , @ - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m " 1 m i n u t e " ( p < 0 . 0 5 ) . 3 4 2 F i g u r e 8 4 . T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 5 p M A 2 3 1 8 7 . * = c o n t r o l a n d a f f e c t e d g r o u p s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t , ( p < 0 . 0 5 ) . F i g u r e 8 5 . I n c r e a s e i n T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) a b o v e t h e b a s e l i n e i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 5 p M A 2 3 1 8 7 . * - c o n t r o l a n d a f f e c t e d g r o u p s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t , ( p < 0 . 0 5 ) . 1 1 3 ! 3 ' U 1 1 1 1 l 1 _ _ ; . ~ . e . ° C A o f n f t e r c o t l e d ‘ 1 1 1 ) l m / g n ( 2 B x T ) l m / g m ( 2 B x T 1 2 i T m e 3 ( m i n u t e s ) - ' + e - ' C A o f n f t e r c o t l e d T i m e ( m i n u t e s ) 4 8 8 3 8 8 2 8 8 1 8 8 4 8 8 3 8 8 2 8 8 1 8 8 3 4 3 A “ L 3 4 4 T a b l e 2 7 . T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 2 0 p M A 2 3 1 8 7 . P o s t — A g o n i s t C o n t r o l A f f e c t e d ( m i n u t e s ) T s z ( n g / m l ) T s z ( n g / m l ) B a s e l i n e 0 1 . 3 1 r 0 . 9 8 ( 1 9 ) 9 . 2 0 r 3 . 8 7 ( 2 8 ) * T x 2 m e a s u r e d 1 2 5 1 . 0 0 : 1 1 0 . 5 5 ( 7 ) ' 6 8 . 5 9 : 3 0 . 3 0 ( 1 2 ) * * 5 4 3 7 . 7 0 1 8 7 . 4 1 ( 8 ) * 9 . 1 9 . 1 8 i 8 . 9 6 ( 1 2 ) * I n c r e a s e a b o v e 0 0 0 b a s e l i n e 1 2 4 9 . 4 0 r 1 0 9 . 7 9 ( 7 ) ' 5 9 . 6 4 i 2 8 . 9 5 ( 1 2 ) * * 5 4 3 6 . 2 9 1 8 6 . 9 2 ( 7 ) " 1 0 . 3 0 s 7 . 4 8 ( 1 2 ) * V a l u e s - m e a n f S D , ( n ) - n u m b e r o f s a m p l e s , * - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l v a l u e ( p < 0 . 0 5 ) , # - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m b a s e l i n e ( p < 0 . 0 5 ) , @ - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m ” 1 m i n u t e " ( p < 0 . 0 5 ) . 3 4 5 F i g u r e 8 6 . T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 2 0 p M A 2 3 1 8 7 . * - c o n t r o l a n d a f f e c t e d g r o u p s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t , ( p < 0 . 0 5 ) . F i g u r e 8 7 . I n c r e a s e i n T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) a b o v e t h e b a s e l i n e i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 2 0 p M A 2 3 1 8 7 . * - c o n t r o l a n d a f f e c t e d g r o u p s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t , ( p < 0 . 0 5 ) . ) l m / g m ( Z E X T ) l m / g m ( Z B X T — “ 0 I — - C A o f n f t e r c o t l e d T i m e ( m i n u t e s ) - ' * J - ' C A o f n f t e r c o t l e d T i m e ( m i n u t e s ) 3 4 6 3 4 7 A r a c h i d o n i c A c i d I n v i e w o f t h e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s i n T s z p r o d u c t i o n b y c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y a r a n g e o f p h y s i o l o g i c a n d n o n - p h y s i o l o g i c a g o n i s t s , i t w a s l o g i c a l t o e x a m i n e T x 2 p r o d u c t i o n i n r e s p o n s e t o e x o g e n o u s a r a c h i d o n i c a c i d . A r a c h i d o n i c a c i d d o e s n o t a l w a y s i n d u c e a g g r e g a t i o n o f n o r m a l c a n i n e p l a t e l e t s . F o r t h i s s t u d y , c o n c e n t r a t i o n s o f a r a c h i d o n i c a c i d w h i c h i n d u c e d a g g r e g a t i o n o f n o r m a l h u m a n p l a t e l e t r i c h p l a s m a w e r e s e l e c t e d a n d t e s t e d o n t h e c o n t r o l g r o u p o f t h r e e n o r m a l B a s s e t h o u n d s a n d o n e n o r m a l L a b r a d o r x H u s k y . O n e o f t h e c o n t r o l B a s s e t h o u n d s a g g r e g a t e d s t r o n g l y i n r e s p o n s e t o 1 . 0 m M a n d 0 . 7 5 m M a n d w e a k l y i n r e s p o n s e t o 0 . 5 m M a r a c h i d o n i c a c i d . P l a t e l e t s o f t h e o t h e r c o n t r o l s a n d a l l a f f e c t e d d o g s c h a n g e d s h a p e , b u t d i d n o t a g g r e g a t e i n r e s p o n s e t o t h e s e c o n c e n t r a t i o n s o f a r a c h i d o n i c a c i d . B o t h c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s p r o d u c e d v e r y l a r g e q u a n t i t i e s o f T s z i n r e s p o n s e t o 0 . 5 a n d 1 . 0 m M a r a c h i d o n i c a c i d , w i t h g r e a t e r q u a n t i t i e s p r o d u c e d i n r e s p o n s e t o 1 . 0 m M a r a c h i d o n i c a c i d . T h e r e w a s n o r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e o c c u r r e n c e o f a g g r e g a t i o n a n d t h e a m o u n t o f T x 2 p r o d u c e d . N e i t h e r t h e l e v e l m e a s u r e d o r t h e i n c r e a s e a b o v e b a s e l i n e d i f f e r e d s i g n i f i c a n t l y b e t w e e n t h e t w o g r o u p s a t e i t h e r o n e o r f i v e m i n u t e s . W i t h i n b o t h g r o u p s , t h e T x 2 w a s s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d b y o n e m i n u t e a n d f u r t h e r i n c r e a s e d b y f i v e m i n u t e s . T h e s e r e s u l t s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e s 2 8 a n d 2 9 a n d F i g u r e s 8 8 , 8 9 , 9 0 a n d 9 1 . 3 4 8 T a b l e 2 8 . T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 0 . 5 m M a r a c h i d o n i c a c i d . P o s t - A g o n i s t C o n t r o l A f f e c t e d ( m i n u t e s ) T s z ( n g / m l ) T s z ( n g / m l ) B a s e l i n e 0 1 . 3 1 1 0 . 9 8 ( 1 9 ) 9 . 2 0 1 3 . 8 7 ( 2 8 ) * 1 s z m e a s u r e d 1 5 4 6 . 8 0 1 1 3 5 . 6 6 ( 4 ) ' 5 1 4 . 1 5 1 8 4 . 1 2 ( 4 ) ' 5 8 2 9 . 1 4 1 2 0 7 . 7 0 ( 4 ) ” 9 8 5 9 . 0 7 1 1 1 0 . 2 3 ( 4 ) 1 " g I n c r e a s e a b o v e 0 0 0 b a s e l i n e 1 5 4 6 . 1 3 1 1 3 5 . 3 9 ( 4 ) 1 " 5 0 5 . 1 2 1 8 5 . 7 6 ( 4 ) ' 5 8 2 8 . 4 8 1 2 0 7 . 4 0 ( 4 ) m 8 5 0 . 0 4 1 1 1 1 . 5 5 ( 4 ) " V a l u e s - m e a n i S D , ( n ) - n u m b e r o f s a m p l e s , * - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l v a l u e ( p < 0 . 0 5 ) , # - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m b a s e l i n e ( p < 0 . 0 5 ) , @ - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m " 1 m i n u t e ” ( p < 0 . 0 5 ) . 3 4 9 F i g u r e 8 8 . T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 0 . 5 m M a r a c h i d o n i c a c i d . * - c o n t r o l a n d a f f e c t e d g r o u p s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t , ( p < 0 . 0 5 ) . F i g u r e 8 9 . I n c r e a s e i n T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) a b o v e t h e b a s e l i n e i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 0 . 5 m M a r a c h i d o n i c a c i d . * - c o n t r o l a n d a f f e c t e d g r o u p s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t , ( p < 0 . 0 5 ) . 1 I I I I 1 I I I I 1 T fl T 0 0 T T m 1 I I 0 0 I H I N 0 0 1 I I I I 1 O I 0 I 0 I I I 1 I 0 0 I U I I 1 I 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 A 0 1 0 I I I - 1 0 I 0 I I 1 1 1 1 1 1 M 1 I 1 0 0 I N T H 0 0 I I 1 I I I I 1 0 r 1 1 1 1 1 7 1 1 1 r W 1 1 ] 1 1 1 1 1 1 T 1 1 ' 1 ) l m / g n 1 ( Z 1 1 1 1 1 B T x T » I T 5 T 1 0 0 - 4 0 0 0 T T T I 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 - w 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 [ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ” 1 T i m e ( m i n u t e s ) p a 0 0 2 8 8 U I O \ \ 1 ( D 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 8 8 p . — * * ~ C o n t r o l A f f e c t e d b a s 4 q d T i m e ( m i n u t e s ) T x B Z ( n g / m l ) 1 1 8 8 1 8 8 8 ~ 0 — . 0 . - 1 C o n t r o l A f f e c t e d - _ A _ . A - v — ‘ — ( 3 5 0 3 5 1 T a b l e 2 9 . T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 . 0 m M a r a c h i d o n i c a c i d . P o s t - A g o n i s t C o n t r o l A f f e c t e d ( m i n u t e s ) T s z ( n g / m l ) T s z ( n g / m l ) B a s e l i n e 0 1 . 3 1 1 0 . 9 8 ( 1 9 ) 9 . 2 0 1 3 . 8 7 ( 2 8 ) * T s z m e a s u r e d 1 8 1 5 . 2 5 1 1 7 2 . 4 3 ( 4 ) * 7 7 9 . 1 3 1 5 5 . 1 6 ( 4 ) ' 5 1 0 6 0 . 5 5 1 2 5 3 . 4 9 ( 4 ) » 1 0 2 2 . 6 1 1 1 0 8 . 7 3 ( 4 ) “ I n c r e a s e a b o v e 0 O 0 b a s e l i n e 1 8 1 4 . 5 9 1 1 7 2 . 1 2 ( 4 ) 1 " 7 7 0 . 1 0 1 5 5 . 6 7 ( 4 ) ' 5 1 0 5 9 . 8 9 1 2 5 3 . 2 0 ( 4 ) * 1 0 1 3 . 7 5 1 1 0 9 . 7 3 ( 4 ) ” V a l u e s - m e a n f S D , ( n ) - n u m b e r o f s a m p l e s , * - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l v a l u e ( p < 0 . 0 5 ) , # - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m b a s e l i n e ( p < 0 . 0 5 ) , @ - s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m " 1 m i n u t e " ( p < 0 . 0 5 ) . F r i i g c r u h e p l 9 a 0 s . m a T s s t z i m u c l o a n n t c e e d t b a r y n t 1 i . o 0 n ( M g a / r m a m l ) c h i i d n o n c i o c n t a r c o i l d . a n d a f f e c t e d p l a t e l e t 3 5 2 * - c o n t r o l a n d a f f e c t e d g r o u p s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t , ( p < 0 . 0 5 ) . F i g u r e 9 1 . I n c r e a s e i n T s z c o n c e n t r a t i o n ( n g / m l ) a b o v e t h e b a s e l i n e i n c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i m u l a t e d b y 1 . 0 m M a r a c h i d o n i c a c i d . * - c o n t r o l a n d a f f e c t e d g r o u p s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t , ( p < 0 . 0 5 ) . ) l m / g n ( 2 B x T ) 1 m / g m ( Z B x T 3 5 3 T i m e ( m i n u t e s 2 ) 3 5 4 D I S C U S S I O N T h e r e a r e d r a m a t i c d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e c o n t r o l a n d a f f e c t e d g r o u p s i n t h e a m o u n t o f T x 2 p r o d u c e d a n d t h e p a t t e r n o f p r o d u c t i o n . A l t h o u g h t h e m e a s u r e m e n t o f T s z d o e s n o t g i v e a l o t o f i n f o r m a t i o n o n t h e k i n e t i c s o f T x A 2 p r o d u c t i o n , t h e r e s u l t s s u g g e s t t h a t a f f e c t e d p l a t e l e t s a r e c a p a b l e o f m o r e r a p i d , a n d g r e a t e r , T x 2 p r o d u c t i o n t h a n c o n t r o l s i n r e s p o n s e t o c e r t a i n s t i m u l i . T h e b a s e l i n e T s z c o n c e n t r a t i o n i n a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a w a s c o n s i s t e n t l y a n d s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t o f c o n t r o l s . I n i t i a l l y , f o r t w o r e a s o n s , t h i s w a s t h o u g h t t o b e a r e f l e c t i o n o f i n c r e a s e d s e n s i t i v i t y t o a c t i v a t i o n i n d u c e d b y s t i r r i n g . F i r s t l y , e x p e r i e n c e w i t h a f f e c t e d p l a t e l e t s h a s i n d i c a t e d t h a t , a l t h o u g h t h e y d o n o t a g g r e g a t e n o r m a l l y , t h e y a r e v e r y s u s c e p t i b l e t o s p o n t a n e o u s s h a p e c h a n g e w h e n s t i r r e d i n t h e a g g r e g o m e t e r c u v e t t e . P r e s u m a b l y , t h i s r e f l e c t s s p o n t a n e o u s a c t i v a t i o n i n d u c e d b y s t i r r i n g . T h i s o c c u r s o c c a s i o n a l l y , b u t m u c h l e s s f r e q u e n t l y , i n c o n t r o l p l a t e l e t s . I n b o t h g r o u p s , g e n t l e h a n d l i n g o f p l a t e l e t s i s e s s e n t i a l t o m i n i m i z e t h i s p r o b l e m . S e c o n d l y , t h e b a s e l i n e c o n c e n t r a t i o n s m e a s u r e d w h e n t h e p l a t e l e t r i c h p l a s m a w a s s t i r r e d i n t h e P I C A a g g r e g o m e t e r w e r e h i g h e r t h a n t h o s e s t i r r e d i n t h e L u m i - a g g r e g o m e t e r . A l t h o u g h t h e s e a r e s i m i l a r i n s t r u m e n t s f r o m t h e s a m e m a n u f a c t u r e r , s e t a t t h e s a m e s t i r b a r s p e e d ( 9 0 0 r p m ) a n d u s i n g t h e s a m e c u v e t t e s a n d s t i r b a r s , p r e v i o u s e x p e r i e n c e w i t h t h e s e i n s t r u m e n t s s u g g e s t s t h a t p l a t e l e t s s t i m u l a t e d w i t h a t h r e s h o l d c o n c e n t r a t i o n o f a g o n i s t a r e m o r e l i k e l y t o a g g r e g a t e i n t h e P I C A t h a n i n t h e L u m i - a g g r e g o m e t e r . T h i s m a y i n d i c a t e t h a t t h e 3 5 5 a c t u a l s t i r s p e e d d i f f e r s s l i g h t l y f r o m t h e t h e o r e t i c a l s e t t i n g , b e i n g r e l a t i v e l y s l i g h t l y f a s t e r i n t h e P I C A . W h e n r e s t i n g c o n c e n t r a t i o n s o f T s z i n n o n - s t i r r e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a w e r e m e a s u r e d a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d a t 3 7 ° C , t h e y w e r e f o u n d t o n o t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y f r o m t h o s e m e a s u r e d a f t e r s t i r r i n g f o r 0 . 5 , 5 . 5 o r 1 2 . 5 m i n u t e s . T h r o m b o x a n e B 2 p r o d u c t i o n a f t e r s t i r r i n g i n t h e a b s e n c e o f a n a g o n i s t w a s i n v e s t i g a t e d t o e l i m i n a t e s t i r r i n g a l o n e a s t h e s o u r c e o f t h e g r e a t e r T s z p r o d u c t i o n b y a f f e c t e d p l a t e l e t s i n r e s p o n s e t o s o m e a g o n i s t s . I t i s p o s s i b l e t h a t t h e h a n d l i n g o f a f f e c t e d p l a t e l e t s d u r i n g c o l l e c t i o n a n d p r e p a r a t i o n i s s u f f i c i e n t t o s t i m u l a t e T x 2 p r o d u c t i o n , m a k i n g i t i m p o s s i b l e t o m e a s u r e t r u e r e s t i n g T s z c o n c e n t r a t i o n s . I f t h i s i s s o , t h e r e m u s t b e a r e a s o n f o r t h e i n c r e a s e d s u s c e p t i b i l i t y t o a c t i v a t i o n i n d u c e d b y h a n d l i n g a n d s t i r r i n g . I t m i g h t r e f l e c t a n i n c r e a s e d s e n s i t i v i t y t o t h e t r a c e s o f t h e A D P r e l e a s e d i n h e m o l y s i s a n d a g e n t s s u c h a s P A F , e i c o s a n o i d s a n d b i o a m i n e s r e l e a s e d f r o m c o n t a m i n a t i n g l e u k o c y t e s . 3 3 2 W h e n p l a t e l e t s a r e g e l - f i l t e r e d , t h e r e i s c o n s i d e r a b l y m o r e m a n i p u l a t i o n , i n c l u d i n g c e n t r i f u g a t i o n a n d r e s u s p e n s i o n a n d i n c u b a t i o n w i t h p r o s t a g l a n d i n E 1 , t h a n w h e n p l a t e l e t s a r e p r e p a r e d i n p l a s m a . T h e T s z c o n c e n t r a t i o n s m e a s u r e d a f t e r 0 . 5 m i n u t e s t i r r i n g d i d n o t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y b e t w e e n c o n t r o l a n d a f f e c t e d g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s . T h i s p o s s i b l y i n d i c a t e s t h a t b o t h g r o u p s a r e s u s c e p t i b l e t o t h e p a r t i a l a c t i v a t i o n t h a t i s k n o w n t o o c c u r d u r i n g g e l - f i l t r a t i o n . T h i s a c t i v a t i o n i s u s u a l l y r e v e r s i b l e a n d p l a t e l e t s r e c o v e r f u l l y w h e n r e s t e d f o r 3 0 m i n u t e s a f t e r g e l - f i l t r a t i o n . 1 6 5 3 5 6 T h e h i g h e r b a s e l i n e c o n c e n t r a t i o n s o f T s z m e a s u r e d i n p l a t e l e t s i n b u f f e r c o m p a r e d t o p l a s m a m a y r e f l e c t i n c r e a s e d T x 2 p r o d u c t i o n b y p l a t e l e t s d u r i n g p r e p a r a t i o n o f g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s . H o w e v e r , i t m o r e l i k e l y i s a r e f l e c t i o n o f t h e d i f f e r e n t p r o t e i n c o n t e n t s o f t h e t w o m e d i a . T h e g e l - f i l t e r e d p l a t e l e t s w e r e i n a b u f f e r w h i c h c o n t a i n e d o n l y 0 . 3 g m / l O O m l b o v i n e s e r u m a l b u m i n , w h e r e a s n o r m a l c a n i n e p l a s m a c o n t a i n s 2 . 3 - 3 . 2 g m / l O O m l a l b u m i n . 1 1 8 A l b u m i n b i n d s s t r o n g l y t o T x A z a n d t h e h i g h e r l e v e l s m e a s u r e d i n b u f f e r a r e m o s t l i k e l y a r e f l e c t i o n o f d e c r e a s e d b i n d i n g t o a l b u m i n . 1 3 9 ' “ ° " 5 ° I n s p i t e o f t h e f a i l u r e o f a f f e c t e d p l a t e l e t s t o a g g r e g a t e i n r e s p o n s e t o 1 0 p M A D P , t h e y v e r y r a p i d l y p r o d u c e d l a r g e r a m o u n t s o f T s z t h a n c o n t r o l p l a t e l e t s . T h i s c o n t r a d i c t s c u r r e n t k n o w l e d g e w h i c h m a i n t a i n s t h a t T x A Q p r o d u c t i o n i n r e s p o n s e t o A D P i s s e c o n d a r y t o p r i m a r y a g g r e g a t i o n . S e c r e t i o n o f d e n s e g r a n u l e c o n t e n t s f r o m n o r m a l p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y A D P i s d e p e n d e n t u p o n a g g r e g a t i o n a n d t h e f o r m a t i o n o f T x A z , a n d i s a l m o s t c o m p l e t e l y i n h i b i t e d b y i n c u b a t i o n w i t h a s p i r i n . ° ° ' z ° ° I n a f f e c t e d p l a t e l e t s , A T P s e c r e t i o n w a s a l s o a s s u m e d t o b e d e p e n d e n t u p o n T x A z f o r m a t i o n b e c a u s e i t w a s a l m o s t c o m p l e t e l y i n h i b i t e d b y a s p i r i n . I t i s p r o b a b l e t h a t t h e r a p i d A T P r e l e a s e f r o m a f f e c t e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y A D P i s n o t a p r i m a r y d e f e c t , b u t i s s e c o n d a r y t o a b n o r m a l l y r a p i d T e r p r o d u c t i o n . T h e a b i l i t y o f a f f e c t e d p l a t e l e t s t o p r o d u c e T x A z i n t h e a b s e n c e o f a g g r e g a t i o n s u g g e s t s t h a t t h e d e f e c t i s r e l a t e d t o a b n o r m a l c o n t r o l o f T x A z p r o d u c t i o n , w i t h t h e r a p i d r e l e a s e o f d e n s e g r a n u l e A T P b e i n g a s e c o n d a r y e v e n t . s e c r e t i o n . 7 7 - 1 7 4 . 3 1 0 , 4 7 0 3 5 7 W h e n c o n t r o l p l a t e l e t s w e r e s t i m u l a t e d b y 0 . 1 o r 1 . 0 p M P A F , t h e y a g g r e g a t e d a n d s e c r e t e d d e n s e g r a n u l e A T P . A g g r e g a t i o n w a s n o t s i g n i f i c a n t l y i n h i b i t e d a n d A T P s e c r e t i o n o n l y p a r t i a l l y i n h i b i t e d b y i n c u b a t i o n w i t h a s p i r i n . T h i s i s c o m p a t i b l e w i t h P A F b e i n g a n a g o n i s t o f i n t e r m e d i a t e s t r e n g t h i n w h i c h T x A z a m p l i f i e s t h e r e s p o n s e o f p l a t e l e t s , b u t i s n o t e s s e n t i a l f o r s e c o n d a r y a g g r e g a t i o n a n d A f f e c t e d p l a t e l e t s a g g r e g a t e d m i n i m a l l y i n r e s p o n s e t o 1 . 0 p M P A F , b u t d i d r e l e a s e d e n s e g r a n u l e A T P . W h e n i n c u b a t e d w i t h a s p i r i n , d e n s e g r a n u l e A T P r e l e a s e w a s i n h i b i t e d t o a g r e a t e r e x t e n t t h a n i n c o n t r o l s . A f f e c t e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 0 . 1 p M P A F d i d n o t a g g r e g a t e o r r e l e a s e d e n s e g r a n u l e A T P . C o n t r o l p l a t e l e t s r a p i d l y p r o d u c e d T x 2 w h e n s t i m u l a t e d b y 0 . 1 o r 1 . 0 p M P A F , w i t h m o r e T x 2 b e i n g p r o d u c e d i n r e s p o n s e t o t h e h i g h e r c o n c e n t r a t i o n o f P A F . A f f e c t e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 1 . 0 p M P A F r a p i d l y p r o d u c e d a p p r o x i m a t e l y t h r e e t i m e s t h e a m o u n t o f T s z g e n e r a t e d b y c o n t r o l p l a t e l e t s , b u t w h e n s t i m u l a t e d b y 0 . 1 p M P A F , t h e y d i d n o t p r o d u c e a n y T s z . T h e p r o d u c t i o n o f T s z ‘ b y a f f e c t e d p l a t e l e t s c o r r e l a t e s w i t h t h e o c c u r r e n c e o f d e n s e g r a n u l e A T P s e c r e t i o n . I t i s p o s s i b l e t h a t r e l e a s e d T x A 2 p l a y s a m o r e i m p o r t a n t r o l e i n i n d u c t i o n o f d e n s e g r a n u l e A T P s e c r e t i o n i n a f f e c t e d p l a t e l e t s t h a n i n c o n t r o l s . A f f e c t e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y 1 . 0 p M P A F p r o d u c e d m o r e T s z t h a n c o n t r o l s , b u t A T P r e l e a s e w a s i n h i b i t e d t o a g r e a t e r d e g r e e b y i n c u b a t i o n w i t h a s p i r i n t h a n i n c o n t r o l p l a t e l e t s . H o w e v e r , f a i l u r e t o p r o d u c e T x 2 w h e n s t i m u l a t e d b y 0 . 1 p M P A F d o e s n o t e x p l a i n t h e c o m p l e t e f a i l u r e o f a f f e c t e d p l a t e l e t s t o s e c r e t e d e n s e 3 5 8 g r a n u l e A T P . C o n t r o l p l a t e l e t s i n c u b a t e d w i t h a s p i r i n s t i l l s e c r e t e d s o m e d e n s e g r a n u l e A T P i n t h e a b s e n c e o f T x A 2 p r o d u c t i o n . T h i s s u g g e s t s t w o p o s s i b l e a b n o r m a l i t i e s i n a f f e c t e d p l a t e l e t s . F i r s t l y , t h e r e m a y b e d e f e c t i v e c o n t r o l o f T x A . 2 p r o d u c t i o n w h i c h r e s u l t s i n i n c r e a s e d p r o d u c t i o n , o r f a i l u r e o f p r o d u c t i o n o f T x A z , d e p e n d i n g o n t h e s t i m u l u s . S e c o n d l y , t h e r e m a y b e f a i l u r e o f , o r a d e f e c t i n , t h e p a t h w a y t h a t m e d i a t e s T x A z - i n d e p e n d e n t d e n s e g r a n u l e s e c r e t i o n . A l t h o u g h n o t a l l c o n t r o l o r a f f e c t e d d o g s a g g r e g a t e d i n r e s p o n s e t o 0 . 0 5 U / m l t h r o m b i n , a g g r e g a t i o n w a s a s s o c i a t e d w i t h t h e p r o d u c t i o n o f T s z a n d f a i l u r e o f a g g r e g a t i o n w i t h l a c k o f p r o d u c t i o n o f T s z . T h i s w a s t o b e e x p e c t e d , a s l o w c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n s u c h a s 0 . 0 5 U / m l a r e w e a k a g o n i s t s a n d d e p e n d e n t o n T x A z p r o d u c t i o n a n d A D P r e l e a s e f o r a g g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n t o o c c u r . “ 1 A t t h e s l i g h t l y h i g h e r c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 1 U / m l , t h r o m b i n i s c o n s i d e r e d t o b e a n a g o n i s t o f i n t e r m e d i a t e s t r e n g t h . I t w a s f o u n d t h a t i n c u b a t i o n w i t h a s p i r i n r e d u c e d , b u t d i d n o t p r e v e n t , t h e r e s p o n s e s o f c o n t r o l p l a t e l e t s t o 0 . 1 U / m l t h r o m b i n . I n c o n t r o l p l a t e l e t s , T x 2 p r o d u c t i o n s t e a d i l y i n c r e a s e d f o r 1 0 m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 1 U / m l t h r o m b i n . A f f e c t e d p l a t e l e t s v a r i e d i n t h e i r a b i l i t y t o a g g r e g a t e i n r e s p o n s e t o 0 . 1 U / m l t h r o m b i n , b u t t h e r e w a s a s i g n i f i c a n t c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e q u a n t i t y o f T x 2 p r o d u c e d a n d t h e p e r c e n t a g g r e g a t i o n f i v e m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f t h r o m b i n . T h i s i s c o m p a t i b l e w i t h t h e c o m p l e t e i n h i b i t i o n o f a g g r e g a t i o n o f a f f e c t e d p l a t e l e t s i n r e s p o n s e t o 0 . 1 U / m l t h r o m b i n a n d s u g g e s t s t h a t T x A Q p l a y s c y c l o o x y g e n a s e i n h i b i t o r s . 1 2 7 , 2 3 3 , 3 4 1 3 5 9 a m u c h m o r e i m p o r t a n t r o l e i n t h e a c t i v a t i o n o f a f f e c t e d p l a t e l e t s b y t h r o m b i n t h a n i n c o n t r o l s . B o t h c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s a g g r e g a t e d a n d s e c r e t e d d e n s e g r a n u l e A T P i n r e s p o n s e t o 0 . 3 U / m l t h r o m b i n , a l t h o u g h t h e i n i t i a l r a t e o f a g g r e g a t i o n o f a f f e c t e d p l a t e l e t s w a s v e r y m u c h s l o w e r t h a n t h a t o f c o n t r o l s . I n c o n t r o l p l a t e l e t s , T s z p r o d u c t i o n s t e a d i l y i n c r e a s e d f o r 1 0 m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 3 U / m l t h r o m b i n . T h i s w a s s i m i l a r t o t h e i r r e s p o n s e t o 0 . 1 U / m l , a l t h o u g h q u a n t i t a t i v e l y g r e a t e r . A f f e c t e d p l a t e l e t s p r o d u c e d s i g n i f i c a n t l y m o r e T s z t h a n c o n t r o l s o n e a n d f i v e m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 3 U / m l t h r o m b i n . W h e n a f f e c t e d p l a t e l e t s w e r e i n c u b a t e d w i t h a s p i r i n , a g g r e g a t i o n w a s i n h i b i t e d m u c h m o r e s t r o n g l y t h a n i n c o n t r o l s a n d t h e r a t e o f a g g r e g a t i o n g r e a t l y d e c r e a s e d . T h i s a l s o s u g g e s t s t h a t T x A 2 p l a y s a m u c h m o r e i m p o r t a n t r o l e i n t h e a c t i v a t i o n o f a f f e c t e d p l a t e l e t s b y t h r o m b i n t h a n c o n t r o l s . I t s e e m s p r o b a b l e t h a t m u c h o f t h e r e s p o n s e s e e n i n a f f e c t e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y t h r o m b i n i s d u e t o T x A z , e v e n a t h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n t h a t a r e n o t d e p e n d e n t o n T x A z p r o d u c t i o n i n n o r m a l p l a t e l e t s . I t h a s b e e n r e p o r t e d p r e v i o u s l y t h a t a g g r e g a t i o n o f h u m a n a n d r a b b i t p l a t e l e t s b y t h e t u m o r - p r o m o t i n g p h o r b o l e s t e r s i s n o t i n h i b i t e d b y T h r o m b o x a n e B 2 p r o d u c t i o n b y p h o r b o l - e s t e r - s t i m u l a t e d p l a t e l e t s h a s b e e n r e p o r t e d t o b e n o t s i g n i f i c a n t o r v e r y s l i g h t a n d T x A z a c t i v i t y b y b i o a s s a y n o t d e t e c t a b l e . " 2 7 ' 1 7 2 ' 2 6 " ' 3 “ 1 B o t h c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s a g g r e g a t e d i r r e v e r s i b l y i n r e s p o n s e t o 3 . 0 p M P M A w i t h o u t p r o d u c i n g s i g n i f i c a n t 3 6 0 a m o u n t s o f T s z . W h i l e t h e l a c k o f p r o d u c t i o n b y t h e c o n t r o l g r o u p i s c o m p a t i b l e w i t h p u b l i s h e d f i n d i n g s , t h e r e a s o n f o r t h e s i g n i f i c a n t d e c r e a s e i n T x 2 p r o d u c t i o n b y t h e a f f e c t e d g r o u p i s n o t c l e a r . I t i s p o s s i b l e t h a t b i n d i n g t o p l a s m a a l b u m i n m a y d e c r e a s e t h e l e v e l s m e a s u r e d f i v e a n d 1 0 m i n u t e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f P M A , b u t t h e T s z c o n c e n t r a t i o n i n a f f e c t e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a s t i r r e d f o r 1 2 . 5 m i n u t e s d i d n o t d e c r e a s e . I t h a s b e e n r e p o r t e d t h a t t h e c o n v e r s i o n o f e x o g e n o u s l y a d d e d a r a c h i d o n a t e t o T s z i s i n h i b i t e d b y a 1 0 s e c o n d t o f i v e m i n u t e s p r e - i n c u b a t i o n w i t h P M A . m “ I n t h e s a m e s t u d y , b o t h a r a c h i d o n a t e r e l e a s e a n d T x 2 p r o d u c t i o n b y t h r o m b i n w e r e i n h i b i t e d b y p r e i n c u b a t i o n w i t h P M A . S i m i l a r l y , p r e i n c u b a t i o n w i t h P M A i n h i b i t e d T s z f o r m a t i o n b y m a x i m a l l y e f f e c t i v e d o s e s o f A D P , P A F a n d e p i n e p h r i n e . ” ” T h e p r e s e n c e o f P M A m a y i n t e r f e r e w i t h t h e T s z p r o d u c t i o n i n d u c e d b y s t i r r i n g i n a f f e c t e d p l a t e l e t s . A l t e r n a t i v e l y , i t i s p o s s i b l e t h a t P M A i n t e r f e r e s w i t h t h e T s z r a d i o i m m u n o a s s a y , b u t t h e l a c k o f i n h i b i t i o n o f T x 2 p r o d u c t i o n b y c o n t r o l g r o u p m a k e s t h i s s e e m l e s s l i k e l y . A t t h i s t i m e i s o n l y p o s s i b l e t o s p e c u l a t e t h a t P M A h a s a n o t y e t c l e a r l y i d e n t i f i e d e f f e c t o n T x 2 p r o d u c t i o n , a n d p o s s i b l y a r a c h i d o n a t e r e l e a s e , i n a f f e c t e d p l a t e l e t s a n d n o r m a l p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y a r a n g e o f o t h e r a g o n i s t s . C a l c i u m i o n o p h o r e s s u c h a s A 2 3 1 8 7 a r e a b l e t o c r o s s t h e p l a s m a m e m b r a n e a n d d i r e c t l y m o b i l i z e C a 9 + : f r o m i n t r a c e l l u l a r s t o r e s t o i n c r e a s e t h e i n t r a c y t o p l a s m i c C a fl ' c o n c e n t r a t i o n a n d a c t i v a t e p h o s p h o l i p a s e A 2 . T h e r e l e a s e d a r a c h i d o n i c a c i d i s m e t a b o l i z e d t o 3 6 1 e n d o p e r o x i d e s a n d T X A Q w h i c h a c t i v a t e p h o s p h o l i p a s e C a n d s t i m u l a t e p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s . 2 7 " " 2 ° 1 " ' 1 3 C o n t r o l p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y A 2 3 1 8 7 g e n e r a t e d l a r g e a m o u n t s o f T s z , a s h a s b e e n r e p o r t e d f o r h u m a n p l a t e l e t s . ” ” A l t h o u g h t h e a m o u n t o f T s z g e n e r a t e d b y a f f e c t e d p l a t e l e t s a t o n e m i n u t e w a s q u i t e l a r g e r e l a t i v e t o t h a t g e n e r a t e d b y s o m e a g o n i s t s , i t w a s s i g n i f i c a n t l y l e s s t h a n t h a t o f t h e c o n t r o l p l a t e l e t s . B y f i v e m i n u t e s , t h e T s z c o n c e n t r a t i o n m e a s u r e d w a s n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t t o t h e b a s e l i n e c o n c e n t r a t i o n . A l b u m i n h a s b e e n s h o w n t o b i n d t o T x A z i n p l a s m a a n d p r o l o n g i t s T % t o u p t o t h r e e m i n u t e s , b u t a s T x 2 h a s b e e n s h o w n t o b e s t a b l e i n p l a s m a , i t i s d i f f i c u l t t o u n d e r s t a n d w h y l e s s T s z ‘ w a s d e t e c t e d a t f i v e t h a n a t o n e m i n u t e . 1 ° 9 ' “ 3 " ° ° I t i s p o s s i b l e t h a t A 2 3 1 8 7 s t i m u l a t e s a n e x t r e m e l y s h o r t - l i v e d b u r s t o f T x A z g e n e r a t i o n i n a f f e c t e d p l a t e l e t s c o m p a r e d t o c o n t r o l s . I n t h e a b s e n c e o f c o n t i n u e d T x A z p r o d u c t i o n , t h e b i n d i n g o f T x A z t o a l b u m i n b e t w e e n o n e a n d f i v e m i n u t e s m a y h a v e e x c e e d e d p r o d u c t i o n , c a u s i n g a d e c r e a s e i n t h e a m o u n t m e a s u r e d a t f i v e m i n u t e s r e l a t i v e t o o n e m i n u t e . A l s o , t h e c o n t r i b u t i o n o f a g g r e g a t i o n - d e p e n d e n t p o s i t i v e f e e d b a c k o n T s z p r o d u c t i o n i n c o n t r o l p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y A 2 3 1 8 7 i s n o t k n o w n a n d m a y e x p l a i n a t l e a s t s o m e o f t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o g r o u p s . A d e c r e a s e i n t h e T s z c o n c e n t r a t i o n m e a s u r e d h a s b e e n r e p o r t e d u n d e r c o n d i t i o n s i n w h i c h t h e r e a c t i o n w a s q u e n c h e d w i t h c i t r i c a c i d . 1 3 9 I t w a s p r o p o s e d t h a t a n e a r l y ” b u r s t " ( < 6 0 s e c o n d s ) o f T s z f o r m a t i o n a f t e r t h e a d d i t i o n o f p r o s t a g l a n d i n H z t o p l a t e l e t r i c h p l a s m a c o u l d b e a c c o u n t e d f o r b y t h e r a p i d h y d r o l y s i s o f t h e T x A 2 p r e s e n t t o T x z ' b y t h e a d d i t i o n o f a c i d b e f o r e t h e T x A 2 c o u l d b i n d t o t h e p r o t e i n p r e s e n t . S a m p l e s c o l l e c t e d 3 6 2 a f t e r 6 0 s e c o n d s c o n t a i n e d l e s s T x 2 b e c a u s e m u c h o f t h e I a n , h a d b o u n d t o a l b u m i n a n d t h e T x 2 p r e s e n t c o u l d b e a c c o u n t e d f o r b y t h e h y d r o l y s i s o f t h e u n b o u n d T x A z i n t h e p l a s m a . B o t h c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y a r a c h i d o n i c a c i d g e n e r a t e d v e r y l a r g e a m o u n t s o f T s z i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r , s i m i l a r t o t h a t d e s c r i b e d f o r h u m a n p l a t e l e t s . 1 ° ° " ' 6 0 T h e a b i l i t y o f p l a t e l e t s t o c o n v e r t e x o g e n o u s a r a c h i d o n i c a c i d t o T s z i n d i c a t e s t h a t t h e e n z y m e s i n v o l v e d a r e p r e s e n t a n d f u n c t i o n a l . T h e g e n e r a t i o n b y a f f e c t e d p l a t e l e t s o f a s i m i l a r q u a n t i t y o f T s z f r o m a r a c h i d o n i c a c i d a t a s i m i l a r r a t e t o c o n t r o l s , i n d i c a t e s t h a t t h e y h a v e f u n c t i o n a l p r o s t a g l a n d i n e n d o p e r o x i d e s y n t h a s e a n d t h r o m b o x a n e A s y n t h a s e e n z y m e s y s t e m s . T h e o n l y a g o n i s t u s e d i n t h i s s t u d y t h a t w a s a b l e t o s t i m u l a t e s i m i l a r T s z g e n e r a t i o n i n b o t h c o n t r o l a n d a f f e c t e d g r o u p s w a s e x o g e n o u s a r a c h i d o n i c a c i d . T h r o m b o x a n e B z g e n e r a t i o n i n r e s p o n s e t o a l l o t h e r a g o n i s t s u s e d w a s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t b e t w e e n t h e t w o g r o u p s . T h u s , i t i s p o s s i b l e t h a t t h e d e f e c t o c c u r s b e f o r e t h e c o n v e r s i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d t o t h r o m b o x a n e . P o s s i b l e s i t e s f o r a d e f e c t i n c l u d e a r a c h i d o n i c a c i d m o b i l i z a t i o n f r o m m e m b r a n e p h o s p h o l i p i d s , p h o s p h o l i p a s e A 2 , a n d C a 2 + m o b i l i z a t i o n . T h e r a n g e o f a b n o r m a l T s z r e s p o n s e s o f a f f e c t e d p l a t e l e t s i s u n i q u e a n d c a n n o t b e e x p l a i n e d b y c u r r e n t k n o w l e d g e o f t h e a r e a . A l t h o u g h t h e m a j o r r o u t e s o f a r a c h i d o n i c a c i d r e l e a s e f r o m m e m b r a n e p h o s p h o l i p i d s a r e k n o w n , r e l a t i v e l y l i t t l e i s k n o w n a b o u t t h e c o n t r o l o f t h e s e a n d 3 6 3 t h e p r e c e d i n g e v e n t s . T h e r e i s g r o w i n g e v i d e n c e f o r a r o l e f o r p r o t e i n k i n a s e C i n t h e r e g u l a t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d m e t a b o l i t e s . I t h a s b e e n s h o w n t h a t a c t i v a t o r s o f p r o t e i n k i n a s e C i n h i b i t t h e l y s o a c y l t r a n s f e r a s e w h i c h i n c r e a s e s t h e a v a i l a b i l i t y o f a r a c h i d o n i c “ 0 ' 3 8 2 H o w e v e r , i t h a s a l s o b e e n a c i d f o r e i c o s a n o i d s y n t h e s i s . d e m o n s t r a t e d t h a t s y n t h e t i c d i a c y l g l y c e r o l s a r e a b l e t o i n h i b i t l y s o p h o s p h a t i d a t e a c y l t r a n s f e r a s e a c t i v i t y i n m a c r o p h a g e s b y a d i r e c t i n t e r a c t i o n i n d e p e n d e n t o f p r o t e i n k i n a s e C . 1 6 1 I f t h e l y s o a c y l t r a n s f e r a s e i n m a c r o p h a g e s i s i n h i b i t e d b y p r e - i n c u b a t i o n w i t h m e r t h i o l a t e , i n c o r p o r a t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d i n t o p h o s p h o l i p i d s i s i n h i b i t e d a n d t h e p r o d u c t i o n o f p r o s t a n o i d s g r e a t l y i n c r e a s e d i n r e s p o n s e t o p h a g o c y t i c s t i m u l i f 1 6 0 I n p l a t e l e t s , a r a c h i d o n i c a c i d l i b e r a t i o n b y A 2 3 1 8 7 i s p o t e n t i a t e d b y p r e i n c u b a t i o n w i t h s t i m u l a t o r s o f p r o t e i n k i n a s e C , a n e f f e c t c o i n c i d e n t w i t h t h e s l o w p h o s p h o r y l a t i o n o f f i v e p r o t e i n s w i t h m o l e c u l a r w e i g h t s o f 6 5 , 4 1 , 3 5 - 3 6 a n d 2 1 k D a . ” ' “ 1 7 2 T h i s p o t e n t i a t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d r e l e a s e b y P M A a p p e a r e d t o b e d u e t o p h o s p h o l i p a s e A 2 a c t i v a t i o n . I f t h e 6 5 k D a p r o t e i n t h a t i s n o t p h o s p h o r y l a t e d n o r m a l l y i n a f f e c t e d p l a t e l e t s i s t h e s a m e 6 5 k D a p r o t e i n a s t h a t d e s c r i b e d a b o v e , i t m a y b e l i n k e d t o a b n o r m a l r e g u l a t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d l i b e r a t i o n . I t i s g e n e r a l l y a s s u m e d t h a t p h o s p h o l i p a s e A 2 c a n b e a c t i v a t e d b y a n i n c r e a s e i n C a 2 + a l o n e , i f t h e i n c r e a s e i s s u f f i c i e n t l y l a r g e . ” 7 E v i d e n c e t h a t a n i n c r e a s e i n C a m ' a l o n e m a y b e s u f f i c i e n t t o a c t i v a t e p h o s p h o l i p a s e A 2 i s p r o v i d e d b y c a l c i u m i o n o p h o r e s s u c h a s A 2 3 1 8 7 w h i c h c a n r e l e a s e a r a c h i d o n i c a c i d f r o m m e m b r a n e p h o s p h o l i p i d s e v e n w h e n p h o s p h o l i p a s e C i s n o t a c t i v a t e d . " 1 3 A l t h o u g h p h o s p h o l i p a s e A . 2 r e q u i r e s 3 6 4 C a m ' f o r a c t i v i t y , i t s r o l e i n t h e r e g u l a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e A 2 i s n o t c l e a r . P r o t e i n k i n a s e C m a y p l a y a n i n h i b i t o r y r o l e i n C a 2 + m o b i l i z a t i o n b y p h o s p h o r y l a t i n g a n d a c t i v a t i n g t h e 5 ' - p h o s p h o m o n o e s t e r a s e w h i c h i n a c t i v a t e s i n o s i t o l 1 , 4 , 5 - t r i s p h o s p h a t e . 9 7 T h e r e i s a l s o e v i d e n c e t h a t p h o s p h o l i p a s e A 2 i n h u m a n p l a t e l e t s i s u n d e r t h e c o n t r o l o f G T P - b i n d i n g p r o t e i n s t h a t a r e d i s t i n c t f r o m t h o s e i n v o l v e d i n t h e r e g u l a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e 0 . 1 5 2 ' 3 ‘ 8 A s p r o t e i n k i n a s e C h a s b e e n s h o w n t o a f f e c t t h e s t a t e o f a s s o c i a t i o n o f G - p r o t e i n o l i g o m e r s a n d t h e f u n c t i o n o f a - s u b u n i t s , t h i s i s a n o t h e r p o s s i b l e w a y i n w h i c h p r o t e i n k i n a s e C m a y i n f l u e n c e t h e r e l e a s e o f a r a c h i d o n i c 8 0 1 d . 1 7 3 , 2 4 4 T h e H a l / H + e x c h a n g e r m a y a l s o p l a y a r o l e i n a r a c h i d o n i c a c i d r e l e a s e , p a r t i c u l a r l y i n r e s p o n s e t o w e a k a g o n i s t s . " 7 2 " ‘ 7 3 " 7 6 P h o s p h o l i p a s e A 2 h a s a n a l k a l i n e p H o p t i m u m a n d t h e s m a l l a l k a l i n i z a t i o n o f t h e c y t o p l a s m t h a t o c c u r s w h e n t h e N a U G U ' e x c h a n g e r i s a c t i v a t e d m a y p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n a c t i v a t i o n b y w e a k a g o n i s t s , p o s s i b l y b y e n a b l i n g p h o s p h o l i p a s e A 2 t o f u n c t i o n a t l o w c o n c e n t r a t i o n s o f i n t r a p l a t e l e t C a f h f ° H o w e v e r , i t d o e s n o t a p p e a r t o p l a y a r o l e i n a c t i v a t i o n b y h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n . A g a i n , p r o t e i n k i n a s e C i s t h o u g h t t o h a v e a r e g u l a t o r y r o l e . A c t i v a t o r s o f p r o t e i n k i n a s e C i n d u c e a c c e l e r a t i o n o f N a n fl f ' e x c h a n g e a n d a n i n c r e a s e i n i n t r a c y t o p l a s m i c p H . ‘ 5 5 T h e r a n g e o f r e s p o n s e s o f a f f e c t e d p l a t e l e t s t o d i f f e r e n t s t i m u l i s u g g e s t s t h a t t h e m e c h a n i s m f o r t h e p r o d u c t i o n o f T s z i s i n t a c t , b u t 3 6 5 n o t u n d e r t h e n o r m a l c o n t r o l m e c h a n i s m s . W h e t h e r t h e d e f e c t i s a t t h e l e v e l o f l i b e r a t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d o r w h e t h e r i t i s s e c o n d a r y t o a n o t h e r d e f e c t h i g h e r u p i n t h e a c t i v a t i o n p r o c e s s c a n n o t b e a n s w e r e d b y t h i s s t u d y . F u r t h e r i n v e s t i g a t i o n o f t h i s a s p e c t o f t h e d e f e c t i n B a s s e t h o u n d h e r e d i t a r y t h r o m b o p a t h y p l a t e l e t s m a y p r o v i d e n e w i n s i g h t s i n t o t h e c o n t r o l o f e i c o s a n o i d p r o d u c t i o n i n n o r m a l p l a t e l e t s . C H A P T E R V I : S U M M A R Y A N D C O N C L U S I O N S A f f e c t e d p l a t e l e t s a g g r e g a t e d w h e n p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s w a s a b l e t o b e b y p a s s e d ( p h o r b o l e s t e r , h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n ) o r w h e n m e m b r a n e p r o p e r t i e s w e r e a l t e r e d b y a r e d u c i n g a g e n t , e n a b l i n g G P I I b - I I I a t o b i n d f i b r i n o g e n ( d i t h i o t h r e i t o l ) . P r i m a r y a g g r e g a t i o n o f a f f e c t e d p l a t e l e t s d i d n o t o c c u r i n r e s p o n s e t o a g o n i s t s o f w e a k ( A D P ) o r i n t e r m e d i a t e s t r e n g t h ( P A F ) w h i c h a r e f u l l y o r p a r t i a l l y d e p e n d e n t u p o n a c t i v a t i o n o f N a n fl f ' e x c h a n g e a n d g e n e r a t i o n o f a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s . P r i m a r y a g g r e g a t i o n a n d d e n s e g r a n u l e A T P r e l e a s e d i d n o t o c c u r i n r e s p o n s e t o t h e c a l c i u m i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 w h i c h i s d e p e n d e n t u p o n t h e f o r m a t i o n o f a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s f o r a c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e C a n d c o m p l e t e a g g r e g a t i o n . T h e f a i l u r e o f p r i m a r y a g g r e g a t i o n i n r e s p o n s e t o A D P a n d P A F w a s n o t a s s o c i a t e d w i t h a n i n a b i l i t y o f a f f e c t e d p l a t e l e t s t o s e c r e t e A T P o r g e n e r a t e T x A z . S e c r e t i o n o f A T P b y a f f e c t e d p l a t e l e t s w a s i n h i b i t e d b y p r e - t r e a t m e n t o f p l a t e l e t s w i t h t h e c y c l o o x y g e n a s e i n h i b i t o r a s p i r i n . S e c r e t i o n o f A T P f r o m a f f e c t e d p l a t e l e t s w a s m o r e s u s c e p t i b l e t o i n h i b i t i o n b y a s p i r i n f o r a l l a g o n i s t s w h i c h i n d u c e d s e c r e t i o n ( P A F , A D P , t h r o m b i n ) . T h r o m b i n - i n d u c e d a g g r e g a t i o n o f a f f e c t e d p l a t e l e t s w a s m u c h m o r e s e n s i t i v e t o i n h i b i t i o n b y a s p i r i n t h a n c o n t r o l p l a t e l e t s . T h e r e s p o n s e s o f a f f e c t e d p l a t e l e t s t o t h r o m b i n w e r e m o r e d e p e n d e n t o n t h e f o r m a t i o n o f a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i t e s t h a n c o n t r o l p l a t e l e t s . 3 6 6 3 6 7 A f f e c t e d p l a t e l e t s h a d s i m i l a r p h o s p h o r y l a t i o n p a t t e r n s o f t h e t w o m a j o r p r o t e i n s ( 2 0 a n d 4 7 k D a ) p h o s p h o r y l a t e d i n c o n t r o l p l a t e l e t s i n r e s p o n s e t o P A F , t h r o m b i n , p h o r b o l e s t e r a n d A 2 3 1 8 7 u n d e r n o n - a g g r e g a t i n g c o n d i t i o n s . P h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 k D a m y o s i n l i g h t c h a i n c o r r e l a t e d w e l l w i t h p l a t e l e t s h a p e c h a n g e i n b o t h g r o u p s , b u t t h e r e d i d n o t a p p e a r t o b e a n y c o n s i s t e n t r e l a t i o n s h i p b e t w e e n p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 a n d 4 7 k D a p r o t e i n s a n d a g g r e g a t i o n o r s e c r e t i o n o f d e n s e g r a n u l e c o n t e n t s . D e c r e a s e d p h o s p h o r y l a t i o n o f a 6 5 k D a b a n d i n a f f e c t e d p l a t e l e t s m a y r e p r e s e n t e i t h e r t h e a b s e n c e o f a p r o t e i n b a n d o r a n i n a b i l i t y o r d e c r e a s e d a b i l i t y t o p h o s p h o r y l a t e a p r o t e i n t h a t i s p r e s e n t . T h e i d e n t i t y a n d f u n c t i o n a l s i g n i f i c a n c e o f t h i s 6 5 k D a p r o t e i n a r e n o t k n o w n , b u t i t m a y b e o f m a j o r i m p o r t a n c e i n t h e p a t h o g e n e s i s o f t h i s d e f e c t . M e a s u r e m e n t o f T s z l e v e l s c o n f i r m e d t h a t a f f e c t e d p l a t e l e t s p r o d u c e T x A z i n r e s p o n s e t o m o s t a g o n i s t s . I n n o n - s t i r r e d a n d s t i r r e d p l a t e l e t r i c h p l a s m a , a f f e c t e d p l a t e l e t s h a d s i g n i f i c a n t l y h i g h e r T s z l e v e l s t h a n c o n t r o l p l a t e l e t s . A g o n i s t s w h i c h i n d u c e d d e n s e g r a n u l e A T P r e l e a s e f r o m a f f e c t e d p l a t e l e t s a l s o i n d u c e d s i g n i f i c a n t l y g r e a t e r T s z p r o d u c t i o n f r o m a f f e c t e d p l a t e l e t s t h a n c o n t r o l s ( A D P , 1 . 0 p M P A F , t h r o m b i n ) . W h e n s t i m u l a t e d b y a g o n i s t s w h i c h d i d n o t i n d u c e e i t h e r a g g r e g a t i o n o r A T P s e c r e t i o n , a f f e c t e d p l a t e l e t s p r o d u c e d n o T s z ( 0 . 1 p M P A F ) o r s i g n i f i c a n t l y l e s s T s z ( A 2 3 1 8 7 ) t h a n c o n t r o l p l a t e l e t s . W h e n a f f e c t e d p l a t e l e t s w e r e s t i m u l a t e d b y t h r o m b i n , a g g r e g a t i o n w a s a s s o c i a t e d w i t h T s z p r o d u c t i o n a n d t h e e x t e n t o f a g g r e g a t i o n w a s p r o p o r t i o n a l t o t h e a m o u n t o f T x 2 p r o d u c e d . T h e a m o u n t o f T s z p r o d u c e d b y c o n t r o l p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y t h r o m b i n w a s n o t r e l a t e d t o 3 6 8 t h e e x t e n t o f a g g r e g a t i o n . A r a c h i d o n i c a c i d w a s t h e o n l y a g o n i s t t o i n d u c e t h e p r o d u c t i o n o f s i m i l a r q u a n t i t i e s o f T x z ' b y b o t h g r o u p s o f p l a t e l e t s . T h r o m b o x a n e p r o d u c t i o n i n r e s p o n s e t o a r a c h i d o n i c a c i d w a s n o t r e l a t e d t o f a i l u r e o f a g g r e g a t i o n ( a f f e c t e d a n d m o s t c o n t r o l p l a t e l e t s ) o r o c c u r r e n c e o f a g g r e g a t i o n ( o n e c o n t r o l ) . N e i t h e r c o n t r o l o r a f f e c t e d p l a t e l e t s p r o d u c e d T s z i n r e s p o n s e t o s t i m u l a t i o n b y p h o r b o l e s t e r . T h e s e r e s u l t s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 3 0 . T a b l e 3 0 . S u m m a r y o f c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t a g g r e g a t i o n , d e n s e g r a n u l e A T P s e c r e t i o n , T s z g e n e r a t i o n a n d 2 0 a n d 4 7 k D a p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n ( c o n t r o l / a f f e c t e d ) . A D P P A F P A F T h r o m b i n T h r o m b i n A 2 3 1 8 7 P M A R e s p o n s e l O p M 0 . 1 p M 1 . 0 p M 0 . 1 0 / m l 0 . 3 0 / m l 2 0 p M 3 . 0 p M A g g r e g a t i o n + / - + / - + / i + / i + / + + / - + / + S e c r e t i o n + / + + / - + / + + / + + / + + / - + / + T s z + / + + + / - + / + + + / + + + / + + + + / + - / - 2 0 k D a P n - / - + / + * N D N D + / + + / + : + / , 4 7 k D a P n - / - + / + * N D N D + / + + / + ’ + / + + - e v e n t o c c u r s , - - e v e n t d o e s n o t o c c u r , 1 - e v e n t m a y o r m a y n o t o c c u r , N D - n o t d o n e . * - u n d e r p r o t e i n - f r e e c o n d i t i o n s , t h e e f f e c t i v e c o n c e n t r a t i o n o f P A F w a s a p p r o x i m a t e l y 1 . 0 p M ( s e e P a g e 2 9 0 ) . # - u n d e r p r o t e i n - f r e e c o n d i t i o n s , 1 . 0 p M A 2 3 1 8 7 w a s u s e d . 3 6 9 F r o m t h e s e r e s u l t s , t h e f o l l o w i n g c o n c l u s i o n s h a v e b e e n m a d e : 1 . A t l e a s t o n e p a t h w a y o f p l a t e l e t a c t i v a t i o n i s f u n c t i o n a l : t h e p a t h w a y ( s ) t h a t m e d i a t e a g g r e g a t i o n b y p h o r b o l e s t e r a n d h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n . 2 . T h e p a t h w a y ( s ) i n v o l v e d i n s i g n a l t r a n s m i s s i o n f r o m t h e p l a t e l e t p l a s m a m e m b r a n e t o t h e c e l l i n t e r i o r i s ( a r e ) e i t h e r d e f e c t i v e , u n a b l e t o b e c o n v e r t e d t o t h e n o r m a l s e q u e n c e o f c e l l u l a r e v e n t s o r n o t u n d e r t h e n o r m a l c o n t r o l m e c h a n i s m s . 3 . P h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 k D a m y o s i n l i g h t c h a i n c o r r e l a t e d w e l l w i t h p l a t e l e t s h a p e c h a n g e i n b o t h g r o u p s , b u t t h e r e w a s n o t a c o n s i s t e n t r e l a t i o n s h i p b e t w e e n p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 0 a n d 4 7 k D a p r o t e i n s a n d a g g r e g a t i o n o r s e c r e t i o n o f d e n s e g r a n u l e A T P . 4 . D e c r e a s e d p h o s p h o r y l a t i o n o f a n u n i d e n t i f i e d 6 5 k D a b a n d i n a f f e c t e d p l a t e l e t s i s o f u n k n o w n f u n c t i o n a l s i g n i f i c a n c e , b u t m a y b e o f m a j o r i m p o r t a n c e i n t h e p a t h o g e n e s i s o f t h e d e f e c t . 5 . T h e p r o d u c t i o n o f T x z ' b y a f f e c t e d p l a t e l e t s i n r e s p o n s e t o d i f f e r e n t a g o n i s t s s u g g e s t s t h a t t h e m e c h a n i s m f o r t h e p r o d u c t i o n o f T s z i s i n t a c t , b u t n o t u n d e r t h e n o r m a l c o n t r o l m e c h a n i s m s . 3 7 0 6 . T h e s i m i l a r p r o d u c t i o n o f T s z b y c o n t r o l a n d a f f e c t e d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y a r a c h i d o n i c a c i d s u g g e s t s t h a t i t i s t h e r e l e a s e o f a r a c h i d o n i c a c i d t h a t i s a b n o r m a l w h e n a f f e c t e d p l a t e l e t s a r e s t i m u l a t e d b y o t h e r a g o n i s t s . A h y p o t h e t i c a l m o d e l o f t h e d e f e c t i s i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 9 2 ( P a g e 3 7 3 ) . I t h a s b e e n c o n s t r u c t e d f r o m t h e r e s u l t s a v a i l a b l e a n d d o e s n o t e x p l a i n a l l t h e f i n d i n g s . I t i s p r o p o s e d t h a t : ( l ) t h e e f f i c i e n c y o f t h e s i g n a l t r a n s d u c t i o n f r o m t h e e x t e r n a l r e c e p t o r t h r o u g h t h e C p r e g u l a t o r y p r o t e i n a n d p h o s p h o l i p a s e C i s d e c r e a s e d ; a n d ( 2 ) t h e d e f e c t c a n b e b y p a s s e d t o s o m e e x t e n t b y a n i n c r e a s e i n t h e s t r e n g t h o f t h e a g o n i s t w h i c h c a n t h e n g e n e r a t e a s i g n a l t h a t i s a b l e t o b e t r a n s m i t t e d . T h e p u t a t i v e A D P r e c e p t o r i s a 1 0 0 k D a m e m b r a n e p r o t e i n w h i c h i s c l o s e l y a s s o c i a t e d w i t h G P I I b - I I I a . m “ ' I n t h e r e s t i n g p l a t e l e t , t h e A D P r e c e p t o r i n t e r f e r e s w i t h t h e b i n d i n g o f f i b r i n o g e n t o G P I I b - I I I a . T h e b i n d i n g o f A D P t o i t s r e c e p t o r i n d u c e s a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e t h a t p e r m i t s t h e b i n d i n g o f f i b r i n o g e n t o G P I I b - I I I a a n d i n d u c e s s h a p e c h a n g e t h a t i s n o t i n h i b i t e d b y t h e p r e s e n c e o f E D T A o r E G T A . “ “ ‘ I t i s p r o p o s e d t h a t w h e n A D P b i n d s t o i t s r e c e p t o r o n a f f e c t e d p l a t e l e t s , s h a p e c h a n g e a n d f i b r i n o g e n b i n d i n g o c c u r , b u t t h e a m o u n t o f T x A z g e n e r a t e d i s n o t s u f f i c i e n t t o a c t i v a t e p h o s p h o l i p a s e C . H o w e v e r , t h i s d o e s n o t e x p l a i n : ( 1 ) t h e f a i l u r e o f p r i m a r y a g g r e g a t i o n , u n l e s s a c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e C , o r a s u b s e q u e n t s t e p , i s e s s e n t i a l f o r p r i m a r y a g g r e g a t i o n ; ( 2 ) t h e a b n o r m a l l y r a p i d A T P s e c r e t i o n , e v e n i f t h e s e c r e t i o n i s m e d i a t e d b y a n i n f l u x o f C a a ' f r o m t h e e x t e r n a l m e d i u m 3 7 1 v i a t h e C a v ’ c h a n n e l t h a t i s p r e s u m e d t o b e c l o s e t o , b u t s e p a r a t e f r o m , G P l l b - l l l a ; ° " 3 9 ‘ a n d ( 3 ) t h e g r e a t e r g e n e r a t i o n o f T s z b y a f f e c t e d p l a t e l e t s u n l e s s , i n t h e a b s e n c e o f p h o s p h o l i p a s e C a c t i v a t i o n , t h e r e i s a l s o f a i l u r e o f a n e g a t i v e f e e d b a c k s t e p w h i c h w o u l d n o r m a l l y i n h i b i t T x A z g e n e r a t i o n . T h r o m b i n i s a s t r o n g p l a t e l e t a g o n i s t w h i c h i n d u c e s r a p i d r e l e a s e o f d e n s e g r a n u l e c o n t e n t s , i n c l u d i n g A D P . A t l o w c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n , p l a t e l e t a g g r e g a t i o n i s i n h i b i t e d b y p r e i n c u b a t i o n w i t h a h i g h a f f i n i t y a n a l o g u e o f A D P . “ “ A t h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n ( > 0 . 0 2 5 U / m l ) , a g g r e g a t i o n i s n o t i n h i b i t e d . A t t h e s e h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s , t h r o m b i n a l s o p r o t e o l y t i c a l l y d e g r a d e s t h e p u t a t i v e 1 0 0 k D a A D P r e c e p t o r a n d a l l o w s G P I I b - I l l a t o u n d e r g o t h e c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e w h i c h p e r m i t s f i b r i n o g e n b i n d i n g . T h e i n a b i l i t y o f a f f e c t e d p l a t e l e t s t o a g g r e g a t e i n r e s p o n s e t o l o w e r c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n c o u l d b e e x p l a i n e d b y f a i l u r e o f a c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e C . A t h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s , t h r o m b i n - i n d u c e d a g g r e g a t i o n m a y b e i n d u c e d b y a c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e C a n d / o r f i b r i n o g e n b i n d i n g i n d u c e d b y p r o t e o l y t i c c l e a v a g e o f t h e 1 0 0 k D a p r o t e i n . T h e g r e a t e r s e n s i t i v i t y o f a f f e c t e d p l a t e l e t s t o i n h i b i t i o n b y a s p i r i n i s n o t e x p l a i n e d . T h e f a i l u r e o f l o w c o n c e n t r a t i o n s o f P A F t o i n d u c e a n y r e s p o n s e e x c e p t s h a p e c h a n g e m a y b e c a u s e d b y a n i n a b i l i t y t o a c t i v a t e p h o s p h o l i p a s e C . H i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f P A F a r e a b l e t o a c t i v a t e p h o s p h o l i p a s e C , i n d u c i n g p h o s p h o r y l a t i o n o f p r o t e i n s , s e c r e t i o n a n d g e n e r a t i o n o f T s z . T h i s d o e s n o t e x p l a i n t h e f a i l u r e o f p r i m a r y 3 7 2 a g g r e g a t i o n . H o w e v e r , h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f P A F d i d c a u s e s o m e i n c r e a s e i n l i g h t t r a n s m i s s i o n i n t h e a g g r e g o m e t e r c u v e t t e . T h e a g g r e g a t i o n o f a f f e c t e d p l a t e l e t s b y t h e p h o r b o l e s t e r P M A w h i c h d i r e c t l y a c t i v a t e s p r o t e i n k i n a s e C s u p p o r t s t h e p r o p o s a l t h a t t h e d e f e c t p r e c e d e s t h e a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C . H o w e v e r , t h e m e a n s b y w h i c h a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C i n d u c e s a g g r e g a t i o n a r e n o t k n o w n . T h e c a l c i u m i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 r e l e a s e s C a y ' f r o m i n t r a c e l l u l a r s t o r e s i n t h e d e n s e t u b u l a r s y s t e m . I n a f f e c t e d p l a t e l e t s , i t i s p r o p o s e d t h a t t h e a m o u n t o f T s z g e n e r a t e d i s n o t s u f f i c i e n t t o a c t i v a t e p h o s p h o l i p a s e C . T h e i n c r e a s e i n i n t r a c y t o p l a s m i c C a m ' c o n c e n t r a t i o n i s s u f f i c i e n t t o a c t i v a t e p r o t e i n k i n a s e C a n d m y o s i n l i g h t c h a i n k i n a s e , b u t t h i s a l o n e d o e s n o t i n d u c e s e c r e t i o n . l I n c o n c l u s i o n , t h e r e s u l t s o b t a i n e d i n e a c h o f t h e t h r e e m a j o r s e c t i o n s o f t h i s s t u d y d o n o t f i t a n y d e s c r i b e d g e n e t i c o r a c q u i r e d p l a t e l e t d e f e c t o r a n y s i t u a t i o n c r e a t e d i n v i g r g a n d c a n n o t b e e x p l a i n e d u s i n g c u r r e n t k n o w l e d g e o f p l a t e l e t f u n c t i o n . V i r t u a l l y a l l k n o w l e d g e o f s i g n a l t r a n s d u c t i o n i n p l a t e l e t s i s b a s e d o n t h e o r e t i c a l a s s u m p t i o n s d e r i v e d p r i m a r i l y f r o m e x p e r i m e n t a l m a n i p u l a t i o n o f n o r m a l p l a t e l e t s . T h e i n a b i l i t y o f t h e s e t h e o r i e s t o e x p l a i n t h e f i n d i n g s i n t h i s s t u d y s u g g e s t s t h a t t h i s g e n e t i c p l a t e l e t d e f e c t m a y h o l d a k e y t o m o r e c o m p l e t e u n d e r s t a n d i n g o f t h e m e c h a n i s m s i n v o l v e d i n n o r m a l p l a t e l e t a c t i v a t i o n . n i b m o r h T n e g o n i r b i F / 8 V 1 a N , w A A n i r i p s A 2 A * 1 ‘ 6 . 6 . “ P D A ‘ H w + 2 a C 8 1 0 P ' D k a P "1 ' P 0 2 a D k 7 4 . y d u t s s i h t n i d e t s r o t c a f g n a i g t i u t b s i e r v t n n i o c r e h t o s y a w h t a p r e s o o / d n h a t s g p n i d u e t s l e c t n a i i n d o e i t n o e i m r r e c e S t a v i t t n i c l a a r e v e s t e l e t a e l v p p Q 1 \ g m ’ 0 f o l e d o m l a c i t A e M 7 h P 1 o 8 t l o v n i y a m y a w h t a p s i 3 h 2 A p y H t - . > 2 - - - - 9 e r u g i F ? 0 - 0 . 0 0 ’ 3 7 3 L I S T O F R E F E R E N C E S 1 0 . 1 1 . L I S T O F R E F E R E N C E S A b d u l l a T H . B - A d r e n e r g i c r e c e p t o r s i n h u m a n p l a t e l e t s . J . A t h e r o s c l e r . R e s . 9 : 1 7 1 - 1 7 7 , 1 9 6 9 . A d e l s t e i n R S , C o n t i M A . P h o s p h o r y l a t i o n o f p l a t e l e t m y o s i n i n c r e a s e s a c t i n - a c t i v a t e d m y o s i n A T P a s e a c t i v i t y . N a t u r e 2 5 6 : 5 9 7 - 5 9 8 , 1 9 7 5 . A d u n y a h S E , D e a n W L . I n o s i t o l t r i p h o s p h a t e - i n d u c e d C a y ' r e l e a s e f r o m h u m a n p l a t e l e t m e m b r a n e s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 2 8 : 1 2 7 4 - 1 2 8 0 , 1 9 8 5 . A d u n y a h S E , D e a n W L . R e g u l a t i o n o f h u m a n p l a t e l e t m e m b r a n e C a 2 + t r a n s p o r t b y c A M P - a n d c a l m o d u l i n - d e p e n d e n t p h o s p h o r y l a t i o n . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 9 3 0 : 4 0 1 - 4 0 9 , 1 9 8 7 . A g r a n o f f B W , M u r t h y P , S e g u i n E B . T h r o m b i n - i n d u c e d p h o s p h o d i e s t e r a t i c c l e a v a g e o f p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l b i s p h o s p h a t e i n h u m a n p l a t e l e t s . J . B i o l . C h e m . 2 5 8 : 2 0 7 6 - 2 0 7 8 , 1 9 8 3 . A g r a n o f f B W . P h o s p h o r y l a t e d d e r i v a t i v e s o f m y o - i n o s i t o l . F e d . P r o c . 4 5 : 2 6 2 9 - 2 6 3 3 , 1 9 8 6 . A k t o r i e s K , J a k o b s K H . E p i n e p h r i n e i n h i b i t s a d e n y l a t e c y c l a s e a n d s t i m u l a t e s a G T P a s e i n h u m a n p l a t e l e t m e m b r a n e s v i a a - a d r e n o c e p t o r s . F E B S L e t t . 1 3 0 : 2 3 5 - 2 3 8 , 1 9 8 1 . A k t o r i e s K , J a k o b s K H . N g - m e d i a t e d i n h i b i t i o n o f h u m a n p l a t e l e t a d e n y l a t e c y c l a s e b y t h r o m b i n . E u r . J . B i o c h e m . 1 4 5 : 3 3 3 - 3 3 8 , 1 9 8 4 . A r d l i e N G , G a r r e t t J J , B e l l L K . C o l l a g e n i n c r e a s e s c y t o p l a s m i c f r e e c a l c i u m i n h u m a n p l a t e l e t s . T h r o m b . R e s . 4 2 : 1 1 5 - 1 2 4 , 1 9 8 6 . A s c h A S , B a r n w e l l J , S i l v e r s t e i n R L , N a c h m a n R L . I s o l a t i o n o f t h e t h r o m b o s p o n d i n m e m b r a n e r e c e p t o r . J . C l i n . I n v e s t . 7 9 : 1 0 5 4 - 1 0 6 1 , 1 9 8 7 . A s h b y B , K o w a l s k a M A , W e r n i c k E , R i g m a i d e n M , D a n i e l J L , S m i t h J B . D i f f e r e n c e s i n t h e m o d e o f a c t i o n o f l - o l e o l - 2 - a c e t y l - g l y c e r o l a n d p h o r b o l e s t e r i n p l a t e l e t a c t i v a t i o n . J . C y c l i c N u c l e o t i d e P r o t e i n P h o s p h o r y l a t i o n R e s . 1 0 : 4 7 3 - 4 8 3 , 1 9 8 5 . 3 7 4 1 2 . 1 3 . 1 4 . 1 5 . 1 6 . 1 7 . 1 8 . 1 9 . 2 0 . 2 1 . 2 2 . 2 3 . 3 7 5 A u t h i K S , C r a w f o r d N C . I n o s i t o l 1 , 4 , 5 - t r i s p h o s p h a t e - i n d u c e d r e l e a s e o f s e q u e s t e r e d C a fl ’ f r o m h i g h l y p u r i f i e d h u m a n p l a t e l e t i n t r a c e l l u l a r m e m b r a n e s . B i o c h e m . J . 2 3 0 : 2 4 7 - 2 5 3 , 1 9 8 5 . A u t h i K S , H o r n b y E J , E v e n d e n B J , C r a w f o r d N . I n o s i t o l 1 , 4 , 5 - t r i s p h o s p h a t e ( 1 P 3 ) i n d u c e d r a p i d f o r m a t i o n o f t h r o m b o x a n e B 2 i n s a p o n i n - p e r m e a b i l i z e d h u m a n p l a t e l e t s : m e c h a n i s m o f 1 P 3 a c t i o n . F E B S L e t t . 2 1 3 : 9 5 - 1 0 1 , 1 9 8 7 . A v d o n i n P V , C h e g l a k o v I B , B o o g r y E M , S v i t i n a - U l i t i n a I V , M a z a e v A V , T k a c h u k V A . E v i d e n c e f o r t h e r e c e p t o r - o p e r a t e d c a l c i u m c h a n n e l s i n h u m a n p l a t e l e t p l a s m a m e m b r a n e . T h r o m b . R e s . 4 6 : 2 9 - 3 7 , 1 9 8 7 . A x e l r o d J , B u r c h R M , J e l s e m a C L . R e c e p t o r - m e d i a t e d a c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e A z ‘ v i a G T P - b i n d i n g p r o t e i n s : a r a c h i d o n i c a c i d a n d i t s m e t a b o l i t e s a s s e c o n d m e s s e n g e r s . T r e n d s N e u r o s c i . 1 1 : 1 1 7 - 1 2 3 , 1 9 8 8 . B a l d a s s a r e J J , F i s h e r G J . G T P a n d c y t o s o l s t i m u l a t e p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s i n i s o l a t e d p l a t e l e t m e m b r a n e s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 3 7 : 8 0 1 - 8 0 5 , 1 9 8 6 . B a l d a s s a r e J J , F i s h e r G J . R e g u l a t i o n o f m e m b r a n e - a s s o c i a t e d a n d c y t o s o l i c p h o s p h o l i p a s e C a c t i v i t i e s i n h u m a n p l a t e l e t s b y g u a n o s i n e t r i p h o s p h a t e . J . B i o l . C h e m . 2 6 1 : 1 1 9 4 2 - 1 1 9 4 4 , 1 9 8 6 . B a l d u i n i C L , S i n i g a g l i a F , B e r t o l i n o G , B i s i o A , N o r i s P , A s c a r i E . S u r f a c e m e c h a n i s m s o f p l a t e l e t a d h e s i o n a n d a g g r e g a t i o n . H a e m a t o l o g i c a 7 2 : 2 6 1 - 2 6 8 , 1 9 8 7 . B a l l o u L R , C h e u n g W Y . M a r k e d i n c r e a s e o f h u m a n p l a t e l e t p h o s p h o l i p a s e A 2 a c t i v i t y i n v i t r o a n d d e m o n s t r a t i o n o f a n e n d o g e n o u s i n h i b i t o r . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 0 : 5 2 0 3 - 5 2 0 7 , 1 9 8 3 . B a l l o u L R , C h e u n g W Y . I n h i b i t i o n o f h u m a n p l a t e l e t p h o s p h o l i p a s e A 2 a c t i v i t y b y u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 2 : 3 7 1 - 3 7 5 , 1 9 8 5 . B a l l o u L R , D e W i t t L M , C h e u n g W Y . S u b s t r a t e - s p e c i f i c f o r m s o f h u m a n p l a t e l e t p h o s p h o l i p a s e A 2 . J . B i o l . C h e m . 2 6 1 : 3 1 0 7 - 3 1 1 1 , 1 9 8 6 . B a n g a H S , S i m o n s E R , B r a s s L F , R i t t e n h o u s e S E . A c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e s A a n d C i n h u m a n p l a t e l e t s e x p o s e d t o e p i n e p h r i n e : R o l e o f g l y c o p r o t e i n s I I b / I I I a a n d d u a l r o l e o f e p i n e p h r i n e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 3 : 9 1 9 7 - 9 2 0 1 , 1 9 8 6 . B a n n o Y , N a k a s h i m a S , N o z a w a Y . P a r t i a l p u r i f i c a t i o n o f p h o s p h o i n o s i t i d e p h o s p h o l i p a s e C f r o m h u m a n p l a t e l e t c y t o s o l ; c h a r a c t e r i z a t i o n o f i t s t h r e e f o r m s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 3 6 : 7 1 3 - 7 2 1 , 1 9 8 6 . 2 4 . 2 5 . 2 6 . 2 7 . 2 8 . 2 9 . 3 0 . 3 1 . 3 2 . 3 3 . 3 4 . 3 5 . 3 7 6 B a n n o Y , N o z a w a Y . C h a r a c t e r i z a t i o n o f p a r t i a l l y p u r i f i e d p h o s p h o l i p a s e C f r o m h u m a n p l a t e l e t m e m b r a n e s . B i o c h e m . J . 2 4 8 : 9 5 - 1 0 1 , 1 9 8 7 . B a n n o Y , N a g a o S , K a t a d a T , N a g a t a K , M i c h i o U , N o z a w a Y . S t i m u l a t i o n b y G T P - b i n d i n g p r o t e i n s ( 0 1 , G O ) o f p a r t i a l l y p u r i f i e d p h o s p h o l i p a s e 0 a c t i v i t y f r o m h u m a n p l a t e l e t m e m b r a n e s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 4 6 : 8 6 1 - 8 6 9 , 1 9 8 7 . B a r o n B M , L i m b i r d L E . H u m a n p l a t e l e t p h o s p h o l i p a s e A 2 a c t i v i t y i s r e s p o n s i v e i n v i t r o t o p H a n d C a fl ' v a r i a t i o n s w h i c h p a r a l l e l t h o s e o c c u r r i n g a f t e r p l a t e l e t a c t i v a t i o n i n v i v o . B i o c h e m . B i o p h y s . A c t a 9 7 1 : 1 0 3 - 1 1 1 , 1 9 8 8 . B e l l R L , K e n n e r l y D A , S t a n f o r d N , M a j e r u s P W . D i g l y c e r i d e l i p a s e : a p a t h w a y f o r a r a c h i d o n a t e r e l e a s e f r o m h u m a n p l a t e l e t s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 7 6 : 3 2 3 8 - 3 2 4 1 , 1 9 7 9 . B e l l T G , M e y e r s K M , P r i e u r D J , F a u c i A S , W o l f f S A , P a d g e t t G A . D e c r e a s e d n u c l e o t i d e a n d s e r o t o n i n s t o r a g e a s s o c i a t e d w i t h d e f e c t i v e f u n c t i o n i n C h e d i a k - H i g a s h i s y n d r o m e c a t t l e a n d h u m a n p l a t e l e t s . B l o o d 4 8 : 1 7 5 - 1 8 4 , 1 9 7 6 . B e l l T G , L e a d e r R W , O l s o n P M , P a d g e t t G A , P e n n e r J A , P a t t e r s o n W R . B a s s e t H o u n d h e r e d i t a r y t h r o m b o p a t h y : A n a u t o s o m a l l y , r e c e s s i v e l y i n h e r i t e d p l a t e l e t d y s f u n c t i o n w i t h 1 1 c a s e s i n a k i n d r e d o f 5 6 d o g s . I n : Q u e M e d i c i n e . R y d e r O A , B y r d M L ( e d s ) . S p r i n g e r - V e r l a g , N e w Y o r k . P a g e s 3 3 5 - 3 4 4 , 1 9 8 4 . B e n n e t J S , V i l a i r e G , C i n e s D B . I d e n t i f i c a t i o n o f t h e f i b r i n o g e n r e c e p t o r o n h u m a n p l a t e l e t s b y p h o t o a f f i n i t y l a b e l l i n g . J . B i o l . C h e m . 2 5 7 : 8 0 4 9 - 8 0 5 4 , 1 9 8 2 . B e n n e t J S , H o x i e J A , L e i t m a n S F , V i l a i r e G , C i n e s D B . I n h i b i t i o n o f f i b r i n o g e n b i n d i n g t o s t i m u l a t e d h u m a n p l a t e l e t s b y a m o n o c l o n a l a n t i b o d y . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 0 : 2 4 1 7 - 2 4 2 1 , 1 9 8 3 . B e n t o n A M , G e r r a r d J M , M i c h i e l T , K i n d o m S E . A r e l y s o p h o s p h a t i d i c a c i d s o r p h o s p h a t i d i c a c i d s i n v o l v e d i n s t i m u l u s a c t i v a t i o n c o u p l i n g i n p l a t e l e t s ? B l o o d 6 0 : 6 4 2 - 6 4 9 , 1 9 8 2 . B e r n d t M C , G r e g o r y C , K a b r a l A , Z o l a H , F o u r n i e r D , C a s t a l d i P A . P u r i f i c a t i o n a n d p r e l i m i n a r y c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e g l y c o p r o t e i n I b c o m p l e x i n t h e h u m a n p l a t e l e t m e m b r a n e . E u r . J . B i o c h e m . 1 5 1 : 6 3 7 - 6 4 9 , 1 9 8 5 . B e r r i d g e M J . I n o s i t o l t r i s p h o s p h a t e a n d d i a c y l g l y c e r o l a s s e c o n d m e s s e n g e r s . B i o c h e m . J . 2 2 0 : 3 4 5 - 3 6 0 , 1 9 8 4 . B e r r i d g e M J . I n t r a c e l l u l a r s i g n a l l i n g t h r o u g h i n o s i t o l t r i s p h o s p h a t e a n d d i a c y l g l y c e r o l . B i o l o g . C h e m . 3 6 7 : 4 4 7 - 4 5 6 , 1 9 8 6 . 3 6 . 3 7 . 3 8 . 3 9 . 4 0 . 4 1 . 4 2 . 4 3 . 4 4 . 4 5 . 4 6 . 4 7 . 3 7 7 B e r r i d g e M J . I n o s i t o l t r i s p h o s p h a t e a n d c a l c i u m m o b i l i z a t i o n . J . C a r d i o v a s c . P h a r m a c o l . 8 ( 8 8 ) : 8 8 5 - S 9 0 , 1 9 8 6 . B i e n z D , C l e m e t s o n K J . H u m a n p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n I a . O n e c o m p o n e n t i s o n l y e x p r e s s e d o n t h e s u r f a c e o f a c t i v a t e d p l a t e l e t s a n d m a y b e a g r a n u l e c o n s t i t u e n t . J . B i o l . C h e m . 2 6 4 : 5 0 7 - 5 1 4 , 1 9 8 9 . B i l l a h M M , L a p e t i n a E G , C u a t r e c a s a s P . P h o s p h o l i p a s e A 2 a n d p h o s p h o l i p a s e C a c t i v i t i e s o f p l a t e l e t s . D i f f e r e n t i a l s u b s t r a t e s p e c i f i c i t y , C a fl ’ r e q u i r e m e n t , p H d e p e n d e n c e , a n d c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n . J . B i o l . C h e m . 2 5 5 : 1 0 2 2 7 - 1 0 2 3 1 , 1 9 8 0 . B i l l a h M M , L a p e t i n a E C , C u a t r e c a s a s P . P h o s p h o l i p a s e A 2 a c t i v i t y s p e c i f i c f o r p h o s p h a t i d i c a c i d . A p o s s i b l e m e c h a n i s m f o r t h e p r o d u c t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d i n p l a t e l e t s . J . B i o l . C h e m . 2 5 6 : 5 3 9 9 - 5 4 0 3 , 1 9 8 1 . B i l l a h M M , L a p e t i n a E G . R a p i d d e c r e a s e o f p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 4 , 5 - b i s p h o s p h a t e i n t h r o m b i n - s t i m u l a t e d p l a t e l e t s . J . B i o l . C h e m . 2 5 7 : 1 2 7 0 5 - 1 2 7 0 8 , 1 9 8 2 . B i l l a h M M , L a p e t i n a E G . P l a t e l e t - a c t i v a t i n g f a c t o r s t i m u l a t e s m e t b o l i s m o f p h o s p h o i n o s i t i d e s i n h o r s e p l a t e l e t s : p o s s i b l e r e l a t i o n s h i p t o C a a ' m o b i l i z a t i o n d u r i n g s t i m u l a t i o n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 0 : 9 6 5 - 9 6 8 , 1 9 8 3 . B i n d e r H , W e b e r P C , S i e s s W . S e p a r a t i o n o f i n o s i t o l p h o s p h a t e s a n d g l y c e r o p h o s p h o i n o s i t o l p h o s p h a t e s b y h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y . A n a l . B i o c h e m . 1 4 8 : 2 2 0 - 2 2 7 , 1 9 8 5 . B i s h o p W R , G a n o n g B R , B e l l R M . A t t e n u a t i o n o f s n - l , 2 - d i a c y l g l y c e r o l s e c o n d m e s s e n g e r s b y d i a c y l g l y c e r o l k i n a s e . I n h i b i t i o n b y d i a c y l g l y c e r o l a n a l o g s i n v i t r o a n d i n h u m a n p l a t e l e t s . J . B i o l . C h e m . 2 6 1 : 6 9 9 3 - 7 0 0 0 , 1 9 8 6 . B i s h o p W R , B e l l R M . A t t e n u a t i o n o f s n - l , 2 - d i a c y l g l y c e r o l s e c o n d m e s s e n g e r s . M e t a b o l i s m o f e x o g e n o u s d i a c y l g l y c e r o l s b y h u m a n p l a t e l e t s . J . B i o l . C h e m . 2 6 1 : 1 2 5 1 3 - 1 2 5 1 9 , 1 9 8 6 . B l a c h e D , C i a v a t t i M , P o n s i n G , N a r g e o t J . D i r e c t e v i d e n c e f o r t h e m o d u l a t i o n o f h u m a n p l a t e l e t f r e e C a m ’ b y i n t r a c e l l u l a r c y c l i c A M P p r o d u c e d w i t h a p h o t o a c t i v a t a b l e d e r i v a t i v e . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 4 6 : 3 2 1 - 3 3 1 , 1 9 8 7 . B o r n G V R . A g g r e g a t i o n o f b l o o d p l a t e l e t s b y a d e n o s i n e d i p h o s p h a t e a n d i t s r e v e r s a l . N a t u r e 1 9 4 : 9 2 7 - 9 2 9 , l 9 6 2 . B o u d r e a u x M K , D o d d s W J , S l a u s o n D O , C a t a l f a m o J L . E v i d e n c e f o r r e g u l a t o r y c o n t r o l o f c a n i n e p l a t e l e t p h o s p h o d i e s t e r a s e . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 4 0 : 5 8 9 - 5 9 4 , 1 9 8 6 . 4 8 . 4 9 . 5 0 . 5 1 . 5 2 . 5 3 . 5 4 . 5 5 . 5 6 . 5 7 . 5 8 . 3 7 8 B o u d r e a u x M K , D o d d s W J , S l a u s o n D O , C a t a l f a m o J L . I m p a i r e d c A M P m e t a b o l i s m a s s o c i a t e d w i t h a b n o r m a l f u n c t i o n o f t h r o m b o p a t h i c c a n i n e p l a t e l e t s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 4 0 : 5 9 5 - 6 0 1 , 1 9 8 6 . B o u v i e r M , L e e b - L u n d b e r g L M F , B e n o v i c J L , C a r o n M G , L e f k o w i t z R J . R e g u l a t i o n o f a d r e n e r g i c r e c e p t o r f u n c t i o n b y p h o s p h o r y l a t i o n . 1 1 . E f f e c t s o f a g o n i s t o c c u p a n c y o n p h o s p h o r y l a t i o n o f a 1 - a n d B z - a d r e n e r g i c r e c e p t o r s b y p r o t e i n k i n a s e C a n d t h e c y c l i c A M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e . J . B i o l . C h e m . 2 6 2 : 3 1 0 6 - 3 1 1 3 , 1 9 8 7 . B r a s s L F , S h a t t i l S J . C h a n g e s i n s u r f a c e - b o u n d a n d e x c h a n g e a b l e c a l c i u m d u r i n g p l a t e l e t a c t i v a t i o n . J . B i o l . C h e m . 2 5 7 : 1 4 0 0 0 - 1 4 0 0 5 , 1 9 8 2 . B r a s s L F . C a 2 + h o m e o s t a s i s i n u n s t i m u l a t e d p l a t e l e t s . J . B i o l . C h e m . 2 5 9 : 1 2 5 6 3 - 1 2 5 7 0 , 1 9 8 4 . B r a s s L F . T h e e f f e c t o f N a + o n C a 2 + h o m e o s t a s i s i n u n s t i m u l a t e d p l a t e l e t s . J . B i o l . C h e m . 2 5 9 : 1 2 5 7 1 - 1 2 5 7 5 , 1 9 8 4 . B r a s s L F , S h a t t i l S J . I d e n t i f i c a t i o n a n d f u n c t i o n o f t h e h i g h a f f i n i t y b i n d i n g s i t e s f o r C a ” ’ o n . t h e s u r f a c e o f p l a t e l e t s . J . C l i n . l n v e s t . 7 3 : 6 2 6 - 6 3 2 . 1 9 8 4 . B r a s s L F . C a 2 + t r a n s p o r t a c r o s s t h e p l a t e l e t p l a s m a m e m e b r a n e . A r o l e f o r m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s I I B a n d I I I A . J . B i o l . C h e m . 2 6 0 : 2 2 3 1 - 2 2 3 6 , 1 9 8 5 . B r a s s L F , J o s e p h S K . A r o l e f o r i n o s i t o l t r i p h o s p h a t e i n i n t r a c e l l u l a r C a 2 + m o b i l i z a t i o n a n d g r a n u l e s e c r e t i o n i n p l a t e l e t s . J . B i o l . C h e m . 2 6 0 : 1 5 1 7 2 - 1 5 1 7 9 , 1 9 8 5 . B r a s s L F , L a p o s a t a M , B a n g a H S , R i t t e n h o u s e S E . R e g u l a t i o n o f t h e p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s p a t h w a y i n t h r o m b i n - s t i m u l a t e d p l a t e l e t s b y a p e r t u s s i s t o x i n - s e n s i t i v e g u a n i n e n u c l e o t i d e - b i n d i n g p r o t e i n . E v a l u a t i o n o f i t s c o n t r i b u t i o n t o p l a t e l e t a c t i v a t i o n a n d c o m p a r i s o n s w i t h t h e a d e n y l a t e c y c l a s e i n h i b i t o r y p r o t e i n , G 1 . J . B i o l . C h e m . 3 6 : 1 6 8 3 8 - 1 6 8 4 7 , 1 9 8 6 . B r a s s L F , L a p o s a t a M . D i a c y l g l y c e r o l c a u s e s C a r e l e a s e f r o m t h e p l a t e l e t d e n s e t u b u l a r s y s t e m : c o m p a r i s o n s w i t h C a r e l e a s e c a u s e d b y i n o s i t o l 1 , 4 , 5 - t r i p h o s p h a t e . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 4 2 : 7 - 1 4 , 1 8 9 7 . B r a s s L F , S h a l l e r C C , B e l m o n t e E J . I n o s i t o l 1 , 4 , 5 - t r i p h o s p h a t e - i n d u c e d g r a n u l e s e c t i o n i n p l a t e l e t s . E v i d e n c e t h a t t h e a c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e C m e d i a t e d b y p l a t e l e t t h r o m b o x a n e r e c e p t o r s i n v o l v e s a g u a n i n e n u c l e o t i d e b i n d i n g p r o t e i n - d e p e n d e n t m e c h a n i s m d i s t i n c t f r o m t h a t o f t h r o m b i n . J . C l i n . I n v e s t . 7 9 : 1 2 6 9 - 1 2 7 5 , 1 9 8 7 . 5 9 . 6 0 . 6 1 . 6 2 . 6 3 . 6 4 . 6 5 . 6 6 . 6 7 . 6 8 . 6 9 . 7 0 . 7 1 . 3 7 9 B r a s s L F , W o o l k a l i s M J , M a n n i n g D R . I n t e r a c t i o n s i n p l a t e l e t s b e t w e e n G p r o t e i n s a n d a g o n i s t s t h a t s t i m u l a t e p h o s p h o l i p a s e C a n d i n h i b i t a d e n y l y l c y c l a s e . J . B i o l . C h e m . 2 6 3 : 5 3 4 8 - 5 3 5 5 , 1 9 8 8 . B r a s s L F . R e g u l a t i o n o f b i o l o g i c a l r e s p o n s e s i n p l a t e l e t s . I n : e l 3 t e i e s H e t s n a n t 3 l e . M e y e r P a n d M a r c h e P . ( E d s ) . R a v e n P r e s s , N e w Y o r k , N Y . P a g e s 5 9 - 9 2 , 1 9 8 9 . B r a y P F , R o s a J - P , L i n g a p p a V R , K a n Y W , M c E v e r R P , S h u m a n M A . B i o g e n e s i s o f t h e p l a t e l e t r e c e p t o r f o r f i b r i n o g e n : e v i d e n c e f o r s e p a r a t e p r e c u r s o r s f o r g l y c o p r o t e i n s I I b a n d I I I a . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 3 : 1 4 8 0 - 1 4 8 4 , 1 9 8 6 . B r e t o n - G o r i u s J , V a i n c h e n k e r W . E x p r e s s i o n o f p l a t e l e t p r o t e i n s d u r i n g t h e i n v i t r o a n d i n v i v o d i f f e r e n t i a t i o n o f m e g a k a r y o c y t e s a n d m o r p h o l o g i c a l a s p e c t s o f t h e i r m a t u r a t i o n . S e m . i n H e m a t o l . 2 3 : 4 3 - 6 7 , 1 9 8 6 . B r o e k m a n M J . P h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 4 , 5 - b i s p h o s p h a t e m a y r e p r e s e n t t h e s i t e o f r e l e a s e o f p l a s m a m e m b r a n e - b o u n d c a l c i u m u p o n s t i m u l a t i o n o f h u m a n p l a t e l e t s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 2 0 : 2 2 6 - 2 3 1 , 1 9 8 4 . B r u g g e J S . T h e p 3 5 / p 3 6 s u b s t r a t e s o f p r o t e i n - t y r o s i n e k i n a s e s a s i n h i b i t o r s o f p h o s p h o l i p a s e A 2 . C e l l 4 6 : 1 4 9 - 1 5 0 , 1 9 8 6 . B u c k l e y J T , H a w t h o r n e J N . E r y t h r o c y t e m e m b r a n e p o l y p h o s p h o i n o s i t i d e m e t a b o l i s m a n d t h e r e g u l a t i o n o f c a l c i u m b i n d i n g . J . B i o l . C h e m . 2 4 7 : 7 2 1 8 - 7 2 2 3 , 1 9 7 2 . B u r c h R M , M a i s D E , S a u s s y D L , H a l u s h k a P V . S o l u b i l i z a t i o n o f a t h r o m b o x a n e A Q / p r o s t a g l a n d i n H 2 a n t a g o n i s t b i n d i n g s i t e f r o m h u m a n p l a t e l e t s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 2 : - 7 4 3 4 - 7 4 3 8 , 1 9 8 5 . B u r g e s s G M , I r v i n e R F , B e r r i d g e M J , M c K i n n e y J S , P u t n e y J W . A c t i o n s o f i n o s i t o l p h o s p h a t e s o n C a y ' p o o l s i n g u i n e a - p i g h e p a t o c y t e s . B i o c h e m . J . 2 2 4 : 7 4 1 - 7 4 6 , 1 9 8 4 . B u r r i d g e K , M a n g e a t P . A n i n t e r a c t i o n b e t w e e n v i n c u l i n a n d t a l i n . N a t u r e 3 0 8 : 7 4 4 - 7 4 5 , 1 9 8 4 . C a r e y F , M e n a s h i S , C r a w f o r d N . L o c a l i z a t i o n o f c y c l o - o x y g e n a s e a n d t h r o m b o x a n e s y n t h e t a s e i n h u m a n p l a t e l e t i n t r a c e l l u l a r m e m b r a n e s . B i o c h e m . J . 2 0 4 : 8 4 7 - 8 5 1 , 1 9 8 2 . C a r p e n t e r D , J a c k s o n T , H a n l e y M R . P r o t e i n k i n a s e C s . C o p i n g w i t h a g r o w i n g f a m i l y . N a t u r e 3 2 5 : 1 0 7 - 1 0 8 , 1 9 8 7 . C a r r e l l N A , F i t z g e r a l d L A , S t e i n e r B , E r i c k s o n H P , P h i l l i p s D R . S t r u c t u r e o f h u m a n p l a t e l e t m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s I I b a n d 1 1 a a s d e t e r m i n e d b y e l e c t r o n m i c r o s c o p y . J . B i o l . C h e m . 2 6 0 : 1 7 4 3 - 1 7 4 9 , 1 9 8 5 . h C l 1 a C a P C p h i 0 u h l g l d a m a p 0 a o e a e t u a a : r n n m r h L e 6 s l t a l - p K 8 t a c s o l a Y 8 A s t o o g a n , , — e l n i t d a 1 c . T e 6 9 S n c K a i e r c 2 5 , a l a c d y 8 J l t m , u o l : p n s 1 e i y e m o H o s t f a L 4 l - n 1 t s u 6 a H 7 t o r 9 o r e s . e g 8 n e - e c R i c t t C r 6 t e r e e i , , s l e r d v E . q l 1 l a 4 l h u a c y M e . 7 e a d h c t 9 e s i T i 1 F . s e t o o 8 y B h m m e i 4 e p p l i . M o o i f p s s o n e c o u m , h e a n n b i a q r u a e e . N u s a T m n s r d h m . c n o a B . e h t n n i i i B g o a d i E a p l l o o f g l y n c a f g c h t a a e r o e e c e t c p m l e t t g r p h y s . f o t t t c r n B o i o i f o s . e t i a i . s a e o A m o o n n d h i a y o z B a 4 - f r b 7 s , . a n : g l d . d 5 o y i a r 3 J r c g R n e . m - e l e n d a 7 r y s o l 3 f p a 9 e r C i o i d m n e m . p t o r i c o . c d e e n i , t l i 9 e 8 s 8 . i n 7 2 . 7 3 . 7 4 . 7 5 . 7 6 . 7 7 . 7 8 . 7 9 . 8 0 . 8 1 . 8 2 . 8 3 . 8 4 . 3 8 0 C a r r o l l R C , B u t l e r R G , M o r r i s P A . S e p a r a b l e a s s e m b l y o f p l a t e l e t p s e u d o p o d a l a n d c o n t r a c t i l e c y t o s k e l e t o n s . C e l l 3 0 : 3 8 5 - 3 9 3 , 1 9 8 2 . C a s t a g n a M , T a k a i Y , K a i b u c h i K , S a n o K , K i k k a w a U , N i s h i z u k a Y . D i r e c t a c t i v a t i o n o f c a l c i u m - a c t i v a t e d , p h o s p h o l i p i d - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e b y t u m o r - p r o m o t i n g p h o r b o l e s t e r s . J . B i o l . C h e m . 2 5 7 : 7 8 4 7 - 7 8 5 1 , 1 9 8 2 . C a s t a g n a M . P h o r b o l e s t e r s a s s i g n a l t r a n s d u c e r s a n d t u m o r p r o m o t e r s . B i o l . o f t h e C e l l 5 9 : 3 - 1 4 , 1 9 8 7 . C a t a l f a m o J L , R a y m o n d S L , W h i t e J G , D o d d s W J . D e f e c t i v e p l a t e l e t - f i b r i n o g e n i n t e r a c t i o n i n h e r e d i t a r y c a n i n e t h r o m b o p a t h i a . B l o o d 6 7 : 1 5 6 8 - 1 5 7 7 , 1 9 8 6 . C a t a l f a m o J L , B o u d r e a u x M K , D o d d s W J . I m p a i r e d r e s p o n s i v e n e s s o f t h r o m b o p a t h i c p l a t e l e t s ( T P ) t o c a l c i u m i o n o p h o r e . F e d . P r o c . 4 5 : 2 2 5 , 1 9 8 6 . C a t t a n e o M , C a n c i a n i M T , M a n n u c c i P M . H u m a n p l a t e l e t a g g r e g a t i o n a n d r e l e a s e r e a c t i o n i n d u c e d b y p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r ( P A F - a c e t h e r ) - e f f e c t s o f a c e t y l s a l i c y l i c a c i d a n d e x t e r n a l i o n i z e d c a l c i u m . T h r o m b . H a e m o s t a s i s 5 4 : 2 2 1 - 2 2 4 , 1 9 8 5 . C e c h P , R o s o v e M H , H a r w i g S S L , L e h r e r R I . E f f e c t s o f p h o r b o l d i e s t e r s a n d t e l e o c i d i n o n n o r m a l h u m a n p l a t e l e t s . T h r o m b . R e s . 4 2 : 3 8 3 - 3 9 6 , 1 9 8 6 . C e r i o n e R A , R e g a n J W , N a k a t a H , C o d i n a J , B e n o v i c J L , G i e r s c h i k P , S o m e r s R L , S p i e g e l A M , B i r n b a u m e r L , L e f k o w i t z R J . F u n c t i o n a l r e c o n s t i t u t i o n o f t h e a z - a d r e n e r g i c r e c e p t o r w i t h g u a n i n e n u c l e o t i d e r e g u l a t o r y p r o t e i n s i n p h o s p h o l i p i d v e s i c l e s . J . B i o l . C h e m . 2 6 1 : 3 9 0 1 - 3 9 0 9 , 1 9 8 6 . C h a r o I F , F e i n m a n R D , D e t w i l e r T C . I n t e r r e l a t i o n s o f p l a t e l e t a g g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n . J . C l i n . I n v e s t . 6 0 : 8 6 6 - 8 7 3 , 1 9 7 7 . C h e u n g W Y . C y c l i c 3 ' , 5 ' - n u c l e o t i d e p h o s p h o d i e s t e r a s e . E v i d e n c e f o r a n d p r o p e r t i e s o f a p r o t e i n a c t i v a t o r . J . B i o l . C h e m . 2 4 6 : 2 8 5 9 - 2 8 6 9 , 1 9 7 1 . n r m g 8 n : n d o d C a a 2 r C 8 C i b p h J o d e g 5 o n y h 0 o y . n e o n o e r : n 5 B s r o n v o p o e 3 3 p m o i l e a l i l e g 9 2 h l o y g y h e m y 7 t — z l r l a 0 l t n l o 0 y l . i o a i 5 - e p o c T f T c o 3 h 3 n s T C n 9 r 2 M M o h M i i e e r i 1 , e r e , , i , 1 4 , e e r e n t L c t L s s B , e t e . e x 2 n , m - h s 1 p a c m m 5 n o 9 2 r b 9 t p b r s A - 6 8 s a i o l i e 8 i p 0 3 D s s r r a r h t 3 t e : P . i . , d t d T o i 7 L y l e L a r p 6 n , , E e E s n o h 8 s e o v E 8 f s . . - t t s d M m a T r h d R a e u l o e h e r o r m . f C m t e o a f u 7 4 , e a e m N n c t a t 7 j h e 8 A o i m s n i n v b h M o i 1 u P a n E i P n p 9 f m f l n W l o 8 a f l a f . . 5 a s n e u c o r t i . l c m r e s e u a h o o t x o c e c f o t p n u m P I e t l o e l o e a m r a , . f t l u t l 1 c s N l t f a a t t 4 N l a o a 5 a s n a p t n t - r . . + l t l t a e i + t o p n N i h , o n e m o . e a o s r l t f p i t e a h m i l h d o B e N f t A J e e A e s v a . p t l c a c e . s a s t i i o h o + a l n o s S c p a h z - d t c l . e a f C m h o u m . l i i i . l t y e r e l U i m n a S . a t A t e s e d 8 5 . 8 6 . 8 7 . 8 8 . 8 9 . 9 0 . 9 1 . 9 2 . 9 3 . 9 3 a . 9 4 . 9 5 . 9 6 . 3 8 1 C l e m m o n s R M , M e y e r s K M . A c q u i s t i o n a n d a g g r e g a t i o n o f c a n i n e b l o o d p l a t e l e t s : B a s i c m e c h a n i s m s o f f u n c t i o n a n d d i f f e r e n c e s b e c a u s e o f b r e e d o r i g i n . A m . J . V e t . R e s . 4 5 : 1 3 7 - 1 4 4 , 1 9 8 4 . C o b b o l d P H , R i n k T J . F l u o r e s c e n c e a n d b i o l u m i n e s c e n c e o f c y t o p l a s m i c f r e e c a l c i u m . B i o c h e m . J . 2 4 8 : 3 1 3 - 3 2 8 , 1 9 8 7 . C o c k c r o f t S , G o m p e r t s B D . R o l e o f g u a n i n e n u c l e o t i d e b i n d i n g p r o t e i n i n t h e a c t i v a t i o n o f p o l y p h o s p h o i n o s i t i d e p h o s p h o d i e s t e r a s e . N a t u r e 3 1 4 : 5 3 4 - 5 3 6 , 1 9 8 5 . C o h e n C M . T h e m o l e c u l a r o r g a n i z a t i o n o f t h e r e d c e l l m e m b r a n e s k e l e t o n . S e m . H e m a t o l . 2 0 : 1 4 1 - 1 5 8 , 1 9 8 3 . C o h e n I , G e r r a r d J M , W h i t e J G . U l t r a s t r u c t u r e o f c l o t s d u r i n g i s o m e t r i c c o n t r a c t i o n . J . C e l l B i o l . 9 3 : 7 7 5 - 7 8 7 , 1 9 8 2 . C o l l e r B S . I n t e r a c t i o n o f n o r m a l , t h r o m b a s t h e n i c , a n d B e r n a r d - S o u l i e r p l a t e l e t s w i t h i m m o b i l i z e d f i b r i n o g e n : d e f e c t i v e p l a t e l e t f i b r i n o g e n i n t e r a c t i o n i n t h r o m b a s t h e n i a . B l o o d 5 5 : 1 6 9 - 1 7 8 , 1 9 8 0 . C o l l e r B S . A n e w m u r i n e m o n o c l o n a l a n t i b o d y r e p o r t s a n a c t i v a t i o n - d e p e n d e n t c h a n g e i n t h e c o n f o r m a t i o n a n d / o r m i c r o e n v i r o n m e n t o f t h e p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n I I b / I I I a c o m p l e x . J . C l i n . I n v e s t . 7 6 : 1 0 1 - 1 0 8 , 1 9 8 5 . C o l l e r B S . A c t i v a t i o n a f f e c t s a c c e s s t o t h e p l a t e l e t r e c e p t o r f o r a d h e s i v e g l y c o p r o t e i n s . J . C e l l B i o l . 1 0 3 : 4 5 1 - 4 5 6 , 1 9 8 6 . C o l l i e r N C , W a n g K . P u r i f i c a t i o n a n d p r o p e r t i e s o f h u m a n p l a t e l e t P 2 3 5 . A h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n s u b s t r a t e o f e n d o g e n o u s c a l c i u m - a c t i v a t e d p r o t e a s e ( s ) . J . B i o l . C h e m . 2 5 7 : 6 9 3 7 - 6 9 4 3 , 1 9 8 2 . C o l m a n R W . P l a t e l e t a c t i v a t i o n : r o l e o f a n A D P r e c e p t o r . S e m . H e m a t o l . 2 3 : 1 1 9 - 1 2 8 , 1 9 8 6 . 9 7 . 9 8 . 9 9 . 1 0 0 . 1 0 1 . 1 0 2 . 1 0 3 . 1 0 4 . 1 0 5 . 1 0 6 . 1 0 7 . 1 0 8 . 3 8 2 C o n n o l l y T M , L a w i n g W J , M a j e r u s P W . P r o t e i n k i n a s e C p h o p h o r y l a t e s h u m a n p l a t e l e t i n o s i t o l t r i s p h o s p h a t e 5 ' - p h o s p h o m o n o e s t e r a s e , i n c r e a s i n g t h e p h o s p h a t a s e a c t i v i t y . C e l l 4 6 : 9 5 1 - 9 5 8 , 1 9 8 6 . C o n n o l l y T M , B a n s a l V S , B r o s s T E , I r v i n e R F , M a j e r u s P W . T h e m e t a b o l i s m o f t r i s - a n d t e t r a p h o s p h a t e s o f i n o s i t o l b y 5 - p h o s p h o m o n o e s t e r a s e a n d 3 - k i n a s e e n z y m e s . J . B i o l . C h e m . 2 6 2 : 2 1 4 6 - 2 1 4 9 , 1 9 8 7 . C o n t i M A , A d e l s t e i n R S . T h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n c a l m o d u l i n b i n d i n g a n d p h o s p h o r y l a t i o n o f s m o o t h m u s c l e m y o s i n k i n a s e b y t h e c a t a l y t i c s u b u n i t o f 3 ' : 5 ' c A M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e . J . B i o l . C h e m . 2 5 6 : 3 1 7 8 - 3 1 8 1 , 1 9 8 1 . C o o p e r D M F , R o d b e l l M . A D P i s a p o t e n t i n h i b i t o r o f h u m a n p l a t e l e t p l a s m a m e m b r a n e a d e n y l a t e c y c l a s e . N a t u r e 2 8 2 : 5 1 7 - 5 1 8 , 1 9 7 9 . C o x A C , C a r r o l l R C . T h e e f f e c t o f t e t r a d e c a n o y l p h o r b o l a c e t a t e o n c a l c i u m - i o n m o b i l i z a t i o n , p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n a n d c y t o s k e l e t a l a s s e m b l y i n d u c e d b y t h r o m b i n o r a r a c h i d o n a t e . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 8 8 6 : 3 9 0 - 3 9 8 , 1 9 8 6 . C r o u c h M F , L a p e t i n a E C . P h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 4 7 k D a p r o t e i n i n g a m m a - t h r o m b i n - s t i m u l a t e d p l a t e l e t s d o e s n o t a c t i v a t e p h o s p h o l i p a s e A 2 : e v i d e n c e a g a i n s t l i p o c o r t i n . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 4 1 : 4 5 9 - 4 6 5 , 1 9 8 6 . C u l l i s P R , H o p e M J . P h y s i c a l p r o p e r t i e s a n d f u n c t i o n a l r o l e s o f l i p i d s i n m e m b r a n e s . I n : B i o c h e m i s g y o f L i p i d s a n d M e m b r a n e s . V a n c e D E a n d V a n c e J E ( E d s ) . T h e B e n j a m i n / C u m m i n g s P u b l i s h i n g C o m p a n y I n c . , M e n l o P a r k , C A . P a g e s 2 5 - 7 2 , 1 9 8 5 . D a n g e l m a i e r C A , D a n i e l J L , S m i t h J B . D e t e r m i n a t i o n o f b a s a l a n d s t i m u l a t e d l e v e l s o f i n o s i t o l t r i p h o s p h a t e i n [ 3 2 F ] o r t h o p h o s p h a t e - l a b e l e d p l a t e l e t s . A n a l . B i o c h e m . 1 5 4 : 4 1 4 - 4 1 9 , 1 9 8 6 . D a n i e l J L , H o l m s e n H , A d e l s t e i n R S . T h r o m b i n - s t i m u l a t e d m y o s i n p h o s p h o r y l a t i o n i n i n t a c t p l a t e l e t s a n d i t s p o s s i b l e i n v o l v e m e n t i n s e c r e t i o n . T h r o m b . H a e m o s t a s i s 3 8 : 9 8 4 - 9 8 9 , 1 9 7 7 . D a n i e l J L , M o l i s h I R , H o l m s e n H . M y o s i n p h o s p h o r y l a t i o n i n i n t a c t p l a t e l e t s . J . B i o l . C h e m . 2 5 6 : 7 5 1 0 - 7 5 1 4 , 1 9 8 1 . D a n i e l J L , M o l i s h I R , R i g m a i d e n M , S t e w a r t G . E v i d e n c e f o r a r o l e o f m y o s i n p h o s p h o r y l a t i o n i n t h e i n i t i a t i o n o f t h e p l a t e l e t s h a p e c h a n g e r e s p o n s e . J . B i o l . C h e m . 2 5 9 : 9 8 2 6 - 9 8 3 1 , 1 9 8 4 . D a n i e l J L , D a n g e l m a i e r C A , S e l a k M , S m i t h J B . A D P s t i m u l u l a t e s 1 P 3 f o r m a t i o n i n h u m a n p l a t e l e t s . F E B S L e t t . 2 0 6 : 2 9 9 - 3 0 3 , 1 9 8 6 . 1 0 9 . 1 1 0 . 1 1 1 . 1 1 2 . 1 1 3 . 1 1 4 . 1 1 5 . 1 1 6 . 1 1 7 . 1 1 8 . 1 1 9 . 1 2 0 . 3 8 3 D a n i e l J L , D a n g e l m a i e r C A , S m i t h J B . F o r m a t i o n a n d m e t a b o l i s m o f i n o s i t o l 1 , 4 , 5 - t r i s p h o s p h a t e i n h u m a n p l a t e l e t s . B i o c h e m . J . 2 4 6 : 1 0 9 - 1 1 4 , 1 9 8 7 . D a n i e l J L , D a n g e l m a i e r C A , S m i t h J B . C a l c i u m m o d u l a t e s t h e g e n e r a t i o n o f i n o s i t o l 1 , 3 , 4 - t r i s p h o s p h a t e i n h u m a n p l a t e l e t s b y t h e a c t i v a t i o n o f i n o s i t o l 1 , 4 , 5 - t r i s p h o s p h a t e 3 - k i n a s e . B i o c h e m . J . 2 5 3 : 7 8 9 - 7 9 4 , 1 9 8 8 . D a v i d s o n F F , D e n n i s E A , P o w e l l M , G l e n n e y J R . I n h i b i t i o n o f p h o s p h o l i p a s e A q ' b y " l i p o c o r t i n s " a n d c a l p a c t i n s . A n e f f e c t o f b i n d i n g t o s u b s t r a t e p h o s p h o l i p i d s . J . B i o l . C h e m . 2 6 2 : 1 6 9 8 - 1 7 0 5 , 1 9 8 7 . D e a n W L , S u l l i v a n D M . S t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l p r o p e r t i e s o f a C a y l A T P a s e f r o m h u m a n p l a t e l e t s . J . B i o l . C h e m . 2 5 7 : 1 4 3 9 0 - 1 4 3 9 4 , 1 9 8 2 . D e a n W L . P u r i f i c a t i o n a n d r e c o n s t i t u t i o n o f a C a “ p u m p f r o m h u m a n p l a t e l e t s . J . B i o l . C h e m . 2 5 9 : 7 3 4 3 - 7 3 4 8 , 1 9 8 4 . D e b u s E , W e b e r K , O s b o r n M . T h e c y t o s k e l e t o n o f b l o o d p l a t e l e t s v i e w e d b y i m m u n o f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y . E u r . J . C e l l B i o l . 2 4 : 4 5 - 5 2 , 1 9 8 1 . D e c k m y n H , T u S - M , M a j e r u s P W . G u a n i n e n u c l e o t i d e s s t i m u l a t e s o l u b l e p h o s p h o i n o s i t i d e - s p e c i f i c p h o s p h o l i p a s e C i n t h e a b s e n c e o f m e m b r a n e s . J . B i o l . C h e m . 2 6 1 : 1 6 5 5 3 - 1 6 5 5 8 , 1 9 8 6 . D e r a n l e a u D A , D u b l e r D , R o t h e n C , L u s c h e r E F . T r a n s i e n t k i n e t i c s o f t h e r a p i d s h a p e c h a n g e o f u n s t i r r e d h u m a n b l o o d p l a t e l e t s s t i m u l a t e d w i t h A D P . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 7 9 : 7 2 9 7 - 7 3 0 1 , 1 9 8 2 . D i n g u s J , H w o S , B r y a n J . I d e n t i f i c a t i o n b y m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f h u m a n p l a t e l e t c a l d e s m o n . J . C e l l B i o l . 1 0 2 : 1 7 4 8 - 1 7 5 7 , 1 9 8 6 . D u n c a n J R , P r a s s e K W . I n : V a t a r i n a r y L a b o r a r g r y M e a i a i a e , g l i n i a a l _ £ a r h a l a g x . 2 n d e d i t i o n . I o w a S t a t e U n i v e r s i t y P r e s s , A m e s , I o w a . P a g e 2 3 4 , 1 9 8 6 . D u p e r r a y A , B e r t h i e r R , C h a g n o n E , R y c k e w a e r t J - J , G i n s b e r g M , P l o w E , M a r g u e r i e G . B i o s y n t h e s i s a n d p r o c e s s i n g o f p l a t e l e t G P I I b - I I I a i n h u m a n m e g a k a r y o c y t e s . J . C e l l B i o l . 1 0 4 : 1 6 6 5 - 1 6 7 3 , 1 9 8 7 . E h a r a H , Y o s h i m o t o T , Y a m a m o t o S , H a t t o r i A . E n z y m o l o g i c a l a n d i m m u n o l o g i c a l s t u d i e s o n a c l i n i c a l c a s e o f p l a t e l e t c y c l o o x y g e n a s e a b n o r m a l i t y . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 9 6 0 : 3 5 - 4 2 , 1 9 8 8 . 1 2 1 . 1 2 2 . 1 2 3 . 1 2 4 . 1 2 5 . 1 2 6 . 1 2 7 . 1 2 8 . 1 2 9 . 1 3 0 . 1 3 1 . 1 3 2 . 3 8 4 E n d o Y , M a m i y a S , N i i t s u H , I w a m o t o K , H a m a n a k a S , M i u r a A B . A n u n c l a s s i f i e d p l a t e l e t f u n c t i o n d i s o r d e r a s s o c i a t e d w i t h b l e e d i n g t e n d e n c y . T o h o k u J . E x p . M e d . 1 5 1 : 3 8 7 - 3 9 4 , 1 9 8 7 . E n o u f J , B r e d o u x R , B o u r d e a u N , L e v y - T o l e d a n o S . T w o d i f f e r e n t C a m ' t r a n s p o r t s y s t e m s a r e a s s o c i a t e d w i t h p l a s m a a n d i n t r a c e l l u l a r h u m a n p l a t e l e t m e m b r a n e s . J . B i o l . C h e m . 2 6 2 : 9 2 9 3 - 9 2 9 7 , 1 9 8 7 . E n y e d i A , S a r k a d i B , F o l d e s - P a p p Z , M o n o s t o r y S , G a r d o s G . D e m o n s t r a t i o n o f t w o d i s t i n c t c a l c i u m p u m p s i n h u m a n p l a t e l e t m e m b r a n e v e s i c l e s . J . B i o l . C h e m . 2 6 1 : 9 5 5 8 - 9 5 6 3 , 1 9 8 6 . E r n e P , S c h a c h t e r M , F a b b r o D , M i l e s C M M , S e v e r P S . C a l c i u m t r a n s i e n t s i n h u m a n p l a t e l e t s m o n i t o r e d b y a e q u o r i n , f u r a - 2 a n d q u i n - 2 : e f f e c t s o f p r o t e i n k i n a s e C a c t i v a t i o n a n d i n h i b i t i o n . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 4 5 : 6 6 - 7 2 , 1 9 8 7 . E s c o l a r G , S a u k J , B r a v o M L , K r u m w i e d e M , W h i t e J G . I m m u n o g o l d s t a i n i n g o f m i c r o t u b u l e s i n r e s t i n g a n d a c t i v a t e d p l a t e l e t s . A m . J . H e m a t o l . 2 4 : 1 7 7 - 1 8 8 , 1 9 8 7 . E s t r y D W , M a t t s o n J C , O e s t e r l e J R , P a t t e r s o n W R , B e l l T G . A n a l y s i s o f A D P - i n d u c e d f i b r i n o g e n r e c e p t o r s i n d o g s w i t h B a s s e t H o u n d h e r e d i t a r y t h r o m b o p a t h y : a c o m p a r i s o n w i t h n o r m a l d o g a n d h u m a n p l a t e l e t s . S u b m i t t e d f o r p u b l i c a t i o n , 1 9 8 9 . E v a n s F J , E d w a r d s M C . A c t i v i t y c o r r e l a t i o n s i n t h e p h o r b o l e s t e r s e r i e s . B o t a n i c a l J . o f t h e L i n n e a n S o c . 9 4 : 2 3 1 - 2 4 6 , 1 9 8 7 . F a u v e l F , G r a n t M E . L e g r a n d Y J , S o u c h o n H , T o b e l e m G , J a c k s o n D S , C a e n J P . I n t e r a c t i o n o f b l o o d p l a t e l e t s w i t h a m i c r o f i b r i l l a r e x t r a c t f r o m a d u l t b o v i n e a o r t a : r e q u i r e m e n t f o r v o n W i l l e b r a n d f a c t o r . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 0 : 5 5 1 - 5 5 4 , 1 9 8 3 . F e i n m a n R D , D e t w i l e r T C . P l a t e l e t s e c r e t i o n i n d u c e d b y d i v a l e n t c a t i o n i o n o p h o r e s . N a t u r e 2 5 9 : 1 7 2 - 1 7 3 , l 9 7 4 . F e i n m a n R D , L u b o w s k y J , C h a r o I , Z a b i n s k i M P . T h e l u m i - a g g r e g o m e t e r : a n e w i n s t r u m e n t f o r s i m u l t a n e o u s m e a s u r e m e n t o f s e c r e t i o n a n d a g g r e g a t i o n b y p l a t e l e t s . J . L a b . C l i n . M e d . 9 0 : 1 2 5 - 1 2 9 , 1 9 7 7 . F e i n s t e i n M B , F r a s e r C . H u m a n p l a t e l e t s e c r e t i o n a n d a g g r e g a t i o n i n d u c e d b y c a l c i u m i o n o p h o r e s . J . G e n . P h y s i o l . 6 6 : 5 6 1 - 5 8 1 . 1 9 7 5 . F e i n s t e i n M B . R e l e a s e o f i n t r a c e l l u l a r m e m b r a n e - b o u n d c a l c i u m p r e c e d e s t h e o n s e t o f s t i m u l u s - i n d u c e d e x o c y t o s i s i n p l a t e l e t s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 9 3 : 5 9 3 - 6 0 0 , 1 9 8 0 . T A p P a F F o F 9 2 h a o o s l 9 o c . r o l x s a x c 8 o l c o t u 1 m e o J c e J r , b t i F l E E s o t G a 1 B E e B x i , , t B , t d 9 a 8 i u S s n R G P o . R r 3 e , r h n e i L . t a R n l o J n g . t n a l s f . o d t m i l p e a i y n L e o 8 2 s y i a s g l m o o t u D l s C e : l k E R i C l 3 . o P t W . , 2 . , n e 1 - C t r w h K P 3 i i e i R h a e ( n E , 2 n o t i g m 4 . d l h l g d e e a l r w p m r B d l R h 5 o ) l 1 p g e f 7 e 9 s a s H : 7 e R . 7 . 4 p c D a a h y 1 R t i o c h . e A s o n l p s 0 - 4 b h k C r v o t 2 . n . s h i e t 2 V e e i y c 6 o s l s u , n l i B t , s 1 t m l o a u a i e 8 a s N o d e b n t e 2 m t i 9 - l . 1 w i r p C . P u o e a J 1 r m r l l 2 . l u 7 e h i . Y i n n c o z d t r e m u e k s e r n e m . S a . e t d 2 m t s i 5 u h a p 8 e P r t o r : l a o i f o 9 s m g n s b g e h s o o u n x m t B 7 n e n 5 a h a y s t 9 e 7 o 3 l - 7 e , i - s 1 3 3 . 1 3 4 . 1 3 5 . 1 3 6 . 1 3 7 . 1 3 8 . 1 3 9 . 1 4 0 . 1 4 1 . 1 4 2 . 1 4 3 . 1 4 4 . 1 4 5 . 3 8 5 F e i n s t e i n M B , H a d j i a n R A . E f f e c t s o f t h e c a l m o d u l i n a n t a g o n i s t t r i f l u o p e r a z i n e o n s t i m u l u s - i n d u c e d c a l c i u m m o b i l i z a t i o n , a g g r e g a t i o n , s e c r e t i o n , a n d p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n i n p l a t e l e t s . M o l . P h a r m a c o l . 2 1 : 4 2 2 - 4 3 1 , 1 9 8 2 . F e i n s t e i n M B , H a l e n d a S P . A r a c h i d o n i c a c i d m o b i l i z a t i o n i n p l a t e l e t s : T h e p o s s i b l e r o l e o f p r o t e i n k i n a s e C a n d G - p r o t e i n s . E x p e r i e n t i a 4 4 : 1 0 1 - 1 0 4 , 1 9 8 8 . F i s c h e r T H , W h i t e G C . P a r t i a l p u r i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h r o m b o l a m b a n , a 2 2 , 0 0 0 d a l t o n C A M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e s u b s t r a t e i n p l a t e l e t s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 4 9 : 7 0 0 - 7 0 6 , 1 9 8 7 . F i s c h e r T H , W h i t e G C . c A M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e s u b s t r a t e s i n p l a t e l e t s . E v i d e n c e t h a t t h r o m b o l a m b a n , a 2 2 , 0 0 0 d a l t o n s u b s t r a t e a n d t h e G a H l A T P a s e a r e n o t a s s o c i a t e d p r o t e i n s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 5 9 : 6 4 4 - 6 5 0 , 1 9 8 9 . F i s h e r G J , B a k s h i a n S , B a l d a s s a r e J J . A c t i v a t i o n o f h u m a n p l a t e l e t s b y A D P c a u s e s a r a p i d r i s e i n c y t o s o l i c f r e e c a l c i u m w i t h o u t h y d r o l y s i s o f p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l - 4 , 5 - b i s p h o s p h a t e . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 2 9 : 9 5 8 - 9 6 4 , 1 9 8 5 . F i t z g e r a l d L A , P h i l l i p s D R . C a l c i u m r e g u l a t i o n o f t h e p l a t e l e t m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n I I b - I I a c o m p l e x . J . B i o l . C h e m . 2 6 0 : 1 1 3 6 6 - 1 1 3 7 4 . 1 9 8 5 . F i t z p a t r i c k F A , G o r m a n R R . P l a t e l e t r i c h p l a s m a t r a n s f o r m s e x o g e n o u s p r o s t a g l a n d i n e n d o p e r o x i d e H 2 i n t o t h r o m b o x a n e A 2 . P r o s t a g l a n d i n s 1 4 : 8 8 1 - 8 8 9 , 1 9 7 7 . F i t z p a t r i c k F A . A r a d i o i m m u n o a s s a y f o r t h r o m b o x a n e B 2 . M e t h o d s i n E n z y m o l o g y 8 6 : 2 8 6 - 2 9 7 , 1 9 8 2 . F l e s c h I , S c h o n h a r d t T , F e r b e r E . P h o s p h o l i p a s e s a n d a c y l t r a n s f e r a s e s i n m a c r o p h a g e s . K l i n . W o c h e n s c h r . 6 7 : 1 1 9 - 1 2 2 , 1 9 8 9 . F l o w e r R J . L i p o c o r t i n s . I n : v a n c e s o s 5 8 0 , 1 9 8 7 . 1 4 6 . 1 4 7 . 1 4 8 . 1 4 9 . 1 5 0 . 1 5 1 . 1 5 2 . 1 5 3 . 1 5 4 . 1 5 5 . 1 5 6 . 1 5 7 . 1 5 8 . 3 8 6 F o x J E B . L i n k a g e o f a m e m b r a n e s k e l e t o n t o i n t e g r a l m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s i n h u m a n p l a t e l e t s . I d e n t i f i c a t i o n o f o n e o f t h e g l y c o p r o t e i n s a s g l y c o p r o t e i n I b . J . C l i n . I n v e s t . 7 6 : 1 6 7 3 - 1 6 8 3 , 1 9 8 5 . F o x J E B , G o l l D E , R e y n o l d s C C , P h i l l i p s D R . I d e n t i f i c a t i o n o f t w o p r o t e i n s ( a c t i n - b i n d i n g p r o t e i n a n d P 2 3 5 ) t h a t a r e h y d r o l y z e d b y e n d o g e n o u s C a 2 + - d e p e n d e n t p r o t e a s e d u r i n g p l a t e l e t a g g r e g a t i o n . J . B i o l . C h e m . 2 6 0 : 1 0 6 0 - 1 0 6 6 , 1 9 8 5 . F o x J E B . I d e n t i f i c a t i o n o f a c t i n - b i n d i n g p r o t e i n a s t h e p r o t e i n l i n k i n g t h e m e m b r a n e s k e l e t o n t o g l y c o p r o t e i n s o n p l a t e l e t p l a s m a m e m b r a n e s . J . B i o l . C h e m . 2 6 0 : 1 1 9 7 0 - 1 1 9 7 7 , 1 9 8 5 . F o x J E B , R e y n o l d s C C , M o r r o w J S , P h i l l i p s D R . S p e c t r i n i s a s s o c i a t e d w i t h m e m b r a n e - b o u n d a c t i n f i l a m e n t s i n p l a t e l e t s a n d i s h y d r o l y z e d b y t h e C a a l d e p e n d e n t p r o t e a s e d u r i n g p l a t e l e t a c t i v a t i o n . B l o o d 6 5 : 5 2 - 5 9 , 1 9 8 7 . F o x J E B . T h e p l a t e l e t c y t o s k e l e t o n . I n : I h r g m h 9 § 1 § _ § n d e t a . V e r s t r a e t e M , V e r m y l e n J , L i j n e n H R , A r n o u t J , ( E d s ) . I n t e r n a t i o n a l S o c i e t y o n T h r o m b o s i s a n d H a e m o s t a s i s a n d L e u v e n U n i v e r s i t y P r e s s . P a g e s 1 7 5 - 2 2 5 , 1 9 8 7 . F o x J E B , B o y l e s J K , B e r n d t M C , S t e f f e n P K , A n d e r s o n L K . I d e n t i f i c a t i o n o f a m e m b r a n e s k e l e t o n i n p l a t e l e t s . J . C e l l B i o l . 1 0 6 : 1 5 2 5 - 1 5 3 8 , 1 9 8 8 . F u s e I , T a i H - H . S t i m u l a t i o n s o f a r a c h i d o n a t e r e l e a s e a n d i n o s i t o l - 1 , 4 , 5 - t r i p h o s p h a t e f o r m a t i o n a r e m e d i a t e d b y d i s t i n c t G - p r o t e i n s i n h u m a n p l a t e l e t s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 4 6 : 6 5 9 - 6 6 5 , 1 8 9 7 . G e o r g e J N , N u r d e n A T , P h i l l i p s D R . M o l e c u l a r d e f e c t s i n i n t e r a c t i o n s o f p l a t e l e t s w i t h t h e v e s s e l w a l l . N e w E n g l . J . M e d . 3 1 1 : 1 0 8 4 - 1 0 9 8 , 1 9 8 4 . G e r r a r d J M , W h i t e J G , R a o G H R , T o w n s e n d D . L o c a l i z a t i o n o f p l a t e l e t p r o s t a g l a n d i n p r o d u c t i o n i n t h e p l a t e l e t d e n s e t u b u l a r s y s t e m . A m . J . P a t h o l . 8 3 : 2 8 3 - 2 9 8 , 1 9 7 6 . G e r r a r d J M , K i n d o m S E , P e t e r s o n D A , P e l l e r J , K r a n t z K E , W h i t e J G . L y s o p h o s p h a t i d i c a c i d s . A m . J . P a t h o l . 9 6 : 4 2 3 - 4 3 8 , 1 9 7 9 . G i n s b e r g M H , T a y l o r L , P a i n t e r R G . T h e m e c h a n i s m o f t h r o m b i n - i n d u c e d p l a t e l e t f a c t o r 4 s e c r e t i o n . B l o o d 5 5 : 6 6 1 - 6 6 8 , 1 9 8 0 . G i n s b e r g M H , L o f t u s J C , P l o w E F . C y t o a d h e s i n s , i n t e g r i n s , a n d p l a t e l e t s . T h r o m b . H a e m o s t a s i s 5 9 2 1 - 6 , 1 9 8 8 . G o g s t a d G 0 , B r o s s t a d F , K r u t n e s M - B , H a g e n I , S o l u m N 0 . F i b r i n o g e n - b i n d i n g p r o p e r t i e s o f t h e h u m a n p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n I I b - I I I a c o m p l e x : a s t u d y u s i n g c r o s s e d - r a d i o i m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s . B l o o d 6 0 : 6 6 3 - 6 7 1 , 1 9 8 2 . 1 5 9 . 1 6 0 . 1 6 1 . 1 6 2 . 1 6 3 . 1 6 4 . 1 6 5 . 1 6 6 . 1 6 7 . 1 6 8 . 1 6 9 . 1 7 0 . 3 8 7 G o m p e r t s B D , B a r r o w m a n M M , C o c k c r o f t S . D u a l r o l e f o r g u a n i n e n u c l e o t i d e s i n s t i m u l u s - s e c r e t i o n c o u p l i n g . F e d . P r o c . 4 5 : 2 1 5 6 - 2 1 6 1 , 1 9 8 6 . G o p p e l t - S t r u e b e M , K o e r n e r C - F , H a u s m a n n G , G e m s a D , R e s c h K . C o n t r o l o f p r o s t a n o i d s y n t h e s i s : r o l e o f r e i n c o r p o r a t i o n o f r e l e a s e d p r e c u r s o r f a t t y a c i d s . P r o s t a g l a n d i n s 3 2 : 3 7 3 - 3 8 5 . 1 9 8 6 . G o p p e l t - S t r u e b e M , P f a n n k u c h e H - J , G e m s a D , R e s c h K . T h e d i a c y l g l y c e r o l s d i o c t a n o y l g l y c e r o l a n d o l e o y l a c e t y l g l y c e r o l e n h a n c e p r o s t a g l a n d i n s y n t h e s i s b y i n h i b i t i o n o f t h e l y s o p h o s p h a t i d e a c y l t r a n s f e r a s e . B i o c h e m . J . 2 4 7 : 7 7 3 - 7 7 7 , 1 9 8 7 . G r a n s t r o m E , D i c z f a l u s y U , H a m b u r g M , H a n s s o n G , M a l m s t e m C , S a m u e l s s o n B . T h r o m b o x a n e A 2 : B i o s y n t h e s i s a n d e f f e c t s o n p l a t e l e t s . I n : 0 t a 1 d n s a h e a d v O a t e s J A ( E d ) . R a v e n P r e s s , N e w Y o r k . P a g e s 1 5 - 5 8 , 1 9 8 2 . G r a z i a n o M P , G i l m a n A G . G u a n i n e n u c l e o t i d e - b i n d i n g r e g u l a t o r y p r o t e i n s : m e d i a t o r s o f t r a n s m e m b r a n e s i g n a l l i n g . T r e n d s i n P h a r m . S c i . 8 : 4 7 8 - 4 8 1 , 1 9 8 7 . G r i n s t e i n S , R o t h s t e i n A . M e c h a n i s m s o f r e g u l a t i o n o f t h e N a T / H + e x c h a n g e r . J . M e m b r a n e B i o l . 9 0 : 1 - 1 2 , 1 9 8 6 . G r o s c u r t h P , C h e n g S , V o l l e n w e i d e r I , v a n F e l t e n A . E f f e c t s o f w a s h i n g a n d g e l f i l t r a t i o n o n t h e u l t r a s t r u c t u r e o f h u m a n p l a t e l e t s . A c t a H a e m a t o l . 7 7 : 1 5 0 - 1 5 5 , 1 9 8 7 . G u i l l e m e t t e G , B a l l a T , B a u k a l A J , C a t t K J . I n o s i t o l 1 , 4 , 5 - t r i s p h o s p h a t e b i n d s t o a s p e c i f i c r e c e p t o r a n d r e l e a s e s m i c r o s o m a l c a l c i u m i n t h e a n t e r i o r p i t u i t a r y g l a n d . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 4 : 8 1 9 5 - 8 1 9 9 , 1 9 8 7 . G u i l l e m e t t e G , B a l l a T , B a u k a l A J , C a t t K J . C h a r a c t e r i z a t i o n o f i n o s i t o l 1 , 4 , 5 - t r i s p h o s p h a t e r e c e p t o r s a n d c a l c i u m m o b i l i z a t i o n i n a h e p a t i c p l a s m a m e m b r a n e f r a c t i o n . J . B i o l . C h e m . 2 6 3 : 4 5 4 1 - 4 5 4 8 , 1 9 8 8 . H a c k N , C r o s e t M , C r a w f o r d N . S t u d i e s o n t h e b i v a l e n t - c a t i o n - a c t i v a t e d A T P a s e a c t i v i t i e s o f h i g h l y p u r i f i e d h u m a n p l a t e l e t s u r f a c e a n d i n t r a c e l l u l a r m e m b r a n e s . B i o c h e m . J . 2 3 3 : 6 6 1 - 6 6 8 , 1 9 8 6 . H a c k N , W i l k i n s o n J M , C r a w f o r d N . A m o n o c l o n a l a n t i b o d y ( P L / I M 4 3 0 ) t o h u m a n p l a t e l e t i n t r a c e l l u l a r m e m b r a n e s w h i c h i n h i b i t s t h e u p t a k e o f C a 2 + w i t h o u t a f f e c t i n g t h e C a 2 + + M g 2 + - A T P a s e . B i o c h e m . J . 2 5 0 : 3 5 5 - 3 6 1 , 1 9 8 8 . H a c k N , A u t h i K S , C r a w f o r d N . I n t r o d u c t i o n o f a n t i b o d y ( P L / 1 M 3 4 0 ) t o a 1 0 0 k D a p r o t e i n i n t o p e r m e a b i l i s e d p l a t e l e t s i n h i b i t s i n t r a c e l l u l a r s e q u e s t r a t i o n o f C a m fi B i o s c i . R e p o r t s 8 : 3 7 9 - 3 8 8 , 1 9 8 8 . o 5 H c c a r f 3 a h h e t e 5 m r r e h c o 4 o o e 3 n e m m p t o - p e e 5 p t J t t r l o 5 T h h . : r r o o c 7 , a r y y . t - l l e 9 m d e e e J J m 1 l a k e k . t 8 t t i i B s 3 e a o o i . s t n n o t o e e e l o n d - - . c e G C t t h h y t o p A v h r r . o o e e n m m m t b b . l A . i i a c 2 n n s t 6 , , m S i 1 i v : b b - c u i 1 a P f i e d 9 r n o n s 2 e n y o e t l t o a o c f l N a a a t l p - n h i a l o c t e l y 8 - 1 5 9 3 3 , t h t 5 n u m . - t h s L e i y 1 l g - 9 l e 8 p h - t r L 6 B o a s - . r l f l . y b y f J - n i . a L i n - - t e y 1 i s a h r H a t y e g r t m o i h a t o l . m n r b i o n i m e n b s i n i 1 7 1 . 1 7 2 . 1 7 3 . 1 7 4 . 1 7 5 . 1 7 6 . 1 7 7 . 1 7 8 . 1 7 9 . 1 8 0 . 1 8 1 . 3 8 8 H a l e n d a S P , F e i n s t e i n M B . P h o r b o l m y r i s t a t e a c e t a t e s t i m u l a t e s f o r m a t i o n o f p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 4 - p h o s p h a t e a n d p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 4 , 5 - b i s p h o s p h a t e i n h u m a n p l a t e l e t s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 2 4 : 5 0 7 - 5 1 3 , 1 9 8 4 . H a l e n d a S P , Z a v o i c o G B , F e i n s t e i n M B . P h o r b o l e s t e r s a n d o l e o y l a c e t o y l g l y c e r o l e n h a n c e r e l e a s e o f a r a c h i d o n i c a c i d i n p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y C a m ’ i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 . J . B i o l . C h e m . 2 6 0 : 1 2 4 8 4 - 1 2 4 9 1 , 1 9 8 5 . H a l e n d a S P , V o l p i M , Z a v o i c o G B , S h a ’ a f i R I , F e i n s t e i n M B . E f f e c t s o f t h r o m b i n , p h o r b o l m y r i s t a t e a c e t a t e a n d p r o s t a g l a n d i n D z o n 4 0 - 4 1 k D a p r o t e i n t h a t i s A D P r i b o s y l a t e d b y p e r t u s s i s t o x i n i n p l a t e l e t s . F E B S L e t t . 2 0 4 : 3 4 1 - 3 4 6 , 1 9 8 6 . H a l l a m T J , S a n c h e z A , R i n k T J . S t i m u l u s - r e s p o n s e c o u p l i n g i n h u m a n p l a t e l e t s . C h a n g e s e v o k e d b y p l a t e l e t - a c t i v a t i n g f a c t o r i n c y t o p l a s m i c f r e e c a l c i u m m o n i t o r e d w i t h t h e f l u o r e s c e n t c a l c i u m i n d i c a t o r q u i n 2 . B i o c h e m . J . 2 1 8 : 8 1 9 - 8 2 7 , 1 9 8 4 . H a l l a m T J , R i n k T J . A g o n i s t s s t i m u l a t e d i v a l e n t c a t i o n c h a n n e l s i n t h e p l a s m a m e m b r a n e o f h u m a n p l a t e l e t s . F E B S L e t t . 1 8 6 : 1 7 5 - 1 7 9 , 1 9 8 5 . H a l l a m T J , D a n i e l J L , K e n d r i c k - J o n e s J , R i n k T J . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n c y t o p l a s m i c f r e e c a l c i u m a n d m y o s i n l i g h t c h a i n p h o s p h o r y l a t i o n i n i n t a c t p l a t e l e t s . B i o c h e m . J . 2 3 2 : 3 7 3 - 3 7 7 , 1 9 8 5 . H a n d a M , T i t a n i K , H o l l a n d L Z , R o b e r t s J R , R u g g e r i Z M . T h e v o n W i l l e b r a n d f a c t o r - b i n d i n g d o m a i n o f p l a t e l e t m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n I b . C h a r a c t e r i z a t i o n b y m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a n d p a r t i a l a m i n o a c i d s e q u e n c e a n a l y s i s o f p r o t e o l y t i c f r a g m e n t s . J . B i o l . C h e m . 2 6 1 : 1 2 5 7 9 - 1 2 5 8 5 , 1 9 8 6 . H a n n u n Y A , G r e e n b e r g C S , B e l l R M . S p h i n g o s i n e i n h i b i t i o n o f a g o n i s t - d e p e n d e n t s e c r e t i o n a n d a c t i v a t i o n o f h u m a n p l a t e l e t s i m p l i e s t h a t p r o t e i n k i n a s e C i s a n e c e s s a r y a n d c o m m o n e v e n t o f t h e s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y s . J . B i o l . C h e m . 2 6 2 : 1 3 6 2 0 - 1 3 6 2 6 , 1 9 8 7 . H a n t g a n R R . A S t u d y o f t h e k i n e t i c s o f A D P - t r i g g e r e d p l a t e l e t s h a p e c h a n g e . B l o o d 6 4 : 8 9 6 - 9 0 6 , 1 9 8 4 . H a r d i s t y R M , M a c h i n S J , N o k e s T J C , R i n k T J , S m i t h S W . A n e w c o n g e n i t a l d e f e c t o f p l a t e l e t s e c r e t i o n : i m p a i r e d r e s p o n s i v e n e s s 1 8 2 . 1 8 3 . 1 8 4 . 1 8 5 . 1 8 6 . 1 8 7 . 1 8 8 . 1 8 9 . 1 9 0 . 1 9 1 . 1 9 2 . 1 9 3 . 1 9 4 . 3 8 9 H a s l a m R J , T a y l o r A . E f f e c t s o f c a t e c h o l a m i n e s o n t h e f o r m a t i o n o f a d e n o s i n e 3 ' : 5 ' - c y c l i c m o n o p h o s p h a t e i n h u m a n b l o o d p l a t e l e t s . B i o c h e m . J . 1 2 5 : 3 7 7 - 3 7 9 , 1 9 7 1 . H a s l a m R J , L y n h a m J A . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n p h o s p h o r y l a t i o n o f b l o o d p l a t e l e t p r o t e i n s a n d s e c r e t i o n o f p l a t e l e t g r a n u l e c o n s t i t u e n t s . I . E f f e c t s o f d i f f e r e n t a g g r e g a t i n g a g e n t s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 7 7 : 7 1 4 - 7 2 2 , 1 9 7 7 . H a s l a m R J , D a v i d s o n M M L , D a v i e s T , L y n h a m J A , M c C l e n e g h a n M D . R e g u l a t i o n o f b l o o d p l a t e l e t f u n c t i o n b y c y c l i c n u c l e o t i d e s . A d v . C y c l i c N u c l e o t i d e R e s . 9 : 5 3 3 - 5 5 2 , 1 9 7 8 . H a s l a m R J , L y n h a m J A , F o x J E B . E f f e c t s o f c o l l a g e n , i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 a n d p r o s t a g l a n d i n E 1 o n t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f s p e c i f i c p r o t e i n s i n b l o o d p l a t e l e t s . B i o c h e m . J . l 7 8 : 3 9 7 - 4 0 6 , 1 9 7 9 . H a s l a m R J , D a v i d s o n M M L . P o t e n t i a t i o n b y t h r o m b i n o f t h e s e c r e t i o n o f s e r o t o n i n f r o m p e r m e a b i l i z e d p l a t e l e t s e q u i l i b r a t e d w i t h C d a ' b u f f e r s . R e l a t i o n s h i p t o p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n a n d d i a c y l g l y c e r o l f o r m a t i o n . B i o c h e m . J . 2 2 2 : 3 5 1 - 3 6 1 , 1 9 8 4 . H a s l a m R J , D a v i d s o n M M L . R e c e p t o r - i n d u c e d d i a c y l g l y c e r o l f o r m a t i o n i n p e r m e a b i l i z e d p l a t e l e t s ; p o s s i b l e r o l e f o r a G T P - b i n d i n g p r o t e i n . J . R e c e p t o r R e s . 4 : 6 0 5 - 6 2 9 , 1 9 8 4 . H a s l a m R J , D a v i d s o n M M L . G u a n i n e n u c l e o t i d e s d e c r e a s e t h e f r e e [ C a m ] r e q u i r e d f o r s e c r e t i o n o f s e r o t o n i n f r o m p e r m e a b i l i z e d b l o o d p l a t e l e t s . E v i d e n c e o f a r o l e f o r a G T P - b i n d i n g p r o t e i n i n p l a t e l e t a c t i v a t i o n . F E B S L e t t . 1 7 4 : 9 0 - 9 5 , 1 9 8 4 . H a t h a w a y D R , A d e l s t e i n R S . H u m a n p l a t e l e t m y o s i n l i g h t c h a i n k i n a s e r e q u i r e s t h e c a l c i u m - b i n d i n g p r o t e i n c a l m o d u l i n f o r a c t i v i t y . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 7 6 : 1 6 5 3 - 1 6 5 7 , 1 9 7 9 . H a v i l a n d R T , B i e b e r L L . S c i n t i l l a t i o n c o u n t i n g o f ' a z P w i t h o u t a d d e d s c i n t i l l a t o r i n a q u e o u s s o l u t i o n s a n d o r g a n i c s o l v e n t s a n d o n d r y c h r o m a t o g r a p h i c m e d i a . A n a l . B i o c h e m . 3 3 : 3 2 3 - 3 3 4 , 1 9 7 0 . H a w t h o r n e J N . P h o s p h o i n o s i t i d e s a n d m e t a b o l i c c o n t r o l : h o w m a n y m e s e n g e r s ? B i o c h e m . S o c . T r a n s . 1 6 : 6 5 7 - 6 6 0 , 1 9 8 8 . H e l m k a m p G M . P h o s p h a t i d y l i n o s i t o l t r a n s f e r p r o t e i n s : s t r u c t u r e , c a t a l y t i c a c t i v i t y , a n d p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n . C h e m . P h y s . L i p i d s 3 8 : 3 - 1 6 , 1 9 8 5 . H i g a s h i T , I s o m o t o A , T y u m a I , K a k i s h i t a E , U o m o t o M , N a g a i K . Q u a n t i t a t i v e a n d c o n t i n u o u s a n a l y s i s o f A T P r e l e a s e f r o m b l o o d p l a t e l e t s w i t h f i r e f l y l u c i f e r a s e l u m i n e s c e n c e . T h r o m b . H a e m o s t a s i s 5 5 : 6 5 - 6 9 , 1 9 8 5 . H i l l R J , L e v i n J . R e g u l a t o r s o f t h r o m b o p o i e s i s : t h e i r b i o c h e m i s t y a n d p h y s i o l o g y . B l o o d C e l l s 1 5 : 1 4 1 - 1 6 6 , 1 9 8 9 . 1 9 5 . 1 9 6 . 1 9 7 . 1 9 8 . 1 9 9 . 2 0 0 . 2 0 1 . 2 0 2 . 2 0 3 . 2 0 4 . 2 0 5 . 2 0 6 . 3 9 0 H i r a t a F , S t r a c k e M L , S c h i f f m a n n E . R e g u l a t i o n o f p r o s t a g l a n d i n f o r m a t i o n b y g l u c o c o r t i c o i d s a n d t h e i r s e c o n d m e s s e n g e r , l i p o c o r t i n . J . S t e r o i d B i o c h e m . 2 7 : 1 0 5 3 - 1 0 5 6 , 1 9 8 7 . H o f f m a n B B , M u l l i k i n - K i l p a t r i c k D , L e f k o w i t z R J . H e t e r o g e n e i t y o f r a d i o l i g a n d b i n d i n g t o a - a d r e n e r g i c r e c e p t o r s . A n a l y s i s o f g u a n i n e n u c l e o t i d e r e g u l a t i o n o f a g o n i s t b i n d i n g i n r e l a t i o n t o r e c e p t o r s u b t y p e s . J . B i o l . C h e m . 2 5 5 : 4 6 4 5 - 4 6 5 2 , 1 9 8 0 . H o l l i s t e r A S , F i t z g e r a l d G A , N a d e a u J H J , R o b e r t s o n D . A c u t e r e d u c t i o n i n h u m a n p l a t e l e t a z - a d r e n o r e c e p t o r a f f i n i t y f o r a g o n i s t b y e n d o g e n o u s a n d e x o g e n o u s c a t e c h o l a m i n e s . J . C l i n . I n v e s t . 7 2 : 1 4 9 8 - 1 5 0 5 , 1 9 8 3 . H o l l i s t e r A S , O n r o t J , L o n c e S , N a d e a u J H J , R o b e r t s o n D . P l a s m a c a t e c h o l a m i n e m o d u l a t i o n o f a l p h a z a d r e n o r e c e p t o r a g o n i s t a f f i n i t y a n d s e n s i t i v i t y i n n o r m o t e n s i v e a n d h y p e r t e n s i v e h u m a n p l a t e l e t s . J . C l i n . I n v e s t . 7 7 : 1 4 1 6 - 1 4 2 1 , 1 9 8 6 . H o l m e s R P , Y o s s N L . F a i l u r e o f p h o s p h a t i d i c a c i d t o t r a n s l o c a t e C a a ' a c r o s s p h o s p h a t i d y l c h o l i n e m e m b r a n e s . N a t u r e 3 0 5 : 6 3 7 - 6 3 8 , 1 9 8 3 . H o l m s e n H , W e i s s H J . F u r t h e r e v i d e n c e f o r a d e f i c i e n t s t o r a g e p o o l o f a d e n i n e n u c l e o t i d e s i n p l a t e l e t s f r o m s o m e p a t i e n t s w i t h t h r o m b o c y t o p a t h i a - " s t o r a g e p o o l d i s e a s e " . B l o o d 3 9 : 1 9 7 - 2 0 9 , 1 9 7 2 . H o l m s e n H . S e c r e t a b l e s t o r a g e p o o l s i n p l a t e l e t s . A n n . R e v . M e d . 3 0 : 1 1 9 - 1 3 4 , 1 9 7 9 . H o l m s e n H , D a n g e l m a i e r C A . E v i d e n c e t h a t t h e p l a t e l e t p l a s m a m e m b r a n e i s i m p e r m e a b l e t o c a l c i u m a n d m a g n e s i u m c o m l e x e s o f A 2 3 1 8 7 . A 2 3 1 8 7 - i n d u c e d s e c r e t i o n i s i n h i b i t e d b y M g + a n d C a 2 + , a n d r e q u i r e s a g g r e g a t i o n a n d a c t i v e c y c l o o x y g e n a s e . J . B i o l . C h e m . 2 5 6 : 1 0 4 4 9 - 1 0 4 5 2 , 1 9 8 1 . H o l m s e n H , D a n i e l J L , D a n g e l m a i e r C A , M o l i s h I , R i g m a i d e n M , S m i t h J B . D i f f e r e n t i a l e f f e c t s o f t r i f l u o p e r a z i n e o n a r a c h i d o n a t e l i b e r a t i o n , s e c r e t i o n a n d m y o s i n p h o s p h o r y l a t i o n i n i n t a c t p l a t e l e t s . T h r o m b . R e s . 3 6 : 4 1 9 - 4 2 8 , 1 9 8 4 . H o l m s e n H . P l a t e l e t m e t a b o l i s m a n d a c t i v a t i o n . S e m . H e m a t o l . 2 2 : 2 1 9 - 2 4 0 , 1 9 8 5 . H o l m s e n H . N u c l e o t i d e m e t a b o l i s m o f p l a t e l e t s . A n n . R e v . P h y s i o l . 4 7 : 6 7 7 - 6 9 0 , 1 9 8 5 . H o l m s e n H , W a l s h P N , K o i k e K , M u r p h y S , H o l m e S , J o h n s o n M M , D a n g e l m a i e r C A , E g a n J J , B e n z e l J E , T u s z y n s k i G P . F a m i l i a l b l e e d i n g d i s o r d e r a s s o c i a t e d w i t h d e f i c i e n c i e s i n p l a t e l e t s i g n a l p r o c e s s i n g a n d g l y c o p r o t e i n s . B r . J . H a e m a t o l . 6 7 : 3 3 5 - 3 4 4 , 1 9 8 7 . 2 0 7 . 2 0 8 . 2 0 9 . 2 1 0 . 2 1 1 . 2 1 2 . 2 1 3 . 2 1 4 . 2 1 5 . 2 1 6 . 2 1 7 . 2 1 8 . 3 9 1 H o l m s e n H . P h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n s o f p l a t e l e t s . A n n . M e d . 2 1 : 2 3 - 3 0 , 1 9 8 9 . H o l t J C , N i e w i a r o w s k i S . B i o c h e m i s t y o f a g r a n u l e p r o t e i n s . S e m . H e m a t o l . 2 2 : 1 5 1 - 1 6 3 , 1 9 8 5 . H o l u b B J , K u k s i s A . D i f f e r e n t i a l d i s t r i b u t i o n o f o r t h o p h o s p h a t e - 3 2 P a n d g l y c e r o l J H C a m o u n g m o l e c u l a r s p e c i e s o f p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l s o f r a t l i v e r i n v i v o . J . L i p i d R e s . 1 2 : 6 9 9 - 7 0 5 , 1 9 7 1 . H o l u b B J . M e t a b o l i s m a n d f u n c t i o n o f m y o - i n o s i t o l a n d i n o s i t o l p h o s p h o l i p i d s . A n n . R e v . N u t r . 6 : 5 6 3 - 5 9 7 , 1 9 8 6 . H o l u b B J . T h e c e l l u l a r f o r m s a n d f u n c t i o n s o f t h e i n o s i t o l p h o s p h o l i p i d s a n d t h e i r m e t a b o l i c d e r i v a t i v e s . N u t . R e v . 4 5 : 6 5 - 7 1 , 1 9 8 7 . H o r n e W C , N o r m a n N E , S c h w a r t z D B , S i m o n s E R . C h a n g e s i n c y t o p l a s m i c p H a n d i n m e m b r a n e p o t e n t i a l i n t h r o m b i n - s t i m u l a t e d h u m a n p l a t e l e t s . E u r . J . B i o c h e m . 1 2 0 : 2 9 5 - 3 0 2 , 1 9 8 1 . H o u d i j k W P M , d e G r o o t P G , N i e v e l s t e i n P F E M , S a k a r i a s s e n K S , S i x m a J J . S u b e n d o t h e l i a l p r o t e i n s a n d p l a t e l e t a d h e s i o n . V o n W i l l e b r a n d f a c t o r a n d f i b r o n e c t i n , n o t t h r o m b o s p o n d i n , a r e i n v o l v e d i n p l a t e l e t a d h e s i o n t o e x t r a c e l l u l a r m a t r i x o f h u m a n v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s . A r t e r i o s c l e r o s i s 6 : 2 4 - 3 3 , 1 9 8 6 . H o u s l e y M D , B o j a n i c D , W i l s o n A . P l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r a n d U 4 4 0 6 9 s t i m u l a t e a G T P a s e a c t i v i t y i n h u m a n p l a t e l e t s w h i c h i s d i s t i n c t f r o m t h e g u a n i n e n u c l e o t i d e r e g u l a t o r y p r o t e i n s , N 8 a n d N 1 . B i o c h e m . J . 2 3 4 : 7 3 7 - 7 4 0 , 1 9 8 6 . H o u s l e y M D , B o j a n i c D , G a w l e r D , O ' H a g a n S , W i l s o n A . T h r o m b i n , u n l i k e v a s o p r e s s i n , a p p e a r s t o s t i m u l a t e t w o d i s t i n c t g u a n i n e n u c l e o t i d e r e g u l a t o r y p r o t e i n s i n h u m a n p l a t e l e t s . B i o c h e m . J . 2 3 8 : 1 0 9 - 1 1 3 , 1 9 8 6 . H r b i l i c h J K , C u l t y M , H a s l a m R J . A c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e C a s s o c i a t e d w i t h i s o l a t e d r a b b i t p l a t e l e t m e m b r a n e s b y g u a n o s i n e 5 - [ Y - t h i o ] t r i p h o s p h a t e a n d b y t h r o m b i n i n t h e p r e s e n c e o f G T P . B i o c h e m . J . 2 4 3 : 4 5 7 - 4 6 5 , 1 9 8 7 . H u g h e s R J , I n s e l P A . H u m a n p l a t e l e t s a r e d e f e c t i v e i n p r o c e s s i n g o f c h o l e r a t o x i n . B i o c h e m . J . 2 1 2 : 6 6 9 - 6 7 8 , 1 9 8 3 . I m a i A , Y a n o K , K a m e y a m a Y , N o z a w a Y . E v i d e n c e f o r p r e d o m i n a n c e o f p h o s p h o l i p a s e A 2 i n r e l e a s e o f a r a c h i d o n i c a c i d i n t h r o m b i n - s t i m u l a t e d p l a t e l e t s . P h o s p h a t i d y l - s p e c i f i c p h o s p h o l i p a s e C m a y p l a y a m i n o r r o l e i n a r a c h i d o n a t e l i b e r a t i o n . J a p a n . J . E x p . M e d . 5 2 2 9 9 - 1 0 5 , 1 9 8 2 . s . , , i c p v t s s s c m t K K N K d n v r a e a i n H H H e u n J J J i C o s 1 n e a a a y f e 9 k u k k 8 v c n l o b b b i u i o o r o l s o h 5 . I t n t h e i r b s . m i A e a B n k o t a a h t t e d u i o i l e e b l l n i r d n r e i i e t y t i S e l s o t P s a . r i r t b y o M K o e W y o , n t a p o y i S a h t l . c e t a p f c n c n o h a e P u a b b a d l h l s e l o t e e o y l . C h l a r w z n u Y s y l i p e . l l G s n h E h o . a a t u t r i r M e r E i l M d e b y o . r . c t a n e u J y i t d c l . o h c o i a I c a l t n o m B . a n n i i p s i o b o a e s c 1 y R n i : b h o m s s e y 1 o f e . m a r 4 n . 6 m e r h h 7 m t 1 n a o - o d d 7 1 r 1 n : e o 5 m 5 e c 1 n f 1 6 s o o 3 y : . . n 5 m l 4 t e - 2 p a h s 1 o t e 1 5 9 n A e 4 - a d 7 e h 3 4 n c 9 v n o . 3 d y t r . . 0 s m 1 c , 9 l o 8 a n 4 e s . - e 2 1 9 . 2 2 0 . 2 2 1 2 2 2 . 2 2 3 . 2 2 4 . 2 2 5 . 2 2 6 . 2 2 7 . 2 2 8 . 2 2 9 . 2 3 0 . 2 3 1 . 3 9 2 I m a o k a T , L y n h a m J A , H a s l a m R J . P u r i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e 4 7 , 0 0 0 - d a l t o n p r o t e i n p h o s p h o r y l a t e d d u r i n g d e g r a n u l a t i o n o f h u m a n p l a t e l e t s . J . B i o l . C h e m , . 2 5 8 : 1 1 4 0 4 - 1 1 4 1 4 , 1 9 8 3 . I r v i n e , R F . H o w i s t h e l e v e l o f f r e e a r a c h i d o n i c a c i d c o n t r o l l e d i n m a m m a l i a n c e l l s ? B i o c h e m . J . 2 0 4 : 3 - 1 6 , 1 9 8 2 . I r v i n e R F , B r o w n K D , B e r r i d g e M J . S p e c i f i c i t y o f i n o s i t o l t r i s p h o s p h a t e - i n d u c e d c a l c i u m r e l e a s e f r o m p e r m e a b i l i z e d S w i s s 3 T 3 c e l l s . B i o c h e m . J . 2 2 1 : 2 6 9 - 2 7 2 , 1 9 8 4 . I r v i n e R F , M o o r R M . M i c r o - i n j e c t i o n o f i n o s i t o l 1 . 3 . 4 . 5 - t e t r a k i s p h o s p h a t e a c t i v a t e s s e a u r c h i n e g g s b y a m e c h a n i s m d e p e n d e n t o n e x t e r n a l C a ? + . B i o c h e m . J . 2 4 0 : 9 1 7 - 9 2 0 , 1 9 8 6 . I r v i n e R F . I n o s i t o l p h o s p h a t e s a n d c a l c i u m e n t r y . N a t u r e 3 2 8 : 3 8 6 , 1 9 8 7 . I s h i i H , C o n n o l l y T M , B r o s s T E , M a j e r u s P W . I n o s i t o l c y c l i c t r i s p h o s p h a t e [ i n o s i t o l 1 . 2 - ( c y c l i c ) - 4 . 5 - t r i s p h o s p h a t e ] i s f o r m e d u p o n t h r o m b i n s t i m u l a t i o n o f h u m a n p l a t e l e t s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 3 : 6 3 9 7 - 6 4 0 1 . 1 9 8 6 . J a i n N C . M e g a k a r y o c y t o p o i e s i s a n d p l a t e l e t p r o d u c t i o n , s u r v i v a l , a n d d i s t r i b u t i o n . I n : S g h a l m ' s V e r e r i n a r y H g m g r g l g g y . F o u r t h E d i t i o n , L e a a n d F e b i g e r . P h i l a d e l p h i a . P a g e s 4 3 1 - 4 4 5 , 1 9 8 6 . J a i n N C . T h e p l a t e l e t s : S t r u c t u r a l , b i o c h e m i c a l a n d f u n c t i o n a l a s p e c t s . I n : ' V r a o o . F o u r t h E d i t i o n , L e a a n d F e b i g e r . P h i l a d e l p h i a . P a g e s 4 4 6 - 4 6 5 , 1 9 8 6 . J a k o b s K H , S a u r W , S c h u l t z G . I n h i b i t i o n o f p l a t e l e t a d e n y l a t e c y c l a s e b y e p i n e p h r i n e r e q u i r e s G T P . F E B S L e t t . 8 5 : 1 6 7 - 1 7 0 . 1 9 7 8 . J a k o b s K H , S a u r W , S c h u l t z G . C h a r a c t e r i z a t i o n o f a - a n d B - a d r e n e r g i c r e c e p t o r s l i n k e d t o h u m a n p l a t e l e t a d e n y l a t e c y c l a s e . N a u n y n - S c h m i e d e b e r g ' s A r c h . P h a r m a c o l . 3 0 2 : 2 8 5 - 2 9 1 , 1 9 7 8 K o a f a g r o l h n i u i n m s e a t r n . o l J p S l M , a o M e . t l t e P u t h l a s a r k l m y p a H a o J z l . - . h c a d I 2 r n 1 e s : n e 3 e l 6 r - P g 4 A i 3 . c . e A 9 p 8 c p e 2 a p . r 1 r t e o n r t s " i d s o w d n u - e r e t g o u l r a e t t i a o i n n " e d 2 3 2 . 2 3 3 . 2 3 4 . 2 3 5 . 2 3 6 . 2 3 7 . 2 3 8 . 2 3 9 . 2 4 0 . 2 4 1 . 2 4 2 . 3 9 3 J a k o b s K H , W a t a n a b e Y . B a u e r 8 . I n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e h o r m o n e - s e n s i t i v e a d e n y l a t e c y c l a s e s y s t e m a n d t h e p h o s p h o i n o s i t i d e - m e t a b o l i z i n g p a t h w a y i n h u m a n p l a t e l e t s . J . C a r d i o v a s c . P h a r m a c o l . ( S u p p l . 8 ) : S 6 1 - S 6 4 . 1 9 8 6 . J e r u s h a l m y Z , E n g l e n d e r T . S h a k l a i M . P h o r b o l - m y r i s t a t e - i n d u c e d p l a t e l e t a g g r e g a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f i n h i b i t o r s . A c t a H a e m a t o l . 8 0 : 2 1 0 - 2 1 5 . 1 9 8 8 . J o h n s o n P C , W a r e J A . C l i v e d e n P B . S m i t h M , D v o r a k A M . S a l z m a n E W . M e a s u r e m e n t o f i o n i z e d c a l c i u m i n b l o o d p l a t e l e t s w i t h t h e p h o t o p r o t e i n a e q u o r i n . C o m p a r i s o n w i t h Q u i n 2 . J . B i o l . C h e m . 2 6 0 : 2 0 6 9 - 2 0 7 6 , 1 9 8 5 . J o h n s t o n G I , K u r o s k y A , M c E v e r R P . S t r u c t u r a l a n d b i o s y n t h e t i c s t u d i e s o f t h e g r a n u l e m e m b r a n e p r o t e i n , G M P - 1 4 0 , f r o m h u m a n p l a t e l e t s a n d e n d o t h e l i a l c e l l s . J . B i o l . C h e m . 2 6 4 : 1 8 1 6 - 1 8 2 3 . 1 9 8 9 . J o h n s t o n e I B . L o t z F . A n i n h e r i t e d p l a t e l e t f u n c t i o n d e f e c t i n B a s s e t h o u n d s . C a n . V e t . J . 2 0 : 2 1 1 - 2 1 5 , 1 9 7 9 . K a i b u c h i K , T a k a i Y , N i s h i z u k a Y . C o o p e r a t i v e r o l e s o f v a r i o u s m e m b r a n e p h o s p h o l i p i d s i n t h e a c t i v a t i o n o f c a l c i u m - a c t i v a t e d , p h o s p h o l i p i d - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e . J . B i o l . C h e m . 2 5 6 : 7 1 4 6 - 7 1 4 9 , 1 9 8 1 . K a i b u c h i K , T a k a i Y , S a w a m u r a M . H o s h i j i m a M . F u j i k u r a T . N i s h i z u k a Y . S y n e r g i s t i c f u n c t i o n s o f p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n a n d c a l c i u m m o b i l i z a t i o n i n p l a t e l e t a c t i v a t i o n . J . B i o l . C h e m . 2 5 8 : 6 7 0 1 - 6 7 0 4 , 1 9 8 3 . K a i b u c h i K , T s u d a T . K i k u c h i A , T a n i m o t o T , T a k a i Y . E n h a n c e m e n t o f c o l l a g e n - i n d u c e d p h o s p h o i n o s i t i d e t u r n o v e r b y t h r o m b o x a n e A 2 a n a l o g u e t h r o u g h C a 2 + m o b i l i z a t i o n i n h u m a n p l a t e l e t s . F E B S L e t t . 1 9 2 : 1 0 4 - 1 0 8 , 1 9 8 5 . K a m e y a m a Y . Y o s h i o k a S . I m a i A , N o z a w a Y . P o s s i b l e i n v o l v e m e n t o f 1 - a c y l - g l y c e r o p h o s p h o r y l i n o s i t o l a c y l t r a n s f e r a s e i n a r a c h i d o n a t e e n r i c h m e n t o f p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l i n h u m a n p l a t e l e t s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 7 5 2 : 2 4 4 - 2 5 0 , 1 9 8 3 . K a s e r - G l a n z m a n n R , J a k a b o v a M , G e o r g e J N , L u s c h e r E F . S t i m u l a t i o n o f c a l c i u m u p t a k e i n p l a t e l e t m e m b r a n e v e s i c l e s b y a d e n o s i n e 3 ' , 5 ' - c y c l i c m o n o p h o s p h a t e a n d p r o t e i n k i n a s e . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 4 6 6 : 4 2 9 - 4 4 0 , 1 9 7 7 . 2 4 3 . 2 4 4 . 2 4 5 . 2 4 6 . 2 4 7 . 2 4 8 . 2 4 9 . 2 5 0 . 2 5 1 . 2 5 2 . 2 5 3 . 2 5 4 . 3 9 4 K a t a d a T , B o k o c h G M , N o r t h u p J K , U i M , G i l m a n A G . T h e i n h i b i t o r y g u a n i n e n u c l e o t i d e - b i n d i n g r e g u l a t o r y c o m p o n e n t o f a d e n y l a t e c y c l a s e . P r o p e r t i e s a n d f u n c t i o n o f t h e p u r i f i e d p r o t e i n . J . B i o l . C h e m . 2 5 9 : 3 5 6 8 - 3 5 7 7 , 1 9 8 4 . K a t a d a T , G i l m a n A G , W a t a n a b e Y . B a u e r 8 . J a k o b s K H . P r o t e i n k i n a s e C p h o s p h o r y l a t e s t h e i n h i b i t o r y g u a n i n e - n u c l e o t i d e - b i n d i n g r e g u l a t o r y c o m p o n e n t a n d a p p a r e n t l y s u p p r e s s e s i t s f u n c t i o n i n h o r m o n a l i n h i b i t i o n o f a d e n y l a t e c y c l a s e . E u r . J . B i o c h e m . 1 5 1 : 4 3 1 - 4 3 7 , 1 9 8 5 . K a w a m o t o S . B e n g u r A R . S e l l e r s J R . A d e l s t e i n R S . I n s i t u p h o s p h o r y l a t i o n o f h u m a n p l a t e l e t m y o s i n h e a v y a n d l i g h t c h a i n s b y p r o t e i n k i n a s e C . J . B i o l . C h e m . 2 6 4 : 2 2 5 8 - 2 2 6 5 . 1 9 8 9 . K e h r e l B . B a l l e i s e n L , K o k o t t R , M e s t e r s R . S t e n z i n g e r W . C l e m e t s o n K J . v a n d e L o o J . D e f i c i e n c y o f i n t a c t t h r o m b o s p o n d i n a n d m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n l a i n p l a t e l e t s w i t h d e f e c t i v e c o l l a g e n - i n d u c e d a g g r e g a t i o n a n d s p o n t a n e o u s l o s s o f d i s o r d e r . B l o o d 7 1 : 1 0 7 4 - 1 0 7 8 , 1 9 8 8 . K e r r y R , S c r u t t o n M C . P l a t e l e t B - a d r e n o c e p t o r s . B r . J . P h a r m a c o l . 7 9 : 6 8 1 - 6 9 1 . 1 9 8 3 . K e r r y R , S c r u t t o n M C , W a l l i s R B . M a m m a l i a n p l a t e l e t a d r e n o c e p t o r s . B r . J . P h a r m a c o l . 8 1 : 9 1 - 1 0 2 , 1 9 8 4 . K h a n n a N C , T o k u d a M , W a i s m a n D M . P h o s p h o r y l a t i o n o f l i p o c o r t i n s i n _ g i r r g b y p r o t e i n k i n a s e C . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 4 1 : 5 4 7 - 5 5 4 , 1 9 8 6 . K i k k a w a U , T a k a i Y . M i n a k u c h i R , I n o h a r a S , N i s h i z u k a Y . C a l c i u m - a c t i v a t e d , p h o s p h o l i p i d - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e f r o m r a t b r a i n . S u b c e l l u l a r d i s t r i b u t i o n , p u r i f i c a t i o n , a n d p r o p e r t i e s . J . B i o l . C h e m . 2 5 7 : 1 3 3 4 1 - 1 3 3 4 8 . 1 9 8 2 . K i s h i m o t o A , K a j i k a w a N , S h i o t a M , N i s h i z u k a Y . P r o t e o l y t i c a c t i v a t i o n o f c a l c i u m - a c t i v a t e d , p h o s p h o l i p i d - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e b y t h e C a y 3 d e p e n d e n t n e u t r a l p r o t e a s e . J . B i o l . C h e m . 2 5 8 : 1 1 5 6 - 1 1 6 4 , 1 9 8 3 . K l o p r o g g e E , H a s s e l a a r P . G o r t e r G , A k k e r m a n J - W N . S t i m u l u s - a g g r e g a t i o n c o u p l i n g i n p l a t e l e t s a c t i v a t e d w i t h P A F - a c e t h e r . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 8 8 3 : 1 2 7 - 1 3 7 , 1 9 8 6 . K n i g h t D E , S c r u t t o n M C . D i r e c t e v i d e n c e f o r a r o l e f o r C a m ’ i n a m i n e s t o r a g e g r a n u l e s e c r e t i o n b y h u m a n p l a t e l e t s . T h r o m b . R e s . 2 0 : 4 3 7 - 4 4 6 . 1 9 8 0 . K n i g h t D E . S c r u t t o n M C . C y c l i c n u c l e o t i d e s c o n t r o l a s y s t e m w h i c h r e g u l a t e s G a y ' s e n s i t i v i t y o f p l a t e l e t s e c r e t i o n . N a t u r e 3 0 9 : 6 6 - 6 8 . 1 9 8 4 . 1 K p K m m d o a K m D r P K f 6 e r r l r f y o 9 r y e e i 6 M u i a r i b p a 9 A i r l p n b : s t s e i c i 5 , . s i e e r i 8 h e h s n h l - s h a n c i 0 n l n t d i i t s n d h 1 a e a e a d z 9 y a a e e B t n m m d o a t 8 m t n i k n 8 i o - g 8 e 1 u u e t n 6 u e c o T r t a r r a a o i n . r e c J n 5 t t t t c a l p x o d h , : . h h a e h t c 3 y n o i m i t e i t i / i - 5 f N P 1 v h r t t b a - u e 9 . S a S y a h y w r S h c e w 8 , , a . t y p t r e f B i m 5 . y i d t e o p t f i a f W o s J a h m r J a e n i o . e n o m d b t c o o o c p e s s i r s x P a o e t h - s n x t e y b e t y s J w p B p e o a p t i s . ( . a i i h i n l h r o P o c n s o t e y M n A n k a m S e S c e p A A m r n i e J y r n g a t a , m n K e d o K o s i m a n d . i s a t h n a n i i l y c a h , , ) t c r a a K s k i i B 9 t k i n h a k P b o - a k D e s e a 2 k o h a n i t t t m L a g 7 k f t h o s a r : r e o , r a b 4 s i r n e t m r V y V c o o a i c y 2 t M . y m n c s r p V V 9 o a V e c p b t e . . e s - t V t l 3 o o l - t 4 e i o 3 a f g i i a . a 3 s c o : S t l E n o n s t 6 x 3 e y a o f d n d o p e , n g b R y 0 l f u . e g 2 e e o u e c i t 1 e 5 t g r l n c e 9 n i n r o M p W e u g i i B n - t d m 8 l a 3 a s i n i h e 7 r . a s 0 s g t o u o a . t 3 e c t m t o - r f r o 5 h i i e i n a a f H , e o a n l i p c n c u n n s d e m . h h m i d p u 1 n a i p t o a i e s . o 9 o c c s s r d l n c f t e 8 e J u b a o B . l e c n n a a h a l o y d e a b 4 . o t n p l u l m i t d n 2 t - l t a o d 3 i i 1 e e t d a c a p 8 o 2 t e n t h C : - s n l A i o a 1 e . 2 o r M 9 w t - + n b P 3 i - - o t l h 2 5 5 . 2 5 6 . 2 5 7 . 2 5 8 . 2 5 9 . 2 6 0 . 2 6 1 . 2 6 2 . 2 6 3 . 2 6 4 . 2 6 5 . 2 6 6 . 3 9 5 K n i g h t D E . S c r u t t o n M C . E f f e c t o f v a r i o u s e x c i t a t o r y a g o n i s t s o n t h e s e c r e t i o n o f S - h y d r o x y t r y t a m i n e f r o m p e r m e a b i l i z e d h u m a n p l a t e l e t s i n d u c e d b y C a m ' i n . t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f G T P . F E B S L e t t . 1 8 3 : 4 1 7 - 4 2 2 . 1 9 8 5 . K n i g h t D E , S c r u t t o n M C . E f f e c t s o f g u a n i n e n u c l e o t i d e s o n t h e p r o p e r t i e s o f 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e s e c r e t i o n f r o m e l e c t r o p e r m e a b i l i z e d h u m a n p l a t e l e t s . E u r . J . B i o c h e m . 1 6 0 : 1 8 3 - 1 9 0 , 1 9 8 6 . K o b i l k a B K , M a t s u i H . K o b i l k a T S . Y a n g - F e n g T L , F r a n c k e U , C a r o n M G , L e f k o w i t z . R e g a n J W . C l o n i n g , s e q u e n c i n g . a n d e x p r e s s i o n o f t h e g e n e c o d i n g f o r t h e h u m a n p l a t e l e t a z - a d r e n e r g i c r e c e p t o r . S c i e n c e 2 3 8 : 6 5 0 - 6 5 6 , 1 9 8 7 . K o i k e K , R a o A K , H o l m s e n H , M u e l l e r P S . P l a t e l e t s e c r e t i o n d e f e c t i n p a t i e n t s w i t h t h e a t t e n t i o n d e f i c i t d i s o r d e r a n d e a s y b r u i s i n g . B l o o d 6 3 : 4 2 7 - 4 3 3 . 1 9 8 4 . K o r n E D . B i o c h e m i s t r y o f a c t o - m y o s i n - d e p e n d e n t c e l l m o t i l i t y ( a r e v i e w ) . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 7 5 : 5 8 8 - 5 9 9 . 1 9 7 8 . K o t i t e N J , C u n n i n g h a m L W . S p e c i f i c a d s o r p t i o n o f a p l a t e l e t m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n b y h u m a n i n s o l u b l e c o l l a g e n . J . B i o l . C h e m . 2 6 1 : 8 3 4 2 - 8 3 4 7 , 1 9 8 6 . K r a f t A S , A n d e r s o n W B . P h o r b o l e s t e r s i n c r e a s e t h e a m o u n t o f G a y } p h o s p h o l i p i d - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e a s s o c i a t e d w i t h p l a s m a m e m b r a n e . N a t u r e 3 0 1 : 6 2 1 - 6 2 3 , 1 9 8 3 . K r a m e r R M , C h e c a n i G C , D e y k i n A , P r i t z k e r C R . D e y k i n D . S o l u b i l i z a t i o n a n d p r o p e r t i e s o f C a y l d e p e n d e n t h u m a n p l a t e l e t p h o s p h o l i p a s e A 2 . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 8 7 8 : 3 9 4 - 4 0 3 , 1 9 8 6 . c a 1 5 L p L c 2 L b p J y 9 n 7 a r a y h a y 9 . 7 c d p o 3 p o p c 2 8 y e d : e p B s e l : . l t u p t l 3 p i t e 3 o i c a i a 9 h i o 6 x n t r n t a n a 4 l 7 y a i a e n a a t - . - g o l l i d 4 3 n s s a e m , e e l d E E n C 0 6 n G e i G t h E t 2 9 i . . a - l e c G h , , e c a . C 1 S 1 p a l h e i 2 i e 7 i 8 t r a e g v d 5 l g 9 1 o r t a a 8 l u . . t u p 9 i c B r t 9 d u c t e e l t : a r a l c l i 7 h e n a a e n 2 l F d t s t e L g 4 M i s . a s 1 M a p o . s s f h n - , r c f a h a o 4 P o h . e t p f u 4 o e p o t a r , c . S s . d e r r r . e t e y 1 e a i c s c r l 9 c m C N o h a h 8 a a t t u o a t 3 s i t o l h n r i . a d l n a r e o g o s . i t e n e n p e a o 7 2 P S r c s C o A c a d . n r n t f f i l P n i o o i a o . . c o a B u a o T c f t c i n h i o i e 4 e d m d i a S p o d 0 c w h c i h n , p p i i i o t 0 h r . m s o n h 0 o o . p f 0 s d U h p h - t S a B u h d a h r A i m a t e a a a 1 i o t u c t i o 7 f c n t d p i y : i p r n c y s 8 d l m l . 1 i a a o a p i h h 5 o o d n . c t 8 n t r n N - 8 i i a A e a o o d o t c l t s t 2 e n e t e i u 2 i a t t r , n o s o e . f l 2 6 7 . 2 6 8 . 2 6 9 . 2 7 0 . 2 7 1 . 2 7 2 . 2 7 3 . 2 7 4 . 2 7 5 . 2 7 6 . 2 7 7 . 2 7 8 . 3 9 6 L a e m m l i U K . C l e a v a g e o f s t r u c t u r a l p r o t e i n s d u r i n g t h e a s s e m b l y o f t h e h e a d o f b a c t e r i o p h a g e T 4 . N a t u r e 2 2 7 : 6 8 0 - 6 8 5 , 1 9 7 0 . L a g a r d e M , G u a l d e N , R i g a u d M . M a t a b o l i c i n t e r a c t i o n s b e t w e e n e i c o s a n o i d s i n b l o o d a n d v a s c u l a r c e l l s . B i o c h e m . J . 2 5 7 : 3 1 3 - 3 2 0 , 1 9 8 9 . L a g e s B . M a l m s t e n C , W e i s s H J . S a m u e l s s o n B . I m p a i r e d p l a t e l e t r e s p o n s e t o t h r o m b o x a n e - A 2 a n d d e f e c t i v e c a l c i u m m o b i l i z a t i o n i n a p a t i e n t w i t h a b l e e d i n g d i s o r d e r . B l o o d 5 7 : 5 4 5 - 5 5 2 . 1 9 8 1 . L a g e s B , W e i s s H J . I m p a i r m e n t o f p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l m e t a b o l i s m i n a p a t i e n t w i t h a b l e e d i n g d i s o r d e r a s s o c i a t e d w i t h d e f e c t s o f i n i t i a l p l a t e l e t r e s p o n s e s . T h r o m b . H a e m o s t a s i s 5 9 : 1 7 5 - 1 7 9 . 1 9 8 8 . L a g e s B , W e i s s H J . H e t e r o g e n e o u s d e f e c t s o f p l a t e l e t s e c r e t i o n a n d r e s p o n s e s t o w e a k a g o n i s t s i n p a t i e n t s w i t h b l e e d i n g d i s o r d e r s . B r . J . H a e m a t o l . 6 8 : 5 3 - 6 2 . 1 9 8 8 . L a n d o n F , G a c h e Y . T o u i t o u H , O l o m u c k i A . P r o p e r t i e s o f t w o i s o f o r m s o f h u m a n b l o o d p l a t e l e t a - a c t i n i n . E u r . J . B i o c h e m . 1 5 3 : 2 3 1 - 2 3 7 , 1 9 8 5 . L a n g e r B G , G o n n e l l a P A , N a c h m i a s V T . a - A c t i n i n a n d v i n c u l i n i n n o r m a l a n d t h r o m b a s t h e n i c p l a t e l e t s . B l o o d 6 3 : 6 0 6 - 6 1 4 . 1 9 8 4 L a n z a F . B e r e t z A . S t i e r l e A , C o r r e G , C a s e n a v e J - P . C y c l i c n u c l e o t i d e p h o s p h o d i e s t e r a s e i n h i b i t o r s p r e v e n t a g g r e g a t i o n o f h u m a n p l a t e l e t s b y r a i s i n g c y c l i c A M P a n d r e d u c i n g c y t o p l a s m i c f r e e c a l c i u m m o b i l i z a t i o n . T h r o m b . R e s . 4 5 : 4 7 7 - 4 8 4 . 1 9 8 7 . L a p e t i n a E G , C h a n d r a b o s e K A . C u a t r e c a s a s P . I o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 - a n d t h r o m b i n - i n d u c e d p l a t e l e t a g g r e g a t i o n : i n d e p e n d e n c e f r o m 2 7 9 . 2 8 0 . 2 8 1 . 2 8 2 . 2 8 3 . 2 8 4 . 2 8 5 . 2 8 6 . 2 8 7 . 2 8 8 . 2 8 9 . 2 9 0 . 3 9 7 L a p e t i n a E G , R e e p B , G a n o n g B R , B e l l R M . E x o g e n o u s s n - l - 2 - d i a c y l g l y c e r o l s c o n t a i n i n g s a t u r a t e d f a t t y a c i d s f u n c t i o n a s b i o r e g u l a t o r s o f p r o t e i n k i n a s e C i n h u m a n p l a t e l e t s . J . B i o l . C h e m . 2 6 0 : 1 3 5 8 - 1 3 6 1 . 1 9 8 5 . L a p e t i n a E G , 8 1 1 1 0 J , R u g g i e r o M . T h r o m b i n i n d u c e s s e r o t o n i n s e c r e t i o n a n d a g g r e g a t i o n i n d e p e n d e n t l y o f i n o s i t o l p h o s p h o l i p i d s h y d r o l y s i s a n d p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n i n h u m a n p l a t e l e t s p e r m e a b i l i z e d w i t h s a p o n i n . J . B i o l C h e m . 2 6 0 : 7 0 7 8 - 7 0 8 3 , 1 9 8 5 . L a p e t i n a E G , R e e p B , W a t s o n S P . I o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 s t i m u l a t e s p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 4 0 , 0 0 0 d a l t o n p r o t e i n i n h u m a n p l a t e l e t s w i t h o u t p h o s p h o l i p a s e C a c t i v a t i o n . L i f e S c i . 3 9 : 7 5 1 - 7 5 9 . 1 9 8 6 . L a p e t i n a E G , R e e p B , C h a n g K - J . T r e a t m e n t o f h u m a n p l a t e l e t s w i t h t r y p s i n , t h r o m b i n , o r c o l l a g e n i n h i b i t s t h e p e r t u s s i s t o x i n - i n d u c e d A D P - r i b o s y l a t i o n o f a 4 1 - k D a p r o t e i n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 3 : 5 8 8 0 - 5 8 8 3 , 1 9 8 6 . L a w l e r J . T h e s t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l p r o p e r t i e s o f t h r o m b o s p o n d i n . B l o o d 6 7 : 1 1 9 7 - 1 2 0 9 , 1 9 8 6 . L e B r e t o n G C , D i n e r s t e i n R J , R o t h L J , F e i n b e r g H . D i r e c t e v i d e n c e f o r i n t r a c e l l u l a r d i v a l e n t c a t i o n r e d i s t r i b u t i o n a s s o c i a t e d w i t h p l a t e l e t s h a p e c h a n g e . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 7 1 : 3 6 2 - 3 7 0 . 1 9 7 6 . L e e b - L u n d b e r g L M F . C o t e c c h i a S , D e B l a s i A . C a r o n M G , L e f k o w i t z R J . R e g u l a t i o n o f a d r e n e r g i c r e c e p t o r f u n c t i o n b y p h o s p h o r y l a t i o n . I . A g o n i s t - p r o m o t e d d e s e n s i t i z a t i o n a n d p h o s p h o r y l a t i o n o f a l - a d r e n e r g i c r e c e p t o r s c o u p l e d t o i n o s i t o l p h o s p h o l i p i d . m e t a b o l i s m i n D D T 1 . M F - 2 s m o o t h m u s c l e c e l l s . J . B i o l . C h e m . 2 6 2 : 3 0 9 8 - 3 1 0 5 , 1 9 8 7 . L e g r a n d Y J , F a u v e l F , G u t m a n N , M u h J P , T o b e l e m G , S o u c h o n H , K a r n i g u i a n A . C a e n J P . M i c r o f i b r i l s ( M F ) p l a t e l e t i n t e r a c t i o n : r e q u i r e m e n t o f v o n W i l l e b r a n d f a c t o r . T h r o m b . R e s . 1 9 : 7 3 7 - 7 3 9 . 1 9 8 0 . L e n o x R H , E l l i s J , v a n R i p e r D , E h r l i c h Y H . A l p h a z - a d r e n e r g i c r e c e p t o r - m e d i a t e d r e g u l a t i o n o f a d e n y l a t e c y c l a s e i n t h e i n t a c t h u m a n p l a t e l e t . E v i d e n c e f o r a r e c e p t o r r e s e r v e . M o l . P h a r m a c o l . 2 7 : 1 - 9 , 1 9 8 5 . L e u n g L . N a c h m a n R . M o l e c u l a r m e c h a n i s m s o f p l a t e l e t a g g r e g a t i o n . A n n . R e v . M e d . 3 7 : 1 7 9 - 1 8 6 . 1 9 8 6 . L e v e n R M , G o n n e l l a P A , R e e b e r P A . N a c h m i a s V T . P l a t e l e t s h a p e c h a n g e a n d c y t o s k e l e t a l a s s e m b l y : e f f e c t s o f p H a n d m o n o v a l e n t c a t i o n i o n o p h o r e s . T h r o m b . H a e m o s t a s i s 4 9 : 2 3 0 - 2 3 4 . 1 9 8 3 . L e v e n R M . M e g a k a r y o c y t e m o t i l i t y a n d p l a t e l e t f o r m a t i o n . S c a n n i n g M i c r o s c o p y 1 : 1 7 0 1 - 1 7 0 9 , 1 9 8 7 . M M M M m h M p o a 2 e B 1 f i 1 f b 2 s l n a a a i a i u 9 a h 9 i : t u d c c h o h n m 8 j o 8 l x f 5 I e a t i p a o a e s 6 4 h i v a 7 n r d n d r h . . r p 7 i e t r t s 4 i e i e y u h y l y - n s v d v p s s o 5 . a o a r i a u a l t n n e a n l P h u p a p a 9 p o u h l p r A p t W o . D i m e h a c a c e . s n 1 D i n V i z t a V N . e E - G G h 9 t a o t e i i p M c f 7 , a 8 , , s u d d 2 b c l y a 1 . f e i b a d t a E e i l r . S i g r H 3 H N a l e - e t o e t i t o : o l d u n e m t n l p l B c e 7 l d e l 3 i h e u i o u r r e - p l b b o i h s o a E D - B B A p e i s 9 h . e c . , e C , a i J J h d d g e t 7 t s s c J v . . . m d n o W y c P u E T D a B p 8 s c e i 2 a m l e B h i c i o o p . r m d a h d a S e o n n t a t o c i s p d o l e r n p L m y D d h d h e o l l o m y B i c n o l e g n t e s . l i t y A s e l i s . n c H . p c h y c s r e c e D d a s 1 l i . F r r n u 9 e i l l . o P h u u c R e n 1 i a a l m e e b a r s 8 c o t a a r n s s g e 0 T n i d i r o t e . e a . r u : u d l d c s a 1 v m p C c t a o t 6 p l l i o t r s . M t u e 0 a e i n m i 0 - t p m i r c p o l 1 1 e . o - i f a t n C a . 6 l n p e s e o h e , t o o P m o 3 f l t 4 e r r e s l r 1 o l s h f m p 4 a c m t r t 1 t i m i t 9 7 e . a o a : t 1 o b 3 s h i m 8 3 h : o p n e a 5 2 7 n n o B - w g i s a s a c . 7 0 o a i o y t n o - 1 c p i n t d l c 1 - c h d i i m . h 3 7 i i o u s u o 3 0 r p l C n t m 3 3 a b a a a s . , , o 2 n t o + c l f e y d 2 9 1 . 2 9 2 . 2 9 3 . 2 9 4 . 2 9 5 . 2 9 6 . 2 9 7 . 2 9 8 . 2 9 9 . 3 0 0 . 3 0 1 . 3 0 2 . 3 0 3 . 3 9 8 L i m b i r d L E , S p e c k J L . S m i t h S K . S o d i u m i o n m o d u l a t e s a g o n i s t a n d a n t a g o n i s t i n t e r a c t i o n s w i t h t h e h u m a n p l a t e l e t a l p h a z - a d r e n e r g i c r e c e p t o r i n m e m b r a n e a n d s o l u b i l i z e d p r e p a r a t i o n s . M o l . P h a r m a c o l . 2 1 : 6 0 9 - 6 1 7 . 1 9 8 2 . L i t o s c h I . R e g u l a t o r y G T P - b i n d i n g p r o t e i n s : e m e r g i n g c o n c e p t s o n t h e i r r o l e i n c e l l f u n c t i o n . L i f e S c i . 4 1 : 2 5 1 - 2 5 8 . 1 9 8 7 . L i v n e A . G r i n s t e i n S , R o t h s t e i n A . C h a r a c t e r i z a t i o n o f N ' a J / H + e x c h a n g e i n p l a t e l e t s . T h r o m b . H a e m o s t a s i s 5 8 : 9 7 1 - 9 7 7 . 1 9 8 7 . L o f t u s J C , A l b r e c h t R M . R e d i s t r i b u t i o n o f t h e f i b r i n o g e n r e c e p t o r o f h u m a n p l a t e l e t s a f t e r s u r f a c e a c t i v a t i o n . J . C e l l B i o l . 9 9 : 8 2 2 - 8 2 8 . 1 9 8 4 . L o w M G , C a r r o l l R C , C o x A C . C h a r a c t e r i z a t i o n o f m u l t i p l e f o r m s o f p h o s p h o i n o s i t i d e - s p e c i f i c p h o s p h o l i p a s e C p u r i f i e d f r o m h u m a n p l a t e l e t s . B i o c h e m . J . 2 3 7 : 1 3 9 - 1 4 5 , 1 9 8 6 . L y n c h C J , S t e e r M L . E v i d e n c e f o r h i g h a n d l o w a f f i n i t y a 2 - r e c e p t o r s . C o m p a r i s o n o f [ 3 H ] n o r e p i n e p h r i n e a n d [ 3 H ] p h e n t o l a m i n e b i n d i n g t o h u m a n p l a t e l e t m e m b r a n e s . J . B i o l . C h e m . 2 5 6 : 3 2 9 8 - 3 3 0 3 . 1 9 8 1 . L y n c h C J , M o r b a c k L . B l a c k m o r e P F , E x t o n J H . a - S u b u n i t s o f N . a r e r e l e a s e d f r o m t h e p l a s m a m e m b r a n e f o l l o w i n g c h o l e r a t o x i n a c t i v a t i o n . F E B S L e t t . 2 0 0 : 3 3 3 - 3 3 6 , 1 9 8 6 . L y o n s R M . A t h e r t o n R M . C h a r a c t e r i z a t i o n o f a p l a t e l e t p r o t e i n p h o s p h o r y l a t e d d u r i n g t h e t h r o m b i n - i n d u c e d r e l e a s e r e a c t i o n . B i o c h e m i s t r y 1 8 : 5 4 4 - 5 5 2 . 1 9 7 9 . 3 0 4 . 3 0 5 . 3 0 6 . 3 0 7 . 3 0 8 . 3 0 9 . 3 1 0 . 3 1 1 . 3 1 2 . 3 1 3 . 3 1 4 . 3 1 5 . 3 9 9 M a j e r u s P W , W i l s o n D B , C o n n o l l y T M , B r o s s T E . N e u f e l d E J . P h o s p h o i n o s i t i d e t u r n o v e r p r o v i d e s a l i n k i n s t i m u l u s - r e s p o n s e c o u p l i n g . T r e n d s B i o c h e m . S c i . 1 0 : 1 6 8 - 1 7 1 . 1 9 8 5 . M a j e r u s P W , C o n n o l l y T M , D e c k m y n H , R o s s T S , B r o s s T E , I s h i i H , B a n s a l V S , W i l s o n D B . T h e m e t a b o l i s m o f p h o s p h o i n o s i t i d e - d e r i v e d m e s s e n g e r m o l e c u l e s . S c i e n c e 2 3 4 : 1 5 1 9 - 1 5 2 6 , 1 9 8 6 . M a l i k M N , R a m a s w a m y S . T u z i o H , S h i e k h A M . F e n k o M D , W i s n i e w s k i H M . H o w a r d R G . M i c r o m o l a r C a fl ’ r e q u i r i n g p r o t e a s e f r o m h u m a n p l a t e l e t s : p u r i f i c a t i o n . p a r t i a l c h a r a c t e r i z a t i o n a n d e f f e c t o n t h e c y t o s k e l e t a l p r o t e i n s . L i f e S c i . 4 0 : 5 9 3 - 6 0 4 . 1 9 8 7 . M a l m s t e n C , H a m b u r g M . S v e n s s o n J , S a m u e l s s o n B . P h y s i o l o g i c a l r o l e o f a n e n d o p e r o x i d e i n h u m a n p l a t e l e t s : H e m o s t a t i c d e f e c t d u e t o p l a t e l e t c y c l o - o x y g e n a s e d e f i c i e n c y . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 7 2 : 1 4 4 6 - 1 4 5 0 , 1 9 7 5 . M a n n e V , K u n g H - F . C h a r a c t e r i z a t i o n o f p h o s p h o i n o s i t i d e - s p e c i f i c p h o s p h o l i p a s e C f r o m h u m a n p l a t e l e t s . B i o c h e m . J . 2 4 3 : 7 6 3 - 7 7 1 . 1 9 8 7 . M a r c h e P . P o l y p h o s p h o i n o s i t i d e s a n d c e l l a c t i v a t i o n . N o u v . R e v . F r . H e m a t o l . 2 7 : 2 2 3 - 2 2 8 . 1 9 8 5 . M a r c u s A J , S a f i e r L B , U l l m a n H L , W o n g K T H . B r o e k m a n M J , W e k s l e r B B , K a p l a n K L . E f f e c t s o f a c e t y l g l y c e r y l e t h e r p h o s p h o r y l c h o l i n e o n h u m a n p l a t e l e t f u n c t i o n i n v i t r o . B l o o d 5 8 : 1 0 2 7 - 1 0 3 1 . 1 9 8 1 . M a r k e y F , P e r s s o n T , L i n d b e r g U . C h a r a c t e r i z a t i o n o f p l a t e l e t e x t r a c t s b e f o r e a n d a f t e r s t i m u l a t i o n w i t h r e s p e c t t o t h e p o s s i b l e r o l e o f p r o f i l a c t i n a s m i c r o f i l a m e n t p r e c u r s o r . C e l l 2 3 : 1 4 5 - 1 5 3 . 1 9 8 1 . M a s s i n i P , L u s c h e r E F . S o m e e f f e c t s o f i o n o p h o r e s f o r d i v a l e n t c a t i o n s o n b l o o d p l a t e l e t s . C o m p a r i s o n w i t h t h e e f f e c t s o f t h r o m b i n . B i o c h e m . B i o p h y s . A c t a . 3 7 2 : 1 0 9 - 1 2 1 , 1 9 7 4 . M a t t s o n J C , B o r g e r d i n g P J . C r a f t D L . F i x a t i o n o f p l a t e l e t s f o r s c a n n i n g a n d t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y . S t a i n T e c h n o l o g y 5 2 : 1 5 1 - 1 5 8 . 1 9 7 7 . M a t t s o n J C , E s t r y D W , B e l l T G , P a t t e r s o n W R . D e f e c t i v e c o n t a c t a c t i v a t i o n o f p l a t e l e t s f r o m d o g s w i t h B a s s e t H o u n d h e r e d i t a r y t h r o m b o p a t h y . T h r o m b . R e s . 4 4 : 2 3 - 3 8 , 1 9 8 6 . M a u c o G , C h a p H , D o u s t e - B l a z y L . C h a r a c t e r i z a t i o n a n d p r o p e r t i e s o f a p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l p h o s p h o d i e s t e r a s e ( p h o s p h o l i p a s e C ) f r o m p l a t e l e t c y t o s o l . F E B S L e t t . 1 0 0 : 3 6 7 - 3 7 0 , 1 9 7 9 . 3 1 6 . 3 1 7 . 3 1 8 . 3 1 9 . 3 2 0 . 3 2 1 . 3 2 2 . 3 2 3 . 3 2 4 . 3 2 5 . 3 2 6 . 3 2 7 . 4 0 0 M a u c o G . C h a p H , D o u s t e - B l a z y L . P l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r ( P A F - a c e t h e r ) p r o m o t e s a n e a r l y d e g r a d a t i o n o f p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l - 4 . 5 - b i p h o s p h a t e i n r a b b i t p l a t e l e t s . F E B S L e t t . 1 5 3 : 3 6 1 - 1 6 5 , 1 9 8 3 . M a u c o G . D a n g e l m a i e r C A . S m i t h J B . I n o s i t o l l i p i d s . p h o s p h a t i d a t e a n d d i a c y l g l y c e r o l s h a r e s t e a r o y l a r a c h i d o n o y l g l y c e r o l a s a c o m m o n b a c k b o n e i n t h r o m b i n - s t i m u l a t e d h u m a n p l a t e l e t s . B i o c h e m . J . 2 2 4 : 9 3 3 - 9 4 0 , 1 9 8 4 . M a y e u x P R , M o r t o n H E , G i l l a r d J , L o r d A , M o r i n e l l i T A , B o e h m A , M a i s D E , H a l u s h k a P V . T h e a f f i n i t i e s o f p r o s t a g l a n d i n H 2 a n d t h r o m b o x a n e A 2 f o r t h e i r r e c e p t o r a r e s i m i l a r i n w a s h e d h u m a n p l a t e l e t s . B i o c h e m B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 5 7 : 7 3 3 - 7 3 9 , 1 9 8 8 . M a z u r E M . M e g a k a r y o c y t o p o i e s i s a n d p l a t e l e t p r o d u c t i o n : a r e v i e w . E x p . H e m a t o l . 1 5 : 3 4 0 - 3 5 0 . 1 9 8 7 . M c E v e r R P , B e n n e t E M , M a r t i n M N . I d e n t i f i c a t i o n o f t w o s t r u c t u r a l l y a n d f u n c t i o n a l l y d i s t i n c t s i t e s o n h u m a n p l a t e l e t m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n I I b - I I I a u s i n g m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s . J . B i o l . C h e m . 2 5 8 : 5 2 6 9 - 5 2 7 5 , 1 9 8 3 . M c E v e r R P , M a r t i n M N . A m o n o c l o n a l a n t i b o d y t o a m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n b i n d s o n l y t o a c t i v a t e d p l a t e l e t s . J . B i o l . C h e m . 2 5 9 : 9 7 9 9 - 9 8 0 4 , 1 9 8 4 . M c G o w a n E B . Y e o K - T , D e t w i l e r T C . T h e a c t i o n o f c a l c i u m - d e p e n d e n t p r o t e a s e o n p l a t e l e t s u r f a c e g l y c o p r o t e i n s . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 2 2 7 : 2 8 7 - 3 0 1 . 1 9 8 3 . M c G o w a n E B , D e t w i l e r T C . M o d i f i e d p l a t e l e t r e s p o n s e s t o t h r o m b i n . E v i d e n c e f o r t w o t y p e s o f r e c e p t o r s o r c o u p l i n g m e c h a n i s m s . J . B i o l . C h e m . 2 6 1 : 7 3 9 - 7 4 6 . 1 9 8 6 . M e h t a P . M e h t a J , O s t r o w s k i N , A g u i l a E . P o t e n t i a t i o n o f p l a t e l e t a g g r e g a t i o n b y c h r o n o l u m e . T h r o m b . R e s . 3 2 : 5 0 9 - 5 1 2 . 1 9 8 3 . M e n a s h i S , D a v i s C , C r a w f o r d N . C a l c i u m u p t a k e a s s o c i a t e d w i t h a n i n t r a c e l l u l a r m e m b r a n e f r a c t i o n p r e p a r e d f r o m h u m a n b l o o d p l a t e l e t s b y h i g h - v o l t a g e , f r e e - f l o w e l e c t r o p h o r e s i s . F E B S L e t t . 1 4 0 : 2 9 8 - 3 0 2 , 1 9 8 2 . M e y e r M , H e r r m a n n F H . D i v e r s i t y o f g l y c o p r o t e i n d e f i c i e n c i e s i n G l a n z m a n n ' s t h r o m b a s t h e n i a . T h r o m b . H a e m o s t a s i s 5 4 : 6 2 6 - 6 2 9 . 1 9 8 5 . M e y e r s K M , K a t z J B . C l e m m o n s R M , S m i t h J B . H o l m s e n H . A n e v a l u l a t i o n o f t h e a r a c h i d o n a t e p a t h w a y o f p l a t e l e t s f r o m c o m p a n i o n a n d f o o d - p r o d u c i n g a n i m a l s , m i n k , a n d m a n . T h r o m b . R e s . 2 0 : 1 3 - 2 4 . 1 9 8 0 . u M M M M M f t 2 s o r d D d c o n r o o o o 6 h y n e i e o o o n s 3 e n n r t e n a f s u m c t : c t w u s t c d f e p a a 6 a v g r h l o t e n l a d d b e 6 o o o i s n r s n i r a a 3 l s m m l v e k o i n 6 S S e i e F r t G b d F g e H w R t t t , o . 6 , , r , l y b s s a H z a t i u 5 l J n i a a l o s a R o r s i g i e i e a 1 y t G t r g l , d s S r o d g l . t g a 9 l z e n e h 7 s . r i l n s K a g a b n 6 a n o e c u n a i t i y . n E w e n z J t f m t n l s C s A i m c o m i d a . k f t . l e c a o t l o r i i o h i C p k n n e l y n - e s e e e t L e n y t t g r a i n s l n l g S i R t m A i J ' i a s n c , s r c s n g . T i y C e t B p n c t e l F h , , n i a s J M t . e p o c n i o i n r T n R r i h u r h h i h I . s e r t a . s o t s b d a v a r n e e . i t H i o v m e u C y e b t n e n a a t o B - a s g g s a e s a t . l e i N i z l s t m r l o n - M , S a p e a c a o C t b a i , n l t . h d l h 7 g e R t d a e 1 m r o i e o e r . V i t e n : g z a l m n e a n e t D i 3 a t P . . s n l a a i n 8 J n e h e e e e 1 I b a J s d a 5 , r n t o 5 g w - . g k r J d l : B a n i y p 3 R 8 o a i 2 a n 2 o t l i m c a g p s 7 s h r d 4 D a . 9 c e g m 3 i n 8 t . , r o A o e 2 I s 4 l i 1 I n x g m o 9 n n 8 I e 9 e e d t . t 3 J - b n p e 9 e i n B l o o a l : . . 4 o s o z o e 1 c s 8 r g 1 n 7 y o 9 r l s P g - m t 8 o e A d n P r . , o 6 e o a l e 6 n s . r , i a f o 8 M t 3 s 2 2 p r r - s e : e a I e l c . . r a a s c 1 g t a e l a - t i a N l t d 9 e a r 1 s n a l - e 8 e t 9 o l a t S l a i l 7 c 8 u o s s o e . e 6 r u s n t p . d d e r e n i y o r 3 2 8 . 3 2 9 . 3 3 0 . 3 3 1 . 3 3 2 . 3 3 3 . 3 3 4 . 3 3 5 . 3 3 6 . 3 3 7 . 3 3 8 . 3 3 9 . 3 4 0 . 4 0 1 M e y e r s K M . H o l m s e n H , S e a c h o r d C L . C o m p a r a t i v e s t u d y o f p l a t e l e t d e n s e g r a n u l e c o n s t i t e n t s . A m . J . P h y s i o l . 2 4 3 : R 4 5 4 - R 4 6 2 . 1 9 8 2 . M i c h e l T . H o f f m a n B B , L e f k o w i t z R J . D i f f e r e n t i a l r e g u l a t i o n o f t h e a z - a d r e n e r g i c r e c e p t o r b y N a + a n d g u a n i n e n u c l e o t i d e s . N a t u r e 2 8 8 : 7 0 9 - 7 1 1 , 1 9 8 0 . M i c h e l T , H o f f m a n B B , L e f k o w i t z R J , C a r o n M G . D i f f e r e n t s e d i m e n t a t i o n p r o p e r t i e s o f a g o n i s t - a n d a n t a g o n i s t - l a b e l l e d p l a t e l e t a l p h a z a d r e n e r g i c r e c e p t o r s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 0 0 : 1 1 3 1 - 1 1 3 6 , 1 9 8 1 . M i c h e l l R H . I n o s i t o l p h o s p h o l i p i d s a n d c e l l s u r f a c e r e c e p t o r f u n c t i o n . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 4 1 5 : 8 1 - 1 4 7 . 1 9 7 5 . M i k h a i l i d i s D P , J e r e m y J Y . P l a t e l e t f u n c t i o n - t h e r o l e o f e s s e n t i a l f a t t y a c i d s a n d e i c o s a n o i d s . P r o s t a g l . L e u k o t r i e n e s a n d E s s e n t i a l F a t t y A c i d s : R e v i e w s 3 5 : 1 8 7 - 1 8 8 . 1 9 8 9 . M i l l s D C B , S m i t h J B . T h e i n f l u e n c e o n p l a t e l e t a g g r e g a t i o n o f d r u g s t h a t a f f e c t t h e a c c u m u l a t i o n o f a d e n o s i n e 3 ' : 5 ' - c y c l i c m o n o p h o s p h a t e i n p l a t e l e t s . B i o c h e m . J . 1 2 1 : 1 8 5 - 1 9 6 , 1 9 7 1 . M i z u n o K . Y a m a m o t o S , L a n d s W E M . E f f e c t s o f n o n - s t e r o i d a l a n t i - i n f l a m m a t o r y d r u g s o n f a t t y a c i d c y c l o o x y g e n a s e a n d p r o s t a g l a n d i n h y d r o p e r o x i d a s e a c t i v i t i e s . P r o s t a g l a n d i n s 2 3 : 7 4 3 - 7 5 7 . 1 9 8 2 . M o l s k i T F P . N a c c a c h e P H , M a r s h M L . K e r m o d e J , B e c k e r E L . S h a ' a f i R I . P e r t u s s i s t o x i n i n h i b i t s t h e r i s e i n t h e i n t r a c e l l u l a r c o n c e n t r a t i o n o f f r e e c a l c i u m t h a t i s i n d u c e d b y c h e m o t a c t i c f a c t o r s i n r a b b i t n e u t r o p h i l s : p o s s i b l e r o l e o f t h e " G p r o t e i n s ” i n c a l c i u m m o b i l i z a t i o n . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 2 4 : 6 4 4 - 6 5 0 , 1 9 8 4 . N p p m N N A t a o h l e r e r r a b o e a e a i i s d t c r n p e h t l l s h a i e l i E m H a a t o t m . z a m e d J e , i s t n n b P P o l y b c a a l y n a , n r i a p e k o c n T c h o f o u i a s H s l r d m i i d i r C c J i l k g a . t a m D n T c l t e . . l a i n a l n u 4 J b . i a m , a R o n k 5 k o l g b - J a s i l . l o g J e E a K i h m s y b c . e s , e B s i N . M r h o f t a l B o A c u s A t y G h n r s p e . n e u b h p m . . u r a M r 3 r e t o R o 3 a p i k o a 9 e e a a r t 3 f d T : i . i 1 k r 8 v e : , o o 1 s n 2 K n s 6 n i i a 3 o u 1 o g t A b - c f g o u 1 R h 3 4 r 0 , e n . M e 6 m i . t 8 . g L 1 , a e s 9 w r 0 o B 9 - t f 5 i 5 k 1 I i n o 9 n o : 8 8 . s n 8 w 6 u 5 i 9 f o . t - f f z 1 i 0 2 e m . c h J i u B , n a 1 t n 9 8 6 . 3 4 1 . 3 4 2 . 3 4 3 . 3 4 4 . 3 4 5 . 3 4 6 . 3 4 7 . 3 4 8 . 3 4 9 . 3 5 0 . 3 5 1 . 3 5 2 . 4 0 2 M u f s o n R A , K u l k a r n i P , E a k i n s K E . W e i n s t e i n I B . E f f e c t s o f p h o r b o l e s t e r t u m o r p r o m o t o r s i n p l a t e l e t a g g r e g a t i o n a n d p l a t e l e t p r o d u c t i o n o f c y c l o o x y g e n a s e p r o d u c t s . C a n c e r R e s . 3 9 : 3 6 0 2 - 3 6 0 6 , 1 9 7 9 . M u r r a y A W , F o u r n i e r A . H a r d y S J . P r o t e o l y t i c a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C : a p h y s i o l o g i c a l r e a c t i o n ? T r e n d s B i o c h e m . S c i . 1 2 : 5 3 - 5 4 , 1 9 8 7 . M u s t a r d J F , P e r r y D W , K i n l o u g h - R a t h b o n e R L . P a c k h a m M A . F a c t o r s r e s p o n s i b l e f o r A D P - i n d u c e d r e l e a s e r e a c t i o n o f h u m a n p l a t e l e t s . A m . J . P h y s i o l . 2 2 8 : 1 7 5 7 - 1 7 6 5 , 1 9 7 5 . N a c h m a n R L . L e u n g L L K . C o m p l e x f o r m a t i o n o f p l a t e l e t m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s I I b a n d I I I a w i t h f i b r i n o g e n . J . C l i n . I n v e s t . 6 9 : 2 6 3 - 2 6 9 . 1 9 8 2 . N a c h m i a s V T . P l a t e l e t a n d m e g a k a r y o c y t e s h a p e c h a n g e : T r i g g e r e d a l t e r a t i o n s i n t h e c y t o s k e l e t o n . S e m . H e m a t o l . 2 0 : 2 6 1 - 2 8 1 . 1 9 8 3 . N a k a M , N i s h i k a w a M . A d e l s t e i n R S , H i d a k a H . P h o r b o l e s t e r - i n d u c e d a c t i v a t i o n o f h u m a n p l a t e l e t s i s a s s o c i a t e d w i t h p r o t e i n k i n a s e C p h o s p h o r y l a t i o n o f m y o s i n l i g h t c h a i n s . N a t u r e 3 0 6 : 4 9 0 - 4 9 2 . 1 9 8 3 . N a k a s h i m a S , T o h m a t s u T . H a t t o r i H , O k a n o Y , N o z a w a Y . I n h i b i t o r y a c t i o n o f c y c l i c G M P o n s e c r e t i o n . p o l y p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s a n d c a l c i u m m o b i l i z a t i o n i n t h r o m b i n - s t i m u l a t e d h u m a n p l a t e l e t s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 3 5 : 1 0 9 9 - 1 1 0 4 , 1 9 8 6 . N a k a s h i m a S , T o h m a t s u T , H a t t o r i H , S u g a n u m a A . N o z a w a Y . G u a n i n e n u c l e o t i d e s s t i m u l a t e a r a c h i d o n i c a c i d r e l e a s e b y p h o s p h o l i p a s e A 2 i n s a p o n i n - p e r m e a b i l i z e d h u m a n p l a t e l e t s . J . B i o c h e m . 1 0 1 : 1 0 5 5 - 1 0 5 8 , 1 9 8 7 . N a k a s h i m a S , H a t t o r i H , S h i r a t o L , T a k e n a k a A , N o z a w a Y . D i f f e r e n t i a l s e n s i t i v i t y o f a r a c h i d o n i c a c i d r e l e a s e a n d 1 , 2 - d i a c y l g l y c e r o l f o r m a t i o n t o p e r t u s s i s t o x i n . G D P B S a n d N a F i n s a p o n i n - p e r m e a b i l i z e d h u m a n p l a t e l e t s : p o s s i b l e e v i d e n c e f o r d i s t i n c t G T P - b i n d i n g p r o t e i n s i n v o l v i n g p h o s p h o l i p a s e C a n d A 2 a c t i v a t i o n . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 4 8 : 9 7 1 - 9 7 8 . 1 9 8 7 . 3 5 3 . 3 5 4 . 3 5 5 . 3 5 6 . 3 5 7 . 3 5 8 . 3 5 9 . 3 6 0 . 3 6 1 . 3 6 2 . 3 6 3 . 3 6 4 . 4 0 3 N e u b i g R R , G a n t z o s R D , B r a s i e r R S . A g o n i s t a n d a n t a g o n i s t b i n d i n g t o a z - a d r e n e r g i c r e c e p t o r s i n p u r i f i e d m e m b r a n e s f r o m h u m a n p l a t e l e t s . I m p l i c a t i o n s o f r e c e p t o r - i n h i b i t o r y n u c l e o t i d e - b i n d i n g p r o t e i n s t o i c h i o m e t r y . M o l . P h a r m a c o l . 2 8 : 4 7 5 - 4 8 6 . 1 9 8 5 . N e u b i g R R , S z a m r a j O . L a r g e - s c a l e p u r i f i c a t i o n o f a z - a d r e n e r g i c r e c e p t o r - e n r i c h e d m e m b r a n e s f r o m h u m a n p l a t e l e t s . P e r s i s t e n t a s s o c i a t i o n o f g u a n i n e n u c l e o t i d e s w i t h n o n p u r i f i e d m e m b r a n e s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 8 5 4 : 6 7 - 7 6 , 1 9 8 6 . N e w m a n P J . M c E v e r R P , D o e r s M P . K u n i c k i T J . S y n e r g i s t i c a c t i o n o f t w o m u r i n e m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s t h a t i n h i b i t A D P - i n d u c e d p l a t e l e t a g g r e g a t i o n w i t h o u t b l o c k i n g f i b r i n o g e n b i n d i n g . B l o o d 6 9 : 6 6 8 - 6 7 6 . 1 9 8 7 . N i e u w e n h u i s H K , A k k e r m a n J W N , H o u d i j k W P M , S i x m a J J . H u m a n b l o o d p l a t e l e t s s h o w i n g n o r e s p o n s e t o c o l l a g e n f a i l t o e x p r e s s s u r f a c e g l y c o p r o t e i n I a . N a t u r e 3 1 8 : 4 7 0 - 4 7 2 . 1 9 8 5 . N i e w i a r o w s k i S , B u d z y n s k i A Z , M o r i n e l l i T A , B r u d z y n s k i T M . S t e w a r t G J . E x p o s u r e o f f i b r i n o g e n r e c e p t o r o n h u m a n p l a t e l e t s b y p r o t e o l y t i c e n z y m e s . J . B i o l . C h e m . 2 5 6 : 9 1 7 - 9 2 5 . 1 9 8 1 . N i i y a K , H o d s o n E . B a d e r R . B y e r s - W a r d V , K o z i o l J A . P l o w E F . R u g g e r i Z M . I n c r e a s e d s u r f a c e e x p r e s s i o n o f t h e m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n I I b / I I I a c o m p l e x i n d u c e d b y p l a t e l e t a c t i v a t i o n . R e l a t i o n s h i p t o t h e b i n d i n g o f f i b r i n o g e n a n d p l a t e l e t a g g r e g a t i o n . B l o o d 7 0 : 4 7 5 - 4 8 3 . 1 9 8 7 . N i s h i k a w a M , T a n a k a T , H i d a k a H . C a a l c a l m o d u l i n - d e p e n d e n t p h o s p h o r y l a t i o n a n d p l a t e l e t s e c r e t i o n . N a t u r e 2 8 7 : 8 6 3 - 8 6 5 , 1 9 8 0 . N i s h i z u k a Y . T h e r o l e o f p r o t e i n k i n a s e C i n c e l l s u r f a c e s i g n a l t r a n s d u c t i o n a n d t u m o u r p r o m o t i o n . N a t u r e 3 0 8 : 6 9 3 - 6 9 8 , 1 9 8 4 . N i s h i z u k a Y . S t u d i e s a n d p e r s p e c t i v e s o f p r o t e i n k i n a s e C . S c i e n c e 2 3 3 : 3 0 5 - 3 1 2 , 1 9 8 6 . N i s h i z u k a Y . T h e m o l e c u l a r h e t e r o g e n e i t y o f p r o t e i n k i n a s e C a n d i t s i m p l i c a t i o n s f o r c e l l u l a r r e g u l a t i o n . N a t u r e 3 3 4 : 6 6 1 - 6 6 5 , 1 9 8 8 . N u n e z D , L e v y - T o l e d a n o 8 . F u r t h e r c h a r a c t e r i z a t i o n o f h u m a n p l a t e l e t a c t i v a t i o n i n t h e a b s e n c e o f a g g r e g a t i o n : p h o s p h o r y l a t i o n o f s p e c i f i c p r o t e i n s a n d r e l a t i o n s h i p w i t h p l a t e l e t s e c r e t i o n . T h r o m b . H a e m o s t a s i s 5 1 : 1 9 8 - 2 0 3 . 1 9 8 4 . N u n n a r i J M , R e p a s k e M G , B r a n d o n S , C r a g o e E J . L i m b i r d L E . R e g u l a t i o n o f p o r c i n e b r a i n a Z - a d r e n e r g i c r e c e p t o r s b y N a + , H + a n d i n h i b i t o r s o f N a n fl f ' e x c h a n g e . J . B i o l . C h e m . 2 6 2 : 1 2 3 8 7 - 1 2 3 9 2 . 1 9 8 7 . a N h P a P g f 1 s e a c l a i a 9 a r o u s c e h c e o m n . r S t o r , i L g o n P i n e . o f V e t e e a n p t r m r b y 8 s t s v i o i s i i r c 5 . d o b i m e o y f h e e s s . b s i c I s p l l e I s e h l b a p R u o P r r n e 1 n 3 g : g o i - s t u s p I t o r p s I s r . . e 1 I h 7 . i R r 7 J o a D i - n 1 s i g 9 1 . n 1 a 9 B P b s m e r O R i p r e i t l s e n g i J t c n u d . o o e x . n . E F c o M i o l 8 s 5 s e t r 8 . i h : t n s y 5 i J d 5 t b . a t r - u i n o o 6 t n B s x l 0 i d i d u c t i i s 9 o , i y o o i n s n n l i 1 g . n 8 f p C o h a n i n 6 . t o e r h p i e e b d h p m . r N t r o s a p t 2 c e s s e s : t / H h J e r 0 s i : r f 1 o e m x i o 0 e f 6 c b d 9 8 h i t p - J i u 6 a n h n - a n l e 1 e n t e s d e g i a 0 7 0 7 s a y . d n e t u l c e i . 3 6 5 . 3 6 6 . 3 6 7 . 3 6 8 . 3 6 9 . 3 7 0 . 3 7 1 . 3 7 2 . 3 7 3 . 3 7 4 . 3 7 5 . 4 0 4 N u r d e n A T , R o s a J - P , F o u r n i e r D , L e g r a n d C . D i d r y D , P a r q u e t A , P i d a r d D . A v a r i a n t o f G l a n z m a n n ' s t h r o m b a s t h e n i a w i t h a b n o r m a l g l y c o p r o t e i n I I b - I l l a c o m p l e x e s i n t h e p l a t e l e t m e m b r a n e . J . C l i n . I n v e s t . 7 9 : 9 6 2 - 9 6 9 . 1 9 8 7 . N u r d e n A T . P l a t e l e t m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s a n d t h e i r c l i n i c a l a s p e c t s . I n : I b r g m b o g i s a n d H a e m o s t a s i s 1 9 8 2 . V e r s t r a e t e M , V e r m y l e n J , L i j n e n H R . A r n o u t J , ( E d s ) . I n t e r n a t i o n a l S o c i e t y o n T h r o m b o s i s a n d H a e m o s t a s i s a n d L e u v e n U n i v e r s i t y P r e s s . P a g e s 9 3 - 1 2 5 , 1 9 8 7 . O ' H a l l o r a n T . B e c k e r l e M C , B u r r i d g e K . I d e n t i f i c a t i o n o f t a l i n a s a m a j o r c y t o p l a s m i c p r o t e i n i m p l i c a t e d i n p l a t e l e t a c t i v a t i o n . N a t u r e 3 1 7 : 4 4 9 - 4 5 1 . 1 9 8 5 . O p s t v e d t A , R o n g v e d S , A a r s a e t h e r N . L i l l e h a u g J R , H o l m s e n H . D i f f e r e n t i a l e f f e c t s o f c h l o r p r o m a z i n e o n s e c r e t i o n , p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n a n d p h o s p h o i n o s i t i d e m e t a b o l i s m i n s t i m u l a t e d p l a t e l e t s . B i o c h e m . J . 2 3 8 : 1 5 9 - 1 6 6 , 1 9 8 6 . O - R o u r k e F . H a l e n d a S P , Z a v o i c o G B . F e i n s t e i n M B . I n o s i t o l 1 . 4 . 5 - t r i s p h o s p h a t e r e l e a s e s C a ? + f r o m a C a ? + - t r a n s p o r t i n g m e m b r a n e v e s i c l e f r a c t i o n d e r i v e d f r o m h u m a n p l a t e l e t s . J . B i o l . C h e m . 2 6 0 : 9 5 6 - 9 6 2 , 1 9 8 5 . O ' R o u r k e F , Z a v o i c o G B , S m i t h L H . F e i n s t e i n M B . S t i m u l u s - r e s p o n s e c o u p l i n g i n a c e l l - f r e e p l a t e l e t m e m b r a n e s y s t e m . G T P - d e p e n d e n t r e l e a s e o f C a y ' b y t h r o m b i n . a n d i n h i b i t i o n b y p e r t u s s i s t o x i n a n d a m o n o c l o n a l a n t i b o d y t h a t b l o c k s c a l c i u m r e l e a s e b y I P 3 . F E B S L e t t . 2 1 4 : 1 7 6 - 1 8 0 , 1 9 8 7 . O s b o u r n e N N . T o b i n A B . G h a z i H . R o l e o f i n o s i t o l t r i s p h o s p h a t e P a c k h a m M A . T h e b e h a v i o r o f p l a t e l e t s a t f o r e i g n s u r f a c e s . P r o c . S o c . E x p . B i o l . M e d . 1 8 9 : 2 6 1 - 2 7 4 . 1 9 8 8 . P a n n o c c h i a A , P r a l o r a n N , A r d u i n o C , D o r a N D , B a z z a n M , S c h i n c o P , B u r a g l i o M , P i l e r i A . T a m p o n i G . A b s e n c e o f ( - ) [ 3 H ] d e s m e t h o x y - v e r a p a m i l b i n d i n g s i t e s o n h u m a n p l a t e l e t s a n d l a c k o f e v i d e n c e f o r v o l t a g e - d e p e n d e n t c a l c i u m c h a n n e l s . E u r . J . P h a r m a c o l . 1 4 2 : 8 3 - 9 1 , 1 9 8 7 . P G f 1 l i 3 i o y b 6 t c r 4 r o o , o p n w r e 1 i o c 9 c 8 t t z 8 e i i n . R n S r , I e O - e c c r I p c I t h a o e r s c k f o u o w n n k t h i i u n R a , P s n o m s N l a p u a g a t e n e n l t a e D t s J i . c t , v a m o t Y J a i . a n C d - e a i l n l K d Y e B , p i K n l u d . e o n e i n 1 c t 0 k 6 i : T 3 J 5 . 9 1 - 3 7 6 . 3 7 7 . 3 7 8 . 3 7 9 . 3 8 0 . 3 8 1 . 3 8 2 . 3 8 3 . 3 8 4 . 3 8 5 . 3 8 6 . 3 8 7 . 4 0 5 P a t t e r s o n W R . E s t r y D W , S c h w a r t z K A . B o r c h e r t R D , B e l l T G . A b s e n t p l a t e l e t a g g r e g a t i o n w i t h n o r m a l f i b r i n o g e n b i n d i n g i n B a s s e t H o u n d h e r e d i t a r y t h r o m b o p a t h y . A c c e p t e d f o r p u b l i c a t i o n , T h r o m b . H a e m o s t a s i s 1 9 8 9 . P a t t e r s o n W R , P a d g e t t G A . B e l l T G . A b n o r m a l r e l e a s e o f s t o r a g e p o o l a d e n i n e n u c l e o t i d e s f r o m p l a t e l e t s o f d o g s a f f e c t e d w i t h B a s s e t h o u n d h e r e d i t a r y t h r o m b o p a t h y . T h r o m b . R e s . 3 7 : 6 1 - 7 1 , 1 9 8 5 . P a t t e r s o n W R , K u n i c k i T J , B e l l T G . T w o - d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e t i c s t u d i e s o f p l a t e l e t s f r o m d o g s a f f e c t e d w i t h B a s s e t h o u n d h e r e d i t a r y t h r o m b o p a t h y : a t h r o m b a s t h e n i a - l i k e a g g r e g a t i o n d e f e c t . T h r o m b . R e s . 4 2 : 1 9 5 - 2 0 3 , 1 9 8 6 . P e e r s c h k e E I , Z u c k e r M B , G r a n t R A , E g a n J J , J o h n s o n M M . C o r r e l a t i o n b e t w e e n f i b r i n o g e n b i n d i n g t o h u m a n p l a t e l e t s a n d p l a t e l e t a g g r e g a b i l i t y . B l o o d 5 5 : 8 4 1 - 8 4 7 . 1 9 8 0 . P e e r s c h k e E I , Z u c k e r M B . F i b r i n o g e n r e c e p t o r e x p o s u r e a n d a g g r e g a t i o n o f h u m a n b l o o d p l a t e l e t s p r o d u c e d b y A D P a n d c h i l l i n g . B l o o d 5 7 : 6 6 3 - 6 6 9 . 1 9 8 1 . P e e r s c h k e E I B . T h e p l a t e l e t f i b r i n o g e n r e c e p t o r . S e m . H e m a t o l . 2 2 : 2 4 1 - 2 5 9 . 1 9 8 5 . P f a n n k u c h e H - J . K a e v e r V , R e s c h K . A p o s s i b l e r o l e o f p r o t e i n k i n a s e C i n r e g u l a t i n g p r o s t a g l a n d i n s y s t h e s i s o f m o u s e p e r i t o n e a l m a c r o p h a g e s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 3 9 : 6 0 4 - 6 1 1 , 1 9 8 6 . P h i l l i p s D R , A g i n P P . P l a t e l e t p l a s m a m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s . I d e n t i f i c a t i o n o f a p r o t e o l y t i c s u b s t r a t e f o r t h r o m b i n . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 7 5 : 9 4 0 - 9 4 7 . 1 9 7 7 . P h i l l i p s D R . J a k a b o v a M . C a 2 + - d e p e n d e n t p r o t e a s e i n h u m a n p l a t e l e t s . S p e c i f i c c l e a v a g e o f p l a t e l e t p o l y p e p t i d e s i n t h e p r e s e n c e o f a d d e d C a 1 + . . J . B i o l . C h e m . 2 5 2 : 5 6 0 2 - 5 6 0 5 , 1 9 7 7 . P h i l l i p s D R , J e n n i n g s L K , E d w a r d s H H . I d e n t i f i c a t i o n o f m e m b r a n e p r o t e i n s m e d i a t i n g t h e i n t e r a c t i o n o f h u m a n p l a t e l e t s . J . C e l l B i o l . 8 6 : 7 7 - 9 6 , 1 9 8 0 . P i e t u G . F r e s s i n a u d E , G i r m a J P , N i e u w e n h u i s H K , R o t h s c h i l d C , M e y e r D . B i n d i n g o f h u m a n v o n W i l l e b r a n d f a c t o r t o c o l l a g e n a n d t o c o l l a g e n - s t i m u l a t e d p l a t e l e t s . J . L a b . C l i n . M e d . 1 0 9 : 6 3 7 - 6 4 6 . 1 9 8 7 . 3 8 8 . 3 8 9 . 3 9 0 . 3 9 1 . 3 9 2 . 3 9 3 . 3 9 4 . 3 9 5 . 3 9 6 . 3 9 7 . 3 9 8 . 3 9 9 . 4 0 6 P o l a s e k J , R i c h a r d s o n M , M o o r e M A , B l a j c h m a n M A . E v i d e n c e f o r a n a l t e r n a t i v e m e c h a n i s m o f h u m a n p l a t e l e t s e c r e t i o n i n v o l v i n g p e r i p h e r a l i z a t i o n o f s e c r e t o r y g r a n u l e s a n d f o r m a t i o n o f m e m b r a n e - a s s o c i a t e d m u l t i v e s i c u l a r s t r u c t u r e s . T h r o m b . R e s . 4 5 : 7 7 1 - 7 8 2 . 1 9 8 7 . P o l l C , W e s t w i c k J . P h o r b o l e s t e r s m o d u l a t e t h r o m b i n - o p e r a t e d c a l c i u m m o b i l i s a t i o n a n d d e n s e g r a n u l e r e l e a s e i n h u m a n p l a t e l e t s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 8 8 6 : 4 3 4 - 4 4 0 , 1 9 8 6 . P o l l a r d T D , C r a i g S W . M e c h a n i s m o f a c t i n p o l y m e r i z a t i o n . T r e n d s B i o c h e m . S c i . 7 : 5 5 - 5 8 , 1 9 8 2 . P o l l a r d T D . C o o p e r J A . A c t i n a n d a c t i n - b i n d i n g p r o t e i n s . A c r i t i c a l e v a l u a t i o n o f m e c h a n i s m s a n d f u n c t i o n s . A n n . R e v . B i o c h e m . 5 5 : 9 8 7 - 1 0 3 5 , 1 9 8 6 . P o l l o c k W K . R i n k T J . I r v i n e R F . L i b e r a t i o n o f [ 3 H ] a r a c h i d o n i c a c i d a n d c h a n g e s i n c y t o s o l i c f r e e c a l c i u m i n f u r a - 2 - l o a d e d h u m a n p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y i o n o m y c i n a n d c o l l a g e n . B i o c h e m . J . 2 3 5 : 8 6 9 - 8 7 7 . 1 9 8 6 . P o l l o c k W K , R i n k T J . T h r o m b i n a n d i o n o m y c i n c a n r a i s e p l a t e l e t c y t o s o l i c C a 2 + t o m i c r o m o l a r l e v e l s b y d i s c h a r g e o f i n t e r n a l C a 2 + s t o r e s : s t u d i e s u s i n g f u r a - 2 . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 3 9 : 3 0 8 - 3 1 4 , 1 9 8 6 . P o w l i n g M J . H a r d i s t y R M . G l y c o p r o t e i n I I b - I I I a c o m p l e x a n d C a 2 + i n f l u x i n t o s t i m u l a t e d p l a t e l e t s . B l o o d 6 6 : 7 3 1 - 7 3 4 . 1 9 8 5 . P o w l i n g M J , H a r d i s t y R M . D i f f e r e n t i a l e f f e c t s o f 1 2 - 0 - t e t r a d e c a n o y l p h o r b o l 1 3 - a c e t a t e o n p l a t e l e t r e s p o n s e s t o v a r i o u s a g o n i s t s i n t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f e x t r a c e l l u l a r C a ” . T h r o m b . R e s . 4 4 : 1 8 5 - 1 9 5 . 1 9 8 6 . P r u l i e r e G , d ' A l b i s A , D e r T e r r o s s i a n E . E f f e c t o f t r o p o m y o s i n o n t h e i n t e r a c t i o n s o f a c t i n w i t h a c t i n - b i n d i n g p r o t e i n s i s o l a t e d f r o m p i g p l a t e l e t s . E u r . J . B i o c h e m . 1 5 9 : 5 3 5 - 5 4 7 , 1 9 8 6 . P u r d o n A D . P a t e l u n a s D , S m i t h J B . E v i d e n c e f o r t h e r e l e a s e o f a r a c h i d o n i c a c i d t h r o u g h t h e s e l e c t i v e a c t i o n o f p h o s p h o l i p a s e A 2 i n t h r o m b i n - s t i m u l a t e d h u m a n p l a t e l e t s . B i o c h e m . B i o p h y s . A c t a . 9 2 0 : 2 0 5 - 2 1 4 , 1 9 8 7 . P u t n e y J W . C a l c i u m - m o b i l i z i n g r e c e p t o r s . T r e n d s P h a r m a c o l . S c i . 8 : 4 8 1 - 4 8 6 . 1 9 8 7 . P y t e l a R , P i e r s c h b a c h e r M D , G i n s b e r g M H , P l o w E F . R u o s l a h t i E . P l a t e l e t m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n I I b - I I I a : m e m b e r o f a f a m i l y o f A r g - G l y - A s p - s p e c i f i c a d h e s i o n r e c e p t o r s . S c i e n c e 2 3 1 : 1 5 5 9 - 1 5 6 2 , 1 9 8 6 . R J c R i a t m a B o . h a m s h e a o p t s r A H i n A c m b K o r K i b o . . l e p o a l a i o o a K s o K a e s i p n i i e e o s l d m o n k h b k w i e o H e e i p n . r r t r y K a h o K . l t d , p l D l o t i l D t c a a n e t a b n t o n y u i l i e o m o e l f H i e t . n P i a a u a l e J n . s a - t , . d m h x t i e e d h d c J L . r B d a l s e S E e c o m f p A c h o i e f m B i r d t n e . t c o 6 J e t i n 4 J k n . e i B o : t o t c n 9 . f C t 1 p l C e c o r l - n f i l t b , 9 . e d 2 m i u H c 1 s a m P . a t a e l i a 4 a d H a a i s s e a d h 1 d n n n t s n l 8 . l f n s 9 H o e o c B r . c a , i m B i r 8 o o i 4 . a a l e a 3 D t l e n c : a e e c h 6 y d m d i y 8 H w o i n o - . J i s 6 n g n t i a 9 y i d 7 S i l e , n t h 6 d p m l s a i i o t t g r e h h d l t e e r t 1 9 8 5 . 4 0 0 . 4 0 1 . 4 0 2 . 4 0 3 . 4 0 4 . 4 0 5 . 4 0 6 . 4 0 7 . 4 0 8 . 4 0 9 . 4 1 0 . 4 1 1 . 4 0 7 R a o A K . H o l m s e n H . C o n g e n i t a l d i s o r d e r s o f p l a t e l e t f u n c t i o n . S e m . H e m a t o l . 2 3 : 1 0 2 - 1 1 8 , 1 9 8 6 . R a o A K . W i l l i s J . K o w a l s k a M A , W a c h t f o g e l Y T . C o l m a n R W . D i f f e r e n t i a l r e q u i r e m e n t s f o r p l a t e l e t a g g r e g a t i o n a n d i n h i b i t i o n o f a d e n y l a t e c y c l a s e b y e p i n e p h r i n e . S t u d i e s o f a f a m i l i a l p l a t e l e t a l p h a z - a d r e n e r g i c r e c e p t o r d e f e c t . B l o o d 7 1 : 4 9 4 - 5 0 1 . 1 9 8 8 . R e g a n J W , N a k a t a H , D e M a r i n i s R M , C a r o n M G , L e f k o w i t z R J . P u r i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e h u m a n p l a t e l e t a 2 - a d r e n e r g i c r e c e p t o r . J . B i o l . C h e m . 2 6 1 : 3 8 9 4 - 3 9 0 0 . 1 9 8 6 . R e n g a s a m y A , S o u r a S . F e i n b e r g H . P l a t e l e t C a z ' h o m e o s t a s i s : N a + - C a u ' e x c h a n g e i n p l a s m a m e m b r a n e v e s i c l e s . T h r o m b . H a e m o s t a s i s 5 7 : 3 3 7 - 3 4 0 . 1 9 8 7 . R e n g a s a m y A , F e i n b e r g H . I n o s i t o l 1 . 4 , 5 - t r i s p h o s p h a t e - i n d u c e d c a l c i u m r e l e a s e f r o m p l a t e l e t p l a s m e m e m b r a n e v e s i c l e s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 5 0 : 1 0 2 1 - 1 0 2 6 , 1 9 8 8 . R i n k T J . S m i t h S W , T s i e n R Y . C y t o p l a s m i c f r e e C a m ' i n . h u m a n p l a t e l e t s : C a a ' t h r e s h o l d s a n d C a - i n d e p e n d e n t a c t i v a t i o n f o r s h a p e - c h a n g e a n d s e c r e t i o n . F E B S L e t t . 1 4 8 : 2 1 - 2 6 , 1 9 8 2 . R i n k T J , S a n c h e z A , H a l l a m T J . D i a c y l g l y c e r o l a n d p h o r b o l e s t e r s t i m u l a t e s e c r e t i o n w i t h o u t r a i s i n g c y t o p l a s m i c f r e e c a l c i u m i n h u m a n p l a t e l e t s . N a t u r e 3 0 5 : 3 1 7 - 3 1 9 , 1 9 8 3 . R i n k T J , S m i t h S W . I n h i b i t o r y p r o s t a g l a n d i n s s u p p r e s s C a 2 + i n f l u x . t h e r e l e a s e o f i n t r a c e l l u l a r C a y ’ a n d t h e r e s p o n s i v e n e s s t o c y t o p l a s m i c C a fl ' i n h u m a n p l a t e l e t s . J . P h y s i o l . 3 3 8 : 6 6 P - 6 7 P , 1 9 8 3 . R i t t e n h o u s e - S i m m o n s S . P r o d u c t i o n o f d i g l y c e r i d e f r o m p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l i n a c t i v a t e d h u m a n p l a t e l e t s . J . C l i n . I n v e s t . 6 3 : 5 8 0 - 5 8 7 . 1 9 7 9 . R i t t e n h o u s e S E . H u m a n p l a t e l e t s c o n t a i n p h o s p h o l i p a s e C t h a t h y d r o l y z e s p o l y p h o s p h o i n o s i t i d e s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 0 : 5 4 1 7 - 5 4 2 0 , 1 9 8 3 . g P f i F S i r S R K H R R W R p a 1 S a 2 l l a u i a u u i n y A a i l a n n 3 a c y a a e g g c l o u S g e s a g d 6 t k m t n f c t l s E g g e f e : o i e t a o f o e e e e S i B , e u A 1 n v 1 4 , t r l C p e l r r b t H S S r D 1 a 1 r r a s r e i i o J O , o . . e O P t 9 2 M o h a - t l - e l . , 4 8 t , . . . . b i 4 r : h e i e i d 1 1 a n T N t Z Z n L a 2 s i d . s 1 - o e d e M M J R p R n - t 1 . . . 1 K L n e 9 a 3 n n u o d i l e : v i 8 k k c a C Z d s c F S I e 5 e e e l i p s Y 8 h E e d 2 m e 9 , b u a t m h T m a B T d e . 1 i e , - y r e L G c a o g s 9 , - s l s 9 . . . H o M m n d m 1 1 a J S J n 3 a a , 5 I r r r e p e 3 L a e h 8 h a n a I a K c M o a m . 9 t r . c e . t 1 n v n K n t t i a i J o 1 . , C I I m c e e h e l u 6 i p M e - e n L h B 9 d h . , n u n t e c . t n 7 h : i r f a t o E 1 a T l i i 8 e m . s Y e c J f 9 t o k b a 1 t , 7 S t p O a P h 8 f G o i . . . i g 8 i i l h s a n e a o d R t g 8 n . 1 c a n e l t t e V e 2 7 o e 1 d l i s e A o b 1 n : 5 a f x : e , M s i e 3 : o 0 n g i u H n e l o L S n i 8 b t f J - - t p , 1 , 1 o n n W 9 G y e i a a 5 c r d i o n c 2 . 3 , 9 s . K l o a s t D B l h i l o u r a n l - 9 0 t f n e d i o , n a e n m o d g e 1 C v r i c r B k l a u a e 9 b a a s n 1 4 e e i i e . l e n s r 8 r 9 t t k s o l i a a i o q t 8 e G 3 c t s . . e n L l y d 9 n i i . e e s a p R t n o l l u 1 . h . 5 b a , t a 8 t t n n e m . i t f f 2 M i b w 7 T T . L b e o o a o - f c y e w h o r e o r l n c f l r e B g d e t t p C o n o i t g v r y o r a c a o m f , u t l l u i o b r a o o r o fl y d t n m n p t e t f h i ' d o u e e o d a r n a Y h c t y i d n d o h m e r W r n s n o t p o h r y m s . s R i m l v R e i m n R f i n . e n b n D a e o o R s c a l c a a n e l s n - c 2 . . g r o c i a 4 m L t r e , . l e J t . a B d d u c u o o l i c r m i n . u e m d e m s . o p a f a n s “ o s l n l : d t C : 2 0 7 - o m b . e s . 4 1 2 . 4 1 3 . 4 1 4 . 4 1 5 . 4 1 6 . 4 1 7 . 4 1 8 . 4 1 9 . 4 2 0 . 4 2 1 . 4 2 2 . 4 2 3 . 4 2 4 . 4 2 5 . 4 0 8 R i t t e n h o u s e S E , H o r n e W C . I o n o m y c i n c a n e l e v a t e i n t r a p l a t e l e t C a 2 + a n d a c t i v a t e p h o s p h o l i p a s e A w i t h o u t a c t i v a t i n g p h o s p h o l i p a s e C . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 2 3 : 3 9 3 - 3 9 7 . 1 9 8 4 . R i t t e n h o u s e S E . A c t i v a t i o n o f h u m a n p l a t e l e t p h o s p h o l i p a s e C b y i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 i s t o t a l l y d e p e n d e n t u p o n c y c l o - o x y g e n a s e p r o d u c t s a n d A D P . B i o c h e m . J . 2 2 2 : 1 0 3 - 1 1 0 , 1 9 8 4 . R i t t e n h o u s e S E , S a s s o n J P . M a s s c h a n g e s i n m y o i n o s i t o l t r i s p h o s p h a t e i n h u m a n p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y t h r o m b i n . J . B i o l . C h e m . 2 6 0 : 8 6 5 7 - 8 6 6 0 , 1 9 8 5 . R o s s R . R a i n e s E W , B o w e n - P o p e D F . T h e b i o l o g y o f p l a t e l e t - d e r i v e d g r o w t h f a c t o r . C e l l 4 6 : 1 5 5 - 1 6 9 . 1 9 8 6 . R o s s R . P l a t e l e t - d e r i v e d g r o w t h f a c t o r . A n n . R e v . M e d . 3 8 : 7 1 - 7 9 , 1 9 8 7 . R o t h G J , M a j e r u s P W . T h e m e c h a n i s m o f t h e e f f e c t o f a s p i r i n o n h u m a n p l a t e l e t s . I . A c e t y l a t i o n o f a p a r t i c u l a t e f r a c t i o n p r o t e i n . J . C l i n . I n v e s t . 5 6 : 6 2 4 - 6 3 2 . 1 9 7 5 . R o t h G J , 0 2 0 1 8 J . N u g e n t D J . W i l l i a m s S A . I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f h u m a n p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n I X . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 5 6 : 9 3 1 - 9 3 9 , 1 9 8 8 . h 9 S p B a E S s h S 2 4 h l c l h h x u e u 6 : a a p b a t o a m m 2 o 1 t t i r s t o t a : s 0 t e t v e e d t n 9 8 i l i a i s q t 9 a - l e t l l p 2 s u 6 s 1 i - t e l i 8 h 9 o s r J o r - t i 1 o 1 S S n o : S a s 8 n 0 m n J J t 1 J t : . . , . e 2 e . 0 1 b M p H f e B 4 e m o d 2 l 0 , x 8 t a . 1 a s y e 1 f 0 n 2 s s n i i u 9 . 3 i s B b e e l s 8 b o i s r i 1 y 7 g i l J t L o k , . o y n i l i A l F g o z y 1 n . . . y H g a 9 c t a u p h n i I a . 6 n n r d n o e m . I r n d e . o n c i t n e u l C o C r e t J 8 p n e s c o c l a g i 2 e e f t u t h n 6 p i l l a 0 h t h o a o m : I P o u n r I p 1 m A r b h M o 1 a m , s y , - 1 n f e I d F 0 s d i 7 i B I l u p t o - a r I a r l h l 1 a a h i a e t o 1 s t e n g 1 s r g e c f y 1 o i t l . 4 L m a b y e o r s . , F t p c r . s l L t i 1 A e i n , J n n 9 v x o b . . 5 h d r t e B C B a 8 y g . a u i e a n i t e n n e . s e g L a c I n r s o p g i s n i n r o l . i M p d . h p h n l e t r e d i m a o . n r . t t h e e . e l o F p n e C t e n 4 2 6 . 4 2 7 . 4 2 8 . 4 2 9 . 4 3 0 . 4 3 1 . 4 3 2 . 4 3 3 . 4 3 4 . 4 3 5 . 4 3 6 . 4 3 7 . 4 3 8 . 4 0 9 S a l a m a S E , H a s l a m R J . C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e p r o t e i n k i n a s e a c t i v i t i e s o f h u m a n p l a t e l e t s u p e r n a t a n t a n d p a r t i c u l a t e f r a c t i o n s . B i o c h e m . J . 2 1 8 : 2 8 5 - 2 9 4 . 1 9 8 4 . S a l i m a t h B P . M i t t e l h o l z e r E , M u g g l i R , D i e t e r P . M a r m e . M i c r o s o m a l C a 2 + u p t a k e i n h u m a n . p 1 a t e 1 e t s i s s t i m u l a t e d b y c a l m o d u l i n . C o m p a r i s o n o f t h r o m b i n a n d c o l l a g e n a c t i o n s . T h r o m b . R e s . 4 1 : 5 1 9 - 5 2 6 . 1 9 8 6 . S a n o K , T a k a i Y . Y a m a n i s h i J . N i s h i z u k a Y . A r o l e o f c a l c i u m - a c t i v a t e d p h o s p h o l i p i d - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e i n h u m a n p l a t e l e t a c t i v a t i o n . J . B i o l . C h e m . 2 5 8 : 2 0 1 0 - 2 0 1 3 . 1 9 8 3 . S a u s s y D L . M a i s D E . B u r c h R M , H a l u s h k a P V . I d e n t i f i c a t i o n o f a p u t a t i v e t h r o m b o x a n e A g / p r o s t a g l a n d i n H 2 r e c e p t o r i n h u m a n p l a t e l e t m e m b r a n e s . J . B i o l . C h e m . 2 6 1 : 3 0 2 5 - 3 0 2 9 . 1 9 8 6 . S c h e u e r W . P h o s p h o l i p a s e A 2 - r e g u l a t i o n a n d i n h i b i t i o n . K l i n . W o c h e n s c h r . 6 7 : 1 5 3 - 1 5 9 . 1 9 8 9 . S c h o l e y J M , T a y l o r K A . K e n d r i c k - J o n e s J . R e g u l a t i o n o f n o n - m u s c l e m y o s i n a s s e m b l y b y c a l m o d u l i n - d e p e n d e n t l i g h t c h a i n k i n a s e . N a t u r e 2 8 7 : 2 3 3 - 2 3 5 , 1 9 8 0 . S e i f t e r J L , A r o n s o n P S . P r o p e r t i e s a n d p h y s i o l o g i c r o l e s o f t h e p l a s m a m e m b r a n e s o d i u m - h y d r o g e n e x c h a n g e r . J . C l i n . I n v e s t . 7 8 : 8 5 9 - 8 6 4 . 1 9 8 6 . S e k a r M C , H o k i n L E . T h e r o l e o f p h o s p h o i n o s i t i d e s i n s i g n a l t r a n s d u c t i o n . J . M e m b . B i o l . 8 9 : 1 9 3 - 2 1 0 . 1 9 8 6 . S e r h a n C , A n d e r s o n P , G o o d m a n E , D u n h a m P . W e i s s m a n n G . P h o s p h a t i d a t e a n d o x i d i z e d f a t t y a c i d s a r e c a l c i u m i o n O p h o r e s . S t u d i e s e m p l o y i n g a r s e n a z o I I I i n l i p o s o m e s . J . B i o l . C h e m . 2 5 6 : 2 7 3 6 - 2 7 4 1 , 1 9 8 1 . S h a t t i l S J , B e n n e t J S . P l a t e l e t s a n d t h e i r m e m b r a n e s i n 4 3 9 4 4 0 . 4 4 1 . 4 4 2 . 4 4 3 . 4 4 4 . 4 4 5 . 4 4 6 . 4 4 7 . 4 4 8 . 4 4 9 . 4 5 0 . 4 1 0 S h e n o l i k a r S . C o n t r o l o f c e l l f u n c t i o n b y r e v e r s i b l e p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n . J . C y c l i c N u c l e o t i d e P r o t e i n P h o s . R e s . 1 1 : 5 3 1 - 5 4 1 . 1 9 8 7 . S h u k l a S D , H a n a h a n D J . A n e a r l y t r a n s i e n t d e c r e a s e i n p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 4 . 5 - b i s p h o s p h a t e u p o n s t i m u l a t i o n o f r a b b i t p l a t e l e t s w i t h a c e t y l g l y c e r y l e t h e r p h o s p h o r y l c h o l i n e ( p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r ) . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 2 2 7 : 6 2 6 - 6 2 9 , 1 9 8 3 . S i e s s W , C u a t r e c a s a s P , L a p e t i n a E G . A r o l e f o r c y c l o o x y g e n a s e p r o d u c t s i n t h e f o r m a t i o n o f p h o s p h a t i d i c a c i d i n s t i m u l a t e d h u m a n p l a t e l e t s . D i f f e r e n t i a l m e c h a n i s m s o f a c t i o n o f t h r o m b i n a n d c o l l a g e n . J . B i o l . C h e m . 2 5 8 : 4 6 8 3 - 4 6 8 6 . 1 9 8 3 . S i e s s W , L a p e t i n a E G . P r o p e r t i e s a n d d i s t r i b u t i o n o f p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l - s p e c i f i c p h o s p h o l i p a s e C i n h u m a n a n d h o r s e p l a t e l e t s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 7 5 2 : 3 2 9 - 3 3 8 , 1 9 8 3 . S i e s s W , S i e g e l F L , L a p e t i n a E G . A r a c h i d o n i c a c i d s t i m u l a t e s t h e f o r m a t i o n o f l , 2 - d i a c y l g l y c e r o l a n d p h o s p h a t i d i c a c i d i n h u m a n p l a t e l e t s . D e g r e e o f p h o s p h o l i p a s e C a c t i v a t i o n c o r r e l a t e s w i t h p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n , p l a t e l e t s h a p e c h a n g e , s e r o t o n i n r e l e a s e a n d a g g r e g a t i o n . J . B i o l . C h e m . 2 5 8 : 1 1 2 3 6 - 1 1 2 4 2 , 1 9 8 3 . S i e s s W . W e b e r P C , L a p e t i n a E G . A c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e C i s d i s s o c i a t e d f r o m a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i s m d u r i n g p l a t e l e t s h a p e c h a n g e i n d u c e d b y t h r o m b i n o r p l a t e l e t - a c t i v a t i n g f a c t o r . E p i n e p h r i n e d o e s n o t i n d u c e p h o s p h o l i p a s e C a c t i v a t i o n o r p l a t e l e t s h a p e c h a n g e . J . B i o l . C h e m . 2 5 9 : 8 2 8 6 - 8 2 9 2 . 1 9 8 4 . S i e s s W , B o e h l i g B , W e b e r P C , L a p e t i n a E G . P r o s t a g l a n d i n e n d o p e r o x i d e a n a l o g u e s s i m u l a t e p h o s p h o l i p a s e C a n d p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n d u r i n g p l a t e l e t s h a p e c h a n g e . B l o o d 6 5 : 1 1 4 1 - 1 1 4 8 , 1 9 8 5 . S i e s s W . B i n d e r H . T h r o m b i n i n d u c e s t h e r a p i d f o r m a t i o n o f i n o s i t o l b i s p h o s p h a t e a n d i n o s i t o l t r i s p h o s p h a t e i n h u m a n p l a t e l e t s . F E B S L e t t . 1 8 0 : 1 0 7 - 1 1 1 , 1 9 8 5 . S i e s s W , L a p e t i n a E G . P h o r b o l e s t e r s s e n s i t i z e p l a t e l e t s t o a c t i v a t i o n b y p h y s i o l o g i c a l a g o n i s t s . B l o o d 7 0 : 1 3 7 3 - 1 3 8 1 . 1 9 8 7 . S i e s s W . L a p e t i n a E G . C a y ' m o b i l i z a t i o n p r i m e s p r o t e i n k i n a s e C i n h u m a n p l a t e l e t s . C a m ' a n d . p h o r b o l e s t e r s s t i m u l a t e p l a t e l e t a g g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n s y n e r g i s t i c a l l y t h r o u g h p r o t e i n k i n a s e C . B i o c h e m . J . 2 5 5 : 3 0 9 - 3 1 8 , 1 9 8 8 . S i e s s . W . M o l e c u l a r m e c h a n i s m s o f p l a t e l e t a c t i v a t i o n . P h y s i o l . R e v . 6 9 : 5 8 - 1 7 8 , 1 9 8 9 . S i f f e r t W , M u c k e n h o f f K , S c h e i d P . E v i d e n c e f o r a r o l e o f N a f / H + e x c h a n g e i n p l a t e l e t s a c t i v a t e d w i t h c a l c i u m - i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 2 5 : 1 1 2 3 - 1 1 2 8 , 1 9 8 4 . 4 5 1 . 4 5 2 . 4 5 3 . 4 5 4 . 4 5 5 . 4 5 6 . 4 5 7 . 4 5 8 . 4 5 9 . 4 6 0 . 4 6 1 . 4 1 1 S i f f e r t W , A k k e r m a n J W N . A c t i v a t i o n o f s o d i u m - p r o t o n e x c h a n g e i s a p r e r e q u i s i t e f o r C m fl ' m o b i l i z a t i o n i n h u m a n p l a t e l e t s . N a t u r e 3 2 5 : 4 5 6 - 4 5 8 . 1 9 8 7 . S i f f e r t W , S i f f e r t G . S c h e i d P , R i e m e n s T , G o r t e r G . A k k e r m a n J W N . I n h i b i t i o n o f N a " / H + e x c h a n g e r e d u c e s C a 2 + m o b i l i z a t i o n w i t h o u t a f f e c t i n g t h e i n i t i a l c l e a v a g e o f p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 4 , 5 - b i s p h o s p h a t e i n t h r o m b i n - s t i m u l a t e d p l a t e l e t s . F E B S L e t t . 2 1 2 : 1 2 3 - 1 2 6 . 1 9 8 7 . S i f f e r t W , S i f f e r t G . S c h e i d P . A c t i v a t i o n o f N a fl fl r ' e x c h a n g e i n h u m a n p l a t e l e t s s t i m u l a t e d b y t h r o m b i n a n d p h o r b o l e s t e r . B i o c h e m . J . 2 4 1 : 3 0 1 - 3 0 3 , 1 9 8 7 . S i f f e r t W . A k k e r m a n J W N . N a h “ ? e x c h a n g e a s a m o d u l a t o r o f p l a t e l e t a c t i v a t i o n . T r e n d s B i o c h e m . S c i . 1 3 : 1 4 8 - 1 5 1 . 1 9 8 8 . S i f f e r t W . A k k e r m a n J W N . P r o t e i n k i n a s e C e n h a n c e s C a z ' m o b i l i z a t i o n i n h u m a n p l a t e l e t s b y a c t i v a t i n g N ' a J / H + e x c h a n g e . J . B i o l . C h e m . 2 5 3 : 4 2 2 3 - 4 2 2 7 . 1 9 8 8 . S i m o n M - F , C h a p H . D o u s t e - B l a z y L . P l a t e l e t a g g r e g a t i n g a c t i v i t y o f l y s o p h o s p h a t i d i c a c i d s i s n o t r e l a t e d t o t h e i r c a l c i u m i o n o p h o r e p r o p e r t i e s . F E B S L e t t . 1 6 6 : 1 1 5 - 1 1 9 , 1 9 8 4 . S i m o n M - F . C h a p H , D o u s t e - B l a z y L . S e l e c t i v e i n h i b i t i o n o f h u m a n p l a t e l e t p h o s p h o l i p a s e A ? b y b u f f e r i n g c y t o p l a s m i c c a l c i u m w i t h t h e f l u o r e s c e n t i n d i c a t o r q u i n 2 . E v i d e n c e f o r d i f f e r e n t c a l c i u m s e n s i t i v i t i e s o f p h o s p h o l i p a s e s A 2 a n d C . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 8 7 5 : 1 5 7 - 1 6 4 , 1 9 8 6 . S i m o n M - F . C h a p H , D o u s t e - B l a z y L . E f f e c t o f a s t i m u l a n t o f g u a n y l a t e c y c l a s e . s i n 1 . o n c a l c i u m m o v e m e n t s a n d p h o s p h o l i p a s e C a c t i v a t i o n i n t h r o m b i n - s t i m u l a t e d h u m a n p l a t e l e t s . B i o c h e m . P h a r m a c o l . 3 7 : 1 2 6 3 - 1 2 6 9 , 1 9 8 8 . S i x m a J J , S c h i p h o r s t M E . V e r h o e c k x C . J o c k u s c h B M . P e r i p h e r a l a n d i n t e g r a l p r o t e i n s o f h u m a n b l o o d p l a t e l e t m e m b r a n e s . a - A c t i n i n i s n o t i d e n t i c a l t o g l y c o p r o t e i n I I I . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 7 0 4 : 3 3 3 - 3 4 4 , 1 9 8 2 . S m i t h J B . I n g e r m a n C , S i l v e r M J . P e r s i s t e n c e o f t h r o m b o x a n e A 2 - l i k e m a t e r i a l a n d p l a t e l e t r e l e a s e - i n d u c i n g a c t i v i t y i n p l a s m a . J . C l i n . I n v e s t . 5 8 : 1 1 1 9 - 1 1 2 2 , 1 9 7 6 . S m i t h S K , L i m b i r d L E . S o l u b i l i z a t i o n o f h u m a n p l a t e l e t a - a d r e n e r g i c r e c e p t o r s : e v i d e n c e t h a t a g o n i s t o c c u p a n c y o f t h e r e c e p t o r s t a b i l i z e s r e c e p t o r - e f f e c t o r i n t e r a c t i o n s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 7 8 : 4 0 2 6 - 4 0 3 0 , 1 9 8 1 . 4 6 2 . 4 6 3 . 4 6 4 . 4 6 5 . 4 6 6 . 4 6 7 . 4 6 8 . 4 6 9 . 4 7 0 . 4 7 1 . 4 7 2 . 4 7 3 . 4 7 4 . 4 1 2 S m i t h W L , B o r g e a t P . T h e E i c o s a n o i d s : p r o s t a g l a n d i n s . l e u k o t r i e n e s , a n d h y d r o x y - e i c o s a e n o i c a c i d s . I n : B i g g h g m i fi r y _ g f , L 1 2 1 Q § _ g n d _ n g m b r g n g § . V a n c e D E a n d V a n c e J E ( E d s ) . T h e B e n j a m i n / C u m m i n g s P u b l i s h i n g C o m p a n y I n c . , M e n l o P a r k . C A . P a g e s 3 2 5 - 3 6 0 . 1 9 8 5 . S o l u m N O . P l a t e l e t m e m b r a n e p r o t e i n s . S e m . H e m a t o l . 2 2 : 2 8 9 - 3 0 2 . 1 9 8 5 . S p a t A , F a b i a t o A , R u b i n R P . B i n d i n g o f i n o s i t o l t r i s p h o s p h a t e b y a l i v e r m i c r o s o m a l f r a c t i o n . B i o c h e m . J . 2 3 3 : 9 2 9 - 9 3 2 , 1 9 8 6 . S p a t A . B r a d f o r d P G . M c K i n n e y J S , R u b i n R P . P u t n e y J W . A s a t u r a b l e r e c e p t o r f o r ' 3 2 P - i n o s i t o l - 1 . 4 , 5 - t r i s p h o s p h a t e i n h e p a t o c y t e s a n d n e u t r o p h i l s . N a t u r e 3 1 9 : 5 1 4 - 5 1 6 . 1 9 8 6 . S p i e g e l A M . S i g n a l t r a n s d u c t i o n b y g u a n i n e n u c l e o t i d e b i n d i n g p r o t e i n s . M o l . C e l l . E n d o c . 4 9 : 1 - 1 6 , 1 9 8 7 . S t e e n V M , H o l m s e n H . C u r r e n t a s p e c t s o n h u m a n p l a t e l e t a c t i v a t i o n . E u r . J . H a e m a t o l . 3 8 : 3 8 3 - 3 9 9 . 1 9 8 7 . S t r e b H , I r v i n e R F . B e r r i d g e M J . S c h u l z I . R e l e a s e o f C a 2 + f r o m a n o n m i t o c h o n d r i a l i n t r a c e l l u l a r s t o r e i n p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s b y i n o s i t o l - 1 . 4 , 5 - t r i s p h o s p h a t e . N a t u r e 3 0 6 : 6 7 - 6 8 . 1 9 8 3 . S t u a r t M J . P r o s t a g l a n d i n s a n d h o m e o s t a s i s : a n o v e r v i e w . A d v . P e d i a t . 3 0 : 3 2 1 - 3 6 4 . 1 9 8 3 . S t u r k A , A s y e e G M , S c h a a p M C L . v a n M a a n e n M , t e n C a t e J W . S y n e r g i s t i c e f f e c t s o f p l a t e l e t - a c t i v a t i n g f a c t o r a n d o t h e r p l a t e l e t a g o n i s t s i n h u m a n p l a t e l e t a g g r e g a t i o n a n d r e l e a s e : t h e r o l e o f A D P a n d p r o d u c t s o f t h e c y c l o o x y g e n a s e p a t h w a y . T h r o m b . R e s . 4 0 : 3 5 9 - 3 7 2 , 1 9 8 5 . S u p a t t a p o n e S . W o r l e y P F . B a r a b a n J M , S n y d e r S H . S o l u b i l i z a t i o n . p u r i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a n i n o s i t o l t r i s p h o s p h a t e r e c e p t o r . J . B i o l . C h e m . 2 6 3 : 1 5 3 0 - 1 5 3 4 . 1 9 8 8 . S w e a t t J D , J o h n s o n S L , C r a g o e E J . L i m b i r d L E . I n h i b i t o r s o f N a fi fl f e x c h a n g e b l o c k s t i m u l u s - p r o v o k e d a r a c h i d o n i c a c i d r e l e a s e i n h u m a n p l a t e l e t s . S e l e c t i v e e f f e c t s o n p l a t e l e t a c t i v a t i o n b y e p i n e p h r i n e , A D P a n d l o w e r c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n . J . B i o l . C h e m . 2 6 0 : 1 2 9 1 0 - 1 2 9 1 9 , 1 9 8 5 . S w e a t t J D , C o n n o l l y T M , C r a g o e E J . L i m b i r d L E . E v i d e n c e t h a t N a J / H + e x c h a n g e r e g u l a t e s r e c e p t o r - m e d i a t e d p h o s p h o l i p a s e A 2 a c t i v a t i o n i n h u m a n p l a t e l e t s . J . B i o l . C h e m . 2 6 1 : 8 6 6 7 - 8 6 7 3 , 1 9 8 6 . S w e a t t J D , B l a i r I A , C r a g o e E J . L i m b i r d L E . I n h i b i t o r s o f N a fl fl f ' e x c h a n g e b l o c k e p i n e p h r i n e - a n d A D P - i n d u c e d s t i m u l a t i o n o f h u m a n p l a t e l e t p h o s p h o l i p a s e C b y b l o c k a d e o f a r a c h i d o n i c a c i d r e l e a s e a t a p r i o r s t e p . J . B i o l . C h e m . 2 6 1 : 8 6 6 0 - 8 6 6 6 , 1 9 8 6 . 4 7 5 . 4 7 6 . 4 7 7 . 4 7 8 . 4 7 9 . 4 8 0 . 4 8 1 . 4 8 2 . 4 8 3 . 4 8 4 . 4 8 5 . 4 1 3 S w e a t t J D , S c h w a r t z b e r g M S . F r a z e r M . C r a g o e E J . B l a i r I A . R e e d P W , L i m b i r d L E . E v i d e n c e f o r a r o l e f o r N a n fl f e x c h a n g e i n a c t i v a t i o n o f h u m a n p l a t e l e t s b y P A F . C i r c . R e s . 6 1 ( S u p p 1 . I I ) : I I 6 - I I l l , 1 9 8 7 . S w e a t t J D , C o n n o l l y T M , B a r o n B M , L i m b i r d L E . I n v o l v e m e n t o f N a U fl F ' e x c h a n g e i n h u m a n p l a t e l e t a c t i v a t i o n . I n : E r o g r e s a i n C l i n i c a l a n d B i o l o g i c a l R e s e a r c h , V o l u m e 2 8 3 I P l a t e l e t M e m b r a n e e t S ’ o e u l o m m u o o d . J a m i e s o n G A ( E d ) . A l a n R . L i s s , N e w Y o r k . P a g e s 5 2 3 - 5 5 7 , 1 9 8 8 . T a k a i Y . K i s h i m o t o A . K i k k a w a U , M o r i T . N i s h i z u k a Y . U n s a t u r a t e d d i a c y l g l y c e r o l a s a p o s s i b l e m e s s e n g e r f o r t h e a c t i v a t i o n o f c a l c i u m - a c t i v a t e d . p h o s p h o l i p i d - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e s y s t e m . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 9 1 : 1 2 1 8 - 1 2 2 4 . 1 9 7 9 . T a k a m a t s u J . H o r n e M K , G r a l n i c k H R . I d e n t i f i c a t i o n o f t h e t h r o m b i n r e c e p t o r o n h u m a n p l a t e l e t s b y c h e m i c a l c r o s s l i n k i n g . J . C l i n . I n v e s t . 7 7 : 3 6 2 - 3 6 8 . 1 9 8 6 . T a m p o n i G , P a n n o c c h i a A . A r d u i n o C . B a z z a n M . D e l l a D o r a N . S c h i n c o P , B u r a g l i o M , E a n d i M . C o n g e n i t a l d e f i c i e n c y o f a l p h a - 2 - a d r e n o c e p t o r s o n h u m a n p l a t e l e t s : d e s c r i p t i o n o f t w o c a s e s . T h r o m b . H a e m o s t a s i s 5 8 : 1 0 1 2 - 1 0 1 6 , 1 9 8 7 . T a n o u e K . H a s e g a w a S , Y a m a g u c h i A , Y a m a m o t o N . Y a m a z e k i H . A n e w v a r i a n t o f t h r o m b a s t h e n i a w i t h a b n o r m a l l y g l y c o s y l a t e d G P I I b / I I I a . T h r o m b . R e s . 4 7 : 3 2 3 - 3 3 3 . 1 9 8 7 . T a p l e y P M , M u r r a y A W . E v i d e n c e t h a t t r e a t m e n t o f p l a t e l e t s w i t h p h o r b o l e s t e r c a u s e s p r o t e o l y t i c a c t i v a t i o n o f C a y - a c t i v a t e d , p h o s p h o l i p i d - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e . E u r . J . B i o c h e m . 1 5 1 : 4 1 9 - 4 2 3 . 1 9 8 5 . T h o m a s J S . M c C o n n e l l M F , B e l l T G . B a s s e t h o u n d t h r o m b o p a t h y . : n o r m a l p l a t e l e t r e s t i n g a n d p o s t - s t i m u l a t i o n c y t o p l a s m i c c o n c e n t r a t i o n s o f i o n i z e d c a l c i u m . P r o c . A m . C o l l e g e V e t . C l i n . P a t h o l . 1 9 8 8 . T h o m p s o n N T . S c r u t t o n M C . I n t r a c e l l u l a r c a l c i u m f l u x e s i n h u m a n p l a t e l e t s . ‘ E u r . J . B i o c h e m . 1 4 7 : 4 2 1 - 4 2 7 . 1 9 8 5 . T h o m p s o n N T , S c r u t t o n M C , W a l l i s R B . P a r t i c l e v o l u m e c h a n g e s a s s o c i a t e d w i t h l i g h t t r a n s m i t t a n c e c h a n g e s i n t h e p l a t e l e t a g g r e g o m e t e r : d e p e n d e n c e u p o n a g g r e g a t i n g a g e n t a n d e f f e c t i v e n e s s o f s t i m u l u s . T h r o m b . R e s . 4 1 : 6 1 5 - 6 2 6 . 1 9 8 6 . T o u q u i L , R o t h h u t B , S h a w A M . F r a d i n A , V a r g a f t i g B B . R u s s o - M a r i e F . P l a t e l e t a c t i v a t i o n - a r o l e f o r a 4 0 K a n t i - p h o s p h o l i p a s e A 2 p r o t e i n i n d i s t i n g u i s h a b l e f r o m l i p o c o r t i n . N a t u r e 3 2 1 : 1 7 7 - 1 8 0 . 1 9 8 6 . 4 8 6 . 4 8 7 . 4 8 8 . 4 8 9 . 4 9 0 . 4 9 1 . 4 9 2 . 4 9 3 . 4 9 4 . 4 9 5 . 4 9 6 . 4 9 7 . 4 1 4 T s a i A , H s u M - J , V i j j e s w a r a p u H . W u K K . S o l u b i l i z a t i o n o f p r o s t a c y c l i n m e m b r a n e r e c e p t o r s f r o m h u m a n p l a t e l e t s . J . B i o l . C h e m . 2 6 4 : 6 1 - 6 7 , 1 9 8 9 . T u s z y n s k i G P . R o t h m a n V L , M u r p h y A , S i e g l e r K , K n u d s e n K A . T h r o m b o s p o n d i n p r o m o t e s p l a t e l e t a g g r e g a t i o n . B l o o d 7 2 : 1 0 9 - 1 1 5 . 1 9 8 8 . T y e r s M . R a c h u b i n s k i R A . S t e w a r t M I , V a r r i c h i o A M , S h o r r R G L , H a s l a m R J , H a r l e y C B . M o l e c u l a r c l o n i n g a n d e x p r e s s i o n o f t h e m a j o r p r o t e i n k i n a s e C s u b s t r a t e o f p l a t e l e t s . N a t u r e 3 3 3 : 4 7 0 - 4 7 3 , 1 9 8 8 . U i M . I s l e t - a c t i v a t i n g p r o t e i n , p e r t u s s u s t o x i n : a p r o b e f o r f u n c t i o n s o f t h e i n h i b i t o r y g u a n i n e n u c l e o t i d e r e g u l a t o r y c o m p o n e n t o f a d e n y l a t e c y c l a s e . T r e n d s P h a r m a c o l . S c i . 5 : 2 7 7 - 2 7 9 . 1 9 8 4 . V e n t e r J C , S c h a b e r J S , U ' P r i c h a r d D C , F r a s e r C M . M o l e c u l a r s i z e o f t h e h u m a n p l a t e l e t a l p h a z - a d r e n e r g i c r e c e p t o r a s d e t e r m i n e d b y r a d i a t i o n i n a c t i v a t i o n . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 1 6 : 1 0 7 0 - 1 0 7 5 , 1 9 8 3 . V e r h o e v e n A . H o r v l i O . H o l m s e n H . I s p o l y - P I t u r n o v e r i n c r e a s e d u p o n p l a t e l e t a c t i v a t i o n ? T r e n d s B i o c h e m . S c i . 1 1 : 6 7 - 6 8 , 1 9 8 6 . V i c k e r s J D . K i n l o u g h - R a t h b o n e R L . M u s t a r d J F . C h a n g e s i n p h o s p h a t i d y l - 4 . 5 - b i s p h o s p h a t e 1 0 s e c o n d s a f t e r s t i m u l a t i o n o f w a s h e d r a b b i t p l a t e l e t s w i t h A D P . B l o o d 6 0 : 1 2 4 7 - 1 2 5 0 , 1 9 8 2 . W a l l a c e R W , T a l l a n t E A , M c M a n u s M C . H u m a n p l a t e l e t c a l m o d u l i n - b i n d i n g p r o t e i n s : i d e n t i f i c a t i o n a n d G a v - d e p e n d e n t p r o t e o l y s i s u p o n p l a t e l e t a c t i v a t i o n . B i o c h e m i s t r y 2 6 : 2 7 6 6 - 2 7 7 3 , 1 9 8 7 . W a r e A J , J o h n s o n P C , S m i t h M . S a l z m a n E W . A e q u o r i n d e t e c t s i n c r e a s e d c y t o p l a s m i c c a l c i u m i n p l a t e l e t s s t i m u l a t e d w i t h p h o r b o l e s t e r o r d i a c y l g l y c e r o l . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 3 3 : 9 8 - 1 0 4 . 1 9 8 5 . W a r e A J , J o h n s o n P C . S m i t h M , S a l z m a n E W . E f f e c t o f c o m m o n a g o n i s t s o n c y t o p l a m i c i o n i z e d c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n i n p l a t e l e t s . M e a s u r e m e n t w i t h 2 - m e t h y l - 6 - m e t h o x y 8 - n i t r o q u i n o l i n e ( q u i n 2 ) a n d a e q u o r i n . J . C l i n . I n v e s t . 7 7 : 8 7 8 - 8 8 6 . 1 9 8 6 . W a t a n a b e Y . H o r n F , B a u e r S , J a k o b s K H . P r o t e i n k i n a s e C i n t e r f e r e s w i t h N i - m e d i a t e d i n h i b i t i o n o f h u m a n p l a t e l e t a d e n y l a t e c y c l a s e . F E B S L e t t . 1 9 2 : 2 3 - 2 7 , 1 9 8 5 . W a t s o n S P , W o l f M , L a p e t i n a E G . T h e f o r m a t i o n o f ' [ 3 H ] i n o s i t o l p h o s p h a t e s i n h u m a n p l a t e l e t s b y p a l m i t o y l l y s o p h o s p h a t i d i c a c i d i s b l o c k e d b y i n d o m e t h a c i n . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 3 2 : 5 5 5 - 5 6 2 . 1 9 8 5 . 4 9 8 . 4 9 9 . 5 0 0 . 5 0 1 . 5 0 2 . 5 0 3 . 5 0 4 . 5 0 5 . 5 0 6 . 5 0 7 . 5 0 8 . 5 0 9 . 5 1 0 . 4 1 5 W a t s o n S P , L a p e t i n a E G . l , 2 - D i a c y l g l y c e r o l a n d p h o r b o l e s t e r i n h i b i t a g o n i s t - i n d u c e d f o r m a t i o n o f i n o s i t o l p h o s p h a t e s i n h u m a n p l a t e l e t s : p o s s i b l e i m p l i c a t i o n s f o r n e g a t i v e f e e d b a c k r e g u l a t i o n o f i n o s i t o l p h o s p h o l i p i d h y d r o l y s i s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 2 : 2 6 2 3 - 2 6 2 6 . 1 9 8 5 . W a t s o n S P . R u g g i e r o M , A b r a h a m s S L , L a p e t i n a E G . I n o s i t o l 1 , 4 , 5 - t r i s p h o s p h a t e i n d u c e s a g g r e g a t i o n a n d r e l e a s e o f 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e f r o m s a p o n i n - p e r m e a b i l i z e d h u m a n p l a t e l e t s . J . B i o l . C h e m . 2 6 1 : 5 3 6 8 - 5 3 7 2 , 1 9 8 6 . W a t s o n S P . M c N a l l y J . S h i p m a n L J , G o d f r e y P P . T h e a c t i o n o f t h e p r o t e i n k i n a s e C i n h i b i t o r , s t a u r o s p o r i n e , o n h u m a n p l a t e l e t s . E v i d e n c e a g a i n s t a r e g u l a t o r y r o l e f o r p r o t e i n k i n a s e C i n t h e f o r m a t i o n o f i n o s i t o l t r i s p h o s p h a t e b y t h r o m b i n . B i o c h e m . J . 2 4 9 : 3 4 5 - 3 5 0 , 1 9 8 8 . W e g n e r A . H e a d t o t a i l p o l y m e r i z a t i o n o f a c t i n . J . M o l . B i o l . 1 0 8 : 1 3 9 - 1 5 0 . 1 9 7 6 . W e i s s H J . T u r i t t o V T . B a u m g a r t n e r H R . P l a t e l e t a d h e s i o n a n d t h r o m b u s f o r m a t i o n o n s u b e n d o t h e l i u m i n p l a t e l e t s d e f i c i e n t i n g l y c o p r o t e i n s I I b - I I I a , I b . a n d s t o r a g e g r a n u l e s . B l o o d 6 7 : 3 2 2 - 3 3 0 , 1 9 8 6 . W h e e l e r M E , C o x A C , C a r r o l l R C . R e t e n t i o n o f t h e g l y c o p r o t e i n I I b - I l l a c o m p l e x i n t h e i s o l a t e d p l a t e l e t c y t o s k e l e t o n . E f f e c t s o f s e p a r a b l e a s s e m b l y o f p l a t e l e t p s e u d o p o d a l a n d c o n t r a c t i l e c y t o s k e l e t o n s . J . C l i n . I n v e s t . 7 4 : 1 0 8 0 - 1 0 8 9 , 1 9 8 4 . W h i t e J G . I n t e r a c t i o n o f m e m b r a n e s y s t e m s i n b l o o d p l a t e l e t s . A m . J . P a t h o l . 6 6 : 2 9 5 - 3 1 2 . 1 9 7 2 . W h i t e J G . R a o G H R , G e r r a r d J M . E f f e c t s o f t h e i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 o n b l o o d p l a t e l e t s . A m . J . P a t h o l . 7 7 : 1 3 5 - 1 5 0 . 1 9 7 4 . W h i t e J G . U l t r a s t r u c t u r a l m o d i f i c a t i o n i n p l a t e l e t m e m b r a n e s a n d c y t o s k e l e t o n f o l l o w i n g a c t i v a t i o n . B l o o d C e l l s 9 : 2 3 7 - 2 6 1 , 1 9 8 3 . W h i t e J G , K r u m w i e d e M . F u r t h e r s t u d i e s o f t h e s e c r e t o r y p a t h w a y s i n t h r o m b i n - s t i m u l a t e d h u m a n p l a t e l e t s . B l o o d 6 9 : 1 1 9 6 - 1 2 0 3 , 1 9 8 7 . W h i t e J G . A n o v e r v i e w o f p l a t e l e t s t r u c t u r a l p h y s i o l o g y . S c a n n i n g M i c r o s c o p y 1 : 1 6 7 7 - 1 7 0 0 , 1 9 8 7 . W h i t e J G . I n h e r i t e d a b n o r m a l i t i e s o f t h e p l a t e l e t m e m b r a n e a n d s e c r e t o r y g r a n u l e s . H u m . P a t h o l . 1 8 : 1 2 3 - 1 3 9 . 1 9 8 7 . W i c k i A N , C l e m e t s o n K J . S t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f p l a t e l e t m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s I b a n d V . E f f e c t s o f l e u k o c y t e e l a s t a s e a n d o t h e r p r o t e a s e s o n p l a t e l e t s r e s p o n s e t o v o n W i l l e b r a n d f a c t o r a n d t h r o m b i n . E u r . J . B i o c h e m . 1 5 3 : 1 - 1 1 , 1 9 8 5 . 5 1 1 . 5 1 2 . 5 1 3 . 5 1 4 . 5 1 5 . 5 1 6 . 5 1 7 . 5 1 8 . 5 1 9 . 5 2 0 . 5 2 1 . 4 1 6 W i l l i a m s K A . H a s l a m R J . E f f e c t s o f N a C l a n d G T P o n t h e i n h i b i t i o n o f p l a t e l e t a d e n y l a t e c y c l a s e b y l - O - o c t a d e c y l - Z - O - a c e t y l - s n - g l y c e r y l - 3 - p h o s p h o r y l c h o l i n e ( s y n t h e t i c p l a t e l e t - a c t i v a t i n g f a c t o r ) . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 7 7 0 : 2 1 6 - 2 2 3 , 1 9 8 4 . W i l l i a m s K A . M u r p h y W , H a s l a m R J . E f f e c t s o f a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C o n t h e a g o n i s t - i n d u c e d s t i m u l a t i o n a n d i n h i b i t i o n o f c y c l i c A M P f o r m a t i o n i n i n t a c t h u m a n p l a t e l e t s . B i o c h e m . J . 2 4 3 : 6 6 7 - 6 7 8 , 1 9 8 7 . W i l s o n D B , B r o s s T E . H o f m a n n S L , M a j e r u s P W . H y d r o l y s i s o f p o l y p h o s p h o i n o s i t i d e s b y p u r i f i e d s h e e p s e m i n a l v e s i c l e p h o s p h o l i p a s e C e n z y m e s . J . B i o l . C h e m . 2 5 9 : 1 1 7 1 8 - 1 1 7 2 4 , 1 9 8 4 . W i l s o n D B . N e u f e l d E J . M a j e r u s P W . P h o s p h o i n o s i t i d e i n t e r c o n v e r s i o n i n t h r o m b i n - s t i m u l a t e d h u m a n p l a t e l e t s . J . B i o l . C h e m . 2 6 0 : 1 0 4 6 - 1 0 5 1 , 1 9 8 5 . W i l s o n D B , C o n n o l l y T M , B r o s s T E . M a j e r u s P W . S h e r m a n W R , T y l e r A N . R u b i n L J , B r o w n J E . I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e i n o s i t o l c y c l i c p h o s p h a t e p r o d u c t s o f p o l y p h o s p h o i n o s i t i d e c l e a v a g e b y p h o s p h o l i p a s e C . P h y s i o l o g i c a l e f f e c t s i n p e r m e a b l i z e d p l a t e l e t s a n d L i m u l u s p h o t o r e c e p t o r c e l l s . J . B i o l . C h e m . 2 6 0 : 1 3 4 9 6 - 1 3 5 0 1 , 1 9 8 5 . W i n t h e r K . K l y s n e r R , G e i s l e r A , A n d e r s e n P H . C h a r a c t e r i z a t i o n o f h u m a n p l a t e l e t b e t a - a d r e n o c e p t o r s . T h r o m b . R e s . 4 0 : 7 5 7 - 7 6 7 . 1 9 8 5 . W o l f M . L e V i n e H , M a y W S , C u a t r e c a s a s P , S a h y o u n N . A m o d e l f o r i n t r a c e l l u l a r t r a n s l o c a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C i n v o l v i n g s y n e r g i s m b e t w e e n C a y ' a n d p h o r b o l e s t e r s . N a t u r e 3 1 7 : 5 4 6 - 5 4 9 . 1 9 8 5 . W o o d s V L , W o l f f L E , K e l l e r D M . R e s t i n g p l a t e l e t s c o n t a i n a s u b s t a n t i a l c e n t r a l l y l o c a t e d p o o l o f g l y c o p r o t e i n I I b - I I I a c o m p l e x w h i c h m a y b e a c c e s s i b l e t o s o m e b u t n o t o t h e r e x t r a c e l l u l a r p r o t e i n s . J . B i o l . C h e m . 2 6 1 : 1 5 2 4 2 - 1 5 2 5 1 , 1 9 8 6 . W y l e r B , B i e n z D . C l e m e t s o n K J . L u s c h e r E F . G l y c o p r o t e i n I b n i s t h e o n l y p h o s p h o r y l a t e d m a j o r m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n i n h u m a n p l a t e l e t s . B i o c h e m . J . 2 3 4 : 3 7 3 - 3 7 9 , 1 9 8 6 . Y a r d u m i a n D A , M a c k i e I J . M a c h i n S J . L a b o r a t o r y i n v e s t i g a t i o n o f p l a t e l e t f u n c t i o n : a r e v i e w o f m e t h o d o l o g y . J . C l i n . P a t h o l . 3 9 : 7 0 1 - 7 1 2 . 1 9 8 6 . Y a t o m i Y , H i g a s h i h a r a M . T a n a b e A , O h a s h i T , O k a H . K u m e S . S y n e r g i s m b e t w e e n s u b t h r e s h o l d c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n a n d 1 2 - O - t e t r a d e c a n o y l p h o r b o l l 3 - a c e t a t e i n p l a t e l e t a c t i v a t i o n . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 4 8 : 1 0 2 5 - 1 0 2 9 , 1 9 8 7 . 5 2 2 . 5 2 3 . 5 2 4 . 5 2 5 . 5 2 6 . 5 2 7 . 5 2 8 . 5 2 9 . 5 3 0 . 5 3 1 . 5 3 2 . 4 1 7 Y i n H L , S t o s s e l T P . C o n t r o l o f c y t o p l a s m i c a c t i n g e l - s o l t r a n s f o r m a t i o n b y g e l s o l i n , a c a l c i u m - d e p e n d e n t r e g u l a t o r y p r o t e i n . N a t u r e 2 8 1 : 5 8 3 - 5 8 5 , 1 9 7 9 . Y i n H L , H a r t w i g J H . M a r u y a m a K , S t o s s e l T P . C a a ' c o n t r o l o f a c t i n f i l a m e n t l e n g t h . E f f e c t s o f m a c r o p h a g e g e l s o l i n o n a c t i n p o l y m e r i z a t i o n . J . B i o l . C h e m . 2 5 6 : 9 6 9 3 - 9 6 9 7 . 1 9 8 1 . Y o s h i d a K , D u b y a k G , N a c h m i a s V T . R a p i d e f f e c t s o f p h o r b o l e s t e r o n p l a t e l e t s h a p e c h a n g e . c y t o s k e l e t o n a n d c a l c i u m t r a n s i e n t . F E B S L e t t . 2 0 6 : 2 7 3 - 2 7 8 , 1 9 8 6 . Y o u n g N , G e r g e l y P , C r a w f o r d N . P l a t e l e t a n d l e u c o c y t e c a l m o d u l i n s . I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n . E u r . J . B i o c h e m . 1 2 0 : 3 0 3 - 3 0 8 . 1 9 8 1 . Z a v o i c o G B , H a l e n d a S P , S h a ' a f i R I , F e i n s t e i n M B . P h o r b o l m y r i s t a t e a c e t a t e i n h i b i t s t h r o m b i n - s t i m u l a t e d C a 2 + m o b i l i z a t i o n a n d p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 4 , 5 - b i s p h o s p h a t e h y d r o l y s i s i n h u m a n p l a t e l e t s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 2 : 3 8 5 9 - 3 8 6 2 , 1 9 8 5 . Z a v o i c o G B , C r a g o e E J . F e i n s t e i n M B . R e g u l a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r p H i n h u m a n p l a t e l e t s . E f f e c t s o f t h r o m b i n , A 2 3 1 8 7 , a n d i o n o m y c i n a n d e v i d e n c e f o r a c t i v a t i o n o f N a J / H + e x c h a n g e a n d i t s i n h i b i t i o n b y a m i l o r i d e a n a l o g s . J . B i o l . C h e m . 2 6 1 : 1 3 1 6 0 - 1 3 1 6 7 . 1 9 8 6 . Z a f a r R S , W a l z D A . P l a t e l e t m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n V : C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e t h r o m b i n - s e n s i t i v e g l y c o p r o t e i n f r o m h u m a n p l a t e l e t s . T h r o m b . R e s . 5 3 : 3 1 - 4 4 , 1 9 8 9 . Z u c k e r M B , T r o l l W , B e l m a n S . T h e t u m o r - p r o m o t e r p h o r b o l e s t e r ( l 2 - O - t e t r a d e c a n o y l - p h o r b o l - l 3 - a c e t a t e ) , a p o t e n t a g g r e g a t i n g a g e n t f o r b l o o d p l a t e l e t s . J . C e l l B i o l . 6 0 : 3 2 5 - 3 3 6 . 1 9 7 4 . Z u c k e r M B , M a s i e l l o N C . P l a t e l e t a g g r e g a t i o n c a u s e d b y d i t h i o t h - r e i t o l . T h r o m b . H a e m o s t a s i s 5 2 : 1 1 9 - 1 2 4 . 1 9 8 4 . Z u c k e r M B . N a c h m i a s V T . P l a t e l e t A c t i v a t i o n . A r t e r i o s c l e r o s i s 5 : 2 - 1 8 , 1 9 8 5 . Z u c k e r - F r a n k l i n D . E n d o c y t o s i s b y h u m a n p l a t e l e t s : m e t a b o l i c a n d f r e e z e - f r a c t u r e s t u d i e s . J . C e l l B i o l . 9 1 : 7 0 6 - 7 1 5 . 1 9 8 1 .