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I . l . l a . l 1 ! . l . o I . v t v . ‘ . § b s . . . v 3 ‘ 0 . . . \ . . - . . . a n . i fi n fl e u ‘ a I ¢ u o - u I : . . . . 3 5 , 5 . . 9 . ‘ . . . i n . . 1 0 2 . 9 . | . . - } . . , . . . l . . t 4 t . ’ 5 u ! l 2 l r . 7 5 f ( 9 ; . ( fl I a i g . . i . 5 . . . 1 . 5 ‘ h u . n ‘ l t a . o 1 n . . . ” " l I i n f b t 1 ( i 1 fi L v l l . 0 . ) | . l 3 . . a - n 1 l 1 2 . l : . ? - . A ! . 1 p ) . V . v ‘ u p L . - o _ . - O r : 1 . “ I . . 0 ' . u t l l a . . L r . H . 4 I f ! I t ‘ l l - n u . 3 6 5 2 1 . ] . . . . v ‘ i l ‘ . i n ? " . f ' . . f " . 3 - . ‘ J @ 5 5 3 1 W “ N I V E R I T Y L l R A B I E S I l l l l l ’ i l l l l fl l u l a l u m l l H I 3 1 2 9 3 0 0 8 7 7 9 1 2 0 T h i s i s t o c e r t i f y t h a t t h e d i s s e r t a t i o n e n t i t l e d A s s e s s m e n t o f t h e R o l e o f P l a n t M i t o c h o n d r i a l R e s p i r a t o r y C o m p l e x e s i n C y t o p l a s m i c M a l e S t e r i l i t y a n d S t r u c t u r a l A n a l y s i s o f P l a n t C y t o c h r o m e c O x i d a s e p r e s e n t e d b y ' — W e n d y E i l e e n P e i f f e r h a s b e e n a c c e p t e d t o w a r d s f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r P h . D . B i o c h e m i s t r y d e g r e e i n [ h u e 3 ? 2 4 4 % 7 ' J Z / / 3 ? § L z 6 / / M S U i s u A m m a n - c A r u b a / E q u a l ( b p o r m fi t y I n s t i t u t i o n 0 - 1 2 7 7 1 F l M i L c U I i i h n B g v R a e A n r s R i S Y t t a y t e P T L O A C A V E O I I N D R F E I T N U E R S N r e B t u O r X n o o t n r e m o r b e o f v o e r t e h d i s u c e h d e u c e k . o u t f r o m y o u r r e c o r d . M S U I s A n A f fi r m a t i v e A c t l o r V E q u a l O p p o r t u n i t y t u t I n c s t i m o n i m m 1 O F P L S T R U C T A U N R T A 3 } I L A S S E S S M E N T O F T H E R O L E O F P L A N T M I T O C H O N D R I A L R E S P I R A T O R Y C O M P L E X E S I N C Y T O P L A S M I C M A L E S T E R I L I T Y A N D S T R U C T U R A L A N A L Y S I S O F P L A N T C Y T O C H R O M E C O X I D A S E V o l u m e I B y W e n d y E i l e e n P e i fi ' e r A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y 1 9 9 2 S t e r i l m a l t C h M a t S e ' r e s S i a t t y o e p i r t u d i O F P l S T R U C T T h e m e l e a f b l i g h t i n q u e m e a n i n h j t o n “ i n h i b i t s 7 9 5 7 . ’ l c / L “ , 7 “ . 2 A B S T R A C T A S S E S S M E N T O F T H E R O L E O F P L A N T M I T O C H O N D R I A L R E S P I R A T O R Y C O M P L E X E S I N C Y T O P L A S M I C M A L E S T E R I L I T Y A N D S T R U C T U R A L A N A L Y S I S O F P L A N T C Y T O C H R O M E C O X I D A S E B y W e n d y E i l e e n P e i fi ‘ e r T h e m e c h a n i s m o f a c t i o n o f t h e f u n g a l t o x i n c a u s i n g S o u t h e r n c o r n l e a f b l i g h t i n p l a n t s w i t h t h e m i t o c h o n d r i a l l y - e n c o d e d t r a i t c y t o p l a s m i c m a l e s t e r i l i t y ( C M S ) i s n o t c o m p l e t e l y u n d e r s t o o d . S o m e e v i d e n c e s u g g e s t s t h a t r e s p i r a t o r y c o m p l e x e s a r e i n v o l v e d i n m e d i a t i n g b o t h t o x i n a c t i o n a n d C M S . S t u d i e s r e p o r t e d h e r e p r o v i d e e v i d e n c e t h a t t h e A T P s y n t h a s e i s i n v o l v e d i n t o x i n a c t i o n a n d C M S t h r o u g h i n t e r a c t i o n w i t h a 1 3 k D a C M S - s p e c i fi c p e p t i d e . T h e A T P a s e i n h i b i t o r s d i c y c l o h e x y l c a r b o d i i m i d e a n d q u e r c e t i n i n h i b i t t o x i n - i n d u c e d m i t o c h o n d r i a l s w e l l i n g . F u r t h e r m o r e , t o x i n i n h i b i t s A T P a s e a c t i v i t y i n m i t o c h o n d r i a f r o m C M S b u t n o t f e r t i l e p l a n t s . F i n a l l y , m a x i m a l A T P a s e a c t i v i t y i n m i t o c h o n d r i a f r o m C M S p l a n t s i s a b o u t 2 0 % l o w e r t h a n i n f e r t i l e p l a n t s . T h e s e fi n d i n g s s u g g e s t t h a t t h e 1 3 k D a p e p t i d e m a y b e p h y s i c a l l y a s s o c i a t e d w i t h t h e A T P a s e . T o t e s t t h i s h y p o t h e s i s , w e a n a l y z e d f r a c t i o n s f r o m a n i o n - e x c h a n g e f a s t p r o t e i n l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( F P L C ) o f s o l u b i l i z e d m a i z e m i t o c h o n d r i a f o r r e a c t i v i t y w i t h a n t i b o d y a g a i n s t t h e 1 3 k D a p e p t i d e . A l l p r o t e i n - h e 9 1 R m a t h a “ p f l r S a o t o t m t n m m t o m i h e e t } n x e t o r h 0 o l c o n t a i n i n g ‘ a s s o c i a t i o n , S i m i l a r e x p e C y t o c l m a k i n g i t o f g e r m t o o v c m i t o c h o n d r i a e x c h a n g e F P Q _ . i n W h i c h s u b I W h i l e t h r e e . O x i d a s e s . A O t i d a s e , S u g g . ‘ A m i n o I E d i t i n g , m g . : I c o n t a i n i n g f r a c t i o n s c o n t a i n e d t h i s p e p t i d e , i n d i c a t i n g n o n - s p e c i fi c a s s o c i a t i o n , b u t t h i s d o e s n o t r u l e o u t a s p e c i fi c e f f e c t o n t h e A T P a s e . A s i m i l a r e x p e r i m e n t w i t h m a l e s t e r i l e p e t u n i a w a s i n c o n c l u s i v e . C y t o c h r o m e o x i d a s e h a s a l s o b e e n p o s t u l a t e d t o b e i n v o l v e d i n C M S , m a k i n g i t o f i n t e r e s t t o p u r i f y a n d c h a r a c t e r i z e . U s i n g c o m m e r i c a l w h e a t g e r m t o o v e r c o m e t h e d i f fi c u l t y i n i s o l a t i n g l a r g e a m o u n t s o f p l a n t m i t o c h o n d r i a , w e p u r i fi e d h i g h l y a c t i v e c y t o c h r o m e o x i d a s e b y a n i o n - e x c h a n g e F P L C i n l a u r y l m a l t o s i d e . S D S - g e l s s h o w a s u b u n i t c o m p o s i t i o n i n w h i c h s u b u n i t s I - I V r e s e m b l e t h e y e a s t o x i d a s e i n s i z e a n d a n t i g e n i c i t y w h i l e t h r e e t o f o u r s m a l l e r p e p t i d e s a r e d i s s i m i l a r t o o t h e r e u k a r y o t i c o x i d a s e s . A 9 k D a p e p t i d e a p p e a r s i n t h e w h e a t g e r m b u t n o t s e e d l i n g o x i d a s e , s u g g e s t i n g a d e v e l o p m e n t a l o r t i s s u e - s p e c i fi c f o r m o f t h e o x i d a s e . A m i n o a c i d s e q u e n c e a n a l y s i s o f s u b u n i t I I v e r i fi e d o n e s i t e o f R N A e d i t i n g , s u g g e s t i n g t h a t a c o n s e r v e d c y s t e i n e l i g a n d t o C u A i s r e s t o r e d . E l e c t r o n p a r a m a g n e t i c r e s o n a n c e a n d v i s i b l e a b s o r p t i o n s p e c t r a c o n fi r m t h a t t h e e n v i r o n m e n t o f C u A i s n o t a l t e r e d i n w h e a t o x i d a s e . H o w e v e r , r e s o n a n c e R a m a n a n d v i s i b l e s p e c t r o s c o p y e x t e n d s p r e v i o u s o b s e r v a t i o n s i n p l a n t m i t o c h o n d r i a i n d i c a t i n g t h a t t h e e n v i r o n m e n t o f h e m e a i s d i f f e r e n t f r o m o t h e r o x i d a s e s . T o m y f a m i l y i v ; “ a . v : q - * S 3 h e p r l o a j g h i n e c t h t h o a r h a y a p a k t a s B T r d a o ] a J o h s B t j o h e G S F u e e l t e r g u r s , o E s t e l l n - M i l l i T t a T , i f a s l C L a a a e n b o r d o , m r a h w i t h a T s h s i s t o m a g r n a h i c L n e e e n : d s n c d : e , I w o u l d A C K N O W L E D G M E N T S I w o u l d l i k e t o t h a n k m y c o m m i t t e ( D r s . L o r a n B i e b e r , C l a r e n c e S u e l t e r , E s t e l l e M c G r o a r t y , J e r r y B a b c o c k , a n d m y p r o f e s s o r , D r . S h e l a g h F e r g u s o n - M i l l e r ) f o r t h e i r h e l p a n d g u i d a n c e , a n d f o r l e t t i n g m e g e t a w a y w i t h s o m e w h i n i n g w h e n t h i n g s d i d n ' t w o r k . I w o u l d l i k e t o t h a n k S h e l a g h i n p a r t i c u l a r . I a m d e e p l y g r a t e f u l t h a t s h e a l l o w e d m e t o w o r k o n a p r o j e c t t h a t d i d n o t i n t e r f e r e w i t h m y e t h i c a l b e l i e f s . T h a n k s a l s o t o t h e p a s t a n d p r e s e n t g r a d s t u d e n t s a n d p o s t d o c s o f m y l a b o r a t o r y : B o b I n g l e , L i n d a G r e g o r y , K r i s h n a k u m a r R a j a r a t h n a m , J i a n l i C a o , T a h a T a h a , B r i d g e t t e B a r r y , J o n H o s l e r , E i l e e n A l l i s o n , C l a u d i a L e r m a , a n d J o h n F e t t e r . I h a v e b e e n f o r t u n a t e t h a t t h e m a n y u n d e r g r a d s a n d h i g h s c h o o l s t u d e n t s w h o h a v e w o r k e d i n t h e l a b h a v e p r o v i d e d m e w i t h f r i e n d s h i p , i d e a l i s t i c i n s p i r a t i o n , a n d i n m a n y c a s e s , t e c h n i c a l a s s i s t a n c e : B e c k y D u t c h , D o n n a M a k i , J a s o n T a k e u c h i , B a r b a r a E l l i s , T h o m a s L e e , G r a c e H o , T e r r i e R i f e , a n d A m a r a S i v a . S p e c i a l t h a n k s a r e i n o r d e r f o r T e r r i e , i n p a r t i c u l a r f o r t h e w o n d e r f u l i m m u n o b l o t i n c h a p t e r 7 . G o o d l u c k t o a l l o f y o u i n t h e f u t u r e ! I m u s t t h a n k D r . R o b e r t B a n d u r s k i f o r h i s i n s i g h t f u l s u g g e s t i o n t h a t w e t r y t o m a k e m i t o c h o n d r i a f r o m w h e a t g e r m . I w o u l d a l s o l i k e t o t h a n k c o l l a b o r a t o r s J u l i o d e P a u l a i n D r . B a b c o c k ’ s l a b , K e n K o r t h i n D r . L e v i n g s l a b , a n d M a r i e C o n n e t t i n D r . M a u r e e n H a n s o n ’ s l a b , f o r s o m e g o o d w o r k , g o o d f u n , a n d a f r e s h p e r s p e c t i v e . T h a n k s a n d b e s t w i s h e s a l s o t o S h e r r y , K a t h y , D i a n e , C a r r i e , W a r r e n a n d P a m , J a m i e , G e r r y a n d L o r r i , J o e G . , J o e L . , a n d C a r o l . M o s t . l o v e a n d 5 T h a n k s J e t f o a n ' t o ’ s Y L a s t l w o n d e r f u l I s w a m n l M o s t o f a l l , I t h a n k m y f a m i l y : M o m , D a d , J e f f , a n d G e o r g e . Y o u r l o v e a n d s u p p o r t h e l p e d m e t h r o u g h s o m e s e e m i n g l y h o p e l e s s t i m e s . T h a n k s J e f f , f o r n o t f a l l i n g a s l e e p d u r i n g m y c o r n s t o r y . T h e w o r l d i s s a f e f o r F r i t o ’ s ! T h a n k y o u G e o r g e , f o r y o u r M E G A h e l p a n d e n d l e s s l o v e . L a s t l y , I w a n t t o t h a n k C a r l S a n d b u r g , f o r w r i t i n g t h i s s i m p l e b u t w o n d e r f u l p o e m w h i c h h a s s e r v e d a s a n i n s p i r a t i o n t o m e s i n c e I w a s i n t h e t h i r d g r a d e : C i r c l e s ’ I T i e w l i i t e m a n d r e w a s m a I I c i r c I e i n t fl e s a n d a n d t o “ t fi e r e d m a n ‘ Q T t i s i s w fi a t t fi e I n d i a n K n o w s . ' fi n d d r a w i n g a m y c i r c l e a r o u n d t l i e s m a l l o n e , ‘ I fi i s i s w fi a t t l i e w l i i t e m a n k n o w s . ' ’ D i e I n d i a n t o o k t f i e s t i c k fi n d s w e p t a n i m m e n s e r i r g a r o u n d fi a t / i c i r c l e s : ” D i r k i s w h e n t fi e w fi i t e m a n a n d t l i e r e d m a n k n o w n o t fi i n g . ' - C a r I S a n d o u i y L i i i L L C s s t t o o f f T F s t o f H A P A I a i b E b g b R l u r , e r s e e 1 , v - T a b l e o f C o n t e n t s P a g e L i s t o f T a b l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x i i L i s t o f F i g u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x i i i L i s t o f A b b r e v i a t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x v i i i C H A P T E R 1 - I n t r o d u c t i o n : P l a n t m i t o c h o n d r i a a n d r e s p i r a t i o n 1 . 1 O v e r v i e w . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 . 2 R e s p i r a t o r y p a t h w a y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 . 3 S t r u c t u r e a n d f u n c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1 . 3 . 1 G e n o m e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1 . 3 . 2 O r i g i n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 1 . 3 . 3 D e f e c t s o f t h e r e s p i r a t o r y c h a i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1 . 3 . 3 . 1 H u m a n m i t o c h o n d r i a l m y o p a t h i e s . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1 . 3 . 3 . 2 P l a n t c o n d i t i o n s a s s o c i a t e d w i t h r e s p i r a t o r y d e f e c t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1 . 4 U n i q u e a s p e c t s o f p l a n t m i t o c h o n d r i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1 . 4 . 1 A d d i t i o n a l N A D H d e h y d r o g e n a s e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 1 . 4 . 2 A l t e r n a t i v e o x i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 1 . 4 . 3 T r a n s p o r t s y s t e m s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 1 . 4 . 4 R N A e d i t i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 1 . 5 R e s e a r c h i n t e r e s t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 C H A P T E R 2 - L i t e r a t u r e r e v i e w o f c y t o p l a s m i c m a l e s t e r i l i t y 2 . 1 O v e r v i e w . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 2 . 2 C M S i n d i f f e r e n t p l a n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 2 . 2 . 1 S o r g h u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 2 . 2 . 2 P e t u n i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 2 . 2 . 3 M a i z e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 2 . 2 . 3 . 1 C M S - C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 2 . 2 . 3 . 2 C M S - S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 2 . 2 . 3 . 3 C M S T $ 2 . 3 H y p o t h e s e s f o r t h e m e c h a n i s m o f C M S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 3 . 3 . 3 3 . 3 . 4 C H A P T E R 3 - A e e a r c h f o r s i g n i fi c a n t s t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l d i fl ‘ e r e n e e s b e t w e e n m i t o c h o n d r i a f r o m n o r m a l a n d T e x a s m a l e - s t e r i l e m a i z e 3 . 1 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . { E 3 . 2 M a t e r i a l s a n d m e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 3 . 2 . 1 M a t e r i a l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 3 . 2 . 2 I s o l a t i o n o f m i t o c h o n d r i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 3 . 2 . 3 D e t e r m i n a t i o n o f a d i f f e r e n c e i n s t e r o l c o n c e n t r a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 3 . 2 . 4 M e a s u r e m e n t o f m i t o c h o n d r i a l s w e l l i n g . . . . . . . . . . . . . . . . 4 5 3 . 2 . 5 A s s a y o f A T P a s e a c t i v i t y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 5 3 . 2 . 6 D e t e r m i n a t i o n o f p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 6 3 . 3 R e s u l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 6 3 . 3 . 1 D i f f e r e n c e 1 n s t e r o l c o n c e n t r a t i o n s b e t w e e n N a n d T m i t o c h o n d r i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 6 3 . 3 . 2 C h a r a c t e r i z a t i o n o f N a n d T m i t o c h o n d r i a . . . . . . . . . . . . . . 5 7 3 . 3 . 2 . 1 R e s p i r a t i o n i n N a n d T m i t o c h o n d r i a . . . . . . . . . . . . 5 7 3 . 3 . 2 . 2 M e t h o m y l a n d t o x i n - i n d u c e d s w e l l i n g o f i s o l a t e d m a i z e m i t o c h o n d r i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 7 3 . 3 . 3 E f f e c t s o f i n h i b i t o r s o n t o x i n a n d m e t h o m y l - i n d u c e d s w e l l i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 2 3 . 3 . 3 . 1 E f f e c t o f D C C D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 2 3 . 3 . 3 . 2 E fi ‘ e c t o f q u e r c e t i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 2 3 . 3 . 3 . 3 E f f e c t o f o l i g o m y c i n a n d d i e t h y l s t i l b e s t r o l . . . . . . 6 7 3 . 3 . 3 . 4 E fi e c t o f c a r b o x y a t r a c t y l o s i d e a n d m e r s a l y l . . . . 6 7 3 . 3 . 4 A T P a s e a c t i v i t y i n N a n d T m i t o c h o n d r i a . . . . . . . . . . . . . . . . 6 7 3 . 3 . 4 . 1 A c t i v i t y o f t h e N a n d T A T P a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 4 3 . 3 . 4 . 2 E f f e c t o f D C C D o n A T P a s e a c t i v i t y . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 4 3 . 3 . 4 . 3 E f f e c t o f t o x i n a n d m e t h o m y l o n A T P a s e a c t i v i t y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 8 3 . 4 D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 8 C H A P T E R 4 - P h y s i c a l a s s o c i a t i o n o f C M S - s p e c i fi c p r o t e i n s i n C M S - T m a i z e a n d p e t u n i a w i t h o t h e r m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n s 4 . 1 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 4 4 . 2 M a t e r i a l s a n d m e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 7 4 . 2 . 1 M a t e r i a l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 7 4 . 2 . 2 P r e p a r a t i o n o f m i t o c h o n d r i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 7 4 . 2 . 3 S e p a r a t i o n o f p r o t e i n s b y F P L C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 7 4 . 2 . 4 G e l e l e c t r o p h o r e s i s a n d W e s t e r n b l o t t i n g . . . . . . . . . . . . . . . . 8 8 4 . 3 R e s u l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . $ 4 . 3 . 1 S e p a r a t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n o f m a i z e p r o t e i n s . . . . . . . 8 9 4 . 3 . 2 D e t e c t i o n o f t h e 1 3 k D a p e p t i d e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 2 4 . 3 . 3 C M S p e t u n i a e x p e r i m e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 ( 5 4 . 3 . 3 . 1 F P L C f r a c t i o n a t i o n o f p e t u n i a m i t o c h o n d r i a 1 ( 5 4 . 3 . 3 . 2 D i fi ‘ e r e n c e s p e c t r a o f p e t u n i a m i t o c h o n d r i a . . 1 % v i i i 4 . 4 D i 4 . 4 . 4 . 4 . C H A P I E R S 5 . 1 I n t r 5 . 2 P u r i 5 . 3 S t 5 . 3 . 5 . 3 . 2 4 . 4 D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 3 4 . 4 . 1 A s s o c i a t i o n o f t h e 1 3 k D a p e p t i d e w i t h m a i z e m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 3 4 . 4 . 2 A s s o c i a t i o n o f u r f S w i t h p e t u n i a m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 7 C H A P T E R 5 - I i t e r a t u r e r e v i e w o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e 5 . 1 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 9 5 . 2 P u r i fi c a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 9 5 . 3 S t r u c t u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 3 5 . 3 . 1 O x i d a s e s a n d t h e i r p o l y p e p t i d e c o m p o s i t i o n . . . . . . . . . . 1 2 3 5 . 3 . 1 . 1 M i t o c h o n d r i a l s u b u n i t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 5 5 . 3 . 1 . 2 N u c l e a r - e n c o d e d s u b u n i t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 7 5 . 3 . 2 T h r e e - d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 7 5 . 3 . 2 . 1 G e n e r a l s h a p e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 7 5 . 3 . 2 . 2 A g g r e g a t i o n s t a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 ) 5 . 3 . 2 . 3 S u b u n i t o r i e n t a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 9 5 . 3 . 3 P r o s t h e t i c g r o u p s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 1 5 . 3 . 3 . 1 C u A s i t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 3 5 . 3 . 3 . 2 H e m e a a n d t h e b i n u c l e a r c e n t e r . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 5 5 . 4 F u n c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 8 5 . 4 . 1 I n t e r a c t i o n w i t h c y t o c h r o m e c . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 8 5 . 4 . 1 . 1 C y t o c h r o m e c b i n d i n g s i t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 8 5 . 4 . 1 . 2 C y t o c h r o m e c k i n e t i c s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 0 5 . 4 . 2 E l e c t r o n t r a n s f e r p a t h w a y i n c y t o c h r o m e o x i d a s e . . 1 4 4 5 . 4 . 3 0 2 r e d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 5 5 . 4 . 4 P r o t o n p u m p i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 6 5 . 4 . 5 T h e r o l e o f t h e n u c l e a r - e n c o d e d s u b u n i t s . . . . . . . . . . . . . . 1 5 0 5 . 4 . 5 . 1 R e g u l a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 0 5 . 4 . 5 . 2 A s s e m b l y o f t h e c o m p l e x . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 3 5 . 5 P l a n t c y t o c h r o m e o x i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 4 5 . 5 . 1 P u r i fi c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 5 5 . 5 . 2 P r o t o n p u m p i n g b y c y t o c h r o m e o x i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 7 5 . 5 . 3 G e n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 7 C H A P T E R G — P u r i fi e a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m w h e a t 6 . 1 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 ) 6 . 2 M a t e r i a l s a n d m e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 1 6 . 2 . 1 M a t e r i a l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 1 6 . 2 . 2 P r e p a r a t i o n o f w h e a t a n d m a i z e s e e d l i n g m i t o c h o n d r i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 % 6 . 2 . 3 P r e p a r a t i o n o f w h e a t g e r m m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 3 i x 6 . 2 . 4 I s o l a t i o n o f c y t o c h r o m e o x i d a s e f r o m m i t o c h o n - d r i a l m e m b r a n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 4 6 . 2 . 5 A s s a y m e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 5 6 . 2 . 6 S p e c t r a l m e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 6 6 . 2 . 7 S D S — P A G E o f p u r i fi e d c y t o c h r o m e o x i d a s e . . . . . . . . . . . . 1 6 6 6 . 3 R e s u l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 7 6 . 3 . 1 M i t o c h o n d r i a f r o m e t i o l a t e d w h e a t s e e d l i n g s a n d w h e a t g e r m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 7 6 . 3 . 2 P u r i fi c a t i o n o f c y t o c h r o m e o x i d a s e b y F P L C . . . . . . . . . . 1 7 2 6 . 3 . 3 C y t o c h r o m e c k i n e t i c s o f w h e a t c y t o c h r o m e o x i d a s e 1 7 9 6 . 3 . 4 S u b u n i t a n a l y s i s o f w h e a t o x i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 5 6 . 4 D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 8 C H A P T E R 7 - T h e n u m b e r a n d n a t u r e o f s u b u n i t s i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m w h e a t 7 . 1 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 1 7 . 2 M a t e r i a l s a n d m e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 3 7 . 2 . 1 G e l e l e c t r o p h o r e s i s a n d i m m u n o b l o t t i n g . . . . . . . . . . . . . . 1 9 3 7 . 2 . 2 P r e p a r a t i o n o f a n t i b o d i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 4 7 . 2 . 3 P u t i fi c a t i o n o f w h e a t o x i d a s e f o r s u b u n i t a n a l y s i s . 1 % 7 . 2 . 3 . 1 S o d i u m b r o m i d e w a s h o f m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 % 7 . 2 . 3 . 2 S o l u b i l i z a t i o n o f m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s w i t h T r i t o n X - 1 0 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 % 7 . 2 . 4 I - I P L C o f w h e a t o x i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 % 7 . 2 . 5 P r o t e o l y t i c d i g e s t i o n o f s u b u n i t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 % 7 . 2 . 6 S e q u e n c i n g o f w h e a t o x i d a s e p e p t i d e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 7 7 . 3 R e s u l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 7 7 . 3 . 1 D e t e r m i n a t i o n o f t h e t r u e s u b u n i t c o m p o s i t i o n o f w h e a t o x i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 7 7 . 3 . 1 . 1 N a t i v e g e l e l e c t r o p h o r e s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 9 7 . 3 . 1 . 2 I m m u n o l o g i c a l m e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 0 7 . 3 . 1 . 3 O t h e r p u r i fi c a t i o n t e c h n i q u e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 2 7 . 3 . 2 A m i n o a c i d s e q u e n c e o f s u u n i t I I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 5 7 . 3 . 2 . 1 I s o l a t i o n o f s u b u n i t I I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 5 7 . 3 . 2 . 2 P r o t e o l y t i c d i g e s t i o n o f s u b u n i t I I . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 3 7 . 3 . 2 . 3 A m i n o a c i d s e q u e n c e s o f s u b u n i t I I p e p t i d e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 5 7 . 3 . 3 C o m p a r i s o n o f w h e a t o x i d a s e s u b u n i t s t o o t h e r o x i d a s e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 7 7 . 3 . 3 . 1 I m m u n o b l o t c o m p a r i s o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 7 7 . 3 . 3 . 2 N - t e r m i n a l s e q u e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 9 7 . 4 D i s c u s s i o n a n d f u t u r e p r o s p e c t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 0 x 6 . 2 . 4 I s o l a t i o n o f c y t o c h r o m e o x i d a s e f r o m m i t o c h o n - d r i a l m e m b r a n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 4 6 . 2 . 5 A s s a y m e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 5 6 . 2 . 6 S p e c t r a l m e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 6 6 . 2 . 7 S D S - P A G E o f p u r i fi e d c y t o c h r o m e o x i d a s e . . . . . . . . . . . . 1 6 6 6 . 3 R e s u l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 7 6 . 3 . 1 M i t o c h o n d r i a f r o m e t i o l a t e d w h e a t s e e d l i n g s a n d w h e a t g e r m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 7 6 . 3 . 2 P u r i fi c a t i o n o f c y t o c h r o m e o x i d a s e b y F P L C . . . . . . . . . . 1 7 2 6 . 3 . 3 C y t o c h r o m e c k i n e t i c s o f w h e a t c y t o c h r o m e o x i d a s e 1 7 9 6 . 3 . 4 S u b u n i t a n a l y s i s o f w h e a t o x i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 5 6 . 4 D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 8 C H A P T E R 7 - T h e n u m b e r a n d n a t u r e o f s u b u n i t s i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m w h e a t 7 . 1 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 1 7 . 2 M a t e r i a l s a n d m e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 % 7 . 2 . 1 G e l e l e c t r o p h o r e s i s a n d i m m u n o b l o t t i n g . . . . . . . . . . . . . . 1 % 7 . 2 . 2 P r e p a r a t i o n o f a n t i b o d i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 4 7 . 2 . 3 P u t i fi c a t i o n o f w h e a t o x i d a s e f o r s u b u n i t a n a l y s i s . 1 % 7 . 2 . 3 . 1 S o d i u m b r o m i d e w a s h o f m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 % 7 . 2 . 3 . 2 S o l u b i l i z a t i o n o f m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s w i t h T r i t o n X - 1 0 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 % 7 . 2 . 4 H P L C o f w h e a t o x i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 % 7 . 2 . 5 P r o t e o l y t i c d i g e s t i o n o f s u b u n i t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 % 7 . 2 . 6 S e q u e n c i n g o f w h e a t o x i d a s e p e p t i d e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 7 7 . 3 R e s u l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 7 7 . 3 . 1 D e t e r m i n a t i o n o f t h e t r u e s u b u n i t c o m p o s i t i o n o f w h e a t o x i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 7 7 . 3 . 1 . 1 N a t i v e g e l e l e c t r o p h o r e s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 9 7 . 3 . 1 . 2 I m m u n o l o g i c a l m e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 ! ) 7 . 3 . 1 . 3 O t h e r p u r i fi c a t i o n t e c h n i q u e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 7 . 3 . 2 A m i n o a c i d s e q u e n c e o f s u u n i t I I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 5 7 . 3 . 2 . 1 I s o l a t i o n o f s u b u n i t I I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 5 7 . 3 . 2 . 2 P r o t e o l y t i c d i g e s t i o n o f s u b u n i t I I . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 3 7 . 3 . 2 . 3 A m i n o a c i d s e q u e n c e s o f s u b u n i t I I p e p t i d e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 5 7 . 3 . 3 C o m p a r i s o n o f w h e a t o x i d a s e s u b u n i t s t o o t h e r o x i d a s e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 7 7 . 3 . 3 . 1 I m m u n o b l o t c o m p a r i s o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 7 7 . 3 . 3 . 2 N - t e r m i n a l s e q u e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 9 7 . 4 D i s c u s s i o n a n d f u t u r e p r o s p e c t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 % C H A P T E R S — S p e c t r a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f c y t o c h m m e c o x i d m e f r o m w h e a t 8 . 1 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 % 8 . 2 M a t e r i a l s a n d m e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 8 8 . 2 . 1 P r e p a r a t i o n o f c y t o c h r o m e o x i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 8 8 . 2 . 2 S p e c t r a l m e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 % 8 . 3 R e s u l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 0 8 . 3 . 1 E P R s p e c t r u m o f w h e a t c y t o c h r o m e o x i d a s e . . . . . . . . . . 2 % 8 . 3 . 2 V i s i b l e a b s o r p t i o n s p e c t r a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 3 8 . 3 . 3 R e s o n a n c e R a m a n s p e c t r o s c o p y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 0 8 . 4 D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 7 8 . 4 . 1 C u A e n v i r o n m e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 7 8 . 4 . 2 V i s i b l e a b s o r p t i o n s p e c t r a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 8 8 . 4 . 3 R e s o n a n c e R a m a n s p e c t r a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 9 8 . 4 . 3 . 1 V i n y l m o d e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 9 8 . 4 . 3 . 2 F o r m y l m o d e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 9 8 . 4 . 4 R e c o n c i l i n g t h e a b s o r p t i o n a n d R R d a t a . . . . . . . . . . . . . . . . 2 ! ) 8 . 4 . 5 I m p l i c a t i o n s f o r p r o t o n p u m p i n g a c t i v i t y . . . . . . . . . . . . . . % 1 B i b l i o g r a p h y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 3 x i 3 . 1 : 3 . 2 : 3 . 3 : 7 . 1 : 7 . 2 : 3 . 1 : C o m p a c h o n d r j C o m p a ; V m a x a 8 . 1 : 3 . 2 : 3 . 3 : 7 . 1 : 7 . 2 : 8 . 1 : L i s t o f T a b l e s P a c e C o m p a r i s o n o f p a s s i v e s w e l l i n g o f N a n d T m a i z e m i t o - c h o n d r i a i n a K 0 1 b u f f e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 5 C o m p a r i s o n o f N a n d T m a i z e m i t o c h o n d r i a A T P a s e V m a x a n d K m v a l u e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 6 I n h i b i t i o n o f A T P a s e a c t i v i t y b y o l i g o m y c i n , m e t h o m y l , a n d B m T t o x i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 9 S e q u e n c e a l i g n m e n t o f s u b u n i t V c f r o m w h e a t a n d s w e e t p o t a t o ( N a k a g a w a e t a l . , 1 9 8 7 ) c y t o c h r o m e o x i d a s e . . . . . . . . . . . . . . 1 2 2 S e q u e n c e a l i g n m e n t o f s u b u n i t N f r o m w h e a t , y e a s t , a n d N . c r a s s a , a n d s u b u n i t V b f r o m b o v i n e c y t o c h r o m e o x i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 A s s i g n m e n t o f h i g h - f r e q u e n c y v i b r a t i o n s ( c m - 1 ) i n p l a n t c y t o c h r o m e o x i d a s e a n d c o m p a r i s o n s w i t h t h e m a m m a l i a n e n z y m e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 6 x i i 1 . 1 : 2 . 1 : 3 . 1 : 3 . 3 : 3 . 4 : 3 . 5 ; 3 . 6 ; : 1 7 ; i s ; D i a g r a S t r u c t ‘ P e t u n i S c h e m . c 0 1 1 1 ( 1 W i t h N M o l e c u l P o l a r o g r a t i o i t P O I a I ‘ O g c h o l l d r 1 . 1 : 2 . 1 : 2 . 2 : 3 . 3 : 3 . 4 : 3 . 5 : 3 . 6 : 3 . 7 : 3 . 8 : L i s t o f F i g m e s P a g e D i a g r a m o f t h e r e s p i r a t o r y c h a i n o f m i t o c h o n d r i a . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 S t r u c t u r e o f t h e C M S - S p e c i fi c g e n e r e a r r a n g e m e n t s i n p e t u n i a ( A ) a n d m a i z e , T c y t o p l a s m ( B ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 S c h e m a t i c c o m p a r i s o n o f s t r u c t u r e s o f a t p 9 ( A ) , a t p 6 ( B ) , c o x I I ( C ) g e n e l o c i i n m i t o c h o n d r i a l D N A f r o m m a i z e w i t h N , T , a n d C c y t o p l a s m s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 M o l e c u l a r s t r u c t u r e s o f m e t h o m y l ( A ) a n d B m T t o x i n ( B ) . . . . . m P o l a r o g r a p h i c m e a s u r e m e n t o f t h e r e s p i r a t o r y c o n t r o l r a t i o i n m a i z e m i t o c h o n d r i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 O P o l a r o g r a p h i c a s s a y o f t h e i n t a c t n e s s o f t h e o u t e r m i t o - c h o n d r i a l m e m b r a n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2 P o l a r o g r a p h i c t r a c e o f a t y p i c a l a s s a y f o r d i g i t o n i n s e n s i t i v i t y o f m i t o c h o n d r i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 4 C o m p a r i s o n o f d i g i t o n i n s e n s i t i v i t y o f t w o N a n d T m i t o - c h o n d r i a p r e p a r a t i o n s e a c h a s m e a s u r e d b y t h e c y t o c h r o m e c l e a k a g e t e s t f o r i n t a c t n e s s o f o u t e r m e m b r a n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 8 C o m p a r i s o n o f d i g i t o n i n s e n s i t i v i t y o f N a n d T m i t o c h o n d r i a a s m e a s u r e d b y r e s p i r a t o r y c o n t r o l r a t i o s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 0 C o m p a r i s o n o f R C R v a l u e s o f T m i t o c h o n d r i a m e a s u r e d i n K C ] o r s u c r o s e b u f f e r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 2 P a s s i v e s w e l l i n g o f T m a i z e m i t o c h o n d r i a i n a K 0 1 b u fi ' e r . . . . . 5 4 C o m p a r i s o n o f d i g i t o n i n s e n s i t i v i t y o f N a n d T m i t o c h o n d r i a a s m e a s u r e d b y t h e s i m p l i fi e d c y t o c h r o m e c l e a k a g e t e s t f o r i n t a c t n e s s o f o u t e r m e m b r a n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 6 x i i i 3 3 . 1 1 3 3 . 1 4 : : 2 : E f f e c t E f f e c t E f f s e e c c t t a s . 3 . 1 5 : E f 3 ' 1 6 : A T f P 3 . 1 7 ; E f r e m ( 3 . 9 : 3 . 1 0 : 3 . 1 1 : 3 . 1 2 : 3 . 1 3 : 3 . 1 4 : 3 . 1 5 : 3 . 1 6 : 3 . 1 7 : 4 . 1 : 4 . 2 : 4 . 3 : 4 . 4 : E fi ' e c t o f t o x i n ( A ) a n d m e t h o m y l ( B ) o n t h e s w e l l i n g o f T a n d N m a i z e m i t o c h o n d r i a u s i n g g l u t a m a t e / m a l a t e a s s u b s t r a t e . . . . 5 9 E fi ‘ e c t o f t o x i n ( A ) a n d m e t h o m y l ( B ) o n t h e s w e l l i n g o f T a n d N m a i z e m i t o c h o n d r i a u s i n g s u c c i n a t e a s s u b s t r a t e . . . . . . . . . . . . . . . . 6 1 E f f e c t o f D C C D o n m e t h o m y l - i n d u c e d s w e l l i n g o f T m a i z e m i t o c h o n d r i a u s i n g s u c c i n a t e a s s u b s t r a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 4 E f f e c t o f D C C D o n m e t h o m y l - i n d u c e d s w e l l i n g o f T m a i z e m i t o c h o n d r i a u s i n g g l u t a m a t e / m a l a t e a s s u b s t r a t e . . . . . . . . . . . . . . % E f f e c t o f q u e r c e t i n o n t h e m e t h o m y l - i n d u c e d s w e l l i n g o f T m a i z e m i t o c h o n d r i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . % E f f e c t s o f v a r i o u s A T P s y n t h a s e i n h i b i t o r s o n t h e t o x i n o r m e t h o m y l - i n d u c e d s w e l l i n g o f T m a i z e m i t o c h o n d r i a . . . . . . . . . . . 7 1 E f f e c t o f m e r s a l y l o n t h e t o x i n a n d m e t h o m y l - i n d u c e d s w e l l i n g o f T m a i z e m i t o c h o n d r i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 3 A T P a s e a c t i v i t y v s . A T P c o n c e n t r a t i o n f o r N a n d T m a i z e m i t o c h o n d r i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 5 E f f e c t o f D C C D o n u n c o u p l e r - i n d u c e d A T P a s e a c t i v i t y i n T m a i z e m i t o c h o n d r i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 7 S e p a r a t i o n o f m a i z e m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n s b y a n i o n - e x c h a n g e F P L C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1 S e p a r a t i o n o f C M S - T m a i z e m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n s b y a n i o n - e x c h a n g e F P L C u n d e r “ l o w s a l t ” c o n d i t i o n s ( A ) , a n d r e a c t i o n o f f r a c t i o n s w i t h a n t i b o d y a g a i n s t t h e 1 3 k D a p e p t i d e ( B ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 4 W e s t e r n b l o t a n a l y s i s o f f r a c t i o n s f r o m “ l o w s a l t ” F P L C ( F i g u r e 4 . 2 A ) u s i n g a n t i b o d i e s a g a i n s t A T P o t a n d c y t o c h r o m e o x i d a s e s u b u n i t I I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 7 S e p a r a t i o n o f C M S - T m a i z e m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n s b y a n i o n - e x c h a n g e F P L C u n d e r “ h i g h s a l t ” c o n d i t i o n s ( A ) , a n d r e a c t i o n w i t h a n t i b o d y a g a i n s t t h e 1 3 k D a p e p t i d e ( B ) . . . . . . . . . . . . % x i v 4 . 5 : 4 . 6 : 4 . 7 : 4 . 8 : 4 . 9 : 4 . 1 0 : 5 . 1 : 5 . 2 : 6 . 1 : 6 . 4 : 6 . 5 : S e p a r a t i o n o f C M S - T m a i z e m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n s b y a n i o n - e x c h a n g e F P L C u n d e r “ h i g h d e t e r g e n t ” c o n d i t i o n s ( A ) , a n d r e a c t i o n o f f r a c t i o n s a n t i b o d y a g a i n s t t h e 1 3 k D a p e p t i d e ( B ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 2 R e - c h r o m a t o g r a p h y o f a C M S - T m a i z e m i t o c h o n d r i a f r a c t i o n f r o m t h e “ h i g h d e t e r g e n t ” F P L C r u n o n a n i o n - e x c h a n g e F P L C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 4 S e p a r a t i o n o f m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n f r o m C M S p e t u n i a ( 3 6 8 8 ) b y c a t i o n - e x c h a n g e F P L C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 8 W e s t e r n b l o t a n a l y s i s o f f r a c t i o n s f r o m C M S p e t u n i a ( 3 6 8 8 ) f r a c t i o n a t i o n o n c a t i o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y . . . . . . . . . . . . . 1 1 0 S e p a r a t i o n o f m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n s f r o m C M S p e t u n i a ( 1 0 6 3 6 ) b y c a t i o n - e x c h a n g e F P L C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 2 V i s i b l e d i f f e r e n c e s p e c t r a ( d i t h i o n i t e - r e d u c e d m i n u s a i r - o x i d i z e d ) o f l a u r y l m a l t o s i d e — s o l u b i l i z e d p e t u n i a m i t o c h o n d r i a f r o m C M S , f e r t i l e , a n d r e s t o r e d l i n e s . . . . . . . . . . . . . 1 1 4 D i a g r a m o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 ) P r o p o s e d r e a c t i o n s e q u e n c e o f 0 2 r e d u c t i o n b y t h e b i n u c l e a r c e n t e r o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 7 P o l a r o g r a p h i c m e a s u r e m e n t o f r e s p i r a t o r y c o n t r o l r a t i o o f m a i z e a n d w h e a t s e e d l i n g m i t o c h o n d r i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 % D i f f e r e n c e s p e c t r a ( d i t h i o n i t e - r e d u c e d m i n u s a i r - o x i d i z e d ) o f l a u r y l m a l t o s i d e - s o l u b i l i z e d ( 2 m g / m g p r o t e i n ) m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s f r o m w h e a t g e r m ( 1 . 0 m g / m L , - - - ) a n d e t i o l a t e d w h e a t s e e d l i n g s ( 0 . 3 2 m g / m L , — ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 1 F P L C e l u t i o n p r o fi l e o f l a u r y l m a l t o s i d e - s o l u b i l i z e d w h e a t g e r m m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 4 V i s i b l e s p e c t r u m o f p u r i fi e d w h e a t g e r m c y t o c h r o m e c o x i d a s e a f t e r g e l fi l t r a t i o n o n S u p e r o s e 6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 6 V i s i b l e s p e c t r u m o f p u r i fi e d w h e a t g e r m b c 1 c o m p l e x a f t e r o n e M o n o Q f r a c t i o n a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 8 7 . 1 : S F D P S - P . L C 7 3 ' D 0 l i f a f u f w r e h y e r l e t r e 7 ' 5 : S D S ~ P A ( i 6 : E a d i e ( A ) o r s e e d l i ( i 7 : E a d i e m i t o c l o x i d a s 6 . 8 : E a d i e - C l l O D d l w i t h 1 2 h e a r t 6 9 : S u b u n w h i c h : 7 2 * h u m o r o x i d a s e m e m b r 7 ' 4 “ . S e p a r a t r e v e r s e . 7 ' 6 : P u l ' i fi c a 7 ' 7 : S D S P A d l g e S t l m l e e C t l ‘ o p A 7 3 : 6 . 6 : 6 . 7 : 6 . 8 : 7 . 1 : 7 . 2 : 7 . 3 : 7 . 4 : 7 . 5 : 7 . 6 : 7 . 7 : 7 . 8 : 7 . 9 : 7 . 1 0 : E a d i e - H o f s t e e p l o t o f t h e l n ' n e t i c s o f r e a c t i o n o f s o l u b i l i z e d ( A ) o r w h o l e ( B ) m e m b r a n e s f r o m w h e a t g e r m a n d w h e a t s e e d l i n g w i t h h o r s e h e a r t c y t o c h r o m e c . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E a d i e - H o f s t e e p l o t o f t h e k i n e t i c s o f r e a c t i o n o f s o l u b i l i z e d m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s a n d p u r i fi e d c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m w h e a t g e r m w i t h h o r s e h e a r t c y t o c h r o m e c . . . . E a d i e - H o f s t e e p l o t o f t h e k i n e t i c s o f r e a c t i o n o f m i t o - c h o n d r i a l m e m b r a n e s f r o m w h e a t g e r m s o l u b i l i z e d w i t h l a u r y l m a l t o s i d e a n d T r i t o n X - 1 0 0 w i t h h o r s e . 1 8 2 h e a r t c y t o c h r o m e c . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 4 S u b u n i t c o m p o s i t i o n a n a l y s i s o f w h e a t g e r m a n d s e e d l i n g c y t o c h r o m e o x i d a s e b y S D S - P A G E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 7 S D S - P A G E a n a l y s i s o f w h e a t g e r m c y t o c h r o m e o r d d a s e F P L C f r a c t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 % I m m u n o b l o t a n a l y s i s o f p u r i fi e d w h e a t g e r m c y t o c h r o m e o x i d a s e , w h e a t g e r m a n d w h e a t s e e d l i n g m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 1 D i f f e r e n c e s p e c t r a ( d i t h i o n i t e - r e d u c e d m i n u s a i r - o x i d i z e d ) o f w h e a t g e r m m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s s o l u b i l i z e d i n l a u r y l m a l t o s i d e o r T r i t o n X — 1 0 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 4 S e p a r a t i o n o f w h e a t c y t o c h r o m e o x i d a s e s u b u n i t s b y r e v e r s e - p h a s e H P L C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 7 S D S - P A G E a n a l y s i s o f p e a k s f r o m r e v e r s e - p h a s e H P L C i n F i g u r e 7 . 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . m 8 P u r i fi c a t i o n o f s u b u n i t I I ‘ b y r e v e r s e - p h a s e H P L C . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 9 S D S - P A G E a n a l y s i s o f s u b u n i t H a n d i t s p r o t e o l y t i c d i g e s t i o n s p u r i fi e d b y H P L C a n d p r e p a r a t i v e g e l e l e c t r o p h o r e s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 2 P r e d i c t e d a m i n o a c i d s e q u e n c e o f w h e a t c y t o c h r o m e o x i d a s e s u b u n i t I I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 4 A m i n o a c i d s o b t a i n e d i n e a c h s e q u e n c i n g c y c l e o f t h e s m a l l e s t b a n d o n S D S g e l s o f a V 8 d i g e s t o f s u b u n i t I I . . . . . . . . . 2 1 6 W e s t e r n b l o t a n a l y s i s o f w h e a t g e r m c y t o c h r o m e o x i d a s e . . . . 2 1 8 I ; 8 . 1 : 8 . 2 : 8 . 3 : 8 . 4 : 8 . 6 : 8 . 7 : 8 . 8 : 8 . 9 : 8 . 1 0 ; 8 . 1 : E P R s p e c t r a o f p u r i fi e d m a i z e ( 6 0 M , u p p e r t r a c e ) a n d w h e a t g e r m ( 6 4 M , l o w e r t r a c e ) c y t o c h r o m e c o x i d a s e i n F P L C b u f f e r ( d e s c r i b e d i n t h e l e g e n d o f F i g . 6 . 3 ) w i t h 0 . 5 M K C l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 2 8 . 2 : 8 3 0 n m a b s o r p t i o n b a n d o f o x i d i z e d ( u p p e r ) a n d r e d u c e d ( l o w e r ) w h e a t c y t o c h r o m e o x i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 5 8 . 3 : C o m p a r i s o n o f o n b a n d a b s o r b a n c e i n a i r - o x i d i z e d ( - - - ) a n d f e r r i c y a n i d e - o x i d i z e d ( — ) w h e a t g e r m o x i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 7 8 . 4 : D i f f e r e n c e s p e c t r u m o f h e m e a i n b e e f h e a r t ( A ) a n d w h e a t g e r m ( B ) o x i d a s e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 0 8 . 5 : E f f e c t o f c y a n i d e b i n d i n g o n t h e a b s o r p t i o n s p e c t r u m o f w h e a t c y t o c h r o m e o x i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 2 8 . 6 : S e c o n d d e r i v a t i v e a n a l y s i s o f h e m e a d i f f e r e n c e s p e c t r a i n b e e f h e a r t ( A ) a n d w h e a t g e r m ( B ) o x i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 5 8 . 7 : E f f e c t o f C O b i n d i n g o n t h e a b s o r p t i o n s p e c t r a o f d i t h i o n i t e - r e d u c e d w h e a t g e r m c y t o c h r o m e o x i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 7 8 . 8 : S e c o n d d e r i v a t i v e a n a l y s i s o f a b s o r p t i o n s p e c t r a o f C O - b o u n d c y t o c h r o m e o x i d a s e f r o m w h e a t g e r m ( A ) a n d b e e f h e a r t ( B ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 9 8 . 9 : R e s o n a n c e R a m a n s p e c t r a o f w h e a t g e r m c y t o c h r o m e o x i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 2 8 . 1 0 : R e s o n a n c e R a m a n s p e c t r a o f m i x e d - v a l e n c e , C N - t r e a t e d w h e a t g e r m c y t o c h r o m e o x i d a s e e x c i t e d a t : ( a ) 4 4 1 . 6 n m ( 1 0 m W ) ; a n d ( b ) 6 0 2 n m ( 1 0 0 m W ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 4 x v i i M o n B S A C A P S C C C P C M S E D T A E G T A E L I S A B S A C A P S C C C P C M S E D T A E G T A E L I S A E N D O R E P R E X A F S F P L C H P L C M C D P M S F P V P R C R R R S D S S D S - P A G E S H A M T E S T F A T M P D L i s t o t ' A b b r e v i a t i o n s b o v i n e s e r u m a l b u m i n 3 - c y c l o h e x y l a m i n o - 1 - p r o p a n e s u l f o n i c a c i d c a r b o n y l c y a n i d e m - c h l o r o p h e n y l h y d r a z o n e c y t o p l a s m i c m a l e s t e r i l i t y e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d e t h y l e n e g l y c o l - b i s ( B o a m i n o e t h y 1 e t h e r ) - N , N , N ' , N ' - t e t r a a c e t i c a c i d e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y e l e c t r o n - n u c l e a r d o u b l e r e s o n a n c e e l e c t r o n p a r a m a g n e t i c r e s o n a n c e ‘ e x t e n d e d X - r a y a b s o r p t i o n fi n e s t r u c t u r e f a s t p r o t e i n l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y m a g n e t i c c i r c u l a r d i c h r o i s m p h e n y l m e t h y l s u l f o n y l fl u o r i d e p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e r e s p i r a t o r y c o n t r o l r a t i o r e s o n a n c e R a m a n s p e c t r o s c o p y s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e S D S p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s s a l i c y l h y d r o x a m i c a c i d N - t r i s [ h y d r o x y m e t h y l ] m e t h y l - Z - a m i n o e t h a n e s u l f o n i c a c i d t r i fl u o r o a c e t i c a c i d N , N , N ’ , N ’ - t e t r a m e t h y l p - p h e n y l e n e d i a m i n e 1 . 1 O v e n : I n a l l a n d c o n s e n t fi p h o s p h a t m a n y b a c t e r m o l e c u l e s w f a t s , a n d p r s u c h a s C C p h O S D h O r y l a I n C O C h a p t e r 1 - P l a n t m i t o c h o n d r i a a n d r e s p i r a t i o n 1 . 1 O v e r v i e w I n a l l l i v i n g o r g a n i s m s e n e r g y i s e x t r a c t e d f r o m t h e e n v i r o n m e n t a n d c o n s e r v e d i n t h e f o r m o f a h i g h e n e r g y c h e m i c a l b o n d , o f t e n t h e t r i p h o s p h a t e b o n d o f A T P , i n o r d e r t o d o c e l l u l a r w o r k . F o r a n i m a l s a n d m a n y b a c t e r i a , t h e s o u r c e o f e n e r g y i s t h e b o n d s b e t w e e n a t o m s o f o r g a n i c m o l e c u l e s w h i c h a r e s e q u e s t e r e d f r o m t h e e n v i r o n m e n t . C a r b o h y d r a t e s , f a t s , a n d p r o t e i n s i n f o o d s t u f f s a r e b r o k e n d o w n i n t o s i m p l e r m o l e c u l e s s u c h a s 0 0 2 , T h e e n e r g y i s c h a n n e l e d i n t o A T P t h r o u g h o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n i n t h e m i t o c h o n d r i a . I n c o n t r a s t , t h e e n e r g y s o u r c e o f p l a n t s a n d s o m e b a c t e r i a i s s u n l i g h t . I n t h e p r o c e s s o f p h o t o s y n t h e s i s , a b s o r b e d p h o t o n s o f l i g h t s t i m u l a t e a c a s c a d e o f r e a c t i o n s i n t h e c h l o r o p l a s t s w h i c h a l l o w s A T P t o b e p r o d u c e d , t h u s s t o r i n g t h e e n e r g y g a i n e d . S i n c e s u n l i g h t i s n o t a v a i l a b l e a l l t h e t i m e , p l a n t s s t o r e l a r g e a m o u n t s o f e n e r g y i n t h e c h e m i c a l b o n d s o f s t a r c h . I n t h e d a r k , t h e s t a r c h i s b r o k e n d o w n t o C 0 2 a n d A T P i s p r o d u c e d i n t h e m i t o c h o n d r i a , b y a p r o c e s s a n a l o g o u s t o a n i m a l r e s p i r a t i o n . B e c a u s e o f t h e d i f f e r e n t e n e r g y - s e c u r i n g s t r a t e g y o f p l a n t s , p l a n t m i t o c h o n d r i a h a v e a s s u m e d s o m e w h a t d i f f e r e n t m e t a b o l i c r o l e s t h a n t h e i r a n i m a l c o u n t e r p a r t s . I n t h e l i g h t , f o r i n s t a n c e , m i t o c h o n d r i a l r e s p i r a t i o n i s u s u a l l y s u p p r e s s e d , b u t p l a n t m i t o c h o n d r i a p a r t i c i p a t e i n t h e c y c l e o f p h o t o r e s p i r a t i o n , d e c a r b o x y l a t i n g g l y c i n e p r o d u c e d i n t h e p e r o x i s o m e s a n d r e t u r n i n g t h e N A D H v i a t h e m a l a t e s h u t t l e . T h e u n i q u e r o l e s o f p l a n t m i t o c h o n d r i a h a v e p r o d u c e d s o m e i n t e r e s t i n g s t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l d i f f e r e n c e s l a n d a n i m a l 1 . 2 R e s p i r T h e 1 b e t w e e n a l l f r o m t h e b r q a c i d C y c l e a d o n a t e t h e i r 0 f m u l t i s u b i n t o t h e c m i t o c h o n d t a c r o s s t h e r A T P S m t h a t h e r e s p i r a t T h e d o n a t e d b y J o f l i p i d ‘ S O I u C h a i n t h r o u t h e ° t h e i - c . c y t o c h r o m e c a n d a r e t r a n s f e r r e d t h r o u g h h e m e A a n d c o p p e r c e n t e r s t o d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e m e t a b o l i c p a t h w a y s a n d t h e i r c o m p o n e n t s o f p l a n t a n d a n i m a l m i t o c h o n d r i a . 1 . 2 R e s p i r a t o r y p a t h w a y T h e m a i n p a t h w a y o f e n e r g y c o n s e r v a t i o n i s r e m a r k a b l y s i m i l a r b e t w e e n a l l s p e c i e s , f r o m a n i m a l s t o p l a n t s t o b a c t e r i a . E l e c t r o n s e x t r a c t e d f r o m t h e b r e a k d o w n o f o r g a n i c m o l e c u l e s i n g l y c o l y s i s a n d t h e t r i c a r b o x y l i c a c i d c y c l e a r e s t o r e d t e m p o r a r i l y a s N A D H a n d F A D H 2 . T h e s e c a r r i e r s d o n a t e t h e i r e l e c t r o n s t o t h e r e s p i r a t o r y c h a i n i n t h e m i t o c h o n d r i a , a s e r i e s o f m u l t i s u b u n i t c o m p l e x e s w h i c h c h a n n e l t h e e n e r g y o f e l e c t r o n t r a n s f e r i n t o t h e c r e a t i o n o f a n e l e c t r o c h e m i c a l g r a d i e n t a c r o s s t h e i n n e r m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e , i n p a r t b y t h e v e c t o r i a l m o v e m e n t o f p r o t o n s a c r o s s t h e m e m b r a n e . T h e c o n t r o l l e d r e l e a s e o f t h e p r o t o n g r a d i e n t b y t h e A T P s y n t h a s e d r i v e s t h e s y n t h e s i s o f A T P f r o m A D P . A r e p r e s e n t a t i o n o f t h e r e s p i r a t o r y c h a i n i s s h o w n i n F i g u r e 1 . 1 T h e N A D H d e h y d r o g e n a s e ( c o m p l e x I ) t r a n s f e r s t h e e l e c t r o n s d o n a t e d b y N A D H t h r o u g h t h e F M N a n d F e - S c e n t e r s o f t h e p r o t e i n t o a p o o l o f l i p i d - s o l u b l e c o e n z y m e Q ( Q ) . A l t e r n a t i v e l y , e l e c t r o n s c a n f e e d i n t o t h e c h a i n t h r o u g h t h e s u c c i n a t e d e h y d r o g e n a s e ( c o m p l e x I I ) . I n c o n t r a s t t o t h e o t h e r c o m p l e x e s , t r a n s f e r o f e l e c t r o n s f r o m F A D H z t o t h e Q p o o l b y c o m p l e x I I i s n o t c o u p l e d t o A T P s y n t h e s i s ; t h e e n z y m e d o e s n o t p u m p p r o t o n s . E l e c t r o n s f r o m t h e Q p o o l t h e n p a s s t h r o u g h t h e c y t o c h r o m e c r e d u c t a s e ( c o m p l e x I I I , a l s o c a l l e d b c 1 c o m p l e x b e c a u s e o f i t s b a n d 0 1 c y t o c h r o m e s ) t o c y t o c h r o m e c i n t h e i n t e r m e m b r a n e s p a c e . F o u r e l e c t r o n s a r e d o n a t e d t o c y t o c h r o m e c o x i d a s e ( c o m p l e x I V ) s e q u e n t i a l l y f r o m _ ~ . - — . £ A : n a n i o o p o o o t a a a o o p , c y t o p l a s m i c N A D H I - . u - . . . - l u n n n u ’ J 2 2 0 H 0 V I N x C e K / l / b h r o C ‘ - e s H > D — t e A c n - a ) N u a c i d r e b r o m m h s l 5 e a l b m w . a i r d n o h c o t i p r - m o H > e t t D f y o — c o u A - N ( 2 A n _ 0 i n l c l y m l a l M ‘ 1 0 l A x ' e a h c / r y t e 0 H i n l 0 / e i / a S o l r p t s 0 i m a a 0 t m 0 / d a , a o 0 n o C I e i t 0 I x r i y l e t ‘ s g v i s a r o p i 0 | e i r o 3 3 . J I I H e D I P s > - = D O - D a O n I A D I e N g O I l o O O a r e n o r t a r i d i e r n b o i h h d h n n t i c o h o f t s c I o o i e t I m t a m i t c x i m n e l l n a a d D l D n r l A u q l p g a m ' a p i n d r l I y e ' h I t l x e ' e d d O r b 3 3 ' C U 1 r ; ’ l o i 1 0 D 0 0 / : 1 . / 0 0 0 0 0 0 0 > ' e > 0 1 0 0 E r r / 0 — e s v e — a " l 0 0 n r O O e " l 0 — t e 0 — u g D H 0 s g s 0 e n o t O " 0 e a 0 D i F O 0 n n A 0 s d e r e l " o O 0 0 n y N n g D 0 h 0 x l e a n i c c l o . - ) O u 0 0 t / e e a r e l D a 0 I n 0 o l n d / " d s r o r n D 0 p y I H r 0 e n O h 0 e m 0 " t O x 0 e e d O 0 ' r 6 o t 0 e D t C A n o " i r ( N 0 0 2 " : ; - ’ c i m s a l p H > — — \ d e o D x t i A H k s y r D . " e c N t l A ; a a m N 4 r : s 0 1 u ” s C . . . ‘ O 0 H 2 0 i n c 0 2 , w h i c h i s r e d u c e d t o w a t e r . P r o t o n s b u i l t u p i n t h e i n t e r m e m b r a n e s p a c e f r o m p r o t o n p u m p i n g a r e t r a n s p o r t e d t h r o u g h t h e m e m b r a n e - b o u n d F 0 r e g i o n o f t h e A T P s y n t h a s e , c a t a l y z i n g t h e r e l e a s e o f n e w l y s y n t h e s i z e d A T P b y t h e F 1 r e g i o n p r o t r u d i n g i n t o t h e m a t r i x . 1 . 3 S t r u c t u r e a n d f t m c t i o n T h e m i t o c h o n d r i o n h a s a s m o o t h o u t e r m e m b r a n e a n d a h i g h l y i n v a g i n a t e d i n n e r m e m b r a n e e n c l o s i n g t h e m a t r i x . A m a j o r c o m p o n e n t o f t h e o u t e r m e m b r a n e i s p o r i n , w h i c h a c t s a s a g a t e t o r e g u l a t e t r a f f i c o f s m a l l m e t a b o l i t e s i n a n d o u t o f t h e m i t o c h o n d r i o n a s w e l l a s a b i n d i n g s i t e f o r a v a r i e t y o f e n z y m e s , s u c h a s t h e h e x o k i n a s e . T h e p r o t e i n - d e n s e i n n e r m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e h o u s e s t h e e l e c t r o n t r a n s f e r c h a i n a s w e l l a s m a n y a u x i l i a r y p r o t e i n s a n d t r a n s p o r t s y s t e m s n e c e s s a r y f o r e n e r g y m e t a b o l i s m , i n c l u d i n g t h e A D P / A T P t r a n s l o c a s e a n d P i t r a n s p o r t e r . T h e m a t r i x c o n t a i n s t h e e n z y m e s o f m a n y i m p o r t a n t m e t a b o l i c p a t h w a y s , i n c l u d i n g t h e t r i c a r b o x y l i c a c i d c y c l e , a m i n o a c i d m e t a b o l i s m , h e m e s y n t h e s i s , m i t o c h o n d r i a l D N A a n d p r o t e i n s y n t h e s i s , a n d i n m o s t e u k a r y o t e s , f a t t y a c i d o x i d a t i o n ( T z a g o l o f f , 1 9 8 2 ) . I n p l a n t s , h o w e v e r , m o s t s t e p s o f f a t t y a c i d o x i d a t i o n o c c u r s i n a s e p a r a t e s u b c e l l u l a r c o m p a r t m e n t c a l l e d t h e g l y o x y s o m e . 1 . 3 . 1 G e n o m e M i t o c h o n d r i a c o n t a i n t h e i r o w n D N A a n d p r o t e i n s y n t h e s i s m a c h i n e r y . M i t o c h o n d r i a l D N A ( m t D N A ) i n m a m m a l s i s a c o m p a c t 1 6 k b c i r c l e ( A n d e r s o n , 1 9 8 1 ; A t t a r d i e t a l . , 1 9 8 1 ) . G e n e s c o d i n g f o r s e v e r a l o f t h e l a r g e r s u b u n i t s o f t h e r e s p i r a t o r y e n z y m e s s u c h a s c y t o c h r o m e o x i d a s e A 1 s u b u n i t s I , I I , a n d I I I a l t e r n a t e b e t w e e n t R N A g e n e s . Y e a s t m t D N A i s s o m e w h a t m o r e c o m p l i c a t e d w i t h a n 8 0 k b c i r c l e e n c o d i n g a s i m i l a r s e t o f p r o t e i n s b u t w i t h a d d i t i o n a l i n t e r v e n i n g s e q u e n c e s a n d i n t r o n s ( B o r s t a n d G r i v e l l , 1 9 7 8 ) . P l a n t m t D N A i s e v e n m o r e c o m p l e x , w i t h g e n o m e s i z e s r a n g i n g f r o m 2 0 0 k b i n O e n o t h e r a ( B r e n n i c k e , 1 9 8 0 ) a n d B r a s s i c a ( L e b a c q e t a l . , 1 9 8 1 ) t o 2 4 0 0 k b i n m u s k m e l O n ( W a r d e t a l . , 1 9 8 1 ) . T h e p u r p o s e o f t h e l a r g e r g e n o m e s i z e o f p l a n t m i t o c h o n d r i a i s u n c l e a r . A h i g h p r o p o r t i o n o f t h e D N A i s t r a n s c r i b e d , b e t w e e n 3 0 % ( M a k a r o f f a n d P a l m e r , 1 9 8 7 ) a n d 1 0 0 % ( F i n n e g a n a n d B r o w n , 1 9 9 0 ) , s u g g e s t i n g t h a t a g r e a t e r n u m b e r o f p r o t e i n s a r e e n c o d e d b y t h e m i t o c h o n d r i a l D N A . H o w e v e r , a s e t o f p r o t e i n s s i m i l a r t o o t h e r e u k a r y o t e s a r e f o u n d t o b e e n c o d e d ( L e v i n g s a n d B r o w n , 1 9 8 9 ) w i t h t h e a d d i t i o n o f t h e A T P s y n t h a s e o n s u b u n i t , w h i c h i s n u c l e a r - e n c o d e d i n b o t h m a m m a l s a n d y e a s t ( B o u t r y e t a l . , 1 9 8 3 ; H a c k a n d L e a v e r , 1 9 8 3 ; I s a a c e t a l . , 1 9 8 5 ) . M a n y o f t h e g e n e s c o n t a i n l a r g e i n t r o n s a s i n y e a s t ( F o x a n d L e a v e r , 1 9 8 1 ; W i s s i n g e r e t a l . , 1 9 8 8 ) , u n l i k e a n i m a l m t D N A , b u t s i n c e t h e p r o t e i n - c o d i n g r e g i o n s w h i c h c o n t a i n t h e i n t r o n s m a k e u p o n l y a s m a l l p a r t o f t h e g e n o m e , t h i s c a n n o t a c c o u n t f o r t h e l a r g e r s i z e o f p l a n t m t D N A . T h e D N A i s o n l y m o d e r a t e l y r e p e t i t i v e ( W a r d e t a l . , 1 9 8 1 ) , s u g g e s t i n g t h a t t h e “ e x t r a ” D N A m a y b e o f e x t e r n a l o r i g i n . I n d e e d , s e q u e n c e s h a v e b e e n f o u n d w h i c h a r e h i g h l y h o m o l o g o u s t o c h l o r o p l a s t D N A ( S t e r n e t a l . , 1 9 8 2 ; L o n s d a l e e t a l . , 1 9 8 3 ; S t e r n a n d P a l m e r , 1 9 8 4 , 1 9 8 6 ) . T r a n s f e r o f c h l o r o p l a s t s e q u e n c e s m a y h a v e t a k e n p l a c e v i a R N A u s i n g a r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e c o d e d f o r i n t h e m i t o c h o n d r i a l g e n o m e ( S c h u s t e r a n d B r e n n i c k e , 1 9 8 7 ) . P o s s i b l y , t h e i n t e g r a t i o n o f r e v e r s e t r a n s c r i b e d f o r e i g n R N A s e q u e n c e s c o n t r i b u t e s t o t h e l a r g e g e n o m e s i z e . h o : 3 1 1 C i n c B r : t i n o t h I D C I I I ) a t 0 r W “ . D i r e c t r e p e a t s s c a t t e r e d t h r o u g h o u t t h e “ m a s t e r c i r c l e ” c a u s e h o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o n , r e s u l t i n g i n m a n y s m a l l e r c i r c l e s i z e s ( P a l m e r a n d S h i e l d s , 1 9 8 4 ; L o n s d a l e e t a l . , 1 9 8 4 ) . R e c o m b i n a t i o n c o u l d h a v e r e s u l t e d i n p s e u d o g e n e s w h i c h h a v e d i v e r g e d a n d b e e n m a i n t a i n e d , i n c r e a s i n g t h e g e n o m e s i z e . H o w e v e r , t h e m i t o c h o n d r i a l D N A f r o m o n e B r a s s i c a s p e c i e s c o n t a i n s n o r e p e a t s a n d i s a l w a y s f o u n d a s a s i n g l e c i r c u l a r m o l e c u l e ( P a l m e r a n d H e r b o n , 1 9 8 7 ) o f 2 0 8 k b , o f s i m i l a r s i z e t o o t h e r p l a n t s . P o s s i b l y t h e e x t r a D N A c o u l d f a c i l i t a t e m R N A p r o c e s s i n g a n d m o d i fi c a t i o n ; h o w e v e r , t h i s h a s n o t b e e n d e m o n s t r a t e d , a n d t h e p u r p o s e a n d s o u r c e o f t h e l a r g e m i t o c h o n d r i a l g e n o m e i n p l a n t s r e m a i n s l a r g e l y u n k n o w n . 1 . 3 . 2 O r i g i n s T h e s i m i l a r i t y o f t h e m i t o c h o n d r i a l a n d b a c t e r i a l e l e c t r o n t r a n s f e r p a t h w a y a n d p r o t e i n s y n t h e s i s m a c h i n e r y l e d t o t h e p r o p o s a l t h a t m i t o c h o n d r i a a r o s e f r o m a n e n d o s y m b i o t i c e v e n t o f a e u b a c t e r i a w i t h a p r o k a r y o t e ( M a r g u l i s , 1 9 7 0 ) , p e r h a p s s i m i l a r t o t h e n o n s u l f u r p u r p l e b a c t e r i a s u c h a s P a r a c o c c u s o r R h o d o b a c t e r ( W h a t l e y , 1 9 8 1 ) . C o m p a r i s o n o f p r o t e i n a n d n u c l e i c a c i d s e q u e n c e s o f v a r i o u s s p e c i e s a l l o w s e v o l u t i o n a r y t r e e s t o b e c o n s t r u c t e d s h o w i n g t h e r e l a t e d n e s s o f s p e c i e s . F r o m t h e s e , D a y h o f f a n d S c h w a r t z ( 1 9 8 1 ) c o n c l u d e t h a t m i t o c h o n d r i a o f a n i m a l s , f u n g i , a n d p l a n t s o r i g i n a t e d f r o m o n e e n d o s y m b i o t i c e v e n t p r e c e d i n g t h e d i v e r g e n c e o f t h e k i n g d o m s . R e c e n t c o m p a r i s o n s h a v e p i n p o i n t e d t h e o r i g i n s o f m i t o c h o n d r i a t o t h e a d i v i s i o n o f t h e p u r p l e b a c t e r i a , s o m e o f w h o s e m e m b e r s a r e k n o w n t o e x i s t i n i n t i m a t e i n t r a c e l l u l a r a s s o c i a t i o n s w i t h e u k a r y o t i c c e l l s ( Y a n g e t a l . , 1 9 8 5 ) , f o r e x a m p l e A g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s , w h i c h i s c o m m o n l y u s e d t o t r a n s f o r m p l a n t s . H o w e v e r , S i l l C 0 1 2 S E C 0 0 0 M a f e r 0 b : S e } P a F e : e h t y 3 0 h c s m a l l a n d l a r g e s u b u n i t r R N A s e q u e n c e s f r o m p l a n t m i t o c h o n d r i a c o m p a r e m o r e f a v o r a b l y t o s e q u e n c e s f r o m b a c t e r i a t h a n t o n o n - p l a n t m i t o c h o n d r i a , s u g g e s t i n g t h a t p l a n t m i t o c h o n d r i a m a y h a v e a r i s e n f r o m a s e c o n d l a t e r e n d o s y m b i o t i c e v e n t ( G r a y e t a l . , 1 9 8 4 ; G r a y e t a l . , 1 9 8 9 ) . 1 . 3 . 3 D e f e c t s o f t h e r e s p i r a t o r y c h a i n S i n c e t h e p r o t e i n c o m p l e x e s o f t h e r e s p i r a t o r y c h a i n h a v e c o m p o n e n t s c o d e d i n b o t h t h e n u c l e u s a n d m i t o c h o n d r i a ( S e b a l d e t a l . , 1 9 7 2 ; M a s o n a n d S c h a t z , 1 9 7 3 ) , a n y d e fi c i e n c y i n r e s p i r a t i o n m a y b e t h e r e s u l t o f a l a r g e n u m b e r o f d e f e c t s i n e i t h e r g e n o m e . R e s p i r a t o r y - d e fi c i e n t y e a s t a r e c a l l e d p e t i t e ( p - ) m u t a n t s b e c a u s e t h e y a r e c h a r a c t e r i z e d b y s m a l l s i z e a n d s l o w g r o w t h ( B o r s t a n d G r i v e l l , 1 9 7 8 ) . T h e y h a v e b e e n r e l a t i v e l y w e l l - s t u d i e d b e c a u s e o f t h e o r g a n i s m ' s a b i l i t y t o s u r v i v e b y m e t a b o l i z i n g f e r m e n t a b l e c a r b o n s o u r c e s . D e f e c t s i n r e s p i r a t i o n a r e l e s s c o m m o n l y o b s e r v e d i n a n i m a l s b e c a u s e t h e r e i s n o a l t e r n a t i v e s o u r c e o f e n e r g y , t h u s s e r i o u s d e f e c t s a r e o f t e n f a t a l ; h o w e v e r , a n i n c r e a s i n g n u m b e r o f “ m i t o c h o n d r i a l m y o p a t h i e s ” h a v e b e e n c h a r a c t e r i z e d i n h u m a n s o v e r t h e p a s t fi v e y e a r s . R e s p i r a t o r y m u t a n t s i n p l a n t s h a v e a l s o b e e n i d e n t i fi e d , r e s u l t i n g i n t h e a b n o r m a l c o n d i t i o n s o f c y t o p l a s m i c m a l e s t e r i l i t y a n d n o n - c h r o m o s o m a l s t r i p e ( d i s c u s s e d b e l o w ) . A c o m m o n e l e m e n t b e t w e e n t h e s e t y p e s o f r e s p i r a t o r y d e f e c t s i s m i t o c h o n d r i a l g e n e r e a r r a n g e m e n t s w h i c h s o m e t i m e s l e a d t o l a r g e d e l e t i o n s o f t h e D N A , p o s s i b l y c a u s e d b y h o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o n b e t w e e n r e p e t i t i v e s e q u e n c e s . 1 . 3 . 3 . 1 H u m a n M i t o c h o n d r i a l M y o p a t h i e s T h e s e d i s o r d e r s ( r e v i e w e d i n C a p a l d i , 1 9 8 8 ) m o s t o f t e n a f f e c t t i s s u e s w i t h h i g h a e r o b i c m e t a b o l i c d e m a n d s , s p e c i fi c a l l y b r a i n , s k e l e t a l m u s c l e , a n d h e a r t . S o m e t i m e s o n l y o n e t i s s u e t y p e i s a f f e c t e d i n a n i n d i v i d u a l , C o . a l l a n p o s s i b l y d u e t o d i f f e r e n t i a l s e g r e g a t i o n o f d e f e c t i v e m i t o c h o n d r i a d u r i n g d e v e l o p m e n t o r b e c a u s e d e f e c t s h a v e o c c u r r e d i n t i s s u e - s p e c i fi c s u b u n i t s . S o m e m y o p a t h i e s a r e m a t e r n a l l y i n h e r i t e d w h i l e o t h e r s a r e n o t , i n d i c a t i n g t h a t b o t h m i t o c h o n d r i a l a n d n u c l e a r g e n e s m a y b e i n v o l v e d . D e f e c t s h a v e b e e n l o c a l i z e d t o s e v e r a l r e s p i r a t o r y c o m p l e x e s w h i c h i n s o m e c a s e s a p p e a r t o b e m i s s i n g o n e o r m o r e s u b u n i t s . T h e m t D N A o f p a t i e n t s w i t h K e a r n s - S a y r e s y n d r o m e a n d p r o g r e s s i v e o p t h a l m o p l e g i a s h o w s l a r g e d e l e t i o n s . O n e v e r y c o m m o n d e l e t i o n i s f o u n d t o b e fl a n k e d b y a 1 3 - b a s e d i r e c t r e p e a t i n n o r m a l m t D N A , s u g g e s t i n g t h a t h o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o n i s r e s p o n s i b i l e f o r t h e d e l e t i o n s ( S c h o n e t a l . , 1 9 8 9 ; H o l t e t a l . , 1 9 8 9 ) . O t h e r d e l e t i o n s a r e a l s o f o u n d t o b e fl a n k e d b y d i r e c t r e p e a t s o f v a r y i n g l e n g t h ( T a n a k a e t a l . , 1 9 8 9 ; Y u z a k i e t a l . , 1 9 8 9 ) . H o w e v e r , n o e v i d e n c e o f a m t D N A d e l e t i o n i s f o u n d i n p a t i e n t s w i t h m y o c l o n u s e p i l e p s y w i t h r a g g e d r e d fi b e r s w h e r e a s e l e c t i v e d e f e c t i n c y t o c h r o m e o x i d a s e s u b u n i t I I i s i n d i c a t e d b y W e s t e r n b l o t s o f m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n ( S c h o n e t a l . , 1 9 8 8 ) . C l e a r l y , t h e m e c h a n i s m s o f m i t o c h o n d r i a l m y o p a t h i e s c a n v a r y g r e a t l y . 1 . 3 . 3 . 2 P l a n t c o n d i t i o n s a s s o c i a t e d w i t h r e s p i r a t o r y d e f e c t s C y t o p l a s m i c m a l e s t e r i l i t y . C y t o p l a s m i c m a l e s t e r i l i t y ( C M S ) i s a m a t e r n a l l y - i n h e r i t e d t r a i t i n w h i c h p o l l e n p r o d u c t i o n i s a b o r t e d . I n m o s t s p e c i e s e x a m i n e d , C M S i s c o r r e l a t e d w i t h m i t o c h o n d r i a l g e n e r e a r r a n g e - m e n t s w h i c h p r e s u m a b l y o c c u r b y h o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o n a s a r e s u l t o f t h e l a r g e n u m b e r o f r e p e a t s i n t h e p l a n t m i t o c h o n d r i a l g e n o m e , l e a d i n g t o p r o d u c t i o n o f n o v e l o r a l t e r e d p r o t e i n s . S e v e r a l g e n e s f o r r e s p i r a t o r y c h a i n c o m p l e x e s a r e i n v o l v e d ; h o w e v e r , n o o n e g e n e s e e m s t o b e c o m m o n t o t h e s e a l t e r a t i o n s ( s e e c h a p t e r 2 ) . C M S c a n b e p r o d u c e d a r t i fi c i a l l y b y s e t t i n g u p a n i n c o m p a t i b i l i t y b e t w e e n t h e n u c l e a r a n d m i t o c h o n d r i a l g e n o m e s b y [ 3 1 ' p a c h ' o t l a s : t h ( 3 3 ‘ I n “ d e C c V a V a a ; f r : p r o t o p l a s t f u s i o n o r r e c u r r e n t b a c k c r o s s i n g . R e c u r r e n t b a c k c r o s s i n g ( c r o s s i n g t h e f e m a l e o f f s p r i n g o f e a c h g e n e r a t i o n w i t h t h e o r i g i n a l m a l e p a r e n t ) p r o d u c e s o f f s p r i n g w h i c h c o n t a i n t h e m i t o c h o n d r i a a n d c h l o r o p l a s t s o f o n e o r i g i n a l p a r e n t ( f e m a l e ) a n d t h e n u c l e a r D N A o f t h e o t h e r o r i g i n a l p a r e n t ( m a l e ) . T h u s a n y e v o l v e d “ m a t c h i n g ” o f t h e n u c l e a r a n d m i t o c h o n d r i a l g e n o m e s i s l o s t . T h e m e c h a n i s m o f d i s r u p t i o n o f m i t o c h o n d r i a l f u n c t i o n i n t h e a n t h e r s h a s y e t t o b e d e t e r m i n e d . I t i s a s s u m e d t h a t t h e n o v e l p r o t e i n s a r e i n v o l v e d , b u t i t n o t u n d e r s t o o d w h y t h e i r p r e s e n c e d o e s n o t a f f e c t t h e n o r m a l f u n c t i o n i n g o f t h e p l a n t . C y t o p l a s m i c m a l e s t e r i l i t y i s d i s c u s s e d i n d e t a i l i n c h a p t e r 2 . N o n - c h r o m o s o m a l s t r i p e . N o n - c h r o m a s o m a l s t r i p e ( N C S ) i s a m a t e r n a l l y - i n h e r i t e d t r a i t i n m a i z e c h a r a c t e r i z e d b y p o o r g r o w t h , d e c r e a s e d y i e l d s , a n d v a r i a b l e l e a f s t r i p i n g ( S c h u m w a y a n d B a u m a n , 1 9 6 7 ; C o e , 1 9 8 3 ) . P l a n t s s u r v i v e b e c a u s e e a c h c o n t a i n s a m i x t u r e o f n o r m a l a n d ' m u t a n t m i t o c h o n d r i a . N C S o r i g i n a t e d s p o n t a n e o u s l y i n t h e T e x a s C M S v a r i e t y , b u t d o e s n o t s e e m t o c o r r e l a t e w i t h t h e C M S c o n d i t i o n . S e v e r a l v a r i e t i e s h a v e b e e n i d e n t i fi e d , e a c h c o n t a i n i n g a d e l e t i o n i n a n e s s e n t i a l m i t o c h o n d r i a l g e n e ( f o r i n s t a n c e c y t o c h r o m e o x i d a s e s u b u n i t I I ) w h i c h a p p e a r s t o h a v e b e e n g e n e r a t e d b y r e c o m b i n a t i o n b e t w e e n s h o r t r e p e a t s f r o m 6 t o 3 1 b p ( N e w t o n e t a l . , 1 9 9 0 ; L a u e r e t a l . , 1 9 9 0 ; H u n t a n d N e w t o n , 1 9 9 0 ) . 1 . 4 U n i q u e a s p e c t s o f p l a n t m i t o c h o n d r i a T h e m a n y u n i q u e a s p e c t s o f p l a n t m i t o c h o n d r i a m a y b e t h e r e s u l t o f t h e i r u n i q u e r e s p i r a t o r y f u n c t i o n i n t h e p l a n t o r t h e i r p o s s i b l y s e p a r a t e o r i g i n f r o m a n i m a l m i t o c h o n d r i a . S e v e r a l d i f f e r e n c e s o c c u r i n t h e c o m p o n e n t s o f t h e r e s p i r a t o r y c h a i n a n d t r a n s p o r t s y s t e m s . M o r e o v e r , i n a d d i t i o n t o t h e i r l a r g e r g e n o m e s i z e , p l a n t m i t o c h o n d r i a e d i t t h e i r m R N A a n d , u n l i k e a n i m a l m i t o c h o n d r i a , t r a n s l a t e t h e i r p r o t e i n s u s i n g t h e u n i v e r s a l c o d e . 1 A 1 A d d i t i o n a l N A D H D e h y d r o g e n a s e s M a m m a l i a n m i t o c h o n d r i a d o n o t o x i d i z e e x o g e n o u s l y s u p p l i e d N A D H b e c a u s e t h e r o t e n o n e - s e n s i t i v e c o m p l e x I b i n d s N A D H o n t h e m a t r i x ( i n t e r n a l ) s i d e o f t h e i n n e r m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e ( L e h n i n g e r , 1 9 5 5 ) a n d n o t r a n s p o r t s y s t e m e x i s t s t o a l l o w N A D H t o c r o s s t h e i n n e r m e m b r a n e ( L a N o u e a n d S c h o o l w e r t h , 1 9 7 9 ) . H o w e v e r , l i k e f u n g i ( v o n J a g o w a n d K l i n g e n b e r g , 1 9 7 0 ; W e i s s e t a l . , 1 9 7 0 ) , p l a n t m i t o c h o n d r i a r a p i d l y m e t a b o l i z e N A D H a n d N A D P H i n a n o n - r o t e n o n e - s e n s i t i v e C a ” - d e p e n d e n t m a n n e r ( P a l m e r a n d P a s s a m , 1 9 7 1 ; K o e p p e a n d M i l l e r , 1 9 7 2 ) . T h i s h a s l e d t o t h e c o n c l u s i o n t h a t p l a n t m i t o c h o n d r i a a l s o c o n t a i n a N A D H d e h y d r o g e n a s e w h i c h c a n a c c e p t N A D H o n t h e o u t e r s i d e o f t h e m e m b r a n e , a l t h o u g h e n d o g e n o u s N A D H a n d N A D - l i n k e d s u b s t r a t e s a r e p r e f e r r e d ( B e r g m a n a n d E r i c s o n , 1 9 8 3 ; D r y e t a l . , 1 9 8 3 ; D a y e t a l . , 1 9 8 5 ) . D i f f e r e n c e s i n p H o p t i m a a n d r e s p o n s e s t o c h e l a t o r s a n d i n h i b i t o r s s u g g e s t e d t h a t N A D H a n d N A D P H u t i l i z e d i s t i n c t d e h y d r o g e n a s e s ( M a l l e t a n d P a l m e r , 1 9 8 1 ; E d m a n e t a l . , 1 9 8 5 ) . F u r t h e r s t u d i e s h a v e i n d i c a t e d t h e p r e s e n c e o f a n i n t e r n a l d e h y d r o g e n a s e w h i c h i s n o t r o t e n o n e - s e n s t i v e a n d h a s l o w e r a f fi n i t y f o r N A D H ( M a l l e r a n d P a l m e r , 1 9 8 2 ) . T h e p h y s i o l o g i c a l s i g n i fi c a n c e f o r t w o i n t e r n a l d e h y d r o g e n a s e s i s u n c l e a r , a l t h o u g h i t h a s b e e n s u g g e s t e d ( P a l m e r , 1 9 7 9 ; M o l l e r a n d L i n , 1 9 8 6 ) t h a t t h e e n e r g y - c o n s e r v i n g c o m p l e x I i s a s s o c i a t e d w i t h e l e c t r o n fl o w t h r o u g h t h e c y t o c h r o m e p a t h w a y w h i l e t h e n o n - r o t e n o n e s e n s i t i v e d e h y d r o g e n a s e , w h i c h i s n o n - e n e r g y c o n s e r v i n g , i s a s s o c i a t e d w i t h t h e a l t e r n a t i v e p a t h w a y ( s e e b e l o w ) . P l a n t m i t o c h o n d r i a , l i k e a n i m a l . m i t o c h o n d r i a , a l s o h a v e a n o u t e r m e m b r a n e N A D H d e h y d r o g e n a s e w h i c h f e e d s e l e c t r o n s t o t h e r e s p i r a t o r y c h a i n a t t h e l e v e l o f c y t o c h r o m e c . T h e p h y s i o l o g i c a l r o l e o f t h i s c o m p l e x i s u n c l e a r . 1 . 4 . 2 A l t e r n a t i v e o x i d a s e T h e o b s e r v a t i o n t h a t p l a n t m i t o c h o n d r i a a r e i n c o m p l e t e l y i n h i b i t e d b y c y a n i d e l e d t o t h e p r o p o s a l t h a t t h e r e s p i r a t o r y c h a i n o f p l a n t m i t o c h o n d r i a c o n t a i n s t w o t e r m i n a l o x i d a s e s ( J a m e s a n d E l l i o t , 1 9 5 5 ; B e n d a l l a n d B o n n e r , 1 9 7 1 ) . I n a d d i t i o n t o t h e C N - s e n s i t i v e “ c y t o c h r o m e ” p a t h w a y i n w h i c h e l e c t r o n s a r e t r a n s f e r r e d t h r o u g h c y t o c h r o m e c r e d u c t a s e a n d o x i d a s e , e l e c t r o n s f r o m t h e Q p o o l m a y i n s t e a d g o t o a C N - i n s e n s i t i v e “ a l t e r n a t i v e ” o x i d a s e ’ ( A O ; S t o r e y , 1 9 7 6 ) w h i c h i s i n h i b i t e d b y s u b s t i t u t e d h y d r o x a m i c a c i d s l i k e s a l i c y l h y d r o x a m i c a c i d ( S c h o n b a u m e t a l . , 1 9 7 1 ) . 0 2 i s r e d u c e d t o w a t e r a s i n t h e c y t o c h r o m e p a t h w a y ; h o w e v e r , t h i s s t e p i s n o t c o u p l e d b y p r o t o n p u m p i n g t o A T P s y n t h e s i s a s a r e t h e c y t o c h r o m e r e d u c t a s e a n d o x i d a s e ( M o o r e e t a l . , 1 9 7 8 ; M o o r e a n d B o n n e r , 1 9 8 2 ; I s h i d a a n d P a l m e r , 1 9 8 8 ) . E n e r g y i s n o t c o n s e r v e d a n d m a y t h e r e f o r e b e g i v e n o f f a s h e a t . T h e i n fl o r e s c e n c e o f s o m e a r o i d s p e c i e s h a s b e e n m e a s u r e d a t 1 2 — 1 4 ° C h i g h e r t h a n a m b i e n t t e m p e r a t u r e s , c o r r e l a t i n g w i t h a d r a m a t i c i n c r e a s e i n A 0 a c t i v i t y p r i o r t o fl o w e r i n g ( E l t h o n e t a l . , 1 9 8 9 a ) . T h e h i g h e r t e m p e r a t u r e m a y a l l o w v o l a t i l i z a t i o n o f a c o m p o u n d p r o d u c e d b y t h e p l a n t w h i c h a t t r a c t s i n s e c t s f o r p o l l i n a t i o n ( S m i t h a n d M e e u s e , 1 9 6 6 ) . A n o t h e r p o s s i b l e f u n c t i o n f o r t h e A 0 m a y b e t o a c c o m o d a t e “ o v e r fl o w ” o f r e d u c i n g e q u i v a l e n t s i n t o t h e c y t o c h r o m e p a t h w a y ( L a m b e r s , 1 9 8 0 ) ; h o w e v e r , D r y e t a l . ( 1 9 8 9 ) , h a v e d e m o n s t r a t e d A 0 a c t i v i t y w h e n t h e c y i s : l l V 3 F c y t o c h r o m e p a t h w a y i s n o t s a t u r a t e d . A l t e r n a t i v e l y , s h u n t i n g e l e c t r o n s t h r o u g h t h e A 0 p a t h w a y c o u l d a l l o w t h e T C A c y c l e t o p r o d u c e c a r b o n s k e l e t o n s a n d r e d u c i n g e q u i v a l e n t s w h i l e n o t g e n e r a t i n g u n n e e d e d a n d p o t e n t i a l l y i n h i b i t o r y A T P ( P a l m e r , 1 9 7 6 ) . T h e n u c l e a r - e n c o d e d A 0 h a s a t l e a s t o n e s u b u n i t n e a r 3 6 k D a ( E l t h o n a n d M c I n t o s h , 1 9 8 7 ; R h o a d s a n d M c I n t o s h , 1 9 9 1 ) , b u t i t i s i m m u n o l o g i c a l l y u n d e t e c t a b l e i n m a n y m o n o c o t s p e c i e s s u c h a s w h e a t a n d ' m a i z e u n d e r n o r m a l c o n d i t i o n s ( H i s e r a n d P e i fl ‘ e r , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . 1 . 4 . 3 T r a n s p o r t s y s t e m s A n u m b e r o f u n i q u e t r a n s p o r t s y s t e m s e x i s t i n p l a n t m i t o c h o n d r i a . F i r s t , t h e i n n e r m e m b r a n e o f m i t o c h o n d r i a h a s b e e n t h o u g h t t o b e l a r g e l y i m p e r m e a b l e t o o x a l o a c e t a t e ( b u t s e e P a s s a r e l l a e t a l . , 1 9 8 5 ) a n d N A D + ( v o n J a g o w a n d K l i n g e n b e r g , 1 9 7 0 ) ; h o w e v e r , p l a n t m i t o c h o n d r i a r e a d i l y t r a n s p o r t t h e s e m e t a b o l i t e s i n t o t h e m a t r i x ( D o u c e a n d B o n n e r , 1 9 7 2 ; N e u b u r g e r a n d D o u c e , 1 9 7 8 ; T o b i n e t a l . , 1 9 8 0 ) . O x a l o a c e t a t e t r a n s p o r t h a s b e e n s h o w n t o b e m e d i a t e d b y a s p e c i fi c c a r r i e r s e p a r a t e f r o m t h a t r e s p o n s i b l e f o r m a l a t e t r a n s p o r t b a s e d o n d i f f e r e n c e s i n i n h i b i t o r s ( D a y a n d W i s k i c h , 1 9 8 4 ) . I t s p h y s i o l o g i c a l r o l e h a s y e t t o b e d e t e r m i n e d , b u t t h e r e s u l t s o f E b b i g h a u s e n e t a l . ( 1 9 8 7 ) s u g g e s t a r o l e i n t h e r e t u r n o f N A D H f r o m m i t o c h o n d r i a t o p e r o x i s o m e s d u r i n g g l y c i n e o x i d a t i o n i n g r e e n l e a v e s o f 0 3 p l a n t s . N A D + t r a n s p o r t i s t h o u g h t t o b e m e d i a t e d b y a s p e c i fi c c a r r i e r b e c a u s e u p t a k e e x h i b i t s M i c h a e l i s - M e n t o n k i n e t i c s ( N e u b u r g e r a n d D o u c e , 1 9 7 8 ; T o b i n e t a l . , 1 9 8 0 ) a n d i s i n h i b i t a b l e b y a s u b s t r a t e a n a l o g ( N e u b u r g e r a n d D o u c e , 1 9 8 3 ) . T h e c a r r i e r m a y a l l o w m a n i p u l a t i o n o f t h e m a t r i x N A D + c o n c e n t r a t i o n a n d t h u s r e g u l a t e s t h e i n t e r n a l r o t e n o n e - i n s e n s i t i v e p a t h w a y 1 3 ( N e u b u r g e r e t a l . , 1 9 8 5 ) . A d d i t i o n a l l y , u p t a k e o f N A D + h a s b e e n s u g g e s t e d t o h a v e a r o l e i n t h e t r a n s i t i o n f r o m a d o r m a n t s t a g e t o a s t a g e o f a c t i v e g r o w t h , s u c h a s t h e p r o c e s s o f g e r m i n a t i o n ( S h i b a s a k a a n d T s u j i , 1 9 8 8 ) . A d e n i n e n u c l e o t i d e s a r e a l s o a c t i v e l y a c c u m u l a t e d i n p l a n t m i t o c h o n d r i a i n a c a r b o x y a t r a c t y l o s i d e - i n s e n s i t i v e m a n n e r , p a r t i c u l a r l y u n d e r c o n d i t i o n s o f h i g h e l e c t r o c h e m i c a l p o t e n t i a l ( A b o u - K a h l i l a n d H a n s o n , 1 9 7 7 , 1 9 7 9 ) , p o s s i b l y e n a b l i n g p l a n t m i t o c h o n d r i a t o m a i n t a i n t h e t o t a l m a t r i x n u c l e o t i d e p o o l d u r i n g m i t o c h o n d r i a l p r o l i f e r a t i o n ( D o u c e a n d N e u b u r g e r , 1 9 8 9 ) . A f u r t h e r d i f f e r e n c e i n m e t a b o l i t e t r a n s p o r t i s t h a t i n p l a n t m i t o c h o n d r i a , u n l i k e a n i m a l m i t o c h o n d r i a , g l u t a m a t e a n d a s p a r t a t e e x c h a n g e d o e s n o t a p p e a r t o b e e l e c t r o g e n i c . T h i s u n i q u e t r a n s p o r t p r o p e r t y m a y b e e x p l a i n e d b y t h e p r e s e n c e o f t h e e x t e r n a l l y - f a c i n g N A D H d e h y d r o g e n a s e o f t h e i n n e r m e m b r a n e a n d t h u s p l a n t m i t o c h o n d r i a d o n o t r e q u i r e c o m p l e x e x c h a n g e s y s t e m s f o r t h e t r a n s f e r o f r e d u c i n g e q u i v a l e n t s f r o m t h e c y t o s o l t o t h e m a t r i x ( D o u c e a n d N e u b u r g e r , 1 9 8 9 ) . 1 . 4 . 4 R N A e d i t i n g F o r m a n y y e a r s r e s e a r c h e r s t h o u g h t t h a t p l a n t m i t o c h o n d r i a p r o t e i n t r a n s l a t i o n d i d n o t f o l l o w e i t h e r t h e u n i v e r s a l c o d e o r t h e “ m i t o c h o n d r i a l ” c o d e . B y c o m p a r i n g p r e d i c t e d p r o t e i n s e q u e n c e s f r o m p l a n t s w i t h h o m o l o g o u s p r o t e i n s f r o m o t h e r e u k a r y o t e s , F o x a n d L e a v e r ( 1 9 8 1 ) d e d u c e d t h a t C G G c o d e d f o r t r y p t o p h a n r a t h e r t h a n a r g i n i n e . A n a d d i t i o n a l u n e x p e c t e d fi n d i n g w a s t h a t t w o w e l l - c o n s e r v e d r e s i d u e s i n c y t o c h r o m e o x i d a s e s u b u n i t I I t h o u g h t t o b e c o p p e r l i g a n d s ( s e e c h a p t e r 5 ) w e r e p r e d i c t e d f r o m t h e D N A s e q u e n c e t o b e d i f f e r e n t i n w h e a t ( B o n e n e t a l . , 1 9 8 4 ) . W h e n R N A w a s s e q u e n c e d “ e i t h e r d i r e c t l y o r f r o m c D N A , h o w e v e r , t h e s e u n e x p e c t e d c h a n g e s d i s a p p e a r e d , a n d t h e c o n s e r v e d a m i n o a c i d s a s 1 4 w e l l a s t h e u n i v e r s a l c o d e w e r e r e s t o r e d ( G u a l b e r t o e t a l . , 1 9 8 9 ; C o v e l l o a n d G r a y , 1 9 8 9 ; H i e s e l e t a l . , 1 9 8 9 ) . I n m o s t c a s e s , R N A e d i t i n g p r o d u c e s p r o t e i n s m o r e h o m o l o g o u s t o s e q u e n c e s f r o m o t h e r s p e c i e s t h a n w o u l d b e p r e d i c t e d f r o m t h e g e n o m i c D N A ( G u a l b e r t o e t a l . , 1 9 8 9 ; H i e s e l e t a l . , 1 9 8 9 ; S c h u s t e r e t a l . , 1 9 9 0 a ; h o w e v e r s e e G r a v e s e t a l . , 1 9 9 0 ) . A l m o s t a l l R N A e d i t i n g i n p l a n t s h a s b e e n s h o w n t o i n v o l v e s u b s t i t u t i o n s o f C f o r U ( L a m a t t i n a e t a l . , 1 9 8 9 ; M u l l i g a n , 1 9 9 1 ; S c h u s t e r e t a l . , 1 9 9 1 ) , a l t h o u g h a f e w c a s e s o f U t o C c o n v e r s i o n s h a v e b e e n r e p o r t e d ( G u a l b e r t o e t a l . , 1 9 9 0 ; S c h u s t e r e t a l . , 1 9 9 0 b ) . T h i s i s s i m i l a r t o C t o U c o n v e r s i o n s i n a p o l i p o p r o t e i n B - 4 8 m R N A f r o m h u m a n i n t e s t i n e ( P o w e l l e t a l . , 1 9 8 7 ; C h e n e t a l . , 1 9 8 7 ) b u t d i f f e r e n t f r o m t h e R N A e d i t i n g o f p a r a m y x o v i r u s P , i n w h i c h a r u n o f G ’ s i s i n s e r t e d ( V i d a l e t a l . , 1 9 9 0 ) , o r t r y p a n o s o m e k i n e t o p l a s t s , i n w h i c h U ’ s a r e a d d e d ( S i m p s o n a n d S h a w , 1 9 8 9 ) . “ G u i d e ” R N A ’ s i n t h e k i n e t o p l a s t s a r e u s e d t o d i r e c t m o d i fi c a t i o n ( B l u m e t a l . , 1 9 9 0 ) . N o m e c h a n i s m f o r R N A e d i t i n g h a s y e t b e e n i d e n t i fi e d i n p l a n t s ; i t i s p o s s i b l e t h a t g u i d e R N A ’ s o r e n z y m a t i c d e a m i n a t i o n i s i n v o l v e d . S o m e t r a n s c r i p t s a r e c o m p l e t e l y e d i t e d a s i s o l a t e d ( S c h u s t e r a n d B r e n n i c k e , 1 9 9 0 ) w h i l e o t h e r s a r e o n l y p a r t i a l l y e d i t e d i n a n a p p a r e n t l y r a n d o m f a s h i o n ( S c h u s t e r e t a l . , 1 9 9 0 a ; C o v e l l o a n d G r a y , 1 9 9 0 ) . , I t i s n o t k n o w n i f p a r t i a l l y e d i t e d s e q u e n c e s a r e t r a n s l a t e d i n t o p r o t e i n s . P r o t e i n s e q u e n c i n g o f t h e N - t e r m i n u s o f A T P s y n t h a s e s u b u n i t 9 f r o m w h e a t h a s c o n fi r m e d t h a t R N A e d i t i n g c o m p l e t e l y c h a n g e s t h e a m i n o a c i d s e q u e n c e p r e d i c t e d b y t h e D N A ( G r a v e s e t a l . , 1 9 9 0 ) ; h o w e v e r , t h e m R N A f o r t h i s p r o t e i n a l s o s h o w e d c o m p l e t e e d i t i n g ( B e g u e t a l . , 1 9 9 0 ) . 1 . 5 R e s e a r c h l n t e r e s t s I n t e r e s t i n C M S h a s i n c r e a s e d s i n c e S o u t h e r n c o r n l e a f b l i g h t d e s t r o y e d a l a r g e p o r t i o n o f t h e 1 9 7 0 c o r n c r o p i n t h e U n i t e d S t a t e s . T h e f u n g a l b l i g h t a f f e c t e d C M S b u t n o t f e r t i l e p l a n t s ; t h e r e f o r e , t h e t o x i n p r o d u c e d b y t h e f u n g u s p r o v i d e s r e s e a r c h e r s w i t h a t o o l f o r s t u d y i n g C M S . P h y s i o l o g i c a l s t u d i e s o n i s o l a t e d m i t o c h o n d r i a c a n p r o d u c e v a l u a b l e - i n f o r m a t i o n o n t h e m e c h a n i s m s o f t o x i n s e n s i t i v i t y a n d p o s s i b l y o f m a l e s t e r i l i t y . S i n c e C M S m a y i n v o l v e d e f e c t s i n r e s p i r a t o r y c h a i n p r o t e i n s , t h e s e p r o t e i n s t h e m s e l v e s h a v e b e c o m e t h e s u b j e c t o f i n c r e a s e d r e s e a r c h e f f o r t s . C y t o c h r o m e o x i d a s e i n p a r t i c u l a r h a s b e e n t h e o r i z e d t o b e i n v o l v e d i n C M S o n t h e b a s i s o f a n u m b e r o f l i n e s o f e v i d e n c e ( s e e s e c t i o n 5 . 5 ) . M o r e o v e r , D N A s e q u e n c e a n a l y s i s i n d i c a t e d r a d i c a l s u b s t i t u t i o n s o f c o n s e r v e d r e s i d u e s i n t h e s u b u n i t I I g e n e t h a t w e r e c o r r e c t e d b y R N A e d i t i n g ( s e e s e c t i o n 1 . 4 . 4 ) . T h e s e fi n d i n g s h a v e f o c u s e d a t t e n t i o n o n t h e n e e d t o d e v e l o p e f fi c i e n t a n d r e l a t i v e l y l a r g e - s c a l e p u r i fi c a t i o n p r o c e d u r e s w h i c h w i l l a l l o w s t u d i e s a i m e d a t c l a r i f y i n g t h e s e i s s u e s . T h e i n i t i a l f o c u s o f t h i s t h e s i s p r o j e c t w a s t o c h a r a c t e r i z e t h e e f f e c t s o f t h e C M S - s p e c i fi c f u n g a l t o x i n o n n o r m a l a n d C M S m a i z e m i t o c h o n d r i a ( c h a p t e r s 2 t h r o u g h 4 ) ; a s e c o n d a n d m o r e i n t e n s i v e e f f o r t w a s t h e p u r i fi c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m w h e a t s e e d l i n g a n d w h e a t g e r m ( c h a p t e r s 5 t h r o u g h 8 ) . C h a p t e r 2 - L i t e r a t r n ' e r e v i e w o f c y t o p l a s m i c m a l e s t e r i l i t y 2 . 1 O v e r v i e w M a l e s t e r i l i t y i s a c o n d i t i o n i n p l a n t s c h a r a c t e r i z e d b y t h e i n a b i l i t y t o s h e d v i a b l e p o l l e n , w h e t h e r b e c a u s e p o l l e n p r o d u c t i o n i s a b o r t e d o r a n t h e r s a r e u n d e r d e v e l o p e d . W h e n t h e t r a i t i s m a t e r n a l l y i n h e r i t e d , a s i s o f t e n t h e c a s e , i t i s c a l l e d c y t o p l a s m i c m a l e s t e r i l i t y ( C M S ) b e c a u s e c y t o p l a s m i c f a c t o r s ( c h l o r o p l a s t o r m i t o c h o n d r i a ) m u s t t h e r e f o r e b e r e s p o n s i b l e . M o s t C M S l i n e s a r o s e s p o n t a n e o u s l y u n d e r n a t u r a l c o n d i t i o n s ; h o w e v e r , t h e t r a i t c a n b e a r t i fi c i a l l y p r o d u c e d b y e i t h e r p r o t o p l a s t f u s i o n o r r e c u r r e n t b a c k c r o s s i n g ( c r o s s i n g t h e f e m a l e o f f s p r i n g o f e a c h g e n e r a t i o n w i t h t h e o r i g i n a l m a l e p a r e n t ) b e t w e e n d i f f e r e n t s p e c i e s . T h e s e t e c h n i q u e s p r o d u c e o f f s p r i n g w h i c h c o n t a i n t h e m i t o c h o n d r i a a n d c h l o r o p l a s t s o f o n e o r i g i n a l p a r e n t ( f e m a l e ) a n d t h e n u c l e a r D N A o f t h e o t h e r o r i g i n a l p a r e n t ( m a l e ) . T h u s , t h e e v o l v e d c o o r d i n a t i o n o f t h e c y t o p l a s m i c a n d n u c l e a r g e n o m e s i s l o s t . T h e i m p o r t a n t r o l e o f t h e n u c l e u s i n o r g a n e l l a r p r o t e i n s y n t h e s i s i s e m p h a s i z e d b y t h e e x i s t e n c e o f n u c l e a r r e s t o r e r g e n e s ( R f s ) , w h i c h r e s t o r e f e r t i l i t y w h e n c r o s s e d i n t o C M S p l a n t s . C M S h a s b e e n e x p l o i t e d f o r t h e c o m m e r c i a l p r o d u c t i o n o f h y b r i d s e e d . S i n c e m a l e - s t e r i l e p l a n t s s t i l l f u n c t i o n n o r m a l l y a s t h e s e e d - p a r e n t ( f e m a l e ) , a n y s e e d m a d e b y t h e C M S p l a n t c a n n o t b e t h e r e s u l t o f s e l f - p o l l i n a t i o n a n d i s n e c e s s a r i l y a h y b r i d . I f r o w s o f C M S p l a n t s a r e a l t e r n a t e d w i t h m a l e - f e r t i l e o r r e s t o r e d p l a n t s , t h e c o r r e c t h y b r i d w i l l a l w a y s b e p r o d u c e d . T h i s p r o c e d u r e a v o i d s t h e l a b o r i o u s a n d o f t e n i m p o s s i b l e t a s k o f h a n d e m a s c u l a t i o n o f t h e a n t h e r s . S i n c e t h e C M S t r a i t a l s o d o e s n o t a f f e c t v e g e t a t i v e g r o w t h o f t h e p l a n t , t h e u s e o f C M S i n m a i z e 1 7 b e c a m e s o c o m m o n t h a t b y t h e l a t e 1 9 6 0 ' s o v e r t h r e e - q u a r t e r s o f a l l a c r e a g e p l a n t e d i n t h e U n i t e d S t a t e s w a s t h e C M S T e x a s ( T ) t y p e . M o s t o f t h e c r o p w a s l o s t t o S o u t h e r n c o r n l e a f b l i g h t i n 1 9 6 9 a n d 1 9 7 0 ( U l l s t r u p , 1 9 7 2 ) , b u t o n l y t h e C M S - T p l a n t s w e r e a f f e c t e d . T h e m e c h a n i s m o f t h e e f f e c t s o f t h e t o x i n p r o d u c e d b y t h e f u n g u s B i p o l a r i s m a y d i s r a c e T ( B m T ; f o r m e r l y c a l l e d H e l m i n t h o s p o r i u m m a y d i s ) o n t h e p l a n t a s w e l l a s t h e m e c h a n i s m o f C M S b e c a m e a f o c u s o f p l a n t r e s e a r c h . S i n c e C M S i s m a t e r n a l l y i n h e r i t e d , t h e t r a i t c o u l d b e e n c o d e d b y e i t h e r t h e c h l o r o p l a s t o r t h e m i t o c h o n d r i a s i n c e b o t h c o n t a i n t h e i r o w n D N A . M a n y s t u d i e s f o u n d d i f f e r e n c e s b e t w e e n m a l e - s t e r i l e a n d m a l e - f e r t i l e p l a n t s i n m i t o c h o n d r i a l b u t n o t t h e c h l o r o p l a s t D N A r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e d i g e s t i o n p a t t e r n s ( L e v i n g s a n d P r i n g , 1 9 7 6 ; P r i n g a n d L e v i n g s , 1 9 7 8 ) a n d t r a n s l a t i o n p r o d u c t s ( F o r d e e t a l . , 1 9 7 8 ; F o r d e a n d L e a v e r , 1 9 8 0 ; , B o r c k a n d W a l b o t , 1 9 8 2 ; D i x o n a n d L e a v e r , 1 9 8 2 ; B o u t r y a n d B r i q u e t , 1 9 8 2 ; B o u t r y e t a l . , 1 9 8 4 ) . M o r e o v e r , m i t o c h o n d r i a b u t n o t o t h e r o r g a n e l l e s w e r e o b s e r v e d t o d e g e n e r a t e i n t h e t a p e t u m a n d m i d d l e l a y e r o f C M S - T a n t h e r s ( W a r m k e a n d L e e , 1 9 7 7 ) , a n d t h e B m T f u n g a l t o x i n w a s s h o w n t o a f f e c t i s o l a t e d m i t o c h o n d r i a b u t n o t c h l o r o p l a s t s ( G r e g o r y e t a l . , 1 9 7 8 ) . T h u s i t i s c l e a r t h a t t h e m i t o c h o n d r i a l D N A ( m t D N A ) e n c o d e s C M S . 2 . 2 C M S i n d i fl ‘ e r e n t p l a n t s C M S h a s b e e n f o u n d i n o v e r 1 4 0 p l a n t s p e c i e s , a n d s i n c e m o s t o f t h e s e h a v e a r i s e n n a t u r a l l y , t h e u n d e r l y i n g c o n d i t i o n c a u s i n g C M S m u s t b e e a s i l y g e n e r a t e d . T h e h a l l m a r k o f m a n y o f t h e t y p e s o f C M S s t u d i e d i s m t D N A r e a r r a n g e m e n t s w h i c h l e a d t o a l t e r e d o r n o v e l p r o t e i n s . T h e l a r g e m i t o c h o n d r i a l g e n o m e s o f p l a n t s c o n t a i n d i r e c t a n d i n v e r t e d r e p e a t s w h i c h c a u s e h o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o n , p r o d u c i n g d i f f e r e n t s i z e D N A c i r c l e s 1 8 ( P a l m e r a n d S h i e l d s , 1 9 8 4 ; L o n s d a l e e t a l . , 1 9 8 4 ) . I t i s t h e r e f o r e l i k e l y t h a t t h e s e m t D N A r e a r r a n g e m e n t s a r e a l s o t h e r e s u l t o f h o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o n s i n v o l v i n g t h e s e r e p e a t s . 2 . 2 . 1 S o r g h u m C M S h a s b e e n g e n e r a t e d s e v e r a l t i m e s i n s o r g h u m b y b a c k c r o s s i n g ( S t e p h e n s a n d H o l l a n d , 1 9 5 4 ; W e b s t e r a n d S i n g h , 1 9 6 4 ) . O n e u n i q u e t y p e o f C M S p o s s e s s e d s m a l l p l a s m i d - l i k e D N A ' s , N 1 a n d N 2 , w h i c h w e r e h o m o l o g o u s t o - t h e S I a n d 8 2 e l e m e n t s i m p l i c a t e d i n C M S S i n m a i z e ( P r i n g e t a l . , 1 9 8 2 ; s e e b e l o w ) . T h e o t h e r t y p e s o f C M S i n s o r g h u m w e r e s h o w n t o h a v e d i f f e r e n t m t D N A r e s t r i c t i o n p a t t e r n s ( C o n d e e t a l . , 1 9 8 2 ) , s u g g e s t i n g m t D N A r e a r r a n g e m e n t s t y p i c a l o f C M S . D i x o n a n d L e a v e r ( 1 9 8 2 ) a n d B a i l e y - S e r r e s e t a l . ( 1 9 8 6 ) d e m o n s t r a t e d t h a t t h e C M S c y t o p l a s m s p r o d u c e d v a r i a n t t r a n s l a t i o n p r o d u c t s w h e n i n n u c l e a r b a c k g r o u n d s o t h e r t h a n t h e i r o w n . O n e c y t o p l a s m , d e s i g n a t e d 9 E , s y n t h e s i z e d a p o l y p e p t i d e o f 4 2 k D a w h i l e e v e r y o t h e r c y t o p l a s m ( a n d o t h e r p l a n t s ) p r o d u c e d a 3 8 k D a p o l y p e p t i d e . A n t i b o d i e s a g a i n t y e a s t c y t o c h r o m e o x i d a s e s u b u n i t I i m m u n o p r e c i p i t a t e d b o t h p r o t e i n s ( D i x o n a n d L e a v e r , 1 9 8 2 ) . T h e s u b u n i t I g e n e ( c o x I ) w a s l a t e r s h o w n t o h a v e u n d e r g o n e a g e n e r e a r r a n g e m e n t i n 9 E w h i c h r e s u l t s i n a C - t e r m i n a l e x t e n s i o n o f 7 5 a m i n o a c i d s ( L e a v e r e t a l . , 1 9 8 5 ; B a i l e y - S e r r e s e t a l . , 1 9 8 6 ) . A c t i v i t y o f c y t o c h r o m e o x i d a s e i n s e e d l i n g s w i t h t h e a l t e r e d c o x I g e n e d o e s n o t a p p e a r t o a f f e c t e d ( B a i l e y - S e r r e s e t a l . , 1 9 8 6 ) , a n d a l i n e w i t h 9 E n u c l e u s a n d c y t o p l a s m s y n t h e s i z e d t h e l a r g e r c o x I p r o t e i n b u t w a s m a l e - f e r t i l e ( L e a v e r e t a l . , 1 9 8 5 ) . T h e r e f o r e , t h e a l t e r a t i o n o f t h e c o r d g e n e m a y n o t b e t h e c a u s e o f C M S , a l t h o u g h B a i l e y - S e r r e s e t a l . ( 1 9 8 6 ) h a v e p o i n t e d o u t t h a t t h e f e r t i l e l i n e s y n t h e s i z i n g t h e a l t e r e d c o x I p r o t e i n m a y h a v e n u c l e a r g e n e s t h a t h a v e c o - e v o l v e d w i t h t h e m i t o c h o n d r i a l g e n o m e r e a r r a n g e m e n t s t o c o m p e n s a t e f o r t h e v a r i a n t p o l y p e p t i d e . 2 . 2 . 2 P e t u n i a O n e u n i q u e r e s t r i c t i o n f r a g m e n t w a s f o u n d i n a l l n a t u r a l l y - o c c u r r i n g C M S p e t u n i a p l a n t s ( B o e s h o r e e t a l . , 1 9 8 5 ) , s u g g e s t i n g t h a t o n l y o n e m t D N A r e a r r a n g e m e n t i s r e s p o n s i b l e f o r C M S i n p e t u n i a . T h e p c f ( f o r p e t u n i a C M S - a s s o c i a t e d f u s i o n g e n e ) l o c u s o f t h e u n i q u e r e s t r i c t i o n f r a g m e n t w a s s e q u e n c e d a n d f o u n d t o c o n t a i n f u s e d f r a g m e n t s o f t h e 5 ' fl a n k i n g a n d c o d i n g r e g i o n s o f s u b u n i t 9 o f t h e A T P a s e ( a t p 9 , w h i c h n a t u r a l l y c o n t a i n s a s h o r t r e g i o n h i g h l y h o m o l o g o u s t o c h l o r o p l a s t a t h , t h e [ 5 s u b u n i t o f t h e A T P a s e ) , i n - f r a m e c o d i n g r e g i o n s o f s u b u n i t I I o f c y t o c h r o m e o x i d a s e ( c o x I I ) , a n d a s e q u e n c e o f u n k n o w n o r i g i n c a l l e d u r f - S ( Y o u n g a n d H a n s o n , 1 9 8 7 ) . A s p l i c e d R N A i n t e r m e d i a t e i s p r o p o s e d f o r t h i s D N A r e a r r a n g e m e n t b e c a u s e t h e i n t r o n n o r m a l l y f o u n d i n t h e p e t u n i a c o x I I g e n e ( P r u i t t a n d H a n s o n , 1 9 8 9 ) i s n o t i n t h e p c f s e q u e n c e ( Y o u n g a n d H a n s o n , 1 9 8 7 ) . F u l l l e n g t h g e n e s o f b o t h a t p 9 a n d c o r d ] a p p e a r e l s e w h e r e i n t h e g e n o m e o f C M S p e t u n i a ( Y o u n g a n d H a n s o n , 1 9 8 7 ) . D o w n s t r e a m f r o m t h e p c f l o c u s i s t h e o n l y g e n o m i c c o p y o f s u b u n i t 3 o f t h e N A D H d e h y d r o g e n a s e ( n a d 3 ) a n d r i b o s o m a l p r o t e i n s m a l l s u b u n i t 1 2 ( r s p 1 2 ) , a n d t h e s e g e n e s a r e c o - t r a n s c r i b e d w i t h p c f ( R a s m u s s e n a n d H a n s o n , 1 9 8 9 ) . T r a n s c r i p t s o f t h e p c f g e n e w e r e f o u n d t o b e f o u r t o fi v e t i m e s m o r e a b u n d a n t i n a n t h e r s t h a n i n t h e l e a v e s o f C M S p l a n t s ( Y o u n g a n d H a n s o n , 1 9 8 7 ) . P o s s i b l y t h e p c f l o c u s i s u n d e r t h e p r o m o t e r o f t h e a t p 9 g e n e s i n c e t h e 5 ‘ fl a n k i n g r e g i o n w h i c h w o u l d c o n t a i n t h e p r o m o t e r i s i n c l u d e d i n p c f ; h o w e v e r , t h e l e v e l s o f a t p 9 t r a n s c r i p t s d o n o t a p p e a r t o v a r y ( Y o u n g a n d H a n s o n , 1 9 8 7 ) . A d i a g r a m o f t h e p c f l o c u s i s s h o w n i n F i g u r e 2 . 1 A . N i v i s o n a n d H a n s o n ( 1 9 8 9 ) p r o d u c e d a n t i b o d i e s t o a n u m b e r o f o l i g o n u c l e o t i d e s p r e d i c t e d f r o m t h e p c f g e n e t o v e r i f y t h e p r e s e n c e o f a t r a n s l a t i o n p r o d u c t . H o w e v e r , i n t h e p e t u n i a m i t o c h o n d r i a t h e p e r i p h e r a l m e m b r a n e p r o t e i n r e a c t i n g t o t h e a n t i b o d y w a s o n l y 2 5 k D a i n s t e a d o f 3 9 k D a a s p r e d i c t e d f r o m t h e o p e n r e a d i n g f r a m e ( N i v i s o n a n d H a n s o n , 1 9 8 9 ) . S i n c e a n t i b o d i e s t o c o x I I - d e r i v e d s e q u e n c e s d i d n o t r e a c t w i t h t h e 2 5 k D a p r o t e i n , n o p a r t o f t h e c o x I I - d e r i v e d s e q u e n c e a p p e a r s t o b e p r e s e n t i n t h e m a t u r e p r o t e i n . A s i n g l e d o m i n a n t n u c l e a r r e s t o r e r g e n e e l i m i n a t e s p r o d u c t i o n o f t h i s p r o t e i n , a l t h o u g h t h e l e v e l s o f t h e p c f t r a n s c r i p t a r e n o t . r e d u c e d ( R a s m u s s e n a n d H a n s o n , 1 9 8 9 ) , s u g g e s t i n g t h a t t h e R f p r o t e i n i s o p e r a t i n g p o s t - t r a n s c r i p t i o n a l l y . A n t i b o d y t o t h e u r f - S s e q u e n c e ( t h e t h i r d s e g m e n t o f t h e f u s i o n g e n e ) a l s o r e a c t e d w i t h a 2 0 k D a i n t e g r a l m e m b r a n e p r o t e i n p r o d u c e d i n b o t h C M S a n d f e r t i l e p e t u n i a m i t o c h o n d r i a ( N i v i s o n a n d H a n s o n , 1 9 8 9 ) . A l t e r n a t i v e o x i d a s e a c t i v i t y w a s f o u n d t o b e l o w e r i n s u s p e n s i o n c u l t u r e c e l l s o f C M S p l a n t s t h a n i n i s o n u c l e a r f e r t i l e o r f e r t i l i t y - r e s t o r e d c e l l s a s w e l l a s i n t h e i r m i t o c h o n d r i a ( C o n n e t t a n d H a n s o n , 1 9 9 0 ) . W h e n s p e c i fi c t i s s u e s w e r e a n a l y z e d , i m m a t u r e a n t h e r s , b u t n o t l e a v e s a n d m a t u r e a n t h e r s , s h o w e d a s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t l o w e r l e v e l o f A O a c t i v i t y i n C M S c o m p a r e d t o f e r t i l e o r r e s t o r e d l i n e s . T h e s e d i f f e r e n c e s w e r e n o t d u e t o e i t h e r s u b s t r a t e s a t u r a t i o n o r A T P i n h i b i t i o n . T h e r e f o r e o n e r e s u l t o f p c f e x p r e s s i o n m a y b e t o l o w e r a l t e r n a t i v e o x i d a s e a c t i v i t y . M u s g r a v e e t a l . ( 1 9 8 6 ) h a v e p r e v i o u s l y r e p o r t e d a c o r r e l a t i o n b e t w e e n l o w A O a c t i v i t y a n d C M S i n s e v e r a l d i f f e r e n t p l a n t s ( b u t s e e O b e n l a n d e t a l . , 1 9 8 8 ; G o y a l e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h e s t r o n g c o r r e l a t i o n i n a n t h e r s b u t n o t l e a v e s b e t w e e n p c f t r a n s c r i p t s a n d l o w e r e d A O a c t i v i t y i s s u g g e s t i v e o f a c o n n e c t i o n b e t w e e n A 0 a n d C M S w h i c h m a y b e d e v e l o p m e n t a l l y r e g u l a t e d . S - p c f W C D a t p B a t p 9 o o x l l u r f S n a d 3 r p s 1 2 ’ 1 1 , ] . > . - - - - : - . . - . ' . ~ : - : - : - : - ‘ . ~ : ~ : o . - r . . . . . . . Z ~ £ ~ I ‘ l - I > ¢ " 2 ' - ' . V . \ ‘ . \ ‘ ' ' ’ ' ‘ ‘ \ ‘ . \ \ S ‘ s \ T - U l ' f 1 3 2 6 $ [ R N A ‘ 5 3 “ ? ! ‘ A “ W K o n » : u \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ ' A ' A ' A ' A ' A v . ' Z - Z C - j i - i ’ ) a t p 6 u r f 1 3 o r f 2 5 c p t R N A F i g u r e 2 . 1 : S c h e m a t i c o f t h e c h i m e r i c s t r u c t u r e s o f t h e C M S - s p e c i fi c g e n e l o c i i n p e t u n i a , S - p c f ( A ) a n d m a i z e , T c y t o p l a s m , T - u r fl 3 ( B ) . 2 . 2 . 3 M a i z e M a i z e h a s b e e n t h e p l a n t o f c h o i c e f o r C M S r e s e a r c h b e c a u s e o f i t s a g r i c u l t u r a l i m p o r t a n c e a n d i t s c o n v e n i e n c e o f u s e . T h r e e C M S c y t o p l a s m t y p e s h a v e b e e n i d e n t i fi e d i n m a i z e o n t h e b a s i s o f t h e i r f e r t i l i t y r e s t o r a t i o n ( B e c k e t t , 1 9 7 1 ) : C ( C h a r r u a ) , S ( U S D A ) , a n d T ( T e x a s ) . A l l t h r e e t y p e s w e r e s h o w n t o c o n t a i n m t D N A r e a r r a n g e m e n t s ( L e v i n g s a n d P r i n g , 1 9 7 6 ; P r i n g a n d L e v i n g s , 1 9 7 8 ) a n d t o e n c o d e n o v e l p r o t e i n s ( F o r d e e t a l . , 1 9 7 8 ; F o r d e a n d L e a v e r , 1 9 8 0 ) r e l a t i v e t o n o r m a l ( N ) f e r t i l e m i t o c h o n d r i a . 2 . 2 . 3 . 1 C M S - C R e a r r a n g e m e n t s i n t h e o n l y g e n o m i c c o p y o f t h r e e m i t o c h o n d r i a l g e n e s ( a t p 9 , a t p 6 , a n d c o x I I ) h a v e b e e n d e t e c t e d i n a l l c y t o p l a s m i c t y p e s o f t h e C g r o u p t e s t e d ( D e w e y e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h e a r r a n g e m e n t s o f t h e s e g e n e l o c i i n C M S - C a n d - T o r N a r e c o m p a r e d i n F i g u r e 2 . 2 . N o d i f f e r e n c e s i n h y b r i d i z a t i o n p a t t e r n s w e r e f o u n d u s i n g p r o b e s t o a n u m b e r o f o t h e r g e n e s . B o t h t h e 5 ‘ a n d 3 ' r e g i o n s o f t h e a t p 9 g e n e h a v e . u n d e r g o n e r e a r r a n g e m e n t s , w h i l e t h e c o d i n g r e g i o n r e m a i n s u n c h a n g e d ( F i g u r e 2 . 2 A ) . F u r t h e r m o r e , t h e a t p 6 a n d c o r d ] g e n e s h a v e u n u s u a l c h i m e r i c o r g a n i z a t i o n s w h i c h m a y a f f e c t t h e s i z e o f t h e i r c o d i n g r e g i o n s ( F i g u r e 2 . 2 B , C ) . A n t i b o d i e s t o c o x I I o l i g o p e p t i d e s r e a c t e d w i t h 2 9 k D a p o l y p e p t i d e s i n b o t h C M S - C a n d - T m i t o c h o n d r i a , i n d i c a t i n g t h a t t h e c o x I I t r a n s l a t i o n p r o d u c t i s p r o c e s s e d o r t h a t t r a n s l a t i o n i s i n i t i a t e d a f t e r t h e p o i n t o f r e a r r a n g e m e n t ( F i g u r e 2 . 2 0 ) . A t t e m p t s t o p r e p a r e a n t i b o d i e s t o a t p 6 s e q u e n c e s w e r e u n s u c c e s s f u l ; t h e r e f o r e , i t c a n n o t b e d e t e r m i n e d w h e t h e r C M S - T a n d - C p r o d u c e i d e n t i c a l l y - s i z e d t r a n s l a t i o n p r o d u c t s f o r t h i s g e n e . I f t h e e n t i r e O R F 5 ' t o t h e a t p 6 c o d i n g r e g i o n i n b o t h C M S - C a n d - T i s t r a n s l a t e d a n d t h e n p r o c e s s e d a t a s i t e n e a r w h e r e s i m i l a r i t y t o o t h e r a t p 6 N C T O R F o f a t 6 a t p 9 5 fl a n k a n d fi r s t 1 3 c o d o n s ¢ u n k n o w n p C e x t e n d e d C O R F : c o x l l a t p 6 C O X I I T e x t e n d e d ; 0 9 ‘ “ a t p 6 c o x I I C = ~ M o ” . I I I / I l l . _ ' / / / / / I l . " I ’ m S ' fl a n k F i g u r e 2 . 2 : S c h e m a t i c c o m p a r i s o n o f s t r u c t u r e s o f a t p 9 ( A ) , a t p 6 ( B ) , a n d c o x I I ( C ) g e n e l o c i i n m i t o c h o n d r i a l D N A f r o m m a i z e w i t h N , T , a n d C c y t 0 p 1 a s m s . T h e v e r t i c a l a r r o w s i n d i c a t e p r o b a b l e s i t e s o f r e c o m b i n a t i o n . s e q u e n c e s b e g i n s , t h e n a m i n o - t e r m i n a l c l e a v a g e p r o d u c t s o f a p p r o x i m a t e l y 1 5 . 5 k D a i n C M S - T a n d 1 7 . 8 k D a i n C M S - C w o u l d b e p r o d u c e d . I n t e r e s t i n g l y , F o r d e a n d L e a v e r ( 1 9 8 0 ) f o u n d t h a t C M S - C m i t o c h o n d r i a s y n t h e s i z e a u n i q u e 1 7 . 5 k D a p r o t e i n , w h i l e t h e y a r e m i s s i n g a 1 5 . 5 k D a p r o t e i n f o u n d i n o t h e r m a i z e c y t o p l a s m s . H o w e v e r , t h i s p a t t e r n o f p r o t e i n s y n t h e s i s , a s w e l l a s t r a n s c r i p t i o n o f t h e s e t h r e e g e n e s , i s u n a fi ‘ e c t e d b y t h e s i n g l e n u c l e a r r e s t o r e r g e n e R f 4 , s u g g e s t i n g t h a t t h e s e r e a r r a n g e m e n t s m a y n o t b e t h e c a u s e o f C M S i n t h e C c y t o p l a s m o f m a i z e . 2 . 2 . 3 . 2 C M S - S G e l e l e c t r o p h o r e s i s a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p y o f m t D N A d e m o n s t r a t e d t h a t m i t o c h o n d r i a w i t h t h e S c y t o p l a s m p o s s e s s 2 s m a l l l i n e a r D N A ’ s ( S 1 a n d S 2 ) i n a d d i t i o n t o t h e n o r m a l m t D N A ( P r i n g e t a l . , 1 9 7 7 ) . $ 1 a n d 8 2 b o t h p o s s e s s 2 0 8 - h p t e r m i n a l i n v e r t e d r e p e a t s ( K i m , 1 9 8 2 ; L e v i n g s a n d S e d e r o f f , 1 9 8 3 ; P a l l i a r d e t a l . , 1 9 8 5 ) a n d t e r m i n a l l y - a t t a c h e d p r o t e i n s ( K e m b l e a n d T h o m p s o n , 1 9 8 2 ) . T h u s 8 1 a n d S 2 a p p e a r s i m i l a r t o s e v e r a l d o u b l e - s t r a n d e d D N A v i r u s e s , s u c h a s a d e n o v i r u s ( R e k o s h e t a l . , 1 9 7 7 ) o r B a c i l l u s s u b t i l i s p h a g e ¢ 2 9 ( S a l a s e t a l . , 1 9 7 8 ) w h i c h b o t h c o n t a i n t e r m i n a l i n v e r t e d r e p e a t s a n d t e r m i n a l l y - a t t a c h e d p r o t e i n s . T h e v i r a l p r o t e i n s ’ r o l e i n D N A r e p l i c a t i o n ( R e k o s h e t a l . , 1 9 7 7 ; M e l l a d o e t a l . , 1 9 8 0 ) h a s p r o m p t e d t h e s u g g e s t i o n t h a t t h e t e r m i n a l p r o t e i n s i n S I a n d 8 2 p r i m e t h e r e p l i c a t i o n o f t h e s e e l e m e n t s ( K e m b l e a n d T h o m p s o n , 1 9 8 2 ) . U p o n s p o n t a n e o u s r e v e r s i o n t o f e r t i l i t y ( w h i c h i s v e r y c o m m o n i n t h e fi e l d f o r C M S - S , u n l i k e C M S - C a n d - T ) , t h e 8 1 a n d S 2 e l e m e n t s a r e l o s t ( L e v i n g s e t a l . , 1 9 8 0 ) , s u g g e s t i n g t h a t t h e y a r e r e s p o n s i b l e f o r C M S . H o w e v e r , f e r t i l i t y r e s t o r a t i o n b y t h e s i n g l e n u c l e a r g e n e R f 3 d i d n o t a f f e c t e i t h e r t h e p r e s e n c e o f S l a n d 8 2 ( K e m b l e a n d B e d b r o o k , 1 9 8 0 ) o r t h e p r o d u c t i o n o f u n i q u e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n s b y C M S - S 2 5 m i t o c h o n d r i a ( F o r d e a n d L e a v e r , 1 9 8 0 ) . M o r e o v e r , a n u m b e r o f f e r t i l e r a c e s o f L a t i n A m e r i c a n m a i z e w e r e f o u n d t o h a v e l i n e a r D N A ’ s s i m i l a r t o S 1 a n d 8 2 , c a l l e d R 1 a n d R 2 . R 1 s h a r e s c o n s i d e r a b l e h o m o l o g y t o $ 1 b u t c o n t a i n s a d d i t i o n a l u n i q u e s e q u e n c e s , a n d R 2 i s i d e n t i c a l t o $ 2 ( W e i s s i n g e r e t a l . , 1 9 8 2 ) . O n e r e p o r t h a s s u g g e s t e d t h a t 8 1 a n d S 2 m a y e v e n b e r e t a i n e d a s f r e e e l e m e n t s i n s o m e r e v e r t a n t s ( E s c o t e e t a l . , 1 9 8 5 ) . T h e r e f o r e , t h e r e l a t i o n o f t h e s e e l e m e n t s t o m a l e - s t e r i l i t y i s n o t c l e a r . O n e t h e o r y f o r t h e i n v o l v e m e n t o f S 1 a n d $ 2 i n C M S r e l a t e s t o t h e m i t o c h o n d r i a l r e o r g a n i z a t i o n t h e i r p r e s e n c e i n d u c e s . I n t h e i r p r e s e n c e , t h e n o r m a l l y c i r c u l a r m i t o c h o n d r i a l g e n o m e i s l i n e a r i z e d ( S c h a r d l e t a l . , 1 9 8 4 ) . R e c o m b i n a t i o n b e t w e e n 8 1 a n d S 2 , a n d g e n o m i c s e q u e n c e s h o m o l o g o u s t o t h e t e r m i n a l i n v e r t e d r e p e a t , p r o d u c e m a n y l i n e a r f r a g m e n t s t e r m i n a t e d b y $ 1 o r S Z s e q u e n c e s . U p o n r e v e r s i o n t o f e r t i l i t y a n d l o s s o f t h e f r e e e l e m e n t s , t h e m i t o c h o n d r i a l D N A i s r e c i r c u l a r i z e d , a l t h o u g h S 1 a n d 8 2 s e q u e n c e s a r e i n t e g r a t e d i n t o t h e m i t o c h o n d r i a l g e n o m e a n d r e t a i n e d ( S c h a r d l e t a l . , 1 9 8 5 ) . T h e r e f o r e C M S m a y b e t h e r e s u l t o f n e w D N A a r r a n g e m e n t s i n t h e p r e s e n c e o f $ 1 a n d 8 2 , a l t h o u g h t h e y d o n o t s p e c i fi c a l l y e n c o d e ' C M S . 8 2 c o n t a i n s 5 4 5 2 b p a n d t w o l o n g o p e n r e a d i n g f r a m e s , U R F l a n d U R F 2 ( L e v i n g s a n d S e d e r o f f , 1 9 8 3 ) . 8 1 i s 6 3 9 7 h p w i t h 1 4 6 2 b p o f n e a r l y p e r f e c t h o m o l o g y w i t h S 2 ; t h e r e a r e t h r e e l o n g o p e n r e a d i n g f r a m e s , U R F 2 , U R F 3 , a n d U R F 4 , w i t h U R F 2 o c c u r r i n g i n t h e r e g i o n o f h o m o l o g y w i t h S Z ( P a i l l a r d e t a l . , 1 9 8 5 ) . B y u s i n g a n t i b o d i e s d i r e c t e d t o o l i g o n u c l e o t i d e s p r e d i c t e d f r o m t h e D N A s e q u e n c e , a 1 3 0 k D a p r o t e i n w a s c o n fi r m e d t o b e t h e g e n e p r o d u c t o f U R F l i n S 2 ( Z a b a l a e t a l . , 1 9 8 7 ) w h i l e a 1 0 3 k D a p r o t e i n i s p r o d u c e d b y U R F 3 i n 8 1 ( Z a b a l a a n d W a l b o t , 1 9 8 8 ) . B o t h a n t i b o d i e s d e t e c t e d p r o t e i n w h e n f e r t i l i t y w a s r e s t o r e d ( s p o n t a n e o u s l y o r b y R f 3 ) , b u t d i d n o t r e a c t w i t h p r o t e i n f r o m C M S - T o r C M S - C m i t o c h o n d r i a . I n N m i t o c h o n d r i a , l o w l e v e l s o f t h e 1 3 0 k D a p r o t e i n b u t n o t t h e 1 0 3 k D a p r o t e i n w e r e d e t e c t e d ( Z a b a l a e t a l . , 1 9 8 7 ; Z a b a l a a n d W a l b o t , 1 9 8 8 ) , i n l i n e w i t h t h e e a r l i e r fi n d i n g s t h a t 8 1 a n d S 2 s e q u e n c e s a r e p r e s e n t i n t h e m t D N A o f N b u t n o t C M S - C a n d - T c y t o p l a s m s ( T h o m p s o n e t a l . , 1 9 8 0 ; L o n s d a l e e t a l . , 1 9 8 1 ) . 2 . 2 . 3 . 3 C M S - T T h e f u n g a l t o x i n c a u s i n g S o u t h e r n c o r n l e a f b l i g h t ( B m T ) w h i c h i s s p e c i fi c f o r C M S - T p l a n t s h a s b e e n a u s e f u l t o o l i n i d e n t i f y i n g t h e d e f e c t s i n v o l v e d i n C M S . T h e t r a i t s o f C M S a n d t o x i n s e n s i t i v i t y a p p e a r t o b e l i n k e d s i n c e C M S - T t i s s u e c u l t u r e r e v e r t a n t s a r e a l m o s t a l w a y s b o t h m a l e f e r t i l e a n d t o x i n i n s e n s i t i v e ( B r e t e l l e t a l . , 1 9 7 9 ; B r e t e l l e t a l . , 1 9 8 0 ; D i x o n e t a l . , 1 9 8 2 ; K e m b l e e t a l . , 1 9 8 2 ; U m b e c k a n d G e n g e n b a c h , 1 9 8 3 ; R o t t m a n e t a l . , 1 9 8 7 ; W i s e e t a l . , 1 9 8 7 b ) . E x p o s u r e t o t h e B m T t o x i n a f f e c t s i s o l a t e d m i t o c h o n d r i a o f T c o r n , i n d u c i n g s w e l l i n g ( M i l l e r a n d K o e p p e , 1 9 7 1 ; G e n g e n b a c h e t a l . , 1 9 7 3 b ; G r e g o r y e t a l . , 1 9 7 8 ; Y o r k e t a l . , 1 9 8 0 ; K l e i n a n d K o e p p e , 1 9 8 5 ) a n d c o l l a p s i n g t h e p o t e n t i a l a c r o s s t h e i n n e r m e m b r a n e ( B e r v i l l e e t a l . , 1 9 8 4 ; H o l d e n a n d S z e , 1 9 8 7 a ) . N A D + a n d 0 0 A l e a k f r o m t h e m a t r i x ( M a t t h e w s e t a l . , 1 9 7 9 ; B e r v i l l e e t a l . , 1 9 8 4 ) a n d C a 2 + t r a n s p o r t i n t o t h e m i t o c h o n d r i a i s r e d u c e d ( H o l d e n a n d S z e , 1 9 8 4 ; K i m b e r a n d S z e , 1 9 8 4 ) . R e s p i r a t i o n i s i n h i b i t e d w h e n N A D + - l i n k e d s u b s t r a t e s ( s u c h a s g l u t a m a t e / m a l a t e ) a r e u s e d , w h i l e s u c c i n a t e r e s p i r a t i o n i s u n c h a n g e d i n t h e p r e s e n c e o f K C l b u t s t i m u l a t e d i n i t s a b s e n c e ( M i l l e r a n d K o e p p e , 1 9 7 1 ) . I n h i b i t e d r e s p i r a t i o n c a n b e r e s t o r e d b y t h e a d d i t i o n o f e x o g e n o u s N A D + , p r e s u m a b l y b y r e p l e n i s h i n g t h e N A D + l o s t b y l e a k a g e ( B e r v i l l e e t a l . , 1 9 8 4 ; M a t t h e w s e t a l . , 1 9 7 9 ) . A D P / O r a t i o s ( t h e a m o u n t o f A D P ‘ p h o s p h o r y l a t e d p e r o x y g e n a t o m c o n s u m e d ) a r e r e d u c e d b y t h e t o x i n ( M i l l e r a n d K o e p p e , 1 9 7 1 ) . S e n s i t i v i t y t o B m T t o x i n r e m a i n s o n e o f t h e f e w m a j o r d i f f e r e n c e s b e t w e e n N a n d T m i t o c h o n d r i a . S i m i l a r r e s p i r a t o r y c o n t r o l r a t i o s ( R C R : t h e s t a t e 3 r a t e , w h e n A D P i s p r e s e n t , d i v i d e d b y t h e s t a t e 4 r a t e , w h e n A D P i s a b s e n t ) a n d A D P / O r a t i o s a r e f o u n d ( D u t c h e t a l . , 1 9 8 7 ) . T h e r e a r e s m a l l d i f f e r e n c e s i n s e n s i t i v i t i e s t o i o n o p h o r e s s u c h a s v a l i n o m y c i n a n d g r a m i c i d i n , a n d a s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e i n s e n s i t i v i t y t o n i g e r i c i n ( G e n g e n b a c h e t a l . , 1 9 7 3 a ) , b u t o n l y t h e t o x i n s h o w s c o m p l e t e s e l e c t i v i t y . M e t h o m y l ( F i g u r e 2 . 3 A ) , a c a r b a m a t e i n s e c t i c i d e w h i c h i n h i b i t s a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e , s h o w s i d e n t i c a l s e l e c t i v i t y f o r T c o r n a n d m i m i c s t o x i n a c t i o n , a l t h o u g h a t h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s t h a n r e q u i r e d f o r t h e t o x i n ( K o e p p e e t a l . , 1 9 7 8 ) . T h e r e i s n o a p p a r e n t s t r u c t u r a l r a t i o n a l e f o r t h e s i m i l a r e f f e c t s o f t h e t o x i n a n d m e t h o m y l . T h e m o d e o f t o x i n a c t i o n h a s b e e n s t u d i e d s i n c e 1 9 7 1 . K o n o a n d D a l y ( 1 9 7 9 ) p u r i fi e d t h e t o r n ' n ( F i g u r e 2 . 3 B ) fi ' o m a f u n g a l e x t r a c t a n d d e t e r m i n e d t h e t o x i n ' s 4 1 - c a r b o n p o l y k e t o l s t r u c t u r e ( K o n o e t a l . , 1 9 8 0 ) . T h e t o x i n c o u l d b e w a s h e d o u t o f a f f e c t e d m i t o c h o n d r i a w i t h f r e s h s u s p e n s i o n m e d i a , r e v e r s i n g i t s i n h i b i t o r y e f f e c t s , i n d i c a t i n g t h a t t h e t o x i n d i d n o t b i n d s t r o n g l y ( B e d n a r s k i e t a l . , 1 9 7 7 ) . O n e r e p o r t h a s i n d i c a t e d t h a t r e m o v a l o f t h e o u t e r m e m b r a n e o f N m i t o c h o n d r i a ( b y t h e s w e l l - s h r i n k m e t h o d ) a n d s u b s e q u e n t t o x i n a d d i t i o n i n d u c e d e f f e c t s s i m i l a r t o t h a t s e e n i n T m i t o c h o n d r i a ( W a t r u d e t a l . , 1 9 7 5 ) . T h i s s u g g e s t e d t h a t t h e s i t e o f a c t i o n m i g h t b e o n t h e i n n e r m e m b r a n e o r i n t h e m a t r i x w i t h s e l e c t i v i t y c o n f e r r e d b y t h e o u t e r m e m b r a n e o r t h e i n t e r - m e m b r a n e s p a c e . A n u m b e r o f t o x i n a n a l o g s a n d d e r i v a t i v e s h a v e a l s o b e e n t e s t e d f o r t h e i r e f f e c t i v e n e s s i n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e s t r u c t u r a l e l e m e n t s n e c e s s a r y O H O o 0 H 0 o ) B ( n i x o t T m B d n a ) A ( l y m o h t e m ‘ f o s e r u t c u r t s r a l u c e l o M : 3 . 2 e r u g i F O H O o O H O o O A 0 l l ‘ C H 3 \ 0 = , O - C - N - C H 3 C H 3 _ ‘ H f o r t o x i n a c t i o n . C h a i n l e n g t h ( S u z u k i e t a l . , 1 9 8 2 ) a n d m e t h y l e n e b r i d g e l e n g t h ( S u z u k i e t a l . , 1 9 8 3 ) d e t e r m i n e t h e p o t e n c y o f t h e t o x i n , w i t h t h e n a t i v e t o x i n m o s t e f f e c t i v e . T h e a c e t y l a t e d d e r i v a t i v e d e m o n s t r a t e d s p e c i fi c i t y a n d e f f e c t i v e n e s s f o r N A D H a n d s u c c i n a t e b u t n o t m a l a t e o x i d a t i o n , s u g g e s t i n g i n d e p e n d e n t m e c h a n i s m s f o r t h e t w o e f f e c t s ( P a y n e e t a l . , 1 9 8 0 ) . B o r o h y d r i d e - r e d u c e d t o x i n a l s o r e t a i n e d b i o l o g i c a l a c t i v i t y a n d s p e c i fi c i t y , a l t h o u g h b i n d i n g o f a t r i t i a t e d f o r m w a s n o n - s p e c i fi c a n d e q u a l b e t w e e n N a n d T m i t o c h o n d r i a ( F r a n t z e n e t a l . , 1 9 8 7 ) , q u e s t i o n i n g t h e e x i s t e n c e o f a d i s c r e t e t o x i n b i n d i n g s i t e . S i m i l a r s t r u c t u r a l s t u d i e s h a v e b e e n p e r f o r m e d o n m e t h o m y l ( A r a n d a a n d G a u v r i t , 1 9 8 6 ) . S o m e e v i d e n c e s u g g e s t s t h a t d i c y c l o h e x y l c a r b o d i i m i d e ( D C C D ) b l o c k s t o x i n a c t i o n ( H o l d e n a n d S z e , 1 9 8 7 b ; B o u t h y e t t e e t a l . , 1 9 8 5 ) . D C C D i s k n o w n t o c o v a l e n t l y b i n d t o m a n y m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n s i n c l u d i n g t h e o u t e r m e m b r a n e p o r i n , t h e K + / H + e x c h a n g e c a r r i e r , c y t o c h r o m e c o x i d a s e , a n d s i t e s o n b o t h F 0 a n d F 1 o f t h e A T P s y n t h a s e ( S o l i o z , 1 9 8 4 ) . A d d i t i o n a l l y , k a e m p f e r o l , a l s o a n A T P s y n t h a s e i n h i b i t o r , h a s b e e n s h o w n t o b l o c k s o m e e f f e c t s o f t h e B m T t o x i n a n d m e t h o m y l ( K o e p p e e t a l . , 1 9 7 8 ) . T h i s e v i d e n c e s t r o n g l y s u g g e s t s t h a t a p r o t e i n i s i n v o l v e d i n t h e t o x i n ' s e f f e c t s a n d s e l e c t i v i t y . H o w e v e r , t h e t o x i n h a s a l s o b e e n s h o w n t o b e a c h a n n e l f o r m e r i n b l a c k l i p i d m e m b r a n e s ( H o l d e n e t a l . , 1 9 8 5 ) , s u g g e s t i n g t h a t n o p r o t e i n b i n d i n g s i t e i s n e c e s s a r y . I f t h e t o x i n f o r m s c h a n n e l s i t c o u l d l e a k l a r g e m o l e c u l e s s u c h a s N A D + a n d o t h e r c o e n z y m e s , a s w e l l a s d i s s i p a t e t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l . S u c h b e h a v i o r , h o w e v e r , w o u l d b e e x p e c t e d t o b e o b s e r v e d i n a n y m e m b r a n e , n o t j u s t t h o s e i n T m i t o c h o n d r i a , u n l e s s t h e r e w e r e a s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e i n l i p i d c o m p o s i t i o n o f N a n d T m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s . s o T h e r e a r e t w o p i e c e s o f e v i d e n c e s u g g e s t i n g t h a t T c o r n m i t o c h o n d r i a h a v e a h i g h e r c o n c e n t r a t i o n o f s t e r o l i n t h e i r m e m b r a n e s . F i r s t , G r e g o r y e t a l . ( 1 9 7 7 ) f o u n d t h a t f o u r t i m e s t h e d i g i t o n i n c o n c e n t r a t i o n n e e d e d i n T w a s n e e d e d i n N t o m a x i m a l l y u n c o u p l e s u c c i n a t e r e s p i r a t i o n i n c o r n r o o t m i t o c h o n d r i a . S i n c e d i g i t o n i n i s a d e t e r g e n t t h a t a t l o w c o n c e n t r a t i o n s i s s e l e c t i v e f o r s t e r o l - r i c h m e m b r a n e s , t h e y p r o p o s e d t h a t T m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s c o n t a i n e d m o r e s t e r o l t h a n N m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s . Y o r k t h e n a t t e m p t e d t o c h e m i c a l l y q u a n t i t a t e t h e s t e r o l c o n t e n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n N a n d T m e m b r a n e s . H e f o u n d t h a t w h i l e t h e r e l a t i v e p r o p o r t i o n s o f t h e m a j o r s t e r o l t y p e s w e r e t h e s a m e , t h e r e w a s a g r e a t e r o v e r a l l a m o u n t o f s t e r o l i n T t h a n N b y a b o u t 2 0 % ( Y o r k , 1 9 8 0 ) . Y o r k d i d n o t , h o w e v e r , a t t e m p t t o d i s t i n g u i s h b e t w e e n t h e i n n e r a n d o u t e r m e m b r a n e s , a n d h e p r o v i d e d n o s t a t i s t i c a l a n a l y s i s o f h i s d a t a . M o r r e c e n t d a t a h a s i n d i c a t e d t h a t C M S - s p e c fi c p r o t e i n s p r o v i d e t h e s p e c i fi c i t y o f t h e t o x i n f o r C M S m i t o c h o n d r i a . M i t o c h o n d r i a l D N A r e a r r a n g e m e n t s c o r r e l a t i n g w i t h C M S - T w e r e i d e n t i fi e d b y r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e a n a l y s i s ( L e v i n g s a n d P r i n g , 1 9 7 6 ; P r i n g a n d L e v i n g s , 1 9 7 8 ) . F o r d e e t a l . ( 1 9 7 8 ) d e m o n s t r a t e d a u n i q u e 1 3 k D a t r a n s l a t i o n p r o d u c t i n C M S - T m i t o c h o n d r i a , w h i l e a 2 1 k D a p r o t e i n f o u n d i n o t h e r c y t o p l a s m s w a s m i s s i n g . A n o p e n r e a d i n g f r a m e e n c o d i n g a 1 2 . 9 k D a p r o t e i n ( D e w e y e t a l . , 1 9 8 6 ) w a s f o u n d o n a C M S - T r e s t r i c t i o n f r a g m e n t t h a t i s l o s t i n m a l e - f e r t i l e t o x i n - i n s e n s i t i v e r e v e r t a n t s ( U m b e c k a n d G e n g e n b a c h , 1 9 8 3 ) a n d t h u s i s p r o p o s e d t o b e t h e u n i q u e 1 3 k D a p e p t i d e . T h e c h i m e r i c g e n e , c a l l e d u r f 1 3 - T , c o n t a i n s s e q u e n c e s f r o m t h e a t p 6 5 ' fl a n k , t h e 2 6 S r R N A 3 ' fl a n k , s e q u e n c e o f u n k n o w n o r i g i n , a n d 2 6 S r R N A c o d i n g r e g i o n s ( D e w e y e t a l . , 1 9 8 6 ) . A d o w n s t r e a m o p e n r e a d i n g f r a m e c o d i n g f o r a 2 5 k D a ” p r o t e i n ( O R F 2 5 ) c o n t a i n s s e q u e n c e h o m o l o g y t o t R N A - A r g f r o m t o b a c c o 3 1 c h l o r o p l a s t , a n d i s t h e o n l y c o p y o f t h i s s e q u e n c e i n t h e g e n o m e . W h i l e t h e i d e n t i t y o f O R F 2 5 i s u n k n o w n , s e q u e n c e s h o m o l o g o u s t o i t h a v e b e e n i d e n t i fi e d i n o t h e r p l a n t s . T h e s t r u c t u r e o f t h e u r f 1 3 - T l o c u s i s i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 2 . 1 B . A n t i b o d i e s t o o l i g o p e p t i d e s p r e d i c t e d b y t h e u r f 1 3 - T s e q u e n c e c o n fi r m e d t h a t t h e t r a n s l a t i o n p r o d u c t o f t h e g e n e i s a 1 3 k D a m e m b r a n e p r o t e i n ( W i s e e t a l . , 1 9 8 7 b ; D e w e y e t a l . , 1 9 8 7 ) . P r e s e n c e o f t h e R f l r e s t o r e r g e n e d e c r e a s e d p r o d u c t i o n o f t h e 1 3 k D a p r o t e i n ( D e w e y e t a l . , 1 9 8 7 ) b u t u r f 1 3 - T t r a n s c r i p t s w e r e r e d u c e d t o a l e s s e r e x t e n t , s u g g e s t i n g t h a t R f 1 a f f e c t s t r a n s l a t i o n a l c o n t r o l r a t h e r t h a n R N A p r o c e s s i n g ( K e n n e l l e t a l . , 1 9 8 7 ; K e n n e l ] a n d P r i n g , 1 9 8 9 ) . L o s s o f t h e 1 3 k D a p e p t i d e b y e i t h e r f r a m e s h i f t m u t a t i o n ( W i s e e t a l . , 1 9 8 7 a ) o r e l i m i n a t i o n b y h o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o n o f t h e u r f 1 3 - T g e n e ( R o t t m a n e t a l . , 1 9 8 7 ) r e s u l t e d i n m a l e - f e r t i l e a n d t o x i n - i n s e n s i t i v e p l a n t s . T h e s e d a t a , t a k e n t o g e t h e r , s t r o n g l y s u g g e s t s t h a t t h e 1 3 k D a p e p t i d e e n c o d e s b o t h t o x i n s e n s i t i v i t y a n d C M S . T h e u r f 1 3 - T g e n e h a s b e e n c l o n e d a n d e x p r e s s e d i n o t h e r o r g a n i s m s t o v e r i f y i t s r o l e i n t o x i n b i n d i n g . I n E . c o l i e x p r e s s i n g t h e 1 3 k D a p e p t i d e , t o x i n c a u s e s i n h i b i t i o n o f w h o l e c e l l r e s p i r a t i o n a n d s w e l l i n g o f s p h e r o p l a s t s ( D e w e y e t a l . , 1 9 8 8 ) . I n y e a s t , t h e g e n e w a s i n t r o d u c e d i n t o t h e n u c l e u s a n d i t s t r a n s l a t i o n p r o d u c t d i r e c t e d t o t h e m i t o c h o n d r i a b y f u s i o n o f t h e g e n e w i t h t h e t a r g e t t i n g p r e s e q u e n c e p o r t i o n o f t h e g e n e f o r N e u r o s p o r a c r a s s a A T P a s e s u b u n i t 9 . T o x i n a n d m e t h o m y l i n h i b i t g r o w t h a n d u n c o u p l e N A D H - s t i m u l a t e d r e s p i r a t i o n i n y e a s t e x p r e s s i n g t h e 1 3 k D a p e p t i d e ( H u a n g e t a l . , 1 9 9 0 ; G l a b e t a l . , 1 9 9 0 ) . M o s t r e c e n t l y , t h e g e n e h a s b e e n i n t r o d u c e d i n t o t o b a c c o , c a u s i n g t o x i n - s e n s i t i v i t y ( v o n A l l m e n e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h e s i t e o f t o x i n a n d m e t h o m y l i n t e r a c t i o n w i t h t h e 1 3 k D a p e p t i d e h a s b e e n i n v e s t i g a t e d b y s i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s a n d b i n d i n g s t u d i e s . A n a m i n o t e r m i n a l d e l e t i o n o f r e s i d u e s 2 - 1 1 e l i m i n a t e d t o x i n s e n s i t i v i t y ( D e w e y e t a l . , 1 9 8 8 ) w h i l e d e l e t i o n s o f u p t o o n e - q u a r t e r o f t h e a m i n o a c i d s a t t h e c a r b o x y l e n d h a d n o e f f e c t ( B r a u n e t a l . , 1 9 8 9 ) . M u t a n t s o f a c i d i c r e s i d u e s i d e n t i fi e d A s p - 1 2 a n d A s p - 3 9 a s D C C D - b i n d i n g s i t e s ( B r a u n e t a l . , 1 9 8 9 ) . A s p - 3 9 s e e m s t o b e t h e m o r e i m p o r t a n t o f t h e t w o f o r t o x i n i n t e r a c t i o n s i n c e t o x i n s e n s i t i v i t y i s e l i m i n a t e d w h e n t h i s r e s i d u e a l o n e i s m u t a t e d o r c o v a l e n t l y m o d i fi e d b y D C C D . D e s p i t e t h e n e g a t i v e r e s u l t s o f F r a n t z e n e t a l . ( 1 9 8 7 , s e e a b o v e ) , B r a u n e t a l . ( 1 9 9 0 ) w e r e a b l e t o d e m o n s t r a t e b i n d i n g o f 3 H - r e d u c e d t o x i n t o t h e 1 3 k D a p e p t i d e i n c o m p e t i t i o n a n d d i s p l a c e m e n t s t u d i e s . F u r t h e r m o r e , t o x i n a n d m e t h o m y l c o u l d c o m p e t e o u t e a c h o t h e r f o r b i n d i n g , s u g g e s t i n g a n i d e n t i c a l o r o v e r l a p p i n g b i n d i n g s i t e . B i n d i n g o f t o x i n i n E . c o l i i s c o o p e r a t i v e , p o s s i b l y i n d i c a t i n g t h a t t h e 1 3 k D a p e p t i d e e x i s t s i n a n o l i g o m e r i c s t r u c t u r e a s s u g g e s t e d b y p r e l i m i n a r y c r o s s - l i n k i n g s t u d i e s ( W i l l i a m s e t a l . , 1 9 9 0 ) . M o s t t o x i n - i n s e n s i t i v e m u t a n t s o f t h e 1 3 k D a p r o t e i n b i n d l i t t l e o r n o t o x i n e x c e p t f o r t h e N - t e r m i n a l 2 - 1 1 d e l e t i o n m u t a n t , w h i c h b i n d s a n o r m a l a m o u n t o f t o x i n , i n d i c a t i n g t h a t t h e s e r e s i d u e s m a y b e i m p o r t a n t f o r t o x i n i n t e r a c t i o n . W h i l e t h e s e e x p e r i m e n t s c o n v i n c i n g l y d e fi n e t h e 1 3 k D a p e p t i d e a s t h e B m T t o x i n b i n d i n g s i t e , t h e r o l e o f t h e 1 3 k D a p e p t i d e i n p r o d u c i n g t h e C M S p h e n o t y p e r e m a i n s u n c l e a r . 2 . 3 H y p o t h e s e s f o r t h e m e c h a n i s m o f C M S I n t h e a b s e n c e o f a n y d i r e c t e v i d e n c e f o r a m e c h a n i s m o f C M S , a n u m b e r o f t h e o r i e s h a v e b e e n p u t f o r t h . A l t h o u g h a f e w o f t h e t h e o r i e s w e r e p r o p o s e d p r i o r t o t h e d i s c o v e r i e s o f t h e u r f 1 3 - T a n d p c f g e n e s , t h e y c a n s t i l l a c c o u n t f o r t h e e x p e r i m e n t a l d a t a o n p o l l e n a b o r t i o n . F l a v e l l ( 1 9 7 4 ) fi r s t p r o p o s e d t h a t a s u b s t a n c e p r o d u c e d o n l y i n t h e a n t h e r i n t e r a c t s w i t h t h e a l t e r e d o r g a n e l l e s i n C M S p l a n t s , p r e v e n t i n g n o r m a l a n t h e r d e v e l o p m e n t . H e p o i n t e d o u t t h a t t h e i n v o l v e m e n t o f a r e g u l a t o r y s u b s t a n c e u n d e r d e v e l o p m e n t a l c o n t r o l c a n a c c o u n t f o r t h e v a r i a t i o n i n t h e e x t e n t o f s t e r i l i t y i n d i f f e r e n t a n t h e r s a n d t h e d e p e n d e n c e o f s t e r i l i t y o n t h e e n v i r o n m e n t . N u c l e a r r e s t o r e r g e n e s a r e p o s t u l a t e d t o c o r r e c t t h e a l t e r e d o r g a n e l l e s t r u c t u r e , m a k i n g t h e o r g a n e l l e i n s e n s i t i v e t o t h e a n t h e r - s p e c i fi c s u b s t a n c e , o r t o i n t e r f e r e w i t h t h e s u b s t a n c e ’ s t r a n s p o r t i n t h e a n t h e r . F l a v e l l ’ s a n t h e r - s p e c i fi c s u b s t a n c e m a y h a v e a s t r u c t u r e s i m i l a r t o t h e B m T t o x i n , b i n d i n g t o t h e 1 3 k D a p e p t i d e ( o r u r f S p e p t i d e i n p e t u n i a ) a n d c a u s i n g m i t o c h o n d r i a l d y s f u n c t i o n a n d t h e r e f o r e p o l l e n a b o r t i o n . T h e t h e o r y o f W a r m k e a n d L e e ( 1 9 7 8 ) i n v o l v e s t h e i r o b s e r v a t i o n o f a m a s s i v e m i t o c h o n d r i a l p r o l i f e r a t i o n i n t h e t a p e t a l a n d s p o r a n g e o u s c e l l s d u r i n g e a r l y g r o w t h s t a g e s o f a n t h e r s i n n o r m a l p l a n t s ( L e e a n d W a r m k e , 1 9 7 9 ) . T h e n u m b e r o f m i t o c h o n d r i a c a n i n c r e a s e . 2 0 t o 4 0 t i m e s i n t h e s e t i s s u e s w h i l e o n l y m o d e r a t e i n c r e a s e s i n t h e c e l l d i m e n s i o n s o c c u r . T h e m i t o c h o n d r i a l v o l u m e w a s s h o w n t o d e c r e a s e c o n c o m i t a n t l y 1 2 t o 1 5 t i m e s . T h i s m i t o c h o n d r i a l p r o l i f e r a t i o n i m m e d i a t e l y p r e c e d e s t h e o b s e r v e d d e g e n e r a t i o n i n a n t h e r s w i t h T c y t o p l a s m . T h e m i t o c h o n d r i a o f t h e f e m a l e r e p r o d u c t i v e t i s s u e s , h o w e v e r , w e r e f o u n d t o r e m a i n r e l a t i v e l y c o n s t a n t i n s i z e a n d n u m b e r d u r i n g g a m e t o g e n e s i s . W a r m k e a n d L e e ( 1 9 7 8 ) t h e r e f o r e p r o p o s e d t h a t t h e a l t e r e d D N A o b s e r v e d b y r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e d i g e s t i o n m a y l e a d t o a c h a n g e i n t h e e n e r g y - g e n e r a t i n g a b i l i t y o f m i t o c h o n d r i a s u c h t h a t t h e y c a n n o t s u p p o r t t h e r a p i d m i t o c h o n d r i a l p r o l i f e r a t i o n i n t h e a n t h e r s . T o u p d a t e t h i s m o d e l , o n e m a y t h e o r i z e t h a t t h e 1 3 k D a o r u r f S p e p t i d e s m a y c a u s e o n l y a s l i g h t i m p e d e n c e t o m i t o c h o n d r i a l r e s p i r a t i o n u n d e r n o r m a l g r o w t h c o n d i t i o n s ; h o w e v e r , t h i s s m a l l d e c r e a s e i n t h e e f fi c i e n c y o f r e s p i r a t i o n m a y b e s u f fi c i e n t t o p r e v e n t t h e r a p i d r e s p i r a t i o n n e c e s s a r y f o r p r o l i f e r a t i o n a n d l e a d t o p o l l e n a b o r t i o n . S i n c e C M S - l i n k e d m t D N A r e a r r a n g e m e n t s o f t e n i n v o l v e d g e n e s o f r e s p i r a t o r y c o m p l e x s u b u n i t s , a l t e r a t i o n s i n t h e p r o t e i n s t r u c t u r e s t h e m s e l v e s h a v e b e e n s u g g e s t e d t o b e t h e c a u s e o f t h e C M S t r a i t . C y t o c h r o m e o x i d a s e w a s s u s p e c t e d b e c a u s e i t s g e n e s a r e i n v o l v e d i n t h e r e a r r a n g e m e n t s o f p e t u n i a , m a i z e - C , s o r g h u m , a n d s e v e r a l o t h e r p l a n t s . A d d i t i o n a l l y , t h e a n t h e r s o f C M S - T m a i z e w e r e f o u n d t o h a v e l o w e r c y t o c h r o m e o x i d a s e c o n c e n t r a t i o n s t h a n n o r m a l f e r t i l e o r r e s t o r e d p l a n t s ( W a t r u d e t a l . , 1 9 7 6 ) . M o r e o v e r , i m m u n o p r e c i p i t a t e s o f t h e o x i d a s e c o n t a i n t h e 1 3 k D a p e p t i d e u n i q u e t o C M S - T ( C . L e a v e r , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . H o w e v e r , N a n d T m a i z e m i t o c h o n d r i a h a v e s i m i l a r r e s p i r a t o r y r a t e s a n d e q u a l e f fi c i e n c i e s o f o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n ( G e n g e n b a c h e t a l . , 1 9 7 3 a ; D u t c h e t a l . , 1 9 8 7 ) . T h e A T P s y n t h a s e h a s b e e n a n o t h e r c a n d i d a t e f o r i n v o l v e m e n t i n C M S s i n c e t h e c h i m e r i c g e n e s o f b o t h p e t u n i a a n d C M S - T c o n t a i n p i e c e s o f A T P a s e g e n e s a n d m a y b e u n d e r c o n t r o l o f A T P a s e g e n e p r o m o t e r s . T h e a t p 6 g e n e i s a l s o d i s r u p t e d i n C M S O g u r a r a d i s h ( M a k a r o f f e t a l . , 1 9 8 9 ) . I n h i b i t o r s o f t h e A T P a s e ( D C C D a n d k a e m p f e r o l ) a l s o b l o c k t o x i n a c t i o n , a n d A T P a s e s u b u n i t s h a v e b e e n f o u n d t o c o p r e c i p i t a t e w i t h a n t i b o d i e s t o t h e 1 3 k D a p r o t e i n ( W i s e e t a l . , 1 9 8 7 a ) . H o w e v e r , r e c e n t s t u d i e s d e m o n s t r a t i n g d i r e c t D C C D a n d t o x i n b i n d i n g t o t h e 1 3 k D a p e p t i d e h a v e c a s t s o m e d o u b t o n t h e p o s s i b i l i t y t h a t a l t e r e d r e s p i r a t o r y p r o t e i n s a r e i n v o l v e d i n C M S . M o r e r e c e n t l y , H a n s o n e t a l . ( 1 9 8 9 ) h a v e p o i n t e d o u t t h a t a c o m m o n f e a t u r e o f C M S i n b o t h T m a i z e a n d p e t u n i a i s t h e p r e s e n c e o f s i n g l e c o p y g e n e s d o w n s t r e a m f r o m t h e c h i m e r i c g e n e e n c o d i n g t h e u n i q u e p r o t e i n . I n t h e c a s e o f p e t u n i a , t h e o n l y g e n o m i c c o p i e s o f t h e n a d 3 ( N A D H d e h y d r o g e n a s e s u b u n i t 3 ) a n d r s p 1 2 ( r i b o s o m a l p r o t e i n s m a l l s u b u n i t 1 2 ) g e n e s a r e , c o - t r a n s c r i b e d w i t h p c f . S i m i l a r l y , O R F 2 5 ( w h o s e i d e n t i fi c a t i o n r e m a i n s u n k n o w n ) i s c o t r a n s c r i b e d w i t h u r f 1 3 - T i n C M S - T . S i n c e b o t h s i n g l e c o p y g e n e s a r e l i k e l y t r a n s c r i b e d f r o m d i f f e r e n t p r o m o t e r s t h a n i n N m i t o c h o n d r i a , t h e i r t r a n s c r i p t i o n a n d e x p r e s s i o n c o u l d b e a f f e c t e d . W h e n f e r t i l i t y i s r e s t o r e d b y R f g e n e s , t r a n s c r i p t i o n a n d t r a n s l a t i o n m a y b e a l t e r e d f o r t h e s e g e n e s , a l l o w i n g a m o r e “ n o r m a l ” e x p r e s s i o n a n d t h u s f e r t i l i t y . F u r t h e r s t u d i e s a r e n e e d e d t o d e t e r m i n e w h i c h , i f a n y , o f t h e s e t h e o r i e s m a y e x p l a i n m a l e s t e r i l i t y . T o a s s e s s t h e H a n s o n t h e o r y , t h e c h i m e r i c g e n e s c o u l d b e i n t r o d u c e d i n t o o t h e r p l a n t s s u c h t h a t n o o t h e r s i n g l e c o p y g e n e s a r e c o - t r a n s c r i b e d . v o n A l l m e n e t a l . ( 1 9 9 1 ) h a v e e x p r e s s e d u r f 1 3 - T u n d e r t h e c o n t r o l o f t h e c a u l i fl o w e r m o s a i c v i r u s 3 5 S p r o m o t e r i n t o b a c c o . T h e t r a n s f o r m e d p l a n t s a r e t o x i n s e n s i t i v e , b u t a p p e a r t o b e f e r t i l e . H o w e v e r , s i n c e t h e g e n e i s n o w l o c a t e d i n t h e n u c l e u s a n d t h e p r o t e i n i s t h e r e f o r e n o t i n s e r t e d i n t h e m i t o c h o n d r i a l i n n e r m e m b r a n e , i t i s n o t p o s s i b l e t o d e t e r m i n e w h e t h e r C M S i s c a u s e d b y t h e 1 3 k D a p e p t i d e . N e w l y d e v e l o p e d m e t h o d s o f m i t o c h o n d r i a l t r a n s f o r m a t i o n ( S a n f o r d , 1 9 9 0 ) s h o u l d b e u s e f u l f o r p e r f o r m i n g t h i s e x p e r i m e n t . C h a p t e r 3 - A s e a r c h f o r s i g n i fi c a n t s t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l d i f f e r e n c e s b e t w e e n m i t o c h o n d r i a f r o m n o r m a l a n d T e x a s m a l e - s t e r i l e m a i z e 3 . 1 I n t r o d u c t i o n B i p o l a r i s m a y d i s r a c e T , t h e f u n g u s w h i c h c a u s e d t h e S o u t h e r n c o r n l e a f b l i g h t e p i d e m i c s o f 1 9 6 9 - 7 1 , p r o d u c e s a t o x i n ( B m T ) w h i c h a f f e c t s T e x a s c y t o p l a s m i c m a l e - s t e r i l e m a i z e b u t n o t n o r m a l - f e r t i l e m a i z e . T h e t o x i n c a u s e s p h y s i o l o g i c a l a n d u l t r a s t r u c t u r a l c h a n g e s i n t h e m i t o c h o n d r i a o f C M S - T m a i z e w h i c h p r e s u m a b l y a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e d a m a g e t o t h e p l a n t . T h e t o x i n p r o v i d e s a v a l u a b l e t o o l i n s t u d y i n g t h e p h e n o m e n o n o f c y t o p l a s m i c m a l e - s t e r i l i t y . P r e v i o u s s t u d i e s o f C M S - T l e a d t o t h r e e m a i n q u e s t i o n s : 1 ) W h a t i s t h e m o d e o f s e l e c t i v i t y o f t o x i n f o r C M S - T m a i z e ? 2 ) W h a t i s t h e a c t i o n o f t h e t o x i n o n m i t o c h o n d r i a ? 3 ) H o w d o e s t h e s e l e c t i v i t y o f t o x i n r e l a t e t o t h e m a l e - s t e r i l e c o n d i t i o n ? D e s p i t e t h e d i s c o v e r y o f a 1 3 k D a p e p t i d e u n i q u e t o C M S - T m a i z e w h i c h b i n d s t o x i n a n d D C C D , m a n y y e a r s o f i n v e s t i g a t i o n h a v e s o f a r f a i l e d t o c o n c l u s i v e l y d e m o n s t r a t e w h a t d i f f e r e n c e s b e t w e e n N a n d T m i t o c h o n d r i a a c c o u n t f o r m a l e - s t e r i l i t y . M o r e o v e r , t h e a c t u a l m e c h a n i s m o f t h e t o x i n - i n d u c e d e f f e c t s r e m a i n s u n e x p l a i n e d . S o m e d i f f e r e n c e i n t h e s t e r o l c o n t e n t o f t h e m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s o f n o r m a l a n d C M S - T m a i z e h a s b e e n d o c u m e n t e d a n d s u g g e s t e d t o b e r e s p o n s i b l e f o r t h e s e l e c t i v i t y o f t h e t o x i n . W e h a v e a t t e m p t e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e s e d i f f e r e n c e s a r e s i g n i fi c a n t a n d r e l e v a n t . O t h e r s t u d i e s h a v e s u g g e s t e d t h a t t h e A T P s y n t h a s e c o m p l e x ( F o - F 1 ) o f t h e i n n e r m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e m a y b e i n v o l v e d . A r e a r r a n g e m e n t o f t h e m i t o c h o n d r i a l g e n o m e 3 6 3 7 t h a t i s u n i q u e t o T i n v o l v e s t h e a t p 6 g e n e , w h i l e A T P a s e i n h i b i t o r s D C C D a n d k a e m p f e r o l w e r e f o u n d t o r e d u c e s o m e t o x i n - i n d u c e d e f f e c t s i n T m i t o c h o n d r i a . A l t h o u g h t h e 1 3 k D a p e p t i d e h a s b e e n s h o w n t o b e s u fi c i e n t t o b i n d t o x i n ( B r a u n e t a l . , 1 9 9 0 ) , t h e a b o v e d a t a s u g g e s t s t h a t t h e r e s p i r a t o r y c o m p l e x e s m a y b e i n v o l v e d i n t o x i n b i n d i n g o r C M S i n s o m e a s y e t u n d e fi n e d w a y . W e t h e r e f o r e h o p e d t o v e r i f y t h e e f f e c t s o f D C C D a n d t e s t o t h e r k n o w n A T P a s e i n h i b i t o r s , a s w e l l a s t o a s s e s s w h e t h e r a n y d i f f e r e n c e s e x i s t b e t w e e n N a n d T m i t o c h o n d r i a l A T P a s e a c t i v i t y . T h e s e s t u d i e s h a v e a t t e m p t e d t o d e t e r m i n e i f t h e A T P s y n t h a s e c o m p l e x , o r s u b u n i t s t h e r e o f , m a y f o r m p a r t o f t h e b i n d i n g s i t e f o r t h e B m T t o x i n o r b e i n v o l v e d i n i t s m e c h a n i s m o f a c t i o n . 3 . 2 M a t e r i a l s a n d m e t h o d s 3 . 2 . 1 M a t e r i a l s M e t h o m y l ( > 9 9 % p u r e ) w a s o b t a i n e d f r o m t h e U n i t e d S t a t e s E n v i r o n m e n t a l P r o t e c t i o n A g e n c y P e s t i c i d e s & I n d u s t r i a l C h e m i c a l s R e p o s i t o r y . B m T t o x i n w a s t h e g i f t o f D r . R o b e r t S c h e fi ‘ e r . T w o m i c r o l i t e r s o f t o x i n e x t r a c t p r o d u c e d e f f e c t s e q u a l t o 2 u L o f 2 M m e t h o m y l . M a i z e l i n e s W 6 4 A T M S ( m a l e - s t e r i l e ) a n d W 6 4 A H T ( f e r t i l e ) w e r e o b t a i n e d f r o m t h e N e b r a s k a F o u n d a t i o n S e e d C o m p a n y . 3 . 2 . 2 I s o l a t i o n o f m i t o c h o n d r i a M a i z e s e e d s w e r e s o a k e d i n w a t e r o v e r n i g h t , p l a n t e d i n v e r m i c u l i t e a n d g r o w n i n d a r k n e s s a t 2 7 ° C a n d 8 0 % r e l a t i v e h u m i d i t y . M i t o c h o n d r i a a r e i s o l a t e d f r o m 4 - d a y o l d e t i o l a t e d m a i z e s e e d l i n g s b y t h e s u c r O s e ” c u s h i o n c e n t r i f u g a t i o n m e t h o d o f D a y a n d H a n s o n ( 1 9 7 7 ) . R e s p i r a t o r y c o n t r o l r a t i o s 3 8 ( R C R ) o f 5 — 7 a n d A D P / O r a t i o s o f 2 . 7 - 2 . 9 a r e t y p i c a l l y o b t a i n e d u s i n g g l u t a m a t e / m a l a t e a s s u b s t r a t e i n a b u f f e r ( “ R C R b u f f e r ” ) c o n t a i n i n g 0 . 2 5 M s u c r o s e , 1 0 m M T E S , 5 m M K H z P O 4 , 5 m M M g C 1 2 , 1 m M E G T A , a n d 0 . 1 % B S A , p H 7 . 2 a r 2 3 ° C ( F i g u r e 3 . 1 ) . R C R v a l u e s w e r e a l s o t e s t e d u s i n g a b u fi e r ( “ K C l b u f f e r ” ) c o n t a i n i n g 0 . 4 M K C l , 4 0 m M H E P E S , 8 m M K H 2 P 0 4 , 2 m g / m L B S A , p H 7 . 4 a t 2 3 ° C . T h e m i t o c h o n d r i a m a i n t a i n g o o d r e s p i r a t o r y c o n t r o l f o r u p t o 6 h o u r s s u s p e n d e d i n 0 . 4 M s u c r o s e a t 2 0 m g / m L p r o t e i n o n i c e . T h e y a r e s h o w n t o b e g r e a t e r t h a n 9 5 % i n t a c t b y t h e i r r e s p o n s e t o e x o g e n o u s l y s u p p l i e d c y t o c h r o m e c . C y t o c h r o m e 0 c a n n o t c r o s s t h e o u t e r m e m b r a n e a n d t h u s c a n n o t b e o x i d i z e d b y c y t o c h r o m e c o x i d a s e u n l e s s t h e m e m b r a n e i s “ l e a k y ” ( W i k s t r o m a n d C a s e y , 1 9 8 5 ) . T h e r a t i o o f t h e r e s p i r a t i o n r a t e i n d u c e d b y c y t o c h r o m e c t o t h e r a t e i n d u c e d b y s u b s e q u e n t a d d i t i o n o f l a u r y l m a l t o s i d e ( w h i c h c o m p l e t e l y d i s r u p t s t h e m e m b r a n e a l l o w i n g fi ' e e a c c e s s o f c y t o c h r o m e c t o o x i d a s e ) g i v e s a m e a s u r e o f t h e d e g r e e o f i n t a c t n e s s ( F i g u r e 3 . 2 ) . 3 . 2 . 3 D e t e r m i n a t i o n o f a d i f f e r e n c e i n s t e r o l c o n c e n t r a t i o n W e r e p e a t e d t h e d i g i t o n i n - s e n s i t i v i t y e x p e r i m e n t s o f G r e g o r y e t a l . ( 1 9 7 7 ) u s i n g R C R b u fi ‘ e r i n s t e a d o f K C l b u f f e r a n d i n c u b a t i o n c o n d i t i o n s w h i c h s u p p o r t g r e a t e r m i t o c h o n d r i a l s t a b i l i t y . D i g i t o n i n , w h o s e i n t e r a c t i o n w i t h m e m b r a n e s i s d e p e n d e n t o n t h e i r s t e r o l c o n t e n t , w a s d i s s o l v e d a t 1 0 m g / m L b y a d d i n g h o t 0 . 2 5 M s u c r o s e , s o n i c a t i n g , a n d c o n t i n u e d h e a t i n g . M i t o c h o n d r i a a n d v a r y i n g c o n c e n t r a t i o n s o f d i g i t o n i n w e r e m i x e d i n 0 . 2 5 M s u c r o s e a n d i n c u b a t e d o n i c e f o r fi v e m i n u t e s p r i o r t o a s s a y . I n e a c h r u n , t w o g l u t a m a t e / m a l a t e R C R v a l u e s a n d o n e s u c c i n a t e R C R v a l u e a r e m e a s u r e d , a n d t h e i n t a c t n e s s o f t h e o u t e r m e m b r a n e i s d e t e r m i n e d b y t h e c y t o c h r o m e c 3 9 F i g u r e 3 . 1 : P o l a r o g r a p h i c m e a s u r e m e n t o f t h e r e s p i r a t o r y c o n t r o l r a t i o i n ‘ - m a i z e m i t o c h o n d r i a . M i t o c h o n d r i a ( 0 . 3 m g p r o t e i n ) a r e a d d e d t o a b u f f e r c o n t a i n i n g 0 . 2 5 M s u c r o s e , 1 0 m M T E S , 5 m M K H z P O 4 , 5 m M M g C l g , 1 m M E G T A , 0 . 1 % B S A , p H 7 . 2 a t 2 3 ° C w i t h 2 5 m o l g l u t a m a t e / 2 5 u m o l m a l a t e . A D P ( 0 . 2 o r 0 . 3 u m o l ) i s a d d e d a s i n d i c a t e d t o i n d u c e a b u r s t o f 0 2 c o n s u m p t i o n ( s t a t e 3 r a t e ) . W h e n t h e A D P h a s b e e n c o n s u m e d , t h e r a t e r e t u r n s t o a l o w e r v a l u e ( s t a t e 4 ) . T h e R C R i s t h e r a t i o o f t h e s t a t e 3 r a t e t o t h e s t a t e 4 r a t e . 9 . 2 a 0 / P D 3 A : 6 = R C R l a m / P t D r U I B A . . l 9 . 2 . n l l ' l l F i g u r e 3 . 1 0 m u m 9 n h r ! L o t t e ( — i n l e t : 4 0 4 1 F i g u r e 3 . 2 : P o l a r o g r a p h i c a s s a y o f t h e i n t a c t n e s s o f t h e o u t e r m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e . A s c o r b a t e ( 0 . 2 u m o l ) a n d c y t o c h r o m e c a r e a d d e d t o a m i t o c h o n d r i a l s u s p e n s i o n ( 0 . 3 m g p r o t e i n ) i n R C R b u f f e r a t 2 3 ° C . A f t e r a r e s p i r a t o r y r a t e h a s b e e n e s t a b l i s h e d , l a u r y l m a l t o s i d e ( L M , fi n a l c o n c e n t r a t i o n 0 . 1 % ) , i s a d d e d t o d i s r u p t t h e m e m b r a n e , p r o d u c i n g a h i g h e r r a t e . T h e r a t i o o f t h e t w o r a t e s g i v e s a n e s t i m a t e o f t h e i n t a c t n e s s o f t h e o u t e r m e m b r a n e . T h e u p p e r t r a c e r e p r e s e n t s t h e t y p i c a l i n t a c t n e s s o f t h e o u t e r m e m b r a n e o f u n t r e a t e d m i t o c h o n d r i a w h i l e t h e l o w e r t r a c e r e p r e s e n t s d i g i t o n i n - t r e a t e d m i t o c h o n d r i a ( 0 . 5 0 m g d i g i t o n i n / m g p r o t e i n ) . O l o m n 5 1 1 1 m i n . 4 2 R a t i o = 0 . 0 5 4 R a t i o = 0 . 5 5 7 F i g u r e 3 . 2 4 3 F i g u r e 3 . 3 : P o l a r o g r a p h i c t r a c e o f a t y p i c a l a s s a y f o r d i g i t o n i n s e n s i t i v i t y o f m i t o c h o n d r i a . M i t o c h o n d r i a ( 0 . 3 m g ) a r e m i x e d w i t h d i g i t o n i n a n d 0 . 2 5 M s u c r o s e t o a t o t a l v o l u m e o f 1 5 0 u L a n d i n c u b a t e d o n i c e f o r fi v e m i n u t e s . G l u t a m a t e / m a l a t e ( 5 0 m o l ) , s u c c i n a t e ( 2 5 m o l ) , a s c o r b a t e ( 2 5 u m o l ) , A D P ( 0 . 2 u m o l ) a n d 1 3 0 u L o f t h e m i t o c h o n d r i a l m i x t u r e w e r e a d d e d a s i n d i c a t e d t o t h e R C R b u f f e r a t 2 3 ° C . C y t o c h r o m e c l e a k a g e i s c a l c u l a t e d a s t h e r a t i o o f t h e 0 2 c o n s u m p t i o n r a t e i n d u c e d b y c y t o c h r o m e c a n d a s c o r b a t e a n d t h e r a t e i n d u c e d b y l a u r y l m a l t o s i d e ( L M , fi n a l c o n c e n t r a t i o n 0 . 1 % ) . O l o m n 5 1 1 J \ g l u t / m o i . 5 3 : 3 p . O 7 9 . I I : p ‘ O H “ ‘ 5 . O l R a t i o = 0 . 2 2 1 W l l x F i g u r e 3 . 3 4 5 l e a k a g e t e s t . ( F i g u r e 3 . 3 ) A C l a r k - t y p e o x y g e n e l e c t r o d e ( Y e l l o w S p r i n g s I n s t r u m e n t s ) w a s u s e d t o m e a s u r e o x y g e n c o n s u m p t i o n c a t a l y z e d b y c y t o c h r o m e c o x i d a s e . 3 . 2 . 4 M e a s u r e m e n t o f m i t o c h o n d r i a l s w e l l i n g S w e l l i n g o f m i t o c h o n d r i a i s d e t e c t e d s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y b y a d e c r e a s e i n a b s o r b a n c e a t 5 2 0 n m ( B e a v i s e t a l . , 1 9 8 5 ) . P a s s i v e s w e l l i n g o f N a n d T m i t o c h o n d r i a i n a K C l b u f f e r w a s m e a s u r e d t o d e t e c t d i f f e r e n c e s i n s e n s i t i v i t y t o K C l . I n R C R b u f f e r a f t e r a d d i t i o n o f a n e n e r g y s u b s t r a t e s u c h a s g l u t a m a t e / m a l a t e o r s u c c i n a t e t o a m i t o c h o n d r i a l s u s p e n s i o n t o e s t a b l i s h a m e m b r a n e p o t e n t i a l , t o x i n o r m e t h o m y l w a s a d d e d a n d s w e l l i n g o b s e r v e d . E f f e c t o r s w e r e a d d e d e i t h e r b e f o r e t h e r u n w a s b e g u n ( a s w i t h D C C D ) o r b e f o r e t o x i n w a s a d d e d ( a s w i t h o l i g o m y c i n a n d q u e r c e t i n ) t o d e t e r m i n e t h e i r e f f e c t o n t h e t o x i n - i n d u c e d s w e l l i n g o f T m i t o c h o n d r i a . 3 . 2 . 5 A s s a y o f A T P a s e a c t i v i t y M i t o c h o n d r i a ( 0 . 1 5 m g p r o t e i n ) w e r e i n c u b a t e d w i t h s u c c i n a t e ( 2 . 5 n m o l ) a s a n e n e r g y s o u r c e f o r fi v e m i n u t e s t o f a c i l i t a t e u p t a k e o f v a r y i n g c o n c e n t r a t i o n s o f e x o g e n o u s l y s u p p l i e d A T P ( A b o u - K a h l i l a n d H a n s o n , 1 9 7 7 ; J u n g a n d H a n s o n , 1 9 7 5 ) . T h e d i s s i p a t i o n o f t h e p r o t o n g r a d i e n t b y 0 . 5 n m o l c a r b o n y l c y a n i d e m - c h l o r o p h e n y l h y d r a z o n e ( C C C P , fi v e m i n u t e s a f t e r A T P a d d i t i o n ) i n d u c e s A T P h y d r o l y s i s . A f t e r t e n m i n u t e s t h e m i t o c h o n d r i a a r e t r e a t e d w i t h o l i g o m y c i n A ( 0 . 3 3 u g / m g p r o t e i n ) t o i n h i b i t t h e r e a c t i o n a n d l y s e d i n t w e n t y v o l u m e s o f w a t e r t o r e l e a s e t h e c o n t e n t s o f t h e m i t o c h o n d r i a . A f t e r t h i r t y m i n u t e s t h e m i x t u r e w a s c e n t r i f u g e d a t 1 2 0 0 0 9 f o r 1 0 m i n u t e s t o r e m o v e m i t o c h o n d r i a l d e b r i s . A T P a s e a c t i v i t y i s t h e n a s s a y e d a s r e l e a s e d i n o r g a n i c p h o s p h a t e i n t h e s u p e r n a t a n t b y t h e m e t h o d o f B e n c i n i e t a l . ( 1 9 8 3 ) 4 6 w h i c h u s e s a n a m m o n i u m m o l y b d a t e r e a g e n t u n d e r m i l d c o n d i t i o n s ( p H 5 . 0 ) w h i c h p r o m o t e m i n i m a l A T P h y d r o l y s i s . T h e a b s o r b a n c e o f e a c h s a m p l e w a s r e a d a t 3 5 0 n m . A l l p r o c e d u r e s w e r e c a r r i e d o u t o n i c e . W h e n D C C D i n h i b i t i o n o f t h e A T P a s e w a s t e s t e d , t h e r e a c t i o n w a s c a r r i e d o u t a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d t e r m i n a t e d w i t h m e r s a l y l ( 6 7 n m o l / m g p r o t e i n ) . ‘ O l i g o m y c i n A i n h i b i t i o n o f A T P a s e a c t i v i t y w a s m e a s u r e d b y a d d i n g o l i g o m y c i n ( 0 . 3 3 u g / m g p r o t e i n ) b e f o r e A T P w a s a d d e d t o t h e m i t o c h o n d r i a l m i x t u r e . A l l o t h e r e f f e c t o r s w e r e a d d e d p r i o r t o C C C P . 3 . 2 . 6 D e t e r m i n a t i o n o f P r o t e i n C o n c e n t r a t i o n M i t o c h o n d r i a l p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n w a s m e a s u r e d b y t h e b i c i n c h o n i n i c a c i d ( B C A ) m e t h o d ( S m i t h e t a l . , 1 9 8 5 ) u s i n g r e a g e n t s p u r c h a s e d f r o m P i e r c e C h e m i c a l C o m p a n y . B o v i n e s e r u m a l b u m i n ( B S A , F r a c t i o n V ) w a s u s e d a s a s t a n d a r d . 3 . 3 R e s u l t s 3 . 3 . 1 D i f f e r e n c e s i n s t e r o l c o n c e n t r a t i o n s b e t w e e n N a n d T m i t o c h o n d r i a T o e x a m i n e t h e r e p r o d u c i b i l i t y o f r e p o r t e d d i f f e r e n c e s i n s t e r o l c o n t e n t o f N a n d T m i t o c h o n d r i a , w e r e p e a t e d t h e e x p e r i m e n t s o f G r e g o r y e t a l . ( 1 9 7 7 ) u s i n g R C R b u f f e r i n s t e a d o f K C l b u f f e r s i n c e t h e f o r m e r s e e m e d t o b e t t e r m a i n t a i n t h e m i t o c h o n d r i a ’ s s t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l i n t e g r i t y . V a r i o u s p a r a m e t e r s o f t h e m i t o c h o n d r i a w e r e m e a s u r e d a s a f u n c t i o n o f c o n c e n t r a t i o n o f d i g i t o n i n , a s t e r o l - s p e c i fi c d e t e r g e n t . W h i l e G r e g o r y t e s t e d o n l y t h e i n t e g r i t y o f t h e i n n e r m e m b r a n e ( r e s p i r a t i o n o f m a l a t e o r s u c c i n a t e ) , w e t e s t e d p a r a m e t e r s r e l a t e d t o t h e p e r m e a b i l i t y o f b o t h t h e i n n e r a n d o u t e r 4 7 m e m b r a n e s s o t h a t t h e l o c a t i o n s o f a n y s t e r o l d i f f e r e n c e s c o u l d b e d e t e r m i n e d . I n n e r m e m b r a n e i n t a c t n e s s w a s j u d g e d b y t h e R C R v a l u e s w i t h g l u t a m a t e / m a l a t e a n d s u c c i n a t e , w h i l e o u t e r m e m b r a n e i n t e g r i t y w a s j u d g e d b y t h e o x i d a t i o n o f e x o g e n o u s l y s u p p l i e d c y t o c h r o m e c . ( F i g u r e 3 . 3 ) T h e d i g i t o n i n c o n c e n t r a t i o n r e q u i r e d t o m a x i m a l l y d i s r u p t t h e o u t e r m e m b r a n e a f t e r fi v e m i n u t e s w a s a t m o s t 1 0 — 2 0 % l o w e r i n T c o m p a r e d t o N m i t o - c h o n d r i a . ( F i g u r e 3 . 4 ) T h e r e w a s a 1 0 — 3 0 % d i f f e r e n c e i n d e t e r i o r a t i o n o f t h e R C R v a l u e s w i t h g l u t a m a t e / m a l a t e o r s u c c i n a t e b e t w e e n N a n d T , b u t t h i s w a s p r o b a b l y n o t s i g n i fi c a n t i n v i e w o f t h e d i f f e r e n c e s i n s e n s i t i v i t y o b s e r v e d b e t w e e n d i f f e r e n t p r e p a r a t i o n s . ( F i g u r e 3 . 5 ) G r e g o r y s a w a g r e a t e r d i f f e r e n c e b e t w e e n N a n d T i n c u b a t i n g h i s m i t o c h o n d r i a w i t h d i g i t o n i n f o r t e n m i n u t e s , w h i l e w e u s e d o n l y fi v e m i n u t e i n c u b a t i o n s . T e n m i n u t e i n c u b a t i o n s , w h e n a s s a y e d i n R C R b u f f e r , s h o w n o g r e a t e r d i f f e r e n c e i n d i g i t o n i n s e n s i t i v i t y t h a n fi v e m i n u t e i n c u b a t i o n s , a n d l o n g e r i n c u b a t i o n s i n t e r f e r e w i t h t h e o u t e r m e m b r a n e i n t a c t n e s s t e s t . I t m a y b e t h a t t h e d i f f e r e n c e i n s e n s i t i v i t y o f N a n d T m i t o c h o n d r i a t o d i g i t o n i n i s d u e t o a d i f f e r e n t i a l s e n s i t i v i t y t o t h e h i g h K C l b u f f e r u s e d b y G r e g o r y , l e a d i n g t o a d i f f e r e n t i a l i n t e r a c t i o n w i t h t h e d i g i t o n i n t h a t i s n o t d i r e c t l y r e l a t e d t o a s t e r o l d i f f e r e n c e . K C l b u f f e r c o n s i s t e n t l y p r o d u c e s l o w e r R C R v a l u e s i n c o n t r o l m i t o c h o n d r i a t h a n t h o s e o b s e r v e d w i t h t h e R C R ( s u c r o s e ) b u f f e r ( F i g u r e 3 . 6 ) , b u t n o d i f f e r e n c e i n p a s s i v e s w e l l i n g i n t h e K C l b u f f e r ( F i g u r e 3 . 7 ) w a s o b s e r v e d b e t w e e n N a n d T m i t o c h o n d r i a . ( T a b l e 3 . 1 ) T h i s a r g u e s a g a i n s t a d i f f e r e n c e i n s e n s i t i v i t y t o K C l b e t w e e n N a n d T . U s i n g a s i m p l i fi e d a s s a y w h i c h m e a s u r e s o n l y t h e o u t e r m e m b r a n e i n t a c t n e s s i n R C R b u f f e r , N m i t o c h o n d r i a a p p e a r e d m o r e s e n s i t i v e t o d i g i t o n i n t h a n T m i t o c h o n d r i a ( F i g u r e 3 . 8 ) , s u g g e s t i n g t h a t a n y d i f f e r e n c e s o b s e r v e d i n d i g i t o n i n s e n s i t i v i t y a s s a y s a r e d u e t o v a r i a t i o n s b e t w e e n m i t o c h o n d r i a p r e p a r a t i o n s . T h e s i m p l i fi e d a s s a y i s p r o b a b l y a m o r e 1 . 0 I I I l I I I l I I I 1 I e g a k a e l c e m o r h I I I fi I ' I T I ' c I " o t y c % 4 8 0 . 8 0 . 6 J I _ I I I 4 I I I J J l j I I 0 . * 0 0 . 0 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 m g d i g i t o n i n l m g p r o t e i n F i g u r e 3 . 4 : C o m p a r i s o n o f d i g i t o n i n s e n s i t i v i t y o f t w o N a n d T m i t o c h o n d r i a p r e p a r a t i o n s e a c h a s m e a s u r e d b y t h e c y t o c h r o m e c l e a k a g e t e s t f o r i n t a c t n e s s o f o u t e r m e m b r a n e s . T h e a s s a y i s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 3 . 2 . 3 a n d i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 3 . 3 . D a s h e d l i n e s a n d o p e n s y m b o l s r e p r e s e n t T m i t o c h o n d r i a , a n d s o l i d l i n e s a n d s o l i d s y m b o l s r e p r e s e n t N m i t o c h o n d r i a . 4 9 F i g u r e 3 . 5 : C o m p a r i s o n o f d i g i t o n i n s e n s i t i v i t y o f N a n d T m i t o c h o n d r i a a s m e a s u r e d b y r e s p i r a t o r y c o n t r o l r a t i o s . T h e a s s a y i s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 3 . 2 . 3 a n d i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 3 . 3 . R C R ’ s w e r e m e a s u r e d u s i n g g l u t a m a t e / m a l a t e ( A ) a n d s u c c i n a t e ( B ) a s s u b s t r a t e . E a c h c u r v e r e p r e s e n t s a s e p a r a t e m i t o c h o n d r i a l A - p r e p a r a t i o n . D a s h e d l i n e s a n d o p e n s y m b o l s r e p r e s e n t T m i t o c h o n d r i a , a n d s o l i d l i n e s a n d s o l i d s y m b o l s r e p r e s e n t N m i t o c h o n d r i a . R C R e t a l a m / e t a m a t u l g R C R e t a n i c c u s 5 0 3 ? 1 I I 4 I I I j I I . - ' ° o . o 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 m g d i g i t o n i n I m g p r o t e i n 5 . 0 . : I j i 1 u i u i fi l l l u 4 . 0 . . 3 . 0 2 . 0 1 . 0 I I I I I _ I I I . . . _ . 0 . 0 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 m g d i g i t o n i n / m g p r o t e i n F i g u r e 3 . 5 5 1 F i g u r e 3 . 6 : C o m p a r i s o n o f R C R v a l u e s o f T m i t o c h o n d r i a m e a s u r e d i n K C l o r s u c r o s e b u f f e r s . T h e s a m e m i t o c h o n d r i a l p r e p a r a t i o n w a s u s e d f o r t h e t w o m e a s u r e m e n t s . G l u t a m a t e / m a l a t e ( 2 5 m o l ) w a s a d d e d t o a m i t o c h o n d r i a l s u s p e n s i o n ( 0 . 3 m g ) i n t h e i n d i c a t e d b u f f e r a t 2 3 ° C . A D P ( 0 . 2 n m o l ) w a s a d d e d a s i n d i c a t e d t o i n d u c e c o u p l e d r e s p i r a t i o n . U p p e r t r a c e : S u c r o s e . . . _ b u f f e r c o n t a i n i n g 0 . 2 5 M s u c r o s e , 1 0 m M T E S , 5 m M K H z P O 4 , 5 m M M g C 1 2 , 1 m M E G T A , 0 . 1 % B S A , p H 7 . 2 . L o w e r t r a c e : K C l b u f f e r c o n t a i n i n g 0 . 4 M K 0 1 , 4 0 m M H E P E S , 8 m M K H 2 P O 4 , 0 . 2 % B S A , p H 7 . 4 . a : fi o n m o m m a c . L 2 u 3 . 3 5 3 : L c i a n m 8 o m M 5 2 m a c 0 I O U - 1 U 9 H F i g u r e 3 . 6 F i g u r e 3 . 7 : P a s s i v e s w e l l i n g o f T m a i z e m i t o c h o n d r i a i n a K C l b u f f e r . S w e l l i n g i s m e a s u r e d a s a c h a n g e i n a b s o r b a n c e a t 5 2 0 r u n o v e r 2 0 m i n u t e s . M i t o c h o n d r i a ( fi n a l c o n c e n t r a t i o n 0 . 1 m g / m L ) w e r e a d d e d a t t i m e = 0 m i n . t o a b u f f e r c o n t a i n i n g 0 . 4 M K C l , 4 0 m M H E P E S , 8 m M K I - 1 2 P 0 4 , 0 . 2 % B S A , p H 7 . 4 a t 2 3 ° C . 0 2 5 1 . n i 0 m 1 , e m i t 0 2 . 0 5 4 w u o z g ‘ e o u e q l o s q v F i g u r e 3 . 7 5 5 T a b l e 3 . 1 : C o m p a r i s o n o f p a s s i v e s w e l l i n g o f N a n d T m a i z e m i t o c h o n d r i a i n a K C l b u f f e r . M i t o c h o n d r i a ( fi n a l c o n c e n t r a t i o n 0 . 1 m g p r o t e i n / m L ) w e r e a d d e d a t t i m e = 0 a n d p e r c e n t a g e o f t h e i n i t i a l a b s o r b a n c e a t 5 2 0 n m w a s m e a s u r e d a f t e r 6 m i n u t e s a n d 1 0 m i n u t e s . s d = s t a n d a r d d e v i a t i o n . % c h a n g e i n a b s o r b a n c e , 5 2 0 n m 6 m i n . 1 0 m i n . N 2 4 . 5 ( s d = 0 . 8 , n = 3 ) 3 0 . 6 ( s d = 0 . 7 , n = 3 ) T 2 4 . 7 ( s d = 0 . 4 , n = 5 ) 3 0 . 0 ( s d = 0 . 6 , n = 4 ) e g a k a e l c e m o r h c o t y c % 1 . 0 0 . 0 ‘ F i g u r e 3 . 8 : 0 . 8 0 . 6 0 . 4 l 0 . 2 5 6 0 . 0 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 1 . 0 m g d i g i t o n i n / m g p r o t e i n C o m p a r i s o n o f d i g i t o n i n s e n s i t i v i t y o f N ( I ) a n d T ( D ) m i t o c h o n d r i a a s m e a s u r e d b y t h e s i m p l i fi e d c y t o c h r o m e c l e a k a g e t e s t f o r i n t a c t n e s s o f o u t e r m e m b r a n e s . T h e a s s a y i s d e s c r i b e d a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 3 . 2 . 2 a n d i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 3 . 2 . E a c h c u r v e i s f r o m o n e m i t o c h o n d r i a l p r e p a r a t i o n . 5 7 r e l i a b l e m e a s u r e o f d e t e r m i n i n g o u t e r m e m b r a n e i n t a c t n e s s b e c a u s e m i t o - c h o n d r i a s p e n d l e s s t i m e i n t h e d i l u t e d s t a t e b e f o r e t h e a s s a y i s p e r f o r m e d . 3 . 3 . 2 C h a r a c t e r i z a t i o n o f N a n d T m i t o c h o n d r i a B e c a u s e o f t h e v a r i e t y o f c o n fl i c t i n g r e s u l t s i n t h e l i t e r a t u r e r e g a r d i n g t h e c o m p a r a t i v e r e s p i r a t o r y p a r a m e t e r s o f t h e N a n d T m i t o c h o n d r i a , a n d t h e i r d i f f e r e n t i a l s e n s i t i v i t y t o t o x i n , s o m e o f t h e s e p r o p e r t i e s w e r e r e - e x a m i n e d . 3 . 3 . 2 . 1 R e s p i r a t i o n i n N a n d T m i t o c h o n d r i a B o t h N a n d T m i t o c h o n d r i a e x h i b i t g o o d r e s p i r a t o r y c o n t r o l w i t h g l u t a m a t e / m a l a t e i n t h e R C R b u f f e r ( d e s c r i b e d i n s e c t i o n 3 . 2 . 2 ) w i t h a v e r a g e R C R v a l u e s o f 5 — 7 a n d A D P / O r a t i o s o f 2 . 7 — 2 . 9 . ( F i g u r e 3 . 1 ) U s i n g t h e K C l b u f f e r ( d e s c r i b e d i n s e c t i o n 3 . 2 . 2 ) t h e R C R v a l u e s a r e m u c h l o w e r . ( F i g u r e 3 . 6 ) I t s h o u l d b e n o t e d t h a t m o s t o f t h e R C R v a l u e s r e p o r t e d i n t h e l i t e r a t u r e a r e c o n s i d e r a b l y l o w e r t h a n t h o s e r e p o r t e d h e r e . N 0 s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e s i n R C R v a l u e s o r A D P / O r a t i o s a r e f o u n d u n d e r o u r a s s a y c o n d i t i o n s b e t w e e n N a n d T m i t o c h o n d r i a . B o t h N a n d T m i t o c h o n d r i a a r e 9 5 % i n t a c t a s d e t e r m i n e d b y t h e c y t o c h r o m e c l e a k a g e t e s t ( F i g u r e 3 . 2 ) . 3 . 3 . 2 . 2 M e t h o m y l a n d t o x i n - i n d u c e d s w e l l i n g o f i s o l a t e d m a i z e m i t o c h o n d r i a U s i n g a s s u b s t r a t e s b o t h g l u t a m a t e / m a l a t e ( F i g u r e 3 . 9 ) a n d s u c c i n a t e ( F i g u r e 3 . 1 0 ) , w h i c h f e e d i n t o t h e e l e c t r o n t r a n s p o r t c h a i n a t C o m p l e x I a n d I I r e s p e c t i v e l y , t o x i n a n d m e t h o m y l w e r e s h o w n t o s w e l l T m i t o c h o n d r i a a s m e a s u r e d b y a d e c r e a s e i n a b s o r b a n c e a t 5 2 0 n m . T h i s s w e l l i n g i s n o t d u e s i m p l y t o t h e t o x i n a n d m e t h o m y l - i n d u c e d c o l l a p s e o f t h e p r o t o n g r a d i e n t s i n c e p r i o r a d d i t i o n o f C C C P , w h i c h d i s s i p a t e s t h e g r a d i e n t a n d t h e r e b y u n c o u p l e s r e s p i r a t i o n , d o e s n o t a f f e c t t h e e x t e n t o f s w e l l i n g . A d d i t i o n o f ‘ " l l 5 8 F i g u r e 3 . 9 : E f f e c t o f t o x i n ( A ) a n d m e t h o m y l ( B ) o n t h e s w e l l i n g o f T a n d N m a i z e m i t o c h o n d r i a u s i n g g l u t a m a t e / m a l a t e a s s u b s t r a t e . A d e c r e a s e i n a b s o r b a n c e ( 5 2 0 n m ) o f a m i t o c h o n d r i a l s u s p e n s i o n i s c o r r e l a t e d w i t h s w e l l i n g o f t h e m i t o c h o n d r i a . G l u t a m a t e / m a l a t e ( 1 0 m o l ) a n d C C C P ( 0 . 5 n m o l ) w e r e a d d e d a s i n d i c a t e d t o a m i t o c h o n d r i a l s u s p e n s i o n ( 0 . 0 9 m g p r o t e i n ) i n R C R b u f f e r a t 2 3 ° C . M e t h o m y l ( 2 n m o l ) o r t o x i n ( 1 u L ) w a s a d d e d a s i n d i c a t e d . l y m o h t e m 0 2 5 1 . n i m 0 1 , e m i t o f T a n t i . b s t r a t e . i s u s p e n i i i o c h o n d t i a . m fl w fi p r o t e i n } i i ( 1 + 1 W 5 9 A O Z S V V % 8 t F i g u r e 3 . 9 6 0 F i g u r e 3 . 1 0 : E f f e c t o f t o x i n ( A ) a n d m e t h o m y l ( B ) o n t h e s w e l l i n g o f T a n d N m a i z e m i t o c h o n d r i a u s i n g s u c c i n a t e a s s u b s t r a t e . A d e c r e a s e i n a b s o r b a n c e ( 5 2 0 n m ) o f a m i t o c h o n d r i a l s u s p e n s i o n i s c o r r e l a t e d w i t h s w e l l i n g o f t h e m i t o c h o n d r i a . S u c c i n a t e ( 1 0 m o l ) a n d C C C P ( 0 . 5 n m o l ) w e r e a d d e d a s i n d i c a t e d t o a m i t o c h o n d r i a l s u s p e n s i o n ( 0 . 0 9 m g p r o t e i n ) i n R C R b u f f e r a t 2 3 ° C . M e t h o m y l ( 2 n m o l ) o r t o x i n ( 1 u L ) w a s a d d e d a s i n d i c a t e d . 0 2 l y 5 m o h t e m 1 . n i m 0 1 , e m i t 6 1 / ‘ F i g u r e 3 . 1 0 6 2 C C C P a f t e r t o x i n o r m e t h o m y l h a s n o e fi ' e c t , s h o w i n g t h a t t h e p r o t o n g r a d i e n t h a s b e e n c o l l a p s e d . N e i t h e r t o x i n n o r m e t h o m y l h a s a n y e f f e c t o n N m i t o c h o n d r i a u s i n g e i t h e r s u b s t r a t e . 3 . 3 . 3 E f f e c t s o f i n h i b i t o r s o n t o x i n a n d m e t h o m y l - i n d u c e d s w e l l i n g R e p o r t s t h a t D C C D a n d k a e m p f e r o l , b o t h A T P s y n t h a s e i n h i b i t o r s , b l o c k e d s o m e e f f e c t s o f t h e t o x i n s u g g e s t e d t h a t t h e A T P s y n t h a s e m i g h t b e i n v o l v e d i n t o x i n b i n d i n g o r a c t i o n . W e h a v e a t t e m p t e d t o e x t e n d t h e s e p r e v i o u s s t u d i e s b y t e s t i n g t h e a b i l i t y o f t h e s e a n d o t h e r A T P s y n t h a s e i n h i b i t o r s t o i n t e r f e r e w i t h t o x i n - i n d u c e d s w e l l i n g , a n e a s i l y q u a n t i fi a b l e e f f e c t t h a t i s u n i q u e t o T m i t o c h o n d r i a . 3 . 3 . 3 . 1 E f f e c t o f D C C D D C C D c o v a l e n t l y l a b e l s m a n y m e m b r a n e p r o t e i n s o f t h e m i t o c h o n d r i a , i n c l u d i n g s i t e s o n F 0 a n d F 1 o f t h e A T P s y n t h a s e , a n d h a s b e e n s h o w n t o b l o c k t h e t o x i n - i n d u c e d c o l l a p s e o f t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l i n T m i t o c h o n d r i a . W e h a v e s h o w n t h a t i n c u b a t i o n o f T m i t o c h o n d r i a w i t h D C C D i n R C R b u f f e r r e d u c e d m e t h o m y l - i n d u c e d s w e l l i n g u s i n g b o t h s u c c i n a t e ( F i g u r e 3 . 1 1 ) a n d g l u t a m a t e / m a l a t e ( F i g u r e 3 . 1 2 ) a s s u b s t r a t e s . T h i s e f f e c t w a s o p t i m a l a t a p p r o r d m a t e l y 2 5 0 n m o l D C C D / m g m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n i n c u b a t e d f o r t w e l v e m i n u t e s ( t h e t i m e r e q u i r e d t o p e r f o r m t h e a s s a y ) . A t h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f D C C D , a v a r i e t y o f i n h i b i t o r y a n d u n c o u p l i n g e f f e c t s o c c u r , a s i n d i c a t e d b y t h e l a c k o f r e s p o n s e t o t h e u n c o u p l e r C C C P ( F i g u r e 3 . 1 1 D , F i g u r e 3 . 1 2 D ) . 3 . 3 . 3 . 2 E fi ‘ e c t o f q u e r c e t i n B e c a u s e q u e r c e t i n , w h i c h i n h i b i t s t h e A T P s y n t h a s e b y b i n d i n g t o F 1 , i s s t r u c t u r a l l y s i m i l a r t o k a e m p f e r o l , w e t e s t e d i t s a b i l i t y t o b l o c k m e t h o m y l - i n d u c e d s w e l l i n g . I n h i b i t i o n o f m e t h o m y l - i n d u c e d s w e l l i n g o f T m i t o c h o n d r i a 6 3 L , 4 : 5 F i g u r e 3 . 1 1 : E f f e c t o f D C C D o n m e t h o m y l - i n d u c e d s w e l l i n g o f T m a i z e m i t o c h o n d r i a u s i n g s u c c i n a t e a s s u b s t r a t e . D C C D w a s a d d e d a t t i m e = 0 t o a m i t o c h o n d r i a l s u s p e n s i o n ( 0 . 0 9 m g p r o t e i n ) i n R C R b u f f e r a t 2 3 ° C . S u c c i n a t e ( 0 . 1 n m o l ) , C C C P ( 0 . 5 n m o l ) , a n d m e t h o m y l ( 2 n m o l ) w e r e a d d e d a s i n d i c a t e d . A . 5 u L M e O H , n o D C C D . B . 1 4 9 . 7 n m o l D C C D / m g m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n . C . 4 4 9 . 1 n m o l D C C D / m g p r o t e i n . D . 5 9 8 . 8 n m o l D C C D / m g p r o t e i n . l y m o h t e m 0 2 5 1 . n i m 0 1 , e m i t T m i t t l S a d d e . ‘ o r e i n l i 3 P { 0 . 5 A . 5 i i o n d ' i i I . 8 m i d ' o s t V ‘ V o S I - F i g u r e 3 . 1 1 6 5 F i g u r e 3 . 1 2 : E f f e c t o f D C C D o n m e t h o m y l - i n d u c e d s w e l l i n g o f T m a i z e m i t o c h o n d r i a u s i n g g l u t a m a t e / m a l a t e a s s u b s t r a t e . D C C D w a s a d d e d a t t i m e = 0 t o a m i t o c h o n d r i a l s u s p e n s i o n ( 0 . 0 9 m g p r o t e i n ) i n R C R b u f f e r a t 2 3 ° C . G l u t a m a t e / m a l a t e ( 0 . 1 n m o l ) . C C C P ( 0 . 5 n m o l ) , a n d m e t h o m y l ( 2 n m o l ) w e r e a d d e d a s i n d i c a t e d . A . 5 u L M e O H , n o D C C D . B . 1 0 6 . 9 n m o l D C C D / m g m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n . C . 2 1 3 . 9 n m o l D C C D / m g p r o t e i n . D . 3 2 0 . 8 n m o l D C C D / m g p r o t e i n . 0 2 5 1 . n i m 0 1 , e m i t C C D r t [ 0 . 0 9 I f » ? , 1 p i n t . d d e d 8 5 C C D i i i i p r o t e i n 6 6 3 8 § \ / 7 E n / o o 0 T o g » ' 5 , — - — > " ' K 0 3 9 V V % 8 L F i g u r e 3 . 1 2 6 7 b y q u e r c e t i n w a s o b s e r v e d w h e n s u c c i n a t e w a s u s e d a s a s u b s t r a t e ( F i g u r e 3 . 1 3 ) . A d d i t i o n o f m o r e m e t h o m y l w a s a b l e t o e l i c i t a w e a k s w e l l i n g r e s p o n s e w h i l e t h e q u e r c e t i n c o n c e n t r a t i o n w a s u n c h a n g e d ( F i g u r e 3 . 1 3 C ) . 3 . 3 . 3 . 3 E f f e c t o f o l i g o m y c i n a n d d i e t h y l s t i l b e s t r o l O l i g o m y c i n A , a n i n h i b i t o r o f t h e A T P s y n t h a s e w h i c h b i n d s t o t h e F 0 c h a n n e l , h a d n o e f f e c t o n t h e t o x i n o r m e t h o m y l - i n d u c e d s w e l l i n g o f T m i t o c h o n d r i a a t a c o n c e n t r a t i o n ( 0 . 5 p i g / m g p r o t e i n ) w h i c h b l o c k e d A D P - s t i m u l a t e d r e s p i r a t i o n ( F i g u r e 3 . 1 4 B ) . A d d i t i o n o f h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f o l i g o m y c i n h a d n o e f f e c t . D i e t h y l s t i l b e s t r o l ( D E S ) , r e c e n t l y s h o w n t o b e a n A T P s y n t h a s e i n h i b i t o r ( M c E n e r y a n d P e d e r s e n , 1 9 8 6 ) , a l s o h a d n o e f f e c t o n m e t h o m y l - i n d u c e d s w e l l i n g i n T m i t o c h o n d r i a ( F i g u r e 3 . 1 4 E ) . 3 . 3 . 3 . 4 E f f e c t o f c a r b o x y a t r a c t y l o s i d e a n d m e r s a l y l S i n c e t h e p r o c e s s e s o f A D P / A T P t r a n s l o c a t i o n a n d P i t r a n s p o r t a r e c l o s e l y l i n k e d t o A T P s y n t h e s i s , i n h i b i t o r s o f t h e s e p r o c e s s e s w e r e a l s o t e s t e d f o r t h e i r a b i l i t y t o i n t e r f e r e w i t h t o x i n a n d m e t h o m y l - i n d u c e d s w e l l i n g i n T m i t o c h o n d r i a . C a r b o x y a t r a c t y l o s i d e , a c o m p e t i t i v e i n h i b i t o r o f t h e A D P / A T P t r a n s l o c a s e , w a s u n a b l e t o b l o c k t o x i n - i n d u c e d m i t o c h o n d r i a l s w e l l i n g a t a c o n c e n t r a t i o n ( 0 . 3 n m o l / m g p r o t e i n ) w h i c h e f f e c t i v e l y b l o c k s A D P - s t i m u l a t e d r e s p i r a t i o n ( F i g u r e 3 . 1 4 D ) . M e r s a l y l , a n i n h i b i t o r o f p h o s p h a t e t r a n s p o r t a n d a d e n i n e n u c l e o t i d e a c c u m u l a t i o n i n m i t o c h o n d r i a ( A b o u - K a h l i l a n d H a n s o n , 1 9 7 7 ) , i n c r e a s e d t h e s w e l l i n g n o r m a l l y i n d u c e d b y t o x i n a n d m e t h o m y l a s m u c h a s t w o - f o l d ( F i g u r e 3 . 1 5 ) a t a c o n c e n t r a t i o n ( 0 . 6 n m o l / m g p r o t e i n ) w h i c h b l o c k e d A D P - s t i m u l a t e d r e s p i r a t i o n . 3 . 3 . 4 A T P a s e a c t i v i t y i n N a n d T m i t o c h o n d r i a S i n c e s e v e r a l l i n e s o f e v i d e n c e h a v e s u g g e s t e d t h a t s o m e a b e r r a t i o n i n t h e A T P s y n t h a s e c o m p l e x c o u l d b e r e l a t e d t o b o t h t o x i n s u s c e p t i b i l i t y 6 8 L n : 1 , F i g u r e 3 . 1 3 : E f f e c t o f q u e r c e t i n o n t h e m e t h o m y l - i n d u c e d s w e l l i n g o f T " ‘ " " m a i z e m i t o c h o n d r i a . A d e c r e a s e i n a b s o r b a n c e ( 5 2 0 n m ) o f t h e m i t o c h o n d r i a l s u s p e n s i o n i s c o r r e l a t e d w i t h s w e l l i n g o f t h e m i t o c h o n d r i a . S u c c i n a t e ( 1 0 n m o l ) w a s a d d e d t o t h e m i t o c h o n d r i a l s u s p e n s i o n ( 0 . 0 9 m g p r o t e i n ) i n R C R b u f f e r a t 2 3 ° C a s i n d i c a t e d . A . D M S O o n l y , 2 n m o l m e t h o m y l . B . 0 . 1 n m o l q u e r c e t i n , 2 n m o l m e t h o m y l a d d e d t w i c e . C . 0 . 1 n m o l q u e r c e t i n , 4 n m o l m e t h o m y l . D . 0 . 2 n m o l q u e r c e t i n , 2 n m o l m e t h o m y l a d d e d t w i c e . 5 1 . n i 0 m 1 , e m i t O S M D F i g u r e 3 . 1 3 2 “ m a i l _ 1 p i n t } t o L t i n fi e r i B 0 i n g o f i n ' o f t t z g o f t t i _ _ , 0 0 : 9 V V % 8 I - 6 9 i i / 0 ] 0 7 0 F i g u r e 3 . 1 4 : E f f e c t s o f v a r i o u s A T P s y n t h a s e i n h i b i t o r s o n t h e t o x i n o r m e t h o m y l - i n d u c e d s w e l l i n g o f T m a i z e m i t o c h o n d r i a . G l u t a m a t e / m a l a t e ( 1 0 n m o l ) o r s u c c i n a t e ( 1 0 n m o l ) , i n h i b i t o r s , a n d t o x i n ( 1 3 1 L ) o r m e t h o m y l ( 2 n m o l ) w e r e a d d e d a s i n d i c a t e d . t o a m i t o c h o n d r i a l s u s p e n s i o n ( 0 . 0 9 m g p r o t e i n ) i n R C R b u f f e r a t 2 3 ° C . A . T o x i n o n l y B . O l i g o m y c i n A ( 0 . 2 8 u g / m g p r o t e i n ) C . M e t h o m y l o n l y D . C a r b o x y a t r a c t y l o s i d e ( 1 0 n m o l ) E . D i e t h y l s t i l b e s t r o l ( D E S , 2 0 n m o l ) 5 . E l y m o h t n e l x o t E a u \ l x m " " 4 1 8 a ) 4 < m 0 - V V — % 8 > | - 0 3 9 h e t o x i n i ‘ : o c h o n d i i , i n h i b i t s . l s i n d i c a ‘ r i R C R b u i e o r W 3 n m o l ) 5 ' 7 1 F i g u r e 3 . 1 4 7 2 i g n i t i n g } ; \ c . u - ‘ F i g u r e 3 . 1 5 : E f f e c t o f m e r s a l y l o n t h e t o x i n a n d m e t h o m y l - i n d u c e d s w e l l i n g ) o f T m a i z e m i t o c h o n d r i a . S u c c i n a t e ( 0 . 1 n m o l ) , C C C P ( 0 . 5 n m o l ) a n d m e r s a l y l ( 2 0 n m o l ) w e r e a d d e d a s i n d i c a t e d t o a m i t o c h o n d r i a l s u s p e n s i o n ( 0 . 0 9 m g p r o t e i n ) i n R C R b u fl ‘ e r a t 2 3 ° C . A . t o x i n ( 1 u L ) B . m e t h o m y l ( 2 n m o l ) d u c I ) , e C n d i c d C a C t e l i i ; l s w P e d W R C R b u fi e r a i 0 2 l y m o h t e m I 5 1 - r 7 . n i m 0 1 , e m i t \ P C C C i ¢ V V 1 % c z 0 8 9 W F i g u r e 3 . 1 5 7 3 7 4 a n d m a l e s t e r i l i t y , a m o r e d i r e c t a s s a y o f A T P s y n t h a s e a c t i v i t y w a s a t t e m p t e d b y t e s t i n g A T P h y d r o l y s i s ( A T P a s e a c t i v i t y ) . 3 . 3 . 4 . 1 A c t i v i t y o f t h e N a n d T A T P a s e A s t r u c t u r a l a l t e r a t i o n i n t h e T A T P s y n t h a s e , p e r h a p s d u e t o i t s a s s o c i a t i o n w i t h t h e 1 3 k D a p e p t i d e , m a y b e e x p e c t e d t o a f f e c t i t s a c t i v i t y i n h y d r o l y z i n g A T P ; t h e r e f o r e , m a x i m a l a c t i v i t y o f N a n d T A T P a s e w a s t e s t e d t o d e t e r m i n e i f a d i f f e r e n c e e x i s t e d . I n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f A T P ( u p t o 6 . 7 n m o l / m g p r o t e i n ) w e r e a d d e d t o N a n d T m i t o c h o n d r i a t o r e a c h a m a x i m a l A T P h y d r o l y s i s v e l o c i t y . T o t a l i n o r g a n i c p h o s p h a t e l i b e r a t e d i n t h e i n c u b a t i o n p e r i o d w a s c a l c u l a t e d a n d c o r r e c t e d f o r s m a l l d i f f e r e n c e s i n p r o - t e i n c o n c e n t r a t i o n . F o u r r e p l i c a t e s ( e a c h f r o m s e p a r a t e m i t o c h o n d r i a l p r e p a - r a t i o n s ) o f e a c h N a n d T w e r e p e r f o r m e d ( F i g u r e 3 . 1 6 ) , a n d t h e d a t a a n a l y z e d u s i n g W i l m a n 4 , a c o m p u t e r p r o g r a m w h i c h u s e s a w e i g h t e d l i n e a r r e g r e s s i o n t o c a l c u l a t e K m a n d V m a , x v a l u e s . T h e N a n d T a v e r a g e s w e r e s h o w n t o b e s i g n i fi c a n t l y d i f f e r e n t u s i n g t h e S t u d e n t t - t e s t a t t h e 9 5 % c o n fi d e n c e l e v e l ( T a b l e 3 . 2 ) . A d i f f e r e n c e o f 2 4 % i n m a x i m a l a c t i v i t y i s i n d i c a t e d . W h e n t h e a s s a y w a s p e r f o r m e d a t r o o m t e m p e r a t u r e , 1 . 3 n m o l P i / m g p r o t e i n / 1 0 m i n u t e s w a s r e l e a s e d b y N m i t o c h o n d r i a , a v a l u e c o m p a r a b l e t o t h o s e o b t a i n e d i n s i m i l a r s t u d i e s ( J u n g a n d H a n s o n , 1 9 7 3 , 1 9 7 5 ) . T h e K m v a l u e s f o r A T P d i d n o t d i f f e r s i g n i fi c a n t l y ( T a b l e 3 . 2 ) , a n d w e r e s i m i l a r t o v a l u e s p r e v i o u s l y r e p o r t e d ( J u n g a n d H a n s o n , 1 9 7 3 ) f o r c a u l i fl o w e r m i t o c h o n d r i a . 3 . 3 . 4 . 2 E fi ' e c t o f D C C D o n A T P a s e a c t i v i t y T o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e A T P s y n t h a s e b i n d s D C C D a t a c o n c e n t r a t i o n s i m i l a r t o t h a t w h i c h i n h i b i t s m e t h o m y l - i n d u c e d s w e l l i n g i n T m i t o c h o n d r i a , w e t e s t e d t h e a b i l i t y o f D C C D t o i n h i b i t a c t i v i t y o f t h e A T P a s e ( F i g u r e 3 . 1 7 ) . T h e c o n c e n t r a t i o n p r o d u c i n g m a x i m a l i n h i b i t i o n w a s 3 5 n m o l D C C D / m g p r o t e i n f o r t e n m i n u t e s . T h i s i s s o m e w h a t l o w e r t h a n t h e 7 5 1 . 5 - I - 1 r l ' l ' . é E O E 1 . 0 . E . 2 O L - a . i s ” a : 0 . 5 0 3 E : 3 . 0 . 0 , 0 A T P , m M F i g u r e 3 . 1 6 : A T P a s e a c t i v i t y v s . . A T P c o n c e n t r a t i o n f o r N a n d T m a i z e m i t o c h o n d r i a . F o u r p r e p a r a t i o n s o f e a c h N a n d T m i t o c h o n d r i a w e r e a s s a y e d f o r A T P a s e a c t i v i t y a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 3 . 2 . 5 . D a s h e d l i n e s a n d o p e n s y m b o l s r e p r e s e n t T m i t o c h o n d r i a , a n d s o l i d l i n e s a n d s o l i d s y m b o l s r e p r e s e n t N m i t o c h o n d r i a . 7 6 T a b l e 3 . 2 : C o m p a r i s o n o f N a n d T m a i z e m i t o c h o n d r i a A T P a s e V m a x a n d K m v a l u e s . A T P a s e a s s a y s w e r e p e r f o r m e d o n f o u r N a n d T m i t o c h o n d r i a l p r e p a r a t i o n s a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 3 . 2 . 5 . T h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e N a n d T V m a ' , a v e r a g e s w a s s h o w n t o b e s i g n i fi c a n t u s i n g t h e S t u d e n t t - t e s t a t t h e 9 5 % c o n fi d e n c e l e v e l . V m a x K m u m o l P ; / m i n / 1 0 m i n m M A T P N T 1 . 2 8 0 . 7 8 A 1 . 4 6 0 . 3 6 1 . 2 2 1 . 2 4 0 . 7 7 ’ 1 . 3 7 1 . 2 6 1 . 0 9 1 . 5 7 1 . 1 8 1 . 5 1 0 . 8 8 0 . 9 4 1 . 3 2 a v e = 1 . 3 2 a v e = 1 . 0 0 a v e = 1 . 1 8 a v e = 1 . 0 6 s d = 0 . 1 3 s d = 0 . 2 1 s d = 0 . 3 9 s d = 0 . 4 1 I I J I I I I 7 7 1 0 0 I I I I I I I j I I I j I I 8 0 U ) . E - . 5 C U E d ) h a s o I E I ‘ 5 . a 4 0 - d ) " ' ' 1 ( I ) I I a . . I E 2 0 . . a < r - 0 ° \ 0 I I I I g l J I I I I l j I I I . 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 n m o l D C C D / m g p r o t e i n F i g u r e 3 . 1 7 : E f f e c t o f D C C D o n u n c o u p l e r - i n d u c e d A T P a s e a c t i v i t y i n T m a i z e m i t o c h o n d r i a . A T P a s e a c t i v i t y w a s m e a s u r e d a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 3 . 2 . 5 e x c e p t t h a t a s s a y s w e r e p e r f o r m e d a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d w e r e t e r m i n a t e d b y t h e a d d i t i o n o f 6 7 n m o l m e r s a l y l / m g p r o t e i n . A T P a s e a c t i v i t y n o t i n h i b i t a b l e b y m e r s a l y l ( a d d e d a t t h e b e g i n n i n g o f t h e a s s a y t o p r e v e n t u p t a k e o f A T P ) w a s s u b t r a c t e d f r o m e a c h v a l u e . T h e s e d a t a f r o m o n e m i t o c h o n d r i a l p r e p a r a t i o n a r e r e p r e s e n a t i v e o f v a l u e s o b t a i n e d f r o m m a n y e x p e r i m e n t s . 7 8 c o n c e n t r a t i o n p r o d u c i n g o p t i m a l e f f e c t s o n m e t h o m y l - i n d u c e d s w e l l i n g ( 2 5 0 n m o l / m g p r o t e i n ) ; h o w e v e r , c o n d i t i o n s w e r e s l i g h t l y d i f f e r e n t i n t h e A T P a s e a s s a y f r o m t h e s w e l l i n g a s s a y . 3 . 3 . 4 . 3 E fi ' e c t o f t o x i n a n d m e t h o m y l o n A T P a s e a c t i v i t y B e c a u s e t o x i n o r m e t h o m y l b i n d i n g t o t h e A T P s y n t h a s e c o m p l e x m i g h t b e e x p e c t e d t o a f f e c t i t s n o r m a l f u n c t i o n , m e t h o m y l a n d t o x i n w e r e t e s t e d f o r t h e i r a b i l i t y t o i n h i b i t A T P a s e a c t i v i t y . T o x i n a n d m e t h o m y l i n h i b i t e d u n c o u p l e r - i n d u c e d A T P a s e a c t i v i t y i n T m i t o c h o n d r i a b u t h a d n o e f f e c t i n N m i t o c h o n d r i a ( T a b l e 3 . 3 ) . H o w e v e r , t h e r e s u l t s o f t h e s e a s s a y s w e r e v a r i a b l e a n d w i d e r a n g e s o f e f f e c t s b y o l i g o m y c i n , t o x i n , a n d m e t h o m y l o n A T P a s e a c t i v i t y w e r e o b s e r v e d . T h e d a t a p r e s e n t e d h e r e r e p r e s e n t a s s a y s p e r f o r m e d c o n s e c u t i v e l y i n o n e w e e k o n s e p a r a t e m i t o c h o n d r i a l p r e p a r a t i o n s . 3 . 4 D i s c u s s i o n T h e w o r k o f Y o r k a n d G r e g o r y s u g g e s t e d t h a t t h e r e i s a d i f f e r e n c e i n t h e s t e r o l c o n c e n t r a t i o n o f N a n d T m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s t h a t c o u l d b e r e s p o n s i b l e f o r t h e s u s c e p t i b i l i t y o f T m i t o c h o n d r i a t o t h e B m T t o x i n . H o w e v e r , m a n y q u e s t i o n s w e r e l e f t u n a n s w e r e d b y t h e i r w o r k . N o s t a t i s t i c a l a n a l y s i s o f Y o r k ’ s N a n d T s t e r o l c o n t e n t v a l u e s w a s p e r f o r m e d . S i n c e i n n e r a n d o u t e r m e m b r a n e s w e r e n o t s e p a r a t e l y a n a l y z e d , t h e v a l u e s r e p o r t e d a r e w e i g h t e d a v e r a g e s o f t h e t w o ( a s w e l l a s m i c r o s o m a l c o n t a m i n a t i o n ) , b e i n g m o r e r e fl e c t i v e o f t h e i n n e r m e m b r a n e c o m p o s i t i o n , s i n c e t h e r e i s m o r e i n n e r t h a n o u t e r m e m b r a n e . H o w e v e r , w e h a v e b e e n a b l e t o d e m o n s t r a t e o n l y a s m a l l o r n o d i f f e r e n c e i n o u t e r m e m b r a n e s t e r o l c o n t e n t ( b y t h e d i g i t o n i n - i n d u c e d c y t o c h r o m e c l e a k a g e t e s t ) a n d i n n e r m e m b r a n e s t e r o l c o n t e n t ( b y d i g i t o n i n - i n d u c e d d e t e r i o r a t i o n o f R C R v a l u e s ) . T h e d i s c r e p a n c y b e t w e e n t h e 7 9 T A B L E 3 . 3 : I n h i b i t i o n o f A T P a s e a c t i v i t y b y o l i g o m y c i n , m e t h o m y l , a n d B m T t o x i n . A T P a s e a s s a y s w e r e p e r f o r m e d o n t h r e e m i t o c h o n d r i a l p r e p a r a t i o n s o f e a c h N a n d T a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 3 . 2 . 5 . V a l u e s r e p o r t e d a r e p e r c e n t a g e s o f i n h i b i t i o n o f t h e C C C P - i n d u c e d A T P a s e a c t i v i t y f o r e a c h m i t o c h o n d r i a l p r e p a r a t i o n b y e a c h i n h i b i t o r . P e r c e n t I n h i b i t i o n o f A T P a s e A c t i v i t y N m a i z e ~ T m a i z e ( 1 ) ( 2 ) ( 3 ) a v e . ( 1 ) ( 2 ) ( 3 ) a v e . O l i g o m y c i n 3 3 6 5 6 9 7 2 3 1 6 7 7 4 7 4 M e t h o m y l 1 6 1 7 2 6 2 o 6 2 4 2 3 1 4 5 T o x i n f o 7 g 2 7 1 a 3 2 4 4 4 9 8 0 r e s u l t s o b t a i n e d b y o u r s e l v e s a n d G r e g o r y m a y b e d u e t o t h e f a c t t h a t w e u s e d m a i z e s h o o t s w h i l e G r e g o r y u s e d m a i z e r o o t s . I t h a s b e e n s h o w n t h a t t h e l i p i d c o m p o s i t i o n o f t h e t w o t i s s u e s v a r i e s ( M a c k e n d e r a n d L e e c h , 1 9 7 4 ) ; t h e r e f o r e , s t e r o l c o m p o s i t i o n m a y a l s o v a r y . H o w e v e r , s i n c e m i t o c h o n d r i a f r o m b o t h s h o o t a n d r o o t a r e e q u a l l y s e n s i t i v e t o t h e t o x i n , i t w o u l d s e e m u n l i k e l y t h a t a n y d i f f e r e n c e s f o u n d b e t w e e n t h e t w o t i s s u e s w o u l d b e r e l e v a n t t o t o x i n s e n s i t i v i t y . ‘ A l t h o u g h t o x i n h a s b e e n s h o w n t o b i n d t o t h e 1 3 k D a p e p t i d e i n b o t h T m a i z e m i t o c h o n d r i a a n d E . c o l i e x p r e s s i n g u r f 1 3 - T ( B r a u n e t a l . , 1 9 9 0 ) , i t i s ' n o t c l e a r y e t w h e t h e r a d d i t i o n a l p r o t e i n s a r e n e c e s s a r y t o m e d i a t e t h e t o x i n e f f e c t . O t h e r p r o t e i n s m a y b e i n v o l v e d i n d i r e c t l y a s p a r t o f a c a s c a d e o f e v e n t s w h i c h l e a d s t o s w e l l i n g a n d u n c o u p l i n g u p o n t o x i n b i n d i n g t o i t s r e c e p t o r . A l t e r n a t i v e l y , t h e n o r m a l f u n c t i o n i n g o f a r e s p i r a t o r y p r o t e i n m a y b e a l t e r e d b y i t s p h y s i c a l a s s o c i a t i o n w i t h t h e 1 3 k D a p e p t i d e , c a u s i n g t h e o b s e r v e d e f f e c t s o f t h e t o x i n . C o - i m m u n o p r e c i p i t a t i o n o f t h e 1 3 k D a p e p t i d e w i t h r e s p i r a t o r y p r o t e i n s ( W i s e e t a l . , 1 9 8 7 a ; C . L e a v e r , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) s u g g e s t s t h e l a t t e r . T h e t o x i n s e n s i t i v i t y o f E . c o l i e x p r e s s i n g t h e 1 3 k D a p e p t i d e d o e s n o t r u l e o u t e i t h e r o f t h e s e p o s s i b i l i t i e s . M a n y p r o t e i n s i n m i t o c h o n d r i a a r e h i g h l y h o m o l o g o u s t o t h e i r c o u n t e r p a r t s i n b a c t e r i a ; t h e r e f o r e , t h e 1 3 k D a p e p t i d e m a y b e a s s o c i a t i n g w i t h a n E . c o l i . p r o t e i n i n a n a l o g o u s m a n n e r , l e a d i n g t o t o x i n s e n s i t i v i t y . U n t i l i t i s s h o w n t h a t t h e p u r i fi e d 1 3 k D a p e p t i d e c a n b e r e c o n s t i t u t e d i n t o a r t i fi c a l l i p i d v e s i c l e s w h i c h t h e n b e c o m e s e n s i t i v e t o t o x i n e f f e c t s , s u c h a s l e a k a g e o f c o f a c t o r s p r o - l o a d e d i n t h e v e s i c l e s , i t r e m a i n s a p o s s i b i l i t y t h a t t h e 1 3 k D a p e p t i d e s a s s o c i a t e s w i t h a m e m b r a n e p r o t e i n i m p o r t a n t f o r r e s p i r a t o r y f u n c t i o n . 8 1 W e s u g g e s t t h a t t h e A T P s y n t h a s e c o m p l e x ( o r s o m e o f i t s s u b u n i t s ) m a y b e i n v o l v e d i n t o x i n a c t i o n . T h r e e p i e c e s o f e v i d e n c e s u p p o r t t h i s h y p o t h e s i s . F i r s t , D C C D a n d q u e r c e t i n , b o t h i n h i b i t o r s o f t h e A T P s y n t h a s e , b l o c k t o x i n - i n d u c e d s w e l l i n g . A l t h o u g h D C C D h a s r e c e n t l y b e e n s h o w n t o b i n d d i r e c t l y t o t h e 1 3 k D a p e p t i d e ( B r a u n e t a l . , 1 9 8 9 ) , g i v e n t h e r e l a t i v e n o n - s p e c i fi c i t y o f D C C D ( S o l i o z , 1 9 8 4 ) , t h i s b i n d i n g s i t e m a y n o t b e t h e o n l y o n e w h i c h a f f e c t s t o x i n a c t i o n . S e c o n d , t h e V m a x o f t h e A T P a s e d i f f e r s b e t w e e n N a n d T m i t o c h o n d r i a i n t h e a b s e n c e o f t o x i n . T h i r d , w e h a v e s h o w n t h a t t o x i n a n d m e t h o m y l i n h i b i t T b u t n o t N m i t o c h o n d r i a l A T P a s e a c t i v i t y . T h e e f f e c t s o f t h e t o x i n , h o w e v e r , n e e d n o t b e d u e t o t h e A T P s y n t h a s e d i r e c t l y . I f t h e t o x i n d i r e c t l y a f f e c t e d A T P / A D P t r a n s l o c a t i o n , o r P ; o r M g 2 + t r a n s p o r t , t h e a c t i v i t y o f t h e A T P a s e w o u l d a l s o b e a f f e c t e d . H o w e v e r , i n h i b i t i o n o f t h e A D P / A T P t r a n s l o c a s e b y c a r b o x y a t r a c t y l o s i d e , a c o m p e t i t i v e i n h i b i t o r o f A D P t r a n s l o c a t i o n i n p l a n t s , d i d n o t b l o c k t o x i n - i n d u c e d s w e l l i n g , s o t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e t r a n s l o c a s e i s i n v o l v e d i s l e s s l i k e l y . I n t e r e s t i n g l y , m e r s a l y l , w h i c h b i n d s t o t h e p h o s p h a t e t r a n s p o r t e r , a c t u a l l y e n h a n c e d t h e t o x i n - i n d u c e d s w e l l i n g e f f e c t . T h e s e r e s u l t s m i g h t s u g g e s t a t o x i n o r 1 3 k D a p e p t i d e i n t e r a c t i o n w i t h t h e p h o s p h a t e t r a n s p o r t e r , b u t m e r s a l y l a l s o b i n d s t o o t h e r m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n s w h i c h h a v e a v a i l a b l e a n d r e a c t i v e s u l f h y d r y l s , i n c l u d i n g F 1 o f t h e A T P a s e . T h e r e f o r e , w e c a n n o t c o n c l u d e fi ' o m t h e a b o v e d a t a t h a t t h e p h o s p h a t e t r a n s p o r t e r i s i m p o r t a n t i n m e d i a t i n g t h e i n c r e a s e i n s w e l l i n g , b u t i t i s a p o s s i b i l i t y w o r t h y o f c o n s i d e r a t i o n . T h u s , t h e o b s e r v e d e f f e c t s o f t o x i n o n m i t o c h o n d r i a m a y i n v o l v e a p r o t e i n w h i c h s u p p o r t s a c t i v i t y o f t h e A T P s y n t h a s e t h r o u g h s u p p l y o f s u b s t r a t e , r a t h e r t h a n t h e A T P s y n t h a s e i t s e l f . O u r fi n d i n g o f t o x i n a n d m e t h o m y l - i n d u c e d i n h i b i t i o n o f A T P a s e a c t i v i t y h a s r e c e n t l y b e e n v e r i fi e d b y M o u s s a e t a l . ( 1 9 9 0 ) . T h e y f o u n d t h a t 8 2 t h e a c t i v i t y o f t h e p a r t i a l l y p u r i fi e d s o l u b l e A T P a s e ( F 1 ) f r o m T , b u t n o t N a n d C m i t o c h o n d r i a , i s i n h i b i t e d 7 5 % b y b o t h t o x i n a n d m e t h o m y l . T h e s e r e s u l t s , a l o n g w i t h t h o s e p r e s e n t e d h e r e i n , p r o v i d e s t r o n g s u p p o r t f o r i n v o l v e m e n t o f t h e A T P a s e i n t o x i n a c t i o n a n d s u g g e s t a d i r e c t e f f e c t r a t h e r t h a n m e d i a t i o n b y a n a u x i l i a r y p r o t e i n . W h i l e t h e e v i d e n c e i n d i c a t e s a r o l e f o r t h e A T P a s e i n t h e a c t i o n o f t h e t o x i n , t h e r o l e o f t h e A T P a s e i n t h e C M S t r a i t r e m a i n s u n c l e a r . O u r r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e V m a x o f t h e A T P a s e d i f f e r s b e t w e e n N a n d T m i t o c h o n d r i a , s u g g e s t i n g t h a t t h e A T P a s e m a y i n f a c t b e i n v o l v e d i n C M S a s w e l l . I f t h e 1 3 k D a p e p t i d e w e r e t o p h y s i c a l l y a s s o c i a t e w i t h t h e A T P a s e , t h e n t h e c o m p l e x ’ s n a t i v e c o n f o r m a t i o n a n d t h e r e f o r e i t s k i n e t i c p r o p e r t i e s c o u l d b e a f f e c t e d , p o s s i b l y r e d u c i n g V m a x a s w e h a v e o b s e r v e d . S e v e r a l m e c h a n i s m s c a n b e p o s t u l a t e d t o e x p l a i n h o w a p h y s i c a l a s s o c i a t i o n o f t h e 1 3 k D a p e p t i d e w i t h a r e s p i r a t o r y p r o t e i n c a u s e s C M S . T h e 1 3 k D a p e p t i d e — A T P a s e c o m p l e x w o u l d b e p r e s e n t i n r e l a t i v e l y l o w a m o u n t s i n m o s t C M S p l a n t t i s s u e s , a n d t h e r e f o r e o n l y a s m a l l e f f e c t o n r e s p i r a t i o n w o u l d b e e x p e c t e d u n d e r n o r m a l g r o w t h c o n d i t i o n s i n t h e a b s e n c e o f t o x i n . T h i s e x p l a i n s w h y R C R v a l u e s a n d A D P / O r a t i o s a r e s i m i l a r i n T a n d N m i t o c h o n d r i a . P e r h a p s o n l y u n d e r t h e s p e c i a l g r o w t h c o n d i t i o n s i n t h e a n t h e r s , o r i n t h e p r e s e n c e o f a n a n t h e r - s p e c i fi c , t o x i n - l i k e s u b s t a n c e , w o u l d a n a b e r r a n t a c t i v i t y o f t h e n e w c o m p l e x b e i n d u c e d . A n o t h e r p o s s i b i l i t y i s t h a t h i g h e r l e v e l s o f a 1 3 k D a p e p t i d e — r e s p i r a t o r y p r o t e i n c o m p l e x a r e n e c e s s a r y t o i n t e r f e r e w i t h e n e r g y p r o d u c t i o n s u c h t h a t p o l l e n p r o d u c t i o n i s a b o r t e d . I n p e t u n i a , g r e a t e r a m o u n t s o f t h e p c f m R N A ( t h e r e a r r a n g e d s e g m e n t o f t h e m i t o c h o n d r i a l g e n o m e p r e s e n t o n l y i n m a l e - s t e r i l e p l a n t s ) a r e p r o d u c e d i n a n t h e r s c o m p a r e d t o o t h e r t i s s u e s d u r i n g p o l l e n p r o d u c t i o n ( Y o u n g a n d H a n s o n , 1 9 8 7 ) . I f t h e 1 3 k D a p e p t i d e o f T 8 3 m a i z e i s a l s o e x p r e s s e d a t h i g h e r l e v e l s d u r i n g p o l l e n p r o d u c t i o n , t w o e f f e c t s c o u l d r e s u l t . F i r s t , n e w l y s y n t h e s i z e d s u b u n i t s o f r e s p i r a t o r y o r t r a n s p o r t c o m p l e x e s c o u l d i n s t e a d a s s o c i a t e w i t h t h e 1 3 k D a p e p t i d e , r e d u c i n g t h e e n e r g y - p r o d u c i n g c a p a c i t y o f t h e p l a n t . H o w e v e r , t h e i n c r e a s e i n p c f e x p r e s s i o n i n p e t u n i a i s p r o b a b l y i n s u f f i c i e n t t o p r o d u c e t h i s e f f e c t . A l t e r n a t i v e l y , t h e p r e s e n c e o f h i g h e r l e v e l s o f t h e a b e r r a n t c o m p l e x m i g h t i n c r e a s e m e m b r a n e p e r m e a b i l i t y t o a p o i n t w h e r e r e s p i r a t i o n i s u n c o u p l e d , a n d t h e r e f o r e n o t e n o u g h e n e r g y i s a v a i l a b l e f o r r a p i d g r o w t h . I n s u m m a r y , o u r e v i d e n c e s u g g e s t s t h a t t h e r e m a y b e a s m a l l d i f f e r e n c e i n t h e m a x i m a l a c t i v i t y o f t h e A T P a s e i n C M S - T m a i z e m i t o c h o n d r i a , i n a c c o r d a n c e w i t h t h e t h e o r y t h a t t h e 1 3 k D a p e p t i d e i s p h y s i c a l l y a s s o c i a t e d w i t h a m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e c o m p l e x . T h i s d a t a , t o g e t h e r w i t h t h e e f f e c t s o f A T P a s e i n h i b i t o r s o n t o x i n a c t i o n , a s w e l l a s i n h i b t i o n o f A T P a s e a c t i v i t y b y t h e t o x i n a n d m e t h o m y l i n T m i t o c h o n d r i a , s u g g e s t s a r o l e f o r t h e A T P a s e i n b o t h t o x i n a c t i o n a n d C M S . C h a p t e r 4 - A n a l y s i s o f p o s s i b l e p h y s i c a l a s s o c i a t i o n o f C M S - s p e c i fi c p r o t e i n s w i t h o t h e r n r i t o c h o n d r i a l p r o t e i n s 4 . 1 I n t r o d u c t i o n C y t o p l a s m i c m a l e s t e r i l i t y ( C M S ) h a s b e e n c o r r e l a t e d w i t h m i t o c h o n d r i a l D N A r e a r r a n g e m e n t s w h i c h o f t e n g e n e r a t e o p e n r e a d i n g f r a m e s d i r e c t i n g s y n t h e s i s o f n o v e l p r o t e i n s . T h e m e c h a n i s m b y w h i c h t h e s e C M S - s p e c i fi c p r o t e i n s c a u s e p o l l e n a b o r t i o n w h i l e a l l o w i n g f e m a l e g a m e t o p h y t e p r o d u c t i o n a n d n o r m a l v e g e t a t i v e g r o w t h i s n o t u n d e r s t o o d . T h e i n a b i l i t y o f m i t o c h o n d r i a t o p r o v i d e s u f fi c i e n t e n e r g y t o s u p p o r t t h e r a p i d m i t o c h o n d r i a l p r o l i f e r a t i o n i n p o l l e n p r o d u c t i o n ( W a r m k e a n d L e e , 1 9 7 8 ) h a s b e e n s u g g e s t e d t o b e c a u s e d b y t h e p r e s e n c e o f a n t h e r - s p e c i fi c s u b s t a n c e s w h i c h b i n d t o t h e n o v e l p r o t e i n s ( F l a v e l l , 1 9 7 4 ) , t h e o v e r - e x p r e s s i o n o f t h e n o v e l p r o t e i n s i n t h e a n t h e r ( Y o u n g a n d H a n s o n , 1 9 8 7 ) , t h e m i s - e x p r e s s i o n o f n o n - C M S - s p e c i f i c g e n e s a f f e c t e d b y m t D N A r e a r r a n g e m e n t s ( H a n s o n e t a l . , 1 9 8 9 ) , a n d t h e a l t e r a t i o n o f r e s p i r a t o r y p r o t e i n s ( B a i l e y - S e r r e s e t a l . , 1 9 8 6 ) . I n t h e p r e v i o u s c h a p t e r , w e h a v e p r o v i d e d e v i d e n c e f o r t h e p o s s i b l e i n v o l v e m e n t o f t h e A T P a s e i n t h e a c t i o n o f t h e f u n g a l t o x i n c a u s i n g S o u t h e r n c o r n l e a f b l i g h t i n C M S - T m a i z e . W h i l e t o x i n m a y b i n d t o o r n e a r t h e A T P a s e , o r i t s a c t i o n m a y i n v o l v e a c a s c a d e o f e v e n t s w h i c h r e q u i r e t h e A T P a s e , t h e r e i s n o t y e t s u f fi c i e n t e v i d e n c e t o c o n c l u d e t h a t t h e A T P a s e i s i n v o l v e d i n t h e m e c h a n i s m o f C M S . O n e e x p l a n a t i o n f o r t h e p a r t i c i p a t i o n o f t h e A T P a s e i n t o x i n a c t i o n a n d C M S i s i t s a s s o c i a t i o n w i t h t h e C M S - T m a i z e - s p e c i fi c 1 3 k D a p e p t i d e . E v e n t h o u g h t h e t o r n ' n b i n d s d i r e c t l y t o t h e 1 3 k D a p e p t i d e , a s s o c i a t i o n o f t h e 1 3 k D a p e p t i d e w i t h o t h e r p r o t e i n s ( s u c h a s t h e A T P a s e ) m a y b e n e c e s s a r y 8 4 f o r f u l l t o x i n e f f e c t s . T h e r o l e o f t h e 1 3 k D a p e p t i d e i n C M S c a n a l s o b e e x p l a i n e d i n t e r m s o f i t s a s s o c i a t i o n w i t h o t h e r p r o t e i n s . A n t h e r - s p e c i f c h o r m o n e s m a y h a v e a t o x i n - l i k e e f f e c t , l e a d i n g t o m i t o c h o n d r i a l d e g e n e r a t i o n , o r s i m p l y i n d u c e m o r e 1 3 k D a p e p t i d e p r o d u c t i o n , r e s u l t i n g i n a h i g h e r l e v e l o f i t s a s s o c i a t e d f o r m . A l t h o u g h t h e n e w c o m p l e x m a y c a u s e o n l y s l i g h t l y a l t e r e d a c t i v i t y u n d e r n o r m a l g r o w t h c o n d i t i o n s , i t s p r e s e n c e a t h i g h e r l e v e l s i n t h e a n t h e r s m a y c a u s e s u f f i c i e n t c h a n g e i n e n e r g y o u t p u t t h a t t h e r a p i d m i t o c h o n d r i a l p r o l i f e r a t i o n n e c e s s a r y f o r p o l l e n p r o d u c t i o n i s n o t p o s s i b l e . T h e r e f o r e , i n o r d e r t o u n d e r s t a n d h o w t h e p r e s e n c e o f t h e 1 3 k D a p e p t i d e m i g h t c a u s e t h e C M S t r a i t , i t i s d e s i r a b l e t o d e t e r m i n e w h e t h e r i t a s s o c i a t e s w i t h o t h e r m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n s . T h i s e x p e r i m e n t fi r s t i n v o l v e s s e p a r a t i o n o f t h e p r o t e i n s . W e h a v e a l r e a d y d e v e l o p e d a n F P L C p r o c e d u r e t o s e p a r a t e t h e m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e p r o t e i n s f o r t h e p u r p o s e o f p u r i f y i n g c y t o c h r o m e o x i d a s e ( s e e c h a p t e r 6 ) . T h e p r o t e i n s a r e fi r s t s o l u b i l i z e d w i t h l a u r y l m a l t o s i d e ( a m i l d n o n - i o n i c d e t e r g e n t w h i c h a l l o w s c y t o c h r o m e o x i d a s e t o r e t a i n h i g h e l e c t r o n t r a n s f e r a c t i v i t y ) , t h e n r a p i d l y c h r o m a t o g r a p h e d o n a n a n i o n - e x c h a n g e c o l u m n ( M o n o Q ) . A m o d i fi c a t i o n o f t h i s p r o c e d u r e i s a l o g i c a l c h o i c e t o u s e f o r t h i s e x p e r i m e n t . A n o t h e r c h o i c e w o u l d b e n a t i v e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ; h o w e v e r , t h e d i f fi c u l t y o f t h i s t e c h n i q u e w h e n m e m b r a n e p r o t e i n s a r e u s e d ( s e e s e c t i o n 7 . 3 . 1 . 1 ) m a k e s t h i s a n u n d e s i r a b l e o p t i o n . D e t e c t i o n o f t h e C M S - s p e c i fi c p e p t i d e s i s t h e s e c o n d p r o b l e m i n p e r f o r m i n g t h i s e x p e r i m e n t . O n e o p t i o n i s t h e u s e o f r a d i o l a b e l l e d t o x i n , p r o d u c e d b y g r o w i n g t h e f u n g u s o n r a d i o l a b e l l e d s u b s t r a t e s o r r e d u c i n g t h e k e t o g r o u p s w i t h t r i t i a t e d b o r o h y d r i d e . H o w e v e r , a p r e v i o u s e x p e r i m e n t f a i l e d t o d e m o n s t r a t e t o x i n b i n d i n g ( F r a n t z e n e t a l . , 1 9 8 7 ) ; t h e r e f o r e , t h i s o p t i o n w o u l d n o t a p p e a r t o b e t h e b e s t c h o i c e . A s e c o n d p o s s i b i l i t y i s t h e u s e o f r a d i o l a b e l l e d D C C D ; D C C D b i n d s t o t h e t o x i n a n d p r e v e n t s t o x i n a c t i o n ( B r a u n e t a l . , 1 9 8 9 ) . D C C D h a s t h e a d v a n t a g e o f b i n d i n g c o v a l e n t l y , s o i t c a n n o t b e w a s h e d a w a y u n d e r t h e d i l u t i n g c o n d i t i o n s u s e d i n c h r o m a t o g r a p h y . H o w e v e r , t h i s a p p r o a c h h a s t h e p r o b l e m t h a t D C C D l a b e l l i n g i s s o m e w h a t u n s p e c i fi c , a n d m a n y p r o t e i n s w o u l d b e c o m e l a b e l l e d , m a k i n g t h e r e s u l t s d i f f i c u l t t o i n t e r p r e t . I n p a r t i c u l a r , l a b e l l i n g o f t h e A T P a s e p r o t e o l i p i d , w h i c h o c c u r s a t v e r y l o w c o n c e n t r a t i o n s o f D C C D , i s l i k e l y t o i n t e r f e r e s i n c e w e m a y e x p e c t t o s e e a s s o c i a t i o n w i t h t h e A T P a s e . T h e t h i r d a p p r o a c h , o n e w h i c h c a n b e a p p l i e d t o o t h e r C M S s y s t e m s , i s t h e o f u s e a n t i b o d i e s a g a i n s t t h e C M S - s p e c i fi c p r o t e i n s . T h e c o n c e r n w i t h t h i s m e t h o d i s t h e d i f fi c u l t y o f g e n e r a t i n g a n t i b o d i e s a g a i n s t h y d r o p h o b i c p r o t e i n s l i k e t h o s e a s s o c i a t e d w i t h C M S - T m a i z e a n d p e t u n i a . H o w e v e r , o t h e r l a b o r a t o r i e s h a v e s u c c e s s f u l l y p r o d u c e d a n t i b o d i e s w h i c h a r e s u i t a b l e f o r t h i s e x p e r i m e n t . T h e r e f o r e , w e h a v e s e p a r a t e d l a u r y l m a l t o s i d e - s o l u b i l i z e d m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n f r o m f e r t i l e a n d m a l e - s t e r i l e m a i z e a n d p e t u n i a u s i n g a n i o n - e x c h a n g e F P L C , a n d p r o b e d t h e f r a c t i o n s s e p a r a t e d o n W e s t e r n b l o t s w i t h a n t i b o d i e s p r e p a r e d b y o u r c o l l a b o r a t o r s a g a i n s t t h e C M S - s p e c i fi c p e p t i d e s , 1 3 k D a a n d u r f S . T h e w o r k o n C M S - T m a i z e h a s b e e n d o n e i n c o o p e r a t i o n w i t h K e n K o r t h f r o m t h e l a b o r a t o r y o f D r . C . S . L e v i n g s , I I I ( N o r t h C a r o l i n a S t a t e U n i v e r s i t y ) , a n d t h e p e t u n i a w o r k w i t h M a r i e C o n n e t t a n d H e l e n N i v i s o n f r o m t h e l a b o r a t o r y o f D r . M a u r e e n H a n s o n ( C o r n e l l U n i v e r s i t y ) . 4 . 2 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s 4 . 2 . 1 M a t e r i a l s A n t i b o d i e s a g a i n s t t h e 1 3 k D a p e p t i d e , A T P a , a n d c y t o c h r o m e o x i d a s e s u b u n i t I I w e r e k i n d l y p r o v i d e d b y D r . C . S . L e v i n g s , I I I . A n t i b o d y a g a i n s t t h e a l t e r n a t i v e o x i d a s e w a s t h e g i f t o f D r . L e e M c I n t o s h , a n d a n t i b o d y a g a i n s t t h e u r f S p e p t i d e w a s k i n d l y p r o v i d e d b y D r . M a u r e e n H a n s o n . A l l o t h e r r e a g e n t s w e r e f r o m t h e s o u r c e s i n d i c a t e d i n c h a p t e r 6 o r f r o m S i g m a . 4 . 2 . 2 P r e p a r a t i o n o f m i t o c h o n d r i a M i t o c h o n d r i a f r o m w h e a t a n d m a i z e g e r m w e r e p r e p a r e d b y t h e m e t h o d d e s c r i b e d i n s e c t i o n 6 . 2 . 3 . M i t o c h o n d r i a f r o m C M S ( 1 0 6 3 6 o r 3 6 8 8 ) , f e r t i l e ( 3 6 9 9 ) , a n d r e s t o r e d ( 3 3 3 7 ) p e t u n i a c e l l l i n e s p r e p a r e d b y t h e m e t h o d o f C o n n e t t a n d H a n s o n ( 1 9 9 0 ) w e r e t h e g i f t o f D r . M a u r e e n H a n s o n . P r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s w e r e d e t e r m i n e d b y t h e B C A m e t h o d ( P i e r c e ) . 4 2 . 3 S e p a r a t i o n o f p r o t e i n s b y F P L C M i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s i n 0 . 3 5 M s u c r o s e , 5 0 m M K C l , 5 m M T E S , 1 m M E G T A , p H 7 . 2 b u f f e r a t n e a r 2 0 m g / m L w e r e s o l u b i l i z e d i n 2 m g l a u r y l m a l t o s i d e p e r m g m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n a n d a p p r o x i m a t e l y 1 0 u g D N a s e p e r m g p r o t e i n w i t h 1 m M M g C 1 2 a t 4 ° C f o r 3 0 m i n u t e s . T h e m i x t u r e w a s c e n t r i f u g e d a t 4 0 0 0 0 g f o r 2 0 m i n u t e s a n d t h e s u p e r n a t a n t fi l t e r e d t h r o u g h a 0 . 4 5 p m p o r e s i z e m e m b r a n e ( G e l m a n A c r o d i s c f o r l a r g e v o l u m e s , M i l l i p o r e H A fi l t e r s y r i n g e u n i t f o r s m a l l v o l u m e s ) a n d l o a d e d o n t o a P h a r m a c i a M o n o Q 1 0 / 1 0 ( m a i z e ) o r 5 / 5 ( p e t u n i a ) a n i o n - e x c h a n g e ( M o n o Q ) o r 5 / 5 c a t i o n - e x c h a n g e ( M o n o S ) c o l u m n o n t h e P h a r m a c i a F P L C s y s t e m a t 0 . 0 — 0 . 1 5 M K C l . U p t o o n e h u n d r e d m i l l i g r a m s o f m a i z e m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n w e r e l o a d e d o n t o t h e 1 0 / 1 0 c o l u m n a n d t w o t o s i x m i l l i g r a m s o f p e t u n i a m i t o c h o n d r i a p r o t e i n w e r e l o a d e d o n t o t h e 5 / 5 c o l u m n . A g r a d i e n t o f 0 t o 1 . 0 M s a l t i n b u f f e r ( F P L C b u f f e r : 5 % s u c r o s e , 2 0 m M K I - I g P O 4 , 4 m M l a u r y l m a l t o s i d e , p H 7 . 5 ) w a s a p p l i e d t o t h e c o l u m n a t 0 . 5 m L / m i n ( 5 / 5 c o l u m n ) o r 1 . 0 m L / m i n ( 1 0 / 1 0 c o l u m n ) . 4 . 2 . 4 G e l e l e c t r o p h o r e s i s a n d W e s t e r n b l o t t i n g P r o t e i n f r o m m a i z e F P L C f r a c t i o n s w a s p r e c i p i t a t e d i n i c e c o l d t r i c h l o r o a c e t i c a c i d ( fi n a l c o n c e n t r a t i o n 4 . 5 % ) a n d c e n t r i f u g e d . R i n s e d p e l l e t s w e r e s o n i c a t e d w i t h s a m p l e b u f f e r ( d e s c r i b e d i n K a d e n b a c h e t a l . , 1 9 8 3 e x c e p t t h a t 0 . 0 4 % b r o m o p h e n o l b l u e w a s a d d e d ) f o r 3 0 m i n u t e s a t 1 5 ° C p r i o r t o l o a d i n g o n t o g e l s . S D S - u r e a p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s w a s p e r f o r m e d a c c o r d i n g t o K a d e n b a c h e t a l . ( 1 9 8 3 ) u s i n g t h e B i o - R a d m i n i g e l s y s t e m . B l o t t i n g o n t o n i t r o c e l l u l o s e ( 0 . 4 5 u r n p o r e s i z e , B i o - R a d ) w a s p e r f o r m e d i n 1 2 . 5 m M T r i s , 9 6 m M g l y c i n e , a n d 2 0 % m e t h a n o l ( i n w h i c h t h e g e l w a s p r e - e q u i l i b r a t e d f o r 1 0 m i n u t e s ) a t 1 0 0 V f o r 1 h o u r . T h e fi l t e r p a p e r o n t h e c a t h o d e s i d e o f t h e g e l w a s s o a k e d i n t h i s b u f f e r w i t h 0 . 5 % S D S f o r t e n m i n u t e s b e f o r e b l o t t i n g . P r o t e i n s w e r e v i s u a l i z e d b y A m i d o b l a c k s t a i n ( 0 . 0 2 5 % i n 7 . 5 % a c e t i c a c i d a n d 2 2 . 5 % e t h a n o l ) a n d b l o t s b l o c k e d o v e r n i g h t i n 5 % d r y m i l k p r o t e i n i n 2 0 m M T r i s , 0 . 5 M N a C l , a n d 0 . 0 5 % T w e e n - 2 0 , p H 7 . 5 . A n t i b o d i e s w e r e i n c u b a t e d w i t h b l o t s f o r a t l e a s t 4 h o u r s , f o l l o w e d b y i n c u b a t i o n w i t h g o a t a n t i - r a b b i t a n t i b o d y c o n j u g a t e d w i t h a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ( B i o - R a d ) . E i t h e r 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l p h o s p h a t e a n d n i t r o b l u e ' t e t r a z o l i u m , o r t h e f a s t r e d s y s t e m ( f a s t r e d T R a n d n a p t h o l A S « M X p h o p h a t e ) w a s u s e d f o r i m m u n o d e t e c t i o n . 4 . 3 R e s u l t s 4 . 3 . 1 S e p a r a t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n o f m a i z e p r o t e i n s N a n d T m a i z e g e r m m i t o c h o n d r i a w e r e f r a c t i o n a t e d b y t h e m e t h o d u s e d t o p u r i f y c y t o c h r o m e o x i d a s e f r o m w h e a t g e r m m i t o c h o n d r i a . L a u r y l m a l t o s i d e - s o l u b i l i z e d m i t o c h o n d r i a a r e t r e a t e d w i t h D N a s e I t o b r e a k t h e m i t o c h o n d r i a l D N A i n t o s m a l l e n o u g h p i e c e s s o a s n o t t o c l o g t h e c o l u m n fi l t e r w h i c h w o u l d i n c r e a s e c o l u m n b a c k p r e s s u r e . C e n t r i f u g e d a n d fi l t e r e d m i t o c h o n d r i a w e r e m a d e 0 . 0 t o 0 . 1 5 M K C l ( d e p e n d i n g o n t h e e x p e r i m e n t ) a n d l o a d e d o n t o t h e M o n o Q 1 0 / 1 0 c o l u m n . U p t o h a l f o f t h e t o t a l p r o t e i n d i d n o t b i n d t o t h e c o l u m n m a t r i x a n d e l u t e d i n t h e fl o w - t h r o u g h ( 1 — 3 i n F i g u r e 4 . 1 ) , a s d e t e c t e d b y c o n t i n u o u s l y m o n i t o r e d a b s o r b a n c e a t 2 8 0 n m . A d i s c o n t i n u o u s K C l g r a d i e n t w a s u s e d t o e l u t e p r o t e i n f r o m t h e c o l u m n . K C l w a s i n c r e a s e d f r o m 0 t o 0 . 3 2 M , e l u t i n g a l a r g e p e a k , o r s o m e t i m e s g r o u p o f p e a k s ( 5 — 8 , F i g u r e 4 . 1 ) . A n t i b o d i e s t o t h e o r s u b u n i t o f t h e c o m p l e x r e a c t e d s t r o n g l y w i t h t h e s e f r a c t i o n s o n W e s t e r n b l o t s ( s e e b e l o w ) , a l t h o u g h a l m o s t a l l f r a c t i o n s r e a c t e d s o m e w h a t . T h i s o b s e r v a t i o n i s c o m m o n i n f r a c t i o n a t i o n s o f p l a n t m i t o c h o n d r i a ( T . E l t h o n , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ; H a w k e s f o r d e t a l . , 1 9 9 0 ) . I f t h e g r a d i e n t w a s h e l d a t 0 . 2 2 M K C l , a s i n F i g u r e 4 . 1 , a p e a k ( 9 ) e l u t e s a f t e r t h e A T P a s e a t a b o u t 0 . 2 5 M K C l . W e t e n t a t i v e l y i d e n t i f y i t a s t h e N A D H d e h y d r o g e n a s e b e c a u s e o f i t s h i g h n u m b e r o f b a n d s o n S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l s . S u b s e q u e n t l y , t h e i d e n t i t y o f t h i s p e a k w a s v e r i fi e d ( i n t h e p e t u n i a s y s t e m , s e e b e l o w ) b y u s i n g a s t a n d a r d a s s a y f o r N A D H d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y w h i c h f o l l o w s t h e r e d u c t i o n o f f e r r i c y a n i d e s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y ( H a t e fi , 1 9 7 8 ) a n d b y u s i n g a n a t i v e g e l a c t i v i t y s t a i n ( C o n n e t t , 1 9 9 1 ) . T h e g r a d i e n t p a u s e a t 0 . 2 2 M w a s F i g u r e 4 . 1 : S e p a r a t i o n o f m a i z e m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n s b y a n i o n - e x c h a n g e F P L C . M e m b r a n e s m a d e 0 . 1 5 M K C l w e r e l o a d e d o n t o a M o n o Q 1 0 / 1 0 c o l u m n a n d w a s h e d i n F P L C b u f f e r ( 5 % s u c r o s e , 2 0 m M K H z P O 4 , 4 m M l a u r y l m a l t o s i d e , p H 7 . 5 ) . B o u n d p r o t e i n w a s e l u t e d a t 1 . 0 m L / m i n w i t h a d i s c o n t i n u o u s K C l g r a d i e n t : 0 — 0 . 2 2 M i n 1 0 m L , 0 . 2 2 — 0 . 3 2 M i n 5 m L , 0 . 3 2 M f o r 1 0 m L , 0 . 3 2 - 0 . 3 9 M i n 1 . 5 m L , 0 . 3 9 M f o r 7 . 5 m L , 0 . 3 9 - 1 . 0 M i n 8 m L . T h e s o l i d l i n e i n d i c a t e s t h e A 2 3 0 a n d t h e d a s h e d l i n e i n d i c a t e s t h e K C l g r a d i e n t . o 7 0 6 o s r e b 0 m 4 u N n o i t c a r F 0 3 o 2 0 1 l i o n - ( a i m o a d e d a n t i ( 5 % s u m 7 5 ) . B i g : i t i n u o u s i ‘ L , 0 . 3 2 i f 0 . 3 3 1 . 0 5 1 : 1 ! 3 d a S h E C « i t ; 2 9 1 O I D 0 . 1 - O O I l - L ‘ - « I i - d L C r — - L . L . P ) - F r P I . l I I 4 ' 1 I D V O N O I n C F i g u r e 4 . 1 u s e d o n l y f o r i n i t i a l p e a k s e p a r a t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n , a n d w a s n o t r o u t i n e l y e m p l o y e d . T h e s a l t c o n c e n t r a t i o n i s h e l d c o n s t a n t a t 0 . 3 2 M K C l f o r a p e r i o d o f t i m e ( 1 0 — 1 5 m L ) t o a l l o w c l e a r i n g o f a l l t h e p r o t e i n f r o m t h e p r e v i o u s p e a k s b e f o r e c o n t i n u i n g t h e g r a d i e n t t o e l u t e t h e c y t o c h r o m e o x i d a s e a t a b o u t 0 . 3 5 M K C l . T h e g r a d i e n t i s a g a i n h e l d a t 0 . 3 9 M K C l t o d e l a y t h e e l u t i o n o f t h e b c l c o m p l e x , w h i c h o t h e r w i s e s e r i o u s l y c o n t a m i n a t e s t h e o x i d a s e . T h e o x i d a s e a n d b c l p e a k s h a v e b e e n i d e n t i fi e d a n d c h a r a c t e r i z e d i n c h a p t e r 6 . F o l l o w i n g t h e b c l e l u t i o n , p e a k s o f v a r y i n g s i z e e l u t e w h i c h a r e i d e n t i fi e d a s n u c l e i c a c i d b y p r e c i p i t a t i o n i n a m m o n i u m a c e t a t e a n d e t h a n o l . 4 . 3 . 2 D e t e c t i o n o f t h e 1 3 k D a p e p t i d e M a i z e p r o t e i n f r o m T g e r m w a s s e p a r a t e d b y t h e s t a n d a r d g r a d i e n t f o r p u r i f y i n g c y t o c h r o m e o x i d a s e , t h a t i s , w i t h g r a d i e n t h o l d s a t 0 . 3 2 a n d 0 . 3 9 M K C l . T h e fi r s t r u n w a s p e r f o r m e d w i t h n o K C l a d d e d b e f o r e l o a d i n g o n t h e c o l u m n , s o t h a t t h e t o t a l K C ] c o n c e n t r a t i o n d u r i n g l o a d i n g o f t h e s a m p l e s i s 0 . 0 5 M K C l , t h e c o n c e n t r a t i o n i n t h e l a s t b u f f e r o f t h e m i t o c h o n d r i a p r e p a r a t i o n f r o m g e r m ( c h a p t e r 6 ) . T h i s r u n i s r e f e r r e d t o a s t h e “ l o w s a l t ” r u n ( F i g u r e 4 . 2 A ) . B e c a u s e o f t h e r e d u c e d s a l t c o n c e n t r a t i o n , a g r e a t e r p e r c e n t a g e o f t h e l o a d e d p r o t e i n i s r e t a i n e d b y t h e c o l u m n . T h e fi r s t g r o u p o f e l u t e d p e a k s ( 6 — 8 ) a r e t h e r e f o r e m u c h l a r g e r , w h i l e t h e l a t e r - e l u t i n g p e a k s r e m a i n r e l a t i v e l y u n c h a n g e d c o m p a r e d t o t h e “ h i g h s a l t ” ( 0 . 1 5 M K C l ) r u n i n F i g u r e 4 . 1 . T h e “ l o w s a l t ” l o a d i n g p r o c e d u r e a l l o w s f o r m a x i m a l s e p a r a t i o n o f a l l m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n s . A p p r o x i m a t e l y e q u a l a m o u n t s o f p r o t e i n f r o m e a c h o f t h e n u m b e r e d p e a k s i n F i g u r e 4 . 2 , a s w e l l a s t o t a l N a n d T m i t o c h o n d r i a a s a c o n t r o l , w e r e r u n o n g e l s a n d b l o t t e d t o n i t r o c e l l u l o s e f o r r e a c t i o n w i t h t h e a n t i b o d y F i g u r e 4 . 2 : S e p a r a t i o n o f C M S - T m a i z e m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n s b y a n i o n - e x c h a n g e F P L C u n d e r “ l o w s a l t ” c o n d i t i o n s ( A ) , a n d r e a c t i o n o f f r a ' c t i O n s w i t h a n t i b o d y a g a i n s t t h e 1 3 k D a p e p t i d e ( B ) . M e m b r a n e s w h i c h w e r e 0 . 0 5 M K C l w e r e l o a d e d o n t o a M o n o Q 1 0 / 1 0 c o l u m n a n d w a s h e d i n F P L C b u f f e r ( 5 % s u c r o s e , 2 0 m M K H g P O 4 , 4 m M l a u r y l m a l t o s i d e , p H 7 . 5 ) . B o u n d p r o t e i n w a s e l u t e d a t 1 . 0 m L / m i n w i t h a d i s c o n t i n u o u s K C l g r a d i e n t : 0 4 3 . 3 2 M i n 1 6 m L , 0 1 3 2 M f o r 1 0 m L , 0 . 3 2 — 0 . 3 9 M i n 1 . 5 m L , 0 . 3 9 M f o r 7 . 5 m L , 0 . 3 9 — 1 . 0 M i n 8 m L . T h e s o l i d l i n e i n d i c a t e s t h e A 2 3 0 a n d t h e d a s h e d l i n e i n d i c a t e s t h e K C l g r a d i e n t . W e s t e r n b l o t s w e r e p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 4 . 2 . 4 . N T 1 1 0 1 0 A ' 7 0 5 i b y a r i i i 1 d r e a c t s a p t i d e z l - l e d o r d e r i t s u m s a n a u o u s K C 4 . 3 9 1 1 2 3 5 0 0 1 1 1 1 1 5 t h e K C s c r i b i e d O Q C N O 0 ‘ D : r . . . r 0 . . | 4 0 - 0 \ I D E 3 C _ O 1 ' : . . 2 ' 5 _ O « E i - l l - _ O N _ O F O O N a g a i n s t t h e 1 3 k D a p e p t i d e . T h e a n t i b o d y r e a c t e d w i t h r e l a t i v e l y e q u a l i n t e n s i t y w i t h p e a k s 6 t h r o u g h 1 1 ( F i g u r e 4 . 2 B ) . T h e s e p e a k s r e p r e s e n t t h e A T P a s e ( 6 — 8 ) , t h e N A D H d e h y d r o g e n a s e ( 8 ) , c y t o c h r o m e o x i d a s e ( 9 ) a n d t h e ~ b c l c o m p l e x ( 1 0 , 1 1 m i x e d w i t h n u c l e i c a c i d ) a s d e d u c e d a b o v e a n d v e r i fi e d b y r e a c t i o n s o f d u p l i c a t e b l o t s w i t h a n t i b o d y a g a i n s t C O X I I a n d A T P o r ( F i g u r e 4 . 3 ) . T h e C O X I I a n t i b o d y r e a c t e d w i t h f r a c t i o n 9 ( F i g u r e 4 . 3 A ) w h i l e t h e A T P o r a n t i b o d y r e a c t e d w i t h f r a c t i o n s 2 t h r o u g h 8 . A s s t a t e d a b o v e , i t i s c o m m o n f o r A T P o r t o a p p e a r i n m a n y f r a c t i o n s o f p l a n t m i t o c h o n d r i a p r o t e i n s e p a r a t i o n s . B e c a u s e t h e 1 3 k D a p e p t i d e a p p e a r e d t o b e i n e v e r y f r a c t i o n t h a t c o n t a i n e d s i g n i fi c a n t a m o u n t s o f p r o t e i n , i t s e e m e d p o s s i b l e t h a t i t w a s a s s o c i a t i n g w i t h a l l o f t h e p r o t e i n s , o r a l t e r n a t i v e l y , t h a t t h e h y d r o p h o b i c n a t u r e o f t h e p e p t i d e c a u s e s i t t o “ s m e a r ” a c r o s s t h e c o l u m n , a p p e a r i n g i n e v e r y f r a c t i o n . T h e r e f o r e , a s e c o n d r u n . w a s p e r f o r m e d i n w h i c h , p r i o r t o l o a d i n g , t h e m i t o c h o n d r i a l f r a c t i o n w a s m a d e 0 . 1 5 M K C ] , i n o r d e r t o l o w e r t h e a m o u n t o f p r o t e i n b i n d i n g t o t h e c o l u m n a n d p e r h a p s r e d u c e s m e a r i n g . T h e e l u t i o n p r o fi l e o f t h i s “ h i g h s a l t r u n ” i s s h o w n i n F i g u r e 4 . 4 A . T h e 1 3 k D a p e p t i d e a n t i b o d y a g a i n r e a c t e d w i t h p r o t e i n f r o m e v e r y f r a c t i o n o f t h e “ h i g h s a l t ” r u n , t h i s t i m e i n c l u d i n g t h e t h e fl o w - t h r o u g h ( F i g u r e 4 . 4 B ) . A l t h o u g h t h e r e a p p e a r s t o b e n o r e a c t i o n w i t h f r a c t i o n 4 , i t i s l i k e l y t h a t t h e r e w a s t o o l i t t l e p r o t e i n i n t h i s f r a c t i o n t o a p p e a r s t r o n g l y o n t h e b l o t , e v e n t h o u g h w e a t t e m p t e d t o l o a d e q u a l a m o u n t s o f p r o t e i n i n e a c h l a n e ( b a s e d o n t h e A 2 3 0 v a l u e ) . A l t e r n a t i v e l y , i t i s p o s s i b l e t h a t t h e r e i s n o 1 3 k D a p e p t i d e i n t h i s f r a c t i o n b e c a u s e t h e r e i s n o o t h e r p r o t e i n i n t h e fi a c t i o n t o w h i c h t h e 1 3 k D a p e p t i d e c o u l d s t i c k . F r a c t i o n 7 a l s o r e a c t e d l e s s s t r o n g l y , p r o b a b l y f o r t h e s a m e r e a s o n s . F i g u r e 4 . 3 : W e s t e r n b l o t a n a l y s i s o f f r a c t i o n s f r o m “ l o w s a l t ” F P L C ( F i g u r e 4 . 2 A ) u s i n g a n t i b o d i e s a g a i n s t A T P o r a n d c y t o c h r o m e o x i d a s e s u b u n i t I I . B l o t s w e r e p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 4 . 2 . 4 . C e ( T i - o x i d i i ” ~ 5 5 0 5 I . L . . ' “ m « e I n . m I » . “ 4 — I o t c c F i g u r e d s “ ' 1 ' : 4 3 . . . 0 0 0 4 . 2 . : F i g u r e 4 . 4 : S e p a r a t i o n o f C M S - T m a i z e m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n s b y a n i o n - e x c h a n g e F P L C u n d e r “ h i g h s a l t ” c o n d i t i o n s ( A ) , a n d r e a c t i o n w i t h a n t i b o d y a g a i n s t t h e 1 3 k D a p e p t i d e ( B ) . M e m b r a n e s w e r e m a d e 0 . 1 5 M K C l w e r e l o a d e d o n t o a M o n o Q 1 0 / 1 0 c o l u m n a n d w a s h e d i n F P L C b u f f e r ( 5 % s u c r o s e , 2 0 m M K H g P O 4 , 4 m M l a u r y l m a l t o s i d e , p H 7 . 5 ) . B o u n d p r o t e i n w a s e l u t e d a t 1 . 0 m L / m i n w i t h a d i s c o n t i n u o u s K C l g r a d i e n t a s d e s c r i b e d i n t h e l e g e n d o f F i g u r e 4 . 2 . T h e s o l i d l i n e i n d i c a t e s t h e A 2 3 0 a n d t h e d a s h e d l i n e i n d i c a t e s t h e K C ] g r a d i e n t . W e s t e r n b l o t s w e r e p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 4 . 2 . 4 . r 0 . 1 U I U ' I l Y I r U ' V “ n ’ r u - n fi “ 1 1 1 0 1 0 r e . 0 . I b I T m . u 7 t ' « I I I n n o i 0 I 5 t c a 4 r F 3 * 2 1 . . . l I I I U I fi 2 I X I ' I I T U 5 ' 3 _ g m 3 1 0 8 3 v I o . o # l l l l l l l l l l l ’ l 4 l l l l l l l l L l l l l l l l l l l l l l 0 . 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 F i g u r e 4 . 4 1 ( 1 ) I f t h e 1 3 k D a p e p t i d e i s s i m p l y “ s m e a r i n g ” a c r o s s t h e c o l u m n d u e t o h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n , a d d i t i o n a l d e t e r g e n t i n t h e b u f f e r s m i g h t b e a b l e t o o v e r c o m e t h i s e f f e c t . T h e r e f o r e w e r e p e a t e d t h e r u n u s i n g 1 5 m M r a t h e r t h a n 4 m M l a u r y l m a l t o s i d e i n t h e b u f f e r s . ( I n t h e s o l u b i l i z a t i o n s t e p , t h e m i t o c h o n d r i a a r e a l r e a d y a t m u c h h i g h e r d e t e r g e n t c o n c e n t r a t i o n t h a n 1 5 m M , a n d a r e l o a d e d o n t o t h e c o l u m n a t t h i s h i g h d e t e r g e n t . ) T h e p r o t e i n f o r t h e “ h i g h d e t e r g e n t r u n ” w a s l o a d e d o n t o t h e c o l u m n a t 0 . 1 M K C l , h i g h e n o u g h t o o v e r c o m e a n y e l e c t r o s t a t i c a d h e s i o n t o t h e c o l u m n , b u t l o w e n o u g h t o p r e v e n t t o o m u c h o f t h e p r o t e i n f r o m fl o w i n g t h r o u g h t h e c o l u m n w i t h o u t b i n d i n g . A l t h o u g h t h e e l u t i o n p r o fi l e w a s s l i g h t l y d i f f e r e n t t h a n p r e v i o u s o n e s , t h e b a s i c f e a t u r e s a n d o r d e r o f e l u t i o n r e m a i n e d t h e s a m e ( F i g u r e 4 . 5 A ) . A g a i n , a l l fi ' a c t i o n s r e a c t e d w i t h t h e a n t i b o d y ( F i g u r e 4 . 5 B ) . i n d i c a t i n g t h a t e i t h e r t h e 1 3 k D a p e p t i d e w a s t r u l y a s s o c i a t i n g w i t h t h e m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n s a n d n o t s i m p l y “ s m e a r i n g ” o n t h e c o l u m n , o r t h a t f a r g r e a t e r d e t e r g e n t i s r e q u i r e d t o p r e v e n t t h i s l a t t e r s i t u a t i o n . I f t h e 1 3 k D a p e p t i d e i s r e a l l y i n t e r a c t i n g o n l y w i t h t h e c o l u m n a n d n o t w i t h t h e p r o t e i n s , t h e n r e - c h r o m a t o g r a p h i n g a f r a c t i o n s h o u l d r e d i s t r i b u t e t h e 1 3 k D a p e p t i d e t h r o u g h o u t t h e g r a d i e n t , a n d r e d u c e t h e a m o u n t o f i t i n t h e f r a c t i o n c o n t a i n i n g t h e r e - r u n p r o t e i n . W e p o o l e d a s e r i e s o f 4 — 1 m L f r a c t i o n s n e a r p e a k 6 , a n d r e - r a n t h e p r o t e i n o n a s m a l l e r c o l u m n u s i n g t h e s a m e b u f f e r s a n d a c o n t i n u o u s g r a d i e n t ( F i g u r e 4 . 6 ) . E q u a l a m o u n t s o f p r o t e i n ( a s d e t e r m i n e d b y t h e B C A p r o t e i n a s s a y ) f r o m t h e o r i g i n a l p o o l a n d f r o m t h e s e c o n d r u n p e a k w e r e p r e c i p i t a t e d f o r g e l e l e c t r o p h o r e s i s a n d b l o t t i n g . T h e i n t e n s i t y o f t h e r e a c t i o n o f t h e s e t w o f r a c t i o n s w i t h t h e 1 3 k D a p e p t i d e a n t i b o d y a p p e a r e d n e a r l y i d e n t i c a l ( F i g u r e 4 . 5 , l a n e s C 1 a n d C 2 ) . T h e r e f o r e , t h e 1 3 k D a p e p t i d e d o e s n o t r e d i s t r i b u t e o n t h e c o l u m n a n d i s p r o b a b l y a s s o c i a t i n g w i t h p r o t e i n a n d n o t t h e c o l u m n . 1 0 1 F i g u r e 4 . 5 : S e p a r a t i o n o f C M S - T m a i z e m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n s b y a n i o n - 1 e x c h a n g e F P L C u n d e r “ h i g h d e t e r g e n t ” c o n d i t i o n s ( A ) , a n d ‘ § r e a c t i o n o f f r a c t i o n s a n t i b o d y a g a i n s t t h e 1 3 k D a p e p t i d e ( B ) . k w , M e m b r a n e s w e r e m a d e 0 . 1 M K C l w e r e l o a d e d o n t o a M o n l e O / I O c o l u m n a n d w a s h e d i n h i g h d e t e r g e n t F P L C b u f f e r ( 5 % s u c r o s e , 2 0 m M K H 2 P O 4 , 1 5 m M l a u r y l m a l t o s i d e , p H 7 . 5 ) . B o u n d p r o t e i n w a s e l u t e d a t 1 . 0 l e m i n w i t h a d i s c o n t i n u o u s K C l g r a d i e n t a s d e s c r i b e d i n t h e l e g e n d o f w F i g u r e 4 . 2 . T h e s o l i d l i n e i n d i c a t e s t h e A 2 3 0 a n d t h e d a s h e d l i n e i n d i c a t e s t h e R O I g r a d i e n t . T h e f r a c t i o n s b e t w e e n t h e a r r o w s w e r e p o o l e d f o r r e c h r o m a t o g r a p h y . W e s t e r n b l o t s w e r e p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 4 . 2 . 4 . L a n e s C l a n d C 2 r e f e r t o t h e p o o l e d p r o t e i n fi o m t h e i n i t i a l ( F i g u r e 4 . 5 A ) a n d s e c o n d ( F i g u r e 4 . 6 ) F P L C r u n s r e s p e c t i v e l y . 0 . 1 r ' 2 c r c 1 1 0 1 9 8 4 : { 6 s 4 3 2 “ . 1 . _ - , , - - > — a D k 3 1 b y a n : - ( A } , i : p t i d e l 1 o u t : a t F P L C m e a t [ 1 W i l l i e g e i d fi 9 ( 1 3 5 2 5 r e a l ! ' 3 l o t s i ? ” ( : 2 r d ! K C I , M 1 0 2 O O I I I o [ s D I D O I n k 0 ) E O « E C ° I 2 ( ' 3 0 - ! 0 I “ h a l l . N O 1 - I l l O O 0 8 3 F i g u r e 4 . 5 1 . 6 t o » i t . i t i t » ? v . 3 ? - . ” fl a g ‘ 1 l . l 1 I t 1 l 1 A u ‘ 1 - \ I ' . ' . . " - . ' - t i m e r 2 ' 3 3 . ' , 1 0 3 F i g u r e 4 . 6 : R e - c h r o m a t o g r a p h y o f a C M S - T m a i z e m i t o c h o n d r i a f r a c t i o n A f r o m t h e “ h i g h d e t e r g e n t ” F P L C r u n o n a n i o n - e x c h a n g e F P L C . T h e p r o t e i n p o o l e d f r o m t h e i n i t i a l r u n ( F i g u r e 4 . 5 A ) w a s d i l u t e d t o 0 . 0 5 M a n d l o a d e d o n t o a M o n o Q 5 / 5 c o l u m n a t 0 . 7 5 m L / m i n . B o u n d p r o t e i n w a s e l u t e d a t 0 . 5 m L / m i n b y a g r a d i e n t f r o m 0 t o 0 . 4 M i n 1 5 m L a n d 0 . 4 t o 1 . 0 M i n 7 m L . T h e f r a c t i o n s b e t w e e n t h e a r r o w s w e r e p o o l e d f o r W e s t e r n b l o t c o m p a r i s o n t o i n i t i a l r u n f r a c t i o n s ( d e s i g n a t e d C 2 i n F i g u r e 4 . 5 B ) . r e b m u N n o i t c a r F 0 . 1 0 . 0 n d r i a . 1 3 i r e 4 . 5 K i i : 5 / 5 c o l u i i ‘ é m L ’ m i fl i i 3 ' i n 7 1 1 1 . i t W e s t e r n i i c 2 i n F 2 " - 1 0 4 K C I , M 0 8 3 F i g u r e 4 . 6 1 0 5 4 . 3 . 3 C M S p e t u n i a e x p e r i m e n t s W e h a v e p r e v i o u s l y r e p o r t e d ( C o n n e t t , 1 9 9 1 ) t h a t t h e u r f S p r o t e i n d o e s n o t b i n d t o M o n o Q ( a n i o n e x c h a n g e ) , b u t d o e s b i n d t o M o n o S ( c a t i o n e x c h a n g e ) , a s d e t e r m i n e d b y i m m u n o b l o t s o f e l u t e d f r a c t i o n s . T h e M o n o Q e l u t i o n p r o fi l e o f p e t u n i a m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n s f o r t h e s e f r a c t i o n a t i o n s w a s s i m i l a r t o t h o s e f r o m w h e a t a n d m a i z e m i t o c h o n d r i a . T h e a l t e r n a t i v e o x i d a s e ( A O ) a l s o b o u n d t o M o n o S b u t n o t M o n o Q , a n d f u r t h e r m o r e , w a s e l u t e d i n t h e s a m e f r a c t i o n s a s u r f S . T h i s r e s u l t w a s v e r y i n t e r e s t i n g i n l i g h t o f t h e o b s e r v a t i o n t h a t A O a c t i v i t y i s s i g n i fi c a n t l y l o w e r w h i l e c y t o c h r o m e o x i d a s e a c t i v i t y i s h i g h e r i n w h o l e ( s u s p e n s i o n ) c e l l s a n d p u r i fi e d m i t o c h o n d r i a f r o m C M S l i n e s t h a n i n m a l e - f e r t i l e l i n e s o f p e t u n i a ( C o n n e t t a n d H a n s o n , 1 9 9 0 ) . D i f f e r e n c e s p e c t r a o f o n e p r e p a r a t i o n e a c h o f l a u r y l - m a l t o s i d e s o l u b i l i z e d m i t o c h o n d r i a f r o m C M S , f e r t i l e , a n d r e s t o r e d p e t u n i a c e l l l i n e s s h o w e d h i g h e r a m o u n t s o f c y t o c h r o m e o x i d a s e i n C M S c o m p a r e d t o m a l e - f e r t i l e a n d r e s t o r e d l i n e s . W e h a v e s u g g e s t e d t h a t t h i s d i f f e r e n c e i n o x i d a s e c o n t e n t i s r e l a t e d t o t h e d i f f e r e n c e s i n a c t i v i t y o b s e r v e d , a n d , s i n c e t h e s e l i n e s w e r e i s o n u c l e a r , m i g h t a l s o b e r e l a t e d t o C M S . 4 . 3 . 3 . 1 F P L C fi ' a c t i o n a t i o n o f p e t u n i a m i t o c h o n d r i a W e h a v e a t t e m p t e d t o r e p e a t t h e f r a c t i o n a t i o n e x p e r i m e n t s i n o r d e r t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e c o - e l u t i o n o f u r f S a n d A 0 r e fl e c t s a t r u e p h y s i c a l a s s o c i a t i o n . I f i t d o e s , p e r h a p s w e c a n b e g i n t o e x p l a i n t h e l o w e r a l t e r n a t i v e o x i d a s e a c t i v i t y a n d p o s s i b l y e v e n t h e m e c h a n i s m o f C M S i n p e t u n i a . B y f r a c t i o n a t i n g m i t o c h o n d r i a f r o m C M S , f e r t i l e , a n d r e s t o r e d , a n d a l s o E . c o l i e x p r e s s i n g u r f S , w e m i g h t d e t e r m i n e i f t h e e l u t i o n c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e A 0 o r u r f S c h a n g e d w h e n t h e t w o p r o t e i n s a r e n o t p r e s e n t t o g e t h e r , w h i c h w o u l d s u g g e s t a n a s s o c i a t i o n . 1 0 6 M i t o c h o n d r i a ( a b o u t 5 m g p e r r u n ) f r o m C M S ( 3 6 8 8 ) , f e r t i l e ( 3 6 9 9 ) . a n d r e s t o r e d ( 3 3 3 7 ) l i n e s w e r e s o l u b i l i z e d ( a s f o r m a i z e m i t o c h o n d r i a a b o v e ) a n d l o a d e d d i r e c t l y o n t o M o n o S f o r f r a c t i o n a t i o n . E l u t i o n p r o fi l e s w e r e s o m e w h a t d i f f e r e n t f r o m t h e p r e v i o u s e x p e r i m e n t , w i t h l e s s s h a r p p e a k s a n d m o r e “ s m e a r i n g ” ( F i g u r e 4 . 7 ) . I n a l l t h r e e c e l l l i n e s t h e A O d i d n o t b i n d t o t h e c o l u m n a n d w a s e l u t e d i n t h e e a r l y fl o w - t h r o u g h ( F i g u r e 4 . 8 , l a n e F 1 1 ) w h i l e u r f S a p p e a r e d t h r o u g h o u t t h e fl o w - t h r o u g h ( F i g u r e 4 . 8 , l a n e s F 1 1 a n d F 1 2 ) a n d t h e fi r s t f e w f r a c t i o n s ( l a n e s 6 — 8 ) . T h e a n t i b o d y a l s o r e a c t e d w i t h a h i g h e r m o l e c u l a r w e i g h t b a n d ( u p p e r a r r o w ) , p o s s i b l y a n u r f S d i m e r w h i c h w a s t h e r e s u l t o f i n c o m p l e t e s o l u b i l i z a t i o n . T h e l o w e r m o l e c u l a r w e i g h t b a n d r e a c t i n g w i t h t h e u r f S a n t i b o d y ( l o w e r a r r o w ) m a y b e t h e 2 0 k D a b a n d w h i c h a l s o r e a c t s w i t h t h e a n t i b o d y ( s e e s e c t i o n 2 . 2 . 2 ) . T h e o r i g i n a l e x p e r i m e n t s u g g e s t i n g a s s o c i a t i o n o f t h e A 0 a n d u r f S w a s n o t r e p r o d u c e d , s i n c e t h e c o l u m n r e t a i n e d s o m e u r f S b u t n o A 0 . A s e c o n d a t t e m p t w a s m a d e t o r e p e a t t h i s e x p e r i m e n t u s i n g m i t o c h o n d r i a ( 4 m g ) f r o m a d i f f e r e n t C M S l i n e ( 1 0 6 3 6 ) . T h e e l u t i o n p r o fi l e m o r e c l o s e l y r e s e m b l e d t h e o r i g i n a l i n w h i c h A 0 a n d u r f S a s s o c i a t e d ( F i g u r e 4 . 9 ) ; h o w e v e r , i m m u n o b l o t s o f t h e f r a c t i o n s r e v e a l e d t h a t A O e l u t e d e q u a l l y i n t h e fl o w - t h r o u g h a n d a l l o f t h e f r a c t i o n s f r o m t h e fi r s t g r o u p o f p e a k s ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e b l o t w a s n o t p r o b e d f o r u r f S . 4 . 3 . 3 . 2 D i f f e r e n c e s p e c t r a o f p e t u n i a m i t o c h o n d r i a I n o r d e r t o p r o v i d e p h y s i c a l e v i d e n c e t o e x p l a i n t h e l o w e r A O b u t h i g h e r c y t o c h r o m e o x i d a s e a c t i v i t y i n C M S c o m p a r e d t o f e r t i l e a n d r e s t o r e d p e t u n i a l i n e s , w e a t t e m p t e d t o v e r i f y t h e p r e v i o u s r e s u l t t h a t m i t o c h o n d r i a f r o m C M S l i n e s c o n t a i n m o r e c y t o c h r o m e o x i d a s e t h a n f e r t i l e o r r e s t o r e d l i n e s a s m e a s u r e d b y v i s i b l e d i f f e r e n c e s p e c t r a . D i f f e r e n t p r e p a r a t i o n s a n d 1 0 7 F i g u r e 4 . 7 : S e p a r a t i o n o f m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n f r o m C M S p e t u n i a ( 3 6 8 8 ) b y c a t i o n - e x c h a n g e F P L C . L a u r y l m a l t o s i d e - s o l u b i l i z e d m i t o - c h o n d r i a a t 0 . 0 1 M K C l w e r e l o a d e d o n t o a M o n o S 5 / 5 c o l u m n a t 0 . 5 m L / m i n a n d w a s h e d i n F P L C b u f f e r ( 5 % s u c r o s e , 2 0 m M K H 2 P O 4 , 4 m M l a u r y l m a l t o s i d e , p H 7 . 5 ) t o r e m o v e u n b o u n d p r o t e i n . B o u n d p r o t e i n w a s e l u t e d a t 0 . 5 m L / m i n w i t h a c o n t i n u o u s g r a d i e n t o f 0 — 0 . 4 M K C l i n 2 0 m L . T h e s o l i d l i n e i n d i c a t e s t h e A 2 3 0 a n d t h e d a s h e d l i n e i n d i c a t e s t h e K 0 1 g r a d i e n t . 0 8 2 M , I A C K ( L S 1 0 8 X 1 0 1 . 0 1 l l k l / I i l l l l l l l l l l l l l l J l l l l l l l l J l o 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 F r a c t i o n n u m b e r F i g u r e 4 . 7 1 0 9 F i g u r e 4 . 8 : W e s t e r n b l o t a n a l y s i s o f f r a c t i o n s f r o m C M S p e t u n i a ( 3 6 8 8 ) f r a c t i o n a t i o n o n c a t i o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y . W e s t e r n b l o t s w e r e p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 4 . 2 . 4 . L a n e s : m t , s t a r t i n g m i t o c h o n d r i a ; F 1 1 a n d F 1 2 , e a r l y a n d l a t e fl o w - t h r o u g h f r a c t i o n s ; 6 — 1 4 , f r a c t i o n s f r o m t h e F P L C r u n s h o w n i n F i g u r e 4 . 7 . T h e A 0 b a n d l a b e l l e d w i t h a n a r r o w w a s t h e o n l y b a n d t o r e a c t w i t h t h e A O a n t i b o d y , w h i l e t h e u r f S a n t i b o d y r e a c t e d w i t h a b a n d a t i t s p r e d i c t e d m o l e c u l a r w e i g h t ( l a b e l l e d a r r o w ) a n d o n e h i g h e r a n d l o w e r m o l e c u l a r w e i g h t b a n d ( u n l a b e l l e d a r r o w s ) . T h e p o s i t i o n o f m o l e c u l a r w e i g h t s t a n d a r d s ( i n k D a ) a r e s h o w n t o t h e r i g h t o f l a n e 1 4 . I ' l l - E l l . . . t r y i n g > 2 2 3 0 . . N F 2 . 2 . m m h m N E 2 “ — 2 . : 8 8 E ” . 3 l ] 1 1 1 A 4 l | O w < t : 1 1 0 F i g u r e 4 . 8 1 1 1 F i g u r e 4 . 9 : S e p a r a t i o n o f m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n s f r o m C M S p e t u n i a ( 1 0 6 3 6 ) b y c a t i o n - e x c h a n g e F P L C . L a u r y l - m a l t o s i d e s o l u b i l i z e d m i t o c h o n d r i a a t 0 . 0 1 M K C l w e r e l o a d e d o n t o a M o n o S 5 / 5 c o l u m n a t 0 . 5 m L / m i n a n d w a s h e d i n F P L C b u f f e r ( 5 % s u c r o s e , 2 0 m M K H z P O 4 , 4 m M l a u r y l m a l t o s i d e , p H 7 . 5 ) t o r e m o v e u n b o u n d p r o t e i n . B o u n d p r o t e i n w a s e l u t e d a t 0 . 5 m L / m i n w i t h a c o n t i n u o u s g r a d i e n t o f 0 — 0 . 3 M K C l i n 1 5 m L . T h e s o l i d l i n e i n d i c a t e s t h e A 2 3 0 a n d t h e d a s h e d l i n e i n d i c a t e s t h e K C ] g r a d i e n t . 0 8 2 A . n - g m ' c . M , I C K 0 . 2 1 1 2 X 2 5 / l u g / u n i 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 “ : i F r a c t i o n n u m b e r 1 0 1 5 F i g u r e 4 . 9 2 0 2 5 1 . 0 1 1 3 t w o C M S l i n e s w e r e a n a l y z e d t h i s t i m e . S i n c e t h e o x i d a s e c o n t e n t w a s b e i n g j u d g e d b y t h e r a t i o o f t h e b a n d c c y t o c h r o m e p e a k s t o a a 3 p e a k s , t h e o u t e r m e m b r a n e w a s r e m o v e d i n s o m e p r e p a r a t i o n s t o d e p l e t e m i t o c h o n d r i a o f c y t o c h r o m e c , w h i c h w h e n p r e s e n t , i n c r e a s e s t h e i n t e n s i t y o f t h e b c 1 p e a k . T h e m i t o c h o n d r i a w e r e f u r t h e r p u r i fi e d b y d e n s i t y g r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o n t o r e m o v e p o s s i b l e m i c r o s o m a l c o n t a m i n a n t s w h i c h m i g h t a l s o c o n t a i n b a n d c c y t o c h r o m e s . A c o m p o s i t e o f t h e s e s p e c t r a , n o r m a l i z e d t o t h e b c l p e a k , i s s h o w n i n F i g u r e 4 . 1 0 . O n e C M S l i n e ( 3 6 9 9 ) h a d m o r e o x i d a s e t h a n a n y o t h e r l i n e , w h i l e t h e o t h e r C M S l i n e ( 1 0 6 3 6 ) c o n t a i n s l e s s t h a n a f e r t i l e l i n e , b u t m o r e t h a n a l l t h e o t h e r s . C l e a r l y , t h e r e i s a l a r g e v a r i a b i l i t y i n o x i d a s e c o n t e n t b e t w e e n m i t o c h o n d r i a l p r e p a r a t i o n s , a s t h e r e w a s i n a s s a y s o f o x i d a s e a c t i v i t y ( C o n n e t t a n d H a n s o n , 1 9 9 0 ) . P e r h a p s i f b o t h o x i d a s e a c t i v i t y a n d c o n t e n t w e r e t e s t e d f o r e a c h p r e p a r a t i o n a c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e m c o u l d b e o b s e r v e d . M a n y m o r e p r e p a r a t i o n s w o u l d n e e d t o b e t e s t e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r C M S i n p e t u n i a i s r e l a t e d t o h i g h e r c y t o c h r o m e o x i d a s e , b u t l o w e r a l t e r n a t i v e o x i d a s e c o n t e n t a n d a c t i v i t y . 4 . 4 D i s c u s s i o n 4 . 4 . 1 A s s o c i a t i o n o f t h e 1 3 k D a p e p t i d e w i t h m a i z e m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n T h e 1 3 k D a p e p t i d e w a s f o u n d t o c o - e l u t e w i t h p r o t e i n - c o n t a i n i n g f r a c t i o n s f r o m M o n o Q f r a c t i o n a t i o n , c o n fi r m i n g t h e o b s e r v a t i o n s o f o t h e r s | t h a t t h e 1 3 k D a p e p t i d e c o - p u r i fi e s w i t h t h e A T P a s e ( R . D e w e y , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) a n d c y t o c h r o m e c o x i d a s e ( C . L e a v e r , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . I n t h e “ l o w s a l t ” r u n , s e v e r a l e a r l y f r a c t i o n s , i n c l u d i n g t h e fl o w - t h r o u g h , d i d n o t a p p e a r t o c o n t a i n a n y t h e t h e 1 3 k D a p e p t i d e . T h i s I I I I ' fi I I I I 1 1 4 I j I I I I I I I I T I I I I I I I I I I I I I I I l I I d . C . C M S ( 3 6 8 8 ) . . 3 ' C M S ( 1 0 6 3 6 ) - C a s . o h o . ( I ) ‘ 2 t e r t l l e . [ 0 8 1 0 r e d f G S ‘ l O r e d I I I I I I 1 4 l I I I I I J I I i I I Q I I I I I I I , s o o . 5 5 0 6 0 0 6 5 0 W a v e l e n g t h , n m F i g u r e 4 . 1 0 : V i s i b l e d i f f e r e n c e s p e c t r a ( d i t h i o n i t e - r e d u c e d m i n u s a i r - o x i d i z e d ) o f l a u r y l m a l t o s i d e - s o l u b i l i z e d p e t u n i a m i t o - c h o n d r i a . T h e r a t i o o f t h e b c l p e a k a t 5 5 5 - 5 6 0 n m t o t h e c y t o c h r o m e o x i d a s e p e a k a t 6 0 2 n m m a y d i f f e r b e t w e e n t h e C M S , f e r t i l e , a n d r e s t o r e d l i n e s . 1 ‘ D d _ — - ' - ] . ' l . 1 1 5 r e s u l t s u g g e s t s o n e o f t w o p o s s i b i l i t i e s : I ) T h e 1 3 k D a p e p t i d e i s t r u l y a s s o c i a t e d w i t h m a n y m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n s b y v i r t u e o f h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n ; a l l t h e i d e n t i fi e d p r o t e i n s a r e s u f f i c i e n t l y h y d r o p h o b i c t o a c c o u n t f o r t h i s p o s s i b i l i t y w h i l e p r e s u m a b l y t h e e a r l y fl o w - t h r o u g h f r a c t i o n s a r e l e s s h y d r o p h o b i c . 2 ) T h e h y d r o p h o b i c n a t u r e o f t h e 1 3 k D a p e p t i d e m a y c a u s e i t t o b i n d s t r o n g l y t o t h e c o l u m n m a t r i x a n d “ s m e a r ” n o n - s p e c i fi c a l l y , s u c h t h a t i t e l u t e s a s a c o n t i n u u m , w i t h o r w i t h o u t t h e p r e s e n c e o f p r o t e i n . W h e n h i g h e r s a l t l o a d i n g c o n d i t i o n s w e r e u s e d , s u c h t h a t s o m e p r o t e i n s w h i c h w o u l d b i n d t o t h e c o l u m n u n d e r l o w s a l t c o n d i t i o n s w o u l d e l u t e i n t h e fl o w - t h r o u g h , t h e 1 3 k D a p e p t i d e w a s a l s o d e t e c t e d i n t h e fl o w - t h r o u g h f r a c t i o n s , s u g g e s t i n g a t r u e a s s o c i a t i o n w i t h t h o s e p r o t e i n s t h a t h a d p r e v i o u s l y b e e n r e t a i n e d b y t h e c o l u m n . H i g h e r d e t e r g e n t , w h i c h m i g h t d i s r u p t h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s t h a t m i g h t b e c a u s i n g t h e 1 3 k D a p e p t i d e t o s m e a r o n t h e c o l u m n , d i d n o t a l t e r t h e e l u t i o n p a t t e r n o f t h e 1 3 k D a p e p t i d e , s u g g e s t i n g t h a t n o n - s p e c i fi c h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s w i t h t h e c o l u m n a r e n o t a f a c t o r . M o r e o v e r , r e - c h r o m a t o g r a p h i n g a p r o t e i n f r a c t i o n d i d n o t “ r e d i s t r i b u t e ” t h e 1 3 k D a p e p t i d e s i n c e t h e s a m e a m o u n t o f i t w a s a s s o c i a t e d w i t h t h e f r a c t i o n b e f o r e a n d a f t e r t h e s e c o n d c o l u m n r u n . T h e r e f o r e , t h e e v i d e n c e s u p p o r t s P o s s i b i l i t y 1 , t h a t t h e 1 3 k D a p e p t i d e i s a s s o c i a t i n g m a i n l y w i t h t h e m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n a n d n o t s i m p l y t h e c o l u m n . B e c a u s e t h e 1 3 k D a p e p t i d e s e e m s t o a s s o c i a t e w i t h a l l t h e m a j o r r e s p i r a t o r y c o m p l e x e s , t h i s e x p e r i m e n t d e m o n s t r a t e s t h a t t h e 1 3 k D a p r o t e i n i s n o t a s s o c i a t e d s p e c i fi c a l l y w i t h a s i n g l e c o m p l e x . H o w e v e r , t h i s d o e s n o t m e a n t h a t a l l o f t h e s e m a n y a s s o c i a t i o n s a r e m e a n i n g f u l , n o r d o e s i t r u l e o u t t h a t t h e 1 3 k D a p e p t i d e i s a c t i n g i n d e p e n d e n t l y ( i n t e r m s o f t o x i n n " U ~ ' 1 ' 1 ‘ " " _ = ' l - f - 3 " ‘ ” ‘ " . . I ' 1 1 6 a c t i o n o r C M S ) . I t i s q u i t e p o s s i b l e t h a t o n l y o n e o f t h e s e a s s o c i a t i o n s i s d e t r i m e n t a l i n a m a n n e r c a u s i n g e i t h e r t o x i n s e n s i t i v i t y o r C M S . I t i s n o t n e c e s s a r y f o r a l a r g e p r o p o r t i o n o f o n e c o m p l e x , f o r i n s t a n c e t h e A T P a s e , t o h a v e 1 3 k D a p e p t i d e a s s o c i a t e d w i t h i t i n o r d e r t o p r o d u c e t o x i n s e n s i t i v i t y . M o d i fi c a t i o n o f o n l y a f e w c h a n n e l s p e r m i t o c h o n d r i o n i s n e c e s s a r y t o c o l l a p s e t h e p r o t o n g r a d i e n t a n d c a u s e l e a k a g e o f c o f a c t o r s . A s m a l l n u m b e r o f 1 3 k D a p e p t i d k A T P a s e c o m p l e x e s c o u l d c a u s e a l a r g e e n o u g h r e d u c t i o n i n t h e e f fi c i e n c y o f r e s p i r a t i o n t o p r e v e n t t h e h u g e m i t o c h o n d r i a l p r o l i f e r a t i o n n e c e s s a r y f o r p o l l e n p r o d u c t i o n , a s d i s c u s s e d i n c h a p t e r 2 . T h e r e f o r e , e v e n t h o u g h t h e 1 3 k D a p e p t i d e a s s o c i a t e s w i t h m a n y p r o t e i n s , o n l y o n e s p e c i fi c i n t e r a c t i o n , w h i c h t h e r e f o r e o c c u r s a t l o w l e v e l s , i s n e c e s s a r y t o p r o d u c e b o t h t o x i n s e n s i t i v i t y a n d C M S . D o e s t h i s a s s o c i a t i o n o f t h e 1 3 k D a p e p t i d e w i t h t h e m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n s r e fl e c t w h a t i s r e a l l y o c c u r r i n g i n t h e m i t o c h o n d r i a , o r i s i t a n a r t i f a c t o f t h e p r o c e d u r e ? P r e l i m i n a r y s t u d i e s h a v e s o f a r d e m o n s t r a t e d t h a t t h e 1 3 k D a p e p t i d e c r o s s - l i n k s o n l y t o i t s e l f u n d e r a v a r i e t y o f c o n d i t i o n s ( W i l l i a m s e t a l . , 1 9 9 0 ) , r a i s i n g t h e p o s s i b i l i t y o f o l i g o m e r i c s t r u c t u r e s i n t h e m e m b r a n e w h i c h f o r m a n i n d e p e n d e n t c h a n n e l - l i k e s t r u c t u r e . H o w e v e r , i f t h e 1 3 k D a p e p t i d e i s r e a l l y a s s o c i a t i n g w i t h m a n y d i fi ’ e r e n t p r o t e i n s , n o o n e p r o t e i n w o u l d b e l i k e l y t o b e i d e n t i fi e d b y c r o s s l i n k i n g t e c h n i q u e s , a l t h o u g h a l a r g e p e r c e n t a g e o f h i g h m o l e c u l a r w e i g h t s p e c i e s w o u l d b e e x p e c t e d t o b e f o r m e d . U n t i l t h e p u r i fi e d 1 3 k D a p e p t i d e i n c o r p o r a t e d i n t o l i p i d v e s i c l e s i s s h o w n t o i n d u c e t o x i n s e n s i t i v i t y , i t m u s t b e c o n s i d e r e d t h a t t h e c r o s s l i n k i n g s t u d y d o e s n o t r u l e o u t t h a t t h e e f f e c t s o f t h e 1 3 k D a p e p t i d e a r e d e p e n d e n t o n a s p e c i fi c i n t e r a c t i o n w i t h a n o t h e r ” p r o t e i n . S u m m a r y . I n t h e p r e v i o u s c h a p t e r , w e h a v e p r o p o s e d t h e i n v o v l e m e n t o f t h e A T P a s e i n t o x i n s e n s i t i v i t y a n d C M S f o r s e v e r a l r e a s o n s : . ‘ . 7 . — w e n A - ‘ . ' 4 4 1 1 3 ' E ‘ . I I ' I . 1 ‘ . ' 1 " : 1 1 7 1 ) A T P a s e i n h i b i t o r s s u c h a s D C C D , k a e m p f e r o l , a n d q u e r c e t i n b l o c k t o x i n - i n d u c e d s w e l l i n g i n T m i t o c h o n d r i a , 2 ) T h e t o x i n i n h i b i t s A T P a s e a c t i v i t y i n T b u t n o t N m i t o c h o n d r i a , a n d 3 ) T h e V m a x o f t h e A T P a s e i s d i f f e r e n t i n N a n d T m i t o c h o n d r i a . W e h y p o t h e s i z e d t h a t t h e p h y s i c a l a s s o c i a t i o n o f t h e C M S - s p e c i fi c 1 3 k D a p e p t i d e w i t h t h e A T P a s e c o u l d m e d i a t e s t h e s e e f f e c t s . I n t h i s c h a p t e r , w e d e m o n s t r a t e b y p a r t i a l f r a c t i o n a t i o n o f m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n s t h a t t h e 1 3 k D a p e p t i d e a s s o c i a t e s w i t h m a n y o f t h e m e m b r a n e c o m p l e x e s , i n c l u d i n g t h e A T P a s e . T h i s a s s o c i a t i o n , e v e n t h o u g h p r e s e n t i n l o w p e r c e n t a g e i n t h e m i t o c h o n d r i a , c o u l d a c c o u n t f o r b o t h t h e s e n s i t i v i t y a n d a c t i o n o f t h e B m T t o x i n a s w e l l a s t h e m i t o c h o n d r i a l b r e a k d o w n l e a d i n g t o p o l l e n a b o r t i o n . 4 . 4 . 2 A s s o c i a t i o n o f u r S w i t h p e t u n i a m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n s D e s p i t e t h e r e p r o d u c i b l e a n d h i g h l y s i m i l a r M o n o Q e l u t i o n p r o fi l e s o f m i t o c h o n d r i a f r o m d i f f e r e n t p l a n t s , w e h a v e b e e n u n a b l e t o r e p r o d u c e o u r p r e v i o u s r e s u l t t h a t u r f S c o - e l u t e s w i t h A 0 f r o m a c a t i o n - e x c h a n g e c o l u m n ( C o n n e t t , 1 9 9 1 ) . I n f a c t , w e o b t a i n e d d i f f e r e n t A 2 3 0 a n d A O / u r f S e l u t i o n p r o fi l e s f r o m t h e t w o f r a c t i o n a t i o n s u s i n g m i t o c h o n d r i a f r o m t h e t w o C M S l i n e s . I n t e r e s t i n g l y , t h e e l u t i o n p r o fi l e o f l i n e 1 0 6 3 6 m o r e c l o s e l y r e s e m b l e d t h e o r i g i n a l r u n ( C o n n e t t , 1 9 9 1 ) w h i c h a l s o u s e d 1 0 6 3 6 ; h o w e v e r , A O / u r f S e l u t e d d i f f e r e n t l y . W h i l e w e h a v e b e e n u n a b l e t o d e fi n i t i v e l y e x p l a i n t h i s , t h e r e a r e s e v e r a l p o s s i b i l i t i e s . W e h a v e o b s e r v e d t h a t c o n t a m i n a n t s i n d i f f e r e n t b a t c h e s o f l a u r y l m a l t o s i d e a f f e c t t h e a c t i v i t y o f w h e a t c y t o c h r o m e o x i d a s e , a n d m a y p o s s i b l y a f f e c t t h e a b i l i t y o f t h e d e t e r g e n t t o s o l u b i l i z e m i t o c h o n d r i a e f f e c t i v e l y . P o o r l y s o l u b i l i z e d p r o t e i n s c o u l d e x i s t i n a g g r e g a t e f o r m s o r s u p e r c o m p l e x e s , p o s s i b l y a c c o u n t i n g f o r d i f f e r e n t d e g r e e s o f “ s m e a r i n g ” o r n o n - b i n d i n g o b s e r v e d i n d i f f e r e n t e x p e r i m e n t s . 1 1 8 A l t e r n a t i v e l y , t h e c o l u m n i t s e l f m a y b e a f f e c t e d i n a d v e r s e w a y s b y t h e p r o t e i n s c h r o m a t o g r a p h e d , s u c h t h a t s u b s e q u e n t e x p e r i m e n t s w o u l d g i v e d i f f e r e n t r e s u l t s . F o r i n s t a n c e , t h e h y d r o p h o b i c A D P / A T P t r a n s l o c a s e , a m a j o r p r o t e i n c o m p o n e n t o f m i t o c h o n d r i a , a p p e a r s t o b i n d t o t h e M o n o S c o l u m n , e l u t i n g a s a “ s m e a r ” o n c e a c e r t a i n s a l t c o n c e n t r a t i o n i s r e a c h e d ( b a s e d o n i t s p r e d i c t e d a b u n d a n c e a n d m o l e c u l a r w e i g h t ) . I t i s p o s s i b l e t h a t n o t a l l t h e p r o t e i n i s r e m o v e d d u r i n g t h e g r a d i e n t o r b y r o u t i n e c l e a n i n g t e c h n i q u e s , s o t h e c o l u m n r e m a i n s “ c o a t e d ” w i t h t h e p r o t e i n w h e n t h e n e x t b a t c h o f s a m p l e i s l o a d e d . T h e c o l u m n m a t r i x w o u l d e f f e c t i v e l y b e c h a n g e d , a n d t h e b i n d i n g a n d e l u t i o n c h a r a c t e r i s t i c s m i g h t b e a l t e r e d . T h i s p h e n o m e n o n c o u l d a c c o u n t f o r o u r u n r e p r o d u c i b l e r e s u l t s . I n a n y c a s e , t h e u r f S a n d A 0 d i d n o t c o - f r a c t i o n a t e i n o u r a t t e m p t t o r e p r o d u c e t h e o r i g i n a l r e s u l t . W h e t h e r o r n o t s o m e e x t e r n a l p r o b l e m c a u s e d t h e d i f f e r e n t e l u t i o n b e h a v i o r , t h e r e s u l t t h a t t h e t w o d i d n o t c o - e l u t e i s m e a n i n g f u l . I f s l i g h t l y a l t e r e d c o n d i t i o n s a r e a b l e t o a b o l i s h c o - e l u t i o n , t h e n c o - e l u t i o n m a y b e c o i n c i d e n t a l , o r t h e p h y s i c a l a s s o c i a t i o n b e t w e e n t h e p e p t i d e s i s n o t v e r y s t r o n g . H o w e v e r , w e a k i n t e r a c t i o n s b e t w e e n p r o t e i n s c a n o f t e n b e f u n c t i o n a l l y s i g n i fi c a n t , a s i n t h e c a s e o f c y t o c h r o m e c a n d c y t o c h r o m e o x i d a s e , w h i c h d o n o t r e m a i n a s s o c i a t e d u n d e r t h e c o n d i t i o n s o f F P L C . T h e r e f o r e , w h i l e o u r r e s u l t s i n d i c a t e t h a t i t i s d o u b t f u l t h a t t h e r e i s a s t r o n g p h y s i c a l a s s o c i a t i o n b e t w e e n u r f S a n d A 0 , w e c a n n o t c o m p l e t e l y r u l e o u t t h e p o s s i b i l i t y t h a t s o m e i n t e r a c t i o n d o e s e x i s t , a n d t h a t i t i s s i g n i fi c a n t f o r C M S . I o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y i s p e r h a p s n o t w e l l s u i t e d t o c l a r i f y t h i s i s s u e . C h a p t e r 5 - L i t e r a t u r e r e v i e w o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e 5 . 1 I n t r o d u c t i o n C y t o c h r o m e c o x i d a s e ( E C . 1 . 9 . 3 . 1 ) i s a m u l t i s u b u n i t e n z y m e i n t h e r e s p i r a t o r y p a t h w a y o f t h e i n n e r m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e o f e u k a r y o t e s a n d t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e o f a e r o b i c b a c t e r i a . I t p l a y s a c e n t r a l r o l e i n a e r o b i c m e t a b o l i s m , f u n c t i o n i n g a s t h e t e r m i n a l e l e c t r o n s i n k f o r t h e o x i d a t i o n o f f o o d s t u f f s b y r e d u c i n g 0 2 t o H 2 0 . I n f a c t , c y t o c h r o m e o x i d a s e i s r e s p o n s i b l e f o r 9 0 % o f a l l 0 2 c o n s u m e d b y l i v i n g o r g a n i s m s o n E a r t h ( W i k s t r b m e t a l . , 1 9 8 1 ) . C y t o c h r o m e o x i d a s e a c c e p t s e l e c t r o n s f r o m r e d u c e d c y t o c h r o m e c a n d t r a n s f e r s t h e m s e q u e n t i a l l y t h r o u g h a s e r i e s o f b o u n d c o p p e r s a n d h e m e s A t o 0 2 . E l e c t r o n t r a n s f e r i s c o u p l e d t o t h e v e c t o r i a l t r a n s p o r t o f _ p r o t o n s a c r o s s t h e m e m b r a n e , c o n t r i b u t i n g w i t h t h e o t h e r r e s p i r a t o r y c o m p l e x e s t o a n e l e c t r o c h e m i c a l g r a d i e n t w h i c h i s u s e d t o g e n e r a t e A T P . F o u r e l e c t r o n s a r e n e e d e d t o r e d u c e t h e b o u n d o x y g e n t o t w o w a t e r m o l e c u l e s a n d p u m p f o u r p r o t o n s . A d i a g r a m o f t h e c o m p o n e n t s a n d r e a c t i o n s o f t h e o x i d a s e i s s h o w n i n F i g u r e 5 . 1 . T h e o v e r a l l r e a c t i o n i s : 4 e ‘ + 8 H + ( m a t r i x ) + 0 2 — > 2 H 2 0 + 4 H + ( c y t o p l a s m ) 5 . 2 P r n i fi c a t i o n O v e r t h e y e a r s t h e r e h a s b e e n a g r e a t d e a l o f c o n t r o v e r s y o v e r t h e s t r u c t u r a l a n d e v e n f u n c t i o n a l a s p e c t s o f c y t o c h r o m e o x i d a s e , p a r t i c u l a r l y t h e m e t a l a n d s u b u n i t c o n t e n t a n d t h e e n z y m e ’ s p r o t o n p u m p i n g a c t i v i t y . M a n y o f t h e d i f f e r e n c e s i n o b s e r v e d p r o p e r t i e s h a v e b e e n f o u n d t o b e t h e 1 1 9 o . a 3 , H ‘ 3 1 3 m , i i i i i i n + 1 H + F i g u r e 5 . 1 : D i a g r a m o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e . W i g - A ‘ ) n i m T ‘ “ “ r “ . 3 : 1 1 . 1 1 2 1 r e s u l t o f v a r i a t i o n s i n p u r i f i c a t i o n p r o c e d u r e s . T h e r e f o r e , a n u n d e r s t a n d i n g o f t h e d i v e r s e a p p r o a c h e s t o p u r i f y i n g t h i s m u l t i s u b u n i t i n t e g r a l m e m b r a n e p r o t e i n i s c r i t i c a l t o u n d e r s t a n d i n g t h e w e a l t h o f c o n fl i c t i n g r e s u l t s i n t h e fi e l d . S i n c e c y t o c h r o m e o x i d a s e i s e m b e d d e d i n a l i p i d b i l a y e r , a m e m b r a n e f r a c t i o n ( t h e m i t o c h o n d r i a l i n n e r m e m b r a n e i n e u k a r y o t e s , t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e i n b a c t e r i a ) m u s t b e i s o l a t e d a n d s o l u b i l i z e d w i t h d e t e r g e n t . O n e a p p r o a c h t o s o l u b i l i z a t i o n i n m i t o c h o n d r i a t a k e s a d v a n t a g e o f t h e p r o p e r t y o f o x i d a s e t h a t i t i s l e s s e a s i l y r e m o v e d f r o m t h e m e m b r a n e b y d e t e r g e n t s t h a n m o s t o t h e r p r o t e i n c o m p l e x e s . B i l e s a l t s s u c h a s d e o x y c h o l a t e o r c h o l a t e ( o r T r i t o n X - 1 1 4 ; H a r t z e l l a n d B e i n e r t , 1 9 7 4 ) a r e u s e d w i t h s a l t a t a c o n c e n t r a t i o n w h i c h e x t r a c t s o t h e r i n t e g r a l m e m b r a n e p r o t e i n s b u t l e a v e s t h e o r d d a s e i n t h e m e m b r a n e , r e s u l t i n g i n a “ r e d - g r e e n s p l i t ” ( b e c a u s e t h e m o r e e a s i l y e x t r a c t e d c y t o c h r o m e b c 1 c o m p l e x i s r e d a n d t h e o x i d a s e i s g r e e n ) ; h i g h e r d e t e r g e n t c o n c e n t r a t i o n s s o l u b i l i z e t h e o x i d a s e f r o m t h e r e m a i n i n g m e m b r a n e f r a c t i o n , r e s u l t i n g i n s i g n i fi c a n t p u r i fi c a t i o n ( F o w l e r e t a l . , 1 9 6 2 ; K u b o y a m a e t a l . , 1 9 7 2 ; E r r e d e e t a l . , 1 9 7 8 ) . A l t e r n a t i v e l y , t h e e n t i r e m e m b r a n e i s d i s s o l v e d i n d e t e r g e n t . A b r i e f d i a l y s i s l o w e r s t h e c o n c e n t r a t i o n o f d e t e r g e n t a n d s a l t t o t h e p o i n t w h e r e t h e o x i d a s e p r e f e r e n t i a l l y a g g r e g a t e s i n t o a m e m b r a n o u s f o r m w h i c h c a n b e r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n a n d r e s o l u b i l i z e d ( S u a r e z e t a l . , 1 9 8 4 ) . T h e f r a c t i o n s f r o m t h e s e r e l a t e d m e t h o d s a r e s u b j e c t e d t o a m m o n i u m s u l f a t e f r a c t i o n a t i o n t o y i e l d a h i g h l y p u r i fi e d e n z y m e . A s e c o n d a p p r o a c h t o p u r i fi c a t i o n u s e s c o l u m n c h r o m a t o g r a p h i e s r e l y i n g o n c y t o c h o m e c a f fi n i t y ( W e i s s e t a l . , 1 9 7 9 ; A z z i e t a l . , 1 9 8 2 ; T h o m p s o n a n d F e r g u s o n - M i l l e r , 1 9 8 3 ; B i s s o n e t a l . , 1 9 8 5 ; H i l l a n d R o b i n s o n , 1 9 8 6 ) , a n i o n e x c h a n g e ( R u b i n a n d T z a g o l o f f , 1 9 7 8 , u s i n g D E A E ; i n n “ 9 . H ‘ u m m - p s a m : t i r w ; 1 * m N W F i n e l a n d W i k s t r i i m , 1 9 8 6 ; S t e f f e n s e t a l . , 1 9 8 7 ; H a l t i a e t a l . , 1 9 8 8 , a l l u s i n g M o n o Q ) , o r h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n ( W e i s s a n d S e b a l d , 1 9 7 8 ; G o t o e t a l . , 1 9 8 2 ; O z a w a e t a l . , 1 9 8 2 ; B i s s o n e t a l . , 1 9 8 5 ) a s a fi r s t o r l a s t s t e p . N o n - i o n i c d e t e r g e n t s s u c h a s T r i t o n X - 1 0 0 , l a u r y l m a l t o s i d e , a n d L D A O a r e g e n e r a l l y u s e d w i t h t h e s e m e t h o d s ; h o w e v e r , a s i n m a n y o f t h e r e f e r e n c e s j u s t c i t e d a n d o t h e r s ( G e o r g e v i c h e t a l . , 1 9 8 3 ; H e i n r i c h s a n d S c h o n e r t , 1 9 8 7 ) l o s s o f s u b u n i t s o c c u r s u n d e r s o m e c o n d i t i o n s , a n d t h e a c t i v i t y o f t h e e n z y m e i s o l a t e d i n d i f f e r e n t d e t e r g e n t s v a r i e s w i d e l y . I t i s n o t c l e a r w h a t c o n d i t i o n s a r e m o s t r e s p o n s i b l e f o r l o s s o f a c t i v i t y , b u t i t i s e v i d e n t t h a t t h e t y p e o f d e t e r g e n t u s e d i s c r i t i c a l . F o r m a n y t y p e s o f o x i d a s e s , l a u r y l m a l t o s i d e a p p e a r s t o b e t h e m o s t a c t i v a t i n g ( R o s e v e a r e t a l . , 1 9 8 0 ) . R a p i d p u r i fi c a t i o n a n d a v o i d a n c e o f t h e u s e o f a m m o n i u m s u l f a t e m a y a l l o w s o m e l a b i l e e n z y m e s t o r e t a i n a c t i v i t y . T h e p u r i t y o f t h e r e s u l t i n g p r e p a r a t i o n m a y b e a n a l y z e d u s i n g S D S - p o l y a c r y l a m i d e e l e c t r o p h o r e s i s . O f t e n , h o w e v e r , t h e r e s o l v i n g a b i l i t y o f t h e g e l i s a l i m i t i n g f a c t o r i n i d e n t i f y i n g b o t h c o n t a m i n a n t s a n d t r u e s u b u n i t s , a n d e l e c t r o p h o r e s i s a l o n e c a n n o t d i s t i n g u i s h b e t w e e n t r u e s u b u n i t s a n d c o n t a m i n a n t s . N a t i v e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( L u d w i g e t a l . , 1 9 7 9 ; H e i n r i c h s a n d S c h b n e r t , 1 9 8 7 ; S c h a g g e r a n d v o n J a g o w , 1 9 9 1 ) a n d i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ( P o y t o n a n d S c h a t z , 1 9 7 5 ; L u d w i g e t a l . , 1 9 7 9 ; M e r l e a n d K a d e n b a c h , 1 9 8 0 a ) h a v e b e e n u s e d t o p r o v i d e a d d i t i o n a l e v i d e n c e f o r p u r i t y a n d s u b u n i t c o m p o s i t i o n o f t h e p r e p a r a t i o n . U l t i m a t e l y , c o m p l e t e s e q u e n c e a n d s t o i c h i o m e t r y d e t e r m i n a t i o n i s n e c e s s a r y t o c o n fi r m t h e s u b u n i t c o m p o s i t i o n . 5 . 3 S t r u c t u r e 5 . 3 . 1 O x i d a s e s a n d t h e i r p o l y p e p t i d e c o m p o s i t i o n T h e o x i d a s e f r o m m a m m a l s h a s b e e n t h e m o s t e x t e n s i v e l y s t u d i e d b e c a u s e o f t h e h i g h c o n c e n t r a t i o n o f t h e e n z y m e i n t h e m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s a n d t h e a b u n d a n c e o f m i t c h o n d r i a i n c e r t a i n t i s s u e s , s u c h a s b e e f h e a r t . A s g e l e l e c t r o p h o r e s i s s y s t e m s b e c a m e m o r e h i g h l y r e s o l v i n g , e a r l y e s t i m a t e s o f s e v e n s u b u n i t s ( D o w n e r e t a l . , 1 9 7 6 ) h a d t o b e u p d a t e d . T h e m a m m a l i a n o x i d a s e c o m p l e x i s n o w t h o u g h t t o h a v e t h i r t e e n s u b u n i t s ( K a d e n b a c h e t a l . , 1 9 8 3 ) w i t h a m o l e c u l a r w e i g h t o f 2 0 4 , 0 0 0 c a l c u l a t e d f r o m t h e p r o t e i n s e q u e n c e s ( B u s e e t a l . , 1 9 8 5 ) . A l t h o u g h s e v e r a l s u b u n i t s ( i n c l u d i n g I I I ) c a n b e r e m o v e d b y r e l a t i v e l y m i l d p r o c e d u r e s ( P e n t t i l a , 1 9 8 3 ; T h o m p s o n a n d F e r g u s o n - M i l l e r , 1 9 8 3 ; P r o c h a s k a a n d R e y n o l d s , 1 9 8 6 ) , t h e y h a v e b e e n c o n c l u d e d t o b e t r u e s u b u n i t s b a s e d o n t h e i r 1 : 1 s t o i c h i o m e t r y w i t h t h e o t h e r s a n d t h e i r p r e s e n c e i n i m m u n o p r e c i p i t a t e s a n d p r e p a r a t i o n s f r o m s e v e r a l m a m m a l s a n d t i s s u e t y p e s ( M e r l e a n d K a d e n b a c h , 1 9 8 0 ) . N u m e r o u s s y s t e m s o f s u b u n i t n o m e n c l a t u r e h a v e b e e n u s e d t h r o u g h o u t t h e l i t e r a t u r e ; t h e s y s t e m o f K a d e n b a c h e t a l . ( 1 9 8 3 ) w i l l b e u s e d h e r e . T h e i d e a o f t h e s e v e n s u b u n i t m a m m a l i a n o x i d a s e m a i n t a i n e d s u p p o r t f o r a l o n g t i m e b e c a u s e y e a s t w a s a t fi r s t a l s o f o u n d t o h a v e s e v e n s u b u n i t s ( R u b i n a n d T z a g a l o f f , 1 9 7 3 ; P o y t o n a n d S c h a t z , 1 9 7 5 ) . Y e a s t w a s l a t e r s h o w n t o h a v e n i n e s u b u n i t s o n a h i g h e r r e s o l v i n g g e l a n d b y H P L C ( P o w e r e t a l . , 1 9 8 4 ) . T h i s e n z y m e h a s b e e n w e l l - s t u d i e d b e c a u s e o f t h e a b i l i t y o f y e a s t t o g r o w d e s p i t e r e s p i r a t o r y d e f e c t s a s w e l l a s t h e i t s a b i l i t y t o b e g e n e t i c a l l y m a n i p u l a t e d . C y t o c h r o m e o x i d a s e f r o m a n o t h e r f u n g u s , N e u r o s p o r a c r a s s a , h a s b e e n p u r i fi e d w i t h e i g h t s u b u n i t s ( W e r n e r , 1 9 7 7 ) . I t w a s fi r s t d i s c o v e r e d i n f u n g i t h a t t h e l a r g e s t t h r e e s u b u n i t s o f a l l e u k a r y o t i c o x i d a s e s a r e e n c o d e d b y m i t o c h o n d r i a l D N A w h i l e t h e r e s t a r e e n c o d e d b y n u c l e a r D N A , s y n t h e s i z e d o n c y t o p l a s m i c r i b o s o m e s a n d i m p o r t e d i n t o t h e m i t o c h o n d r i a ( S e b a l d e t a l . , 1 9 7 2 ; M a s o n a n d S c h a t z , 1 9 7 3 b ; s e e H a r t ] a n d N e u p e r t , 1 9 9 0 o r P f a n n e r e t a l . , 1 9 9 2 f o r a r e v i e w ) . O x i d a s e s f r o m m a n y o t h e r s o u r c e s h a v e b e e n a n a l y z e d f o r s u b u n i t c o m p o s i t i o n . T h e r e l a t i v e l y s i m p l e s l i m e m o l d , D i c t y o s t e l i u m d i s c o i d e u m , h a s a s e v e n - s u b u n i t o x i d a s e ( B i s s o n e t a l . , 1 9 8 5 ) . P l a n t o x i d a s e s h a v e s e v e n t o n i n e s u b u n i t s ( M a e s h i m a a n d A s a h i , 1 9 8 7 ; H a w k e s f o r d e t a l . , 1 9 8 9 ; P e i f f e r e t a l . , 1 9 9 0 ) , w h i l e b i r d a n d fi s h o x i d a s e s h a v e e l e v e n t o t h i r t e e n ( M e r l e a n d K a d e n b a c h , 1 9 8 0 b ; M o n t e c u c c o e t a l . , 1 9 8 7 ) . O x i d a s e s o f t h e a a 3 - t y p e ( s e e b e l o w ) w i t h s i m i l a r c a t a l y t i c a n d p r o t o n - p u m p i n g a c t i v i t i e s h a v e b e e n p u r i fi e d a n d s t u d i e d f r o m a n u m b e r o f a e r o b i c b a c t e r i a , i n c l u d i n g P a r a c o c c u s d e n i t r i f i c a n s ( S o l i o z e t a l . , 1 9 8 2 ; H a l t i a e t a l . , 1 9 8 8 ) , R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s ( G e n n i s e t a l . , 1 9 8 2 ; H o s l e r e t a l . , 1 9 9 2 ) , B a c i l l u s s u b t i l i s ( S a r a s t e e t a l . , 1 9 9 1 ; L a u r a e u s e t a l . , 1 9 9 1 ) , t h e t h e r m o p h i l i c b a c t e r i a P S 3 ( S o n e a n d Y a n a g i t a , 1 9 8 2 ; S o n e e t a l . , 1 9 9 0 ) a n d T h e r m u s t h e r m o p h i l u s ( F e e e t a l . , 1 9 8 0 ; H o n - n a m i a n d O s h i m a , 1 9 8 4 ; B u s e e t a l . , 1 9 8 9 ) , a n d t h e t h e r m o a c i d o p h i l i c a r c h a e b a c t e r i u m S u l f o l o b u s a c i d o c a l d a r i u s ( A n e m t ' i l l e r a n d S c h a f e r , 1 9 8 9 ) . T h e s u b u n i t c o m p o s i t i o n o f t h e s e b a c t e r i a l e n z y m e s i s m u c h s i m p l e r , c o n t a i n i n g o n l y 2 o r 3 s u b u n i t s w h i c h a r e h o m o l o g o u s t o t h e m i t o c h o n d r i a l l y - e n c o d e d s u b u n i t s o f e u k a r y o t e s . T h e P S 3 ( S o n e e t a l . , 1 9 9 0 ) a n d o n e o f t h e B . s u b t i l i s o x i d a s e s ( S a r a s t e e t a l . , 1 9 9 1 ) h a v e b e e n i s o l a t e d w i t h a f o u r t h s u b u n i t ; t h e P S 3 s e q u e n c e a p p e a r s u n r e l a t e d t o t h e f o u r t h s u b u n i t o f e u k a r y o t i c o x i d a s e s b u t n e v e r t h e l e s s c r o s s r e a c t s w i t h m a m m a l i a n s u b u n i t I V a n t i b o d i e s ( S o n e e t a l . , 1 9 9 0 ) . ' _ . ‘ - l “ I . m . 1 2 5 M a n y a e r o b i c b a c t e r i a c o n t a i n m u l t i p l e t e r m i n a l o x i d a s e s , s o m e o f w h i c h u s e o t h e r h e m e t y p e s o r a c c e p t e l e c t r o n s f r o m u b i q u i n o l s i n s t e a d o f c y t o c h r o m e c . T h e u b i q u i n o l o x i d a s e b o c o m p l e x i n E . c o l i a l s o p u m p s p r o t o n s ( P u u s t i n e n e t a l . , 1 9 8 9 ) a n d s h o w s s t r i k i n g s e q u e n c e h o m o l o g i e s w i t h t h e a a 3 - t y p e o x i d a s e s , p a r t i c u l a r l y i n s u b u n i t I . T h e h e m e 0 s t r u c t u r e i s s i m i l a r t o h e m e A ( P u u s t i n e n a n d W i k s t r o m , 1 9 9 1 ; W u e t a l . , 1 9 9 2 ) w i t h a m e t h y l g r o u p r e p l a c i n g t h e f o r m y l , a n d i t m a y r e p l a c e ( : 3 i n t h e ( r a g e n z y m e o f P . d e n i t r i fl c a n s u n d e r c e r t a i n e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s ( S o n s a n d F u j i w a r a , 1 9 9 1 ) . 5 . 3 . 1 . 1 M i t o c h o n d r i a l s u b u n i t s T h e s e q u e n c e s o f t h e m i t c h o n d r i a l l y - e n c o d e d s u b u n i t s o f o x i d a s e s f r o m d i f f e r e n t s o u r c e s a r e h i g h l y h o m o l o g o u s , w i t h 5 6 % a m i n o a c i d i d e n t i t y b e t w e e n m a m m a l i a n a n d y e a s t s u b u n i t I ( C a p a l d i e t a l . , 1 9 8 6 ) . H o m o l o g y w i t h t h e b a c t e r i a l s e q u e n c e s i s g e n e r a l l y l o w e r , a l t h o u g h R . s p h a e r o i d e s a n d P . d e n i t r i fl c a n s , m e m b e r s o f t h e p u r p l e b a c t e r i a c l a s s f r o m w h i c h m i t o c h o n d r i a a r e t h o u g h t t o h a v e a r i s e n , s h o w a m i n o a c i d i d e n t i t y w i t h t h e m a m m a l i a n s e q u e n c e a l m o s t a s h i g h a s y e a s t , 5 1 % ( S h a p l e i g h a n d G e n n i s , 1 9 9 2 ) a n d 5 4 % ( R a i t i o e t a l . , 1 9 8 7 ; M a t h e r e t a l . , 1 9 9 0 ) r e s p e c t i v e l y . A l l s u b u n i t I s e q u e n c e s t o g e t h e r s h o w o n l y 1 5 % i d e n t i t y w i t h 3 5 s t r i c t l y c o n s e r v e d a m i n o a c i d s . S u b u n i t I f r o m t h e c y t o c h r o m e b o c o m p l e x i s h o m o l o g o u s t o t h o s e f r o m o t h e r b a c t e r i a b u t h a s e x t e n s i o n s a t b o t h t h e N a n d C - t e r m i n i ( C h e p u r i a n d G e n n i s , 1 9 9 0 ) , w h i l e B . s u b t i l u s a a 3 h a s o n l y a C - t e r m i n a l e x t e n s i o n ( S a r a s t e e t a l . , 1 9 9 1 ) . P . d e n i t r i fl c a n s m a y c o n t a i n i s o z y m e s o f c y t o c h r o m e o x i d a s e ; t w o g e n e s f o r s u b u n i t I w h i c h a r e 9 0 % h o m o l o g o u s h a v e b e e n f o u n d ( R a i t i o e t a l . , 1 9 9 0 ) . S u b u n i t I I f r o m s o m e o r g a n i s m s h a s a n N - t e r m i n a l e x t e n s i o n w h i c h i s r e t a i n e d i n b a c t e r i a b u t i s r e m o v e d i n N e u r o s p o r a ( M a c h l e i d t a n d W u 1 ' . . . ‘ 5 fi l l - 3 , 1 W e r n e r , 1 9 7 9 ) , y e a s t ( S e v a r i n o a n d P o y t o n , 1 9 8 0 ) , a n d p e r h a p s p l a n t s ( M a e s h i m a e t a l . , 1 9 8 9 ) . C y t o c h r o m e c c o v a l e n t l y b o u n d t o s u b u n i t I I h a s b e e n f o u n d i n t h e s u b u n i t I V - c o n t a i n i n g B . s u b t i l i s ( S a r a s t e e t a l . , 1 9 9 1 ) o x i d a s e a n d t h e o x i d a s e s o f t h e t h e r m o p h i l i c b a c t e r i a T . t h e r m o p h i l u s ( B u s e e t a l . , 1 9 8 9 ; M a t h e r e t a l . , 1 9 9 0 ) a n d P S 3 ( S o n e a n d Y a n a g i t a , 1 9 8 2 ) ; t h i s a p p e a r s t o b e t h e r e s u l t o f g e n e f u s i o n o f s u b u n i t I I a n d c y t o c h r o m e c . T h e r e i s h i g h h o m o l o g y i n t h e C - t e r m i n a l r e g i o n o f m o s t s u b u n i t s I I w h e r e c y t o c h r o m e c a n d C u p , a r e p r o p o s e d t o b i n d ( s e e b e l o w ) . O n e e x c e p t i o n i s t h e D N A s e q u e n c e o f w h e a t s u b u n i t I I w h i c h p r e d i c t s a n a r g i n i n e i n p l a c e o f a s t r i c t l y c o n s e r v e d c y s t e i n e ( B o n e n e t a l . , 1 9 8 4 ) . R e c e n t l y , h o w e v e r , R N A s e q u e n c i n g h a s s h o w n t h a t t h e c y s t e i n e i s r e s t o r e d ( C o v e l l o a n d G r a y , 1 9 8 9 ) . R N A e d i t i n g n o w a p p e a r s t o b e r e l a t i v e l y c o m m o n i n t h e m i t o c h o n d r i a o f p l a n t s . S u b u n i t I I I h a s b e e n s u g g e s t e d t o h a v e a r o l e i n p r o t o n p u m p i n g b e c a u s e D C C D , w h i c h b i n d s a c i d i c r e s i d u e s i n h y d r o p h o b i c r e g i o n s o f p r o t e i n s , i n h i b i t s p r o t o n p u m p i n g u n d e r c o n d i t i o n s w h e r e p r e d o m i n a n t l y s u b u n i t I I I i s l a b e l l e d ( C a s e y e t a l . , 1 9 8 0 ) . P r o c h a s k a e t a l . ( 1 9 8 1 ) s h o w e d t h a t t h e l a b e l l e d r e s i d u e i s G l u - 9 0 . H o w e v e r , w h e n t h i s r e s i d u e i s m u t a g e n i z e d i n P . d e n i t r i fl c a n s , p r o t o n p u m p i n g a c t i v i t y i s r e t a i n e d ( H a l t i a e t a l . , 1 9 9 1 ) . M o r e o v e r , s u b u n i t I I I - d e p l e t e d m a m m a l i a n o x i d a s e s ( P i i t t n e r e t a l . , 1 9 8 5 ; T h o m p s o n e t a l . , 1 9 8 5 ; S a r t i e t a l . , 1 9 8 5 ; F i n e l a n d W i k s t r b m , 1 9 8 6 ) a s w e l l a s m a n y t w o - s u b u n i t p r e p a r a t i o n s o f b a c t e r i a l o x i d a s e s ( S o l i o z e t a l . , 1 9 8 2 ) p u m p p r o t o n s . A f t e r d e l e t i o n o f t h e s u b u n i t I I I g e n e i n P . d e n i t r i fi c a n s f r e e s u b u n i t I a n d I I a n d o n l y s o m e I - I I c o m p l e x e s a r e f o r m e d , s u g g e s t i n g t h a t s u b u n i t H I p l a y s a r o l e i n e n z y m e a s s e m b l y ( H a l t i a e t a l . , 1 9 8 9 ) . 5 . 3 . 1 . 2 N u c l e a r - e n c o d e d s u b u n i t s T h e N - t e r m i n a l a m i n o a c i d s e q u e n c e s o f a l l t h e n u c l e a r - e n c o d e d s u b u n i t s o f b o v i n e h e a r t a n d y e a s t o x i d a s e h a v e b e e n d e t e r m i n e d . A l l o f t h e n i n e y e a s t s u b u n i t s h a v e h o m o l o g u e s i n t h e t h i r t e e n - s u b u n i t m a m m a l i a n e n z y m e ( w i t h 1 3 — 2 8 % h o m o l o g y ; C a p a l d i e t a l . , 1 9 8 6 ) w h i l e s u b u n i t s V I a , V I b , W e , a n d V I I b a r e u n i q u e t o m a m m a l s . T h e h o m o l o g i e s b e t w e e n t h e s u b u n i t s m o s t l y o c c u r i n s h o r t w e l l - c o n s e r v e d d o m a i n s ( e . g . t h e N - t e r m i n u s o f s u b u n i t V I I a ; C a p a l d i e t a l . , 1 9 8 6 ) w i t h i n o t h e r w i s e d i s s i m i l a r s e q u e n c e s . S u b u n i t V I a c o n t a i n s a c o n s e r v e d c y s t e i n e w h i c h m a y b i n d t h e z i n c a s s o c i a t e d w i t h t h e o x i d a s e ( N a q u i e t a l . , 1 9 8 8 ) . 5 . 3 . 2 T h r e e - d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e A c l e a r u n d e r s t a n d i n g o f t h e t h e t h r e e - d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e o f c y t o c h r o m e o x i d a s e h a s r e m a i n e d e l u s i v e b e c a u s e o f t h e d i f fi c u l t y i n p r o d u c i n g t h r e e - d i m e n s i o n a l c r y s t a l s f r o m m e m b r a n e p r o t e i n s . I n f a c t , o n l y a f e w c r y s t a l s t r u c t u r e s h a v e b e e n d e d u c e d f r o m m e m b r a n e p r o t e i n s , i n c l u d i n g t h e p h o t o s y n t h e t i c r e a c t i o n c e n t e r f r o m R h o d o p s e u d o m o n a s v i r d i s ( D e i s e n h o f e r e t a l . , 1 9 8 5 ) a n d f r o m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s ( C h a n g e t a l . , 1 9 8 6 ; A l l e n e t a l . , 1 9 8 7 ) , a n d t h e b a c t e r i a l p o r i n f r o m R h o d o b a c t e r c a p s u l a t u s ( W e i s s e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h e r e f o r e o n l y t h e g e n e r a l s h a p e o f t h e o x i d a s e h a s b e e n d e d u c e d f r o m t w o - d i m e n s i o n a l c r y s t a l s t r u c t u r e s a t 1 0 — 2 0 A r e s o l u t i o n , w h i l e o t h e r m e t h o d s h a v e h a d t o b e u s e d t o d e t e r m i n e t h e a g g r e g a t i o n s t a t e a n d o r i e n t a t i o n s o f t h e s u b u n i t s . 5 . 3 . 2 . 1 G e n e r a l s h a p e T w o m e t h o d s h a v e p r o d u c e d t w o - d i m e n s i o n a l c r y s t a l s . D e o x y c h o l a t e e x t r a c t i o n o f m i t o c h o n d r i a p r o d u c e s p r o t e i n - r i c h s h e e t s c o n t a i n i n g n o c o n t i n u o u s b i l a y e r . T h e o x i d a s e e x i s t s a s a m o n o m e r l i n e d u p i n ‘ — - | — - ‘ A . w . Z 2 4 : “ a l t e r n a t i n g o r i e n t a t i o n ( F u l l e r e t a l . , 1 9 7 9 ) . T r i t o n X - 1 0 0 t r e a t m e n t o f m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s c a n p r o d u c e fl a t t e n e d v e s i c l e s w i t h p a t c h e s o f o r d e r e d o x i d a s e m o l e c u l e s . E l e c t r o n m i c r o s c o p y o f t h e s e v e s i c l e s w i t h 3 0 A r e s o l u t i o n s h o w e d t h a t t h e o x i d a s e e x i s t s a s a d i m e r w i t h a l l m o l e c u l e s o r i e n t e d t h e s a m e i n t h e m e m b r a n e . T h e m o l e c u l e a p p e a r e d Y - s h a p e d w i t h m o s t o f t h e m o l e c u l a r m a s s i n s i d e t h e v e s i c l e s a t t h e s t e m o f t h e Y ; s u b u n i t - s p e c i fi c a n t i b o d i e s s h o w e d t h a t t h e i n s i d e o f t h e v e s i c l e s c o r r e s p o n d e d t o t h e c y t o p l a s m i c ( C ) s i d e o f t h e o x i d a s e , w h i l e t h e o u t s i d e w a s t h e m a t r i x ( M ) s i d e ( F r e y e t a l . , 1 9 7 8 ) . A n i m p r o v e d i m a g e w a s p r o d u c e d b y D e a t h e r a g e e t a l . ( 1 9 8 2 ) w i t h 2 0 A r e s o l u t i o n , c o n fi r m i n g t h a t s e p a r a t e “ M 1 ” a n d “ M 2 ” d o m a i n s p r o t r u d e f r o m t h e v e s i c l e s . A d d i t i o n a l l y a c l e f t w a s s e e n a t t h e d i m e r i n t e r f a c e i n t h e “ C ” d o m a i n . C a l c u l a t i o n o f a v o l u m e f o r t h e m o l e c u l e i n d i c a t e d a m o l e c u l a r w e i g h t o f 1 1 0 - 1 6 5 k D a p e r m o n o m e r , w h i c h i s m u c h l o w e r t h a n t h e 2 0 4 k D a d e d u c e d f r o m g e n e s e q u e n c e s . M o r e d e t a i l c o u l d b e s e e n i n t h e t h r e e - d i m e n s i o n a l i m a g e r e c o n s t r u c t i o n o f V a l p u e s t a e t a l . ( 1 9 9 0 ) . A n e g a t i v e l y s t a i n e d v e s i c l e c r y s t a l p r e p a r a t i o n a n a l y z e d b y e l e c t r o n c r y o - m i c r o s c o p y p r o v i d e d 1 0 A r e s o l u t i o n . W h i l e t h e o v e r a l l s t r u c t u r e d e d u c e d f r o m p r e v i o u s s t u d i e s w a s v e r i fi e d , a h o l l o w c a v i t y a t t h e c e n t e r o f t h e d i m e r w a s i d e n t i fi e d ( c o r r e s p o n d i n g t o D e a t h e r a g e ’ s c l e f t ) a n d i s p r o p o s e d t o b e t h e c y t o c h r o m e c . b i n d i n g s i t e . A d d i t i o n a l l y , t h e M 1 a n d M 2 d o m a i n s a p p e a r n o t t o s e p a r a t e u n t i l t h e y a r e o u t o f t h e m e m b r a n e . A s b e f o r e , c r o s s - s e c t i o n a l a r e a s c a n a c c o u n t f o r o n l y 1 2 - 1 6 a h e l i c e s d e s p i t e p r e d i c t i o n s o f 2 1 f o r a l l t h e s u b u n i t s c o m b i n e d . T h e a u t h o r s p o i n t o u t t h a t i f o n l y s u b u n i t s I , I I , a n d I I I a r e c o n s i d e r e d , t h e n u m b e r o f s e q u e n c e - p r e d i c t e d h e l i c e s i s c l o s e r t o t h e n u m b e r a l l o w e d b y t h e o b s e r v e d s i z e . H o w e v e r , s i n c e m o l e c u l a r e d g e s a r e fl f ‘ f m ‘ 1 * ' . ‘ " " ¥ " H E - I W W 1 2 9 i m p r e c i s e l y d e t e r m i n e d i n t h i s t y p e o f i m a g e r e c o n s t r u c t i o n , t h e a c t u a l n u m b e r o f h e l i c e s fi t t i n g i n t o t h e p r e d i c t e d s p a c e c o u l d b e m u c h l a r g e r . 5 . 3 . 2 . 2 A g g r e g a t i o n s t a t e T h e a g g r e g a t i o n s t a t e o f a p r e p a r a t i o n c a n b e d e t e r m i n e d b y s e d i m e n t a t i o n e q u i l i b r i u m , g e l fi l t r a t i o n o r r a d i a t i o n i n a c t i v a t i o n ( S u a r e z e t a l . , 1 9 8 4 ) . A s w i t h t h e c r y s t a l l i n e m e m b r a n e p r e p a r a t i o n s d i s c u s s e d a b o v e , c y t o c h r o m e o x i d a s e c a n b e i s o l a t e d a s a d i m e r , a l t h o u g h c e r t a i n d e t e r g e n t s ( a n d h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f o t h e r s ) c a n p r o d u c e a m o n o m e r ( G e o r g e v i c h e t a l . , 1 9 8 3 ; S u a r e z e t a l . , 1 9 8 4 ; R o b i n s o n a n d T a l b e r t , 1 9 8 6 ; F i n e l , 1 9 8 7 ) . C o n d i t i o n s w h i c h r e m o v e s u b u n i t I I I o f t e n m o n o m e r i z e t h e o x i d a s e , s u g g e s t i n g t h a t t h i s s u b u n i t p l a y s a r o l e i n p r o m o t i n g d i m e r i z a t i o n ( G e o r g e v i c h e t a l . , 1 9 8 3 ; F i n e l , 1 9 8 7 ) a l t h o u g h m o n o m e r c o n t a i n i n g s u b u n i t I I I c a n b e p r e p a r e d ( S u a r e z e t a l . , 1 9 8 4 ; F i n e l a n d W i k s t r t i m , 1 9 8 6 ) . I t i s n o t c l e a r w h a t f u n c t i o n a l r o l e t h e d i m e r m i g h t p l a y , s i n c e f o r m a n y o f i t s p r o p o s e d f u n c t i o n s i t h a s b e e n s h o w n t h a t m o n o m e r s a r e s u f fi c i e n t . M o n o m e r s a r e f u l l y c a p a b l e o f e l e c t r o n t r a n s f e r a n d b i p h a s i c k i n e t i c s ( T h o m p s o n a n d F e r g u s o n - M i l l e r , 1 9 8 3 ; S u a r e z e t a l . , 1 9 8 4 ; R o b i n s o n a n d T a l b e r t , 1 9 8 6 ; H a k v o o r t e t a l . , 1 9 8 7 ) . I t h a s a l s o b e e n p r o p o s e d t h a t d i m e r i z a t i o n i s i m p o r t a n t f o r p r o t o n p u m p i n g ( F i n e l a n d W i k s t r o m , 1 9 8 6 ) ; h o w e v e r , s h a r k o x i d a s e , w h i c h a p p e a r s t o e x i s t a s a m o n o m e r u n d e r a l l c o n d i t i o n s s t u d i e d , p u m p s p r o t o n s ( B i c k a r e t a l . , 1 9 8 5 ) . 5 . 3 . 2 . 3 S u b u n i t o r i e n t a t i o n s H y d r o p a t h y p l o t s ( K y t e a n d D o o l i t t l e , 1 9 8 2 ) i d e n t i f y l o n g s t r e t c h e s o f p r e d o m i n a n t l y h y d r o p h o b i c r e s i d u e s w h i c h a r e l i k e l y t o f o r m t r a n s m e m b r a n e a h e l i c e s i n t h e m e m b r a n e . O n t h i s b a s i s , s u b u n i t I i s p r e d i c t e d t o h a v e t w e l v e h e l i c e s , s u b u n i t I I t w o a n d s u b u n i t I I I s i x t o s e v e n . I n a d d i t i o n , t h e b o v i n e s u b u n i t s I V , V I a c , V I I a , b , c , a n d V I I I a r e 1 3 0 p r e d i c t e d t o h a v e t r a n s m e m b r a n e h e l i c e s , w h i l e s u b u n i t s V a , V b , a n d V I b d o n o t h a v e o b v i o u s m e m b r a n e - s p a n n i n g r e g i o n s ( C a p a l d i e t a l . , 1 9 8 6 ) a n d d o n o t r e a c t w i t h l i p o p h i l i c r e a g e n t s ( C e r l e t t i a n d S c h a t z , 1 9 7 9 ; B i s s o n e t a l . , 1 9 7 9 ) . T h i s t o t a l s 2 8 t r a n s m e m b r a n e h e l i c e s , a n d a s m e n t i o n e d a b o v e , t h i s n u m b e r o f h e l i c e s c a n n o t fi t i n t o t h e a r e a i n t h e m e m b r a n e t h a t c a n b e c a l c u l a t e d fi ' o m t h e c u r r e n t 3 - D m o d e l ( V a l p u e s t a e t a l . , 1 9 9 0 ) . C h e p u r i a n d G e n n i s ( 1 9 9 0 ) e x a m i n e d t h e o r i e n t a t i o n o f s u b u n i t I o f t h e c y t o c h r o m e b o c o m p l e x i n t h e m e m b r a n e b y r a n d o m g e n e f u s i o n s w i t h a l k a l i n e p h o s p h a t a s e o r B - g a l a c t o s i d a s e . E x t r a m e m b r a n e l o o p s c o u l d t h e n b e l o c a l i z e d t o e i t h e r s i d e o f t h e m e m b r a n e b y a s s a y i n g f o r m a r k e r e n z y m e a c t i v i t y . S i n c e t h e s e q u e n c e o f c y t o c h r o m e o i s s o s i m i l a r t o s u b u n i t I o f t h e d o g o x i d a s e s , t h e i r r e s u l t s h a v e b e e n i n t e r p r e t e d t o c o n fi r m t h e 1 2 - h e l i x m o d e l o f s u b u n i t I . T h e s e g e n e f u s i o n e x p e r i m e n t s a l s o c o n fi r m e d t h e b a s i c t o p o l o g y o f s u b u n i t I I a s w e l l . H y d r o p a t h y p l o t s p r e d i c t 2 t r a n s m e m b r a n e h e l i c e s ( t h e s e c o n d o f w h i c h c o n t a i n s a l a r g e n u m b e r o f c o n s e r v e d r e s i d u e s ) f o r m i n g a h a i r p i n n e a r t h e N - t e r m i n u s w i t h a l a r g e e x t r a m e m b r a n o u s C - t e r m i n a l d o m a i n w h i c h w a s d e m o n s t r a t e d t o b e o n t h e c y t o p l a s m i c s i d e o f t h e m e m b r a n e b y l a b e l l i n g e x p e r i m e n t s ( r e v i e w e d i n C a p a l d i e t a l . , 1 9 8 3 ) o f t h e c y t o c h r o m e c b i n d i n g s i t e . T h e l o o p o f t h e h a i r p i n w a s s h o w n t o b e i n t h e m i t o c h o n d r i a l m a t r i x ( i n s i d e t h e b a c t e r i a l c e l l ) b y p r o t e a s e a c c e s s i b i l i t y e x p e r i m e n t s ( F i n e l , 1 9 8 8 ) . S u b u n i t I I I , p r e d i c t e d t o h a v e s e v e n t r a n s m e m b r a n e h e l i c e s , i s t h o u g h t t o f o r m a s o m e w h a t i n d e p e n d e n t d o m a i n b a s e d o n t h e r m a l d e n a t u r a t i o n s t u d i e s ( M o r i n e t a i , 1 9 9 0 ) a n d i t s e a s e o f r e m o v a l b y m i l d c o n d i t i o n s ( s e e a b o v e ) . T h e o r i e n t a t i o n s o f t h e m a m m a l i a n s u b u n i t s h a v e b e e n i n v e s t i g a t e d b y c h e m i c a l l a b e l l i n g a n d p r o t e a s e d i g e s t i o n ( Z h a n g e t a l . , 1 9 8 4 ; M a l a t e s t a e t a 1 , 1 9 8 3 ; J a r a u s c h a n d K a d e n a c h , 1 9 8 5 b ; Z h a n g e t a l . , 1 9 8 8 ; Z h a n g e t a l . , - i s “ A s - I ' D ? ? ? ” I I , n ¢ i ‘ - — ' - m u m 1 3 1 1 9 9 1 ) . M o s t o f t h e s e s t u d i e s h a v e c o n fi r m e d t h e t r a n s m e m b r a n e p r e d i c t i o n s o f t h e h y d r o p a t h y p l o t s a n d h a v e i n d i c a t e d w h i c h s i d e o f t h e m e m b r a n e e x p o s e s t h e N a n d C - t e r m i n i ( s e e C a p a l d i , 1 9 9 0 a f o r r e v i e w ) . N e a r - n e i g h b o r r e l a t i o n s h i p s o f t h e s u b u n i t s h a v e b e e n s t u d i e d b y c r o s s l i n k i n g . S i n c e I V , V a , V b , V I c a r e t h e f o u r s u b u n i t s c o m m o n t o a l l e u k a r y o t e s ( e x c e p t p l a n t s ) , i t m i g h t b e e x p e c t e d t h a t t h e y w o u l d i n t e r a c t w i t h t h e m i t o c h o n d r i a l l y - e n c o d e d s u b u n i t s , w h i c h i s c o n fi r m e d b y t h e c r o s s - l i n k i n g d a t a ( B r i g g s a n d C a p a l d i , 1 9 7 7 ; B r i g g s a n d C a p a l d i , 1 9 7 8 ; J a r a u s c h a n d K a d e n b a c h , 1 9 8 5 a ) . U n f o r t u n a t e l y , i n t e r p r e t a t i o n o f t h e r e s u l t s o f t h e s e s t u d i e s i s v e r y d i f fi c u l t . b e c a u s e o f t h e d i f f e r e n t g e l s y s t e m s u s e d i n t h e s t u d i e s , s o m e o f w h i c h w e r e u n a b l e t o r e s o l v e a l l 1 3 s u b u n i t s . 5 . 3 . 3 P r o s t h e t i c g r o u p s C y t o c h r o m e o z n ' d a s e c o n t a i n s t w o i r o n s a n d a t l e a s t t w o c o p p e r s . T h e i r o n s a r e b o t h i n s e r t e d i n t h e p o r p h y r i n r i n g ' o f a h e m e A , w h i c h i s d i s t i n g u i s h e d f r o m o t h e r h e m e t y p e s b y i t s f o r m y l i n p o s i t i o n 8 a n d a n i s o p r e n o i d c h a i n i n p o s i t i o n 2 . T h e h e m e s h a v e b e e n d e s i g n a t e d h e m e s a a n d a 3 ( h e n c e c y t o c h r o m e c o x i d a s e i s o f t e n r e f e r r e d t o a s c y t p c h r o m e 0 0 3 ) , t h e l a t t e r b i n d i n g 0 2 a n d p o i s o n o u s l i g a n d s s u c h a s H C N , C O , a n d H N 3 ( K e i l i n a n d H a r t r e e , 1 9 3 9 ) . T h e s e h e m e s p r o d u c e c y t o c h r o m e o x i d a s e ’ s c h a r a c t e r i s t i c v i s i b l e a b s o r p t i o n s p e c t r a : i n t h e S o r e t r e g i o n o f t h e b e e f h e a r t c y t o c h r o m e o x i d a s e s p e c t r u m , a b r o a d p e a k c e n t e r e d a t 4 2 1 n m i n t h e o x i d i z e d s t a t e a n d a n a r r o w e r p e a k a t 4 4 3 n m i n t h e r e d u c e d s t a t e r e s u l t s f r o m t h e e q u a l , a d d i t i v e c o n t r i b u t i o n s f r o m h e m e a ( A m a x = 4 2 6 / 4 4 4 n m , o x / r e d ) a n d a 3 ( l m a x = 4 1 4 / 4 4 2 . 5 n m , o x / r e d ) w h e r e a s h e m e a c o n t r i b u t e s 8 0 % t o t h e a b a n d a t 6 0 5 n m i n t h e r e d u c e d e n z y m e ( V a n n e s t e , 1 9 6 6 ) . O n e o f t h e c o p p e r i o n s i s d e s i g n a t e d C u A ; w h e n o x i d i z e d i t p r o d u c e s a b r o a d v i s i b l e ’ r ‘ ” w u 1 . . fl ‘ . I ’ v 1 3 2 a b s o r p t i o n c e n t e r e d a t 8 3 0 n m ( W h a r t o n a n d T z a g o l o fi ‘ , 1 9 6 4 ; B e i n e r t e t a l . , 1 9 8 0 ) a n d a c h a r a c t e r i s t i c e l e c t r o n p a r a m a g n e t i c r e s o n a n c e ( E P R ) s i g n a l a t g = 2 . 0 3 ( B e i n e r t e t a l . , 1 9 6 2 ; A a s a e t a l . , 1 9 7 6 ) w h i c h d i s t i n g u i s h e s c y t o c h r o m e o x i d a s e f r o m m a n y o t h e r c o p p e r - c o n t a i n i n g p r o t e i n s . A n o t h e r c o p p e r i s d e s i g n a t e d C u } ; a n d i s E P R - u n d e t e c t a b l e . T h e h e m e a a n d C u A h a v e a r o l e i n a c c e p t i n g e l e c t r o n s f r o m c y t o c h r o m e c a n d h a v e b e e n s h o w n t o b e l o c a t e d n e a r t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e f a c e ( R i c h e t a l . , 1 9 8 8 ; O h n i s h i e t a l . , 1 9 8 5 ) . H e m e a 3 a n d C u } ; a r e m a g n e t i c a l l y c o u p l e d a n d f o r m a “ b i n u c l e a r c e n t e r ” p o s s i b l y l o c a t e d m o r e d e e p l y i n t h e m e m b r a n e ( O h n i s h i e t a l . , 1 9 8 5 ) . R e c e n t s t r u c t u r a l m o d e l s , h o w e v e r , p l a c e t h e t w o h e m e s a t s i m i l a r d e p t h s i n t h e m e m b r a n e ( S h a p l e i g h e t a l . , 1 9 9 2 ) . I n a d d i t i o n t o t h e t w o c o p p e r s a n d t w o i r o n s t h o u g h t t o b e c a t a l y t i c a l l y a c t i v e , o n e z i n c a n d o n e m a g n e s i u m p e r m o n o m e r , a n d o n e a d d i t i o n a l c o p p e r p e r d i m e r w a s f o u n d i n t h e b o v i n e h e a r t o x i d a s e w i t h i n d u c t i v e l y - c o u p l e d ( E i n a r s d o t t i r a n d C a u g h e y , 1 9 8 4 , 1 9 8 5 ) o r d i r e c t c u r r e n t ( P a n e t a l . , 1 9 9 1 a ) p l a s m a a t o m i c e m i s s i o n s p e c t r o s c o p y ( A E S ) . O t h e r g r o u p s c a l c u l a t e d t h a t c y t o c h r o m e o x i d a s e c o n t a i n e d o n e a d d i t i o n a l c o p p e r p e r m o n o m e r , n o t d i m e r , i n b o v i n e h e a r t a n d P a r a c o c c u s d e n i t r i fi c a n s e n z y m e b y u s i n g i n d u c t i v e l y - c o u p l e d p l a s m a A E S ( S t e fl ' e n s a n d B u s e , 1 9 8 7 ) a s w e l l a s i n d i f f e r e n t t i s s u e s o f s e v e r a l m a m m a l s b y p r o t o n - i n d u c e d X - r a y e m i s s i o n ( B o m b e l k a e t a l . , 1 9 8 6 ) , a n d i n b o v i n e h e a r t w i t h e n e r g y d i s p e r s i v e X - r a y fl u o r e s c e n c e ( O b l a d e t a l . , 1 9 8 9 ) . T h i s c o p p e r h a s b e e n d e s i g n a t e d “ C u x ” . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h i s c o p p e r i s “ a d v e n t i t i o u s ” s i n c e f u l l y f u n c t i o n a l o x i d a s e c a n b e p r e p a r e d l a c k i n g i t ( Y . L i e t a l . , 1 9 8 7 ) ; h o w e v e r , s o m e o t h e r a t t e m p t s t o r e m o v e t h e c o p p e r b y d i a l y s i s a g a i n s t c h e l a t i n g a g e n t s f a i l e d ( Y e w e y a n d C a u g h e y , 1 9 8 8 ) . I n c o n t r a s t t o e a r l i e r r e p o r t s t h a t s u b u n i t I I I c o u l d b e r e m o v e d w i t h n o c h a n g e o f m e t a l c o n t e n t ( Y e w e y a n d 1 3 3 C a u g h e y , 1 9 8 7 ) , P a n e t a l . ( 1 9 9 1 a ) r e p o r t t h a t C u x i s r e m o v e d b y m o n o m e r i z a t i o n o f t h e e n z y m e o r s u b u n i t I I I r e m o v a l , s u g g e s t i n g t h a t C u x a s s o c i a t e s w i t h s u b u n i t I I I a n d m a y p l a y a r o l e i n d i m e r i z a t i o n . T h e r o l e s o f t h e z i n c a n d m a g n e s i u m r e m a i n e d u n d e fi n e d . Z i n c c o u l d n o t b e r e m o v e d b y d i a l y s i s a g a i n s t E D T A ( N a q u i e t a l . , 1 9 8 8 ; Y e w e y a n d C a u g h e y , 1 9 8 8 ) , b u t c o u l d b e p a r t i a l l y r e m o v e d b y v a r i o u s c h e m i c a l t r e a t m e n t s w i t h l i t t l e o r n o l o s s i n a c t i v i t y , s u g g e s t i n g a s t r u c t u r a l r o l e ( N a q u i e t a l . , 1 9 8 8 ; M o u b a r e k e t a l . , 1 9 8 7 ) . A r o l e f o r z i n c i n d i o x y g e n r e d u c t i o n a n d p r o t o n t r a n s l o c a t i o n h a s b e e n s u g g e s t e d ( E i n a r s d o t t i r e t a l . , 1 9 8 8 ; Y o s h i k a w a a n d C a u g h e y , 1 9 9 0 ) a l t h o u g h t h e r e i s n o e v i d e n c e f o r t h i s . M a g n e s i u m i s p r o p o s e d t o a s s o c i a t e w i t h a n A T P w h i c h b i n d s t o t h e c o m p l e x ( Y e w e y a n d C a u g h e y , 1 9 8 7 ) . 5 . 3 . 3 . 1 C u A s i t e H o m o l o g y b e t w e e n a r e g i o n o f s u b u n i t I I a n d b l u e c o p p e r p r o t e i n s s u c h a s a z u r i n a n d p l a s t o c y a n i n w a s fi r s t n o t i c e d b y S t e f f e n s a n d B u s e ( 1 9 7 9 ) w h o t h e r e f o r e s u g g e s t e d t h a t s u b u n i t I I m i g h t c o n t a i n t h e C u A s i t e . B l u e c o p p e r p r o t e i n s c o n t a i n a c y s t e i n e f o l l o w e d a f e w a m i n o a c i d s l a t e r b y a h i s t i d i n e w i t h a m e t h i o n i n e a f e w r e s i d u e s b e y o n d . A h i s t i d i n e e a r l i e r i n t h e s e q u e n c e i s o f t e n u s e d i n t h e b l u e c o p p e r s i t e . I n c y t o c h r o m e o x i d a s e , C y s - 1 9 6 a n d 2 0 0 a r e c o n s e r v e d , a s w e l l a s H i s - 2 0 4 a n d M e t - 2 0 7 , i n a n a l o g y t o t h e b l u e c o p p e r p r o t e i n s . I n a d d i t i o n , I - I i s - 1 6 2 i s a l s o i n v a r i a n t , p e r h a p s p r o v i d i n g a n o t h e r l i g a n d f o r C u A . N o n e o f t h e s e r e s i d u e s i s c o n s e r v e d i n n o n - C u A - c o n t a i n i n g o x i d a s e s s u c h a s c y t o c h o m e b e i n E . c o l i . a n d t h e 0 0 3 - t y p e q u i n o l o x i d a s e s i n B . s u b t i l i s ( L a u r a e u s e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h e u n i q u e E P R s p e c t r u m o f c y t o c h r o m e o x i d a s e a t t r i b u t a b l e t o C u A ( B e i n e r t e t a l . , 1 9 6 2 ) i s d i s s i m i l a r t o t h a t o f t h e b l u e c o p p e r p r o t e i n s . T h e r e f o r e , a l t h o u g h o n l y o n e c y s t e i n e l i g a n d i s p r o p o s e d f o r b l u e c o p p e r “ . x “ . " a s A U p r o t e i n s , t w o w e r e p r o p o s e d f o r c y t o c h r o m e o x i d a s e b a s e d o n c h e m i c a l m o d i fi c a t i o n s t u d i e s ( M a n n a n d A u e r , 1 9 8 0 ; D a r l e y - U s m a r e t a l . , 1 9 8 1 ; V e r h e u l e t a l . , 1 9 8 2 ) . A n u m b e r o f s p e c t r o s c o p i c s t u d i e s s u p p o r t t h e s e p r e d i c t i o n s . C h a n g e s i n e l e c t r o n - n u c l e a r d o u b l e r e s o n a n c e ( E N D O R ) s p e c t r a u s i n g y e a s t o x i d a s e w i t h i n c o r p o r a t e d 1 5 N - I - I i s a n d 2 H - C y s i n d i c a t e d t h a t a t l e a s t o n e h i s t i d i n e a n d o n e c y s t e i n e w e r e l i g a n d s o f G u y ; ( S t e v e n s e t a l . , 1 9 8 2 ) . U s i n g 1 3 C - C y s , M a r t i n e t a l . ( 1 9 8 8 ) c o n c l u d e d t h a t t w o s y m m e t r i c c y s t e i n e s c o u l d e x p l a i n t h e E N D O R d a t a . E x t e n d e d X - r a y a b s o r p t i o n fi n e s t r u c t u r e ( E X A F S ) c o n fi r m e d p r e v i o u s h y p o t h e s e s , d e m o n s t r a t i n g t w o s u l f u r a n d fi v e o r s i x n i t r o g e n o r o x y g e n l i g a n d s f o r b o t h c o p p e r s t o g e t h e r ( S c o t t e t a l . , 1 9 8 6 ) . T h e c o n t r i b u t i o n s o f t h e t w o c o p p e r s w e r e d e c o n v o l u t e d b y r e m o v i n g t h e C u A b y c h e m i c a l m o d i fi c a t i o n , l e a v i n g C u B ( P . M . L i e t a l . , 1 9 8 7 ) . T h u s G u y ; w a s s h o w n t o h a v e t w o s u l f u r a n d t w o n i t r o g e n o r o x y g e n l i g a n d s . H o w e v e r , a b a g o x i d a s e ( c a t a l y z i n g c y t o c h r o m e c o x i d a t i o n ) p u r i fi e d f r o m T h e r m u s t h e r m o p h i l u s a s a s i n g l e p o l y p e p t i d e w a s f o u n d t o h a v e o n l y o n e c y s t e i n e b u t a n o r m a l C u A ( E P R ) s p e c t r u m ( Z i m m e r m a n e t a l . , 1 9 8 8 ) . M o r e r e c e n t e v i d e n c e i n d i c a t e s t h a t t h e o x i d a s e i s c o d e d f o r b y g e n e s f o r s u b u n i t s h o m o l o g o u s t o I , I I , a n d I I I o f t h e e u k a r y o t i c o x i d a s e w i t h a c o n s e r v e d C u A s i t e i n s u b u n i t I I ( K e i g h t l e y e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h e r e f o r e , m o s t m o d e l s o f t h e C u A s i t e a r e c o n s t r u c t e d u s i n g t w o c y s t e i n e s a n d t w o h i s t i d i n e s ( H o l m e t a l . , 1 9 8 7 ) o r t w o c y s t e i n e s , o n e h i s t i d i n e a n d o n e m e t h i o n i n e ( C o v e l l o a n d G r a y , 1 9 9 0 ) . T h e C u A s i t e o f c y t o c h r o m e o x i d a s e h a s a l w a y s b e e n t h o u g h t t o b e “ u n i q u e ” b a s e d o n i t s s p e c t r o s c o p y a n d l i g a n d i n g . R e c e n t l y t h o u g h , n i t r o u s o x i d e r e d u c t a s e , t h e t e r m i n a l o x i d a s e i n t h e d e n i t r i fi c a t i o n p a t h w a y o f b a c t e r i a , h a s b e e n c l o n e d a n d p u r i fi e d f r o m P s e u d o m o n a s s t u t z e r i a n d i s f o u n d t o h a v e s e q u e n c e h o m o l o g y t o t h e p r o p o s e d C u A s i t e o f c y t o c h r o m e r ! i i l ‘ 3 L L “ A ‘ L ‘ o x i d a s e ( V i e b r o c k a n d Z u m f t , 1 9 8 8 ) . M o r e o v e r , E P R , m a g n e t i c c i r c u l a r d i c h r o i s m ( M C D ) , a n d E X A F S s p e c t r a w e r e a l l s i m i l a r ( S c o t t e t a l . , 1 9 8 9 ) , s u g g e s t i n g a s i m i l a r C u A e n v i r o n m e n t b e t w e e n t h e t w o e n z y m e s . K r o n e c k e t a l . ( 1 9 8 8 , 1 9 9 0 ) i n t e r p r e t l o w f r e q u e n c y E P R d a t a t o i n d i c a t e a C u - C u i n t e r a c t i o n i n b o t h e n z y m e s , w h i c h c a n n o t b e r u l e d o u t i n v i e w o f t h e e v i d e n c e f o r C u x i n c y t o c h r o m e o x i d a s e . T h e p r o p o s e d C u A s i t e h a s b e e n s h o w n t o b e o n t h e c y t o p l a s m i c s i d e o f t h e m e m b r a n e n e a r s e v e r a l a c i d i c r e s i d u e s p r e d i c t e d t o b e i n v o l v e d i n c y t o c h r o m e c b i n d i n g ( M i l l e t t e t a l . , 1 9 8 3 ) . R i c h e t a l . ( 1 9 8 8 ) h a v e s u p p o r t e d t h i s p e r i p h e r a l l o c a t i o n b y t h e i r fi n d i n g t h a t C u p , i s o n l y 1 0 % o r l e s s i n t o t h e m e m b r a n e d i e l e c t r i c . 5 . 3 . 3 . 2 H e m e a a n d b i n u c l e a r c e n t e r E v i d e n c e c o n c e r n i n g t h e s i t e s o f h e m e a a n d t h e b i n u c l e a r c e n t e r ( h e m e a 3 a n d G u n ) h a s b e e n d e r i v e d f r o m t w o m a i n s o u r c e s . T h e i d e n t i t y o f t h e r e s i d u e s l i g a t i n g t h e s e c e n t e r s h a s b e e n , d e t e r m i n e d b y v a r i o u s s p e c t r o s c o p i e s , w h i l e t h e l o c a t i o n o f t h e s e r e s i d u e s h a s b e e n d e d u c e d f r o m s i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s e x p e r i m e n t s a n d a n a l y s i s o f c o n s e r v e d r e s i d u e s . T h e h e m e a i r o n i s l o w s p i n a n d s i x - c o o r d i n a t e d : f o u r n i t r o g e n o u s l i g a n d s f r o m t h e h e m e r i n g , a n d t w o h i s t i d i n e l i g a n d s f r o m t h e p r o t e i n , a s s h o w n b y R a m a n ( B a b c o c k e t a l . , 1 9 8 1 ) , E X A F S ( P o w e r s e t a l . , 1 9 8 1 ) ; M C D ( C a r t e r a n d P a l m e r , 1 9 8 2 ) , a n d E N D O R ( M a r t i n e t a l . , 1 9 8 5 ) s p e c t r o s c o p y . H e m e a 3 i r o n i s h i g h s p i n a n d s i x - c o o r d i n a t e w h e n o x i d i z e d a n d fi v e - c o o r d i n a t e w h e n r e d u c e d ( B a b c o c k e t a l . , 1 9 8 1 ) . T h e c o o r d i n a t i o n p o s i t i o n n o t a t t r i b u t a b l e t o t h e h e m e r i n g , t h e fi f t h , o r “ a x i a l ” p o s i t i o n , i s l i g a t e d b y h i s t i d i n e , a s d e t e r m i n e d b y E P R ( B l o k z i l - H o m a n a n d v a n G e l d e r , 1 9 7 1 ; S t e v e n s a n d C h a n , 1 9 8 1 ) , R a m a n ( B a b c o c k e t a l . , 1 9 8 1 ) , a n d E X A F S ( P o w e r s e t a l . , 1 9 8 1 ) s p e c t r o s c o p i e s . T h e s i x t h p o s i t i o n , a b r i d g i n g l i g a n d b e t w e e n 9 « 2 9 . 3 : 5 0 1 * _ ) l J . n I — e s u m . ‘ a L i . I — G i M h e m e 0 3 a n d C u } ; r e m a i n s u n i d e n t i fi e d , b u t i t h a s b e e n p r o p o s e d t o b e s u l f u r o r c h l o r i d e ( P o w e r s e t a l . , 1 9 8 2 ; R M . L i e t a l . , 1 9 8 7 ; S c o t t e t a l . , 1 9 8 8 ) i n t h e o x i d i z e d s t a t e o r H 2 0 o r O H - u n d e r t u r n o v e r c o n d i t i o n s ( C l i n e e t a l . , 1 9 8 3 ) . C u } ; i s E P R - i n v i s i b l e i n t h e o x i d i z e d s t a t e , b u t s i g n a l s f r o m t h e p a r t i a l l y r e d u c e d c e n t e r a l l o w e d t h r e e n i t r o g e n o u s l i g a n d s t o b e i d e n t i fi e d u s i n g E N D O R s p e c t r o s c o p y ( C l i n e e t a l . , 1 9 8 3 ) . E X A F S s p e c t r a o n C u A - d e p l e t e d e n z y m e v e r i f y t h i s r e s u l t ( P . M . L i e t a l . , 1 9 8 7 ) , a l t h o u g h p r e l i m i n a r y E X A F S r e s u l t s f r o m c y t o c h r o m e b e , w h i c h l a c k s t h e p o t e n t i a l l y i n t e r f e r i n g C u A , s u g g e s t t w o n i t r o g e n s a n d a s u l f u r a s C u B l i g a n d s ( I n g l e d e w a n d B a c o n , 1 9 9 1 ) , a p o s s i b i l i t y a l s o r a i s e d b y S c o t t e t a l . ( 1 9 8 6 ) . T h e s u l f u r c o u l d p e r h a p s c o r r e s p o n d t o t h e b r i d g i n g l i g a n d m e n t i o n e d a b o v e ; h o w e v e r , t h e r e a r e n o c o n s e r v e d c y s t e i n e s i n s u b u n i t I , t h e p r e s u m e d b i n d i n g s i t e ( s e e b e l o w ) , a n d m e t h i o n i n e h a s t h e r e f o r e b e e n s u g g e s t e d ( H a l t i a a n d W i k s t r o m , 1 9 9 2 ) . T h e l o c a t i o n s o f t h e s e l i g a n d i n g r e s i d u e s w a s l i m i t e d t o s u b u n i t I a n d I I b y t h e p u r i fi c a t i o n o f a c t i v e t w o - s u b u n i t o x i d a s e f r o m P a r a c o c c u s d e n i t r i fl c a n s ( L u d w i g a n d S c h a t z , 1 9 8 0 ) w h i c h c o n t a i n e d a l l f o u r m e t a l s . W i n t e r e t a l . ( 1 9 8 0 ) i n i t i a l l y p l a c e d h e m e a i n s u b u n i t I I w i t h C u A b a s e d o n a n a l y s i s o f e l e c t r o p h o r e t i c a l l y — p u r i fi e d s u b u n i t s ; h o w e v e r , i t i s n o w g e n e r a l l y a c c e p t e d t h a t b o t h h e m e s a n d C u } ; r e s i d e i n s u b u n i t I , w h i l e o n l y C u A r e s i d u e s i n s u b u n i t I I ( S a r a s t e , 1 9 9 0 ; S h a p l e i g h e t a l . , 1 9 9 2 ; H a l t i a a n d W i k s t r o m , 1 9 9 2 ) s i n c e t h e r e a r e i n s u f fi c i e n t c o n s e r v e d h i s t i d i n e s i n s u b u n i t I I t o l i g a t e b o t h h e m e a a n d C u A . A s o x i d a s e s f r o m m a n y s o u r c e s w e r e s e q u e n c e d , p r e d i c t i o n s o f t r a n s m e m b r a n e h e l i c e s ( b y h y d r o p a t h y p l o t ) a l o n g w i t h a s h o r t e n i n g l i s t o f c o n s e r v e d r e s i d u e s p r o v i d e d t o o l s t o m o d e l b u i l d e r s . W i k s t r o m e t a l . ( 1 9 8 5 ) o b s e r v e d a w e a k h o m o l o g y b e t w e e n r e g i o n s 1 3 7 o f s u b u n i t I a n d s e v e r a l h e m o g l o b i n s a n d b a s e d a m o d e l o f h e m e a 3 a n d C u } ; l i g a n d i n g o n i t . H o l m e t a l . ( 1 9 8 7 ) a t t e m p t e d t o fi t t h e l i g a n d s o n t o t h r e e h e l i c e s ( V I , V I I , a n d X ) w i t h t w o c o n s e r v e d h i s t i d i n e s e a c h . H o w e v e r , t h i s m o d e l n e e d e d t o b e u p d a t e d b e c a u s e o n e h e m e a l i g a n d w a s n o l o n g e r f o u n d t o b e c o n s e r v e d . T h e S a r a s t e ( 1 9 9 0 ) m o d e l c o u n t e d o n o n l y 7 i n v a r i a n t h i s t i d i n e s a n d a d d e d h e l i x I I t o r e p l a c e t h e l o s t h e m e a l i g a n d . A d d i t i o n a l l y , o t h e r l i g a n d s w e r e e x c h a n g e d t o i n c r e a s e t h e F e - F e d i s t a n c e . N o n e o f t h e s e m o d e l s w e r e b a s e d o n e x p e r i m e n t a l e v i d e n c e , a n d s h i f t i n g o f r e s i d u e s i n a n d o u t o f p r e d i c t e d t r a n s m e m b r a n e h e l i c e s m a d e c o m p a r i s o n s d i f fi c u l t . T h e r e c e n t w o r k o f S h a p l e i g h e t a l . ( 1 9 9 2 ) [ s e e a l s o M i n a g a w a e t a l . ( 1 9 9 2 ) , a n d L e m i e u x e t a l . ( 1 9 9 2 ) ] p r e d i c t s a m o d e l b a s e d o n c h a n g e s i n s p e c t r o s c o p i c p r o p e r t i e s o f s i t e - d i r e c t e d m u t a n t s o f c y t o c h r o m e a a 3 - t y p e o x i d a s e f r o m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s , w h i c h i s h i g h l y h o m o l o g o u s t o t h e m a m m a l i a n e n z y m e ( s e e 5 . 3 . 1 . 1 a n d H o s l e r e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h e a u t h o r s m u t a t e d e a c h o f t h e c o n s e r v e d h i s t i d i n e s a n d p u r i fi e d t h e m u t a n t o x i d a s e s f o r v i s i b l e a n d R a m a n s p e c t r o s c o p i c s t u d i e s . A l l o f t h e m u t a n t s e x c e p t t h e H i s - 4 1 1 ( i n t h e R . s p h a e r o i d e s n u m b e r i n g s y s t e m ) , w h i c h i s o u t o f t h e m e m b r a n e i n t h i s m o d e l , w e r e i n a c t i v e , s u g g e s t i n g t h a t H i s - 4 1 1 i s n o t a m e t a l l i g a n d . T h e v i s i b l e 6 0 5 n m p e a k a t t r i b u t a b l e t o h e m e a w a s d i s r u p t e d i n H i s - 1 0 2 ( h e l i x I I , B H 6 1 ) a n d H i s - 4 2 1 ( h e l i x X , B H 3 7 8 ) m u t a n t s , b u t n o t i n t h e o t h e r s , i n d i c a t i n g t h a t t h e f o r m e r a r e t h e h e m e a l i g a n d s . T h e r e m a i n i n g l i g a n d s w e r e a s s i g n e d b a s e d o n t h e f e a t u r e s o f t h e r e s o n a n c e R a m a n s p e c t r a a n d s t r u c t u r a l a n a l y s i s . A c c o r d i n g t o t h e m o d e l , h e m e a 3 i s l i g a n d e d b y H i s - 2 8 4 ( h e l i x V I , B H 2 4 0 ) , w h i l e t h e t h r e e C u B l i g a n d s a r e H i s - 3 3 3 , H i s - 3 3 4 ( h e l i x V I I , B H 2 9 0 , 2 9 1 ) a n d H i s - 4 1 9 ( h e l i x X , B H 3 7 6 ) . l ‘ I 1 a - . m ’ W u ' n 1 3 8 H a l t i a a n d W i k s t r o m ( 1 9 9 2 ) u s e t h e s a m e s e t o f l i g a n d s a s S h a p l e i g h e t a l . ( 1 9 9 2 ) b u t s h i f t t h e p o s i t i o n s o f t h e h e l i c e s s l i g h t l y . T h e p l a n e s o f t h e t w o h e m e s a r e p e r p e n d i c u l a r i n t h i s m o d e l , a s o p p o s e d t o b e i n g n e a r l y c o p l a n a r i n o t h e r m o d e l s , a c c o u n t i n g f o r t h e r e l a t i v e l y s l o w e l e c t r o n t r a n s f e r b e t w e e n t h e m m e a s u r e d b y M o o d y e t a l . ( 1 9 9 1 ) . H e l i x V I I I h a s b e e n a d d e d t o t h e i r m o d e l ( f a c i n g t h e C u } ; s i t e ) b e c a u s e i t c o n t a i n s a l a r g e n u m b e r o f c o n s e r v e d r e s i d u e s t h a t h a v e h y d r o g e n - b o n d i n g c a p a c i t y a n d c o u l d b e i n v o l v e d i n p r o t o n a t i o n o f 0 2 r e d u c t i o n i n t e r m e d i a t e s o r p r o t o n p u m p i n g . 5 . 4 F u n c t i o n 5 . 4 . 1 I n t e r a c t i o n w i t h c y t o c h r o m e c T h e m o b i l e o n e - e l e c t r o n c a r r i e r c y t o c h r o m e c i s r e d u c e d b y c y t o c h r o m e c r e d u c t a s e ( b c l ) a n d t h e n d o n a t e s i t s e l e c t r o n t o c y t o c h r o m e o x i d a s e . A r e g i o n o f l y s i n e s o n o n e f a c e o f t h e g l o b u l a r c y t o c h r o m e c m o l e - c u l e h a s b e e n s h o w n t o i n t e r a c t w i t h c y t o c h r o m e o x i d a s e ( F e r g u s o n - M i l l e r e t a l . , 1 9 7 6 , 1 9 7 8 ; O s h e r o f f e t a l . , 1 9 8 0 ) i n a n i o n i c - s t r e n g t h d e p e n d e n t m a n n e r ( F e r g u s o n - M i l l e r e t a l . , 1 9 7 6 ) . T h e a r e a o f i n t e r a c t i o n h a s b e e n l o c a l i z e d t o s e v e r a l c a r b o x y l s o n t h e C - t e r m i n a l d o m a i n o f s u b u n i t I I . 5 . 4 . 1 . 1 C y t o c h r o m e c b i n d i n g s i t e W h e n a c y t o c h r o m e c — c y t o c h r o m e o x i d a s e c o m p l e x f o r m e d a t l o w i o n i c s t r e n g t h w a s c o v a l e n t l y c r o s s l i n k e d , a d d u c t s o f s u b u n i t I I w i t h c y t o c h r o m e c w e r e i d e n t i fi e d ( B r i g g s a n d C a p a l d i , 1 9 7 8 ) . S u b u n i t I I w a s a l s o i m p l i c a t e d i n c y t o c h r o m e c b i n d i n g b y c r o s s l i n k i n g w i t h t h e p h o t o a fi i n i t y l a b e l a r y l a z i d o c y t o c h r o m e c ( B i s s o n e t a l . , 1 9 7 8 ) . C r o s s l i n k i n g o f t h e o x i d a s e w i t h c y t o c h r o m e c v i a a r y l a z i d o - m o d i fi e d L y s - 2 2 ( n o t o n t h e 1 3 9 f r o n t f a c e ) d i d n o t i n h i b i t t h e o x i d a s e , a n d c y t o c h r o m e c w a s f o u n d t o b e a s s o c i a t e d o n l y w i t h c a r d i o l i p i n ( B i s s o n e t a l . , 1 9 8 0 ) . H o w e v e r , w h e n c y t o c h r o m e c w a s m o d i fi e d a t L y s - 1 3 , o n t h e f r o n t f a c e o f t h e m o l e c u l e i n t h e v i c i n i t y o f t h e h e m e e d g e , i t w a s c r o s s l i n k e d t o s u b u n i t I I a n d i n h i b i t e d t h e a c t i v i t y o f t h e o x i d a s e a t a n a p p a r e n t s t o i c h i o m e t r y o f o n e c y t o c h r o m e c p e r o x i d a s e d i m e r . T r y p t i c m a p p i n g l o c a l i z e d t h e l a b e l l i n g s i t e t o n e a r A s p - 1 5 8 , V a l - 1 5 9 , a n d H i s - 1 6 1 ( B i s s o n e t a l . , 1 9 8 2 ) . T h e s e a r e c o n s e r v e d r e s i d u e s i n t h e C - t e r m i n a l d o m a i n o f s u b u n i t I I , w h i c h i s t h o u g h t t o e x t e n d i n t o t h e i n t e r m e m b r a n e s p a c e ( s e e a b o v e ) . A s p - 1 5 8 o n s u b u n i t I I c a n t h u s b e i n f e r r e d t o b e a n a t u r a l s i t e o f i n t e r a c t i o n w i t h L y s - 1 3 o f c y t o c h r o m e c . C y t o c h r o m e c m o d i fi e d a t C y s - 1 0 7 , o n t h e b a c k f a c e o f t h e m o l e c u l e , w a s c r o s s l i n k e d t o c y t c h r o m e o x i d a s e a n d s p e c i fi c a l l y l a b e l l e d a r e s i d u e i n s u b u n i t I I I o f y e a s t ( B i r c h m e i e r e t a l . , 1 9 7 6 ) a n d b o v i n e ( F u l l e r e t a l . , 1 9 8 1 ) o x i d a s e , l a t e r i d e n t i fi e d a s C y s - 1 1 5 ( M a l a t e s t a a n d C a p a l d i , 1 9 8 2 ) . F u l l e r e t a l . ( 1 9 8 1 ) f o u n d t h a t e x o g e n o u s c y t o c h r o m e c c o u l d n o t s t i m u l a t e a c t i v i t y o f t h i s c r o s s - l i n k e d f o r m , b u t a s c o r b a t e a n d T M P D a l o n e c o u l d , p r e s u m a b l y t h r o u g h r e d u c t i o n o f t h e c r o s s - l i n k e d c y t o c h r o m e c . D a r l e y - U s m a r e t a l . ( 1 9 8 4 ) f o u n d t h a t a l t h o u g h c y t o c h r o m e c w a s c r o s s l i n k e d t o b o t h m o n o m e r s a n d d i m e r s , o n l y t h e d i m e r s w e r e i n h i b i t e d , s u g g e s t i n g t h a t w h e n c y t o c h r o m e c i s b o u n d c o r r e c t l y t o t h e s u b u n i t I I o f o n e m o n o m e r i n a d i m e r , i t s b a c k f a c e i s i n c l o s e p r o x i m i t y t o s u b u n i t I I I o f t h e o t h e r m o n o m e r i n t h e d i m e r . I n t h i s p o s i t i o n i t w o u l d b l o c k a c c e s s t o a d d i t i o n a l c y t o c h r o m e c b i n d i n g , g i v i n g r i s e t o a n i n a c t i v e s p e c i e s . A d i f f e r e n t a p p r o a c h t o l o c a l i z i n g t h e c y t o c h r o m e c b i n d i n g s i t e w a s t a k e n b y M i l l e t t e t a l . ( 1 9 8 3 ) . M o d i fi c a t i o n o f t h e o x i d a s e c a r b o x y l s w i t h t h e c a r b o d i i m i d e E T C i n h i b i t e d t h e a c t i v i t y o f t h e o x i d a s e ; h o w e v e r , t h e p r e s e n c e o f c y t o c h r o m e c p r o t e c t e d A s p - 1 1 2 , G l u - 1 1 4 , a n d G l u - 1 9 8 . G l u - 1 9 8 , 1 4 0 a l o n g w i t h G l u - 1 0 9 , A s p - 1 5 8 , a n d A s p - 1 7 3 a r e i n f a c t s t r i c t l y c o n s e r v e d i n a l l s u b u n i t I I s e q u e n c e s e x c e p t t h o s e o f c y t o c h r o m e b o , w h i c h d o e s n o t b i n d c y t o c h r o m e c . M o r e o v e r , G l u - 1 9 8 f a l l s b e t w e e n p u t a t i v e C u A l i g a n d s C y s - 1 9 6 a n d C y s - 2 0 0 , w h i c h p r o v i d e s t h e c l o s e a s s o c i a t i o n o f c y t o c h r o m e c a n d C u A n e c e s s a r y f o r e l e c t r o n t r a n s f e r . T h i s d a t a , t o g e t h e r w i t h t h e a r y l a z i d o — c l a b e l l i n g n e a r A s p - 1 5 8 ( B i s s o n e t a l . , 1 9 8 2 ) p r o v i d e s a s t r u c t u r a l m o d e l f o r t h e b i n d i n g o f c y t o c h r o m e c t o t h e c o n s e r v e d ( a n d s o m e s p e c i e s - s p e c i fi c ) c a r b o x y l r e s i d u e s i n t h e C - t e r m i n a l d o m a i n o f s u b u n i t I I . 5 . 4 . 1 . 2 C y t o c h r o m e c k i n e t i c s C y t o c h r o m e o x i d a s e c a n b e a s s a y e d s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y b y f o l l o w i n g t h e o x i d a t i o n o f a d d e d c y t o c h r o m e c ( S m i t h a n d C o n r a d , 1 9 5 6 ) o r b y m e a s u r i n g o x y g e n c o n s u m p t i o n p o l a r o g r a p h i c a l l y i n t h e p r e s e n c e o f c y t o c h r o m e c a n d t h e a r t i fi c i a l r e d u c t a n t s a s c o r b a t e a n d N , N , N ’ , N ’ - t e t r a m e t h y l p - p h e n y l e n e d i a m i n e ( T M P D , N i c h o l l s , 1 9 6 5 ; F e r g u s o n - M i l l e r e t a l . , 1 9 7 6 ) . A t l o w i o n i c s t r e n g t h a n d l o w c o n c e n t r a t i o n s o f c y t o c h r o m e c , m a x i m a l r a t e s m e a s u r e d b y t h e s p e c t r o p h o t o m e t r i c m e t h o d a r e l o w e r t h a n t h e p o l a r o g r a p h i c m e t h o d b e c a u s e c y t o c h r o m e c m u s t d i s s o c i a t e f r o m t h e o x i d a s e a n d i s r a t e l i m i t i n g ( F e r g u s o n - M i l l e r e t a l . , 1 9 7 8 ; W i l m s e t a l . , 1 9 8 1 ; S i n j o r g o e t a l . , 1 9 8 4 ) . I n c o n t r a s t , T M P D c a n r e d u c e b o u n d c y t o c h r o m e c , s o t h i s s t e p c o u l d b e c o m e r a t e l i m i t i n g i n t h e p o l a r o g r a p h i c a s s a y ( F e r g u s o n - M i l l e r e t a l . , 1 9 7 8 ) . T h e r e f o r e i t h a s b e e n a r g u e d t h a t t h e s p e c t r o p h o t o m e t r i c a s s a y i s m o r e p h y s i o l o g i c a l ( H i i t h e r a n d K a d e n b a c h , 1 9 8 7 ; S i n j o r g o e t a l . , 1 9 8 7 ; h o w e v e r s e e C o o p e r , 1 9 9 0 ) . T h e k i n e t i c s o f t h e r e a c t i o n h a v e b e e n s t u d i e d u s i n g b o t h a s s a y m e t h o d s ; h o w e v e r , s o m e u n u s u a l r e s u l t s o c c u r w h i c h e v e r m e t h o d i s u s e d . F i r s t , w h e n m e a s u r e d s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y t h e r e a c t i o n i s fi r s t o r d e r u n d e r m o s t c o n d i t i o n s , a n d t h e fi r s t o r d e r r a t e c o n s t a n t c h a n g e s w i t h t h e l 4 1 ‘ 9 . — u n - g n i W c . . . . - . ‘ l 1 1 4 1 c o n c e n t r a t i o n o f c y t o c h r o m e c ( S m i t h a n d C o n r a d , 1 9 5 6 ) . S e c o n d , w h e n m e a s u r e d b y e i t h e r m e t h o d t h e r e a c t i o n d o e s n o t f o l l o w M i c h a e l i s - M e n t e n l n ' n e t i c s . W h e n t h e d a t a a r e p l o t t e d o n a n E a d i e - H o f s t e e p l o t , t w o p h a s e s a r e o b s e r v e d : a h i g h a f fi n i t y , l o w t u r n o v e r p h a s e , a n d a l o w a f fi n i t y , h i g h t u r n o v e r p h a s e ( F e r g u s o n - M i l l e r e t a l . , 1 9 7 6 ) . I t h a s b e e n a m a j o r f o c u s o f s t u d y t o e x p l a i n t h e s e u n u s u a l r e s u l t s i n t e r m s o f a m e c h a n i s m . A s y e t , n o h y p o t h e s i s h a s s a t i s f a c t o r i l y e x p l a i n e d a l l t h e d a t a a n d g a i n e d u n i v e r s a l a c c e p t a n c e . T h e s i m p l e s t e x p l a n a t i o n f o r t h e b i p h a s i c b e h a v i o r i s t h a t t h e r e a r e t w o b i n d i n g s i t e s f o r c y t o c h r o m e c . B a s e d o n g e l fi l t r a t i o n - d e t e r m i n a t i o n o f K D v a l u e s w h i c h m a t c h e d K m v a l u e s , F e r g u s o n - M i l l e r e t a l . ( 1 9 7 6 ) p r o p o s e d t w o b i n d i n g s i t e s w h i c h c a n t r a n s f e r e l e c t r o n s i n d e p e n d e n t l y . I n a g r e e m e n t w i t h t h i s i s t h e e x p e r i m e n t o f V e e r m a n e t a l . ( 1 9 8 0 ) , w h i c h s h o w e d t h a t b i n d i n g o f p o r p h y r i n ( n o i r o n ) c y t o c h r o m e c t o t h e h i g h a fi n i t y s i t e d i d n o t i n h i b i t t h e o x i d a s e f r o m a c c e p t i n g e l e c t r o n s f r o m n o r m a l c y t o c h r o m e c ( w h i c h p r e s u m a b l y b o u n d a t a s e c o n d s i t e ) . F u r t h e r e v i d e n c e f o r a t w o i n d e p e n d e n t - s i t e m o d e l i s t h e k i n e t i c b e h a v i o r o f t h e w a g - o x i d a s e s o f s e v e r a l s p e c i e s o f t h e r m o p h i l i c b a c t e r i a . T M P D a l o n e c a t a l y z e s h i g h t u r n o v e r , b u t a d d e d s o l u b l e c y t o c h r o m e c p r o d u c e s m o n o p h a s i c , l o w a fl i n i t y k i n e t i c s ( N i c h o l l s a n d S o n e , 1 9 8 4 ; Y o s h i d a a n d F e e , 1 9 8 4 ) . T h e fi n d i n g o f t w o b i n d i n g s i t e s d o e s n o t , h o w e v e r , i m p l y t h a t t h e y a c t i n d e p e n d e n t l y i n e l e c t r o n t r a n s f e r . C y t o c h r o m e c a t t h e s e c o n d b i n d i n g s i t e c o u l d m e r e l y i n fl u e n c e t h e a c t i v i t y o f t h e fi r s t b i n d i n g s i t e ( E r r e d e e t a l . , 1 9 7 6 ; E r r e d e a n d K a m e n , 1 9 7 8 ) . A r g u i n g a g a i n s t t w o i n d e p e n d e n t s i t e s a r e t h e e x p e r i m e n t s o f B i s s o n e t a l . ( 1 9 8 0 ) a n d F u l l e r e t a l . ( 1 9 8 1 ) . C o v a l e n t c r o s s l i n k i n g o f c y t o c h r o m e c t o t h e h i g h a f fi n i t y s i t e r e n d e r e d t h e o x i d a s e i n a c t i v e i n t h e p r e s e n c e o f a d d i t i o n a l c y t o c h r o m e c w h i c h w a s f r e e t o b i n d a t ‘ ‘ 0 . ' I \ ’ " . “ . I " 1 1 4 2 a s e c o n d s i t e a n d d o n a t e e l e c t r o n s . F u r t h e r m o r e , w h i l e a s c o r b a t e / T M P D w a s a b l e t o s t i m u l a t e s o m e a c t i v i t y o f t h e c r o s s l i n k e d c o m p l e x , o n l y a f t e r a s c o r b a t e / T M P D . w a s a d d e d a n d c y t o c h r o m e c a l l o w e d t o b i n d t o t h e s e c o n d s i t e w a s t h e a c t i v i t y f u l l y r e s t o r e d . T h i s c o u l d s u g g e s t t h a t b i n d i n g o f t h e s e c o n d c y t o c h r o m e c i n c r e a s e s e l e c t r o n t r a n s f e r a c t i v i t y a t t h e fi r s t s i t e b y a n a l l o s t e r i c m e c h a n i s m . T h e “ c o n t r o l l e d b i n d i n g ” h y p o t h e s i s o f S p e c k e t a l . ( 1 9 8 4 ) a l s o p r o p o s e s t h a t t h e s e c o n d c y t o c h r o m e c s i t e i s r e g u l a t o r y , c a u s i n g t h e c a t a l y t i c s i t e t o i n c r e a s e a c t i v i t y b y i n c r e a s i n g t h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t . T h i s s u g g e s t i o n i s s u p p o r t e d b y t h e w o r k o f W i l m s e t a l . ( 1 9 8 1 ) , w h o s h o w e d t h a t t h e “ o f f ” r a t e o f t h e h i g h a f fi n i t y s i t e i s i n c r e a s e d b y b i n d i n g o f p o l y l y s i n e , w h i c h h a s a h i g h c o n c e n t r a t i o n o f p o s i t i v e c h a r g e s s i m u l a t i n g c y t o c h r o m e c , a t t h e l o w a m n i t y s i t e . S i n c e o n l y o n e b i n d i n g s i t e w a s f o u n d o n t h e o x i d a s e b y c r o s s l i n k i n g s t u d i e s ( s e e a b o v e ) , a n d s i n c e t h e c y t o c h r o m e c m o l e c u l e i s s o h i g h l y p o s i t i v e l y c h a r g e d , i t w a s p o s t u l a t e d t h a t t h e l o w a f fi n i t y o r s e c o n d s i t e i s c o m p r i s e d o f n e g a t i v e l y c h a r g e d p h o s p h o l i p i d a s s o c i a t e d w i t h t h e p r o t e i n . , B i s s o n e t a l . ( 1 9 8 0 ) s h o w e d t h a t a r y l a z i d o c y t o c h r o m e c m o d i fi e d o n a s i d e o r r e a r f a c e d i d c r o s s l i n k t o p h o s p h o l i p i d a n d d i d n o t i n h i b i t a c t i v i t y . V i k e t a l . ( 1 9 8 1 ) a l s o s h o w e d t h a t l i p i d - d e p l e t e d e n z y m e e x h i b i t e d m o n o p h a s i c k i n e t i c s ; h o w e v e r , t h e h i g h l y l i p i d - d e p l e t e d o x i d a s e p r e p a r a t i o n o f T h o m p s o n e t a l . ( 1 9 8 3 ) d i s p l a y e d n o r m a l b i p h a s i c k i n e t i c s . M o r e o v e r , w h e n M a r s h a n d P o w e l l ( 1 9 8 8 ) s u b s t i t u t e d n e u t r a l p h o s p h o l i p i d s f o r t h e n o r m a l c h a r g e d o n e s , b i p h a s i c k i n e t i c s w e r e s t i l l o b s e r v e d . M a n y o t h e r t h e o r i e s w i t h o n l y o n e b i n d i n g s i t e h a v e b e e n p r o p o s e d . B y u s i n g t h e s m a l l p e r t u r b a t i o n i n t h e s p e c t r u m o f c y t o c h r o m e c u p o n b i n d i n g t o t h e o x i d a s e , M i c h e l a n d B o s s h a r d ( 1 9 8 9 ) C o n c l u d e d t h a t t h e r e . . . . 1 . ) t . J I 1 4 3 w a s o n l y o n e b i n d i n g s i t e ; h o w e v e r , t h e i r m e t h o d s h a v e b e e n c r i t i c i z e d ( C o o p e r , 1 9 9 0 ) . B e c a u s e N a l e c z e t a l . ( 1 9 8 3 ) o b s e r v e d t h a t d i m e r s b u t n o t m o n o m e r s e x h i b i t e d b i p h a s i c k i n e t i c s , t h e y p r o p o s e d t h a t t h e c o o p e r a t i o n o f t w o d i m e r s e a c h w i t h a b o u n d c y t o c h r o m e c w a s r e q u i r e d . H o w e v e r , o t h e r s ( S u a r e z e t a l . , 1 9 8 4 ; R o b i n s o n a n d T a l b e r t , 1 9 8 6 ; H a k v o o r t e t a l . , 1 9 8 7 ; M i c h e l a n d B o s s h a r d , 1 9 8 9 ) h a v e s h o w n m o n o m e r s t o h a v e b i p h a s i c k i n e t i c s . T h e “ s e q u e n t i a l b i n d i n g ” h y p o t h e s i s o f A n t a l i s a n d P a l m e r ( 1 9 8 2 ) e x p l a i n e d b i p h a s i c k i n e t i c s b y a o n e - s i t e m o d e l i n w h i c h t w o c y t o c h r o m e c m o l e c u l e s b i n d s e q u e n t i a l l y t o t h e o x i d a s e a t t h e s a m e b i n d i n g s i t e w i t h i d e n t i c a l a s s o c i a t i o n a n d d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s . T h e s e c o n d m o l e c u l e o f c y t o c h r o m e c c a n n o t r e a c t u n t i l t h e fi r s t d i s s o c i a t e s , l e a d i n g t o r a t e e q u a t i o n s c o n t a i n i n g h i g h e r o r d e r t e r m s . S i m u l a t i o n s u s i n g t h e s e e q u a t i o n s y i e l d e d r e s u l t s m a t c h i n g s o m e o f t h e e x p e r i m e n t a l d a t a . H o w e v e r s u c h s i m u l a t i o n s a r e p r o b l e m a t i c s i n c e , a s p o i n t e d o u t b y M y e r s a n d P a l m e r ( 1 9 8 8 ) , a r a t e e q u a t i o n t a k i n g i n t o a c c o u n t a l l r e l e v a n t i n t e r m e d i a t e s p e c i e s w o u l d c o n t a i n m o r e t h a n 2 1 , 0 0 0 t e r m s ! T w o o n e - s i t e m o d e l s f o r c y t o c h r o m e c b i n d i n g i n v o l v e c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s t o a c c o u n t f o r t h e k i n e t i c b e h a v i o r . B r z e z i n s k i a n d M a l m s t r b m ( 1 9 8 6 ) p r o p o s e t h a t t h e r e a r e t w o c o n f o r m a t i o n a l f o r m s o f t h e o x i d i z e d o x i d a s e w h i c h a r e l i n k e d t o p r o t o n p u m p i n g : t h e “ i n p u t ” f o r m p i c k s u p p r o t o n s , a n d t h e “ o u t p u t ” f o r m r e l e a s e s p r o t o n s . T h e d i f f e r e n t i n t e r a c t i o n o f c y t o c h r o m e c w i t h t h e s e t w o f o r m s w o u l d r e s u l t i n b i p h a s i c k i n e t i c s . A l t e r n a t i v e l y , t h e h y s t e r e s i s m o d e l o f G a r b e r e t a l . ( 1 9 9 0 ) s u g g e s t s t h a t a s u b s t r a t e - i n d u c e d c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e p r i m e s t h e e n z y m e f o r f a s t e r t u r n o v e r . T h e e n z y m e r e l a x e s b a c k t o t h e s l o w f o r m a f t e r e l e c t r o n t r a n s f e r , b u t a t h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f c y t o c h r o m e c , m o r e s u b s t r a t e c a n b i n d b e f o r e . T M i I I 1 . 1 - i n . . 3 2 ; “ , n . 1 4 4 t h e r e l a x a t i o n i s c o m p l e t e , t h u s t h e s u b s t r a t e r e a c t s i m m e d i a t e l y w i t h t h e h i g h t u r n o v e r f o r m o f t h e o x i d a s e , l e a d i n g t o b i p h a s i c k i n e t i c s . 5 . 4 . 2 E l e c t r o n t r a n s f e r p a t h w a y i n c y t o c h r o m e o x i d a s e A s d e s c r i b e d a b o v e , s t u d i e s o n t h e c y t o c h r o m e c b i n d i n g s i t e o f t h e o x i d a s e p l a c e d t h e i n t e r a c t i n g a c i d i c r e s i d u e s v e r y c l o s e t o t h e h i s t i d i n e s a n d c y s t e i n e s w h i c h m a k e u p t h e C u A b i n d i n g s i t e . H o l m ’ s m o d e l ( 1 9 8 7 ) e m p h a s i z e d t h e s p a t i a l c l o s e n e s s o f t h e t w o s i t e s a n d p r e d i c t e d t h a t C u A m u s t t h e r e f o r e b e t h e i n i t i a l e l e c t r o n a c c e p t o r f r o m c y t o c h r o m e c , d e s p i t e s t u d i e s s u g g e s t i n g t h a t c y t o c h r o m e a w a s r e d u c e d fi r s t ( G i b s o n e t a l . , 1 9 6 5 ; A n d r é a s s o n e t a l . , 1 9 7 2 ; H a l a k a e t a l . , 1 9 8 4 ; B l a i r e t a l . , 1 9 8 5 ) . F u r t h e r s u p p o r t i n g t h e i d e a t h a t C u A i s t h e s i t e o f e l e c t r o n e n t r y i n t o t h e o x i d a s e i s t h e o b s e r v a t i o n t h a t c y t o c h r o m e b o u s e s u b i q u i n o n e r a t h e r t h a n c y t o c h r o m e c a s a n e l e c t r o n d o n o r a n d h a s l o s t C u A w h i l e s t i l l r e t a i n i n g t h e o t h e r r e d o x c e n t e r s ( D u e w e k e a n d G e n n i s , 1 9 9 1 ) . , R e c e n t l y H o l m ’ s p r e d i c t i o n h a s b e e n p r o v e n c o r r e c t b y a n u m b e r o f m e t h o d s : p u l s e r a d i o l y s i s w i t h a r t i fi c i a l e l e c t r o n d o n o r s ( K o b a y a s h i e t a l . , 1 9 8 9 ) a n d fl a s h p h o t o l y s i s o f h e m e a 3 - C O ( H i l l , 1 9 9 1 ) o n t h e p u r i fi e d e n z y m e , a n d s t e a d y - s t a t e s p e c t r o s c o p i c m e a s u r e m e n t s o f r e d u c t i o n l e v e l s o f C u A a n d h e m e a o n i n t a c t m i t o c h o n d r i a ( M o r g a n a n d W i k s t r t i m , 1 9 9 1 ) . H o w e v e r , e v e n t h o u g h C u A m a y b e t h e fi r s t e l e c t r o n a c c e p t o r , i t m a y n o t b e s t r i c t l y r e q u i r e d f o r e l e c t r o n t r a n s f e r a s s h o w n b y G u y ; d e p l e t i o n s t u d i e s ( G e l l e s a n d C h a n , 1 9 8 5 ; P a n e t a l . , 1 9 9 1 b ) . E l e c t r o n s r a p i d l y e q u i l i b r a t e b e t w e e n G u y ; a n d h e m e a ( M o r g a n e t a l . , 1 9 8 9 ) , a n d a r e p a s s e d o n t o t h e b i n u c l e a r c e n t e r f r o m h e m e a ( H i l l , 1 9 9 1 ; O l i v e b u r g a n d M a l m s t r o m , 1 9 9 1 ) . B a b c o c k a n d W i k s t r i i m ( 1 9 9 2 ) a r g u e t h a t C u } ; i s m o s t l i k e l y t h e i n i t i a l a c c e p t o r i n t h e b i n u c l e a r c e n t e r . 1 4 5 I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t i n t e r n a l e l e c t r o n t r a n s f e r ( f r o m h e m e a t o t h e b i n u c l e a r c e n t e r ) i s t h e r a t e - l i m i t i n g s t e p o f t h e c a t a l y t i c c y c l e u n d e r h i g h s u b s t r a t e c o n d i t i o n s ( W i l s o n e t a l . , 1 9 8 1 ) , a n d i n . s u p p o r t o f t h i s i d e a , S a r t i e t a l . ( 1 9 8 8 ) h a v e s h o w n t h a t t h e r a t e o f h e m e a 3 r e d u c t i o n i s c o m p a r a b l e t o t h e t u r n o v e r n u m b e r . T h e r a t e o f i n t e r n a l e l e c t r o n t r a n s f e r i s p r o p o s e d t o b e i n c r e a s e d b y a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e c o r r e s p o n d i n g t o t h e “ c l o s e d ” t o “ o p e n ” t r a n s i t i o n d u r i n g t h e c a t a l y t i c c y c l e ( B r z e z i n s k i a n d M a l m s t r t i m , 1 9 8 7 ; T h b r n s t r o m e t a l . , 1 9 8 8 ) . R e d u c t i o n o f C u A ( C o p e l a n d e t a l . , 1 9 8 7 ) , h e m e 0 ( W i l s o n e t a l . , 1 9 8 8 ) , o r b o t h ( S c h o l e s a n d M a l m s t r b m , 1 9 8 6 ) i n d u c e s t h e “ c l o s e d ” t o “ o p e n ” t r a n s i t i o n , w h i c h i s m a r k e d b y a d r a m a t i c i n c r e a s e i n t h e r a t e o f c y a n i d e b i n d i n g ( J o n e s e t a l . , 1 9 8 4 ; J e n s e n e t a l . , 1 9 8 4 ) . T h i s p r o p o s e d c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e h a s b e e n s u g g e s t e d t o h a v e a r o l e i n p r o t o n p u m p i n g ( S c h o l e s a n d M a l m s t r o m , 1 9 8 6 ; B r z e z i n s k i a n d M a l m s t r t i m , 1 9 8 7 ; C o p e l a n d e t a l . , 1 9 8 7 ; T h 6 r n s t r 6 m e t a l . , 1 9 8 8 ) ; h o w e v e r , a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e h a s n o t b e e n d i r e c t l y m e a s u r e d ( W i l s o n e t a l . , 1 9 8 8 ; F e r r e i r a - R a j a b i a n d H i l l , 1 9 8 9 ) a n d h a s b e e n q u e s t i o n e d ( M o o d y e t a l . , 1 9 9 1 ) . 5 . 4 . 3 0 2 r e d u c t i o n T h e m e c h a n i s m o f 0 2 r e d u c t i o n b y t h e b i n u c l e a r c e n t e r h a s b e e n e l u c i d a t e d b y t i m e - r e s o l v e d s p e c t r o s c o p y o f p h o t o l y z e d r e d u c e d F e - C O o x i d a s e a s w e l l a s p a r t i a l r e v e r s a l o f t h e r e a c t i o n c y c l e i n m i t o c h o n d r i a u n d e r h i g h p r o t o n m o t i v e f o r c e s u c h t h a t r e a c t i o n i n t e r m e d i a t e s a c c u m u l a t e . C u r r e n t i d e a s r e g a r d i n g r e a c t i o n i n t e r m e d i a t e s a r e r e v i e w e d i n B a b c o c k a n d W i k s t r b m ( 1 9 9 2 ) , a n d a p r o p o s e d r e a c t i o n s e q u e n c e i s i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 5 . 2 . T h e o x i d i z e d ( 0 ) f o r m o f t h e b i n u c l e a r c e n t e r ( F e 3 + C u “ ) i s r e d u c e d t o t h e R f o r m ( F e 2 + C u t ) i n t w o s t e p s i n t h e “ e l e c t r o n 1 4 6 fi l l i n g ” p h a s e . M o l e c u l a r o x y g e n b i n d s w e a k l y t o F e 2 + t o f o r m a n o x y - a d d u c t ( A ) a n d i s “ t r a p p e d ” b y e l e c t r o n t r a n s f e r f r o m b o t h m e t a l s t o p r o d u c e a p e r o x y i n t e r m e d i a t e ( P ) . I n t h e “ p o w e r s t r o k e ” p h a s e , t h e a d d i t i o n o f a n e l e c t r o n a n d t w o p r o t o n s c l e a v e s t h e 0 — 0 b o n d y i e l d i n g t h e f e r r y l ( F ) f o r m w i t h H 2 0 c o o r d i n a t e d t o C u 2 + . T h e l a s t e l e c t r o n l e a v e s b o t h m e t a l s w i t h b o u n d h y d r o x i d e a s s h o w n . b y t h e p H - d e p e n d e n c e o f t h i s s t e p ( W i k s t r o m , 1 9 8 8 ) . T w o m o r e p r o t o n s f u l l y r e d u c e t h e o x y g e n a t o m s t o w a t e r , r e g e n e r a t i n g t h e o x i d i z e d f o r m . S i n c e t h e r a t e o f 0 2 r e d u c t i o n b y t h e R f o r m i s m u c h f a s t e r ( 1 0 0 u s ) t h a n t h e m a x i m a l t u r n o v e r r a t e u n d e r s t e a d y - s t a t e c o n d i t i o n s w i t h a r t i fi c i a l e l e c t r o n d o n o r s ( 5 0 0 — 1 0 0 0 8 ' 1 ) , t h e 0 s t a t e i s m o s t c o m m o n l y o b s e r v e d i n s p e c t r o s c o p i c s t u d i e s . P h y s i o l o g i c a l r a t e s a r e e v e n l o w e r , o n l y a b o u t 5 0 8 ' 1 : s i n c e s u b s t r a t e i s o f t e n l i m i t i n g . H a l t i a a n d W i k s t r b m ( 1 9 9 2 ) p o i n t o u t t h a t t h e s e o b s e r v a t i o n s i n d i c a t e t h a t t h e “ e l e c t r o n fi l l i n g ” p h a s e , n o t 0 2 r e d u c t i o n , i s t h e r a t e - l i m i t i n g s t e p o f t h e c a t a l y t i c c y c l e . 5 . 4 . 4 P r o t o n p u m p i n g I n M i t c h e l l ’ s c h e m i o s m o s t i c t h e o r y ( 1 9 6 6 ) , m i t o c h o n d r i a l e ' t r a n s f e r w a s p r o p o s e d t o b e l i n k e d t o p r o t o n t r a n s l o c a t i o n f o r t h e p u r p o s e o f e n e r g y c o n s e r v a t i o n . W i k s t r t i m fi r s t o b s e r v e d p r o t o n p u m p i n g b y c y t o c h r o m e o x i d a s e i n 1 9 7 7 a l t h o u g h a c c e p t a n c e o f t h e o b s e r v a t i o n w a s s l o w ( M o y l e a n d M i t c h e l l , 1 9 7 8 ; M i t c h e l l e t a l . , 1 9 8 5 ) . D e s p i t e s o m e s u g g e s t i o n s o f a r e d o x l o o p m e c h a n i s m s i m i l a r t o t h e Q c y c l e i n c y t o c h r o m e c r e d u c t a s e ( M i t c h e l l , 1 9 8 7 ) , m o s t r e s e a r c h e r s n o w a g r e e t h a t g e n e r a t i o n o f a n e l e c t r o c h e m i c a l g r a d i e n t i s t h e s u m o f t h e e l e c t r o g e n i c t r a n s f e r o f e l e c t r o n s f r o m O + e f o r e s t 2 a n e c r a e u C + 3 h P g l I I e n F i l l i F c u n i b e h - t ' n 9 o r t c y b n o i e t 0 2 H 2 / l E + H 2 c u d e r 2 0 f o e c + n e u q . e e s s a n d o i i x t o c c a e e r m d o e r h s c o o e s a + t o 2 y P h p 1 1 H 3 e ( O k r c P : 2 o . H r O - t a t S 5 e r u g e r | i F l ' O e F w o P 1 4 7 I a ) + + — 1 4 8 c y t o c h r o m e c o n t h e c y t o p l a s m i c s i d e t o t h e b i n u c l e a r c e n t e r i n s i d e t h e m e m b r a n e , s c a l a r c o n s u m p t i o n o f p r o t o n s t a k e n u p f r o m t h e m a t r i x f o r 0 2 r e d u c t i o n ( W i k s t r t i m , 1 9 8 8 ) , a n d v e c t o r i a l t r a n s l o c a t i o n o f p r o t o n s a c r o s s t h e m e m b r a n e ( p r o t o n p u m p i n g ) . T h e c o u p l i n g o f p r o t o n p u m p i n g t o e l e c t r o n t r a n s f e r m a y b e d i r e c t o r i n d i r e c t . I n a d i r e c t m e c h a n i s m , a r e d o x - d e p e n d e n t p r o t o n a t i o n / d e p r o t o n a t i o n o f t h e m e t a l l i g a n d s t h e m s e l v e s w o u l d o c c u r ( p r o t o n p u m p i n g b y b a c t e r i o r h o d o p s i n m a y b e c a t e g o r i z e d a s d i r e c t ) , w h i l e t h e c o u p l i n g i s m e d i a t e d b y l o n g - r a n g e c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s i n t h e i n d i r e c t m e c h a n i s m . ( T h e B o h r e f f e c t o f h e m o g l o b i n i s a n i n d i r e c t m e c h a n i s m . ) S e v e r a l m o d e l s f o r a d i r e c t m e c h a n i s m h a v e b e e n p r o p o s e d . B a b c o c k a n d C a l l a h a n ( 1 9 8 3 ) s u g g e s t e d t h a t h e m e a p r o v i d e s a l i n k b e t w e e n e l e c t r o n t r a n s f e r a n d p r o t o n p u m p i n g . B y c o m p a r i n g t h e s p e c t r a l p r o p e r t i e s o f h e m e m o d e l c o m p o u n d s t o c y t o c h r o m e a o f t h e o x i d a s e , t h e y d e m o n s t r a t e d t h a t t h e f o r m y l g r o u p o f h e m e ( 1 p r o b a b l y h y d r o g e n b o n d s t o a n — O H g r o u p . R e s o n a n c e R a m a n s p e c t r o s c o p y s h o w e d t h a t t h e s t r e n g t h o f t h i s b o n d i s r e d o x - d e p e n d e n t , p r o v i d i n g a p o s s i b l e s o u r c e o f e n e r g y f o r c o u p l i n g p r o t o n p u m p i n g t o e l e c t r o n t r a n s f e r . C u A w a s s u g g e s t e d t o b e t h e c o u p l i n g s i t e b y G e l l e s e t a l . ( 1 9 8 6 ) b a s e d o n e x p e r i m e n t s s h o w i n g t h a t m o d i fi c a t i o n o f t h e G u y ; s i t e b y t r e a t m e n t w i t h p - ( h y d r o x y m e r c u r i ) b e n z o a t e ( N i l s s o n , e t a l . , 1 9 8 8 ) a n d h e a t ( P . M . L i e t a l . , 1 9 8 8 ) e l i m i n a t e d p r o t o n p u m p i n g . T h e y p r o p o s e d t h a t g e o m e t r i c a l s t r a i n w o u l d c a u s e a c y s t e i n e s u l f u r t o e x c h a n g e f o r a t y r o s i n e d u r i n g t h e r e d o x c y c l e , w i t h H + m o v i n g f r o m o n e r e s i d u e t o t h e o t h e r i n a v e c t o r i a l f a s h i o n . E l e c t r o n a n d p r o t o n “ g a t i n g ’ ( p r e v e n t i o n o f “ s l i p p a g e ” o r “ s h o r t - c i r c u i t i n g ” ) i s i m p o s e d b y c o n f o r m a t i o n a l c o n s t r a i n t s . ” 1 . ” . t w r i m m g ' j u m ' . . 1 2 . " a n ' u 4 n - . : n ’ , . I 1 4 9 R e c e n t l y , W i k s t r t i m ( 1 9 8 9 ) s h o w e d t h a t t h e t h e f o u r e l e c t r o n s w h i c h r e d u c e 0 2 a r e n o t e q u a l l y c o u p l e d t o p r o t o n p u m p i n g . T h e P - 9 F a n d F - — > O s t e p s ( F i g . 5 . 2 ) a r e e a c h c o u p l e d t o t r a n s l o c a t i o n o f 2 H + / e ' . T h i s d a t a h a s f o r c e d r e c o n s i d e r a t i o n o f t h e a b o v e t h e o r i e s w h i c h h a v e a s s u m e d t h a t e a c h e l e c t r o n i s e q u a l l y c o u p l e d t o a p r o t o n . I n o r d e r f o r h e m e a o r C u A t o b e t h e c o u p l i n g s i t e , t h e a s s u m p t i o n m u s t b e m a d e t h a t t h e p a t h o f e l e c t r o n t r a n s f e r i s d i f f e r e n t f o r t h e “ e l e c t r o n fi l l i n g " a n d “ p o w e r s t r o k e ” e l e c t r o n s . C h a n a n d L i ( 1 9 9 0 ) s u g g e s t t h a t t h e fi r s t t w o e l e c t r o n s a r e t r a n s f e r r e d f r o m h e m e a t o t h e b i n u c l e a r c e n t e r ( w i t h o u t p a s s i n g t h r o u g h C u A ) a n d t h e s e c o n d t w o a r e t r a n s f e r r e d t h r o u g h C u A , w h i c h i s l i n k e d t o t h e p r o t o n p u m p . I f t h i s m e c h a n i s m i s c o r r e c t , b o t h h e m e a a n d C u A s h o u l d a l w a y s b e l e s s t h a n 5 0 % r e d u c e d u n d e r s t e a d y s t a t e c o n d i t i o n s , w h i c h h a s b e e n s h o w n ( M o r o n e y e t a l . , 1 9 8 4 ; G r e g o r y a n d F e r g u s o n - M i l l e r , 1 9 8 9 ) . A l t e r n a t i v e l y , W i k s t r t i m ( 1 9 8 9 ) p o i n t s o u t t h a t n e g a t i v e r e d o x c o o p e r a t i v i t y b e t w e e n h e m e a a n d t h e b i n u c l e a r c e n t e r ( G o o d m a n , 1 9 8 4 ; B l a i r e t a l . , 1 9 8 6 ) c o u l d a l t e r t h e c o n fi g u r a t i o n a r o u n d h e m e a w h e n 0 2 i s b o u n d , a n d a l l o w p r o t o n s t o b e p u m p e d o n l y t h e n . B e c a u s e t h e c y t o c h r o m e b o c o m p l e x , w h i c h h a s b e e n s h o w n t o p u m p p r o t o n s ( P u u s t i n e n e t a l . , 1 9 8 9 ) , c o n t a i n s n o C u A s i t e ( C h e p u r i a n d G e n n i s , 1 9 9 0 ; P u u s t i n e n e t a l . , 1 9 9 1 ) , a n d n e i t h e r o f i t s h e m e s ( B a n d O - t y p e s ) h a v e a f o r m y l o n t h e p o r p h y r i n r i n g ( P u u s t i n e n a n d W i k s t r t i m , 1 9 9 1 ) , i t s e e m s u n l i k e l y t h a t t h e c o u p l i n g s i t e i s r e l a t e d t o t h e s e t w o c e n t e r s . B a b c o c k a n d W i k s t r o m ( 1 9 9 2 ) c o n c l u d e t h a t C u B m u s t t h e r e f o r e s e r v e a s t h e c o u p l i n g s i t e , e l i m i n a t i n g h e m e a o r t h e 0 2 c h e m i s t r y i t s e l f b e c a u s e t h e 0 2 i n t e r m e d i a t e s a r e s o d i fi ' e r e n t b e t w e e n t h e P ( p e r o x y ) a n d F ( f e r r y l ) s t a t e s . S i n c e a l l f o u r e l e c t r o n s m u s t s t i l l g o t h r o u g h t h e b i n u c l e a r c e n t e r , H a l t i a a n d W i k s t r o m ( 1 9 9 2 ) s u g g e s t t h a t c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s i n t h e b i n u c l e a r t m r m ; 1 t 1 5 0 c e n t e r i n d u c e d b y r e d u c t i o n ( S c o t t , 1 9 8 9 ) a l l o w o n l y t h e 0 2 - b 0 u n d f o r m t o p u m p p r o t o n s , o r t h a t C u B o n l y a c c e p t s e - f r o m h e m e a i n t h e 0 2 - h o u n d f o r m . T h e y p r o p o s e t h a t r e d o x - l i n k e d g e o m e t r i c a l c h a n g e s i n C u } ; a l l o w t w o o f t h e h i s t i d i n e l i g a n d s t o p r o t o n a t e a n d d e p r o t o n a t e , a n d t h a t a c o u p l e o f c o n s e r v e d t h r e o n i n e s ( m o r e t h a n o n e m u s t b e i n v o l v e d s i n c e t w o p r o t o n s a r e p u m p e d i n o n e s t e p ) i n h e l i x V I I I f o r m t r a n s i e n t h y d r o g e n b o n d s w i t h t h e h i s t i d i n e s a s t h e fi r s t s t e p o f a p r o t o n l a d d e r . C u r r e n t s i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s w o r k o n s u b u n i t I r e s i d u e s s h o u l d p r o v e v a l u a b l e i n e v a l u a t i n g t h e s e t h e o r i e s . 5 . 4 . 5 T h e m l e o f t h e n u c l e a r - e n c o d e d s u b u n i t s S i n c e t h e c a t a l y t i c c o r e i s a g r e e d t o b e i n t h e m i t o c h o n d r i a l l y - e n c o d e d s u b u n i t s , t h e f u n c t i o n o f t h e n u c l e a r - e n c o d e d s u b u n i t s h a s b e e n o p e n t o d e b a t e . R e g u l a t i o n o f e n z y m e a c t i v i t y a n d a s s e m b l y o f t h e c o m p l e x a r e t h e t w o m o s t l i k e l y p o s s i b i l i t i e s . 5 . 4 . 5 . 1 R e g u l a t i o n A s p o i n t e d o u t b y C a p a l d i ( 1 9 9 0 b ) , r e g u l a t i o n o f t h e o x i d a s e c o u l d o c c u r a t m a n y s t e p s : c y t o c h r o m e c b i n d i n g , 0 2 b i n d i n g , i n t e r n a l e l e c t r o n t r a n s f e r , a n d p r o t o n p u m p i n g . T h e a c t i v i t y o f t h e o x i d a s e c o u l d b e m o d u l a t e d a t t h e s e s t e p s b y t h e p r e s e n c e o f t h e n u c l e a r - e n c o d e d s u b u n i t s w h i c h d o n o t e x i s t i n b a c t e r i a . L o n g - t e r m c o n t r o l c a n b e p r o v i d e d b y s u b u n i t s w h i c h a s s i s t i n b i n d i n g s u b s t r a t e o r c o f a c t o r s , o r b y t h e s u b s t i t u t i o n o f d i f f e r e n t s u b u n i t s i n d i f f e r e n t s i t u a t i o n s ( i s o z y m e s ) . S h o r t - t e r m c o n t r o l c a n b e e x e r t e d b y a l l o s t e r i c e f f e c t o r s . B i n d i n g o f e f f e c t o r s . A n u m b e r o f e f f e c t o r s h a v e b e e n s h o w n t o a l t e r t h e k i n e t i c p r o p e r t i e s o f t h e o x i d a s e , i n c l u d i n g f a t t y a c i d s ( T h i e l a n d K a d e n b a c h , 1 9 8 9 ) , n u c l e o t i d e s ( F e r g u s o n - M i l l e r e t a l . , 1 9 7 6 ; H u t h e r a n d 1 5 1 K a d e n b a c h , 1 9 8 6 ) , a n d a n i o n s s u c h a s c a r b o n a t e ( O s h e r o f f e t a l , 1 9 8 0 ) . c i t r a t e ( F e r g u s o n - M i l l e r e t a l . , 1 9 7 8 ) , a n d p h o s p h a t e ( F e r g u s o n - M i l l e r e t a l . , 1 9 7 8 ; B u g e a n d K a d e n b a c h , 1 9 8 6 ; M a l a t e s t a e t a l . , 1 9 8 7 ) . A T P h a s b e e n s h o w n t o a f f e c t t h e k i n e t i c p r o p e r t i e s o f t h e e n z y m e ( F e r g u s o n - M i l l e r e t a l . , 1 9 7 6 ) , a b o l i s h i n g t h e h i g h a f fi n i t y K m a n d l i n e a r i z i n g E a d i e - H o f s t e e p l o t s . T h e b a c t e r i a l e n z y m e , h o w e v e r , i s i n s e n s i t i v e t o i n t r a l i p o s o m a l n u c l e o t i d e s ( H i i t h e r a n d K a d e n b a c h , 1 9 8 8 ) , s u g g e s t i n g t h a t t h e e f f e c t m a y a l s o b e m e d i a t e d b y n u c l e a r - e n c o d e d s u b u n i t s . I n f a c t , p h o t o a f fi n i t y l a b e l l i n g s t u d i e s w i t h 8 - a r y l a z i d o A T P s h o w e d t h a t t h e n u c l e a r - e n c o d e d s u b u n i t s I V a n d V I I I b o u n d A T P ( M o n t e c u c c o e t a l . , 1 9 8 6 ; B i s s o n e t a l . , 1 9 8 6 ) , a l t h o u g h R e i m a n n e t a l . ( 1 9 8 8 ) w e r e u n a b l e t o r e p r o d u c e t h i s r e s u l t . B i n d i n g o f s u b s t r a t e a n d m e t a l s . S o m e s t u d i e s s u g g e s t t h a t t h e n u c l e a r s u b u n i t s f o r m p a r t o f t h e b i n d i n g s i t e f o r c y t o c h r o m e c a l o n g w i t h s u b u n i t I I a n d p e r h a p s s u b u n i t I I I . W h e n w a t e r - s o l u b l e c a r b o d i i m i d e s w e r e r e a c t e d w i t h t h e o x i d a s e , c y t o c h r o m e c p r o t e c t e d s e v e r a l o f t h e n u c l e a r - e n c o d e d s u b u n i t s ( B i s s o n a n d M o n t e c u c c o , 1 9 8 2 ; K a d e n b a c h a n d S t r o h , 1 9 8 4 ; T a h a a n d F e r g u s o n - M i l l e r , 1 9 9 2 ) . S i n c e t h e s e s u b u n i t s d o n o t e x i s t i n t h e b a c t e r i a l e n z y m e s , i t m a y b e h y p o t h e s i z e d t h a t t h e y a r e n o t s t r i c t l y n e c e s s a r y f o r c y t o c h r o m e c b i n d i n g a n d m a y m e r e l y m o d u l a t e t h e b i n d i n g c h a r a c t e r i s t i c s . H o w e v e r , t h i s i n t e r p r e t a t i o n h a s b e e n c a l l e d i n t o q u e s t i o n ( C a p a l d i , 1 9 9 0 b ) s i n c e A T P p r o t e c t s t h e s a m e s e t o f s u b u n i t s f r o m c a r b o d i i m i d e l a b e l l i n g a s d o e s c y t o c h r o m e c ( B i s s o n e t a l . , 1 9 8 7 ) , s u g g e s t i n g t h a t t h e p r o t e c t i o n i s d u e t o c y t o c h r o m e c - a n d A T P - i n d u c e d c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s . A s m e n t i o n e d a b o v e ( s e c t i o n 5 . 3 . 1 . 2 ) , a c o n s e r v e d c y s t e i n e o n s u b u n i t V I a h a s b e e n s u g g e s t e d t o b i n d t h e z i n c f o u n d i n m e t a l a n a l y s e s ( N a q u i e t a l . , 1 9 8 8 ) . H o w e v e r , n o r o l e f o r t h i s m e t a l h a s b e e n d e m o n s t r a t e d . 1 5 2 I s o z y m e s . T h e e x i s t e n c e o f i s o z y m e s o f c y t o c h r o m e o x i d a s e s t r o n g l y s u g g e s t s t h a t t h e n u c l e a r - e n c o d e d s u b u n i t s h a v e a r e g u l a t o r y r o l e . I n m a m m a l s , s u b u n i t s V I a , V I I a , a n d V I I I h a v e b e e n s h o w n t o h a v e t i s s u e - s p e c i fi c f o r m s b a s e d o n d i f f e r e n c e s i n p o l y a c r y l a m i d e g e l s ( M e r l e a n d K a d e n b a c h , 1 9 8 0 ) , i m m u n o l o g i c a l p r o p e r t i e s ( J a r a u s c h a n d K a d e n b a c h , 1 9 8 2 ; K u h n - N e n t w i g a n d K a d e n b a c h , 1 9 8 5 ) a n d N - t e r m i n a l a m i n o a c i d s e q u e n c e s ( K a d e n b a c h e t a l . , 1 9 8 2 ; Y a n a m u r a e t a l . , 1 9 8 8 ; K a d e n b a c h e t a l . , 1 9 9 0 ) . I n d i f f e r e n t t i s s u e s o f b o v i n e o x i d a s e , s u b u n i t V I c a n a p p e a r i n e i t h e r t h e l i v e r f o r m ( 1 ) o r t h e h e a r t f o r m ( h ) . I n r a t o x i d a s e , h o w e v e r , h e a r t c o n t a i n s b o t h V I - h a n d V I - l f o r m s , w h i l e t h e l i v e r c o n t a i n e s o n l y V I - l ( S c h l e r f e t a l . , 1 9 8 8 ; K a d e n b a c h e t a l . , 1 9 9 0 ) , d e m o n s t r a t i n g t h a t t h e e x p r e s s i o n o f i s o z y m e s v a r i e s b e t w e e n s p e c i e s . I n f a c t , N - t e r m i n a l p r o t e i n s e q u e n c e s r e v e a l t h a t t h e r a t b r o w n f a t o x i d a s e c o n t a i n s t h e l i v e r f o r m o f s u b u n i t V I a b u t t h e h e a r t f o r m o f s u b u n i t V I I I ( K a d e n b a c h e t a l . , 1 9 9 0 ) , s u g g e s t i n g t h a t t h e o x i d a s e f r o m d i f f e r e n t t i s s u e s c a n “ m i x a n d m a t c h ” i s o s u b u n i t s t o s u i t t h e i r p a r t i c u l a r n e e d s . A s i m i l a r s i t u a t i o n o c c u r s i n m o u s e , w h e r e t h e t h y m u s o x i d a s e c o n t a i n s l i v e r - t y p e V I a b u t h e a r t - t y p e V I I I . I n t h i s c a s e , t h e t w o f o r m s o f V I a a r e d i s t i n g u i s h e d b y t h e i r d i f f e r e n t s t a i n i n g i n t e n s i t i e s a n d n o t d i f f e r e n t e l e c t r o p h o r e t i c m o b i l i t i e s ( V a n d e n B o g e r t e t a l . , 1 9 9 2 ) . A t i s s u e - s p e c i fi c f o r m o f t h e o x i d a s e i n p l a n t s i s s u g g e s t e d b y t h e d i f f e r e n t r e a c t i v i t i t e s o f o x i d a s e s f r o m m u n g b e a n r o o t s a n d h y p o c o t y l s t o a s u b u n i t - s p e c i fi c a n t i b o d y ( N a k a g a w a e t a l . , 1 9 8 8 ) . T h e s e q u e n c e c o n s e r v a t i o n o f i s o z y m e s b e t w e e n d i f f e r e n t s p e c i e s i s v e r y s t r o n g . I n f a c t , t h e h o m o l o g y i s o f t e n g r e a t e r b e t w e e n i s o z y m e s e q u e n c e s f r o m t h e s a m e t i s s u e o f d i f f e r e n t s p e c i e s t h a n b e t w e e n i s o z y m e s f r o m d i f f e r e n t t i s s u e s i n t h e s a m e s p e c i e s . F o r i n s t a n c e , t h e r e i s 5 0 % h o m o l o g y b e t w e e n r a t h e a r t a n d l i v e r s u b u n i t V I a i s o z y m e s , b u t 7 4 % 1 5 3 h o m o l o g y b e t w e e n r a t a n d b o v i n e h e a r t V I a i s o z y m e s ( S c h l e r f e t a l . , 1 9 8 8 ) . T h e l i v e r f o r m c o n t a i n s fi v e m o r e n e g a t i v e c h a r g e s t h a n t h e h e a r t f o r m , p e r h a p s m o d u l a t i n g t h e e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s w i t h c y t o c h r o m e c . T h i s m a y e x p l a i n t h e d i f f e r e n t k i n e t i c s o b s e r v e d f o r t h e t w o i s o z y m e s a s s s a y e d i n i n t a c t o r d e o x y c h o l a t e - d i s s o l v e d m e m b r a n e s ( M e r l e a n d K a d e n b a c h , 1 9 8 2 ) o r r e c o n s t i t u t e d o x i d a s e ( B u g e a n d K a d e n b a c h , 1 9 8 6 ) u s i n g t h e p o l a r o g r a p h i c a s s a y , a l t h o u g h S i n j o r g o e t a l . ( 1 9 8 7 ) f o u n d n o d i f f e r e n c e s u s i n g t h e s p e c t r a l a s s a y . T h e e f f e c t s o f A T P a n d A D P o n t h e k i n e t i c s o f t h e s e t w o o x i d a s e s w e r e a l s o f o u n d t o b e d i f f e r e n t ( K a d e n b a c h e t a l . , 1 9 9 1 ) . E n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s a l s o a f f e c t e x p r e s s i o n o f t h e n u c l e a r s u b u n i t s . I n y e a s t , s u b u n i t V a i s e x p r e s s e d a t h i g h l e v e l s b u t V b a t l o w l e v e l s u n d e r n o r m a l a e r o b i c c o n d i t i o n s . A n u l l m u t a n t o f V a r e s u l t s i n a f u n c t i o n a l o x i d a s e , b u t a t o n l y 1 0 % o f t h e n o r m a l l e v e l s d u e t o l o w e r e x p r e s s i o n r e l a t i v e t o t h e n o r m a l V a ( P o y t o n e t a l . , 1 9 8 8 ) . W h e n 0 2 o r h e m e b e c o m e s l i m i t i n g , V b i s e x p r e s s e d a t h i g h e r l e v e l s w h i l e V a d e c r e a s e s . T h e s e t w o g e n e s s h a r e a 6 6 % h o m o l o g y ( C u m s k y e t a l . , 1 9 8 7 ) . T h e s l i m e m o l d D i c t y o s t e l i u m d i s c o i d e u m p r o d u c e s s u b u n i t V I I e d u r i n g t h e e x p o n e n t i a l p h a s e o f g r o w t h a n d t h e u n r e l a t e d V I I a , d u r i n g s t a t i o n a r y p h a s e ( B i s s o n a n d S c h i a v o , 1 9 8 6 ) , t h u s s u g g e s t i n g t h a t s u b u n i t e x p r e s s i o n c a n b e c o n t r o l l e d d e v e l o p m e n t a l l y . T h i s d i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o n , l i k e t h e y e a s t s u b u n i t V , i s a p p a r e n t l y c o n t r o l l e d b y 0 2 l e v e l s ( B i s s o n a n d S c h i a v o , 1 9 8 8 ; S c h i a v o a n d B i s s o n , 1 9 8 9 ) . 6 . 4 . 5 . 2 A s s e m b l y o f t h e c o m p l e x N u l l m u t a n t s o f e a c h o f t h e n u c l e a r s u b u n i t s o f y e a s t w e r e c r e a t e d t o s t u d y t h e i r e f f e c t o n t h e a s s e m b l y a n d f u n c t i o n o f t h e o x i d a s e c o m p l e x . M u t a n t s i n a l l s u b u n i t s e x c e p t V I I I r e s u l t e d i n n o d e t e c t a b l e c y t o c h r o m e s a a 3 a n d n o o x i d a s e a c t i v i t y . T h e n u l l m u t a n t i n s u b u n i t V I I I r e d u c e d a a 3 1 5 4 a n d r e s p i r a t i o n t o 8 0 % o f w i l d t y p e ( P a t t e r s o n e t a l . , 1 9 8 6 ) , i n d i c a t i n g t h a t i t i s n o t a b s o l u t e l y n e c e s s a r y f o r a s s e m b l y o f t h e e n z y m e a n d m a y b e t h e l a s t s u b u n i t a d d e d . I t i s n o t c l e a r w h a t r o l e t h e n u c l e a r s u b u n i t s h a v e i n p r o p e r a s s e m b l y o f t h e o x i d a s e s i n c e b a c t e r i a l o x i d a s e s a s s e m b l e w i t h o u t t h e m . T h e n u c l e a r - e n c o d e d s u b u n i t s m a y p r o v i d e a “ s c a fi ‘ o l d i n g ” f o r a s s e m b l y , a s s i s t i n t h e f o l d i n g o f s u b u n i t s , o r r e g u l a t e s y n t h e s i s o f t h e l a r g e r m i t o c h o n d r i a l s u b u n i t s . 5 . 5 P l a n t c y t o c h r o m e o x i d a s e I n t e r e s t i n t h e c y t o c h r o m e o x i d a s e f r o m p l a n t s i n c r e a s e d a f t e r c y t o p l a s m i c m a l e s t e r i l i t y ( C M S , s e e c h a p t e r 2 ) w a s s u g g e s t e d t o i n v o l v e t h e e n z y m e . T h e s u b u n i t I g e n e f r o m a C M S l i n e o f s o r g h u m w a s s h o w n t o p o s s e s s a u n i q u e C - t e r m i n a l e x t e n s i o n a n d d i f f e r e n t g e n o m i c l o c a t i o n r e l a t i v e t o a f e r t i l e l i n e o f s o r g h u m ( B a i l e y - S e r r e s e t a l . , 1 9 8 6 ) a s a r e s u l t o f m i t o c h o n d r i a l D N A r e a r r a n g e m e n t s . R e a r r a n g e m e n t o f C O X I I i n p e t u n i a ( Y o u n g a n d H a n s o n , 1 9 8 7 ) a l s o c o r r e l a t e s w i t h C M S . M o r e o v e r , p a r t i a l l y p u r i fi e d f r a c t i o n s o f c y t o c h r o m e o x i d a s e f r o m m a i z e ( R . I n g l e , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) a s w e l l a s i m m u n o p r e c i p i t a t e s o f t h e o x i d a s e ( C . L e a v e r , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) a p p e a r e d t o c o n t a i n t h e n o v e l p o l y p e p t i d e s p r o d u c e d a s a r e s u l t o f t h e s e D N A r e a r r a n g e m e n t s . F u r t h e r i n t e r e s t h a s b e e n s p a r k e d b y t h e i d e n t i fi c a t i o n o f w h e a t a s t h e o n l y o r g a n i s m w h o s e D N A d o e s n o t e n c o d e a c y s t e i n e a t p o s i t i o n 1 9 6 ( b e e f . h e a r t n u m b e r i n g ) , t h e p u t i t i v e C u A l i g a n d ( B o n e n e t a l . , 1 9 8 4 ) . R N A s e q u e n c i n g l a t e r s h o w e d t h a t C — ) U e d i t i n g o f t h e m e s s a g e o c c u r r e d , r e s t o r i n g t h e c o n s e r v e d c y s t e i n e ( C o v e l l o a n d G r a y , 1 9 8 9 ) . H o w e v e r , a l t h o u g h e x t e n s i v e R N A e d i t i n g a p p e a r s t o t a k e p l a c e i n t h e m i t o c h o n d r i a _ N a n a - a . 1 . y a . 1 5 5 o f p l a n t s ( s e e s e c t i o n 1 . 4 . 4 ) , o n l y o n e a m i n o a c i d s e q u e n c e h a s b e e n o b t a i n e d f r o m a p l a n t p r o t e i n t h a t i s p r o d u c e d f r o m a n e d i t e d m e s s a g e , t h a t o f t h e A T P a s e s u b u n i t 9 ( G r a v e s e t a l . , 1 9 9 0 ) . D e s p i t e t h e s e m o t i v a t i o n s , c y t o c h r o m e o x i d a s e f r o m p l a n t s , a s w e l l a s m a n y o t h e r p l a n t p r o t e i n s , h a v e n o t b e e n a s w e l l s t u d i e d a s t h o s e f r o m m a m m a l i a n , y e a s t , o r b a c t e r i a f o r m a n y r e a s o n s . A m a j o r p r o b l e m i s t h a t t h e p l a n t c y t o p l a s m c o n t a i n s c h l o r 0 p 1 a s t s , a n d s t a n d a r d m e t h o d s f o r p r e p a r i n g m i t o c h o n d r i a f r o m o t h e r s o u r c e s f a i l t o s e p a r a t e t h e t w o o r g a n e l l e s b e c a u s e o f t h e i r s i m i l a r d e n s i t i e s . T o o v e r c o m e t h i s p r o b l e m t i s s u e s c o n t a i n i n g u n d e v e l o p e d c h l o r o p l a s t s a r e o f t e n u s e d , f o r e x a m p l e e t i o l a t e d s h o o t s ( m o s t p l a n t s , b u t e s p e c i a l l y g r a s s e s s u c h a s m a i z e a n d w h e a t ) , r o o t s o r t u b e r s ( p o t a t o ) , f r u i t ( t o m a t o ) , s e e d e a r s ( m a i z e ) , o r c e l l s u s p e n s i o n c u l t u r e . A s e c o n d p r o b l e m i s t h a t t h e s e s o u r c e s y i e l d l o w a m o u n t s o f m i t o c h o n d r i a . A t h i r d p r o b l e m i s t h a t t h e p r e s e n c e o f p h e n o l i c c o m p o u n d s u s e d f o r c e l l w a l l s y n t h e s i s t e n d t o p o l y m e r i z e a n d b i n d t o p r o t e i n s , i n t e r f e r i n g w i t h p u r i fi c a t i o n . 5 . 5 . 1 P u r i fi c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n T h e fi r s t a t t e m p t s t o p u r i f y c y t o c h r o m e o x i d a s e f r o m p l a n t s o u r c e s o c c u r r e d i n t h e 1 9 4 0 ’ s . G o d d a r d ( 1 9 4 4 ) i s o l a t e d a f r a c t i o n b y a c e t o n e - b e n z o l e x t r a c t i o n o f w h e a t g e r m ; h o w e v e r , m a n y o f t h e m o d e r n t o o l s f o r a n a l y s i s o f p u r i t y a n d i n t e g r i t y w e r e u n a v a i l a b l e t h e n . T h e a c t i v i t y , a s m e a s u r e d b y 0 2 c o n s u m p t i o n , w a s l o w , a n d n o U V - v i s s p e c t r a w e r e p r e s e n t e d . S p e c t r a l p r o p e r t i e s o f t h e o x i d a s e a n d o t h e r p l a n t c y t o c h r o m e s w e r e l a t e r i n v e s t i g a t e d i n i n t a c t m i t o c h o n d r i a , s h o w i n g t h e p l a n t o x i d a s e t o h a v e u n i q u e s p e c t r a l p r o p e r t i e s r e l a t i v e t o o t h e r e u k a r y o t e s ( C h a n c e e t a l . , 1 9 6 8 ) . S p e c i fi c a l l y , t h e a b a n d i n t h e o p t i c a l s p e c t r a o f t h e r e d u c e d e n z y m e i s b l u e - f u n - n . . . ‘ : - ' ~ ‘ m - q — n w f n I T - I U : . _ I 1 5 6 s h i f t e d f r o m 6 0 5 t o 6 0 2 n m , a r e s u l t c o n fi r m e d l a t e r b y s e v e r a l r e s e a r c h e r s o n t h e i r p u r i fi e d f r a c t i o n s . M o r e r e c e n t l y , c y t o c h r o m e o x i d a s e h a s b e e n p u r i fi e d f r o m a n u m b e r o f p l a n t s o u r c e s . H o w e v e r , t h e v a r i o u s m e t h o d s e m p l o y e d r e s u l t i n o x i d a s e s h a v i n g w i d e l y r a n g i n g c a t a l y t i c a c t i v i t i e s , a n d a p p a r e n t s u b u n i t c o m p o s i t i o n s d i f f e r e n t f r o m o t h e r e u k a r y o t i c o x i d a s e s a s w e l l a s f r o m e a c h o t h e r . T h e o x i d a s e p u r i fi e d f r o m s w e e t p o t a t o r o o t t i s s u e ( M a e s h i m a a n d A s a h i , 1 9 7 8 ) a n d e t i o l a t e d p e a s e e d l i n g ( M a t s u o k a e t a l . , 1 9 8 1 ) b y a s e l e c t i v e s o l u b i l i z a t i o n o f m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s w i t h d e o x y c h o l a t e f o l l o w e d b y D E A E c h r o m a t o g r a p h y i n T r i t o n X - 1 0 0 a n d a m m o n i u m s u l f a t e p r e c i p i t a t i o n a p p e a r s t o b e e x t r e m e l y l a b i l e ; t h e p u r i fi e d e n z y m e h a d m i n i m a l c a t a l y t i c a c t i v i t y . S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l s s u g g e s t t h a t p l a n t o x i d a s e s h a v e a s i m p l e r a n d s o m e w h a t d i f f e r e n t s u b u n i t c o m p o s i t i o n t h a n o x i d a s e s f r o m m a m m a l s o r y e a s t . L o w - r e s o l u t i o n g e l s i d e n t i fi e d o n l y fi v e s u b u n i t s w i t h m o l e c u l a r w e i g h t s : 1 - 3 9 , I I - 3 3 . 5 , 1 1 1 - 2 6 , I V - 2 0 , V - 5 . 7 k D a ( M a e s h i m a a n d A s a h i , 1 9 7 8 ) . S u b u n i t V w a s l a t e r r e s o l v e d i n t o V a , b , a n d c w i t h m o l e c u l a r w e i g h t s 7 . 4 , 6 . 8 , a n d 6 . 2 k D a b y u s i n g a h i g h e r r e s o l u t i o n g e l s y s t e m ( N a k a g a w a e t a l . , 1 9 8 7 ) . N - t e r m i n a l a m i n o a c i d s e q u e n c i n g o f V c r e v e a l e d n o h o m o l o g y t o s u b u n i t s i n y e a s t o r m a m m a l s . P o l y c l o n a l a n t i b o d i e s p r e p a r e d a g a i n s t t h e p u r i fi e d e n z y m e i m m u n o p r e c i p i t a t e d a d d i t i o n a l p o l y p e p t i d e s o f 1 3 a n d 1 0 k D a ( M a t s u o k a e t a l . , 1 9 8 1 ) . I n c o n t r a s t , m a i z e o x i d a s e r e t a i n s h i g h c a t a l y t i c a c t i v i t y w h e n i t i s p u r i fi e d i n l a u r y l m a l t o s i d e b y h y r o x y a p a t i t e ( D u t c h e t a l . , 1 9 8 7 ) o r b y a n i o n - e x c h a n g e F P L C f o l l o w e d b y g e l fi l t r a t i o n ( H a w k e s f o r d e t a l . , 1 9 8 9 ) . T h e s u b u n i t c o m p o s i t i o n o f t h e m a i z e o x i d a s e p u r i fi e d b y F P L C w a s s i m i l a r t o t h e s w e e t p o t a t o o x i d a s e e x c e p t t h a t t h e p r e d i c t e d m o l e c u l a r w e i g h t s w e r e d i f f e r e n t a s a r e s u l t o f a d i f f e r e n t g e l s y s t e m . T h e l a r g e s t f o u r b a n d s — - — — 7 ! A . ' 4 ' . p é I 1 5 7 a s s i g n e d t o b e s u b u n i t s a p p r o x i m a t e l y c o m i g r a t e d w i t h t h o s e o f t h e y e a s t o x i d a s e ; h o w e v e r , t h e a d d i t i o n a l g e l b a n d s i n t h e m a i z e p r e p a r a t i o n ( i n c l u d i n g o n e n e a r 1 0 k D a w h i c h w a s n o t a c o m p o n e n t o f s u b u n i t V o f N a k a g a w a e t a l . ( 1 9 8 7 ) ) w e r e d i s s i m i l a r t o t h o s e o f t h e y e a s t . S u b u n i t - s p e c i fi c a n t i b o d i e s t o y e a s t s u b u n i t s I a n d I I b u t n o t I V c r o s s - r e a c t e d , s u g g e s t i n g t h a t t h e p l a n t a n d y e a s t n u c l e a r - e n c o d e d s u b u n i t s m i g h t n o t b e r e l a t e d . 5 . 5 . 2 P r o t o n p u m p i n g b y c y t o c h r o m e o x i d a s e I n t a c t p l a n t m i t o c h o n d r i a a r e c a p a b l e o f A D P / O r a t i o s n e a r 3 . 0 ( D u t c h e t a l . , 1 9 8 7 ) , s i m i l a r t o m a m m a l i a n v a l u e s , s u g g e s t i n g t h a t c o m p l e x e s 1 , I I I , a n d I V a r e a l l e n e r g y - c o n s e r v i n g s i t e s . M a n y s t u d i e s o n p r o t o n p u m p i n g u s i n g t h e 0 2 p u l s e t e c h n i q u e h a v e a n a l y z e d l a r g e s p a n s o f t h e r e s p i r a t o r y c h a i n a t o n c e , o f t e n s u c c i n a t e t o 0 2 ( d e V i r i l l e a n d M o r e a u , 1 9 8 4 ; M o r e a u a n d d e V i r v i l l e , 1 9 8 5 ) , c o n fi r m i n g t h a t t h e c y t o c h r o m e p a t h w a y b u t n o t t h e a l t e r n a t i v e p a t h w a y p u m p s p r o t o n s ( I s h i d a a n d P a l m e r , 1 9 8 8 ) . d e V r i l l e a n d M o r e a u ( 1 9 9 0 ) u s e d a s c o r b a t e a n d T M P D a s e l e c t r o n d o n o r s i n 0 2 p u l s e a s s a y s o f a n t i m y c i n - i n h i b i t e d p o t a t o m i t o c h o n d r i a t o e x a m i n e c y t o c h r o m e o x i d a s e d i r e c t l y , d e m o n s t r a t i n g H + / e ' r a t i o s o f 1 . 0 . N o m e a s u r e m e n t s o f p r o t o n p u m p i n g b y t h e p u r i fi e d c y t o c h r o m e o x i d a s e r e c o n s t i t u t e d i n t o l i p i d v e s i c l e s h a s y e t b e e n r e p o r t e d . 5 . 5 . 3 G e n e s G e n e s e q u e n c e s h a v e v e r i fi e d t h e s i m i l a r i t y o f t h e m i t o c h o n d r i a l l y - e n c o d e d s u b u n i t s i n p l a n t s w i t h t h o s e o f y e a s t a n d m a m m a l s . T h e p r e d i c t e d a m i n o a c i d s e q u e n c e h o m o l o g i e s b e t w e e n m a i z e a n d y e a s t a r e 5 8 % f o r s u b u n i t I ( I s a a c e t a l . , 1 9 8 5 ) a n d 4 7 % f o r s u b u n i t 1 1 ( F o x a n d L e a v e r , 1 9 8 1 ) , w h i l e t h e n u c l e o t i d e s e q u e n c e h o m o l o g y i s 5 8 % b e t w e e n m a i z e a n d b o v i n e s u b u n i t I I I g e n e s ( M c C a r t y e t a l . , 1 9 8 8 ) . A m o n g p l a n t s p e c i e s , n u c l e o t i d e s e q u e n c e h o m o l o g i e s a r e v e r y h i g h : s u b u n i t I I g e n e s a r e 9 9 % h o m o l o g o u s w i t h i n m o n o c o t s a n d 8 9 % w i t h i n d i c o t s ( T u r a n o e t a l . , 1 9 8 7 ) . T h e s e v a l u e s d o n o t t a k e i n t o a c c o u n t R N A e d i t i n g , w h i c h c h a n g e s u p t o 5 % o f t h e a m i n o a c i d r e s i d u e s i n s o m e g e n e s ( C o v e l l o a n d G r a y , 1 9 9 0 ) . T h e s u b u n i t I I g e n e o f w h e a t w a s p r e d i c t e d t o c o d e f o r s e v e r a l r a d i c a l a m i n o a c i d s u b s t i t u t i o n s , i n c l u d i n g a n a r g i n i n e f o r t h e c o n s e r v e d c y s t e i n e a t p o s i t i o n 2 2 8 ( b e e f h e a r t 1 9 6 ) , w h i c h h a s b e e n p r o p o s e d t o b e a l i g a n d o f C u A ( B o n e n e t a l . , 1 9 8 4 ) . H o w e v e r , R N A e d i t i n g “ c o r r e c t s ” t h i s a n o m a l y , a l l o w i n g , a s i n m a n y o t h e r c a s e s , t h e c o n s e r v e d r e s i d u e t o b e a p p e a r i n t h e s e q u e n c e ( C o v e l l o a n d G r a y , 1 9 8 9 ; C o v e l l o a n d G r a y , 1 9 9 0 ) . N o g e n e s f o r n u c l e a r - e n c o d e d s u b u n i t s o f c y t o c h r o m e o x i d a s e h a v e b e e n i s o l a t e d f r o m p l a n t s . H o w e v e r , N a k a g a w a e t a l . ( 1 9 9 0 ) h a v e c l o n e d a c D N A f o r s u b u n i t V c f r o m t h e s w e e t p o t a t o o x i d a s e . T h i s s e q u e n c e s h o w s r e g i o n s o f h o m o l o g y w i t h b e e f h e a r t o x i d a s e s u b u n i t V I I I a n d y e a s t o x i d a s e s u b u n i t V I I a . I n t e r e s t i n g l y , t h e b e e f h e a r t o x i d a s e s u b u n i t V I I I i s e x p r e s s e d i n a t i s s u e - s p e c i fi c m a n n e r , w h i l e t h e p l a n t V c h a s b e e n s u g g e s t e d t o b e i n v o l v e d i n t i s s u e - s p e c i fi c c h a n g e s i n t h e i m m u n o r e a c t i v i t y o f t h e p l a n t o x i d a s e ( N a k a g a w a e t a l . , 1 9 9 0 ) . I n t h e a b s e n c e o f f u r t h e r s e q u e n c e i n f o r m a t i o n , i t i s n o t p o s s i b l e t o s a y w h e t h e r o t h e r n u c l e a r s u b u n i t s f r o m p l a n t s s h a r e h o m o l o g y w i t h t h e i r m a m m a l i a n o r y e a s t c o u n t e r p a r t s , b u t i t s e e m s l i k e l y . T h e h o m o l o g y o f V c t o s u b u n i t s f r o m o t h e r o x i d a s e s s t r e s s e s t h e i m p o r t a n c e o f t h e n u c l e a r s u b u n i t s i n o x i d a s e f u n c t i o n . T h e s t u d y o f p l a n t o x i d a s e , i n a d d i t i o n t o a n s w e r i n g b a s i c q u e s t i o n s o n s t r u c t u r e - f u n c t i o n r e l a t i o n s h i p s , s h o u l d p r o v i d e a u n i q u e o p p o r t u n i t y t o i n v e s t i g a t e t h e r o l e o f t h e n o n - c a t a l y t i c s u b u n i t s o f t h e c o m p l e x . i s . . . ; T I . U i I ) I I ; . 1 A 3 : f . . l 4 ) f . v : ! ! . l . l J 1 I I l i a } . 4 2 5 5 . . . £ 2 3 . . ) I . M l C H i G A N S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S L M l c h I l B g R a A n R S Y t a t e ‘ 0 0 8 1 1 1 7 7 9 1 3 8 U n i v e r s i t y P L A C E I N R E T U R N B O X t o r e m o v e t h I e c h e c k o u t f r o m y o u r r e c o r d . T O A V O I D F I N E S r e t u r n o n o r b a t o n o n e d u e . D A T E D U E D A T E D U E D A T E D U E M S U I s A n A f fi r m a t i v e A c t i o n / E q u a l O p p o r t u n l t y I n e t l t u t i c n c m m G - M S T R U C T U I 0 F P I A } A S S E S S M E N T O F T H E R O L E O F P L A N T M I T O C H O N D R I A L R E S P I R A T O R Y C O M P L E X E S I N C Y T O P L A S M I C M A L E S T E R I L I T Y A N D S T R U C T U R A L A N A L Y S I S O F P L A N T C Y T O C H R O M E C O X I D A S E V o l u m e I I B y W e n d y E i l e e n P e i fl ‘ e r A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f . D O C T O R O F P H I L O S O P H Y D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y 1 9 9 2 6 . 1 1 n t r o d u T h e p . C y t o p l a s m i c : i n t e r e s t i n t } W h e a t i n p a r t h a t a n a r g i r ( B o n e n e t a l . , C U A m i g h t I M A s e q u e n . ( C o v e l l o a n d s e q u e n c i n g . i n t o t h e r o l e d i f f e r f r o m t ] C h a p t e r 6 - P u r i fi c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m w h e a t 6 . 1 I n t r o d u c t i o n T h e p o s s i b i l i t y t h a t c y t o c h r o m e o x i d a s e p l a y s a r o l e i n t h e c y t o p l a s m i c m a l e s t e r i l i t y t r a i t ( s e e c h a p t e r 2 ) h a s g e n e r a t e d i n c r e a s e d i n t e r e s t i n t h e e n z y m e f r o m p l a n t s . W e c h o s e t o p u r i f y t h e o x i d a s e f r o m w h e a t i n p a r t i c u l a r b e c a u s e t h e D N A s e q u e n c e o f w h e a t s u b u n i t I I p r e d i c t s t h a t a n a r g i n i n e r e p l a c e s a c o n s e r v e d c y s t e i n e ( 2 2 8 ) a t t h e p u t i t i v e C u A s i t e ( B o n e n e t a l . , 1 9 8 4 ) , i m p l y i n g t h a t t h e l i g a n d i n g a n d f u n c t i o n a l p r o p e r t i e s o f G u y ; m i g h t b e a l t e r e d i n w h e a t c y t o c h r o m e o x i d a s e . R e c e n t l y , h o w e v e r , R N A s e q u e n c i n g h a s s h o w n t h a t e d i t i n g o f t h e m R N A r e s t o r e s t h e c y s t e i n e ( C o v e l l o a n d G r a y , 1 9 8 9 ) . T h i s h a s y e t t o b e c o n f i r m e d b y d i r e c t p r o t e i n s e q u e n c i n g . S t u d i e s o n t h e p l a n t o n d d a s e s m a y a l s o p r o v i d e n e w i n s i g h t i n t o t h e r o l e s o f t h e n u c l e a r - e n c o d e d s u b u n i t s , w h i c h i n p l a n t s a p p e a r t o d i f f e r f r o m t h o s e o f e u k a r y o t i c o x i d a s e s . T h e p l a n t c y t o c h r o m e c o x i d a s e s s t u d i e d t h u s f a r , f r o m s w e e t p o t a t o ( M a e s h i m a a n d A s a h i , 1 9 7 8 ; N a k a g a w a e t a l . , 1 9 8 7 ) , p e a ( M a t s u o k a e t a l . , 1 9 8 1 ) , a n d m a i z e ( D u t c h e t a l . , 1 9 8 7 ; H a w k e s f o r d e t a l . , 1 9 8 9 ) , h a v e a n a p p a r e n t s u b u n i t c o m p o s i t i o n n o t o n l y d i f f e r e n t f r o m o t h e r e u k a r y o t i c o x i d a s e s , b u t d i f f e r e n t f r o m e a c h o t h e r . M o r e o v e r , e l e c t r o n t r a n s f e r a c t i v i t y d i f f e r s s i g n i fi c a n t l y b e t w e e n p r e p a r a t i o n s . T h e p r e p a r a t i o n s o f D u t c h e t a l . ( 1 9 8 7 ) a n d H a w k e s f o r d e t a l . ( 1 9 8 9 ) r e t a i n e d h i g h a c t i v i t y b y u s i n g t h e n o n i o n i c d e t e r g e n t l a u r y l m a l t o s i d e , w h i c h h a s b e e n s h o w n t o s t i m u l a t e t h e a c t i v i t y o f o t h e r e u k a r y o t i c o x i d a s e s ( R o s e v e a r e t a l . , 1 9 8 0 ) . T h e m e t h o d o f p u r i fi c a t i o n i s w e l l k n o w n t o a f f e c t b o t h t h e a p p a r e n t s u b u n i t c o m p o s i t i o n a n d a c t i v i t y . W i t h m u l t i s u b u n i t c o m p l e x e s , t h e r e i s a l w a y s a c o n c e r n t h a t 1 6 0 - s ‘ n a m L E M c p r u f F p r m A W s t e h a e s r i r e i s h p x h a r a c t d o u n a s d c t i o n r t a e a e l d o p a e t e i s c v o h c o a h . i r i i d t : fi c t c a r b e e a s T s d e e h o i t l a W h n 1 g m g e a e c o n t s t s o y i e a d 9 e t h n 7 r c i t I ] : t ] 5 e ' : r t “ c ? p r e p a r a t i o n s a c t i v i t y a n d a c t i v i t y b u t ( i t o r e t a i n a c t c o m p o s i t i o n . T h e f L 1 6 1 p r e p a r a t i o n s s u b j e c t e d t o s t r i n g e n t p u r i fi c a t i o n c o n d i t i o n s m a y l o s e b o t h a c t i v i t y a n d s u b u n i t s , w h i l e l e s s r i g o r o u s p u r i fi c a t i o n m a y r e s u l t i n h i g h e r a c t i v i t y b u t c o n t a m i n a t i n g p r o t e i n s . T h e r e f o r e , a g o a l o f o u r p r e p a r a t i o n i s t o r e t a i n a c t i v i t y w h i l e a c h i e v i n g h i g h e n o u g h p u r i t y t o e s t a b l i s h s u b u n i t c o m p o s i t i o n . T h e f u n c t i o n a l s i g n i fi c a n c e o f t h e u n u s u a l s u b u n i t a n d s p e c t r a l c h a r a c t e r i s t i c s o f p l a n t c y t o c h r o m e o x i d a s e s h a s n o t b e e n e s t a b l i s h e d , i n p a r t d u e t o t h e d i f fi c u l t y i n o b t a i n i n g e n o u g h p l a n t m i t o c h o n d r i a t o p u r i f y a r e a s o n a b l y l a r g e q u a n t i t y o f t h e o x i d a s e . E t i o l a t e d s e e d l i n g s a r e f r e q u e n t l y u s e d a s a s t a r t i n g m a t e r i a l t o r e d u c e c o n t a m i n a t i o n o f t h e m i t o c h o n d r i a l f r a c t i o n w i t h c h l o r o p l a s t s , b u t ' t h i s a p p r o a c h i s t i m e - c o n s u m i n g a n d l o w - y i e l d . T h e u s e o f w h e a t g e r m a s a n a l t e r n a t i v e s o u r c e o f p l a n t m a t e r i a l p r o v i d e s a s u b s t a n t i a l a d v a n t a g e i n t i m e a n d y i e l d . A l t h o u g h i t h a s b e e n r e p o r t e d t h a t u n i m b i b e d p l a n t e m b r y o s d o n o t c o n t a i n r e c o v e r a b l e i n t a c t m i t o c h o n d r i a a n d h a v e l o w a m o u n t s o f m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n ( S a t o a n d A s a h i , 1 9 7 5 ) , w e h a v e i s o l a t e d a m e m b r a n e f r a c t i o n f r o m c o m m e r c i a l w h e a t g e r m t h a t h a s a p r o t e i n c o m p l e m e n t a n d c y t o c h r o m e o x i d a s e s p e c i fi c a c t i v i t y s i m i l a r t o e t i o l a t e d w h e a t s e e d l i n g m i t o c h o n d r i a . U s i n g t h i s c o n v e n i e n t a n d r i c h s o u r c e , w e h a v e s u c c e e d e d i n p u r i f y i n g b y a n i o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y i n l a u r y l m a l t o s i d e a h i g h l y a c t i v e c y t o c h r o m e o x i d a s e w h i c h i s w e l l s u i t e d f o r s t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l a n a l y s i s . 6 . 2 M a t e r i a l s a n d m e t h o d s 6 . 2 . 1 M a t e r i a l s W h e a t g e r m w a s p u r c h a s e d f r o m S t a r o f t h e W e s t M i l l i n g C o m p a n y i n F r a n k e n m u t h , M i c h i g a n , a n d K i n g M i l l i n g C o m p a n y i n L o w e l l , i 8 0 1 a t i o n M i c h i g a n . f r o m M i c h i g G L 4 6 6 ) w a m a l t o s i d e v c S i g m a ' 1 F e r g u s o n - 3 m g / m L a s o i n 2 % c h o l a s u l f o n i c a c i “ d i c a t e d : s e r u m 8 1 b ( B o e h r i n g . ( S e x - V a ) , 1 c a r b o x m e a l k a l i n e p B i o R a d L 6 - 2 2 p m ; A l l f r e e g l a s s S t u d i e s “ e t i o l a t e d r e l a t i V e h T o 9 “ “ 3 8 1 1 1 a e r a t e d ‘ v 1 6 2 M i c h i g a n . W h e a t s e e d ( T r i t i c u m a e s t i v u s v a r . T i t a n R e d ) w a s o b t a i n e d f r o m M i c h i g a n F o u n d a t i o n S e e d C o m p a n y . M a i z e s e e d ( Z e a m a y s v a r i e t y G L 4 6 6 ) w a s p u r c h a s e d f r o m G r e a t L a k e s H y b r i d s , I n c . L a u r y l B - D - m a l t o s i d e w a s s y n t h e s i z e d a c c o r d i n g t o R o s e v e a r e t a l . ( 1 9 8 0 ) . C y t o c h r o m e c S i g m a T y p e V I w a s f u r t h e r p u r i fi e d a c c o r d i n g t o T h o m p s o n a n d F e r g u s o n - M i l l e r ( 1 9 8 3 ) . A s o l e c t i n v e s i c l e s w e r e p r e p a r e d b y s o n i c a t i n g 4 0 m g / m L a s o l e c t i n ( A s s o c i a t e d C o n c e n t r a t e s , L o n g I s l a n d , N Y ) f o r 1 m i n / m L i n 2 % c h o l a t e a n d 7 5 m M K - I - I E P E S ( 4 - ( 2 - h y d r o x y e t h y l ) - l - p i p e r a z i n e - e t h a n e - s u l f o n i c a c i d ) , p H 7 . 4 . O t h e r c h e m i c a l s w e r e o b t a i n e d f r o m t h e s o u r c e s i n d i c a t e d : B C A P r o t e i n A s s a y R e a g e n t ( P i e r c e C h e m i c a l C o m p a n y ) , b o v i n e s e r u m a l b u m i n ( B S A , S i g m a f r a c t i o n V ) , u l t r a - p u r e s u c r o s e ( I C N ) , E - 6 4 ( B o e h r i n g e r - M a n n h e i m ) , a c r y l a m i d e a n d N , N ' - m e t h y l e n e b i s a c r y l a m i d e ( S e r v a ) , i n s o l u b l e p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e ( P V P , S e r v a P o l y c l a r A T ) , c a r b o x y m e t h y l c e l l u l o s e r e s i n ( W h a t m a n ) , a n d g o a t a n t i - r a b b i t I g G ( H + L ) a l k a l i n e p h o s p h a t a s e c o n j u g a t e ( W e s t e r n b l o t t i n g g r a d e a f fi n i t y p u r i fi e d , B i o - R a d L a b o r a t o r i e s ) . 6 . 2 . 2 P r e p a r a t i o n o f w h e a t a n d m a i z e s e e d l i n g m i t o c h o n d r i a A l l o p e r a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t a t 0 — 4 ° C u s i n g p r e - c h i l l e d d e t e r g e n t - f r e e g l a s s w a r e . I n t a c t w h e a t m i t o c h o n d r i a f o r u s e i n r e s p i r a t o r y c o n t r o l s t u d i e s w e r e p r e p a r e d b y t h e m e t h o d o f D a y a n d H a n s o n ( 1 9 7 7 ) f r o m e t i o l a t e d s e e d l i n g s g r o w n i n v e r m i c u l i t e f o r fi v e d a y s a t 2 5 ° C a n d 8 0 % r e l a t i v e h u m i d i t y . T o p r e p a r e m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s f o r c y t o c h r o m e o x i d a s e i s o l a t i o n , w h e a t s e e d s w e r e s o a k e d i n a e r a t e d w a t e r o v e r n i g h t , s p r e a d b e t w e e n t w o s h e e t s o f s t i f f p l a s t i c m e s h , a n d s u s p e n d e d o v e r d i s t i l l e d , a e r a t e d w a t e r . S o a k e d m a i z e s e e d s w e r e p l a n t e d i n v e r m i c u l i t e . S e e d l i n g s ‘ h l - w e r e g r o w e r e b a r i n c o l d I 1 0 s e c o m 3 4 3 L 2 2 ) 7 . 7 , a n d s e e d l i n g s a n d c e n t : a t 2 7 0 0 1 r e s u S p e n 0 . 2 m ) i a c i d ) , 0 . 1 D e n e t , r e s 5 0 m M K c u s h i o n I m i t o c h o n c S U S p e n S i m 0 f c y t O C h r u 1 6 3 w e r e g r o w n i n t h e d a r k a t 2 5 ° C a n d 8 0 % r e l a t i v e h u m i d i t y f o r fi v e d a y s a n d w e r e h a r v e s t e d u s i n g e l e c t r i c g r a s s s h e a r s . T h e c u t s e e d l i n g s w e r e s o a k e d i n c o l d ( 4 ° C ) d i s t i l l e d w a t e r f o r a n h o u r t h e n d r a i n e d b e f o r e g r i n d i n g 1 0 s e c o n d s a t t h e h i g h e s t s p e e d i n a c o m m e r c i a l W a r i n g b l e n d e r ( M o d e l 3 4 B L 2 2 ) w i t h 0 . 4 M m a n n i t o l , 5 0 m M K H g P O 4 , 5 m M E G T A , 0 . 2 % B S A , p H 7 . 7 , a n d P V P ( 0 . 1 g / g s e e d l i n g s ) a t a p p r o x i m a t e l y 1 m L b u fi ‘ e r p e r g r a m s e e d l i n g s . T h e h o m o g e n a t e w a s fi l t e r e d t h r o u g h f o u r l a y e r s o f c h e e s e c l o t h a n d c e n t r i f u g e d a t 5 0 0 g f o r 1 5 m i n u t e s . T h e s u p e r n a t a n t w a s r e c e n t r i f u g e d a t 2 7 0 0 0 g f o r 2 0 m i n u t e s t o p e l l e t t h e m i t o c h o n d r i a , w h i c h w e r e r e s u s p e n d e d u s i n g a P o t t e r - E l v e h j e m t y p e t i s s u e g r i n d e r ( c l e a r a n c e 0 . 2 m m ) i n 0 . 4 M m a n n i t o l , 5 m M M O P S ( 3 - [ N - m o r p h o l i n o ] p r o p a n e s u l f o n i c a c i d ) , 0 . 1 % B S A , p H 7 . 2 a n d c e n t r i f u g e d a t 4 0 0 0 0 g f o r 2 0 m i n u t e s . T h e p e l l e t , r e s u s p e n d e d i n a s m a l l v o l u m e o f 0 . 3 5 M m a n n i t o l , 5 m M M O P S , 5 0 m M K C l , a n d 1 m M E G T A , p H 7 . 2 , w a s l a y e r e d o n t o a 0 . 6 M s u c r o s e c u s h i o n a n d c e n t r i f u g e d a t 4 0 0 0 0 g f o r 2 0 m i n u t e s . I n t h i s s t e p t h e m i t o c h o n d r i a a r e p e l l e t e d , w h i l e t h e f l u fl ‘ y y e l l o w c o n t a m i n a n t s r e m a i n i n s u s p e n s i o n a n d a r e e a s i l y p o u r e d o f f . T h e m i t o c h o n d r i a w e r e n e x t d e p l e t e d o f c y t o c h r o m e c b y r e s u s p e n d i n g t h e p e l l e t i n a t e n - f o l d v o l u m e o f d i s t i l l e d w a t e r f o r o n e m i n u t e ( t o b u r s t t h e o u t e r m e m b r a n e ) b e f o r e a d d i n g K C ] t o a fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 1 5 M . T h i s m i x t u r e w a s c e n t r i f u g e d a t 4 0 0 0 0 g f o r 2 0 m i n u t e s a n d t h e m i t o c h o n d r i a l p e l l e t r e s u s p e n d e d i n t h e p r e v i o u s m a n n i t o l b u f f e r a n d s t o r e d a t - 8 0 ° C . C y t o c h r o m e c c o u l d b e r e c o v e r e d f r o m t h e d i l u t e d s u p e r n a t a n t b y i n c u b a t i o n w i t h c a r b o x y m e t h y l c e l l u l o s e r e s i n . 6 . 2 . 3 P r e p a r a t i o n o f w h e a t g e r m m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s W h e a t g e r m ( u n i m b i b e d ) w a s h o m o g e n i z e d f o r fi f t e e n s e c o n d s i n a c h i l l e d ( 4 ° C o r l e s s ) b u f f e r ( 0 . 4 M s u c r o s e o r m a n n i t o l , 5 0 m M K H z P O 4 , 5 m M E G ( P M S F ) , 1 D e c k e r m c b u f f e r . T l s u p e r n a t a T h e fi l t r z s u p e r n a t a i n c u b a t i o C h r o m a t o g ( 0 - 4 M s u e a n d 1 m i l 0 . 2 m m ) , d E b r i s . T 1 t o r e m o v e fi n a l m i t e m a m m a l , 6 3 . 4 1 5 0 1 3 1 6 4 5 m M E G T A , 0 . 2 % B S A , p H 7 . 0 ; | - _ 2 m M p h e n y l m e t h y l s u l f o n y l fl u o r i d e ( P M S F ) , 1 m M E D T A , a n d 1 0 M E 6 4 ) u s i n g a f o o d p r o c e s s o r ( B l a c k a n d D e c k e r m o d e l F P l D ) a t a r a t i o o f 1 5 0 g w h e a t g e r m a n d 1 0 g P V P p e r l i t e r b u f f e r . T h e h o m o g e n a t e w a s c e n t r i f u g e d a t 1 3 0 0 0 g f o r 1 5 m i n u t e s , a n d t h e s u p e r n a t a n t fi l t e r e d t h r o u g h 3 5 u m n y l o n m e s h t o r e m o v e c o n g e a l e d f a t . T h e fi l t r a t e w a s t h e n c e n t r i f u g e d a t 2 8 0 0 0 g f o r 4 0 m i n u t e s . T h e s u p e r n a t a n t c o n t a i n e d t h e c y t o c h r o m e c , w h i c h c o u l d b e r e c o v e r e d b y i n c u b a t i o n w i t h c a r b o x y m e t h y l c e l l u l o s e r e s i n a n d s u b s e q u e n t c h r o m a t o g r a p h y . T h e l o o s e m i t o c h o n d r i a l p e l l e t w a s r e s u s p e n d e d i n b u f f e r ( 0 . 4 M s u c r o s e o r m a n n i t o l , 5 m M T E S , 0 . 1 % B S A , p H 7 . 2 , : I : 2 m M P M S F a n d 1 m M E D T A ) u s i n g a P o t t e r - E l v e h i e m t y p e t i s s u e g r i n d e r ( c l e a r a n c e 0 . 2 m m ) a n d t h e n c e n t r i f u g e d a t 3 0 0 0 g f o r 1 5 m i n u t e s t o r e m o v e l a r g e d e b r i s . T h e r e s u l t i n g s u p e r n a t a n t w a s fi l t e r e d t h r o u g h 3 5 u m n y l o n m e s h t o r e m o v e c o n g e a l e d f a t b e f o r e c e n t r i f u g i n g a t 4 8 0 0 0 g f o r 2 0 m i n u t e s . T h e fi n a l m i t o c h o n d r i a l p e l l e t w a s r e s u s p e n d e d i n b u f f e r ( 0 . 3 5 M s u c r o s e o r m a n n i t o l , 5 0 m M K C l , 5 m M T E S , 1 m M E G T A , p H 7 . 2 ) a n d s t o r e d a t - 8 0 ° C . 6 . 2 . 4 I s o l a t i o n o f c y t o c h r o m e o x i d a s e f r o m m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s M i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s w e r e i n c u b a t e d o n i c e f o r 3 0 m i n u t e s w i t h 2 m g l a u r y l m a l t o s i d e p e r m g m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n , 1 0 p g D N a s e p e r m g p r o t e i n a n d 1 m M M g C l z . I n s o m e p r e p a r a t i o n s , 2 m M P M S F a n d 1 0 M E - 6 4 w e r e a d d e d t o t h e fi n a l s u s p e n s i o n b u fl ‘ e r . ( P r o t e o l y t i c i n h i b i t o r s w e r e n o r m a l l y u s e d t h r o u g h o u t i n t h e w h e a t g e r m b u t n o t i n t h e w h e a t o r m a i z e s e e d l i n g p r e p a r a t i o n s . ) T h e m i x t u r e w a s c e n t r i f u g e d a t 4 0 0 0 0 g f o r 2 0 m i n u t e s . T h e s u p e r n a t a n t w a s fi l t e r e d t h r o u g h a 0 . 4 5 p m m e m b r a n e a n d l o a d e d o n t o a P h a r m a c i a M o n o Q 1 0 / 1 0 a n i o n e x c h a n g e c o l u m n o n t h e P h a r m a c i a F P L C s y s t e m a t 0 . 1 5 M K C l . T y p i c a l l y 9 0 0 m g o f s t a r t i n g 1 6 5 m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n w e r e l o a d e d o n t o t h e 1 0 / 1 0 c o l u m n . A d i s c o n t i n u o u s g r a d i e n t ( d e s c r i b e d i n t h e l e g e n d o f F i g u r e 6 . 3 ) o f 0 t o 1 . 0 M s a l t i n b u f f e r ( F P L C b u f f e r : 5 % s u c r o s e , 2 0 m M K H g P O 4 , 4 m M l a u r y l m a l t o s i d e , p H 7 . 5 ) w a s a p p l i e d t o t h e c o l u m n a t 1 m L / m i n . T h e s a l t c o n c e n t r a t i o n w a s h e l d c o n s t a n t a t 0 . 3 2 a n d 0 . 3 9 M K C ] , j u s t b e f o r e a n d j u s t a f t e r t h e o x i d a s e e l u t e s a t 0 . 3 5 M K C 1 . T h i s s e p a r a t e s t h e o x i d a s e f r o m b o t h t h e l a r g e p r e c e d i n g p e a k a n d t h e f o l l o w i n g p e a k , c y t o c h r o m e c r e d u c t a s e , e l u t i n g a t 0 . 4 2 M K C l . T h e o x i d a s e w a s c o n c e n t r a t e d b y r e l o a d i n g t h e e n z y m e d i l u t e d t e n f o l d o n t o a M o n o Q 5 / 5 c o l u m n , w a s h i n g a t 0 . 3 M K C ] t o r e m o v e c o n t a m i n a n t s a n d i n a c t i v e e n z y m e . T h e c o l u m n w a s t h e n i n v e r t e d , a n d t h e o x i d a s e e l u t e d w i t h 0 . 5 M K C ] i n F P L C b u f f e r a t a v e r y s l o w fl o w r a t e . T h e e n z y m e c o u l d t h e n b e f u r t h e r p u r i fi e d b y r u n n i n g c o n c e n t r a t e d o x i d a s e o n a S u p e r o s e 6 g e l fi l t r a t i o n c o l u m n ( e q u i l i b r a t e d t o 0 . 1 M K C ] i n F P L C b u f f e r ) a t a fl o w r a t e o f 0 . 2 m L / m i n . C y t o c h r o m e o x i d a s e w a s p u r i fi e d f r o m m a i z e m i t o c h o n d r i a b y a s i m i l a r p r o c e d u r e e x c e p t t h a t a c o n t i n u o u s ( 0 t o 1 M K C ] i n F P L C b u f f e r ) g r a d i e n t w a s u s e d i n t h e e l u t i o n , n o p r o t e o l y t i c i n h i b i t o r s w e r e u s e d , a n d t h e f r a c t i o n s w e r e s o m e t i m e s f r o z e n a n d t h a w e d b e t w e e n p u r i fi c a t i o n s t e p s . 6 . 2 . 5 A s s a y m e t h o d s T h e e l e c t r o n t r a n s f e r a c t i v i t y o f p u r i fi e d c y t o c h r o m e o x i d a s e w a s m e a s u r e d p o l a r o g r a p h i c a l l y w i t h a G i l s o n m o d e ] 5 \ 6 H o x y g r a p h a t 2 5 ° C a s d e s c r i b e d b y F e r g u s o n - M i l l e r ( 1 9 7 5 ) e x c e p t t h a t a s o l e c t i n v e s i c l e s ( 1 . 1 m g / m L ) a n d 0 . 1 % l a u r y l m a l t o s i d e w e r e a d d e d t o e a c h a s s a y m i x t u r e . A s s a y s f o r m a x i m a l a c t i v i t y w e r e p e r f o r m e d i n 5 0 m M K H g P O 4 , p H 6 . 5 . T u r n o v e r n u m b e r s w e r e c a l c u l a t e d a s d e s c r i b e d i n T h o m p s o n a n d 1 6 6 F e r g u s o n - M i l l e r ( 1 9 8 3 ) . C y t o c h r o m e c k i n e t i c s w e r e a s s a y e d i n e i t h e r 2 5 m M T r i s - c a c o d y l a t e , p H 7 . 9 o r 5 0 m M K H 2 P O 4 , p H 6 . 5 . K i n e t i c s o f t h e o x i d a s e i n w h o l e m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s w e r e m e a s u r e d w i t h o u t l a u r y l m a l t o s i d e , w h i l e k i n e t i c s o f d e t e r g e n t - s o l u b i l i z e d m e m b r a n e s a n d p u r i fi e d o x i d a s e w e r e a s s a y e d w i t h a d d e d a s o l e c t i n v e s i c l e s ( 1 . 1 m g / m L ) a n d 0 . 1 % l a u r y l m a l t o s i d e . M i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s w e r e s o l u b i l i z e d w i t h e i t h e r l a u r y l m a l t o s i d e a t 2 m g d e t e r g e n t p e r m g p r o t e i n a s d e s c r i b e d i n 6 . 2 . 4 o r w i t h 3 . 5 m g T r i t o n X - 1 0 0 p e r m g p r o t e i n a n d c e n t r i f u g e d a t 4 0 , 0 0 0 g f o r 1 5 m i n u t e s . T h e k i n e t i c a n a l y s i s o f t h e o x i d a s e u s i n g w h e a t c y t o c h r o m e c w a s p e r f o r m e d w i t h w h o l e m e m b r a n e s b u t w i t h 0 . 1 % a d d e d l a u r y l m a l t o s i d e . P r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s w e r e d e t e r m i n e d b y t h e b i c i n c h o n i n i c a c i d ( B C A ) m e t h o d ( S m i t h e t a l . , 1 9 8 5 ) . 6 . 2 . 6 S p e c t r a l m e t h o d s U V a n d v i s i b l e s p e c t r a w e r e r e c o r d e d o n a P e r k i n - E l m e r L a m b d a 4 B s p e c t r o p h o t o m e t e r . T h e e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t s f o r a b s o l u t e s p e c t r a o f c y t o c h r o m e a a g ( d i t h i o n i t e r e d u c e d o r a i r o x i d i z e d ) w e r e t a k e n f r o m t h e s p e c t r a p u b l i s h e d b y v a n B u u r e n e t a l . ( 1 9 7 2 ) : c y t o c h r o m e 0 0 3 ( r e d u c e d ) , ( 6 0 5 - 6 5 0 n m ) = 4 0 m M ' l c m ' 1 a n d ( 4 4 0 - 4 9 0 n m ) = 2 0 4 m M 1 c m ' l ; c y t o c h r o m e 0 0 3 ( o x i d i z e d ) , ( 4 2 0 - 4 9 0 n m ) = 1 4 0 m M ' l c m ' l . 6 . 2 . 7 S D S - P A G E o f p u r i fi e d c y t o c h r o m e o x i d a s e S u b u n i t c o m p o s i t i o n o f t h e o x i d a s e f r a c t i o n s w a s e v a l u a t e d b y S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( B i o - R a d P r o t e a n I I , 2 0 0 V f o r 2 h o u r s i n c h i l l e d b u f f e r ) u s i n g t h e p r o c e d u r e o f K a d e n b a c h e t a l . ( 1 9 8 3 ) e x c e p t t h a t 0 . 0 4 % b r o m o p h e n o l b l u e w a s a d d e d t o t h e s a m p l e b u f f e r . P r o t e i n s a m p l e s w e r e p r e « b e f o r e r e s 1 5 — 2 0 ° C . b l u e . 1 6 7 w e r e p r e c i p i t a t e d w i t h 1 0 % t r i c h l o r o a c e t i c a c i d ( fi n a l c o n c e n t r a t i o n 4 . 5 % ) b e f o r e r e s u s p e n s i o n i n t h e s a m p l e b u f f e r , a n d s o n i c a t e d f o r 3 0 m i n u t e s a t 1 5 — 2 0 ° C . P r o t e i n b a n d s w e r e s t a i n e d o v e r n i g h t w i t h C o o m a s s i e b r i l l i a n t b l u e . 6 . 3 R e s u l t s 6 . 3 . 1 M i t o c h o n d r i a f r o m e t i o l a t e d w h e a t s e e d l i n g s a n d w h e a t g e r m M i t o c h o n d r i a p r e p a r e d b y t h e m e t h o d o f D a y a n d H a n s o n ( 1 9 7 7 ) f r o m e t i o l a t e d w h e a t s e e d l i n g s h a d r e s p i r a t o r y c o n t r o l r a t i o s r a n g i n g f r o m 5 . 0 — 7 . 0 , s i m i l a r t o v a l u e s o b t a i n e d f o r m a i z e m i t o c h o n d r i a p r e p a r e d b y t h e s a m e m e t h o d ( F i g u r e 6 . 1 ) . T h e s e v a l u e s d e t e r i o r a t e d a f t e r a n h o u r , f a s t e r t h a n m a i z e m i t o c h o n d r i a . A D P / O r a t i o s w e r e 2 . 7 - 2 . 9 u s i n g g l u t a m a t e / m a l a t e a s s u b s t r a t e , s i m i l a r t o t h o s e r e p o r t e d f o r m a i z e m i t o c h o n d r i a ( D u t c h e t a l . , 1 9 8 7 ) . I n c o n t r a s t , t h e r e s p i r a t i o n r a t e s o f m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e f r a c t i o n s f r o m w h e a t g e r m w e r e n o t s t i m u l a t e d b y A D P , a n d e x o g e n o u s l y s u p p l i e d c y t o c h r o m e c h a d c o m p l e t e a c c e s s t o c y t o c h r o m e o x i d a s e , i n d i c a t i n g t h a t t h e m i t o c h o n d r i a w e r e n o t i n t a c t . M i t o c h o n d r i a ] m e m b r a n e f r a c t i o n s i s o l a t e d f r o m e t i o l a t e d w h e a t s e e d l i n g s a n d f r o m w h e a t g e r m a p p e a r t o b e v e r y s i m i l a r w i t h r e s p e c t t o c y t o c h r o m e c o n t e n t . T h e d i f f e r e n c e s p e c t r a ( r e d u c e d m i n u s o x i d i z e d ) i n F i g u r e 6 . 2 s h o w t h a t t h e t w o s o u r c e s o f m i t o c h o n d r i a y i e l d s i m i l a r a m o u n t s a n d r a t i o s o f c y t o c h r o m e s ( 0 . 1 2 a n d 0 . 1 9 n m o l a a g p e r m g m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n f o r w h e a t g e r m a n d s e e d l i n g s , r e s p e c t i v e l y ) . T h e c y t o c h r o m e o x i d a s e s p e c i fi c a c t i v i t y o f s e e d l i n g m i t o c h o n d r i a w a s u s u a l l y h i g h e r ( 0 . 1 1 n m o ] 0 2 c o n s u m e d p e r s e c o n d p e r m g p r o t e i n ) , b u t o n l y b y a b o u t 1 0 % . A n e x t r a r e - p e l l e t i n g s t e p i n c r e a s e d t h e s p e c i fi c a c t i v i t y t o e q u a l t h e 1 6 8 F i g u r e 6 . 1 : P o l a r o g r a p h i c m e a s u r e m e n t o f r e s p i r a t o r y c o n t r o l r a t i o o f m a i z e a n d w h e a t s e e d l i n g m i t o c h o n d r i a . M a i z e ( u p p e r ) o r w h e a t s e e d l i n g ( l o w e r ) m i t o c h o n d r i a ( 0 . 3 m g p r o t e i n ) w e r e a s s a y e d w i t h g l u t a m a t e / m a l a t e a s s u b s t r a t e a s d e s c r i b e d i n t h e l e g e n d o f F i g u r e 3 . 1 . 8 . 2 a 1 . 7 a O / R P C D R A 8 . 2 3 9 . 8 a O / R P C D R A . n i m 1 0 r o o m 9 1 1 l T A E H W 6 . 1 ‘ 9 1 ‘ 9 I O f l 0 i 1 6 9 ' 2 ' ! 1 7 o _ F i g u r e 6 . 2 : D i f f e r e n c e s p e c t r a ( d i t h i o n i t e - r e d u c e d m i n u s a i r - o x i d i z e d ) o f l a u r y l m a l t o s i d e - s o l u b i l i z e d ( 2 m g / m g p r o t e i n ) m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s f r o m w h e a t g e r m ( 1 . 0 m g / m L , - - - - ) a n d e t i o l a t e d w h e a t s e e d l i n g s ( 0 . 3 2 m g / m L , — ) . . I . 3 . 1 . 1 . 0 6 3 " ! / . , , . x c . . . . q a q . . E 0 0 u 5 0 . a \ s _ I ; \ 1 3 / , . . L . , N . . . . . \ a \ \ \ ( I J / . \ \ £ 3 . 2 . 0 0 q 9 2 0 5 q a 5 \ \ \ 0 u a \ . 0 a 0 . . . l 0 0 1 7 1 a o u o q i o s q v F i s u m G - Z 1 7 2 s e e d l i n g m i t o c h o n d r i a , a l t h o u g h t h i s s t e p w a s n o t r o u t i n e l y d o n e . F P L C e l u t i o n p r o fi l e s o f s o l u b i l i z e d m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s f r o m b o t h s o u r c e s w e r e n e a r l y i d e n t i c a l , s u g g e s t i n g a s i m i l a r p r o t e i n c o m p l e m e n t . W h e a t g e r m o b t a i n e d f r o m t w o d i f f e r e n t m i l l i n g c o m p a n i e s a n d a t v a r i o u s t i m e s d u r i n g t h e y e a r y i e l d e d t h e s a m e r e s u l t s . 6 . 3 . 2 P m i fi c a t i o n o f c y t o c h r o m e o x i d a s e b y F P I D W h e n m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s s o l u b i l i z e d i n l a u r y l m a l t o s i d e w e r e a p p l i e d t o a P h a r m a c i a M o n o Q c o l u m n , o x i d a s e e l u t e d a t 0 . 3 5 - 0 . 3 7 M K C ] , a l l o w i n g s e p a r a t i o n f r o m t h e b c l c o m p l e x , w h i c h e l u t e s s l i g h t l y l a t e r a t 0 . 4 2 - 0 . 4 5 M K C ] . A n e l u t i o n p r o fi l e o f s o l u b i l i z e d w h e a t g e r m m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s i s s h o w n i n F i g u r e 6 . 3 , a n d i s n e a r l y i d e n t i c a l t o t h a t o b t a i n e d f r o m w h e a t s e e d l i n g m i t o c h o n d r i a . C o n c e n t r a t i o n o f t h e o x i d a s e f r a c t i o n s b y t h e i n v e r t e d c o l u m n m e t h o d d e s c r i b e d i n s e c t i o n 6 . 2 . 4 c a n y i e l d a h i g h l y c o n c e n t r a t e d e n z y m e ; f o r e x a m p l e 0 . 5 — 1 . 0 m L o f 5 0 M o x i d a s e c a n b e o b t a i n e d f r o m 9 0 0 m g m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n ( i n a d d i t i o n t o s e v e r a l m o r e d i l u t e f r a c t i o n s ) . T h e v i s i b l e s p e c t r a o b t a i n e d f r o m t h e fi n a l f r a c t i o n a r e s h o w n i n F i g u r e 6 . 4 . P e a k s a t 4 4 1 n m a n d 6 0 2 n m i n t h e r e d u c e d s p e c t r u m a r e b l u e - s h i f t e d r e l a t i v e t o b e e f h e a r t e n z y m e , w h o s e r e d u c e d p e a k s a r e a t 4 4 3 a n d 6 0 4 n m . A p r o t e i n - t o - h e m e r a t i o ( A z g o n m t o A 4 2 0 n m ) o f l e s s t h a n 2 . 2 i s o b t a i n e d a f t e r g e l fi l t r a t i o n . T h i s fi n a l f r a c t i o n h a s a t u r n o v e r n u m b e r o f 5 0 0 - 8 0 0 s ' l , w h i l e f r a c t i o n s f r o m e a r l i e r s t a g e s o f p u r i fi c a t i o n h a v e t u r n o v e r n u m b e r s u p t o 1 0 0 0 s ' l . T h e v i s i b l e s p e c t r u m f r o m t h e b c 1 c o m p l e x ( F i g u r e 6 . 5 ) i s c o m p a r a b l e t o t h o s e f r o m o t h e r o r g a n i s m s , w i t h S o r e t p e a k s a t 4 1 4 n m ( o x i d i z e d ) a n d 4 2 6 n m ( r e d u c e d ) a n d a p e a k s a t 5 5 4 — 5 6 0 n m ( r e d u c e d ) . A p r o t e i n - t o - h e m e 1 7 3 F i g u r e 6 . 3 : F P L C e l u t i o n p r o fi l e o f l a u r y l m a l t o s i d e - s o l u b i l i z e d w h e a t g e r m m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s . M e m b r a n e s m a d e 0 . 2 M K C ] w e r e l o a d e d o n t o a M o n o Q 1 0 / 1 0 c o l u m n a n d w a s h e d w i t h F P L C b u f f e r ( 5 % s u c r o s e , 2 0 m M K H z P O 4 , 4 m M l a u r y l m a l t o s i d e , p H 7 . 5 ) t o r e m o v e u n b o u n d p r o t e i n . B o u n d p r o t e i n w a s e l u t e d a t 1 . 0 m L / m i n w i t h a d i s c o n t i n u o u s K C ] g r a d i e n t : 0 — 0 . 3 2 M i n 1 5 m L , 0 . 3 2 M f o r 2 0 m L , 0 . 3 2 — 0 . 3 9 M i n 7 m L , 0 . 3 9 M f o r 1 5 m L , 0 . 3 9 — 1 . 0 M i n 1 6 m L . T h e s o l i d l i n e i n d i c a t e s t h e A 2 3 0 a n d t h e d a s h e d l i n e i n d i c a t e s t h e K C ] g r a d i e n t . 8 9 ' ' 0 0 ' " 0 0 Y I I 0 I 8 I V I V I I V Y T I I I U I ' U I I I 0 I 9 V V U ’ - - . . . . . - - - I - - 9 ’ I W V V Y ‘ I T I I T U I V U 0 t ] ? U V ' I ' J V a ' V " I V V q w n u ‘ U O I I D D 0 J 3 j U I I I I I I ‘ V I I I V ' U ’ I I T U U I U U ' I 0 O I 0 2 3 O l 1 7 4 W ’ U O I I D J l U B D U O D l 3 ) 4 0 8 2 V F i g u r e 6 . 3 1 7 5 F i g u r e 6 . 4 : V i s i b l e s p e c t r u m o f p u r i fi e d w h e a t g e r m c y t o c h r o m e c o x i d a s e a f t e r g e l fi l t r a t i o n o n S u p e r o s e 6 . O x i d a s e w a s 2 . 5 M i n F P L C A b u f f e r ( d e s c r i b e d i n t h e l e g e n d o f F i g u r e 6 . 3 ) . A i r - o x i d i z e d ( - - - - ) ; d i t h i o n i t e - r e d u c e d ( — ) . - $ 0 n o . . 0 0 N 0 . 0 . _ . p . — p E S £ 3 2 9 0 2 p , p p h o m . o 0 O N _ . . 0 0 . 0 O 0 a w Smm H O . V . n . m M . 1 7 6 . 0 0 m 0 0 $ 0 0 0 0 0 0 0 0 ¢ 0 0 0 . _ . _ . . _ 1 7 7 F i g u r e 6 . 5 : V i s i b l e s p e c t r u m o f w h e a t g e r m b c 1 c o m p l e x a f t e r o n e M o n o Q f r a c t i o n a t i o n . A i r - o x i d i z e d ( - - - - ) ; d i t h i o n i t e - r e d u c e d ( — ) . 0 N ¢ 0 0 o 0 0 . 0 . . 0 0 . 0 I I E S £ 9 2 9 2 5 0 _ 0 ¢ 0 . 0 . v . 0 1 7 8 0 0 m 0 m m _ a o u o q r o s q v F i g u r e 6 . 5 1 7 9 r a t i o ( A z s o n m t o A 4 1 4 m n ) o f 1 . 2 i s t y p i c a l l y o b t a i n e d o n p e a k f r a c t i o n s f r o m t h e i n i t i a l M o n o Q s e p a r a t i o n . F u r t h e r p u r i fi c a t i o n w a s n o t a t t e m p t e d . Y u e t a l . ( p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) h a v e f o u n d t h a t o u r p u r i fi e d b c l h a s l i t t l e a s s o c i a t e d p h o s p h o l i p i d , r e l a t i v e l y l o w t u r n o v e r n u m b e r , b u t s h o w p r o t o n t r a n s l o c a t i n g a c t i v i t y . W e h a v e b e e n u n a b l e t o d e m o n s t r a t e p r o t o n p u m p i n g b y t h e p u r i fi e d o x i d a s e r e c o n s t i t u t e d i n t o p h o s p h o l i p i d m e m b r a n e s u s i n g t h e m e t h o d o f G r e g o r y a n d F e r g u s o n - M i l l e r ( 1 9 8 9 ) , a l t h o u g h t h e v e s i c l e s s h o w g o o d r e s p i r a t o r y c o n t r o l ( r a t i o : 5 — 6 ) . U p o n a d d i t i o n o f r e d u c e d c y t o c h r o m e c , a n a l k a l i n i z a t i o n s i m i l a r t o r e c o n s t i t u t e d b e e f h e a r t o x i d a s e i n m a g n i t u d e a n d s p e e d o c c u r s o u t s i d e t h e v e s i c l e s , b u t n o i n i t i a l a c i d i fi c a t i o n i s s e e n . H o w e v e r , t h e n o r m a l A D P / O r a t i o s a c h i e v e d i n w h e a t s e e d l i n g m i t o c h o n d r i a ( F i g u r e 6 . 1 ) s u g g e s t s t h a t t h e o x i d a s e d o e s p u m p p r o t o n s . F u t u r e e f f o r t s s h o u l d i n c l u d e a s s a y o f w h e a t s e e d l i n g m i t o p l a s t s b y t h e o x y g e n p u l s e m e t h o d ( M i t c h e l l e t a l . , 1 9 7 9 ) w h i c h d o e s n o t r e q u i r e p u r i fi c a t i o n a n d r e c o n s t i t u t i o n , a s w e l l a s a t t e m p t s t o a s s a y r e c o n s t i t u t e d o x i d a s e p u r i fi e d f r o m s o d i u m b r o m i d e - w a s h e d o r T r i t o n X - l O O - p u r i fi e d m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s , w h i c h m a y h a v e f e w e r c o n t a m i n a n t s ( s u c h a s c o m p o n e n t s o f t h e A T P s y n t h a s e c o m p l e x ) t h a t m i g h t i n t e r f e r e w i t h r e c o n s t i t u t i o n o r t h e a s s a y . 6 . 3 . 3 C y t o c h m m e c k i n e t i c s o f w h e a t c y t o c h r o m e o x i d a s e T h e k i n e t i c p r o p e r t i e s o f t h e p l a n t c y t o c h r o m e o x i d a s e w e r e m e a s u r e d u n d e r a v a r i e t y o f c o n d i t i o n s t o e v a l u a t e t h e s i m i l a r i t y o f t h e w h e a t g e r m a n d s e e d l i n g o x i d a s e s a s w e l l a s t h e i r s i m i l a r i t y t o o t h e r e u k a r y o t i c o x i d a s e s . R e s u l t s a r e p r e s e n t e d a s a n E a d i e - H o f s t e e p l o t , i n w h i c h t h e s l o p e o f t h e d a t a i s t h e n e g a t i v e i n v e r s e o f t h e K m . H o w e v e r , K m 1 8 0 v a l u e s c a l c u l a t e d f r o m t h e s e p l o t s c a n n o t b e c o n s i d e r e d t r u e K m v a l u e s b e c a u s e o f t h e b i p h a s i c n a t u r e o f t h e s u b s t r a t e d e p e n d e n c e , a n d b e c a u s e s u b s t r a t e d e p l e t i o n o c c u r s a t l o w c o n c e n t r a t i o n s o f c y t o c h r o m e c ( a p r o b l e m i n t h e h i g h a f fi n i t y p h a s e ) w h e r e s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n a p p r o a c h e s t h e e n z y m e c o n c e n t r a t i o n . A n E a d i e — H o f s t e e p l o t o f t h e k i n e t i c s o f w h e a t g e r m a n d s e e d l i n g o x i d a s e s i n s o l u b i l i z e d a n d w h o l e m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s a s s a y e d - i n c a c o d y l a t e i s s h o w n i n F i g u r e 6 . 6 A a n d B r e s p e c t i v e l y . B i p h a s i c k i n e t i c s a r e c l e a r l y s e e n w i t h b o t h f o r m s o f t h e e n z y m e s . T h e c o r r e s p o n d i n g l o w a n d h i g h a f f i n i t y a p p a r e n t K m a n d V m a x v a l u e s a r e e q u a l ( a v e r a g e v a l u e s f o r s o l u b i l i z e d m e m b r a n e s : K m 1 = 0 . 0 6 1 1 M , K m 2 = 4 . 0 u M ; w h o l e m e m b r a n e s : K m 1 = 0 . 0 2 u M , K m 2 = 0 . 6 H M ) , a n d c o m p a r e f a v o r a b l y t o p r e v i o u s l y p u b l i s h e d r e s u l t s f o r m a m m a l i a n o x i d a s e s ( T h o m p s o n a n d F e r g u s o n - M i l l e r , 1 9 8 3 ) . F u r t h e r m o r e , t h e k i n e t i c s o f p u r i fi e d w h e a t g e r m o x i d a s e a r e i d e n t i c a l t o t h e s o l u b i l i z e d m e m b r a n e s u s e d f o r f r a c t i o n a t i o n ( F i g u r e 6 . 7 ) , i n d i c a t i n g t h a t t h e s e n s i t i v e k i n e t i c p r o p e r t i e s o f t h e e n z y m e h a v e n o t b e e n d i s r u p t e d d u r i n g t h e p u r i fi c a t i o n p r o c e d u r e . T h e h i g h e r t u r n o v e r n u m b e r s i n t h i s p l o t r e s u l t f r o m t h e u s e o f p r o t e o l y t i c i n h i b i t o r s d u r i n g t h e m i t o c h o n d r i a p r e p a r a t i o n a n d s u b s e q u e n t p u r i fi c a t i o n s t e p s . P r e v i o u s r e p o r t s h a v e s h o w n t h a t c y t o c h r o m e o x i d a s e a c t i v i t y i s s t i m u l a t e d m o r e i n l a u r y l m a l t o s i d e t h a n i n o t h e r d e t e r g e n t s . H o w e v e r , w h e a t g e r m o x i d a s e a c t i v i t y i s s t i m u l a t e d a l m o s t e q u a l l y b y l a u r y l m a l t o s i d e a n d T r i t o n X - 1 0 0 . T h e c y t o c h r o m e c k i n e t i c s o f m e m b r a n e s s o l u b i l i z e d b y t h e s e t w o d e t e r g e n t s w e r e t h e r e f o r e m e a s u r e d a n d f o u n d t o b e i d e n t i c a l ( F i g u r e 6 . 8 ) . V m a x v a l u e s w e r e e q u a l u s i n g b o t h d e t e r g e n t s , i n c o n t r a s t t o o t h e r o x i d a s e s , w h i c h e x h i b i t m u c h l o w e r a c t i v i t y i n T r i t o n X - 1 0 0 t h a n i n l a u r y l m a l t o s i d e ( R o s e v e a r e t a l . , 1 9 8 0 ; S i n j o r g o e t a l . , 1 9 8 7 ) . , 0 0 8 1 8 1 F i g u r e 6 . 6 : E a d i e - H o f s t e e p l o t o f t h e k i n e t i c s o f r e a c t i o n o f s o l u b i l i z e d ( A ) o r w h o l e ( B ) m e m b r a n e s f r o m w h e a t g e r m ( D ) a n d w h e a t s e e d l i n g ( O ) w i t h h o r s e h e a r t c y t o c h r o m e c . A s s a y s w e r e p e r f o r m e d p o l a r o g r a p h i c a l l y a s d e s c r i b e d u n d e r s e c t i o n 6 . 2 . 5 i n 2 5 m M T r i s - c a c o d y l a t e , p H 7 . 9 . O x i d a s e c o n c e n t r a t i o n w a s 0 . 0 1 9 “ M f o r w h e a t s e e d l i n g w h o l e m e m b r a n e s a n d 0 . 0 1 7 M f o r s o l u b i l i z e d m e m b r a n e s ; c y t o c h r o m e c c o n c e n t r a t i o n r a n g e d f r o m 0 . 0 1 t o 2 8 . 4 M . O x i d a s e c o n c e n t r a t i o n w a s 0 . 0 2 9 M f o r w h e a t g e r m w h o l e m e m b r a n e s a n d 0 . 0 2 6 M f o r s o l u b i l i z e d m e m b r a n e s ; c y t o c h r o m e c c o n c e n t r a t i o n r a n g e d f r o m 0 . 0 2 5 t o 2 5 . 5 W . n n n n . 0 0 0 3 ~ o o a 0 0 4 0 0 0 5 0 0 4 0 0 3 0 0 2 0 0 1 0 6 0 0 2 0 0 0 , . w fl , . s ‘ I S l / N l . , . w fi , . s ‘ I S l / N l . 6 6 1 0 0 0 2 0 0 T N , s " - . n _ 1 F i g u r e 6 . 7 . 1 T M / r o r - - I I I I I I I l I I I I I I I I I I I ' 1 0 0 0 ‘ I I I l I j I l I I I I I I I 8 , 0 0 I J I I I 4 1 I I I 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 2 0 0 K 0 T N , s " F i g u r e 6 . 7 : E a d i e - H o f s t e e p l o t o f t h e k i n e t i c s o f r e a c t i o n o f s o l u b i l i z e d m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s ( 0 ) a n d p u r i fi e d c y t o c h r o m e c o x i d a s e ( A ) f r o m w h e a t g e r m w i t h h o r s e h e a r t c y t o c h r o m e c . A s s a y s w e r e p e r f o r m e d p o l a r o g r a p h i c a l l y a s d e s c r i b e d u n d e r s e c t i o n 6 . 2 . 5 i n 2 5 m M T r i s - c a c o d y l a t e , p H 7 . 9 . O x i d a s e ' c o n c e n t r a t i o n w a s 0 . 0 2 5 M f o r m e m b r a n e s a n d 0 . 0 2 1 M f o r p u r i fi e d o x i d a s e ; c y t o c h r o m e c c o n c e n t r a t i o n r a n g e d f r o m 0 . 0 2 1 t o 2 1 . 1 M . 8 0 0 I I I 1 ' M u 1 ' s , ] S [ / N T 6 0 0 4 0 0 2 0 0 i I . I . J . 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 T N , 5 ' 1 F i g u r e 6 . 8 : E a d i e - H o f s t e e p l o t o f t h e k i n e t i c s o f r e a c t i o n o f m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s f r o m w h e a t g e r m s o l u b i l i z e d w i t h l a u r y l m a l t o s i d e ( O ) a n d T r i t o n X - 1 0 0 ( C I ) w i t h h o r s e h e a r t c y t o c h r o m e c . A s s a y s w e r e p e r f o r m e d p o l a r o g r a p h i c a l l y a s d e s c r i b e d u n d e r s e c t i o n 6 . 2 . 5 i n 2 5 m M T r i s - c a c o d y l a t e , p H 7 . 9 . O x i d a s e c o n c e n t r a t i o n w a s 0 . 0 2 2 u M ; c y t o c h r o m e c c o n c e n t r a t i o n r a n g e d f r o m 0 . 0 2 6 t o 1 7 . 6 M . 1 8 5 T h i s u n u s u a l s t a b i l i t y o f t h e p l a n t e n z y m e i n T r i t o n X - 1 0 0 m i g h t a l l o w p u r i fi c a t i o n o f a n i n t a c t , a c t i v e e n z y m e i n t h i s i n e x p e n s i v e d e t e r g e n t n o t p o s s i b l e w i t h o t h e r s y s t e m s . T h i s p o s s i b i l i t y i s e x p l o r e d i n c h a p t e r 7 . C y t o c h r o m e c f r o m w h e a t s e e d l i n g a n d w h e a t g e r m w a s p u r i fi e d i n o r d e r t o t e s t t h e k i n e t i c p a r a m e t e r s w i t h t h e n a t u r a l s u b s t r a t e . T y p i c a l l y , c y t o c h r o m e c f r o m t h e s a m e s p e c i e s a s t h e o x i d a s e e x h i b i t s l o w e r K m v a l u e s b e c a u s e o f o p t i m i z e d p o s i t i o n i n g o f t h e p o s i t i v e a n d n e g a t i v e c h a r g e s i n v o l v e d i n t h e i n t e r a c t i o n o f c y t o c h r o m e c a n d c y t o c h r o m e o x i d a s e ( F e r g u s o n - M i l l e r e t a l . , 1 9 7 6 ) . P r e l i m i n a r y r e s u l t s i n d i c a t e t h a t w i t h w h e a t g e r m o x i d a s e t h e K m v a l u e s o b t a i n e d u s i n g c y t o c h r o m e c f r o m w h e a t g e r m a r e l o w e r t h a n t h o s e o b t a i n e d u s i n g c y t o c h r o m e c f r o m w h e a t s e e d l i n g , w h i l e b o t h a r e l o w e r t h a n t h o s e o b t a i n e d u s i n g h o r s e h e a r t c y t o c h r o m e c ( d a t a n o t s h o w n ) . T h i s m a y r e fl e c t a r e a l d i f f e r e n c e i n i n t e r a c t i o n ; h o w e v e r , b e c a u s e o f t h e s m a l l a m o u n t s a n d l a c k “ o f p u r i t y o f t h e p l a n t c y t o c h r o m e s c , f u r t h e r w o r k i s n e e d e d t o v e r i f y t h i s r e s u l t . 6 . 3 . 4 S u b u n i t a n a l y s i s o f w h e a t o x i d a s e S D S - u r e a p o l y a c r y l a m i d e g e l s o f w h e a t c y t o c h r o m e o x i d a s e , F i g u r e 6 . 9 , s u g g e s t a r a d i c a l l y d i f f e r e n t s u b u n i t c o m p o s i t i o n f r o m t h e m a m m a l i a n e n z y m e , b u t a s i m i l a r c o m p o s i t i o n t o w h a t h a s b e e n r e p o r t e d f o r o t h e r p l a n t o x i d a s e s . S u b u n i t d e s i g n a t i o n s o f t h e b e e f h e a r t e n z y m e a r e s h o w n n e x t t o i t i n l a n e ( a ) . L a n e ( 1 ) ) i s w h e a t g e r m o x i d a s e a f t e r M o n o Q p u r i fi c a t i o n a n d c o n c e n t r a t i o n . T h e f o u r l a r g e s t b a n d s h a v e a s i m i l a r m i g r a t i o n b e h a v i o r t o t h e fi r s t f o u r s u b u n i t s o f t h e b e e f h e a r t e n z y m e i n l a n e ( 3 ) . L a n e ( a ) i s t h e b c 1 c o m p l e x a s i t a p p e a r s a f t e r e l u t i o n f r o m t h e fi r s t M o n o Q c o l u m n . C o m p a r i s o n s h o w s t h a t c o n t a m i n a t i o n o f t h e o x i d a s e f r o m b c 1 d o e s e x i s t ( e s p e c i a l l y i n t h e r e g i o n b e l o w s u b u n i t I I ) , t h o u g h i t i s n o t s p e c t r a l l y F i g u r e 6 . 9 : S u b u n i t c o m p o s i t i o n a n a l y s i s o f w h e a t g e r m a n d s e e d l i n g c y t o c h r o m e o x i d a s e b y S D S - P A G E . L a n e ( a ) , b e e f h e a r t o x i d a s e , w i t h s u b u n i t d e s i g n a t i o n s ( I - I V ) t o t h e r i g h t ; l a n e ( b ) , w h e a t g e r m o x i d a s e c o n c e n t r a t e d f r o m t h e fi r s t M o n o Q r u n , w i t h s u b u n i t d e s i g n a t i o n s t o t h e l e f t ; l a n e ( c ) , w h e a t s e e d l i n g o x i d a s e c o n c e n t r a t e d f r o m t h e fi r s t M o n o Q r u n , ( * ) d e s i g n a t e s . a p o s s i b l e a l t e r n a t i v e s u b u n i t a s d e s c r i b e d i n R e s u l t s ; l a n e ( d ) , c o r n s e e d l i n g o x i d a s e c o n c e n t r a t e d f r o m t h e fi r s t M o n o Q r u n f r a c t i o n s ; a n d l a n e ( e ) , b c 1 c o m p l e x f r o m t h e fi r s t M o n o Q r u n . T h e p o s i t i o n o f m o l e c u l a r w e i g h t s t a n d a r d s ( A m e r s h a m r a i n b o w m a r k e r s ) i n k D a a r e s h o w n t o t h e r i g h t o f l a n e ( e ) . ' — 2 1 . 5 - 1 4 . 3 - 6 . 5 F 3 . 4 F i g u r e 6 . 9 1 8 8 e v i d e n t i n t h e f r a c t i o n s . O x i d a s e s p u r i fi e d f r o m w h e a t s e e d l i n g a n d m a i z e s e e d l i n g m i t o c h o n d r i a a r e s h o w n i n l a n e s ( c ) a n d ( ( 1 ) r e s p e c t i v e l y . T h e o x i d a s e f r o m w h e a t s e e d l i n g h a s r e t a i n e d s o m e s u b u n i t I V w i t h o u t t h e u s e o f p r o t e o l y t i c i n h i b i t o r s ; h o w e v e r , c o r n s e e d l i n g o x i d a s e p u r i fi e d b y a s i m i l a r ( b u t l e s s r a p i d ) p r o c e d u r e h a s l i t t l e s u b u n i t I V e x c e p t f o r s o m e l o w e r m o l e c u l a r w e i g h t b a n d s t h a t a r e p e r h a p s d e g r a d a t i o n p r o d u c t s . O f p a r t i c u l a r i n t e r e s t i s a n a d d i t i o n a l b a n d i n t h e w h e a t g e r m c y t o c h r o m e o x i d a s e , l a b e l l e d V * , t h a t m i g r a t e s n e a r 9 k D a i m m e d i a t e l y a b o v e t h e t h r e e s m a l l s u b u n i t s l a b e l l e d V a , b , a n d c . I t i s r e p r o d u c i b l y p r e s e n t a n d h a s a d i f f e r e n t m o b i l i t y t h a n f a i n t b a n d s i n t h a t r e g i o n o f w h e a t s e e d l i n g ( l a n e c ) o r m a i z e ( l a n e d ) o x i d a s e . T h i s b a n d h a s n o t b e e n o b s e r v e d i n p r e v i o u s r e p o r t s o f p u r i fi e d p l a n t o x i d a s e . I n t h e c a s e o f t h e s e e d l i n g o x i d a s e s , a b a n d a t 1 0 k D a i s s e e n w i t h v a r i a b l e i n t e n s i t y t h r o u g h o u t t h e p u r i fi c a t i o n ( l a n e d , * ) ; t h i s m a y r e p r e s e n t a n a l t e r n a t i v e s u b u n i t t o V * w h i c h i s d e v e l o p m e n t a l l y r e g u l a t e d , s i m i l a r t o s u b u n i t V I I i n s l i m e m o l d o x i d a s e . 6 . 4 D i s c u s s i o n C o m m e r c i a l w h e a t g e r m i s i n e x p e n s i v e , r e a d i l y a v a i l a b l e , a n d n o t h i g h l y v a r i a b l e . I f s t o r e d c o l d ( 4 ° C ) i n c l o s e d c o n t a i n e r s , i t c a n b e u s e d f o r a t l e a s t s i x m o n t h s . A l t h o u g h i n t a c t m i t o c h o n d r i a w e r e n o t o b t a i n e d , c o m m e r c i a l w h e a t g e r m y i e l d s a m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e f r a c t i o n w i t h a s i m i l a r c o n t e n t o f c y t o c h r o m e s b c l a n d a m ; t o t h a t f o u n d i n m i t o c h o n d r i a i s o l a t e d f r o m e t i o l a t e d s e e d l i n g s . T h e r e l a t i v e l y e a s y a n d r a p i d p r e p a r a t i o n w e h a v e d e v e l o p e d o f f e r s t h e p o t e n t i a l o f i s o l a t i n g l a r g e q u a n t i t i e s o f c y t o c h r o m e o x i d a s e a n d m a n y o t h e r p l a n t m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n s a s w e l l . 1 8 9 S i n c e t h e g e r m i s a n e m b r y o n i c t i s s u e , d e v e l o p m e n t a l a n d t i s s u e - s p e c i fi c c h a n g e s i n e n z y m e s m a y a l s o b e s t u d i e d . C y t o c h r o m e c o x i d a s e c a n b e p u r i fi e d i n r e l a t i v e l y l a r g e a m o u n t s f r o m t h e s e w h e a t g e r m m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s u s i n g a n i o n e x c h a n g e F P L C . T h u s w e c a n n o w d o s t u d i e s o n p l a n t o x i d a s e t h a t w e r e f o r m e r l y n o t p o s s i b l e d u e t o l a c k o f m a t e r i a l , s u c h a s p r o t e i n s e q u e n c i n g a n d R a m a n s p e c t r o s c o p y ( s e e c h a p t e r 8 ) . I n a d d i t i o n t o q u a n t i t y , o u r e n z y m e i s h i g h l y a c t i v e , w h i l e p r e v i o u s s t u d i e s o n p l a n t c y t o c h r o m e o x i d a s e s s h o w s i g n i fi c a n t l o s s o f a c t i v i t y d u r i n g p u r i fi c a t i o n . T h e s e r e p o r t s h a v e a l s o n o t p r o v i d e d a n y a n a l y s i s o f t h e e n z y m e ' s k i n e t i c c h a r a c t e r i s t i c s . T h e p u r i fi e d o x i d a s e r e t a i n s h i g h a n d l o w a f fi n i t y a p p a r e n t K m v a l u e s i d e n t i c a l t o t h o s e o f t h e s o l u b i l i z e d m e m b r a n e s , i n d i c a t i n g t h a t t h e p u r i fi c a t i o n p r o c e d u r e h a s n o t a l t e r e d t h e o x i d a s e w i t h r e s p e c t t o t h i s s e n s i t i v e m e a s u r e o f o x i d a s e i n t e g r i t y . I n c o n t r a s t , t h e k i n e t i c p a r a m e t e r s o f r a t l i v e r o x i d a s e a r e d i f f e r e n t f r o m t h o s e o f t h e s o l u b i l i z e d m e m b r a n e s , i n c l u d i n g a s e r i o u s d e c r e a s e i n t h e V m a X ( T h o m p s o n a n d F e r g u s o n - M i l l e r , 1 9 8 3 ) . M a i z e o x i d a s e p u r i fi e d b y a s i m i l a r b u t l e s s r a p i d p r o c e d u r e e x h i b i t s a d r a m a t i c l o s s o f a f fi n i t y f o r c y t o c h r o m e c i n t h e i n i t i a l k i n e t i c p h a s e , c o m p a r e d t o t h e m e m b r a n e - b o u n d f o r m ( R . I n g l e , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . C o n c o m i t t a n t l y , t h e m a i z e o x i d a s e s h o w s a l m o s t c o m p l e t e l o s s o f s u b u n i t N , w h i c h s u g g e s t s a p o s s i b l e r o l e f o r t h i s s u b u n i t i n d e t e r m i n i n g t h e c y t o c h r o m e c a f fi n i t y o f t h e i n i t i a l k i n e t i c p h a s e , t h o u g h o t h e r l e s s o b v i o u s p r o t e o l y t i c d a m a g e c o u l d b e i n v o l v e d . S u b u n i t I V a p p e a r s t o b e p a r t i c u l a r l y l a b i l e t o p r o t e o l y t i c d e g r a d a t i o n ; e v e n w h e n p r o t e o l y t i c i n h i b i t o r s a r e u s e d i n t h e p u r i fi c a t i o n o f w h e a t g e r m o x i d a s e , s u b u n i t I V i s o f t e n p r e s e n t i n l e s s t h a n s t o i c h i o m e t r i c a m o u n t s . T h e a p p a r e n t c o n t e n t o f s u b u n i t I V m a y a l s o b e a fl ‘ e c t e d b y e l e c t r o p h o r e t i c s e p a r a t i o n c o n d i t i o n s s u c h a s e x t e n t o f s o l u b i l i z a t i o n i n t h e l o a d i n g b u f f e r o r d i f f u s i o n f r o m t h e g e l d u r i n g s t a i n i n g . I n g e n e r a l , h o w e v e r , r a p i d p u r i fi c a t i o n a p p e a r s t o b e e s s e n t i a l f o r m a i n t a i n i n g t h e n a t i v e c h a r a c t e r i s t i c s o f p l a n t c y t o c h r o m e o x i d a s e . T h e U V - v i s s p e c t r a l p r o p e r t i e s o f t h e w h e a t g e r m a n d s e e d l i n g o x i d a s e s a r e v e r y s i m i l a r t o t h o s e r e p o r t e d f o r m a i z e a n d o t h e r p l a n t o x i d a s e s . T h e b l u e s h i f t o f t h e r e d u c e d p e a k s i n d i C a t e s a n a l t e r e d h e m e 0 e n v i r o n m e n t ( C h a n c e a t a l . , 1 9 6 8 ) , a c o n c l u s i o n t h a t i s s u p p o r t e d b y a n a l y s i s o f t h e p l a n t o x i d a s e b y r e s o n a n c e R a m a n s p e c t r o s c o p y ( C h a p t e r 8 ) . P l a n t o x i d a s e s h a v e p r e v i o u s l y b e e n s h o w n t o h a v e n u c l e a r - e n c o d e d s u b u n i t s t h a t d i f f e r f r o m a n i m a l o r y e a s t o x i d a s e s . T h e l a r g e r s u b u n i t s ( I , I I , I I I , I V ) o f t h e w h e a t g e r m o x i d a s e a p p e a r t o b e s i m i l a r i n s i z e t o t h e b e e f h e a r t e n z y m e , b u t t h e 3 o r 4 s m a l l e r s u b u n i t s b e l o w 1 0 k D a a r e s i m i l a r o n l y t o o t h e r p l a n t o x i d a s e s . . A s u b u n i t o f a b o u t 9 k D a i s r e t a i n e d d u r i n g p u r i fi c a t i o n o f t h e w h e a t g e r m o x i d a s e , b u t i s n o t s e e n a t a n y s t a g e o f p u r i fi c a t i o n o f t h e w h e a t s e e d l i n g e n z y m e , w h e r e a s t h e l a t t e r e n z y m e a p p e a r s t o h a v e a l a r g e r ( 1 0 k D a ) p e p t i d e t h a t d o e s n o t a p p e a r i n t h e g e r m . T h i s s u g g e s t s a p o s s i b l e d e v e l o p m e n t a l f o r m o f t h e o x i d a s e i n w h e a t , s i m i l a r t o t h e d e v e l o p m e n t a l f o r m s f o u n d i n s l i m e m o l d ( B i s s o n a n d S c h i a v o , 1 9 8 6 ) . T h e s u b u n i t c o m p o s i t i o n o f t h e w h e a t o x i d a s e i s d i s c u s s e d f u r t h e r i n c h a p t e r 7 . C h a p t e r 7 - T h e n u m b e r a n d n a t u r e o f s u b u n i t s i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m w h e a t 7 . 1 I n t r o d u c t i o n C h a p t e r 6 d e s c r i b e s a p u r i fi c a t i o n p r o c e d u r e y i e l d i n g h i g h l y a c t i v e c y t o c h r o m e o x i d a s e f r o m w h e a t g e r m a n d w h e a t s e e d l i n g . H o w e v e r , t h e a p p a r e n t s u b u n i t c o m p o s i t i o n o n S D S - g e l s d i f f e r s f r o m o t h e r e u k a r y o t i c o x i d a s e s a n d e v e n f r o m s e v e r a l o t h e r p l a n t o x i d a s e p r e p a r a t i o n s . O u r p r e p a r a t i o n d i f f e r s m o s t n o t a b l y f r o m t h e o t h e r p l a n t o x i d a s e s b y t h e a b s e n c e o f b a n d s i n t h e 1 0 — 1 3 k D a m o l e c u l a r w e i g h t r a n g e o n S D S - g e l s . H o w e v e r , a 9 k D a p e p t i d e ( d e s i g n a t e d s u b u n i t V “ ) i s r e t a i n e d d u r i n g a n i o n e x c h a n g e a n d g e l fi l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y o f w h e a t g e r m b u t n o t s e e d l i n g o x i d a s e , w h i l e a b a n d o f v a r i a b l e i n t e n s i t y o f t e n a p p e a r s a t 1 0 k D a i n t h e w h e a t s e e d l i n g o x i d a s e . W e h a v e s u g g e s t e d t h a t t h i s d i f f e r e n c e i n a p p a r e n t s u b u n i t c o m p o s i t i o n b e t w e e n w h e a t g e r m a n d s e e d l i n g o x i d a s e m a y b e d e v e l o p m e n t a l l y c o n t r o l l e d , a s i n s l i m e m o l d o x i d a s e , o r t i s s u e - s p e c i fi c , a s i n m a m m a l i a n o x i d a s e . A n o t h e r i s s u e r e l a t e s t o t h e i d e n t i t y o f a n i n t e n s e l y - s t a i n i n g b a n d ( d e s i g n a t e d “ m y s t e r y b a n d ” ) t h a t r u n s b e l o w s u b u n i t I I o n S D S - g e l s . T h i s b a n d s e e m s t o a p p e a r i n o t h e r p l a n t o x i d a s e p r e p a r a t i o n s a s w e l l ( N a k a g a w a e t a l . , 1 9 8 7 ; H a w k e s f o r d e t a l . , 1 9 8 9 ) . T h e r e f o r e , i t i s c r i t i c a l t h a t w e e s t a b l i s h t h e t r u e s u b u n i t c o m p o s i t i o n o f t h e w h e a t o x i d a s e , w i t h p a r t i c u l a r r e f e r e n c e t o V * a n d t h e “ m y s t e r y b a n d ” . T h e d e t e r m i n a t i o n o f s u b u n i t c o m p o s i t i o n i s a d i f fi c u l t p r o b l e m w i t h a m u l t i s u b u n i t c o m p l e x s u c h a s c y t o c h r o m e o x i d a s e , a n d i n d e e d , t h e r e h a s b e e n m u c h d i s a g r e e m e n t o v e r t h e y e a r s a b o u t t h e t r u e n u m b e r o f s u b u n i t s i n t h e o x i d a s e s f r o m m a m m a l s a n d y e a s t ( s e e s e c t i o n 5 . 2 ) . T h e r e a r e a 1 9 1 n u m b e r p r o c e d u i d i f f e r e n t r e q u i r e d a c t i v i t y a r e m i s s a n a l y s i s s u b u n i t a n a l y z i n o v e r l a p a n o m o l o P a r t i c u l ; h a v e b e e n u m b e r o f r e a s o n s f o r t h i s d i s a g r e e m e n t . D i f f e r e n t p r e p a r a t i o n p r o c e d u r e s , s u c h a s t h e u s e o f v a r i o u s d e t e r g e n t s , r e s u l t i n o x i d a s e s w i t h d i f f e r e n t a p p a r e n t s u b u n i t c o m p o s i t i o n s . S i n c e n o t a l l s u b u n i t s m a y b e r e q u i r e d f o r t h e a s p e c t s o f a c t i v i t y t h a t a r e r e a d i l y m e a s u r e d , r e t e n t i o n o f a c t i v i t y m a y n o t b e a g o o d e n o u g h c r i t e r i o n t o j u d g e w h e t h e r s u b u n i t s t h a t a r e m i s s i n g a r e a c t u a l l y p a r t o f t h e t r u e e n z y m e c o m p l e x . T h e m e t h o d s o f a n a l y s i s o f p r e p a r a t i o n s a l s o c o n t r i b u t e d t o t h e d i fi c u l t y i n a g r e e i n g u p o n a s u b u n i t c o m p o s i t i o n . R e s e a r c h e r s o f t e n e m p l o y d i f f e r e n t c o n d i t i o n s i n a n a l y z i n g s u b u n i t c o m p o s i t i o n b y S D S - g e l e l e c t r o p h o r e s i s , s o p e p t i d e s m a y o v e r l a p o n o n e , b u t s e p a r a t e o n a n o t h e r g e l s y s t e m . M o r e o v e r , t h e a n o m a l o u s m i g r a t i o n b e h a v i o r o f s o m e h y d r o p h o b i c p e p t i d e s ( s u b u n i t I I I i n p a r t i c u l a r ) l e a d s t o c o n f u s i o n i n a s s i g n i n g s u b u n i t s . T h e s e d i f f i c u l t i e s h a v e b e e n l a r g e l y o v e r c o m e b y t h e u s e o f o n e h i g h l y r e s o l v i n g g e l s y s t e m ( u s u a l l y t h a t o f K a d e n b a c h e t a l . , 1 9 8 3 ) , b y a n a l y z i n g i m m u n o - r e a c t i v i t i e s o f s u b u n i t s f r o m d i f f e r e n t o x i d a s e s , a n d b y p r o t e i n a n d g e n e s e q u e n c i n g . T h e r e l a t i v e l y l a r g e a m o u n t s o f p l a n t o x i d a s e w h i c h w e c a n n o w p u r i f y s h o u l d e n a b l e u s t o e m p l o y s o m e o f t h e s e m e t h o d s i n o r d e r t o i d e n t i f y a n d c h a r a c t e r i z e t h e s u b u n i t s o f t h e w h e a t o x i d a s e . I T h e a m i n o a c i d s e q u e n c e o f s u b u n i t I I i s o f p a r t i c u l a r i n t e r e s t i n w h e a t b e c a u s e o f t h e p o s s i b i l i t y t h a t a n a r g i n i n e r e p l a c e s a c o n s e r v e d c y s t e i n e s u g g e s t e d t o b e a C u A l i g a n d ( B o n e n e t a l . , 1 9 8 4 ) . W h i l e i t i s v e r y l i k e l y t h a t R N A e d i t i n g r e s t o r e s t h e c o n s e r v e d c y s t e i n e ( C o v e l l o a n d G r a y , 1 9 8 9 ) , t h i s h a s y e t t o b e c o n fi r m e d b y p r o t e i n s e q u e n c i n g . O n l y o n e p l a n t m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n h a s b e e n s e q u e n c e d ; t h e r e f o r e , s e q u e n c i n g o f e d i t i n g s i t e s i n s u b u n i t I I , t h e c y s t e i n e i n p a r t i c u l a r , i s i m p o r t a n t f o r u n d e r s t a n d i n g t h e p r o c e s s o f p l a n t m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n s y n t h e s i s , a s w e l l a s t h e i m p o r t a n c e o f c e r t a i n r e s i d u e s o f t h e o x i d a s e i n c a t a l y s i s . 7 . 2 M a t e r i a l s a n d m e t h o d s 7 . 2 . 1 G e l e l e c t r o p h o r e s i s a n d i m m u n o b l o t t i n g S D S - u r e a g e l e l e c t r o p h o r e s i s w a s p e r f o r m e d b y t h e m e t h o d o f K a d e n b a c h e t a l . ( 1 9 8 3 ) a s d e s c r i b e d i n c h a p t e r 6 . P r e p a r a t i v e g e l e l e c t r o p h o r e s i s u s e d t o p u r i f y o x i d a s e s u b u n i t s f o r s u b u n i t I I d i g e s t i o n a n d a n t i b o d y p r o d u c t i o n w e r e r u n b y t h e s a m e p r o c e d u r e ; 3 n m o l o f o x i d a s e w a s r u n p e r 0 . 7 5 m m B i o - R a d M i n i - P R O T E A N I I g e l . G e l s w e r e s t a i n e d f o r 1 0 m i n u t e s i n 5 0 % m e t h a n o l , 7 . 5 % a c e t i c a c i d , a n d 0 . 2 5 % C o o m a s s i e b l u e , t h e n d e s t a i n e d f o r 1 0 m i n u t e s i n 2 5 % m e t h a n o l , 1 0 % a c e t i c a c i d . G e l s w e r e s o a k e d f o r a n a d d i t i o n a l 5 - 1 0 m i n u t e s i n w a t e r t o r e m o v e S D S , u r e a , a n d d e s t a i n i n g s o l u t i o n . B a n d s e x c i s e d w i t h a r a z o r b l a d e w e r e n e u t r a l i z e d w i t h 2 M a m m o n i u m b i c a r b o n a t e , a n d t h e n m i n c e d a n d i n c u b a t e d w i t h 0 . 2 M a m m o n i u m b i c a r b o n a t e a n d 0 . 1 % S D S f o r 1 8 — 2 4 h o u r s a t r o o m t e m p e r a t u r e w i t h a g i t a t i o n . G e l s u s e d f o r W e s t e r n b l o t a n a l y s i s w e r e b l o t t e d o n t o n i t r o c e l l u l o s e ( 0 . 4 5 p m p o r e s i z e , B i o - R a d L a b o r a t o r i e s ) i n a b u f f e r c o n t a i n i n g 1 2 . 5 m M T r i s , 9 6 m M g l y c i n e , a n d 2 0 % m e t h a n o l ( i n w h i c h t h e g e l w a s p r e - e q u i l i b r a t e d f o r 1 0 m i n u t e s ) f o r 1 h o u r a t 1 0 0 V . ( T h e fi l t e r p a p e r o n t h e c a t h o d e s i d e o f t h e g e l w a s s o a k e d i n t h i s b u fl ' e r w i t h 0 . 5 % S D S f o r t e n m i n u t e s b e f o r e b l o t t i n g . ) T h e b l o t s w e r e s t a i n e d f o r fi v e m i n u t e s w i t h a m i d o b l a c k ( 0 . 0 2 5 % i n 7 . 5 % a c e t i c a c i d a n d 2 2 . 5 % e t h a n o l ) a n d d e s t a i n e d w i t h w a t e r . B l o t s w e r e b l o c k e d f o r t h i r t y m i n u t e s t o o v e r n i g h t i n a s o l u t i o n o f 5 % m i l k p o w d e r i n 2 0 m M T r i s , 0 . 5 M N a C l , a n d 0 . 0 5 % T w e e n - 2 0 , p H 7 . 5 . Y e a s t s u b u n i t I V a n t i b o d i e s w e r e i n c u b a t e d f o r f o u r h o u r s , w h i l e n u c l e a r s u b u n i t a n t i b o d y w a s i n c u b a t e d o v e r n i g h t . G o a t a n t i - r a b b i t I g G a l k a l i n e p h o s p h a t a s e c o n j u g a t e w a s a p p l i e d a s t h e s e c o n d a r y a n t i b o d y , w i t h 5 - b r o m c i m m u m B c y c l o h e m e t h a n 3 0 m i n i m M K I - j P H b e f C o o m a s S t a i n i n g 7 . 2 . 2 P n M Y e a s t c 3 ( U n i v e r s 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l p h o s p h a t e a n d n i t r o b l u e t e t r a z o l i u m u s e d f o r i m m u n o d e t e c t i o n . B l o t t i n g f o r a m i n o a c i d s e q u e n c i n g w a s p e r f o r m e d i n 1 0 m M 3 - c y c l o h e x y l a m i n o - 1 - p r o p a n e s u l f o n i c a c i d ( C A P S ) , p H 1 1 . 0 , w i t h 1 0 % m e t h a n o l ( i n w h i c h t h e g e l w a s p r e - e q u i l i b r a t e d f o r 1 0 m i n u t e s ) a t 1 0 0 V f o r 3 0 m i n u t e s o n t o P r o B l o t ( A p p l i e d B i o s y s t e m s ) . T h e b l o t s w e r e r i n s e d i n 2 0 m M K H z P O 4 , 1 5 0 m M K C ] , p H 7 . 2 f o l l o w e d b y w a t e r t o n e u t r a l i z e t h e h i g h p H b e f o r e s t a i n i n g w i t h 1 % a c e t i c a c i d a n d 5 0 % m e t h a n o l i n 0 . 0 5 % C o o m a s s i e B r i l l i a n t B l u e R f o r 3 0 s e c o n d s . D e s t a i n i n g w a s p e r f o r m e d i n s t a i n i n g s o l u t i o n w i t h o u t d y e . 7 . 2 . 2 P r e p a r a t i o n o f a n t i b o d i e s M o n o s p e c i fi c p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s t o t h e n u c l e a r - e n c o d e d s u b u n i t s o f y e a s t c y t o c h r o m e o x i d a s e w e r e k i n d l y p r o v i d e d b y D r . R o b e r t P o y t o n ( U n i v e r s i t y o f C o l o r a d o , B o u l d e r ) . T h e c e l l l i n e p r o d u c i n g a m o n o c l o n a l a n t i b o d y t o y e a s t o x i d a s e s u b u n i t I I w a s t h e g i f t o f D r . T h o m a s M a s o n ( U n i v e r s i t y o f M a s s a c h u s e t t s , A m h e r s t ) . M o n o c l o n a l a n d p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s a g a i n s t w h e a t o x i d a s e p e p t i d e s w e r e p r e p a r e d b y C a r r i e H i s e r a n d R o x y N i c k e l s i n D r . L e e M c I n t o s h ’ s l a b o r a t o r y ( M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y ) u s i n g t h e p r o t o c o l d e s c r i b e d b y E l t h o n e t a l . ( 1 9 8 9 b ) . M o n o c l o n a l a n t i b o d i e s t o t h e “ m y s t e r y b a n d ” w e r e p r e p a r e d b y i n j e c t i n g F P L C - p u r i fi e d w h e a t g e r m o x i d a s e i n t o m i c e . A p o l y c l o n a l a n t i b o d y a s c i t e s fl u i d w a s g e n e r a t e d b y i n j e c t i n g p o o l e d f r a c t i o n s o f n u c l e a r - e n c o d e d s u b u n i t s ( I V , V * , V a , V b , a n d V c ) p u r i fi e d b y h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( H P L C , s e e s e c t i o n 7 . 2 . 4 ) , d e l i b e r a t e l y e x c l u d i n g t h e “ m y s t e r y b a n d ” a n d o t h e r l a r g e s u b u n i t s . A s c i t e s fl u i d w a s r e m o v e d f r o m t h e a b d o m e n o f t h e m i c e . 7 . 2 . 3 P u r i fi c a t i o n o f w h e a t o x i d a s e f o r s u b u n i t a n a l y s i s 7 . 2 . 3 . 1 S o d i u m b r o m i d e w a s h o f m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s S o l i d s o d i u m b r o m i d e w a s a d d e d t o s t i r r i n g m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s o n i c e t o a fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f 2 M . A f t e r 1 5 m i n u t e s , t h e m i t o c h o n d r i a w e r e d i l u t e d fi v e - f o l d i n 0 . 3 5 M s u c r o s e o r m a n n i t o l , 5 0 m M K C ] , 5 m M T E S , 1 m M E G T A , p H 7 . 2 a n d c e n t r i f u g e d a t 4 0 0 0 0 g f o r 3 0 m i n u t e s . T h e p e l l e t w a s r e s u s p e n d e d i n t h i s b u f f e r , r e c e n t r i f u g e d , a n d r e s u s p e n d e d . T h e s e w a s h e d m e m b r a n e s w e r e t h e n s u b j e c t e d t o l a u r y l m a l t o s i d e s o l u b i l i z a t i o n a n d F P L C a s d e s c r i b e d f o r u n w a s h e d m e m b r a n e s i n c h a p t e r 6 . 7 . 2 . 3 . 2 S o l u b i l i z a t i o n o f m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s w i t h T r i t o n X - 1 0 0 M i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s w e r e s o l u b i l i z e d w i t h 1 . 5 t o 3 . 5 m g T r i t o n X - 1 0 0 p e r m g p r o t e i n a n d 0 . 2 M K C ] ( fi n a l c o n c e n t r a t i o n ) . T h e m i x t u r e w a s a g i t a t e d f o r 3 0 m i n u t e s a n d c e n t r i f u g e d a t 4 0 0 0 0 g f o r 3 0 m i n u t e s . T h e s u p e r n a t a n t w a s r e m o v e d f r o m b e n e a t h a l a y e r o f c l o u d y w h i t e m a t e r i a l fl o a t i n g o n t o p . I f t h e p e l l e t c o n t a i n e d t h e o x i d a s e , i t w a s r e s u s p e n d e d i n b u f f e r ( 0 . 3 5 M s u c r o s e o r m a n n i t o l , 5 0 m M K C ] , 5 m M T E S , 1 m M E G T A , p H 7 . 2 ) t o w h i c h 2 m g l a u r y l m a l t o s i d e p e r m g p r o t e i n w a s a d d e d . A f t e r 3 0 m i n u t e s t h e m i x t u r e w a s c e n t r i f u g e d a t 4 0 0 0 0 g f o r 3 0 m i n u t e s , a n d t h e g r e e n i s h s u p e r n a t a n t c o n t a i n i n g t h e o x i d a s e u s e d f o r F P L C f r a c t i o n a t i o n . 7 . 2 . 4 H P L C o f w h e a t o x i d a s e T o p u r i f y t h e s u b u n i t s o f t h e w h e a t g e r m o x i d a s e f o r a n t i b o d y p r o d u c t i o n a n d s u b u n i t I I d i g e s t i o n a n d p r o t e o l y t i c c l e a v a g e , w e a t t e m p t e d t o u s e t h e m e t h o d o f R o b i n s o n e t a l . ( 1 9 9 0 ) . 2 0 0 1 1 L o f 2 0 u M o x i d a s e w a s d i s s o l v e d i n 0 . 1 % t r i fl u o r o a c e t i c a c i d ( T F A ) a n d fi l t e r e d b e f o r e l o a d i n g o n t o a V y d a c C 4 c o l u m n p r e - e q u i l i b r a t e d w i t h 0 . 1 % T F A . A g r a d i e n t f r o m 0 . 1 % T F A i n w a t e r t o 0 . 1 % T F A i n 1 0 0 % a c e t o n i t r i l e w a s p e r f o r m e d b y a W a t e r s P r e p L C 3 0 0 0 a t a fl o w r a t e o f 1 m L / m i n i n 4 5 m i n u t e s a n d t h e a b s o r b a n c e w a s m o n i t o r e d a t 2 1 4 n m a n d w a s r e c o r d e d b y t h e W a t e r s D a t a M o d u l e . W h e n t h i s p r o c e d u r e w a s a p p l i e d t o b e e f h e a r t o x i d a s e , t h e e l u t i o n p r o fi l e o b t a i n e d w a s s i m i l a r t o t h a t r e p o r t e d b y R o b i n s o n e t a l . ( 1 9 9 0 ) . S i n c e s u b u n i t I I f r o m w h e a t g e r m o x i d a s e d i d n o t e l u t e u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , s e v e r a l v a r i a t i o n s o n t h i s m e t h o d w e r e t r i e d , i n c l u d i n g s u b s t i t u t i o n o f i s o p r o p a n o l f o r a c e t o n i t r i l e , o r a 5 5 : 4 5 ( v / v ) m i x t u r e o f i s o p r o p a n o l a n d a c e t o n i t r i l e . F r a c t i o n s w e r e d r i e d u n d e r v a c u u m b e f o r e f u r t h e r t r e a t m e n t . 7 . 2 . 5 P r o t e o l y t i c d i g e s t i o n o f s u b u n i t s P r o t e i n p r e p a r e d b y e i t h e r H P L C w a s d i s s o l v e d i n 0 . 2 M a m m o n i u m b i c a r b o n a t e a n d 0 . 1 % S D S ; p r o t e i n f r o m p r e p a r a t i v e g e l e l e c t r o p h o r e s i s w a s a l r e a d y i n t h i s b u f f e r . F o r t r y p s i n d i g e s t s , 0 . 2 — 1 u L o f 1 m g / m L t r y p s i n ( S i g m a ) w a s a d d e d t o 5 0 — 1 0 0 u L o f s u b u n i t I I a n d f o r V 8 d i g e s t i o n , 1 u L o f 1 m g / m L V 8 ( B o e h r i n g e r M a n n h e i m ) w a s a d d e d p e r 3 0 0 u L . I n b o t h c a s e s , a p p r o x i m a t e l y 3 u g s u b u n i t I I w a s d i g e s t e d p e r t u b e . T h e d i g e s t s w e r e i n c u b a t e d f o r 3 h o u r s a t 3 7 ° C a n d d r i e d u n d e r v a c u u m . E n d o p r o t e i n a s e s L y s - C a n d A r g - C ( B o e h r i n g e r - M a n n h e i m ) a n d E n d o - p e p t i d a s e P r o - C ( S e i k a g a k u K o g y o C o . ) w e r e a l s o u s e d u n d e r t h e c o n d i t i o n s o f V 8 b u t a t c o n c e n t r a t i o n s o f u p t o 2 0 u L p e r 3 0 0 u L s a m p l e a n d d i g e s t i o n s t i m e s u p t o 2 4 h o u r s . S D S w a s r e m o v e d b y c o l d 8 0 % a c e t o n e p r e c i p i t a t i o n . T h e p e l l e t s w e r e d r i e d t o r e m o v e a c e t o n e b e f o r e a d d i n g g e l l o a d i n g b u f f e r ( a s d e s c r i b e d i n K a d e n b a c h e t a l . ( 1 9 8 3 ) w i t h t h e a d d i t i o n o f 0 . 0 4 % b r o m o p h e n o l b l u e ) . S a m p l e s w e r e s o n i c a t e d a t 1 5 — 2 0 ° C f o r 3 0 m i n u t e s a n d l e f t o v e r n i g h t b e f o r e r u n n i n g t h e m o n g e l s . 7 . 2 . 6 S e q u e n c i n g o f w h e a t o x i d a s e p e p t i d e s F o u r t o fi v e b a n d s w e r e e x c i s e d f r o m P r o B l o t f o r e a c h a m i n o a c i d s e q u e n c i n g o n a n A p p l i e d B i o s y s t e m s M o d e l 4 7 7 p u l s e d - l i q u i d p e p t i d e s e q u e n c e r w i t h a n o n - l i n e M o d e l 1 2 0 P T H - a m i n o a c i d a n a l y z e r . 7 . 3 R e s u l t s 7 . 3 . 1 D e t e r m i n a t i o n o f t h e t r u e s u b u n i t c o m p o s i t i o n o f w h e a t o x i d a s e S i n c e t h e w h e a t g e r m o x i d a s e p u r i fi e d b y t h e F P L C m e t h o d s o f t h e l a s t c h a p t e r c o n t a i n s h i g h a m o u n t s o f “ m y s t e r y b a n d ” a n d a p p a r e n t l y s t o i c h i o m e t r i c a m o u n t s o f V * , t h e p u t i t i v e “ d e v e l o p m e n t a l ” s u b u n i t , w e h a v e t r i e d t o b e t t e r d e fi n e t h e s u b u n i t c o m p o s i t i o n o f t h e w h e a t o x i d a s e w i t h p a r t i c u l a r r e f e r e n c e t o t h e s e t w o p e p t i d e s . A fi r s t a n a l y s i s c a n b e m a d e b y e x a m i n i n g t h e S D S - g e l s o f o x i d a s e f r o m d i f f e r e n t p o i n t s o n t h e e l u t e d p e a k f r o m a t y p i c a l m i t o c h o n d r i a l f r a c t i o n a t i o n o n M o n o Q . F i g u r e 7 . 1 s h o w s t w o f r a c t i o n s b e f o r e t h e p e a k ( l a n e s 1 — 2 , c o r r e s p o n d i n g t o f r a c t i o n 4 5 - 4 6 i n F i g u r e 6 . 3 ) , t h e p e a k ( l a n e 3 ) , a n d o n e f r a c t i o n a f t e r t h e p e a k ( l a n e 4 , c o r r e s p o n d i n g t o f r a c t i o n 5 5 i n F i g u r e 6 . 3 ) w h i c h i s c o n t a m i n a t e d w i t h p e p t i d e s f r o m t h e b c l c o m p l e x ( l a n e 5 ) . T h e “ m y s t e r y b a n d ” ( s h o w n b y a n a r r o w ) i s n o t p r e s e n t i n t h e e a r l i e s t f r a c t i o n , b u t b e g i n s t o a p p e a r i n l a n e 2 . I t i s v e r y s t r o n g i n t h e p e a k f r a c t i o n , a n d i s r e d u c e d a g a i n i n t h e l a t e r f r a c t i o n s . T h e e a r l y f r a c t i o n s w h i c h l a c k t h e “ m y s t e r y b a n d ” a r e a c t i v e ( T N = 4 5 0 8 4 ) , s h o w i n g t h a t i t s p r e s e n c e i s n o t r e q u i r e d f o r a c t i v i t y a n d s u g g e s t i n g t h a t i t i s p e r h a p s n o t a t r u e s u b u n i t . T h e “ d e v e l o p m e n t a l ” s u b u n i t , V “ , a p p e a r s t o b e r e l a t i v e l y s t o i c h i o m e t r i c t h r o u g h o u t t h e e l u t i o n p r o fi l e , s u g g e s t i n g t h a t i t i s a t r u e s u b u n i t . B o t h t h e “ m y s t e r y b a n d ” a n d V “ a r e p r e s e n t i n s i m i l a r a m o u n t s a f t e r g e l fi l t r a t i o n ( P h a r m a c i a S u p e r o s e 6 ) 1 2 3 4 5 ' ‘ r — - r V v ' I _ ! I I — = I l l — . ‘ 9 z I I v — o 7 * H H a n d . . - * — ‘ M g . a : ' - _ v b _ = . . = _ c " ‘ " ~ — F i g u r e 7 . 1 : S D S - P A G E a n a l y s i s o f w h e a t g e r m c y t o c h r o m e o x i d a s e F P L C f r a c t i o n s . L a n e 1 a n d 2 a r e f r a c t i o n s p r e c e d i n g t h e p e a k , l a n e 3 i s t h e m o s t c o n c e n t r a t e d f r a c t i o n o f t h e p e a k , l a n e 4 i s a f r a c t i o n a f t e r t h e p e a k , a n d l a n e 5 i s t h e b c 1 c o m p l e x i n t h e p e a k f o l l o w i n g t h e o x i d a s e . D e s i g n a t i o n s o f t h e s u b u n i t s o f t h e w h e a t g e r m o x i d a s e a r e m a r k e d t o t h e l e f t o f l a n e 1 . T h e a r r o w p o i n t s t o t h e p o s i t i o n o f t h e “ m y s t e r y b a n d ” . 1 9 9 o f M o n o Q - p u r i fi e d o x i d a s e . F u r t h e r e v i d e n c e , h o w e v e r , w a s n e e d e d t o s u p p o r t t h e s e c o n c l u s i o n s . 7 . 3 . 1 . 1 N a t i v e g e l e l e c t r o p h o r e s i s T h e r e c e n t m e t h o d o f S c h a g g e r a n d v o n J a g o w ( 1 9 9 1 ) a p p e a r e d v e r y p r o m i s i n g f o r a p p l i c a t i o n t o o u r p r o b l e m o f d e t e r m i n i n g s u b u n i t c o m p o s i t i o n w i t h m i n i m a l p r o c e s s i n g o f t h e e n z y m e w h i c h c o u l d l e a d t o a l t e r a t i o n o f t h e p e p t i d e c o n t e n t . T h i s u n i q u e m e t h o d u t i l i z e s t h e p r o t e i n d y e C o o m a s s i e B l u e G i n t h e s a m p l e a n d c a t h o d e b u f f e r t o i n d u c e “ c h a r g e s h i f t ” , s i m i l a r t o t h e a c t i o n o f S D S i n d e n a t u r i n g g e l s . T h e r e f o r e t h e c o m p l e x e s r u n m o r e o r l e s s a c c o r d i n g t o t h e i r m o l e c u l a r w e i g h t s . T h e c o m p l e x e s a r e s o l u b i l i z e d b y l a u r y l m a l t o s i d e a n d k e p t s o l u b l e i n t h e g e l b y h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f a m i n o c a p r o i c a c i d . S i n c e s o m e d y e r e m a i n s b o u n d t o t h e p r o t e i n s , v i s u a l i z a t i o n i s i m m e d i a t e . B a n d s c a n b e e x c i s e d f r o m t h e g e l a n d r u n u n d e r d e n a t u r i n g c o n d i t i o n s t o d e t e r m i n e t h e s u b u n i t c o m p o s i t i o n . W e h a v e t r i e d t o r e p r o d u c e t h e r e s u l t s o f S c h a g g e r a n d v o n J a g o w ( 1 9 9 1 ) w i t h o n l y l i m i t e d s u c c e s s . I n o u r h a n d s , l a u r y l m a l t o s i d e — s o l u b i l i z e d b e e f h e a r t i n n e r m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e p a r t i c l e s , w h i c h s h o u l d b e a n a l o g o u s t o t h e b e e f m u s c l e m i t o c h o n d r i a u s e d i n t h e a b o v e r e p o r t , p r o d u c e d s e v e r a l w a v y b a n d s o n t o p o f a s t r e a k e d b a c k g r o u n d . P u r i fi e d b e e f h e a r t o x i d a s e p r o d u c e d t w o m a j o r a n d s e v e r a l m i n o r b a n d s ( t h e m u l t i p l e b a n d s p r o b a b l y a r i s e f r o m o l i g o m e r i c s t a t e s o f t h e e n z y m e ) , a s d i d p u r i fi e d w h e a t o x i d a s e s , a l t h o u g h n o t r e p r o d u c i b l y . H o w e v e r , w h e n s o l u b i l i z e d m i t o c h o n d r i a fi ‘ o m w h e a t s e e d l i n g , w h e a t g e r m , a n d y e a s t m i t o c h o n d r i a w e r e r u n o n t h e n a t i v e g e l s y s t e m , i n t e n s e s m e a r i n g r e s u l t e d t h r o u g h o u t t h e e n t i r e l a n e , c o m p l e t e l y o b s c u r i n g a n y b a n d s w h i c h m a y h a v e f o r m e d . V a r i o u s m o d i fi c a t i o n s o f t h e p r o c e d u r e w i t h r e g a r d t o p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n a n d d e t e r g e n t c o n c e n t r a t i o n i n t h e s a m p l e a n d g e l g a v e n o i m p r o v e m e n t s . W e h a v e t h e r e f o r e a b a n d o n e d t h i s m e t h o d a s a n a p p r o a c h t o d e t e r m i n i n g s u b u n i t c o m p o s i t i o n o f t h e w h e a t o x i d a s e . 7 . 3 . 1 . 2 I m m u n o l o g i c a l m e t h o d s I m m u n o b l o t s . T o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e a b s e n c e o f t h e V * b a n d i n w h e a t s e e d l i n g i s t h e r e s u l t o f i t s l o s s d u r i n g p u r i fi c a t i o n , w e u s e d p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s a g a i n s t H P L C - p u r i fi e d n u c l e a r - e n c o d e d s u b u n i t s f r o m w h e a t g e r m o x i d a s e t o a n a l y z e s o l u b i l i z e d m i t o c h o n d r i a f r o m b o t h w h e a t s e e d l i n g a n d g e r m . F i g u r e 7 . 2 s h o w s a n i m m u n o b l o t o f p u r i fi e d w h e a t g e r m o x i d a s e ( l a n e 1 ) , s o l u b i l i z e d w h e a t g e r m m i t o c h o n d r i a ( l a n e 2 ) , a n d s o l u b i l i z e d w h e a t s e e d l i n g m i t o c h o n d r i a ( l a n e 3 ) . R e a c t i o n w i t h V * i s c l e a r i n t h e t w o w h e a t g e r m l a n e s ; h o w e v e r , t h e r e i s n o r e a c t i o n a t t h a t m o l e c u l a r w e i g h t i n t h e w h e a t s e e d l i n g l a n e . A v e r y f a i n t r e a c t i o n o c c u r s a t a s l i g h t l y h i g h e r m o l e c u l a r w e i g h t i n w h e a t s e e d l i n g m i t o c h o n d r i a ( m a r k e d b y a n a r r o w ) , a t a p o s i t i o n w h i c h m a y c o r r e s p o n d t o t h e 1 0 k D a p u t i t i v e a n a l o g t o V “ . N o r e a c t i o n i s s e e n a t t h a t p o s i t i o n i n e i t h e r w h e a t g e r m l a n e . T h e r e f o r e , t h e a b s e n c e o f V * a t i t s “ n a t i v e ” m o l e c u l a r w e i g h t i s c o n fi r m e d b y t h i s b l o t , b u t t h e p o s s i b i l i t y r e m a i n s t h a t a n a n a l o g t h a t i s i m m u n o l o g i c a l l y r e l a t e d e x i s t s i n t h e s e e d l i n g . I m m u n o p r e c i p i t a t i o n . A n t i b o d i e s a g a i n s t o x i d a s e f r o m s e v e r a l s o u r c e s w e r e t e s t e d f o r a b i l i t y t o i m m u n o p r e c i p i t a t e , a s m e a s u r e d b y a b i l i t y t o r e m o v e a c t i v i t y f r o m t h e p r o t e i n - c o n t a i n i n g s o l u t i o n . A y e a s t o x i d a s e s u b u n i t I V p o l y c l o n a l a n t i b o d y , a y e a s t o x i d a s e s u b u n i t I I m o n o c l o n a l , t h e “ m y s t e r y b a n d ” m o n o c l o n a l , a n d t h e H P L C - p u r i fi e d n u c l e a r - e n c o d e d w h e a t g e r m o x i d a s e s u b u n i t s m o u s e p o l y c l o n a l a l l w e r e s t r o n g l y p o s i t i v e i n a n e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y ( E L I S A ) ; h o w e v e r , n o n e w e r e a b l e t o 2 0 1 a : V b — c — F i g u r e 7 . 2 : I m m u n o b l o t a n a l y s i s o f p u r i fi e d w h e a t g e r m c y t o c h r o m e o x i d a s e ( l a n e 1 ) , w h e a t g e r m m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s ( l a n e 2 ) , a n d w h e a t s e e d l i n g m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s ( l a n e 3 ) . M e m b r a n e s w e r e s o l u b i l i z e d w i t h l a u r y l m a l t o s i d e a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 6 . 2 . 4 a n d p r e p a r e d f o r e l e c t r o p h o r e s i s a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 6 . 2 . 7 . T h e b l o t w a s i n c u b a t e d o v e r n i g h t w i t h a n t i b o d i e s a g a i n s t H P L C - p u r i fi e d n u c l e a r - e n c o d e d s u b u n i t s ( d e s c r i b e d i n s e c t i o n 7 . 2 . 2 ) . 2 0 2 i m m u n o p r e c i p i t a t e o x i d a s e a c t i v i t y f r o m s o l u b i l i z e d w h e a t g e r m m i t o c h o n d r i a u n d e r a b r o a d r a n g e o f p r o t e i n a n d d e t e r g e n t c o n c e n t r a t i o n s . 7 . 3 . 1 . 3 O t h e r p u r i fi c a t i o n t e c h n i q u e s S o d i u m b r o m i d e w a s h . S i n c e a n u m b e r o f u n i d e n t i fi e d p e p t i d e s i n t h e h i g h e r m o l e c u l a r w e i g h t r a n g e ( > 5 0 k D a ) a p p e a r i n S D S g e l s o f t h e w h e a t g e r m c y t o c h r o m e o x i d a s e p r e p a r a t i o n , i n a d d i t i o n t o t h e “ m y s t e r y b a n d ” ( w h i c h r u n s b e l o w s u b u n i t I I o n g e l s ) , a s w e l l a s s e v e r a l f a i n t b a n d s a b o v e V a ( i n c l u d i n g t h e p u t a t i v e d e v e l o p m e n t a l V “ ) , w e s u b j e c t e d o u r m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s t o a w a s h w i t h s o d i u m b r o m i d e , w h i c h r e m o v e s p e r i p h e r a l m e m b r a n e p r o t e i n s . T y p i c a l l y t h e A T P a s e 0 : a n d B , a n d a n u m b e r o f t h e N A D H d e h y d r o g e n a s e s u b u n i t s a r e r e m o v e d w i t h t h i s t r e a t m e n t i n o t h e r m i t o c h o n d r i a l a n d m i c r o b i a l m e m b r a n e p r e p a r a t i o n s . T h e t w i c e b u f f e r - w a s h e d a n d r e s u s p e n d e d p e l l e t f r o m s o d i u m b r o m i d e - w a s h e d m e m b r a n e s r e t a i n e d o n l y 4 0 — 5 0 % o f t h e o r i g i n a l c y t o c h r o m e o x i d a s e a c t i v i t y . A n o t h e r 2 0 % w a s f o u n d i n t h e s u p e r n a t a n t o f t h e w a s h . W h e n t h e w a s h e d m e m b r a n e s w e r e s o l u b i l i z e d a n d s u b j e c t e d t o a n i o n - e x c h a n g e F P L C , t h e e l u t i o n p r o fi l e w a s s i m i l a r t o t h o s e f r o m u n w a s h e d m e m b r a n e s ( s e e F i g u r e 6 . 3 ) , e x c e p t t h a t t h e o f f - s c a l e p e a k p r i o r t o t h e e l u t i o n o f t h e o x i d a s e w a s m u c h l o w e r r e l a t i v e t o t h e h e i g h t o f t h e o x i d a s e p e a k , a s w o u l d b e e x p e c t e d s i n c e t h e A T P a s e a a n d 8 s u b u n i t s m a k e u p a l a r g e p a r t o f t h i s p e a k . H o w e v e r , f r a c t i o n s f r o m t h e t a i l o f t h i s o fi l s c a l e p e a k w e r e g r e e n i s h , a n d c o n t a i n e d h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f o x i d a s e w h i c h h a d l i t t l e o r n o a c t i v i t y . T h e p r e s e n c e o f m a n y o t h e r c o m p o n e n t s p r e v e n t e d p r e c i s e i d e n t i fi c a t i o n o f w h i c h s u b u n i t s w e r e p r e s e n t i n t h i s i n a c t i v e c o m p l e x . T h e o x i d a s e p e a k e l u t i n g i n t h e e x p e c t e d p o s i t i o n h a d t y p i c a l t u r n o v e r n u m b e r s ( > 5 0 0 8 ' 1 ) a n d s p e c t r a l c h a r a c t e r i s t i c s . H o w e v e r , S D S g e l s o f t h i s f r a c t i o n s h o w l i t t l e i f a n y i m p r o v e m e n t o v e r c o n c e n t r a t e d f r a c t i o n s p u r i fi e d f r o m u n w a s h e d m e m b r a n e s , a n d t h e “ m y s t e r y b a n d ” a n d V * a r e b o t h s t i l l p r e s e n t . T h i s r e s u l t s u g g e s t s t h a t t h e a c t i v i t y l o s t d u r i n g t h e p r o c e d u r e w a s l a r g e l y d u e t o o x i d a s e b e i n g i n a c t i v a t e d b y t h e s o d i u m b r o m i d e , p o s s i b l y d u e t o d e n a t u r a t i o n o f t h e e n z y m e . T r i t o n X - 1 0 0 s o l u b i l i z a t i o n . S i n c e t h e c y t o c h r o m e o x i d a s e o f w h e a t g e r m m i t o c h o n d r i a a p p e a r s t o b e r e a s o n a b l y s t a b l e i n T r i t o n X - 1 0 0 ( s e e c h a p t e r 6 ) , w e h a v e a t t e m p t e d t o p e r f o r m i n i t i a l s t e p s o f o u r p u r i fi c a t i o n i n t h i s d e t e r g e n t . O n e i m m e d i a t e b e n e fi t i s c o n s e r v a t i o n o f t h e e x p e n s i v e d e t e r g e n t l a u r y l m a l t o s i d e w h i c h i s u s e d i n l a r g e q u a n t i t i e s f o r t h e i n i t i a l m i t o c h o n d r i a l s o l u b i l i z a t i o n . A s e c o n d b e n e fi t i s t h a t T r i t o n a l l o w s a “ m e m b r a n e s p l i t t i n g ” s i m i l a r t o t h a t a c h i e v e d w i t h d e o x y c h o l a t e i n b e e f h e a r t o x i d a s e p r e p a r a t i o n , r e m o v i n g m a n y p o t e n t i a l c o n t a m i n a n t s e a r l y i n t h e p r o c e d u r e . A t m o d e r a t e c o n c e n t r a t i o n s o f T r i t o n X - 1 0 0 ( 1 . 7 5 m g d e t e r g e n t p e r m g p r o t e i n , o r “ m g / m g ” ) , m a n y m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n s a r e s e l e c t i v e l y s o l u b i l i z e d w h i l e o t h e r s r e m a i n m e m b r a n e - e m b e d d e d a n d a r e e a s i l y p e l l e t e d b y c e n t r i fi i g a t i o n . T h e b c 1 a n d A T P a s e c o m p l e x e s a r e s o l u b i l i z e d , b u t t h e c y t o c h r o m e o x i d a s e i s n o t . I n f a c t , 9 0 % o f t h e t o t a l p r o t e i n i s s o l u b i l i z e d , r e s u l t i n g i n a n i m m e d i a t e t e n - f o l d p u r i fi c a t i o n o f t h e o x i d a s e . A t h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s ( a b o v e 2 m g / m g ) t h e o x i d a s e i s a l s o s o l u b i l i z e d . D i f f e r e n c e s p e c t r a o f m i t o c h o n d r i a e x t r a c t e d i n e i t h e r T r i t o n X - 1 0 0 o r l a u r y l m a l t o s i d e a r e s h o w n i n F i g u r e 7 . 3 . S o l u b i l i z a t i o n o f t h e T r i t o n - i n s o l u b l e p e l l e t ( f r o m t h e 1 . 7 5 m g / m g s o l u b i l i z a t i o n ) w i t h 2 m g l a u r y l m a l t o s i d e / m g p r o t e i n a l l o w s r e c o v e r y o f a n a c t i v e c y t o c h r o m e o x i d a s e . H o w e v e r , t h i s f r a c t i o n i s u n a b l e t o p a s s t h r o u g h a 0 . 4 5 p m fi l t e r , a n e c e s s a r y s t e p p r i o r t o l o a d i n g o n t o t h e p r e s s u r e - s e n s i t i v e F P L C c o l u m n . T h i s m a y b e d u e t o l a r g e m i c e l l e s o f i n c o m p l e t e l y - e c n a b r o s b A W a v e l e n g t h , n m F i g u r e ‘ 7 . 3 : D i f f e r e n c e s p e c t r a ( d i t h i o n i t e - r e d u c e d m i n u s a i r - o x i d i z e d ) o f w h e a t g e r m m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s e x t r a c t e d w i t h l a u r y l m a l t o s i d e o r T r i t o n X — 1 0 0 . S o l u b i l i z a t i o n w a s p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 7 . 2 . 3 . 2 w i t h l a u r y l m a l t o s i d e ( — ) a t 2 m g / m g p r o t e i n o r T r i t o n X - 1 0 0 ( - - - - ) a t 1 . 7 5 m g / m g p r o t e i n . I n t h e l a t t e r c a s e , t h e o x i d a s e i s n o t s i g n i fi c a n t l y e x t r a c t e d , a s i n d i c a t e d b y t h e a b s e n c e o f a p e a k a t 6 0 2 n m . ' w h fl n H Z l f a c t , t h e fi l t e r e d , I fl m m d s d n h fl i z r e s u l t e d b y fl m c : t h e m y s t t h e t e c h u n u s a b l 7 . 3 . 2 A n T ‘ S E p a r a o e d i t i n g s e v e r a l s o l u b i l i z e d p r o t e i n s a n d l i p i d f o r m e d a t l o w e r T r i t o n c o n c e n t r a t i o n s . I n f a c t , t h e s u p e r n a t a n t o f t h e 1 . 7 5 m g / m g s o l u b i l i z a t i o n c a n a l s o n o t b e fi l t e r e d , b u t a 3 . 5 m g / m g s u p e r n a t a n t ( w h i c h c o n t a i n s t h e o x i d a s e ) c a n b e fi l t e r e d . O n e a t t e m p t a t a M o n o Q f r a c t i o n a t i o n o f t h e l a u r y l m a l t o s i d e - s o l u b i l i z e d p e l l e t o f t h e 1 . 7 5 m g / m g e x t r a c t i o n m a d e w i t h o u t fi l t e r i n g r e s u l t e d i n l o s s o f a m a j o r i t y o f t h e o x i d a s e w h i c h p r e s u m a b l y w a s r e t a i n e d b y t h e c o l u m n fi l t e r . O x i d a s e w h i c h d i d e l u t e w a s a c t i v e , b u t r e t a i n e d b o t h t h e m y s t e r y b a n d a n d V * ( d a t a n o t s h o w n ) . M o r e w o r k i s n e e d e d t o a l l e v i a t e t h e t e c h n i c a l p r o b l e m s w h i c h c u r r e n t l y r e n d e r t h i s p r o m i s i n g p r o c e d u r e u n u s a b l e . 7 . 3 . 2 A m i n o a c i d s e q u e n c e o f s u b u n i t I I T h e fi r s t s t e p i n s e q u e n c i n g s u b u n i t I I R N A e d i t i n g s i t e s w a s t o s e p a r a t e s u b u n i t I I f r o m t h e o t h e r s u b u n i t s . B e c a u s e n o n e o f t h e R N A e d i t i n g s i t e s . o c c u r r e d n e a r t h e N - t e r m i n u s o f t h e p r o t e i n , a n d i n f a c t s e v e r a l i m p o r t a n t o n e s a p p e a r o n l y n e a r t h e C - t e r m i n u s ( e . g . C y s - 2 2 8 ) , i t w a s n e c e s s a r y t o d i g e s t t h e s u b u n i t i n t o s m a l l e r p i e c e s u s i n g p r o t e o l y t i c e n z y m e s . T h e r e s u l t i n g p e p t i d e s r e q u i r e d s e p a r a t i o n a n d t r a n s f e r t o a m a t r i x a p p r o p r i a t e f o r a m i n o a c i d s e q u e n c i n g . 7 . 3 . 2 . 1 I s o l a t i o n o f s u b u n i t I I H P L C . T h e t e c h n i q u e o f R o b i n s o n ( 1 9 9 0 ) f o r l a r g e s c a l e p u r i fi c a t i o n o f s u b u n i t 1 ] f r o m b e e f h e a r t o x i d a s e w a s t r i e d f o r t h e w h e a t o x i d a s e . T h e n u c l e a r s u b u n i t s a n d t h e m y s t e r y b a n d e l u t e a s s h a r p p e a k s ; h o w e v e r I , I I , a n d I I I d o n o t e l u t e a n d p r e s u m a b l y r e m a i n b o u n d t o t h e c o l u m n ( F i g u r e 7 . 4 ) . P e a k s w e r e i d e n t i fi e d b y t h e m o b i l i t i e s o f t h e f r a c t i o n s o n S D S g e l s ( F i g u r e 7 . 5 ) . S u b s t i t u t i n g t h e l e s s p o l a r i s o p r o p a n o l o r i s o p r o p a n o l : a c e t o n i t r i l e ( 5 5 : 4 5 , F i g u r e 7 . 6 ) f o r a c e t o n i t r i l e a n d i n c r e a s i n g t h e s t e e p n e s s o f t h e g r a d i e n t i n o r d e r t o d e c r e a s e r e s i d e n c e t i m e o n t h e c o l u m n e l u t e s I I I , I I , a n d I ( o n l y w i t h p u r e i s o p r o p a n o l ) , i n t h a t o r d e r , a l t h o u g h t h e t h r e e s u b u n i t s t e n d t o o v e r l a p , p a r t i c u l a r l y w h e n u s i n g i s o p r o p a n o l a l o n e . C o l u m n l i f e w a s s h o r t w h e n t h e w h e a t g e r m o x i d a s e w a s r u n ; o n l y 2 0 r u n s c o u l d b e d o n e w i t h g o o d r e c o v e r y , e v e n u n d e r o p t i m a l c o n d i t i o n s w i t h e x t e n s i v e w a s h i n g b e t w e e n r u n s w i t h m e t h y l e n e c h l o r i d e . S i n c e t h e b e e f h e a r t o x i d a s e s u b u n i t I I e l u t e s f r o m t h e c o l u m n i n a w e l l - r e s o l v e d p e a k u n d e r a l l t h e a b o v e c o n d i t i o n s ( i n o u r h a n d s ) , w e t r i e d t o d e t e r m i n e w h a t d i f f e r e n c e s m i g h t e x i s t b e t w e e n t h e w h e a t g e r m a n d t h e b e e f h e a r t e n z y m e w h i c h m a y a c c o u n t f o r t h i s o b s e r v e d d i f f e r e n c e i n e l u t i o n . _ W e s u s p e c t e d t h a t o u r e n z y m e m i g h t c o n t a i n m o r e a s s o c i a t e d l i p i d t h a n t h e b e e f h e a r t e n z y m e c l u e t o i t s d i f f e r e n t m e t h o d s o f p u r i fi c a t i o n , a n d t h a t t h i s , c o m b i n e d w i t h t h e n a t u r a l h y d r o p h o b i c i t y o f I a n d I I I , w a s c a u s i n g I I t o e l u t e l a t e r t h a n t h e b e e f h e a r t I I . W e . a t t e m p t e d t o r e m o v e t h e l i p i d b y p r e c i p i t a t i o n w i t h a m m o n i u m s u l f a t e ( t h e l a s t s t e p o f b e e f h e a r t o x i d a s e p u r i fi c a t i o n ) a n d t r i c h l o r o a c e t i c a c i d ( T C A ) , a n d t o r e m o v e I a n d / o r I I I b y h e a t a n d a c e t o n e p r e c i p i t a t i o n , w h i c h a g g r e g a t e t h e s u b u n i t s . W e a l s o t r i e d I I I - d e p l e t e d ( b u t s t i l l c o n t a i n i n g 1 ) e n z y m e n o r m a l l y p r o d u c e d i n t h e F P L C p u r i fi c a t i o n ( b y w a s h o f t h e c o l u m n - b o u n d p u r i fi e d o x i d a s e w i t h 0 . 3 M K C ] , s e e s e c t i o n 6 . 2 . 4 ) . N o n e o f t h e s e t e c h n i q u e s i m p r o v e d t h e e l u t i o n o f I I . . A n o t h e r d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e w h e a t s u b u n i t I I a n d t h e b e e f h e a r t 1 1 s e q u e n c e s i s t h a t t h e w h e a t s e q u e n c e c o n t a i n s fi v e c y s t e i n e s i n s t e a d o f t w o . W h e n I I i s d e n a t u r e d , t h e c y s t e i n e s m a y c r o s s l i n k I I t o i t s e l f o r t o I a n d I I I , r e s u l t i n g i n a b e r r a n t e l u t i o n . H o w e v e r , n e i t h e r a d d i t i o n o f h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f B M E a n d d i t h i o t h r e i t o ] n o r c o v a l e n t m o d i fi c a t i o n o f t h e r e d u c e d c y s t e i n e s w i t h 4 - v i n y l p y r i d i n e a l t e r e d t h e e l u t i o n p r o fi l e s . 0 . 5 0 1 0 0 / / / / / / 1 / / / / / / E 2 / 4 g 3 O N 0 . 2 5 - / 6 - s o : 2 / 5 o D . / / 3 / 3 / / / / J 0 . 0 0 1 J , 0 0 2 0 4 0 6 0 E l u t i o n t i m e , m i n . F i g u r e 7 . 4 : S e p a r a t i o n o f c y t o c h r o m e o x i d a s e s u b u n i t s b y r e v e r s e - p h a s e H P L C . O x i d a s e w a s r u n o n a C 4 c o l u m n f r o m w a t e r / 0 . 1 % T F A t o 1 0 0 % a c e t o n i t r i l e / 0 . 1 % T F A i n 6 0 m i n u t e s . E l u t e d p r o t e i n w a s d e t e c t e d b y a b s o r b a n c e a t 2 1 4 n m . F i g u r e 7 . 5 : S D S - P A G E a n a l y s i s o f p e a k s f r o m r e v e r s e - p h a s e H P L C i n F i g u r e 7 . 4 . H P L C f r a c t i o n s w e r e d r i e d u n d e r v a c u u m a n d i n c u b a t e d i n s a m p l e b u f f e r w i t h 4 % S D S ( s e c t i o n 6 . 2 . 7 ) o v e r n i g h t p r i o r t o e l e c t r o p h o r e s i s . V F N < , . 7 . 3 N < 0 0 0 ' . . 7 3 0 5 _ / u l / / / / 7 ' / 0 1 5 0 ° ‘ ‘ 2 ' 6 r g 5 3 I ” ‘ : 5 . / / / / I I l l . / / / L l / / / / / / / / / 0 ‘ 0 0 ' 0 1 I 0 2 0 3 0 E I u t i o n t i m e , m i n . F i g u r e 7 . 6 : P u r i fi c a t i o n o f s u b u n i t I I b y r e v e r s e - p h a s e H P L C . - C y t o c h r o m e o x i d a s e d i l u t e d i n 0 . 1 % T F A w a s l o a d e d o n t o a C 4 c o l u m n a n d e l u t e d b y a g r a d i e n t o f H z O / 0 . 1 % T F A t o 5 5 : 4 5 ( v / v ) i s o p r o p a n o l : a c e t o n i t r i l e / 0 . 1 % T F A i n 3 0 m i n u t e s . P r o t e i n w a s d e t e c t e d b y a b s o r b a n c e a t 2 1 4 n m . i n c d i ; t h I f S I S I 0 } a t 2 1 0 R e g a r d l e s s o f t h e e l u t i o n p r o t o c o l , H P L C - p r e p a r e d s u b u n i t I I w a s i n c o m p l e t e l y s o l u b l e i n 0 . 1 % S D S . S D S u r e a g e l s o f i t a n d i t s p r o t e o l y t i c d i g e s t s h a d a c o n s i d e r a b l y h i g h e r C o o m a s s i e b l u e s t a i n i n g b a c k g r o u n d t h a n t h e s a m e d i g e s t o n b e e f h e a r t I I o r w h e a t s u b u n i t I I e l u t e d f r o m p r e p a r a t i v e g e l s ( F i g u r e 7 . 7 , l a n e s 1 a n d 2 ) . T h i s b a c k g r o u n d w a s a c c e n t u a t e d u p o n t r a n s f e r t o n i t r o c e l l u l o s e . C o o m a s s i e b l u e s t a i n i n g o f t h e b l o t r e s u l t e d i n a b l u e s m e a r d o w n t h e l a n e t o t h e p o s i t i o n o f t h e l o w e s t b a n d , w i t h d i s c r e t e b a n d s b a r e l y d i s c e r n i b l e ( n o t s h o w n ) . T h i s i s m o s t l i k e l y d u e t o i n s u f fi c i e n t s o l u b i l i z a t i o n o f t h e p r o t e i n i n t h e g e l l o a d i n g b u fi ‘ e r ( 4 % S D S ) c a u s i n g t h e p r o t e i n t o e n t e r t h e g e l a t d i f f e r e n t t i m e s a n d c r e a t i n g a c o n t i n u o u s s t r e a m d o w n t h e l a n e . T h e a p p e a r a n c e o f t h e g e l w a s n o t a l t e r e d b y t h e a d d i t i o n o f 8 % S D S o r 6 M u r e a , a c e t o n e p r e c i p i t a t i o n , a n d h e a t i n g i m m e d i a t e l y b e f o r e l o a d i n g t h e g e l . T h e p r o t e i n h a s p e r h a p s b e c o m e t o o s e r i o u s l y d e n a t u r e d f r o m t h e H P L C s o l v e n t s o r c o l u m n t o b e r e s o l u b i l i z e d , a n d w e t h e r e f o r e a b a n d o n e d t h e H P L C m e t h o d o f p u r i f y i n g s u b u n i t I I . P r e p a r a t i v e g e l e l e c t r o p h o r e s i s . B e c a u s e H P L C p u r i fi c a t i o n p r o v e d u n f e a s i b l e , w e a t t e m p t e d t o i s o l a t e s u b u n i t I I b y p r e p a r a t i v e g e l e l e c t r o p h o r e s i s . W e h a v e p r e l i m i n a r i l y d e t e r m i n e d t h a t t h e r e c o v e r y o f s u b u n i t I I ( d e t e r m i n e d b y p r o t e i n a s s a y ) w a s 1 5 p g p e r g e l w h e n ~ 1 . 5 n m o l o x i d a s e w a s l o a d e d ( 3 0 — 5 0 % ) . I n t h e f u t u r e , e l e c t r o e l u t i o n m a y b e a t t e m p t e d t o i n c r e a s e t h e y i e l d . W h e n t h e d r i e d a c e t o n e - e x t r a c t e d s a m p l e w a s s o l u b i l i z e d i n t h e s t a n d a r d s a m p l e b u f f e r ( c o n t a i n i n g 4 % S D S ) a n d r e - r u n o n a g e l , s u b u n i t I I r a n c l e a n l y w i t h a l m o s t n o b a c k g r o u n d F i g u r e 7 . 7 , l a n e 3 ) . T h e r e f o r e , t h i s m e t h o d w a s u s e d f o r a l l s u b s e q u e n t p r o t e o l y t i c d i g e s t i o n e x p e r i m e n t s . 2 1 1 F i g u r e 7 . 7 : S D S - P A G E a n a l y s i s o f s u b u n i t I I a n d i t s p r o t e o l y t i c d i g e s t i o n s p u r i fi e d b y H P L C a n d p r e p a r a t i v e g e l e l e c t r o p h o r e s i s . S u b u n i t I I w a s p u r i fi e d b y t h e s e m e t h o d a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n s 7 . 2 . 4 a n d 7 . 2 . 1 r e s p e c t i v e l y ; t r y p s i n a n d V 8 d i g e s t s w e r e p e r f o r m e d a n d s a m p l e s p r e p a r e d f o r e l e c t r o p h o r e s i s a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 7 . 2 . 5 . L a n e 1 : s u b u n i t I I p u r i fi e d b y H P L C a s i n F i g u r e 7 . 6 ; l a n e 2 : t r y p s i n d i g e s t o f H P L C - p u r i fi e d s u b u n i t I I ; l a n e 3 : s u b u n i t I I p u r i fi e d b y p r e p a r a t i v e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ; l a n e 4 : t r y p s i n d i g e s t o f g e l - p u r i fi e d s u b u n i t I I ; l a n e 5 : V 8 d i g e s t o f g e l - p u r i fi e d s u b u n i t I I ; l a n e 6 : C o o m a s s i e - b l u e s t a i n e d b l o t ( C A P S - t r a n s f e r r e d ) o f V 8 d i g e s t o f g e l - p u r i fi e d s u b u n i t I I . . — — | | a s t i o n u b u n i i b r m é i I G d i n 3 W a n e l m e i e s t o f I b l o t F i g u r e 7 . 7 2 1 3 7 . 3 . 2 . 2 P r o t e o l y t i c d i g e s t i o n o f s u b u n i t I I E n d o p r o t e i n a s e L y s - C , A r g - C , P r o - C , t r y p s i n a n d V 8 ( G l u - C ) w e r e t e s t e d f o r t h e i r a b i l i t y t o d i g e s t s u b u n i t I I i n t o p i e c e s a p p r o p r i a t e f o r s u b s e q u e n t a m i n o s e q u e n c i n g . T h e s e q u e n c e o f s u b u n i t I I i s s h o w n i n F i g u r e 7 . 8 , w i t h e d i t i n g s i t e s d o u b l e - u n d e r l i n e d . L y s - C , A r g - C , a n d P r o o C w e r e u n a b l e t o c l e a v e s u b u n i t I I , m o s t l i k e l y b e c a u s e o f t h e i r l a b i l i t y i n S D S , w h i c h i s r e q u i r e d t o m a i n t a i n s o l u b i l i t y o f s u b u n i t I I . T r y p s i n a n d V 8 a r e n o t a s s e n s i t i v e t o S D S , a n d a d e q u a t e c l e a v a g e w a s i n f a c t a c h i e v e d . F i g u r e 7 . 7 s h o w s t h e r e s u l t s o f t h e s e d i g e s t s f r o m s u b u n i t I I p r e p a r e d b y b o t h H P L C a n d p r e p a r a t i v e g e l e l e c t r o p h o r e s i s . A s i g n i fi c a n t a m o u n t o f u n d i g e s t e d s u b u n i t I I r e m a i n s a f t e r t r y p s i n d i g e s t ( l a n e 4 ) ; h o w e v e r , m o r e c o m p l e t e d i g e s t i o n , a c h i e v e d b y a d d i n g m o r e t r y p s i n , d o e s n o t a l t e r t h e p a t t e r n o f p e p t i d e s ( l a n e 2 ) . T h e t r y p s i n d i g e s t a p p e a r s s i m i l a r t o t h a t o b t a i n e d w i t h b e e f h e a r t o x i d a s e , a n d a n t i b o d i e s r e a c t e d w i t h t h e l o w e r m o l e c u l a r w e i g h t b a n d i n b o t h c a s e s , s u p p o r t i n g t h e c o n c l u s i o n t h a t t h e s a m e c l e a v a g e s i t e , A r g - 1 6 2 ( T a h a a n d F e r g u s o n - M i l l e r , 1 9 9 2 ) , i s i n v o l v e d . H o w e v e r , n o R N A e d i t i n g s i t e s a r e f o u n d w i t h i n 1 0 a m i n o a c i d s o f t h i s s i t e , t h e r e f o r e t r y p s i n c l e a v a g e w a s n o t u s e d f u r t h e r . A n a l y s i s o f t h e s i z e s o f t h e V 8 c l e a v a g e p r o d u c t s s u g g e s t s t h a t s e v e r a l p i e c e s m i g h t c o n t a i n R N A e d i t i n g s i t e s n e a r t h e N - t e r m i n u s . T h e b a n d b e l o w t h e 1 4 k D a m o l e c u l a r w e i g h t m a r k e r c o u l d r e s u l t f r o m c l e a v a g e a t G l u - 1 3 2 , G l u - 1 4 1 , G l u - 1 5 4 , G l u - 1 5 8 , o r G l u - 1 6 5 ( i n d i c a t e d w i t h i n t h e a m i n o a c i d s e q u e n c e o f s u b u n i t I I i n F i g u r e 7 . 8 b y v e r t i c a l a r r o w s ) , w h i c h w o u l d r e s u l t i n p i e c e s o f 1 4 . 3 , 1 3 . 2 , 1 1 . 8 , o r 1 1 . 3 k D a r e s p e c t i v e l y , w i t h G l u - 1 4 1 b e i n g t h e m o s t l i k e l y c l e a v a g e s i t e b a s e d o n a p p a r e n t s i z e o f t h e p e p t i d e o n t h e g e l . T h e l o w e r m o l e c u l a r w e i g h t b a n d s w e r e m o r e d i f fi c u l t t o a n a l y z e b e c a u s e o f t h e d i s t o r t i o n s o f p r e d i c t e d m o l e c u l a r w e i g h t a t t h a t 0 0 0 0 0 2 4 8 0 2 4 6 8 1 1 1 1 2 0 0 0 0 0 u u y l e e p t l e l a l l e s G G V L A I M I s y C a p s a u r r g s l s e i l h e r y A A A L H T A S L a t l e e e : l u l e a l l l a e e A M V I I V I S L p p e e e a n y s l s l £ h l l a i l A I A 2 A I P H G . _ s y g u o u z u : r y l r e e r ¥ e h C G L A L P I T L _ — _ u n n u p l n s : e s l l e n a L G G A L A V y e L S _ a t e o l e x o l e h r a l e A M P P V fi I r P _ l e e l t l u x l l l ¥ e a e a a I M V V I I V L r u o l o : u a h e r r a e l l T L P P V S G A u r e n o y r e h l s r l y L T A I P G T e a u r e p r h l e s h h h P A L T P A T ' p r T r e S g e a n t e p s r l l l e l £ A A I g I G M . s p u u r r r y s e l h e y C A L G T S T _ i H u e L r n e n p p r l e l h s g y r a S V g T T G P A . u : e e e p u n e h h h l e l s L P P E I L G W A r y e s e s u a e l h i l e i l S H G P I L H A g u e p u a y r A e l l r l l L T G A I G r e S — — r u n p u e e e e l s e h l l h L L P G A I I T e a p s r r a l l r i l h e l a I T H A T S A V l t o s g r o s e r i r h r y M P H A W T P L e l I l . G l u G l n S e r L e u T h r P h e A s p S e r T y r M e t I l e P r o G l u A s p A s p L e u G l u L e n _ § 1 y _ fi 1 n 1 6 0 A s p A l a V a l P r o G l y A r g L e u A s n L e u T h r S e r I l e L e u V a l G l n A r g G l u G l y V a l T y r 2 2 0 T y r G l y G l n C y s S e r G l u I l e C y s G l y T h r A s n H i s A l a P h e M e t P r o I l e V a l V a l G l u 2 4 0 A l a V a l T h r L e u L y s A s p T y r A l a A s p T r p V a l S e r A s n G l n L e u I l e L e u G l n T h r A s n 2 6 0 F i g u r e 7 . 8 : P r e d i c t e d a m i n o a c i d s e q u e n c e o f w h e a t c y t o c h r o m e o x i d a s e s u b u n i t I I . S i t e s o f R N A e d i t i n g a r e d o u b l e - u n d e r l i n e d ; s e q u e n c e d p e p t i d e s a r e u n d e r l i n e d , a n d a r r o w s p o i n t t o p r e d i c t e d V 8 c l e a v a g e s i t e s . 2 1 4 2 1 5 p o s i t i o n i n t h e g e l , a n d b e c a u s e m a n y c l e a v a g e s w o u l d r e s u l t i n p i e c e s o f t h a t s i z e . A s s u m i n g o n l y o n e c u t p e r m o l e c u l e , h o w e v e r , t h e m o s t l i k e l y c l e a v a g e s i t e s p r o d u c i n g t h e s e b a n d s w o u l d b e G l u - 2 1 7 o r G l u - 2 2 6 . T h e l a t t e r w o u l d b e m o s t i d e a ] b e c a u s e s e q u e n c e c o n fi r m a t i o n w o u l d b e p o s s i b l e o f b o t h C y s - 2 2 8 a n d M e t - 2 3 5 , t w o h i g h l y c o n s e r v e d r e s i d u e s a n d p o s s i b l e C u A l i g a n d s . 7 . 3 . 2 . 3 A m i n o a c i d s e q u e n c e s o f s u b u n i t H p e p t i d e s B a s e d o n t h e p r e d i c t e d c l e a v a g e s i t e s , w e s e q u e n c e d b o t h t h e 1 3 k D a p e p t i d e , a s w e l l a s t h e l o w e r b a n d o f t h e s m a l l e r p e p t i d e s . T h e s e q u e n c e o f s u b u n i t H i s s h o w n i n F i g u r e 7 . 8 , w i t h s e q u e n c e d p e p t i d e s u n d e r l i n e d , w h i l e e d i t e d r e s i d u e s a r e d o u b l e - u n d e r l i n e d . T h e fi r s t fi v e a m i n o a c i d s o f t h e 1 3 k D a p e p t i d e m a t c h e x a c t l y t h e s e q u e n c e s t a r t i n g a f t e r G l u - 1 3 2 . T h e r e f o r e , s i n c e t h e n e a r e s t e d i t i n g s i t e i s M e t - 1 5 0 , n o i n f o r m a t i o n o n t h e p r e s e n C e o f R N A e d i t i n g w a s p o s s i b l e f r o m t h i s p e p t i d e . S e q u e n c e a n a l y s i s o f t h e s e c o n d b a n d p r o v e d m o r e a m b i g u o u s . T h e r e s i d u e s p r o d u c e d i n e a c h s e q u e n c e c y c l e a r e s h o w n i n F i g u r e 7 . 9 . T w o s e q u e n c e s c a n b e e x t r a c t e d f r o m t h i s c o m p l e x m i x t u r e : o n e s t a r t i n g a f t e r G l n - 1 5 7 , a n d a s e c o n d a f t e r G l n - 1 6 5 ( u n d e r l i n e d o n F i g u r e 7 . 8 ) . M a n y o f t h e r e s i d u e s c o r r e s p o n d i n g t o a t h i r d s e q u e n c e s t a r t i n g a t G l n - 1 5 3 a p p e a r t o b e i n t h e s e q u e n c i n g c y c l e s , b u t t h a t s e q u e n c e i s i n c o n c l u s i v e . T h e e x a c t s i z e s o f t h e s e p i e c e s c a n n o t b e d e t e r m i n e d , s i n c e s e v e r a l s i z e s a r e p o s s i b l e f o r t h e fi r s t s e q u e n c e ; h o w e v e r , t h e p i e c e s t a r t i n g a t G l n - 1 6 5 m u s t c o n t i n u e t o a t l e a s t G l n - 2 1 7 , m a k i n g i t 5 . 7 k D a . ( T h e r e w o u l d t h e n b e a 4 . 8 k D a o r l e s s p i e c e s t a r t i n g a t G l y - 2 1 8 , b u t w e h a v e n o t r e c o v e r e d i t . ) F o r t h e e d i t i n g s i t e c o n t a i n e d w i t h i n t h i s s e q u e n c e s , L e u - 1 6 1 , t h e r e i s n o e v i d e n c e o f t h e D N A - p r e d i c t e d r e s i d u e , S e r , w h i c h w o u l d b e e x p e c t e d i f a n y p r o t e i n h a d b e e n m a d e f r o m u n e d i t e d m R N A . T h e r e f o r e , i t i s m o s t l i k e l y t h a t t h e 2 1 6 M W T S D E G l n - 1 6 5 : V D N R V V V P A G l n - 1 5 7 : L G Q L R L L E F i g u r e 7 . 9 : A m i n o a c i d s o b t a i n e d i n e a c h s e q u e n c i n g c y c l e o f t h e s m a l l e s t b a n d o n S D S - g e l s o f a V 8 d i g e s t o f s u b u n i t I I . 2 1 7 m a t u r e p r o t e i n i s s y n t h e s i z e d o n l y f r o m t h e c o m p l e t e l y e d i t e d m R N A , a s w a s f o u n d b y G r a v e s e t a l . ( 1 9 9 0 ) f o r A T P a s e s u b u n i t 9 . 7 . 3 . 3 C o m p a r i s o n o f w h e a t o x i d a s e s u b u n i t s t o o t h e r o x i d a s e s 7 . 3 . 3 . 1 I m m u n o b l o t c o m p a r i s o n s C o m p a r i s o n t o p l a n t o x i d a s e s . T h e m o u s e p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s a g a i n s t t h e H P L C - p u r i fi e d w h e a t g e r m n u c l e a r - e n c o d e d s u b u n i t s c r o s s - r e a c t w i t h o t h e r p l a n t m i t o c h o n d r i a t e s t e d , i n c l u d i n g m a i z e , p e a , t o m a t o , a n d p o t a t o ( d a t a n o t s h o w n ) . H o w e v e r , i n e a c h c a s e , o n l y s u b u n i t I V a n d V a , V b , a n d V c c a n b e s e e n ; V * i s o n l y s e e n i n w h e a t g e r m . A m o n o c l o n a l a n t i b o d y a g a i n s t t h e “ m y s t e r y b a n d ” r e a c t s o n l y w i t h w h e a t g e r m a n d s e e d l i n g m i t o c h o n d r i a , n o t t h e c l o s e l y r e l a t e d m a i z e o r a n y o t h e r p l a n t , d e s p i t e t h e f a c t t h a t a s i m i l a r - l o o k i n g b a n d a t t h e s a m e l o c a t i o n i s c l e a r l y e v i d e n t i n g e l s o f t h e m a i z e o x i d a s e . M o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a g a i n s t y e a s t o x i d a s e s u b u n i t I I s t r o n g l y c r o s s - r e a c t w i t h w h e a t a n d b e e f h e a r t o x i d a s e a s w e l l a s a l l p l a n t m i t o c h o n d r i a t e s t e d . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t a l t h o u g h s o m e m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n s m a y n o t b e n o t w e l l - c o n s e r v e d a m o n g t h e p l a n t s ( e . g . t h e “ m y s t e r y b a n d ” ) , t h e s u b u n i t s o f c y t o c h r o m e o x i d a s e a r e i n f a c t w e l l - c o n s e r v e d e v e n a m o n g p l a n t s w h i c h a r e n o t c l o s e l y r e l a t e d . N 0 o t h e r p l a n t w a s f o u n d t o p o s s e s s V * , d e s p i t e t h e v a r i e t y o f p l a n t s a n d d i f f e r e n t t i s s u e s t e s t e d . C o m p a r i s o n t o y e a s t o x i d a s e . S i n c e s u b u n i t I V w a s r e a d i l y l o s t d u r i n g p u r i fi c a t i o n , i t w a s i m p o r t a n t t o d e t e r m i n e w h e t h e r i t w a s a n a u t h e n t i c o x i d a s e s u b u n i t . T h e a v a i l a b i l i t y o f m o n o s p e c i fi c p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s t o y e a s t o r n ' d a s e s u b u n i t I V a l l o w e d u s t o t e s t w h e t h e r i t w a s a r e l a t e d p e p t i d e . N i t r o c e l l u l o s e b l o t s o f y e a s t m i t o c h o n d r i a ( Y ) a n d p u r i fi e d b e e f h e a r t ( B ) a n d w h e a t g e r m ( W ) o x i d a s e s a r e s h o w n i n F i g u r e 7 . 1 0 . 2 1 8 Y W B Y W B F i g u r e 7 . 1 0 : W e s t e r n b l o t a n a l y s i s o f w h e a t g e r m c y t o c h r o m e o x i d a s e . N i t r o c e l l u l o s e b l o t s i n p a n e l s ( a ) a n d ( b ) c o n t a i n l a n e s ( Y ) , y e a s t m i t o c h o n d r i a ; l a n e s ( W ) , w h e a t g e r m o x i d a s e ; a n d l a n e s ( B ) , b e e f h e a r t o x i d a s e . P a n e l ( a ) i s t h e a m i d o b l a c k s t a i n o f t h e n i t r o c e l l u l o s e b l o t , a n d p a n e l ( b ) i s t h e i m m u n o d e t e c t i o n o f s u b u n i t I V o n t h e b l o t u s i n g m o n o s p e c i fi c p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s t o y e a s t o x i d a s e s u b u n i t I V . T h e p o s i t i o n o f s u b u n i t I V i s i n d i c a t e d b y t h e a r r o w s . 2 1 9 P a n e l ( a ) i s t h e a m i d o b l a c k s t a i n o f t h e s e t r a n s f e r s ; m o s t o f t h e s u b u n i t s o f t h e o x i d a s e s a r e v i s i b l e , b u t s u b u n i t s I a n d I I I t r a n s f e r l e s s e f fi c i e n t l y , l e a v i n g a “ h o l e ” i n t h e t r a n s f e r . P a n e l ( b ) s h o w s t h e s a m e s a m p l e s a s i n ( a ) a f t e r i n c u b a t i o n w i t h m o n o s p e c i fi c p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s t o y e a s t o x i d a s e s u b u n i t I V , f o l l o w e d b y s e c o n d a r y a n t i b o d y l a b e l l i n g a n d a l k a l i n e p h o s p h a t a s e c o l o r d e v e l o p m e n t . S u b u n i t I V o f t h e y e a s t o x i d a s e a n d w h e a t g e r m o x i d a s e r e a c t w i t h t h e s e a n t i b o d i e s , b u t t h e p u r i fi e d b e e f h e a r t o x i d a s e d o e s n o t . T h e p o s i t i o n o f s u b u n i t I V , w h i c h i s h i g h e r i n t h e y e a s t t h a n i n t h e b e e f h e a r t o r w h e a t g e r m o x i d a s e s , i s m a r k e d b y t h e a r r o w s . S o m e n o n - s p e c i fi c r e a c t i o n w i t h h i g h e r m o l e c u l a r w e i g h t s p e c i e s i s a l s o s e e n . M o n o s p e c i fi c p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s a g a i n s t y e a s t s u b u n i t s V a , V I , V I I , a n d V I I a d i d n o t c r o s s - r e a c t w i t h t h e w h e a t o x i d a s e b y i m m u n o b l o t o r E L I S A a n a l y s i s . 7 . 3 . 3 . 2 N - t e r m i n a l s e q u e n c e s W e h a v e a t t e m p t e d t o d e t e r m i n e N - t e r m i n a l s e q u e n c e s o f s e v e r a l o f t h e n u c l e a r - e n c o d e d s u b u n i t s . S u b u n i t V a w a s d r i e d a n d r e s u s p e n d e d i n w a t e r a f t e r H P L C p u r i fi c a t i o n , b u t d i d n o t y i e l d a s e q u e n c e . N a k a g a w a e t a l . ( 1 9 8 7 ) a l s o f o u n d t h i s s u b u n i t t o b e b l o c k e d w h e n t h e y c u t i t o u t o f p o l y a c r y l a m i d e g e l s . S e q u e n c i n g o f s e v e r a l o t h e r s u b u n i t s w a s a t t e m p t e d u s i n g p r o t e i n b l o t t e d i n C A P S o n t o P r o b l o t . S u b u n i t V c w a s c u t f r o m a b l o t o f p u r i fi e d o x i d a s e a n d s u c c e s s f u l l y s e q u e n c e d . T h i s s e q u e n c e c o m p a r e d f a v o r a b l y t o t h a t o f t h e s w e e t p o t a t o b y N a k a g a w a e t a l . ( 1 9 8 7 ) w i t h fi v e o r s i x i d e n t i c a l r e s i d u e s o u t o f t e n ( T a b l e 7 . 1 ) . T h e fi r s t u n i n t e r p r e t a b l e r e s i d u e ( # 4 ) c o u l d b e a h i s t i d i n e a s N a k a g a w a e t a l . ( 1 9 8 7 ) f o u n d , b u t t h e s e v e n t h i s n o t . T h e l a c k o f a r e s i d u e i n t h e f o u r t h p o s i t i o n o f o u r s e q u e n c e c o u l d i n d i c a t e t h e p r e s e n c e o f a c y s t e i n e , s i n c e m o d i fi c a t i o n o f t h i s r e s i d u e w a s n o t p e r f o r m e d p r i o r t o s e q u e n c i n g . T h e s e q u e n c e o f s u b u n i t I V w a s a l s o e l t a , c . . o y l N c t l e i a a h t n e i . d a e d w e n a i r l a g r a e e p n t w u a b e u r h s e t w d m B o n o P a r K k d m f n p , a o u a N a e s u r ( e s d ) f r P a i o n a / t D a s ( r s c e e k r t . e a A G P G I N t e d e h . T e n L r c a o s c p e n u t e d e i u w e , e e c m o q e n e s w e e s s r d o o n w w a t t t e d h a n t e a . T , t w e d u s n e n q E a o e e s s i y i l r e r J , h e P t t a d p n a G e m u f o o h h n e N w c t r M s r a V m e V w o n t e o f s r E E r e r e e u f h S f c s b q e c s s V e e n t A V c e L I n n u L u t e q a t V t R d h a u e N i i e i q s t n K n K s u e h b w r u s l e a h f c t o i f t t o n n e u e Q b S T o e w t I u A s . n i t G f n e fi T ) o e e s a d e G K t d n i s w H P r V ( e d m I u o n f e x s t o e m e n y b M l A e s g A g . m s i e R i e l i E o e s l s E l a a c y r u a h d e K K d K e i c c i s e e o s Q T c n c x D o n i e e d u m e q o r e r a S h e c p e h t n r t y A E E e n c l u e a S q e c r e n i a S i t p v n : o e n : : o i p a 1 t . a 7 y c e 2 b d I . s e 7 m c s o : : . n e e u . ) e r T t ) l 7 i e d n b 8 s v l 4 f A s u b 8 9 q E a a r c a 9 b . e e 1 s a 1 e e H T r s T ( y W N V W H E A T : A G . 5 y B D / P T Y S W E E T P O T A T O : A Q Q H M A H L V Y K G P S V B o v i n e V b : A S G 2 2 1 o b t a i n e d f r o m t h e s a m e b l o t s ( T a b l e 7 . 2 ) . T h e h o m o l o g y b e t w e e n w h e a t I V a n d y e a s t I V a p p e a r s t o b e l i m i t e d , a l t h o u g h t h e r e i s a m a t c h o f L y s ( K ) — P r o ( P ) a c r o s s t h e t h r e e s e q u e n c e s a t p o s i t i o n s 4 a n d 5 o f t h e w h e a t s e q u e n c e . T h e n e x t t w o a m i n o a c i d s a r e V a l ( V ) — V a l ( V ) i n t h e y e a s t s e q u e n c e , w h i c h i s s i m i l a r t o A l a ( A ) — A l a ( A ) i n t h e w h e a t s e q u e n c e . S i n c e a n t i b o d i e s t o y e a s t s u b u n i t I V c r o s s - r e a c t w i t h w h e a t , i t m a y b e p o s s i b l e t h a t l a t e r r e g i o n s o f t h e s e q u e n c e s h a r e g r e a t e r h o m o l g y . H o w e v e r , t h e h o m o l o g o u s b e e f h e a r t V b , w h i c h l a c k s a m a j o r N - t e r m i n a l s e g m e n t , d o e s n o t r e a c t w i t h t h e s a m e a n t i b o d y . H P L C - p u r i fi e d V * w a s r u n o n g e l s a n d b l o t t e d , b u t y i e l d e d n o s e q u e n c e . V * w a s c u t f r o m t h e s a m e b l o t s w h i c h s u c c e s s f u l l y y i e l d e d I V a n d V c s e q u e n c e , b u t a g a i n n o s e q u e n c e w a s o b t a i n e d , s u g g e s t i n g n a t u r a l b l o c k i n g . 7 . 4 D i s c u s s i o n a n d f u t u r e p r o s p e c t s T h e a p p a r e n t s u b u n i t c o m p o s i t i o n o f o u r w h e a t g e r m a n d s e e d l i n g o x i d a s e s p u r i fi e d b y a n i o n - e x c h a n g e F P L C e x h i b i t s s o m e d i f f e r e n c e s c o m p a r e d t o o x i d a s e s p u r i fi e d f r o m o t h e r p l a n t s . W e o b t a i n a s t r o n g l y - s t a i n i n g b a n d b e l o w s u b u n i t I I o n S D S - g e l s w h i c h w e c a l l t h e “ m y s t e r y b a n d ” a n d b e l i e v e t o b e a c o n t a m i n a n t o f t h e o x i d a s e p r e p a r a t i o n . M o r e i n t e r e s t i n g l y , i n w h e a t g e r m b u t n o t w h e a t s e e d l i n g , w e r e p r o d u c i b l y o b t a i n a n a d d i t i o n a l b a n d , c a l l e d V * , w h i c h r u n s a b o v e V a , a n d i s s t r o n g l y r e t a i n e d t h r o u g h o u t p u r i fi c a t i o n b y a n i o n - e x c h a n g e a n d g e l fi l t r a t i o n . W e h a v e p o s t u l a t e d t h a t t h e e x p r e s s i o n o f t h i s p e p t i d e m a y b e d e v e l o p m e n t a l l y r e g u l a t e d . I n t h i s c h a p t e r w e h a v e a t t e m p t e d t o p r o v i d e e v i d e n c e f o r o u r h y p o t h e s e s t h a t t h e “ m y s t e r y b a n d ” i s n o t , b u t t h a t V * i s , a t r u e s u b u n i t o f t h e o x i d a s e . W e h a v e b e e n u n a b l e t o u s e n a t i v e g e l e l e c t r o p h o r e s i s o r i m m u n o p r e c i p i t a t i o n f o r t h e p u r p o s e o f d e t e r m i n i n g s u b u n i t c o m p o s i t i o n . H o w e v e r , n e i t h e r p e p t i d e i s r e m o v e d b y g e l fi l t r a t i o n , s o d i u m b r o m i d e w a s h , o r T r i t o n X - 1 0 0 m e m b r a n e - s p l i t t i n g . T h i s i s n o t n e c e s s a r i l y s u r p r i s i n g , s i n c e m a n y p e p t i d e s w i t h h y d r o p h o b i c p r o p e r t i e s a r e n o t e a s i l y s e p a r a t e d o n c e t h e y h a v e a s s o c i a t e d . H o w e v e r , t h e f a c t t h a t t h e “ m y s t e r y b a n d ” s h o w s a d i f f e r e n t e l u t i o n p r o fi l e t h a n o x i d a s e s u g g e s t s t h a t i t i s n o t a t r u e s u b u n i t . . T h e u n u s u a l b e h a v i o r o f t h e “ m y s t e r y b a n d ” i n g e l s s u g g e s t s t h a t i t i s t h e s a m e p e p t i d e t h a t N a k a g a w a e t a l . ( 1 9 8 7 ) d e s i g n a t e s a s s u b u n i t I I I . T h e m o b i l i t y o f t h i s p e p t i d e i s d e p e n d e n t o n t h e a c r y l a m i d e c o n c e n t r a t i o n : a t 1 8 % i t r u n s b e l o w s u b u n i t I I , a t 1 4 % i t r u n s a b o v e ( d a t a n o t s h o w n ) . T h i s b e h a v i o r w a s d e s c r i b e d b y N a k a g a w a e t a l . ( 1 9 8 7 ) f o r t h e i r s u b u n i t I I I . M o r e o v e r , t h e y r e p o r t t h a t t h e i r s u b u n i t I V b i n d s D C C D , w h i l e t h e i r s u b u n i t s I a n d I V a g g r e g a t e u p o n h e a t i n g , p r o p e r t i e s o f e u k a r y o t i c s u b u n i t I I I . T h e r e f o r e , t h e s e r e s u l t s s t r o n g l y s u g g e s t t h a t N a k a g a w a e t a l . ( 1 9 8 7 ) h a s i n c o r r e c t l y a s s i g n e d s u b u n i t I V a s I I I , a n d i t i s l i k e l y t h a t t h e i r s u b u n i t I I I i s t h e “ m y s t e r y b a n d ” . I f s o , t h e y d o n o t r e t a i n a s u b u n i t I V ; h o w e v e r , w e h a v e a l s o o b s e r v e d i t s l a b i l i t y i n t h e c a s e o f t h e m a i z e o x i d a s e p u r i fi c a t i o n . B e c a u s e o u r m o n o c l o n a l a n t i b o d y a g a i n s t t h e “ m y s t e r y b a n d ” d o e s n o t c r o s s - r e a c t w i t h a n y o t h e r s p e c i e s , i n c l u d i n g m a i z e , w e h a v e n o t b e e n a b l e t o u s e i m m u n o l o g i c a l t e c h n i q u e s t o i d e n t i f y i t . T h i s l a c k o f c r o s s - r e a c t i v i t y m a y i n d i c a t e t h a t e v e n a n . N - t e r m i n a l s e q u e n c e w o u l d n o t n e c e s s a r i l y b e u s e f u l i n i d e n t i f y i n g i t . O u r o n l y c l u e a t t h i s t i m e i s i t s v i s u a l s i m i l a r i t y t o t h e 3 0 k D a B - h y d r o x y b u t y r a t e d e h y d r o g e n a s e : t h i s e n z y m e f o r m s a b a n d i n g e l s t h a t i s u n u s u a l l y “ w a v y ” ( N e l s o n e t a l . , 1 9 8 4 ) j u s t l i k e w e s e e f o r t h e “ m y s t e r y b a n d ” . F u r t h e r m o r e , B - h y d r o x y b u t y r a t e d e h y d r o g e n a s e h a s b o t h h y d r o p h o b i c a n d h y d r o p h i l i c b e h a v i o r ; i t r e q u i r e s d e t e r g e n t t o b e s o l u b i l i z e d f r o m m e m b r a n e s b u t n o t f o r f u r t h e r p u r i fi c a t i o n . S i m i l a r l y , t h e “ m y s t e r y b a n d ” i s i n i t i a l l y s o l u b i l i z e d b y d e t e r g e n t , b u t t h e r e a f t e r h a s m o r e h y d r o p h i l i c b e h a v i o r , s u c h a s e a s e o f t r a n s f e r t o b l o t s a n d e a r l y e l u t i o n i n r e v e r s e p h a s e H P L C . I m m u n o b l o t a n a l y s i s u s i n g a n t i b o d i e s a g a i n s t t h e w h e a t g e r m o x i d a s e s m a l l p e p t i d e s s h o w s t h a t t h e a b s e n c e o f V * f r o m w h e a t s e e d l i n g o x i d a s e i s n o t t h e r e s u l t o f l o s s d u r i n g p u r i fi c a t i o n . W e m u s t s t i l l c o n s i d e r t h e p o s s i b i l i t y t h a t i t s p r e s e n c e i n w h e a t g e r m m a y b e a n a r t i f a c t o f t h e d i f f e r e n c e s i n m i t o c h o n d r i a l p r e p a r a t i o n . T h e w h e a t g e r m m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s r e q u i r e m u c h h i g h e r s p e e d s t o p e l l e t , p r e s u m a b l y b e c a u s e t h e y a r e m e m b r a n e v e s i c l e s n o t w h o l e m i t o c h o n d r i a . T h e r e f o r e , t h i s p r e p a r a t i o n m a y c o n t a i n m o r e m i c r o s o m a l c o n t a m i n a t i o n , i n t r o d u c i n g c o - e l u t i n g p e p t i d e s n o t p r e s e n t i n t h e w h e a t s e e d l i n g m i t o c h o n d r i a . I n t h e i m m u n o b l o t , t h e f a i n t r e a c t i o n i n w h e a t s e e d l i n g m i t o c h o n d r i a o f a p e p t i d e a t a s l i g h t l y h i g h e r m o l e c u l a r w e i g h t t h a n t h e w h e a t g e r m V * s u g g e s t s t h a t a n a l t e r n a t i v e s u b u n i t m a y i n f a c t b e p r e s e n t . F r e q u e n t l y , b a n d s i n t h i s r e g i o n a r e s e e n i n w h e a t s e e d l i n g o x i d a s e ; h o w e v e r , t h e s e c o u l d b e c o n t a m i n a n t s f r o m t h e N A D H d e h y d r o g e n a s e w h i c h e l u t e s j u s t p r i o r t o t h e o x i d a s e . T h e s e c o n t a m i n a n t s c o u l d b e m o r e c o n c e n t r a t e d i n w h e a t s e e d l i n g o x i d a s e b e c a u s e i t i s l e s s p u r e . I t n e e d s t o b e p o i n t e d o u t t h a t t h e H P L C - p u r i fi e d s u b u n i t s u s e d t o g e n e r a t e a n t i b o d i e s a r e n o t f r e e o f a l l c o n t a m i n a n t s ; N A D H d e h y r o g e n a s e p e p t i d e s c o u l d b e p r e s e n t ( l i k e l y w h a t i s s e e n a b o v e s u b u n i t V * i n l a n e s 1 - 3 o f F i g u r e 7 . 1 ) a n d r e a c t ( f a i n t l y ) o n l y w i t h w h e a t s e e d l i n g b e c a u s e o f a s l i g h t c o n c e n t r a t i o n d i fi ‘ e r e n c e . I n a n y c a s e , o u r i n a b i l i t y t o o b t a i n N - t e r m i n a l s e q u e n c e o f V * 2 2 4 h i n d e r s o u r a b i l i t y t o d e t e r m i n e h o m o l o g y t o e x i s t i n g p r o t e i n s , w h i c h c o u l d c l a r i f y i t s i d e n t i t y . W e a r e c u r r e n t l y a t t e m p t i n g t o p r o d u c e p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s t o V * w h i c h h a s b e e n p u r i fi e d b y p r e p a r a t i v e g e l e l e c t r o p h o r e s i s . T h e a b i l i t y o f t h e s e a n t i b o d i e s t o i m m u n o p r e c i p i t a t e t h e e n t i r e c o m p l e x fi o m a s o l u t i o n o f s o l u b i l i z e d m e m b r a n e s w o u l d p r o v i d e s t r o n g e r e v i d e n c e o f V * b e i n g a s u b u n i t . M o r e o v e r , w e w o u l d b e a b l e t o e x p l o r e w h e t h e r V * i s d e v e l o p m e n t a l l y e x p r e s s e d , b y t e s t i n g r e a c t i v i t y a t d i f f e r e n t d e v e l o p m e n t a l s t a g e s . T h e a n t i b o d i e s w o u l d p r o v i d e a t o o l f o r c l o n i n g ; t h e d e v e l o p m e n t a l r e g u l a t i o n o f i t s e x p r e s s i o n c o u l d t h e n b e s t u d i e d . A t l e a s t s o m e o f t h e n u c l e a r - e n c o d e d s u b u n i t s i n p l a n t o x i d a s e s a r e r e l a t e d t o t h o s e i n o t h e r e u k a r y o t i c o x i d a s e s . I m m u n o b l o t a n a l y s i s a n d N - t e r m i n a l s e q u e n c i n g s h o w s t h a t s u b u n i t I V f r o m w h e a t o x i d a s e i s r e l a t e d t o t h a t f r o m y e a s t o x i d a s e , w h i l e t h e c D N A s e q u e n c e o f s w e e t p o t a t o V c e x h i b i t s s e q u e n c e s i m i l a r i t y t o b e e f h e a r t o x i d a s e s u b u n i t V I I I . T h e r e f o r e , i t s e e m s l i k e l y t h a t a s o t h e r p l a n t s u b u n i t s a r e s e q u e n c e d , m o r e s i m i l a r i t i e s w i l l b e f o u n d . H o m o l o g i e s i n t h e n u c l e a r - e n c o d e d s u b u n i t s b e t w e e n p l a n t s a n d o t h e r e u k a r y o t e s w o u l d s e e m t o s u p p o r t t h e i d e a t h a t o n l y o n e e n d o s y m b i o t i c e v e n t t o o k p l a c e , g i v i n g r i s e t o t h e m i t o c h o n d r i a o f b o t h p l a n t s a n d o t h e r e u k a r y o t e s . T h i s i s i n c o n t r a s t t o t h e t h e o r y o f G r a y , w h i c h s u g g e s t s a s e p a r a t e e n d o s y m b i o t i c e v e n t l e a d i n g t o p l a n t m i t o c h o n d r i a , b a s e d o n s i m i l a r i t i e s o f r i b o s o m a l p r o t e i n s e q u e n c e . H o w e v e r , i f b a c t e r i a l e n z y m e s s t a r t e d o u t m o r e c o m p l e x , a n d e v o l v e d t o b e s i m p l e r a s t h e y a r e t o d a y , t h e n t h e t h e o r y o f G r a y m i g h t s t i l l a p p l y , d e s p i t e t h i s e v i d e n c e . W e h a v e b e e n u n s u c c e s s f u l i n i s o l a t i n g t h e p e p t i d e s n e c e s s a r y t o c o n fi r m t h e p r e s e n c e o f c y s t e i n e a t r e s i d u e 2 2 8 ; h o w e v e r , m u c h e v i d e n c e i n d i c a t e s t h a t i t i s i n d e e d p r e s e n t . G r a v e s e t a l . ( 1 9 9 0 ) h a v e s h o w n t h a t t h e a m i n o a c i d s e q u e n c e o f A T P a s e s u b u n i t 9 r e fl e c t s c o m p l e t e e d i t i n g o f i t s R N A t e m p l a t e . W h i l e w e h a v e n o t u n e q u i v o c a l l y s h o w n t h a t t h e w h e a t s u b u n i t I I a m i n o a c i d s e q u e n c e a l s o i s t h e r e s u l t o f c o m p l e t e l y e d i t e d R N A , t h e a b s e n c e o f t h e r e s i d u e p r e d i c t e d f r o m t h e u n e d i t e d s e q u e n c e s u g g e s t s t h a t , i n t h e c a s e s o f L e u - 1 6 1 a t l e a s t , t h a t p r o t e i n i s s y n t h e s i z e d o n l y f r o m c o m p l e t e l y e d i t e d R N A . O n t h i s b a s i s , a n d o n t h e b a s i s o f s p e c t r a l e v i d e n c e p r e s e n t e d i n t h e n e x t c h a p t e r s u p p o r t i n g t h e p r e s e n c e o f a n o r m a l C u A s i t e , w e c o n c l u d e t h a t r e s i d u e 2 2 8 i s i n d e e d a c y s t e i n e i n w h e a t o x i d a s e . C h a p t e r 8 - S p e c t r a l c h a r a c t e r i z a fi o n o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m w h e a t 8 . 1 I n t r o d u c t i o n S e v e r a l s t u d i e s i n w h o l e m i t o c h o n d r i a h a v e s u g g e s t e d t h a t t h e p l a n t o x i d a s e h a s u n i q u e s p e c t r a l p r o p e r t i e s . T h e a b a n d o f p l a n t o x i d a s e s i s b l u e - s h i f t e d f r o m 6 0 4 n m i n b e e f h e a r t t o 6 0 2 n m ( L a n c e a n d B o n n e r , 1 9 6 8 ) . F u r t h e r m o r e , l o w t e m p e r a t u r e d i f f e r e n c e s p e c t r a o f h e m e a s h o w a s p l i t p e a k , w i t h a m a m ' m u m a t 4 3 8 n m a n d a s h o u l d e r a t 4 4 5 n m ( B e n d a l l a n d B o n n e r , 1 9 6 6 ; L a n c e a n d B o n n e r , 1 9 6 8 ) . T h e S o r e t a b s o r b a n c e o f h e m e A g r o u p s i n g e n e r a l i s e x p e c t e d t o h a v e s o m e s p l i t t i n g d u e t o t h e i n n a t e a s y m m e t r y o f t h e h e m e s u b s t i t u e n t s ( f o r m y l a n d v i n y l o n o p p o s i t e c o r n e r s ) , b u t u s u a l l y t h e s e t w o c o n t r i b u t i o n s a r e s o c l o s e t o g e t h e r t h a t t h e y a r e n o t e a s i l y r e s o l v e d , e s p e c i a l l y a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e a c c e n t u a t i o n o f t h i s s p l i t s u g g e s t s d i f f e r e n c e s i n t h e h e m e a e n v i r o n m e n t o f p l a n t o x i d a s e r e l a t i v e t o m a m m a l i a n o x i d a s e . ' T h e s e p r e v i o u s s t u d i e s o f t h e s p e c t r a l c h a r a c t e r i s t i c s o f p l a n t c y t o c h r o m e o r d d a s e s w e r e h a m p e r e d b y t h e p r e s e n c e o f o t h e r c y t o c h r o m e s i n w h o l e m i t o c h o n d r i a . B e c a u s e o f t h e r e l a t i v e l y l a r g e a m o u n t s o f p u r i fi e d w h e a t o x i d a s e n o w a v a i l a b l e , w e h a v e b e e n a b l e t o e x a m i n e i t s s p e c t r a l p r o p e r t i e s w i t h o u t t h i s d i f fi c u l t y . A d d i t i o n a l l y , w e h a v e e x t e n d e d o u r i n v e s t i g a t i o n o f t h e s p e c t r a l p r o p e r t i e s o f t h e w h e a t o x i d a s e t o i n c l u d e C u A b e c a u s e o f t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e C u A s i t e i s d i s r u p t e d b y a n a m i n o a c i d s u b s t i t u t i o n a t o n e o f t h e c o p p e r l i g a n d s ( B o n e n e t a l . , 1 9 8 4 ) . 2 2 7 I f t h e r e a r e c h a n g e s i n t h e s t r u c t u r e o r e n v i r o n m e n t o f t h e h e m e a o r C u A s i t e s o f p l a n t o x i d a s e s , t h e f u n c t i o n o f t h e o x i d a s e m i g h t b e a f f e c t e d . I n f a c t , s o m e m o d e l s f o r c o u p l i n g o f p r o t o n p u m p i n g t o e l e c t r o n t r a n s f e r a r e b a s e d o n t h e p r e m i s e t h a t p r o t o n p u m p i n g a c t i v i t y i s r e l a t e d t o s p e c i fi c s t r u c t u r a l f e a t u r e s o f C u » , o r h e m e a . G e l l e s e t a l . ( 1 9 8 6 ) h a v e d e s c r i b e d a ' m e c h a n i s m w h e r e b y s h u t t l i n g o f p r o t o n s i s p r o m o t e d b y r e d o x - l i n k e d c h a n g e s i n t h e c o o r d i n a t i o n o f C u A . I n s u p p o r t o f t h i s m o d e l , N i l s s o n e t a l . ( 1 9 8 8 ) h a v e o b s e r v e d t h a t p e r t u r b a t i o n o f t h e C u A s i t e l e a d s t o a m a r k e d d e c r e a s e i n t h e p r o t o n - p u m p i n g a c t i v i t y o f c y t o c h r o m e o x i d a s e . A n o t h e r m o d e l i s b a s e d o n s p e c t r o s c o p i c o b s e r v a t i o n s t h a t i n d i c a t e t h a t t h e f o r m y l g r o u p o f h e m e a i s h y d r o g e n - b o n d e d t o a p r o t e i n r e s i d u e ( B a b c o c k a n d C a l l a h a n , 1 9 8 3 ) . T h e o b s e r v e d e n e r g y d i f f e r e n t i a l b e t w e e n t h e h y d r o g e n b o n d t o t h e f o r m y l g r o u p i n t h e o x i d i z e d a n d r e d u c e d f o r m s o f h e m e a i s p o s t u l a t e d t o b e a s o u r c e o f e n e r g y f o r p u m p i n g p r o t o n s a c r o s s t h e m e m b r a n e . A m o r e r e c e n t m o d e l s u g g e s t s t h a t t h e h e m e a 3 - C u 3 s i t e p r o v i d e s t h e m e c h a n i s t i c c o u p l i n g b e t w e e n e l e c t r o n t r a n s f e r a n d p r o t o n t r a n s l o c a t i o n i n c y t o c h r o m e o x i d a s e ( W i k s t r o m , 1 9 8 9 ) . T h i s m o d e l g a i n s s u p p o r t f r o m t h e r e p o r t t h a t t h e b a c t e r i a l c y t o c h r o m e b o a c t s a s a p r o t o n p u m p ( P u u s t i n e n e t a l . , 1 9 8 9 ) , d e s p i t e t h e a b s e n c e o f C u A ( C h e p u r i a n d G e n n i s , 1 9 9 0 ) . A l s o , t h e b a n d o h e m e s d o n o t h a v e t h e p e r i p h e r a l f o r m y l g r o u p t h a t i s t h o u g h t t o b e t h e c r i t i c a l f e a t u r e o f a h e m e a - m e d i a t e d p r o t o n p u m p ( P u u s t i n e n a n d W i k s t r o m , 1 9 9 1 ) . H o w e v e r , i t c a n b e a r g u e d t h a t t h e p r o t o n p u m p i n g m e c h a n i s m n e e d n o t b e t h e s a m e i n t h e t w o e n z y m e s s i n c e b o i s a c c e p t i n g e l e c t r o n s f r o m u b i q u i n o l r a t h e r t h a n c y t o c h r o m e c . A c o m p a r a t i v e a p p r o a c h h a s b e e n u s e d t o l i n k s t r u c t u r e t o f u n c t i o n i n c y t o c h r o m e o x i d a s e . ' W e h a v e i s o l a t e d c y t o c h r o m e o x i d a s e f r o m m a i z e a n d w h e a t g e r m a n d d e t e r m i n e d t h e s p e c t r o s c o p i c p r o p e r t i e s o f t h e C u A a n d h e m e a s i t e s . B y c o m p a r i n g o u r r e s u l t s w i t h t h o s e f o r t h e b e e f h e a r t e n z y m e , a n d m o r e r e c e n t l y f r o m t h e s i m p l e r e n z y m e f r o m t h e b a c t e r i a R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s , i t i s p o s s i b l e t o p i n p o i n t t h o s e s t r u c t u r a l c h a r a c t e r i s t i c s t h a t a r e c o m m o n t o t h e C u A a n d h e m e 0 s i t e s o f a l l c y t o c h r o m e o x i d a s e s . T h e s e c o m p a r i s o n s , i n t u r n , m a y h e l p u s d e t e r m i n e i f t h e s e s i t e s c o r r e l a t e w i t h a b i l i t y t o p u m p p r o t o n s . T h e fi r s t t a r g e t o f o u r i n v e s t i g a t i o n w a s C u A . . A b r o a d a b s o r p t i o n b a n d a t 8 3 0 n m a n d a c h a r a c t e r i s t i c g = 2 s i g n a l i n t h e E P R s p e c t r u m a r e n o r m a l f e a t u r e s o f o x i d i z e d C u A i n b e e f h e a r t o x i d a s e . I f t h e s e s p e c t r a l p r o p e r t i e s a r e u n c h a n g e d i n w h e a t o x i d a s e , i t w o u l d i n d i c a t e t h a t t h e p r o t e i n l i g a n d s o f C u A a r e t h e s a m e a s i n o t h e r o x i d a s e s , i n s t e a d o f a l t e r e d a s s u g g e s t e d b y D N A s e q u e n c e i n f o r m a t i o n ( B o n e n e t a l . , 1 9 8 4 ) . T h e e n v i r o n m e n t s o f h e m e s a a n d a 3 c a n b e i n v e s t i g a t e d b y b o t h v i s i b l e a n d r e s o n a n c e R a m a n ( R R ) s p e c t r o s c o p i e s . T h e s i m i l a r i t i e s a n d d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e p l a n t a n d m a m m a l i a n s y s t e m s a r e d i s c u s s e d i n l i g h t o f t h e p o s s i b l e i n v o l v e m e n t o f h e m e a i n p r o t o n p u m p i n g . 8 . 2 M a t e r i a l s a n d m e t h o d s 8 . 2 . 1 P r e p a r a t i o n o f c y t o c h r o m e o x i d a s e s B e e f h e a r t c y t o c h r o m e o x i d a s e w a s i s o l a t e d b y u s i n g a m o d i fi e d H a r t z e l l - B e i n e r t p r o t o c o l ( C e n t e n o , 1 9 8 7 ) . W h e a t g e r m c y t o c h r o m e o x i d a s e w a s p r e p a r e d a c c o r d i n g t o t h e p r o c e d u r e o u t l i n e d i n c h a p t e r 6 . 8 . 2 . 2 S p e c t r a l m e t h o d s E P R s p e c t r a o f a i r - o x i d i z e d o x i d a s e w e r e r e c o r d e d a t X - b a n d w i t h a B r u k e r E R 2 0 0 D w i t h 1 m W m i c r o w a v e p o w e r a n d 1 0 G m o d u l a t i o n a m p l i t u d e . S a m p l e s w e r e k e p t a t 1 0 K b y u s i n g a n O x f o r d E S E - 9 l i q u i d h e l i u m c r y o s t a t . V i s i b l e a b s o r p t i o n s p e c t r a w e r e o b t a i n e d a t r o o m t e m p e r a t u r e w i t h a P e r k i n - E l m e r L a m b d a 6 s p e c t r o p h o t o m e t e r . D i f f e r e n c e a n d s e c o n d d e r i v a t i v e s p e c t r a w e r e c a l c u l a t e d b y t h e P e r k i n - E l m e r U V D a t a M a n a g e r c o m p u t e r s o f t w a r e . S a m p l e s o f c y t o c h r o m e o x i d a s e w e r e a i r - o x i d i z e d u n l e s s c o m p l e t e o x i d a t i o n b y p o t a s s i u m f e r r i c y a n i d e i s i n d i c a t e d . F u l l y o x i d i z e d e n z y m e w a s s e p a r a t e d f r o m f e r r i c y a n i d e o n a G - 5 0 c o l u m n e q u i l i b r a t e d i n 5 % s u c r o s e , 2 0 m M K H z P O 4 , p H 7 . 5 , a n d 0 . 5 % l a u r y l m a l t o s i d e . F o r c y a n i d e b i n d i n g , 5 m M K C N w a s i n c u b a t e d w i t h t h e f u l l y o x i d i z e d e n z y m e o n i c e f o r 6 - 1 2 h o u r s . T h e m i x e d v a l e n c e f o r m ( r e d u c e d h e m e a , o x i d i z e d h e m e 0 3 ) w a s g e n e r a t e d b y r e d u c t i o n o f t h e C N - b o u n d e n z y m e w i t h a s c o r b a t e / I ‘ M P D ( 5 m M / l m M ) . T h e f u l l y r e d u c e d f o r m w a s g e n e r a t e d f r o m t h e a i r - o x i d i z e d e n z y m e w i t h s o d i u m d i t h i o n i t e . T o b i n d C O , p u r e C O g a s ( 1 m L ) w a s s l o w l y b u b b l e d t h r o u g h d i t h i o n i t e - r e d u c e d o x i d a s e o v e r 5 m i n u t e s a n d t h e s p e c t r a t a k e n i m m e d i a t e l y . U n l e s s o t h e r w i s e n o t e d , s a m p l e s f o r r e s o n a n c e R a m a n s p e c t r o s c o p y w e r e t y p i c a l l y 2 5 - 7 0 W e n z y m e i n a b u f f e r s y s t e m t h a t c o n s i s t s o f 1 0 0 m M K H 2 P O 4 ( p H 7 . 5 ) , 0 . 5 M K C l , 5 % s u c r o s e a n d 4 m M l a u r y l m a l t o s i d e . R e d u c t i o n o f c y t o c h r o m e o x i d a s e w a s a c h i e v e d b y a d d i t i o n o f e x c e s s s o d i u m d i t h i o n i t e u n d e r a n a e r o b i c c o n d i t i o n s . E x c i t a t i o n i n t o t h e S o r e t b a n d s o f h e m e s a a n d ( 1 3 w a s a c h i e v e d b y u s i n g e i t h e r a C o h e r e n t I N N O V A - 9 0 K K r + l a s e r ( 4 0 6 . 7 n m ) o r a L i c o n i x 4 2 4 0 N H e - C d l a s e r ( 4 4 1 . 6 n m ) . V i s i b l e b a n d e x c i t a t i o n a t 6 0 2 n m w a s 2 3 0 o b t a i n e d w i t h a S p e c t r a P h y s i c s M o d e l 3 7 5 d y e l a s e r , w i t h R h o d a m i n e R 6 G a s t h e d y e , p u m p e d b y a S p e c t r a P h y s i c s M o d e l 1 6 4 A r + l a s e r . T h e f u l l y o x i d i z e d s a m p l e s w e r e c o n t a i n e d i n a q u a r t z s p i n n i n g c e l l t h a t w a s o p e n t o t h e a t m o s p h e r e . T h e s e c o n d i t i o n s , c o m b i n e d w i t h l o w l a s e r p o w e r s ( 5 - 1 0 m W ) p r e v e n t e d t h e p h o t o r e d u c t i o n o f t h e e n z y m e . T h e f u l l y r e d u c e d a n d m i x e d - v a l e n c e s a m p l e s w e r e c o n t a i n e d i n 0 . 2 c m q u a r t z c u v e t t e s a d a p t e d f o r a n a e r o b i c w o r k . R a m a n s c a t t e r i n g w a s c o l l e c t e d i n a 9 0 ° g e o m e t r y a n d d i s p e r s e d i n a S p e x 1 4 0 1 s p e c t r o m e t e r . T h e d e t e c t o r w a s a t h e r m o e l e c t r i c a l l y - c o o l e d p h o t o m u l t i p l i e r t u b e ( R C A 3 4 0 3 1 A ) o p e r a t e d i n t h e p h o t o n c o u n t i n g m o d e . D a t a a c q u i s i t i o n a n d s i g n a l a v e r a g i n g w e r e a c c o m p l i s h e d w i t h a D E C L S I l l c o m p u t e r . S p e c t r a l r e s o l u t i o n w a s 5 - 6 c m ' l . T h e t e m p e r a t u r e o f t h e s a m p l e s w a s k e p t b e t w e e n - 5 ° C a n d 4 ° C b y fl o w i n g c o l d n i t r o g e n g a s a r o u n d t h e s a m p l e c e l l . 0 2 c o n s u m p t i o n m e a s u r e m e n t s s h o w e d t h a t p r o l o n g e d e x p o s u r e t o t h e l a s e r b e a m d e c r e a s e d t h e a c t i v i t y o f w h e a t g e r m c y t o c h r o m e o x i d a s e o n l y b y 1 0 — 2 5 % . N o c h a n g e s i n t h e a b s o r p t i o n s p e c t r u m o f t h e e n z y m e w e r e d e t e c t e d a f t e r . t h e R a m a n e x p e r i m e n t . 8 . 3 R e s u l t s 8 . 3 . 1 E P R s p e c t r u m o f w h e a t c y t o c h r o m e o x i d a s e T h e E P R s p e c t r a o f t h e p u r i fi e d w h e a t g e r m a n d m a i z e o x i d a s e s a r e s h o w n i n F i g u r e 8 . 1 . T h e g = 2 s i g n a l s d u e t o C u A a r e v e r y s i m i l a r a n d s h o w t h e s m a l l c o p p e r n u c l e a r h y p e r fi n e c o u p l i n g t y p i c a l o f o t h e r c y t o c h r o m e o x i d a s e s . T h e g r z s i g n a l a t 3 a n d t h e g y a t 2 . 2 9 a r e n o r m a l f o r t h e l o w - s p i n i r o n o f c y t o c h r o m e a . T h e w e a k s i g n a l a t g = 4 . 3 i n d i c a t e s v e r y l o w l e v e l s o f c o n t a m i n a t i n g m e t a l s , s u c h a s n o n - i n t e g r a l i r o n , a n d s i n c e t h e r e a r e n o Z 3 1 F i g u r e 8 . 1 : E P R s p e c t r a o f p u r i fi e d m a i z e ( 6 0 p M , u p p e r t r a c e ) a n d w h e a t g e r m ( 6 4 M , l o w e r t r a c e ) c y t o c h r o m e c o x i d a s e i n F P L C b u fi ' e r ( d e s c r i b e d i n t h e l e g e n d o f F i g . 6 . 3 ) w i t h 0 . 5 M K C l . S p e c t r a w e r e r u n a t 1 0 K a s d e s c r i b e d i n t h e s e c t i o n 8 . 2 . 2 . ) a n d w h i z ? P L C b . » C l . S p a ? 6 . 0 g - v a l u e 4 . 0 3 . 0 1 6 0 0 2 6 0 0 F i e l d , G a u s s F i g u r e 8 . 1 3 5 0 0 4 6 0 0 2 3 3 f u r t h e r m a j o r s i g n a l s , c y t o c h r o m e s a 3 a n d C u } ; a r e E P R - s i l e n t i n t h e r e s t i n g e n z y m e . T h u s , t h e E P R s p e c t r a d e m o n s t r a t e b o t h t h e s i m i l a r i t y o f t h e w h e a t g e r m o x i d a s e t o o t h e r o x i d a s e s a s w e l l a s t h e p u r i t y a n d i n t e g r i t y o f t h e e n z y m e . 8 . 3 . 2 V i s i b l e a b s o r p t i o n s p e c t r a T h e b r o a d a b s o r p t i o n b a n d a t 8 3 0 n m d u e t o o x i d i z e d C u A i s s h o w n i n F i g u r e 8 . 2 . T h i s b a n d a p p e a r s s i m i l a r t o t h e C u A s i g n a l i n b e e f h e a r t o x i d a s e ( n o t s h o w n ) , f u r t h e r s u p p o r t i n g t h e E P R e v i d e n c e t h a t t h e e n v i r o n m e n t o f C u A i s n o t a l t e r e d i n w h e a t o x i d a s e . T h e c o m p l e t e v i s i b l e s p e c t r a o f a i r - o x i d i z e d a n d d i t h i o n i t e - r e d u c e d w h e a t o x i d a s e w e r e p r e s e n t e d i n c h a p t e r 6 ( F i g u r e 6 . 4 ) a n d a r e s i m i l a r t o t h o s e o f p u r i fi e d m a i z e o x i d a s e ( d e P a u l a e t a l . , 1 9 9 0 ) . T h e s p e c t r a s h o w t h a t t h e S o r e t a n d a b a n d s o f t h e r e d u c e d e n z y m e s , w h i c h o c c u r a t 4 4 1 - 4 4 2 a n d 6 0 2 n m , r e s p e c t i v e l y , a r e b l u e - s h i f t e d r e l a t i v e t o t h e e q u i v a l e n t b a n d s i n t h e b e e f h e a r t e n z y m e , w h i c h o c c u r a t 4 4 3 a n d 6 0 4 n m , r e s p e c t i v e l y . T h e v i s i b l e a b s o r p t i o n b a n d s o f t h e r e d u c e d p l a n t e n z y m e s a r e s t i l l , h o w e v e r , c o n s i d e r a b l y r e d - s h i f t e d f r o m t h e a b s o r p t i o n b a n d s o f s i x - c o o r d i n a t e h e m e a 2 + m o d e l c o m p o u n d s i n p r o t i c s o l v e n t s ( B a b c o c k a n d C a l l a h a n , 1 9 8 3 ) . A n i m p o r t a n t f a c t o r i n p r o d u c i n g t h i s s h i f t i s p r o p o s e d t o b e t h e e x i s t e n c e o f a h y d r o g e n b o n d b e t w e e n t h e p r o t e i n a n d t h e h e m e a f o r m y l . T h e g r e a t e r s h i f t i n b e e f h e a r t o x i d a s e s u g g e s t s a s t r o n g e r h y d r o g e n b o n d i n b e e f h e a r t t h a n i n w h e a t o x i d a s e ; h o w e v e r , o t h e r c h a n g e s i n t h e i m m e d i a t e p r o t e i n e n v i r o n m e n t m a y b e i n v o l v e d . T h e p l a n t o x i d a s e i s m o s t l y o x i d i z e d a f t e r p u r i fi c a t i o n ; h o w e v e r , w h i l e t h e a b a n d o f o x i d i z e d b e e f h e a r t o x i d a s e i s a t 5 9 8 n m , t h i s p e a k a p p e a r s a t 6 0 1 - 6 0 2 n m i n “ a i r - o x i d i z e d ” w h e a t o x i d a s e ( F i g u r e 8 . 3 ) . T h e F i g u r e 8 . 2 : 8 3 0 n m a b s o r p t i o n b a n d o f o x i d i z e d ( u p p e r ) a n d r e d u c e d ( l o w e r ) w h e a t c y t o c h r o m e o x i d a s e . O x i d a s e w a s 7 0 M i n F P L C b u fl ‘ e r ( d e s c r i b e d i n t h e l e g e n d o f F i g u r e 6 . 3 ) . 0 0 9 0 5 8 0 0 8 0 5 7 0 1 0 0 . 0 7 a o u e q r o s q v F i g u r e 8 . 2 W a v e l e n g t h , n m F i g u r e 8 . 3 : C o m p a r i s o n o f a b a n d a b s o r b a n c e i n a i r - o x i d i z e d ( - - - ) a n d f e r r i c y a n i d e - o x i d i z e d ( — ) w h e a t g e r m o x i d a s e . T h e v e r t i c a l l i n e i s c e n t e r e d o n t h e a b s o r p t i o n m a x i m u m o f t h e f e r r i c y a n i d e r e d u c e d a t 5 9 8 n m , b l u e - s h i f t e d f r o m t h e a b s o r p t i o n m a x i m u m o f t h e a i r - o x i d i z e d a t 6 0 2 n m , i n d i c a t i n g p a r t i a l r e d u c t i o n o f t h e a i r - o x i d i z e d f o r m . O x i d a s e w a s 1 0 . 8 u M i n F P L C b u f f e r ( d e s c r i b e d i n t h e l e g e n d o f F i g u r e 6 . 3 ) . 0 5 6 0 0 6 m n , h t g n e l e v 0 a 5 W 5 0 0 5 5 0 1 1 . . 0 0 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I l I I I I ; I I I I I I I - 0 d O p o q I C L g . . C : - c l 1 - u I - a t D d " N " L , O . C D - - I - a | - u I - d b C I d I - a h u b a I - u - - ' I - I I - d p d - c l h d r u p « I I - q I - d I I I I I I I I J I I I I I I I I I I I I I I I I I I I O O O a o u e q i o s q v F i g u r e 8 . 3 0 . 0 0 2 3 8 i n t e n s i t y a n d p o s i t i o n o f t h e 6 0 2 n m p e a k ( w h i c h i s d u e m o s t l y t o h e m e a ) s u g g e s t s p a r t i a l r e d u c t i o n ( ~ 2 0 % ) o f h e m e a i n t h e p u r i fi e d e n z y m e . C o m p l e t e o x i d a t i o n w i t h p o t a s s i u m f e r r i c y a n i d e s h i f t s t h e m a x i m u m t o 5 9 8 - 5 9 9 n m ( F i g u r e 8 . 3 ) . T h e i n t e n s i t y o f t h e 8 3 0 n m C u A b a n d , h o w e v e r , d o e s n o t i n c r e a s e u p o n f e r r i c y a n i d e o x i d a t i o n , i n d i c a t i n g t h a t i t i s f u l l y o x i d i z e d e v e n t h o u g h h e m e a i s p a r t l y r e d u c e d . H e m e a d o e s n o t b e c o m e r e - r e d u c e d a f t e r t h e f e r r i c y a n i d e i s r e m o v e d b y g e l fi l t r a t i o n . W h i l e t h e 6 0 2 n m a p e a k o f t h e r e d u c e d e n z y m e i s 8 0 % d u e t o h e m e a , t h e 4 4 2 n m S o r e t p e a k i s c o m p o s e d o f r o u g h l y e q u a l c o n t r i b u t i o n s o f a a n d a 3 . T h e s p e c t r u m o f h e m e a a l o n e c a n b e o b t a i n e d b y s u b t r a c t i n g t h e s p e c t r u m o f C N - b o u n d f u l l y o x i d i z e d o x i d a s e f r o m t h e s p e c t r u m o f t h e t h e C N - b o u n d s a m p l e r e d u c e d w i t h a s c o r b a t e / T M P D . S i n c e c y a n i d e r e m a i n s b o u n d t o o x i d i z e d 0 3 u n d e r b o t h t h e s e c o n d i t i o n s , t h e c o n t r i b u t i o n o f a 3 c a n c e l s o u t u p o n s u b t r a c t i o n , l e a v i n g a r e d u c e d m i n u s o x i d i z e d s p e c t r u m o f h e m e a a l o n e . W h e n t h i s p r o c e d u r e i s d o n e w i t h b e e f h e a r t o x i d a s e , w e o b s e r v e t h e h e m e a p e a k a t 4 4 6 n m ( F i g u r e 8 . 4 A ) , i n g e n e r a l a g r e e m e n t w i t h V a n n e s t e ( 1 9 6 6 ) . I n t h e p u r i fi e d w h e a t o x i d a s e , h e m e a i s p a r t i a l l y r e d u c e d a n d b e c o m e s m o r e r e d u c e d d u r i n g i n c u b a t i o n w i t h c y a n i d e . T h u s , s u b t r a c t i n g i t s s p e c t r u m f r o m a fi r l l y r e d u c e d o x i d a s e s p e c t r u m y i e l d s o n l y a p o r t i o n o f t h e t o t a l h e m e a c o n t e n t . I n a n a t t e m p t t o o v e r c o m e t h i s p r o b l e m , t h e e n z y m e w a s o x i d i z e d w i t h f e r r i c y a n i d e a n d t h e n s e p a r a t e d f r o m i t , y i e l d i n g a s t a b l e f u l l y o x i d i z e d e n z y m e . H o w e v e r , w h e n t h i s f u l l y o x i d i z e d e n z y m e i s i n c u b a t e d w i t h c y a n i d e , h e m e a i s a g a i n r e d u c e d . T h e 5 9 8 n m p e a k s h i f t s t o 6 0 2 n m a n d i n c r e a s e s d r a m a t i c a l l y i n i n t e n s i t y , i n d i c a t i n g a h e m e a r e d u c t i o n l e v e l o f n e a r 7 0 % ( F i g u r e 8 . 5 ) . T h u s , o n l y a b o u t 3 0 % o f t h e h e m e a i s o b s e r v e d i n t h e d i f f e r e n c e s p e c t r u m . U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , w e c a n F i g u r e 8 . 4 : D i f f e r e n c e s p e c t r u m o f h e m e a i n b e e f h e a r t ( A ) a n d w h e a t g e r m ( B ) o x i d a s e s . S p e c t r a w e r e o b t a i n e d b y t h e c y a n i d e b i n d i n g p r o c e d u r e d e s c r i b e d i n s e c t i o n 8 . 3 . 2 u s i n g 5 . 6 u M b e e f h e a r t o x i d a s e a n d 7 . 0 u M w h e a t g e r m o x i d a s e i n F P L C b u fl ‘ e r ( d e s c r i b e d i n t h e l e g e n d o f F i g u r e 6 . 3 ) . T h e S o r e t b a n d i n t h e w h e a t e n z y m e i s s p l i t , w i t h m a x i m a a t 4 4 0 a n d 4 4 4 r u n , w h i l e t h e s i n g l e b e e f h e a r t o x i d a s e m a x i m u m o c c u r s a t 4 4 6 n m . a o u e q i o s q v I I I j L I I I I I I a o u I l I I e I I q r o s q v I I I I I I I I I I J I I j I ' I I I I I j 7 ' 3 W m w u ‘ u r fi u a I a A e M 0 9 9 0 0 9 0 9 9 0 0 9 0 9 v 0 0 v 0 9 8 I I I I ' I I I I I I I I I I I I T I I I I I I I I I r I 3 0 9 V V V U O V V l l l L l l L l l I l l l l l l l l l ' l l l l l l l l L u m ‘ u r fi u a w n e M 0 9 9 0 0 9 0 9 9 0 0 9 0 9 7 0 0 1 7 0 9 8 fi I I I I I I I r ' I I I I I I I I I r fi I I I ' I I 9 0 9 9 9 ? I L I L I L I L I I I I I I I L I I I I I I I I I I I I I 2 4 1 F i g u r e 8 . 5 : E f f e c t o f c y a n i d e b i n d i n g o n t h e a b s o r p t i o n s p e c t r u m o f w h e a t c y t o c h r o m e o x i d a s e . T h e a b s o r p t i o n m a x i m a o f f u l l y o x i d i z e d o x i d a s e ( p r e p a r e d b y f e r r i c y a n i d e o x i d a t i o n a n d r e m o v a l a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 8 . 2 . 2 ) w a s a t 4 2 0 n m ( — - — ) , w h i l e t h e C N - b o u n d o x i d i z e d a b s o r b e d a t 4 3 2 n m ( — ) a n d t h e a s c o r b a t e T M P D - r e d u c e d C N - b o u n d a b s o r b e d a t 4 3 7 n m ( - - - - ) . O x i d a s e w a s 7 . 0 u M i n F P L C b u f f e r ( d e s c r i b e d i n t h e l e g e n d o f F i g u r e 6 . 3 ) . ' 0 5 6 0 5 5 m n , h t g n e l e v a 0 W 5 4 0 5 3 L J J I I J J I I I I I I I I J I J I I I I I I I I I I I ‘ D V O O a o u e q r o s q v F i g u r e 8 . 5 O O 2 4 3 o b s e r v e a p a r t i a l s p l i t t i n g o f h e m e a , w i t h m a x i m a a t 4 4 0 a n d 4 4 4 n m ( F i g u r e 8 . 4 B ) . S p e c t r a l p e a k s d u e t o p a r t i a l l y o v e r l a p p i n g c o n t r i b u t i o n s c a n s o m e t i m e s b e d e c o n v o l u t e d b y s e c o n d d e r i v a t i v e a n a l y s i s . S h e r m a n e t a l . ( 1 9 9 1 ) h a v e r e c e n t l y u s e d t h i s t e c h n i q u e t o r e s o l v e t h e h e m e c o n t r i b u t i o n s t o t h e s p e c t r u m o f C N o r C O - b o u n d c y t o c h r o m e o x i d a s e . T h e s e c o n d d e r i v a t i v e o f t h e w h e a t h e m e a d i f f e r e n c e s p e c t r u m i n t h e p r e s e n c e o f C N r e v e a l s t w o c o m p o n e n t s w i t h m a x i m a a t 4 3 8 a n d 4 4 6 n m ( F i g u r e 8 . 6 B ) , s i m i l a r t o v a l u e s o b t a i n e d a t l o w t e m p e r a t u r e i n p l a n t m i t o c h o n d r i a . I n c o n t r a s t , t h e s e c o n d d e r i v a t i v e o f t h e b e e f h e a r t o x i d a s e h e m e a d i f f e r e n c e s p e c t r u m u n d e r t h e s a m e c o n d i t i o n s s h o w s m a x i m a a t 4 4 3 a n d 4 5 1 ( F i g u r e 8 . 6 B ) , c o n s i d e r a b l y s h i f t e d f r o m t h e w h e a t v a l u e s . T h i s s t r o n g l y s u g g e s t s a d i f f e r e n c e i n h e m e a b e t w e e n w h e a t a n d b e e f h e a r t o x i d a s e e v e n t h o u g h n o q u a n t i t a t i v e c o n c l u s i o n s c a n b e d r a w n w i t h r e g a r d t o t h e r e l a t i v e a m o u n t s o f t h e a b s o r b i n g s p e c i e s . A n a l y s i s o f t h e f u l l y r e d u c e d C O - b o u n d e n z y m e a l s o p r o v i d e s a d d i t i o n a l e v i d e n c e f o r t h e s p e c t r a l s h i f t o f h e m e a a n d p o s s i b l y a 3 . B i n d i n g o f C O s h i f t s t h e S o r e t p e a k f r o m 4 4 2 t o 4 3 4 n m ( F i g u r e 8 . 7 ) , c o m p a r e d t o 4 3 2 i n b e e f h e a r t . S i n c e h e m e a i s r e d u c e d b o t h b e f o r e a n d a f t e r C O b i n d i n g , t h e d i f f e r e n c e i n t h e w a v e l e n g t h m a x i m a o f t h e C O b o u n d f o r m m a y b e d u e t o a d i f f e r e n c e i n m g . H o w e v e r , t h e s e c o n d d e r i v a t i v e o f t h e C O - b o u n d s p e c t r a i n d i c a t e s t h a t t h e C O - 0 3 c o m p l e x a c t u a l l y a b s o r b s a t 4 2 9 n m i n b o t h e n z y m e s ( F i g u r e 8 . 8 A ) . P e a k s a t c o m p o n e n t s a t 4 2 9 n m d u e t o C O - b o u n d a 3 , a n d a t 4 3 8 a n d 4 4 8 n m a r e d u e t o r e d u c e d h e m e a i n t h e w h e a t o x i d a s e , w h i l e t h e s e h e m e a c o m p o n e n t s o c c u r a t 4 4 2 a n d 4 5 1 n m i n b e e f h e a r t o x i d a s e ( S h e r m a n e t a l . , 1 9 9 1 , F i g u r e 8 . 8 B ) . T h e s e c o m p n e n t s a r e s i m i l a r t o t h o s e s e e n f o r h e m e a i n t h e C N - s p e c t r a , s t r o n g l y s u g g e s t i n g a c h a n g e i n F i g u r e 8 . 6 : S e c o n d d e r i v a t i v e a n a l y s i s o f h e m e a d i f f e r e n c e s p e c t r a i n b e e f h e a r t ( A ) a n d w h e a t g e r m ( B ) o r d d a s e . T h e m a n ' m a a t 4 3 8 a n d 4 4 6 n m i n w h e a t g e r m o x i d a s e a n d a t 4 4 3 a n d 4 5 1 i n b e e f h e a r t o x i d a s e r e p r e s e n t t h e s p l i t t i n g o f t h e h e m e a a b s o r p t i o n d u e t o t h e a s y m m e t r y o f t h e h e m e r i n g s u b s t i t u e n t s . O x i d a s e s w e r e a s d e s c r i b e d i n t h e l e g e n d s o f F i g u r e s 8 . 4 . e c n a b r o s b A I I I ' I e c I n a I b I I I r o I I s I b A I I I I I I I I L I I I j I F l I T T I I I I ' I I I I I I I I I I l I T I I c l q 4 ’ 4 5 1 " , 4 4 3 r I I 4 I I I I I I I I I 4 L . I I I I I I I I I 3 7 5 4 0 0 4 2 5 4 5 0 4 7 5 5 0 0 W a v e l e n g t h , n m I I I I I I I I I I 1 I I I I I I I I I I I I I U 4 4 6 4 3 8 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I l I I I 3 7 5 4 0 0 4 2 5 4 5 0 4 7 5 5 0 0 W a v e l e n g t h , n m F i g u r e 8 . 6 ; ; F i g u r e 8 . 7 : E f f e c t o f C O b i n d i n g o n t h e a b s o r p t i o n s p e c t r a o f d i t h i o n i t e - r e d u c e d w h e a t g e r m c y t o c h r o m e o x i d a s e . C O b i n d i n g w a s p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 8 . 2 . 2 . T h e S o r e t p e a k s h i f t s f r o m 4 4 2 n m i n t h e r e d u c e d t o 4 3 4 n m i n t h e C O - b o u n d f o r m . O x i d a s e w a s 8 . 0 u M i n F P L C b u f f e r ( d e s c r i b e d i n t h e l e g e n d o f F i g u r e 6 . 3 ) . 0 5 6 0 5 5 m n , h t g n e l e v a 0 W 5 4 0 5 3 2 4 7 I I I I I I I I I I I I I j I I I I I ' I I I I I I j I J I I I I I I I I I I I I l I I I I I I I L ] I I I I 4 I 6 ' ) N 1 - O O O O O a o u e q i o s q v F i g u r e 8 . 7 , ‘ u w ' u - V i a - L 9 . 1 F i g u r e 8 . 8 : S e c o n d d e r i v a t i v e a n a l y s i s o f a b s o r p t i o n s p e c t r a o f C O - b o u n d c y t o c h r o m e o x i d a s e f r o m w h e a t g e r m ( A ) a n d b e e f h e a r t ( B ) . T h e m a x i m a n e a r 4 2 9 n m i n b o t h c a s e s i s d u e t o t h e C O - b o u n d h e m e 0 3 , w h i l e t h e o t h e r t w o m a x i m a ( 4 3 8 a n d 4 4 8 n m i n w h e a t g e r m , 4 4 3 a n d 4 5 1 i n b e e f h e a r t o x i d a s e ) a r e d u e t o r e d u c e d h e m e 0 . W h e a t o x i d a s e w a s a s d e s c r i b e d i n F i g u r e 8 . 7 ; b e e f h e a r t o x i d a s e w a s 5 . 4 M i n F P L C b u fl ‘ e r ( d e s c r i b e d i n t h e l e g e n d o f F i g u r e 6 . 3 ) . T I I I I I I l e c n a b r o s b A I I I I I ' I I I I ' I I I I ' I I T I I I I I e I c n a b r o s I I l I b I A I I I I I I I k I I I I I I I I I I I d I I I I I I I J I I I I I I I I I C I I I I I I I I I I I I I I 3 7 5 4 0 0 4 2 5 4 5 0 4 7 5 W a v e l e n g t h , n m I j I I I I I I I I I I I I I 1 I I I I I 4 4 3 4 5 1 _ 4 2 9 I I I I I I l I I I L I l I 3 7 5 4 0 0 4 2 5 4 5 0 4 7 5 W a v e l e n g t h , n m F i g u r e 8 . 8 r ' - - - — r - 1 2 5 0 t h e e n v i r o n m e n t o f h e m e a r e l a t i v e t o b e e f h e a r t o x i d a s e . I n t e r e s t i n g l y , C O a p p e a r s t o b i n d s t a b l y i n w h e a t a n d i s n o t r e m o v e d b y b u b b l i n g w i t h a i r , i n c o n t r a s t t o t h e r e p o r t o f N a i k e t a l . ( 1 9 9 1 ) u s i n g w h o l e p l a n t t i s s u e . 8 . 3 . 3 R e s o n a n c e R a m a n s p e c t r o s o o p y H e m e s a a n d a 3 o f w h e a t g e r m c y t o c h r o m e c o x i d a s e w e r e i n v e s t i g a t e d b y r e s o n a n c e R a m a n s p e c t r o s c o p y . B y c o m p a r i n g o u r r e s u l t s t o t h o s e f r o m t h e w e l l - c h a r a c t e r i z e d b e e f h e a r t e n z y m e ( s e e B a b c o c k , 1 9 8 8 , f o r a c o m p r e h e n s i v e r e v i e w o f r e s o n a n c e R a m a n s t u d i e s o f c y t o c h r o m e o x i d a s e ) , w e w e r e a b l e t o i n f e r s t r u c t u r a l f e a t u r e s o f t h e c h r o m o p h o r e s i n t h e p l a n t e n z y m e s . I t h a s a l r e a d y b e e n s h o w n t h a t a l m o s t a l l v i b r a t i o n a l b a n d s o f t h e b e e f h e a r t c y t o c h r o m e o x i d a s e h a v e d i r e c t a n a l o g s i n t h e m a i z e s y s t e m ( D u t c h e t a l . , 1 9 8 7 ) . T h e w h e a t ( F i g u r e 8 . 9 , 8 . 1 0 ) a n d m a i z e s p e c t r a a r e v e r y s i m i l a r , s u g g e s t i n g t h a t t h e h e m e s i n t h e m a i z e a n d w h e a t g e r m e n z y m e s h a v e s i m i l a r e n v i r o n m e n t s . T h e r e f o r e , w e d e c i d e d t o f o c u s o n t h e p l a n t e n z y m e f r o m w h e a t g e r m f o r c o m p a r i s o n w i t h t h e m a m m a l i a n e n z y m e , s i n c e w e c o u l d p r o d u c e g r e a t e r q u a n t i t i e s o f e n z y m e i n p u r e f o r m a n d t h e r e f o r e o b t a i n s p e c t r a w i t h l e s s n o i s e a n d g r e a t e r r e s o l u t i o n . T h e s t r a t e g y f o r t h e a s s i g n m e n t o f t h e r e s o n a n c e R a m a n s p e c t r a o f w h e a t g e r m c y t o c h r o m e o x i d a s e t a k e s a d v a n t a g e o f t h e s e l e c t i v e e n h a n c e m e n t o f h e m e a a n d h e m e a 3 m o d e s a s a f u n c t i o n o f r e d o x s t a t e a n d e x c i t a t i o n w a v e l e n g t h s ( r e v i e w e d b y B a b c o c k , 1 9 8 8 ) . T h e i n t e n s i t y o f t h e w e a k R a m a n e f f e c t i s e n h a n c e d b y a b s o r p t i o n o f l i g h t ; t h e r e f o r e , m o d e s a s s o c i a t e d w i t h e i t h e r t h e r e d u c e d o r o x i d i z e d s t a t e w i l l b e e n h a n c e d w h e n t h e e x c i t a t i o n w a v e l e n g t h m a t c h e s t h e a b s o r p t i o n w a v e l e n g t h m a x i m a f o r t h a t s t a t e . T h u s , f u l l y o x i d i z e d s a m p l e s e x c i t e d a t 4 0 6 . 7 n m s h o w v i b r a t i o n s 2 5 1 F i g u r e 8 . 9 : R e s o n a n c e R a m a n s p e c t r a o f w h e a t g e r m c y t o c h r o m e o x i d a s e : ( a ) o x i d i z e d e n z y m e , e x c i t e d a t 4 0 6 . 7 n m ( 1 0 m W ) ; ( b ) d i t h i o n i t e - r e d u c e d e n z y m e , e x c i t e d a t 4 0 6 . 7 n m ( 5 m W ) ; ( c ) d i t h i o n i t e - r e d u c e d e n z y m e , e x c i t e d a t 4 4 1 . 6 n m ( 1 0 m W ) . F u r t h e r e x p e r i m e n t a l d e t a i l s a r e d e s c r i b e d i n s e c t i o n 4 . 2 . 2 . O f p a r t i c u l a r i n t e r e s t a r e t h e 1 6 5 7 c m ' 1 m o d e i n ( a ) d u e t o t h e o x i d i z e d f o r m y l ( a b s e n t i n t h e r e d u c e d ) a n d t h e a p p e a r a n c e o f 1 6 1 0 c h i n ( c ) d u e t o t h e r e d u c e d f o r m y l . T h e 1 6 2 7 c m ' 1 m o d e i n ( c ) c o r r e s p o n d s t o t h e v i n y l g r o u p i n t h e r e d u c e d h e m e a . y t i s n e t n i n a m a R 5 6 6 1 u e w i ‘ a ‘ m ' 1 1 1 1 8 * m e ( 1 . ( a ) o x i d i z e d 4 0 6 . 7 n m e x c i t a t i o n ( b ) r e d u c e d 4 0 6 . 7 n m e x c i t a t i o n ( 0 ) r e d u c e d 4 4 1 . 6 n m e x c i t a t i o n R a m a n s h i f t ( c m _ 1 ) F i g u r e 8 . 9 F i g u r e 8 . 1 0 : R e s o n a n c e R a m a n s p e c t r a o f m i x e d - v a l e n c e , C N ‘ - t r e a t e d . w h e a t g e r m c y t o c h r o m e o x i d a s e e x c i t e d a t : ( a ) 4 4 1 . 6 n m ( 1 0 m W ) ; a n d ( b ) 6 0 2 n m ( 1 0 0 m W ) . F u r t h e r e x p e r i m e n t a l d e t a i l s a r e d e s c r i b e d i n s e c t i o n 8 . 2 . 2 . T h e p r e s e n c e o f b o t h t h e 1 6 1 0 a n d 1 6 2 8 c m ‘ 1 m o d e s c o n fi r m s t h a t t h e y a r e d u e t o h e m e a , n o t 0 3 f o r m y l a n d v i n y l g r o u p s r e s p e c t i v e l y . T h e e n h a n c e m e n t o f t h e 1 6 1 8 c m " 1 b a n d w i t h v i s i b l e ( 6 0 2 n m ) e x c i t a t i o n o n l y i n d i c a t e s t h a t i t i s c o m p o s e d o f a C — C s t r e t c h i n g v i b r a t i o n o f t h e p o r p h y r i n c o r e ( v 1 0 m o d e , s e e B a b c o c k , 1 9 8 8 ) . ( O ( I ) t o r i _ ( I ) ( \ l ( O ( a ) 4 4 1 . 6 n m e x c i t a t i o n E : ' 5 7 ) C . 8 2 c . 2 g E ' a . _ 8 . 5 3 5 2 5 ‘ ; o o 2 5 . ' — ( b ) 6 0 2 n m e x c i t a t i o n r I 1 I 1 I 1 . I n I l I 1 I n . 1 5 0 0 1 6 2 5 1 7 5 0 - R a m a n s h i f t ( c m 7 ' 1 ) F i g u r e 8 . 1 0 2 5 5 d u e t o o x i d i z e d h e m e s a a n d 0 3 . L i k e w i s e , f u l l y r e d u c e d s a m p l e s p r o b e d a t 4 0 6 . 7 a n d i n p a r t i c u l a r 4 4 1 . 6 n m b r i n g o u t v i b r a t i o n s f r o m r e d u c e d h e m e s a a n d 0 3 . T h e C N ' - t r e a t e d , m i x e d - v a l e n c e s a m p l e s e x i s t a s a 2 + ( a 3 3 + C N ' ) a n d , c o n s e q u e n t l y , w h e n p r o b e d a t 4 4 1 . 6 a n d 6 0 2 n m , a l l o w f o r t h e o b s e r v a t i o n o f r e d u c e d h e m e 0 m o d e s o n l y , s i n c e r e d u c e d h e m e a b u t n o t o x i d i z e d 0 3 a b s o r b s l i g h t s i g n i fi c a n t l y a t t h o s e w a v e l e n g t h s . W e c a n a s s i g n t h e 1 6 6 5 c m ' 1 m o d e t o a h e m e a 3 v i b r a t i o n b e c a u s e i t i s e n h a n c e d b y S o r e t e x c i t a t i o n o f t h e f u l l y r e d u c e d e n z y m e ( F i g u r e 8 . 9 b , c ) b u t n o t b y S o r e t o r v i s i b l e e x c i t a t i o n o f t h e m i x e d - v a l e n c e e n z y m e ( F i g u r e 8 . 1 0 a , b ) . A c o m p a r i s o n w i t h t h e r e s o n a n c e R a m a n s p e c t r a o f m a m m a l i a n c y t o c h r o m e o x i d a s e f u r t h e r i n d i c a t e s t h a t t h e 1 6 6 5 c h m o d e i s c o m p r i s e d m o s t l y o f a C = C s t r e t c h i n g v i b r a t i o n o f t h e f o r m y l g r o u p o f h e m e 0 3 2 + . S i n c e t h e 1 6 1 0 a n d 1 6 2 8 c m ' 1 m o d e s a p p e a r i n b o t h t h e r e d u c e d a n d m i x e d - v a l e n c e ( F i g u r e s 8 . 9 c , 8 . 1 0 a ) , t h e y m u s t b e d u e t o 0 2 + a n d n o t 0 3 2 + . T h e s e v i b r a t i o n s c a n b e a s s i g n e d b y a n a l o g y t o t h e R R s p e c t r a o f m a m m a l i a n c y t o c h r o m e o x i d a s e a s a r i s i n g f r o m a v i n y l C = C s t r e t c h ( 1 6 2 8 c m ' l ) a n d a f o r m y l C = O s t r e t c h ( 1 6 1 0 c m ' l ) . T h e l a t t e r v i b r a t e s a t t h e s a m e f r e q u e n c y a s i n b e e f h e a r t , b u t s h o w s w e a k e r e n h a n c e m e n t . T h e r e m a i n i n g a s s i g n m e n t s o f o u r R R s p e c t r a a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 8 . 1 , w h e r e d a t a f r o m w h e a t g e r m a n d b e e f h e a r t c y t o c h r o m e o x i d a s e s a r e c o m p a r e d . I n t h e t a b l e , v d e n o t e s a s t r e t c h i n g v i b r a t i o n ; C = C a n d C = C r e f e r t o t h e f o r m y l a n d v i n y l g r o u p s , r e s p e c t i v e l y . T h e n u m b e r e d v i b r a t i o n s a r e c o m p o s e d m o s t l y o f C — C s t r e t c h e s o f t h e p o r p h y r i n r i n g ( s e e K i t a g a w a a n d O s a k i ( 1 9 8 7 ) f o r a r e v i e w ) . M o d e s ( ) 2 , v 3 , U 1 0 , a n d 0 1 9 v a r y w i t h t h e s i z e o f t h e p o r p h y r i n c e n t r a l c o r e . M o d e ( ) 4 r e fl e c t s t h e e x t e n t o f o x i d a t i o n o f t h e F e i o n . T h e n u m b e r i n g s y s t e m a d o p t e d h e r e i s t h a t o f A b e ( 1 9 8 6 ) . O f p a r t i c u l a r n o t e , a s d i s c u s s e d b e l o w , a r e t h e d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e p l a n t . I — - l ' " . T a b l e 8 . 1 : A s s i g n m e n t o f h i g h - f r e q u e n c y v i b r a t i o n s ( c m ‘ l ) i n p l a n t c y t o c h r o m e o x i d a s e a n d c o m p a r i s o n s w i t h t h e m a m m a l i a n e n z y m e . R e d u c e d O x i d i z e d W h e a t G e r m B e e f H e a r t W h e a t G e r m B e e f H e a r t M o d e 8 2 + 3 2 + 8 2 4 » a 2 + 3 3 + 8 3 + 8 3 + 8 3 + ” 0 . 0 1 6 1 0 1 6 6 5 1 6 1 0 1 6 6 5 1 6 5 7 1 6 7 7 1 6 5 0 1 6 7 6 ” C = C 1 6 2 7 1 6 2 7 1 6 2 3 1 6 2 3 0 1 0 1 6 1 8 n o “ 1 6 1 4 1 & 7 1 6 3 8 n . 0 . 1 6 4 1 1 6 1 5 0 2 1 5 8 7 n . 0 1 5 8 5 1 5 7 9 1 5 8 6 1 5 7 6 1 5 9 0 1 5 7 2 0 1 9 1 5 8 6 1 5 8 6 U 3 8 0 ) 1 5 6 7 1 5 6 7 0 3 8 ( 2 ) 1 5 4 1 1 5 4 6 1 : 1 1 1 5 1 8 1 5 1 9 v 3 1 4 9 2 n . o . 1 4 9 1 1 4 6 4 1 5 0 3 1 4 7 7 1 5 0 6 1 4 7 8 v , 1 3 5 6 1 3 6 1 1 3 5 4 1 3 5 6 1 3 7 1 1 3 7 1 1 3 7 3 1 3 7 3 “ n . o . = n o t o b s e r v e d d u e t o o v e r l a p p i n g b a n d s . 2 5 7 a n d m a m m a l i a n e n z y m e s w i t h r e s p e c t t o t h e f r e q u e n c y o f t h e o x i d i z e d h e m e a f o r m y l v i b r a t i o n ( 1 6 5 7 c m “ 1 v e r s u s 1 6 5 0 c m ' 1 r e s p e c t i v e l y ) a n d t h e r e d u c e d h e m e a v i n y l v i b r a t i o n ( 1 6 2 7 c m “ 1 v e r s u s 1 6 2 3 c m ' 1 r e s p e c t i v e l y ) . 8 . 4 D i s c u s s i o n 8 . 4 . 1 C u A e n v i r o n m e n t T h e s i m i l a r i t y o f t h e g = 2 E P R s i g n a l a n d t h e 8 3 0 _ n m a b s o r p t i o n b a n d o f w h e a t a n d m a i z e t o b e e f h e a r t c y t o c h r o m e o z d d a s e s s u g g e s t s t h a t C u A h a s t h e s a m e l i g a n d s i n b o t h e n z y m e s . T h u s i t i s u n l i k e l y t h a t a n a m i n o a c i d s u b s t i t u t i o n h a s t a k e n p l a c e a t t h e C u ) ; s i t e . T h i s r e s u l t s u p p o r t s t h e e v i d e n c e t h a t m R N A e d i t i n g h a s o c c u r r e d a t c o d o n 2 2 8 o f s u b u n i t I I t o r e s t o r e t h e c o n s e r v e d c y s t e i n e a t t h i s s i t e ( C o v e l l o a n d G r a y , 1 9 8 9 ) . A m i n o a c i d s e q u e n c e i n f o r m a t i o n f r o m w h e a t o x i d a s e s u b u n i t I I i s n e c e s s a r y t o c o n fi r m t h i s o b s e r v a t i o n ; h o w e v e r , a s d i s c u s s e d i n c h a p t e r 7 , t h e c o n fi r m a t i o n o f e d i t i n g a t o t h e r s i t e s m a k e s i t h i g h l y l i k e l y t h a t t h i s s i t e i s e d i t e d . S i n c e t h e E P R a n d v i s i b l e s p e c t r a i n d i c a t e a n o r m a l C u A , w h e a t o x i d a s e d o e s n o t c h a l l e n g e t h e t h e o r y o f G e l l e s e t a l . ( 1 9 8 6 ) r e g a r d i n g a c e n t r a l r o l e o f t h i s m e t a l i n p r o t o n p u m p i n g . W e h a v e b e e n u n a b l e t o d e m o n s t r a t e t h e e n z y m e ’ s p r o t o n p u m p i n g c a p a b i l i t i e s , b u t t h e n o r m a l A D P / O r a t i o s m e a s u r e d f o r i n t a c t w h e a t s e e d l i n g m i t o c h o n d r i a s u g g e s t t h a t i t d o e s p u m p p r o t o n s . F u r t h e r m o r e , p u r i fi e d e n z y m e r e c o n s t i t u t e d i n t o a s o l e c t i n v e s i c l e s h a s g o o d r e s p i r a t o r y c o n t r o l r a t i o s ( 5 — 6 , d a t a n o t s h o w n ) . 8 . 4 2 V i s i b l e a b s o r p t i o n s p e c t r a T h e b l u e - s h i f t o b s e r v e d i n t h e o n a n d S o r e t p e a k s o f p l a n t o x i d a s e s h a s p r e v i o u s l y b e e n a t t r i b u t e d t o h e m e 0 , s i n c e l o w t e m p e r a t u r e d i f f e r e n c e s p e c t r a o f h e m e a w e r e d i f f e r e n t f r o m b e e f h e a r t , w h i l e h e m e 0 3 w a s t h e s a m e ( L a n c e a n d B o n n e r , 1 9 6 8 ) . W e a l s o o b s e r v e d i fi ' e r e n c e s i n a b s o r p t i o n d u e t o h e m e a i n s p e c t r a w i t h O N o r C O b o u n d t o h e m e 0 3 . A l t h o u g h w e w e r e u n a b l e t o p e r f o r m o u r s p e c t r a a t l o w t e m p e r a t u r e , w e o b s e r v e a s m a l l s p l i t t i n g o f t h e S o r e t h e m e a d i f f e r e n c e p e a k , w i t h c o n t r i b u t i o n s o f t h e t w o c o m p o n e n t s a t s i m i l a r w a v e l e n g t h s t o t h o s e o b s e r v e d i n w h o l e m i t o c h o n d r i a ( L a n c e a n d B o n n e r , 1 9 6 8 ) . T h e r e l i a b i l i t y o f o u r r e s u l t w o u l d b e g r e a t e r i f t h e e x p e r i m e n t w e r e i n f a c t d o n e a t l o w t e m p e r a t u r e , a n d i f t h e p r o b l e m o f t h e r e d u c t i o n o f h e m e a u p o n C N b i n d i n g w e r e s o l v e d . T h i s p r o b l e m i s a p a r t i c u l a r l y d i f fi c u l t o n e b e c a u s e a f t e r f e r r i c y a n i d e r e d u c t i o n , t h e o r i g i n a l s o u r c e o f e l e c t r o n s i n t h e p r o t e i n s h o u l d h a v e b e e n o x i d i z e d a s w e l l . S i n c e b e e f h e a r t o x i d a s e d i d n o t s h o w t h i s C N — i n d u c e d r e d u c t i o n o f h e m e a u n d e r t h e s a m e c o n d i t i o n s , i t s e e m s u n l i k e l y t h a t t h e K C N i t s e l f i s t h e e l e c t r o n s o u r c e ; h o w e v e r , i t c o u l d b e t h e s o u r c e o f e l e c t r o n s f o r r e d u c t i o n o f a c o n t a m i n a n t o f t h e p l a n t e n z y m e t h a t i s n o t p r e s e n t i n t h e b e e f h e a r t e n z y m e . A l t e r n a t i v e l y , i f t h e r e d o x p o t e n t i a l o f t h e w h e a t h e m e a w e r e h i g h e n o u g h , e l e c t r o n s m i g h t b e e x t r a c t e d f r o m t h e b u f f e r , b u t p r e v i o u s r e p o r t s h a v e s h o w n t h e r e d o x p o t e n t i a l o f h e m e a t o b e s l i g h t l y l o w e r i n p l a n t m i t o c h o n d r i a ( B u t t o n a n d S t o r e y , 1 9 7 1 ) . P o s s i b l y t h e b i n d i n g o f C N t o ( 1 3 c a u s e s s o m e c h a n g e i n h e m e a t h a t a l t e r s i t s r e d o x p o t e n t i a l . F u r t h e r s t u d i e s w i l l b e r e q u i r e d t o e v a l u a t e t h e s e p o s s i b i l i t i e s ; n e v e r t h e l e s s , t h i s u n u s u a l b e h a v i o r o f h e m e a i n p l a n t o x i d a s e u n d o u b t e d l y r e fl e c t s s o m e u n i q u e a s p e c t s o f t h e h e m e 0 e n v i r o n m e n t . $ 9 T h e e n v i r o n m e n t o f h e m e a 3 m a y a l s o b e a l t e r e d i n t h e p l a n t o x i d a s e , a s s u g g e s t e d b y C O - s p e c t r a , b u t w e d o n o t y e t h a v e d i r e c t e v i d e n c e f o r t h i s . 8 . 4 . 3 R e s o n a n c e R a m a n s p e c t r a T w o m a i n d i f f e r e n c e s a r e o b s e r v e d b e t w e e n t h e R R s p e c t r a o f b e e f h e a r t a n d w h e a t o x i d a s e . S o m e v i b r a t i o n a l m o d e s m a y b e m o r e s t r o n g l y e n h a n c e d i n o n e e n z y m e , f o r i n s t a n c e t h e 1 6 1 0 c m ; 1 f o r m y l m o d e i n b e e f h e a r t o x i d a s e . O t h e r s m o d e s s h i f t f r e q u e n c y , s u c h a s t h e v i n y l m o d e o f t h e w h e a t e n z y m e . H o w e v e r , i n t e r p r e t a t i o n o f f r e q u e n c y a n d i n t e n s i t y c h a n g e s i n R s p e c t r a r e m a i n s o m e w h a t s p e c u l a t i v e . 8 . 4 . 3 . 1 V i n y l m o d e s T h e v i b r a t i o n a l b a n d s a r i s i n g f r o m t h e C = C s t r e t c h o f t h e v i n y l g r o u p s o f b o t h h e m e a a n d ( : 3 o c c u r a t h i g h e r f r e q u e n c y i n t h e p l a n t e n z y m e s ( 1 6 2 7 c m - 1 ) t h a n i n t h e m a m m a l i a n e n z y m e ( 1 6 2 3 c m ' l ) . T h i s m a y b e d u e t o t h e v i n y l g r o u p a n d t h e p o r p h y r i n n o t b e i n g c o p l a n a r , r e d u c i n g c o n j u g a t i o n b e t w e e n t h e t w o 1 : s y s t e m s ( G e r s o n d e e t a l . , 1 9 8 9 ) . T h e v i n y l g r o u p m a y b e r o t a t e d m o r e o u t o f t h e p o r p h y r i n p l a n e i n t h e p l a n t h e m e 0 t h a n i n m a m m a l i a n h e m e 0 . 8 . 4 . 3 . 1 F o r m y l m o d e s T h e v i b r a t i o n a l m o d e o f t h e f o r m y l g r o u p o f h e m e a i s a l t e r e d i n b o t h f r e q u e n c y a n d i n t e n s i t y i n t h e p l a n t e n z y m e . T h e f r e q u e n c y o f t h e 0 : 0 v i b r a t i o n r e fl e c t s i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e h e m e a f o r m y l g r o u p a n d i t s e n v i r o n m e n t . T h e i n t e r a c t i o n m a y b e a h y d r o g e n b o n d t o t h e p r o t e i n ( B a b c o c k a n d C a l l a h a n , 1 9 8 3 ) o r r e s o n a n c e e n e r g y t r a n s f e r w i t h a n e a r b y w a t e r m o l e c u l e ( S a s s a r o l i e t a l . , 1 9 8 9 ) . T h e h e m e a — p r o t e i n i n t e r a c t i o n s a r e o f s i m i l a r s t r e n g t h i n t h e r e d u c e d p l a n t a n d t h e m a m m a l i a n o x i d a s e s , s i n c e t h e f o r m y l C = O v i b r a t i o n s b o t h o c c u r a t 1 6 1 0 c m ' l . I n t h e f u l l y $ 0 o x i d i z e d f o r m , h o w e v e r , t h e i n t e r a c t i o n i s w e a k e r i n p l a n t h e m e a ( v 0 = o = 1 6 5 7 c m ' l ) t h a n i n m a m m a l i a n h e m e a ( 0 0 : 0 = 1 6 5 0 c m ' l ) . T h e R R s p e c t r u m o f p l a n t r e d u c e d h e m e a r e v e a l s a n o t h e r u n i q u e f e a t u r e : t h e 1 6 1 0 c m ' 1 f o r m y l C = O m o d e i s s t r o n g l y e n h a n c e d i n t h e b e e f h e a r t e n z y m e b u t o n l y w e a k l y e n h a n c e d i n t h e r e d u c e d f o r m s o f t h e m a i z e a n d w h e a t g e r m e n z y m e s . E n h a n c e m e n t o f t h e C = O v i b r a t i o n m a y b e d e t e r m i n e d b y t h e d e g r e e o f c o n j u g a t i o n o f t h e f o r m y l g r o u p w i t h t h e p o r p h y r i n 1 1 : s y s t e m ( d e P a u l a e t a l . , 1 9 9 0 ) . T h e r e f o r e t h e f o r m y l o f h e m e a i n t h e p l a n t o x i d a s e m a y b e i n a d i f f e r e n t c o n f o r m a t i o n t h a n i n b e e f h e a r t , s u p p o r t i n g o u r e a r l i e r s p e c t r a l d a t a t h a t h e m e a i s i n a d i f f e r e n t p r o t e i n e n v i r o n m e n t . A l t e r n a t i v e e x p l a n a t i o n s a r e c o n s i d e r e d b e l o w . 8 . 4 . 4 R e c o n c i l i n g t h e a b s o r p t i o n a n d R R d a t a W e h a v e s h o w n t h a t t h e h e m e 0 a b s o r p t i o n b a n d s o f r e d u c e d p l a n t o x i d a s e s a r e b l u e - s h i f t e d w i t h r e s p e c t t o r e d u c e d m a m m a l i a n c y t o c h r o m e o x i d a s e s . A c c o r d i n g t o t h e m o d e l p u t f o r t h b y B a b c o c k a n d C a l l a h a n ( 1 9 8 3 ) . t h i s m e a n s t h a t t h e h y d r o g e n b o n d b e t w e e n t h e p r o t e i n a n d t h e f o r m y l g r o u p o f h e m e a i s w e a k e r i n t h e p l a n t s y s t e m . H o w e v e r , a c c o r d i n g t o t h e f r e q u e n c y o f t h e f o r m y l C = O s t r e t c h i n g v i b r a t i o n ( 1 6 1 0 c m ' l ) , t h e s t r e n g t h o f t h i s p u t a t i v e h y d r o g e n b o n d i s s i m i l a r i n p l a n t a n d m a m m a l i a n o x i d a s e s . B e c a u s e t h e 1 6 1 0 a n 1 i n t e n s i t y i s s i g n i fi c a n t l y l o w e r i n p l a n t s , d e P a u l a e t a l . ( 1 9 9 0 ) h a s s u g g e s t e d t h a t t h e f o r m y l g r o u p c o n j u g a t e s o n l y w e a k l y w i t h t h e p o r p h y r i n g r o u p i n p l a n t o x i d a s e s b e c a u s e i t i s n o t c o p l a n a r w i t h t h e p o r p h y r i n r i n g . H o w e v e r , t h e r e m a y b e o t h e r e x p l a n a t i o n s . I n o x i d a s e f r o m w i l d - t y p e R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s , t h e a p e a k o c c u r s a t 6 0 7 m n , w h i l e t h e 1 6 1 0 c m ' 1 i s m o r e s t r o n g l y e n h a n c e d t h a n i n b e e f h e a r t ( H o s l e r e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h e r e f o r e , p e r h a p s t h e i n t e n s i t y o f t h e $ 1 1 6 1 0 c m ' l , n o t i t s f r e q u e n c y , r e l a t e s t o t h e a b s o r p t i o n m a x i m a o f t h e o n p e a k . H o w e v e r , t h e a p e a k o f a m u t a n t s u b s t i t u t i n g p h e n y l a l a n i n e f o r t y r o s i n e a t r e s i d u e 4 1 4 o f s u b u n i t I i s s h i f t e d t o 6 1 1 n m w h i l e t h e i n t e n s i t y o f t h e 1 6 1 0 c m ' 1 m o d e i s u n c h a n g e d f r o m w i l d - t y p e ( F e t t e r e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h u s , i t i s l i k e l y t h a t t h e p o s i t i o n o f t h e h e m e 0 a b s o r p t i o n b a n d s d e p e n d o n m o r e f a c t o r s t h a n j u s t t h e e n v i r o n m e n t o f t h e f o r m y l g r o u p . A n o t h e r p o s s i b l e f a c t o r i n t h e d i fi ' e r e n c e s o b s e r v e d i n t h e i n t e n s i t y o f t h e 1 6 1 0 c m ' 1 m o d e m i g h t b e t h e e x c i t a t i o n w a v e l e n g t h . O n l y o n e c o m p o n e n t o f t h e h e m e a a b s o r b a n c e m i g h t b e i n v o l v e d i n t h i s v i b r a t i o n , p e r h a p s t h e l o w e r w a v e l e n g t h , 4 3 8 n m i n w h e a t a n d 4 4 3 n m i n b e e f h e a r t . T h u s t h e e x c i t a t i o n w a v e l e n g t h . ( 4 4 1 . 7 n m ) i s c l o s e r t o “ r e s o n a n c e ” w i t h t h e b e e f h e a r t a t 4 4 3 n m t h a n t h e w h e a t a t 4 3 8 n m , e n h a n c i n g i t s f o r m y l ‘ v i b r a t i o n m o r e t h a n t h e w h e a t . I f t h i s i s s o , t h e n t h e w h e a t h e m e a f o r m y l m a y n o t b e v e r y d i f f e r e n t f r o m b e e f h e a r t i n b o n d s t r e n g t h a n d d e g r e e o f c o n j u g a t i o n t o t h e p o r p h y r i n r i n g . A t a n y r a t e , t h e a v a i l a b l e d a t a s u g g e s t s t h a t o t h e r f a c t o r s b e s i d e s t h e h e m e a f o r m y l h y d r o g e n b o n d s t r e n g t h m u s t b e c o n s i d e r e d i n i n t e r p r e t i n g t h e p o s i t i o n o f t h e m a x i m u m o f t h e o n b a n d o f c y t o c h r o m e o n ’ d a s e . 8 . 4 5 I m p l i c a t i o n s f o r p r o t o n p u m p i n g a c t i v i t y O u r r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e n a t u r e o f t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e f o r m y l C = O g r o u p o f h e m e a a n d i t s e n v i r o n m e n t m a y b e d i fi ‘ e r e n t i n t h e p l a n t a n d m a m m a l i a n c y t o c h r o m e o x i d a s e s . T h e f o r m y l — p r o t e i n i n t e r a c t i o n s a r e o f s i m i l a r s t r e n g t h i n t h e r e d u c e d f o r m s o f t h e p l a n t a n d m a m m a l i a n e n z y m e s , b u t i n t h e o x i d i z e d f o r m t h e C = O g r o u p v i b r a t e s a t a h i g h e r f r e q u e n c y i n w h e a t g e r m c o m p a r e d t o t h e b e e f h e a r t e n z y m e . T h u s t h e c h a n g e i n b o n d e n e r g y i s g r e a t e r f o r t h e p l a n t e n z y m e b e t w e e n t h e m 2 o x i d i z e d a n d r e d u c e d s t a t e s . A c c o r d i n g t o B a b c o c k a n d C a l l a h a n ( 1 9 8 3 ) , t h i s s u g g e s t s t h a t t h e w h e a t e n z y m e w o u l d b e a n e f f e c t i v e p r o t o n p u m p ( B a b c o c k a n d C a l l a h a n , 1 9 8 3 ) . W h e t h e r o f n o t t h i s e n e r g y c h a n g e i s i n v o l v e d i n p r o t o n p u m p i n g , i t a p p e a r s t o b e a c o n s e r v e d f e a t u r e o f t h e o x i d a s e w h i c h m a y h a v e f u n c t i o n a l s i g n i fi c a n c e . B I B L I O G R A P H Y 2 6 3 B I B L I O G R A P H Y A a s a , R . , A l b r a c h t , S . P . J . , F a l k , K . - E . , L a n n a , B . , & V a n n g é r d , T . ( 1 9 7 6 ) E P R s i g n a l s f r o m c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 4 2 2 , 2 6 0 - 2 7 2 . A b e , M . ( 1 9 8 6 ) N o r m a l c o o r d i n a t e a n a l y s i s o f l a r g e m o l e c u l e s o f b i o l o g i c a l i n t e r e s t : m e t a l l o p o r p h y r i n s a n d l u m i fl a v i n . i n S p e c t r o s c o p y o f ‘ B i o l o g i c a l S y s t e m s ( R . J . H . C l a r k & R . E . H e s t e r , e d s . ) , W i l e y & S o n s , L o n d o n , 3 4 7 - 3 9 3 . A b o u - K a b l i l , S . , & H a n s o n , J . B . ( 1 9 7 7 ) N e t a d e n o s i n e d i p h o s p h a t e a c c u m u l a t i o n i n m i t o c h o n d r i a . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 1 8 3 , 5 8 1 - 5 8 7 . A b o u - K a h l i l , S . , & H a n s o n , J . B . ( 1 9 7 9 ) E n e r g y - l i n k e d a d e n o s i n e d i p h o s p h a t e a c c u m u l a t i o n b y c o r n m i t o c h o n d r i a . I . G e n e r a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d e f f e c t o f i n h i b i t o r s . P l a n t P h y s i o l . 6 4 , 2 7 6 - 2 8 0 . A l l e n , J . P . , F e h e r , G . , Y e a t e s , T . O . , K o m i y a , H . , & R e e s , D C . ( 1 9 8 7 ) S t r u c t u r e o f t h e r e a c t i o n c e n t e r fi o m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s R — 2 6 : t h e p r o t e i n s u b u n i t s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 8 4 , 6 1 6 2 - 6 1 6 6 . A n d e r s o n , S . , B a n k i e r , A . T . , B a r r e l ] , B . G . , d e B r u i j n , M . H . L . , C o u l s o n , A . R . , D r o u i n , J . , E p e r o n , I . C . , N i e r l i c h , D . P . , R o e , B . A . , S a n g e r , F . , S c h r e i e r , P . H . , S m i t h , A . J . H . , S t a d e n , R . , & Y o u n g , L G . ( 1 9 8 1 ) S e q u e n c e a n d o r g a n i z a t i o n o f t h e h u m a n m i t o c h o n d r i a l g e n o m e . N a t u r e 2 9 0 , 4 5 7 - 4 6 5 . A n d r é a s s o n , L . - E . , M a l m s t r b m , B . G . , S t r t i m b e r g , C . , & V a n n g a r d , T . ( 1 9 7 2 ) T h e r e a c t i o n o f f e r r o c y t o c h r o m e c w i t h c y t o c h r o m e o x i d a s e : A n e w l o o k . F E B S L e t t . 2 8 , 2 9 7 - 3 0 1 . A n e m i i l l e r , S . , & S c h a f e r , G . ( 1 9 8 9 ) C y t o c h r o m e a a 3 f r o m t h e t h e r m o a c i d o p h i l i c a r c h a e b a c t e r i u m S u l f o l o b u s a c i d o c a l d a r i u s . F E B S L e t t . 2 4 4 , 4 5 1 - 4 5 5 . A n t a l i s , T M . a n d P a l m e r , G . ( 1 9 8 2 ) K i n e t i c c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n c y t o c h r o m e o x i d a s e a n d c y t o c h r o m e c . J . B i o l . C h e m . 2 5 7 , 6 1 9 4 - 6 2 0 6 . A r a n d a , G . , & G a u v r i t , C . ( 1 9 8 6 ) T o p o g r a p h i c a l g e o m e t r i c f a c t o r s g o v e r n i n g t h e b i o l o g i c a l a c t i v i t i e s o f m e t h o m y l d e r i v a t i v e s o n b i n d i n g r e c e p t o r s o f m a i z e m i t o c h o n d r i a . B i o o r g . C h e m . 1 4 , 1 9 4 - 2 0 1 . A t t a r d i , G . ( 1 9 8 1 ) O r g a n i z a t i o n a n d e x p r e s s i o n o f t h e m a m m a l i a n m i t o c h o n d r i a l g e n o m e : a l e s s o n i n e c o n o m y . T r e n d s B i o c h e m . S c i . 6 , 8 6 - 8 9 . 2 6 4 A z z i , A . , B i l l , K . , & B r o g e r , C . ( 1 9 8 2 ) A f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y p u r i fi c a t i o n o f c y t o c h r o m e c b i n d i n g e n z y m e s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 7 9 , 2 4 4 7 - 2 4 5 0 . B a b c o c k , G . T . ( 1 9 8 8 ) R a m a n s c a t t e r i n g b y c y t o c h r o m e o x i d a s e a n d b y h e m e a m o d e l c o m p o u n d s . i n B i o l o g i c a l a p p l i c a t i o n s o f R a m a n s p e c t r o s c o p y ( T . G . S p i r o , e d . ) W i l e y & S o n s , N Y , 2 9 3 - 3 4 6 . B a b c o c k , G . T . , & C a l l a h a n , P M . ( 1 9 8 3 ) R e d o x - l i n k e d h y d r o g e n b o n d s t r e n g t h c h a n g e s i n c y t o c h r o m e a : I m p l i c a t i o n s f o r a c y t o c h r o m e o x i d a s e p r o t o n p u m p . B i o c h e m i s t r y 2 2 , 2 3 1 4 - 2 3 1 9 . B a b c o c k , G . T . , & W i k s t r o m , M . ( 1 9 9 2 ) O z a c t i v a t i o n a n d t h e c o n s e r v a t i o n o f e n e r g y i n c e l l r e s p i r a t i o n . N a t u r e , i n p r e s s . B a b c o c k , G . T . , C a l l a h a n , P . M . , O n d r i a s , M . R . , & S a l m e e n , I . ( 1 9 8 1 ) . C o o r d i n a t i o n g e o m e t r i e s a n d v i b r a t i o n a l p r o p e r t i e s o f c y t o c h r o m e s a a n d a 3 i n c y t o c h r o m e o x i d a s e f r o m S o r e t e x c i t a t i o n R a m a n s p e c t r o s c o p y . B i o c h e m i s t r y 2 0 , 9 5 9 - 9 6 6 . B a i l e y - S e r r e s , J . , H a n s o n , D . K . , F o x , T . D . , & L e a v e r , C . J . ( 1 9 8 6 ) _ M i t o c h o n d r i a l g e n o m e r e a r r a n g e m e n t l e a d s t o e x t e n s i o n a n d r e l o c a t i o n o f t h e c y t o c h r o m e c o x i d a s e s u b u n i t I g e n e i n s o r g h u m . C e l l 4 7 , 5 6 7 - 5 7 6 . * B e a v i s , A . D . , B r a n n a n , R . D . , & G a r l i d , K . D . ( 1 9 8 5 ) S w e l l i n g a n d c o n t r a c t i o n o f t h e m i t o c h o n d r i a l m a t r i x . I . A s t r u c t u r a l i n t e r p r e t a t i o n o f t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n l i g h t s c a t t e r i n g a n d m a t r i x v o l u m e . J . B i o l . C h e m . 2 6 0 , 1 3 4 2 4 - 1 3 4 3 3 . B e c k e t t , J . B . ( 1 9 7 1 ) C l a s s i fi c a t i o n o f m a l e - s t e r i l e c y t o p l a s m s i n m a i z e ( Z e a m a y s L . ) C r o p S c i . 1 1 , 7 2 4 - 7 2 7 . B e d n a r s k i , M . A . , I z a w a , S . , & S c h e fl ‘ e r , R P . ( 1 9 7 7 ) R e v e r s i b l e e f f e c t s o f t o x i n f r o m H e l m i n t h o s p o r i u m m a y d i s r a c e T o n o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n b y m i t o c h o n d r i a fi - o m m a i z e . P l a n t P h y s i o l . 5 9 , 5 4 0 - 5 4 5 . B e g u , D . , G r a v e s , P . - V . , D o m e c , G . , L i t v a k , S . , & A r a y a , A . ( 1 9 9 0 ) R N A e d i t i n g o f w h e a t m i t o c h o n d r i a l A T P s y n t h a s e s u b u n i t 9 : d i r e c t p r o t e i n a n d c D N A s e q u e n c i n g . P l a n t C e l l 2 , 1 2 8 3 - 1 2 9 0 . B e i n e r t , H . , G r i f fi t h s , D . E . , W h a r t o n , D . C . , & S a n d s , R H . ( 1 9 6 2 ) P r o p e r t i e s o f t h e c o p p e r a s s o c i a t e d w i t h c y t o c h r o m e o x i d a s e a s s t u d i e d b y p a r a m a g n e t i c r e s o n a n c e s p e c t r o s c o p y . J . B i o l . C h e m . 2 3 7 , 2 3 3 7 - 2 3 4 6 . B e i n e r t , H . , S h a w , R . W . , H a n s e n , R . E . , & H a r t z e l l , C R . ( 1 9 8 0 ) S t u d i e s o n t h e o r i g i n o f t h e n e a r - i n f r a r e d ( 8 0 0 - 9 0 0 n m ) a b s o r p t i o n o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 5 9 1 , 4 5 8 - 4 7 0 . B e n c i n i , D . A . , W i l d , J . R . , & O ' D o n o v a n , G A . ( 1 9 8 3 ) L i n e a r o n e - s t e p a s s a y f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f o r t h o p h o s p h a t e . A n a l . B i o c h e m . 1 3 2 , 2 5 4 - 2 5 8 . . d fi h n r l . 2 6 5 B e n d a l l , D . S . , & B o n n e r , W . D . , J r . ( 1 9 6 6 ) O p t i c a l p r o p e r t i e s o f p l a n t c y t o c h r o m e o x i d a s e . i n H e m e s a n d H e m o p r o t e i n s , ( B . C h a n c e , R . W . E s t a b r o o k , & T . Y o n e t a n i , e d s . ) A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k , 4 8 5 - 4 8 8 . B e n d a l l , D . S . , & B o n n e r , W . D . , J r . ( 1 9 7 1 ) C y a n i d e - i n s e n s i t i v e r e s p i r a t i o n i n p l a n t m i t o c h o n d r i a . P l a n t P h y s i o l . 4 7 , 2 3 6 - 2 4 5 . B e r g m a n , A . , & E r i c s o n , I . ( 1 9 8 3 ) E f f e c t s o f p H , N A D H , s u c c i n a t e a n d m a l a t e o n t h e o x i d a t i o n o f g l y c i n e i n s p i n a c h l e a f m i t o c h o n d r i a . P h y s i o l . P l a n t . 5 9 , 4 2 1 - 4 2 7 . B e r v i l l e , A . , G h a z i , A . , C h a r b o n n i e r , M . , & B o n a v e n t , J . ( 1 9 8 4 ) E f f e c t s o f m e t h o m y l a n d H e l m i n t h o s p o r i u m m a y d i s t o x i n i n m a t r i x v o l u m e , p r o t o n m o t i v e f o r c e , a n d N A D a c c u m u l a t i o n i n m a i z e ( Z e a m a y s L . ) m i t o c h o n d r i a . P l a n t P h y s i o l . 7 6 , 5 0 8 - 5 1 7 . B i c k a r , D . , L e h n i n g e r , A . , B r u n o r i , M . , B o n a v e n t u r a , J . , & B o n a v e n t u r a , C . ( 1 9 8 5 ) F u n c t i o n a l e q u i v a l e n c e o f m o n o m e r i c ( s h a r k ) a n d d i m e r i c ( b o v i n e ) c y t o c h r o m e c o x i d a s e . J . I n o r g . B i o c h e m . 2 3 , 3 6 5 - 3 7 2 . B i r c h m e i e r , W . , K o h l e r , C . E . , & S c h a t z , G . ( 1 9 7 6 ) I n t e r a c t i o n o f i n t e g r a l a n d p e r i p h e r a l m e m b r a n e p r o t e i n s : A fi n i t y l a b e l i n g o f y e a s t c y t o c h r o m e o x i d a s e b y m o d i fi e d y e a s t c y t o c h r o m e c . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 7 3 , 4 3 3 4 - 4 3 3 8 . B i s s o n , R . , & M o n t e c u c c o , C . ( 1 9 8 2 ) D i f f e r e n t p o l y p e p t i d e s o f b o v i n e h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e a r e i n c o n t a c t w i t h c y t o c h r o m e c . F E E S L e t t . 1 5 0 , 4 9 - 5 3 . B i s s o n , R . , & S c h i a v o , G . ( 1 9 8 6 ) T w o d i f f e r e n t f o r m s o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e c a n b e p u r i fi e d f r o m t h e s l i m e m o l d D i c t y o s t e l i u m d i s c o i d e u m : . J . B i o l . C h e m . 2 6 1 , 4 3 7 3 - 4 3 7 6 . B i s s o n , R . , & S c h i a v o , G . ( 1 9 8 8 ) S l i m e m o l d c y t o c h r o m e c o x i d a s e . A n n . N Y A c a d . S c i . 5 5 0 , 3 2 5 - 3 3 6 . B i s s o n , R . , A z z i , A . , G u t w e n i g e r , H . , C o l o n n a , R . , M o n t e c u c c o , C . , & Z a n o t t i , A . ( 1 9 7 8 ) I n t e r a c t i o n o f c y t o c h r o m e c w i t h c y t o c h r o m e c o x i d a s e . J . B i o l . C h e m . 2 5 3 , 1 8 7 4 - 1 8 8 0 . B i s s o n , R . , J a c o b s , B . , & C a p a l d i , R A . ( 1 9 8 0 ) B i n d i n g o f a r y l a z i d o c y t o c h r o m e c d e r i v a t i v e s t o b e e f h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e : C r o s s - l i n k i n g i n t h e h i g h - a n d l o w - a f fi n i t y b i n d i n g s i t e s . B i o c h e m i s t r y 1 9 , 4 1 7 3 - 4 1 7 8 . B i s s o n , R . , M o n t e c u c c o , C . , G u t w e n i g e r , H . , & A z z i , A . ( 1 9 7 9 ) C y t o c h r o m e c o x i d a s e s u b u n i t s i n c o n t a c t w i t h p h o s p h o l i p i d s : H y d r o p h o b i c p h o t o l a b e l i n g w i t h a z i d o p h o s p h o l i p i d s . J . B i o l . C h e m . 2 5 4 , 9 9 6 2 - 9 9 6 5 . ! . % 1 2 6 6 B i s s o n , R . , S c h i a v o , G . , & M o n t e c u c c o , C . ( 1 9 8 7 ) A T P i n d u c e s c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s i n m i t o c h o n d r i a l c y t o c h r o m e c o x i d a s e . J . B i o l . C h e m . 2 6 2 , 5 9 9 2 - 5 9 9 8 . B i s s o n , R . , S c h i a v o , G . , & P a p i n i , E . ( 1 9 8 5 ) C y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m t h e s l i m e m o l d D i c t y o s t e l i u m d i s c o i d e u m : P u r i fi c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n . B i o c h e m i s t r y 2 4 , 7 8 4 5 - 7 8 5 2 . B i s s o n , R . , S t e fi ‘ e n s , G . C . M . , C a p a l d i , R . A . , & B u s e , G . ( 1 9 8 2 ) M a p p i n g o f t h e c y t o c h r o m e c b i n d i n g s i t e o n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . F E B S L e t t . 1 4 4 , 3 5 9 - 3 6 3 . B l a i r , D . F . , E l l i s , W . R . , W a n g , H . , G r a y , H . B . , & C h a n , S I . ( 1 9 8 6 ) S p e c t r o e l e c t r o c h e m i c a l s t u d y o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e : p H a n d t e m p e r a t u r e d e p e n d e n c e s o f t h e c y t o c h r o m e p o t e n t i a l s . J . B i o l . C h e m . 2 6 1 , 1 1 5 2 4 - 1 1 5 3 7 . B l a i r , D . F . , W i t t , S . N . , & C h a n , S J . ( 1 9 8 5 ) M e c h a n i s m o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e - c a t a l y z e d d i o x y g e n r e d u c t i o n a t l o w t e m p e r a t u r e s . E v i d e n c e f o r t w o i n t e r m e d i a t e s a t t h e t h r e e - e l e c t r o n l e v e l a n d e n t r o p i c p r o m o t i o n o f t h e b o n d - b r e a k i n g s t e p . J . A m . C h e m . S o c . 1 0 7 , 7 3 8 9 - 7 3 9 9 . B l o k z i j l - H o m a n , M . F . J . & v a n G e l d e r , B . F . ( 1 9 7 1 ) B i o c h e m i c a l a n d b i o p h y s i c a l s t u d i e s o n c y t o c h r o m e a a 3 . I I I . T h e E P R s p e c t r u m o f N O — f e r r o c y t o c b r o m e a 3 . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 2 3 4 , 4 9 3 - 4 9 8 . B l u m , B . , B a k a l a r a , N . , & S i m p s o n , L . ( 1 9 9 0 ) A m o d e l f o r R N A e d i t i n g i n k i n e t o p l a s t i d m i t o c h o n d r i a : “ G u i d e ” R N A m o l e c u l e s t r a n s c r i b e d fi - o m m a x i c i r c l e D N A p r o v i d e t h e e d i t e d i n f o r m a t i o n . C e l l 6 0 , 1 8 9 - 1 9 8 . B o e l e n s , R . , & W e v e r , R . ( 1 9 8 0 ) R e d o x r e a c t i o n s i n m i x e d - v a l e n c e c y t o c h r o m e c o x i d a s e . F E B S L e t t . 1 1 6 , 2 2 3 - 2 2 6 . B o e s h o r e , M . L . , H a n s o n , M . R . , & I z h a r , S . ( 1 9 8 5 ) A v a r i a n t m i t o c h o n d r i a l D N A a r r a n g e m e n t s p e c i fi c t o P e t u n i a s t a b l e s t e r i l e s o m a t i c h y b r i d s . P l a n t M o l e c . B i o . 4 , 1 2 5 - 1 3 2 . B o m b e l k a , E . , R i c h t e r , F . - W . , S t r o h , A . , & K a d e n b a c h , B . ( 1 9 8 6 ) A n a l y s i s o f t h e C u , F e , a n d Z n c o n t e n t s i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e s f r o m d i fl ‘ e r e n t s p e c i e s a n d t i s s u e s b y p r o t o n - i n d u c e d X - r a y e m i s s i o n ( P I X E ) . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 4 0 , 1 0 0 7 - 1 0 1 4 . B o n e n , L . , B o e r , P . H . , & G r a y , M . W . ( 1 9 8 4 ) T h e w h e a t c y t o c h r o m e o x i d a s e s u b u i n t I I g e n e h a s a n i n t r o n i n s e r t a n d t h r e e r a d i c a l a m i n o a c i d c h a n g e s r e l a t i v e t o m a i z e . E M E O J . 3 , 2 5 3 1 - 2 5 3 6 . B o r c k , K S , & W a l b o t , V . ( 1 9 8 2 ) C o m p a r i s o n o f t h e r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e d i g e s t i o n p a t t e r n s o f m i t o c h o n d r i a l D N A fi o m n o r m a l a n d m a l e s t e r i l e c y t o p l a s m s o f Z e a m a y s L . G e n e t i c s 1 0 2 , 1 0 9 - 1 2 8 . 2 6 7 B o r s t , P . , & G r i v e l l , L A . ( 1 9 7 8 ) T h e m i t o c h o n d r i a l g e n o m e o f y e a s t . C e l l 1 5 , 7 0 5 - 7 2 3 . B o u t h y e t t e , P . - Y . , S p i t s b e r g , V . , & G r e g o r y , P . ( 1 9 8 5 ) M i t o c h o n d r i a l i n t e r a c t i o n w i t h H e l m i n t h o s p o r i u m m a y d i s r a c e T t o x i n : B l o c k i n g b y d i c y c l o h e x y l c a r b o d i i m d e . J . E x p . B o t . 3 6 , 5 1 1 - 5 2 8 . B o u t r y , M . , & B r i q u e t , M . ( 1 9 8 2 ) M i t o c h o n d r i a l m o d i fi c a t i o n s a s s o c i a t e d w i t h t h e c y t o c p l a s m i c m a l e s t e r i l i t y i n f a b a b e a n s . E u r . J . B i o c h e m . 1 2 7 , 1 2 9 - 1 3 5 . B o u t r y , M . , B r i q u e t , M . , & G o fi ‘ e a u , A . ( 1 9 8 3 ) T h e a s u b u n i t o f a p l a n t m i t o c h o n d r i a l F l - A T P a s e i s t r a n s l a t e d i n m i t o c h o n d r i a . J . B i o l . C h e m . 2 5 8 , 8 5 2 4 - 8 5 2 6 . B o u t r y , M . , F a b e r , A . - M . , C h a r b o n n i e r , M . , & B r i q u e t , M . ( 1 9 8 4 ) M i c r o a n a l y s i s o f p l a n t m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n s y n t h e s i s p r o d u c t s . P l a n t M o l e c . B i o l . 3 , 4 4 5 - 4 5 2 . B r a u n , C . , S i e d o w , J . N . , W i l l i a m s , M . E . , & L e v i n g s , 0 . 8 . , I I I . ( 1 9 8 9 ) M u t a t i o n s i n t h e m a i z e m i t o c h o n d r i a l T - u r f 1 3 g e n e e l i m i n a t e s e n s i t i v i t y t o a f u n g a l p a t h o t o x i n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 8 6 , 4 4 3 5 - 4 4 3 9 . B r a u n , C . J . , S i e d o w , J . N . , & L e v i n g s , 0 . 8 . , I I I . ( 1 9 9 0 ) F u n g a l t o n ' n s b i n d t o t h e U R F 1 3 p r o t e i n i n m a i z e m i t o c h o n d r i a a n d E s c h e r i c h i a c o l i . P l a n t C e l l 2 , 1 5 3 - 1 6 1 . B r e n n i c k e , A . ( 1 9 8 0 ) M i t o c h o n d r i a l D N A f r o m O e n o t h e r a b e r t e r i a n a . P l a n t P h y s i o l . 6 5 , 1 2 0 7 - 1 2 1 0 . B r e t t e l l , R . I . S . , G o d d a r d , B . V . D . , & I n g r a m , D . S . ( 1 9 7 9 ) S e l e c t i o n o f T m s - c y t o p l a s m m a i z e t i s s u e c u l t u r e s r e s i s t a n t t o D r e s c h l e r a m a y d i s T - t o x i n . M a y d i c a 2 4 , 2 0 3 - 2 1 3 . B r e t t e l l , R . I . S . , T h o m a s , E . , & I n g r a m , D . S . ( 1 9 8 0 ) R e v e r s i o n o f T e x a s m a l e - s t e r i l e c y t o p l a s m m a i z e i n c u l t u r e t o g i v e f e r t i l e , T - t o x i n r e s i s t a n t p l a n t s . T h e o r . A p p l . G e n e t . 5 8 , 5 5 - 5 8 . B r i g g s , M . M . , & C a p a l d i , R A . ( 1 9 7 7 ) N e a r - n e i g h b o r r e l a t i o n s h i p s o f t h e s u b u n i t s o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 1 6 , 7 3 - 7 7 . B r i g g s , M . M . , & C a p a l d i , R A . ( 1 9 7 8 ) C r o s s - l i n k i n g s t u d i e s o n a c y t o c h r o m e c — c y t o c h r o m e c o x i d a s e c o m p l e x . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 8 0 , 5 5 3 - 5 5 9 . ' B r u n o r i , M . , A n t o n i n i , G . , M a l a t e s t a , F . , S a r t i , P . , & W i l s o n , M . T . ( 1 9 8 7 ) C y t o c h r o m e — c o x i d a s e : S u b u n i t s t r u c t u r e a n d p r o t o n p u m p i n g . E u r . J . B i o c h e m . 1 6 9 , 1 - 8 . 2 6 8 B r z e z i n s k i , P . , & M a l m s t r o m , B . ( 1 9 8 7 ) T h e m e c h a n i s m o f e l e c t r o n g a t i n g i n p r o t o n p u m p i n g c y t o c h r o m e c o x i d a s e : t h e e f f e c t o f p H a n d t e m p e r a t u r e o n i n t e r n a l e l e c t r o n t r a n s f e r . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 8 9 4 , 2 9 - 3 8 . B r z e z i n s k i , P . , & M a l m s t r t i m , B . G . ( 1 9 8 6 ) E l e c t r o n - t r a n s p o r t - d r i v e n p r o t o n p u m p s d i s p l a y n o n h y p e r b o l i c k i n e t i c s : S i m u l a t i o n o f t h e s t e a d y - s t a t e k i n e t i c s o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 8 3 , 4 2 8 2 - 4 2 8 6 . B r z e z i n s k i , P . , T h i i r n s t r t i m , P . - E . , & M a l m s t r t i m , B . G . ( 1 9 8 6 ) T h e r a t e - l i m i t i n g s t e p a n d n o n h y p e r b o l i c k i n e t i c s i n t h e o r d d a t i o n o f f e r r i c y t o c h r o m e c c a t a l y z e d b y c y t o c h r o m e c o x i d a s e . F E B S L e t t . 1 9 4 , 1 - 5 . B i i g e , U . , & K a d e n b a c h , B . ( 1 9 8 6 ) I n fl u e n c e o f b u f f e r c o m p o s i t i o n , m e m b r a n e l i p i d s a n d p r o t e a s e s o n t h e k i n e t i c s o f r e c o n s t i t u t e d c y t o c h r o m e — c o x i d a s e f r o m b o v i n e l i v e r a n d h e a r t . E u r . J . B i o c h e m . 1 6 1 , 3 8 3 - 3 9 0 . B u s e , G . , H e n s e l , S . , & F e e , J . A . ( 1 9 8 9 ) E v i d e n c e f o r c y t o c h r o m e o x i d a s e s u b u n i t I a n d a c y t o c h r o m e c - s u b u n i t I I f u s e d p r o t e i n i n t h e c y t o c h r o m e ' c 1 a a 3 ' o f T h e r m u s t h e r m o p h i l u s . E u r . J . B i o c h e m . 1 8 1 , 2 6 1 - 2 6 8 . B u s e , G . , M e i n e c k e , L . , B r u c h , B . ( 1 9 8 5 ) T h e p r o t e i n f o r m u l a o f b e e f h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e . J . I n o r g . B i o c h e m . 2 3 , 1 4 9 - 1 5 3 . C a o , J . , S h a p l e i g h , J . , G e n n i s , R . , R e v z i n , A . , & F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 1 9 9 1 ) T h e g e n e e n c o d i n g c y t o c h r o m e c o x i d a s e s u b u n i t I I f r o m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s ; c o m p a r i s o n o f t h e d e d u c e d a m i n o a c i d s e q u e n c e w i t h s e q e u n c e s o f t h e c o r r e s p o n d i n g p e p t i d e s f r o m o t h e r s p e c i e s . G e n e 1 0 1 , 1 3 3 - 1 3 7 . . C a p a l d i , R A . ( 1 9 8 8 ) M i t o c h o n d r i a l m y o p a t h i e s a n d r e s p i r a t o r y c h a i n p r o t e i n s . T r e n d s B i o c h e m . S c i . 1 3 , 1 4 4 - 1 4 7 . C a p a l d i , R . A . ( 1 9 9 0 a ) S t r u c t u r e a n d a s s e m b l y o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 2 8 0 , 2 5 2 - 2 6 2 . C a p a l d i , R . A . ( 1 9 9 0 b ) S t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e . A n n . R e v . B i o c h e m . 5 9 , 5 6 9 - 5 9 6 . C a p a l d i , R . A . , G o n z a l e z - H a l p h e n , D . , & T a k a m i y a , S . ( 1 9 8 6 ) S e q u e n c e h o m o l o g i e s a n d s t r u c t u r a l s i m i l a r i t i e s b e t w e e n t h e p o l y p e p t i d e s o f y e a s t a n d b e e f h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e . F E B S L e t t . 2 0 7 , 1 1 - 1 7 . C a p a l d i , R . A . , M a l a t e s t a , F . , & D a r l e y - U s m a r , V . M . ( 1 9 8 3 ) S t r u c t u r e o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 7 2 6 , 1 3 5 - 1 4 8 . . n i 1 : 3 2 6 9 C a r t e r , K , & P a l m e r , G . ( 1 9 8 2 ) M o d e l s o f t h e t w o h e m e c e n t e r s i n c y t o c h r o m e o x i d a s e : T h e o p t i c a l p r o p e r t i e s o f c y t o c h r o m e a a n d a 3 . J . B i o l . C h e m . 2 5 7 , 1 3 5 0 7 - 1 3 5 1 4 . C a s e y , R . P . , T h e l e n , M . , & A z z i , A . ( 1 9 7 9 ) D i c y c l o h e x y l c a r b o d i i m i d e i n h i b i t s p r o t o n t r a n s l o c a t i o n b y c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 8 7 , 1 0 4 4 - 1 0 5 1 . C a s e y , R . P . , T h e l e n , M . , & A z z i , A . ( 1 9 8 0 ) D i c y c l o h e x y l c a r b o d i i m i d e b i n d s s p e c i fi c a l l y a n d c o v a l e n t l y t o c y t o c h r o m e c o x i d a s e w h i l e i n h i b i t i n g i t s H + - t r a n s l o c a t i n g a c t i v i t y . J . B i o l . C h e m . 2 5 5 , 3 9 9 4 - 4 0 0 0 . C e n t e n o , J . A . ( 1 9 8 7 ) H y d r o g e n b o n d i n g i n t e r a c t i o n s i n c y t o c h r o m e a o f c y t o c h r o m e o x i d a s e : a r e s o n a n c e R a m a n s t u d y . P h . D . t h e s i s , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y , E a s t L a n s i n g , M i c h i g a n . C e r l e t t i , N . , & S c h a t z , G . ( 1 9 7 9 ) C y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m b a k e r s ’ y e a s t : P h o t o l a b e l i n g o f s u b u n i t s e x p o s e d t o t h e l i p i d b i l a y e r . J . B i o l . C h e m . 2 5 4 , 7 7 4 6 - 7 7 5 1 . C h a n , S . I . , & L i , R M . ( 1 9 9 0 ) C y t o c h r o m e c o x i d a s e : U n d e r s t a n d i n g n a t u r e ’ s d e s i g n o f a p r o t o n p u m p . B i o c h e m i s t r y 2 9 , 1 - 1 2 . C h a n c e , B . , B o n n e r , W . D . , J r . , S t o r e y , B . ( 1 9 6 8 ) E l e c t r o n t r a n s p o r t i n r e s p i r a t i o n . A n n . R e v . P l . P h y s i o l . , 3 1 2 - 3 2 0 . C h a n g , C . - H . , T i e d e , 1 ) . , T a n g , J . , S m i t h , U . , N o r r i s , J . , & S m . . . M . ( 1 9 8 6 ) S t r u c t u r e o f t h e R h o d o p s e u d o m o n a s s p h a e r o i d e s R - 2 6 r e a c t i o n c e n t e r . F E E S L e t t . 2 0 5 , 8 2 - 8 6 . C h e n , S . - H . , H a b i b , G . , Y a n g , C . - Y . , G u , Z . - W . , L e e , B . R . , W a n g , S . - A . , S i l b e r m a n , S . R . , C a i , S . - J . , D e s l y p e r e , J . P . , R o s s e n e u , M . , G o t t o , A . M . , J r . , L i , W . - H . , & C h a n , L . ( 1 9 8 7 ) A p o l i p o p r o t e i n B - 4 8 i s t h e p r o d u c t o f a m e s s e n g e r R N A w i t h a n o r g a n - s p e c i fi c i n - f r a m e s t o p c o d o n . S c i e n c e 2 3 8 , 3 6 3 - 3 6 6 . C h e p u r i , V . , & G e n n i s , R B . ( 1 9 9 0 ) T h e u s e o f g e n e f u s i o n s t o d e t e r m i n e t h e t o p o l o g y o f a l l t h e s u b u n i t s o f t h e c y t o c h r o m e a t e r m i n a l o x i d a s e c o m p l e x o f E s c h e r i c h i a c o l i . J . B i o l . C h e m . 2 6 5 , 1 2 9 7 8 - 1 2 9 8 6 . C l i n e , J . , R e i n h a m m a r , B . , J e n s e n , P . , V e n t e r s , R . , & H o fl ' m a n , B M . ( 1 9 8 3 ) C o o r d i n a t i o n e n v i r o n m e n t f o r t h e t y p e 3 c o p p e r c e n t e r o f t r e e l a c c a s e a n d C u ] ; o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e a s d e t e r m i n e d b y e l e c t r o n n u c l e a r d o u b l e r e s o n a n c e . J . B i o l . C h e m . 2 5 8 , 5 1 2 4 - 5 1 2 8 . C o e , E H . ( 1 9 8 3 ) M a t e r n a l l y i n h e r i t e d a b n o r m a l p l a n t t y p e s i n m a i z e . M a y d i c a 2 7 , 1 5 1 - 1 6 7 . 2 7 0 C o n d e , M . F . , P r i n g , D . R . , S c h e r t z , K . F . , & R o s s , W . M . ( 1 9 8 2 ) C o r r e l a t i o n o f m i t o c h o n d r i a l D N A r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e p a t t e r n s w i t h s t e r i l i t y e x p r e s s i o n i n s i x m a l e - s t e r i l e s o r g h u m c y t o p l a s m s . C r o p S c i . 2 2 , 5 3 6 - 5 3 9 . C o n n e t t , M . ( 1 9 9 1 ) R e l a t i o n s h i p o f m i t o c h o n d r i a l r e s p i r a t o r y p a t h w a y s t o c y t o p l a s m i c m a l e s t e r i l i t y : S t u d i e s i n t h e m o d e l o r g a n i s m p e t u n i a . P h . D . T h e s i s , C o r n e l l U n i v e r s i t y , I t h a c a , N Y . C o n n e t t , M . B . , & H a n s o n , M B . ( 1 9 9 0 ) D i f f e r e n t i a l m i t o c h o n d r i a l e l e c t r o n t r a n s p o r t t h r o u g h t h e c y a n i d e - s e n s i t i v e a n d c y a n i d e - i n s e n s i t i v e p a t h w a y s i n i s o n u c l e a r l i n e s o f c y t o p l a s m i c m a l e s t e r i l e , m a l e f e r t i l e , a n d r e s t o r e d P e t u n i a . P l a n t P h y s i o l . 9 3 , 1 6 3 4 - 1 6 4 0 . C o o p e r , C . E . ( 1 9 9 0 ) T h e s t e a d y - s t a t e k i n e t i c s o f c y t o c h r o m e c o x i d a t i o n b y c y t o c h r o m e o x i d a s e . B i o c h e m . B i o p h y s . A c t a 1 0 1 7 , 1 8 7 - 2 0 3 . C o p e l a n d , R . A . , & C h a n , S I . ( 1 9 3 9 ) P r o t o n t r a n s l o c a t i o n i n p r o t e i n s . A n n . R e v . P h y s . C h e m . 4 0 , 6 7 1 - 6 9 8 . C o p e l a n d , R . A . , S m i t h , P . A . , & C h a n , S I . ( 1 9 8 7 ) C y t o c h r o m e c o x i d a s e e x h i b i t s a r a p i d c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e u p o n r e d u c t i o n o f C u A : A t r y p t o p h a n fl u o r e s c e n c e s t u d y . B i o c h e m i s t r y 2 6 , 7 3 1 1 - 7 3 1 6 . C o v e l l o , P . S . , & G r a y , M . W . ( 1 9 8 9 ) R N A e d i t i n g i n p l a n t m i t o c h o n d r i a . N a t u r e 3 4 1 , 6 6 2 - 6 6 6 . C o v e l l o , P . S . , & G r a y , M . W . ( 1 9 9 0 a ) D i fi ‘ e r e n c e s i n e d i t i n g a t h o m o l g o u s s i t e s i n m e s s e n g e r R N A s f r o m a n g i o s p e r m m i t o c h o n d r i a . N u c l . A c i d s R e s . 1 8 , 5 1 8 9 - 5 1 9 6 . C o v e l l o , P . S . , & G r a y , M . W . ( 1 9 9 0 b ) R N A s e q u e n c e a n d t h e n a t u r e o f t h e C u A - b i n d i n g s i t e i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . F E B S L e t t . 2 6 8 , 5 - 7 . C u m s k y , M . G . , T r u e b l o o d , C . E . , K 0 , C . , & P o y t o n , R D . ( 1 9 8 7 ) S t r u c t u r a l a n a l y s i s o f t w o g e n e s e n c o d i n g d i v e r g e n t f o r m s o f y e a s t c y t o c h r o m e c o x i d a s e s u b u n i t V . M o l . C e l l . B i o l . 7 , 3 5 1 1 - 3 5 1 9 . D a r l e y - U s m a r , V . M . , C a p a l d i , B . A . , & W i l s o n , M . T . ( 1 9 8 1 ) I d e n t i fi c a t i o n o f c y s t e i n e s i n s u b u n i t I I a s l i g a n d s t o t h e r e d o x c e n t e r s o f b o v i n e c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 0 3 , 1 2 2 3 - 1 2 3 0 . D a r l e y - U s m a r , V . M . , G e o r g e v i c h , G . , & C a p a l d i , R A . ( 1 9 8 4 ) R e a c t i o n o f t h i o n i t r o b e n z o a t e - m o d i fi e d y e a s t c y t o c h r o m e c w i t h m o n o m e r i c a n d d i m e r i c f o r m s o f b e e f h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e . F E B S L e t t . 1 6 6 , 1 3 1 - 1 3 5 . D a y , D . A . , & H a n s o n , J . B . ( 1 9 7 7 ) O n m e t h o d s f o r t h e i s o l a t i o n o f m i t o c h o n d r i a f r o m e t i o l a t e d c o r n s h o o t s . P l a n t S c i . L e t t . 1 1 , 9 9 - 1 0 4 . ‘ . E I - n - T “ “ . r I 2 7 1 D a y , D . A . , & W i s k i c h , J . T . ( 1 9 8 4 ) T r a n s p o r t p r o c e s s e s o f i s o l a t e d p l a n t m i t o c h o n d r i a . P h y s i o l . V e g . 2 2 , 2 4 1 - 2 6 1 . D a y , D . A . , N e u b e r g e r , M . , & D o u c e , R . ( 1 9 8 5 ) I n t e r a c t i o n s b e t w e e n g l y c i n e d e c a r b o x y l a s e , t h e t r i c a r b o x y l i c a c i d c y c l e a n d t h e r e s p i r a t o r y c h a i n i n p e a l e a f m i t o c h o n d r i a . A u s t . J . P l a n t P h y s i o l . 1 2 , 1 1 9 - 1 3 0 . D a y h o f f , M O . a n d S c h w a r t z , R M . ( 1 9 8 1 ) E v i d e n c e o n t h e o r i g i n o f e u k a r y o t i c m i t o c h o n d r i a f r o m p r o t e i n a n d n u c l e i c a c i d s e q u e n c e s . A n n a l s N Y . A c a d . S c i . 3 6 1 , 9 2 - 1 0 4 . D e a t h e r a g e , J . F . , H e n d e r s o n , R . , & C a p a l d i , R A . ( 1 9 8 2 ) T h r e e - d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e s o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e v e s i c l e c r y s t a l s i n n e g a t i v e s t a i n . J . M o l . B i o l . 1 5 8 , 4 8 7 - 4 9 9 . - D e i s e n h o f e r , J . , E p p , 0 . , M i k i , K . , H u b e r , R . , & M i c h e l , H . ( 1 9 8 5 ) S t r u c t u r e o f t h e p r o t e i n s u b u n i t s i n t h e p h o t o s y n t h e t i c r e a c t i o n c e n t r e o f R h o d o p s e u d o m o n a s v i r d i s a t 3 A r e s o l u t i o n . N a t u r e 3 1 8 , 6 1 8 - 6 2 3 . d e P a u l a , J . C . , P e i f f e r , W . E . , I n g l e , R . T . , C e n t e n o , J . A . , F e r g u s o n - M i l l e r , S . , & B a b c o c k , G . T . ( 1 9 9 0 ) H e m e s a a n d a 3 e n v i r o n m e n t s o f p l a n t c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 2 9 , 8 7 0 2 - 8 7 0 6 . d e V i r v i l l e , J . D . , & M o r e a u , F . ( 1 9 8 4 ) E l e c t r o g e n i c p r o t o n e x t r u s i o n c o u p l e d t o s u c c i n a t e o x i d a t i o n i n p l a n t m i t o c h o n d r a . P h y s i o l . V e g . 2 2 , 5 9 7 - 6 0 6 . d e V i r v i l l e , J . D . , & M o r e a u , F . ( 1 9 9 0 ) E f f e c t o f m e m b r a n e c o n d u c t a n c e o n p r o t o n / e l e c t r o n s t o i c h i o m e t r y o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e a c t i v i t y i n p l a n t m i t o c h o n d r i a . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 1 0 1 5 , 4 6 4 - 4 7 0 . d e V r i j , W . , A z z i , A . , & K o n i n g s , W . N . ( 1 9 8 3 ) S t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l p r o p e r t i e s o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e fi - o m B a c i l l u s s u b t i l i s W 2 3 . E u r . J . B i o c h e m . 1 3 1 , 9 7 - 1 0 3 . D e w e y , R . E . , L e v i n g s , 0 . 8 . , I I I , & T i m o t h y , D H . ( 1 9 8 6 ) N o v e l r e c o m b i n a t i o n s i n t h e m a i z e m i t o c h o n d r i a l g e n o m e p r o d u c e a u n i q u e t r a n s c r i p t i o n a l u n i t i n t h e T e x a s m a l e - s t e r i l e c y t o p l a s m . C e l l 4 4 , 4 3 9 - 4 4 9 . D e w e y , R . E . , S i e d o w , J . N . , T i m o t h y , D . H . , & L e v i n g s , C . S . , I I I . ( 1 9 8 8 ) A 1 3 - k i l o d a l t o n m a i z e m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n i n E . c o l i c o n f e r s s e n s i t i v i t y t o B i p o l a r i s m a y d i s t o x i n . S c i e n c e 2 3 9 , 2 9 3 - 2 9 5 . D e w e y , R . E . , T i m o t h y , D . H . , & L e v i n g s , C . S . , I I I . ( 1 9 8 7 ) A m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n a s s o c i a t e d w i t h c y t o p l a s m i c m a l e s t e r i l i t y i n t h e T c y t o p l a s m o f m a i z e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 8 4 , 5 3 7 4 - 5 3 7 8 . D e w e y , R . E . , T i m o t h y , D . H . , & L e v i n g s , C . S . , I I I . ( 1 9 9 1 ) C h i m e r i c m i t o c h o n d r i a l g e n e s e x p r e s s e d i n t h e c m a l e - s t e r i l e c y t o p l a s m o f m a i z e . C u r r . G e n e t . 2 0 , 4 7 5 - 4 8 2 . 2 7 2 D i x o n , L . K . , & L e a v e r , C . J . ( 1 9 8 2 ) M i t o c h o n d r i a l g e n e e x p r e s s i o n a n d c y t o p l a s m i c m a l e s t e r i l i t y i n s o r g h u m . P l a n t M o l e c . B i o . 1 , 8 9 - 1 0 2 . D i x o n , L . K . , L e a v e r , C . J . , B r e t t e l l , R . I . S . , & G e n g e n b a c h , B . G . ( 1 9 8 2 ) M i t o c h o n d r i a l s e n s i t i v i t y t o D r e s c h l e r a m a y d i s T - t o x i n a n d t h e s y n t h e s i s o f a v a r i a n t m i t o c h o n d r i a l p o l y p e p t i d e i n p l a n t s d e r i v e d f r o m m a i z e t i s s u e c u l t u r e s w i t h T e x a s m a l e - s t e r i l e c y t o p l a s m . T h e o r . A p p l . G e n e t . 6 3 , 7 5 - 8 0 . D o u c e , R . , & B o n n e r , W . D . , J r . ( 1 9 7 2 ) O x a l o a c e t a t e c o n t r o l o f K r e b s c y c l e o x i d a t i o n s i n p u r i fi e d p l a n t m i t o c h o n d r i a . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 4 7 , 6 1 9 - 6 2 4 . D o u c e , R . , & N e u b u r g e r , M . ( 1 9 8 9 ) T h e u n i q u e n e s s o f p l a n t m i t o c h o n d r i a . A n n . R e v . P l a n t P h y s i o l . P l a n t M o l . B i o l . 4 0 , 3 7 1 - 4 1 4 . D o w n e r , N . W . , R o b i n s o n , N . C . , & C a p a l d i , R A . ( 1 9 7 6 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f a s e v e n t h d i f f e r e n t s u b u n i t o f b e e f h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e . S i m i l a r i t i e s b e t w e e n t h e b e e f h e a r t e n z y m e a n d t h a t fi ' o m o t h e r s p e c i e s . B i o c h e m i s t r y 1 5 , 2 9 3 0 - 2 9 3 6 . D r y , I . B . , D a y , D . A . , & W i s k i c h , J . T . ( 1 9 8 3 ) P r e f e r e n t i a l o r n ' d a t i o n o f g l y c i n e b y t h e r e s p i r a t o r y c h a i n o f p e a l e a f m i t o c h o n d r i a . F E B S L e t t . 1 5 8 , 1 5 4 - 1 5 8 . D r y , I . B . , M o o r e , A . L . , D a y , D . A . , & W i s l n ' c h , J . T . ( 1 9 8 9 ) R e g u l a t i o n o f a l t e r n a t i v e p a t h w a y a c t i v i t y i n p l a n t m i t o c h o n d r i a : N o n l i n e a r r e l a t i o n s h i p b e t w e e n fl u x a n d t h e r e d o x p o i s e o f t h e q u i n o n e p o o l . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 2 7 3 , 1 4 8 - 1 5 7 . D u e w e k e , T . J . , & G e n n i s , R B . ( 1 9 9 1 ) P r o t e o l y s i s o f t h e c y t o c h r o m e d c o m p l e x w i t h t r y p s i n a n d c h y m o t r y p s i n l o c a l i z e s a q u i n o l o x i d a s e d o m a i n . B i o c h e m i s t r y 3 0 , 3 4 0 1 - 3 4 0 6 . D u t c h , R . , I n g l e , R . , C e n t e n o , J . , P e i f f e r , W . , B a b c o c k , G . & F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 1 9 8 7 ) C y t o c h r o m e o x i d a s e f r o m e t i o l a t e d c o r n s e e d l i n g s . P l a n t M i t o c h o n d r i a : S t r u c t u r a l , f u n c t i o n a l , a n d p h y s i o l o g i c a l a s p e c t s . ( A . L . M o o r e & R . B . B e e c h e y , e d s . ) , P l e n u m P u b l i s h i n g , 3 0 1 - 3 0 4 . D u t t o n , P . L . , & S t o r e y , B . T . ( 1 9 7 1 ) T h e r e s p i r a t o r y c h a i n o f m i t o c h o n d r i a . I X . O x i d a t i o n - r e d u c t i o n p o t e n t i a l s o f t h e c y t o c h r o m e s o f m u n g b e a n m i t o c h o n d r i a . P l a n t P h y s i o l . 4 7 , 2 8 2 - 2 8 8 . E b b i g h a u s e n , H . , H a t c h , M . D . , L i l l e y , R . M c C . , K r t i m e r , S . , S t i t t , M . , & H e l d t , H . W . ( 1 9 8 7 ) O n t h e f u n c t i o n o f m a l a t e - o x a l o a c e t a t e s h u t t l e s i n a p l a n t c e l l . i n P l a n t m i t o c h o n d r i a : S t r u c t u r a l , f u n c t i o n a l , a n d p h y s i o l o g i c a l a s p e c t s . ( A . L . M o o r e a n d R B . B e e c h e y , e d s . ) , P l e n u m P u b l i s h i n g , 1 7 1 - 1 8 0 . I f ? " ’ r m : - 2 7 3 E d m a n , K . , E r i c s o n , I . , & M u l l e r , I . M ( 1 9 8 5 ) T h e r e g u l a t i o n o f e x o g e n o u s N A D ( P ) H o x i d a t i o n i n s p i n a c h ( S p i n a c i a o l e r a c e a ) l e a f m i t o c h o n d r i a b y p H a n d c a t i o n s . B i o c h e m . J . 2 3 2 , 4 7 1 - 4 7 7 . E i n a r s d o t t i r , O . & C a u g h e y , W . S . ( 1 9 8 4 ) Z i n c i s a c o n s t i t u e n t o f b o v i n e h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e p r e p a r a t i o n s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 2 4 , 8 3 6 - 8 4 2 . E i n a r s d é t t i r , O . , & C a u g h e y , W . S . ( 1 9 8 5 ) B o v i n e h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e p r e p a r a t i o n s c o n t a i n h i g h a fi n i t y b i n d i n g s i t e s f o r m a g n e s i u m a s w e l l a s f o r z i n c , c o p p e r , a n d h e m e i r o n . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 2 9 , 8 4 0 - 8 4 7 . E i n a r s d o t t i r , C . , C h o c , M . G . , W e l d o n , 5 . , & C a u g h e y , W . S . ( 1 9 8 8 ) T h e s i t e a n d m e c h a n i s m o f d i o x y g e n r e d u c t i o n i n b o v i n e h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e . J . B i o l . C h e m . 2 6 3 , 1 3 6 4 1 - 1 3 6 5 4 . E l t h o n , T . E . , & M c I n t o s h , L . ( 1 9 8 7 ) I d e n t i fi c a t i o n o f t h e a l t e r n a t i v e t e r m i n a l o x i d a s e o f h i g h e r p l a n t m i t o c h o n d r i a . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 8 4 , 8 3 9 9 - 8 4 0 3 . E l t h o n , T . E . , N i c k e l s , R . L . , & M c I n t o s h , L . ( 1 9 8 9 a ) M i t o c h o n d r i a l e v e n t s d u r i n g d e v e l o p m e n t o f t h e r m o g e n e s i s i n S a u r o m a t u m g u t t a t u m ( S c h o t t ) . P l a n t a 1 8 0 , 8 2 - 8 9 . E l t h o n , T . E . , N i c k e l s , R . L . , & M c I n t o s h , L . ( 1 9 8 9 b ) M o n o c l o n a l a n t i b o d i e s t o t h e a l t e r n a t i v e o x i d a s e o f h i g h e r p l a n t m i t o c h o n d r i a . P l a n t P h y s i o l . 8 9 , 1 3 1 1 - 1 3 1 7 . E r r e d e , B . , & K a m e n , M D . ( 1 9 7 8 ) C o m p a r i t i v e s t u d i e s o f c y t o c h r o m e s c i n r e a c t i o n s w i t h m i t o c h o n d r i a l c y t o c h r o m e c o x i d a s e a n d r e d u c t a s e . B i o c h e m i s t r y 1 7 , 1 0 1 5 - 1 0 2 7 . E r r e d e , B . , K a m e n , M . D . , & H a t e fi , Y . ( 1 9 7 8 ) P r e p a r a t i o n a n d p r o p e r t i e s o f c o m p l e x N ( f e r r o c y t o c h r o m e c : o x y g e n o x i é . o r e d u c t a s e E C 1 . 9 . 3 . 1 ) M e t h . E n z . 5 3 , 4 0 - 4 7 . E s c o t e , L . J . , G a b a y - L a u g h n a n , S . J . , & L a u g h n a n , J . R . ( 1 9 8 5 ) C y t o p l a s m i c r e v e r s i o n t o f e r t i l i t y i n c m s - S m a i z e n e e d n o t i n v o l v e l o s s o f l i n e a r m i t o c h o n d r i a l p l a s m i d s . P l a s m i d 1 4 , 2 6 4 - 2 6 7 . E y t a n , G . D . , & S c h a t z , G . ( 1 9 7 5 ) C y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m b a k e r s ’ y e a s t : A r r a n g e m e n t o f t h e s u b u n i t s i n t h e i s o l a t e d a n d m e m b r a n e - b o u n d e n z y m e . J . B i o l . C h e m . 2 5 0 , 7 6 7 - 7 7 4 . F e e , J . A . , C h o c , M . G . , F i n d l i n g , K . L . , L o r e n c e , R . , Y o s h i d a , T . ( 1 9 8 0 ) P r o p e r t i e s o f a c o p p e r - c o n t a i n i n g c y t o c h r o m e c 1 a a 3 c o m p l e x : A t e r m i n a l o x i d a s e o f t h e e x t r e m e t h e r m o p h i l e T h e r m u s t h e r m o p h i l u s H B 8 . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 7 7 , 1 4 7 - 1 5 1 . 2 7 4 F e r g u s o n - M i l l e r , S . , B r a u t i g a n , D . L . & M a r g o l i a s h , E . ( 1 9 7 6 ) C o r r e l a t i o n o f t h e k i n e t i c s o f e l e c t r o n t r a n s f e r a c t i v i t y o f v a r i o u s e u k a r y o t i c c y t o c h r o m e s c w i t h b i n d i n g t o m i t o c h o n d r i a l c y t o c h r o m e c o x i d a s e . J . B i o l . C h e m . 2 5 1 , 1 1 0 4 - 1 1 1 5 . F e r g u s o n - M i l l e r , S . , B r a u t i g a n , D . L . , & M a r g o l i a s h , E . ( 1 9 7 8 ) D e fi n i t i o n o f c y t o c h r o m e c b i n d i n g d o m a i n s b y c h e m i c a l m o d i fi c a t i o n . J . B i o l . C h e m . 2 5 3 , 1 4 9 - 1 5 9 . F e r r e i r a - R a j a b i , L . , & H i l l , B C . ( 1 9 8 9 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f r e d u c t a n t - i n d u c e d , t r y p t o p h a n fl u o r e s c e n c e c h a n g e s i n c y t o c h r o m e o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 2 8 , 8 0 2 8 - 8 0 3 2 . F e t t e r , J . , H o s l e r , J . P . , S h a p l e i g h , J . P . , T e c k l e n b u r g , M . M . J . , G e n n i s , R . B . , B a b c o c k , G . T . , & F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 1 9 9 2 ) A n a l y s i s o f p r o t o n p u m p i n g b y s i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s o f R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o p h y s . J . 6 1 , A 2 0 3 . F i n e l , M . & W i k s t r o m , M . ( 1 9 8 6 ) S t u d i e s o n t h e r o l e o f t h e o l i g o m e r i c s t a t e a n d s u b u n i t I I I o f c y t o c h r o m e o x i d a s e i n p r o t o n p u m p i n g . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 8 5 1 , 9 9 - 1 0 8 . F i n e l , M . ( 1 9 8 7 ) S t u d i e s o n t h e o l i g o m e r i c s t a t e o f i s o l a t e d c y t o c h r o m e o x i d a s e u s i n g c r o s s - l i n k i n g m a g e n t a . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 8 9 4 , 1 7 4 - 1 7 9 . F i n e l , M . ( 1 9 8 8 ) P r o t e o l y s i s o f P a r a c o c c u s d e n i t r i fl c a n s c y t o c h r o m e o x i d a s e b y t r y p s i n a n d c h y m o t r y p s i n . F E B S L e t t . 2 3 6 , 4 1 5 - 4 1 9 . F i n n i g a n , P . M . , & B r o w n , G . G . ( 1 9 9 0 ) T r a n s c r i p t i o n a l a n d p o s t - t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n o f R N A l e v e l s i n m a i z e m i t o c h o n d r i a . P l a n t C e l l 2 , 7 1 - 8 3 . F l a v e l l , R . ( 1 9 7 4 ) A m o d e l f o r t h e m e c h a n i s m o f c y t o p l a s m i c m a l e s t e r i l i t y i n p l a n t s , w i t h s p e c i a l r e f e r e n c e t o m a i z e . P l a n t S c i . L e t t . 3 , 2 5 9 - 2 6 3 . F o r d e , B . G . , & L e a v e r , C . J . ( 1 9 8 0 ) N u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c g e n e s c o n t r o l l i n g s y n t h e s i s o f v a r i a n t m i t o c h o n d r i a l p o l y p e p t i d e s i n m a l e - s t e r i l e m a i z e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 7 7 , 4 1 8 - 4 2 2 . F o r d e , B . G . , O l i v e r , R . J . C . , & L e a v e r , C . J . ( 1 9 7 8 ) V a r i a t i o n i n m i t o c h o n d r i a l t r a n s l a t i o n p r o d u c t s a s s o c i a t e d w i t h m a l e - s t e r i l e c y t o p l a s m s i n m a i z e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 7 5 , 3 8 4 1 - 3 8 4 5 . F o w l e r , L . R . , R i c h a r d s o n , S . H . , & H a t e fi , Y . ( 1 9 6 2 ) A r a p i d m e t h o d f o r t h e p r e p a r a t i o n o f h i g h l y p u r i fi e d c y t o c h r o m e o x i d a s e . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 6 4 , 1 7 0 - 1 7 3 . F o x , T . D . , & L e a v e r , C . J . ( 1 9 8 1 ) T h e Z e a m a y s m i t o c h o n d r i a l g e n e c o d i n g c y t o c h r o m e o x i d a s e s u b u n i t I I h a s a n i n t e r v e n i n g s e q u e n c e a n d d o e s n o t c o n t a i n T G A c o d o n s . C e l l 2 6 , 3 1 5 - 3 2 3 . I ’ I l ' i ' 2 7 5 F r a n t z e n , K A . , D a l y , J . M . , & K n o c h , H . W . ( 1 9 8 7 ) T h e b i n d i n g o f h o s t - s e l e c t i v e t o x i n a n a l o g s t o m i t o c h o n d r i a f r o m n o r m a l a n d ‘ T e x a s ’ m a l e s t e r i l e c y t o p l a s m m a i z e . P l a n t P h y s i o l . 8 3 , 8 6 3 - 8 6 8 . F r e y , T . G . , C h a n , S . H . P . , & S c h a t z , G . ( 1 9 7 8 ) S t r u c t u r e a n d o r i e n t a t i o n o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e i n c r y s t a l l i n e m e m b r a n e s . S t u d i e s b y e l e c t r o n m i c r o s c o p y a n d b y l a b e l i n g w i t h s u b u n i t - s p e c i fi c a n t i b o d i e s . J . B i o l . C h e m . 2 5 3 , 4 3 8 9 - 4 3 9 5 . F u l l e r , S . D . , C a p a l d i , B . A . , & H e n d e r s o n , R . ( 1 9 7 9 ) S t r u c t u r e o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e i n d e o x y c h o l a t e - d e r i v e d t w o - d i m e n s i o n a l c r y s t a l s . J . M o l . B i o l . 1 3 4 , 3 0 5 - 3 2 7 . F u l l e r , S . D . , D a r l e y - U s m a r , V . M . , & C a p a l d i , R A . ( 1 9 8 1 ) C o v a l e n t c o m p l e x b e t w e e n y e a s t c y t o c h r o m e c a n d b e e f h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e w h i c h i s a c t i v e i n e l e c t r o n t r a n s f e r . B i o c h e m i s t r y 2 0 , 7 0 4 6 - 7 0 5 3 . G a l a n t e , Y . M . , & H a t e fi , Y . ( 1 9 7 8 ) R e s o l u t i o n o f c o m p l e x I a n d i s o l a t i o n o f N A D H d e h y d r o g e n a s e a n d a n i r o n - s u l f u r p r o t e i n . M e t h . E n z . 5 3 , 1 5 - 2 1 . G a r b e r , E . A . E . , M a r g o l i a s h , E . ( 1 9 9 0 ) I n t e r a c t i o n o f c y t o c h r o m e c w i t h c y t o c h r o m e c o x i d a s e : a n u n d e r s t a n d i n g o f t h e h i g h - t o l o w - a f fi n i t y t r a n s i t i o n . B i o c h i m . B i o p h y s L A c t a 1 0 1 5 , 2 7 9 - 2 8 7 . G e l l e s , J . , & C h a n , S . I . ( 1 9 8 5 ) C h e m i c a l m o d i fi c a t i o n o f t h e C u A c e n t e r i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e b y s o d i u m p - ( h y d r o x y m e r c u r i ) b e n z o a t e . B i o c h e m i s t r y 2 4 , 3 9 6 3 - 3 9 7 2 . G e l l e s , J . , B l a i r , D . F . , C h a n , S J . ( 1 9 8 6 ) T h e p r o t o n - p u m p i n g s i t e o f c y t o c h r o m e o x i d a s e : A m o d e l o f i t s s t r u c t u r e a n d m e c h a n i s m . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 8 5 3 , 2 0 5 - 2 3 6 . G e n g e n b a c h , B . , K o e p p e , D . E . , & M i l l e r , R . J . ( 1 9 7 3 a ) A c o m p a r i s o n o f m i t o c h o n d r i a i s o l a t e d fi o m m a l e - s t e r i l e a n d n o n s t e r i l e c y t o p l a s m e t i o l a t e d c o r n s e e d l i n g s . P h y s i o l . P l a n t . 2 9 , 1 0 3 - 1 0 7 . G e n g e n b a c h , B . G . , M i l l e r , R . J . , K o e p p e , D . E . , & A r n t z e n , C . J . ( 1 9 7 3 b ) T h e e f f e c t o f t o x i n f r o m H e l m i n t h s p o r i u m m a y d i s ( r a c e T ) o n i s o l a t e d c o r n m i t o c h o n d r i a : S w e l l i n g . C a n . J . B o t . 5 1 , 2 1 1 9 - 2 1 2 5 . G e n n i s , R . B . , C a s e y , R . P . , A z z i , A . , & L u d w i g , B . ( 1 9 8 2 ) P u r i fi c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m R h o d o p s e u d o m o n a s s p h a e r o i d e s . E u r . J . B i o c h e m . 1 2 5 , 1 8 9 - 1 9 5 . G e o r g e v i c h , G . , D a r l e y - U s m a r , V . M . , M a l a t e s t a , F . , & C a p a l d i , R A . ( 1 9 8 3 ) E l e c t r o n t r a n s f e r i n m o n o m e r i c f o r m s o f b e e f a n d s h a r k h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 2 2 , 1 3 1 7 - 1 3 2 2 . 2 7 6 G e r s o n d e , K . , Y u , N . - T . , L i n , S . - H . , S m i t h , K . M . , & P a r i s h , D . W . ( 1 9 8 9 ) R e s o n a n c e R a m a n a s s i g n m e n t a n d e v i d e n c e f o r n o n c o u p l i n g o f i n d i v i d u a l 2 - a n d 4 - v i n y l v i b r a t i o n a l m o d e s i n a m o n o m e r i c c y a n o m e t h e m o g l o b i n . B i o c h e m i s t r y 2 8 , 3 9 6 0 - 3 9 6 6 . G i b s o n , Q . H . , G r e e n w o o d , C . , W h a r t o n , D . C . , & P a l m e r , G . ( 1 9 6 5 ) T h e r e a c t i o n o f c y t o c h r o m e o x i d a s e w i t h c y t o c h r o m e c . J . B i o l . C h e m . 2 4 0 , 8 8 8 - 8 9 4 . G l a b , N . , W i s e , R . P . , P r i n g , D . R . , J a c q , C . , & S l o m i n s k i , P . ( 1 9 9 0 ) E x p r e s s i o n i n S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e o f a g e n e a s s o c i a t e d w i t h c y t o p l a s m i c m a l e s t e r i l i t y f r o m m a i z e : R e s p i r a t o r y d y s f u n c t i o n a n d u n c o u p l i n g o f y e a s t m i t o c h o n d r i a . M o l . G e n . G e n e t . 2 2 3 , 2 4 - 3 2 . G o d d a r d , D R . ( 1 9 4 4 ) C y t o c h r o m e c a n d c y t o c h r o m e o x i d a s e f r o m w h e a t g e r m . A m . J . B o t . 3 1 , 2 7 0 - 2 7 6 . G o o d m a n , G . ( 1 9 8 4 ) M e t a l s i t e c o o p e r a t i v i t y w i t h i n c y t o c h r o m e o x i d a s e . J . B i o l . C h e m . 2 5 9 , 1 5 0 9 4 - 1 5 0 9 9 . G o t o , Y . , A m u r o , N . , & S h u k u y a , R . ( 1 9 8 2 ) C y t o c h r o m e c o x i d a s e fi - o m t h e l i v e r o f b u l l fi ° o g , R a n a c a t e s b e i a n a a n d c h a n g e i n i t s t u r n o v e r r a t e d u r i n g m e t a m o r p h o s i s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 7 1 9 , 1 0 2 - 1 0 9 . t “ . G o y a l , A . , H i s e r , C . , N . E . T o l b e r t , & M c I n t o s h , L . ( 1 9 9 1 ) P r o g r e s s N o . 9 c u l t i v a r o f p e a h a s a l t e r n a t i v e r e s p i r a t o r y c a p a c i t y a n d n o r m a l g l y c i n e m e t a b o l i s m . P l a n t C e l l P h y s i o l . 3 2 , 2 4 7 - 2 5 1 . G r a v e s , P . V . , B e g u , D . , V e l o u r s , J . , N e a u , E . , B e l l o c , F . , L i t v a k , S . , & A r a y a , A . ( 1 9 9 0 ) D i r e c t p r o t e i n s e q u e n c i n g o f w h e a t m i t o c h o n d r i a l A T P s y n t h a s e s u b u n i t 9 c o n fi r m s R N A e d i t i n g i n p l a n t s . J . M o l . B i o l . 2 1 4 , 1 - 6 . G r a y , M . W . , C e d e r g r e n , R . , A b e l , Y . , & S a n k o f f , D . ( 1 9 8 9 ) O n t h e e v o l u t i o n a r y o r i g i n o f t h e p l a n t m i t o c h o n d r i a n a n d i t s g e n o m e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 8 6 , 2 2 6 7 - 2 2 7 1 . G r a y , M . W . , S a n k o f f , D . , & C e d e r g r e n , R . J . ( 1 9 8 4 ) O n t h e e v o l u t i o n a r y d e s c e n t o f o r g a n e l l e s : a g l o b a l p h y l o g e n y b a s e d o n a h i g h l y c o n s e r v e d s t r u c t u r a l c o r e i n s m a l l s u b u n i t r i b o s o m a l R N A . N u c l . A c i d s R e s . 1 2 , 5 8 3 7 - 5 8 5 1 . G r e g o r y , L . , & F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 1 9 8 9 ) I n d e p e n d e n t c o n t r o l o f r e s p i r a t i o n i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e v e s i c l e s b y p H a n d e l e c t r i c a l g r a d i e n t . B i o c h e m i s t r y 2 8 , 2 6 5 5 - 2 6 6 2 . G r e g o r y , R , G r a c e n , V . E . , Y o d e r , O . C . , & S t e i n k r a u s , N A ( 1 9 7 7 ) D i f f e r e n t i a l e f f e c t s o f d i g i t o n i n o n m i t o c h o n d r i a i s o l a t e d f r o m m a l e - s t e r i l e a n d n o n — m a l e - s t e r i l e c y t o p l a s m s o f c o r n . P l a n t S c i . L e t t . 9 , 1 7 - 2 1 . 2 7 7 G r e g o r y , R , M a t t h e w s , D . E . , Y o r k , D . W . , E a r l e , E . D . , & G r a c e n , V . E . ( 1 9 7 8 ) S o u t h e r n c o r n l e a f b l i g h t d i s e a s e : S t u d i e s o n m i t o c h o n d r i a l b i o c h e m i s t r y a n d u l t r a s t r u c t u r e . M y c o p a t h o l o g i a 6 6 , 1 0 5 - 1 1 2 . G u a l b e r t o , J . M . , L a m a t t i n a , L . , B o n n a r d , G . , W e i l , J . - H . , & G r i e n e n b e r g e r , J . - M . ( 1 9 8 9 ) R N A e d i t i n g i n w h e a t m i t o c h o n d r i a r e s u l t s i n t h e c o n s e r v a t i o n o f p r o t e i n s e q u e n c e s . N a t u r e 3 4 1 , 6 6 0 - 6 6 2 . G u a l b e r t o , J . M . , W e i l , J . - H . , & G r i e n e n b e r g e r , J . - M . ( 1 9 9 0 ) E d i t i n g o f t h e w h e a t c o x I I I t r a n s c r i p t : E v i d e n c e f o r t w e l v e C t o U a n d o n e U t o C c o n v e r s i o n s a n d f o r s e q u e n c e s i m i l a r i t i e s a r o u n d e d i t i n g s i t e s . N u c l . A c i d s R e s . 1 8 , 3 7 7 1 - 3 7 7 6 . H a c k , E . , & L e a v e r , C . J . ( 1 9 8 3 ) T h e a - s u b u n i t o f t h e m a i z e F l - A T P a s e i s s y n t h e s i z e d i n t h e m i t o c h o n d r i a . E M B O J . 2 , 1 7 8 3 - 1 7 8 9 . H a k v o o r t , T . E . M , M o o l e n a a r , K . , L a n k v e l t , A . H . M . , S i n j o r g o , K . M . C . , D e k k e r , H . L . , & M u i j s e r s , A . O . ( 1 9 8 7 ) S e p e r a t i o n , s t a b i l i t y a n d k i n e t i c s o f m o n o m e r i c a n d d i m e r i c b o v i n e h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 8 9 4 , 3 4 7 - 3 5 4 . H a l a k a , F . G . , B a r n e s , Z . K . , B a b c o c k , G . T . , D y e , J . L . ( 1 9 8 4 ) R e d u c t i o n o f c y t o c h r o m e o x i d a s e b y 5 , 1 0 - d i h y d r o - 5 - m e t h y l p h e n a z i n e : K i n e t i c p a r a m e t e r s f r o m r a p i d - s c a n n i n g s t o p p e d - fl o w e x p e r i m e n t s . B i o c h e m i s t r y 2 3 , 2 0 0 5 - 2 0 1 1 . H a l t i a , T . a n d W i k s t r t i m , M . ( 1 9 9 2 ) C y t o c h r o m e o x i d a s e : N o t e s o n s t r u c t u r e a n d m e c h a n i s m . M o l e c u l a r M e c h a n i s m i n B i o e n e r g e t i c s E l s e v i e r , E d . L . E r n s t e r , i n p r e s s . H a l t i a , T . , F i n e l , M . , H a r m s , N . , N a k a r i , T . , R a i t i o , M . , W i k s t r o m , M . , & S a r a s t e , M . ( 1 9 8 9 ) D e l e t i o n o f t h e g e n e f o r s u b u n i t I I I l e a d s t o d e f e c t i v e a s s e m b l y o f b a c t e r i a l c y t o c h r o m e o x i d a s e . E M B O J . 8 , 3 5 7 1 - 3 5 7 9 . H a l t i a , T . , P u u s t i n e n , A . , & F i n e l , M . ( 1 9 8 8 ) T h e P a r a c o c c u s d e n i t r i fi c a n s c y t o c h r o m e a m ; h a s a t h i r d s u b u n i t . E u r . J . B i o c h e m . 1 7 2 , 5 4 3 - 5 4 6 . H a l t i a , T . , S a r a s t e , M . , & W i k s t r o m , M . ( 1 9 9 1 ) S u b u n i t I I o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e i s n o t i n v o l v e d i n p r o t o n t r a n s l o c a t i o n : A s i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s s t u d y . E M B O J . 1 0 , 2 0 1 5 - 2 0 2 1 . H a n s o n , M . E . , P r u i t t , K . D . , & N i v i s o n , H T . ( 1 9 8 9 ) M a l e s t e r i l i t y l o c i i n p l a n t m i t o c h o n d r i a l g e n o m e s . O x f o r d s u r v e y s o f p l a n t m o l e c u l a r & c e l l b i o l o g y 6 , 6 1 - 8 5 . H a r t l , F . - U . , & N e u p e r t , W . ( 1 9 9 0 ) P r o t e i n s o r t i n g t o m i t o c h o n d r i a : E v o l u t i o n a r y c o n s e r v a t i o n s o f f o l d i n g a n d a s s e m b l y . S c i e n c e 2 4 7 , 9 3 0 - 9 3 8 . 2 7 8 H a r t z e l l , C . R . , & B e i n e r t , H . ( 1 9 7 4 ) C o m p o n e n t s o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e d e t e c t a b l e b y E P R s p e c t r o s c o p y . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 3 6 8 , 3 1 8 - 3 3 8 . H a w k e s f o r d , M . J . , L i d d e l l , A . D . , & L e a v e r , C . J . ( 1 9 8 9 ) S u b u n i t c o m p o s i t i o n o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e i n m i t o c h o n d r i a o f Z e a m a y s . P l a n t P h y s i o l . 9 1 , 1 5 3 5 - 1 5 4 2 . H e i n r i c h s , M . , & S c h b n e r t , H . ( 1 9 8 7 ) I d e n t i f i c a t i o n o f d i f f e r e n t q u a t e r n a r y s t r u c t u r e s o f b e e f h e a r t c y t o c h r o m e — c o x i d a s e b y t w o - d i m e n s i o n a l p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s . F E B S L e t t . 2 2 3 , 2 5 5 - 2 6 1 . H e n d e r s o n , R . , C a p a l d i , R . A . , & L e i g h , J . S . ( 1 9 7 7 ) A r r a n g e m e n t o f c y t o c h r o m e o x i d a s e m o l e c u l e s i n t w o - d i m e n s i o n a l v e s i c l e c r y s t a l s . J . M a l . B i o l . 1 1 2 , 6 3 1 - 6 4 8 . H i e s e l , R . , S c h o b e l , W . , S c h u s t e r , W . , & B r e n n i c k e , A . ( 1 9 8 7 ) T h e c y t o c h r o m e o x i d a s e s u b u n i t I a n d s u b u n i t I I I g e n e s i n O e n o t h e r a m i t o c h o n d r i a a r e t r a n s c r i b e d f r o m i d e n t i c a l p r o m o t e r s e q u e n c e s . E M B O J . 6 , 2 9 - 3 4 . H i e s e l , R . , W i s s i n g e r , B . , S c h u s t e r , W . , & B r e n n i c k e , A . ( 1 9 8 9 ) R N A e d i t i n g i n p l a n t m i t o c h o n d r i a . S c i e n c e 2 4 6 , 1 6 3 2 - 1 6 3 4 . H i l l , B C . ( 1 9 9 1 ) T h e r e a c t i o n o f t h e e l e c t r o s t a t i c c y t o c h r o m e c - c y t o c h r o m e o x i d a s e c o m p l e x w i t h o x y g e n . J . B i o l . C h e m . 2 6 6 , 2 2 1 9 - 2 2 2 6 . H i l l , B . C , & R o b i n s o n , N . C . ( 1 9 8 6 ) C y a n i d e b i n d i n g t o b o v i n e h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e d e p l e t e d o f s u b u n i t I I I b y t r e a t m e n t w i t h l a u r y l m a l t o s i d e . J . B i o l . C h e m . 2 6 1 , 1 5 3 5 6 - 1 5 3 5 9 . H o l d e n , M . J . , & S z e , H . ( 1 9 8 4 ) H e l m i n t h s p o r i u m m a y d i s , T t o x i n i n c r e a s e d m e m b r a n e p e r m e a b i l i t y t o C a 2 + i n s u s c e p t i b l e c o r n m i t o c h o n d r i a . P l a n t P h y s i o l . 7 5 , 2 3 5 - 2 3 7 . H o l d e n , M . J . , & S z e , H . ( 1 9 8 7 b ) D i s s p i a t i o n o f t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l i n s u s c e p t i b l e c o r n m i t o c h o n d r i a b y t h e t o x i n o f H e l m i n t h a s p a r i u m m a y d i s , r a c e T , a n d t o x i n a n a l o g s . P l a n t P h y s i o l . 8 4 , 6 7 0 - 6 7 6 . H o l d e n , M . J . , C o l o m b i n i , M . , & S z e , H . ( 1 9 8 5 ) C h a n n e l f o r m a t i o n i n p h o s p h o l i p i d b i l a y e r m e m b r a n e s b y t h e t o x i n o f H e l m i n t h s p o r i u m m a y d i s , r a c e T . J . M e m b r a n e B i o l . 8 7 , 1 5 1 - 1 5 7 . H o l d e n , M . J . , S z e , H . ( 1 9 8 7 a ) D i c y c l o h e x y l c a r b o d i i m i d e p r o t e c t s a g a i n s t H e l m i n t h a s p a r i u m m a y d i s r a c e T t o x i n a c t i o n o n s u s c e p t i b l e c o r n m i t o c h o n d r i a . i n P l a n t m i t o c h o n d r i a : S t r u c t u r a l , f u n c t i o n a l , a n d p h y s i o l o g i c a l a s p e c t s . A . L . M o o r e a n d R B . B e e c h e y , e d s . , P l e n u m P u b , l i s h i n g 3 0 5 - 3 0 8 . H o l m , L . , S a r a s t e , M . , & W i k s t r o m , M . ( 1 9 8 7 ) S t r u c t u r a l m o d e l s o f t h e r e d o x c e n t r e s i n c y t o c h r o m e o x i d a s e . E M B O J . 6 , 2 8 1 9 - 2 8 2 3 . 2 7 9 H o l t , I . J . , H a r d i n g , A . E . , M o r g a n - H u g h e s , J . A . ( 1 9 8 9 ) D e l e t i o n s o f m u s c l e m i t o c h o n d r i a l D N A i n m i t o c h o n d r i a l m y o p a t h i e s : S e q u e n c e a n a l y s i s a n d p o s s i b l e m e c h a n i s m s . N u c l . A c i d s R e s . 1 7 , 4 4 6 5 - 4 4 6 9 . H o n - n a m i , K . , & O s h i m a , T . ( 1 9 8 4 ) P u r i fi c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m T h e r m u s t h e r m o p h i l u s H B 8 . B i o c h e m i s t r y 2 3 , 4 5 4 - 4 6 0 . H o s l e r , J . P . , F e t t e r , J . , T e c k l e n b u r g , M . M . J . , E s p e , M . , L e m a , C . , & F e r g u s o n - M i l l e r . ( 1 9 9 2 ) C y t o c h r o m e a m ; o f R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s ; a s a m o d e l f o r m i t o c h o n d r i a l c y t o c h r o m e c o x i d a s e : P u r i fi c a t i o n , l é i l r l r e e t i c s , p r o t o n p u m p i n g a n d s p e c t r a l a n a l y s i s . S u b m i t t e d t o J . B i o l . m . H u a n g , J . , L e e , S . - H . , L i n , C . , M e d i c i , R . , H a c k , E . , & M y e r s , A . M . ( 1 9 9 0 ) E x p r e s s i o n i n y e a s t o f t h e T - U R F 1 3 p r o t e i n f r o m T e x a s m a l e - s t e r i l e m a i z e m i t o c h o n d r i a c o n f e r s s e n s i t i v i t y t o m e t h o m y l a n d t o T e x a s - c y t o p l a s m - s p e c i f c f u n g a l t o x i n s . E M B O J . 9 , 3 3 9 - 3 4 7 . H u n t , M . D . , & N e w t o n , K J . ( 1 9 9 0 ) T h e N C S 3 m i t o c h o n d r i a l m u t a t i o n i n t e r r u p t s a t r a n s c r i p t e n c o d i n g S 3 - a n d L 1 6 - l i k e r i b o s o m a l p r o t e i n s . F o u r t h I n t e r n a t i o n a l W o r k s h o p o n P l a n t M i t o c h o n d r i a , C o r n e l l U n i v e r s i t y , I t h a c a , N e w Y o r k . H i i t h e r , F . - J . , & K a d e n b a c h , B . ( 1 9 8 6 ) S p e c i fi c e f f e c t s o f A T P o n t h e k i n e t i c s o f r e c o n s t i t u t e d b o v i n e h e a r t c y t o c h r o m H o x i d a s e . F E B S L e t t . 2 0 7 , 8 9 - 9 4 . H i i t h e r , F . - J . , & K a d e n b a c h , B . ( 1 9 8 7 ) A D P i n c r e a s e s t h e a f f i n i t y f o r c y t o c h r o m e c b y i n t e r a c t i o n w i t h t h e m a t r i x s i d e o f b o v i n e h e a r t c y t o c h r o m e c . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 4 7 , 1 2 6 8 - 1 2 7 5 . H i i t h e r , F . - J . , & K a d e n b a c h , B . ( 1 9 8 8 ) I n t r a l i p o s o m a l n u c l e o t i d e s c h a n g e t h e k i n e t i c s o f r e c o n s t i t u t e d c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m b o v i n e h e a r t b u t n o t f r o m P a r a c o c c u s d e n i t r i fi c a n s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 5 3 , 5 2 5 - 5 3 4 . I n g l e d e w , W . J . & B a c o n , M . ( 1 9 9 1 ) A c o m p a r a t i v e r e v i e w o f t h e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f c y t o c h r o m e a fi ' o m E s c h e r i c h i a c o l i a n d c y t o c h r o m e a a 3 . B i o c h e m . S o c . T r a n s . 1 9 , 6 1 3 - 6 1 6 . I s a a c , P . G . , B r e n n i c k e , A . , D u n b a r , S . M . , & L e a v e r , C . J . ( 1 9 8 5 ) T h e m i t o c h o n d r i a l g e n o m e o f f e r t i l e m a i z e ( Z e a m a y s L . ) c o n t a i n s t w o c o p i e s o f t h e g e n e e n c o d i n g t h e a - s u b u n i t o f t h e F 1 - A T P a s e . C u r r . G e n e t . 1 0 , 3 2 1 - 3 2 8 . I s a a c , P . G . , J o n e s , V . P . , & L e a v e r , C . J ( 1 9 8 5 ) T h e m a i z e c y t o c h r o m e c o x i d a s e s u b u n i t I g e n e : s e q u e n c e , e x p r e s s i o n a n d r e a r r a n g e m e n t i n c y t o p l a s m i c m a l e s t e r i l e p l a n t s . E M B O J . 4 , 1 6 1 7 - 1 6 2 3 . 2 8 0 I s h i d a , B . K . , & P a l m e r , J . M . ( 1 9 8 8 ) M e a s u r e m e n t s o f p r o t o n p u m p i n g i n A r u m m a c u l a t u m m i t o c h o n d r i a . P l a n t P h y s i o l . 8 8 , 9 8 7 - 9 8 9 . J a m e s , W . O . , & E l l i o t , D C . ( 1 9 5 5 ) C y a n i d e - r e s i s t a n t m i t o c h o n d r i a f r o m t h e s p a d i x o f a n A r u m . N a t u r e 1 7 5 , 8 9 . J a r a u s c h , J . , & K a d e n b a c h , B . ( 1 9 8 2 ) T i s s u e - s p e c i fi c i t y o v e r r i d e s s p e c i e s - s p e c i fi c i t y i n c y t o p l a s m i c c y t o c h r o m e c o x i d a s e p o l y p e p t i d e s . H a p p e - S e y l . Z . P h y s i o l . C h e m . 3 6 3 , 1 1 3 3 - 1 1 4 0 . J a r a u s c h , J . , & K a d e n b a c h , B . ( 1 9 8 5 a ) S t r u c t u r e o f t h e c y t o c h r o m e c o x i d a s e c o m p l e x o f r a t l i v e r . 1 . S t u d i e s o n n e a r e s t - n e i g h b o u r r e l a t i o n s h i p o f p o l y p e p t i d e s w i t h c r o s s - l i n k i n g r e a g e n t s . E u r . J . B i o c h e m . 1 4 6 , 2 1 1 - 2 1 7 . J a r a u s c h , J . , & K a d e n b a c h , B . ( 1 9 8 5 b ) S t r u c t u r e o f t h e c y t o c h r o m e c o x i d a s e c o m p l e x o f r a t l i v e r . 2 . T o p o l o g i c a l o r i e n t a t i o n o f p o l y p e p t i d e s i n t h e m e m b r a n e a s s t u d i e d b y p r o t e o l y t i c d i g e s t i o n a n d i m m u n o b l o t t i n g . E u r . J . B i o c h e m . 1 4 6 , 2 1 9 - 2 2 5 . J e n s e n , P . , W i l s o n , M . T . , A a s a , R . , & M a l m s t r t i m , B . G . ( 1 9 8 4 ) C y a n i d e i n h i b i t i o n o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e : a r a p i d - fi ' e e z e e . p . r . i n v e s t i g a t i o n . B i o c h e m . J . 2 2 4 , 8 2 9 - 8 3 7 . J o n e s , M . G . , B i c k a r , D . , W i l s o n , M . T . , B r u n o r i , M . , C o l o s i m o , A . , & S a r t i , P . ( 1 9 8 4 ) A r e - e x a m i n a t i o n o f t h e r e a c t i o n s o f c y a n i d e w i t h c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h e m . J . 2 2 0 , 5 7 - 6 6 . J u n g , D . W . , & H a n s o n , J . B . ( 1 9 7 3 ) R e s p i r a t o r y a c t i v a t i o n o f 2 , 4 - d i n i t r o p h e n o l - s t i m u l a t e d A T P a s e a c t i v i t y i n p l a n t m i t o c h o n d r i a . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 1 5 8 , 1 3 9 - 1 4 8 . J u n g , D . W . , & H a n s o n , J . B . ( 1 9 7 5 ) A c t i v a t i o n o f 2 , 4 - d i n i t r o p h e n o l s t i m u l a t e d A T P a s e a c t i v i t y i n c a u l i fl o w e r a n d c o r n m i t o c h o n d r i a . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 1 6 8 , 3 5 8 - 3 6 8 . K a d e n b a c h , B . J a r a u s c h , J . , H a r t m a n , R . , & M e r l e , P . ( 1 9 8 3 ) S e p a r a t i o n o f m a m m a l i a n c y t o c h r o m e c o r d d a s e i n t o 1 3 p o l y p e p t i d e s b y a s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e — g e l e l e c t r o p h o r e s i s p r o c e d u r e . A n a l . B i o c h e m . 1 2 9 , 5 1 7 - 5 2 1 . K a d e n b a c h , B . , & S t r o h , A . ( 1 9 8 4 ) D i f f e r e n t r e a c t i v i t y o f c a r b o x y l i c g r o u p s o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e p o l y p e p t i d e s fi ' o m p i g l i v e r a n d h e a r t . F E B S L e t t . 1 7 3 , 3 7 4 - 3 8 0 . K a d e n b a c h , B . , H a r t m a n n , R . , G l a n v i l l e , R . & B u s e , G . ( 1 9 8 2 ) T i s s u e - s p e c i fi c g e n e s c o d e f o r p o l y p e p t i d e V I a o f b o v i n e a n d h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e . F E E S L e t t . 1 3 8 , 2 3 6 - 2 3 8 . I " . 7 W Y S ! 2 8 1 K a d e n b a c h , B . , S t r o h , A . , B e c k e r , A . , E c k e r s k o m , C . , & L o t t s p e i c h , F . ( 1 9 9 0 ) T i s s u e - a n d s p e c i e s - s p e c i fi c e x p r e s s i o n o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e i s o z y m e s i n v e r t e b r a t e s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 1 0 1 5 , 3 6 8 - 3 7 2 . K a d e n b a c h , B . , S t r o h , A . , H i i t h e r , F . - J . , R e i m a n n , A . , & S t e v e r d i n g , D . ( 1 9 9 1 ) E v o l u t i o n a r y a s p e c t s o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e . J . B i a e n e r g . B i a m e m . 2 3 , 3 2 1 - 3 3 4 . K a d e n b a c h , B . , S t r o h , A . , U n g i b a u e r , M . , K u h n - N e n t w i g , L . , B i i g e , U . , & J a r a u s c h , J . ( 1 9 8 6 ) I s o z y m e s o f c y t o c h r o m e — c o x i d a s e : C h a r a c t e r i z a t i o n a n d i s o l a t i o n f r o m d i f f e r e n t t i s s u e s . M e t h . E n z . 1 2 6 , 3 2 - 4 5 . K e i g h t l e y , J . A . , M a t h e r , M . W . , S p r i n g e r , P . , & F e e , J . A . ( 1 9 9 2 ) M o l e c u l a r g e n e t i c s s t u d i e s o f c y t o c h r o m e b a g f r o m T h e r m u s t h e r m o p h i l u s ( T t ) : E v i d e n c e f o r a m u l t i s u b u n i t s t r u c t u r e a n d h o m o l o g y t o c y t o c h r o m e c a a 3 . F A S E B J . 6 , A 1 9 4 . K e i l i n , D . , & H a r t r e e , , E R ( 1 9 3 9 ) C y t o c h r o m e a n d c y t o c h r o m e o x i d a s e . P r o c . R . S o c . L o n d o n 1 2 7 , 1 6 7 - 1 9 1 . K e m b l e , R . J . , & B e d b r o o k , J . R . ( 1 9 8 0 ) L o w m o l e c u l a r w e i g h t c i r c u l a r a n d l i n e a r D N A i n m i t o c h o n d r i a f r o m n o r m a l a n d m a l e - s t e r i l e Z e a m a y s c y t o p l a s m . N a t u r e 2 8 4 , 5 6 5 - 5 6 6 . K e m b l e , R . J . , & T h o m p s o n , R D . ( 1 9 8 2 ) S 1 a n d 8 2 , t h e l i n e a r m i t o c h o n d r i a l D N A s p r e s e n t i n a m a l e s t e r i l e l i n e o f m a i z e , p o s s e s s t e r m i n a l l y a t t a c h e d p r o t e i n s . N u c l . A c i d s R e s . 1 0 , 8 1 8 1 - 8 1 9 0 . K e m b l e , R . J . , F l a v e l l , R . B . , & B r e t t e l l , R . I . S . ( 1 9 8 2 ) M i t o c h o n d r i a l D N A a n a l y s i s o f f e r t i l e a n d s t e r i l e m a i z e p l a n t s d e r i v e d f r o m t i s s u e c u l t u r e w i t h t h e T e x a s m a l e s t e r i l e c y t p o p l a s m . T h e o r . A p p l . G e n e t . 6 2 , 2 1 3 - 2 1 7 . K e n n e l l , J . C . , & P r i n g , D R . ( 1 9 8 9 ) I n i t i a t i o n a n d p r o c e s s i n g o f a t p 6 , T - u r f 1 3 a n d 0 R F 2 2 1 t r a n s c r i p t s f r o m m i t o c h o n d r i a o f T c y t o p l a s m m a i z e . M o l . G e n . G e n e t . 2 1 6 , 1 6 - 2 4 . K e n n e l l , J . C . , W i s e , R . P . , & P r i n g , D R . ( 1 9 8 7 ) I n fl u e n c e o f n u c l e a r b a c k g r o u n d o n t r a n s c r i p t i o n o f a m a i z e m i t o c h o n d r i a l r e g i o n a s s o c i a t e d w i t h T e x a s m a l e s t e r i l e c y t o p l a s m . M a l . G e n . G e n e t . 2 1 0 , 3 9 9 - 4 0 6 . K h e y r - P u r , A . , G r a c e n , V . E . , & E v e r e t t , H . L . ( 1 9 8 1 ) G e n e t i c s o f f e r t i l i t y r e s t o r a t i o n i n t h e C - g r o u p o f c y t o p l a s m i c m a l e s t e r i l i t y i n m a i z e . G e n e t i c s 9 8 , 3 7 9 - 3 8 8 . K i m , B . D . , M a n s , R . J , C o n d e , M . F . , P r i n g , D . R . , & L e v i n g s , C . S . ( 1 9 8 2 ) P h y s i c a l m a p p i n g o f h o m o l o g o u s s e g m e n t s o f m i t o c h o n d r i a l e p i s o m e s f r o m S m a l e - s t e r i l e m a i z e . P l a s m i d 7 , 1 - 1 4 . 2 8 2 K i m b e r , A . S z e , H . ( 1 9 8 4 ) H e l m i n t h s p o r i u m m a y d i s , T t o x i n d e c r e a s e d c a l c i u m t r a n s p o r t i n t o m i t o c h o n d r i a o f s u s c e p t i b l e c o r n . P l a n t P h y s i o l . 7 4 , 8 0 4 - 8 0 9 . K i t i g a w a , T . , & O z a k i , Y . ( 1 9 8 7 ) I n f r a r e d a n d R a m a n s p e c t r a o f m e t a l l o p o r p h y r i n s . S t r u c t u r e a n d B o n d i n g 6 4 , 7 1 - 1 1 4 . K l e i n , R . P . , K o e p p e , D E . ( 1 9 8 5 ) M a d e o f m e t h o m y l a n d B i p o l a r i s m a y d i s ( r a c e T ) t o x i n i n u n c o u p l i n g T e x a s m a l e - s t e r i l e c y t o p l a s m c o r n m i t o c h o n d r i a . P l a n t P h y s i o l . 7 7 , 9 1 2 - 9 1 6 . K o b a y a s h i , K . , U n e , H . , & H a y a s h i , K . ( 1 9 8 9 ) E l e c t r o n t r a n s f e r p r o c e s s i n c y t o c h r o m e o x i d a s e a f t e r p u l s e r a d i o l y s i s . J . B i o l . C h e m . 2 6 4 , 7 9 7 6 - 7 9 8 0 . y : K o c h , G . ( 1 9 7 6 ) S y n t h e s i s o f t h e m i t o c h o n d r i a l i n n e r m e m b r a n e i n c u l t u r e d X e n a p u s l a e v i s o o c y t e s . J . B i o l . C h e m . 2 5 1 , 6 0 9 7 - 6 1 0 7 . I " ‘ . _ ‘ _ _ m . . s - K o e p p e , D . E . , & M i l l e r , R . J . ( 1 9 7 2 ) O x i d a t i o n o f r e d u c e d n i c o t i n a m i d e a d e n i n e d i n u c l e o t i d e p h o s p h a t e b y i s o l a t e d c o r n m i t o c h o n d r i a . P h a n t P h y s i o l . 4 9 , 3 5 3 - 3 5 7 . K o e p p e , D E , C o x , J . K . , G r u e n w a l d , P . J . ( 1 9 7 8 ) M a i z e m i t o c h o n d r i a l s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n : t h e s e l e c t i v e i o n o p h o r e - l i k e e f f e c t o f m e t h o m y l o n T e x a s - m a l e - s t e r i l e c y t o p l a s m m i t o c h o n d r i a . i n P l a n t M i t o c h o n d r i a , G . D u c e t a n d C . L a n c e , e d . , 4 1 9 - 4 2 6 . K a n o , Y . , D a l y , J . M . ( 1 9 7 9 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e h o s t - s p e c i fi c p a t h o t o x i n p r o d u c e d b y H e l m i n t h s p o r i u m m a y d i s , r a c e T , a fi ‘ e c t i n g c o r n w i t h T e x a s m a l e s t e r i l e c y t o p l a s m . B i a a r g a n i c C h e m . 8 , 3 9 1 - 3 9 7 . K a n o , Y . , T a k e u c h i , S . , K a w a r a d a , A . , D a l y , J . M . , & K n o c h e , H . W . ( 1 9 8 0 ) S t r u c t u r e o f t h e h o s t - s p e c i fi c p a t h o t o x i n s p r o d u c e d b y H e l m i n t h a s p a r i u m m a y d i s , r a c e T . T e t r a h e d . L e t t . 2 1 , 1 5 3 7 - 1 5 4 0 . K r o n e c k , P . H . M . , A n t h o l i n e , W . A . , R i e s t e r , J . , & Z u m f t , W . G . ( 1 9 8 8 ) T h e c u p r i c s i t e i n n i t r o u s o x i d e r e d u c t a s e c o n t a i n s a m i x e d - v a l e n c e [ C u ( I I ) , C u ( I ) ] b i n u c l e a r c e n t e r : a m u l t i f r e q u e n c y e l e c t r o n p a r a m a g n e t i c r e s o n a n c e i n v e s t i g a t i o n . F E B S L e t t . 2 4 2 , 4 0 - 7 4 . K r o n e c k , P . M . H . , A n t h o l i n e , W . E . , K a s t r a u , D . H . W . , B u s e , G . , S t e fi ‘ e n s , G . C . M . , & Z u m f t , W . G . ( 1 9 9 0 ) M u l t i fi ' e q u e n c y E P R e v i d e n c e f o r a b i m e t a l l i c c e n t e r a t t h e C u A s i t e o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e . F E B S L e t t . 2 6 8 , 2 7 4 - 2 7 6 . K u b o y a m a , M . , Y o n g , F . C . , & K i n g , T E . ( 1 9 7 2 ) S t u d i e s o n c y t o c h r o m e o x i d a s e . V I I I . P r e p a r a t i o n a n d s o m e p r o p e r t i e s o f c a r d i a c c y t o c h r o m e o x i d a s e . J . B i o l . C h e m . 2 4 7 , 6 3 7 5 - 6 3 8 3 . 2 8 3 K u h n - N e n t w i g , L . , & K a d e n b a c h , B . ( 1 9 8 5 ) I s o l a t i o n a n d p r o p e r t i e s o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m r a t l i v e r a n d q u a n t i fi c a t i o n o f i m m u n o l o g i c a l d i f f e r e n e s b e t w e e n i s o z y m e s f r o m v a r i o u s r a t t i s s u e s w i t h s u b u n i t - s p e c i fi c a n t i s e r a . E u r . J . B i o c h e m . 1 4 9 , 1 4 7 - 1 5 8 . K y t e , J . , & D o o l i t t l e , R F . ( 1 9 8 2 ) A s i m p l e m e t h o d f o r d i s p l a y i n g t h e h y d r o p a t h i c c h a r a c t e r o f a p r o t e i n . J . M a l . B i o l . 1 5 7 , 1 0 5 - 1 3 2 . L a m a t t i n a , L . , W e i ] , J . - H . , & G r i e n e n b e r g e r , J . - M . ( 1 9 8 9 ) R N A e d i t i n g a t a s p l i c i n g s i t e o f N A D H d e h y d r o g e n a s e e s u b u n i t I V g e n e t r a n s c r i p t i n w h e a t m i t o c h o n d r i a . F E B S L e t t . 2 5 8 , 7 9 - 8 3 . L a m b e r s , H . L . ( 1 9 8 0 ) T h e p h y s i o l o g i c a l s i g n i fi c a n c e o f c y a n i d e - r e s i s t a n t r e s p i r a t i o n i n h i g h e r p l a n t s . P l a n t , C e l l E n v . 3 , 2 9 3 - 3 0 2 . L a n c e , C . , & B o n n e r , W . D . , J r . ( 1 9 6 8 ) T h e r e s p i r a t o r y c h a i n c o m p o n e n t s o f h i g h e r p l a n t m i t o c h o n d r i a . P l a n t P h y s i o l . 4 3 , 7 5 6 - 7 6 6 . L a N o u e , K . F . , & S c h o o l w e r t h , A C . ( 1 9 7 9 ) M e t a b o l i t e t r a n s p o r t i n m i t o c h o n d r i a . A n n . R e v . B i o c h e m . 4 8 , 8 7 1 - 9 2 2 . L a u e r , M . , K n u d s e n , C . , N e w t o n , K . J . , G a b a y - L a u g h n a n , S . , & L a u g h n a n , J . R . ( 1 9 9 0 ) A p a r t i a l l y d e l e t e d m i t o c h o n d r i a l c y t o c h r o m e o x i d a s e g e n e i n t h e N C S 6 a b n o r m a l g r o w t h m u t a n t o f m a i z e . N e w B i o l o g i s t 2 , 1 7 9 - 1 8 6 . L a u r a e u s , M . , H a l t i a , T . , S a r a s t e , M . , & W i k s t r o m , M . ( 1 9 9 1 ) B a c i l l u s s u b t i l i s e x p r e s s e s t w o k i n d s o f h a e m - A — c o n t a i n i n g t e r m i n a l o x i d a s e s . E u r . J . B i o c h e m . 1 9 7 , 6 9 9 - 7 0 5 . L e a v e r , C . J . , I s a a c , P . G . , B a i l e y - S e r r e s , J . , S m a l l , I . D . , H a n s o n , D . K . , F o x , T D . ( 1 9 8 5 ) A c h i e v e m e n t s a n d P e r s p e c t i v e s o f M i t o c h o n d r i a l R e s e a r c h , V o l u m e H , 1 1 1 - 1 2 2 . L e b a c q , P . , & V e d e l , F . ( 1 9 8 1 ) S a l I r e s t r i c t i o n e n z y m e a n a l y s i s o f c h l o r o p l a s t a n d m i t o c h o n d r i a l D N A s i n t h e g e n u s B r a s s i c a . P l a n t S c i . L e t t . 2 3 , 1 - 9 . L e e , S . - L . J . , & W a r m k e , H E . ( 1 9 7 9 ) O r g a n e l l e s i z e a n d n u m b e r i n f e r t i l e a n d T - c y t o p l a s m i c m a l e - s t e r i l e c o r n . A m e r . J . B o t . 6 6 ( 2 ) , 1 4 1 - 1 4 8 . L e h n i n g e r , A L . ( 1 9 5 5 ) i n T h e H a r v e y l e c t u r e s 1 9 5 3 - 1 9 5 4 , A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k , 1 7 6 - 2 1 5 . L e m i e u x , L . J . , C a l h o u n , M . W . , T h o m a s , J . W . , I n g l e d e w , W . J . , & G e n n i s , R B . ( 1 9 9 2 ) D e t e r m i n a t i o n o f t h e l i g a n d s o f t h e l o w s p i n h e m e o f t h e c y t o c h r o m e a u b i q u i n o l o x i d a s e c o m p l e x u s i n g s i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s . J . B i o l . C h e m . , 2 6 7 , 2 1 0 5 - 2 1 1 3 . 2 8 4 L e v i n g s , C . J . , I s a a c , F . G . , B a i l e y - S e r r e s , J . , S m a l l , I . D . , H a n s o n , D . K . , & F o x , T D . ( 1 9 8 5 ) R e c o m b i n a t i o n e v e n t s a s s o c i a t e d w i t h t h e c y t o c h r o m e c o x i d a s e s u b u n i t I g e n e i n f e r t i l e a n d c y t o p l a s m i c m a l e s t e r i l e m a i z e a n d s o r g h u m . A c h i e v e m e n t s a n d P e r s p e c t i v e s o f M i t o c h o n d r i a l R e s e a r c h , v o l . I I : B i o g e n e s i s . E l s e v i e r S c i e n c e P u b l i s h e r s , 1 1 1 - 1 2 2 . L e v i n g s , C . S . & B r o w n , G . G . ( 1 9 8 9 ) M o l e c u l a r b i o l o g y o f p l a n t m i t o c h o n d r i a . C e l l , 5 6 , 1 7 1 - 1 7 9 . L e v i n g s , C . S . , & P r i n g , D R . ( 1 9 7 6 ) R e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e a n a l y s i s o f m i t o c h o n d r i a l D N A f r o m n o r m a l a n d T e x a s c y t o p l a s m i c m a l e - s t e r i l e m a i z e . S c i e n c e 1 9 3 , 1 5 8 - 1 6 0 . L e v i n g s , C . S . , I I I , & S e d e r o f f , R R . ( 1 9 8 3 ) N u c l e o t i d e s e q u e n c e o f t h e S - 2 m i t o c h o n d r i a l D N A f r o m t h e S c y t o p l a s m o f m a i z e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 8 0 , 4 0 5 5 - 4 0 5 9 . L e v i n g s , C . S . , I I I , K i m , B . D . , P r i n g , D . R . , C o n d e , M . F . , M a n s , R . J . , L a u g h n a n , J . R . , & G a b a y - L a u g h n a n , S J . ( 1 9 8 0 ) C y t o p l a s m i c r e v e r s i o n o f c m s - S i n m a i z e : A s s o c i a t i o n w i t h a t r a n s p o s i t i o n a l e v e n t . S c i e n c e 2 0 9 , 1 0 2 1 - 1 0 2 3 . - L i , P . M . , G e l l e s , J . , C h a n , S . I . , S u l l i v a n , R . J . , & S c o t t , R . ( 1 9 8 7 ) E x t e n d e d X - r a y a b s o r p t i o n fi n e s t r u c t u r e o f c o p p e r i n C u A - d e p l e t e d p - ( h y d r o x y m e r c u r i ) b e n z o a t e - m o d i fi e d , a n d n a t i v e c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 2 6 , 2 0 9 1 - 2 0 9 5 . L i , P . M . , M o r g a n , J . E . , N i l s s o n , T . , M a , M . , & C h a n , S I . ( 1 9 8 8 ) H e a t t r e a t m e n t o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e p e r t u r b s t h e C u A s i t e a n d a f f e c t s p r o t o n p u m p i n g b e h a v i o r . B i a c h e m i s t r y 2 7 , 7 5 3 8 - 7 5 4 6 . L i , Y . , N a q u i , A . , F r e y , T . G . , & C h a n c e , B . ( 1 9 8 7 ) A n e w p r o c e d u r e f o r t h e p u r i fi c a t i o n o f m o n o d i s p e r s e h i g h l y a c t i v e c y t o c h r o m e c o x i d a s e fi ' o m b o v i n e h e a r t . B i o c h e m . J . 2 4 2 , 4 1 7 - 4 2 3 . L o n s d a l e , D . M . , H o d g e , T . P . , & F a u r o n , C . M . - R . ( 1 9 8 4 ) T h e p h y s i c a l m a p a n d o r g a n i s a t i o n o f t h e m i t o c h o n d r i a l g e n o m e f r o m t h e f e r t i l e c y t o p l a s m o f m a i z e . N u c l . A c i d s R e s . 1 2 , 9 2 4 9 - 9 2 6 1 . L o n s d a l e , D . M . , H o d g e , T . P . , H o w e , C . J , & S t e r n , D B . ( 1 9 8 3 ) M a i z e m i t o c h o n d r i a l D N A c o n t a i n s a s e q u e n c e h o m o l o g o u s t o t h e r i b u l o s e - 1 , 5 - b i s p h o s p h a t e c a r b o x y l a s e l a r g e s u b u n i t g e n e o f c h l o r o p l a s t D N A . C e l l 3 4 , 1 0 0 7 - 1 0 1 4 . L o n s d a l e , D . M . , T h o m p s o n , R . D . , & H o d g e , T R ( 1 9 8 1 ) T h e i n t e g r a t e d f o r m o f t h e S l a n d 8 2 D N A e l e m e n t s o f m a i z e m a l e s t e r i l e m i t o c h o n d r i a l D N A a r e fl a n k e d b y a l a r g e r e p e a t e d s e q u e n c e . N u c l . A c i d s R e s . 9 , 3 6 5 7 - 3 6 6 9 . 2 8 5 L u d w i g , B . , & S c h a t z , G . ( 1 9 8 0 ) A t w o - s u b u n i t c y t o c h r o m e c o x i d a s e ( c y t o c h r o m e a a 3 ) f r o m P a r a c o c c u s d e n t r i fi c a n s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 7 7 , 1 9 6 - 2 0 0 . L u d w i g , B . , D o w n e r , & C a p a l d i , R A . ( 1 9 7 9 ) L a b e l i n g o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e w i t h [ 3 5 8 1 d i a z o b e n z e n e s u l f o n a t e . O r i e n t a t i o n o f t h i s e l e c t r o n t r a n s f e r c o m p l e x i n t h e i n n e r m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e . B i o c h e m i s t r y 1 8 , 1 4 0 1 - 1 4 0 7 . M a c h l e i d t , W . , & W e r n e r , S . ( 1 9 7 9 ) I s t h e m i t o c h o n d r i a l l y m a d e s u b u n i t 2 o f c y t o c h r o m e o x i d a s e s y n t h e s i z e d a s a p r e c u r s o r i n N e u r a s p a r a c r a s s a ? F E B S L e t t . 1 0 7 , 3 2 7 - 3 3 0 . M a c k e n d e r , R . O . , L e e c h , R M . ( 1 9 7 4 ) T h e g a l a c t o l i p i d . p h o s p h o l i p i d , a n d f a t t y a c i d c o m p o s i t i o n o f t h e c h l o r o p l a s t e n v e l o p e m e m b r a n e s o f V i c i a f a b a L . P l a n t P h y s i o l . 5 3 , 4 9 6 - 5 0 2 . M a e s h i m a , M . , & A s a h i , T . ( 1 9 7 8 ) P u r i fi c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f s w e e t p o t a t o c y t o c h r o m e c o x i d a s e . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 1 8 7 , 4 2 3 - 4 3 0 . M a e s h i m a , M , & A s h a i , T . ( 1 9 8 1 ) M e c h a n i s m o f m c r e a s e i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e a c t i v i t y m s w e e t p o t a t o r o o t t i s s u e d u r i n g a g i n g o f s l i c e s . J . B i o c h e m . 9 0 , 3 9 1 - 3 9 7 . M a e s h i m a , M . , N a k a g a w a , T . , & A s a h i , T . ( 1 9 8 9 ) N - t e r m i n a l a m i n o a c i d s e q u e n c e a n d p r o c e s s i n g s i t e o f s w e e t p o t a t o c y t o c h r o m e c o x i d a s e s u b u n i t I I . P l a n t C e l l P h y s i o l . 3 0 , 1 1 8 7 - 1 1 8 8 . , M a k a r o f f , C . A . , & P a l m e r , J . D . ( 1 9 8 7 ) E x t e n s i v e m i t o c h o n d r i a l s p e c i fi c t r a n s c r i p t i o n o f t h e B r a s s i c a c a m p e s t r i s m i t o c h o n d r i a l g e n o m e . N u c l . A c i d s R e s . 1 5 , 5 1 4 1 - 5 1 5 4 . M a k a r o f f , C . A . , A p e l , I . J . , & P a l m e r , J . D . ( 1 9 8 9 ) T h e a t p 6 c o d i n g r e g i o n h a s b e e n d i s r u p t e d a n d a n o v e l r e a d i n g fi ' a m e g e n e r a t e d i n t h e m i t o c h o n d r i a l g e n o m e o f c y t o p l a s m i c m a l e - s t e r i l e r a d i s h . J . B i o l . C h e m . 2 6 4 , 1 1 7 0 6 - 1 1 7 1 3 . M a l a t e s t a , F . , & C a p a l d i , R . ( 1 9 8 2 ) L o c a l i z a t i o n o f c y s t e i n e 1 1 5 i n s u b u n i t I I I o f b e e f h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e t o t h e c s i d e o f t h e m i t o c h o n d r i a l i n n e r m e m b r a n e . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 0 9 , 1 1 8 0 - 1 1 8 5 . M a l a t e s t a , F . , A n t o n i n i , G . , S a r t i , P . , & B r u n o r i , M . ( 1 9 8 7 ) M o d u l a t i o n o f c y t o c h r o m e o x i d a s e a c t i v i t y b y i n o r g a n i c a n d o r g a n i c p h o s p h a t e . B i o c h e m . J . 2 4 8 , 1 6 1 - 1 6 5 . M a l a t e s t a , F . , D a r l e y - U s m a r , V . , d e J o n g , C . , P r o c h a s k a , L . J . , B i s s o n , R . , C a p a l d i , R . A . , S t e f f e n s , G . C . M . , & B u s e , G . ( 1 9 8 3 ) A r r a n g e m e n t o f s u b u n i t I V i n b e e f h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e p r o b e d b y c h e m i c a l l a b e l i n g a n d p r o t e a s e d i g e s t i o n e x p e r i m e n t s . B i o c h e m i s t r y 2 2 , 4 4 0 5 - 4 4 1 1 . 2 8 6 M a n n , A . J . , & A u e r , H E . ( 1 9 8 0 ) P a r t i a l i n a c t i v a t i o n o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e b y n o n - p o l a r m e r c u r i a l r e a g e n t s . J . B i o l . C h e m . 2 5 5 , 4 5 4 - 4 5 8 . M a r g u l i s , L . ( 1 9 7 0 ) O r i g i n o f E u k a r y a t i c C e l l s . Y a l e U n i v e r s i t y P r e s s , N e w H a v e n , C o n n . M a r s h , D . & P o w e l l , G . L . ( 1 9 8 8 ) P r o p e r t i e s o f c a r d i o l i p i n a n d f u n c t i o n a l i m p l i c a t i o n s f o r c y t o c h r o m e o x i d a s e a c t i v i t y . B i o e l e c t r a c h e m . B i a e n e r g . 2 0 , 7 3 - 8 2 . M a r t i n , C . T . , S c h o l e s , C . P . , & C h a n , S I . ( 1 9 8 5 ) T h e i d e n t i fi c a t i o n o f h i s t i d i n e l i g a n d s t o c y t o c h r o m e a i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . J . B i o l . C h e m . 2 6 0 , 2 8 5 7 - 2 8 6 1 . M a r t i n , G . T . , S c h o l e s , C . P . , & C h a n , S I . ( 1 9 8 8 ) O n t h e n a t u r e o f c y s t e i n e c o o r d i n a t i o n t o C u A i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . J . B i o l . C h e m . 2 6 3 , 8 4 2 0 - 8 4 2 9 . M a s o n , T . L . , & S c h a t z , G . ( 1 9 7 3 ) C y t o c h r o m e c o x i d a s e fi ' o m b a k e r s y e a s t : S i t e o f t r a n s l a t i o n o f t h e p r o t e i n c o m p o n e n t s . J . B i o l . C h e m . 2 4 8 , 1 3 5 5 - 1 3 6 0 . M a s o n , T . L . , & S c h a t z , G . ( 1 9 7 3 a ) C y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m b a k e r s y e a s t . 1 . I s o l a t i o n a n d p r o p e r t i e s . J . B i o l . C h e m . 2 4 8 , 1 3 4 6 - 1 3 5 4 . M a s o n , T . L . , & S c h a t z , G . ( 1 9 7 3 b ) C y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m b a k e r s y e a s t : S i t e o f t r a n s l a t i o n o f t h e p r o t e i n c o m p o n e n t s . , J . B i o l . C h e m . 2 4 8 , 1 3 5 5 - 1 3 6 0 . M a t h e r , M . W . , S p r i n g e r , P . , & F e e , J . A . ( 1 9 9 0 ) R e l a t i o n s h i p o f c y t o c h r o m e m m ; f r o m T h e r m u s T h e r m a p h i l u s t o o t h e r h e m e - a n d c o p p e r - c o n t a i n i n g t e r m i n a l o x i d a s e s . P r o c . o f t h e 4 1 . C o l l o q u i u m M a s b a c h , T h e M o l e c u l a r B a s i s o f B a c t e r i a l M e t a b o l i s m , S p r i n g e r - V e r l a g , B e r l i n H e i d e l b e r g , 9 4 - 1 0 4 . M a t s u o k a , M . , M a e s h i m a , M . , & A s a h i , T . ( 1 9 8 1 ) T h e s u b u n i t c o m p o s i t i o n o f p e a c y t o c h r o m e c o x i d a s e . J . B i o c h e m . 9 0 , 6 4 9 - 6 5 5 . M a t s u s h i t a , K . , P a t e l , L . , & K a b a c k , H R ( 1 9 8 4 ) C y t o c h r o m e a t y p e o x i d a s e f r o m E s c h e r i c h i a c o l i . C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e e n z y m e a n d m e c h a n i s m o f e l e c t r o c h e m i c a l p r o t o n g r a d i e n t g e n e r a t i o n . B i o c h e m i s t r y 2 3 , 4 7 0 3 - 4 7 1 4 . M a t t h e w s , D . E . , G r e g o r y , R , G r a c e n , V . E . ( 1 9 7 9 ) H e l m i n t h a s p a r i u m m a y d i s r a c e T t o x i n i n d u c e s l e a k a g e o f N A D + f r o m T c y t o p l a s m c o r n m i t o c h o n d r i a . P l a n t P h y s i o l . 6 3 , 1 1 4 9 - 1 1 5 3 . M c C a r t y , D . M . , H e h m a n , G . L . , & H a u s w i r t h , W . W . ( 1 9 8 8 ) N u c l e o t i d e s e q u e n c e o f t h e Z e a m a y s m i t o c h o n d r i a l c y t o c h r o m e o x i d a s e s u b u n i t I I I g e n e . N u c l . A c i d s R e s . 1 6 , 9 8 7 3 . 2 8 7 M c E n e r y , M . W . , P e d e r s e n , P . ( 1 9 8 6 ) D i e t h y l s t i l b e s t r a l : A n o v e l F o - d i r e c t e d p r o b e o f t h e m i t o c h o n d r i a l p r o t o n A T P a s e . J . B i o l . C h e m . 2 6 1 , 1 7 4 5 - 1 7 5 2 . M e l l a d o , R . P . , P e r ‘ r a l v a , M . A . , I n c i a r t e , M . R . , & S a l a s , M . ( 1 9 8 0 ) T h e p r o t e i n c o v a l e n t l y l i n k e d t o t h e 5 ' t e r m i n i o f t h e D N A o f B a c i l l u s s u b t i l i s p h a g e { 0 2 9 i s i n v o l v e d i n t h e i n i t i a t i o n o f D N A r e p l i c a t i o n . V i r o l o g y 1 0 4 , 8 4 - 9 6 . M e r l e , P . & K a d e n b a c h , B . ( 1 9 8 0 a ) T h e s u b u n i t c o m p o s i t i o n o f m a m m a l i a n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . E u r . J . B i o c h e m . 1 0 5 , 4 9 9 - 5 0 7 . M e r l e , P . , & K a d e n b a c h , B . ( 1 9 8 0 b ) O n t h e h e t e r o g e n e i t y o f v e r t e b r a t e c y t o c h r o m e c o x i d a s e p o l y p e p t i d e c h a i n c o m p o s i t i o n . H a p p e - S e y l . Z . P h y s i o l . C h e m . 3 6 1 , 1 2 5 7 - 1 2 5 9 . M e r l e , P . , & K a d e n b a c h , B . ( 1 9 8 2 ) K i n e t i c a n d s t r u c t u r a l d i f f e r e n c e s b e t w e e n c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m b e e f l i v e r a n d h e a r t . E u r . J . B i o c h e m . 1 2 5 , 2 3 9 - 2 4 4 . M i c h e l , B . , & B o s s h a r d , H R . ( 1 9 8 9 ) O x i d a t i o n o f c y t o c h r o m e c b y c y t o c h r o m e c o x i d a s e : s p e c t r o s c o p i c b i n d i n g s t u d i e s a n d s t e a d y - s t a t e k i n e t i c s s u p p o r t a c o n f o r m a t i o n a l t r a n s i t i o n m e c h a n i s m . B i o c h e m i s t r y 2 8 , 2 4 4 - 2 5 2 . M i l l e r , R . J . , K o e p p e , D E . ( 1 9 7 1 ) S o u t h e r n c o r n l e a f b l i g h t : S u s c e p t i b l e a n d r e s i s t a n t m i t o c h o n d r i a . S c i e n c e 1 7 3 , 6 7 - 6 9 . M i l l e t t , F . , d e J o n g , C . , P a u l s o n , L . , & C a p a l d i , R A . ( 1 9 8 3 ) I d e n t i fi c a t i o n o f s p e c i fi c c a r b o x y l a t e g r o u p s o n c y t o c h r o m e c o x i d a s e t h a t a r e i n v o l v e d i n b i n d i n g c y t o c h r o m e c . B i o c h e m i s t r y 2 2 , 5 4 6 - 5 5 2 . M i n a g a w a , J . , M a g i , T . , G e n n i s , R . B . , & A n r a k u , Y . ( 1 9 9 2 ) I d e n t i fi c a t i o n o f h e m e a n d c o p p e r l i g a n d s i n s u b u n i t I o f t h e c y t o c h r o m e b a c o m p l e x i n E s c h e r i c h i a c o l i . J . B i o l . C h e m , 2 6 7 , 2 0 9 6 - 2 1 0 4 . M i t c h e l l , P . ( 1 9 6 6 ) C h e m i o s m o t i c c o u p l i n g i n o x i d a t i v e a n d p h o t o s y n t h e t i c p h o p h o r y l a t i o n . G l y n n R e s e a r c h L t d . , B o d m i n , U . K . M i t c h e l l , P . ( 1 9 8 7 ) A n e w r e d o x 1 0 0 p f o r m a l i t y i n v o l v i n g m e t a l - c a t a l y s e d h y d r o x i d e - i o n t r a n s l o c a t i o n : A h y p o t h e t i c a l C u l o o p m e c h a n i s m f o r c y t o c h r o m e o x i d a s e . F E B S L e t t . 2 2 2 , 2 3 5 - 2 4 5 . M i t c h e l l , P . ( 1 9 8 8 ) S t r a t e g y o f r e s e a r c h o n t h e c h e m i o s m o t i c m e c h a n i s m o f c y t o c h r o m e o x i d a s e . F E B S L e t t . 2 3 1 , 2 7 0 - 2 7 1 . M i t c h e l l , R , M i t c h e l l , R . , M o o d y , J . , W e s t , I . C . , B a u m , H . , & W r i g g l e s w o r t h , J . M . ( 1 9 8 5 ) C h e m i o s m o t i c c o u p l i n g i n c y t o c h r o m e o x i d a s e : P o s s i b l e p r o t o n m o t i v e 0 l o o p a n d 0 c y c l e m e c h a n i s m . F E B S L e t t . 1 8 8 , 1 - 7 . 2 8 8 M i t c h e l l , P . , M o y l e , J . , & M i t c h e l l , R . ( 1 9 7 9 ) M e a s u r e m e n t o f - > H + / O i n m i t o c h o n d r i a a n d s u b m i t o c h o n d r i a l v e s i c l e s . M e t h . E n z . 5 5 , 6 2 7 - 6 4 0 . M a l l e t , I . M . , & L i n , W . ( 1 9 8 6 ) M e m b r a n e - b o u n d N A D ( P ) H d e h y d r o g e n a s e e i n h i g h e r p l a n t c e l l s . A n n . R e v . P l a n t P h y s i o l . 3 7 , 3 0 9 - 3 3 4 . M a l l e r , I . M . , & P a l m e r , J . M . ( 1 9 8 1 ) T h e i n h i b i t i o n o f e x o g e n o u s N A D ( P ) H o x i d a t i o n i n p l a n t m i t o c h o n d r i a b y c h e l a t o r s a n d m e r s a l y l a s a f u n c t i o n o f p H . P h y s i o l . P l a n t . 5 3 , 4 1 3 - 4 2 0 . M a l l e r , I . M . , & P a l m e r , J . M . ( 1 9 8 2 ) D i r e c t e v i d e n c e f o r t h e p r e s e n c e o f a r o t e n o n e - r e s i s t a n t N A D H d e h y d r o g e n a s e o n t h e i n n e r s u r f a c e o f t h e i n n e r m e m b r a n e o f p l a n t m i t o c h o n d r i a . P h y s i o l . P l a n t . 5 4 , 2 6 7 - 2 7 4 . M o n t e c u c c o , C . , S c h i a v o , G . , & B i s s o n , R . ( 1 9 8 6 ) A T P b i n d i n g t o b o v i n e h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e : A p h o t o a f fi n i t y l a b e l l i n g s t u d y . B i o c h e m . J . 2 3 4 , 2 4 1 - 2 4 3 . M o n t e c u c c o , C . , S c h i a v o , G . , B a c c i , B . , & B i s s o n , R . ( 1 9 8 7 ) I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m b i r d a n d fi s h h e a r t m i t o c h o n d r i a . C o m p . B i o c h e m . P h y s i o l . 8 7 B , 8 5 1 - 8 5 6 . M o o d y , A . J . , B r a n d t , U . , R i c h , P . ( 1 9 9 1 ) S i n g l e e l e c t r o n r e d u c t i o n o f ‘ s l o w ’ i a n d ‘ f a s t ’ c y t o c h r o m e - c o r n ' d a s e . F E E S L e t t . 2 9 3 , 1 0 1 - 1 0 5 . M o o r e , A . L . , & B o n n e r , W . D . , J r . ( 1 9 8 2 ) M e a s u r e m e n t s o f m e m b r a n e p o t e n t i a l s i n p l a n t m i t o c h o n d r i a w i t h t h e s a f r a n i n e m e t h o d . P l a n t P h y s i o l . 7 0 , 1 2 7 1 - 1 2 7 6 . M o o r e , A . L . , B o n n e r , W . D . , J r . , & R i c h , P . R . ( 1 9 7 8 ) T h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e p r o t o n - m o t i v e f o r c e d u r i n g c y a n i d e - i n s e n s i t i v e r e s p i r a t i o n i n p l a n t m i t o c h o n d r i a . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 1 8 6 , 2 9 8 - 3 0 6 . M o r e a u , F . , & d e V i r v i l l e , J . D . ( 1 9 8 5 ) S t o i c h i o m e t r y o f p r o t o n t r a n s l o c a t i o n c o u p l e d t o s u b s t r a t e o x i d a t i o n i n p l a n t m i t o c h o n d r i a . P l a n t P h y s i o l . 7 7 , 1 1 8 - 1 2 3 . M o r g a n , J . E . , & W i k s t r o m , M . ( 1 9 9 1 ) S t e a d y - s t a t e r e d o x b e h a v i o r o f c y t o c h r o m e c , c y t o c h r o m e a a n d C u A o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e i n i n t a c t r a t l i v e r m i t o c h o n d r i a . B i o c h e m i s t r y 3 0 , 9 4 8 - 9 5 8 . M o r g a n , J . E . , L i , P . M . , J a n g , D . - J . , E l — S a y e d , M . A . , & C h a n , S J . ( 1 9 8 9 ) E l e c t r o n t r a n s f e r b e t w e e n c y t o c h r o m e a a n d c o p p e r A i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e : A p e r t u r b e d e q u i l i b r i u m s t u d y . B i o c h e m i s t r y 2 8 , 6 9 7 5 - 6 9 8 3 . M a r i n , P . E . , D i g g s , D . , & F r e i r e , E . ( 1 9 9 0 ) T h e r m a l s t a b i l i t y o f m e m b r a n e - r e c o n s t i t u t e d y e a s t c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 2 9 , 7 8 1 - 7 8 8 . 2 8 9 M o r o n e y , P . M . , S c h o l e s , T . A . , & H i n k l e , R C . ( 1 9 8 4 ) E f f e c t o f m e m b r a n e p o t e n t i a l a n d p H g r a d i e n t a n e l e c t r o n t r a n s f e r i n c y t o c h r o m e o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 2 3 , 4 9 9 1 - 4 9 9 7 . M o u b a r e k , A . , P a n , L . P . , & M i l l e t , F . ( 1 9 8 7 ) F l u o r e s c e i n m e r c u r i c a c e t a t e s p e c i fi c a l l y d i s p l a c e s z i n c f r o m c y t o c h r o m e o x i d a s e . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 4 3 , 1 0 3 0 - 1 0 3 6 . M o u s s a , M . , O u a z z a n i , C . , B o n a v e n t , J . - F . , B e r v i l l e , A . , & G h a z i , A . ( 1 9 9 0 ) P o s s i b l e i n v o l v e m e n t o f t h e A T P a s e i n t h e r e s p o n s e o f s u s c e p t a b l e m a i z e m i t o c h o n d r i a t o t h e t o x i n o f H e l m i n t h a s p a r i u m m a y d i s , r a c e T a n d t o m e t h o m y l . P l a n t S c i . 6 6 , 8 1 - 8 6 . M o y l e , J . , & M i t c h e l l , P . ( 1 9 7 8 ) C y t o c h r o m e c o x i d a s e i s n o t a p r o t o n p u m p . F E E S L e t t . 8 8 , 2 6 8 - 2 7 2 . M u l l i g a n , R M . ( 1 9 9 1 ) R N A e d i t i n g : W h e n t r a n s c r i p t s e q u e n c e s c h a n g e . P l a n t C e l l 3 , 3 2 7 - 3 3 0 . M u s g r a v e , M . E . , A n t o n o v i c s , J . , & S i e d o w , J . N . ( 1 9 8 6 ) I s m a l e - s t e r i l i t y i n p l a n t s r e l a t e d t o l a c k o f c y a n i d e - r e s i s t a n t r e s p i r a t i o n i n t i s s u e s ? P l a n t S c i . 4 4 , 7 - 1 1 . M y e r s , D . , & P a l m e r , G . ( 1 9 8 8 ) T h e k i n e t i c m e c h a n i s m ( s ) o f c y t o c h r o m e o x i d a s e . A n n . N Y . A c a d . S c i . 5 5 0 , 8 5 - 9 7 . N a i k , R . M . , M u n j a l , S . V . , S i n g h , P . , D e s a i , B . B . , M e h t a , S . L . , & N a i k , M S . ( 1 9 9 1 ) D i s s o c i a t i o n o f c y t o c h r o m e o x i d a s e - c a r b o n m o n o r n ' d e c o m p l e x i n c o m p l e t e d a r k n e s s . P h y t o c h e m i s t r y 3 0 , 1 0 6 1 - 1 0 6 3 . N a k a g a w a , T . , M a e s h i m a , M . , & A s a h i , T . ( 1 9 8 8 ) D i f f e r e n c e s i n t h e t h e r m o s t a b i l i t y a n d s u b u n i t s p e c i e s o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e a m o n g t i s s u e s . P l a n t C e l l P h y s i o l . 2 9 , 1 2 9 7 - 1 3 0 2 . N a k a g a w a , T . , M a e s h i m a , M . , M u t o , H . , K a j i u r a , H . , H a t t o r i , H . , & A s a h i , T . ( 1 9 8 7 ) S e p a r a t i o n , a m i n o - t e r m i n a l s e q u e n c e a n d c e l l - f r e e s y n t h e s i s o f t h e s m a l l e s t s u b u n i t o f s w e e t p o t a t o c y t o c h r o m e c o x i d a s e . E u r . J . B i o c h e m . 1 6 5 , 3 0 3 - 3 0 7 . N a k a g a w a , T . , M a e s h i m a , M . , N a k a m u r a , K . , & A s a h i , T . ( 1 9 9 0 ) M o l e c u l a r ‘ c l o n i n g o f a c D N A f o r t h e s m a l l e s t n u c l e a r - e n c o d e d s u b u n i t o f s w e e t p o t a t o c y t o c h r o m e c o x i d a s e . . E u r . J . B i o c h e m . 1 9 1 , 5 5 7 - 5 6 1 . N a l e c z , K . A . , B o l l i , R . , & A z z i , A . ( 1 9 8 3 ) P r e p a r a t i o n o f m o n o m e r i c c y t o c h r o m e c o x i d a s e : i t s k i n e t i c s d i f f e r f r o m t h o s e o f t h e d i m e r i c e n z y m e . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 1 4 , 8 2 2 - 8 2 8 . N a q u i , A . , P o w e r s , L . , L u n d e e n , M . , C o n s t a n t i n e s c u , A . , & C h a n c e , B . ( 1 9 8 8 ) O n t h e e n v i r o n m e n t o f z i n c i n b e e f h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e : A n X - r a y a b s o r p t i o n s t u d y . J . B i o l . C h e m . 2 6 3 , 1 2 3 4 2 - 1 2 3 4 5 . 2 9 0 N e u b u r g e r , M . , & D o u c e , R . ( 1 9 7 8 ) T r a n s p o r t o f N A D + t h r o u g h t h e i n n e r m e m b r a n e o f p l a n t m i t o c h o n d r i a . i n P l a n t M i t o c h o n d r i a , E l s e v i e r / N o r t h - H o l l a n d B i o m e d i c a l P r e s s . N e u b u r g e r , M . , & D o u c e , R . ( 1 9 8 3 ) S l o w p a s s i v e d i f f u s i o n o f N A D + b e t w e e n i n t a c t i s o l a t e d p l a n t m i t o c h o n d r i a a n d s u s p e n d i n g m e d i u m . B i o c h e m . J . 2 1 6 , 4 4 3 - 4 5 0 . N e u b u r g e r , M . , D a y , D . A . , & D o u c e , R . ( 1 9 8 5 ) T r a n s p o r t o f N A D + i n P e r c o l l - ‘ p u r i fi e d p o t a t o t u b e r m i t o c h o n d r i a . I n h i b i t i o n o f N A D + i n fl u x a n d e fi l u x b y N — 4 - a z i d o - 1 - n i t r o p h e n y l - 4 - a m i n o b u t y r y l - 3 ' - N A D + . P l a n t P h y s i o l . 7 8 , 4 0 5 - 4 1 0 . N e w t o n , K . J . , K n u d s e n , C . , G a b a y - L a u g h n a n , S . , & L a u g h n a n , J . R . ( 1 9 9 0 ) A n a b n o r m a l g r o w t h m u t a n t i n m a i z e h a s a d e f e c t i v e m i t o c h o n d r i a l c y t o c h r o m e o x i d a s e g e n e . P l a n t C e l l 2 , 1 0 7 - 1 1 3 . N i c h o l l s , P . ( 1 9 6 5 ) C y t o c h r o m e o x i d a s e i n s i t u : C o n c e p t s a n d q u e s t i o n s . i n O x i d a s e s a n d r e l a t e d r e d o x s y s t e m s . e d s . T . E . K i n g , H . S . M a s o n , & M . M o r r i s o n , W i l e y , N e w Y o r k , 7 6 4 - 7 7 7 . N i c h o l l s , P . , & S a n e , N . ( 1 9 8 4 ) K i n e t i c s o f c y t o c h r o m e c a n d T M P D o x i d a t i o n b y c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m t h e t h e r m o p h i l i c b a c t e r i u m , P S 3 . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 7 6 7 , 2 4 0 - 2 4 7 . N i l s s o n , T . , G e l l e s , J . , L i , P . M . , & C h a n . S . I . ( 1 9 8 8 ) C h e m i c a l m o d i fi c a t i o n o f t h e C u A s i t e a f f e c t s t h e p r o t o n p u m p i n g a c t i v i t y o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 2 7 , 2 9 6 - 3 0 1 . N i v i s o n , H . T . , & H a n s o n , M . R . ( 1 9 8 9 ) I d e n t i fi c a t i o n o f a m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n a s s o c i a t e d w i t h c y t o p l a s m i c m a l e s t e r i l i t y i n P e t u n i a . P l a n t C e l l 1 , 1 1 2 1 - 1 1 3 0 . O b e n l a n d , D . , H i s e r , C . , M c I n t o s h , L . , S b i b l e s , R . , & S t e w a r t , C R . ( 1 9 8 8 ) O c c u r r e n c e o f a l t e r n a t i v e r e s p i r a t o r y c a p a c i t y i n s o y b e a n a n d p e a ; P l a n t P h y s i a l . 8 8 , 5 2 8 - 5 3 1 . O b l a d , M . , S e l i n , E . , M a l m s t r o m , B . , S t r i d , L . , A a s a , R . , & M a l m s t r o m , B . G . ( 1 9 8 9 ) A n a l y t i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f c y t o c h r o m e o x i d a s e p r e p a r a t i o n s w i t h r e g a r d t o m e t a l a n d p h o s p h o l i p i d c o n t e n t s , p e p t i d e c o m p o s i t i o n a n d c a t a l y t i c a c t i v i t y . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 9 7 5 , 2 6 7 - 2 7 0 . O h n i s h i , T . , H a r m o n , H . J . , & W a r i n g , A . J . ( 1 9 8 5 ) E l e c t r o n - p a r a m a g n e t i c - r e s o n a n c e s t u d i e s o n t h e s p a t i a l r e l a t i o n s h i p o f r e d o x c o m p o n e n t s i n c y t o c h r o m e o x i d a s e . B i o c h e m . S o c . T r a n s . 1 3 , 6 0 7 - 6 1 0 . O l i v e b e r g , M . , & M a l m s t r o m , B . G . ( 1 9 9 1 ) I n t e r n a l e l e c t r o n t r a n s f e r i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e : E v i d e n c e f o r a r a p i d e q u i l i b r i u m b e t w e e n c y t o c h r o m e a a n d t h e b i m e t a l i c s i t e . B i o c h e m i s t r y 3 0 , 7 0 5 3 - 7 0 5 7 . 2 9 1 O s h e r o fi ' , N . , B r a u t i g a n , D . L . , & M a r g o l i a s h , E . ( 1 9 8 0 ) D e fi n i t i o n o f e n z y m a t i c i n t e r a c t i o n d o m a i n s o n c y t o c h r o m e c . J B i o l . C h e m . 2 5 5 , 8 2 4 5 - 8 2 5 1 . O z a w a , T . , T a n a k a , M . , & W a k a b a y a s h i , T . ( 1 9 8 2 ) C r y s t a l l i z a t i o n o f m i t o c h o n d r i a l c y t o c h r o m e o x i d a s e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 7 9 , 7 1 7 5 - 7 1 7 9 . P a i l l a r d , M . , S e d e r o f f , R . R . , & L e v i n g s , C . S . , I I I . ( 1 9 8 5 ) N u c l e o t i d e s e q u e n c e o f t h e S - 1 m i t o c h o n d r i a l D N A f r o m t h e S c y t a p l a s m o f m a i z e . E M B O J . 4 , 1 1 2 5 - 1 1 2 8 . P a l m e r , J . D . , & H e r b o n , L . A . ( 1 9 8 7 ) U n i c i r c u l a r s t r u c t u r e o f t h e B r a s s i c a h i r t a m i t o c h o n d r i a l g e n o m e . C u r r . G e n e t . 1 1 , 5 6 5 - 5 7 0 . P a l m e r , J . D . , & S h i e l d s , C R . ( 1 9 8 4 ) T r i p a r t i t e s t r u c t u r e o f t h e B r a s s i c a c a m p e s t r i s m i t o c h o n d r i a l g e n o m e . N a t u r e 3 0 7 , 4 3 7 - 4 4 0 . P a l m e r , J . M . ( 1 9 7 6 ) T h e o r g a n i z a t i o n a n d r e g u l a t i o n o f e l e c t r o n t r a n s p o r t i n p l a n t m i t o c h o n d r i a . A n n . R e v . P l a n t P h y s i o l . 2 7 , 1 3 3 - 1 5 7 . P a l m e r , J . M . ( 1 9 7 9 ) T h e ‘ u n i q u e n e s s ’ o f p l a n t m i t o c h o n d r i a . B i o c h e m . S o c . T r a n s . 7 , 2 4 6 - 2 5 2 . P a l m e r , J . M . , & P a s s a m , H . C . ( 1 9 7 1 ) T h e o x i d a t i o n o f e x o g e n o u s r e d u c e d n i c o t i n a m i d e — a d e n i n e d i n u c l e o t i d e b y p l a n t m i t o c h o n d r i a . B i o c h e m . J . 1 2 2 , 1 6 - 1 7 p . P a n , L . - P . , H a z z a r d , J . T . , L i n , J . , T o l l i n , G . , & C h a n , S . I . ( 1 9 9 1 b ) T h e e l e c t r o n i n p u t t o c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m c y t o c h r o m e c . J . A m . C h e m . S o c . 1 1 3 , 5 9 0 8 - 5 9 1 0 . P a n , L . P . , L i , Z . , L a r s e n , R . , & C h a n , S . I . ( 1 9 9 1 a ) T h e n a t u r e o f C u x i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . J . B i o l . C h e m . 2 6 6 , 1 3 6 7 - 1 3 7 0 . P a s s a r e l l a , S . , S t l a n t e , A . , & Q u a g l i a r i e l l o , E . ( 1 9 8 5 ) O x a l o a c e t a t e p e r m e a t i o n i n r a t k i d n e y m i t o c h o n d r i a : p y r u v a t e / o x a l o a c e t a t e a n d m a l a t e / o x a l o a c e t a t e t r a n s l o c a t o r s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 2 9 , 1 - 1 0 . P a t t e r s o n , T . E . , & P a y t o n , R D . ( 1 9 8 6 ) C O X 8 , t h e s t r u c t u r a l g e n e f o r y e a s t c y t o c h r o m e c o x i d a s e s u b u n i t V I I I . J . B i o l . C h e m . 2 6 1 , 1 7 1 9 2 - 1 7 1 9 7 . P a y n e , G . , K a n o , Y . , & D a l y , J . M . ( 1 9 8 0 ) A c o m p a r i s o n o f p u r i fi e d h o s t s p e c i fi c t o x i n f r o m H e l m i n t h a s p a r i u m m a y d i s , r a c e T , a n d i t s a c e t a t e d e r i v a t i v e a n o x i d a t i o n b y m i t o c h o n d r i a f r o m s u s c e p t i b l e a n d r e s i s t a n t p l a n t s . P l a n t P h y s i o l . 6 5 , 7 8 5 - 7 9 1 . 2 9 2 P e i f f e r , W . E . , I n g l e , R . T . , & F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 1 9 9 0 ) S t r u c t u r a l l y u n i q u e p l a n t c y t o c h r o m e c o x i d a s e i s o l a t e d f r o m w h e a t g e r m , a r i c h s o u r c e o f p l a n t m i t o c h o n d r i a l e n z y m e s . B i o c h e m i s t r y 2 9 , 8 6 9 6 - 8 7 0 1 . P e n t t i l a , T . ( 1 9 8 3 ) P r o p e r t i e s a n d r e c o n s t i t u t i o n o f c y t o c h r o m e o x i d a s e d e fi c i e n t i n s u b u n i t I I I . E u r . J . B i o c h e m . 1 3 3 , 3 5 5 - 3 6 1 . P f a n n e r , N . , R a s s o w , J . , v a n d e r K l e i , I . J . & N e u p e r t , W . ( 1 9 9 2 ) A d y n a m i c m o d e l o f t h e m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n i m p o r t m a c h i n e r y . C e l l 6 8 , 9 9 9 - 1 0 0 2 . P o w e l l , L . M . , W a l l i s , S . C . , P e a s e , R . J . , E d w a r d s , Y . H . , K n o t t , T . J . , & S c o t t , J . ( 1 9 8 7 ) A n o v e l f a r m o f t i s s u e - s p e c i fi c R N A p r o c e s s i n g p r o d u c e s a p o l i p o p r o t e i n - B 4 8 i n i n t e s t i n e . C e l l 5 0 , 8 3 1 - 8 4 0 . P o w e r , S . D . , L o c h r i e , M . A . , S e v a r i n o , K . A . , P a t t e r s o n , T . E . , & P a y t o n , R D . ( 1 9 8 4 ) T h e n u c l e a r - c o d e d s u b u n i t s o f y e a s t c y t o c h r o m e c o x i d a s e . I . F r a c t i o n a t i o n o f t h e h o l o e n z y m e i n t o c h e m i c a l l y p u r e p o l y p e p t i d e s a n d t h e i d e n t i fi c a t i o n o f t w o n e w s u b u n i t s u s i n g s o l v e n t e x t r a c t i o n a n d r e v e r s e d p h a s e h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y . J . B i o l . C h e m . 2 5 9 , 6 5 6 4 - 6 5 7 0 . P o w e r s , L . , C h a n c e , B . , C h i n g , T . - C . , & L e e , C . - P . ( 1 9 8 7 ) S t r u c t u r e o f t h e c o p p e r s i t e s i n m e m b r a n e - b o u n d c y t o c h r o m e c o x i d a s e . J . B i o l . C h e m . 2 6 2 , 3 1 6 0 - 3 1 6 4 . P o w e r s , L . , C h a n c e , B . , C h i n g , Y . , & A n g i o l i l l o , P . ( 1 9 8 1 ) S t r u c t u r a l f e a t u r e s - a n d t h e r e a c t i o n m e c h a n i s m o f c y t o c h r o m e o x i d a s e . B i o p h y s . J . 3 4 , 4 6 5 - 4 9 8 . P o w e r s , L . , C h a n c e , B . , C h i n g , Y . , M u h o b e r a c , B . , W e i n t r a u b , S . T . , & W h a r t o n , D C . ( 1 9 8 2 ) S t r u c t u r a l f e a t u r e s o f t h e c o p p e r - d e p l e t e d c y t o c h r o m e o x i d a s e f r o m b e e f h e a r t : I r o n E X A F S . F E B S L e t t . 1 3 8 , 2 4 5 - 2 4 8 . P o y t o n , R . O . , & S c h a t z , G . ( 1 9 7 5 ) C y t o c h r o m e c o x i d a s e fi - o m b a k e r s ’ y e a s t . N . I m m u n o l o g i c a l e v i d e n c e f o r t h e p a r t i c i p a t i o n o f a m i t o c h o n d r i a l l y s y n t h e s i z e d s u b u n i t i n e n z y m a t i c a c t i v i t y . J . B i o l . C h e m . 2 5 0 , 7 6 2 - 7 6 6 . P a y t o n , R . O . , T r u e b l o o d , C . E . , W r i g h t , R . M . , & F a r r e l l , L E . ( 1 9 8 8 ) E x p r e s s i o n a n d f r m c t i o n o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e s u b u n i t i s o l o g u e s . A n n . N Y A c a d . S c i . 5 5 0 , 2 8 9 - 3 0 7 . P r i n g , D . R . , & L e v i n g s , 0 . 8 . , I I I . ( 1 9 7 8 ) H e t e r o g e n e i t y o f m a i z e c y t o p l a s m i c g e n o m e s a m o n g m a l e - s t e r i l e c y t o p l a s m s . G e n e t i c s 8 9 , 1 2 1 - 1 3 6 . P r i n g , D . R . , C o n d e , M . F . , S c h e r t z , K . F . , & L e v i n g s , C . S . , I I I . ( 1 9 8 2 ) P l a s m i c - l i k e D N A s a s s o c i a t e d w i t h m i t o c h o n d r i a o f c y t 0 p l a s m i c m a l e - s t e r i l e S o r g h u m . M a l . G e n . G e n e t . 1 8 6 , 1 8 0 - 1 8 4 . 2 9 3 P r i n g , D . R . , L e v i n g s , C . S . , I I I , H u , W . W . L . , & T i m o t h y , D H . ( 1 9 7 7 ) U n i q u e D N A a s s o c i a t e d w i t h m i t o c h o n d r i a i n t h e " S " - t y p e c y t o p l a s m o f m a l e - s t e r i l e m a i z e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 7 4 , 2 9 0 4 - 2 9 0 8 . P r o c h a s k a , L . J . , & R e y n o l d s , K A . ( 1 9 8 6 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f e l e c t r o n - t r a n s f e r a n d p r o t o n - t r a n s l o c a t i o n a c t i v i t i e s i n b o v i n e h e a r t m i t o c h o n d r i a l c y t o c h r o m e c o x i d a s e d e fi c i e n t i n s u b u n i t I I I . B i o c h e m i s t r y 2 5 , 7 8 1 - 7 8 7 . P r o c h a s k a , L . J . , B i s s o n , R . , C a p a l d i , R . A . , S t e f f e n s , G . C . M . , & B u s e , G . ( 1 9 8 1 ) I n h i b i t i o n o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e f u n c t i o n b y d i c y c l o h e x y l c a r b o d i i m i d e . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 6 3 7 , 3 6 0 - 3 7 3 . P r u i t t , K . D . , & H a n s o n , M R . ( 1 9 8 9 ) C y t o c h r o m e o x i d a s e s u b u n i t I I s e q u e n c e s i n P e t u n i a m i t o c h o n d r i a : t w o i n t r o n - c o n t a i n i n g g e n e s a n d a n i n t r o n - l e s s p s e u d o g e n e a s s o c i a t e d w i t h c y t o p l a s m i c m a l e s t e r i l i t y . C u r r . G e n e t . 1 6 , 2 8 1 - 2 9 1 . P fi t t n e r , I . , C a r a f o l i , E . , & M a l a t e s t a , F . ( 1 9 8 5 ) S p e c t r o s c o p i c a n d f u n c t i o n a l p r o p e r t i e s o f s u b u n i t I H - d e p l e t e d c y t o c h r o m e o x i d a s e . J . B i o l . C h e m . 2 6 0 , 3 7 1 9 - 3 7 2 3 . P i i t t n e r , I . , S o l i o z , M . , C a r a f o l i , E . , & L u d w i g , B . ( 1 9 8 3 ) D i c y c l o h e x y l c a r b o d i i m i d e d o e s n o t i n h i b i t p r o t o n p u m p i n g b y c y t o c h r o m e c o x i d a s e o f P a r a c o c c u s d e n i t r i f i c a n s . E u r . J . B i o c h e m . 1 3 4 , 3 3 - 3 7 . P u u s t i n e n , A . & W i k s t r o m , M . ( 1 9 9 1 ) T h e h e m e g r o u p s o f c y t o c h r o m e a f r o m E s c h e r i c h i a c o l i . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 8 8 , 6 1 2 2 - 6 1 2 6 . P u u s t i n e n , A . , F i n e l , M . , H a l t i a , T . , G e n n i s , R . , & W i k s t r o m , M . ( 1 9 9 1 ) P r o p e r t i e s o f t h e t w o t e r m i n a l o x i d a s e s o f E s c h e r i c h i a c o l i . B i o c h e m i s t r y 3 0 , 3 9 3 6 - 3 9 4 2 . P u u s t i n e n , A . , F i n e l , M . , V i r k k i , M . , & W i k s t r o m , M . ( 1 9 8 9 ) C y t o c h r o m e a ( b o ) i s a p r o t o n p u m p i n P a r a c o c c u s d e n i t r i fl c a n s a n d E s c h e r i c h i a c o l i . F E B S L e t t . 2 4 9 , 1 6 3 - 1 6 7 . R a i t i o , M . P i s p a , J . M . , M e t s o , T . , & S a r a s t e , M . ( 1 9 9 0 ) A r e t h e r e i s o z y m e s o f c y t o c h r o m e o x i d a s e i n P a r a c o c c u s d e n i t r i fi c a n s ? F E B S L e t t . 2 6 1 , 4 3 1 - 4 3 5 . R a i t i o , M . , J a l l i , T . , & S a r a s t e , M . ( 1 9 8 7 ) I s o l a t i o n a n d a n a l y s i s o f t h e g e n e s f o r c y t o c h r o m e c o x i d a s e i n P a r a c o c c u s d e n i t r i fi c a n s . E M B O J . 6 , 2 8 2 5 - 2 8 3 3 . R a s m u s s e n , J . , & H a n s o n , M R . ( 1 9 8 9 ) A N A D H d e h y d r o g e n a s e s u b u n i t g e n e i s c o - t r a n s c r i b e d w i t h t h e a b n o r m a l P e t u n i a m i t o c h o n d r i a l g e n e a s s o c i a t e d w i t h c y t o p l a s m i c m a l e s t e r i l i t y . M o l . G e n . G e n e t . 2 1 5 , 3 3 2 - 3 3 6 . ' 3 “ . r 2 9 4 R e k o s h , D . M . K . , R u s s e l l , W . C . , B e l l e t , A . J . D . , & R o b i n s o n , A . J . ( 1 9 7 7 ) I d e n t i fi c a t i o n o f a p r o t e i n l i n k e d t o t h e e n d s o f a d e n o v i r u s D N A . C e l l 1 1 , 2 8 3 - 2 9 5 . R h o a d s , D . M . , & M c I n t o s h , L . ( 1 9 9 1 ) I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a c D N A c l o n e e n c o d i n g a n a l t e r n a t i v e o x i d a s e p r o t e i n o f S a u r o m a t u m g u t t a t u m ( S c h o t t ) . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 8 8 , 2 1 2 2 - 2 1 2 6 . R i c h , P . R . , W e s t , I . C . , & M i t c h e l l , P . ( 1 9 8 8 ) T h e l o c a t i o n o f C u A i n m a m m a l i a n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . F E B S L e t t . 2 3 3 , 2 5 - 3 0 . R i e m a n n , A . , H i i t h e r , F . - J . , B e r d e n , J . A . , & K a d e n b a c h , B . ( 1 9 8 8 ) A n i o n s i n d u c e c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s a n d i n fl u e n c e t h e a c t i v i t y a n d p h o t o a f fi n i t y - l a b e l l i n g b y 8 - a z i d o - A T P o f i s o l a t e d c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h e m . J . 2 5 4 , 7 2 3 - 7 3 0 . R o b i n s o n , N . C . , & T a l b e r t , L . ( 1 9 8 6 ) T r i t o n X - 1 0 0 i n d u c e d d i s s o c i a t i o n o f b e e f h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e i n t o m o n o m e r s . B i o c h e m i s t r y 2 5 , 2 3 2 8 - 2 3 3 5 . R o b i n s o n , N . C . , D a l e , M . P . , & T a l b e r t , L . H . ( 1 9 9 0 ) S u b u n i t a n a l y s i s o f b o v i n e c y t o c h r o m e c o x i d a s e b y r e v e r s e p h a s e h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 2 8 1 , 2 3 9 - 2 4 4 . R o s e v e a r , P . , v a n A k e n , T . , B a x t e r , J . , & F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 1 9 8 0 ) A l k y l g l y c o s i d e d e t e r g e n t s : A s i m p l e r s y n t h e s i s a n d t h e i r e f f e c t s o n l n ' n e t i c a n d p h y s i c a l p r o p e r t i e s o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 1 9 , 4 1 0 8 - 4 1 1 5 . R o t t m a n , W . H . , B r e a r s , T . , H o d g e , T . P . , & L o n s d a l e , B M . ( 1 9 8 7 ) A m i t o c h o n d r i a l g e n e i s l o s t v i a h o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o n d u r i n g r e v e r s i o n o f C M S T m a i z e t o f e r t i l i t y . E M B O J . 6 , 1 5 4 1 - 1 5 4 6 . R u b i n , M . S . , & T z a g a l o f f , A . ( 1 9 7 8 ) C y t o c h r o m e o x i d a s e o f S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e . M e t h . E n z . 5 3 , 7 3 - 7 9 . R u b i n , M . S . , & T z a g o l o f f , A . ( 1 9 7 3 ) A s s e m b l y o f t h e m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s y s t e m . D C . P u r i fi c a t i o n , c h a r a c t e r i z a t i o n , a n d s u b u n i t s t r u c t u r e o f y e a s t a n d b e e f c y t o c h r o m e o x i d a s e . J . B i o l . C h e m . 2 4 8 , 4 2 6 9 - 4 2 7 4 . S a l a s , M . , M e l l a d o , R . P . , & V i r ‘ i u e l a , E . ( 1 9 7 8 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f a p r o t e i n c o v a l e n t l y l i n k e d t o t h e 5 ' t e r m i n i o f t h e D N A o f B a c i l l i s s u b t i l i s p h a g e 9 2 9 . J . M a l . B i o l . 1 1 9 , 2 6 9 - 2 9 1 . S a l e r n o , J . C . , B o l g i a n o , B . , & I n g l e d e w , W . J . ( 1 9 8 9 ) P o t e n t i o m e t r i c t i t r a t i o n o f c y t o c h r o m e b a - t y p e q u i n o l o x i d a s e o f E s c h e r i c h i a c o l i : e v i d e n c e f o r h e m e - h e m e a n d c a p p e r - h e m e i n t e r a c t i o n . F E B S L e t t . 2 4 7 , 1 0 1 - 1 0 5 . S a n f o r d , J . C . ( 1 9 9 0 ) O p t i m i z a t i o n o f t h e b i o l i s t i c p r o c e s s f o r o r g a n e l l e t r n a s f o r m a t i o n . F o u r t h I n t e r n a t i o n a l W o r k s h o p o n P l a n t M i t o c h o n d r i a , C o r n e l l U n i v e r s i t y , I t h a c a , N e w Y o r k . 2 9 5 S a r a s t e , M . ( 1 9 9 0 ) S t r u c t u r a l f e a t u r e s o f c y t o c h r o m e o x i d a s e . Q . R e v . B i o p h y s . 2 3 , 3 3 1 - 3 6 6 . S a r a s t e , M . , M e t s o , T . , N a k a r i , T . , J a l l i , T . , L a u r a e u s , M . , & v a n d e r O o s t , J . ( 1 9 9 1 ) T h e B a c i l l u s s u b t i l i s c y t o c h o m e — c o x i d a s e . V a r i a t i o n s o n a c o n s e r v e d p r o t e i n t h e m e . E u r . J . B i o c h e m . 1 9 5 , 5 1 7 - 5 2 5 . S a r a s t e , M . , P e n t t i l a , T . , & W i k s t r o m , M . ( 1 9 8 1 ) Q u a t e r n a r y s t r u c t u r e o f b o v i n e c y t o c h r o m e o x i d a s e . E u r . J . B i o c h e m . 1 1 5 , 2 6 1 - 2 6 8 . S a r t i , P . , A n t o n i n i , G . , M a l a t e s t a , F . , V a l l o n e , B . , & B r u n o r i , M . ( 1 9 8 8 ) I s t h e i n t e r n a l e l e c t r o n t r a n s f e r t h e r a t e - l i m i t i n g s t e p i n t h e c a t a l y t i c c y c l e o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e ? A n n . N Y . A c a d . S c i . 5 5 0 , 1 6 1 - 1 6 6 . S a r t i , P . , J o n e s , M . G . , A n t o n i n i , G . , M a l a t e s t a , F . , C o l o s i m o , A . , W i l s o n , M . T . , & B r r m o r i , M . ( 1 9 8 5 ) K i n e t i c s o f r e d o x - l i n k e d p r o t o n p u m p i n g a c t i v i t y o f n a t i v e a n d s u b u n i t I I I - d e p l e t e d c y t o c h r o m e c o x i d a s e : A s t o p p e d - fl o w i n v e s t i g a t i o n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 8 2 , 4 8 7 6 - 4 8 8 0 . S a s s a r o l i , M . , C h i n g , Y . - C . , D a s g u p t a , S . , & R o u s s e a u , D . ( 1 9 8 9 ) C y t o c h r o m e c o x i d a s e : E v i d e n c e f o r i n t e r a c t i o n o f w a t e r m o e l e c u l e s w i t h - c y t o c h r o m e a . B i o c h e m i s t r y 2 8 , 3 1 2 8 - 3 1 3 2 . S c h a g g e r , H . , & v a n J a g o w , G . ( 1 9 9 1 ) B l u e n a t i v e e l e c t r o p h o r e s i s f o r i s o l a t i o n o f m e m b r a n e p r o t e i n c o m p l e x e s i n e n z y m a t i c a l l y a c t i v e f o r m . A n a l . B i o c h e m . 1 9 9 , 2 2 3 - 2 3 1 S c h a r d l , C . L . , L o n s d a l e , D M . , P r i n g , D . R . , & R o s e , K R . ( 1 9 8 4 ) L i n e a r i z a t i o n o f m a i z e m i t o c h o n d r i a l c h r o m o s o m e s b y r e c o m b i n a t i o n w i t h l i n e a r e p i s o m e s . N a t u r e 3 1 0 , 2 9 2 - 2 9 6 . S c h a r d l , C . L . , P r i n g , D . R . , & L o n s d a l e , D . M . ( 1 9 8 5 ) M i t o c h o n d r i a l D N A r e a r r a n g e m e n t s a s s o c i a t e d w i t h f e r t i l e r e v e r t a n t s o f S - t y p e m a l e - s t e r i l e m a i z e . C e l l 4 3 , 3 6 1 - 3 6 8 . S c h i a v o , G . , & B i s s o n , R . ( 1 9 8 9 ) O x y g e n i n fl u e n c e s t h e s u b u n i t s t r u c t u r e o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e i n t h e s l i m e m o l d D i c t y a s t e l i u m d i s c o i d e u m . J . B i o l . C h e m . 2 6 4 , 7 1 2 9 - 7 1 3 4 . S c h l e r f , A . , D r o s t e , M . , W i n t e r , M . & K a d e n b a c h , B . ( 1 9 8 8 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f t w o d i f f e r e n t g e n e s ( c D N A ) f o r c y t o c h r o m e c o x i d a s e s u b u n i t V I a f r o m h e a r t a n d l i v e r o f t h e r a t . E M B O J . 7 , 2 3 8 7 - 2 3 9 1 . S c h o l e s , C . P . , & M a l m s t r o m , B . G . ( 1 9 8 6 ) T w o - e l e c t r o n r e d u c t i o n o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e t r i g g e r s a c o n f o r m a t i o n a l t r a n s i t i o n . F E B S L e t t . 1 9 8 , 1 2 5 - 1 2 9 . S c h o n , E . A . , B o n i l l a , E . , L o m b e s , A . , M o r a e s , G . T . , N a k a s e , H . , R i z z u t o , R . , Z e v i a n i , M . , & D i M a u r o , S . ( 1 9 8 8 ) C l i n c a l a n d b i o c h e m i c a l s t u d i e s o n c y t o c h r o m e o x i d a s e d e fi c i e n c i e s . A n n . N Y A c a d . S c i . 5 5 0 , 3 4 8 - 3 5 9 . ‘ 1 3 ‘ 1 2 9 6 S c h o n , E . A . , R i z z u t o , R . , M o r a e s , C . T . , N a k a s e , H . , Z e v i a n i , M . , & D i M a u r o , S . ( 1 9 8 9 ) A d i r e c t r e p e a t i s a h o t s p o t f o r l a r g e - s c a l e d e l e t i o n o f h u m a n m i t o c h o n d r i a l D N A . S c i e n c e 2 4 4 , 3 4 6 - 3 4 9 . S c h o n b a u m , G . R . , B o n n e r , W . D . , J r . , S t o r e y , B . T . , & B a h r , J . T . ( 1 9 7 1 ) S p e c i fi c i n h i b i t i o n o f t h e c y a n i d e - i n s e n s i t i v e r e s p i r a t o r y p a t h w a y i n p l a n t m i t o c h o n d r i a b y h y d r o x a m i c a c i d s . P l a n t P h y s i o l . 4 7 , 1 2 4 - 1 2 8 . . S c h u s t e r , W . , & B r e n n i c k e , A . ( 1 9 8 7 ) P l a s t i d , n u c l e a r a n d r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e s e q u e n c e s i n t h e m i t o c h o n d r i a l g e n o m e o f O e n o t h e r a : I s g e n e t i c i n f o r m a t i o n t r a n s f e r r e d b e t w e e n o r g a n e l l e s v i a R N A ? E M B O J . 6 , 2 8 5 7 - 2 8 6 3 . S c h u s t e r , W . , & B r e n n i c k e , A . ( 1 9 9 0 ) R N A e d i t i n g o f A T P a s e s u b u n i t 9 t r a n s c r i p t s i n O e n o t h e r a m i t o c h o n d r i a . F E B S L e t t . 2 6 8 , 2 5 2 - 2 5 6 . S c h u s t e r , W . , H i e s e l , R . , W i s s i n g e r , B . , & B r e n n i c k e , A . ( 1 9 9 0 b ) R N A e d i t i n g i n t h e c y t o c h r o m e b l o c u s o f t h e h i g h e r p l a n t O e n o t h e r a b e r t e r i a n a i n c l u d e s a U - t o - C t r a n s i t i o n . M o l . C e l l B i o l . 1 0 , 2 4 2 8 - 2 4 3 1 . S c h u s t e r , W . , W i s s i n g e r , B . , H i e s e l , R . , U n s e l d , M . , G e r a l d , E . , K n o o p , V . , M a r c h f e l d e r , A . , B i n d e r , 8 . , S c h o b e l , W . , S c h e i k e , R . , G r t i n g e r , P . , T e r n e s , R . , & B r e n n i c k e , A . ( 1 9 9 1 ) B e t w e e n D N A a n d p r o t e i n - R N A e d i t i n g i n p l a n t m i t o c h o n d r i a . P h y s i o l . P l a n t . 8 1 , 4 3 7 - 4 4 5 . S c h u s t e r , W . , W i s s i n g e r , B . , U n s e l d , M . , & B r e n n i c k e , A . ( 1 9 9 0 a ) T r a n s c r i p t s o f t h e N A D H - d e h y d r o g e n a s e s u b u n i t 3 g e n e a r e d i f f e r e n t i a l l y e d i t e d i n O e n o t h e r a m i t o c h o n d r i a . E M B O J . 9 , 2 6 3 - 2 6 9 . S c o t t , R A . ( 1 9 8 9 ) X - r a y a b s o r p t i o n s p e c t r o s c o p i c i n v e s t i g a t i o n s o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n . A n n . R e v . B i o p h y s . B i o p h y s . C h e m . 1 8 , 1 3 7 - 1 5 8 . S c o t t , R . A . , L i , P . M . , & C h a n , S I . ( 1 9 8 8 ) T h e b i n u c l e a r s i t e o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e : S p e c t r a l e v i d e n c e f r o m i r o n X - r a y a b s o r p t i o n s p e c t r o s c o p y . A n n . N Y . A c a d . S c i . 5 5 0 , 5 3 - 5 8 . S c o t t , R . A . , S c h w a r t a z , J . R . , & C r a m e r , S P . ( 1 9 8 6 ) S t r u c t u r a l a s p e c t s o f t h e c o p p e r s i t e s i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . A n X - r a y a b s o r p t i o n s p e c t r o s c o p i c i n v e s t i g a t i o n o f t h e r e s t i n g - s t a t e o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 2 5 , 5 5 4 6 - 5 5 5 5 . S c o t t , R . A . , Z u m f t , W . G . , C o y l e , C . L . , & D o o l e y , D . M . ( 1 9 8 9 ) P s e u d a m a n a s s t u t z e r i N 2 0 r e d u c t a s e c o n t a i n s C u A - t y p e s i t e s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 8 6 , 4 0 8 2 - 4 0 8 6 . S e b a l d , W . , W e i s s , H . , & J a c k l , G . ( 1 9 7 2 ) I n h i b i t i o n o f t h e a s s e m b l y o f c y t o c h r o m e o x i d a s e i n N e u r a s p a r a c r a s s a b y c h l o r a m p h e n i c o l . E u r . J . B i o c h e m . 3 0 , 4 1 3 - 4 1 7 . 2 9 7 S e v a r i n o , K . A . , & P a y t o n , R . O . ( 1 9 8 0 ) M i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e b i o g e n e s i s : I d e n t i fi c a t i o n o f a p r e c u r s o r t o y e a s t c y t o c h r o m e c o x i d a s e s u b u n i t I I , a n i n t e g r a l p o l y p e p t i d e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 7 7 , 1 4 2 - 1 4 6 . S h a k e s p e a r e , P . G . , & M a h l e r , H R . ( 1 9 7 1 ) P u r i fi c a t i o n a n d s o m e p r o p e r t i e s o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m t h e y e a s t S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e . J . B i o l . C h e m . 2 4 6 , 7 6 4 9 - 7 6 5 5 . S h a p l e i g h , J . P . , & G e n n i s , R B . ( 1 9 9 2 ) C l o n i n g , s e q u e n c i n g a n d d e l e t i o n f r o m t h e c h r o m o s o m e o f t h e g e n e e n c o d i n g s u b u n i t I o f t h e a a 3 - t y p e c y t o c h r o m e c o r n ' d a s e o f R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s . M a l . M i c r o . 6 , 6 3 5 - 6 4 2 . S h a p l e i g h , J . P . , H o s l e r , J . P . , T e c k l e n b u r g , M . M . J , K i m , Y . , B a b c o c k , G . T . , G e n n i s , R . B . , & F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 1 9 9 2 ) D e fi n i t i o n o f t h e c a t a l y t i c s i t e o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e : T h e s p e c i fi c l i g a n d s o f h e m e a a n d t h e h e m e a 3 — C u 3 c e n t e r . P r o c . N a t l . A c a d . S c i , i n p r e s s . S h e r m a n , D . , K o t a k e , S . , I s h i b e , N . , & C o p e l a n d , R A . ( 1 9 9 1 ) R e s o l u t i o n o f t h e e l e c t r o n i c t r a n s i t i o n s o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e : E v i d e n c e f o r t w o c o n f o r m a t i o n a l s t a t e s o f f e r r o u s c y t o c h r o m e a . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 8 8 , 4 2 6 5 - 4 2 6 9 . S h i b a s a k a , M . , & T s u j i , H . ( 1 9 8 8 ) R e s p i r a t o r y p r o p e r t i e s o f m i t o c h o n d r i a f r o m r i c e s e e d l i n g s g e r m i n a t e d u n d e r w a t e r a n d t h e i r c h a n g e s d u r i n g a i r a d a p t a t i o n . P l a n t P h y s i o l . 8 6 , 1 0 0 8 - 1 0 1 2 . S h u m w a y , L . K . , & B a u m a n , L E ( 1 9 6 7 ) N o n c h r o m o s o m a l s t r i p e o f m a i z e . G e n e t i c s 5 5 , 3 3 - 3 8 . S i m p s o n , L . , & S h a w , J . ( 1 9 8 9 ) R N A e d i t i n g a n d t h e m i t o c h o n d r i a l c r y p t o g e n e s o f k i n e t o p l a s t i d p r o t o z o a . C e l l 5 7 , 3 5 5 - 3 6 6 . S i n j o r g o , K . M . C . , D u r a k , I . , D e k k e r , H . L . , E d e l , C . M . , B i e l e m a n , A . H . L . , B a c k , N . B . T . , H a k v o o r t , T . B . M . , & M u i s j e r s , A . O . ( 1 9 8 7 b ) T h e e f f e c t o f ' d e t e r g e n t s o n b o v i n e c y t o c h r o m e c o x i d a s e : a k i n e t i c a p p r o a c h . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 8 9 3 , 2 4 1 - 2 5 0 . S i n j o r g o , K . M . C . , D u r a k , I . , D e k k e r , H . L . , E d e l , C . M . , H a k v o o r t , T . B . M . , v a n G e l d e r , B . F . , & M u i j s e r s , A . O . ( 1 9 8 7 a ) B o v i n e c y t o c h r o m e c o x i d a s e s , p u r i fi e d f r o m h e a r t , s k e l e t a l m u s c l e , l i v e r a n d k i d n e y , d i f f e r i n t h e s m a l l s u b u n i t s b u t s h o w t h e s a m e r e a c t i o n k i n e t i c s w i t h c y t o c h r o m e c . B i o c h e m . B i o p h y s . A c t a 8 9 3 , 2 5 1 - 2 5 8 . S i n j o r g o , K . M . C . , M e i j l i n g , J . H . , & M u i j s e r s , A . O . ( 1 9 8 4 ) T h e c o n c e p t o f h i g h - a n d l o w - a f fi n i t y r e a c t i o n s i n b o v i n e c y t o c h r o m e c o x i d a s e s t e a d y - s t a t e k i n e t i c s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 7 6 7 , 4 8 - 5 6 . 2 9 8 S m i t h , B . N . , & M e e u s e , B . J . D . ( 1 9 6 6 ) P r o d u c t i o n o f v o l a t i l e a m i n e s a n d s k a t o l e a t a n t h e s i s i n s o m e A r u n l i l y s p e c i e s . P l a n t P h y s i o l . 4 1 , 3 4 3 - 3 4 7 . S m i t h , L . , & C o n r a d , H . ( 1 9 5 6 ) A s t u d y o f t h e k i n e t i c s o f t h e o x i d a t i o n o f c y t o c h r o m e c b y c y t o c h r o m e c o x i d a s e . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 6 3 , 4 0 3 - 4 1 3 . S m i t h , P . K . , K r o h n , R . I . , H e r m a n s o n , G . T . , M a l l i a , A . K . , G a r t n e r , F . H . , P r o v e n z a n o , M . D . , F u j i m o t o , E . K . , O l s o n , B . J . , K l e n k , D C . ( 1 9 8 5 ) M e a s u r e m e n t o f p r o t e i n u s i n g b i c i n c h o n i n i c a c i d . A n a l . B i o c h e m . 1 5 0 , 7 6 - 8 5 . S o l i o z , M . ( 1 9 8 4 ) D i c y c l o h e x y l c a r b o d i i m i d e a s a p r o b e f o r p r o t e i n s t r a n s l o c a t i n g e n z y m e s . T r e n d s i n B i o c h e m . S c i . 9 , 3 0 9 - 3 1 2 . S o l i o z , M . , C a r a f o l i , E . , & L u d w i g , B . ( 1 9 8 2 ) T h e c y t o c h r o m e c o x i d a s e o f P a r a c o c c u s d e n i t r i fl c a n s p u m p s p r o t o n s i n a r e c o n s t i t u t e d s y s t e m . J . B i o l . C h e m . 2 5 7 , 1 5 7 9 - 1 5 8 2 . S a n e , N . , & F u j i w a r a , Y . ( 1 9 9 1 ) H a e m O c a n r e p l a c e h a e m A i n t h e a c t i v e s i t e o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e fi ‘ a m t h e r m o p h i l i c b a c t e r i u m P S 3 . F E B S L e t t . 2 8 8 , 1 5 4 - 1 5 8 . S a n e , N . , & Y a n a g i t a , Y . ( 1 9 8 2 ) A c y t o c h r o m e a a 3 - t y p e t e r m i n a l o x i d a s e o f a t h e r m o p h i l i c b a c t e r i u m . P u r i fi c a t i o n , p r o p e r t i e s a n d p r o t o n p u m p i n g . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 6 8 2 , 2 1 6 - 2 2 6 . S a n e , N . , S h i m a d a , S . , O h m o r i , T . , S o u m a , Y . , G o n d a , M . , & I s h i z u k a , M . ( 1 9 9 0 ) A f o u r t h s u b u n i t i s p r e s e n t i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m t h e t h e r m o p h i l i c b a c t e r i u m P S 3 . F E B S L e t t . 2 6 2 , 2 4 9 - 2 5 2 . S p e c k , S . H . , D y e , D . , & M a r g o l i a s h , E . ( 1 9 8 4 ) S i n g l e c a t a l y t i c s i t e m o d e l f o r t h e o x i d a t i o n o f f e r r o c y t o c h r o m e c b y m i t o c h o n d r i a l c y t o c h r o m e c o x i d a s e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 8 1 , 3 4 7 - 3 5 1 . S t e f f e n s , G . C . M . , B u s e , G . , O p p l i g e r , W . , & L u d w i g , B . ( 1 9 8 3 ) S e q u e n c e h o m o l o g y o f b a c t e r i a l a n d m i t o c h o n d r i a l c y t o c h r o m e c o x i d a s e s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 1 6 , 3 3 5 - 3 4 0 . S t e f f e n s , G . J . , & B u s e , G . ( 1 9 7 9 ) S t u d i e s o n c y t o c h r o m e c o x i d a s e , N P r i m a r y s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f s u b u n i t I I . H a p p e - S e y l e r ' s Z . P h y s i o l . C h e m . 3 6 0 , 6 1 3 - 6 1 9 . S t e f f e n s , G . M . , B i e w a l d , R . , & B u s e , G . ( 1 9 8 7 ) C y t o c h r o m e o x i d a s e i s a t h r e e - c o p p e r , t w o - h e m e - A p r o t e i n . E u r . J . B i o c h e m . 1 6 4 , 2 9 5 - 3 0 0 . S t e r n , D . B . , & L o n s d a l e , D . M . ( 1 9 8 2 ) M i t o c h o n d r i a l a n d c h l o r o p l a s t g e n o m e s o f m a i z e h a v e a 1 2 - k i l o b a s e D N A s e q u n e c e i n c o m m o n . N a t u r e 2 9 9 , 6 9 8 - 7 0 2 . 2 9 9 S t e r n , D . B . , & P a l m e r , J . D . ( 1 9 8 4 ) E x t e n s i v e a n d w i d e s p r e a d h o m o l o g i e s b e t w e e n m i t o c h o n d r i a l D N A a n d c h l o r o p l a s t D N A i n p l a n t s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 8 1 , 1 9 4 6 - 1 9 5 0 . S t e r n , D . B . , & P a l m e r , J . D . ( 1 9 8 6 ) T r i p a r t i t e m i t o c h o n d r i a l g e n o m e o f s p i n a c h : P h y s i c a l s t r u c t u r e , m i t o c h o n d r i a l g e n e m a p p i n g , a n d l o c a t i o n s o f t r a n s p o s e d c h l o r o p l a s t D N A s e q u e n c e s . N u c l . A c i d s R e s . 1 4 , 5 6 5 1 - 5 6 6 6 . S t e v e n s , J . C . , & H o l l a n d , R F . ( 1 9 5 4 ) C y t o p l a s m i c m a l e - s t e r e i l i t y f o r h y b r i d s o r g h u m s e e d p r o d u c t i o n . A g r o n o m y J . 4 6 , 2 0 - 2 3 . S t e v e n s , T . H . , & C h a n , S . I . ( 1 9 8 1 ) H i s t i d i n e i s t h e a x i a l l i g a n d t o c y t o c h r o m e a 3 i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . J . B i o l . C h e m . 2 5 6 , 1 0 6 9 - 1 0 7 1 . S t e v e n s , T . H . , M a r t i n , G . T . , W a n g , H . , B r u d v i g , G . W . , S c h o l e s , C . P . , & C h a n , S I . ( 1 9 8 2 ) T h e n a t u r e o f C u A i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . J . B i o l . C h e m . 2 5 7 , 1 2 1 0 6 - 1 2 1 1 3 . S t o r e y , B . T . ( 1 9 7 6 ) R e s p i r a t o r y c h a i n o f p l a n t m i t o c h o n d r i a . X V I I I . P o i n t o f i n t e r a c t i o n o f t h e a l t e r n a t i v e o x i d a s e w i t h t h e r e s p i r a t o r y c h a i n . P l a n t P h y s i o l . 5 8 , 5 2 1 - 5 2 5 . S u a r e z , M . D . , R e v z i n , A . , N a r l o c k , R . , K e m p n e r , E . S . , T h o m p s o n , D . A . , & F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 1 9 8 4 ) T h e f u n c t i o n a l a n d p h y s i c a l f o r m o f m a m m a l i a n c y t o c h r o m e c o x i d a s e d e t e r m i n e d b y g e l fi l t r a t i o n , r a d i a t i o n i n a c t i v a t i o n , a n d s e d i m e n t a t i o n e q u i l i b r i u m a n a l y s i s . J . B i o l . C h e m . 2 5 9 , 1 3 7 9 1 - 1 3 7 9 9 . S u z u k i , Y . , D a n k o , S . J . , D a l y , J . M . , K a n o , Y . , K n o c h e , H . W . , & T a k e u c h i , S . ( 1 9 8 3 ) C o m p a r i s o n o f a c t i v i t i e s o f t h e h o s t - s p e c i fi c t o r n ' n o f H e l m i n t h a s p a r i u m m a y d i s , r a c e T , a n d a s y n t h e t i c C 4 1 a n a l o g . P l a n t P h y s i o l . 7 3 , 4 4 0 - 4 4 4 . S u z u k i , Y . , T e g t m e i e r , K . J . , D a l y , J . M . , & K n o c h e , H . W . ( 1 9 8 2 ) A n a l o g s o f h o s t - s p e c i fi c p h y t o t o x i n p r o d u c e d b y H e l m i n t h a s p a r i u m m a y d i s , r a c e T . I I . B i o l o g i c a l A c t i v i t i e s . B i a o r g . C h e m . 1 1 , 3 1 3 - 3 2 1 . T a h a , T . S . M . , & F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 1 9 9 2 ) I n t e r a c t i o n o f c y t o c h r o m e c w i t h c y t o c h r o m e c o r n ' d a s e s t u d i e d b y m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a n d a p r o t e i n m o d i f y i n g r e a g e n t . S u b m i t t e d t o B i o c h e m i s t r y . T a n a k a , M . , S a t o , W . , O h n o , K . , Y a m a m o t o , T . , & O z a w a , T . ( 1 9 8 9 ) D i r e c t s e q u e n c i n g o f d e l e t e d m i t o c h o n d r i a l D N A i n m y o p a t h i c p a t i e n t s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 6 4 , 1 5 6 - 1 6 3 . T h i e l , C . & K a d e n b a c h , B . ( 1 9 8 9 ) I n fl u e n c e o f n a n - e s t e r i fi e d f a t t y a c i d s o n r e s p i r a t o r y c o n t r o l o f r e c o n s t i t u t e d c y t o c h r o m e - c o x i d a s e . F E B S L e t t . 2 5 1 , 2 7 0 - 2 7 3 . 3 0 0 T h o m p s o n , D . A . , & F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 1 9 8 3 ) L i p i d a n d s u b u n i t I I I d e p l e t e d c y t o c h r o m e c o x i d a s e p u r i fi e d b y h o r s e c y t o c h r o m e c a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y i n l a u r y l m a l t o s i d e . B i o c h e m i s t r y 2 2 , 3 1 7 8 - 3 1 8 7 . T h o m p s o n , D . A . , G r e g o r y , L . , & F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 1 9 8 5 ) C y t o c h r o m e c o x i d a s e d e p l e t e d o f s u b u n i t I I I : P r o t o n p u m p i n g , r e s p i r a t o r y c o n t r o l , a n d p H d e p e n d e n c e o f t h e m i d p o i n t p o t e n t i a l o f c y t o c h r o m e a . J . I n o r g . B i o c h e m . 2 3 , 3 5 7 - 3 6 4 . T h o m p s o n , R . D . , K e m b l e , R . J . , & F l a v e l l , R B . ( 1 9 8 0 ) V a r i a t i o n s i n m i t o c h o n d r i a l D N A o r g a n i z a t i o n b e t w e e n n o r m a l a n d m a l e - s t e r i l e c y t o p l a s m s o f m a i z e . N u c l . A c i d s R e s . 8 , 1 9 9 9 - 2 0 0 8 . T h t i m s t r o m , P . - E . , N i l s s o n , T . , & M a l m s t r t i m , B . G . ( 1 9 8 8 ) T h e p o s s i b l e r o l e o f t h e c l o s e d - o p e n t r a n s i t i o n i n p r o t o n p u m p i n g b y c y t o c h r o m e c o x i d a s e : t h e p H - d e p e n d e n c e o f c y a n i d e i n h i b i t i o n . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 9 3 5 , 1 0 3 - 1 0 8 . T o b i n , A . , D j e r d i o u r , B . , J o u r n e t , E . , N e u b u r g e r , M . , & D o u c e , R . ( 1 9 8 0 ) E f f e c t o f N A D + o n m a l a t e o x i d a t i o n i n i n t a c t p l a n t m i t o c h o n d r i a . P l a n t P h y s i o l . 6 6 , 2 2 5 - 2 2 9 . T u r a n o , F . J . , D e B o n t e , L . , W i l s o n , K . G . , & M a t t h e w s , B E ( 1 9 8 7 ) C y t o c h r o m e o x i d a s e s u b u n i t I I g e n e f r o m c a r r o t c o n t a i n s a n i n t r o n . P l a n t P h y s i o l . 8 4 , 1 0 7 4 - 1 0 7 9 . T z a g o l o f f , A . ( 1 9 8 2 ) M i t o c h o n d r i a . P l e n u m P r e s s , N e w Y o r k . U l l s t r u p , A . J . ( 1 9 7 2 ) T h e i m p a c t s o f t h e s o u t h e r n c o r n l e a f b l i g h t e p i d e m i c s o f 1 9 7 0 - 1 9 7 1 . A n n . R e v . P h y t a p a t h a l . 1 0 , 3 7 - 5 0 . U m b e c k , P . F . , & G e n g e n b a c h , B . G . ( 1 9 8 3 ) R e v e r s i o n o f m a l e - s t e r i l e T - c y t o p l a s m m a i z e t o m a l e f e r t i l i t y i n t i s s u e c u l t u r e . C r o p S c i . 2 3 , 5 8 4 - 5 8 8 . V a l p u e s t a , J . M . , H e n d e r s o n , R . , & F r e y , T . G . ( 1 9 9 0 ) E l e c t r o n c r y o - m i c r o s c o p i c a n a l y s i s o f c r y s t a l l i n e c y t o c h r o m e o x i d a s e . J . M a l . B i o l . 2 1 4 , 2 3 7 - 2 5 1 . V a n d e n B o g e r t , C . , D e k k e r , H . L . , C o m e l i s s e n , J . C . , V a n K u i l e n b u r g , A . B . P . , B o l h u i s , P . A . , M u i s j e r s , A . O . ( 1 9 9 2 ) I s o f ' o r m s o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e i n t i s s u e s a n d c e l l l i n e s o f t h e m o u s e . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 1 0 9 9 , 1 1 8 - 1 2 2 . v a n G e l d e r , B . F . , & B e i n e r t , H . ( 1 9 6 9 ) S t u d i e s o f t h e h e m e c o m p o n e n t s o f c y t o c h r o m e c o r n ' d a s e b y E P R s p e c t r o s c o p y . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 1 8 9 , 1 - 2 4 . V a n n e s t e , W . H . ( 1 9 6 6 ) T h e s t o i c h i o m e t r y a n d a b s o r p t i o n s p e c t r a o f c o m p o n e n t s a a n d a 3 i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 5 , 8 3 8 - 8 4 8 . 1 1 . - w a r t s 3 0 1 V e e r m a n , E . C . I . , W i l m s , J . , C a s t l e i j n , G . , & v a n G e l d e r , B . F . ( 1 9 8 0 ) T h e p r e - s t e a d y s t a t e r e a c t i o n o f f e r r o c y t o c h r o m e c w i t h t h e c y t o c h r o m e c — c y t o c h r o m e a a 3 c o m p l e x . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 5 9 0 , 1 1 7 - 1 2 7 . V e r h e u l , F . E . A . M . , D r a i j e r , J . W . , M u i j s e r s , A . O . , & v a n G e l d e r , B . F . ( 1 9 8 2 ) T h e r e a c t i v i t y o f t h i o l g r o u p s i n b o v i n e c y t o c h r o m e c o x i d a s e t o w a r d s 5 , 5 ' - d i t h i o b i s ( 2 - n i t r o b e n z o i c a c i d ) . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 6 8 1 , 1 1 8 - 1 2 9 . V i d a l , S . , C u r r a n , J . , & K o l a k o f s k y , D . ( 1 9 9 0 ) A s t u t t e r i n g m o d e l f o r p a r a m y x o v i r u s P m R N A e d i t i n g . E M B O J . 9 , 2 0 1 7 - 2 0 2 2 . V i e b r o c k , A . , & Z u m f t , W . G . ( 1 9 8 8 ) M o l e c u l a r c l o n i n g , h e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o n , a n d p r i m a r y s t r u c t u r e o f t h e s t r u c t u r a l g e n e f o r t h e c o p p e r e n z y m e n i t r o u s o x i d e r e d u c t a s e f r o m d e n i t r i f y i n g P s e u d a m a n a s s t u t z e r i . J . B a c t e r i a l . 1 7 0 , 4 6 5 8 - 4 6 6 8 . V i k , S . B . , G e o r g e v i c h , G . & C a p a l d i , R A . ( 1 9 8 1 ) D i p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l i s r e q u i r e d f o r o p t i m a l a c t i v i t y o f b e e f h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e . P r o c . N a t l . S c i . 7 8 , 1 4 5 6 - 1 4 6 0 . v o n A l l m e n , J . - M . , R o t t m a n , W . H . , G e n g e n b a c h , B . G . , H a r v e y , A . J . , & L o n s d a l e , D . M . ( 1 9 9 1 ) T r a n s f e r o f m e t h o m y l a n d H m T - t o x i n s e n s i t i v i t y f r o m T - c y t o p l a s m m a i z e t o t o b a c c o . M a l . G e n . G e n e t . 2 2 9 , 4 0 5 - 4 1 2 . v o n J a g o w , G . , & K l i n g e n b e r g , M . ( 1 9 7 0 ) P a t h w a y s o f h y d r o g e n i n m i t o c h o n d r i a o f S a c c h a r o m y c e s c a r l s b e r g e n s i s . E u r . J . B i o c h e m . 1 2 , 5 8 3 - 5 9 2 . W a r d , B . L . , A n d e r s o n , R . S . , & B e n d i c h , A . J . ( 1 9 8 1 ) T h e m i t o c h o n d r i a l g e n o m e i s l a r g e a n d v a r i a b l e i n a f a m i l y o f p l a n t s ( C u c u r b i t a c e a e ) . C e l l 2 5 , 7 9 3 - 8 0 3 . W a r m k e , H . E . , & h e , S . - L . J . ( 1 9 7 7 ) M i t o c h o n d r i a l d e g e n e r a t i o n i n T e x a s c y t o p l a s m i c m a l e - s t e r i l e c o r n a n t h e r s . J . H e r e d . 6 8 , 2 1 3 - 2 2 2 . W a r m k e , H . E . , & L e e , S . - L . J . ( 1 9 7 8 ) P o l l e n a b o r t i o n i n T c y t o p l a s m i c m a l e - s t e r i l e c o r n ( Z e a m a y s ) : A s u g g e s t e d m e c h a n i s m . S c i e n c e 2 0 0 , 5 6 1 - 5 6 3 . W a t r u d , L . S . , B a l d w i n , J . K . , M i l l e r , R . J . , K o e p p e , D E . ( 1 9 7 5 ) I n d u c t i o n o f a s e n s i t i v e r e s p o n s e t o H e l m i n t h a s p a r i u m m a y d i s r a c e T t o x i n i n r e s i s t a n t m i t o c h o n d r i a o f c o r n ( Z e a m a y s L . ) b y r e m o v a l o f t h e o u t e r m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e . P l a n t P h y s i o l . 5 6 , 2 1 6 - 2 2 1 . W a t r u d , L . S . , L a u g h n a n , J . R . , G a b a y , S . J . , & K o e p p e , D E . ( 1 9 7 6 ) E fi ‘ e c t s o f n u c l e a r r e s t o r e r g e n e s o n t h e c y t o c h r o m e c o n t e n t o f c o r n p o l l e n m i t o c h o n d r i a . C a n . J . B o t . 5 4 , 2 7 1 8 - 2 7 2 5 . W e b s t e r , O . J . , & S i n g h , S P . ( 1 9 6 4 ) B r e e d i n g b e h a v i o r a n d h i s t o l o g i c a l s t r u c t u r e o f a n o n d e h i s c e n t a n t h e r c h a r a c t e r i n S o r g h u m v u l g a r e P e r s . C r o p S c i . 4 , 6 5 6 - 6 5 8 . 3 0 2 W e i s s , H . , & K a l b , H . J . ( 1 9 7 9 ) I s o l a t i o n o f m i t o c h o n d r i a l s u c c i n a t e z u b i q u i n o n e r e d u c t a s e , c y t o c h r o m e c r e d u c t a s e a n d c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m N e u r a s p a r a c r a s s a u s i n g n o n i o n i c d e t e r g e n t . E u r . J . B i o c h e m . 9 9 , 1 3 9 - 1 4 9 . W e i s s , H . , & S e b a l d , W . ( 1 9 7 8 ) P u r i fi c a t i o n o f c y t o c h r o m e o x i d a s e f r o m N e u r a s p a r a c r a s s a a n d o t h e r s o u r c e s . M e t h . E n z . 5 3 , 6 6 - 7 3 . W e i s s , H . , v o n J a g o w , G . , K l i n g e n b e r g , M . , & B t ‘ r c h e r , T . ( 1 9 7 0 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f N e u r a s p a r a c r a s s a m i t o c h o n d r i a p r e p a r e d w i t h a g r i n d - m i l l . E u r . J . B i o c h e m . 1 4 , 7 5 - 8 2 . W e i s s , M . S . , K r e u s c h , A . , S c h i l t z , E . , N e s t e l , U . , W e l t e , W . , W e c k e s s e r , J . , & S c h u l z , G E . ( 1 9 9 1 ) T h e s t r u c t u r e o f p o r i n f r o m R h o d o b a c t e r c a p s u l a t u s a t 1 . 8 A r e s o l u t i o n . F E B S L e t t . 2 8 0 , 3 7 9 - 3 8 2 . W e i s s i n g e r , A . K . , T i m o t h y , D . H . , L e v i n g s , 0 . 8 . , I I I , H u , W . W . L . , & G o o d m a n , M . M . ( 1 9 8 2 ) U n i q u e p l a s m i d - l i k e m i t o c h o n d r i a l D N A s f r o m i n d i g e n o u s m a i z e r a c e s o f L a t i n A m e r i c a . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 7 9 , 1 - 5 . W e r n e r , S . ( 1 9 7 7 ) P r e p a r a t i o n o f p o l y p e p t i d e s u b u n i t s o f c y t o c h r o m e o x i d a s e f r o m N e u r a s p a r a c r a s s a . E u r . J . B i o c h e m . 7 9 , 1 0 3 - 1 1 0 . W h a r t o n , D . C . , & T z a g o l o f f , A . ( 1 9 6 4 ) S t u d i e s o n t h e e l e c t r o n t r a n s f e r s y s t e m : L V I I . T h e n e a r i n f r a r e d a b s o r p t i o n b a n d o f c y t o c h r o m e o x i d a s e . J . B i o l . C h e m . 2 3 9 , 2 0 3 6 - 2 0 4 1 . W h a r t o n , D . C . , & T z a g o l o f f , A . ( 1 9 6 7 ) C y t o c h r o m e o x i d a s e fi o m b e e f h e a r t m i t o c h o n d r i a . M e t h . E n z . 1 0 , 2 4 5 - 2 5 0 . W h a t l e y , F R . ( 1 9 8 1 ) T h e e s t a b l i s h m e n t o f m i t o c h o n d r i a : P a r a c o c c u s a n d R h o d o p s e u d o m o n a s . A n n a l s N Y . A c a d . S c i . 3 6 1 , 3 3 0 - 3 4 0 . W i k s t r o m , M . ( 1 9 7 7 ) P r o t o n p u m p c o u p l e d t o c y t o c h r o m e c o r n ' d a s e i n m i t o c h o n d r i a . N a t u r e 2 6 6 , 2 7 1 - 2 7 3 . W i k s t r t i m , M . ( 1 9 8 8 ) P r o t o n i c s i d e d n e s s o f t h e b i n u c l e a r i r o n - c o p p e r c e n t r e i n c y t o c h r o m e o x i d a s e . F E B S L e t t . 2 3 1 , 2 4 7 - 2 5 2 . W i k s t r t i m , M . ( 1 9 8 9 ) I d e n t i fi c a t i o n o f t h e e l e c t r o n t r a n s f e r s i n c y t o c h r o m e o x i d a s e t h a t a r e c o u p l e d t o p r o t o n - p u m p i n g . N a t u r e 3 3 8 , 7 7 6 - 7 7 8 . W i k s t r t i m , M . , C a s e y , R . ( 1 9 8 5 ) T h e o x i d a t i o n o f e x o g e n o u s c y t o c h r o m e c b y m i t o c h o n d r i a : R e s o l u t i o n o f a l o n g - s t a n d i n g c o n t r o v e r s y . F E B S L e t t . 1 8 3 , 2 9 3 - 2 9 8 . W i k s t r t m , M . , K r a b , K . , & S a r a s t e , M . ( 1 9 8 1 ) C y t o c h r o m e a x i d a s e : A s y n t h e s i s . A c a d e m i c P r e s s , L o n d o n . 3 0 3 W i k s t r b m , M . , S a r a s t e , M . , & P e n t t i l a , T . ( 1 9 8 5 ) R e l a t i o n s h i p s b e t w e e n s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n i n c y t o c h r o m e o x i d a s e . T h e e n z y m e s o f b i o l o g i c a l m e m b r a n e s , v o l . 4 , e d . A n t h o n y N . M a r t o n o s i , P l e n u m P u b l i s h i n g , N e w Y o r k , 1 1 1 - 1 4 8 . W i l l i a m s , M . E . , K a s p i , C . I . , K o r t h , K . L . , W a r d , G . C . , S i e d o w , J . N . , & L e v i n g s , C . S . , I I I ( 1 9 9 0 ) M u t a t i o n a l a n d t o p o l o g i c a l s t u d i e s o f a 1 3 k D a m a i z e m i t o c h o n d r i a l C M S - T p r o t e i n . F o u r t h I n t e r n a t i o n a l W o r k s h o p o n P l a n t M i t o c h o n d r i a , C a m e l ] U n i v e r s i t y , I t h a c a , N e w Y o r k . W i l m s , J . , V e e r m a n , E . C . I . , K b n i g , B . W . , D e k k e r , H . L . , v a n G e l d e r , B . F . ( 1 9 8 1 ) I o n i c s t r n g t h e f f e c t s o n c y t o c h r o m e a a 3 k i n e t i c s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 6 3 5 , 1 3 - 2 4 . ' W i l s o n , M . T . , A l l e y n e , T . , C l a g u e , M . , C o n r o y , K . , & E l - A g e z , B . ( 1 9 8 8 ) E l e c t r o n t r a n s f e r a n d c o n f o r m a t i o n s t a t e s i n b o v i n e c y t o c h r o m e c o r n ' d a s e . A n n . N Y . A c a d . S c i . 5 5 0 , 1 6 7 - 1 7 6 . W i l s o n , M . T . , G r e e n w o o d , C . , B r u n o r i , M . , & A n t o n i n i , E . ( 1 9 7 5 ) K i n e t i c s t u d i e s o n t h e r e a c t i o n b e t w e e n c y t o c h r o m e c o x i d a s e a n d f e r r o c y t o c h r o m e c . B i o c h e m . J . 1 4 7 , 1 4 5 - 1 5 3 . W i l s o n , M . T . , P e t e r s o n , J . , A n t o n i n i , E . , B r u n o r i , M . , C o l o s i m o , A . , & W y m a n , J . ( 1 9 8 1 ) A p l a u s i b l e t w o - s t a t e m o d e l f o r c y t o c h r o m e c o x i d a s e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 7 8 , 7 1 1 5 - 7 1 1 8 . W i n t e r , D . B . , - B r u y n i n c k x , W . J . , F o u l k e , F . G . , G r i n i c h , N . P . , & M a s o n , H S . ( 1 9 8 0 ) L o c a t i o n o f h e m e a o n s u b u n i t s I a n d I I a n d c o p p e r o n s u b u n i t I I o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e . J . B i o l . C h e m . 2 5 5 , 1 1 4 0 8 - 1 1 4 1 4 . W i s e , R . P . , F l i s s , A . E . , P r i n g , D . R . , & G e n g e n b a c h , B . G . ( 1 9 8 7 a ) u r f 1 3 - T o f T c y t o p l a s m m a i z e m i t o c h o n d r i a e n c o d e s a 1 3 k D p r o t e i n . P l a n t . M o l e c . B i o l . 9 , 1 2 1 - 1 2 6 . W i s e , R . P . , P r i n g , D . R . , & G e n g e n b a c h , B . G . ( 1 9 8 7 b ) M u t a t i o n t o m a l e f e r t i l i t y a n d t o x i n i n s e n s i t i v i t y i n T e x a s ( T ) - c y t 0 p l a s m m a i z e i s a s s o c i a t e d w i t h a f r a m e s h i f t i n a m i t o c h o n d r i a l o p e n r e a d i n g fi a m e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 8 4 , 2 8 5 8 - 2 8 6 2 . W i s s i n g e r , B . , H i e s e l , R . , S c h u s t e r , W . , & B r e n n i c k e , A . ( 1 9 8 8 ) T h e N A D H - d e h y d r o g e n a s e s u b u n i t 5 g e n e i n O e n o t h e r a m i t o c h o n d r i a c o n t a i n s t w o i n t r o n s a n d i s c o - t r a n s c r i b e d w i t h t h e 5 8 r R N A g e n e . M o l . G e n . G e n e t . 2 1 2 , 5 6 - 6 5 . W u , W . , C h a n g , C . K . , V a r o t s i s , C . , B a b c o c k , G . T . , P u u s t i n e n , A . , & W i k s t r o m , M . ( 1 9 9 2 ) S t r u c t u r e o f t h e h e m e a p r o s t h e t i c g r o u p f r o m t h e t e r m i n a l q u i n o l o x i d a s e o f E s c h e r i c h i a c o l i . J . A m . C h e m . S o c . 1 1 4 , 1 1 8 2 - 1 1 8 7 . Y a n a m u r a , W . , Z h a n g , Y . - Z . , T a k a m i y a , S . , & C a p a l d i , R A . ( 1 9 8 8 ) T i s s u e - s p e c i fi c d i f f e r e n c e s b e t w e e n h e a r t a n d l i v e r c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 2 7 , 4 9 0 9 - 4 9 1 4 . 3 0 4 Y a n g , D . , O y a i z u , Y . , O y a i z u , H . , O l s e n , G . J . , & W o e s e , C R . ( 1 9 8 5 ) M i t o c h o n d r i a l o r i g i n s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 8 2 , 4 4 4 3 - 4 4 4 7 . Y e w e y , G . L . , & C a u g h e y , W . S . ( 1 9 8 7 ) M e t a l s a n d a c t i v i t y o f b o v i n e h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e a r e i n d e p e n d e n t o f p o l y p e p t i d e s u b u n i t s I I I , V I I , a a n d b . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 4 8 , 1 5 2 0 - 1 5 2 6 . Y e w e y , G . L . , & C a u g h e y , W . S . ( 1 9 8 8 ) M e t a l s o f b o v i n e h e a r t c y t o c h r o m e c ' o x i d a s e . A n n . N Y . A c a d . S c i . 5 5 0 , 2 2 - 3 2 . Y o n e t a n i , T . ( 1 9 8 1 ) S t u d i e s o n c y t o c h o m e o x i d a s e . I I I . I m p r o v e d p r e p a r a t i o n a n d s o m e p r o p e r t i e s . J . B i o l . C h e m . 2 3 6 , 1 6 8 0 - 1 6 8 8 . Y o r k , D . W . ( 1 9 8 0 ) U l t r a s t r u c t u r a l a n d b i o c h e m i c a l a s p e c t s o f S o u t h e r n c o r n l e a f b l i g h t d i s e a s e . P h . D . T h e s i s , C o r n e l l U n i v e r s i t y . Y o r k , D . W . , E a r l e , E . D . , G r a c e n , V . E . ( 1 9 8 0 ) U 1 t r a s t r u c t u r a l e f f e c t s o f H e l m i n t h s p o r i u m m a y d i s , r a c e T t o x i n o n i s o l a t e d c o r n m i t o c h o n d r i a a n d m i t o c h o n d r i a w i t h i n c o r n p r o t o p l a s t s . C a n . J . B o t . 5 8 , 1 5 6 2 - 1 5 7 0 . Y o s h i d a , T . , & F e e , J . A . ( 1 9 8 4 ) S t u d i e s o n c y t o c h r o m e c o x i d a s e a c t i v i t y o f t h e c y t o c h r o m e c 1 a a 3 c o m p l e x f r o m T h e r m u s t h e r m o p h i l u s . J . B i o l . C h e m . 2 5 9 , 1 0 3 1 - 1 0 3 6 . Y o s h i k a w a , S . , & C a u g h e y , W . S . ( 1 9 9 0 ) I n f r a r e d e v i d e n c e o f c y a n i d e b i n d i n g t o i r o n a n d c o p p e r s i t e s m b o v i n e h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e : I m p l i c a t i o n s r e g a r d i n g o x y g e n r e d u c t i o n . J . B i o l . C h e m . 2 6 5 , 7 9 4 5 - 7 9 5 8 . Y o s h i k a w a , S . , T e r a , T . , T a k a h a s h i , Y . , T s u k i h a r a , T . , & C a u g h e y , W . S . ( 1 9 8 8 ) C r y s t a l l i n e c y t o c h r o m e c o x i d a s e o f b o v i n e h e a r t m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e : C o m p o s i t i o n a n d x - r a y d i f f r a c t i o n s t u d i e s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 8 5 , 1 3 5 4 - 1 3 5 8 . Y o u n g , E . G . , & H a n s o n , M R . ( 1 9 8 7 ) A f u s e d m i t o c h o n d r i a l g e n e a s s o c i a t e d w i t h c y t 0 p l a s m i c m a l e s t e r i l i t y i s d e v e l o p m e n t a l l y r e g u l a t e d . C e l l 5 0 , 4 1 - 4 9 . Y u z a k i , M . , O h k o s h i , M . , K a n a z a w a , I . , K a g a w a , Y . , & O h t a , S . ( 1 9 8 9 ) M u l t i p l e d e l e t i o n s i n m i t o c h o n d r i a l D N A a t d i r e c t r e p e a t s o f n o n - D - l o o p r e g i o n s i n c a s e s o f f a m i l i a l m i t o c h o n d r i a l m y o p a t h y . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 6 4 , 1 3 5 2 - 1 3 5 7 . Z a b a l a , G . , & W a l b o t , V . ( 1 9 8 8 ) A n S 1 e p i s o m a l g e n e o f m a i z e m i t o c h o n d r i a i s e x p r e s s e d m m a l e s t e r i l e a n d f e r t i l e p l a n t s o f t h e S - t y p e c y t o p l a s m . M o l . G e n . G e n e t . 2 1 1 , 3 8 6 - 3 9 2 . Z a b a l a , G . , O ' B r i e n - V e d d e r , C . , & W a l b o t , V . ( 1 9 8 7 ) 8 2 e p i s o m e o f m a i z e m i t o c h o n d r i a e n c o d e s a 1 3 0 - k i l o d a l t o n p r o t e i n f o u n d i n m a l e s t e r i l e a n d f e r t i l e p l a n t s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 8 4 , 7 8 6 1 - 7 8 6 5 . . - ‘ . . . ‘ . 3 0 5 Z h a n g , C . - S . , H o l l o c h e r , T . C . , K o l o d z i e j , A . F . , & O r m e - J o h n s o n , W . H . ( 1 9 9 1 ) E l e c t r o n p a r a m a g n e t i c r e s o n a n c e o b s e r v a t i o n s o n t h e c y t o c h r o m e c - c o n t a i n i n g n i t r o u s o x i d e r e d u c t a s e f r o m W a l i n e l l a s u c c i n a g e n e s . J . B i o l . C h e m . 2 6 6 , 2 1 9 9 - 2 2 0 2 . Z h a n g , Y . - Z . , E w a r t , G , & C a p a l d i , R . A . ( 1 9 9 1 ) T o p o l o g y o f s u b u n i t s o f t h e m a m m a l i a n c y t o c h r o m e c o x i d a s e : R e l a t i o n s h i p t o t h e a s s e m b l y o f t h e e n z y m e c o m p l e x . B i o c h e m i s t r y 3 0 , 3 6 7 4 - 3 6 8 1 . Z h a n g , Y . - Z . , G e o r g e v i c h , G . , & C a p a l d i , R A . ( 1 9 8 4 ) T o p o l o g y o f b e e f h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m s t u d i e s o n r e c o n s t i t u t e d m e m b r a n e s . B i o c h e m i s t r y 2 3 , 5 6 1 6 - 5 6 2 1 . Z h a n g , Y . - Z . , L i n d o r f e r , M . A . , & C a p a l d i , R A . ( 1 9 8 8 ) O r i e n t a t i o n o f t h e c y t o p l a s m i c a l l y m a d e s u b u n i t s o f b e e f h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e d e t e r m i n e d b y p r o t e a s e d i g e s t i o n a n d a n t i b o d y b i n d i n g e x p e r i m e n t s . B i o c h e m i s t r y 2 7 , 1 3 8 9 - 1 3 9 4 . Z i m m e r m a n , B . H . , N i t s c h e , C . I . , F e e , J . A . , R u s n a k , F . , M i ' m c k , E . ( 1 9 8 8 ) P r o p e r t i e s o f a c o p p e r - c o n t a i n i n g c y t o c h r o m e b a 3 : A s e c o n d t e r m i n a l o x i d a s e f r o m t h e e x t r e m e t h e r m o p h i l e T h e r m u s t h e r m o p h i l u s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 8 5 , 5 7 7 9 - 5 7 8 3 . a n _ '