” W N W ‘ m r ' m V u N h t i c s L n fi 3 M " 4 ; p u r - . 1 - , g u m " ‘ : : ! . . u u r L > - q . ‘ . ' k ‘ - . _ . . . ~ p _ _ - . » w . J . ' 1 g 6 ‘ 6 ’ “ ~ - : T ¢ ‘ 4 r f : , ; l . 2 ! a v i a n w : . 2 . r 1 3 7 5 ‘ , W E S fi ’ a w g ' , ~ . r : u T E ? " " m . ‘ V ‘ 1 n fl fi m c ’ u a ' , - 4 v £ 2 5 . ; , . : , ‘ . " , { . ~ ’ - , . ” p i - u “ 3 . 2 “ . . . ” 1 ‘ r " . f r R m » p g £ 5 3 " ? ' f ‘ f ’ " . 4 . ’ ‘ . 4 r fl y w ' u 1 L 7 — : C r " “ m i c ? w - m - f r “ ‘ 2 ? " " " 6 r : - M ‘ . : 5 , J £ , - & } ‘ £ : ' . ’ f z ’ : : ; : § . . fl ¢ ; - . r t ' 1 ‘ 6 " ; 6 " V . . * 1 “ . 1 " . . — { r h 5 - ; : : c . ' 1 w : - M p g ; a » ; ‘ i n fi l l . - 5 6 : 6 6 ” ? M 5 " 2 : 1 ; 2 % 3 £ . c : . . . ¢ . . . z . . . . - . 2 2 . . . . . . , . . . , . , . , “ . 4 ' A - ; f : . $ - “ ~ 3 3 ‘ } X X I I - 5 C " . — . u p . » < q . ‘ . - u a » . . 3 , : m ' ‘ _ ¢ ; . W E 6 3 6 2 : 1 6 6 2 . “ : . x . . y ‘ v w . 1 . _ _ $ K ~ fi m u . : 2 _ - _ w a l t z z z ' : 2 ; : 1 “ : 3 3 “ T V ‘ « ‘ 3 ' , u l ' 5 : i f . u « 3 ; > 3 : , . W A ~ - . ' . . r ‘ ? ‘ c ' 6 _ - : r . “ e r - 6 I . “ 4 { “ 3 5 “ J 1 } r _ . { r n i n ? ” « 5 “ " S i — 3 % 5 5 . 1 % : fi g ‘ n h ” 3 - ; § ‘ ' 1 ’ " ; " 2 . . " ' J 4 1 u fi : . € . . . . x . m e g a ) : . . ' 6 ; 3 5 ; : A “ , r u f f - 3 . 1 x : W S ‘ " ‘ 3 3 . « c w y o u . ‘ 9 - - ~ ~ ‘ ; _ . _ . v w ~ " - 6 W a r " a r k ? r 2 3 5 2 - J i g — : 3 6 . . . ” P J ’ H ‘ b x . ” r 2 1 2 . ‘ 3 ; ‘ 1 , 6 , ? “ " : 6 fl 4 6 3 1 $ 3 IllllllllllfllllllllIIHHllllllllllllllllllllllllllllillllHl 2J ” W V : P h . D d e g r e e i n E n g i n e e r i n g M S U i s a n A f fi r m a t i v e A c t i o n / E q u a l O p p o r t u n i t y I n s t i t u t i o n 0 - 1 2 7 7 1 V . \ 3 1 2 9 3 0 0 7 7 9 3 0 9 3 V ‘ £ 2 1 3 a y T h i s i s t o c e r t i f y t h a t t h e d i s s e r t a t i o n e n t i t l e d T e c h n o l o g i c a l a n d M i c r o b i o l o g i c a l A s p e c t s o f A n a e r o b i c D i g e s t i o n G r a n u l e s p r e s e n t e d b y W e i - M i n W u h a s b e e n a c c e p t e d t o w a r d s f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r 2 2 / 7 2 2 / 2 2 / M a j o r p r o f e s s o r D a t e A u g u s t 1 6 , 1 9 9 1 P L A C E I N R E T U R N B O X t o r e m o v e t h i s c h e c k o u t f r o m y o u r r e c o r d . T O A V O I D F I N E S r e t u r n o n o r b e f o r e o n e d u e . M S U t o A n A f fi r m d l v o A d i o r V E q u o l O p p o r t u n i t y I n s t i t u t i o n c a m p u s - 9 . 1 T E C H N O L O G I C A L A N D M I C R O B I O L O G I C A L A S P E C T S O F A N A E R O B I C D I G E S T I O N G R A N U L E S V o l u m e I B y W e i - M i n W u A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y D e p a r t m e n t o f C i v i l a n d E n v i r o n m e n t a l E n g i n e e r i n g 1 9 9 1 A B S T R A C T T E C H N O L O G I C A L A N D M I C R O B I O L O G I C A L A S P E C T S O F A N A E R O B I C D I G E S T I O N G R A N U L E S B y W e i - M i n W u T h e p r o c e s s o f a n a e r o b i c g r a n u l e f o r m a t i o n w a s c h a r a c t e r i z e d i n t h r e e l a b o r a t o r y - s c a l e u p fl o w a n a e r o b i c s l u d g e b l a n k e t ( U A S B ) r e a c t o r s ( 3 5 ° C ) f e d g l u c o s e m o l a s s e s s o l u t i o n o r b r e w e r y w a s t e w a t e r , u s i n g b o t h d i g e s t e d s e w a g e s l u d g e a n d a e r o b i c a c t i v a t e d s l u d g e a s i n o c u l a . T h e g r a n u l a t i o n p r o c e s s i n t h i s s t u d y w a s b a s i c a l l y t h e s a m e a s t h a t r e p o r t e d u s i n g v o l a t i l e f a t t y a c i d ( V F A ) m i x t u r e s . A n i m p o r t a n t p a r a m e t e r a f f e c t i n g t h e g r a n u l a t i o n p r o c e s s w a s s p e c i fi c C O D l o a d i n g r a t e . T w o t y p e s o f g r a n u l e s d e v e l o p e d o n V F A m i x t u r e s c o n t a i n i n g l o w s u l f a t e c o n c e n t r a t i o n s ( < 0 . 1 5 m M ) w e r e c o m p a r e d s y s t e m a t i c a l l y a s t o t h e i r m i c r o b i a l p o p u l a t i o n , o p e r a t i o n a l p e r f o r m a n c e , g r a n u l a r s t r u c t u r e , a n d k i n e t i c p a r a m e t e r s . T h e R - g m n u l e s w h i c h h a d r o d - t y p e M e t h a n o t h r i x s p e c i e s a s p r e d o m i n a n t a c e t a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s s h o w e d h i g h e r g r a n u l e d e n s i t y a n d b e t t e r o p e r a t i o n a l p e r f o r m a n c e t h a n t h e F - g r a n u l e s w h i c h c o n t a i n e d fi l a m e n t o u s M e t h a n o t h r i x s p e c i e s a s p r e d o m i n a n t s p e c i e s . G r a n u l e s f r o m a n i n d u s t r i a l U A S B r e a c t o r t r e a t i n g b r e w e r y w a s t e w a t e r c o n t a i n i n g a m o d e r a t e s u l f a t e c o n c e n t r a t i o n s ( 0 . 6 t o 1 . 3 m M ) w e r e c h a r a c t e r i z e d i n t e r m s o f t h e r o l e o f s u l f a t e r e d u c i n g b a c t e r i a ( S R B ) i n s u b s t r a t e m e t a b o l i s m a n d g r a n u l e s t r u c t u r e . S y n t r o p h i c p r o p i o n a t e a n d e t h a n o l d e g r a d a t i o n w a s p e r f o r m e d b y S R B . F i v e m e t h a n o g e n i c s t r a i n s , t w o p r o p i o n a t e - d e g r a d i n g s t r a i n s , a n d t w o b u t y r a t e - d e g r a d i n g s t r a i n s w e r e i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s a n d i d e n t i fi e d a s p r e v a l e n t o r g a n i s m s . V F A d e g r a d a t i o n w a s c h a r a c t e r i z e d b y c o m p a r i n g t h e s e i s o l a t e d s p e c i e s v e r s u s t h e g r a n u l e s i n t e r m s o f t h e r o l e o f d i f f e r e n t s p e c i e s i n V F A m e t a b o l i s m , i n c l u d i n g t h e s y n t h e s i s o f v a l e r a t e a n d 2 - m e t h y l b u t y r a t e , i s o m e r i z a t i o n b e t w e e n i s o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e , s y n t h e s i s o f f o r m a t e f r o m H 2 p l u s H C O 3 ' , a n d i n t e r s p e c i e s e l e c t r o n t r a n s f e r . M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m T l N w a s a p r e d o m i n a n t s p e c i e s i n t h e R - g r a n u l e s a n d p l a y e d a n i m p o r t a n t r o l e i n g r a n u l e f o r m a t i o n a n d i t f o r m e d a g g r e g a t e s i n a n U A S B r e a c t o r ( 3 5 ° C ) f e d w i t h f o r m a t e a s s u b s t r a t e . T h e a g g r e g a t e f o r m a t i o n b y t h e i s o l a t e d m e t h a n o g e n i c a n d V F A - d e g r a d i n g c u l t u r e s f r o m t h e R — g r a n u l e s w a s i n v e s t i g a t e d . D e fi n e d g r a n u l e s w e r e f o r m e d i n a l a b o r a t o r y - U A S B r e a c t o r ( 3 5 ° C ) f e d w i t h a m e d i u m c o n t a i n i n g a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e m i x t u r e u s i n g t h e s e s p e c i e s a s i n o c u l u m : M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m T l N , M e t h a n o t h r i x M 7 , M e t h a n o s a r c i n a m a z e i T 1 8 , p r o p i o n a t e d e g r a d i n g s t r a i n P T a n d b u t y r a t e d e g r a d i n g s t r a i n B H . M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m a n d M e t h a n o t h r i x s p e c i e s w e r e d e m o n s t r a t e d t o b e a d h e s i v e o r g a n i s m s i m p o r t a n t f o r g r a n u l e f o r m a t i o n . C o p y r i g h t b y W E I - M I N W U 1 9 9 1 D e d i c a t e d t o m y l a t e f a t h e r , D e - R a n g W u , m y m o t h e r , B o - H u a D a i , a n d m y w i f e , P i n g X i n g , w h o m I l o v e . A C K N O W L E D G E M E N T S I w o u l d l i k e t o e x p r e s s g r a t i t u d e t o m y m a j o r p r o f e s s o r a n d r e s e a r c h a d v i s o r , D r . R o b e r t F . H i c k e y , f o r h i s i n s t r u c t i o n , g u i d a n c e a n d e n c o u r a g e m e n t d u r i n g t h e P h . D s t u d y . S p e c i a l t h a n k s a r e e x t e n d e d t o m y a n o t h e r r e s e a r c h a d v i s o r , D r . J . G r e g o r y Z e i k u s , D e p a r t m e n t s o f B i o c h e m i s t r y a n d M i c r o b i o l o g y & P u b l i c H e a l t h , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y , f o r h i s i n s t r u c t i o n , g u i d a n c e a n d e n c o u r a g e m e n t t h r o u g h o u t t h i s r e s e a r c h w o r k . I w o u l d l i k e t o t h a n k D r . T h o m a s C . V o i c e a n d D r . C r a i g S . C r i d d l e f o r r e v i e w i n g t h i s d i s s e r t a t i o n , a n d f o r t h e i r v a l u a b l e c o m m e n t s a n d s u g g e s t i o n s . S p e c i a l t h a n k s a r e e x t e n d e d t o m y r e s e a r c h c o l l a b o r a t o r s D r . M a h e n d r a K . J a i n a n d D r . I t i r g e n H . T h i e l e ( M i c h i g a n B i o t e c h n o l o g y I n s t i t u t e ) , a n d m y c h i n e s e a d v i s o r s P r o f e s s o r X i a - S h e n g G u ( D e p a r t m e n t o f C i v i l E n g i n e e r i n g , T s i n g h u a U n i v e r s i t y , B e i j i n g , C h i n a ) f o r t h e i r g u i d a n c e a n d i n s t r u c t i o n i n m y r e s e a r c h w o r k . I t h a n k H . S t u a r t P a n k r a t z , D r . F l e g l e r S t a n l e y , Y o n g - E o k L e e , D r . R a p h a e l L a m e d , A p r i l S u n d a y , M a r k R u p p e l a n d S h e r r i K e n y o n ( M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y a n d M i c h i g a n B i o t e c h n o l o g y I n s t i t u t e ) , a n d D r . E . C o n w a y d e M a c a r i o ( W a d s w o r t h C e t e r f o r L a b o r a t o r i e s a n d R e s e a r c h , N e w Y o r k S t a t e D e p a r t m e n t o f H e a l t h ) f o r t h e i r h e l p a n d a s s i s t a n c e . T h a n k s a r e d u e t o t h e r e s e a r c h f e l l o w s i n M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y a n d M i c h i g a n B i o t e c h n o l o g y I n s t i t u t e , i n c l u d i n g : D r . L a k s h m i B h a t n a g a r , D r . S u s a n E . L o w e , D r . J e r - S o n g S h i e h , J o h n K e m n e r , D r . L i n L u , D r . J i a n - E r L i n , D r . D e m i n g L i , i v V D r . M a r i a V e i g a , D r . C h r i s t i a n K e n n e s , A l i S i a h p u s h , J i a X i n g , S a r o j M a t h u p a l a , D r . B a d a l C . S a h a , S h e n - P o n g L i , M a y W u a n d D a n i e l W a g n e r f o r t h e i r s u p p o r t a n d s t i m u l a t i n g d i s c u s s i o n s d u r i n g t h e r e s e a r c h p e r i o d . T h i s r e s e a r c h w a s s u p p o r t e d b y g r a n t s t o D r . J . G r e g o r y Z e i k u s b y D e p a r t m e n t o f E n e r g y , U . S . A . , a n d D r . R o b e r t F . H i c k e y b y M i c h i g a n B i o t e c h n o l o g y I n s t i t u t e . T A B L E O F C O N T E N T S C h a p t e r p a g e L I S T O F T A B L E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x i i i L I S T O F F I G U R E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x v i i K E Y T O A B B R E V I A T I O N S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x x i v I N T R O D U C T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 G E N E R A L L I T E R A T U R E R E V I E W . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 . 1 H i s t o r i c b a c k g r o u n d o f a n a e r o b i c d i g e s t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 . 2 M i c r o b i o l o g i c a l p r i n c i p l e s o f a n a e r o b i c d i g e s t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 1 . 2 . 1 T r o p h i c g r o u p s f o r a n a e r o b i c d e g r a d a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 1 . 2 . 2 M e t h a n o g e n e s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1 . 2 . 3 S y n t r o p h i c a c e t o g e n e s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 1 . 2 . 4 S u l f a t e r e d u c i n g b a c t e r i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 1 . 3 A n a e r o b i c g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 1 . 3 . 1 U p fl o w a n a e r o b i c s l u d g e b l a n k e t ( U A S B ) s y s t e m . . . . . . . . . . . . . 2 1 1 . 3 . 2 G r a n u l a t i o n i n a n a e r o b i c r e a c t o r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 1 . 3 . 3 C h a r a c t e r i s t i c s o f g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 1 . 3 . 4 M e c h a n i s m o f g r a n u l e f o r m a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 1 . 4 G o a l s a n d o b j e c t i v e s o f t h i s s t u d y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 2 C U L T I V A T I O N O F G R A N U L E S I N L A B - S C A L E U A S B R E A C T O R S F E D W I ' I ' H C O M P L E X S U B S T R A T E S U S I N G N O N G R A N U L A R I N O C U L U M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1 2 . 1 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1 2 . 2 M a t e r i a l s a n d m e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2 2 . 2 . 1 C h e m i c a l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2 2 . 2 . 2 A c t i v a t e d s l u d g e s a m p l e s f o r e n u m e r a t i o n o f m e t h a n o g e n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2 2 . 2 . 3 E n u m e r a t i o n o f t o t a l m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2 v i 2 . 2 . 4 L a b o r a t o r y - s c a l e U A S B r e a c t o r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 5 2 . 2 . 5 I n o c u l u m m a t e r i a l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 5 2 . 2 . 6 F e e d c o m p o s i t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 5 2 . 2 . 7 A n a l y s i s o f m i n e r a l c o m p o s i t i o n i n g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 7 2 . 2 . 8 L i g h t a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 7 2 . 2 . 9 A n a l y t i c a l m e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 7 2 . 3 M o s t p r o b a b l e n u m b e r ( M P N ) e n u m e r a t i o n o f m e t h a n o g e n s i n a c t i v a t e d s l u d g e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 8 2 . 4 G r a n u l a t i o n i n l a b o r a t o r y - s c a l e U A S B r e a c t o r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 9 2 . 4 . 1 A n a e r o b i c d i g e s t e d s l u d g e a s i n o c u l u m f e d a g l u c o s e m o l a s s e s s o l u t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 9 2 . 4 . 2 A n a e r o b i c d i g e s t e d s l u d g e a s i n o c u l u m f o r t h e b r e w e r y w a s t e w a t e r f e d r e a c t o r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 7 2 . 4 . 3 A c t i v a t e d s l u d g e a s i n o c u l u m f e d a g l u c o s e m o l a s s e s s o l u t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 2 2 . 4 . 4 S l u d g e p r o fi l e d u r i n g g r a n u l a t i o n p r o c e s s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 6 2 . 4 . 5 G r o w t h r a t e o f g r a n u l e s a n d s l u d g e y i e l d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 7 2 . 5 C h a r a c t e r i z a t i o n o f g r a n u l e s d e v e l o p e d o n c o m p l e x s u b s t r a t e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 0 2 . 5 . 1 P h y s i c a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d c h e m i c a l c o m p o s i t i o n . . . . . . . . . . . . . 7 0 2 . 5 . 2 M e t a b o l i c a n d o p e r a t i o n a l p e r f o r m a n c e o f g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . 7 3 2 . 5 . 3 M i c r o s c o p i c a n d s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 4 2 . 6 D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 7 2 . 6 . 1 F e a s i b i l i t y o f u s i n g a c t i v a t e d s l u d g e a s i n o c u l u m . . . . . . . . . . . . . . 7 7 2 . 6 . 2 C h a r a c t e r i s t i c s o f t h e g r a n u l a t i o n p r o g r e s s . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 9 2 . 6 . 3 P a r a m e t e r s f o r c u l t i v a t i o n o f g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 9 2 . 7 S u m m a r y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 5 3 C O M P A R I S O N O F T W O T Y P E S O F G R A N U L E S D E V E L O P E D O N V O L A T I L E F A T T Y A C I D C O N T A I N I N G F E E D . . . . . . . . . . . . . . . 8 7 3 . 1 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 7 3 . 2 M a t e r i a l s a n d m e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 8 3 . 2 . 1 C h e m i c a l s , a n a l y t i c m e t h o d s a n d m e d i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 8 3 . 2 . 2 G r a n u l e s o u r c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 8 3 . 2 . 3 R e a c t o r f e e d c o m p o s i t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 0 3 . 2 . 4 L a b o r a t o r y - s c a l e r e a c t o r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 0 3 . 2 . 5 R e a c t o r o p e r a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 0 3 . 2 . 6 D e t e r m i n a t i o n o f m a x i m u m s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s , K m a n d s p e c i fi c g r o w t h r a t e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 3 3 . 2 . 7 T e m p e r a t u r e a n d p H e f f e c t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 3 3 . 2 . 8 M i c r o b i a l p o p u l a t i o n a n a l y s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 4 3 . 3 O p e r a t i o n a l p e r f o r m a n c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 6 v i i 3 . 3 . 1 S u b s t r a t e u t i l i z a t i o n a n d C O D r e m o v a l p e r f o r m a n c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 6 3 . 3 . 2 G r o w t h r a t e o f g r a n u l e b e d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 7 3 . 4 P h y s i c a l a n d c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s 3 . 5 K i n e t i c s f o r g r o w t h a n d m e t a b o l i s m o n d i f f e r e n t s u b s t r a t e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 2 3 . 5 . 1 S p e c i fi c g r o w t h r a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 2 3 . 5 . 2 M a x i m u m s p e c i fi c s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e a n d h a l f v e l o c i t y c o e f fi c i e n t ( K ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 5 3 . 5 . 3 T e m p e r a t u r e a n d p H e f f e c t s 3 . 6 M i c r o b i a l c o m p o s i t i o n a n d s t r u c t u r e o f g r a n u l e s 3 . 6 . 1 M o s t p r o b a b l e n u m b e r ( M P N ) e n u m e r a t i o n 3 . 6 . 2 M i c r o s c o p i c a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n . . . . . . . . . . . 1 1 3 3 . 7 D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 0 3 . 7 . 1 S i m i l a r i t i e s a n d d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e R - a n d F - g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 0 3 . 7 . 2 F a c t o r s a f f e c t i n g g r a n u l e d e n s i t y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 4 3 . 7 . 3 K i n e t i c p a r a m e t e r s f o r V F A d e g r a d a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 0 3 . 8 S u m m a r y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 7 C H A R A C T E R I Z A T I O N O F M E T A B O L I C P E R F O R M A N C E A N D M I C R O B I A L S T R U C T U R E O F G R A N U L E S G R O W N I N T H E P R E S E N C E O F S U L F A T E : T H E R O L E O F S U L F A T E R E D U C I N G B A C T E R I A . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 9 4 . 1 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 9 4 . 2 M a t e r i a l s a n d m e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 0 4 . 2 . 1 S o u r c e s o f g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 0 4 . 2 . 2 S u b s t r a t e d e g r a d a t i o n a n d m a x i m u m s p e c i fi c a c t i v i t y a s s a y s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 1 4 . 2 . 3 M a s s b a l a n c e e x p e r i m e n t s f o r m e t h a n o g e n e s i s a n d s u l f a t e r e d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 3 4 . 2 . 4 M o l y b d a t e e f f e c t e x p e r i m e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 4 4 . 2 . 5 E n r i c h m e n t s o f s p e c i a l t r o p h i c g r o u p s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 4 4 . 3 P h y s i c a l , c h e m i c a l a n d m i c r o b i a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f g r a n u l e s . . . . . . . 1 3 5 4 . 3 . 1 P h y s i c a l a n d c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 5 4 . 3 . 2 M i c r o s c o p i c a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n . . . . . . . . . . . 1 3 5 4 . 3 . 3 P r e d o m i n a n t s p e c i e s i n e n r i c h m e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 1 4 . 4 S u b s t r a t e m e t a b o l i c p e r f o r m a n c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 3 4 . 4 . 1 T i m e - c o u r s e o f s u b s t r a t e d e g r a d a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 3 4 . 4 . 2 S u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s a n d m a x i m u m m e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 8 4 . 4 . 3 E f f e c t o f s u l f a t e o n m e t h a n e y i e l d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 0 4 . 4 . 4 F o r m a t e f r o m H Q - C O Z a n d e f f e c t o f s u l f a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 3 v i i i 4 . 4 . 5 E f f e c t o f m o l y b d a t e o n s u b s t r a t e m e t a b o l i s m . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 3 4 . 5 D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 6 4 . 5 . 1 M i c r o b i a l p o p u l a t i o n o f g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 6 4 . 5 . 2 S y n t r o p h i c e t h a n o l d e g r a d a t i o n a n d i n t e r s p e c i e s e l e c t r o n t r a n s f e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 7 4 . 5 . 3 H y d r o g e n a n d f o r m a t e m e t a b o l i s m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 8 4 . 5 . 4 T h e r o l e o f s u l f a t e r e d u c i n g b a c t e r i a i n s u b s t r a t e m e t a b o l i s m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 0 4 . 5 . 5 T h e r o l e o f s u l f a t e r e d u c i n g b a c t e r i a i n g r a n u l a r s t r u c t u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 3 4 . 5 . 6 P r o p o s e d e l e c t r o n f l o w i n t h e p r e s e n c e o f s u f fi c i e n t a m o u n t o f s u l f a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 4 4 . 6 S u m m a r y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 6 5 M I C R O B I A L C O M P O S I T I O N S A N D C H A R A C T E R I Z A T I O N O F P R E V A L E N T S P E C I E S I N V O L A T I L E F A T T Y A C I D F E D G R A N U L E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 8 5 . 1 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 8 5 . 2 M a t e r i a l s a n d m e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 9 5 . 2 . 1 G r a n u l e s a n d m i c r o b i a l s o u r c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 9 5 . 2 . 2 R o l e o f s u l f a t e r e d u c i n g b a c t e r i a i n f a t t y a c i d d e g r a d a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 9 5 . 2 . 3 E n u m e r a t i o n o f p r e v a l e n t s p e c i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 0 5 . 2 . 4 I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f m e t h a n o g e n s . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 0 5 . 2 . 5 I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f f a t t y a c i d d e g r a d i n g a c e t o g e n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 3 5 . 2 . 6 I m m u n o l o g i c a l a s s a y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 6 5 . 2 . 7 S e n s i t i v i t y t o a n t i b i o t i c s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 6 5 . 2 . 8 M e d i u m , m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n a n d a n a l y t i c m e t h o d s . . . . . . . 1 7 6 5 . 3 S u l f a t e r e d u c i n g b a c t e r i a i n t h e R - g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 7 5 . 4 I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f m e t h a n o g e n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 0 5 . 4 . 1 M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n T l N . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 5 5 . 4 . 2 M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n R F . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 9 5 . 4 . 3 M e t h a n o s p i r i l l u m h u n g a t e i s t r a i n B D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 9 5 . 4 . 4 M e t h a n o s a r c i n a m a z e i s t r a i n T 1 8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 1 5 . 4 . 5 M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 2 5 . 5 I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f f a t t y a c i d d e g r a d i n g a c e t o g e n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 5 5 . 5 . 1 P r o p i o n a t e d e g r a d i n g s t r a i n P T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 5 5 . 5 . 2 P r o p i o n a t e d e g r a d i n g s t r a i n P W . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 9 5 . 5 . 3 B u t y r a t e d e g r a d i n g s t r a i n B H . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 0 5 . 5 . 4 I s o b u t y r a t e — b u t y r a t e d e g r a d i n g s t r a i n I B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 3 5 . 6 I d e n t i fi c a t i o n o f p r e v a l e n t s p e c i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 4 i x 5 . 7 D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 8 5 . 7 . 1 I d e n t i fi c a t i o n o f i s o l a t e d m e t h a n o g e n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 8 5 . 7 . 2 I d e n t i fi c a t i o n o f i s o l a t e d s y n t r o p h i c a c e t o g e n s . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 9 5 . 7 . 3 T h e r o l e o f p r e v a l e n t s p e c i e s i n g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 0 5 . 8 S u m m a r y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 1 6 C H A R A C T E R I Z A T I O N O F F A T T Y A C I D M E T A B O L I S M B Y D E F I N E D C U L T U R E S I S O L A T E D F R O M G R A N U L E S . . . . . . . . . . . . 2 1 3 6 . 1 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 3 6 . 2 M a t e r i a l s a n d m e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 4 6 . 2 . 1 S o u r c e s o f c u l t u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 4 6 . 2 . 2 E x p e r i m e n t a l p r o c e d u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 5 6 . 2 . 3 C a l c u l a t i o n o f c o n v e r s i o n r a t e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 6 f o r i s o b u t y r a t e - b u t y r a t e d e g r a d a t i o n 6 . 2 . 4 P e r t u r b a t i o n w i t h f o r m a t e a n d H 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 6 6 . 3 S y n t r o p h i c m e t a b o l i s m o f f a t t y a c i d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 7 6 . 3 . 1 S y n t r o p h i c d e g r a d a t i o n o f f a t t y a c i d s b y g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . 2 1 8 6 . 3 . 2 E n d p r o d u c t s o f s y n t r o p h i c f a t t y a c i d d e g r a d a t i o n b y d e fi n e d c u l t u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 1 6 . 3 . 3 M e t a b o l i s m o f V F A b y a c o c u l t u r e o f s t r a i n B H p l u s M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n T l N . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 3 6 . 3 . 4 M e t a b o l i s m o f V F A b y a t r i c u l t u r e c o n t a i n i n g s t r a i n I B , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T l N a n d M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 . . . . . . . . . 2 2 6 6 . 4 C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e m e c h a n i s m o f i s o m e r i z a t i o n b e t w e e n b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 8 6 . 4 . 1 P e r t u r b a t i o n w i t h f o r m a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 8 6 . 4 . 2 P e r t u r b a t i o n w i t h h y d r o g e n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 4 6 . 4 . 3 E n e r g e t i c a n a l y s i s o f b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e i s o m e r i z a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 9 6 . 5 C h a r a c t e r i z a t i o n o f h y d r o g e n - f o r m a t e m e t a b o l i s m . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 4 6 . 5 . 1 F o r m a t e s y n t h e s i s b y t h e R - g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 4 6 . 5 . 2 F o r m a t e s y n t h e s i s b y p u r e m e t h a n o g e n c u l t u r e s . . . . . . . . . . . . . . 2 5 5 6 . 6 D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 1 6 . 6 . 1 T h e r o l e o f d i f f e r e n t s p e c i e s i n V F A d e g r a d a t i o n . . . . . . . . . . . . 2 6 1 6 . 6 . 2 I s o m e r i z a t i o n i n c o m p l e x a n a e r o b i c e c o s y s t e m s . . . . . . . . . . . . . . 2 6 2 6 . 6 . 3 P a t h w a y s o f s y n t r o p h i c d e g r a d a t i o n o f 2 - m e t h y l b u t y r a t e a n d v a l e r a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 3 6 . 6 . 4 F o r m a t e s y n t h e s i s f r o m H 2 p l u s H C O 3 ' o r C O 2 . . . . . . . . . . . . . . 2 6 6 6 . 6 . 5 I n t e r s p e c i e s e l e c t r o n t r a n s f e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 7 6 . 7 S u m m a r y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 8 7 E C O P H Y S I O L O G I C A L R O L E O F D E F I N E D S P E C I E S I S O L A T E D F R O M G R A N U L E S I N G R A N U L E F O R M A T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 1 7 . 1 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 1 7 . 2 M a t e r i a l a n d M e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 3 7 . 2 . 1 B a c t e r i a l s t r a i n s a n d a n a l y t i c a l m e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 3 7 . 2 . 2 H y d r o p h o b i c i t y m e a s u r e m e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 3 7 . 2 . 3 R e - a g g r e g a t i o n t e s t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 4 7 . 2 . 4 S e n s i t i v i t y t e s t t o t e t r a c y c l i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 4 7 . 2 . 5 A g g r e g a t e f o r m a t i o n b y d e fi n e d c u l t u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 5 7 . 2 . 6 U p fl o w r e a c t o r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 6 7 . 2 . 7 F e e d c o m p o s i t i o n o f r e a c t o r e x p e r i m e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 7 7 . 2 . 8 R e a c t o r s t a r t - u p a n d o p e r a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 9 7 . 3 T h e r o l e o f M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n T l N i n g r a n u l e f o r m a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 2 7 . 3 . 1 E l e c t r o n m i c r o s c o P i c o b s e r v a t i o n o f a g g r e g a t e s f o r m e d b y M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T l N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 2 7 . 3 . 2 E f f e c t o f t e t r a c y c l i n e o n m e t h a n o g e n e s i s o f d i s r u p t e d R - t y p e g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 4 7 . 3 . 3 R e - a g g r e g a t i o n o f d i s p e r s e d c e l l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 4 7 . 3 . 4 A g g r e g a t e f o r m a t i o n i n l a b o r a t o r y s c a l e r e a c t o r b y M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T l N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 7 7 . 4 G r a n u l e f o r m a t i o n b y d e fi n e d s y n t r o p h i c f a t t y a c i d d e g r a d i n g c u l t u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 1 7 . 4 . 1 E x t r a c e l l u l a r p o l y m e r s o f M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 . . . . . . . . . . . . 2 9 1 7 . 4 . 2 H y d r o p h o b i c i t y o f c e l l s u r f a c e o f v a r i o u s m e t h a n o g e n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 1 7 . 4 . 3 E v a l u a t i o n o f a g g r e g a t i o n b e h a v i o r o f m e t h a n o g e n a n d s y n t r o p h i c c u l t u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 5 7 . 4 . 4 G r a n u l e f o r m a t i o n b y d e fi n e d s p e c i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 9 7 . 4 . 5 M i c r o b i a l s t r u c t u r e o f g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 3 7 . 4 . 6 C h a r a c t e r i z a t i o n o f g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 4 7 . 5 D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 8 7 . 5 . 1 T h e r o l e o f M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s p e c i e s i n g r a n u l e f o r m a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 8 7 . 5 . 2 E c o p h y s i o l o g i c a l r o l e o f d i f f e r e n t s p e c i e s i n g r a n u l e s t r u c t u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 9 7 . 5 . 3 H y d r o p h o b i c i t y a n d a d h e r e n c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 2 7 . 6 S u m m a r y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 3 8 S U M M A R Y A N D C O N C L U S I O N S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 5 9 R E C O M M E N D A T I O N S F O R F U T U R E R E S E A R C H . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 0 x i A P P E N D I C E S A M a t e r i a l s , g e n e r a l a n a l y t i c m e t h o d s a n d m e d i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 2 1 . C h e m i c a l s , g a s e s a n d m a t e r i a l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 2 2 . A n a l y t i c a l m e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 2 3 . P r e p a r a t i o n o f m e d i a a n d s t o c k s o l u t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 6 4 . M e d i a f o r g r o w t h a n d m a i n t e n a n c e o f d i f f e r e n t m i c r o b i a l s p e c i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 0 5 . M e d i a f o r s u b s t r a t e c o n v e r s i o n t e s t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 2 B D e t e r m i n a t i o n o f m a x i m u m s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s a n d s p e c i fi c g r o w t h r a t e s i n r e a c t o r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 3 1 . T h e m a x i m u m s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 3 2 . S p e c i fi c g r o w t h r a t e s o f d i f f e r e n t t r o p h i c g r o u p s . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 6 C D e t e n n i n a t i o n o f a p p a r e n t h a l f v e l o c i t y c o e f fi c i e n t s ( K , , ) u s i n g t i m e c o u r s e t e s t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 8 1 . E q u a t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 8 2 . D e t e r m i n a t i o n o f K l l n v a l u e s o f t h e R - a n d F - g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . 3 4 0 3 . D e t e r m i n a t i o n o f K I I I v a l u e o f M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 f o r a c e t a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 3 4 . D e t e r m i n a t i o n o f K I n v a l u e s o f g r a n u l e s d e v e l o p e d u s i n g d e fi n e d s p e c i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 4 5 . C o n c l u s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 4 D L i g h t m i c r o s c o p i c , s c a n n i n g e l e c t r o n a n d t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 9 1 . L i g h t m i c r o s c o p y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 9 2 . S c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( S E M ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 9 3 . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( T E M ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 0 4 . C e l l d e n s i t y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 1 5 . G r a n u l e s i z e a n a l y s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 1 E F r e e e n e r g y c a l c u l a t i o n s f o r b i o c h e m i c a l r e a c t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 5 1 . G e n e r a l e q u a t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 5 2 . F o r m a t e s y n t h e s i s f r o m h y d r o g e n p l u s b i c a r b o n a t e . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 6 3 . I s o m e r i z a t i o n b e t w e e n b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 6 4 . I n t e r s p e c i e s e l e c t r o n t r a n s f e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 7 F C a l c u l a t i o n f o r s u b s t r a t e c o n v e r s i o n v i a s u l f a t e r e d u c t i o n . . . . . . . . . . . . 3 7 0 1 . E q u a t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 0 2 . C a l c u l a t i o n o f r e s u l t s i n T a b l e 4 . 5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 1 3 . C a l c u l a t i o n o f r e s u l t s i n T a b l e 5 . 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 3 L I S T O F R E F E R E N C E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 4 x i i l e b T 1 1 2 1 1 1 1 1 a . . . . . . . . b 1 2 3 4 7 5 6 1 M P R S G fl S C y e y — r o e p o t h a n n o a s p S e m i i e r u x s r t n y c p n d b s o l t l a e p a i o fi s r t n e h t o c i p c o e i t o i i g t o a e i r C n t n o h a n O i a n i c c o o c f m t v t D i r a u w n t n t b o r t f a o n n s c g u a s t e s s e d m n i f o e r e l m o u f e i o s e o e e a v d i a i n c l o r e g a s b s f n n r a a e g o e r u s l i l t u s u a - e r . y c n g r a a . r n i c i t d n d . o o i u i t t e n a o a . e r r g n f e s a e t d i n g r s b . l n a b p a i o o . h a n a n l i c a c r u m a . e c t t o e . e i e c a r o r a l o o y . o . u c n t o s a d c . i e a r . i o o b i t c t b c n s t d x . . g l g e e n a . y . m e . e e n t l . m a p i s s . m u . r e u r x . . f . a . . r . e s m e . . . t n i . . y t . . . . a . . . . . l . t s a . s . . . . . c . . s . t e c i a l . i . . i . . . . . . d . . . . . . . . s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p e a 1 1 1 1 2 2 3 4 0 2 4 6 0 g 0 6 6 L I S T O F T A B L E S 2 . 2 M P N v a l u e s o f m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a i n a c t i v a t e d s l u d g e s f r o m f o u r t r e a t m e n t p l a n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 9 2 . 3 O p e r a t i o n a l r e s u l t s o f r e a c t o r i n o c u l a t e d w i t h d i g e s t e d s l u d g e a n d f e d w i t h g l u c o s e - m o l a s s e s d u r i n g g r a n u l a t i o n ( r e a c t o r A ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 3 2 . 4 C o m p o s i t i o n a n d s e t t l e a b i l i t y o f s l u d g e f r o m s l u d g e b l a n k e t r e g i o n d u r i n g g r a n u l a t i o n i n r e a c t o r A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 6 2 . 5 O p e r a t i o n a l r e s u l t s o f r e a c t o r i n o c u l a t e d w i t h d i g e s t e d s l u d g e a n d f e d w i t h b r e w e r y w a s t e w a t e r ( r e a c t o r B ) . . . . . . . . . . . . . . . . 6 1 2 . 6 O p e r a t i o n a l r e s u l t s o f r e a c t o r s t a r t e d w i t h a c t i v a t e d s l u d g e a n d f e d w i t h g l u c o s e - m o l a s s e s ( r e a c t o r C ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 3 x i i i 2 . 7 2 . 8 3 . 1 3 . 2 3 . 3 3 . 4 3 . 5 3 . 6 3 . 7 3 . 8 3 . 9 4 . 1 4 . 2 4 . 3 4 . 4 C o m p a r i s o n o f p e r f o r m a n c e o f g r a n u l e s f r o m r e a c t o r s A , B a n d C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 9 C o m p a r i s o n o f p h y s i c a l a n d c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f g r a n u l e s f r o m r e a c t o r s A , B a n d C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 2 F e e d c o m p o s i t i o n f o r l a b o r a t o r y r e a c t o r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 9 C o m p a r i s o n o f g r o w t h a n d o p e r a t i o n a l c o n d i t i o n s o f t h e R - g r a n u l e s a n d F — g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 8 O p e r a t i o n a l r e s u l t s o f t h e R - g r a n u l e s a n d F - g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . 9 9 C o m p a r i s o n o f t h e p h y s i c a l a n d c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e R - g r a n u l e s a n d F — g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 0 C o m p a r i s o n o f g r o w t h r a t e s o f d i f f e r e n t m e t a b o l i c t r o p h i c g r o u p s o f t h e R - g r a n u l e s a n d F - g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 4 C o m p a r i s o n o f m a x i m u m c o n v e r s i o n r a t e s a n d h a l f v e l o c i t y c o e f fi c i e n t s ( K m ) f o r m a j o r f e r m e n t a t i o n a n d i n t e r m e d i a t e p r o d u c t s b y t h e R - g r a n u l e s a n d F - g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 6 T r o p h i c g r o u p p o p u l a t i o n i n t h e R - g r a n u l e s a n d F - g r a n u l e s . . . . . . . . . . 1 1 2 C o m p a r i s o n o f m i c r o b i a l c e l l d e n s i t i e s o f t h e R - a n d F — g r a n u l e s . . . . . . . 1 1 9 S i m i l a r i t i e s a n d d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e R - a n d F - g r a n u l e s . . . . . . . . . . 1 2 2 C o m p o s i t i o n o f t h e i n fl u e n t b r e w e r y w a s t e w a t e r a n d e f fl u e n t o f U A S B r e a c t o r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 1 P h y s i c a l , c h e m i c a l a n d m i c r o b i a l c h a r a c t e r i s t i c s o f b r e w e r y g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 6 I n t e r m e d i a t e s f o r m e d d u r i n g s y n t r o p h i c e t h a n o l d e g r a d a t i o n b y b r e w e r y g r a n u l e s a n d e n e r g e t i c a n a l y s i s o f i n t e r s p e c i e s e l e c t r o n t r a n s f e r a n d f o r m a t e s y n t h e s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 6 M a x i m u m s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s a n d m a x i m u m m e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e s b y b r e w e r y g r a n u l e s i n t h e p r e s e n c e a n d t h e a b s e n c e o f s u l f a t e ( 3 5 ° C ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 9 x i v 4 . 5 4 . 5 5 . 1 5 . 2 5 . 3 5 . 4 5 . 5 5 . 6 5 . 7 5 . 8 S u b s t r a t e c o n v e r s i o n b y b r e w e r y g r a n u l e s i n t h e p r e s e n c e a n d t h e a b s e n c e o f s u l f a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 1 M o l y b d a t e e f f e c t s o n t h e m a x i m u m s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s f o r a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d e t h a n o l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 4 E f f e c t o f s u l f a t e a n d m o l y b d a t e o n t h e m a x i m u m s p e c i fi c f a t t y a c i d d e g r a d a t i o n r a t e s ( m m o l / g V S S - d ) b y t h e R - g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . 1 7 8 M a s s b a l a n c e f o r s u b s t r a t e c o n v e r s i o n i n t h e p r e s e n c e a n d t h e a b s e n c e o f s u l f a t e b y t h e R - g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 9 G e n e r a l p r o p e r t i e s o f p r e v a l e n t m e t h a n o g e n s i s o l a t e d fi o m t h e R - g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 3 A n t i g e n i c fi n g e r p r i n t o f m e t h a n o g e n i s o l a t e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 6 C o m p a r i s o n o f s e n s i t i v i t y t o v a r i o u s a n t i b i o t i c s ( 1 m g / m L ) a m o n g m e t h a n o g e n s t r a i n s T I N a n d R F a n d M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n M F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 7 G u a n i n e - p l u s — c y t o s i n e c o n t e n t s a n d D N A - D N A h y b r i d i z a t i o n b e t w e e n s t r a i n T l N a n d M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n M F . . . . . . . . . . . . 1 8 8 C o m p a r i s o n o f s e n s i t i v i t y t o v a r i o u s a n t i b i o t i c s ( 1 m g / m L ) b e t w e e n m e t h a n o g e n s t r a i n B D a n d M e t h a n o s p i r i l l u m h u n g a t e i s t r a i n I F 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 0 C o m p a r i s o n o f s e n s i t i v i t y t o v a r i o u s a n t i b i o t i c s ( 0 . 1 m g / m L ) a m o n g m e t h a n o g e n s t r a i n M 7 , M e t h a n o t h r i x s o e h n g e n i i s t r a i n O p fi k o n a n d M e t h a n o s a e t a c o n c i l l i i s t r a i n G P 6 . . . . . . . . . . . . . . 1 9 4 5 . 9 G e n e r a l p r o p e r t i e s o f p r e v a l e n t p r o p i o n a t e d e g r a d e r s i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 9 5 . 1 0 G e n e r a l p r o p e r t i e s o f p r e v a l e n t s y n t r o p h i c b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e - b u t y r a t e d e g r a d e r s i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s . . . . . . . . . . 2 0 3 5 . 1 1 P r e v a l e n t m o r p h o t y p e s o b s e r v e d i n M P N t u b e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 5 6 . 1 D e fi n e d c u l t u r e s u s e d f o r c h a r a c t e r i z a t i o n o f s u b s t r a t e m e t a b o l i s m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 5 X V 6 . 2 6 . 3 6 . 4 6 . 5 6 . 6 6 . 7 6 . 8 6 . 9 7 . 1 7 . 2 7 . 3 7 . 4 C I E n d p r o d u c t s o f p r o p i o n a t e d e g r a d a t i o n b y s y n t r o p h i c c o c u l t u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 1 E n d p r o d u c t s o f V F A d e g r a d a t i o n b y d e fi n e d b u t y r a t e d e g r a d i n g c u l t u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 2 I s o m e r i z a t i o n a n d c o n v e r s i o n r a t e s o f b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e b y t h e s y n t r o p h i c t r i c u l t u r e o f M b . f o r m i c i c u m T I N , M s . m a z e i T 1 8 a n d s t r a i n I B . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 2 E x p e r i m e n t a l r e s u l t s o f i s o b u t y r a t e c o n v e r s i o n i n t h e p r e s e n c e o f t h e p e r t u r b a t i o n w i t h f o r m a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 0 E x p e r i m e n t a l r e s u l t s o f b u t y r a t e c o n v e r s i o n i n t h e p r e s e n c e o f t h e p e r t u r b a t i o n w i t h f o r m a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 3 E x p e r i m e n t a l r e s u l t s o f i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f t h e p e r t u r b a t i o n w i t h h y d r o g e n g a s . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 6 E x p e r i m e n t a l r e s u l t s o f b u t y r a t e d e g r a d a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f t h e p e r t u r b a t i o n w i t h h y d r o g e n g a s . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 8 F r e e e n e r g y v a l u e s f o r b u t y r a t e f o r m a t i o n f r o m i s o b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e f o r m a t i o n f r o m b u t y r a t e w h e n s y n t r o p h i c b u t y r a t e o r i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n w a s c o m p l e t e l y i n h i b i t e d b y h i g h l e v e l o f f o r m a t e o r H 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 9 H y d r o p h o b i c i t y a n d c e l l a d h e s i o n p r o p e r t i e s o f m e t h a n o g e n i c s p e c i e s o b t a i n e d f r o m t h e R - g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 4 A g g r e g a t i o n b e h a v i o r s o f p u r e m e t h a n o g e n a n d d e fi n e d s y n t r o p h i c m e t h a n o g e n i c c u l t u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 6 O p e r a t i o n a l c o n d i t i o n a n d r e a c t o r p e r f o r m a n c e o f t h e r e a c t o r i n o c u l a t e d w i t h d e fi n e d s y n t r o p h i c m e t h a n o g e n i c c u l t u r e . . . . . . . . . . . . 3 0 1 P h y s i c a l - c h e m i c a l , m e t a b o l i c a n d m i c r o b i a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e g r a n u l e s d e v e l o p e d b y t h e d e fi n e d s p e c i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 7 R e s u l t s o f a p p a r e n t h v a l u e s ( m M ) f o r t h e R - a n d F - g r a n u l e s . . . . . . . 3 4 5 x v i L I S T O F F I G U R E S F i g u r e p a g e 1 . 1 C a r b o n fl o w s c h e m e i n c o m p l e t e m i n e r a l i z a t i o n o f o r g a n i c m a t t e r t o m e t h a n e a n d c a r b o n d i o x i d e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 2 . 1 S c h e m a t i c d i a g r a m o f l a b o r a t o r y - U A S B r e a c t o r s u s e d i n g r a n u l a t i o n e x p e r i m e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 4 2 . 2 a O p e r a t i o n a l r e s u l t s o f r e a c t o r i n o c u l a t e d w i t h d i g e s t e d s l u d g e a n d f e d w i t h g l u c o s e - m o l a s s e s ( r e a c t o r A ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 1 2 . 2 b O p e r a t i o n a l r e s u l t s o f r e a c t o r i n o c u l a t e d w i t h d i g e s t e d s l u d g e a n d f e d w i t h g l u c o s e - m o l a s s e s ( r e a c t o r A ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 2 2 . 3 R e s u l t s o f s e t t l i n g t e s t s c o n d u c t e d i n a 1 0 0 m L c y l i n d e r w i t h s l u d g e f r o m r e a c t o r A a t v a r i o u s d a y s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 5 2 . 4 a O p e r a t i o n a l r e s u l t s o f r e a c t o r i n o c u l a t e d w i t h d i g e s t e d s l u d g e a n d f e d w i t h b r e w e r y w a s t e w a t e r ( r e a c t o r B ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 9 2 . 4 b O p e r a t i o n a l r e s u l t s o f r e a c t o r i n o c u l a t e d w i t h d i g e s t e d s l u d g e a n d f e d w i t h b r e w e r y w a s t e w a t e r ( r e a c t o r B ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 0 2 . 5 a O p e r a t i o n a l r e s u l t s o f r e a c t o r i n o c u l a t e d w i t h a c t i v a t e d s l u d g e a n d f e d w i t h g l u c o s e m o l a s s e s ( r e a c t o r C ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 4 2 . 5 b O p e r a t i o n a l r e s u l t s o f r e a c t o r i n o c u l a t e d w i t h a c t i v a t e d s l u d g e a n d f e d w i t h g l u c o s e m o l a s s e s ( r e a c t o r C ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 5 2 . 6 C o m p a r i s o n o f t h e s l u d g e c o n c e n t r a t i o n p r o fi l e s i n t h e r e a c t o r s A , B a n d C d u r i n g g r a n u l a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 8 2 . 7 S i z e d i s t r i b u t i o n o f g r a n u l e s f r o m r e a c t o r s A a n d B . . . . . . . . . . . . . . . 7 1 2 . 8 S E M g r a p h s o f g r a n u l e s f r o m r e a c t o r s A , B a n d C . . . . . . . . . . . . . . . . 7 6 x v i i 3 . 1 3 . 2 3 . 3 3 . 4 3 . 5 3 . 6 3 . 7 3 . 8 4 . 1 4 . 2 4 . 3 4 . 4 4 . 5 4 . 6 4 . 7 S c h e m a t i c d i a g r a m o f l a b - u p fl o w r e a c t o r s y s t e m u s e d f o r c o m p a r i s o n o f r o d - t y p e a n d fi l a m e n t - t y p e a n a e r o b i c g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 2 S i z e d i s t r i b u t i o n o f t h e R - a n d F - g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 1 I n c r e a s e o f f a t t y a c i d c o n v e r s i o n r a t e s o f t h e R - a n d F - g r a n u l e s i n r e a c t o r s v e r s u s o p e r a t i o n a l p e r i o d . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 3 T e m p e r a t u r e e f f e c t o n s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s a t p H 6 . 8 . . . . . . . . . 1 0 9 p H e f f e c t s o n s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s a t 3 7 ° C . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 0 M i c r o s c o p i c c o m p a r i s o n b e t w e e n t h e R - g r a n u l e s a n d F — g r a n u l e s . . . . . 1 1 4 S E M p h o t o s o f t h e R - g r a n u l e s f e d w i t h V F A m i x t u r e a n d t h e F - g r a n u l e s f e d w i t h V F A p l u s g l u c o s e a n d e t h a n o l . . . . . . . . . . . . 1 1 6 T E M p h o t o s o f t h e R - a n d F - g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 7 S c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o p h o t o g r a p h s o f b r e w e r y g r a n u l e s . . . . . . . . . . 1 3 7 T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h s o f t h e t h i n c r o s s s e c t i o n o f g r a n u l e s t h a t s h o w t h e p r e s e n c e o f d i f f e r e n t m i c r o c o l o n i e s . . . . . . . . . 1 3 9 M i c r o b i a l s p e c i e s o b s e r v e d i n a c e t a t e , e t h a n o l a n d p r o p i o n a t e e n r i c h m e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 2 E t h a n o l d e g r a d a t i o n a n d i n t e r m e d i a t e p r o d u c t f o r m a t i o n i n t h e a b s e n c e o f s u l f a t e a t 3 5 ° C b y b r e w e r y g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . 1 4 5 V o l a t i l e f a t t y a c i d ( a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e ) d e g r a d a t i o n i n t h e a b s e n c e o f s u l f a t e b y b r e w e r y g r a n u l e s a t 3 5 ° C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 7 M e t h a n o g e n e s i s f r o m I - I Q - C O 2 i n t h e a b s e n c e a n d t h e p r e s e n c e o f s u l f a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 2 T h e e f f e c t o f d i f f e r e n t N a z M o O 4 c o n c e n t r a t i o n s o n t h e p r o p i o n a t e c o n v e r s i o n b y t h e g r a n u l e s i n t h e a b s e n c e o f s u l f a t e a t 3 5 ° C . . . . . . . 1 5 5 x v fi i 4 . 8 5 . 1 5 . 2 5 . 3 5 . 4 5 . 5 5 . 6 5 . 7 5 . 8 5 . 9 5 . 1 0 5 . 1 1 5 . 1 2 6 . 1 6 . 2 S u b s t r a t e a n d e n e r g y fl o w s c h e m e p r o p o s e d f o r t h e a n a e r o b i c d i g e s t i o n o f m a j o r o r g a n i c m a t t e r i n t h e b r e w e r y w a s t e w a t e r i n t h e p r e s e n c e s u f fi c i e n t s u l f a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 5 P r o c e d u r e s f o r t h e i s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f m e t h a n o g e n s f r o m H z - C O 2 o r f o r m a t e e n r i c h m e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 2 P r o c e d u r e s f o r t h e i s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f s y n t r o p h i c V F A - d e g r a d i n g b a c t e r i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 5 P h a s e - c o n t r a s t m i c r o p h o t o g r a p h s o f t h e p r e v a l e n t m e t h a n o g e n s i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 1 T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n p h o t o g r a p h s o f m e t h a n o g e n s i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 2 E f f e c t s o f p H a n d t e m p e r a t u r e o n t h e g r o w t h o f m e t h a n o g e n s i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 4 S D S g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f t o t a l c e l l u l a r p r o t e i n s o f s t r a i n s T l N , R F a n d M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n M F . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 8 E f f e c t o f s u l fi d e c o n c e n t r a t i o n o n m e t h a n o g e n e s i s f r o m a c e t a t e b y s t r a i n M 7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 2 P h a s e - c o n t r a s t m i c r o p h o t o g r a p h s o f f a t t y a c i d d e g r a d i n g a c e t o g e n s i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 6 T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n p h o t o g r a p h s o f f a t t y a c i d d e g r a d e r s . . . . . . . . . . 1 9 8 I l l u s t r a t i o n o f d i f f e r e n t g r o w t h s t a g e s d u r i n g s p o r u l a t i o n b y s y t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d e r s t r a i n B H p r e s u m a b l y b e i n g S y n t r o p h o s p o r a b r y a n t i i . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 2 S c a n n i n g e l e c t r o n p h o t o m i c r o g r a p h s o f t h e R — g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . 2 0 6 T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n p h o t o m i c r o g r a p h s o f t h e R - g r a n u l e s . . . . . . . . . 2 0 7 S i m u l t a n e o u s d e g r a d a t i o n o f a m i x t u r e o f a c e t a t e , p r 0 p i o n a t e a n d b u t y r a t e b y t h e R - g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 9 B u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y t h e R - g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . 2 2 0 x i x 6 . 3 6 . 4 6 . 5 6 . 6 6 . 7 6 . 8 6 . 9 6 . 1 0 6 . 1 1 6 . 1 2 T h e g r o w t h o f t h e c o c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n B H a n d M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N o n b u t y r a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 4 T h e g r o w t h o f t h e c o c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n B H a n d M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N o n b u t y r a t e i n t h e p r e s e n c e o f p r o p i o n a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 5 T h e g r o w t h o f t h e t r i c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n I B , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N a n d M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 o n b u t y r a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 7 T h e g r o w t h o f t h e t r i c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n I B , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N a n d M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 o n i s o b u t y r a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 8 T h e g r o w t h o f t h e t r i c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n I B , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N a n d M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 o n a n e q u a l m o l a r c o n c e n t r a t i o n s o f i s o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 9 B a t c h — f e d e x p e r i m e n t o n i s o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y t h e t r i c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n I B , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N a n d M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 . . . . . . . . . . . . 2 3 0 T h e g r o w t h o f t h e t r i c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n I B , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N a n d M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 o n v a l e r a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 4 T h e g r o w t h o f t h e t r i c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n I B , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N a n d M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 o n 2 - m e t h y l b u t y r a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 5 T h e g r o w t h o f t h e t r i c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n I B , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N a n d M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 o n b u t y r a t e i n t h e p r e s e n c e p r o p i o n a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 7 P e r t u r b a t i o n o f s y n t r o p h i c i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y t h e t r i c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n I B , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N a n d M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 o f w i t h f o r m a t e . . . . . . . . . . . . . 2 3 9 X X 6 . 1 3 6 . 1 4 6 . 1 5 6 . 1 6 6 . 1 7 6 . 1 8 6 . 1 9 6 . 2 0 6 . 2 1 6 . 2 2 7 . 1 7 . 2 7 . 3 P e r t u r b a t i o n o f s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y t h e t r i c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n I B , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N a n d M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 w i t h f o r m a t e . . . . . . . . . . . . . . 2 4 2 P e r t u r b a t i o n o f s y n t r o p h i c i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y t h e t r i c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n I B , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N a n d M s . m a z e i T 1 8 w i t h h y d r o g e n . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 5 P e r t u r b a t i o n o f s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y t h e t r i c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n I B , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N a n d M s . m a z e i T 1 8 w i t h h y d r o g e n . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 7 F r e e e n e r g y c h a n g e o f i s o m e r i z a t i o n c o u p l e d w i t h b u t y r a t e o x i d a t i o n v s t h e p e r c e n t a g e o f b u t y r a t e i n a b u t y r a t e - i s o b u t y r a t e m i x t u r e , b a s e d o n f o r m a t e i n t e r s p e c i e s t r a n s f e r . . . . . . . . . 2 5 3 F o r m a t e f o r m a t i o n d u r i n g m e t h a n o g e n e s i s f r o m H z - C O 2 b y t h e R - g r a n u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 5 F o r m a t e f o r m a t i o n d u r i n g t h e g r o w t h o f M b . f o r m i c i c u m s t r a i n M P o n H z - C O Z . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 6 F o r m a t e f o r m a t i o n d u r i n g t h e g r o w t h o f M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N o n H z - C O 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 7 F o r m a t e f o r m a t i o n d u r i n g t h e g r o w t h o f M b . f o r m i c i c u m s t r a i n R F o n 1 1 2 - C 0 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 8 F o r m a t e f o r m a t i o n d u r i n g t h e g r o w t h o f M s p . h u n g a t e i s t r a i n B D o n H z - C O 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 9 F o r m a t e a n d a c e t a t e f o r m a t i o n d u r i n g t h e g r o w t h o f M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 o n 1 1 2 - C O 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 0 S c h e m a t i c d i a g r a m o f u p fl o w r e a c t o r s y s t e m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 8 S E M p h o t o g r a p h s o f M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n T I N . . . . . . 2 8 3 C o m p a r i s o n o f a g g r e g a t i o n o f d i s p e r s e d c e l l s b e t w e e n t h e R - g r a n u l e s a n d M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n T I N a g g r e g a t e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 6 x x i 7 . 4 7 . 5 7 . 6 7 . 7 7 . 8 7 . 9 7 . 1 0 7 . 1 1 C I C 2 C 3 C 4 C . 5 O p e r a t i o n a l r e s u l t s o f u p f l o w r e a c t o r i n o c u l a t e d w i t h M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n T I N a n d o p e r a t e d a t 3 5 ° C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 8 G r a n u l e - l i k e a g g r e g a t e s f o r m e d b y M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n T I N i n t h e u p f l o w r e a c t o r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 9 S i z e d i s t r i b u t i o n o f g r a n u l e - l i k e a g g r e g a t e s f o r m e d b y M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n T I N i n t h e r e l a t i o n t o t o t a l n u m b e r s a n d g r a n u l e b e d v o l u m e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 0 S c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o p h o t o g r a p h s o f M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 2 A g g r e g a t e f o r m a t i o n b y s y n t r o p h i c m e t h a n o g e n i c c o c u l t u r e s a n d t r i c u l t u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 7 R e s u l t s o f r e a c t o r s y s t e m u s e d t o s t u d y f o r m a t i o n o f s y n t r o p h i c a n a e r o b i c g r a n u l e s b y d e fi n e d s p e c i e s . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 0 G r a n u l e s f o r m e d b y d e fi n e d s p e c i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 6 S i z e d i s t r i b u t i o n o f t h e g r a n u l e s f o r m e d b y d e fi n e d s p e c i e s . . . . . . . . . 3 0 8 T i m e - c o u r s e o f a c e t a t e d e g r a d a t i o n b y t h e R - g r a n u l e s a n d t h e p l o t f o r d e t e r m i n a t i o n o f K I n u s i n g e q u a t i o n C - S . . . . . . . . . . . . . . 3 4 6 T i m e - c o u r s e o f a c e t a t e d e g r a d a t i o n b y t h e F - g r a n u l e s a n d t h e p l o t f o r d e t e r m i n a t i o n o f K , u s i n g e q u a t i o n C - 5 . . . . . . . . . . . . . . 3 4 7 T i m e — c o u r s e o f p r o p i o n a t e d e g r a d a t i o n b y t h e R - g r a n u l e s a n d t h e p l o t f o r d e t e r m i n a t i o n o f K I I I u s i n g e q u a t i o n C - 5 . . . . . . . . . . . . . . 3 4 8 T i m e - c o u r s e o f p r o p i o n a t e d e g r a d a t i o n b y t h e F — g r a n u l e s a n d t h e p l o t f o r d e t e r m i n a t i o n o f K I I I u s i n g e q u a t i o n C - 5 . . . . . . . . . . . . . . 3 4 9 T i m e - c o u r s e o f b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y t h e R - g r a n u l e s a n d t h e p l o t f o r d e t e r m i n a t i o n o f K I I I u s i n g e q u a t i o n s C - 7 a n d C - 8 . . . . . . . 3 5 0 x x i i C . 6 T i m e - c o u r s e o f b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y t h e F - g r a n u l e s a n d t h e p l o t f o r d e t e r m i n a t i o n o f K . . . u s i n g e q u a t i o n s C — 7 a n d C - 8 . . . . . . . 3 5 1 C 7 T i m e - c o u r s e o f i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y t h e R - g r a n u l e s a n d t h e p l o t f o r d e t e r m i n a t i o n o f K I I I u s i n g e q u a t i o n C - 5 . . . . . . . . . . . . . . 3 5 2 C 8 T i m e - c o u r s e o f i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y t h e F — g r a n u l e s a n d t h e p l o t f o r d e t e r m i n a t i o n o f K I l l u s i n g e q u a t i o n C - 5 . . . . . . . . . . . . . . 3 5 3 C 9 T i m e - c o u r s e o f v a l e r a t e d e g r a d a t i o n b y t h e R - g r a n u l e s a n d t h e p l o t f o r d e t e r m i n a t i o n o f K I l l u s i n g e q u a t i o n C - 5 . . . . . . . . . . . . . . 3 5 4 C . 1 0 T i m e - c o u r s e o f v a l e r a t e d e g r a d a t i o n b y t h e F - g r a n u l e s a n d t h e p l o t f o r d e t e r m i n a t i o n o f K I n u s i n g e q u a t i o n C - 5 . . . . . . . . . . . . . . 3 5 5 C . 1 1 T i m e - c o u r s e o f a c e t a t e d e g r a d a t i o n b y M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 a n d t h e p l o t f o r d e t e r m i n a t i o n o f K m u s i n g e q u a t i o n C — 5 . . . . . . . . . . . 3 5 6 C . 1 2 T i m e - c o u r s e o f p r o p i o n a t e d e g r a d a t i o n b y t h e g r a n u l e s d e v e l o p e d u s i n g d e fi n e d s p e c i e s a n d t h e p l o t f o r d e t e r m i n a t i o n o f K m u s i n g e q u a t i o n C - 5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 7 C . 1 3 T i m e - c o u r s e o f b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y t h e g r a n u l e s d e v e l o p e d u s i n g d e fi n e d s p e c i e s a n d t h e p l o t f o r d e t e r m i n a t i o n o f K I n u s i n g e q u a t i o n C - 5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 8 x x i i i B O D c a . C F C O D D D - w a t e r D N A E G T A F - g r a n u l e s G C H P L C M b v . M s t . M t r x . N M R O D P H B P B B R - g r a n u l e s S E M S I A s p . S R B S S S T P S V I T C D T E M K E Y T O A B B R E V I A T I O N S B i o l o g i c a l o x y g e n d e m a n d C a l c u l a t e d C a t i o n i z e d f e n i t i n C h e m i c a l o x y g e n d e m a n d D o u b l e - d i s t i l l e d w a t e r D e o x y r i b o n u c l e i c a c i d D i s s o l v e d o x y g e n E t h y l e n e g l y c o l - b i s ( B - a m i n o e t h y l e t h e r ) - N , N , - t e t r a a c e t i c a c i d F i l a m e n t — t y p e g r a n u l e s F l a m e i o n i z a t i o n d e t e c t o r G a s c h r o m a t o g r a p h y H i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y H y d r a u l i c r e t e n t i o n t i m e M e t h a n o b a c t e r i u m M e t h a n o b r e v i b a c t e r M e t h a n o c o c c u s M o s t p r o b a b l e n u m b e r M e t h a n o s a r c i n a M e t h a n o s p r i l l u m M e t h a n o s a e t a M e t h a n o t h r i x N u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e O p t i c a l d e n s i t y P o l y - B - h y d r o x y b u t y r a t e P h o s p h a t e b u f f u r e d b a s a l m e d i u m R o d - t y p e g r a n u l e s S c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y S l i d e i r n m u n o e n z y m a t i c a s s a y s p e c i e s S u l f a t e - r e d u c i n g b a c t e r i a S u s p e n d e d s o l i d s S t a n d a r d p r e s s u r e a n d t e m p e r a t u r e S l u d g e v o l u m e i n d e x T h e r m a l c o n d u c t i v i t y d e t e c t o r T r a n s n r i s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y x x i v U A S B U p fl o w a n a e r o b i c s l u d g e b l a n k e t V F A V o l a t i l e f a t t y a c i d V S S V o l a t i l e s u s p e n d e d s o l i d s X X V I N T R O D U C T I O N I n r e c e n t y e a r s , a n a e r o b i c t r e a t m e n t h a s r e c e i v e d c o n s i d e r a b l e a t t e n t i o n f r o m e n v i r o n m e n t a l e n g i n e e r s a n d m i c r o b i o l o g i s t s . T h e m o s t w i d e l y u s e d p r o c e s s c o n fi g u r a t i o n i s t h e u p fl o w a n a e r o b i c s l u d g e b l a n k e t ( U A S B ) p r o c e s s . T h e d e v e l o p m e n t o f a n a e r o b i c d i g e s t i o n g r a n u l e s w i t h g o o d s e t t l i n g p r o p e r t i e s i s e s s e n t i a l f o r t h e s t a r t - u p a n d o p e r a t i o n o f U A S B s y s t e m . T o d a t e , m o s t U A S B s y s t e m s a r e s t a r t i n g u s i n g g r a n u l e s o b t a i n e d f r o m e x i s t i n g r e a c t o r s , a l t h o u g h t h i s i s n o t a l w a y s s u c c e s s f u l a n d i s n o t a l w a y s a p r a c t i c a l a n d e c o n o m i c a l p r o p o s i t i o n . T h e r e f o r e , u n d e r s t a n d i n g h o w t o c u l t i v a t e g r a n u l e s f r o m n o n - g r a n u l a r i n o c u l u m m a t e r i a l s a n d d e t e r m i n i n g t h e u n d e r l y i n g m e c h a n i s m s o f t h e g r a n u l a t i o n p r o c e s s i s a t t r a c t i v e . T h e o b j e c t i v e s o f t h i s s t u d y w e r e t o i n v e s t i g a t e : ( i ) t h e e m p i r i c a l p r i n c i p l e s f o r t h e c u l t i v a t i o n o f g r a n u l e s , ( i i ) t h e i n fl u e n c e o f m i c r o b i a l c o m p o s i t i o n o n o p e r a t i o n a l , k i n e t i c , a n d m e t a b o l i c p e r f o r m a n c e o f g r a n u l e s , a n d ( i i i ) t h e r o l e o f s e l e c t b a c t e r i a l s p e c i e s i n g r a n u l a t i o n . T h e r e f o r e , t h i s s t u d y i s a c o m p r e h e n s i v e i n v e s t i g a t i o n o f t h e g r a n u l a t i o n p r o c e s s a n d t h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f g r a n u l e s , i n c l u d i n g : . i n v e s t i g a t i n g a n d g e n e r a l i z i n g t h e e m p i r i c a l p r i n c i p l e s i n v o l v e d i n t h e d e v e l o p m e n t o f g r a n u l e s f r o m n o n - g r a n u l a r i n o c u l u m m a t e r i a l s , 0 c h a r a c t e r i z i n g t h e p e r f o r m a n c e o f g r a n u l e s f r o m d i f f e r e n t s o u r c e s , - i s o l a t i n g p r e v a l e n t s p e c i e s f r o m t h e s e g r a n u l e s a n d - c h a r a c t e r i z i n g t h e i r r o l e s i n s u b s t r a t e m e t a b o l i s m a n d g r a n u l e f o r m a t i o n . T h i s w o r k w a s i n i t i a t e d a t T s i n g h u a U n i v e r s i t y , B e i j i n g , P . R . C h i n a , a n d 1 c o m p l e t e d a t M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y a n d M i c h i g a n B i o t e c h n o l o g y I n s t i t u t e , L a n s i n g , M i c h i g a n . T h e m a j o r c o n t e n t s i n C h a p t e r 2 h a v e b e e n p u b l i s h e d i n t h e P r o c e e d i n g s o f F o u r t h I n t e r n a t i o n a l S y m p o s i u m o n A n a e r o b i c d i g e s t i o n , A n a e r o b i c D i g e s t i o n 1 9 8 5 ( W u e t a l . , 1 9 8 5 ) , A i a . S c i e n t . C i r w s i a l t ( W u e t a l . , 1 9 8 6 ; 1 9 8 7 a ) a n d fl a g R e s e a r c h ( W u e t a l . , 1 9 8 7 b ) . A p o r t i o n o f t h e m a t e r i a l s i n C h a p t e r 3 a n d 6 w a s p r e s e n t e d a s p o s t e r s a t t h e A n n u a l M e e t i n g o f t h e A m e r i c a n S o c i e t y o f M i c r o b i o l o g y i n 1 9 8 8 ( T h i e l e e t a l . , 1 9 8 8 b ) , 1 9 9 0 ( W u a n d J a i n , 1 9 9 0 ) a n d 1 9 9 1 ( W u e t a l . , 1 9 9 1 a ) , r e s p e c t i v e l y . A p o r t i o n o f t h e c o n t e n t s i n C h a p t e r 4 w a s p r e s e n t e d a t t h e 4 6 t h I n d u s t r i a l W a s t e C o n f e r e n c e , P u r d u e U n i v e r s i t y ( W u a n d H i c k e y , 1 9 9 1 ) a n d w i l l b e p u b l i s h e d i n A p p l i e d a n d E n v i r o n m e n t a l M i c r o b i o l o g y ( W u e t a l . , 1 9 9 1 b ) . C H A P T E R 1 G E N E R A L L I T E R A T U R E R E V I E W 1 . 1 H I S T O R I C B A C K G R O U N D O F A N A E R O B I C D I G E S T I O N A l e x a n d r e V o l t a ( 1 7 7 6 ) i s c o n s i d e r e d t o b e t h e fi r s t t o r e a l i z e t h e r e l a t i o n b e t w e e n d e c a y i n g v e g e t a t i o n a n d i n fl a m m a b l e g a s , a l t h o u g h " n a t u r a l g a s " f r o m u n d e r g r o u n d w a s u t i l i z e d b y a n c i e n t c h i n e s e p e o p l e a b o u t 2 , 0 0 0 y e a r s a g o . S i n c e L o u i s M o u r a s ( 1 8 8 1 ) i n v e n t e d t h e fi r s t s e p t i c t a n k , a n a e r o b i c d i g e s t i o n h a s b e e n a p p l i e d f o r o r g a n i c w a s t e a n d w a s t e w a t e r t r e a t m e n t ( M c C a r t y , 1 9 8 1 ) . B e f o r e t h e 1 9 5 0 ’ s , a n a e r o b i c d i g e s t i o n w a s u t i l i z e d m a i n l y f o r t h e t r e a t m e n t o f s o l i d o r g a n i c w a s t e ( a n a e r o b i c s l u d g e d i g e s t o r s ) a n d f o r p r i m a r y t r e a t m e n t o f s e w a g e ( I m h o f f t a n k s ) . D u r i n g t h e l a s t t w e n t y y e a r s a n a e r o b i c b i o l o g i c a l w a s t e w a t e r t r e a t m e n t p r o c e s s e s h a v e b e e n d e v e l o p e d f o r i n d u s t r i a l w a s t e w a t e r t r e a t m e n t . T h e a p p l i c a t i o n o f a n a e r o b i c d i g e s t i o n f o r i n d u s t r i a l w a s t e w a t e r w a s i n i t i a t e d w h e n S c h r o e p f e r e t a l . ( 1 9 5 5 ) p r o p o s e d a n a n a e r o b i c c o n t a c t p r o c e s s . S i n c e t h e n , n e w c o n c e p t u a l p r o c e s s c o n fi g u r a t i o n s h a v e b e e n i n t r o d u c e d o n e a f t e r a n o t h e r , i n c l u d i n g t h e a n a e r o b i c fi l t e r ( Y o u n g a n d M c C a r t y , 1 9 6 7 ) , u p fl o w a n a e r o b i c s l u d g e b l a n k e t ( U A S B ) r e a c t o r ( L e t t i n g a e r a l . , 1 9 8 0 ) , d o w n fl o w a n a e r o b i c fi x e d fi l m r e a c t o r ( v a n d e n B e r g a n d L e n t z , 1 9 7 9 ) , a n a e r o b i c fl u i d i z e d b e d r e a c t o r ( H i c k e y a n d O w e n s , 1 9 8 1 ) , a n a e r o b i c a t t a c h e d m i c r o b i a l fi l m e x p a n d e d b e d r e a c t o r ( J e w e l l e t a l . , 1 9 8 1 ) , a n a e r o b i c b a f fl e d r e a c t o r ( M c C a r t y , 1 9 8 2 ) , u p fl o w a n a e r o b i c r e a c t o r c o m b i n i n g a s l u d g e b l a n k e t a n d a fi l t e r ( G u i o t e t a l . , 1 9 8 5 ; G u i o t a n d v a n d e n B e r g , 1 9 8 5 ) o r u p fl o w a n a e r o b i c h y b r i d r e a c t o r s ( C r a w f o r d a n d T e l e t z k e , 1 9 8 6 ; O l e s z k i e w i c z e t a l . , 1 9 8 6 ) , a n d m a n y o t h e r s . M a t h e m a t i c a l m o d e l i n g o f a n a e r o b i c d i g e s t i o n p r o c e s s w a s i n i t i a t e d i n t h e l a t e 1 9 6 0 ’ s ( A n d r e w s , 1 9 6 8 ; L a w r e n c e a n d M c C a r t y , 1 9 6 9 ; O ’ R o u r k e , 1 9 6 9 ) a n d w a s d e v e l o p e d b y m a n y r e s e a r c h e r s . D u r i n g t h i s p e r i o d , a b e t t e r a n d b e t t e r u n d e r s t a n d i n g o f m e t h a n o g e n i c r e a c t i o n s w a s o b t a i n e d ( Z e i k u s , 1 9 7 7 , 1 9 7 9 ; B a l c h e t a l . , 1 9 7 9 ; B r y a n t , 1 9 7 9 ; W o l f e a n d H i g g i n s , 1 9 7 9 ; Z e h n d e r e t a l . , 1 9 8 1 ) . I t i s d i f fi c u l t t o s i n g l e o u t r e s u l t s o f m i c r o b i o l o g i c a l r e s e a r c h t h a t s p e c i fi c a l l y c o n t r i b u t e d t o t h e d e v e l o p m e n t o f t h e c u r r e n t a n a e r o b i c s y s t e m s , b u t m i c r o b i o l o g i c a l r e s e a r c h h a s i n d e e d p r o v i d e d t h e k n o w l e d g e a n d i d e a s t h a t t h e s c i e n t i s t s a n d e n g i n e e r s h a v e p u t t o u s e i n t h e d e v e l o p m e n t o f o p e r a t i o n a l s t r a t e g i e s f o r a n a e r o b i c p r o c e s s e s . C o n v e r s e l y , r e s e a r c h o f t h e h i g h - r a t e p r o c e s s e s h a s a l s o s t i m u l a t e d f u n d a m e n t a l r e s e a r c h o n t h e m i c r o b i o l o g y o f t h e s e s y s t e m s . T h e a d v a n t a g e s o f a n a e r o b i c b i o l o g i c a l w a s t e w a t e r t r e a t m e n t o v e r c o n v e n t i o n a l a e r o b i c b i o l o g i c a l t r e a t m e n t i n c l u d e : - l o w p r o d u c t i o n o f e x c e s s s l u d g e ; . l o w n u t r i e n t r e q u i r e m e n t ( n i t r o g e n , p h o s p h o r u s , e t c ) ; - n o e n e r g y r e q u i r e m e n t f o r a e r a t i o n ; - h i g h v o l u m e t r i c o r g a n i c l o a d i n g r a t e s c a n b e t o l e r a t e d ; - p o t e n t i a l r e c o v e r y o f e n e r g y i n t h e f o r m e d b i o g a s ; - d e g r a d a t i o n o f s o m e t o x i c c o m p o u n d s ( s u c h a s h a l o g e n a t e d c o m p o u n d s ) w h i c h a r e r e c a l c i t r a n t t o a e r o b i c d e g r a d a t i o n ; a n d - a n a e r o b i c s l u d g e c a n b e p r e s e r v e d u n d e r u n f e d c o n d i t i o n s f o r a l o n g t i m e w i t h o u t a s e r i o u s r e d u c t i o n o f a c t i v i t y . A n a e r o b i c t r e a t m e n t a l s o h a s c e r t a i n d r a w b a c k s a n d u n s o l v e d p r o b l e m s : - s l o w g r o w t h o f a n a e r o b i c b a c t e r i a e s p e c i a l l y m e t h a n o g e n i c a n d s y n t r o p h i c a c e t o g e n i c b a c t e r i a a n d r e s u l t i n g s l o w s t a r t - u p o f t h e p r o c e s s ; - s e n s i t i v i t y o f m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a a n d s y n t r o p h i c a c e t o g e n s t o e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s ( p H , t e m p e r a t u r e e t c . ) a n d t o x i c c o m p o u n d s ; a n d - t h e e f fl u e n t f r o m a n a n a e r o b i c r e a c t o r n o r m a l l y r e q u i r e s p o s t - t r e a t m e n t f o r r e m o v a l o f r e m a i n i n g B O D ( b i o l o g i c a l o x y g e n d e m a n d ) o r C O D ( c h e m i c a l o x y g e n d e m a n d ) , a m m o n i a a n d m a l o d o r o u s c o m p o u n d s . 1 . 2 M I C R O B I O L O G I C A L P R I N C I P L E S O F A N A E R O B I C D I G E S T I O N A n a e r o b i c d i g e s t i o n o r t h e d e c o m p o s i t i o n o f o r g a n i c m a t e r i a l t o i n o r g a n i c p r o d u c t s b y m i c r o b i a l e c o s y s t e m s i n v o l v e s b i o l o g i c a l o x i d a t i o n s w i t h p r o t o n s , s u l f u r o r c a r b o n a t o m s s e r v i n g a s t h e e l e c t r o n s i n k s . I n t h e a b s e n c e o f l i g h t a n d i n o r g a n i c e l e c t r o n a c c e p t o r s ( s u c h a s s u l f a t e , n i t r a t e ) , t h e e n d p r o d u c t s o f t h e b i o d e g r a d a t i o n o f o r g a n i c m a t e r i a l s a r e m e t h a n e a n d c a r b o n d i o x i d e . A c e r t a i n a m o u n t o f s u l fi d e i s a l s o p r o d u c e d t h r o u g h s u l f a t e r e d u c t i o n i n a n a e r o b i c d i g e s t o r s , b u t t h i s i s g e n e r a l l y i n s i g n i fi c a n t i n t e r m s o f c a r b o n fl o w . 1 . 2 . 1 T r o p h i c g r o u p s f o r a n a e r o b i c d e g r a d a t i o n T h e c o m p l e t e a n a e r o b i c d i g e s t i o n o f c o m p l e x o r g a n i c c o m p o u n d s ( p o l y s a c c h a r i d e s , p r o t e i n s a n d l i p i d s ) r e q u i r e s a t l e a s t t h r e e t r o p h i c g r o u p s o f m i c r o o r g a n i s m s , w h i c h f o r m a m i c r o b i a l f o o d c h a i n o r w e b ( B r y a n t , 1 9 7 9 ; M c I n e m e y e t a l . , 1 9 7 9 a ; Z e i k u s , 1 9 7 9 , 1 9 8 3 ; T h i e l e a n d Z e i k u s , 1 9 8 8 a ) : - H y d r o l y t i c - f e r m e n t a t i v e m i c r o o r g a n i s m s ; - S y n t r o p h i c a c e t o g e n i c b a c t e r i a ; a n d . M e t h a n o g e n i c b a c t e r i a ( F i g u r e 1 . 1 ) . O r g a n i c m a t t e r P o l y m e r i c c a r b o h y d r a t e s p r o t e i n s , l l p l d s I : H y d r o l y t l c - t e r m e n t e t l v e P r o p i o n a t e , b u t y r a t e , a n d o t h e r t e t t y e c l d s , a l c o h o l s I I : S y n t r o p h i c a c e t o g e n i c A c e t a t e I I I : M e t h a n o g e n i c M e t h a n e F i g u r e 1 . 1 C a r b o n fl o w s c h e m e i n c o m p l e t e m i n e r a l i z a t i o n o f o r g a n i c m a t t e r t o m e t h a n e a n d c a r b o n d i o x i d e T h e h y d r o l y t i c - f e r m e n t a t i v e o r g a n i s m s c o n v e r t a v a r i e t y o f c o m p l e x o r g a n i c m a t t e r i n t o s i m p l e o r g a n i c c o m p o u n d s ( f o r m a t e , a c e t a t e , p r o p i o n a t e , b u t y r a t e , e t h a n o l e t c . ) , h y d r o g e n a n d c a r b o n d i o x i d e . E u b a c t e r i a a r e p r e v a l e n t h y d r o l y t i c - f e r m e n t a t i v e m i c r o o r g a n i s m s , a l t h o u g h f u n g i a n d p r o t o z o a a l s o p l a y a r o l e i n s o m e a n a e r o b i c e c o s y s t e m s ( H u n g a t e , 1 9 6 6 ; B r y a n t , 1 9 7 7 ; W i l l i a m s , 1 9 8 6 ; M o u n t f o r t , 1 9 8 7 ) . T h e s y n t r o p h i c a c e t o g e n s t h e n c o n v e r t t h e m e t a b o l i c p r o d u c t s f r o m t h e fi r s t g r o u p , s u c h a s e t h a n o l , p r o p i o n a t e , b u t y r a t e , v a l e r a t e , i s o v a l e r a t e , b e n z o a t e e t c . , i n t o d i r e c t m e t h a n o g e n i c p r e c u r s o r ( a c e t a t e a n d h y d r o g e n o r f o r m a t e ) . T h e s e b a c t e r i a a r e c a l l e d " s y n t r o p h i c b a c t e r i a " b e c a u s e t h e y c a n o n l y c o n v e r t t h e a b o v e s u b s t r a t e s i n t h e a s s o c i a t i o n w i t h a h y d r o g e n - u t i l i z i n g p a r t n e r , u s u a l l y a m e t h a n o g e n ( o r s u l f a t e r e d u c e r i f s u l f a t e i s a v a i l a b l e ) t o p r e v e n t t h e a c c u m u l a t i o n o f t h e i n t e r m e d i a t e p r o d u c t H 2 o r f o r m a t e a n d , a s a r e s u l t , t o k e e p t h e c o n v e r s i o n t h e r m o d y n a m i c a l l y f a v o r a b l e ( B r y a n t e t a l . 1 9 6 7 ; M c I n e m e y e t a l . , 1 9 7 9 a ; Z e i k u s , 1 9 7 9 ; T h i e l e a n d Z e i k u s , 1 9 8 8 a ) . T h e t h i r d t r o p h i c g r o u p i s t h e m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a . M e t h a n o g e n s u t i l i z e t h e a c e t a t e , I - I z - C O 2 a n d f o r m a t e p r o d u c e d b y o t h e r t r o p h i c g r o u p s t o p r o d u c e m e t h a n e a n d C 0 2 . I n a d d i t i o n t o t h e s e t h r e e m a j o r t r o p h i c g r o u p s m e n t i o n e d a b o v e , h o m o a c e t o g e n s a r e a n a d d i t i o n a l t r o p h i c g r o u p i n v o l v e d i n a n a e r o b i c d i g e s t i o n ( Z e i k u s , 1 9 8 3 ; Z e h n d e r e t a l . , 1 9 8 1 ) . H o m o a c e t o g e n s , w h i c h i n c l u d e s e v e r a l s p e c i e s o f A c e t o b a c t e r i u m , A c e t o g e n e n i u m , a n d S p o r o m u s a u s e g l u c o s e , l a c t o s e , e t h a n o l , f o r m a t e a n d 1 1 2 - C O 2 t o p r o d u c e a c e t a t e ( B a l c h e t a l . , 1 9 7 7 ; L e i g h e t a l . , 1 9 8 1 ; M o l l e r e t a l . , 1 9 8 3 ; L j u n g d a h l , 1 9 8 6 ; B r e z n a k e t a l . , 1 9 8 8 ) . A t h e r m o p h i l i c i s o l a t e w a s o b s e r v e d t o o x i d i z e a c e t a t e i n t o I r I z - C O 2 t o g e t h e r w i t h a h y d r o g e n - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n ( L e e e t a l . , 1 9 8 8 ) . M a r k i e a n d B r y a n t ( 1 9 8 1 ) e s t i m a t e d t h a t o n l y 1 t o 2 % o f t o t a l a c e t a t e w a s s y n t h e s i z e d f r o m 1 1 2 - C O 2 i n a 4 0 ° C c a t t l e w a s t e d i g e s t o r . S u l f a t e r e d u c i n g b a c t e r i a a r e a d i v e r s e g r o u p o f b a c t e r i a t h a t e x i s t i n a n a e r o b i c e c o s y s t e m s . U s i n g s u l f a t e a s e l e c t r o n a c c e p t o r , t h e y c a n d e g r a d e a l m o s t a l l i n t e r m e d i a t e s p r o d u c e d f e r r n e n t a t i v e l y u n d e r a n a e r o b i c c o n d i t i o n s ( W i d d e l , 1 9 8 8 ) . S o m e s t r a i n s c a n a l s o g r o w s y n t r o p h i c a l l y w i t h H z - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s o n s u b s t r a t e s s u c h a s e t h a n o l a n d l a c t a t e ( B r y a n t e r a l . , 1 9 7 7 ) . T h e r o l e o f s u l f a t e r e d u c i n g b a c t e r i a i n a n a e r o b i c d i g e s t i o n o f i n d u s t r i a l w a s t e w a t e r h a s n o t b e e n w e l l e m p h a s i z e d . 1 . 2 . 2 M e t h a n o g e n e s i s M e t h a n o g e n e s i s b y p u r e c u l t u r e s o f m e t h a n o g e n s h a s b e e n i n v e s t i g a t e d c o m p r e h e n s i v e l y d u r i n g t h e l a s t t w o d e c a d e s . A l l m e t h a n o g e n s b e l o n g t o t h e a r c h a e b a c t e r i a l k i n g d o m a n d d i f f e r f r o m e u b a c t e r i a i n t h e i r R N A p o l y m e r a s e , o l i g o n u c l e o t i d e c a t a l o g s f o r 1 6 S r R N A , m e m b r a n e l i p i d s , a n d w a l l c o m p o n e n t s . S y s t e m a t i c r e v i e w s o f t h e t a x o n o m y a n d p h y s i o l o g y o f m e t h a n o g e n s a r e g i v e n b y s e v e r a l a u t h o r s ( Z e i k u s , 1 9 7 7 ; B a l c h e t a l . , 1 9 7 9 ; W o e s e a n d W o l f e , 1 9 8 5 ; J o n e s e t a l . , 1 9 8 7 ; W o e s e , 1 9 8 7 ; J a i n e t a l . , 1 9 8 8 ) . M e t h a n o g e n s g e n e r a l l y c a n n o t u t i l i z e t h e i n t e r r n e d i a t o r y p r o d u c t s w i t h t h r e e o r m o r e c a r b o n a t o m s f o r g r o w t h o r m e t h a n e p r o d u c t i o n . T h e y c a n u s e o n l y s i m p l e e n e r g y s o u r c e s s u c h a s f o r m a t e , a c e t a t e , m e t h a n o l , m e t h y l a m i n e s , C O , a n d H 2 . R e c e n t l y , h o w e v e r , i t w a s r e p o r t e d t h a t s e v e r a l s t r a i n s o f M e t h a n o c o c c u s , M e t h a n o s p i r i l l u m a n d M e t h a n o b a c t e r i u m c a n p a r t i a l l y o x i d i z e a l c o h o l s ( e t h a n o l , i s o p r o p a n o l a n d i s o b u t a n o l ) i n t o a c e t a t e a n d a c e t o n e ( W i d d e l , 1 9 8 6 ; Z e l l n e r a n d W i n t e r , 1 9 8 7 ) . T h e p r e v a l e n t m e t h a n o g e n s i n a n a e r o b i c w a s t e d i g e s t o r s a r e a c e t a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s w h i c h u s e a c e t a t e a s a n e n e r g y s o u r c e , h y d r o g e n - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s w h i c h u s e 1 1 2 - C 0 2 o r b o t h H z - C O 2 a n d f o r m a t e a s e n e r g y s o u r c e s , a n d m i x e d f u n c t i o n m e t h a n o g e n s , w h i c h u s e H z - C O Z a n d a c e t a t e a s w e l l a s m e t h a n o l a n d m e t h y l a m i n e s . S o m e i m p o r t a n t m e t h a n o g e n s i n a n a e r o b i c d i g e s t o r s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 1 . 1 . M e t h a n o b a c t e r i u m , M e t h a n o c o c c u s , M e t h a n o s p i r i l l u m , M e t h a n o b r e v i b a c t e r , M e t h a n o t h r i x ( M e t h a n o s a e t a ) , a n d M e t h a n o s a r c i n a a r e f r e q u e n t l y f o u n d i n a n a e r o b i c s e w a g e d i g e s t o r s a n d a n a e r o b i c w a s t e w a t e r t r e a t m e n t p l a n t s . U s i n g 1 “ C a s a t r a c e r , i t w a s d e t e r m i n e d t h a t a b o u t 6 0 t o 7 5 % o f m e t h a n e i s p r o d u c e d f r o m a c e t a t e i n a n a e r o b i c d i g e s t o r s ( J e r i s a n d M c C a r t y , 1 9 6 5 ; S m i t h a n d M a h , 1 9 6 6 ; Z e i k u s , 1 9 7 9 ; M a c k i e a n d B r y a n t , 1 9 8 1 ) . A c e t a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s p e r f o r m t h e i m p o r t a n t f u n c t i o n o f c a r b o n a n d e l e c t r o n r e m o v a l ( i . e . t h e y r e m o v e a t l e a s t 5 0 t o 6 0 % o f t h e t o t a l C O D i n d i g e s t o r s ) . H y d r o g e n a n d f o r m a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s a r e a l s o e s s e n t i a l f o r a n a e r o b i c c o n v e r s i o n o f o r g a n i c m a t t e r s i n c e H 2 a n d f o r m a t e a c c u m u l a t i o n w o u l d r e t a r d a n d e v e n t u a l l y s t o p t h e s y n t r o p h i c a c e t o g e n i c r e a c t i o n s . M e t h a n o g e n e s i s o c c u r s o v e r a w i d e t e m p e r a t u r e r a n g e , c a . 0 ° C t o 9 7 ° C ( Z e h n d e r e t a l . , 1 9 8 1 ) . M o s t p u r e c u l t u r e s o f m e t h a n o g e n s i s o l a t e d t o d a t e h a v e b e e n m e s o p h i l i c ( o p t i m u m t e m p e r a t u r e a t 3 7 t o 4 0 ° C ) a l t h o u g h s o m e t h e r m o p h i l i c s t r a i n s h a v e b e e n i s o l a t e d ( o p t i m u m t e m p e r a t u r e a t 5 5 t o 6 0 ° C ) . M e t h a n o g e n s a r e a b l e t o g r o w a t h i g h t e m p e r a t u r e s , u p t o 9 0 t o 9 7 ° C , h a v e a l s o b e e n i s o l a t e d ( S t e t t e r e t a l . , 1 9 8 1 ; L a u e r e r e t a l . , 1 9 8 6 ) . N o p s y c h r o p h i l i c m e t h a n o g e n s h a v e b e e n i s o l a t e d t o d a t e . A l l m e t h a n o g e n s t e s t e d s h o w a m a r k e d p H o p t i m u m s o m e w h e r e b e t w e e n 6 . 0 a n d 8 . 0 ( J a i n e t a l . , 1 9 8 8 ) . M e t h a n o g e n e s i s i s o b s e r v e d t o b e m o s t a c t i v e i n h a b i t a t s w i t h a p H a r o u n d 6 . 8 t o 7 . 2 ( Z e h n d e r e t a l . , 1 9 8 1 ) . 1 0 T a b l e 1 . 1 M e t h a n o g e n i c b a c t e r i a i n a n a e r o b i c e c o s y s t e m s F a m i l y M o r p h o l o g y S u b s t r a t e s O p t . O p t . t e m p . ( ° C ) p H M e t h a n o b a c t e r i a c e a M e t h a n o b a c t e r i u m r o d H Z , f o r m a t e 3 7 7 . 0 f o r m i c i c u m M b . b r y a n t i i r o d H 2 3 8 7 . 0 M b . t h e r m o a u t o t r o p h i c u m r o d H 2 6 5 - 7 0 7 . 2 - 7 . 6 M b . w o l f e i r o d P 1 2 5 5 - 6 5 7 . 0 - 7 . 5 M b . t h e r m o a g g r e g a n s r o d H 2 6 5 7 . 0 - 7 . 5 M b . s m i t h i i r o d 1 1 2 , f o r m a t e 3 8 6 . 9 - 7 . 4 M e t h a n o b r e v i b a c t e r r o d 1 1 2 , f o r m a t e 3 8 7 . 2 r u m i n a n t i u m M b v . a r b o r i p h i l u s r o d H 2 3 0 - 3 7 7 . 5 - 8 . 0 M e t h a n o s p h e r a c o c c u s 1 1 , , m e t h a n o l 3 6 - 4 0 6 . 5 - 6 . 9 s t a d t m a n i a e M e t h n o c o c c a c e a e M e t h a n o c o c c u s c o c c u s 1 1 2 , f o r m a t e 3 6 - 4 0 7 . 0 - 9 . 0 v a n n i e l i i M c . v o l t a e c o c c u s 1 1 2 , f o r m a t e 3 2 - 4 0 6 . 7 - 7 . 4 M c . m a r i p a l u d i s c o c c u s 1 1 2 , f o r m a t e 3 8 6 . 8 - 7 . 2 M c . d e l t a e c o c c u s 1 1 2 , f o r m a t e 3 7 N D M c . t h e r m o l i t h o t r o p h i c u s c o c c u s I 1 2 , f o r m a t e 6 5 6 . 5 - 7 . 5 M c . j a n n a s c h i i c o c c u s H 2 8 5 6 . 0 M e t h a n o m i c r o b i a c e a e M e t h a n o m i c r o b i u m r o d 1 1 2 , f o r m a t e 4 0 6 . 1 - 6 . 9 m o b i l e M m . I i m i c o l a p l a n e s 1 1 2 , f o r m a t e 4 0 7 . 0 M e t h a n o s p i r i l l u m s p i r i l l u m 1 1 2 , f o r m a t e 3 0 - 3 7 6 . 6 - 7 . 4 h u n g a t e i M e t h a n o s a r c i n a c e a e M e t h a n o s a r c i n a s a r c i n a 1 1 2 , m e t h a n o l , 3 5 7 . 0 b a r k e r i m e t h y l a m i n e s , a c e t a t e M s . m a z e i s a r c i n a 1 1 2 , m e t h a n o l , 4 0 6 . 0 - 7 . 0 o r c o c c u s m e t h y l a m i n e s , a c e t a t e M e t h a n o s a e t a fi l a m e n t a c e t a t e 3 5 - 4 0 7 . 1 - 7 . 5 c o n c i l i i M r s . t h e r m o a c e t o p h i l a fi l a m e n t a c e t a t e 6 0 6 . 5 S o u r c e : J o n e s e t a l . ( 1 9 8 7 ) ; P a t e l a n d S p r o t t ( 1 9 9 0 ) . N D : n o t d e t e r m i n e d . 1 1 1 . 2 . 3 S y n t r o p h i c a c e t o g e n e s i s T h e t e r m o f " s y n t r o p h i c a c e t o g e n " i s u s e d t o d e s c r i b e t h o s e a n a e r o b i c b a c t e r i a t h a t o x i d i z e s a t u r a t e d f a t t y a c i d s , e t h a n o l a n d b e n z o a t e a n d p r o d u c e a c e t a t e t o g e t h e r w i t h a h y d r o g e n o r f o r m a t e u t i l i z i n g p a r t n e r ( m e t h a n o g e n s o r s u l f a t e r e d u c e r s ) . T h e s y n t r o p h i c a c e t o g e n s i s o l a t e d t o d a t e c a n b e c o n v e n i e n t l y c l a s s i fi e d a s p r o p i o n a t e d e g r a d e r s , b u t y r a t e d e g r a d e r s , i s o v a l e r a t e d e g r a d e r s a n d b e n z o a t e d e g r a d e r s . T h e s y n t r o p h i c a c e t o g e n i c b a c t e r i a t h a t h a v e b e e n i s o l a t e d t o d a t e a r e l i s t e d i n T a b l e 1 . 2 . i ) P r o p i o n a t e d e g r a d e r s D u r i n g c o m p l e t e d e g r a d a t i o n o f c o m p l e x o r g a n i c m a t e r i a l s u n d e r m e t h a n o g e n i c c o n d i t i o n s , a b o u t 1 5 % o f t h e t o t a l c a r b o n i s d e g r a d e d v i a p r o p i o n a t e a s a n i n t e r m e d i a t e ( G u j e r a n d Z e h n d e r 1 9 8 3 ) . T o d a t e , o n l y t w o d e fi n e d s y n t r o p h i c c u l t u r e s h a v e b e e n i s o l a t e d . O n e i s a c o c u l t u r e c o n s i s t i n g s y n t r o p h i c p r o p i o n a t e d e g r a d e r ( S y n t r o p h o b a c t e r w o l i n i i ) a n d D e s u l f o v i b r i o G 1 1 ( B o o n e a n d B r y a n t , 1 9 8 0 ) . A n o t h e r i s a t h e r m o p h i l i c m e t h a n o g e n i c c o n s o r t i u m T 1 3 , c o n s i s t i n g o f fl u o r e s c e n t m e t h a n o g e n i c r o d s , M e t h a n o s a r c i n a s p . , c o n i c a l t a p e r e d r o d s w i t h c e n t r a l e n d o s p o r e s , a n d fi l a m e n t o u s r o d s w i t h t e r m i n a l e n d o s p o r e s ( M u c h a e t a l . , 1 9 8 8 ) . U s i n g a k i n e t i c a n a l y s i s o f r e s u l t s f r o m a c o n t i n u o u s l y f e d , m i x e d d i g e s t o r , H e y e s a n d H a l l ( 1 9 8 3 ) s u g g e s t e d t h a t t h e r e w e r e a t l e a s t t w o s u b - g r o u p s o f p r o p i o n a t e - u t i l i z i n g o r g a n i s m s : o n e , a s l o w e r g r o w i n g g r o u p w i t h a m a x i m u m s p e c i fi c g r o w t h r a t e ( P m . . . ) o f 0 . 0 0 5 4 h ‘ 1 a n d a h a l f v e l o c i t y c o e f fi c i e n t ( K ) o f 1 1 m g / L , s i m i l a r t o S y n t r o p h o b a c t e r w o l i n i i ( u , m o f 0 . 0 0 4 h " ) a n d a n o t h e r f a s t e r g r o w i n g g r o u p w i t h a u m o f 0 . 0 5 h ' 1 a n d a K , o f 3 3 0 m g / L . T h e s e f a s t g r o w i n g p r o p i o n a t e u t i l i z i n g b a c t e r i a h a v e n o t b e e n i s o l a t e d . . 0 9 9 1 , e ) . 0 l c a ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) 1 2 3 4 4 5 6 7 9 4 8 1 n e r e f e ( ( ( ( ( ( ( ( ( ( ( ( t e ) ) ) ) s s s s n o d d d d d o n n n a e e e e e o o o b t t t t t h . b 7 R r a a a a a b b b r r r r r r r r a u u u u u a a a c t t t c t c t c a a a a a 1 Z 8 9 ; 1 5 8 s s s s s 6 6 8 1 , c c c c c o o o o s d 9 1 a 7 i 9 t t t t i i i i i c l l l l l a 4 4 4 4 y y y y y ( ( ( ( x x x x x y t , 8 8 . 9 4 k 9 1 8 n 1 9 i e s s s s o o o o o e n 1 e l b b b b a b c t d d d d t f r r r r r e e e S . a i i i i a a a , e e r t t a n c c c c t t t n l a a a a a e t a a a a a a a t h . t n a a a r l d e r o t i s p c c c c c o o o o o y y y y t t t t r r r a o o y y y v z z n t r a z e e t t b o n n n n n t t t t t t t o n n u r o o o o o u u s u e e a a a a t S p m b m f m f m f f m b b b b i b i s e w e r i o o W t f r S o d t ) L n n e 8 7 3 a u 2 3 ( o ; 5 g M . 8 n 1 ; 9 i 8 1 2 r t 8 9 a d o t d e t a 1 , 9 h l A 1 a 1 - , ) M t , 9 8 P m 7 ( t e 9 n 1 y . a u o 5 y , 8 r l . R l 9 B o s i a i r e t c l l i ) a 1 r r i e ( , n h a 5 d p . t s y 8 i t o e 8 m r n m o 9 S a 1 e f a h b c i n e d t t n , . n n e I l a u M a c o s u M t M n e o ) ) g s l o p 2 r 0 ( n 1 e e ( l . y H - 0 w . S 8 ) 6 P 9 8 D 7 1 9 ( t e c a c i ; h p o r t n y S 2 . 1 e l b a T . 1 D , 4 . 8 5 t , 9 8 n k 1 9 a y n 1 , i r . h , B l . c a l S d a t n e t d a e n n a e i o n e b t l e o m e i o o h t B S S T ) ) ) ) 1 9 6 4 ( ( ( ( O r g a n i s m s S y n t r o p h i c p a r t n e r T e m p ( ° C ) S y n t r o p h o b a c t e r w o l i n i i S y n t r o p h o m o n a s w o l f e i S y n t r o p h o s p o r a b r y a n t i i S t r a i n N S F - 2 S t r a i n S F - l S y n t r o p h o m o n a s s a p o v a r a n s S t r a i n R o t s e e S O 4 T h e r m o p h i l i c b a c t e r i u m T h e r m o p h i l i c b a c t e r i u m S t r a i n G r a l v a l S y n t r o p h u s b u s w e l l i i S t r a i n B Z — 2 D e s u l f o v i b r i o G 1 1 o r M s p . h u n g a t e i J F I p l u s D . G 1 1 D e s u l f o v i b r i o C l 1 , M s p . h u n g a t e i l F l D e s u l f o v i b r i o E 7 0 , M s p . h u n g a t e i M l h M s p . h u n g a t e i o r D e s u l f o v i b r i o s p . M s p . h u n g a t e i o r D e s u l f o v i b r i o s p . M s p . h u n g a t e i o r D e s u l f o v i b r i o D e s u l f o v i b r i o s p M e t h a n o b a c t e r i u m t h e r m o a u t o t r o p h i c u m M e t h a n o b a c t e r i u m t h e r m o a u t o t r o p h i c u m D e s u l f o v i b r i o E 7 0 D e s u l f o v i b r i o G l l o r D e s u l f o v i b r i o P S - l 3 7 3 5 2 8 3 7 3 7 3 5 3 0 5 5 5 5 3 7 1 2 1 3 i i ) B u t y r a t e d e g r a d e r s . B u t y r a t e i s a n i m p o r t a n t i n t e r m e d i a t e p r o d u c t i n a n a e r o b i c d i g e s t o r s . A l l s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d i n g a c e t o g e n s i s o l a t e d a n d i d e n t i fi e d t o d a t e a r e e i t h e r S y n t r o p h o m o n a s s p . o r S y n t r o p h o s p o r a s p . B u t y r a t e d e g r a d e r s c a n s y n t r o p h i c a l l y m e t a b o l i z e e v e n n u m b e r e d f a t t y a c i d s w i t h u p t o 1 8 c a r b o n a t o m s ( M c I n e m e y e t a l . , 1 9 7 9 b , 1 9 8 1 ; R o y e t a l . , 1 9 8 5 , 1 9 8 6 ; B e a t y e t a l . , 1 9 9 0 ; Z h a o e t a l . , 1 9 9 0 ) a n d g r o w a s m o n o c u l t u r e s o n c r o t o n a t e ( B e a t y a n d M c I n e m e y , 1 9 8 7 ; L o r o w i t z e t a l . , 1 9 8 9 ; Z h a o e t a l . , 1 9 9 0 ) . S y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d e r s a l s o d e g r a d e f a t t y a c i d s w i t h 5 o r m o r e o d d - n u m b e r e d c a r b o n a t o m s . T h e d e g r a d a t i o n p r o d u c t s b y S y n t r o p h o m o n a s w o l f e i a r e c o n s i s t e n t w i t h [ i - o x i d a t i o n ( i . e . e v e n - c a r b o n — n u m b e r e d f a t t y a c i d s a r e c o n v e r t e d i n t o a c e t a t e a n d H g ; o d d - c a r b o n - n u m b e r e d f a t t y a c i d s i n t o a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d H 2 ; l o n g e r b r a n c h e d - c h a i n a c i d ( i s o h e p t a n o a t e ) i n t o a c e t a t e , s h o r t e r b r a n c h e d - c h a i n a c i d ( i s o v a l e r a t e ) a n d H 2 ) , a s i s s h o w n i n T a b l e 1 . 3 . E n z y m e a n a l y s i s i n d i c a t e d t h a t S y n t r o p h o m o n a s w o l f e i c o n t a i n e d h i g h l e v e l s o f B - o x i d a t i o n e n z y m e s ( B e a t y e t a l . , 1 9 8 6 ) . T h e d e g r a d a t i o n o f s a t u r a t e d m o n o c a r b o x y l i c f a t t y a c i d s b y S y n t r o p h o s p o r a b r y a n t i i ( " C l o s t r i d i u m b r y a n t i i " ) a l s o a p p e a r s t o o c c u r v i a fl - o x i d a t i o n , b a s e d o n t h e e n d p r o d u c t s ( S t i e b a n d S c h i n k , 1 9 8 5 ) . B u t y r a t e d e g r a d e r s d o n o t d e g r a d e p r o p i o n a t e o r i s o v a l e r a t e . B u t y r a t e - d e g r a d i n g S y n t r o p h o s p o r a s p . o x i d i z e 2 - m e t h y 1 b u t y r a t e i n t o H 2 , a c e t a t e a n d p r o p i o n a t e ( S t i e b a n d S c h i n k , 1 9 8 5 ; R o y e t a l . , 1 9 8 5 ) b u t d o n o t u t i l i z e i s o b u t y r a t e . + H 3 + 2 ” H H 6 2 + + ‘ 2 O H O + C 4 H 3 + H + ' C 2 O 4 H O 2 C > 3 — + H ' C 0 O 3 2 O H C ) 6 3 — H + C O ‘ 2 Z O H O > — C 4 - 2 + H 0 2 ' C 1 O 2 n 1 O H o C C 2 i t c a 2 2 + H H ' C C e O 2 2 R O H H C C C 2 2 2 . ) H 1 H H C C C 2 2 2 H H H C C C 3 3 3 H H H C C C 8 9 1 ( . l a r e n o y b r a C 8 4 6 s e m e n d I i c a d e r e b m e u e t e t c M m o r f a t a t a d n - a l a d o r y : i y r e n r c A e p t p t v a u a o E C B C N T a b l e 1 . 3 [ i - o x i d a t i o n o f n o r m a l s a t u r a t e d m o n o c a r b o x y l i c f a t t y a c i d s b y S y m r o p h o m o n a s w o l f e i O d d - n u m b e r e d a c i d s V a l e r a t e 5 C H 3 C H 2 C H 2 C I - 1 2 C O O ' + 2 H Z O - — > C H 3 C H 2 C O O ' + C H C O O ’ + 2 + H " H e p t a n o a t e 7 C H 3 C H 2 C H 2 C I - 1 2 C H 2 C H 2 C O O ' + 4 H 2 0 - ) C H 3 C H 2 C O ' + 2 C H 3 C ‘ + 4 H 2 + 2 H + 1 4 1 5 i i i ) I s o v a l e r a t e d e g r a d e r s I s o v e r a l e r a t e , a c o m m o n l y o b s e r v e d b r a n c h e d - f a t t y a c i d f o u n d i n a n a e r o b i c d i g e s t o r s , o r i g i n a t e s p r i m a r i l y f r o m p r o t e i n f e r m e n t a t i o n . O n l y t w o c o c u l t u r e s o f s y n t r o p h i c i s o v a l e r a t e - d e g r a d i n g b a c t e r i a h a v e b e e n i s o l a t e d , s t r a i n G r a I v a l w i t h a D e s u l f o v i b r i o s p . a n d s t r a i n G o I v a l w i t h a D e s u l f o v i b r i o s p . ( S t i e b a n d S c h i n k , 1 9 8 6 ) . I s o v a l e r a t e ( 1 m o l ) i s s y n t r o p h i c a l l y c o n v e r t e d t o a c e t a t e ( 3 m o l ) . i v ) I s o m e r i z a t i o n b e t w e e n b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e . I s o b u t y r a t e i s m a i n l y p r o d u c e d f r o m p r o t e i n f e r m e n t a t i o n ( M c I n e m e y , 1 9 8 8 ) . I s o m e r i z a t i o n b e t w e e n b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e w a s o b s e r v e d d u r i n g b o t h s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d a t i o n ( L o v l e y a n d K l u g , 1 9 8 2 ; G o u r d o n e t a l . , 1 9 8 8 ; L e m a e t a l . , 1 9 8 8 ) a n d i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n u s i n g d i g e s t e d s l u d g e ( Z i n d e r e t a l . 1 9 8 4 a ; L e m a e t a l . , 1 9 8 8 ) . U s i n g n u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e ( N M R ) e x p e r i m e n t s w i t h l 3 C - l a b e l l e d b u t y r a t e , T h o l o z a n e t a l . ( 1 9 8 8 a ) d e m o n s t r a t e d t h a t i s o m e r i z a t i o n b e t w e e n b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e w a s r e v e r s i b l e a n d b u t y r a t e w a s a n i n t e r m e d i a t e o f s y n t r o p h i c i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n . T h e e x p e r i m e n t a l d a t a o f s y n t r o p h i c b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y s l u d g e w e r e f o u n d t o fi t a k i n e t i c m o d e l d e v e l o p e d o n t h i s m e c h a n i s m ( A g u i l a r e t a l . , 1 9 9 0 ) . T o d a t e , i t i s n o t c l e a r w h e t h e r t h e i s o m e r i z a t i o n i s c o u p l e d w i t h s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d a t i o n a n d w h a t c o n t r o l s t h e d i r e c t i o n o f t h e i s o m e r i z a t i o n . I t i s n o t p o s s i b l e t o f u r t h e r i n v e s t i g a t e t h e m e c h a n i s m o f i s o m e r i z a t i o n a n d s y n t r o p h i c i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n u s i n g a n a e r o b i c d i g e s t e d s l u d g e c o n t a i n i n g b o t h s y n t r o p h i c i s o b u t y r a t e d e g r a d e r s a n d s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d e r s w h i c h d o n o t u t i l i z e i s o b u t y r a t e . T o d a t e , n o d e fi n e d s y n t r o p h i c i s o b u t y r a t e - d e g r a d i n g c u l t u r e h a s b e e n i s o l a t e d ( S t i e b a n d S c h i n k , 1 9 8 9 ) . A s p o r e - f o r m i n g r o d , s t r a i n S F - I , r e p o r t e d t o b e s y n t r o p h i c b u t y r a t e - d e g r a d i n g b a c t e r i a t h a t u s e d i s o b u t y r a t e ( S h e l t o n a n d T i e d j e , 1 9 8 4 ) , w a s l a t e r r e p o r t e d n o t t o b e c a p a b l e o f t h i s r e a c t i o n ( S t i e b a n d S c h i n k , 1 9 8 9 ) . I s o l a t i o n 1 6 o f a s y n t r o p h i c i s o b u t y r a t e d e g r a d e r i s n e c e s s a r y t o s t u d y t h e m e t a b o l i s m o f i s o b u t y r a t e . T a b l e 1 . 4 P o s s i b l e r e a c t i o n s d u r i n g s y n t r o p h i c a c e t o g e n e s i s F r e e E n e r g y R e a c t i o n k J / r e a c t i o n 1 . I n t e r s p e c i e s H 2 t r a n s f e r E t O H + H , O — 2 > A c + H + + 2 H , + 9 . 6 P r + 3 1 1 , 0 — - > A c + H + + 3 H , + H C O 3 + 7 6 . 1 B t + 2 1 1 , 0 — - > 2 A c + H + + 2 H , ‘ + 4 8 3 2 . I n t e r s p e c i e s f o r m a t e t r a n s f e r E t O H + 2 H C O 3 — ) A c + H + + 2 H C O O + H 2 0 + 6 . 9 P r + 2 H C O 3 ' — — > A c + H + + 3 H C O O + 7 2 . 4 B r + 2 H C O 3 — > 2 A c + H ” + 2 H C O O 4 4 5 . 6 3 . M e t h a n o e n e s i s 4 H , + H O 3 ' + H " — - > — - > C H 4 + 3 H , O - 1 3 5 . 6 4 H C O O + H , O + H ” — > C H , + 3 H C O 3 - 1 3 0 . 1 4 . S u l f a t e r e d u c t i o n 4 H , + S O 2 + H + — > 4 H , O + H S - 1 5 2 . 2 E t O H : e t h a n o l ; A c : a c e t a t e ; P r : p r o p i o n a t e ; B t : b u t y r a t e . F r e e e n e r g y v a l u e s u n d e r s t a n d a r d c o n d i t i o n s f r o m T h a u e r e t a l . , ( 1 9 7 7 ) V ) I n t e r s p e c i e s e l e c t r o n t r a n s f e r B a s e d o n e n e r g e t i c a n a l y s i s , t h e f r e e e n e r g y a v a i l a b l e f o r a c e t o g e n e s i s f r o m e t h a n o l , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e w i t h e i t h e r h y d r o g e n o r f o r m a t e a s a n i n t e r m e d i a t e i s n o t t h e r m o d y n a m i c a l l y f a v o r a b l e u n d e r s t a n d a r d c o n d i t i o n s ( T a b l e 1 . 4 ) . T h e l e v e l s o f h y d r o g e n a n d f o r m a t e h a v e t o b e m a i n t a i n e d a t l o w l e v e l s ( 1 0 3 t o 1 0 ' 5 a t r n H , ) v i a 1 7 m e t h a n o g e n e s i s o r s u l f a t e r e d u c t i o n d u r i n g a c e t o g e n e s i s t o a l l o w t h e r e a c t i o n t o p r o c e e d . H u n g a t e w a s t h e fi r s t t o e x p r e s s t h e i d e a t h a t h y d r o g e n p r o d u c t i o n a n d u t i l i z a t i o n c a n p r o f o u n d l y i n fl u e n c e t h e c o u r s e o f f e r m e n t a t i o n s i n a n a e r o b i c e c o s y s t e m s ( H u n g a t e , 1 9 6 7 ) . I n f a c t , l o w h y d r o g e n p a r t i a l p r e s s u r e s w e r e o b s e r v e d i n a l l s y n t r o p h i c a c e t o g e n i c c u l t u r e s ( B r y a n t , 1 9 7 9 ; M c I n e m e y a n d B r y a n t , 1 9 8 0 ; B e a t y e t a l . , 1 9 8 6 ) . E x p e r i m e n t s a l s o d e m o n s t r a t e d t h a t p e r t u r b a t i o n w i t h h i g h p a r t i a l p r e s s u r e s o f H 2 i n h i b i t e d s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d a t i o n u n t i l h y d r o g e n w a s c o n s u m e d t o a l o w l e v e l ( A h r i n g e t a l . , 1 9 8 7 b ; D w y e r e t a l . 1 9 8 8 ) . I n a d d i t i o n t o h y d r o g e n , f o r m a t e w a s r e c e n t l y s u g g e s t e d t o b e a n i n t e r m e d i a t e i n s y n t r o p h i c e t h a n o l d e g r a d a t i o n a n d f a t t y a c i d d e g r a d a t i o n ( T h i e l e a n d Z e i k u s , 1 9 8 8 a , 1 9 8 8 b ; O z t u r k e t a l . , 1 9 8 9 ; B o o n e e t a l . , 1 9 8 9 ) . T h e c o n c e p t o f i n t e r s p e c i e s e l e c t r o n t r a n s f e r u s i n g f o r m a t e a s t h e e l e c t r o n c a r r y i n g i n t e r m e d i a t e r e q u i r e s t h a t f o r m a t e b e s y n t h e s i z e d f r o m b i c a r b o n a t e b y s y n t r o p h i c a c e t o g e n s a n d o x i d i z e d b a c k t o b i c a r b o n a t e b y f o r m a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s o r s u l f a t e r e d u c e r s t o m a i n t a i n a l o w f o r m a t e c o n c e n t r a t i o n ( T h i e l e a n d Z e i k u s , 1 9 8 8 a , 1 9 8 8 b ) . T h i s c o n c e p t a p p e a r s t o b e p o s s i b l e i n t h e c a s e w h e r e s y n t r o p h i c a c e t o g e n i c i s o l a t e s a r e a s s o c i a t e d w i t h a h y d r o g e n a n d f o r m a t e - u t i l i z i n g s y n t r o p h i c p a r t n e r s , e i t h e r M e t h a n o b a c t e r i u m s p . , M e t h a n o s p i r i l l u m s p . o r D e s u l f o r v i b r i o s p . ( s e e T a b l e 1 . 2 ) . I n a d d i t i o n , h y d r o g e n p r o d u c t i o n w a s o b s e r v e d w h e n f o r m a t e w a s a d d e d t o a c u l t u r e o f S y n t r o p h o m o n a s w o l f e i s p . , i n d i c a t i n g t h a t t h i s s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d i n g o r g a n i s m a p p e a r e d t o h a v e f o r m a t e d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y ( B o o n e e t a l . , 1 9 8 9 ) . H o w e v e r , t h e r e a r e s o m e e x c e p t i o n s t o t h i s p r o p o s e d s u g g e s t i o n . F o r e x a m p l e , s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d e r s w e r e i s o l a t e d w i t h M e t h a n o b a c t e r i u m t h e r m o a u t o t r o p h i c u m , w h i c h d o e s n o t u t i l i z e f o r m a t e ( H e n s o n a n d S m i t h , 1 9 8 5 ; A h r i n g e t a l . , 1 9 8 7 a ) . I n t h e l a t t e r c a s e , f o r m a t e c a n n o t s e r v e a s a n i n t e r m e d i a t e d u r i n g i n t e r s p e c i e s e l e c t r o n t r a n s f e r . F u r t h e r m o r e , t h e m e c h a n i s m o f 1 8 i n h i b i t i o n o f H 2 h a s n o t b e e n w e l l e x p l a i n e d b y p r e s e n t i n t e r s p e c i e s f o r m a t e t r a n s f e r m o d e l s . A b s o l u t e e v i d e n c e o f f o r m a t e a s a n i n t e r m e d i a t e a n d t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n f o r m a t e a n d h y d r o g e n d u r i n g s y n t r o p h i c a c e t o g e n e s i s r e q u i r e s f u r t h e r e v a l u a t i o n . 1 . 2 . 4 S u l f a t e r e d u c i n g b a c t e r i a S u l f a t e r e d u c i n g b a c t e r i a ( S R B ) a r e q u i t e d i v e r s e , i n t e r m s o f m e t a b o l i c a c t i v i t i e s , m o r p h o t y p e s , t r o p h i c p r o p e r t i e s a n d s u b s t r a t e a f fi n i t i e s . I n t h e p r e s e n c e o f s u l f a t e , a c e t a t e c a n b e o x i d i z e d t o C O 2 b y s o m e p u r e S R B c u l t u r e s ; p r 0 p i o n a t e , b u t y r a t e , a n d o t h e r n o r m a l f a t t y a c i d s c a n b e o x i d i z e d c o m p l e t e l y t o C O 2 o r c o n v e r t e d t o a c e t a t e o r a c e t a t e p l u s p r o p i o n a t e ( i n t h e c a s e o f o d d - n u m b e r e d l o n g c h a i n a c i d s w i t h 5 o r m o r e c a r b o n a t o m s ) ; b r a n c h - f a t t y a c i d s s u c h a s i s o b u t y r a t e , i s o v a l e r a t e a n d 2 - m e t h y l b u t y r a t e c a n a l s o b e o x i d i z e d c o m p l e t e l y t o C O 2 o r t o a c e t a t e ( W i d d e l a n d P f e n n i g , 1 9 8 4 ; W i d d e l , 1 9 8 8 ) . H y d r o g e n a n d f o r m a t e c a n b e u t i l i z e d b y m a n y S R B a s e l e c t r o n d o n o r s f o r s u l f a t e r e d u c t i o n ( W i d d e l , 1 9 8 8 ) . A f e w s t r a i n s o f S R B a l s o u t i l i z e b e n z o a t e a n d p h e n y l c o m p o u n d s a s e l e c t r o n d o n o r s . S o m e S R B a n d t h e s u b s t r a t e s w h i c h t h e y c a n u s e a s e l e c t r o n d o n o r s f o r s u l f a t e r e d u c t i o n a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 1 . 5 . O t h e r t h a n r e d u c e s u l f a t e i n m o n o c u l t u r e , S R B c a n a l s o g r o w i n s y n t r o p h i c a s s o c i a t i o n s i n t h e p r e s e n c e o f s u l f a t e . S R B u t i l i z e H z a n d f o r m a t e a s e l e c t r o n d o n o r s t o r e d u c e s u l f a t e w h e n g r o w n t o g e t h e r w i t h s y n t r o p h i c a c e t o g e n s t h a t d e g r a d e b e n z o a t e ( M o u n t f o r t a n d B r y a n t , 1 9 8 2 ; M o u n t f o r t e t a l . , 1 9 8 4 ) a n d f a t t y a c i d s w i t h 3 o r m o r e c a r b o n s ( B o o n e a n d B r y a n t , 1 9 8 0 ; M c I n e m e y e t a l . , 1 9 8 1 ; S t i e b a n d S c h i n c k , 1 9 8 5 ) . D e g r a d a t i o n o f a c e t a t e a n d m e t h a n o l v i a s u l f a t e r e d u c t i o n w a s a l s o d e m o n s t r a t e d u s i n g a c o c u l t u r e c o n s i s t i n g o f D e s u l f o v i b r i o v u l g a r i s a n d M e t h a n o s a r c i n a b a r k e r i ( P h e l p s e t a l . , 1 9 8 5 ) . M e t h a n o l c a n b e d e g r a d e d t o C O 2 v i a s u l f a t e r e d u c t i o n b y a c o c u l t u r e 1 9 c o n s i s t i n g o f D e s u l f o v i b r i o v u l g a r i s a n d h o m o a c e t o g e n , S p o r o m u s a a c i d o v o r a n s ( C o r d - R u w i s c h a n d O l l i v i e r , 1 9 8 6 ) . I n t h e a b s e n c e o f s u l f a t e , c e r t a i n S R B , s u c h a s D e s u l f o v i b r i o s p . , c a n g r o w t o g e t h e r w i t h 1 1 3 - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s t o c o n v e r t e t h a n o l o r l a c t a t e t o a c e t a t e s y n t r o p h i c a l l y ( B r y a n t e t a l . , 1 9 7 7 ; M c I n e m e y a n d B r y a n t , 1 9 8 1 ; T r a o r e e t a l . , 1 9 8 3 ) . S y n t r o p h i c c o n v e r s i o n o f f o r m a t e t o m e t h a n e w a s a l s o o b s e r v e d i n s y n t r o p h i c a s s o c i a t i o n c o n s i s t i n g a H z - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n , M e t h a n o b a c t e r i u m b r y a n t i i a n d D e s u l f o v i b r i o v u l g a r i s w h i c h c a n s p l i t f o r m a t e t o h y d r o g e n a n d C O 2 ( G u y o t a n d B r a u m a n , 1 9 8 6 ) . I t w a s p r o p o s e d t h a t s y t r o p h i c h y d r o g e n p r o d u c t i o n b y S R B i n a n a s s o c i a t i o n w i t h h y d r o g e n - d e p e n d e n t m e t h a n o g e n s o c c u r r e d i n t h e s e d i m e n t s f r o m L a k e M e n d o t a ( C o n r a d e t a l . , 1 9 8 7 ) . N o m e n t i o n o f S R B c a p a b l e o f s y n t r o p h i c a l l y c a t a b o l i z i n g v o l a t i l e f a t t y a c i d s ( V F A s ) h a s b e e n r e p o r t e d . V F A s s u c h a s p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e , a r e t h o u g h t t o b e c o n v e r t e d o n l y b y s y n t r o p h i c a c e t o g e n s i n c o n c e r t w i t h H z - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s ( B o o n e a n d B r y a n t , 1 9 8 0 ; M c I n e m e y e t a l . , 1 9 7 9 , 1 9 8 1 ; S t i e b a n d S c h i n k , 1 9 8 5 ; W i d d e l , 1 9 8 8 ) . 2 0 T a b l e 1 . 5 R e p r e s e n t a t i v e s u l f a t e r e d u c i n g b a c t e r i a O r g a n i s m O p t i m u m S u b s t r a t e u s e d a s e l e c t r o n d o n o r s t e m p . ( ° C ) D e s u l f o t o m a c u l u m 3 5 a c e t a t e , b u t y r a t e , v a l e r a t e , e t h a n o l , b u t a n o l a c e t o x i d a n s D . s a p o m a n d e n s 3 8 f o r m a t e , a c e t a t e , f a t t y a c i d s ( 4 t o 1 8 c a r b o n s ) e t h a n o l , i s o v a l e r a t e , 3 - m e t h y l b u t y r a t e , b e n z o a t e D . n i g r i fi c a n s 5 5 H 3 , f o r m a t e , l a c t a t e , e t h a n o l , f r u c t o s e D e s u l f o v i b r i o 3 0 3 6 H 3 , f o r m a t e , l a c t a t e , e t h a n o l , f u m a r a t e , m a l a t e v u l g a r i s D . d e s u l fi m ’ c a n s 3 0 3 6 H 3 , f o r m a t e , l a c t a t e , e t h a n o l , f u m a r a t e , m a l a t e D . s a p o v o r a n s 3 4 f a t t y a c i d s ( 4 t o 1 6 c a r b o n ) , 2 - m e t h y l b u t y r a t e , l a c t a t e D . b a a r s i i 3 5 - 3 9 f o r m a t e , a c e t a t e , f a t t y a c i d s ( 3 t o 1 8 c a r b o n ) , i s o v a l e r a t e , 2 - m e t h y l b u t y r a t e , 3 - m e t h y l b u t y r a t e D e s u l f o m o n a s 3 7 H 3 , l a c t a t e , e t h a n o l p i g r a D e s u l f o b u l b u s 2 8 - 3 9 H 3 , p r o p i o n a t e , l a c t a t e , e t h a n o l p r o p i o n i c u s D . e l o n g a t u s 3 5 H 3 , p r o p i o n a t e , l a c t a t e , e t h a n o l D e s u l f o b a c t e r 2 8 - 3 2 a c e t a t e p o s t g a t e i D . h y d r o g e n o p h i l u s 2 8 - 3 2 H 3 , a c e t a t e , e t h a n o l D . l a t u s 2 8 - 3 2 a c e t a t e D . c u r v a t u s 2 8 - 3 0 H 3 , a c e t a t e , e t h a n o l D e s u l f o c o c c u s 3 5 f o r m a t e , a c e t a t e , f a t t y a c i d s ( 3 t o 1 6 c a r b o n ) , m u l t i v o r a n s i s o v a l e r a t e , 2 - m e t h y l b u t y r a t e , 3 - m e t h y l b u t y r a t e l a c t a t e , e t h a n o l , b e n z o a t e , p h e n y l a c e t a t e , p h e n y l p r o p i o n a t e D . n i a c i n i 2 9 H 3 , f o r m a t e , a c e t a t e , f a t t y a c i d s ( 3 t o 1 6 c a r b o n ) , i s o v a l e r a t e , 2 - m e t h y l b u t y r a t e , 3 - m e t h y l b u t y r a t e e t h a n o l , n i c o t i n a t e , s u c c i n a t e , g l u t a r a t e , p i r n e l a t e D e s u l f o s a r c i n a 3 3 H 3 , f o r m a t e , a c e t a t e , f a t t y a c i d s ( 3 t o 1 4 c a r b o n ) , v a r i a b i l i s 2 - m e t h y l b u t y r a t e , 3 - m e t h y l b u t y r a t e , l a c t a t e , e t h a n o l , b e n z o a t e , p h e n y l a c e t a t e , p h e n y l p r o p i o n a t e , f u m a r a t e D e s u l f o b a c t e r i u m 2 0 - 2 6 H 3 , f o r m a t e , a c e t a t e , f a t t y a c i d s ( 3 t o 1 6 c a r b o n ) , a u t o t r o p h i c u m i s o v a l e r a t e , 2 - m e t h y l b u t y r a t e , l a c t a t e , s u c c i n a t e , e t h a n o l , f u m a r a t e D . v a c u o l a t u m 2 5 - 3 0 H 3 , f o r m a t e , a c e t a t e , f a t t y a c i d s ( 3 t o 1 6 c a r b o n ) , i s o v a l e r a t e , 2 - m e t h y l b u t y r a t e , 3 — m e t h y l b u t y r a t e , l a c t a t e , s u c c i n a t e , f u m a r a t e , m a l a t e , e t h a n o l D . p h e n o l i c u m 2 8 f o r m a t e , a c e t a t e , b u t y r a t e , f u m a r a t e , m a l a t e , b e n z o a t e , e t h a n o l , p h e n o l , p - c r e s o l , g l u t a r a t e N o t e : F a t t y a c i d s : m o l o c a r b o x y l i c s a t u r a t e d f a t t y a c i d s . D a t a f r o m W i d d e l ( 1 9 8 8 ) . 2 1 1 . 3 A N A E R O B I C G R A N U L E S 1 . 3 . 1 U p fl o w A n a e r o b i c S l u d g e B l a n k e t ( U A S B ) S y s t e m T h e u p fl o w a n a e r o b i c s l u d g e b l a n k e t ( U A S B ) s y s t e m , d e v e l o p e d b y L e t t i n g a a n d h i s c o w o r k e r s i n 1 9 7 0 ’ s ( L e t t i n g a e t a l . , 1 9 8 0 , 1 9 8 4 ; d e Z e e u w , 1 9 8 8 ) , h a s r e c e i v e d w i d e s p r e a d a c c e p t a n c e a n d b e e n s u c c e s s f u l l y u s e d t o t r e a t i n d u s t r i a l w a s t e w a t e r s . A l t h o u g h t h e r e v e r s e d D o r r O l i v e r C l a r i g e s t e r , u s e d s u c c e s s f u l l y t o t r e a t s e v e r a l i n d u s t r i a l w a s t e s i n 1 9 6 0 ’ s ( H e m e n s e t a l . , 1 9 6 2 ; S t a n d e r e t a l . , 1 9 6 7 ) , c a n b e c o n s i d e r e d t o b e a p r e c u r s o r o f t h e U A S B p r o c e s s a s i t i s n o w e m p l o y e d , t h e fi r s t u p fl o w s l u d g e b l a n k e t c o n c e p t w a s a c t u a l l y u s e d b y W i n s l o w a n d P h e l p s ( 1 9 1 1 ) a n d r e f e r r e d t o a s t h e " b i o l y t i c t a n k " . A t y p i c a l U A S B p l a n t d e s i g n c o n s i s t s o f a b i o l o g i c a l r e a c t i o n z o n e a n d a s e d i m e n t a t i o n z o n e . I n t h e r e a c t i o n z o n e , t h e o r g a n i c c o m p o u n d s i n i n fl u e n t a r e m i n e r a l i z e d t o m e t h a n e a n d C O 2 a s t h e y p a s s t h r o u g h t h e s l u d g e b e d . T h e g a s p r o d u c e d a n d t h e s l u d g e b u o y e d b y e n t r a p p e d o r a t t a c h e d g a s b u b b l e s a r e s e p a r a t e d f r o m l i q u i d e f fl u e n t v i a a g a s - s o l i d - l i q u i d s e p a r a t o r i n s t a l l e d a t t h e t o p o f t h e r e a c t o r . I n w e l l - o p e r a t e d U A S B r e a c t o r s , t h e a n a e r o b i c s l u d g e h a s h i g h s e t t l e a b i l i t y a n d i s o f t e n g r a n u l a r i n n a t u r e . H i g h c o n c e n t r a t i o n s o f b i o m a s s r e t a i n e d i n t h e U A S B s y s t e m a l l o w s t h e p r o c e s s t o a c h i e v e h i g h r e m o v a l e f fi c i e n c i e s a t h i g h v o l u m e t r i c C O D l o a d i n g r a t e s . S e v e r a l m o d i f i c a t i o n s o f t h e c o n v e n t i o n a l U A S B p r o c e s s h a v e b e e n d e v e l o p e d a n d c u r r e n t l y b e i n g m a r k e t e d . O n e s u c h m o d i fi c a t i o n , t h e " c o m b i n e d U A S B - A F p r o c e s s " u t i l i z e s fi l t e r - t y p e p a c k i n g m e d i a a t t h e t o p p a r t o f s e t t l e r s e c t i o n t o p r e v e n t s u s p e n d e d s o l i d s f r o m e s c a p i n g ( L e t t i n g a e t a l . , 1 9 8 1 ; W a n g e t a l . , 1 9 8 5 ) . T h e p a c k e d m e d i a m a t e r i a l c a n b e a l s o i n s t a l l e d a t t h e f r o n t o f t h e g a s - s o l i d - l i q u i d s e p a r a t o r t o e n h a n c e b i o m a s s r e t e n t i o n a n d g r a n u l a t i o n . T h i s m o d i fi c a t i o n l e d t o d e v e l o p m e n t o f t h e " U A S B fi l t e r p r o c e s s " ( G u i o t e t a l . , 1 9 8 5 ; 2 2 G u i o t a n d v a n d e n B e r g , 1 9 8 5 ) o r " h y b r i d a n a e r o b i c r e a c t o r " ( C r a w f o r d a n d T e l e t z k e , 1 9 8 6 ; O l e s z k i e w i c z e t a l . , 1 9 8 6 ) i n w h i c h t h e fi l t e r m e d i a s e r v e s a s t h e s o l e s o l i d - l i q u i d — g a s s e p a r a t i o n d e v i c e . T h e h y b r i d u p fl o w a n a e r o b i c r e a c t o r i s a l s o c o n s i d e r e d t o b e a m o d i fi c a t i o n o f u p fl o w a n a e r o b i c fi l t e r s ( Y o u n g , 1 9 9 0 ; T i l c h e , 1 9 9 0 ) . T h e s e m o d i fi e d p r o c e s s c o n fi g u r a t i o n s h a v e n o t y e t e n j o y e d l a r g e - s c a l e a p p l i c a t i o n a s h a s t h e c o n v e n t i o n a l U A S B p r o c e s s . T o d a t e , o v e r a h u n d r e d f u l l - s c a l e U A S B p l a n t s h a v e b e e n c o m m i s s i o n e d i n t h e N e t h e r l a n d s a n d o t h e r W e s t e r n E u r o p e a n c o u n t r i e s , C a n a d a , t h e U . S . A . , C h i n a , e t c . V a r i o u s f o o d p r o c e s s i n g w a s t e w a t e r s ( s u g a r b e e t , l i q u i d s u g a r , p o t a t o s t a r c h , p o t a t o p r o c e s s i n g , y e a s t , c o f f e e , d a i r y , c o r n s t a r c h , v e g e t a b l e c a n n i n g , s l a u g h t e r h o u s e , s o f t d r i n k i n g , r e n d e r i n g p l a n t , m u s s e l c o n n i n g , fi s h p r o c e s s i n g ) , f e r m e n t a t i o n w a s t e w a t e r s ( d i s t i l l e r y , b r e w e r y , c i t r a t e m a n u f a c t u r e , a c e t o n e - b u t a n o l f e r m e n t a t i o n ) , i n d u s t r i a l w a s t e w a t e r s ( p a p e r m i l l , t e r a p h t h a l a t e p r o d u c t i o n , w o o l w a s h i n g , fi b r e b o a r d m a n u f a c t u r i n g ) , l a n d fi l l l e a c h a t e , a n d s e w a g e h a v e b e e n s u c c e s s f u l l y t r e a t e d a t m e s o p h i l i c t e m p e r a t u r e s ( L e t t i n g a e t a l . , 1 9 8 3 ; 1 9 8 4 ; 1 9 8 5 ; W a n g e t a l . , 1 9 8 5 ; d e Z e e u w , 1 9 8 8 ; H u l s h o f f P o l , 1 9 8 9 ) . T h e r m o p h i l i c t r e a t m e n t o f w a s t e w a t e r u s i n g t h e U A S B r e a c t o r s h a s a l s o b e e n d e m o n s t r a t e d t o b e p o s s i b l e v i a l a b o r a t o r y - s c a l e e x p e r i m e n t s ( W i e g a n t e t a l . , 1 9 8 3 , 1 9 8 5 ; W i e g a n t a n d L e t t i n g a , 1 9 8 5 ) a n d p i l o t - s c a l e t e s t ( L a n t i n g e t a l . , 1 9 8 9 ) . S e l e c t i o n o f a s u i t a b l e i n o c u l u m m a t e r i a l i s e s s e n t i a l t o s u c c e s s f u l l y s t a r t - u p a U A S B r e a c t o r . I n o c u l u m m a t e r i a l s h o u l d p o s s e s s m i c r o o r g a n i s m s t h a t c a n d e g r a d e t h e o r g a n i c c o m p o u n d s i n t h e t a r g e t w a s t e w a t e r , a n d i n d u c e g r a n u l e f o r m a t i o n ( o r d e v e l o p s l u d g e w i t h g o o d - s e t t l i n g p r o p e r t i e s ) . T h e i n o c u l u m c a n b e c l a s s i fi e d a s g r a n u l a r o r n o n - g r a n u l a r s l u d g e . G r a n u l a r s l u d g e f r o m e x i s t i n g U A S B r e a c t o r s i s w i d e l y u s e d a s i n o c u l u m 2 3 m a t e r i a l t o s t a r t - u p n e w U A S B r e a c t o r s , m a i n l y i n W e s t e r n E u r o p e , C a n a d a a n d t h e U . S . A . A s m o r e U A S B r e a c t o r s a r e p u t i n t o o p e r a t i o n , t h e s u r p l u s g r a n u l a r s l u d g e f r o m t h e s e o p e r a t i n g r e a c t o r s c a n b e s t o r e d a n d u s e d t o i n o c u l a t e n e w r e a c t o r s . U t i l i z a t i o n o f g r a n u l a r s l u d g e a s i n o c u l u m h a s t h e a d v a n t a g e o f b e i n g a b l e t o a c h i e v e h i g h C O D r e m o v a l r a t e w i t h i n a s h o r t s t a r t - u p p e r i o d . W h e n g r a n u l a r s l u d g e i s n o t a v a i l a b l e f o r t h e s t a r t - u p o f r e a c t o r s , n o n - g r a n u l a r i n o c u l u m m a t e r i a l s c a n b e u s e d . O v e r t h e l a s t t e n y e a r s , m u c h r e s e a r c h h a s b e e n c o n c e n t r a t e d t o w a r d s u n d e r s t a n d i n g a n d i m p r o v i n g t h e s t a r t - u p o f U A S B r e a c t o r s a n d f o r m a t i o n o f g r a n u l e s f r o m n o n - g r a n u l a r m a t e r i a l s . N o n - g r a n u l a r m a t e r i a l s s u c h a s a n a e r o b i c d i g e s t e d s l u d g e ( H u l s h o f f P o l e t a l . , 1 9 8 2 , 1 9 8 3 ; d e Z e e u w , 1 9 8 4 ; W u , 1 9 8 4 ; W u e t a l . , 1 9 8 5 ; M a n j u n a t h e t a l . , 1 9 8 9 ) , a n d c o w m a n u r e ( W i e g a n t e t a l . , 1 9 8 5 ; W i e g a n t a n d d e M a n , 1 9 8 6 ) h a v e b e e n u s e d a s i n o c u l u m t o s t a r t - u p t h e U A S B r e a c t o r s a n d c u l t i v a t e g r a n u l a r s l u d g e s . I n v e s t i g a t i o n a n d g e n e r a l i z a t i o n o f e m p i r i c a l p r i n c i p l e s f o r c u l t i v a t i o n o f g r a n u l e s f r o m n o n - g r a n u l a r m a t e r i a l s a r e o f i m p o r t a n c e i n a p p l i c a t i o n o f U A S B r e a c t o r s ( a s w e l l a s u p fl o w a n a e r o b i c h y b r i d r e a c t o r s ) . 1 . 3 . 2 G r a n u l a t i o n i n a n a e r o b i c r e a c t o r s T h e f o r m a t i o n o f b i o m a s s w i t h g o o d - s e t t l i n g i s a w i d e s p r e a d p h e n o m e n o n i n t h e U A S B a n d o t h e r a n a e r o b i c r e a c t o r s , a n d i t i s d u e t o t h e f o r m a t i o n o f c o n g l o m e r a t e s b y m i c r o o r g a n i s m s t h e m s e l v e s . T h e s e c o n g l o m e r a t e s c a n b e c l a s s i fi e d a s fl o c s , p e l l e t s , o r g r a n u l e s ( D o l fi n g , 1 9 8 7 ) : . F l o c s a r e c o n g l o m e r a t e s w i t h a l o o s e s t r u c t u r e . A f t e r s e t t l i n g , a l a y e r o f fl o c s f o r m s a m a c r o s c o p i c l a y e r ; . P e l l e t s a r e c o n g l o m e r a t e s w i t h a m o r e d e n s e s t r u c t u r e t h a n fl o c s . A f t e r s e t t l i n g t h e y a r e s t i l l v i s i b l e a s s e p a r a t e e n t i t i e s ; 2 4 - G r a n u l e s a r e d e n s e p e l l e t s ; t h e y h a v e a g r a n u l a r a p p e a r a n c e a n d t h e i r s h a p e s d o n o t r e l y o n t h e p r e s e n c e o f w a t e r . T h e y c a n w i t h s t a n d a c e r t a i n a m o u n t o f p r e s s u r e . A n a e r o b i c g r a n u l e s a r e f o r m e d i n t h e U A S B r e a c t o r a n d o t h e r p l u g fl o w p a t t e r n a n a e r o b i c r e a c t o r s . G r a n u l e s t h a t c o n t a i n m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a a s p r e d o m i n a n t s p e c i e s c a n r e m a i n i n a fi x e d g r a n u l a r s h a p e f o r l o n g p e r i o d s o f t i m e ( s e v e r a l y e a r s ) . G r a n u l e s w e r e a l s o o b s e r v e d f o r m e d i n a n U A S B r e a c t o r a c i d i f y i n g g l u c o s e . T h e g r a n u l e s f o r m e d w e r e a b o u t 1 m m i n d i a m e t e r b u t w e r e u n s t a b l e u n d e r u n f e d c o n d i t i o n s ( Z o e t e m e i j e r e t a l . , 1 9 8 1 ) . G r a n u l e s w e r e a l s o r e p o r t e d f o r m e d i n u p fl o w s l u d g e b l a n k e t d e n i t r i fi c a t i o n r e a c t o r s f e d w i t h m e t h a n o l a s t h e c a r b o n s o u r c e . T h e s e g r a n u l e s c o n t a i n e d c a l c i u m p r e c i p i t a t e s a n d w e r e n o t s t a b l e ( K l a p w i j k e t a l . , 1 9 8 1 ) . T h e y d i s a g g r e g a t e d w h e n m e t h a n o l w a s r e p l a c e d w i t h a n o t h e r c a r b o n s o u r c e s u c h a s e t h a n o l o r g l u c o s e ( V a n d e r H o e k , 1 9 8 8 ) . i ) F e a s i b i l i t y o f g r a n u l a t i o n T o d a t e , g r a n u l a r s l u d g e h a s b e e n d e v e l o p e d f r o m a n u m b e r o f w a s t e w a t e r s u s i n g n o n - g r a n u l a r i n o c u l u m m a t e r i a l s a t m e s o p h i l i c , t h e r m o p h i l i c a n d a m b i e n t t e m p e r a t u r e s . A n a e r o b i c m e t h a n o g e n i c g r a n u l e s h a v e b e e n p r i m a r i l y o b s e r v e d i n t h e U A S B r e a c t o r s t r e a t i n g s u g a r b e e t w a s t e a t m e s o p h i l i c t e m p e r a t u r e s ( H e e r t j e s e t a l . , 1 9 7 8 ; v a n d e r M e e r , 1 9 7 9 ; L e t t i n g a e t a l . , 1 9 8 0 ) . T h e d e v e l o p m e n t o f g r a n u l a r s l u d g e f r o m d i g e s t e d s e w a g e s l u d g e w a s a l s o r e p o r t e d i n m e s o p h i l i c U A S B r e a c t o r s t r e a t i n g o t h e r w a s t e w a t e r s s u c h a s , p o t a t o p r o c e s s i n g w a s t e w a t e r ( L e t t i n g a e t a l . , 1 9 8 0 ) , p a p e r m i l l w a s t e w a t e r ( H a b e r t s e t a l . , 1 9 8 5 ) , b r e w e r y w a s t e w a t e r ( W u e t a l . , 1 9 8 5 ; H u e t a l . , 1 9 8 5 ) , t h e r m o m e c h a n i c a l p u l p i n g e f fl u e n t ( V o u r i r a n t a e t a l . , 1 9 8 5 ) , a l c o h o l d i s t i l l e r y w a s t e w a t e r ( S h e n , 1 9 8 5 ) , s u g a r m a n u f a c t u r e w a s t e w a t e r ( W a n g e t a l . , 1 9 8 5 ) , s l a u g h t e r h o u s e w a s t e w a t e r a n d t e r a p h t h a l a t e p r o d u c t i o n w a s t e w a t e r ( W u , W . - G . , 1 9 8 9 ) , w h e y 2 5 ( C l a r k , 1 9 8 8 ; K i l l i l i a a n d C o l l e r a n , 1 9 8 8 ) , a s u c r o s e s o l u t i o n ( S i e r r a - A l v a r e z e t a l . , 1 9 8 8 ; H a r a d a e t a l . , 1 9 8 8 ) , n i g h t s o i l ( E n d o a n d T o h a y , 1 9 8 5 ) , a n d V F A m i x t u r e s ( H u l s h o f f P o l l e t a l . , 1 9 8 2 , 1 9 8 3 ; d e Z e e u w , 1 9 8 4 ; N a r a d a e t a l . , 1 9 8 8 ) . G r a n u l e s h a v e a l s o b e e n o b t a i n e d u s i n g a c t i v a t e d s l u d g e a s i n o c u l u m i n U A S B r e a c t o r s t r e a t i n g g l u c o s e m o l a s s e s ( W u e t a l . , 1 9 8 7 b ) , c i t r a t e f e r m e n t a t i o n w a s t e w a t e r ( W u e t a l . , 1 9 8 7 b ) a n d a V F A m i x t u r e ( G u y o t e t a l . , 1 9 9 0 ) . T h e f o r m a t i o n o f g r a n u l a r s l u d g e ( g r a n u l a t i o n ) w a s a l s o r e p o r t e d i n t h e r m o p h i l i c l a b - s c a l e p l a n t s i n o c u l a t e d w i t h d i g e s t e d s e w a g e s l u d g e a n d c o w m a n u r e a n d f e d w i t h v i n a s s e ( W i e g a n t e t a l . , 1 9 8 5 ) , a s u g a r s o l u t i o n ( W i e g a n t a n d L e t t i n g a , 1 9 8 5 ) , a c e t a t e a n d a n a c e t a t e - b u t y r a t e m i x t u r e ( W i e g a n t a n d d e M a n , 1 9 8 6 ) . A t a m b i e n t t e m p e r a t u r e s , g r a n u l a t i o n w a s a l s o o b s e r v e d t o o c c u r i n t h e r e a c t o r s t r e a t i n g b r e w e r y w a s t e w a t e r ( J i a n g , Q . , 1 9 8 9 ) a n d s l a u g h t e r h o u s e w a s t e w a t e r ( W u , W . - G . , 1 9 8 9 ) . G r a n u l a r s l u d g e u p t o 3 - 5 m m i n s i z e w a s a l s o o b t a i n e d i n l a b - U A S B r e a c t o r t r e a t i n g s e w a g e w i t h o u t a d d i t i o n o f i n o c u l u m m a t e r i a l ( B a r b o s a a n d S a n t ’ A n n a , 1 9 8 9 ) . I n a d d i t i o n t o U A S B r e a c t o r s , a n a e r o b i c g r a n u l e s h a v e a l s o b e e n o b s e r v e d t o f o r m i n a n a e r o b i c fi l t e r s ( Y o u n g a n d D a h a b , 1 9 8 3 ) , u p fl o w a n a e r o b i c r e a c t o r s c o m b i n i n g a s l u d g e b l a n k e t a n d a fi l t e r ( U B F ) t r e a t i n g s u g a r s o l u t i o n ( G u i o t e t a l . , 1 9 8 5 , 1 9 8 8 ) , u p fl o w a n a e r o b i c h y b r i d r e a c t o r t r e a t i n g t h e r m a l s l u d g e c o n d i t i o n i n g l i q u o r ( K i m a t a e t a l . , 1 9 9 0 ) , s l u d g e b e d a n a e r o b i c b a f fl e d r e a c t o r s t r e a t i n g m o l a s s e s s t i l l a g e e v a p o r a t o r c o n d e n s a t e s ( T i l c h e a n d Y a n g , 1 9 8 8 ) a n d s e w a g e ( O r o z c o , 1 9 8 8 ) , a n d a t t h e t o p a b o v e t h e c a r r i e r m e d i a i n a n a e r o b i c fl u i d i z e d b e d r e a c t o r s f e d w i t h e i t h e r a c e t a t e , p r o p i o n a t e , b u t y r a t e o r a m i x t u r e o f t h e s e a c i d s ( G o n ' i s a n d v a n D e u r s e n , 1 9 8 8 ) a n d f e d w i t h b e e t s u g a r w a s t e w a t e r ( I z a e t a l . , 1 9 8 8 ) . A s u m m a r y o f g r a n u l a t i o n f r o m n o n - g r a n u l a r i n o c u l a w i t h v a r i o u s w a s t e w a t e r s i n U A S B a n d o t h e r u p fl o w - t y p e r e a c t o r s i s p r e s e n t e d i n T a b l e 1 . 6 . " e c n e r e f e R d a ) o d d e - L v 3 e m D i / h g O c k C a ( n o i ) t s a h d l t o u n i n o r a e m r p ( G m u l u c o n I . p m ) C e ° T ( 5 5 7 7 4 5 0 5 5 1 4 3 0 0 0 0 0 0 1 0 0 . . . 1 4 0 . . 2 2 2 0 0 0 0 0 r o u q i s s e e e l l s s s s a e s s e e e u m s g a a r r n E E s o r l l t u u i a n Y Y h e a o o t t n l o r l h m m 6 + + . 1 e l b x x e e h t r e o t o i y a i y y i i e e t t c t e t m t r r m m e s e s e l h h u a a i t t e e l r g o o A A u t t w w i d a a a d c c t n r r a o e e e e g u u u a r s r o t t F F g p d a l l l c c u l r r i e i i p c T V D S V B C B S S C A A G T G G r a n u l a t i o n t e s t u s i n g n o n - g r a n u l a r i n o c u l u m m a t e r i a l s ‘ W a s t e w a t e r R e a c t o r v o l u m e ( m 3 ) 6 . 0 0 . 0 2 0 . 0 4 8 0 . 0 2 6 1 0 0 . 0 3 ( 1 1 ) a ) D S : D i g e s t e d s l u d g e ; A S : A c t i v a t e d s l u d g e ; C M : C o w m a n u r e ; N R : N o t r e p o r t e d ; Y E : y e a s t e x t r a c t . b ) ( 1 ) H u l s h o f f P o l e t a l . ( 1 9 8 3 ) ; ( 2 ) W i e g a n t a n d d e M a n , 1 9 8 6 ; ( 5 ) W u , W . - G . ( 1 9 8 9 ) ; ( 6 ) M a n j u n a t h e t a l . , 1 9 8 9 ; ( 7 ) G u y o t e t a l . , 1 9 9 0 ; ( 8 ) K i m a t a e t a l . , 1 9 9 0 ; ( 9 ) G u , G . - G . ( 1 9 8 6 ) ; ( 1 0 ) W u e t a l . , 1 9 8 5 ; ( l l ) W u e t a l . , 1 9 8 7 b ; ( 1 2 ) J i a n g , Q . ( 1 9 8 9 ) . 2 6 2 7 i i ) P r o c e s s o f g r a n u l a t i o n i n U A S B r e a c t o r s T h e g r a n u l a t i o n p r o g r e s s h a s b e e n i n v e s t i g a t e d u s i n g l a b - s c a l e U A S B r e a c t o r s u n d e r m e s o p h i l i c c o n d i t i o n s ( H u l s h o f f P o l e t a l . , 1 9 8 2 , 1 9 8 3 ; H u l s h o f f P o l , 1 9 8 9 ; d e Z e e u w , 1 9 8 4 ; B r u m m e l e r e t a l . , 1 9 8 5 ; W u , 1 9 8 4 ; W u e t a l . , 1 9 8 5 , 1 9 8 6 ; 1 9 8 7 b ; M a n j u n a t h e t a l . , 1 9 8 9 ) . H u l s h o f f P o l e t a l . ( 1 9 8 2 , 1 9 8 3 ) i n d i c a t e d t h a t w h e n d i g e s t e d s e w a g e s l u d g e w a s u s e d a s i n o c u l u m a n d a V F A m i x t u r e ( a c e t a t e p l u s p r o p i o n a t e ) w a s u s e d a s f e e d , t h r e e d i f f e r e n t p h a s e s c o u l d b e d i s t i n g u i s h e d d u r i n g t h e g r a n u l a t i o n p r o g r e s s . E a c h p h a s e w a s c h a r a c t e r i z e d a c c o r d i n g t o t h e s l u d g e c o n c e n t r a t i o n p r o fi l e s i n r e a c t o r s a n d t h e n a t u r e o f t h e s l u d g e . I n p h a s e I , t h e s l u d g e b e d e x p a n d e d a n d t h e s l u d g e c o n c e n t r a t i o n i n s l u d g e b l a n k e t i n c r e a s e d . D u r i n g p h a s e I I , t h e s l u d g e c o n c e n t r a t i o n i n t h e b l a n k e t c o n t i n u e d t o i n c r e a s e a n d t h e w a s h - o u t o f l i g h t f r a c t i o n o f s l u d g e s t a r t e d ; c o n s e q u e n t l y t h e t o t a l a m o u n t o f t h e s l u d g e i n t h e r e a c t o r d r o p p e d t o t h e m i n i m u m l e v e l . A t t h e s a m e t i m e , g r a n u l e s w e r e g r a d u a l l y f o r m e d i n t h e s l u d g e b e d . I n p h a s e I I I , t h e g r o w t h o f g r a n u l e s e x c e e d e d t h e r a t e o f s l u d g e w a s h - o u t a n d , t h e r e f o r e , t h e t o t a l b i o m a s s i n t h e r e a c t o r i n c r e a s e d a g a i n . D e Z e e u w ( 1 9 8 4 , 1 9 8 8 ) f o u n d t h a t t h e a m o u n t o f s l u d g e t h a t w a s h e d - o u t a n d l e v e l o f s l u d g e r e m a i n i n g i n r e a c t o r d e p e n d e d h e a v i l y o n t h e d e n s i t y o f i n o c u l a t e d s l u d g e ( i . e . h i g h d e n s i t y s l u d g e l e d t o l e s s w a s h - o u t ) . T h e r e s u l t s o n g r a n u l a t i o n , h o w e v e r , w e r e a l l o b t a i n e d u s i n g V F A m i x t u r e s a n d a n a e r o b i c d i g e s t e d s l u d g e f r o m t h e s a m e s o u r c e s . T h e r e f o r e , g e n e r a l p r i n c i p l e s f o r g r a n u l a t i o n c a n n o t b e d r a w n u n t i l e x p e r i m e n t s w i t h o t h e r i n o c u l u m a n d s u b s t r a t e a r e p e r f o r m e d . W i e g a n t a n d d e M a n ( 1 9 8 6 ) d e s c r i b e d g r a n u l a t i o n i n t h e r m O p h i l i c U A S B r e a c t o r s u s i n g a s u g a r s o l u t i o n a n d a c e t a t e a s f e e d a n d w i t h d i g e s t e d s e w a g e s l u d g e o r c o w m a n u r e a s i n o c u l u m . T h e g r a n u l a t i o n p r o c e s s u n d e r t h e r m o p h i l i c t e m p e r a t u r e c o n d i t i o n s i s e s s e n t i a l l y t h e s a m e a s t h a t u n d e r m e s o p h i l i c c o n d i t i o n s ( L e t t i n g a e t a l . , 2 8 1 9 8 5 ; W i e g a n t a n d d e M a n , 1 9 8 6 ) . A d d i t i o n o f a s m a l l a m o u n t o f c r u s h e d g r a n u l e s t o n o n - g r a n u l a r i n o c u l u m c a n s t i m u l a t e t h e g r a n u l a t i o n p r o c e s s ( H u l s h o f f P o l e t a l . , 1 9 8 3 ; H u l s h o f f P o l , 1 9 8 9 ; A l i b h a i a n d F o r s t e r , 1 9 8 6 ) . T h i s i s p r o b a b l y t h e r e s u l t o f s u p p l y i n g m i c r o o r g a n i s m s w h i c h a r e r e s p o n s i b l e f o r g r a n u l a t i o n a n d s u p p l y i n g b i o - n u c l e i s i t e s f o r b a c t e r i a l a t t a c h e d g r o w t h . R e s u l t s o f a d d i n g i n e r t m a t e r i a l s t o t h e i n o c u l u m s l u d g e i n o r d e r t o e n h a n c e g r a n u l a t i o n h a v e n o t p r o d u c e d c l e a r c o n c l u s i o n s . N o d i f f e r e n c e w a s f o u n d f o r g r a n u l a t i o n u n d e r t h e r m o p h i l i c c o n d i t i o n s w i t h o r w i t h o u t t h e a d d i t i o n o f s a n d ( 5 0 - 1 0 0 p m ) a l o n g w i t h t h e i n o c u l a t e d d i g e s t e d s l u d g e , a l t h o u g h t h e g r a n u l e s f o r m e d i n t h e f o r m e r c a s e h a d s a n d p a r t i c l e s w i t h i n t h e m . B y c o n t r a s t , a d d i t i o n o f h y d r o a n t h r a c i t e p a r t i c l e s ( 1 0 0 p m i n s i z e ) s i g n i fi c a n t l y r e d u c e d t h e t i m e n e e d e d f o r g r a n u l a t i o n u n d e r m e s o p h i l i c c o n d i t i o n s ( H u l s h o f f P o l , 1 9 8 9 ) . 1 . 3 . 3 C h a r a c t e r i s t i c s o f g r a n u l e s . C h a r a c t e r i z a t i o n o f a n a e r o b i c g r a n u l e s h a s b e e n p e r f o r m e d b y s e v e r a l r e s e a r c h e r s , b a s e d o n a s p e c t s o f p h y s i c a l - c h e m i c a l p r o p e r t i e s , g r a n u l e t y p e , m e t a b o l i c a c t i v i t y a n d m i c r o b i a l c o m p o s i t i o n . i ) P h y s i c a l a n d c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s T h e s p e c i fi c g r a v i t y o f a n a e r o b i c d i g e s t i o n g r a n u l e s f r o m U A S B r e a c t o r s w e r e e s t i m a t e d t o b e g e n e r a l l y i n a r a n g e b e t w e e n 1 . 0 0 t o 1 . 0 9 ( V a n d e r M e e r , 1 9 7 9 ; D o l fi n g e t a l . , 1 9 8 5 ; W u , 1 9 8 4 ; W u e t a l . , 1 9 8 5 ; H u l s h o f f P o l , 1 9 8 9 ) . T h e s i z e o f g r a n u l e s v a r i e s f r o m 0 . 1 t o 8 m m i n d i a m e t e r . T h e g r a n u l e s i z e d i s t r i b u t i o n a l s o d e p e n d s o n t h e m i c r o b i a l p o p u l a t i o n , f e e d c o m p o s i t i o n a n d b i o g a s fl u x r a t e i n r e a c t o r s . G r a n u l e s c o n t a i n i n g m o r e fi l a m e n t o u s M e t h a n o t h r i x t e n d t o g r o w t o a l a r g e r s i z e t h a n t h o s e g r a n u l e s c o n t a i n i n g m a i n l y r o d - t y p e M e t h a n o t h r i x ( H u l s h o f f P o l e t a l . , 1 9 8 3 ) . 2 9 M o r e c a r b o h y d r a t e s i n t h e f e e d s t i m u l a t e t h e f o r m a t i o n o f l a r g e - s i z e d b u t l o w e r - d e n s i t y g r a n u l e s ( S i e r r a - A l v a r e z e t a l . , 1 9 8 8 ) . T h e m i n e r a l c o m p o s i t i o n o f g r a n u l e s v a r i e s w i d e l y ; t h e a s h c o n t e n t s i n g r a n u l e s v a r y a c c o r d i n g t h e m i n e r a l c o m p o s i t i o n i n f e e d s . G e n e r a l l y , i n l a b - s c a l e U A S B r e a c t o r e x p e r i m e n t s w i t h s y n t h e t i c f e e d ( s u c h a s g l u c o s e s o l u t i o n s , V F A m i x t u r e s ) , t h e a s h c o n t e n t o f t h e s l u d g e b e d c a n b e a s l o w a s 1 2 % ( T h i e l e e t a l . , 1 9 9 0 ) t o 1 5 t o 1 6 % ( W u , 1 9 8 4 ; W u e t a l . , 1 9 8 5 ) . T h i s i s b e c a u s e t h e s e s y n t h e t i c f e e d s c o n t a i n e d l o w c o n c e n t r a t i o n s o f c a l c i u m a n d i r o n s a l t s . W h e n t h e f e e d c o n t a i n s m o r e i n o r g a n i c m a t t e r , t h e a s h c o n t e n t w i l l b e h i g h e r . G r a n u l e s i n a l a b o r a t o r y - s c a l e r e a c t o r f e d w i t h a l a c t a t e s o l u t i o n c o n t a i n i n g r e l a t i v e l y h i g h s a l t c o n c e n t r a t i o n s h a d a s h c o n t e n t s a s h i g h a s 4 1 . 5 % ( S w i t z e n b a u m a n d E i m s t a d , 1 9 8 7 ) . G r a n u l e s f r o m r e a c t o r s t r e a t i n g i n d u s t r i a l w a s t e w a t e r s g e n e r a l l y h a v e h i g h e r a s h c o n t e n t s , v a r y i n g f r o m 1 9 % t o 4 6 % ( A l i b h a i a n d F o r s t e r , 1 9 8 6 ) . T h e h i g h e r a s h l e v e l s a r e d u e p r i n c i p a l l y t o t h e p r e s e n c e o f h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f c a l c i u m a n d / o r i r o n s a l t s i n t h e w a s t e w a t e r s o r m o r e s u s p e n d e d s o l i d s i n t h e f e e d . F o r e x a m p l e , i n t h e g r a n u l e s d e v e l o p e d o n c i t r a t e f e r m e n t a t i o n w a s t e w a t e r , w h i c h c o n t a i n e d s o l u b l e c a l c i u m s a l t a t a c o n c e n t r a t i o n o f a b o u t 8 0 0 m g / L , a s h c o n t e n t s w e r e a s h i g h a s 2 6 % ( W u e t a l . , 1 9 8 7 ) . D u b o u r g u i e r e t a l . ( 1 9 8 8 a ) r e p o r t e d t h a t t h e s l u d g e f r o m l o w e r p a r t o f a n U A S B r e a c t o r c o n t a i n e d h i g h e r a s h l e v e l s t h a n t h a t f r o m t h e u p p e r p a r t o f t h e b e d . R e s e a r c h o n t h e c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e a s h c o n t e n t a n d t h e g r a n u l e s t r e n g t h d i d n o t y i e l d p o s i t i v e r e s u l t s ( H u l s h o f f P o l , 1 9 8 9 ) , s u g g e s t i n g t h a t t h e s t r e n g t h o f g r a n u l e s p r o b a b l y r e l i e s u p o n o t h e r f a c t o r s . C h e m i c a l p r e c i p i t a t e s m a y , h o w e v e r , b e i m p o r t a n t i n t h e g r a n u l a t i o n p r o c e s s . L e t t i n g a e t a l . ( 1 9 8 5 ) p o i n t e d o u t t h a t g r a n u l a t i o n w a s e n h a n c e d b y s u p p l y i n g c a r r i e r m a t e r i a l s s u c h a s a n t h r a c i t e o r g r a v e l a n d t h a t m i n e r a l p r e c i p i t a t e s o r c r y s t a l s i n s i d e t h e g r a n u l e s s e r v e d a s c a r r i e r s o r n u c l e i s i t e s t h a t h e l p e d i n i t i a t e g r a n u l a t i o n . e c n e r e f e R d a o l c d i r - r o 3 t t m e c / m a e D u l ; 6 8 9 1 ; , 0 n 8 a 9 1 M ; , d 5 . n l 8 a 9 a t t 1 e n , e l a . t g a t e t r a O C i e P o f W V o g ) d D - e O t S a S C r V c l g fi a / i v D c o 3 ) u ( 6 W ( ; ) 4 ; 9 8 ( 8 8 9 9 ; 1 1 0 , 9 . , 9 l . a l 1 . a 8 t 8 , e 9 t . e l a 1 a t , a g d e . O l e m p e C S g r . p m e C T ° n a a i r a t a t t t a H e e m t L ) i o 5 ) K ( i 2 u ( ) ; G 8 8 ( ; 8 ) 3 9 l 7 9 9 9 ; 3 2 2 2 - - - - 4 7 7 7 5 5 5 3 3 3 3 2 2 2 8 l 1 5 9 ( 1 , 8 9 . ; , l 1 0 . a l , 9 a t . 9 r l e 1 t a o u z , e s t q e . i r e l l l e l l s o o a a r a v t s n P e e g a e m l e a e r r h A r n r l f l u u e i e o u t - e f 7 t t h n t o l m a e m o h e x r . t + x x y m 1 e i s e i e e e r i e t o g o o o o t a a d l s r d c a t t A r r r - - w H S B b a c u u c c c t e e A A e n ) 0 o ) ) ) F a e u l l u u u F F r o c c c 1 4 7 1 i i t r e e l h e u o t t s s s s e m s m i r m e u i T T V Y S S S ( ( ( ( P V B S S A A G V S p e c i fi c C O D r e m o v a l r a t e s o f a n a e r o b i c g r a n u l e s S u b s t r a t e s o u r c e S u g a r b e e t 6 ! ‘ 7 ' ' 1 0 ) ” ‘ i ‘ H H I — l h v — O N N v — O \ O . \ O ( 1 1 ) ( 1 1 ) 3 0 3 1 i i ) M e t a b o l i c a c t i v i t y M e t a b o l i c a c t i v i t i e s o f g r a n u l e s c a n b e e x p r e s s e d i n t e r m s o f s p e c i fi c m e t h a n o g e n i c a c t i v i t y , s p e c i fi c C O D r e m o v a l r a t e a n d s p e c i fi c s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e , d e p e n d i n g o n t h e o b j e c t i v e s o f t h e a s s a y . C O D r e m o v a l r a t e c a n b e d e t e r m i n e d d i r e c t l y b y C O D m e a s u r e m e n t s o r i n d i r e c t l y b y m e t h a n e p r o d u c t i o n ( 0 . 3 5 L ( S T P ) m e t h a n e p e r g C O D ) . T o d a t e , m o s t r e s e a r c h e r s h a v e u s e d t h e s e a s s a y s t o c h a r a c t e r i z e t h e a c t i v i t y o f g r a n u l e s ( L e t t i n g a e t a l . , 1 9 8 0 , 1 9 8 4 , 1 9 8 5 ; H u l s h o f f P o l e t a l . , 1 9 8 3 ; d e Z e e u w 1 9 8 4 ; D o l fi n g a n d B l o m e n , 1 9 8 5 ; H a r a d a e t a l . , 1 9 8 8 ) . A t m e s o p h i l i c c o n d i t i o n s , t h e a c t i v i t y o f g r a n u l e s c a n b e a s h i g h a s 7 t o 8 g C O D / g V S S - d a y f o r g r a n u l e s d e v e l o p e d o n V F A m i x t u r e s ( T h i e l e e t a l . , 1 9 9 0 ) . G r a n u l e s f r o m f u l l - s c a l e U A S B r e a c t o r s t r e a t i n g c o m p l e x w a s t e w a t e r s u s u a l l y p o s s e s s a c t i v i t i e s r a n g i n g f r o m 0 . 5 t o 1 . 0 g C O D / g V S S - d . A c o m p a r i s o n o f r e p o r t e d a c t i v i t i e s o f g r a n u l e s f r o m d i f f e r e n t w a s t e s i n t e r m s o f s p e c i fi c C O D r e m o v a l r a t e i s p r o v i d e d i n T a b l e 1 . 7 . M e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e a n d C O D r e m o v a l r a t e , h o w e v e r , d o n o t d e s c r i b e t h e a c t i v i t y o f i n d i v i d u a l m i c r o b i a l t r o p h i c ( s u b - t r o p h i c ) g r o u p s i n a n a e r o b i c s l u d g e . T h e r e f o r e , f o r i n v e s t i g a t i o n o f b i o d e g r a d a b i l i t y a n d t o x i c i t y o f w a s t e w a t e r , a p p l i c a t i o n o f s p e c i fi c s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e r a t h e r t h a n C O D r e m o v a l r a t e i s r e c o m m e n d e d ( W u e t a l . , 1 9 8 9 ) . i i i ) T y p e o f g r a n u l e s D e p e n d i n g o n t h e p r e d o m i n a n t a c e t a t e u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s o b s e r v e d , a n a e r o b i c g r a n u l e s d e v e l o p e d o n V F A m i x t u r e s ( a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e ) u n d e r m e s o p h i l i c t e m p e r a t u r e c o n d i t i o n s h a v e b e e n c l a s s i fi e d i n t o t h r e e t y p e s ( H u l s h o f f P o l e t a l . , 1 9 8 3 ; L e t t i n g a e t a l . , 1 9 8 4 ; d e Z e e u w 1 9 8 4 , 1 9 8 8 ) , i . e . : - " R o d - t y p e " g r a n u l e s , w h i c h a r e m a i n l y c o m p o s e d o f r o d - s h a p e d b a c t e r i a r e s e m b l i n g M e t h a n o t h r i x s p . i n f r a g m e n t s o f a b o u t 4 t o 6 c e l l s . T h i s t y p e o f 3 2 g r a n u l e o r i g i n a t e d f r o m f u l l - s c a l e p l a n t s t r e a t i n g p o t a t o - p r o c e s s i n g w a s t e a n d s u g a r - b e e t w a s t e s , a n d d e v e l o p e d i n a l a b - s c a l e r e a c t o r s t a r t e d u s i n g a s m a l l a m o u n t o f c r u s h e d g r a n u l e s a n d d i g e s t e d s e w a g e s l u d g e . T h e s e g r a n u l e s a r e c o m p a c t a n d s p h e r i c a l ; - " F i l a m e n t - t y p e " g r a n u l e s , w h i c h c o n s i s t p r e d o m i n a n t l y o f l o n g m u l t i c e l l u l a r r o d - s h a p e d b a c t e r i a . T h e s e g r a n u l e s w e r e d e v e l o p e d o n V F A s u b s t r a t e s u s i n g a d i g e s t e d s e w a g e s l u d g e a s i n o c u l u m . T h e p r e v a i l i n g b a c t e r i a r e s e m b l e d t h e M e t h a n o t h r i x s o e h n g e n i i w h i c h g r o w s a s l o n g fi l a m e n t s . T h e s e g r a n u l e s a p p e a r e d t o b e l e s s d e n s e ; o " S a r c i n a t y p e " g r a n u l e s , w h i c h w e r e d e v e l o p e d i n t h e p r e s e n c e o f a h i g h c o n c e n t r a t i o n o f a c e t i c a c i d i n a r e a c t o r . T h e p r e v a i l i n g b a c t e r i a w e r e M e t h a n o s a r c i n a - l i k e c e l l s . T h e s e g r a n u l e s h a v e a c o m p a c t s p h e r i c a l s h a p e . T o d a t e , t h e r e a s o n w h y r o d - t y p e o r fi l a m e n t - t y p e g r a n u l e s a r e f o r m e d r e m a i n s a q u e s t i o n ( H u l s h o f f P o l e t a l . , 1 9 8 3 ; d e Z e e u w , 1 9 8 8 ) a l t h o u g h s e v e r a l h y p o t h e s i s w e r e p r e s e n t e d ( W i e g a n t , 1 9 8 8 ; C o l l e r a n , 1 9 8 8 ) . T h e o r i g i n a l i n o c u l a ( d i g e s t e d s e w a g e s l u d g e s ) o f r o d - t y p e a n d fi l a m e n t - t y p e g r a n u l e s w e r e f r o m t w o d i f f e r e n t s o u r c e s ( L e t t i n g a a n d H u l s h o f f P o l , 1 9 9 0 ) . T h r e e m e s o p h i l i c s t r a i n s o f M e t h a n o t h r i x h a v e b e e n i d e n t i fi e d t o b e M e t h a n o t h r i x s o e h n g e n i i w h i c h g r o w a s l o n g fi l a m e n t s ( T o u z e l e t a l . , 1 9 8 8 ; K a m a g a t a a n d M i k a r n i , 1 9 9 0 ) . T h e r o d - t y p e M e t h a n o t h r i x s p . h a s n o t b e e n t h o r o u g h l y i n v e s t i g a t e d . I n U A S B r e a c t o r s f e d w i t h c o m p l e x o r g a n i c w a s t e w a t e r s , t h e g r a n u l e s f o r m e d a r e n o t r e p o r t e d t o b e d i s t i n c t l y i d e n t i fi e d i n t o t h e t h r e e t y p e s m e n t i o n e d a b o v e , e x c e p t f o r t h e r o d - t y p e g r a n u l e s d e v e l o p e d o n p o t a t o - p r o c e s s i n g a n d s u g a r — b e e t w a s t e w a t e r s , r e s p e c t i v e l y ( L e t t i n g a e t a l . , 1 9 8 5 ) . 3 3 i v ) M i c r o b i a l c o m p o s i t i o n o f g r a n u l e s D i r e c t c o u n t o f c e l l s u s i n g m i c r o s c o p y i n d i c a t e s t h a t g r a n u l a r s l u d g e s c o n t a i n c e l l c o u n t s b e t w e e n 1 x 1 0 1 2 a n d 4 x 1 0 1 2 c e l l s p e r g V S S ( D u b o u r g u i e r e t a l . , 1 9 8 8 a , 1 9 8 8 c ) . G r a n u l a r s l u d g e s , d e v e l o p e d e i t h e r o n c o m p l e x s u b s t r a t e s o r V F A m i x t u r e s , h a v e b e e n o b s e r v e d t o c o n t a i n a l l t h e m i c r o b i a l t r o p h i c g r o u p s t y p i c a l l y f o u n d i n a n a e r o b i c d i g e s t o r s , i . e . h y d r o l y t i c - f e r m e n t a t i v e , s y n t r o p h i c a c e t o g e n i c , a n d m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a a s w e l l a s s u l f a t e r e d u c i n g b a c t e r i a . M e t h a n o g e n s , p a r t i c u l a r l y a c e t a t e u t i l i z e r s , w e r e f o u n d t o b e t h e m a j o r m i c r o o r g a n i s m s i n a l l t h e g r a n u l e s e x a m i n e d . T h e m o s t p r o b a b l e n u m b e r s ( M P N ) o f d i f f e r e n t t r o p h i c g r o u p s i n t h e g r a n u l e s t r e a t i n g s t a r c h i n d u s t r y w a s t e w a t e r w e r e r e p o r t e d t h a t t h e p o p u l a t i o n o f d i f f e r e n t t r O p h i c g r o u p s ( c e l l s / m L ) w e r e g l u c o s e a n d l a c t o s e u t i l i z e r s o f 1 0 9 , H 3 - C 0 3 - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s o f 1 0 9 , a c e t a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s o f 1 0 9 , e t h a n o l u t i l i z i n g s y n t r o p h s 1 0 3 t o 1 0 9 , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e u t i l i z i n g s y n t r o p h s o f 1 0 8 , S R B u t i l i z i n g l a c t a t e o f 1 0 8 t o 1 0 9 , S R B u t i l i z i n g e t h a n o l o f 1 0 7 , S R B p r o p i o n a t e - u t i l i z i n g o f 1 0 7 a n d S R B b u t y r a t e - u t i l i z i n g o f 1 0 7 ( D u b o u r g u i e r e t a l . , 1 9 8 8 a ) . D o l f m g e t a l . ( 1 9 8 5 ) o b t a i n e d 1 0 1 0 c e l l s / m L o f s u c r o s e d e g r a d e r s , 1 0 9 o f h y d r o g e n u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s , 1 0 8 o f a c e t a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s , 1 0 7 o f s y n t r o p h i c p r o p i o n a t e o r b u t y r a t e u t i l i z e r s i n t h e g r a n u l e s t r e a t i n g l i q u i d s u g a r w a s t e w a t e r . S c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( S E M ) a n d t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( T E M ) h a v e a l s o b e e n u s e d t o s t u d y t h e m i c r o b i a l c o m p o s i t i o n a n d s t r u c t u r e o f g r a n u l e s . M e t h a n o t h r i x s p . , w h i c h i s e a s y t o i d e n t i f y b a s e d o n t h e i r b a m b o o — s h a p e , i s n o r m a l l y t h e p r e d o m i n a n t o r g a n i s m o b s e r v e d ( D o l fi n g e t a l . , 1 9 8 5 ; D o l fi n g , 1 9 8 7 ; H u l s h o f f P o l e t a l . , 1 9 8 3 ; H u l s h o f f P o l , 1 9 8 9 ; L e t t i n g a e t a l . , 1 9 8 4 , 1 9 8 5 ; W u e t a l . , 1 9 8 5 , 1 9 8 7 ; W i e g a n t a n d d e M a n , 1 9 8 6 ; K i m a t a e t a l . , 1 9 9 0 ) . M e t h a n o b a c t e r i u m s p . a n d M e t h a n o b r e v i b a c t e r s p . c a n b e i d e n t i fi e d b y t h e i r a u t o fl u o r e s c e n c e u n d e r 3 4 fl u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y o r b y T E M b a s e d o n t h e i r m o r p h o t y p e s . R o d m o r p h o t y p e M e t h a n o b a c t e r i u m o r M e t h a n o b r e v i b a c t e r - l i k e b a c t e r i a r a t h e r t h a n M e t h a n o s p i r i l l u m - l i k e b a c t e r i a w e r e f o u n d , i n g r a n u l e s f r o m d i f f e r e n t s o u r c e s , t o b e t h e m a j o r h y d r o g e n u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s ( D u b o u r g u i e r e t a l . , 1 9 8 8 b ; W u e t a l . , 1 9 8 5 ) . U s i n g S E M a n d T E M p r e s u m p t i v e i d e n t i fi c a t i o n a n d i m m u n o l o g i c a l p r o b e s , D u b o u r g u i e r e t a l . ( 1 9 8 8 a , 1 9 8 8 b ) a n d P r e n s i e r e t a l . ( 1 9 8 8 ) r e p o r t e d t h a t M e t h a n o b r e v i b a c t e r s p . w e r e t h e m a i n 1 1 3 - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s i n g r a n u l e s t r e a t i n g s u g a r b e e t w a s t e . I m m u n o l o g i c a l t e c h n i q u e s h a v e a l s o b e e n u s e d t o c h a r a c t e r i z e m e t h a n o g e n i c s p e c i e s i n g r a n u l e s ( K o o m n e e f e t a l . , 1 9 9 0 ) . U s i n g a n t i b o d y p r o b e s a n d a n t i g e n i c fi n g e r p r i n t i n g m e t h o d s , m e t h a n o g e n s a n t i g e n i c a l l y r e l a t e d t o M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n M F , M e t h a n o b r e v i b a c t e r a r b o r i p h i l i c u s s t r a i n A Z , a n d M e t h a n o t h r i x s o e h n g e n i i s t r a i n O p fi k o n w e r e f o u n d i n a l l g r a n u l e s f r o m fi v e U A S B r e a c t o r s m a i n t a i n e d o n d i f f e r e n t s u b s t r a t e s . T h e o t h e r m e t h a n o g e n s f o u n d w e r e a n t i g e n i c a l l y r e l a t e d t o : M e t h a n o s p i r i l l u m h u n g a t e i I F 1 a n d M e t h a n o b r e v i b a c t e r s m i t h i i A L I i n f o u r o f t h e g r a n u l e s ; M e t h a n o b a c t e r i u m b r y a n t i i M o H i n t h r e e ; M e t h a n o b r e v i b a c t e r a r b o r i p h i l u s D H l i n t w o ; M e t h a n o b r e v i b a c t e r r u m i n a n t i u m M 1 , M e t h a n o g e n i u m m a r i s n i g r i R 1 a n d M e t h a n o s a r c i n a t h e r m o p h i l a T M l i n o n e e a c h . A t r e n d w a s o b s e r v e d t o w a r d s a w i d e r d i v e r s i t y o f m e t h a n o g e n i c s u b p o p u l a t i o n s p a r a l l e l l i n g w i t h a n i n c r e a s e i n t h e c o m p l e x i t y o f s u b s t r a t e . M i c r o c o l o n i e s w e r e f o u n d i n g r a n u l a r s l u d g e s t r e a t i n g s t a r c h w a s t e w a t e r ( D u b o u r g u i e r e t a l . , 1 9 8 8 a , 1 9 8 8 c ) . S y n t r o p h o b a c t e r s p . a n d S y n t r o p h o m o n a s s p . w e r e i d e n t i fi e d a s t h e p r o p i o n a t e d e g r a d e r a n d t h e b u t y r a t e d e g r a d e r i n t h e s e g r a n u l e s , r e s p e c t i v e l y . T h e s e t w o s y n t r o p h s w e r e a s s o c i a t e d w i t h M e t h a n o b r e v i b a c t e r a r b o r i p h i l i c u s a s m i c r o c o l o n i e s i n s i d e t h e g r a n u l e s a n d t h e d i s t a n c e s b e t w e e n s y n t r o p h s 3 5 a n d t h e m e t h a n o g e n s w e r e v e r y s h o r t . I n t h e s e m i c r o c o l o n i e s , t h e r a t i o b e t w e e n m e t h a n o g e n s a n d s y n t r o p h s w a s 2 . 3 3 t o 2 . 4 6 f o r S y n t r o p h o b a c t e r a n d 0 . 4 8 t o 0 . 7 1 f o r S y n t r o p h o m o n a s . I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f p r e d o m i n a n t b a c t e r i a i n t h e g r a n u l e s i s p e r h a p s t h e b e s t t e c h n i q u e t o a i d i n u n d e r s t a n d i n g t h e e c o p h y s i o l o g y a n d t h e i n t e r a c t i o n a m o n g t h e d i f f e r e n t t r o p h i c g r o u p s , a s w e l l a s t h e c o n t r i b u t i o n o f i n d i v i d u a l o r g a n i s m i n t h e g r a n u l a t i o n p r o c e s s . N o v a e s e t a l . ( 1 9 8 8 ) r e p o r t e d t h a t t h r e e a c e t o g e n s , B u t y r i v i b r i o fi b r i s o l v e n s , C l o s t r i d i u m s p . a n d D e s u l f o v i b r i o d e s u l fi t r i c a n s , a n d t w o m e t h a n o g e n s , a h y d r o g e n - u t i l i z i n g M e t h a n o b a c t e r i u m s p . a n d fi l a m e n t - f o r m i n g M e t h a n o t h r i x s p . w e r e i s o l a t e d f r o m t h e g r a n u l e s t r e a t i n g s e w a g e . 1 . 3 . 4 M e c h a n i s m o f g r a n u l e f o r m a t i o n T o d a t e , t h e f o r m a t i o n o f t h e g r a n u l e s f r o m n o n - g r a n u l a r m a t e r i a l s a n d t h e g r o w t h o f t h e g r a n u l e s a r e s t i l l n o t w e l l u n d e r s t o o d a t t h e m i c r o b i a l l e v e l . H o w e v e r , s e v e r a l h y p o t h e t i c a l r e a s o n s f o r g r a n u l a t i o n h a v e b e e n d i s c u s s e d a n d s u m m a r i z e d a s f o l l o w s . i ) T h e a g g l u t i n a t i o n o f M e t h a n o t h r i x B a s e d o n d i r e c t m i c r o s c o p i c a n d S E M e x a m i n a t i o n , M e t h a n o t h r i x a r e t h e p r e d o m i n a n t b a c t e r i a i n g r a n u l e s f r o m v a r i o u s s o u r c e s . T h i s o r g a n i s m f o r m s a n e t w o r k i n t h e g r a n u l e s w h i c h m a y p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e s t a b i l i z a t i o n o f t h e g r a n u l a r s t r u c t u r e ( W i e g a n t a n d d e M a n , 1 9 8 6 ; W i e g a n t , 1 9 8 8 ; D u b o u r g u i e r e t a l . , 1 9 8 8 a , 1 9 8 8 c ) . I n t h e f o r m a t i o n o f g r a n u l e s f r o m n o n - g r a n u l a r m a t e r i a l , t h e i n i t i a l a g g r e g a t i o n o r i n i t i a l g r a n u l a t i o n i s a d e c i s i v e s t e p . I t w a s p r o p o s e d t h a t t h e i n i t i a l g r a n u l a t i o n m i g h t b e a t t r i b u t e d t o t h e g r o w t h o f M e t h a n o t h r i x s p . o n s m a l l i n e r t p a r t i c l e s f r o m t h e i n o c u l u m ( H u l s h o f f P o l e t a l . , 1 9 8 8 ) , t h e g r o w t h o f M e t h a n o t h r i x 3 6 s p . o n c l u m p s o f M e t h a n o s a r c i n a s p . ( d e Z e e u w , 1 9 8 8 ) , t h e b r i d g e e f f e c t o f M e t h a n o t h r i x s p . o n m i c r o fl o c s o r i g i n a t i n g f r o m t h e i n o c u l a t e d d i g e s t o r s l u d g e ( D u b o u r g u i e r e t a l . , 1 9 8 8 a ) , o r t h e f o r m a t i o n o f s m a l l a g g r e g a t e s o f M e t h a n o t h r i x c a u s e d b y b i o g a s t u r b u l e n c e ( W i e g a n t , 1 9 8 8 ) . G r a n u l e s , m a i n l y c o n s i s t i n g o f M e t h a n o t h r i x s p . , w e r e o b t a i n e d u s i n g a c e t a t e ( 2 . 8 t o 3 . 0 g / L ) a s m a j o r c a r b o n a n d e n e r g y s o u r c e u n d e r t h e r m o p h i l i c t e m p e r a t u r e s ( W i e g a n t a n d d e M a n , 1 9 8 6 ) a n d m e s o p h i l i c t e m p e r a t u r e s ( N a r a d a e t a l . 1 9 8 8 ) . T h i s f a c t s u p p o r t s t h e i m p o r t a n c e o f M e t h a n o t h r i x i n t h e g r a n u l a t i o n p r o c e s s . H o w e v e r , t h e r o l e o f o t h e r o r g a n i s m s c a n n o t b e i g n o r e d s i n c e y e a s t e x t r a c t ( 0 . 1 5 t o 0 . 3 g / L ) w a s a d d e d t o t h e f e e d u s e d i n t h e s e e x p e r i m e n t s . F o r e x a m p l e , t h e p r e s e n c e o f m e t h a n o g e n i c a c t i v i t y f r o m s u c r o s e , p r o p i o n a t e , f o r m a t e a n d H 3 - C O 2 w a s d e t e c t e d a t l e v e l s a s h i g h a s 1 0 t o 5 % o f t h a t f r o m a c e t a t e ( N a r a d a e t a l . 1 9 8 8 ) . T h e r e f o r e , f u r t h e r s t u d y s t i l l n e e d s t o b e c o n d u c t e d t o b e t t e r e s t a b l i s h t h e r o l e o f M e t h a n o t h r i x i n t h e g r a n u l a t i o n p r o c e s s . i i ) S y n t r o p h i c m i c r o c o l o n i e s I t w a s p r o p o s e d t h a t s y n t r o p h i c r e l a t i o n s h i p s i n m i x e d c u l t u r e s m i g h t e v e n t u a l l y l e a d t o t h e f o r m a t i o n o f s t a b l e m i c r o c o l o n i e s o r c o n s o r t i a ( H i r s c h , 1 9 8 4 ) . S c h i n k a n d T h a u e r ( 1 9 8 8 ) c a l c u l a t e d t h e d i f f u s i o n d i s t a n c e f o r t r a n s f e r m e t a b o l i t e s ( H z a n d a c e t a t e ) a n d i n d i c a t e d t h a t a g g r e g a t i o n o f b a c t e r i a o f d i f f e r e n t t r o p h i c g r o u p s w a s i m p o r t a n t f o r e n e r g e t i c s a n d k i n e t i c s o f s u b s t r a t e c o n v e r s i o n . D u b o u r g u i e r e t a l . ( 1 9 8 8 a , 1 9 8 8 b , 1 9 8 8 c ) o b s e r v e d s y n t r o p h i c m i c r o c o l o n i e s i n t h e g r a n u l e s a n d e m p h a s i z e d t h e i r i m p o r t a n c e i n i n t e r s p e c i e s h y d r o g e n t r a n s f e r . H o w e v e r , n o e v i d e n c e h a s b e e n p r e s e n t e d t o p r o v e t h a t t h e f o r m a t i o n o f s y n t r o p h i c m i c r o c o l o n i e s p r o c e e d s f o r m a t i o n o f g r a n u l e s . T h e r o l e o f t h e s y n t r o p h i c g r o w t h i n t h e g r a n u l a t i o n p r o c e s s i s , h o w e v e r , w o r t h i n v e s t i g a t i n g . 3 7 i i i ) E x t r a c e l l u l a r p o l y m e r p r o d u c i n g b a c t e r i a O r g a n i s m s t h a t p r o d u c e e x t r a c e l l u l a r p o l y m e r a n d f o r m c l u m p s a r e a l s o c o n s i d e r e d t o p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n g r a n u l a t i o n . T h i s i s b e c a u s e p o l y m e r s h a v e b e e n c l e a r l y o b s e r v e d o n t h e s u r f a c e o f g r a n u l e s u n d e r S E M ( D o l fi n g e t a l . , 1 9 8 5 ; D u b o u r g u i e r e t a l . , 1 9 8 8 a ) . T h e n a t u r e o r r o l e o f t h e s e e x t r a c e l l u l a r p o l y m e r s a n d t h e o r g a n i s m s r e s p o n s i b l e f o r t h e i r p r o d u c t i o n a r e n o t k n o w n . F u r t h e r r e s e a r c h i s n e e d e d i n t h i s a r e a . S o m e h y d r o l y t i c - f e r m e n t a t i o n b a c t e r i a s u c h a s S e l e n o m a n s r u m i n a n t i u m , C l o s m ' d i u m b u t y r i c u m p r o d u c e p o l y s a c c h a r i d e s a n d f o r m a g g r e g a t e s w h e n g r o w n o n c a r b o h y d r a t e - c o n t a i n i n g m e d i a i n a n a e r o b i c g a s - l i f t r e a c t o r s ( Z o u t b e r g e t a l . , 1 9 8 8 ) . I t w a s r e p o r t e d t h a t g r a n u l a t i o n o n c a r b o h y d r a t e - c o n t a i n i n g w a s t e w a t e r w a s f a s t e r t h a n o n a V F A m i x t u r e ( L e t t i n g a e t a l . , 1 9 8 4 ; d e Z e e u w , 1 9 8 8 ) . H o w e v e r , i t i s n o t r e a s o n a b l e t o d r a w a n y c o n c l u s i o n t h a t t h e p o l y s a c c h a r i d e s p r o d u c e d b y f e r m e n t a t i v e b a c t e r i a p l a y a n e s s e n t i a l r o l e i n g r a n u l a t i o n . T h e s e b a c t e r i a d o n o t e x i s t i n a l a r g e n u m b e r s i n t h e g r a n u l e s d e v e l o p e d o n V F A m i x t u r e s o r e v e n i n g r a n u l e s f e d w i t h c a r b o h y d r a t e - c o n t a i n i n g w a s t e w a t e r . T h e f r a c t i o n o f e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d s i n g r a n u l e s i s o n l y 1 t o 2 % b a s e d o n d r y w e i g h t ( D o l fi n g e t a l . , 1 9 8 5 ) . T h i s i s c o n t r a s t t o a p p r o x i m a t e l y 3 0 % i n a g g r e g a t e s o f C l o s t r i d i u m b u t y r i c u m ( Z o u t b e r g e t a l . , 1 9 8 8 ) . P o l y m e r s o t h e r t h a n p o l y s a c c h a r i d e s m a y p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n b i n d i n g b a c t e r i a t o g e t h e r . C l e a r l y m o r e r e s e a r c h i s n e e d e d . H y d r o g e n u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s e x i s t a t a g r e a t n u m b e r i n m o s t g r a n u l e s . S a m - S o o n e t a l . ( 1 9 8 8 ) p r o p o s e d t h a t t h e p e l l e t i z a t i o n i n a n a e r o b i c r e a c t o r s w a s d u e t o t h e a c t i o n o f M e t h a n o b a c t e r i u m s t r a i n A Z ( i . e . M e t h a n o b r e v i b a c t e r a r b o r i p h i l i c u s A Z ) . T h i s m e t h a n o g e n u s e s h y d r o g e n a s i t s o n l y e n e r g y s o u r c e a n d p r o d u c e s a l l o f t h e a m i n o a c i d s ( e x c e p t c y s t e i n e ) r e q u i r e d f o r c e l l s y n t h e s i s ( Z e h n d e r a n d W u h r r n a n n , 3 8 1 9 7 7 ) . A t a h i g h h y d r o g e n p a r t i a l p r e s s u r e a n d l i m i t e d c y s t e i n e s u p p l y , o v e r p r o d u c t i o n o f a m i n o a c i d s o c c u r s . T h e s e a c i d s i n d u c e f o r m a t i o n o f e x t r a c e l l u l a r l o n g - c h a i n p o l y p e p t i d e s w h i c h b i n d t h i s m i c r o o r g a n i s m a n d o t h e r b a c t e r i a t o f o r m t h e p e l l e t s o r g r a n u l e s . T h i s h y p o t h e s i s , h o w e v e r , c a n n o t e x p l a i n w h y g r a n u l a t i o n o c c u r s i n l o w h y d r o g e n p a r t i a l e n v i r o n m e n t s , w h e n V F A m i x t u r e s a r e u s e d a s s u b s t r a t e s ( I - I u l s h d f f P o l e t a l . , 1 9 8 3 ; d e Z e e u w , 1 9 8 4 ) o r a c e t a t e p l u s a s m a l l a m o u n t o f y e a s t e x t r a c t i s u s e d a s s u b s t r a t e ( W i e g a n t a n d d e M a n , 1 9 8 6 ; N a r a d a e t a l . , 1 9 8 8 ) . T h e r o l e o f h y d r o g e n - f o r m a t e u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s i n g r a n u l e f o r m a t i o n n e e d s t o b e e v a l u a t e d f u r t h e r . i v ) M i n e r a l p r e c i p i t a t e s a n d s m a l l i n o r g a n i c p a r t i c l e s S m a l l s a n d a n d o t h e r i n e r t p a r t i c l e s a r e f r e q u e n t l y o b s e r v e d i n g r a n u l e s ( L e t t i n g a e t a l . , 1 9 8 4 ; d e Z e e u w , 1 9 8 4 ; D u b o u r g u i e r e t a l . , 1 9 8 8 a ) . T h e a t t a c h m e n t o f c e l l s t o t h e s u r f a c e s o f i n e r t m a t t e r h a s b e e n p r o p o s e d a s t h e i n i t i a t i n g s t e p f o r g r a n u l a t i o n ( A r c h e r , 1 9 8 8 ) . G r a n u l e s b e d e v e l o p e d u s i n g p o w d e r e d z e o l i t e ( 1 0 0 p m i n s i z e ) a s c a r r i e r ( Y o d a e t a l . , 1 9 8 9 ) . H u l s h o f f P o l ( 1 9 8 9 ) r e p o r t e d t h a t w h e n t h e i n e r t p a r t i c l e s ( 4 0 t o 1 0 0 p m i n s i z e ) w e r e r e m o v e d f r o m i n o c u l a t e d s e w a g e s l u d g e , g r a n u l a t i o n w a s n o t o b s e r v e d w i t h i n t h e p e r i o d o f t i m e t h a t w a s u s u a l l y r e q u i r e d f o r t h e f o r m a t i o n o f g r a n u l e s . H o w e v e r , g r a n u l e s c a n b e d e v e l o p e d w i t h o u t t h e a d d i t i o n o f a n y i n e r t m a t e r i a l s ( L e t t i n g a e t a l . , 1 9 8 5 ; T h i e l e e t a l . , 1 9 9 0 ) . M i n e r a l p r e c i p i t a t e s , s u c h a s c a l c i u m p h o s p h a t e , c a l c i u m c a r b o n a t e a n d f e r r o u s s u l fi d e , a r e f o r m e d a s a c o n s e q u e n c e o f m e t a b o l i c a c t i v i t i e s a n d a c c u m u l a t e i n s i d e g r a n u l e s ( W u e t a l . , 1 9 8 7 ; D u b o u r g u i e r e t a l . , 1 9 8 8 a , 1 9 8 8 b ) . F e r r o u s s u l fi d e w a s o b s e r v e d a t t a c h e d fi r m l y t o t h e s h e a t h o f M e t h a n o t h r i x s p . a n d , t h e r e f o r e , w a s t h o u g h t t o s t a b i l i z e b a c t e r i a l a g g r e g a t i o n w i t h i n g r a n u l e s ( D u b o u r g u i e r e t a l . , 1 9 8 8 a ) . L o w c o n c e n t r a t i o n s o f C a “ ( 1 0 0 t o 2 0 0 m g / L ) w a s f o u n d t o h a v e a p o s i t i v e e f f e c t o n 3 9 g r a n u l a t i o n ( H u l s h o f f P o l e t a l . , 1 9 8 3 ) . H i g h c o n c e n t r a t i o n s o f C a 2 + ( > 6 0 0 m g / L ) h a s a n e g a t i v e i n fl u e n c e o n g r a n u l e f o r m a t i o n ( H u l s h o f f P o l e t a l . , 1 9 8 3 ; G u i o t e t a l . , 1 9 8 8 ) . E G T A ( e t h y l e n e g l y c o l - b i s ( l 3 - a m i n o e t h y l e t h e r ) - N , N , - t e t r a a c e t i c a c i d ) , a C a 2 + c h e l a t i n g a g e n t w a s u s e d t o t r e a t s e v e r a l g r a n u l a r s l u d g e s f r o m a l a b o r a t o r y - s c a l e r e a c t o r a n d f u l l - s c a l e r e a c t o r s ( G r o t h e n t h u i s e t a l . , 1 9 8 8 b ) . I n a E G T A / C a 2 + s o l u t i o n w i t h a r a t i o o f 1 : 3 ( m o l : m o l ) , t h e g r a n u l e s d i s i n t e g r a t e d o r b e c a m e w e a k e r . B a s e d o n t h i s , G r o t h e n t h u i s e t a l . ( 1 9 8 8 b ) s u g g e s t e d t h a t c a l c i u m m i g h t p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n g r a n u l e s t r u c t u r e a s c a l c i u m p h o s p h a t e p r e c i p i t a t e s f o r a d h e s i o n o f b a c t e r i a o r / a n d a c o n s t i t u e n t o f e x t r a c e l l u l a r p o l y m e r s . H o w e v e r , n o c o n c l u s i v e e v i d e n c e h a s b e e n r e p o r t e d t h a t i n d i c a t e s m i n e r a l p r e c i p i t a t e s a r e e s s e n t i a l f o r g r a n u l a t i o n . G r a n u l a t i o n i s u n d o u b t e d l y a c o m p l e x p r o c e s s w h i c h i n c l u d e s s e v e r a l i n d i v i d u a l s t e p s a n d i n v o l v e s a n u m b e r o f d i f f e r e n t b a c t e r i a , s o m e o f w h i c h m a y n o t b e e s s e n t i a l b u t d o a c c e l e r a t e t h e p r o c e s s . I d e n t i f y i n g a n d c h a r a c t e r i z i n g t h e k e y o r g a n i s m s i n g r a n u l e s i s o n e w a y t o s t u d y t h e g r a n u l a t i o n p r o c e s s . 1 . 4 G O A L S A N D O B J E C T I V E S O F T H I S S T U D Y T h e o b j e c t i v e s o f t h i s s t u d y w e r e t o c h a r a c t e r i z e t h e p r i n c i p l e s f o r t h e c u l t i v a t i o n o f a n a e r o b i c g r a n u l e s , t h e e f f e c t o f m i c r o b i a l c o m p o s i t i o n i n g r a n u l e s o n t h e p h y s i c a l , o p e r a t i o n a l , k i n e t i c a n d m e t a b o l i c p e r f o r m a n c e o f g r a n u l e s , a n d t h e p r e v a l e n t b a c t e r i a l s p e c i e s i n g r a n u l e s a n d t h e i r r o l e s i n g r a n u l e f o r m a t i o n . I n o r d e r t o e x a m i n e a n d g e n e r a l i z e t h e e m p i r i c a l p r i n c i p l e s f o r g r a n u l a t i o n o b t a i n e d f r o m p r e v i o u s e x p e r i m e n t s o n a n a e r o b i c d i g e s t e d s l u d g e s w i t h V F A m i x t u r e s , b o t h a n a e r o b i c d i g e s t e d s e w a g e s l u d g e a n d a e r o b i c a c t i v a t e d s l u d g e w e r e u s e d a s 4 o i n o c u l u m f o r t h e c u l t i v a t i o n o f g r a n u l e s u s i n g c o m p l e x o r g a n i c w a s t e w a t e r s ( g l u c o s e m o l a s s e s s o l u t i o n a n d b r e w e r y w a s t e w a t e r ) ( C h a p t e r 2 ) . T w o t y p i c a l t y p e s o f g r a n u l e s ( r o d - t y p e a n d fi l a m e n t o u s - t y p e ) w e r e c o m p a r e d w i t h r e g a r d t o o p e r a t i o n a l p e r f o r m a n c e , p h y s i c a l a n d c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s , s u b s t r a t e k i n e t i c s , a n d m i c r o b i a l p o p u l a t i o n s . T h e r o l e o f m i c r o b i a l p o p u l a t i o n s w a s i n v e s t i g a t e d f o r g r a n u l e s d e v e l o p e d o n a V F A m i x t u r e w i t h l o w l e v e l s o f s u l f a t e ( C h a p t e r 3 ) . G r a n u l e s d e v e l o p e d o n a b r e w e r y w a s t e w a t e r c o n t a i n i n g m o d e r a t e c o n c e n t r a t i o n s o f s u l f a t e ( 0 . 6 t o 1 . 3 m M ) w e r e c h a r a c t e r i z e d w i t h r e s p e c t t o t h e i r m e t a b o l i c p e r f o r m a n c e a n d g r a n u l a r s t r u c t u r e . T h e r o l e o f s u l f a t e r e d u c i n g b a c t e r i a w a s i n v e s t i g a t e d ( C h a p t e r 4 ) . T h e p r e v a l e n t m i c r o b i a l s p e c i e s i n t h e r o d - t y p e g r a n u l e s w e r e i s o l a t e d a n d c h a r a c t e r i z e d i n o r d e r t o u n d e r s t a n d t h e r o l e o f i n d i v i d u a l s p e c i e s i n g r a n u l a r s t r u c t u r e ( C h a p t e r 5 ) . T h e m e t a b o l i s m o f f a t t y a c i d s ( w i t h 1 t o 5 c a r b o n a t o m s ) a n d 1 1 3 - C 0 3 i n t h e i s o l a t e d s p e c i e s w a s c h a r a c t e r i z e d a n d c o m p a r e d w i t h t h e r o d - t y p e g r a n u l e s t o u n d e r s t a n d t h e r o l e o f t h e s e s p e c i e s i n f a t t y a c i d d e g r a d a t i o n b y t h e g r a n u l e s . ( C h a p t e r 6 ) . B a s e d o n t h e i s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e p r e v a l e n t s p e c i e s i n g r a n u l e s , t h e m i c r o b i a l a n d p h y s i c o c h e m i c a l f a c t o r s a f f e c t i n g g r a n u l a t i o n w e r e i n v e s t i g a t e d . D e fi n e d b a c t e r i a l s p e c i e s w e r e u s e d t o d e v e l o p g r a n u l e s t o d e t e r m i n e t h e i r r o l e i n a g g r e g a t i o n a n d g r a n u l e f o r m a t i o n ( C h a p t e r 7 ) . C H A P T E R 2 C U L T I V A T I O N O F G R A N U L E S I N L A B - S C A L E U A S B R E A C T O R S F E D W I T H C O M P L E X S U B S T R A T E S U S I N G N O N - G R A N U L A R I N O C U L U M 2 . 1 I N T R O D U C T I O N O b t a i n i n g a n a e r o b i c g r a n u l e s f r o m n o n - g r a n u l a r i n o c u l u m m a t e r i a l s i s a d i f fi c u l t s t a r t - u p p r o b l e m f o r t h e a p p l i c a t i o n o f t h e U A S B p r o c e s s . T o d a t e , d e t a i l s t u d i e s o n g r a n u l a t i o n h a v e b e e n p e r f o r m e d u s i n g v o l a t i l e f a t t y a c i d ( V F A ) m i x t u r e s a s f e e d a n d a n a e r o b i c d i g e s t e d s e w a g e s l u d g e a s i n o c u l u m ( H u l s h o f f P o l e t a l . , 1 9 8 3 ; H u l s h o f f P o l , 1 9 8 9 ; d e Z e e u w 1 9 8 4 ) . T h e g r a n u l a t i o n p r o c e s s , w h e n c o m p l e x o r g a n i c c o m p o u n d s a r e u s e d a s f e e d , h a s n o t b e e n s t u d i e d i n d e t a i l . O t h e r i n o c u l a b e s i d e s a n a e r o b i c d i g e s t e d s l u d g e a n d c o w m a n u r e h a v e n o t b e e n e v a l u a t e d f o r g r a n u l a t i o n u n d e r m e s o p h i l i c t e m p e r a t u r e c o n d i t i o n s . I n t h i s c h a p t e r , g r a n u l a t i o n w i t h a n a e r o b i c d i g e s t e d s l u d g e a s i n o c u l u m o n a g l u c o s e m o l a s s e s s o l u t i o n a n d b r e w e r y w a s t e w a t e r w a s i n v e s t i g a t e d t o c h a r a c t e r i z e g r a n u l a t i o n o n c o m p l e x s u b s t r a t e s . T h e r e s u l t s a r e c o m p a r e d w i t h t h e r e s u l t s o b t a i n e d u s i n g V F A m i x t u r e s . S i g n i fi c a n t l e v e l s o f m e t h a n o g e n s w e r e o b s e r v e d i n a e r o b i c a c t i v a t e d s l u d g e s a n d , t h e r e f o r e , a c t i v a t e d s l u d g e w a s u s e d a s i n o c u l u m t o c u l t i v a t e 4 1 4 2 a n a e r o b i c g r a n u l e s a n d s t u d y g r a n u l a t i o n p r o c e s s . T h e g r a n u l e s f o r m e d w e r e p r i m a r i l y c h a r a c t e r i z e d i n t e r m s o f p h y s i c a l c h a r a c t e r i s t i c s , c h e m i c a l c o m p o s i t i o n , m e t a b o l i c a c t i v i t y a n d m i c r o b i a l s t r u c t u r e . S o m e e m p i r i c a l p a r a m e t e r s f o r t h e c u l t i v a t i o n o f g r a n u l e s a r e d i s c u s s e d a n d s u m m a r i z e d . 2 . 2 M A T E R I A L S A N D M E T H O D S 2 . 2 . 1 C h e m i c a l s A l l c h e m i c a l s u s e d w e r e o f a n a l y t i c a l g r a d e a n d o b t a i n e d f r o m B e i j i n g A n a l y t i c a l C h e m i c a l C o m p a n y ( B e i j i n g , C h i n a ) e x c e p t g l u c o s e m o l a s s e s ( c o n t a i n i n g 7 0 % g l u c o s e ) ( W u h a n S u g a r C o m p a n y , W u h a n , H u b e i , C h i n a ) . 2 . 2 . 2 A c t i v a t e d s l u d g e s a m p l e s f o r e n u m e r a t i o n o f m e t h a n o g e n s F o u r a c t i v a t e d s l u d g e s w e r e u t i l i z e d a s t h e s a m p l e s f o r t h e e n u m e r a t i o n o f m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a . S l u d g e N o . 1 w a s o b t a i n e d f r o m a n a e r a t i o n t a n k ( d i s s o l v e d o x y g e n o f 4 . 0 m g / L ) a t t h e G a o b e i d i a n S e w a g e T r e a t m e n t P l a n t , B e i j i n g ; N o . 2 f r o m a s e c o n d a r y s e d i m e n t a t i o n t a n k o f a n a c t i v a t e d s l u d g e p l a n t i n t h e C h a n g z h o u D o n g f a n h o n g T e x t i l e C o m p a n y , C h a n g z h o u ; N o . 3 f r o m a n a c t i v a t e d s l u d g e a e r a t i o n t a n k t r e a t i n g c h e m i c a l w a s t e w a t e r a t t h e X i a y o u n g P e t r o c h e m i s t r y C o m p a n y , B e i j i n g ; a n d N o . 4 f r o m a s e c o n d a r y s e d i m e n t a t i o n t a n k i n t h e l s t N a t i o n a l T e x t i l e C o m p a n y o f S i c h u a n P r o v i n c e , C h e n g d u , C h i n a . T h e s e a c t i v a t e d s l u d g e s a r e r e p r e s e n t a t i v e o f t h e a c t i v a t e d s l u d g e s t r e a t i n g s e w a g e a n d i n d u s t r i a l w a s t e w a t e r . 2 . 2 . 3 E n u m e r a t i o n o f t o t a l m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a T h e e n u m e r a t i o n e x p e r i m e n t s o f t o t a l m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a i n d i f f e r e n t a e r o b i c 4 3 a c t i v a t e d s l u d g e a n d a n a e r o b i c g r a n u l e s w e r e c o n d u c t e d u s i n g t h e H u n g a t e t e c h n i q u e ( B r y a n t , 1 9 7 2 ) . P r e p a r a t i o n a n d s t e r i l i z a t i o n o f m e d i u m a n d d i l u t i o n o f s a m p l e s w e r e p e r f o r m e d u n d e r o x y g e n - f r e e n i t r o g e n a t m o s p h e r e . G l a s s p r e s s u r e t u b e s ( 2 0 m l i n v o l u m e , T i a n g j i n g G l a s s I n s t r u m e n t C o m p a n y , T i a n g j i n g , C h i n a ) w i t h b u t y l r u b b e r s t o p p e r s w e r e u s e d i n t h e s e e x p e r i m e n t s . T h e e n u m e r a t i o n m e d i u m c o n t a i n e d f o l l o w i n g c o m p o n e n t s ( p e r l i t e r ) : N H 4 C 1 , 1 . 0 g ; M g C 1 2 - 6 H 3 O , 0 . 1 g ; C a C l z , 0 . 1 g ; K 3 H P O 4 , 0 . 4 g ; K H 3 P 0 4 , 0 . 4 g ; N a 3 8 - 9 H 3 0 , 0 . 1 g ; N a H C O 3 , 1 . 0 g ; y e a s t e x t r a c t 2 . 0 g ; t r y p t i c a s e p e p t o n e , 2 . 0 g ; L - c y s t e i n e - H C I , 0 . 5 g ; s o d i u m a c e t a t e , 2 . 0 g ; s o d i u m f o r m a t e 2 . 0 g ; r e s a z u r i n , 0 . 0 0 1 g ; t r a c e e l e m e n t s o l u t i o n ( Z e i k u s a n d W o l f e , 1 9 7 3 ) , 1 0 m L a n d v i t a m i n s o l u t i o n ( Z e i k u s a n d W o l f e , 1 9 7 3 ) , 1 0 m L . T h e fi n a l p H w a s 7 . 0 t o 7 . 2 . A f t e r i n o c u l a t i o n , e a c h a n a e r o b i c t u b e w a s p r e s s u r i z e d w i t h H 3 - C O 2 ( 8 0 : 2 0 ) g a s m i x t u r e b y 0 . 2 a t m . E a c h t u b e c o n t a i n e d 4 . 5 m L o f t h e m e d i u m . A s e r u m b o t t l e ( 5 0 m L i n v o l u m e ) , c o n t a i n i n g a b o u t 1 0 g l a s s b e a d s ( 3 - 4 m m d i a m e t e r ) , w a s m a d e a n a e r o b i c b y fl u s h i n g w i t h O 3 - f r e e n i t r o g e n , t h e n fi l l e d w i t h 3 0 m L o f a c t i v a t e d s l u d g e o r a n a e r o b i c g r a n u l e s p l u s t h e e f fl u e n t l i q u i d f r o m a l a b o r a t o r y - s c a l e U A S B r e a c t o r ( d e s c r i b e d b e l o w ) , a n d s u b s e q u e n t l y s e a l e d w i t h a b l a c k r u b b e r s t o p p e r . T h e s a m p l e i n t h e b o t t l e w a s d i s p e r s e d u s i n g a v i b r a t o r a n d i n o c u l a t e d i n t o t h e t u b e s . S e r i a l d i l u t i o n s w e r e m a d e f r o m 1 0 ' 1 t o 1 0 ’ 8 f o r t h e a c t i v a t e d s l u d g e s a n d f r o m 1 0 1 t o 1 0 ' 1 1 f o r t h e g r a n u l e s . T h r e e o r fi v e t u b e s p e r d i l u t i o n w e r e u s e d . T h e i n o c u l a t e d t u b e s w e r e i n c u b a t e d a t 3 5 ° C f o r 2 5 d a y s . M e t h a n e p r o d u c t i o n w a s c h e c k e d b y g a s c h r o m a t o g r a p h y t o e s t a b l i s h w h e t h e r o r n o t t h e t u b e s w e r e p o s i t i v e f o r m e t h a n o g e n s . A f t e r o n e w e e k , m e t h a n e w a s c h e c k e d a g a i n . T h e M o s t P r o b a b l e N u m b e r ( M P N ) v a l u e i n t h e s a m p l e a n d 9 5 % c o n fi d e n c e l i m i t s w e r e c a l c u l a t e d b y u s i n g a m i c r o c o m p u t e r p r o g r a m f o r t h e c o m p u t a t i o n o f M P N ( M a c D o n e l l e t a l . , 1 9 8 4 ) . 4 4 B i o g a s E f f l u e n t G a s - S o l l d - l l q u l d " / s e p a r a t o r W e t g a s m e t e r S e t t l e r / / > < " S l u d g e W a t e r s e a l / b l a n k e t / I S a m p l i n g p o r t . G r a n u l e / b e d I 2 / ‘ 1 ’ F e e d p u m p \ S t o r a g e t a n k I n t l u e n t F i g u r e 2 . 1 S c h e m a t i c d i a g r a m o f l a b o r a t o r y — U A S B r e a c t o r s u s e d i n g r a n u l a t i o n e x p e r i m e n t s 4 5 2 . 2 . 4 L a b o r a t o r y - s c a l e U A S B r e a c t o r s T h r e e l a b o r a t o r y s c a l e - U A S B r e a c t o r s ( A , B a n d C ) m a d e o f p l e x i g l a s t u b e s w e r e u s e d f o r t h e c u l t i v a t i o n o f a n a e r o b i c g r a n u l e s . A s c h e m a t i c d i a g r a m o f t h e t h r e e r e a c t o r s i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 2 . 1 . T h e f e e d w a s s t o r e d i n a p o l y v i n y l c h l o r i d e ( P V C ) p l a s t i c t a n k ( 2 0 0 l i t e r i n v o l u m e ) a n d d e l i v e r e d t o t h e r e a c t o r s o n a c o n t i n u o u s b a s i s u s i n g a I Z I T r e p l a c e m e n t p u m p ( S h i j i a z h o u n g C h e m i c a l E n g i n e e r i n g I n s t i t u t e , S h i j i a z h o u n g , C h i n a ) . T h e v o l u m e o f b i o g a s p r o d u c e d w a s m e a s u r e d u s i n g a D S D - 0 . 5 w e t g a s m e t e r ( S h a n g h a i G a s M e t e r C o m p a n y , S h a n g h a i , C h i n a ) . R e a c t o r s A a n d B w e r e i d e n t i c a l w i t h a n i n n e r d i a m e t e r o f 1 0 . 4 c m a n d a h e i g h t o f 2 . 6 m . T h e i r t o t a l v o l u m e w a s 2 1 l i t e r s ( r e a c t i o n v o l u m e 1 7 . 8 L ) . T h e t o t a l v o l u m e o f r e a c t o r C w a s 2 9 L ( r e a c t i o n v o l u m e 2 3 L ) w i t h a n i n n e r d i a m e t e r o f 1 4 c m a n d a h e i g h t o f 2 . 0 m . T h e s a m p l i n g p o r t s w e r e p l a c e d a l o n g t h e p r o fi l e ( h e i g h t ) o f t h e t h r e e r e a c t o r s . A l l t h e r e a c t o r s w e r e i n s t a l l e d i n a 3 5 ° C c o n s t a n t t e m p e r a t u r e c h a m b e r . 2 . 2 . 5 I n o c u l u m m a t e r i a l s T w o d i f f e r e n t i n o c u l a w e r e u s e d f o r t h e r e a c t o r e x p e r i m e n t s . T h e i n o c u l u m o f r e a c t o r s A a n d B w a s a n a n a e r o b i c d i g e s t e d s l u d g e o b t a i n e d f r o m a n I m h o f f t a n k a t t h e J i u x i a n q i a o S e w a g e T r e a t m e n t P l a n t , B e i j i n g . T h e i n o c u l u m o f r e a c t o r C w a s a c t i v a t e d s l u d g e f r o m a n a e r a t i o n t a n k a t t h e G a o b e i d i a n S e w a g e t r e a t m e n t P l a n t , B e i j i n g . 2 . 2 . 6 F e e d c o m p o s i t i o n T w o f e e d s o l u t i o n s w e r e u s e d i n t h i s s t u d y . R e a c t o r s A a n d C w e r e f e d w i t h a g l u c o s e m o l a s s e s s o l u t i o n w h i l e r e a c t o r B w a s f e d w i t h a b r e w e r y w a s t e w a t e r ( T a b l e 2 . 1 ) . T h e g l u c o s e m o l a s s e s s o l u t i o n w a s p r e p a r e d w i t h g l u c o s e m o l a s s e s e v e r y o t h e r 4 6 d a y . N i c k e l ( a s N i S O 4 - 6 H 3 O ) , c o b a l t ( a s C o C l 3 ° 6 H 3 O ) , a n d m o l y b d e n u m ( a s N a Q M o O 4 - 2 H 2 0 ) w e r e a d d e d t o t h i s s o l u t i o n t o a c h i e v e c o n c e n t r a t i o n s o f 0 . 1 , 0 . 0 5 , a n d 0 . 0 5 m g / L , r e s p e c t i v e l y . T h e b r e w e r y w a s t e w a t e r ( 1 5 , 0 0 0 t o 2 0 , 0 0 0 m g C O D / L ) w a s c o l l e c t e d f r o m t h e s a c c h a r i fi c a t i o n a n d y e a s t p r o c e s s i n g s e c t i o n s a t B e i j i n g B r e w e r y C o m p a n y . T h e w a s t e w a t e r s f r o m t h e t w o s e c t i o n s w e r e m i x e d ( 1 : 1 , v o l : v o l ) a n d d i l u t e d w i t h t a p w a t e r t o a c h i e v e a n i n fl u e n t C O D c o n c e n t r a t i o n b e t w e e n 1 , 0 0 0 a n d 4 , 0 0 0 m g / L , s i m u l a t i n g t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e t o t a l s e w e r e d b r e w e r y w a s t e w a t e r f o r t h i s p l a n t . T a b l e 2 . 1 C o m p o s i t i o n o f f e e d s u s e d i n g r a n u l a t i o n e x p e r i m e n t s R e a c t o r A a n d C B F e e d G l u c o s e B r e w e r y C O D ( m g / L ) 1 0 0 0 - 4 0 0 0 1 0 0 0 - 4 0 0 0 B O D 3 / C O D 0 . 8 0 . 7 4 B O D 3 / K j e l d a h l n i t r o g e n ( a s N ) 3 0 3 4 - 5 6 B O D 3 / p h o s p h a t e s ( a s P ) 1 5 0 N D C a ( m g / L ) 8 0 - 9 0 8 0 - 9 0 N a Q C O 3 ( m g / L ) 2 5 0 - 6 0 0 2 5 0 - 6 0 0 A c e t a t e ( m g / L ) N D 2 0 0 - 5 0 0 P r o p i o n a t e ( m g / L ) N D 1 0 0 - 2 5 0 B u t y r a t e ( m g / L ) N D 3 0 - 8 0 E t h a n o l ( m g / L ) N D 1 4 0 - 2 8 0 p H 5 . 5 - 6 . 0 5 . 5 - 6 . 0 T r a c e e l e m e n t s u p p l e m e n t e d N i 2 + ( m g / L ) 0 . 1 0 . 1 C O “ ( m g / L ) 0 . 0 5 0 . 0 5 M o 2 + ( m 0 . 0 5 0 . 0 5 F e C l 3 ( m g / L ) 1 0 N A ( 1 ) N D : n o t d e t e r m i n e d . N A : n o t a d d e d . ( 2 ) N i S O 4 , C o C l 2 a n d N a Q M o O 4 w e r e u s e d a s t r a c e e l e m e n t s o u r c e s f o r n i c k e l , c o b a l t a n d m o l y b d e n u m , r e s p e c t i v e l y . 4 7 2 . 2 . 7 A n a l y s i s o f m i n e r a l c o m p o s i t i o n i n g r a n u l e s G r a n u l e s ( 1 0 m L ) w e r e w a s h e d 5 t i m e s w i t h 3 0 m L o f d o u b l e d i s t i l l e d w a t e r , t o r e m o v e a n y w a s t e w a t e r f r o m t h e r e a c t o r s , a n d t h e n c e n t r i f u g e d a t 3 , 0 0 0 x g f o r 5 m i n . T h e p e l l e t w a s t h e n t r a n s f e r r e d t o a p r e - w e i g h e d p o r c e l a i n e v a p o r a t i n g d i s h . T h e d r y w e i g h t ( 1 0 3 ° C ) a n d t h e a s h w e i g h t ( 5 5 0 ° C ) o f t h e p e l l e t w e r e t h e n d e t e r m i n e d . T h e a s h w a s t h e n d i s s o l v e d i n t o a m i x t u r e ( 3 m L ) o f c o n c e n t r a t e d H N O 3 , H 3 8 0 , a n d H C l ( 1 : 1 : 1 ) . T h e s u p e r n a t a n t o f t h e a c i d i fi e d s o l u t i o n , a f t e r s e t t l i n g , w a s d i l u t e d w i t h d o u b l e d i s t i l l e d w a t e r b y 5 t o 2 0 t i m e s p r i o r t o a n a l y s i s . M e t a l s , i n c l u d i n g F e , C a , M g , M n , N i , C o , N a a n d K , i n t h e d i l u t e d s a m p l e w e r e d e t e r m i n e d u s i n g a H i t a c h i 1 8 0 - 8 0 P o l a r i z e d Z e e m a n A t o m i c S p e c t r o p h o t o m e t e r . 2 . 2 . 8 L i g h t a n d e l e c t r o n i c m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n S l u d g e s a n d g r a n u l e s w e r e e x a m i n e d u s i n g a L e i t z O r t h o p l a n M i c r o s c o p e . S a m p l e p r e p a r a t i o n o f g r a n u l a r s l u d g e s f o r s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( S E M ) i s d e s c r i b e d i n A p p e n d i x D . T h e S E M g r a p h s w e r e t a k e n o n a H i t a c h i $ 5 2 0 a n d a J E O L J S M 3 5 C a t 2 5 k V . T h e y w e r e e q u i p p e d w i t h a E D A x 9 1 0 0 X - r a y s p e c t r o m e t e r ( H i t a c h i D o n s h i L t d . , J a p a n ) . 2 . 2 . 9 A n a l y t i c a l M e t h o d s A n a l y s i s f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f C O D , B O D 3 , s u s p e n d e d s o l i d s ( S S ) , v o l a t i l e s u s p e n d e d s o l i d s ( V S S ) , N H 4 - N , K j e l d a h l n i t r o g e n , a n d a l k a l i n i t y a s w e l l s p e c i fi c g r a v i t y o f g r a n u l a r s l u d g e w e r e m a d e i n a c c o r d a n c e w i t h S t a n d a r d M e t h o d s ( A P H A e t a l . , 1 9 8 0 ) . S l u d g e v o l u m e i n d e x ( S V I ) w a s m e a s u r e d u s i n g a 1 0 0 m L g r a d u a t e d c y l i n d e r . 4 8 V o l a t i l e f a t t y a c i d s ( V F A ) w e r e d e t e r m i n e d u s i n g a 1 0 2 6 g a s c h r o m a t o g r a p h ( S h a n g h a i A n a l y t i c I n s t r u m e n t C o m p a n y , S h a n g h a i , C h i n a ) w i t h a fl a m e i o n i z a t i o n d e t e c t o r ( F I D ) a n d n i t r o g e n a s c a r r i e r g a s . M e t h a n e a n d C O 2 w e r e m e a s u r e d b y a 1 0 2 G g a s c h r o m a t o g r a p h w i t h t h e r m a l c o n d u c t i v i t y d e t e c t o r ( T C D ) a n d N 2 a s c a r r i e r g a s . T h e p H w a s m e a s u r e d u s i n g a n P H S - 2 p r e c i s i o n p H m e t e r ( S h a n g h a i A n a l y t i c a l I n s t r u m e n t C o . , S h a n g h a i , C h i n a ) . 2 . 3 M O S T P R O B A B L E N U M B E R ( M P N ) E N U M E R A T I O N O F M E T H A N O G E N S I N A C T I V A T E D S L U D G E S T o i d e n t i f y w h e t h e r t h e a c t i v a t e d s l u d g e s a m p l e s c o n t a i n e d m e t h a n o g e n s , t h r e e k i n d s o f s u b s t r a t e s ( i . e . a c e t a t e , f o r m a t e a n d H z - C O Z ) w e r e a d d e d t o t h e e n u m e r a t i o n m e d i u m . T h e s e s u b s t r a t e s c a n b e u t i l i z e d b y t h e k n o w n m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a . T h e r e f o r e , t h e c o u n t i n g r e s u l t s s h o u l d a c c u r a t e l y i n d i c a t e t h e n u m b e r o f t o t a l m e t h a n o g e n s . T h e r e s u l t s o f t h e M P N e n u m e r a t i o n d e m o n s t r a t e d t h a t a s i g n i fi c a n t a n d c o n s i s t e n t p o p u l a t i o n o f m e t h a n o g e n s w a s p r e s e n t i n e a c h o f t h e a c t i v a t e d s l u d g e s a t l e v e l s o f c a . 1 0 8 / g S S ( T a b l e 2 . 2 ) . M i c r o s c 0 p i c e x a m i n a t i o n i n d i c a t e d t h a t , i n t h e s e a c t i v a t e d s l u d g e s , s o m e c l u m p s o f r o d s a n d c o c c i e x h i b i t i n g b l u e - g r e e n a u t o fl u o r e s c e n c e w e r e d i s p e r s e d i n s i d e t h e s l u d g e fl o c s . T h e s e b a c t e r i a w e r e l i k e l y h y d r o g e n - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s . A f t e r i n c u b a t i o n o f f o r o v e r a m o n t h , M e t h a n o c o c c u s - l i k e c o c c i a n d M e t h a n o b a c t e r i u m - l i k e r o d s e x h i b i t i n g a u t o fl u o r e s c e n c e w e r e o b s e r v e d v e r y c l e a r l y i n t h e 1 0 " a n d / o r 1 0 4 5 M P N t u b e s w h i l e M e t h a n o s a r c i n a - l i k e a g g r e g a t e s w e r e o b s e r v e d i n l o w e r d i l u t i o n M P N t u b e s ( 1 0 2 t o 1 0 " ) . M e t h a n o t h r i x - t y p e c e l l s c o u l d n o t b e i d e n t i fi e d i n t h e M P N t u b e s , h o w e v e r , s i n c e t h i s s p e c i e s d o e s n o t e x h i b i t a u t o fl u o r e s c e n c e . 4 9 T h i s r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t a c t i v a t e d s l u d g e c o n t a i n s e n o u g h m e t h a n o g e n s t o s e r v e a s a n i n o c u l u m f o r a n a n a e r o b i c r e a c t o r . T a b l e 2 . 2 M P N v a l u e s o f m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a i n a c t i v a t e d s l u d g e s f r o m f o u r t r e a t m e n t p l a n t s S S c o n c . T u b e s p e r M P N 9 5 % c o n fi d e n c e l i m i t s S a m p l e x 1 0 8 / E S S g S S / L d i l u t i o n x 1 0 5 / m L x 1 0 8 / g S S l o w e r u p p e r N o . 1 4 . 0 3 4 . 6 1 . 1 0 . 2 5 5 . 0 N o . 2 1 0 . 9 3 1 5 1 . 4 0 . 3 8 4 . 9 N o . 3 1 1 . 1 5 9 . 2 5 . 8 2 . 6 2 6 . 5 N o . 4 1 1 . 9 5 1 . 7 1 . 3 0 . 5 5 3 . 9 N o . 1 : s l u d g e t r e a t i n g s e w a g e , V S S / S S = 0 . 5 8 . N o . 2 : s l u d g e t r e a t i n g t e x t i l e w a s t e w a t e r , V S S / S S = 0 . 6 7 . N o . 3 : s l u d g e t r e a t i n g p e t r o - c h e m i s t r y w a s t e w a t e r , V S S / S S = 0 . 6 3 . N o . 4 : s l u d g e t r e a t i n g t e x t i l e w a s t e w a t e r , V S S / S S = 0 . 7 5 . 2 . 4 G R A N U L A T I O N P R O C E S S I N L A B O R A T O R Y S C A L E U A S B R E A C T O R 2 . 4 . 1 A n a e r o b i c d i g e s t e d s l u d g e a s i n o c u l u m f e d a g l u c o s e m o l a s s e s s o l u t i o n R e a c t o r A w a s i n o c u l a t e d w i t h a n a n a e r o b i c d i g e s t e d s l u d g e a n d f e d a g l u c o s e m o l a s s e s s o l u t i o n t o i n v e s t i g a t e t h e p r o c e s s o f g r a n u l a t i o n o n a c o m p l e x s u b s t r a t e a n d t h e e f f e c t o f g r a n u l a t i o n o n s l u d g e b e h a v i o r i n a s l u d g e b l a n k e t . B e f o r e s t a r t - u p , r e a c t o r A w a s fi l l e d w i t h 1 0 L o f m e d i u m c o n t a i n i n g g l u c o s e 5 0 m o l a s s e s ( C O D 1 , 0 0 0 m g / L ) a n d 1 0 L o f a d i l u t e a n a e r o b i c d i g e s t e d s e w a g e s l u d g e c o n t a i n i n g 1 0 8 0 g S S ( 2 6 % v o l a t i l e ) . A f t e r i n o c u l a t i o n , t h e r e a c t o r w a s i n c u b a t e d a t 3 5 ° C w i t h o u t f e e d f o r 1 4 h o u r s a n d s u b s e q u e n t l y f e d c o n t i n u o u s l y a t t h e f e e d r a t e o f 0 . 2 6 L / h r . I t r e q u i r e d 1 6 0 d a y s t o c o m p l e t e g r a n u l a t i o n i n t h e r e a c t o r . O p e r a t i o n a l d a t a i n c l u d i n g C O D c o n c e n t r a t i o n s i n i n fl u e n t a n d e f fl u e n t , v o l u m e t r i c C O D l o a d i n g r a t e s , C O D r e m o v a l p e r c e n t a g e s , t o t a l b i o m a s s c o n t e n t ( i n t e r m s o f S S a n d V S S ) , a s w e l l a s s p e c i fi c C O D l o a d i n g r a t e s a n d s p e c i fi c C O D r e m o v a l r a t e s , a r e i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 2 . 2 a a n d 2 . 2 b . T h e o p e r a t i o n a l d a t a o b t a i n e d f r o m t h i s r e a c t o r i s s u m m a r i z e d i n T a b l e 2 . 3 . T h e p H i n t h e e f fl u e n t w a s m a i n t a i n e d b e t w e e n 6 . 4 a n d 6 . 9 w i t h t h e a l k a l i n i t y r a n g i n g f r o m 6 0 0 t o 7 0 0 m g / L ( a s C a C O 3 ) . I n m o s t c a s e s , e f fl u e n t C O D c o n c e n t r a t i o n s w e r e l o w e r t h a n 3 0 0 m g / L w i t h a c e t a t e a n d p r o p i o n a t e l o w e r t h a n 1 . 0 m M , a n d 0 . 5 m M , r e s p e c t i v e l y . B u t y r a t e w a s n o t d e t e c t e d . G r a n u l a t i o n i n t h i s r e a c t o r w a s s i m i l a r t o t h a t o n a V F A m i x t u r e u s i n g a n a e r o b i c d i g e s t e d s l u d g e a s i n o c u l u m r e p o r t e d b y H u l s h o f f P o l e t a l . ( 1 9 8 3 ) . I t c a n b e d e s c r i b e d a s o c c u r r i n g i n t h r e e p h a s e s : i ) P h a s e I : s t a r t - u p ( d a y 1 t o d a y 7 7 ) I n t h i s p h a s e , t h e s l u d g e i n t h e r e a c t o r d e v e l o p e d f r o m a p o o r l y a g g r e g a t e d f o r m t o r e l a t i v e l y d e n s e fl o c s . N o g r a n u l e s w e r e o b s e r v e d i n t h e r e a c t o r . T h e i n i t i a l v o l u m e t r i c C O D l o a d i n g r a t e w a s 1 g / L — d a n d t h e s p e c i fi c C O D l o a d i n g r a t e l e s s t h a n 0 . 1 g / g V S S - d . T h e r e a c t o r l o a d i n g r a t e w a s g r a d u a l l y i n c r e a s e d t o a s p e c i fi c C O D l o a d i n g r a t e o f 0 . 3 g / g V S S - d ( F i g u r e 2 . 2 b a n d T a b l e 2 . 3 ) . A t t h e e n d o f t h i s p h a s e , e x p a n s i o n o f s l u d g e b e d w a s o b s e r v e d . T h e s o l i d c o n c e n t r a t i o n i n s l u d g e b l a n k e t i n c r e a s e d f r o m 1 . 0 t o 3 . 0 g S S / L t o 2 2 . 5 g S S / L o v e r t h i s p e r i o d . 5 1 5 , 0 0 0 - { - 5 . 0 0 0 4 . 0 0 0 ‘ I n t l u e n t “ 4 . 0 0 0 3 3 , 0 0 0 - - 3 , 0 0 0 3 5 , 8 2 , 0 0 0 - - 2 , 0 0 0 o " ° ° ° 1 . ‘ E f f l u e n t ” m m 0 ~ ‘ - ‘ \ ’ ? ~ " ’ l " : ~ \ o a \ a g fl t . 0 0 5 0 1 0 0 1 5 0 0 1 2 0 - P 1 0 0 E i ~ . \ ‘ s l " " \ ' d “ " " . ‘ ¥ o 0 : o " I fi d ‘ l C O D r e m o v a l 8 0 A g > 1 5 a r ' t ' 5 5 ' - a ' . l o 1 3 < < _ " - 6 0 > o \ o ' 4 Q 1 0 ‘ 2 g 8 r - 4 0 E m U ) 5 g 1 - 2 0 g 5 ' C O D l o a d i n g r a t e > o I l 1 o 0 5 0 1 0 0 1 5 0 O P E R A T I O N A L T I M E ( d a y s ) F i g u r e 2 . 2 a O p e r a t i o n a l r e s u l t s o f r e a c t o r i n o c u l a t e d w i t h d i g e s t e d s l u d g e a n d f e d w i t h g l u c o s e - m o l a s s e s ( r e a c t o r A ) . 5 2 u r E 0 8 - - 0 . 8 a : _ l < s i n c o m a d ' t o 3 E : 0 . 6 . p e c c o I n g r a - O . 6 G E a m a O > 0 . 4 - - O . 4 O I » O \ m o o 8 0 2 - 0 2 O a , . ' - o < V S p e c i f i c C O D r e m o v a l r a t e 9 . o o I I I I o 8 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 1 , 2 0 0 - F 1 3 0 0 A 1 , 0 0 0 . ~ 1 , 0 0 0 0 3 g 8 0 0 . T o t a l $ 8 - 3 0 0 < 5 6 0 0 - ~ 6 0 0 E ' I g 4 0 0 W - - - - . - - - - - - - " ” + 4 0 0 2 2 0 0 4 T o t a l v s s - 2 o o 0 l . t 0 O 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 O P E R A T I O N A L T I M E ( d a y s ) F i g u r e 2 . 2 b O p e r a t i o n a l r e s u l t s o f r e a c t o r i n o c u l a t e d w i t h d i g e s t e d s l u d g e a n d f e d w i t h g l u c o s e - m o l a s s e s ( r e a c t o r A ) . 5 3 T a b l e 2 . 3 O p e r a t i o n a l r e s u l t s o f r e a c t o r i n o c u l a t e d w i t h d i g e s t e d s l u d g e a n d f e d w i t h g l u c o s e - m o l a s s e s d u r i n g g r a n u l a t i o n ( r e a c t o r A ) D a t e I n f . C O D C O D G a s d a y C O D r e m o v a l l o a d i n g r a t e p r o d u c t i o n C P L H R T g / L % g / L - d g / g V S S - d L ( S ' I ' P ) / L - d % h r P h a s e I 1 - 1 6 3 . 5 - 3 . 8 8 1 - 8 8 1 . 0 - 1 . 1 0 . 0 7 3 0 0 7 6 0 . 2 2 - 0 . 2 8 N D 8 0 1 7 - 2 0 2 . 8 - 2 . 9 8 7 - 8 9 1 . 3 - 1 . 4 0 . 1 0 . 4 8 - 0 . 4 9 N D 5 0 2 1 - 2 7 1 . 2 - 1 . 3 7 8 - 8 3 0 . 9 - 1 . 0 0 . 0 7 0 . 3 9 0 4 N D 3 2 2 8 - 4 1 1 . 6 - 1 . 8 8 8 - 9 1 0 . 9 - 1 . 0 0 . 0 7 0 . 3 5 - 0 . 4 2 N D 4 5 4 2 - 5 4 1 . 5 - 3 . 3 8 2 - 9 2 1 . 7 - 3 . 9 0 . 1 5 - 0 . 2 4 1 . 0 - 1 . 8 6 0 2 0 5 5 - 6 0 3 . 1 - 4 . 2 8 9 - 9 2 2 . 8 - 3 . 7 0 . 1 8 - 0 . 2 9 1 . 3 - 2 . 1 6 1 1 7 6 1 - 7 7 3 . 6 - 4 . 0 8 9 - 9 3 4 . 3 — 4 . 8 0 . 2 8 0 3 1 2 . 6 - 3 . 0 6 5 2 0 P h a s e I I 7 8 - 8 8 3 . 6 - 4 . 7 9 0 - 9 4 5 . 8 - 7 . 5 0 . 3 8 - 0 . 4 4 2 . 7 - 3 . 8 6 0 1 5 8 9 - 9 4 3 . 8 - 4 . 0 9 3 - 9 4 4 . 8 - 5 . 1 0 . 3 3 - 0 . 3 5 2 . 5 - 2 . 8 6 0 1 9 9 5 - 1 2 5 2 . 4 - 3 . 2 9 3 - 9 5 5 . 2 - 7 . 2 0 . 4 3 — 0 . 5 2 2 . 8 - 3 . 5 6 0 l 1 1 2 6 - 1 3 4 2 . 2 - 2 . 9 9 3 - 9 5 5 . 3 - 7 . 0 0 . 3 5 - 0 . 4 0 2 . 6 - 3 . 2 6 2 1 0 P h a s e 1 1 1 1 3 5 - 1 4 2 2 . 7 - 3 . 4 9 3 - 9 5 5 . 4 - 6 . 8 0 . 3 5 - 0 . 4 0 3 . 0 - 3 . 5 6 2 1 2 1 4 3 - 1 5 1 3 . 2 - 3 . 4 9 5 - 9 6 1 1 . 6 - 1 2 . 4 0 . 6 1 - 0 . 6 4 4 . 9 - 5 . 5 6 0 6 . 5 1 5 2 - 1 6 0 3 . 8 - 4 . 3 8 7 - 9 5 1 4 . 3 - 1 6 . 1 0 . 6 2 - 0 . 7 0 7 . 1 - 7 . 9 6 0 6 . 5 ( 1 ) T h e d a t e s e q u e n c e b e g i n s o n t h e fi r s t d a y o f t h e c o n t i n u o u s f e e d . ( 2 ) N D : n o t d e t e r m i n e d . 5 4 i i ) P h a s e I I : g r a n u l e f o r m a t i o n a n d fl o c w a s h - o u t ( d a y 7 8 t o d a y 1 3 4 ) I n t h i s p h a s e , t h e v o l u m e t r i c C O D l o a d i n g r a t e w a s m a i n t a i n e d a t a b o u t 5 g / L - d w i t h a s p e c i fi c l o a d i n g r a t e o f a p p r o x i m a t e 0 . 3 t o 0 . 4 g / g V S S - d . A s m a l l a m o u n t o f g r a n u l e s w e r e o b s e r v e d i n t h e s l u d g e f r o m t h e b o t t o m o f t h e s l u d g e b e d b e t w e e n d a y 8 0 a n d d a y 9 0 . S u b s e q u e n t l y , g r a n u l e s d e v e l o p e d t h r o u g h w h o l e s l u d g e b e d . T h e d i a m e t e r o f t h e g r a n u l e s i n i t i a l l y f o r m e d w a s a b o u t 0 . 1 t o 0 . 2 m m . I n t h i s p h a s e , s l u d g e c o n c e n t r a t i o n i n s l u d g e b l a n k e t w a s m a i n t a i n e d a s h i g h a s 2 3 g S S / L , a n d t h e l i g h t f r a c t i o n o f t h e s l u d g e ( c o n s i s t i n g m a i n l y o f fl o c s ) w a s w a s h e d o u t t h r o u g h t h e t o p s e t t l e r o f t h e r e a c t o r . A t t h e e n d o f t h i s p h a s e , t h e t o t a l m a s s o f s l u d g e ( S S ) i n t h e r e a c t o r w a s r e d u c e d t o a m i n i m u m l e v e l ( F i g u r e 2 . 2 b ) . i i i ) P h a s e I I I : g r a n u l e g r o w t h ( d a y 1 3 5 t o d a y 1 6 0 ) I n t h i s p h a s e t h e fl o c c u l e n t s l u d g e i n s l u d g e b l a n k e t w a s a l m o s t c o m p l e t e l y w a s h e d - o u t . G r a n u l e s d e v e l o p e d q u i c k l y a n d fi l l e d t h e s l u d g e b e d . T h e t o t a l m a s s o f s l u d g e b e g a n t o i n c r e a s e s i n c e t h e g r a n u l e s f o r m e d w e r e n o t w a s h e d - o u t . C o n s e q u e n t l y , a v o l u m e t r i c C O D l o a d i n g r a t e u p t o 1 6 k g / m 3 - d a n d h y d r a u l i c r e t e n t i o n t i m e o f 6 . 5 h o u r s w e r e a c h i e v e d w i t h a C O D r e m o v a l o f m o r e t h a n 9 0 % . T h e s l u d g e c o n c e n t r a t i o n i n t h e s l u d g e b l a n k e t e v e n t u a l l y d r o p p e d t o 6 . 4 g S S / L ( T a b l e 2 . 4 ) . D u r i n g t h e g r a n u l a t i o n p r o c e s s , t h e c o n c e n t r a t i o n a n d n a t u r e o f s l u d g e i n t h e s l u d g e b l a n k e t c h a n g e d ( T a b l e 2 . 4 ) . I n i t i a l l y , s l u d g e w a s i n a fl o c c u l e n t f o r m w i t h l o w c o n c e n t r a t i o n s ( 1 t o 3 g S S / L ) i n t h e s l u d g e b l a n k e t . A t t h e e n d o f p h a s e I a n d d u r i n g p h a s e I I , t h e s o l i d s c o n c e n t r a t i o n i n c r e a s e d w h i l e t h e fl o c c u l e n t s l u d g e w a s h e d o u t . E v e n t u a l l y , t h e s o l i d s c o n c e n t r a t i o n d e c l i n e d t o a l o w l e v e l a s s m a l l g r a n u l e s b e c a m e t h e m a j o r c o m p o n e n t s o f t h e s l u d g e . T h e s e t t l i n g p r o p e r t y a n d s l u d g e v o l u m e i n d e x ( S V I ) i m p r o v e d a s g r a n u l e s d e v e l o p e d . T h e r e s u l t s o f s e t t l i n g t e s t s o f t h e s l u d g e t a k e n 5 5 f r o m s l u d g e b l a n k e t d u r i n g g r a n u l a t i o n a r e i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 2 . 3 . W h e n fl o c c u l e n t s l u d g e w a s p r e d o m i n a n t , z o n e s e t t l i n g p r e v a i l e d , a n d a c l e a r i n t e r f a c e o c c u r r e d b e t w e e n t h e t o p c l a r i fi e d l i q u i d a n d t h e s l u d g e b l a n k e t i n t h e c y l i n d e r . W h e n b o t h g r a n u l e s a n d fl o c w e r e p r e s e n t ( P h a s e I I ) , s e t t l i n g b e g a n a s fl o c c u l e n t s e t t l i n g w i t h o u t a n i n t e r f a c e a n d , a f t e r 2 m i n u t e s , b e c a m e t h e z o n e s e t t l i n g . W h e n g r a n u l e s o r d i s t i n c t p a r t i c l e s p r e v a i l e d ( P h a s e I I I ) , n o i n t e r f a c e f o r m e d d u r i n g t h e s e t t l i n g t e s t s . F r e e s e t t l i n g w a s o b s e r v e d . F l o c c u l e n t s l u d g e h a d a S V I o f 2 9 m L / g S S w h i l e g r a n u l a r s l u d g e h a d a S V I o f 2 1 m L / g S S . 1 0 0 A : a t t h e 9 7 t h d a y , 8 5 : 2 3 g l l ' B : a t t h e 1 2 2 n d d a y , 8 8 : 2 2 g / I : C : a t t h e 1 5 4 t h d a y , 8 3 : 1 6 g l l E D : a t t h e 1 7 0 d a y , 8 8 : 6 . 4 g l l V 8 0 - I . ” 2 E 6 0 " l L L I B I ' - E 4 0 - u — ‘ C O I - . I 2 0 g 0 D J I 0 l I l i l I 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 T I M E ( m i n ) F i g u r e 2 . 3 R e s u l t s o f s e t t l i n g t e s t s c o n d u c t e d i n a 1 0 0 m L c y l i n d e r w i t h s l u d g e f r o m r e a c t o r A a t d a y 9 7 ( A ) , d a y 1 2 1 ( B ) , d a y 1 5 4 ( C ) , a n d d a y 1 7 0 ( D ) , r e s p e c t i v e l y . 5 6 T a b l e 2 . 4 C o m p o s i t i o n a n d s e t t l e a b i l i t y o f s l u d g e f r o m s l u d g e b l a n k e t r e g i o n d u r i n g g r a n u l a t i o n i n r e a c t o r A D a t e S S v S V I S l u d g e c o m p o s i t i o n d a y g / L m / h m L / g P h a s e I 2 0 . 5 N D N D t i n y fl o c 5 0 3 . 0 N D N D fl o c 6 0 4 . 0 N D N D fl o c 6 8 2 2 . 5 N D N D fl o c P h a s e I I 9 0 2 3 . 0 N D N D fl o c 9 7 2 3 . 3 0 . 3 0 2 4 . 3 fl o c 1 0 8 1 6 . 1 0 . 5 4 2 9 . 3 fl o c 1 1 9 1 9 . 1 0 . 5 3 2 8 . 6 fl o c , f e w g r a n u l e s 1 2 2 2 2 . 1 0 . 4 0 2 4 . 4 fl o c , a f e w g r a n u l e s 1 2 3 2 1 . 1 0 . 4 4 2 2 . 4 fl o c p l u s g r a n u l e s P h a s e I I I 1 4 8 1 4 . 3 1 . 3 7 2 1 . 5 g r a n u l e s , a f e w fl o c s 1 5 4 1 0 . 9 1 . 5 2 2 1 . 0 g r a n u l e s , f e w fl o c s 1 7 0 6 . 4 N D 2 1 . 0 g r a n u l e s ( 1 ) v : T h e m a x i m u m s e t t l i n g v e l o c i t y o f s l u d g e i n t e r f a c e w a s m e a s u r e d i n a 1 0 0 m L g r a d u a t e d c y l i n d e r . S l u d g e s a m p l e s w e r e w i t h d r a w n f r o m t h e s a m p l i n g p o r t a t 2 m h e i g h t o f r e a c t o r A . ( 2 ) N D : N o t d e t e r m i n e d . 5 7 2 . 4 . 2 A n a e r o b i c d i g e s t e d s l u d g e a s i n o c u l u m f o r t h e b r e w e r y w a s t e w a t e r f e d r e a c t o r R e a c t o r B w a s i n o c u l a t e d w i t h a n a e r o b i c d i g e s t e d s l u d g e a n d f e d a b r e w e r y w a s t e w a t e r . T h i s e x p e r i m e n t w a s d e s i g n e d t o i n v e s t i g a t e t h e f e a s i b i l i t y o f o b t a i n i n g g r a n u l a r s l u d g e u s i n g b r e w e r y w a s t e w a t e r a n d e x a m i n e t h e e f f e c t o f C O D l o a d i n g r a t e o n g r a n u l a t i o n . R e a c t o r B w a s i n o c u l a t e d w i t h 1 0 l i t e r s o f d i l u t e a n a e r o b i c d i g e s t e d s l u d g e w i t h a h i g h e r v o l a t i l e f r a c t i o n ( 4 2 % ) t h a n t h a t i n r e a c t o r A ( 2 0 % ) . A f t e r i n o c u l a t i o n , a b r e w e r y w a s t e w a t e r ( d i l u t e d t o a p p r o x i m a t e l y 1 , 0 0 0 m g C O D / L ) w a s f e d i n t e r m i t t e n t l y ( f o r 1 8 h o u r s p e r d a y ) a t a fl o w r a t e o f 0 . 5 L / h r . A f t e r 1 0 d a y s , t h e r e a c t o r w a s f e d c o n t i n u o u s l y a t 0 . 5 L / h r . C o n t i n u o u s o p e r a t i o n l a s t e d 7 5 d a y s . G r a n u l a t i o n o c c u r r e d m o r e q u i c k l y i n r e a c t o r B t h a n i n r e a c t o r A . T h e p H i n t h e e f fl u e n t r a n g e d f r o m 6 . 9 t o 7 . 2 d u r i n g t h e o p e r a t i o n a l p e r i o d . T h e r e s u l t s o f c o n t i n u o u s o p e r a t i o n a r e i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 2 . 4 a n d s u m m a r i z e d i n T a b l e 2 . 5 . T h e t h r e e p h a s e s o f g r a n u l e f o r m a t i o n o b s e r v e d i n r e a c t o r A , w e r e a l s o o b s e r v e d i n r e a c t o r B . T h e l e n g t h o f e a c h p h a s e , h o w e v e r , w a s r e d u c e d c o m p a r e d w i t h r e a c t o r A . D u r i n g P h a s e I ( d a y 1 t h r o u g h d a y 1 8 ) , r e a c t o r B r e c e i v e d h i g h e r v o l u m e t r i c C O D l o a d i n g a n d h i g h e r s p e c i fi c C O D l o a d i n g r a t e s t h a n r e a c t o r A . A f t e r c o n t i n u o u s f e e d i n g o f r e a c t o r B f o r 1 0 d a y s , t h e v o l u m e t r i c C O D l o a d i n g r a t e w a s i n c r e a s e d f r o m 2 - 3 t o 4 . 0 - 5 . 0 g / L - d ( 0 . 2 t o 0 . 3 5 0 4 4 g / g V S S - d ) . A f t e r 1 0 d a y s , C O D r e m o v a l i n c r e a s e d f r o m 5 8 % t o 7 5 % . B y d a y 1 8 , C O D r e m o v a l r e a c h e d 9 2 % w i t h a l o a d i n g r a t e o f 5 . 5 g / L - d . D u r i n g t h i s p e r i o d , t h e s l u d g e a p p e a r e d fl o c c u l e n t , m u c h l i k e t h a t o b s e r v e d i n r e a c t o r A d u r i n g p h a s e I . N o g r a n u l e s w e r e o b s e r v e d , a n d e x p a n s i o n o f 5 8 t h e s l u d g e b e d w a s o b s e r v e d . P h a s e I I i n r e a c t o r B l a s t e d 2 4 d a y s ( d a y 1 9 t h r o u g h d a y 4 2 ) . T h e v o l u m e t r i c C O D l o a d i n g r a t e e x c e e d e d 6 g / L - d ( F i g u r e 2 . 4 a ) , r e s u l t i n g i n a s p e c i fi c l o a d i n g r a t e g r e a t e r t h a n 0 . 4 g / g V S S - d ( F i g u r e 2 . 4 b ) . O n d a y 1 9 a f e w s m a l l g r a n u l e s , 0 . 1 t o 0 . 2 m m i n d i a m e t e r , w e r e o b s e r v e d a t t h e b o t t o m o f t h e s l u d g e b e d . U p o n i n c r e a s i n g t h e C O D l o a d i n g r a t e ( > 0 . 6 g / g V S S - d ) a n d t h e h y d r a u l i c l o a d i n g r a t e ( 0 . 3 7 t o 0 . 4 9 m / h r ) , g r a n u l a t i o n p r o g r e s s e d r a p i d l y . T h e s l u d g e b l a n k e t c o m p o s i t i o n c h a n g e d f r o m m o s t l y fl o c t o p r i m a r i l y g r a n u l e s w i t h i n 1 0 d a y s . O n d a y 4 2 t h e t o t a l a m o u n t o f s l u d g e i n t h e r e a c t o r r e a c h e d a m i n i m u m l e v e l d u e t o c o n t i n u o u s w a s h - o u t o f fl o c s . B y t h i s t i m e , m o s t o f t h e s l u d g e h a d b e c o m e g r a n u l a r i n n a t u r e . A d e n s e g r a n u l e b e d d e v e l o p e d b y t h e b e g i n n i n g o f P h a s e I I I ( d a y 4 3 t o d a y 7 5 ) . T h e g r a n u l e b e d i n c r e a s e d i n h e i g h t c o n t i n u o u s l y a s t h e v o l u m e t r i c C O D l o a d i n g r a t e w a s i n c r e a s e d f r o m 1 1 t o 3 2 g / L — d ( 0 . 9 t o 2 . 2 g C O D / g V S S - d ) . T h e s l u d g e b l a n k e t r e g i o n w a s h a d a s o l i d s c o n c e n t r a t i o n o f 3 t o 4 g S S / L , a n d t h e s l u d g e b e d h a d a c o n c e n t r a t i o n o f 7 0 g S S / L . B i o g a s p r o d u c t i o n r a n g e d f r o m 7 t o 1 7 L / L - d i n t h e r e a c t o r ( b i o g a s fl u x o f 0 . 2 8 t o 0 . 9 6 m / h r ) . C O D r e m o v a l w a s a b o u t 9 0 % a t a H R T o f 3 . 2 h o u r s w i t h a n i n fl u e n t C O D o f 4 , 2 5 0 m g / L . 5 9 5 , 0 0 0 - ~ 5 , 0 0 0 4 , 0 0 0 - H . 0 0 0 % 3 , 0 0 0 ‘ l n f l u e n t _ 3 , 0 0 0 E o 8 2 , 0 0 0 - * - 2 , 0 0 0 1 , 0 0 0 - ~ 1 , 0 0 0 E f f l u e n t . ‘ ~ . \ ¢ - - . o - - ‘ ~ - ' - ' \ - " " . - 0 I J r r 0 0 2 0 4 0 6 0 8 O 4 0 a . ” 1 0 0 E ' ~ ” . . . ~ ’ ~ ~ - . ’ . ‘ ¢ ’ ~ O - . n : ’ r C O D r e m o v a l _ 8 0 . . p A g A 3 0 . \ ' é a 3 ' ‘ - I a 1 ? ~ 6 0 g . 4 1 ’ 2 0 - O o 8 _ E l E 0 4 ° 1 1 I I I 9 a = 1 ° ‘ 2 . . 8 g C O D l o a d i n g r a t e > o T I I o 0 2 0 4 0 6 0 8 0 O P E R A T I O N A L T I M E ( d a y s ) F i g u r e 2 . 4 a O p e r a t i o n a l r e s u l t s o f r e a c t o r i n o c u l a t e d w i t h d i g e s t e d s l u d g e a n d f e d w i t h b r e w e r y w a s t e w a t e r ( r e a c t o r B ) 6 0 S p e c i fi c C O D l o a d i n g r a t e c o o L O A D o n c o o R E M O V A L R A T E ( 9 c o m g V S S - d a y ) ~ 0 . 5 0 8 0 - 7 0 0 6 0 0 - ‘ 6 0 0 ’ 6 5 ° 0 4 T e t a l S S F 5 0 0 g 4 0 0 - ~ 4 O O 9 i n 3 0 0 - , . . , . n a o o i - - — ' — ‘ . ~ ‘ Q v " ’ . 6 - 2 m “ ~ ~ " ‘ ' 2 m " " T e t a l V S S 1 0 0 ‘ ~ 1 0 0 O l r I 0 0 2 0 4 O 6 0 8 0 O P E R A T I O N A L T I M E ( d a y s ) F i g u r e 2 . 4 b O p e r a t i o n a l r e s u l t s o f r e a c t o r i n o c u l a t e d w i t h d i g e s t e d s l u d g e a n d f e d w i t h b r e w e r y w a s t e w a t e r ( r e a c t o r B ) 6 1 T a b l e 2 . 5 O p e r a t i o n a l r e s u l t s o f r e a c t o r i n o c u l a t e d w i t h d i g e s t e d s l u d g e a n d f e d w i t h b r e w e r y w a s t e w a t e r ( r e a c t o r B ) I n f . C O D C O D G a s D a t e C O D r e m o v a l l o a d i n g r a t e p r o d u c t i o n C H , 3 H R T d a y g / L % g / L — d g / g V S S - d L ( S T P ) / L - d % h r P h a s e 1 1 - 1 0 1 . 0 - 1 . 3 5 8 - 7 5 2 . 0 - 3 . 0 0 . 1 8 - 0 . 2 4 0 . 5 6 - 1 . 2 2 7 9 1 1 1 1 - 1 8 1 . 3 - 1 . 7 8 2 - 9 2 4 . 3 - 5 . 5 0 . 3 5 - 0 . 4 4 2 . 0 - 2 . 6 8 0 7 . 2 P h a s e I I 1 9 - 2 5 2 . 0 - 3 . 0 9 4 - 9 6 6 . 1 - 9 . 0 0 . 6 0 - 0 . 6 3 3 . 3 - 4 . 8 8 0 6 . 6 2 6 - 2 9 2 . 0 - 2 . 5 9 4 - 9 6 8 . 7 - 9 . 0 0 . 6 1 - 0 . 6 8 4 . 1 - 4 . 8 8 0 5 . 5 3 0 - 4 2 1 . 9 - 2 . 7 9 2 - 9 4 9 . 1 - 1 2 . 9 0 . 7 6 - 1 . 3 4 . 2 - 6 . 2 8 0 5 . 0 P h a s e I I I 4 3 - 5 9 2 . 3 - 2 . 8 8 9 - 9 2 1 1 . 0 - 1 3 . 7 0 . 9 - 1 . 4 0 5 . 7 - 6 . 9 8 0 5 . 0 6 0 - 6 6 2 . 9 - 3 . 0 8 6 - 9 2 1 7 . 0 - 1 8 . 3 1 . 3 - 1 . 4 0 7 . 1 - 8 . 6 7 9 4 . 0 6 7 - 7 5 2 . 7 - 4 . 2 5 8 9 - 9 2 2 2 . 5 - 3 1 . 7 1 . 5 - 2 . 2 1 0 - 1 7 . 2 7 9 3 . 2 T h e d a t e s e q u e n c e b e g i n s o n t h e fi r s t d a y o f t h e c o n t i n u o u s f e e d . 6 2 2 . 4 . 3 A c t i v a t e d s l u d g e a s i n o c u l u m f e d a g l u c o s e m o l a s s e s s o l u t i o n R e a c t o r C w a s u s e d t o i n v e s t i g a t e t h e g r a n u l a t i o n p r o c e s s u s i n g a c t i v a t e d s l u d g e a s t h e i n o c u l u m . A f t e r t h i c k e n i n g , a c t i v a t e d s l u d g e o f 2 2 l i t e r s , c o n t a i n i n g 1 7 9 g V S S ( v o l a t i l e f r a c t i o n o f 6 8 % ) , w a s a d d e d t o r e a c t o r C . T h i s r e s u l t e d i n a n a v e r a g e V S S c o n c e n t r a t i o n o f 7 . 8 g / L i n t h e r e a c t i o n r e g i o n . T h e r e a c t o r w a s f e d i n t e r m i t t e n t l y f o r 1 4 d a y s p r i o r t o t h e s t a r t o f c o n t i n u o u s f e e d . F o r t h e fi r s t 5 d a y s , g l u c o s e m o l a s s e s ( 2 0 g ) a n d N a H C O 3 ( 6 g ) w e r e a d d e d d a i l y t o r e a c t o r C ; t h e r e a f t e r , a g l u c o s e m o l a s s e s s o l u t i o n ( 1 0 0 0 m g C O D / L ) w a s f e d i n t e r m i t t e n t l y a t a fl o w o f l l i t e r / h r f o r 1 0 t o 1 2 h r e a c h d a y . T h e c o n t i n u o u s f e e d o p e r a t i o n l a s t e d 7 0 d a y s . C h a n g e s i n t h e v o l u m e t r i c a n d s p e c i fi c C O D l o a d i n g r a t e , C O D r e m o v a l , C O D c o n c e n t r a t i o n i n i n fl u e n t a n d e f fl u e n t , a n d t o t a l b i o m a s s c o n c e n t r a t i o n s ( S S a n d V S S ) a r e s u m m a r i z e d i n F i g u r e 2 . 5 . O p e r a t i o n a l d a t a a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 2 . 6 . A t t h e b e g i n n i n g o f t h e c o n t i n u o u s f e e d p e r i o d , t h e v o l u m e t r i c C O D l o a d i n g r a t e w a s s e t a t 1 . 0 g / L - d a y . C O D r e m o v a l w a s o n l y 6 5 % a t t h a t t i m e . A f t e r a w e e k , t h e C O D l o a d i n g r a t e w a s i n c r e a s e d t o 1 . 5 g / L - d a y a n d C O D r e m o v a l s o f 7 0 % w e r e o b s e r v e d . A s t h e o p e r a t i o n c o n t i n u e d , C O D l o a d i n g r a t e w a s i n c r e a s e d t o 6 . 0 g / L - d a y b y d a y 2 7 a n d t o c a . 1 2 . 0 g / L - d ( w i t h a C O D r e m o v a l o f 8 0 t o 8 5 % ) b y d a y 6 0 . A h i g h e r s p e c i fi c C O D l o a d i n g r a t e w a s a p p l i e d t o r e a c t o r C c o m p a r e d w i t h r e a c t o r A . A f t e r 2 0 d a y s o f c o n t i n u o u s o p e r a t i o n r e a c t o r C w a s l o a d e d t o m o r e t h a n 0 . 5 g C O D / g V S S - d . 6 3 T a b l e 2 . 6 O p e r a t i o n a l r e s u l t s o f r e a c t o r s t a r t e d w i t h a c t i v a t e d s l u d g e a n d f e d w i t h g l u c o s e - m o l a s s e s ( r e a c t o r C ) I n f . C O D C O D G a s D a t e C O D r e m o v a l l o a d i n g r a t e p r o d u c t i o n C I - I 4 H R T d a y g / L % g / L - d g / g V S S - d L ( S T P ) / L - d % h r P h a s e I + P h a s e I I 1 - 6 0 . 9 - 1 . 0 6 4 - 6 7 1 . 0 - 1 . 2 0 . 1 8 - 0 . 2 0 0 . 3 0 - 0 . 3 7 7 0 2 3 7 - 1 4 1 . 2 - 1 . 5 7 0 - 7 4 1 . 5 - 1 . 9 0 . 3 2 - 0 . 3 5 0 . 4 9 - 0 . 6 0 6 7 - 7 0 2 0 1 5 - 1 9 1 . 2 - 1 . 4 6 7 - 7 0 2 . 0 - 2 . 5 0 . 3 6 - 0 . 4 6 0 . 6 6 - 0 . 7 8 6 7 1 5 2 0 - 2 3 1 . 3 - 1 . 6 6 8 - 7 3 3 . 4 - 3 . 8 0 . 4 8 — 0 . 6 3 0 . 8 2 - 0 . 9 2 6 8 1 0 2 4 - 3 8 1 . 5 - 1 . 8 6 6 - 7 7 5 . 3 - 6 . 8 0 . 6 7 - 0 . 9 9 1 . 3 - 2 . 2 6 6 7 P h a s e I I I 3 9 - 6 0 2 . 1 - 3 . 0 7 8 - 9 0 7 . 5 - 9 . 9 0 . 9 5 - l . 1 2 . 5 - 3 . 7 6 8 7 6 1 - 7 0 3 . 6 - 3 . 8 8 0 - 8 5 1 1 . 8 - 1 3 . 2 1 . 2 - 1 . 4 4 . 2 - 5 . 1 6 7 7 T h e d a t e s e q u e n c e b e g i n s o n t h e fi r s t d a y o f t h e c o n t i n u o u s f e e d . ) t / a I " ( D O C 4 3 2 , : , 0 0 0 0 0 0 0 0 0 - " _ 1 $ 0 0 0 " ‘ o 0 l n f l u e n t ‘ . ‘ ~ l \ " . . - - - " - 2 , ° E I f fl u ~ e " ‘ \ - ~ \ m 6 ' . 0 - . ° 4 : , , 0 0 0 0 0 0 0 0 0 , o o o - " . _ P 4 3 2 1 o s o - 1 0 0 ) 6 9 ( L A V O M E R D O C v o w u e r n l c L O A D I N G R A T E ( g c o o / L - d a y ) F i g u r e 2 . 5 a 6 4 O P E R A T I O N A L T I M E ( d a y s ) O p e r a t i o n a l r e s u l t s o f r e a c t o r i n o c u l a t e d w i t h a c t i v a t e d s l u d g e a n d f e d w i t h g l u c o s e - m o l a s s e s ( r e a c t o r C ) 6 5 E 1 . 2 - S p e c i fi c c o o l o a d i n g r a t e — 1 . 2 E 2 ' - 1 > 3 ‘ . § § # 0 3 m ( 0 3 " : 1 w e 0 \ O 3 8 ~ 0 . 4 2 3 3 - 0 . 2 8 o 0 8 0 - 4 0 0 3 - 3 0 0 3 Q - 2 0 0 m e . ~ I 7 1 ' ~ . . . ‘ , . ’ T o t a l V S S . — , 9 1 0 0 - - 1 0 0 0 t . 3 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 O P E R A T I O N A L T I M E ( d a y s ) F i g u r e 2 . 5 b O p e r a t i o n a l r e s u l t s o f r e a c t o r i n o c u l a t e d w i t h a c t i v a t e d s l u d g e a n d f e d w i t h g l u c o s e - m o l a s s e s ( r e a c t o r C ) 6 6 G r a n u l e s s t a r t e d t o f o r m o n d a y 3 3 . T h e C O D l o a d i n g r a t e w a s b e t w e e n 0 . 8 t o 0 . 9 6 g / g V S S - d a t t h a t t i m e . T h e p H v a l u e o f t h e e f fl u e n t w a s m a i n t a i n e d a t 7 . 0 t o 7 . 3 , b u t t h e a l k a l i n i t y i n t h e e f fl u e n t v a r i e d f r o m 4 0 0 m g / L t o 8 0 0 m g / L ( a s C a C O 3 ) d e p e n d i n g u p o n t h e N a 3 C O 3 a d d i t i o n r a t e . T h e g r a n u l a t i o n p r o c e s s w a s s o m e w h a t s i m i l a r t o t h a t o b s e r v e d i n r e a c t o r s A a n d B w i t h s o m e e x c e p t i o n s . T h e c h a n g e s o f t o t a l b i o m a s s ( a s S S a n d V S S ) a p p e a r e d t o b e t h e s a m e a s i n r e a c t o r s A a n d B . T h e g r a n u l a t i o n p r o c e s s f o l l o w e d t h e t h r e e p h a s e s a s b e f o r e ( T a b l e 2 . 6 ) . H o w e v e r , p h a s e I a n d p h a s e I I ( d a y 1 t o d a y 3 8 ) c a n b e c o m b i n e d s i n c e a s i g n i fi c a n t s l u d g e b e d e x p a n s i o n d i d n o t o c c u r . A t t h e b e g i n n i n g o f c o n t i n u o u s o p e r a t i o n , t h e s l u d g e b e d v o l u m e h a d s t a b i l i z e d d u e t o t h e 1 4 d a y s o f p r e - i n c u b a t i o n o f a c t i v a t e d s l u d g e u n d e r a n a e r o b i c c o n d i t i o n s . A f t e r i n i t i a t i n g c o n t i n u o u s o p e r a t i o n , t h e l i g h t f r a c t i o n o f s l u d g e i n r e a c t o r C w a s h e d - o u t . O n d a y 2 0 , t h e t o t a l a m o u n t o f s l u d g e ( o r S S ) r e t a i n e d i n t h e r e a c t o r w a s r e d u c e d t o a m i n i m u m l e v e l , 6 7 % o f t h e o r i g i n a l l e v e l ( F i g u r e 2 . 5 b ) . A t t h a t t i m e , g r a n u l e s w e r e n o t o b s e r v e d i n t h e s l u d g e b e d . G r a n u l e s w e r e o b s e r v e d p r i o r t o r e a c h i n g t h e m i n i m u m s o l i d l e v e l i n r e a c t o r s A a n d B . T h i s w a s a l s o o b s e r v e d b y H u l s h o f f P o l e t a l . ( 1 9 8 3 ) a n d d e Z e e u w ( 1 9 8 4 ) i n t h e i r w o r k . I t w a s n o t u n t i l d a y 3 3 t h a t g r a n u l a r s l u d g e b e g a n t o a p p e a r i n t h e l o w e r p o r t i o n o f r e a c t o r C . T h e s l u d g e b e d r e g i o n i n r e a c t o r C fi l l e d - u p w i t h g r a n u l e s d u r i n g t h e f o l l o w i n g w e e k . S u b s e q u e n t l y ( p h a s e I I I ) , t h e t o t a l a m o u n t o f s l u d g e i n c r e a s e d s i g n i fi c a n t l y a s g r a n u l e s g r e w i n s i z e . 2 . 4 . 4 S l u d g e p r o f i l e d u r i n g g r a n u l a t i o n p r o c e s s T y p i c a l s l u d g e p r o fi l e s i n r e a c t o r s A , B a n d C d u r i n g g r a n u l a t i o n a r e i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 2 . 6 . T h e s l u d g e p r o fi l e s o f t h e d i f f e r e n t p h a s e s o f g r a n u l a t i o n p r o c e s s i n r e a c t o r s A a n d B w e r e s i m i l a r t o t h o s e r e p o r t e d b y H u l s h o f f P o l e t a l . ( 1 9 8 3 ) a n d d e 6 7 Z e e u w ( 1 9 8 4 ) . B u t c h a n g e s i n t h e s l u d g e p r o fi l e s o f r e a c t o r C w e r e s l i g h t l y d i f f e r e n t . I n b o t h r e a c t o r s A a n d B , t h r e e d i s t i n c t s l u d g e p r o fi l e s w e r e o b s e r v e d d u r i n g t h e d i f f e r e n t p h a s e s o f g r a n u l a t i o n . A t t h e b e g i n n i n g ( p h a s e I ) , s l u d g e w a s n o t a c t i v e a n d b i o g a s p r o d u c t i o n w a s l o w e r t h a n 1 L I L - d a y ; t h u s , t h e s l u d g e c o n c e n t r a t i o n i n t h e s l u d g e b l a n k e t r e g i o n w a s l o w a n d m o s t s l u d g e a c c u m u l a t e d a t t h e b o t t o m ( d a y 6 7 a n d d a y 2 i n F i g u r e 2 . 6 a a n d 2 . 6 b , r e s p e c t i v e l y ) . A s v o l u m e t r i c C O D l o a d i n g r a t e a n d t h e a c t i v i t y o f s l u d g e i n c r e a s e d ( p h a s e I I ) , t h e c o n c e n t r a t i o n o f s l u d g e i n s l u d g e b l a n k e t a l s o i n c r e a s e d u p t o 2 0 g S S / L o r m o r e a n d t h e c o n c e n t r a t i o n a l o n g t h e r e a c t o r p r o fi l e b e c a m e m o r e u n i f o r m ( d a y 9 3 a n d d a y 2 5 i n F i g u r e s 2 . 6 a a n d 2 . 6 b , r e s p e c t i v e l y ) . A t t h e e n d o f t h e p h a s e I o r i n p h a s e I I , t h e i n t e r f a c e b e t w e e n t h e s l u d g e b e d a n d t h e s l u d g e b l a n k e t b e c a m e d i f fi c u l t t o o b s e r v e . A s t h e r e a c t o r s b e c a m e fi l l e d w i t h g r a n u l e s ( p h a s e I I I ) , t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n s l u d g e b e d a n d s l u d g e b l a n k e t r e g i o n a g a i n b e c a m e v i s i b l e , w i t h l o w s o l i d s c o n c e n t r a t i o n s i n t h e s l u d g e b l a n k e t a n d h i g h c o n c e n t r a t i o n s i n t h e s l u d g e b e d ( d a y 1 5 7 a n d d a y 6 2 i n F i g u r e s 2 . 6 a a n d 2 . 6 b , r e s p e c t i v e l y ) . I n r e a c t o r C , t h e c o n c e n t r a t i o n i n t h e s l u d g e b e d w a s l o w e r t h a n i n r e a c t o r s A a n d B t h r o u g h o u t ( F i g u r e 2 . 6 c ) . H i g h c o n c e n t r a t i o n s o f s o l i d s i n t h e s l u d g e b l a n k e t w e r e n o t o b s e r v e d . 2 . 4 . 5 G r o w t h r a t e o f g r a n u l e s a n d s l u d g e y i e l d G r o w t h r a t e o f g r a n u l a r b e d i s s t r o n g l y d e p e n d e n t o n t h e s p e c i fi c C O D l o a d i n g r a t e a p p l i e d a n d f e e d s u b s t r a t e . T h e g r t h r a t e o f t h e g r a n u l e b e d w a s e s t i m a t e d b a s e d o n t h e c h a n g e i n g r a n u l e b e d h e i g h t . T h e r a t e w a s a p p r o x i m a t e l y 0 . 0 1 5 d a y ’ 1 i n r e a c t o r A w h e n t h e s p e c i fi c C O D l o a d i n g r a t e w a s a b o u t 0 . 7 g / g V S S - d a y , 0 . 0 0 9 4 d a y ' 1 i n r e a c t o r B a t a C O D l o a d i n g r a t e o f 1 . 5 t o 2 . 2 g / g V S S - d , a n d 0 . 0 0 9 5 d a y ‘ l i n r e a c t o r C a t C O D l o a d i n g r a t e o f 0 . 8 g / g V S S - d ( T a b l e 2 . 7 ) . F i g u r e 2 . 6 6 8 2 . 5 - R e a c t o r A 2 C T h e 6 7 t h d a y A I T h e 9 3 r d d a y E , 1 5 q A T h e 1 5 7 t h d a y 6 m 1 0 I 0 . 5 - o ' I T I r I ' I 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 . 5 ' - R e a c t o r B 2 " C T h e 2 n d d a y E I T h e 2 5 t h d a y V 1 . 5 ~ A T h e 6 2 n d d a y 3 1 - 1 I 0 . 5 - 0 f 1 r t ' I ' ' ' ' ' ‘ 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 2 - R e a c t o r C O T h e 2 0 t h d a y A I T h e 2 8 t h d a y g A T h e 4 3 r d d a y 8 \ ~ ~ ~ ~ e — e e ~ _ . . ‘ I ‘ I . . . ~ . 3 Q ~ ’ . 1 3 - - - ! 9 ’ - 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 S L U D G E C O N C E N T R A T I O N ( g S S / I ) C I n P h a s e I I I n P h a s e I I A I n P h a s e m C o m p a r i s o n o f t h e s l u d g e c o n c e n t r a t i o n p r o fi l e s i n r e a c t o r s A , B a n d C d u r i n g g r a n u l a t i o n . 6 9 T h e a p p a r e n t s l u d g e y i e l d c o e f fi c i e n t w a s e s t i m a t e d b y c o m p a r i n g t h e q u a n t i t y o f t h e s l u d g e i n c r e a s e i n t h e r e a c t o r p l u s s o l i d s i n t h e e f fl u e n t v e r s u s t h e q u a n t i t y o f C O D r e m o v e d . T h e a p p a r e n t s l u d g e y i e l d c o e f fi c i e n t s w e r e 0 . 0 7 4 , 0 . 0 4 9 , a n d 0 . 0 8 g V S S / g C O D f o r r e a c t o r s A , B a n d C , r e s p e c t i v e l y ( T a b l e 2 . 7 ) . T a b l e 2 . 7 C o m p a r i s o n o f p e r f o r m a n c e o f g r a n u l e s f r o m r e a c t o r s A , B a n d C ( 3 5 ° C ) R e a c t o r A B C F e e d g l u c o s e b r e w e r y g l u c o s e I n o c u l u m C O D r e m o v a l r a t e g / g V S S - d 0 . 0 6 0 . 1 2 0 . 1 G r a n u l e s C O D r e m o v a l r a t e g / g V S S - d 0 . 6 2 2 . 0 1 . 0 g / L ( g r a n u l e s ) - d 3 5 . 9 1 3 2 . 0 3 6 . 0 C H 4 p r o d u c t i o n r a t e L ( S T P ) / L ( g r a n u l e s ) - d 1 0 . 8 4 7 . 5 1 1 . 0 G r a n u l e g r o w t h r a t e ( 1 / d ) 0 . 0 1 5 0 . 0 0 9 4 0 . 0 0 9 5 S l u d g e y i e l d ( g V S S / g C O D r e m o v e d ) 0 . 0 7 4 0 . 0 4 9 0 . 0 8 0 T o t a l m e t h a n o g e n s M P N ( 1 0 l l c e l l s / g S S ) 4 . 5 5 . 4 2 . 9 ( 1 ) A c t i v i t y o f i n o c u l u m s l u d g e w a s c a l c u l a t e d b a s e d o n o p e r a t i o n a l d a t a . ( 2 ) G r a n u l a r b e d v o l u m e w a s o p e r a t i o n a l v o l u m e , c a l c u l a t e d b a s e d o n t h e m e a s u r e d b e d h e i g h t . ( 3 ) M P N n u m b e r o f m e t h a n o g e n s w a s e n u m e r a t e d u s i n g 3 t u b e s p e r d i l u t i o n . ( 4 ) T h e C O D r e m o v a l r a t e o f i n o c u l u m w a s d e t e r m i n e d a f t e r p r e - i n c u b a t i o n p e r i o d . 7 0 2 . 5 C H A R A C T E R I Z A T I O N O F G R A N U L E S D E V E L O P E D O N C O M P L E X S U B S T R A T E S 2 . 5 . 1 P h y s i c a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d c h e m i c a l c o m p o s i t i o n T h e s i z e d i s t r i b u t i o n o f t h e g r a n u l e s t a k e n f r o m t h e u p p e r p o r t i o n o f r e a c t o r s A a n d B i s s h o w n i n F i g u r e 2 . 7 . A l t h o u g h t h e s e s a m p l e s m i g h t n o t c o n t a i n s o m e o f t h e l a r g e r s i z e g r a n u l e s ( > 3 . 0 m m i n d i a m e t e r ) w h i c h a c c u m u l a t e d a t t h e r e a c t o r b o t t o m , t h e y a r e r e a s o n a b l y r e p r e s e n t a t i v e s a m p l e s s i n c e t h e g r a n u l e s w e r e w e l l m i x e d b y t h e h i g h r a t e o f b i o g a s p r o d u c t i o n . T h e m a j o r f r a c t i o n o f g r a n u l e s w a s o b s e r v e d t o b e b e t w e e n 0 . 3 a n d 0 . 7 m m i n d i a m e t e r i n t h e t w o r e a c t o r s . R e a c t o r A , h o w e v e r , c o n t a i n e d m o r e g r a n u l e s w i t h a l a r g e s i z e t h a n r e a c t o r B . I n r e a c t o r A , 9 0 % o f t o t a l g r a n u l e v o l u m e w a s c o n t r i b u t e d b y t h e g r a n u l e s w i t h a d i a m e t e r o f 1 . 0 m m o r m o r e c o m p a r e d t o r e a c t o r B ( 4 8 . 7 % ) . T h e s i z e o f g r a n u l e s i n r e a c t o r C a p p e a r e d t o b e l a r g e r t h a n r e a c t o r A a n d B , r a n g i n g f r o m 0 . 2 t o 2 . 0 m m i n d i a m e t e r . G r a n u l e s u p t o 4 m m i n s i z e w e r e o b s e r v e d . T h e p h y s i c a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d c h e m i c a l c o m p o s i t i o n o f t h e g r a n u l e s f r o m r e a c t o r s A , B , a n d C w e r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 2 . 7 . T h e s p e c i fi c g r a v i t y o f t h e g r a n u l e s i n r e a c t o r A , B a n d C r a n g e d f r o m 1 . 0 2 t o 1 . 0 4 . T h e g r a n u l e s o r i g i n a t i n g f r o m d i g e s t e d s l u d g e h a d a h i g h e r s p e c i fi c g r a v i t y a n d d e n s i t y t h a n t h o s e o b t a i n e d f r o m a c t i v a t e d s l u d g e . T h e c o n t e n t o f K j e l d a h l - n i t r o g e n a n d t h e r a t i o b e t w e e n V S S a n d S S i n t h e t h r e e l a b - s c a l e U A S B r e a c t o r s w e r e a p p r o x i m a t e l y t h e s a m e . A l l t h e g r a n u l e s c o n t a i n e d s i g n i fi c a n t a m o u n t s o f p r e c i p i t a t e d c a l c i u m , m a g n e s i u m a n d i r o n . I ‘ \ \ \ \ \ ‘ X L X \ \ \ \ \ \ \ \ E R M E U B L M O U V N L L A A T T O O T T F F O O % % R O 7 1 3 5 - R e a c t o r A 3 0 a t 2 5 q U V e l u ' n e 2 0 u 3 ' . M r I ' I I I I I I I ’ 0 . 1 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 1 . 0 1 . 2 1 . 4 1 . 6 1 . 8 2 . 0 2 . 2 2 . 4 2 . 8 > 3 . 0 5 0 . 5 0 - ; R e a c t o r a . 4 0 " g D V e h m e ‘ 3 0 - g / 3 ° . / A / / 0 ‘ 4 / I ' I ’ I r 4 0 . 6 0 . 8 1 . 0 1 . 2 0 . 1 0 . 2 0 . 1 . 4 1 . 8 > 1 3 S I Z E O F G R A N U L E S ( m m ) F i g u r e 2 . 7 S i z e d i s t r i b u t i o n o f g r a n u l e s f r o m r e a c t o r s A a n d B . G r a n u l e s f r o m r e a c t o r A ( t o t a l n u m b e r 7 8 2 ) w e r e w i t h d r a w n f r o m t h e s a m p l i n g p o r t a t 0 . 7 m h e i g h t ( g r a n u l e b e d h e i g h t w a s a b o u t 1 m a t t h a t t i m e ) a f t e r 1 8 0 d a y s o f o p e r a t i o n . G r a n u l e s f r o m r e a c t o r B ( t o t a l n u m b e r 5 8 7 ) w e r e f r o m t h e s a m p l i n g p o r t a t 0 . 4 m ( g r a n u l e b e d h e i g h t w a s 0 . 6 m ) a f t e r 6 0 d a y s o f o p e r a t i o n . 7 2 T a b l e 2 . 8 C o m p a r i s o n o f p h y s i c a l a n d c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f g r a n u l e s i n r e a c t o r s A , B a n d C R e a c t o r A B C S p e c i fi c g r a v i t y 1 . 0 4 1 . 0 3 1 . 0 2 D e n s i t y ( g S S / L ) 1 1 0 1 1 2 7 0 . 6 V S S / S S 0 . 8 4 0 . 8 6 0 . 8 4 K j e l d a h l - N ( g / g V S S ) 0 . 2 6 0 . 2 7 0 . 2 9 A s h ( % ) 1 6 1 4 1 6 M e t a l c o n t e n t ( m g / g S S ) C a l c i u m 1 9 . 0 2 1 . 0 8 . 9 M a g n e s i u m 3 . 9 2 . 7 1 5 I r o n 3 . 0 1 . 9 1 0 . 6 N i c k e l 0 . 3 3 0 . 2 7 0 . 2 6 C o b a l t 0 . 0 4 0 . 0 3 0 . 0 3 5 Z i n c 0 . 3 6 0 . 8 5 0 . 8 9 S o d i u m 2 2 . 8 2 1 . 9 2 2 . 1 P o t a s s i u m 0 . 6 1 0 . 7 6 0 . 8 6 M a n g a n e s e i n a l l g r a n u l e s w a s b e l o w d e t e c t i o n l i m i t ( < 0 . 0 1 m g / g S S ) . 7 3 2 . 5 . 2 O p e r a t i o n a l p e r f o r m a n c e o f g r a n u l e s O p e r a t i o n a l p e r f o r m a n c e o f t h e g r a n u l a r s l u d g e s p r o d u c e d i n r e a c t o r s A , B a n d C i s a l s o s u m m a r i z e d i n T a b l e 2 . 7 . I n r e a c t o r A , i n o c u l a t e d a n a e r o b i c d i g e s t e d s e w a g e s l u d g e h a d a s p e c i fi c C O D r e m o v a l r a t e o f 0 . 0 6 g C O D / g V S S - d . A f t e r g r a n u l a t i o n , t h e a c t i v i t y i n c r e a s e d t o a b o u t 0 . 6 g C O D / g V S S - d w i t h t h e g l u c o s e m o l a s s e s s o l u t i o n a s f e e d . T h e C O D c o n c e n t r a t i o n i n t h e e f fl u e n t w a s m a i n t a i n e d l o w ( 3 8 0 t o 4 0 0 m g / L ) a n d i n c l u d e d s o m e a c e t a t e ( 1 t o 1 . 2 m M ) a n d p r o p i o n a t e ( 0 . 4 t o 0 . 6 m M ) . T h e i n i t i a l s p e c i fi c C O D r e m o v a l r a t e i n r e a c t o r B w a s 0 . 1 g C O D / g V S S - d a n d a fi n a l s p e c i fi c C O D r e m o v a l r a t e o f 2 . 0 g C O D / g V S S - d a y w a s a c h i e v e d w h e n t h e v o l u m e t r i c l o a d i n g r a t e w a s 3 2 g / L - d a y ( C O D r e m o v a l o f 9 0 % ) . A t t h a t t i m e t h e e f fl u e n t c o n t a i n e d 1 m M a c e t a t e a n d 0 . 2 6 m M p r o p i o n a t e . A s s h o w n i n F i g u r e 2 . 5 b , t h e s p e c i fi c C O D r e m o v a l r a t e o f r e a c t o r C w a s i n i t i a l l y 0 . 1 g / g V S S - d a t t h e b e g i n n i n g o f c o n t i n u o u s f e e d . A t t h e e n d o f t h e e x p e r i m e n t , t h e m a x i m u m s p e c i fi c C O D r e m o v a l r a t e w a s e s t i m a t e d t o b e 1 . 0 g C O D / g V S S - d , w i t h a n e f fl u e n t C O D o f 5 0 0 m g / L . C o m p a r i n g t h e d a t a o f t h e t h r e e r e a c t o r s , t h e g r a n u l e s f e d w i t h b r e w e r y w a s t e w a t e r h a d t h e h i g h e s t a c t i v i t y a m o n g t h e t h r e e g r a n u l e s . I t s h o u l d b e n o t e d t h a t t h e C O D c o n c e n t r a t i o n i n t h e t h r e e r e a c t o r s w a s n o r m a l l y m a i n t a i n e d l o w e r t h a n 3 0 0 m g / L a n d d i d n o t e x c e e d 6 0 0 m g / L . T h e f a t t y a c i d c o n c e n t r a t i o n s i n t h e r e a c t o r s w e r e a l w a y s c o n t r o l l e d a t l o w e r t h a n 1 t o 2 m M a c e t a t e a n d 1 . 0 m M p r o p i o n a t e . I f t h e e f fl u e n t f a t t y a c i d c o n c e n t r a t i o n s w e r e m a i n t a i n e d a t a h i g h e r l e v e l , t h e s p e c i fi c a c t i v i t y w o u l d l i k e l y b e e n h a n c e d . T h e M P N e n u m e r a t i o n i n d i c a t e s t h a t t h e t o t a l n u m b e r s o f m e t h a n o g e n s i n t h e g r a n u l e s p r o d u c e d i n t h e t h r e e r e a c t o r s w e r e a t t h e s a m e l e v e l ( 1 0 " / g S S ) ( T a b l e 2 . 7 ) . 7 4 2 . 5 . 3 M i c r o s c o p i c a n d s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n . i ) M i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n I n g r a n u l e s t a k e n f r o m r e a c t o r s A , B , a n d C , a l a r g e n u m b e r o f b a c t e r i a a u t o fl u o r e s c i n g b l u e - g r e e n u n d e r U V l i g h t w e r e o b s e r v e d . M o s t o f t h e s e b a c t e r i a w e r e r o d s , w i t h a f e w s a r c i n a a n d c o c c i . T h e s e m e t h a n o g e n - l i k e b a c t e r i a m a y h a d b e e n M e t h a n o b a c t e r i u m , M e t h a n o s a r c i n a a n d M e t h a n o c o c c u s r e s p e c t i v e l y . I n a d d i t i o n , a f e w s p i r a l fi l a m e n t s w i t h a u t o fl u o r e s c e n c e w e r e a l s o o b s e r v e d a n d a p p e a r e d m o r p h o l o g i c a l l y s i m i l a r t o M e t h a n o s p i r i l l u m s p . A l a r g e n u m b e r o f b a m b o o - s h a p e d , M e t h a n o t h r i x - l i k e fi l a m e n t o u s b a c t e r i a , w h i c h d i d n o t s h o w a u t o fl u o r e s c e n c e w e r e t h e d o m i n a n t b a c t e r i a l m o r p h o t y p e i n t h e g r a n u l e s . i i ) S E M e x a m i n a t i o n . T h e S E M p h o t o g r a p h s o f t h e g r a n u l e s f r o m r e a c t o r s A , B a n d C a r e s h o w n i n F i g u r e 2 . 8 . T h e o v e r a l l s u r f a c e o f t h e g r a n u l e s w a s r o u g h a n d u n e v e n ( F i g u r e 2 . 8 A , B a n d C ) . S o m e c r y s t a l s a n d p r e c i p i t a t e s w e r e e m b e d d e d i n t h e g r a n u l e s . T h e s e p r e c i p i t a t e s c o n t a i n e d C a o r S i a s m a j o r c o m p o n e n t s a s d e t e r m i n e d w h e n a n a l y z e d b y e n e r g y d i s p e r s i v e X - r a y s p e c t r o m e t r y . I n a d d i t i o n , i r o n w a s d i s p e r s e d u n i f o r m l y o n t h e s u r f a c e o f t h e g r a n u l e s a n d t h r o u g h t h e c r o s s s e c t i o n o f g r a n u l e s , m o s t l i k e l y a s f e r r o u s s u l fi d e p r e c i p i t a t e s . 7 5 F i g u r e 2 . 8 S E M s g r a p h s o f g r a n u l e s f r o m r e a c t o r s A ( A , D a n d G ) , B ( B , E a n d H ) a n d C ( C , F a n d I ) . A , B , a n d C : O u t l i n e s o f g r a n u l e s . D , E , a n d F : M e t h a n a o t h r i x s p . o n t h e s u r f a c e o f g r a n u l e s . G , H a n d I : A g g r e g a t e s o f M e t h a n o s a r c i n a s p . o n t h e s u r f a c e o f g r a n u l e s . 7 6 7 7 A h e t e r o g e n e o u s b a c t e r i a l p o p u l a t i o n w a s o b s e r v e d o n t h e s u r f a c e o f t h e g r a n u l e s . M o s t o f t h e b a c t e r i a c o u l d n o t b e d e fi n i t i v e l y i d e n t i fi e d u s i n g o n l y t h e i r m o r p h o l o g y . H o w e v e r , s o m e m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a h a v i n g d i s t i n c t m o r p h o t y p e s w e r e e a s y t o r e c o g n i z e . L o n g fi l a m e n t o u s r o d s w e r e o b s e r v e d o n t h e g r a n u l e s f r o m r e a c t o r s A a n d B ( F i g u r e 2 . 8 D a n d E ) , w h i l e r o d c h a i n s c o n s i s t i n g o f 2 t o 5 c e l l s w e r e o b s e r v e d f r e q u e n t l y i n t h e g r a n u l e s o f r e a c t o r C ( F i g u r e 2 . 8 F ) . B o t h t h e s e r o d s ( 0 . 7 t o 0 . 8 p m i n d i a m e t e r ) s h o w e d t h e t y p i c a l m o r p h o t y p e ( b a m b o o - l i k e ) o f M e t h a n o t h r i x s p e c i e s ( Z e h n d e r e t a l . 1 9 8 0 ; P a t e l , 1 9 8 4 ; Z i n d e r e t a l . 1 9 8 4 a ; T o u z e l e t a 1 . 1 9 8 8 ) . T h e l o n g fi l a m e n t s a r e p r e s u m a b l y M e t h a n o t h r i x s o e h n g e n i i w h i l e t h e s h o r t c h a i n e d r o d s m i g h t b e a n u n i d e n t i fi e d M e t h a n o t h r i x s p . I n a d d i t i o n , b a c t e r i a r e s e m b l i n g M e t h a n o s a r c i n a s p . w e r e d i s p e r s e d o v e r t h e s u r f a c e o f t h e g r a n u l e s f r o m t h e t h r e e r e a c t o r s ( F i g u r e 2 . 8 6 , H a n d I ) . 2 . 6 D I S C U S S I O N 2 . 6 . 1 F e a s i b i l i t y o f u s i n g a c t i v a t e d s l u d g e a s i n o c u l u m M P N e n u m e r a t i o n a n d r e a c t o r e x p e r i m e n t s d e m o n s t r a t e d t h a t a c t i v a t e d s l u d g e i s a v i a b l e a l t e r n a t i v e i n o c u l u m t o d i g e s t e d s e w a g e s l u d g e f o r t h e c u l t i v a t i o n o f a n a e r o b i c g r a n u l e s . I t i s e s s e n t i a l t h a t t h e i n o c u l u m m a t e r i a l f o r a n a n a e r o b i c r e a c t o r c o n t a i n a m o d e s t m i c r o b i a l e c o s y s t e m i n v o l v e d i n m e t h a n o g e n e s i s , a n d t h i s e c o s y s t e m s h o u l d c o n t a i n a c o n s i d e r a b l e v a r i e t y o f m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a i n c l u d i n g h y d r o g e n u t i l i z i n g a n d a c e t a t e u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s . M i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n a n d S E M o b s e r v a t i o n s h o w e d t h e e x i s t e n c e o f a v a r i e t y o f m e t h a n o g e n - l i k e b a c t e r i a r e s e m b l i n g M e t h a n o b a c t e r i u m , M e t h a n o c o c c u s a n d M e t h a n o s a r c i n a i n t h e a c t i v a t e d s l u d g e s 7 8 e n u m e r a t e d b y M P N t e c h n i q u e , a n d i n t h e g r a n u l e s c u l t i v a t e d u s i n g t h i s i n o c u l u m . M e t h a n o s p i r i l l u m - l i k e b a c t e r i a a n d M e t h a n o t h r i x - l i k e b a c t e r i a f o u n d i n t h e g r a n u l e s , p r o b a b l y a l s o o r i g i n a t e d f r o m t h e a c t i v a t e d s l u d g e . S i m i l a r o b s e r v a t i o n s w e r e m a d e f o r o t h e r a n a e r o b i c g r a n u l e s c u l t i v a t e d u s i n g a c t i v a t e d s l u d g e f r o m a t e x t i l e w a s t e w a t e r f a c i l i t y ( W u e t a l . , 1 9 8 7 b ) a n d a V F A m i x t u r e ( G u y o u t e t a l . , 1 9 9 0 ) . A l t h o u g h o t h e r i m p o r t a n t a n a e r o b e s ( i . e . h y d r o l y s i s - f e r m e n t a t i v e b a c t e r i a a n d s y n t r o p h i c a c e t o g e n s ) w e r e n o t i n v e s t i g a t e d , t h e s u c c e s s f u l s t a r t - u p o f r e a c t o r C w i t h a c t i v a t e d s l u d g e a s i n o c u l u m d e m o n s t r a t e d t h a t a c t i v a t e d s l u d g e s p o s s e s s t h o s e b a c t e r i a . M e t h a n e p r o d u c t i o n f r o m g l u c o s e a n d o t h e r c a r b o h y d r a t e s s h o u l d p a s s t h r o u g h s e v e r a l i n t e r m e d i a t e s s u c h a s p r o p i o n a t e , b u t y r a t e a n d e t h a n o l e t c . ( C o h e n 1 9 8 2 ; C o h e n e t a l . , 1 9 8 4 ; C h a r t r a i n a n d Z e i k u s , 1 9 8 6 a , 1 9 8 6 b ) . T h e r e s u l t s o f b a c t e r i a l e n u m e r a t i o n r e v e a l e d t h a t t h e f o u r a c t i v a t e d s l u d g e s , w h i c h a p p e a r t y p i c a l o f m o s t a c t i v a t e d s l u d g e s , c o n t a i n e d a l m o s t i d e n t i c a l n u m b e r s o f m e t h a n o g e n s , u p t o 1 0 8 c e l l s / g S S ( T a b l e 2 . 2 ) . T h i s v a l u e i s l a r g e r t h a n t h a t o b s e r v e d i n f r e s h w a t e r s e d i m e n t s i . e . 1 0 2 t o 1 0 6 / g S S ( Z e i k u s a n d W i n f r e y , 1 9 7 6 ) , a n d a p p r o x i m a t e l y e q u a l t o t h a t d e t e r m i n e d i n a l o t u s p o n d m u d , i . e . 4 x 1 0 7 / g m u d . T h e l a t t e r s o u r c e w a s s u c c e s s f u l l y u s e d a s t h e i n o c u l u m f o r a d i g e s t o r ( O i e r a l . , 1 9 8 5 ) . T h i s m e a n s t h a t a c t i v a t e d s l u d g e h a s a s u f fi c i e n t p o p u l a t i o n o f m e t h a n o g e n s t o b e u t i l i z e d a s t h e i n o c u l u m f o r a n a e r o b i c p r o c e s s e s . T h e M P N v a l u e s f o r m e t h a n o g e n s i n a c t i v a t e d s l u d g e s w e r e , h o w e v e r , s m a l l e r t h a n t h o s e o f a n a e r o b i c d i g e s t e d s l u d g e . F o r e x a m p l e , Z e i k u s ( 1 9 7 9 ) r e p o r t e d 1 0 8 / m L ( a b o u t 1 0 m c e l l s / g S S ) i n a d i g e s t e d s l u d g e , a n d Z h a o e t a 1 . ( 1 9 8 5 ) f o u n d 1 0 7 / m L ( 1 0 9 t o 1 0 1 0 c e l l s / g S S ) i n a d i g e s t e d r u r a l w a s t e s l u d g e . T h e M P N v a l u e s f o r m e t h a n o g e n s i n a c t i v a t e d s l u d g e w i l l b e o n e o r t w o m a g n i t u d e s s m a l l e r t h a n t h o s e i n t h e d i g e s t e d s l u d g e s i f t h e d i g e s t e d s l u d g e s c o n t a i n 3 0 t o 1 0 0 g S S / L . T h u s , s t a r t - u p o f a n a n a e r o b i c r e a c t o r u s i n g a c t i v a t e d s l u d g e m a y 7 9 r e q u i r e a l o n g e r p e r i o d t h a n d i g e s t e d s l u d g e i n o r d e r t o a c c u m u l a t e a s u f fi c i e n t p o p u l a t i o n o f m e t h a n o g e n s a n d s y n t r o p h i c a c e t o g e n s w h i c h g r o w s l o w l y . T h e e x i s t e n c e o f m e t h a n o g e n s i n t h e a c t i v a t e d s l u d g e i s l i k e l y d u e t o s o m e a n a e r o b i c n u c l e i i n s i d e t h e s l u d g e fl o c s . T h e n u c l e i p r o t e c t s t h e m e t h a n o g e n s f r o m o x y g e n o r h i g h r e d o x p o t e n t i a l , a n d t h e m e t a b o l i c p r o d u c t s o f a e r o b e s o r o t h e r a n a e r o b e s p r o v i d e t h e m w i t h s u b s t r a t e s ( W u e t a l . , 1 9 8 7 a , 1 9 8 7 b ) . 2 . 6 . 2 C h a r a c t e r i s t i c s o f t h e g r a n u l a t i o n p r o g r e s s B o t h g l u c o s e m o l a s s e s a n d b r e w e r y w a s t e w a t e r a r e c a r b o h y d r a t e - c o n t a i n i n g b u t n o t c o m p o s i t i o n - d e fi n e d s u b s t r a t e s . T h e g r a n u l a t i o n p r o g r e s s u s i n g t h e s e s u b s t r a t e s i s o f s i g n i fi c a n c e i n s t a r t i n g - u p a r e a c t o r t r e a t i n g s i m i l a r o r g a n i c w a s t e w a t e r . I n t h e e x p e r i m e n t s w i t h r e a c t o r s A a n d B , t h e s a m e t h r e e p h a s e s o f g r a n u l a t i o n a n d s l u d g e p r o fi l e s w e r e o b s e r v e d , a s d e s c r i b e d b y H u l s h o f f P o l e t a l . ( 1 9 8 3 ) a n d d e Z e e u w ( 1 9 8 4 ) w h o s t u d i e d g r a n u l a t i o n o n V F A ( a c e t a t e , p r o p i o n a t e , a n d b u t y r a t e ) m i x t u r e s u s i n g d i g e s t e d s l u d g e a s i n o c u l u m . T h i s d e m o n s t r a t e s t h a t t h e g r a n u l a t i o n p r o g r e s s o n c o m p l e x o r g a n i c s u b s t r a t e i s b a s i c a l l y t h e s a m e a s t h a t o n V F A m i x t u r e w h e n d i g e s t e d s e w a g e s l u d g e s e r v e s a s i n o c u l u m , a l t h o u g h t h e m i c r o b i a l c o m p o s i t i o n m a y b e d i f f e r e n t d u e t o d i f f e r e n t s o u r c e s . T h e g r a n u l a t i o n p r o c e s s u s i n g a c t i v a t e d s l u d g e i n r e a c t o r C w a s s i m i l a r t o t h a t u s i n g d i g e s t e d s l u d g e e x c e p t f o r s o m e w h a t d i f f e r e n t s l u d g e p r o fi l e s . T h e r e f o r e , c u l t i v a t i o n o f g r a n u l e s o n c a r b o h y d r a t e - c o n t a i n i n g f e e d w i t h e i t h e r a n a e r o b i c d i g e s t e d s l u d g e o r a e r o b i c a c t i v a t e d s l u d g e a s t h e i n o c u l u m c a n b e c o n d u c t e d i n e s s e n t i a l l y t h e s a m e m a n n e r a s s y s t e m s s t a r t e d o n V F A f e e d . 2 . 6 . 3 P a r a m e t e r s f o r c u l t i v a t i o n o f g r a n u l e s T h e p a r a m e t e r s a f f e c t i n g g r a n u l a t i o n a n d t h e p e r f o r m a n c e o f t h e d e v e l o p e d 8 0 g r a n u l e s i n c l u d e t y p e o f i n o c u l u m , a m o u n t o f i n o c u l u m , c o m p o s i t i o n o f f e e d , o p e r a t i o n a l v a r i a b l e s ( s p e c i fi c C O D l o a d i n g r a t e , h y d r a u l i c l o a d i n g r a t e , e t c . ) a n d e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s ( p H , t e m p e r a t u r e , a n d n u t r i e n t r e q u i r e m e n t s ) . S o m e o f t h e s e p a r a m e t e r s h a v e b e e n d i s c u s s e d p r e v i o u s l y ( L e t t i n g a e t a l . , 1 9 8 4 , 1 9 8 5 ; H u l s h o f f P o l e t a l . , 1 9 8 3 , 1 9 8 8 ; H u l s h o f f P o l , 1 9 8 9 ; d e Z e e u w , 1 9 8 4 , 1 9 8 8 ) . i ) T y p e o f i n o c u l u m T h e e x p e r i m e n t s i n t h i s s t u d y c o n fi r m e d t h a t a n a e r o b i c d i g e s t e d s e w a g e s l u d g e c a n s e r v e a s i n o c u l u m t o c u l t i v a t e g r a n u l e s , a s r e p o r t e d p r e v i o u s l y ( H u l s h o f f P o l e t a l . , 1 9 8 2 , 1 9 8 3 ; d e Z e e u w , 1 9 8 4 ; M a n j u n a t h e t a l . , 1 9 8 9 ) , a n d d e m o n s t r a t e d t h a t a c t i v a t e d s l u d g e c a n a l s o b e u s e d . S e v e r a l a d d i t i o n a l i n o c u l a h a v e b e e n r e p o r t e d f o r t h e c u l t i v a t i o n o f g r a n u l e s . A s e w e r s l u r r y w a s u s e d t o s t a r t a m e s o p h i l i c U A S B r e a c t o r t r e a t i n g a s t a r c h p r o c e s s i n g w a s t e w a t e r ( L u i e r a l . , 1 9 8 5 ) . W i e g a n t a n d d e M a n ( 1 9 8 6 ) s u c c e s s f u l l y c u l t i v a t e d t h e r m o p h i l i c a n a e r o b i c g r a n u l e s u s i n g c o w m a n u r e a s i n o c u l u m . T h u s , i t a p p e a r s t h a t t h e i n o c u l u m m a t e r i a l s f o r t h e c u l t i v a t i o n o f g r a n u l e s c a n b e q u i t e d i v e r s e a n d i t s c h o i c e w i l l d e p e n d i n p a r t o n a v a i l a b i l i t y . T h e k e y f a c t o r f o r a n y i n o c u l u m m a t e r i a l i s t h a t i t s h o u l d c o n t a i n a m o d e s t m i c r o b i a l e c o s y s t e m i n v o l v e d i n m e t h a n o g e n e s i s f r o m c o m p l e x o r g a n i c c o m p o u n d s . B a s e d o n m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n a n d S E M o b s e r v a t i o n , t h e p r e d o m i n a n t m e t h a n o g e n s i n t h e g r a n u l e s f r o m r e a c t o r s A , B a n d C a p p e a r e d s i m i l a r , i . e . M e t h a n o t h r i x - l i k e , a n d M e t h a n o b a c t e r i u m - l i k e b a c t e r i a w e r e m o s t c o m m o n . T h e a n a e r o b i c g r a n u l e s c u l t i v a t e d f r o m a c t i v a t e d s l u d g e a n d f r o m d i g e s t e d s e w a g e s l u d g e p o s s e s s e d t h e s a m e o r d e r o f m a g n i t u d e o f m e t h a n o g e n s i . e . 1 0 l l c e l l s / g S S . T h i s d e m o n s t r a t e s t h a t a f t e r l o n g t e r m i n c u b a t i o n , t h e r e i s n o s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e i n t h e t o t a l a m o u n t o f t h e m e t h a n o g e n s i n t h e g r a n u l e s c u l t i v a t e d f r o m d i f f e r e n t i n o c u l a u n d e r s i m i l a r c o n d i t i o n s . W i e g a n t a n d d e M a n ( 1 9 8 6 ) a l s o r e p o r t e d t h a t n o s i g n i fi c a n t 8 1 d i f f e r e n c e w a s o b s e r v e d i n t h e t h e r m o p h i l i c g r a n u l e s o r i g i n a t i n g f r o m d i g e s t e d s l u d g e a n d f r o m c o w m a n u r e . T h e r e f o r e , c u l t i v a t i o n o f g r a n u l e s i n a n a n a e r o b i c d i g e s t o r d o e s n o t a p p e a r t o b e s i g n i fi c a n t l y a f f e c t e d b y t h e t y p e o f i n o c u l u m u s e d , p r o v i d e d i t c o n t a i n s a n e c o s y s t e m c a p a b l e o f m e t h a n o g e n e s i s . T h e t y p e o f i n o c u l u m m a y , h o w e v e r , a f f e c t t h e p h y s i c a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d o p e r a t i o n a l p e r f o r m a n c e o f t h e g r a n u l e s . G r a n u l e s f r o m d i g e s t e d s e w a g e s l u d g e h a d a g r e a t e r s p e c i fi c g r a v i t y a n d w e r e d e n s e r t h a n t h o s e f r o m t h e a c t i v a t e d s l u d g e ( T a b l e 2 . 8 ) a l t h o u g h t h e y w e r e f e d w i t h s a m e g l u c o s e m o l a s s e s s o l u t i o n . T h e r e a s o n f o r t h i s o b s e r v a t i o n i s n o t c l e a r . I t m a y b e b e c a u s e t h e d i g e s t e d s l u d g e c o n t a i n e d m o r e i n o r g a n i c o r i n e r t m a t e r i a l s t h a n t h e a c t i v a t e d s l u d g e , o r m i c r o b i a l c o m p o s i t i o n o f t h e t w o i n o c u l a m a y d i f f e r i n a m a n n e r t h a t w a s n o t o b s e r v e d . i i ) A m o u n t o f i n o c u l u m I n t h i s c h a p t e r , t h e i n i t i a l a v e r a g e s l u d g e c o n c e n t r a t i o n s i n r e a c t o r s A , B a n d C w e r e 1 3 . 2 , 1 1 . 4 a n d 6 . 0 g V S S / L a n d i n i t i a l s p e c i fi c C O D r e m o v a l r a t e s w e r e 0 . 0 5 , 0 . 1 2 a n d 0 . 1 g C O D / g V S S - d , r e s p e c t i v e l y . T h e m i n i m u m a m o u n t o f s l u d g e r e t a i n e d w a s 5 1 % o f t h e a m o u n t o f t h e i n o c u l u m ( a s S S ) i n r e a c t o r A , 5 8 % i n r e a c t o r B , a n d 6 7 % i n r e a c t o r C . T h e s e d a t a w e r e s i m i l a r t o o t h e r s y s t e m s t u d i e d w i t h d i g e s t e d s l u d g e i . e . i n i t i a l a c t i v i t y w a s 0 . 1 2 g C O D / g V S S - d a n d a b o u t 5 0 % r e t a i n e d i n t h e r e a c t o r ( d e Z e e u w , 1 9 8 4 ) . T h e r e f o r e , a m i n i m u m a m o u n t o f i n o c u l u m o f a b o u t 1 0 g V S S / L i n t h e r e a c t o r i s a d v i s a b l e . i i i ) S p e c i fi c C O D l o a d i n g r a t e T h e s p e c i fi c o r g a n i c l o a d i n g r a t e o b v i o u s l y e f f e c t s t h e r a t e o f g r a n u l e f o r m a t i o n a n d s u b s e q u e n t g r o w t h . I n r e a c t o r A , a f t e r s t a r t - u p , t h e l o a d i n g r a t e w a s m a i n t a i n e d a t l o w e r t h a n 0 . 3 g C O D / g V S S - d f o r 7 7 d a y s . G r a n u l e s w e r e n o t o b s e r v e d u n t i l 2 w e e k s a f t e r a h i g h e r C O D l o a d i n g r a t e w a s a p p l i e d . I n r e a c t o r B , t e n d a y s a f t e r 8 2 s t a r t - u p , t h e C O D l o a d i n g r a t e w a s i n c r e a s e d t o o v e r 0 . 3 g C O D / g V S S - d . C o n s e q u e n t l y , g r a n u l e s w e r e o b s e r v e d b y d a y 1 9 . I n r e a c t o r C , a f t e r 1 0 d a y s o f c o n t i n u o u s f e e d , t h e C O D l o a d i n g r a t e w a s i n c r e a s e d t o o v e r 0 . 4 g C O D / g V S S - d . G r a n u l e s w e r e o b s e r v e d a f t e r 3 3 d a y s . T h u s , a C O D l o a d i n g r a t e i n e x c e s s o f 0 . 3 g C O D / g V S S - d a p p e a r s i m p o r t a n t f o r g r a n u l e f o r m a t i o n . I n a l l t h r e e r e a c t o r s t h e p r o g r e s s o f g r a n u l a t i o n , o n c e i n i t i a t e d , w a s s o f a s t t h a t t h e s l u d g e b e d i n t h e r e a c t o r s fi l l e d w i t h g r a n u l e s w i t h i n o n e o r t w o w e e k s o n c e a C O D l o a d i n g r a t e h i g h e r t h a n 0 . 6 g C O D / g V S S - d w a s a p p l i e d . T h e s a m e o b s e r v a t i o n h a s a l s o b e e n r e p o r t e d b y o t h e r r e s e a r c h e r s . H u l s h o f f P o l e t a l . ( 1 9 8 3 ) t e s t e d t w o U A S B r e a c t o r s , i n o c u l a t e d w i t h d i g e s t e d s l u d g e , a n d f e d w i t h a c e t a t e - p r o p i o n a t e m i x t u r e a t 3 0 ° C . O n e r e a c t o r w a s f e d a t a l o a d i n g r a t e o f 0 . 3 g C O D / g V S S - d f o r m o r e t h a n 1 3 w e e k s w i t h o u t g r a n u l a t i o n o c c u r r i n g . A n o t h e r r e a c t o r l o a d e d a t 0 . 9 g C O D / g V S S - d h a d r a p i d g r a n u l a t i o n . M a n j u n a t h e t a l . ( 1 9 8 9 ) o b s e r v e d t h a t g r a n u l a t i o n i n l a b - s c a l e r e a c t o r s f e d a s u g a r m o l a s s e s s o l u t i o n w a s p o s s i b l e o n l y a t a v o l u m e t r i c C O D l o a d i n g r a t e s a b o v e 5 g / L - d ( C O D l o a d i n g r a t e o f m o r e t h a n 0 . 7 g / g V S S - d ) . T h e p o s i t i v e e f f e c t o f a h i g h s p e c i fi c l o a d i n g r a t e o n g r a n u l a t i o n m a y p o s s i b l y b e a t t r i b u t e d t o : ( 1 ) t h e e n h a n c e d g r o w t h r a t e o f s o m e a g g r e g a t e - f o r m i n g m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a s u c h a s M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m a n d M e t h a n o t h r i x s p . o r s o m e s y n t r o p h i c a c e t o g e n s w h i c h u t i l i z e b u t y r a t e a n d o t h e r v o l a t i l e f a t t y a c i d s ( s e e C h a p t e r s 5 a n d 7 ) ; o r ( 2 ) e n h a n c e d g r o w t h r a t e o f s o m e a g g r e g a t e - f o r m i n g f e r m e n t a t i v e b a c t e r i a . F o r e x a m p l e , Z o u t b e r g e t a l . ( 1 9 8 8 ) r e p o r t e d t h a t S e l e n o m o n a s r u m i n a n t i u m a n d C l o s t r i d i u m b u t y r i c u m p r o d u c e p o l y s a c c h a r i d e s w h e n t h e y g r o w o n g l u c o s e . M o r e w o r k w i l l b e r e q u i r e d t o d e t e r m i n e t h e t r u e r e a s o n f o r t h e d r a m a t i c e f f e c t l o a d i n g r a t e e x e r t s o n t h e g r a n u l a t i o n p r o c e s s . 8 3 i v ) H y d r a u l i c l o a d i n g r a t e a n d b i o g a s fl u x T h e s e l e c t i v e r e t e n t i o n o f p r e - f o r r n e d a g g r e g a t e s a n d c o n c u r r e n t w a s h - o u t o f fl o c c u l e n t s l u d g e i s i m p o r t a n t i n c u l t i v a t i o n o f g r a n u l e s ( H u l s h o f f P o l e t a l . , 1 9 8 3 ; L e t t i n g a e t a l . , 1 9 8 4 , 1 9 8 5 ; d e Z e e u w 1 9 8 4 ; 1 9 8 8 ) . C l e a r l y , t h e h y d r a u l i c fl u x a n d b i o g a s fl u x , r e s u l t i n g f r o m C H 4 a n d C O 2 p r o d u c t i o n , i n t h e r e a c t o r p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e g r a n u l a t i o n p r o c e s s . T h e s a m e f o r c e s a l s o p l a y a n e s s e n t i a l r o l e i n t h e r e d u c t i o n o f f o r m a t i o n o f c h a n n e l s a n d d e a d s p a c e i n t h e s l u d g e b e d r e g i o n ( v a n d e r M e e t , 1 9 7 9 ) . I n t h e s e e x p e r i m e n t s , t h e h y d r a u l i c l o a d i n g r a t e w a s c o n t r o l l e d b e t w e e n 0 . 2 5 a n d 0 . 5 m / h r . T h i s w a s s u f fi c i e n t t o w a s h - o u t t h e l i g h t f r a c t i o n o f s l u d g e f r o m t h e r e a c t o r s w i t h a c o n c u r r e n t b i o g a s f l u x o f 0 . 1 8 m / h r ( r e a c t o r C ) t o 0 . 2 4 m / h r ( r e a c t o r A ) . T h e o p t i m a l h y d r a u l i c l o a d i n g r a t e a n d b i o g a s fl u x w i l l , o b v i o u s l y , v a r y w i t h t h e n a t u r e o f i n o c u l u m m a t e r i a l a n d t h e r e a c t o r d e s i g n . T h e r a n g e u s e d h e r e , h o w e v e r , a p p e a r s t o w o r k q u i t e w e l l a n d c a n b e u s e d a s a g u i d e . v ) W a s t e w a t e r c o m p o s i t i o n T h e c o m p o s i t i o n o f w a s t e w a t e r w i l l h a v e a d r a m a t i c e f f e c t o n t h e g r a n u l a t i o n p r o c e s s a s w e l l a s t h e t y p e a n d p e r f o r m a n c e o f t h e g r a n u l e s f o r m e d . U p t o n o w , g r a n u l a t i o n u n d e r m e s o p h i l i c t e m p e r a t u r e c o n d i t i o n s h a s b e e n r e p o r t e d i n U A S B r e a c t o r s t r e a t i n g o r g a n i c w a s t e w a t e r s s u c h a s s u g a r - b e e t ( H e e r t j e s e t a l . , 1 9 7 8 ; v a n d e r M e e r , 1 9 7 9 ; L e t t i n g a e r a l . , 1 9 8 0 ) , p o t a t o p r o c e s s i n g ( L e t t i n g a e t a l . , 1 9 8 0 ) , p a p e r m i l l ( H a b e r t s e t a l . , 1 9 8 5 ) , a l c o h o l d i s t i l l e r y ( S h e n 1 9 8 5 ) , s u c r o s e s o l u t i o n s ( S i e r r a - A l v a r e z e t a l . , 1 9 8 8 ; H a r a d a e t a l . , 1 9 8 8 ) , n i g h t s o i l ( E n d o a n d T o h a y , 1 9 8 5 ) , c i t r a t e f e r m e n t a t i o n ( W u e t a l . , 1 9 8 7 ) , a n d p u l p i n g w a s t e w a t e r s ( V u o r i a n t a e t a l . , 1 9 8 5 ) . G r a n u l a t i o n w a s a l s o r e p o r t e d t o o c c u r i n t h e r e a c t o r s f e d w i t h V F A m i x t u r e s c o n s i s t i n g o f a c e t a t e - p r o p i o n a t e , o r a c e t a t e - p r o p i o n a t e - b u t y r a t e ( H u l s h o f f P o l e t a l . , 1 9 8 3 ; d e Z e e u w , 1 9 8 4 ) . T h i s i n d i c a t e s t h a t g r a n u l a t i o n c a n o c c u r f o r m o s t 8 4 s t a r c h a n d s u g a r b a s e d m o d e r a t e t o h i g h - s t r e n g t h o r g a n i c w a s t e w a t e r s . G r a n u l a t i o n d i d n o t o c c u r i n r e a c t o r s f e d a V F A m i x t u r e o r s u c r o s e s o l u t i o n , w h i c h c o n t a i n e d h i g h a m m o n i u m c o n c e n t r a t i o n s ( 1 0 0 0 m g N H 4 - N / L ) ( H u l s h o f f P o l e t a l . , 1 9 8 3 ; H a r a d a e t a l , 1 9 8 8 ) . N o g r a n u l a t i o n w a s o b s e r v e d i n a r e a c t o r f e d w i t h t h e r m a l s l u d g e c o n d i t i o n i n g l i q u o r c o n t a i n i n g h i g h t o t a l n i t r o g e n ( N H 4 - N a n d t o t a l K j e l d a h l n i t r o g e n > 1 1 0 0 m g / L ) ( H a l l a n d J o v a n o v i c , 1 9 8 2 ; C r a w f o r d a n d T e l e t z k e , 1 9 8 6 ) . T h e r e a s o n f o r t h e a b s e n c e o f g r a n u l e f o r m a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f h i g h a m m o n i u m o r t o t a l n i t r o g e n c o n c e n t r a t i o n s i s u n k n o w n a n d r e q u i r e s f u r t h e r e l u c i d a t i o n . O b v i o u s l y , w a s t e w a t e r s c o n t a i n i n g s i g n i fi c a n t c o n c e n t r a t i o n o f c a r b o h y d r a t e s w i l l d e v e l o p g r a n u l e s c o n s i s t i n g o f m o r e f e r m e n t a t i v e m i c r o o r g a n i s m s , w h i l e a w a s t e w a t e r c o m p o s e d m a i n l y o f f a t t y a c i d s a n d a l c o h o l s w i l l p r o d u c e g r a n u l e s c o n t a i n i n g a h i g h e r p e r c e n t a g e o f m e t h a n o g e n s a n d s y n t r o p h i c a c e t o g e n s . T h e l a t t e r w i l l n o r m a l l y h a v e a h i g h e r s p e c i fi c m e t h a n o g e n i c a c t i v i t y . T h i s h a s b e e n d e m o n s t r a t e d b y t h e e x p e r i m e n t s c o n d u c t e d h e r e . A s i s s h o w n i n T a b l e 2 . 7 , t h e g r a n u l e s d e v e l o p e d o n b r e w e r y w a s t e w a t e r ( m a i n l y c o m p o s e d o f e t h a n o l , a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e ) h a d a t h r e e - f o l d h i g h e r s p e c i fi c C O D r e m o v a l r a t e c o m p a r e d t o t h o s e d e v e l o p e d o n t h e g l u c o s e m o l a s s e s s o l u t i o n . T h i s i s d e s p i t e t h e f a c t t h a t t h e C O D c o n c e n t r a t i o n s i n t h e t w o r e a c t o r w e r e a l m o s t e q u a l . T h e w a s t e w a t e r c o m p o s i t i o n a l s o a p p e a r s t o a f f e c t t h e s i z e d i s t r i b u t i o n o f t h e g r a n u l e s . G r a n u l e s d e v e l o p e d o n g l u c o s e m o l a s s e s h a d m o r e g r a n u l e s o f a l a r g e r s i z e t h a n t h o s e d e v e l o p e d w i t h b r e w e r y w a s t e w a t e r ( F i g u r e 2 . 7 ) . T h e f a c t t h a t c a r b o h y d r a t e s , s u c h a s s u c r o s e , i n d u c e d l a r g e s i z e d g r a n u l e s w a s a l s o r e p o r t e d b y S i e r r a - A l v a r e z e t a l . ( 1 9 8 8 ) . 8 5 v i ) p H a n d n u t r i e n t s A w i d e p H r a n g e ( 6 . 0 t o 7 . 5 ) m a y b e s u i t a b l e f o r t h e c u l t i v a t i o n o f g r a n u l e s a l t h o u g h t h e o p t i m a l p H f o r m e S O p h i l i c a n a e r o b i c d i g e s t o r s i s c o n s i d e r e d t o b e b e t w e e n 6 . 7 a n d 7 . 4 ( Z e h n d e r e t a l . , 1 9 8 1 ) . I n t h e s e e x p e r i m e n t s , t h e g r a n u l e s w e r e f o r m e d a t p H b e t w e e n 6 . 5 a n d 6 . 9 i n r e a c t o r A , a n d b e t w e e n 7 . 0 a n d 7 . 2 i n r e a c t o r s B a n d C . A c t u a l l y , t h e p H i n s i d e t h e g r a n u l e s i s d i f f e r e n t f r o m t h e p H i n t h e l i q u i d b u l k b e c a u s e t h e m e t a b o l i s m o f s u b s t r a t e s o c c u r s i n s i d e t h e g r a n u l e s a n d b a c t e r i a l a g g r e g a t e s w h i c h m a y e v e n t u a l l y d e v e l o p i n t o g r a n u l e s . W h e n m e t h a n o g e n e s i s f r o m a c e t a t e o r p r o p i o n a t e o c c u r s w i t h i n g r a n u l e s , t h e p H i n s i d e g r a n u l e s w i l l i n c r e a s e t o l e v e l s a b o v e t h a t i n t h e l i q u i d b u l k . I n f a c t , g r a n u l e s h a v e d e v e l o p e d o n a n a c e t a t e - p r o p i o n a t e m i x t u r e a t p H 6 ( B r u m m e l e r e t a l . , 1 9 8 5 ) . T h e n u t r i e n t l e v e l s s u p p l i e d i n t h i s s t u d y p r o v i d e d a m o d e s t c a r b o n / n i t r o g e n r a t i o a s w e l l a s s u p p l e m e n t i n g t r a c e e l e m e n t s N i , C o a n d F e . T o d a t e , t h e r e a r e s e v e r a l r e p o r t s o n t h e t r a c e e l e m e n t s e n h a n c i n g m e t h a n o g e n i c a c t i v i t y i n a n a e r o b i c r e a c t o r s a n d g r a n u l a r f o r m a t i o n ( M u r r a y e t a l . , 1 9 8 1 ; T a k a s h i m a a n d S p e e c e , 1 9 8 8 ; G u i o t e t a l . , 1 9 8 8 ) . T h e r e f o r e , e n s u r i n g t h a t w a s t e w a t e r s a r e s u p p l e m e n t e d w i t h t h e p r o p e r n u t r i e n t s i s a d v i s a b l e . 2 . 7 S U M M A R Y 1 ) A e r o b i c a c t i v a t e d s l u d g e s c o n t a i n c o n s i d e r a b l e a m o u n t s o f m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a ( i . e . a p p r o x i m a t e l y 1 0 8 c e l l s / g V S S ) a n d c a n b e u s e d a s i n o c u l u m m a t e r i a l f o r t h e c u l t i v a t i o n o f g r a n u l e s . 2 ) A n a e r o b i c g r a n u l e s c a n b e d e v e l o p e d f r o m b o t h a n a e r o b i c d i g e s t e d s e w a g e s l u d g e a n d a e r o b i c a c t i v a t e d s l u d g e o n c a r b o h y d r a t e - c o n t a i n i n g w a s t e w a t e r , g l u c o s e 8 6 m o l a s s e s s o l u t i o n a n d b r e w e r y w a s t e w a t e r u n d e r m e s o p h i l i c t e m p e r a t u r e c o n d i t i o n s . 3 ) T h e c h a n g e s i n t o t a l b i o m a s s d u r i n g t h e g r a n u l a t i o n p r o g r e s s w i t h n o n - g r a n u l a r i n o c u l u m m a t e r i a l s w a s b a s i c a l l y s i m i l a r t o t h o s e r e p o r t e d u s i n g V F A m i x t u r e s a s s u b s t r a t e a n d d i g e s t e d s l u d g e a s i n o c u l u m ( H u l s h o f f P o l e t a l . , 1 9 8 3 ; d e Z e e u w , 1 9 8 5 ) . T h e t h r e e p h a s e s o f g r a n u l a t i o n w i t h t h r e e t y p i c a l s l u d g e c o n c e n t r a t i o n p r o fi l e s w e r e o b s e r v e d d u r i n g g r a n u l a t i o n w i t h d i g e s t e d s l u d g e . T h e g r a n u l a t i o n p r o c e s s a n d s l u d g e p r o fi l e s w i t h a c t i v a t e d s l u d g e w e r e s o m e w h a t d i f f e r e n t . 4 ) B a s e d u p o n m i c r o s c o p i c a n d S E M e x a m i n a t i o n s , t h e p r e v a l e n t a c e t a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s i n t h e g r a n u l e s w e r e M e t h a n o t h r i x s p . a n d p r e v a l e n t h y d r o g e n - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s w e r e M e t h a n o b a c t e r i u m s p . 5 ) S p e c i fi c o r g a n i c l o a d i n g r a t e w a s a n i m p o r t a n t p a r a m e t e r f o r i n i t i a t i o n o f g r a n u l a t i o n . C H A P T E R 3 C O M P A R I S O N O F T W O T Y P E S O F G R A N U L E S D E V E L O P E D O N F A T T Y A C I D C O N T A I N I N G F E E D S 3 . 1 I N T R O D U C T I O N T o d a t e , a t l e a s t t h r e e d i s t i n c t t y p e s o f m e s o p h i l i c g r a n u l e s h a v e b e e n f o u n d i n l a b o r a t o r y U A S B r e a c t o r s f e d w i t h V F A m i x t u r e s : ( 1 ) " r o d - t y p e " g r a n u l e s w h i c h c o n t a i n r o d - s h a p e d M e t h a n o t h r i x — l i k e c e l l s g r o w i n g a s a g g r e g a t e s w i t h 3 t o 5 c e l l s a s t h e p r e d o m i n a n t a c e t a t e u t i l i z i n g s p e c i e s ; ( 2 ) " fi l a m e n t - t y p e " g r a n u l e s w h i c h c o n t a i n l o n g fi l a m e n t o u s M e t h a n o t h r i x s o e h n g e n i i - l i k e c e l l s a s t h e p r e v a l e n t s p e c i e s ; a n d ( 3 ) " s a r c i n a - t y p e " g r a n u l e s w h i c h c o n t a i n M e t h a n o s a r c i n a s p . a s t h e p r e v a l e n t s p e c i e s ( L e t t i n g a e r a l . , 1 9 8 4 , 1 9 8 5 ; d e Z e e u w , 1 9 8 8 ) . I n g e n e r a l d u r i n g w a s t e w a t e r t r e a t m e n t , h i g h l e v e l s o f a c e t a t e s u c h a s 2 t o 3 t i m e s t h e h a l f v e l o c i t y c o e f fi c i e n t , K I n ( c a . 5 m M a c e t a t e ) f o r M e t h a n o s a r c i n a b a r k e r i a r e n o t m a i n t a i n e d i n t h e r e a c t o r . T h e s e t y p e g r a n u l e s , t h e r e f o r e , a r e u n c o m m o n . M o s t g r a n u l e s f r o m w a s t e w a t e r t r e a t m e n t s y s t e m s c o n t a i n M e t h a n o t h r i x — l i k e b a c t e r i a a s p r e d o m i n a n t a c e t a t e u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s ( G o n i s e t a l . , 1 9 8 8 ; D u b o u r g u i e r e t a l . , 1 9 8 8 b ; T i l c h e a n d Y a n g , 1 9 8 8 ; s e e C h a p t e r 2 ) . N o d e t a i l e d s t u d y h a s b e e n d o n e , h o w e v e r , t o c o m p a r e a n d c o n t r a s t t h e r o d - t y p e a n d 8 7 8 8 fi l a m e n t - t y p e g r a n u l e s . R e c e n t l y , a t y p e o f h i g h - p e r f o n n a n c e a n a e r o b i c g r a n u l e s w a s d e v e l o p e d o n a V F A m i x t u r e ( T h i e l e e t a l . , 1 9 9 0 ) . B a s e d o n t h e m o r p h o t y p e o f p r e d o m i n a n t M e t h a n o t h r i x s p . i n t h e s e g r a n u l e s , t h e y c a n b e c l a s s i fi e d t o b e t h e r o d - t y p e g r a n u l e s ( R - g r a n u l e s f o r s h o r t ) . T h e g r a n u l e s d e v e l o p e d f r o m a l a b o r a t o r y - U A S B r e a c t o r t r e a t i n g b r e w e r y w a s t e w a t e r ( r e a c t o r B i n C h a p t e r 2 ) w e r e s u b s e q u e n t l y g r o w n o n a V F A m i x t u r e p l u s s o m e g l u c o s e a n d e t h a n o l . T h e g r a n u l e s w e r e o b s e r v e d t o b e t h e fi l a m e n t - t y p e g r a n u l e s ( F - g r a n u l e s f o r s h o r t ) . T h e p u r p o s e o f t h i s c h a p t e r i s t o c o m p a r e t h e s e t w o t y p e s o f g r a n u l e s i n r e l a t i o n t o o p e r a t i o n a l p e r f o r m a n c e , p h y s i c a l - c h e m i c a l p r o p e r t i e s , s u b s t r a t e k i n e t i c s , m e t a b o l i c p e r f o r m a n c e a n d o v e r a l l m i c r o b i a l c o m p o s i t i o n . 3 . 2 M A T E R I A L S A N D M E T H O D S 3 . 2 . 1 C h e m i c a l s , a n a l y t i c m e t h o d s a n d m e d i a C h e m i c a l s , g a s e s , a n a l y t i c a l m e t h o d s a n d m e d i a u s e d i n t h i s a n d f o l l o w i n g c h a p t e r s a r e d e s c r i b e d i n A p p e n d i x A . O b s e r v a t i o n s u s i n g l i g h t m i c r o s c o p e , s e a m i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p e ( S E M ) a n d t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p e ( T E M ) , t h e g r a n u l e s i z e d i s t r i b u t i o n , a n d m i c r o b i a l c e l l d e n s i t y a n a l y s i s a r e d e s c r i b e d i n A p p e n d i x D . 3 . 2 . 2 G r a n u l e s o u r c e s T w o t y p e s o f a n a e r o b i c g r a n u l e s w e r e i n v e s t i g a t e d i n t h i s e x p e r i m e n t . T h e R - g r a n u l e s w e r e i n i t i a l l y o b t a i n e d f r o m a n U A S B r e a c t o r t r e a t i n g p o t a t o - p r o c e s s i n g w a s t e w a t e r . T h e y w e r e s h i p p e d t o M i c h i g a n B i o t e c h n o l o g y I n s t i t u t e ( M B I ) f r o m 8 9 F r a n c e b y D r . D u b o u r g u i e r . T h e y w e r e s u b s e q u e n t l y s t a r v e d a n d t h e n f e d a V F A m i x t u r e t o i m p r o v e t h e i r o p e r a t i o n a l a n d m e t a b o l i c p e r f o r m a n c e ( T h i e l e e t a l . , 1 9 9 0 ) . T h e F - g r a n u l e s w e r e t r a n s f e r r e d f r o m a l a b o r a t o r y - s c a l e U A S B r e a c t o r t r e a t i n g b r e w e r y w a s t e w a t e r ( r e a c t o r B i n c h a p t e r 2 ) t o M B I . T a b l e 3 . 1 F e e d c o m p o s i t i o n f o r l a b o r a t o r y r e a c t o r s F e e d A B e t h a n o l ( m M ) 0 6 . 5 a c e t i c a c i d ( m M ) 1 0 0 1 3 0 p r o p i o n i c a c i d ( m M ) 5 0 4 0 b u t y r i c a c i d ( m M ) 5 0 4 0 g l u c o s e ( m M ) 0 2 C O D ( g / L ) ‘ 2 0 2 1 K H 3 P O , 3 ( m M ) 3 3 N a s t , 3 ( m M ) 0 . 1 0 . 1 F e S O 4 ( m M ) 0 . 0 5 0 . 0 5 N a 3 S 0 9 H 3 0 ( m M ) 0 . 1 5 0 . 1 5 N I L C I ( m M ) 6 . 6 0 N a O H ( m M ) 1 0 0 1 0 0 u r e a ( m M ) 0 6 . 6 N a C l ( g / L ) 1 . 0 1 . 0 M g C l z ( g / L ) 0 . 2 0 . 2 C a C l z ( g / L ) 0 . 1 0 . 1 R e s a z u r i n ( g / L ) 0 . 0 0 1 0 . 0 0 1 T r a c e e l e m e n t s o l u t i o n b ( m L / L ) 1 0 1 0 a : C O D w a s c a l c u l a t e d b a s e d o n s t o i c h i o m e t r y o f f u l l o x i d a t i o n t o C 0 3 . T h e r a t i o s ( g C O D / m o l e ) a r e 9 6 , 6 4 , 1 1 2 , 1 6 0 a n d 1 9 2 f o r e t h a n o l , a c e t a t e , p r o p i o n a t e , b u t y r a t e a n d g l u c o s e r e s p e c t i v e l y . b : T r a c e e l e m e n t s o l u t i o n i s t h e s a m e a s u s e d i n t h e b a s a l m e d i u m ( s e e A p p e n d i x A ) 9 0 3 . 2 . 3 R e a c t o r f e e d c o m p o s i t i o n T h e f e e d c o m p o s i t i o n f o r t h e r e a c t o r s i s l i s t e d i n T a b l e 3 . 1 . T w o d i f f e r e n t f e e d s w e r e u s e d f o r t h e F - g r a n u l e s . B o t h h a d a n i n fl u e n t C O D o f 2 0 t o 2 1 g / L . T h e R - g r a n u l e s w e r e s u p p l i e d w i t h f e e d A t h r o u g h o u t t h e d u r a t i o n o f t h e e x p e r i m e n t s . F e e d A c o n t a i n e d 1 0 0 m M a c e t i c a c i d , 5 0 m M p r o p i o n i c a c i d , a n d 5 0 m M b u t y r i c a c i d a s m a j o r o r g a n i c s u b s t r a t e s . F e e d B c o n t a i n e d 1 1 0 m M a c e t i c a c i d , 4 0 m M p r o p i o n i c a c i d , 4 0 m M b u t y r i c a c i d , 0 . 5 g / L g l u c o s e , a n d 8 m M e t h a n o l . B o t h m e d i a w e r e s u p p l e m e n t e d w i t h e s s e n t i a l n u t r i e n t s a n d t r a c e e l e m e n t s . 3 . 2 . 4 L a b o r a t o r y - s c a l e r e a c t o r s T w o g l a s s c o l u m n r e a c t o r s , 2 . 1 c m i n d i a m e t e r a n d 2 8 c m i n l e n g t h , w e r e u s e d . T h e r e a c t o r v o l u m e w a s 1 0 0 m L a n d s e t t l e r v o l u m e w a s 1 5 0 m L . A l l p a r t s w e r e e i t h e r o f g l a s s ( c o l u m n a n d s e t t l e r ) , s t a i n l e s s s t e e l t u b i n g o r b u t y l r u b b e r t u b i n g ( A m e r i c a n S c i e n t i fi c P r o d u c t s , M c G a w P a r k , I L ) . A s c h e m a t i c d i a g r a m o f t h e r e a c t o r s y s t e m s i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 3 . 1 . T h e r e a c t o r s w e r e o p e r a t e d a t 3 5 ° C w i t h c o n t i n u o u s f e e d s u p p l i e d b y a M i n i p u l s p e r i s t a l t i c p u m p ( G i l s o n M e d i c a l E l e c t r o n i c s , M i d d l e t o n , W I ) . R e c y c l e o f t r e a t e d e f fl u e n t f r o m t o p s e t t l e r t o t h e r e a c t o r i n l e t ( r e c y c l e fl o w o f 1 L / h r ) w a s a c c o m p l i s h e d u s i n g a n o t h e r p e r i s t a l t i c p u m p . G a s s a m p l e s f o r m e t h a n e a n d h y d r o g e n a n a l y s i s a n d l i q u i d s a m p l e s f o r f a t t y a c i d s w e r e w i t h d r a w n f r o m t h e s a m p l i n g p o r t s o n t h e r e a c t o r ( F i g u r e 3 . 1 ) . G a s p r o d u c t i o n w a s m e a s u r e d b y l i q u i d d i s p l a c e m e n t o f a n H C l s o l u t i o n ( 0 . 1 N ) i n a n i n v e r t e d g r a d u a t e d c y l i n d e r . 3 . 2 . 5 R e a c t o r o p e r a t i o n T h e t w o r e a c t o r s w e r e o p e r a t e d s i d e b y s i d e u n d e r t h e s a m e e n v i r o n m e n t a l 9 1 c o n d i t i o n s . R e a c t o r R w a s s t a r t e d w i t h f e e d A a n d i n o c u l a t e d w i t h t h e R - g r a n u l e s . R e a c t o r F w a s i n o c u l a t e d w i t h t h e F - g r a n u l e s a n d s t a r t e d u s i n g f e e d B . I n i t i a l l y , t h e r e a c t o r s w e r e a u t o c l a v e d , fl u s h e d w i t h o x y g e n - f r e e N 2 g a s , a n d fi l l e d w i t h t h e b a s a l m e d i u m ( A p p e n d i x A ) b u f f e r e d w i t h 3 0 m M N a H C O 3 a n d 3 0 m M p o t a s s i u m p h o s p h a t e ( p H 7 . 0 t o 7 . 1 ) a n d p r e - r e d u c e d w i t h 0 . 3 m M N a 3 8 . A f t e r t h e r e d o x p o t e n t i a l i n d i c a t o r , r e s a z u r i n , b e c a m e c o l o r l e s s ( i n d i c a t i n g r e d u c e d c o n d i t i o n s ) , a b o u t 1 0 m L o f g r a n u l e s w e r e i n o c u l a t e d i n t o e a c h r e a c t o r t h r o u g h a s a m p l i n g p o r t u s i n g a s t e r i l e s y r i n g e . A f t e r i n o c u l a t i o n , t h e r e a c t o r s w e r e s e a l e d a n d t h e c o n t i n u o u s f e e d s t a r t e d . T h e r e a c t o r s w e r e m o n i t o r e d d a i l y f o r V F A c o n c e n t r a t i o n s , b i o g a s p r o d u c t i o n , m e t h a n e c o n t e n t , fl o w r a t e , a n d p H . G r o w t h o f t h e g r a n u l e b e d h e i g h t w a s a l s o r e c o r d e d . A f t e r o v e r o n e y e a r o f o p e r a t i o n , t h e g r a n u l e s i n b o t h r e a c t o r s w e r e e x a m i n e d t o d e t e r m i n e b i o m a s s c o n c e n t r a t i o n , p r e d o m i n a n t m o r p h o l o g i e s , g r a n u l e d e n s i t y , s i z e d i s t r i b u t i o n a n d m e t h a n o g e n i c a c t i v i t y . D a t a w e r e r e c o r d e d w i t h r e g a r d t o p h y s i c a l c h a r a c t e r i s t i c s , b i o c h e m i c a l a n d m i c r o b i a l c o m p o s i t i o n , a n d m e t a b o l i c p e r f o r m a n c e t o h e l p c o m p a r e p e r f o r m a n c e . T h e f e e d s u p p l i e d t o t h e F - g r a n u l e s w a s c h a n g e d f r o m f e e d B t o f e e d A a f t e r o n e a n d h a l f y e a r s o p e r a t i o n t o i n v e s t i g a t e i f t h e r e w a s a n y e f f e c t o f m e d i u m c o m p o s i t i o n o n p e r f o r m a n c e . T h e r e a c t o r w a s t h e n o p e r a t e d f o r f o u r m o n t h s t o c o l l e c t a d d i t i o n a l d a t a f o r p e r f o r m a n c e c o m p a r i s o n w i t h R - g r a n u l e s . F i g u r e 3 . 1 1 ' - 2 ‘ 9 2 W 7 0 5 S c h e m a t i c d i a g r a m o f l a b - u p fl o w r e a c t o r s y s t e m u s e d f o r c o m p a r i s o n o f r o d - t y p e a n d fi l a m e n t - t y p e a n a e r o b i c g r a n u l e s . 1 : m e d i u m r e s e r v o i r ; 2 : r e c y c l e p u m p ; 3 : f e e d p u m p ; 4 : c o l u m n r e a c t o r ; 5 : s a m p l i n g p o r t w i t h a b u t y l r u b b e r s t o p p e r ; 6 : s e t t l e r ; 7 : e f fl u e n t c o l l e c t i n g fl a s k ; 8 : b i o g a s v o l u m e m e a s u r e m e n t . 9 3 3 . 2 . 6 D e t e r m i n a t i o n o f m a x i m u m s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s , K m a n d s p e c i f i c g r o w t h r a t e s E i g h t s u b s t r a t e s ( m e t h a n o l , e t h a n o l , f o r m a t e , a c e t a t e , p r o p i o n a t e , b u t y r a t e , i s o b u t y r a t e , v a l e r a t e , a n d g l u c o s e ) w e r e t e s t e d f o r d e t e r m i n a t i o n o f m a x i m u m c o n v e r s i o n r a t e s b y b o t h R - a n d F - g r a n u l e s . T h e r a t e s w e r e d e t e r m i n e d b y p u l s e - a d d i t i o n o f t h e r e s p e c t i v e s u b s t r a t e s i n t o t h e r e a c t o r s a n d t r a c k i n g t h e i r r e m o v a l o v e r t i m e ( A p p e n d i x B ) . A p p a r e n t h a l f v e l o c i t y c o e f fi c i e n t s ( K m ) f o r a c e t a t e , p r o p i o n a t e , i s o b u t y r a t e , b u t y r a t e a n d v a l e r a t e w e r e d e t e r m i n e d ( i n t r i p l i c a t e ) b y t i m e - c o u r s e e x p e r i m e n t s u s i n g g r a n u l e s w h i c h w e r e d i s r u p t e d t o e l i m i n a t e d i f f u s i o n r e s i s t a n c e ( A p p e n d i x B ) . S p e c i fi c g r o w t h r a t e s o f a c e t a t e u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s , p r o p i o n a t e d e g r a d e r s a n d b u t y r a t e d e g r a d e r s w e r e d e t e r m i n e d i n o p e r a t i n g r e a c t o r s ( A p p e n d i x B ) . 3 . 2 . 7 T e m p e r a t u r e a n d p H e f f e c t s T h e e f f e c t o f t e m p e r a t u r e o n c o n v e r s i o n o f a c e t a t e , p r o p i o n a t e , b u t y r a t e , f o r m a t e a n d H 3 - C O 2 w a s t e s t e d s e p a r a t e l y i n 5 8 m L s e r u m b o t t l e s c o n t a i n i n g 2 0 m L o f t h e b a s a l m e d i u m ( A p p e n d i x A ) w h i c h w a s r e d u c e d b y N a 3 8 ( 0 . 4 m M ) a n d b u f f e r e d w i t h 9 0 m M N a H C O 3 ( p H 6 . 8 ) . T h e b o t t l e s w e r e p r e s s u r i z e d b y a d d i t i o n o f 0 . 3 a t r n o f C O 2 g a s i n t o h e a d s p a c e e x c e p t s a m p l e s i n c u b a t e d w i t h H 3 - C 0 3 ( 8 0 : 2 0 ) . F o r s a m p l e s i n c u b a t e d w i t h H z - C O z , t h e b o t t l e s w e r e p r e s s u r i z e d t o 1 . 4 a t m . I n c u b a t i o n t e m p e r a t u r e s o f 2 2 , 3 0 , 3 5 , 3 7 , 4 0 , 4 2 , 4 5 , 5 0 , 5 5 a n d 6 0 ° C w e r e e x a m i n e d u s i n g t r i p l i c a t e s a m p l e s f o r e a c h s u b s t r a t e a t e a c h t e m p e r a t u r e . T h e i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s o f f o r m a t e , a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e w e r e 7 0 , 1 0 , 1 0 a n d 1 0 m M , r e s p e c t i v e l y . G r a n u l e s w e r e w i t h d r a w n f r o m r e a c t o r u s i n g a g l a s s s y r i n g e w i t h a n 1 8 - g a u g e n e e d l e a n d p l a c e d i n t o b o t t l e s c o n t a i n i n g t h e b a s a l m e d i u m ( p H 6 . 8 ) w i t h o u t a d d i t i o n o f a n y s u b s t r a t e . S u b s e q u e n t l y , g r a n u l e s ( 0 . 5 m L ) w e r e t r a n s f e r r e d t o e a c h t e s t b o t t l e . A f t e r 9 4 5 h o u r s o f i n c u b a t i o n a t t h e r e s p e c t i v e t e m p e r a t u r e s , 0 . 6 m L l i q u i d s a m p l e s a n d / o r 0 . 4 m L g a s s a m p l e s w e r e w i t h d r a w n f r o m e a c h b o t t l e f o r V F A a n d m e t h a n e a n a l y s i s , r e s p e c t i v e l y . T h e c o n v e r s i o n r a t e o f a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e w e r e c a l c u l a t e d f r o m V F A a n a l y s i s a n d t h e a m o u n t o f b i o m a s s a d d e d . F o r m a t e a n d H z - C O 2 c o n v e r s i o n r a t e s w e r e b a s e d o n m e t h a n e p r o d u c t i o n . S u b s t r a t e c o n v e r s i o n a n d C H 4 p r o d u c t i o n r a t e s w e r e n o r m a l i z e d b a s e d o n t h e h i g h e s t r a t e s . T h e e f f e c t o f p H o n s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s b y t h e R - a n d F - g r a n u l e s w a s a l s o e x a m i n e d u s i n g a c e t a t e , p r o p i o n a t e , b u t y r a t e , f o r m a t e a n d H 3 - C O 2 a s s u b s t r a t e . M e d i u m c o n d i t i o n s w e r e s i m i l a r t o t h e t e m p e r a t u r e s t u d i e s . T h e p H o f t h e m e d i u m w a s a d j u s t e d t o 5 . 5 , 6 . 0 , 6 . 5 , 7 . 0 , 7 . 5 , 7 . 9 a n d 8 . 4 b y a d d i n g d i f f e r e n t a m o u n t s o f s o d i u m b i c a r b o n a t e i n t o l i q u i d p h a s e a n d C O 2 g a s i n t o t h e h e a d s p a c e . B o t t l e s w e r e i n c u b a t e d i n a s h a k i n g w a t e r b a t h ( 3 7 ° C ) . R e s u l t s r e p o r t e d w e r e a v e r a g e s o f t r i p l i c a t e s a m p l e s . 3 . 2 . 8 M i c r o b i a l p o p u l a t i o n a n a l y s i s M i c r o b i a l p o p u l a t i o n s f o r b o t h t y p e g r a n u l e s w e r e e n u m e r a t e d u s i n g t h e m o s t p r o b a b l e n u m b e r ( M P N ) t e c h n i q u e i n s e a l e d p r e s s u r e t u b e s . A l l t h e t u b e s c o n t a i n e d t h e b a s a l m e d i u m ( 9 m L ) b u f f e r e d w i t h 2 0 m M p h o s p h a t e a n d 2 0 m M b i c a r b o n a t e , r e s p e c t i v e s u b s t r a t e a n d 1 . 0 m M s o d i u m s u l fi d e a s r e d u c t a n t ( m e d i u m f o r a c e t a t e u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s c o n t a i n e d 0 . 3 m M N a Q S ) . T h e h e a d s p a c e w a s p r e s s u r i z e d t o 4 0 k P a u s i n g a n N 3 - C O 2 ( 9 5 : 5 ) g a s m i x t u r e e x c e p t f o r H z - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s . T h e t u b e s f o r m e t h a n o g e n s w e r e s u p p l e m e n t e d w i t h 0 . 0 1 % y e a s t e x t r a c t , p l u s 1 5 m M a c e t a t e , 8 0 m M f o r m a t e , 8 0 m M m e t h a n o l , o r 2 0 2 k P a ( 2 . 0 a t r n ) o f H 3 - C O 2 ( 8 0 : 2 0 ) . S y n t r o p h i c b a c t e r i a l p o p u l a t i o n s u t i l i z i n g p r o p i o n a t e o r b u t y r a t e w e r e e n u m e r a t e d i n t h e t u b e s c o n t a i n i n g t h e b a s a l m e d i u m w i t h 1 5 m M o f t h e r e s p e c t i v e e n e r g y s o u r c e 9 5 a n d p r e - i n o c u l a t e d w i t h 0 . 5 m 1 o f a H 2 a n d f o r m a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n , M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n T l N ( i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s , s e e C h a p t e r 5 ) a s t h e s y n t r o p h i c H z - u t i l i z i n g p a r t n e r . A s e r i e s o f c o n t r o l s w e r e p r e p a r e d , w h i c h c o n t a i n e d t h e s a m e c o m p o n e n t s w i t h t h e e x c e p t i o n o f t h e e n e r g y s o u r c e . H y d r o l y t i c - f e r m e n t a t i v e b a c t e r i a w e r e e n u m e r a t e d u s i n g g l u c o s e ( 2 g / L ) o r l a c t o s e ( 1 g / L ) a s s u b s t r a t e s . T h e g r a n u l e s a m p l e s w e r e w i t h d r a w n f r o m t h e r e a c t o r s i n t o a n a e r o b i c t u b e s , d i s p e r s e d b y r e p e a t e d l y p r e s s i n g g r a n u l e s b a c k a n d f o r t h t h r o u g h a 2 3 - g a u g e n e e d l e a n d g l a s s s y r i n g e , a n d r e - i n j e c t i n g t h e d i s r u p t e d g r a n u l e s i n t o t h e t u b e s . T h e s e d i s r u p t e d o r d i s p e r s e d s a m p l e s w e r e t h e n d i l u t e d s e r i a l l y a n d i n o c u l a t e d i n t o t h e M P N t u b e s b y i n j e c t i n g 1 m L o f s a m p l e i n t o 9 m L m e d i u m . T h e s a m p l e s w e r e d i l u t e d s e r i a l l y f r o m 1 0 ' 1 t o 1 0 1 2 u s i n g 5 t u b e s f o r e a c h d i l u t i o n . O n e m L o f u n d i l u t e d s a m p l e w a s t a k e n f o r e a c h g r a n u l e s a m p l e t o d e t e r m i n e s u s p e n d e d s o l i d s ( S S ) . F o r t h e e n u m e r a t i o n o f m e t h a n o g e n s , t h e i n o c u l a t e d t u b e s w e r e i n c u b a t e d a t 3 7 ° C f o r 2 m o n t h s , a n d t h e r e s u l t s w e r e r e c o r d e d t o b e p o s i t i v e o n t h e b a s i s o f t h e p r e s e n c e o f m e t h a n e ( > 2 m M ) i n t h e h e a d s p a c e o f t h e t u b e s . T h e M P N n u m b e r s o f s y n t r o p h i c p o p u l a t i o n s w e r e a s s a y e d a f t e r 3 m o n t h s o f i n c u b a t i o n a t 3 7 ° C . M e t h a n e f o r m a t i o n ( > 0 . 5 m M C H 4 ) w a s u s e d t o e s t a b l i s h w h e t h e r o r n o t t h e t u b e w a s p o s i t i v e . H y d r o l y t i c b a c t e r i a l p o p u l a t i o n s w e r e e n u m e r a t e d i n t h e t u b e s c o n t a i n i n g t h e b a s a l m e d i u m w i t h 2 g / L o f g l u c o s e o r l a c t o s e . T h e t u b e s w e r e i n c u b a t e d a t 3 7 ° C f o r 2 w e e k s . T h e r e s u l t s f o r p o s i t i v e t u b e s w e r e r e c o r d e d o n t h e b a s i s o f i n c r e a s e i n o p t i c a l d e n s i t y ( > 0 . 2 ) a t 6 6 0 n m a n d p r o d u c t i o n o f v o l a t i l e f a t t y a c i d s ( > 5 m M t o t a l V F A ) , a n d c o m p a r e d w i t h n o n - i n o c u l a t e d c o n t r o l t u b e s . T h e M P N v a l u e s a n d 9 5 % c o n fi d e n c e l i m i t s w e r e c a l c u l a t e d u s i n g a M P N m i c r o c o m p u t e r p r o g r a m ( M a c D o n e l l e t a l . , 1 9 8 4 ) . 9 6 3 . 3 O P E R A T I O N A L P E R F O R M A N C E 3 . 3 . 1 S u b s t r a t e u t i l i z a t i o n a n d C O D r e m o v a l p e r f o r m a n c e G r o w t h a n d o p e r a t i o n a l c o n d i t i o n s m a i n t a i n e d d u r i n g t h e c o m p a r i s o n o f t h e r e a c t o r s i n c u b a t e d w i t h t h e R - a n d F - g r a n u l e s a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 3 . 2 . T h e e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s ( p H , t e m p e r a t u r e , a n d h y d r a u l i c l o a d i n g r a t e ) w e r e m a i n t a i n e d a p p r o x i m a t e l y t h e s a m e f o r b o t h r e a c t o r s . T h e o p e r a t i o n a l c o n d i t i o n s i n b o t h r e a c t o r s w e r e c o n t r o l l e d t o a c h i e v e a p p r o x i m a t e l y t h e s a m e e f fl u e n t c o m p o s i t i o n ( i . e . 2 t o 5 m M o f a c e t a t e , 2 t o 5 m M o f p r o p i o n a t e a n d 0 . 1 t o 0 . 3 m M o f b u t y r a t e ) . T r a c e a m o u n t s o f i s o b u t y r a t e , 2 - m e t h y l b u t y r a t e a n d v a l e r a t e w e r e a l s o d e t e c t e d i n t h e e f fl u e n t s . T h e o p e r a t i o n a l p e r f o r m a n c e s o f b o t h r e a c t o r s a f t e r o n e y e a r i s s u m m a r i z e d i n T a b l e 3 . 3 . B o t h s y s t e m s h a d r e l a t i v e l y h i g h V F A d e g r a d a t i o n a n d C O D r e m o v a l r a t e s . T h e R - g r a n u l e s h a d a l m o s t d o u b l e t h e s p e c i fi c v o l u m e t r i c m e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e ( 1 5 0 t o 1 8 0 L C H 4 ] L g r a n u l e s - d a y ) c o m p a r e d w i t h F - g r a n u l e s ( 7 0 t o 9 0 C H 4 ] L g r a n u l e s - d a y ) , o n t h e b a s i s o f g r a n u l a r b e d v o l u m e . A f t e r r e a c t o r F w a s f e d t h e s a m e m e d i u m a s t h a t o f r e a c t o r R f o r f o u r m o n t h s , t h e s y s t e m d i d n o t e x h i b i t a n y s i g n i fi c a n t i n c r e a s e i n V F A d e g r a d a t i o n o r C O D r e m o v a l r a t e s e x c e p t p e r h a p s a s l i g h t i n c r e a s e i n m e t h a n o g e n i c a c t i v i t y l e v e l s . H y d r o g e n p a r t i a l p r e s s u r e i n b i o g a s f o r r e a c t o r F d e c r e a s e d f r o m 4 - 7 P a t o 1 - 3 P a ( t h e s a m e a s i n r e a c t o r R ) a f t e r c h a n g i n g t h e f e e d . T h e v o l u m e t r i c C O D r e m o v a l r a t e , b a s e d o n t h e r e a c t o r v o l u m e ( 1 0 0 m L ) w a s a s h i g h a s 2 2 5 t o 2 5 0 g C O D / L - d a n d 1 2 5 t o 1 4 5 g C O D / L - d f o r r e a c t o r s R a n d F , r e s p e c t i v e l y . T h e r e a c t o r w i t h R - g r a n u l e s h a d s i g n i fi c a n t l y h i g h e r C O D r e m o v a l c a p a c i t y . D u r i n g a l m o s t t w o y e a r s o f o p e r a t i o n w i t h f e e d A , t h e R - g r a n u l e s m a i n t a i n e d 9 7 a d e n s e s t r u c t u r e a n d a c o n s t a n t y e l l o w i s h - b l u e c o l o r . O r i g i n a l F - g r a n u l e s a p p e a r e d g r e y i s h - b l a c k i n c o l o r . H o w e v e r , a f t e r 4 m o n t h s o f o p e r a t i o n w i t h f e e d B , t h e g r a n u l e s c h a n g e d t o g r e y i s h - y e l l o w s p h e r i c a l g r a n u l e s o f a s i z e l a r g e r t h a n t h e R - g r a n u l e s . A f t e r o n e a n d a h a l f y e a r s o f o p e r a t i o n , t h e i n fl u e n t o f t h e F - g r a n u l e s w a s s w i t c h e d t o f e e d A ( n o g l u c o s e a n d e t h a n o l ) . T h e r e w a s n o d i s c e r n i b l e c h a n g e i n t h e s i z e o r c o l o r o f F - g r a n u l e s a f t e r 4 m o n t h s . 3 . 3 . 2 G r o w t h r a t e o f g r a n u l e b e d s A f t e r i n o c u l a t i o n , t h e g r a n u l e b e d s i n b o t h r e a c t o r s g r e w c o n t i n u o u s l y u n t i l t h e y a t t a i n e d a m a x i m u m h e i g h t . T h e b e d l e v e l s d i d n o t e x c e e d a c e r t a i n h e i g h t r e g a r d l e s s o f t h e a m o u n t o f r o o m a v a i l a b l e f o r b e d e x p a n s i o n . A t h i g h o r g a n i c l o a d i n g r a t e s f o r r e a c t o r R ( 4 0 0 t o 4 5 0 g C O D / L g r a n u l e s - d ) a n d f o r r e a c t o r F ( 2 0 0 t o 2 5 0 g C O D / L g r a n u l e s - d ) , t h e m a x i m u m h e i g h t a t t a i n e d a p p e a r e d t o b e s t r o n g l y d e p e n d e n t o n b i o g a s fl u x a n d t h e p h y s i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e g r a n u l e s . T h e m a x i m u m b e d h e i g h t f o r r e a c t o r R w a s 1 6 c m w h e n t h e b i o g a s fl u x r a t e w a s 1 . 2 t o 1 . 4 m 3 / m 2 - h r , a n d 1 9 t o 2 0 c m a t a b i o g a s fl u x o f 0 . 8 t o 0 . 9 m 3 / m 2 - h r f o r r e a c t o r F . T h e R - g r a n u l e s o c c u p i e d o v e r 5 5 % o f r e a c t o r v o l u m e w h e n b i o g a s p r o d u c t i o n w a s a b o u t c a . 1 2 0 v o l u m e p e r r e a c t o r v o l u m e p e r d a y . T h e F - g r a n u l e s o c c u p i e d 6 5 % o f r e a c t o r v o l u m e a t a b i o g a s p r o d u c t i o n r a t e o f 7 0 v o l / v o l - d . T h e g r a n u l e b e d g r o w t h r a t e o f t h e F - g r a n u l e s ( 0 . 0 4 5 t o 0 . 0 4 8 / d a y ) w a s a l m o s t t w i c e t h a t o f t h e R - g r a n u l e s ( 0 . 0 2 2 / d a y ) . T h i s w a s a p p a r e n t l y d u e t h e s e g r a n u l e s b e i n g l e s s d e n s e . C e l l g r o w t h y i e l d s o f b o t h t y p e s o f g r a n u l e s w e r e a p p r o x i m a t e l y t h e s a m e ( 0 . 0 2 t o 0 . 0 2 5 g S S / g C O D r e m o v e d ) . S w i t c h i n g t h e f e e d f o r t h e F — g r a n u l e r e a c t o r d i d n o t s i g n i fi c a n t l y c h a n g e t h e g r a n u l e b e d g r o w t h r a t e o r t h e b e d d e n s i t y . 9 8 T a b l e 3 . 2 C o m p a r i s o n o f g r o w t h a n d o p e r a t i o n a l c o n d i t i o n s o f t h e R - g r a n u l e s a n d F - g r a n u l e s G r a n u l e s C o n d i t i o n s r o d - t y m fi l a m e n t - t y p e F e e d A B A e t h a n o l ( m M ) 0 6 . 5 0 a c e t a t e ( m M ) 1 0 0 1 3 0 1 0 0 p r o p i o n a t e ( m M ) 5 0 4 0 5 0 b u t y r a t e ( m M ) 5 0 4 0 5 0 g l u c o s e ( m M ) 0 2 0 O p e r a t i o n a l c o n d i t i o n h y d r a u l i c l o a d ( m / h ) a 4 . 4 4 . 4 4 . 4 C O D l o a d i n g r a t e 4 0 0 - 4 5 0 2 0 0 - 2 5 0 2 0 0 - 2 5 0 ( g C O D / L g r a n u l e - d ) C O D r e m o v a l ( % ) > 9 7 % > 9 7 % > 9 7 % E f fl u e n t c o m p o s i t i o n : e t h a n o l ( m M ) 0 0 0 | a c e t a t e ( m M ) 2 - 5 2 - 5 2 - 5 p r o p i o n a t e ( m M ) 2 - 5 2 - 5 2 - 4 b u t y r a t e ( m M ) 0 . 1 - 0 . 3 0 . 1 - 0 . 3 0 . 1 - 0 . 3 i s o b u t y r a t e ( m M ) 0 . 0 5 - 0 . 1 0 . 0 5 - 0 . 1 0 . 0 5 - 0 . 1 2 - m e t h y l b u t y r a t e ( m M ) < 0 . 0 5 < 0 . 0 5 < 0 . 0 5 v a l e r a t e ( m M ) < 0 . 0 5 < 0 . 0 5 < 0 . 0 5 g l u c o s e ( m M ) 0 0 0 b i o m a s s ( m g S S / L ) < 2 0 - 5 0 < 3 0 - 5 0 < 2 0 - 5 0 p H 7 . 3 - 7 . 5 7 . 2 - 7 . 4 7 . 3 - 7 . 7 a : H y d r a u l i c l o a d w a s c a l c u l a t e d b a s e d o n t h e u p fl o w v e l o c i t y c a u s e d b y r e c y c l e p l u s f e e d fl o w . 9 9 T a b l e 3 . 3 O p e r a t i o n a l r e s u l t s o f t h e R - g r a n u l e s a n d F - g r a n u l e s G r a n u l e s P a r a m e t e r r o d - t m fi l a m e n t - t y p e f e e d A f e e d B f e e d A v o l u m e t r i c m e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e ( L / L g r a n u l e s - d ) o p e r a t i o n a l ‘ 1 5 0 - 1 8 0 7 0 - 9 0 8 0 - 9 0 m a x i m u m b 2 3 0 - 2 5 0 1 1 0 1 2 0 - 1 3 0 g a s c o m p o s i t i o n m e t h a n e ( % ) 7 0 - 7 5 6 8 - 7 0 7 0 - 7 5 h y d r o g e n ( P a ) 1 - 3 4 - 7 1 - 3 o p e r a t i o n a l b i o g a s l o a d i n g r a t e c ( m 3 g a s / m z - h r ) 1 . 3 - 1 . 4 0 . 8 - 0 . 9 0 . 8 - 0 . 9 v o l u m e t r i c C O D r e m o v a l r a t e ( g C O D / L - d ) r e a c t o r v o l u m e 2 2 5 - 2 5 0 1 2 5 - 1 4 5 1 3 5 - 1 5 0 t o t a l s y s t e m 9 0 - 1 0 0 5 0 — 5 4 5 0 - 5 8 s p e c i fi c C O D r e m o v a l r a t e ( g C O D / g V S S - d ) o p e r a t i o n a l “ 6 . 9 - 7 . 6 5 . 6 - 6 . 9 5 . 5 - 6 . 9 g r o w t h g r a n u l e g r o w t h r a t e ( l / d ) c 0 . 0 2 2 z i : 0 . 0 0 2 0 . 0 4 5 : l : 0 . 0 0 3 0 . 0 4 8 g r t h y i e l d ( g S S / g C O D ) d 0 . 0 2 2 0 . 0 2 6 0 . 0 2 4 a : L o n g - t e r m a v e r a g e o v e r m o r e t h a n f o u r m o n t h s t o o n e y e a r . b : M e a s u r e d a f t e r i n c r e a s i n g f e e d r a t e o r i n j e c t i n g V F A s t o c k s o l u t i o n t o a c h i e v e 1 0 - 1 5 m M a c e t a t e , 1 0 - 1 5 m M p r o p i o n a t e , a n d 5 - 1 0 m M b u t y r a t e i n s i d e r e a c t o r s . c : C a l c u l a t e d b a s e d o n t h e c r o s s s e c t i o n o f r e a c t o r c o l u m n . A t t h e s e l o a d i n g r a t e s , t h e m a x i m u m b e d h e i g h t w a s 1 5 . 5 c m i n r e a c t o r R a n d 1 9 c m i n r e a c t o r F f e d w i t h b o t h f e e d A a n d B . ( 1 : C a l c u l a t e d b a s e d o n t h e t o t a l C O D r e m o v e d v s . t h e i n c r e a s e d b i o m a s s o f g r a n u l e b e d p l u s t h e w a s h e d - o u t b i o m a s s i n e f fl u e n t . 1 0 0 3 . 4 P H Y S I C A L A N D C H E M I C A L C H A R A C T E R I S T I C S T h e m a j o r p h y s i c a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d b i o c h e m i c a l c o m p o s i t i o n o f t h e R - a n d F - g r a n u l e s a f t e r o n e y e a r o f o p e r a t i o n a n d t h e c o m p o s i t i o n o f t h e F - g r a n u l e s f e d w i t h f e e d A f o r f o u r m o n t h s a r e c o m p a r e d i n T a b l e 3 . 4 . T h e R - g r a n u l e s h a d a h i g h e r s p e c i fi c g r a v i t y ( c a . 1 . 0 3 ) a n d b i o m a s s p e r u n i t o f g r a n u l e b e d v o l u m e ( 6 5 t o 7 0 g S S / L g r a n u l e s ) c o m p a r e d w i t h t h e F - g r a n u l e s ( s p e c i fi c g r a v i t y o f 1 . 0 1 a n d c a . 4 0 g S S / L g r a n u l e s ) . T h e r a t i o o f V S S / S S a n d p r o t e i n c o n t e n t s o f t h e t w o g r a n u l e s w e r e a p p r o x i m a t e l y e q u a l . T h e t o t a l c a r b o n a t e c o n t e n t o f t h e R - g r a n u l e s ( a b o u t 0 . 0 8 m m o l / g S S ) w a s h i g h e r t h a n i n F - g r a n u l e s ( 0 . 0 5 m m o l / g S S ) , i n d i c a t i n g t h a t R - g r a n u l e s c o n t a i n e d m o r e t h a n t w i c e a m o u n t o f c a r b o n a t e s a l t s , p r o b a b l y c a l c i u m a n d m a g n e s i u m c a r b o n a t e s , p e r u n i t v o l u m e . T a b l e 3 . 4 C o m p a r i s o n o f t h e P h y s i c a l a n d c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e R - g r a n u l e s a n d F - g r a n u l e s G r a n u l e T y p e P a r a m e t e r £ 3 1 fi l a m e n t f e e d A f e e d B f e e d A s p e c i fi c g r a v i t y 1 . 0 2 5 - 1 . 0 3 1 . 0 1 1 . 0 1 d e n s i t y , g S S / L g r a n u l e s 6 5 - 7 0 3 9 - 4 0 4 0 - 4 3 V S S / S S 0 . 8 7 0 . 8 8 0 8 8 p r o t e i n , g p r o t e i n / g 8 8 0 . 7 7 0 . 7 8 N D i n t e r n a l c a r b o n a t e , m m o l / g S S 0 . 0 7 - 0 . 0 8 0 . 0 5 N D N D : N o t d e t e r m i n e d . 1 0 1 T h e s i z e d i s t r i b u t i o n o f t h e R - a n d F — g r a n u l e s a f t e r o n e y e a r o f o p e r a t i o n i s s h o w n i n F i g u r e 3 . 2 . O v e r 8 0 % o f t o t a l n u m b e r o f R - g r a n u l e s w e r e l e s s t h a n 1 . 2 m m i n d i a m e t e r a n d 7 4 % o f t o t a l g r a n u l e b e d v o l u m e w a s c o m p o s e d o f g r a n u l e s n o t l a r g e r t h a n 1 . 4 m m i n d i a m e t e r . B y c o n t r a s t , o n l y 4 0 % o f t o t a l n u m b e r o f F - g r a n u l e s h a d d i a m e t e r s l e s s t h a n 1 . 2 m m a n d 8 5 % o f t o t a l g r a n u l e b e d v o l u m e w a s c o m p r i s e d o f g r a n u l e s w i t h a d i a m e t e r l a r g e r t h a n 1 . 4 m m . A f t e r t h e F - g r a n u l e s r e c e i v e d a c h a n g e i n f e e d , n o s i g n i fi c a n t c h a n g e i n s i z e d i s t r i b u t i o n w a s o b s e r v e d . M o s t g r a n u l e s w e r e s t i l l r e l a t i v e l y l a r g e , r a n g i n g f r o m 1 . 2 t o 2 . 0 m m i n d i a m e t e r o r m o r e . 1 0 0 - . . - - I ' é ‘ 3 ° ‘ 3 R - g r a n u l e e . O 5 0 - ~ ° > g 4 0 I ‘ I . ‘ \ F q n n u l e e . . , I ' T ' s 2 ° ‘ o 1 v v 1 1 . 5 2 2 . 5 3 1 0 0 - 3 ' . - c 3 0 " . u l . 2 : r 6 0 - . ° ' 2 ‘ R - g r e n u l e e \ F r a n u l e s . 3 4 0 - I ' 9 p . 2 u a ! 2 0 . . I ‘ I 1 : 5 a 2 : 5 5 T H E s r z e G R A N U L E S L E S S T H A N o n E O U A L T o ( m m ) F i g u r e 3 . 2 S i z e d i s t r i b u t i o n o f t h e R - a n d F - g r a n u l e s . T h e F - g r a n u l e s w e r e f e d w i t h f e e d B . T o t a l n u m b e r o f g r a n u l e s a m p l e s w e r e 3 4 3 f o r t h e R - a n d 1 4 6 f o r F - g r a n u l e s , r e s p e c t i v e l y . 1 0 2 3 . 5 K I N E T I C S F O R G R O W T H A N D M E T A B O L I S M O N D I F F E R E N T S U B S T R A T E S 3 . 5 . 1 S p e c i fi c g r o w t h r a t e H y d r o g e n a n d f o r m a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s h a v e r e l a t i v e l y h i g h s p e c i fi c g r o w t h r a t e s c o m p a r e d t o a c e t a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s a n d s y n t r o p h i c a c e t o g e n s . G r o w t h o f t h e l a t t e r b a c t e r i a l g r o u p s , e s p e c i a l l y o f p r o p i o n a t e d e g r a d e r s , m a y b e a r a t e l i m i t i n g s t e p i n t h e d e v e l o p m e n t o f g r a n u l e s . T h e c o n v e r s i o n r a t e s , p e r r e a c t o r v o l u m e , o f a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e i n c r e a s e d e x p o n e n t i a l l y a s t h e f u n c t i o n o f o p e r a t i o n a l t i m e f o r b o t h r e a c t o r s ( F i g u r e 3 . 3 ) . T h e s p e c i fi c g r o w t h r a t e s o f d i f f e r e n t t r o p h i c g r o u p s a n d r e s p e c t i v e f a t t y a c i d c o n c e n t r a t i o n i n t h e r e a c t o r s i s s u m m a r i z e d i n T a b l e 3 . 5 . T h e s e d a t a d e m o n s t r a t e t h a t t h e s p e c i fi c g r o w t h r a t e s o f a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e d e g r a d e r s i n b o t h R - g r a n u l e s a n d F - g r a n u l e s w e r e q u i t e s i m i l a r ( 0 . 1 t o 0 . 1 3 / d a y ) w h e n s u b j e c t t o s i m i l a r o p e r a t i o n a l c o n d i t i o n r e g a r d l e s s o f w h i c h f e e d w a s u s e d . T h e s e d a t a a l s o r e v e a l t h a t t h e g r o w t h o f s y n t r o p h i c p r o p i o n a t e d e g r a d e r s i s l i k e l y t h e r a t e l i m i t i n g r e a c t i o n i n b o t h g r a n u l e s b e c a u s e t h e p r o p i o n a t e c o n c e n t r a t i o n i n t h e r e a c t o r s w a s m u c h h i g h e r t h a n t h e a p p a r e n t K m f o r p r o p i o n a t e d e g r a d a t i o n ( T a b l e 3 . 6 ) . A n a t t e m p t w a s m a d e t o d e t e r m i n e t h e t h r e s h o l d c o n c e n t r a t i o n s o f d i f f e r e n t f a t t y a c i d s b e l o w w h i c h s u b s t r a t e c o n v e r s i o n c e a s e s . T o d o t h i s , t h e f e e d t o t h e r e a c t o r s w a s s t o p p e d f o r o n e h o u r w h i l e r e c y c l e w a s c o n t i n u e d . A c e t a t e , p r o p i o n a t e , i s o b u t y r a t e , b u t y r a t e , 2 - m e t h y l b u t y r a t e a n d v a l e r a t e i n b o t h r e a c t o r s w e r e c o n s u m e d t o c o n c e n t r a t i o n s b e l o w d e t e c t i o n l i m i t s o f t h e G C a n a l y s i s ( a c e t a t e < 0 . 0 1 m M , o t h e r f a t t y a c i d s < 0 . 0 0 5 m M ) . S E T A R ) N r O o I t T c a A e D r A r R e G p E D y a D d I / C I A o m Y m T ( T A F d 9 d 0 l 1 0 3 1 0 . 5 fi 1 1 0 . 3 - 0 . 6 - 0 . 4 - B U T Y R A T E 0 . 2 - - - f - - o 1 2 3 4 5 e 7 O P E R A ' R O N A L 1 1 M B ( d a y s ) I T h e F - g r a n u l e s w i t h f e e d A A T h e R - g r a n u l e e w i t h f e e d A I T h e F - g r a n u l e s w i t h f e e d 8 F i g u r e 3 . 3 I n c r e a s e o f f a t t y a c i d c o n v e r s i o n r a t e s o f t h e R a n d F - g r a n u l e s i n r e a c t o r s v e r s u s o p e r a t i o n a l p e r i o d 1 0 4 T a b l e 3 . 5 C o m p a r i s o n o f g r o w t h r a t e o f m e t a b o l i c t r o p h i c g r o u p s o f t h e R - a n d F - g r a n u l e s G r a n u l e s P a r a m e t e r r o d - t m fi l a m e n t - t y p e f e e d A f e e d B f e e d A V F A c o n c e n t r a t i o n i n r e a c t o r s a a c e t a t e ( m M ) 2 . 7 4 i 0 3 0 4 . 2 8 : | : 0 . 3 5 2 . 5 8 : l : 0 . 2 4 p r o p i o n a t e ( m M ) 1 . 9 8 i 0 5 3 1 . 7 0 : I : 0 . 3 3 1 . 8 3 1 0 . 4 8 b u t y r a t e ( m M ) 0 . 1 5 i 0 . 0 1 5 0 . 1 6 2 1 : 0 . 0 5 0 . 0 7 : l : 0 . 0 1 G r o w t h r a t e b A c e t a t e d e g r a d e r s g r o w t h r a t e ( l / d ) 0 . 1 2 6 0 . 1 2 9 0 . 1 1 1 r e g r e s s i o n c o e f fi c i e n t 0 . 9 8 4 0 . 9 9 8 0 . 9 9 2 P r o p i o n a t e d e g r a d e r s g r o w t h r a t e ( 1 / d ) 0 . 1 2 0 0 . 1 3 0 0 . 1 0 4 r e g r e s s i o n c o e f fi c i e n t 0 . 9 8 7 0 . 9 9 6 0 . 9 9 2 B u t y r a t e d e g r a d e r s g r o w t h r a t e ( l / d ) 0 . 1 2 8 0 . 1 2 9 0 . 1 1 3 r e g r e s s i o n c o e f fi c i e n t 0 . 9 8 2 0 . 9 9 9 0 . 9 9 2 a : A v e r a g e c o n c e n t r a t i o n s i n o n e w e e k o f o p e r a t i o n . b : O b t a i n e d f r o m l o g a r i t h m i c l i n e a r r e g r e s s i o n o f f a t t y a c i d d e g r a d a t i o n r a t e p e r r e a c t o r v e r s u s o p e r a t i o n a l p e r i o d ( d a y ) . 1 0 5 3 . 5 . 2 M a x i m u m s p e c i fi c s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e a n d h a l f v e l o c i t y c o e f f i c i e n t ( K m ) T h e m a x i m u m s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s f o r d i f f e r e n t s u b s t r a t e s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 3 . 6 . T h e m a x i m u m r a t e s w e r e d e t e r m i n e d d i r e c t l y i n t h e r e a c t o r s b y i n j e c t i n g c o n c e n t r a t e d s t o c k s o l u t i o n s o f d i f f e r e n t s u b s t r a t e s t o o b t a i n a h i g h s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n i n t h e s y s t e m s . A f t e r p u l s e a d d i t i o n o f f o r m a t e , h i g h h y d r o g e n l e v e l s w e r e o b s e r v e d O b s e r v e d h y d r o g e n c o n c e n t r a t i o n s i n b i o g a s r e a c h e d a s h i g h a s 0 . 1 4 % ( v o l / v o l ) i n r e a c t o r R ( C H 4 c o n t e n t w a s 4 4 t o 4 5 % a t t h a t t i m e ) a n d u p t o 0 . 6 6 % i n r e a c t o r F ( C H , 3 c o n t e n t 4 2 t o 4 3 % ) . T h e t o t a l f o r m a t e c o n v e r s i o n r a t e s a n d t h e r a t e s o f m e t h a n e a n d h y d r o g e n p r o d u c t i o n a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 3 . 6 . T h e r a t i o o f m e t h a n e t o h y d r o g e n p r o d u c e d w a s c a . 1 6 0 0 f o r t h e R - a n d 2 7 0 f o r t h e F - g r a n u l e s . A f t e r p u l s e a d d i t i o n o f b u t y r a t e ( 6 t o 8 m M ) , a c e t a t e a n d i s o b u t y r a t e a c c u m u l a t e d . I n r e a c t o r R , a c e t a t e a n d i s o b u t y r a t e c o n c e n t r a t i o n s a c c u m u l a t e d t o 1 . 5 a n d 0 . 2 m M , r e s p e c t i v e l y . I n r e a c t o r F , a c e t a t e a n d i s o b u t y r a t e l e v e l s o f 1 . 2 m M a n d 0 . 0 5 m M , r e s p e c t i v e l y , w e r e o b s e r v e d . T h e t o t a l c o n v e r s i o n r a t e o f b u t y r a t e , t h e r a t e o f b u t y r a t e d e g r a d a t i o n t o a c e t a t e p l u s C H 4 , a n d t h e r a t e o f b u t y r a t e i s o m e r i z a t i o n t o i s o b u t y r a t e a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 3 . 6 . T h e r a t i o b e t w e e n c o n v e r s i o n o f b u t y r a t e i n t o a c e t a t e a n d C H 4 a n d i s o m e r i z a t i o n o f b u t y r a t e t o i s o b u t y r a t e w a s 2 0 a n d 4 7 f o r R - g r a n u l e s a n d F - g r a n u l e s , r e s p e c t i v e l y . P u l s e a d d i t i o n o f i s o b u t y r a t e t o e i t h e r t y p e o f g r a n u l e s p r o d u c e d o n l y t r a c e a m o u n t s ( n e a r d e t e c t a b l e l e v e l s ) o f a c e t a t e a n d b u t y r a t e . T h i s i n d i c a t e d t h a t b u t y r a t e p r o d u c e d f r o m i s o b u t y r a t e w a s r a p i d l y c o n v e r t e d t o C I - I , 3 v i a a c e t a t e , b e c a u s e t h e c o n v e r s i o n r a t e s o f b u t y r a t e a r e h i g h e r t h a n t h e c o n v e r s i o n r a t e s o f i s o b u t y r a t e t o b u t y r a t e i n b o t h s y s t e m s ( T a b l e 3 . 6 ) . T h e r a t i o b e t w e e n t h e r a t e o f b u t y r a t e t o a c e t a t e a n d C H , a n d t h e r a t e o f i s o b u t y r a t e t o a c e t a t e a n d C H 4 w a s 2 . 6 a n d 3 . 5 f o r t h e R - a n d F - g r a n u l e s , r e s p e c t i v e l y . T h i s i n d i c a t e s t h a t 1 0 6 c o n v e r s i o n o f i s o b u t y r a t e t o b u t y r a t e i s l i k e l y t h e r a t e l i m i t i n g s t e p i n t h e d e g r a d a t i o n o f i s o b u t y r a t e . H i g h e r c o n v e r s i o n r a t e s o f i s o b u t y r a t e a n d i s o m e r i z a t i o n r a t e s w e r e o b s e r v e d f o r t h e R - g r a n u l e s c o m p a r e d t o t h e F - g r a n u l e s , i n d i c a t i n g t h a t t h e R - g r a n u l e s c o n t a i n e d m o r e i s o b u t y r a t e - b u t y r a t e d e g r a d e r s t h a n t h e F - g r a n u l e s . T a b l e 3 . 6 C o m p a r i s o n o f m a x i m u m o f r a t e s a n d h a l f v e l o c i t y c o e f fi c i e n t s ( K m ) f o r m a j o r f e r m e n t a t i o n a n d i n t e r m e d i a t e p r o d u c t s b y R - a n d F - g r a n u l e s M a x i m u m C o n v e r s i o n R a t e s V o l g m e t r i c S p e c i fi c K m I m M ) S u b s t r a t e ( m o l / L - d a y ) ( m m o l / g V S S - h r ) R F R F R F m e t h a n o l 0 . 9 3 0 . 2 0 . 6 9 0 . 2 4 N D N D e t h a n o l 0 . 2 3 2 . 2 0 . 1 7 2 . 7 N D N D f o r m a t e 5 5 . 9 2 9 . 6 4 1 . 3 3 5 . 9 N D N D t o C H , 5 5 . 9 2 9 . 5 4 1 . 3 3 5 . 8 N D N D t o H 2 0 . 0 3 5 0 . 1 1 0 . 0 2 5 0 . 1 3 N D N D a c e t a t e 7 . 1 3 . 2 5 . 3 5 . 4 0 . 4 3 : 0 . 0 1 0 . 4 2 i 0 1 6 p r o p i o n a t e l . 8 0 . 7 6 1 . 3 0 . 9 2 0 . 0 4 8 : t 0 . 0 2 0 0 3 7 1 0 . 0 0 5 b u t y r a t e 4 . 1 1 . 8 3 . 0 2 . 2 0 . 1 5 : l : 0 . 0 1 4 0 . 1 9 : 0 . 0 0 6 t o a c e t a t e 3 . 9 1 . 7 6 2 . 8 8 2 . 1 4 N D N D t o i s o b u t y r a t e 0 . 2 0 0 . 0 4 0 . 1 5 0 . 0 5 N D N D i s o b u t y r a t e 1 . 5 0 . 5 1 . 1 1 0 . 6 1 0 . 1 5 : 0 . 0 3 4 0 . 1 5 : 1 : 0 . 0 5 6 v a l e r a t e 2 . 0 1 . 2 1 . 7 0 1 . 4 5 0 . 1 3 : l : 0 . 0 1 3 0 . 1 0 i 0 . 0 0 9 g l u c o s e 0 . 1 l 0 . 5 0 . 0 8 0 . 6 1 N D N D ( 1 ) N D : N o t d e t e r m i n e d . ( 2 ) T h e g r a n u l e b e d d e n s i t i e s u s e d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f m a x i m u m c o n v e r s i o n r a t e s w e r e 6 4 a n d 3 9 g S S / L g r a n u l e s f o r t h e R - a n d F - g r a n u l e s , r e s p e c t i v e l y . ( 3 ) T e m p e r a t u r e : 3 5 ° C . 1 0 7 A f t e r p u l s e a d d i t i o n o f v a l e r a t e , p r o p i o n a t e a c c u m u l a t e d t o l e v e l s o f 1 . 2 m M a n d 1 . 5 m M i n r e a c t o r R a n d F , r e s p e c t i v e l y . T r a c e a m o u n t s o f b u t y r a t e a n d 2 - m e t h y l b u t y r a t e w e r e a l s o o b s e r v e d . P r o p i o n a t e i s a p r o d u c t o f v a l e r a t e d e g r a d a t i o n b y s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d e r s ( M c I n e m e y e t a l . , 1 9 8 1 ; S t i e b a n d S c h i n k , 1 9 8 5 ; S h e l t o n a n d T i e d j e , 1 9 8 4 ; R o y e t a l . , 1 9 8 5 ; A h r i n g a n d W e s t e r m a n n , 1 9 8 7 a ) . T h e m e a s u r e d c o n v e r s i o n r a t e s o f p r o p i o n a t e w e r e 2 7 % a n d 5 8 % l o w e r t h a n t h o s e o f v a l e r a t e o n a m o l a r b a s i s f o r t h e R - a n d F - g r a n u l e s r e s p e c t i v e l y ( T a b l e 3 . 6 ) . T h i s i s l i k e l y t h e r e a s o n f o r t h e o b s e r v e d a c c u m u l a t i o n o f p r o p i o n a t e . T h e a c c u m u l a t i o n o f b u t y r a t e a n d 2 - m e t h y l b u t y r a t e m a y b e d u e t o o t h e a c t i v i t y o f s y n t r o p h i c i s o b u t y r a t e d e g r a d e r s ( s e e C h a p t e r 6 ) . W h e n r e a c t o r s w e r e s u b j e c t t o p u l s e a d d i t i o n o f e t h a n o l , m e t h a n o l , a c e t a t e a n d g l u c o s e , n o a c c u m u l a t i o n o f f a t t y a c i d s o r o t h e r o r g a n i c c o m p o u n d s w a s o b s e r v e d . T h e c o n v e r s i o n r a t e s f o r m e t h a n o l a n d a l l t h e f a t t y a c i d s t e s t e d w e r e h i g h e r i n t h e R - g r a n u l e s t h a n t h o s e i n t h e F - g r a n u l e s , b a s e d o n v o l u m e t r i c c o n v e r s i o n r a t e s ( m o l / L g r a n u l e s - d a y ) . T h e c o n v e r s i o n r a t e s w e r e a p p r o x i m a t e l y 2 - f o l d h i g h e r f o r f o r m a t e , p r o p i o n a t e , b u t y r a t e a n d v a l e r a t e , a p p r o x i m a t e l y 3 - f o l d g r e a t e r f o r a c e t a t e a n d i s o b u t y r a t e , a n d 4 . 5 - t i m e s g r e a t e r f o r m e t h a n o l f o r t h e R - g r a n u l e s . W h e n t h e s p e c i fi c r a t e s w e r e c a l c u l a t e d i n t e r m s o f s u b s t r a t e c o n v e r t e d b y u n i t o f b i o m a s s ( i . e . m m o l s u b s t r a t e / g V S S - h r ) , h o w e v e r , t h e s p e c i fi c a c t i v i t i e s o f t h e F - g r a n u l e s w e r e o n l y s l i g h t l y l e s s t h a n t h e R - g r a n u l e s f o r v o l a t i l e f a t t y a c i d s a n d m e t h a n o l . T h e c o n v e r s i o n r a t e f o r e t h a n o l a n d g l u c o s e w e r e a p p r o x i m a t e l y 1 0 - a n d 5 - f o l d h i g h e r i n t h e F - g r a n u l e s c o m p a r e d t o t h e R - g r a n u l e s . T h e m a x i m u m h y d r o g e n c o n v e r s i o n r a t e s c o u l d n o t b e d e t e r m i n e d d i r e c t l y i n t h e r e a c t o r s . T h e y w e r e m e a s u r e d i n d i r e c t l y i n p H c o n t r o l l e d b a t c h e x p e r i m e n t s . T h e s e r e s u l t s w e r e c o m p a r e d w i t h f o r m a t e c o n v e r s i o n r a t e s . T h e R - a n d F - g r a n u l e s 1 0 8 w e r e o b s e r v e d t o h a v e d i f f e r e n t r a t i o s o f t h e c o n v e r s i o n r a t e s o f H 3 - C O 2 a n d f o r m a t e , d e p e n d i n g o n t h e p H . A t p H 7 . 0 , t h e r a t i o w a s a p p r o x i m a t e l y 1 . 0 3 f o r b o t h t h e R - a n d F - g r a n u l e s . A t p H 7 . 5 , h o w e v e r , t h e r a t i o w a s 0 . 8 5 f o r t h e R - g r a n u l e s a n d 1 . 4 f o r t h e F - g r a n u l e s . D e t e r m i n a t i o n o f a p p a r e n t K m d e m o n s t r a t e d t h a t t h e d i s r u p t e d R - a n d F - g r a n u l e s h a d a s i m i l a r r a n g e o f K m v a l u e s i . e . 0 . 4 3 a n d 0 . 4 2 m M f o r a c e t a t e , 0 . 0 4 8 a n d 0 . 0 3 7 m M f o r p r o p i o n a t e , 0 . 1 5 a n d 0 . 1 5 m M f o r i s o b u t y r a t e , 0 . 1 5 a n d 0 . 1 9 m M f o r b u t y r a t e , a n d 0 . 1 3 a n d 0 . 1 0 m M f o r v a l e r a t e , r e s p e c t i v e l y ( T a b l e 3 . 6 ) . 3 . 5 . 3 T e m p e r a t u r e a n d p H e f f e c t s T h e e f f e c t o f t e m p e r a t u r e s o n t h e s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s f o r H 3 - C O 3 , f o r m a t e , a c e t a t e , p r o p i o n a t e , a n d b u t y r a t e i s i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 3 . 4 . B o t h R - a n d F - g r a n u l e s s h o w e d t h e s a m e t e m p e r a t u r e m a x i m u m s . T e m p e r a t u r e m a x i m u m s w e r e o b s e r v e d t o b e c a . 4 5 ° C f o r H z - C O 2 a n d f o r m a t e , a n d 4 0 ° C f o r a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e . T h e R - g r a n u l e s b u t n o t F - g r a n u l e s s h o w e d s i g n i fi c a n t b u t y r a t e c o n v e r s i o n a c t i v i t y e v e n a t 5 0 ° C . T h e s e r e s u l t s o n l y r e p r e s e n t t h e e f f e c t o f t e m p e r a t u r e o n t h e s u b s t r a t e m e t a b o l i c a c t i v i t i e s o v e r a s h o r t t e r m ( w i t h i n o n e d a y ) a n d d o n o t s h o w t h e e f f e c t o f t e m p e r a t u r e o n m i c r o b i a l g r o w t h . L o n g - t e r m e f f e c t s m a y b e q u i t e d i f f e r e n t . T h e e f f e c t o f p H o n t h e c o n v e r s i o n r a t e s o f H 3 - C O Z , f o r m a t e , a c e t a t e , p r o p i o n a t e , a n d b u t y r a t e i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 3 . 5 . B o t h t y p e o f g r a n u l e s h a d s i m i l a r p H o p t i m a f o r c o n v e r s i o n o f f o r m a t e , a c e t a t e a n d b u t y r a t e . H o w e v e r , t h e y h a d d i f f e r e n t o p t i m u m p H f o r m a x i m u m c o n v e r s i o n r a t e s o f H z - C O 2 a n d p r o p i o n a t e . T h e o p t i m u m p H f o r H 3 - C O 2 u t i l i z a t i o n b y t h e R - g r a n u l e s w a s 7 . 0 , c o m p a r e d t o 7 . 5 f o r t h e F - g r a n u l e s . B y c o n t r a s t , t h e h i g h e s t p r o p i o n a t e c o n v e r s i o n r a t e w a s a t p H 7 . 4 f o r t h e R - g r a n u l e s c o m p a r e d t o 7 . 8 f o r t h e F - g r a n u l e s . 5 . Y T I V I T C A M U M I X A M E V I T A L E R 1 0 9 ( b ) ( C ) P a t P A . ° t o P F o r m a t e . l . 1 4 1 A _ l P r o p i o n a t e ( d ) ( e ) 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 2 0 8 0 4 0 5 0 6 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 T E M P E R A T U R E ( ° C ) . R - g r a n u l e s I F - g r a n u l e s F i g u r e 3 . 4 T e m p e r a t u r e e f f e c t o n s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s a t p H 6 . 8 . ( a ) H z - C O Z ; ( b ) f o r m a t e ; ( c ) a c e t a t e ; ( ( 1 ) p r o p i o n a t e ; ( e ) b u t y r a t e . 1 1 0 ( C ) t 1 E l - 0 < 0 . 8 E D E 0 . 6 E . 1 . 1 . 1 0 . 4 : a l . — : S I 0 . 2 I I E F o r m a t e A c e t a t e P r o p i o n a t e B u t y r a t e 0 . l . l . l . l I . 1 . 1 1 . 1 . 1 L I | . | . | , | . | I . l l l . l I . I N 6 7 8 6 7 8 6 7 8 6 7 8 6 7 8 p H . R - g r a n u l e s I F - g r a n u l e s F i g u r e 3 . 5 p H e f f e c t s o n s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s a t 3 7 ° C . ( a ) H 3 - C O 3 ; ( b ) f o r m a t e ; ( c ) a c e t a t e ; ( ( 1 ) p r o p i o n a t e ; ( e ) b u t y r a t e . 1 1 1 3 . 6 M I C R O B I A L C O M P O S I T I O N A N D S T R U C T U R E O F G R A N U L E S 3 . 6 . 1 M o s t p r o b a b l e n u m b e r ( M P N ) e n u m e r a t i o n T h e r e s u l t s o f M P N e n u m e r a t i o n f o r v a r i o u s m i c r o b i a l t r o p h i c g r o u p s i n t h e t w o t y p e s o f g r a n u l e s a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 3 . 7 . B o t h t y p e o f g r a n u l e s h a d a p p r o x i m a t e l y t h e s a m e p o p u l a t i o n l e v e l s f o r H 3 - , f o r m a t e - , a n d a c e t a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s p e r g r a m o f S S . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b t a i n e d f o r s y n t r O p h i c p r o p i o n a t e - a n d b u t y r a t e - d e g r a d i n g b a c t e r i a . T h e F - g r a n u l e s c o n t a i n e d 1 0 t o 1 0 0 - f o l d h i g h e r n u m b e r s o f h y d r o l y t i c - f e r m e n t a t i v e b a c t e r i a t h a n R - g r a n u l e s w h e n l a c t o s e o r g l u c o s e w e r e u s e d a s s u b s t r a t e s a s w o u l d b e e x p e c t e d b a s e d o n t h e r e s p e c t i v e f e e d s u s e d . B a s e d o n t h e M P N v a l u e s , t h e m a j o r m i c r o b i a l p o p u l a t i o n s i n b o t h t y p e s o f g r a n u l e s w e r e H 3 - , f o n n a t e - , a n d a c e t a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s . T h e s e o r g a n i s m s c o n t r i b u t e d a b o u t 9 0 % o f t h e t o t a l c u l t u r a b l e m i c r o b i a l p o p u l a t i o n s . S y n t r o p h i c a c e t o g e n s c o n t r i b u t e d a b o u t 1 0 % o f p o p u l a t i o n r e c o r d e d v i a t h e M P N t e s t . T h e p o p u l a t i o n o f h y d r o l y t i c - f e r m e n t a t i v e m i c r o o r g a n i s m s w a s n o t l a r g e e v e n i n t h e F - g r a n u l e s , w h i c h c o n t a i n e d a h i g h e r l e v e l o f h y d r o l y t i c b a c t e r i a ( 1 0 ‘ 1 c e l l s / g V S S ) c o m p a r e d t o t h e R - g r a n u l e s ( 1 0 ° ) . T h e s e M P N r e s u l t s a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s o f t h e t w o t y p e s o f g r a n u l e s . B a s e d o n t h e M P N r e s u l t s , t h e n u m b e r o f t o t a l b a c t e r i a i n t h e g r a n u l e s i s e s t i m a t e d t o b e b e t w e e n 1 0 1 2 t o 1 0 1 3 c e l l s / g S S . r 0 3 e 9 6 4 0 9 p 3 6 0 9 4 . 9 0 p . . . . . 3 . . u 0 0 0 9 0 1 1 1 s t i m i l S . . 4 7 4 4 0 0 e S c n g e / s d l fi l n e o c c 2 ‘ 0 0 r 9 2 % 0 e 6 0 1 . 6 2 1 p . d 0 1 2 2 3 9 0 5 p . . . . . . . 0 e 9 u x 0 0 0 6 3 0 1 1 t 7 6 1 1 0 5 2 6 0 0 1 2 6 4 . . . . . . 0 0 0 0 0 1 p e c c a e r e w s t s e t n o i t p m 8 3 g / 2 ' 0 1 4 u 1 2 9 3 8 6 3 s 1 1 0 6 6 0 s 1 7 . . . . . . . . a 0 0 0 0 3 4 0 0 e h t , s t x l 6 s u N P 6 2 0 4 . . M 0 0 g n i g g g n e r n o i t a r e m u n z e n g n i i l i n c i z z i i z N i i i z t n l i i l u e i l g c t i - t i g n M i u t e u t o i h u - t - u z l p - a e - i n l l l i P o n t e l a o e r o a t i h t n t t t i r a a a n e p y t u m h a r o o t - e r F t y S r z c u o e M P F M B H A . . I I I I I ) 2 ( T a b l e 3 . 7 T r o p h i c g r o u p p o p u l a t i o n s i n t h e R - a n d F - g r a n u l e s B a c t e r i a l g r o u p R F l o w e r l o w e r F I . H y d r o l y t i c L a c t o s e - u t i l i z i n g G l u c o s e - u t i l i z i n g 0 . 0 0 2 7 0 . 0 0 5 6 3 . 5 2 . 0 1 . 3 0 . 0 0 4 3 0 . 0 0 1 0 0 . 0 0 1 9 0 . 0 1 0 0 . 1 2 1 . 1 1 . 7 0 . 2 3 0 . 0 1 0 ( 1 ) M P N e n u m e r a t i o n u s e d 5 t u b e s p e r d i l u t i o n l e v e l . T h e b a c t e r i a l c o n c e n t r a t i o n s i n t h e s a m p l e s w e r e 2 . 6 t o 8 . 2 m g S S / m L . 1 1 2 1 1 3 3 . 6 . 2 M i c r o s c o p i c a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n S i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e s i n t h e m i c r o b i a l c o m p o s i t i o n o f d i f f e r e n t g r a n u l e s w e r e e a s i l y o b s e r v e d b y m i c r o s c o p i c a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n s . C o m p a r i s o n o f d i s r u p t e d g r a n u l e s u n d e r p h a s e - c o n t r a s t m i c r o s c o p y i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 3 - 6 . T h e m o s t s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e R - a n d F - g r a n u l e s w a s t h e p r e d o m i n a n t a c e t a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s o b s e r v e d . I n t h e R - g r a n u l e s , a l a r g e n u m b e r o f b a m b o o - s h a p e d r o d s i n c h a i n s o f 3 t o 5 c e l l s w e r e o b s e r v e d ( F i g u r e 3 . 6 A ) . I n t h e F - g r a n u l e s , l o n g - fi l a m e n t o u s , b a m b o o - s h a p e d r o d s i n c h a i n s o f t e n o r m o r e c e l l s w e r e o b s e r v e d ( F i g u r e 3 . 6 8 a n d C ) . N e i t h e r o f t h e s e c e l l s h a d s i g n i fi c a n t e p i fl u o r e s c e n c e , a c h a r a c t e r i s t i c w h i c h a s s o c i a t e s t h e s e w i t h M e t h a n o t h r i x s p e c i e s . M e t h a n o b a c t e r i u m - l i k e r o d s w e r e f o u n d t o b e t h e p r e d o m i n a n t m e t h a n o g e n s i n b o t h g r a n u l e s t h a t fl u o r e s c e d , w h e n o b s e r v e d u n d e r u l t r a - v i o l e n t l i g h t . M e t h a n o s a r c i n a a g g r e g a t e s a n d a s p i r i l l u m - s h a p e d m e t h a n o g e n , r e s e m b l i n g M e t h a n o s p i r i l l u m s p . , w e r e a l s o o b s e r v e d u n d e r e p i fl u o r e s c e n t m i c r o s c o p y . T h e s t r u c t u r e s o f t h e R - a n d F - g r a n u l e s w e r e o b s e r v e d u s i n g S E M a n d T E M p h o t o m i c r o g r a p h s . B o t h t h e s u r f a c e a n d i n s i d e s e c t i o n s o f t h e R - a n d F - g r a n u l e s a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e 3 . 7 . U n d e r l o w m a g n i fi c a t i o n , b o t h g r a n u l e s w e r e o b s e r v e d t o h a v e a n u n e v e n s u r f a c e ( F i g u r e 3 . 7 A a n d B ) . U n d e r h i g h e r m a g n i fi c a t i o n , d e n s e m i c r o b i a l s t r u c t u r e s , b o t h o n t h e s u r f a c e a n d i n s i d e t h e g r a n u l e s , w e r e o b s e r v e d f o r t h e R - g r a n u l e s . T h e r o d - s h a p e d , M e t h a n o t h r i x — l i k e a n d o t h e r b a c t e r i a w e r e p a c k e d t i g h t l y t o g e t h e r t o f o r m d e n s e g r a n u l e s ( F i g u r e 3 . 7 C a n d E ) . O n t h e s u r f a c e o f t h e F - g r a n u l e s , a t l e a s t t w o t y p e s o f l o n g - fi l a m e n t o u s b a c t e r i a w e r e o b s e r v e d t o o c c u p y m u c h o f t h e s p a c e . T h e s e fi l a m e n t s f o r m e d a l o o s e s t r u c t u r e c o m p a r e d t o t h e t i g h t l y p a c k e d R - g r a n u l e s ( F i g u r e 3 . 7 D ) . O n e o f t h e s e o r g a n i s m s t h a t g r e w a s M e t h a n o t h r i x s o e h n g e n i i - l i k e fi l a m e n t s , w a s o b s e r v e d b o t h o u t s i d e a n d i n s i d e t h e F - g r a n u l e s ( F i g u r e 3 - 7 F ) . T h e 1 1 4 o t h e r fi l a m e n t o u s t y p e c e l l s , w h i c h w e r e m u c h t h i n n e r ( a b o u t 0 . 2 p m i n d i a m e t e r ) t h a n M e t h a n o r h r i x s p . ( 0 . 7 t o 0 . 8 p m d i a m e t e r ) , w e r e o b s e r v e d m a i n l y o n t h e s u r f a c e o f t h e F — g r a n u l e s . T h e s a m e o r g a n i s m s w e r e a l s o o b s e r v e d i n t h e w a s h e d — o u t fl o c s f r o m t h e F - g r a n u l e s r e a c t o r . T h e s e t y p e o f c e l l s d i s a p p e a r e d f r o m t h e F - g r a n u l e s w h e n f e e d B ( g l u c o s e c o n t a i n i n g ) w a s r e p l a c e d w i t h f e e d A . F i g u r e 3 . 6 M i c r o s c o p i c c o m p a r i s o n b e t w e e n t h e R - g r a n u l e s a n d F - g r a n u l e s . ( A ) D i s r u p t e d R - g r a n u l e s s h o w i n g r o d - t y p e M e t h a n o t h r i x a s p r e d o m i n a n t b a c t e r i a i n t h e g r a n u l e s . ( B ) D i s r u p t e d F - g r a n u l e s s h o w i n g M e t h a n o t h r i x s o e h n g e m ' i — l i k e fi l a m e n t s a s p r e d o m i n a n t b a c t e r i a w h e n f e d w i t h V F A m i x t u r e p l u s e t h a n o l a n d g l u c o s e . ( C ) L o n g fi l a m e n t o u s M e t h a n o t h r i x s o e h n g e n i i - l i k e b a c t e r i a w e r e s t i l l p r e d o m i n a n t b a c t e r i a i n t h e F - g r a n u l e s a f t e r f e d w i t h V F A m i x t u r e f o r m o r e t h a n 4 m o n t h s . F i g u r e 3 . 7 1 1 5 S E M p h o t o s o f t h e R - g r a n u l e s f e d w i t h V F A m i x t u r e a n d t h e F - g r a n u l e s f e d w i t h V F A p l u s g l u c o s e a n d e t h a n o l . ( A ) O v e r v i e w o f t h e R - g r a n u l e s . ( B ) O v e r v i e w o f t h e F - g r a n u l e s . ( C ) D e n s e l y p a c k e d r o d - t y p e M e t h a n o t h r i x s p . o n t h e s u r f a c e o f t h e R - g r a n u l e s . ( D ) T h e s u r f a c e o f t h e F - g r a n u l e s s h o w s fi l a m e n t o u s M e t h a n o t h r i x s o e h n g e n i i - l i k e b a c t e r i a a n d o t h e r fi l a m e n t s f o r m a l o o s e n e t w o r k . ( E ) T h e c r o s s s e c t i o n o f t h e R - g r a n u l e s s h o w i n g d e n s e s t r u c t u r e p a c k e d b y M e t h a n o t h r i x s p . a n d o t h e r b a c t e r i a . ( F ) T h e c r o s s s e c t i o n o f t h e F - g r a n u l e s s h o w i n g t h e n e t w o r k f o r m e d m a i n l y b y M t r x . s o e h n g e n i i — l i k e fi l a m e n t s . o : 1 1 7 F i g u r e 3 . 8 T E M p h o t o s o f t h e R - g r a n u l e s a n d F - g r a n u l e s . ( A ) H i g h e r c e l l d e n s i t y o f t h e R - g r a n u l e s . ( B ) T E M t h i n s e c t i o n s h o w i n g l o w e r c e l l d e n s i t y o f t h e F - g r a n u l e s . . W { a . . H . O H — . ” n ” 4 e h a e . . . . . fi v e . 0 e — “ C . v ‘ h . a 0 " g I . m 9 . l a b e . I fi e . . , e . z 0 " e O . 4 e ‘ ” 1 o V 0 V ’ e . 0 3 . . ‘ . W w e m @ V . . . o e a A . ‘ . o v g . m . . — I . e J . e . \ t . ‘ § r < a . ‘ . e e e e O t c e e n . " c 1 o . ' . 0 u 0 V 4 . 0 0 . \ J ‘ 1 " , N ” l d W e . Z o H . ‘ \ C 0 I ‘ . 0 I . . ’ 0 I . ’ 0 . ” . ‘ 0 ‘ . O J G \ . L 0 W . . . , 1 1 8 1 1 9 T E M e x a m i n a t i o n r e v e a l e d t h a t t h e R - g r a n u l e s h a d a h i g h e r m i c r o b i a l d e n s i t y t h a n t h e F - g r a n u l c s . M e t h a n o t h r i x - m o r p h o t y p e c e l l s w e r e p r e v a l e n t i n b o t h t y p e s o f g r a n u l e s ( F i g u r e 3 . 8 A a n d B ) . U s i n g c r o s s s e c t i o n s o f t h e g r a n u l e s , M e t h a n o t h r i x - l i k e b a c t e r i a w e r e c o u n t e d . N e a r l y 2 . 9 ) t h 7 c e l l s / c m 2 w e r e o b s e r v e d i n t h e R - g r a n u l e s , a n d 2 . 0 x 1 0 7 c e l l s / c m 2 w e r e f o u n d p r e s e n t i n t h e F - g r a n u l e s . O t h e r b a c t e r i a a n d e m p t y c e l l s w e r e o b s e r v e d t o b e p r e s e n t a t 3 . 7 x 1 0 7 a n d 1 . 4 x 1 0 7 c e l l s / c m z , a n d 3 . 6 x 1 0 7 a n d 0 . 4 x 1 0 7 c e l l s / c m 2 i n t h e R - a n d F - g r a n u l e s , r e s p e c t i v e l y ( T a b l e 3 . 8 ) . V i a b l e c e l l d e n s i t y c a n b e e s t i m a t e d b y c o n s i d e r i n g t h a t t h e g r a n u l e s h a v e t h r e e d i m e n s i o n s i n s t e a d o f t w o . C e l l d e n s i t i e s w e r e c a l c u l a t e d t o b e 7 x 1 0 ” / c m 3 a n d 4 . 6 x 1 0 1 1 c e l l s / c m 3 f o r t h e R - a n d F - g r a n u l e s , r e s p e c t i v e l y . T h e s e v a l u e s c o m p a r e f a v o r a b l y w i t h t h e r e s u l t s f o r t h e M P N a n a l y s i s . T a b l e 3 . 8 C o m p a r i s o n o f m i c r o b i a l c e l l d e n s i t i e s o f t h e R - a n d F - g r a n u l e s m ( 1 0 7 c e l l s p e r c m z ) G r a n u l e s R o d t y p e F i l a m e n t - t y p e M e t h a n o t h r i x - l i k e 2 . 9 2 . 0 O t h e r b a c t e r i a 3 . 7 3 . 6 e m p t y c e l l s 1 . 4 0 . 4 t o t a l c e l l s 9 . 0 6 . 0 1 2 0 3 . 7 D I S C U S S I O N 3 . 7 . 1 S i m i l a r i t i e s a n d d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e R - a n d F - g r a n u l e s A s u m m a r y o f t h e s i m i l a r i t i e s a n d d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e R - g r a n u l e s a n d F - g r a n u l e s i s p r e s e n t e d i n T a b l e 3 . 9 . T h e t w o t y p e s o f g r a n u l e s h a d s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e s i n p h y s i c a l c h a r a c t e r i s t i c s ( d e n s i t y , s p e c i fi c g r a v i t y , a n d g r a n u l e s i z e ) , v o l u m e t r i c o p e r a t i o n a l p e r f o r m a n c e , s p e c i fi c m e t a b o l i c a c t i v i t i e s f o r l o n g e r c h a i n ( m o r e t h a n t w o c a r b o n s ) V F A s , a n d m i c r o b i a l c o m p o s i t i o n . S i m i l a r i t i e s b e t w e e n t h e t w o g r a n u l e t y p e s w e r e o b s e r v e d i n r e l a t i o n t o b i o m a s s f r a c t i o n , c e l l y i e l d , s p e c i fi c o p e r a t i o n a l a c t i v i t y , s p e c i fi c m e t a b o l i c a c t i v i t i e s f o r H z - C O Z , f o r m a t e a n d a c e t a t e , a p p a r e n t h f o r V F A d e g r a d a t i o n , a n d s p e c i fi c g r o w t h r a t e s . T h e t e m p e r a t u r e a n d p H e f f e c t s w e r e s o m e w h a t d i f f e r e n t f o r t h e d i f f e r e n t g r a n u l e s . B o t h t h e R - a n d F - g r a n u l e s e x h i b i t e d s i m i l a r s p e c i fi c a c t i v i t i e s a n d a c h i e v e d h i g h s p e c i fi c C O D r e m o v a l r a t e s ( u p t o 6 . 9 t o 7 . 6 a n d 5 . 5 t o 6 . 9 g C O D / g V S S - d , r e s p e c t i v e l y ) . T h i s a c t i v i t y l e v e l i s m u c h h i g h e r t h a n r e p o r t e d f o r o t h e r h i g h - r a t e m e s o p h i l i c g r a n u l e s f e d w i t h V F A m i x t u r e s . H u l s h o f f P o l ( 1 9 8 9 ) r e p o r t e d t h a t t h e a c t i v i t y o f g r a n u l e s d e v e l o p e d o n a n a c e t a t e - p r o p i o n a t e m i x t u r e w e r e n e v e r e x c e e d e d 4 . 0 g C O D / g V S S - d a t 3 8 ° C . W i e g a n t a n d d e M a n ( 1 9 8 6 ) r e p o r t e d t h a t t h e i r t h e r m o p h i l i c g r a n u l e s ( 5 5 ° C ) h a d a c t i v i t i e s o f 4 . 2 t o 7 . 3 g C O D / g V S S - d . I t i s l i k e l y t h a t t h e h i g h s p e c i fi c a c t i v i t i e s o b t a i n e d i s d u e t o s e v e r a l f a c t o r s i n c l u d i n g f e e d i n g t h e R - a n d F - g r a n u l e s w i t h V F A m i x t u r e ( a c e t a t e , p r o p i o n a t e , a n d b u t y r a t e ) , m a i n t a i n i n g a r e l a t i v e l y h i g h s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n i n t h e e f fl u e n t , a n d s u p p l y i n g a l o w l e v e l o f s u l f a t e ( 0 . 1 5 m M s o d i u m s a l t a n d f e r r i c s a l t s ) i n t h e f e e d ( T h i e l e e t a l . , 1 9 9 0 ) . T h e s e f a c t o r s p r o b a b l y a r e a l s o t h e r e a s o n f o r t h e i n c r e a s e i n t h e s p e c i fi c C O D r e m o v a l r a t e o f F - g r a n u l e s w h i c h i n c r e a s e d b y a b o u t 2 - f o l d o v e r t h e i r o r i g i n a l a c t i v i t y o f 2 . 0 g C O D / g V S S - d w h e n d e v e l o p e d o n b r e w e r y 1 2 1 w a s t e w a t e r ( C h a p t e r 2 ) . T h e C O D r e m o v a l r a t e o b s e r v e d f o r t h e R - g r a n u l e s ( b a s e d o n r a t e p e r m a s s o f b i o m a s s ) w e r e o n l y s l i g h t l y h i g h e r ( I O - 2 0 % ) t h a n o b s e r v e d f o r t h e F - g r a n u l e s . T h e s p e c i fi c v o l u m e t r i c C O D r e m o v a l r a t e a n d m a x i m u m s p e c i fi c v o l u m e t r i c c o n v e r s i o n r a t e s o f a c e t a t e , p r o p i o n a t e , a n d b u t y r a t e o f t h e R - g r a n u l e s w e r e a p p r o x i m a t e l y t w i c e t h o s e o f F — g r a n u l e s . T h i s c a n b e a t t r i b u t e d t o t h e d i f f e r e n c e i n g r a n u l e d e n s i t i e s ( i . e . t h e R - g r a n u l e s c o n t a i n e d c a . 6 0 % m o r e b i o m a s s t h a n t h e F - g r a n u l e s p e r u n i t v o l u m e ) . H i g h e r d e n s i t y a n d h i g h e r s p e c i fi c g r a v i t y o f t h e R - g r a n u l e s a l l o w e d m o r e b i o m a s s t o b e r e t a i n e d i n r e a c t o r R p e r u n i t v o l u m e . G r e a t e r t h a n 1 . 5 t i m e s o f t h e b i o m a s s w a s s t a b l y m a i n t a i n e d i n r e a c t o r R c o m p a r e d t o r e a c t o r F , e v e n w i t h a 1 . 5 - f o l d g r e a t e r b i o g a s f l u x r a t e . T h i s r e s u l t e d i n h i g h e r v o l u m e t r i c C O D r e m o v a l a n d h i g h e r v o l u m e t r i c m e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e s . T h e g r o w t h r a t e s o f g r a n u l e b e d f o r t h e t w o t y p e s o f g r a n u l e s w e r e d i f f e r e n t . T h e F — g r a n u l e s g r e w m o r e r a p i d l y o n a v o l u m e t r i c b a s i s t h a n t h e R - g r a n u l e s . B o t h t y p e o f g r a n u l e s h a d a s i m i l a r c e l l g r o w t h y i e l d i . e . 0 . 0 2 2 t o 0 . 0 2 6 g S S / g C O D . T h e d i f f e r e n c e i n b e d g r o w t h r a t e i s b e c a u s e t h e d e n s e r g r a n u l e s r e q u i r e l e s s v o l u m e f o r a c c u m u l a t i o n o f t h e s a m e a m o u n t o f b i o m a s s . T h e t w o t y p e s o f g r a n u l e s w e r e i n i t i a l l y s u p p l i e d w i t h d i f f e r e n t f e e d c o m p o s i t i o n s . T h e o b s e r v e d m e t a b o l i c a c t i v i t i e s a n d m i c r o b i a l p o p u l a t i o n s d e v e l o p e d a p p e a r e d t o b e d i r e c t l y r e l a t e d t o t h e f e e d s u p p l i e d t o t h e d i f f e r e n t r e a c t o r s . F e e d A u s e d f o r t h e R - g r a n u l e s h a d 2 5 % m o r e p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e t h a n f e e d B w h i c h w a s s u p p l i e d t o t h e F - g r a n u l e s . A c c o r d i n g l y , h i g h e r p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e c o n v e r s i o n r a t e s w e r e o b s e r v e d f o r t h e R - g r a n u l e s . T h e F - g r a n u l e s h a d h i g h e r s p e c i fi c c o n v e r s i o n r a t e s f o r g l u c o s e a n d e t h a n o l . A g a i n t h i s i s b e c a u s e t h e s e g r a n u l e s w e r e f e d w i t h g l u c o s e a n d e t h a n o l w h i l e t h e R - g r a n u l e s w e r e n o t . . ) m m . d a i a r h ; 5 . e 2 t F . 0 c C a Z € ; , O - s b 4 C - i 2 e . C e 1 s i - v 1 c e z i e i H d t p c , . a s e 4 e d C s n n a t p n t s o e n , t a 4 2 m c a 1 n 3 C u r n > r C 3 l a e i ( , g f . n o m C l d f t o m r f o i y s d e l u n a r ) 8 a a n ) n a c e s o r r d n o i o n f e 0 4 h p l m a e e e r d 5 r 0 t o i b 1 . e e n l s p - m a 0 l l t m a g p s 5 h - o e u d 2 1 5 t r o c t n x a 4 e o i e r x r f r r r ) 0 ) z 1 i 0 0 4 . s . . s 0 v r e e h e i e s h r h o h h t e g f h g g g o 1 . i i t n u i i . e s g v . r 5 s a 2 0 s h h v e a l h s h a o h n v d d u d d t a v 2 l a a 0 l 7 3 - e - r 2 a 2 e 0 v a a e h h h h h M t s e c n e e 0 1 . h s s s s - e 5 r . 6 1 o ( ( m 1 0 g r d M e e e e ( ( i e o - l l l l h w r t u u u u o n l n n r n n F F F F d d u n e f d a l e a a a a a a r r i r m a i n l - - - - f h d g g g a g > > < h > h r R a R F R R R fi F R D R R F g - F d n a s e l u s b i e e i i i i i i i a s e c n e r e f f i d d m m m m m m m m m m i l i i i i i i i m d a n S a a s s s s s s s s s s C a ) ) d d - e n ) a s ) S v S o V m e g ) S S g / e s l i t i r a e / l l u ) S S D / l e ) O ( D s c r d n s ( A : a e g d O C r g / y t t n F - e 2 s a t C C l g g t a o e r c ) ( V i i ( i r g ; m t e l y y v d r l e y / t - o t t h i u h f i t S f m a t n i i t f t S t n S c a S / i e r a S v a r i g i e t o m S g t t m a o V e r n ( e w v v w S m 9 o l s g u c r c K g r c r o r r ( / n c a L d g g f i a g u a t . 3 e e l e n / c l e : S c c c t e e n a t a o l f y i n l fi t a D fi fi fi S e i l e r i l e a i f i i i y i i o c m u r e N , C r t t c l c e o i O e / m c t e b s i e t c u n a p c c c m C b l a i a S l o P : b p e i r o p p p r p e y e c t e t e ( M r S g s r l a H r e n m e l e e e a p m z m o a a P d s s p V v ( s g s s a p t c h i p o h e T C M P M O N n a r g - R e h t n e e y w t i t r e a l s r 2 e O d C n e 4 3 C C g n o e b o s u a s - n d d g r g e d z a o n n H a a h t t e i : , r C ) 8 o A f 7 F s s s s 2 2 e c a C C m , , r c , , o i e e e e V C C f h u u u u p l l l l r r r l o a a e 2 o a a o o r v v f f v v f v C t . 0 - ) 7 8 7 8 . . 0 0 ( ( r r r r r r r l d y b e n u a a a a a a a l l l l l l l e n s . e t a r e l a v : 5 C ; e t a r y t - i ; e t a r y t : 4 C ; e t a n o i p o r p : 3 C ; e t a t e c a S E M o b s e r v a t i o n T E M o b s e r v a t i o n 1 2 2 1 2 3 T h e d i f f e r e n c e s i n p H e f f e c t o n H Z - C O 2 c o n v e r s i o n r a t e s a n d t h e r a t i o o f H z - C O 2 a n d f o r m a t e c o n v e r s i o n a s r e s u l t s o f v a r i o u s p H a l s o i n d i c a t e d t h a t t h e R - a n d F - g r a n u l e s p r o b a b l y h a d d i f f e r e n t h y d r o g e n u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s . T h e f o r m e r e x h i b i t e d l o w p H o p t i m a a n d a h i g h a f fi n i t y f o r f o r m a t e . O t h e r o b s e r v e d d i f f e r e n c e s i n t h e g r a n u l e s i n c l u d e V F A m e t a b o l i s m . T h e p r o p i o n a t e d e g r a d e r s i n t h e F - g r a n u l e s p r e f e r r e d m o r e a l k a l i n e c o n d i t i o n s a n d b u t y r a t e d e g r a d e r s i n t h e R - g r a n u l e s h a d g r e a t e r t o l e r a n c e t o h i g h e r t e m p e r a t u r e s ( 4 5 t o 5 0 ° C ) . F i n a l l y , b a s e d o n s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s , t h e R - g r a n u l e s c o n t a i n e d m o r e i s o b u t y r a t e - b u t y r a t e d e g r a d e r s a n d m o r e M e t h a n o s a r c i n a s p . M P N e n u m e r a t i o n r e s u l t s r e v e a l e d t h a t b o t h t y p e s o f g r a n u l e s h a d 1 0 ‘ 2 c e l l s / g 5 8 . T h i s i s c o n s i s t e n t w i t h t h e c e l l c o u n t r e s u l t s o f T E M ( 7 x 1 0 1 1 f o r t h e R - g r a n u l e s a n d 4 . 6 x 1 0 ” c e l l s / c m 3 f o r t h e F o g r a n u l e s ) a n d 1 - 4 x 1 0 1 2 c e l l s / g S S o f t o t a l c e l l s i n o t h e r a n a e r o b i c g r a n u l e s ( D u b o u r g u i e r e t a l . , 1 9 8 8 c ) . T h e M P N v a l u e s o f a c e t a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s w e r e o f t h e s a m e m a g n i t u d e a s h y d r o g e n - o r f o r m a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s . T h e v a l u e s o f s y n t r o p h i c a c e t o g e n s w e r e a b o u t 1 0 % o f t o t a l c e l l c o u n t s f o r b o t h g r a n u l e t y p e s . T h i s i n d i c a t e s t h a t t h e M P N t e c h n i q u e u s e d i n t h i s s t u d y d i d n o t l i k e l y u n d e r e s t i m a t e p o p u l a t i o n l e v e l s o f t h e d i f f e r e n t t r o p h i c g r o u p s . T h i s i s i n c o n t r a s t t o t h e r e s u l t s p u b l i s h e d e l s e w h e r e ( D o l fi n g e t a l . , 1 9 8 5 ; D u b o u r g u i e r e t a l . , 1 9 8 8 b ) . T h e M P N r e s u l t s f o r t h e d i f f e r e n t t r o p h i c g r o u p s w e r e c o n s i s t e n t w i t h t h e m a x i m u m s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s o b s e r v e d . T h e r e s u l t s o f m i c r o s c 0 p i c e x a m i n a t i o n s r e v e a l e d t h a t t h e t w o t y p e s o f g r a n u l e s h a d d i f f e r e n t m i c r o b i a l c o m p o s i t i o n s . M i c r O S C O p i c a n d S E M e x a m i n a t i o n i n d i c a t e d t h e m a j o r d i f f e r e n c e i n t h e m i c r o b i a l c o m p o s i t i o n b e t w e e n t h e t w o t y p e s o f g r a n u l e s w a s t h e a c e t a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s w h i c h p r e d o m i n a t e d . S h o r t r o d t y p e a c e t a t e u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s w e r e p r e v a l e n t i n t h e R - g r a n u l e s w h i l e t y p i c a l M e t h a n o t h r i x s o e h n g e n i i — 1 2 4 l i k e fi l a m e n t o u s c e l l s w e r e d o m i n a n t i n t h e F - g r a n u l e s . 3 . 7 . 2 F a c t o r s a f f e c t i n g g r a n u l e d e n s i t y T h e r e a r e a t l e a s t t w o f a c t o r s t h a t h a v e a s i g n i fi c a n t i n fl u e n c e o n t h e g r a n u l e d e n s i t y ( o r s p e c i fi c g r a v i t y ) : ( i ) m i n e r a l c o m p o s i t i o n , a n d ( i i ) m i c r o b i a l c e l l d e n s i t y . T h e f o r m e r i s d e p e n d e n t p r i m a r i l y o n t h e f e e d c o m p o s i t i o n , a n d t h e l a t t e r o n t h e m i c r o b i a l p o p u l a t i o n d e v e l o p e d . T h e l a t t e r f a c t o r i s a f u n c t i o n o f b o t h t h e o p e r a t i o n a l c o n d i t i o n s a n d t h e f e e d c o m p o s i t i o n . S o m e g r a n u l e s t r e a t i n g i n d u s t r i a l w a s t e w a t e r c o n t a i n a s i g n i fi c a n t a m o u n t o f m i n e r a l p r e c i p i t a t e s a n d c r y s t a l s ( V S S / S S l e s s t h a n 0 . 7 ) . T h i s t e n d s t o i n c r e a s e t h e s p e c i fi c g r a v i t y . B u t t h e s e g r a n u l e s d o n o t g e n e r a l l y , h o w e v e r , h a v e h i g h m e t a b o l i c a c t i v i t y . T h e R - a n d F - g r a n u l e s i n t h i s w o r k w e r e b a s i c a l l y m i c r o b i a l a g g r e g a t e s a n d c o n t a i n e d v e r y f e w m i n e r a l p r e c i p i t a t e s ( c a . 0 . 8 8 g V S S / g S S ) . T h e d i f f e r e n c e s i n t h e s p e c i fi c g r a v i t y b e t w e e n t h e t w o g r a n u l e t y p e s a r e m a i n l y d u e t o d i f f e r e n c e s i n t h e m i c r o b i a l c e l l d e n s i t i e s . S E M e x a m i n a t i o n o f t h e g r a n u l e s r e v e a l e d t h a t M e t h a n o t h r i x - t y p e c e l l s a p p e a r e d t o p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n d e t e r m i n i n g t h e t y p e o f g r a n u l e s f o r m e d . T h e s e m e t h a n o g e n s a p p e a r t o f o r m a n e t w o r k t h a t h e l p s b i n d t h e o t h e r b a c t e r i a t o g e t h e r . T h e m o r p h o t y p e o f t h e m e t h a n o g e n t h a t p r e d o m i n a t e s e f f e c t s t h e s t r u c t u r e o f g r a n u l e s . T h e s h o r t r o d - s h a p e d a c e t a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n g r o w s c o m p a c t l y a n d , s u b s e q u e n t l y , l e a d s t o a d e n s e s t r u c t u r e a s o b s e r v e d f o r t h e R - g r a n u l e s . F i l a m e n t o u s M e t h a n o t h r i x - l i k e c e l l s b u i l d l o o s e g r a n u l e s t r u c t u r e w i t h m o r e s p a c e b e t w e e n t h e o r g a n i s m s . T h e f a c t , t h a t d e n s e r g r a n u l e s c o n s i s t m a i n l y o f s h o r t r o d - s h a p e d c e l l s a n d l o o s e g r a n u l e s a r e c o m p o s e d o f fi l a m e n t o u s M e t h a n o t h r i x s p . , w a s o b s e r v e d i n e a r l i e r s t u d i e s ( H u l s h o f f P o l e t a l . , 1 9 8 3 ; d e Z e e u w , 1 9 8 4 , 1 9 8 8 ) . T h e f o r m a t i o n o f a l o o s e g r a n u l a r s t r u c t u r e m a y a l s o b e p a r t l y d u e t o t h e p r e s e n c e o f fi l a m e n t o u s h y d r o l y t i c b a c t e r i a 1 2 5 f o u n d i n t h e F - g r a n u l e s . T h i n - fi l a m e n t s g r e w o n t h e s u r f a c e o f t h e F - g r a n u l e s w h e n t h e s e g r a n u l e s r e c e i v e d a f e e d c o n t a i n i n g g l u c o s e . T h e s e fi l a m e n t s d i s a p p e a r e d w h e n g l u c o s e w a s r e m o v e d f r o m t h e f e e d . T h e c h a n g e i n f e e d f r o m g l u c o s e - c o n t a i n i n g m e d i u m t o n o n - g l u c o s e m e d i u m d i d n o t , h o w e v e r , i m p r o v e t h e d e n s i t y o r r e s u l t i n d e c r e a s e o f t h e s i z e o f t h e F — g r a n u l e s . I t c a n , t h e r e f o r e , b e a s s u m e d t h a t t h e s e t h i n fi l a m e n t o u s c e l l s m a y b e o f l e s s i m p o r t a n c e i n t h e m a i n t e n a n c e o f g r a n u l a r s t r u c t u r e t h a n t h e fi l a m e n t o u s M e t h a n o t h r i x ~ t y p e c e l l s . W h e t h e r t h e y h a v e a r o l e i n t h e d e v e l o p m e n t o f l o w d e n s i t y g r a n u l e s i s n o t c l e a r . F i l a m e n t o u s h y d r o l y t i c b a c t e r i a o f t h i n d i a m e t e r ( 0 . 2 u M ) h a v e b e e n o b s e r v e d i n o t h e r a n a e r o b i c r e a c t o r s ( E n d o a n d T o h y a , 1 9 8 8 ) . B e s i d e s a c e t a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s , s y n t r o p h i c a c e t o g e n s a n d o t h e r m e t h a n o g e n s a l s o c o n t r i b u t e t o t h e m i c r o b i a l c e l l d e n s i t y , b e c a u s e t h e y a r e p r e s e n t i n c o n s i d e r a b l e n u m b e r s i n t h e s e g r a n u l e s . K i n e t i c a n a l y s i s , t e m p e r a t u r e a n d p H e f f e c t s i n d i c a t e d t h a t t h e r e w e r e s o m e d i f f e r e n c e s i n t h e m i c r o b i a l p o p u l a t i o n o f h y d r o g e n - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s , a n d p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e d e g r a d e r s . T h e r o l e s o f t h e s e o r g a n i s m s i n d e t e r m i n i n g g r a n u l a r s t r u c t u r e a n d d e n s i t y a r e n o t k n o w n . A h i g h e r p e r c e n t a g e o f l a r g e s i z e d g r a n u l e s w a s o b s e r v e d i n t h e r e a c t o r f e d a g l u c o s e m o l a s s e s f e e d s o l u t i o n c o m p a r e d t o a b r e w e r y w a s t e w a t e r ( C h a p t e r 2 ) . I t h a s b e e n r e p o r t e d e l s e w h e r e t h a t g l u c o s e o r s u c r o s e i n d u c e d t h e f o r m a t i o n o f l a r g e g r a n u l e s ( u p t o 3 — 5 m m ) ( G u i o t e t a l . , 1 9 8 5 ) o r l o w s t r e n g t h g r a n u l e s ( 3 - 6 t i m e s l e s s t h a n t h o s e g r o w n i n p a r t l y a c i d i fi e d w a s t e ) ( S i e r r a - A l v a r e z e t a l . , 1 9 8 8 ) . T h e s e e f f e c t s h a v e b e e n g e n e r a l l y a t t r i b u t e d t o h y d r o l y t i c - f e n n e n t a t i v e b a c t e r i a l g r o w t h . T h e r e s u l t s o b t a i n e d h e r e c a s t s o m e d o u b t o n t h e s e b e i n g t h e o n l y f a c t o r s a f f e c t i n g g r a n u l e d e n s i t y . D e t e r m i n a t i o n i f g l u c o s e o r o t h e r c a r b o h y d r a t e s p r o v i d e a n y s t i m u l u s t o t h e g r o w t h o f l o n g fi l a m e n t o u s M e t h a n o t h r i x - t y p e m e t h a n o g e n s i s a n a r e a o f r e s e a r c h t h a t c o u l d h e l p 1 2 6 a n s w e r t h e s e q u e s t i o n s . 3 . 7 . 3 K i n e t i c p a r a m e t e r s f o r V F A d e g r a d a t i o n B o t h d i s r u p t e d R - a n d F - g r a n u l e s h a d t h e s a m e K , n f o r a c e t a t e d e g r a d a t i o n . C o m p a r i n g t h e a p p a r e n t K I n w i t h d a t a i n t h e l i t e r a t u r e , t h e K m v a l u e s f o r a c e t a t e a r e c l o s e t o t h e K s ( 0 . 4 6 m M ) r e p o r t e d f o r M e t h a n o t h r i x s o e h n g e n i i O p fi k o n ( Z e h n d e r e t a l . , 1 9 8 0 ; H u s e r e t a l . , 1 9 8 2 ) , a n d s l i g h t l y l o w e r t h a n t h e K I ( 1 . 2 m M ) f o r M e t h a n o t h r i x c o n c i l i i G P 6 ( P a t e l , 1 9 8 4 ) a n d a t h e r m o p h i l i c a c e t a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n i c b a c t e r i u m ( 0 . 8 m M ) w h i c h s h o w e d a s i m i l a r m o r p h o t y p e t o M e t h a n o t h r i x s p . ( A h r i n g a n d W e s t e r m a n n , 1 9 8 5 ) . T h e s p e c i fi c g r o w t h r a t e s o b s e r v e d ( c a . 0 . 1 1 t o 0 . 1 3 / d ) a r e w i t h i n t h e r a n g e ( 0 . 1 1 t o 0 . 2 9 / d ) r e p o r t e d f o r M e t h a n o t h r i x s o e h n g e n i i ( Z e h n d e r e t a l . , 1 9 8 0 ; H u s e r e t a l . , 1 9 8 0 ; T o u z e l e t a l . , 1 9 8 8 ) . T h e s e f a c t s f u r t h e r s u p p o r t t h e m i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o n t h a t t h e p r e d o m i n a n t a c e t a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s i n b o t h g r a n u l e s w e r e M e t h a n o t h r i x — t y p e . H i g h M P N v a l u e s f o r m e t h a n o l - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s w o u l d h a v e i n d i c a t e d t h e p r e s e n c e o f a l a r g e p o p u l a t i o n o f M e t h a n o s a r c i n a . T h i s w a s n o t o b s e r v e d , i n d i c a t i n g t h a t M e t h a n o s a r c i n a d i d n o t p l a y a s i g n i fi c a n t r o l e i n a c e t a t e c a t a b o l i s m . I n a d d i t i o n , t h e l o w r e s i d u a l a c e t a t e c o n c e n t r a t i o n ( < 0 . 0 1 m M ) o b s e r v e d w h e n t h e f e e d w a s s t o p p e d f o r o n e h o u r , w a s m u c h l e s s t h a n t h e r e p o r t e d t h r e s h o l d a c e t a t e c o n c e n t r a t i o n s ( 0 . 4 t o 1 m M ) f o r M e t h a n o s a r c i n a ( M i n a n d Z i n d e r , 1 9 8 9 ; W e s t e r m a n n e t a l . , 1 9 8 9 a ) . T h e a p p a r e n t K m s o b s e r v e d f o r p r o p i o n a t e d e g r a d a t i o n i n b o t h t h e g r a n u l e s ( 0 . 0 4 8 m M f o r t h e R - a n d 0 . 0 3 7 m M f o r F - g r a n u l e s ) a r e w i t h i n a r a n g e ( 0 . 0 4 4 t o 0 . 1 9 1 m M ) s i m i l a r t o t h a t r e p o r t e d f o r s l u d g e f r o m a m u n i c i p a l w a s t e d i g e s t e r ( K a s p a r a n d W u h r m a n n 1 9 7 8 ) b u t d i f f e r e n t f r o m o t h e r r e p o r t e d v a l u e s 0 . 4 3 m M ( L a w r e n c e a n d M c C a r t y , 1 9 6 9 ) a n d 0 . 1 5 m M a n d 4 . 5 m M ( H e y e s a n d H a l l , 1 9 8 3 ) f o r o t h e r 1 2 7 m e t h a n o g e n i c s l u d g e s . T h i s d i f f e r e n c e m a y b e d u e t o t h e e x i s t e n c e o f d i f f e r e n t p r o p i o n a t e d e g r a d e r s i n t h e s e s y s t e m s o r i t m a y r e p r e s e n t t h e e f f e c t o f m a s s t r a n s f e r l i m i t a t i o n s i n t h e s e l a t t e r r e f e r e n c e d s t u d i e s . T h e s p e c i fi c g r o w t h r a t e s o f p r o p i o n a t e d e g r a d e r s i n t h e R - a n d F - g r a n u l e s ( 0 . 1 2 t o 0 . 1 3 / d ) w e r e c l o s e t o t h a t r e p o r t e d f o r S y n t r o p h o b a c t e r w o l i m ' i ( 0 . 1 0 3 / d ) , t h e o n l y m e S O p h i l i c s y n t r o p h i c p r o p i o n a t e d e g r a d e r i s o l a t e d t o d a t e ( B o o n e a n d B r y a n t , 1 9 8 0 ) . T h i s o r g a n i s m i s a l s o c o n s i d e r e d t o b e d o m i n a n t s y n t r o p h i c a c e t o g e n i n g r a n u l e s ( D u b o u r g u i e r e t a l . , 1 9 8 8 a , 1 9 8 8 c ) . O n e o f p r o p i o n a t e d e g r a d e r s o b s e r v e d i n b o t h t h e R - a n d F - g r a n u l e s , h o w e v e r , i s a s p o r e — f o r m e r , a n d t h u s d i f f e r e n t f r o m S y n t r o p h o b a c t e r w o l i n i i ( s e e C h a p t e r 5 ) . T h e b u t y r a t e d e g r a d e r s i n b o t h g r a n u l e s h a d a l m o s t t h e s a m e s p e c i fi c g r o w t h r a t e ( 0 . 1 3 / d ) a t a b u t y r a t e c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 1 5 t o 0 . 1 6 m M . T h i s i s c l o s e t o h a l f t h e m a x i m u m s p e c i fi c g r o w t h r a t e s r e p o r t e d f o r m e t h a n o g e n i c c o c u l t u r e s o f S y n t r o p h o m o n a s s p . ( 0 . 1 9 t o 0 . 4 2 / d ) ( M c I n e m e y e t a l . , 1 9 7 9 , 1 9 8 1 : T o m e i e t a l . , 1 9 8 5 ; D w y e r e t a l . , 1 9 8 8 ) a n d e s s e n t i a l l y e q u a l t o t h a t o f S y n t r o p h o s p o r a b r y a n t i i ( 0 . 1 7 t o 0 . 2 3 / d ) ( S t i e b a n d S c h i n k , 1 9 8 5 ) . 3 . 8 S U M M A R Y 1 ) T w o t y p e s o f a n a e r o b i c g r a n u l e s c a p a b l e o f h i g h C O D r e m o v a l r a t e s ( 2 7 g C O D / g V S S - d a y ) w e r e d e v e l o p e d i n l a b o r a t o r y - s c a l e U A S B r e a c t o r s a t 3 5 ° C . O n e g r a n u l e t y p e h a d a r o d - t y p e M e t h a n o t h r i x s p . a s p r e d o m i n a n t s p e c i e s ( t h e R - g r a n u l e s ) w h i l e t h e o t h e r h a d a fi l a m e n t - t y p e M e t h a n o t h r i x s o e h n g e n i i - l i k e a c e t a t e u t i l i z e r s a s p r e d o m i n a n t s p e c i e s ( t h e F - g r a n u l e s ) . 2 ) T h e R — g r a n u l e s h a d a h i g h e r d e n s i t y ( 6 5 t o 7 0 v s 3 9 t o 4 0 g S S / L ) , s p e c i fi c g r a v i t y ( 1 . 0 3 v s 1 . 0 1 ) a n d s p e c i fi c v o l u m e t r i c m e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e ( 1 8 0 v s 1 2 0 L C H , 1 / L g r a n u l e s - d a y ) t h a n t h e F - g r a n u l e s . S w i t c h i n g a f e e d c o n t a i n i n g g l u c o s e , : L L I l . 1 2 8 e t h a n o l a n d V F A s t o a f e e d c o n t a i n i n g o n l y V F A s d i d n o t c h a n g e t h e s i z e o r d e n s i t y o f t h e F - g r a n u l e s . T h e d i f f e r e n c e s i n o p e r a t i o n a l p e r f o r m a n c e w e r e m a i n l y d u e t o t h e d i f f e r e n t m i c r o b i a l c o m p o s i t i o n , e s p e c i a l l y t h e p r e d o m i n a n t a c e t a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s i n t h e g r a n u l e s . T h e l o n g fi l a m e n t o u s M e t h a n o t h r i x s p . a p p e a r e d t o i n d u c e l o w e r d e n s i t y a n d l a r g e s i z e d g r a n u l e s . 3 ) A c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e d e g r a d e r s f r o m b o t h t y p e s o f g r a n u l e s h a d s i m i l a r s p e c i fi c g r o w t h r a t e s a n d s u b s t r a t e a f fi n i t i e s . 4 ) B o t h t y p e s o f g r a n u l e s h a d t h e s a m e o p t i m u m t e m p e r a t u r e s f o r H z - C O 2 a n d f o r m a t e u t i l i z a t i o n ( 4 5 ° C ) a n d f o r a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e u t i l i z a t i o n ( 4 0 ° C ) , a n d s h o w e d b a s i c a l l y t h e s a m e o p t i m u m p H f o r H z - C O Z , f o r m a t e , a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e u t i l i z a t i o n . 5 ) R e s u l t s o f m o s t p r o b a b l e n u m b e r ( M P N ) e n u m e r a t i o n s i n d i c a t e d t h a t b o t h t y p e s o f g r a n u l e s h a d t h e s a m e n u m b e r s o f c e l l s p e r g r a m o f S S i n t h e t e r m s o f m e t h a n o g e n s ( 1 0 1 2 f o r H z - C O Z , f o r m a t e , a n d a c e t a t e u t i l i z i n g ) a n d s y n t r o p h i c a c e t o g e n s ( 1 0 1 0 " f o r p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e u t i l i z i n g ) . H y d r o l y t i c f e r m e n t a t i v e b a c t e r i a w e r e p r e s e n t i n g r e a t e r n u m b e r s i n t h e F - g r a n u l e s ( 1 0 “ ) t h a n i n t h e R - g r a n u l e s ( 1 0 9 ) a s w o u l d b e e x p e c t e d b a s e d u p o n t h e r e s p e c t i v e f e e d u s e d f o r t h e t w o r e a c t o r s . 6 ) O b s e r v a t i o n s m a d e u s i n g s c a n n i n g a n d t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y s h o w e d h i g h e r c e l l d e n s i t i e s i n t h e R - g r a n u l e s ( w h i c h d i d n o t c o n t a i n fi l a m e n t o u s t y p e o f M e t h a n o t h r i x s p . ) c o m p a r e d w i t h t h e F - g r a n u l e s w h i c h c o n t a i n e d M e t h a n o t h r i x s o e h n g e n i i - l i k e l o n g fi l a m e n t s a s t h e p r e d o m i n a n t a c e t a t e - u t i l i z e r s . C H A P T E R 4 C H A R A C T E R I Z A T I O N O F M E T A B O L I C P E R F O R M A N C E A N D M I C R O B I A L S T R U C T U R E O F G R A N U L E S G R O W N I N T H E P R E S E N C E O F S U L F A T E : R O L E O F S U L F A T E - R E D U C I N G B A C T E R I A I N T R O D U C T I O N I n C h a p t e r 3 , a c h a r a c t e r i z a t i o n a n d c o m p a r i s o n o f t w o t y p e s o f g r a n u l e s d e v e l o p e d o n t h e f e e d c o n t a i n i n g a v e r y l o w l e v e l o f s u l f a t e ( 0 . 1 t o 0 . 1 5 m M ) w a s m a d e . T h e r o l e o f s u l f a t e r e d u c i n g b a c t e r i a ( S R B ) i n s u b s t r a t e m e t a b o l i s m a n d t h e g r a n u l a r s t r u c t u r e w a s n o t c o n s i d e r e d f o r t h e R - a n d F - g r a n u l e s s i n c e s u l f a t e r e d u c i n g b a c t e r i a d i d n o t a p p e a r t o p l a y a s i g n i fi c a n t r o l e i n s u b s t r a t e m e t a b o l i s m . T o d a t e , p u b l i s h e d w o r k o n t h e g r a n u l e - f o r m a t i o n , m i c r o b i a l c o m p o s i t i o n , t h e s u b s t r a t e c o n v e r s i o n p o t e n t i a l s , a n d m i c r o b i a l s t r u c t u r e s o f g r a n u l e s h a s f o c u s e d o n m e t h a n o g e n s a n d s y n t r o p h i c a c e t o g e n s . ( H u l s h o f f P o l e t a l . , 1 9 8 3 ; H u l s h o f f P o l , 1 9 8 9 ; W u e t a l . , 1 9 8 5 , 1 9 8 7 b ; D o l fi n g , 1 9 8 5 ; D o l fi n g a n d B l o m e n , 1 9 8 5 ; D o l fi n g a n d M u l d e r , 1 9 8 5 ; D o l fi n g e t a l . , 1 9 8 5 ; D u b o u r g u i e r e t a l . , 1 9 8 8 a , 1 9 8 8 b , 1 9 8 8 c ; P r e n s i e r e t a l . , 1 9 8 8 ; H a r a d a e t a l . , 1 9 8 8 ) . T h i s i s l i k e l y d u e t o t h e o b s e r v a t i o n t h a t s u l f a t e r e d u c i n g b a c t e r i a w e r e f o u n d t o b e p r e s e n t a t m u c h l o w e r l e v e l s t h a n s y n t r o p h i c a c e t o g e n s i n g r a n u l e s t r e a t i n g s u g a r w a s t e w a t e r u s i n g t h e m o s t p r o b a b l e n u m b e r ( M P N ) e n u m e r a t i o n ( D u b o u r g u i e r e t a l . , 1 9 8 8 a , 1 9 8 8 c ) . 1 2 9 1 3 0 I n t h i s C h a p t e r , a n a e r o b i c g r a n u l e s o b t a i n e d f r o m a f u l l - s c a l e U A S B p l a n t t r e a t i n g b r e w e r y w a s t e w a t e r w h i c h c o n t a i n e d e t h a n o l , a c e t a t e a n d p r o p i o n a t e a s m a j o r c a r b o n s o u r c e s w e r e c h a r a c t e r i z e d f o r t h e i r p h y s i c a l a n d c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s , s u b s t r a t e m e t a b o l i s m a n d m i c r o b i a l c o m p o s i t i o n . T h e s e g r a n u l e s w e r e g r o w n i n t h e p r e s e n c e o f a s i g n i fi c a n t l e v e l o f s u l f a t e ( 0 . 6 t o 1 . 3 m M ) . T h e i m p o r t a n t r o l e t h a t S R B p l a y e d i n s y n t r o p h i c m e t h a n o g e n e s i s f o r t h e s e g r a n u l e s w a s e x a m i n e d . 4 . 2 M A T E R I A L S A N D M E T H O D S C h e m i c a l s , g a s e s , m e d i a , a n d a n a l y t i c a l m e t h o d s a r e d e s c r i b e d i n A p p e n d i x A . M i c r o s c o p i c a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n i s p r e s e n t e d i n A p p e n d i x D . T h e c a l c u l a t i o n o f f r e e e n e r g y a v a i l a b l e f o r s y n t r o p h i c a c e t o g e n e s i s f r o m e t h a n o l i s d e s c r i b e d i n A p p e n d i x E . 4 . 2 . 1 S o u r c e o f m e t h a n o g e n i c g r a n u l e s B r e w e r y g r a n u l e s w e r e o b t a i n e d f r o m a f u l l - s c a l e u p fl o w a n a e r o b i c s l u d g e b l a n k e t ( U A S B ) r e a c t o r o p e r a t e d a t G . H e i l e m a n B r e w e r y C o . ( L a C r o s s e , W I ) . T h i s s y s t e m w a s c o m m i s s i o n e d i n 1 9 8 2 u s i n g 2 0 , 0 0 0 k g o f a n a e r o b i c g r a n u l a r s l u d g e o b t a i n e d f r o m a U A S B r e a c t o r t r e a t i n g s u g a r b e e t w a s t e w a t e r a t t h e s u g a r f a c t o r y C S M , B r e d a , t h e N e t h e r l a n d s a n d 2 , 0 0 0 k g o f m u n i c i p a l d i g e s t o r s l u d g e f r o m t h e L a C r o s s e t r e a t m e n t p l a n t ( S a x , 1 9 8 5 ) . T h e O p e r a t i o n a l v o l u m e t r i c C O D l o a d i n g r a t e w a s a b o u t 1 0 k g C O D / m 3 - d w i t h a C O D r e m o v a l o f 8 0 t o 9 0 % . T h e r e a c t o r s w e r e m a i n t a i n e d a t a n o p e r a t i n g t e m p e r a t u r e b e t w e e n 2 8 a n d 3 0 ° C . I n fl u e n t s u l f a t e c o n c e n t r a t i o n s i n r a w w a s t e w a t e r r a n g e d f r o m 0 . 6 t o 1 . 3 m M . S u l f a t e r e m o v a l o f b e t w e e n 2 0 a n d 6 0 % w a s n o r m a l l y o b s e r v e d i n t h i s s y s t e m . T h e m a j o r c h e m i c a l c o m p o s i t i o n o f t h e b r e w e r y w a s t e w a t e r f e d t o t h e U A S B r e a c t o r a n d i n t h e e f fl u e n t i s 1 3 1 s u m m a r i z e d i n T a b l e 4 . 1 . T h e m a j o r i t y o f C O D i n t h e i n fl u e n t w a s d u e t o i n c o m i n g e t h a n o l , a c e t a t e , a n d p r o p i o n a t e . T a b l e 4 . 1 C o m p o s i t i o n o f t h e i n fl u e n t b r e w e r y w a s t e w a t e r a n d e f fl u e n t o f U A S B r e a c t o r P a r a m e t e r s I n fl u e n t E f fl u e n t C O D ( m g / L ) 1 , 2 0 0 - 2 , 0 0 0 1 7 0 - 3 0 0 A c e t a t e ( m M ) 2 . 0 - 3 . 2 0 . 2 - 0 . 4 P r o p i o n a t e ( m M ) 1 . 0 - 2 . 1 0 . 0 6 - 0 . 2 E t h a n o l ( m M ) 7 . 3 - 1 3 . 0 < 0 . 0 5 S O 4 2 ' ( m M ) 0 . 6 - 1 . 3 0 . 4 - 1 . 0 C l ' ( m M ) 2 . 5 - 4 . 8 2 . 5 - 4 . 8 p H 6 . 0 - 7 . 0 7 . 0 - 7 . 2 ( 1 ) T r a c e a m o u n t s ( < 0 . 2 m M ) o f g l u c o s e , b u t y r a t e , l a c t a t e a n d s u c c i n a t e w e r e a l s o f o u n d i n t h e i n fl u e n t ( 2 ) D e t e c t i o n l i m i t f o r e t h a n o l w a s 0 . 0 5 m M . G r a n u l e s w e r e a n a e r o b i c a l l y p r e p a r e d , s h i p p e d , a n d i m m e d i a t e l y t r a n s f e r r e d i n t o 1 5 8 m L s e r u m b o t t l e s u n d e r a n N 2 a t m o s p h e r e . T h e g r a n u l e s w e r e s t o r e d a t r o o m t e m p e r a t u r e ( a b o u t 2 0 ° C ) . T h e m a x i m u m s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s a n d t h e m a x i m u m m e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e s w e r e d e t e r m i n e d w i t h i n 7 2 h o u r s . 4 . 2 . 2 S u b s t r a t e d e g r a d a t i o n a n d m a x i m u m s p e c i fi c a c t i v i t y a s s a y s S u b s t r a t e d e g r a d a t i o n a s s a y s w e r e p e r f o r m e d u s i n g e t h a n o l a n d a m i x t u r e o f a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e . E i g h t s u b s t r a t e s ( a c e t a t e , p r o p i o n a t e , b u t y r a t e , 1 3 2 m e t h a n o l , e t h a n o l , f o r m a t e , H z - C O Z , a n d g l u c o s e ) w e r e t e s t e d t o d e t e r m i n e m a x i m u m s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s a n d / o r m a x i m u m m e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e s o f t h e g r a n u l e s a t 3 5 ° C . T h e m a x i m u m s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s w e r e d e t e r m i n e d f o r a c e t a t e , p r o p i o n a t e , b u t y r a t e , m e t h a n o l , e t h a n o l , a n d g l u c o s e , b a s e d o n s u b s t r a t e c o n s u m p t i o n p e r g r a m o f V S S p e r d a y u s i n g t h e d a t a w i t h i n t h e i n i t i a l s e v e r a l h o u r s o f t h e a s s a y w h e n t h e s u b s t r a t e c o n v e r s i o n c o u l d b e a p p r o x i m a t e d b y z e r o o r d e r k i n e t i c s . T h e m a x i m u m m e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e s w e r e c a l c u l a t e d b a s e d o n t h e m o l e s o f m e t h a n e p r o d u c e d p e r g r a m o f V S S p e r d a y . B o t h s u b s t r a t e c o n v e r s i o n a n d m e t h a n e p r o d u c t i o n w e r e c o n d u c t e d i n t h e p r e s e n c e a n d i n t h e a b s e n c e o f a d d e d F e S O 4 ( 8 t o 9 m M i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n ) e x c e p t f o r g l u c o s e c o n v e r s i o n . F o r H z - C O 2 a n d f o r m a t e , b o t h i n t a c t a n d d i s r u p t e d g r a n u l e s w e r e u s e d a s i n o c u l a t o a s s a y t h e e f f e c t o f s u b s t r a t e d i f f u s i o n . D i s r u p t e d g r a n u l e s w e r e p r e p a r e d f r o m a 3 0 g S S / L c e l l s u s p e n s i o n u s i n g a c e l l h o m o g e n i z e r i n s i d e a n a n a e r o b i c g l o v e b a g ( C o y L a b o r a t o r y P r o d u c t s I n c . , A n n A r b o r , M I ) . B e f o r e t h e m e d i a w e r e i n o c u l a t e d w i t h g r a n u l e s , t h e b a s a l m e d i u m ( 5 0 m L p e r b o t t l e ) w a s r e d u c e d w i t h a n N a Z S 9 H 2 0 s t o c k s o l u t i o n ( 2 . 5 % ) . S u b s e q u e n t l y , t h e i n t a c t g r a n u l e s ( a b o u t 2 m L ) w e r e t r a n s f e r r e d t o e a c h b o t t l e i n s i d e t h e a n a e r o b i c g l o v e b a g . T h e h e a d s p a c e i n t h e b o t t l e s w a s fl u s h e d w i t h a n N z - C O 2 m i x t u r e ( 7 0 : 3 0 ) t o r e m o v e t h e H 2 g a s f r o m t h e g l o v e b a g . F o r i n o c u l a t i o n o f d i s r u p t e d g r a n u l e s , t h e c e l l s u s p e n s i o n ( 5 m L ) w a s a d d e d b y s y r i n g e d i r e c t l y t o t h e b o t t l e s . I n o c u l a t e d b o t t l e s w e r e t h e n s u p p l i e d w i t h s m a l l a m o u n t ( a b o u t 1 m M f o r f a t t y a c i d s a n d e t h a n o l , a n d 0 . 1 g / L f o r g l u c o s e ) o f t h e r e s p e c t i v e s u b s t r a t e s a n d i n c u b a t e d i n a 3 5 ° C s h a k i n g w a t e r b a t h f o r 2 t o 3 h o u r s t o a c t i v a t e t h e r e s p e c t i v e t r o p h i c b a c t e r i a a n d t h e r e b y e l i m i n a t e a n y l a g i n s u b s t r a t e c o n s u m p t i o n . T h e s e r u m b o t t l e s w e r e s u b s e q u e n t l y s u p p l i e d w i t h 1 3 3 t h e r e s p e c t i v e s u b s t r a t e s . T h e c o n c e n t r a t i o n s u s e d w e r e a b o u t 9 m M f o r a c e t a t e o r p r o p i o n a t e , 5 m M f o r b u t y r a t e , 6 0 m M f o r f o r m a t e , 2 2 m M f o r m e t h a n o l , 1 7 m M f o r e t h a n o l , 2 g / L f o r g l u c o s e , a n d 1 . 0 a t r n f o r H z - C O 2 ( 8 0 : 2 0 ) . T h e s e c o n c e n t r a t i o n s w e r e m u c h h i g h e r t h a n t h e k n o w n v a l u e s o f K m f o r t h e r e s p e c t i v e s u b s t r a t e s d u r i n g a n a e r o b i c d i g e s t i o n a n d a l l o w e d d e t e r m i n a t i o n o f m a x i m u m s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s . T h e w a t e r b a t h w a s s h a k e n a t 1 2 5 s t r o k e s p e r m i n t o r e d u c e m a s s t r a n s f e r r e s i s t a n c e f r o m b u l k l i q u i d t o t h e s u r f a c e o f t h e g r a n u l e s . D u r i n g t h e e x p e r i m e n t s , g a s s a m p l e s f o r m e t h a n e a n d H 2 a n d l i q u i d s a m p l e s f o r V F A , e t h a n o l a n d g l u c o s e w e r e t a k e n e v e r y 1 t o 3 h o u r s , d e p e n d i n g o n o b s e r v e d s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s . A f t e r a n e x p e r i m e n t w a s c o n c l u d e d , t h e c o n t e n t s o f s e r u m b o t t l e s w e r e c e n t r i f u g e d a t 2 0 , 0 0 0 x g f o r 6 t o 1 0 m i n a n d t h e p e l l e t w a s c o l l e c t e d f o r s o l i d s a n a l y s i s . 4 . 2 . 3 M a s s b a l a n c e e x p e r i m e n t s f o r m e t h a n o g e n e s i s a n d s u l f a t e r e d u c t i o n M a s s b a l a n c e e x p e r i m e n t s f o r H z - C O Z , f o r m a t e , e t h a n o l , a c e t a t e , a n d p r o p i o n a t e w e r e p e r f o r m e d i n 1 5 8 - m L s e r u m b o t t l e s a s d e s c r i b e d a b o v e w i t h t h e f o l l o w i n g e x c e p t i o n . I n t a c t g r a n u l e s ( 1 m L ) w e r e t r a n s f e r r e d i n t o t h e b o t t l e s a n d t h e n i n c u b a t e d i n a 3 5 ° C w a t e r b a t h f o r a b o u t 1 2 h o u r s t o c o n s u m e a n y r e s i d u a l s u b s t r a t e a n d , t h e r e f o r e , r e d u c e p o t e n t i a l e r r o r s i n m e t h a n e p r o d u c t i o n c a l c u l a t i o n . S u b s e q u e n t l y , g a s s a m p l e s w e r e w i t h d r a w n f r o m t h e b o t t l e s f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f s t a r t i n g m e t h a n e a n d H 2 l e v e l s . T h e r e s p e c t i v e s u b s t r a t e s t o c k s o l u t i o n s o r H z - C O 2 g a s m i x t u r e w a s t h e n a d d e d t o t h e b o t t l e s . B o t t l e s w i t h o u t s u b s t r a t e a d d e d w e r e u s e d a s c o n t r o l s t o e s t i m a t e t h e m e t h a n e p r o d u c t i o n f r o m a n y e n d o g e n o u s m e t a b o l i s m . T h e b o t t l e s c o n t a i n i n g t h e r e s p e c t i v e s u b s t r a t e s w e r e p r e p a r e d a s t w o g r o u p s : w i t h a n d w i t h o u t a d d i t i o n o f F e S O 4 ( 9 . 0 m M ) . A f t e r 9 6 h o u r s o f i n c u b a t i o n ( 1 2 0 h o u r s f o r m e t h a n o l ) a t 3 5 ° C , s u b s t r a t e c o n s u m p t i o n ( i n c l u d i n g s u l f a t e ) a n d m e t h a n e f o r m a t i o n w e r e q u a n t i fi e d f o r m a s s 1 3 4 b a l a n c e c a l c u l a t i o n s . T h e c a l c u l a t i o n o f p e r c e n t a g e s o f s u b s t r a t e c o n v e r t e d v i a s u l f a t e r e d u c t i o n i s d e s c r i b e d i n A p p e n d i x F . 4 . 2 . 4 M o l y b d a t e e f f e c t e x p e r i m e n t s T h e e f f e c t s o f m o l y b d a t e o n t h e c o n v e r s i o n o f a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d e t h a n o l a n d r e l a t e d m e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e s w e r e d e t e r m i n e d a s f o l l o w s . I n t a c t g r a n u l e s w e r e t r a n s f e r r e d i n t o s e r u m b o t t l e s c o n t a i n i n g 5 0 m L m e d i u m r e d u c e d b y s o d i u m s u l fi d e a n d t h e n s u p p l i e d w i t h 1 m M o f r e s p e c t i v e s u b s t r a t e s . A n N a z M o O 4 s t o c k s o l u t i o n w a s t h e n a d d e d t o t h e b o t t l e s t o o b t a i n t h e d e s i r e d ' s t a r t i n g c o n c e n t r a t i o n s o f m o l y b d a t e . T h e b o t t l e s w e r e i n c u b a t e d i n a 3 0 ° C s h a k i n g w a t e r b a t h f o r a b o u t 1 2 h o u r s t o p e r m i t m o l y b d a t e i n d u c e d i n h i b i t i o n l e v e l s t o s t a b i l i z e . T h e t e m p e r a t u r e o f t h e w a t e r b a t h w a s t h e n i n c r e a s e d t o 3 5 ° C , a n d t h e r e s p e c t i v e s u b s t r a t e s w e r e a d d e d t o t h e b o t t l e s . T h e e x p e r i m e n t s d e s i g n e d t o m e a s u r e t h e m a x i m u m s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s a n d t h e m a x i m u m m e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e s w e r e t h e n b e g u n . 4 . 2 . 5 E n r i c h m e n t s o f s p e c i a l t r 0 p h i c g r o u p s A c e t a t e ( 2 0 m M ) , p r o p i o n a t e ( 2 0 m M ) , a n d e t h a n o l ( 2 0 m M ) w e r e u s e d a s t h e s u b s t r a t e s t o e n r i c h t h e p r e v a l e n t s p e c i e s i n t h e g r a n u l e s . O n e s e t o f t h e e n r i c h m e n t s w a s s u p p l i e d w i t h s o d i u m s u l f a t e ( 5 m M ) w h i l e a n o t h e r w a s n o t . D i s r u p t e d g r a n u l e s ( 0 . 5 m L ) w i t h a c o n c e n t r a t i o n o f 3 0 g V S S / L w e r e i n o c u l a t e d i n t o t h e a n a e r o b i c b o t t l e s c o n t a i n i n g 5 0 m L o f t h e r e s p e c t i v e e n r i c h m e n t m e d i a . T h e s e b o t t l e s w e r e t h e n i n c u b a t e d a t 3 5 ° C . T h e g r o w t h o f d i f f e r e n t t r 0 p h i c s p e c i e s w a s m o n i t o r e d b y e x a m i n i n g m e t h a n e p r o d u c t i o n a n d s u b s t r a t e c o n s u m p t i o n . T h e e n r i c h m e n t s w e r e t r a n s f e r r e d a t l e a s t 5 t i m e s a t a 1 % ( v o l / v o l ) i n o c u l u m . T h e fi n a l e n r i c h m e n t s w e r e 1 3 5 e x a m i n e d b y m i c r o s c o p y a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p y . 4 . 3 P H Y S I C A L , C H E M I C A L A N D M I C R O B I A L C H A R A C T E R I Z A T I O N O F G R A N U L E S 4 . 3 . 1 P h y s i c a l a n d c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s T h e g r a n u l e s w e r e b l a c k , a n d t h e i r s i z e v a r i e d f r o m 0 . 3 t o 4 . 5 m m i n d i a m e t e r ( m o s t l e s s t h a n 3 m m ) . T h e p h y s i c a l a n d c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e g r a n u l e s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 4 . 2 . T h e g r a n u l e s h a d a r e l a t i v e l y h i g h s p e c i fi c g r a v i t y ( 1 . 0 4 6 ) a n d g r a n u l e b e d d e n s i t y ( 9 1 . 7 g S S / L ) . T h e a s h c o n t e n t w a s 1 8 % b a s e d o n t h e r a t i o o f V S S / S S . B a s e d o n X - r a y a n a l y s i s , t h e m a j o r m i n e r a l s o l i d s i n t h e g r a n u l e s a p p a r e n t l y w e r e f e r r o u s s u l fi d e , c a l c i u m p h o s p h a t e a s w e l l a s s i l i c o n c o m p o u n d s . C a r b o n a t e p r e c i p i t a t e s w e r e i n s i g n i fi c a n t . A s s u m i n g a l l t h e c a r b o n a t e i n t h e g r a n u l e s w e r e p r e s e n t a s c a l c i u m s a l t s , a m a x i m u m o f 2 . 4 m g C a C O 3 / g S S w o u l d h a v e b e e n p r e s e n t . 4 . 3 . 2 M i c r o s c o p i c a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n O b s e r v a t i o n o f d i s r u p t e d g r a n u l e s u s i n g p h a s e - c o n t r a s t e p i fl u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y r e v e a l e d t h a t t h e g r a n u l e s c o n t a i n e d a n u m b e r o f m o r p h o l o g i c a l l y d i s t i n c t b a c t e r i a . M e t h a n o b a c t e r i u m - l i k e r o d s w e r e i d e n t i fi e d a s t h e p r e v a l e n t H z - C O 2 a n d f o r m a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s w h i l e M e t h a n o t h r i x - l i k e b a m b o o - s h a p e d r o d s a p p e a r e d t o b e t h e p r e v a l e n t a c e t a t e u t i l i z i n g m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a . M e t h a n o s p i r i l l u m - l i k e s p i r i l l a w e r e o c c a s i o n a l l y o b s e r v e d . M e t h a n o s a r c i n a - t y p e a g g r e g a t e s w e r e n o t o b s e r v e d . W h e n g r a n u l e s w e r e i n c u b a t e d w i t h a m e t h a n o l c o n t a i n i n g ( i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n o f 2 2 m M ) m e d i u m a t 3 5 ° C f o r 5 d a y s , s o m e M e t h a n o s a r c i n a - l i k e 1 3 6 a g g r e g a t e s t h a t a u t o - fl u o r e s c e n c e d ( i n d i c a t i n g t h e p r e s e n c e o f c o e n z y m e F 4 2 0 ) w e r e o b s e r v e d . I n a d d i t i o n t o m e t h a n o g e n s , s e v e r a l m o r p h o t y p e s o f n o n - fl u o r e s c e n t , u n i d e n t i fi e d s h o r t r o d s w e r e o b s e r v e d a s t h e p r e d o m i n a n t c e l l s . T h e s e b a c t e r i a w e r e n o r m a l l y f o u n d i n s m a l l c l u s t e r s s u r r o u n d e d b y t h e M e t h a n o b a c t e r i u m - l i k e r o d s . T a b l e 4 . 2 P h y s i c a l , c h e m i c a l a n d m i c r o b i a l c h a r a c t e r i s t i c s o f b r e w e r y g r a n u l e s S p e c i fi c g r a v i t y 1 . 0 4 6 G r a n u l e b e d d e n s i t y ( g S S / L g r a n u l e s ) 9 1 . 7 D r y w e i g h t / w e t w e i g h t ( g / g ) 0 . 1 3 V S S / S S ( g / g ) 0 . 8 2 I n t e r n a l c a r b o n a t e ( a s C O 2 u m o l / g S S ) 2 4 . 4 M i n e r a l c o m p o s i t i o n ( % ) ‘ I S i l i c o n 2 . 4 3 S u l f u r 2 2 . 6 P h o s p h o r u s 3 1 . 0 P o t a s s i u m 6 . 9 5 S o d i u m 1 3 . 2 C a l c i u m 1 0 . 9 I r o n 1 2 . 9 M i c r o b i a l m o r p h o t y p e d e n s i t y ( x 1 0 7 c e l l s / c m 2 ) ° M e t h a n o t h r i x — l i k e 1 . 3 1 M e t h a n o b a c t e r i u m - l i k e 2 . 2 2 o t h e r s 1 . 4 9 e m p t y c e l l s 0 . 7 6 t o t a l c e l l s 5 . 7 8 a ) M i n e r a l c o m p o s i t i o n w a s a n a l y s i s b y E D X , b a s e d o n t h e a v e r a g e v a l u e s o f d i f f e r e n t s i t e s o n t h e s u r f a c e a n d c r o s s s e c t i o n o f g r a n u l e s . b ) T h e t o t a l n u m b e r s o f c e l l s c o u n t e d o n T E M t h i n c r o s s s e c t i o n s a m p l e s w e r e 6 7 6 9 . 1 3 7 F i g u r e 4 . 1 S E M m i c r o p h o t o g r a p h s o f b r e w e r y g r a n u l e s . ( A ) L o w m a g n i fi c a t i o n S E M m i c r o g r a p h o f a g r a n u l e s h o w s t h a t s m a l l h o l e s e x i s t o n t h e s u r f a c e o f g r a n u l e s . ( B ) O u t l i n e o f v e n t s o r h o l e s o n g r a n u l e s u r f a c e . ( C ) O p e n i n g o f a v e n t h o l e s u r r o u n d e d b y M e t h a n o t h r i x - l i k e b a c t e r i a . ( D ) A n o t h e r o p e n i n g s u r r o u n d e d b y M e t h a n o b a c t e r i u m - l i k e r o d s a n d o t h e r b a c t e r i a . F i g u r e 4 . 2 1 3 8 T E M m i c r o g r a p h s o f t h i n c r o s s s e c t i o n o f g r a n u l e s t h a t s h o w t h e p r e s e n c e o f d i f f e r e n t m i c r o c o l o n i e s . ( A ) T y p e I m i c r o c o l o n y o f p r i m a r i l y M e t h a n o t h r i x - l i k e b a c t e r i a ( M t ) a n d l o w l e v e l s o f M e t h a n o b a c t e r i u m - l i k e b a c t e r i a ( M b ) . ( B ) M i c r o c o l o n y t y p e I I i s h o m o g e n e o u s l y c o m p o s e d o f M e t h a n o b a c t e r i u m - l i k e r o d s ( M b ) a n d r e g u l a r l y s h a p e d , D e s u l f o b u l b u s - l i k e r o d s ( D b ) . ( C ) M i c r o c o l o n y c o n s i s t s o f i r r e g u l a r l y — s h a p e d , D e s u l f o v i b r i o - l i k e r o d s ( D v ) a n d M e t h a n o b a c t e r i u m - l i k e r o d s ( M b ) . M e t h a n o s p i r i l l u m - l i k e c e l l s ( M s ) a r e a l s o o b s e r v e d o u t s i d e t h e t y p e I I I c o l o n y . . : h . s a J . . . . . . v e . . . m . . . a . f . n D . . . M . . 4 . . . W . . 1 ‘ . V . . . . m . “ . . . . . - . ? m . 1 . m . . 3 . . . r . m . . m . . 1 . A . 4 w - . . . . 5 0 3 . . . V Y . . . . . P 1 1 . 0 . . M . u 1 . . { . ! k l . f . . _ . “ 0 . o t 0 . . . . ’ r ' . o 3 o . t u 0 f : c m . f u r / r . . J . 9 2 . . ‘ . V 0 . O J ‘ a ' 5 . _ r ‘ 4 ? . 3 ’ . ' . 3 ' . 4 . ’ F 1 3 9 1 4 0 T h e g r a n u l e s w e r e g e n e r a l l y s p h e r o i d a l i n s h a p e . A l a r g e n u m b e r o f s m a l l h o l e s o r v e n t s w e r e o b s e r v e d o n t h e s u r f a c e o f t h e g r a n u l e s ( F i g u r e 4 . 1 A ) . T h e s e h o l e s a p p e a r e d t o b e r a n d o m l y d i s t r i b u t e d o n t h e g r a n u l e s u r f a c e w i t h o p e n i n g s o f 1 0 t o 2 0 p m ( F i g u r e 4 . 1 B ) . S o m e o f t h e o p e n i n g s w e r e s u r r o u n d e d b y b a m b o o - s h a p e d M e t h a n o t h r i x — l i k e r o d s ( F i g u r e 4 . 1 C ) , w h i l e o t h e r s w e r e s u r r o u n d e d b y M e t h a n o b a c t e r i u m — l i k e r o d s t o g e t h e r w i t h o t h e r f a t r o d s . ( F i g u r e 4 . 1 D ) . T h i n - s e c t i o n a n a l y s i s o f t h e g r a n u l e s r e v e a l e d t h a t t h e d i s t r i b u t i o n o f d i f f e r e n t b a c t e r i a l m o r p h o t y p e s w a s n o t h o m o g e n e o u s a n d t h a t l o w - a n d h i g h — c e l l d e n s i t y a r e a s e x i s t e d w i t h i n t h e g r a n u l e s . A l t h o u g h i t i s i m p o s s i b l e t o s a y w i t h a n y c e r t a i n t y t h a t t h e l o w - d e n s i t y a r e a s w e r e n o t s i m p l y a r t i f a c t s o f s a m p l e p r e p a r a t i o n , i t a p p e a r s t h a t t h e s e a r e a s m a y b e i n t e r n a l g a s c h a n n e l s . T h i s i s s u p p o r t e d b y t h e o b s e r v a t i o n t h a t t h e s e l o w - d e n s i t y a r e a s w e r e g e n e r a l l y v o i d o f c e l l s o r d e a d c e l l s a n d w e r e a p p r o x i m a t e l y t h e s a m e d i a m e t e r a s t h e v e n t h o l e s o n t h e g r a n u l e s u r f a c e . T h e h i g h c e l l d e n s i t y a r e a s w e r e m a i n l y c o m p o s e d o f m i c r o c o l o n i e s o r c l u s t e r s w h i c h c a n b e c h a r a c t e r i z e d i n t o t h r e e d i s t i n c t t y p e s . T h e fi r s t t y p e o f m i c r o c o l o n y c o n s i s t e d a l m o s t e n t i r e l y o f M e t h a n o t h r i x - l i k e b a c t e r i a , w h i l e M e t h a n o b a c t e r i u m - l i k e r o d s w e r e o c c a s i o n a l l y o b s e r v e d w i t h i n t h e m i c r o c o l o n i e s ( F i g u r e 4 . 2 A ) . T h e s e m i c r o c o l o n i e s c o n t r i b u t e d a b o u t 3 0 t o 4 0 % o f t h e t o t a l a r e a o f t h e t h i n s e c t i o n s . T h e r e m a i n i n g t w o t y p e s o f m i c r o c o l o n i e s w e r e m o r e h e t e r o g e n e o u s w i t h r e s p e c t t o m o r p h o t y p e s . T h e y c o n s i s t e d p r e d o m i n a n t l y o f M e t h a n o b a c t e r i u m - l i k e r o d s i n c l o s e a s s o c i a t i o n w i t h o t h e r r o d - s h a p e d b a c t e r i a p r e s u m e d t o b e i n v o l v e d i n a c e t o g e n e s i s . O n e t y p e o f m i c r o c o l o n y w a s c o m p o s e d o f g r a m - n e g a t i v e - l i k e r e g u l a r r o d s w h i c h g r o w r a t h e r h e t e r o g e n e o u s l y w i t h t h e r o d - s h a p e d m e t h a n o g e n s ( F i g u r e 4 . 2 B ) . T h e fi n a l t y p e o f m i c r o c o l o n i e s w e r e c o m p o s e d o f i r r e g u l a r s h a p e d , g r a m - n e g a t i v e r o d s a n d r o d - s h a p e d m e t h a n o g e n s . T h e y a l s o g r e w q u i t e h e t e r o g e n e o u s l y ( F i g u r e 4 . 2 C ) . T h e t w o 1 4 1 n o n - m e t h a n o g e n i c r o d s w e r e t h e p r e v a l e n t n o n - m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a f o u n d i n t h e t h i n - s e c t i o n s o f t h e g r a n u l e s . A r o u n d t h e s e c e l l s , a p o l y m e r m a t r i x s t r u c t u r e w a s e a s i l y v i s i b l e ( F i g u r e 4 . 2 B a n d C ) . W h e t h e r t h i s p o l y m e r m a t r i x i s i n p a r t r e s p o n s i b l e f o r m a i n t a i n i n g t h e i n t e g r i t y o f t h e g r a n u l e s o r s t r e n g t h e n i n g t h e g r a n u l a r s t r u c t u r e i s n o t c l e a r . O t h e r t h a n t h e a b o v e m o r p h o t y p e s , M e t h a n o s p i r i l l u m - l i k e c e l l s w e r e o c c a s i o n a l l y o b s e r v e d ( F i g u r e 4 . 2 C ) . T h e a p p r o x i m a t e c o n c e n t r a t i o n o f t h e d i f f e r e n t m o r p h o t y p e s o b s e r v e d i n t h e T E M t h i n - s e c t i o n s i s s u m m a r i z e d i n T a b l e 4 . 2 . T h e t o t a l m i c r o b i a l d e n s i t y o f t h e g r a n u l e c r o s s s e c t i o n w a s c a . 6 x 1 0 7 c e l l s / c m z . A m o n g t h e s e c e l l s , c a . 2 3 % w e r e t h e M e t h a n o t h r i x - l i k e b a c t e r i a , 3 8 % w e r e t h e M e t h a n o b a c t e r i u m - l i k e b a c t e r i a , 2 6 % w e r e o t h e r r o d - s h a p e d b a c t e r i a w h i l e 1 3 % w e r e e m p t y c e l l s . B a s e d o n t h e s e d a t a , t h e g r a n u l e s w o u l d h a v e a b o u t 4 . 4 x 1 0 1 1 c e l l s / c m ’ o r 4 . 0 x 1 0 1 2 c e l l s / g V S S , b a s e d o n t h e d e n s i t y a n d V S S / S S r a t i o i n T a b l e 4 . 2 . 4 . 3 . 3 P r e d o m i n a n t s p e c i e s i n e n r i c h m e n t s S i x e n r i c h m e n t s w e r e o b t a i n e d : t w o a c e t a t e e n r i c h m e n t s ( p l u s a n d m i n u s s u l f a t e ) , t w o e t h a n o l e n r i c h m e n t s ( p l u s a n d m i n u s s u l f a t e ) a n d t w o p r o p i o n a t e e n r i c h m e n t s ( p l u s a n d m i n u s s u l f a t e ) . M e t h a n o t h r i x s o e h n g e n i i - l i k e l o n g fi l a m e n t o u s r o d s w e r e p r e d o m i n a n t s p e c i e s i n t h e t w o a c e t a t e e n r i c h m e n t s . T h e s e c e l l s g r e w a s fl o c s . M e t h a n o s a r c i n a — l i k e c e l l s w e r e n o t o b s e r v e d . N o n - a u t o - fl u o r e s c e n c e n t , i r r e g u l a r l y - s h a p e d r o d s , r e s e m b l i n g D e s u l f o v i b r i o s p . , a n d s h o r t r o d s w i t h a u t o - fl u o r e s c e n c e , p r e s u m a b l y M e t h a n o b a c t e r i u m s p . o r M e t h a n o b r e v i b a c t e r s p . , w e r e o c c a s i o n a l l y o b s e r v e d d u r i n g m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n o f t h e e n r i c h m e n t n o t r e c e i v i n g s u l f a t e ( F i g u r e 4 . 3 A ) . T h e s e t w o r o d - s h a p e d m e t h a n o g e n s w e r e a l s o o b s e r v e d i n t h e e n r i c h m e n t r e c e i v i n g s u l f a t e ; h o w e v e r , m a n y m o r e D e s u l f o v i b r i o - l i k e c e l l s w e r e o b s e r v e d . 1 4 2 F i g u r e 4 . 3 M i c r o b i a l s p e c i e s o b s e r v e d i n a c e t a t e , e t h a n o l a n d p r o p i o n a t e e n r i c h m e n t s . ( A ) M e t h a n o t h r i x s o e h n g e n i i - l i k e l o n g fi l a m e n t s ( M t ) w e r e p r e d o m i n a n t s p e c i e s i n t h e a c e t a t e e n r i c h m e n t m i n u s s u l f a t e . M e t h a n o b a c t e r i u m ( M b ) a n d D e s u l f o v i b r i o ( D v ) — l i k e c e l l s w e r e a l s o f o u n d . ( B ) S y n t r o p h i c g r o w t h o f D e s u l f o v i b r i o s p ( D v ) . a n d M e t h a n o b a c t e r i u m s p . ( M b ) i n e t h a n o l e n r i c h m e n t m i n u s s u l f a t e . ( C ) C l u m p o f D e s u l f o b u l b u s - l i k e ( D b ) , r e g u l a r f a t r o d s i n p r o p i o n a t e e n r i c h m e n t ( p l u s s u l f a t e ) . ( D ) T E M t h i n s e c t i o n o f D e s u l f o v i b r i o s p . ( D v ) i n e t h a n o l e n r i c h m e n t s h o w e d t h e s a m e m o r p h o l o g y a s t h e i r r e g u l a r r o d s i n g r a n u l e s ( F i g u r e 4 . 2 D ) . ( E ) T E M m i c r o g a p h o f s y n t r o p h i c g r o w t h o n p r o p i o n a t e o f D e s u l f o b u l b u s - l i k e ( D b ) a n d M e t h a n o s p i r i l l u m - l i k e ( M s ) c e l l s i n p r o p i o n a t e e n r i c h m e n t m i n u s s u l f a t e . 1 4 3 I n t h e t w o e t h a n o l e n r i c h m e n t s , D e s u l f o v i b r i o - l i k e c e l l s w e r e t h e p r e d o m i n a n t o r g a n i s m s . I n t h e a b s e n c e o f s u l f a t e , t h e s e c e l l s g r e w t o g e t h e r w i t h M e t h a n o b a c t e r i u m - l i k e c e l l s ( F i g u r e 4 . 3 B ) , a n d m e t h a n e p r o d u c t i o n w a s o b s e r v e d d u r i n g e t h a n o l d e g r a d a t i o n . I n t h e s u l f a t e a d d e d e n r i c h m e n t , n o m e t h a n o g e n s w e r e o b s e r v e d . T h i s r e s u l t i n d i c a t e s t h a t t h e D e s u l f o v i b r i o - l i k e c e l l s c a n g r o w o n e t h a n o l e i t h e r s y n t r o p h i c a l l y w i t h m e t h a n o g e n s o r a l o n e i f s u l f a t e i s p r e s e n t a s a n e l e c t r o n a c c e p t o r . P r o p i o n a t e w a s n o t u t i l i z e d b y t h e s e c u l t u r e s . T h i n s e c t i o n T E M m i c r o g r a p h s ( F i g u r e 4 . 3 D ) r e v e a l e d t h a t t h e D e s u l f o v i b r i o - l i k e c e l l s h a d t h e s a m e m o r p h o t y p e a s t h e i r r e g u l a r r o d s i d e n t i fi e d i n t h e s y n t r o p h i c m i c r o c o l o n i e s i n s i d e t h e g r a n u l e s a s s h o w n i n F i g u r e 4 . 2 C . I n t h e p r o p i o n a t e e n r i c h m e n t s , t h e p r e d o m i n a n t c e l l s w e r e f a t r o d s w h i c h w e r e o b s e r v e d t o f o r m l a r g e a g g r e g a t e s ( F i g u r e 4 . 3 C ) . M e t h a n o s p r i l l u m - l i k e , M e t h a n o b a c t e r i u m - l i k e , a n d M t r x . s o e h n g e n i i — l i k e c e l l s w e r e f o u n d i n t h e e n r i c h m e n t n o t r e c e i v i n g s u l f a t e . I n t h e p r e s e n c e o f s u l f a t e a d d e d , o n l y M e t h a n o s p i r i l l u m - l i k e c e l l s w e r e o b s e r v e d o c c a s i o n a l l y . A p o l y m e r s t r u c t u r e a r o u n d t h e s u l f a t e r e d u c i n g r o d s c a n b e o b s e r v e d e a s i l y ( F i g u r e 4 . 3 E ) . B o t h t h e p r o p i o n a t e e n r i c h m e n t s w e r e a b l e t o u t i l i z e e t h a n o l . B a s e d u p o n T E M m i c r o s c o p y , t h e s e r o d s w e r e s i m i l a r i n a p p e a r a n c e t o D e s u l f o b u l b u s p r o p i o n i c u s a n d t h e n o n - m e t h a n o g e n i c r o d s i n F i g u r e 4 . 2 C . 4 . 4 S U B S T R A T E M E T A B O L I C P E R F O R M A N C E 4 . 4 . 1 T i m e - c o u r s e o f s u b s t r a t e d e g r a d a t i o n S u b s t r a t e d e g r a d a t i o n o f s o m e m a j o r i n t e r m e d i a t e s w a s t e s t e d w i t h e s s e n t i a l l y n o s u l f a t e ( c a . 3 . 7 u M o f s u l f a t e a d d e d w i t h t h e t r a c e e l e m e n t s o l u t i o n ) t o e x a m i n e 1 4 4 s y n t r o p h i c m e t h a n o g e n i c r e a c t i o n s i n t h e g r a n u l e s . T h e r e s u l t s o f s y n t r o p h i c e t h a n o l c o n v e r s i o n i s i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 4 . 4 a n d s u m m a r i z e d i n T a b l e 4 . 3 . A s e t h a n o l w a s c o n s u m e d , a c e t a t e a c c u m u l a t e d a n d t h e n d e c l i n e d u p o n d e p l e t i o n o f e t h a n o l . A s w o u l d b e a n t i c i p a t e d , H 2 a c c u m u l a t e d r a p i d l y d u r i n g e t h a n o l c o n v e r s i o n ( u p t o 9 7 P a ) a n d w a s t h e n c o n s u m e d t o l o w l e v e l s . F o r m a t e ( u p t o 7 0 u M ) w a s o b s e r v e d t o a c c u m u l a t e a n d t h e n b e s u b s e q u e n t l y c o n s u m e d a s e t h a n o l l e v e l s d e c r e a s e d . P r o p i o n a t e a l s o a c c u m u l a t e d t o a m a x i m u m l e v e l o f 0 . 2 6 m M a n d w a s t h e n d e g r a d e d . T h e v a l u e s o f f r e e e n e r g y a v a i l a b l e f o r i n t e r s p e c i e s h y d r o g e n t r a n s f e r a n d f o r m a t e t r a n s f e r w e r e b a s i c a l l y t h e s a m e ( T a b l e 4 . 3 ) . F r e e e n e r g y a v a i l a b l e f o r s y n t h e s i s o f f o r m a t e f r o m h y d r o g e n w a s n e a r z e r o , i n d i c a t i n g t h e s e t w o e l e c t r o n c a r r y i n g i n t e r m e d i a t e s w e r e a t e q u i l i b r i u m . S i m u l t a n e o u s d e g r a d a t i o n o f a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e w a s e x a m i n e d t o d e t e r m i n e t h e r e l a t i v e r a t e s o f c o n v e r s i o n o f t h e s e t h r e e V F A s ( F i g u r e 4 . 5 ) . A c e t a t e w a s c o n s u m e d m u c h q u i c k e r t h a n t h e o t h e r V F A s . B u t y r a t e c o n s u m p t i o n w a s e x t r e m e l y s l o w , i n d i c a t i n g t h a t t h i s a c i d i s n o t a n o r m a l s u b s t r a t e f o r t h e s e g r a n u l e s a s w o u l d b e e x p e c t e d b a s e d o n t h e c o m p o s i t i o n o f b r e w e r y w a s t e w a t e r . D u r i n g b u t y r a t e d e g r a d a t i o n , a c o n s i d e r a b l e a m o u n t o f i s o b u t y r a t e ( 0 . 7 m M ) a c c u m u l a t e d a n d a t r a c e a m o u n t o f 2 - m e t h y l b u t y r a t e ( 0 . 0 5 m M ) w a s f o r m e d . B u t y r a t e d i s a p p e a r e d f a s t e r t h a n i s o b u t y r a t e u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s . T h i s r e s u l t i n d i c a t e s t h e p r e s e n c e o f b u t y r a t e — a n d i s o b u t y r a t e - b u t y r a t e - d e g r a d i n g m i c r o o r g a n i s m s i n t h e g r a n u l e s ( s e e C h a p t e r 6 ) . T h e H 2 p a r t i a l p r e s s u r e o b s e r v e d d u r i n g t h i s e x p e r i m e n t w a s m u c h l o w e r t h a n p r e v i o u s l y o b s e r v e d d u r i n g e t h a n o l c o n s u m p t i o n . F o r m a t e w a s n o t d e t e c t e d ( < 5 u M ) . 1 4 5 1 4 - - 1 4 0 ‘ H y d r o g e n ' A r z q \ - 1 2 0 A 2 ‘ ' § . 5 . 1 ° : 9 4 M e t h a n e T 1 0 0 ‘ 2 ’ l “ 8 ‘ - P 8 0 u ] a ‘ . a : r : 6 - - s o 8 r . » g 4 ' ~ 4 0 2 fi 3 : 2 . a ' 2 0 G . . . - 0 r I l Q Q - T G - : - - @ o 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 " ‘ ~ 4 0 0 $ 1 . 1 4 E t h a n o l E “ / 3 0 0 < O . 3 E 1 0 - l l - a Q A c e t a t e m < - 2 0 0 ' - < I ! E 0 ‘ u : _ , 5 - 0 o F o r m a t e - 1 o o I L : 2 < 1 : L 1 - 0 ' 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 T I M E ( h r s ) F i g u r e 4 . 4 S y n t r o p h i c e t h a n o l d e g r a d a t i o n a n d i n t e r m e d i a t e p r o d u c t f o r m a t i o n b y b r e w e r y g r a n u l e s i n t h e a b s e n c e o f s u l f a t e a t 3 5 ° C . s i s e h t 2 . n 4 . . . . C 5 7 1 4 y + 1 0 1 2 S < - - - - N e t a m 4 r 5 5 9 6 C C o - 3 2 2 d n a e l u n a r g y s F < - N N - - r i e s e w h e t r n b y s y b e t n a 2 3 3 8 2 C C o m 6 3 2 2 1 i r 1 - - - - N N t o a f d a d r n g a e d r e l f o s n n a a r h t t e n o ) M 5 6 0 0 5 5 ( < 5 7 3 3 < c ) r i a t h P 8 7 7 8 2 ( 6 9 9 7 1 1 c p e o l r e t n s y e s i c g e n p s 2 2 ) 5 i r r M 0 0 4 6 9 5 . . 0 2 1 1 m 0 0 . . . . ( < < 0 0 0 0 e u t d n i d e f m o r s o i f s y s l e ) a t 5 n M a a . i d c e i m t r e e g t r n I e n e 3 . 4 e l b a T m 1 1 8 5 5 1 . . . . . ( 0 4 9 9 1 1 ) M m 5 5 9 5 0 0 . . . . 6 8 4 1 . . 0 0 ( 8 2 < < 1 1 ) r 5 8 5 8 6 3 h . . . . . ( 0 0 5 2 3 1 T i m e e t h a n o l a c e t a t e p r o p i o n a t e H 2 f o r m a t e j A G ’ ( Q / r e a c t i o n ) i n t e r s p e c i e s t r a n s f e r F o r m a t e ( 1 ) C a l c u l a t i o n o f A G ’ v a l u e s i s d e s c r i b e d i n A p p e n d i x E . ( 2 ) N C : N o t c a l c u l a t e d . D e t e c t i o n l i m i t s w e r e 0 . 0 2 m M , 0 . 0 5 m M a n d 5 M f o r p r o p i o n a t e , e t h a n o l a n d f o r m a t e , r e s p e c t i v e l y i n t h i s a s s a y . ( 3 ) T e s t c o n d i t i o n s : i n i t i a l p H 7 . 0 , H C O 3 ' 5 9 m M , a n d 3 5 ° C . 1 4 6 1 4 7 1 5 - E 1 0 . i g 5 < 8 E I : O : 5 5 E 0 : . 1 0 - 5 E h < " ‘ 3 ' 4 S I I I 6 ' 3 a : ' - E E g u t y n t e ' g r ! " 4 - a E E m I . m m 0 2 O 2 - 3 ‘ P r o p i o n a t e " . . . ” 0 5 ° 1 7 ' 3 1 “ ’ 1 g ' 5 a e — x — I . . . ‘ o - " " " - 0 o 5 0 t o o 1 5 0 2 0 0 2 5 0 T I M E ( h r s ) F i g u r e 4 . 5 V F A ( a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e ) d e g r a d a t i o n i n t h e a b s e n c e o f s u l f a t e b y b r e w e r y g r a n u l e s a t 3 5 ° C . 1 4 8 4 . 4 . 2 S u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s a n d m a x i m u m m e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e s A l t h o u g h t h e e x p e r i m e n t s c o n d u c t e d a b o v e p r o v i d e d s o m e i n f o r m a t i o n a s t o t h e c a p a c i t y o f t h e g r a n u l e s t o d e g r a d e c o m m o n s u b s t r a t e s , t h e a s s a y s w e r e p e r f o r m e d w i t h o n l y t r a c e s u l f a t e p r e s e n t . A s i n d i c a t e d i n t h e c o m p o s i t i o n o f b r e w e r y w a s t e w a t e r ( T a b l e 4 . 1 ) , m o d e r a t e q u a n t i t i e s o f s u l f a t e w e r e n o r m a l l y p r e s e n t i n t h e w a s t e w a t e r t h e s e g r a n u l e s h a d b e c o m e a c c l i m a t e d t o . A c c o r d i n g l y , s o m e m a j o r i n t e r m e d i a t e s w e r e t e s t e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e p r e s e n c e o f s u l f a t e i n fl u e n c e d t h e i r m e t a b o l i s m . T h e m a x i m u m s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s a n d / o r m a x i m u m m e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e s f o r t h e e i g h t s u b s t r a t e s e x a m i n e d ( w i t h / w i t h o u t s u l f a t e ) a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 4 . 4 . I n t h e a b s e n c e o f s u l f a t e , t h e g r a n u l e s d e m o n s t r a t e d r e l a t i v e l y h i g h m a x i m u m s p e c i fi c c o n v e r s i o n r a t e s ( m m o l / g V S S - d ) f o r e t h a n o l ( 4 5 . 1 ) , a c e t a t e ( 8 . 0 ) , p r o p i o n a t e ( 4 . 1 ) a n d g l u c o s e ( 5 . 7 ) , a n d l o w r a t e s f o r m e t h a n o l ( 1 . 2 ) a n d b u t y r a t e ( 0 . 8 5 ) . T h e m a x i m u m s p e c i fi c m e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e s f r o m f o r m a t e a n d H z - C O Z w e r e e s s e n t i a l l y t h e s a m e . A l t h o u g h g r a n u l e s p h y s i c a l l y d i s r u p t e d t o r e d u c e m a s s t r a n s f e r r e s i s t a n c e h a d m u c h h i g h e r s p e c i fi c m e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e s t h a n t h e i n t a c t g r a n u l e s , t h e m e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e s w e r e e s s e n t i a l l y t h e s a m e f o r b o t h s u b s t r a t e s f o r b o t h i n t a c t a n d d i s r u p t e d g r a n u l e s . T h e a d d i t i o n o f s u l f a t e d i d n o t s i g n i fi c a n t l y a f f e c t t h e m e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e s f r o m H z - C O 2 o r f o r m a t e . W h e n f o r m a t e w a s u s e d a s t h e s u b s t r a t e t o d e t e r m i n e t h e m a x i m u m m e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e , s i g n i fi c a n t c o n c e n t r a t i o n s o f h y d r o g e n a c c u m u l a t e d , u p t o m o r e t h a n 1 5 0 P a , a t t h e b e g i n n i n g o f t h e e x p e r i m e n t a n d w a s s u b s e q u e n t l y c o n s u m e d . T h e i n i t i a l m a x i m u m H 2 a c c u m u l a t i o n r a t e s f r o m a d d e d f o r m a t e w e r e t h e s a m e i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f s u l f a t e ( T a b l e 4 . 4 ) . C o m p a r i s o n o f t h e m a x i m u m m e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e s w i t h t h e i n i t i a l m a x i m u m h y d r o g e n a c c u m u l a t i o n r a t e , c a . 1 t o 2 % o f t h e f o r m a t e w a s c o n v e r t e d a n d r e l e a s e d i n t o t h e h e a d s p a c e a s h y d r o g e n g a s . 1 4 9 T a b l e 4 . 4 M a x i m u m s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s a n d m a x i m u m m e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e s b y t h e b r e w e r y g r a n u l e s i n t h e p r e s e n c e a n d t h e a b s e n c e o f s u l f a t e ( 3 5 ° C ) ‘ l M a x . s u b s t r a t e M a x . m e t h a n e c o n v e r s i o n r a t e p r o d u c t i o n r a t e S u b s t r a t e ( m m o l / g V S S - d ) ( m m o l / g V S S - d ) G r a n u l e s - S O 4 ” + 8 0 4 " - S O 4 ” + 5 0 4 ” 1 . g l u c o s e 5 . 7 N D 8 . 8 N D i n t a c t 2 . m e t h a n o l 1 . 2 1 . 2 0 . 8 4 0 . 5 6 i n t a c t 3 . e t h a n o l 4 5 . 1 4 4 . 5 2 9 . 8 2 6 . 7 i n t a c t 4 . H z - C O 2 N D " N D 1 3 . 7 1 3 . 6 i n t a c t H z - C O 2 N D N D 4 2 . 3 4 2 . 9 d i s r u p t e d 5 . f o r m a t e N D N D 1 3 5 ° 1 3 . 4 c i n t a c t f o r m a t e N D N D 3 6 . 8 ‘ 1 3 7 3 ° d i s r u p t e d 6 . a c e t a t e 8 . 0 8 . 1 8 . 0 7 . 9 i n t a c t 7 . p r o p i o n a t e 4 . 1 5 . 4 6 . 6 7 . 0 i n t a c t 8 . b u t y r a t e 0 . 8 5 0 . 8 4 1 . 9 1 . 5 i n t a c t a ) F e S O 4 ' 5 H z O w a s u s e d a s t h e s u l f a t e s o u r c e . b ) N D : n o t d e t e r m i n e d . c ) T h e i n i t i a l H 2 a c c u m u l a t i o n r a t e s f r o m f o r m a t e w e r e 1 . 0 4 a n d 1 . 0 8 m m o l / g V S S - d , r e s p e c t i v e l y . ( 1 ) T h e i n i t i a l H 2 a c c u m u l a t i o n r a t e s f r o m f o r m a t e w e r e 1 . 6 1 a n d 1 . 4 1 m m o l / g V S S - d , r e s p e c t i v e l y . I n t h e p r e s e n c e o f s u l f a t e , t h e m a x i m u m s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s f o r m e t h a n o l , e t h a n o l , a c e t a t e , a n d b u t y r a t e w e r e e s s e n t i a l l y e q u a l t o t h o s e s a m p l e s w i t h o u t a d d e d s u l f a t e . T h e a d d i t i o n o f s u l f a t e d i d n o t c h a n g e t h e m a x i m u m m e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e s f r o m a c e t a t e , b u t d i d r e d u c e m e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e s f r o m m e t h a n o l a n d e t h a n o l 1 5 0 i n d i c a t i n g i n v o l v e m e n t o f S R B i n d e g r a d a t i o n o f t h e s e c o m p o u n d s . T h e m a x i m u m p r o p i o n a t e c o n v e r s i o n r a t e i n c r e a s e d b y 3 0 % d u e t o a d d i t i o n o f s u l f a t e . T h e m a x i m u m m e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e f r o m p r o p i o n a t e w a s a l s o o b s e r v e d t o i n c r e a s e a s a c o n s e q u e n c e o f s u l f a t e a d d i t i o n . 4 . 4 . 3 E f f e c t o f s u l f a t e o n m e t h a n e y i e l d s M a s s b a l a n c e s w e r e c o n d u c t e d w i t h v a r i o u s s u b s t r a t e s ( 1 1 2 , f o r m a t e , a c e t a t e , p r o p i o n a t e , a n d e t h a n o l ) i n t h e a b s e n c e o r p r e s e n c e o f a d d e d s u l f a t e t o d e t e r m i n e s u b s t r a t e c o n s u m p t i o n , m e t h a n e p r o d u c t i o n a n d s u l f a t e c o n s u m p t i o n ( T a b l e 4 . 5 ) . S u l f a t e w a s s u p p l e m e n t e d t o o b t a i n i n i t i a l 8 0 4 2 ‘ c o n c e n t r a t i o n s r a n g i n g f r o m 8 . 2 t o 9 . 4 m M . I n t h e e x p e r i m e n t s c o n d u c t e d w i t h a d d e d s u l f a t e , a m i n i m u m o f 1 . 6 m M a n d , i n g e n e r a l , m u c h h i g h e r l e v e l s o f s u l f a t e w e r e p r e s e n t a t t h e c o n c l u s i o n o f t h e e x p e r i m e n t s . T h e a m o u n t o f m e t h a n e f o r m e d i n t h e p r e s e n c e o f a d d e d s u l f a t e i n d i c a t e s a l i m i t e d r o l e f o r s u l f a t e r e d u c t i o n i n t h e c o m p l e t e c o n v e r s i o n o f t h e s e s u b s t r a t e s . T h e m a j o r e x c e p t i o n t o t h i s w a s p r o p i o n a t e . T h e m e t h a n e y i e l d i n t h e p r e s e n c e o f s u l f a t e w a s r e d u c e d b y 2 8 % c o m p a r e d t o s a m p l e s c o n v e r t i n g p r o p i o n a t e w i t h o u t a d d e d s u l f a t e . B a s e d o n t h e d a t a o b t a i n e d , t h e p e r c e n t a g e s o f s u l f a t e r e d u c t i o n i n t h e c o n v e r s i o n o f d i f f e r e n t s u b s t r a t e s a r e s h o w n i n T a b l e 4 . 5 ( C a l c u l a t i o n i s d e s c r i b e d i n A p p e n d i x F ) . O n l y a s m a l l a m o u n t o f H 2 , f o r m a t e a n d a c e t a t e w a s c o n v e r t e d b y s u l f a t e r e d u c t i o n . T h e m e t h a n e y i e l d f r o m p r o p i o n a t e a n d e t h a n o l i n t h e p r e s e n c e o f s u l f a t e w a s r e d u c e d b y 2 8 a n d 1 2 % , r e s p e c t i v e l y , c o m p a r e d w i t h s a m p l e s c o n v e r t i n g p r o p i o n a t e a n d e t h a n o l w i t h o u t a d d e d s u l f a t e . B a s e d o n m e t h a n e p r o d u c e d , c a . 6 0 % o f p r o p i o n a t e a n d 3 0 % o f e t h a n o l w e r e c o n v e r t e d t o s u l fi d e a n d a c e t a t e w h e n a h i g h l e v e l o f s u l f a t e w a s s u p p l i e d . d d e e t t p p t t t t t c c c c c u u a a a a a r r t t t t t s s n n n n n i i i i i i i d d ) % ( ) l o m m z l o m m ( 4 O S + 4 O S - - T a b l e 4 . 5 S u b s t r a t e c o n v e r s i o n b y b r e w e r y g r a n u l e s i n t h e p r e s e n c e a n d t h e a b s e n c e o f s u l f a t e S u b s t r a t e S O 4 2 ” C H 4 C H i f o r m e d S u b s t r a t e c o n v e r t e d S u b s t r a t e c o n s u m e d c o n s u m e d f o r m e d + S O 4 / - S O 4 ” v i a s u l f a t e r e d u c t i o n G r a n u l e ( m m o l ) ( m m o l ) ( m m o l ) ( + s u l f a t e ) S O 4 + S O 4 + 8 0 4 z 1 . H 2 1 . 8 3 1 . 8 3 0 . 0 2 0 . 4 6 0 . 4 3 0 . 9 4 H 2 4 . 9 7 4 . 9 7 0 . 0 1 1 1 . 2 4 1 . 2 2 0 . 9 8 2 . f o r m a t e 4 . 5 0 4 . 5 0 0 . 0 6 1 . 0 9 1 . 0 3 0 . 9 5 f o r m a t e 3 . 3 5 3 . 3 5 0 . 0 0 5 8 0 . 8 3 4 0 . 8 2 6 0 . 9 9 3 . a c e t a t e 1 . 0 0 1 . 0 0 0 . 0 0 7 0 . 9 9 0 . 9 5 0 . 9 6 4 . p r o p i o n a t e 1 . 0 0 1 . 0 0 0 . 4 1 1 . 6 7 1 . 2 0 0 . 7 2 5 . e t h a n o l 1 . 0 0 1 . 0 0 0 . 1 8 1 . 4 5 1 . 2 7 0 . 8 8 C O O \ O N W — ‘ V O N 1 5 1 1 5 2 0 . 4 ( A ) " 8 0 . 3 ‘ ‘ s ‘ ‘ 6 \ H y d r o g e n I " . A . . . . . . . . . A 0 . 2 . l “ ‘ \ M e t h a n e . 4 0 . 1 ' ‘ s * 2 ‘ F o r m a t e . ‘ E z e E 2 ‘ 5 E 3 I n u . z 3 5 ' ( D 8 E n : s 5 ° 5 E I 0 l l . T I M E ( h r s ) F i g u r e 4 . 6 M e t h a n o g e n e s i s f r o m H z - C O 2 b y t h e b r e w e r y g r a n u l e s ( i n i t i a l p H 7 . 1 0 ) . ( A ) I n i t i a l H 2 p a r t i a l p r e s s u r e w a s 0 . 3 4 a t m , a n d C O 2 p r e s s u r e w a s 0 . 3 2 a t m . F o r m a t e a c c u m u l a t e d a n d t h e n c o n s u m e d i n t h e a b s e n c e o f s u l f a t e . ( B ) I n i t i a l H 2 p a r t i a l p r e s s u r e w a s 0 . 3 8 a t m , C O 2 p r e s s u r e w a s 0 . 3 0 a t m , a n d F e S O 4 c o n c e n t r a t i o n w a s 7 . 5 m M . F o r m a t e d i d n o t a c c u m u l a t e d t o a d e t e c t a b l e l e v e l ( > 5 M ) , a n d s u l f a t e w a s c o n v e r t e d t o a s m a l l e x t e n t . 1 5 3 4 . 4 . 4 F o r m a t e f r o m H z - C O 2 a n d t h e e f f e c t o f s u l f a t e A s d e s c r i b e d a b o v e , s i g n i fi c a n t c o n c e n t r a t i o n o f h y d r o g e n a c c u m u l a t e d d u r i n g f o r m a t e c o n v e r s i o n b y t h e g r a n u l e s i n t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f s u l f a t e . F o r m a t e p r o d u c t i o n w a s a l s o o b s e r v e d d u r i n g m e t h a n o g e n e s i s f r o m H z - C O z . T h e c o n c e n t r a t i o n s o f f o r m a t e t h a t a c c u m u l a t e d w e r e i n fl u e n c e d b y h y d r o g e n p r e s s u r e s u p p l i e d a n d a d d i t i o n o f s u l f a t e . W h e n m o d e r a t e h y d r o g e n p r e s s u r e ( 0 . 3 4 a t m ) w a s s u p p l i e d i n t h e a b s e n c e o f s u l f a t e , s i g n i fi c a n t a m o u n t s o f f o r m a t e ( 0 . 6 m M ) a c c u m u l a t e d w i t h i n 1 h o u r a n d w e r e t h e n c o n s u m e d c o n c u r r e n t w i t h h y d r o g e n c o n s u m p t i o n ( F i g u r e 4 . 6 a ) . W h e n s u l f a t e w a s e x c e e d e d , f o r m a t e c o n c e n t r a t i o n w a s a s l o w a s t h e d e t e c t a b l e l e v e l ( 5 p M ) d u r i n g t h e m e t h a n o g e n e s i s f r o m H z - C O 2 ( F i g u r e 4 . 6 b ) . W h e n h i g h e r h y d r o g e n p r e s s u r e ( 0 . 9 a t m ) w a s s u p p l i e d , f o r m a t e a c c u m u l a t e d t o 0 . 8 a n d 0 . 2 m M i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f s u l f a t e , r e s p e c t i v e l y , a n d w a s t h e n d e g r a d e d . T h i s i n d i c a t e s t h a t a r e v e r s i b l e r e a c t i o n b e t w e e n f o r m a t e s y n t h e s i s a n d h y d r o g e n p r o d u c t i o n c a n b e p e r f o r m e d b y t h e g r a n u l e s . 4 . 4 . 5 E f f e c t o f m o l y b d a t e o n s u b s t r a t e m e t a b o l i s m M o l y b d a t e i s k n o w n t o b e a n e f f e c t i v e a n d r e l a t i v e l y s e l e c t i v e i n h i b i t o r o f S R B ( T a y l o r a n d O r e m l a n d , 1 9 7 9 ; B a n a t e t a l . , 1 9 8 1 ; S m i t h a n d K l u g , 1 9 8 1 ) . E x p e r i m e n t s u s i n g d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f s o d i u m m o l y b d a t e w e r e c o n d u c t e d t o d e t e r m i n e d m o r e c l e a r l y i f S R B w e r e i n f a c t i n v o l v e d i n t h e c o n v e r s i o n o f p r o p i o n a t e , a c e t a t e a n d e t h a n o l . A c e t a t e c o n v e r s i o n w a s n o t s e n s i t i v e t o M 0 0 4 7 ” ( T a b l e 4 . 6 ) . T h e a d d i t i o n o f 1 0 m M m o l y b d a t e r e d u c e d t h e m a x i m u m c o n v e r s i o n r a t e o f a c e t a t e b y o n l y 1 7 % . S y n t r o p h i c p r o p i o n a t e c o n v e r s i o n , h o w e v e r , w a s e x t r e m e l y s e n s i t i v e t o m o l y b d a t e a d d i t i o n . O n l y 0 . 1 m M m o l y b d a t e w a s r e q u i r e d t o d e c r e a s e t h e m a x i m u m p r o p i o n a t e 1 5 4 d e g r a d a t i o n r a t e b y 6 7 % . T h e i n h i b i t i o n o f p r o p i o n a t e c o n v e r s i o n i n c r e a s e d i n p r o p o r t i o n t o t h e c o n c e n t r a t i o n o f M o O f ’ ( F i g u r e 4 . 7 ) . S y n t r o p h i c c o n v e r s i o n o f e t h a n o l w a s m o d e r a t e l y s e n s i t i v e t o m o l y b d a t e a d d i t i o n . I n t h e p r e s e n c e o f 0 . 1 m M m o l y b d a t e , e t h a n o l c o n v e r s i o n w a s r e d u c e d c a . 6 % . W h e n m o l y b d a t e c o n c e n t r a t i o n w a s i n c r e a s e d b e t w e e n 2 . 0 a n d 1 0 . 0 m M , t h e m a x i m u m c o n v e r s i o n r a t e o f e t h a n o l w a s r e d u c e d b y 3 0 % . T a b l e 4 . 6 M o l y b d a t e e f f e c t s o n t h e m a x i m u m s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s f o r a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d e t h a n o l M o l y b d a t e ( m M ) 0 0 . 1 0 . 2 0 . 5 1 . 0 2 . 0 1 0 . 0 1 . a c e t a t e r a t e , m m o l / g V S S - d 8 . 1 6 7 . 6 0 N D N D N D 7 . 1 4 6 . 7 4 i n h i b i t i o n ( % ) 0 6 . 9 N D N D N D 1 2 . 6 1 7 . 4 2 . p r o p i o n a t e r a t e , m m o l / g V S S - d 4 . 1 7 1 . 3 7 0 . 4 1 0 . 2 0 0 . 2 0 0 . 1 4 N D i n h i b i t i o n ( % ) 0 6 7 . 1 9 0 . 2 9 5 . 2 9 5 . 2 9 6 . 6 N D 3 . e t h a n o l r a t e , m m o l / g V S S - d 3 9 . 0 3 6 . 6 N D N D N D 2 7 . 7 2 7 . 0 i n h i b i t i o n ( % ) 0 6 . 3 N D N D N D 2 9 . 1 3 0 . 9 N D : n o t d e t e r m i n e d . ) M m ( E T A N O I P O R P A c 1 5 5 N L . > — > N / / O N a t 1 / C 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 T I M E ( h r s ) F i g u r e 4 . 7 T h e e f f e c t o f d i f f e r e n t N a g M o O 4 c o n c e n t r a t i o n s o n t h e p r o p i o n a t e c o n v e r s i o n b y t h e g r a n u l e s i n t h e a b s e n c e o f s u l f a t e a t 3 5 ° C . M o l y b d a t e c o n c e n t r a t i o n s ( m M ) w e r e 0 , 0 . 1 , 0 . 2 , 0 . 5 , 1 . 0 a n d 2 . 0 a n d g r a n u l e b i o m a s s ( g V S S ) w e r e 0 . 2 3 , 0 . 2 4 , 0 . 2 9 , 0 . 2 4 , 0 . 2 6 a n d 0 . 3 3 f o r s a m p l e N o . 1 t h r o u g h N o . 6 , r e s p e c t i v e l y . 1 5 6 4 . 5 D I S C U S S I O N 4 . 5 . 1 M i c r o b i a l p o p u l a t i o n o f g r a n u l e s S u b s t r a t e c o m p o s i t i o n h a s a s t r o n g e f f e c t o n d e t e r m i n a t i o n o f m i c r o b i a l c o m p o s i t i o n i n a n e c o s y s t e m . C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e i n fl u e n t r e v e a l e d t h a t t h e m a j o r s u b s t r a t e s c o n s i s t e n t l y a v a i l a b l e t o t h e g r a n u l e s u s e d i n t h i s s t u d y w e r e e t h a n o l , a c e t a t e a n d p r o p i o n a t e ( 6 5 t o 9 0 % o f t o t a l C O D ) . T h e r e f o r e , t h e p r e v a l e n t m i c r o b i a l t r o p h i c g r o u p s i n t h e g r a n u l e s w o u l d b e e x p e c t e d t o c o n s i s t o f e t h a n o l - , p r o p i o n a t e - , a c e t a t e - , a n d H 2 a n d f o r m a t e - u t i l i z i n g b a c t e r i a T h i s w a s , i n f a c t , b o r n e o u t b y s u b s e q u e n t s u b s t r a t e d e g r a d a t i o n e x p e r i m e n t s . B a s e d o n t h e m a x i m u m s p e c i fi c c o n v e r s i o n r a t e s f o r t h e v a r i o u s s u b s t r a t e s t e s t e d , t h e s e g r a n u l e s c o n t a i n e d a l l t h r e e m i c r o b i a l t r o p h i c g r o u p s d e s c r i b e d i n C h a p t e r 1 : h y d r o l y t i c - f e r m e n t a t i v e b a c t e r i a , s y n t r o p h i c a c e t o g e n i c b a c t e r i a ( e t h a n o l - , p r o p i o n a t e - , b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e - u t i l i z i n g ) , a n d m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a . H o w e v e r , t h e m a j o r i t y o f t r 0 p h i c g r o u p s a p p e a r e d t o b e e t h a n o l , p r o p i o n a t e , a c e t a t e , a n d H 2 a n d f o r m a t e - u t i l i z i n g b a c t e r i a a s w o u l d b e a n t i c i p a t e d b a s e d o n t h e w a s t e w a t e r c o m p o s i t i o n . H y d r o l y t i c - f e r m e n t a t i v e b a c t e r i a c o n s t i t u t e d a l i m i t e d p o r t i o n o f t h e o v e r a l l p o p u l a t i o n i n t h e g r a n u l e s , b a s e d o n t h e r e l a t i v e l y l o w g l u c o s e c o n v e r s i o n r a t e . M e t h a n o l - u t i l i z i n g b a c t e r i a a n d b u t y r a t e ( o r b u t y r a t e - i s o b u t y r a t e ) d e g r a d e r s a l s o d i d n o t a p p e a r t o b e p r e s e n t i n g r e a t n u m b e r s s i n c e p o o r s u b s t r a t e c o n v e r s i o n a n d m e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e s w e r e o b s e r v e d u s i n g t h e s e s u b s t r a t e s . T E M e x a m i n a t i o n a l s o s u p p o r t s t h i s . T h e m a j o r i t y o f t h e b a c t e r i a i n t h e g r a n u l e s w e r e M e t h a n o t h n ' x — l i k e a n d M e t h a n o b a c t e r i u m - l i k e m e t h a n o g e n s . T h e r e m a i n i n g c e l l s w e r e a p p a r e n t l y m a i n l y b a c t e r i a i n v o l v e d i n e t h a n o l a n d p r o p i o n a t e d e g r a d a t i o n . T h e l e v e l o f s u l f a t e ( 0 . 6 t o 1 . 3 m M ) i n t h e i n f l u e n t p r o v i d e d f a v o r a b l e c o n d i t i o n s f o r s u l f a t e 1 5 7 r e d u c i n g b a c t e r i a t o p r o l i f e r a t e . 4 . 5 . 2 S y n t r o p h i c e t h a n o l d e g r a d a t i o n a n d i n t e r s p e c i e s e l e c t r o n t r a n s f e r E t h a n o l w a s t h e m a j o r c a r b o n s o u r c e p r e s e n t i n t h e b r e w e r y w a s t e w a t e r . E x p e r i m e n t s i n d i c a t e d t h a t d u r i n g s y n t r o p h i c e t h a n o l d e g r a d a t i o n , a c e t a t e , f o r m a t e , H 2 a n d p r o p i o n a t e w e r e f o r m e d a s i n t e r m e d i a t e s . A l l w e r e s u b s e q u e n t l y c o n v e r t e d t o m e t h a n e . A c e t a t e a c c u m u l a t i o n i s a c o n s e q u e n c e o f m a x i m u m r a t e o f a c e t a t e c o n s u m p t i o n b e i n g m u c h l o w e r t h a n t h e r a t e o f e t h a n o l c o n s u m p t i o n ( T a b l e 4 . 3 ) . T h e a c c u m u l a t i o n o f b o t h H 2 a n d f o r m a t e , t o r e l a t i v e l y h i g h c o n c e n t r a t i o n s , d u r i n g s y n t r o p h i c e t h a n o l c o n v e r s i o n i s i n t e r e s t i n g . I t a p p e a r s l i k e l y b o t h m a y b e i n v o l v e d i n i n t e r s p e c i e s e l e c t r o n t r a n s f e r d u r i n g s y n t r o p h i c e t h a n o l o x i d a t i o n t o a c e t a t e . E n e r g e t i c a n a l y s i s i n d i c a t e d t h a t t h e f r e e e n e r g y a v a i l a b l e f o r b o t h i n t e r s p e c i e s f o r m a t e a n d h y d r o g e n t r a n s f e r d u r i n g s y n t r o p h i c e t h a n o l d e g r a d a t i o n w a s b a s i c a l l y t h e s a m e a n d t h a t t h e c o n c e n t r a t i o n o f f o r m a t e a n d t h e p a r t i a l p r e s s u r e o f h y d r o g e n w e r e a t a n e q u i l i b r i u m l e v e l ( A G ’ f o r f o r m a t e s y n t h e s i s f r o m H 2 p l u s H C O 3 ' w a s n e a r z e r o , a s s h o w n i n T a b l e 4 . 3 ) . T h e l e v e l s o f f o r m a t e a n d H 2 s u g g e s t e d t h a t t h e r e v e r s i b l e c o n v e r s i o n ( f o r m a t e ‘ + H 2 0 v - H 2 + H C O 3 ' ) w a s a t e q u i l i b r i u m d u r i n g s y n t r o p h i c e t h a n o l d e g r a d a t i o n . T h i s i n d i c a t e s t h a t b o t h f o r m a t e a n d h y d r o g e n s e r v e a s i n t e r m e d i a t e s d u r i n g s y n t r o p h i c e t h a n o l d e g r a d a t i o n b y t h e b r e w e r y g r a n u l e s r e g a r d l e s s o f w h i c h ( o r b o t h ) a r e a c t u a l l y p r o d u c e d b y e t h a n o l - d e g r a d i n g o r g a n i s m ( s ) . T h e c o n c e n t r a t i o n s o f f o r m a t e a n d h y d r o g e n a r e l i k e l y r e g u l a t e d b y t h e e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s s u c h a s H C O 3 ' , p H e t c . T h e a c c u m u l a t i o n o f p r o p i o n a t e p r o b a b l y i s d u e t o t h e a c t i o n o f s o m e S R B s u c h a s D e s u l f o b u l b u s p r o p i o n i c u s , w h i c h c a n f e r m e n t e t h a n o l t o p r o p i o n a t e o r p r o d u c e p r o p i o n a t e f r o m e t h a n o l , h y d r o g e n a n d H C O 3 ' , o r f r o m a c e t a t e , h y d r o g e n a n d H C O 3 ' 1 5 8 i n t h e a b s e n c e o f s u l f a t e ( L a a n b r o e k e t a l . , 1 9 8 2 ) . I n t h e b a t c h e x p e r i m e n t s a n d i n t h e f u l l - s c a l e U A S B r e a c t o r , t h e p r o d u c t i o n o f p r o p i o n a t e b y t h e g r a n u l e s i s l i k e l y a s s o c i a t e d w i t h e t h a n o l f e r m e n t a t i o n s i n c e t h e h y d r o g e n p a r t i a l p r e s s u r e d i d n o t r e a c h h i g h l e v e l s i n a n y c a s e s o f t h e e x p e r i m e n t s . T h e p r o d u c t i o n o f p r o p i o n a t e b y t h e p r o p i o n a t e - u t i l i z i n g p o p u l a t i o n m a y b e a s u r v i v a l s t r a t e g y t h a t a l l o w t h e s e o r g a n i s m s t o c o m p e t e f o r c o m m o n s u b s t r a t e ( s u c h a s e t h a n o l ) a n d s i m u l t a n e o u s l y " s t o r e " s u b s t r a t e t h a t o n l y a l i m i t e d p o p u l a t i o n , i n c l u d i n g t h e m s e l v e s a s p r e d o m i n a n t m i c r o b e s , c a n u s e . T h i s r e a c t i o n , h o w e v e r , m a y n o t b e i m p o r t a n t f o r e t h a n o l d e g r a d a t i o n b y t h e g r a n u l e s s i n c e t h e m o l a r r a t i o b e t w e e n p r o p i o n a t e f o r m e d v e r s u s e t h a n o l c o n v e r t e d w a s l e s s t h a n 2 % ( T a b l e 4 . 3 ) , a n d t h e p r o p i o n a t e c o n v e r s i o n r a t e w a s m u c h s l o w e r t h a n t h e e t h a n o l c o n v e r s i o n r a t e . 4 . 5 . 3 H y d r o g e n a n d f o r m a t e m e t a b o l i s m H y d r o g e n p r o d u c t i o n f r o m f o r m a t e w a s o b s e r v e d i n p u r e c u l t u r e s o f M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m ( S c h a u e r a n d F e r r y , 1 9 8 0 ; S c h a u e r e t a l . , 1 9 8 2 ) . T h e r e v e r s i b l e r e a c t i o n b e t w e e n h y d r o g e n p r o d u c t i o n f r o m f o r m a t e a n d f o r m a t e s y n t h e s i s f r o m h y d r o g e n a n d b i c a r b o n a t e ( o r C O 7 ) w a s d e s c r i b e d u s i n g a f o r m a t e h y d r o g e n l y a s e s y s t e m f r o m M b . f o r m i c i c u m ( B a r o n a n d F e r r y , 1 9 8 9 ) a n d p u r e c u l t u r e s ( C h a p t e r 6 ) . T h e p r o d u c t i o n o f h y d r o g e n a n d f o r m a t e s y n t h e s i s w e r e o b s e r v e d d u r i n g e x p e r i m e n t s u s i n g t h e b r e w e r y g r a n u l e s . T h i s m a y b e d u e t o t h e p r e s e n c e o f H z - C O 2 a n d f o r m a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s s u c h a s M b . f o r m i c i c u m a n d M s p . h u n g a t e i i n t h e g r a n u l e s . T h e s e m e t h a n o g e n s c a n s y n t h e s i z e f o r m a t e f r o m h y d r o g e n p l u s b i c a r b o n a t e o r C O 2 ( s e e C h a p t e r 6 ) . H o w e v e r , f o r m a t e w a s p r o d u c e d a t m u c h l o w e r q u a n t i t i e s i n t h e p r e s e n c e o f s u l f a t e t h a n i n t h e a b s e n c e o f s u l f a t e . T h i s i n d i c a t e s t h a t t h e s y n t h e s i s o f f o r m a t e f r o m H 2 a n d H C O 3 ' m a y i n v o l v e S R B , w h i c h u t i l i z e h y d r o g e n a s e l e c t r o n d o n o r t o 1 5 9 r e d u c e s u l f a t e w h e n s u l f a t e i s a v a i l a b l e a n d s y n t h e s i z e f o r m a t e f r o m h y d r o g e n w h e n s u l f a t e i s l i m i t i n g . T h e o b s e r v a t i o n t h a t t h e m e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e s f r o m b o t h f o r m a t e a n d H 2 - C O 2 i n c r e a s e d o v e r t h r e e - f o l d w h e n t h e g r a n u l e s w e r e d i s r u p t e d r e v e a l s t h e p r e s e n c e o f m a s s t r a n s f e r l i m i t a t i o n f o r b o t h f o r m a t e a n d H z - C O 2 w i t h i n i n t a c t g r a n u l e s . T h e o b s e r v a t i o n t h a t m e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e s f r o m t h e s e t w o s u b s t r a t e s w e r e e s s e n t i a l l y i d e n t i c a l f o r b o t h i n t a c t a n d d i s r u p t e d g r a n u l e s i s s o m e w h a t p e r p l e x i n g a n d c o n t r a r y t o w h a t w o u l d b e a n t i c i p a t e d b a s e d u p o n m a s s t r a n s p o r t c a l c u l a t i o n f o r m i c r o b i a l fl o c s ( O z u t u r k e t a l . , 1 9 8 8 ) a n d i n d i v i d u a l c e l l s ( B o o n e e t a l . , 1 9 8 9 ) . T h e c a t a b o l i s m o f f o r m a t e s h o u l d b e m o r e f a v o r a b l e a s m a s s t r a n s f e r l i m i t a t i o n s b e c o m e g r e a t e r b e c a u s e o f t h e h i g h e r d i f f u s i v i t y o f f o r m a t e c o m p a r e d w i t h h y d r o g e n i n t h e i n t a c t g r a n u l e s . T h e p r o d u c t i o n o f m e t h a n e f r o m f o r m a t e w o u l d b e e x p e c t e d t o b e g r e a t e r t h a n t h a t f r o m h y d r o g e n . T h e r e a s o n t h i s w a s n o t o b s e r v e d i s n o t c l e a r . T h e r e a r e s e v e r a l p l a u s i b l e e x p l a n a t i o n s . I t i s p o s s i b l e t h a t t h e g a s c h a n n e l s o r v e n t s o b s e r v e d i n t h e g r a n u l e s n o t o n l y s e r v e a s c o n d u i t s f o r r e l e a s e o f g a s f o r m e d w i t h i n t h e g r a n u l e s b u t a l s o e x c h a n g e d i s s o l v e d a n d g a s e o u s s u b s t r a t e s i n t o t h e i n t e r i o r p o r t i o n s o f t h e g r a n u l e s , e f f e c t i v e l y r e d u c i n g m a s s t r a n s f e r l i m i t a t i o n s . T h e o b s e r v a t i o n o f s u c h c h a n n e l s o r v e n t s i s n o t n e w . S i m i l a r , a l t h o u g h c o n s i d e r a b l y l a r g e r v e n t s ( 1 0 0 t o 5 0 0 u m ) w i t h a s m o o t h m i c r o b i a l l i n i n g w e r e o b s e r v e d i n t h i c k b i o fi l m s f r o m a n a e r o b i c fi l t e r s , w h i l e s m a l l v e n t s ( 1 0 t o 2 0 u m ) w e r e o b s e r v e d i n t h i n n e r fi l m s f r o m t h e w a l l s o f t h e r e a c t o r s ( R o b i n s o n e t a l . , 1 9 8 4 ) . T h e s e a u t h o r s s u g g e s t e d t h e s e c h a n n e l s m i g h t b e c o n d u i t s f o r n u t r i e n t s a s w e l l a s g a s e x i t . I n t e r n a l g a s c h a n n e l s i n i n d i v i d u a l c y s t s o f M s . b a r k e r i h a v e b e e n o b s e r v e d ( B o c h e m e t a l . , 1 9 8 2 ) . H o l e s a n d c h a n n e l s w e r e a l s o o b s e r v e d i n b i o fi l m s a n d g r a n u l e s f r o m a n a e r o b i c fi l t e r s , U A S B r e a c t o r s a n d fl u i d i z e d b e d r e a c t o r s ( S w i t z e n b a u m a n d E i m s t a d , 1 9 8 7 ) . T h e p r e s e n c e o f t h e s e 1 6 0 c h a n n e l s c o u l d b e , i n p a r t , r e s p o n s i b l e f o r t h e h i g h e f f e c t i v e n e s s f a c t o r s o b s e r v e d f o r g r a n u l e s d e g r a d i n g a c e t a t e a n d o t h e r f a t t y a c i d s ( T r a m p e r e t a l . , 1 9 8 4 ) . A l t h o u g h t h e s e c h a n n e l s m a y r e d u c e m a s s t r a n s f e r r e s i s t a n c e , t h e y d o n o t a l t o g e t h e r e l i m i n a t e i t a s d e m o n s t r a t e d b y t h e d i f f e r e n c e s i n m e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e s f r o m f o r m a t e a n d H z - C O 2 b y i n t a c t a n d d i s r u p t e d g r a n u l e s . A n a l t e r n a t e e x p l a n a t i o n f o r t h e s a m e r e a c t i o n r a t e s o f f o r m a t e a n d H 2 c o u l d b e t h a t a r e v e r s i b l e c o n v e r s i o n b e t w e e n f o r m a t e a n d h y d r o g e n o c c u r r e d i n t h e g r a n u l e s . S i g n i fi c a n t h y d r o g e n a c c u m u l a t i o n w a s o b s e r v e d a t t h e b e g i n n i n g o f m e t h a n e p r o d u c t i o n f r o m f o r m a t e ( T a b l e 4 . 3 ) . F o r m a t e f o r m a t i o n u p t o 0 . 6 t o 0 . 8 m M w a s a l s o o b s e r v e d d u r i n g m e t h a n e p r o d u c t i o n f r o m H z - C O Z . I n f a c t , t h e f o r m a t e a n d h y d r o g e n c o n c e n t r a t i o n s w e r e o b s e r v e d t o r e m a i n c l o s e t o t h e i r c a l c u l a t e d t h e r m o d y n a m i c e q u i l i b r i u m I f f o r m a t e i s r a p i d l y c o n v e r t e d t o H 2 a n d v i c e v e r s a i n g r a n u l e s t o m a i n t a i n c l o s e t o t h e r m o d y n a m i c a l l y e q u i l i b r i u m , l i t t l e d i f f e r e n c e i n m e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e s v i a f o r m a t e a n d H 2 w o u l d b e e x p e c t e d i f t h e r e v e r s i b l e c o n v e r s i o n b e t w e e n h y d r o g e n a n d f o r m a t e i s r a p i d , a s w a s o b s e r v e d . T h e s e t w o e x p l a n a t i o n s a r e n o t m u t u a l l y e x c l u s i v e a n d , i n f a c t , b o t h c o u l d c o n t r i b u t e t o t h e o b s e r v e d p h e n o m e n a . 4 . 5 . 4 T h e r o l e o f s u l f a t e r e d u c i n g b a c t e r i a i n s u b s t r a t e m e t a b o l i s m B a s e d o n t h e r e l a t i v e a m o u n t s o f m e t h a n e f o r m e d i n t h e p r e s e n c e a n d i n t h e a b s e n c e o f s u l f a t e d u r i n g t h e c o n v e r s i o n o f H z - C O 2 a n d f o r m a t e ( T a b l e 4 . 4 ) , S R B p l a y e d a m i n o r r o l e i n t h e c o n s u m p t i o n o f t h e s e e l e c t r o n t r a n s f e r i n t e r m e d i a t e s . O n l y 6 a n d 5 p e r c e n t o f t h e t o t a l a m o u n t o f h y d r o g e n a n d f o r m a t e w e r e , r e s p e c t i v e l y , u s e d f o r s u l f a t e r e d u c t i o n . S i m i l a r l y , o n l y a b o u t 4 p e r c e n t o f a v a i l a b l e a c e t a t e w a s c o n v e r t e d v i a s u l f a t e r e d u c t i o n . T h i s i s c o n s i s t e n t w i t h t h e o b s e r v a t i o n t h a t t h e m a j o r i t y o f t h e m o r p h o t y p e s o b s e r v e d i n t h e t h i n s e c t i o n s o f t h e g r a n u l e s w e r e a c e t a t e - 1 6 1 u t i l i z i n g M e t h a n o t h r i x — l i k e a n d h y d r o g e n / f o r m a t e — u t i l i z i n g M e t h a n o b a c t e r i u m — l i k e c e l l s ( T a b l e 4 . 2 ) . C o n s u m p t i o n o f s u l f a t e d u r i n g d e g r a d a t i o n o f e t h a n o l a n d p r o p i o n a t e , h o w e v e r , i n d i c a t e s s o m e i n v o l v e m e n t o f S R B i n t h e c o n v e r s i o n o f t h e s u b s t r a t e s . T h e d e g r a d a t i o n o f e t h a n o l , a c e t a t e a n d p r o p i o n a t e b y p u r e c u l t u r e s o f S R B v i a s u l f a t e r e d u c t i o n h a s b e e n r e p o r t e d ( W i d d e l , 1 9 8 8 ) . I n t h i s s t u d y , t h e r o l e o f S R B i n s y n t r o p h i c a c e t o g e n e s i s o f e t h a n o l a n d p r o p i o n a t e w a s i n v e s t i g a t e d b y a d d i n g m o l y b d a t e i n t h e a b s e n c e o f s u l f a t e . M o l y b d a t e i s w e l l e s t a b l i s h e d a s a n i n h i b i t o r o f S R B ( T a y l o r a n d O r e m l a n d , 1 9 7 9 ; B a n a t e t a l . , 1 9 8 1 ; S m i t h a n d K l u g , 1 9 8 1 ; Y a d a v a n d A r c h e r , 1 9 8 8 ) . T h e c o n c e n t r a t i o n o f m o l y b d a t e r e q u i r e d f o r e s s e n t i a l l y c o m p l e t e i n h i b i t i o n o f s u l f a t e r e d u c t i o n w a s f o u n d t o b e 0 . 2 m M f o r a l a k e s e d i m e n t ( S m i t h a n d K l u g , 1 9 8 1 ) . A m o l y b d a t e c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 1 m M c o m p l e t e l y i n h i b i t s t h e g r t h o f D e s u l f o v i b r i o d e s u l f u r i c a n s o n e t h a n o l i n a c o c u l t u r e w i t h M b . f o r m i c i c u m M F ( Y a d a v a n d A r c h e r , 1 9 8 8 ) . T h e i n h i b i t i o n l e v e l o f m o l y b d a t e f o r m e t h a n o g e n s a p p e a r e d t o b e m u c h h i g h e r t h a n t h a t f o r S R B . M o l y b d a t e a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 m M d i d n o t i n h i b i t t h e g r o w t h o f M b . f o r m i c i c u m ( Y a d a v a n d A r c h e r , 1 9 8 8 ) . I n l a k e s e d i m e n t s , a h i g h l e v e l ( 2 0 m M ) o f m o l y b d a t e i n h i b i t e d m e t h a n o g e n e s i s ( S m i t h a n d K l u g , 1 9 8 1 ) . A d e c r e a s e o f m e t h a n o g e n e s i s a n d t h e a c c u m u l a t i o n o f a c e t a t e i n a n a n a e r o b i c fi l t e r w a s r e p o r t e d t o b e d u e t o a c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 m M m o l y b d a t e ( H i l t o n a n d A r c h e r , 1 9 8 8 ) . O u r d a t a i n d i c a t e d t h a t i n t h e a b s e n c e o f s u l f a t e , t h e m a x i m u m a c e t a t e c o n v e r s i o n r a t e w a s o n l y s l i g h t l y d e c r e a s e d b y t h e a d d i t i o n o f m o l y b d a t e ( 0 . 1 t o 1 0 m M ) . M a s s b a l a n c e e x p e r i m e n t s r e v e a l e d t h a t c a . 3 0 % o f e t h a n o l w a s c o n v e r t e d v i a s u l f a t e r e d u c t i o n i f s u f fi c i e n t s u l f a t e w a s p r e s e n t . T h e m o l y b d a t e i n h i b i t i o n e x p e r i m e n t s s h o w e d t h a t i n t h e a b s e n c e o f s u l f a t e , s y n t r o p h i c e t h a n o l c o n v e r s i o n w a s 1 6 2 i n h i b i t e d b y 2 9 % b y 2 . 0 m M o f m o l y b d a t e . T h e s e r e s u l t s s t r o n g l y s u g g e s t e d t h a t S R B w e r e i n v o l v e d i n e t h a n o l c o n v e r s i o n w h e t h e r s u l f a t e w a s a v a i l a b l e o r n o t . I t i s w e l l k n o w n t h a t i n t h e a b s e n c e o f s u l f a t e , D e s u l f o v i b r i o s p . c a n s y n t r o p h i c a l l y c a t a b o l i z e e t h a n o l t o g e t h e r w i t h H z - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s ( B r y a n t e t a l . , 1 9 7 7 ; M c I n e m e y a n d B r y a n t , 1 9 8 1 ; T r a o r e e t a l . , 1 9 8 3 ) . R e s u l t s f r o m e t h a n o l e n r i c h m e n t s t u d i e s i n d i c a t e d t h a t D e s u l f o v i b r i o s p . m a y b e o n e o f S R B c a p a b l e o f s y n t r o p h i c e t h a n o l d e g r a d a t i o n i n t h e g r a n u l e s . M o l y b d a t e s e v e r e l y i n h i b i t e d t h e s y n t r o p h i c c o n v e r s i o n o f p r o p i o n a t e a t l o w l e v e l s ( 0 . 1 t o 0 . 2 m M ) w i t h e s s e n t i a l l y c o m p l e t e i n h i b i t i o n ( 9 5 t o 9 7 % ) a t h i g h e r m o l y b d a t e c o n c e n t r a t i o n s ( 0 . 5 t o 2 . 0 m M ) . C o m p a r i s o n e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d u s i n g t h e r o d - t y p e g r a n u l e s d e s c r i b e d i n C h a p t e r 3 , w h i c h w e r e g r o w n o n a v o l a t i l e f a t t y a c i d m i x t u r e ( a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e ) m e d i u m c o n t a i n i n g l o w s u l f a t e ( 0 . 1 5 m M ) . T h e s a m e l e v e l o f m o l y b d a t e a d d i t i o n ( 0 . 1 t o 2 . 0 m M ) d i d n o t a f f e c t s y n t r o p h i c p r o p i o n a t e c o n v e r s i o n b y t h e r o d - t y p e g r a n u l e s t o a n y w h e r e n e a r t h i s e x t e n t ( s e e C h a p t e r 5 ) . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e s y n t r o p h i c c o n v e r s i o n o f p r o p i o n a t e i n t h e b r e w e r y g r a n u l e s w a s m a i n l y p e r f o r m e d b y S R B . T o d a t e , s e v e r a l s t r a i n s o f p r o p i o n a t e - d e g r a d i n g S R B h a v e b e e n r e p o r t e d ( W i d d e l a n d P f e n n i g , 1 9 8 2 ; W i d d e l a n d a n e n n i g , 1 9 8 4 ; S a m a i n e t a l . , 1 9 8 4 ; W i d d e l , 1 9 8 8 ) , b u t t h e s y n t r o p h i c c o n v e r s i o n o f p r o p i o n a t e b y S R B a s s o c i a t e d w i t h m e t h a n o g e n s h a s n o t b e e n r e p o r t e d . R e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e p r o p i o n a t e - d e g r a d i n g S R B i n t h e b r e w e r y g r a n u l e s a r e a b l e t o c o u p l e p r o p i o n a t e o x i d a t i o n w i t h s u l f a t e r e d u c t i o n i f s u l f a t e i s a v a i l a b l e , o r t o c o m p l e t e p r o p i o n a t e o x i d a t i o n s y n t r o p h i c a l l y w i t h a n o t h e r p a r t n e r t h a t i s a b l e t o r e m o v e H 2 o r f o r m a t e f o r m e d d u r i n g p r o p i o n a t e o x i d a t i o n i f s u l f a t e i s n o t a v a i l a b l e . T h i s r e p r e s e n t s a c o n s i d e r a b l e e c o l o g i c a l a d v a n t a g e f o r t h i s t y p e o f S R B o v e r o b l i g a t e l y s y n t r o p h i c p r o p i o n a t e d e g r a d e r s i n e c o s y s t e m s w h e r e s u l f a t e i s c o n t i n u o u s l y o r i n t e r m i t t e n t l y a v a i l a b l e . T h e r e s u l t s a l s o s u g g e s t t h a t t h e s e e t h a n o l - a n d p r o p i o n a t e - d e g r a d i n g S R B 1 6 3 c a n n o t e f f e c t i v e l y c o m p e t e w i t h m e t h a n o g e n s f o r h y d r o g e n o r f o r m a t e . O t h e r w i s e , a c o n s i d e r a b l y g r e a t e r p o r t i o n o f t h e h y d r o g e n a n d f o r m a t e w o u l d h a v e b e e n u s e d f o r s u l f a t e r e d u c t i o n d u r i n g t h e m a s s b a l a n c e e x p e r i m e n t s . 4 . 5 . 5 T h e r o l e o f s u l f a t e r e d u c i n g b a c t e r i a i n g r a n u l a r s t r u c t u r e M i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o n s , e s p e c i a l l y T E M e x a m i n a t i o n i n d i c a t e d t h a t S R B p l a y e d a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e g r a n u l a r s t r u c t u r e . O n e d i s t i n c t c h a r a c t e r i s t i c o f t h e b r e w e r y g r a n u l e s w a s t h a t t h e y w e r e m a i n l y c o m p o s e d o f m i c r o c o l o n i e s a n d c l u s t e r s . M i c r o c o l o n i e s o r c l u s t e r s c o m p o s e d o f t h e s y n t r o p h i c a c e t o g e n s , S y n t r o p h o m o n a s s p . o r S y n t r o p h o b a c t e r s p . a n d H z - u t i l i z i n g M e t h a n o b r e v i b a c t e r s p . , w e r e o b s e r v e d i n s i d e g r a n u l e s e x a m i n e d b y D u b o u r g u i e r e t a l . ( 1 9 8 8 a , 1 9 8 8 c ) . T E M e x a m i n a t i o n r e v e a l e d t h a t s y n t r o p h i c m i c r o c o l o n i e s a l s o e x i s t e d i n t h e g r a n u l e s t r e a t i n g b r e w e r y w a s t e w a t e r . I n a d d i t i o n , i t w a s o b s e r v e d t h a t M e t h a n o t h r i x s p . f o r m e d t h e i r o w n m i c r o c o l o n i e s . T h e p r e v a l e n t s p e c i e s i n t h e o t h e r m i c r o c o l o n i e s w e r e p r e l i m i n a r i l y i d e n t i fi e d b y u s i n g s e r i e s d i l u t i o n w i t h d i f f e r e n t s u b s t r a t e s a n d m i c r o s c o p i c a n d T E M o b s e r v a t i o n o f t h e c e l l s f r o m h i g h l y - d i l u t e d e n r i c h m e n t s . M t r x . s o e h n g e n i i — l i k e l o n g fi l a m e n t s w e r e o b t a i n e d i n a c e t a t e e n r i c h m e n t ( F i g u r e 4 . 3 A ) , r e v e a l i n g t h a t t h i s s p e c i e s p r o b a b l y i s t h e p r e d o m i n a n t a c e t a t e u t i l i z e r i n t h e g r a n u l e s . T h e i r r e g u l a r r o d s i n F i g u r e 4 . 2 C w e r e p r e s u m a b l y i d e n t i fi e d t o b e a D e s u l f o v i b r i o s p . w h i c h c a n g r o w a l o n e o n e t h a n o l p l u s s u l f a t e a n d c a n a l s o g r o w s y n t r o p h i c a l l y o n e t h a n o l w i t h M e t h a n o b a c t e r i u m “ s p . i n t h e a b s e n c e o f s u l f a t e . T h e r e g u l a r l y - s h a p e d , n o n - m e t h a n o g e n i c r o d s w e r e f o u n d i n h i g h d i l u t i o n s o f t h e p r o p i o n a t e e n r i c h m e n t s o b t a i n e d b o t h i n t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f s u l f a t e . W h e n s u l f a t e w a s p r e s e n t , b o t h s u l f a t e a n d p r o p i o n a t e w e r e c o n s u m e d a n d n o m e t h a n e w a s p r o d u c e d . T h e s e e n r i c h m e n t s c o u l d a l s o u t i l i z e e t h a n o l i n t h e p r e s e n c e o f s u l f a t e . T h i s i n d i c a t e s t h a t t h e s e u n k n o w n r o d s a r e s u l f a t e r e d u c e r s . 1 6 4 M o r p h o t y p i c a l l y , t h e s e r o d s a r e q u i t e s i m i l a r t o D e s u l f o b u l b u s p r o p i o n i c u s a s r e p o r t e d b y W i d d e l a n d P f e n n i g ( 1 9 8 2 ) . H o w e v e r , D e s u l f o b u l b u s p r o p i o n i c u s c a n n o t g r o w s y n t r o p h i c a l l y w i t h H z - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s ( L a a n b r o e k e t a l . , 1 9 8 2 ; W i d d e l , 1 9 8 8 ) . A p o l y m e r - l i k e s t r u c t u r e w a s o b s e r v e d a r o u n d t h e S R B c e l l s i n t h e m i c r o c o l o n i e s o r c l u s t e r s i n t h e T E M m i c r o g r a p h s o f t h e g r a n u l e s ( F i g u r e 4 . 2 B a n d C ) a n d i n t h e e n r i c h m e n t s ( F i g u r e 4 . 3 D a n d E ) . T h i s c i r c u m s t a n t i a l l y i n d i c a t e s t h a t t h e p o l y m e r s p r o d u c e d b y S R B m a y b e a t l e a s t i n p a r t r e s p o n s i b l e f o r t h e f o r m a t i o n a n d / o r s t a b i l i z a t i o n o f t h e c l u s t e r s i n t h e s e g r a n u l e s . 4 . 5 . 6 P r o p o s e d e l e c t r o n fl o w i n t h e p r e s e n c e o f s u f fi c i e n t a m o u n t o f s u l f a t e B a s e d u p o n m a s s b a l a n c e e x p e r i m e n t s , a n e l e c t r o n f l o w s c h e m e f o r t h e a n a e r o b i c d e g r a d a t i o n o f t h e m a j o r c o m p o u n d s ( e t h a n o l , a c e t a t e a n d p r o p i o n a t e ) i n t h e b r e w e r y w a s t e w a t e r c a n b e c o n s t r u c t e d ( F i g u r e 4 . 8 ) . T h i s s c h e m e i l l u s t r a t e s t h a t i n t h e p r e s e n c e o f h i g h s u l f a t e c o n c e n t r a t i o n s ( 8 t o 9 m M ) , a p p r o x i m a t e l y 8 7 % o f t h e e n e r g y a s s o c i a t e d w i t h t h e s o l u b l e o r g a n i c m a t t e r i s c h a n n e l e d t o m e t h a n e w i t h t h e r e m a i n d e r u s e d f o r s u l f a t e r e d u c t i o n . T h e p e r c e n t a g e o f o r g a n i c m a t t e r c o n v e r t e d t o m e t h a n e i n t h e U A S B s y s t e m w a s s o m e w h a t h i g h e r ( c a . 9 7 % ) t h a n t h a t c a l c u l a t e d b a s e d u p o n t h e m a s s b a l a n c e e x p e r i m e n t s . P a r t o f t h e e x p l a n a t i o n f o r t h i s i s t h a t t h e s u l f a t e c o n c e n t r a t i o n i n t h e b r e w e r y w a s t e w a t e r w a s c o n s i d e r a b l y l o w e r ( 0 . 6 t o 1 . 3 m M ) t h a n t h a t u s e d i n t h e m a s s b a l a n c e e x p e r i m e n t s . A m a x i m u m o f b e t w e e n 5 a n d 6 p e r c e n t o f t h e C O D i n b r e w e r y w a s t e w a t e r c o u l d b e u s e d f o r s u l f a t e r e d u c t i o n b a s e d o n t h e r e l a t i o n o f C O D a n d s u l f a t e c o n c e n t r a t i o n i n t h e w a s t e w a t e r . M a s s t r a n s f e r l i m i t a t i o n s w i t h i n t h e g r a n u l e s m a y h a v e l i m i t e d s u l f a t e r e d u c t i o n b e l o w t h i s m a x i m u m o f 5 t o 6 p e r c e n t . F i g u r e 4 . 8 1 6 5 M a j o r O r g a n i c M a t t e r i n B r e w e r y W a s t e w a t e r | A c e t a t e I [ P r o p i o n a t e ] I E t h a n o l I 2 . 6 0 1 . 5 0 1 0 . 2 0 1 0 . 2 0 1 . 5 0 I A c e t a t e 0 . 6 8 1 . 5 3 1 4 . 3 0 * 0 . 4 5 1 3 . 7 5 0 - 5 7 - M e t h a n e S u l f i d e 1 7 . 7 5 2 . 7 8 U n i t : m m o l e S u b s t r a t e a n d e l e c t r o n f l o w s c h e m e p r o p o s e d f o r t h e a n a e r o b i c d i g e s t i o n o f m a j o r o r g a n i c m a t t e r i n o n e l i t e r o f b r e w e r y w a s t e w a t e r i n t h e p r e s e n c e s u f fi c i e n t s u l f a t e . T h e r e s p e c t i v e c o n c e n t r a t i o n s o f a c e t a t e , p r o p i o n a t e , a n d e t h a n o l a r e a s s u m e d t o b e 2 . 6 , 1 . 5 , a n d 1 0 . 2 m M , r e s p e c t i v e l y . T h e r a t i o b e t w e e n m e t h a n o g e n e s i s a n d s u l f a t e r e d u c t i o n i s e s t i m a t e d f r o m r e s u l t s i n T a b l e 4 . 5 a n d e q u a t i o n s F - l t o F - l O i n A p p e n d i x F . 1 6 6 4 . 6 S U M M A R Y 1 ) T h e g r a n u l e s f r o m a n i n d u s t r i a l U A S B p l a n t t r e a t i n g b r e w e r y w a s t e w a t e r w h i c h c o n t a i n e d a m o d e r a t e l e v e l o f s u l f a t e ( 0 . 6 t o 1 . 3 m M ) h a d h i g h s p e c i fi c g r a v i t y ( 1 . 0 4 6 ) a n d c o n t a i n e d f e r r o u s s u l fi d e a s t h e m a j o r m i n e r a l p r e c i p i t a t e . A l a r g e n u m b e r o f s m a l l h o l e s o r v e n t s ( 1 0 t o 2 0 p m i n d i a m e t e r ) w a s f o u n d o n t h e s u r f a c e o f g r a n u l e s . T h e s e h o l e s m a y s e r v e a s c o n d u i t s o f g a s p r o d u c e d w i t h i n t h e g r a n u l e s a n d t o d e l i v e r s u b s t r a t e s t o t h e i n t e r i o r o f t h e g r a n u l e s . 2 ) T h e m a x i m u m s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s a t 3 5 ° C i n a b s e n c e o f s u l f a t e w e r e 1 . 2 , 4 5 . 1 , 8 . 0 4 , 4 . 1 4 , 0 . 8 5 , a n d 5 . 7 5 m m o l e / g V S S - d f o r m e t h a n o l , e t h a n o l , a c e t a t e , p r o p i o n a t e , b u t y r a t e , a n d g l u c o s e , r e s p e c t i v e l y . T h e m a x i m u m m e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e s ( m m o l / g V S S - d ) f r o m H z - C O 2 a n d f o r m a t e w e r e e s s e n t i a l l y e q u a l ( 1 3 . 7 a n d 1 3 . 5 f o r i n t a c t g r a n u l e s , a n d 4 2 a n d 3 7 f o r p h y s i c a l l y d i s r u p t e d g r a n u l e s , r e s p e c t i v e l y ) . 3 ) T h e p r e s e n c e o f s u l f a t e ( 8 t o 9 m M ) d i d n o t c h a n g e t h e m a x i m u m c o n v e r s i o n r a t e s o f m a j o r s u b s t r a t e s e x c e p t f o r p r o p i o n a t e c o n v e r s i o n r a t e w h i c h w a s i n c r e a s e d b y 3 0 % . M a s s b a l a n c e c a l c u l a t i o n i n d i c a t e d t h a t s i g n i fi c a n t p a r t s o f e t h a n o l ( 3 0 % ) a n d p r o p i o n a t e ( 6 0 % ) w e r e c o n v e r t e d t h r o u g h s u l f a t e r e d u c t i o n w h i l e o n l y s m a l l p a r t s ( < 5 % ) o f H z - C O Z , f o r m a t e , a n d a c e t a t e w e r e c o n v e r t e d t h r o u g h s u l f a t e r e d u c t i o n . 4 ) A r e v e r s i b l e r e a c t i o n b e t w e e n h y d r o g e n p r o d u c t i o n f r o m f o r m a t e a n d f o r m a t e s y n t h e s i s f r o m H z - C O 2 w a s o b s e r v e d t o o c c u r w i t h t h e s e g r a n u l e s . A d d i t i o n o f s u l f a t e r e d u c e d t h e c o n c e n t r a t i o n o f f o r m a t e p r o d u c e d . T h i s i n d i c a t e s t h a t S R B m a y h a v e b e e n i n v o l v e d i n f o r m a t e s y n t h e s i s . T h i s m a y b e o n e r e a s o n f o r o b s e r v e d a p p r o x i m a t e e q u i v a l e n t m a x i m u m s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s f o r b o t h f o r m a t e a n d H 2 - C O 2 i n t h e g r a n u l e s . 1 6 7 5 ) H y d r o g e n a n d f o r m a t e a c c u m u l a t e d a t a n e q u i l i b r i u m l e v e l d u r i n g s y n t r o p h i c e t h a n o l d e g r a d a t i o n . E n e r g e t i c a n a l y s i s s u g g e s t s b o t h a r e i n t e r m e d i a t e s o f s y n t r o p h i c e t h a n o l d e g r a d a t i o n . 6 ) I n t h e a b s e n c e o f s u l f a t e , a d d i t i o n o f 0 . 1 t o 2 . 0 m M m o l y b d a t e i n h i b i t e d s y n t r o p h i c p r o p i o n a t e c o n v e r s i o n b y 6 7 t o 9 7 % . M o l y b d a t e a t 2 t o 1 0 . 0 m M w a s o b s e r v e d t o i n h i b i t s y n t r o p h i c e t h a n o l c o n v e r s i o n b y 2 9 % . T h i s i n d i c a t e s t h a t t h e s y n t r o p h i c p r o p i o n a t e c o n v e r s i o n w a s p e r f o r m e d p r i m a r i l y b y s u l f a t e r e d u c i n g b a c t e r i a a n d t h e s y n t r o p h i c e t h a n o l c o n v e r s i o n p a r t i a l l y b y S R B . T h i s c o n c l u s i o n w a s s u p p o r t e d b y t e s t s u s i n g e n r i c h m e n t s o f t h e p r e d o m i n a n t s p e c i e s . 7 ) A t l e a s t f o u r t y p e s o f m i c r o c o l o n i e s w e r e o b s e r v e d i n s i d e t h e g r a n u l e s . O n e o f t h e s e m i c r o c o l o n i e s c o n s i s t e d o f M e t h a n o t h r i x - l i k e r o d s , w h i l e t h e r e m a i n i n g t y p e s w e r e m a i n l y c o m p o s e d o f n o n - m e t h a n o g e n i c r o d s t o g e t h e r w i t h M e t h a n o b a c t e r i u m - l i k e r o d s . O n e o f t h e n o n - m e t h a n o g e n i c r o d s t h a t h a d a n i r r e g u l a r m o r p h o t y p e w a s , t e n t a t i v e l y , i d e n t i fi e d a s a D e s u l f o v i b r i o s p . T h e r e m a i n i n g r o d s w e r e o b s e r v e d t o b e p r o p i o n a t e - d e g r a d i n g , s u l f a t e - r e d u c i n g b a c t e r i a . T h e s e S R B c o u l d a l s o c o n v e r t e t h a n o l t o p r o p i o n a t e , a l l o w i n g a p o t e n t i a l l y l a r g e e c o l o g i c a l a d v a n t a g e f o r t h e s e o r g a n i s m s . T h e s e S R B , b a s e d u p o n T E M a n d S E M o b s e r v a t i o n , m a y p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n g r a n u l a r s t r u c t u r e f o r t h e s e g r a n u l e s . h - . 2 1 1 _ . . o 1 . 7 4 i p M a y : . : 9 ! - r t : . 3 1 . . . I . ~ . 3 . ; , f . " L « 6 . 1 . . . . p m . 4 . . H P . ~ . . . . . . . s u n m a n » ; e I/fI/Ll/II/fi/IZI/lllfl/WII/f/I/II/llfll/IIW s u n s r r y w n u " ‘ 7 4 Z ) \ 4 . 2 1 7 7 9 3 1 0 6 n i L i fi fi fl fi ‘ f M i c i ' fi fi z a n S ‘ W a U n i v m s i fi y P L A C E I I R E T U R N B O X t o r e m o v e t h i s c h e c k ” f r o m y o u r r e c o r d . T O A V O D F I N E S r e t u n o n o r b e f o r e d d e d u e . V — — — _ — — — — — — — — — _ _ — _ — _ _ — _ _ — — — _ — _ _ _ — ' — _ T D A T E D U E D A T E D U E D A T E D U E m s u I s A n M i m i - a v . A M q u e l O p p o n u n l t y I m m o n m W M i _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ . — T E C H N O L O G I C A L A N D M I C R O B I O L O G I C A L A S P E C T S O F A N A E R O B I C D I G E S T I O N G R A N U L E S V o l u m e I I B y W e i - M i n W u A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y D e p a r t m e n t o f C i v i l a n d E n v i r o n m e n t a l E n g i n e e r i n g 1 9 9 1 C H A P T E R 5 M I C R O B I A L C O M P O S I T I O N S A N D C H A R A C T E R I Z A T I O N O F P R E V A L E N T S P E C I E S I N V O L A T I L E F A T T Y A C I D F E D G R A N U L E S 5 . 1 I N T R O D U C T I O N K n o w l e d g e o f t h e m i c r o b i a l c o m p o s i t i o n o f g r a n u l e s a n d t h e r o l e o f i n d i v i d u a l s p e c i e s i n m e t a b o l i s m , a d h e s i o n a n d g r a n u l a t i o n i s o f c r i t i c a l i m p o r t a n c e t o u n d e r s t a n d h o w h i g h - r a t e a n a e r o b i c d i g e s t i o n s y s t e m s w o r k . S e v e r a l r e c e n t s t u d i e s h a v e a t t e m p t e d t o i n v e s t i g a t e a n d u n d e r s t a n d t h e m i c r o b i a l p o p u l a t i o n l e v e l s i n g r a n u l e s ( D o l fi n g e t a l . , 1 9 8 5 ; D u b o u r g u i e r e t a l . , 1 9 8 8 a , 1 9 8 8 b , 1 9 8 8 c ) . T h e s e s t u d i e s , h o w e v e r , d i d n o t d e fi n e t h e p r e v a l e n t s p e c i e s c o m p o s i t i o n o r t h e i r n u m b e r . N o v a e s e t a l . ( 1 9 8 8 ) r e p o r t e d o n t h e s p e c i e s c o m p o s i t i o n a n d a n u m b e r o f p r e v a l e n t h y d r o l y t i c - f e r m e n t a t i v e a n d m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a i n a n a e r o b i c g r a n u l e s f r o m a s y s t e m t r e a t i n g s e w a g e s l u d g e . M o r e r e c e n t l y , m e t h a n o g e n i c s u b p o p u l a t i o n s h a v e b e e n i m m u n o l o g i c a l l y i d e n t i fi e d a n d q u a n t i fi e d i n fi v e d i f f e r e n t g r a n u l a r c o n s o r t i a f r o m U S A B r e a c t o r s m a i n t a i n e d o n d i f f e r e n t s u b s t r a t e s ( K o o e n n e e f e t a l . , 1 9 9 0 ) . O t h e r i m p o r t a n t f a t t y a c i d d e g r a d i n g a c e t o g e n s , h o w e v e r , t h a t m a y h a v e b e e n p r e s e n t i n t h e s e g r a n u l e s w e r e n o t i n v e s t i g a t e d . I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e p r e v a l e n t s p e c i e s i n g r a n u l e s i s 1 6 8 1 6 9 e s s e n t i a l t o a i d i n u n d e r s t a n d i n g t h e e c o p h y s i o l o g y a n d i n t e r a c t i o n a m o n g t h e d i f f e r e n t t r o p h i c b a c t e r i a , a s w e l l a s i d e n t i f y i n g t h e c o n t r i b u t i o n o f i n d i v i d u a l o r g a n i s m s i n s u b s t r a t e m e t a b o l i s m a n d t h e g r a n u l a t i o n p r o c e s s . C h a p t e r 3 d e s c r i b e s s t u d i e s o n t w o t y p e s ( R - t y p e a n d F - t y p e ) o f a n a e r o b i c g r a n u l e s d e v e l o p e d o n a V F A f e e d c o n s i s t i n g o f a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e . T h e R - g r a n u l e s e x h i b i t e d b e t t e r o p e r a t i o n a l p e r f o r m a n c e t h a n t h e F - g r a n u l e s . T h e r e s u l t s o f s u b s t r a t e c o n v e r s i o n e x p e r i m e n t s a n d M P N e n u m e r a t i o n s r e v e a l e d t h a t t h e R - g r a n u l e s w e r e m a i n l y c o m p o s e d o f m e t h a n o g e n s , w h i c h u t i l i z e a c e t a t e , H z - C O Z , a n d f o r m a t e , a n d s y n t r o p h i c p r o p i o n a t e - a n d b u t y r a t e - u t i l i z i n g a c e t o g e n s . T h e p u r p o s e o f t h i s c h a p t e r w a s t o i n v e s t i g a t e , i s o l a t e a n d c h a r a c t e r i z e t h e p r e v a l e n t s y n t r o p h i c a c e t o g e n i c a n d m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a i n t h e R - g r a n u l e s a n d e x a m i n e t h e i r r o l e i n g r a n u l a r s t r u c t u r e . 5 . 2 M A T E R I A L S A N D M E T H O D S 5 . 2 . 1 G r a n u l e s a n d m i c r o b i a l s o u r c e s T h e R - g r a n u l e s w e r e m a i n t a i n e d i n u p fl o w a n a e r o b i c r e a c t o r s b y c o n t i n u o u s l y f e e d i n g a V F A m i x t u r e c o n s i s t i n g o f 1 0 0 m M a c e t a t e , 5 0 m M p r o p i o n a t e a n d 5 0 m M b u t y r a t e i n t h e b a s a l m e d i u m ( s e e C h a p t e r 3 ) . M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n M F ( D S M 1 5 3 5 ) w a s o b t a i n e d f r o m t h e D e u t s c h e S a m m l u n g v o n M i k r o o r g a n i s m e n . 5 . 2 . 2 R o l e o f s u l f a t e - r e d u c i n g b a c t e r i a i n f a t t y a c i d d e g r a d a t i o n T h e a s s a y s f o r s u b s t r a t e d e g r a d a t i o n b y t h e g r a n u l e s w e r e p e r f o r m e d u s i n g a m i x t u r e o f a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e i n 1 5 8 m 1 s e r u m b o t t l e s w i t h 5 0 m L o f 1 7 0 b a s a l m e d i u m ( A p p e n d i x A ) a t 3 5 ° C . T h e c o n c e n t r a t i o n o f g r a n u l e s w a s a p p r o x i m a t e l y 5 g S S / L . T h e t e s t p r o c e d u r e s w e r e t h e s a m e a s d e s c r i b e d i n C h a p t e r 4 ( 4 . 2 . 2 a n d 4 . 2 . 4 ) . F e r r o u s s u l f a t e ( S m M ) a n d s o d i u m m o l y b d a t e ( 0 . 5 t o 2 m M ) w e r e a d d e d t o c h e c k i f s u l f a t e - r e d u c i n g b a c t e r i a ( S R B ) p l a y e d a r o l e i n s u b s t r a t e m e t a b o l i s m . M a s s b a l a n c e e x p e r i m e n t s f o r H 2 , f o r m a t e , a c e t a t e , p r o p i o n a t e , a n d b u t y r a t e w e r e p e r f o r m e d t o d e t e r m i n e p e r c e n t a g e o f s u b s t r a t e c o n v e r t e d v i a s u l f a t e r e d u c t i o n . T h e m e t h o d e m p l o y e d w a s t h e s a m e a s d e s c r i b e d i n C h a p t e r 4 ( 4 . 2 . 3 ) . T h e c o n c e n t r a t i o n o f g r a n u l e s w a s a p p r o x i m a t e l y 2 . 0 g V S S / L . T h e c a l c u l a t i o n o f p e r c e n t a g e s o f s u b s t r a t e c o n v e r t e d v i a s u l f a t e r e d u c t i o n i s d e s c r i b e d i n A p p e n d i x F . 5 . 2 . 3 E n u m e r a t i o n o f p r e v a l e n t s p e c i e s T h e e n u m e r a t i o n o f p r e v a l e n t s p e c i e s o f m e t h a n o g e n s a n d s y n t r o p h i c a c e t o g e n s w e r e c a r r i e d o u t b y c o m p a r i n g m i c r o b i a l m o r p h o t y p e s f o u n d i n s e r i a l l y d i l u t e d M P N t u b e s w i t h t h e m o r p h o t y p e s o f i s o l a t e d s t r a i n s f r o m t h e g r a n u l e s . T h e p r o c e d u r e s f o r M P N e n u m e r a t i o n w e r e d e s c r i b e d i n C h a p t e r 3 ( 3 . 2 . 8 ) . 5 . 2 . 4 I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f m e t h a n o g e n s A l l t h e m a n i p u l a t i o n s w e r e p e r f o r m e d u n d e r s t r i c t l y a n a e r o b i c c o n d i t i o n s e i t h e r i n s i d e a n a n a e r o b i c g l o v e b a g ( M / S C o y M a n u f a c t u r i n g C o . , A n n A r b o r , M 1 ) o r b y u s i n g s t e r i l e s y r i n g e s a n d n e e d l e s f o r a l l t r a n s f e r s i n p r e s s u r e t u b e s ( 2 7 m L ) a n d s e r u m b o t t l e s ( 1 5 8 m L ) . T h e i s o l a t i o n o f m e t h a n o g e n s w a s d o n e b y e n r i c h m e n t i n t h e b a s a l m e d i u m ( A p p e n d i x A ) c o n t a i n i n g 1 . 5 a t m ( 1 5 1 k P a ) o f H z - C O 2 ( 8 0 : 2 0 ) g a s m i x t u r e i n h e a d s p a c e p l u s 2 m M s o d i u m a c e t a t e , o r 4 0 m M f o r m a t e p l u s 2 m M a c e t a t e f o r 1 7 1 h y d r o g e n - f o r m a t e u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s , a n d 1 5 m M s o d i u m a c e t a t e f o r a c e t a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s . P e n i c i l l i n - G ( 1 m g / m L ) w a s a d d e d t o t h e h y d r o g e n , o r f o r m a t e e n r i c h m e n t s w h i l e v a n c o m y c i n ( 0 . 2 m g / m L ) w a s u s e d f o r a c e t a t e e n r i c h m e n t s . A p p r o x i m a t e l y 0 . 3 m L o f g r a n u l e s w e r e a n a e r o b i c a l l y r e m o v e d f r o m t h e r e a c t o r , d i s r u p t e d b y p a s s a g e t h r o u g h a s y r i n g e w i t h a 2 3 - g a u g e n e e d l e , a n d t r a n s f e r r e d i n t o 1 5 8 m L a n a e r o b i c b o t t l e s c o n t a i n i n g 5 0 m L o f t h e e n r i c h m e n t m e d i u m T h e s e e n r i c h m e n t s w e r e r e p l e n i s h e d w i t h s u b s t r a t e s a t l e a s t t h r e e t i m e s b e f o r e b e i n g t r a n s f e r r e d i n t o f r e s h e n r i c h m e n t m e d i u m G r o w t h o f m e t h a n o g e n s w a s m o n i t o r e d b y m i c r o s c o p y a n d p r o d u c t i o n o f m e t h a n e . T o o b t a i n c o l o n i e s o f p u r e m e t h a n o g e n i c i s o l a t e s f r o m H z - C O 2 a n d f o r m a t e e n r i c h m e n t s , H z - C O 2 w a s u s e d a s s u b s t r a t e f o r t h e g r o w t h o f c e l l s o n a g a r m e d i u m . A f t e r t h r e e t r a n s f e r s , e n r i c h e d c u l t u r e s w e r e s e r i a l l y d i l u t e d a n d t h e n p l a t e d o n t h e a p p r o p r i a t e e n r i c h m e n t m e d i u m s o l i d i fi e d w i t h 1 . 6 5 % D i f c o p u r i fi e d a g a r . T h e s e p l a t e s w e r e i n c u b a t e d i n s i d e p r e s s u r e p a i n t t a n k s a s d e s c r i b e d b y J a i n a n d Z e i k u s ( 1 9 8 7 ) . A n I - I 2 - C O 2 ( 8 0 : 2 0 ) g a s m i x t u r e w a s p r e s s u r i z e d t o 1 a t m a s s u b s t r a t e . D u r i n g t h e i n c u b a t i o n p e r i o d ( 1 t o 2 m o n t h s ) , p r o d u c t i o n o f m e t h a n e i n t h e p a i n t t a n k s w a s p e r i o d i c a l l y m o n i t o r e d a n d w h e n n e c e s s a r y , t h e p a i n t t a n k s w e r e r e - p r e s s u r i z e d w i t h H z - C O Z . T h e c o l o n i e s w e r e p i c k e d f r o m t h e p l a t e s w i t h s t e r i l e t o o t h p i c k s a n d p l a c e d i n t o 1 0 m L o f l i q u i d m e d i a c o n t a i n e d i n 2 7 m L p r e s s u r e t u b e s . A f t e r t u r b i d g r o w t h w a s o b s e r v e d , t h e c u l t u r e s w e r e p u r i fi e d b y s t r e a k i n g o n a g a r m e d i u m p l a t e s . A s i n g l e c o l o n y w a s t h e n p i c k e d a n d p l a c e d i n t o t h e l i q u i d m e d i u m a n d , a f t e r g r o w t h w a s o b s e r v e d , r e - c h e c k e d o n a g a r p l a t e s f o r p u r i t y . I s o l a t e d c o l o n i e s w e r e a g a i n p i c k e d a s b e f o r e , a n d t h e p u r i t y o f c u l t u r e s w a s c o n fi r m e d b y m i c r o s c 0 p i c e x a m i n a t i o n . 1 7 2 D i s r u p t e d g r e n u l e e E n r i c h i n g P l a t i n g P i c k i n g P l a t i n g P i c k i n g P l a t i n g P i c k i n g c o l o n y c o l o n y c o l o n y 6 ’ 0 7 : ‘ 4 0 * 4 D * 4 C ] . 1 . . . / P u r i t y C h a r a c t e r i z i n g a n d i d e n t i f y i n g l , C e l l u l a r S u b s t r a t e p H A n t i b i o t i c e I m m u n o l o g y D N A G + C M o r p h o l o g y T e m p . P r o t e i n D N A h y b r i d i z a t i o n N u t r i e n t s F i g u r e 5 . 1 P r o c e d u r e s f o r t h e i s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f m e t h a n o g e n s f r o m H z - C O 2 o r f o r m a t e e n r i c h e m e n t s 1 7 3 F o r t h e i s o l a t i o n o f a c e t a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s , d i r e c t t u b e d i l u t i o n s w e r e u s e d . T h i s p r o c e d u r e w a s r e p e a t e d s e v e r a l t i m e s w i t h e n d d i l u t i o n s u n t i l a p u r i fi e d c u l t u r e w a s o b t a i n e d a n d i t w a s v e r i fi e d b y o b s e r v a t i o n t h a t n o o t h e r m o r p h o t y p e c e l l s g r e w o n a c e t a t e , g l u c o s e ( 5 g / L ) o r y e a s t e x t r a c t ( 5 g / L ) - c o n t a i n i n g m e d i u m . M e t h a n o g e n s w e r e i d e n t i fi e d i n a c c o r d a n c e w i t h e s t a b l i s h e d m e t h o d s ( B o o n e a n d W h i t m a n 1 9 8 8 ; J a i n e t 0 1 . , 1 9 8 8 ; J o n e s e t a l . , 1 9 8 7 ) . T h e g e n e r a l t e s t s e m p l o y e d f o r i d e n t i fi c a t i o n i n c l u d e d m o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s , s u b s t r a t e r a n g e , p H a n d t e m p e r a t u r e o p t i m a , s e n s i t i v i t y t o a n t i b i o t i c s a n d / o r a n t i g e n i c a n a l y s i s . T h e p r o c e d u r e s f o r i s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f m e t h a n o g e n s u s i n g H z - C O 2 o r f o r m a t e a n d t h e n H , - C O 2 a r e i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 5 . 1 . 5 . 2 . 5 I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f f a t t y a c i d d e g r a d i n g a c e t o g e n s S y n t r o p h i c b u t y r a t e , i s o b u t y r a t e , a n d p r o p i o n a t e d e g r a d e r s w e r e i n i t i a l l y e n r i c h e d i n 1 5 8 m L s e r u m b o t t l e s c o n t a i n i n g 5 0 m L o f t h e b a s a l m e d i u m b u f f e r e d w i t h 2 0 m M p o t a s s i u m p h o s p h a t e a n d 4 0 m M N a H C O 3 ( p H 7 . 1 t o 7 . 2 ) . S u b s t r a t e s w e r e a d d e d t o o b t a i n 1 5 m M o f p r o p i o n a t e , i s o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e , r e s p e c t i v e l y . T h e b o t t l e s w e r e i n o c u l a t e d w i t h d i s r u p t e d g r a n u l e s a s d e s c r i b e d a b o v e . E n r i c h m e n t s w e r e t r a n s f e r r e d a t l e a s t t h r e e t i m e s ( 2 t o 3 m o n t h s ) w i t h 2 % i n o c u l u m ( v / v ) . T h e g r o w t h o f s y n t r o p h i c a c e t o g e n s w a s m o n i t o r e d b y s u b s t r a t e d i s a p p e a r a n c e a n d m e t h a n e p r o d u c t i o n i n t h e b o t t l e s . S u b s e q u e n t l y , e n r i c h m e n t s w e r e s e r i a l l y d i l u t e d a n d i n o c u l a t e d i n t o b o t t l e s c o n t a i n i n g a p r e - g r o w n H z - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n , M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n T l N o r M e t h a n o s p i r i l l u m h u n g a t e i s t r a i n B D , w h i c h w a s a l s o i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s . T h e c u l t u r e s i n t h e p o s i t i v e e n d - d i l u t i o n t u b e s w e r e u s e d f o r p l a t i n g o n t h e a p p r o p r i a t e a g a r m e d i u m i n a n a n a e r o b i c g l o v e b a g . A n H z - C O z - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n w a s fi r s t p l a t e d a s a n a g a r l a w n a n d t h e s e p l a t e s 1 7 4 w e r e k e p t i n b e t w e e n t h e p l a t e s o n t o w h i c h t h e e n d d i l u t i o n s w e r e p l a t e d . T h e p l a t e s w e r e k e p t i n t h e p a i n t t a n k s w i t h 0 . 8 a t m ( 8 0 . 8 k P a ) o f a n N z - C O 2 ( 9 5 : 5 ) g a s m i x t u r e u n d e r 3 7 ° C f o r 3 t o 6 m o n t h s . P r i o r t o i n c u b a t i o n , t h e p a i n t t a n k s w e r e f l u s h e d a n d e v a c u a t e d w i t h t h e N z - C O 2 m i x t u r e a t l e a s t 5 t i m e s , i n o r d e r t o r e m o v e m a x i m u m p o s s i b l e H 2 c o m i n g f r o m t h e g l o v e b a g . T h e g r o w t h o f s y n t r o p h i c V F A d e g r a d e r s w a s m o n i t o r e d b y m e t h a n e p r o d u c t i o n i n t h e p a i n t t a n k s . T h e i s o l a t e d c o l o n i e s o f a c e t o g e n s w e r e p i c k e d , w i t h M b . f o r m i c i c u m o r M s p . h u n g a t e i a n d p l a c e d i n t o t u b e s c o n t a i n i n g t h e a p p r o p r i a t e f a t t y a c i d . A p r o p i o n a t e d e g r a d i n g , s u l f a t e r e d u c i n g s t r a i n P W w a s i n i t i a l l y i s o l a t e d a s a s y n t r o p h i c c o c u l t u r e t o g e t h e r w i t h M s p . h u n g a t e i s t r a i n B D . T h e f u r t h e r p u r i fi c a t i o n w a s p e r f o r m e d u s i n g s e r i a l d i l u t i o n ( u p t o 1 0 ° ) a n d t h e n s t r e a k i n g o n a g a r m e d i u m p l a t e s u n t i l p u r e c o l o n i e s w e r e i s o l a t e d . T h e m e d i u m ( c o n t a i n i n g 2 0 m M N a S O 4 a n d 2 0 m M s o d i u m p r o p i o n a t e ) u s e d f o r p u r i fi c a t i o n a n d m a i n t e n a n c e o f s t r a i n P W i s d e s c r i b e d i n A p p e n d i x A . P u r i t y o f t h e s y n t r o p h i c a c e t o g e n s w a s c h e c k e d a f t e r g r o w t h i n l i q u i d m e d i u m b y m i c r o s c o p y a n d b y s t r e a k i n g o n a p l a t e o f t h e a p p r o p r i a t e m e d i u m a n d o b s e r v i n g c o l o n y h o m o g e n e i t y . T h e g e n e r a l p r o c e d u r e s f o r i s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f s y n t r o p h i c a c e t o g e n s a r e i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 5 . 2 . 1 7 5 D i a r u p t e d E n r i c h i n g ' P l a t i n g P i c k i n g P l a t i n g P i c k i n g P l a t i n g P i c k i n g c o l o n y c o l o n y c o l o n y i n a a i n g m ; 6 x ; i n M Y . . . / W W I C h a r a c t e r i z i n g a n d i d e n t i f y i n g I i l C e l l r l a r s w a t r a t e p H s m a t e r e d u c t i o n M o r p h o l o g y T e m p . N u t r i e n t s P r o c e d u r e s f o r t h e i s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f s y n t r o p h i c V F A - F i g u r e 5 . 2 d e g r a d i n g b a c t e r i a 1 7 6 5 . 2 . 6 I m m u n o l o g i c a l a s s a y s T h e a n t i g e n i c fi n g e r p r i n t s o f m e t h a n o g e n s t r a i n s T l N , T 1 8 a n d M 7 w e r e d e t e r m i n e d w i t h a p a n e l o f c a l i b r a t e d a n t i b o d y p r o b e s u s i n g a b a t t e r y o f c o m p l e m e n t a r y p r o c e d u r e s t h a t i n c l u d e d i n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e a n d q u a n t i t a t i v e s l i d e i m m u n o e n z y m a t i c a s s a y ( S I A ) , a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y b y M a c a r i o a n d d e M a c a r i o ( 1 9 8 3 ) . A n t i g e n i c r e l a t e d n e s s w a s m e a s u r e d b y c o m p a r i n g t h e s t r a i n s ’ fi n g e r p r i n t s w i t h t h o s e o f r e f e r e n c e o r g a n i s m s ( M a c a r i o a n d d e M a c a r i o , 1 9 8 5 , 1 9 8 8 ) . 5 . 2 . 7 S e n s i t i v i t y t o a n t i b i o t i c s S e n s i t i v i t y o f i s o l a t e d m e t h a n o g e n s t o v a r i o u s a n t i b i o t i c s w e r e a s s a y e d i n t r i p l i c a t e i n 2 7 m L p r e s s u r e t u b e s c o n t a i n i n g 1 0 m L o f t h e b a s a l m e d i u m . A g a s m i x t u r e o f H z - C O 2 ( 8 0 : 2 0 , 2 . 0 a t m ) w a s u s e d a s s u b s t r a t e f o r s t r a i n s T l N , R F , B D a n d T 1 8 . A c e t a t e w a s u s e d f o r t h e g r o w t h o f s t r a i n M 7 . A q u e o u s s o l u t i o n s o f a n t i b i o t i c s w e r e fi l t e r - s t e r i l i z e d f o r s o l u b l e a n t i b i o t i c s . I n s o l u b l e a n t i b i o t i c s w e r e d i s s o l v e d i n a 3 0 % m e t h a n o l a q u e o u s s o l u t i o n i n 5 8 m L s e r u m b o t t l e s . T h e b o t t l e s w e r e t h e n s e a l e d w i t h b u t y l r u b b e r s t o p p e r s a n d f l u s h e d w i t h N 2 f o r 3 0 m i n . T h e a n t i b i o t i c s w e r e a d d e d a t a 1 . 0 m g / m L c o n c e n t r a t i o n f o r a l l c u l t u r e s e x c e p t f o r s t r a i n M 7 ( 0 . 1 m g / m L ) . C o n t r o l s w i t h a n d w i t h o u t m e t h a n o l i n t h e a b s e n c e o f a n t i b i o t i c s w e r e k e p t t o e x a m i n e t h e e f f e c t o f m e t h a n o l o n g r o w t h e x c e p t f o r s t r a i n T 1 8 . T h e m e t h a n o l c o n c e n t r a t i o n u s e d h e r e d i d n o t a f f e c t c e l l g r o w t h o r m e t h a n e p r o d u c t i o n . 5 . 2 . 8 M e d i u m , m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n s a n d a n a l y t i c a l m e t h o d s T h e m e d i u m c o m p o s i t i o n f o r t h e i s o l a t i o n a n d m a i n t e n a n c e o f m e t h a n o g e n s a n d V F A - d e g r a d i n g a c e t o g e n s i s d e s c r i b e d i n A p p e n d i x A . T e c h n i q u e s o f m i c r o s c o p i c , s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p i c ( S E M ) , a n d t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p i c ( T E M ) 1 7 7 e x a m i n a t i o n a r e d e s c r i b e d i n A p p e n d i x D . T o t a l c e l l u l a r p r o t e i n s o f M b . f o r m i c i c u m s t r a i n M F a n d i s o l a t e d m e t h a n o g e n s s t r a i n s T I N a n d R F w e r e a n a l y z e d a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d b y J a i n e t a l . ( 1 9 8 7 ) . C e l l s f o r t h e a n a l y s i s w e r e g r o w n o n H z - C O Z . V F A s , H 2 a n d m e t h a n e w e r e d e t e c t e d b y u s i n g g a s c h r o m a t o g r a p h y ( A p p e n d i x A ) . T h e h a l f v e l o c i t y c o e f fi c i e n t ( K m ) f o r a c e t a t e u t i l i z a t i o n b y s t r a i n M 7 , i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s , w a s d e t e r m i n e d u s i n g t i m e - c o u r s e e x p e r i m e n t ( s e e A p p e n d i x C ) . 5 . 3 S U L F A T E R E D U C I N G B A C T E R I A I N T H E R - G R A N U L E S I n C h a p t e r 3 , t h e m a j o r t r o p h i c g r o u p s i n t h e R - g r a n u l e s w e r e c h a r a c t e r i z e d b a s e d o n t h e M P N e n u m e r a t i o n a n d t h e m a x i m u m s p e c i fi c s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s . A c e t a t e - u t i l i z i n g , H z - C O 2 a n d f o r m a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s w e r e t h e p r e d o m i n a n t b a c t e r i a . P r o p i o n a t e - a n d b u t y r a t e - d e g r a d i n g b a c t e r i a w e r e a l s o p r e v a l e n t , T o f u r t h e r e x a m i n e t h e r o l e o f s u l f a t e r e d u c i n g b a c t e r i a ( S R B ) i n t h e m e t a b o l i s m o f a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e , t h e m a x i m u m s u b s t r a t e d e g r a d a t i o n r a t e s f o r a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e w e r e d e t e r m i n e d f r o m b a t c h e x p e r i m e n t s ( 3 5 ° C ) i n t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f s u l f a t e ( 5 m M ) o r m o l y b d a t e ( 0 . 5 t o 2 . 0 m M ) ( T a b l e 5 . 1 ) . A d d i t i o n o f s u l f a t e o r m o l y b d a t e d i d n o t s i g n i fi c a n t l y i n fl u e n c e t h e d e g r a d a t i o n r a t e s o f a c e t a t e a n d b u t y r a t e , i n d i c a t i n g t h a t S R B m a y n o t b e i n v o l v e d i n t h e m e t a b o l i s m o f t h e s e t w o f a t t y a c i d s . A d d i t i o n o f s u l f a t e s l i g h t l y i n c r e a s e d t h e m a x i m u m s p e c i fi c p r o p i o n a t e d e g r a d a t i o n r a t e ( b y c a . 1 0 % ) w h i l e a d d i t i o n o f m o l y b d a t e r e d u c e d t h e r a t e b y c a . 2 2 % , i n d i c a t i n g t h a t S R B m a y h a v e b e e n p a r t i a l l y i n v o l v e d i n t h e m e t a b o l i s m o f p r o p i o n a t e . T h e r e s u l t s o f m a s s b a l a n c e e x p e r i m e n t s ( T a b l e 5 . 2 ) s h o w e d t h a t S R B d i d n o t 1 7 8 p l a y a v i s i b l e r o l e i n c o n v e r s i o n o f H 2 , f o r m a t e a n d a c e t a t e b y t h e R - g r a n u l e s w h e n s u l f a t e w a s a d d e d t o 9 . 0 m M . T h e p o r t i o n o f b u t y r a t e d e g r a d e d v i a s u l f a t e r e d u c t i o n w a s l o w ( c a . 5 . 8 % ) w h i l e a s i g n i fi c a n t f r a c t i o n o f p r o p i o n a t e ( c a . 1 2 % ) w a s d e g r a d e d v i a s u l f a t e r e d u c t i o n . T o f u r t h e r i n v e s t i g a t e t h e m i c r o b i a l e c o l o g y o f t h e R - g r a n u l e s , i s o l a t i o n o f p r e v a l e n t m e t h a n o g e n s w a s p e r f o r m e d u s i n g a c e t a t e , H z - C O 2 a n d f o r m a t e a s s u b s t r a t e . P r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e w e r e u s e d a s s u b s t r a t e s t o e n r i c h s y n t r o p h i c V F A d e g r a d i n g o r g a n i s m s . T h e i s o l a t e d s y n t r o p h i c V F A d e g r a d e r s w e r e e x a m i n e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e y w e r e s u l f a t e - r e d u c i n g b a c t e r i a . T a b l e 5 . 1 E f f e c t o f s u l f a t e a n d m o l y b d a t e o n t h e m a x i m u m s p e c i fi c f a t t y a c i d d e g r a d a t i o n r a t e s ( m m o l e / g V S S - h r ) b y t h e R - g r a n u l e s S p e c i fi c V F A d e g a d a t i o n r a t e T r e a t m e n t a c e t a t e p r o p i o n a t e b u t y r a t e C o n t r o l 6 . 1 1 . 5 9 3 . 7 0 F e S O 4 ( 5 m M ) 6 . 1 1 . 7 5 3 . 7 0 N a Z M o O 4 ( 0 . 5 m M ) 6 . 0 1 . 3 6 3 . 7 0 N a z M o O 4 ( 1 . 0 m M ) 5 . 7 1 . 3 3 3 . 5 0 N a 2 M 0 0 4 ( 2 . 0 m M ) 5 . 7 1 . 2 3 3 . 5 8 ) e t a f l u s + , % ( ’ ) 4 l O o S m - m ' z Z l 4 o O m S m + ( ' 4 ) O l S o + m m ( 4 O S - ) ' l o 4 m 0 m 8 ( + ‘ . 0 ) 8 l + o m ' m ( 4 O S - T a b l e 5 . 2 M a s s b a l a n c e f o r s u b s t r a t e c o n v e r s i o n i n t h e p r e s e n c e a n d t h e a b s e n c e o f s u l f a t e b y t h e R - g r a n u l e s S u b s t r a t e 8 0 4 2 ‘ C H 4 C H 4 f o r m e d S u b s t r a t e c o n v e r t e d S u b s t r a t e c o n s u m e d c o n s u m e d f o r m e d v i a s u l f a t e r e d u c t i o n 1 . H 2 2 . 3 0 2 . 3 0 0 . 0 0 2 6 0 . 5 6 3 0 . 5 6 1 0 . 9 9 6 0 . 4 2 . f o r m a t e 4 . 5 0 4 . 5 0 0 . 0 0 1 6 0 . 8 8 1 0 . 8 8 0 0 . 9 9 9 0 . 1 3 . a c e t a t e 0 . 9 0 0 . 9 0 0 . 0 0 3 0 0 . 8 2 2 0 . 8 2 0 0 . 9 9 7 0 . 3 4 . p r o p i o n a t e 0 . 6 2 0 . 6 2 0 . 0 5 5 8 1 . 0 5 0 . 9 9 4 0 . 9 4 7 1 2 . 0 5 . b u t y r a t e 0 . 5 8 0 . 5 8 0 . 0 1 4 7 1 . 4 0 1 . 3 8 0 . 9 8 6 5 . 8 1 7 9 1 8 0 5 . 4 I S O L A T I O N A N D C H A R A C T E R I Z A T I O N O F M E T H A N O G E N S F i v e p r e v a l e n t s t r a i n s o f m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a w e r e i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s ( F i g u r e s 5 . 3 a n d 5 . 4 ) . A m o n g t h e m , t h r e e s t r a i n s ( s t r a i n s T l N , R F a n d B D ) w e r e H Q - C O 2 a n d f o r m a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s ; s t r a i n T 1 8 w a s m i x e d f u n c t i o n m e t h a n o g e n ( u s i n g a c e t a t e , H z - C O 2 a n d m e t h a n o l ) , a n d s t r a i n M 7 w a s a n a c e t a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n . T h e i r g e n e r a l p r o p e r t i e s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 5 . 3 . T h e e f f e c t s o f p H a n d t e m p e r a t u r e o n g r o w t h a r e i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 5 . 5 . . , 4 . 0 1 8 1 F i g u r e 5 . 3 P h a s e - c o n t r a s t m i c r o p h o t o g r a p h s o f t h e p r e v a l e n t m e t h a n o g e n s i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s . ( A ) A g g r e g a t e o f M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n T l N . ( B ) S m a l l c l u m p s f o r m e d b y M e t h a n o b a c t e r i u m f o n n i c i c u m s t r a i n R F . ( C ) M e t h a n o s p i r i l l u m h u n g a t e i s t r a i n B D . ( D ) D i s a g g r e g a t e d M e t h a n o s a r c i n a m a z e i s t r a i n T 1 8 . ( E ) S i n g l e c e l l s a n d r o s e t t e c l u m p s o f M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 . B a r r e p r e s e n t s 1 0 u m . 1 8 2 F i g u r e 5 . 4 T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n p h o t o g r a p h s o f m e t h a n o g e n s i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s . ( A ) M e t h a n o b a c t e r i u m f o m u ' c i c u m s t r a i n T l N . ( B ) M e t h a n o b a c t e r i u m f o n n i c i c u m s t r a i n R F . ( C ) M e t h a n o s p i r i l l w n h u n g a t e i s t r a i n B D . ( D ) M e t h a n o s a r c i n a m a z e i s t r a i n T 1 8 . ( E ) M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 . 1 8 3 T a b l e 5 . 3 G e n e r a l p r o p e r t i e s o f p r e v a l e n t m e t h a n o g e n s i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s M e t h a n o g e n i c S t r a i n P r o p e r t i e s T l N R F B D T 1 8 M 7 C e l l u l a r c e l l s h a p e r o d r o d s p i r i l l u m s a r c i n a r o d c e l l w a l l , g r a m + + - + - M o t i l i t y ‘ - - + - - g r o w t h ” o p t i m u m t e m p . ( ° C ) 3 7 - 4 0 3 8 - 4 0 4 5 3 5 - 3 7 4 0 n o g r o w t h a t ( ° C ) > 4 5 4 5 > 5 0 > 4 5 > 4 5 o p t i m u m p H 6 . 5 - 7 . 0 6 . 7 - 7 . 4 7 . 0 - 7 . 5 6 . 0 - 6 . 5 7 . 0 p H r a n g e 5 . 3 - 8 . 5 5 . 9 - 8 . 2 6 . 0 - 8 . 2 5 . 5 - 8 . 5 5 . 6 - 8 . 5 d o u b l i n g t i m e ( h r ) 6 - 8 6 - 8 6 - 7 1 0 - 1 2 3 0 - 3 6 c o l o n y c o l o r y e l l o w y e l l o w b r o w n y e l l o w - b r o w n N F c o l o n y s i z e ( m m ) 1 - 2 1 - 2 2 - 3 3 - 5 N F S u b s t r a t e c H . _ , - C O 2 + + + + - f o r m a t e + + + - - a c e t a t e - - - + + m e t h a n o l - - - + - m o n o m e t h y l a m i n e - - - + - d i m e t h y l a m i n e - - - + - t r i m e t h y l a m i n e - - - + - a : + , m o t i l e ; - , n o t m o t i l e . b : G r o w t h p a r a m e t e r s w e r e d e t e r m i n e d b y u s i n g H z - C O 2 a s s u b s t r a t e e x c e p t b y u s i n g a c e t a t e f o r s t r a i n M 7 . p H e f f e c t a n d d o u b l i n g t i m e w e r e d e t e r m i n e d a t 3 7 ° C . N F : N o c o l o n y f o r m e d a n d i s o l a t e d b y s e r i a l d i l u t i o n . c : 4 » , g r o w t h ; - , n o g r o w t h . N o n e o f t h e s t r a i n s u s e d e t h a n o l , 2 - p r o p a n o l , 2 - b u t a n o l , a n d g l u c o s e a s g r o w t h s u b s t r a t e s . E T A R H T W O R G C I F I C E P S E V I T A L E R F i g u r e 5 . 5 1 8 4 0 . 8 r 0 . 6 ‘ 0 . 4 ' 0 . 4 r 0 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 2 b a b 4 2 ) 5 0 6 0 T E M P E R A T U R E ( ’ 0 ) E l m : A R E o e o * T 1 8 I M ' I E f f e c t s o f p H a n d t e m p e r a t u r e o n t h e g r o w t h o f m e t h a n o g e n s i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s . M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m t r a i n s T I N a n d R F , M e t h a n o s p i r i l l u m h u n g a t e i B D , a n d M e t h a n o s a r c i n a m a z e i T 1 8 w e r e g r o w n o n H , - C o , . M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 w a s g r o w n o n a c e t a t e . 1 8 5 5 . 4 . 1 M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n T I N S t r a i n T l N , i s o l a t e d f r o m a H Z - C O 2 e n r i c h m e n t , d i s p l a y e d a r o d m o r p h o t y p e . T h i s s t r a i n g r e w o n a g a r m e d i u m a s y e l l o w i s h , r o u n d c o l o n i e s w i t h 1 t o 1 . 5 m m i n d i a m e t e r . I t s c e l l s w e r e s l e n d e r , c y l i n d r i c a l , a n d i r r e g u l a r l y c r o o k e d , w i t h b l u n t , r o u n d e d e n d s a n d g r a m - p o s i t i v e - l i k e c e l l w a l l s ( F i g u r e 5 . 4 A ) . T h e a v e r a g e c e l l l e n g t h a n d w i d t h w a s 1 . 2 t o 3 b y 0 . 3 5 p m w h e n g r o w n a t 3 7 ° C . S t r a i n T l N w a s v e r y a d h e s i v e a n d f o r m e d l a r g e a g g r e g a t e s ( u p t o 2 t o 3 m m ) d u r i n g g r o w t h o n H z - C O 2 o r f o r m a t e ( F i g u r e 5 . 3 A ) a t t e m p e r a t u r e s o f 3 7 ° C o r l o w e r . C e l l s o f s t r a i n T l N g r e w v e r y s l o w l y a t 4 5 ° C a n d f o r m e d l o n g fi l a m e n t s ( 5 0 t o 1 0 0 u m ) w h i c h f o r m e d t h i n a n d l o o s e f l o c s . W h e n t h e t e m p e r a t u r e w a s d e c r e a s e d b a c k t o 3 7 ° C o r l o w e r , t h e c e l l s r e t u r n e d t o t h e i r o r i g i n a l m o r p h o t y p e a n d a g a i n f o r m e d l a r g e d e n s e a g g r e g a t e s . T h e o p t i m u m t e m p e r a t u r e a n d o p t i m u m p H r a n g e f o r g r o w t h w e r e 3 7 t o 4 0 ° C a n d p H 6 . 5 t o 7 . 5 , r e s p e c t i v e l y ( F i g u r e 5 . 5 ) . Q u a n t i t a t i v e c o m p a r i s o n o f t h e a n t i g e n i c fi n g e r p r i n t s o f s t r a i n T l N w i t h c h a r a c t e r i z e d m e t h a n o g e n s t r a i n s i n d i c a t e d t h a t i t w a s n o t a n t i g e n i c a l l y r e l a t e d t o r e f e r e n c e d s t r a i n s ( T a b l e 5 . 4 ) . H o w e v e r , t h e e f f e c t o f a n t i b i o t i c s o n g r o w t h ( T a b l e 5 . 5 ) a n d t o t a l c e l l u l a r p r o t e i n p a t t e r n s ( F i g u r e 5 . 6 ) o f s t r a i n T l N w e r e t h e s a m e a s t h o s e o f M b . f o r m i c i c u m s t r a i n M F ( n e o t y p e s t r a i n ) . F u r t h e r i d e n t i fi c a t i o n c o m p a r i n g t h e r a t i o o f g u a n i n e p l u s c y t o s i n e a n d D N A - D N A h y b r i z a t i o n w i t h s t r a i n M F ( r e l a t e d n e s s > 8 8 % ) s h o w e d t h a t t h e s e t w o s t r a i n s w e r e g e n e t i c a l l y r e l a t e d ( T a b l e 5 . 6 ) . S t r a i n T l N w a s i d e n t i fi e d a s a m e m b e r o f M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m , b a s e d o n i t s s i m i l a r c e l l u l a r a n d p h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s t o t h e n e o t y p e s t r a i n ( B r y a n t a n d B o o n e 1 9 8 7 ; B o o n e a n d W h i t m a n , 1 9 8 8 ) , a l t h o u g h s t r a i n T l N s h o w e d a n t i g e n i c a l l y n o - r e l a t e d n e s s t o t h e n e o t y p e s t r a i n . 1 8 6 T a b l e 5 . 4 A n t i g e n i c fi n g e r p r i n t o f m e t h a n o g e n i s o l a t e s S t r a i n R e a c t i o n w i t h S p r o b e f r o m a n t i s e r u m N o . * 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 0 T I N 0 0 0 0 0 0 T 1 8 0 2 0 4 2 4 M 7 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 ( 1 ) T h e d e t e r m i n a t i o n w a s p e r f o r m e d b y D r . E . C o n w a y d e M a c a r i o . ( 2 ) T h e i m m u n i z i n g s t r a i n f o r t h e a n t i s e r a a s f o l l o w s : 1 M e t h a n o b r e v i b a c t e r s m i t h i i P S ; 2 M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m M F ; 3 M e t h a n o s a r c i n a b a r k e r i M S ; 4 M e t h a n o b a c t e r i u m b r y a n t i i M o H ; 5 M e t h a n o b a c t e r i u m b r y a n t i i M o H G ; 6 M e t h a n o s a r c i n a b a r k e r i R 1 M 3 ; 7 M e t h a n o b r e v i b a c t e r r u m i n a n t i u m M 1 ; 8 M e t h a n o b r e v i b a c t e r a r b o r i p h i l u s D H I ; 9 M e t h a n o b r e v i b a c t e r s m i t h i i A L I ; 1 0 M e t h a n o b a c t e r i u m t h e r m o a u t o t r o p h i c u m G C I ; 1 1 M e t h a n o b a c t e r i u m t h e r m o a u t o t r o p h i c u m G ; 1 2 M e t h a n o s a r c i n a b a r k e r i 2 2 7 ; 1 3 M e t h a n o s a r c i n a m a z e i S 6 ; 1 4 M e t h a n o s a r c i n a b a r k e r i W ; 1 5 M e t h a n o s a r c i n a t h e r m o p h i l a T M l ; 1 6 M e t h a n o b r e v i b a c t e r a r b o r i p h i l u s A Z ; 1 7 M e t h a n o b r e v i b a c t e r a r b o r i p h i l u s D C ; 1 8 M e t h a n o t h e r m u s f e r v i d u s V 2 4 S ; 1 9 M e t h a n o t h r i x s o e h n g e n i i O p f i k o n ; 2 0 M e t h a n o t h r i x C A L S - l . B l a n k s m e a n n o t d o n e . 1 8 7 T a b l e 5 . 5 C o m p a r i s o n o f s e n s i t i v i t y t o v a r i o u s a n t i b i o t i c s ( 1 m g / m L ) a m o n g m e t h a n o g e n s t r a i n s T I N a n d R F a n d M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n M F s t r a i n T I N R F M F C y c l o s e r i n e - - V a n c o m y c i n - - - P e n i c i l l i n - G - - - B a c i t r a c i n + + + R i f a m p i c i n - - - C h l o r a m p h e n i c o l + + + T e t r a c y c l i n e + - + * E r y t h r o m y c i n - - - K a n a m y c i n - - - G r a m i c i d i n S + + G r a m i c i d i n D - - - M o n e n s i n - N D - * N e o m y c i n + N D N R N o v o b i o c i n + N D N R S t r e p t o m y c i n - - - * A m p i c i l l i n - - - * ( 1 ) D a t a f o r M b . f o r m i c i c u m s t r a i n M F f r o m H i l p e r t e t a l . ( 1 9 8 1 ) i n e x c e p t i o n o f " * " w h i c h w a s o b t a i n e d i n t h i s s t u d y . ( 2 ) N D : N o t d e t e r m i n e d ; N R : N o t r e p o r t e d . ( 3 ) + : S e n s i t i v e ; - : n o t s e n s i t i v e . 1 8 8 T a b l e 5 . 6 G u a n i n e - p l u s - c y t o s i n e c o n t e n t s a n d D N A — D N A h y b r i d i z a t i o n b e t w e e n s t r a i n T I N a n d M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n M F s t r a i n T I N M F G + C , % 4 5 . 8 4 4 . 6 % s i m i l a r i t y w i t h D N A o f T l N 1 0 0 8 8 D N A o f M P 9 6 1 0 0 F i g u r e 5 . 6 k d - - . _ _ _ 9 7 . 4 — - — — 6 6 . 2 “ r ‘ ‘ " " - - ~ 4 2 . 6 " " w H 3 1 . 0 2 1 . 5 S o d i u m d o d e c y l s u l f a t e p o l y a c r y l a m i d e ( S D S ) - g e 1 e l e c t r o p h o r e s i s o f t o t a l c e l l u l a r p r o t e i n s o f s t r a i n s T l N , R F a n d M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n M F . L a n e s S s h o w s t h e s t a n d a r d p r o t e i n w i t h m o l e c u l a r w e i g h t m a r k e r s , w h i l e l a n e s T , R a n d M r e p r e s e n t s t r a i n s T l N , R F a n d M F , r e s p e c t i v e l y . 1 8 9 5 . 4 . 2 M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n R F S t r a i n R F , i s o l a t e d f r o m a f o r m a t e e n r i c h m e n t , d i s p l a y e d a r o d - m o r p h o t y p e . I t u t i l i z e d H z - C O 2 a n d f o r m a t e a s e n e r g y s o u r c e s . I t f o r m e d l o n g fi l a m e n t s d u r i n g g r o w t h t h a t a s s o c i a t e d i n t o s m a l l , l o o s e c l u m p s i n l i q u i d m e d i u m ( F i g u r e 5 . 3 B ) . C e l l s o f s t r a i n R F w e r e 3 t o 1 5 p m i n l e n g t h a n d 0 . 4 p m i n d i a m e t e r a n d h a d a g r a m - p o s i t i v e - l i k e c e l l w a l l ( F i g u r e 5 . 4 B ) . T h e o p t i m u m p H a n d t e m p e r a t u r e r a n g e f o r g r o w t h w e r e 7 . 0 t o 7 . 5 a n d 3 7 t o 4 0 ° C , r e s p e c t i v e l y ( F i g u r e 5 . 5 ) . T h e e f f e c t s o f v a r i o u s a n t i b i o t i c s o n g r o w t h w a s e s s e n t i a l l y t h e s a m e a s f o r M b . f o r m i c i c u m s t r a i n M F ( a n d s t r a i n T I N ) e x c e p t t h a t s t r a i n R F w a s n o t i n h i b i t e d b y t e t r a c y c l i n e ( T a b l e 5 . 4 ) . T h e e l e c t r o p h o r e t i c p r o t e i n p a t t e r n s o f M b . f o r m i c i c u m s t r a i n M F ( n e o t y p e s t r a i n ) a n d R F w e r e i d e n t i c a l ( F i g u r e 5 . 6 ) . T h e r e f o r e , s t r a i n R F w a s i d e n t i fi e d a s a m e m b e r o f M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m , b a s e d o n s i m i l a r c e l l u l a r a n d p h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s t o t h e n e o t y p e s t r a i n ( B r y a n t a n d B o o n e 1 9 8 7 ; B o o n e a n d W h i t m a n , 1 9 8 8 ) . T h e m a j o r d i f f e r e n c e a m o n g s t r a i n s T I N , R F a n d M F w a s o b s e r v e d i n t h e c h a r a c t e r o f a g g r e g a t e f o r m a t i o n . C e l l s o f s t r a i n T I N c a n f o r m a g g r e g a t e s a f t e r d i s a g g r e g a t i o n b y w a s h i n g w i t h d i s t i l l e d w a t e r a n d d i s r u p t i o n o n s o n i c a t i o n w h i l e t h e c e l l s o f s t r a i n s R F a n d M F c a n n o t ( C h a p t e r 7 ) . 5 . 4 . 3 M e t h a n o s p i r i l l u m h u n g a t e i s t r a i n B D S t r a i n B D w h i c h d i s p l a y e d a s p i r i l l u m m o r p h o t y p e , w a s i s o l a t e d f r o m a f o r m a t e e n r i c h m e n t . S t r a i n B D g r e w a s a s h o r t s p i r i l l u m a t t h e b e g i n n i n g o f t h e l o g a r i t h m i c p h a s e b u t l a t e r f o r m e d l o n g t h i n s p i r a l fi l a m e n t s t y p i c a l o f M e t h a n o s p i r i l l u m ( F i g u r e 5 . 3 C ) . T h e c e l l s o f s t r a i n B D w e r e 0 . 4 b y 4 t o 1 5 p m i n s i z e a n d h a d g r a m - n e g a t i v e c e l l w a l l ( F i g u r e 5 . 4 C ) . I I + I + I 1 9 0 T a b l e 5 . 7 C o m p a r i s o n o f s e n s i t i v i t y t o v a r i o u s a n t i b i o t i c s ( 1 m g / m L ) b e t w e e n m e t h a n o g e n s t r a i n B D a n d M e t h a n o s p i r i l l u m h u n g a t e i s t r a i n J F l s t r a i n B D J F l C y c l o s e r i n e - - V a n c o m y c i n - - P e n i c i l l i n - G - - B a c i t r a c i n N D - R i f a m p i c i n - - C h l o r a m p h e n i c o l + T e t r a c y c l i n e - - E r y t h r o m y c i n N D K a n a m y c i n - G r a m i c i d i n S + G r a m i c i d i n D - M o n e n s i n N D S t r e p t o m y c i n - A m p i c i l l i n - ( 1 ) D a t a f o r M s p . h u n g a t e i s t r a i n I F 1 f r o m H i l p e r t e t a l . ( 1 9 8 1 ) . ( 2 ) + : S e n s i t i v e ; - : n o t s e n s i t i v e . ( 3 ) N D : N o t d e t e r m i n e d . S t r a i n B D u t i l i z e d H z - C O 2 a n d f o r m a t e , b u t d i d n o t u t i l i z e 2 - p r o p a n o l a n d 2 - b u t a n o l . S t r a i n B D g r e w p o o r l y a t 5 0 ° C a n d f o r m e d l o n g fi l a m e n t s u p t o 2 0 0 t o 3 0 0 p m . T h e o p t i m u m t e m p e r a t u r e f o r g r o w t h w a s 4 5 ° C a n d t h e o p t i m u m p H r a n g e w a s 6 . 8 a n d 7 . 5 T h e e f f e c t o f t h e a n t i b i o t i c s o n t h e g r o w t h o f s t r a i n B D w a s t h e s a m e a s t h a t r e p o r t e d f o r M s p . h u n g a t e i J F l ( H i p e r t e t a l . , 1 9 8 1 ) a s s h o w n i n T a b l e 5 . 7 . S t r a i n B D h a s b e e n i d e n t i fi e d a s M e t h a n o s p i r i l l u m h u n g a t e i o n t h e b a s i s o f i d e n t i c a l m o r p h o l o g i c a l a n d p h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r s w i t h M e t h a n o s p i r i l l u m h u n g a t e i ( B o o n e a n d W h i t m a n 1 9 8 8 ; 1 9 1 J a i n e t a l . , 1 9 8 8 ; P a t e l e t a l . , 1 9 7 6 ; Z e l l n e r a n d W i n t e r 1 9 8 7 ) . T h i s s t r a i n i s d i f f e r e n t f r o m M e t h a n o s p i r i l l u m s t r a i n s w h i c h u t i l i z e 2 - p r o p a n o l a n d 2 - b u t a n o l ( W i d d e l , 1 9 8 6 ) . 5 . 4 . 4 M e t h a n o s a r c i n a m a z e i s t r a i n T 1 8 S t r a i n T 1 8 w a s i s o l a t e d f r o m a H z - C O 2 e n r i c h m e n t b u t i t c o u l d a l s o g r o w o n a c e t a t e , m e t h a n o l a n d m e t h y l a m i n e s . I t f o r m e d s p h e r i c a l p a c k e t s d u r i n g e a r l y g r o w t h i n l i q u i d m e d i u m b u t i t d i s a g g r e g a t e d i n t o s i n g l e c e l l s d u r i n g l a t e g r o w t h , s h o w i n g a t y p i c a l M e t h a n o s a r c i n a m a z e i m o r p h o t y p e ( F i g u r e 5 . 3 D ) . T h e s i z e o f c e l l s v a r i e d f r o m 1 . 2 t o 3 . 0 p m i n d i a m e t e r a n d a p o l y m e r - l i k e s t r u c t u r e w a s o b s e r v e d ( F i g u r e 5 . 4 D ) . T h e d o u b l i n g t i m e o f s t r a i n T 1 8 o n m e t h a n o l a n d m e t h y l a m i n e w a s m u c h s h o r t e r ( 6 t o 7 h o u r s ) t h a n o n H z - C O 2 ( 1 0 t o 1 2 h o u r s ) . T h e d o u b l i n g t i m e f o r g r o w t h o n a c e t a t e w a s 3 2 t o 3 4 h o u r s . A d d i t i o n o f H 2 ( m o r e t h a n 5 0 0 P a ) w a s r e q u i r e d t o i n i t i a t e g r o w t h o n a c e t a t e , a l t h o u g h H 2 p a r t i a l p r e s s u r e w a s l o w ( a b o u t 2 0 P a ) d u r i n g i t s g r o w t h o n a c e t a t e . T h e t h r e s h o l d c o n c e n t r a t i o n f o r a c e t a t e w a s o b s e r v e d a t a b o u t 0 . 3 t o 0 . 4 m M . T h e r e q u i r e m e n t o f H 2 t o i n i t i a t e g r o w t h o n a c e t a t e w a s s i m i l a r t o t h a t r e p o r t e d f o r M s . b a r k e r i 2 2 7 a n d M s . m a z e i S 6 p r e - g r o w n o n 1 - 1 2 ( B o o n e e t a l . , 1 9 8 7 ) . O p t i m u m g r o w t h c o n d i t i o n s o n H z - C O 2 w e r e a t p H 6 . 3 t o 6 . 5 , a n d a t a t e m p e r a t u r e o f 3 5 t o 3 7 ° C ( F i g u r e 5 . 5 ) . Q u a n t i t a t i v e c o m p a r i s o n o f a n t i g e n i c fi n g e r p r i n t s o f s t r a i n T 1 8 w i t h c h a r a c t e r i z e d m e t h a n o g e n s t r a i n s i n d i c a t e d t h a t i t w a s c l o s e r t o M s . m a z e i s t r a i n S 6 a n d M s . t h e r m o a u t o t r o p h i c u m s t r a i n G C l t h a n M s . b a r k e r i s t r a i n s R 1 M 3 a n d 2 2 7 ( T a b l e 5 . 5 ) . T h e r e f o r e , s t r a i n T 1 8 w a s i d e n t i fi e d a s M e t h a n o s a r c i n a m a z e i s i n c e i t d i s p l a y e d s t r o n g a n t i g e n i c r e s e m b l a n c e a n d h a d t y p i c a l m o r p h o l o g i c a l a n d p h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h i s s p e c i e s d e s c r i b e d i n l i t e r a t u r e s ( L u i e t a l . , 1 9 8 5 ; M a h , 1 9 8 0 ; T o u z e l e t a l . , 1 9 8 3 ) . ) M m ( E N A H T E M 1 9 2 T I M E ( h r s ) F i g u r e 5 . 7 E f f e c t o f s u l fi d e c o n c e n t r a t i o n o n m e t h a n o g e n e s i s f r o m a c e t a t e b y s t r a i n M 7 . 5 . 4 . 5 M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 S t r a i n M 7 w a s a p o o r l y f l u o r e s c e n t , b a m b o o - s h a p e d r o d w i t h s q u a r e e n d s t h a t w a s i s o l a t e d f r o m a n a c e t a t e e n d d i l u t i o n e n r i c h m e n t t u b e ( 1 0 9 ) . A t t e m p t s t o o b t a i n c o l o n y g r o w t h o n e i t h e r p u r i fi e d a g a r o r g e l r i t e ( 0 . 6 , 0 . 7 a n d 0 . 8 % ) s o l i d i fi e d m e d i u m p l a t e s w e r e n o t s u c c e s s f u l . S t r a i n M 7 g r e w a s r o d s c o n s i s t i n g o f 1 t o 4 c e l l s b u t d i d n o t f o r m l o n g fi l a m e n t s i n t h e g r o w t h m e d i a t e s t e d . N o t a b l y , t h e c e l l s a r e a d h e s i v e a n d i n l i q u i d m e d i u m , a n d t h e c e l l e n d s a g g r e g a t e t o f o r m a r o s e t t e c l u m p s ( F i g u r e 1 9 3 5 . 3 B ) . T h e c e l l s w e r e 0 . 7 b y 2 . 2 p m i n s i z e a n d h a d g r a m - n e g a t i v e c e l l w a l l s t r u c t u r e ( F i g u r e 5 . 4 B ) . T h e m o r p h o t y p e o f s i n g l e c e l l o f s t r a i n M 7 a p p e a r e d t o b e t h e s a m e a s t h a t o f M e t h a n o t h r i x s o e h n g e n i i o r M e t h a n o s e a t a c o n c i l l i i n l i t e r a t u r s ( Z e h n d e r e t a l . , 1 9 8 0 ; H u s e r e t a l . , 1 9 8 2 ; P a t e l , 1 9 8 4 ; T o u z e l e t a l . , 1 9 8 8 ; P a t e l a n d S p r o t t , 1 9 9 0 ) . S t r a i n M 7 u s e d a c e t a t e a s a s u b s t r a t e f o r g r o w t h b u t d i d n o t u s e H z - C O Z , f o r m a t e , m e t h a n o l , o r m e t h y l a m i n e . T h e K I n v a l u e f o r a c e t a t e d e g r a d a t i o n w a s 0 . 4 1 m M ( s e e A p p e n d i x C ) . S t r a i n M 7 w a s e x t r e m e l y s e n s i t i v e t o s u l fi d e c o m p a r e d w i t h o t h e r a c e t a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s i s o l a t e d t o d a t e . S o d i u m s u l fi d e o f 1 . 2 m M s i g n i f i c a n t l y i n h i b i t e d t h e g r o w t h w h e n p H w a s 7 . 4 ( F i g u r e 5 . 7 ) . T h e e f f e c t o f v a r i o u s a n t i b i o t i c s o n g r o w t h w a s s i m i l a r t o t h a t f o r M e t h a n o t h r i x s o e h n g e n i i s t r a i n O p fi k o n ( n e o t y p e s t r a i n ) a n d M e t h a n o s e a t a c o n c i l l i s t r a i n G P 6 ( T a b l e 5 . 8 ) e x c e p t t h a t s t r a i n M 7 w a s m o r e s e n s i t i v e t o p e n i c i l l i n - G ( S t r a i n M 7 w a s i n h i b i t e d b y a c o n c e n t r a t i o n o f 1 . 0 m g / m L w h i l e s t r a i n G P 6 w a s n o t ) . Q u a n t i t a t i v e c o m p a r i s o n o f t h e a n t i g e n i c fi n g e r p r i n t s o f s t r a i n M 7 w i t h r e f e r e n c e s t r a i n s i n d i c a t e d i t w a s a n i m m u n o t y p e d i s t i n c t f r o m M t r x . s o e h n g e n i i b u t s h o w e d a v e r y w e a k r e a c t i o n t o M e t h a n o b r e v i b a c t e r a r b o r i p h i l u s ( T a b l e 5 - 6 ) . B a s e d o n i t s m o r p h o l o g i c a l a n d p h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s , s t r a i n M 7 w a s i d e n t i fi e d a s M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 . 1 9 4 T a b l e 5 . 8 C o m p a r i s o n o f s e n s i t i v i t y t o v a r i o u s a n t i b i o t i c s ( 0 . 1 m g / m L ) a m o n g m e t h a n o g e n s t r a i n M 7 , M e t h a n o t h r i x s o e h n g e n i i s t r a i n O p fi k o n a n d M e t h a n o s a e t a c o n c i l l i i s t r a i n G P 6 s t r a i n M 7 O p fi k o n G P 6 C y c l o s e r i n e + + + V a n c o m y c i n - - - P e n i c i l l i n - G “ + - - B a c i t r a c i n - N R - R i f a m p i c i n - N R N R C h l o r a m p h e n i c o l + N R N R T e t r a c y c l i n e + N R N R E r y t h r o m y c i n + N R N R K a n a m y c i n + N R N R G r a m i c i d i n S + N R N R G r a m i c i d i n D + N R N R M o n e n s i n + N R N R N e o m y c i n + N R N R N o v o b i o c i n + N R N R S t r e p t o m y c i n - N R N R A m p i c i l l i n - - - ( 1 ) D a t a f o r M e t h a n o t h r i x s o e h n g e n i i O p fi k o n a n d M e t h a n o s a e t a c o n c i l l i i G P 6 f r o m T o u z e l e t a l . ( 1 9 8 8 ) , a n d P a t e l a n d S p r o t t ( 1 9 9 0 ) . ( 2 ) * : S t r a i n s M 7 a n d O p fi k o w e r e i n h i b i t e d b y p e n i c i l l i n - G ( 1 . 0 m g / m L ) w h i l e s t r a i n G P 6 w a s n o t i n h i b i t e d . ( 3 ) + : S e n s i t i v e ; - : n o t s e n s i t i v e . ( 4 ) N R : N o t r e p o r t e d . 1 9 5 5 . 5 I S O L A T I O N A N D C H A R A C T E R I Z A T I O N O F F A T T Y A C I D D E G R A D I N G A C E T O G E N S F o u r d i f f e r e n t f a t t y a c i d d e g r a d i n g s t r a i n s w e r e a l s o i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s ( F i g u r e 5 . 8 ) . T w o o f t h e s t r a i n s ( s t r a i n s P I ‘ a n d B H ) w e r e i s o l a t e d a s c o - c u l t u r e s w i t h H z - C O 2 a n d f o r m a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n i c s t r a i n s . O n e s t r a i n ( s t r a i n P W ) w a s i s o l a t e d a s a m o n o c u l t u r e . T h e f o u r t h ( s t r a i n [ 3 ) w a s i s o l a t e d a s a t r i - c u l t u r e w i t h a H z - C O 2 a n d f o r m a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n , a n d a m i x e d f u n c t i o n m e t h a n o g e n p r e s e n t t o c o n s u m e H 2 - C 0 2 a n d f o r m a t e . C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e s e V F A - d e g r a d i n g o r g a n i s m s e x c e p t s t r a i n P W w a s n o t p o s s i b l e i n m o n o - c u l t u r e b e c a u s e o f l a c k o f g r o w t h u n d e r t e s t c o n d i t i o n s w i t h o u t a m e t h a n o g e n . T h e g e n e r a l p r o p e r t i e s o f t h e f a t t y a c i d d e g r a d i n g a c e t o g e n s i s o l a t e d a r e s h o w n i n T a b l e s 5 . 9 a n d 5 . 1 0 . 5 . 5 . 1 P r o p i o n a t e d e g r a d i n g s t r a i n P T S y n t r o p h i c a c e t o g e n s t r a i n P T , w h i c h d e g r a d e d p r o p i o n a t e , w a s i s o l a t e d a s a c o - c u l t u r e w i t h M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N ( F i g u r e 5 . 8 A ) . V e g e t a t i v e c e l l s w e r e l e m o n - o v a l s h a p e d a n d f o r m e d r o u n d c e n t r a l e n d o s p o r e s i n t h e l a t e s t a t i o n a r y p h a s e o f g r o w t h . T h e s i z e o f c e l l s w e r e 0 . 8 5 t o 0 . 9 5 b y 0 . 9 t o 1 . 2 m m a n d t h e c e l l w a l l s h o w e d g r a m - p o s i t i v e s t r u c t u r e ( F i g u r e 5 . 9 B ) . S t r a i n P T d e g r a d e d p r o p i o n a t e b u t n o t b u t y r a t e , a n d d i d n o t r e d u c e s u l f a t e i n t h e p r e s e n c e o f p r o p i o n a t e . T h e d o u b l i n g t i m e o f s t r a i n P T d u r i n g g r o w t h o n p r e p i o n a t e i n c o - c u l t u r e w i t h s t r a i n T l N w a s 7 d a y s a t 3 7 ° C . U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , p r o p i o n a t e w a s c o n v e r t e d t o C H 4 a n d a c e t a t e a s e n d p r o d u c t s o f t h e c o - c u l t u r e . F i g u r e 5 . 8 1 9 6 t i t " . ” 9 5 . 3 6 ; . . _ ‘ I ‘ . . . : 3 P h a s e — c o n t r a s t m i c r o p h o t o g r a p h s o f f a t t y a c i d d e g r a d i n g a c e t o g e n s i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s . ( A ) S p o r e - f o r m i n g , p r o p i o n a t e d e g r a d i n g a c e t o g e n s t r a i n P T a n d a c l u m p o f M e t h a n o b a c t e r i u m f o n n i c i c u m s t r a i n T l N . ( B ) N o n - s p o r e - f o r r n i n g , p r o p i o n a t e d e g r a d i n g a c e t o g e n s t r a i n P W w i t h M e t h a n o s p i r i l l u m h u n g a t e i s t r a i n B D . ( C ) S p o r e - f o r m i n g , b u t y r a t e d e g r a d i n g a c e t o g e n B H w i t h M e t h a n o b a c t e r i u m f o m r i c i c u m s t r a i n T l N . ( D ) I s o b u t y r a t e - b u t y r a t e d e g r a d i n g a c e t o g e n s t r a i n I B w i t h a g g r e g a t e o f M e t h a n o s a r c i n a m a z e i s t r a i n T 1 8 a n d c l u m p o f M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n T I N . B a r r e p r e s e n t s 1 0 u m . 1 9 7 F i g u r e 5 . 9 T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n p h o t o g r a p h s o f f a t t y a c i d d e g r a d e r s . ( A ) s t r a i n P W , ( B ) s t r a i n P T a n d ( C ) s t r a i n I B i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s . 1 9 9 T a b l e 5 . 9 G e n e r a l p r o p e r t i e s o f p r e v a l e n t p r o p i o n a t e d e g r a d e r s i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s S n m n P r o p e r t y P T P W C e l l u l a r c e l l w a l l g r a m - n e g a t i v e g r a m - n e g a t i v e c e l l s h a p e o v a l s h o r t r o d e n d o s p o r e s c e n t r a l n o n e D o u b l i n g t i m e ( d a y s ) 7 5 M e t h a n o g e n p a r t n e r s t r a i n T I N s t r a i n B D S y n t r o p h i c a c e t o g e n e s i s p r o p i o n a t e + + S u l f a t e r e d u c t i o n p r o p i o n a t e - + f o r m a t e - + H 2 - + p y r u v a t e - + N o t e : B o t h s t r a i n s P T a n d P W d i d n o t u t i l i z e g l u c o s e , b u t y r a t e , i s o b u t y r a t e , s u c c i n a t e , l a c t a t e , b e n z o a t e , e t h a n o l a n d b u t a n o l . 5 . 5 . 2 P r o p i o n a t e d e g r a d i n g s t r a i n P W P r o p i o n a t e d e g r a d i n g s t r a i n P W w a s i n i t i a l l y i s o l a t e d a s a c o - c u l t u r e w i t h M s p . h u n g a t e i s t r a i n B D i n t h e a b s e n c e o f s u l f a t e ( F i g u r e 5 . 8 B ) . S u b s e q u e n t l y , i t w a s f o u n d t h a t t h i s s t r a i n P W o x i d i z e d p r o p i o n a t e t o a c e t a t e a n d r e d u c e d s u l f a t e t o s u l fi d e . P u r e c o l o n i e s o f s t r a i n P W w e r e o b t a i n e d o n s o l i d i fi e d a g a r m e d i u m c o n t a i n i n g s o d i u m s u l f a t e ( 2 0 m M ) a n d s o d i u m p r o p i o n a t e ( 2 0 m M ) a f t e r 1 . 5 m o n t h s o f i n c u b a t i o n . C o l o n i e s o f s t r a i n P W w e r e s m o o t h , r o u n d i n s h a p e w i t h d a r k - b r o w n c o l o r a n d a d i a m e t e r o f a p p r o x i m a t e l y 1 . 0 m m . T h i s s t r a i n w a s a s h o r t r o d w i t h r o u n d e d e n d s ( 0 . 7 6 t o 0 . 9 0 b y 1 . 0 t o 1 . 2 p m i n s i z e ) a n d s h o w e d g r a m - n e g a t i v e c e l l w a l l s t r u c t u r e ( F i g u r e 5 . 9 A ) . S p o r e f o r m a t i o n w a s n o t d e t e c t e d . I n t h e p r e s e n c e o f s u l f a t e s t r a i n P W c o u l d u t i l i z e H 2 , f o r m a t e , p r o p i o n a t e , a n d p y r u v a t e a s e l e c t r o n d o n o r s t o r e d u c e s u l f a t e . S t r a i n P W c o u l d 2 0 0 a l s o g r o w s y n t r o p h i c a l l y i n t h e a b s e n c e o f s u l f a t e w h e n M s p . h u n g a t e i s t r a i n B D o r M b . f o r m i c i c u m s p e c i e s ( s t r a i n T I N o r s t r a i n R F o r s t r a i n M F ) w a s a d d e d t o t h e p u r e c u l t u r e o f s t r a i n P W . T h e d o u b l i n g t i m e o f s t r a i n P W i n c o - c u l t u r e w i t h M s p . h u n g a t e i s t r a i n B D o n p r o p i o n a t e ( n o s u l f a t e p r e s e n t ) w a s 5 d a y s a t 3 7 ° C . A t h r e e - d a y d o u b l i n g t i m e w a s o b s e r v e d i n p u r e c u l t u r e w i t h s u l f a t e p r e s e n t . T h e c o - c u l t u r e f o r m e d C H 4 a n d a c e t a t e f r o m p r o p i o n a t e w h i l e t h e p u r e c u l t u r e o x i d i z e d p r o p i o n a t e t o a c e t a t e a n d r e d u c e d s u l f a t e t o s u l fi d e . 5 . 5 . 3 B u t y r a t e d e g r a d i n g s t r a i n B H S y n t r o p h i c a c e t o g e n s t r a i n B H d e g r a d e d b u t y r a t e a n d w a s i s o l a t e d a s a c o - c u l t u r e w i t h M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N ( F i g u r e 5 . 8 C ) . S t r a i n B H w a s r o d - s h a p e d w i t h a s i z e o f 0 . 4 0 t o 0 . 5 6 b y 2 . 6 t o 4 . 7 p m . T h i s o r g a n i s m f o r m e d t e r m i n a l e n d o s p o r e s ( F i g u r e 5 . 1 0 ) . B a s e d o n T E M o b s e r v a t i o n , t h e w a l l o f t h e c e l l s a p p e a r e d g r a m - p o s i t i v e . P o l y - B - h y d r o x y b u t y r a t e ( P H B ) , w h i c h h a s b e e n f o u n d i n s i d e S y n t r o p h o m o n a s s p . ( D u b o u r g u i e r e t a l . , 1 9 8 8 a ) , w a s n o t o b s e r v e d i n s i d e t h e c e l l s o f s t r a i n B H . T h e d o u b l i n g t i m e o f s t r a i n B H o n b u t y r a t e i n c o - c u l t u r e w i t h s t r a i n T I N w a s 6 6 h a t 3 7 ° C . T h e c o - c u l t u r e c o n v e r t e d b u t y r a t e i n t o C H 4 a n d a c e t a t e . T h e c o c u l t u r e c o u l d u t i l i z e m o n o c a r b o x y l i c s a t u r a t e d f a t t y a c i d s w i t h 4 t o 9 c a r b o n a t o m s t o m e t h a n e a n d a c e t a t e o r m e t h a n e , a c e t a t e a n d p r o p i o n a t e . T h e c o c u l t u r e a l s o c o n v e r t e d 2 - m e t h y l b u t y r a t e t o C H 4 , a c e t a t e , a n d p r o p i o n a t e ( T a b l e 5 . 1 0 ) . H o w e v e r , t h i s c u l t u r e d i d n o t u s e p r o p i o n a t e a n d i s o b u t y r a t e a n d c o u l d n o t u s e b u t y r a t e a s a n e l e c t r o n d o n o r t o r e d u c e s u l f a t e . S t r a i n B H d i s p l a y e d m o r p h o l o g i c a l a n d p h y s i o l o g i c a l p r o p e r t i e s s i m i l a r t o s p o r e - f o r m i n g S y n t r o p h o s p o r a b r y a n t i i ( S t i e b a n d S c h i n k , 1 9 8 5 ; Z h a o e t a l . , 1 9 9 0 ) a n d w a s l i k e l y i d e n t i fi e d a s a s t r a i n o f t h i s s p e c i e s . T h i s s t r a i n a p p e a r s u n r e l a t e d t o S y n t r o p h o m o n a s w o l f e i ( M c I n e r n e y e t a l . , 1 9 8 1 ) a n d S y n t r o p h o m o n a s s a p o v a r a n s ( R o y e t a l . , 1 9 8 6 ) , w h i c h b o t h d o n o t f o r m s p o r e s . 2 0 1 F i g u r e 5 . 1 0 l l u s t r a t i o n o f d i f f e r e n t g r o w t h s t a g e s d u r i n g s p o r u l a t i o n b y s y t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d e r s t r a i n B H p r e s u m a b l y b e i n g S y n t r o p h o s p o r a b r y a n t i i m u 5 . 0 2 0 2 2 0 3 T a b l e 5 . 1 0 G e n e r a l p r o p e r t i e s o f p r e v a l e n t s y n t r o p h i c b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e - b u t y r a t e d e g r a d e r s i s o l a t e d f r o m R — g r a n u l e s S a g P r o p e r t y B H I B C e l l u l a r c e l l - w a l l g r a m - p o s i t i v e g r a m - p o s i t i v e c e l l s h a p e m e d i u m r o d m e d i u m r o d e n d o s p o r e s t e r m i n a l n o n e M e t h a n o g e n p a r t n e r s t r a i n T I N s t r a i n T I N a n d T 1 8 D o u b l i n g t i m e ( h r s ) 6 6 6 0 S u b s t r a t e s d e g r a d e d b u t y r a t e + + i s o b u t y r a t e - + v a l e r a t e + + 2 — m e t h y l b u t y r a t e + + c a p r o a t e + + 4 - m e t h y 1 v a l e r a t e N D + h e p t a n o a t e + + 2 - m e t h y l h e x a n o a t e N D + c a p r y l a t e + + p e l a r g o a t e + + ( 1 ) S t r a i n s B H a n d I B d o n o t u s e e t h a n o l , p r o p i o n a t e , i s o v a l e r a t e , t r i m e t h y l a c e t a t e a n d 3 - m e t h y l v a l e r a t e . ( 2 ) N D : N o t d e t e r m i n e d . 5 . 5 . 4 I s o b u t y r a t e - b u t y r a t e d e g r a d i n g s t r a i n I B S y n t r o p h i c a c e t o g e n s t r a i n I B w a s g r o w n a s a t r i - c u l t u r e w i t h m e t h a n o g e n s M b . f o m i c i c u m s t r a i n T l N a n d M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 ( F i g u r e 5 . 8 D ) . S t r a i n [ B w a s i s o l a t e d a s a t r i - c u l t u r e f r o m a n i s o b u t y r a t e e n r i c h m e n t c u l t u r e b y a d d i n g s t r a i n T l N a n d t h e n p l a t i n g s e r i a l d i l u t i o n s o n t o a g a r p l a t e s . T h e c e l l s o f s t r a i n I B w e r e r o d - s h a p e d w i t h a s i z e o f 0 . 4 5 b y 2 . 0 t o 3 . 5 u m S t r a i n I B h a d g r a m - p o s i t i v e c e l l w a l l s t r u c t u r e ( F i g u r e 2 0 4 5 . 9 C ) . P H B w a s n o t o b s e r v e d i n s i d e t h e c e l l s o f t h i s s t r a i n . T h e d o u b l i n g t i m e o f s t r a i n I B i n t r i - c u l t u r e o n i s o b u t y r a t e w a s 6 0 h a t 3 7 ° C . T h e t r i - c u l t u r e c a n u t i l i z e m o n o c a r b o x y l i c s a t u r a t e d f a t t y a c i d s w i t h 4 t o 9 c a r b o n a t o m s , a n d a l s o u s e b r a n c h e d - f a t t y a c i d s i s o b u t y r a t e , 2 — m e t h y l b u t y r a t e , 4 - m e t h y 1 v a l e r a t e , a n d 2 - m e t h y l h e x a n o a t e ( T a b l e 5 . 1 0 ) . T h e c u l t u r e d i d n o t u s e b u t y r a t e a s e l e c t r o n d o n o r t o r e d u c e s u l f a t e . W h e n s t r a i n I B d e g r a d e d e i t h e r i s o b u t y r a t e o r b u t y r a t e i n t h e t r i - c u l t u r e , i s o m e r i z a t i o n a l w a y s o c c u r r e d r e s u l t i n g i n b o t h f a t t y a c i d s b e i n g p r e s e n t ( C h a p t e r 6 ) . 5 . 6 I D E N T I F I C A T I O N O F P R E V A L E N T S P E C I E S T h e p r e v a l e n t s p e c i e s i n t h e R - g r a n u l e s w e r e i d e n t i fi e d b y m i c r o s c o p i c a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n a n d c o m p a r e d t o t h e i s o l a t e d s t r a i n s . U n d e r a m i c r o s c o p e , f o u r p r e v a l e n t c e l l m o r p h o t y p e s o f m e t h a n o g e n s w e r e o b s e r v e d i n d i s r u p t e d g r a n u l e s : a s h o r t , b a m b o o - s h a p e d r o d w i t h s q u a r e e n d s ( M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 - l i k e ) , a s p i r i l l u m ( M s p . h u n g a t e i s t r a i n B D - l i k e ) , a t h i n r o d ( M b . f o r m i c i c u m - l i k e ) , a n d a s a r c i n a ( M s . m a z e i - l i k e ) . A l l o f t h e s e c e l l t y p e s ( e x c e p t t h e f a t , M e t h a n o t h r i x - l i k e r o d ) a c t i v e l y fl u o r e s c e d u n d e r U V l i g h t w h i c h i s a d i a g n o s t i c f o r c o - e n z y m e F 4 2 0 ( M i n k a n d D u g a n , 1 9 7 7 ) . T h e s a m e m o r p h o t y p e s o f s y n t r o p h i c a c e t o g e n s t h a t d e g r a d e d p r o p i o n a t e ( s t r a i n s P T a n d P W ) a n d b u t y r a t e ( s t r a i n s B H a n d [ 8 ) w e r e a l s o o b s e r v e d . T o e x a m i n e t h e p o p u l a t i o n l e v e l s o f i n d i v i d u a l i s o l a t e d s t r a i n s i n t h e g r a n u l e s , t h e m i c r o b i a l m o r p h o t y p e s i n v a r i o u s d i l u t i o n s o f M P N t u b e s w e r e e x a m i n e d c o m p a r e d w i t h t h e m o r p h o t y p e s o f i s o l a t e d s t r a i n s ( T a b l e 5 . 1 1 ) . T h e s a m e m o r p h o t y p e s a s M b . f o r m i c i c u m ( s t r a i n T I N o r s t r a i n R F ) w e r e o b s e r v e d i n t h e 2 0 5 h i g h e s t p o s i t i v e M P N t u b e s ( 1 0 ‘ 2 / g S S ) u s i n g H z - C O 2 o r f o r m a t e a s t h e s u b s t r a t e . M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 - l i k e r o d s , c o n s i s t i n g o f 2 t o 4 c e l l s , w e r e o b s e r v e d a s p r e d o m i n a n t m o r p h o t y p e i n t h e h i g h e s t p o s i t i v e M P N t u b e ( 1 0 ‘ 2 / g S S ) u s i n g a c e t a t e . A f e w o f M e t h a n o b a c t e r i u m — l i k e c e l l s , p r e s u m a b l y , s t r a i n T l N o r R F , w e r e a l s o f o u n d i n t h e h i g h e s t a c e t a t e t u b e s ( 1 0 1 2 / g S S ) . M s . m a z e i - l i k e , a n d M e t h a n o s p i r i l l u m - l i k e c e l l s w e r e o b s e r v e d a t l e v e l s o f 1 0 8 a n d 1 0 9 / g S S , r e s p e c t i v e l y . S p o r e - f o r m i n g , p r o p i o n a t e - d e g r a d i n g s t r a i n P T w a s o b s e r v e d i n a l l t h e h i g h e s t p o s i t i v e M P N t u b e s u s i n g p r o p i o n a t e a s s u b s t r a t e ( l O ‘ l / g S S ) w h i l e s t r a i n P W - l i k e c e l l s w e r e o b s e r v e d i n l o w e r p o s i t i v e t u b e s ( 1 0 ‘ ° / g S S o r l o w e r ) . S p o r e - f o r m i n g , b u t y r a t e d e g r a d i n g s t r a i n B H a n d n o n - s p o r e f o r m i n g i s o b u t y r a t e - b u t y r a t e - d e g r a d i n g s t r a i n 1 B w e r e o b s e r v e d i n t h e h i g h e s t p o s i t i v e M P N t u b e s ( 1 0 1 1 / g S S ) c o n t a i n i n g b u t y r a t e a s s u b s t r a t e . T a b l e 5 . 1 1 P r e v a l e n t m o r p h o t y p e s o b s e r v e d i n M P N t u b e s S u b s t r a t e f o r M P N m o r p h t y p e o b s e r v e d l e v e l ( c e l l / g S S ) 1 . p r o p i o n a t e s t r a i n P T - l i k e 1 0 1 1 s t r a i n P W - l i k e 1 0 1 0 2 . b u t y r a t e s t r a i n s B H a n d I B - l i k e 1 0 1 1 3 . H z - C O 2 M e t h a n o b a c t e r i u m - l i k e 1 0 1 2 M e t h a n o s a r c i n a - l i k e 1 0 9 M e t h a n o s p i n ' l l u m - l i k e 1 0 1 0 4 . f o r m a t e M e t h a n o b a c t e r i u m — l i k e 1 0 l l M e t h a n o s p i r i l l u m - l i k e 1 0 9 5 . a c e t a t e M e t h a n o t h r i x - l i k e 1 0 1 2 M e t h a n o s a r c i n a - l i k e 1 0 8 M e t h a n o b a c t e n ' u m — l i k e 1 0 1 2 2 0 6 F i g u r e 5 . 1 1 S c a n n i n g e l e c t r o n p h o t o m i c r o g r a p h s o f t h e R - g r a n u l e s . M f : M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m - l i k e r o d s ; M t : M e t h a n o t h r i x - l i k e r o d s : M p : M e t h a n o s p i r i l l u m h u n g a t e i - l i k e fi l a m e n t s ; B H : S y n t r o p h o s p o r a b r y a n t i i — l i k e r o d s ; P T : s p o r e - f o r m i n g , s y n t r o p h i c p r o p i o n a t e d e g r a d e r . 2 0 7 ' . e 0 . . ) 0 : ‘ . ' e ‘ ‘ I ‘ T O : . . ' ‘ : I z i " ’ é : : : ‘ . ; . O . ’ ) ) o 0 L , . a . ” ” \ J . “ f . O . . 0 e . 6 ' ! . . 9 . ' P W . \ ' . ' . : M r b . 3 . ’ ’ g ' t 1 . 1 3 . . . . : . O \ O \ : . O I ” v . - \ . I l a ' Q ) 4 " . § 6 : : L n 1 ‘ a . . ’ 1 0 g i g " \ - 0 ; : m 3 ; : 0 . V , ‘ f l / r . e L , - e O “ i ” 9 . . . . ' ' B H ' ? " ; . . " . s . ‘ v . 8 ' O ' 7 ' ; , 1 5 ) - . \ ‘ e , . " , " * " ” " u “ E . " ' 0 ' 0 a a - — F i g u r e 5 . 1 2 T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n p h o t o m i c r o g r a p h s o f t h e R — g r a n u l e s . M f : M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m - l i k e r o d s ; M t : M e t h a n o t h r i x — l i k e r o d s ; M s : M e t h a n o s a r c i n a m a z e i - l i k e c o c c i ; B H : s p o r e - f o r m i n g , S y n t r o p h o s p o r a b r y a n t i i — l i k e r o d s ; P T : s p o r e - f o r m i n g s y n t r o p h i c p r o p i o n a t e d e g r a d e r ; P W : n o n - s p o r e — f o r m i n g p r o p i o n a t e d e g r a d e r . T h e r o l e o f t h e i s o l a t e d s t r a i n s i n t h e m i c r o b i a l c o m p o s i t i o n o f t h e g r a n u l e s w a s i n v e s t i g a t e d u s i n g S E M a n d T E M e x a m i n a t i o n o f g r a n u l e s i n c o m p a r i s o n w i t h t h e m o r p h o t y p e s o f t h e i s o l a t e s . T h e s a m e m o r p h o t y p e s a s t h o s e o f M b . f o r m i c i c u m ( s t r a i n T l N o r R F ) a n d M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 w e r e o b s e r v e d a s p r e d o m i n a n t s p e c i e s o n t h e s u r f a c e a n d c r o s s s e c t i o n s o f t h e g r a n u l e s ( F i g u r e 5 . 1 1 a n d F i g u r e 5 . 1 2 ) . F a t t y a c i d 2 0 8 d e g r a d i n g s t r a i n s P T , P W , B H a n d I B - l i k e m o r p h o t y p e s w e r e a l s o f r e q u e n t l y o b s e r v e d o n t h e s u r f a c e a n d g r a n u l e c r o s s s e c t i o n s ( F i g u r e 5 . 1 1 a n d 5 . 1 2 ) . T h e s e v e r a l c e l l m o r p h o t y p e s w e r e c l o s e l y j u x t a p o s e d b u t d i d n o t a p p e a r a s m i c r o c o l o n i e s . A s i d e f r o m M e t h a n o s p i r i l l u m - l i k e c e l l s , w h i c h w e r e o n l y o b s e r v e d o n t h e s u r f a c e o f t h e g r a n u l e s u n d e r S E M ( F i g u r e 5 . 1 1 ) , a l l o t h e r m e t h a n o g e n - l i k e , a n d s y n t r o p h i c a c e t o g e n - l i k e c e l l s w e r e f o u n d i n s i d e a n d o n t h e s u r f a c e o f t h e g r a n u l e s . S m a l l a g g r e g a t e s o f M e t h a n o s a r c i n a - l i k e c e l l s w e r e s c a t t e r e d o n t h e s u r f a c e a n d i n s i d e o f t h e g r a n u l e s ( F i g u r e 5 . 1 2 ) a n d w e r e n o t e v e n l y j u x t a p o s e d t o t h e p u t a t i v e s y n t r o p h i c a c e t o g e n i c c e l l s . T h e s a m e m o r p h o t y p e s a s e i t h e r S y n t r o p h o m o n a s s p . o r S y n t r o p h o b a c t e r s p . , d e s c r i b e d b y D u b o u g u i e r e t a l . ( 1 9 8 8 3 , 1 9 8 8 0 ) , w e r e n o t o b s e r v e d o n t h e t h i n c r o s s s e c t i o n o f t h e g r a n u l e s . T h i s r e v e a l s t h a t t h e s e t w o s p e c i e s , a t l e a s t , m a y n o t b e p r e v a l e n t s p e c i e s i n t h e R - g r a n u l e s . 5 . 7 D I S C U S S I O N 5 . 7 . 1 I d e n t i fi c a t i o n o f i s o l a t e d m e t h a n o g e n s F i v e s t r a i n s o f m e t h a n o g e n s w e r e i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s . E x c e p t s t r a i n M 7 , a l l o f t h e p r e v a l e n t m e t h a n o g e n i c s t r a i n s i s o l a t e d a r e p r e v i o u s l y d e s c r i b e d s p e c i e s : M b . f o r m i c i c u m , M s p . h u n g a t e i a n d M s . m a z e i ( T a b l e 1 . 1 i n C h a p t e r 1 ) . S t r a i n M 7 i s i d e n t i fi e d a s b e i n g a M e t h a n o t h r i x s p . , b a s e d o n i t s m o r p h o l o g i c a l a n d p h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s . H o w e v e r , i t m a y b e a n e w s p e c i e s d i f f e r e n t f r o m M t r x . s o e h n g e n i i s i n c e t h i s s t r a i n g r e w a s n o n - fi l a m e n t o u s , b a m b o o - s h a p e d r o d s c o n s i s t i n g o f 1 4 c e l l s , f o r m e d r o s e t t e c l u m p s a n d w a s n o t a n t i g e n i c a l l y r e l a t e d t o M t r x . s o e h n g e n i i s t r a i n s w h i c h f o r m l o n g fi l a m e n t s ( Z e h n d e r e t a l . , 1 9 8 0 ; H u s e r e t a l . , 1 9 8 2 ; T o u z e l e t a l . , 2 0 9 1 9 8 8 ) . S t r a i n M 7 w a s m o r e s e n s i t i v e t o s u l fi d e t h a n M t r x . s o e h n g e n i i o r M e t h a n o s a e t a c o n c i l l i ( P a t e l 1 9 8 4 ; P a t e l a n d S p r o t t , 1 9 9 0 ) o n w h o s e g r o w t h w a s n o t i n h i b i t e d b y 1 . 0 m M s u l fi d e a s w a s s t r a i n M 7 . T h e r e s u l t s o f D N A - D N A h y b r i z a t i o n s h o w i n g l e s s r e l a t e d n e s s ( < 1 0 % ) b e t w e e n s t r a i n M 7 a n d M M . s o e h n g e m ’ i s t r a i n O p fi k o a l s o s u p p o r t t h a t s t r a i n M 7 m a y b e a n e w s p e c i e s ( T o u z e l , 1 9 8 9 ) . 5 . 7 . 2 I d e n t i fi c a t i o n o f i s o l a t e d s y n t r o p h i c a c e t o g e n s A m o n g t h e f o u r f a t t y a c i d d e g r a d e r s i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s , o n l y s t r a i n B H a p p e a r e d t o b e a d e s c r i b e d s p e c i e s , S y n t r o p h o s p o r a b r y a n t i i s p . S y n t r o p h i c a c e t o g e n s t r a i n I B a p p e a r s t o b e a n e w , n o n - s p o r e - f o r m i n g i s o b u t y r a t e - b u t y r a t e d e g r a d i n g s p e c i e s t h a t g r o w s w i t h m e t h a n o g e n s i n t h e a b s e n c e o f s u l f a t e . I t d i f f e r s m o r p h o l o g i c a l l y a n d m e t a b o l i c a l l y f r o m S y n t r o p h o m o n a s s p . a n d S y n t r o p h o s p o r a s p . w h i c h d o n o t u t i l i z e i s o b u t y r a t e , a n d a l s o f r o m D e s u l f o c o c c u s m u l t i v o r a n s w h i c h g r o w s o n i s o b u t y r a t e v i a s u l f a t e r e d u c t i o n ( S t i e b a n d S c h i n k , 1 9 8 9 ) a n d o t h e r S R B ( W i d d e l , 1 9 8 8 ) . I t i s a l s o m o r p h o l o g i c a l l y d i f f e r e n t f r o m t h e m a j o r n o n - m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a f o u n d i n a s y n t r o p h i c i s o b u t y r a t e d e g r a d i n g m e s o p h i l i c e n r i c h m e n t c u l t u r e ( S t i e b a n d S c h i n k , 1 9 8 9 ) . P r o p i o n a t e - d e g r a d i n g s t r a i n s P W a n d P T a p p e a r a s n e w s p e c i e s s i n c e t h e y a r e b o t h m o r p h o l o g i c a l l y d i f f e r e n t f r o m n o n - s p o r e f o r m i n g S y n t r o p h o b a c t e r w o l i n i i , w h i c h g r o w s w i t h s h o r t c h a i n s a n d fi l a m e n t s ( B o o n e a n d B r y a n t , 1 9 8 0 ) a n d p h y s i o l o g i c a l l y d i f f e r e n t f r o m t w o r e p o r t e d s p o r e - f o r m i n g , t h e r m o p h i l i c p r o p i o n a t e d e g r a d i n g - b a c t e r i a ( M o c h a e t a l . 1 9 8 8 ) . S t r a i n P W r e d u c e d s u l f a t e a n d w a s m o r p h o l o g i c a l l y s i m i l a r t o D e s u l f o b u l b u s p r o p i o n i c u s ( W i d d e l a n d P f e n n i g , 1 9 8 2 , 1 9 8 4 ) . H o w e v e r , D e s u l f o b u l b u s p r o p i o n i c u s a n d o t h e r p r o p i o n a t e - u t i l i z i n g S R B s p e c i e s i s o l a t e d t o d a t e c o u l d n o t g r o w s y n t r o p h i c a l l y w i t h a H z - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n ( L a a n b r e o e k e t a l . , 1 9 8 2 ; W i d d e l , 1 9 8 8 ) . 2 1 0 T h i s s t r a i n , p r e s u m a b l y , i s a c l a s s i c e x a m p l e o f a s u l f a t e r e d u c e r w h i c h g r o w s s y n t r o p h i c a l l y o n p r o p i o n a t e . T h e i s o l a t i o n o f s t r a i n P W c o n fi r m e d t h e p r e s e n c e o f S R B w h i c h c a n a l s o d e g r a d e p r o p i o n a t e s y n t r o p h i c a l l y i n t h e a b s e n c e o f s u l f a t e a s s u g g e s t e d i n C h a p t e r 4 . 5 . 7 . 3 T h e r o l e o f p r e v a l e n t s p e c i e s i n g r a n u l e s I n C h a p t e r 3 , i t w a s c o n c l u d e d t h a t t h e g r a n u l e s d e v e l o p e d o n t h e V F A m i x t u r e c o n t a i n e d m e t h a n o g e n s a n d s y n t r o p h i c a c e t o g e n s a s p r e v a l e n t s p e c i e s a n d a n i n s i g n i fi c a n t n u m b e r o f h y d r o l y t i c - f e r m e n t a t i v e b a c t e r i a , b a s e d o n t h e m a x i m u m s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s ( T a b l e 3 . 5 i n C h a p t e r 3 ) a n d M P N e n u m e r a t i o n d a t a ( T a b l e 3 . 7 i n C h a p t e r 3 ) . B a s e d o n S E M , T E M a n d m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n , t h e p r e d o m i n a n t b a c t e r i a o b s e r v e d i n t h e R - g r a n u l e s w e r e H z - C O 2 a n d f o r m a t e - u t i l i z i n g M b . f o r m i c i c u m ( i n c l u d i n g s t r a i n s T I N a n d R F ) , a n d a c e t a t e - u t i l i z i n g M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 . T h e p r e d o m i n a n c e o f M b . f o r m i c i c u m s p e c i e s i s a l s o s u p p o r t e d b y t h e s a m e l e v e l s o f H z - C O 2 a n d f o r m a t e u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s i n M P N e n u m e r a t i o n ( T a b l e 3 . 7 i n C h a p t e r 3 ) . T h e p r e v a l e n c e o f M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 w a s v e r i fi e d b y c e l l c o u n t s o n c r o s s s e c t i o n s o f t h e R - g r a n u l e s ( 2 . 9 x 1 0 7 M e t h a n o t h r i x — l i k e c e l l / c m 2 v s . 9 x 1 0 7 t o t a l c e l l / c m 2 i n T a b l e 3 . 8 ) a n d t h e s i m i l a r a f fi n i t y f o r a c e t a t e b y s t r a i n M 7 a n d t h e g r a n u l e s ( b o t h s t r a i n M 7 a n d t h e d i s r u p t e d R - g r a n u l e s h a d K m o f c a 0 . 4 m M ) . T h e s e m e t h a n o g e n s a r e a d h e s i v e s p e c i e s a n d m a y b e i m p o r t a n t f o r t h e s t a b i l i t y o f g r a n u l a r s t r u c t u r e . T h e c o m b i n a t i o n o f s y n t r o p h i c a c e t o g e n s a n d m e t h a n o g e n s i s o l a t e d f r o m t h e g r a n u l e s c a n m i n e r a l i z e a l l f a t t y a c i d s f r o m r e a c t o r f e e d a n d m e t a b o l i c i n t e r m e d i a t e s f o r m e d i n t h e r e a c t o r s , i n c l u d i n g a c e t a t e , p r o p i o n a t e , i s o b u t y r a t e , b u t y r a t e , v a l e r a t e a n d 2 - m e t h y 1 b u t y r a t e . A l l t h e i s o l a t e d s t r a i n s a p p e a r t o b e r e p r e s e n t a t i v e m e t a b o l i c s p e c i e s 2 1 1 i n t h e R - g r a n u l e s . T h e m i c r o b i a l c o m p o s i t i o n o f t h e g r a n u l e s a p p e a r s t o b e s t r o n g l y d e p e n d e n t o n t h e f e e d c o m p o s i t i o n . T h e M P N e n u m e r a t i o n s s u g g e s t e d t h a t t h e p o p u l a t i o n l e v e l s o f t h e s y n t r o p h i c a c e t o g e n i c a n d m e t h a n o g e n i c s t r a i n s i n t h e s e g r a n u l e s w e r e a s h i g h o r h i g h e r t h a n t h e t o t a l n u m b e r o f a n a e r o b e s r e p o r t e d i n t h e g r a n u l e s d e v e l o p e d o n i n d u s t r i a l w a s t e w a t e r , w h i c h c o n t a i n e d m o r e h y d r o l y t i c - f e r m e n t a t i v e b a c t e r i a ( D o l fi n g e t a l . , 1 9 8 5 ; D u b o u r g u i e r e t a l . , 1 9 8 8 a , 1 9 8 8 c ) . I n M P N e n u m e r a t i o n e x p e r i m e n t s , H z - C o z - u t i l i z i n g , M e t h a n o b a c t e r i u m - l i k e c e l l s w e r e o b s e r v e d i n t h e h i g h e s t a c e t a t e t u b e s ( T a b l e 5 . 1 1 ) f o r b o t h t h e R - a n d F - g r a n u l e s . I t i s i n t e r e s t i n g h o w t h e s e b a c t e r i a g o t e n e r g y s o u r c e i n t h e s e t u b e s w h e r e a c e t a t e w a s s u p p l i e d a s s o l e s u b s t r a t e . I t m a y b e d u e t o a s m a l l a m o u n t h y d r o g e n p r o d u c e d b y a c e t a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s , w h i c h w a s u t i l i z e d a s e n e r g y s o u r c e b y t h e H z - C O z - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s . 5 . 8 S U M M A R Y 1 ) T h e R - g r a n u l e s , d e v e l o p e d o n a V F A m i x t u r e , w e r e m a i n l y c o m p o s e d o f m e t h a n o g e n s a n d s y n t r o p h i c p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e d e g r a d e r s . S u l f a t e - r e d u c i n g b a c t e r i a d i d n o t p l a y a s i g n i fi c a n t r o l e i n m e t a b o l i s m o f H 2 , f o r m a t e , a c e t a t e , a n d b u t y r a t e i n t h e p r e s e n c e o f s u l f a t e b u t t h e y w e r e i n v o l v e d , t o a l i m i t e d e x t e n t , i n s y n t r o p h i c p r o p i o n a t e d e g r a d a t i o n . 2 ) T h e p r e v a l e n t m e t h a n o g e n s i n t h e g r a n u l e s w e r e i s o l a t e d a n d i d e n t i fi e d a s M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n s T I N a n d R F , M e t h a n o s p i r i l l u m h u n g a t e i s t r a i n B D , M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 a n d M e t h a n o s a r c i n a m a z e i s t r a i n T 1 8 . M b . f o r m i c i c u m s t a i n T l N , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n R F , a n d M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 w e r e t h e 2 1 2 p r e d o m i n a n t s p e c i e s i n t h e g r a n u l e s . T h e s e o r g a n i s m s a p p e a r e d t o p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n g r a n u l a r s t r u c t u r e . 3 ) A s p o r e - f o r m i n g , s y n t r o p h i c p r o p i o n a t e d e g r a d e r s t r a i n P T a n d s u l f a t e - r e d u c i n g , p r o p i o n a t e d e g r a d e r , s t r a i n P W ( w h i c h c a n a l s o d e g r a d e p r o p i o n a t e s y n t r o p h i c a l l y ) w e r e i s o l a t e d a s t h e p r e v a l e n t p r o p i o n a t e d e g r a d e r s . B o t h s t r a i n s a r e d i f f e r e n t f r o m o t h e r p r o p i o n a t e d e g r a d e r s i s o l a t e d t o d a t e . 4 ) A s p o r e - f o r m i n g , s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d e r , s t r a i n B H , w a s i s o l a t e d a n d i d e n t i fi e d a s a p r e v a l e n t s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d e r . A r o d - s h a p e d , s y n t r o p h i c i s o b u t y r a t e - b u t y r a t e d e g r a d e r , s t r a i n 1 B , w a s a l s o i s o l a t e d a s a n o t h e r p r e v a l e n t b u t y r a t e d e g r a d e r i n t h e g r a n u l e s . 5 ) M i c r o s c o p i c a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n c o n fi r m e d t h a t a b o v e s p e c i e s r e p r e s e n t e d t h e m a j o r o r g a n i s m s c o n t a i n e d i n t h e g r a n u l e s . T h e c o m b i n a t i o n o f a l l i s o l a t e d s t r a i n s c a n c o m p l e t e l y m i n e r a l i z e a l l f a t t y a c i d s f r o m r e a c t o r f e e d a n d m e t a b o l i c i n t e r m e d i a t e s f o r m e d i n t h e r e a c t o r s . C H A P T E R 6 C H A R A C T E R I Z A T I O N O F F A T T Y A C I D M E T A B O L I S M B Y D E F I N E D C U L T U R E S I S O L A T E D F R O M G R A N U L E S 6 . 1 I N T R O D U C T I O N A c e t a t e , p r o p i o n a t e , b u t y r a t e a n d v a l e r a t e a r e c o m m o n m e t a b o l i c p r o d u c t s o f h y d r o l y s i s - f e r m e n t a t i o n . I s o b u t y r a t e a n d 2 - m e t h y l b u t y r a t e a r e i n t e r m e d i a t e s o f t h e a n a e r o b i c d i g e s t i o n o f p r o t e i n s ( M c I n e r n e y , 1 9 8 8 ) . I s o b u t y r a t e , v a l e r a t e a n d 2 - m e t h y l b u t y r a t e w e r e o b s e r v e d i n l a b o r a t o r y - s c a l e U A S B r e a c t o r s c o n t a i n i n g e i t h e r t h e R - g r a n u l e s o r F - g r a n u l e s ( C h a p t e r 3 ) a n d d u r i n g b a t c h b o t t l e e x p e r i m e n t s u s i n g g r a n u l e s f r o m a f u l l - s c a l e U A S B r e a c t o r t r e a t i n g b r e w e r y w a s t e w a t e r ( C h a p t e r 4 ) , w h e n a V F A m i x t u r e c o n s i s t i n g o f a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e w a s u s e d a s t h e o n l y a d d e d s u b s t r a t e s . T h e a p p e a r a n c e o f i s o b u t y r a t e d u r i n g s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d a t i o n i s b e l i e v e d t o b e t h e p r e s e n c e o f a r e v e r s i b l e i s o m e r i z a t i o n r e a c t i o n b e t w e e n b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e ( T h o l o z a n e t a l . , 1 9 8 8 a ; A g u i l a r e t a l . , 1 9 9 0 ) . H o w e v e r , t h e m e c h a n i s m o f t h e i s o m e r i z a t i o n i s p o o r l y u n d e r s t o o d . H o w v a l e r a t e a n d 2 - m e t h y l b u t y r a t e a r e f o r m e d f r o m a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e i s n o t c l e a r . I n C h a p t e r 4 , b o t h H 2 a n d f o r m a t e w e r e o b s e r v e d a s i n t e r m e d i a t e p r o d u c t s 2 1 3 2 1 4 d u r i n g s y n t r o p h i c e t h a n o l d e g r a d a t i o n . T h e r o l e o f h y d r o g e n a n d f o r m a t e i n i n t e r s p e c i e s e l e c t r o n t r a n s f e r d u r i n g V F A d e g r a d a t i o n a n d t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n h y d r o g e n a n d f o r m a t e , h o w e v e r , r e q u i r e s f u r t h e r e v a l u a t i o n . I n p r e v i o u s s t u d i e s ( C h a p t e r 5 ) , fi v e m e t h a n o g e n s a n d f o u r s y n t r o p h i c V F A - d e g r a d i n g c u l t u r e s w e r e i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s d e v e l o p e d o n a n V F A m i x t u r e . T h e s e c u l t u r e s c o u l d u t i l i z e a l l t h e f a t t y a c i d s m e n t i o n e d a b o v e . A m o n g fi v e m e t h a n o g e n s i s o l a t e d f r o m g r a n u l e s d e v e l o p e d o n t h e V F A m i x t u r e , f o u r s t r a i n s c o u l d u t i l i z e H r C O 2 a n d t h r e e s t r a i n s c o u l d c o n v e r t f o r m a t e t o m e t h a n e ( C h a p t e r 5 ) . I n t h i s c h a p t e r , c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e m e t a b o l i s m o f f a t t y a c i d s w i t h t h r e e t o fi v e c a r b o n a t o m s ( w h i c h w e r e f e e d c o m p o n e n t s o r o b s e r v e d i n t h e p r e v i o u s r e a c t o r e x p e r i m e n t s ) b y t h e s e d e fi n e d c u l t u r e s a n d c o m p a r i s o n o f r e s u l t s f r o m t h e g r a n u l e s w a s p e r f o r m e d . T h i s c o m p a r i s o n a l l o w e d t e n t a t i v e i d e n t i fi c a t i o n o f t h e s p e c i e s r e s p o n s i b l e f o r t h e d i f f e r e n t m e t a b o l i c s t e p s a n d p o s s i b l e p a t h w a y s i n v o l v e d . T h e i s o m e r i z a t i o n b e t w e e n b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e , t h e i n t e r s p e c i e s e l e c t r o n t r a n s f e r , a n d f o r m a t e s y n t h e s i s f r o m I - 1 2 p l u s H C O 3 ' a r e a l s o d i s c u s s e d . 6 . 2 M A T E R I A L S A N D M E T H O D S M e d i u m a n d a n a l y t i c a l m e t h o d s a r e d e s c r i b e d i n A p p e n d i x A . F r e e e n e r g y c a l c u l a t i o n s a r e p r e s e n t e d i n A p p e n d i x E . 6 . 2 . 1 S o u r c e s o f c u l t u r e s T h e R - g r a n u l e s w e r e d e v e l o p e d a n d m a i n t a i n e d i n l a b - s c a l e U A S B r e a c t o r s , a s d e s c r i b e d i n C h a p t e r 3 . D e fi n e d c u l t u r e s u s e d f o r t h e d i f f e r e n t a s s a y s a r e d e s c r i b e d i n 2 1 5 T a b l e 6 . 1 . T h e s e c u l t u r e s w e r e i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s o r o b t a i n e d f r o m c o m m e r c i a l c u l t u r e c o l l e c t i o n s ( C h a p t e r 5 ) . T a b l e 6 . 1 D e fi n e d c u l t u r e s u s e d f o r c h a r a c t e r i z a t i o n o f s u b s t r a t e m e t a b o l i s m C u l t u r e O b j e c t i v e o f t h e a s s a y 1 . M o n o c u l t u r e a ) M b . f o r m i c i c u m M F H 2 a n d f o r m a t e m e t a b o l i s m b ) M b . f o m r i c i c u m T I N H 2 a n d f o r m a t e m e t a b o l i s m c ) M b . f o r m i c i c u m R F H 2 a n d f o r m a t e m e t a b o l i s m ( 1 ) M s p . h u n g a t e i B D H 2 a n d f o r m a t e m e t a b o l i s m e ) M s . m a z e i T 1 8 H 2 a n d a c e t a t e m e t a b o l i s m 2 . C o c u l t u r e a ) S t r a i n P T p l u s M b . f o r m i c i c u m T I N P r o p i o n a t e d e g r a d a t i o n b ) S t r a i n P W p l u s M s p . h u n g a t e i B D P r o p i o n a t e d e g r a d a t i o n c ) S t r a i n B H p l u s M b . f o r m i c i c u m T I N V F A ( C 4 a n d C 5 ) d e g r a d a t i o n 3 . T r i c u l t u r e S t r a i n I B , M s . m a z e i T 1 8 a n d V F A d e g r a d a t i o n , i s o m e r i z a t i o n , M b . f o r m i c i c u m T I N I n t e r s p e c i e s e l e c t r o n t r a n s f e r 6 . 2 . 2 E x p e r i m e n t a l p r o c e d u r e s A l l e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d u s i n g 1 5 8 m L s e r u m b o t t l e s c o n t a i n i n g 5 0 m L m e d i a a t 3 5 ° C a n d 3 7 ° C f o r t h e a n a e r o b i c g r a n u l e s a n d d e fi n e d c u l t u r e s , r e s p e c t i v e l y . T h e b o t t l e s w e r e p l a c e d h o r i z o n t a l l y i n a N e w B r u n s w i c k s h a k i n g w a t e r b a t h o p e r a t e d a t 1 2 5 s t r o k e s / m i n t o r e d u c e m a s s t r a n s f e r r e s i s t a n c e f o r H 2 . P r i o r t o i n o c u l a t i o n , a l l t h e b o t t l e s w e r e b r o u g h t t o t h e d e s i r e d t e m p e r a t u r e b y p l a c i n g t h e b o t t l e s i n t h e w a t e r b a t h . T h e g r o w t h o f m e t h a n o g e n s a n d s y n t r o p h i c c u l t u r e s w a s m o n i t o r e d b y d e t e r m i n i n g m e t h a n e p r o d u c t i o n , s u b s t r a t e c o n s u m p t i o n , a n d i n t e r m e d i a t e o r e n d 2 1 6 p r o d u c t f o r m a t i o n . 6 . 2 . 3 C a l c u l a t i o n o f c o n v e r s i o n r a t e s f o r i s o b u t y r a t e - b u t y r a t e d e g r a d a t i o n S y n t r o p h i c d e g r a d a t i o n o f b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e i n v o l v e s t h r e e r e a c t i o n s : i ) i s o m e r i z a t i o n o f b u t y r a t e t o i s o b u t y r a t e , i i ) i s o m e r i z a t i o n o f i s o b u t y r a t e t o b u t y r a t e , a n d i i i ) B - o x i d a t i o n o f b u t y r a t e t o a c e t a t e a n d f o r m a t e o r H 2 . T h i s m o d e l c a n b e e x p r e s s e d a s : v 1 v 3 i s o b u t y r a t e ~ b u t y r a t e — > 2 a c e t a t e + 2 f o r m a t e ( o r H , ) ( 6 - 1 ) V 2 w h e r e , V 1 i s t h e r a t e o f b u t y r a t e t o i s o b u t y r a t e , v 2 i s t h e r a t e o f i s o b u t y r a t e t o b u t y r a t e , a n d v 3 i s t h e r a t e o f b u t y r a t e t o a c e t a t e a n d f o r m a t e o r H 2 . C a l c u l a t i o n o f t h e r a t e s f o r v 1 a n d v 2 i s d i f fi c u l t w h e n t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e c o n c e n t r a t i o n s o f b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e i s n o t s i g n i fi c a n t l y h i g h . W h e n S b > S n » t h e i s o m e r i z a t i o n o f i s o b u t y r a t e t o b u t y r a t e i s t h e r m o d y n a m i c a l l y u n f a v o r a b l e ( s e e 6 . 4 . 3 ) a n d t h e a p p a r e n t r a t e f o r b u t y r a t e t o i s o b u t y r a t e ( v 1 ) c a n b e e s t i m a t e d a s : V 1 = ( S i b z ' s i b l ) / ( t 2 ' t l ) ( 6 - 2 ) S i m i l a r l y , w h e n S i t , > S b , t h e a p p a r e n t r a t e f o r i s o b u t y r a t e t o b u t y r a t e ( v g c a n b e a p p r o x i m a t e l y c a l c u l a t e d a s : V 2 : ( S i b l ' s i b Q / ( t z ‘ t r ) ( 6 ' 3 ) T h e r a t e f o r v 3 c a n b e c a l c u l a t e d a s : V 3 : ( S i m ' S i b 2 + s b 1 ' s b z ) / ( t 2 ' t 1 ) ( 6 ’ 4 ) w h e r e , S i b l a n d S m , o r S b l a n d s z a r e t h e c o n c e n t r a t i o n s o f i s o b u t y r a t e o r b u t y r a t e a t t i m e t 2 a n d t 1 , r e s p e c t i v e l y . 6 . 2 . 4 P e r t u r b a t i o n w i t h f o r m a t e a n d H 2 P e r t u r b a t i o n w i t h f o r m a t e o r h y d r o g e n w a s u s e d t o i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t o f f o r m a t e o r H 2 o n s y n t r o p h i c b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n . W e l l - g r o w n 2 1 7 s y n t r o p h i c V F A - d e g r a d i n g c u l t u r e s w e r e u s e d . A t t h e b e g i n n i n g o f e x p e r i m e n t s , t h e h e a d s p a c e o f t h e b o t t l e s w a s r e p l a c e d b y a n N z - C O 2 ( 7 0 : 3 0 ) g a s m i x t u r e t o o b t a i n a p H o f a b o u t 7 . 0 , a n d t h e n a s u b s t r a t e ( b u t y r a t e o r i s o b u t y r a t e ) s t o c k s o l u t i o n w a s a d d e d t o t h e b o t t l e s t o o b t a i n a fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f a b o u t 2 m M . T h e b o t t l e s w e r e t h e n i n c u b a t e d i n t h e w a t e r b a t h f o r a b o u t 8 t o 1 2 h o u r s t o a c t i v a t e c e l l s . S u b s e q u e n t l y , s u b s t r a t e ( s t o c k s o l u t i o n ( 1 M ) ) w a s a d d e d t o t h e b o t t l e s b y s y r i n g e i n j e c t i o n t o o b t a i n a s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n o f 5 t o 1 0 m M . A t t h e s a m e t i m e , l i q u i d a n d g a s s a m p l e s w e r e w i t h d r a w n f o r i n i t i a l d e t e r m i n a t i o n o f t h e p H a n d f a t t y a c i d s i n l i q u i d p h a s e , a n d C 0 2 , C H 4 a n d H 2 i n g a s p h a s e . A f t e r s e v e r a l h o u r s o f i n c u b a t i o n , a n a e r o b i c s o d i u m f o r m a t e s t o c k s o l u t i o n ( 4 M ) w a s a d d e d i n t o t h e c u l t u r e s t o p r o v i d e a c o n c e n t r a t i o n o f 1 5 t o 1 6 m M t o e x a m i n e t h e e f f e c t o f f o r m a t e o n t h e s y n t r o p h i c V F A c o n v e r s i o n . T o e x a m i n e t h e e f f e c t o f H z , I 1 2 g a s w a s a d d e d b y s y r i n g e i n j e c t i o n i n t o t h e h e a d s p a c e o f t h e b o t t l e s . T h e p H , f a t t y a c i d s , C H 4 a n d 1 1 2 w e r e m o n i t o r e d c o n t i n u o u s l y t h r o u g h o u t t h e e x p e r i m e n t s . C O 2 w a s d e t e r m i n e d a t t h e e n d o f e a c h e x p e r i m e n t . T h e b i c a r b o n a t e c o n c e n t r a t i o n i n t h e l i q u i d p h a s e w a s e s t i m a t e d f r o m p H a n d C O 2 p a r t i a l p r e s s u r e i n g a s p h a s e a c c o r d i n g t o H e n r r y ’ s l a w a n d b i c a r b o n a t e - C O 2 e q u i l i b r i u m a t 3 7 ° C ( S n o e y i n k a n d J e n k i n s , 1 9 8 0 ) . 6 . 3 S Y N T R O P H I C M E T A B O L I S M O F F A T T Y A C I D S F a t t y a c i d d e g r a d a t i o n w a s c h a r a c t e r i z e d u s i n g b o t h t h e R - g r a n u l e s a n d d e fi n e d s y n t r o p h i c c u l t u r e s i n o r d e r t o i d e n t i f y t h e r o l e o f i n d i v i d u a l a c e t o g e n s i n f a t t y a c i d m e t a b o l i s m b y t h e g r a n u l e e c o s y s t e m P r o p i o n a t e , b u t y r a t e , i s o b u t y r a t e , v a l e r a t e a n d 2 - m e t h y l b u t y r a t e w e r e u s e d a s s u b s t r a t e s s i n c e t h e y w e r e f e e d c o m p o n e n t s f o r t h e g r a n u l e s o r t h e y w e r e f o u n d i n t h e r e a c t o r e f fl u e n t ( C h a p t e r 3 ) . 2 1 8 6 . 3 . 1 S y n t r o p h i c d e g r a d a t i o n o f f a t t y a c i d s b y g r a n u l e s S i m u l t a n e o u s d e g r a d a t i o n o f a c e t a t e , p r o p i o n a t e , a n d b u t y r a t e b y t h e R - g r a n u l e s i s i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 6 . 1 . B u t y r a t e w a s c o n s u m e d m u c h q u i c k e r t h a n p r o p i o n a t e s i n c e t h e s e g r a n u l e s h a d a h i g h e r s p e c i fi c a c t i v i t y f o r b u t y r a t e ( T a b l e 3 . 5 i n C h a p t e r 3 ) . A t t h e b e g i n n i n g o f t h e a s s a y , a c e t a t e a c c u m u l a t e d s i n c e t h e t o t a l r a t e o f a c e t o g e n e s i s f r o m p r o p i o n a t e p l u s b u t y r a t e w a s m u c h h i g h e r t h a n t h a t o f a c e t a t e u t i l i z a t i o n . W i t h i n t h e i n i t i a l 3 4 h o u r s , i s o b u t y r a t e , v a l e r a t e a n d 2 — m e t h y l b u t y r a t e a c c u m u l a t e d t o t h e h i g h e s t l e v e l s e a c h a t t a i n e d a n d t h e n d e c r e a s e d a s t h e b u t y r a t e c o n c e n t r a t i o n d e c r e a s e d t o l e s s t h a n 1 m M . T h e h y d r o g e n p a r t i a l p r e s s u r e o b s e r v e d w a s p r o p o r t i o n a l t o t h e b u t y r a t e p l u s p r o p i o n a t e c o n c e n t r a t i o n s . H i g h e r b u t y r a t e a n d p r o p i o n a t e l e v e l s r e s u l t e d i n h i g h e r h y d r o g e n l e v e l s . F o r m a t e w a s n o t d e t e c t e d ( < 5 u M ) . W h e n b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e w e r e u s e d a s s u b s t r a t e s , a r e v e r s i b l e i s o m e r i z a t i o n w a s o b s e r v e d . I s o b u t y r a t e w a s p r o d u c e d d u r i n g b u t y r a t e d e g r a d a t i o n a n d v i c e v e r s a ( F i g u r e 6 . 2 A a n d B ) . T h e l e v e l o f i s o b u t y r a t e f o r m e d d u r i n g b u t y r a t e d e g r a d a t i o n , h o w e v e r , w a s m u c h h i g h e r t h a n t h e c o n c e n t r a t i o n o f b u t y r a t e t h a t a c c u m u l a t e d d u r i n g i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n . I n t h e b o t h c a s e s i s o b u t y r a t e p e r s i s t e d l o n g e r . H y d r o g e n a n d a c e t a t e w e r e i n t e r m e d i a t e s . N e i t h e r v a l e r a t e n o r 2 - m e t h y l b u t y r a t e w e r e o b s e r v e d . W h e n p r o p i o n a t e w a s u s e d a s t h e p r i m a r y s u b s t r a t e , a c e t a t e c o n c e n t r a t i o n s r e m a i n e d l o w ( < 0 . 3 m M ) . T h i s i s b e c a u s e t h e g r a n u l e s h a d a h i g h e r m a x i m u m s p e c i fi c c o n v e r s i o n r a t e o f a c e t a t e t h a n t h a t o f p r o p i o n a t e ( T a b l e 3 . 5 i n C h a p t e r 3 ) . T h e h y d r o g e n p r e s s u r e r e m a i n e d l o w ( < 7 P a ) d u r i n g p r o p i o n a t e c o n v e r s i o n a n d n o o t h e r f a t t y a c i d s w e r e d e t e c t e d . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e i s o m e r i z a t i o n b e t w e e n b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e w a s p e r f o r m e d b y s o m e o r g a n i s m s d u r i n g b u t y r a t e d e g r a d a t i o n . N o f o r m a t i o n o f v a l e r a t e a n d 2 - m e t h y l b u t y r a t e d u r i n g e i t h e r p r o p i o n a t e o r b u t y r a t e d e g r a d a t i o n i n d i c a t e s t h a t t h e f o r m a t i o n o f t h e s e a c i d s r e q u i r e b u t y r a t e t o g e t h e r w i t h p r o p i o n a t e . 2 1 9 ’ 7 ; 9 ' 1 é g o < C E 9 g I o I I I I I I o 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 0 a A c e t a t e - 1 E E ‘ 4 “ A P r o p i o n a t e E g _ ‘ A I B u t y r a t e - 0 3 g E 8 \ ‘ o i s o b u t y r a t e g E g 5 5 a V a l e r a t e 3 g 8 I L ! 6 l - 2 4 m t h y l b u t y r a t e . . 0 . 5 g t a : < . a a “ m - 0 . 4 E $ 5 ' 5 5 “ i t E a : _ 0 2 a g 2 O 2 8 N 9 s 0 0 T I M E ( h r ) F i g u r e 6 . 1 S i m u l t a n e o u s d e g r a d a t i o n o f a m i x t u r e c o n s i s t i n g a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e b y t h e R - g r a n u l e s . I s o b u t y r a t e , v a l e r a t e , 2 — m e t h y l b u t y r a t e a n d h y d r o g e n a c c u m u l a t e d d u r i n g i n i t i a l p o r t i o n o f t h e a s s a y a n d w e r e t h e n c o n s u m e d . ) M m ( S D I C A Y T T A F 2 2 0 A A c e t a t e 1 4 O A Q I s o b u t y r a t e F 1 4 1 2 . o B u t y r a t e 1 2 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 T I M E ( h r s ) F i g u r e 6 . 2 B u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y t h e R - g r a n u l e s . ( A ) B u t y r a t e f o r m a t i o n d u r i n g s y n t r o p h i c i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n . ( B ) I s o b u t y r a t e f o r m a t i o n d u r i n g s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d a t i o n . 2 2 1 6 . 3 . 2 E n d p r o d u c t s o f s y n t r o p h i c f a t t y a c i d d e g r a d a t i o n b y d e fi n e d c u l t u r e s i ) S y n t r o p h i c p r o p i o n a t e d e g r a d e r s T h e c o c u l t u r e o f s y n t r o p h i c p r o p i o n a t e d e g r a d e r s t r a i n P T p l u s M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N a n d t h e c o c u l t u r e o f p r o p i o n a t e d e g r a d e r s t r a i n P W a n d M s p . h u n g a t e i s t r a i n B D h a d t h e s a m e e n d p r o d u c t s f o r p r o p i o n a t e d e g r a d a t i o n ( T a b l e 6 . 2 ) . T h e m o l e r a t i o f o r p r o p i o n a t e c o n s u m e d , m e t h a n e p r o d u c e d , a n d a c e t a t e p r o d u c e d i s c a . 1 : 0 . 7 5 : 1 . H y d r o g e n ( f r o m a n i n i t i a l c a . 8 P a t o fi n a l l e v e l o f 2 P a ) w a s o b s e r v e d d u r i n g s y n t r o p h i c p r o p i o n a t e d e g r a d a t i o n . F o r m a t e w a s n o t d e t e c t e d ( l o w e r t h a n 5 p M ) . T a b l e 6 . 2 E n d p r o d u c t s o f p r o p i o n a t e d e g r a d a t i o n b y s y n t r o p h i c c o c u l t u r e s ( m m o l e p e r m o l e p r o p i o n a t e c o n s u m e d ) C u l t u r e C H 4 a c e t a t e s t r a i n P I ‘ p l u s s t r a i n T I N 0 . 7 4 0 . 9 7 s t r a i n P W p l u s s t r a i n B D 0 . 7 3 0 . 9 6 T h e s e c o c u l t u r e s d i d n o t u t i l i z e b u t y r a t e a n d o t h e r f a t t y a c i d s . B u t y r a t e a n d o t h e r f a t t y a c i d s w e r e a l s o n o t d e t e c t e d d u r i n g p r o p i o n a t e d e g r a d a t i o n . T h i s i n d i c a t e s t h a t t h e d e g r a d a t i o n o f p r o p i o n a t e b y t h e s e c o c u l t u r e s m a y f o l l o w t h e m e t h y l m a l o n y l - C o A p a t h w a y ( K o c h e t a l . , 1 9 8 3 ; M u c h a e t a l . , 1 9 8 8 ) r a t h e r t h a n t h e r e d u c t i v e c a r b o x y l a t i o n - a c e t o g e n e s i s p a t h w a y i n w h i c h b u t y r a t e i s a n i n t e r m e d i a t e 2 2 2 ( T h o l o z a n e t a l . , 1 9 8 8 b , 1 9 9 0 ) . N e i t h e r v a l e r a t e n o r 2 - m e t h y l b u t y r a t e w a s d e t e c t e d d u r i n g t h e d e g r a d a t i o n o f p r o p i o n a t e i n t h e p r e s e n c e o f b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e . T h i s i n d i c a t e s t h a t t h e s e t w o p r o p i o n a t e d e g r a d e r s a r e n o t i n v o l v e d i n t h e f o r m a t i o n o f v a l e r a t e a n d 2 - m e t h y l b u t y r a t e . T a b l e 6 . 3 E n d p r o d u c t s o f V F A d e g r a d a t i o n b y d e fi n e d b u t y r a t e d e g r a d i n g c u l t u r e s ( m m o l e p e r m o l e s u b s t r a t e c o n s u m e d ) C u l t u r e s S u b s t r a t e N u m b e r B H p l u s T I N I B , T I N a n d T 1 8 o f c a r b o n s C H . 4 a c e t a t e p r o p i o n a t e C P L p r o p i o n a t e b u t y r a t e 4 0 . 4 7 2 . 0 1 0 2 . 4 6 0 i s o b u t y r a t e 4 N D 2 . 4 4 0 v a l e r a t e 5 1 . 0 2 0 . 9 6 0 . 4 6 1 . 5 2 0 . 9 1 2 — m e t h y l b u t y r a t e 5 1 . 0 1 0 . 9 7 0 . 4 7 1 . 4 9 0 . 9 2 c a p r o a t e 6 0 . 8 8 2 . 8 2 0 3 . 8 4 0 4 - m e t h y l v a l e r a t e 6 N D 3 . 8 2 0 h e p t a n o a t e 7 0 . 9 9 2 . 0 0 . 9 8 2 . 4 6 0 . 9 9 2 - m e t h y l h e x a n o a t e 7 N D 2 . 4 9 0 . 9 7 c a p r y l a t e 8 1 . 4 5 3 . 8 2 0 4 . 6 5 0 p e l a r g o a t e 9 0 . 7 3 2 . 9 7 0 . 9 8 3 . 7 2 0 . 9 0 ( 1 ) E x p e r i m e n t w a s p e r f o r m e d a t 3 5 ° C . I n i t i a l V F A c o n c e n t r a t i o n w a s 1 0 m M f o r t h e a c i d s w i t h 4 t o 6 c a r b o n a t o m s , 5 m M f o r t h o s e w i t h 7 a t o m s , a n d 2 . 5 m M f o r t h o s e w i t h 8 t o 9 a t o m s , r e s p e c t i v e l y . I n i t i a l p H w a s 7 . 0 t o 7 . 1 . ( 2 ) N D : n o t d e t e r m i n e d . ( 3 ) T I N : M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N ; T 1 8 : M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 ; B s z u t y r a t e d e g r a d e r s t r a i n B H ; I B : i s o b u t y r a t e - b u t y r a t e d e g r a d e r s t r a i n [ 3 . 2 2 3 i i ) S y n t r o p h i c b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e d e g r a d e r s T h e e n d p r o d u c t s p r o d u c e d p e r m o l e o f s u b s t r a t e f o r t h e c o c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n B H a n d M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N a n d t h e t r i c u l t u r e c o n s i s t i n g o f i s o b u t y r a t e - b u t y r a t e d e g r a d e r s t r a i n I B , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N a n d M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 6 . 3 . C o n s i d e r i n g t h a t o n e m o l e o f a c e t a t e p r o d u c e d f r o m s y n t r o p h i c a c e t o g e n e s i s s h o u l d b e c o n v e r t e d t o c a . o n e m o l e o f m e t h a n e b y M s . m a z e i T 1 8 , t h e e n d p r o d u c t s o f b o t h c u l t u r e s w e r e b a s i c a l l y t h e s a m e f o r t h e d e g r a d a t i o n o f n o r m a l c a r b o x y l i c s a t u r a t e d f a t t y a c i d s w i t h f o u r o r m o r e c a r b o n a t o m s . B a s e d o n t h e n a t u r e o f t h e e n d p r o d u c t s , t h e d e g r a d a t i o n a p p e a r s t o f o l l o w fi - o x i d a t i o n , a s d e s c r i b e d i n T a b l e 1 . 3 i n C h a p t e r 1 . A s f a r a s b r a n c h e d f a t t y a c i d s a r e c o n c e r n e d , b o t h c u l t u r e s w e r e a b l e t o d e g r a d e 2 - m e t h y l b u t y r a t e . A s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e i s t h a t s t r a i n I B w a s a b l e t o d e g r a d e i s o b u t y r a t e w h i l e s t r a i n B H d i d n o t . 6 . 3 . 3 M e t a b o l i s m o f V F A b y a c o c u l t u r e o f s t r a i n B H p l u s M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n T I N I n t h e f o l l o w i n g e x p e r i m e n t s , t h e r e s p e c t i v e t i m e c o u r s e f o r d e g r a d a t i o n o f b u t y r a t e , v a l e r a t e , a n d 2 - m e t h y l b u t y r a t e b y a c o c u l t u r e o f s t r a i n B H a n d M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T l N w a s m o n i t o r e d t o i n v e s t i g a t e t h e m e t a b o l i c p a t h w a y s i n v o l v e d . T h e d e g r a d a t i o n o f b u t y r a t e i n t h e p r e s e n c e o f p r o p i o n a t e w a s a l s o e x a m i n e d t o i d e n t i f y w h e t h e r t h i s c o c u l t u r e c o u l d s y n t h e s i z e v a l e r a t e a n d 2 - m e t h y l b u t y r a t e . i ) G r o w t h o n b u t y r a t e T h e g r o w t h o f t h e c o c u l t u r e o n b u t y r a t e i s i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 6 . 3 . A c e t a t e c o n c e n t r a t i o n i n c r e a s e d f r o m a n i n i t i a l l e v e l o f 2 . 3 m M ( a d d e d w i t h i n o c u l u m ) a t a m o l a r r a t i o o f a p p r o x i m a t e l y 1 . 9 ( a c e t a t e p r o d u c e d p e r b u t y r a t e c o n s u m e d ) . N o i s o b u t y r a t e w a s o b s e r v e d , i n d i c a t i n g t h i s c o c u l t u r e d o e s n o t c a r r y o u t i s o m e r i z a t i o n 2 2 4 b e t w e e n b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e . H y d r o g e n w a s o b s e r v e d p r o d u c e d d u r i n g t h e s y n t r o p h i c d e g r a d a t i o n . T h e m a x i m u m o b s e r v e d p a r t i a l p r e s s u r e o f h y d r o g e n w a s l e s s t h a n 2 0 P a . F o r m a t e w a s n o t d e t e c t e d ( < 5 M ) . i i ) G r o w t h o n v a l e r a t e a n d 2 - m e t h y l b u t y r a t e W h e n t h i s c o c u l t u r e w a s g r o w n o n e i t h e r v a l e r a t e o r 2 - m e t h y l b u t y r a t e , t h e a m o u n t s o f a c e t a t e a n d p r o p i o n a t e p r o d u c e d w e r e p r o p o r t i o n a l o n a m o l a r b a s i s t o t h e a m o u n t o f v a l e r a t e o r 2 - m e t h y l b u t y r a t e c o n s u m e d ( 0 . 9 7 o r 0 . 9 8 ) . 2 0 A 3 ? E - 1 5 9 : I E z - 1 0 ( 5 < O E 5 E 2 E o 2 0 0 1 1 4 A E ~ 1 2 5 E E - 1 0 v L L I I n - 8 I - . — E ' ° 5 o ' 4 E < ‘ 2 m o 2 0 0 T I M E ( h r ) F i g u r e 6 . 3 T h e g r o w t h o f t h e c o c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n B H a n d M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T l N o n b u t y r a t e . A c e t a t e a n d m e t h a n e w e r e e n d p r o d u c t s . H y d r o g e n g a s w a s o b s e r v e d d u r i n g b u t y r a t e d e g r a d a t i o n . ) M m ( u I d — I d N A E . { E 1 M . . l l H T 8 9 ° 8 1 l E T A ) M m ( N O I P E O T R A P R a Y , T E U 3 T B A T R O E C A 2 2 5 i i i ) G r o w t h o n b u t y r a t e i n t h e p r e s e n c e o f p r o p i o n a t e T h e g r o w t h o f t h i s c o c u l t u r e o n b u t y r a t e i n t h e p r e s e n c e o f p r o p i o n a t e i s s h o w n i n F i g u r e 6 . 4 . c o n c e n t r a t i o n s w e r e c a 2 . 4 , 8 . 8 a n d 1 2 . 3 m M , r e s p e c t i v e l y . h y d r o g e n a n d v a l e r a t e w e r e p r o d u c e d d u r i n g s y n t r o p h i c o x i d a t i o n o f b u t y r a t e . V a l e r a t e a c c u m u l a t e d u p t o a p e a k c o n c e n t r a t i o n o f c a . 0 . 1 1 m M a n d w a s s u b s e q u e n t l y d e g r a d e d w h e n t h e b u t y r a t e c o n c e n t r a t i o n s d e c r e a s e d . F i g u r e 6 . 4 3 - 2 . 5 - 4 1 T h e g r o w t h o f t h e c o c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n B H a n d M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N o n b u t y r a t e i n t h e p r e s e n c e o f p r o p i o n a t e . A c e t a t e a n d m e t h a n e w e r e e n d p r o d u c t s . H y d r o g e n a n d v a l e r a t e w e r e o b s e r v e d , . . . . . . . a “ 1 m : 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 A A c e t a t e I P r o p l o n a t e O B u t y r a t e A V a l e r a t e , - - - - - - - - - - e e e I e e . 0 0 T I M E ( h r s ) d u r i n g b u t y r a t e d e g r a d a t i o n . A A A A A T h e i n i t i a l a c e t a t e ( f r o m i n o c u l u m ) , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e 8 H Y D R O G E N ( P a ) ~ 0 3 g 5 h a s E ~ o . 4 E - I - 0 2 § A c e t a t e , m e t h a n e , 2 2 6 T o t e s t i f p r o p i o n a t e d e g r a d a t i o n w a s p e r f o r m e d b y t h e c o c u l t u r e a n d i f v a l e r a t e c o u l d b e f o r m e d i n t h e a b s e n c e o f b u t y r a t e , a c o n t r o l e x p e r i m e n t w a s c a r r i e d o u t b y i n o c u l a t i n g t h e c o c u l t u r e i n t o a m e d i u m c o n t a i n i n g 1 0 m M a c e t a t e a n d 1 0 m M p r o p i o n a t e . A f t e r 3 m o n t h s o f i n c u b a t i o n , n e i t h e r p r o p i o n a t e n o r a c e t a t e w a s c o n s u m e d , a n d n o o t h e r f a t t y a c i d s w e r e f o r m e d . T o f u r t h e r i d e n t i f y i f t h e f o r m a t i o n o f v a l e r a t e w a s c o u p l e d w i t h s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d a t i o n , t w o a d d i t i o n a l e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d . P r 0 p i o n a t e ( 8 m M ) o r p r o p i o n a t e ( 8 m M ) p l u s b u t y r a t e ( 1 0 m M ) w e r e a d d e d t o a p r e - g r o w n c o c u l t u r e i n w h i c h b u t y r a t e h a d b e e n c o n s u m e d t o a v e r y l o w l e v e l ( < O . l m M ) a n d a c e t a t e ( 2 0 m M ) h a d a c c u m u l a t e d . H y d r o g e n ( 1 . 3 a t m ) w a s a d d e d t o i n h i b i t s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d a t i o n . I n t h e e x p e r i m e n t u s i n g p r o p i o n a t e p l u s b u t y r a t e , v a l e r a t e w a s d e t e c t e d o n l y a f t e r h y d r o g e n w a s c o n s u m e d t o a l o w l e v e l ( < 4 P a ) a n d b u t y r a t e d e g r a d a t i o n h a d b e g a n . N o v a l e r a t e w a s f o r m e d i n t h e e x p e r i m e n t i n t h e a b s e n c e o f b u t y r a t e . T h e s e r e s u l t s r e v e a l t h a t v a l e r a t e w a s s y n t h e s i z e d f r o m p r o p i o n a t e a n d t h e s y n t h e s i s r e a c t i o n w a s c o u p l e d t o a c t i v e s y n t r o p h i c b u t y r a t e o x i d a t i o n . 6 . 3 . 4 M e t a b o l i s m o f V F A b y a t r i c u l t u r e c o n t a i n i n g s t r a i n I B , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N a n d M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 T h e d e g r a d a t i o n p r o c e s s e s o f b u t y r a t e , i s o b u t y r a t e , v a l e r a t e , a n d 2 — m e t b y 1 b u t y r a t e b y a t r i c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n I B , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T l N a n d M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 w e r e m o n i t o r e d t o i n v e s t i g a t e w h a t i n t e r m e d i a t e s w e r e p r o d u c e d . T h e d e g r a d a t i o n o f b u t y r a t e i n t h e p r e s e n c e o f p r o p i o n a t e w a s a l s o e x a m i n e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h i s t r i c u l t u r e w e r e a b l e t o s y n t h e s i z e v a l e r a t e a n d 2 - m e t h y l b u t y r a t e . i ) G r o w t h o n b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e T h e g r o w t h o f t h e t r i c u l t u r e o n b u t y r a t e i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 6 . 5 . A f t e r 2 2 7 i n o c u l a t i o n , b u t y r a t e w a s d e g r a d e d w i t h c o n c u r r e n t p r o d u c t i o n o f i s o b u t y r a t e . T h e h i g h e s t c o n c e n t r a t i o n o f i s o b u t y r a t e d e t e c t e d w a s 0 . 7 5 m M . T h i s o c c u r r e d a s t h e b u t y r a t e c o n c e n t r a t i o n d e c r e a s e d f o r m 7 . 2 t o 3 . 1 m M . S u b s e q u e n t l y , b o t h w e r e s i m u l t a n e o u s l y d e g r a d e d w i t h c o n c u r r e n t p r o d u c t i o n a n d c o n s u m p t i o n o f a c e t a t e . T h e h y d r o g e n p a r t i a l p r e s s u r e i n t h e b o t t l e r e a c h e d a p e a k l e v e l o f 1 8 . 5 P a a t 4 8 h o u r s o f i n c u b a t i o n a n d e v e n t u a l l y d e c r e a s e d t o t h e i n i t i a l l e v e l o f 4 . 8 P a . g E < 8 I a : t i 2 2 z : z 2 ' 2 E m B u t y r a t e 0 2 O 0 < u . > o 1 6 0 ' 2 6 0 ' 3 6 0 ' 4 6 0 ' 5 6 0 6 0 0 T I M E ( h r ) F i g u r e 6 . 5 T h e g r o w t h o f t h e t r i c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n I B , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T l N a n d M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 o n b u t y r a t e . A c e t a t e , w h i c h w a s t h e n c o n v e r t e d t o m e t h a n e b y M s . m a z e i T 1 8 , a n d m e t h a n e w e r e e n d p r o d u c t s o f s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d a t i o n . H y d r o g e n a n d i s o b u t y r a t e w e r e o b s e r v e d d u r i n g b u t y r a t e d e g r a d a t i o n . ) a P ( E G N O H R D Y a ) u m ( N O I T A R T 9 N E C N O C A F V 2 2 8 I n t h e a s s a y u s i n g i s o b u t y r a t e a s t h e s u b s t r a t e , i s o m e r i z a t i o n o f i s o b u t y r a t e t o b u t y r a t e o c c u r r e d i m m e d i a t e l y ( F i g u r e 6 . 6 ) . T h e c o n c e n t r a t i o n o f b u t y r a t e r o s e t o 2 . 4 m M a s t h e i s o b u t y r a t e c o n c e n t r a t i o n d e c r e a s e d f r o m 8 . 0 t o 2 . 7 m M . T h e r e a f t e r , t h e c o n c e n t r a t i o n s o f b o t h a c i d s d e c r e a s e d a t c a . t h e s a m e r a t e . T h e c h a n g e i n h y d r o g e n p a r t i a l p r e s s u r e i n t h e h e a d s p a c e a n d t h e a c e t a t e p r o d u c t i o n a n d c o n s u m p t i o n w a s s i m i l a r t o t h e t i m e - c o u r s e p r o fi l e o b s e r v e d f o r b u t y r a t e d e g r a d a t i o n . T h e h i g h e s t H 2 c o n c e n t r a t i o n o b s e r v e d w a s 2 3 P a . . 1 - : B u t y r a t e N - v r v ' v I V I ' I ' I o 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 T I M E ( h r ) F i g u r e 6 . 6 T h e g r o w t h o f t h e t r i c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n I B , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T l N a n d M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 o n i s o b u t y r a t e . A c e t a t e , w h i c h w a s t h e n c o n v e r t e d t o m e t h a n e b y M s . m a z e i T 1 8 , a n d m e t h a n e w e r e e n d p r o d u c t s o f s y n t r o p h i c i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n . H y d r o g e n a n d b u t y r a t e w e r e o b s e r v e d d u r i n g i s o b u t y r a t e o x i d a t i o n . ) I P ( N E G O R D Y H ) M m ( E N A H T E M ) M m ( E T A R Y T U B R O E T A R Y T U B O S I 2 2 9 W h e n t h e t r i c u l t u r e w a s i n o c u l a t e d i n t h e m e d i u m c o n t a i n i n g a l m o s t t h e s a m e l e v e l s o f b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e ( 4 . 4 a n d 4 . 1 m M , r e s p e c t i v e l y ) , t h e c o n c e n t r a t i o n s o f t h e t w o a c i d s d e c r e a s e d a t a p p r o x i m a t e l y t h e s a m e r a t e u n t i l b o t h w e r e c o m p l e t e l y c o n s u m e d ( F i g u r e 6 . 7 ) . T h e p e a k H 2 c o n c e n t r a t i o n o b s e r v e d d u r i n g t h i s a s s a y w a s 1 6 P a . F o r m a t e w a s n o t d e t e c t e d i n t h e s e o r a n y o f t h e p r e v i o u s e x p e r i m e n t s . T h e s e r e s u l t s d e m o n s t r a t e t h a t s t r a i n [ E c a r r i e s o u t a r e v e r s i b l e i s o m e r i z a t i o n b e t w e e n i s o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e d u r i n g s y n t r o p h i c o x i d a t i o n o f b u t y r a t e o r i s o b u t y r a t e . H y d r o g e n A C E T A T E ( m M ) o 1 6 0 2 6 0 3 6 0 4 6 0 5 6 0 6 6 0 T I M E ( h r ) F i g u r e 6 . 7 T h e g r o w t h o f t h e t r i c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n I B , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T l N a n d M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 o n a n e q u a l m o l a r c o n c e n t r a t i o n s o f i s o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e . 2 3 0 i i ) K i n e t i c a n a l y s i s o f s y n t r o p h i c d e g r a d a t i o n o f i s o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e A f e d b a t c h e x p e r i m e n t w a s p e r f o r m e d t o e s t i m a t e t h e r e l a t i v e r a t e s o f s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d a t i o n a n d t h e i s o m e r i z a t i o n r e a c t i o n . 1 4 ' a s c e u r v m r e u s e s u r v m r a 1 2 a s o e u r v n n e m o m m a . e u r v m r e . . . v s I d § 8 — 1 m a 6 E 6 - E 4 _ 2 . 1 0 . u v u 0 5 0 1 0 0 1 5 0 T I M E ( h r ) 0 I s o b u t y r a t e o B u t y r a t e F i g u r e 6 . 8 B a t c h - f e d e x p e r i m e n t o n i s o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y t h e t r i c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n I B , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N a n d M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 . A n e q u a l l e v e l o f i s o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e o c c u r r e d a f t e r e a c h a d d i t i o n o f s u b s t r a t e . T h e r e s u l t s o f s y n t r o p h i c i s o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e d e g r a d a t i o n i n t h i s f e d b a t c h e x p e r i m e n t i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 6 . 8 . S u b s t r a t e ( i s o b u t y r a t e o r i s o b u t y r a t e p l u s b u t y r a t e ) w a s a d d e d f o u r t i m e s . I n i t i a l l y , o n l y i s o b u t y r a t e ( 1 0 . 5 m M ) w a s p r o v i d e d i n t h e m e d i u m . I s o b u t y r a t e w a s i s o m e r i z e d t o b u t y r a t e u n t i l a n e q u a l l e v e l 2 3 1 ( a p p r o x i m a t e 4 m M o f e a c h b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e ) w a s r e a c h e d . S u b s e q u e n t l y , b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e d i s a p p e a r e d a t a p p r o x i m a t e l y t h e s a m e r a t e , a s o b s e r v e d p r e v i o u s l y . A d d i n g a n o t h e r 1 2 . 3 m M o f i s o b u t y r a t e t o t h e c u l t u r e l e d t o t h e s a m e r e s u l t . T h e t h i r d a d d i t i o n o f s u b s t r a t e w a s p e r f o r m e d u s i n g 9 . 0 m M o f i s o b u t y r a t e a n d 3 . 8 m M o f b u t y r a t e . T h e i s o b u t y r a t e c o n c e n t r a t i o n d e c r e a s e d i m m e d i a t e l y w h i l e l i t t l e c h a n g e w a s o b s e r v e d i n t h e b u t y r a t e c o n c e n t r a t i o n . W h e n t h e c o n c e n t r a t i o n s o f b o t h a c i d s r e a c h e d a p p r o x i m a t e l y e q u a l c o n c e n t r a t i o n t h e y s u b s e q u e n t l y d i s a p p e a r e d a t t h e s a m e r a t e . F i n a l l y , 1 . 6 m M i s o b u t y r a t e a n d 9 . 6 m M b u t y r a t e w e r e s u p p l e m e n t e d i n t o t h e c u l t u r e . T h e c o n c e n t r a t i o n o f b u t y r a t e d e c r e a s e d w h i l e t h e c o n c e n t r a t i o n o f i s o b u t y r a t e i n c r e a s e d . W h e n t h e c o n c e n t r a t i o n s o f t h e t w o a c i d s w e r e e q u a l , t h e y d i s a p p e a r e d a t t h e s a m e r a t e . R e s u l t s o f t h e i s o m e r i z a t i o n a n d c o n v e r s i o n o f b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e w h e n i s o b u t y r a t e o r b u t y r a t e w a s a d d e d a s s u b s t r a t e a n d t h e c a l c u l a t e d n e t d e g r a d a t i o n r a t e s a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 6 . 4 . W h e n o n l y i s o b u t y r a t e w a s a d d e d t o t h e c u l t u r e ( N 0 . 1 i n T a b l e 6 . 4 ) , t h e a p p a r e n t r a t e o f i s o b u t y r a t e t o b u t y r a t e ( v 2 ) w a s a b o u t 4 t i m e s o f t h e d e g r a d a t i o n r a t e o f b u t y r a t e ( v 3 ) . A s b u t y r a t e a c c u m u l a t e d ( f r o m 0 t o 4 . 1 m M ) , t h e b u t y r a t e d e g r a d a t i o n r a t e ( v 3 ) i n c r e a s e d f r o m 0 . 0 9 t o 0 . 2 2 m M / h r . C o n v e r s e l y , w h e n t h e s y s t e m w a s s u p p l i e d w i t h a h i g h e r s t a r t i n g b u t y r a t e c o n c e n t r a t i o n ( 9 . 6 m M ) , t h e h i g h e s t b u t y r a t e d e g r a d a t i o n r a t e ( v 3 = 0 . 4 0 m M / h r ) w a s o b s e r v e d a t t h e b e g i n n i n g o f t h e e x p e r i m e n t . T h i s r a t e w a s t w i c e t h e a p p a r e n t r a t e o f b u t y r a t e t o i s o b u t y r a t e ( v 1 ) . 2 3 2 T a b l e 6 . 4 I s o m e r i z a t i o n a n d c o n v e r s i o n r a t e s o f b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e b y t h e s y n t r o p h i c t r i c u l t u r e o f M b . f o r m i c i c u m T I N , M s . m a z e i T 1 8 a n d s t r a i n I B . N o . t i m e i C 4 C 4 c o n v e r s i o n r a t e ( m M / h r ) h r m M m M v 1 v 2 v 3 1 0 1 0 . 5 0 1 3 . 7 5 . 2 4 . 1 N D 0 . 3 9 0 . 0 9 2 1 . 6 3 . 7 3 . 9 N D N D 0 . 2 2 3 5 . 6 2 . 2 2 . 3 N D . N D 0 . 2 3 4 9 . 8 0 . 5 5 0 . 7 N D N D 0 . 2 2 6 2 . 4 0 0 N D N D 0 . 1 3 2 0 1 . 6 9 . 6 9 . 2 3 . 5 4 . 1 0 . 2 0 N D 0 . 4 0 1 3 . 6 3 . 4 3 . 1 N D N D 0 . 2 3 1 9 . 3 2 . 9 2 . 3 N D N D 0 . 2 3 2 4 . 8 2 . 3 1 . 8 N D N D 0 . 1 9 4 7 . 0 1 . 0 1 . 1 N D N D 0 . 1 3 8 5 . 7 0 . 1 1 0 . 1 2 N D N D 0 . 0 5 ( 1 ) T h e s e q u e n c e o f t i m e b e g i n s u p o n a d d i t i o n o f s u b s t r a t e . ( 2 ) T h e a p p a r e n t r a t e s f o r t h e f o r m a t i o n o f i s o b u t y r a t e f r o m b u t y r a t e ( v 1 ) , t h e f o r m a t i o n o f b u t y r a t e f r o m i s o b u t y r a t e ( v 2 ) , a n d b u t y r a t e d e g r a d a t i o n ( v 3 ) w e r e c a l c u l a t e d f r o m e q u a t i o n s ( 6 - 2 ) , ( 6 - 3 ) a n d ( 6 - 4 ) , r e s p e c t i v e l y . ( 3 ) N D : n o t d e t e r m i n e d . 2 3 3 T h e e x p e r i m e n t a l d a t a p r e s e n t e d i n T a b l e 6 . 4 s h o w s t h a t w h e n i s o b u t y r a t e w a s u s e d a s t h e s o l e s u b s t r a t e , t h e a p p a r e n t c o n v e r s i o n r a t e o f b u t y r a t e t o a c e t a t e a n d m e t h a n e ( v 3 : 0 . 0 9 m M / h r ) w a s m u c h l o w e r t h a n w h e n i s o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e w e r e b o t h p r e s e n t ( v 3 = 0 . 2 2 m M / h r ) . T h i s c o n fi r m e d t h a t b u t y r a t e w a s a n i n t e r m e d i a t e i n t h e d e g r a d a t i o n o f i s o b u t y r a t e ( i . e . i s o b u t y r a t e w a s i s o m e r i z e d t o b u t y r a t e a n d t h e n d e g r a d e d v i a B - o x i d a t i o n ) . T h u s , t h e s y n t r o p h i c c o n v e r s i o n o f i s o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e b y s t r a i n I B i n t h e t r i c u l t u r e i n v o l v e s a t l e a s t t h r e e r e a c t i o n s : ( 1 ) i s o m e r i z a t i o n o f b u t y r a t e t o i s o b u t y r a t e , ( 2 ) i s o m e r i z a t i o n o f i s o b u t y r a t e t o b u t y r a t e , a n d ( 3 ) B - o x i d a t i o n o f b u t y r a t e t o a c e t a t e a n d H 2 o r f o r m a t e . W h e n t h e c o n c e n t r a t i o n o f i s o b u t y r a t e o r b u t y r a t e i s m u c h h i g h e r t h a n t h e K m , t h e r e a c t i o n r a t e s f o r v 1 , v 2 a n d v 3 i n T a b l e 6 . 4 c a n b e u s e d t o e s t i m a t e t h e r e l a t i o n s a m o n g t h e s e t h r e e r e a c t i o n s , a s s u m i n g t h a t t h e K I I I o f t h e t h r e e r e a c t i o n s w e r e c l o s e t o t h e a p p a r e n t K I n o f i s o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y a n a e r o b i c g r a n u l e s ( 0 . 1 2 a n d 0 . 1 5 m M , r e s p e c t i v e l y ) a s d e s c r i b e d i n T a b l e 3 . 6 o f C h a p t e r 3 , . W h e n t h e c o n c e n t r a t i o n o f i s o b u t y r a t e i s m u c h h i g h e r t h a n b u t y r a t e ( c a s e N o . 1 ) , t h e v a l u e o f v 2 ( 0 . 3 9 m M / h r ) c o u l d b e e s t i m a t e d t o b e t h e m a x i m u m r a t e o f i s o b u t y r a t e t o b u t y r a t e ( s z ) . V r n a x 3 c o u l d b e e s t i m a t e d a s 0 . 2 2 m M / h r . W h e n t h e c o n c e n t r a t i o n o f b u t y r a t e w a s h i g h e r ( c a s e N o . 2 ) , V m l c o u l d b e e s t i m a t e d t o b e 0 . 2 0 m M / h r , a n d m e w a s 0 . 4 0 m M / h r . T h u s , t h e r a t i o a m o n g l e , s z a n d V m m c o u l d b e r o u g h l y e s t i m a t e d a s 0 . 5 : 1 . 7 7 : 1 . 0 . i i i ) G r o w t h o n v a l e r a t e a n d 2 - m e t h y l b u t y r a t e D u r i n g t h e t i m e - c o u r s e f o r d e g r a d a t i o n o f v a l e r a t e ( i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n o f 7 . 4 m M ) , p r o p i o n a t e i n c r e a s e d t o a c o n c e n t r a t i o n o f 6 . 8 m M ( F i g u r e 6 . 9 ) . T h e m o l a r r a t i o b e t w e e n p r o p i o n a t e p r o d u c e d a n d v a l e r a t e c o n s u m e d w a s 0 . 9 2 . D u r i n g t h e a s s a y , i s o b u t y r a t e , b u t y r a t e a n d 2 - m e t h y l b u t y r a t e w e r e a l s o p r o d u c e d . I s o b u t y r a t e , b u t y r a t e 2 3 4 a n d 2 - m e t h y l b u t y r a t e a p p e a r e d a l m o s t s i m u l t a n e o u s l y a f t e r 4 5 h o u r s o f g r o w t h . T h e c o n c e n t r a t i o n o f b u t y r a t e f o r m e d w a s s l i g h t l y h i g h e r t h a n t h e c o n c e n t r a t i o n o f i s o b u t y r a t e f o r m e d . B u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e d i s a p p e a r e d w i t h t h e c o n s u m p t i o n o f v a l e r a t e p r i o r t o t h e d i s a p p e a r a n c e o f 2 - m e t h y l b u t y r a t e . T h e h i g h e s t h y d r o g e n p a r t i a l p r e s s u r e ( 5 . 6 P a ) o b s e r v e d d u r i n g v a l e r a t e c o n v e r s i o n w a s m u c h l o w e r t h a n t h a t o b s e r v e d d u r i n g b u t y r a t e o r i s o b u t y r a t e c o n v e r s i o n . i 1 " . V 2 I l l I . “ 5 8 a 5 I l l 2 E 0 . . . f . . - o A o 2 0 4 0 s o s o 1 0 0 1 2 0 1 4 0 E 3 1 2 V 1 0 8 E 5 8 I n “ ' e E 6 p r o p l o n a t e E I f m 4 5 . 8 N . C 8 2 q a " o o 3 . o 2 0 4 o 6 0 s o 1 0 0 1 2 0 1 4 0 3 T I M E ( h r ) F i g u r e 6 . 9 T h e g r o w t h o f t h e t r i c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n I B , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N a n d M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 o n v a l e r a t e . A c e t a t e , w h i c h w a s t h e n c o n v e r t e d t o m e t h a n e b y M s . m a z e i T 1 8 , p r o p i o n a t e a n d m e t h a n e w e r e e n d p r o d u c t s o f v a l e r a t e d e g r a d a t i o n . B u t y r a t e , i s o b u t y r a t e a n d 2 - m e t h y 1 b u t y r a t e w e r e o b s e r v e d d u r i n g v a l e r a t e d e g r a d a t i o n . _ . . . o q - 4 3 2 1 o 5 0 5 o 1 1 s . g g 2 E A 2 a 9 o < E a 9 I 8 8 5 . : n ? 5 0 m a - r 0 ‘ 5 l s o b u 6 5 4 3 2 1 . - 1 - - - . J 2 5 0 o 2 ‘ ‘ ‘ - - - E 2 V g g E ) ' E v a 9 o E E 3 g ' 5 . 5 1 1 0 o H y d r o g e n M e t h a n e 1 0 A 0 1 5 0 ' 2 0 0 c e t a t e e t h y l b u t y m t e p r o p i o n a t e t e ’ 1 0 T 0 I 0 1 r 5 ) M E ( h V 2 0 0 > 2 5 0 2 3 5 F i g u r e 6 . 1 0 T h e g r o w t h o f t h e t r i c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n I B , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T l N a n d M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 o n 2 - m e t h y l b u t y r a t e . A c e t a t e , w h i c h w a s t h e n c o n v e r t e d t o m e t h a n e b y M s . m a z e i T 1 8 , p r o p i o n a t e a n d m e t h a n e w e r e e n d p r o d u c t s o f 2 - m e t h y 1 b u t y r a t e d e g r a d a t i o n . B u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e w e r e o b s e r v e d d u r i n g t h e d e g r a d a t i o n . 2 3 6 T h e i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n o f 2 - m e t h y l b u t y r a t e a p p l i e d t o t h e t r i c u l t u r e w a s 6 . 7 m M ( F i g u r e 6 . 1 0 ) . P r o p i o n a t e w a s p r o d u c e d a s 2 - m e t h y l b u t y r a t e w a s c o n v e r t e d a t a m o l a r r a t i o o f 0 . 9 1 ( p r o p i o n a t e f o r m e d v e r s u s 2 — m e t h y l b u t y r a t e c o n s u m e d ) . I n a d d i t i o n t o p r o p i o n a t e , i s o b u t y r a t e r e a c h e d a m a x i m u m c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 2 7 m M a f t e r 1 1 6 h o u r s . B u t y r a t e , w h i c h w a s o b s e r v e d o n l y a f t e r i s o b u t y r a t e , r e a c h e d a m a x i m u m l e v e l ( 0 . 0 6 m M ) a f t e r 1 6 8 h o u r s . I s o b u t y r a t e p r o b a b l y i s o m e r i z e d t o b u t y r a t e r a t h e r t h a n b u t y r a t e b e i n g p r o d u c e d d i r e c t l y . B o t h b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e w e r e c o n s u m e d p r i o r t o t h e c o m p l e t e c o n s u m p t i o n o f 2 - m e t h y l b u t y r a t e . N o v a l e r a t e w a s d e t e c t e d d u r i n g t h e a s s a y . T h e m a x i m u m h y d r o g e n p a r t i a l p r e s s u r e ( 5 . 3 P a ) d e t e c t e d w a s s i m i l a r t o t h a t d e t e c t e d d u r i n g v a l e r a t e d e g r a d a t i o n . F o r m a t e w a s n o t d e t e c t e d i n t h e t r i c u l t u r e c o n t a i n i n g e i t h e r v a l e r a t e o r 2 — m e t h y l b u t y r a t e d u r i n g t h e i r d e g r a d a t i o n . i v ) S y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f p r o p i o n a t e I n t h i s e x p e r i m e n t , b u t y r a t e a n d p r o p i o n a t e w e r e a d d e d i n t o a w e l l g r o w n t r i c u l t u r e t o a c h i e v e s t a r t i n g c o n c e n t r a t i o n s o f 6 . 0 m M a n d 6 . 1 m M , r e s p e c t i v e l y . A s i s s h o w n i n F i g u r e 6 . 1 1 , t h e i s o m e r i z a t i o n o f b u t y r a t e t o i s o b u t y r a t e o c c u r r e d i m m e d i a t e l y . A s i g n i fi c a n t a m o u n t o f 2 — m e t h y l b u t y r a t e w a s a l s o p r o d u c e d . T h i s a p p e a r e d t o b e c o u p l e d w i t h t h e d i s a p p e a r a n c e o f p r o p i o n a t e . A f t e r 5 5 h o u r s , t h e b u t y r a t e c o n c e n t r a t i o n d e c r e a s e d t o a l o w l e v e l ( 0 . 1 m M ) . T h e h i g h e s t c o n c e n t r a t i o n o f 2 - m e t h y l b u t y r a t e a c c u m u l a t e d , 0 . 9 1 m M , c o r r e s p o n d e d t o a d e c r e a s e i n p r o p i o n a t e f r o m 6 . 1 m M t o 5 . 2 m M . W h e n 2 - m e t h y 1 b u t y r a t e w a s c o n s u m e d , t h e c o n c e n t r a t i o n o f p r o p i o n a t e r o s e t o i t s o r i g i n a l c o n c e n t r a t i o n . T h e t r e n d o f t h e c h a n g e i n h y d r o g e n p a r t i a l p r e s s u r e i n t h e h e a d s p a c e w a s s i m i l a r t o o t h e r e x p e r i m e n t s , w i t h t h e h i g h e s t c o n c e n t r a t i o n b e i n g 9 P a T h e a c e t a t e c o n c e n t r a t i o n i n t h e c u l t u r e i n c r e a s e d f r o m i n i t i a l 1 4 . 9 m M t o 2 1 . 9 m M d u r i n g t h e a s s a y d u e t o t h e s l o w c o n v e r s i o n o f a c e t a t e t o m e t h a n e . 2 3 7 ’ 2 ‘ E g v 2 L I ] L I ] . 2 . 8 I o : ' 5 E E : l : 0 r - - . - . ~ . - . - - - . 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 A - A E 1 2 2 5 5 a ) 1 0 - ‘ 2 0 e - - 0 . 2 E 8 P r o p i o n a t e . . 1 5 g a 6 / : - — - — — - — — - — - ~ " - 1 o * - 8 4 . { 5 ‘ a “ ‘ < . . 2 I s o b u t y r a t e 2 - m e t h y l b u t y r a t o . . 5 § 4 8 0 ~ . w . - o 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 T I M E ( h r ) F i g u r e 6 . 1 1 T h e g r o w t h o f t h e t r i c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n I B , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T l N a n d M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 o n b u t y r a t e i n t h e p r e s e n c e p r o p i o n a t e . A c e t a t e , w h i c h w a s t h e n c o n v e r t e d t o m e t h a n e b y M s . m a z e i T 1 8 , a n d m e t h a n e w e r e e n d p r o d u c t s o f b u t y r a t e d e g r a d a t i o n . I s o b u t y r a t e a n d 2 - m e t h y l b u t y r a t e w e r e o b s e r v e d d u r i n g t h e d e g r a d a t i o n . 2 3 8 T o t e s t i f p r o p i o n a t e d e g r a d a t i o n w a s c a r r i e d o u t b y s t r a i n I B a n d i f 2 - m e t h y l b u t y r a t e c o u l d b e f o r m e d i n t h e a b s e n c e o f i s o b u t y r a t e o r b u t y r a t e , a c o n t r o l e x p e r i m e n t w a s p e r f o r m e d b y i n o c u l a t i n g t h e t r i c u l t u r e i n a m e d i u m c o n t a i n i n g 1 0 m M a c e t a t e a n d 1 0 m M p r o p i o n a t e . A f t e r 3 m o n t h s i n c u b a t i o n , a c e t a t e w a s d e g r a d e d a n d m e t h a n e w a s p r o d u c e d . N o p r o p i o n a t e w a s d e g r a d e d a n d n o o t h e r f a t t y a c i d s w e r e f o r m e d . 6 . 4 C H A R A C T E R I Z A T I O N O F T H E M E C H A N I S M O F I S O M E R I Z A T I O N B E T W E E N B U T Y R A T E A N D I S O B U T Y R A T E T h e p e r t u r b a t i o n o f s y n t r o p h i c f a t t y a c i d d e g r a d a t i o n w i t h h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f e i t h e r f o r m a t e o r H 2 w a s u s e d t o d e t e r m i n e i f i s o m e r i z a t i o n b e t w e e n b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e w a s c o u p l e d w i t h b u t y r a t e o r i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n . T h e t r i c u l t u r e o f s t r a i n I B , M b . f o r m i c i c u m T l N a n d M s . m a z e i T 1 8 w a s u t i l i z e d . 6 . 4 . 1 P e r t u r b a t i o n w i t h f o r m a t e R e s u l t s o f p e r t u r b a t i o n o f i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n w i t h f o r m a t e i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 6 . 1 2 a n d T a b l e 6 . 5 . P r i o r t o t h e a d d i t i o n o f f o r m a t e , t h e h y d r o g e n p a r t i a l p r e s s u r e w a s l o w ( 4 P a ) a n d n o d e t e c t a b l e l e v e l o f f o r m a t e ( < 5 M ) w a s o b s e r v e d i n t h e t r i c u l t u r e . A f t e r 4 h o u r o f i n c u b a t i o n , f o r m a t e ( 1 5 . 7 m M ) w a s a d d e d . T h e a d d i t i o n o f f o r m a t e i m m e d i a t e l y c a u s e d c o m p l e t e i n h i b i t i o n o f b o t h t h e i s o m e r i z a t i o n a n d s y n t r o p h i c o x i d a t i o n r e a c t i o n s . T h e c o n c e n t r a t i o n s o f i s o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e r e m a i n e d c o n s t a n t f o r a b o u t 1 2 h o u r s u n t i l t h e f o r m a t e c o n c e n t r a t i o n d e c r e a s e d t o a l o w l e v e l ( < 0 . 4 3 m M ) . M e t h a n e w a s p r o d u c e d c o n t i n u o u s l y a t a h i g h e r r a t e t h a n t h a t p r i o r t o t h e a d d i t i o n o f f o r m a t e , i n d i c a t i n g t h a t f o r m a t e w a s c o n v e r t e d t o m e t h a n e . s d i c A y t t a F 4 : ( , 2 6 H 2 ( P a ) F i g u r e 6 . 1 2 2 3 9 7 0 D 3 5 6 0 _ + F O B M A T E _ 3 . 0 C H 5 0 " 4 " ‘ 2 . 5 A E E 4 0 + - ' * 2 0 ' 3 ' : 1 : u 3 0 - - 1 . 5 2 0 ~ - 1 . 0 H 2 1 0 _ J - ‘ 0 . 5 l l l l l 1 J l J l o + F O B M A T E 6 a c e t a t e _ 2 4 > 5 ’ - _ , 2 0 A < ' E 4 — i s o b u t y r a t e d 1 6 ; ' f o r m a t e i / I ; 3 - « 1 2 E 6 L L 2 e f - * 8 b u t y r a t e l ' — 4 o J l l 1 1 4 1 l o 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 m m ; ( h r ) P e r t u r b a t i o n o f s y n t r o p h i c i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y t h e t r i c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n I B , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T l N a n d M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 o f w i t h f o r m a t e . T h e i s o m e r i z a t i o n f r o m i s o b u t y r a t e t o b u t y r a t e a n d s y n t r o p h i c d e g r a d a t i o n w a s i n h i b i t e d i n t h e p r e s e n c e o f f o r m a t e w i t h d e t e c t a b l e l e v e l . 2 4 0 T a b l e 6 . 5 E x p e r i m e n t a l r e s u l t s o f i s o b u t y r a t e c o n v e r s i o n i n t h e p r e s e n c e o f t h e p e r t u r b a t i o n w i t h f o r m a t e T i m e F a t t y a c i d s ( m M ) H 2 F r e e e n e r g y ( k J / r e a c t i o n ) ( h r ) C 1 C 2 i - C 4 C 4 ( P a ) F o r m a t e t r a n s f e r 0 < 0 . 0 0 5 4 . 5 4 6 . 3 1 0 . 4 0 3 . 6 < - 3 1 . 6 1 . 6 3 < 0 . 0 0 5 4 . 4 8 5 . 7 8 0 . 7 1 4 . 3 < — 3 3 . 1 3 . 9 7 < 0 . 0 0 5 4 . 4 5 5 . 2 4 1 . 2 5 4 . 3 < - 3 4 . 3 3 . 9 7 1 5 . 7 4 . 4 5 5 . 2 4 1 . 2 5 4 . 3 + 5 8 2 5 . 1 3 1 4 . 4 4 . 4 3 5 . 2 3 1 . 2 6 2 9 . 5 + 5 7 . 3 6 . 3 5 1 3 . 2 5 4 . 2 6 5 . 2 1 1 . 2 8 4 1 . 6 + 5 6 . 0 8 . 0 3 1 1 . 0 4 . 2 8 5 . 2 3 1 . 2 8 5 2 . 5 + 5 4 . 1 1 0 . 6 3 7 . 2 5 4 . 1 4 5 . 2 1 1 . 2 5 5 2 . 8 + 4 9 . 6 1 2 . 8 3 5 . 0 4 . 0 2 5 . 2 2 1 . 2 6 4 6 . 0 + 4 5 . 4 1 4 . 1 2 3 . 3 6 3 . 9 7 5 . 1 9 1 . 2 9 4 4 . 0 + 4 1 . 1 1 5 . 9 0 . 4 3 3 . 8 2 5 . 1 7 1 . 3 0 3 2 . 0 + 1 9 . 5 2 0 . 8 < 0 . 0 0 5 4 . 0 4 . 4 3 1 . 7 9 7 . 6 < - 3 5 . 9 2 3 . 3 < 0 . 0 0 5 4 . 2 2 4 . 2 1 1 . 9 9 7 . 6 < - 3 5 . 5 2 6 . 4 < 0 . 0 0 5 4 . 4 3 3 . 9 0 2 . 1 1 5 . 7 < - 3 4 . 9 3 0 . 0 N D 4 . 5 7 3 . 5 9 2 . 2 2 5 . 5 N C 3 8 . 5 N D 4 . 8 8 2 . 8 7 2 . 2 6 5 . 1 N C 4 8 . 5 N D 5 . 1 0 1 . 9 9 2 . 0 1 4 . 9 N C 6 0 . 4 N D 5 . 3 4 1 . 7 6 1 . 5 1 4 . 7 N C 7 4 . 2 N D 5 . 6 1 1 . 2 6 1 . 1 0 4 . 5 N C 8 5 . 9 N D 5 . 5 7 0 . 9 5 0 . 8 7 4 . 1 N C 9 6 . 3 N D 5 . 4 6 0 . 5 1 0 . 4 3 4 . 0 N C 1 0 9 . 6 N D 5 . 2 9 0 . 0 9 0 . 0 8 3 . 0 N C ( 1 ) F r e e e n e r g y c a l c u l a t i o n i s d e s c r i b e d i n A p p e n d i x E . ( 2 ) H C O 3 ' i n t h e c u l t u r e v a r i e d f r o m 4 6 t o 3 7 m M a s h y d r o g e n w a s c o n v e r t e d . A c o n c e n t r a t i o n o f 4 0 m M w a s c h o s e n f o r f r e e e n e r g y c a l c u l a t i o n . ( 3 ) C 1 : f o r m a t e ; C 2 : a c e t a t e ; i - C 4 : i s o b u t y r a t e ; C 4 : b u t y r a t e . ( 4 ) N D : n o t d e t e r m i n e d . N C : n o t c a l c u l a t e d . 2 4 1 A s s o o n a s f o r m a t e w a s a d d e d , t h e h y d r o g e n p a r t i a l p r e s s u r e i n t h e h e a d s p a c e o f t h e c u l t u r e s i n c r e a s e d f r o m 4 . 3 P a t o 2 9 . 5 P a i n a b o u t o n e h o u r a n d fi n a l l y p e a k e d a t 5 2 . 8 P a b e f o r e d e c l i n i n g a s f o r m a t e w a s c o n s u m e d . B y t h e t i m e f o r m a t e r e a c h e d t h e u n d e t e c t a b l e l e v e l ( < 5 M ) , t h e H 2 p a r t i a l p r e s s u r e h a d d e c r e a s e d t o 7 . 6 P a T h e r a t e o f m e t h a n e p r o d u c t i o n d e c r e a s e d t o a p p r o x i m a t e l y t h e r a t e o b s e r v e d b e f o r e t h e a d d i t i o n o f f o r m a t e . U n l i k e i s o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e , t h e a c e t a t e c o n c e n t r a t i o n d e c r e a s e d f r o m 4 . 4 5 m M t o 3 . 8 2 m M d u r i n g t h e p e r t u r b a t i o n w i t h f o r m a t e , i n d i c a t i n g t h a t t h e a d d i t i o n o f f o r m a t e d i d n o t s t o p a c e t a t e c o n v e r s i o n t o m e t h a n e . W h e n f o r m a t e w a s c o n s u m e d , i s o m e r i z a t i o n o f i s o b u t y r a t e t o b u t y r a t e r e s u m e d . T h e i s o b u t y r a t e c o n c e n t r a t i o n d e c r e a s e d f r o m 5 . 2 m M a t h o u r 1 5 . 9 t o 2 . 0 m M a t h o u r 4 8 . 5 . T h e b u t y r a t e l e v e l i n c r e a s e d f r o m 1 . 3 m M t o 2 . 0 m M d u r i n g t h e s a m e p e r i o d . T h e s e t w o f a t t y a c i d s t h e n d e c r e a s e d a t a p p r o x i m a t e l y t h e s a m e r a t e . B u t y r a t e d e g r a d a t i o n p e r t u r b e d w i t h f o r m a t e a d d i t i o n p r o d u c e d s i m i l a r r e s u l t s t o t h o s e o b t a i n e d d u r i n g i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n ( F i g u r e 6 . 1 3 a n d T a b l e 6 . 6 ) . T h e a d d i t i o n o f f o r m a t e i m m e d i a t e l y i n d u c e d c o m p l e t e i n h i b i t i o n o f b u t y r a t e d e g r a d a t i o n a n d t h e i s o m e r i z a t i o n r e a c t i o n . T h e h y d r o g e n p a r t i a l p r e s s u r e i n h e a d s p a c e i n c r e a s e d r a p i d l y d u e t o f o r m a t e a d d i t i o n . T h e i s o m e r i z a t i o n o f b u t y r a t e t o i s o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e o x i d a t i o n r e s u m e d w h e n t h e f o r m a t e c o n c e n t r a t i o n d e c r e a s e d t o a l o w l e v e l ( < 0 . 8 6 m M ) . A d d i t i o n o f f o r m a t e d i d n o t i n h i b i t a c e t a t e d e g r a d a t i o n . 2 4 2 4 0 4 . 0 3 5 ~ 1 3 . 5 + F 0 | 1 M A T E ” " 4 3 0 " - J - 3 . 0 . — 2 5 . . - 2 . 5 E G E . 2 0 - - 2 . 0 2 ' , z " E , 1 5 - ~ 1 . 5 H t o - / 2 4 1 . 0 5 0 . 5 o J l l l 1 1 I l g 1 a + F O B M A T E 7 a c e t a t e _ 2 3 5 ‘ ¢ > E 6 - 2 4 I ; ' 5 5 t — " 2 0 : 5 b u t y r a t e g . < a 4 - - 1 6 g a ' 2 3 _ f o r m a t e _ 1 2 3 Q l b ” 3 . 2 L , i s o b u t y r a t e _ . 3 ° J r - 4 o i l I l l 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 T l M E l l l r ) F i g u r e 6 . 1 3 P e r t u r b a t i o n o f s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y t h e t r i c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n I B , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T l N a n d M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 w i t h f o r m a t e . T h e i s o m e r i z a t i o n f r o m b u t y r a t e t o i s o b u t y r a t e a n d s y n t r o p h i c d e g r a d a t i o n w a s i n h i b i t e d i n t h e p r e s e n c e o f f o r m a t e w i t h d e t e c t a b l e l e v e l . 2 4 3 T a b l e 6 . 6 E x p e r i m e n t a l r e s u l t s o f b u t y r a t e c o n v e r s i o n i n t h e p r e s e n c e o f t h e p e r t u r b a t i o n w i t h f o r m a t e T i m e F a t t y a c i d s ( m M ) H 2 F r e e e n e r g y ( k l / r e a c t i o n ) ( h r ) C 1 C 2 i - C 4 C 4 ( P a ) f o r m a t e t r a n s f e r 0 < 0 . 0 0 5 6 . 6 7 1 . 0 6 5 . 8 2 3 . 6 < - 3 0 . 0 1 . 6 3 < 0 . 0 0 5 6 . 6 4 1 . 2 7 5 . 5 2 4 . 3 < - 3 0 . 3 3 . 9 7 < 0 . 0 0 5 6 . 4 8 1 . 6 1 4 . 9 8 4 . 3 < - 3 0 . 9 3 . 9 7 1 6 . 6 6 . 4 8 1 . 6 1 4 . 9 8 4 . 3 + 6 2 ] 5 . 1 3 1 5 . 6 6 . 3 4 1 . 6 0 4 . 9 8 1 7 . 2 + 6 1 . 4 6 . 3 5 1 4 . 2 6 . 1 3 1 . 6 1 4 . 9 9 2 1 . 9 + 6 0 . 0 8 . 0 3 1 2 . 0 6 . 0 6 1 . 6 1 4 . 9 8 2 4 . 1 + 5 8 . 1 1 0 . 6 3 9 . 3 6 . 0 1 1 . 6 1 4 . 9 8 2 4 . 4 + 5 5 . 3 1 2 . 8 3 7 . 5 5 . 8 5 1 . 6 1 4 . 9 8 2 2 . 0 + 5 2 . 9 1 4 . 1 2 5 . 8 5 . 7 2 1 . 6 0 4 . 9 9 2 1 . 0 + 5 0 . 1 1 8 . 8 0 . 8 6 5 . 3 5 1 . 6 1 4 . 9 7 1 5 . 0 + 2 9 . 6 2 0 . 8 0 . 0 0 6 5 . 5 0 1 . 9 5 4 . 7 2 6 . 0 - 2 1 . 6 2 3 . 3 < 0 . 0 0 5 5 . 6 0 2 . 2 6 4 . 1 2 6 . 0 < - 3 2 . 8 2 6 . 4 < 0 . 0 0 5 5 . 7 5 2 . 4 8 3 . 5 0 5 . 8 < - 3 2 . 4 3 2 . 0 < 0 . 0 0 2 6 . 0 0 2 . 6 7 2 . 8 7 5 . 7 < - 3 l . 6 3 8 . 5 < 0 . 0 0 2 6 . 2 3 2 . 5 4 2 . 4 0 5 . 5 < - 3 0 . 6 4 8 . 5 N D 6 . 5 0 1 . 8 6 1 . 7 3 5 . 3 N C 6 0 . 4 N D 6 . 9 2 1 . 6 8 1 . 4 0 5 . 1 N C 7 4 . 2 N D 7 . 6 1 1 . 0 1 0 . 8 5 4 . 9 N C 8 5 . 9 N D 7 . 5 1 0 . 6 9 0 . 5 8 4 . 0 N C 9 6 . 3 N D 7 . 4 1 0 . 3 1 0 . 2 6 3 . 8 N C 1 0 9 . 7 N D 6 . 6 5 0 0 1 . 8 N C 1 ) F r e e e n e r g y c a l c u l a t i o n i s d e s c r i b e d i n A p p e n d i x E . 2 ) H C O ; i n t h e c u l t u r e v a r i e d f r o m 4 6 t o 3 7 m M a s h y d r o g e n w a s c o n v e r t e d . A c o n c e n t r a t i o n o f 4 0 m M w a s c h o s e n f o r f r e e e n e r g y c a l c u l a t i o n . 3 ) C 1 : f o r m a t e ; C 2 : a c e t a t e ; i - C 4 : i s o b u t y r a t e ; C 4 : b u t y r a t e . 4 ) N D : n o t d e t e r m i n e d . N C : n o t c a l c u l a t e d . 2 4 4 6 . 4 . 2 P e r t u r b a t i o n w i t h h y d r o g e n H y d r o g e n g a s w a s a d d e d t o t h e t r i c u l t u r e g r o w i n g o n i s o b u t y r a t e ( F i g u r e 6 . 1 4 a n d T a b l e 6 . 7 ) . B e f o r e a d d i t i o n o f H 2 , t h e c o n c e n t r a t i o n o f i s o b u t y r a t e d e c r e a s e d f r o m 5 . 2 3 t o 3 . 9 7 m M w h i l e t h e b u t y r a t e c o n c e n t r a t i o n r o s e f r o m 1 . 4 3 t o 2 . 2 7 m M a n d a c e t a t e c o n c e n t r a t i o n i n c r e a s e d f r o m 1 0 . 7 8 t o 1 1 . 4 0 m M , i n d i c a t i n g t h a t i s o b u t y r a t e w a s c o n t i n u o u s l y i s o m e r i z e d t o b u t y r a t e a n d t h e n d e g r a d e d t o C H 4 v i a a c e t a t e . T h e H 2 p a r t i a l p r e s s u r e w a s a b o u t 2 0 P a a n d f o r m a t e w a s b e l o w t h e d e t e c t a b l e l e v e l . A b o u t 0 . 1 7 a t m ( 1 7 k P a ) H 2 w a s a d d e d t o p e r t u r b i s o m e r i z a t i o n a n d d e g r a d a t i o n o f i s o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e . T h e a d d i t i o n o f 1 1 2 r e s u l t e d i n m e a s u r a b l e q u a n t i t i e s o f f o r m a t e a c c u m u l a t i n g . T h e f o r m a t e c o n c e n t r a t i o n r e a c h e d a p e a k l e v e l o f 1 . 3 2 m M . I s o m e r i z a t i o n o f i s o b u t y r a t e t o b u t y r a t e a n d s u b s e q u e n t d e g r a d a t i o n o f b u t y r a t e w e r e i n h i b i t e d f o r a t l e a s t 1 3 h o u r s u n t i l t h e H 2 p a r t i a l p r e s s u r e i n t h e h e a d s p a c e a n d t h e f o r m a t e l e v e l i n t h e l i q u i d p h a s e d e c r e a s e d t o l e s s t h a n 2 . 7 2 k P a a n d 0 . 0 2 5 m M , r e s p e c t i v e l y . U n l i k e t h e p e r t u r b a t i o n w i t h f o r m a t e , a c e t a t e d e g r a d a t i o n w a s i n h i b i t e d d u r i n g t h i s a s s a y . T h i s m a y b e b e c a u s e h i g h p a r t i a l p r e s s u r e o f H 2 i n h i b i t e d a c e t a t e d e g r a d a t i o n b y M s . m a z e i s p e c i e s , a s r e p o r t e d b y F e r g u s o n a n d M a h ( 1 9 8 3 ) . T h e e f f e c t o f a d d i t i o n o f h y d r o g e n o n t h e i s o m e r i z a t i o n o f b u t y r a t e a n d i t s d e g r a d a t i o n b y t h e t r i c u l t u r e i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 6 . 1 5 a n d T a b l e 6 . 8 . T h e a d d i t i o n o f H 2 ( c a . 0 . 4 a t m o r 4 1 . 3 k P a ) r e s u l t e d i n t h e s i g n i fi c a n t f o r m a t i o n o f f o r m a t e . T h e h i g h e s t f o r m a t e l e v e l d e t e c t e d w a s 1 . 9 2 m M . T h e a d d i t i o n o f h y d r o g e n i n h i b i t e d t h e i s o m e r i z a t i o n a n d d e g r a d a t i o n o f b u t y r a t e a s w e l l a s a c e t a t e d e g r a d a t i o n . T h e i s o m e r i z a t i o n a n d d e g r a d a t i o n o f b u t y r a t e r e s u m e d a f t e r t h e H 2 p a r t i a l p r e s s u r e a n d t h e f o r m a t e l e v e l d e c r e a s e d t o l e s s t h a n 1 . 7 k P a a n d 0 . 0 1 m M , r e s p e c t i v e l y . 2 4 5 5 ' 0 + 1 1 2 5 . 0 1 0 4 r r 4 0 I ' 2 3 a _ 3 o E ' 8 1 0 E 2 ! C H 4 : 1 ? z “ 1 0 2 - - 2 o " ’ 1 0 r - 1 0 o 1 1 1 1 1 1 o o 9 ' - - 1 8 . — 3 _ a c e t a t e 0 _ 1 6 E 7 r o - 1 4 A _ . ' o E : 3 6 . « o o o o . 0 ' ‘ 1 2 E 9 q 5 - - 1 0 ” E . “ I s o b u t y r a t e E : 5 4 " - 8 e O “ P _ _ b u t y r a t e 4 v - 3 . ' 1 6 " 1 « c o c o . ’ 9 ‘ “ . . 2 O I _ . 4 u < t o r m a t e \ I 1 — ' \ V \ _ 2 0 l l l l ( o 0 2 0 4 0 6 0 T I M E I I I I ‘ ) F i g u r e 6 . 1 4 P e r t u r b a t i o n o f s y n t r o p h i c i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y t h e t r i c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n I B , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T 1 N a n d M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 w i t h h y d r o g e n . T h e i s o m e r i z a t i o n f r o m i s o b u t y r a t e t o b u t y r a t e a n d s y n t r o p h i c d e g r a d a t i o n w a s i n h i b i t e d i n t h e p r e s e n c e o f h i g h e r p a r t i a l p r e s s u r e o f h y d r o g e n . F o r m a t e w a s s y n t h e s i z e d d u r i n g t h e p e r t u r b a t i o n w i t h h y d r o g e n . 2 4 6 T a b l e 6 . 7 E x p e r i m e n t a l r e s u l t s o f i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f t h e p e r t u r b a t i o n w i t h h y d r o g e n g a s T i m e F a t t y a c i d s ( m M ) H 2 F r e e e n e r g y ( k J / r e a c t i o n ) ( h r ) C 1 C 2 i - C 4 C 4 ( P a ) f o r m a t e t r a n s f e r 0 < 0 . 0 0 5 1 0 . 7 8 5 . 2 3 1 . 4 3 1 2 . 7 < - 2 5 . 5 1 . 4 3 < 0 . 0 0 5 1 1 . 0 7 4 . 3 5 1 . 9 9 1 7 . 1 < - 2 5 . 6 2 . 5 < 0 . 0 0 5 1 1 . 4 0 3 . 9 7 2 . 2 7 2 0 . 1 < - 2 5 . 4 2 . 5 < 0 . 0 0 5 1 1 . 4 0 3 . 9 7 2 . 2 7 1 7 0 7 6 < - 2 5 . 4 3 . 7 7 0 . 7 0 1 1 . 4 3 3 . 9 1 2 . 3 0 1 6 2 0 0 + 3 5 . 1 4 . 9 5 1 . 0 5 1 1 . 4 2 3 . 9 0 2 . 3 0 1 5 1 0 0 + 3 9 . 3 6 . 7 1 . 3 2 1 1 . 4 2 3 . 8 9 2 . 2 9 1 3 1 3 0 + 4 1 . 6 1 3 . 0 5 1 . 1 0 1 1 . 4 2 3 . 8 9 2 . 2 9 4 9 6 8 + 3 9 7 1 5 . 2 3 0 . 0 2 5 1 1 . 4 2 3 . 8 3 2 . 2 8 2 7 2 0 + 0 . 7 5 1 7 . 2 < 0 . 0 0 5 1 1 . 2 2 3 . 5 8 2 . 3 9 9 5 2 < - 2 5 . 4 1 9 . 9 2 < 0 . 0 0 5 1 1 . 6 0 3 . 2 8 2 . 5 7 1 9 3 < — 2 5 . 1 2 1 . 6 8 < 0 . 0 0 5 1 1 . 9 2 3 . 0 7 2 . 5 5 1 0 2 < - 2 4 . 6 2 4 . 5 < 0 . 0 0 5 1 2 , 5 7 2 . 7 6 2 . 4 2 4 3 < - 2 3 . 6 2 8 . 9 < 0 . 0 0 5 1 3 . 4 3 2 . 4 5 2 . 1 8 1 4 < - 2 2 . 4 3 1 . 6 N D 1 3 . 8 0 2 . 2 5 1 . 9 9 1 3 N C 4 5 . 3 N D 1 5 . 3 9 1 . 3 3 1 . 1 5 1 0 N C 5 2 . 7 N D 1 6 . 2 5 0 . 9 1 0 . 7 9 8 N C 6 5 . 6 N D 1 8 . 7 8 0 . 2 3 0 . 2 1 4 N C ( 1 ) F r e e e n e r g y c a l c u l a t i o n i s d e s c r i b e d i n A p p e n d i x E . ( 2 ) H C O 3 ‘ i n t h e c u l t u r e v a r i e d f r o m 4 6 t o 3 7 m M a s h y d r o g e n w a s c o n v e r t e d . A c o n c e n t r a t i o n o f 4 0 m M w a s c h o s e n f o r f r e e e n e r g y c a l c u l a t i o n . ( 3 ) C 1 : f o r m a t e ; C 2 : a c e t a t e ; i - C 4 : i s o b u t y r a t e ; C 4 : b u t y r a t e . ( 4 ) N D : n o t d e t e r m i n e d . N C : n o t c a l c u l a t e d . ) M m [ 4 H C 2 4 7 0 7 . " ‘ 1 4 O O — a — E 1 2 E E E 0 - 1 0 z ; 3 C E . 5 _ . 8 c I : : 1 > . 5 ' 2 " . - . . 6 . - 5 3 1 1 ‘ ; ” v \ . _ 4 ” N . ‘ r i s o h u t v r a t e 2 : 5 " I r t o r m a t e . \ . ‘ ' 1 ‘ \ o 0 1 1 1 1 1 1 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 T i m e ( h r ) F i g u r e 6 . 1 5 P e r t u r b a t i o n o f s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y t h e t r i c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n I B , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T l N a n d M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 w i t h h y d r o g e n . T h e i s o m e r i z a t i o n f r o m b u t y r a t e t o i s o b u t y r a t e a n d s y n t r o p h i c d e g r a d a t i o n w a s i n h i b i t e d i n t h e p r e s e n c e o f h i g h e r p a r t i a l p r e s s u r e o f h y d r o g e n . F o r m a t e w a s s y n t h e s i z e d d u r i n g t h e p e r t u r b a t i o n w i t h h y d r o g e n . 2 4 8 T a b l e 6 . 8 E x p e r i m e n t a l r e s u l t s o f b u t y r a t e d e g r a d a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f t h e p e r t u r b a t i o n w i t h h y d r o g e n g a s T i m e F a t t y a c i d s ( m M ) H 2 F r e e e n e r g y ( I d / r e a c t i o n ) ( h r ) C 1 C 2 i — C 4 C 4 ( P a ) f o r m a t e t r a n s f e r 0 < 0 . 0 0 5 4 . 3 3 0 . 1 9 6 . 9 2 5 . 8 < - 3 0 . 4 1 . 6 < 0 . 0 0 5 4 . 6 5 0 . 5 8 5 . 6 4 1 2 . 2 < - 3 2 . 1 3 . 7 < 0 . 0 0 5 5 . 1 9 1 . 3 0 4 . 4 0 1 4 . 7 < - 3 2 . 4 3 . 7 < 0 . 0 0 5 5 . 1 9 1 . 3 0 4 . 4 0 4 1 3 0 0 + 3 2 . 4 5 . 2 0 . 6 0 5 . 1 4 1 . 3 3 4 . 1 7 4 0 0 7 0 + 2 6 . 5 6 . 5 0 . 9 4 5 . 1 4 1 . 3 2 4 . 1 7 3 8 7 4 0 4 3 1 . 1 8 . 9 1 . 2 5 5 . 1 4 1 . 3 3 4 . 1 6 3 6 3 6 0 + 3 4 . 0 1 2 . 2 1 . 6 7 5 . 1 4 1 . 3 3 4 . 1 7 3 2 1 6 0 + 3 6 . 8 2 3 . 2 1 . 9 2 5 . 1 4 1 . 3 3 4 . 1 7 1 0 8 1 0 + 3 8 . 3 2 5 . 2 0 . 9 0 5 . 1 3 1 . 3 2 4 . 1 7 4 1 2 3 + 3 0 . 5 2 6 . 4 0 . 0 1 5 . 1 4 1 . 3 3 4 . 1 7 1 7 0 0 - 1 6 . 0 2 8 . 2 < 0 . 0 0 5 5 . 5 1 1 . 7 0 3 . 5 9 3 8 6 < - 3 1 . 9 2 9 . 8 < 0 . 0 0 5 5 . 8 0 1 . 9 3 3 . 0 8 9 7 . 2 < - 3 1 . 3 3 3 . 3 < 0 . 0 0 5 6 . 1 6 2 . 4 1 2 . 3 6 1 3 . 5 < - 3 0 . 6 5 2 . 2 N D 9 . 1 1 1 . 6 0 1 . 3 0 6 . 8 N C 5 8 . 4 N D 1 0 . 4 3 1 . 4 3 1 . 1 1 5 . 5 N C 7 4 . 1 N D 1 2 . 4 0 0 . 8 6 0 . 6 4 4 . 8 N C 9 5 . 5 N D 1 3 . 0 8 0 . 3 4 0 . 3 0 4 . 5 N C ( 1 ) F r e e e n e r g y c a l c u l a t i o n i s d e s c r i b e d i n A p p e n d i x E . ( 2 ) H C O 3 ‘ i n t h e c u l t u r e v a r i e d f r o m 4 0 t o 4 8 m M a s h y d r o g e n w a s c o n v e r t e d . A c o n c e n t r a t i o n o f 4 0 m M w a s c h o s e n f o r f r e e e n e r g y c a l c u l a t i o n . ( 3 ) C 1 : f o r m a t e ; C 2 : a c e t a t e ; i - C 4 : i s o b u t y r a t e ; C 4 : b u t y r a t e . ( 4 ) N D : n o t d e t e r m i n e d . N C : n o t c a l c u l a t e d . 2 4 9 6 . 4 . 3 E n e r g e t i c a n a l y s i s o f b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e i s o m e r i z a t i o n D u r i n g t h e e x p e r i m e n t s w h e n b u t y r a t e d e g r a d a t i o n w a s p e r t u r b e d b y a d d i n g f o r m a t e a n d h y d r o g e n , t h e a v a i l a b l e f r e e e n e r g y f o r c o n v e r s i o n o f b u t y r a t e t o i s o b u t y r a t e a n d v i c e v e r s a w a s s t i l l t h e r m o d y n a m i c a l l y f a v o r a b l e ( T a b l e 6 . 9 ) , a l t h o u g h c l o s e t o e q u i l i b r i u m . A p p a r e n t l y , t h e i s o m e r i z a t i o n r e a c t i o n w a s c o m p l e t e l y i n h i b i t e d b y h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f f o r m a t e o r H 2 . T h e i s o m e r i z a t i o n r e a c t i o n o c c u r r e d o n l y w h e n d e g r a d a t i o n o f b u t y r a t e w a s o b s e r v e d . W h e n b u t y r a t e d e g r a d a t i o n w a s i n h i b i t e d , t h e i s o m e r i z a t i o n r e a c t i o n d i d n o t o c c u r . T h i s i n d i c a t e s t h a t i s o m e r i z a t i o n o f b u t y r a t e t o i s o b u t y r a t e o r i s o b u t y r a t e t o b u t y r a t e i s c o u p l e d t o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n a n d i s n o t a n i n d e p e n d e n t r e a c t i o n . T a b l e 6 . 9 F r e e e n e r g y v a l u e s f o r b u t y r a t e f o r m a t i o n f r o m i s o b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e f o r m a t i o n f r o m b u t y r a t e w h e n s y n t r o p h i c b u t y r a t e o r i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n w a s c o m p l e t e l y i n h i b i t e d b y h i g h l e v e l o f f o r m a t e o r H 2 . N o . C o n c e n t r a t i o n ( m M ) D r i v i n g f o r c e , k J / r e a c t i o n i C 4 C 4 f r o m i C 4 t o C 4 f r o m C 4 t o i C 4 1 5 . 2 4 1 . 2 5 - 1 . 5 2 1 . 6 1 4 . 9 8 - 4 . 7 3 3 . 9 0 2 . 3 0 - 0 . 7 4 1 . 3 3 4 . 1 7 - 4 . 9 ( 1 ) F r e e e n e r g y c a l c u l a t i o n i s d e s c r i b e d i n A p p e n d i x E . ( 2 ) i C 4 : i s o b u t y r a t e . C 4 : b u t y r a t e . ( 3 ) N o . 1 : i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n i n h i b i t e d b y f o r m a t e . N o . 2 : b u t y r a t e d e g r a d a t i o n i n h i b i t e d b y f o r m a t e . N o . 3 : i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n i n h i b i t e d b y H 2 . N o . 4 : b u t y r a t e d e g r a d a t i o n i n h i b i t e d b y H z . 2 5 0 D u r i n g t h e d e g r a d a t i o n o f b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e b y t h e d e fi n e d t r i c u l t u r e , i s o b u t y r a t e w a s i s o m e r i z e d t o b u t y r a t e u n t i l n e a r e q u a l c o n c e n t r a t i o n s w e r e r e a c h e d . S u b s e q u e n t l y , b o t h w e r e c o n v e r t e d t o m e t h a n e v i a a c e t a t e . T h e f o l l o w i n g t h e r m o d y n a m i c a n a l y s i s i s u s e d t o e x p l a i n h o w t h e r a t i o b e t w e e n i s o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e c o n t r o l s t h e d i r e c t i o n o f i s o m e r i z a t i o n a n d w h y t h e t w o f a t t y a c i d s t e n d t o r e a c h e q u a l c o n c e n t r a t i o n s . I n t h e f o l l o w i n g s i m u l a t i o n , c o n d i t i o n s w e r e p H = 7 . 0 , t h e t o t a l c o n c e n t r a t i o n o f a n i s o b u t y r a t e - b u t y r a t e m i x t u r e w a s 1 0 m M , t h e c o n c e n t r a t i o n s o f f o r m a t e , a c e t a t e a n d b i c a r b o n a t e w e r e a s s u m e d t o b e 5 m M , 2 1 . 1 M a n d 5 0 m M , r e s p e c t i v e l y , a n d f o r m a t e w a s a s s u m e d t o b e t h e e l e c t r o n c a r r i e r d u r i n g s y n t r o p h i c b u t y r a t e o x i d a t i o n . i ) W h e n t h e b u t y r a t e c o n c e n t r a t i o n w a s m u c h h i g h e r t h a n i s o b u t y r a t e , b u t y r a t e w a s s i m u l t a n e o u s l y i s o m e r i z e d t o i s o b u t y r a t y e a n d d e g r a d e d t o a c e t a t e a n d f o r m a t e ( o r H Q , a n d i s o b u t y r a t e a c c u m u l a t i o n o c c u r r e d : p b u t y r a t e ' — ) p i s o b u t y r a t e ‘ ( 6 — 5 ) a n d b u t y r a t e “ + 2 H C O 3 ' — > 2 a c e t a t e ' + H * + 2 f o r m a t e ’ ( 6 - 6 ) T h e s u m o f t h e s e t w o r e a c t i o n s i s : ( 1 + p ) b u t y r a t e + 2 H C O 3 ' - — > 2 a c e t a t e + H + + 2 f o r m a t e ' + p i s o b u t y r a t e ( 6 - 7 ) w h e r e p i s a s t o i c h i o m e t r i c c o e f fi c i e n t f o r b u t y r a t e t h a t i s i s o m e r i z e d t o i s o b u t y r a t e w h e n o n e m o l e c u l e o f b u t y r a t e i s d e g r a d a d e d t o a c e t a t e a n d f o r m a t e ( o r 1 4 2 ) . T h e v a l u e o f p i s 2 0 b e c a u s e w h e n b u t y r a t e i s n o t i s o m e r i z e d t o i s o b u t y r a t e , p i s e q u a l t o z e r o . T h e c h a n g e i n f r e e e n e r g y a v a i l a b l e f o r r e a c t i o n s ( 6 - 7 ) v s . t h e c h a n g e o f p e r c e n t a g e o f b u t y r a t e i n t h e b u t y r a t e - i s o b u t y r a t e m i x t u r e , u s i n g v a r i o u s v a l e s o f p , i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 6 - 1 6 a . M o r e f r e e e n e r g y w a s a v a i l a b l e w h e n t h e v a l u e o f p w a s 2 5 1 l a r g e r t h a n z e r o a t h i g h e r b u t y r a t e p e r c e n t a g e s . T h i s i s c o n s i s t e n t w i t h t h e o b s e r v a t i o n t h a t r a p i d i s o b u t y r t a t e f o r m a t i o n o c c u r r e d w h e n t h e b u t y r a t e c o n c e n t a t i o n w a s m u c h h i g h e r t h a n i s o b u t y r a t e ( F i g u r e 6 . 5 , 6 . 1 3 a n d 6 . 1 5 ) . A s t h e p e r c e n t a g e o f b u t y r a t e w a s r e d u c e d ( a s r e s u l t o f i s o b u t y r a t e a c c u m u l a t i o n ) t o l e s s 5 0 % , t h e m o s t e n e r g e t i c a l l y f a v o r a b l e c o n d i t i o n w a s o b s e r v e d w h e n p a p p r o a c h e d t o z e r o . B a s e d o n t h e d a t a o f e x p e r i m e n t N o . 2 i n T a b l e 6 . 4 , w h e n t h e i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s o f i s o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e w e r e 1 . 6 a n d 9 . 6 m M , r e s p e c t i v e l y , t h e a p p a r e n t c o n v e r s i o n r a t e s o f b u t y r a t e t o i s o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e t o a c e t a t e a n d f o r m a t e ( o r H z ) w e r e 0 . 2 0 a n d 0 . 4 0 m M / h r , r e s p e c t i v e l y . T h e p v a l u e h e r e , t h e r e f o r e , c a n b e e s t i m a t e d t o b e l a r g e r t h a n 0 . 5 . i i ) W h e n t h e i s o b u t y r a t e c o n c e n t r a t i o n w a s m u c h h i g h e r t h a n b u t y r a t e , i s o b u t y r a t e w a s i s o m e r i z e d t o b u t y r a t e , b u t y r a t e w a s t h e n d e g r a d e d t o a c e t a t e a n d f o r m a t e ( o r H 2 ) , a n d b u t y r a t e a c c u m u l a t i o n o c c u r r e d : q i s o b u t y r a t e ’ - ) q b u t y r a t e ‘ ( 6 - 8 ) a n d b u t y r a t e ' + 2 H C O ; — - ) 2 a c e t a t e ’ + H ” + 2 f o r m a t e ' ( 6 - 9 ) T h e s u m o f r e a c t i o n s ( 6 - 8 ) a n d ( 6 - 9 ) i s q i s o b u t y r a t e + 2 H C O , ’ — ) 2 a c e t a t e ' + H “ + 2 f o r m a t e “ + ( q - l ) b u t y r a t e ( 6 - 1 0 ) w h e r e q i s a s t o i c h i o m e t r i c c o e f fi c i e n t f o r i s o b u t y r a t e t h a t i s i s o m e r i z e d t o b u t y r a t e w h e n o n e m o l e c u l e o f b u t y r a t e i s d e g r a d e d . T h e v a l u e o f q i s 2 1 b e c a u s e w h e n b u t y r a t e d o e s n o t a c c u m u l a t e , q i s e q u a l t o l . T h e c h a n g e i n f r e e e n e r g y a v a i l a b l e f o r r e a c t i o n ( 6 - 1 0 ) v s t h e c h a n g e o f p e r c e n t a g e o f b u t y r a t e i n t h e b u t y r a t e - i s o b u t y r a t e m i x t u r e , u s i n g v a r i o u s v a l e s o f q , i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 6 - 1 6 b . H i g h e r d r i v i n g f o r c e c a n b e o b t a i n e d w i t h v a l u e o f q l a r g e r t h a n 1 a t l o w e r b u t y r a t e p e r c e n t a g e ( m o r e i s o b u t y r a t e ) . T h i s i s c o n s i s t e n t w i t h t h e o b s e r v a t i o n t h a t f a s t b u t y r a t e a c c u m u l a t i o n 2 5 2 o c c u r r e d w h e n i s o b u t y r a t e c o n c e n t r a t i o n w a s m u c h h i g h e r t h a n b u t y r a t e ( F i g u r e s 6 . 6 , 6 . 8 , 6 . 1 2 a n d 6 . 1 4 ) . A s t h e p e r c e n t a g e o f b u t y r a t e i n c r e a s e d ( a s r e s u l t o f b u t y r a t e a c c u m u l a t i o n ) t o m o r e t h a n 3 0 % , t h e m o s t e n e r g e t i c a l l y f a v o r a b l e c o n d i t i o n w a s o b s e r v e d w h e n q a p p r o a c h e d t o z e r o . B a s e d o n t h e d a t a o f e x p e r i m e n t N o . 1 i n T a b l e 6 . 4 , w h e n t h e i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s o f i s o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e w e r e 1 0 . 5 a n d 0 m M , r e s p e c t i v e l y , t h e a p p a r e n t c o n v e r s i o n r a t e s o f i s o b u t y r a t e t o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e t o a c e t a t e a n d f o r m a t e ( o r H z ) w e r e 0 . 3 9 a n d 0 . 0 9 m M / h r , r e s p e c t i v e l y . T h e q v a l u e h e r e , t h e r e f o r e , c a n b e e s t i m a t e d t o b e l a r g e r t h a n 4 . 3 . i i i ) B u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e w e r e a t n e a r e q u a l c o n c e n t r a t i o n s a n d w e r e d e g r a d e d t o a c e t a t e a n d f o r m a t e ( o r H 2 ) s i m u l t a n e o u s l y . B a s e d o n a b o v e a n a l y s i s , w h e n t h e r a t i o b e t w e e n b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e w a s n e a r e q u a l , t h e m o s t e n e r g e t i c a l l y f a v o r a b l e c o n d i t i o n s a r e a t a r a n g e w h e r e p v a l u e i n e q u a t i o n ( 6 - 7 ) a p p r o a c h e d t o z e r o a n d q v a l u e i n e q u a t i o n ( 6 - 1 0 ) w a s n e a r 1 . B o t h r e a c t i o n s ( 6 - 7 ) a n d ( 6 - 1 0 ) c o u l d b e p e r f o r m e d a t p = 0 a n d q = l a n d b e c a m e : 1 / 2 b u t y r a t e ' + 1 / 2 i s o b u t y r a t e + 2 H C O 3 ‘ — ) 2 a c e t a t e “ + H + + 2 f o r m a t e ' ( 6 - 1 1 ) C a l c u l a t i o n o f f r e e e n e r g y a v a i l a b l e f o r r e a c t i o n ( 6 - 1 1 ) i n d i c a t e s t h a t t h e m o s t t h e r m o d y n a m i c a l l y f a v o r a b l e c o n d i t i o n i s o b t a i n e d a t e q u a l c o n c e n t r a t i o n s o f i s o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e ( F i g u r e 6 - 1 6 c ) . E x p e r i m e n t a l r e s u l t s a r e c o n s i s t e n t w i t h t h i s a n a l y s i s ( F i g u r e s 6 . 5 , 6 . 7 , 6 . 8 , 6 . 1 2 t o 6 . 1 5 ) . T h e s a m e s i m u l a t i o n c a n a l s o b e o b t a i n e d b y c h a n g i n g t h e c o n c e n t r a t i o n s o f a c e t a t e , i s o b u t y r a t e - b u t y r a t e m i x t u r e a n d f o r m a t e , o r a s s u m i n g H 2 a s e l e c t r o n c a r r i e r w i t h i n n o r m a l r a n g e s f o u n d i n a n a e r o b i c d i g e s t e r s . ' 1 1 . B " ‘ . p c I I , “ . 0 , I , = ' s l y " ° . 9 I ' , I " " l I , $ 0 ’ O “ 1 . I - I I u ’ I " . b a ’ 1 ’ ” f 5 ” 0 1 ” ” ' j ’ h l a v a v = 1 v ‘ " “ ¥ 4 4 0 " ” ? 4 0 ' X 1 : ” ! j ] N V I I ‘ 0 ’ " Q . » ' I I , 1 : l l % O F B U T Y R A T E I N B U T Y R A T E - I S O B U T Y R A T E M I X T U R E A : ( 1 + p ) b u t y r a t e ' + 2 H C O , , ' — ) 2 a c e t a t e ' + H + + 2 f o r m a t e ' + p i s o b u t y r a t e ' ( 1 0 2 0 ) B : q i s o b u t y r a t e + 2 H C O 3 ‘ — > 2 a c e t a t e ‘ + H + + 2 f o r m a t e ‘ + ( q - l ) b u t y r a t e ' ( 4 2 1 ) C : 1 / 2 b u t y r a t e ' + 1 / 2 i s o b u t y r a t e + 2 H C O , ’ — - > 2 a c e t a t e ’ + H “ + 2 f o r m a t e ‘ F i g u r e 6 . 1 6 F r e e e n e r g y c h a n g e o f i s o m e r i z a t i o n c o u p l e d w i t h b u t y r a t e o x i d a t i o n v s . t h e p e r c e n t a g e o f b u t y r a t e i n a b u t y r a t e - i s o b u t y r a t e m i x t u r e , b a s e d o n i n t e r s p e c i e s f o r m a t e t r a n s f e r . S i m u l a t i o n w a s c o n d u c t e d a t p H 7 . 0 , a c e t a t e 5 m M , f o r m a t e 2 1 1 M , b i c a r b o n a t e 5 0 m M a n d i s o b u t y r a t e p l u s b u t y r a t e 1 0 m M . 2 5 4 6 . 5 C H A R A C T E R I Z A T I O N O F H Y D R O G E N - F O R M A T E M E T A B O L I S M I n a p r e v i o u s s t u d y , f o r m a t e w a s o b s e r v e d d u r i n g m e t h a n o g e n e s i s f r o m H z - C O 2 b y t h e g r a n u l e s d e v e l o p e d o n a b r e w e r y w a s t e w a t e r ( C h a p t e r 4 ) , a n d a l s o o b s e r v e d d u r i n g t h e p e r t u r b a t i o n o f f a t t y a c i d d e g r a d a t i o n b y h y d r o g e n ( F i g u r e 6 . 1 4 a n d 6 . 1 5 ) . M e t h a n o g e n e s i s f r o m l - I z - C O 2 w a s e x a m i n e d u s i n g t h e R - g r a n u l e s a n d s e v e r a l p u r e m e t h a n o g e n i c c u l t u r e s t o i d e n t i f y i f t h e f o r m a t i o n o f f o r m a t e w a s a l s o p e r f o r m e d b y o t h e r a n a e r o b i c g r a n u l e s a n d t o i d e n t i f y t h e o r g a n i s m s r e s p o n s i b l e f o r f o r m a t e s y n t h e s i s . 6 . 5 . 1 F o r m a t e s y n t h e s i s b y t h e R - g r a n u l o s F o r m a t e f o r m a t i o n d u r i n g m e t h a n o g e n e s i s f r o m H z - C O 2 b y t h e R - g r a n u l e s ( 3 5 ° C ) i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 6 . 1 7 . T h e i n i t i a l e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s w e r e : p H 7 . 0 5 , h y d r o g e n p a r t i a l p r e s s u r e 0 . 9 5 a t m , a n d H C O 3 ' 5 0 m M . I n o c u l a t e d g r a n u l e s w e r e 0 . 8 g V S S / L . F o r m a t e ( 0 . 0 4 2 m M ) w a s o b s e r v e d a f t e r c a . 5 m i n u t e s o f i n o c u l a t i o n a n d w a s s y n t h e s i z e d r a p i d l y t o r e a c h a m a x i m u m l e v e l o f 3 . 5 m M w i t h i n 6 h o u r s . F o r m a t e t h e n g r a d u a l l y d e c l i n e d a s H 2 w a s c o n s u m e d . D u r i n g t h e i n i t i a l o n e h o u r , t h e r a t e f o r m e t h a n e p r o d u c t i o n a n d n e t f o r m a t e s y n t h e s i s ( a s s u m i n g t h a t f o r m a t e w a s n o t c o n c u r r e n t l y d e g r a d e d ) w e r e 5 0 m m o l e / h r a n d 1 0 1 m m o l e / h r , r e s p e c t i v e l y . T h i s i n d i c a t e s t h a t a m i n i m u m o f o n e t h i r d o f t o t a l h y d r o g e n c o n s u m e d w a s u s e d t o s y n t h e s i z e f o r m a t e . F o r m a t e f o r m a t i o n f r o m h y d r o g e n w a s a c o m m o n c h a r a c t e r i s t i c o f v a r i o u s g r a n u l e s . I t w a s a l s o p r o d u c e d b y t h e F - g r a n u l e s a n d b r e w e r y g r a n u l e s ( C h a p t e r 4 ) . 2 5 5 1 . 2 ' 1 4 A E - 1 2 E 1 H y d r o g e n M e t h a n e G O E E > 0 z 3 0 . 8 ' . 0 ‘ E z " 8 g 0 . 6 i Q G 8 O . - ' 5 I : n : - Q “ 0 g 0 . 4 3 ; . H m I A - 2 0 . 2 - A 3 6 / A ~ t 2 g “ : 3 F o r m a t e m E 0 I r l " 0 o 5 1 o 1 5 2 0 2 5 T I M E ( h r s ) F i g u r e 6 . 1 7 F o r m a t e f o r m a t i o n d u r i n g m e t h a n o g e n e s i s f r o m H z - C O 2 b y t h e R — g r a n u l e s . 6 . 5 . 2 F o r m a t e s y n t h e s i s b y p u r e m e t h a n o g e n c u l t u r e s F i v e s t r a i n s o f m e t h a n o g e n s w e r e e x a m i n e d t o d e t e r m i n e i f t h e y c o u l d s y n t h e s i z e f o r m a t e f r o m H 2 p l u s H C O 3 ' o r C 0 2 . F o u r o f t h e s e s t r a i n s , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n M F ( t y p e s t r a i n ) , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T l N , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n R F a n d M s p . h u n g a t e i s t r a i n B D c a n u s e b o t h H z - C O 2 a n d f o r m a t e t o p r o d u c e m e t h a n e . O n e s t r a i n , M s . m a z e i T 1 8 c a n u s e H z - C O 2 a n d a c e t a t e b u t d o e s n o t u s e f o r m a t e t o p r o d u c e m e t h a n e . 2 5 6 O a - 0 I I P - 5 - - - 5 > € d , . g . g - 1 0 - - - 1 0 g 0 r . u , : 0 g - 1 5 - - - 1 5 g ‘ 3 ‘ P u . 5 . 2 0 ~ 2 0 . - t 1 - 2 5 2 5 O 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 . g ' : 1 0 I r o g e n _ : A 0 . 5 : ~ _ 5 A g 5 0 . 3 - " 5 c v 0 . 2 - F o r m . " 0 1 0 ’ ‘ . ‘ ” 0 1 ‘ 6 ‘ 2 5 O E 0 . 1 ' 1 S « ' 5 . . I a ; > . o : 1 , t h a t . : r , U - 0 . 0 5 ' _ 1 E I . 0 . 0 3 . . ' \ t 0 . 0 2 w . - - . . . . - L ' 0 5 0 2 0 4 0 s o 8 0 ' 1 0 0 ' T i m e ( h r ) F i g u r e 6 . 1 8 F o r m a t e f o r m a t i o n d u r i n g t h e g r o w t h o f M b . f o r m i c i c u m s t r a i n M P o n H z - C O Z . F r e e e n e r g y c a l c u l a t i o n i s d e s c r i b e d i n A p p e n d i x E . i ) M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s p . F o r m a t e w a s o b s e r v e d d u r i n g t h e g r o w t h o f t h r e e s t r a i n s o f M b . f o r m i c i c u m t e s t e d . F o r m a t e s y n t h e s i s b y M b . f o r m i c i c u m s t r a i n M F g r o w n o n H z - C O 2 a n d t h e c h a n g e s i n f r e e e n e r g y ( A G ’ ) f o r f o r m a t e s y n t h e s i s f r o m H 2 p l u s b i c a r b o n a t e a t 3 7 ° C i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 6 . 1 8 . I n i t i a l c o n d i t i o n s w e r e p H o f 6 . 9 0 , H 2 o f 0 . 8 6 a t m . , a n d 5 0 m M H C O 3 ‘ . A f t e r i n o c u l a t i o n ( 2 % , v o l / v o l ) , f o r m a t e ( 0 . 0 2 4 m M ) w a s o b s e r v e d w i t h i n a f e w m i n u t e s . T h e f o r m a t e l e v e l i n c r e a s e d q u i c k l y d u r i n g t h e i n i t i a l 2 4 h o u r s , ) m t a ( N E G O R D Y H ) M m ( E T A M R O F R O E N A H T E M 2 5 7 r e a c h i n g a m a x i m u m c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 4 m M . T h e a v a i l a b l e f r e e e n e r g y f o r f o r m a t e s y n t h e s i s c h a n g e d f r o m H 2 p l u s H C O , ‘ f r o m - 2 1 t o - 1 4 k J / r e a c t i o n . A s h y d r o g e n w a s f u r t h e r c o n s u m e d , t h e f o r m a t e c o n c e n t r a t i o n g r a d u a l l y d e c l i n e d f r o m 0 . 4 0 m M t o 0 . 1 8 m M . F i n a l l y , f o r m a t e w a s c o n s u m e d t o a n u n d e t e c t a b l e l e v e l ( < 5 M ) a s t h e H 2 p a r t i a l p r e s s u r e d e c r e a s e d t o b e l o w 1 0 3 a t m . D u r i n g t h i s p e r i o d , a n e a r s t e a d y - s t a t e v a l u e f o r A G ’ o f a p p r o x i m a t e l y - 1 4 k J / r e a c t i o n w a s o b s e r v e d . T I M E ( h r ) F i g u r e 6 . 1 9 F o r m a t e f o r m a t i o n d u r i n g t h e g r o w t h o f M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T l N o n H z - C O Z . ) M m ( S T A M R O F ) M m ( R E O ) m t a ( N E G O R D Y H N A H T E M 2 5 8 1 . 2 ' 1 4 H y d r o g e n / T I M E ( h r ) F i g u r e 6 . 2 0 F o r m a t e f o r m a t i o n d u r i n g t h e g r o w t h o f M b . f o r m i c i c u m s t r a i n R F o n H 2 ' C O z . S i m i l a r p a t t e r n s o f f o r m a t e s y n t h e s i s w e r e o b s e r v e d d u r i n g t h e g r o w t h o f M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N ( F i g u r e 6 . 1 9 ) a n d M b . f o r m i c i c u m s t r a i n R F ( F i g u r e 6 . 2 0 ) o n H z - C O Z . E n e r g e t i c c a l c u l a t i o n s i n d i c a t e d t h a t t h e f r e e e n e r g y v a l u e s f o r t h e s y n t h e s i s o f f o r m a t e f r o m H 2 p l u s H C O 3 ' w e r e f a v o r a b l e . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t s y n t h e s i s o f f o r m a t e i s a c o m m o n p h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f M b . f o r m i c i c u m s p e c i e s . i i ) M e t h a n o s p i r i l l u m h u n g a t e i s t r a i n B D F o r m a t e w a s s y n t h e s i z e d b y M s p . h u n g a t e i s t r a i n B D g r o w n o n I - I z - C O Z , a s i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 6 . 2 1 . T h e i n i t i a l g r o w t h c o n d i t i o n s w e r e p H 7 . 0 4 , H 2 p a r t i a l p r e s s u r e 1 . 3 6 a t m , a n d 6 0 m M H C O 3 ‘ . T h e c u l t u r e w a s i n c u b a t e d i n t h e s h a k i n g w a t e r b a t h ( 3 7 ° C ) . A t r a c e a m o u n t o f f o r m a t e w a s o b s e r v e d w i t h i n a h a l f h o u r a f t e r ) m t a ( N E G O R D Y H ) M m ( E N A H T E M 2 5 9 i n o c u l a t i o n . T h e l e v e l o f f o r m a t e c o n t i n u o u s l y i n c r e a s e d t o 1 . 5 m M u n t i l t h e h y d r o g e n p a r t i a l p r e s s u r e h a d d e c r e a s e d t o 0 . 1 7 a t m . T h e f o r m a t e c o n c e n t r a t i o n t h e n c o n c u r r e n t l y d e c r e a s e d a s I - I 2 w a s c o n s u m e d . T h e f r e e e n e r g y a v a i l a b l e f o r f o r m a t e s y n t h e s i s r e m a i n e d f a v o r a b l e d u r i n g t h e e n t i r e a s s a y . a - - a 2 . 5 - - 2 . 5 m 2 1 . 5 - A A “ ? - 1 . 5 E a : 1 . F o r m a t e / . 1 o A / I I I . A ‘ 0 . 5 - 1 I - 0 . 5 A " ’ A ’ ‘ 0 « 1 r " . . . 0 . 4 — - o 0 2 0 4 0 s o s o 1 0 0 1 2 0 1 4 0 2 ' I n m 1 5 _ H y d r o g e n £ 5 4 3 _ 1 5 “ ' 1 0 T I M E ( h r s ) F i g u r e 6 . 2 1 F o r m a t e f o r m a t i o n d u r i n g t h e g r o w t h o f M s p . h u n g a t e i s t r a i n B D o n H 2 ' C O z . 2 6 0 a - - 1 . 4 « X - 2 - 5 ‘ A c e t a t e 0 1 * r 1 2 E f \ 1 1 . ’ 2 ‘ E 2 4 ‘ 1 H E v f ' A . A ' A . - - 0 0 v I “ ! 1 . 5 - / 4 P F o r m a t e I E < I ” 0 . 6 < 2 f l ; g I d J , A - 0 . 4 0 I L 0 5 f r I < - A — A ’ e A ~ 0 2 o I U I I I I I o 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 1 F 1 2 . . . . . . N ' s - " 0 m . E H y d r o g e n . M e t h a n e g s . . I “ E z ' ‘ ( “ 5 ’ L - e g 0 0 . 4 - < a - 4 E E 0 . 2 " e . 1 - 2 2 0 o - " 0 o r I r I I - 0 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 T I M E ( h r s ) F i g u r e 6 . 2 2 F o r m a t e a n d a c e t a t e f o r m a t i o n d u r i n g t h e g r o w t h o f M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 o n H z - C O Z . F o r m a t e w a s s y n t h e s i z e d b u t w a s n o t c o n s u m e d . i i i ) M e t h a n o s a r c i n a m a z e i s t r a i n T 1 8 F o r m a t e w a s a l s o s y n t h e s i z e d b y M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 w h e n g r o w n o n H z - C O 2 ( F i g u r e 6 . 2 2 ) . T h e i n i t i a l g r o w t h c o n d i t i o n s w e r e p H 6 . 8 , 0 . 8 8 a t m H 2 a n d 5 0 m M H C O 3 ' . A l o w i n i t i a l l e v e l o f f o r m a t e ( 0 . 1 5 m M ) w a s p r e s e n t a s a c o n s e q u e n c e o f i n o c u l a t i o n . T h e f o r m a t e l e v e l c o n t i n u o u s l y i n c r e a s e d u n t i l h y d r o g e n w a s c o n s u m e d . 2 6 1 U n l i k e t h e s i t u a t i o n d u r i n g t h e g r o w t h o f M b . f o r m i c i c u m a n d M s p . h u n g a t e i , t h e f o r m a t e s y n t h e s i z e d w a s n o t s u b s e q u e n t l y c o n s u m e d . A c e t a t e f o r m a t i o n w a s a l s o o b s e r v e d d u r i n g t h e g r o w t h . T h e a c e t a t e c o n c e n t r a t i o n i n c r e a s e d f r o m a n i n i t i a l l e v e l o f 0 . 3 2 m M t o a p e a k l e v e l ( 1 . 2 4 m M ) a n d t h e n d e c r e a s e d t o a fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 9 5 m M . 6 . 6 D I S C U S S I O N 6 . 6 . 1 T h e r o l e o f d i f f e r e n t s p e c i e s i n V F A d e g r a d a t i o n F o u r s y n t r o p h i c a c e t o g e n s a n d fi v e m e t h a n o g e n s w e r e i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s . T h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f s u b s t r a t e u t i l i z a t i o n f o r t h e s e b a c t e r i a r e v e a l s h o w t h e s e o r g a n i s m s w o r k t o g e t h e r i n t h e g r a n u l e e c o s y s t e m t o c o m p l e t e l y m i n e r a l i z e a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e i n t h e r e a c t o r f e e d t o m e t h a n e a n d C 0 2 . T o g e t h e r w i t h M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T l N , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n R F , a n d M s p . h u n g a t e i s t r a i n B D , p r o p i o n a t e i s s y n t r o p h i c a l l y d e g r a d e d t o a c e t a t e a n d m e t h a n e b y s t r a i n s P W a n d P T . L i k e w i s e , b u t y r a t e i s s y n t r o p h i c a l l y d e g r a d e d t o a c e t a t e a n d m e t h a n e b y s t r a i n s B H a n d I B , r e s p e c t i v e l y i n c o n j u n c t i o n w i t h H 2 a n d f o r m a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s t h a t w o r k a s s y n t r o p h i c p a r t n e r s t o m a i n t a i n t h e r m o d y n a m i c a l l y f a v o r a b l e c o n d i t i o n s f o r V F A d e g r a d a t i o n . T h e f o r m a t i o n o f i s o b u t y r a t e , 2 - m e t h y l b u t y r a t e a n d v a l e r a t e w a s o b s e r v e d d u r i n g t h e d e g r a d a t i o n o f a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e b y t h e R - g r a n u l e s . W i t h i n t h e R - g r a n u l e s , i s o b u t y r a t e w a s i s o m e r i z e d f r o m b u t y r a t e b y s t r a i n I B a n d 2 - m e t h y l b u t y r a t e w a s s y n t h e s i z e d f r o m p r o p i o n a t e d u r i n g s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y s t r a i n I B . V a l e r a t e w a s s y n t h e s i z e d f r o m p r o p i o n a t e d u r i n g s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y 2 6 2 s t r a i n B H . T h e i s o b u t y r a t e f o r m e d i s a l s o d e g r a d e d b y s t r a i n I B , w h i l e 2 - m e t h y l b u t y r a t e a n d v a l e r a t e w e r e d e g r a d e d b y s t r a i n s 1 B a n d B H . 6 . 6 . 2 I s o m e r i z a t i o n i n c o m p l e x a n a e r o b i c e c o s y s t e m s R e s u l t s f r o m C h a p t e r 4 d e m o n s t r a t e d t h a t i s o b u t y r a t e w a s f o r m e d f r o m b u t y r a t e a n d s u b s e q u e n t l y i s o m e r i z e d b a c k t o b u t y r a t e a n d d e g r a d e d b y t h e g r a n u l e s d e v e l o p e d o n a b r e w e r y w a s t e w a t e r . T h e f o r m a t i o n o f i s o b u t y r a t e f r o m b u t y r a t e a n d v i c e v e r s a w e r e a l s o o b s e r v e d i n t h e R - a n d F - g r a n u l e s ( C h a p t e r 3 ) . T h e s e f a c t s c o n fi r m e d t h e r e s u l t s o f T h o l o z a n e t a l . ( 1 9 8 8 a ) w i t h d i g e s t e d s l u d g e ( i . e . t h e i s o m e r i z a t i o n b e t w e e n b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e w a s r e v e r s i b l e ) . I n t h e R - g r a n u l e s , t h e m e t a b o l i c f u n c t i o n w a s p e r f o r m e d b y a n i s o b u t y r a t e - b u t y r a t e d e g r a d e r , s t r a i n I B . T h e r e m a r k a b l e c h a r a c t e r i s t i c o f s y n t r o p h i c d e g r a d a t i o n o f i s o b u t y r a t e o r b u t y r a t e b y s t r a i n I B ( a n d , p r o b a b l y , o t h e r s y n t r o p h i c i s o b u t y r a t e - b u t y r a t e d e g r a d e r s ) w a s t h a t e q u a l c o n c e n t r a t i o n s o f i s o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e w e r e e v e n t u a l l y a c h i e v e d a n d t h e n b o t h t h e f a t t y a c i d s d i s a p p e a r e d a t t h e s a m e r a t e s . T h i s w a s n o t o b s e r v e d d u r i n g t h e i s o b u t y r a t e o r b u t y r a t e d e g r a d a t i o n i n a n a e r o b i c d i g e s t e d s l u d g e s o r a n a e r o b i c g r a n u l e s . I n t h e l a t t e r c a s e , b u t y r a t e a l w a y s d i s a p p e a r e d a t a m u c h h i g h e r r a t e s t h a n i s o b u t y r a t e ( e . g . F i g u r e s 4 . 5 , 6 . 1 a n d 6 . 2 ) b e c a u s e o t h e r b u t y r a t e d e g r a d e r s , s u c h a s S y n t r o p h o s p o r a s p e c i e s ( S t i e b a n d S h i n c k , 1 9 8 5 ; Z h a o e t a l . , 1 9 9 0 ) o r / a n d S y n t r o p h o m o n a s s p e c i e s ( M c l n e m e y e t a l . , 1 9 8 1 ) t h a t u s e b u t y r a t e b u t d o n o t u t i l i z e i s o b u t y r a t e , a r e p r e s e n t . T h e p h y s i o l o g i c a l r e a s o n f o r i s o m e r i z a t i o n o f b u t y r a t e t o i s o b u t y r a t e i s n o t c l e a r s i n c e i s o b u t y r a t e f o r m e d h a s t o b e r e - i s o m e r i z e d t o b u t y r a t e f o r f u r t h e r d e g r a d a t i o n . O n e p o s s i b l e e x p l a n a t i o n m a y b e t h a t t h e r e v e r s i b l e f u n c t i o n o f a n i s o m e r a s e s y s t e m a l l o w s t h e b a c t e r i a t o " s t o r e " b u t y r a t e i n a f o r m t h a t o n l y a l i m i t e d n u m b e r o f o r g a n i s m s c a n u t i l i z e . T h i s i s a t y p e o f e x t r a c e l l u l a r s t o r a g e m e c h a n i s m r a t h e r t h a n 2 6 3 s t o r a g e d e p o t f o r c a r b o n a n d e n e r g y a s i n c l u s i o n w i t h i n c e l l s s u c h a s P H B w h i c h w a s o b s e r v e d i n s i d e t h e c e l l s o f S y n t r o p h o m o n a s s p . ( D u b o u r g u i e r e t a l . , 1 9 8 8 a ) . 6 . 6 . 3 P a t h w a y s o f s y n t r o p h i c d e g r a d a t i o n o f 2 - m e t h y l b u t y r a t e a n d v a l e r a t e V a l e r a t e a n d 2 - m e t h y l b u t y r a t e a r e b y - p r o d u c t s o f b u t y r a t e d e g r a d a t i o n t h a t w e r e o b s e r v e d f o r m e d o n l y i n t h e p r e s e n c e o f p r o p i o n a t e . T h e s e c o m p o u n d s c a n t h e n b e d e g r a d e d b y s t r a i n B H a n d s t r a i n I B . i ) B y s t r a i n B H T h e p a t h w a y o f s y n t r o p h i c v a l e r a t e d e g r a d a t i o n b y c o c u l t u r e o f s t r a i n B H a n d M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T l N a p p e a r e d t o b e B - o x i d a t i o n s i n c e p r o p i o n a t e a n d a c e t a t e w e r e o b s e r v e d d u r i n g t h e d e g r a d a t i o n a n d t h e m o l a r r a t i o a m o n g t h e s e a c i d s p r o d u c e d a n d m e t h a n e f o r m e d w a s a l s o c o n s i s t e n t w i t h t h a t e x p e c t e d f r o m a B - o x i d a t i o n r e a c t i o n ( T a b l e 1 . 3 i n C h a p t e r 1 ) . T h e e n d p r o d u c t s ( m e t h a n e , a c e t a t e a n d p r o p i o n a t e ) o f 2 - m e t h y 1 b u t y r a t e d e g r a d a t i o n w e r e b a s i c a l l y t h e s a m e a s t h o s e o f v a l e r a t e d e g r a d a t i o n . T h e p a t h w a y o f 2 — m e t h y l b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y s t r a i n B H w a s n o t c l e a r s i n c e p r o p i o n a t e c a n n o t b e p r o d u c e d d i r e c t l y f r o m B - o x i d a t i o n o f 2 - m e t h y l b u t y r a t e a n d n o o t h e r f a t t y a c i d s w e r e o b s e r v e d . i i ) B y s t r a i n I B S y n t r o p h i c d e g r a d a t i o n o f 2 - m e t h y 1 b u t y r a t e a n d v a l e r a t e b y s t r a i n I B a p p e a r e d m o r e c o m p l i c a t e d t h a n d e g r a d a t i o n o f a c i d s w i t h f o u r c a r b o n a t o m s . A l t h o u g h t h e s e t w o f a t t y a c i d s h a v e a s i m i l a r m o l e c u l a r s t r u c t u r e a s i n b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e , t h e p r e s e n c e o f a r e v e r s i b l e i s o m e r i z a t i o n b e t w e e n 2 - m e t h y l b u t y r a t e a n d v a l e r a t e w a s n o t o b s e r v e d . I s o m e r i z a t i o n f r o m 2 - m e t h y l b u t y r a t e t o v a l e r a t e c o u l d n o t d e t e c t e d d u r i n g 2 - m e t h y l b u t y r a t e c o n v e r s i o n ( F i g u r e 6 . 9 ) . H o w e v e r , i s o m e r i z a t i o n o f v a l e r a t e t o 2 - m e t h y l b u t y r a t e d i d i n d e e d o c c u r . A t r a c e a m o u n t o f 2 - m e t h y l b u t y r a t e w a s 2 6 4 r e p e a t e d l y d e t e c t e d d u r i n g s y n t r o p h i c d e g r a d a t i o n o f v a l e r a t e ( F i g u r e 6 . 1 0 ) . D u r i n g d e g r a d a t i o n o f 2 ~ m e t h y 1 b u t y r a t e , p r o p i o n a t e w a s f o r m e d a t a m o l a r r a t i o o f 0 . 9 1 ( p r o p i o n a t e p r o d u c e d p e r 2 - m e t h y l b u t y r a t e c o n s u m e d ) . H o w e v e r , i s o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e a l s o w e r e f o r m e d a n d t h e n d e g r a d e d . T h i s s h o w s t h a t c o n v e r s i o n o f 2 - m e t h y l b u t y r a t e i s m o r e c o m p l i c a t e d t h a n a s i m p l e B - o x i d a t i o n r e a c t i o n . T h e r e s u l t s o f b u t y r a t e c o n v e r s i o n i n t h e p r e s e n c e o f p r o p i o n a t e p r o v i d e d u s e f u l i n f o r m a t i o n t o e x a m i n e t h e s y n t r o p h i c c o n v e r s i o n o f 2 - m e t h y l b u t y r a t e . I n a d d i t i o n t o i s o b u t y r a t e , 2 - m e t h y l b u t y r a t e w a s a l s o f o r m e d d u r i n g b u t y r a t e d e g r a d a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f p r o p i o n a t e ( F i g u r e 6 . 1 1 ) . I t a p p e a r e d t h a t 2 - m e t h y l b u t y r a t e m a y h a d b e e n s y n t h e s i z e d f r o m p r o p i o n a t e a n d i s o b u t y r a t e , b e c a u s e ( i ) t h e i n c r e a s e i n t h e 2 - m e t h y 1 b u t y r a t e c o n c e n t r a t i o n w a s d i r e c t l y p r o p o r t i o n a l t o t h e d e c r e a s e i n p r o p i o n a t e c o n c e n t r a t i o n , a n d t h e p r o p i o n a t e c o n c e n t r a t i o n w a s r e s t o r e d t o i t s o r i g i n a l l e v e l w h e n t h e 2 - m e t h y l b u t y r a t e f o r m e d w a s s u b s e q u e n t l y c o n s u m e d ; ( i i ) n o 2 - m e t h y l b u t y r a t e w a s f o r m e d i n t h e p r e s e n c e o f a c e t a t e p l u s p r o p i o n a t e w i t h o u t i s o b u t y r a t e o r b u t y r a t e p r e s e n t ; a n d ( i i i ) i s o b u t y r a t e w a s d e t e c t e d p r i o r t o t h e d e t e c t i o n o f b u t y r a t e d u r i n g 2 - m e t h y l b u t y r a t e c o n v e r s i o n . P r e s u m a b l y , t h e f o r m a t i o n o f 2 - m e t h y l b u t y r a t e m a y i n v o l v e t h e e x c h a n g e o f t h e m e t h y l - g r o u p i n i s o b u t y r a t e w i t h e t h y l - g r o u p i n p r o p i o n a t e : C H 3 C I I 2 C O O ‘ + C H 3 C H C O O ' : - C H 3 C I - 1 2 C H C O O ' + C H 3 C O O ' E H , 6 H , ( p r o p i o n a t e ) ( i s o b u t y r a t e ) ( 2 - m e t h y l b u t y r a t e ' ) ( a c e t a t e ' ) A G ° ’ = - 0 . 0 3 k J / r e a c t i o n ( 6 - 1 2 ) I n t h i s p r o p o s e d r e a c t i o n , 2 - m e t h y l b u t y r a t e a n d a c e t a t e a r e p r o d u c e d i n t h e p r e s e n c e o f h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f p r o p i o n a t e a n d i s o b u t y r a t e a n d v i c e v e r s a s i n c e t h e r e a c t i o n 2 6 5 a p p e a r s t o b e r e v e r s i b l e . T h i s p r o p e r l y e x p l a i n s t h e s y n t r o p h i c d e g r a d a t i o n o f 2 - m e t h y 1 b u t y r a t e : i n i t i a l l y , a m o l e c u l e o f 2 - m e t h y l b u t y r a t e e x c h a n g e s i t s e t h y l - g r o u p f o r t h e m e t h y l - g r o u p o f a m o l e c u l e o f a c e t a t e t o f o r m a m o l e c u l e o f i s o b u t y r a t e a n d a m o l e c u l e o f p r o p i o n a t e ; a n d t h e n i s o b u t y r a t e i s i s o m e r i z e d t o b u t y r a t e . E v e n t u a l l y , t h e b u t y r a t e i s c o n v e r t e d t o a c e t a t e a n d f o r m a t e o r H 2 v i a B — o x i d a t i o n . T h u s , d u r i n g t h e s y n t r o p h i c c o n v e r s i o n o f 2 - m e t h y 1 b u t y r a t e i n t h e p r e s e n c e o f a c e t a t e , t h e s e q u e n c e o f d e t e c t a b l e f a t t y a c i d s o t h e r t h a n 2 - m e t h y l b u t y r a t e a n d a c e t a t e a r e e x p e c t e d t o b e p r o p i o n a t e a n d i s o b u t y r a t e f o l l o w e d b y b u t y r a t e . T h e s e a s s u m p t i o n s h a v e b e e n s u p p o r t e d b y t h e e x p e r i m e n t a l o b s e r v a t i o n s ( F i g u r e 6 . 1 0 ) . O n t h e o t h e r h a n d , t h e i s o m e r i z a t i o n o f 2 - m e t h y 1 b u t y r a t e t o v a l e r a t e a n d t h e n d e g r a d a t i o n v i a B - o x i d a t i o n w a s n o t s u p p o r t e d b y t h e e x p e r i m e n t s p e r f o r m e d . W h e n t h e t r i c u l t u r e w a s g r o w n o n v a l e r a t e , p r o p i o n a t e w a s p r o d u c e d a t a m o l a r r a t i o o f 0 . 9 2 ( p r o p i o n a t e p r o d u c e d / v a l e r a t e c o n s u m e d ) . T h e c o n v e r s i o n o f v a l e r a t e t o m e t h a n e a n d p r o p i o n a t e p r o b a b l y f o l l o w e d B - o x i d a t i o n a s h a s b e e n s h o w n f o r o t h e r s y n t r o p h i c b u t y r a t e - d e g r a d i n g c u l t u r e s ( M c I n e r n e y e t a l . , 1 9 8 1 ; S t i e b a n d S c h i n k , 1 9 8 5 ) . H o w e v e r , t h e f o r m a t i o n o f i s o b u t y r a t e , b u t y r a t e a n d 2 - m e t h y 1 b u t y r a t e d u r i n g v a l e r a t e c o n v e r s i o n ( F i g u r e 6 . 9 ) i n d i c a t e s t h a t o t h e r p a t h w a y s a l s o e x i s t . O n e p o s s i b l e p a t h w a y m a y b e d e g r a d a t i o n o f v a l e r a t e t h r o u g h 2 - m e t h y l b u t y r a t e s i n c e 2 - m e t h y l b u t y r a t e w a s d e t e c t e d d u r i n g t h e c o n v e r s i o n o f v a l e r a t e . A n o t h e r p o s s i b l e p a t h w a y m a y b e e n t a i l e x c h a n g e o f t h e e t h y l - g r o u p o f v a l e r a t e w i t h t h e m e t h y l - g r o u p i n a c e t a t e t o f o r m b u t y r a t e a n d p r o p i o n a t e : C H 3 C H 2 C H 2 C H 2 C O O ' + C H 3 C O O ‘ v C H 3 C H 2 C O O ‘ + C H 3 C H 2 C H 2 C O O ' ( v a l e r a t e ' ) ( a c e t a t e ' ) ( p r o p i o n a t e ' ) ( b u t y r a t e ' ) A G ” 2 + 0 . 0 4 k J / r e a c t i o n ( 6 - 1 3 ) 2 6 6 B u t y r a t e f o r m e d i n t h e a b o v e m a n n e r c o u l d b e c o n v e r t e d v i a f u r t h e r B - o x i d a t i o n . A t t h e s a m e t i m e , b u t y r a t e i s a l s o c o n c u r r e n t l y i s o m e r i z e d t o i s o b u t y r a t e s i n c e a l o w e r c o n c e n t r a t i o n o f i s o b u t y r a t e ( c o m p a r e d w i t h b u t y r a t e ) w a s d e t e c t e d i n t h e e x p e r i m e n t T h e l a t t e r t w o p a t h w a y s m a y n o t b e t h e m a j o r m e t a b o l i c r e a c t i o n s f o r v a l e r a t e c o n v e r s i o n , h o w e v e r , s i n c e t h e l e v e l s o f b u t y r a t e , i s o b u t y r a t e a n d 2 — m e t h y l b u t y r a t e o b s e r v e d w e r e l o w . M o r e w o r k i s n e e d e d t o d e fi n e t h e a c t u a l p a t h w a y s a n d t h e s i g n i fi c a n c e o f t h e i s o m e r i z a t i o n r e a c t i o n ( s ) . 6 . 6 . 4 F o r m a t e s y n t h e s i s f r o m H 2 p l u s H C O , ’ o r C O 2 A l l H z - C O Z a n d f o r m a t e u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s ( M b . f o r m i c i c u m a n d M s p . h u n g a t e i ) i n t h e R - g r a n u l e s w e r e a b l e t o s y n t h e s i z e f o r m a t e f r o m H 2 p l u s H C O 3 ' ( o r C 0 , ) a n d e v e n t u a l l y c a t a b o l i z e i t t o m e t h a n e . T h e m i x e d f u n c t i o n m e t h a n o g e n ( M s . m a z e i ) , c a n s y n t h e s i z e f o r m a t e f r o m H 2 p l u s H C O 3 ' ( o r C 0 , ) b u t c a n n o t c a t a b o l i z e i t . T h e s y n t h e s i s o f f o r m a t e b y M b . f o r m i c i c u m i s l i k e l y p e r f o r m e d b y t h e f o r m a t e h y d r o g e n l y a s e s y s t e m c o n s i s t i n g o f h y d r o g e n a s e a n d f o r m a t e d e h y d r o g e n a s e w h i c h c a n p e r f o r m a r e v e r s i b l e c o n v e r s i o n b e t w e e n H 2 p l u s H C O , ‘ a n d f o r m a t e ( B a r o n a n d F e r r y , 1 9 8 9 ) . T h e s a m e e n z y m e s y s t e m p r o b a b l y e x i s t s i n M s p . h u n g a t e i . F o r m a t e h y d r o g e n l y a s e , w h i c h w a s i n v o l v e d i n f o r m a t e s y n t h e s i s f r o m H z - C O Z , w a s a l s o f o u n d i n M e t h a n o s a r c i n a b a r k e r i ( N a g a i a n d N i s h i o , 1 9 8 9 ) . A s i m i l a r e n z y m e m a y e x i s t i n M s . m a z e i . W h e t h e r s y n t r o p h i c a c e t o g e n s a r e a l s o a b l e t o s y n t h e s i z e f o r m a t e f r o m H 2 p l u s H C O 3 ' ( o r C 0 , ) i s n o t c l e a r . H y d r o g e n p r o d u c t i o n f r o m f o r m a t e h a s b e e n f o u n d i n a m o n o c u l t u r e o f S y n t r o p h o m o n a s w o l f e i ( B o o n e e t a l . , 1 9 8 9 ) . T h i s s u g g e s t s t h a t f o r m a t e s y n t h e s i s b y t h i s s y n t r o p h i c a c e t o g e n m a y a l s o b e p o s s i b l e . F u r t h e r r e s e a r c h s h o u l d b e p e r f o r m e d t o i d e n t i f y w h e t h e r s y n t r o p h i c p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e d e g r a d e r s 2 6 7 c a n s y n t h e s i z e f o r m a t e f r o m H , p l u s H C O , ’ ( o r C 0 , ) a n d v i c e v e r s a . 6 . 6 . 5 I n t e r s p e c i e s e l e c t r o n t r a n s f e r I n C h a p t e r 4 , b o t h H , a n d f o r m a t e o c c u r r e d a s i n t e r m e d i a t e p r o d u c t s d u r i n g s y n t r o p h i c e t h a n o l d e g r a d a t i o n . T h e l e v e l o f H , a n d f o r m a t e w a s e q u i l i b r i u m f o r s y n t h e s i s o f f o r m a t e f r o m H , p l u s H C O , ' . I f b o t h H , a n d f o r m a t e a r e a l s o i n t e r m e d i a t e p r o d u c t s d u r i n g s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d a t i o n a t n e a r e q u a l i b r i u m c o n c e n t r a t i o n s , t h e f o r m a t e c o n c e n t r a t i o n w i l l b e t o o l o w t o d e t e c t ( < 5 1 . 1 M ) . T h e r o l e o f f o r m a t e a n d H , s e r v e a s e l e c t r o n c a r r i e r s , t h e r e f o r e , c a n b e e v a l u a t e d o n l y i n d i r e c t l y . T h e p e r t u r b a t i o n o f t h e t r i c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n I B , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T l N a n d M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 w i t h f o r m a t e d e m o n s t r a t e d t h a t a d d i t i o n o f f o r m a t e c o m p l e t e l y i n h i b i t e d b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e o x i d a t i o n . T h e h y d r o g e n p a r t i a l p r e s s u r e a c c u m u l a t e d c o n c u r r e n t l y w i t h f o r m a t e a d d i t i o n . F r e e e n e r g y c a l c u l a t i o n s , b a s e d o n i n t e r s p e c i e s f o r m a t e t r a n s f e r i n d i c a t e d t h a t d u r i n g t h e p e r t u r b a t i o n w i t h f o r m a t e , e x t r e m e l y u n f a v o r a b l e e n e r g e t i c s o c c u r r e d . T h e s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d a t i o n r e s t a r t e d o n l y w h e n f o r m a t e a n d H , c o n c e n t r a t i o n s b e c a m e v e r y l o w a n d t h e f r e e e n e r g y v a l u e s b e c a m e t h e r m o d y n a m i c a l l y f a v o r a b l e ( T a b l e 6 . 5 t o 6 . 6 ) . P e r t u r b a t i o n w i t h H , a l s o c a u s e d c o m p l e t e i n h i b i t i o n o f s y n t r o p h i c b u t y r a t e o x i d a t i o n . S i g n i fi c a n t a m o u n t s o f f o r m a t e a c c u m u l a t e d i n t h e t r i c u l t u r e a n d i n d u c e d u n f a v o r a b l e e n e r g e t i c s f o r s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d a t i o n . S y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d a t i o n a l s o r e s t a r t e d w h e n H , a n d f o r m a t e c o n c e n t r a t i o n s b e c a m e v e r y l o w ( T a b l e 6 . 7 t o 6 . 8 ) . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t b o t h f o r m a t e a n d H , w e r e a n i n t e r m e d i a t e d u r i n g s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d a t i o n . H i g h l e v e l o f h y d r o g e n c a u s e d c o m p l e t e i n h i b i t i o n o f s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d a t i o n d u r i n g h y d r o g e n p e r t u r b a t i o n ( T a b l e 6 . 8 a n d 6 . 9 ) . D u r i n g f o r m a t e 2 6 8 p e r t u r b a t i o n , o n l y a l i m i t e d l e v e l o f h y d r o g e n a c c u m u l a t e d . B e c a u s e o f . m a s s t r a n s f e r r e s i s t a n c e o f h y d r o g e n b e t w e e n g a s a n d l i q u i d p h a s e s , t h e d i s s o l v e d h y d r o g e n c o n c e n t r a t i o n s c o u l d n o t b e a c c u r a t e l y e s t i m a t e d f r o m t h e h y d r o g e n p a r t i a l p r e s s u r e s m e a s u r e d . A s a r e s u l t , t h e a c t u a l A G ’ v a l u e s f o r i n t e r s p e c i e s h y d r o g e n t r a n s f e r a r e d i f fi c u l t t o c a l c u l a t e f r o m t h e d a t a o f h y d r o g e n p a r t i a l p r e s s u r e s i n T a b l e s 6 - 6 t o 6 - 9 , e s p e c i a l l y w h e n t h e h y d r o g e n c o n c e n t r a t i o n w a s l o w . B a s e d o n t h e o b s e r v a t i o n o f t h e r e v e r s i b l e c o n v e r s i o n b e t w e e n h y d r o g e n a n d f o r m a t e i n g r a n u l e s a n d p u r e m e t h a n o g e n i c c u l t u r e s , h o w e v e r , b o t h f o r m a t e a n d h y d r o g e n a r e p o s s i b l e i n t e r m e d i a t e s d u r i n g s y n t r o p h i c i s o b u t y r a t e - b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y t h i s t r i c u l t u r e . I n a n a e r o b i c d i g e s t e r s , b o t h f o r m a t e a n d h y d r o g e n c a n b e c o n s i d e r e d a s i n t e r m e d i a t e s d u r i n g s y n t r o p h i c a c e t o g e n e s i s . A n a e r o b i c d i g e s t e r s a r e b i c a r b o n a t e - r i c h e c o s y s t e m s ( u s u a l l y , w i t h a l k a l i n i t i e s r a n g i n g f r o m 8 0 0 t o 3 0 0 0 m g / L a s C a C O 3 ) . A s d e s c r i b e d a b o v e , H , - C O , a n d f o r m a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s s u c h a s M b . f o r m i c i c u m a n d M s p . h u n g a t e i ( w h i c h a r e p r e v a l e n t s p e c i e s i n m o s t a n a e r o b i c d i g e s t e r s ) c a n p e r f o r m r e v e r s i b l e c o n v e r s i o n b e t w e e n H , p l u s H C O , ‘ a n d f o r m a t e . I t i s a l s o p o s s i b l e ‘ t h a t o t h e r o r g a n i s m s i n t h e e c o s y s t e m s s u c h a s s y n t r o p h i c a c e t o g e n s c a n p e r f o r m t h i s r e v e r s i b l e r e a c t i o n . T h e r e f o r e , b o t h h y d r o g e n a n d f o r m a t e a r e l i k e l y c o n v e r t e d f r o m o n e t o a n o t h e r c o n t i n u o u s l y . I t i s v i r t u a l l y i m p o s s i b l e , t h e r e f o r e , t o i d e n t i f y w h i c h o f t h e s e s e r v e s a s t h e p r e d o m i n a n t e l e c t r o n c a r r i e r d u r i n g s y n t r o p h i c a c e t o g e n e s i s . 6 . 7 S U M M A R Y 1 ) S y n t r o p h i c p r o p i o n a t e d e g r a d a t i o n i n t h e R - g r a n u l e s w a s p e r f o r m e d b y s t r a i n s P I ‘ a n d P W t o g e t h e r w i t h H , - f o r m a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s . S y n t r o p h i c b u t y r a t e 2 6 9 d e g r a d a t i o n w a s p e r f o r m e d b y s t r a i n s B H a n d I B . 2 ) R e v e r s i b l e i s o m e r i z a t i o n b e t w e e n b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e o c c u r r e d d u r i n g s y n t r o p h i c b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y a n a e r o b i c g r a n u l e s . I n t h e R - g r a n u l e s , t h i s r e a c t i o n w a s p e r f o r m e d b y s y n t r o p h i c i s o b u t y r a t e - b u t y r a t e d e g r a d i n g s t r a i n I B . T h e r e v e r s i b l e i s o m e r i z a t i o n w a s c o u p l e d w i t h b u t y r a t e o x i d a t i o n . T h e d i r e c t i o n o f t h e i s o m e r i z a t i o n w a s c o n t r o l l e d b y t h e r a t i o b e t w e e n i s o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e . T h e m o s t t h e r m o d y n a m i c a l l y f a v o r a b l e c o n d i t i o n f o r t h e s y n t r o p h i c d e g r a d a t i o n o f b u t y r a t e o r i s o b u t y r a t e i n c o n j u n c t i o n w i t h t h e i s o m e r i z a t i o n w a s a t e q u a l c o n c e n t r a t i o n s o f i s o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e . 3 ) V a l e r a t e a n d 2 - m e t h y l b u t y r a t e w e r e p r o d u c e d d u r i n g s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y a n a e r o b i c g r a n u l e s w h e n p r o p i o n a t e w a s p r e s e n t . S t r a i n B H s y n t h e s i z e d v a l e r a t e f r o m p r o p i o n a t e o n l y d u r i n g s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d a t i o n . I s o b u t y r a t e d e g r a d i n g s t r a i n I B w a s r e s p o n s i b l e f o r t h e s y n t h e s i s o f 2 - m e t h y l b u t y r a t e . T h e m e t a b o l i c p a t h w a y f o r s y n t r o p h i c v a l e r a t e d e g r a d a t i o n b y s t r a i n s I B a n d B H a p p e a r e d t o f o l l o w B - o x i d a t i o n w h i l e t h e p a t h w a y s f o r t h e d e g r a d a t i o n o f 2 - m e t h y l b u t y r a t e a p p e a r e d t o b e m o r e c o m p l i c a t e d . 4 ) T h e s y n t r o p h i c d e g r a d a t i o n o f i s o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e b y t h e t r i c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n I B , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T l N a n d M s . m a z e i T 1 8 w a s c o m p l e t e l y i n h i b i t e d i n t h e p r e s e n c e o f a h i g h h y d r o g e n p a r t i a l p r e s s u r e ( > 2 0 0 0 P a ) o r a m e a s u r a b l e l e v e l o f f o r m a t e ( > 1 0 t o 2 0 0 M ) . S i g n i fi c a n t l e v e l o f f o r m a t e ( m o r e t h a n 1 m M ) w a s d e t e c t e d d u r i n g t h e p e r t u r b a t i o n w i t h h y d r o g e n ( 1 7 t o 4 0 k P a ) . B o t h h y d r o g e n a n d f o r m a t e a r e l i k e l y e l e c t r o n c a r r i e r s i n s y n t r o p h i c d e g r a d a t i o n . 5 ) F o r m a t e s y n t h e s i s f r o m h y d r o g e n p l u s b i c a r b o n a t e o r C O , w a s o b s e r v e d d u r i n g t h e g r o w t h o f H , - C O , a n d f o r m a t e u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s i n c l u d i n g M b . j o r m i c i c u m s p e c i e s ( s t r a i n s M F , T l N a n d R F ) a n d M s p . h u n g a t e i s t r a i n B D . F o r m a t e 2 7 0 s y n t h e s i s w a s a l s o p e r f o r m e d b y M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 , u n l i k e o t h e r s t r a i n s , w h i c h w a s n o t a b l e t o c a t a b o l i z e t h i s f o r m a t e t o m e t h a n e . T h e s e m e t h a n o g e n s a r e , a t l e a s t p a r t i a l l y , r e s p o n s i b l e f o r t h e f o r m a t e s y n t h e s i s d u r i n g m e t h a n o g e n e s i s f r o m H , - C O , b y a n a e r o b i c g r a n u l e s a n d d e fi n e d s y n t r o p h i c f a t t y a c i d d e g r a d i n g c u l t u r e s . T h e f o r m a t i o n o f f o r m a t e f r o m h y d r o g e n p l u s b i c a r b o n a t e a n d v i c e v e r s a r e v e a l s t h a t b o t h f o r m a t e a n d h y d r o g e n a r e e l e c t r o n c a r r i e r s i n i n t e r s p e c i e s e l e c t r o n t r a n s f e r d u r i n g s y n t r o p h i c f a t t y a c i d d e g r a d a t i o n . C H A P T E R 7 E C O P H Y S I O L O G I C A L R O L E O F D E F I N E D S P E C I E S I S O L A T E D F R O M G R A N U L E S I N G R A N U L E F O R M A T I O N 7 . 1 I N T R O D U C T I O N A t p r e s e n t , f a c t o r s c o n t r o l l i n g t h e g r a n u l a t i o n p r o c e s s a r e s t i l l p o o r l y u n d e r s t o o d ( A r c h e r , 1 9 8 8 ; C o l l e r a n , 1 9 8 8 ) . T h e g r a n u l a t i o n p r o c e s s i s b e l i e v e d t o b e s u b s t a n t i a l l y m i c r o b i a l s e l f - i m m o b i l i z a t i o n . I d e n t i fi c a t i o n o f t h e b a c t e r i a l s p e c i e s t h a t p l a y a n e s s e n t i a l r o l e i n g r a n u l e f o r m a t i o n i s t h e k e y t o u n d e r s t a n d i n g t h e p h e n o m e n o n o f g r a n u l e f o r m a t i o n . T h e k e y s p e c i e s m a y b e d e fi n e d a s o n e s w h i c h i ) f o r m d e n s e a g g r e g a t e s b y t h e m s e l v e s i n a n a n a e r o b i c r e a c t o r ; a n d / o r i i ) p r o v i d e a b i n d i n g s u r f a c e f o r o t h e r b a c t e r i a , w h i c h c a n n o t f o r m a g g r e g a t e s b y t h e m s e l v e s , t o a t t a c h a n d f o r m g r a n u l e s . T h e r e f o r e , t h e s e s p e c i e s s h o u l d h a v e t h e a b i l i t y t o a g g r e g a t e a n d w i l l l i k e l y b e a p r e v a l e n t m i c r o o r g a n i s m i n t h e g r a n u l e s . M e t h a n o g e n s h a v e a l r e a d y b e e n p r o p o s e d a s k e y s p e c i e s i n g r a n u l e f o r m a t i o n . S e v e r a l p r o p o s a l s o n m i c r o b i a l m e c h a n i s m s o f g r a n u l e f o r m a t i o n ( s e e C h a p t e r 1 ) c a n b e s u m m a r i z e d a s f o l l o w s : i ) M e t h a n o t h r i x s p . p l a y s a n e s s e n t i a l r o l e i n g r a n u l a t i o n ( W i e g a n t a n d d e M a n , 1 9 8 6 ; D u b o u r g u i e r e t a l . , 1 9 8 8 a , 1 9 8 8 c ; H u l s h o f f P o l e t a l . , 2 7 1 2 7 2 1 9 8 8 ; H u l s h o f f P o l , 1 9 8 9 ) ; i i ) h y d r o g e n - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n M e t h a n o b r e v i b a c t e r a r b o r i p h i l u s s t r a i n A Z p r o d u c e s e x t r a c e l l u l a r p o l y p e p t i d e s t o i n d u c e g r a n u l e f o r m a t i o n u n d e r h i g h H , p a r t i a l p r e s s u r e c o n d i t i o n ( S a m - S o o n e t a l . , 1 9 8 8 ) ; i i i ) M e t h a n o s a r c i n a p r o d u c e s i n i t i a l a g g r e g a t e s a s n u c l e i t o f o r m g r a n u l e s ( d e Z e e u w , 1 9 8 8 ) . T h e s e p r o p o s a l s a n d m e c h a n i s m s , h o w e v e r , h a v e n o t b e e n v a l i d a t e d e x p e r i m e n t a l l y . M i c r o c o l o n i e s o f s y n t r o p h i c a c e t o g e n s i n g r a n u l a r s t r u c t u r e s h a v e b e e n o b s e r v e d w i t h i n a n a e r o b i c g r a n u l e s ( D u b o u r g u i e r e t a l . , 1 9 8 8 a , 1 9 8 8 b ) . I n C h a p t e r 4 , s y n t r o p h i c m i c r o c o l o n i e s c o n s i s t i n g o f a c e t o g e n s a n d m e t h a n o g e n s w e r e m a j o r s t r u c t u r a l c o m p o n e n t s o f g r a n u l e s d e v e l o p e d o n b r e w e r y w a s t e w a t e r . T h e r o l e o f s y n t r o p h i c a c e t o g e n s i n g r a n u l e f o r m a t i o n h a s n o t b e e n c l e a r l y e l u c i d a t e d . I n C h a p t e r s 5 a n d 6 , m e t h a n o g e n s a n d s y n t r o p h i c a c e t o g e n s i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s a s p r e v a l e n t s p e c i e s w e r e c h a r a c t e r i z e d a c c o r d i n g t o t h e i r t a x o n o m y a n d r o l e i n f a t t y a c i d m e t a b o l i s m . T h e s e o r g a n i s m s i n c l u d e H , - C O , a n d f o r m a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s , a c e t a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s , s y n t r o p h i c p r o p i o n a t e d e g r a d e r s a n d s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d e r s . S t u d y o f t h e s e i s o l a t e d o r g a n i s m s p r o v i d e s a c o n v e n i e n t m e t h o d t o d i r e c t l y s t u d y t h e m i c r o b i a l m e c h a n i s m o f g r a n u l a t i o n w i t h v o l a t i l e f a t t y a c i d s a s s u b s t r a t e s . O n e o f t h e p r e v a l e n t H , - C O , a n d f o r m a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s i s o l a t e d w a s M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n T l N , w h i c h r e a d i l y f o r m e d s t r o n g a g g r e g a t e s . I n t h i s c h a p t e r , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T l N w a s e x a m i n e d t o d e t e r m i n e i f i t p l a y e d a k e y r o l e i n t h e f o r m a t i o n o f g r a n u l e s . T h e a g g r e g a t e f o r m i n g b e h a v i o r a m o n g v a r i o u s d e fi n e d m e t h a n o g e n i c a n d s y n t r o p h i c f a t t y a c i d d e g r a d i n g c u l t u r e s w a s a l s o c o m p a r e d t o s c r e e n f o r p o t e n t i a l g r a n u l e - f o r m i n g s y n t r o p h i c a s s o c i a t i o n s . F i n a l l y , a n a e r o b i c g r a n u l e s u s i n g d e fi n e d c u l t u r e s w e r e d e v e l o p e d a n d c h a r a c t e r i z e d a c c o r d i n g t o t h e i r p e r f o r m a n c e . 2 7 3 7 . 2 M A T E R I A L S A N D M E T H O D S 7 . 2 . 1 B a c t e r i a l s t r a i n s a n d a n a l y t i c a l m e t h o d s A l l c u l t u r e s u s e d i n t h i s c h a p t e r w e r e i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s ( C h a p t e r 4 ) e x c e p t M e t h a n o b a c t e r i u m f o n n i c i c u m s t r a i n M F o b t a i n e d f r o m t h e D e u t s c h e S a m m l u n g v o n M i k r o o r g a n i s m e n . T h e R - g r a n u l e s w e r e m a i n t a i n e d i n u p fl o w a n a e r o b i c r e a c t o r s ( s e e C h a p t e r 3 ) . C h e m i c a l s , g a s e s a n d m e d i a f o r g r o w t h o f m e t h a n o g e n s a n d s y n t r o p h i c a c e t o g e n s a r e d e s c r i b e d i n A p p e n d i x A . T h e m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n s ( i n c l u d i n g t h e s a m p l e p r e p a r a t i o n a n d c e l l d e n s i t y a c c o u n t ) a r e p r o v i d e d i n A p p e n d i x D . A n a l y t i c a l m e t h o d s e x c e p t f o r m a t e a n a l y s i s a r e d e s c r i b e d A p p e n d i x A . L i q u i d s a m p l e s f o r f o r m a t e d e t e r m i n a t i o n w e r e a c i d i fi e d w i t h 1 2 N H C l ( 1 0 : 1 , v / v ) a n d c e n t r i f u g e d . F o r m a t e w a s d e t e r m i n a t e b y a H P L C W a t e r 6 0 0 ( M i l l i p o r e C o r p . , W a t e r C h r o m a t o g r a p h y D i v . , M i l f o r d , M A ) fi t t e d w i t h a B i o r a d 8 7 H c o l u m n a t 8 5 ° C a n d w i t h 0 . 0 1 2 N H , S O 4 a s m o b i l e p h a s e ( fl o w r a t e 0 . 6 m L / m i n ) . T h e s e n s i t i v i t y o f t h i s m e t h o d f o r f o r m a t e d e t e r m i n a t i o n w a s 2 m M . 7 . 2 . 2 H y d r o p h o b i c i t y m e a s u r e m e n t T h e h y d r o p h o b i c i t y o f t h e c e l l s u r f a c e o f M b . f o m u ’ c i c u m s t r a i n s M F . T I N a n d R F , M e t h a n o s p i r i l l u m h u n g a t e i s t r a i n B D a n d M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 w a s m e a s u r e d u s i n g t h e m e t h o d o f R o s e n b e r g e t a l . ( 1 9 8 0 ) . C e l l s w e r e d i s p e r s e d i n a p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 1 ) c o n t a i n i n g ( g p e r l i t e r ) : K , H P O 4 - 3 H , O , 2 2 . 2 ; K H , P O 4 , 7 . 2 6 ; u r e a , 1 . 8 ; a n d M g S O 4 - 7 H , O , 0 . 2 . H e x a d e c a n e , x y l e n e o r h e x a n e ( 0 . 4 m L ) w a s a d d e d a s a n a p o l a r p h a s e i n t o c e l l s u s p e n s i o n s ( 2 . 4 m L ) . F o l l o w i n g 1 0 m i n p r e - i n c u b a t i o n a t 3 0 2 7 4 ° C , t h e m i x t u r e s w e r e a g i t a t e d u n i f o r m l y o n a v o r t e x m i x e r f o r 1 2 0 s e c o n d s . A f t e r a l l o w i n g 1 5 m i n f o r t h e a p o l a r p h a s e t o r i s e c o m p l e t e l y , l i g h t a b s o r b a n c e o f a q u e o u s p h a s e w a s m e a s u r e d a t 4 0 0 n m . T h e c h a n g e i n a b s o r b a n c e o f a q u e o u s p h a s e a n d t h e a d s o r p t i o n o f c e l l s t o t h e a p o l a r p h a s e w e r e u s e d t o e s t i m a t e h y d r o p h o b i c i t y . 7 . 2 . 3 R e - a g g r e g a t i o n t e s t C e l l s ( a b o u t 1 . 0 g w e t w e i g h t ) o f M b . f o r m i c i c u m s t r a i n s T l N , M F a n d R F o r t h e R — g r a n u l e s w e r e w a s h e d i n d o u b l e - d i s t i l l e d ( D D ) w a t e r , d i s r u p t e d w i t h a g l a s s r o d i n 1 5 m L D D - w a t e r , a n d t h e n c e n t r i f u g e d f o r 1 0 m i n a t 3 , 0 0 0 x g . T h e p e l l e t w a s t h e n w a s h e d i n D D - w a t e r a t l e a s t 6 a d d i t i o n a l t i m e s . S u b s e q u e n t l y , t h e s u s p e n s i o n s o f c e l l s w e r e s o n i c a t e d w i t h a n u l t r a s o n i c c e l l d i s r u p t e r ( K o n t e s G l a s s C o r p . , V i n e l a n d , N J ) f o r t w o s e c o n d s , a n d d i l u t e d u s i n g D D - w a t e r t o a n o p t i c a l d e n s i t y ( O D ) o f 0 . 3 t o 0 . 6 a t 6 6 0 n m . A t t h i s s t a g e , t h e c e l l s i n s u s p e n s i o n a p p e a r e d t o b e c o m p l e t e l y d i s p e r s e d ( w h e n c h e c k e d b y m i c r o s c o p y ) a n d d i d n o t r e - a g g r e g a t e a f t e r t h e y w e r e v o r t e x e d f o r 2 m i n . A d d i t i o n o f s o d i u m c h l o r i d e s o l u t i o n ( 0 . 0 4 M , 0 . 2 m L ) t o t h e d i l u t e d s u s p e n s i o n s ( 2 . 0 m L ) w a s u s e d t o t e s t t h e e f f e c t o f t h e c o n c e n t r a t i o n o f s a l i n e o n r e - a g g r e g a t i o n o f c e l l s o f s t r a i n T l N , s t r a i n M F a n d d i s r u p t e d g r a n u l e s . I n a d d i t i o n t o t h e s a l i n e , a c e t i c a c i d - s o d i u m a c e t a t e b u f f e r s ( 0 . 0 4 M ) w i t h p H r a n g i n g f r o m 3 . 6 t o 5 . 8 , K H , P O 4 - N a O H b u f f e r s ( 0 . 0 4 M ) w i t h p H f r o m 6 . 0 t o 8 . 5 , N a O H - N a , C O 3 b u f f e r s ( 0 . 0 4 M ) w i t h p H 1 1 a n d 1 2 w e r e a l s o u s e d t o t e s t p H e f f e c t o n r e - a g g r e g a t i o n . T h e a b o v e b u f f e r s ( 0 . 2 m L ) w e r e a d d e d i n t o t h e 2 m L o f c e l l s u s p e n s i o n s . 7 . 2 . 4 S e n s i t i v i t y t o t e t r a c y c l i n e I n o r d e r t o e s t i m a t e t h e p o p u l a t i o n l e v e l o f t e t r a c y c l i n e s e n s i t i v e , H , - C O , - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s , t h e R - t y p e g r a n u l e s ( 0 . 3 m L ) w e r e w i t h d r a w n f r o m a n o p e r a t i n g 2 7 5 l a b - s c a l e u p fl o w r e a c t o r a n d t r a n s f e r r e d i n t o a n a n a e r o b i c p r e s s u r e t u b e c o n t a i n i n g 1 0 m L o f t h e b a s a l m e d i u m , b u f f e r e d w i t h 3 0 m M p o t a s s i u m p h o s p h a t e a n d 2 0 m M s o d i u m b i c a r b o n a t e ( p H 7 . 1 ) , a n d p r e - r e d u c e d b y a d d i t i o n o f a n N a , S s o l u t i o n ( 2 . 5 % ) t o a c h i e v e a c o n c e n t r a t i o n o f 1 . 0 m M . T h e g r a n u l e s w e r e d i s r u p t e d b y p a s s i n g t h e m t h r o u g h a 1 m L g l a s s s y r i n g e w i t h a 2 3 g a u g e n e e d l e s e v e r a l t i m e s u n t i l t h e c e l l s w e r e c o m p l e t e l y d i s p e r s e d i n t h e m e d i u m . D i s r u p t e d g r a n u l e s u s p e n s i o n s ( 0 . 5 m L ) w e r e t r a n s f e r r e d i n t o 1 5 8 m L s e r u m b o t t l e s c o n t a i n i n g 2 5 m L o f t h e b a s a l m e d i u m ( p H 6 . 9 ) w i t h 2 m M a c e t a t e . T h e b o t t l e s w e r e t h e n p r e s s u r i z e d w i t h 1 8 0 k P a H , - C O , . D u p l i c a t e s w e r e u s e d . T e t r a c y c l i n e w a s a d d e d t o o n e s e t ( 1 m g / m L ) w h i l e a n o t h e r s e t t h a t d i d n o t r e c e i v e d t h e a n t i b i o t i c s w a s m a i n t a i n e d a s a c o n t r o l . T e t r a c y c l i n e w a s p r e p a r e d i n a n a n a e r o b i c w a t e r a s a s u s p e n s i o n ( 5 0 m g / m L ) d u e t o i t s l o w s o l u b i l i t y . T h e s u s p e n s i o n ( 0 . 5 m L ) w a s t h e n i n j e c t e d t o t h e s e r u m b o t t l e s . T h e s e r u m b o t t l e s w e r e i n o c u l a t e d w i t h t h e g r a n u l e s u s p e n s i o n o n l y a f t e r a l l t e t r a c y c l i n e h a d d i s s o l v e d . T h e s e b o t t l e s w e r e t h e n i n c u b a t e d i n a 3 5 ° C s h a k i n g w a t e r b a t h ( 1 2 5 s t r o k e s p e r m i n ) . M e t h a n e p r o d u c t i o n w a s d e t e r m i n e d e v e r y 8 t o 1 2 h o u r s t o m o n i t o r g r o w t h . 7 . 2 . 5 A g g r e g a t e f o r m a t i o n b y d e f i n e d c u l t u r e s V a r i o u s p u r e m e t h a n o g e n i c c u l t u r e s a n d d e fi n e d s y n t r o p h i c c u l t u r e s w e r e i n c u b a t e d t o d e t e r m i n e i f t h e y f o r m e d a g g r e g a t e s . A t o t a l o f t h r e e m e t h a n o g e n i c c u l t u r e s ( M b . f o m u ' c i c u m s t r a i n s T l N , M F a n d R F ) , t w o s y n t r o p h i c b u t y r a t e - d e g r a d i n g c o c u l t u r e s ( b u t y r a t e d e g r a d e r s t r a i n B H p l u s M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T l N , a n d s t r a i n B H p l u s M s p . h u n g a t e i s t r a i n B D ) , o n e s y n t r 0 p h i c p r o p i o n a t e d e g r a d i n g c o c u l t u r e ( p r o p i o n a t e d e g r a d e r s t r a i n P T p l u s M b . f o m r i c i c u m s t r a i n T I N ) , a n d o n e s y n t r o p h i c p r o p i o n a t e d e g r a d i n g t r i c u l t u r e ( s t r a i n P T , s t r a i n T l N p l u s M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 ) w e r e e x a m i n e d . T h e g r o w t h c o n d i t i o n s u s e d f o r t h e s e c u l t u r e s a r e d e s c r i b e d i n 2 7 6 A p p e n d i x A . T o p r e p a r e t h e t r i c u l t u r e o f s t r a i n P T , s t r a i n T l N a n d s t r a i n M 7 , a b o t t l e c o n t a i n i n g w e l l - g r o w n c o c u l t u r e o f s t r a i n s P T p l u s T l N , i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s ( C h a p t e r 5 ) , w a s i n o c u l a t e d w i t h 2 % o f M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 c u l t u r e a s t h e t h i r d p a r t n e r t o u t i l i z e a c e t a t e . T o o b t a i n t h e c o c u l t u r e o f s t r a i n B H a n d M s p . h u n g a t e i s t r a i n B D , t h e c o c u l t u r e o f s t r a i n B H p l u s M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T l N , i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s ( C h a p t e r 5 ) , w a s h e a t - t r e a t e d a t 8 0 ° C f o r 2 0 m i n t o k i l l t h e c e l l s o f s t r a i n T l N . T h e t r e a t e d c u l t u r e w a s t h e n i n o c u l a t e d ( 2 % , v / v ) i n t o a b o t t l e c o n t a i n i n g f r e s h m e d i u m A 2 % i n o c u l u m o f w e l l g r o w n M s p . h u n g a t e i s t r a i n B D w a s a d d e d . A l l t h e d e fi n e d c u l t u r e s w e r e i n c u b a t e d a t 3 7 ° C . I n i t i a l l y , c u l t u r e t r a n s f e r w a s d o n e u s i n g s y r i n g e s e q u i p p e d w i t h 2 2 g a u g e n e e d l e s . W h e n a g g r e g a t e s o r c l u m p s w e r e f o r m e d i n t h e b o t t l e s , c u l t u r e t r a n s f e r w a s p e r f o r m e d u s i n g s y r i n g e s e q u i p p e d w i t h 1 8 g a u g e n e e d l e s i n o r d e r t o p r o t e c t t h e s t r u c t u r e o f t h e a g g r e g a t e s o r c l u m p s f r o m a n y d a m a g e d u r i n g t r a n s f e r . 7 . 2 . 6 U p f l o w r e a c t o r s L a b o r a t o r y - s c a l e u p fl o w r e a c t o r s , m a d e o f a g l a s s c o l u m n a n d a g l a s s b o t t l e , w e r e o p e r a t e d t o i n v e s t i g a t e t h e d e v e l o p m e n t o f a g g r e g a t e s u s i n g M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T l N a n d c u l t i v a t i o n o f g r a n u l e s u s i n g d e fi n e d s y n t r o p h i c f a t t y a c i d d e g r a d i n g c u l t u r e s a s i n o c u l u m . T o t a l v o l u m e o f e a c h r e a c t o r w a s 2 2 0 m L i n c l u d i n g a 1 2 0 m L s e t t l e r . A l l t u b i n g u s e d w a s e i t h e r s t a i n l e s s s t e e l o r b l a c k b u t y l r u b b e r o f 0 . 2 5 - i n ( 0 . 6 4 c m ) t h i c k n e s s . A s c h e m a t i c d i a g r a m o f r e a c t o r s y s t e m i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 7 . 1 . T h e r e a c t o r s w e r e o p e r a t e d a t 3 5 ° C . D u r i n g c o n t i n u o u s o p e r a t i o n , o x y g e n - f r e e N , ( a t 4 0 k P a p a s s e d t h r o u g h a s t e r i l i z e d g l a s s w o o l fi l t e r ) w a s b u b b l e d i n t o t h e m e d i u m r e s e r v o i r t o k e e p a c o n s t a n t p o s i t i v e p r e s s u r e i n t h e h e a d s p a c e a n d m a i n t a i n a n a e r o b i o s i s . T h e m e d i u m w a s p u m p e d i n t o t h e b o t t o m o f t h e r e a c t o r u s i n g a 2 7 7 p e r i s t a l t i c p u m p ( G i l s o n M e d i c a l E l e c t r o n i c s I n c . , M i d d l e t o n , W I ) . A f t e r g a s - l i q u i d - s o l i d s e p a r a t i o n i n s e t t l e r , t h e e f fl u e n t w a s a l l o w e d t o l e a v e t h e r e a c t o r t h r o u g h a w a t e r s e a l e r m a d e o f a 5 m L g l a s s t u b e i n s t a l l e d i n s i d e t h e e f fl u e n t c o l l e c t i n g fl a s k i n o r d e r t o k e e p t h e r e a c t o r f r e e o f o x y g e n . S o m e o f t h e l i q u i d i n t h e s e t t l e r w a s r e c y c l e d b a c k t o t h e r e a c t o r u s i n g a n o t h e r p e r i s t a l t i c p u m p , a t a fl o w r a t e o f 1 L / h r , t o n e u t r a l i z e t h e f e e d a n d t o m a i n t a i n t h e d e s i r e d h y d r a u l i c l o a d i n g r a t e ( c a . 2 . 8 m / h r ) . B i o g a s s a m p l e s f o r m e t h a n e a n d h y d r o g e n d e t e r m i n a t i o n s w e r e w i t h d r a w n u n d e r s t e r i l e c o n d i t i o n s f r o m t h e g l a s s " T " t u b e o n e f fl u e n t t u b i n g u s i n g a 1 m L g l a s s s y r i n g e . L i q u i d s a m p l e s w e r e w i t h d r a w n a s e p t i c a l l y t h r o u g h t h e s a m p l i n g p o r t o n t h e r e a c t o r . 7 . 2 . 7 F e e d c o m p o s i t i o n f o r r e a c t o r e x p e r i m e n t s F o r t h e g r o w t h o f M b . f o m u ' c i c u m s t r a i n T l N i n t h e r e a c t o r , l i q u i d m e d i u m ( 1 6 l i t e r s ) w a s m a d e i n a 2 0 l i t e r c a r b o y ( m e d i u m r e s e r v o i r ) s e a l e d w i t h a b u t y l r u b b e r s t o p p e r . T h e m e d i u m c o m p o s i t i o n w a s ( p e r l i t e r o f d i s t i l l e d w a t e r ) : M g C l , - 6 H , O , 0 . 3 2 g ; C a C l , - 2 H , O , 0 . 3 2 g ; N a C l , 0 . 8 g ; N H 4 C 1 , 0 . 8 g ; K H , P O 4 , 0 . 3 2 g ; s o d i u m a c e t a t e , 0 . 0 8 g ; s o d i u m f o r m a t e , 6 . 8 1 g ; f o r m i c a c i d ( 8 8 % ) , 6 . 4 4 m L ; N a , S 9 H , O , 0 . 1 2 g ; r e s a z u r i n , 0 . 0 0 2 g ; t r a c e e l e m e n t s o l u t i o n ( K e n e a l y a n d Z e i k u s , 1 9 8 1 ) , 5 m L ; v i t a m i n s o l u t i o n ( W o l i n e t a l . , 1 9 6 3 ) , 5 m L . A f t e r a u t o c l a v i n g f o r 9 0 m i n a t 1 2 1 ° C , a n O , - f r e e n i t r o g e n g a s w a s u s e d t o p r e s s u r i z e t h e h e a d s p a c e o f t h e c a r b o y u p t o 4 0 k P a i n o r d e r t o m a i n t a i n a n a e r o b i c c o n d i t i o n s . V i t a m i n s o l u t i o n , f o r m i c a c i d - s o d i u m f o r m a t e s o l u t i o n , a n d s o d i u m s u l fi d e s o l u t i o n ( 1 5 % , v / v ) w e r e a d d e d i n t o t h e c a r b o y a n a e r o b i c a l l y a f t e r m e d i u m w a s c o o l e d t o r o o m t e m p e r a t u r e . T h e p H o f t h e m e d i u m w a s 4 . 0 , a n d t o t a l c o n c e n t r a t i o n o f s o d i u m f o r m a t e p l u s f o r m i c a c i d w a s 2 2 0 m M . 2 7 8 F i g u r e 7 . 1 S c h e m a t i c d i a g r a m o f u p fl o w r e a c t o r s y s t e m . 1 : c o l u m n r e a c t o r ; 2 : s e t t l e r ; 3 : r e c y c l e p u m p ; 4 : f e e d p u m p ; 5 : e f fl u e n t c o l l e c t i n g fl a s k ; 6 : w a t e r s e a l e r ; 7 : s a m p l i n g p o r t w i t h a b u t y l r u b b e r s t o p p e r ; 8 : m e d i u m r e s e r v o i r ; 9 : s t e r i l e d a i r fi l t e r ; 1 0 : g l a s s " T " w i t h a b u t y l r u b b e r s t o p p e r . 2 7 9 F o r d e v e l o p m e n t o f g r a n u l e s u s i n g d e fi n e d f a t t y a c i d d e g r a d i n g c u l t u r e s a s t h e i n o c u l u m , l i q u i d m e d i u m ( 1 6 l i t e r s ) w a s p r e p a r e d i n a 2 0 l i t e r c a r b o y , u s i n g t h e p r o c e d u r e d e s c r i b e d a b o v e . T h e m e d i u m c o m p o s i t i o n w a s ( p e r l i t e r o f d i s t i l l e d w a t e r ) : M g C l , - 6 H , O , 0 . 3 2 g ; C a C l , - 2 H , O , 0 . 3 2 g ; N a C l , 0 . 8 g ; N I L C I , 0 . 8 g ; K H , P O 4 , 0 . 3 2 g ; N a , S o 9 H , O , 0 . 0 8 g ; r e s a z u r i n , 0 . 0 0 2 g ; a n d t r a c e e l e m e n t s o l u t i o n , 5 m L . T h e c o n c e n t r a t i o n s o f a c e t a t e , p r o p i o n a t e , a n d b u t y r a t e w e r e a d j u s t e d b y a d d i n g t h e m i x t u r e s o f t h e s o d i u m s a l t a n d a c i d f o r m s o f t h e v o l a t i l e a c i d s . p H o f t h e m e d i u m w a s 4 . 7 . 7 . 2 . 8 R e a c t o r s t a r t - u p a n d o p e r a t i o n i ) A n a e r o b i c t e c h n i q u e p r i o r t o i n o c u l a t i o n T o e n s u r e s u c c e s s f u l s t a r t - u p , a n a e r o b i c c o n d i t i o n s w e r e e s t a b l i s h e d i n t h e r e a c t o r s y s t e m s p r i o r t o i n o c u l a t i o n . T h e r e a c t o r s , i n c l u d i n g f e e d p u m p t u b i n g a n d r e c y c l e p u m p t u b i n g , w e r e a u t o c l a v e d a t 1 2 1 0 C f o r 3 0 m i n b e f o r e i n o c u l a t i o n . I n i t i a l l y , a n H C l s o l u t i o n ( 1 N ) w a s a d d e d i n t o t h e w a t e r s e a l e r i n s t a l l e d i n t h e e f fl u e n t fl a s k , a n d t h e r e a c t o r s w e r e fl u s h e d w i t h o x y g e n - f r e e N , g a s f o r 3 0 m i n . S u b s e q u e n t l y , t h e b a s a l m e d i u m ( p H 7 . 0 t o 7 . 1 ) p r e - r e d u c e d w i t h 0 . 5 m M N a , S a n d b u f f e r e d w i t h s o d i u m b i c a r b o n a t e ( 3 0 m M ) a n d p o t a s s i u m p h o s p h a t e ( 3 0 m M ) w a s a d d e d t o fi l l t h e r e a c t o r . R e c y c l e o f m e d i u m w a s s t a r t e d , a n d N , fl u s h i n g w a s s t o p p e d . A n a e r o b i c c o n d i t i o n s i n t h e r e a c t o r w e r e m o n i t o r e d u s i n g t h e r e d o x p o t e n t i a l i n d i c a t o r r e s a z u r i n . F i n a l l y , t h e c a r b o y c o n t a i n i n g t h e f e e d m e d i u m w a s c o n n e c t e d t o t h e r e a c t o r u n d e r a s e p t i c c o n d i t i o n s . T h e r e a c t o r w a s i n o c u l a t e d t h r o u g h t h e s a m p l i n g p o r t , a n d f e e d i n g w a s i n i t i a t e d . i i ) I n o c u l a t i o n w i t h M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n T I N M b . f o m r i c i c u m s t r a i n T l N w a s u s e d a s i n o c u l u m i n o r d e r t o e x a m i n e i f t h i s 2 8 0 o r g a n i s m c o u l d d e v e l o p g r a n u l e - l i k e a g g r e g a t e s b y i t s e l f u s i n g f o r m a t e a s s u b s t r a t e . I n o c u l u m o f c o n c e n t r a t e d s t r a i n T I N c l u m p s ( 3 0 m L i n v o l u m e a n d a b o u t 0 . 1 2 g d r y w e i g h t ) f o r m e d a b o u t 5 m L c o m p a c t c e l l b e d i n t h e r e a c t o r . A f t e r i n o c u l a t i o n , s o d i u m f o r m a t e s t o c k s o l u t i o n ( 1 . 1 m L o f 4 M ) w a s a d d e d t o t h e r e a c t o r t o a c h i e v e a s t a r t i n g c o n c e n t r a t i o n o f c a . 2 0 m M . T h e r e a c t o r w a s p l a c e d o n r e c y c l e w i t h o u t a n y a d d i t i o n o f f e e d f o r t h e i n i t i a l 1 2 h o u r s . W h e n s i g n i fi c a n t g a s p r o d u c t i o n w a s o b s e r v e d , t h e f e e d p u m p w a s t u r n e d o n a n d t h e r e a c t o r f e d c o n t i n u o u s l y . D u r i n g t h e o p e r a t i o n a l p e r i o d , fl o w r a t e , e f fl u e n t p H , m e t h a n e a n d h y d r o g e n c o n t e n t i n b i o g a s , a n d f o r m a t e c o n c e n t r a t i o n i n t h e e f fl u e n t w e r e m o n i t o r e d d a i l y . i i i ) I n o c u l a t i o n w i t h d e fi n e d c u l t u r e s W e l l - g r o w n m o n o c u l t u r e s a n d s y n t r o p h i c c u l t u r e s w e r e u s e d a s i n o c u l u m . T h e i n o c u l a t i o n s e q u e n c e o f d i f f e r e n t s p e c i e s w a s a s f o l l o w s : i n i t i a l l y , a c t i v e l y g r o w i n g c e l l s o f M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T l N ( 4 0 m L , 0 . 2 2 g S S ) w e r e i n o c u l a t e d a n d a b o u t 1 0 m M s o d i u m f o r m a t e w a s a d d e d i n t o t h e r e a c t o r ; a f t e r 8 h o u r s , a g g r e g a t e s o f M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 ( 0 . 0 5 m L ) a n d c e l l s o f M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 c u l t u r e ( 3 0 m L , 0 . 0 5 g S S ) w e r e i n o c u l a t e d a n d t h e n t h e r e a c t o r w a s f e d c o n t i n u o u s l y a t 7 m L / h r . F i n a l l y , a c o c u l t u r e o f s t r a i n B H a n d M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N ( 3 0 m L , 0 . 0 2 5 g S S ) a n d a t r i c u l t u r e o f p r o p i o n a t e d e g r a d e r s t r a i n P T , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T l N a n d M e t h a n o t h r i x M 7 ( 3 0 m L , 0 . 0 6 g S S ) w e r e a d d e d i n t o t h e r e a c t o r o n e a f t e r a n o t h e r a t i n t e r v a l s o f 1 2 h o u r s . A f t e r i n o c u l a t i o n , p H a n d f a t t y a c i d c o n c e n t r a t i o n s i n t h e r e a c t o r w e r e d e t e r m i n e d i n i t i a l l y o n a l t e r n a t e d a y s a n d t h e n d a i l y . M e t h a n e a n d h y d r o g e n c o n t e n t s i n b i o g a s w e r e d e t e r m i n e d e v e r y o t h e r d a y . i v ) M a x i m u m V F A d e g r a d a t i o n r a t e s a n d a p p a r e n t K I n T o d e t e r m i n e t h e m a x i m u m V F A d e g r a d a t i o n r a t e s o f t h e g r a n u l e s d e v e l o p e d f r o m t h e d e fi n e d c u l t u r e s , a n o t h e r r e a c t o r w i t h t h e s a m e s i z e w a s p r e p a r e d a n d fi l l e d 2 8 1 w i t h p r e - r e d u c e d b a s a l m e d i u m ( p H 7 . 0 ) a s d e s c r i b e d a b o v e . T h e b a s a l m e d i u m i n t h e r e a c t o r c o n t a i n e d a c e t a t e ( 5 m M ) , p r o p i o n a t e ( 5 m M ) a n d b u t y r a t e ( 5 m M ) . T h e g r a n u l e s ( f r e e o f fl o c s ) i n t h e o r i g i n a l r e a c t o r w e r e t r a n s f e r r e d a n a e r o b i c a l l y u s i n g a 1 0 m L g l a s s s y r i n g e w i t h a 1 8 g a u g e n e e d l e i n t o t h e n e w r e a c t o r . T h i s i n o c u l u m c o n t a i n e d 5 m L o f c o m p a c t g r a n u l e . A f t e r i n o c u l a t i o n , t h e n e w r e a c t o r w a s c o n t i n u o u s l y f e d w i t h a m e d i u m c o n t a i n i n g p r o p i o n a t e ( 3 0 m M ) a n d b u t y r a t e ( 3 0 m M ) . T h e m a x i m u m d e g r a d a t i o n r a t e s f o r p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e w e r e d e t e r m i n e d o n t h e b a s i s o f t h e f o l l o w i n g d a y ’ s o p e r a t i o n a l d a t a ( V F A c o n c e n t r a t i o n s i n t h e r e a c t o r a n d f e e d r a t e ) u s i n g f o l l o w i n g e q u a t i o n s : d S / d t = V R - ( S u - S Q M l 0 0 0 - ( t , - t , ) + Q - ( S o - 0 . 5 - ( S , , + S , , ) ) ( 7 - 1 ) w h e r e , d S / d t i s d e g r a d a t i o n r a t e ( m m o l / h r ) ; V R i s t h e l i q u i d b u l k v o l u m e o f r e a c t o r s y s t e m i n c l u d i n g r e c y c l e t u b i n g , 2 2 0 m L i n t h i s e x p e r i m e n t ; S , l a n d S . , a r e p r o p i o n a t e o r b u t y r a t e c o n c e n t r a t i o n ( m M ) a t t i m e t 1 a n d t , , r e s p e c t i v e l y ; Q i s f e e d r a t e ( m L / h r ) . S 0 i s p r o p i o n a t e o r b u t y r a t e c o n c e n t r a t i o n i n f e e d ( p r o p i o n a t e , 3 0 m M ; a n d b u t y r a t e , 3 0 m M ) . A c e t a t e d e g r a d a t i o n r a t e w a s c a l c u l a t e d a s : d S J d t = V R . ( S , , , - S , , , ) l ( 1 0 0 0 ( t , - t , ) + Q ~ ( S , 0 - 0 . 5 - ( S , , 1 + S , , , ) ) + d S P / d t + 2 - d S b / d t ( 7 - 2 ) w h e r e , d S J d t , d S P / d t a n d d S b / d t a r e d e g r a d a t i o n r a t e s ( m m o l / h r ) f o r a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e , r e s p e c t i v e l y . I n e q u a t i o n ( 7 - 2 ) , a c e t a t e p r o d u c e d f r o m s y n t r o p h i c p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e d e g r a d a t i o n i s i n c l u d e d b u t v a l e r a t e f o r m e d i n t h e r e a c t o r w a s i g n o r e d f o r t h i s p u r p o s e s i n c e v a l e r a t e c o n c e n t r a t i o n s w e r e l o w ( < 0 . 1 m M ) . T h e d e t e r m i n a t i o n o f a p p a r e n t K I n v a l u e s o f p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e u s i n g t h e g r a n u l e s d e v e l o p e d w i t h t h e d e fi n e d s p e c i e s i s d e s c r i b e d i n A p p e n d i x C . 2 8 2 7 . 3 T H E R O L E O F M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m S T R A I N T I N I N G R A N U L E F O R M A T I O N M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N , i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s ( a p r e d o m i n a n t s p e c i e s ) , e x h i b i t e d s t r o n g a g g r e g a t i o n . T h e r o l e o f M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N i n g r a n u l e f o r m a t i o n , w a s e v a l u a t e d u s i n g S E M o b s e r v a t i o n , i t s p o p u l a t i o n i n g r a n u l e s , a d h e s i o n b e h a v i o r , a n d a g g r e g a t e f o r m a t i o n ( b y a p u r e c u l t u r e ) i n a c o n t i n u o u s f e d u p fl o w r e a c t o r . 7 . 3 . 1 E l e c t r o n m i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o n o f a g g r e g a t e s f o r m e d b y M . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N A s d e s c r i b e d i n C h a p t e r 5 , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N w a s v e r y a d h e s i v e a n d f o r m e d a g g r e g a t e s . U n d e r S E M o b s e r v a t i o n ( F i g u r e 7 . 2 A ) , t h e a g g r e g a t e s h a d a c o m p l i c a t e d t h r e e - d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e . C a t i o n i z e d f e r r i t i n ( C F ) s t a i n i n g i s a m e t h o d t h a t c a n b e u s e d r e v e a l t h e s u r f a c e t o p o l o g y o f b a c t e r i a l c e l l s , p r e s e n c e o f e x t r a c e l l u l a r p o l y m e r s a n d o t h e r e x t r a c e l l u l a r s t r u c t u r e s v i a . S E M o b s e r v a t i o n ( L a m e d e t a l . , 1 9 8 7 ) . C F s t a i n e d s t r a i n T I N c e l l s s h o w e d a b u n d a n t m a s s i v e fi b e r s f o r m i n g a n e t w o r k a m o n g t h e c e l l s a n d p r o t u b e r a n t - l i k e s t r u c t u r e s ( f o r m e d b y C F p a r t i c l e s ) o n t h e c e l l s u r f a c e ( F i g u r e 7 . 2 B ) . T h e s e fi b e r s f o r m e d b y t h e p o l y m e r s , c o n n e c t e d t h e c e l l s t o e a c h o t h e r t o f o r m a g g r e g a t e s . T h e p r e s e n c e o f C F p a r t i c l e s o n t h e c e l l s u r f a c e a n d t h e fi b e r s r e v e a l s t h e e x i s t e n c e o f a n i o n i c g r o u p s o n t h e p o l y m e r s a n d t h e s u r f a c e o f c e l l s . T h e p o l y m e r s o n t h e s u r f a c e o f M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N a p p e a r t o c o n t r i b u t e t o t h e f o r m a t i o n o f a g g r e g a t e s a n d m a y a l s o c o n t r i b u t e t o g r a n u l a r s t r u c t u r e . 2 5 K U 8 2 0 0 0 0 0 0 0 6 1 . 0 U C E 0 8 8 F i g u r e 7 . 2 2 8 3 4 3 . 1 7 S E M p h o t o g r a p h s o f M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n T I N . ( A ) S a m p l e t r e a t e d u s i n g n o r m a l p r o c e d u r e s h o w e d t h e c o m p l i c a t e d s t r u c t u r e o f a g g r e g a t e s . ( B ) F i b e r s f o r m e d b y e x t r a c e l l u l a r p o l y m e r s w h i c h c o n n e c t e d c e l l s t o e a c h o t h e r t o f o r m a g g r e g a t e s a n d C F p a r t i c l e s o n t h e s u r f a c e o f C F t r e a t e d c e l l s . 2 8 4 7 . 3 . 2 E f f e c t o f t e t r a c y c l i n e o n m e t h a n o g e n e s i s o f d i s r u p t e d R - g r a n u l e s I n t h e R - g r a n u l e s , t h e p r e v a l e n t H , - C O , a n d f o r m a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s w e r e M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N a n d M b . f o r m i c i c u m s t r a i n R F p l u s c o n s i d e r a b l y l o w e r p o p u l a t i o n s o f a M s p . h u n g a t e i s t r a i n B D ( C h a p t e r 5 ) . T h e f o r m e r w a s t e t r a c y c l i n e s e n s i t i v e a n d t h e l a t t e r t w o s t r a i n s w e r e r e s i s t a n t t o t e t r a c y c l i n e . T h e r e f o r e , t e t r a c y c l i n e w a s a d d e d t o t h e d i s r u p t e d g r a n u l e s u n d e r a H , - C O , a t m o s p h e r e t o e s t i m a t e t h e p o p u l a t i o n o f M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N i n t h e R - g r a n u l e s . A f t e r i n c u b a t i o n , m e t h a n e c o n c e n t r a t i o n i n b o t h t e s t b o t t l e s ( p l u s a n d m i n u s t e t r a c y c l i n e ) i n c r e a s e d l o g a r i t h m i c a l l y a t a n i d e n t i c a l r a t e ( d o u b l i n g t i m e o f a b o u t 8 h o u r s ) . A f t e r t h e i n i t i a l 1 2 h o u r s , h o w e v e r , t h e s p e c i fi c m e t h a n e p r o d u c t i o n r a t e i n t h e b o t t l e s r e c e i v i n g 1 m g / m L o f t e t r a c y c l i n e w a s 4 0 t o 6 0 % o f t h a t i n t h e b o t t l e s w i t h o u t t e t r a c y c l i n e . T h i s i n d i c a t e d t h a t a p p r o x i m a t e l y h a l f o f t h e H , - C O , u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s i n t h e R - g r a n u l e s w e r e i n h i b i t e d b y a d d i t i o n o f t e t r a c y c l i n e . S i n c e o n l y M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N w a s t e t r a c y c l i n e - s e n s i t i v e , s t r a i n T I N w a s p r e s e n t i n g r e a t n u m b e r s i n t h e R - t y p e g r a n u l e s . 7 . 3 . 3 R e - a g g r e g a t i o n o f d i s p e r s e d c e l l s R e - a g g r e g a t i o n r e s u l t s o f M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N a n d t h e R - g r a n u l e s a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e 7 . 3 . A g g r e g a t e s o f M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N a n d t h e g r a n u l e s w e r e d i s r u p t e d c o m p l e t e l y a f t e r w a s h i n g w i t h D D - w a t e r a n d s o n i c a t i o n . N o a g g r e g a t i o n o c c u r r e d a f t e r t h e s u s p e n s i o n s w e r e v o r t e x e d f o r 2 . 0 m i n i n D D — w a t e r . S i g n i fi c a n t a g g r e g a t i o n , h o w e v e r , w a s o b s e r v e d i n t h e s u s p e n s i o n s o f s t r a i n T I N a n d t h e d i s r u p t e d g r a n u l e s t o w h i c h N a C l s o l u t i o n w a s a d d e d ( 4 m M ) b e f o r e v o r t e x i n g t h e s a m p l e f o r 2 . 0 m i n . I n t h e s u s p e n s i o n o f s t r a i n T I N , a l m o s t a l l c e l l s a g g r e g a t e d 2 8 5 t o g e t h e r a s c l u m p s . C l u m p s a l s o f o r m e d q u i c k l y i n s u s p e n s i o n s o f d i s r u p t e d g r a n u l e s , b u t m a n y f r e e c e l l s s t i l l r e m a i n e d i n t h e s u s p e n s i o n s . M o s t f r e e c e l l s f r o m t h e g r a n u l e s w e r e i d e n t i fi e d a s M e t h a n o t h r i x — l i k e a n d M e t h a n o s p i r i l l u m - l i k e b a c t e r i a . O t h e r s a l t s , s u c h a s p o t a s s i u m p h o s p h a t e , s o d i u m a c e t a t e , s o d i u m b i c a r b o n a t e , a n d p o t a s s i u m c h l o r i d e a l s o i n d u c e d r e - a g g r e g a t i o n o f t h e d i s p e r s e d c e l l s w h e n p r o v i d e d a t t h e s a m e c o n c e n t r a t i o n ( 4 m M ) . T h e e f f e c t o f p H o n r e - a g g r e g a t i o n o f M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N d i s p e r s e d c e l l s a n d d i s r u p t e d g r a n u l e s w a s i d e n t i c a l . T h e s u s p e n d e d c e l l s o f s t r a i n T I N a n d d i s r u p t e d g r a n u l e s h a d t h e s a m e t e n d e n c y t o r e - a g g r e g a t e a t a p H r a n g e o f 3 . 6 t o 8 . 5 i n t h e v a r i o u s b u f f e r s , b u t t h e n d i d n o t r e - a g g r e g a t e a t p H 1 1 o r h i g h e r . M b . f o r m i c i c u m s t r a i n s M F a n d R F w e r e a l s o e x a m i n e d f o r r e - a g g r e g a t i o n p e r f o r m a n c e . T h e c e l l s o f t h e s e s t r a i n s w e r e d i s p e r s e d b y w a s h i n g w i t h D D - w a t e r a n d s o n i c a t i o n , a n d w e r e h o m o g e n e o u s l y s u s p e n d e d i n D D - w a t e r . N e i t h e r o f t h e s t r a i n s f o r m e d a n y a g g r e g a t e s a f t e r v o r t e x i n g t h e s u s p e n s i o n s f o r 2 m i n . A f t e r s o n i c a t i o n , s o d i u m c h l o r i d e ( 2 t o 3 0 m M ) o r p o t a s s i u m p h o s p h a t e ( 1 0 t o 3 0 m M ) w a s a d d e d , r e - a g g r e g a t i o n o f c e l l s o f s t r a i n s M F a n d R F d i d n o t o c c u r . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N h a s r e - a g g r e g a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s w h i c h o t h e r M b . f o r m i c i c u m s t r a i n s t e s t e d d i d n o t . T h e r e f o r e , t h e r e - a g g r e g a t i o n o f d i s r u p t e d R - g r a n u l e s m a y b e m a i n l y a t t r i b u t e d t o s t r a i n T I N . T h i s f a c t s u g g e s t e d t h a t t h i s s t r a i n m i g h t p l a y a m o r e i m p o r t a n t r o l e i n t h e s t r u c t u r e o f t h e R - g r a n u l e s t h a n d o o t h e r m e t h a n o g e n i c s t r a i n s . F i g u r e 7 . 3 2 8 6 C o m p a r i s o n o f a g g r e g a t i o n o f d i s p e r s e d c e l l s b e t w e e n t h e R - g r a n u l e s a n d M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n T l N a g g r e g a t e s . ( a ) I n t a c t R - g r a n u l e s . ( b ) C l u m p s f o r m e d b y d i s p e r s e d c e l l s o f d i s r u p t e d g r a n u l e s a f t e r a d d i t i o n o f N a C l ( 2 m M ) . ( c ) C e l l s u s p e n s i o n o f g r a n u l e s , d i s p e r s e d b y w a s h i n g w i t h D D - w a t e r a n d s o n i c a t i n g . ( d ) I n t a c t a g g r e g a t e s f o r m e d b y M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N . ( e ) A g g r e g a t e s r e - f o r m e d b y d i s p e r s e d c e l l s o f s t r a i n T I N a f t e r a d d i t i o n o f N a C l ( 2 m M ) . ( f ) C e l l s u s p e n s i o n o f s t r a i n T l N , d i s p e r s e d b y w a s h i n g w i t h D D - w a t e r a n d s o n i c a t i n g . 2 8 7 7 . 3 . 4 A g g r e g a t e f o r m a t i o n i n l a b o r a t o r y - s c a l e r e a c t o r b y M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n T I N G r a n u l e - l i k e a g g r e g a t e s w e r e d e v e l o p e d u s i n g a m o n o c u l t u r e o f M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N g r o w n o n f o r m a t e i n t h e l a b o r a t o r y u p fl o w r e a c t o r s y s t e m d e s c r i b e d i n t h e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s s e c t i o n . O p e r a t i o n a l r e s u l t s o f g r t h o f s t r a i n T I N i n t h e u p fl o w r e a c t o r i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 7 . 4 . T h e f o r m a t e c o n v e r s i o n r a t e i n t h e r e a c t o r i n c r e a s e d g r a d u a l l y a s f e e d fl o w r a t e s w e r e i n c r e a s e d . D u r i n g t h e i n i t i a l t h r e e w e e k s , r e l a t i v e l y h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f f o r m a t e r e m a i n e d i n t h e r e a c t o r . G r a d u a l l y t h e f o r m a t e c o n c e n t r a t i o n d r o p p e d f r o m 2 0 m M t o 2 . 2 m M . W i t h i n t h r e e w e e k ’ s c o n t i n u o u s o p e r a t i o n , f o r m a t e l e v e l s d e c r e a s e d t o l o w e r t h a n t h e d e t e c t i o n l i m i t s o f H P L C ( < 2 m M ) . H y d r o g e n w a s p r o d u c e d f r o m f o r m a t e d u r i n g m e t h a n e p r o d u c t i o n . T h e h y d r o g e n p a r t i a l p r e s s u r e r a n g e d b e t w e e n 5 a n d 2 6 P a s t a y i n g g e n e r a l l y b e t w e e n 1 0 a n d 2 0 P a . T h e i n i t i a l e f fl u e n t p H w a s a b o u t 6 . 9 t o 7 . 0 . A s f o r m a t e l e v e l s d e c r e a s e d , t h e p H r o s e t o 7 . 2 t o 7 . 3 . M e t h a n e p r o d u c t i o n i n c r e a s e d f r o m a b o u t 6 . 7 m L ( S T P ) C H 4 / h r t o 2 8 m L ( S T P ) / h r a f t e r 1 m o n t h o f o p e r a t i o n . M e t h a n e c o n t e n t i n t h e b i o g a s i n c r e a s e d f r o m 3 5 % a t t h e b e g i n n i n g t o 4 6 % i n t h r e e w e e k s , a n d r e m a i n e d a t t h a t l e v e l t h e r e a f t e r . A f t e r i n o c u l a t i o n , i n i t i a l f e e d fl o w r a t e o f a b o u t 5 . 5 m L / h r w a s g r a d u a l l y i n c r e a s e d t o 2 4 m L / h b y d a y 3 8 o f c o n t i n u o u s o p e r a t i o n . T h e b a c t e r i a s o o n f o r m e d a g g r e g a t e s , s o m e o f t h e m a c c u m u l a t e d i n t h e b o t t o m o f t h e r e a c t o r , s o m e w e r e c a p t u r e d i n t h e t o p s e t t l e r , a n d o t h e r s w a s h e d o u t f r o m t h e r e a c t o r w i t h t h e e f fl u e n t . D u r i n g t h e fi r s t t h r e e w e e k s , fl o c s a c c u m u l a t e d i n t h e s e t t l e r w e r e r e c y c l e d b a c k t o t h e r e a c t o r e v e r y d a y b y i n c r e a s i n g t h e r e c y c l e r a t e a n d s h a k i n g t h e s e t t l e r g e n t l y t o a l l o w t h e c l u m p s a n d fl o c s t o b e c o m e e n t r a i n e d i n t h e r e c y c l e fl o w . I n i t i a l l y , t h e v o l u m e o f S A G O I B N I N E G O R D Y H 3 . F F E N I . c u o o E F O A R T M ) M m ( 2 8 8 fl o c s w a s a b o u t 5 m L . T h e e f fl u e n t O D 6 6 0 i n c r e a s e d f r o m 0 . 1 0 a t t h e b e g i n n i n g t o 0 . 2 3 a f t e r 2 0 d a y s b u t t h e n d r o p p e d t o 0 . 1 2 t o 0 . 1 4 , i n d i c a t i n g w a s h - o u t o f l i g h t fl o c s . M i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n r e v e a l e d t h a t s m a l l fl o c s a n d f r e e c e l l s w e r e i n t h e e f fl u e n t . D e n s e a g g r e g a t e s w e r e r e t a i n e d i n t h e r e a c t o r . T h e s e e v e n t u a l l y f o r m e d g r a n u l e - l i k e a g g r e g a t e s a f t e r 2 0 d a y s t h a t w e r e e a s i l y i d e n t i fi e d v i a n a k e d - e y e - o b s e r v a t i o n s . H y d r o g e n I n b I o g a e . 4 0 3 0 ( P I ) 2 0 5 F o r m a t e I n e f fl u e n t ‘ ‘ ° 0 r . - : : : : : : : : : : : : : : : : 0 1 0 2 0 3 0 5 0 . . . J u n : 2 4 0 - 1 1 2 ° 1 1 . 1 . 3 % t i F o r m a t e c o n v e r s l o n r a t e 1 0 0 z 3 m 1 ‘ Q . 3 3 e , I ; I I n v a ” i 6 ° § 3 1 1 . 1 ' 1 1 1 g u . ‘ 0 1 - 1 0 . I ; F e e d fl o w r a t e 2 0 o : . O u . o T l | 0 1 0 2 0 s o O P E R A T I O N A L T I M E ( d a y s ) F i g u r e 7 . 4 O p e r a t i o n a l r e s u l t s o f u p fl o w r e a c t o r i n o c u l a t e d w i t h M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n T I N a n d o p e r a t e d a t 3 5 ° C . ( A ) F o r m a t e c o n c e n t r a t i o n i n r e a c t o r a n d H , p a r t i a l p r e s s u r e i n b i o g a s . ( B ) F e e d fl o w r a t e a n d f o r m a t e c o n v e r s i o n r a t e . 2 8 9 ' ‘ f l ‘ a a ' fi . ( " g “ 0 W 3 , " ‘ 1 5 ‘ 3 5 ” “ , 3 ‘ a 2 " “ . I ’ . - f e . . fi ‘ “ ‘ 0 ‘ o . . - 3 . ; 1 3 " ? “ ‘ F i g u r e 7 . 5 G r a n u l e - l i k e a g g r e g a t e s f o r m e d b y M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n T I N i n t h e u p fl o w r e a c t o r . ( a ) A g g r e g a t e s w i t h fl o c s u n d e r U V - l i g h t . ( h ) u n d e r v i s i b l e l i g h t . ( c ) T E M p h o t o g r a p h o f a t h i n s e c t i o n o f a a g g r e g a t e s h o w i n g d e n s e m i c r o b i a l s t r u c t u r e s . A f t e r 4 0 d a y s o f o p e r a t i o n , t h e r e a c t o r w a s o p e n e d t o e x a m i n e t h e a g g r e g a t e s . A b o u t 4 m L g r a n u l e - l i k e a g g r e g a t e s w e r e h a r v e s t e d . T h e a g g r e g a t e s f o r m e d b y s t r a i n T l N a p p e a r e d y e l l o w i n c o l o r a n d s p h e r i c a l i n s h a p e ( F i g u r e 7 . 5 3 ) . T h e s e a g g r e g a t e s fl u o r e s c e d w i t h a b l u e - g r e e n c o l o r u n d e r U V - l i g h t ( F i g u r e 7 . 5 A ) . S o m e fl o c s o r c l u m p s w e r e f o u n d a m o n g t h e g r a n u l e - l i k e a g g r e g a t e s . I n t h e s e t t l e r a b o u t 1 5 m L c o m p a c t c l u m p s w e r e o b s e r v e d . A l s o , a t h i n l a y e r o f b i o fi l m o f s t r a i n T I N w a s f o u n d 2 9 0 i n s i d e r e c y c l e t u b i n g a n d o n t h e g l a s s w a l l o f b o t h t h e r e a c t o r a n d s e t t l e r . T E M e x a m i n a t i o n o f c r o s s s e c t i o n s o f t h e g r a n u l e - l i k e a g g r e g a t e s f o r m e d b y s t r a i n T I N h a d h i g h c e l l d e n s i t i e s ( 2 . 6 x 1 0 ’ c e l l s / c m z ) w h i c h w a s a p p r o x i m a t e l y 4 . 2 x 1 0 1 2 c e l l s / c m ’ . T h e c e l l s w e r e p a c k e d t o g e t h e r s i d e t o s i d e i n r e g u l a r p a t t e r n ( F i g u r e 7 . 5 C ) . T h e s i z e d i s t r i b u t i o n o f t h e g r a n u l e - l i k e a g g r e g a t e s i s i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 7 - 6 . A l l t h e a g g r e g a t e s w e r e l e s s t h a n 0 . 7 m m i n d i a m e t e r w i t h 6 0 % o f t o t a l n u m b e r o f m e a s u r i n g b e t w e e n 0 . 1 t o 0 . 2 m m . A b o u t 7 0 % o f t o t a l a g g r e g a t e v o l u m e , h o w e v e r , i s c o n t r i b u t e d b y t h e a g g r e g a t e s w i t h a d i a m e t e r r a n g i n g f r o m 0 . 4 t o 0 . 6 m m . 3 ‘ “ 0 V I ? e e n e e e - e e 1 e e e m ' 0 ' . " d - e e a e e e I . . I e e e ~ 0 0 4 e e e » e e u e e e r e o - e e e ~ e e ‘ 9 . 0 . 0 . q e e e . . . l e e e - e e e e e a n r c c g fi d e e e e e e e e e . e e e e e e e e e e e - e e ‘ 1 fi fi § 5 & 3 e e e e e e e e e - e e « e e e e e e e e e » e e e e e e e e e e e r e e - , , e e e e e e v . 3 % % % T u g - e e ¢ e e e - e e ' e e e e e e e e e . - e e c e e e t e e « e e e e e e e e e I 0 0 1 . 0 . v v v 1 0 0 ' e e e e e e I e e e e e 9 ” ? % fi & 3 3 3 9 ? ? w e e e e e e e e - e w e e e e e v e e e e e - e e o e e e e e e o e e - D e e e e e r e e v e e e r e e c e e e e e e - e e o e e e e e e t e e e e e - e e c e e e e e e - e e « ‘ fi fi fl f ” ? 3 3 % % & 3 e e e e e t e e e e e - e e e e e e e e - e e - 0 e e e ' 0 0 e e e . 0 O . 0 . C O . ' 0 0 . . 0 . . 0 . D O . . 0 . e 0 0 e e e e e e - e e - 0 0 - e e e e s e e r e e e 0 0 e e e e e e e e - e e ~ e - e e e 0 . . e e e 0 0 e e e e e - e e - r e e - e D O O ~ e e e ' e % 9 fi fi fi U V ? 0 O O . 0 . . b . . . e e . e b e e e e e e e e e e e e - e e v e . e e e - e e e e e . e e n e e : 9 0 0 0 0 . e e - e e e 0 e u e e c e e e v e e o 5 3 $ % % % k g fi i fi fi fi m o - ' 9 ‘ . . . i o n . . . ’ A ’ A ' . k . . . ‘ 0 . 7 d e 0 . 0 5 . 0 5 < . 1 O . 0 . 2 0 . 3 0 . 4 0 . G R A N U L E S I Z E ( m m ) ( I I P 0 1 F i g u r e 7 . 6 S i z e d i s t r i b u t i o n o f g r a n u l e - l i k e a g g r e g a t e s f o r m e d b y M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n T I N i n t h e r e l a t i o n t o t o t a l n u m b e r s a n d a g g r e g a t e v o l u m e . 2 9 1 7 . 4 G R A N U L E F O R M A T I O N B Y D E F I N E D S Y N T R O P H I C F A T T Y A C I D D E G R A D I N G C U L T U R E S 7 . 4 . 1 T h e e x t r a c e l l u l a r p o l y m e r s o f M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 w a s a p r e d o m i n a n t s p e c i e s i n t h e R - g r a n u l e s ( C h a p t e r 5 ) . T h i s o r g a n i s m w a s o b s e r v e d t o f o r m r o s e t t e c l u m p s i n t h e s t a t i o n a r y p h a s e . T h e t h r e e d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e o f t h e c l u m p s o f M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 s h o w e d t h a t t h e c e l l s f o r m e d a c o m p l i c a t e d n e t w o r k ( F i g u r e 7 . 7 A ) , w h i c h m a y e n t r a p o t h e r b a c t e r i a l s p e c i e s . C F — s t a i n e d c e l l s e x h i b i t e d a fi b e r - l i k e s t r u c t u r e w h i c h a p p e a r e d t o c o n n e c t c e l l s t o e a c h o t h e r ( F i g u r e 7 . 7 B ) . T h i s i n d i c a t e s t h a t s t r a i n M 7 p r o d u c e s e x t r a c e l l u l a r p o l y m e r s . T h i s r e s u l t s u p p o r t e d t h e h y p o t h e s i s t h a t M e t h a n o t h r i x M 7 m a y b e o n e o f k e y s p e c i e s r e q u i r e d f o r f o r m a t i o n o f t h e R - g r a n u l e s . 7 . 4 . 2 H y d r o p h o b i c i t y o f c e l l s u r f a c e s o f v a r i o u s m e t h a n o g e n s H y d r o p h o b i c i t y i s a n i m p o r t a n t p a r a m e t e r f o r d e s c r i b i n g t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e c e l l s u r f a c e . I t c a n s i g n i fi c a n t l y i n fl u e n c e t h e a d h e r e n c e o f b a c t e r i a l c e l l s t o s u p p o r t m e d i a a s w e l l c e l l s t o c e l l s . H y d r o p h o b i c i t y c a n b e e s t i m a t e d b y m e a s u r i n g t h e r e d u c t i o n o f c e l l c o n c e n t r a t i o n i n a q u e o u s p h a s e a f t e r a d d i t i o n o f h y d r o c a r b o n s o l v e n t ( R o s e n b e r g e t a l . , 1 9 8 0 ) . I S K U 8 1 0 0 0 0 0 2 7 8 1 . 0 U C E U S S F i g u r e 7 . 7 2 9 2 S c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o p h o t o g r a p h s o f M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 . ( A ) S a m p l e t r e a t e d b y n o r m a l p r o c e d u r e s h o w s m i c r o s t r u c t u r e o f c l u m p s . ( B ) C a t i o n i z e d f e r r i t i n ( C F ) s t a i n e d c e l l s s h o w p o l y m e r fi b e r s c o n n e c t i n g t h e c e l l s e a c h o t h e r a n d t h e p r e s e n c e o f C F p a r t i c l e s o n c e l l s u r f a c e . 2 9 3 F i v e s t r a i n s o f m e t h a n o g e n s w e r e t e s t e d f o r h y d r o p h o b i c i t y , i n c l u d i n g M b . f o r m i c i c u m s t r a i n s M F , T I N a n d R F , M s p . h u n g a t e i s t r a i n B D , a n d M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 . T h e t h r e e h y d r o c a r b o n s u s e d ( h e x a d e c a n e , x y l e n e a n d h e x a n e ) e x h i b i t e d s i m i l a r r e s u l t s f o r h y d r o p h o b i c i t y t e s t s . T h e r e s u l t s u s i n g h e x a n e a s t h e a p o l a r p h a s e a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 7 . 1 . T h e c e l l s o f s t r a i n T I N f o r m e d a g g r e g a t e s i n t h e a q u e o u s p h a s e c o n t a i n i n g p o t a s s i u m p h o s p h a t e v e r y q u i c k l y a n d c o u l d n o t b e a d s o r b e d b y h e x a d e c a n e , h e x a n e o r x y l e n e . A l l c e l l s r e m a i n e d i n t h e a q u e o u s p h a s e a s a g g r e g a t e s . T h u s , i t w a s n o t p o s s i b l e t o a c c u r a t e l y d e t e r m i n e h y d r o p h o b i c i t y o f s t r a i n T I N c e l l s . L e s s t h a n 6 % o f s t r a i n M F c e l l s r e m a i n e d i n t h e a q u e o u s p h a s e i n d i c a t i n g t h a t s t r a i n M F c e l l s w e r e s i g n i fi c a n t l y h y d r o p h o b i c . S t r a i n R F c e l l s w e r e a l s o h y d r o p h o b i c . O n t h e o t h e r h a n d , c e l l s o f M s p . h u n g a t e i s t r a i n B D r e m a i n e d i n a q u e o u s p h a s e , i n d i c a t i n g t h e s e c e l l s w e r e m o r e h y d r o p h i l i c . A f t e r t h e s u s p e n s i o n o f M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 ( O D 4 0 0 0 . 2 1 ) w a s v o r t e x e d w i t h h e x a n e , t h e O D 4 0 0 i n t h e a q u e o u s p h a s e w a s r e d u c e d b y 8 5 % . M o s t c e l l s w e r e p a r t i t i o n e d t o t h e a p o l a r p h a s e , i n d i c a t i n g t h a t t h e s u r f a c e o f t h e s e c e l l s w a s h y d r o p h o b i c i n n a t u r e . I t i s k n o w n t h a t t w o h y d r o p h o b i c s u r f a c e s w i l l a t t r a c t e a c h o t h e r w h e n t h e y c o m e t o g e t h e r , w h i l e t w o h y d r o p h i l i c s u r f a c e s w i l l r e p e l e a c h o t h e r ( R a p p o r t e u r e t a l . , 1 9 8 4 ) . T h e h y d r o p h o b i c i t y t e s t e x p l a i n e d w h y i t i s p o s s i b l e f o r M b . f o r m i c i c u m s t r a i n s M F a n d R F a n d M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 t o f o r m a g g r e g a t e s o r c l u m p s b u t i t i s i m p o s s i b l e f o r M s p . h u n g a t e i s t r a i n B D . T h e r e f o r e , b a s e d o n t h e s e r e s u l t s , M b . f o r m i c i c u m s p e c i e s a n d M e t h a n o t h r i x M 7 a r e l i k e l y t o b e m o r e i m p o r t a n t i n g r a n u l e f o r m a t i o n t h a n M s p . h u n g a t e i s t r a i n B D . s e o o o o y n n n n s s s s s e e e e e y y y y y n w o n k n u - + + + 2 2 5 3 8 0 0 0 1 0 . . . . . 0 0 0 0 0 5 5 0 0 4 4 4 2 1 2 m . . . . . 0 0 0 0 0 u c i i c e i t m r o f m a g n u h u m i r e t c a b o n u l l i r x i N r i I F p F D h 7 T M R B M s t o o n n n n n n n a i i i i i a a h t e a a a a a h h r r r r r t t t t t t t s s s s s e e M M M T a b l e 7 . 1 H y d r o p h o b i c i t y a n d c e l l a d h e s i o n p r o p e r t i e s o f m e t h a n o g e n i c s p e c i e s o b t a i n e d f r o m t h e R - g r a n u l e s O D 4 0 0 i n l i q u i d p h a s e O r g a n i s m H y d r o p h o b i c A g g r e g a t i o n R e - a g g r e g a t i o n b e f o r e a f t e r 1 ) N o n - p o l a r p h a s e w a s h e x a n e ( 0 . 8 m L ) , a n d a q u e o u s p h a s e w a s p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 0 , 3 . 6 m L ) . 2 ) T h e c h a n g e i n o p t i c a l d e n s i t y o f c e l l s a t 4 0 0 n m ( O D m ) b e f o r e a n d a f t e r v o r t e x e d f o r 2 m i n w a s u s e d t o e s t i m a t e h y d r o p h o b i c i t y . T h e r e d u c t i o n o f O D 4 0 0 w a s d u e t o t h e a d s o r p t i o n o f c e l l s t o a p o l a r p h a s e e x c e p t t h e c a s e f o r M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N . 2 9 4 2 9 5 7 . 4 . 3 E v a l u a t i o n o f a g g r e g a t i o n b e h a v i o r o f m e t h a n o g e n s a n d s y n t r o p h i c c u l t u r e s T h e a g g r e g a t i o n b e h a v i o r o f v a r i o u s s y n t r o p h i c f a t t y a c i d d e g r a d i n g a s s o c i a t i o n s a n d p u r e m e t h a n o g e n c u l t u r e s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 7 . 2 . T h e r e l a t i v e a g g r e g a t i o n p e r c e n t a g e s ( R ) w e r e e s t i m a t e d o n t h e b a s i s o f o p t i c a l d e n s i t y a t 6 6 0 n m ( O D 6 6 0 ) o f l i q u i d a n d t h e m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n . T h e O D 6 6 0 o f p u r e c u l t u r e s o f M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N a n d M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 w a s v e r y l o w ( < 0 . 0 2 ) b e c a u s e c e l l s f o r m e d a g g r e g a t e s ; t h u s R f o r s t r a i n T I N a n d s t r a i n T 1 8 w a s t a k e n a s 1 0 0 % . M o s t c e l l s o f M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 f o r m e d r o s e t t e c l u m p s b u t s o m e r e m a i n e d a s d i s p e r s e d c e l l s ( R = 7 0 % ) . M s p . h u n g a t e i s t r a i n B D g r e w a s d i s p e r s e d c e l l s o n l y ( R = 0 % ) . C e l l s o f M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N a n d s t r a i n B H i n c o c u l t u r e f o r m e d d e n s e a g g r e g a t e s . S o m e o f t h e a g g r e g a t e s w e r e a s l a r g e a s 0 . 2 t o 0 . 4 m m i n d i a m e t e r a f t e r t w o t r a n s f e r s . M i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n i n d i c a t e d t h a t t h e c e l l s o f t h e t w o s t r a i n s g r e w h o m o g e n e o u s l y ( F i g u r e 7 . 8 A ) . W h e n t h e a g g r e g a t e s f o r m e d , t h e m e d i u m a p p e a r e d c l e a r ( O D , 5 6 0 < 0 . 0 4 ) a n d o n l y v e r y f e w c e l l s w e r e f o u n d f r e e i n t h e l i q u i d ( R = 0 . 9 5 ) . N o a g g r e g a t e s w e r e o b s e r v e d i n c o c u l t u r e s o f s t r a i n s B H a n d M s p . h u n g a t e i s t r a i n B D . M i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n r e v e a l e d t h a t M s p . h u n g a t e i s t r a i n B D g r e w a s s i n g l e fi l a m e n t s w h i l e s t r a i n B H f o r m e d s m a l l c l u m p s c o n s i s t i n g o f o n l y a f e w c e l l s . I t w a s a l s o o b s e r v e d d u r i n g m i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o n t h a t t h e c e l l s o f t h e t w o s t r a i n s w e r e a l w a y s s e p a r a t e d f r o m e a c h o t h e r ( F i g u r e 7 . 8 B ) . T h i s c o c u l t u r e w a s a s s i g n e d a n R v a l u e o f z e r o . T h e c l u m p - f o r m i n g c h a r a c t e r i s t i c o f s t r a i n B H i n d i c a t e s t h e p r e s e n c e o f a d h e s i v e c e l l s u r f a c e p o l y m e r s o n t h e s u r f a c e o f s t r a i n B H c e l l s . d e n fi e d d n a n e g o n a h t s e e r m u t e l r u u c p c f i o n r e o g i o v n a a h h e t b e m n o c i i t h a p g o e r r t g n y g s A 2 . 7 e l b a T C u l t u r e O b s e r v a t i o n R e l a t i v e a g g r e g a t i o n ( % ) s t r a i n T I N A g g r e g a t e s 1 0 0 s t r a i n T 1 8 A g g r e g a t e s 1 0 0 s t r a i n M 7 A g g r e g a t e s a n d f r e e c e l l s 7 0 s t r a i n B D F r e e c e l l s 0 s t r a i n s T 1 N + B H D e n s e a g g r e g a t e s f o r m e d w i t h d i a m e t e r 9 5 0 . 2 - 0 . 4 m m , f e w f r e e c e l l s s t r a i n s B D + B H N o a g g r e g a t e s , b u t v e r y s m a l l c l u m p s 2 5 o f s t r a i n B H . B D g r e w a s s i n g l e c e l l s s t r a i n s T 1 N + P T S t r a i n T I N f o r m e d c l u m p , b u t s t r a i n P T 2 0 g r e w a s f r e e c e l l s o u t s i d e T I N c l u m p s . s t r a i n s T 1 N + P T + M 7 S m a l l a g g r e g a t e s c o n t a i n e d t h e t h r e e 7 0 s t r a i n s . F r e e c e l l s a l s o p r e s e n t e d . N o t e : A f t e r 1 — 2 m o n t h s i n c u b a t i o n a t 3 7 ° C . 2 9 6 2 9 7 F i g u r e 7 . 8 A g g r e g a t e f o r m a t i o n b y s y n t r o p h i c m e t h a n o g e n i c c o c u l t u r e s a n d t r i c u l t u r e . ( A ) . A g g r e g a t e f o r m e d b y M b . f o r m i c i c u m T I N a n d b u t y r a t e - d e g r a d i n g s t r a i n B H . ( B ) C e l l s o f M s p . h u n g a t e i B D d i d n o t f o r m a n y c l u m p s o r a g g r e g a t e s w i t h s t r a i n B H . ( C ) C e l l s o f p r o p i o n a t e d e g r a d e r s t r a i n P T d i d n o t g r o w w i t h i n t h e a g g r e g a t e o f M b . f o r m i c i c u m T I N . ( D ) T h e c e l l s o f s t r a i n P T g r e w t o g e t h e r w i t h t h e c e l l s o f M e t h a n o t h r i x M 7 a n d M b . f o r m i c i c u m T I N t o f o r m s y n t r o p h i c a g g r e g a t e . . e . a . . . ? . a s a \ u . r . ~ . 4 ‘ . . ) . n . i w r . E . . A b { J . . . . 0 . n e . . . . . . . . 0 . o T . A U § \ 1 . : . . . 0 . a { 2 9 8 2 9 9 C e l l s o f p r o p i o n a t e d e g r a d e r s t r a i n P T a n d M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N d i d n o t g r o w h o m o g e n e o u s l y i n c o c u l t u r e . M i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o n r e v e a l e d t h a t c e l l s o f s t r a i n P T w e r e a l w a y s f o u n d o u t s i d e t h e c l u m p s o f s t r a i n T l N ( F i g u r e 7 . 8 C ) . H o w e v e r , i n t h e t r i c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n P T , s t r a i n T I N a n d M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 , a l a r g e r n u m b e r o f a g g r e g a t e s f o r m e d . T h e s e a g g r e g a t e s w e r e h o m o g e n e o u s l y c o m p r i s e d o f c e l l s f r o m t h e t h r e e s t r a i n s ( F i g u r e 7 . 8 D ) . S o m e f r e e c e l l s w e r e a l s o o b s e r v e d . T h e R v a l u e s f o r c o c u l t u r e a n d t r i c u l t u r e w e r e 2 0 % a n d 7 0 % , r e s p e c t i v e l y . 7 . 4 . 4 G r a n u l e f o r m a t i o n b y d e fi n e d s p e c i e s T h e a n a e r o b i c g r a n u l e s d e g r a d i n g V F A s h o u l d c o n t a i n a t m i n i m u m a n a c e t a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n , a n H , - C O , - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n , a n d s y n t r o p h i c f a t t y a c i d d e g r a d e r s . D e v e l o p m e n t o f s y n t r o p h i c a n a e r o b i c g r a n u l e s w a s a t t e m p t e d u s i n g t h e f o l l o w i n g o r g a n i s m s : M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N , M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 , M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 , s y n t r o p h i c p r o p i o n a t e d e g r a d e r s t r a i n P T a n d b u t y r a t e d e g r a d i n g s t r a i n B H . T h i s m i c r o b i a l c o m p o s i t i o n d e s i g n w a s b a s e d o n t h e s e c r i t e r i a : i ) t h e s e s p e c i e s p o s s e s s e d t h e c a p a b i l i t y t o c o m p l e t e l y m i n e r a l i z e a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e i n t o C H 4 a n d C O , ; i i ) t h e y h a d b e e n d e m o n s t r a t e d t o f o r m a g g r e g a t e s i n t h e i r p u r e c u l t u r e o r t h e i r s y n t r o p h i c a s s o c i a t i o n s . G r a n u l e s w e r e f o r m e d u s i n g t h e d e fi n e d s p e c i e s . R e s u l t s , i n c l u d i n g t h e c o n c e n t r a t i o n s o f f a t t y a c i d s i n t h e i n fl u e n t a n d e f fl u e n t , V F A d e g r a d a t i o n r a t e s p e r r e a c t o r , C O D v o l u m e t r i c l o a d i n g r a t e s a n d C O D v o l u m e t r i c r e m o v a l r a t e s , a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e 7 . 9 . T h e o p e r a t i o n a l c o n d i t i o n s o f t h e r e a c t o r a n d t h e r e s u l t s o b t a i n e d a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 7 . 3 . F o r t h e i n i t i a l 3 1 d a y s o f o p e r a t i o n , t h e f e e d c o n t a i n e d 5 m M s o d i u m a c e t a t e , 1 0 m M s o d i u m p r o p i o n a t e a n d 1 0 m M b u t y r i c a c i d . S u b s e q u e n t t o d a y 3 0 , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e w e r e g r a d u a l l y i n c r e a s e d t o 1 5 a n d 1 6 . 6 3 0 0 m M . A f t e r 5 7 d a y s o f o p e r a t i o n , t h e r e a c t o r w a s w i t h f e d f r e s h m e d i u m c o n t a i n i n g 3 0 m M p r o p i o n a t e a n d 3 0 m M b u t y r a t e ( n o a c e t a t e ) . B a s e d o n t h e s t o i c h i o m e t r y o f m e t h a n e p r o d u c t i o n f o r m p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e ( T a b l e 1 . 4 i n C h a p t e r 1 ) , a b o u t 7 0 t o 7 5 % o f t h e m e t h a n e s h o u l d b e p r o d u c e d t h r o u g h a c e t a t e a s t h e t e r m i n a l i n t e r m e d i a t e . 3 5 - A § A - — - — - o 2 I E 5 , 5 I E . “ 5 3 E . I z _ 4 1 : c 4 - ' § . . \ 5 - s “ I I I — o / Q 3 E 1 0 - - — - - - — ' - - - c 1 9 r . . — — \ / c 2 2 o . . . E t 2 0 4 0 s o 0 0 E 2 5 ' 3 5 . : 1 0 - D . . I ‘ 5 ‘ : E 2 5 - y r ‘ H i i ' 1 1 . 1 > . 2 0 - g , f I E ' 3 $ a ! 8 1 ' . r e l é o . 2 o 1 0 : e d 0 . _ E a c o n t e n d i n g r a t e ' J E 5 ' . . . . L i l - ' 9 ‘ . . . “ C O D R e m o v a l r a t e 0 . . . . c 2 0 4 0 6 0 s o O P E R A T I O N A L T I M E ( d a y s ) F i g u r e 7 . 9 R e s u l t s o f r e a c t o r s y s t e m u s e d t o s t u d y f o r m a t i o n o f s y n t r o p h i c a n a e r o b i c g r a n u l e s b y d e fi n e d s p e c i e s . ( a ) V F A c o n c e n t r a t i o n s i n t h e i n fl u e n t . ( b ) V F A c o n c e n t r a t i o n s i n t h e e f fl u e n t . ( c ) V F A d e g r a d a t i o n r a t e s o f t h e r e a c t o r v s . o p e r a t i o n a l p e r i o d . ( D ) C O D v o l u m e t r i c l o a d i n g r a t e s a n d v o l u m e t r i c C O D r e m o v a l r a t e s . C 2 : a c e t a t e ; C 3 : p r o p i o n a t e ; a n d C 4 : b u t y r a t e . 4 4 - - 3 3 5 0 7 8 - - 4 9 7 7 0 3 8 8 - - 8 1 7 6 9 2 - . 3 3 5 . 5 7 11 3 6 . . 3 6 O 1 1 3 0 0 1 3 7 7 2 1 4 5 8 3 o t o o o t t t 2 8 8 1 3 4 5 y y y y a a a a d d d d T a b l e 7 . 3 O p e r a t i o n a l c o n d i t i o n s a n d p e r f o r m a n c e o f a r e a c t o r i n o c u l a t e d w i t h d e fi n e d s y n t r o p h i c m e t h a n o g e n i c c u l t u r e s O p e r a t i o n F e e d V F A ( m M ) F e e d r a t e p H C O D l o a d C O D r e m o v a l C H 4 H , d a t e C , C 3 n - C 4 m l / h r g / L / d a y ( % ) ( % ) ( P a ) 5 7 - 5 9 7 0 — 7 5 5 - 9 1 0 1 0 2 0 3 . 2 — 5 . 0 6 4 - 8 0 7 4 - 7 5 3 - 5 6 7 1 I n H m i n t / 3 0 ( 1 ) C , : a c e t a t e ; C 3 : p r o p i o n a t e ; n - C 4 : b u t y r a t e . ( 2 ) T h e d a t e s e q u e n c e b e g i n s o n t h e fi r s t d a y w h e n a l l s t a r t e r c u l t u r e s a d d e d i n t o r e a c t o r . ( 3 ) C O D l o a d w a s c a l c u l a t e d o n t h e b a s i s o f s t o i c h i o m e u ' y o f c o m p l e t e o x i d a t i o n o f s u b s t r a t e s t o C O , ( g C O D / m o l ) : a c e t a t e , 6 4 ; p r o p i o n a t e , 1 1 2 ; b u t y r a t e , 1 6 0 . 3 0 1 3 0 2 A f t e r s t a r t - u p , a c e t a t e w a s d e g r a d e d i m m e d i a t e l y . B u t y r a t e c o n c e n t r a t i o n r e m a i n e d a t 1 0 m M f o r a b o u t 1 0 d a y s b e f o r e s i g n i fi c a n t b u t y r a t e d e g r a d a t i o n o c c u r r e d . T h e g r o w t h r a t e o f p r o p i o n a t e d e g r a d e r s w a s v e r y s l o w . S i g n i fi c a n t p r o p i o n a t e d e g r a d a t i o n o c c u r r e d o n l y a f t e r 3 7 d a y s . F a t t y a c i d d e g r a d a t i o n r a t e s i n t h e r e a c t o r i n c r e a s e d a l m o s t l o g a r i t h m i c a l l y d u r i n g t h e o p e r a t i o n a l p e r i o d . T h e i n i t i a l p H i n t h e r e a c t o r w a s 6 . 2 3 . T h i s g r a d u a l l y i n c r e a s e d u p t o a b o u t 7 . 0 i n 1 6 d a y s a s t h e f a t t y a c i d c o n c e n t r a t i o n s d e c r e a s e d . A f t e r t h e f e e d w a s s w i t c h e d t o a p r o p i o n a t e - b u t y r a t e m i x t u r e , t h e p H i n c r e a s e d f r o m 7 . 0 t o 7 . 3 . T h e h y d r o g e n p a r t i a l p r e s s u r e w h i c h w a s a b o u t 1 7 P a a t t h e b e g i n n i n g , d r o p p e d t o 3 t o 5 P a o n d a y 1 6 a n d r e m a i n e d a t t h i s l e v e l d u r i n g t h e r e s t o f t h e o p e r a t i o n a l p e r i o d . T h e m e t h a n e c o n t e n t i n b i o g a s w a s 7 0 t o 7 5 % w h e n r e a c t o r w a s f e d w i t h a c e t a t e - p r o p i o n a t e - b u t y r a t e m i x t u r e . T h i s i n c r e a s e d s l i g h t l y t o 7 5 t o 7 6 % w h e n f e d w i t h p r o p i o n a t e — b u t y r a t e m i x t u r e , a s w o u l d b e a n t i c i p a t e d . T h e i n c r e a s e i n t h e C O D v o l u m e t r i c r e m o v a l r a t e s w a s p r o p o r t i o n a l t o t h e i n c r e a s e i n t h e C O D v o l u m e t r i c l o a d i n g . A t t h e b e g i n n i n g , t h e C O D r e m o v a l r a t e ( t o t a l r e a c t o r s y s t e m ) w a s l e s s t h a n 0 . 1 g C O D / L - d w i t h a C O D r e m o v a l o f l e s s t h a n 3 % . A t t h e e n d o f t h e o p e r a t i o n , t h e v o l u m e t r i c C O D r e m o v a l r a t e h a d i n c r e a s e d t o 2 2 . 5 g C O D / L - d a y w i t h C O D r e m o v a l e f fi c i e n c i e s o f 8 0 t o 8 3 % . A n a t t e m p t t o m o n i t o r t h e s p e c i fi c v o l u m e t r i c l o a d i n g r a t e a n d s p e c i fi c C O D r e m o v a l r a t e o n t h e b a s i s o f b i o m a s s o f g r a n u l e s w a s i m p o s s i b l e s i n c e b o t h fl o c s a n d b i o fi l m s w e r e p r e s e n t e d i n t h e r e a c t o r s y s t e m . A t t h e b e g i n n i n g , t h e r e a c t o r c o n t a i n e d a b o u t 5 m L b a c t e r i a l b e d c o n s i s t i n g o f i n o c u l a t e d c u l t u r e s o f a p p a r e n t l y l o w d e n s i t y a g g r e g a t e s . A f t e r 1 7 d a y s o f c o n t i n u o u s o p e r a t i o n , m o s t o f t h e l i g h t f r a c t i o n o f t h e a g g r e g a t e s w e r e w a s h e d o u t o f c o l u m n r e a c t o r i n t o t h e s e t t l e r . A f e w d e n s e s m a l l a g g r e g a t e s w i t h a b r o w n i s h - y e l l o w c o l o r , r e m a i n e d a t t h e b o t t o m o f t h e r e a c t o r . T h e g r a n u l e - l i k e a g g r e g a t e s w e r e o b s e r v e d a t 3 0 3 t h e b o t t o m o f t h e r e a c t o r a f t e r 2 0 d a y s o f o p e r a t i o n . T h e s e g r a d u a l l y d e v e l o p e d t o f o r m a g r a n u l e b e d i n t h e r e a c t o r . B y d a y 8 2 , a b o u t 7 m L o f g r a n u l e s h a d d e v e l o p e d i n t h e r e a c t o r . D u r i n g t h i s p e r i o d ( a f t e r a b o u t 5 0 d a y s ) , a t t a c h m e n t o f b a c t e r i a t o t h e r e a c t o r w a l l b e c a m e v i s i b l e . T h i s p r o c e s s o f a t t a c h m e n t a n d s u b s e q u e n t g r t h o f b i o fi l m s c o n t i n u e d u n t i l t h e t e r m i n a t i o n o f t h e e x p e r i m e n t a t d a y 8 2 , r o u g h l y 5 0 % o f t h e t o t a l b i o m a s s w a s a t t a c h e d t o t h e r e a c t o r w a l l a n d t h e r e s t w a s i n t h e g r a n u l e b e d . T h e a t t a c h e d b i o fi l m s w e r e y e l l o w i s h i n c o l o r w h i l e t h e c o l o r o f g r a n u l e s w a s b r o w n i s h y e l l o w i n c o l o r . 7 . 4 . 5 M i c r o b i a l s t r u c t u r e o f g r a n u l e s T h e g r a n u l e s d e v e l o p e d b y t h e d e fi n e d s p e c i e s w e r e o f i r r e g u l a r s h a p e a n d a b o u t 1 m m i n d i a m e t e r ( F i g u r e 7 . 1 0 ) . M i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n r e v e a l e d t h a t b o t h g r a n u l e s a n d b i o fi l m s h a d t h e s a m e m i c r o b i a l c o m p o s i t i o n a n d b o t h h a d a l l fi v e o f t h e s p e c i e s i n o c u l a t e d i n t o t h e r e a c t o r a t r e a d i l y o b s e r v a b l e n u m b e r s . U n d e r S E M e x a m i n a t i o n , t h e c e l l s o f M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N , p r o p i o n a t e d e g r a d i n g s t r a i n P T a n d b u t y r a t e d e g r a d i n g s t r a i n B H w e r e f r e q u e n t l y o b s e r v e d o n t h e s u r f a c e o f g r a n u l e s ( F i g u r e 7 . 1 0 ) . T h e c e l l s o f M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 w e r e o b s e r v e d o n l y o c c a s i o n a l l y . T E M c r o s s t h i n s e c t i o n r e v e a l e d t h a t s t r a i n T I N , s t r a i n M 7 , s t r a i n P T a n d s t r a i n B H ( e x c e p t s t r a i n T 1 8 ) g r e w h o m o g e n e o u s l y w i t h i n t h e g r a n u l e s ( F i g u r e 7 . 1 0 ) . M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 g r e w a s i n d i v i d u a l a g g r e g a t e s i n s i d e t h e g r a n u l e s a n d d i d n o t a p p e a r t o m i x w i t h o t h e r b a c t e r i a . O n t h e o u t e r s u r f a c e o f t h e a g g r e g a t e s s t r a i n s T 1 8 a n d T I N g r e w i n w h a t a p p e a r e d t o b e a n a t t a c h e d l a y e r ( F i g u r e 7 . 1 0 ) . T h i s l a y e r o f s t r a i n T I N a p p e a r e d t o s e r v e a s a b r i d g e b e t w e e n T 1 8 a g g r e g a t e s a n d t h e o t h e r s y n t r o p h i c b a c t e r i a g r o w i n g t o g e t h e r . T h e o v e r a l l c e l l d e n s i t y o f s t r a i n T 1 8 i n t h e s e g r a n u l e s w a s h a r d t o d e t e r m i n e b y d i r e c t m i c r o s c o p i c c o u n t d u e t o a g g r e g a t i o n a n d 3 0 4 b e c a u s e t h e s i z e o f M s . m a z e i T 1 8 c e l l s w a s i r r e g u l a r . T h e a g g r e g a t e s o f s t r a i n T 1 8 o c c u p i e d a b o u t 3 0 - 3 5 % o f t o t a l s u r f a c e o f c r o s s s e c t i o n o f t h e g r a n u l e s . T h e d e n s i t y o f t h e f o u r s t r a i n s i n t h e g r a n u l e s w a s d e t e r m i n e d ( T a b l e 7 . 4 ) . T h e c e l l d e n s i t y o f t h e g r a n u l e s w a s 8 . 7 x 1 0 7 c e l l s / c m z . D i r e c t c o u n t i n g o f t h e i n d i v i d u a l m o r p h o t y p e — c e l l s o n t h e e l e c t r o n m i c r o p h o t o g r a p h s l e d t o t h e a p p r o x i m a t e r a t i o a m o n g t h e s t r a i n s . T h e r a t i o o f T 1 N : M 7 : B H : P T w a s 1 0 0 : 5 9 z 2 4 z l 3 . 7 . 4 . 6 C h a r a c t e r i z a t i o n o f g r a n u l e s T h e m a x i m u m s p e c i fi c c o n v e r s i o n r a t e s f o r a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e w e r e d e t e r m i n e d u s i n g b a t c h t e s t i n t h e r e a c t o r d e s c r i b e d i n t h e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s s e c t i o n . T h e r e s u l t s o f a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e c o n v e r s i o n r a t e s o f t h e s y n t r o p h i c a n a e r o b i c g r a n u l e s a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 7 . 4 . T h e g r a n u l e s h a d h i g h f a t t y a c i d d e g r a d a t i o n r a t e s , s p e c i fi c g r a v i t y o f 1 . 0 2 3 , a n d d e n s i t y o f 5 8 g S S / L . B a s e d o n t h e s t o i c h i o m e t r y o f c o m p l e t e o x i d a t i o n o f a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e t o m e t h a n e a n d C 0 , , t h e m a x i m u m C O D r e m o v a l r a t e o f t h e g r a n u l e s w a s 3 . 2 2 g C O D / g S S - d a t 3 5 ° C . T h e s e g r a n u l e s h a d a n o r m a l d i s t r i b u t i o n w i t h 0 . 8 m m a s t h e m e a n d i a m e t e r b a s e d o n t h e t o t a l n u m b e r o f g r a n u l e s ( F i g u r e 7 . 1 1 ) . T h e v o l u m e o f g r a n u l e b e d w a s p r i n c i p a l l y d u e t o t h e g r a n u l e s w i t h a s i z e n o t l a r g e r t h a n 1 . 0 m m i n d i a m e t e r . T h i s i n d i c a t e s t h a t t h e g r a n u l e s h a d a r e l a t i v e l y u n i f o r m s i z e d i s t r i b u t i o n . T h e a p p a r e n t h a l f v e l o c i t y c o e f fi c i e n t s , K , n o f t h e g r a n u l e s w e r e d e t e r m i n e d t o b e 0 . 0 3 8 m M f o r p r o p i o n a t e a n d 0 . 1 8 9 m M f o r b u t y r a t e , r e s p e c t i v e l y . T h e s e v a l u e s c a n b e c o n s i d e r e d a s t h e r e s p e c t i v e k i n e t i c p a r a m e t e r s o f p r o p i o n a t e - d e g r a d i n g s t r a i n P T a n d b u t y r a t e - d e g r a d i n g s t r a i n B H . T h e s e v a l u e s a r e b a s i c a l l y t h e s a m e a s t h o s e o f t h e R - g r a n u l e s i n T a b l e 3 . 6 a s e x p e c t e d s i n c e s t r a i n s P T a n d B H a r e p r e v a l e n t V F A - d e g r a d i n g s p e c i e s i n t h e R - g r a n u l e s . 3 0 5 F i g u r e 7 . 1 0 G r a n u l e s f o r m e d b y d e fi n e d s p e c i e s . L e f t : O v e r v i e w o f t h e g r a n u l e s . B e l o w : T h e s u r f a c e o f a g r a n u l e u n d e r S E M . B H : b u t y r a t e d e g r a d i n g s t r a i n B H ; M 7 : M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 ; P T : p r o p i o n a t e d e g r a d e r s t r a i n P T ; T I N : M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N . R i g h t : H o m o g e n e o u s g r o w t h o f s t r a i n s T I N , M 7 , B H a n d P T f o r m e d t h e b u l k o f g r a n u l e s o n T E M t i n s e c t i o n . I n d i v i d u a l a g g r e g a t e o f M s . m a z e i T 1 8 w a s a s s o c i a t e d t o t h e g r a n u l e b u l k t h r o u g h M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T l N c e l l s . 3 0 7 T a b l e 7 . 4 P h y s i c a l - c h e m i c a l , m e t a b o l i c a n d m i c r o b i a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e g r a n u l e s d e v e l o p e d b y t h e d e fi n e d s p e c i e s P h y s i c a l - c h e m i c a l D e n s i t y ( g S S / L ) 5 8 V S S / S S 0 . 8 8 s p e c i fi c g r a v i t y 1 . 0 2 3 S p e c i fi c f a t t y a c i d c o n v e r s i o n r a t e ‘ ( m m o l / g S S - d ) A c e t a t e 4 3 . 1 P r o p i o n a t e 8 . 9 6 B u t y r a t e 1 7 . 1 A p p a r e n t K m ( m M ) b P r o p i o n a t e 0 . 0 3 8 b u t y r a t e 0 . 1 8 9 S p e c i fi c C O D r e m o v a l r a t e ( g C O D / g S S - d ) 3 . 2 2 R a t i o a m o n g v a r i o u s d e fi n e d s p e c i e s c ( % ) M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N 5 0 . 8 M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 3 0 . 0 B u t y r a t e d e g r a d i n g s t r a i n B H 1 2 . 4 P r 0 p i o n a t e d e g r a d i n g s t r a i n P T 6 . 8 a ) D e t e r m i n e d i n r e a c t o r f e d w i t h V F A m i x t u r e c o n t i n u o u s l y a t 3 5 ° C . A c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e c o n c e n t r a t i o n s i n r e a c t o r w e r e 5 m M , 6 m M a n d 1 m M , r e s p e c t i v e l y . F e e d c o n t a i n e d 0 . 3 m M s o d i u m s u l fi d e a s r e d u c t a n t . b ) T h e d e t e r m i n a t i o n o f K I n i s d e s c r i b e d i n A p p e n d i x C . c ) D e t e r m i n e d b y s e q u e n t l y c o u n t i n g t h e n u m b e r o f i d e n t i fi e d i n d i v i d u a l m o r p h o t y p e - c e l l s o n t h e c r o s s t h i n s e c t i o n u n d e r T E M . T h e t o t a l c e l l s n u m b e r w a s 9 5 4 . T h e n u m b e r o f M e t h a n o s a r c i n a m a z e i T 1 8 w a s n o t c o u n t i n t o t h e t o t a l c e l l n u m b e r . ) % ( S E L U N A R G F O R E B M U N R O E M U L O V E . V 9 ' . e 0 . ' 0 e 0 ' e 0 0 ' 0 . 0 ' 0 ' 0 0 ' 0 0 ' 0 0 0 ' 0 0 e ' . 0 0 e ' 0 . 0 e ' 0 . 0 . 3 0 0 ' A 0 . ' 0 . e . ' 0 o e ' . . e e e e ' e e 0 0 . e e 0 . ' e e " . 0 e ' . e e ' . e 0 ' 2 e 0 ' 2 d ' " 9 0 ‘ e . o . 0 0 0 2 0 2 0 " ' I . 2 . e . . T A L E R 5 M O m 0 ’ e e f 0 . e ' e 0 e v 0 . ' 0 ' 0 . 0 . . 0 0 . 0 0 . 0 . V . . 0 . . 0 0 . 0 , 0 0 0 0 ' 0 0 0 0 . 0 0 ? 3 0 8 3 2 ' 1 . 0 w v o l u m e 9 6 l 0 0 a . . . . . . . 0 0 0 . . . . . . - n u m b e r 9 6 2 4 - 0 0 ° e 0 . 0 . . " I 0 2 0 1 0 1 6 1 4 1 2 . o 0 3 ° O . 0 I L L I L I e e e e ' e . e e e e e ’ e ’ e ’ e ’ e ’ e . 0 0 0 . - . o ‘ 0 . 0 . o f : O . 0 . 0 9 . 0 3 . . 0 0 0 . 0 . 0 0 . 0 . . . . . 0 . . 0 e ' e . . ' e s a f e ? “ 3 . . e . . . 0 . 0 0 0 0 0 0 0 0 . 9 . v 0 0 ' 0 0 0 a A . . . . 5 0 ' 0 0 0 , 0 0 ’ e V 0 . 0 0 . 0 0 0 0 A 0 0 0 . 0 0 . 0 _ 0 . 0 0 ' 0 ' 0 ' 0 0 . 0 0 ' : e 0 : ' e ‘ e e ‘ 0 0 . 0 0 0 . . [ L I M J w 0 . 0 0 0 0 0 . . 0 2 0 0 ' 0 0 . 0 e 9 e ' . e e « . 1 0 . 1 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 1 1 . 2 1 . 4 1 . 5 1 . 8 G R A N U L E S I Z E ( m m ) F i g u r e 7 . 1 1 S i z e d i s t r i b u t i o n o f t h e g r a n u l e s f o r m e d b y d e fi n e d s p e c i e s . 7 . 5 D I S C U S S I O N 7 . 5 . 1 T h e r o l e o f M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s p e c i e s i n g r a n u l e f o r m a t i o n M b . f o r m i c i c u m s p e c i e s ( s t r a i n s T I N , R F a n d M F ) p o s s e s s e d a g g r e g a t e - f o r m i n g c h a r a c t e r i s t i c s . T h e y m a y , t h e r e f o r e , f o r m a n e t w o r k b y b r i d g i n g b e t w e e n c e l l s t o f o r m a g r a n u l e s t r u c t u r e w h e n t h e y a r e p r e d o m i n a n t s p e c i e s i n g r a n u l e s . R e c e n t l y , K o o m n e e f e t a l . ( 1 9 9 0 ) r e p o r t e d t h a t m e t h a n o g e n s a n t i g e n i c a l l y r e l a t e d t o M b . f o r m i c i c u m s t r a i n M F w e r e o b s e r v e d i n a l l g r a n u l e s f r o m fi v e d i f f e r e n t s o u r c e s . T h i s i n d i c a t e s t h a t M b . f o r m i c i c u m i s l i k e l y t o b e a p r e v a l e n t s p e c i e s i n a n a e r o b i c g r a n u l e s . M b . f o r m i c i c u m s t r a i n s T I N a n d R F w e r e i d e n t i fi e d a s t h e p r e d o m i n a n t s p e c i e s i n t h e 3 0 9 R - g r a n u l e s d e v e l o p e d o n a V F A m i x t u r e ( C h a p t e r 5 ) . B a s e d o n t h e T E M o b s e r v a t i o n , t h e s e s t r a i n s f o r m e d g r a n u l e s t r u c t u r e t o g e t h e r w i t h M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 a n d o t h e r b a c t e r i a . A m o n g t h e t h r e e s t r a i n s , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N w a s i n v e s t i g a t e d m o r e i n d e t a i l . T h i s s t r a i n w a s a b l e t o r e - a g g r e g a t e a f t e r d i s a g g r e g a t i o n a n d f o r m e d g r a n u l e s i n m o n o c u l t u r e . T h e p r o p e r t y o f a g g r e g a t i o n a n d g r a n u l e - l i k e a g g r e g a t e f o r m a t i o n o f s t r a i n T I N m a y b e l i n k e d t o p o l y m e r s o n t h e c e l l s u r f a c e , w h i c h a p p e a r t o p r o m o t e c e l l s a d h e r i n g t o o n e a n o t h e r . T h e c e l l s o f s t r a i n T I N c a n r e - a g g r e g a t e u n d e r a w i d e p H r a n g e ( 3 . 6 t o 8 . 5 ) . S E M o b s e r v a t i o n d e m o n s t r a t e d t h a t l a r g e n u m b e r s o f C F p a r t i c l e s a p p a r e n t l y i n t e r a c t e d w i t h a n i o n i c g r o u p s o f p o l y m e r s a n d t h e s u r f a c e o f s t r a i n T l N . T h i s i n d i c a t e s t h a t t h e p o l y m e r s m a y b e s t r o n g l y p o l a r i z e d w i t h a n i o n i c g r o u p s . T h e p r e s e n c e o f a n i o n i c g r o u p s i s a l s o s u p p o r t e d b y d i s a g g r e g a t i o n a t l o w i o n i c s t r e n g t h a n d s u b s e q u e n t r e - a g g r e g a t i o n o b s e r v e d a s r e s u l t s o f a d d i n g s m a l l a m o u n t o f d i f f e r e n t s a l t s . I d e n t i fi c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e p o l y m e r s n e e d s f u r t h e r s t u d y . P o l y m e r s m a y a l s o p r o d u c e d b y o t h e r s t r a i n s o f M b . f o r m i c i c u m s p e c i e s a n d m a y b e s o m e w h a t d i f f e r e n t f r o m t h o s e p r o d u c e d b y s t r a i n T l N s i n c e c l u m p o r a g g r e g a t e - f o r m i n g i s a c o m m o n p r o p e r t y o f t h i s s p e c i e s . T h i s p r o p e r t y a p p e a r s t o m a k e M b . f o r m i c i c u m s p e c i e s i m p o r t a n t i n f o r m a t i o n o f g r a n u l e s t r e a t i n g w a s t e w a t e r w h e n h y d r o g e n a n d f o r m a t e m e t a b o l i s m i s n e c e s s a r y f o r s u b s t r a t e m e t a b o l i s m . I n a d d i t i o n t o M b . f o r m i c i c u m , o t h e r H , - C O , u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s e . g . M e t h a n o b r e v i b a c t e r s p . w e r e a l s o p r e v a l e n t m e t h a n o g e n s i n g r a n u l e s ( D u b o u r g u i e r a t a l . , I 9 8 8 a , 1 9 8 8 c ) . T h e i r r o l e i n a n a e r o b i c g r a n u l e f o r m a t i o n n e e d s f u r t h e r s t u d y . 7 . 5 . 2 E c o p h y s i o l o g i c a l r o l e o f d i f f e r e n t s p e c i e s i n g r a n u l a r s t r u c t u r e T h e R - g r a n u l e s w e r e f o u n d t o b e c o m p o s e d p r i m a r i l y o f H , - C O , a n d f o r m a t e - 3 1 0 u t i l i z i n g a n d a c e t a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s p l u s s y n t r o p h i c f a t t y a c i d d e g r a d e r s ( C h a p t e r 3 a n d 5 ) . T h e k e y s p e c i e s i n g r a n u l e f o r m a t i o n , t h e r e f o r e , a r e l i k e l y t o b e l o n g t o t h e s e g r o u p s . A l l t h e s p e c i e s t e s t e d f o r c o m p a t i b i l i t y a n d a g g r e g a t i o n i . e . M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T l N , M e t h a n o t h n ' x s t r a i n M 7 , M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 , M s p . h u n g a t e i s t r a i n B D , b u t y r a t e d e g r a d i n g s t r a i n B H a n d p r o p i o n a t e d e g r a d e r s t r a i n P T , a r e p r e v a l e n t o r g a n i s m s i n t h e R - g r a n u l e s . T h e r o l e o f e a c h s p e c i e s i n t h e f o r m a t i o n o f a g g r e g a t e s a n d r e s u l t a n t o f t h e g r a n u l e s f o r m e d b y t h e s e s p e c i e s i s d i s c u s s e d b e l o w . M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N i s b e l i e v e d t o b e o n e o f t h e e s s e n t i a l o r g a n i s m s r e s p o n s i b l e f o r g r a n u l e f o r m a t i o n o f t h e R - g r a n u l e s . T h i s o r g a n i s m f o r m e d a g g r e g a t e s ( w h i c h g r e w a s b i g a s 0 . 3 m m o r m o r e i n d i a m e t e r ) t o g e t h e r w i t h s t r a i n B H . I t a l s o f o r m e d h o m o g e n e o u s a g g r e g a t e s w i t h s t r a i n s P T a n d M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 i n t r i c u l t u r e . S t r a i n T I N g r e w a s t h e m a j o r s p e c i e s i n g r a n u l a r m a t r i x t o g e t h e r w i t h a l l o t h e r s p e c i e s . S t r a i n T l N , t h e r e f o r e , a p p e a r s t o p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n b r i d g i n g t h e g a p b e t w e e n t h e a g g r e g a t e s o f M e t h a n o s a r c i n a a n d t h e a g g r e g a t e s f o r m e d b y o t h e r s p e c i e s t o f o r m g r a n u l e s . T h a t M e t h a n o t h r i x s p e c i e s p l a y a n e s s e n t i a l r o l e i n g r a n u l a r s t r u c t u r e h a s b e e n p r o p o s e d b y s e v e r a l i n v e s t i g a t o r s ( W i e g a n t a n d d e M a n , 1 9 8 6 ; D u b o u r g u i e r e t a l . , 1 9 8 8 a ; H u l s h o f f P o l e t a l . , 1 9 8 8 ; H u l s h o f f P o l , 1 9 8 9 ) . T h e r e s u l t s f r o m t h i s w o r k s u p p o r t t h i s a s w e l l . I n t h e g r a n u l e s f o r m e d u s i n g t h e d e fi n e d s p e c i e s , M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 f o r m e d a n e t w o r k t o g e t h e r w i t h M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N t h a t a p p e a r e d t o s u p p o r t t h e g r a n u l a r s t r u c t u r e . I t w a s o b s e r v e d t h a t t h i s s t r a i n p o s s e s s e s b i n d i n g p r o p e r t i e s t h a t m a k e a g g r e g a t e s w i t h s t r a i n T I N a n d p r o p i o n a t e d e g r a d i n g s t r a i n P T . T h e s e l a t t e r t w o s p e c i e s d i d n o t a g g r e g a t e w i t h o t h e r p a r t n e r s . T h i s c h a r a c t e r i s t i c o f s t r a i n M 7 a p p e a r s t o b e i m p o r t a n t i n t h e f o r m a t i o n o f s y n t r o p h i c a n a e r o b i c g r a n u l e s . M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 h a s a s t r o n g a g g r e g a t i o n c h a r a c t e r s i m i l a r t o o t h e r s t r a i n s 3 1 1 o f M e t h a n o s a r c i n a s p e c i e s . H o w e v e r , t h e r o l e o f M e t h a n o s a r c i n a i n g r a n u l a t i o n h a s b e e n q u e s t i o n e d ( L e t t i n g a e t a l . , 1 9 8 5 ; H u l s h o f f P o l e t a l . , 1 9 8 8 ) . E x c e p t f o r g r a n u l e s d e v e l o p e d i n t h e p r e s e n c e o f h i g h a c e t a t e c o n c e n t r a t i o n s , M e t h a n o s a r c i n a s p e c i e s a r e n o t n o r m a l l y f o u n d i n h i g h n u m b e r s . I n t h e d e v e l o p m e n t o f t h e d e fi n e d s p e c i e s g r a n u l e s , M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 c o n t r i b u t e d c a . 3 0 % o f c r o s s s e c t i o n o r 1 6 . 4 % i n t o t a l v o l u m e o f t h e g r a n u l e s . T E M o b s e r v a t i o n r e v e a l e d t h a t c e l l s o f s t r a i n T 1 8 w e r e a l w a y s p r e s e n t a s i n d i v i d u a l a g g r e g a t e s i n g r a n u l e s a n d w e r e b o u n d t o b u l k m a t r i x o f g r a n u l e s v i a . M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N c e l l s . T h e a d d i t i o n o f M e t h a n o s a r c i n a a p p e a r e d t o e n h a n c e t h e g r a n u l a t i o n p r o g r e s s . I t i s p o s s i b l e t h a t a g g r e g a t e s o f M e t h a n o s a r c i n a p r o v i d e n u c l e i f o r g r a n u l e f o r m a t i o n . W h e t h e r t h i s r o l e i s e s s e n t i a l f o r g r a n u l e f o r m a t i o n a n d i f t h i s r o l e c a n b e a d e q u a t e l y fi l l e d b y i n e r t m a t e r i a l s c a n n o t b e d e t e r m i n e d f r o m t h e s e e x p e r i m e n t s . M s p . h u n g a t e i s t r a i n B D d i d n o t g r o w t o g e t h e r w i t h s t r a i n B H i n s y n t r o p h i c a s s o c i a t i o n a s a g g r e g a t e s , a l t h o u g h t h e l a t t e r c o u l d f o r m a g g r e g a t e s b y i t s e l f . S t r a i n B D w a s o b s e r v e d o c c a s i o n a l l y i n s i d e t h e b r e w e r y g r a n u l e s ( C h a p t e r 4 ) a n d o n l y o n t h e s u r f a c e o f t h e R — g r a n u l e s ( C h a p t e r 5 ) . T h i s i n d i c a t e s t h a t M s p . h u n g a t e i s t r a i n B D i s n o t e s s e n t i a l f o r s t r u c t u r e s o f t h e s e t w o g r a n u l e s . T h e r e f o r e , w e d i d n o t u s e i t a s s t a r t e r c u l t u r e f o r d e v e l o p m e n t o f g r a n u l e s . H o w e v e r , i t d i d g r o w i n t h e c l u m p s f o r m e d b y a n o n - s p o r e - f o r m i n g p r 0 p i o n a t e d e g r a d e r s t r a i n P W ( o n e o f t h e p r e v a l e n t p r o p i o n a t e d e g r a d e r s i n R - t y p e g r a n u l e s ) ( C h a p t e r 5 ) . S t r a i n B H r e a d i l y f o r m e d a g g r e g a t e s w h e n i t g r e w w i t h M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N . R e s u l t s f r o m S E M m i c r o p h o t o g r a p h i n d i c a t e d t h a t t h i s s t r a i n p r o d u c e d p o l y m e r a n d , t h e r e f o r e , a l s o c o n t r i b u t e d t o m a i n t e n a n c e o f t h e g r a n u l a r s t r u c t u r e . T h e 1 * , i f a n y , o f s p o r e - f o r m i n g p r o p i o n a t e d e g r a d e r , s t r a i n P T , i n g r a n u l a t i o n w a s n o t d e t e r m i n e d . T h i s o r g a n i s m w a s e s s e n t i a l , h o w e v e r , f o r p r o p i o n a t e m e t a b o l i s m . 3 1 2 F o r m a t i o n o f s y n t r o p h i c a n a e r o b i c g r a n u l e s a p p e a r s t o b e t h e r e s u l t o f c o n t r i b u t i o n s b y a n u m b e r o f t h e s p e c i e s u s e d a s i n o c u l u m . A g g r e g a t e f o r m a t i o n i s l i k e l y t o b e t h e e s s e n t i a l s t e p t h a t l e a d s t o g r a n u l e f o r m a t i o n . T h e a g g r e g a t e f o r m a t i o n b y t h e c e l l s o f o n e s p e c i e s o r m u l t i - s p e c i e s i s l i k e l y r e l a t e d t o t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f c e l l s u r f a c e ( e x t r a c e l l u l a r p o l y m e r f o r m a t i o n , h y d r o p h o b i c i t y , e t c . ) . E x t r a c e l l u l a r p o l y m e r f o r m a t i o n b y t h e s p e c i e s ( M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T l N , M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 , a n d s t r a i n B H ) w h i c h i n d u c e a g g r e g a t i o n i s p r o b a b l y t h e k e y i n h e l p i n g f o r m a n d s t a b i l i z e g r a n u l e s . M s p . h u n g a t e i s t r a i n B D d i d n o t p r o d u c e p o l y m e r a n d i s , t h e r e f o r e , p r o b a b l y l e s s i m p o r t a n t i n g r a n u l e f o r m a t i o n . 7 . 5 . 3 H y d r o p h o b i c i t y a n d a d h e r e n c e H y d r o p h o b i c i t y i s a n i m p o r t a n t c h a r a c t e r i s t i c o f t h e c e l l s u r f a c e . I t p r o b a b l y a f f e c t s t h e f o r m a t i o n o f a g g r e g a t e s a n d g r a n u l e s . T h e h y d r o p h o b i c b a c t e r i a m a y p l a y a g r e a t e r r o l e i n g r a n u l e f o r m a t i o n t h a n h y d r o p h i l i c o n e s . T h e c e l l s u r f a c e o f M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 a p p e a r e d q u i t e h y d r o p h o b i c . T h i s i s c o n s i s t e n t w i t h t h e r e s u l t s f r o m t e s t i n g o f M e t h a n o t h r i x s o e h n g e n i i s t r a i n F E ( V e r r i e r e t a l . , 1 9 8 8 ) . M s p . h u n g a t e i s t r a i n B D w a s h y d r o p h i l i c . S o w a s M s p . h u n g a t e i s t r a i n J F l ( V e r r i e r e t a l . , 1 9 8 8 ) . M b . f o r m i c i c u m s t r a i n s M F a n d R F w e r e i d e n t i fi e d a s b e i n g h y d r o p h o b i c . ' I h e h y d r o p h o b i c i t y o f M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N c o u l d n o t b e d e t e r m i n e d u s i n g t h e R o s e n b e r g ’ m e t h o d ( 1 9 8 0 ) b e c a u s e t h i s s t r a i n f o r m e d a g g r e g a t e s v e r y q u i c k l y i n t h e a q u e o u s p h a s e . I t m a y , h o w e v e r , h a v e t h e s a m e h y d r o p h o b i c i t y a s o t h e r s t r a i n s ( M F a n d R F ) . M s . m a z e i T 1 8 w a s n o t j u d g e d u s i n g R o s e n b e r g ’ s m e t h o d . T h e e x t r a c e l l u l a r p o l y m e r s o f M s . m a z e i , h o w e v e r , h a v e b e e n r e p o r t e d t o b e h i g h l y h y d r o p h i l i c ( K r e i s l a n d K a n d l e r , 1 9 8 6 ) . T h e h y d r o p h o b i c i t y o f s t r a i n B H a n d p r o p i o n a t e d e g r a d i n g s t r a i n P T c o u l d n o t b e d e t e r m i n e d b e c a u s e t h e y d i d g r o w a s 3 1 3 m o n o c u l t u r e s . B a s e d o n t h e h y d r o p h o b i c i t y a n a l y s i s , t h e a g g r e g a t e f o r m a t i o n b y c o c u l t u r e s o f s t r a i n T I N a n d s t r a i n B H i s d u e t o t h e i r h y d r o p h o b i c i t y . T h i s i s c o n s i s t e n t w i t h t h e o b s e r v a t i o n t h a t h y d r o p h o b i c b a c t e r i a t e n d t o a d h e r e t o a h i g h e r e x t e n t t o s o l i d s u r f a c e s t h a n d o h y d r o p h i l i c b a c t e r i a ( K j e l l e b e r g , 1 9 8 4 ) , a n d h y d r o p h o b i c m e t h a n o g e n s s u c h a s M t r x . s o e h n g e n i i s t r a i n F E , M e t h a n o b r e v i b a c t e r a r b o r i p h i l u s s t r a i n A Z a d h e r e w e l l t o h y d r o p h o b i c i n e r t s u p p o r t m a t e r i a l s ( V e r i e r e t a l . , 1 9 8 8 ) . B a s e d o n T E M a n d S E M o b s e r v a t i o n , t h e m a j o r i t y o f c e l l s i n t h e R — g r a n u l e s w e r e M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 a n d M b . f o r m i c i c u m s p e c i e s ( C h a p t e r 3 a n d 5 ) . T h e r o l e o f t h e s e t w o s p e c i e s i n g r a n u l e f o r m a t i o n m a y b e , i n p a r t , r e l a t e d t o t h e i r h y d r o p h o b i c i t y . 7 . 6 S U M M A R Y 1 ) M e t h a n o b a c t e r z ’ u m f o r m i c i c u m s t r a i n T I N w a s o n e o f p r e d o m i n a n t s p e c i e s i n t h e R - g r a n u l e s . T h i s s t r a i n g r e w a s a g g r e g a t e s i n l i q u i d m e d i u m a n d p r o d u c e d e x t r a c e l l u l a r p o l y m e r s t h a t w e r e i d e n t i fi e d b y a c a t i o n i z e d f e r r i t i n s t a i n i n g m e t h o d . T h e c e l l s , d i s p e r s e d b y w a s h i n g w i t h d i s t i l l e d w a t e r a n d s o n i c a t i n g c o u l d r e - a g g r e g a t e w h e n a l o w l e v e l o f s a l t s ( 4 m M ) w a s a d d e d t o t h e m e d i u m . T h e R - g r a n u l e s h a d s i m i l a r r e - a g g r e g a t i o n c a p a b i l i t y p r e s u m a b l y d u e t o t h e p r e s e n c e o f a l a r g e n u m b e r o f c e l l s o f M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N i n t h e g r a n u l e s . 2 ) G r a n u l e - l i k e a g g r e g a t e s w e r e f o r m e d i n a l a b o r a t o r y u p fl o w r e a c t o r ( 3 5 0 C ) w i t h i n 4 0 d a y s u s i n g M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N a s i n o c u l u m a n d f o r m i c a c i d a s t h e s o l e s u b s t r a t e . T h e s i z e o f t h e g r a n u l e s w a s b e t w e e n 0 . 1 t o 0 . 7 m m w i t h 2 . 6 x 1 0 8 c e l l s / c m 2 o n c r o s s t h i n s e c t i o n . 3 ) M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 a l s o h a d c l u m p - f o r m i n g c h a r a c t e r i s t i c s . T h e p r e s e n c e o f e x t r a c e l l u l a r p o l y m e r s , w h i c h a p p a r e n t l y c o n n e c t e d o t h e r c e l l s t o 3 1 4 c o m p l i c a t e d n e t w o r k , w a s i d e n t i fi e d u s i n g t h e c a t i o n i z e d f e r r i t i n s t a i n i n g m e t h o d . 4 ) T h e c e l l s u r f a c e o f M b . f o r m i c i c u m s p e c i e s a n d M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 w e r e m o r e h y d r o p h o b i c w h i l e M e t h a n o s p i r i l l u m h u n g a t e i s t r a i n B D h a d a h y d r o p h i l i c s u r f a c e . I n s y n t r o p h i c a s s o c i a t i o n , c l u m p s o r a g g r e g a t e s w e r e f o r m e d i n a c o c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n B H p l u s M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N a n d a t r i c u l t u r e c o n s i s t i n g o f p r o p i o n a t e d e g r a d i n g s t r a i n P T , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N a n d M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 . 5 ) A n a e r o b i c g r a n u l e s w e r e d e v e l o p e d i n a l a b - s c a l e u p fl o w r e a c t o r f e d w i t h a V F A m i x t u r e u s i n g d e fi n e d c u l t u r e c o n s i s t i n g o f M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N , M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 , M e t h a n o s a r c i n a m a z e i s t r a i n T 1 8 , s t r a i n B H a n d p r o p i o n a t e d e g r a d e r s t r a i n P T a s i n o c u l u m T h e m a x i m u m f a t t y a c i d d e g r a d a t i o n r a t e s o f t h e g r a n u l e s w e r e 4 3 . 1 , 8 . 9 6 a n d 1 7 . 1 m m o l / g S S - d f o r a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e , r e s p e c t i v e l y . T h e m a x i m u m s p e c i fi c C O D r e m o v a l r a t e w a s 3 . 2 2 g C O D / g S S - d . T h e a v e r a g e s i z e o f t h e g r a n u l e s w a s a b o u t 0 . 8 m m . 6 ) T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o n s r e v e a l e d t h a t M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T l N , M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 , b u t y r a t e d e g r a d i n g s t r a i n B H a n d p r o p i o n a t e d e g r a d i n g s t r a i n P T f o r m e d t h e b u l k o f t h e g r a n u l e a s h o m o g e n e o u s s y n t r o p h i c a s s o c i a t i o n w i t h a r a t i o o f 1 0 0 : 5 9 : 2 4 : l 3 , r e s p e c t i v e l y . C e l l s o f M s . m a z e i s t r a i n T 1 8 e x i s t e d i n s i d e t h e g r a n u l e s a s i t s o w n a g g r e g a t e s w h i c h w e r e a p p a r e n t l y l i n k e d t o r e s t o f t h e g r a n u l e v i a M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N . T h e i n t e r a c t i o n o f d i f f e r e n t s p e c i e s i n t h e f o r m a t i o n o f t h e a g g r e g a t e s a n d g r a n u l e s i s l i k e l y r e l a t e d t o b o t h p o l y m e r f o r m a t i o n a n d t h e h y d r o p h o b i c i t y o f t h e s u r f a c e o f s o m e o f t h e s p e c i e s . C H A P T E R 8 S U M M A R Y A N D C O N C L U S I O N S 1 . C o n s i d e r a b l e a m o u n t s o f m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a ( i . e . a p p r o x i m a t e l y 1 0 8 c e l l s / g V S S ) w e r e e n u m e r a t e d i n f o u r a c t i v a t e d s l u d g e s f r o m d i f f e r e n t s o u r c e s , i n d i c a t i n g t h a t a c t i v a t e d s l u d g e c o u l d b e u s e d a s i n o c u l u m m a t e r i a l f o r a n a e r o b i c r e a c t o r s . 2 . A n a e r o b i c g r a n u l e s w e r e d e v e l o p e d f r o m e i t h e r a n a e r o b i c d i g e s t e d s e w a g e s l u d g e , a e r o b i c a c t i v a t e d s l u d g e o r d e fi n e d m i c r o b i a l s p e c i e s i s o l a t e d f r o m g r a n u l e s a s i n o c u l u m . 3 . S p e c i fi c o r g a n i c l o a d i n g r a t e w a s a n i m p o r t a n t p a r a m e t e r a f f e c t i n g g r a n u l a t i o n p r o c e s s . T h e g r a n u l a t i o n p r o g r e s s u s i n g c a r b o h y d r a t e — c o n t a i n i n g w a s t e w a t e r s w a s b a s i c a l l y s i m i l a r t o t h a t u s i n g v o l a t i l e f a t t y a c i d ( V F A ) m i x t u r e s a s s u b s t r a t e a n d d i g e s t e d s l u d g e a s i n o c u l u m r e p o r t e d i n l i t e r a t u r e s . 4 . A n a e r o b i c g r a n u l e s c a p a b l e o f h i g h C O D r e m o v a l r a t e s ( 2 7 g C O D / g V S S ) w e r e d e v e l o p e d u s i n g a n V F A m i x t u r e w i t h l o w s u l f a t e l e v e l ( 0 . 1 5 m M ) a t 3 5 ° C . O n e g r a n u l e t y p e h a d a r o d - t y p e M e t h a n o t h r i x s p . a s p r e d o m i n a n t s p e c i e s ( t h e R - g r a n u l e s ) a n d d i s p l a y e d h i g h e r m a s s a n d c e l l d e n s i t y t h a n t h e o t h e r ( t h e F - g r a n u l e s ) w h i c h h a d fi l a m e n t - t y p e M e t h a n o t h r i x s o e h n g e n i i - l i k e c e l l s a s p r e d o m i n a n t s p e c i e s . T h e s e t w o t y p e s d i s p l a y e d s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e i n o p e r a t i o n a l p e r f o r m a n c e . T h i s w a s 3 1 5 3 1 6 d u e t o t h e p r e d o m i n a n t a c e t a t e u t i l i z i n g m e t h a n o g e n p o p u l a t i o n s . 5 . B o t h R - a n d F - g r a n u l e s h a d s i m i l a r p r o p e r t i e s i n s u b s t r a t e k i n e t i c s a n d m i c r o b i a l p o p u l a t i o n l e v e l s f o r m e t h a n o g e n s a n d s y n t r o p h i c a c e t o g e n s . 6 . S u l f a t e r e d u c i n g b a c t e r i a d i d n o t p l a y a s i g n i fi c a n t r o l e i n m e t a b o l i s m o f H , , f o r m a t e a n d a c e t a t e i n t h e R - g r a n u l e s i n t h e a b s e n c e o r p r e s e n c e o f s u l f a t e . S u l f a t e r e d u c i n g b a c t e r i a d i d n o t p l a y a s i g n i fi c a n t r o l e i n b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b u t t h e y w e r e i n v o l v e d , t o a l i m i t e d e x t e n t , i n s y n t r o p h i c p r o p i o n a t e d e g r a d a t i o n . 7 . I n g r a n u l e s d e v e l o p e d o n a s u l f a t e - c o n t a i n i n g b r e w e r y w a s t e w a t e r ( 0 . 6 t o 1 . 3 m M a s 8 0 4 2 ‘ . s u l f a t e r e d u c i n g b a c t e r i a p l a y e d a s i g n i fi c a n t r o l e i n d e g r a d a t i o n o f p r o p i o n a t e a n d e t h a n o l e i t h e r v i a s u l f a t e r e d u c t i o n o r s y n t r o p h i c a c e t o g e n e s i s b u t d i d n o t m e t a b o l i z e H , , f o r m a t e , a n d a c e t a t e t o a n y s i g n i fi c a n t e x t e n t . 8 . A t l e a s t t h r e e t y p e s o f m i c r o c o l o n i e s w e r e o b s e r v e d i n s i d e t h e b r e w e r y g r a n u l e s . O n e o f t h e s e m i c r o c o l o n i e s c o n s i s t e d o f M e t h a n o t h r i x — l i k e r o d s , w h i l e t h e r e m a i n i n g t y p e s w e r e m a i n l y c o m p o s e d o f n o n - m e t h a n o g e n i c r o d s t o g e t h e r w i t h M e t h a n o b a c t e r i u m - l i k e r o d s . O n e o f t h e n o n - m e t h a n o g e n i c r o d s t h a t h a d a n i r r e g u l a r m o r p h o t y p e w a s , t e n t a t i v e l y , i d e n t i fi e d a s a D e s u l f o v i b r i o s p . T h e r e m a i n i n g r o d s w e r e o b s e r v e d t o b e p r o p i o n a t e d e g r a d i n g , s u l f a t e r e d u c i n g b a c t e r i a . T h e s e S R B , b a s e d u p o n T E M a n d S E M o b s e r v a t i o n , m a y p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n g r a n u l a r s t r u c t u r e f o r t h e s e g r a n u l e s . 9 . F i v e s t r a i n s o f m e t h a n o g e n s w e r e i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s a n d c h a r a c t e r i z e d . T h e p r e v a l e n t m e t h a n o g e n s i n t h e R - g r a n u l e s w e r e i d e n t i fi e d a s M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n s T I N a n d R F , a n d M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 . A s p o r e - f o r m i n g , s y n t r o p h i c p r o p i o n a t e d e g r a d e r s t r a i n P T a n d s u l f a t e - r e d u c i n g , p r o p i o n a t e d e g r a d e r , s t r a i n P W ( w h i c h c a n a l s o d e g r a d e p r 0 p i o n a t e s y n t r o p h i c a l l y ) w e r e i s o l a t e d a s t h e p r e v a l e n t p r o p i o n a t e d e g r a d e r s i n t h e g r a n u l e s . B o t h s t r a i n s a r e 3 1 7 d i f f e r e n t f r o m o t h e r p r o p i o n a t e d e g r a d e r s i s o l a t e d t o d a t e . B u t y r a t e d e g r a d i n g s t r a i n B H w a s i s o l a t e d a n d p r i m a r i l y i d e n t i fi e d t o b e S y n t r o p h o s p o r a b r y a n t i i s p . , a s p r e v a l e n t s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d e r . A r o d - s h a p e d , s y n t r o p h i c i s o b u t y r a t e - b u t y r a t e d e g r a d e r , s t r a i n I B , w a s a l s o i s o l a t e d a s a n o t h e r p r e v a l e n t b u t y r a t e d e g r a d e r i n t h e g r a n u l e s . 1 0 . T h e c o m b i n a t i o n o f a l l i s o l a t e d s t r a i n s c a n c o m p l e t e l y m i n e r a l i z e a l l V F A s f r o m r e a c t o r f e e d ( a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e ) a n d m e t a b o l i c i n t e r m e d i a t e s ( i s o b u t y r a t e , 2 - m e t h y l b u t y r a t e a n d v a l e r a t e ) f o r m e d i n t h e r e a c t o r s . 1 1 . S y n t r o p h i c p r o p i o n a t e d e g r a d a t i o n i n t h e R — g r a n u l e s w a s p e r f o r m e d b y s t r a i n s P T a n d P W t o g e t h e r w i t h H , u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s . S y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d a t i o n w a s c a r r i e d o u t b y s t r a i n s B H a n d I B . 1 2 . R e v e r s i b l e i s o m e r i z a t i o n b e t w e e n b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e o c c u r r e d d u r i n g s y n t r o p h i c b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y t h e R - , F - a n d b r e w e r y g r a n u l e s . I n R - g r a n u l e s , t h i s r e a c t i o n w a s p e r f o r m e d b y s y n t r o p h i c i s o b u t y r a t e - b u t y r a t e d e g r a d i n g s t r a i n I B . T h e r e v e r s i b l e i s o m e r i z a t i o n w a s c o u p l e d w i t h s y n t r o p h i c b u t y r a t e o x i d a t i o n . T h e m o s t t h e r m o d y n a m i c a l l y f a v o r a b l e c o n d i t i o n f o r t h e s y n t r o p h i c d e g r a d a t i o n o f b u t y r a t e o r i s o b u t y r a t e i n c o n j u n c t i o n w i t h t h e i s o m e r i z a t i o n w a s a t a n e q u a l c o n c e n t r a t i o n s o f i s o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e . 1 3 . V a l e r a t e a n d 2 - m e t h y l b u t y r a t e w e r e p r o d u c e d d u r i n g s y n t r o p h i c b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y R - , F - , a n d b r e w e r y g r a n u l e s w h e n p r o p i o n a t e w a s p r e s e n t . I n t h e R - g r a n u l e s , s t r a i n B H s y n t h e s i z e d v a l e r a t e f r o m p r o p i o n a t e o n l y d u r i n g s y n t m p h i c b u t y r a t e d e g r a d a t i o n . I s o b u t y r a t e - d e g r a d i n g s t r a i n 1 B w a s r e s p o n s i b l e f o r t h e s y n t h e s i s o f 2 - m e t h y l b u t y r a t e . T h e m e t a b o l i c p a t h w a y f o r s y n t r o p h i c v a l e r a t e d e g r a d a t i o n b y s t r a i n s I B a n d B H a p p e a r e d t o f o l l o w B - o x i d a t i o n w h i l e t h e p a t h w a y i n v o l v e d i n t h e d e g r a d a t i o n o f 2 - m e t h y l b u t y r a t e a p p e a r e d t o b e m o r e c o m p l i c a t e d . 3 1 8 1 4 . H y d r o g e n a n d f o r m a t e a c c u m u l a t e d a t a n e q u i l i b r i u m l e v e l d u r i n g s y n t r o p h i c e t h a n o l d e g r a d a t i o n b y t h e b r e w e r y g r a n u l e s . E n e r g e t i c a n a l y s i s s u g g e s t s b o t h a r e i n t e r m e d i a t e s o f e t h a n o l d e g r a d a t i o n . 1 5 . S y n t o p h i c d e g r a d a t i o n o f i s o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e b y t h e t r i c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t r a i n I B , M b . f o r m i c i c u m s t r a i n T I N a n d M e t h a n o s a r c i n a m a z e i T 1 8 w a s c o m p l e t e l y i n h i b i t e d i n t h e p r e s e n c e o f a h i g h h y d r o g e n p a r t i a l p r e s s u r e ( > 2 0 0 0 P a ) o r a m e a s u r a b l e l e v e l o f f o r m a t e ( > 1 0 t o 2 0 0 1 1 M ) . S i g n i fi c a n t l e v e l o f f o r m a t e ( m o r e t h a n 1 m M ) w a s d e t e c t e d d u r i n g t h e p e r t u r b a t i o n w i t h h y d r o g e n ( 1 7 t o 4 0 k P a ) . B o t h h y d r o g e n a n d f o r m a t e w e r e l i k e l y e l e c t r o n c a r r i e r s i n t h e s y n t o p h i c d e g r a d a t i o n . 1 6 . A r e v e r s i b l e r e a c t i o n b e t w e e n h y d r o g e n p r o d u c t i o n f r o m f o r m a t e a n d f o r m a t e s y n t h e s i s f r o m H , p l u s H C O , ’ w a s o b s e r v e d t o o c c u r d u r i n g m e t h a n o g e n e s i s b y t h e R - g r a n u l e s a n d b r e w e r y g r a n u l e s . T h i s r e a c t i o n w a s o b s e r v e d d u r i n g t h e g r o w t h o f H , - C O , a n d f o r m a t e u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s i n c l u d i n g M b . f o r m i c i c u m s p e c i e s ( s t a i n s M F , T I N a n d R F ) a n d M e t h a n o s p i r i l l u m h u n g a t e i s t a i n B D . F o r m a t e s y n t h e s i s w a s a l s o p e r f o r m e d b y M s . m a z e i s t a i n T 1 8 . U n l i k e o t h e r s t a i n s , t h i s s t a i n w a s n o t a b l e t o c a t a b o l i z e f o r m a t e t o m e t h a n e . 1 7 . M b . f o r m i c i c u m s p e c i e s a c t i v e l y f o r m e d c e l l a g g r e g a t e s a n d e x t a c e l l u l a r p o l y m e r s , t h a t a p p e a r e d t o p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n g r a n u l e f o r m a t i o n . G r a n u l e - l i k e a g g r e g a t e s w e r e f o r m e d i n a c o n t i n u o u s l y - f e e d i n g , l a b o r a t o r y u p fl o w r e a c t o r u s i n g M b . f o r m i c i c u m s t a i n T I N a s i n o c u l u m a n d f o r m i c a c i d a s s u b s t a t e . 1 8 . M e t h a n o t h r i x s t a i n M 7 a l s o h a d c l u m p - f o r m i n g c h a r a c t e r i s t i c s . T h e p r e s e n c e o f e x t a c e l l u l a r p o l y m e r s , w h i c h a p p a r e n t l y c o n n e c t e d o t h e r c e l l s t o f o r c o m p l i c a t e d n e t w o r k , w a s i d e n t i fi e d u s i n g a c a t i o n i z e d f e r r i t i n s t a i n i n g m e t h o d . T h e c e l l s u r f a c e o f M b . f o r m i c i c u m s p e c i e s a n d M e t h a n o t h r i x s t a i n M 7 w e r e m o r e h y d r o p h o b i c w h i l e M s p . h u n g a t e i s t a i n B D h a d a h y d r o p h i l i c s u r f a c e . I n s y n t o p h i c 3 1 9 a s s o c i a t i o n , c l u m p s o r a g g r e g a t e s w e r e f o r m e d i n a c o c u l t u r e c o n s i s t i n g o f s t a i n B H p l u s M b . f o r m i c i c u m s t a i n T I N a n d a t r i c u l t u r e c o n s i s t i n g o f p r o p i o n a t e d e g r a d i n g s t a i n P T , M b . f o r m i c i c u m s t a i n T I N a n d M e t h a n o t h r i x s t a i n M 7 . 1 9 . A n a e r o b i c g r a n u l e s a c t i v e l y d e g r a d i n g f a t t y a c i d s w e r e d e v e l o p e d w h e n M b . f o r m i c i c u m s t a i n T I N , M e t h a n o t h r i x s t a i n M 7 , M s . m a z e i s t a i n T 1 8 , b u t y r a t e - d e g r a d i n g s t a i n B H a n d p r o p i o n a t e - d e g r a d i n g s t a i n P T w e r e u s e d a s i n o c u l u m . C H A P T E R 9 R E C O M M E N D A T I O N F O R F U T U R E R E S E A R C H 1 . F u r t h e r r e s e a r c h i s n e e d e d t o e v a l u a t e t h e f a c t o r s i n fl u e n c i n g s t a b i l i t y o f g r a n u l e s , i n c l u d i n g t h e c o m p o s i t i o n o f p o l y m e r s o f g r a n u l e s , f a c t o r s e f f e c t i n g s t a b i l i t y o f p o l y m e r s , a n d f a c t o r s e n h a n c i n g a n d i n h i b i t i n g p o l y m e r p r o d u c t i o n . 2 . T h e f a c t o r s e n h a n c i n g g r a n u l a t i o n a r e t o b e f u r t h e r c h a r a c t e r i z e d . T h e y c a n b e e i t h e r a d d i t i o n o f m i c r o b i a l a g g r e g a t e s a s b i o - n u c l e i ; o r a d d i t i o n o f i n o r g a n i c a n d o r g a n i c p a r t i c l e s a s n u c l e i . I t i s a d v i s a b l e t o d e v e l o p a f a s t - s c r e e n i n g t e c h n i q u e s t o a s s a y s u i t a b i l i t y o f n o n - g r a n u l a r i n o c u l u m . 3 . D e v e l o p m e n t o f g r a n u l e s w i t h s p e c i fi c b i o d e g r a d a t i o n c a p a b i l i t y i s n e e d e d t o i n v e s t i g a t e . T h e s e g r a n u l e s c a n d e g r a d e t o x i c c o m p o u n d s s u c h a s a r o m a t i c c o m p o u n d s , c h l o r i n a t e d c o m p o u n d s . 4 . I n t h i s s t u d y , M e t h a n o t h r i x , a n d M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m h a v e b e e n d e m o n s t a t e d a s i m p o r t a n t s p e c i e s f o r g r a n u l a t i o n . T h e r o l e o f o t h e r m e t h a n o g e n s s u c h a s M e t h a n o b r e v o b a c t e r , w h i c h w a s s u g g e s t e d t o b e a i m p o r t a n t s p e c i e s f o r g r a n u l a t i o n , i s n e e d e d t o e x a m i n e . H y d r o l y t i c b a c t e r i a , w h i c h a r e p r e v a l e n t s p e c i e s i n t h e g r a n u l e s d e v e l o p e d o n c o m p l e x w a s t e w a t e r s , a n d s u l f a t e - r e d u c i n g b a c t e r i a , w h i c h f o r m e d s y n t o p h i c m i c r o c o l o n i e s w i t h m e t h a n o g e n s ( s e e C h a p t e r 4 ) , a r e a l s o n e e d e d t o b e e v a l u a t e t h e i r r o l e i n g r a n u l e f o r m a t i o n . 3 2 0 3 2 1 5 . S o m e i s o l a t e s i n t h i s s t u d y n e e d t o b e c h a r a c t e r i z e d f u r t h e r . M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 ( h a s a s o m e w h a t d i f f e r e n t m o r p h o l o g y f r o m M e t h a n o t h r i x s o e h n g e n i i . R e c e n t D N A - D N A h y b r i d i z a t i o n d a t a s h o w e d l e s s - r e l a t e d n e s s b e t w e e n t h e s e t w o b a c t e r i a . I f s t a i n M 7 i s a n e w s p e c i e s , i t n e e d s t o b e c l a s s i fi e d u s i n g o t h e r m e t h o d s ( s u c h a s c o m p a r i s o n o f s e q u e n c e 1 6 S r R N A ) . T h e t a x o n o m y o f s y n t o p h i c a c e t o g e n s t a i n s B H , I B a n d P T , a n d s u l f a t e - r e d u c i n g b a c t e r i a s t a i n n e e d s t o b e d e t e r m i n e d . A P P E N D I C E S A P P E N D I X A M A T E R I A L S , G E N E R A L A N A L Y T I C M E T H O D S A N D M E D I A 1 . C h e m i c a l s , g a s e s a n d m a t e r i a l s A l l c h e m i c a l s u s e d i n t h i s s t u d y e x c e p t f o r C h a p t e r 2 w e r e o f a n a l y t i c a l g r a d e a n d w e r e o b t a i n e d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o . ( S t . L o u i s , M O ) o r M a l l i n c k r o d t , I n c . ( P a r i s , K Y ) e x c e p t b u t y r i c a c i d ( E a s t m a n K o d a k C o . , R o c h e s t e r , N Y ) , a n d y e a s t e x t a c t a n d p u r i fi e d a g a r ( D i f c o C o . , D e t o i t , M I ) . N i t r o g e n , h y d r o g e n , C O , g a s e s a n d m i x t u r e s o f N , - C O , ( 9 5 : 5 ) , N , - C O , ( 7 0 : 3 0 ) a n d H , - C O , ( 8 0 : 2 0 ) w e r e o b t a i n e d f r o m U n i o n C a r b i d e C o r p . , L i n d e D i v i s i o n ( W a r r e n , M I ) . B e f o r e u s e , a l l g a s e s w e r e p a s s e d o v e r c o p p e r fi l i n g s h e a t e d t o 3 7 0 ° C t o r e m o v e t a c e s o f 0 , . P r e s s u r e t u b e s ( 2 7 m L i n v o l u m e , B e l l c o G l a s s , I n c . , V i n e l a n d , N J ) a n d s e r u m b o t t l e s ( 5 8 m L o r 1 5 8 m L i n v o l u m e , W h e a t o n S c i e n t i fi c , M i l l v i l l e , N J ) w i t h b u t y l r u b b e r s t o p p e r s ( A m e r i c a n S c i e n t i fi c P r o d u c t s , M c G a w P a r k , I L ) w e r e u s e d f o r g r o w t h o f a n a e r o b i c b a c t e r i a o r b a t c h e x p e r i m e n t s . 2 . A n a l y t i c a l m e t h o d s i ) M e t h a n e a n d C O , M e t h a n e w a s a n a l y z e d w i t h a H e w l e t t - P a c k a r d m o d e l 5 8 9 0 A g a s c h r o m a t o g r a p h 3 2 2 3 2 3 ( G C ) e q u i p p e d w i t h a fl a m e i o n i z a t i o n d e t e c t o r ( F I D ) u s i n g a c h r o m o s o r b 1 0 1 c o l u m n a n d N , a s a c a r r i e r g a s ( 1 0 m L / m i n ) . T h e c o l u m n t e m p e r a t u r e u s e d w a s 6 0 ° C . T h e t e m p e r a t u r e s o f i n j e c t o r a n d d e t e c t o r w e r e 1 0 0 a n d 2 5 0 ° C , r e s p e c t i v e l y . H y d r o g e n w a s a n a l y z e d w i t h t h e s a m e m o d e l G C e q u i p p e d w i t h a t h e r m a l c o n d u c t i v i t y d e t e c t o r ( T C D ) a n d a c a r b o s p h e r e c o l u m n ( A n a l a b s - F o x b o r o , N o r t h H a v e n , C T ) w i t h N , ( 1 0 m L / m i n ) a s a c a r r i e r g a s . T h e t e m p e r a t u r e s o f c o l u m n , i n j e c t o r a n d d e t e c t o r w e r e 6 0 , 1 0 0 , a n d 1 0 0 ° C , r e s p e c t i v e l y . C O , w a s m e a s u r e d u s i n g a S e r i e s 5 8 0 T C D G C ( G O W - M A C I n s t u m e n t C o . , B r i d g e w a t e r , N J ) w i t h a T C D a n d C a b o s p h e r e S S c o l u m n w i t h H e a s a c a r r i e r g a s ( 5 0 m L / m i n ) a n d a c o l u m n t e m p e r a t u r e o f 1 0 0 ° C . T h e t e m p e r a t u r e s o f i n j e c t o r a n d d e t e c t o r w e r e 1 0 0 a n d 1 5 0 ° C , r e s p e c t i v e l y . T h e d e t e c t o r c u r r e n t w a s 1 5 0 m A . G a s s a m p l e s w e r e w i t h d r a w n f r o m t h e g a s s a m p l i n g p o r t s o n u p fl o w a n a e r o b i c r e a c t o r s o r t h e h e a d s p a c e o f p r e s s u r e t u b e s o r s e r u m b o t t l e s w i t h 1 m L g l a s s s y r i n g e s ( C o n t a i n e r C o r p . , S i o u x C i t y , I W ) e q u i p p e d w i t h a g a s t i g h t M I N I N E R T s y r i n g e v a l v e s ( A l l t e c h A s s o c i a t e s , I n c . , D e e r fi e l d , I L ) a n d 2 5 g a u g e n e e d l e s . A n i n j e c t i o n v o l u m e o f 0 . 4 m L w a s u s e d f o r a l l c a s e s . i i ) V o l a t i l e f a t t y a c i d s F a t t y a c i d s ( a c e t a t e , p r o p i o n a t e , b u t y r a t e , i s o b u t y r a t e , 2 - m e t h y l b u t y r a t e , v a l e r a t e ) w e r e d e t e r m i n e d w i t h a H e w l e t t - P a c k a r d m o d e l 5 8 9 0 A G C e q u i p p e d w i t h a F I D a n d C h r o m o s o r b 1 0 1 c o l u m n ( 1 8 0 ° C ) a n d N , a s a c a r r i e r g a s ( 2 0 m L / m i n ) . T h e t e m p e r a t u r e s o f i n j e c t o r a n d d e t e c t o r w e r e 2 0 0 a n d 2 5 0 ° C , r e s p e c t i v e l y . M e t h a n o l a n d e t h a n o l w e r e a l s o a n a l y z e d b y t h i s G C w i t h a F I D u s i n g a c o l u m n t e m p e r a t u r e o f 1 5 0 a n d 1 7 0 ° C , r e s p e c t i v e l y . L i q u i d s a m p l e s w e r e w i t h d r a w n f r o m s a m p l i n g p o r t s o n t h e r e a c t o r o r t h e p r e s s u r e t u b e s w i t h 1 m L s t e r i l i z e d s y r i n g e w i t h 2 3 g a u g e n e e d l e . S a m p l e s w e r e c e n t r i f u g e d a t 2 , 5 0 0 x g f o r 5 n r i n w i t h a n E p p e n d o r f 5 4 1 5 3 2 4 c e n t r i f u g e ( B r i n k m a n n I n s t u m e n t s I n c . , W e s t u r y , N Y ) , a n d t h e s u p e r n a t a n t w a s a c i d i fi e d u s i n g 1 0 N H , , P O 4 ( 1 0 : 1 , v o l . s a m p l e / v o l . a c i d ) . T h e i n j e c t i o n a m o u n t o f s a m p l e s w a s 3 1 1 L f o r m o s t e x p e r i m e n t s b u t u p t o 6 1 1 L w a s i n j u c t e d f o r t h e K m d e t e r m i n a t i o n i n A p p e n d i x C . T h e d e t e c t l i m i t s o f d i f f e r e n t V F A s r a n g e d f r o m 0 . 0 0 2 t o 0 . 0 2 m M , d e p e n d i n g u p o n t h e i n j e c t i o n a m o u n t a n d t h e s e n s i t i v i t y o f G C u s e d . i i i ) F o r m a t e , g l u c o s e a n d p r o t e i n F o r m a t e w a s d e t e r m i n e d b y a n e n z y m a t i c m e t h o d w i t h f o r m a t e d e h y d r o g e n a s e b y t h e m e t h o d o f H o p n e r a n d K n a p p e r ( 1 9 7 4 ) . T h e s e n s i t i v i t y o f t h i s a n a l y s i s w a s 5 1 1 M . S a m p l e s w e r e w i t h d r a w n f r o m a n a e r o b i c s e r u m b o t t l e s o r p r e s s u r e t u b e s a n d c e n t r i f u g e d a t 2 , 5 0 0 x g f o r 3 m i n i n a n E p p e n d o r f 5 4 1 4 c e n t r i f u g e . T h e s u p e r n a t a n t w a s i m m e d i a t e l y t a n s f e r r e d i n t o a - 2 0 ° C f r e e z e r . P r i o r t o d e t e r m i n a t i o n , t h e s a m p l e s w e r e t h a w e d a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d c e n t r i f u g e d a g a i n . T h e s u p e r n a t a n t w a s s t o r e d i n a n i c e b o x p r i o r t o u s e . T h e s a m p l e s w e r e d i l u t e d t o o b t a i n a f o r m a t e c o n c e n t a t i o n o f a p p r o x i m a t e l y 0 . 5 t o 1 . 5 m M i f n e c e s s a r y . G l u c o s e w a s d e t e r m i n e d u s i n g a Y S I g l u c o s e a n a l y z e r e q u i p p e d w i t h a n e n z y m e e l e c t o d e s e n s o r ( Y S I m o d e l 2 7 , Y e l l o w S p r i n g s I n s t u m e n t s C o . , Y e l l o w S p r i n g s , O H ) . T h e p r e - t e a t n e n t o f s a m p l e s w e r e t h e s a m e a s t h a t f o r f o r m a t e d e t e r m i n a t i o n . T o d e t e r m i n e t h e p r o t e i n c o n t e n t o f g r a n u l e s , s a m p l e s w e r e t a n s f e r r e d i n t o a B C ] s o l u t i o n ( 0 . 0 5 N ) a n d s u b s e q u e n t l y d i s p e r s e d b y r e p e a t e d l y p a s s i n g t h e g r a n u l e s t h r o u g h a g l a s s s y r i n g e ( 1 0 m L ) a n d a 2 3 g a u g e n e e d l e . P r o t e i n i n t h e s a m p l e s w a s d e t e r m i n e d b y t h e L o w r y m e t h o d ( H a r t e e , 1 9 7 2 ) w i t h b o v i n e s e r u m a l b u m i n a s s t a n d a r d . i v ) S u s p e n d e d s o l i d s , v o l a t i l e s u s p e n d e d s o l i d s , a n d s p e c i f i c g r a v i t y S u s p e n d e d s o l i d s ( S S ) w e r e d e t e r m i n e d b y c e n t r i f u g a t i o n ( V e s i l i n d , 1 9 7 4 ) o r fi l t r a t i o n ( A P H A e t a l . , 1 9 8 5 ) . V o l a t i l e s u s p e n d e d s o l i d s ( V S S ) a n d s p e c i fi c g r a v i t y 3 2 5 o f g r a n u l e s w e r e d e t e r m i n e d a c c o r d i n g t o S t a n d a r d M e t h o d s ( A P H A e t a l . , 1 9 8 5 ) . v ) A n i o n c o n c e n t r a t i o n d e t e r m i n a t i o n C o n c e n t a t i o n o f a n i o n s ( s o l u b l e s u l f a t e , p h o s p h a t e , c h l o r i d e a n d n i t a t e ) w e r e d e t e r m i n e d u s i n g a D i o n e x 4 0 0 1 i I o n - C h r o m a t o g r a p h y M o d u l e / S P ( D i o n e x C o r p . , I t a s c a , I L ) w i t h a D i o n e x c o n d u c t i v i t y d e t e c t o r a n d I o n p a c A 5 4 A c o l u m n . T h e d e t e r m i n a t i o n r e q u i r e d t h a t t h e c o n c e n t a t i o n o f t h e a n i o n s w a s l o w e r t h a n 1 5 t o 2 0 m g / L i n o r d e r t o o b t a i n a l i n e a r r e s p o n s e . T h e s u s p e n d e d s o l i d s i n s a m p l e s w e r e r e m o v e d u s i n g c e n t r i f u g a t i o n p r i o r t o t h e d e t e r m i n a t i o n . T h e s a m p l e s w e r e d i l u t e d w i t h d o u b l e d i s t i l l e d w a t e r a s n e c e s s a r y , d e p e n d i n g o n t h e c o n c e n t a t i o n o f a n i o n t o b e m e a s u r e d . v i ) I n s o l u b l e c a r b o n a t e c o n t e n t T h e i n s o l u b l e c a r b o n a t e c o n t e n t i n g r a n u l e s w a s d e t e r m i n e d u s i n g a 1 m L s a m p l e c e n t r i f u g e d f o r 5 m i n i n a n E p p e n d o r f 5 4 1 5 c e n t r i f u g e a t 2 , 5 0 0 x g . T h e p e l l e t w a s r e - s u s p e n d e d i n d i s t i l l e d w a t e r a n d t h e c e n t r i f u g a t i o n r e p e a t e d . T h e p e l l e t w a s t h e n w e i g h e d a n d d i v i d e d i n t o t w o p o r t i o n s . O n e h a l f w a s u s e d f o r d r y w e i g h t ( o r S S ) d e t e r m i n a t i o n a n d t h e r e m a i n d e r w a s t a n s f e r r e d i n t o a 1 5 8 m L s e r u m b o t t l e . T h e b o t t l e w a s s e a l e d w i t h a b u t y l s t O p p e r a n d t h e C O , b a c k g r o u n d c o n c e n t a t i o n w a s d e t e r m i n e d b y G C . H C l ( 6 . 5 N , 5 m L ) w a s t h e n i n j e c t e d i n t o t h e b o t t l e , a n d t h e s a m p l e w a s v i g o r o u s l y a g i t a t e d f o r 3 0 m i n . T h e c a r b o n a t e c o n t e n t i n t h e s a m p l e w a s c a l c u l a t e d u s i n g t h e i n c r e a s e i n C O , p a r t i a l p r e s s u r e , a n d t h e c a l c u l a t e d d i s s o l v e d C O , i n t h e l i q u i d . v i i ) O p t i c a l d e n s i t y T h e o p t i c a l d e n s i t y o r l i g h t a b s o r b a n c e o f b a c t e r i a l c u l t u r e s a n d r e a c t o r e f fl u e n t w e r e d e t e r m i n e d u s i n g a s p e c t o p h o t o m e t e r m o d e l S I M A D Z U U V - 1 6 0 ( S i m a d z u C o r p . , K y o t o , J a p a n ) a t 4 0 0 o r 6 6 0 n m . 3 2 6 3 . P r e p a r a t i o n o f m e d i a a n d s t o c k s o l u t i o n s i ) B a s a l m e d i u m ( B S ) B a s a l ( B S ) m e d i u m w a s u s e d f o r g r o w i n g m e t h a n o g e n s a n d s y n t o p h i c a c e t o g e n s . I t w a s m o d i fi e d f r o m t h e p h o s p h a t e b u f f e r e d b a s a l ( P B B ) m e d i u m ( K e n e a l y a n d Z e i k u s , 1 9 8 1 ) . T h e f o l l o w i n g c o m p o n e n t s w e r e a d d e d i n t o o n e l i t e r d o u b l e d i s t i l l e d w a t e r : N a C l , 0 . 9 g ; M g C l - 6 H , O , 0 . 2 g ; C a C l , - 2 H , O , 0 . 1 g ; N H 4 C l , 1 . 0 g ; t a c e m i n e r a l s o l u t i o n ( f o r B S ) , 1 0 m L ; a n d r e s a z u r i n s o l u t i o n ( 0 . 2 % ) , 1 . 0 m L . p H w a s a d j u s t e d t o 7 . 2 t o 7 . 4 u s i n g N a O H s o l u t i o n ( I N ) . T h i s m e d i u m w a s b o i l e d u n d e r a n o x y g e n - f r e e n i t o g e n a t m o s p h e r e f o r 2 0 m i n a n d t h e n , w h e n i t b e c a m e c o o l , w a s d i s p e n s e d i n t o p r e s s u r e t u b e s o r s e r u m b o t t l e s u n d e r t h e n i t r o g e n a t m o s p h e r e . T h e t u b e s o r b o t t l e s w e r e s e a l e d w i t h b u t y l r u b b e r s t o p p e r s a n d a l u m i n u m c r a m p s a n d t h e n a u t o c l a v e d u n d e r 1 2 1 ° C f o r 3 0 m i n . i i ) B a s a l m e d i u m f o r s u l f a t e - r e d u c i n g b a c t e r i a ( 8 8 8 ) T h e m e d i u m f o r g r o w t h o f s u l f a t e - r e d u c i n g b a c t e r i a w a s m o d i fi e d f r o m t h e m e d i u m u s e d f o r t h e g r o w t h o f D e s u l f o b u l b u s p r o p i o n i c u s ( W i d d e l a n d P f e n n i g , 1 9 8 4 ) . T h e f o l l o w i n g c h e m i c a l s w e r e a d d e d t o o n e l i t e r d o u b l e d i s t i l l e d w a t e r : N 3 , 8 0 4 , 3 . 0 g ; K H , P O 4 , 0 . 2 g ; N I L C I , 0 . 3 g ; N a C l , 1 . 0 g ; M g C l , - 6 H , O , 0 . 4 g ; K C l , 0 . 5 g ; C a C l , - 2 H , O , 0 . 1 5 g ; N a H C O , , 5 g ; a n d r e s a z u r i n s o l u t i o n ( 0 . 2 % ) , 1 . 0 m L . T h e m e d i u m w a s p r e p a r e d b y a d d i n g a l l a b o v e c h e m i c a l s e x c e p t f o r N a H C O , , b o i l e d u n d e r t h e o x y g e n - f r e e n i t o g e n a t m o s p h e r e f o r 2 0 m i n a n d t h e n w a s a l l o w e d t o c o o l u n d e r a n N , - C O , g a s m i x t u r e ( 7 0 : 3 0 ) a t m o s p h e r e . S u b s e q u e n t l y , N a H C O 3 ( 5 g ) w a s a d d e d i n t o t h e c o o l e d m e d i u m a n d c o m p l e t e l y d i s s o l v e d . T h e m e d i u m w a s d i s p e n s e d t o s e r u m b o t t l e s o r p r e s s u r e t u b e s u n d e r t h e N , - C O , a t m o s p h e r e a n d t h e n a u t o c l a v e d a t 1 2 1 ° C f o r 3 0 m i n . 3 2 7 S u l f a t e - f r e e B S S m e d i u m w a s a l s o p r e p a r e d f o r t h e g r o w t h o f m e t h a n o g e n s a n d s y n t o p h i c a c e t o g e n s a n d f o r o t h e r s p e c i a l t e s t s . I n t h i s c a s e , N a , S O , w a s n o t a d d e d . i i i ) T r a c e m i n e r a l s o l u t i o n s ( 1 ) T r a c e m i n e r a l s o l u t i o n f o r t h e B S m e d i u m T h i s m i n e r a l s o l u t i o n w a s u s e d i n t h e B S m e d i u m f o r t h e g r o w t h o f m e t h a n o g e n a n d s y n t o p h i c a c e t o g e n s , p r e p a r e d a s d e s c r i b e d b y K e n l e a l y a n d Z e i k u s ( 1 9 8 1 ) . I t c o n t a i n s ( p e r o n e l i t e r d o u b l e d i s t i l l e d w a t e r ) : N i t i l o t r i a c e t i c a c i d ( N T A ) , 1 2 . 8 g ; F e S O 4 - 7 H , O , 0 . 1 0 g ; M n C l , - 4 H , O , 0 . 1 0 g ; C o C l , - 6 H , O , 0 . 1 7 g ; C a C l , . 2 H , O , 0 . 1 0 g ; Z n C l , , 0 . 1 0 g ; C u C I , - 2 H , O , 0 . 0 2 g ; H , B O , , 0 . 0 1 g ; N a , M o O 4 , 0 . 0 1 g ; N a C l , 1 . 0 0 g ; N a , S e O , , 0 . 0 1 7 g ; a n d N i S O , - 6 H , O , 0 . 2 6 g . I n i t i a l l y , N T A w a s a d d e d t o 2 ( 1 ) m L o f d o u b l e d i s t i l l e d w a t e r , a n d t h e p H w a s t h e n a d j u s t e d t o 6 . 5 u s i n g a n K O H s o l u t i o n ( 5 N ) u n t i l a l l c r y s t a l s o f N T A w e r e c o m p l e t e l y d i s s o l v e d . S u b s e q u e n t l y , a b o u t 6 0 0 m L o f t h e w a t e r w a s a d d e d t o a b o v e s o l u t i o n . E a c h c o m p o u n d w a s t h e n d i s s o l v e d i n t h e s o l u t i o n i n t h e s e q u e n c e l i s t e d . F i n a l l y , t h e w a t e r w a s a d d e d t o t h e s o l u t i o n t o a t t a i n a n o n e l i t e r v o l u m e . T h e t a c e m i n e r a l s o l u t i o n w a s a d d e d t o t h e b a s a l m e d i u m p r i o r t o a u t o c l a v i n g . ( 2 ) T r a c e m i n e r a l s o l u t i o n f o r B S S m e d i u m T h i s m i n e r a l s o l u t i o n w a s u s e d i n t h e B S S m e d i u m a n d s u l f a t e - f r e e B S S m e d i u m . I t w a s m o d i fi e d f r o m t h e t a c o m i n e r a l s o l u t i o n u s e d f o r D e s u l f o b u l b u s s p . ( W i d d e l a n d P f e n n i g , 1 9 8 4 ) . I t c o n t a i n s ( p e r 1 0 0 0 m L d o u b l e d i s t i l l e d w a t e r ) : H C l ( 1 2 N ) , 6 . 4 m L ; F e C 1 , - 4 H , O , 1 . 5 g ; e r C l , , 0 . 0 7 g ; M n C l , - 4 H , O , 0 . 1 g ; H 3 B O , , 0 . 0 6 g ; C o C l , - 6 H , O , 0 . 1 9 g ; C u C l , - 2 H , O , 0 . 0 0 2 g ; N i C l , - 6 H , O , 0 . 0 2 4 g ; a n d N a , M o O , , - 2 H , O , 0 . 3 6 g . F i r s t , F e C l , - 4 H , O w a s d i s s o l v e d i n t h e H C l , a n d t h e n t h i s s o l u t i o n w a s m i x e d w i t h 9 9 0 m L o f t h e w a t e r . S u b s e q u e n t l y , t h e o t h e r s a l t s w e r e d i s s o l v e d t o t h e s o l u t i o n . p H w a s a d j u s t e d t o 6 . 0 w i t h N a O H s o l u t i o n ( 1 N ) . F i n a l l y , t h e s o l u t i o n 3 2 8 v o l u m e w a s m a d e u p t o 1 0 0 0 m L . T h e t r a c e m i n e r a l s o l u t i o n w a s d i s p e n s e d t o s e v e r a l s e r u m b o t t l e s ( 1 5 8 m L ) , a n d t h e s e b o t t l e s w e r e t h e n s e a l e d w i t h b u t y l r u b b e r s t o p p e r s a n d a l u m i n u m c r a m p s . E a c h b o t t l e c o n t a i n e d 5 0 m L o f t h e s o l u t i o n . T h e s e b o t t l e s w e r e r e p e a t e d l y fl u s h e d w i t h o x y g e n - f r e e n i t r o g e n a n d s u b s e q u e n t l y d r a w n w i t h v a c u u m f o r 3 0 m i n , a n d t h e n a u t o c l a v e d a t 1 2 1 ° C f o r 2 5 m i n . T h e t a c e m i n e r a l s o l u t i o n ( f o r B S S ) w a s a d d e d t o t h e B S S m e d i u m b e f o r e i n o c u l a t i o n . i v ) V i t a m i n s o l u t i o n T h e v i t a m i n s o l u t i o n u s e d w a s t h a t o f W o l i n e r a l . ( 1 9 6 3 ) . I t c o n t a i n s ( p e r 1 0 0 0 m L d o u b l e d i s t i l l e d w a t e r ) : b i o t i n , 2 m g ; f o l i c a c i d 2 m g ; p y r i d o x i n e — H C I ( B e ) , 1 0 m g ; t h i a m i n e - H C I ( B 1 ) , 5 m g ; r i b o fl a v i n ( B , ) , 5 m g ; n i c o t i n i c a c i d , 5 m g ; p a n t o t h e n i c a c i d , 5 m g ; c y a n o c o b a l a m i n ( B 1 , ) , 0 . 1 m g ; a n d P - a m i n o b e n z o i c a c i d ( P A B A ) , 5 m g . T h e a b o v e c o m p o u n d s w e r e a d d e d i n t h e s e q u e n c e l i s t e d t o e n s u r e c o m p l e t e d i s s o l u t i o n . T h e s o l u t i o n w a s t h e n fi l t e r s t e r i l i z e d ( v i a 0 . 2 5 M fi l t e r ) a n d s t o r e d i n s e r u m b o t t l e s , w h i c h h a d b e e n v a c u u m fl u s h e d w i t h o x y g e n - f r e e n i t o g e n g a s a n d t h e n a u t o c l a v e d . v ) S t o c k s o l u t i o n s ( I ) 2 . 5 % N a , S o 9 H , O s t o c k s o l u t i o n w a s p r e p a r e d u n d e r a n o x y g e n - f r e e N , a t m o s p h e r e . D o u b l e d i s t i l l e d w a t e r w a s b o i l e d f o r 1 5 r r r i n i n a fl a s k u n d e r a n N , g a s a t m o s p h e r e a n d t h e n c o o l e d f o r 5 m i n . A p o r t i o n o f t h i s w a t e r w a s r e m o v e d a n d s e t a s i d e u n d e r a n N , g a s a t m o s p h e r e . C r y s t a l s o f N a , S - 9 H , O ( 2 5 g ) w e r e t a n s f e r r e d i n t o t h e fl a s k ( c o n t a i n i n g n e a r 1 0 0 0 m L w a t e r ) a n d d i s s o l v e d b y s t i r r i n g . W h e n t h e s o l u t i o n w a s c o o l e d t o r o o m t e m p e r a t u r e ( 2 5 o C ) , c o n c e n t a t e d H C l ( 1 2 N ) w a s a d d e d t o a d j u s t p H t o 9 . 5 u n d e r t h e N , a t m o s p h e r e . T h e s o l u t i o n w a s t h e n b r o u g h t t o a v o l u m e o f 1 0 0 0 m L w i t h t h e w a t e r s e t a s i d e , d i s p e n s e d i n t o s e r u m b o t t l e s , a n d a u t o c l a v e d a t 1 2 1 ° C f o r 2 5 m i n . 3 2 9 ( 2 ) T h e f o l l o w i n g s t o c k s o l u t i o n s w e r e p r e p a r e d b y d i r e c t l y d i s s o l v i n g s o l i d c h e m i c a l s i n d o u b l e d i s t i l l e d w a t e r , r e p e a t e d l y v a c u u m - fl u s h i n g w i t h t h e o x y g e n - f r e e n i t o g e n g a s f o r 3 0 m i n , a n d a u t o c l a v i n g u n d e r 1 2 1 ° C f o r 2 5 m i n , w h i c h i n c l u d i n g : - 1 0 % s o d i u m b i c a r b o n a t e ( 1 0 g N a H C O 3 i n 1 0 0 m L w a t e r ) ; - - 2 . 7 6 M p h o s p h a t e s o l u t i o n ( 1 5 g K H , P O 4 a n d 2 9 g K , H P O , , i n 1 0 0 m L w a t e r ) ; - - 1 M N a , S O 4 s o l u t i o n ; - - 4 M s o d i u m f o r m a t e , 1 M s o d i u m a c e t a t e , 4 M s o d i u m a c e t a t e , 1 M s o d i u m p r o p i o n a t e , a n d 1 M s o d i u m b u t y r a t e s o l u t i o n s . ( 3 ) T h e f o l l o w i n g s t o c k s o l u t i o n s w e r e p r e p a r e d b y a d d i n g t h e r e s p e c t i v e q u a n t i t y o f s o l v e n t s i n 5 0 m L o f d o u b l e d i s t i l l e d w a t e r ( n e u t r a l i z i n g w i t h 1 0 N N a O H s o l u t i o n , i f i t w a s a f a t t y a c i d e x c e p t f o r f o r m i c a c i d ) , a n d t h e n b r i n g i n g t o t h e v o l u m e o f 1 0 0 m L . T h e s o l u t i o n s w e r e t h e n d i s p e n s e d i n t o s e r u m b o t t l e s , r e p e a t e d l y v a c u u m - fl u s h e d w i t h N , , a n d t h e n a u t o c l a v e d , w h i c h i n c l u d i n g : - - 1 M i s o b u t y r a t e , 1 M v a l e r a t e , 1 M 2 - m e t h y l b u t y r a t e , 0 . 5 M c a p r o a t e , 0 . 5 M 4 - m e t h y l v a l e r a t e , 0 . 2 5 M h e p t a n o a t e , 0 . 2 5 M 2 - m e t h y l h e x a n o a t e , 0 . 1 M c a p r y l a t e , a n d 0 . 1 M p e l a r g o a t e s o l u t i o n s ; - 5 0 % f o r m i c a c i d , 2 0 % m e t h a n o l , 1 M e t h a n o l , 1 M p r o p a n o l , l M i s o p r o p a n o l , 1 M b u t a n o l , a n d 1 M i s o b u t a n o l s o l u t i o n s . ( 4 ) T h e f o l l o w i n g s t o c k s o l u t i o n s w e r e p r e p a r e d u s i n g fi l t e r s t e r i l i z a t i o n a s t h e p r o c e d u r e s f o r p r e p a r a t i o n o f v i t a m i n s o l u t i o n : - - 0 . 5 M F e S O , s o l u t i o n ; - 1 M s o d i u m p y r u v a t e s o l u t i o n ; - 1 0 0 g / L g l u c o s e a n d 1 0 0 g / L l a c t o s e s o l u t i o n s ; - - 1 M u r e a s o l u t i o n ; 3 3 0 - - I M c y s t e i n e - H C I s o l u t i o n . 4 . M e d i a f o r g r o w t h a n d m a i n t e n a n c e o f d i f f e r e n t m i c r o b i a l s p e c i e s i ) M e t h a n o g e n s ( 1 ) M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t a i n s T I N , R F a n d M P T h e B S m e d i u m ( 5 0 m L ) i n 1 5 8 m L s e r u m b o t t l e s w a s s u p p l e m e n t e d w i t h f o l l o w i n g s o l u t i o n s : v i t a m i n , 0 . 5 m L ; 1 0 % b i c a r b o n a t e , 0 . 5 m L ; 2 . 7 6 M p h o s p h a t e , 0 . 2 5 m L ; 1 M s o d i u m a c e t a t e ; 0 . 2 m L ; a n d 2 . 5 % N a , S - 9 H , O , 0 . 5 m L . T h e b o t t l e s w e r e t h e n p r e s s u r i z e d w i t h a n H , - C O , ( 8 0 : 2 0 ) g a s m i x t u r e t o 1 . 5 a t m . I n o c u l u m o f 1 t o 2 % ( v o l / v o l ) w a s t h e n a d d e d u s i n g s t e r i l e s y r i n g e s . ( 2 ) M e t h a n o s p i r i l l u m h u n g a t e i s t a i n B D T h e B S m e d i u m ( 5 0 m L ) i n 1 5 8 m L s e r u m b o t t l e s w a s s u p p l e m e n t e d w i t h f o l l o w i n g s o l u t i o n s : v i t a m i n , 0 . 5 m L ; 1 0 % b i c a r b o n a t e , 2 . 0 m L ; 2 . 7 6 M p h o s p h a t e , 0 . 1 0 m L ; 1 M s o d i u m a c e t a t e ; 0 . 2 m L ; a n d 2 . 5 % N a , S ~ 9 H , O , 0 . 5 m L . T h e b o t t l e s w e r e t h e n p r e s s u r i z e d w i t h a n H , - C O , ( 8 0 : 2 0 ) g a s m i x t u r e t o 1 . 5 a t m . I n o c u l u m a t 2 t o 4 % ( v o l / v o l ) w a s t h e n a d d e d . ( 3 ) M e t h a n o s a r c i n a m a z e i s t a i n T 1 8 T h e B S m e d i u m ( 5 0 m L ) i n 1 5 8 m L s e r u m b o t t l e s w a s s u p p l e m e n t e d w i t h f o l l o w i n g s o l u t i o n s : v i t a m i n , 0 . 5 m L ; 1 0 % b i c a r b o n a t e , 1 . 0 m L ; 2 . 7 6 M p h o s p h a t e , 0 . 1 m L ; 4 M s o d i u m a c e t a t e ; 0 . 2 5 m L ; a n d 2 . 5 % , N a , S - 9 H , O , 0 . 4 m L . T h e b o t t l e s w e r e t h e n p r e s s u r i z e d w i t h H , - C O , ( 8 0 : 2 0 ) g a s m i x t u r e t o 1 . 0 a t m . T h e s e t t l e d a g g r e g a t e s ( 0 . 1 t o 0 . 2 m L ) w e r e u s e d a s i n o c u l u m . ( 4 ) M e t h a n o t h r i x s t a i n M 7 T h e B S m e d i u m ( 5 0 m L ) i n 1 5 8 m L s e r u m b o t t l e s w a s s u p p l e m e n t e d w i t h f o l l o w i n g s o l u t i o n s : v i t a m i n , 0 . 5 m L ; 1 0 % b i c a r b o n a t e , 2 . 5 m L ; 2 . 7 6 M p h o s p h a t e , 0 . 2 3 3 1 m L ; 4 M s o d i u m a c e t a t e ; 0 . 2 m L ; a n d 2 . 5 % N a , S - 9 1 1 , 0 , 0 . 2 m L . T h e b o t t l e s w e r e t h e n p r e s s u r i z e d w i t h N , - C O , ( 7 0 : 3 0 ) g a s m i x t u r e t o 1 . 0 a t m . I n o c u l u m o f 5 t o 1 0 % ( v o l / v o l ) w a s t h e n a d d e d . i i ) S y n t r o p h i c a c e t o g e n s ( I ) C o c u l t u r e o f s t a i n P T p l u s M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t r a i n T I N T h e B S m e d i u m ( 5 0 m L ) i n 1 5 8 m L s e r u m b o t t l e s w a s s u p p l e m e n t e d w i t h f o l l o w i n g s o l u t i o n s : v i t a m i n , 0 . 5 m L ; 1 0 % b i c a r b o n a t e , 2 . 0 m L ; 2 . 7 6 M p h o s p h a t e , 0 . 2 5 m L ; 1 M s o d i u m p r o p i o n a t e ; 0 . 7 5 m L ; a n d 2 . 5 % N a , S - 9 1 1 , 0 , 0 . 5 m L . T h e b o t t l e s w e r e t h e n p r e s s u r i z e d w i t h N , - C O , ( 7 0 : 3 0 ) g a s m i x t u r e t o 1 . 0 a t m . I n o c u l u m o f 1 0 - 2 0 % ( v o l / v o l ) w a s t h e a d d e d . ( 2 ) C o c u l t u r e o f s t a i n P W p l u s M e t h a n o s p i r i l l u m h u n g a t e i s t a i n B D ( o r M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m R F ) T h e s u l f a t e - f r e e B S S m e d i u m ( 5 0 m L ) i n 1 5 8 m L s e r u m b o t t l e s w a s s u p p l e m e n t e d w i t h f o l l o w i n g s o l u t i o n s : v i t a m i n , 0 . 5 m L ; 1 M s o d i u m p r o p i o n a t e ; 0 . 7 5 m L ; 0 . 5 M N a , S O 4 , 0 . 0 2 m L ; t a c e m i n e r a l s o l u t i o n ( f o r B S S ) , 0 . 2 m L ; a n d 2 . 5 % N a , S - 9 1 1 , 0 , 0 . 5 m L . T h e b o t t l e s w e r e t h e n p r e s s u r i z e d w i t h N , g a s m i x t u r e t o 1 . 0 a t m . I n o c u l u m o f 5 t o 1 0 % ( v o l / v o l ) w a s t h e n a d d e d . ( 3 ) M o n o c u l t u r e o f s t r a i n P W T h e B S S m e d i u m ( 5 0 m L ) i n 1 5 8 m L s e r u m b o t t l e s w a s s u p p l e m e n t e d w i t h f o l l o w i n g s o l u t i o n s : v i t a m i n , 0 . 5 m L ; 1 M s o d i u m p r o p i o n a t e ; 0 . 7 5 m L ; t r a c e m i n e r a l s o l u t i o n ( f o r B S S ) , 0 . 2 m L ; a n d 2 . 5 % N a , S - 9 H , O , 0 . 5 m L . T h e b o t t l e s w e r e t h e n p r e s s u r i z e d w i t h N , g a s m i x t u r e t o 1 . 0 a t m . I n o c u l u m o f 5 t o 1 0 % ( v o l / v o l ) w a s t h e n a d d e d . ( 4 ) C o c u l t u r e o f s t a i n B H a n d M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t a i n T I N T h e B S m e d i u m ( 5 0 m L ) i n 1 5 8 m L s e r u m b o t t l e s w a s s u p p l e m e n t e d w i t h 3 3 2 f o l l o w i n g s o l u t i o n s : v i t a m i n , 0 . 5 m L ; 1 0 % b i c a r b o n a t e , 2 . 0 m L ; 2 . 7 6 M p h o s p h a t e , 0 . 2 5 m L ; 1 M s o d i u m b u t y r a t e ; 0 . 5 m L ; a n d 2 . 5 % N a , S ~ 9 H , O , 0 . 5 m L . T h e b o t t l e s w e r e t h e n p r e s s u r i z e d w i t h N , - C O , ( 7 0 : 3 0 ) g a s m i x t u r e t o 1 . 0 a t n . I n o c u l u m o f 5 t o 1 0 % ( v o l / v o l ) w a s t h e n a d d e d . ( 5 ) T r i c u l t u r e s t a i n I B , M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m s t a i n T I N a n d M e t h a n o s a r c i n a m a z e i s t a i n T 1 8 T h e B S m e d i u m ( 5 0 m L ) i n 1 5 8 m L s e r u m b o t t l e s w a s s u p p l e m e n t e d w i t h f o l l o w i n g s o l u t i o n s : v i t a m i n , 0 . 5 m L ; 1 0 % b i c a r b o n a t e , 2 . 0 m L ; 2 . 7 6 M p h o s p h a t e , 0 . 2 m L ; 1 M s o d i u m i s o b u t y r a t e ; 0 . 5 m L ; a n d 2 . 5 % N a , S - 9 H , O , 0 . 4 m L . T h e b o t t l e s w e r e t h e n p r e s s u r i z e d w i t h a n N , - C O , ( 7 0 : 3 0 ) g a s m i x t u r e t o 1 . 0 a t m . I n o c u l u m o f 5 t o 1 0 % ( v o l / v o l ) w a s a d d e d . 5 . M e d i a f o r s u b s t r a t e c o n v e r s i o n t e s t s T h e s e m e d i a w e r e u s e d i n s u b s t a t e c o n v e r s i o n o r d e g r a d a t i o n t e s t s b y a n a e r o b i c g r a n u l e s p e r f o r m e d i n C h a p t e r 3 , 4 , 5 a n d 6 . I n V F A ( a c e t a t e , p r o p i o n a t e , a n d b u t y r a t e ) a n d f o r m a t e c o n v e r s i o n t e s t s , t h e B S m e d i u m ( 5 0 m L ) i n 1 5 8 m L s e r u m b o t t l e s w a s s u p p l e m e n t e d w i t h f o l l o w i n g s t o c k s o l u t i o n s : 1 0 % b i c a r b o n a t e , 2 . 5 m L ; 2 . 7 6 M p h o s p h a t e , 0 . 2 m L ; 2 . 5 % N a , S - 9 1 1 , 0 , 0 . 2 m L ; a n d r e s p e c t i v e s u b s t a t e s t o c k s o l u t i o n . T h e b o t t l e s w e r e t h e n p r e s s u r i z e d w i t h 1 a t m N , — C O , ( 7 0 : 3 0 ) g a s m i x t u r e . W h e n H , - C O , ( 8 0 : 2 0 ) g a s m i x t u r e w a s u s e d a s s u b s t a t e ( 1 . 0 a t m ) , a d d i t i o n o f b i c a r b o n a t e ( 1 0 % ) w a s 3 . 0 m L . S u l f a t e w a s s u p p l i e d , w h e n r e q u i r e d f o r t e s t s u l f a t e r e d u c t i o n , b y a d d i t i o n o f F e S O 4 s t o c k s o l u t i o n ( 0 . 5 M ) . A P P E N D I X B D E T E R M I N A T I O N O F M A X I M U M S U B S T R A T E C O N V E R S I O N R A T E S A N D S P E C I F I C G R O W T H R A T E S I N R E A C T O R S 1 . T h e m a x i m u m s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s T h e m a x i m u m s u b s t a t e c o n v e r s i o n r a t e s b y t h e R - a n d F - g r a n u l e s w e r e d e t e r m i n e d i n l a b o r a t o r y - s c a l e u p fl o w r e a c t o r s w h i c h a r e d e s c r i b e d i n C h a p t e r 3 ( F i g u r e 3 . 1 ) , b a s e d o n s u b s t a t e c o n s u m p t i o n w i t h t h e e x c e p t i o n o f f o r m a t e . P r i o r t o a d d i t i o n o f t h e s u b s t a t e p u l s e , a l l b a c t e r i a l fl o c s a n d fi n e p a r t i c l e s a c c u m u l a t e d i n t h e t o p s e t t l e r s w e r e c o m p l e t e l y r e m o v e d u s i n g s y r i n g e s . T h e f e e d w a s s t o p p e d f o r h a l f a n h o u r , b u t n o t t h e r e c y c l e , i n o r d e r t o a l l o w t h e b a c t e r i a t o c o n s u m e m o s t o f t h e s u b s t a t e s . T h e m a x i m u m s u b s t a t e c o n v e r s i o n r a t e s w e r e d e t e r m i n e d u s i n g p u l s e f e e d o f r e s p e c t i v e s t o c k s o l u t i o n s . T h e f o l l o w i n g s t o c k s o l u t i o n s w e r e u s e d : s o d i u m f o r m a t e , 4 M ; f o r m i c a c i d , 5 0 % ( v o l / v o l ) ; s o d i u m a c e t a t e , 4 M ; s o d i u m p r o p i o n a t e , 1 M ; s o d i u m b u t y r a t e , 1 M ; s o d i u m i s o b u t y r a t e , 1 M ; s o d i u m v a l e r a t e , 1 M ; m e t h a n o l , 2 0 % ( v o l / v o l ) ; e t h a n o l , 1 M ; a n d g l u c o s e , 1 0 0 g / L . T h e y w e r e p r e p a r e d a n a e r o b i c a l l y a s d e s c r i b e d i n A p p e n d i x 1 . T h e s t o c k s o l u t i o n s ( e x c e p t f o r f o r m a t e a n d f o r m i c a c i d ) w e r e s l o w l y i n j e c t e d i n t o t h e t o p s e t t l e r t h r o u g h a s y r i n g e a n d w e r e m i x e d b y s h a k i n g t h e s e t t l e r g e n t l y a n d 3 3 3 3 3 4 i n c r e a s i n g t h e r e c y c l e r a t e f r o m a b o u t 3 0 m L / m i n t o 6 0 m L / m i n . T h e i n j e c t i o n v o l u m e o f t h e r e s p e c t i v e s u b s t a t e s w a s c a l c u l a t e d t o a t t a i n c o n c e n t a t i o n s o f 4 0 m M m e t h a n o l , 2 0 m M e t h a n o l , 1 5 m M a c e t a t e , 1 0 m M p r o p i o n a t e , 1 0 m M b u t y r a t e , 1 0 m M i s o b u t y r a t e , 1 0 m M v a l e r a t e , a n d 2 . 0 g / L g l u c o s e w i t h i n t h e r e a c t o r s , r e s p e c t i v e l y . A p p r o x i m a t e l y 1 0 m i n u t e s a f t e r t h e i n j e c t i o n , l i q u i d s a m p l e s w e r e w i t h d r a w n t h r o u g h a s a m p l i n g p o r t o n t h e r e a c t o r e v e r y 1 0 t o 1 5 m i n u t e s f o r a n a l y s i s t o o b t a i n t h e t i m e - d e p e n d e n t s u b s t a t e c o n c e n t a t i o n c h a n g e a n d t h e m a x i m u m s u b s t a t e c o n v e r s i o n r a t e s p e r r e a c t o r ( m m o l / h r ) . T h e m a x i m u m v o l u m e t r i c c o n v e r s i o n r a t e s ( m o l / L g r a n u l e s - d a y ) a n d t h e m a x i m u m s p e c i fi c c o n v e r s i o n r a t e s ( m m o l / g V S S - d ) w e r e t h e n c a l c u l a t e d b a s e d o n t h e g r a n u l e v o l u m e ( l i t e r ) i n t h e r e a c t o r s a n d t h e g r a n u l e b e d d e n s i t y ( g V S S / L g r a n u l e s ) . i ) A c e t a t e , p r o p i o n a t e , i s o b u t y r a t e , v a l e r a t e , m e t h a n o l , e t h a n o l a n d g l u c o s e T h e e q u a t i o n f o r t h e c a l c u l a t i o n o f s u b s t r a t e c o n v e r s i o n r a t e s o f a c e t a t e , p r o p i o n a t e , v a l e r a t e , m e t h a n o l , e t h a n o l , a n d g l u c o s e i s d e s c r i b e d a s f o l l o w s : d S / d t = ( S u - S a ) ° V n / ( 1 0 0 0 ( t 2 - t r ) ) ( B - l ) w h e r e , d S / d t i s s u b s t a t e c o n v e r s i o n r a t e p e r r e a c t o r ( m m o l / h I ’ ) ; S n a n d 8 , , a r e s u b s t a t e c o n c e n t a t i o n ( m M ) i n s i d e r e a c t o r a t t i m e t 1 a n d t , , r e s p e c t i v e l y ; V R i s t h e l i q u i d b u l k v o l u m e o f t h e t o t a l r e a c t o r s y s t e m ( m L ) . I n i t i a l l y , t h e v a l u e f o r V R w a s c a l i b r a t e d b y i n j e c t i n g a c e r t a i n a m o u n t ( V P , 1 m L w a s u s e d ) o f s o d i u m p r o p i o n a t e s o l u t i o n ( I M ) t o t h e r e a c t o r s u s i n g e q u a t i o n ( B - 1 ) a n d f o l l o w i n g e q u a t i o n : V R = ( 1 0 0 0 V P / 1 0 0 0 - T - d S P / d t ) / S T ( B - 2 ) w h e r e , V 1 ) i s t h e v o l u m e o f p r o p i o n a t e s o l u t i o n ( m L ) ; S T i s t h e p r o p i o n a t e c o n c e n t a t i o n a f t e r T h r ( 1 / 6 h r i . e . 1 0 r r r i n w a s u s e d ) o f i n j e c t i o n ; d S P / d t i s t h e m a x i m u m p r o p i o n a t e c o n v e r s i o n r a t e ( m m o l / h r ) . T h e v a l u e f o r V R w a s c a l c u l a t e d b y a s s u m i n g t h a t a n i n i t i a l 3 3 5 v a l u e o f V R e q u a l s t h e t o t a l r e a c t o r v o l u m e ( 2 6 5 m L ) m i n u s t h e g r a n u l e b e d v o l u m e . B y i t e r a t i v e l y e s t i m a t i n g t h e i n i t i a l d S P / d t f r o m e q u a t i o n ( B - l ) , a n d t h e n c a l c u l a t i n g t h e v a l u e o f V R f r o m e q u a t i o n ( B - 2 ) u n t i l t h e d e v i a t i o n b e t w e e n t w o V R v a l u e s w a s l e s s t h a n 0 . 5 % , t h e c a l c u l a t e d v a l u e s f o r V 1 , w e r e a p p r o x i m a t e l y 2 2 5 a n d 2 3 5 m L f o r r e a c t o r s R a n d F i n C h a p t e r 3 , r e s p e c t i v e l y . A s s o o n a s t h e v a l u e f o r V R w a s o b t a i n e d , i t w a s u s e d f o r t h e c a l c u l a t i o n o f t h e o t h e r s u b s t a t e c o n v e r s i o n r a t e s . i i ) B u t y r a t e F o r b u t y r a t e c o n v e r s i o n , t h e t o t a l c o n v e r s i o n r a t e , t h e c o n v e r s i o n r a t e o f b u t y r a t e t o a c e t a t e , a n d c o n v e r s i o n r a t e o f b u t y r a t e t o i s o b u t y r a t e w e r e d e t e r m i n e d s i m u l t a n e o u s l y , b e c a u s e i s o m e r i z a t i o n b e t w e e n b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e o c c u r r e d d u r i n g t h e p u l s e f e e d t e s t s ( s e e C h a p t e r 6 ) : I s o b u t y r a t e - B u t y r a t e ' - — ) 2 A c e t a t e ‘ + 0 . 5 C H , T h e t o t a l m a x i m u m b u t y r a t e c o n v e r s i o n r a t e s w e r e c a l c u l a t e d u s i n g e q u a t i o n ( B - I ) , t h e c o n v e r s i o n r a t e o f b u t y r a t e t o i s o b u t y r a t e w a s ( d S / d t h b = ( S m - S i m ) ° V a / ( 1 0 0 0 ( t 2 - t r ) ) ( B - 3 ) w h e r e , ( d S / d t ) , . , i s c o n v e r s i o n r a t e f o r b u t y r a t e t o i s o b u t y r a t e ( m m o l / h r ) ; S “ , l a n d S m a r e i s o b u t y r a t e c o n c e n t a t i o n ( m M ) i n s i d e r e a c t o r a t t i m e t 1 a n d t , , r e s p e c t i v e l y . T h e r a t e o f c o n v e r s i o n o f b u t y r a t e t o a c e t a t e w a s c a l c u l a t e d a s f o l l o w s , ( d S / d t ) , = ( S m + S a m - S s a - S m ) : V R / ( 1 0 0 0 ° ( t z - t r » ( B - 4 ) w h e r e , ( d S / d t ) , i s c o n v e r s i o n r a t e f o r b u t y r a t e t o a c e t a t e ( m m o l / h r ) ; S , “ a n d S h e a r e b u t y r a t e c o n c e n t a t i o n ( m M ) i n s i d e r e a c t o r a t t i m e t 1 a n d t , , r e s p e c t i v e l y . i i i ) F o r m a t e T h e c o n v e r s i o n r a t e s o f f o r m a t e w e r e d e t e r m i n e d b a s e d o n f o r m a t i o n o f p r o d u c t s ( m e t h a n e a n d h y d r o g e n ) . I n i t i a l l y , a f o r m a t e s t o c k s o l u t i o n ( 4 M , p H 7 ) w a s 3 3 6 i n j e c t e d i n t o t h e s e t t l e r o f t h e r e a c t o r t o a t t a i n a c o n c e n t a t i o n o f c a . 3 0 m M f o r m a t e w i t h i n t h e r e a c t o r s y s t e m . A f t e r 1 0 m i n u t e s , a c e r t a i n a m o u n t o f 5 0 % a n a e r o b i c f o r m i c a c i d s o l u t i o n ( p H 2 ) w a s s l o w l y i n j e c t e d i n t o t h e r e a c t o r e v e r y t w o m i n t o k e e p t h e p H i n s i d e t h e r e a c t o r b e t w e e n 6 . 9 a n d 7 . 1 . M e t h a n e a n d h y d r o g e n c o n t e n t i n t h e b i o g a s w e r e a n a l d e e v e r y 3 m i n a n d g a s p r o d u c t i o n w a s m e a s u r e d b y a l i q u i d d i s p l a c e m e n t m e t h o d ( 3 5 ° C ) . D u r i n g t h e p u l s e f e e d t e s t o f f o r m a t e , m e t h a n e a n d h y d r o g e n w e r e p r o d u c e d s i n c e t h e g r a n u l e s p e r f o r m e d t h e f o l l o w i n g r e a c t i o n s ( s e e C h a p t e r 6 ) : 4 H C O O H + H , O + H ” - > C I L + 3 H C O , ‘ a n d H C O O H + H , O — - ) H , + H C O , ‘ + H + I n t h e s h o r t - t e r m t e s t , t h e f o r m a t e u s e d f o r g r o w t h w a s i g n o r e d . T h e t o t a l c o n v e r s i o n r a t e , t h e r a t e o f f o r m a t e t o m e t h a n e , a n d t h e r a t e o f f o r m a t e t o h y d r o g e n w e r e c a l c u l a t e d b y u s i n g t h e f o l l o w i n g e q u a t i o n s , d S / d t = d V / d t { ( 4 - f c m + r , , , > - 2 7 3 / [ ( 2 7 3 + 3 5 ) . 2 2 . 4 ] } ( B - 5 ) ( a s h r a m , = d V / d t { 4 - r m - 2 7 3 / [ ( 2 7 3 + 3 5 ) - 2 2 . 4 ] 1 ( B - 6 ) a n d ( d S / d t ) H , = d V / d t - f m - 2 7 3 / [ ( 2 7 3 + 3 5 ) - 2 2 . 4 ] ( r s - 7 ) w h e r e , d S / d t , ( d S / d t ) c m , a n d ( d S / d t ) H , a r e t h e t o t a l c o n v e r s i o n r a t e ( m m o l / h r ) , t h e r a t e o f f o r m a t e t o m e t h a n e , a n d t h e r a t e o f f o r m a t e t o h y d r o g e n , r e s p e c t i v e l y ; d V / d t i s m e a s u r e d b i o g a s p r o d u c t i o n ( m L / h r ) , f a n a n d f H , a r e a v e r a g e m e t h a n e a n d h y d r o g e n f r a c t i o n i n b i o g a s . 2 . S p e c i fi c g r o w t h r a t e s o f d i f f e r e n t t r o p h i c g r o u p s T h e s p e c i fi c g r o w t h r a t e s f o r a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e d e g r a d e r s w e r e d e t e r m i n e d i n r e a c t o r s o p e r a t e d a t 3 5 ° C . D u r i n g t h e d e t e r m i n a t i o n p e r i o d ( 6 t o 7 d a y s w e r e u s e d ) , c o n c e n t a t i o n s o f a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e i n t h e r e a c t o r s w e r e c o n t o l l e d a t r e l a t i v e l y s t e a d y l e v e l s ( s e e T a b l e 3 . 5 i n C h a p t e r 3 ) b y a d j u s t i n g f e e d r a t e 3 3 7 o n a d a i l y b a s i s . A l l t h e b i o m a s s ( i n c l u d i n g g r a n u l e s a n d fl o c s ) w e r e k e p t i n s i d e r e a c t o r s . T h e s p e c i fi c g r o w t h r a t e s o f t h e d i f f e r e n t t o p h i c b a c t e r i a i n t h e r e a c t o r , i n c l u d i n g g r a n u l e s a n d fl o c s , w e r e d e t e r m i n e d b a s e d o n t h e i n c r e a s e i n s u b s t a t e c o n v e r s i o n ( t o m e t h a n e o r a c e t a t e p l u s m e t h a n e ) r a t e s ( m o n a y p e r r e a c t o r ) w h i c h w e r e a s s u m e d a s p r o p o r t i o n a l t o t h e r e s p e c t i v e b i o m a s s . T h e s u b s t a t e c o n v e r s i o n r a t e s o f p r o p i o n a t e , b u t y r a t e a n d a c e t a t e w e r e c a l c u l a t e d u s i n g e q u a t i o n s ( B - 8 ) , ( B - 9 ) a n d ( B - 1 0 ) , r e s p e c t i v e l y a s p / d 1 = ( S W - s p a m ( B - 8 ) d S b / d t = ( S m ' s b f s i u a ' Q ( 3 ' 9 ) a n d d S J d t = ( s m s c m - s n r s x g o + d S P / d t + 2 - d S b / d t ( 1 3 - 1 0 ) w h e r e d S P / d t , d S b / d t , a n d d S P / d t a r e c o n v e r s i o n r a t e s ( m m o l / d p e r r e a c t o r ) o f p r o p i o n a t e , b u t y r a t e a n d a c e t a t e , r e s p e c t i v e l y ; S p i n S h h , S c i , a n d S , i l l w e r e t h e i n fl u e n t c o n c e n t a t i o n s ( m M ) o f p r o p i o n a t e , b u t y r a t e , e t h a n o l , a n d a c e t a t e , r e s p e c t i v e l y ; S p a , S H , S e e , a n d S I I e f w e r e t h e e f fl u e n t c o n c e n t a t i o n s ( m M ) o f p r o p i o n a t e , b u t y r a t e , e t h a n o l a n d a c e t a t e , r e s p e c t i v e l y ; Q i s f e e d r a t e ( L / d ) . I n a b o v e e q u a t i o n s , t h e e f f e c t o f i s o m e r i z a t i o n b e t w e e n b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e o n t h e c o n v e r s i o n r a t e o f b u t y r a t e i s c o n s i d e r e d w h i l e t h e e f f e c t o f f o r m a t i o n o f v a l e r a t e a n d 2 - m e t h y l b u t y r a t e o n t h e c o n v e r s i o n r a t e s f o r p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e w a s i g n o r e d b e c a u s e o f t h e i r l o w c o n c e n t a t i o n s ( < 0 . 0 5 m M ) . F o r t h e a c e t a t e c o n v e r s i o n r a t e , t h e a m o u n t s o f a c e t a t e p r o d u c e d f r o m t h e d e g r a d a t i o n o f p r o p i o n a t e , b u t y r a t e a n d e t h a n o l w e r e t a k e n i n a c c o u n t . T h e s m a l l f r a c t i o n o f f a t t y a c i d c o n v e r s i o n c o n t r i b u t e d b y g l u c o s e ( 2 m M ) i n m e d i u m B w a s i g n o r e d . T h e s p e c i fi c g r o w t h r a t e s w e r e c a l c u l a t e d u s i n g l i n e a r s e m i - l o g a r i t h m i c r e g r e s s i o n s o f t h e c o n v e r s i o n r a t e s v s t i m e ( s e e F i g u r e 3 . 3 ) . A P P E N D I X C D E T E R M I N A T I O N O F A P P A R E N T H A L F V E L O C I T Y C O E F F I C I E N T S ( K _ ) U S I N G T I M E - C O U R S E T E S T S 1 . E q u a t i o n s I n a n a e r o b i c d i g e s t i o n , M o n o d k i n e t i c s a r e w i d e l y u s e d t o m o d e l t h e p r o c e s s o f s u b s t a t e d e g r a d a t i o n , e s p e c i a l l y f o r f a t t y a c i d s ( a c e t a t e , p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e ) . U n d e r n o r m a l c o n c e n t a t i o n r a n g e s o b s e r v e d i n d i g e s t e r s , t h e s e e q u a t i o n s fi t e x p e r i m e n t a l o b s e r v a t i o n s q u i t e w e l l ( L a w e r e n c e a n d M c C a r t y , 1 9 7 0 ; O ’ R o u r k e , 1 9 6 8 ) . T h e M o n o d e q u a t i o n s a r e e x p r e s s e d a s d X / d t = — Y - d S / d t - b X ( C - l ) I l = I l m ' S / ( K . + S ) - b ( C - 2 ) d S / d t = - V m - X - S / ( K , + S ) ( C - 3 ) w h e r e , X = m i c r o o r g a n i s m c o n c e n t a t i o n , g / L S = s u b s t a t e c o n c e n t a t i o n , m M ( o r g / L ) Y = y i e l d c o e f fi c i e n t , g o r g a n i s m / m m o l ( o r g ) s u b s t a t e c o n v e r t e d p = m i c r o o r g a n i s m g r o w t h r a t e , I / d u m = m i c r o o r g a n i s m m a x i m u m g r o w t h r a t e , 1 / d V m = m a x i m u m s p e c i fi c s u b s t a t e c o n v e r s i o n r a t e , 3 3 8 3 3 9 m m o l ( o r g ) s u b s t a t e / g o r g a n i s m - d K , = h a l f - v e l o c i t y c o e f fi c i e n t , m m o l s u b s t a t e / L ( o r g / L ) b = m i c r o o r g a n i s m d e c a y r a t e , I / d W h e n r e a c t i o n o c c u r s o v e r a s h o r t p e r i o d ( c o m p a r e d w i t h t h e d o u b l i n g t i m e o f m i c r o o r g a n i s m s ) , t h e g r o w t h o f t h e o r g a n i s m s c a n b e i g n o r e d . I n t h i s c a s e , e q u a t i o n ( O 3 ) i s e q u i v a l e n t t o t h e M i c h a e l i s - M e n t e n e q u a t i o n : - d S / d t = k - S / ( K . . + S ) ( C - 4 ) w h e r e , k = m a x i m u m s u b s t a t e c o n v e r s i o n r a t e , m m o l / L - d ( o r g / L — d ) K I I = M i c h a e l i s - M e n t e n c o e f fi c i e n t , m m o l / L ( o r g / L ) T h e v a l u e o f K , i n e q u a t i o n ( C - 3 ) c a n , t h e r e f o r e , b e e s t i m a t e d u s i n g t h e v a l u e o f K . . . o b s e r v e d d u r i n g s h o r t t e r m s u b s t a t e c o n v e r s i o n . F o r t h e m i c r o o r g a n i s m s g r o w i n g a s fl o c s ( o r g r a n u l e s ) , t h e v a l u e o f K m d e t e r m i n e d i s i n fl u e n c e d b y s u b s t a t e d i f f u s i o n w i t h i n t h e fl o c s ( N g i a n e t a l . , 1 9 7 7 ; D o l fi n g , 1 9 8 5 ) . U s u a l l y , t h e v a l u e d e t e r m i n e d i s c o n s i d e r e d t o b e a n a p p a r e n t K I I I v a l u e . T h e a p p a r e n t K I n v a l u e c a n b e e s t i m a t e d f r o m a n i n t e g r a t e d s o l u t i o n t o t h e M i c h a e l i s - M e n t e n e q u a t i o n ( H a l w a c h s , 1 9 7 8 ) : W = K J k - ( l l U - l n ( 1 / ( l - U ) ) - l ) + ( S o + K . ) / k ( C - 5 ) w h e r e , U : ( S o - S J / S o , S o i s t h e i n i t i a l s u b s t a t e c o n c e n t a t i o n , S t i s t h e s u b s t a t e c o n c e n t a t i o n a t t i m e t . T h e a d v a n t a g e f o r t h i s m e t h o d i s t h a t o n l y o n e t i m e - c o u r s e e x p e r i m e n t i s r e q u i r e d t o e s t i m a t e t h e k i n e t i c p a r a m e t e r s . T h e a p p a r e n t K I l l c a n a l s o b e d e t e r m i n e d u s i n g a L i n e w e a v e r — B u r k p l o t : I N = K m l k - ( l / S ) + ( 1 / k ) ( 0 6 ) o r S / v = K m l k + ( 1 / k ) ° S ( 0 7 ) w h e r e , v = d S / d t . T h i s t e c h n i q u e r e q u i r e s a s e r i e s o f e x p e r i m e n t s , c o n s i s t i n g o f 3 4 o s e v e r a l i n i t i a l s u b s t a t e c o n c e n t a t i o n s , t o o b t a i n t h e d e g r a d a t i o n r a t e a t d i f f e r e n t s u b s t a t e c o n c e n t a t i o n s . S i m p l y , t h e a v e r a g e r a t e a n d a v e r a g e s u b s t a t e c o n c e n t r a t i o n o b t a i n e d f r o m a s i n g l e t i m e - c o u r s e e x p e r i m e n t c a n i n t o d u c e a r e l a t i v e l y l a r g e e r r o r . 2 . D e t e r m i n a t i o n o f K . v a l u e s o f R - a n d F - g r a n u l e s i ) P r o c e d u r e s T h e a p p a r e n t K I l l v a l u e s o f t h e R - a n d F — g r a n u l e s ( s e e C h a p t e r 3 ) w e r e d e t e r m i n e d f o r a c e t a t e , p r o p i o n a t e , i s o b u t y r a t e , b u t y r a t e a n d v a l e r a t e . D e t e r m i n a t i o n w a s p e r f o r m e d u s i n g s e r u m b o t t l e s ( 1 5 8 m L ) i n a 3 5 ° C s h a k i n g w a t e r b a t h ( 1 2 5 s t r i k e s / m i n ) . T h e B S m e d i u m ( 5 0 m L ) u s e d w a s b u f f e r e d w i t h 9 0 m M N a H C O 3 a n d p r e s s u r i z e d w i t h 0 . 4 a t n C O , g a s , r e s u l t i n g i n a p H o f 6 . 8 . S o d i u m s u l fi d e ( 0 . 3 5 m M ) w a s u s e d a s a r e d u c t a n t . P r i o r t o t h e s e t e s t s , g r a n u l e s ( a p p r o x i m a t e l y 1 m L ) w e r e w i t h d r a w n a n a e r o b i c a l l y f r o m o p e r a t i o n a l r e a c t o r s u s i n g a g l a s s s y r i n g e ( 1 m L ) e q u i p p e d w i t h a n 1 8 g a u g e n e e d l e a n d t a n s f e r r e d i n t o a s e r u m b o t t l e c o n t a i n i n g t h e r e d u c e d m e d i u m w h i c h h a d b e e n w a r m e d i n t h e 3 5 ° C w a t e r b a t h . T o r e d u c e t h e m a s s t a n s f e r e f f e c t s , t h e g r a n u l e s w e r e f u r t h e r d i s p e r s e d b y r e p e a t e d l y p a s s i n g t h e g r a n u l e s t h r o u g h a g l a s s s y r i n g e ( 1 m L ) w i t h a 2 5 g a u g e n e e d l e a n d r e - i n j e c t i n g i n t o t h e b o t t l e . A f t e r a d d i n g t h e r e s p e c t i v e s u b s t a t e s ( 2 m M ) , t h e b o t t l e s w e r e i n c u b a t e d a t 3 5 ° C f o r 2 h o u r s f o r a c t i v a t i o n o f t h e r e s p e c t i v e t o p h i c g r o u p . S u b s e q u e n t l y , l i q u i d s a m p l e s w e r e w i t h d r a w n f r o m e v e r y 1 t o 0 . 1 h o u r s f o r d e t e r m i n a t i o n o f s u b s t a t e c o n v e r s i o n t i l l t h e s u b s t a t e w a s c o n s u m e d . F i n a l l y , t h e d i s r u p t e d g r a n u l e s r e t a i n e d i n t h e v i a l s w e r e c e n t r i f u g e d a t 4 0 0 0 r p m u s i n g a S o r v a l l R C S C c e n t r i f u g e w i t h S S 3 4 r o t o r ( D u P o n t C o . , N e w t o w n , C T ) f o r 5 m i n . T h e p e l l e t w a s u s e d f o r s u s p e n d e d s o l i d s ( S S ) d e t e r m i n a t i o n . I n t h i s a s s a y , t h e p l o t f o r t h e i n t e g r a t e d s o l u t i o n t o M i c h a e l i s - M e n t e n e q u a t i o n 3 4 1 ( C - 5 ) w a s u s e d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f K _ f o r a c e t a t e , p r o p i o n a t e , i s o b u t y r a t e a n d v a l e r a t e . D u r i n g s y n t o p h i c b u t y r a t e d e g r a d a t i o n , t h e c o n c e n t a t i o n o f i s o b u t y r a t e f o r m e d w a s s i g n i fi c a n t s i n c e t h e r e v e r s i b l e i s o m e r i z a t i o n b e t w e e n i s o b u t y r a t e a n d b u t y r a t e o c c u r r e d ( s e e C h a p t e r 3 a n d C h a p t e r 6 ) . I t , t h e r e f o r e , w a s i m p o s s i b l e t o u s e t h e p l o t f o r t h e i n t e g r a t e d s o l u t i o n . T h e K I l l f o r b u t y r a t e w a s d e t e r m i n e d u s i n g t h e L i n e w e a v e r - B u r k p l o t ( C - 7 ) . T h e c o n v e r s i o n r a t e ( d S , , / d t ) w a s c a l c u l a t e d f o l l o w s : d S J d t = ( S . , , - S , , , + S , , , l — S , b , ) / ( t , - t , ) ( C - 8 ) w h e r e , S , , , , S , , , , S , . , l a n d 3 1 1 . 2 a r e b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e c o n c e n t a t i o n a t t i m e t 1 a n d t , , r e s p e c t i v e l y . i i ) R e s u l t s a n d d i s c u s s i o n T h e r e s u l t s o f t h e K m d e t e r m i n a t i o n f o r t h e b o t h R - a n d F — g r a n u l e s a r e p r e s e n t e d i n T a b l e C . 1 . F i g u r e C I t o C . 1 0 d e s c r i b e t h e t i m e - c o u r s e o f r e s p e c t i v e s u b s t a t e d e g r a d a t i o n a n d t h e p l o t s u s i n g t h e i n t e g r a t e d s o l u t i o n ( e q u a t i o n C - 5 ) o r m o d i fi e d L i n e w e a v e r — B u r k e x p r e s s i o n . T h e l o w e r s t a n d a r d d e v i a t i o n ( < 4 % ) a m o n g t h e d e t e r m i n e d K , v a l u e s w e r e o b s e r v e d f o r a c e t a t e d e g r a d a t i o n w h i l e h i g h e r s t a n d a r d d e v i a t i o n ( 2 2 t o 3 7 % ) w a s o b s e r v e d f o r i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n . I n g e n e r a l , t h e s t a n d a r d d e v i a t i o n f o r t h e s e a s s a y s w a s c a . 2 . 3 t o 3 7 % u s i n g t h e i n t e g r a t e d s o l u t i o n ( C - 5 ) , a n d c a . 3 . 1 t o 9 . 3 % u s i n g t h e L i n e w e a v e r - B u r k p l o t . A s s a y s w e r e c o m p l e t e d w i t h i n 6 h r s f o r a c e t a t e d e g r a d a t i o n ( F i g u r e s C l a n d C . 2 ) , 1 3 h o u r s f o r p r o p i o n a t e d e g r a d a t i o n ( F i g u r e C 3 a n d C 4 ) , a n d 5 h o u r s f o r b u t y r a t e ( F i g u r e s C 5 a n d C 6 ) , i s o b u t y r a t e ( F i g u r e s C 7 a n d C 8 ) a n d v a l e r a t e d e g r a d a t i o n ( F i g u r e s C 9 a n d C . 1 0 ) . C o m p a r e d w i t h t h e d o u b l i n g t i m e o f 3 0 h o u r s t o 7 d a y s f o r a c e t a t e u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s , 5 t o 7 d a y s f o r s y n t o p h i c p r o p i o n a t e d e g r a d e r s , a n d 5 0 t o 7 0 h o u r s f o r s y n t o p h i c b u t y r a t e d e g r a d e r s , g r o w t h o f t h e m i c r o o r g a n i s m s c a n b e c o n s i d e r e d i n s i g n i fi c a n t . I n a l l t h e a s s a y s ( p H 6 . 8 t o 7 . 0 ) , t h e 3 4 2 c o n c e n t a t i o n s o f f a t t y a c i d s w e r e l o w , a n d p o t e n t i a l i n h i b i t i o n d u e t o n o n - i o n i z e d a c i d s w a s e l i m i n a t e d . D u r i n g t h e d e g r a d a t i o n o f p r o p i o n a t e , i s o b u t y r a t e , b u t y r a t e a n d v a l e r a t e , t h e a c e t a t e c o n c e n t a t i o n a n d h y d r o g e n p a r t i a l p r e s s u r e w e r e l o w , r e s u l t i n g i n f a v o r a b l e e n e r g e t i c s f o r d e g r a d a t i o n . D u r i n g t h e a s s a y f o r a c e t a t e d e g r a d a t i o n , t h e i n i t i a l a c e t a t e c o n c e n t a t i o n s w e r e a p p r o x i m a t e l y 6 . 0 t o 7 . 0 m M , t h e d a t a w e r e w e l l fi t t o t h e i n t e g r a t e d s o l u t i o n ( F i g u r e s C I a n d C . 2 ) w i t h g o o d r e p r o d u c i b i l i t y ( T a b l e C D . T h i s i n d i c a t e s t h a t a c e t a t e d e g r a d a t i o n i n t h e g r a n u l e s c a n b e e x p r e s s e d v i a M o n o d o r M i c h a e l i s - M e n t e n e q u a t i o n w i t h i n t h i s c o n c e n t a t i o n r a n g e . T h e d a t a f o r t h e p r o p i o n a t e a s s a y fi t e q u a t i o n ( C - 5 ) a s s h o w n i n F i g u r e s C . 3 a n d C A . H o w e v e r , a s l i g h t l y h i g h e r s t a n d a r d d e v i a t i o n w a s o b s e r v e d i n t h e K , v a l u e s c a l c u l a t e d f o r t h e R - g r a n u l e s . D u r i n g t h e a s s a y f o r b u t y r a t e , s i g n i fi c a n t f o r m a t i o n o f i s o b u t y r a t e w a s o b s e r v e d ( F i g u r e s C S a n d C . 6 ) . T h e i n t e g r a t e d s o l u t i o n ( C - 5 ) c o u l d n o t b e u s e d , t h e r e f o r e , t o d e s c r i b e t h e d e g r a d a t i o n o f b u t y r a t e t o m e t h a n e ( o r [ i - o x i d a t i o n ) . C o n s i d e r i n g t h a t i s o b u t y r a t e w a s d e g r a d e d v i a b u t y r a t e ( s e e C h a p t e r 6 ) , e q u a t i o n ( C - 8 ) w a s u s e d t o c a l c u l a t e t h e r a t e o f b u t y r a t e d e g r a d a t i o n . T h e a v e r a g e c o n c e n t a t i o n b e t w e e n t w o s e q u e n c e d s a m p l e s w a s u s e d f o r p l o t . T h e d a t a o b t a i n e d w e r e fi t t o e q u a t i o n 0 7 a n d g o o d r e g r e s s i o n c o e f fi c i e n t s w e r e o b t a i n e d . W h e n i s o b u t y r a t e w a s d e g r a d e d , a l o w l e v e l o f b u t y r a t e ( < 0 . 0 6 m M ) w a s o b s e r v e d ( F i g u r e s C 7 a n d C 8 ) . C o n s i d e r i n g b u t y r a t e w a s a n i n t e r m e d i a t e o f i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n ( s e e C h a p t e r 6 ) , t h e K I l l w a s d e t e r m i n e d u s i n g t h e i n t e g r a t e d e q u a t i o n . T h e d a t a w a s fi t b y e q u a t i o n ( 0 5 ) , a s s h o w n i n F i g u r e s C 7 a n d C S . A r e l a t i v e h i g h s t a n d a r d d e v i a t i o n w a s o b s e r v e d f r o m t h e c a l c u l a t e d K . . . v a l u e s . T h i s m a y b e d u e t o n e g l e c t i n g t h e i s o m e r i z a t i o n r e a c t i o n . 3 4 3 T h e d e g r a d a t i o n o f v a l e r a t e a p p e a r e d t o fi t e q u a t i o n 0 5 a l t h o u g h d u r i n g t h e a s s a y l o w l e v e l s o f a c e t a t e a n d p r o p i o n a t e a c c u m u l a t e d a s i n t e r m e d i a t e s ( F i g u r e s C 9 a n d C . 1 0 ) . 3 . D e t e r m i n a t i o n o f K . v a l u e o f M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 f o r a c e t a t e i ) P r o c e d u r e s C e l l s o f M e t h a n o t h r i x s t a i n M 7 , i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s ( s e e C h a p t e r 5 ) , w e r e g r o w n o n a c e t a t e a t 3 5 ° C i n s e r u m b o t t l e s c o n t a i n i n g 6 0 m L m e d i u m . A f t e r s u p p l e m e n t i n g t h e b o t t l e s w i t h a c e t a t e 4 t i m e s ( 1 5 m M p e r t i m e ) , t h e a b s o r b e n c y d e n s i t y ( O D ) o f t h e c e l l s u s p e n s i o n i n t h e b o t t l e s r e a c h e d 0 . 1 4 a t 6 6 0 n m . T h e c u l t u r e s w e r e t h a n u s e d f o r t h e K . . . d e t e r m i n a t i o n . T h e a s s a y w a s p e r f o r m e d i n t h e 3 5 ° C s h a k i n g w a t e r b a t h ( 1 2 5 s t r i k e s / m i n ) . L i q u i d s a m p l e s w e r e w i t h d r a w n f r o m t h e b o t t l e s p e r i o d i c a l l y f o r a c e t a t e a n a l y s i s . T h e i n i t i a l c o n c e n t a t i o n o f a c e t a t e w a s a p p r o x i m a t e l y 4 . 0 m M . T h e p H c h a n g e ( f r o m 7 . 0 3 t o 7 . 0 5 ) d u r i n g t h i s a s s a y w a s i n s i g n i fi c a n t . i i ) R e s u l t s a n d d i s c u s s i o n T h e a s s a y l a s t e d 3 8 t o 4 5 h o u r s . T h e d o u b l i n g t i m e o f t e s t e d c u l t u r e s w e r e o b s e r v e d t o b e 7 d a y s , b e i n g m u c h l o n g e r t h a n t h e d o u b l i n g t i m e u n d e r o p t i m u m c o n d i t i o n s ( s e e C h a p t e r 5 ) . T h e e f f e c t o f c e l l g r o w t h w a s , t h e r e f o r e , i g n o r e d . A t y p i c a l a c e t a t e d e g r a d a t i o n c u r v e a n d t h e p l o t f o r t h e i n t e g r a t e d s o l u t i o n i s p r e s e n t e d i n F i g u r e C H . T h e K . . . f o r a c e t a t e d e g r a d a t i o n w a s c a . 0 4 1 1 0 . 0 3 m M . T h i s i s c o n s i s t e n t t o t h e K m v a l u e s o b t a i n e d f r o m t h e R - g r a n u l e s , i n w h i c h M e t h a n o t h r i x s t a i n M 7 w a s p r e d o m i n a n t a c e t a t e - u t i l i z i n g s p e c i e s . 3 4 4 4 . D e t e r m i n a t i o n o f K . v a l u e s o f t h e g r a n u l e s d e v e l o p e d u s i n g d e f i n e d s p e c i e s 1 ) P r o c e d u r e s T h e a p p a r e n t K l l v a l u e s f o r t h e d e g r a d a t i o n o f p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e w e r e d e t e r m i n e d f o r t h e g r a n u l e s d e v e l o p e d u s i n g d e fi n e d s p e c i e s w h i c h w e r e i s o l a t e d f r o m t h e R - g r a n u l e s ( s e e C h a p t e r 7 ) . T h e p r o c e d u r e s w e r e t h e s a m e a s t h o s e f o r t h e R - a n d F - g r a n u l e s . T h e K I l l v a l u e s w e r e c a l c u l a t e d u s i n g t h e p l o t f o r t h e i n t e g r a t e d s o l u t i o n . i i ) R e s u l t s a n d d i s c u s s i o n T h e a s s a y f o r p r o p i o n a t e d e g r a d a t i o n w a s c o m p l e t e d w i t h i n 7 h o u r s . T h e a c e t a t e p r o d u c e d d u r i n g p r o p i o n a t e d e g r a d a t i o n w a s l o w ( < 0 . 0 5 m M ) . T h e d a t a w e r e w e l l fi t t o t h e i n t e g r a t e d s o l u t i o n , a s s h o w n i n F i g u r e C . 1 2 . T h e K , v a l u e d e t e r m i n e d w a s c a . 0 . 0 3 8 m M , b e i n g c l o s e t o t h e v a l u e s o b t a i n e d f r o m t h e R - g r a n u l e s . T h e i s o m e r i z a t i o n o f b u t y r a t e t o i s o b u t y r a t e w a s n o t o b s e r v e d i n t h i s a s s a y s i n c e t h e d e f i n e d S p e c i e s d i d n o t i n c l u d e i s o b u t y r a t e - b u t y r a t e d e g r a d i n g s p e c i e s . T h e K “ l v a l u e f o r b u t y r a t e d e g r a d a t i o n d e t e r m i n e d w a s c a . 0 . 1 8 9 m M ( F i g u r e C B ) . 5 . C o n c l u s i o n 1 ) T h e d a t a o f d e g r a d a t i o n o f a c e t a t e , p r o p i o n a t e , i s o b u t y r a t e , b u t y r a t e a n d v a l e r a t e a t l o w c o n c e n t a t i o n s i n a s h o r t t e r m c a n b e e x p r e s s e d u s i n g M i c h a e l i s - M e n t e n r e l a t i o n . 2 ) T h e a p p a r e n t h a l f v e l o c i t y c o e f fi c i e n t ( K ) f o r a c e t a t e , p r o p i o n a t e , i s o b u t y r a t e a n d v a l e r a t e c a n b e e s t i m a t e d t h e p l o t t i n g d a t a f r o m t i m e - c o u r s e e x p e r i m e n t s u s i n g t h e i n t e g r a t e d s o l u t i o n t o M i c h a e l i s - M e n t e n e q u a t i o n . T h e K I n v a l u e f o r b u t y r a t e d e g r a d a t i o n c a n a l s o e s t i m a t e d u s i n g t h i s m e t h o d i f i s o m e r i z a t i o n b e t w e e n b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e i s n o t p r e s e n t . 3 ) W h e n i s o m e r i z a t i o n o c c u r s , t h e K I I I v a l u e f o r b u t y r a t e d e g r a d a t i o n c a n b e e s t i m a t e d u s i n g L i n e w e a v e r - B u r k p l o t . m d 5 K e g a r 0 6 6 e 0 0 5 t . 0 0 0 0 0 1 1 1 a l u c 7 9 5 l e 1 3 1 v 0 . . A 0 0 0 1 4 4 5 9 8 9 9 . . a c e r e w e t a r e l a v . ) 7 - C ( s e l u 9 6 0 0 d n n a o , e t a i t a u r q e n y 4 2 3 6 7 0 0 t 1 0 3 3 3 9 1 u g 4 4 0 0 4 1 1 b n . . . . . . . 0 0 0 0 0 0 0 o i s s i u , d e e t t a a n l o u i c p l m a o K 1 1 3 p 4 4 r c e 0 0 0 , e r g 0 e 0 0 a 1 1 1 r 3 5 5 e 4 1 1 v . . . A 0 0 0 t e a w t e e c t a f o n o a r y t u b i f t o a d n a o r i g t e a d d a r g - F d n a - R r o f ) M m ( s e u l a v m K t n e s r a e p l p a f u m o - s t l u s e R e - u C l ( a R t I . C e l b a T e e t K a l a u v t q n e m e t t e a a e r g K r e n t n y t a o a i e t p a a i r u h r s p t p y b e u A T e o t o l c r u s a ) ) A P B I V 1 2 ( ( r o f . ) s 5 a r g e d r o f v s n o e m u i S u b s t a t e K . . . R 1 : . K . . . 0 . 4 3 0 0 . 4 2 7 0 . 4 2 0 0 . 0 6 9 0 . 0 3 6 0 . 0 3 7 8 0 . 1 4 3 0 . 1 4 8 0 . 1 6 9 0 . 1 5 6 0 . 1 9 0 0 . 1 2 1 0 . 1 2 1 0 . 1 4 6 0 . 1 3 6 0 . 9 9 6 3 0 . 9 8 4 6 0 . 9 7 9 9 0 . 9 9 5 6 0 . 9 9 1 6 0 . 9 9 1 3 0 . 9 9 1 3 0 . 9 9 6 4 0 . 9 9 9 6 0 . 9 8 8 2 0 . 9 9 4 1 0 . 9 9 5 0 0 . 9 9 7 5 0 . 9 9 7 5 0 . 9 9 9 2 0 0 4 8 1 0 . 0 1 8 0 1 3 4 1 0 . 0 1 3 0 . 1 8 6 0 . 1 9 4 0 . 0 9 2 5 0 . 1 1 0 0 . 0 9 7 6 0 . 9 8 9 3 0 . 9 9 4 6 0 . 9 9 2 0 0 . 9 7 8 1 0 . 9 8 7 5 0 . 9 8 8 8 0 . 9 7 6 8 0 . 9 8 6 7 0 . 9 8 4 8 0 . 9 9 2 3 0 . 4 2 1 0 0 1 6 0 1 0 0 1 0 . 0 0 9 3 4 5 3 4 6 E . 5 . E ! < 1 - 1 . 1 . 1 0 < 5 . 4 . T I M E ( h r ) 5 . 2 ' 1 5 . 1 : 3 D 4 . 8 d 4 . 6 - K m : 0 . 4 3 0 m M R : 0 . 9 9 6 3 4 . 4 ' - 4 . 2 . 1 . 1 . , . , . , . . . . 0 0 5 1 1 5 2 2 5 3 3 5 1 / U * l n ( 1 / ( 1 - U ) ) - 1 F i g u r e C . 1 T i m e - c o u r s e o f a c e t a t e d e g r a d a t i o n b y t h e R - g r a n u l e s a n d t h e p l o t f o r d e t e r m i n a t i o n o f K . u s i n g e q u a t i o n C - 5 . ) M m ( E T A T E C A U / 1 F i g u r e C 2 3 4 7 T I M E ( h r ) 5 . 0 - 5 . 7 " ' 5 . 6 " ‘ 5 . 5 " 5 " " K m : 0 . 4 1 4 m M R : 0 . 9 8 9 3 5 . 3 " 5 - 2 ' I - I . , I T I ' I 0 0 5 ‘ I 1 . 5 2 2 5 1 / U * | n ( 1 / ( 1 - U ) ) - 1 T i m e - c o u r s e o f a c e t a t e d e g r a d a t i o n b y t h e F - g r a n u l e s a n d t h e p l o t f o r d e t e r m i n a t i o n o f K . . . u s i n g e q u a t i o n C - 5 . 3 4 8 E E . 1 ' . ’ < z 9 o . o m m T I M E ( h r ) 1 3 . 2 - 1 3 4 1 2 . 8 - D 1 2 . 6 - b 1 2 - 4 ' K m : 0 . 0 6 9 m M R : 0 . 9 9 5 6 1 2 . 2 - 1 2 ' I ' I . I ' I ' I o 1 2 a 4 5 1 / U * l n ( 1 / ( 1 - u » - 1 F i g u r e C . 3 T i m e - c o u r s e o f p r o p i o n a t e d e g r a d a t i o n b y t h e R - g r a n u l e s a n d t h e p l o t f o r d e t e r m i n a t i o n o f K I l l u s i n g e q u a t i o n C — 5 . 3 4 9 ’ 2 ‘ . E . E < z 0 E 0 t r : a T I M E ( h r ) 1 0 . 6 - 1 0 . 4 - C l C I 1 0 . 2 - E l 1 0 - a a 9 . 8 1 K m : 0 . 0 3 7 m M 9 ' 6 ' n : 0 . 9 7 0 1 9 . 4 - 9 . 2 ' l ' l ' l ' l ' l ' I ' l ' I 0 0 . 5 1 1 . 5 2 2 . 5 3 3 . 5 4 1 / U * I n ( 1 / ( 1 - U ) ) - 1 F i g u r e C . 4 T i m e - c o u r s e o f p r o p i o n a t e d e g r a d a t i o n b y t h e F - g r a n u l e s a n d t h e p l o t f o r d e t e r m i n a t i o n o f K , u s i n g e q u a t i o n C - S . ) M m ( E T A R Y T U B O S I R O E T A R Y T U B o I 0 ' I . 5 0 V 1 I T I I . 5 1 ) r ( h I M E u 2 2 . 5 3 5 0 0 . 8 " B u t y r a t e 0 . 6 r 0 . 4 ' I s o b u t y r e t e 0 . 2 2 F " " " A - " ” A > ' 1 . 8 - 1 . 6 " 1 . 4 ' 1 . 2 - ‘ 1 S N K m : 0 . 1 4 3 m M 0 . 6 - R : 0 . 9 9 1 3 0 . 4 - 0 . 2 - I ' I ' I ' I ' I 0 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 1 F i g u r e C . 5 T i m e - c o u r s e o f b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y t h e R - g r a n u l e s a n d t h e p l o t f o r d e t e r m i n a t i o n o f K _ u s i n g e q u a t i o n s C - 7 a n d C - 8 . S i g n i fi c a n t l e v e l o f i s o b u t y r a t e a c c u m u l a t e d d u r i n g b u t y r a t e d e g r a d a t i o n . ) M m ( E T A R Y T U B O S I R O E T A R Y T U B S N F i g u r e C 6 3 5 1 T I M E ( m M ) 1 . 2 - D 1 . 0 . 8 ' - 0 . 6 ' - K m : 0 . 1 8 6 m M 0 . 4 ‘ R : 0 . 9 8 8 8 0 . 2 ' o I I ' I I I 0 0 . 5 1 1 5 2 T i m e - c o u r s e o f b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y t h e F - g r a n u l e s a n d t h e p l o t f o r d e t e r m i n a t i o n o f K . u s i n g e q u a t i o n s C - 7 a n d C - 8 . S i g n i fi c a n t l e v e l o f i s o b u t y r a t e a c c u m u l a t e d d u r i n g b u t y r a t e d e g r a d a t i o n . ) M m ( E T A R Y T U B R O E T A R Y T U B O S I 3 5 2 0 . 8 ' 1 I s o b u t y r a t e 0 . 6 - 0 . 4 " 0 ' 2 . B u t y r a t e L g ; * r ' f / ‘ r ' 9 m 2 . 3 , T I M E ( h r ) 2 . 7 " 2 . 6 " D a 2 . 5 " ‘ 2 ' 4 ' K m : 0 . 1 5 6 m M R : 0 . 9 8 8 2 2 . 3 " ' D 2 . 2 v I ' I ' I ' l 0 0 5 1 1 5 2 1 / U * I n ( 1 / ( 1 - U ) ) - 1 F i g u r e C . 7 T i r n e — c o u r s e o f i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y t h e R — g r a n u l e s a n d t h e p l o t f o r d e t e r m i n a t i o n o f K , u s i n g e q u a t i o n C - 5 . T r a c e a m o u n t o f b u t y r a t e a c c u m u l a t e d a s a n i n t e r m e d i a t e d u r i n g i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n . ) M m ( E T A R Y T U B R O E T A R Y T U B O S I F i g u r e C 8 3 5 3 2 . 5 1 . 5 4 I s o b u t y r a t e 0 . 5 - B u t y r a t e T I M E ( h r ) 5 . 3 ' - 5 3 . 5 . 1 - 4 . 9 . K m : 0 . 1 9 0 m M 4 . 0 - R : 0 . 9 9 4 1 C I 4 . 7 ' 1 4 0 6 V r V I V l V ‘ I ‘ T r V I i ‘ l v I v I 0 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 1 1 . 2 1 . 4 1 . 6 1 . 8 1 / U ‘ I n ( 1 / ( 1 - U ) ) - 1 T i m e - c o u r s e o f i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y t h e F - g r a n u l e s a n d t h e p l o t f o r d e t e r m i n a t i o n o f K I I I u s i n g e q u a t i o n C - 5 . T r a c e a m o u n t o f b u t y r a t e a c c u m u l a t e d a s a n i n t e r m e d i a t e d u r i n g i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n . 3 5 4 2 6 A P r o p i o n a t e E 5 1 5 - 5 . 5 - I t ' ' i ‘ E E I n 5 g 1 1 ' > 1 - . / g ‘ 5 . ° A c e t a t e d 4 . 5 2 - u r , . 0 ° : 2 0 . 5 ‘ I t e ’ . . ‘ a E ( 0 ' 4 < T 7 0 | v I I ‘ 3 . 5 0 1 2 3 4 T I M E ( h r ) 4 I 3 . 8 - 3 . 6 a g 3 . 4 - 3 . 2 ‘ K m : 0 . 1 2 1 m M R : 0 . 9 9 7 5 3 ' I 2 . 8 l V l I T I 0 1 2 3 4 5 1 / U ‘ I n ( 1 / ( 1 - U ) ) - 1 F i g u r e C . 9 T i m e - c o u r s e o f v a l e r a t e d e g r a d a t i o n b y t h e R — g r a n u l e s a n d t h e p l o t f o r d e t e r m i n a t i o n o f K , u s i n g e q u a t i o n C - S . A c e t a t e a n d p r o p i o n a t e a c c u m u l a t e d d u r i n g v a l e r a t e d e g r a d a t i o n . 3 5 5 3 . 5 - 3 ' . I I ‘ h E 2 . 5 . " I " o p i o n a t e : n ' . , . I ‘ Q 2 v . - 2 E 1 . 5 / V a l e r a t e E 1 A c e t a t e 0 . 5 0 O 1 2 3 4 5 T I M E ( h r ) 4 . 4 - 4 . 2 - 4 . - : 3 b 3 . 8 - K m : 0 . 0 9 3 m M R : 0 . 9 8 6 7 3 . 6 - 3 - 4 ' I ‘ I ' I ' I ' I ' I O 1 2 3 4 5 6 1 / U * I n ( 1 / ( 1 - u » - 1 F i g u r e C . 1 0 T i m e - c o u r s e o f v a l e r a t e d e g r a d a t i o n b y t h e F - g r a n u l e s a n d t h e p l o t f o r d e t e r m i n a t i o n o f K m u s i n g e q u a t i o n 0 5 . A c e t a t e a n d p r o p i o n a t e a c c u m u l a t e d d u r i n g v a l e r a t e d e g r a d a t i o n J N A C E T A T E ( m M ) F i g u r e o n 3 5 6 M l 4 1 _ T I M E ( h r ) 4 0 - K m : 0 . 4 1 m M R : 9 9 4 1 0 0 : 5 1 ' 1 : 5 1 / U ‘ I n ( 1 / ( 1 - U ) ) - 1 T i m e - c o u r s e o f a c e t a t e d e g r a d a t i o n b y M e t h a n o t h r i x s t r a i n M 7 a n d t h e p l o t f o r d e t e r m i n a t i o n o f K I l l u s i n g e q u a t i o n C - S . ) M m ( E T A N O I P O R P U 6 3 5 7 6 . 9 _ T I M E ( h r ) 6 . 8 ' 6 . 6 - t / . 5 K m : 0 . 0 3 8 m M R : 0 . 9 9 1 4 6 . 4 ' - 6 . 3 ' 6 0 2 ' I ' I ' I ' I ' I ' 1 ' I 1 / U ‘ l n ( 1 / ( 1 - u » - 1 F i g u r e C . 1 2 T i m e - c o u r s e o f p r o p i o n a t e d e g r a d a t i o n b y t h e g r a n u l e s d e v e l o p e d u s i n g d e fi n e d s p e c i e s a n d t h e p l o t f o r d e t e r m i n a t i o n o f K I I I u s i n g e q u a t i o n 0 5 . 3 5 8 0 . 8 0 . 6 - 0 . 4 - B U T Y R A T E ( m M ) 0 . 2 - . I . . 0 0 . 5 1 1 . 5 2 2 . 5 3 2 . 3 . T I M E ( h r ) 2 . 6 " 2 . 4 . . 2 . 2 - t / U K m : 0 . 1 8 9 m M R : 0 . 9 9 8 7 1 . 8 - ' 1 . 6 ' I ' I I ' j ' I ‘ I 0 0 . 5 l 1 . 5 2 2 . 5 3 3 . 5 1 / U * l n ( 1 / ( 1 - U ) ) - 1 F i g u r e C . 1 3 T i m e - c o u r s e o f b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y t h e g r a n u l e s d e v e l o p e d u s i n g d e fi n e d s p e c i e s a n d t h e p l o t f o r d e t e r m i n a t i o n o f K I I I u s i n g e q u a t i o n 0 5 . I s o b u t y r a t e f o r m a t i o n w a s n o t o b s e r v e d A P P E N D I X D L I G H T M I C R O S C O P I C , S C A N N I N G E L E C T R O N M I C R O S C O P I C A N D T R A N S M I S S I O N E L E C T R O N M I C R O S C O P I C E X A M I N A T I O N 1 . L i g h t m i c r o s c o p y P h a s e - c o n t r a s t a n d e p i fl u o r e s c e n c e o b s e r v a t i o n s o f m i c r o o r g a n i s m s w e r e m a d e w i t h a n O l y m p u s m i c r o s c o p e m o d e l B H 2 e q u i p p e d w i t h a m e r c u r y l a m p a n d a n a u t o m a t i c - e x p o s u r e c a m e r a . T h e a u t o fl u o r e s c e n c e o f m e t h a n o g e n s w a s o b s e r v e d w i t h a B ( I F - 4 9 0 ) e x c i t a t i o n fi l t e r . K o d a k p l u s - X p a n fi l m s w e r e u s e d f o r p h o t o g r a p h s . 2 . S c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( S E M ) T h e s a m p l e s o f b a c t e r i a l c u l t u r e s w e r e w i t h d r a w n f r o m a n a e r o b i c s e r u m b o t t l e s u s i n g 1 m L s y r i n g e w i t h a 1 8 g a u g e n e e d l e . A g g r e g a t e d c e l l s w e r e i m m e d i a t e l y w a s h e d w i t h 0 . 9 % N a C l fi v e t i m e s . D i s p e r s e d c e l l s w e r e c e n t r i f u g e d ( a t 1 0 , 0 0 0 r p m ) t o o b t a i n a c e l l p e l l e t w h i c h w a s , t h e n , w a s h e d i n a 0 . 9 % N a C l s o l u t i o n . T h i s c e n t r i f u g a t i o n - w a s h i n g p r o c e d u r e w a s r e p e a t e d f o r 4 t o 5 a d d i t i o n a l t i m e s . T h e s a m p l e s o f g r a n u l e s w e r e t a k e n f r o m t h e r e a c t o r s a n d w a s h e d w i t h 0 . 9 % N a C l . T h e w a s h e d s a m p l e s ( a g g r e g a t e s , c e n t r i f u g e d p e l l e t s , o r g r a n u l e s ) w e r e t h e n fi x e d i n 0 . 1 M p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 0 ) c o n t a i n i n g 4 % g l u t a r a l d e h y d e f o r m o r e t h a n 3 0 m i n , w a s h e d w i t h 0 . 1 M p h o s p h a t e b u f f e r f o r 1 0 m i n , a n d t h e n d e h y d r a t e d u s i n g a g r a d e d s e r i e s o f 3 5 9 3 6 0 e t h a n o l s o l u t i o n s ( 2 5 , 5 0 , 7 5 , 8 5 , 9 5 , a n d 1 0 0 % o f e t h a n o l ) . T h e s a m p l e s w e r e d r i e d b y t h e c r i t i c a l - p o i n t m e t h o d a n d s p u t t e r c o a t e d w i t h g o l d . S a m p l e s f o r X - r a y a n a l y s i s w e r e p r e p a r e d e s s e n t i a l l y t h e s a m e a s t h o s e f o r S E M e x c e p t t h e y w e r e s p u t t e r c o a t e d w i t h c a r b o n i n s t e a d o f g o l d . F o r t h e p r e p a r a t i o n o f c a t i o n i z e d - f e r r i t i n ( C F ) s t a i n e d s a m p l e s , c e l l s u s p e n s i o n ( 1 m L ) , w a s h e d w i t h 0 . 9 % N a C l s o l u t i o n , w a s t r a n s f e r r e d t o t h e s u r f a c e o f a F E m e m b r a n e ( 4 M , 1 3 m m i n d i a m e t e r , N u c l e p o r e C o . , P l e a s a n t o n , C A ) . S u b s e q u e n t l y , l i q u i d w a s r e m o v e d f r o m t h e m e m b r a n e b y v a c u u m . T h e c e l l s w e r e s t a i n e d b y o v e r l a y i n g w i t h d i l u t e d C F ( 1 0 % ) f o r 1 0 m i n , t h e n w a s h e d w i t h 0 . 9 % N a C l , a n d fi x e d i n 5 % g l u t a r a l d e h y d e - p h o s p h a t e b u f f e r ( 0 . 1 M , p H 7 . 0 ) i n i t i a l l y a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r o n e h o u r a n d t h e n o v e r n i g h t a t 4 ° C . T h e c e l l s a n d m e m b r a n e w e r e d e h y d r a t e d t h r o u g h t h e g r a d e d s e r i e s o f e t h a n o l s o l u t i o n s , d r i e d a n d s p u t t e r c o a t e d w i t h g o l d . S E M m i c r o p h o t o g r a p h s w e r e t a k e n w i t h a n I S M 3 5 C s e a m i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p e ( J E O L , T o k y o , J a p a n ) e q u i p p e d w i t h a t r a c o r N o r t h e r n e n e r g y - d i s p e r s i v e X - r a y s p e c t r o m e t e r M o d e l 5 5 0 0 ( E D X I n s t r u m e n t s , M i d d l e t o w n , W I ) . 3 . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( T E M ) S a m p l e s o f b a c t e r i a l c u l t u r e s w e r e w a s h e d u s i n g 0 . 1 m M p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 2 ) b y c e n t r i f u g a t i o n f o u r t i m e s . G r a n u l e s a m p l e s w e r e w a s h e d w i t h t h e p h o s p h a t e b u f f e r d i r e c t l y . T h e s a m p l e s ( c e n t r i f u g e d p e l l e t s o r g r a n u l e s ) w e r e fi x e d i n 0 . 1 M p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 2 ) c o n t a i n i n g 2 . 5 % g l u t a r a l d e h y d e f o r 1 2 t o 1 6 h r s a t 4 ° C . T h e fi x e d s a m p l e s w e r e r i n s e d 3 t i m e s a t a m b i e n t t e m p e r a t u r e i n 0 . 1 m M p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 2 ) , p o s t - fi x e d w i t h 1 % O s O 4 i n t h e s a m e b u f f e r , d e h y d r a t e d t h r o u g h a g r a d e d s e r i e s o f e t h a n o l s o l u t i o n s f o l l o w e d b y p r o p y l e n e o x i d e . S a m p l e s w e r e e m b e d d e d i n p o l y b e d 8 1 2 ( P o l y s c i e n c e I n c . , W a r r i n g t o n , P A ) . T h i n s e c t i o n s w e r e c u t 3 6 1 w i t h a L K B U l t r a t o m e a n d t h e n p o s t - s t a i n e d w i t h u r a n y l a c e t a t e a n d l e a d c i t r a t e . T E M e x a m i n a t i o n w a s p e r f o r m e d u s i n g a P h i l i p s C M - 1 0 e l e c t r o n m i c r o s c o p e . 4 . C e l l d e n s i t y T h e c e l l d e n s i t y i n t h e g r a n u l e s w a s d e t e r m i n e d b y c o u n t i n g t h e n u m b e r o f c e l l s o n T E M m i c r o p h o t o g r a p h s o f t h i n c r o s s s e c t i o n s b a s e d o n t h e n u m b e r o f d i f f e r e n t m o r p h o t y p e s p e r c m z . 5 . G r a n u l e s i z e a n a l y s i s . S i z e d i s t r i b u t i o n o f g r a n u l e s w a s d e t e r m i n e d u s i n g p h o t o g r a p h s . T h e g r a n u l e s i n a n o p e r a t i n g r e a c t o r w e r e c o m p l e t e l y m i x e d b y i n v e r t i n g t h e r e a c t o r s e v e r a l t i m e s . T h e r e a c t o r w a s o p e n e d , a n d a p o r t i o n o f t h e m i x e d g r a n u l e s w a s p o u r e d i n t o p e t r i d i s h e s . T h e l i q u i d w a s e v e n l y s p r e a d t o o b t a i n a s i n g l e g r a n u l e l a y e r . T h e p e t r i d i s h e s w e r e p l a c e d u n d e r a d i s s e c t i n g p h o t o m i c r o s c o p e ( O l y m p u s S Z H ) . A l o n g w i t h a n i n t e r n a l s i z e s t a n d a r d , p h o t o g r a p h s o f d i f f e r e n t a r e a s o f t h e p r e p a r a t i o n w e r e t h e n t a k e n . T o e s t i m a t i o n o f t h e s i z e d i s t r i b u t i o n ( p e r c e n t a g e o f c e r t a i n s i z e d g r a n u l e s i n t o t a l g r a n u l e n u m b e r a n d t h e p e r c e n t a g e o f c e r t a i n s i z e d g r a n u l e s i n t o t a l g r a n u l e v o l u m e ) , t h e s h a p e o f t h e g r a n u l e s w a s a s s u m e d t o b e s p h e r i c a l . T h e m e a n d i a m e t e r o f e a c h g r a n u l e m e a s u r e d b y a v e r a g i n g t h e m a x i m u m d i a m e t e r a n d m i n i m u m d i a m e t e r o f t h e g r a n u l e o n t h e p h o t o g r a p h s w a s u s e d f o r t h e c a l c u l a t i o n . T h e t o t a l n u m b e r o f e a c h t y p e o f g r a n u l e s f o r s i z e d i s t r i b u t i o n e s t i m a t i o n w a s n o t l e s s t h a n 1 5 0 . T h e s i z e d i s t r i b u t i o n w a s c a l c u l a t e d u s i n g t h e f o l l o w i n g c o m p u t e r p r o g r a m . 3 6 2 5 R E M : M A I N P R O G R A M F O R N U M B E R O F G R A N U L E S V S . T H E A V E R A G E S I Z E A N D G R A N U L E B E D V O L U M E . 1 0 R E M : D A T A F O R T H E I N T E R V A L O F D I A M E T E R S 1 2 D A T A ( “ t e n “ ) 1 4 R E M : D A T A F O R A V E R A G E D I A M E T E R M E A S U R E D F R O M M I C R O S C O P I C P H O T O G R A P H S ; N U M B E R 1 0 0 0 0 0 I S U S E D F O R E N D O F T H E D A T A . l 6 D A T A ( t u m - n u ) , 1 0 0 0 0 0 1 8 I N P U T " N U M B E R O F T H E I N T E R V A L O F D I A M E T E R " ; N 2 0 R E M : I N P U T M U L T I P L Y F A C I O R W H I C H W A S C A L C U L A T E D B A S E D O N I N T E R N A L S I Z E S T A N D A R D O N T H E P H O T O G R A P H S 2 4 I N P U T " M U L T I P L Y F A C T O R " , F A C T O R 3 0 G O S U B 1 0 0 4 0 E N D 1 0 0 R E M : S U B P R O G R A M F O R N U M B E R O F G R A N U L E S V S . T H E A V E R A G E S I E A N D G R A N U L E B E D V O L U M E . 1 1 0 D I M F R A C T I O N V O L U M E ( N ) , F R A C I ' I O N N U M B E R ( N ) , S I Z E ( N ) 1 2 0 N U M B E R = 0 1 3 0 F O R I = l T O N 1 3 5 R E A D S I Z E ( I ) 1 3 8 N E X T I 1 4 0 R E A D D I A M E T E R 1 4 5 I F D I A M E T E R > = r o o o o G O T O 1 4 0 0 1 5 0 N U M B E I = N U M B E R + 1 3 6 3 1 5 5 D I A M E T E R = D I A M E T E R I F A C I O R 1 6 0 V O L U M E = 3 . 1 4 1 6 " D I A M E T E R " 3 / 6 1 6 5 T O T A L V O L U M E = T O T A L V O L U M E + V O L U M E 1 7 0 F O R I = l T O N - l 1 8 0 I F D I A M E T H b S I Z E a ) G O T O 1 1 4 0 1 1 0 0 F R A C I ' I O N N U M B E R G k F R A C I ' I T O N N U M B E R W I 1 1 2 0 F R A C I ' I O N V O L U M E ( I ) = F R A C T I O N V O L U M E ( I ) - I - V O L U M E 1 1 4 0 I F D I A M E T F R > S I Z E ( N - l ) G O T O 1 2 0 0 1 1 6 0 N E X T I 1 1 8 0 G O T O 1 4 0 1 2 0 0 F R A C T I O N N U M B E R ( N ) = F R A C I T I O N N U M B E R ( N ) + 1 1 2 2 0 F R A C I I O N V O L U M E ( N ) = F R A C I ' I O N V O L U M E ( N ) + V O L U M E 1 2 4 0 G O T O 1 4 0 1 4 0 0 P R I N T " N U M B E I O F G R A N U L E S " ; N U M B E R 1 4 2 0 P R I N T ' M U L T I P L Y F A C I O R " ; F A C T O R 1 4 4 0 P R I N T ” S I Z E < " ; D I A M E T E R ( 1 ) ; " m m ” ; " N U M B E R ( % ) " ; F R A C T I O N N U M B E R ( 1 ) * l O O / N U M B E R , " V O L U M E ( 9 6 ) " : F R A C T I O N V O L U M E ( 1 ) * I O U / T O T A L V O L U M E 1 4 6 0 F O R I = 2 ' I O N - l 1 4 8 0 P R I N T D I A M E T E R ( I - l ) ; " = < S I Z E < " ; D I A M E T E R ( I ) ; " m m ” ; " N U M B E R ( % ) ” ; F R A C T I O N N U M B E R ( I ) * l O O / N U M B E R , " V O L U M E ( % ) " ; F R A C T I O N V O L U M E O ) " l O O / I O T A L V O L U M E 1 5 0 0 N E X T I 1 5 2 0 P R I N T ” S I Z E > = " ; D I A M E T E R ( N ) ; " m m ” ; " N U M B E R ( % ) " ; F R A C T I O N N U M B E R ( N ) * l O O / N U M B E R , ” V O L U M E ( % ) " ; 3 6 4 F R A C T I O N V O L U M E ( N ) * l O O / I O T A L V O L U M E 1 5 4 0 R E T U R N A P P E N D I X E F R E E E N E R G Y C A L C U L A T I O N S F O R B I O C H E M I C A L R E A C T I O N S 1 . G e n e r a l e q u a t i o n I n t h i s s t u d y , G i b b s f r e e e n e r g i e s ( A G F ) o f f o r m a t i o n f r o m t h e e l e m e n t s f o r c o m p o u n d s w e r e o b t a i n e d f r o m T h a u e r e t a l . ( 1 9 7 7 ) e x c e p t f o r t h e v a l u e o f i s o b u t y r a t e ( 3 5 4 . 6 1 k J / m o l ) , w h i c h w a s e s t i m a t e d b y u s i n g v a n K r e v e l e n a n d C h e r r n i n e q u a t i o n a n d a s s u m i n g t h a t p e r C H 3 , p e r C H 2 a n d p e r C H g r o u p , 6 1 0 d e c r e a s e s b y - 1 8 . 1 6 , 8 . 5 7 a n d 3 3 . 3 2 k J / m o l , r e s p e c t i v e l y , f r o m b u t y r a t e ( P e r r y ’ s C h e m i c a l E n g . H a n d b o o k , 1 6 t h e d . , 1 9 8 4 ) . F r e e e n e r g y c h a n g e s w e r e c a l c u l a t e d u n d e r p h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n s ( p H 7 ) u s i n g t h e f o l l o w i n g e q u a t i o n s : A G ’ = A G ” + R T 2 v i I n A , - ( 1 3 - 1 ) w h e r e A G ’ = f r e e e n e r g y c h a n g e o f r e a c t i o n u n d e r p h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n s A ° ’ = t h e i n c r e m e n t o f f r e e e n e r g y u n d e r s t a n d a r d p h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n s ( 2 5 ° C , 1 a t m a n d p H 7 ) R = g a s c o n s t a n t 8 . 3 1 4 3 J / K ° m o l 3 6 5 3 6 6 T = T e m p e r a t u r e ( K ) V i = t h e s t o i c h i o m e t r i c c o e f fi c i e n t f o r c o m p o n e n t A i i n a b i o l o g i c a l r e a c t i o n ( i = 1 , 2 , 3 . . . , n ) a n d i s n e g a t i v e f o r r e a c t a n t s a n d p o s i t i v e f o r p r o d u c t s A , - = t h e p h y s i o l o g i c a l c o n c e n t r a t i o n s o f t h e c o m p o n e n t i i n t h e r e a c t i o n ( m o l / L ) 2 . F o r m a t e s y n t h e s i s f r o m h y d r o g e n p l u s b i c a r b o n a t e F o r m a t e s y n t h e s i s f r o m h y d r o g e n p l u s b i c a r b o n a t e : H 2 + H C O 3 ' - - — ) f o r m a t e ' + H 2 0 A G ° ’ = - l . 3 k J / r e a c t i o n ( E - 2 ) A t 3 5 ° C a n d p H 7 , t h e f r e e e n e r g y a v a i l a b l e f o r f o r m a t e s y n t h e s i s w a s c a l c u l a t e d a s f o l l o w i n g : A G ’ = - 1 . 3 + 5 . 9 l o g { [ f o r m a t e ’ 1 / [ H 2 ] [ H C O 3 ’ ] } ( E 3 ) 3 . I s o m e r i z a t i o n b e t w e e n b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e b u t y r a t e ' - - — ) i s o b u t y r a t e ’ ( E - 4 ) A G ° ’ = - 1 . 9 8 k J / r e a c t i o n A t 3 7 ° C a n d p H 7 , t h e f r e e e n e r g y a v a i l a b l e f o r t h e f o r m a t i o n o f i s o b u t y r a t e f r o m b u t y r a t e a n d t h e f o r m a t i o n o f b u t y r a t e f r o m i s o b u t y r a t e w e r e c a l c u l a t e d a s f o l l o w i n g s , r e s p e c t i v e l y : A G ’ = - 1 . 9 8 + 5 . 9 4 l o g { [ i s o b u t y r a t e ' ] / [ b u t y r a t e ’ ] } ( E - 5 ) a n d A G ’ = 1 . 9 8 + 5 . 9 4 l o g { [ b u t y r a t e ' 1 / [ i s o b u t y r a t e ' ] } ( E - 6 ) 3 6 7 4 . I n t e r s p e r c i e s e l e c t r o n t r a n s f e r 1 ) E t h a n o l d e g r a d a t i o n : I n t e r s p e c i e s h y d r o g e n t r a n s f e r d u r i n g s y n t r o p h i c e t h a n o l d e g r a d a t i o n : e t h a n o l + H 2 0 - - — > a c e t a t e ' + H " + 2 H 2 A G ° ’ = + 9 . 6 k J / r e a c t i o n ( E - 7 ) I n t e r s p e c i e s f o r m a t e t r a n s f e r : e t h a n o l + 2 H C O 3 ‘ - - — ) a c e t a t e ‘ + H ” + 2 f o r m a t e ’ + H 2 0 A G ° ’ = + 6 . 9 k J / r e a c t i o n ( E 8 ) T h e A G ° ’ i s t h e i n c r e m e n t o f f r e e e n e r g y f o r t h e r e a c t i o n s u n d e r s t a n d a r d c o n d i t i o n s ( 2 7 3 ° K , 1 a t m ) , p H 7 . 0 a n d 1 M c o n c e n t r a t i o n . T h e f r e e e n e r g y a t p H 7 u n d e r n o n - s t a n d a r d c o n d i t i o n s ( 3 5 ° C o r 3 0 8 ° K , p H 7 . 0 ) w a s c a l c u l a t e d a s t h e f o l l o w i n g e q u a t i o n s : I n t e r s p e c i e s h y d r o g e n t r a n s f e r : A G ’ = 9 . 6 - + 5 . 9 l o g { [ a c e t a t e ' ] [ H ¢ ] 2 / [ e t h a n o l ] } ( E - 9 ) I n t e r s p e c i e s f o r m a t e t r a n s f e r : A G ’ = 6 . 9 + 5 . 9 l o g { [ a c e t a t e ' ] [ f o n n a t e ' ] 2 / [ e t h a n o l ] [ H C O 3 ' ] 2 } ( E - 1 0 ) T h e i n i t i a l p H o f s y n t m p h i c e t h a n o l d e g r a d a t i o n w a s p r o x i m a t e l y 7 . 0 . T h e c h a n g e d u r i n g e t h a n o l d e g r a d a t i o n w a s n o t s i g n i fi c a n t b e c a u s e t h e m e d i u m h a d h i g h H C O 3 ' - - C O 2 b u f f e r c a p a c i t y ( H C O ; 5 9 m M ) . T h e i n fl u e n c e o f p H c h a n g e o n f r e e e n e r g y c h a n g e w a s i g n o r e d . i i ) B u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n : I n t e r s p e c i e s H 2 t r a n s f e r b u t y r a t e ‘ + 2 1 1 2 0 - - — > 2 a c e t a t e ' + 2 H 2 + H ” ( E - l l ) A G ° ’ = + 4 8 . 1 k J / r e a c t i o n 3 6 8 i s o b u t y r a t e ’ + 2 H 2 0 - — ) 2 a c e t a t e ' + 2 H 2 + H + ( E - 1 2 ) A G ° ’ = + 5 0 . 0 8 k J / r e a c t i o n 1 / 2 b u t y r a t e ' + 1 / 2 i s o b u t y r a t e ‘ + 2 H 2 0 - - — - ) 2 a c e t a t e ‘ + 2 H 2 + H + A G ° ’ = + 4 9 . 0 9 k J / r e a c t i o n ( E - l 3 ) I n t e r s p e c i e s f o r m a t e t r a n s f e r b u t y r a t e ' + 2 H C O , ‘ - - — ) 2 a c e t a t e ' + H ’ + 2 f o r m a t e ' ( I i - 1 4 ) A G ° ’ = + 4 5 . 5 k J / r e a c t i o n i s o b u t y r a t e ' + 2 H C O , ‘ - - - > 2 a c e t a t e ' + H “ + 2 f o r m a t e “ ( E - 1 5 ) A G ° ’ = + 4 7 . 4 8 k J / r e a c t i o n 1 / 2 b u t y r a t e ' + 1 / 2 i s o b u t y r a t e “ + 2 H C 0 3 ' - - — > 2 a c e t a t e ' + 2 f o r m a t e ' + H “ A G ° ’ = + 4 6 . 4 9 k J / r e a c t i o n ( E - 1 6 ) T h e v a l u e s o f A G ’ u n d e r p H 7 a n d 3 7 ° C f o r a b o v e r e s p e c t i v e r e a c t i o n s w e r e c a l c u l a t e d b a s e d o n e q a u t i o n ( E 1 ) a n d A G ” f o r r e s p e c t i v e r e a c t i o n s . i i i ) B u t y r a t e d e g r a d a t i o n c o u p l e d w i t h i s o m e r i z a t i o n b e t w e e n b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e : ( 1 ) W h e n b u t y r a t e c o n c e n t r a t i o n i s m u c h h i g h e r t h a n i s o b u t y r a t e , i s o b u t y r a t e w i l l a c c u m u l a t e d u r i n g b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y i s o b u t y r a t e - b u t y r a t e d e g r a d e r s . S u p p o s e t h a t p m o l e o f i s o b u t y r a t e i s f o r m e d f r o m b u t y r a t e w h e n o n e m o l e o f b u t y r a t e i s d e g r a d e d w i t h f o r m a t e a s e l e c t r o n c a r r i e r s : ( 1 + p ) b u t y r a t e ‘ + 2 H C 0 3 ' - - — ) 2 a c e t a t e ‘ + H + + 2 f o r m a t e ' + p i s o b u t y r a t e A G ° ’ = + 4 5 . 5 - 1 . 9 8 p k J / r e a c t i o n ( E - 1 7 ) w h e r e , p i s a v a r i a b l e w h i c h 2 0 . U n d e r p H 7 . 0 a n d 3 7 ° C , t h e f r e e e n e r g y w a s c a l c u l a t e d a s A G ’ = 4 5 . 5 - 1 . 9 8 p + 5 . 9 4 l o g { [ a c e t a t e ' ] 2 [ f o r m a t e ' ] 2 [ i s o b u t y r a t e ] p l l b u t y r a t c l “ * ” [ I I C 0 3 ' ] 2 } ( E - 1 8 ) 3 6 9 ( 2 ) W h e n i s o b u t y r a t e c o n c e n t r a t i o n i s m u c h h i g h e r t h a n b u t y r a t e , b u t y r a t e w i l l a c c u m u l a t e d u r i n g i s o b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y i s o b u t y r a t e - b u t y r a t e d e g r a d e r s . S u p p o s e t h a t q m o l e o f b u t y r a t e i s f o r m e d f r o m i s o b u t y r a t e w h e n o n e m o l e o f b u t y r a t e i s d e g r a d e d w i t h f o r m a t e a s e l e c t r o n c a r r i e r s : q i s o b u t y r a t e ‘ + 2 H C O 3 ‘ - - — ) 2 a c e t a t e ‘ + H “ + 2 f o r m a t e ‘ + ( q - l ) b u t y r a t e ' A G ° ’ = + 4 7 . 4 8 + 1 . 9 8 q k J / r e a c t i o n ( I E - 1 9 ) w h e r e , q i s a v a r i a b l e w h i c h 2 0 . U n d e r p H 7 . 0 a n d 3 7 ° C , t h e f r e e e n e r g y w a s c a l c u l a t e d a s A G ’ = 4 7 . 4 8 + 1 . 9 8 q + 5 . 9 4 l o g { [ a c e t a t e ‘ ] 2 [ f o r m a t e ‘ ] 2 [ b u t y r a t e ‘ ] ( ‘ ” ) / [ i s o b u t y r a t e ] " [ H C O 3 ‘ ] 2 } ( E - 2 0 ) ( 3 ) W h e n b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e a r e a t n e a r l y e q u a l c o n c e n t r a t i o n s , b o t h a r e d e g r a d e d a t t h e s a m e r a t e s : 1 / 2 b u t y r a t e ‘ + 1 / 2 i s o b u t y r a t e ‘ + 2 H C O 3 ‘ - - — ) 2 a c e t a t e ‘ + H ” + 2 f o r m a t e ‘ A G ° ’ = + 4 7 . 4 8 + 1 . 9 8 q k J / r e a c t i o n ( E - 2 1 ) U n d e r p H 7 . 0 a n d 3 7 ° C , t h e f r e e e n e r g y w a s c a l c u l a t e d a s A G ’ = 4 6 . 4 9 + 5 . 9 4 l o g { [ a c e t a t e ‘ ] 2 [ f o r m a t e ‘ ] 2 / [ b u t y r a t e ‘ ] ‘ ” [ i s o b u t y r a t e ] m [ H C O 3 ‘ ] 2 } ( E 2 2 ) A P P E N D I X F C A L C U L A T I O N F O R S U B S T R A T E C O N V E R S I O N V I A S U L F A T E R E D U C T I O N 1 . R e a c t i o n s D u r i n g a n a e r o b i c d i g e s t i o n i n t h e p r e s e n c e o f s u l f a t e , t h e f o l l o w i n g s u b s t r a t e c a n b e c o n v e r t e d v i a s u l f a t e r e d u c t i o n o r / a n d m e t h a n o g e n e s i s : 4 H , + S O , " + H “ - - — > 4 1 1 , 0 + H S ‘ ( F - l ) 4 H , + H C O , ‘ + H + - - — ) 3 H , O + C H 4 ( E 2 ) 4 f o r m a t e ‘ + 8 0 4 2 ‘ + H + - - — ) 4 H C O , ‘ + H S ‘ ( F - 3 ) 4 f o r m a t e ‘ + H , O + H + - - - ) 3 H C O , ‘ + C H 4 ( F - 4 ) a c e t a t e ‘ + 8 0 4 2 ‘ - - — > 2 H C O , ‘ + H S ‘ ( F - S ) a c e t a t e ‘ + H , O - — ) H C O , ‘ + C H 4 ( E 6 ) 2 e t h a n o l + 8 0 , ” - - — > 2 a c e t a t e ’ + 2 H , O + H S ‘ + H ” ( F - 7 ) 2 e t h a n o l + H C O , ‘ - - — ) 2 a c e t a t e ‘ + H , O + C H . + H “ ( F - 8 ) 4 p r o p i o n a t e ‘ + 3 S O , " - - — ) 4 a c e t a t e ‘ + 4 H C O , ‘ + 3 H S ‘ + H + ( E 9 ) 4 p r o p i o n a t e ‘ + 3 H , O - — ) 4 a c e t a t e ‘ + H C O , ‘ + 3 C H 4 + H ” ( F - 1 0 ) 2 b u t y r a t e ‘ + S O . " - - — ) 4 a c e t a t e ‘ + H 8 ‘ + H “ ( F - l l ) 2 b u t y r a t e ‘ + H C O , ‘ + H , O - — - ) 4 a c e t a t e ‘ + C H , + H + ( F - 1 2 ) 3 7 0 3 7 1 2 . C a l c u l a t i o n o f r e s u l t s i n T a b l e 4 . 5 1 ) C o n v e r s i o n o f H , , f o r m a t e a n d a c e t a t e T h e s u b s t r a t e c o n v e r t e d v i a s u l f a t e r e d u c t i o n w a s c a l c u l a t e d d i r e c t l y f r o m t h e r a t i o o f m o l a r m a s s o f m e t h a n e p r o d u c e d i n t h e p r e s e n c e v e r s u s t h e a b s e n c e o f s u l f a t e . F o r e x a m p l e , t h e r a t i o f o r m e t h a n e p r o d u c e d f r o m h y d r o g e n w a s 0 . 9 4 a n d 0 . 9 8 f o r i n t a c t a n d d i s r u p t e d g r a n u l e s , r e s p e c t i v e l y . H y d r o g e n c o n v e r t e d v i a s u l f a t e r e d u c t i o n w a s , t h e r e f o r e , c a . 6 % a n d 2 % . I n t h i s c a l c u l a t i o n , t h e p e r c e n t a g i e s c o u l d a l s o b e c a l c u l a t e d u s i n g s u b s t r a t e c o n s u m e d a n d s u l f a t e c o n v e r t e d a n d e q u a t i o n ( F - l ) , ( E B ) a n d ( F - 4 ) . I n T a b l e 4 . 5 , t h e r e s u l t s w a s c a l c u l a t e d b a s e d o n C H , p r o d u c e d r a t h e r t h a n s u l f a t e r e m o v e d b e c a u s e s u l f a t e c o n s u m p t i o n w a s i n s i g n i fi c a n t d u r i n g c o n v e r s i o n o f h y d r o g e n , f o r m a t e a n d a c e t a t e a n d , t h e r e f o r e t h e d e t e r m i n a t i o n o f C H , w a s m o r e a c c u r a t e t h a n s u l f a t e . i i ) C o n v e r s i o n o f p r o p i o n a t e P r o p i o n a t e c o n v e r s i o n v i a s u l f a t e r e d u c t i o n c a n b e c a l c u l a t e d u s i n g t w o m e t h o d s : ( 1 ) I n t h e b a s i s o f m e t h a n e p r o d u c e d i n t h e p r e s e n c e v e r s u s t h e a b s e n c e o f s u l f a t e . W h e n p r o p i o n a t e i s d e g r a d e d v i a m e t h a n o g e n e s i s , 1 m o l o f p r o p i o n a t e p r o d u c e s 0 . 7 5 m o l o f C H , a n d 1 m o l a c e t a t e ( e q u a t i o n E 1 0 ) a n d 1 m o l a c e t a t e p r o d u c e s 1 m o l o f m e t h a n e ( e q u a t i o n F - 6 ) . E x p e r i m e n t a l r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e r a t i o o f C H , p r o d u c e d i n t h e p r e s e n c e v e r s u s t h e a b s e n c e o f s u l f a t e f o r a c e t a t e c o n v e r s i o n a n d p r o p i o n a t e c o n v e r s i o n w e r e 0 . 9 6 a n d 0 . 7 2 , r e s p e c t i v e l y ( T a b l e 4 . 5 ) . T h e f o l l o w i n g e q u a t i o n c a n b e o b t a i n e d b a s e d o n m a s s b a l a n c e ( 0 . 7 5 F + 0 . 9 6 ) / ( 1 . 0 + 0 . 7 5 ) = 0 . 7 2 3 7 2 w h e r e , F i s t h e f r a c t i o n o f m e t h a n e p r o d u c e d v i a s y n t r o p h i c p r o p i o n a t e c o n v e r s i o n a n d F = 0 . 4 . T h e p r o p i o n a t e c o n v e r t e d v i a s u l f a t e r e d u c t i o n , t h e r e f o r e , i s ( 1 0 4 ) * 1 0 0 % = 6 0 % . ( 2 ) I n t h e b a s i s o f c o n s u m p t i o n o f p r o p i o n a t e a n d s u l f a t e W h e n s u b s t r a t e c o n s u m p t i o n f o r c e l l s y n t h e s i s i s i g n o r e d , p r o p i o n a t e c o n v e r s i o n v i a s u l f a t e r e d u c t i o n c a n b e c a l c u l a t e d o n t h e b a s i s o f s u l f a t e c o n s u m p t i o n . A c c o r d i n g t o e q u a t i o n ( F — 9 ) , c o n v e r s i o n o f 1 m m o l p r o p i o n a t e t o 1 m m o l a c e t a t e r e q u i r e s 0 . 7 5 m m o l o f s u l f a t e . I n T a b l e 4 . 5 , s u l f a t e c o n s u m e d ( m m o l p e r m o l s u b s t r a t e ) w a s 0 . 0 0 7 a n d 0 . 4 1 d u r i n g c o n v e r s i o n o f a c e t a t e a n d p r o p i o n a t e , r e s p e c t i v e l y . T h e f r a c t i o n o f p r o p i o n a t e c o n v e r t e d t o a c e t a t e v i a s u l f a t e r e d u c t i o n i s ( ( 0 . 4 1 - 0 . 0 0 7 ) / 1 . 0 ) / 0 . 7 5 = 0 . 5 4 ( o r 5 4 % ) T h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e s e t w o c a l c u l a t i o n s m a y b e d u e t o t h e a n a l y t i c e r r o r , e s p e c i a l l y i n t h e d e t e r m i n a t i o n o f s u l f a t e c o n s u m p t i o n d u r i n g a c e t a t e c o n v e r s i o n , a n d a s s i m i l a t o r y u p t a k e o f p r o p i o n a t e a n d a c e t a t e b y m i c r o o r g a n i s m s . I n T a b l e 4 . 5 , t h e v a l u e o f 6 0 % r a t h e r t h a n 5 4 % w a s u s e d a s t h e r e s u l t s i n c e t h e c a l c u l a t i o n o n t h e b a s i s o f m e t h a n e p r o d u c t i o n w a s m o r e a c c u r a t e a n d f r e e o f t h e i n fl u e n c e o f a s s i m i l a t o r y s u b s t r a t e u p t a k e . i i i ) e t h a n o l c o n v e r s i o n T h e r a t i o o f C H , p r o d u c e d f r o m a c e t a t e a n d s y n t r o p h i c a c e t o g e n e s i s i s 1 . 0 : 0 . 5 p e r m o l e e t h a n o l , b a s e d o n e q u a t i o n s ( F - 6 ) a n d ( F - 8 ) . I n T a b l e 4 . 5 , t h e r a t i o o f C H . p r o d u c e d i n t h e p r e s e n c e v e r s u s t h e a b s e n c e o f s u l f a t e f o r a c e t a t e c o n v e r s i o n a n d e t h a n o l c o n v e r s i o n w e r e 0 . 9 6 a n d 0 . 8 8 , r e s p e c t i v e l y . O n t h e b a s i s o f C H , p r o d u c t i o n , t h e f r a c t i o n o f e t h a n o l t o a c e t a t e v i a s u l f a t e r e d u c t i o n w a s c a l c u l a t e d a s 1 - ( 0 . 8 8 * 1 . 5 — 0 . 9 6 ) ] 0 . 5 = 0 . 2 8 ( o r 2 8 % ) O n t h e b a s i s o f e t h a n o l c o n s u m e d a n d s u l f a t e c o n s u m e d , t h e f r a c t i o n o f e t h a n o l 3 7 3 t o a c e t a t e v i a s u l f a t e r e d u c t i o n i s ( ( 0 . 1 8 - 0 . 0 0 7 ) / 1 . 0 ) / 0 . 5 = 0 . 3 4 ( o r 3 4 % ) . I n T a b l e 4 . 5 , t h e v a l u e o f 2 8 % w a s u s e d a s r e s u l t a c c o r d i n g t h e s a m e r e a s o n s d i s c u s s e d f o r p r o p i o n a t e c o n v e r s i o n . 3 . C a l c u l a t i o n o f r e s u l t s i n T a b l e 5 . 2 T h e c a l c u l a t i o n o f p e r c e n t a g e s o f s u b s t r a t e s c o n v e r t e d v i a s u l f a t e r e d u c t i o n f o r H , , f o r m a t e , a c e t a t e , a n d p r o p i o n a t e w a s t h e s a m e a s d e s c r i b e d a b o v e , o n t h e b a s i s o f m e t h a n e p r o d u c t i o n . B u t y r a t e c o n v e r t e d v i a s u l f a t e r e d u c t i o n w a s a l s o e s t i m a t e d o n t h e b a s i s o f m e t h a n e p r o d u c t i o n . T h e r a t i o o f C I L p r o d u c e d f r o m a c e t a t e a n d s y n t r o p h i c b u t y r a t e c o n v e r s i o n i s 2 : 0 . 5 p e r m o l e o f b u t y r a t e , b a s e d o n e q u a t i o n s ( F - 6 ) a n d ( F - 1 2 ) . I n T a b l e 5 . 2 , t h e r a t i o o f m e t h a n e p r o d u c e d i n t h e p r e s e n c e v e r s u s t h e a b s e n c e o f s u l f a t e w a s 0 . 9 9 7 a n d 0 . 9 8 6 , r e s p e c t i v e l y . O n t h e b a s i s o f m e t h a n e p r o d u c t i o n , t h e f r a c t i o n ( F ) o f m e t h a n e p r o d u c e d v i a s u l f a t e r e d u c t i o n w a s e s t i m a t e d f r o m t h e f o l l o w i n g m a s s b a l a n c e ( 0 . 5 F + 0 . 9 9 7 * 2 ) / 2 . 5 0 = = 0 . 9 8 6 T h u s , F w a s 0 . 9 4 2 o r 9 4 . 2 % a n d b u t y r a t e d e g r a d e d v i a s u l f a t e r e d u c t i o n w a s 5 . 8 % . L I S T O F R E F E R E N C E S L I S T O F R E F E R E N C E S A g u i l a r , A . , C . C a s a s , J . L a f u e n t e , a n d J . M . L e m a . 1 9 9 0 . K i n e t i c m o d e l l i n g o f i s o m e r i z a t i o n o f n - a n d i - b u t y r a t e . J . F e r m e n t . a n d B i o e n g . 6 9 : 2 6 1 - 2 6 4 . A h r i n g , B . K . , a n d P . W e s t e r m a n n . 1 9 8 4 . I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a t h e r m o p h i l i c , a c e t a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n i c b a c t e r i u m . F E M S M i c r o b i o l . L e t t . 2 5 : 4 7 - 5 2 . A h r i n g , B . K . , a n d P . W e s t e r m a n n . 1 9 8 5 . M e t h a n o g e n e s i s f r o m a c e t a t e : p h y s i o l o g y o f a t h e r m o p h i l i c , a c e t a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n i c b a c t e r i u m . F E M S M i c r o b i o l . L e t t . 2 8 : 1 5 - 1 9 . A h r i n g , B . K . , a n d P . W e s t e r m a n n . 1 9 8 7 a . T h e r m o p h i l i c a n a e r o b i c d e g r a d a t i o n o f b u t y r a t e b y a b u t y r a t e - u t i l i z i n g b a c t e r i u m i n c o c u l t u r e a n d t r i c u l t u r e w i t h m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a . A p p l . E n v r o n . M i c r o b i o l . 5 3 : 4 2 9 - 4 3 3 . A h r i n g , B . K . , a n d P . W e s t e r m a n n . 1 9 8 7 b . K i n e t i c s o f b u t y r a t e , a c e t a t e , a n d h y d r o g e n m e t a b o l i s m i n a t h e r m o p h i l i c , a n a e r o b i c b u t y r a t e - d e g r a d i n g t r i c u l t u r e . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 3 : 4 3 4 - 4 3 9 . A l i b h a i , K . R . K . , a n d C . F . F o r s t e r . 1 9 8 6 . A n e x a m i n a t i o n o f t h e g r a n u l a t i o n p r o c e s s i n U A S B r e a c t o r s . E n v i r o n . T e c h . L e t t . 7 : 1 9 3 - 2 0 0 . A n d r e w s , J . F . 1 9 6 8 . A d y n a m i c m o d e l o f t h e a n a e r o b i c d i g e s t i o n p r o c e s s . I n 2 3 r d P u r e d u e i n d u s t r i a l w a s t e c o n f e r e n c e p r o c e e d i n g s . p p 2 8 5 - 3 1 0 . A P H A - A W W A - W P C F . ( e d . ) . 1 9 8 0 . S t a n d a r d m e t h o d s f o r t h e e x a m i n a t i o n o f w a t e r a n d w a s t e w a t e r , 1 5 t h e d i t i o n . A m e r i c a n P u b l i c H e a l t h A s s o c i a t i o n , W a s h i n g t o n , D C . A P H A - A W W A - W P C F ( e d . ) . 1 9 8 5 . S t a n d a r d m e t h o d s f o r t h e e x a m i n a t i o n o f w a t e r a n d w a s t e w a t e r , 1 6 t h e d i t i o n . A m e r i c a n P u b l i c H e a l t h A s s o c i a t i o n , W a s h i n g t o n , D C . 3 7 4 3 7 5 A r c h e r , D . B . , 1 9 8 8 . R e p o r t o n t h e m i c r o b i o l o g i c a l a s p e c t s o f g r a n u l a t i o n . I n L e t t i n g a , G . , A . J . B . Z e h n d e r , J . T . C . G r o t e n h u i s , a n d L . W . H u l s h o f f P o l ( e d . ) , G r a n u l a r a n a e r o b i c s l u d g e ; m i c r o b i o l o g y a n d t e c h n o l o g y . P u d o c , W a g e n i n g e n , N e t h e r l a n d s , 1 9 8 8 . p p 1 0 7 - 1 1 1 . B a l c h , W . E . , S . S c h o b e r t h , R . S . T a n n e r , a n d R . S . W o l f e . 1 9 7 7 . A c e t o b a c t e r i u m , a n e w g e n u s o f h y d r o g e n - o x i d i z i n g , c a r b o n d i o x i d e - r e d u c i n g , a n a e r o b i c b a c t e r i a . I n t . J . S y s t . B a c t e r i o l . 2 7 : 3 5 5 - 3 6 1 . B a l c h , W . E . , G . E . F o x , L . J . M a g r u m , C . R . W o e s e , a n d R . S . W o l f e . 1 9 7 9 . M e t h a n o g e n s : r e e v a l u a t i o n o f a u n i q u e b i o l o g i c a l g r o u p . M i c r o b i o l . R e v . 4 3 : 2 6 0 - 2 9 6 . B a n a t , I . M . , E . B . L i n d s t r o m , D . B . N e d w e l l , a n d M . T . B a l b a . 1 9 8 1 . E v i d e n c e f o r c o e x i s t e n c e o f t w o d i s t i n c t f u n c t i o n a l g r o u p s o f s u l f a t e - r e d u c i n g b a c t e r i a i n s a l t m a r s h s e d i m e n t . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 2 : 9 8 5 - 9 9 2 . B a r b r o s a , R . A . , a n d G . L . S a n t ’ A n n a J r . 1 9 8 9 . T r e a t m e n t o f r a w d o m e s t i c s e w a g e i n a n U A S B r e a c t o r . W a t . R e s . 2 3 : 1 4 8 3 - 1 4 9 0 . B a r o n , S . F . a n d J . G . F e r r y . 1 9 8 9 . R e c o n s t i t u t i o n a n d p r o p e r t i e s o f a c o e n z y m e F m - m e d i a t e d f o r m a t e h y d r o g e n l y a s e s y s t e m i n M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m . J . B a c t e r i o l . 1 7 1 : 3 8 5 4 - 3 8 5 9 . B e a t y , P . S . , M . J . M c I n e r n e y , a n d N . Q . W o r f f o r d . 1 9 8 6 . E n e r g e t i c s o f H , - p r o d u c i n g s y n t r o p h i c b a c t e r i a . A n t o n o p o u l o s , A . A . ( e d ) . B i o t e c h n o l o g i c a l a d v a n c e s i n p r o c e s s i n g m u n i c i p a l w a s t e s f o r f u e l s a n d c h e m i c a l s . A r g o n n e N a t u r a l L a b o r a t o r y , A r g o n n e , I L . p p 6 7 - 8 3 . B e a t y , P . S . , a n d M . J . M c I n e r n e y . 1 9 8 7 . G r o w t h o f S y n t r o p h o m o n a s w o l f e i i n p u r e c u l t u r e o n c r o t o n a t e . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 1 4 7 : 3 8 9 - 3 9 3 . B e a t y , P . S . , a n d M . J . M c I n e r n e y . 1 9 9 0 . N u t r i t i o n a l f e a t u r e s o f S y n t r o p h o m o n a s w o l f e i . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 6 : 3 2 2 3 - 3 2 2 4 . B o c h e m , H . P . , S . M . S c h o b e r t h , B . S p r e y , a n d P . W e r g l e r . 1 9 8 2 . T h e r m o p h i l i c b i o m e t h a n a t i o n o f a c e t i c a c i d : m o r p h o l o g y a n d u l t r a s t r u c t u r e o f a g r a n u l a r c o n s o r t i u m . C a n . J . M i c r o b i a l . 2 8 : 5 0 0 - 5 1 0 . B o l l e , W . L . , J . v a n B r e u g e l , G . C . V a n E y b e r g e n , N . W . F . K o s s e n , a n d W . v a n G i l s . 1 9 8 6 . K i n e t i c s o f a n a e r o b i c p u r i fi c a t i o n o f i n d u s t r i a l w a s t e w a t e r . B i o t e c h . B i o e n g . 2 8 : 5 4 2 - 5 4 8 . 3 7 6 B o o n e , D . R . , a n d M . P . B r y a n t . 1 9 8 0 . P r o p i o n a t e - d e g r a d i n g b a c t e r i u m , S y n t r o p h o b a c t e r w o l i n i i s p . n o v . g e n . n o v . , f r o m m e t h a n o g e n i c e c o s y s t e m s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 0 : 6 2 6 - 6 3 2 . B o o n e , D . R . , J . A . G . F . M e n a i a , J . E . B o o n e , a n d R . A . M a h . 1 9 8 7 . E f f e c t s o f h y d r o g e n p r e s s u r e d u r i n g g r o w t h a n d e f f e c t s o f p r e g r o w t h w i t h h y d r o g e n o n a c e t a t e d e g r a d a t i o n b y M e t h a n o s a r c i n a s p e c i e s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i a l . 5 3 : 8 3 - 8 7 . B o o n e , D . R . , a n d W . B . W h i t m a n . 1 9 8 8 . P r o p o s a l o f m i n i m a l s t a n d a r d s f o r d e s c r i b i n g n e w t a x a o f m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a . I n t . J . S y s t . B a c t e r i o l . 3 8 : p p 2 1 2 - 2 1 9 . B o o n e , D . R . , R . L . J o h n s o n , a n d Y . L i u . 1 9 8 9 . D i f f u s i o n o f t h e i n t e r s p e c i e s e l e c t r o n c a r r i e r H , a n d f o r m a t e i n m e t h a n o g e n i c e c o s y s t e m s a n d i t s i m p l i c a t i o n s i n t h e m e a s u r e m e n t o f K l l f o r H , o r f o r m a t e u p t a k e . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 5 : 1 7 3 5 - 1 7 4 1 . B r e z n a k , J . A . , J . M . S w i t z e r , a n d H . - J . S e i t z . 1 9 8 8 . S p o r a m u r a t e r m i t r ' d a s p . n o v . , a H , / C O , - u t i l i z i n g a c e t o g e n i s o l a t e d f r o m t e r m i t e s . A r c h . M i c r o b i o l . 1 5 0 : 2 8 2 - 2 8 8 . B r u m m e l e r , E . , L . W . H u l s h o f f P o l , J . D o l fi n g , G . L e t t i n g a , a n d A . J . B . Z e h n d e r . 1 9 8 5 . M e t h a n o g e n e s i s i n a n a n a e r o b i c s l u d g e b l a n k e t r e a c t o r a t p H 6 o n a n a c e t a t e - p r o p i o n a t e m i x t u r e . A p l l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 9 : 1 4 7 2 - 1 4 7 7 . B r y a n t , M . P . , E . A . W o l i n , M . J . W o l i n , a n d R . S . W o l f e . 1 9 6 7 . M e t h a n o b a c i l l u s o m e l i a n s k i i , a s y m b i o t i c a s s o c i a t i o n o f t w o s p e c i e s o f b a c t e r i a . A r c h . M i c r o b i o l . 5 9 : 2 0 - 3 1 . B r y a n t , M . P . 1 9 7 2 . C o m m e n t a r y o n t h e H u n g a t e t e c h n i q u e f o r c u l t u r e o f a n a e r o b i c b a c t e r i a . A m . J . C l i n . N u t r . 2 5 : 1 3 4 2 - 1 3 2 8 . B r y a n t , M . P . 1 9 7 7 . M i c r o b i o l o g y o f t h e r u m e n . I n S t e v e n s o n , M . J . ( e d . ) , D u k e ’ s p h y s i o l o g y o f d o m e s t i c a n i m a l s , 9 t h e d . C o r n e l l U n i v e r s i t y P r e s s , I t h a c a , N Y . p p 2 8 7 - 3 0 4 . B r y a n t , M . P . , L . L . C a m p b e l l , C . A . R e d d y , a n d M . R . C r a b i l l . 1 9 7 7 . G r o w t h o f D e s u l f o v i r i o i n l a c t a t e o r e t h a n o l m e d i a l a w i n s u l f a t e i n a s s o c i a t i o n w i t h H , - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 3 3 : 1 1 6 2 - 1 1 6 9 . B r y a n t , M . P . 1 9 7 9 . M i c r o b i a l m e t h a n e p r o d u c t i o n - t h e o r e t i c a l a s p e c t s . J . A n i r n . S c i . 4 8 : 1 9 3 - 2 0 1 . 3 7 7 B r y a n t , M . P . , a n d D . R . B o o n e . 1 9 8 7 . I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m M F . I n t . J . S y s t e m . B a c t e r i a l . 3 7 : 1 7 1 . C h a r t r a i n , M . , a n d J . G . Z e i k u s . 1 9 8 6 a . M i c r o b i a l E c o p h y s i o l o g y o f w h e y b i o m e t h a n a t i o n : i n t e r m e d i a r y m e t a b o l i s m o f l a c t o s e d e g r a d a t i o n i n c o n t i n u o u s c u l t u r e . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 1 : 1 8 0 — 1 8 7 . C h a r t r a i n , M . , a n d J . G . Z e i k u s . 1 9 8 6 b . M i c r o b i a l E c o p h y s i o l o g y o f w h e y b i o m e t h a n a t i o n : C h a r a c t e r i z a t i o n o f b a c t e r i a l t r o p h i c p o p u l a t i o n s a n d p r e v a l e n t s p e c i e s i n c o n t i n u o u s c u l t u r e . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 1 : 1 8 8 - 1 9 6 . C l a r k , J . N . 1 9 8 8 . A n a e r o b i c d i g e s t i o n o f w h e y i n a p i l o t - s c a l e u p f l o w a n a e r o b i c s l u d g e b l a n k e t d i g e s t e r . I n T i l c h e , A . , a n d A . R o z z i . ( e d s . ) P o s t e r - p a p e r s , fi f t h i n t e r n a t i o n a l s y m p o s i u m a n a n a e r o b i c d i g e s t i o n . B o l o g n a , I t a l y , 2 2 - 2 6 M a y 1 9 8 8 . p p 4 8 9 - 4 9 3 . C o h e n , A . 1 9 8 2 . O p t i m i z a t i o n o f a n a e r o b i c d i g e s t i o n o f s o l u b l e c a r b o h y d r a t e c o n t a i n i n g w a s t e w a t e r s b y p h a s e s e p a r a t i o n . P h . D t h e s i s , U n i v e r s i t e i t v a n A m s t e r d a m , A m s t e r d a m , T h e N e t h e r l a n d s . C o h e n , A . , J . M . v a n G e m e r t , R . J . Z o e t e m e y e r , a n d A . M . B r e u r e . 1 9 8 4 . M a i n c h a r a c t e r i s t i c s a n d s t o i c h i o m e t r i c a s p e c t s o f a c e t o g e n e s i s o f s o l u b l e c a r b o h y d r a t e c o n t a i n i n g w a s t e w a t e r s . P r o c e s s B i o c h e m . D e c : 2 2 8 - 2 3 2 . C o l l e r a n , E . 1 9 8 8 . R e p o r t o n t e c h n o l o g i c a l a s p e c t s o f g r a n u l a t i o n . I n L e t t i n g a , G . , A . J . B . Z e h n d e r , J . T . C . G r o t e n h u i s , a n d L . W . H u l s h o f f P o l ( e d . ) , G r a n u l a r a n a e r o b i c s l u d g e ; m i c r o b i o l o g y a n d t e c h n o l o g y . P u d o c , W a g e n i n g e n , N e t h e r l a n d s , 1 9 8 8 . p p 2 3 7 - 2 4 0 . C o n r a d , R . , F . L . L u p t o n , a n d J . G . Z e i k u s . 1 9 8 7 . H y d r o g e n m e t a b o l i s m a n d s u l f a t e - d e p e n d e n t i n h i b i t i o n o f m e t h a n o g e n e s i s i n a n e u t r o p h i c l a k e s e d i m e n t s . F E M S M i c r o b i o l . E c o l . 4 5 : 1 0 7 - 1 1 5 . C o r d - R u w i s c h , R . a n d B . O l l i v i e r . 1 9 8 6 . I n t e r s p e c i e s h y d r o g e n t r a n s f e r d u r i n g m e t h a n o l d e g r a d a t i o n b y S p o r o m u s a a c i d o v o r a n s a n d h y d r o g e n o p h i l i c a n a e r o b e s . A r c h . M i c r o b i o l . 1 4 4 : 1 6 3 - 1 6 5 . C r a w f o r d , G . V . , a n d G . H . T e l e t z k e . 1 9 8 6 . P e r f o r m a n c e o f a h y b r i d a n a e r o b i c p r o c e s s . I n P r o c e e d i n g s o f t h e 4 1 s t i n d u s t r i a l w a s t e c o n f e r e n c e , P u r d u e U n i v e r s i t y , W e s t L a f a y e t t e , I n d i a n a . L e w i s P u b l i s h e r , I n c . , M I . p p 1 9 6 - 2 0 8 . 3 7 8 D o l fi n g J . , 1 9 8 5 . K i n e t i c s o f m e t h a n e f o r m a t i o n b y g r a n u l a r s l u d g e a t l o w s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s , t h e i n fl u e n c e o f m a s s t r a n s f e r l i m i t a t i o n . A p p l . M i c r o b i o l . B i o t e c h n o l . 2 2 : 7 7 - 8 1 D o l fi n g , J . , a n d W . G . B . M . B l a m e n . 1 9 8 5 . A c t i v i t y m e a s u r e m e n t s a s a t o o l t o c h a r a c t e r i z e t h e m i c r o b i a l c o m p o s i t i o n o f m e t h a n o g e n i c e n v i r o n m e n t s . J . M i c r o b i o l . M e t h o d s . 4 : 1 - 1 2 D o l fi n g , J . , A . G r i f fi o e n , A . R . W . v a n N e e r v e n , a n d L . P . T . M . Z e v e n h u i z e n . 1 9 8 5 . C h e m i c a l a n d b a c t e r i o l o g i c a l c o m p o s i t i o n o f g r a n u l a r m e t h a n o g e n i c s l u d g e . C a n . J . M i c r o b i o l . 3 1 : 7 4 4 - 7 5 0 . D o l fi n g , J . 1 9 8 7 . M i c r o b i o l o g i c a l a s p e c t s o f g r a n u l a r m e t h a n o g e n i c s l u d g e , P h . D T h e s i s , A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y , W a g e n i n g e n , t h e N e t h e r l a n d s . D o l fi n g , J . , a n d J . M . T i e d j e . 1 9 8 8 . A c e t a t e I n h i b i t i o n o f m e t h a n o g e n i c , s y n t r o p h i c b e n z o a t e d e g r a d a t i o n . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 4 : 1 8 7 1 - 1 8 7 3 . D u b o u r g u i e r , H . C . , G . P r e n s i e r a n d G . A l b a g n a c . 1 9 8 8 a . S t r u c t u r e a n d m i c r o b i a l a c t i v i t i e s o f g r a n u l a r a n a e r o b i c s l u d g e s . I n L e t t i n g a , G . , A . J . B . Z e h n d e r , J . T . C . G r o t e n h u i s , a n d L . W . H u l s h o f f P o l ( e d . ) , G r a n u l a r a n a e r o b i c s l u d g e ; m i c r o b i o l o g y a n d t e c h n o l o g y . P u d o c , W a g e n i n g e n , N e t h e r l a n d s , 1 9 8 8 . p p 1 8 - 3 3 . D u b o u r g u i e r , H . C . , M . N . B u i s s o n , J . P . T i s s i e r , G . P r e n s i e r a n d G . A l b a g n a c . 1 9 8 8 b . S t r u c t u r a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d m e t a b o l i c a c t i v i t i e s o f g r a n u l a r m e t h a n o g e n i c s l u d g e o n a m i x e d d e fi n e d s u b s t r a t e . I n L e t i i n g a , G . , A . J . B . Z e h n d e r , J . T . C . G r o t e n h u i s , a n d L . W . H u l s h o f f P o l ( e d . ) , G r a n u l a r a n a e r o b i c s l u d g e ; m i c r o b i o l o g y a n d t e c h n o l o g y . P u d o c , W a g e n i n g e n , N e t h e r l a n d s , 1 9 8 8 . p p 7 8 - 8 6 . D u b o u r g u i e r , H . C . , D . B . A r c h e r , G . A l b a g n a c . a n d G . P r e n s i e r c . 1 9 8 8 c . S t r u c t u r e a n d m e t a b o l i s m o f m e t h a n o g e n i c m i c r o b i a l c o n g l o m e r a t e s . I n H a l l , E . R . , a n d P . N . H o b s o n ( e d . ) , A n a e r o b i c D i g e s t i o n 1 9 8 8 . P e r g r a m o n P r e s s , O x f o r d , U K . p p 1 3 - 2 3 . D w y e r , D . F . , E . W e e g - A e r s s e n s , D . R . S h e l t o n , a n d J . M . T i e d j e . 1 9 8 8 . B i o e n e r g e t i c c o n d i t i o n s o f b u t y r a t e m e t a b o l i s m b y a s y n t r o p h i c , a n a e r o b i c b a c t e r i u m i n c o c u l t u r e w i t h h y d r o g e n - o x i d i z i n g m e t h a n o g e n i c a n d s u l fi d o g e n i c b a c t e r i a . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i a l . 5 4 : 1 3 5 4 - 1 3 5 9 . E n d o , G . , a n d Y . T a h a y . 1 9 8 5 . H i g h r a t e t r e a t m e n t o f n i g h t s o i l b y a n a e r o b i c u p fl o w s l u d g e b l a n k e t ( U A S B ) p r o c e s s . I n C h i n a S t a t e B i o g a s A s s o c i a t i o n ( e d ) , A n a e r o b i c d i g e s t i o n 1 9 8 5 . G u a n g z h o u , C h i n a . p p 4 4 1 - 4 4 3 . 3 7 9 E n d o , G . , a n d Y . T o h a y . 1 9 8 8 . E c o l o g i c a l s t u d y a n a n a e r o b i c s l u d g e b u l k i n g c a u s e d b y fi l a m e n t o u s b a c t e r i a g r o w t h i n a n a n a e r o b i c c o n t a c t p r o c e s s . I n O l s o n , B . H . , a n d D . J e n k i n s . ( e d . ) , P r o c e e d i n g s o f i n t e r n a t i o n a l c o n f e r e n c e o n w a t e r a n d w a s t e w a t e r m i c r o b i o l o g y . V o l u m e 2 , 3 4 ( 1 ) . N e w p o r t B e a c h , C a l i f o r n i a . F a t h e p u r e , B . Z . 1 9 8 3 . I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a n a c e t o c l a s t i c m e t h a n o g e n f r o m a b i o g a s d i g e s t e r . F E M S M i c r o b i o l . L e t t . 1 9 : 1 5 1 - 1 5 6 . F e r g u s o n , T . J . , a n d R . A . M a h . 1 9 8 3 . E f f e c t o f H , - C O , o n m e t h a n o g e n e s i s f r o m a c e t a t e o r m e t h a n o l i n M e t h a n o s a r c i n a s p . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i a l . 4 6 : 3 4 8 - 3 5 5 . G o r r i s , L . G . M . , a n d J . M . A . v a n D e u r s e n . 1 9 8 8 . B i o fi l r n d e v e l o p m e n t i n l a b - s c a l e m e t h a n o g e n i c fl u i d i z e d b e d r e a c t o r s . L e t t i n g a , G . , A . J . B . Z e h n d e r , J . T . C . G r o t e n h u i s , a n d L . W . H u l s h o f f P o l ( e d s ) . G r a n u l a r a n a e r o b i c s l u d g e ; m i c r o b i o l o g y a n d t e c h n o l o g y . P u d o c , W a g e n i n g e n , N e t h e r l a n d s , 1 9 8 8 . p p 8 7 - 9 5 G o r r i s , L . G . M . , T . M . d e K o k , B . M . K r o o n , C . v a n d e r D r i f t , a n d G . D . V o g e l s . 1 9 8 8 . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n m e t h a n o g e n i c c o f a c t o r c o n t e n t a n d m a x i m u m s p e c i fi c m e t h a n o g e n i c a c t i v i t y o f a n a e r o b i c g r a n u l a r s l u d g e s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 4 : 1 1 2 6 - 1 1 3 0 . G r o t e n h u i s , J . T . C . , J . v a n L i e r , C . M . P l u g g e . 1 9 8 8 b . E f f e c t o f c a l c i u m r e m o v a l o n s i z e a n d s t r e n g t h o f m e t h a n o g e n i c g r a n u l e s . I n T i l c h e , A . , a n d A . R o z z i . ( e d s . ) P o s t e r - p a p e r s , fi f t h i n t e r n a t i o n a l s y m p o s i u m a n a n a e r o b i c d i g e s t i o n . B o l o g n a , I t a l y , 2 2 — 2 6 M a y 1 9 8 8 . p p 1 1 7 - 1 2 0 . G u i a t , S . R . , a n d L . v a n d e n B e r g . 1 9 8 5 . P e r f o r m a n c e o f a n u p fl o w a n a e r o b i c r e a c t o r c o m b i n i n g a s l u d g e b l a n k e t a n d a fi l t e r t r e a t i n g s u g a r w a s t e . B i o t e c h . B i o e n g . 2 7 : 8 0 0 - 8 0 6 . G u i a t , S . R . , K . L . K e n n e d y , a n d L . v a n d e n B e r g . 1 9 8 5 . C o m p a r i s o n o f U B F a n d U A S B r e a c t o r c o n c e p t s . P o s t e r p r e s e n t e d a t 4 t h I n t e r n a t i o n a l s y m p o s i u m a n a n a e r o b i c d i g e s t i o n , G u a n g z h o u , C h i n a , N o v . 1 1 - 1 5 , 1 9 8 5 . G u i a t , S . R . , S . S . G o r u r , a n d K J . K e n n e d y . 1 9 8 8 . N u t r i t i o n a l a n d e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s c o n t r i b u t i n g t o m i c r o b i a l a g g r e g a t i o n d u r i n g u p fl o w a n a e r o b i c s l u d g e b e d - fi l t e r ( U B F ) r e a c t o r s t a r t - u p . I n H a l l , E . R . , a n d P . N . H o b s o n ( e d . ) , A n a e r o b i c D i g e s t i o n 1 9 8 8 . P e r g r a m o n P r e s s , O x f o r d , U K . p p . 4 7 - 5 3 . G u j e r , W . , a n d A . J . B . Z e h n d e r . 1 9 8 3 . C o n v e r s i o n p r o c e s s e s i n a n a e r o b i c d i g e s t i o n . W a t . S c i . T e c h . 1 5 : 1 2 7 - 1 6 7 . 3 8 0 G u y o t , J . P . , a n d A . B r a u m a n . 1 9 8 6 . M e t h a n e p r o d u c t i o n f r o m f o r m a t e b y s y n t r o p h i c a s s o c i a t i o n o f M e t h a n o b a c t e r i u m b r y a n t i i a n d D e s u l f o v i b r i o v u l g a r i s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 2 : 1 4 3 6 - 1 4 3 7 . G u y o t , J . P . , A . N o y o l a , a n d O . M o n r o y . 1 9 9 0 . E v o l u t i o n o f m i c r o b i a l a c t i v i t i e s a n d p o p u l a t i o n i n g r a n u l a r s l u d g e f r o m a n U A S B r e a c t o r . B i o t e c h n o l . L e t t . 1 2 : 1 5 5 - 1 6 0 . H a b e t s , L . H . A . , a n d J . H . K n e l i s s e n . 1 9 8 5 . A p p l i c a t i o n o f t h e U A S B - r e a c t o r f o r a n a e r o b i c t r e a t m e n t o f p a p e r a n d b o a r d m i l l e f fl u e n t . W a t . S c i . T e c h . 1 7 : 6 1 - 7 5 . H a l l , E . R . , a n d M . J o v a n o v i c . 1 9 8 2 . A n a e r o b i c t r e a t m e n t o f t h e r m a l s l u d g e c o n d i t i o n i n g l i q u o r w i t h fi x e d - fi l m a n d s u s p e n d e d g r o w t h p r o c e s s e s . I n P r o c e e d i n g s o f t h e 3 7 t h i n d u s t r i a l w a s t e c o n f e r e n c e , P u r d u e U n i v e r s i t y , W e s t L a f a y e t t e , I n d i a n a . p p 7 1 9 . H a w l w a c h s , W . 1 9 7 8 . K , a n d V . , , f r o m o n l y o n e e x p e r i m e n t . B i o t e c h . B i o e n g . 2 0 : 2 8 1 - 2 8 5 . H a r a d a , H . , G . E n d o , Y . T o h y a , a n d K . M o m o n o i . 1 9 8 8 . H i g h r a t e p e r f o r m a n c e a n d i t s r e l a t e d c h a r a c t e r i s t i c s o f g r a n u l a t e d s l u d g e s i n U A S B r e a c t o r s t r e a t i n g v a r i o u s w a s t e w a t e r s . I n T i l c h e , A . , a n d A . R o z z i . ( e d s . ) P o s t e r - p a p e r s , fi f t h i n t e r n a t i o n a l s y m p o s i u m a n a n a e r o b i c d i g e s t i o n . B o l o g n a , I t a l y , 2 2 - 2 6 M a y 1 9 8 8 . p p 1 0 1 1 - 1 0 2 0 . H a r t e e E . F . 1 9 7 2 . A m o d i fi c a t i o n o f t h e L o w r y M e t h o d , t h a t g i v e s a l i n e a r p h o t o m e t r i c r e s p o n s e . A n a l . B i o c h e m . 4 8 : 4 2 2 - 4 2 6 . H e e r t j e s , P . M . , a n d R . R . v a n d e r M e e r . 1 9 7 8 . D y n a m i c s o f l i q u i d fl o w i n a n u p fl o w r e a c t o r u s e d f o r a n a e r o b i c t r e a t m e n t o f w a s t e w a t e r . B i o t e c h . B i o e n g . 2 0 : 1 5 7 7 - 1 5 9 4 . H e r n e n s , J . , P . G . M e i r i n g , a n d G . J . S t a n d e r . 1 9 6 2 . F u l l s c a l e a n a e r o b i c d i g e s t i o n o f e f fl u e n t f r o m t h e p r o d u c t i o n o f m a i z e s t a r c h . W a t e r a n d W a s t e T r e a t m e n t . 9 : 1 6 - 1 8 . H e n s o n , J . M . , a n d P . H . S m i t h . 1 9 8 5 . I s o l a t i o n o f a b u t y r a t e - u t i l i z i n g b a c t e r i u m i n c o c u l t u r e w i t h M e t h a n o b a c t e r i u m t h e r m o a u t o t r o p h i c u m f r o m a t h e r m o p h i l i c d i g e s t e r . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 9 : 1 4 6 1 - 1 4 6 6 . 3 8 1 H e y e s , R . H . , a n d R . J . H a l l . 1 9 8 3 . K i n e t i c s o f t w o s u b g r o u p s o f p r o p i o n a t e - u s i n g o r g a n i s m s i n a n a e r o b i c d i g e s t i o n . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 6 : 7 1 0 - 7 1 5 . H i c k e y , R . F . a n d R . F . O w e n s . 1 9 8 1 . M e t h a n e g e n e r a t i o n f r o m h i g h s t r e n g t h i n d u s t r i a l w a s t e s w i t h t h e a n a e r o b i c fl u i d i z e d b e d . B i o t e c h . B i o e n g . S y m p . S e r . N o . 1 1 , 3 9 9 . H i l p e r t , R . , J . W i n t e r , W . H a m m e s a n d O . K a n d l e r . 1 9 8 1 . T h e s e n s i t i v i t y o f a r c h a e b a c t e r i a t o a n t i b i o t i c s . Z b l . B a k t . H y g . , I . A b t . O r i g . C 2 : 1 1 - 2 0 . H i l t o n , M . G . , a n d D . B . A r c h e r . 1 9 8 8 . A n a e r o b i c d i g e s t i o n o f a s u l f a t e - r i c h m o l a s s e s w a s t e w a t e r : i n h i b i t i o n o f h y d r o g e n s u l fi d e p r o d u c t i o n . B i o t e c h . B i o e n g . 3 1 : 8 8 5 - 8 8 8 . H i r s c h , R . 1 9 8 4 . M i c r o c o l o n y f o r m a t i o n a n d c o n s o r t i a . M a r s h a l l , K . C . ( e d s . ) . M i c r o b i a l a d h e s i o n a n d a g g r e g a t i o n . S p r i n g e r V e r l a g , B e r l i n . p p 3 7 3 - 3 9 3 . H o p n e r , T . , a n d J . K n a p p e . 1 9 7 4 . D e t e r m i n a t i o n w i t h f o r m a t e d e h y d r o g e n a s e . I n B e r g r n e r y e r , H . U . ( e d s . ) , M e t h o d s o f e n z y m a t i c a n a l y s i s . A c a d e m i c P r e s s I n c . , N e w Y o r k a n d L o n d o n , p p 1 5 5 1 - 1 5 5 5 . H u , J . - C . , W . - M . W u , a n d X . - S . G u . 1 9 8 5 . E x p e r i m e n t a l s t u d i e s o n t h e t r e a t m e n t o f b e e r y e a s t a n d s a c c h a r i fi c a t i o n w a s t e w a t e r b y U A S B r e a c t o r . E n e r g y S o u r c e s R e s e a r c h C o m m i t t e e a n d I n t e r n a t i o n a l C o o p e r a t i o n B u r e a u o f A c a d e m i a S i n i c a ( e d s ) . S i n o - J a p a n e s e S y m p o s i u m o n R e n e w a b l e E n e r g y R e s o u r c e s . C h e n g d u , C h i n a . p p 3 5 - 4 3 . H u l s h o f f P o l , L . W . , J . D o l fi n g , W . d e Z e e u w , a n d G . L e t t i n g a . 1 9 8 2 . C u l t i v a t i o n o f w e l l a d a p t e d p e l l e t i z e d m e t h a n o g e n i c s l u d g e . B i o t e c h . L e t t e r s . 4 : 3 2 9 - 3 3 2 . H u l s h o f f P o l , L . W . , W . J . d e Z e e u w , C . T . M . V e l z e b o e r a n d G . L e t t i n g a . 1 9 8 3 . G r a n u l a t i o n i n U A S B r e a c t o r . W a t . S c i . T e c h . 1 5 : 2 9 1 - 3 0 4 . H u l s h o f f P o l , L . W . , K . H e i j n e k a m p a n d G . L e t t i n g a . 1 9 8 8 . T h e s e l e c t i o n p r e s s u r e a s a d r i v i n g f o r c e b e h i n d t h e g r a n u l a t i o n o f a n a e r o b i c s l u d g e . I n L e t t i n g a , G . , A . J . B . Z e h n d e r , J . T . C . G r o t e n h u i s , a n d L . W . H u l s h o f f P o l ( e d . ) , G r a n u l a r a n a e r o b i c s l u d g e ; m i c r o b i o l o g y a n d t e c h n o l o g y . P u d o c , W a g e n i n g e n , N e t h e r l a n d s , 1 9 8 8 . p p 1 5 3 - 1 6 1 H u l s h o f f P o l , L . W . 1 9 8 9 . T h e p h e n o m e n o n o f g r a n u l a t i o n o f a n a e r o b i c s l u d g e . P h . D T h e s i s , D e p a r t m e n t o f E n v i r o n m e n t a l E n g i n e e r i n g , A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y , W a g e n i n g e n , T h e N e t h e r l a n d s . 3 8 2 H u n g a t e , R . E . 1 9 6 6 . T h e r u m e n a n d i t s m i c r o b e s . A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k . H u n g a t e , R . E . 1 9 6 7 . H y d r o g e n a s a n i n t e r m e d i a t e i n t h e r u m e n f e r m e n t a t i o n . A r c h . M i c r o b i o l . 5 9 : 1 5 8 - 1 6 4 . H u s e r , B . A . , K . W u h r r n a n n , a n d A . J . B . Z e h n d e r . 1 9 8 2 . M e t h a n o t h r i x s o e h n g e n i i g e n . n o v . s p . n o v . , a n e w a c e t a t r o p h i c n a n - h y d r o g e n — o x i d i z i n g m e t h a n e b a c t e r i u m . A r c h . M i c r o b i o l . 1 3 2 : 1 - 9 . I s a , 2 . , S . G r u s e n m e y e r , a n d W . V e r s t r a e t e . 1 9 8 6 . S u l f a t e r e d u c t i o n r e l a t i v e t o m e t h a n e p r o d u c t i o n i n h i g h - r a t e a n a e r o b i c d i g e s t i o n : m i c r o b i o l o g i c a l a s p e c t s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 1 : 5 8 0 - 5 8 7 . I z a , J . , P . A . G a r c i a , 1 . S a n z , a n d F . F d z - P o l a n c o . 1 9 8 8 . G r a n u l a t i o n r e s u l t s i n a n a e r o b i c fl u i d i z e d b e d r e a c t o r s . I n L e t t i n g a , G . , A . J . B . Z e h n d e r , J . T . C . G r o t e n h u i s , a n d L . W . H u l s h o f f P o l . ( e d . ) . G r a n u l a r a n a e r o b i c s l u d g e ; m i c r o b i o l o g y a n d t e c h n o l o g y . P u d o c , W a g e n i n g e n , N e t h e r l a n d s , 1 9 8 8 . p p 1 9 5 - 2 0 2 . J a i n , M . K . , T . E . T h o m p s o n , E . C o n w a y d e M a c a r i o , a n d J . G . Z e i k u s . 1 9 8 7 . S p e c i a t i o n o f M e t h a n o b a c t e r i u m s t r a i n I v a n o v a s M e t h a n o b a c t e r i u m i v a n o v i i s p . n o v . S y s t e m . A p p l . M i c r o b i o l . 9 : 7 7 - 8 2 . I a i n , M . K . , a n d J . G . Z e i k u s . 1 9 8 7 . M e t h o d s f o r i s o l a t i o n o f a u x o t r o p h i c m u t a n t s o f M e t h a n o b a c t e r i u m i v a n o v i i a n d i n i t i a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f a c e t a t e a u x o t r o p h s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i a l . 5 3 : 1 3 8 7 - 1 3 9 0 . J a i n , M . K . , L . B h a t n a g a r , a n d J . G . Z e i k u s . 1 9 8 8 . A t a x o n o m i c o v e r v i e w o f m e t h a n o g e n s . I n d i a n J . M i c r o b i o l o l . 2 8 : 1 4 3 - 1 7 7 . J e r i s , J . S . , a n d P . L . M c C a r t y . 1 9 6 5 . T h e b i o c h e m i s t r y o f m e t h a n e f e r m e n t a t i o n u s i n g 1 ‘ C t r a c e s . J . W P C F . 3 7 : 1 7 8 - 1 9 2 . J e w e l l , W . J . , M . S . S w i t z e n b a u m , a n d J . W . M o r r i s . 1 9 8 1 . M u n i c i p a l w a s t e w a t e r t r e a t m e n t w i t h t h e a n a e r o b i c a t t a c h e d m i c r o b i a l fi l m e x p a n d e d p r o c e s s . J . W P C F . 5 3 : 4 8 2 — 4 9 0 . J i a n g , Q . 1 9 8 9 . U n i v e r s i t y o f A r i z o n a , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n . J o n e s , W . J . , D . P . N a g l e , a n d W . B . W h i t m a n . 1 9 8 7 . M e t h a n o g e n s a n d d i v e r s i t y o f a r c h a e b a c t e r i a . M i c r o b i o l . R e v . 5 1 : 1 3 5 - 1 7 7 . 3 8 3 K a r n a g a t a , Y . , a n d E . M i k a m i . 1 9 9 0 . S o m e C h a r a c t e r i s t i c s o f t w o m o r p h o t y p e s o f M e t h a n o t h r i x s o e h n g e n i i f r o m m e s o p h i l i c a n a e r o b i c d i g e s t e r s . J . F e r m e n t . B i o e n g . 7 0 : 2 7 2 - 2 7 4 . K a s p a r , H . F . , a n d K . W u h r r n a n n . 1 9 7 8 . K i n e t i c p a r a m e t e r s a n d r e l a t i v e t u m o v e r o f s o m e i m p o r t a n t c a t a b o l i c r e a c t i o n s i n d i g e s t i n g s l u d g e . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i a l . 3 6 : 1 - 7 . K e n e a l y , W . , a n d J . G . Z e i k u s . 1 9 8 1 . I n fl u e n c e o f c o r r i n o i d a n t a g o n i s t s o n m e t h a n o g e n m e t a b o l i s m . J . B a c t e r i o l . 1 4 6 : 1 3 3 - 1 4 0 . K i l l i l i a , E . a n d E . C o l l e r a n . 1 9 8 8 . C o m p a r i s o n o f fi x e d - b e d a n d h y b r i d fi x e d b e d / s l u d g e b e d r e a c t o r s f o r a n a e r o b i c d i g e s t i o n o f c h e e s e w h e y . I n T i l c h e , A . , a n d A . R o z z i . ( e d s . ) P o s t e r - p a p e r s , fi f t h i n t e r n a t i o n a l s y m p o s i u m a n a n a e r o b i c d i g e s t i o n . B o l o g n a , I t a l y , 2 2 - 2 6 M a y 1 9 8 8 . p p 5 4 1 - 5 4 6 . K i r n a t a , T . , T . K a w a i , M . T a d a , K . T a n a k a , K . S h i n a b e , a n d K . S h i m i z u . 1 9 9 0 . A n a e r o b i c t r e a t m e n t o f t h e r m a l c o n d i t i o n i n g l i q u o r . P a p e r p r e s e n t e d a t t h e 6 3 r d a n n u a l c o n f e r e n c e o f t h e w a t e r p o l l u t i o n c o n t r o l f e d e r a t i o n , O c t o b e r 7 - 1 1 , 1 9 9 0 , W a s h i n g t o n D C . K j e l l e b e r g . S . 1 9 8 4 . A d h e s i o n t o i n a n i m a t e s u r f a c e s . I n M a r s h a l l , K . C . ( e d . ) M i c r o b i a l a d h e s i o n a n d a g g r e g a t i o n . S p r i n g e r - V e r l a g , B e r l i n . p p 5 1 - 7 0 . K l a p w i j k , A . , H . S r n i t , a n d A . M o o r e . 1 9 8 1 . D e n i t r i fi c a t i o n o f d o m e s t i c w a s t e w a t e r i n u p fl o w s l u d g e - b l a n k e t r e a c t o r w i t h o u t c a r r i e r m a t e r i a l f o r t h e b i o m a s s . C o o p e r , R . F . , a n d B . A t k i n s o n . ( e d s . ) B i o l o g i c a l fl u i d i z e d b e d t r e a t m e n t o f w a t e r a n d w a s t e w a t e r . E l l i s H o r w o o d L i m i t e d , C h i c h e s t e r . p p 2 0 5 - 2 1 6 . K o b a y a s h i , H . A . , E . C o n w a y d e M a c a r i o , R . S . W i l l i a m s , a n d A . J . L . M a c a r i o . 1 9 8 8 . D i r e c t c h a r a c t e r i z a t i o n o f m e t h a n o g e n s i n t w o h i g h - r a t e a n a e r o b i c b i o l o g i c a l r e a c t o r s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 4 : 6 9 3 - 6 9 8 . K o c h , M . , J . D o l fi n g , K . W u h r m a n n , a n d A . J . B . Z e h n d e r . 1 9 8 3 . P a t h w a y s o f p r o p i o n a t e d e g r a d a t i o n b y e n r i c h e d m e t h a n o g e n i c c u l t u r e s . 4 5 : 1 4 1 1 - 1 4 1 4 . K o o m n e e f , E . , A . J . L . M a c a r i o , J . T . C . G r o t e n h u i s , a n d E . C . d e M a c a r i o . 1 9 9 0 . M e t h a n o g e n s r e v e a l e d i m m u n o l o g i c a l l y i n g r a n u l e s f r o m fi v e u p fl o w a n a e r o b i c s l u d g e b l a n k e t ( U A S B ) b i a r e a c t o r s g r o w n o n d i f f e r e n t s u b s t r a t e s . F E M S M i c r o b i o l . E c o l o g y . 7 3 : 2 2 5 - 2 3 0 . 3 8 4 K o s t e r , I . W . , a n d G . L e t t i n g a . 1 9 8 4 . T h e i n fl u e n c e o f a m m o n i u m - n i t r o g e n o n t h e s p e c i fi c a c t i v i t y o f p e l l e t i z e d m e t h a n o g e n i c s l u d g e . A g r i c u l t u r a l W a s t e s . 9 : 2 0 5 - 2 1 6 . K r e i s l , P . , a n d K a n d l e r . 1 9 8 6 . C h e m i c a l s t r u c t u r e o f t h e c e l l w a l l p o l y m e r o f M e t h a n o s a r c i n a . S y s t e m . A p p l . M i c r o b i a l . 7 : 2 9 3 - 2 9 9 . K r i s t j a n s s o n , J . K . , P . S c h b n h e i t , a n d R . K . T h a u e r . 1 9 8 2 . D i f f e r e n t K s v a l u e s f o r h y d r o g e n o f m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a a n d s u l f a t e r e d u c i n g b a c t e r i a : a n e x p l a n a t i o n f o r t h e a p p a r e n t i n h i b i t i o n o f m e t h a n o g e n e s i s b y s u l f a t e . A r c h . M i c r o b i o l . 1 3 1 : 2 7 8 - 2 8 2 . L a a n b r o e k , H . J . , T . A b e e , a n d J . L . V o o g d . 1 9 8 2 . A l c o h o l c o n v e r s i o n s b y D e s u l f o b u l b u s p r o p i o n i c u s L i n d h o r s t i n t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f s u l f a t e a n d h y d r o g e n . A r c h . M i c r o b i o l . 1 3 3 : 1 7 8 - 1 8 4 . L a m e d , R . , J . N a i m a r k , E . M o r g e n s t e m a n d E . A . B a y e r . 1 9 8 7 . S c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p i c d e l i n e a t i o n o f b a c t e r i a l s u r f a c e t o p o l o g y u s i n g c a t i o n i z e d f e n i t i n . J . M i c r o b i a l . M e t h o d s . 7 : 2 3 3 - 2 4 0 . L a n t i n g , J . , J . A . J o r d a n , M . T . S c h o n e , A . K u l l , W . W . C a r e y , a n d B . L . K i t n e y . 1 9 8 8 . T h e r m o p h i l i c a n a e r o b i c d i g e s t i o n o f c o f f e e w a s t e w a t e r . I n P r o c e e d i n g s o f t h e 4 7 t h i n d u s t r i a l w a s t e c o n f e r e n c e , P u r d u e U n i v e r s i t y , W e s t L a f a y e t t e . L e w i s P u b l i s h e r I n c . , M I . p p 5 1 3 - 5 2 4 . L a w r e n c e , A . W . , a n d P . L . M c C a r t y . 1 9 6 9 . K i n e t i c s o f m e t h a n e f e r m e n t a t i o n i n a n a e r o b i c t r e a t m e n t . J . W P C F . 4 1 : R 1 - R 1 7 . L a u e r e r , G . , J . K . K r i s t j a n s s o n , T . A . L a n g w o r t h y , H . K o n i g , a n d K . O . S t e t t e r . 1 9 8 6 . M e t h a n o t h e r m u s s o c i a b i l i s s p . n o v . , a s e c o n d s p e c i e s w i t h i n t h e M e t h a n o t h e r m a c e a e g r o w i n g a t 9 7 ° C . S y s t . A p p l . M i c r o b i o l . 8 : 1 0 0 - 1 0 5 . L e e , M . J . , a n d S . H . Z i n d e r . 1 9 8 8 . I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a t h e r m o p h i l i c b a c t e r i u m w h i c h o x i d i z e s a c e t a t e i n s y n t r o p h i c a s s o c i a t i o n w i t h a m e t h a n o g e n a n d w h i c h g r o w s a c e t o g e n i c a l l y o n H , - C O , . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 4 : 1 2 4 - 1 2 9 . L e i g h , J . A . , F . M a y e r , a n d R . S . W o l f e . 1 9 8 1 . A c e t o g e n i u m k i v u i , a t h e r m o p h i l i c h y d r o g e n - o x i d i z i n g , a c e t o g e n b a c t e r i u m . A r c h . M i c r o b i o l . 1 2 9 : 2 7 5 - 2 8 0 . 3 8 5 L e m a , J . M . , C . C a s a s , A . A g u i l a r , a n d J . L a f u e n t e . 1 9 8 8 . O n t h e i s o m e r i z a t i o n b e t w e e n n - b u t y r a t e a n d i - b u t y r a t e . I n T i l c h e , A . , a n d A . R o z z i . ( e d . ) , P o s t e r - p a p e r s , fi f t h i n t e r n a t i o n a l s y m p o s i u m a n a n a e r o b i c d i g e s t i o n . B o l o g n a , I t a l y , 2 2 - 2 6 M a y 1 9 8 8 . p p 4 9 - 5 1 . L e t t i n g a G . , v a n V e l s e n A . F . M . , H o b m a S . W . , W . d e Z e e u w . , A . K l a p w i j k . 1 9 8 0 U s e o f t h e u p fl o w s l u d g e b l a n k e t ( U S B ) r e a c t o r c o n c e p t f o r b i o l o g i c a l w a s t e w a t e r t r e a t m e n t , e s p e c i a l l y f o r a n a e r o b i c t r e a t m e n t . B i o t e c h n o l . B i o e n g . 2 2 : 6 9 9 - 7 3 4 . L e t t i n g a , G . , R . R o e r s m a , P . G r i n , W . d e Z e e u w , L . H u l s h o f f P o l , L . v a n V e l s e n , S . H o b m a a n d G . Z e e m a n . 1 9 8 1 . A n a e r o b i c t r e a t m e n t o f s e w a g e a n d l o w s t r e n g t h w a s t e w a t e r s . I n H u g h e s , D . E . , D . A . S t a f f o r d , B . I . W h e a t l e y , W . B a a d e r , G . L e t t i n g a , E . J . N y n s , W . V e r s r a e t e , a n d R . L . W e n t w o r t h ( e d s . ) , A n a e r o b i c d i g e s t i o n 1 9 8 1 . E l s e v i e r b i o m e d i c a l P r e s s , A m s t e r d a m , 1 9 8 2 . p p 2 7 1 - 2 9 1 . L e t t i n g a , G . , S . W . H o m a , L . W . H u l s h o f f P o l , W . d e Z e e u w , P . d e J o n g , D . G r i n , a n d R . R o e r s m a . 1 9 8 3 a . D e s i g n , o p e r a t i o n a n d e c o n o m y o f a n a e r o b i c t r e a t m e n t . W a t . S c i . T e c h . 1 5 : 1 7 7 - 1 9 6 . L e t t i n g a , G . , R . R o e r s m a , a n d D . G r i n . 1 9 8 3 b . A n a e r o b i c t r e a t m e n t o f r a w d o m e s t i c s e w a g e a t a m b i e n t t e m p e r a t u r e s u s i n g a g r a n u l a r b e d U A S B r e a c t o r . B i o t e c h n o l . B i o e n g . 2 5 : 1 7 0 1 - 1 7 2 3 . L e t t i n g a , G . , L . W . H u l s h o f f P a l , I . W . K o s t e r , W . M . W i e g a n t , W . J . d e Z e e u w , A . R i n z e m a , D . C . G r i n , R . E . R o e r s m a , a n d S W . H o b m a . 1 9 8 4 . H i g h - r a t e a n a e r o b i c w a s t e w a t e r t r e a t m e n t u s i n g t h e U A S B r e a c t o r u n d e r a w i d e r a n g e o f t e m p e r a t u r e c o n d i t i o n s . B i o t e c h n o l . G e n e t . E n e r g . R e v . 2 : 2 5 3 - 2 8 4 . L e t t i n g a , G . , W . J . d e Z e e u w , L . H u l s h o f f P o l , W . M . W i e g a n t , a n d A . R i n z e m a . 1 9 8 5 . A n a e r o b i c w a s t e w a t e r t r e a t m e n t b a s e d o n b i o m a s s r e t e n t i o n w i t h e m p h a s i s o n t h e U A S B p r o c e s s . I n C h i n a S t a t e B i o g a s A s s o c i a t i o n ( e d ) , A n a e r o b i c d i g e s t i o n 1 9 8 5 . G u a n g z h o u , C h i n a . p p 2 7 9 - 3 0 1 . L e t t i n g a , G . , a n d L . H u l s h o f f P o l . 1 9 9 0 . A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y , W a g e n e g e n , t h e N e t h e r l a n d s , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n . L j u n g d a h l , L . G . 1 9 8 6 . T h e a u t a t r a p h i c p a t h w a y o f a c e t a t e s y n t h e s i s i n a c e t o g e n i c b a c t e r i a . A n n u . R e v . M i c r o b i o l . 4 0 : 4 1 5 - 4 5 0 . 3 8 6 L o r o w i t z , W . H . , H . X . Z h a o , a n d M . P . B r y a n t . 1 9 8 9 . S y n t r o p h o m o n a s w o l f e i s u b s p . n o v . , a l o n g - c h a i n f a t t y - a c i d - d e g r a d i n g , a n a e r o b i c , s y n t r o p h i c b a c t e r i u m ; S y n t r o p h o m o n a s w o l f e i s u b s p . w o l f e i s u b s p . n o v . ; a n d a m e n d e d d e s c r i p t i o n s o f t h e g e n u s a n d s p e c i e s . I n t . J . S y s t . B a c t e r i o l . 3 9 : 1 2 2 - 1 2 6 . L o v l e y , D . R . , a n d M . K l u g . 1 9 8 2 . I n t e r m e d i a r y m e t a b o l i s m o f o r g a n i c m a t t e r i n t h e s e d i m e n t s o f a e u t r o p h i c l i k e . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 3 : 5 5 2 - 5 6 0 . L u i , Y . , D . R . B o o n e , R . S l e a t , a n d R . A . M a h . 1 9 8 5 . M e t h a n o s a r c i n a m a z e i L Y C , a n e w m e t h a n o g e n i c i s o l a t e w h i c h p r o d u c e s a d i s a g g r e g a t i n g e n z y m e . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 9 : 6 0 8 - 6 1 3 . L u i , K . , X . L u i , H . X u . 1 9 8 5 . T h e r e s e a r c h o f t r e a t i n g t h e s t a r c h w a s t e s b y i m p r o v i n g t h e U A S B r e a c t o r s . P o s t e r p r e s e n t e d a t t h e 4 t h I n t e r n a t i o n a l S y m p o s i u m o n A n a e r o b i c D i g e s t i o n . G u a n g z h o u , C h i n a , N o v . 1 1 - 1 5 , 1 9 8 5 . M a c a r i o , A . J . L . , a n d E . C o n w a y d e M a c a r i o . 1 9 8 3 . A n t i g e n i c fi n g e r p r i n t i n g o f m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a w i t h p o l y c l o n a l a n t i b o d y p r o b e s . S y s t . A p p l . M i c r o b i o l . 4 : 4 5 1 - 4 5 8 . M a c a r i o , A . J . L . , a n d E . C o n w a y d e M a c a r i o . 1 9 8 5 . M o n o c l o n a l a n t i b o d i e s o f d e fi n e d m o l e c u l a r s p e c i fi t y f o r i d e n t i fi c a t i o n a n d f o r p r o b i n g t h e i r e c o l o g i c n i c h e s . I n : M a c a r i o , A . J . L . , a n d E . C o n w a y d e M a c a r i o ( e d ) , M o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a g a i n s t b a c t e r i a , V o l . 2 . A c a d e m i c P r e s s , I n c . , O r l a n d o , F L . p p 2 1 3 - 2 4 7 . M a c a r i o , A . J . L . , a n d E . C o n w a y d e M a c a r i o . 1 9 8 8 . Q u a n t i t a t i v e i m m u n o l o g i c a n a l y s i s o f t h e m e t h a n o g e n i c fl o r a o f d i g e s t o r s r e v e a l s a c o n s i d e r a b l e d i v e r s i t y . A p p l . E n v i r o n . , M i c r o b i o l . 5 4 : 7 9 - 8 6 . M a c D o n e l l , M . T . , E . R u s s e k , a n d R . R . C a l w e l l . 1 9 8 4 . A n i n t e r a c t i v e m i c r o c o m p u t e r p r o g r a m f o r t h e c o m p u t a t i o n o f m o s t p r o b a b l e n u m b e r . J . M i c r o b i o l . M e t h . 2 : 1 - 7 . M a c k i e , R . I . , a n d M . P . B r y a n t . 1 9 8 1 . M e t a b o l i c a c t i v i t y o f f a t t y a c i d - o x i d i z i n g b a c t e r i a a n d t h e c o n t r i b u t i o n o f a c e t a t e , p r o p i o n a t e , b u t y r a t e , a n d C O , t o m e t h a n o g e n e s i s i n c a t t l e w a s t e a t 4 0 a n d 6 0 ° C . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 1 : 1 3 6 3 - 1 3 7 3 . M a h , R . A . 1 9 8 0 . I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f M e t h a n o c o c c u s m z e i . C u r r . M i c r o b i a l . 3 : 3 2 1 - 3 2 6 . 3 8 7 M a h , R . A . , a n d D . A . K u h n . 1 9 8 4 . T r a n s f e r o f t h e t y p e s p e c i e s o f t h e g e n u s M e t h a n o c o c c u s m a z e i t o t h e g e n u s M e t h a n o s a r c i n a , n a m i n g i t M e t h a n o s a r c i n a m a z e i ( B a r k e r 1 9 3 6 ) c o m b . n o v . e t e m e n d a n d c o n s e r v a t i o n o f t h e g e n u s M e t h a n o c o c c u s ( A p p r o v e d L i s t s 1 9 8 0 ) w i t h M e t h a n o c o c c u s v a n n i e l i i ( A p p r o v e d L i s t s 1 9 8 0 ) a s t h e t y p e s p e c i e s . I n t . J . S y s t . B a c t e r i o l . 3 4 : 2 6 3 - 2 6 5 . M a h o n e y , E . M . , L . K . V a r a n g u , W . L . C a i r n s , a n d N . K o s a r i c . 1 9 8 4 . C e l l s u r f a c e a n d a g g r e g a t i o n s t u d i e s o f m i c r o b e s f r o m a n a e r o b i c s y s t e m s . P a p e r p r e s e n t e d a t t h e 5 7 t h W P C F c o n f e r e n c e , N e w O r l e a n s , L o u i s i a n a , O c t o b e r 1 - 4 , 1 9 8 4 . M a n j u n a t h , D . L . , I . M e h r o t r a , a n d R . P . M a t h u r . 1 9 8 9 . T r e a t m e n t o f c a n e s u g a r m i l l w a s t e w a t e r i n u p fl a w a n a e r o b i c s l u d g e b l a n k e t ( U A S B ) r e a c t o r s . I n 4 4 t h P u r d u e i n d u s t r i a l w a s t e c o n f e r e n c e p r o c e e d i n g s . L e w i s P u b l i s h e r s , C h e l s e a , M I . p p 2 1 5 - 2 2 3 . M a u p i n , P . , a n d T . D . P o l l a r d . 1 9 8 3 . I m p r o v e d p r e s e r v a t i o n a n d s t a i n i n g o f h e l a c e l l a c t i o n fi l a m e n t s , c l a t h r b c o a t e d m e m b r a n e s , a n d o t h e r c y t o p l a s m i c s t r u c t u r e s b y t a n n i c a c i d g l u t a r a l d e h y d e - s a p o n i n fi x a t i o n . J . C e l l . B i o l . 9 6 : 5 1 - 6 2 . M c C a r t y , P . L . 1 9 7 4 . A n a e r o b i c p r o c e s s . P r e s e n t e d a t t h e B i r m i n g h a m c o u r s e o n d e s i g n a s p e c t s o f b i o l o g i c a l t r e a t m e n t , I n t e r n a t i o n a l A s s o c i a t i o n o f W a t e r P o l l u t i o n r e s e a r c h , U . K . M c C a r t y , P . L . 1 9 8 2 . O n e h u n d r e d y e a r s o f a n a e r o b i c t r e a t m e n t . I n H u g h e s , D . E . , D . A . S t a f f o r d , B . I . W h e a t l e y , W . B a a d e r , G . L e t t i n g a , E . J . N y n s , W . V e r s r a e t e , a n d R . L . W e n t w o r t h ( e d s . ) , A n a e r o b i c d i g e s t i o n 1 9 8 1 . E l s e v i e r b i o m e d i c a l P r e s s , A m s t e r d a m . p p 3 - 2 2 . M c I n e m e y , M . J . , M . P . B r y a n t , a n d D . A . S t a f f o r d 1 9 7 9 a . M e t a b o l i c s t a g e s a n d e n e r g e t i c s o f m i c r o b i a l a n a e r o b i c d i g e s t i o n . I n S t a f f o r d , D . A . , B . I . W h e a t l e y a n d D . E . H u g h e s ( e d ) , A n a e r o b i c d i g e s t i o n . A p p l i e d S c i e n c e P u b l i s h e r s L t d , C a r d i f f , U K . p p 9 1 - 9 8 . M c I n e m e y , M . J . , M . P . B r y a n t , a n d N . P f e n n i n g . 1 9 7 9 b . A n a e r o b i c b a c t e r i u m t h a t d e g r a d e s f a t t y a c i d s i n s y n t r o p h i c a s s o c i a t i o n w i t h m e t h a n o g e n s . A r c h . M i c r o b i o l . 1 2 2 : 1 2 9 - 1 3 5 . M c I n e m e y , M . J . , a n d M . P . B r y a n t . 1 9 8 0 . S y n t r o p h i c A s s o c i a t i o n o f H , - p r o d u c i n g a l c o h o l a n d f a t t y a c i d - d e g r a d i n g b a c t e r i a i n a n a e r o b i c d e g r a d a t i o n o f o r g a n i c m a t t e r . I n G o t t s c b a l k e t a l . ( e d s ) , A n a e r o b e s a n d a n a e r o b i c i n f e c t i o n s . G u s t a v F i s c b e r V e r l a g , S t u t t g a r t , N e w Y o r k . p p 1 1 7 - 1 2 6 . 3 8 8 M c I n e m e y , M . J . , a n d M . P . B r y a n t . 1 9 8 1 . A n a e r o b i c d e g r a d a t i o n o f l a c t a t e b y s y t r o p h i c a s s o c i a t i o n s o f M e t h a n o s a r c i n a b a r k e r i a n d D e s u l f o v i b r i o s p e c i e s a n d e f f e c t o f H , o n a c e t a t e d e g r a d a t i o n . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 1 : 3 4 6 - 3 5 4 . M c I n e m e y , M . J . , M . P . B r y a n t , R . B . H e s p e l l , a n d J . W . C o s t e r t o n . 1 9 8 1 . S y n t r o p h o m o n a s w o l f e i g e n . n o v . , a n a n a e r o b i c , s y n t r o p h i c , f a t t y a c i d - o x i d i z i n g b a c t e r i u m . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 1 : 1 0 2 9 - 1 0 3 9 . M c I n e m e y , M . J . 1 9 8 8 . A n a e r o b i c h y d r o l y s i s a n d f e r m e n t a t i o n o f f a t s a n d p r o t e i n s . I n Z e h n d e r , A . J . B . ( e d ) , B i o l o g y o f a n a e r o b i c m i c r o o r g a n i s m s , J o h n W i l e y & S o n s , N e w Y o r k . p p 3 7 3 - 4 1 6 . M i n , H . , a n d S . H . Z i n d e r . 1 9 8 9 . K i n e t i c s o f a c e t a t e u t i l i z a t i o n b y t w o t h e r m o p h i l i c a c e t o t r a p h i c m e t h a n o g e n s : M e t h a n o s a r c i n a s p . s t r a i n C A L S - l a n d M e t h a n o t h r i x s p . s t r a i n C A L S - l . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 5 : 4 8 8 - 4 9 1 . M i n k , R . W . , a n d P . R . D u g a n . 1 9 7 7 . T e n t a t i v e i d e n t i fi c a t i o n o f m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a b y fl u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 3 3 : 7 1 3 - 7 1 7 . M o l l e r , B . , R . O s s m e r , B . H . H o w a r d , G . G o t t s c h a l k , a n d H . H i p p e . 1 9 8 3 . S p o r o m u s a , a n e w g e n u s o f g r a m - n e g a t i v e a n a e r o b i c b a c t e r i a i n c l u d i n g S p o r o m u s a s p h a e r o i d e s s p e c . n o v . a n d S p o r o m u s a o v a t a s p e c . n o v . A r c h . M i c r o b i o l . 1 3 9 : 3 8 8 - 3 9 6 . M o r v a i , L . , P . M i h é l t z , L . C z a k o , M . P e t e r f y , a n d J . H a l l o . 1 9 9 0 . T h e i n fl u e n c e o f o r g a n i c l o a d o n g r a n u l a r s l u d g e d e v e l o p m e n t i n a n a c e t a t e — f e d s y s t e m . A p p l . M i c r o b i o l . B i o t e c h n o l . 3 3 : 4 6 3 - 4 6 8 . M o u n t f o r t , B D . , a n d M . P . B r y a n t . 1 9 8 2 . I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a n a n a e r o b i c s y n t r o p h i c b e n z o a t e - d e g r a d i n g b a c t e r i u m f r o m s e w a g e s l u d g e . A r c h . M i c r o b i o l . 1 3 3 : 2 4 9 - 2 5 6 . M o u n t f o r t , D . 0 . , W . J . B r u l l a , L . R . K r u m h o l t z , a n d M . P . B r y a n t . 1 9 8 4 . S y n t r o p h u s b u s w e l l i i g e n . n o v . , s p . n o v . : a b e n z o a t e - d e g r a d i n g b a c t e r i u m f r o m s e w a g e s l u d g e . A r c h . M i c r o b i o l . 1 3 3 : 2 4 9 - 2 5 6 . M o u n t f o r t , D . O . 1 9 8 7 . T h e r u m e n a n a e r o b i c f u n g i . F E M S M i c r o b i o l . R e v . 4 6 : 4 0 1 - 4 0 8 . M u c h a , H . , F . L i n g e n s , a n d W . T r o s c h . 1 9 8 8 . C o n v e r s i o n o f p r o p i o n a t e t o a c e t a t e a n d m e t h a n e b y s y n t r o p h i c c o n s t o r t i a . A p p l . M i c r o b i o l . B i o t e c h n o l . 2 7 : 5 8 1 - 5 8 6 . 3 8 9 M u r r a y , W . D . , a n d L . v a n d e n B e r g . 1 9 8 1 . e f f e c t s o f n i c k e l . c o b a l t , a n d m o l y b d e n u m o n p e r f o r m a n c e o f m e t h a n o g e n i c fi x e d - fi l m r e a c t o r s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 2 : 5 0 2 - 5 0 5 . N a g a i , S . , a n d N . N i s h i o . 1 9 9 0 . A p p l i c a t i o n o f M e t h a n o s a r c i n a b a r k e r i c e l l s f o r t h e p r o d u c t i o n o f u s e f u l c h e m i c a l s . I n T . K . G h o s e ( e d ) , B i o p r o c e s s e n g i n e e r i n g : t h e fi r s t g e n e r a t i o n . E l l i s H o r w o o d L i m i t e d P u b l i s h e r s , C h i c h e s t e r . U . K . p p 2 9 1 - 3 0 2 . N g i a n , R . F . , S . H . L i n , a n d W . R . B . M a r t i n . 1 9 7 7 . E f f e c t o f m a s s t r a n s f e r r e s i s t a n c e o n t h e L i n e w e a v e r - B u r k p l o t s f o r fl o c c u l a t i n g m i c r o o r g a n i s m s . B i o t e c h . B i o e n g . 1 9 : 1 7 7 3 - 1 7 8 4 . N i s h i o , N . , S . Y . E g u c h i , K . R y u n o , H . K a w a s h i m a , a n d S . N a g a i . 1 9 8 3 a . I s o l a t i o n o f a f o r m a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n i c b a c t e r i u m b y a c h e m o s t a t c u l t u r e t e c h n i q u e . J . F e r m e n t . T e c h n o l . 6 1 : 4 3 7 - 4 4 1 . N i s h i o , N . , S . Y . E g u c h i , H . K a w a s h i m a , a n d S . N a g a i . 1 9 8 3 b . M u t u a l c o n v e r s i o n b e t w e e n H , p l u s C O , a n d f o r m a t e b y a f o r m a t e - u t i l i z i n g m e t h a n o g e n . J . F e r m e n t . T e c h n o l . 6 1 : 5 5 7 - 5 6 1 . N o v a e s , R . F . V . , C . M . R e c h , M . G . F i g u e i r e d o a n d L . A . G i a j - L e v r a . 1 9 8 8 . B a c t e r i a l i d e n t i fi c a t i o n o f g r a n u l a r s l u d g e f r o m d o m e s t i c s e w a g e U A S B - r e a c t o r . I n T i l c h e , A . , a n d A . R o z z i . ( e d ) , P o s t e r - p a p e r s , fi f t h i n t e r n a t i o n a l s y m p o s i u m a n a n a e r o b i c d i g e s t i o n . B o l o g n a , I t a l y , 2 2 - 2 6 M a y 1 9 8 8 . p p 6 1 - 6 4 . O i , S . , G . D h a v i s e s , P . S r i p r a s e t s a k , T . T a n a k a , a n d T . M a k o t o . 1 9 8 5 . M e t h a n e f e r m e n t a t i o n o f a g r o - w a s t e a n d g r a s s e s . C h i n a S t a t e B i o g a s A s s o c i a t i o n ( e d s ) . A n a e r o b i c D i g e s t i o n 1 9 8 5 . G u a n g z h o u , C h i n a . p p . 1 4 5 - 1 5 7 . O l e s z k i e w i t z , J . A . , E . R . H a l l , a n d I . Z . O z i e m b l o . 1 9 8 6 . P e r f o r m a n c e o f l a b o r a t o r y a n a e r o b i c h y b r i d r e a c t o r s w i t h v a r y i n g d e p t h s o f m e d i a . E n v i r o n . T e c h n o l . L e t t . 7 : 4 4 5 - 4 5 2 . O ’ R o u r k e J . T . 1 9 6 9 . K i n e t i c s o f a n a e r o b i c w a s t e t r e a t m e n t a t r e d u c e d t e m p e r a t u r e s . P h . D . T h e s i s . S t a n f o r d U n i v e r s i t y , C A , U . S . A . O r o z c o . A . 1 9 8 8 . A n a e r o b i c w a s t e w a t e r t r e a t m e n t u s i n g a n o p e n p l u g fl o w b a f fl e d r e a c t o r a t l o w t e m p e r a t u r e . I n T i l c h e , A . , a n d A . R o z z i . ( e d s . ) P o s t e r - p a p e r s , fi f t h i n t e r n a t i o n a l s y m p o s i u m a n a n a e r o b i c d i g e s t i o n . B o l o g n a , I t a l y , 2 2 - 2 6 M a y 1 9 8 8 . p p 7 5 9 - 7 6 2 . 3 9 0 O z t u r k , S . S . , B . O . P a l s s o n , a n d J . H . T h i e l e . 1 9 8 9 . C o n t r o l o f i n t e r s p e c i e s e l e c t r o n t r a n s f e r fl o w d u r i n g a n a e r o b i c d i g e s t i o n : d y n a m i c d i f f u s i o n r e a c t i o n m o d e l s f o r h y d r o g e n g a s t r a n s f e r i n m i c r o b i a l fl o c s . B i o t e c h . B i o e n g . 3 3 : 7 4 5 - 7 5 7 . P a t e l , G . B . , L . A . R o t h , L . v a n d e n B e r g , a n d D . S . C l a r k . 1 9 7 6 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f a s t r a i n o f M e t h a n o s p i r i l l u m h u n g a t e i . C a n . J . M i c r o b i o l . 2 2 : 1 4 0 4 - 1 4 1 0 . P a t e l , G . B . , A . W . K h a n , a n d L . A . R o t h . 1 9 7 8 . O p t i m u m l e v e l s o f s u l f a t e a n d i r o n f o r t h e c u l t i v a t i o n o f p u r e c u l t u r e o f m e t h a n o g e n s i n s y n t h e t i c m e d i a . J . A p p l . B a c t e r i a l . 4 5 : 3 4 7 - 3 5 6 . P a t e l , G . B . , L . A . R o t h , a n d G . D . S p r o t t . 1 9 7 9 . F a c t o r s i n fl u e n c i n g fi l a m e n t l e n g t h o f M e t h a n o s p r i l l u m h u n g a t i i . J . G e m e r a l M i c r o b i a l . 1 1 2 : 4 1 1 - 4 1 5 . P a t e l , G . B . 1 9 8 4 . C h a r a c t e r i z a t i o n a n d n u t r i t i o n a l p r o p e r t i e s o f M e t h a n o t h r i x c o n c i l i i s p . n o v . , a m e s o p h i l i c a c e t o c l a s t i c m e t h a n o g e n . C a n . J . M i c r o b i o l . 3 0 : 1 3 8 3 - 1 3 9 6 . P a t e l , G . B . , a n d G . D . S p r o t t . 1 9 9 0 . M e t h a n o s a e t a c o n c i l i i g e n . n o v . , s p . n o v . ( " M e t h a n o t h r i x c o n c i l i i " ) a n d M e t h a n o s a e t a t h e r m o a c e t o p h i l a . , c o m b . n o v . I n t . J . S y s t . B a c t e r i a l . 4 0 : 7 9 - 8 2 . P a t t e , K . C . , a n d A . I . V e r s p r i l l e . 1 9 8 2 . A p p l i c a t i o n o f t h e U . A . S . B . - c o n c e p t f o r w a s t e w a t e r t r e a t m e n t . I n H u g h e s , D . B . , D . A . S t a f f o r d , B . I . W h e a t l e y , W . B a a d e r , G . L e t t i n g a , E . J . N y n s , W . V e r s r a e t e , a n d R . L . W e n t w o r t h ( e d ) , A n a e r o b i c d i g e s t i o n 1 9 8 1 . E l s e v i e r B i o m e d i c a l P r e s s , A m s t e r d a m , p p 1 2 1 - 1 3 3 . P e r r y , R . B . , D . W . G r e e n , a n d J . O . M a l o n e y ( e d ) . 1 9 8 4 . P e e r y ’ s C h e m i c a l E n g i n e e r s ’ H a n d b o o k , 1 6 t h e d i t i o n . M c G r a w - H i l l , I n c . , N e w Y o r k . p p 3 - 2 7 5 t o 3 - 3 3 5 . P h e l p s , T . J . , R . C o n r a d a n d J . G . Z e i k u s . 1 9 8 5 . S u l f a t e - d e p e n d e n t i n t e r s p e c i e s H , t r a n s f e r b e t w e e n M e t h a n o s a r c i n a b a r k e r i a n d D e s u l f o v i b r i o v u l g a r i s d u r i n g c o c u l t u r e m e t a b o l i s m o f a c e t a t e o r m e t h a n o l . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 0 : 5 8 9 - 5 9 4 . P o r t e r , K . G . , a n d Y . S . F e i g . 1 9 8 0 . T h e u s e o f D A P I f o r i d e n t i f y i n g a n d c o u n t i n g a q u a t i c m i c r o fl o r a . L i r n n . O c e a n . 2 5 : 9 4 3 - 9 4 8 . P r e n s i e r , G . , H . C . D u b o u r g u i e r , 1 . T h o m a s , G . A l b a g n a c . a n d M . N . B u i s s o n . 1 9 8 8 . S p e c i fi c i m m u n o l o g i c a l p r o b e s f o r s t u d y i n g t h e b a c t e r i a l a s s o c i a t i o n s i n g r a n u l e s a n d b i o fi h n s . I n L e t t i n g a , G . , A . J . B . Z e h n d e r , J . T . C . G r o t e n h u i s , a n d L . W . H u l s h o f f P o l ( e d ) , G r a n u l a r a n a e r o b i c s l u d g e ; m i c r o b i o l o g y a n d T e c h n o l o g y . P u d o c , W a g e n i n g e n , N e t h e r l a n d s , 1 9 8 8 . p p 5 5 - 6 1 . 3 9 1 R i n z e m a , A . , J . v a n L i e r , a n d G . L e t t i n g a . 1 9 8 8 . S o d i u m i n h i b i t i o n o f a c e t o c l a s t i c m e t h a n o g e n s i n g r a n u l a r s l u d g e f r o m a U A S B r e a c t o r . I n L e t t i n g a , G . , A . J . B . Z e h n d e r , J . T . C . G r o t e n h u i s , a n d L . W . H u l s h o f f P o l ( e d ) , G r a n u l a r a n a e r o b i c s l u d g e ; m i c r o b i o l o g y a n d t e c h n o l o g y . P u d o c , W a g e n i n g e n , N e t h e r l a n d s , 1 9 8 8 . p p 2 1 6 - 2 2 2 . R o b i n s o n , R . W . , D . E . A k i n , R . A . N o r d s t e d t , M . V . T h o m a s , a n d H . C . A l d r i c h . 1 9 8 4 . L i g h t a n d e l e c t r o n m i c r o s 0 0 p i c e x a m i n a t i o n s o f m e t h a n e - p r o d u c i n g b i o fi l m s f r o m A n a e r o b i c fi x e d - b e d r e a c t o r s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 8 : 1 2 7 - 1 3 6 . R o b i n s o n , R . W . 1 9 8 6 . L i f e c y c l e s i n t h e m e t h a n o g e n i c a r c h a e b a c t e r i u m M e t h a n o s a r c i n a m a z e i . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 2 : 1 7 - 2 7 . R o s e n b e r g , M . , D . G u t n i c k , a n d E . R o s e n b e r g . 1 9 8 0 . A d h e r e n c e o f b a c t e r i a t o h y d r o c a r b o n s : a s i m p l e m e t h o d f o r m e a s u r i n g c e l l - s u r f a c e h y d r o p h o b i c i t y . F E M S M i c r o b i o l . L e t t . 9 : 2 9 - 3 3 . R o y , F . , G . A l b a g n a c , a n d E . S a m a i n . 1 9 8 5 . I n fl u e n c e o f c a l c i u m a d d i t i o n o n g r o w t h o f h i g h l y p u r i fi e d s y n t r o p h i c c u l t u r e s d e g r a d i n g l o n g - c h a i n f a t t y a c i d s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 9 : 7 0 2 - 7 0 5 . R o y , F . , E . S a m a i n , H . C . D u b o u r g u i e r , a n d G . A l b a g n a c . 1 9 8 6 . S y n t r o p h o m o n a s s a p o v o r a n s s p . n o v . , a n e w o b l i g a t e l y p r o t o n r e d u c i n g a n a e r o b e o x i d i z i n g s a t u r a t e d a n d u n s a t u r a t e d l o n g c h a i n f a t t y a c i d s . A r c h . M i c r o b i o l . 1 4 5 : 1 4 2 - 1 4 7 . S a m a i n , B . , H . C . D u b o u r g u i e r , a n d G . A l b a g n a c . 1 9 8 4 . I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f D e s u l f o b u l b u s e l o n g a t u s s p . n o v . f r o m a m e s o p h i l i c i n d u s t r i a l d i g e s t e r . S y s t . A p p l . M i c r o b i o l . 5 : 3 9 1 - 4 0 1 . S a m a i n , B . , R . M o l e t t a , H . C . D u b o u r g u i e r , a n d G . A l b a g n a c . 1 9 8 7 . P r 0 p i o n a t e c o n v e r s i o n t o b u t y r a t e i n a n a n a e r o b i c d i g e s t e r . I n A n t o n o p o u l o s , A . A . ( e d s ) . B i o t e c h n o l o g i c a l a d v a n c e i n p r o c e s s i n g m u n i c i p a l w a s t e s f o r f u e l s a n d c h e m i c a l s . N o y e s D a t a C o r p . , P a r k R i d g e , N . J . , U . S . A . , 1 9 8 7 . p p 2 2 3 - 2 3 3 . S a m - S o o n , P . A . L . N . S . , R . E . L o o e w e n t h a l , P . L . D o l d , a n d G . V . R . M a r a i s . 1 9 8 8 . P e l l e t i z a t i o n i n u p fl o w a n a e r o b i c s l u d g e b e d r e a c t o r s . I n H a l l , E . R . , a n d P . N . H o b s o n ( e d ) , A n a e r o b i c D i g e s t i o n 1 9 8 8 . P e r g r a m o n P r e s s , O x f o r d , U . K . p p 5 5 - 6 0 . 3 9 2 S a x , R . I . , 1 9 8 5 . A n a e r o b i c p r e t r e a t m e n t o f b r e w e r y w a s t e w a t e r o n t h e i n d u s t r i a l s c a l e . I n P r o c e e d i n g s o f t h e 4 0 t h i n d u s t r i a l w a s t e c o n f e r e n c e , P u r d u e U n i v e r s i t y , W e s t L a f a y e t t e , I n d i a n a . p p 5 9 - 6 8 . S a y e d , S . W . d e Z e e u w , a n d G . L e t t i n g a . 1 9 8 4 . A n a e r o b i c t r e a t m e n t o f s l a u g h t e r h o u s e w a s t e u s i n g a fl o c c u l e n t s l u d g e U A S B r e a c t o r . A g r i c u l t u r a l W a s t e s , 1 1 : 1 9 7 - 2 2 6 . S c h a u e r , N . L . , a n d J . G . F e r r y . 1 9 8 0 . M e t a b o l i s m o f f o r m a t e i n M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m . J . B a c t e r i o l . 4 2 : 8 0 0 - 8 0 7 . S c h a u e r , N . L . , D . P . B r o w n , a n d J . G . F e r r y . 1 9 8 2 . K i n e t i c s o f f o r m a t e m e t a b o l i s m i n M e t h a n o b a c t e r i u m f o r m i c i c u m a n d M e t h a n o s p i r i l l u m h u n g a t e i . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 4 : 5 4 9 - 5 5 4 . S c h i n k , B . , a n d R . K . T h a u e r . 1 9 8 8 . E n e r g e t i c s o f s y n t r o p h i c m e t h a n e f o r m a t i o n a n d t h e i n fl u e n c e o f a g g r e g a t i o n . I n L e t t i n g a , G . , A . J . B . Z e h n d e r , J . T . C . G r o t e n h u i s , a n d L . W . H u l s h o f f P o l . ( e d ) , G r a n u l a r a n a e r o b i c s l u d g e ; m i c r o b i o l o g y a n d t e c h n o l o g y . P u d o c , W a g e n i n g e n , N e t h e r l a n d s , 1 9 8 8 . p p 5 - 1 7 . S c h o n h e i t , P . , J . K . K r i s t j a n s s o n , R . K . T h a u e r . 1 9 8 2 . K i n e t i c m e t h a n n i s m f o r t h e a b i l i t y o f s u l f a t e r e d u c e r s t o o u t - c o m p e t e m e t h a n o g e n s f o r a c e t a t e . A r c h . M i c r o b i o l . 1 3 2 : 2 8 5 - 2 8 8 . S c h r o e p f e r , G . J . , W . J . F u l l e r , A S . J o h n s o n N . R . Z i e m k e , a n d J . J . A n d r e r s o n . 1 9 5 5 . T h e a n a e r o b i c c o n t a c t p r o c e s s a s a p p l i e d t o p a c k i n g h o u s e w a s t e s . S e w a g e I n d . W a s t e s . 2 7 : 4 6 0 - 4 8 6 . S h e l t o n , D . R . , a n d J . M . T i e d j e . 1 9 8 4 . I s o l a t i o n a n d p a r t i a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f b a c t e r i a i n a n a n a e r o b i c c o n s o r t i u m t h a t r n i n e r a l i z e s 3 - c h l o r o b e n z o i c a c i d A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 8 : 8 4 0 - 8 4 8 . S h e n , L . 1 9 8 5 . A p i l o t s c a l e e x p e r i m e n t o n a l c o h o l d i s t i l l e r y w a s t e w a t e r t r e a t m e n t w i t h u p fl o w a n a e r o b i c s l u d g e b l a n k e t r e a c t o r . I n C h i n a S t a t e B i o g a s A s s o c i a t i o n . ( e d ) , A n a e r o b i c d i g e s t i o n 1 9 8 5 . G u a n g z h o u , C h i n a . p p 4 1 6 - 4 1 7 . S i e r r a - A l v a r e z , R . , L . W . H u l s h o f f P o l , G . L e t t i n g a . 1 9 8 8 . S t a r t - u p o f a U A S B r e a c t o r o n a c a r b o h y d r a t e s u b s t r a t e . I n L e t t i n g a , G . , A . J . B . Z e h n d e r , J . T . C . G r o t e n h u i s , a n d L . W . H u l s h o f f P o l ( e d ) , G r a n u l a r a n a e r o b i c s l u d g e ; m i c r o b i o l o g y a n d t e c h n o l o g y . P u d o c , W a g e n i n g e n , N e t h e r l a n d s . p p 2 2 3 - 2 2 8 . S m i t h , R . L . , a n d M . J . K l u g . 1 9 8 1 . E l e c t r o n D o n o r s u t i l i z e d b y s u l f a t e - r e d u c i n g b a c t e r i a i n e u t r o p h i c l a k e s e d i m e n t s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 2 : 1 1 6 - 1 2 1 . 3 9 3 S m i t h , M . R . , a n d R . A . M a h . 1 9 6 6 . K i n e t i c s o f a c e t a t e m e t a b o l i s m d u r i n g s l u d g e d i g e s t i o n . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 1 4 : 3 6 8 - 3 7 1 . S n o e y i n k , V . L . , a n d D . J e n k i n s . 1 9 8 0 . W a t e r c h e m i s t r y . J o h n W i l e y & S o n s , N e w Y o r k . S t a n d e r . G . J . , G . C . C i l l i e , W . R . R o s s , a n d R . D . B a i l l i e . 1 9 6 7 . T r e a t m e n t o f w i n e d i s t i l l e r y w a s t e s b y a n a e r o b i c d i g e s t i o n . I n P r o c e e d i n g s o f t h e 2 2 n d i n d u s t r i a l w a s t e c o n f e r e n c e , P u r d u e U n i v e r s i t y , W e s t L a f a y e t t e , I n d i a n a . p p 8 9 2 - 9 0 7 . S t e t t e r . K . O . , M . T h o m m , J . W i n t e r , G . W i l d g r a b e r , H . H u b e r , W . Z i l l i n g , D . J a n é c o v i c , H . K o n i g , P . P a l m , a n d S . W u n d e r l . 1 9 8 1 . M e t h a n o t h e r m u s f e r v i d u s s p . n o v . , a n o v e l e x t r e m e l y t h e n n o p h i l i c m e t h a n o g e n i s o l a t e d f r o m a n I c e l a n d i c h o t s p r i n g . Z e n t . B a k t e r i o l . H y g . , I . A b t . O r i g . C 2 , 1 6 6 - 1 7 8 . S t i e b , M . , a n d B . S c h i n k . 1 9 8 5 . A n a e r o b i c o x i d a t i o n o f f a t t y a c i d s b y C l o s t r i d i u m b r y a n t i i s p . n o v . , a s p o r e f o r r n i n g , o b l i g a t e l y s y n t r o p h i c b a c t e r i u m . A r c h . M i c r o b i o l . 1 4 0 : 3 8 7 - 3 9 0 . S t i e b , M . , a n d B . S c h i n k . 1 9 8 6 . A n a e r o b i c d e g r a d a t i o n o f i s o v a l e r a t e b y a d e fi n e d m e t h a n o g e n i c c o c u l t u r e . A r c h . M i c r o b i o l . 1 4 4 : 2 9 1 - 2 9 5 . S t i e b , M . , a n d B . S c h i n k . 1 9 8 9 . A n a e r o b i c d e g r a d a t i o n o f i s o b u t y r a t e b y m e t h a n o g e n i c e n r i c h m e n t c u l t u r e s a n d b y a D e s u l f o c o c c u s m u l t i v o r a n s s t r a i n . A r c h . M i c r o b i o l . 1 5 1 : 1 2 6 - 1 3 2 . S w i t z e n b a u m , M . S . , a n d R . B . E i r n s t a d . 1 9 8 7 . A n a l y s i s o f a n a e r o b i c b i o fi l m s . E n v i r o n . T e c h n o l . L e t t . 8 : 2 1 - 3 2 . T a k a s h i m a , M . , a n d R . E . S p e e c e . 1 9 8 8 . M i n e r a l n u t r i e n t r e q u i r e m e n t s f o r h i g h r a t e m e t h a n e f e r m e n t a t i o n o f a c e t a t e a t l o w S R T . P r e s e n t e d a t t h e 6 1 s t A n n u a l C o n f e r e n c e o f W a t e r P o l l u t i o n C o n t r o l f e d e r a t i o n , D a l l a s , T e x a s , O c t . 5 , 1 9 8 8 . T a t t o n , M . J . , D . B . A r c h e r , G . E . P o w e l l , a n d M . L . P a r k e r . 1 9 8 9 . M e t h n o g e n e s i s f r o m e t h a n o l b y d e fi n e d m i x e d c o n t i n u o u s c u l t u r e s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 5 : 4 4 0 - 4 4 5 . T a y l o r , B . F . , a n d R . S . O r e m l a n d 1 9 7 9 . D e p l e t i o n o f a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e i n D e s u l f o v i b r i o b y o x y a n i o n s o f g r o u p V I e l e m e n t s . C u r r . M i c r o b i a l . 3 : 1 0 1 - 1 0 3 . T h a u e r , R . K . , K . J u n g e r r n a n n , a n d K . D e c k e r . 1 9 7 7 . E n e r g y c o n s e r v a t i o n i n c h e m o t r o p h i c a n a e r o b i c b a c t e r i a . B a c t e r i a l . R e v . 4 1 : 1 0 0 - 1 8 0 . 3 9 4 T h i e l e , J . H . , M . C h a r t r a i n a n d J . G . Z e i k u s . 1 9 8 8 a . C o n t r o l o f i n t e r s p e c i e s e l e c t r o n fl o w d u r i n g a n a e r o b i c d i g e s t i o n : t h e r o l e o f fl o c f o r m a t i o n i n s y n t r o p h i c m e t h a n o g e n e s i s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 4 : 1 0 - 1 9 . T h i e l e , J . H . , W . - M . W u , S . P a n k r a t z , a n d M . K . J a i n . 1 9 8 8 b . H i g h p e r f o r m a n c e g r a n u l a r b i o c a t a l y s t s f o r s y n t r o p h i c b i o m e t h a n a t i o n s y s t e m s . P o s t e r p r e s e n t e d a t 1 9 8 8 A S M A n n u a l M e e t i n g , M i a m i B e a c h , F L . , 8 - 1 3 M a y , 1 9 8 8 . T h i e l e , J . H . , a n d L G . Z e i k u s . 1 9 8 8 a . C o n t r o l o f i n t e r s p e c i e s e l e c t r o n fl o w d u r i n g a n a e r o b i c d i g e s t i o n : t h e r o l e o f f o r m a t e v e r s u s h y d r o g e n t r a n s f e r s d u r i n g s y n t r o p h i c m e t h a n o g e n e s i s i n fl o c s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 4 : 2 0 - 2 9 . T h i e l e , J . H . , a n d J . G . Z e i k u s . 1 9 8 8 b . I n t e r a c t i o n s b e t w e e n h y d r o g e n - a n d f o r m a t e - p r o d u c i n g b a c t e r i a a n d m e t h a n o g e n s d u r i n g a n a e r o b i c d i g e s t i o n . I n E r i c k s o n , L . E . , a n d D . Y . C . F u n g ( e d s . ) , H a n d b o o k a n a n a e r o b i c f e r r n e n t a t i o n s . M a r c e l D e k k e r , I n c . , N e w Y o r k . p p 5 3 7 - 5 9 5 . T h i e l e , J . H . , W . - M . W u , M . K . J a i n a n d J . G . Z e i k u s . 1 9 9 0 . E c o e n g i n e e r i n g h i g h r a t e a n a e r o b i c d i g e s t i o n s y s t e m s : a n a l y s i s o f i m p r o v e d s y n t r o p h i c b i o m e t h a n a t i o n c a t a l y s t s . B i o t e c h . a n d B i o e n g . 3 5 : 9 9 0 - 9 9 9 . T h o l o z a n , J . L . , E . S a m a i n , a n d J . P . G r i v e t . 1 9 8 8 a . I s o m e r i z a t i o n b e t w e e n n — b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e i n e n r i c h m e n t c u l t u r e s . F E M S M i c r o b i o l . E c o l o g y . 5 3 : 1 8 7 - 1 9 1 . T h o l o z a n J . L . , E . S a m a i n , J . P . G r i v e t , a n d G . A l b a g a n c . 1 9 8 8 b . A c e t o g e n e s i s p a t h w a y s f r o m p r o p i o n a t e i n e n r i c h m e n t c u l t u r e . I n T i l c h e , A . , a n d A . R o z z i . ( e d s . ) , P o s t e r - p a p e r s , fi f t h i n t e r n a t i o n a l s y m p o s i u m a n a n a e r o b i c d i g e s t i o n . B o l o g n a , I t a l y , 2 2 - 2 6 M a y 1 9 8 8 . p p 8 5 - 9 0 . T h o l o z a n , J . L . , E . S a m a i n , J . P . G r i v e t , a n d G . A l b a g n a c . 1 9 9 0 . P r o p i o n a t e m e t a b o l i s m i n a m e t h a n o g e n i c e n r i c h m e n t c u l t u r e . D i r e c t r e d u c t i v e c a r b o x y l a t i o n a n d a c e t o g e n e s i s p a t h w a y s . F E M M i c r o b i a l . E c o l o g y . 7 3 : 2 9 1 - 2 9 8 . T i l c h e , A . , a n d X . Y a n g . 1 9 8 8 . L i g h t a n d s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p e o b s e r v a t i o n s o f t h e g r a n u l a r b i o m a s s o f e x p e r i m e n t a l S B A F a n d H A B R r e a c t o r s . I n L e t t i n g a , G . , A . J . B . Z e h n d e r , J . T . C . G r o t e n h u i s , a n d L . W . H u l s h o f f P o l ( e d . ) , G r a n u l a r a n a e r o b i c s l u d g e ; m i c r o b i o l o g y a n d t e c h n o l o g y . P u d o c , W a g e n i n g e n , N e t h e r l a n d s , 1 9 8 8 . p p 1 7 0 - 1 7 8 . T i l c h e , A . 1 9 9 0 . D i s c u s s i o n r e p o r t o n u p fl o w a n d d o w fl o w a n a e r o b i c fi l t e r s . P a p e r p r e s e n t e d a t I n t e r n a t i o n a l w o r k s h o p , a n a e r o b i c t r e a t m e n t t e c h n o l o g y f o r m u n i c i p a l a n d i n d u s t r i a l w a s t e w a t e r , S e p t e m b e r 2 3 - 2 6 , 1 9 9 0 , V a l l a d o l i d , S p a i n . 3 9 5 T o m e i , F . A . , J . S . M a k i , a n d P . M i t c h e l l . 1 9 8 5 . I n t e r a c t i o n i n s y n t r o p h i c a s s o c i a t i o n s o f e n d o s p o r e - f o r r n i n g , b u t y r a t e — d e g r a d i n g b a c t e r i a a n d H , - c o n s u m i n g b a c t e r i a . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 0 : 1 2 4 4 - 1 2 5 0 . T o u z e l , J . P . , a n d G . A l b a g n a c . 1 9 8 3 . I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f M e t h a n o c o c c u s m a z e i s t r a i n M C 3 . F E M S M i c r o b i o l . L e t t . 1 6 : 2 4 1 - 2 4 5 . T o u z e l , J . P . , G . P r e n s i e r , J . L . R o u s t a n , 1 . T h o m a s , H . C . D u b o u r g u i e r , a n d G . A l b a g n a c . 1 9 8 8 . D e s c r i p t i o n o f a n e w s t r a i n o f M e t h a n o t h r i x s o e h n g e n i i a n d r e j e c t i o n o f M e t h a n o t h r i x c o n c i l i i a s a s y n o n y m o f M e t h a n o t h r i x s o e h n g e n i i . I n t . J . S y s t . B a c t e r i o l . 3 8 : 3 0 - 3 6 . T o u z e l , J . P . 1 9 8 9 . p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n . T r a m p e r , J . , J . W . v a n G r o e n e s t i j n , K . C h . A . M . L u y b e n , a n d L . W . H u l s h o f f P o l . 1 9 8 4 . S o m e p h y s i c a l p r o p e r t i e s o f g r a n u l a r a n a e r o b i c s l u d g e . I n H o u w i n k , E . H . , a n d R . R . v a n d e r M e e r ( e d s . ) , I n n o v a t i o n s i n b i o t e c h n o l o g y . E l s e r v i e r S c i e n c e P u b l i s h e r B . V . , A m s t e r d a m . p p 1 4 5 - 1 5 5 . T r a o r e , A . S . , M . - L . F a r d e a u , C . E . H a t c h i k i a n , J . L e G a l l , a n d J . - P . B e l a i c h . 1 9 8 3 . E n e r g e t i c s o f g r o w t h o f a d e fi n e d m i x e d c u l t u r e o f D e s u l f o v i b r i o v u l g a r i s a n d M e t h a n o s a r c i n a b a r k e r i : i n t e r s p e c i e s h y d r o g e n t r a n s f e r i n b a t c h a n d c o n t i n u o u s c u l t u r e s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 6 : 1 1 5 2 - 1 1 5 6 . v a n d e n B e r g , L . , a n d C . P . L e n t z . 1 9 7 9 . C o m p a r i s o n b e t w e e n u p - a n d d o w n fl o w a n a e r o b i c fi x e d fi l m r e a c t o r s o f v a r y i n g s u r f a c e - t o - v o l u m e r a t i o s f o r t h e t r e a t m e n t o f b e a n b l a n c h i n g w a s t e . P r o c e e d i n g s o f t h e 3 4 t h P u r d u e I n d u s t r i a l W a s t e C o n f e r e n c e , M a y , 1 9 7 9 . A n n A b o r S c i e n c e P u b l i s h e r s I n c . , A n n A r b o r , M I . p p 3 1 9 — 3 2 5 . v a n d e r H o c k , J . P . 1 9 8 8 . G r a n u l a t i o n o f d e n i t r i f y i n g s l u d g e . I n L e t t i n g a , G . , A . J . B . Z e h n d e r , J . T . C . G r o t e n h u i s , a n d L . W . H u l s h o f f P o l ( e d ) . G r a n u l a r a n a e r o b i c s l u d g e ; m i c r o b i o l o g y a n d t e c h n o l o g y . P u d o c , W a g e n i n g e n , N e t h e r l a n d s , 1 9 8 8 . p p 2 0 3 - 2 1 0 . v a n d e r M e e r , R . R . 1 9 7 9 . A n a e r o b i c t r e a t m e n t o f w a s t e w a t e r c o n t a i n i n g f a t t y a c i d s i n u p fl o w r e a c t o r s . P h . D T h e s i s , T e c h n i c a l U n i v e r s i t y o f D e l f t , t h e N e t h e r l a n d s . V e r r i e r , D . , B . M o r t i e r , H . C . D u b o u r g u i e r a n d G . A l b a g n a c . 1 9 8 8 . A d h e s i o n o f a n a e r o b i c b a c t e r i a t o i n e r t s u p p o r t s a n d d e v e l o p m e n t o f m e t h a n o g e n i c b i o fi l r n s . I n H a l l , E . R . , a n d P . N . H o b s o n ( e d ) , A n a e r o b i c D i g e s t i o n 1 9 8 8 . P e r g r a m o n P r e s s , O x f o r d , U . K . p p 6 1 - 6 9 . 3 9 6 V e s i l i n d , P . A . 1 9 7 4 . T r e a t m e n t a n d d i s p o s a l o f w a s t e w a t e r s l u d g e s . A n n A r b o r S c i e n c e P u b l i s h e r , A n n A r b o r , M i c h i g a n . V u o r i r a n t a , P . J . , J . A . R i n t a l a , a n d H . K i r j a v a i n e n . 1 9 8 5 . S l u d g e c h a r a c t e r i s t i c s i n U A S B - r e a c t o r t r e a t i n g t h e r m o m e c h a n i c a l p u l p i n g e f fl u e n t s . W a t . S c i . T e c h . 1 7 : 3 1 3 - 3 1 6 . W a n g , Z X . , Z . P . C h e n , a n d Z . S . Q i a n . 1 9 8 5 . S t a t u s q u o a n d p r o s p e c t s o n t h e s t u d y o f a n a e r o b i c d i s p o s a l f o r i n d u s t r i a l w a s t e w a t e r . I n C h i n a S t a t e B i o g a s A s s o c i a t i o n ( e d ) , A n a e r o b i c D i g e s t i o n 1 9 8 5 . G u a n g z h o u , C h i n a , 1 9 8 5 . p p 2 5 9 - 2 7 7 . W e s t e r m a n n , P . , B . K . A h r i n g , a n d R . A . M a h . 1 9 8 9 a . T h r e s h o l d a c e t a t e c o n c e n t r a t i o n s f o r a c e t a t e c a t a b o l i s m b y a c e t i c l a s t i c m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 5 : 5 1 4 - 5 1 5 . W e s t e r m a n n , P . , B . K . A h r i n g , a n d R . A . M a h . 1 9 8 9 b . A c e t a t e p r o d u c t i o n b y m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 5 : 2 2 5 7 - 2 2 6 1 . W i d d e l , F . , a n d N . P f e n n i g . 1 9 8 1 . S p o r u l a t i o n a n d f u r t h e r n u t r i t i o n a l c h a r a c t e r i s t i c s o f D e s u l f o t o m a c u l u m a c e t o x i d a n s . A r c h . M i c r o b i o l . 1 2 9 : 4 0 1 - 4 0 2 . W i d d e l , F . , a n d N . P f e n n i g . 1 9 8 2 . S t u d i e s o n d i s s i r n i l a t o r y s u l f a t e - r e d u c i n g b a c t e r i a t h a t d e c o m p o s e f a t t y a c i d s , 1 1 . i n c o m p l e t e o x i d a t i o n o f p r o p i o n a t e b y D e s u l f o b u l b u s p r o p i o n i c u s g e n . n o v . , s p . n o v . A r c h . M i c r o b i o l . 1 3 1 : 3 6 0 - 3 6 5 . W i d d e l , F . , a n d N . P f e n n i g . 1 9 8 4 . D i s s i r n i l a t o r y s u l f a t e - o r s u l f u r - o x i d i z i n g b a c t e r i a . I n K r i e g , N . R . , a n d J . G . H o l t . ( e d ) , B e r g e y ’ s m a n u a l o f s y s t e m a t i c b a c t e r i o l o g y , V o l . 1 . W i l l i a m s a n d W i l k i n s , B a l t i m o r e L o n d o n . p p 6 6 3 - 6 7 9 . W i d d e l , F . 1 9 8 6 . G r o w t h o f m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a i n p u r e c u l t u r e w i t h 2 - p r o p a n o l a n d o t h e r a l c o h o l s a s h y d r o g e n d o n o r s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 1 : 1 0 5 6 - 1 0 6 2 . W i d d e l , F . 1 9 8 8 . M i c r o b i o l o g y a n d e c o l o g y o f s u l f a t e - a n d s u l f u r - r e d u c i n g b a c t e r i a . I n Z e h n d e r , A . J . B . ( e d ) , B i o l o g y o f a n a e r o b i c m i c r o o r g a n i s m s . J o h n W i l e y & S o n s , N e w Y o r k . p p 4 6 9 - 5 8 5 . W i e g a n t , W . M . , J . A . C l a a s s e n , A . J . M . L . B o r g h a n s , a n d G . L e t t i n g a . 1 9 8 3 . H i g h r a t e t h e r m o p h i l i c a n a e r o b i c d i g e s t i o n f o r t h e g e n e r a t i o n o f m e t h a n e f r o m o r g a n i c w a s t e s . i n v a n d e n B r i n k , W . J . ( e d ) , P r o c e e d i n g s o f a n a e r o b i c w a s t e w a t e r t r e a t m e n t c o n f e r e n c e , N o v . 2 3 - 2 5 , 1 9 8 3 , N o o r d w y k e r h o w , t h e N e t h e r l a n d s . p p 3 9 2 - 4 1 1 . 3 9 7 W i e g a n t , W , M . , J . A . C l a a s s e n , a n d G . L e t t i n g a . 1 9 8 5 . T h e r m o p h i l i c a n a e r o b i c d i g e s t i o n o f h i g h s t r e n g t h w a s t e w a t e r s . B i o t e c h . B i o e n g . 2 7 : 1 3 7 4 - 1 3 8 1 . , W i e g a n t , W . M . , a n d G . L e t t i n g a . 1 9 8 5 . T h e r m o p h i l i c a n a e r o b i c d i g e s t i o n o f s u g a r s i n u p fl o w a n a e r o b i c s l u d g e b l a n k e t r e a c t o r s . B i o t e c h . B i o e n g . 2 7 : 1 6 0 3 - 1 6 0 7 . W i e g a n t , W . M . , a n d A . W . A . d e M a n . 1 9 8 6 . G r a n u l a t i o n o f b i o m a s s i n t h e r m o p h i l i c u p fl o w a n a e r o b i c s l u d g e b l a n k e t r e a c t o r s t r e a t i n g a c i d i fi e d w a s t e w a t e r s . B i o t e c h n o l . B i o e n g . 2 8 : 7 1 8 - 7 2 7 . W i e g a n t , W . M . 1 9 8 8 . T h e ‘ s p a g h e t t i t h e o r y ’ a n a n a e r o b i c s l u d g e f o r m a t i o n , o r t h e i n e v i t a b i l i t y o f g r a n u l a t i o n . I n L e t t i n g a , G . , A . J . B . Z e h n d e r , J . T . C . G r o t e n h u i s , a n d L . W . H u l s h o f f P o l ( e d ) . G r a n u l a r a n a e r o b i c s l u d g e ; m i c r o b i o l o g y a n d t e c h n o l o g y . P u d o c , W a g e n i n g e n , N e t h e r l a n d s , 1 9 8 8 . p p 1 4 6 - 1 5 2 . W i j b e n g a , D . J . , a n d H . T h . P . B 0 8 . 1 9 8 8 . P h y s i c a l a n d b i o l o g i c a l f a c t o r s i n fl u e n c i n g t h e g r o w t h o f a n a e r o b i c g r a n u l a r s l u d g e . I n L e t t i n g a , G . , A . J . B . Z e h n d e r , J . T . C . G r o t e n h u i s , a n d L . W . H u l s h o f f P o l . ( e d ) , G r a n u l a r a n a e r o b i c s l u d g e ; m i c r o b i o l o g y a n d t e c h n o l o g y . P u d o c , W a g e n i n g e n , N e t h e r l a n d s , 1 9 8 8 . p p 2 2 9 - 2 3 4 . W i l l i a m s , A . G . 1 9 8 6 . R u m e n h o l o t r i c h c i l i a t e p r o t o z o a . M i c r o b i o l . R e v . 5 0 : 2 5 - 4 9 . W i n s l o w , C . - E . A . , a n d E . B . P h e l p s . 1 9 1 1 . I n v e s t i g a t i o n s o n t h e p u r i fi c a t i o n o f B o s t o n s e w a g e . J . I n f e c t i o u s D i s e a s e s . 8 : 2 5 9 - 2 8 8 . W o e s e , C . R . , a n d R . S . W o l f e . ( e d ) . 1 9 8 5 . T h e b a c t e r i a , a t r e a t i s e o n s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n , V o l u m e V I I I : a r c h a e b a c t e r i a . A c a d e m i c P r e s s , I n c . , O r l a n d o , F l o r i d a . W o e s e , C . R . 1 9 8 7 . B a c t e r i a l e v o l u t i o n . M i c r o b i o l . R e v . 5 1 : 2 2 1 - 2 7 1 . W o l f e , R . 8 . , a n d I . J . H i g g i n s . 1 9 7 9 . M i c r o b i a l B i o c h e m i s t r y o f m e t h a n e - a s t u d y i n c o n t r a s t s . I n Q u a y l e , J . R . ( e d s ) , I n t e r n a t i o n a l r e v i e w o f b i o c h e m i s t r y , M i c r o b i a l b i o c h e m i s t r y , V o l u m e 2 1 . U n i v . P a r k P r e s s , B a l t i m o r e . p p 2 6 7 - 3 5 3 . W o l i n , E . A . , M . R . J . W o l i n , a n d R . S . W o l f e . 1 9 6 3 . F o r m a t i o n o f m e t h a n e b y b a c t e r i a l e x t r a c t s . J . B i o . C h e m . 2 3 8 : 2 8 8 2 - 2 8 8 6 . W u , W . - G . 1 9 8 9 . K a n s a s U n i v e r s i t y , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n . W u , W . - M . 1 9 8 4 . G r a n u l a r s l u d g e i n u p fl o w a n a e r o b i c s l u d g e b l a n k e t ( U A S B ) r e a c t o r a n d i t s P r o p e r t i e s . M S . T h e s i s , T s i n g h u a u n i v e r s i t y , B e i j i n g , C h i n a ( i n C h i n e s e ) . 3 9 8 W u , W . - M . , J . - C . H u , a n d X . - S . G u . 1 9 8 5 . P r o p e r t i e s o f g r a n u l a r s l u d g e i n u p fl o w a n a e r o b i c s l u d g e b l a n k e t ( U A S B ) r e a c t o r a n d i t s f o r m a t i o n . I n C h i n a S t a t e B i o g a s A s s o c i a t i o n ( e d ) , A n a e r o b i c D i g e s t i o n 1 9 8 5 . G u a n g z h o u , C h i n a . p p . 3 3 9 - 3 5 4 . W u , W . - M . , J . - C . , H u , a n d X . - S . G u . 1 9 8 6 . E f f e c t o f g r a n u l a t i o n o f s l u d g e i n u p fl o w a n a e r o b i c s l u d g e b l a n k e t ( U A S B ) r e a c t o r o n s o l i d - l i q u i d s e p a r a t i o n . A c t a . S c i e n t . C i r c u m s t a n t . ( i n C h i n e s e ) . 6 : 8 6 - 9 5 . W u , W . - M . , J . - C . H u , X . - S . G u , X . Q . Z h u , Y . - Z . Z h a o , H . Z h a n g , a n d Y . - S . X u . 1 9 8 7 a . M e t h a n o g e n i c b a c t e r i a i n a e r o b i c a c t i v a t e d s l u d g e . A c t a . S c i e n t . C i r c u m s t a n t ( i n C h i n e s e ) . 7 : 1 ( X J - 1 0 6 . W u , W . - M , J . - C . H u , X . - S . G u , Y . - Z . Z h a o , H . Z h a n g , a n d G . - G . G u . 1 9 8 7 b . C u l t i v a t i o n o f a n a e r o b i c g r a n u l a r s l u d g e i n U A S B r e a c t o r s w i t h a e r o b i c a c t i v a t e d s l u d g e a s s e e d W a t e r R e s . 2 1 : 7 8 9 - 7 9 9 . W u , W . - M , R . F . H i c k e y , L . B h a t n a g a r , M . K . J a i n , a n d J . G . Z e i k u s . 1 9 8 9 . F a t t y a c i d d e g r a d a t i o n a s a t o o l t o m o n i t o r a n a e r o b i c s l u d g e a c t i v i t y a n d t o x i c i t y . I n 4 4 t h P u r d u e i n d u s t r i a l w a s t e c o n f e r e n c e p r o c e e d i n g s . L e w i s P u b l i s h e r s , C h e l s e a , M I . p p 2 2 5 - 2 3 3 . W u , M . - M . , a n d M . K . J a i n . 1 9 9 0 . M e c h a n i s m o f i s o m e r i z a t i o n a n d i n t e r s p e c i e s e l e c t r o n t r a n s f e r d u r i n g i s o b u t y r a t e - b u t y r a t e d e g r a d a t i o n b y a s y n t r o p h i c b i o m e t h a n a t i o n t r i c u l t u r e . P o s t e r p r e s e n t e d a t 1 9 9 0 A S M A n n u a l M e e t i n g , A n a h e i m , C A , 1 3 - 1 7 M a y , 1 9 9 0 . W u , W . - M . , R . F . H i c k e y , a n d J . G . Z e i k u s . 1 9 9 1 a . F o r m a t e s y n t h e s i s f r o m h y d r o g e n b y h y d r o g e n u t i l i z i n g m e t h a n o g e n s . P o s t e r p r e s e n t e d a t 1 9 9 1 A S M A n n u a l M e e t i n g , D a l l a s , T X , 5 - 9 M a y , 1 9 9 1 . W u , W . - M . , R . F . H i c k e y , a n d J . G . Z e i k u s . 1 9 9 1 b . C h a r a c t e r i z a t i o n o f m e t a b o l i c p e r f o r m a n c e o f m e t h a n o g e n i c g r a n u l e s t r e a t i n g b r e w e r y w a s t e w a t e r : t h e r o l e o f s u l f a t e - r e d u c i n g b a c t e r i a . A p p . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 7 : ( a c c e p t e d f o r p u b l i c a t i o n ) . W u , W . - M , a n d R . F . H i c k e y . 1 9 9 1 . T h e c o n t r i b u t i o n o f s u l f a t e r e d u c i n g b a c t e r i a t o a n a e r o b i c d e g r a d a t i o n a n d C O D r e m o v a l b y a n a e r o b i c g r a n u l a r s l u d g e . P a p e r p r e s e n t e d a t t h e 4 6 t h i n d u s t r i a l w a s t e c o n f e r e n c e , P u r d u e U n i v e r s i t y , W e s t L a f a y e t t e , I N , M a y 1 4 - 1 6 , 1 9 9 1 . 3 9 9 Y a d a v , V . K . , a n d D . B . A r c h e r . 1 9 8 8 . S p e c i fi c i n h i b i t i o n o f s u l p h a t e - r e d u c i n g b a c t e r i a i n m e t h a n o g e n i c c o - c u l t u r e . L e t t . A p p l . M i c r o b i o l . 7 : 1 6 5 - 1 6 8 . Y o d a , M . , M . K i t a g a w a , a n d Y . M i y a j i . 1 9 8 9 . G r a n u l a r s l u d g e f o r m a t i o n i n t h e a n a e r o b i c e x p a n d e d m a c r o - c a r r i e r b e p r o c e s s . W a t . S c i . T e c h . 2 1 : 1 0 9 - 1 2 0 . Y o u n g , J . C . , a n d P . L . M c C a r t y . 1 9 6 7 . T h e a n a e r o b i c fi l t e r f o r w a s t e t r e a t m e n t . I n P r o c e e d i n g s o f t h e 2 2 n d P u r d u e i n d u s t r i a l w a s t e c o n f e r e n c e . A n n A b o r S c i e n c e P u b l i s h e r I n c . , A n n A b o r , M I . 1 9 6 7 . p p 5 5 9 - 5 7 4 . Y o u n g , J . C . , a n d M . F . D a h a b . 1 9 8 3 . E f f e c t o f m e d i a d e s i g n o n t h e p e r f o r m a n c e o f fi x e d - b e d a n a e r o b i c r e a c t o r s . W a t . S c i e . T e c h . 1 5 : 3 6 9 - 3 8 3 . Y o u n g , J . C . 1 9 9 0 . F a c t o r s a f f e c t i n g t h e d e s i g n a n d p e r f o r m a n c e o f u p fl o w a n a e r o b i c fi l t e r s . P a p e r p r e s e n t e d a t I n t e r n a t i o n a l w o r k s h o p , a n a e r o b i c t r e a t m e n t t e c h n o l o g y f o r m u n i c i p a l a n d i n d u s t r i a l w a s t e w a t e r , S e p t e m b e r 2 3 - 2 6 , 1 9 9 0 , V a l l a d o l i d , S p a i n . Z e e u w , W . J . d e . 1 9 8 4 . A c c l i m a t i z a t i o n o f a n a e r o b i c s l u d g e f o r U A S B - r e a c t o r s t a r t - u p . p h . D T h e s i s , A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y , W a g e n e g e n , t h e N e t h e r l a n d s . Z e e u w , W . J . d e . 1 9 8 8 . G r a n u l a r s l u d g e i n U A S B - r e a c t o r s . I n L e t t i n g a , G . , A . J . B . Z e h n d e r , J . T . C . G r o t e n h u i s , a n d L . W . H u l s h o f f P o l ( e d ) , G r a n u l a r a n a e r o b i c s l u d g e ; m i c r o b i o l o g y a n d T e c h n o l o g y . P u d o c , W a g e n i n g e n , N e t h e r l a n d s , 1 9 8 8 . p p 1 3 2 - 1 4 5 . Z e h n d e r , A . J . B . , a n d K . W u h r r n a n n . 1 9 7 7 . P h y s i o l o g y o f a M e t h a n o b a c t e r i u m s t r a i n A Z . A r c h . M i c r o b i o l . 1 1 1 : 1 9 9 - 2 0 5 . Z e h n d e r , A . J . B . , B . A . H u s e r , T . D . B r o c k , a n d K . W u h r r n a n n . 1 9 8 0 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f a n a c e t a t e d e c a r b o x y l a t i n g n o n h y d r o g e n - o x i d i z i n g m e t h a n e b a c t e r i u m . A r c h . M i c r o b i o l . 1 2 4 : 1 - 1 1 . Z e h n d e r , A . J . B . , K . . I n g v o r s e n a n d T . M a r t i . 1 9 8 1 . M i c r o b i o l o g y o f m e t h a n e b a c t e r i a . I n H u g h e s , D . E . , D . A . S t a f f o r d B . I . W h e a t l e y , W . B a a d e r , G . L e t t i n g a , E . J . N y n s , W . V e r s r a e t e , a n d R . L . W e n t w o r t h ( e d ) . A n a e r o b i c d i g e s t i o n 1 9 8 1 . E l s e v i e r B i o m e d i c a l P r e s s , A m s t e r d a m . p p 4 5 - 6 8 . Z e n g , Y . J . , a n d W . - G . W u . 1 9 8 5 . A s t u d y o f m e a t p a c k i n g p l a n t w a s t e w a t e r t r e a t m e n t w i t h u p fl o w a n a e r o b i c s l u d g e b l a n k e t p r o c e s s . I n C h i n a S t a t e B i o g a s A s s o c i a t i o n ( e d ) , A n a e r o b i c D i g e s t i o n 1 9 8 5 . G u a n g z h o u , C h i n a , 1 9 8 5 . p p 3 2 7 - 3 3 7 . 4 0 0 Z e i k u s , J . G . , a n d R . S . W o l f e . 1 9 7 3 . F i n e s t r u c t u r e o f M e t h a n o b a c t e r i u m t h e r m o a u t o t r o p h i c u m : e f f e c t o f g r o w t h t e m p e r a t u r e o n m o r p h o l o g y a n d u l t r a s t r u c t u r e . J . B a c t e r i o l . 1 1 3 : 4 6 1 - 4 6 7 . Z e i k u s , J . G . , a n d M . R . W i n f r e y . 1 9 7 6 . T e m p e r a t u r e l i m i t a t i o n o f m e t h a n o g e n e s i s i n a q u a t i c s e d i m e n t s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 3 1 : 9 9 - 1 0 7 . Z e i k u s , J . G . 1 9 7 7 . T h e b i o l o g y o f m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a . B a c t e r i a l . R e v . 4 1 : 5 1 4 - 5 4 1 . Z e i k u s , J . G . 1 9 7 9 . M i c r o b i a l p o p u l a t i o n i n d i g e s t e r s . I n S t a f f o r d , D . A . , 3 . 1 . W h e a t l e y a n d D . E . H u g h e s ( e d ) , A n a e r o b i c d i g e s t i o n . A p p l i e d S c i e n c e P u b l i s h e r s L t d , C a r d i f f , U . K . , 1 9 7 9 . p p 7 5 - 1 0 3 . Z e i k u s , J . G . , A . B e n - B a s s a t , a n d P . W . H e g g e . 1 9 8 0 . M i c r o b i o l o g y o f m e t h a n o g e n e s i s i n t h e r m a l , v o l c a n i c e n v i r o n m e n t s . J . B a c t e r i o l . 1 4 3 : 4 3 2 - 4 6 4 . Z e i k u s , J . G . 1 9 8 3 . M e t a b o l i c c o m m u n i c a t i o n b e t w e e n b i o d e g r a d a t i v e p o p u l a t i o n s i n n a t u r e . I n S l a t e r , J . H . ( e d s ) . M i c r o b e s i n t h e i r n a t u r a l e n v i r o n m e n t . W i l e y I n t e r s c i e n c e . , N e w Y o r k . p p 4 2 3 - 4 6 2 . Z e i k u s , J . G . , R . K e r b y , a n d J . A . K r z y c k i . 1 9 8 3 . S i n g l e c a r b o n c h e m i s t r y o f a c e t o g e n i c a n d m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a . S c i e n c e . 2 2 7 : 1 1 6 7 - 1 1 7 3 . Z e l l n e r , G . , a n d J . W i n t e r . 1 9 8 7 . S e c o n d a r y a l c o h o l a s h y d r o g e n d o n o r s f o r C O , - r e d u c t i o n b y m e t h a n o g e n s . F E M S M i c r o b i o l . 4 4 : 3 2 3 - 3 2 8 . Z h a o , Y . , H . Z h a n g , G . L i u , L . L i a n , Y . Y i a o , a n d W . Z h o u . 1 9 8 5 . M i c r o b i a l p o p u l a t i o n i n r u r a l b i o g a s d i g e s t e r s o f C h i n a . I n C h i n a S t a t e B i o g a s A s s o c i a t i o n ( e d ) . A n a e r o b i c D i g e s t i o n 1 9 8 5 . G u a n g z h o u , C h i n a . p p . 4 7 7 - 4 9 5 . Z h a o , H . , D . Y a n g , C . R . W o e s e , a n d M . P . B r y a n t . 1 9 9 0 . A s s i g n m e n t o f C l o s t r i d i u m b r y a n t i i t o S y t r o p h o s p o r a b r y a n t i i g e n . n o v . , c o m b . n o v . o n t h e b a s i s o f a 1 6 S r R N A s e q u e n c e a n a l y s i s o f i t s c r o t o n a t e - g r o w n p u r e c u l t u r e . I n t . J . S y s t . B a c t e r i o l . 4 0 : 4 0 - 4 4 . Z i n d e r , S . H . , S . C . C a r d w e l l , T . A n g u i s h , M . L e e a n d M . K o c h . 1 9 8 4 a . M e t h a n o g e n e s i s i n a t h e r m o p h i l i c ( 5 8 ° C ) a n a e r o b i c d i g e s t o r : M e t h a n o t h r i x s p . a s a n i m p o r t a n t a c e t i c l a s t i c m e t h a n o g e n . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 7 : 7 9 6 - 8 0 7 . Z i n d e r , S . H . , T . A n g u i s h , a n d S . C . C a r d w e l l . 1 9 8 4 b . E f f e c t s o f t e m p e r a t u r e o n m e t h a n o g e n e s i s i n a t h e r m o p h i l i c ( 5 8 ° C ) a n a e r o b i c d i g e s t o r . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 7 : 8 0 8 - 8 1 3 . 4 0 1 Z i n d e r , S . H . , a n d M . K o c h . 1 9 8 4 . N o n - a c e t o c l a s t i c m e t h a n o g e n e s i s f r o m a c e t a t e : a c e t a t e o x i d a t i o n b y a t h e r m o p h i l i c s y n t r o p h i c c u l t u r e . A r c h . M i c r o b i o l . 1 3 8 : 2 6 3 - 2 7 2 . Z i n d e r , S . H . , T . A n g u i s h , a n d A . L . L o b o . 1 9 8 7 . I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a t h e r m o p h i l i c a c e t o t r a p h i c s t r a i n o f M e t h a n o t h r i x . A r c h . M i c r o b i o l . 1 4 6 : 3 1 5 - 3 2 2 . Z o e t e m e i j e r , R . J . , A . J . C . M . M a t t h i j s e n , J . C . v a n d e r H e u v e l , A . c o h e n , a n d C . B o e l h o u w e r . 1 9 8 1 . A c e t o g e n e s i s o f s o l u b l e c a r b o h y d r a t e - c o n t a i n i n g w a s t e w a t e r s . T r i . C e b e d e u . 3 4 : 4 4 4 - 4 6 5 . Z o u t b e r g , G . R . , R . M u l d e r , M . J . T e i x e i r a , d e M a t t o s a n d O . M . N e i j s s e l . 1 9 8 8 . A g g r e g a t e f o r m a t i o n i n a n a e r o b i c g a s l i f t r e a c t o r . I n L e t t i n g a , G . , A . J . B . Z e h n d e r , J . T . C . G r o t e n h u i s , a n d L . W . H u l s h o f f P o l ( e d ) , G r a n u l a r a n a e r o b i c s l u d g e ; m i c r o b i o l o g y a n d t e c h n o l o g y . P u d o c , W a g e n i n g e n , N e t h e r l a n d s , 1 9 8 8 . p p 3 4 - 4 2 .