N W W W W W W “ “ N H H P h . D i d e g r e e i n C h e m i c a l E n g r . R S I T Y L I B R A R I E S 3 1 2 9 3 0 1 0 H i T h i s i s t o c e r t i f y t h a t t h e d i s s e r t a t i o n e n t i t l e d I n V i t r o D e p o l y m e r i z a t i o n o f N a t u r a l I n s o l u b l e L i g n i n i n A q u e o u s M e d i a b y t h e E x t r a c e l l u l a r P e r o x i d a s e s o f P h a n e r o c h a e t e C h r y s o s p o r i u m p r e s e n t e d b y D a v i d N e i l T h o m p s o n h a s b e e n a c c e p t e d t o w a r d s f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r i m a m » M a j o r p r o f e s s o r D a t e 2 0 7 . ) " H , i ? q 4 ' M S U i s a n A f fi r m a t i v e A c t i o n / E q u a l O p p o r t u n i t y I n s t i t u t i o n 0 4 2 7 7 1 . 7 — M N i c L U I h n i l B g v R a e E E U S T m E U n o R n N r o D B d b A A n O m r T s d E M T O A A D O V C A E I T D E H F I R D R l S Y t t a y t e X - M t o D M d U U o u V . E O N W M W M M D A T E D U E M S U l e m m a » . A c t i o n / E q u a l O p p o r t u n i t y I n fl a t i o n I N V I T R O D E P O L Y M E R I Z A T I O N O F N A T U R A L I N S O L U B L E L I G N I N I N A Q U E O U S M E D I A B Y T H E E X T R A C E L L U L A R P E R O X I D A S E S O F P H A N E R O C H A E T E C I - I R Y S O S P O R I U M V o l u m e I b y D a v i d N e i l T h o m p s o n A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u u ' e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y D e p a r t m e n t o f C h e m i c a l E n g i n e e r i n g 1 9 9 4 A B S T R A C T I N V I T R O D E P O L Y M E R I Z A T I O N o r N A T U R A L I N S O L U B L E L I G N I N I N A Q U E O U S M E D I A B Y T H E E X T R A C E L L U L A R P E R O X I D A S E S o r P H A N E R O C H A E T E C H R Y S O S P O R I U M b y D a v i d N e i l T h o m p s o n T h e l i g n i n p e r o x i d a s e s ( L I P S ) a n d m a n g a n e s e p e r o x i d a s e s ( M N P S ) o f P h a n e r o c h a e t e C h r y s o s p o r i u m h a v e e v o k e d w o r l d w i d e i n t e r e s t b e c a u s e o f t h e i r p o t e n t i a l t o d e g r a d e a w i d e r a n g e o f x e n o b i o t i c c o m p o u n d s , t o d e c o l o r i z e b l e a c h p l a n t e f fl u e n t s , a n d t o b e u s e d i n b i o p u l p i n g . L I P S a n d M N P s c a t a l y z e a w i d e r a n g e o f r e a c t i o n s w h i c h a r e c o n s i s t e n t w i t h t h o s e n e c e s s a r y t o d e p o l y m e r i z e l i g n i n ; h o w e v e r , t h e i r a b i l i t y t o d e g r a d e t h e i n s o l u b l e n a t u r a l l i g n i n p o l y m e r i n a q u e o u s m e d i a h a s n o t b e e n d e m o n s t r a t e d . T h i s s t u d y i n v e s t i g a t e s t h e r o l e s o f t h e s e e n z y m e s i n t h e i n v i t r o d e p o l y m e r i z a t i o n o f a n i n s o l u b l e p o p l a r l i g n i n i n a q u e o u s m e d i a . A s m a l l s c a l e d i a l y s i s r e a c t o r w a s c o n s t r u c t e d a n d u s e d t o c o n t r o l v e r a t r y l a l c o h o l a n d / o r H 2 0 , c o n c e n t r a t i o n s i n c o n t a c t w i t h t h e e n z y m e s . I s o l a t e d p o p l a r l i g n i n w a s t r e a t e d f o r 1 2 h o u r s w i t h L I P S a n d M N P s a l o n e a n d i n c o m b i n a t i o n . A f t e r t r e a t m e n t , t h e r e s i d u a l s o l i d l i g n i n w a s a n a l y z e d b y F o u r i e r T r a n s f o r m I n f r a r e d S p e c t r o s c o p y / P a r t i a l L e a s t S q u a r e s R e g r e s s i o n . U n i q u e l i g n i n - d e r i v e d p r o d u c t s f o r m e d w e r e i d e n t i fi e d b y g a s c h r o m a t o g r a p h y / m a s s s p e c t r o m e t r y ( G C / M S ) a n d s u b j e c t e d t o s t r u c t u r a l a n a l y s e s b a s e d o n t h e i r m a s s s p e c t r a . T r e a t m e n t w i t h M N P a l o n e d a r k e n e d t h e r e s i d u a l s o l i d l i g n i n , s l i g h t l y i n c r e a s e d t h e m a s s o f t h e s o l i d , a n d p r o d u c e d m e a s u r a b l e a m o u n t s o f l i g n i n - d e r i v e d 2 , 6 — d i m e t h o x y h y d r o q u i n o n e a n d 2 - m e t h o x y h y d r o q u i n o n e , b u t e f f e c t e d n o m e a s u r a b l e c h a n g e i n l i g n i n c o n t e n t . T r e a t m e n t w i t h L I P a l o n e d i d n o t c h a n g e t h e c o l o r o f t h e s o l i d , b u t s l i g h t l y d e c r e a s e d t h e m a s s , p r o d u c e d s i g n i fi c a n t a m o u n t s o f l i g n i n - d e r i v e d p - h y d r o x y b e n z o i c a c i d , a n d s l i g h t l y d e c r e a s e d t h e l i g n i n c o n t e n t . F i n a l l y , t r e a t m e n t w i t h L I P a n d M N P t o g e t h e r fi r s t d a r k e n e d t h e s o l i d a n d t h e n l i g h t e n e d i t b a c k t o i t s o r i g i n a l c o l o r , d e c r e a s e d i t s m a s s b y 1 1 % , d e c r e a s e d t h e l i g n i n c o n t e n t b y 8 % , a n d g a v e c o m p o u n d s w i t h m o l e c u l a r w e i g h t s a n d m a s s s p e c t r a c o n s i s t e n t w i t h s t r u c t u r e s o f o x i d i z e d l i g n i n - d e r i v e d p r o d u c t s . M a n y o f t h e s e p r o d u c t s , h o w e v e r , w e r e p r e s e n t i n l o w c o n c e n t r a t i o n s ( < 1 p p m i n t h e c o n c e n t r a t e d e x t r a c t s ) . L I P S a n d M N P S e a c h m a y h a v e t h e p o t e n t i a l f o r l i m i t e d d e g r a d a t i o n o f i n s o l u b l e l i g n i n i n a q u e o u s m e d i a ; h o w e v e r , t h e s e r e u l t s s u g g e s t t h a t t h e m a i n r o l e o f M N P S i n l i g n i n d e g r a d a t i o n i s t o i n c r e a s e t h e e f f e c t i v e n e s s o f L I P - m e d i a t e d d e g r a d a t i o n t h r o u g h m o d i fi c a t i o n o f t h e l i g n i n p o l y m e r . I t i s a l s o c l e a r t h a t s o m e m e t h o d o f c o n t r o l o f H 2 0 2 ( a n d v e r a t r y l a l c o h o l ) c o n c e n t r a t i o n s i n c o n t a c t w i t h t h e e n z y m e s i s n e c e s s a r y t o a c h i e v e t h i s d e g r a d a t i o n , a n d t h a t l o n g e r r e a c t i o n t i m e s a r e n e c e s s a r y f o r e x t e n s i v e d e g r a d a t i o n o f t h e l i g n i n p o l y m e r . A C K N O W L E D G E M E N T S T h e r e a r e m a n y p e o p l e t o w h o m I a m i n d e b t e d f o r a s s i s t a n c e o v e r t h e c o u r s e o f t h i s p r o j e c t w h o d e s e r v e r e c o g n i t i o n ; t h i s w o r k w o u l d n o t h a v e b e e n p o s s i b l e w i t h o u t t h e i r a s s i s t a n c e . M y d e e p e s t g r a t i t u d e g o e s t o m y w i f e V i c k i , w h o s e l o v e , s u p p o r t a n d e n c o u r a g e m e n t k e p t m e o n t r a c k t o fi n i s h . S p e c i a l t h a n k s g o t o b o t h B o n n i e H a m e s o f t h e N a t i o n a l R e n e w a b l e E n e r g y L a b o r a t o r y f o r h e r e x p e r t a n a l y s i s o f t h e F T I R d a t a a n d f o r h e r a d v i c e i n m a t t e r s o f l i g n i n c h e m i s t r y , a n d t o J e n n i f e r J o h n s o n f o r s t a y i n g i n l a t e s o m a n y n i g h t s a n d w e e k e n d s t o r u n m y s e e m i n g l y e n d l e s s s u p p l y o f G C / M S s a m p l e s . T h a n k s g o t o N i s h a n t R a o a n d D r . E l i s M . O w e n s f o r g e n e r a l a s s i s t a n c e i n m a n y a r e a s o v e r t h e c o u r s e o f t h e p r o j e c t . I w o u l d l i k e t o t h a n k m y a d v i s o r , D r . H a n s E . G r e t h l e i n , f o r h i s a d v i c e a n d s u p p o r t o v e r t h e c o u r s e o f t h i s p r o j e c t , a n d D r . C . A . R e d d y f o r l e n d i n g h i s e x p e r t i s e i n t h e l i g n i n b i o d e g r a d a t i o n a r e a t o t h e s u c c e s s f u l c o m p l e t i o n o f t h i s p r o j e c t . I w i s h t o t h a n k D r . J o h n R . O b s t o f t h e U S D A F o r e s t P r o d u c t s L a b o r a t o r y f o r p e r f o r m i n g t h e a e e t y l a t i o n a n d t h i o a c i d o l y s i s t e s t s o n t h e i s o l a t e d l i g n i n s u b s t r a t e . I w o u l d a l s o l i k e t o t h a n k D r . M i c h a e l H . G o l d o f t h e O r e g o n G r a d u a t e I n s t i t u t e o f S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y f o r h i s u s e f u l i n s i g h t s o n t h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f M N P - r e l e a s e d p r o d u c t s . F i n a l l y , I w i s h t o t h a n k t h e N S F C e n t e r f o r M i c r o b i a l E c o l o g y , t h e C r o p a n d F o o d B i o p r o c e s s i n g C e n t e r , a n d t h e D e p a r t m e n t o f C h e m i c a l E n g i n e e r i n g a t M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y f o r t h e i r fi n a n c i a l s u p p o r t . i v T A B L E O F C O N T E N T S p a g e L i s t o f T a b l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i x L i s t o f F i g u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x i v C h a p t e r I : I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 C h a p t e r I I : L i t e r a t u r e S u r v e y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 1 . L i g n i n F o r m a t i o n a n d S u b s t r u c t u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 2 . A e r o b i c L i g n i n D e g r a d a t i o n B y W h i t e R o t F u n g i . . . . . . . . . . . . . . . . 6 3 . T h e L i g n i n D e g r a d i n g S y s t e m o f P . c h t y s o s p o r i u m . . . . . . . . . . . . . . 1 0 l . L i g n i n P e r o x i d a s e s ( L I P S ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 2 . M a n g a n e s e P e r o x i d a s e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 4 . M e c h a n i s t i c S t u d i e s O f L i g n i n D e g r a d a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 1 . W a t e r - s o l u b l e L i g n i n S u b s t r u c t u r e M o d e l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . l 7 2 . S y n t h e t i c P o l y m e r i c L i g n i n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 5 . T e c h n i q u e s f o r C h a r a c t e r i z a t i o n o f L i g n i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 1 . C h e m i c a l T e c h n i q u e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 2 . P y r o l y s i s - G C / M S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 3 . 1 3 C N M R o f S o l u b i l i z e d a n d S o l i d L i g n i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 4 . S p e c t r o p h o t o m e t r i c T e c h n i q u e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 6 . G C / M S a n d L C / M S T e c h n i q u e s f o r C h a r a c t e r i z a t i o n o f S o l u b l e L i g n i n F r a g m e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 C h a p t e r I I I : R e s e a r c h G o a l s a n d S t r a t e g i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 1 . H y p o t h e s e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 O 2 . R e s e a r c h S t r a t e g i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 0 1 . C h o i c e o f S u b s t r a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 0 2 . I n v i v o v s I n v i t r o D e p o l y m e r i z a t i o n o f I n s o l u b l e L i g n i n . . . . . . . . . . 4 O 3 . C h o i c e o f R e a c t o r S y s t e m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1 4 . C h o i c e o f R e a c t i o n C o n d i t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2 5 . C h o i c e o f S o l i d M e a s u r e m e n t T e c h n i q u e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 3 6 . C h o i c e o f L i q u i d M e a s u r e m e n t T e c h n i q u e . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 3 C h a p t e r I V : M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 5 1 . S u b s t r a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 5 1 . A c i d H y d r o l y s i s P r e t r e a t m e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 5 2 . C e l l u l o s e R e m o v a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 7 3 . S o l v e n t E x t r a c t i o n o f I s o l a t e d L i g n i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 8 4 . M e a s u r e m e n t o f S u b s t r a t e C o m p o s i t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 9 2 . E n z y m e P r e p a r a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 3 1 . C u l t u r e M a i n t e n a n c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 3 2 . C u l t u r e C o n d i t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 4 3 . E n z y m e P r o d u c t i o n P r o c e d u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 4 4 . E n z y m e A c t i v i t y A s s a y s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 6 5 . F P L C P r o fi l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 7 3 . I n v i t r o R e a c t o r S y s t e m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 7 4 . C o n t r o l S c h e m e f o r D i a l y s i s R e a c t o r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 1 1 . S p e c i e s T r a n s p o r t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 1 2 . K i n e t i c s o f V e r a t r y l A l c o h o l O x i d a t i o n b y L I P . . . . . . . . . . . . . . . . 6 7 3 . K i n e t i c s o f M n ( I I ) O x i d a t i o n b y M N P . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 0 4 . S t a b i l i t y o f H 2 0 , a n d V A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 4 5 . S t a b i l i t y o f L I P a n d M N P . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 6 5 . D i a l y s i s R e a c t o r M o d e l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 6 1 . U n s t e a d y S t a t e B a l a n c e s o n S i d e B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 7 2 . I n i t i a l C o n d i t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 9 3 . F O R T R A N M o d e l S i m u l a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 2 l . L I P A l o n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 3 2 . L I P + M N P . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 5 3 . M N P A l o n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 7 4 . P e r t u r b a t i o n A n a l y s i s o f M o d e l P a r a m e t e r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 8 6 . I n v i t r o T r e a t m e n t o f L i g n i n i n t h e R e a c t o r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 8 1 . R e a c t o r R u n P r o c e d u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 0 A 2 . R e c o v e r y o f L i q u i d a n d S o l i d F r a c t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 9 7 . G C / M S A n a l y s i s o f S o l u b i l i z e d C o m p o u n d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 0 1 . S a m p l e P r e p a r a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 0 2 . S a m p l e M e a s u r e m e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 2 3 . G C / M S D a t a A n a l y s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 3 8 . P ' I ' I R A n a l y s i s o f R e m a i n i n g S o l i d L i g n i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 5 1 . S a m p l e P r e p a r a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 5 2 . S a m p l e M e a s u r e m e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 6 C h a p t e r V : R e s u l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 8 1 . S u b s t r a t e C o m p o s i t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 8 2 . L I P a n d M N P P r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 1 v i 3 . S p e c i e s T r a n s p o r t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 7 1 . 1 « 1 2 0 2 a n d M n ( I I ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 7 2 . V e r a t r y l A l c o h o l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 2 3 . - [ M n ( I I I ) t a r t q j . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 1 4 . K i n e t i c s o f V A O x i d a t i o n b y L I P . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 1 1 . C a s e 1 : E x c e s s V A , [ H 2 0 2 ] / K I ~ 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 2 2 . C a s e 2 : E x c e s s H 2 0 2 , [ 1 - 1 2 0 2 ] / K l ~ 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 2 3 . C a s e 3 : E x c e s s H 2 0 2 , [ 1 1 2 0 2 ] ~ K I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 5 5 . M N P / M n ( I I ) a n d M n ( I I I ) K i n e t i c s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 9 1 . K i n e t i c s o f M n ( I I ) O x i d a t i o n b y D 5 N o M n M N P ( M N P ) . . . . . . . . . 1 3 9 2 . K i n e t i c s o f M n ( I I ) O x i d a t i o n b y D 4 H i M n M N P ( M N P b ) . . . . . . . . . . 1 3 9 3 . K i n e t i c s o f [ M n ( I I I ) - t a n g R e d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 2 6 . S t a b i l i t i e s o f H 2 0 , a n d V A a t 3 7 ° C , p H 3 . 5 0 , a n d 3 5 0 s p m . . . . . . . . 1 4 2 7 . S t a b i l i t y o f D 5 N o M n L I P a t 3 7 ° C , p H 3 . 5 0 , a n d 3 5 0 s p m . . . . . . . . . 1 4 4 8 . S t a b i l i t i e s o f D 5 N o M n a n d D 4 H i M n M N P S a t 3 7 ° C , p H 3 . 5 0 , a n d 3 5 0 s p r n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 5 9 . D i a l y s i s R e a c t o r M o d e l - - R u n S i m u l a t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 0 1 . L I P O n l y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 0 2 . M N P O n l y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 3 3 . L I P + M N P . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 7 1 0 . D i a l y s i s R e a c t o r M o d e l - - P e r t u r b a t i o n A n a l y s e s . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 3 1 . C o n fi d e n c e I n t e r v a l s o n M o d e l P a r a m e t e r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 6 2 . P e r t u r b a t i o n A n a l y s e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 6 1 1 . T r e a t m e n t o f L i g n i n i n D i a l y s i s R e a c t o r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 2 1 2 . F T I R / P L S A n a l y s i s o f P e r o x i d a s e T r e a t e d S o l i d L i g n i n . . . . . . . . . . . 1 8 0 1 3 . G C / M S A n a l y s i s o f S o l u b i l i z e d C o m p o u n d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 2 1 . S t r u c t u r a l A n a l y s i s P r o c e d u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 5 2 . L I P O n l y R e a c t o r R u n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 7 1 . P e a k s I n T h e L I P A l o n e B C L - C E x t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 4 2 . P e a k s I n T h e L I P A l o n e B C L - E A E x t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 4 3 . L I P + M N P R e a c t o r R u n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 7 1 . P e a k s I n T h e L I P + M N P B C L - E A E x t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 0 2 . P e a k s I n T h e L I P + M N P B C S - C E x t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 0 3 . P e a k s I n T h e L I P + M N P B C S - E A E x t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 6 . 4 . M N P A l o n e R e a c t o r R u n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 9 1 . P e a k s I n T h e M N P A l o n e B C L - C E x t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 3 2 . P e a k s I n T h e M N P A l o n e B C L - E A E x t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 1 3 . P e a k s I n T h e M N P A l o n e B C S - C E x t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 1 4 . P e a k s I n T h e M N P A l o n e B C S - E A E x t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 8 5 . S u m m a r y o f G C / M S A n a l y s i s R e s u l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 8 v i i C h a p t e r V I : D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 6 1 . S u b s t r a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 6 2 . R e a c t o r a n d M o d e l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 7 3 . E n z y m e P r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 0 4 . I n v i t r o T r e a t m e n t o f L i g n i n i n t h e R e a c t o r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 1 1 . L i g n i n C o l o r C h a n g e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 1 2 . L i g n i n R e c o v e r y f r o m t h e R e a c t o r R u n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 2 3 . F T I R / P L S A n a l y s i s o f S o l i d L i g n i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 3 4 . G C / M S A n a l y s i s o f S o l u b l e P r o d u c t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 4 5 . S i g n i fi c a n c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 7 6 . C o n c l u s i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 8 7 . F u t u r e D i r e c t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 9 A P P E N D I X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 0 A p p e n d i x A : A s s a y s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 0 l . L I P A s s a y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 0 2 . M N P A s s a y # 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 0 3 . M N P A s s a y # 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 1 . 4 . H 0 2 A s s a y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 2 5 . V e r a t r y l A l c o h o l ( V A ) A s s a y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 3 A p p e n d i x B : D e r i v a t i o n o f H 2 0 2 a n d V A T r a n s p o r t E q u a t i o n s . . . . . . . . . 2 8 5 d i x C : D e r i v a t i o n o f E n z y m e K i n e t i c E q u a t i o n s . . . . . . . . . . . . . . 2 8 8 . K i n e t i c s o f V e r a t r y l O x i d a t i o n b y L I P . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 8 2 . K i n e t i c s o f M n ( I I ) O x i d a t i o n b y M N P . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 0 A p p e n d i x D : F O R T R A N P R O G R A M S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ' . . . . 2 9 3 1 . F O R T R A N S i m u l a t i o n o f R e a c t o r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 3 1 . V a r i a b l e s U s e d I n F O R T R A N P r o g r a m R K G . F O R . . . . . . . . . . . 2 9 3 2 . F O R T R A N P r o g r a m R K G . F O R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 7 2 . P e r t u r b a t i o n P r o g r a m f o r R e a c t o r M o d e l S i m u l a t i o n . . . . . . . . . . . . 3 2 4 1 . V a r i a b l e s U s e d I n F O R T R A N P r o g r a m P E R T U R B . F O R . . . . . . . . 3 2 4 2 . F O R T R A N P r o g r a m P E R T U R B . F O R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 7 3 . L i n e a r R e g r e s s i o n P r o g r a m f o r C o n fi d e n c e I n t e r v a l s . . . . . . . . . . . . 3 3 7 1 . V a r i a b l e s U s e d I n F O R T R A N P r o g r a m L I N R E G . F O R . . . . . . . . . 3 3 7 2 . F O R T R A N P r o g r a m L I N R E G . F O R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 8 A p p e n d i x E : T a b u l a t e d D a t a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 1 A p p e n d i x F : F i g u r e s N o t S h o w n I n T e x t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 1 B i b l i o g r a p h y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 0 v i i i T a b l e 2 . 1 4 . 1 4 . 2 4 . 3 4 . 4 4 . 5 4 . 6 4 . 7 L I S T O F T A B L E S t i t l e B a n d a s s i g n m e n t s i n t h e m i d - i n f r a r e d r e g i o n f o r n o n — d e r i v a t i z e d g u a i a c y l — ( G ) , g u a i a c y l / s y r i n g y l - ( G S ) , a n d h y d r o x y p h e n y l / g u a i a c y l / s y r i n g y l - t y p e ( H G S ) m i l l e d w o o d l i g n i n s . B a n d i n t e n s i t i e s a r e i n p a r e n t h e s i s . ( A d a p t e d f r o m F a i x , 1 9 9 2 ) . . . . . . . . . . . . . . O r d e r o f s o l v e n t e x t r a c t i o n s p e r f o r m e d o n t h e C A B l i g n i n r e s i d u e . E x t r a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t c o n s e c u t i v e l y o n a s i n g l e 1 0 g s a m p l e o f t h e r e s i d u e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . t i m a l c o n d i t i o n s f o r i n v i t r o d e l i g n i fi c a t i o n o f p a p e r p u l p b y a r m x t u r e o f x y l a n a s e s a n d t h e L I P S a n d M N P S o f P . c h r y s o s p o r i u m ( O l s e n e t a l . , 1 9 9 1 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P u l s e p r o fi l e s p r e d i c t e d b y R K G . F O R f o r t h e L I P A l o n e e n z y m e c a s e . P u l s e v o l u m e s a n d c o n c e n t r a t i o n s a r e l i s t e d f o r b o t h S i d e A a n d S i d e B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P u l s e p r o fi l e s p r e d i c t e d b y R K G . F O R f o r t h e M N P A l o n e e n z y m e c a s e . P u l s e v o l u m e s a n d c o n c e n t r a t i o n s a r e l i s t e d f o r b o t h S i d e A a n d S i d e B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P u l s e p r o fi l e s p r e d i c t e d b y R K G . F O R f o r t h e L I P + M N P e n z y m e e a s e . P u l s e v o l u m e s a n d c o n c e n t r a t i o n s a r e l i s t e d f o r b o t h S i d e A a n d S i d e B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . L i s t o f r e a c t o r c o m p o n e n t s p r e s e n t i n e a c h e x p e r i m e n t p e r f o r m e d f o r t h e L I P A l o n e e n z y m e c a s e ( B a s e = B a s e C a s e ; L ' = N o l i g n i n c o n t r o l ; R ’ = N o r e a g e n t c o n t r o l ; E ‘ = N o e n z y m e c o n t r o l ; A B = A u t o c l a v e d e n z y m e c o n t r o l ; a n d E R ‘ = N o e n z y m e , n o r e a g e n t c o n t r o l ) . A " + " i n d i c a t e s t h e p r e s e n c e o f t h e c o m p o n e n t i n t h e S i d e B r e a c t i o n m i x t u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . L i s t o f r e a c t o r c o m p o n e n t s p r e s e n t i n e a c h e x p e r i m e n t p e r f o r m e d f o r t h e M N P A l o n e e n z y m e c a s e ( B a s e = B a s e C a s e ; L ' = N o l i g n i n c o n t r o l ; R ’ = N o r e a g e n t c o n t r o l ; E ‘ = N o e n z y m e c o n t r o l ; A B = A u t o c l a v e d e n z y m e c o n t r o l ; a n d E R ' = N o e n z y m e , n o r e a g e n t c o n t r o l ) . A " + " i n d i c a t e s t h e p r e s e n c e o f t h e c o m p o n e n t i n t h e S i d e B r e a c t i o n m i x t u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i x p a g e 3 4 5 0 9 3 9 4 9 5 9 6 9 7 4 . 8 5 . 1 5 . 2 5 . 3 5 . 4 5 . 5 5 . 6 5 . 7 L i s t o f r e a c t o r c o m p o n e n t s p r e s e n t i n e a c h e x p e r i m e n t p e r f o r m e d f o r t h e L I P + M N P e n z y m e c a s e ( B a s e = B a s e C a s e ; L ‘ = N o l i g n i n c o n t r o l ; R ‘ = N o r e a g e n t c o n t r o l ; E ’ = N o e n z y m e c o n t r o l ; A B = A u t o c l a v e d e n z y m e c o n t r o l ; a n d E R ' = N o e n z y m e , n o r e a g e n t c o n t r o l ) . A " + " i n d i c a t e s t h e p r e s e n c e o f t h e c o m p o n e n t i n t h e S i d e B r e a c t i o n m i x t u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C o m p o s i t i o n s o f t h e p o p l a r s u b s t r a t e a n d e a c h r e s i d u e a t e a c h s t e p o f t h e l i g n i n i s o l a t i o n p r o c e d u r e a s m e a s u r e d b y t h e Q u a n t i t a t i v e 9 8 S a c c h a r i fi c a t i o n t e c h n i q u e ( S a e m a n e r a l . , 1 9 4 5 ) . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 9 I s o e n z y m e c o m p o s i t i o n s a n d o v e r a l l L I P a n d M N P c o m p o s i t i o n s o f t h e D 5 N o M n a n d D 4 H i M n e x t r a c e l l u l a r fl u i d ( c o n c e n t r a t e d a n d d i a l y z e d ) a n d t h e D 5 N o M n / D 4 H i M n m i x t u r e . P e r c e n t a g e s w e r e d e t e r m i n e d f r o m p e a k a r e a s i n t h e F P L C p r o fi l e s a n d r e p r e s e n t p e r c e n t a g e o f t o t a l h e m e p r o t e i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 6 S l o p e s , i n t e r c e p t s , a n d r 2 f o r t h e s t a t i s t i c a l fi t s o f t h e L I P / V A k i n e t i c d a t a f o r C a s e 3 ( i n h i b i t i n g H 2 0 2 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 6 M e a s u r e d v a l u e s o f t h e p h y s i c a l p a r a m e t e r s e x p e r i m e n t a l l y d e t e r m i n e d f o r u s e i n t h e r e a c t o r m o d e l R K G . F O R a n d t h e i r 9 5 % C o n fi d e n c e I n t e r v a l s ( l i s t e d a s j ; p e r c e n t a g e s o f t h e i r v a l u e s ) . . . . . . . 1 6 7 M a x i m u m a n d m i n i m u m c o n c e n t r a t i o n s o f 1 1 , 0 , a n d o f V A i n t h e L I P A l o n e e n z y m e c a s e p r e d i c t e d b y P E R T U R B F O R t o b e r e a c h e d i n S i d e B w h e n e a c h p a r a m e t e r m e a s u r e d f o r t h e m o d e l ( fi r s t c o l u m n ) w a s u s e d a t t h e l o w e r ( l s t a n d 2 n d c o l u m n s u n d e r [ H 2 0 2 ] , a n d u n d e r [ V A ] B ) a n d u p p e r ( 3 r d a n d 4 t h c o l u m n s u n d e r [ I - I Z O Z J B a n d u n d e r [ V A ] B ) b o u n d s o f i t s 9 5 % C o n fi d e n c e I n t e r v a l . T h e p u l s e p r o fi l e s u s e d w e r e t h o s e d e t e r m i n e d b y R K G . F O R w i t h t h e m e a s u r e d v a l u e s o f t h e p a r a m e t e r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 8 M a x i m u m a n d m i n i m u m c o n c e n t r a t i o n s o f H 2 0 2 a n d o f V A i n t h e L I P + M N P e n z y m e c a s e p r e d i c t e d b y P E R T U R B F O R t o b e r e a c h e d i n S i d e B w h e n e a c h p a r a m e t e r m e a s u r e d f o r t h e m o d e l ( fi r s t c o l u m n ) w a s u s e d a t t h e l o w e r ( l s t a n d 2 n d c o l u m n s u n d e r [ 1 1 2 0 , ] , a n d u n d e r [ V A ] B ) a n d u p p e r ( 3 r d a n d 4 t h c o l u m n s u n d e r [ H 2 0 2 ] , a n d u n d e r [ V A ] B ) b o u n d s o f i t s 9 5 % C o n fi d e n c e I n t e r v a l . T h e p u l s e p r o fi l e s u s e d w e r e t h o s e d e t e r m i n e d b y R K G . F O R w i t h t h e m e a s u r e d v a l u e s o f t h e p a r a m e t e r s . . . . . . . . . 1 6 9 M a x i m u m a n d m i n i m u m c o n c e n t r a t i o n s o f H 2 0 2 a n d o f V A i n t h e M N P A l o n e e n z y m e e a s e p r e d i c t e d b y P E R T U R B . F O R t o b e r e a c h e d i n S i d e B w h e n e a c h p a r a m e t e r m e a s u r e d f o r t h e m o d e l ( fi r s t c o l u m n ) w a s u s e d a t t h e l o w e r ( l s t a n d 2 n d c o l u m n s u n d e r [ 1 1 , 0 2 1 3 a n d u n d e r [ V A ] 3 ) a n d u p p e r ( 3 r d a n d 4 t h c o l u m n s u n d e r [ H Z O J B a n d u n d e r [ V A ] . , ) b o u n d s o f i t s 9 5 % C o n fi d e n c e I n t e r v a l . T h e p u l s e p r o fi l e s u s e d w e r e t h o s e d e t e r m i n e d b y R K G . F O R w i t h t h e m e a s u r e d v a l u e s o f t h e p a r a m e t e r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 0 5 . 8 a I n i t i a l ( t i m e z e r o ) l i g n i n a n d e n z y m e l e v e l s i n S i d e B o f t h e r e a c t o r f o r e a c h B a s e C a s e a n d i t s c o n t r o l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 3 5 . 8 b I n i t i a l ( t i m e z e r o ) H 2 0 2 a n d V A c o n c e n t r a t i o n s i n S i d e s A a n d B o f t h e r e a c t o r a n d M n ( I I ) i n S i d e B f o r e a c h B a s e C a s e a n d i t s c o n t r o l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 4 5 . 9 I n i t i a l ( t i m e z e r o ) a n d fi n a l ( 1 2 h o u r ) m a s s o f l i g n i n p r e s e n t , a n d t h e fi n a l l i g n i n m a s s a s a p e r c e n t a g e o f t h e i n i t i a l f o r e a c h B a s e C a s e a n d i t s c o n t r o l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 5 5 . 1 0 L i g n i n c o n c e n t r a t i o n s i n t h e K B r p e l l e t s u s e d t o m e a s u r e d t h e F T I R s p e c t r a o f e a c h B a s e C a s e a n d i t s c o n t r o l s . T h e o r d e r o f m e a s u r e m e n t i n d i c a t e s t h e o r d e r i n w h i c h t h e I R s p e c t r u m o f e a c h p e l l e t w a s m e a s u r e d , a n d i s u s e d t o i n d i c a t e w h i c h s p e c t r a w e r e m e a s u r e d m o r e c l o s e l y i n t i m e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 1 5 . 1 1 L i g n i n a n d c a r b o h y d r a t e c o n t e n t s f o r t h e l i g n i n r e c o v e r e d f r o m t h e r e a c t o r r u n s f o r e a c h B a s e C a s e a n d i t s c o n t r o l s , a s p r e d i c t e d b y t h e F I ‘ I R / P L S t e c h n i q u e ( H a m e s e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h e s t a n d a r d e r r o r s o f t h e p r e d i c t i o n s a n d t h e r 2 f o r t h e c a l i b r a t i o n s o f t h e m e t h o d s w i t h m i l l e d w o o d l i g n i n s a r e l i s t e d a t t h e b o t t o m o f e a c h c o l u m n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 8 5 . 1 2 M e t h o x y l c o n t e n t s o f t h e l i g n i n r e c o v e r e d f r o m t h e r e a c t o r r u n s f o r e a c h B a s e C a s e a n d i t s c o n t r o l s , a s p r e d i c t e d b y t h e F T I R / P L S t e c h n i q u e ( H a m e s e t a I . , 1 9 9 1 ) . T h e s t a n d a r d e r r o r o f t h e p r e d i c t i o n a n d t h e r 2 f o r t h e c a l i b r a t i o n w i t h m i l l e d w o o d l i g n i n s a r e l i s t e d a t t h e b o t t o m o f t h e c o l u m n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 1 5 . 1 3 P e a k s i n t h e L I P A l o n e B C e x t r a c t s s e l e c t e d f o r s t r u c t u r a l a n a l y s i s b y c o m p a r i n g t h e T o t a l I o n C h r o m a t o g r a m s o f t h e B C e x t r a c t s w i t h t h e c o r r e s p o n d i n g e x t r a c t s o f i t s c o n t r o l s . T h e i d e n t i t y o f t h e c o m p o u n d i s l i s t e d i f k n o w n ; i f n o t , t h e p o s s i b l e m o l e c u l a r f o r m u l a s ( b a s e d o n t h e m o l e c u l a r w e i g h t d e t e r m i n e d f r o m t h e m a s s s p e c t r u m ) a r e l i s t e d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 3 5 . 1 4 P e a k s i n t h e L I P + M N P B C e x t r a c t s s e l e c t e d f o r s t r u c t u r a l a n a l y s i s b y c o m p a r i n g t h e T o t a l I o n C h r o m a t o g r a m s o f t h e B C e x t r a c t s . w i t h t h e c o r r e s p o n d i n g e x t r a c t s o f i t s c o n t r o l s . T h e i d e n t i t y o f t h e c o m p o u n d i s l i s t e d i f k n o w n ; i f n o t , t h e p o s s i b l e m o l e c u l a r f o r m u l a s ( b a s e d o n t h e m o l e c u l a r w e i g h t d e t e r m i n e d f r o m t h e m a s s s p e c t r u m ) a r e l i s t e d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 1 5 . 1 5 P e a k s i n t h e M N P A l o n e B C e x t r a c t s s e l e c t e d f o r s t r u c t u r a l a n a l y s i s b y c o m p a r i n g t h e T o t a l I o n C h r o m a t o g r a m s o f t h e B C e x t r a c t s w i t h t h e c o r r e s p o n d i n g e x t r a c t s o f i t s c o n t r o l s . T h e i d e n t i t y o f t h e c o m p o u n d i s l i s t e d i f k n o w n ; i f n o t , t h e p o s s i b l e m o l e c u l a r f o r m u l a s ( b a s e d o n t h e m o l e c u l a r w e i g h t d e t e r m i n e d f r o m t h e m a s s s p e c t r u m ) a r e l i s t e d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 4 x i 5 . 1 6 S u m m a r y o f p r o b a b l e l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r p e a k s i n t h e L I P A l o n e B C e x t r a c t s w h i c h w e r e s e l e c t e d f o r s t r u c t u r a l a n a l y s i s . T h e s t r u c t u r e s a r e i n d i c a t e d b y n u m b e r ; t h e i d e n t i t y o f t h e c o m p o u n d i s l i s t e d i f v e r i fi e d b y a n a u t h e n t i c s t a n d a r d . P e a k s f o r w h i c h o n l y s t r u c t u r e s t h a t c o n t a i n a s a t u r a t e d c a r b o n i n a n o t h e r w i s e c o n j u g a t e d r i n g ( i e . l i k e s t r u c t u r e I ) a r e l i s t e d a s p r o b a b l e r i n g o o p e n e d p r o d u c t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 1 5 . 1 7 S u m m a r y o f p r o b a b l e l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r p e a k s i n t h e M N P A l o n e B C e x t r a c t s w h i c h w e r e s e l e c t e d f o r s t r u c t u r a l a n a l y s i s . T h e s t r u c t u r e s a r e i n d i c a t e d b y n u m b e r ; t h e i d e n t i t y o f t h e c o m p o u n d i s l i s t e d i f v e r i fi e d b y a n a u t h e n t i c s t a n d a r d . P e a k s f o r w h i c h o n l y s t r u c t u r e s t h a t c o n t a i n a s a t u r a t e d c a r b o n i n a n o t h e r w i s e c o n j u g a t e d i n g ( i e . l i k e s t r u c t u r e I ) a r e l i s t e d a s p r o b a b l e r i n g - o p e n e d p r o d u c t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 2 5 . 1 8 S u m m a r y o f p r o b a b l e l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r p e a k s i n t h e L I P + M N P B C e x t r a c t s w h i c h w e r e s e l e c t e d f o r s t r u c t u r a l a n a l y s i s . T h e s t r u c t u r e s a r e i n d i c a t e d b y n u m b e r ; t h e i d e n t i t y o f t h e c o m p o u n d i s l i s t e d i f v e r i fi e d b y a n a u t h e n t i c s t a n d a r d . P e a k s f o r w h i c h o n l y s t r u c t u r e s t h a t c o n t a i n a s a t u r a t e d c a r b o n i n a n o t h e r w i s e c o n j u g a t e d r i n g ( i e . l i k e s t r u c t u r e I ) a r e l i s t e d a s p r o b a b l e r i n g - o p e n e d p r o d u c t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 3 E l D a t a f o r F i g u r e 5 . 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 1 E 2 D a t a f o r F i g u r e 5 . 5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 2 E 3 D a t a f o r F i g u r e 5 . 6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 3 E 4 D a t a f o r F i g u r e 5 . 7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 4 E 5 D a t a f o r F i g u r e 5 . 8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 5 E 6 D a t a f o r F i g u r e 5 . 9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 6 E 7 D a t a f o r F i g u r e 5 . 1 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 7 E 8 D a t a f o r F i g u r e 5 . 1 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 8 E 9 D a t a f o r F i g u r e 5 . 1 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 9 E . 1 0 D a t a f o r F i g u r e 5 . 1 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 0 E U D a t a f o r F i g u r e 5 . 1 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 1 E . 1 2 D a t a f o r F i g u r e 5 . 1 5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 2 E . 1 3 D a t a f o r F i g u r e 5 . 1 6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 3 E . 1 4 D a t a f o r F i g u r e 5 . 1 7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 4 E . 1 5 D a t a f o r F i g u r e 5 . 1 8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 5 x i i E . 1 6 D a t a f o r F i g u r e s 5 . 1 9 a a n d 5 . 1 % . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 6 E U D a t a f o r F i g u r e 5 . 2 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 7 E . 1 8 D a t a f o r F i g u r e 5 . 2 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 8 E . 1 9 D a t a f o r F i g u r e 5 . 2 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 9 1 3 . 2 0 D a t a f o r F i g u r e 5 . 2 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 0 L I S T O F F I G U R E S F i g u r e t i t l e p a g e 1 . 1 2 . 1 2 . 2 2 . 3 2 . 4 2 . 5 2 . 6 2 . 7 2 . 8 3 . 1 4 . 1 4 . 2 R e p r e s e n t a t i v e s t r u c t u r e f o r s p r u c e l i g n i n ( B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 P r e c u r s o r m o l e c u l e s u s e d i n b i o s y n t h e s i s o f l i g n i n ( B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 G u a i a c y l - a n d S y r i n g l - u n i t s t r u c t u r e s . T h e t e r m g u a i a c y l — r e f e r s t o t h e b a s e s t r u c t u r e - m e t h o x y - 4 - h y d r o x y - , w h i l e s y r i n g y l - r e f e r s t o 3 , 5 - d i m e t h o x y - 4 - h y d r o x y - s u b s t i t u t e d s t r u c t u r e s . . . . . . . . . . . . . 8 T y p i c a l r e a c t i o n s c a t a l y z e d b y P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r t ' u m l i g n i n p e r o x i d a s e ( B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . l 3 T Z p i c a l F P L C p r o fi l e o f t h e e x t r a c e l l u l a r p e r o x i d a s e s o f P h a n e r o c h a e t e c r y s o s p o r t ' w n g r o w n i n a c e t a t e b u f f e r e d , a g i t a t e d c u l t u r e ( B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 C o m p a r i s o n o f t h e L I P a n d M N P c a t a l y t i c c y c l e s . ( a . ) L I P c a t a l y t i c c y c l e , a n d ( b . ) M N P c a t a l y t i c c y c l e ( G o l d e t a l . , 1 9 8 9 ) . . . . . . . . . . 1 8 T h e m e c h a n i s m o f Q C , c l e a v a g e b y L I P f o r t w o t y p e s o f l i g n i n m o d e l d i m e r s : A . 6 - 1 l i n k e d d i m e r , a n d B . B - O - 4 h n k e d d i m e r ( T i e n , 1 9 8 7 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 T h e m e c h a n i s m o f a l k y l - p h e n y l c l e a v a g e o f a l i g n i n - m o d e l d i m e r b y M N P a n d C a - o x i d a t i o n . S o l i d ” 0 " r e f e r s t o o x y g e n a t o m d e r i v e d f r o m 1 1 0 i n l a b e l l e d w a t e r ( T u o r e t a l . , 1 9 9 2 ) . . . . . . . . . . . 2 4 T h e m e c h a n i s m o f C a - C c l e a v a g e o f a l i g n i n m o d e l d i m e r b y M N P ( T u o r e t a l . , 1 9 9 2 ; . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 F l o w c h a r t i n d i c a t i n g t h e s t r a t e g y f o r t h i s s t u d y a n d t h e r e l a t i o n s h i p s a m o n g t h e v a r i o u s p a r t s c o n t r i b u t e s t o o t h e r t h e p a r t s . A l l s t e p s i n t h e t o p h a l f o f t h e fi g u r e c o n t r i b u t e d i r e c t l y t o t h e d e s i g n , d e v e l o p m e n t , a n d o p e r a t i o n o f t h e r e a c t o r f o r t h e i n v i t r o l i g n i n d e g r a d a t i o n e x p e r i m e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 S c h e m a t i c d i a g r a m o f t h e M B I H i g h T e m p e r a t u r e F l o w R e a c t o r . . . . . 4 6 S c h e m a t i c d i a g r a m o f t h e d i a l y s i s r e a c t o r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 9 x i v 4 . 3 4 . 4 4 . 5 4 . 6 4 . 7 4 . 8 5 . 1 5 . 2 5 . 3 5 . 4 5 . 5 5 . 6 P h o t o g r a p h o f a n a s s e m b l e d d i a l y s i s r e a c t o r a n d i t s c o m p o n e n t p a r t s M e c h a n i s m o f b i n d i n g b e t w e e n a s i n g l e t a r t r a t e m o l e c u l e a n d a m a n g a n e s e i o n i n w a t e r ( B e l l , 1 9 7 7 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G r a p h i c a l r e p r e s e n t a t i o n o f t h e s t r u c t u r e o f a n [ M n ( I I I ) - t a m ] c o m p l e x a s p r e d i c t e d b y t h e m o l e c u l a r m o d e l l i n g s o f t w a r e P o l y g r a f ( M o l e c u l a r S i m u l a t i o n s I n c . , B u r l i n g t o n , M A ) . . . . . . . . . . . . . . . T h e g e n e r a l s t r u c t u r e o f a s y r i n g y l - p h e n y l p r o p a n e u n i t i n l i g n i n ( A d a p t e d f r o m S a r k a n e n a n d L u d w i g ( 1 9 7 1 ) ) . I n t e r m o n o m e r l i n k a g e s o c c u r g e n e r a l l y t h r o u g h t h e o x y g e n a t p o s i t i o n 4 o f t h e r i n g a n d t h r o n g h C a , C a , a n d C , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F l o w c h a r t r e p r e s e n t a t i o n o f t h e s o l u t i o n s t r a t e g y u s e d b y t h e r e a c t o r m o d e l p r o g r a m R K G . F O R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . V a r i a t i o n o f L I P a n d M N P a c t i v i t i e s w i t h p H o f t h e s y s t e m ( M i c h e l , 1 9 9 1 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F P L C p r o fi l e o f t h e c o n c e n t r a t e d , d i a l y z e d D 5 N o M n e x t r a c e l l u l a r fl u i d . T h e p e a k s d e s i g n a t e d H 1 , H 2 , H A , H 6 , H 7 , H 8 , a n d H 1 0 a r e l i g n i n p e r o x i d a s e s , w h i l e H 4 , H 5 , a n d H 9 a r e m a n g a n e s e p e r o x i d a s e s . T h e d i a g o n a l l i n e r e p r e s e n t s t h e s o d i u m a c e t a t e g r a d i e n t ( 1 0 m M t o l M ) u s e d t o e l u t e t h e p r o t e i n s . . . . . . . . . . . . F P L C p r o fi l e o f t h e c o n c e n t r a t e d , d i a l y z e d D 4 H i M n e x t r a c e l l u l a r fl u i d . T h e p e a k s d e s i g n a t e d H A , H 6 , H 7 , a n d H 8 a r e l i g n i n p e r o x i d a s e s , w h i l e H 3 , H 4 , a n d H 5 a r e m a n g a n e s e p e r o x i d a s e s . T h e d i a g o n a l l i n e r e p r e s e n t s t h e s o d i u m a c e t a t e g r a d i e n t ( 1 0 m M 6 0 6 4 6 5 8 4 8 9 . 1 1 2 t o l M ) u s e d t o e l u t e t h e p r o t e i n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 4 F P L C p r o fi l e o f t h e D 5 N o M n / D 4 H i M n e x t r a c e l l u l a r fl u i d m i x t u r e u s e d f o r m i x e d e n z y m e r e a c t o r r u n s . T h e p e a k s d e s i g n a t e d H 1 , H 2 , H A , H 6 , H 7 , H 8 , a n d H 1 0 a r e l i g n i n p e r o x i d a s e s , w h i l e H 3 , H 4 , H 5 , a n d H 9 a r e m a n g a n e s e p e r o x i d a s e s . T h e d i a g o n a l l i n e r e p r e s e n t s t h e s o d i u m a c e t a t e g r a d i e n t ( 1 0 m M t o l M ) u s e d t o e l u t e t h e p r o t e i n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S o l u t i o n o f t h e u n s t e a d y s t a t e d i f f u s i o n e q u a t i o n f o r d i f f u s i o n t h r o u g h t h e m e m b r a n e o f t h e d i a l y s i s r e a c t o r f o r H 2 0 2 u s i n g a v a l u e o f 1 . 8 0 x 1 0 4 c m z l m i n f o r t h e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t . S h o w n a r e t h e c o n c e n t r a t i o n p r o fi l e s w i t h i n t h e m e m b r a n e w i t h d i m e n s i o n l e s s d i s t a n c e f o r 0 . 0 0 2 , 0 . 0 0 5 , 0 . 0 1 0 , 0 . 0 2 0 , 0 . 0 4 0 , 0 . 0 6 0 , 0 . 0 8 0 , a n d 0 . 5 0 0 m i n u t e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T h e fi n a l i t e r a t i o n v a l u e s o f l h s v e r s u s t i m e f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f D " f o r H 2 0 2 . I n i t i a l [ H z o f l ‘ c o n c e n t r a t i o n s f o r e a c h d a t a s e t a r e l i s t e d i n t h e l e g e n d b o x . T h e fi n a l i t e r a t i o n v a l u e s o f - l h s v e r s u s t i m e f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f D " f o r M n ( I I ) . r 2 f o r t h e fi t w a s 0 . 9 9 9 . . . . . . . . . . . . . . . . . X V f o r t h e fi t w a s 0 . 9 6 8 . . . . . . . . . . . . 1 1 5 . 1 1 9 1 2 1 . 1 2 3 5 . 7 E f f e c t i v e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t f o r V A c a l c u l a t e d f r o m t h e [ V A ] B v e r s u s t i m e d a t a a s s u m i n g t h a t D ” f o r V A w a s i n d e p e n d e n t o f c o n c e n t r a t i o n a n d t h a t s t e a d y s t a t e c o u l d b e a s s u m e d . T h e d a t a w e r e fi t u s i n g P E A K F I T t o t h e e q u a t i o n A 0 , 3 3 = a . + a l e x p ( a 1 e x p { - E ; T l i l — a ‘ ) ( 5 - 1 2 ) V a l u e s o f a 0 , a , , a 2 , a 3 , a n d a 4 w e r e f o u n d t o b e 8 . 8 6 5 X 1 0 " , 3 . 2 1 3 x 1 0 “ , - 1 . 0 5 1 , - 1 1 3 4 . 8 , a n d - 3 . 4 3 5 , r e s p e c t i v e l y . r 2 f o r t h e fi t w a s 0 . 9 2 8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 4 5 . 8 S o l u t i o n o f t h e u n s t e a d y s t a t e d i f f u s i o n e q u a t i o n f o r d i f f u s i o n t h r o u g h t h e m e m b r a n e o f t h e d i a l y s i s r e a c t o r f o r V A u s i n g a v a l u e o f 4 . 3 7 x 1 0 " c m z l m i n f o r t h e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t . S h o w n a r e t h e c o n c e n t r a t i o n p r o fi l e s w i t h i n t h e m e m b r a n e w i t h d i m e n s i o n l e s s d i s t a n c e f o r 0 . 0 1 0 , 0 . 0 2 0 , 0 . 0 4 0 , 0 . 0 6 0 , 0 . 0 8 0 , 0 . 1 6 0 , 0 . 5 0 0 , a n d 2 . 0 0 m i n u t e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 5 5 . 9 S o l u t i o n o f t h e u n s t e a d y s t a t e d i f f u s i o n e q u a t i o n f o r d i f f u s i o n t h r o u g h t h e m e m b r a n e o f t h e d i a l y s i s r e a c t o r f o r V A u s i n g a v a l u e o f 1 . 0 0 x 1 0 " c m z / m i n f o r t h e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t . S h o w n a r e t h e c o n c e n t r a t i o n p r o fi l e s w i t h i n t h e m e m b r a n e w i t h d i m e n s i o n l e s s d i s t a n c e f o r 0 . 0 1 0 , 0 . 0 2 0 , 0 . 0 4 0 , 0 . 0 6 0 , 0 . 0 8 0 , 0 . 1 6 0 , 0 . 5 0 0 , a n d 2 . 0 0 m i n u t e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 6 5 . 1 0 V a r i a t i o n o f t h e v i s c o s i t y o f a q u e o u s V A s o l u t i o n s w i t h [ V A ] , a n d t h e e x p o n e n t i a l v i s c o s i t y fi t d e t e r m i n e d u s i n g P E A K F I T . r 3 f o r t h e » f i t w a s 0 . 9 9 9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 7 5 . 1 1 T h e fi n a l i t e r a t i o n v a l u e s o f l h s v e r s u s t i m e f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f D " a n d a , f o r t h e c o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n c e o f D 4 f o r V A . I n i t i a l [ V A ] A c o n c e n t r a t i o n s f o r e a c h d a t a s e t a r e l i s t e d i n t h e l e g e n d b o x . r 2 f o r t h e fi t w a s 0 . 9 8 6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 9 5 . 1 2 P r e d i c t e d v a r i a t i o n o f V A a g g r e g a t e r a d i u s w i t h t h e c o n c e n t r a t i o n o f V A , d e t e r m i n e d u s i n g t h e v a l u e o f a l c a l c u l a t e d i n t h e d e t e r m i n a t i o n o f D 4 f o r V A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 0 5 . 1 3 L i n e w e a v e r - B u r k p l o t f o r C a s e 1 ( e x c e s s V A ) o f t h e L I P / V A k i n e t i c e x p e r i m e n t s . 1 ' 2 f o r t h e fi t w a s 0 . 9 3 9 . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 3 5 . 1 4 L i n e w e a v e r - B u r k p l o t f o r C a s e 2 ( e x c e s s , n o n i n h i b i t i n g H 2 0 2 ) o f t h e L I P / V A k i n e t i c e x p e r i m e n t s . r 2 f o r t h e fi t w a s 0 . 9 9 6 . . . . . . . . . 1 3 4 5 . 1 5 L i n e w e a v e r - B u r k p l o t f o r C a s e 3 ( e x c e s s , i n h i b i t i n g H 2 0 2 ) o f t h e L I P / V A k i n e t i c e x p e r i m e n t s . T h e i n t e r c e p t s a r e n o t s t a t i s t i c a l l y d i f f e r e n t w i t h i n 9 5 % c o n fi d e n c e , i n d i c a t i n g c o m p e t i t i v e s u b s t r a t e i n h i b i t i o n . H 2 0 2 c o n c e n t r a t i o n s a r e l i s t e d i n t h e l e g e n d b o x , a l o n g w i t h t h e c o r r e s p o n d i n g fi t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 7 x v i 5 . 1 6 5 . 1 7 5 . 1 8 5 . 1 9 5 . 2 0 5 . 2 1 5 . 2 2 5 . 2 3 5 . 2 4 5 . 2 5 5 . 2 6 5 . 2 7 S e c o n s l o p e p l o t f o r C a s e 3 ( e x c e s s , i n h i b i t i n g H 2 0 2 ) o f t h e L I P / V A ' n e t r c e x p e r i m e n t s . r 2 f o r t h e fi t w a s 0 . 9 2 9 . . . . . . . . . . . 1 3 8 L i n e w e a v e r - B u r k p l o t f o r t h e M N P / M n ( I I ) k i n e t i c e x p e r i m e n t s ( e x c e s s M n ( I I ) ) u s i n g D 5 N o M n M N P ( M N P ) . r 2 f o r t h e fi t w a s 0 . 9 3 8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 0 L i n e w e a v e r - B u r k p l o t f o r t h e M N P / M n ( I I ) k i n e t i c e x p e r i m e n t s ( e x c e s s M n ( I I ) ) u s i n g D 4 H i M n M N P ( M N P b ) . r 2 f o r t h e fi t w a s 0 . 9 5 9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 1 V a r i a t i o n o f t h e c o n c e n t r a t i o n o f H 2 0 2 w i t h t i m e i n t h e H 2 0 2 s t a b i l i t y e x p e r i m e n t s a t 3 7 ° C , p H 3 . 5 0 , a n d 3 5 0 s p m a g i t a t i o n , f o r : ( a . ) L o w i n i t i a l H 2 0 2 c o n c e n t r a t i o n s , a n d ( b . ) H i g h i n i t i a l H 2 0 2 c o n c e n t r a t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 3 l b s v e r s u s t i m e f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f k “ , a n d k d u f o r L I P s t a b i l i t y . I n i t i a l L I P l e v e l s a r e l i s t e d i n t h e l e g e n d b o x . 1 ' 2 f o r t h e fi t w a s 0 . 9 6 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 6 P l o t o f [ L I P ] ( U / L ) v e r s u s t i m e f o r t h e L I P s t a b i l i t y e x p e r i m e n t s a t 3 7 ° C , p H 3 . 5 0 , a n d 3 5 0 s p m a g i t a t i o n . T h e c u r v e s s h o w n a r e t h e p r e d i c t e d v a l u e s f r o m t h e fi t t o z e r o o r d e r p l u s fi r s t o r d e r d e c a y . I n i t i a l L I P l e v e l s a r e i n d i c a t e d i n t h e l e g e n d b o x . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 7 P l o t o f [ M N P ] ( U / L ) v e r s u s t i m e f o r t h e M N P , s t a b i l i t y e x p e r i m e n t s a t 3 7 ° C , p H 3 . 5 0 , a n d 3 5 0 s p m a g i t a t i o n . T h e c u r v e s s h o w n a r e t h e p r e d i c t e d v a l u e s f r o m t h e fi t t o a s i m p l e fi r s t o r d e r d e c a y m o d e l ( r 2 o f 0 . 9 7 8 ) . I n i t i a l M N P l e v e l s a r e i n d i c a t e d i n t h e l e g e n d b o x . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 8 P l o t o f [ M N P ] ( U / L ) v e r s u s t i m e f o r t h e M N P , s t a b i l i t y e x p e r i m e n t s a t 3 7 ° C , p H 3 . 5 0 , a n d 3 5 0 s p m a g i t a t i o n . T h e c u r v e s s h o w n a r e t h e p r e d i c t e d v a l u e s f r o m t h e fi t t o a s i m p l e fi r s t o r d e r d e c a y m o d e l ( r 2 o f 0 . 8 3 0 ) . I n i t i a l M N P l e v e l s a r e i n d i c a t e d i n t h e l e g e n d b o x . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 9 [ F 1 2 0 2 ] B v a r i a t i o n w i t h t i m e p r e d i c t e d b y R K G . F O R u s i n g t h e p u l s e p r o fi l e l i s t e d i n T a b l e 4 . 3 ( L I P A l o n e e n z y m e c a s e ) . T h e u p p e r a n d l o w e r d a s h e d l i n e s i n d i c a t e t h e a l l o w e d r a n g e o f [ 1 1 2 0 2 1 3 . . . . . . . 1 5 1 [ V A ] , v a r i a t i o n w i t h t i m e p r e d i c t e d b y R K G . F O R u s i n g t h e p u l s e p r o fi l e l i s t e d i n T a b l e 4 . 3 ( L I P A l o n e e n z y m e c a s e ) . T h e u p p e r a n d l o w e r d a s h e d l i n e s i n d i c a t e t h e a l l o w e d r a n g e o f [ V A ] B . . . . . . . . 1 5 1 [ L I P ] , 3 v a r i a t i o n w i t h t i m e p r e d i c t e d b y R K G . F O R u s i n g t h e p u l s e p r o fi l e l i s t e d i n T a b l e 4 . 3 ( L I P A l o n e e n z y m e c a s e ) . . . . . . . . . . . . . 1 5 2 [ L i g n i n ] , v a r i a t i o n w i t h t i m e p r e d i c t e d b y R K G . F O R u s i n g t h e p u l s e p r o fi l e l i s t e d i n T a b l e 4 . 3 ( L I P A l o n e e n z y m e c a s e ) . B e c a u s e u s e o f H 1 0 2 t o o x i d i z e d l i g n i n i s n e g l e c t e d i n t h e m o d e l , t h e o n l y c h a n g e s 1 n [ L i g n i n ] 3 o c c u r b e c a u s e o f d i l u t i o n d u e t o p u l s e s . . . . . . . 1 5 2 x v i i 5 . 2 8 5 . 2 9 5 . 3 0 5 . 3 1 5 . 3 2 5 . 3 3 5 . 3 4 5 . 3 5 5 . 3 6 5 . 3 7 5 . 3 8 5 . 3 9 P l o t o f [ 1 1 2 0 2 ] A w i t h t i m e ( L I P A l o n e e n z y m e c a s e ) p r e d i c t e d b y R K G . F O R t o b e n e c e s s a r y t o m a i n t a i n [ 1 1 2 0 , ] , a n d [ V A ] , w r t h m t h e d e s i r e d r a n g e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 4 P l o t o f [ V A ] A w i t h t i m e ( L I P A l o n e e n z y m e c a s e ) p r e d i c t e d b y . R K G . F O R t o b e n e c e s s a r y t o m a i n t a i n [ H 2 0 2 ] , a n d [ V A ] , w r t h r n t h e d e s i r e d r a n g e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 4 V a r i a t i o n o f t h e t r a n s p o r t a n d c o n s u m p t i o n r a t e s o f H 2 0 2 a n d V A i n S i d e B ( L I P A l o n e e n z y m e c a s e ) . T h e l i n e t y p e f o r e a c h i s l i s t e d i n t h e l e g e n d b o x . T h e r a t e s a r e m a i n t a i n e d c l o s e l y t o o n e a n o t h e r t o a t t e n u a t e t h e l e v e l s o f H 2 0 , a n d V A i n S i d e B . . . . . . . . . 1 5 5 [ 1 1 2 0 2 ] , v a r i a t i o n w i t h t i m e p r e d i c t e d b y R K G . F O R u s i n g t h e p u l s e p r o fi l e l i s t e d i n T a b l e 4 . 4 ( M N P A l o n e e n z y m e c a s e ) . T h e u p p e r a n d l o w e r d a s h e d l i n e s i n d i c a t e t h e a l l o w e d r a n g e o f [ 1 1 2 0 , ] , . . . . . . . 1 5 5 V a r i a t i o n o f M n s p e c i e s w i t h t i m e p r e d i c t e d b y R K G . F O R u s i n g t h e p u l s e p r o fi l e l i s t e d i n T a b l e 4 . 4 ( M N P A l o n e e n z y m e c a s e ) . ( a . ) [ M n ( I I ) ] A ( d a s h e d c u r v e ) a n d [ M n ( I I I ) - t a r s ] , ( s o l i d c u r v e ) , a n d ( b . ) [ M n ( I I ) ] , ( d a s h e d c u r v e ) a n d [ M n ( I I I ) - t a m ] , ( s o l i d c u r v e ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 6 [ M N P , ] , v a r i a t i o n w i t h t i m e p r e d i c t e d b y R K G . F O R u s i n g t h e p u l s e p r o fi l e l i s t e d i n T a b l e 4 . 4 ( M N P A l o n e e n z y m e c a s e ) . . . . . . . . 1 5 8 [ L i g n i n ] , v a r i a t i o n w i t h t i m e p r e d i c t e d b y R K G . F O R u s i n g t h e p u l s e p r o fi l e l i s t e d i n T a b l e 4 . 4 ( M N P A l o n e e n z y m e e a s e ) . C h a n g e s i n [ L i g n i n ] , o c c u r b e c a u s e o f b o t h o x i d a t i o n b y [ M n ( I I I ) - t a r t z ] a n d b y d i l u t i o n d u e t o p u l s e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 8 P l o t o f [ H 2 0 2 ] , w i t h t i m e ( M N P A l o n e e n z g m e c a s e ) p r e d i c t e d b y R K G . F O R t o b e n e c e s s a r y t o m a i n t a i n [ H 2 , t h e d e s i r e d r a n g e . . . . 1 5 9 V a r i a t i o n o f t h e t r a n s p o r t a n d c o n s u m p t i o n r a t e s o f H 2 0 , i n S i d e B ( M N P A l o n e e n z y m e c a s e ) . T h e l i n e t y p e f o r e a c h i s l i s t e d i n t h e l e g e n d b o x . T h e r a t e s a r e m a i n t a i n e d c l o s e l y t o o n e a n o t h e r t o a t t e n u a t e t h e l e v e l s o f H 2 0 2 i n S i d e B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 9 [ 1 1 , 0 2 ] , v a r i a t i o n w i t h t i m e p r e d i c t e d b y R K G . F O R u s i n g t h e p u l s e p r o fi l e l i s t e d i n T a b l e 4 . 5 ( L I P + M N P e n z y m e c a s e ) . T h e u p p e r a n d l o w e r d a s h e d l i n e s i n d i c a t e t h e a l l o w e d r a n g e o f [ 1 1 2 0 2 ] , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 0 [ V A ] , v a r i a t i o n w i t h t i m e p r e d i c t e d b y R K G . F O R u s i n g t h e p u l s e p r o fi l e l i s t e d i n T a b l e 4 . 5 ( L I P + M N P e n z y m e c a s e ) . T h e u p p e r a n d l o w e r d a s h e d l i n e s i n d i c a t e t h e a l l o w e d r a n g e o f [ V A ] , . . . . . . . . 1 6 0 V a r i a t i o n o f M n s p e c i e s w i t h t i m e p r e d i c t e d b y R K G . F O R u s i n g t h e p u l s e p r o fi l e l i s t e d i n T a b l e 4 . 5 ( L I P + M N P e n z y m e c a s e ) . ( a . ) [ M n ( I I ) ] A ( d a s h e d c u r v e ) a n d [ M n ( I I I ) - t a m ] , ( s o l i d c u r v e ) , a n d ( b . ) [ M n ( I I ) ] , ( d a s h e d c u r v e ) a n d [ M n ( I I I ) - t a m ] , ( s o l i d c u r v e ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 1 5 . 4 0 [ L I P ] , v a r i a t i o n w i t h t i m e p r e d i c t e d b y R K G . F O R u s i n g t h e p u l s e p r o fi l e l i s t e d i n T a b l e 4 . 5 ( L I P + M N P e n z y m e c a s e ) . T h e s u d d e n s h a r p d r o p s a r e d u e t o M N P a d d i t i o n w i t h o u t a d d r n g 1 6 2 L I P . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 . 4 1 T o t a l [ M N P ] , v a r i a t i o n w i t h t i m e p r e d i c t e d b y R K G . F O R u s i n g t h e p u l s e p r o fi l e l i s t e d i n T a b l e 4 . 5 ( L I P + M N P e n z y m e c a s e ) . T h e s u d d e n s h a r p d r o p s a r e d u e t o L I P a d d i t i o n w i t h o u t a d d i n g s u b s t a n t i a l a m o u n t s o f M N P ( s m a l l a m o u n t s o f M N P , a r e a d d e d ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 2 5 . 4 2 [ L i g n i n ] , v a r i a t i o n w i t h t i m e p r e d i c t e d b y R K G . F O R u s i n g t h e p u l s e p r o fi l e l i s t e d i n T a b l e 4 . 5 ( L I P + M N P e n z y m e c a s e ) . C h a n g e s i n [ L i g n i n ] , o c c u r b e c a u s e o f b o t h o x i d a t i o n b y [ M n ( I I I ) - t a r t 2 ] a n d b y d i l u t i o n d u e t o p u l s e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 4 5 . 4 3 P l o t o f [ 1 1 2 0 2 ] A w i t h t i m e ( L I P + M N P e n z y m e c a s e ) p r e d i c t e d b y R K G . F O R t o b e n e c e s s a r y t o m a i n t a i n [ H 2 0 2 ] , a n d [ V A ] , w i t h i n t h e d e s i r e d r a n g e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 4 5 . 4 4 P l o t o f [ V A ] A w i t h t i m e ( L I P + M N P e n z y m e c a s e ) p r e d i c t e d b y R K G . F O R t o b e n e c e s s a r y t o m a i n t a i n [ 1 1 2 0 , ] , a n d [ V A ] , w i t h i n t h e d e s i r e d r a n g e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 5 5 . 4 5 V a r i a t i o n o f t h e t r a n s p o r t a n d c o n s u m p t i o n r a t e s o f H 2 0 , a n d V A i n S i d e B ( L I P + M N P e n z y m e c a s e ) . T h e l i n e t y p e f o r e a c h i s l i s t e d i n t h e l e g e n d b o x . T h e r a t e s o f H 2 0 , s u p p l y a n d c o n s u m p t i o n a r e a b o v e t h o s e f o r V A d u e t o t h e a d d i t i o n a l c o n s u m p t i o n o f H 2 0 2 b y M N P . T h e r a t e s a r e m a i n t a i n e d c l o s e l y t o o n e a n o t h e r t o a t t e n u a t e t h e l e v e l s o f H 2 0 , a n d V A i n S i d e B . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 5 5 . 4 6 P h o t o g r a p h o f t h e l i g n i n r e c o v e r e d f r o m t h e L I P A l o n e e n z y m e r u n s , s t i l l i n t h e c o n r c a l v i a l s , a n d u n d e r 1 m L o f d i s t i l l e d w a t e r . F r o m l e f t t o r i g h t : B a s e C a s e , N o r e a g e n t c o n t r o l ( R ' ) , N o L I P c o n t r o l ( B ) , A u t o c l a v e d L I P c o n t r o l ( A E ) , a n d N o r e a g e n t , n o L I P c o n t r o l ( E R ' ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 6 5 . 4 7 P h o t o g r a p h s o f t h e l i g n i n r e c o v e r e d f r o m t h e M N P A l o n e e n z y m e r u n s , s t i l l i n t h e c o n i c a l v i a l s , a n d u n d e r 1 m L o f d i s t i l l e d w a t e r . F r o m l e f t t o r i g h t : B a s e C a s e , N o r e a g e n t c o n t r o l ( R ' ) , N o M N P c o n t r o l ( B ) , A u t o c l a v e d M N P c o n t r o l ( A E ) , a n d N o r e a g e n t , n o M N P c o n t r o l ( E R ‘ ) . ( a . ) 6 h o u r t r e a t m e n t t i m e ; a n d ( b . ) 1 2 h o u r t r e a t m e n t t i m e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 8 5 . 4 8 P h o t o g r a p h o f t h e l i g n i n r e c o v e r e d f r o m t h e L I P + M N P e n z y m e r u n s , s t i l l i n t h e c o m c a l v i a l s , a n d u n d e r 1 m L o f d i s t i l l e d w a t e r . F r o m l e f t t o r i g h t : B a s e C a s e , N o r e a g e n t c o n t r o l ( R ' ) , N o L I P , n o M N P c o n t r o l ( B ) , A u t o c l a v e d L I P , a u t o c l a v e d M N P c o n t r o l ( A B ) , a n d N o r e a g e n t , n o L I P , n o M N P c o n t r o l ( E R ‘ ) . . . . . . . . . . . 1 7 9 5 . 4 9 T r a n s m i s s i o n F I ‘ I R s p e c t r u m o f t h e K B r b a c k g r o u n d p e l l e t f r o m 4 0 0 0 - 7 0 0 w a v e n u m b e r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 2 x i x 5 . 5 0 F I ' I R a b s o r b a n c e s p e c t r a o f ( a . ) L I P A l o n e B C l i g n i n a f t e r 5 . 5 1 5 . 5 2 5 . 5 3 5 . 5 4 5 . 5 5 5 . 5 6 5 . 5 7 5 . 5 8 t r e a t m e n t f o r 1 2 h o u r s ; a n d ( b . ) N o r e a g e n t , n o L I P c o n t r o l ( E R ‘ ) l i g n i n a f t e r t r e a t m e n t f o r 1 2 h o u r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F T I R a b s o r b a n c e s p e c t r a o f ( a . ) L I P + M N P B C l i g n i n a f t e r t r e a t m e n t f o r 1 2 h o u r s ; a n d ( b . ) N o r e a g e n t , n o L I P , n o M N P c o n t r o l ( E R ' ) l i g n i n a f t e r t r e a t m e n t f o r 1 2 h o u r s . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 5 E U R a b s o r b a n c e s p e c t r a o f ( a . ) M N P A l o n e B C l i g n i n a f t e r t r e a t m e n t f o r 1 2 h o u r s ; a n d ( b . ) N o r e a g e n t , n o M N P c o n t r o l ( E R ‘ ) l i g n i n a f t e r t r e a t m e n t f o r 1 2 h o u r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E l e c t r o n — i m p a c t m a s s t r u m o f t h e i n t e r n a l s t a n d a r d , 2 - c h l o r o - 5 - ( t r i fl u o r o m e t h y l ) - b e n z o r c a c i d ( m o n o - T M S d e r i v a t i v e ) . T h e s p e c t r u m w a s o b t a i n e d f r o m s c a n 4 9 9 ( 7 ’ 2 8 " ) a f t e r e l u t i o n f r o m t h e D B - l G C c o l u m n . T h e b a c k g r o u n d s u b t r a c t i o n w a s t h e a v e r a g e o f s c a n s 4 9 5 a n d 5 0 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T o t a l I o n C h r o m a t o g r a m ( T I C ) f o r t h e e t h y l a c e t a t e e x t r a c t o f t h e L I P A l o n e B a s e C a s e s o l i d p h a s e o v e r t h e s c a n r a n g e 2 5 0 - 1 6 0 0 . 1 8 6 . 1 9 3 ( 3 ’ 4 4 ” t o 2 3 ’ 5 8 ” ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 8 E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r a o f : ( a . ) V e r a t r a l d e h y d e ; a n d ( b . ) V e r a t r y l A l c o h o l ( m o n o - T M S d e r i v a t i v e ) . T h e s p e c t r a w e r e o b t a i n e d f r o m s c a n s 6 0 4 ( 9 ’ 0 2 " ) a n d 6 9 7 ( 1 0 ’ 2 6 " ) , r e s p e c t i v e l y , a f t e r e l u t i o n f r o m t h e D B ] G C c o l u m n . T h e b a c k g r o u n d s u b t r a c t i o n s w e r e f r o m s c a n s 5 9 1 a n d 6 8 9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 0 E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r a o f : ( a . ) S y r i n g a l d e h y d e ( m o n o - T M S d e r i v a t i v e ) ; ( b . ) V a n i l l i c A c i d ( d i - T M S d e r i v a t i v e ) ; a n d ( c . ) S y r i n g i c A c i d ( d i - T M S d e r i v a t i v e ) . T h e s p e c t r a w e r e o b t a i n e d f r o m s c a n s 7 9 5 ( 1 1 ’ 5 4 ' ) , 8 5 7 ( 1 2 ’ 5 0 ' ) , a n d 9 5 3 ( 1 4 ’ 1 6 " ) , r e s p e c t i v e l y , a f t e r e l u t i o n f r o m t h e D B 1 G C c o l u m n . T h e b a c k g r o u n d s u b t r a c t i o n s w e r e t h e a v e r a g e s o f s c a n s 7 9 0 a n d 7 9 9 , 8 5 2 a n d 8 6 0 , a n d 9 4 7 a n d 9 5 6 , r e s p e c t i v e l y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 1 E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r a o f : ( a . ) 2 , 6 - d i m e t h o x y h y d r o q u i n o n e ( d i - T M S d e r i v a t i v e ; m a t c h e d w i t h t h a t o f W a r i i s h i e t a l . ( 1 9 8 9 a ) ) ; a n d ( b . ) 2 - m e t h o x y - h d r o q u i n o n e ( d i - T M S d e r i v a t i v e ; m a t c h e d w i t h t h a t o f V a l l i e t a l . ( 1 9 2 b ) ) . T h e s p e c t r a w e r e o b t a i n e d f r o m s c a n s 8 6 0 ( l 2 ’ 5 2 ' ) a n d 7 4 4 ( 1 1 ’ 0 8 " ) , r e s p e c t i v e l y , a f t e r e l u t i o n f r o m t h e D B S M S G C c o l u m n . T h e b a c k g r o u n d s u b t r a c t i o n f o r ( a . ) w a s f r o m s c a n 8 5 8 , a n d f o r ( b . ) w a s f r o m t h e a v e r a g e o f s c a n s 7 4 2 a n d 7 4 6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 2 ( a . ) E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m s c a n 1 0 6 9 ( b a c k g r o u n d a v e r a g e o f s c a n s 1 0 6 7 a n d 1 0 7 0 ) o f t h e T I C f r o m t h e L I P A l o n e B C L - C e x t r a c t ; a n d ( b . ) T I C a n d m a s s C h r o m a t o g r a m s f o r i o n s o f m a s s 1 5 1 , 2 3 9 , 3 2 7 , a n d 3 7 0 o v e r t h e s c a n r a n g e 1 0 4 0 - 1 0 8 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 5 X X 5 . 5 9 5 . 6 0 5 . 6 1 5 . 6 2 5 . 6 3 5 . 6 4 5 . 6 5 5 . 6 6 5 . 6 7 5 . 6 8 5 . 6 9 5 . 7 0 5 . 7 1 ( a . ) E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m s c a n 5 4 4 ( b a c k g r o u n d a v e r a g e o f s c a n s 5 4 2 a n d 5 4 7 ) o f t h e T I C f r o m t h e L I P A l o n e B C L - E A e x t r a c t ; a n d ( b . ) T I C a n d m a s s C h r o m a t o g r a m s f o r i o n s o f m a s s 1 1 1 , 1 3 9 , 1 5 4 , a n d 1 8 2 o v e r t h e s c a n r a n g e 5 0 0 - 6 0 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 6 E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o f u n d e r i v a t i z e d s y r i n g a l d e h y d e o b t a i n f r o m t h e N I S T d a t a b a s e ( p r o v i d e d f o r c o m p a r i s o n w i t h F i g u r e 5 . 5 9 a ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 8 P r o p o s e d l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r t h e c o m p o u n d w i t h m a s s s p e c t r u m s h o w n i n F i g u r e 5 . 5 % . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 0 ( a . ) E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m s c a n 6 0 0 ( b a c k g r o u n d a v e r a g e o f s c a n s 5 9 6 a n d 6 0 2 ) o f t h e T I C f r o m t h e L I P A l o n e B C L - E A e x t r a c t ; a n d ( b . ) T I C a n d m a s s C h r o m a t o g r a m s f o r i o n s o f m a s s 1 5 3 , 1 8 3 , 2 1 1 , a n d 2 2 6 o v e r t h e s c a n r a n g e 5 5 0 - 6 5 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 2 P r o p o s e d l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r t h e c o m p o u n d w i t h m a s s s p e c t r u m s h o w n i n F i g u r e 5 . 6 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 3 ( a . ) E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m s c a n 7 4 5 ( b a c k g r o u n d a v e r a g e o f s c a n s 7 4 0 a n d 7 4 8 ) o f t h e T I C f r o m t h e L I P A l o n e B C L - E A e x t r a c t . T h i s c o m p o u n d w a s i d e n t i fi e d a s p - h y d r o x y b e n z o i c a c i d b y c o m p a r i s o n t h e r e f e r e n c e s p e c t r u m o f t h e a u t h e n t i c c o m p o u n d s h o w n i n ( b . ) ( o b t a i n e d f r o m t h e N I S T d a t a b a s e ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 5 ( a . ) E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m s c a n 7 5 2 ( b a c k g r o u n d a v e r a g e o f s c a n s 7 4 5 a n d 7 5 4 ) o f t h e T I C f r o m t h e L I P A l o n e B C L - E A e x t r a c t ; a n d ( b . ) T I C a n d m a s s C h r o m a t o g r a m s f o r i o n s o f m a s s 1 0 7 , 1 3 7 , 1 5 1 , a n d 2 5 6 o v e r t h e s c a n r a n g e 7 0 0 - 8 0 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 6 P r o p o s e d l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r t h e c o m p o u n d w i t h m a s s s p e c t r u m s h o w n i n F i g u r e 5 . 6 5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 8 T o t a l I o n C h r o m a t o g r a m ( T I C ) f o r t h e L I P + M N P B C L - E A e x t r a c t o v e r t h e s c a n r a n g e 2 5 0 - 1 6 0 0 ( 3 ’ 4 4 ” t o 2 3 ’ 5 8 " ) . . . . . . . . . . 2 1 9 E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m s c a n 4 2 6 ( b a c k g r o u n d s e a n 4 2 8 ) o f t h e T I C f r o m t h e L I P + M N P B C L - E A e x t r a c t . . . . . . 2 2 2 P r o p o s e d l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r t h e c o m p o u n d w i t h m a s s s p e c t r u m s h o w n i n F i g u r e 5 . 6 8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 3 E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m s c a n 9 8 7 ( b a c k g r o u n d s c a n 9 8 3 ) o f t h e T I C f r o m t h e L I P + M N P B C L - E A e x t r a c t . . . . . . 2 2 5 P r o p o s e d l i g n i n - d e r i v e d i o n f r a g m e n t s o f m a s s e s 2 2 3 a n d 2 5 3 , f o r m e d b y l o s s f o r H O S i ( C H 3 ) 3 f r o m a n a ' c a r b o x y l i c a c i d w i t h g u a i a c y l - a n d s y r i n g y l - t y p e s t r u c t u r e s , r e s p e c t i v e l y . . . . . . . . . . . . . 2 2 7 x x i 5 . 7 2 a P r o p o s e d l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r t h e c o m p o u n d w i t h m a s s s p e c t r u m s h o w n i n F i g u r e 5 . 7 0 . ( a . ) S t r u c t u r e s w h i c h f o r m m o n o - T M S d e r i v a t i v e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 8 5 . 7 2 b P r o p o s e d l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r t h e c o m p o u n d w i t h m a s s 5 . 7 3 5 . 7 4 5 . 7 5 5 . 7 6 5 . 7 7 5 . 7 8 5 . 7 9 5 . 8 0 5 . 8 1 5 . 8 2 5 . 8 3 s p e c t r u m s h o w n i n F i g u r e 5 . 7 0 . ( b . ) S t r u c t u r e s w h i c h f o r m d i - o r t r i - T M S d e r i v a t i v e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 9 E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m s c a n 6 2 0 ( b a c k g r o u n d s c a n 6 1 8 ) o f t h e T I C f r o m t h e L I P + M N P B C S — C e x t r a c t . . . . . . . . 2 3 1 P r o p o s e d l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r t h e c o m p o u n d w i t h m a s s s p e c t r u m s h o w n i n F i g u r e 5 . 7 3 , i n c l u d i n g s t r u c t u r e s w h i c h f o r m m o n o - o r d i - T M S d e r i v a t i v e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 2 E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m s c a n 8 3 4 ( b a c k g r o u n d a v e r a g e o f s c a n s 8 3 1 a n d 8 3 6 ) o f t h e T I C f r o m t h e L I P + M N P B C S - C e x t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 4 P r o p o s e d l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r t h e c o m p o u n d w i t h m a s s s p e c t r u m s h o w n i n F i g u r e 5 . 7 5 , i n c l u d i n g s t r u c t u r e s w h i c h f o r m d i - o r t r i - T M S d e r i v a t i v e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 5 E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m s c a n 8 0 9 ( b a c k g r o u n d a v e r a g e o f s c a n s 8 0 7 a n d 8 1 1 ) o f t h e T I C f r o m t h e L I P + M N P B C S - E A e x t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 7 P r o p o s e d l i g n i n — d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r t h e c o m p o u n d w i t h m a s s s p e c t r u m s h o w n i n F i g u r e 5 . 7 7 , i n c l u d i n g s t r u c t u r e s w h i c h f o r m d i - o r t r i - T M S d e r i v a t i v e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 8 T o t a l I o n C h r o m a t o g r a m ( T I C ) f o r t h e M N P A l o n e B C L - C e x t r a c t o v e r t h e s c a n r a n g e 2 5 0 - 1 6 0 0 ( 3 ’ 4 4 ” t o 2 3 ’ 5 8 " ) . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 0 ( a . ) E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m s c a n 1 0 3 0 ( b a c k g r o u n d a v e r a g e o f s c a n s 1 0 2 7 a n d 1 0 3 3 ) o f t h e T I C f r o m t h e M N P A l o n e B C L - C e x t r a c t ; a n d ( b . ) T I C a n d m a s s C h r o m a t o g r a m s f o r i o n s o f m a s s 2 5 4 , 2 9 7 , 3 2 7 , a n d 3 4 2 o v e r t h e s c a n r a n g e 9 8 0 - 1 0 8 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 6 P r o p o s e d l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r t h e c o m p o u n d w i t h m a s s s p e c t r u m s h o w n i n F i g u r e 5 . 8 0 , i n c l u d i n g s t r u c t u r e s w h i c h f o r m d i - o r t r i - T M S d e r i v a t i v e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 7 E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m s c a n 1 4 4 4 ( b a c k g r o u n d a v e r a g e o f s c a n s 1 4 4 2 a n d 1 4 4 7 ) o f t h e T I C f r o m t h e M N P A l o n e B C L - C e x t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 9 P r o p o s e d l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r t h e c o m p o u n d w i t h m a s s s p e c t r u m s h o w n i n F i g u r e 5 . 8 2 , i n c l u d i n g s t r u c t u r e s w h i c h f o r m m o n o - , d i - , t r i - o r t e t r a - T M S d e r i v a t i v e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 0 5 . 8 4 E l e c t r o n - i m t m a s s s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m s c a n 6 8 2 ( b a c k g r o u n d s c a n 6 8 1 ) o t h e T I C f r o m t h e M N P A l o n e B C L - E A e x t r a c t . . . . . . 5 . 8 5 E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m s c a n 1 4 9 8 ( b a c k g r o u n d a v e r a g e o f s c a n s 1 4 9 6 a n d 1 5 0 0 ) o f t h e T I C f r o m t h e M N P A l o n e B C S - C e x t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 . 8 6 a P r o p o s e d l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r t h e c o m p o u n d w i t h m a s s s p e c t r u m s h o w n i n F i g u r e 5 . 8 5 . ( a . ) S t r u c t u r e s w h i c h f o r m m o n o - T M S d e r i v a t i v e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 . 8 6 b P r o p o s e d l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r t h e c o m p o u n d w i t h m a s s s p e c t r u m s h o w n i n F i g u r e 5 . 8 5 . ( b . ) S t r u c t u r e s w h i c h f o r m d i - T M S d e r i v a t i v e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 . 8 6 c P r o p o s e d l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r t h e c o m p o u n d w i t h m a s s s p e c t r u m s h o w n i n F i g u r e 5 . 8 5 . ( c . ) S t r u c t u r e s w h i c h f o r m t r i - T M S d e r i v a t i v e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 . 8 7 E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m s c a n 4 3 7 ( b a c k g r o u n d a v e r a g e o f s c a n s 4 3 5 a n d 4 3 9 ) o f t h e T I C f r o m t h e M N P A l o n e B C S - E A e x t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 . 8 8 S u m m a r y o f t h e g e n e r a l r e s u l t s f o r c o l o r c h a n g e s , r e s i d u a l s o l i d m a s s l o s s e s , h g n i n c o n t e n t s , a n d f o r m a t i o n o f u n i q u e l i g n i n - d e r i v e d p r o d u c t s f o r t h e t r e a t m e n t o f i s o l a t e d i n s o l u b l e p o p l a r l i g n i n i n a q u e o u s m e d i a b y L I P S A l o n e , M N P S A l o n e , a n d L I P S + M N P S F . 1 F I ' I R a b s o r b a n c e s p e c t r u m o f t h e L I P A l o n e , N o r e a g e n t c o n t r o l ( R ‘ ) l i g n i n a f t e r t r e a t m e n t f o r 1 2 h o u r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F . 2 F I ‘ I R a b s o r b a n c e s p e c t r u m o f t h e L I P A l o n e , N o L I P c o n t r o l ( B ) l i g n i n a f t e r t r e a t m e n t f o r 1 2 h o u r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F . 3 F ' I ' I R a b s o r b a n c e s p e c t r u m o f t h e L I P A l o n e , A u t o c l a v e d L I P c o n t r o l ( A B ) l i g n i n a f t e r t r e a t m e n t f o r 1 2 h o u r s . . . . . . . . . . . . . . F . 4 F T I R a b s o r b a n c e S p e c t r u m o f t h e L I P + M N P , N o r e a g e n t c o n t r o l ( R ' ) l i g n i n a f t e r t r e a t m e n t f o r 1 2 h o u r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F . 5 F I ‘ I R a b s o r b a n c e s p e c t r u m o f t h e L I P + M N P , N o L I P , n o M N P c o n t r o l ( 1 3 ‘ ) l i g n i n a f t e r t r e a t m e n t f o r 1 2 h o u r s . . . . . . . . . . . . . . . F . 6 F I ‘ I R a b s o r b a n c e s p e c t r u m o f t h e L I P + M N P , A u t o c l a v e d L I P , a u t o c l a v e d M N P c o n t r o l ( A E ) l i g n i n a f t e r t r e a t m e n t f o r 1 2 h o u r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F . 7 F T I R a b s o r b a n c e s p e c t r u m o f t h e M N P A l o n e , N o r e a g e n t c o n t r o l ( R ' ) l i g n i n a f t e r t r e a t m e n t f o r 1 2 h o u r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F . 8 F T I R a b s o r b a n c e s p e c t r u m o f t h e M N P A l o n e , N o M N P c o n t r o l ( E ) l i g n i n a fi e r t r e a t m e n t f o r 1 2 h o u r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x x i i i . 2 5 2 . 2 5 3 . 2 5 5 . 2 5 6 . 2 5 7 . 2 5 9 . 2 6 4 . 3 6 1 . 3 6 2 . 3 6 3 . 3 6 4 . 3 6 5 . 3 6 6 . 3 6 7 . 3 6 8 F . 9 F ' I ' I R a b s o r b a n c e s p e c t r u m o f t h e M N P A l o n e , A u t o c l a v e d M N P c o n t r o l ( A E ) l i g n i n a f t e r t r e a t m e n t f o r 1 2 h o u r s . . . . . . . . . . . . . . F . 1 0 E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o f 2 , 6 — d i m e t h o x y p h e n o l ( A l d r i c h ) o b t a i n e d f r o m s c a n 5 3 6 ( b a c k g r o u n d a v e r a g e o f s c a n s 5 3 3 a n d 5 3 8 ) o f t h e T I C f r o m a n a u t h e n t i c s t a n d a r d a n a l y z e d w i t h t h e D B ] G C c o l u m n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F . 1 1 E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o f 3 , 5 - d i m e t h o x y p h e n o l ( A l d r i c h ) o b t a i n e d f r o m s c a n 6 2 5 ( b a c k g r o u n d a v e r a g e o f s c a n s 6 2 3 a n d 6 2 7 ) o f t h e T I C f r o m a n a u t h e n t i c s t a n d a r d a n a l y z e d w i t h t h e D B — l G C c o l u m n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F . 1 2 E l e c t r o n — i m p a c t m a s s s p e c t r u m o f 3 , 4 - d i m e t h o x y p h e n o l ( A l d r i c h ) o b t a i n e d f r o m s c a n 5 9 8 ( b a c k g r o u n d a v e r a g e o f s c a n s 5 9 6 a n d 6 0 0 ) o f t h e T I C f r o m a n a u t h e n t i c s t a n d a r d a n a l y z e d w i t h t h e D B 1 G C c o l u m n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F . 1 3 E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o f p - h y d r o x y b e n z o i c a c i d ( A l d r i c h ) o b t a i n e d f r o m s c a n 7 4 4 ( b a c k g r o u n d s c a n 7 4 5 ) o f t h e T I C f r o m a n a u t h e n t i c s t a n d a r d a n a l y z e d w i t h t h e D B — l G C c o l u m n . . . . . . . . F . 1 4 E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o f 3 , 5 - d i m e t h o x y c i n n a m i c a c i d ( A l d r i c h ) o b t a i n e d f r o m s c a n 1 0 2 1 ( b a c k g r o u n d a v e r a g e o f s c a n s 1 0 1 8 a n d 1 0 2 2 ) o f t h e T I C f r o m a n a u t h e n t i c s t a n d a r d a n a l y z e d w i t h t h e D B 1 G C c o l u m n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F . 1 5 E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o f 3 , 4 - d i m e t h o x y c i n n a m i c a c i d ( A l d r i c h ) o b t a i n e d f r o m s c a n 1 0 2 0 ( b a c k g r o u n d a v e r a g e o f s c a n s 1 0 1 8 a n d 1 0 2 2 ) o f t h e T I C f r o m a n a u t h e n t i c s t a n d a r d a n a l y z e d w i t h t h e D B 1 G C c o l u m n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F . 1 6 E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o f 4 - c o u m a r i c a c i d ( 4 - h y d r o x y - c i n n a m i c a c i d ; A l d r i c h ) o b t a i n e d f r o m s c a n 9 7 5 ( b a c k ; g r o u n d a v e r a g e o f s c a n s 9 7 2 a n d 9 7 7 ) o f t h e T I C f r o m a n a u t h e n t i c s t a n d a r d a n a l y z e d w i t h t h e D B 1 G C c o l u m n . . . . . . . . . . . . . . . . F . 1 7 E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o f 3 - c o u m a r i c a c i d ( 3 - h y d r o x y - c i n n a m i c a c r d ; A l d r i c h ) o b t a i n e d f r o m s c a n 9 2 6 ( b a c k g r o u n d a v e r a g e o f s c a n s 9 2 3 a n d 9 2 9 ) o f t h e T I C f r o m a n a u t h e n t i c s t a n d a r d a n a l y z e d w i t h t h e D B ] G C c o l u m n . . . . . . . . . . . . . . . . F . 1 8 E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m ‘ o f v a n i l l i n ( v a n i l l y l a l d e h y d e ; A l d r i c h ) o b t a i n e d f r o m s c a n 6 4 9 ( b a c k g r o u n d a v e r a g e o f s c a n s ' 6 4 7 a n d 6 5 1 ) o f t h e T I C f r o m a n a u t h e n t i c s t a n d a r d a n a l y z e d w i t h t h e D B 1 G C c o l u m n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F . 1 9 E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o f 1 , 2 , 4 - b e n z e n e t r i o l ( 1 , 2 , 4 - t 1 i - h y d r o x y b e n z e n e ; A l d r i c h ) o b t a i n e d f r o m s c a n 7 3 2 ( b a c k g r o u n d a v e r a g e o f s c a n s 7 3 0 a n d 7 3 5 ) o f t h e T I C f r o m a n a u t h e n t i c s t a n d a r d a n a l y z e d w i t h t h e D B 1 G C c o l u m n . . . . . . . . . . . . . . . . x x i v . 3 6 9 . . 3 7 0 . . 3 7 1 . . 3 7 2 3 7 3 . 3 7 4 . 3 7 5 . 3 7 6 . 3 7 7 . 3 7 8 . 3 7 9 C H A P T E R I : I N T R O D U C T I O N B i l l i o n s o f t o n s o f l i g n o c e l l u l o s e a r e p r o d u c e d a n n u a l l y i n t h e b i o s p h e r e ( T s a o e t a l . , 1 9 8 7 ) . W e r e i t n o t f o r t h e a c t i o n o f l i g n i n d e g r a d i n g m i c r o o r g a n i s m s , t h i s b i o m a s s w o u l d b e o n l y p a r t i a l l y d e c o m p o s e d d u e t o t h e p r o t e c t i v e r o l e p l a y e d b y l i g n i n , a r a n d o m p h e n y l p r o p a n o i d p o l y m e r c o m p r i s i n g 2 0 - 3 0 % o f t h e d r y m a s s o f w o o d y p l a n t s ( B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) . W h i l e t h e c a r b o n p o o l r e p r e s e n t e d b y l i g n i n i s a n i m p o r t a n t r e n e w a b l e r e s o u r c e i n i t s o w n r i g h t , m o s t b i o m a s s c o n v e r s i o n s t u d i e s h a v e f o c u s e d o n e f fi c i e n t r e c o v e r y o f c a r b o h y d r a t e s f r o m t h e t w o o t h e r m a j o r c o m p o n e n t s o f l i g n o c e l l u l o s i c m a t e r i a l s , c e l l u l o s e a n d h e m i c e l l u l o s e . C e l l u l o s e a n d h e m i c e l l u l o s e a r e c o m p r i s e d m a i n l y o f c a r b o h y d r a t e s ( g l u c o s e i n c e l l u l o s e a n d h e m i c e l l u l o s e , a n d x y l o s e , m a n n o s e , g a l a c t o s e , a r a b i n o s e , a n d c e r t a i n u r o n i c a c i d s i n h e m i c e l l u l o s e ) j o i n e d b y e a s i l y h y d r o l y z a b l e b o n d s . T h i s m a k e s t h e m p r i m e c a n d i d a t e s f o r u s e i n c o m m e r c i a l a n d i n d u s t r i a l e n t e r p r i s e s s u c h a s e t h a n o l p r o d u c t i o n , f o o d s , e t c . L i g n i n , o n t h e o t h e r h a n d , i s a h i g h l y c o m p l e x h e t e r o g e n e o u s a r o m a t i c p o l y m e r ( s e e F i g u r e 1 . 1 ) , a n d t h e r e f o r e y i e l d s c o m p l e x m i x t u r e s o f a r o m a t i c p r o d u c t s w h e n d e g r a d e d . T h u s , l i g n i n i s n o t w e l l s u i t e d f o r t h e e c o n o m i c a l p r o d u c t i o n o f i n d u s t r i a l c h e m i c a l s a n d f u e l s g i v e n t h e c u r r e n t p r o c e s s t e c h n o l o g y . I n a d d i t i o n , t h e c o m p l e x s t r u c t u r e m a k e s l i g n i n d i f fi c u l t t o d e g r a d e a n d t h e r e f o r e p r e s e n t s e f f e c t i v e b a r r i e r s t o m i c r o b i a l d e g r a d a t i o n o f l i g n o c e l l u l o s e a n d t o c h e m i c a l r e m o v a l o f l i g n i n f o r p a p e r p r o d u c t i o n . I n t h e p u l p a n d p a p e r i n d u s t r y , l i g n i n r e m o v a l i s q u i t e i m p o r t a n t a n d i s a v e r y e n e r g y i n t e n s i v e a n d e x p e n s i v e p r o c e s s ( M i c h e l e t a l . , 1 9 9 1 ) . T o x i c e f fl u e n t s a r e p r o d u c e d b y t h e v a r i o u s b l e a c h i n g p r o c e s s e s , w h i c h m u s t b e c l e a n e d u p p r i o r t o d i s c h a r g e . C l e a r l y , c h e m i c a l r e m o v a l o f l i g n i n h a s m a j o r d r a w b a c k s w h i c h m i g h t b e s o l v e d b y t h e u s e o f m i c r o b i a l d e l i g n i fi e r s . T h e m a j o r a e r o b i c l i g n i n d e g r a d i n g o r g a n i s m s a r e t h e w h i t e r o t f u n g i ( B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) . D e s p i t e i t s h i g h c a r b o n c o n t e n t , l i g n i n i s u n a b l e t o a c t a s a c a r b o n s o u r c e f o r w h i t e r o t f u n g i . W h i t e r o t f u n g i a l s o a p p e a r t o d e g r a d e h e r b i c i d e s , p e s t i c i d e s , P C B S , p o l y a r o m a t i c h y d r o c a r b o n s , a n d o t h e r x e n o b i o t i c s 1 M a c o n R C O H “ 3 : , n i c e N H ' . H z c o n . 2 9 ° c u t [ a 1 4 3 6 0 . C " - 9 " ” : 6 0 H S - H f : o N o n “ " 3 . 1 ’ 2 ” 9 2 0 ‘ N C O ) H z ” 3 6 0 H e H e . - 0 1 1 3 ( : 0 0 — H R C U t e — O : c ' : H 0 0 " O C H 0 c “ ” a ? " 3 3 ' c o n \ n e a r : 1 n , o , « 2 . E M S n " I ? f ” O N 0 . ’ ’ [ / 1 1 1 - c u a 0 . ? ” a l s o " O C H : . 0 " H H 1 C O p e g — o “ $ 9 “ ' O C H : I R C O O C R R C O H S R 3 ’ “ a ? “ c u \ o n 0 c " ! ~ 9 1 c \ o e c u , P C " : ‘ o c u " 3 : 0 0 O H _ 0 3 F i g u r e 1 . 1 : R e p r e s e n t a t i v e s t r u c t u r e f o r S p r u c e l i g n i n ( B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) . 3 ( B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) . C l e a r l y , o p t i m i z a t i o n o f t h e s e p r o c e s s e s f o r i n d u s t r i a l u s e w i l l i n t h e e n d d e p e n d o n w h i c h l i g n i n o l y t i c e n z y m e s a r e m o s t i m p o r t a n t i n d e p o l y m e r i z a t i o n o f l i g n i n , a n d t h e p r o d u c t s w h i c h a r e f o r m e d . R e a c t i o n s c a t a l y z e d b y t h e l i g n i n o l y t i c e n z y m e s o f P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m , t h e b e s t c h a r a c t e r i z e d w h i t e r o t f u n g u s , o n s o l u b l e l i g n i n m o d e l c o m p o u n d s h a v e b e e n f a i r l y w e l l c h a r a c t e r i z e d ( T i e n , 1 9 8 7 ) . H o w e v e r , r a t e s o f d e g r a d a t i o n o f i n s o l u b l e l i g n i n a r e v e r y s l o w c o m p a r e d t o r a t e s o b s e r v e d f o r t h e s e s o l u b l e s u b s t r a t e s , a n d t h u s t h e r e i s s o m e q u e s t i o n a s t o w h e t h e r t h e r e s u l t s w i t h s o l u b l e c o m p o u n d s c a n b e e x t e n d e d t o t h e r e s u l t s f r o m i n s o l u b l e s u b s t r a t e s . T o f u l l y u n d e r s t a n d h o w l i g n i n d e g r a d a t i o n o c c u r s a n d w h a t p r o d u c t s t o e x p e c t u n d e r o p t i m i z e d c o n d i t i o n s , t h e i n v i t r o m e c h a n i s m o f a c t i o n o f t h e l i g n i n o l y t i c e n z y m e s o n n a t u r a l i n s o l u b l e l i g n i n m u s t b e d e t e r m i n e d ( T i e n , 1 9 8 7 ) . T h i s i n f o r m a t i o n c o u l d t h e n b e u s e d t o d e v e l o p i n d u s t r i a l p r o c e s s e s f o r i n v i t r o r e m o v a l o f l i g n i n b y t h e s e e n z y m e s , s u b s t a n t i a l l y d e c r e a s i n g t h e e n e r g y c o s t s a n d t h e t o x i c i t y o f p l a n t e f fl u e n t s . T h e b r o a d g o a l o f t h i s s t u d y w a s t o v e r i f y w h e t h e r t h e e x t r a c e l l u l a r l i g n i n o l y t i c e n z y m e s o f P . c h r y s o s p o r i w n d e p o l y m e r i z e w a t e r - i n s o l u b l e n a t u r a l l i g n i n i n c o m p l e t e l y a q u e o u s m e d i a , a n a c t i v i t y w h i c h h a s b e e n s u g g e s t e d b u t n o t p r o v e n b y t h e a b i l i t i e s o f t h e s e e n z y m e s t o c l e a v e l i g n i n m o d e l d i m e r s a n d t o d e p o l y m e r i z e s y n t h e t i c l i g n i n s i n a q u e o u s o r g a n i c m e d i a . C o n c e n t r a t e d e x t r a c e l l u l a r p e r o x i d a s e s o f P . c h r y s o s p o r t ' w n w e r e i n c u b a t e d w i t h i n s o l u b l e l i g n i n i n a t w o - c h a m b e r e d r e a c t i o n v e s s e l , i n t h e p r e s e n c e o f 0 , , H 2 0 2 , a n d v e r a t r y l a l c o h o l a n d / o r M n ( I I ) , i n t a r t r a t e b u f f e r . O n e c h a m b e r o f t h e r e a c t o r c o n t a i n e d t h e i n s o l u b l e l i g n i n s u b s t r a t e a n d h i g h l e v e l s o f l i g n i n o l y t i c e n z y m e s a n d w a s c o n t i n u o u s l y s u p p l i e d a c r o s s a m e m b r a n e w i t h v e r a t r y l a l c o h o l a n d / o r H 2 0 2 b y d i f f u s i o n f r o m c o n c e n t r a t e d s t o c k s o l u t i o n s i n t h e s e c o n d c h a m b e r . I n s o l u b l e l i g n i n r e m a i n i n g a f t e r t r e a t m e n t w i t h t h e l i g n i n o l y t i c e n z y m e s w a s q u a n t i t a t i v e l y r e c o v e r e d a n d a n y c h a n g e s i n l i g n i n , c a r b o h y d r a t e , m e t h o x y l , a n d p h e n o l i c h y d r o x y l c o n t e n t s w e r e d e t e r m i n e d b y F o u r i e r T r a n s f o r m I n f r a r e d S p e c t r o s c o p y ( F I ' I R ) c o m b i n e d w i t h P a r t i a l L e a s t S q u a r e s R e g r e s s i o n . T h e s o l u b l e p h a s e f r o m t h e r e a c t o r w a s a l s o r e c o v e r e d a n d 4 t h e m a j o r s o l u b l e p r o d u c t s o f l i g n i n d e p o l y m e r i z a t i o n w e r e p a r t i a l l y c h a r a c t e r i z e d b y g a s c h r o m a t o g r a p h y / m a s s s p e c t r o m e t r y ( G C / M S ) . V a r y i n g t h e c u l t u r e c o n d i t i o n s ( B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) u s e d f o r e n z y m e p r o d u c t i o n e n a b l e d b o t h f a m i l i e s o f l i g n i n o l y t i c e n z y m e s ( l i g n i n p e r o x i d a s e s a n d m a n g a n e s e - d e p e n d e n t p e r o x i d a s e s ) t o b e s t u d i e d i n d i v i d u a l l y a n d i n c o m b i n a t i o n . T h i s i n f o r m a t i o n w a s u s e d t o S h o w t h a t w h i l e L I P S a n d M N P S b o t h a p p e a r t o e f f e c t a v e r y l i m i t e d r e l e a s e o f l i g n i n - d e r i v e d d e g r a d a t i o n p r o d u c t s , t h e m a i n r o l e o f M N P i s t o m o d i f y t h e i n s o l u b l e l i g n i n p o l y m e r , t h e r e b y i n c r e a s i n g t h e e f f e c t i v e n e s s o f L I P - m e d i a t e d d e g r a d a t i o n . T h i s d i s s e r t a t i o n i s d i v i d e d i n t o s i x c h a p t e r s , i n c l u d i n g t h i s fi r s t c h a p t e r ( I n t r o d u c t i o n ) . A b r i e f r e v i e w o f t h e r e l e v a n t l i t e r a t u r e i s p r e s e n t e d i n C h a p t e r I I , f o c u s i n g o n l i g n i n s t r u c t u r e , i n v i v o a e r o b i c d e g r a d a t i o n o f l i g n i n b y w o o d r o t t i n g f u n g i ( m a j o r f o c u s o n t h e w h i t e r o t f u n g i ) , t h e l i g n i n d e g r a d i n g e n z y m e s o f t h e b e s t c h a r a c t e r i z e d w h i t e r o t f u n g u s , P . c h r y s o s p o r i u m , r e s u l t s o f s t u d i e s o n i n v i t r o d e g r a d a t i o n o f l i g n i n [ m o d e l c o m p o u n d s a n d s y n t h e t i c l i g n i n s b y l i g n i n d e g r a d i n g e n z y m e s , a n d m e t h o d s f o r a n a l y z i n g s o l i d l i g n i n a n d l i g n i n d e g r a d a t i o n p r o d u c t s . T h e r a t i o n a l e a n d a p p r o a c h f o r e a c h p a r t o f t h e p r o j e c t a r e p r e s e n t e d i n C h a p t e r I I I . E x p e r i m e n t a l a n d t h e o r e t i c a l m e t h o d s , a n d m a t e r i a l s u s e d a r e t h e s u b j e c t o f C h a p t e r I V . T h e r e s u l t s o f t h e s e e x p e r i m e n t s a r e p r e s e n t e d i n C h a p t e r V a n d d i s c u s s e d i n C h a p t e r V I . F i n a l l y , p e r t i n e n t e q u a t i o n s , a s s a y s , c o m p u t e r p r o g r a m s , t a b u l a t e d d a t a , a n d F I ‘ I R a n d m a s s s p e c t r a n o t p r e s e n t e d i n t h e b o d y o f t h e t e x t a r e p r e s e n t e d i n A p p e n d i c e s A - F . C H A P T E R I I : L I T E R A T U R E S U R V E Y T h e l i g n i n b i o d e g r a d a t i o n fi e l d i s w i d e l y d i v e r s e , e n c o m p a s s i n g l i g n i n s t r u c t u r e , d e g r a d a t i o n b y a w i d e v a r i e t y o f m i c r o o r g a n i s m s , m e c h a n i s m s o f d e g r a d a t i o n o f l i g n i n b y t h e v a r i o u s l i g n i n - d e g r a d i n g e n z y m e s , a n d t h e g e n e t i c s o f l i g n i n d e g r a d i n g o r g a n i s m s . M a n y e x c e l l e n t r e v i e w s ( T s a o e t a l . , 1 9 8 7 ; B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ; T i e n , 1 9 8 7 ; F i e c h t e r , 1 9 9 3 ; d e J o n g e t a l . , 1 9 9 4 ; E v a n s e t a l . , 1 9 9 4 ; H i g u c h i , 1 9 9 3 ; H a d a r e t a l . , 1 9 9 3 ; S u s m e l a n d S t e f a n o n , 1 9 9 3 ; R e d d y a n d D ’ S o u z a , 1 9 9 4 ; G o l d a n d A l i c , 1 9 9 3 ) h a v e b e e n p u b l i s h e d w i t h s o m e r e g u l a r i t y o n a l l t h e s e t o p i c s . B e c a u s e t h e r e i s s o m u c h i n f o r m a t i o n o n l i g n i n b i o d e g r a d a t i o n a v a i l a b l e i n t h e l i t e r a t u r e , a c o m p r e h e n s i v e l i t e r a t u r e r e v i e w i s n o t n e c e s s a r y a n d t h u s w i l l n o t b e d o n e h e r e ; o n l y a r e a s d i r e c t l y c o n t r i b u t i n g t o t h i s w o r k w i l l b e p r e s e n t e d . T h e a r e a s i n c l u d e d a r e l i g n i n f o r m a t i o n a n d s u b s t r u c t u r e ; a e r o b i c l i g n i n d e g r a d a t i o n b y w h i t e r o t f u n g i , s p e c i fi c a l l y , P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m ; t h e l i g n i n p e r o x i d a s e s ( L I P S ) a n d m a n g a n e s e p e r o x i d a s e s ( M N P S ) o f P . c h r y s o s p o r i u m ; m e c h a n i s t i c s t u d i e s w i t h L I P S a n d M N P S f r o m P . c h r y s o s p o r i u m ; i n v i t r o l i g n i n a n d l i g n i n s u b s t r u c t u r e m o d e l c o m p o u n d d e g r a d a t i o n b y t h e L I P S a n d M N P S o f P . c h r y s o s p o r i w n ; a n d a b r i e f o v e r v i e w o f t e c h n i q u e s u s e d f o r t h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f s o l i d l i g n i n a n d s o l u b l e l i g n i n f r a g m e n t s . 2 . 1 L i g n i n F o r m a t i o n a n d S u b s t r u c t u r e L i g n i n i s a c o m p l i c a t e d , s t e r e o c h e m i c a l l y c o m p l e x , a r o m a t i c , h e t e r o g e n e o u s r e n e w a b l e b i o p o l y m e r t h a t c o m p r i s e s 2 0 - 3 0 % o f t h e d r y m a s s o f w o o d y p l a n t s . I t i s t h e s e c o n d m o s t a b u n d a n t o r g a n i c p o l y m e r i n t h e b i o s p h e r e a n d i s r e l a t i v e l y r e s i s t a n t t o b i o d e g r a d a t i o n ( A n d e r a n d E r i k s s o n , 1 9 7 8 ; C r a w f o r d , R . L . , 1 9 8 1 ; E r i k s s o n a n d K i r k , 1 9 8 5 ; H i g u c h i e t a l . , 1 9 8 3 ; K i r k a n d F a r r e l l , 1 9 8 7 ; B u s w e l l a n d O d i e r , 1 9 8 7 ) . S i n c e l i g n i n o c c u r s i n c l o s e p h y s i c a l a n d c h e m i c a l a s s o c i a t i o n w i t h c e l l u l o s e a n d h e m i c e l l u l o s e , i t l i m i t s a c c e s s b y p o l y s a c c h a r i d e — d i g e s t i n g e n z y m e s t o t h e s e p l a n t p o l y m e r s a n d i s a m a j o r o b s t a c l e t o t h e e f fi c i e n t e c o n o m i c c o n v e r s i o n o f l i g n o c e l l u l o s i c m a t e r i a l s t o f e e d s , f u e l s , a n d c h e m i c a l s ( E r i k s s o n a n d K i r k , 1 9 8 5 ; B u s w e l l a n d O d i e r , 1 9 8 7 ; B o o m i n a t h a n 5 a n d R e d d y , 1 9 9 2 ; H i g u c h i , 1 9 9 0 ) . L i g n i n i s f o r m e d b y r a n d o m f r e e r a d i c a l p o l y m e r i z a t i o n o f s i n a p y l , c o n i f e r y l a n d c o u m a r y l a l c o h o l s , w h i c h a r e s y n t h e s i z e d f r o m c i n n a m y l a l c o h o l ( u l t i m a t e l y d e r i v e d f r o m p h e n y l a l a n i n e ) i n t h e p l a n t ( s t r u c t u r e s s h o w n i n F i g u r e 2 . 1 ) , t o f o r m a h e t e r o g e n e o u s , o p t i e a l l y i n a c t i v e , c r o s s l i n k e d , a n d h i g h l y p o l y d i s p e r s e p o l y m e r o f g u a i a c y l , s y r i n g y l a n d s m a l l a m o u n t s o f p - h y d r o x y p h e n y l u n i t s ( K i r k a n d F a r r e l l , 1 9 8 7 ) . G y m n o s p e r m l i g n i n s c o n t a i n p r i m a r i l y g u a i a c y l u n i t s , w h i l e a n g i o s p e r m l i g n i n s c o n t a i n e s s e n t i a l l y e q u a l a m o u n t s o f g u a i a c y l a n d s y r i n g y l u n i t s ; s e e F i g u r e 2 . 2 f o r t h e s t r u c t u r e s o f t h e s e b a s e u n i t s . A t y p i c a l f o r m u l a f o r s p r u c e l i g n i n i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 1 . 1 i n t h e I n t r o d u c t i o n . T h e l i n k a g e t y p e s b e t w e e n t h e v a r i o u s l i g n i n ” m o n o m e r s " h a v e b e e n f a i r l y w e l l c h a r a c t e r i z e d . T h e p r e d o m i n a n t t y p e i s t h e B - O — 4 l i n k a g e , c o m p r i s i n g a b o u t 4 0 - 6 0 % o f l i g n i n l i n k a g e s . T h e l i n k a g e s i n F i g u r e 1 . 1 b e t w e e n t h e l i g n i n m o n o m e r s l a n d 4 , 5 a n d 4 , 5 a n d 6 , 7 a n d 8 , 1 3 b a n d 1 4 b , a n d 1 5 a n d 1 6 , a r e o f t h i s t y p e . O t h e r s i n c l u d e p h e n y l c o u m a r a n ( 6 - 1 2 % o f t h e t o t a l n u m b e r o f l i n k a g e s ; b e t w e e n l i g n i n m o n o m e r s 1 7 a n d 1 8 ) , d i a r y l p r o p a n e ( 5 - 1 0 % ; b e t w e e n l i g n i n m o n o m e r s 1 6 a n d 2 0 ) , a - a r y l e t h e r l i n k a g e s ( 6 - 8 % ; b e t w e e n l i g n i n m o n o m e r s 1 1 a n d 1 2 ) , p i n o r e s i n o l ( l e s s t h a n 5 % ; b e t w e e n l i g n i n m o n o m e r s 8 a n d 9 ) , b i p h e n y l ( 5 - 1 0 % ; b e t w e e n l i g n i n m o n o m e r s 1 2 a n d 1 3 a ) , a n d d i p h e n y l e t h e r ( 4 - 6 % ; b e t w e e n l i g n i n m o n o m e r s 6 a n d 7 ) ( B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) . T h i s c o m p l i c a t e d p o l y m e r p r e s e n t s a n e f f e c t i v e d e t e r r e n t t o b i o d e g r a d a t i o n o f l i g n o c e l l u l o s e s i n c e a n y e n z y m e s y s t e m u t i l i z e d m u s t b e e x t r a c e l l u l a r , n o n s p e c i fi c , a n d n o n h y d r o l y t i c . T h e e n z y m e s y s t e m s t h u s f a r d i s c o v e r e d t e n d t o r e l y o n r a n d o m f r e e r a d i c a l m e d i a t e d l i g n i n d e g r a d a t i o n ( C r a w f o r d , R . L . , 1 9 8 1 , B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) , w h i c h w i l l b e d i s c u s s e d b e l o w . 2 . 2 A e r o b i c L i g n i n D e g r a d a t i o n B y W h i t e R o t fi t n g i T h e r e i s a c o n s i d e r a b l e p o t e n t i a l f o r t h e u s e o f l i g n i n o l y t i c o r g a n i s m s o r t h e i r e n z y m e s i n m a n y p r o c e s s e s o f i n d u s t r i a l i m p o r t a n c e , i n c l u d i n g b i o p u l p i n g a n d b i o b l e a c h i n g o f p a p e r p u l p s ( E r i k s s o n a n d K i r k , 1 9 8 5 ; R e i d a n d P a i c e , 1 9 9 4 ; M e s s n e r 1 , 0 1 1 3 C 1 H [ l l o n H A R Y L A L C O H O L O H fi H H O H o u r , N I C O O L L A L C O H 0 \ Y H , S C I 0 N A P O I N N O H E R Y L A L C O H C O O L U i i O H H Y L " A L C O H O L F A F i g u r e 2 . 1 : P r e c u r s o r m o l e c u l e s u s e d i n b i o s y n t h e s i s o f l i g n i n ( B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) . H 3 C O S O s H u b s t r u c y r i n g y l O t C H 3 u r e O C H 3 O H C u a i a c y l s u b s t r u c t u r e F i g u r e 2 . 2 : G u a i a c y l — a n d S ' n g y l - u n i t s t r u c t u r e s . T h e t e r m g u a i a c y l - r e f e r s t o t h e b a s e s t r u c t u r e 3 — m e t h o x y - 4 - y d r o x y - , w h i l e s y r i n g y l - r e f e r s t o 3 , 5 - d i m e t h o x y - 4 - h y d r o x y - s u b s t i t u t e d s t r u c t u r e s . 9 a n d S r e b o t n i k , 1 9 9 4 ) , d e c o l o r i z a t i o n o f b l e a c h e d p u l p e f fl u e n t s ( M i c h e l e t a l . , 1 9 9 1 , B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) , b i o t r a n s f o r r n a t i o n o f l i g n i n i n t o a r o m a t i c c h e m i c a l f e e d s t o c k s a n d r e l a t e d a p p l i c a t i o n s ( E r i k s s o n , 1 9 9 3 ) . I n v i e w o f t h e e c o l o g i c a l a n d i n d u s t r i a l i m p o r t a n c e o f l i g n i n b i o d e g r a d a t i o n , t h e r e h a s b e e n m u c h i n t e r e s t i n r e c e n t y e a r s o n l i g n i n d e g r a d a t i o n b y w h i t e r o t f u n g i b e c a u s e t h e s e o r g a n i s m s r a p i d l y a n d c o m p l e t e l y d e g r a d e l i g n i n t o C O 2 a n d H 2 0 ( C r a w f o r d , R . L . , 1 9 8 1 ; K i r k a n d F a r r e l l , 1 9 8 7 ; T i e n , 1 9 8 7 ; H i g u c h i , 1 9 9 0 ; B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ; F i e c h t e r , 1 9 9 3 ) . M a n y f u n g i , i n c l u d i n g t h e w h i t e r o t f u n g i ( d e J o n g e t a l . , 1 9 9 2 ; O r t h e t a l . , 1 9 9 3 ; H a t a k k a , 1 9 9 4 ) , d e g r a d e l i g n i n . B r o w n r o t ( K i r k e r a l . 1 9 7 5 ; H a i d e r a n d T r o j a n o w s k i , 1 9 8 0 ) a n d s o f t r o t ( H a i d e r a n d T r o j a n o w s k i , 1 9 8 0 ; K i r k , 1 9 8 4 ; K i r k a n d C o w l i n g , 1 9 8 4 ) f u n g i , a s w e l l a s s o m e b a c t e r i a ( A n t a i a n d C r a w f o r d , 1 9 8 1 ; C r a w f o r d , D . L . e t a l . , 1 9 8 2 ; M c C a r t h y a n d B r o d a , 1 9 8 4 ) h a v e a l s o b e e n S h o w n t o d e g r a d e l i g n i n a e r o b i c a l l y ( l i g n i n i s n o t d e g r a d e d t o a n y g r e a t e x t e n t a n a e r o b i c a l l y ( K i r k a n d F a r r e l l , 1 9 8 7 ) ) , b u t t h e m a j o r l i g n i n d e g r a d i n g o r g a n i s m s h a v e b e e n f o u n d t o b e t h e w h i t e r o t f u n g i ( B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) . S i n c e t h i s s t u d y w i l l f o c u s o n t h e e x t r a c e l l u l a r p e r o x i d a s e s p r o d u c e d b y a w h i t e r o t f u n g u s , o n l y w h i t e r o t f u n g i w i l l b e t r e a t e d i n d e t a i l h e r e . W h i t e r o t b a s i d i o m y c e t e s h a v e b e e n f o u n d t o d e g r a d e l i g n i n m o r e r a p i d l y a n d e x t e n s i v e l y t h a n o t h e r m i c r o b i a l g r o u p s t h a t h a v e b e e n s t u d i e d . T h e i r a p p a r e n t m o d e o f a t t a c k i s t o g r o w i n t o t h e l u m e n s o f c e l l w a l l s , w h e r e t h e y s e c r e t e e x t r a c e l l u l a r e n z y m e s , i n c l u d i n g c e l l u l a s e s , h e m i c e l l u l a s e s , a n d p e r o x i d a s e s . I t h a s b e e n s h o w n , u s i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p i c t e c h n i q u e s , t h a t l i g n i n d e g r a d a t i o n t a k e s p l a c e a t s o m e d i s t a n c e f r o m t h e h y p h a e a n d t h a t l i g n i n i s p r o g r e s s i v e l y r e m o v e d f r o m t h e l u m e n s a s d e g r a d a t i o n p r o c w d s ( B l a n c h e t t e , 1 9 8 4 ; B l a n c h e t t e a n d R e i d , 1 9 8 6 ; O t j e n a n d B l a n c h e t t e , 1 9 8 6 ; R u e l a n d B a m o u d , 1 9 8 5 ) . W h i l e t h e s e f u n g i d o n o t u t i l i z e t h e l i g n i n a s a g r o w t h s u b s t r a t e , t h e r e m o v a l o f t h e p r o t e c t i v e l i g n i n b a r r i e r o p e n s u p t h e s t r u c t u r e o f t h e c a r b o h y d r a t e m a t r i x s o t h a t n e a r c o m p l e t e d e g r a d a t i o n o f t h e l i g n o c e l l u l o s e i s p o s s i b l e ( B l a n c h e t t e e t a l . , 1 9 8 9 ) . C e l l u l o s e a n d h e m i c e l l u l o s e s e r v e a s t h e s u b s t r a t e s f o r g r o w t h a n d o t h e r 1 0 m e t a b o l i c f u n c t i o n s . L i g n i n o l y t i c e n z y m e s a r e p r o d u c e d b y t h e f u n g u s d u r i n g s e c o n d a r y m e t a b o l i s m a s a r e s u l t o f c a r b o n a n d / o r n i t r o g e n l i m i t a t i o n i n w o o d . T h e s e f a c t o r s i n d i e a t e t h a t l i g n i n d e p o l y m e r i z a t i o n i s l i k e l y t o b e a r a t e l i m i t i n g s t e p i n t h e m i n e r a l i z a t i o n ( d e g r a d a t i o n t o C 0 , ) o f l i g n o c e l l u l o s e . T h e b e s t s t u d i e d o f t h e w h i t e r o t f u n g i i s P h a n e r o c h a e t e C h r y s o s p o r i u m ( B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) . T h i s o r g a n i s m l e n d s i t s e l f w e l l t o l i g n i n b i o d e g r a d a t i o n s t u d i e s b e c a u s e o f a n u m b e r o f f a c t o r s . T h e r e i s a l r e a d y a w i d e b a s e o f k n o w l e d g e o n i t s p h y s i o l o g y , m o l e c u l a r b i o l o g y , b i o c h e m i s t r y , a n d g e n e t i c s ( B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ; R e d d y , 1 9 9 3 ; R e d d y a n d D ’ S o u z a , 1 9 9 4 ) . I t c a n b e r e p r o d u c i b l y g r o w n o n c h e m i c a l l y d e fi n e d m e d i a . T h e f u n g u s p r o d u c e s b o t h c o n i d i a ( a s e x u a l s p o r e s ) a n d b a s i d i o s p o r e s ( s e x u a l s p o r e s ) , s o c u l t u r e m a i n t e n a n c e a n d s t a b i l i t y a r e g r e a t l y s i m p l i fi e d . M o r e i m p o r t a n t l y , h o w e v e r , t h e f u n g u s g r o w s r a p i d l y i n a g i t a t e d c u l t u r e s , p r o d u c e s s u b s t a n t i a l l e v e l s o f e x t r a c e l l u l a r p e r o x i d a s e s r e l a t i v e t o p e r o x i d a s e p r o d u c t i o n b y o t h e r w h i t e r o t f u n g i , a n d r a p i d l y d e g r a d e s l i g n o c e l l u l o s e ( B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) . T h e f o l l o w i n g s e c t i o n s w i l l d e s c r i b e P . C h r y s o s p o r i u m a n d i t s l i g n i n d e g r a d i n g s y s t e m ( L D S ) . 2 . 3 T h e L i g n i n D e g r a d i n g S y s t e m o f P . c h r y s o s p o n ’ u m P . c h r y s o s p o r i w n i s k n o w n t o d e g r a d e l i g n i n e x t e n s i v e l y a n d r a p i d l y a n d h a s b e e n t h e o r g a n i s m o f c h o i c e f o r l i g n i n d e g r a d a t i o n s t u d i e s i n m o s t l a b o r a t o r i e s w o r l d w i d e . T h i s f u n g u s h a s a l s o e v o k e d w o r l d w i d e i n t e r e s t b e c a u s e o f t h e p o t e n t i a l o f i t s l i g n i n o l y t i c s y s t e m i n d e g r a d i n g a v a r i e t y o f t o x i c x e n o b i o t i c c o m p o u n d s f r o m t h e e n v i r o n m e n t s u c h a s P C B S ( B u m p u s e t a l . , 1 9 8 5 ) , b e n z o ( a ) p y r e n e s ( S a n g l a r d e t a l . , 1 9 8 6 ) , d i - a n d t r i c h l o r o p h e n o l s ( V a l l i a n d G o l d , 1 9 9 1 ; J o s h i a n d G o l d , 1 9 9 3 ) , d i o x i n s ( V a l l i e t a l . , 1 9 9 2 a ) , a n d d i n i t r o t o l u e n e ( V a l l i e t a l . , 1 9 9 2 b ) . C o n s e q u e n t l y , k n o w l e d g e i s r a p i d l y a c c u m u l a t i n g o n t h e p h y s i o l o g y , b i o c h e m i s t r y , a n d m o l e c u l a r b i o l o g y o f t h e l i g n i n - d e g r a d i n g s y s t e m o f t h i s o r g a n i s m . A l t h o u g h l i g n i n i s r a p i d l y m i n e r a l i z e d b y P . c h r y s o s p o n ’ w n , t h e l i g n i n i t s e l f i s o f l i t t l e s i g n i fi c a n c e a s a c a r b o n s o u r c e f o r t h i s 1 1 o r g a n i s m ( a s w i t h o t h e r w h i t e r o t f u n g i ) , a n d a s u i t a b l e c o s u b s t r a t e s u c h a s c e l l u l o s e , h e m i c e l l u l o s e o r g l u c o s e m u s t b e p r e s e n t f o r l i g n i n d e g r a d a t i o n t o o c c u r ( K i r k e t a l . , 1 9 7 6 ; K i r k a n d F a r r e l l , 1 9 8 7 ; B u s w e l l a n d O d i e r , 1 9 8 7 ; B u s w e l l , 1 9 9 1 ) . T h e l i g n i n o l y t i c e n z y m e s o f P . c h r y s o s p o r i u m , a s w i t h o t h e r w h i t e - r o t f u n g i , a r e p r o d u c e d d u r i n g s e c o n d a r y m e t a b o l i s m t r i g g e r e d b y l i m i t a t i o n o f n u t r i e n t s s u c h a s c a r b o n a n d / o r n i t r o g e n . P . c h r y s o s p o n ' u m p r o d u c e s t w o f a m i l i e s o f e x t r a c e l l u l a r p e r o x i d a s e s , d e s i g n a t e d l i g n i n p e r o x i d a s e s ( L I P S ) a n d m a n g a n e s e - d e p e n d e n t p e r o x i d a s e s ( M N P S ) ( K i r k a n d F a r r e l l , 1 9 8 7 ; B u s w e l l , 1 9 9 1 ) a n d s e v e r a l H 2 0 2 p r o d u c i n g e n z y m e s a s m a j o r c o m p o n e n t s o f i t s l i g n i n - d e g r a d i n g e n z y m e s y s t e m . A t l e a s t s i x L I P i s o e n z y m e s a n d 4 M N P i s o e n z y m e s h a v e b e e n d e s c r i b e d ( T i e n , 1 9 8 7 ; G o l d a t a l . , 1 9 8 9 ; D a s s a n d R e d d y , 1 9 9 0 ; B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) . A v e r a g e m o l e c u l a r w e i g h t s o f t h e t w o f a m i l i e s a r e 4 1 a n d 4 6 k D a , r e s p e c t i v e l y ( B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) . E a c h i s o e n z y m e i s a g l y c o p r o t e i n w h i c h p o s s e s s e s o n e m o l e o f i r o n p r o t o p o r p h y r i n I X p e r m o l e o f e n z y m e a n d o b l i g a t e l y r e q u i r e s H 2 0 2 f o r a c t i v i t y . M N P S , i n a d d i t i o n t o t h e s e c h a r a c t e r i s t i c s , a l s o r e q u i r e M n ( I I ) ( G o l d a t a l . , 1 9 8 9 ; B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) . T h e s e e n z y m e f a m i l i e s a r e d i s c u s s e d b e l o w . 2 . 3 . 1 L i g n i n P e r o x i d a s e s ( L I P S ) L I P S a r e g l y c o s y l a t e d h e m e p r o t e i n s ( m o l e c u l a r w e i g h t 3 8 , 0 0 0 t o 4 6 , 0 0 0 ) . T h e y a r e o b l i g a t e l y d e p e n d e n t o n H 2 0 2 f o r a c t i v i t y , a n d h a v e b e e n s h o w n t o c a t a l y z e t h e o x i d a t i v e c l e a v a g e o f B - O — 4 l i n k a g e s ( t h e m o s t a b u n d a n t l i n k a g e i n t h e l i g n i n p o l y m e r ) , C a - C , l i n k a g e s , a n d 3 - 1 l i n k a g e s i n l i g n i n s u b s t r u c t u r e m o d e l c o m p o u n d s . L I P S h a v e a l s o b e e n s h o w n t o d e p o l y m e r i z e t h e w a t e r - i n s o l u b l e s y n t h e t i c l i g n i n p o l y m e r w h e n s o l u b i l i z e d i n o r g a n i c s o l v e n t s , a n d t o c a t a l y z e d e m e t h o x y l a t i o n o f r i n g s t r u c t u r e s , p r o d u c e e t h y l e n e f r o m K T B A ( 2 - k e t o - 4 - t h i o m e t h y l b u t y r i c a c i d ) , a n d d e c o l o r i z e t h e p o l y m e r i c d y e s P o l y - R a n d R e m a z o l b l u e , w h i c h h a v e s o m e s t r u c t u r a l s i m i l a r i t i e s t o t h e l i g n i n p o l y m e r ( K i r k a n d F a r r e l l , 1 9 8 7 ; B u s w e l l , 1 9 9 1 ; T i e n a n d K i r k , 1 9 8 4 ; A n d e r s s o n 1 2 e t a l . , 1 9 8 5 ) . R e a c t i o n s t y p i c a l o f t h o s e f o u n d t o b e c a t a l y z e d b y L I P o n l i g n i n m o d e l c o m p o u n d s a r e s h o w n i n F i g u r e 2 . 3 ( B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) . L I P a c t i v i t y i s c o n v e n i e n t l y a s s a y e d b y m e a s u r i n g t h e o x i d a t i o n o f v e r a t r y l a l c o h o l ( V A ) t o v e r a t r a l d e h y d e ( T i e n a n d K i r k , 1 9 8 4 ) . V A a l s o s t i m u l a t e s L I P a c t i v i t y i n v i v a ( S h i m a d a e t a l . , 1 9 8 1 ; T i e n a n d K i r k , 1 9 8 4 ; F a i s o n e t a l . , 1 9 8 6 ; H a r v e y e t a l . , 1 9 8 6 ; H a m m e l a n d M o e n , 1 9 9 1 ; d e J o n g e t a l . , 1 9 9 4 ) . A t l e a s t s i x h e m e p r o t e i n s ( H I , H 2 , H 6 , H 7 , H 8 , a n d H 1 0 ) w i t h L I P a c t i v i t y a r e s e e n i n F a s t P r o t e i n L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y ( F P L C ) p r o fi l e s o f P . C h r y s o s p o r i u m s t r a i n B K M F - l 7 6 7 ( D a s s a n d R e d d y , 1 9 9 0 ; K i r k e r a l . , 1 9 8 6 a ; K i r k e r a l . 1 9 8 6 b ) c u l t u r e s g r o w n i n n i t r o g e n - l i m i t e d m e d i a a l t h o u g h o t h e r i n v e s t i g a t o r s h a v e r e p o r t e d o b s e r v i n g a s m a n y a s 1 5 i s o e n z y m e s ( L e i s o l a e t a l . , 1 9 8 7 ) . A t y p i c a l F P L C p r o fi l e f o r a n a c e t a t e b u f f e r e d , a g i t a t e d c u l t u r e o f P . C h r y s o s p o r i w n i s s h o w n i n F i g u r e 2 . 4 ( B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) . T h e L I P i s o e n z y m e s H 2 , H 6 , H 8 , a n d H 1 0 c o n s t i t u t e t h e m a j o r L I P S i n b o t h s t a t i c a n d a g i t a t e d c u l t u r e s o f P . c h r y s o s p o r i u m ( K i r k e t a l . , 1 9 8 6 b ; L e i s o l a e t a l . , 1 9 8 7 ; B a s s a n d R e d d y , 1 9 9 0 ) . T h e o p t i m u m p H f o r L I P a c t i v i t y i s 2 . 5 , a l t h o u g h t h e e n z y m e s a r e n o t v e r y s t a b l e a t t h i s p H ( T i e n , 1 9 8 7 ; B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) . D e t a i l e d i n v e s t i g a t i o n o f L I P i s o e n z y m e s h a s s h o w n t h a t e a c h i s o e n z y m e i s e n c o d e d b y a s e p a r a t e l i p g e n e ( B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ; G a s k e l l a n d C u l l e n , 1 9 9 3 ; R e d d y a n d D ’ S o u z a , 1 9 9 4 ) . H 1 a n d H 2 h a v e b e e n S h o w n t o b e n e a r l y i d e n t i c a l ( T i e n , 1 9 8 7 ; B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ; R e d d y a n d D ’ S o u z a , 1 9 9 4 ) . H 7 a n d H 8 w e r e s h o w n t o b e s i m i l a r t o e a c h o t h e r a n d t o H 1 a n d H 2 , b u t d i f f e r e n t i n t h a t t h e y l a c k e d a t l e a s t t w o m a j o r p e p t i d e s ( T i e n , 1 9 8 7 ; B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) . H 6 a n d H 1 0 h a v e b e e n s h o w n t o b e m o s t s i m i l a r t o H 7 a n d H 8 ( T i e n , 1 9 8 7 ; B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) . T h e v a n / K m ( p r o d u c t i v e b i n d i n g r a t e ) f o r H 2 0 2 i s e s s e n t i a l l y t h e s a m e f o r a l l t h e i s o e n z y m e s , w h i l e t h e b i n d i n g c o n s t a n t s ( K m ) v a r y m a r k e d l y . A b r o a d e r r a n g e o f l e K “ I a n d K I l l w e r e o b s e r v e d f o r t h e r e d u c i n g s u b s t r a t e s ( m e t h o x y l a t e d a r o m a t i c s a n d l i g n i n s u b s t r u c t u r e m o d e l s ) o f t h e L I P i s o e n z y m e s ( T i e n e t a l . , 1 9 8 6 ) . T h u s , t h e l 3 O C H 3 O C H 3 8 H 2 C O - l H O R o H H Z C O H é + H 0 R O C H : O C H : O C H ; O C H ; C H O C H 3 O C H 3 O C H 3 0 0 - 5 D ( 1 0 4 , ) , 6 1 0 9 : “ C H 9 ; l O C H 3 H 3 C O J Q ( ‘ 3 ‘ O C H , O H O H E 3 _ . . . . a O C H . 0 F i g u r e 2 . 3 : T y p i c a l r e a c t i o n s c a t a l y z e d b y P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o n ' w n l i g n i n p e r o x i d a s e ( B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) . t h g i e H k a e P e v i t a l e R 1 4 H 4 H 2 H 1 . . N o a 1 1 6 2 4 E l u t i o n V o l u m e ( m l ) F i g u r e 2 . 4 : T y p i c a l F P L C p r o fi l e o f t h e e x t r a c e l l u l a r p e r o x i d a s e s o f P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o n ’ w n g r o w n i n a c e t a t e b u f f e r e d , a g i t a t e d c u l t u r e ( B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) 1 5 i s o e n z y m e s a r e q u i t e S i m i l a r i n s o m e r e s p e c t s b u t a l s o s o m e w h a t d i f f e r e n t i n t h e i r p r e f e r r e d s u b s t r a t e s ( T i e n e t a l . , 1 9 8 6 ; L e i s o l a e t a l . , 1 9 8 7 ; B a s s a n d R e d d y , 1 9 9 0 ) . S t u d i e s d o n e w i t h l i g n i n s u b s t r u c t u r e m o d e l s h a v e s h o w n t h a t L I P S , o p e r a t e b y a fi e e r a d i c a l g e n e r a t i n g m e c h a n i s m ( H a m m e l e t a l . , 1 9 8 5 ; K e r s t e n e t a l . , 1 9 8 5 ; G o l d a t a l . , 1 9 8 9 ) . S t e a d y - s t a t e k i n e t i c s t u d i e s w i t h V A h a v e i n d i c a t e d a p i n g - p o n g m e c h a n i s m i n w h i c h t h e L I P h e m e i s fi r s t o x i d i z e d b y H 2 0 2 , a n d t h e o x i d i z e d h e m e t h e n r e a c t s w i t h V A t o f o r m v e r a t r a l d e h y d e ( T i e n e t a l . , 1 9 8 6 ; G o l d a t a l . , 1 9 8 9 ; H a r v e y e t a l . , 1 9 9 3 ; d e J o n g e t a l . , 1 9 9 4 ) . H 2 0 2 w a s f o u n d t o c o m p e t i t i v e l y i n h i b i t b i n d i n g o f V A t o t h e e n z y m e , a n d t o i r r e v e r s i b l y i n a c t i v a t e t h e e n z y m e a t h i g h r e l a t i v e c o n c e n t r a t i o n s ( T i e n e t a l . , 1 9 8 6 ) . S i n c e V A i s n o r m a l l y p r o d u c e d b y t h i s f u n g u s u n d e r s e c o n d a r y m e t a b o l i c c o n d i t i o n s ( S h i m a d a e t a l . , 1 9 8 1 ; F a i s o n e t a l . , 1 9 8 6 ; L i e b e s k i n d e t a l . , 1 9 9 0 ) , i t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t L I P m a y c a t a l y z e t h e o x i d a t i o n o f V A t o a c a t i o n r a d i c a l w h i c h i s t h e n f r e e t o d i f f u s e i n t o t h e l i g n i n m a t r i x a n d r e a c t w i t h o x i d i z a b l e l i g n i n b o n d s ( H a r v e y e t a l . , 1 9 8 6 ; C u i a n d D o l p h i n , 1 9 9 1 ; H a m m e l a n d M o e n , 1 9 9 1 ; H a r v e y e t a l . , 1 9 9 3 ; S c h o e m a k e r e t a l . , 1 9 9 4 ; d e J o n g e t a l . , 1 9 9 4 ) . E S R s p e c t r o s c o p y s t u d i e s ( K e r s t e n e t a l . , 1 9 8 5 ) h a v e i n d i c a t e d t h a t s o m e L I P - g e n e r a t e d f r e e r a d i c a l s a r e s t a b l e e n o u g h t o d i f f u s e a w a y f r o m t h e a c t i v e s i t e o f t h e e n z y m e ; t h i s d o e s n o t , h o w e v e r , c o m p l e t e l y r u l e o u t p h y s i c a l a c c e s s i b i l i t y o f t h e l i g n i n t o t h e e n z y m e a s a r a t e l i m i t i n g f a c t o r ( T i e n , 1 9 8 7 ; D a n i e l e t a l . , 1 9 8 9 ; B l a n c h e t t e e t a l . , 1 9 8 9 ) . P h y s i c a l a c c e s s i b i l i t y o f t h e s u b s t r a t e t o c e l l u l a s e s h a s b e e n s h o w n t o b e t h e r a t e l i m i t i n g f a c t o r i n t h e h y d r o l y s i s o f c e l l u l o s e ( T h o m p s o n e t a l . 1 9 9 2 ) ; i t i s p r o b a b l e t h a t t h i s l i m i t a t i o n a f f e c t s o t h e r e n z y m e s y s t e m s a s w e l l ( T i e n , 1 9 8 7 ) . 2 . 3 . 2 M a n g a n e s e P e r o x i d a s e s M N P S a r e a l s o g l y c o s y l a t e d h e m e p r o t e i n s ( a v e r a g e m o l e c u l a r w e i g h t 4 6 , 0 0 0 ) a n d a r e o b l i g a t e l y d e p e n d e n t o n H 2 0 2 f o r a c t i v i t y . I n a d d i t i o n , M N P S r e q u i r e M n ( I I ) f o r a c t i v i t y , a n d c a t a l y z e t h e o x i d a t i o n o f M n ( I I ) t o M n ( I I I ) w h i c h i n t u r n o x i d i z e s p h e n o l s t o p h e n o x y r a d i e a l s ( G l e n n a n d G o l d , 1 9 8 5 ; P a s z c z y n s k i e r a l . , 1 9 8 5 ; G o l d e t a l . 1 9 8 9 ; 1 6 G o l d a n d A l i c , 1 9 9 3 ) . M N P S h a v e b e e n S h o w n c a t a l y z e a n u m b e r o f o x i d a t i o n s o f a r o m a t i c c o m p o u n d s . T h e d y e s P o l y B 4 1 1 a n d P o l y R - 4 8 1 a r e d e c o l o r i z e d b y o x i d a t i o n b y M N P ( G l e n n a n d G o l d , 1 9 8 5 ) . H i g h e r m o l e c u l a r w e i g h t c h l o r o l i g n i n s a r e a l s o d e g r a d e d b y M N P S ( L a c k n e r e t a l . , 1 9 9 1 ) . M N P S h a v e b e e n s h o w n t o p a r t i a l l y d e p o l y m e r i z e s y n t h e t i c l i g n i n ( W a r i i s h i e t a l . , 1 9 9 1 ) , t o c l e a v e a - c a r b o n y l l i g n i n m o d e l d i m e r s ( T u o r e t a l . , 1 9 9 2 ) , a n d t o d e g r a d e a w i d e r a n g e o f p h e n o l i c e n v i r o n m e n t a l c o n t a m i n a n t s ( V a l l i a n d G o l d , 1 9 9 1 ; V a l l i e t a l . , 1 9 9 2 a ; V a l l i e t a l . , 1 9 9 2 b ; J o s h i a n d G o l d , 1 9 9 3 ) . I n a d d i t i o n , M N P S h a v e b e e n s h o w n t o b e t h e l i m i t i n g f a c t o r i n t h e d e c o l o r i z a t i o n o f k r a f t b l e a c h p l a n t e f fl u e n t ( B P E ) b y c o n t i n u o u s c u l t u r e s o f P . c h r y s o s p o r i u m ( M i c h e l e t a l . , 1 9 9 1 ) , a l t h o u g h F e r r e r e t a l . ( 1 9 9 1 ) f o u n d t h a t l i g n i n p e r o x i d a s e a l s o d e c o l o r i z e d k r a f t B P E i f t h e L I P w a s i m m o b i l i z e d . M N P a c t i v i t y i s a s s a y e d b y m e a s u r i n g t h e o x i d a t i o n o f P h e n o l R e d d y e ( K u w a h a r a e t a l . , 1 9 8 4 ) o r b y m e a s u r i n g t h e c o n v e r s i o n o f M n ( I I ) t o M n ( I I I ) i n t h e p r e s e n c e o f t a r t r a t e ( P a s z c z y n s k i e t a l . , 1 9 8 8 ) . A t l e a s t f o u r h e m e p r o t e i n s , H 3 , H 4 , H 5 , a n d H 9 ( s e e F i g u r e 2 . 4 ) w i t h M N P a c t i v i t y h a v e b e e n d e s c r i b e d i n n i t r o g e n - l i m i t e d a g i t a t e d o r s t a t i c c u l t u r e s o f P . c h r y s o s p o r i u m s t r a i n B K M F - l 7 6 7 ( K i r k e t a l . , 1 9 8 6 b ; G l e n n a n d G o l d , 1 9 8 5 ; P a s z c z y n s k i e t a l . , 1 9 8 5 ; K u w a h a r a e t a l . , 1 9 8 4 ) a l t h o u g h o t h e r i n v e s t i g a t o r s h a v e r e p o r t e d o b s e r v i n g a s m a n y a s 6 o r m o r e i s o e n z y m e s ( L e i s o l a e t a l . , 1 9 8 7 ) . T h e M N P i s o e n z y m e H 4 c o n s t i t u t e s t h e m a j o r M N P i n b o t h s t a t i c a n d a g i t a t e d c u l t u r e s o f P . c h r y s o s p o r i w n ( D a s s a n d R e d d y , 1 9 9 0 ) . M N P a c t i v i t y i s s t i m u l a t e d b y t h e a d d i t i o n o f a n a - h y d r o x y a c i d s u c h a s m a l o n a t e , t a r t r a t e , l a c t a t e , e t c . a s a c h e l a t o r ( G l e n n e t a l . , 1 9 8 6 ; W a r i i s h i e t a l . , 1 9 8 8 ) . I n a c e t a t e - b u f f e r e d c u l t u r e s a t 3 7 ° C , f u n g a l p r o d u c t i o n o f L I P i s s u p p r e s s e d a n d M N P p r o d u c t i o n i s e n h a n c e d b y a d d i t i o n o f 4 0 - 1 0 0 p p m M n ( I I ) ( B o n n a r m e a n d J e f f r i e s , 1 9 9 0 ; B r o w n e t a l . , 1 9 9 0 ) . S i m i l a r l y , M N P p r o d u c t i o n c a n b e e l i m i n a t e d b y t h e o m i s s i o n o f M n ( I I ) f r o m t h e m e d i u m ( B o n n a r m e a n d J e f f r i e s , 1 9 9 0 ) . T h e c a t a l y t i c c y c l e o f M N P S i s s i m i l a r t o t h a t o f L I P S , e x c e p t t h a t M n ( I I ) i s o x i d i z e d t o 1 7 M n ( I I I ) b y t h e M N P , a n d t h e M n ( I I I ) i n t u r n o x i d i z e s t h e s u b s t r a t e m o l e c u l e . A c o m p a r i s o n o f t h e c a t a l y t i c c y c l e s o f L I P a n d M N P i s s h o w n i n F i g u r e 2 . 5 . K i n e t i c s t u d i e s o n t h e o x i d a t i o n o f M n ( I I ) b y M N P a n d h y d r o g e n p e r o x i d e h a v e i n d i c a t e d t h a t t h e s t o i c h i o m e t r y i s 2 M n ( I I ) o x i d i z e d p e r H 2 0 2 c o n s u m e d , t h a t t h e c a t a l y s i s o c c u r s v i a a t y p i c a l p e r o x i d a s e p i n g - p o n g m e c h a n i s m s i m i l a r t o t h a t o f L I P , a n d t h a t a n o r g a n i c a c i d c h e l a t o r ( s u c h a s m a l o n a t e , l a c t a t e , t a r t r a t e , e t c . ) m u s t b e p r e s e n t t o s t a b i l i z e t h e M n ( I I I ) t h a t i s f o r m e d a n d t o e f fi c i e n t l y r e m o v e i t f r o m t h e a c t i v e s i t e o f t h e M N P ( W a r i i s h i e t a l . , 1 9 8 9 a ; A i t k e n a n d I r v i n e , 1 9 9 0 ; W a r i i s h i e t a l . , 1 9 9 2 ) . P e r e z a n d J e f f r i e s ( 1 9 9 2 ; 1 9 9 3 ) f o u n d t h a t b o t h M n ( I I ) a n d o r g a n i c a c i d c h e l a t o r s w e r e i m p o r t a n t i n r e g u l a t i n g n o t o n l y t h e e x p r e s s i o n o f b o t h L I P S a n d M N P S , b u t a l s o t h e i r a c t i v i t y . T h e y f o u n d t h a t i n w h o l e c u l t u r e s w h e n h i g h l e v e l s o f M n w e r e p r e s e n t a l o n g w i t h a s u i t a b l e c h e l a t o r , s o m e d e p o l y m e r i z a t i o n o f a s y n t h e t i c l i g n i n o c c u r r e d , b u t t h e b u l k o f t h e d e p o l y m e r i z a t i o n d i d n o t o c c u r u n t i l t h e M n e v e n t u a l l y p r e c i p i t a t e d o u t a s M n O 2 a n d L I P S w e r e e x p r e s s e d . I n a d d i t i o n , t h e y f o u n d t h a t l i g n i n m i n e r a l i z a t i o n w a s m o s t e f fi c i e n t a t l o w M n c o n c e n t r a t i o n s . T h i s l e d t h e m t o c o n c l u d e t h a t M N P S c a t a l y z e a n i n i t i a l m o d i fi c a t i o n o f l i g n i n , p r e p a r i n g i t f o r f u r t h e r d e g r a d a t i o n b y L I P S ( P e r e z a n d J e f f r i e s , 1 9 9 2 ; P e r e z a n d J e f f r i e s , 1 9 9 3 ) . 2 . 4 M e c h a n i s t i c S t u d i e s O f L i g n i n D e g r a d a t i o n 2 . 4 . 1 W a t e r - s o l u b l e L i g n i n S u b s t r u c t u r e M o d e l s I n v i t r o m e c h a n i s t i c s t u d i e s w i t h L I P H 8 h a v e s h o w n t h a t i n t h e p r e s e n c e o f H 2 0 2 , L I P w i l l c a t a l y z e C a - C , c l e a v a g e , o x i d a t i o n o f b e n z y l i c a l c o h o l s , B - a r y l e t h e r c l e a v a g e , l o s s o f m e t h o x y l g r o u p s , a n d a r o m a t i c r i n g o p e n i n g ( K i r k a n d F a r r e l l , 1 9 8 7 ; B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ; T i e n , 1 9 8 7 ; G o l d e t a l . , 1 9 8 9 ; T i e n e t a l . , 1 9 8 6 ; K e r s t e n e t a l . , 1 9 8 5 ; H a m m e l e t a l . , 1 9 8 5 ) . T h e m e c h a n i s m o f C a - C , c l e a v a g e o f l i g n i n m o d e l c o m p o u n d s i s s h o w n i n F i g u r e 2 . 6 ( T i e n , 1 9 8 7 ) . U s i n g l i g n i n m o d e l c o m p o u n d s , M N P S h a v e b e e n s h o w n t o e a t a l y z e , t h r o u g h t h e g e n e r a t i o n o f M n ( I I I ) , t h e c l e a v a g e o f p h e n o l i c B - l d i m e r s ( G o l d e t a l . , 1 9 8 9 ) a n d a - c a r b o n y l l i g n i n m o d e l d i m e r s ( T u o r e t a l . , 1 9 9 2 ) , ( b . ) v n n ’ . A C o F m e p 1 o 1 2 u n 8 d 0 I I M " ? A ” 1 8 H 2 0 : H 2 0 C o m p o u n d I I t . F e N = O I P 2 1 k 3 k g N A H F e m . A H C o m p o u n d I ! A . ( 8 . ) F e I I 3 0 E x c e s s H 2 0 2 H 2 0 C o m p o u n d I l l F e m 0 2 7 H 2 0 2 H 2 0 C o m p o u n d I a - F a l l ! A ” F e m = 0 1 P f l A - M a n M n l l A " E x c e s s A ' ” 2 0 2 H 2 0 C o m p o u n d I I I F e m 0 2 7 F i g u r e 2 . 5 : C o m p a r i s o n o f t h e L I P a n d M N P c a t a l y t i c c y c l e s . ( a . ) L I P c a t a l y t i c c y c l e , a n d ( b . ) M N P c a t a l y t i c c y c l e ( G o l d e t a l . , 1 9 8 9 ) . 1 9 F i g u r e 2 . 6 : T h e m e c h a n i s m o f Q C , c l e a v a g e b y L I P f o r t w o o f l i g n i n m o d e l d i m e r s : A . B - l l i n k e d d i m e r , a n d B . B - O - 4 l i n k e d d i m e r ( T i e n , 1 8 7 ) . 2 0 a l k y l - p h e n y l c l e a v a g e , a n d C a - C , c l e a v a g e ( W a r i i s h i e t a l . , 1 9 8 9 b ; W a r i i s h i e r a l . , 1 9 9 1 ) . T h e s e r e a c t i o n s a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e t y p e s o f b o n d b r e a k a g e s n e c e s s a r y t o r e l e a s e m o n o m e r s f r o m p o l y m e r i c l i g n i n ( T i e n , 1 9 8 7 ; B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ; G o l d a n d A l i c , 1 9 9 3 ) , l e a d i n g t o t h e l i g n i n d e g r a d a t i o n r o l e s a s s i g n e d t o b o t h L I P S a n d M N P S . A t p r e s e n t , t h e r e a r e a t l e a s t t w o t h e o r i e s o n t h e p u t a t i v e r o l e s o f L I P S a n d M N P S i n l i g n i n d e g r a d a t i o n . P e r e z a n d J e f f r i e s ( 1 9 9 0 ; 1 9 9 2 ; 1 9 9 3 ) , i n s t u d i e s w i t h s o l u b l e “ C - l a b e l l e d s y n t h e t i c l i g n i n s , s u g g e s t e d t h a t M N P S p e r f o r m t h e i n i t i a l s t e p s o f l i g n i n d e p o l y m e r i z a t i o n , b u t t h a t L I P S a r e n e c e s s a r y f o r f u r t h e r d e g r a d a t i o n o f t h e p o l y m e r t o l o w m o l e c u l a r w e i g h t p r o d u c t s , a n d f o r c o m p l e t e m i n e r a l i z a t i o n . B o y l e e t a l . ( 1 9 9 2 ) , h o w e v e r , i n a s t u d y w i t h “ C - l i g n i n l a b e l l e d w o o d , f o u n d e v i d e n c e t h a t L I P S p l a y e d t h e m a i n r o l e i n l i g n i n s o l u b i l i z a t i o n a n d M N P S w e r e i m p o r t a n t i n s u b s e q u e n t C O , p r o d u c t i o n . H a e m m e r l i e r a l . ( 1 9 8 6 ) d e m o n s t r a t e d t h a t a t l e a s t i n s o m e c a s e s , L I P c a t a l y z e s p o l y m e r i z a t i o n o f s o l u b i l i z e d i s o l a t e d l i g n i n f r a g m e n t s a n d n o t d e p o l y m e r i z a t i o n , a n d t h a t t h e p o l y m e r i z a t i o n w a s e n h a n c e d b y t h e a d d i t i o n o f V A . T h i s l e d t h e m t o c o n c l u d e t h a t L I P S a r e n o t d i r e c t l y i n v o l v e d i n t h e d e p o l y m e r i z a t i o n o f l i g n i n . H o w e v e r , t h e s e s t u d i e s w e r e d o n e u n d e r c o n d i t i o n s o f l o w 0 , a n d a t e x t r e m e l y l o w H 2 0 , a n d V A l e v e l s r e l a t i v e t o L I P . T h i s m a y r e s u l t i n a n a e r o b i c f r e e r a d i c a l c o u p l i n g r e a c t i o n s d u e t o b o t h t h e l o w 0 2 a n d t h e l o w e r e d l e v e l s o f c a t i o n r a d i c a l s g e n e r a t e d f r o m H 2 0 2 . S a r k a n e n e t a l . ( 1 9 9 1 ) a l s o i n d i c a t e d t h a t L I P S a r e n o t i n v o l v e d d i r e c t l y i n t h e d e p o l y m e r i z a t i o n o f l i g n i n , b u t m a y e i t h e r p l a y a r o l e i n d e t o x i fi c a t i o n o f l o w e r m o l e c u l a r w e i g h t p h e n o l i c f r a g m e n t s r e l e a s e d b y M N P S , o r m a y d i r e c t l y e n h a n c e t h e s u s c e p t i b i l i t y o f p o l y m e r i c l i g n i n t o w a r d d e p o l y m e r i z a t i o n b y a n o t h e r e n z y m e t h r o u g h t h e i n t r o d u c t i o n o f s u i t a b l e f u n c t i o n a l g r o u p s . 2 . 4 . 2 S y n t h e t i c P o l y m e r i c L i g n i n s M o s t o f t h e s t u d i e s o n d e g r a d a t i o n o f w a t e r - i n s o l u b l e n a t u r a l l y o c c u r r i n g l i g n o c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s h a v e f o c u s e d o n t o t a l C O 2 p r o d u c t i o n b y c u l t u r e s o f t h e w h o l e 2 1 o r g a n i s m ( P . c h r y s a s p a r i w n o r o t h e r w h i t e r o t f u n g i ) ( K i r k a n d F a r r e l l , 1 9 8 7 ; B u s w e l l a n d O d i e r , 1 9 8 7 ; B u s w e l l , 1 9 9 1 ; B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) . T h e r e i s a w e a l t h o f i n f o r m a t i o n o n L I P a n d M N P c a t a l y z e d r e a c t i o n s u s i n g w a t e r - s o l u b l e , l o w e r m o l e c u l a r w e i g h t l i g n i n s a n d l i g n i n s u b s t r u c t u r e m o d e l s ; h o w e v e r , v e r y l i t t l e h a s b e e n d o n e w i t h w a t e r - i n s o l u b l e p o l y m e r i c l i g n i n s u b s t r a t e s u n t i l t h e r e c e n t s t u d i e s o f H a m m e l a n d M o e n ( 1 9 9 1 ) , H a m m e l e t a l . ( 1 9 9 3 ) , a n d W a r i i s h i e t a l . ( 1 9 9 1 ) . T h e r e a s o n s b e h i n d t h i s r e l u c t a n c e t o u s e a w a t e r - i n s o l u b l e , h i g h m o l e c u l a r w e i g h t n a t u r a l l i g n i n a r e n o t t r i v i a l : ( 1 ) t h e r a t e s o f i n v i v a d e p o l y m e r i z a t i o n o f w a t e r - i n s o l u b l e l i g n i n a r e o r d e r s o f m a g n i t u d e S l o w e r t h a n r a t e s s e e n w i t h w a t e r - s o l u b l e l i g n i n s a n d m o d e l c o m p o u n d s ; ( 2 ) m a i n t e n a n c e o f a s t e a d y s u p p l y o f H 2 0 , a t l e v e l s w h i c h w i l l n o t i n a c t i v a t e t h e e n z y m e , y e t s u s t a i n t h e r e a c t i o n i s d i f fi c u l t ; a n d ( 3 ) a n a l y t i c a l t e c h n i q u e s f o r t h e r a p i d c h a r a c t e r i z a t i o n o f p a r t i a l l y d e g r a d e d s o l i d s u b s t r a t e a r e n o t r e a d i l y a c c e s s i b l e ( T i e n , 1 9 8 7 ) . H a m m e l a n d M o e n ( 1 9 9 1 ) p r e s e n t e d t h e fi r s t d i r e c t e v i d e n c e f o r t h e i n v i t r a d e p o l y m e r i z a t i o n o f s y n t h e t i c g u a i a c y l - s y r i n g y l l i g n i n . T h e y d e m o n s t r a t e d t h e p a r t i a l s o l u b i l i z a t i o n o f a “ C , - l a b e l l e d s y n t h e t i c h a r d w o o d l i g n i n p a r t i a l l y s o l u b l e i n 9 : 1 s o d i u m a c e t a t e ( p H 4 . 5 ) / N , N - d i m e t h y l f o r m a m i d e , i n t h e p r e s e n c e o f L I P , H 2 0 2 , a n d V A . L I P a n d H 2 0 2 w e r e c o n t i n u o u s l y a d d e d s l o w l y t o a s t i r r e d d i s p e r s i o n o f l i g n i n i n t h e p r e s e n c e o f V A ( b y m e a n s o f a p e r i s t a l t i c p u m p ) . P r o d u c t s w i t h m o l e c u l a r w e i g h t s a s l o w a s 1 7 0 w e r e d e t e c t e d a n d 2 5 - 3 0 % o f t h e r a d i o l a b e l o r i g i n a l l y p r e s e n t w a s c o n v e r t e d t o v o l a t i l e p r o d u c t s . I n e x p e r i m e n t s w h e r e L I P o r H 2 0 2 w e r e o m i t t e d , n o e v i d e n c e o f d e p o l y m e r i z a t i o n w a s f o u n d . M o r e o v e r , l i t t l e d i s c e r n i b l e l i g n i n d e p o l y m e r i z a t i o n w a s o b s e r v e d i n r e a c t i o n s l a c k i n g V A . S i n c e t h e m a j o r i t y o f i n t e r m o n o m e r l i n k a g e s i n l i g n i n o c c u r t h r o u g h C , o f t h e p r o p y l s i d e c h a i n ( A d l e r , 1 9 7 7 ; A n d e r a n d E r i k s s o n , 1 9 7 8 ; H i g u c h i , 1 9 9 0 ) , t h e e x t e n s i v e v o l a t i l i z a t i o n o f “ C f r o m a l ‘ C , , - l a b e l l e d l i g n i n c a n o n l y o c c u r i f t h e s i d e c h a i n i s b r o k e n ( H a m m e l a n d M o e n , 1 9 9 1 ) . T h u s , t h e s e r e s u l t s c l e a r l y i n d i e a t e t h e p e r o x i d a t i v e a l k y l s i d e - c h a i n c l e a v a g e o f t h e s y n t h e t i c l i g n i n i n t h e p r e s e n c e o f L I P , H 2 0 2 , a n d V A . 2 2 H a m m e l e t a l . ( 1 9 9 3 ) , i n f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n s u s i n g t h e s y s t e m d e s c r i b e d a b o v e , a g a i n f o u n d t h a t L I P d e p o l y m e r i z e d s y n t h e t i c l i g n i n s , b u t o n l y i f t h e l i g n i n w a s d i s p e r s e d i n a n o r g a n i c s o l v e n t . V e r a t r y l a l c o h o l w a s a l s o r e q u i r e d ; l i g n i n o l y s i s w a s m o s t e f f e c t i v e w h e n V A w a s a d d e d a t 3 7 5 p m o l e s / l i t e r o f r e a c t i o n , w i t h H 2 0 2 p r e s e n t i n l i m i t i n g a m o u n t s . I n c r e a s e s o f V A a b o v e t h i s a m o u n t g a v e l i t t l e c h a n g e i n t h e e x t e n t o f l i g n i n d e p o l y m e r i z a t i o n . L I P w a s f o u n d t o d e g r a d e h i g h l y m e t h y l a t e d ( d e r i v a t i z e d ) p h e n o l i c l i g n i n a s w e l l a s p h e n o l i c l i g n i n , b u t M N P w a s o n l y e f f e c t i v e w i t h p h e n o l i c l i g n i n . C o n c l u s i o n s f r o m t h i s s t u d y w e r e : ( 1 . ) o r g a n i c c o s o l v e n t s a r e p r e f e r r e d f o r i n v i t r a l i g n i n d e p o l y m e r i z a t i o n s t u d i e s ; ( 2 . ) H 2 0 2 s h o u l d b e p r e s e n t a s l i m i t i n g s u b s t r a t e , a n d p r e f e r a b l y a t c o n c e n t r a t i o n s l e s s t h a n 1 0 0 1 1 M ; ( 3 . ) V A i s r e q u i r e d f o r p r o t e c t i o n o f t h e L I P f r o m H z o z - m e d i a t e d i n a c t i v a t i o n , a n d a l s o a s a o n e - e l e c t r o n r e d o x S h u t t l e t o p r o m o t e L I P c a t a l y z e d o x i d a t i o n s ; ( 4 . ) l i g n i n c o n c e n t r a t i o n s s h o u l d b e l o w ; a n d ( 5 . ) O , i s a b s o l u t e l y r e q u i r e d t o p r e v e n t f r e e r a d i c a l c o u p l i n g r e a c t i o n s , w h i c h l e a d t o p o l y m e r i z a t i o n r a t h e r t h a n d e p o l y m e r i z a t i o n . O l s e n e t a l . ( 1 9 9 1 ) , i n a r e c e n t E u r o p e a n P a t e n t A p p l i c a t i o n , d e s c r i b e d a p r o c e s s i n w h i c h w a t e r - i n s o l u b l e p a p e r p u l p i s t r e a t e d i n v i t r a w i t h m i x t u r e s o f L I P S , M N P S , a n d x y l a n a s e s i n t h e p r e s e n c e o f H 2 0 2 , V A , M n ( I I ) , l a c t a t e , a n d 0 , . M e a s u r e m e n t s o f p u l p b r i g h t n e s s a n d K a p p a n u m b e r f o r t h e t r e a t e d m a t e r i a l v e r s u s c o n t r o l s ( i n w h i c h n o e n z y m e s w e r e a d d e d ) i n d i c a t e d t h a t e x t e n s i v e d e l i g n i fi c a t i o n h a d o c c u r r e d . T h i s i s t h e fi r s t d i r e c t e v i d e n c e o f i n v i t r a d e l i g n i fi c a t i o n o f a w a t e r - i n s o l u b l e p o l y m e r i c l i g n i n f r o m a n a t u r a l s o u r c e ( a s o p p o s e d t o s y n t h e t i c l i g n i n ) , a l t h o u g h d u r i n g t h e p u l p i n g p r o c e s s i t i s l i k e l y t h a t t h e l i g n i n i n t h e p u l p w a s m o d i fi e d e n o u g h t h a t i t n o l o n g e r c l o s e l y r e s e m b l e d l i g n i n a s i t o c c u r s u n d i s t u r b e d i n w o o d . I n t h i s s t u d y , H 2 0 2 w a s g e n e r a t e d i n t h e r e a c t i o n v e s s e l b y g l u c o s e o x i d a s e , w h i l e V A w a s a d d e d i n t e r m i t t e n t l y . R a n g e s o f e n z y m a t i c a c t i v i t i e s a n d r e a g e n t c o n c e n t r a t i o n s t o a c h i e v e m a x i m u m d e l i g n i fi c a t i o n w e r e p r e s e n t e d i n t h e p r e f e r r e d e m b o d i m e n t o f t h e p a t e n t . T h e s e r a n g e s a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 4 . 2 ( C h a p t e r I V ) r a t h e r t h a n h e r e , s i n c e t h e y w e r e u s e d i n t h e d e s i g n o f 2 3 e x p e r i m e n t s f o r t h i s S t u d y . W a r i i s h i e t a l . ( 1 9 9 1 ) r e c e n t l y d e m o n s t r a t e d t h a t a p u r i fi e d M N P a l s o c a t a l y z e s t h e d e p o l y m e r i z a t i o n o f “ C - l a b e l l e d s y n t h e t i c g u a i a c y l a s w e l l a s g u a i a c y l - s y r i n g y l l i g n i n s i n 3 % D M F i n w a t e r . R e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t u n d e r a n a t m o s p h e r e o f 1 0 0 % O , a t 3 7 ° C , p H 4 . 5 , 2 0 0 p M M n ( I I ) , a n d w i t h a n H 2 0 2 g e n e r a t i n g s y s t e m c o n s i s t i n g o f 2 . 5 m M g l u c o s e a n d 0 . 0 2 5 U n i t s o f g l u c o s e o x i d a s e . G e l p e r m e a t i o n p r o fi l e s s h o w e d s i g n i fi c a n t d e p o l y m e r i z a t i o n o f t h e v a r i o u s s y n t h e t i c l i g n i n s , i n d i c a t i n g i n v o l v e m e n t o f M N P S i n l i g n i n d e p o l y m e r i z a t i o n . T h e m a j o r p r o d u c t r e l e a s e d f r o m t h e s y r i n g y l l i g n i n w a s i d e n t i fi e d a s 3 , 5 - d i m e t h o x y - l , 4 - b e n z o q u i n o n e , w i t h m u c h s m a l l e r a m o u n t s o f 3 , 5 - d i m e t h o x y - l , 4 — d i h y d r o x y b e n z e n e a n d s y r i n g a l d e h y d e . T u o r e t a l . ( 1 9 9 2 ) a l s o i d e n t i fi e d t h e q u i n o n e a n d h y d r o q u i n o n e s t r u c t u r e s a b o v e i n a s t u d y o f t h e o x i d a t i o n o f p h e n o l i c a r y l g l y c e r o l B - a r y l e t h e r l i g n i n m o d e l c o m p o u n d s ; a g a i n , t h e q u i n o n e w a s p r e s e n t i n m u c h h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s t h a n t h e h y d r o q u i n o n e f o r m . I t w a s f o u n d t h a t i n t h e p r e s e n c e o f O , o r M n ( I I I ) , t h e h y d r o q u i n o n e f o r m w a s s p o n t a n e o u s l y o x i d i z e d t o t h e q u i n o n e f o r m , a c c o u n t i n g f o r t h e l o w c o n c e n t r a t i o n s o f t h e h y d r o q u i n o n e ( M . H . G o l d , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . B a s e d o n t h e s e s t u d i e s , p a t h w a y s f o r C a - C , c l e a v a g e , C , - o x i d a t i o n , a n d a l k y l - p h e n y l c l e a v a g e o f l i g n i n b y M N P w e r e p r o p o s e d ; t h e s e p a t h w a y s a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e s 2 . 7 a n d 2 . 8 . T h e y c o n c l u d e d t h a t M N P o x i d i z e d C a — o x o - s u b s t i t u t e d s u b s t r u c t u r e s a s w e l l a s C a - C , s u b s t r u c t u r e s , l e a d i n g t o t h e d e p o l y m e r i z a t i o n o f l i g n i n . ' 2 . 5 T e c h n i q u e s f o r C h a r a c t e r i z a t i o n o f L i g n i n L i g n i n c h e m i s t r y i s a c o m p l e x , i l l - d e fi n e d fi e l d d u e t o t h e h e t e r o g e n e o u s a r o m a t i c s t r u c t u r e o f l i g n i n ( S a r k a n e n a n d L u d w i g , 1 9 7 1 ) . M o s t e a r l y t e c h n i q u e s f o r l i g n i n c h a r a c t e r i z a t i o n r e l i e d o n o x i d a t i v e d e g r a d a t i o n o f t h e l i g n i n o r a c i d h y d r o l y s i s o f t h e a l i p h a t i c s i d e c h a i n s i n l i g n i n , f o l l o w e d b y c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e a r o m a t i c p r o d u c t s r e l e a s e d , a n d f o r m u l a t i o n o f p r o b a b l e i n t e r m o n o m e r l i n k a g e s b a s e d o n t h e f u n c t i o n a l g r o u p s a n d s i d e c h a i n s p r e s e n t i n t h e p r o d u c t s ( S a r k a n e n a n d L u d w i g , 1 9 7 1 ) . M o r e 2 4 F i g u r e 2 . 7 : T h e m e c h a n i s m o f a l k y l - p h e n y l c l e a v a g e o f a l i g n i n - m o d e l d i m e r b y M N P a n d C a - o x i d a t i o n . S o l i d " 0 " r e f e r s t o o x y g e n a t o m d e r i v e d f r o m I “ O i n l a b e l l e d w a t e r ( T u o r e t a l . , 1 9 9 2 ) . P 1 « w E 3 r “ - : . “ ? ” K “ [ 7 g m & 1 a n ] g / 1 [ % m ] l 2 5 l e e - 5 : 1 F i g u r e 2 . : 8 T h e m e c h a n i s o m o f C - , C c c v e l e a a g o a f l i n g i n e i e r m o d l d m r u b y M N P C I ‘ o r e t a l . , 1 9 9 2 ) . 2 6 r e c e n t d e v e l o p m e n t s , s u c h a s F o u r i e r T r a n s f o r m I n f r a r e d S p e c t r o s c o p y ( F T I R ) h a v e a l l o w e d n o n d e g r a d a t i v e c h a r a c t e r i z a t i o n o f l i g n i n , a l t h o u g h i n t e r p r e t a t i o n o f t h e S p e c t r a i n t e r m s o f t h e a c t u a l l i g n i n s t r u c t u r e a r e d i f fi c u l t . P y r o l y s i s - G a s C h r o m a t o g r a p h y / M a s s S p e c t r o m e t r y ( P y r o l y s i s - G C / M S ) , a l t h o u g h s t i l l a d e g r a d a t i v e t e c h n i q u e , h a s g a i n e d i n p o p u l a r i t y i n r e c e n t y e a r s d u e t o i t s n o n o x i d a t i v e m e t h o d o f d e p o l y m e r i z a t i o n , y i e l d i n g l i g n i n - d e r i v e d p r o d u c t s t h a t a r e n o t s i g n i fi c a n t l y m o r e o x i d i z e d t h a n t h e y o c c u r i n t h e p o l y m e r i c l i g n i n . F i n a l l y , 1 3 C N u c l e a r M a g n e t i c R e s o n a n c e ( N M R ) o f b o t h s o l u b i l i z e d a n d s o l i d l i g n i n s h a s p r o v e n t o b e a u s e f u l t e c h n i q u e i n c h a r a c t e r i z i n g t h e s t r u c t u r e a n d i n t e r m o n o m e r l i n k a g e s i n l i g n i n . T h e s e t e c h n i q u e s w i l l b e b r i e fl y r e v i e w e d b e l o w . 2 . 5 . 1 C h e m i c a l T e c h n i q u e s T h e t h r e e m a j o r d e g r a d a t i v e c h e m i c a l t e c h n i q u e s f o r l i g n i n c h a r a c t e r i z a t i o n a r e p o t a s s i u m p e r m a n g a n a t e o x i d a t i o n ( S a r k a n e n a n d L u d w i g , 1 9 7 1 ; T a n a h a s h i a n d H i g u c h i , 1 9 8 8 ; G e l l e r s t e d t , 1 9 9 2 ) , n i t r o b e n z e n e o x i d a t i o n ( S a r k a n e n a n d L u d w i g , 1 9 7 1 ; T a n a h a s h i a n d H i g u c h i , 1 9 8 8 ) , a n d t h i o a c i d o l y s i s ( O b s t , 1 9 8 2 ; T a n a h a s h i a n d H i g u c h i , 1 9 8 8 ; R o l a n d o e t a l . , 1 9 9 2 ) . E a c h t e c h n i q u e r e l e a s e s l i g n i n m o n o m e r s b y d i f f e r e n t m e c h a n i s m s , r e s u l t i n g i n d i f f e r e n t f u n c t i o n a l g r o u p c h a n g e s , w h i c h a r e u s e d t o p r e d i c t t h e o r i g i n a l l i n k a g e t y p e s i n t h e l i g n i n . D e t a i l e d d e s c r i p t i o n s o f p r o c e d u r e s f o r t h e s e t e c h n i q u e s a n d S p e c i fi c r e s u l t s f r o m s t u d i e s u s i n g t h e m a r e b e y o n d t h e s c o p e o f t h i s r e v i e w ; r a t h e r , o n l y t h e g e n e r a l i n f o r m a t i o n w h i c h c a n b e g a i n e d f r o m e a c h t e c h n i q u e a n d t h e a d v a n t a g e s a n d d i s a d v a n t a g e s o f e a c h w i l l b e g i v e n . P o t a s s i u m p e r m a n g a n a t e o x i d a t i o n h a s b e e n u s e d f o r q u i t e a n u m b e r o f y e a r s i n t h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f l i g n i n s a m p l e s ; t h e i n i t i a l p u b l i c a t i o n d e s c r i b i n g t h e p r o c e d u r e w a s p u b l i s h e d i n 1 9 3 6 ( F r e u d e n b u r g e t a l . , 1 9 3 6 ) . T h i s t e c h n i q u e i n v o l v e s t h e s e l e c t i v e d e g r a d a t i o n o f a l l a l i p h a t i c s i d e c h a i n s d i r e c t l y a t t a c h e d t o a r o m a t i c r i n g s i n l i g n i n w i t h p o t a s s i u m p e r m a n g a n a t e , r e s u l t i n g i n a m i x t u r e o f a r o m a t i c s y r i n g y l - a n d g u a i a c y l - d e r i v e d c a r b o x y l i c a c i d s . T h e a m o u n t s a n d i d e n t i t i e s o f e a c h a c i d , u s u a l l y d e t e r m i n e d b y H P L C o r G C / M S , p r o v i d e i n f o r m a t i o n a s t o t h e f r e q u e n c y o f o c c u r r e n c e o f e a c h 2 7 a r o m a t i c r i n g s u b s t i t u t i o n p a t t e r n a n d t h e a m o u n t s o f d i f f e r e n t t y p e s o f i n t e r m o n o m e r l i n k a g e s ( G e l l e r s t e d t , 1 9 9 2 ) . T h e b i g g e s t d r a w b a c k o f p e r m a n g a n a t e o x i d a t i o n i s t h a t l i g n i n m o n o m e r s w h i c h d o n o t c o n t a i n f r e e p h e n o l i c h y d r o x y l g r o u p s c a n n o t b e a n a l y z e d b y t h i s m e t h o d , s o t h e i n f o r m a t i o n g a i n e d r e p r e s e n t s o n l y a s m a l l f r a c t i o n o f t h e t o t a l l i g n i n s t r u c t u r e s . S a m p l e s i z e i s p r e f e r e n t i a l l y o n t h e o r d e r o f 1 0 - 1 0 0 m g c a l c u l a t e d a s l i g n i n ( G e l l e r s t e d t , 1 9 9 2 ) ; t h e r e f o r e , i f q u a n t i t a t i v e r e p l i c a t e a n a l y s e s a r e r e q u i r e d , r e l a t i v e l y l a r g e l i g n i n s a m p l e s ( u p t o 3 0 0 m g c a l c u l a t e d a s l i g n i n ) a r e n e e d e d . N i t r o b e n z e n e o x i d a t i o n , fi r s t r e p o r t e d b y F r e u d e n b e r g e t a l . ( 1 9 4 0 ) r e l e a s e s a r o m a t i c a l d e h y d e s a n d c a r b o x y l i c a c i d s f r o m l i g n i n . H i g h y i e l d s o f v a n i l l i n , a n d v a n i l l i n a n d s y r i n g a l d e h y d e a r e o b t a i n e d f r o m g y m n o s p e r m a n d a n g i o s p e r m l i g n i n s , r e s p e c t i v e l y ( T a n a h a s h i a n d H i g u c h i , 1 9 8 8 ) . I n a d d i t i o n , l a r g e a m o u n t s o f p - h y d r o x y b e n z a l d e h y d e a r e o b t a i n e d f r o m g r a s s l i g n i n . T h e d e t e r m i n a t i o n o f e a c h a l d e h y d e p r e s e n t , u s u a l l y b y G C / M S , i n t h e o x i d a t i o n m i x t u r e p r o v i d e s i n f o r m a t i o n t h a t i s u s e f u l i n t h e c h e m i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e l i g n i n . C a r b o x y l i c a c i d s p r o d u c e d f r o m t h e c o r r e s p o n d i n g a l d e h y d e s b y t h e C a n n i z a r o r e a c t i o n ( T a n a h a s h i a n d H i g u c h i , 1 9 8 8 ) d e c r e a s e t h e y i e l d s o f t h e a l d e h y d e s , a n d s h o u l d b e i n c l u d e d i n t h e a l d e h y d e t o t a l s . T h i s m e t h o d h a s b e e n o n e o f t h e m o s t u s e f u l i n p r o v i d i n g i n f o r m a t i o n f o r t h e p h y l o g e n e t i c a n d t a x o n o m i c c l a s s i fi c a t i o n o f w o o d y p l a n t s . S a m p l e s i z e s o f 6 0 m g o f w o o d m e a l o r 1 5 m g o f l i g n i n ( b o t h e x t r a c t i v e - f r e e ) a r e n e c e s s a r y f o r g o o d q u a n t i t a t i v e r e s u l t s . T h i o a c i d o l y s i s i s b u t o n e o f a n u m b e r o f h y d r o l y s i s t e c h n i q u e s , i n c l u d i n g e t h a n o l y s i s , a c i d o l y s i s , t h i o a c i d o l y s i s , a n d t h i o a c e t o l y s i s , c o m m o n l y u s e d f o r t h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f l i g n i n ( T a n a h a s h i a n d H i g u c h i , 1 9 8 8 ) . T h e s e t e c h n i q u e s c l e a v e t h e a l k y l - a r y l e t h e r l i n k a g e s ( t h e m o s t c o m m o n i n t e r r n o n o m e r i c b o n d s i n l i g n i n ) t o f o r m s y r i n g y l — a n d g u a i a c y l - d e r i v e d l i g n i n m o n o m e r s w h i c h c a n b e q u a n t i fi e d a n d u s e d t o d e t e r m i n e , a m o n g o t h e r t h i n g s , t h e s y r i n g y l a n d g u a i a c y l c o n t e n t s o f t h e l i g n i n ( O b s t , 1 9 8 2 ; T a n a h a s h i a n d H i g u c h i , 1 9 8 8 ; R o l a n d o e t a l . , 1 9 9 2 ) . A c i d o l y s i s a n d t h i o a c i d o l y s i s a r e u s e d t o d e t e r m i n e a r y l g l y c e r o l - B - a r y l e t h e r l i n k a g e s i n l i g n i n ( T a n a h a s h i a n d H i g u c h i , 2 8 1 9 8 8 ) t h r o u g h c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e y - m e t h y l i s o m e r s o f B — o x y - p — c o u m a r y l a l c o h o l d e r i v a t i v e s r e l e a s e d f r o m t h e l i g n i n . C o m p a r e d t o a c i d o l y s i s , t h i o a c i d o l y s i s g i v e s g r e a t e r y i e l d s o f l e s s c o m p l e x m o n o m e r s , e s p e c i a l l y f r o m h a r d w o o d s , w h i c h m a k e s t h e r e s u l t i n g m o n o m e r i c c o m p o s i t i o n o f h y d r o l y z a b l e s t r u c t u r e s i n t h e l i g n i n m o r e r e l i a b l e . R e l a t i v e l y l i t t l e ( 2 0 m g ) o f s a m p l e i s n w d e d f o r e i t h e r t e c h n i q u e ( O b s t , 1 9 8 2 ; T a n a h a s h i a n d H i g u c h i , 1 9 8 8 ; R o l a n d o e t a l . , 1 9 9 2 ) , b u t c o m p l e t e c h e m i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e l i g n i n i s n o t p o s s i b l e b y t h i s t e c h n i q u e ( o r b y a n y o f t h e t e c h n i q u e s a b o v e ) ; r a t h e r , i n f o r m a t i o n f r o m t h i s a n d a l l o f t h e a b o v e t e c h n i q u e s i s n e c e s s a r y f o r c o m p l e t e c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e l i g n i n . T h e b i g g e s t d r a w b a c k t o c h e m i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f l i g n i n t h r o u g h t h e u s e o f t h e s e d e g r a d a t i v e t e c h n i q u e s , t h e n , i s t h a t a l a r g e a m o u n t ( 4 0 0 m g o r m o r e ) o f s a m p l e w o u l d b e n w d e d t o g e t c o m p l e t e , r e l i a b l e r e s u l t s . 2 . 5 . 2 P y r o l y s i s - G C I M S P y r o l y s i s - G C / M S , w i t h t h e a d v a n c e s i n G C / M S a n a l y s i s i n r e c e n t y e a r s , h a s g a i n e d i n p o p u l a r i t y b e c a u s e i t y i e l d s l i g n i n - d e r i v e d p r o d u c t s t h a t a r e n o t s i g n i fi c a n t l y m o r e o x i d i z e d t h a n t h e y o c c u r i n t h e p o l y m e r i c l i g n i n . W i t h i n t h e l a s t 1 5 y e a r s , a w e a l t h o f i n f o r m a t i o n o n l i g n i n m o n o m e r i c p r o d u c t s h a s b e e n g e n e r a t e d u s i n g p y r o l y s i s c o m b i n e d w i t h e l e c t r o n - i m p a c t G C / M S ( M a r t i n e t a l . , 1 9 7 9 ; P h i l p e t a l . , 1 9 8 2 ; F u l l e r t o n a n d F r a n i c h , 1 9 8 3 ; S a i z - J i m e n e z a n d d e L e e u w , 1 9 8 4 ; F a i x e t a l . , 1 9 8 7 ; P o u w e l s a n d B o o n , 1 9 8 7 ; B o o n e t a l . , 1 9 8 7 ; G e n u i t e t a l . , 1 9 8 7 ; F a i x e t a l . , 1 9 8 8 ; S j o s t r o m a n d R e u n a n e n , 1 9 9 0 ; F a i x e t a l . , 1 9 9 0 a ; F a i x e t a l . , 1 9 9 0 b ; v a n d e r H a g e e t a l . , 1 9 9 3 ) . S i n c e t h e s t r u c t u r e o f l i g n i n i s s o c o m p l i c a t e d , m a n y d i f f e r e n t d e g r a d a t i o n p r o d u c t s a r e p o s s i b l e u s i n g a n y d e g r a d a t i v e t e c h n i q u e . T h e m a s s S p e c t r a o f t h e l i g n i n - d e r i v e d p r o d u c t s f o u n d i n t h e s e s t u d i e s s h o u l d b e u s e f u l i n i d e n t i f y i n g o x i d a t i v e l i g n i n d e g r a d a t i o n p r o d u c t s , s i n c e t h e m o r e s t a b l e m o l e c u l a r f r a g m e n t s ( c o n t a i n i n g t h e a r o m a t i c m o i e t y a n d s u b s t i t u e n t s a t t a c h e d d i r e c t l y t o t h e r i n g ) p r o d u c e d b y e l e c t r o n i m p a c t m a s s s p e c t r o m e t r y S h o u l d b e s i m i l a r w h e t h e r t h e a l i p h a t i c s i d e c h a i n s a r e o x i d i z e d o r n o t . T h e m o s t c o m p l e t e s t u d i e s o n p y r o l y s i s - G C / M S o f l i g n i n s h a v e b e e n d o n e b y F a i x a n d c o - 2 9 w o r k e r s ( 1 9 8 7 ; 1 9 8 8 ; 1 9 9 0 a ; 1 9 9 0 b ; G e n u i t e t a l . , 1 9 8 7 ) , i n w h i c h t h e y d e t e r m i n e d t h e m a s s s p e c t r a o f h u n d r e d s o f p r e v i o u s l y u n m e a s u r e d c o m p o u n d s d e r i v e d f r o m l i g n i n , i n c l u d i n g s u b s t i t u t e d g u a i a c y l a n d s y r i n g y l a l c o h o l s , a l d e h y d e s , a n d k e t o n e s ; c a t e c h o l s , a l i p h a t i c - s u b s t i t u t e d p h e n o l s , a n d m a n y o t h e r s . I t w a s f o u n d i n t h e s e s t u d i e s t h a t t h e r e a r e k e y m a s s f r a g m e n t s t h a t c a n b e a s s i g n e d t o c e r t a i n l i g n i n - r e l a t e d s t r u c t u r e s : m / z 1 0 7 i s t y p i c a l f o r a l k y l a t e d p h e n o l s , m / z 1 3 7 a n d 1 6 7 a r e k e y f r a g m e n t s f o r a l k y l a t e d g u a i a c y l - a n d s y r i n g y l - s t r u c t u r e s , r e s p e c t i v e l y , a n d m / z 1 5 1 a n d 1 8 1 , i n g e n e r a l , i n d i e a t e a c a r b o n y l - g r o u p a t t h e a — c a r b o n o f t h e p r o p y l s i d e c h a i n i n g u a i a c y l - a n d s y r i n g y l - s t r u c t u r e s , r e s p e c t i v e l y ( F a i x e t a l . , 1 9 9 0 a ; F a i x e t a l . , 1 9 9 0 b ) . T h e m a s s e s o f t h e s e f r a g m e n t s c h a n g e w i t h d e g r e e o f s u b s t i t u t i o n b e y o n d t h e b a s e s y r i n g y l a n d g u a i a c y l s t r u c t u r e s ( F a i x e t a l . , 1 9 9 0 b ) . A s l i t t l e a s 1 0 0 p g o f l i g n i n c a n b e u s e d f o r p y r o l y s i s - G C / M S ( F a i x e t a l . , 1 9 9 0 a ) . O n e d i s a d v a n t a g e o f u s i n g p y r o l y s i s - G C / M S f o r r o u t i n e l i g n i n a n a l y s i s i s t h a t i t r e q u i r e s v e r y e x p e n s i v e e q u i p m e n t w h i c h i s d e d i c a t e d s o l e l y t o t h a t t a s k , m a k i n g i t u n a v a i l a b l e t o m o s t r e s e a r c h e r s . I n a d d i t i o n , t h e m a s s s p e c t r a o b t a i n e d f r o m p y r o l y s i s - G C / M S m a y b e o f l i m i t e d u s e t o s o m e l i g n i n d e g r a d a t i o n s t u d i e s ; s i n c e d e r i v a t i z a t i o n o f t h e v o l a t i l e p r o d u c t s i s n o t p o s s i b l e , m a t c h i n g o f s p e c t r a o b t a i n e d i s t h e n l i m i t e d t o n o n d e r i v a t i z a b l e p r o d u c t s . 2 . 5 . 3 u C N M R o f S o l u b i l i z e d a n d S o l i d L i g n i n 1 3 C N M R h a s b e e n u s e d e x t e n s i v e l y t o c h a r a c t e r i z e l i g n i n s t r u c t u r e , w i t h b o t h a c e t y l a t e d a n d o t h e r s o l u b i l i z e d l i g n i n s , a n d w i t h t h e d e v e l o p m e n t o f c r o s s - p o l a r i z a t i o n m a g i c a n g l e s p i n n i n g ( C P M A S o r C P / M A S ; Y a n n o n i , 1 9 8 2 ) , s o l i d l i g n i n s . E a c h c a s e w i l l b e b r i e fl y d e s c r i b e d b e l o w . L i q u i d - s t a t e l 3 C N M R h a s b e e n u s e d b o t h q u a l i t a t i v e l y a n d q u a n t i t a t i v e l y t o c h a r a c t e r i z e s o l u b i l i z e d l i g n i n s . Q u a l i t a t i v e l i q u i d 1 3 C N M R h a s b e e n s u c c e s s f u l l y u s e d t o d i f f e r e n t i a t e b e t w e e n l i g n i n s f r o m h a r d w o o d s a n d s o f t w o o d s ( N i m z e t a l . , 1 9 8 1 ) , t o i d e n t i f y d e g r a d a t i o n p r o d u c t s o f l i g n i n d e g r a d e d i n v i v a b y P h a n e r o c h a e t e c h r y s a s p a r i u m ( C h u a e t a l . , 1 9 8 2 ; C h e n e t a l . , 1 9 8 2 ) , t o c o m p a r e t h e i m p o r t a n c e o f s y r i n g y l a n d 3 O g u a i a c y l u n i t s i n P o p l a r l i g n i n ( L a p i e r r e e r a l . , 1 9 8 2 ; L a p i e r r e a n d M o n t i e s , 1 9 8 4 ) , t o s t u d y t h e s t r u c t u r e o f K r a f t l i g n i n s ( K r i n g s t a d a n d M e r c k , 1 9 8 3 ; M o r c k e t a l . , 1 9 8 6 ) , a n d t o c o m p a r e t h e s t r u c t u r e o f a s y n t h e t i c l i g n i n t o a m i l l e d w o o d l i g n i n i s o l a t e d f r o m s p r u c e w o o d ( E v l i y a , 1 9 8 9 ) . Q u a n t i t a t i v e l y ( q u a n t i fi e d b y i n t e g r a t i o n o f t h e p e a k s i n t h e N M R s p e c t r u m ) , i t h a s b e e n u s e d t o d e t e r m i n e h a r d w o o d s y r i n g y l t o g u a i a c y l r a t i o s ( O b s t a n d R a l p h , 1 9 8 3 ) , m e t h o x y l t o a r y l r a t i o s ( O b s t a n d L a n d u c c i , 1 9 8 6 ) i n h a r d w o o d s , t o e s t i m a t e t o t a l h y d r o x y l c o n t e n t i n m i l l e d w o o d l i g n i n f r o m s p r u c e a n d i n a s y n t h e t i c l i g n i n ( R o b e r t a n d B r u n o w , 1 9 8 4 ) , a n d t o q u a n t i f y C a - C , b o n d s p r e s e n t i n s p r u c e w o o d d e c a y e d b y P h a n e r o c h a e t e C h r y s a s p a r i u m ( R o b e r t a n d C h e n , 1 9 8 9 ) . C l e a r l y , L i q u i d - S t a t e 1 3 C N M R i s a p o w e r f u l t o o l f o r t h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f l i g n i n s t h a t c a n b e s o l u b i l i z e d . T h e m a i n d r a w b a c k t o u s i n g L i q u i d - S t a t e ” C N M R i s t h a t i t h a s a ' v e r y l o w s e n s i t i v i t y , w h i c h m a k e s n e c e s s a r y t h e u s e o f l a r g e a m o u n t s o f l i g n i n i n o r d e r t o g e t r e l a t i v e l y c o n c e n t r a t e d s a m p l e s , a n d a l o n g d u r a t i o n o f a n a l y s i s ( i n t h e i n s t r u m e n t ) i s r e q u i r e d i n o r d e r t o g e t c l e a r p e a k s f o r m i n o r , b u t i m p o r t a n t s t r u c t u r e s ( L a p i e r r e a n d M o n t i e s , 1 9 8 4 ) . I n a d d i t i o n , o n l y l i g n i n s a m p l e s t h a t a r e o f l o w e n o u g h m o l e c u l a r w e i g h t t o b e s o l u b i l i z e d c a n b e a n a l y z e d w i t h t h i s t e c h n i q u e . S o l i d - S t a t e 1 3 C N M R u t i l i z i n g C P / M A S h a s b e e n u s e d i n s e v e r a l s t r u c t u r a l s t u d i e s o f s o l i d l i g n i n i s o l a t e d f r o m S p r u c e w o o d ( F l e m i n g a n d B o l k e r , 1 9 8 0 ; B a r t u s k a e t a l . , 1 9 8 0 ) , i n t a c t l o d g e p o l e p i n e w o o d ( K o l o d z i e j s k i e t a l . , 1 9 8 2 ; T a y l o r e t a l . , 1 9 8 3 ) , a n d r e s i d u a l K r a f t l i g n i n ( L e a r y e t a l . , 1 9 8 8 ) , w i t h m i x e d r e s u l t s . T h i s t e c h n i q u e c a n b e u s e d t o d e t e r m i n e d i f f e r e n c e s i n f u n c t i o n a l g r o u p c o n t e n t s b e t w e e n r e l a t e d l i g n i n s a m p l e s ( T a y l o r e t a l . , 1 9 8 3 ) , b u t i t r e m a i n s t o b e s e e n w h e t h e r t r u l y q u a n t i t a t i v e r e s u l t s c a n b e o b t a i n e d d u e t o t h e l a c k o f s h a r p n e s s a n d s e p a r a t i o n o f p e a k s i n t h e N M R s p e c t r u m . T h e S o l i d S t a t e 1 3 C N M R t e c h n i q u e u s i n g C P / M A S h a s t h e a d v a n t a g e o v e r L i q u i d - S t a t e ” C N M R t h a t t h e m o l e c u l a r w e i g h t o f t h e l i g n i n t o b e a n a l y z e d i s n o t l i m i t e d b y s o l u b i l i t y ; h o w e v e r , s a m p l e s i z e s r e m a i n l a r g e ( 0 . 4 c m 3 s a m p l e v o l u m e ; K o l o d z i e j s k i e r a l . , 1 9 8 2 ; T a y l o r e t a l . , 1 9 8 3 ) a n d a n a l y s i s t i m e s a r e v e r y l o n g ( 1 - 4 h o u r s p e r s a m p l e ; T a y l o r e t 3 1 a l . , 1 9 8 3 ) . I n s h o r t , b o t h 1 3 C N M R t e c h n i q u e s r e q u i r e l a r g e s a m p l e s a n d l o n g a n a l y s i s t i m e s t o g e t g o o d r e s u l t s , a s t r o n g d i s a d v a n t a g e i f s a m p l e s i z e i s l i m i t e d . 2 . 5 . 4 S p e c t r o p h o t o m e t r i c T e c h n i q u e s T h e S p e c t r o p h o t o m e t r i c t e c h n i q u e s m o s t c o m m o n l y u s e d f o r l i g n i n a n a l y s i s a r e U l t r a v i o l e t ( U V ) a n d F o u r i e r T r a n s f o r m I n f r a r e d S p e c t r o s c o p y ( F I ' I R ) , d u e t o t h e r e p r o d u c i b l e a b s o r b a n c e m a x i m a e x h i b i t e d w i t h i n r e l a t i v e l y n a r r o w w a v e l e n g t h r a n g e s b y a r o m a t i c r i n g s a n d f u n c t i o n a l g r o u p s a t t a c h e d t o t h e m . C h a r a c t e r i z a t i o n o f l i g n i n b y U V a n d F T I R s p e c t r o s c o p y d e p e n d s c o m p l e t e l y o n t h e a s s i g n m e n t o f a b s o r b a n c e s a t v a r i o u s w a v e l e n g t h s t o s p e c i fi c f u n c t i o n a l g r o u p s , u s u a l l y i d e n t i fi e d t h r o u g h s t u d i e s o f t h e a b s o r b a n c e s o f m o d e l c o m p o u n d s ( S a r k a n e n a n d L u d w i g , 1 9 7 1 ) . T h e u s e o f U V a n d F I ' I R S p e c t r o s c o p y f o r l i g n i n c h a r a c t e r i z a t i o n w i l l b e d i s c u s s e d b e l o w . T h e m a j o r u s e f o r U V s p e c t r o s c o p y i n l i g n i n c h a r a c t e r i z a t i o n i s i n t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e l i g n i n c o n t e n t o f w o o d s a n d i s o l a t e d l i g n i n s ( F e r g u s e t a l . , 1 9 6 9 ; B a g b y e t a l . , 1 9 7 3 ; B o u t e l j e a n d E r i k s s o n , 1 9 8 2 ; S a k a e t a l . , 1 9 8 2 ; J a n s h e k a r e t a l . , 1 9 8 1 ; B o u t e l j e a n d E r i k s s o n , 1 9 8 4 ) , s i n c e t h e a r o m a t i c r i n g s i n l i g n i n a b s o r b i n t e n s e l y a t 2 8 0 r u n , w h i l e c e l l u l o s e a n d h e m i c e l l u l o s e a r e t r a n s p a r e n t t o U V i n t h i s r e g i o n ( S a r k a n e n a n d L u d w i g , 1 9 7 1 ) . S o m e f u n c t i o n a l g r o u p c o n t e n t s c a n a l s o b e e s t i m a t e d w i t h t h i s m e t h o d , i n c l u d i n g c a r b o x y l i c a c i d c o n t e n t ( S a r k a n e n a n d L u d w i g , 1 9 7 1 ) a n d p h e n o l i c h y d r o x y l c o n t e n t ( Y a n g a n d G o r i n g , 1 9 8 0 ; B o u t e l j e a n d E r i k s s o n , 1 9 8 4 ) . C l e a r l y , t h i s m e t h o d c o u l d b e p o t e n t i a l l y u s e f u l f o r t h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f l i g n i n s , b u t i t e a n n o t b e u s e d t o c o m p l e t e l y c h a r a c t e r i z e l i g n i n s i n c e t h e a l i p h a t i c s i d e c h a i n s i n t h e l i g n i n e a n n o t b e m e a s u r e d b y U V ( S a r k a n e n a n d L u d w i g , 1 9 7 1 ) . I R S p e c t r o s c o p y h a s b e e n u s e f u l i n d e t e r m i n i n g d i f f e r e n c e s b e t w e e n l i g n i n s f r o m d i f f e r e n t s o u r c e s , a n d b e t w e e n l i g n i n s f r o m t h e s a m e s o u r c e b u t i s o l a t e d b y d i f f e r e n t m e t h o d s ( S a r k a n e n a n d L u d w i g , 1 9 7 1 ) . C o m p a r i s o n o f a b s o r b a n c e s a t t h e v a r i o u s m a x i m a i n t h e r a n g e o f 4 0 0 0 7 0 0 w a v e n u m b e r s ( l l k , c m " ) , w h i c h c a n b e a t t r i b u t e d t o v a r i o u s f u n c t i o n a l g r o u p s a n d l i g n i n b o n d s ( i d e n t i fi e d b y i n s p e c t i n g I R s p e c t r a o f l i g n i n 3 2 m o d e l m o n o m e r s a n d d i m e r s ( S a r k a n e n a n d L u d w i g , 1 9 7 1 ) ) , g i v e s i m p o r t a n t i n f o r m a t i o n a b o u t d i f f e r e n c e s i n t h e c h e m i c a l a n d s t r u c t u r a l m a k e u p o f t h e l i g n i n . T h e s e I R b a n d a s s i g n m e n t s a r e s h o w n i n T a b l e 2 . 1 ( F a i x , 1 9 9 2 ) . L i g n i n d o e s n o t h a v e t o b e s o l u b l e t o b e u s e d i n I R s t u d i e s ( S a r k a n e n a n d L u d w i g , 1 9 7 1 ) , m a k i n g t h e t e c h n i q u e q u i t e u s e f u l i n s t u d i e s o f w h o l e , i n s o l u b l e i s o l a t e d l i g n i n s ( a n d n o t j u s t o r g a n i c s o l v e n t - s o l u b l e e x t r a c t s ) . W i t h t h e d e v e l o p m e n t o f F T I R , w h i c h a l l o w s f o r m u c h f a s t e r a n d a c c u r a t e m e a s u r e m e n t a n d a n a l y s i s d u e t o t h e a b i l i t y t o q u i c k l y m e a s u r e a n d a v e r a g e a l a r g e n u m b e r o f s c a n s ( G r i f fi t h s a n d d e H a s e t h , 1 9 8 6 ) , m e t h o d s h a v e b e e n d e v e l o p e d f o r t h e q u a n t i t a t i v e m e a s u r e m e n t o f f u n c t i o n a l g r o u p c o m p o s i t i o n s o f l i g n i n s u s i n g F T I R a n d B e e r ’ s L a w ( S a r k a n e n a n d L u d w i g , 1 9 7 1 ) , a n d v a r i o u s m a t h e m a t i c a l m e t h o d s ( S c h u l t z e t a l . , 1 9 8 5 ; S c h u l t z a n d G l a s s e r , 1 9 8 6 ; F u l l e r e t a l . , 1 9 8 8 a ; F u l l e r e t a l . , 1 9 8 8 b ; H a m e s e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h e fi r s t m e t h o d t o b e d e v e l o p e d e m p l o y e d w a s D i f f u s e R e fl e c t a n c e F T I R ( D R I F T F T I R ; S c h u l t z e t a l . , 1 9 8 5 ; S c h u l t z a n d G l a s s e r , 1 9 8 6 ) a n d e m p i r i c a l r e g r e s s i o n m e t h o d s . I n D R I F T F T I R , t h e F T I R s p e c t r u m o f t h e s o l i d l i g n i n s a m p l e i s d e t e r m i n e d b y m e a s u r i n g t h e s p e c t r u m o f I R r a d i a t i o n r e fl e c t e d f r o m t h e l i g n i n ( 1 : 4 0 i n p o w d e r e d K B r ) u s i n g a c o m p l e x s y s t e m o f m i r r o r s ; t h e m e t h o d i s m a d e q u a n t i t a t i v e b y i n t e g r a t i n g t h e s p e c t r a l p e a k s c o r r e s p o n d i n g t o e a c h f u n c t i o n a l g r o u p a n d a p p l y i n g a n e m p i r i c a l r e l a t i o n s h i p d e r i v e d u s i n g l i n e a r r e g r e s s i o n o n d a t a o b t a i n e d f r o m c h e m i c a l m e a s u r e m e n t s o f f u n c t i o n a l g r o u p c o n t e n t s ( S c h u l t z a n d G l a s s e r , 1 9 8 6 ) . N o r m a l l y , F T I R s p e c t r a o f s o l i d s a m p l e s a r e m e a s u r e d w i t h t h e l i g n i n ( fi n e l y g r o u n d ) d i s p e r s e d i n a K B r p e l l e t ( o r w a f e r ) ( S a r k a n e n a n d L u d w i g , 1 9 7 1 ; G r i f fi t h s a n d d e H a s e t h , 1 9 8 6 ) ; D R I F T F T I R w a s f o u n d t o o f f e r t h e a d v a n t a g e t h a t t h e s p e c t r a l b a s e l i n e w a s m o r e s t a b l e t h a n t h o s e o b t a i n e d w i t h K B r p e l l e t s , a l l o w i n g f o r m o r e a c c u r a t e m e a s u r e m e n t s o f p e a k a r e a s . G o o d w r r e l a t i o n s w e r e o b t a i n e d f o r p h e n o l i c h y d r o x y l c o n t e n t , h y d r o l y s i s r a t i o , m e t h o x y l c o n t e n t , a r o m a t i c h y d r o g e n c o n t e n t , a n d c o n d e n s a t i o n r a t i o ( S c h u l t z a n d G l a s s e r , 1 9 8 6 ) . T h e a d v a n t a g e s t o D R I F T F T I R w e r e t h a t s a m p l e p r e p a r a t i o n w a s 3 3 T a b l e 2 . 1 : B a n d a s s i g n m e n t s i n t h e m i d - i n f r a r e d r e g i o n f o r n o n - d e r i v a t i z e d g u a i a c y l - ( G ) , g u a i a c y l / s y r i n g 1 - ( G S ) , a n d h y d r o x y p h e n y l / g u a i a c y l l s ' g y l - t y p e ( H G S ) m i l l e d w o o d l i g n i n s . B a n i n t e n s i t i e s a r e 1 n p a r e n t h e s i s . ( A d a p f r o m F a x , 1 9 9 2 ) . 3 4 1 0 7 8 0 T a b l e 2 . 1 W m k m " ) B u n d o r i g i r g e h o fl o o r m i e n t s M a x i m a e t e r n " , % a h e o r b e n e e ( % A ) f t o m d a n d e r d s p e e t r a B a s e l i n e R a n g e d S p r u c e B e e c h B a m b o o ( A h a - 0 ) M a x i n e M W L M W L M W L a n " % A c m " 9 6 A c m " % A M 3 6 9 5 3 4 1 2 - 3 4 6 0 O - H s t r e t c h 3 4 1 2 ( 5 8 ) 3 4 6 0 ( 4 9 ) 3 4 2 8 ( 4 5 ) 1 0 3 0 4 2 M 3 0 4 2 3 0 0 0 - 2 8 4 2 C - H u r e t c h i n m e t h y l a n d m e t h y l a i e p o u p s 3 0 0 0 ( 5 ) 3 0 0 0 ( 7 ) 3 0 0 2 ( 6 ) 2 9 3 7 ( 2 4 ) 2 9 4 0 ( 2 2 ) 2 9 4 2 ( 2 2 ) 2 8 7 9 ( 1 5 ) 2 8 8 0 ( 1 2 ) 2 8 7 9 ( 1 1 ) 2 8 4 0 ( 1 2 ) 2 8 4 0 ( 1 2 ) 2 8 4 0 ( 1 1 ) 1 1 1 2 7 8 2 0 0 1 1 1 1 8 0 0 1 7 3 8 - 1 7 0 9 C - O u r e t c h h r m i e a r j u p t e d k e t u i e a e e r b o n y l s m d i n 1 7 2 2 ( 1 1 ) 1 7 3 5 ( 1 8 ) 1 7 0 9 ( 4 5 ) e n u m m e q r e m l y o f e u b o h y fi a t e o r i g i n ) ; e m j u p t e d a l d e h y d e u n d e a r b o x y l i c a c i c k a b e o r b m i d “ W t - l o o a n " 1 6 5 5 - 1 6 7 5 C - O n r u d t h t o m j u g a t e d p - w u e r y l k m m 1 6 6 3 ( 2 9 ) 1 6 5 8 ( 2 3 ) e l e c t r o n e g a t i v e m b s t i h t e r n l o w e r t h e w a v e m n n b e r 1 5 9 3 - 1 6 0 5 A m n e t i c e k e l e t a l v i b n t i o m p l m C - O s u e t d u s > 0 ; 1 5 9 6 ( 4 6 ) 1 5 9 3 ( 5 4 ) 1 6 0 1 ( 7 5 ) G e m d e r u e d > 0 e t h e r i fi e d 1 5 0 5 - 1 5 1 5 A r o m a t i c e k e l e t a l v i h n t i o r m 6 > s 1 5 1 0 ( 9 5 ) 1 5 0 5 ( 6 0 ) 1 5 1 1 ( 7 7 ) 1 4 6 0 - 1 4 7 0 C - H d e f m t i o r u z e s y r n ' m - C H n n d - C fl a - 1 4 6 4 ( 6 0 ) 1 4 6 2 ( 6 3 ) 1 4 6 2 ( 6 8 ) 1 4 2 2 - 1 4 3 0 N a n n i c e k e l e t a l v i b n t i o m e o m b i n e d w i t h C - H i n - p l a n e 1 4 2 3 ( 5 3 ) 1 4 2 2 ( 5 3 ) 1 4 2 3 ( 5 6 ) d e f o n n a t i o m 1 3 6 5 - 1 3 7 0 N i p h e fi c C - k u d i h C t h a m O M e p h e n O H 1 3 6 7 ( 3 3 ) 1 3 6 7 ( 2 7 ) 1 3 2 5 - 1 3 3 0 S W 9 1 “ G F I I I § M G ¢ . . O W N M I W I I I 1 3 2 6 ( 3 8 ) 1 3 2 9 ( 4 8 ) 1 3 2 9 ( 5 7 ) p o s i t i o n ” 1 2 6 6 - 1 2 7 0 O r ' m g p l u s C - O s t r e t e h 1 2 6 9 ( 1 0 0 ) 1 2 6 6 ( 4 8 ) 1 2 6 7 ( 8 0 ) 1 2 2 1 - 1 2 3 0 C - C p h u C - O p l m C - O M G e o n d e m e d > 0 1 2 2 1 0 0 ) 1 2 2 7 ( 6 7 ) 1 2 2 9 ( 8 1 ) e t h e r i fi e d 1 1 6 6 T y p i c a l f o r H O S I i M C - O ' m e s t e r y o u p q e o n j . ) 1 1 6 6 ( 7 1 ) 1 1 4 0 A r o m a t i c C - H i n p l a n e d e f o r m e t i o n z t y p i c e l f o r G u n i t s : 1 1 4 0 ( 7 8 ) w h a e b y G e o n d e m e d > G e t h e r i fi e d 1 1 2 8 - 1 1 2 5 A m n e t i c C - H i n — p l m e d e f o r m a t i o n ( t y p i e a 1 f o r 8 u n i t s ) ; 1 1 2 6 ( 1 0 0 ) 1 1 2 7 ( 1 0 0 ) p l u s e e e o n d e r y a l e o h o l e p l m C - O e t r e t c h 1 0 8 6 C - O s t r e t c h ' n u e o n d a r y e l e o h o b a n d s l i p h s t i c 1 0 8 6 ( 4 5 ) o t h e r s 1 0 3 0 - 1 0 3 5 N u n a t i c C - H i n - p l a n e d e f o n n a t i o n . 0 > s ; p l u s C - O 1 0 3 2 ( 7 6 ) 1 0 3 3 ( 5 4 ) 1 0 3 2 ( 5 8 ) d e f o r m i n p u i r n e r y a l o o h o l g p l u s C - O s t r e t c h ( M i ) 9 6 6 - 9 9 0 - H C - C H m a i d - p l a n e d e f o r m ( t r a m ) 9 1 5 - 9 2 5 C - H m n - o f - p l u m a r o m a t i c 9 1 9 ( 5 ) 9 2 5 ( 2 0 ) 8 5 3 - 8 5 8 C - H o I n - o f - p l m e i n p o e i t i o n z 5 . m d 6 o f 0 u n i t s 8 5 8 ( 1 1 ) 8 3 4 - 8 3 5 C - H o u t - o f - p l a n e i n p o e i t i m 2 a n d 6 o f 8 . a n d i n a l l 8 3 5 ( 1 0 ) 8 3 4 ( 2 6 ) p o e i t i o r u o f fl u n i t s 8 1 7 - 8 3 2 C - H o u t - o f - p l a n e i n p o e i t i o m 2 . 5 . a n d 6 o q u n i t s 8 1 7 ( 8 ) 3 5 r e l a t i v e l y e a s i e r t h a n p r e s s i n g K B r p e l l e t s , t h e b a s e l i n e w a s r e l a t i v e l y l e v e l , a n d f e w e r p r o b l e m s w e r e i n t r o d u c e d b y m o i s t u r e - r e l a t e d n o i s e ( S c h u l t z a n d G l a s s e r , 1 9 8 6 ) . T h e o n l y m a j o r d r a w b a c k t o t h i s m e t h o d , i t w a s c o n c l u d e d , w a s t h a t t h e D R I F T c e l l h a d a r e l a t i v e l y l o w t h r o u g h p u t ( I R r a d i a t i o n r e a c h i n g t h e d e t e c t o r ) v e r s u s p e l l e t - b a s e d F T I R m e a s u r e m e n t ( S c h u l t z a n d G l a s s e r , 1 9 8 6 ) . D e s p i t e t h e e a s e o f s a m p l e p r e p a r a t i o n , K B r p e l l e t m e a s u r e m e n t s a r e g e n e r a l l y p r e f e r r e d o v e r D R I F T m e a s u r e m e n t s b e c a u s e t h e r e p r o d u c i b i l i t y o f t h e b a n d w i d t h , i n a d d i t i o n t o t h e i n t e n s i t y , f o r D R I F T m e a s u r e m e n t s i s a b o u t f o u r t i m e s l e s s t h a n t h o s e o b t a i n e d w i t h K B r p e l l e t s ( G r i f fi t h s a n d d e H a s e t h , 1 9 8 6 ) . T h e r e i s n o r e a s o n t o e x p e c t , h o w e v e r , t h a t t h e e m p i r i c a l r e l a t i o n s h i p s d e r i v e d ( S c h u l t z a n d G l a s s e r , 1 9 8 6 ) c o u l d n o t b e u s e d f o r P e l l e t F T I R s p e c t r a . P a r t i a l L e a s t S q u a r e s R e g r e s s i o n ( P L S ) o f F T I R S p e c t r a , t h e s e c o n d m e t h o d a n d t h e m o r e a c c u r a t e o f t h e t w o ( F a i x , 1 9 9 2 ) , h a s p r o v e n u s e f u l i n a c c u r a t e l y p r e d i c t i n g f u n c t i o n a l g r o u p c o n t e n t s i n l i g n i n s ( F u l l e r e t a l . , 1 9 8 8 a ; F u l l e r e t a l . , 1 9 8 8 b ; H a m e s e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h e P L S t e c h n i q u e w a s d e v e l o p e d i n r e s p o n s e t o t h e o b s e r v a t i o n t h a t s i n g l e I R a b s o r b a n c e p e a k a r e a s c o u l d n o t f u l l y a c c o u n t f o r a l l a b s o r b a n c e s f o r a p a r t i c u l a r f u n c t i o n a l g r o u p , a n d t h u s c o u l d n o t f u l l y a c c o u n t f o r t h e c o n t e n t s o f s i n g l e f u n c t i o n a l g r o u p s ( F u l l e r e t a l . , 1 9 8 8 a ; F u l l e r e t a l . , 1 9 8 8 b ; H a r n e s e t a l . , 1 9 9 1 ) . W h e n c o m b i n e d w i t h a n e w , f a s t e r a n d e a s i e r m e t h o d o f p r o d u c i n g h i g h q u a l i t y K B r p e l l e t s ( B r e n e m a n e t a l . , 1 9 8 9 ) , t h i s t e c h n i q u e o f f e r s a n e x c e l l e n t a l t e r n a t i v e w i t h f e w d r a w b a c k s t o t h e D R I F T m e t h o d ( H a m e s e t a l . , 1 9 9 1 ) . W h e n t h e P L S m e t h o d w a s c a l i b r a t e d w i t h c h e m i c a l a n a l y s i s d a t a f r o m a l a r g e n u m b e r o f m i l l e d w o o d l i g n i n s , g o o d c o r r e l a t i o n s w e r e o b t a i n e d f o r m e t h o x y l c o n t e n t , m e t h o x y l t o a r y l r a t i o ( H a m e s e t a l . , 1 9 9 1 ) , l i g n i n a n d c a r b o h y d r a t e c o m p o s i t i o n s , a n d p h e n o l i c h y d r o x y l c o n t e n t ( B . H a m e s , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n ) . T h i s t e c h n i q u e r e q u i r e s o n l y 1 . 5 m g o f l i g n i n s a m p l e ( 1 : 2 0 0 i n a K B r w a f e r ) , w h i c h m a k e s i t q u i t e u s e f u l w h e n s a m p l e a v a i l a b i l i t y i s l i m i t e d ( H a m e s e t a l . , 1 9 9 1 ) . 3 6 2 . 6 G C / M S a n d L C / M S T e c h n i q u e s f o r C h a r a c t e r i z a t i o n o f S o l u b l e L i g n i n F r a g m e n t s M a s s s p e c t r o m e t r y i s a u s e f u l t o o l i n t h e i d e n t i fi c a t i o n o f u n k n o w n c o m p o u n d s . W h e n c o m b i n e d w i t h a s e p a r a t i o n t e c h n i q u e s u c h a s g a s o r l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y , t h e r e s u l t i s a p o w e r f u l s y s t e m f o r t h e s e p a r a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f p r o d u c t s i n c o m p l e x m i x t u r e s . G C / M S i s o n e o f t h e m o r e p o w e r f u l t o o l s i n t h e a n a l y s i s o f c o m p l e x m i x t u r e s , d u e t o i t s a b i l i t y t o s e p a r a t e m i x t u r e s a n d t o o b t a i n h i g h - q u a l i t y m a s s s p e c t r a w h i c h c a n b e u s e d t o i d e n t i f y t h e c o m p o u n d s w i t h o u t i s o l a t i n g t h e m ( S e d g w i c k a n d H i n d e n l a n g , 1 9 8 8 ; E v e r s h e d , 1 9 8 9 ) . G C / M S i s s e n s i t i v e i n t h e d e t e c t i o n o f n a n o g r a m q u a n t i t i e s o f c o m p o u n d s , m a k i n g i t e x t r e m e l y u s e f u l i n d e t e c t i n g m a j o r a s w e l l a s m i n o r p r o d u c t s i n c o m p l e x m i x t u r e s ( S e d g w i c k a n d H i n d e n l a n g , 1 9 8 8 ; E v e r s h e d , 1 9 8 9 ) . D e r i v a t i z a t i o n m e t h o d s f o r n o n v o l a t i l e c o m p o u n d s ( B l a u a n d K i n g , 1 9 7 8 ; K i m e t a l . , 1 9 8 9 ) a s w e l l a s l i g n i n - e r c o m p o u n d s ( D r a w e r t a n d L e u p o l d , 1 9 7 6 ; S a l o m o n s s o n e t a l . , 1 9 7 8 ; H o f f m a n n a n d S w e e t m a n , 1 9 8 7 ; H y a t t , 1 9 8 9 ) t o m a k e t h e m v o l a t i l e a n d / o r s t a b l e f o r G C a n a l y s i s h a v e b e e n w e l l c h a r a c t e r i z e d . M a n y s t u d i e s h a v e b e e n d o n e o n t h e l i g n i n - d e r i v e d p r o d u c t s p r e s e n t i n s p e n t b l e a c h l i q u o r a n d K r a f t l i q u o r , w i t h t h e i d e n t i fi c a t i o n o f a w i d e r a n g e o f p h e n o l i c l i g n i n - d e r i v e d a c i d s , a l d e h y d e s , a n d a l c o h o l s ( L i n d s t r o m a n d O s t e r b e r g , 1 9 8 4 ; O s t e r b e r g a n d L i n d s t r o m , 1 9 8 5 a ; O s t e r b e r g a n d L i n d s t r o m , 1 9 8 5 b ; V a n d e r K l a s h o r s t , 1 9 8 8 ; N i e m e l a , 1 9 8 8 a ; N i e m e l a , 1 9 8 8 b ; N i e m e l a , 1 9 8 9 ) . I n a d d i t i o n , G C / M S h a s s e e n e x t e n s i v e u s e i n c h a r a c t e r i z i n g s o l u b l e l i g n i n - d e r i v e d a n d l i g n i n - l i k e p r o d u c t s ( C o n c i n e r a l . , 1 9 8 3 ; F r i t z a n d M o o r e , 1 9 8 7 ; U m e z a w a a n d H i g u c h i , 1 9 8 8 ; C h e n , 1 9 8 8 ; P o m e t t o a n d C r a w f o r d , 1 9 8 8 a ; K a t a y a m a e r a l . , 1 9 8 9 ; W a r i i s h i e t a l . , 1 9 9 1 ; V a l l i a n d G o l d , 1 9 9 1 ; V a l l i e t a l . , 1 9 9 2 a ; V a l l i e r a l . , 1 9 9 2 b ; J o s h i a n d G o l d , 1 9 9 3 ) . M o s t s t u d i e s h a v e u s e d d i f f e r e n t d e r i v a t i z a t i o n p r o c e d u r e s ( o r n o d e r i v a t i z a t i o n a t a l l ) , s o m a t c h i n g o f s p e c t r a i s o f t e n n o t p o s s i b l e ; h o w e v e r , t h e s t r u c t u r e s o f t h e l i g n i n - d e r i v e d p r o d u c t s i d e n t i fi e d i n t h e s e s t u d i e s a r e u s e f u l i n p r o v i d i n g a s t a r t i n g p o i n t f o r d e t e r m i n a t i o n o f m o l e c u l a r 3 7 s t r u c t u r e s i n t h e a n a l y s i s o f m a s s s p e c t r a f r o m c o m p o u n d s d e r i v a t i z e d b y a d i f f e r e n t p r o c e d u r e . M a n y o f t h e p r o d u c t s s e e n w i t h p y r o l y s i s - G C / M S a r e e i t h e r i d e n t i c a l o r v e r y s i m i l a r t o t h o s e f o u n d i n t h e l i g n i n d e g r a d a t i o n s t u d i e s w h i c h u s e d G C / M S t o c h a r a c t e r i z e s o l u b l e p r o d u c t s , f o r e x a m p l e s y r i n g a l d e h y d e , v a n i l l i c a c i d , c o n i f e r a l d e h y d e , e t c . , s o t h e f r a g m e n t a t i o n r u l e s o u t l i n e d a b o v e f o r l i g n i n - d e r i v e d p r o d u c t s s h o u l d a l s o h o l d f o r t h e s o l u b l e p r o d u c t s t u d i e s ( C o n c i n e t a l . , 1 9 8 3 ; F r i t z a n d M o o r e , 1 9 8 7 ; U m e z a w a a n d H i g u c h i , 1 9 8 8 ; C h e n , 1 9 8 8 ) . T h e m a i n d r a w b a c k t o u s i n g G C / M S f o r s o l u b l e p r o d u c t i d e n t i fi c a t i o n i s t h a t o n l y p r o d u c t s o f m o l e c u l a r w e i g h t o f a b o u t 6 0 0 a n d b e l o w c a n b e a n a l y z e d , b e c a u s e a n y t h i n g m u c h l a r g e r t h a n t h a t i s n o t l i k e l y t o b e v o l a t i l i z e d , e v e n w i t h d e r i v a t i z a t i o n ( S e d g w i c k a n d H i n d e n l a n g , 1 9 8 8 ; E v e r s h e d , 1 9 8 9 ) . F o r p r o d u c t s b e l o w m o l e c u l a r w e i g h t 6 0 0 , h o w e v e r , G C / M S p r o v i d e s a n e x c e l l e n t t o o l f o r i d e n t i f y i n g ( a n d r o u g h l y q u a n t i f y i n g t h r o u g h G C p e a k i n t e g r a t i o n ) t r a c e q u a n t i t i e s o f u n k n o w n s i n c o m p l e x m i x t u r e s . L i q u i d c h r o m a t o g r a p h y c o m b i n e d w i t h m a s s s p e c t r o m e t r y ( H a r t l e y a n d B u c h a n , 1 9 7 9 ; P o m e t t o a n d C r a w f o r d , 1 9 8 8 b ; C a t l o w a n d R o s e , 1 9 8 9 ; B u d d e e r a l . , 1 9 9 0 ) i s e m e r g i n g a s a m e t h o d o f a n a l y s i s f o r p r o d u c t s w h i c h a r e e i t h e r o f t o o h i g h a m o l e c u l a r w e i g h t t o b e v o l a t i l i z e d b y G C , o r w h i c h d e c o m p o s e a t t h e t e m p e r a t u r e s r e q u i r e d f o r v o l a t i l i z a t i o n . R e l a t i v e l y l i t t l e h a s b e e n d o n e i n t h e a n a l y s i s o f l i g n i n d e r i v e d p r o d u c t s u s i n g L C / M S o r H P L C / M S , a l t h o u g h H a r t l e y a n d B u c h a n ( 1 9 7 9 ) i n a s t u d y o n H P L C o f l i g n i n - d e r i v e d p r o d u c t s , w e r e a b l e t o d e t e c t a s l i t t l e a s 1 0 0 n g o f v a r i o u s l i g n i n - d e r i v e d m o n o m e r s u s i n g U V d e t e c t i o n . I t r e m a i n s t o b e s e e n w h e t h e r L C / M S o r H P L C / M S w i l l b e c o m e c o m p e t i t i v e w i t h G C / M S i n t h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f s o l u b l e l i g n i n - d e r i v e d m o n o m e r s , d u e t o d i f fi c u l t i e s i n t e c h n i c a l i n t e r f a c i n g o f t h e i n s t r u m e n t s ( E v e r s h e d , 1 9 8 9 ) . C H A P T E R I I I : R E S E A R C H G O A L S A N D S T R A T E G I E S T h e b r o a d g o a l s o f t h i s s t u d y w e r e : ( 1 ) t o v e r i f y w h e t h e r t h e e x t r a c e l l u l a r l i g n i n o l y t i c e n z y m e s o f P . c h r y s a s p a r i u m d e p o l y m e r i z e a w a t e r - i n s o l u b l e l i g n i n f r o m a n a t u r a l s o u r c e w h i c h w a s n o t s i g n i fi c a n t l y d i f f e r e n t f r o m l i g n i n a s i t o c c u r s i n t h e l i g n o c e l l u l o s i c m a t r i x ; ( 2 ) t o d e t e r m i n e t h e d i f f e r e n c e s i n h o w t h e t w o c l a s s e s o f p e r o x i d a s e s , l i g n i n p e r o x i d a s e s ( L I P S ) a n d m a n g a n e s e p e r o x i d a s e s ( M N P S ) d e p o l y m e r i z e l i g n i n ; a n d ( 3 ) t o i d e n t i f y s o l u b l e p r o d u c t s w h o s e r e l e a s e c o u l d b e u s e d t o f o l l o w t h e r a t e o f l i g n i n d e p o l y m e r i z a t i o n , i n o r d e r t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e m a c r o p o r o u s s t r u c t u r e o f l i g n o c e l l u l o s e l i m i t s i t s a c c e s s i b i l i t y t o t h e l i g n i n o l y t i c e n z y m e s . T h e S p e c i fi c o b j e c t i v e s o f t h e p r o p o s e d s t u d y w e r e t o : ( 1 ) d e m o n s t r a t e w h e t h e r a n y s o l u b l e l i g n i n — d e r i v e d p r o d u c t s a r e r e l e a s e d f r o m l i g n i n b y L I P S a n d / o r M N P S , a n d , i f s o , t h e i r i d e n t i t i e s ; ( 2 ) d e t e r m i n e w h e t h e r a n y s i g n i fi c a n t m o d i fi c a t i o n o f t h e s o l i d l i g n i n o c c u r s d u e t o t h e a c t i o n o f L I P S a n d / o r m s ; ( 3 ) c h a r a c t e r i z e t h e m a j o r s o l u b l e p r o d u c t s w h i c h a r e f o r m e d s o t h a t i n t h e f u t u r e , a m e t h o d b y w h i c h m e a s u r e m e n t o f t h e s e p r o d u c t s m a y b e u s e d t o d e t e r m i n e r a t e s o f l i g n i n d e p o l y m e r i z a t i o n c o u l d b e d e v e l o p e d ; a n d , ( 4 ) d e t e r m i n e t h e r o l e s o f l i g n i n p e r o x i d a s e s ( L I P S ) a n d m a n g a n e s e p e r o x i d a s e s ( M N P S ) i n i n v i t r a d e p o l y m e r i z a t i o n o f i n s o l u b l e l i g n i n p o l y m e r . T h i s s t u d y w a s c o m p o s e d o f fi v e s e p a r a t e p a r t s d e a l i n g w i t h e n g i n e e r i n g d e s i g n a n d o p t i m i z a t i o n , m o d e l l i n g , l i g n i n c h e m i s t r y , m i c r o b i o l o g y a n d b i o c h e m i s t r y , a n d a n a l y t i c a l c h e m i s t r y . T h e s e p a r t s w e r e c o m b i n e d i n t h e d e v e l o p m e n t o f a s i m p l e , i n e x p e n s i v e r e a c t o r s y s t e m f o r t h e i n v i t r a d e g r a d a t i o n o f i n s o l u b l e n a t u r a l l i g n i n b y e x t r a c e l l u l a r p e r o x i d a s e s , w h i c h h a s n o t p r e v i o u s l y b e e n p r o v e n t o o c c u r ( T i e n , 1 9 8 7 ; B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) . T h i s c h a p t e r i s p r o v i d e d a s a p r e l i m i n a r y d i s c u s s i o n a b o u t w h y a n d h o w e a c h p a r t o f t h e p r o j e c t w a s a p p r o a c h e d , a n d h o w e a c h p a r t fi t s t o g e t h e r i n t o t h e w h o l e . A fl o w c h a r t i n d i c a t i n g t h e g e n e r a l s t r a t e g y f o r t h e w o r k i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 3 . 1 . 3 8 l C fi d 3 9 P o p l a r E n z y m e R e a c t o r M o d e l S u b s t r a t e P r e p a r a t i o n D e v e l o p m e n t D e v e l o p m e n t A d d - L I P A l o n e & I * i H y d r o l y s i s M N P A l o n e D e r i v a t i o n l C e l l u l o s e - C o n c e n t r a t i o n , l t r n e n t 8 ‘ “ ‘ 1 d e C o m t r u c t i o n P M “ ! ' E s t i m a t i o n S o l v e n t _ V E x t r a c t i o n I T i t a n s p o r t & 7 L ' S t a b i l i t y M o d e l S o l i d - O p t i m i z a t i o n ] R e c o v e r y S t a b i l i t y R e a c t o r R u n s L I P , M N P , & L I P + M N P S o l v e n t E x t r a c t i o n L i q u i d L i q u i d E x i t - a c t E x t r a c t 1 3 ° “ D r y W e i g h t I D a t a A n a l y s i s I D i d D e g r a d a t i o n O c c u r ? I F i g u r e 3 . 1 : F l o w c h a r t i n d i e a t i n g t h e s t r a t e g y f o r t h i s s t u d y a n d h o w e a c h p a r t c o n t r i b u t e s t o o t h e r t h e p a r t s . A l l s t e p s i n t h e t o p h a l f o f t h e fi g u r e c o n t r i b u t e d i r e c t l y t o t h e d e s i g n , d e v e l o p m e n t , a n d o p e r a t i o n o f t h e r e a c t o r f o r t h e i n v u r a l i g m n d e g r a d a t i o n e x p e r i m e n t s . 4 0 3 . 1 H y p o t h e s e s T h e h y p o t h e s e s f o r t h i s s t u d y w e r e : ( 1 . ) T h a t a r e l a t i v e l y s i m p l e a n d i n e x p e n s i v e r e a c t o r s y s t e m c o u l d b e d e v e l o p e d w h i c h c o u l d m a i n t a i n r e a c t a n t a n d e n z y m e c o n c e n t r a t i o n s a t l e v e l s o p t i m a l f o r t h e a c t i o n o f L I P S a n d M N P S o f P . c h r y s a s p a r i w n ; ( 2 . ) T h a t i n v i t r a l i g n i n d e p o l y m e r i z a t i o n w o u l d b e a c h i e v e d b y o n e o r t h e o t h e r o f t h e s e e n z y m e s , u s i n g a h i g h m o l e c u l a r w e i g h t , w a t e r - i n s o l u b l e l i g n i n i s o l a t e d f r o m a n a t u r a l s o u r c e i n s t e a d o f l o w m o l e c u l a r w e i g h t s y n t h e t i c l i g n i n s u s e d i n p r e v i o u s s t u d i e s ; ( 3 ) . T h a t t h e e x t r a c e l l u l a r l i g n i n o l y t i c e n z y m e s o f P . c h r y s a s p a r i u m ( L I P S a n d M N P S ) a r e b o t h i n v o l v e d i n t h e d e p o l y m e r i z a t i o n o f i n s o l u b l e n a t u r a l l i g n i n ; a n d ( 4 . ) T h a t M N P S m o d i f y t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t , i n s o l u b l e l i g n i n p o l y m e r , m a k i n g i t a b e t t e r s u b s t r a t e f o r t h e L I P S , w h i c h t h e n d e p o l y m e r i z e t h e l i g n i n b y r e l e a s e o f l o w m o l e c u l a r w e i g h t f r a g m e n t s . 3 . 2 R e s e a r c h S t r a t e g i e s 3 . 2 . 1 C h o i c e o f S u b s t r a t e T h e i n s o l u b l e s u b s t r a t e c h o s e n f o r t h e s e s t u d i e s w a s a n i n s o l u b l e l i g n i n i s o l a t e d f r o m g r o u n d p o p l a r w o o d fl o u r ( P o p l a r ) o b t a i n e d t h r o u g h t h e N S F C e n t e r f o r M i c r o b i a l E c o l o g y a t M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y ( s e e C h a p t e r I V ) . T h e d e s i r e d s u b s t r a t e w a s o n e e s s e n t i a l l y f r e e o f c e l l u l o s e a n d h e m i c e l l u l o s e s o t h a t m a s k i n g o f l i g n i n a b s o r b a n c e s b y c e l l u l o s e a n d h e m i c e l l u l o s e a b s o r b a n c e s w o u l d n o t o c c u r w h e n F T I R w a s u s e d t o c h a r a c t e r i z e t h e s o l i d l i g n i n ( c a r b o h y d r a t e s a b s o r b I R r a d i a t i o n i n s a m e r e g i o n a s l i g n i n ) . 3 . 2 . 2 I n v i v a v s I n v i t r a D e p o l y m e r i z a t i o n o f I n s o l u b l e L i g n i n P r e v i o u s s t u d i e s w i t h s o l u b l e l i g n i n m o d e l c o m p o u n d s h a v e s u g g e s t e d t h a t L I P S a n d M N P S d e p o l y m e r i z e l i g n i n ; h o w e v e r , n o e v i d e n c e d i r e c t l y l i n k i n g t h e s e a c t i v i t i e s t o d e p o l y m e r i z a t i o n o f u n m o d i fi e d i n s o l u b l e l i g n i n i n a q u e o u s m e d i a h a s b e e n r e p o r t e d . I n v i v a d e p o l y m e r i z a t i o n o f l i g n i n ( b y t h e f u n g u s ) , w h i l e t e c h n i c a l l y m u c h e a s i e r t o a c c o m p l i s h , w o u l d n o t s u p p l y t h e n e c e s s a r y d a t a o n s o l u b l e p r o d u c t f o r m a t i o n s i n c e t h e s e c o m p o u n d s w o u l d b e f u r t h e r m e t a b o l i z e d b y t h e f u n g u s . I n v i t r a d e p o l y m e r i z a t i o n o f 4 1 l i g n i n b y l i g n i n p e r o x i d a s e s h a s b e e n a c h i e v e d w i t h p a r t i a l l y s o l u b l e s y n t h e t i c l i g n i n ( s e e C h a p t e r I I ) , a n d w i t h i n s o l u b l e l i g n o c e l l u l o s e w h e n H 2 0 2 w a s s u p p l i e d t r a n s i e n t l y b y g l u c o s e o x i d a s e . H o w e v e r , t h e s e s t u d i e s h a v e r e l i e d o n d e t e c t i o n o f " C - c o n t a i n i n g c o m p o u n d s b e i n g s o l u b i l i z e d . I n t h i s s t u d y , t h e i n v i t r a e x p e r i m e n t s w e r e c h o s e n t o p r o v i d e d i r e c t e v i d e n c e o f l i g n i n d e p o l y m e r i z a t i o n b y f o l l o w i n g c h a n g e s i n t h e c h e m i e a l c o m p o s i t i o n o f t h e i n s o l u b l e l i g n i n a n d t h e m a j o r s o l u b l e p r o d u c t s f o r m e d . 3 . 2 . 3 C h o i c e o f R e a c t o r S y s t e m T h e s y s t e m c h o s e n f o r t h e i n v i t r a r e a c t i o n S t u d i e s a n i n s o l u b l e l i g n i n w a s a s m a l l d i a l y s i s r e a c t o r . T h e r e a c t o r w a s o p e r a t e d s u c h t h a t t h e c o n c e n t r a t i o n o f H 2 0 , i n c o n t a c t w i t h t h e e n z y m e s w o u l d n o t b e d i f fi c u l t t o c o n t r o l . T h i s i s n e c e s s a r y b e c a u s e h i g h H 2 0 2 c o n c e n t r a t i o n s i n a c t i v a t e t h e e n z y m e s , a n d b e c a u s e c o n s u m p t i o n o f H 2 0 2 b y o x i d a t i o n o f l i g n i n i s v e r y s l o w r e l a t i v e t o r a t e s o f c o n s u m p t i o n i n t h e o x i d a t i o n o f V A . T h e r e a s o n s f o r t h i s c h o i c e o f r e a c t o r s y s t e m a r e d i s c u s s e d b e l o w . A n u m b e r o f i m p o r t a n t p o i n t s w e r e c o n s i d e r e d i n t h e d e s i g n o f t h i s s t u d y ( r e f e r t o C h a p t e r I I f o r d i s c u s s i o n s o f t h e s e t o p i c s ) : ( 1 ) H 2 0 2 a n d V A a r e r e q u i r e d f o r t h e d e g r a d a t i o n o f l i g n i n b y L I P ; ( 2 ) H 2 0 2 i n a c t i v a t e s t h e e n z y m e s o v e r t i m e ; ( 3 ) H 2 0 , c o m p e t i t i v e l y i n h i b i t s t h e o x i d a t i o n o f V A t o v e r a t r a l d e h y d e , a r e a c t i o n w h i c h i s n e c e s s a r y f o r s t a b i l i z a t i o n o f L I P a c t i v i t y a g a i n s t i n a c t i v a t i o n b y H 2 0 2 ; ( 4 ) t h e p e r o x i d a s e s o f P . c h r y s a s p a r i u m a r e d i f fi c u l t t o o b t a i n i n l a r g e q u a n t i t i e s , s o o n l y f a i r l y s m a l l q u a n t i t i e s o f e n z y m e w o u l d b e a v a i l a b l e ; a n d ( 5 ) d e g r a d a t i o n o f i n s o l u b l e l i g n i n h a s b e e n s h o w n t o b e v e r y s l o w a s c o m p a r e d t o t h e r a p i d r e a c t i o n r a t e s o b s e r v e d w i t h l i g n i n m o d e l c o m p o u n d s a n d w i t h s y n t h e t i c l i g n i n s i n a q u e o u s o r g a n i c s o l v e n t s . T h u s , l a r g e a m o u n t s o f e n z y m e r e l a t i v e t o t h e a m o u n t o f l i g n i n p r e s e n t w e r e u s e d i n o r d e r t o s h o r t e n t h e t i m e n e e d e d t o s e e c h e m i c a l c h a n g e s i n t h e l i g n i n a n d p r o d u c t i o n o f s o l u b l e l i g n i n - d e r i v e d p r o d u c t s , a n d s m a l l a m o u n t s o f l i g n i n w e r e u s e d s o t h a t l e s s e n z y m e w o u l d b e n e e d e d . F i n a l l y , t h e m u l t i p l e r o l e s o f V A i n t h e c u l t u r e a n d t h e a d v e r s e e f f e c t s o f h i g h H 2 0 , c o n c e n t r a t i o n s o n e n z y m e a c t i v i t y n e c e s s i t a t e d t h e d e v e l o p m e n t o f a f e a s i b l e 4 2 m e t h o d f o r c o n t r o l o f t h e c o n c e n t r a t i o n s o f H 2 0 , a n d V A i n c o n t a c t w i t h t h e e n z y m e , s i n c e w i t h o u t t h i s c o n t r o l , d e p o l y m e r i z a t i o n w o u l d l i k e l y n o t o c c u r ( O l s e n e r a l . , 1 9 9 1 ; H a m m e l e t a l . , 1 9 9 3 ) . T h r e e m e t h o d s w e r e c o n s i d e r e d : ( 1 ) s u p p l y o f H 2 0 , b y e n z y m a t i c g e n e r a t i o n f r o m g l u c o s e b y g l u c o s e o x i d a s e a n d m e t e r e d a d d i t i o n o f V A ; ( 2 ) m e t e r e d a d d i t i o n o v e r t i m e o f b o t h H 2 0 , a n d V A ; a n d ( 3 ) t r a n s i e n t s u p p l y o f H 2 0 2 a n d V A b y t r a n s p o r t p r o c e s s e s a c r o s s a m e m b r a n e . T h e m a i n d r a w b a c k t o M e t h o d 1 i s t h a t , g l u c o s e o x i d a s e i s m o s t a c t i v e n e a r p H 5 ( O l s e n e t a l . , 1 9 9 1 ) , w h i l e L I P i s n e a r l y i n a c t i v e a t t h i s p H ( L I P i s m o s t a c t i v e a t p H 2 . 5 ( b u t l e a s t s t a b l e ) ) ( B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) . T h u s , u s i n g M e t h o d 1 w o u l d m e a n t h a t l o n g e r r e a c t i o n t i m e s w o u l d b e n e c e s s a r y t o s e e a n y c h e m i c a l c h a n g e i n t h e i n s o l u b l e l i g n i n . I f M e t h o d 2 w e r e c h o s e n ( a s d o n e b y H a m m e l e t a l . , 1 9 9 1 a n d H a m m e l e t a l . , 1 9 9 3 ) , t h e r e a c t i o n m i x t u r e w o u l d b e s i g n i fi c a n t l y d i l u t e d o v e r t h e c o u r s e o f t h e r u n , w h i c h w o u l d o n l y s e r v e t o l e n g t h e n r e a c t i o n t i m e s b y d e c r e a s i n g t h e a m o u n t o f r e a c t i o n p e r u n i t v o l u m e o f t h e s o l u t i o n . W i t h M e t h o d 3 , t h e r a t e s o f s u p p l y a n d c o n s u m p t i o n c o u l d b e r e g u l a t e d b y a d d i n g c o n c e n t r a t e d , s m a l l v o l u m e p u l s e s o f H 2 0 2 a n d V A t o t h e r e a c t a n t r e s e r v o i r a n d L I P a n d / o r M N P t o t h e r e a c t i o n c h a m b e r , w i t h o u t s i g n i fi c a n t l y i n c r e a s i n g t h e v o l u m e o f t h e r e a c t i o n m i x t u r e ( v o l u m e i n c r e a s e s o v e r 1 2 h o u r s o f r e a c t i o n w e r e k e p t t o 8 % , 1 0 % , a n d 1 6 % o f t h e i n i t i a l v o l u m e o f t h e r e a c t i o n m i x t u r e f o r M N P a l o n e , L I P a l o n e , a n d L I P + M N P ; s e e C h a p t e r I V ) . T h u s , t h e d i a l y s i s r e a c t o r w a s c h o s e n . 3 . 2 . 4 C h o i c e o f R e a c t i o n C o n d i t i o n s A r e c e n t p a t e n t a p p l i c a t i o n ( O l s e n e t a l . , 1 9 9 1 ) d e s c r i b e d a p r o c e s s i n w h i c h i n s o l u b l e p a p e r p u l p w a s t r e a t e d i n v i t r a w i t h a m i x t u r e o f x y l a n a s e s , M N P S , a n d L I P S . I n t h i s p r o c e s s , H 2 0 2 w a s s u p p l i e d t r a n s i e n t l y b y g l u c o s e o x i d a s e . T h e r a t e s o f d e p o l y m e r i z a t i o n w e r e s t i l l v e r y s l o w , h o w e v e r , b e c a u s e g l u c o s e o x i d a s e o p e r a t e s b e s t a r o u n d p H 5 , w h i l e t h e l i g n i n p e r o x i d a s e o p t i m u m i s 2 . 5 . . T h e p H w a s c h o s e n t o b e 3 . 5 f o r t h i s s t u d y , a s a t r a d e o f f b e t w e e n e n z y m e s t a b i l i t y a n d g o o d a c t i v i t y . T h e r e a c t i o n 4 3 t e m p e r a t u r e w a s c h o s e n a s 3 7 ° C s i n c e t h e f u n g u s a l s o g r o w s w e l l a t t h i s t e m p e r a t u r e . R e a c t a n t c o n c e n t r a t i o n s i n c o n t a c t w i t h t h e e n z y m e w e r e c h o s e n b y m a i n t a i n i n g t h e l e v e l s w i t h i n r a n g e s s p e c i fi e d i n t h e p a t e n t d e s c r i b e d a b o v e . 3 . 2 . 5 C h o i c e o f S o l i d M e a s u r e m e n t T e c h n i q u e I t w a s d e c i d e d e a r l y o n t h a t c h e m i c a l c h a n g e s i n t h e i n s o l u b l e l i g n i n p o l y m e r w o u l d b e m e a s u r e d b y F T I R c o m b i n e d w i t h P a r t i a l L e a s t S q u a r e s R e g r e s s i o n ( P L S ) . S o l i d - s t a t e “ C - N M R u s i n g C P / M A S w a s a v a i l a b l e , b u t t h i s t e c h n i q u e r e q u i r e s r e l a t i v e l y l a r g e a m o u n t s o f s a m p l e , a n d l o n g a n a l y s i s t i m e s ( a n d w o u l d t h u s b e v e r y e x p e n s i v e ) . C h e m i c a l t e c h n i q u e s , w h i l e i n e x p e n s i v e , w o u l d r e q u i r e l a r g e a m o u n t s o f s a m p l e f o r c o m p l e t e a n a l y s i s . F i n a l l y , U V s p e c t r o s c o p y s i m p l y w o u l d n o t h a v e p r o v i d e d e n o u g h i n f o r m a t i o n o n t h e c h e m i c a l c o m p o s i t i o n o f t h e s o l i d l i g n i n t o m a k e a s u p p o r t a b l e c a s e t h a t d e p o l y m e r i z a t i o n o r m o d i fi c a t i o n h a d o c c u r r e d . F T I R e q u i p m e n t f o r t h e m e a s u r e m e n t s w a s r e a d i l y a v a i l a b l e t h r o u g h t h e M i c h i g a n B i o t e c h n o l o g y I n s t i t u t e , L a n s i n g , M I . I n a d d i t i o n , t h e K B r p e l l e t F T I R / P L S t e c h n i q u e r e q u i r e d o n l y 1 . 5 m g o f d r i e d s a m p l e p e r r u n , s o s u f fi c i e n t s a m p l e ( 2 0 m g w o u l d b e t r e a t e d ) w o u l d b e a v a i l a b l e f o r r e p l i c a t e m e a s u r e m e n t s . T h e u s e o f i s o l a t e d l i g n i n i n s t e a d o f l i g n o c e l l u l o s e , a s d e s c r i b e d a b o v e , c i r c u m v e n t s t h e p r o b l e m o f m a s k i n g o f l i g n i n p e a k s b y c e l l u l o s e a n d h e m i c e l l u l o s e . A n y c h a n g e s i n s p e c t r a l p e a k a r e a s r e l a t i v e t o u n t r e a t e d i n s o l u b l e l i g n i n c o u l d t h e n b e d e t e r m i n e d b y p e a k d e c o n v o l u t i o n a n d i n t e g r a t i o n u s i n g t h e P L S t e c h n i q u e d e v e l o p e d a t t h e N a t i o n a l R e n e w a b l e E n e r g y l a b o r a t o r y ( N R E L , G o l d e n , C O ) ( H a m e s e t a l . , 1 9 9 1 ) . 3 . 2 . 6 C h o i c e o f L i q u i d M e a s u r e m e n t T e c h n i q u e G a s C h r o m a t o g r a p h y / M a s s S p e c t r o m e t r y ( G C / M S ) h a s b e e n w i d e l y u s e d f o r t h e c h a r a c t e r i z a t i o n s o l u b l e l i g n i n d e g r a d a t i o n p r o d u c t s i n c o m p l e x m i x t u r e s , a n d w a s t h u s w e l l s u i t e d f o r t h i s s t u d y . G C / M S a n a l y s i s w a s r e a d i l y a v a i l a b l e t h r o u g h t h e M S U - N I H M a s s S p e c t r o m e t r y F a c i l i t y a t M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y . P y r o l y s i s - G C / M S h a s b e e n s u c c e s s f u l l y e m p l o y e d o n a v a r i e t y o f l i g n o c e l l u l o s e a n d l i g n i n s a m p l e s , b u t t h e p a t n o n - l a 3 1 4 1 1 4 4 4 p r o c e d u r e i s b o t h t i m e - c o n s u m i n g a n d e x p e n s i v e , i n a d d i t i o n t o n o t b e i n g r e a d i l y a v a i l a b l e a t M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y . V o l a t i l i z a t i o n o f l o w m o l e c u l a r w e i g h t p h e n o l i c c o m p o u n d s b y d e r i v a t i z a t i o n , a s w o u l d b e n e c e s s a r y f o r t h e G C / M S i s a l s o w e l l s t u d i e d . T h u s , G C / M S w a s c h o s e n t o c h a r a c t e r i z e s o l u b l e l i g n i n - d e r i v e d p r o d u c t s . 4 . 1 E l l i i n a s c h : B i o s C H A P T E R I V : M A T E R I A L S A N D M E T H O D S 4 . 1 S u b s t r a t e T h e w a t e r - i n s o l u b l e l i g n i n s u b s t r a t e f o r t h i s s t u d y w a s i s o l a t e d f r o m a h y b r i d p o p l a r g r o w n a t t h e K e l l o g g B i o l o g i c a l S t a t i o n f o r t h e C e n t e r f o r M i c r o b i a l E c o l o g y a t M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y . T h e c l o n e ( P o p l a r e a g e n e i t ) i s a h y b r i d b e t w e e n P o p l a r n i g r a a n d P o p l a r d e l t a i d e r a n d h a s b e e n d e s i g n a t e d P o p l a r x e u r a m e r i c a n a . T h e h a r v e s t e d p o p l a r w a s g r o u n d i n a W i l e y m i l l t o a b o u t 6 0 m e s h b e f o r e i s o l a t i n g t h e l i g n i n f o r u s e a s s u b s t r a t e i n b i o d e g r a d a t i o n s t u d i e s . T h e l i g n i n i s o l a t i o n w a s c a r r i e d o u t i n t h r e e s t e p s : ( 1 ) D i l u t e a c i d h y d r o l y s i s i n a p l u g fl o w r e a c t o r ; ( 2 ) T r e a t m e n t w i t h c e l l u l a s e ; a n d ( 3 ) E x h a u s t i v e e x t r a c t i o n a t 3 7 ° C w i t h i n c r e a s i n g l y p o l a r s o l v e n t s a n d s u b s e q u e n t r e h y d r a t i o n . T h e s e s t e p s a r e d e s c r i b e d i n t h e f o l l o w i n g s e c t i o n s . 4 . 1 . 1 A c i d H y d r o l y s i s P r e t r e a t m e n t D i l u t e a c i d h y d r o l y s i s p r e t r e a t m e n t o f N a t i v e ( u n t r e a t e d ) p o p l a r w a s p e r f o r m e d i n a h i g h t e m p e r a t u r e p l u g fl o w r e a c t o r s y s t e m a s d e s c r i b e d b y A l l e n e t a l . ( 1 9 8 3 ) . A s c h e m a t i c o f t h e r e a c t o r s y s t e m u s e d ( M B I H i g h T e m p e r a t u r e F l o w R e a c t o r , M i c h i g a n B i o t e c h n o l o g y I n s t i t u t e , L a n s i n g , M I ) i s s h o w n i n F i g u r e 4 . 1 . T h e r e a c t o r i s f e d f r o m a 2 0 L f e e d t a n k b y a M o y n o p u m p ( m o v i n g c a v i t y p o s i t i v e d i s p l a c e m e n t p u m p , R o b b i n s - M y e r , S p r i n g fi e l d , O H ) w i t h 1 8 s t a g e s , w h i c h w a s d e s i g n e d t o h a n d l e s l u r r i e s a t u p t o 1 6 5 0 p s i g a n d fl o w r a t e s f r o m 1 t o 8 L / m i n . T h e r e a c t o r i s c o n s t r u c t e d o f 0 . 5 " o . d . s t a i n l e s s s t e e l t u b i n g w i t h 0 . 0 4 8 ” w a l l t h i c k n e s s , w i t h a t o t a l r e a c t o r v o l u m e o f 1 9 0 . 1 m L . H i g h t e m p e r a t u r e s a r e a t t a i n e d b y t h e i n j e c t i o n o f s t e a m t h r o u g h a s e r i e s o f d r i l l h o l e s n e a r t h e i n l e t o f t h e r e a c t o r . A 1 m m o r i fi c e i s l o c a t e d n e a r t h e e n d o f t h e r e a c t o r a t w h i c h t h e r e a c t i o n m i x t u r e i s fl a s h e d f r o m r e a c t o r p r e s s u r e a n d t e m p e r a t u r e t o a t m o s p h e r i c p r e s s u r e ( a n d 1 0 0 ° C ) . T h e r e m a i n i n g s t e a m i s t h e n c o n d e n s e d a n d t h e p r e t r e a t e d s l u r r y c o l l e c t e d a t t h e r e a c t o r o u t l e t . T e m p e r a t u r e i s c o n t r o l l e d b y s t e a m a d d i t i o n , a n d r e s i d e n c e t i m e i s c o n t r o l l e d b y m a s s fl o w r a t e o f t h e s l u r r y i n c o n j u n c t i o n w i t h s t e a m a d d i t i o n . O p e r a t i n g p r e s s u r e i s t y p i c a l l y a b o u t 5 0 p s i a b o v e t h e s t e a m 4 5 H I G H T E M P E R A T U R E F L O W ' R E A C T O R //////////> f i % O R I F I C E 4 " } R E A C T O R I n ! : 5 . . . P R O D U C T ’ fi l ' C O O L E R > fi g ‘ I } . / ’ " ‘ H I X E ' a , , . " \ - . F E E D 0 \ , , = : \ 5 5 : ? ’ , C H E M I C A L I O { ’ 3 . ‘ M E T E R I N G \ ‘ s v l s l ’ . ” V , , l ‘ v ’ § ” T ’ / “ l l ‘ P R O D U C T , 1 ‘ 4 / 4 3 , 9 5 ” . . ’ ' : - P U M P H I G H P R E S S U R E B O I L E R s a x t / z a / a e F i g u r e 4 . 1 : S c h e m a t i c d i a g r a m o f t h e M B I H i g h T e m p e r a t u r e F l o w R e a c t o r . 4 7 s a t u r a t i o n p r e s s u r e a t t h e d e s i r e d r e a c t o r t e m p e r a t u r e . T h e p r e t r e a t m e n t w a s c a r r i e d o u t a t 2 2 0 ° C o n a 5 . 0 % ( w / v ) s l u r r y , w i t h t h e a d d i t i o n o f 1 . 0 w t . % H 2 8 0 4 . T h e n o m i n a l r e s i d e n c e t i m e f o r t h e p r e t r e a t m e n t w a s 7 . 3 s e c o n d s . T h e p r e t r e a t e d s l u r r y w a s t h e n w a s h e d f r e e o f a c i d a n d s o l u b i l i z e d c o m p o u n d s b y fi l t r a t i o n w i t h d i s t i l l e d w a t e r , c o l l e c t e d a n d s t o r e d a t 4 ° C a s a w e t fi l t e r c a k e . 4 . 1 . 2 C e l l u l o s e R e m o v a l W a t e r - i n s o l u b l e i s o l a t e d l i g n i n c o n t a i n i n g l i t t l e c a r b o h y d r a t e s w a s p r e p a r e d f r o m t h e p r e t r e a t e d p o p l a r b y c e l l u l o l y t i c h y d r o l y s i s . T h e e n z y m a t i c h y d r o l y s i s w a s c a r r i e d o u t i n S t o p p e r e d 2 5 0 m L E r l e n m e y e r fl a s k s w i t h c r u d e c e l l u l a s e p o w d e r f r o m T r i c h a d e r m a r e c r e i ( R u t g e r s C 3 0 , U S . A r m y N a t i c k R e s e a r c h a n d D e v e l o p m e n t C e n t e r , N a t i c k , M A ) w i t h a r e p o r t e d c e l l u l a s e a c t i v i t y o f 0 . 3 8 F P U / m g e n z y m e p o w d e r ( 0 . 4 0 8 F P U / m g d r y e n z y m e p o w d e r ) . I n a d d i t i o n , t h e c e l l u l a s e , w h i c h h a s v e r y l o w l e v e l s o f B - g l u c o s i d a s e , w a s s u p p l e m e n t e d w i t h N o v o z y m T N 1 8 8 , a l i q u i d B — g l u c o s i d a s e f r o m A s p e r g i l l a r n i g e r ( N o v o I n d u s t r i e s , D e n m a r k ) w i t h a B — g l u c o s i d a s e a c t i v i t y o f 5 8 8 U n i t s / m L . T h e B — g l u c o s i d a s e w a s a d d e d i n o r d e r t o m i n i m i z e c e l l o b i o s e a c c u m u l a t i o n , w h i c h i n h i b i t s t h e c e l l o b i o h y d r o l a s e a c t i v i t y o f t h e T . r e c r e i c e l l u l a s e c o m p l e x ( M a r s d e n a n d G r a y , 1 9 8 6 ) . H y d r o l y s i s w a s p e r f o r m e d a t t h e o p t i m u m c o n d i t i o n s ( M a r s d e n a n d G r a y , 1 9 8 6 ) o f 5 0 . 0 ° C a n d p H 4 . 8 0 . T h e r e a c t i o n m i x t u r e , p r e h e a t e d t o 5 0 ° C b y t h e t i m e o f e n z y m e a d d i t i o n , c o n s i s t e d o f c i t r a t e b u f f e r ( 5 0 m M , p H 4 . 8 0 ) , R u t g e r s C 3 0 c e l l u l a s e ( 4 0 . 8 F P U / g s u b s t r a t e ) , N o v o z y m T N 1 8 8 fl - g l u c o s i d a s e ( 4 0 . 8 U n i t s / g s u b s t r a t e ) , a n d 4 % ( w / v ) o v e n - d r i e d e q u i v a l e n t o f w e t s u b s t r a t e . S o d i u m a z i d e i s n o r m a l l y u s e d a s p r e s e r v a t i v e i n t h i s p r o c e d u r e , b u t n o n e w a s a d d e d s i n c e a z i d e s b i n d i r r e v e r s i b l y t o t h e h e m e g r o u p o f l i g n i n p e r o x i d a s e ( T i e n , 1 9 8 7 ) , a n d t h e fi n a l l i g n i n r e s i d u e w a s t o b e u s e d f o r l i g n i n p e r o x i d a s e a n d m a n g a n e s e p e r o x i d a s e d e g r a d a t i o n s t u d i e s . R e a c t i o n w a s c a r r i e d o u t a t 2 0 0 r p m i n a s h a k e r b a t h . H o m o g e n e o u s 2 m L s a r n p l e s w e r e w i t h d r a w n a t v a r i o u s t i m e s a n d q u e n c h e d b y a d d i n g 1 0 i t L o f 7 2 % H 2 8 0 4 4 8 ( t h i s s t o p s t h e r e a c t i o n b y p r e c i p i t a t i n g t h e c e l l u l a s e ) . T h e s a m p l e s w e r e t h e n n e u t r a l i z e d w i t h a s c o o p o f P b C O , ( p o w d e r , S i g m a ) , t h e i n s o l u b l e P b S O , w a s r e m o v e d b y fi l t r a t i o n , a n d t h e g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n w a s m e a s u r e d b y H P L C w i t h a B i o R a d H P X - 8 7 P C a r b o h y d r a t e c o l u m n . G l u c o s e y i e l d f r o m t h e e n z y m a t i c h y d r o l y s i s w a s c a l c u l a t e d a s t h e p e r c e n t o f p o t e n t i a l g l u c o s e i n t h e o r i g i n a l s a m p l e w h i c h w a s f o r m e d a s a r e s u l t o f t h e h y d r o l y s i s : % Y i e l d _ _ _ _ g r a m r g l u c o s e f o r m e d g r a m s p o t e n t i a l g l u c o s e x 1 0 0 ( 4 - 1 ) H y d r o l y s i s w a s c o n t i n u e d u n t i l n o i n c r e a s e i n y i e l d w a s m e a s u r e d i n c o n s e c u t i v e s a m p l e s ( a b o u t 4 8 h o u r s ) . A t t h e e n d o f t h e e n z y m a t i c h y d r o l y s i s , t h e s l u r r i e s f r o m a l l fl a s k s w e r e c o m b i n e d a n d t h e s o l i d s c o l l e c t e d b y fi l t r a t i o n o n W h a t m a n G F / D g l a s s fi b e r fi l t e r p a p e r . T h e fi l t e r c a k e w a s r e s u s p e n d e d i n d i s t i l l e d w a t e r , a c i d i fi e d w i t h 5 0 m M H 2 8 0 , ( t o p r e c i p i t a t e t h e c e l l u l a s e ) a n d w a s h e d f r e e o f a c i d a n d c e l l u l a s e b y fi l t r a t i o n w i t h 1 M N a C l , u n t i l t h e p H w a s o n c e a g a i n n e u t r a l a n d n o p r o t e i n w a s d e t e c t e d i n t h e fi l t r a t e , a s m e a s u r e d b y t h e B r a d f o r d M e t h o d ( B r a d f o r d , 1 9 7 6 ) . 4 . 1 . 3 S o l v e n t E x t r a c t i o n o f I s o l a t e d L i g n i n S o l v e n t e x t r a c t i o n o f t h e l i g n i n i s o l a t e d b y e n z y m a t i c h y d r o l y s i s w a s c a r r i e d o u t i n o r d e r t o r e m o v e s m a l l m o l e c u l a r w e i g h t l i g n i n f r a g m e n t s , i f a n y , p r o d u c e d d u r i n g t h e i n i t i a l p r e t r e a t m e n t i n t h e p l u g fl o w r e a c t o r ; t h i s w a s e x p e c t e d t o l e a v e a h i g h m o l e c u l a r w e i g h t , c o m p l e t e l y w a t e r - i n s o l u b l e l i g n i n r e s i d u e w h i c h r e s e m b l e d l i g n i n a s i t o c c u r s i n t h e l i g n o c e l l u l o s e m a t r i x . T h e e x t r a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t s e q u e n t i a l l y o n a 1 0 g r a m ( d r y w e i g h t ) b a t c h o f l i g n i n w h i c h w a s i n i t i a l l y s a t u r a t e d w i t h w a t e r . E a c h e x t r a c t i o n s t e p w a s e a r r i e d o u t i n a r e a g e n t b o t t l e w i t h 1 0 0 m L o f s o l v e n t p e r g r a m d r y w e i g h t o f l i g n i n . T h e b o t t l e w a s s e c u r e d o n i t s s i d e ( c a p p e d w i t h a t e fl o n l i n e d c a p ) o n a r o t a r y s h a k e r p l a t f o r m a t 3 7 ° C a n d 4 0 0 r p m f o r 3 0 — 4 0 m i n u t e s p e r e x t r a c t i o n s t e p . T h r e e e x t r a c t i o n s o l v e n t s w i t h i n c r e a s i n g p o l a r i t i e s ( c h l o r o f o r m , e t h y l a c e t a t e , a n d m e t h a n o l ) w e r e u s e d i n c o n s e c u t i v e e x t r a c t i o n s . T h e i n s o l u b l e l i g n i n w a s c o l l e c t e d a f t e r e a c h s t e p 4 9 b y fi l t r a t i o n o n W h a t m a n G F / C g l a s s fi b e r fi l t e r p a p e r . E x t r a c t i o n w i t h e a c h s o l v e n t o r s o l v e n t m i x t u r e w a s d e t e r m i n e d t o b e c o m p l e t e w h e n t h e s o l v e n t a f t e r e x t r a c t i o n w a s c o l o r l e s s a n d h a d n o a b s o r b a n c e a t 2 8 0 n m ( a b s o r b a n c e m a x i m u m f o r a r o m a t i c r i n g s ) . T h e o r d e r a n d n u m b e r o f e x t r a c t i o n S t e p s a r e S h o w n i n T a b l e 4 . 1 . A b o u t 3 . 6 % o f t h e d r y w e i g h t o f t h e s o l i d w a s r e m o v e d a s e x t r a c t a b l e m a t e r i a l i n t h e s e s t e p s ( s e e C h a p t e r V ) . 4 . 1 . 4 M e a s u r e m e n t o f S u b s t r a t e C o m p o s i t i o n s C a r b o h y d r a t e a n d l i g n i n c o m p o s i t i o n s w e r e d e t e r m i n e d u s i n g t h e Q u a n t i t a t i v e S a c c h a r i fi c a t i o n M e t h o d o f S a e m a n e t a l . ( 1 9 4 5 ) . I n t h i s p r o c e d u r e , l i g n o c e l l u l o s i c s a m p l e s w e r e s u b j e c t e d fi r s t t o h y d r o l y s i s w i t h 7 2 % H 2 8 0 , a t 3 0 ° C f o r o n e h o u r a n d s u b s e q u e n t l y w i t h 4 % H 2 8 0 , a t 1 2 1 ° C f o r o n e h o u r i n a n a u t o c l a v e . T h e r e m a i n i n g i n s o l u b l e p o r t i o n w a s d e fi n e d a s K l a s s o n l i g n i n w i t h e x t r a c t i v e s a n d a s h . T h e l i q u o r f r o m t h e h y d r o l y s i s w a s m e a s u r e d f o r c a r b o h y d r a t e s b y H P L C , u s i n g a B i o R a d H P X - 8 7 P C a r b o h y d r a t e c o l u m n . T h e p r o c e d u r e w a s a s f o l l o w s . T o b e g i n , 2 0 0 . 0 : 1 ; 2 0 . 0 m g o f g r o u n d , o v e n - d r i e d s a m p l e w a s w e i g h e d , t o t h e n e a r e s t 0 . 1 m g , i n t o a n 1 8 x 1 5 0 m m t e s t t u b e . T w o m i l l i l i t e r s o f 7 2 % ( w / w ) H 2 8 0 , w e r e t h e n a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s m i x e d t h o r o u g h l y w i t h a g l a s s s t i r - r o d ( w h i c h w a s l e f t i n t h e t u b e ) . T h e s a m p l e w a s t h e n p l a c e d i n a 3 0 ° C w a t e r b a t h f o r o n e h o u r a n d w a s m i x e d w i t h t h e s t i r r o d a t 1 0 , 2 0 a n d 4 0 m i n u t e s . A t t h e e n d o f o n e h o u r , t h e s a m p l e w a s t r a n s f e r r e d q u a n t i t a t i v e l y t o a 5 0 0 m L E r l e n m e y e r fl a s k u s i n g 2 8 m L o f d i s t i l l e d w a t e r p e r 1 m L o f 7 2 % H 2 8 0 , o r i g i n a l l y u s e d ( 5 6 m L o f d i s t i l l e d w a t e r ) . T h e fl a s k w a s t h e n c o v e r e d w i t h a l u m i n u m f o i l a n d a u t o c l a v e d f o r o n e h o u r a t 1 2 1 ° C . T h e a c i d i n s o l u b l e p o r t i o n w a s q u a n t i t a t i v e l y c o l l e c t e d b y fi l t r a t i o n o n a t a r e d 3 0 m L c o a r s e p o r o s i t y f r i t t e d g o o c h c r u c i b l e t o w h i c h a 1 . 2 u m p o r o s i t y W h a t m a n G F / C g l a s s fi b e r fi l t e r p a p e r d i s k h a d b e e n a d d e d t o i m p r o v e t h e fi l t r a t i o n r a t e a n d r e c o v e r y o f s m a l l p a r t i c l e s . S u b s e q u e n t d r y i n g o f t h e i n s o l u b l e p o r t i o n t o c o n s t a n t w e i g h t i n a 1 0 5 ° C o v e n , c o o l i n g i n a d e s i c c a t o r a n d w e i g h i n g y i e l d e d t h e m a s s o f K l a s s o n l i g n i n w i t h T E a x b t l a r e c t 4 i . o 1 n : s O r d r e e c r a o i f e d r r w e s o o l u v t e n c t o n e s x e t c r u a t c i t v i e o l s n y o p n e r a f o S r n i m g e l d e n o 0 1 g t h s e a m C p A e l H o f l t i h n g e i r n e r r e d s s u i e d . u e . 5 0 V o l u m e T o t a l E x t r a c t i o n W e i g h t o f N o . l i g n i n ( g ) S o l v e n t 1 S o l v e n t 2 R a t i o ( 1 : 2 ) V o l u m e 1 1 0 . 0 0 C H C l ; E t O A c ' 1 : 1 1 L 2 1 0 . 0 0 C H C 1 3 E t O A c 1 : 1 1 L 3 1 0 . 0 0 C H C 1 3 E t O A c 1 : 1 1 L 4 1 0 . 0 0 C H C 1 3 ' E t O A c 1 : 1 1 L 5 1 0 . 0 0 C H C l ; C H 3 0 H 1 : 2 1 L 7 1 0 . 0 0 C H C l ; C H 3 0 H 1 : 2 1 L 8 1 0 . 0 0 C H C l , C H 3 0 H 1 : 2 1 L 9 1 0 . 0 0 C H 3 0 H - - 1 0 0 % 1 L 1 0 1 0 . 0 0 C H 3 0 H D I H 2 0 3 : 1 1 L 1 1 1 0 . 0 0 C H 3 0 H D I H 2 0 1 : 1 1 L 1 2 1 0 . 0 0 C H 3 0 H D I H 2 0 1 : 3 1 L 1 3 1 0 . 0 0 D I H 2 0 - - 1 0 0 % 1 L 1 4 1 0 . 0 0 D I H 2 0 - - 1 0 0 % l L 1 5 1 0 . 0 0 D I H 2 0 - - 1 0 0 % 1 L 1 6 1 0 . 0 0 D I H 2 0 - - - 1 0 0 % 1 L 1 7 1 0 . 0 0 D I H 2 0 - - - 1 0 0 % 1 L 1 8 1 0 . 0 0 D I H 2 0 - - 1 0 0 % 2 L * E t O A c = E t h y l A c e t a t e 5 1 e x t r a c t i v e s a n d a s h . T h e l i q u o r f r o m t h e h y d r o l y s i s w a s q u a n t i t a t i v e l y d i l u t e d w i t h d i s t i l l e d w a t e r t o 1 0 0 . 0 0 : 1 ; 0 . 0 8 m L i n a v o l u m e t r i c fl a s k . T w e n t y m i l l i l i t e r s o f t h i s s o l u t i o n w e r e t h e n s t o r e d i n a l e a k - p r o o f p o l y e t h y l e n e b o t t l e a t 4 ° C f o r f u r t h e r a n a l y s i s . D e t e r m i n a t i o n s o f t h e c a r b o h y d r a t e c o n c e n t r a t i o n s i n t h e d i l u t e d h y d r o l y s i s l i q u o r w e r e m a d e b y H P L C u s i n g a B i o R a d H P X - 8 7 P c o l u m n . D e g a s s e d H P L C - g r a d e w a t e r ( f r o m a M i l l i p o r e d e i o n i z i n g s y s t e m ) w a s u s e d a s e l u e n t . C o n d i t i o n s f o r t h e c h r o m a t o g r a p h y w e r e 0 . 5 0 0 m L / m i n a n d 7 0 ° C . T h e c o l u m n s y s t e m c o n s i s t e d o f c a r b o h y d r a t e d e a s h i n g s y s t e m ( B i o R a d , H o l d e r C a t . N o . 1 2 5 - 0 1 3 9 , C a r t r i d g e s C a t . N o . 1 2 5 - 0 1 1 8 ) a n d a G C 6 2 0 G u a r d C o l u m n S y s t e m ( I n t e r a c t i o n C h e m i c a l s ) w h i c h c o n t a i n e d a l e a d - b a s e d i o n - e x c h a n g e r e s i n s i m i l a r t o t h a t o f t h e c h r o m a t o g r a p h y c o l u m n . S a m p l e s w e r e p r e p a r e d b y fi r s t n e u t r a l i z i n g 3 m L w i t h a s c o o p o f P b C O 3 ( p o w d e r f o r m , F i s h e r S c i e n t i fi c ) , c e n t r i f u g i n g f o r 3 m i n a t 1 4 , 0 0 0 r p m a n d fi l t e r i n g t h e s u p e r n a t a n t t h r o u g h a 0 . 4 5 p m s y r i n g e fi l t e r i n t o a n a u t o i n j e c t o r v i a l . C o n c e n t r a t i o n s d e t e r m i n e d b y H P L C w e r e c o r r e c t e d f o r r e c o v e r y l o s s e s i n c u r r e d d u r i n g t h e h i g h t e m p e r a t u r e s t e p b y p e r f o r m i n g a n a d d i t i o n a l e x p e r i m e n t t o d e t e r m i n e t h e r e c o v e r i e s o f t h e v a r i o u s w o o d s u g a r s w h e n s u b j e c t e d t o t h i s s t e p i n m o n o m e r f o r m . I n t h i s r e c o v e r y e x p e r i m e n t , s o l i d s a m p l e s c o n t a i n i n g a l l fi v e w o o d s u g a r s w e r e s u b j e c t e d t o t h e a u t o c l a v e s t e p o f t h e p r o c e d u r e a n d t h e n t r e a t e d a s n o r m a l l i g n o c e l l u l o s i c s a m p l e s . T h e f r a c t i o n a l r e c o v e r i e s w e r e t h e n d e fi n e d a s : w h e r e R , i s t h e f r a c t i o n a l r e c o v e r y o f s u g a r i , m m i s t h e m a s s o f s u g a r i r e c o v e r e d f r o m t h e e x p e r i m e n t ( m e a s u r e d b y H P L C ) , a n d i n , i i s t h e m a s s o f s u g a r 1 ' i n i t i a l l y p r e s e n t i n t h e s a m p l e . I n a d d i t i o n , i n p o l y m e r i c f o r m , w o o d c a r b o h y d r a t e s a r e p r e s e n t a s a n h y d r o - m o n o m e r s , s o t o c o m p l e t e t h e m a t e r i a l b a l a n c e , t h e m a s s o f e a c h s u g a r m u s t b e 5 2 m u l t i p l i e d b y a " p o l y m e r i z a t i o n f a c t o r ” , a s d e fi n e d b e l o w : F = ( M W , - M W , ) , ( 4 3 ) M W . w h e r e F , i s t h e p o l y m e r i z a t i o n f a c t o r f o r s u g a r i , M W , i s t h e m o l e c u l a r w e i g h t o f s u g a r i , a n d M W . i s t h e m o l e c u l a r w e i g h t o f w a t e r . F o r a n y w o o d s u g a r , t h e n , t h e p o t e n t i a l a m o u n t i n t h e o r i g i n a l s a m p l e , e x p r e s s e d a s a p e r c e n t , i s : w e , ( 4 - 4 ) W K : P , = w h e r e P , i s t h e p e r c e n t p o t e n t i a l s u g a r i , C , i s t h e d i l u t e d l i q u o r c o n c e n t r a t i o n ( g / L ) o f s u g a r i , a n d W i s t h e m a s s o f o r i g i n a l l i g n o c e l l u l o s i c s a m p l e ( g ) . R , i s u s e d a s d e fi n e d i n e q u a t i o n ( 4 - 2 ) ; n o t e t h a t R , m u s t b e b e t w e e n 0 a n d 1 . I t S h o u l d a l s o b e n o t e d t h a t s i n c e t h e P , v a l u e s a r e b a s e d o n t h e m a s s e s o f t h e i r f r e e s u g a r s a n d n o t t h e i r a n h y d r o - f o r m s , t h e m a t e r i a l b a l a n c e n e e d n o t s u m t o 1 0 0 % o r l e s s . T h e c a r b o h y d r a t e c o n t e n t s , e x p r e s s e d i n t h e i r a n h y d r o - f o r m s ( f o r e x a m p l e , g l u c a n i n s t e a d o f g l u c o s e ) , a r e t h e n : P m = 1 0 , 1 7 , ( 4 - 5 ) w h e r e P “ , i s t h e p e r c e n t p o t e n t i a l s u g a r m o n o m e r i , a n d F , a n d P , a r e a s d e fi n e d i n t h e a b o v e e q u a t i o n s , r e s p e c t i v e l y . T h e v a l u e s o f P W , t h e n , m u s t s u m t o 1 0 0 % o r l e s s . W h e n c o m b i n e d w i t h t h e p e r c e n t l i g n i n w i t h e x t r a c t i v e s a n d a s h , c a l c u l a t e d b y d i v i d i n g t h e m a s s o f t h e a c i d i n s o l u b l e f r a c t i o n b y t h e i n i t i a l s a m p l e m a s s a n d m u l t i p l y i n g b y 1 0 0 % , t h e s e v a l u e s c o m p l e t e t h e m a t e r i a l b a l a n c e ( n e g l e c t i n g u r o n i c a c i d c o n t e n t a n d r e c o v e r y e r r o r s ) . 5 3 4 . 2 E n z y m e P r e p a r a t i o n L I P a n d M N P e n z y m e s u s e d i n t h i s s t u d y w e r e i s o l a t e d f r o m t h e e x t r a c e l l u l a r fl u i d f r o m n i t r o g e n - l i m i t e d s h a k e fl a s k c u l t u r e s o f P h a n e r o c h a e t e c h r y r a r p a r i w n , S t r a i n B K M — F - 1 7 6 7 ( A T C C 2 4 7 2 5 ) o b t a i n e d f r o m t h e l a b o r a t o r y o f D r . C . A . R e d d y , D e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y a n d P u b l i c H e a l t h , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y . 4 . 2 . 1 C u l t u r e M a i n t e n a n c e S t o c k c u l t u r e s w e r e m a i n t a i n e d ( T i e n a n d K i r k , 1 9 8 8 ) o n m a l t a g a r e x t r a c t s l a n t s , p H 4 . 5 , a t 4 ° C . T h e m a l t a g a r m e d i a c o n t a i n e d 2 % ( w / v ) a g a r ( D i f c o B a c t o a g a r ) , 1 % ( w / v ) m a l t e x t r a c t ( D i f c o ) , 5 5 . 5 m M g l u c o s e , 1 4 . 7 0 m M K H 2 P 0 4 , 4 . 0 5 7 m M M g S O , , 6 . 6 6 m M L - a s p a r a g i n e , 2 . 8 1 u M t h i a m i n e h y d r o c h l o r i d e , 1 % ( w / v ) m a l t e x t r a c t , 0 . 2 % ( w / v ) p e p t o n e ( D i f c o ) , a n d 0 . 2 % ( w / v ) y e a s t e x t r a c t ( D i f c o ) . T h e S l a n t c u l t u r e s w e r e s u b c u l t u r e d e v e r y 4 t o 6 m o n t h s b y a d d i n g 3 m L o f s t e r i l e w a t e r t o t h e o l d s l a n t , s c r a p i n g t h e s u r f a c e o f t h e a g a r t o s u s p e n d t h e c o n i d i o s p o r e s , a n d i n o c u l a t i n g a n e w s l a n t w i t h o n e l o o p f u l o f t h e s u s p e n s i o n . T h e n e w s l a n t w a s t h e n i n c u b a t e d f o r 4 t o 5 d a y s a t 3 7 ° c a n d t h e n s t o r e d a t 4 ° C . ' F r o z e n c o n i d i o s p o r e s t o c k s w e r e p r e p a r e d f o r i n o c u l a t i o n o f s t a t i o n a r y s t a r t e r c u l t u r e s . T h i s w a s d o n e b y a d d i n g 3 m L o f s t e r i l e w a t e r t o a s t o c k s l a n t , s c r a p i n g t h e s u r f a c e o f t h e a g a r t o s u s p e n d t h e c o n i d i o s p o r e s , a n d p l a t i n g o u t 0 . 2 m L o f t h e s u s p e n s i o n o n t o a p l a t e c o n t a i n i n g i d e n t i c a l m e d i a . A f t e r i n c u b a t i o n f o r 4 t o 6 d a y s a t 3 7 ° C , c o n i d i o s p o r e s w e r e h a r v e s t e d b y a d d i n g 5 m L o f s t e r i l e w a t e r t o t h e p l a t e a n d s c r a p i n g t h e s u r f a c e o f t h e a g a r t o s u s p e n d t h e c o n i d i o s p o r e s . T h e c o n i d i a ] s u s p e n s i o n w a s t h e n fi l t e r e d t h r o u g h s t e r i l e g l a s s w o o l t o r e m o v e m y c e l i a , a n d t h e a b s o r b a n c e a t 6 5 0 n m w a s m e a s u r e d ( 1 O D i s e q u i v a l e n t t o 5 x 1 0 ° c o n i d i o s p o r e s / m L ) . T h e s u s p e n s i o n w a s t h e n d i l u t e d t o 1 5 - 2 0 O D w i t h s t e r i l e w a t e r , d i s p e n s e d t o S t e r i l e c u l t u r e t u b e s , a n d f r o z e n a t - 2 0 ° C . 5 4 4 . 2 . 2 C u l t u r e C o n d i t i o n s E n z y m e p r o d u c t i o n r u n s w e r e c a r r i e d o u t , u s i n g a s e p t i c t e c h n i q u e s , a t 3 7 ° C i n a g i t a t e d a c e t a t e - b u f f e r e d , n i t r o g e n - l i m i t e d c u l t u r e w i t h g l u c o s e a s c a r b o n s o u r c e a s d e s c r i b e d b y T i e n a n d K i r k ( 1 9 8 8 ) . T h e d e fi n e d c u l t u r e m e d i u m c o n t a i n e d 1 . 0 9 m M d i a m m o n i u m t a r t r a t e a s t h e n i t r o g e n s o u r c e a n d 5 5 . 5 m M g l u c o s e a s t h e c a r b o n s o u r c e . T h e m e d i a a l s o c o n t a i n e d 1 4 . 7 0 m M K H Z P O 4 , 5 . 9 0 m M M g S O , , 0 . 9 0 0 m M C a C l z , 2 . 8 1 u M t h i a m i n e h y d r o c h l o r i d e , 0 . 5 g / L T w e e n 8 0 ( n o t a d d e d i n s t a t i o n a r y s t a r t e r c u l t u r e s ) , 2 0 . 0 m M a c e t a t e ( p H 4 . 5 0 ) a n d 0 . 4 m M v e r a t r y l a l c o h o l ( V A ) . T h e f o l l o w i n g t r a c e e l e m e n t s w e r e a l s o a d d e d : 0 . 5 0 0 m M n i t r i l o a c e t a t e t r i s o d i u m s a l t , 1 . 2 0 m M N a C l , 2 5 . 2 t t M F e S O . , 5 3 . 0 1 1 M C o C 1 2 , 2 4 . 3 1 4 M Z n S O , , 4 . 3 7 t t M C u S O 4 , 1 . 4 8 1 1 M A l K ( S O 4 ) 2 , 1 1 . 3 t t M H 3 B 0 3 , a n d 2 . 8 9 1 1 M N a , M o O , . D e p e n d i n g o n t h e e n z y m e m i x t u r e d e s i r e d , M n ( I I ) w a s a d d e d ( a s M n S O , ) t o t h e s h a k e fl a s k c u l t u r e s i n v a r i o u s a m o u n t s , a s f o l l o w s : ( 1 ) L I P S o n l y , n o M n ( I I ) a d d e d ( d e n o t e d ” D 5 N o M n " ) ; a n d ( 2 ) M N P S o n l y , 1 0 0 . 0 p p m o f M n ( I I ) a d d e d ( d e n o t e d ” D 4 H i M n " ) . T h e s t a r t e r c u l t u r e s a l w a y s c o n t a i n e d 1 1 . 5 p p m o f M n ( I I ) ( T i e n a n d K i r k , 1 9 8 8 ) . 4 . 2 . 3 E n z y m e P r o d u c t i o n P r o c e d u r e S t a t i o n a r y s t a r t e r c u l t u r e s w e r e b e g u n b y m e a s u r i n g 7 5 m L o f s t e r i l e m e d i a i n t o a s t e r i l e 1 5 0 0 m L F e m b a c h fl a s k a n d i n o c u l a t i n g t o 0 . 1 5 O D w i t h f r o z e n c o n i d i o s p o r e s t o c k ( p r e p a r e d a s d e s c r i b e d a b o v e ) a n d g e n t l y m i x i n g , t a k i n g c a r e n o t t o s p l a s h t h e t h i n l a y e r o f l i q u i d o n t o t h e s i d e s o f t h e fl a s k . T h e fl a s k s w e r e t h e n s t o p p e r e d w i t h a s t e r i l e s t o p p e r o f g l a s s w o o l c o v e r e d w i t h c h e e s e c l o t h , s e a l e d w i t h t h r e e l a y e r s o f p a r a fi l m t o p r e v e n t e x c e s s i v e e v a p o r a t i o n , a n d i n c u b a t e d f o r 2 4 - 4 8 h o u r s a t 3 7 ° C . T h e m y c e l i a l m a t p r o d u c e d w a s t h e n h o m o g e n i z e d i n a s t e r i l e h o m o g e n i z e r c u p ( C a t . N o . 6 3 0 1 0 0 0 1 0 C , V i r t i s , G a r d i n e r , N Y ) a n d u s e d a s i n o c u l u m f o r t h e s h a k e fl a s k c u l t u r e . T o b e g i n a s h a k e fl a s k c u l t u r e , 8 1 m L o f s t e r i l e m e d i a c o n t a i n i n g t h e d e s i r e d M n ( I I ) c o n c e n t r a t i o n w e r e d i s p e n s e d i n t o s t e r i l e 2 5 0 m L r u b b e r s t o p p e r e d E r l e n m e y e r fl a s k s . 9 m L o f h o m o g e n i z e d m y c e l i a f r o m t h e s t a r t e r c u l t u r e w e r e t h e n a d d e d t o t h e 5 5 fl a s k . T h e h e a d s p a c e ( 1 6 0 m L ) w a s fl u s h e d i n i t i a l l y a n d t h e n e v e r y 2 4 h o u r s w i t h p u r e o x y g e n f o r a p p r o x i m a t e l y 3 m i n u t e s a t a fl o w r a t e o f 1 L / m i n . T h e fl a s k s w e r e a g i t a t e d a t 1 7 5 r p m o n a r o t a r y S h a k e r t a b l e ( N e w B r u n s w i c k G y r o t o r y G - 1 0 ) w i t h a n e c c e n t r i c i t y o f 2 . 5 c m . T h e c u l t u r e s w e r e h a r v e s t e d e i t h e r o n d a y 4 o r d a y 5 , d e p e n d i n g o n t h e e n z y m e m i x t u r e b e i n g p r o d u c e d a n d t h e l e v e l o f e n z y m e a c t i v i t y o n t h a t d a y : ( 1 ) L I P S o n l y , d a y 5 ( D 5 N o M n ) ; a n d ( 2 ) M N P S o n l y , d a y 4 ( D 4 H i M n ) . O n l y o n e r u n ( 7 0 fl a s k s ) w a s n e c e s s a r y f o r t h e D 4 H i M n c u l t u r e s , S i n c e t h e M N P a c t i v i t y w a s a b o u t 3 t i m e s t h e e x p e c t e d l e v e l s . F o r t h e D 5 N o M n c u l t u r e s , h o w e v e r , t h e L I P a c t i v i t y w a s a b o u t 3 0 % o f t h e e x p e c t e d l e v e l s , a n d m a n y fl a s k s p r o d u c e d s i g n i fi c a n t l e v e l s o f M N P , p r o b a b l y d u e t o c o n t a m i n a t i n g M n ( I I ) p r e s e n t i n t h e d i s t i l l e d ( t a p ) w a t e r . T h u s , f u t u r e D 5 N o M n c u l t u r e m e d i a w a s m a d e u p w i t h d e i o n i z e d / d i s t i l l e d w a t e r f r o m a M i l l i p o r e d e i o n i z i n g fi l t e r s y s t e m . T h e L I P l e v e l s w e r e s t i l l l o w , h o w e v e r , s o s e v e n s e t s o f 7 0 fl a s k s e a c h w e r e r u n . E a c h fl a s k w a s a s s a y e d o n d a y 5 f o r M N P a c t i v i t y , a n d o n l y fl a s k s c o n t a i n i n g l e s s t h a n 1 0 0 U / L o f M N P ( b y M N P A s s a y # 1 ) w e r e k e p t . A l l r e m a i n i n g fl a s k s w e r e c o m b i n e d a n d s t o r e d f o r l a t e r c o n c e n t r a t i o n . T h e e x t r a c e l l u l a r fl u i d ( E F ) f r o m e a c h t y p e o f c u l t u r e w a s c o l l e c t e d a n d s t o r e d f r o z e n a t - 2 0 ° C u n t i l a l l p r o d u c t i o n r u n s f o r t h e d e s i r e d e n z y m e w e r e c o m p l e t e d . T h e b o t t l e s o f E F w e r e t h e n t h a w e d a n d fi l t e r e d t h r o u g h w e t c h e e s e c l o t h t o r e m o v e e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e s ( p r e c i p i t a t e d d u e t o f r e e z i n g ) . T h e B F w a s t h e n c o n c e n t r a t e d b y u l t r a fi l t r a t i o n i n t w o s t e p s . T h e fi r s t s t e p w a s d o n e w i t h a n A m i c o n M o d e l S l - 1 0 S p i r a l - W o u n d U l t r a fi l t r a t i o n C a r t r i d g e w i t h a P M m e m b r a n e ( 1 0 , 0 0 0 M W C O ) i n o r d e r t o r e d u c e t h e v o l u m e o f t h e E F f r o m 6 . 3 L t o a b o u t 3 0 0 m L f o r t h e D 4 H i M n E F , a n d f r o m 4 0 L t o a b o u t 3 0 0 m L f o r t h e D 5 N o M n E F . T h e 3 0 0 m L r e m a i n i n g f o r e a c h c a s e w e r e t h e n c o n c e n t r a t e d t o 2 0 - 3 0 m L i n a 5 0 0 m L b a t c h u l t r a fi l t r a t i o n a p p a r a t u s ( A m i c o n ) , a l s o w i t h a 1 0 , 0 0 0 M W C O P M - t y p e m e m b r a n e , a n d u s i n g N , g a s a t 6 0 p s i g a s d r i v i n g f o r c e f o r t h e u l t r a fi l t r a t i o n . B o t h c o n c e n t r a t e s w e r e t h e n d i a l y z e d t w i c e a t a r a t i o o f 4 0 0 0 m L o f b u f f e r p e r 2 0 - 3 0 m L o f c o n c e n t r a t e ( 1 3 3 : 1 ) 5 6 u s i n g 6 0 0 0 - 8 0 0 0 M W C O d i a l y s i s t u b i n g ( C a t N o . 1 3 2 7 0 3 , S p e c t r u m M e d i c a l I n d u s t r i e s , L o s A n g e l e s , C A ) . T h e fi r s t d i a l y s i s w a s d o n e w i t h 1 0 m M s o d i u m a c e t a t e a t p H 7 . 0 , w h i l e t h e s e c o n d w a s w i t h 5 m M p h o s p h a t e b u f f e r , p H 6 . 0 ( b e t t e r f o r s t o r a g e o f t h e e n z y m e ) . A l i q u o t s o f t h e d i a l y z e d c o n c e n t r a t e s w e r e t h e n p i p e t t e d t o E p p e n d o r f t u b e s , c a p p e d , a n d s t o r e d f r o z e n a t - 2 0 ° C f o r f u t u r e u s e i n k i n e t i c s t u d i e s , t e m p e r a t u r e a n d p H s t a b i l i t y s t u d i e s , F P L C p r o fi l e s , a n d i n v i t r a r e a c t o r r u n s . 4 . 2 . 4 E n z y m e A c t i v i t y A s s a y s L I P a c t i v i t y w a s d e t e r m i n e d b y s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y m e a s u r i n g t h e r a t e o f f o r m a t i o n o f v e r a t r a l d e h y d e f r o m v e r a t r y l a l c o h o l a t p H 2 . 5 , r o o m t e m p e r a t u r e ( 2 3 ° C ) a n d a t a w a v e l e n g t h o f 3 1 0 n m a s d e s c r i b e d b y T i e n a n d K i r k ( 1 9 8 8 ) . O n e U / L o f L I P a c t i v i t y i s t h e n d e fi n e d a s o n e p m o l e o f v e r a t r a l d e h y d e f o r m e d p e r l i t e r p e r m i n u t e a t t h e s e c o n d i t i o n s , u s i n g a n e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t o f 9 3 0 0 M ‘ 1 c m " . A d e t a i l e d d e s c r i p t i o n o f t h i s a s s a y i s g i v e n i n A p p e n d i x A ( L I P A s s a y ) . , M N P a c t i v i t y w a s m e a s u r e d a s d e s c r i b e d b y K u w a h a r a e t a l . ( 1 9 8 4 ) a n d M i c h e l e t a l . ( 1 9 9 1 ) a t 3 0 ° C , p H 4 . 5 , a n d a w a v e l e n g t h o f 6 1 0 n m . T h e r e a c t i o n t i m e w a s 4 m i n u t e s , a n d s a m p l e v o l u m e s o f 2 0 o r 4 0 p L w e r e u s e d . T o s t o p t h e r e a c t i o n , 4 0 t t L o f 2 N N a O H w e r e a d d e d , b r i n g i n g t h e t o t a l v o l u m e t o 1 . 0 6 o r 1 . 0 8 m L , d e p e n d i n g o n t h e s a m p l e v o l u m e . O n e U / L i s t h e n d e fi n e d a s o n e p m o l e o f p h e n o l r e d o x i d i z e d p e r l i t e r p e r m i n u t e , u s i n g a n e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t ( M i c h e l e t a l . , 1 9 9 1 ) o f 4 4 6 0 M " c m “ . A d e t a i l e d d e s c r i p t i o n o f t h i s a s s a y i s g i v e n i n A p p e n d i x A ( M N P A s s a y # 1 ) . M N P w a s a l s o a s s a y e d b y f o l l o w i n g t h e o x i d a t i o n o f p h e n o l r e d a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d a w a v e l e n g t h o f 5 3 0 n m . I n t h i s a s s a y ( O l s e n e r a l . , 1 9 9 1 ) , i n s t e a d o f l e t t i n g t h e r e a c t i o n g o f o r 4 m i n u t e s a n d t h e n s t o p p i n g i t w i t h N a O H , w h i c h c h a n g e s t h e c o l o r f o r m e a s u r e m e n t a t 6 1 0 n m , t h e a b s o r b a n c e c h a n g e i s t r a n s i e n t l y m e a s u r e d a t 5 3 0 n m . F o r t h i s a s s a y , o n e U / L i s d e fi n e d a s a n i n c r e a s e o f o n e a b s o r b a n c e u n i t p e r m i n u t e p e r l i t e r o f s a m p l e v o l u m e . A d e t a i l e d d e s c r i p t i o n o f t h i s a s s a y i s g i v e n i n A p p e n d i x A ( M N P A s s a y # 2 ) . M e a s u r e m e n t o f M N P b y t h i s a s s a y w a s n e c e s s a r y t o d e t e r m i n e 5 7 M n ( I I ) c o n c e n t r a t i o n s f o r t h e i n v i t r a s t u d i e s ( d e s c r i b e d l a t e r ) . M e a s u r e m e n t o f i d e n t i c a l s a m p l e s w i t h b o t h a s s a y s g a v e a r e l a t i o n s h i p o f 2 . 0 8 U ( M N P A s s a y # 2 ) p e r 1 U ( M N P A s s a y # 1 ) . 4 . 2 . 5 F P L C P r o f i l e s L I P a n d M N P i s o e n z y m e p r o fi l e s f o r e a c h e n z y m e m i x t u r e w e r e d e t e r m i n e d b y F P L C w i t h a P h a r r n a c i a F P L C S y s t e m ( P h a r m a c i a , P i s c a t a w a y , N J ) . T h e s y s t e m c o n s i s t e d o f a L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y C o n t r o l l e r L C C - 5 0 0 P l u s , t w o P - 5 0 0 p u m p s , a m i x e r , M o t o r V a l v e M V - 7 , M o n o Q C o l u m n , S i n g l e P a t h M o n i t o r U V - l , a n d F r a c t i o n C o l l e c t o r F R A C - 1 0 0 . T h e c h r o m a t o g r a p h y w a s p e r f o r m e d a t 2 3 ° C , a fl o w r a t e o f 1 m L / m i n , a p H 4 . 5 s o d i u m a c e t a t e g r a d i e n t f r o m 1 0 m M t o 1 M , a n d a c o l u m n l o a d i n g o f 2 0 0 p g o f p r o t e i n . P r o fi l e s w e r e m o n i t o r e d b y t h e a b s o r b a n c e a t 4 0 9 n m ( m a x i m u m a b s o r b a n c e w a v e l e n g t h f o r t h e h e m e g r o u p ) w i t h a c h a r t r e c o r d e r o v e r t h e c o u r s e o f t h e r u n . F r a c t i o n s w e r e c o l l e c t e d a n d a s s a y e d f o r L I P a n d M N P a c t i v i t y i n o r d e r t o a s s i g n e a c h p e a k i n t h e F P L C c h r o m a t o g r a r n . P e r c e n t a g e s o f e a c h i s o e n z y m e w e r e d e t e r m i n e d u s i n g p e a k a r e a s . S i n c e n o o n - l i n e d a t a s y s t e m w a s a v a i l a b l e t o s t o r e t h e C h r o m a t o g r a m s , p e a k a r e a s w e r e m e a s u r e d b y c u t t i n g o u t t h e p e a k s o n a c o p y o f t h e c h a r t r e c o r d e r p r i n t o u t a n d w e i g h i n g t h e m . 4 . 3 I n v i t r o R e a c t o r S y s t e m A s m a l l - s c a l e r e a c t o r s y s t e m f o r t h e i n v i t r a t r e a t m e n t o f w a t e r - i n s o l u b l e l i g n i n w i t h l i g n i n p e r o x i d a s e s a n d m a n g a n e s e p e r o x i d a s e s w a s d e v e l o p e d w h i c h w a s d e s i g n e d t o r e g u l a t e t h e c o n c e n t r a t i o n s o f H 2 0 , a n d v e r a t r y l a l c o h o l ( V A ) i n c o n t a c t w i t h t h e p e r o x i d a s e s o v e r l o n g p e r i o d s o f t i m e ( 6 t o 1 2 h o u r s ) . A n u m b e r o f i m p o r t a n t p o i n t s w e r e c o n s i d e r e d i n t h e d e v e l o p m e n t o f t h e r e a c t o r ; t h e y a r e r e s t a t e d h e r e f o r c o n v e n i e n c e : ( 1 ) H 2 0 , a n d V A a r e r e q u i r e d f o r t h e d e g r a d a t i o n o f l i g n i n b y L I P ( T i e n , 1 9 8 7 ; B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ; d e J o n g e t a l . , 1 9 9 4 ) ; ( 2 ) H 2 0 2 i n a c t i v a t e s t h e e n z y m e o v e r t i m e ( T i e n , 1 9 8 7 ; H a m m e l e t a l . , 1 9 9 3 ; d e J o n g e t a l . , 1 9 9 4 ) ; ( 3 ) H 2 0 , c o m p e t i t i v e l y i n h i b i t s t h e o x i d a t i o n o f V A t o v e r a t r a l d e h y d e ( T i e n e r a l . , 1 9 8 6 ) ; ( 4 ) t h e 5 8 p e r o x i d a s e s o f P . c h r y r a r p a r i u m a r e d i f fi c u l t t o o b t a i n i n l a r g e q u a n t i t i e s , s o o n l y s m a l l a m o u n t s o f e n z y m e w o u l d b e a v a i l a b l e f o r u s e ; a n d ( 5 ) d e g r a d a t i o n o f i n s o l u b l e l i g n i n h a s b e e n s h o w n t o b e v e r y S l o w a s c o m p a r e d t o t h e o x i d a t i o n r a t e s f o r w a t e r - s o l u b l e l i g n i n m o d e l c o m p o u n d s ( T i e n , 1 9 8 7 ) . T h e s y s t e m d e v e l o p e d w a s a s m a l l d i a l y s i s r e a c t o r w h i c h w o u l d t r a n s i e n t l y s u p p l y H 2 0 2 a n d V A t o t h e r e a c t i o n a t c o n t r o l l a b l e r a t e s ( s e e C h a p t e r I I I f o r t h e r a t i o n a l e b e h i n d t h i s c h o i c e ) . T h i s s y s t e m i s d e s c r i b e d b e l o w . T h e d i a l y s i s r e a c t o r w h i c h w a s c o n s t r u c t e d f o r t h e i n v i t r a l i g n i n d e g r a d a t i o n e x p e r i m e n t s i s d e p i c t e d i n F i g u r e s 4 . 2 a n d 4 . 3 . T h e r e a c t o r w a s c o n s t r u c t e d i n t w o h a l v e s , h e l d t o g e t h e r a t a g r o u n d g l a s s j o i n t b y a m e t a l p i n c h - t y p e c l a m p ( C a t . N o . C 6 1 2 1 - 2 , B a x t e r S c i e n t i fi c , M c G a w P a r k , I L ) . B o t h c h a m b e r s o f t h e r e a c t o r ( S i d e A , r e a c t a n t r e s e r v o i r , a n d S i d e B , r e a c t i o n c h a m b e r ) w e r e c o n s t r u c t e d w i t h a s a m p l i n g p o r t f o r a d d i t i o n o f p u l s e s a n d r e c o v e r y o f s o l u t i o n s . T h e s a m p l i n g p o r t s w e r e t h r e a d e d s o t h a t t h e y c o u l d b e c l o s e d w i t h o p e n - h o l e v i a l c a p s s e a l e d w i t h t e fl o n - f a c e d r u b b e r s e p t a . T h e t w o c h a m b e r s w e r e s e p a r a t e d b y a 6 0 0 0 - 8 0 0 0 M W c u t o f f ( p o r e s s m a l l e r t h a n L I P o r M N P e n z y m e s a n d l i g n i n p a r t i c l e s ) d i a l y s i s m e m b r a n e ( S p e c t r a / P a r D i a l y s i s D i s c s , N o . 1 3 2 4 7 8 , S p e c t r u m M e d i c a l I n d u s t r i e s , L o s A n g e l e s , C A ) w i t h a n a v e r a g e w e t m e m b r a n e t h i c k n e s s o f 6 1 . 3 6 a m ( m e a s u r e d ) . T h e v o l u m e o f e a c h c h a m b e r w a s a p p r o x i m a t e l y 2 . 0 m L , w i t h a n 0 . 5 3 0 0 c m d i a m e t e r o p e n i n g b e t w e e n t h e c h a m b e r s , g i v i n g a n a r e a a v a i l a b l e f o r t r a n s p o r t o f 0 . 2 2 0 6 c m ’ . A r e a c t o r h o l d e r w a s c r a f t e d f r o m a N o . 1 3 r u b b e r S t o p p e r s o t h a t t h e r e a c t o r w o u l d fi t s n u g l y i n t o a 1 2 5 m L E r l e n m e y e r fl a s k c l a m p o n t h e p l a t f o r m o f a r e c i p r o c a l s h a k e r f o r a g i t a t i o n p e r p e n d i c u l a r t o t h e p l a n e o f t h e m e m b r a n e . T h e h e a d s p a c e ( a b o u t 1 m L ) o f S i d e B w a s s e t u p t o b e c o n t i n u o u s l y fl u s h e d w i t h h u m i d i fi e d 1 0 0 % 0 , t h r o u g h a n 1 8 g a u g e n e e d l e i n s e r t e d t h r o u g h t h e s e p t u m , a n d v e n t e d t o t h e a t m o s p h e r e t h r o u g h a n o t h e r 1 8 g a u g e n e e d l e ; t h e O , w a s h u m i d i fi e d a t 3 7 ° C b y b u b b l i n g i t t h r o u g h w a t e r a n d t h e n t h e fl o w w a s m e t e r e d t o t h e r e a c t o r s w i t h v a r i a b l e a r e a r o t a m e t e r s ( C a t N o . L - 0 3 2 1 6 - 0 0 , C o l e P a r m e r , N i l e s , I L ) . A l s o n o t e t h a t t h e r e a c t o r h a l v e s w e r e s i l a n i z e d ( W a t s o n , 1 9 8 5 ) p r i o r t o u s e t o p r e v e n t 5 9 S i d e A ( r e s e r v o i r ) 1 r e l l i q u i d . . A g i t a t i o n D i r e c t i o n F i g u r e 4 . 2 : S c h e m a t i c d i a g r a m o f t h e d i a l y s i s r e a c t o r . F i g u r e 4 . 3 : P h o t o g r a p h o f a n a s s e m b l e d d i a l y s i s r e a c t o r a n d i t s c o m p o n e n t p a r t s . 6 1 b i n d i n g o f c o m p o u n d s r e l e a s e d f r o m l i g n i n t o t h e g l a s s ( a p r e c a u t i o n f o r l a t e r G C / M S a n a l y s i s ) . 4 . 4 C o n t r o l S c h e m e f o r D i a l y s i s R e a c t o r I n o r d e r t o m a i n t a i n p e r o x i d e a n d V A c o n c e n t r a t i o n s i n c o n t a c t w i t h t h e e n z y m e s i n s i d e B , i t w a s n e c e s s a r y t o d e v e l o p a p r e d i c t i v e c o n t r o l s c h e m e w h i c h d e t e r m i n e d p e r o x i d e a n d V A c o n c e n t r a t i o n s a d j u s t m e n t s f o r S i d e A ( n e c e s s a r y b e c a u s e o f t h e s m a l l v o l u m e o f t h e s y s t e m ) . A m a s s b a l a n c e w a s d e r i v e d f o r e a c h s p e c i e s i n v o l v e d , a n d t h e b a l a n c e s w e r e j o i n e d i n t o a c o n t r o l m o d e l a n d s o l v e d . T h e p r o c e s s e s i n c l u d e d i n t h e b a l a n c e s i n c l u d e d : ( 1 ) H 2 0 2 , V A , M n ( I I ) , a n d M n ( I I I ) ( c h e l a t e d w i t h t a r t r a t e ) t r a n s p o r t a c r o s s t h e m e m b r a n e f r o m S i d e A ; ( 2 ) R a t e s o f c o n s u m p t i o n o f H 2 0 2 , V A , M n ( I I ) , a n d M n ( I I I ) i n S i d e B d u e t o r e a c t i o n ; ( 3 ) R a t e s o f l o s s o f H 2 0 , a n d V A d u e t o d e c o m p o s i t i o n a t 3 7 ° C a n d p H 3 . 5 0 ; a n d ( 4 ) R a t e s o f l o s s o f L I P a n d M N P a c t i v i t y d u e t o d e c o m p o s i t i o n a t 3 7 ° C a n d p H 3 . 5 0 . T h e s e p r o c e s s e s a r e d e a l t w i t h i n t h i s s e c t i o n . 4 . 4 . 1 S p e c i e s T r a n s p o r t T h e t r a n s p o r t o f H 2 0 2 , V A , M n ( I I ) , a n d M n ( I I I ) a c r o s s t h e d i a l y s i s m e m b r a n e w a s t r e a t e d a s s i m p l e d i f f u s i o n i n a m o d i fi e d d i a p h r a g m c e l l ( C u s s l e r , 1 9 8 6 ) . A l t h o u g h d i a p h r a g m c e l l s s h o u l d b e v e r t i c a l i n o r i e n t a t i o n ( h o r i z o n t a l m e m b r a n e ) ( C u s s l e r , 1 9 8 6 ) , p r e l i m i n a r y t r a n s p o r t e x p e r i m e n t s i n t h e d i a l y s i s r e a c t o r ( v e r t i c a l m e m b r a n e ) i n d i c a t e d t h a t t h e t r a n s p o r t o f H 2 0 2 , V A , a n d M n ( I I ) c o u l d b e d e s c r i b e d b y S i m p l e d i f f u s i o n ( s e e C h a p t e r V ) . N o t e t h a t w h i l e d i a p h r a g m c e l l s u s u a l l y d o n o t c o n t a i n f r e e h e a d s p a c e ( C u s s l e r , 1 9 8 6 ) , t h e d i a l y s i s r e a c t o r s y s t e m u s e d h e r e d o e s h a v e a b o u t 1 m L o f h e a d s p a c e i n e a c h s i d e ( s e e a b o v e ) . T h e t r a n s p o r t r a t e e q u a t i o n s f o r d i f f u s i o n o f H 2 0 2 , V A , M n ( I I ) , a n d M n ( I I I ) a c r o s s t h e m e m b r a n e f r o m S i d e A t o S i d e B a r e ( s e e A p p e n d i x B f o r d e r i v a t i o n ) d C A D e fl A T w , C A ' ‘ 3 ’ ‘ 3 ‘ ” 6 2 a n d d c : D ‘ W A — = — ( C - C ( B - S ) J r W , ‘ ' ) w h e r e C , d e n o t e s c o n c e n t r a t i o n ( m M ) i n s i d e i , t i s t i m e ( m i n ) , V , i s t h e c h a m b e r v o l u m e f o r s i d e i ( m L ) , I i s t h e m e m b r a n e t h i c k n e s s ( c m ) , A i s t h e m e m b r a n e a r e a a v a i l a b l e f o r t r a n s p o r t ( c m ’ ) , a n d D J i s t h e e f f e c t i v e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t ( c m ’ l m i n ) . C o m b i n i n g e q u a t i o n s ( B - 4 ) a n d ( B - 5 ) a n d s o l v i n g g i v e s C — C I n i — ‘ — — 1 — ) = ~ 1 0 " : ( e 1 1 ) C A . - 0 , . w h e r e A l l = _ . — + — — - 1 0 1 ' ( V A V . ) ( B - ) K n o w l e d g e o f t h e c e l l m e a s u r e m e n t s , i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s , a n d c o n c e n t r a t i o n s a t a c e r t a i n t i m e i n t o t h e e x p e r i m e n t a l l o w s c a l c u l a t i o n o f D " . E x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d t o d e t e r m i n e t h e v a l u e s o f t h e e f f e c t i v e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t s ( 0 " ) f o r H , O , , M n ( I I ) , a n d M n ( I I I ) , a n d t h e d e p e n d e n c e o f D " f o r V A o n c o n c e n t r a t i o n . I n t h e fi r s t s e t o f e x p e r i m e n t s , t h e t r a n s p o r t o f H , O , a c r o s s t h e m e m b r a n e w a s m e a s u r e d w i t h v a r i o u s d r i v i n g f o r c e s o v e r 1 0 - 1 2 m i n u t e s . [ I - I , O , ] A w a s v a r i e d f r o m 5 0 m M t o 5 0 0 0 m M , w h i l e [ H , O , ] , r e m a i n e d c o n s t a n t a t 8 m M . F o u r 1 0 t t L s a m p l e s w e r e t a k e n f r o m S i d e B o v e r t h e t i m e r a n g e , a n d a s s a y e d f o r H , O , b y f o l l o w i n g t h e d e c o l o r i z a t i o n o f R e m a z o l B l u e d y e ( t o c o m p l e t i o n ) b y H o r s e r a d i s h P e r o x i d a s e ( T y p e I I , S i g m a ) u s i n g a s e t o f H , O , s t a n d a r d s ( c a l i b r a t e d w i t h t h e a b s o r b a n c e a t 2 3 0 n m w i t h a n e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t o f 8 1 M " c m ' l ( P i c k a n d K e i s a r i , 1 9 8 0 ) ) t o c a l c u l a t e c o n c e n t r a t i o n s . T h i s a s s a y i s d e s c r i b e d i n d e t a i l i n A p p e n d i x A ( H , O , A s s a y ) . T h e d a t a w e r e t h e n u s e d 6 3 w i t h e q u a t i o n ( B - 8 ) t o c a l c u l a t e a n a v e r a g e D ” f o r H 2 0 2 . I n a n a n a l o g o u s s e t o f e x p e r i m e n t s , [ M n ( I I ) ] A w a s v a r i e d f r o m 5 0 m M t o 2 0 0 0 m M , w i t h [ M n ( I I ) ] , 3 c o n s t a n t a t 0 m M . T w e n t y m i c r o l i t e r s a m p l e s w e r e w i t h d r a w n f r o m S i d e A e a c h h o u r o v e r a 6 h r p e r i o d , a n d [ M n ( I I ) ] A c o n c e n t r a t i o n s i n t h e s e s a m p l e s w e r e m e a s u r e d b y t i t r a t i o n w i t h E D T A ( H a r r i s , 1 9 8 2 ; C l e s c e r i e t a l . , 1 9 8 9 ) . { M n ( I I ) } , c o n c e n t r a t i o n s w e r e c a l c u l a t e d b y d i f f e r e n c e . T h e s e d a t a w e r e t h e n u s e d w i t h e q u a t i o n ( B 8 ) t o e a l C u l a t e a n a v e r a g e D " f o r M n ( I I ) . B e c a u s e M n ( I I I ) i s a r e l a t i v e l y s t r o n g o x i d i z i n g a g e n t ( G l e n n e t a l . , 1 9 8 6 ) , i t d o e s n o t r e m a i n a s f r e e M n ( I I I ) i n w a t e r ( t w o M n ( I I I ) a t o m s d i s m u t e t o M n ( I I ) + M n ( I V ) ) , b u t m u s t b e c h e l a t e d t o r e m a i n a t t h a t o x i d a t i o n s t a t e ( G l e n n e t a l . , 1 9 8 6 ; W a r i i s h i e t a l . , 1 9 9 2 ) . S i n c e t h e b u f f e r t o b e u s e d i n t h e i n v i t r o l i g n i n d e g r a d a t i o n e x p e r i m e n t s w a s t a r t r a t e , a n d t a r t r a t e i s a b e t t e r c h e l a t o r o f M n ( I I I ) t h a n l a c t a t e ( W a r i i s h i e t a l . , 1 9 9 2 ) , i t w a s d e c i d e d t o o m i t l a c t a t e f r o m f u t u r e r e a c t i o n m i x t u r e s a n d t o d e t e r m i n e t h e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t o f t h e M n ( I I I ) - t a r t r a t e c o m p l e x . P r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s , s u p p o r t e d b y p u b l i s h e d e v i d e n c e o n M n ( I I I ) - c h e l a t e s t a b i l i t y ( W a r i i s h i e t a l . , 1 9 9 2 ) , i n d i c a t e d t h a t t h e M n ( I I I ) — t a r t r a t e c o m p l e x w a s n o t s t a b l e e n o u g h a t 3 7 ° C t o a l l o w f o r d e l a y e d c o n c e n t r a t i o n m e a s u r e m e n t s . S i n c e n o o n - l i n e m e t h o d o f m e a s u r i n g t h e M n ( I I I ) - t a r t r a t e c o m p l e x c o n c e n t r a t i o n i n t h e r e a c t o r w a s a v a i l a b l e , i t w a s d e c i d e d i n s t e a d t o e s t i m a t e t h e e f f e c t i v e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t o f t h e M n ( I I I ) - t a r t r a t e c o m p l e x . T h e a v a i l a b l e l i t e r a t u r e i n d i c a t e d t h a t M n ( I I I ) h a s a c o o r d i n a t i o n n u m b e r o f 6 ( M e l l o r , 1 9 7 9 ) , a n d t h a t t a r t r a t e b i n d s t o m a n g a n e s e i o n s a s d e p i c t e d i n F i g u r e 4 . 4 ( B e l l , 1 9 7 7 ) . T h i s i n d i c a t e d t h a t t w o t a r t r a t e m o l e c u l e s b i n d p e r M n ( I I I ) a t o m . I n a d d i t i o n , t h e b o n d s b e t w e e n e a c h t a r t r a t e a n d t h e M n ( I I I ) a t o m a r e p l a n a r ( R a m a k r i s h n a n a n d M a r o o r , 1 9 8 8 ) . T h i s i n f o r m a t i o n w a s u s e d , w i t h t h e s o f t w a r e p a c k a g e P o l y g r a f ( M o l e c u l a r S i m u l a t i o n s , I n c . , B u r l i n g t o n , M A ) t o fi n d a l i k e l y e n e r g e t i c m i n i m u m f o r [ M n ( I I I ) - t a m ] i n w a t e r . T h e s t r u c t u r e o f t h e p r e d i c t e d c h e l a t e c o m p l e x i s s h o w n i n F i g u r e 4 . 5 , w i t h s e v e r a l m e a s u r e m e n t s o f t h e d i a t h e t e r o f t h e c o m p l e x . T h e c e n t e r a t o m i s t h e M n ( I I I ) , a n d t h e s h a d e d a r e a F i g u r e 4 . 4 : M e c h a n i s m o f b i n d i n g b e t w e e n a s i n g l e t a r t r a t e m o l e c u l e a n d a m a n g a n e s e i o n i n w a t e r ( B e l l , 1 9 7 7 ) . e . . - o I O - I - . ’ Q a c Q u o O o u . . u . ' a l . a . a . a . v o a - o t n o o s I n u I I ‘ - - C - l ' O l s o : O o I Q I a I o . - I o Q c ’ O 0 V a \ - C ’ - . C a O U O fi a : I a h D i a o c h o . o I i u o . I o fi l . O o ‘ o ‘ . ‘ o r Q - a I o a r I O - l o ‘ - n a " o a o o o o 0 a a a o * i , n ' a \ . a o o . I l t ' . " l ‘ a 9 - u a . o n f " o a l u f a . a o . a 0 - . C . I o 5 O ‘ a . O o 0 I a I O a . - V - 0 I I O I a \ 0 - D o o - o O I O n o e J O n J c n o I ‘ O a O O O o I o - I c a I o O f . n - o o O O a c - a o u V o o Q ’ . l - I n . e s n e a u t - n a u G . . . . . o . . . ~ . . o . . § . . l . . . . o . . ‘ . § . - - . . . . . o n Q . . . w l o o ‘ . n . I - . a w a o l - o o u n o O - o n ’ . . . . . . . . . . - . . . 5 . . . o : . o - . a . . . . w u . a . . a o n . . . . . . . . a w a . . . . . . . a . . . a u . . » n u n n n . . r . n . . . . v I l I a - . I - O o I u | . - . D . . . I . . 0 0 p ' I - e d r r e 4 . 5 u r l i n g t o n , M A ) . c t e d b y t h e m o l e c u l a r m o d e l l i n g s o f t w a r e P o l y g r a f ( M o l e c u l a r S i m u l a t i o n s I n c . , G r a p h i c a l r e p r e s e n t a t i o n o f t h e s t r u c t u r e o f a n [ M n ( I I I ) - t a m ] c o m p l e x a s 6 5 6 6 s u r r o u n d i n g t h e c o m p l e x r e p r e s e n t s t h e c h a r g e d e n s i t y s u r f a c e . T h e e f f e c t i v e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t o f [ M n ( I I I ) - t a n g ] w a s t h e n c a l c u l a t e d f r o m t h e a v e r a g e d i a m e t e r o f t h e c h e l a t e c o m p l e x ( r m s a v e r a g e , 1 0 . 7 1 A ) , t h e e f f e c t i v e r a d i u s o f M n ( I I ) i n w a t e r ( B e l l , 1 9 7 7 ) a s s u m i n g t h a t i t i s i n a h i g h s p i n s t a t e ( N i c h o l l s , 1 9 7 4 ) , a n d t h e m e a s u r e d e f f e c t i v e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t f o r M n ( I I ) . T h i s w a s d o n e b y a s s u m i n g t h a t t h e r a t i o o f t h e t w o e f f e c t i v e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t s w a s p r o p o r t i o n a l t o t h e i n v e r s e r a t i o o f t h e i r r a d i i , t h e r e s u l t o b t a i n e d b y r a t i o i n g t h e S t o k e s - E i n s t e i n E q u a t i o n s ( B i r d e t a l . , 1 9 6 0 ) f o r e a c h s p e c i e s . I n t h e n e x t s e t o f e x p e r i m e n t s , t h e t r a n s p o r t o f V A a c r o s s t h e m e m b r a n e w a s m e a s u r e d w i t h v a r i o u s d r i v i n g f o r c e s o v e r 1 0 — 1 2 m i n u t e s i n a m a n n e r i d e n t i c a l t o t h a t u s e d f o r H 2 0 2 . [ V A ] A w a s v a r i e d f r o m 5 0 m M t o 2 5 0 0 m M ( t h e m a x i m u m [ V A ] A i s l o w e r t h a n t h e m a x i m u m [ H 2 0 7 ] A b e c a u s e a b o v e 2 5 0 0 m M , t h e t r a n s p o r t d i d n o t i n c r e a s e m u c h w i t h a n i n c r e a s e w i t h c o n c e n t r a t i o n ) , w h i l e [ V A ] , , r e m a i n e d c o n s t a n t a t 1 0 m M . F o u r 1 0 p . L s a m p l e s w e r e t a k e n f r o m S i d e B o v e r t h e t i m e r a n g e , a n d a s s a y e d f o r V A b y m e a s u r i n g t h e t o t a l a b s o r b a n c e c h a n g e ( r e a c t i o n c o m p l e t i o n ) b y L I P i n a n a s s a y I ‘ l ‘ l o d i fi e d f r o m t h e L I P A s s a y ( A p p e n d i x A ) u s i n g a s e t o f V A s t a n d a r d s t o c a l c u l a t e c o n c e n t r a t i o n s . T h i s a s s a y i s d e s c r i b e d i n d e t a i l i n A p p e n d i x A ( V A A s s a y ) . T h e d a t a w e r e t h e n u s e d w i t h e q u a t i o n ( B - 8 ) t o c a l c u l a t e a v a l u e o f D " f o r V A a t e a c h [ V A ] A . h e D " v s [ V A ] A d a t a w e r e t h e n s t a t i s t i c a l l y fi t u s i n g P E A K F I T ( J a n d e l S c i e n t i fi c ) t o e ( a n a t i o n ( B - 6 ) . T o d e m o n s t r a t e t h e e f f e c t o f c o n c e n t r a t i o n o n v i s c o s i t y , t h e v i s c o s i t y o f S o l u t i o n s o f V A r a n g i n g f r o m 0 t o 2 5 0 0 m M w e r e m e a s u r e d i n a c a p i l l a r y t u b e V i s c o m e t e r . A s t a t i s t i c a l fi t o f t h e v i s c o s i t y ( [ 1 , ) v s [ V A ] d a t a u s i n g P E A K F I T g a v e a n e z l c l a o n e n t i a l r e l a t i o n s h i p ( s e e C h a p t e r V ) w h i c h i s c o n s i s t e n t w i t h r e l a t i o n s h i p s g i v e n i n t h e l i t e r a t u r e ( B i r d e t a l . , 1 9 6 0 ) . T h i s r e l a t i o n s h i p w a s i n s e r t e d i n t o t h e S t o k e s - E i n s t e i n S q n a t i o n ( B i r d e t a l . , 1 9 6 0 ) t o y i e l d a c o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n t e f f e c t i v e d i f f u s i o n c ( ) " ‘ é . - ' 1 ° f i c i e n t f o r V A . T h e c o n c e n t r a t i o n - t i m e d a t a f r o m t h e e x p e r i m e n t s w e r e t h e n fi t b y t r i a l a n d e r r o r t o t h e d i f f u s i o n e q u a t i o n w i t h c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t d i f f u s i o n 6 7 c o e f fi c i e n t . A n a d d i t i o n a l e x p o n e n t i a l t e r m w a s n e c e s s a r y t o o b t a i n a g o o d fi t t o t h e d a t a , a n d t h i s w a s a s s u m e d t o b e t h e e f f e c t o f m o l e c u l a r a g g r e g a t i o n o f V A m o l e c u l e s ( r e l a t i v e l y h y d r o p h o b i c ) i n w a t e r , e f f e c t i v e l y i n c r e a s i n g t h e m o l e c u l a r d i a m e t e r o f V A i n w a t e r ; t h e r e f o r e a n a d d i t i o n a l t e r m r e p r e s e n t i n g a n e x p o n e n t i a l d e p e n d e n c e o f m o l e c u l a r a g g r e g a t e r a d i u s w a s a d d e d t o t h e S t o k e s - E i n s t e i n e x p r e s s i o n . T h i s p o i n t i s d i s c u s s e d i n m o r e d e t a i l i n C h a p t e r V . E x p e r i m e n t s w e r e a l s o c o n d u c t e d w i t h 1 1 2 0 2 a n d V A t o g e t h e r t o s e e i f t h e i n c r e a s e d v i s c o s i t y o f t h e s o l u t i o n d u e t o h i g h e r V A c o n c e n t r a t i o n s h a d a n e f f e c t o n D i ” r f o r H 2 0 2 . T h e e x p e r i m e n t s w e r e i d e n t i c a l t o t h o s e f o r H 2 0 2 d e s c r i b e d a b o v e , e x c e p t t h a t t h e s o l u t i o n c o n t a i n e d V A a t v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s f r o m 5 0 m M u p t o 2 5 0 0 m M ( b o t h s i d e s ) . [ P 1 2 0 2 1 1 1 w a s v a r i e d f r o m 5 0 m M t o 5 0 0 0 m M , a n d s a m p l e s w e r e m e a s u r e d w i t h H o r s e r a d i s h P e r o x i d a s e a s d e s c r i b e d i n A p p e n d i x A ( I - 1 2 0 2 A s s a y ) . N o e f f e c t o f s o l u t i o n v i s c o s i t y w a s f o u n d o n t h e e f f e c t i v e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t s f o r H 2 0 2 o r M n ( I I ) . T h e a c t u a l c o n c e n t r a t i o n s o f H 2 0 2 a n d V A u s e d i n S i d e B d u r i n g r e a c t o r r u n s ( s e e C h a p t e r V ) w e r e m u c h l e s s t h a n 8 m M a n d 1 0 m M ( t h e S i d e B c o n c e n t r a t i o n s u s e d i n t h e t r a n s p o r t e x p e r i m e n t s ) , r e s p e c t i v e l y ; h o w e v e r , s i n c e t h e d r i v i n g f o r c e ( c o n c e n t r a t i o n i n S i d e A m i n u s c o n c e n t r a t i o n i n S i d e B ) w a s v e r y l a r g e c o m p a r e d t o t h e c o n c e n t r a t i o n i n S i d e B , t h i s d i f f e r e n c e w a s n e g l e c t e d . 4 . 4 . 2 K i n e t i c s o f V e r a t r y l A l c o h o l O x i d a t i o n b y L I P T h e r e a c t i o n s f o r o x i d a t i o n o f v e r a t r y l a l c o h o l t o v e r a t r a l d e h y d e b y L I P , a s p r o p o s e d b y T i e n e t a l . ( 1 9 8 6 ) , a r e 1 : 1 1 , 0 , + c p d o — - l — e 0 d e + 1 1 , 0 ( 4 " ) 1 1 , 0 , + d e l « : 1 » o p a l - 1 1 , 0 , ( 4 - 7 ) - 2 V A + 0 d e : 1 » d e l I - V A ' ( 4 - 8 ) T o 6 ” u s e i t i b a i m i r l i b D i e t s r i r k i m h h h w p m m l # 1 1 1 , 0 1 1 [ H T + , ] ) , O — I ( C - l l ) 6 8 I t d e I I - V A ' — — 1 — > V A “ + c p d o ( 4 - 9 ) w h e r e d e O , d e I a n d d e I I r e p r e s e n t t h e d i f f e r e n t o x i d a t i o n s t a t e s o f t h e L I P h e m e , a n d V A “ i s v e r a t r a l d e h y d e ( T i e n e t a l . , 1 9 8 6 ) . T h e s e k i n e t i c s r e p r e s e n t t w o s u b s t r a t e p i n g - p o n g k i n e t i c s w i t h c o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n b y t h e fi r s t s u b s t r a t e a n d t w o - s t e p r e a c t i o n o f t h e s e c o n d ( T i e n e t a l . , 1 9 8 6 ; T i e n , 1 9 8 7 ) . T h e r a t e e q u a t i o n f o r t h e s e k i n e t i c s , d e r i v e d i n A p p e n d i x C , i s k , k , k , [ u n , [ H , 0 , J [ V A ] T a k i n g t h e r e c i p r o c a l a n d c a n c e l i n g l i k e t e r m s g i v e s fl = _ ! _ + + — _ ) [ H 2 0 7 J l 1 4 - 1 0 v 1 r , [ H , 0 , ] ( 1 1 r , ( 1 4 1 1 . 4 1 ) + 1 : , ( ) T o e v a l u a t e t h e k i n e t i c r a t e c o n s t a n t s , 3 s e p a r a t e c a s e s a r e n e e d e d : ( 1 ) V a r y [ 1 4 1 2 0 2 ] w i t h e x c e s s V A , a n d [ 1 1 2 0 2 ] < < K , , s o t h a t [ V A ] i s a p p r o x i m a t e l y c o n s t a n t a n d t h e r e i s n o i n h i b i t i o n ; ( 2 ) V a r y [ V A ] w i t h e x c e s s H 2 0 2 , a n d [ H 2 0 2 ] < < K “ s o t h a t [ H 2 0 2 ] i s a p p r o x i m a t e l y c o n s t a n t a n d t h e r e i s n o i n h i b i t i o n ; a n d ( 3 ) V a r y [ V A ] w i t h s e v e r a l i n h i b i t o r y e x c e s s H 2 0 2 c o n c e n t r a t i o n s . T h e n t h e d a t a a r e p l o t t e d o n d o u b l e r e c i p r o c a l p l o t s a n d t h e k i n e t i c c o n s t a n t s d e t e r m i n e d a s f o l l o w s . C a s e 1 : s l o p e = — l - l " ! 1 ( 4 . 1 1 ) i n t e r c e p t = + — ) M W ] . * 4 C a s e 2 : s l o p e = - 1 - " 3 ( 4 . 1 2 ) i n t e r c e p t = ( 1 l ) 6 9 C a s e 3 : 1 [ H 2 0 2 ] s l o p e = - — ( l + — — — ) * 3 K 1 ( 4 - 1 3 ) i n t e r c e p t = ( l + i ) * r l e O r J . * 4 P l o t t i n g t h e s l o p e s f r o m C a s e 3 v e r s u s t h e p e r o x i d e c o n c e n t r a t i o n s t h e n g i v e s a l i n e w i t h s l o p e = l ’ 5 ‘ ; ( 4 . 1 4 ) i n t e r c e p t = — * 3 E x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d f o r e a c h o f t h e c a s e s l i s t e d a b o v e , u s i n g L I P a l o n e ( D 5 N o M n L I P ) , w h i c h c o n t a i n e d a s m a l l a m o u n t o f M N P . T h e e x p e r i m e n t s w e r e d o n e s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y i n q u a r t z c u v e t s a t 3 7 ° C i n 2 0 m M t a r t r a t e b u f f e r , p H 3 . 5 0 . T o d o t h i s , t h e s p e c t r o p h o t o m e t e r w a s m o v e d i n t o t h e 3 7 ° C r o o m s i n c e i t d i d n o t h a v e a t e m p e r a t u r e c o n t r o l l e d s a m p l e c h a m b e r . E x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d a s f o l l o w s : ( 1 ) t h e s p e c t r o p h o t o m e t e r w a s b l a n k e d a t 3 1 0 n m w i t h d i s t i l l e d w a t e r ; ( 2 ) 1 0 0 “ L o f a s o l u t i o n c o n t a i n i n g H 2 0 2 a n d V A w e r e a d d e d t o a n e m p t y q u a r t z c u v e t ( a t c o n c e n t r a t i o n s w h i c h w o u l d g i v e t h e d e s i r e d fi n a l c o n c e n t r a t i o n s w h e n d i l u t e d t o 1 1 0 0 u L ) ; ( 3 ) 1 0 0 0 u L o f c o n c e n t r a t e d , d i a l y z e d L I P , d i l u t e d t o t h e d e s i r e d a c t i v i t y , w a s a d d e d t o t h e c u v e t ; ( 4 ) t h e c u v e t c o n t e n t s w e r e i m m e d i a t e l y m i x e d b y p l a c i n g a p i e c e o f p a r a fi l m o v e r t h e c u v e t a n d i n v e r t i n g s e v e r a l t i m e s ; a n d ( 5 ) t h e a b s o r b a n c e a t 3 1 0 n m w a s m e a s u r e d f o r 1 m i n u t e w i t h a c h a r t r e c o r d e r a t 2 c m / m i n a n d 2 t o 1 0 0 m V ( 0 . 0 2 t o 1 . 0 O D f u l l s c a l e ) . T h e i n i t i a l r a t e o f v e r a t r a l d e h y d e f o r m a t i o n ( m M / m i n ) w a s t h e n c a l c u l a t e d f r o m t h e r e c o r d e r t r a c e u s i n g a n e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t ( T i e n e t a l . , 1 9 8 6 ) o f 9 3 0 0 M " c m " . F r o m e q u a t i o n ( C - l O ) , t h i s w a s t h e n e g a t i v e o f t h e v e r a t r y l a l c o h o l a n d H 2 0 , c o n s u m p t i o n r a t e s ( s t o i c h i o m e t r y o f 1 : 1 ( T i e n e t a l . , 1 9 8 6 ) ) . T h e r a t e s w e r e t h e n p l o t t e d o n d o u b l e r e c i p r o c a l p l o t s a s d e s c r i b e d a b o v e a n d t h e k i n e t i c r a t e c o n s t a n t s w e r e d e t e r m i n e d . F o r C a s e 1 , [ 1 1 2 0 2 ] w a s v a r i e d f r o m 1 t o 2 0 0 0 u M , w i t h [ V A ] , a t 5 0 m M . L I P a c t i v i t i e s o f 7 0 7 8 . 4 5 a n d 1 9 9 . 8 U / L w e r e u s e d t o d e m o n s t r a t e t h a t t h e r a t e o f c o n s u m p t i o n w a s d i r e c t l y p r o p o r t i o n a l t o t h e e n z y m e a c t i v i t y . F o r C a s e 2 , [ V A ] w a s v a r i e d f r o m 1 0 t o 1 0 0 1 4 M , w i t h [ 1 1 2 0 2 ] a t 2 0 0 a n d 5 0 0 1 4 M , a n d [ L I P ] a t a b o u t 2 0 0 U / L . F o r C a s e 3 , [ V A ] w a s v a r i e d f r o m 1 0 t o 1 0 0 0 “ M , a n d [ 1 1 2 0 2 ] w a s v a r i e d f r o m 5 0 0 t o 2 0 0 0 1 1 M , w i t h [ L I P ] a t a b o u t 2 0 0 U / L . 4 . 4 . 3 K i n e t i m o f M n ( I I ) O x i d a t i o n b y M N P T h e r e a c t i o n s f o r o x i d a t i o n o f M n ( I I ) t o M n ( I I I ) b y M N P a r e ( W a r i i s h i e t a l . , 1 9 8 9 a ) k M N P + 1 1 , 0 , — — - § - — > M N P ; + 1 1 , 0 ( 4 - 1 5 ) I t M N P ! + M n ( I I ) - — i - > M N P I I + M n ( I I I ) ( 4 - 1 6 ) k 7 ( 4 - 1 7 ) M N P I I + M n ( I I ) _ _ _ r . M N P + M n ( I I I ) 1 " ( 4 - 1 8 ) M n ( I I I ) + A H _ _ _ » M n ( I I ) + A ' w h e r e M N P , M N P I a n d M N P I I r e p r e s e n t t h e d i f f e r e n t o x i d a t i o n s t a t e s o f t h e M N P h e m e , A H r e p r e s e n t s a n o x i d i z a b l e c o m p o u n d , a n d A ' i s t h e o x i d i z e d ( f r e e r a d i c a l ) c o m p o u n d ( W a r i i s h i e t a l . , 1 9 8 9 a ) . T h e fi r s t t h r e e r e a c t i o n s r e p r e s e n t a t w o s u b s t r a t e p e r o x i d a s e p i n g - p o n g m e c h a n i s m ( W a r i i s h i e t a l . , 1 9 8 9 a ; W a r i i s h i e r a l . , 1 9 9 2 ) , w h i l e t h e t h i r d r e a c t i o n i s i n d e p e n d e n t o f M N P a n d h a s b e e n s h o w n t o b e s e c o n d o r d e r ( W a r i i s h i e t a l . , 1 9 9 2 ) . N o t e t h e 2 : 1 s t o i c h i o m e t r y f o r M n ( I I ) o x i d i z e d p e r H 2 0 2 c o n s u m e d . I t w a s s h o w n ( W a r i i s h i e t a l . , 1 9 9 2 ) t h a t a - h y d r o x y a c i d s s t i m u l a t e t h e t h i r d r e a c t i o n s t e p b y f a c i l i t a t i n g t h e r e l e a s e o f t h e M n ( I I I ) f r o m t h e a c t i v e s i t e o f t h e e n z y m e , a n d t h e n s t a b i l i z i n g t h e M n ( I I I ) w h i l e i t d i f f u s e s t o t h e o x i d i z a b l e s u b s t r a t e f o r t h e f o u r t h r e a c t i o n ( W a r i i s h i e t a l . , 1 9 9 2 ) . S e v e r a l a - h y d r o x y a c i d s w e r e e v a l u a t e d i n t h i s r o l e i n t h e o x i d a t i o n o f 2 , 6 - d i m e t h o x y p h e n o l ( W a r i i s h i e t a l . , 1 9 9 2 ) , a n d t h e fi v e m o s t e f f i c i e n t 7 1 c h e l a t o r s w e r e a s s i g n e d a s ( l i s t e d a s c h e l a t o r { R e l a t i v e r e a c t i o n r a t e } ) : M a l o n a t e { 1 0 0 } ) M a l a t e { 9 9 } ) T a r t r a t e { 9 3 } ) L a c t a t e { 8 3 } ) O x a l a t e { 4 2 } . S i n c e t h e L I P A l o n e e x p e r i m e n t s w e r e t o t a k e p l a c e i n t a r t r a t e b u f f e r ( a n d t h e L I P k i n e t i c s w e r e m e a s u r e d i n t a r t r a t e b u f f e r ) , i t w a s d e c i d e d t h a t t a r t r a t e w o u l d b e u s e d i n a l l M N P e x p e r i m e n t s a s w e l l . T h i s d e c i s i o n d o e s n o t a f f e c t t h e r a t e o f s t e p 4 v e r y m u c h , a s s h o w n i n t h e r e l a t i v e e f fi c i e n c i e s a b o v e . T h e r a t e e q u a t i o n f o r t h e s e k i n e t i c s ( r a t e o f f o r m a t i o n o f M n ( I I I ) ) , a l s o d e r i v e d i n A p p e n d i x C , i s v = 2 k ; , k . , [ M N P ] . [ H , O , J [ M n ( I I ) ] k ‘ k , [ M n ( 1 1 ) ] + k , ( k ‘ + k . , ) [ H , 0 , ] — , [ M r r a r m u m ( 4 4 9 ) A n o t h e r a s s a y f o r M N P m e a s u r e s t h e o x i d a t i o n o f M n ( I I ) t o M n ( I I I ) i n t a r t r a t e b u f f e r ( P a s z c z y n s k i e t a l . , 1 9 8 8 ) . T h i s a s s a y ( h e r e a f t e r r e f e r r e d t o a s M N P A s s a y # 3 ) , w a s n o t u s e d i n t h e s e s t u d i e s f o r g e n e r a l m e a s u r e m e n t o f M N P a c t i v i t y b e c a u s e i t i s a n e x t r e m e l y f a s t r e a c t i o n a n d t h u s i s n o t w e l l s u i t e d f o r a c c u r a t e r e p e t i t i v e m e a s u r e m e n t o f a l a r g e n u m b e r o f s a m p l e s . I n t h i s a s s a y , w h i c h e n c o m p a s s e s o n l y t h e fi r s t t h r e e r e a c t i o n s a b o v e , i f n o o x i d i z a b l e s u b s t r a t e i s a d d e d , r e a c t i o n 4 d o e s n o t o c c u r , a n d k , , k , ” a n d k , c a n b e e s t i m a t e d . D r o p p i n g t h e t e r m f o r r e a c t i o n 4 , t a k i n g t h e r e c i p r o c a l a n d c a n c e l i n g l i k e t e r m s g i v e s [ M N P ] l k ‘ + l _ _ _ ; = _ _ _ — — + _ ) _ _ _ ( 4 - 2 0 ) v 2 k 5 [ H , 0 , ] ( Z k ‘ k , [ M n ( I I ) ] N o t e t h a t v a l u e s f o r k , a n d k 7 c a n n o t b e d e t e r m i n e d i f a l l t h r e e r e a c t i o n s a r e c o n s i d e r e d , s i n c e t h e y c a n n o t b e s e p a r a t e d i n t h e s e c o n d t e r m . T h i s p o i n t i s d e a l t w i t h i n t h e f o l l o w i n g s e c t i o n . T o e v a l u a t e t h e k i n e t i c r a t e c o n s t a n t s , o n l y o n e c a s e w a s n e e d e d , s i n c e k , 5 a n d k 7 e a n n o t b e e x p l i c i t l y e v a l u a t e d . I n t h i s c a s e , [ H 2 0 2 ] w a s v a r i e d i n t h e p r e s e n c e o f e x c e s s t h e y - i n t e r c e p t b e c o m e s V = " 6 " k k c i n t e r c e p t = — 2 [ M " 7 r ' — I - ) ] I n ( ( C - 2 1 ( 4 - 2 2 ) ) 7 2 M n ( I I ) a n d t a r t r a t e . T h e d a t a w e r e t h e n p l o t t e d o n a d o u b l e r e c i p r o c a l d o u b l e r e c i p r o c a l p l o t a n d t h e k i n e t i c c o n s t a n t s d e t e r m i n e d a s f o l l o w s . l s l o p e = — 2 “ ( 4 - 2 1 ) i n t e r c e p t = k ‘ “ 7 2 k . k , r M n ( m r k , w a s c a l c u l a t e d f r o m t h e s l o p e a s s h o w n a b o v e , w h i l e t h e b e s t t h a t c o u l d b e d o n e f o r k , a n d k 7 i s t o c a l c u l a t e t h e r a t i o ( k 6 + k - , ) / ( k , k 7 ) . I n a l l o f t h e k i n e t i c e x p e r i m e n t s p e r f o r m e d f o r t h i s e n z y m e , [ M n ( I I ) ] w a s 2 m M . D e fi n i n g a n e w p a r a m e t e r , \ I ' , a s w h i c h c a n b e u s e d t o s o l v e f o r \ I ' . I n s e r t i n g ( k 6 + k - , ) \ I ' i n t o t h e k i n e t i c e q u a t i o n f o r k 6 k 7 , a n d n o t i n g t h a t [ M n ( I I ) ] i n t h e k i n e t i c e x p e r i m e n t s w a s a l w a y s 2 m M , y i e l d s t h e f o r m o f t h e e q u a t i o n w h i c h w a s u s e d i n t h e r e a c t o r m o d e l : = 2 k , r M N P r . r H , 0 , r r M n ( m r _ [ M n ( I I ) ] + 4 k 5 t l H , 0 , ] k , [ M u ( 1 1 1 ) ] [ A 1 1 1 ( C - 2 3 ) E x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d f o r e a c h s o u r c e o f M N P , D 5 N o M n M N P , d e s i g n a t e d M N P ” a n d D 4 H i M n M N P , d e s i g n a t e d M N P b . T h e k i n e t i c r a t e c o n s t a n t k , a n d t h e p a r a m e t e r \ I ' f o r e a c h c a s e w e r e t h e n d e s i g n a t e d k , , a n d ‘ 1 ' ” a n d k 5 , , a n d ‘ 1 3 , r e s p e c t i v e l y . T h e e x p e r i m e n t s w e r e d o n e s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y i n q u a r t z c u v e t s a t 3 7 ° C i n 2 0 m M t a r t r a t e b u f f e r , p H 3 . 5 0 . T o d o t h i s , t h e s p e c t r o p h o t o m e t e r w a s m o v e d 7 3 i n t o t h e 3 7 ° C r o o m s i n c e i t d i d n o t h a v e a t e m p e r a t u r e c o n t r o l l e d s a m p l e c h a m b e r . E x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d a s f o l l o w s : ( 1 ) t h e s p e c t r o p h o t o m e t e r w a s b l a n k e d a t 2 3 8 n m w i t h 1 m L o f r e a c t i o n m i x , c o n t a i n i n g t h e d e s i r e d a c t i v i t y o f M N P , 2 m M M n S O , , a n d 2 0 m M t a r t a r i c a c i d , p H 3 . 5 0 ; ( 2 ) 1 0 0 u L o f H 2 0 2 w e r e a d d e d t o a n e m p t y q u a r t z c u v e t ( a t c o n c e n t r a t i o n s w h i c h w o u l d g i v e t h e d e s i r e d fi n a l c o n c e n t r a t i o n s w h e n d i l u t e d t o 1 1 0 0 u L ) , a n d t h e c u v e t w a s p l a c e d i n t h e s p e c t r o p h o t o m e t e r ; ( 3 ) 1 0 0 0 u L o f r e a c t i o n m i x ( d e s c r i b e d i n ( 1 ) a b o v e ) w e r e a d d e d t o t h e c u v e t ; ( 4 ) t h e a b s o r b a n c e a t 2 3 8 n m w a s m e a s u r e d f o r 3 0 - 4 5 s e c o n d s w i t h a c h a r t r e c o r d e r s e t a t 2 0 t o 1 0 0 c m / m i n a n d 2 0 t o 5 0 0 m V ( 0 . 2 t o 5 . 0 O D f u l l s c a l e ) . T h e i n i t i a l r a t e o f M n ( I I I ) f o r m a t i o n i n m M / m i n ( M n ( I I I ) p r e s e n t a s M n ( I I I ) - t a r t r a t e c h e l a t e c o m p l e x , w h i c h a b s o r b s a t 2 3 8 n m ) w a s t h e n c a l c u l a t e d f r o m t h e r e c o r d e r t r a c e u s i n g a n e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t ( P a s z c z y n s k i e t a l . , 1 9 8 8 ) o f 6 5 0 0 M " c m " . T h e r a t e s w e r e t h e n p l o t t e d o n a d o u b l e r e c i p r o c a l p l o t a s d e s c r i b e d a b o v e a n d t h e k i n e t i c r a t e c o n s t a n t k , a n d t h e p a r a m e t e r ‘ 1 ' w e r e d e t e r m i n e d . F o r M N P ” [ 1 1 2 0 , ] w a s v a r i e d f r o m 3 8 . 6 2 t o 4 8 1 . 5 u M , w i t h [ M n ( I I ) ] , a t 2 m M , a n d f o r M N P ” [ 1 1 2 0 , ] w a s v a r i e d f r o m 1 0 . 5 9 t o 5 4 4 . 7 1 1 M , a l s o w i t h [ M n ( I I ) ] , a t 2 m M . M N P , w a s p r e s e n t a t 1 0 0 0 U / L f o r m e a s u r e m e n t o f i t s k i n e t i c p a r a m e t e r s , w h i l e M N P , w a s p r e s e n t a t 3 1 6 0 U / L i n i t s e x p e r i m e n t s ( b o t h u s i n g M N P A s s a y # 1 ) . T h e v a l u e o f k g w a s e s t i m a t e d f r o m v a l u e s p u b l i s h e d p r e v i o u s l y ( W a r i i s h i e r a l . , l 9 9 2 ) . T h i s w a s d o n e b e c a u s e k . f o r e a c h s u b s t r a t e w i l l b e d i f f e r e n t , a n d t h e s u b s t r a t e f o r t h e r e a c t o r s t u d i e s w a s t o b e l i g n i n ; n o v a l u e s f o r k . f o r l i g n i n b o n d s h a v e b e e n ( o r a r e l i k e l y t o e v e r b e ) m e a s u r e d d u e t o t h e c o m p l e x i t y o f l i g n i n . S i n c e t h e l i g n i n t o b e u s e d w a s k n o w n t o b e o f a v e r y h i g h m o l e c u l a r w e i g h t , a n d w a s i n s o l u b l e i n w a t e r , b u t t h e c o m p o u n d f o r w h i c h t h e v a l u e o f k , w a s p u b l i s h e d ( v a n i l l y l a l c o h o l , m o l e c u l a r w e i g h t 1 5 4 ) w a s w a t e r - s o l u b l e , i t w a s l i k e l y t h a t t h e 1 : , v a l u e f o r t h e l i g n i n b o n d s w o u l d b e l n u c h l o w e r t h a n t h a t f o r v a n i l l y l a l c o h o l . I t w a s t h u s a s s u m e d t h a t t h e l i g n i n v a l u e o f 1 ‘ 8 w o u l d b e s m a l l e r b y t h e r a t i o o f t h e m o l e c u l a r w e i g h t s o f t h e t w o ( v a n i l l y l a l c o h o l / l i g n i n ) . S i n c e n o d i r e c t l y m e a s u r e d v a l u e o f m o l e c u l a r w e i g h t w a s o b t a i n a b l e f o r 7 4 t h e l i g n i n u s e d i n t h i s s t u d y d u e t o i t s c o m p l e t e i n s o l u b i l i t y i n l i g n i n s o l v e n t s ( s e e C h a p t e r V ) , a n e s t i m a t e w a s n e e d e d f o r t h e m o l e c u l a r w e i g h t ( M W ) . A t t h i s p o i n t , t h e a s s u m p t i o n w a s m a d e t h a t s i n c e t h e M W o f t h e h i g h e s t M W l i g n i n t h a t i s s t i l l a m e n a b l e t o g e l p e r m e a t i o n c h r o m a t o g r a p h y ( i e . s o l u b l e i n l i g n i n s o l v e n t s b u t n o t w a t e r ) i s 1 0 5 g / m o l e ( C o n n o r s e t a l . , 1 9 8 0 ) , t h e l i g n i n u s e d i n t h i s s t u d y m u s t h a v e a h i g h e r M W b e c a u s e i t w a s n o t s o l u b l e i n t h e s e s o l v e n t s ( s e e C h a p t e r V ) . T h e r e f o r e , t h e M W o f t h e l i g n i n u s e d i n t h i s s t u d y w a s e s t i m a t e d ( s o m e w h a t a r b i t r a r i l y ) t o b e o n e o r d e r o f m a g n i t u d e h i g h e r , i e . 1 0 ‘ g / m o l e . T h e b a s e l i g n i n m o n o m e r i s a s u b s t i t u t e d C 9 u n i t ( S a r k a n e n a n d L u d w i g , 1 9 7 1 ) a s s h o w n i n F i g u r e 4 . 6 . M o l e c u l a r f o r m u l a s f o r t h e ” a v e r a g e “ m o n o m e r i n B e e c h a n d B i r c h l i g n i n s ( a l s o h a r d w o o d s ) h a v e b e e n d e t e r m i n e d t o b e ( S a r k a n e n a n d L u d w i g , 1 9 7 1 ) C 9 1 1 , , 0 5 0 2 , 7 O ( O C H 3 ) W a n d C 9 H 9 m O Z . - , 7 ( O C H , ) , . , 8 , r e s p e c t i v e l y ; t h e a v e r a g e o f t h e s e t w o f o r m u l a s g i v e s C 9 H 8 _ 4 5 0 2 _ 7 3 ( O C H 3 ) , _ , 0 , w h i c h g i v e s a c a l c u l a t e d " a v e r a g e ” m o n o m e r m o l e c u l a r w e i g h t o f 2 0 6 . 9 g / m o l e . A s s u m i n g t h a t t h e r e a r e a n a v e r a g e o f 2 o x i d i z a b l e b o n d s p e r m o n o m e r ( S a r k a n e n a n d L u d w i g , 1 9 7 1 ) , a n d t h a t f e w ( a r b i t r a r i l y a s s u m e d t o b e o n t h e o r d e r o f 1 0 % b a s e d o n o b s e r v a t i o n s f r o m c e l l u l o s e a c c e s s i b i l i t y s t u d i e s ( T h o m p s o n e t a l . , 1 9 9 2 ) ) o f t h e l i g n i n b o n d s a r e a c c e s s i b l e t o t h e e n z y m e ( B l a n c h e t t e e t a l . , 1 9 8 9 ) , t h e c o n c e n t r a t i o n o f o x i d i z a b l e l i g n i n b o n d s f o r 2 0 m g o f l i g n i n i n 1 m L o f w a t e r ( r e a c t o r r u n l e v e l s ) i s 1 9 3 . 3 m M . T h e s e v a l u e s w e r e u s e d , a l o n g w i t h a n e s t i m a t e d m o l e c u l a r w e i g h t ( s e e C h a p t e r V ) t o e s t i m a t e k g . 4 . 4 . 4 S t a b i l i t y o f H 3 0 , a n d V A T h e s t a b i l i t y o f H 2 0 2 a t t h e d e s i r e d r e a c t o r r u n c o n d i t i o n s w a s m e a s u r e d f o r V a r i o u s i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s o f H 2 0 2 b y m a k i n g u p t h e d e s i r e d H 2 0 2 s o l u t i o n i n 2 0 m M t a r t r a t e b u f f e r , p H 3 . 5 0 , a n d i n c u b a t i n g a t 3 7 ° C i n a t e s t t u b e o n t h e r e c i p r o c a l s h a k e r a t 3 5 0 s p m ( s t r o k e s p e r m i n u t e ) . S a m p l e s w e r e t a k e n a t v a r i o u s t i m e s o v e r a 2 4 h o u r P e r i o d a n d t h e c o n c e n t r a t i o n m e a s u r e d . H 2 0 2 c o n c e n t r a t i o n s w e r e m e a s u r e d b y a t ’ S i o r b a n c e a t 2 3 0 n m u s i n g a n e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t o f 8 1 M " c m “ ( P i c k a n d K e i s a r i , 1 9 8 0 ) . V A w a s a s s u m e d t o b e s t a b l e b e c a u s e o f i t s a r o m a t i c s t r u c t u r e ( V A i s 7 5 O C H 3 O C H 3 E g u r e 4 . 6 : T h e g e n e r a l s t r u c t u r e o f a s y r i n g y l - p h e n l p r o p a n e u n i t i n l i g n i n ( A d a p t e d f r o m S a r k a n e n a n d L u d w i g ( 1 9 7 1 ) ) . I n t e r r n o n o m e r i n k a g e s o c c u r g e n e r a l l y t h r o u g h t h e o x y g e n a t p o s i t i o n 4 o f t h e r i n g a n d t h r o u g h C “ , C , , a n d C 7 . 7 6 3 , 4 — d i m e t h o x y b e n z y l a l c o h o l ) . 4 . 4 . 5 S t a b i l i t y o f L I P a n d M N P L I P a n d M N P s t a b i l i t y a t p H 3 . 5 0 a n d 3 7 ° C w e r e m e a s u r e d b y p l a c i n g 3 m L o f c o n c e n t r a t e d , d i a l y z e d e x t r a c e l l u l a r fl u i d c o n t a i n i n g U P S a n d l o w l e v e l s o f M N P S ( D 5 N o M n ) o r M N P S ( D 4 H i M n ) a t v a r i o u s l e v e l s o f a c t i v i t y i n t o t e s t t u b e s a n d i n c u b a t i n g t h e m f o r 8 h o u r s a t 3 5 0 s p m o n t h e r e c i p r o c a l s h a k e r . S a m p l e s ( 0 . 5 5 m L ) w e r e t a k e n a t v a r i o u s t i m e s a n d t h e e n z y m e a c t i v i t i e s w e r e d e t e r m i n e d u s i n g t h e L I P A s s a y a n d M N P A s s a y # 1 ( s e e A p p e n d i x A ) . S t a t i s t i c a l fi t s o f t h e e n z y m e a c t i v i t y d e c a y d a t a w e r e o b t a i n e d b y s e q u e n t i a l l y fi t t i n g t h e d a t a t o i n c r e a s i n g o r d e r ( z e r o o r d e r , fi r s t o r d e r , e t c . ) d e c a y m o d e l s ( B a i l e y a n d O l l i s , 1 9 8 6 ) . T h e s i m p l e s t d e c a y m o d e l w h i c h g a v e a g o o d fi t o f t h e d a t a w a s u s e d f o r e a c h e n z y m e . O n l y t h e fi n a l f o r m s o f t h e d e c a y r a t e e q u a t i o n s a r e p r e s e n t e d h e r e ; s e e C h a p t e r V f o r m o r e d e t a i l . T h e fi n a l f o r m s o f t h e L I P a n d M N P d e c a y r a t e s a r e : L I P ( s u m o f z e r o o r d e r a n d fi r s t o r d e r ) : 3 1 % . = - ( k , 1 + I : 4 1 1 1 1 ) ( 4 - 2 3 ) M N P ( fi r s t o r d e r ) : 5 3 7 1 m — = - k , [ M N 1 1 ( 4 - 2 4 ) 4 - 5 D i a l y s i s R e a c t o r M o d e l T h e r e a c t o r s y s t e m w a s m o d e l l e d t o p r o v i d e a p r e d i c t i v e c o n t r o l s c h e m e i n o r d e r t o m a i n t a i n t h e r e a c t a n t c o n c e n t r a t i o n s i n S i d e B ( r e a c t i o n c h a m b e r ) w i t h i n t h e r a n g e s S p e c i fi e d b y O l s e n e t a l . ( 1 9 9 1 ) . P h y s i c a l p r o c e s s e s i n c l u d e d i n t h e m o d e l w e r e : ( 1 ) H 2 0 2 , V A , M n ( I I ) , a n d [ M n ( I I I ) - t a m ] t r a n s p o r t a c r o s s t h e m e m b r a n e ; ( 2 ) T h e k i n e t i c s 0 1 ’ 1 1 , 0 2 a n d V A c o n s u m p t i o n b y L I P ; ( 3 ) T h e k i n e t i c s o f H 2 0 2 a n d M n ( I I ) c o n s u m p t i o n b y M N P ( f r o m b o t h e n z y m e s o u r c e s ) ; ( 4 ) T h e k i n e t i c s o f M n ( I I I ) c o n s u m p t i o n t h r o u g h 7 7 o x i d a t i o n o f l i g n i n b o n d s ( a n d t h e r a t e o f p r o d u c t i o n o f M n ( I I ) f r o m t h i s r e a c t i o n ) ; a n d ( 5 ) T h e S t a b i l i t i e s o f L I P , M N P , H 2 0 2 , a n d V A a t p H 3 . 5 0 , 3 7 ° C , a n d 3 5 0 s p m a g i t a t i o n r a t e . T h e r a t e o f c o n s u m p t i o n o f H 2 0 2 i n l i g n i n o x i d a t i o n c a t a l y z e d b y L I P w a s a s s u m e d t o b e s m a l l r e l a t i v e t o t h e r a t e o f c o n s u m p t i o n i n o x i d a t i o n o f V A ( T i e n , 1 9 8 7 ) , a n d t h u s w a s i g n o r e d . B y e x p e r i m e n t , H 2 0 2 a n d V A w e r e f o u n d t o b e s t a b l e o v e r a 2 4 h o u r p e r i o d a t p H 3 . 5 0 , 3 7 ° C , a n d 3 5 0 s p m a g i t a t i o n r a t e ( s e e C h a p t e r V ) , a n d t h u s i t w a s n o t n e c e s s a r y t o i n c l u d e t h e s e p r o c e s s e s i n t h e m o d e l . M n ( I I ) w a s a s s u m e d t o b e s t a b l e s i n c e i t i s o x i d i z e d v e r y q u i c k l y t o M n ( I I I ) b y M N P ( W a r i i s h i e t a l . , 1 9 8 9 b ; W a r i i s h i e t a l . , 1 9 9 2 ) a n d t h u s w o u l d n o t b e p r e s e n t l o n g e n o u g h f o r s t a b i l i t y t o b e a c o n c e r n , s o i t w a s a l s o l e f t o u t o f t h e m o d e l . l a s t l y , [ M n ( I I I ) - t a r t ? ) w a s a s s u m e d t o b e s t a b l e e n o u g h t o d i f f u s e t o a l i g n i n b o n d a n d r e a c t ( W a r i i s h i e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h e e q u a t i o n s f o r e a c h p r o c e s s c o m b i n e d i n t o m a t e r i a l b a l a n c e s a n d w e r e u s e d t o d e v e l o p a n u n s t e a d y s t a t e m o d e l f o r S i d e B ( d e r i v e d i n A p p e n d i c e s B a n d C ) . T h i s m o d e l i s p r e s e n t e d b e l o w . 4 . 5 . 1 U n s t e a d y S t a t e B a l a n c e s o n S i d e B A m a s s b a l a n c e f o r S i d e B f o r a n y s p e c i e s i , a t c o n s t a n t v o l u m e , g i v e s a c , a c , 1 0 , e = e ) _ a ) ( 4 - 2 5 ) I n s e r t i n g t h e p r o p e r t e r m s f o r e a c h s p e c i e s , H 2 0 2 , V A , M n ( I I ) , a n d [ M n ( I I I ) - t a m ] g i v e s t h e e q u a t i o n s s h o w n b e l o w ( f o l l o w i n g p a g e ) : d ! M 2 m ] , .._ fi 0 ' g ” h i n g » ) , 1 1 1 n m . ) t B + M I M R U H ) - t a r t , ] , [ L i g n i n ] B ( 4 - 2 8 ) 7 8 A . H 3 0 1 : H o D ‘ ” A a f , ” = — — 4 I ‘ , ' ; , ° ’ H . 0 1 1 . 1 1 1 . 0 1 . ) 3 _ h e n r u n r w r o r l i v u . [ H z o z l r k 3 k , [ V A ] , + k l k 3 I H 2 0 1 ] 3 [ V A ] , + k l k 4 I H 2 0 2 ] 8 ( 1 + — K — — — ) 1 _ k , . [ M N P . ] , [ H , 0 , ] , [ M n ( I I ) ] , [ M n ( I I ) ] , M k s ‘ t . [ H , O , ] B . _ k , . [ M N P , ] , [ H , 0 , ] , [ M n ( I I ) ] , ( ” 6 ) [ M n ( I I ) ] , “ k s ’ b I H z o z l a B . V A : 4 V A 1 3 = D . V A A [ e - fl V A ] . _ C - W N ‘ ) ( 4 . 2 7 ) d : a V , ‘ _ h t . k . r u n . r H . 0 . 1 . r V A l . [ 3 2 0 2 ] » w m , # 1 1 1 1 0 1 1 V A ] . # 1 1 1 9 1 1 1 ” ‘ 7 ‘ " 1 C . M n ( I I ) : _ 2 k , a [ l l ! 1 V P . ] , , [ l ‘ I , 0 , ] , , [ 1 l ! n ( 1 1 ) ] , I [ M n ( I I ) ] , « t a x m a n , _ 2 1 r , [ M N P , 1 , [ 1 1 , 0 , ] , [ M n ( 1 1 ) ] , [ M " ( 1 0 ] , “ * s fl r l e O J r 7 9 D . M n ( I I I ) : “ m m ” W ' - 0 3 m ; « M r ( 1 1 1 ) 1 1 1 v , “ + 2 k 5 . [ M N P , ] , [ H , 0 , ] , , [ M n ( 1 1 ) ] , [ M n ( I n l . + 4 k . , ¢ . I H . 0 . J . 2 & 5 . [ M N P , ] B [ H , 0 , ] , [ M n ( 1 1 ) ] , [ M n ( I I ) ] , + 4 k s , ' b [ H 2 0 2 J e - k , [ M u ( 1 1 1 ) - r a u , ] , [ L i g n i n ] , ( 4 - 2 9 ) « m g , - [ M n ( 1 1 1 ) - t a r r , ] , ) I n a l l c a s e s , k , , k , , k . , a n d K , a r e D 5 N o M n L I P k i n e t i c c o n s t a n t s , k , , a n d \ I V , ( = { k 6 , + k 7 , } / { k 6 . k - , , } ) a r e D 5 N o M n M N P ( M N P ) k i n e t i c c o n s t a n t s , k , , , a n d ‘ 1 ' , ( = { k , , , , + k - , , , } / { k a , k - , , , } ) a r e D 4 H i M n M N P ( M N P b ) k i n e t i c c o n s t a n t s , B ( = a + l / a , ) d e p e n d s o n V A v i s c o s i t y a n d a g g r e g a t e r a d i u s , k 8 i s t h e r a t e c o n s t a n t f o r c o n s u m p t i o n o f M n ( I I I ) i n t h e o x i d a t i o n o f l i g n i n b o n d s , a n d t h e o t h e r v a r i a b l e s a r e a s d e s c r i b e d e a r l i e r . F o r a c o m p l e t e d e fi n i t i o n a n d e x p l a n a t i o n o f t h e s e v a r i a b l e s , r e f e r t o t h e m o d e l d e r i v a t i o n i n A p p e n d i c e s B a n d C . 4 . 5 . 2 I n i t i a l C o n d i t i o n s A t t i m e z e r o , t h e c o n c e n t r a t i o n s o f H 2 0 , a n d V A a r e s e t a t t h e i r m a x i m u m v a l u e s a s d e fi n e d b y O l s e n e t a l . ( 1 9 9 1 ) . T h e c o n c e n t r a t i o n s o f H 2 0 2 a n d V A i n S i d e A a r e t h e n s e t s o t h a t t h e i n i t i a l r a t e s o f c o n s u m p t i o n o f b o t h H 2 0 , a n d V A a r e s l i g h t l y h i g h e r t h a n t h e i r i n i t i a l r a t e s o f s u p p l y . T h i s e f f e c t i v e l y d r i v e s t h e c o n c e n t r a t i o n s o f H 2 0 , a n d V A i n S i d e B d o w n i n t o t h e i r r e s p e c t i v e r a n g e s . S i n c e t h e r a t e s o f c o n s u m p t i o n o f H 2 0 2 a n d V A w i l l f o l l o w t h e r e a c t a n t i n l o w e r c o n c e n t r a t i o n , t h e i r r a t e s o f s u p p l y m u s t b e m a i n t a i n e d c l o s e t o o n e a n o t h e r . I n a d d i t i o n , t h e c o n c e n t r a t i o n s o f H 2 0 , a n d V A i n S i d e B m u s t b e m a i n t a i n e d w i t h i n n a r r o w r a n g e s ( s e e T a b l e 4 . 2 ) w h i c h a r e d e p e n d e n t o n t h e L I P a n d M N P a c t i v i t i e s a s s p e c i fi e d b y O l s e n e r a l . ( 1 9 9 1 ) . S i n c e 0 ‘ ” f o r H 2 0 2 i s m u c h l ‘ I - l ‘ g e r t h a n D " f o r V A , t h e r a t e o f s u p p l y o f H 2 0 2 c a n b e e x p e c t e d t o d e c r e a s e m u c h 8 0 T a b l e 4 . 2 : O p t i m a l c o n d i t i o n s f o r i n v i t r o d e l i g n i fi c a t i o n o f p a p e r p u a l p b y a m i x t u r e o f x y l a n a s e s a n d t h e U P S a n d M N P S o f P . c h r y s o s p o r i u m ( O l s e n e t 1 9 9 1 ) . P a r a m e t e r C o n d i t i o n s C a s e s B u f f e r 1 5 - 2 5 m M T a r t r a t e A l l p H 3 . 0 t o 5 . 0 A l l T w e e n 8 0 0 . 0 1 t o 0 . 0 5 % A l l L a c t a t e A d d @ 1 . 0 t o 1 0 . 0 m M M N P , L I P + M N P L i g n o c e l l u l o s e 2 t o 1 0 % ( w / v ) A l l H 2 0 2 M a i n t a i n @ 0 . 0 0 5 t o 0 . 1 m M A l l V A M a i n t a i n @ 0 . 0 0 5 t o 0 . 6 m M L I P , L I P + W P M n ( I I ) A d d @ 0 . 1 t o 0 . 5 0 m M M N P , L I P + M N P L I P A d d @ 1 5 t o 3 0 U / g L I P , L I P + M N P M N P A d d @ 3 5 t o 1 0 0 U / g M N P , L I P + M N P a 1 m 0 — 3 ] — ; , ) . ] ( 1 4 = f ( d r “ ” V 2 A 0 r , 2 1 : 8 1 m o r e r a p i d l y t h a n t h e r a t e o f s u p p l y o f V A . T h e v o l u m e o f t h e r e a c t o r c h a m b e r s i s n o t l a r g e e n o u g h t o a l l o w c o n s t a n t r a t e s o f s u p p l y w i t h o u t c o n c e n t r a t i o n a d j u s t m e n t o v e r t i m e ; t h u s , t o . k e e p t h e c o n c e n t r a t i o n s o f H 2 0 2 a n d V A i n S i d e B w i t h i n t h e i r r e s p e c t i v e r a n g e s , p u l s e s o f c o n c e n t r a t e d H 2 0 2 , V A , L I P , a n d M N P m u s t b e a d d e d i n o r d e r t o m a i n t a i n t h e r a t e s o f s u p p l y a n d c o n s u m p t i o n . D u r i n g a t t e m p t s t o d e t e r m i n e t h e i n i t i a l r a t e s , i t w a s n o t e d t h a t t h e r a t e s o f s u p p l y h a d t o b e s e t a t v a l u e s l o w e r t h a n t h e r a t e o f c o n s u m p t i o n o r e l s e o n e o f t h e r e a c t a n t s w o u l d a c c u m u l a t e r a p i d l y ( n o r m a l l y V A ) . T h e r e f o r e t h e i n i t i a l c o n d i t i o n s w e r e s e t g e n e r a l l y a s ( T M = f z ( ( I t s u r e » w h e r e f , a n d f 2 a r e f r a c t i o n s . O l s e n e t a l . ( 1 9 9 1 ) s u g g e s t e d r a n g e s o f L I P a n d M N P a c t i v i t y a n d c o r r e s p o n d i n g r a n g e s o f H 2 0 2 a n d V A c o n c e n t r a t i o n s w h i c h t h e y f o u n d w e r e O p t i m u m f o r i n v i t r o d e g r a d a t i o n o f p a p e r p u l p . B y u s i n g t h e i r c r i t e r i a , w e c a n d e fi n e t h r e e c o n s t a n t s 3 , , 5 , a n d e s u c h t h a t ” 1 2 0 2 1 1 1 . “ = ” J u n e , [ V A ] , _ = s u m , ‘ ( 4 — 3 1 ) [ M n ( 1 1 ) ] , _ = e fl M N P J B . + [ M N P , ] , , . ) T h e s e e q u a t i o n s a r e s o l v e d f o r S i d e B c o n c e n t r a t i o n s , i n s e r t e d i n t o t h e i n i t i a l c o n d i t i o n s a b o v e , a n d s o l v e d f o r [ 1 1 2 0 2 ] A a n d [ V A ] A . T h e fi n a l f o r m s o f t h e e q u a t i o n s f o r [ 1 1 2 0 2 ] A a n d [ V A ] , a r e ( f o l l o w i n g p a g e ) : [ H 2 0 1 1 ‘ = p 1 [ u n 3 . ( 4 - 3 3 ) k r k s k e p r m v s l u p fi l , 8 2 [ V A L " ' % h i t - m m " ( 4 - 3 2 ) l i k e m i b W V r l L I P J i , 9 [ U P ] D Q A Q J J + k , k , fl , 0 [ U I ’ ] , . + k l k , B , ( l + l K a , » 1 a n d B l l L I P l . n g A g k , a + k , k , | l , 6 [ L I P ] , . + k , k , l l , ( l + x e ) I k , . B , e l V , [ U I ’ ] , . [ M N P J , . fl M A V P J B . + l M N P J B . ) 1 1 : 0 3 . 4 l e ( [ M N P , ] , . + [ M N P , ] , , . ) + 4 k , 3 . p , [ u n , . } k , , B , e I V , [ L I P l . . [ M N P J s fl M N P J B . + [ M N P 5 1 1 1 , ) D 3 3 0 3 . 4 l e a M N P J , . + [ M N P , ] . . ) + 4 1 : , ¢ , p , [ 1 . 1 1 1 , } C h o o s i n g t h e L I P , M N P , , a n d M N P , a c t i v i t i e s t h e n s e t s t h e i n i t i a l c o n d i t i o n s f o r t h e m o d e l . 4 . 5 . 3 F O R T R A N M o d e l S i m u l a t i o n T h e m o d e l p r e s e n t e d a b o v e w a s n u m e r i c a l l y s o l v e d b y c o m p u t e r u s i n g a f o u r t h - o r d e r R u n g e - K u t t a - G i l l p r e d i c t o r - c o r r e c t o r m e t h o d ( F i n l a y s o n , 1 9 8 0 ) w i t h a t i m e s t e p o f 0 . 1 m i n u t e s f o r L I P a l o n e o r 0 . 0 1 m i n u t e s f o r M N P a l o n e a n d f o r L I P + M N P . T h e p r o g r a m , R K G . F O R , i s l i s t e d i n A p p e n d i x D , w i t h d e fi n i t i o n s o f t h e v a r i a b l e s p r e c e d i n g t h e p r o g r a m . I n i t i a l c o n d i t i o n s w e r e s e t a s d e s c r i b e d a b o v e . T h e p r o g r a m w a s u s e d a s a p r e d i c t o r / c o r r e c t o r t o c o n s t r u c t a c o n t r o l s c h e m e f o r e a c h e n z y m e a n d t h e m i x t u r e ( L I P + M N P ) , a s f o l l o w s . S t a r t i n g w i t h t h e i n i t i a l c o n d i t i o n s , t h e m o d e l w a s s o l v e d s t e p - w i s e 8 3 u n t i l c o n d i t i o n s ( 1 1 2 0 , a n d V A c o n c e n t r a t i o n s a n d / o r L I P a n d M N P a c t i v i t i e s ) i n S i d e B w a r r a n t e d a d j u s t m e n t o f t h e s u p p l y a n d c o n s u m p t i o n r a t e s o r e n z y m e a c t i v i t i e s . P r o g r a m o u t p u t i n c l u d e d p u l s e ( r e a g e n t a d d i t i o n s t o S i d e A o r e n z y m e a d d i t i o n s t o S i d e B ) t i m e s , v o l u m e s , a n d c o n c e n t r a t i o n s n e c e s s a r y t o m a i n t a i n S i d e B l e v e l s o f r e a c t a n t s a n d e n z y m e s w i t h i n t h e i r p r e s c r i b e d r a n g e s . T h e p u l s e t i m e s a n d c o n c e n t r a t i o n s w e r e o p t i m i z e d f o r e a c h L I P a n d / o r M N P a c t i v i t y a n d e n z y m e s o u r c e b y u s i n g a s h o o t i n g m e t h o d t o c h o o s e t h e b e s t v a l u e s o f a d j u s t a b l e m o d e l p a r a m e t e r s ( s e e A p p e n d i x D ) . T h e o p t i m i z a t i o n a l g o r i t h m i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 4 . 7 . T h e c o n d i t i o n s c h o s e n f o r r e a c t i o n / t r a n s p o r t r a t e a d j u s t m e n t s ( t h r o u g h a d j u s t m e n t o f [ 1 1 2 0 2 ] , “ [ V A ] A , [ L I P ] , , , [ M N P ] , , , o r c o m b i n a t i o n s o f t h e s e ) , a n d t h e a c t i o n s t a k e n t o c o r r e c t t h e r a t e s a r e g i v e n b e l o w . F o r t h e fi r s t c a s e ( ( 1 a ) ) b e l o w , t h e c o n d i t i o n s f o r c o n c e n t r a t i o n a d j u s t m e n t s a r e e x p l a i n e d i n b o t h v e r b a l a n d m a t h e m a t i c a l t e r m s ; f o r s u b s e q u e n t c a s e s , o n l y t h e m a t h e m a t i c a l s h o r t h a n d i s u s e d . A l l f r a c t i o n s u s e d b e l o w a r e n a m e d i d e n t i c a l l y t o t h e v a r i a b l e s u s e d i n R K G . F O R . ( l ) L I P A l o n e : ( a ) I f t h e V A c o n c e n t r a t i o n i n S i d e B e x c e e d s a p r e d e fi n e d f r a c t i o n b r a n g e o f i t s m a x i m u m , i e . [ V A ] , 2 b r a n g e x [ V A ] m , a n d t h e L I P i n S i d e B i s a b o v e a c e r t a i n p r e d e fi n e d f r a c t i o n l r a n g e o f i t s i n i t i a l ( a b s o l u t e t i m e z e r o ) a c t i v i t y , i e . [ L I P ] , > I r a n g e x [ L I P ] , , o , w h e r e [ V A l n m = 0 . 6 m M , a n d [ L I P ] , , , , = 1 0 0 0 U / L , t h e n [ 1 1 , 0 2 ] A i s a d j u s t e d s u c h t h a t 4 1 1 0 , } J I V A ] < + ‘ + m = W — fi w “ - 3 " w h e r e d e l t a ) 1 . F o r a c o n s t a n t p u l s e c o n c e n t r a t i o n , R K G . F O R c a l c u l a t e s t h e p u l s e v o l u m e n e c e s s a r y t o a d j u s t t h e H 2 0 , c o n c e n t r a t i o n i n S i d e A . 8 4 D e c l a r e V a r i a b l e s , S e t C o m m o n B l o c k s i I n i t i a l i z e M o d e l I P a r a m e t e r s , fl a g s , e t c . 1 R e a d i n E n z y m e C o n c ’ s , 7 E n z y m e P u l s e C o n c ’ s , A d j u s t a b l e P a r a m e t e r s , e t c . i I I n i t i a l i z e O u t p u t F i l e s I i C a l c u l a t e I n i t i a l A C o n d i t i o n s i I B e g i n S t e p w i s e S o l u t i o n | I S e t R e f e r e n c e T i m e i = 0 l < A , C a l c u l a t e N e w C o n d i t i o n s I l C a l c u l a t e C o n c e n t r a t i o n s ] N e c e s s a r y f o r A d j u s t m e n t ; ‘ a t T i m e i + 1 A d j u s t C o n c e n t r a t i o n a n d O u t p u t P u l s e V o l u m e } a n d / o r C o n c e n t r a t i o n N e c e s s a r y Q u e s t i o n : A r e C o n d i t i o n s M e t T h a t W a r r a n t J , R e a d j u s t m e n t o f N 0 T r a n s p o r t o r R e a c t i o n Y e s R a t e s ? fi g u r e 4 . 7 : F l o w c h a r t r e p r e s e n t a t i o n o f t h e s o l u t i o n s t r a t e g y u s e d b y t h e r e a c t o r m o d e l p r o g r a m R K G . F O R . 4 , . , . , . “ — ( H — a - 1 d r : , 0 ) : m 1 , = e ( 1 “ l H e Z A d O l ! I . J B m . . . ( 4 3 5 ) 8 5 ( b ) I f ( [ V A l n 2 b r a n g e X I V A l n m ) a n d ( [ L 1 P ] n S I r a n g e l e l P l n o ) . t h e n [ 1 1 2 0 2 1 1 a n d [ V A ] A a r e a d j u s t e d s u c h t h a t ( T m = ( A T M w h e r e g , a n d g , a r e a n a l o g o u s t o f , a n d f , i n t h e i n i t i a l c o n d i t i o n s . T h e t w o e q u a t i o n s , w h i c h d e p e n d o n L I P a c t i v i t y , a r e s o l v e d f o r [ I - I , O , ] A , a n d [ V A ] , , , f o r a c o n s t a n t v o l u m e ( 2 0 1 1 L ) , c o n s t a n t c o n c e n t r a t i o n ( 5 0 0 0 U / L ) L I P p u l s e t o S i d e B . F o r a c o n s t a n t p u l s e v o l u m e o f 4 0 u L , R K G . F O R c a l c u l a t e s t h e S i d e A p u l s e c o n c e n t r a t i o n s o f I - I , O , a n d V A n e c e s s a r y t o s a t i s f y t h e a b o v e r a t e c o n d i t i o n s . ( c ) T i m e d e l a y s i n p u l s e a d d i t i o n : T h e c o m p u t e r s i m u l a t i o n c a n c h a n g e S i d e A c o n c e n t r a t i o n s i n s t a n t a n e o u s l y . T h i s i s n o t p h y s i c a l l y p o s s i b l e , s o a p u l s e t i m e d e l a y w a s p r o g r a m m e d i n t o t h e s o l u t i o n , a s f o l l o w s : ( i ) P u l s e [ H , O , ] A a l o n e , r e m o v e p u l s e v o l u m e f r o m S i d e A , a n d 3 t i m e s t e p s ( 0 . 3 m i n ) l a t e r a d d i d e n t i c a l v o l u m e a t p u l s e c o n c e n t r a t i o n t o S i d e A ( k e e p s v o l u m e s o f S i d e A a n d S i d e B e q u a l ) ; ( i i ) P u l s e [ H , O , ] , , , [ V A ] , , , a n d [ L I P ] , , , r e m o v e 2 0 1 1 L f r o m S i d e A , 3 t i m e s t e p s l a t e r a d d 4 0 u L o f S i d e A p u l s e s o l u t i o n t o S i d e A , a n d 4 t i m e s t e p s l a t e r ( 0 . 4 m i n ) a d d 2 0 u L o f L I P p u l s e s o l u t i o n . T h e n e t v o l u m e i n c r e a s e ( b o t h s i d e s ) i n t h i s c a s e i s 2 0 p L . ( 2 ) L I P + M N P : ( a ) I f ( I V A l n 2 b r a n g e w a l e x ) ’ b u t ( [ L I P J n ) l r a n g e l e l P l n . ) a n d ( [ M N P I n ) m r a n g e x [ M N P ] , , , ) w h e r e m r a n g e i s a f r a c t i o n , [ M N P ] , , , , i s t h e M N P a c t i v i t y a t a b s o l u t e t i m e z e r o , a n d a l l o t h e r v a r i a b l e s a r e a s a b o v e , t h e n [ I - I , O , _ ] A i s a d j u s t e d s u c h t h a t d [ H , O , ] A d I V A l ‘ H 0 ( — — d t — — - ) , . , , , , = d a m - T . . . ” + ( ” I ’ ’ 1 ' ( 4 3 6 ) a W ” w h e r e d e l t a ) 1 . T h i s c o n d i t i o n i s a n a l o g o u s t o ( l a ) a b o v e . 8 6 ( b ) I f ( [ V A l n 2 b r a n g e X I V A l a m ) a n d ( [ L I P l n S l m n g e X I I - I p l n o ) . b u t ( [ M N P J n ) m r a n g e X f N I N P ] , , , ) , t h e n [ H , 0 , ] , a n d [ V A ] , a r e a d j u s t e d s u c h t h a t 4 3 2 0 1 1 1 ( T m = g 1 ( ( I t ” P r e c e d e - 4 V 4 ] ( fi m = 8 1 ( d ! m m ( 4 - 3 7 ) w h e r e g , a n d g , a r e a n a l o g o u s t o f , a n d f , i n t h e i n i t i a l c o n d i t i o n s . T h i s c a s e i s a n a l o g o u s t o ( 1 b ) a b o v e . ( c ) I f ( [ V A ] , , 2 b r a n g e x W A ] , , m ) , b u t ( [ L I P ] , ) I r a n g e > < [ L I P ] , , ° ) a n d ( [ M N P ] , s m r a n g e x [ M N P ] , , , , ) , t h e n [ I - I , 0 , ] , i s a d j u s t e d e x a c t l y a s i n ( 2 a ) a b o v e , a n d M N P . i s a d d e d t o S i d e B . T h i s c o n d i t i o n i s a l s o a n a l o g o u s t o ( l a ) a b o v e . ( d ) I f ( [ V A ] , , 2 b r a n g e x [ V A ] B w ) a n d ( [ L I P ] , s l r a n g e x [ L I P ] , , , , ) , a n d ( [ M N P ] , s m r a n g e X [ M N P ] , , , ) , t h e n [ H , 0 , ] , a n d [ V A ] , a r e a d j u s t e d s u c h t h a t 4 1 1 , 0 , 1 , 4 1 1 , 0 , 1 , ( — — — — ) = r ( — — ) a r m ] , a m ] , ( T r - u p o n = g l ( d 1 m m w h e r e g , i s n o t e q u i v a l e n t t o g , . B o t h L I P a n d M N P , a r e a d d e d f o r t h i s c a s e . T h i s c a s e i s a n a l o g o u s t o ( 2 b ) a b o v e . ( c ) T i m e d e l a y s i n p u l s e a d d i t i o n : P u l s e d e l a y s f o r t h e s e c a s e s a r e : ( i ) P u l s e [ 1 1 2 0 2 ] , a l o n e , r e m o v e p u l s e v o l u m e f r o m S i d e A , a n d 3 0 t i m e s t e p s ( 0 . 3 m i n ) l a t e r a d d i d e n t i c a l v o l u m e a t p u l s e c o n c e n t r a t i o n t o S i d e A ( k e e p s v o l u m e s o f S i d e A a n d S i d e B e q u a l ) ; ( i i ) P u l s e [ H , 0 , ] , , [ V A ] , , a n d [ L I P ] , , , r e m o v e 2 0 1 4 L f r o m S i d e A , 3 0 t i m e s t e p s l a t e r a d d 4 0 p L o f S i d e A p u l s e s o l u t i o n t o S i d e A , a n d 4 0 t i m e s t e p s l a t e r ( 0 . 4 m i n ) a d d 2 0 a t . o f L I P p u l s e s o l u t i o n ; ( i i i ) P u l s e [ I - I , 0 , ] , a n d m a x i m , a d d 2 0 a t . o f S i d e A p u l s e s o l u t i o n t o S i d e A , a n d 4 0 t i m e s t e p s l a t e r a d d 2 0 u L o f M N P , p u l s e s o l u t i o n t o S i d e B ; ( i v ) P u l s e [ H , 0 , ] , , [ V A ] , , [ L I P ] , , , a n d [ M N P , ] , , , r e m o v e 2 0 u L f r o m S i d e A , 3 0 t i m e 8 7 s t e p s l a t e r a d d 4 0 u L o f S i d e A p u l s e s o l u t i o n t o S i d e A , a n d 4 0 t i m e s s t e p s l a t e r a d d 2 0 # 1 . . o f L I P + M N P , p u l s e s o l u t i o n t o S i d e B . T h e v o l u m e i n c r e a s e i n t h i s c a s e i s 2 0 # 1 . . . ( 3 ) M N P A l o n e ( N o V A i s P r e s e n t ) : ( a ) I f ( [ H z o z l n 2 { [ H z o z l m + a r a n g e X Q H z O z l n m - m z o d m ) ” b u t ( [ M N P l n ) m r a n g e x [ M N P ] , , o ) , w h e r e a r a n g e i s a f r a c t i o n , [ 1 1 , 0 2 ] “ , = 0 . 0 0 5 m M , [ H , 0 , ] m = 0 . 1 m M , a n d [ M N P ] B o i s t h e M N P a c t i v i t y a t a b s o l u t e t i m e z e r o , t h e n [ H , 0 , ] , i s a d j u s t e d s u c h t h a t [ 1 1 . 0 . ] . # 1 1 9 0 1 , ( # 3 9 ) w h e r e f , i s a n e m p i r i c a l f r a c t i o n , a n d [ H , 0 , ] , , , i s t h e S i d e A c o n c e n t r a t i o n o f H , 0 , a t a b s o l u t e t i m e z e r o . N o t e t h a t [ M n ( I I ) ] , d e c r e a s e s o v e r t i m e s i n c e n o n e i s i n i t i a l l y a d d e d t o S i d e A . T h e k i n e t i c r a t e o f c o n s u m p t i o n t h e n a l s o d e c r e a s e s , a n d s o f 3 m u s t d e c r e a s e w i t h e a c h c o n s e c u t i v e p u l s e ; a r b i t r a r i l y i t w a s m a d e t o d e c r e a s e l i n e a r l y . A l s o n o t e t h a t t h i s i s a c o m p l e t e l y e m p i r i c a l a p p r o a c h f o r t h i s c a s e . F o r a c o n s t a n t p u l s e c o n c e n t r a t i o n , R K G . F O R c a l c u l a t e s t h e S i d e A p u l s e c o n c e n t r a t i o n o f H , 0 , , a t c o n s t a n t p u l s e v o l u m e o f 2 0 u L , n e c e s s a r y t o s a t i s f y t h e a b o v e r a t e c o n d i t i o n s . 0 ) ) I f ( [ H z o z l a 5 { [ H z o z l a n i n + “ r a n g e x ( [ H 2 0 2 ] B m a x " m z o z l e n n i n ) » a n d ( [ M N P ] ; 5 m r a n g e x [ M N P ] , , , , ) , t h e n [ I - I , 0 , ] , i s a d j u s t e d s u c h t h a t [ 3 2 0 2 1 . 4 = f s t I H z o z l A , ( 4 ' 4 0 ) w h e r e f , i s a s a b o v e a n d f , i s a n a d d i t i o n a l e m p i r i c a l f r a c t i o n w h i c h a c c o u n t s f o r r a t e c h a n g e s w h e n M N P i s l a t e r a d d e d t o S i d e B . T h i s i s a l s o a c o m p l e t e l y e m p i r i c a l a p p r o a c h t o c o n t r o l o f t h i s c a s e . ( c ) T i m e d e l a y s i n p u l s e a d d i t i o n : P u l s e t i m e d e l a y s f o r t h i s c a s e a r e : ( i ) P u l s e ( 3 1 2 0 2 ] , a l o n e , r e m o v e p u l s e v o l u m e f r o m S i d e A , a n d 4 0 t i m e s t e p s ( 0 . 4 m i n ) l a t e r a d d i d e n t i c a l v o l u m e a t p u l s e c o n c e n t r a t i o n t o S i d e A ( k e e p s v o l u m e s o f S i d e A a n d S i d e B e q m l ) ; ( i i ) P u l s e [ H , 0 , ] , a n d [ M N P ] , , , a d d 2 0 u L o f S i d e A p u l s e s o l u t i o n t o S i d e A , 8 8 a n d 4 0 t i m e s t e p s l a t e r ( 0 . 4 m i n ) a d d 2 0 u L o f M N P p u l s e s o l u t i o n . T h e n e t v o l u m e i n c r e a s e ( b o t h s i d e s ) i n t h i s c a s e i s 2 0 u L . 4 . 5 . 4 P e r t u r b a t i o n A n a l y s i s o f M o d e l P a r a m e t e r s I n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e s t a b i l i t y c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e r e a c t o r s i m u l a t i o n w i t h r e s p e c t t o t h e a c c u r a c y o f t h e m e a s u r e d m o d e l p a r a m e t e r s , a n a d d i t i o n a l F O R T R A N p r o g r a m w a s d e v e l o p e d . T h i s p r o g r a m , n a m e d P E R T U R B . F O R , a n d l i s t e d i n A p p e n d i x D , a c c e p t s t h e p u l s e t i m e / v o l u m e / c o n c e n t r a t i o n o u t p u t f r o m R K G . F O R , a n d s o l v e s t h e m o d e l u s i n g t h i s d a t a . 9 5 % C o n fi d e n c e I n t e r v a l s w e r e c a l c u l a t e d f o r e a c h m e a s u r e d m o d e l p a r a m e t e r ( i e . e f f e c t i v e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t s , k i n e t i c c o n s t a n t s , e t c . ) u s i n g l i n e a r r e g r e s s i o n ( i f d a t a w e r e fi t t o o b t a i n t h e v a l u e s ) , o r e l e m e n t a r y s t a t i s t i c s ( T a y l o r , 1 9 8 2 ) u s i n g t h e N o r m a l D i s t r i b u t i o n . I n o r d e r t o s i m p l i f y c a l c u l a t i o n s f o r t h e l i n e a r r e g r e s s i o n , a F O R T R A N p r o g r a m u s i n g m a t r i x a l g e b r a w a s w r i t t e n t o p e r f o r m t h e o p e r a t i o n s ( L I N R E G . F O R , l i s t e d i n A p p e n d i x D ) . T h e S i d e B r e a c t a n t a n d e n z y m e p r o fi l e s u s i n g t h e m e a s u r e d m o d e l p a r a m e t e r s + / - t h e i r 9 5 % C o n fi d e n c e I n t e r v a l s w e r e c a l c u l a t e d i n o r d e r t o fi n d t h e p a r a m e t e r s w h i c h h a d t h e g r e a t e s t e f f e c t o n t h e s t a b i l i t y o f t h e m o d e l s o l u t i o n s , a n d h o w m u c h e r r o r i n t h e i r m e a s u r e m e n t w a s p o s s i b l e b e f o r e t h e m o d e l s o l u t i o n n o l o n g e r s t a y e d w i t h i n t h e p r e s c r i b e d c o n c e n t r a t i o n l i m i t s . T h i s p e r t u r b a t i o n a n a l y s i s p r o v i d e d n o i n f o r m a t i o n o n h o w t h e r e a c t o r w a s t o b e r u n , i e . r e a c t a n t c o n c e n t r a t i o n s , p u l s e s , e t c . , b u t s e r v e d m e r e l y a s a t o o l t o g e t a f e e l f o r t h e m o r e i m p o r t a n t m e a s u r e d p a r a m e t e r s a n d t h e n e c e s s a r y d e g r e e o f a c c u r a c y i n t h e i r m e a s u r e m e n t . T h i s i n f o r m a t i o n w o u l d b e h e l p f u l i n d e s i g n i n g s i m i l a r s y s t e m s i n t h e f u t u r e . 4 . 6 I n v i t r o T r e a t m e n t o f L i g n i n i n t h e R e a c t o r T r e a t m e n t o f i n s o l u b l e l i g n i n w i t h L I P s a n d / o r M N P s w a s c a r r i e d o u t i n t h e d i a l y s i s r e a c t o r a t 3 7 ° C , 2 % ( w / v ) s o l i d s , a p p r o x i m a t e l y 5 0 U / g o f L I P a n d / o r 2 8 0 0 U / g o f M N P ( b y M N P A s s a y # 1 ) i n 2 0 m M t a r t r a t e b u f f e r , p H 3 . 5 0 . T h i s p H w a s C h o s e n a s a t r a d e o f f b e t w e e n L I P a c t i v i t y a n d M N P a c t i v i t y ( s e e F i g u r e 4 . 8 ( M i c h e l , 8 9 1 - , . M N P L I P 7 , — ’ — v c r a t r y l a l e o h o l 0 . 9 “ o x i d a t i o n a s e a y - — O — - p h a n o l r e d o x l d a t i o n 0 . 8 - - m a y 0 7 _ _ — - ¢ — r e m a z o l b l u e o x l d a t l o n . a s s a y 0 . 6 - - N o r m a l i z e d E n z y m e 0 . 5 - ~ A c t i v i t y 0 . 4 - r 0 . 3 ~ - 0 . 2 - - 0 . 1 ~ - 0 r m u n + v v r i v e u 4 t n r r r r u t n r i 1 2 3 4 5 6 7 8 I g g r i r e 4 . 8 : V a r i a t i o n o f L I P a n d M N P a c t i v i t i e s w i t h p H o f t h e s y s t e m ( M i c h e l , ) . 9 0 1 9 9 1 ) ) . T h e i n i t i a l l i q u i d v o l u m e i n b o t h s i d e s w a s 1 m L . I n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s o f H , 0 2 a n d V A i n S i d e A w e r e d e t e r m i n e d f o r g i v e n L I P , M N P , o r L I P + M N P a c t i v i t i e s u s i n g R K G . F O R ( d e s c r i b e d a b o v e ) . W h e n M N P w a s i n c l u d e d i n t h e r u n , e n o u g h M n ( I I ) f o r a fi n a l S i d e B c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 1 m M w a s a d d e d fi r s t t o a t u b e c o n t a i n i n g t h e M N P e n z y m e , a s t o i c h i o m e t r i c a m o u n t o f H , 0 , , a n d 2 0 m M t a r t r a t e b u f f e r , p H 3 . 5 0 , i n o r d e r t o c o n v e r t i t t o [ M n ( I I I ) - t a r t , ] p r i o r t o s t a r t i n g t h e r e a c t i o n . T h i s m a d e t h e r e a c t i o n r a t e s e a s i e r t o c o n t r o l s i n c e b y f a r t h e h i g h e s t r a t e o f c o n s u m p t i o n o f H , 0 2 i s i n t h e i n i t i a l c o n v e r s i o n o f M n ( I I ) t o [ M n ( I I I ) - t a r t ] N o t e t h a t l a c t a t e w a s n o t a d d e d t o a n y r e a c t o r r u n s i n c e t a r t r a t e i s a b e t t e r c h e l a t o r o f M n ( I I I ) t h a n l a c t a t e ( W a r i i s h i e t a l . , 1 9 9 2 ) , a n d t h a t M n ( I I ) w a s a d d e d o n l y t o S i d e B ( n o n e a d d e d t o S i d e A ) . T h e m a x i m u m a n d m i n i m u m v a l u e s o f [ H , 0 , ] , , , [ V A ] , , , a n d [ M n ( I I ) ] , w e r e d e t e r m i n e d f r o m t h e r a n g e s r e p o r t e d b y O l s e n e r a l . ( 1 9 9 1 ) , a n d a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 4 . 2 a b o v e . S i d e B c o n c e n t r a t i o n s o f H , 0 , , V A , a n d M n ( I I ) w e r e s e t a t t h e m a x i m u m v a l u e s s p e c i fi e d b y O l s e n e t a l . ( 1 9 9 1 ) ( T a b l e 4 . 2 ) . R u n s w e r e c a r r i e d o u t a s d e s c r i b e d b e l o w . 4 . 6 . 1 R e a c t o r R u n P r o c e d u r e B e f o r e s t a r t i n g a r e a c t o r r u n , t h e L I P a n d M N P a c t i v i t i e s i n t h e s t o r e d e n z y m e w e r e m e a s u r e d u s i n g t h e L I P A s s a y a n d M N P A s s a y # 1 ( M N P a c t i v i t y t h e n c o n v e r t e d t o M N P A s s a y # 2 u n i t s f o r c a l c u l a t i o n o f i n i t i a l c o n d i t i o n s ; s e e A p p e n d i x A ) . T h e a m o u n t o f s t o r e d e n z y m e t o a d d t o S i d e B w a s t h e n c a l c u l a t e d f o r t h e d e s i r e d L I P l e v e l . I f L I P o r M N P w e r e t o b e r u n a l o n e , t h e p u l s e t i m e s a n d c o n c e n t r a t i o n s w e r e a l r e a d y d e t e r m i n e d k n o w n f r o m p r i o r o p t i m i z a t i o n o f R K G . F O R f o r t h o s e c o n d i t i o n s a n d e n z y m e l e v e l s . H o w e v e r , w h e n L I P a n d M N P w e r e p r e s e n t i n t h e r u n , t h e r a t i o o f M N P , ( p r e s e n t i n s m a l l a m o u n t s w i t h t h e D 5 N o M n L I P ) a n d M N P , ( c o n c e n t r a t e d D 4 H i M n ) w a s c a l c u l a t e d a n d R K G . F O R w a s r u n a n d o p t i m i z e d f o r t h o s e c o n d i t i o n s p r i o r t o s t a r t i n g t h e r u n , i n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e p u l s e p r o fi l e s . T h i s w a s d o n e b e e a u s e t h e k i n e t i c c o n s t a n t s f o r t h e t w o M N P s o u r c e s w e r e d i f f e r e n t d u e t o t h e i r d i f f e r i n g i s o e n z y m e p r o fi l e s ( r e f e r t o F P L C p r o fi l e s i n C h a p t e r V ) . T h e S i d e A p u l s e s o l u t i o n s ( i e . H , 0 , 9 1 a l o n e a n d H , 0 , w i t h V A i f L I P w a s r u n a l o n e ) a n d S i d e B p u l s e s o l u t i o n ( i e . L I P p u l s e f o r a L I P a l o n e r u n ) w e r e t h e n m a d e . T h e t i m e z e r o S i d e A s o l u t i o n , c o n t a i n i n g t h e d e s i r e d l e v e l s o f H , 0 , + / - V A i n 2 0 m M t a r t r a t e b u f f e r , p H 3 . 5 0 , w a s m a d e b y a d d i n g t h e n e c e s s a r y v o l u m e s o f f r e s h c o n c e n t r a t e d s t o c k r e a g e n t s a n d d i s t i l l e d w a t e r t o g i v e 1 m L t o t a l v o l u m e o f s o l u t i o n a t t h e d e s i r e d c o n c e n t r a t i o n s . S t o c k r e a g e n t s i n c l u d e d : ( 1 ) 7 . 3 7 M H , 0 2 ( S i g m a ) ; ( 2 ) 6 . 6 0 M V A ( A l d r i c h , 9 6 w t 9 6 V A i n w a t e r ) ; ( 3 ) 1 2 5 m M T a r t a r i c A c i d , p H 3 . 5 0 ; ( 4 ) 2 m M H , 0 , , m a d e f r e s h d a i l y ; ( 5 ) 8 m M H , 0 , , m a d e f r e s h d a i l y ; ( 6 ) 5 0 0 m M H , 0 , , m a d e f r e s h d a i l y ; ( 7 ) 4 0 m M V A , m a d e f r e s h d a i l y ; a n d ( 8 ) 4 m M M n S O , , m a d e f r e s h e a c h m o n t h . T h e t i m e z e r o S i d e B s o l u t i o n , c o n t a i n i n g t h e d e s i r e d l e v e l s o f H , O , + / - V A + l - M n ( I I ) ) i n t a r t r a t e b u f f e r , p H 3 . 5 0 , w a s m a d e i n a s i m i l a r m a n n e r , e x c e p t t h a t t h e v o l u m e w a s m a d e u p t o 1 m L m i n u s t h e n e c e s s a r y v o l u m e o f s t o r e d e n z y m e ( s e e a b o v e f o r e x c e p t i o n i n t h e c a s e o f M N P p r e s e n c e i n t h e r u n ) . C o n c e n t r a t i o n s w e r e s u c h t h a t w h e n d i l u t e d t o 1 m L w i t h t h e s t o r e d e n z y m e , t h e d e s i r e d S i d e B l e v e l s w o u l d b e p r e s e n t . I n i t i a l s o l u t i o n s w e r e o x y g e n a t e d a t 3 7 ° C w i t h p u r e , h u m i d i fi e d 0 2 a t a fl o w r a t e o f 2 m L / m i n f o r 1 0 m i n u t e s b y b u b b l i n g t h e g a s t h r o u g h t h e s o l u t i o n s i n E p p e n d o r f t u b e s ; t h e s o l u t i o n s t h e n r e m a i n e d a t 3 7 ° C f o r a b o u t 5 t o 1 0 m i n u t e s b e f o r e b e i n g a d d e d t o t h e r e a c t o r . W h i l e t h e s t a r t i n g s o l u t i o n s w e r e b e i n g o x y g e n a t e d , 2 0 . 0 m g d r y w e i g h t o f w e t i n s o l u b l e l i g n i n w e r e m e a s u r e d i n t o S i d e B . A ( w e t ) m e m b r a n e w a s t h e n p l a c e d i n t h e r e a c t o r j o i n t , t h e t w o h a l v e s o f t h e r e a c t o r c l a m p e d t o g e t h e r , a n d t h e j o i n t s e a l e d w i t h a d o u b l e l a y e r o f p a r a fi l m . T o b e g i n t h e r e a c t o r r u n , t h e i n i t i a l S i d e A s o l u t i o n ( 1 m L ) w a s p i p e t t e d i n t o S i d e A . N e x t , t h e i n i t i a l S i d e B s o l u t i o n ( 1 m L m i n u s t h e n e c e s s a r y v o l u m e o f s t o r e d e n z y m e o r M N P / [ M n ( I I I ) - t a r t , ] m i x t u r e ) w a s p i p e t t e d i n t o S i d e B , a n d t h e n e c e s s a r y v o l u m e o f s t o r e d e n z y m e ( o r M N P / [ M n ( I I I ) - t a r t , ] ) m i x t u r e , w h i c h c o n t a i n e d t h e M N P , i m m e d i a t e l y a d d e d . T h e s a m p l e p o r t s w e r e t h e n c a p p e d ( t e fl o n f a c e o f s e p t a f a c i n g r e a c t i o n m i x t u r e ) , a n d a g i t a t i o n w a s b e g u n ( 3 5 0 s p m , p e r p e n d i c u l a r t o t h e m e m b r a n e ) . P u l s e s w e r e a d d e d 9 2 t o S i d e A a n d / o r S i d e B w h e n p r e d i c t e d t o b e n e c e s s a r y b y R K G . F O R o p t i m i z a t i o n , a s d e s c r i b e d a b o v e . P u l s e s t o S i d e A w e r e a d d e d b y p i p e t a f t e r r e m o v a l o f t h e c a p a n d s e p t u m ( c a p a n d s e p t u m w e r e r e p l a c e d a f t e r t h e p u l s e w a s c o m p l e t e d ) . P u l s e s t o S i d e B ( a l w a y s e n z y m e o n l y ) w e r e a d d e d t h r o u g h t h e s e p t u m u s i n g a g l a s s m i c r o l i t e r s y r i n g e ( H a m i l t o n C o . , R e n o , N V ) . W h e n t h e r e a c t i o n h a d p r o c w d e d f o r t h e d e s i r e d a m o u n t o f t i m e , t h e s h a k e r w a s t u r n e d o f f a n d t h e r e a c t o r s r e m o v e d f r o m t h e 3 7 ° C r o o m f o r r e c o v e r y o f t h e S i d e A a n d S i d e B s o l u t i o n s . T h e p u l s e p r o fi l e s ( p r e d i c t e d b y R K G . F O R ) f o r t h e L I P a l o n e ( 5 0 U / g ) , M N P a l o n e ( 2 8 0 0 U / g ) , a n d L I P + M N P ( 5 0 U / g L I P a n d 2 8 0 0 m g t o t a l M N P ) a r e p r e s e n t e d i n T a b l e s 4 . 3 t h r o u g h 4 . 5 . W h i l e t h e s e p u l s e p r o fi l e s a r e r e s u l t s o f t h e m o d e l , t h e y a r e p r e s e n t e d h e r e b e c a u s e t h e y w e r e u s e d t o m a k e u p a n d a d d p u l s e s i n t h e a c t u a l r e a c t o r r u n s . P l e a s e r e f e r t o C h a p t e r V f o r t h e S i d e A a n d S i d e B c o n c e n t r a t i o n p r o fi l e s p r e d i c t e d b y t h e m o d e l ; t h e p u l s e p r o fi l e s l i s t e d i n T a b l e s 4 . 3 - 4 . 5 a n d t h e c o n c e n t r a t i o n p r o fi l e s w e r e s i m u l t a n e o u s l y g e n e r a t e d b y R K G . F O R , a n d a s s u c h , t h e c o n c e n t r a t i o n p r o fi l e s a r e t h e d i r e c t r e s u l t o f u s i n g t h e p u l s e p r o fi l e s l i s t e d . C o n t r o l s f o r e a c h c a s e w e r e r u n i n w h i c h o n e o r m o r e c o m p o n e n t s o f t h e r e a c t i o n m i x t u r e w e r e l e f t o u t . T h e s e c o n t r o l s w e r e c a r e f u l l y c h o s e n i n o r d e r t o s c r e e n o u t c o m p o u n d s o r i g i n a t i n g f r o m s o u r c e s o t h e r t h a n t h e l i g n i n . T h e s e c o n t r o l s ( p r e s e n t e d i n t a b u l a r f o r m i n T a b l e s 4 . 6 t h r o u g h 4 . 8 ) i n c l u d e d : ( 1 ) E n z y m e ( s ) + r e a g e n t s ( 1 4 1 , 0 2 + / - V A + l - M n ( I I ) ) + O , + b u f f e r ( n o l i g n i n ) , h e r e a f t e r r e f e r r e d t o a s L ‘ c o n t r o l , t o s c r e e n o u t p r o d u c t s o f o x i d a t i o n o f V A b y L I P , a n d / o r p r o d u c t s f r o m t h e a c t i o n o f [ M n ( I I I ) - t a r t , ] o n M N P s o l u t i o n c o n t a m i n a n t s ; ( 2 ) E n z y m e ( s ) + l i g n i n + 0 , + b u f f e r ( n o r e a g e n t s ) , d e s i g n a t e d R ' , t o s c r e e n o u t c o m p o u n d s p r o d u c e d b y t h e a c t i o n o f a n y p r o t e i n o r c o m p o u n d p r e s e n t i n t h e e n z y m e m i x t u r e ( s ) o t h e r t h a n t h e p e r o x i d a s e e n z y m e s ( L I P a n d / o r M N P ) ; ( 3 ) L i g n i n + r e a g e n t s + 0 , + b u f f e r ( n o e n z y m e ( s ) ) , d e s i g n a t e d E ' , t o s c r e e n o u t c o m p o u n d s a r i s i n g p u r e l y f r o m t h e a c t i o n o f t h e r e a g e n t s o n t h e l i g n i n o r l o w m o l e c u l a r w e i g h t c o m p o u n d s s t i l l p r e s e n t i n t h e l i g n i n ; 9 3 T a b l e 4 . 3 : P u l s e p r o fi l e s p r e d i c t e d b y R K G . F O R f o r t h e L I P A l o n e e n z y m e c a s e . P u l s e v o l u m e s a n d c o n c e n t r a t i o n s a r e l i s t e d f o r b o t h S i d e A a n d S i d e B . S i d e A S i d e B P u l s e S i d e A P u l s e C o n c ' s S i d e B P u l s e E n z y m e A c t i v i t y t i m e P u l s e V o l [ 1 1 3 0 ; ] [ V A ] P u l s e V o l [ L I P ] [ M N P J [ M N P s ] ( m i n ) ( _ u L ) ( m M ) ( M ( “ U ( U / L ) ( U / L ) ( U / L ' ) 6 3 . 5 0 9 . 2 6 1 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 1 2 1 . 2 0 4 0 . 0 0 4 0 6 . 7 8 5 7 . 4 2 0 . 0 0 5 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 1 8 4 . 9 0 9 . 5 5 1 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 2 4 3 . 6 0 4 0 . 0 0 4 1 9 . 4 8 7 6 . 1 2 0 . 0 0 5 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 3 0 8 . 3 0 9 . 9 5 1 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 3 6 8 . 2 0 4 0 . 0 0 4 3 2 . 4 8 9 5 . 3 2 0 . 0 0 5 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 4 3 4 . 0 0 1 0 . 3 3 1 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 4 9 4 . 8 0 4 0 . 0 0 4 4 3 . 6 9 1 1 . 7 2 0 . 0 0 5 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 5 6 1 . 7 0 1 0 . 6 9 1 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 6 2 3 . 6 0 4 0 . 0 0 4 5 4 . 5 9 2 6 . 0 2 0 . 0 0 5 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 6 9 1 . 6 0 1 1 . 0 3 1 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 9 4 T a b l e 4 . 4 : P u l s e p r o fi l e s p r e d i c t e d b y R K G . F O R f o r t h e M N P A l o n e e n z y m e c a s e . P u l s e v o l u m e s a n d c o n c e n t r a t i o n s a r e l i s t e d f o r b o t h S i d e A a n d S i d e B . S i d e A S i d e B P u l s e S i d e A P u l s e C o n c ' s S i d e B P u l s e E n z y m e A c t i v i t y t i m e P u l s e V o l [ 1 1 2 0 ; ] [ V A ] P u l s e V o l [ L I P ] [ M N P J [ M N P b ] ( m i n ) ( 3 L ) ( m M ) ( m M ) ( 1 1 L ) ( U / L ) C U / L ) C U / L ) 2 1 . 9 0 1 5 . 2 4 1 5 0 . 0 0 . 0 0 . 0 0 0 . 0 0 . 0 ' 0 . 0 6 1 . 4 4 1 3 . 4 7 1 5 0 . 0 0 . 0 0 . 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 1 0 2 . 1 5 1 3 . 1 4 1 5 0 . 0 0 . 0 0 . 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 1 4 3 . 6 1 2 0 . 0 0 8 6 . 5 0 . 0 2 0 . 0 0 0 . 0 0 . 0 2 5 0 0 0 0 0 1 8 2 . 6 6 1 2 . 6 2 1 5 0 . 0 0 . 0 0 . 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 2 3 0 . 0 6 1 3 . 0 7 1 5 0 . 0 0 . 0 0 . 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 2 7 8 . 4 1 1 2 . 6 2 1 5 0 . 0 0 . 0 0 . 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 3 2 7 . 3 5 2 0 . 0 0 8 3 . 9 0 . 0 2 0 . 0 0 0 . 0 0 . 0 2 5 0 0 0 0 0 3 7 3 . 7 2 1 1 . 9 1 1 5 0 . 0 0 . 0 0 . 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 4 2 8 . 1 5 1 2 . 0 5 1 5 0 . 0 0 . 0 0 . 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 4 8 2 . 7 4 2 0 . 0 0 8 0 . 1 0 . 0 2 0 . 0 0 0 . 0 0 . 0 2 5 0 0 0 0 0 5 3 4 . 2 8 1 1 . 1 4 1 5 0 . 0 0 . 0 0 . 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 ' 5 9 3 . 3 4 1 1 . 0 6 1 5 0 . 0 0 . 0 0 . 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 6 5 1 . 4 7 2 0 . 0 0 7 2 . 6 0 . 0 2 0 . 0 0 0 . 0 0 . 0 2 5 0 0 0 0 0 7 0 5 . 1 9 9 . 8 1 1 5 0 . 0 0 . 0 0 . 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 9 5 T a b l e 4 . 5 : P u l s e p r o fi l e s p r e d i c t e d b y R K G . F O R f o r t h e L I P + M N P e n z y m e c a s e . P u l s e v o l u m e s a n d c o n c e n t r a t i o n s a r e l i s t e d _ f o r b o t h S i d e A a n d S i d e B . S i d e A S i d e B P u l s e S i d e A P u l s e C o n c ' s S i d e B P u l s e E n z y m e A c t i v i t y t i m e P u l s e V o l [ 1 1 2 0 , ] [ V A ] P u l s e V o l [ L I P ] [ M N P J [ M N P b ] ( m i n ) ( u L ) ( m M ) ( l e 1 ) ' ( P L ) ( U / L ) ( U / L ) ( U / L ) 5 9 . 1 2 1 0 . 0 9 1 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 1 1 5 . 5 3 4 0 . 0 0 2 4 9 . 1 2 7 2 . 0 2 0 . 0 0 5 0 0 0 . 0 4 4 9 3 . 4 0 . 0 1 5 3 . 7 5 2 0 . 0 0 4 0 9 . 4 0 . 0 2 0 . 0 0 0 . 0 0 . 0 2 5 0 0 0 0 0 2 1 8 . 3 2 4 0 . 0 0 3 2 7 . 2 5 3 4 . 0 2 0 . 0 0 5 0 0 0 . 0 4 4 9 3 . 4 0 . 0 2 6 6 . 5 0 2 0 . 0 0 4 4 3 . 9 0 . 0 2 0 . 0 0 0 . 0 0 . 0 2 5 0 0 0 0 0 3 3 5 . 0 8 4 0 . 0 0 3 4 2 . 1 4 7 1 . 5 2 0 . 0 0 5 0 0 0 . 0 4 4 9 3 . 4 0 . 0 3 9 8 . 9 4 4 0 . 0 0 3 2 0 . 9 3 3 0 . 8 3 0 . 0 0 3 3 3 3 . 3 2 9 9 5 . 4 1 6 3 6 7 1 3 4 7 1 . 3 5 4 0 . 0 0 3 4 7 . 7 3 3 0 . 5 3 0 . 0 0 3 3 3 3 . 3 2 9 9 5 . 4 1 6 3 6 7 1 3 5 5 3 . 4 5 1 0 . 2 1 1 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 6 2 6 . 2 4 4 0 . 0 0 3 6 8 . 2 4 4 5 . 5 3 0 . 0 0 3 3 3 3 . 3 2 9 9 5 . 4 1 6 3 6 7 1 3 7 1 9 . 0 8 4 0 . 0 0 3 7 8 . 2 3 2 2 . 8 3 0 . 0 0 3 3 3 3 . 3 2 9 9 5 . 4 1 6 3 6 7 1 3 9 6 T a b l e 4 . 6 : L i s t o f r e a c t o r c o m p o n e n t s p r e s e n t i n e a c h e x p e r i m e n t p e r f o r m e d f o r t h e L I P A l o n e e n z y m e e a s e ( B a s e = B a s e C a s e ; L ' = N o l i g n i n c o n t r o l ; R ’ = N o r e a g e n t c o n t r o l ; E ’ = N o e n z y m e c o n t r o l ; A E = A u t o c l a v e d e n z y m e c o n t r o l ; a n d E R ‘ = N o e n z y m e , n o r e a g e n t c o n t r o l ) . A ' + " i n d i e a t e s t h e p r e s e n c e o f t h e c o m p o n e n t i n t h e S i d e B r e s c t i o n m i x t u r e . C 8 8 8 L I P l i g n i n H 2 0 2 V A 0 2 B U E C ! ‘ B a s e + + + + + + L ’ + + + + + R ‘ + + + + E ‘ + + + + + A E ( + ) ‘ + + + + + B K + + + " E n z y m e p r e s e n t b u t i n a c t i v e . 9 7 T a b l e 4 . 7 : L i s t o f r e a c t o r c o m p o n e n t s p r e s e n t i n e a c h e x p e r i m e n t p e r f o r m e d f o r t h e M N P A l o n e e n z y m e c a s e ( B a s e = B a s e C a s e ; L ' = N o l i g n i n c o n t r o l ; ' = N o r e a g e n t c o n t r o l ; E ‘ = N o e n z y m e c o n t r o l ; A B = A u t o c l a v e d e n z y m e c o n t r o l ; a n d E R ‘ = N o e n z y m e , n o r e a g e n t c o n t r o l ) . A ' + " i n d i c a t e s t h e p r e s e n c e o f t h e c o m p o n e n t i n t h e S i d e B r e a c t i o n m i x t u r e . B a s e + + + + + + L ' + + + + + R ‘ + + + + E ' + + + + + A E ( + ) ‘ + + + + + E R ’ + + + * E n z y m e p r e s e n t b u t i n a c t i v e . 9 8 T a b l e 4 . 8 : L i s t o f r e a c t o r c o m p o n e n t s p r e s e n t i n e a c h e x p e r i m e n t p e r f o r m e d f o r t h e L I P + M N P e n z y m e c a s e ( B a s e = B a s e C a s e ; L ’ = N o l i g n i n c o n t r o l ; R ‘ = N o r e a g e n t c o n t r o l ; E “ = N o e n z y m e c o n t r o l ; A B = A u t o c l a v e d e n z y m e c o n t r o l ; a n d E R ' = N o e n z y m e , n o r e a g e n t c o n t r o l ) . A " + " i n d i c a t e s t h e p r e s e n c e o f t h e c o m p o n e n t i n t h e S i d e B r e a c t i o n m i x t u r e . C a s e L I P M N P L g n i n H 2 0 , V A M n ( I I ) 0 2 B u f f e r B a s e + + + + + + + + L ' + + + + + + + R ’ + + + + + E ‘ + + + + + + A B ( + ) ° ( + ) ' + + + + + 1 » E R ' 1 » + + ‘ E n z y m e p r e s e n t b u t i n a c t i v e . 9 9 ( 4 ) A u t o c l a v e d e n z y m e ( s ) + r e a g e n t s + O , + b u f f e r ( i n a c t i v e e n z y m e ( s ) ) , d e s i g n a t e d A E , t o s c r e e n o u t p r o d u c t s a r i s i n g f r o m t h e a c t i o n o f f r e e ( n o n - e n z y m e — b o u n d ) h e m e a n d r e a g e n t s o n t h e l i g n i n ; a n d ( 5 ) L i g n i n + 0 , + b u f f e r ( n o e n z y m e ( s ) o r r e a g e n t s ) , d e s i g n a t e d E R ' , t o s c r e e n o u t l o w m o l e c u l a r w e i g h t c o m p o u n d s a l r e a d y p r e s e n t i n t h e l i g n i n . T h e s a m p l e s ( l i q u i d a n d s o l i d ) f r o m t h e s e c o n t r o l s w e r e t r e a t e d i n e x a c t l y t h e s a m e m a n n e r a s t h e c a s e s i n w h i c h a l l c o m p o n e n t s o f t h e r e a c t i o n m i x t u r e s w e r e p r e s e n t ( h e r e a f t e r r e f e r r e d t o a s t h e ” b a s e c a s e s , " o r " B C s ' ) , w i t h t h e f o l l o w i n g e x c e p t i o n s i n t h e p u l s e p r o fi l e s : ( 1 ) N o l i g n i n c o n t r o l s : N o e x c e p t i o n s - - i d e n t i c a l p u l s e s a n d t i m e s t o b a s e c a s e ; ( 2 ) N o r e a g e n t c o n t r o l s : S a m e p u l s e v o l u m e s a n d t i m e s a s b a s e c a s e , b u t r e a g e n t p u l s e s r e p l a c e d w i t h d i s t i l l e d w a t e r ( e n z y m e p u l s e s i d e n t i c a l t o b a s e c a s e ) ; ( 3 ) N o e n z y m e c o n t r o l s : P u l s e t i m e s a n d v o l u m e s i d e n t i c a l t o b a s e c a s e , b u t r e a g e n t p u l s e s e q u a l t o i n i t i a l r e a g e n t c o n c e n t r a t i o n s ( m a x i m u m i n c o n c e n t r a t i o n c o n t r o l r a n g e s ) , a n d e n z y m e p u l s e s r e p l a c e d w i t h d i s t i l l e d w a t e r ; ( 4 ) A u t o c l a v e d e n z y m e c o n t r o l s : P u l s e t i m e s a n d v o l u m e s i d e n t i e a l t o b a s e c a s e , b u t r e a g e n t p u l s e s e q u a l t o i n i t i a l r e a g e n t c o n c e n t r a t i o n s ( m a x i m u m i n c o n c e n t r a t i o n c o n t r o l r a n g e s ) , a n d e n z y m e p u l s e s r e p l a c e d w i t h a u t o c l a v e d e n z y m e p u l s e s ( s o l u t i o n s m a d e u p w i t h v o l u m e s o f a u t o c l a v e d e n z y m e s o l u t i o n i d e n t i c a l t o t h e a m o u n t o f a c t i v e e n z y m e s o l u t i o n u s e d i n t h e b a s e c a s e ) ; a n d ( 5 ) L i g n i n o n l y c o n t r o l s : P u l s e t i m e s a n d v o l u m e s i d e n t i c a l t o b a s e c a s e , b u t a l l p u l s e s r e p l a c e d w i t h d i s t i l l e d w a t e r . 4 . 6 . 2 R e c o v e r y o f L i q u i d a n d S o l i d F r a c t i o n s A f t e r t h e r e a c t i o n w a s s t o p p e d , t h e s o l u t i o n f r o m S i d e A w a s r e m o v e d w i t h a P a s t e u r p i p e t a n d f r o z e n a t - 2 0 ° C i n a s i l a n i z e d g l a s s t e s t t u b e f o r f u r t h e r a n a l y s i s ( N o t e t h a t a l l g l a s s w a r e t o c o m e i n t o c o n t a c t w i t h t h e s a m p l e s f r o m t h e r e a c t o r r u n 0 n w a s s i l a n i z e d a s a p r e c a u t i o n f o r t h e G C / M S a n a l y s i s ( s e e a b o v e ) ) . T h e s l u r r y i n S i d e B w a s t r a n s f e r r e d w i t h a d r y , s i l a n i z e d P a s t e u r p i p e t i n t o a d r y , t a r e d , s i l a n i z e d ( W a t s o n , 1 9 8 5 ) g l a s s c o n i c a l v i a l ( C a t . N o . B 7 7 9 7 - 2 , B a x t e r S c i e n t i fi c , M c G a w P a r k , I L ) a n d c e n t r i f u g e d f o r 1 0 m i n u t e s a t 4 0 0 0 r p m . T h e s u p e r n a t a n t w a s t r a n s f e r r e d t o a ' s i l a n i z e d 1 0 0 g l a s s t e s t t u b e a n d f r o z e n a t - 8 0 ° C f o r f u t u r e a n a l y s i s b y G C / M S . S i d e B o f t h e r e a c t o r w a s w a s h e d c o n s e c u t i v e l y w i t h 1 m L o f d i s t i l l e d w a t e r t o q u a n t i t a t i v e l y r e c o v e r s o l i d s r e m a i n i n g i n t h e r e a c t o r . A s i m p l e r e c o v e r y e x p e r i m e n t ( u s i n g i s o l a t e d l i g n i n i n t h e r e a c t o r ) i n d i c a t e d a b o u t 9 5 % r e c o v e r y o f s o l i d s b y t h i s p r o c e d u r e . T h e s e w a s h v o l u m e s w e r e a d d e d t o t h e c o n i c a l v i a l a n d c e n t r i f u g e d ; t h e s u p e m a t a n t s f r o m t h e r e a c t o r w a s h e s w e r e d i s c a r d e d . A f t e r a l l t h e l i g n i n h a d b e e n t r a n s f e r r e d f r o m t h e r e a c t o r t o t h e c o n i c a l v i a l , t h e l i g n i n p e l l e t w a s w a s h e d b y c e n t r i f u g a t i o n i n t h e c o n i c a l v i a l fi v e t i m e s w i t h 2 m L o f 1 M N a C l t o r e m o v e t h e e n z y m e ( s ) , a n d t h e n fi v e t i m e s w i t h 2 m L o f d i s t i l l e d w a t e r t o r e m o v e t h e N a C l . T h e l i g n i n p e l l e t , s t i l l i n t h e c o n i c a l v i a l , w a s t h e n s u s p e n d e d i n 1 m L o f d i s t i l l e d w a t e r , c a p p e d ( t e fl o n - l i n e d s e p t u m ) a n d s t o r e d f r o z e n a t - 8 0 ° C f o r f u r t h e r a n a l y s i s . 4 . 7 G C / M S A n a l y s i s o f S o l u b i l i z e d C o m p o u n d s C h l o r o f o r m a n d e t h y l a c e t a t e e x t r a c t s o f t h e l i q u i d a n d s o l i d f r a c t i o n s f r o m e a c h r u n w e r e d e r i v a t i z e d w i t h N , 0 — b i s - ( t r i m e t h y l s i l y l ) - t r i f l u o r o a c e t a m i d e ( B S T F A ; S u p e l c o ) a n d a n a l y z e d ( a s t h e T M S e t h e r s ) b y G a s C h r o m a t o g r a p h y / M a s s S p e c t r o m e t r y ( G C / M S ) . S a m p l e a n a l y s i s p r o c e d u r e s a r e d e s c r i b e d b e l o w . 4 . 7 . 1 S a m p l e P r e p a r a t i o n A l l s a m p l e s w e r e p r e p a r e d u s i n g r e a g e n t - g r a d e c h l o r o f o r m a n d e t h y l a c e t a t e , a n d w e r e c o n t a c t e d o n l y w i t h s i l a n i z e d ( W a t s o n , 1 9 8 5 ) g l a s s w a r e . L a t e x g l o v e s w e r e w o r n a t a l l t i m e s d u r i n g s a m p l e h a n d l i n g . O n c e e x t r a c t e d , t h e G C / M S s a m p l e s w e r e s t o r e d a t - 2 0 ° C , a n d w e r e a l l o w e d t o s i t n o l o n g e r t h a n 2 4 h o u r s b e f o r e a n a l y s i s t o g u a r d a g a i n s t u n w a n t e d l o s s o f p r o d u c t s d u e t o v o l a t i l i z a t i o n o v e r t i m e . L i q u i d a n d s o l i d e x t r a c t s w e r e p r e p a r e d a s f o l l o w s . T h e r e c o v e r e d l i q u i d f r a c t i o n s f r o m e a c h e x p e r i m e n t w e r e r e m o v e d f r o m t h e - 8 0 ° C f r e e z e r a n d t h a w e d . T h e l i q u i d w a s t h e n t r a n s f e r r e d t o a s i l a n i z e d 1 / 2 d r a m v i a l ( C a t . N o . 6 0 9 1 0 - L , K i m b l e ) a n d t h e a p p r o x i m a t e v o l u m e n o t e d . A n e q u a l v o l u m e o f c h l o r o f o r m w a s a d d e d t o t h e v i a l u s i n g a g l a s s p i p e t . T h e r u b b e r s e p t u m i n t h e v i a l c a p 1 0 1 w a s r e p l a c e d w i t h a t e f l o n - f a c e d r u b b e r s e p t u m ( C a t . N o . 7 3 0 4 8 , A l l t e c h A s s o c i a t e s , D e e r fi e l d , I L ) t a k i n g c a r e n o t t o t o u c h t h e s e p t u m w i t h b a r e h a n d s . T h e v i a l , c o n t a i n i n g l i q u i d p h a s e f r o m t h e r e a c t o r a n d a n e q u a l v o l u m e o f c h l o r o f o r m , w a s c a p p e d a n d s h a k e n v i g o r o u s l y 3 t i m e s f o r 1 5 s e c o n d s e a c h t i m e . T h e v i a l w a s t h e n u n c a p p e d a n d t h e c h l o r o f o r m ( b o t t o m l a y e r ) w a s t r a n s f e r r e d w i t h a s i l a n i z e d P a s t e u r p i p e t a s q u a n t i t a t i v e l y a s p o s s i b l e t o a n o t h e r s i l a n i z e d 1 / 2 d r a m v i a l , w h i c h w a s t h e n c a p p e d ( a l s o w i t h t e fl o n - f a c e d s e p t u m ) . T h i s p r o c e d u r e w a s r e p e a t e d 2 m o r e t i m e s , a n d t h e t h r e e c h l o r o f o r m e x t r a c t s w e r e m i x e d t o g e t h e r i n t h e s i l a n i z e d c o l l e c t i o n v i a l . T h e e n t i r e p r o c e d u r e w a s t h e n r e p e a t e d i n a n i d e n t i c a l m a n n e r e x c e p t t h a t e t h y l a C e t a t e w a s u s e d a s e x t r a c t i o n s o l v e n t i n s t e a d o f c h l o r o f o r m ( e t h y l a c e t a t e i s t h e t o p l a y e r i n t h e s e e x t r a c t i o n s ) . T h e e t h y l a c e t a t e a n d c h l o r o f o r m e x t r a c t s w e r e n o t m i x e d b u t w e r e a n a l y z e d s e p a r a t e l y . T h e r e c o v e r e d s o l i d f r a c t i o n s f r o m e a c h e x p e r i m e n t w e r e r e m o v e d f r o m t h e - 8 0 ° C f r e e z e r ( s t i l l i n t h e i r t a r e d c o n i c a l g l a s s v i a l s ) a n d t h a w e d . T h e t h a w e d s l u r r i e s ( s l u r r i e d w i t h 1 m L o f d i s t i l l e d w a t e r b e f o r e f r e e z i n g f o r s t o r a g e ) w e r e t h e n c e n t r i f u g e d f o r 1 0 m i n u t e s a t 4 0 0 0 r p m a n d t h e s u p e r n a t a n t d i s c a r d e d . O n e m L o f c h l o r o f o r m w a s t h e n a d d e d t o t h e c o n i c a l g l a s s v i a l , a n d t h e v i a l w a s c a p p e d ( s a m e c a p a s f o r s t o r a g e , w i t h s a m e t e fl o n - l i n e d s e p t u m ) , m i x e d b y v o r t e x i n g , a n d p l a c e d o n i t s s i d e o n a r e c i p r o e a l s h a k e r , p a r a l l e l t o t h e d i r e c t i o n o f s h a k i n g , a t 3 7 ° C . T h e m i x t u r e w a s s h a k e n v i g o r o u s l y ( 4 5 0 s p m ) f o r 1 5 m i n u t e s . T h e v i a l w a s t h e n r e m o v e d f r o m t h e s h a k e r a n d c e n t r i f u g e d f o r 1 0 m i n u t e s a t 4 0 0 0 r p m t o s e p a r a t e t h e s o l i d l i g n i n a n d t h e c h l o r o f o r m . T h e c h l o r o f o r m w a s t h e n p i p e t t e d f r o m t h e c o n i c a l v i a l u s i n g a s i l a n i z e d g l a s s P a s t e u r p i p e t a n d t r a n s f e r r e d t o a s i l a n i z e d 1 / 2 d r a m v i a l ( s a m e t y p e a s u s e d a b o v e ) w i t h a t e fl o n - f a c e d r u b b e r s e p t u m i n t h e v i a l c a p . T h e e x t r a c t i o n p r o c e d u r e w a s r e p e a t e d o n c e m o r e w i t h c h l o r o f o r m , a n d t h e n t w i c e w i t h e t h y l a c e t a t e . A s w i t h t h e l i q u i d e x t r a c t s , t h e c h l o r o f o r m e x t r a c t s w e r e m i x e d t o g e t h e r a s w e r e t h e e t h y l a c e t a t e f r a c t i o n s , b u t t h e c h l o r o f o r m a n d e t h y l a c e t a t e e x t r a c t s w e r e k e p t s e p a r a t e . T h e e x t r a c t e d s o l i d s w e r e t h e n w a s h e d , s t i l l i n t h e t a r e d c o n i c a l g l a s s v i a l s , b y c e n t r i f u g a t i o n ( a s b e f o r e ) 5 t i m e s w i t h 1 0 2 2 m L o f d i s t i l l e d w a t e r t o d i s p l a c e a n y r e m a i n i n g e x t r a c t i o n s o l v e n t s , a n d s t o r e d f r o z e n a t - 8 0 ° C u n d e r 1 m L o f d i s t i l l e d w a t e r f o r f u t u r e F T I R a n a l y s i s . A t t h i s p o i n t , 2 0 u L o f 5 1 fl g / fl L 2 - c h l o r o - 5 - t r i fl u o r o m e t h y l b e n z o i c a c i d ( A l d r i c h ) i n e t h y l a c e t a t e w e r e a d d e d t o e a c h v i a l c o n t a i n i n g s o l v e n t e x t r a c t s o f t h e s a m p l e s u s i n g a c l e a n g l a s s m i c r o l i t e r s y r i n g e . T h i s c o m p o u n d w a s a d d e d a s a n i n t e r n a l s t a n d a r d a n d w a s u s e d b e c a u s e o f i t s s i m i l a r i t y i n s t r u c t u r e t o e x p e c t e d l i g n i n d e g r a d a t i o n p r o d u c t s , a n d a l s o b e c a u s e i t w o u l d h a v e a c l e a r l y r e c o g n i z a b l e m a s s s p e c t r u m d u e t o t h e c h l o r i n e m o l e c u l e . A s e p a r a t e s a m p l e c o n t a i n i n g o n l y t h e i n t e r n a l s t a n d a r d w a s a l s o p r e p a r e d w i t h e a c h s e t o f s a m p l e s b y a d d i n g 2 0 u L o f t h e i n t e r n a l s t a n d a r d t o 1 8 0 0 ” L o f e t h y l a c e t a t e , a n d t r e a t i n g t h e s t a n d a r d a s a n o r m a l s a m p l e i n f u t u r e s t e p s . I n a d d i t i o n , o n e s a m p l e w a s p r e p a r e d ( o n e t i m e o n l y ) c o n t a i n i n g t h e 2 0 p L o f t h e i n t e r n a l s t a n d a r d , 2 0 u L o f a s o l u t i o n c o n t a i n i n g 4 9 . 2 n g / r t L s y r i n g a l d e h y d e ( A l d r i c h ) , 4 9 . 6 n g / u L s y r i n g i c a c i d ( A l d r i c h ) , a n d 5 3 n g / r t L v a n i l l i c a c i d ( A l d r i c h ) i n e t h y l a c e t a t e , a n d 1 8 0 0 p t L o f e t h y l a c e t a t e ( h e r e a f t e r r e f e r r e d t o a s S T D M i x ) , s i n c e t h e s e c o m p o u n d s w e r e e x p e c t e d t o b e r e l e a s e d f r o m t h e l i g n i n d u e t o e n z y m e a c t i v i t y . T h e l i q u i d a n d s o l i d e x t r a c t s w e r e t h e n c o n c e n t r a t e d w i t h a l i g h t s t r e a m o f n i t r o g e n ( m a n i f o l d m a d e o f 9 0 % g l a s s , 1 0 % N a l g e n e t u b i n g ) t o a b o u t 2 0 0 1 4 L . T h e s a m p l e v i a l s w e r e t h e n c a p p e d a n d d e l i v e r e d t o t h e M a s s S p e c t r o m e t r y F a c i l i t y w h e r e t h e y w e r e s t o r e d n o l o n g e r t h a n 2 4 h o u r s a t - 2 0 ° C b e f o r e a n a l y s i s . B e f o r e a n a l y s i s , t h e s a m p l e s w e r e c o n c e n t r a t e d t o d r y n e s s ( j u s t ) u n d e r a l i g h t s t r e a m o f n i t r o g e n ( s t a i n l e s s s t e e l / t e fl o n m a n i f o l d ) a n d 2 0 p L o f B S T F A i n p y r i d i n e ( S u p e l c o ) w e r e a d d e d u s i n g a c l e a n g l a s s m i c r o l i t e r s y r i n g e . T h e v i a l s w e r e t h e n c a p p e d a n d h e a t e d f o r 3 0 m i n u t e s a t 6 0 ° C t o d e r i v a t i z e t h e s a m p l e s . A f t e r d e r i v a t i z a t i o n , t h e s a m p l e s w e r e a l l o w e d t o c o o l ( c a p p e d ) i n t h e s a n d b a t h a n d w e r e t h e n a n a l y z e d b y G C / M S . 4 . 7 . 2 S a m p l e M e a s u r e m e n t S a m p l e s w e r e r u n b y J e n n i f e r J o h n s o n a t t h e N I H M a s s S p e c t r o m e t r y F a c i l i t y a t M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y u s i n g a J E O L A X 5 0 5 d o u b l e f o c u s s i n g m a g n e t i c s e c t o r m a s s 1 0 3 s p e c t r o m e t e r a n d e q u i p p e d w i t h a n H P 5 8 9 0 g a s c h r o m a t o g r a p h ( G C ) . T h e c a p i l l a r y G C c o l u m n w a s i n t e r f a c e d d i r e c t l y t o t h e i o n s o u r c e v i a a h e a t e d i n l e t ; i o n i z a t i o n w a s a c h i e v e d b y e l e c t r o n i m p a c t a t 7 0 e V . S e p a r a t i o n w a s a c h i e v e d w i t h a 3 0 m D B 5 - M S c a p i l l a r y G C c o l u m n ( 5 % p h e n y l m e t h y l s i l i c o n e ; J & W , F o l s o m , C A ) w i t h a n i n s i d e d i a m e t e r o f 0 . 3 2 m m a n d a fi l m t h i c k n e s s o f 0 . 2 5 n m f o r t h e M N P o n l y s a m p l e s , a n d w i t h a 3 0 m D B - l c a p i l l a r y G C c o l u m n ( S P B - l , S u p e l c o ) f o r t h e L I P o n l y a n d L I P + M N P s a m p l e s . T h e s a m p l e s ( 2 u L ) w e r e v o l a t i l i z e d f o r G C u s i n g a t e m p e r a t u r e p r o g r a m a s f o l l o w s : H o l d f o r 2 m i n u t e s a t 1 0 0 ° C ; i n c r e a s e t o 3 2 0 ° C a t 1 0 ° C / m i n ; h o l d f o r 5 m i n u t e s a t 3 2 0 ° C . M a s s d a t a f o r m / z f r o m 4 5 - 6 0 0 w e r e c o l l e c t e d a t a s c a n r a t e o f 1 s e a n / s e c o n d f o r 2 5 m i n u t e s . I n t h e e a r l y s a m p l e s ( M N P O n l y s a m p l e s ) , t h e m a s s s p e c t r a l d a t a w e r e r e c o r d e d s t a r t i n g a t 2 m i n u t e s i n t o t h e r u n i n o r d e r t o a v o i d s w a m p i n g t h e d e t e c t o r w i t h t h e s o l v e n t f r o n t ; i n l a t e r s a m p l e s ( L I P O n l y , L I P + M N P , a n d S T D M i x s a m p l e s ) , _ t h i s i n i t i a l w a i t i n g t i m e b e f o r e d a t a c o l l e c t i o n w a s 3 . 7 5 m i n u t e s . T h i s c a u s e d r e t e n t i o n t i m e d a t a f r o m t h e l a t e r r u n s t o b e s l o w e r t h a n t h e e a r l i e r r u n s b y 5 0 - 7 5 s e a n s ( i e . t h e i n t e r n a l s t a n d a r d c a m e o u t i n t h e s c a n r a n g e 5 4 5 - 5 5 5 i n t h e e a r l i e r r u n s , b u t i n t h e s c a n r a n g e 4 9 0 - 5 0 0 i n t h e l a t e r r u n s ) . D a t a fi l e s f r o m e a c h r u n w e r e s t o r e d o n o p t i c a l d i s k f o r f u t u r e a n a l y s i s . 4 . 7 . 3 G C / M S D a t a A n a l y s i s T h e G C / M S d a t a w e r e a n a l y z e d i n i t i a l l y b y c o m p a r i n g t h e T o t a l I o n C h r o m a t o g r a m s ( T I C s ) f o r e a c h e x t r a c t w i t h t h o s e o f t h e c o r r e s p o n d i n g e x t r a c t s f r o m t h e c o n t r o l s . A s s u m i n g t h a t t h e p a r t i t i o n c o e f fi c i e n t f o r a p a r t i c u l a r c o m p o u n d w a s t h e s a m e i n d i f f e r e n t s a m p l e s ( a r e a s o n a b l e a s s u m p t i o n ) , t h e c o n c e n t r a t i o n s i n c o r r e s p o n d i n g e x t r a c t s s h o u l d b e d i r e c t l y c o m p a r a b l e . T h e T I C s f r o m e a c h s a m p l e , e a c h c o n t a i n i n g 1 0 0 o r m o r e s e p a r a t e p e a k s , w e r e p r i n t e d o u t w i t h i d e n t i c a l x - a x e s ( r e t e n t i o n t i m e / s c a n n u m b e r ) a n d t h e C h r o m a t o g r a m s f r o m d i f f e r e n t s a m p l e s w e r e l i n e d u p a n d s e a r c h e d f o r p e a k s t h a t w e r e p r e s e n t i n t h e b a s e c a s e b u t n o t i n t h e c o n t r o l s , a n d t h e n f o r p e a k s t h a t w e r e p r e s e n t i n t h e b a s e e a s e i n a t l e a s t 3 t i m e s t h e c o n c e n t r a t i o n t h a t t h e y w e r e i n t h e 1 0 4 c o n t r o l s ( c o n c e n t r a t i o n s c o m p a r e d b y r a t i o i n g t h e p e a k h e i g h t o f t h e u n k n o w n t o t h e p e a k h e i g h t o f t h e i n t e r n a l s t a n d a r d i n t h a t s a m p l e ) . A n y p e a k s n o t m e e t i n g t h e s e c r i t e r i a w e r e n o t c o n s i d e r e d t o b e p e a k s o f i n t e r e s t a n d w e r e b a r r e d f r o m f u t u r e c o n s i d e r a t i o n . P e a k s r e m a i n i n g a f t e r t h e fi r s t s e t o f c o m p a r i s o n s , w e r e c h e c k e d ( a g a i n u s i n g t h e T I C s ) v e r s u s o t h e r e x t r a c t s f r o m t h e s a m e b a s e c a s e . I f t h e p e a k w a s p r e s e n t i n t h e o t h e r b a s e c a s e e x t r a c t , b u t w a s n o t m a r k e d a s a p e a k o f i n t e r e s t i n t h a t b a s e c a s e ( m e a n i n g t h a t i t w a s i n a t l e a s t o n e c o n t r o l f o r t h a t b a s e c a s e a t a s i m i l a r c o n c e n t r a t i o n ) , i t w a s d i s c a r d e d . F i n a l l y , t h e m a s s s p e c t r a f o r t h e p e a k s o f i n t e r e s t w e r e o b t a i n e d , a n d i f t h e p e a k s o f i n t e r e s t a p p e a r e d i n l o w e r c o n c e n t r a t i o n s i n t h e c o n t r o l s o f t h a t e x t r a c t , c o m p a r e d w i t h t h e m a s s s p e c t r a o f t h e c o r r e s p o n d i n g p e a k s i n t h e c o n t r o l s . I f t h e p e a k s o f i n t e r e s t d i d n o t a p p e a r i n a n y o f t h e c o n t r o l s , t h e m a j o r i o n s i n i t s m a s s s p e c t r u m w e r e s e a r c h e d f o r i n t h e c o r r e s p o n d i n g e x t r a c t s o f t h e c o n t r o l s . T h e m a s s s p e c t r a o f t h e u n k n o w n s r e m a i n i n g w e r e c h e c k e d t o m a k e s u r e t h a t t h e y w e r e e v e n m o l e c u l a r w e i g h t ( c o m p o u n d s c o n t a i n i n g o n l y C , H , a n d 0 , s u c h a s l i g n i n , c a n n o t h a v e a n o d d m o l e c u l a r w e i g h t ) , t h a t t h e y w e r e n o t f a t t y a c i d s ( T M S e t h e r s o f f a t t y a c i d s h a v e c h a r a c t e r i s t i c m a s s p e a k s ( D r . D . A . G a g e , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n ) a t M + , M + - 1 5 ( 1 0 0 % ) , a n d 1 1 7 , 1 2 9 o r 1 3 2 , a n d 1 4 5 ) , t h a t t h e y w e r e n o t h y d r o c a r b o n s p r e s e n t d u e t o c o n t a m i n a t i o n f r o m c o n t a c t w i t h r u b b e r ( i e . f r o m s y r i n g e s e a l s , s e p t a , e t c . ; H a m m i n g a n d F o s t e r , 1 9 7 2 ; M c L a f f e r t y , 1 9 7 3 ) , a n d t h a t t h e y w e r e n o t l i k e l y t o b e G C c o l u m n b l e e d ( l a r g e m a s s p e a k s a t 2 0 7 , 2 2 1 , a n d 3 5 5 ( D r . D . A . G a g e , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n » . A n y p e a k s n o t p a s s i n g t h e s e t e s t s w e r e d i s c a r d e d . T h e r e m a i n i n g p e a k s w e r e t h e n i n t e g r a t e d , a n d t h e i r c o n c e n t r a t i o n s e s t i m a t e d u s i n g t h e c a l i b r a t i o n f o r t h e i n t e r n a l s t a n d a r d f o r e a c h s t a n d a r d . T h i s c o n c e n t r a t i o n i s n o t e x a c t , b u t i s o n l y a b a l l - p a r k e s t i m a t e s i n c e t h e c a l i b r a t i o n ( p r o p o r t i o n a l i t y b e t w e e n c o n c e n t r a t i o n a n d p e a k a r e a ) w i l l b e d i f f e r e n t f o r e a c h c o m p o u n d , b u t n o t s u b s t a n t i a l l y . T h e N I S T a n d W i l e y m a s s s p e c t r a l d a t a b a s e s w e r e s e a r c h e d f o r m a t c h e s t o t h e m a s s s p e c t r a o f t h e u n k n o w n s . U n f o r t u n a t e l y , o n l y t w o m a t c h e s w e r e f o u n d s i n c e t h e r e 1 0 5 a r e n o t m a n y T M S - d e r i v a t i z e d c o m p o u n d s t h a t h a v e b e e n s u b m i t t e d t o t h e d a t a b a s e s , r e l a t i v e t o n o n - d e r i v a t i z e d c o m p o u n d s ; a n a l y s e s o f t h e m a s s s p e c t r a w e r e t h e n c o m p l e t e d b y h a n d . 4 . 8 F T I R A n a l y s i s o f R e m a i n i n g S o l i d L i g n i n A p e l l e t F o u r i e r T r a n s f o r m I n f r a r e d s p e c t r u m ( F T I R ) w a s m e a s u r e d f o r a l l b a s e c a s e s a n d c o n t r o l s t h a t c o n t a i n e d l i g n i n . M e a s u r e m e n t s w e r e p e r f o r m e d w i t h a P e r k i n - E l m e r M o d e l 1 6 0 0 F T - I R S p e c t r o p h o t o m e t e r ( P e r k i n E l m e r , N o r w a l k , C T ) w i t h a D T G S d e t e c t o r ; t h e i n s t r u m e n t w a s s u p p l i e d b y M i c h i g a n B i o t e c h n o l o g y I n s t i t u t e ( M B I , L a n s i n g , M I ) . D e s i c c a t e d I R - g r a d e K B r w a s u s e d a s p e l l e t m e d i u m ; a K B r b a c k g r o u n d s p e c t r u m w a s s u b t r a c t e d f r o m e a c h F T I R s p e c t r u m m e a s u r e d . T h e p r o c e d u r e i s d e s c r i b e d b e l o w . 4 . 8 . 1 S a m p l e P r e p a r a t i o n T h e s o l i d s a m p l e s , a f t e r e x t r a c t i o n w i t h c h l o r o f o r m a n d e t h y l a c e t a t e , w e r e r e m o v e d f r o m t h e - 8 0 ° C f r e e z e r , t h e v i a l s c o v e r e d w i t h a p i e c e o f d r y , t a r e d 1 0 p m p o l y e t h y l e n e m e s h , a n d l y o p h i l i z e d t o d r y n e s s ( 4 8 h o u r s ) . T h e v i a l s , w i t h m e s h , w e r e t h e n w e i g h e d a n d t h e l i g n i n r e c o v e r e d f r o m t h e r e a c t o r r u n w a s c a l c u l a t e d b y w e i g h t d i f f e r e n c e . T h e m e s h w a s t h e n d i s c a r d e d , a n d t h e d r y s o l i d l i g n i n w a s s t o r e d u n d e r d e s i c c a t i o n f o r F T I R a n a l y s i s . S a m p l e s w e r e d r i e d a n d w e i g h e d j u s t p r i o r t o F T I R a n a l y s i s i n o r d e r t o m i n i m i z e i n t e r f e r e n c e i n t h e F T I R a n a l y s i s f r o m a d s o r b e d w a t e r . P e l l e t s f o r F T I R a n a l y s i s w e r e p r e s s e d a t r o o m t e m p e r a t u r e ( 2 3 ° C ) u s i n g a 1 2 t o n C a r v e r p r e s s ( M o d e l C , F r e d S . C a r v e r , I n c . , M e n o m o n e e F a l l s , W I ) a n d a p a i r o f 1 3 m m p e l l e t d i e s ( C a t . N o . 0 0 1 6 - 0 0 1 , M o d e l 1 2 9 , S p e c t r a T e c h , S t a m f o r d , C T ) . P e l l e t s w e r e p r e s s e d f r o m s a m p l e a n d K B r g r o u n d a n d m i x e d i n a W i g - L - B u g g r i n d e r / m i x e r ( M o d e l 3 1 1 0 B , C r e s c e n t D e n t a l M f g . C o . , L y o n s , I L ) . T o p r e s s a p e l l e t , 1 . 5 : 1 ; 0 . 1 m g o f d r y l i g n i n w e r e m e a s u r e d i n t o a d r y , t a r e d p l a s t i c 0 5 " x 1 " ( d x 1 ) W i g - L - B u g v i a l ( C a t . N o . 3 1 1 1 , C r e s c e n t D e n t a l M f g . C o . , L y o n s , I L ) . N e x t , 2 9 8 . 5 : 1 ; 0 . 5 m g o f d e s i c c a t e d s p e c t r a l g r a d e K B r w e r e a d d e d t o t h e 1 0 6 v i a l ( f o r a b a c k g r o u n d s p e c t r u m , o n l y 3 0 0 m g o f K B r w a s a d d e d t o t h e v i a l ) . A n u n u s e d , d r y , t a r e d p l a s t i c b a l l p e s t l e ( C a t . N o . 3 1 1 2 , C r e s c e n t D e n t a l M f g . C o . , L y o n s , I L ) w a s t h e n a d d e d a n d t h e m i x t u r e g r o u n d / m i x e d o n t h e W i g - L - B u g f o r 1 m i n u t e . T h e p o w d e r e d K B r / l i g n i n m i x t u r e w a s t h e n t r a n s f e r r e d t o t h e d i e s . T h e v i a l , c a p , a n d b a l l p e s t l e , w h i c h c o n t a i n e d r e s i d u a l s a m p l e a n d K B r , w e r e i m m e d i a t e l y p l a c e d i n t h e d e s i c c a t o r a n d l a t e r w e i g h e d t o d e t e r m i n e t h e p e l l e t m a s s . A s s u m i n g t h e m i x t u r e w a s c o m p l e t e l y h o m o g e n e o u s , t h i s g a v e t h e m a s s o f l i g n i n s a m p l e p e r p e l l e t . T h e d i e w a s q u i c k l y a s s e m b l e d a n d p l a c e d i n t o t h e C a r v e r p r e s s . A v a c u u m l i n e w a s a t t a c h e d t o t h e d i e t o c o n t i n u o u s l y e v a c u a t e t h e p e l l e t c h a m b e r d u r i n g t h e p e l l e t p r e s s i n g o p e r a t i o n . T i r e p e l l e t m a t e r i a l w a s p r e s s e d i n a f o u r s t e p p r o c e s s : ( 1 ) T h e m a t e r i a l w a s c o m p r e s s e d t o 5 0 0 0 p s i a n d t h e p r e s s u r e q u i c k l y r e l e a s e d ; ( 2 ) T h e m a t e r i a l w a s c o m p r e s s e d t o 1 0 0 0 0 p s i a n d t h e p r e s s u r e q u i c k l y r e l e a s e d ; ( 3 ) T h e m a t e r i a l w a s c o m p r e s s e d t o 1 5 0 0 0 p s i a n d t h e p r e s s u r e h e l d a t 1 5 0 0 0 p s i f o r 2 m i n u t e s ; a n d ( 4 ) T h e p r e s s u r e w a s s l o w l y r e l e a s e d t o z e r o . T h e n e w l y p r e s s e d p e l l e t w a s t h e n q u i c k l y r e m o v e d f r o m t h e d i e , p l a c e d i n a g l a s s v i a l , a n d s t o r e d u n d e r d e s i c c a t i o n ( n o l o n g e r t h a n 2 4 h o u r s ) f o r s p e c t r a l m e a s u r e m e n t . 4 . 8 . 2 S a m p l e M e a s u r e m e n t T r a n s m i s s i o n F T I R s p e c t r a o f t h e p e l l e t s a v e r a g e d f r o m 5 0 s c a n s w e r e m e a s u r e d f r o m 4 0 0 0 t o 7 0 0 c m “ w i t h 2 c m ‘ 1 r e s o l u t i o n u s i n g a P e r k i n E l m e r M o d e l 1 6 0 0 F o u r i e r T r a n s f o r m I n f r a r e d S p e c t r o p h o t o m e t e r ( 1 6 0 0 S e r i e s F T I R , P e r k i n E l m e r , N o r w a l k , C T ) e q u i p p e d w i t h a D T G S d e t e c t o r ( c e s i u m i o d i d e w i n d o w ) . S a m p l e s w e r e m e a s u r e d u s i n g s t r o n g a p o d i z a t i o n , a n d w i t h t h e J a c q u i n o t s t o p i n p l a c e . A t a l l t i m e s , t h e s a m p l e c h a m b e r w a s c o n t i n u o u s l y p u r g e d w i t h m o i s t u r e - f r e e , C O , - f r e e N , t o k e e p t h e m o i s t u r e a n d C O , a t u n d e t e c t a b l e l e v e l s . T h e t r a n s m i s s i o n s p e c t r a w e r e t h e n c o n v e r t e d t o a b s o r b a n c e s p e c t r a , w h i c h w e r e t h e n c o n v e r t e d t o A S C I I f o r m a t a n d t r a n s f e r r e d t o a n I B M c o m p a t i b l e P C . T h e F T I R s p e c t r a w e r e a n a l y z e d b y B o n n i e H a m e s o f t h e A n a l y t i c a l C h e m i s t r y G r o u p , N a t i o n a l R e n e w a b l e E n e r g y L a b o r a t o r y ( N R E L , G o l d e n , 1 0 7 C O ) u s i n g a P a r t i a l L e a s t S q u a r e s ( P L S ) r e g r e s s i o n t e c h n i q u e d e v e l o p e d f o r t h i s t y p e o f a n a l y s i s ( H a m e s e t a l . , 1 9 9 1 ) a n d c a l i b r a t e d w i t h m i l l e d w o o d l i g n i n s f r o m v a r i o u s s o u r c e s ( H a m e s e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h e s p e c t r a w e r e a n a l y z e d f o r c a r b o h y d r a t e a n d l i g n i n c o n t e n t , m e t h o x y l c o n t e n t p e r C , u n i t ( m e t h o x y l z a r y l r a t i o ) , a n d p h e n o l i c h y d r o x y l c o n t e n t p e r C , u n i t . S y r i n g y l t o g u a i a c y l r a t i o s w e r e c a l c u l a t e d f r o m t h e p r e d i c t e d m e t h o x y l : a r y l r a t i o s . A f o u r f a c t o r r e g r e s s i o n m o d e l w a s u s e d f o r t h e P L S a n a l y s i s o f t h e l i g n i n a n d c a r b o h y d r a t e c o n t e n t s , w h i l e fi v e f a c t o r m o d e l s w e r e u s e d f o r b o t h t h e m e t h o x y l c o n t e n t a n a l y s i s a n d t h e p h e n o l i c h y d r o x y l c o n t e n t a n a l y s i s b y P L S ( H a m e s e t a l . , 1 9 9 1 ) . C H A P T E R V : R E S U L T S 5 . 1 S u b s t r a t e C o m p o s i t i o n T h e c o m p o s i t i o n s o f t h e u n t r e a t e d ( n a t i v e ) p o p l a r s u b s t r a t e , a c i d p r e t r e a t e d ( A H ) p o p l a r , t h e c e l l u l a s e - t r e a t e d a c i d p r e t r e a t e d ( C A H ) p o p l a r , a n d t h e e x t r a c t e d r e s i d u a l ( E C ‘ A H ) l i g n i n ( fi n a l s u b s t r a t e f o r t h e r e a c t o r r u n s ) a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 5 . 1 . A l l c o m p o n e n t s w e r e p r e s e n t i n t h e n a t i v e p o p l a r a t l e v e l s c o n s i s t e n t w i t h t h i s t y p e o f h a r d w o o d ( G r o u s e t a l . , 1 9 8 6 ) , w i t h 5 8 . 4 % c a r b o h y d r a t e s a n d 2 5 . 4 % l i g n i n . P r e t r e a t m e n t i n t h e fl o w r e a c t o r a t 2 2 0 ° C w i t h 1 % H , S O . , r e s u l t e d i n a r e s i d u e w i t h a c o m p o s i t i o n s i m i l a r t o t h a t o b t a i n e d w i t h m i x e d h a r d w o o d ( 9 0 % b i r c h , 1 0 % m a p l e ) i n a n e a r l i e r s t u d y ( T h o m p s o n e t a l . , 1 9 9 2 ) , i n c r e a s i n g t h e c a r b o h y d r a t e c o n t e n t t o 6 3 . 8 % a n d t h e l i g n i n c o n t e n t t o 2 9 . 3 % . A f t e r t r e a t m e n t w i t h s a t u r a t i n g l e v e l s ( T h o m p s o n , 1 9 8 9 ) o f c e l l u l a s e , t h e C ‘ A H r e s i d u e w a s r e d u c e d t o 9 . 3 % c a r b o h y d r a t e s a n d 7 8 . 1 % l i g n i n . F i n a l l y , t h e e x t r a c t i o n s w i t h i n c r e a s i n g l y p o l a r s o l v e n t s a t 3 7 ° C y i e l d e d a fi n a l s u b s t r a t e ( E C ' A H ) w h i c h c o n t a i n e d 7 4 . 5 % l i g n i n a n d 1 2 . 2 % c a r b o h y d r a t e s ( t h i s i n d i c a t e s a n e x t r a c t i v e s c o n t e n t o f a t l e a s t 3 . 6 % i n t h e C ' A H r e s i d u e ) . T h e r e s u l t i n g l i g n i n s u b s t r a t e w a s s u b j e c t e d t o s e v e r a l t e s t s i n a n a t t e m p t t o j u s t i f y t h e a s s u m p t i o n t h a t i t w a s s i m i l a r t o n a t u r a l l y o c c u r r i n g l i g n i n . F i r s t , s e v e r a l k n o w n l i g n i n s o l v e n t s ( S a r k a n e n a n d L u d w i g , 1 9 7 1 ) w e r e u s e d t o t r y t o s o l u b i l i z e t h e r e s i d u e s o t h a t a m o l e c u l a r w e i g h t d i s t r i b u t i o n c o u l d b e o b t a i n e d b y g e l p e r m e a t i o n c h r o m a t o g r a p h y . S o l v e n t s t r i e d i n c l u d e d d i o x a n e , d i m e t h y l f o r m a m i d e ( D M F ) , a n d v a r i o u s a q u e o u s s o l u t i o n s o f t h e t w o , a s f o l l o w s : ( 1 . ) 1 0 0 % d i o x a n e ; ( 2 . ) d i o x a n e z w a t e r a t 9 : 1 , 3 : 1 , a n d 1 : 1 ; ( 3 . ) 1 0 0 % D M F ; ( 4 . ) D M s z a t e r a t 9 : 1 a n d 1 : 1 ; ( 5 . ) d i o x a n e : D M F a t 1 : 1 ; a n d ( 6 . ) d i o x a n e : D M F : w a t e r a t 1 : 1 : 2 . I n a l l c a s e s , n o l i g n i n w a s s o l u b i l i z e d a s d e t e r m i n e d b y m e a s u r i n g t h e a b s o r b a n c e o f t h e l i q u i d p h a s e a t 2 8 0 n m ( a b s o r b a n c e m a x i m u m o f t h e a r o m a t i c r i n g ) ( S a r k a n e n a n d L u d w i g , 1 9 7 1 ) . A s a m p l e o f t h e l i g n i n w a s t h e n s e n t t o D r . J o h n R . O b s t , a t t h e U S D A F o r e s t P r o d u c t s R e s e a r c h L a b o r a t o r y i n M a d i s o n , W I f o r f u r t h e r a n a l y s i s . D r . O b s t i s a n e x p e r t i n t h e fi e l d o f 1 0 8 1 0 9 T a b l e 5 . 1 : C o m p o s i t i o n s o f t h e p o p l a r s u b s t r a t e a n d e a c h r e s i d u e a t e a c h s t e p o f t h e l i g n i n i s o l a t i o n p r o c e d u r e a s m e a s u r e d b y t h e Q u a n t i t a t i v e S a c c h a r i fi c a t i o n t e c h n i q u e ( S a e m a n e t a l . , 1 9 4 5 ) . N a t i v e A H C ‘ A H E C ’ A H P o p l a r P o p l a r P o p l a r P o p l a r C o m p o n e n t ( 9 6 ) ( 9 6 ) ( 9 6 ) ( 9 6 ) G l u c a n 4 2 . 9 6 2 . 9 8 . 1 1 0 . 1 X y l a n 1 3 . 8 0 . 9 0 . 9 1 . 1 G a l a c t a n 0 . 1 N D ‘ 0 . 3 1 . 0 A r a b i n a n 0 . 6 N D N D N D M a n n a n 1 . 0 N D N D N D S U M ” 8 3 . 8 9 3 . 1 8 7 . 4 8 6 . 7 " N D = N o n e D e t e c t e d * * I n c l u d e s K l a s s o n l i g n i n , e x t r a c t i v e s , a n d a s h . + N o t e q u a l t o 1 0 0 % d u e t o r e c o v e r y e r r o r s a n d u n k n o w n u r o n i c a c i d c o n t e n t . 1 1 0 l i g n i n c h a r a c t e r i z a t i o n , a n d r o u t i n e l y p e r f o r m s s t a n d a r d t e s t s t o d e t e r m i n e p r o p e r t i e s o f l i g n i n s . A c e t y l a t i o n ( S a r k a n e n a n d L u d w i g , 1 9 7 1 ) o f t h e l i g n i n w a s p e r f o r m e d i n o r d e r t o m a k e i t m o r e s o l u b l e i n t h e l i g n i n s o l v e n t s ; h o w e v e r , e v e n a f t e r a c e t y l a t i o n , t h e l i g n i n w a s s t i l l c o m p l e t e l y i n s o l u b l e i n a l l l i g n i n s o l v e n t s t r i e d ( J . R . O b s t , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n ) . O n e p o s s i b l e e x p l a n a t i o n f o r t h i s m a r k e d i n s o l u b i l i t y o f t h e l i g n i n w a s t h a t t h e B - O — 4 e t h e r b o n d s i n t h e l i g n i n , w h i c h f o r m t h e c r o s s l i n k s b e t w e e n t h e v a r i o u s m o n o m e r s , w e r e h i g h l y c o n d e n s e d d u r i n g t h e p r e t r e a t m e n t a t 2 2 0 ° C , c a u s i n g t h e l i g n i n t o b e i n s o l u b l e ( J . R . O b s t , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n ) . T h i s p o s s i b i l i t y w a s t e s t e d b y D r . O b s t u s i n g t h i o a c i d o l y s i s ( O b s t , 1 9 8 2 ; R o l a n d o e t a l . , 1 9 9 2 ) , a d e g r a d a t i v e t e c h n i q u e w h i c h r e l e a s e s s u b s t i t u t e d s y r i n g y l a n d g u a i a c y l m o n o m e r s f r o m t h e l i g n i n ( w h i c h c a n b e a n a l y z e d a s g r o u p s b a s e d o n t h e d i f f e r e n c e s i n t h e i r b a s i c s t r u c t u r e s ; s e e C h a p t e r I I ) . I f t h e r e c o v e r i e s o f s y r i n g y l a n d g u a i a c y l m o n o m e r s p e r u n i t m a s s o f t h e i s o l a t e d l i g n i n w e r e m u c h l e s s t h a n t h e v a l u e s o b t a i n e d f o r t h e n a t i v e w o o d l i g n i n , t h e n a h i g h d e g r e e o f c o n d e n s a t i o n w o u l d b e c o n fi r m e d . T h e r e l a t i v e y i e l d o f s y r i n g y l t h i o a c i d o l y s i s m o n o m e r p r o d u c t w a s 7 8 % o f t h a t o f t h e n a t i v e w o o d l i g n i n , w h i l e t h e y i e l d o f t h e g u a i a c y l p r o d u c t w a s 8 7 % o f t h a t o f t h e n a t i v e w o o d l i g n i n . T h e s y r i n g y l t o g u a i a c y l r a t i o s f o r t h e i s o l a t e d l i g n i n a n d t h e n a t i v e w o o d l i g n i n w e r e 1 . 0 2 a n d 1 . 1 5 , r e s p e c t i v e l y , w h i c h a r e n o t s i g n i fi c a n t l y d i f f e r e n t . T h i s i n d i c a t e s t h a t , a l t h o u g h a s m a l l a m o u n t o f c o n d e n s a t i o n o c c u r r e d d u r i n g p r e t r e a t m e n t , t h e fi n a l i s o l a t e d l i g n i n w a s a t t h e v e r y l e a s t s i m i l a r t o n a t i v e l i g n i n i n b o t h a b s o l u t e m o n o m e r c o n t e n t s , r a t i o o f m o n o m e r t y p e s , a n d f r e q u e n c y o f i n t a c t i n t e r u n i t l i n k a g e s ( , 6 - 0 - 4 e t h e r b o n d s ) . T h i s l e a d s t o t h e c o n c l u s i o n ( J . R . O b s t , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n ) t h a t t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t l i g n i n f r a g m e n t s p r e s e n t i n t h e n a t i v e , A H , a n d C A H l i g n i n s , w h i c h a r e t h e s u b s t r a t e s n o r m a l l y u s e d i n l i g n i n d e g r a d a t i o n s t u d i e s ( T i m , 1 9 8 7 ) , w e r e e x t r a c t e d i n t h e fi n a l i s o l a t i o n s t e p , l e a v i n g a v e r y h i g h m o l e c u l a r w e i g h t l i g n i n ( E C ' A H ) . 1 1 1 5 . 2 L I P a n d M N P P r o d u c t i o n D u e t o t h e l o w l e v e l s o f L I P ( 1 / 1 0 t o 1 / 4 o f t h e 2 5 0 U / L n o r m a l l y o b t a i n e d i n o u r l a b o r a t o r y w i t h t h e i d e n t i c a l i s o l a t e o f P . c h r y s o s p o r i u m ( D o s o r e t z a n d G r e t h l e i n , 1 9 9 1 ) ) a n d t h e p r e s e n c e o f r e l a t i v e l y h i g h l e v e l s o f M N P i n t h e e x t r a c e l l u l a r fl u i d c o l l e c t e d f r o m t h e s e c u l t u r e s , m a n y m o r e p r o d u c t i o n r u n s w e r e n e c e s s a r y t h a n w a s o r i g i n a l l y i n t e n d e d . E a c h fl a s k w a s a s s a y e d f o r M N P b e f o r e h a r v e s t , a n d a n y fl a s k w h i c h c o n t a i n e d m o r e t h a n 1 0 0 U / L o f M N P ( b y M N P A s s a y # 1 ) w a s d i s c a r d e d ; t h i s h e l p e d t o m i n i m i z e t h e fi n a l a m o u n t o f c o n t a m i n a t i n g M N P i n t h e fi n a l D 5 N o M n e n z y m e . T h e b o t t l e s o f e x t r a c e l l u l a r fl u i d ( E F ) c o l l e c t e d f r o m e a c h o f t h e D 5 N o M n e n z y m e p r o d u c t i o n r u n s w e r e c o m b i n e d a n d a s s a y e d f o r L I P a n d M N P ; L I P a c t i v i t y w a s a r o u n d 7 5 U / L , w h i l e a b o u t 1 0 0 U / L o f M N P a c t i v i t y w a s d e t e c t e d . T h e B F w a s c o n c e n t r a t e d a n d d i a l y z e d , a n d a s s a y e d a g a i n f o r L I P a n d M N P a c t i v i t y , a n d f o r t o t a l p r o t e i n b e f o r e s t o r a g e ; L I P a c t i v i t y w a s f o u n d t o b e 9 , 9 0 0 U / L , M N P w a s p r e s e n t a t a b o u t 1 6 , 0 0 0 U / L , a n d t h e t o t a l p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n w a s 1 9 2 . 0 u g / m L . A t t h i s p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n , a s s u m i n g a l l o f t h e p r o t e i n i s L I P o r M N P , t h e s p e c i fi c a c t i v i t i e s o f L I P a n d M N P w e r e 5 1 . 5 6 a n d 8 3 . 3 3 U / m g t o t a l p r o t e i n , r e s p e c t i v e l y ( n o t e t h e d i f f e r e n t d e fi n i t i o n s o f o n e U n i t ( U ) o f e n z y m e a c t i v i t y f o r e a c h ) . A s a m p l e o f t h e E F w a s s u b j e c t e d t o F P L C ; t h e F P L C p r o fi l e i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 1 . T h e t r a c e i s t h e a b s o r b a n c e a t 4 0 9 n m , w h i c h i s t h e a b s o r b a n c e m a x i m u m f o r t h e h e m e g r o u p , w h i l e t h e d i a g o n a l l i n e r e p r e s e n t s t h e s o d i u m a c e t a t e g r a d i e n t ( 1 0 M m t o 1 M ) u s e d t o e l u t e t h e p r o t e i n s . E a c h i s o e n z y m e ( 1 1 # ) l a b e l e d w a s a s s i g n e d b y t h e p o s i t i o n a t w h i c h i t e l u t e d o n t h e s a l t g r a d i e n t . T h e e n z y m e a c t i v i t y p r e s e n t i n e a c h p e a k w a s v e r i fi e d b y a s s a y i n g f r a c t i o n s c o l l e c t e d d u r i n g t h e F P L C r u n . T h e i s o e n z y m e s H 1 , H 2 , H A , H 6 , H 7 , H 8 , a n d H 1 0 a r e l i g n i n p e r o x i d a s e s , w h i l e H 3 ( n o t p r e s e n t o r m a s k e d b y H 2 ) , H 4 , H 5 , a n d H 9 a r e m a n g a n e s e p e r o x i d a s e s . T h e s m a l l p e a k e l u t i n g b e t w e e n H 3 a n d H 4 i s a l s o a m a n g a n e s e p e r o x i d a s e , b u t i s n o t a s s i g n e d a d e s i g n a t i o n i n t h e l i t e r a t u r e , a n d s o i s n o t d e s i g n a t e d h e r e . T h e D 5 N o M n c o n c e n t r a t e w a s d i s p e n s e d t o t u b e s ( 0 . 3 m L / t u b e ) a n d m n 9 0 4 t a e c n a b r o s b A 1 1 2 0 . 2 0 0 . 1 8 - 0 . 1 0 " ' 0 . 1 4 ' - E 0 . 1 2 ' - 0 . 1 0 ' - H 8 0 . 0 4 ' - H 1 0 . 0 2 E l u l i o n V o l u m e ( m L ) F i g u r e 5 . 1 : F P L C p r o fi l e o f t h e c o n c e n t r a t e d , d i a l y z e d D 5 N o M n e x t r a c e l l u l a r fl u i d . T h e p e a k s d e s i g n a t e d H 1 , H 2 , H A , H 6 , H 7 , H 8 , a n d H 1 0 a r e l i g n i n p e r o x i d a s e s , w h i l e H 4 , H 5 , a n d H 9 a r e m a n g a n e s e p e r o x i d a s e s . T h e d i a g o n a l l i n e r e p r e s e n t s t h e s o d i u m a c e t a t e g r a d i e n t ( 1 0 m M t o l M ) u s e d t o e l u t e t h e p r o t e i n s . 1 1 3 f r o z e n f o r f u t u r e u s e . T h e M N P a c t i v i t y l e v e l p r o d u c e d i n t h e D 4 H i M n r u n w a s h i g h e r t h a n e x p e c t e d ; t h r e e r u n s w e r e p l a n n e d , b u t o n l y o n e w a s n e c e s s a r y b e c a u s e t h e M N P a c t i v i t y f r o m t h e s i n g l e r u n w a s a b o u t t h r e e t i m e s h i g h e r t h a n e x p e c t e d ( a b o u t 9 7 0 0 U / L i n t h e D 4 H i M n r u n v e r s u s a n o r m a l ( D o s o r e t z a n d G r e t h l e i n , 1 9 8 6 ) l e v e l o f a b o u t 3 0 0 0 U / L ) . T h e E F w a s c o n c e n t r a t e d a n d d i a l y z e d , a n d t h e c o n c e n t r a t e w a s a s s a y e d f o r L I P , a n d d i l u t i o n s o f t h e c o n c e n t r a t e w e r e a s s a y e d f o r M N P ( u s i n g M N P A s s a y # 1 ) a n d f o r t o t a l p r o t e i n . N o L I P a c t i v i t y w a s d e t e c t e d i n t h e D 4 H i M n E F c o n c e n t r a t e , M N P a c t i v i t y w a s p r e s e n t a t a b o u t 5 6 0 , 0 0 0 U / L , a n d t h e t o t a l p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n w a s 1 2 6 5 . 5 j i g / m L . T h e s p e c i fi c a c t i v i t y o f t h e M N P w a s t h e n c a l c u l a t e d ( s e e a s s u m p t i o n a b o v e ) t o b e 4 4 2 . 5 U / m g t o t a l p r o t e i n . T h e F P L C p r o fi l e o f t h e D 4 H i M n c o n c e n t r a t e i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 2 . T h e t r a c e a n d d i a g o n a l l i n e a r e a s b e f o r e . F r a c t i o n s w e r e c o l l e c t e d d u r i n g t h e r u n a n d a s s a y e d f o r L I P a n d M N P a c t i v i t y , a s a b o v e , a n d t h e r e s u l t s u s e d w i t h t h e r e t e n t i o n t i m e t o a s s i g n t h e i s o e n z y m e i d e n t i t i e s . N o t e t h a t H A , H 6 , H 7 , a n d H 8 a r e a s s i g n e d s o l e l y b a s e d o n t h e i r r e t e n t i o n t i m e s , a s t h e r e w a s n o d e t e c t a b l e L I P a c t i v i t y i n t h e f r a c t i o n s c o l l e c t e d a t t h e s e r e t e n t i o n t i m e s ; t h e p r e s e n c e o f L I P a c t i v i t y i n t h e D 4 H i M n c o n c e n t r a t e w a s c o n fi r m e d i n r e a c t o r r u n s u s i n g t h e D 4 H i M n c o n c e n t r a t e , t h r o u g h t h e p r e s e n c e o f v e r a t r a l d e h y d e f o r m e d f r o m v e r a t r y l a l c o h o l p r e s e n t i n t h e c o n c e n t r a t e ( d i s c u s s e d i n t h e r e a c t o r r u n s e c t i o n ) . T h e s m a l l p e a k e l u t i n g b e t w e e n H 3 a n d H 4 w a s f o u n d t o c o r r e s p o n d w i t h t h a t s e e n a b o v e ( i t i s a n M N P ) . A m i x t u r e o f t h e D 5 N o M n a n d D 4 H i M n c o n c e n t r a t e s w h i c h w a s e q u i v a l e n t t o t h a t u s e d i n t h e r e a c t o r r u n c o n t a i n i n g b o t h U P S a n d M N P S , w a s a l s o a n a l y z e d b y F P L C ; t h e F P L C p r o fi l e i s s h o w n i n F i g u r e 5 . 3 . I s o e n z y m e s w e r e a s s i g n e d a s a b o v e . I n o r d e r t o d e t e r m i n e h o w m u c h o f t h e h e m e p r o t e i n e l u t i n g w a s L I P a n d M N P i s o e n z y m e s , t h e F P L C p r o fi l e s o f e a c h s a m p l e a b o v e w e r e i n t e g r a t e d a n d t h e p e a k a r e a s u s e d t o e s t i m a t e p e r c e n t a g e s o f e a c h e n z y m e c l a s s ; t h e r e s u l t s a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 5 . 2 . S i n c e H 2 a n d H 3 c o e l u t e d ( f o r s o m e r e t e n t i o n t i m e s ) i n t h e m i x t u r e , t h e r a t i o o f H 2 t o m n 9 0 4 t a e c n a b r o s b A 1 1 4 0 . 5 0 0 . 4 0 ' - 0 . 3 0 7 0 . 2 5 - 0 . 2 0 - 0 . 1 5 ' - E l u t i o n V o l u m e ( m L ) F i g u r e 5 . 2 : F P L C p r o fi l e o f t h e c o n c e n t r a t e d , d i a l y z e d D 4 H i M n e x t r a c e l l u l a r fl u i d . T h e p e a k s d e s i g n a t e d H A , H 6 , H 7 , a n d H 8 a r e l i g n i n p e r o x i d a s e s , w h i l e H 3 , H 4 , a n d H 5 a r e m a n g a n e s e p e r o x i d a s e s . T h e d i a g o n a l l i n e r e p r e s e n t s t h e s o d i u m a c e t a t e g r a d i e n t ( 1 0 m M t o 1 M ) u s e d t o e l u t e t h e p r o t e i n s . m n 9 0 4 t a e c n a b r o s b A 1 1 5 0 . 2 0 0 . 1 8 ' - 0 . 1 8 ' - 0 . 1 4 ' - 0 . 1 0 - I 0 . 0 8 ' - H 8 H 4 H 8 0 . 0 6 " H 5 0 . 0 4 ' - m | l H A H 7 H 9 H 1 0 I i l l l l l I I l I l l l l I I 0 4 6 1 2 1 6 2 0 2 4 2 8 3 2 E l u l i o n V o l u m e ( m L ) 0 . 0 2 F i g u r e 5 . 3 : F P L C p r o fi l e o f t h e D 5 N o M n / D 4 H i M n e x t r a c e l l u l a r fl u i d m i x t u r e u s e d f o r m i x e d e n z y m e r e a c t o r r u n s . T h e p e a k s d e s i g n a t e d H 1 , H 2 , H A , H 6 , H 7 , H 8 , a n d H 1 0 a r e l i g n i n p e r o x i d a s e s , w h i l e H 3 , H 4 , H 5 , a n d H 9 a r e m a n g a n e s e p e r o x i d a s e s . t T h h e d i a g o n a l l i n e r e p r e s e n t s t h e s o d i u m a c e t a t e g r a d i e n t ( 1 0 m M t o l M ) u s e d t o e l u t e e p r o t e i n s . 1 1 6 T a b l e 5 . 2 : I s o e n z y m e c o m p o s i t i o n s a n d o v e r a l l L I P a n d M N P c o m p o s i t i o n s o f t h e D 5 N o M n a n d D 4 H i M n e x t r a c e l l u l a r fl u i d ( c o n c e n t r a t e d a n d d i a l y z e d ) a n d t h e D 5 N o M n / D 4 H i M n m i x t u r e . P e r c e n t a g e s w e r e d e t e r m i n e d f r o m p e a k a r e a s i n t h e F P L C p r o fi l e s a n d r e p r e s e n t p e r c e n t a g e o f t o t a l h e m e p r o t e i n . D 5 N o M n D 4 H i M n M i x t u r e I s o e n z y m e M ) M ) ( W H 1 4 . 5 0 . 0 2 . 8 H 2 3 6 . 8 0 . 0 2 2 . 8 H 3 0 . 0 6 7 . 5 2 6 . 5 1 1 7 ‘ 0 . 7 7 . 1 3 . 4 H 4 3 . 7 1 4 . 7 9 . 9 H 5 1 . 7 4 . 8 2 . 9 H A 2 . 9 1 . 8 3 . 0 H 6 2 4 . 8 2 . 2 1 3 . 1 H 7 2 . 9 1 . 3 1 . 8 H 8 2 0 . 1 0 . 7 1 1 . 2 H 9 0 . 1 0 . 0 0 . 8 H 1 0 1 . 9 0 . 0 1 . 8 t o t a l 1 0 0 . 0 1 0 0 . 0 1 0 0 . 0 L I P 9 3 . 8 6 . 0 5 6 . 5 M N P 6 . 2 9 4 . 0 4 3 . 5 " ' T h i s p e a k h a s n o t b e e n d e s i g n a t e d , b u t i s a n M N P i s o e n z y m e . 6 _ a C t = p . 8 3 2 1 , 5 1 ( 5 - 1 ) 1 1 7 H 1 i n t h e D 5 N o M n F P L C p r o fi l e w a s u s e d t o d e t e r m i n e H 2 , a n d H 3 w a s c a l c u l a t e d b y d i f f e r e n c e ; t h i s w a s p o s s i b l e s i n c e H 1 a n d H 2 w e r e n o t p r e s e n t i n t h e D 4 H i M n c o n c e n t r a t e . 5 . 3 S p e c i e s T r a n s p o r t B e f o r e u s i n g t h e p s e u d o s t e a d y s t a t e a s s u m p t i o n t o c a l c u l a t e t h e e f f e c t i v e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t s f o r e a c h s p e c i e s , t h e u n s t e a d y s t a t e c a s e w a s s o l v e d u s i n g a c o n s t a n t d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t . ’ T h e d e t e r m i n a t i o n o f e f f e c t i v e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t s f o r H , 0 , , M n ( I I ) , [ M n ( I I I ) - t a r t , ] , a n d V A a r e d e a l t w i t h i n t h e f o l l o w i n g s e c t i o n s . 5 . 3 . 1 H , O z a n d M n ( I I ) T h e p a r t i a l d i f f e r e n t i a l e q u a t i o n f o r m e m b r a n e d i f f u s i o n w i t h a c o n s t a n t d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t i s ( C u s s l e r , 1 9 8 6 ) w h e r e C i s c o n c e n t r a t i o n , t i s t i m e , x i s d i s t a n c e t h r o u g h t h e m e m b r a n e , a n d D i s t h e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t . N o n d i m e n s i o n a l i z i n g b y d e fi n i n g , . £ . 6 C o C a f e s , ( 5 - 2 ) 5 = 3 5 - 1 = E 1 ’ 1 2 w h e r e C , , , a n d C 3 , , a r e t h e i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s i n S i d e s A a n d B , r e s p e c t i v e l y a n d l i s t h e m e m b r a n e t h i c k n e s s , t h e e q u a t i o n b e c o m e s i = fl ( 5 ' 3 ) 3 1 3 5 2 T h e b o d ' t i u n d a r y c o n 1 o n s a r e = fl = - 3 f a t : 1 . ( ) , . 1 < — x — — ) , . , a t V , 6 6 ( 5 4 ) 6 f ( 7 1 : 1 1 , ? “ . ) a t = 0 . 1 % » . . . H I N 1 : 2 2 1 , 1 2 ) 0 ) + + n e 2 2 , w 1 0 ) + + 1 9 E : l a 1 i 2 a : 8 4 : : 1 1 8 T h e i n i t i a l c o n d i t i o n a n d s t e a d y s t a t e a r e I . C : a t r = 0 , f = 0 f o r 0 < E < 1 S t e a d y S t a t e : a s s - t o o , f - t g S o l v i n g b y s e p a r a t i o n o f v a r i a b l e s ( K r e y s z i g , 1 9 8 8 ) a n d d e fi n i n g f = + 8 “ , ? ) t h e s o l u t i o n i s - ’ 1 l . 1 1 6 . 0 = % + 2 ; . a r e “ ( c o s t a r ) - 3 3 m m » 2 - 2 ( 1 ‘ B ) t a n r , = 1 2 0 1 , w h e r e B = ( A l ) / V , , , a , i s g i v e n b y “ 1 a n d 1 h : = fl £ 9 0 ) - ' 5 1 . Z , = c o s t a r ) - F ‘ s i n t i x ) . ( 5 - 5 ) ( 5 - 6 ) ( 5 - 7 ) ( 5 - 3 ) ( 5 - 9 ) a n d t h e o t h e r p a r a m e t e r s a r e a s p r e v i o u s l y d e fi n e d . N o t e t h a t H i n t h i s e q u a t i o n i s n o t r e l a t e d t o t h e B i n t h e r e a c t o r b a l a n c e s ( C h a p t e r I V ) . T h e e f f e c t i v e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t e s t i m a t e d f r o m t h e c o n c e n t r a t i o n - t i m e d a t a f o r H , O , u s i n g e q u a t i o n ( B - 1 1 ) ( t h i s u s e s t h e p s e u d o s t e a d y s t a t e a s s u m p t i o n t o e s t i m a t e t h e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t ) w a s u s e d w i t h t h i s e q u a t i o n , a l o n g w i t h t h e r e a c t o r m e a s u r e m e n t s ( s e e C h a p t e r I V ) t o d e t e r m i n e t h e t i m e n e e d e d t o r e a c h s t e a d y s t a t e . T h e s o l u t i o n , f o r t i m e s u p t o 2 m i n u t e s , a r e p l o t t e d i n F i g u r e 5 . 4 ; s t e a d y s t a t e w a s a c h i e v e d i n o n l y i l l n o i t a r t n e c n o C e d i x o r e P 1 1 9 5 0 4 0 ~ - l n c r e a s i n g T i m e 3 0 - 2 0 u \ 1 0 - - 0 . 6 0 . 8 1 I — _ 0 0 . 2 0 . 4 x l l F i g u r e 5 . 4 : S o l u t i o n o f t h e u n s t e a d y s t a t e d i f f u s i o n g u a t i o n f o r d i f f u s i o n t h r o u g h t h e m e m b r a n e o f t h e d i a l y s i s r e a c t o r f o r H , O 2 u s i n g a v u e o f 1 . 8 0 x 1 0 * c m ’ l m r n f o r t h e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t . S h o w n a r e t h e c o n c e n t r a t i o n p r o fi l e s w i t h i n t h e m e m b r a n e g i s t h o o d i m e n s i o n l e s s d i s t a n c e f o r 0 . 0 0 2 , 0 . 0 0 5 , 0 . 0 1 0 , 0 . 0 2 0 , 0 . 0 4 0 , 0 . 0 6 0 , 0 . 0 8 0 , a n d . m i n u t e s . 1 2 0 3 0 s e c o n d s . T h e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t u s e d w a s 1 . 8 0 x 1 0 4 ( c m ’ l m i n ) , a n d w a s c a l c u l a t e d b y a v e r a g i n g t h e s o l u t i o n o f e q u a t i o n ( B - 1 1 ) e v a l u a t e d a t e a c h t i m e p o i n t , a n d u s i n g a l l d i f f u s i o n e x p e r i m e n t s f o r H , O , ( d i f f e r e n t i n i t i a l [ H , O , ] , , , i n e a c h r u n ) . O r d e r - o f - m a g n i t u d e c h a n g e s i n t h e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t h a d r e l a t i v e l y l i t t l e e f f e c t , i n c r e a s i n g o r d e c r e a s i n g t h e t i m e t o r e a c h s t e a d y s t a t e b y a m i n u t e o r s o e a c h w a y . T h e m e a s u r e d e f f e c t i v e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t f o r M n ( I I ) w a s o n t h e s a m e o r d e r o f m a g n i t u d e a s t h a t f o r H , 0 , , s o t h e e q u a t i o n w a s s o l v e d o n l y f o r H , O , . T h e r e f o r e , t h e p s e u d o s t e a d y s t a t e a p p r o x i m a t i o n w a s u s e d t o e s t i m a t e t h e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t s o f H , O , a n d M n ( I I ) , b u t u s i n g d a t a f r o m a l l t h e e x p e r i m e n t s ( d i f f e r e n t [ H , O , ] , , , a n d n o t j u s t s i n g l e t i m e p o i n t s . I n o r d e r t o d o t h i s f o r H , 0 , , e q u a t i o n ( B 6 ) w a s s o l v e d t o g i v e [ H , O , ] , , a s a f u n c t i o n o f t i m e , a n d t h i s e x p r e s s i o n w a s s o l v e d f o r t i m e t o y i e l d l V ' é ' a H z o z A . + [ H 2 0 2 ] B , ) - [ H 2 0 2 ] B l h s = r = - ( — — ; — ) 1 n ! 1 1 ( 5 - 1 0 ) 2 0 5 5 0 2 " 5 a ” 2 0 2 1 . 1 0 ' [ H 2 0 2 ] a o ) w h e r e ” l h s " s t a n d s f o r t h e ” l e f t - h a n d - s i d e " o f t h e e q u a t i o n , a n d i s a c t u a l l y t h e ” t i m e ” c a l c u l a t e d f r o m e a c h c o n c e n t r a t i o n m e a s u r e m e n t . T h e d a t a f r o m a l l t r a n s p o r t e x p e r i m e n t s f o r H , O , w e r e c o m b i n e d , t h e v a l u e o f " l h s ” c a l c u l a t e d f o r e a c h c o n c e n t r a t i o n / t i m e p o i n t , a n d t h e r e s u l t i n g d a t a w e r e p l o t t e d v e r s u s t h e a c t u a l e x p e r i m e n t a l t i m e a t w h i c h t h e d a t a w e r e t a k e n . U s i n g a s h o o t i n g m e t h o d , v a l u e s f o r D " w e r e c h o s e n , t h e v a l u e o f ' l h s " w a s c a l c u l a t e d , a n d t h e r e s u l t i n g d a t a s e t w a s fi t t e d v e r s u s a c t u a l t i m e v a l u e s u s i n g l i n e a r r e g r e s s i o n . T h e v a l u e o f D 5 " w h i c h g a v e t h e b e s t fi t t o t h e d a t a w a s c h o s e n a s t h e t r u e v a l u e o f D " f o r H , O , ; t h i s v a l u e w a s d e t e r m i n e d t o b e 1 . 7 0 0 x 1 0 ‘ c m ’ l m i n , w i t h a n r 2 o f 0 . 9 6 8 . T h e fi n a l i t e r a t i o n o f t h e s h o o t i n g m e t h o d , w i t h t h e b e s t fi t t o t h e d a t a , i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 5 . I n t h e c a s e o f M n ( I I ) , t h e c o n c e n t r a t i o n i n S i d e B w a s t o o l o w t o m e a s u r e b y t i t r a t i o n w i t h E D T A ( s e e C h a p t e r I V ) , s o [ M n ( I I ) ] , w a s m e a s u r e d a n d u s e d t o c a l c u l a t e 1 2 1 3 0 - - I . I . . - 0 i i i 0 4 8 1 2 1 6 2 0 2 4 t i m e ( m i n ) F i g u r e 5 . 5 : T h e fi n a l i t e r a t i o n v a l u e s o f l h s v e r s u s t i m e f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f D " f o r H , O , . I n i t i a l [ H $ 1 , c o n c e n t r a t i o n s f o r e a c h d a t a s e t a r e l i s t e d i n t h e l e g e n d b o x . 1 ’ f o r t h e fi t w a s 0 . 9 . l h s = w i t h : 4 % ) 1 1 1 1 1 1 ( 5 - 1 1 ) 1 2 2 t h e e f f e c t i v e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t f o r M n ( I I ) . W h e n e q u a t i o n ( B - 4 ) i s s o l v e d f o r [ M n ( I I ) ] , i n s t e a d o f [ M N ( I I ) ] , , , i t g i v e s 2 1 m m ] , _ [ M n ( I I ) ] , + 1 M n < 1 0 1 , , T h i s e q u a t i o n i s a n a l o g o u s t o e q u a t i o n ( 5 - 1 0 ) a b o v e , e x c e p t t h a t ” l h s " i s e q u a l t o t h e e f f e c t i v e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t m u l t i p l i e d b y t i m e a n d n o t j u s t e q u a l t o t i m e . T h i s e q u a t i o n w a s s o l v e d i n a m a n n e r i d e n t i c a l t o t h a t d e s c r i b e d a b o v e f o r H , O , ; t h e fi n a l i t e r a t i o n i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 6 . T h e b e s t fi t v a l u e o f D " f o r M n ( I I ) w a s 1 . 3 1 9 x 1 0 4 c m ’ l m i n , w i t h a n r 2 o f 0 . 9 9 9 . 5 . 3 . 2 V e r a t r y l A l c o h o l T h e e f f e c t i v e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t f o r V A w a s a l s o e s t i m a t e d i n i t i a l l y u s i n g e q u a t i o n ( B - l l ) , e v e n t h o u g h i t w a s f o u n d t o d e p e n d o n [ V A ] , a s s h o w n i n F i g u r e 5 . 7 . T o i n c l u d e t o v a r i a t i o n o f D " f o r V A w i t h V A c o n c e n t r a t i o n , e q u a t i o n ( 5 - 7 ) a b o v e w a s s o l v e d u s i n g b o t h t h e h i g h e s t a n d l o w e s t v a l u e s f o r D " f o r V A e s t i m a t e d f r o m e q u a t i o n ( B - l l ) ( a t t h e h i g h e s t a n d l o w e s t [ V A ] , , r e s p e c t i v e l y ; s e e F i g u r e 5 . 7 ) . T h e e s t i m a t e d h i g h e s t a n d l o w e s t v a l u e s f o r D " f o r V A w e r e 4 . 3 7 x 1 0 ‘ a n d 1 . 0 0 x 1 0 " c m z / m i n , r e s p e c t i v e l y . T h e s o l u t i o n f o r e a c h v a l u e o f D " f o r V A u s e d a r e s h o w n i n F i g u r e s 5 . 8 a n d 5 . 9 ; t h e t i m e s r e q u i r e d t o r e a c h s t e a d y s t a t e w e r e 3 0 s e c o n d s a n d 2 m i n u t e s , r e s p e c t i v e l y . S i n c e t h e v a l u e o f D " f o r V A w a s n o t e x p e c t e d t o e x c e e d t h e s e b o u n d s ( a ' r e a s o n a b l e a s s u m p t i o n ) , i t w a s d e c i d e d t o u s e t h e s t e a d y s t a t e a p p r o x i m a t i o n f o r V A d i f f u s i o n , a l s o . T h e f o r m o f t h e V A d i f f u s i o n e q u a t i o n u s e d i n t h e r e a c t o r m o d e l i s d e r i v e d i n A p p e n d i x B . T h e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t w a s f o u n d t o d e p e n d e x p o n e n t i a l l y o n V A c o n c e n t r a t i o n d u e t o s o l u t i o n v i s c o s i t y e f f e c t s a n d t o t h e e f f e c t o f i n c r e a s i n g r a d i u s o f m o l e c u l a r a g g r e g a t e s i n s o l u t i o n ( s e e C h a p t e r I V f o r a d i s c u s s i o n o f t h i s p o i n t ) . T h e d e p e n d e n c e o f s o l u t i o n v i s c o s i t y o n V A c o n c e n t r a t i o n i s s h o w n i n F i g u r e 5 . 1 0 ; t h i s s h l - 1 2 3 0 . 0 4 - - 0 . 0 3 ~ - 0 . 0 2 - - I 0 . 0 1 - 0 i i i i i 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 t i m e ( m i n i F i g u r e 5 . 6 : T h e fi n a l i t e r a t i o n v a l u e s o f - 1 h s v e r s u s t i m e f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f D ” f o r M n ( I I ) . r 2 f o r t h e fi t w a s 0 . 9 9 9 . ) ' 0 1 x n r m l ’ n n e t o 1 2 4 I D a t a — F i t I I O i i i i i J . O 4 0 0 8 0 0 1 2 0 0 1 6 0 0 2 0 0 0 2 4 0 0 V A C o n c e n t r a t i o n m m F i g u r e 5 . 7 : E f f e c t i v e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t f o r V A c a l c u l a t e d f r o m t h e [ V A ] , v e r s u s t i m e d a t a a s s u m i n g t h a t D " f o r V A w a s i n d e p e n d e n t o f c o n c e n t r a t i o n a n d t h a t s t e a d y s t a t e c o u l d b e a s s u m e d . T h e d a t a w e r e fi t u s i n g P E A K F I T t o t h e e q u a t i o n V A D 3 - a , + a , e x p ( a , e x p { - L ; ] i l - a , ) ( 5 - 1 2 ) V a l u e s o f a , , a , , 3 , , 1 1 , , a n d a , w e r e f o u n d t o b e 8 . 8 6 5 x 1 0 " , 3 . 2 1 3 x 1 0 ‘ , - 1 . 0 5 1 , - 1 1 3 4 . 8 , a n d — 3 . 4 3 5 , r e s p e c t i v e l y . r 2 f o r t h e fi t w a s 0 . 9 2 8 . i l i n o i t a r t n e c n o C A V 1 2 5 \ I n c r e a s i n g T i m e x i i 1 0 0 F i g u r e 5 . 8 : S o l u t i o n o f t h e u n s t e a d y s t a t e d i f f u s i o n e q u a t i o n f o r d i f f u s i o n t h r o u g h t h e m e m b r a n e o f t h e d i a l y s i s r e a c t o r f o r V A u s i n g a v a l u e o f 4 . 3 7 x 1 0 ’ c m ’ l m i n f o r t h e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t . S h o w n a r e t h e c o n c e n t r a t i o n p r o fi l e s w i t h i n t h e m e m b r a n e w i t h d i m e n s i o n l e s s d i s t a n c e f o r 0 . 0 1 0 , 0 . 0 2 0 , 0 . 0 4 0 , 0 . 0 6 0 , 0 . 0 8 0 , 0 . 1 6 0 , 0 . 5 0 0 , a n d 2 . 0 0 m i n u t e s . i l l n o i t a r t n e c n o C A V 1 2 6 1 0 0 I n c r e a s i n g T i m e x l l F i g u r e 5 . 9 : S o l u t i o n o f t h e u n s t e a d y s t a t e d i f f u s i o n e q u a t i o n f o r d i f f u s i o n t h r o u g h t h e m e m b r a n e o f t h e d i a l y s i s r e a c t o r f o r V A u s i n g a v a l u e o f 1 . 0 0 x 1 0 ’ c m / m i n f o r t h e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t . S h o w n a r e t h e c o n c e n t r a t i o n p r o fi l e s w i t h i n t h e m e m b r a n e w i t h d i m e n s i o n l e s s d i s t a n c e f o r 0 . 0 1 0 , 0 . 0 2 0 , 0 . 0 4 0 , 0 . 0 6 0 , 0 . 0 8 0 , 0 . 1 6 0 , 0 . 5 0 0 , a n d 2 . 0 0 m i n u t e s . l P c l y t i s o c s i V 1 2 7 0 i i i 0 4 0 0 8 0 0 1 2 0 0 1 6 0 0 2 0 0 0 2 4 0 0 V A C o n c e n t r a t i o n l l i l l I I U 1 F i g u r e 5 . 1 0 : V a r i a t i o n o f t h e v i s c o s i t y o f a q u e o u s V A s o l u t i o n s w i t h [ V A ] , a n d t h e e x p o n e n t i a l v i s c o s i t y fi t d e t e r m i n e d u s i n g P E A K F I T . 1 3 f o r t h e fi t w a s 0 . 9 9 9 . 1 2 8 d e p e n d e n c e i s c l e a r l y e x p o n e n t i a l ( 1 1 ° = 0 . 6 5 2 9 c P , a = 5 . 5 3 2 x 1 0 ‘ m M “ , r 2 — 0 . 9 9 9 ) , w h i c h i s s u p p o r t e d b y c o m m o n v i s c o s i t y - c o n c e n t r a t i o n r e l a t i o n s h i p s p u b l i s h e d i n t h e l i t e r a t u r e ( B i r d e t a l . , 1 9 6 0 ) . E q u a t i o n ( B - 1 2 ) w a s u s e d , w i t h t h e v a l u e o f [ 1 . d e t e r m i n e d f r o m t h e fi t d e p i c t e d i n F i g u r e 5 . 1 0 , t o d e t e r m i n e t h e b e s t v a l u e s o f D " a n d a , ( a , i s t h e a d d i t i o n a l e x p o n e n t i a l t e r m d u e t o a g g r e g a t e r a d i u s e f f e c t s , a n d w a s n e c e s s a r y t o o b t a i n a g o o d fi t t o t h e d a t a ; s e e C h a p t e r I V ) , w h e r e o n ; . D ° e " “ “ " " m 0 3 - 7 ) E q u a t i o n ( B - 1 2 ) w a s s o l v e d f o r D " t ( a g a i n n a m e d " l h s " ) ; l h s t h e n d e p e n d e d o n l y o n D " , w h i l e t h e r i g h t - h a n d - s i d e o f t h e e q u a t i o n d e p e n d e d o n l y o n a , . T o fi n d t h e b e s t v a l u e s f o r D " a n d a , , a v a l u e o f a , w a s c h o s e n a n d l h s w a s c a l c u l a t e d f o r e a c h c o n c e n t r a t i o n - t i m e d a t a p o i n t . T h e v a l u e s w e r e t h e n p l o t t e d v e r s u s t h e t i m e a t w h i c h t h e d a t a w e r e o r i g i n a l l y t a k e n , a n d t h e b e s t fi t s l o p e w a s d e t e r m i n e d u s i n g l i n e a r r e g r e s s i o n ( t h e s l o p e i s e q u a l t o D ” ) . T h i s w a s r e p e a t e d o v e r a w i d e r a n g e o f v a l u e s o f a , . A t e a c h v a l u e o f a , , t h e t o t a l r e s i d u a l e r r o r f o r t h e fi t w a s c a l c u l a t e d ; t h e s e v a l u e s w e r e t h e n p l o t t e d v e r s u s a , , a n d t h e ” t r u e " v a l u e s o f D ” a n d a , w e r e c h o s e n a t t h e p o i n t w h e r e t h e r e s i d u a l e r r o r w a s m i n i m i z e d . T h e m e t h o d b r o k e d o w n a t c o n c e n t r a t i o n s a b o v e 7 2 0 m M V A , s o d a t a a b o v e t h e v a l u e w e r e e x c l u d e d ; t h i s p r o b a b l y o c c u r r e d b e c a u s e t h e S t o k e s - E i n s t e i n e q u a t i o n , w h i c h w a s u s e d t o d e r i v e t h e fi n a l f o r m o f t h e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t ( i n c l u d i n g t h e e x p o n e n t i a l d e p e n d e n c e o n a g g r e g a t e r a d i u s ) , i s o n l y v a l i d f o r d i l u t e s o l u t i o n s ( B i r d e r a l . , 1 9 6 0 ) . T h e p l o t o f ” l h s " v e r s u s t i m e u s e d t o e s t i m a t e t h e b e s t fi t v a l u e s f o r D " a n d a , ( m i n i m u m t o t a l r e s i d u a l e r r o r ) i s s h o w n i n F i g u r e 5 . 1 1 . T h e v a l u e s o f D " a n d a , w e r e d e t e r m i n e d t o b e 4 . 4 9 4 x 1 0 5 c m z l m i n a n d 6 0 0 m M , r e s p e c t i v e l y ; r 2 f o r t h e fi t w a s 0 . 9 8 6 . U s i n g t h i s v a l u e o f a , , t h e d e p e n d e n c e o f V A m o l e c u l a r a g g r e g a t e r a d i u s w a s c a l c u l a t e d ; t h i s r e l a t i o n s h i p i s p l o t t e d i n F i g u r e 5 . 1 2 . T h e a g g r e g a t e r a d i u s a t i n fi n i t e d i l u t i o n w a s c a l c u l a t e d f r o m t h e y - i n t e r c e p t o f t h i s p l o t , a n d w a s f o u n d t o b e 4 6 . 5 A . T h i s v a l u e s e e m s t o b e u n u s u a l l y h i g h , c o n s i d e r i n g t h a t t h e m o l e c u l a r w e i g h t o f V A s h l 1 2 9 3 - 1 - I 4 8 m M u 9 6 m M I 0 L 1 i i i i 1 i i i i i i O 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 O 3 5 4 O 4 5 5 0 5 5 6 0 t i m e ( m i n ) F i g u r e 5 . 1 1 : T h e fi n a l i t e r a t i o n v a l u e s o f l h s v e r s u s t i m e f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f D " a n d a , f o r t h e c o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n c e o f D " f o r V A . I n i t i a l [ V A ] , c o n c e n t r a t i o n s f o r e a c h d a t a s e t a r e l i s t e d i n t h e l e g e n d b o x . r 2 f o r t h e fi t w a s 0 . 9 8 6 . 1 3 0 4 . . 3 . . ' s 2 - - 1 . 0 i i i : g g 0 1 2 5 2 5 0 3 7 5 5 0 0 6 2 5 7 5 0 V A C o n c e n t r a t i o n ( l i F i g u r e 5 . 1 2 : P r e d i c t e d v a r i a t i o n o f V A a g g r e g a t e r a d i u s w i t h t h e c o n c e n t r a t i o n o f V A , d e t e r m i n e d u s i n g t h e v a l u e o f a , c a l c u l a t e d i n t h e d e t e r m i n a t i o n o f D " f o r V A . 1 3 1 i s o n l y 1 6 8 g / m o l e , a n d t h a t t h e m o l e c u l e i s e s s e n t i a l l y p l a n a r ( V A i s 3 , 4 - d i m e t h o x y b e n z y l a l c o h o l ) . P e r h a p s t h i s i n d i c a t e s t h a t t h e a d d i t i o n a l e x p o n e n t i a l t e r m n e e d e d t o g e t a g o o d fi t t o t h e d a t a w a s n o t e n t i r e l y a t t r i b u t a b l e t o a g g r e g a t e r a d i u s ( o r e v e n n o t a t a l l ) ; s i n c e t h i s q u e s t i o n i s b e y o n d t h e s c o p e o f t h i s p r o j e c t , i t w i l l n o t b e d i s c u s s e d f u r t h e r h e r e . 5 . 3 . 3 [ M n ( I H ) - t a r t , ] S i n c e [ M n ( I I I ) - t a r t , ] w a s n o t s t a b l e e n o u g h t o t a k e s a m p l e s a n d s t o r e t h e m f o r l a t e r a n a l y s i s , a n d s i n c e n o s i m p l e w a y o f m e a s u r i n g i t s c o n c e n t r a t i o n o n - l i n e w a s a v a i l a b l e , t h e S t o k e s - E i n s t e i n e q u a t i o n w a s u s e d t o e s t i m a t e t h e v a l u e o f W f o r [ M n ( I I I ) - t a r t , ] f r o m t h e v a l u e o f D " m e a s u r e d f o r M n ( I I ) . A s s u m i n g t h a t M n ( I I ) i s i n a h i g h s p i n s t a t e ( N i c h o l l s , 1 9 7 4 ) , i t s r a d i u s i s 8 2 p m . I n w a t e r , M n ( I I ) i s c o o r d i n a t e d w i t h 6 w a t e r m o l e c u l e s i n o c t a h e d r a l c o o r d i n a t i o n ( M e l l o r , 1 9 7 9 ) , b u t t h e s e w a t e r m o l e c u l e s a r e c o n s t a n t l y e x c h a n g i n g w i t h o t h e r w a t e r m o l e c u l e s a s t h e i o n d i f f u s e s t h r o u g h t h e b u l k l i q u i d . T h u s , t h e e f f e c t i v e d i a m e t e r o f t h e [ M n ( I I ) - 6 H , O ] w a s a s s u m e d t o b e s i m p l y t h e d i a m e t e r o f t h e M n ( I I ) i o n . A s s u m i n g t h a t t h e v i s c o s i t y o f d i l u t e s o l u t i o n s o f [ M n ( I I I ) - t a r t , ] a n d [ M n ( I I ) - 6 H , O ] a r e t h e s a m e ( e q u a l t o t h e v i s c o s i t y o f w a t e r ) , r a t i o i n g t h e S t o k e s — E i n s t e i n e q u a t i o n s e v a l u a t e d f o r e a c h s p e c i e s y i e l d s t h e r e l a t i o n s h i p D i g - ( H D - w ’ r u n r u n - s a 0 1 - . ( 5 - 1 3 ) D a m - 6 1 1 , 0 1 ’ r u n a m - w g U s i n g t h e m e a s u r e d v a l u e o f D " f o r M n ( I I ) , t h e e s t i m a t e d r a d i u s o f t h e [ M n ( I I I ) - t a m ] c o m p l e x ( s e e C h a p t e r I V ) , a n d t h e d i a m e t e r o f M n ( I I ) l i s t e d a b o v e , D ‘ ” f o r [ M n ( I I I ) - t a r t , ] w a s c a l c u l a t e d t o b e 2 . 0 2 0 x 1 0 ’ c m z l m i n . 5 . 4 K i n e t i c s o f V A O x i d a t i o n b y L I P R e c o r d e r t r a c e s f r o m t h e L I P k i n e t i c e x p e r i m e n t s w e r e c o n v e r t e d t o n u m e r i c a l d a t a u s i n g a n e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t o f 9 3 0 0 M " c m " , t h e c h a r t s p w d , a n d t h e f u l l s c a l e O D t o y i e l d r a t e v e r s u s c o n c e n t r a t i o n d a t a f o r e a c h c a s e d e s c r i b e d i n C h a p t e r I V . T h e 1 3 2 r e c i p r o c a l s o f e a c h d a t a p o i n t w e r e c a l c u l a t e d a n d p l o t t e d i n a L i n e w e a v e r - B u r k a r r a n g e m e n t ( d o u b l e r e c i p r o c a l p l o t ) , w h i c h w a s t h e n u s e d t o c a l c u l a t e t h e k i n e t i c c o n s t a n t s . E a c h c a s e t r e a t e d i s d e s c r i b e d i n t u r n b e l o w . 5 . 4 . 1 C a s e 1 : E x c e s s V A , [ H , O J / K , ~ 0 . T h e L i n e w e a v e r - B u r k p l o t f o r t h i s c a s e i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 1 3 . [ L I P ] f o r t h i s c a s e w a s 1 5 5 . 7 U / L , w i t h [ V A ] a t 5 2 . 0 8 m M ; [ H , O , ] w a s v a r i e d f r o m 9 . 6 2 8 t o 1 9 0 5 1 1 M . T h e i n c r e a s e i n [ L I P ] / v a t l o w v a l u e s o f 1 / [ 1 - 1 , 0 , ] i s t y p i c a l f o r c o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n ( B a i l e y a n d O l l i s , 1 9 8 6 ) . T h e d a t a ( n o t i n c l u d i n g t h e p o i n t s w h e r e c o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n w a s i n fl u e n c i n g t h e r e a c t i o n r a t e ( i e . w h e r e [ L I P ] / v i n c r e a s e d a s 1 / [ H , O , ] d e c r e a s e d ) w e r e fi t t e d t o a l i n e u s i n g l i n e a r r e g r e s s i o n ; t h e s l o p e a n d i n t e r c e p t w e r e 4 6 . 5 8 m i n ( U / L ) a n d 7 9 9 . 5 m i n ( U / L ) / m M , w i t h a n r 2 o f 0 . 9 3 9 . T h e v a l u e o f k , ( c a l c u l a t e d f r o m t h e s l o p e ) w a s t h e n 2 . 1 4 7 x 1 0 2 ( m i n ( U / L ) ) “ . T h e v a l u e o f t h e i n t e r c e p t w a s k e p t f o r f u t u r e u s e i n e s t i m a t i n g k , ( s e e b e l o w ) . 5 . 4 . 2 C a s e 2 : E x c e s s H , 0 , , [ H , O J / K , ~ 0 . T h e L i n e w e a v e r - B u r k p l o t f o r C a s e 2 i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 1 4 . [ L I P ] f o r t h i s c a s e w a s a g a i n 1 5 5 . 7 U / L , w i t h [ H , O , ] a t 1 9 2 . 3 1 1 M ; [ V A ] w a s v a r i e d f r o m 2 0 . 0 0 t o 5 7 9 . 1 ” M . T h e c o n c e n t r a t i o n o f 1 1 , 0 , i n t h i s c a s e w a s n o t i n e x c e s s o v e r t h e e n t i r e r a n g e o f t h e [ V A ] u s e d i n t h e m e a s u r e m e n t s ; t h i s w a s b e c a u s e c o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n b y H , O , b e g a n t o a f f e c t t h e r a t e i n t h e r a n g e 4 0 0 — 5 0 0 1 1 M [ H , O , ] . T h u s , a l o w e r c o n c e n t r a t i o n o f H , O , w a s u s e d t o m a k e s u r e t h a t n o i n h i b i t i o n w a s t a k i n g p l a c e ; a t a n y r a t e , t h e l o w e r e d [ H , O , ] d i d n o t a f f e c t t h e l i n e a r i t y o f t h e L i n e w e a v e r - B u r k p l o t ( s e e F i g u r e 5 . 1 4 ) . T h e d a t a w e r e fi t t e d t o a l i n e u s i n g l i n e a r r e g r e s s i o n ; t h e s l o p e a n d i n t e r c e p t w e r e 1 3 0 . 3 m i n ( U / L ) a n d 9 4 4 . 5 m i n ( U / L ) / m M , w i t h a n r ' 2 o f 0 . 9 9 6 . T h e v a l u e o f k 3 ( c a l c u l a t e d f r o m t h e s l o p e ) w a s t h e n 7 . 6 7 6 x 1 0 3 ( m i n ( U / L ) ) “ . T h e v a l u e o f t h e i n t e r c e p t w a s k e p t f o r f u t u r e u s e i n e s t i m a t i n g k , ( s e e b e l o w ) . ) " m m " . 1 n i m m m o m 1 3 3 2 4 0 0 - I L I I I I I I I v I I I I I I - 2 0 - 1 5 - 1 O - 5 O 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 O [ P e r o x i d e l d l m M " ) F i g u r e 5 . 1 3 : L i n e w e a v e r - B u r k p l o t f o r C a s e 1 ( e x c e s s V A ) o f t h e L I P / V A k i n e t i c e x p e r i m e n t s . r 2 f o r t h e fi t w a s 0 . 9 3 9 . 1 3 4 3 6 0 0 ~ - 3 0 0 0 - 7 : 2 4 0 0 - E L . 5 E a 1 8 0 0 " S a . a 1 2 0 0 a 6 0 0 - - - 1 0 - 5 0 5 1 0 1 5 2 0 N A ) " ( m M ) “ F i g u r e 5 . 1 4 : L i n e w e a v e r - B u r k l o t f o r C a s e 2 ( e x c e s s , n o n i n h i b i t i n g H , O , ) o f t h e L I P / V A k i n e t i c e x p e r i m e n t s . 1 " o r t h e fi t w a s 0 . 9 9 6 . 1 3 5 5 . 4 . 3 C a s e 3 : E x c e s s H , 0 , , [ H , O , ] ~ K , T h e L i n e w e a v e r - B u r k p l o t f o r C a s e 3 i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 1 5 ; e a c h l i n e r e p r e s e n t s a s e p a r a t e e x p e r i m e n t w i t h a d i f f e r e n t [ H , O , ] . [ L I P ] f o r t h i s c a s e w a s a g a i n 1 5 5 . 7 U / L . C o m p l e t e e x p e r i m e n t s w e r e d o n e w i t h [ H , O , ] a t 4 8 1 . 5 , 9 4 0 . 4 , 1 4 2 8 , a n d 1 9 0 5 1 1 M , r e s p e c t i v e l y ; [ V A ] w a s v a r i e d i n e a c h f r o m 5 7 . 9 1 t o 5 7 9 . 1 1 1 M . E a c h s e t o f d a t a w a s fi t t e d t o a l i n e u s i n g l i n e a r r e g r e s s i o n ; t h e s l o p e s , i n t e r c e p t s , a n d v a l u e s o f r 2 f o r e a c h a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 5 . 3 . F o r t r u e c o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n , a l l f o u r l i n e s s h o u l d i n t e r c e p t t h e y - a x i s a t t h e s a m e p o i n t ; i n d e e d , a n a n a l y s i s o f v a r i a n c e o f t h e i n t e r c e p t s o f t h e l i n e s i n d i c a t e d n o s t a t i s t i c a l d i f f e r e n c e i n t h e i n t e r c e p t s ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e v a l u e s o f t h e i n t e r c e p t s f r o m F i g u r e 5 . 1 5 w e r e k e p t f o r f u t u r e u s e i n e s t i m a t i n g k . ( s e e b e l o w ) . T h e s l o p e s w e r e p l o t t e d v e r s u s [ H , O , ] ; t h i s i s s h o w n i n F i g u r e 5 . 1 6 ; r 2 f o r t h i s p l o t i s 0 . 9 2 9 , w i t h a s l o p e o f 2 3 . 8 5 m i n ( U / L ) / m M a n d a y - i n t e r c e p t o f 1 1 7 . 3 m i n ( U / L ) . A n o t h e r v a l u e f o r k , , 8 . 5 2 7 x 1 0 ' 3 ( m i n ( U / L ) ) “ , w a s e s t i m a t e d f r o m t h e y - i n t e r c e p t o f t h i s p l o t a n d a v e r a g e d w i t h t h e v a l u e o f k , c a l c u l a t e d f r o m C a s e 2 a b o v e . T h e a v e r a g e d v a l u e o f k 3 w a s u s e d , w i t h t h e s l o p e o f F i g u r e 5 . 1 6 , t o c a l c u l a t e K , . T h e a v e r a g e d v a l u e o f k , w a s f o u n d t o b e 8 . 1 0 1 x 1 0 3 ( m i n ( U / L ) ) “ , a n d t h e v a l u e o f K , w a s f o u n d t o b e 4 . 9 1 8 m M . A t t h i s p o i n t , t w o e s t i m a t e s o f k , w e r e k n o w n , o n e e s t i m a t e o f k , w a s k n o w n , a n d t h e r e w e r e s i x e q u a t i o n s r e l a t i n g k , t o e i t h e r k , o r k , . A v a l u e f o r k , w a s c a l c u l a t e d f r o m e a c h i n t e r c e p t e q u a t i o n , u s i n g b o t h v a l u e s o f k , ( t o g e t t w o e s t i m a t e s f o r k . ) a n d t h e s i n g l e e s t i m a t e o f k , ; t h i s g a v e s e v e n e s t i m a t e s o f k . . T h e s e v e n v a l u e s w e r e a v e r a g e d , a n d a n y v a l u e s m o r e t h a n t w o s t a n d a r d d e v i a t i o n s a w a y f r o m t h e m e a n w e r e d r o p p e d ( o n l y o n e e s t i m a t e w a s d r o p p e d ) . T h e " t r u e ” v a l u e o f k , , 1 . 2 4 6 x 1 0 3 m M ( m i n ( U / L ) " w a s t h e n c a l c u l a t e d a s t h e a v e r a g e o f t h e r e m a i n i n g s i x e s t i m a t e s . T o s u m m a r i z e , t h e v a l u e s o f t h e L I P k i n e t i c c o n s t a n t s k , , k , , k , , a n d K , w e r e f o u n d t o b e 2 . 1 4 7 X 1 0 2 ( m i n ( U / L ) ) " , 8 . 1 0 1 x 1 0 3 ( m i n ( U / L ) ) " , 1 . 2 4 6 x 1 0 3 m M ( m i n ( U / L ) " , a n d 4 . 9 1 8 m M , r e s p e c t i v e l y . T a b l e 5 . 3 . 8 1 0 f o r C a s e 3 ( i n h i b i t i n g H , O , ) . 1 3 6 , i n t e r c e p t s , a n d r 2 f o r t h e s t a t i s t i c a l fi t s o f t h e L I P / V A k i n e t i c d a t a [ H 2 0 2 ] s l o p e y - i n t e r c e p t 1 ’ ( “ W ( U m i n / L ) ( U m i n / L N M ) 4 8 1 . 5 1 3 0 . 5 8 8 6 . 1 0 . 9 9 1 9 4 0 . 4 1 4 0 . 0 8 5 8 . 3 0 . 9 5 5 1 4 2 8 1 4 5 . 6 8 6 1 . 5 0 . 9 9 5 1 9 0 5 1 6 6 . 4 8 1 7 . 9 0 . 9 9 4 1 3 7 4 0 0 0 - - 3 2 0 0 - - 3 v . “ 2 4 0 0 - - , , E l 3 I 4 8 1 . 5 1 1 M ' 5 , ' a 9 4 0 . 3 1 1 1 1 . g e 1 4 2 8 m a 1 6 0 0 - - 0 1 9 0 5 R M 3 t 4 8 1 . 5 M 5 _ - - - 9 4 0 . 3 1 1 M " ' ° - - - - - - 1 4 2 8 u m 8 0 , - - - - 1 9 0 5 M ( ’ 1 4 , I f " r e f f / V , 4 ‘ ; g g g A : - 1 0 - 5 o 5 1 0 1 5 2 0 t v m " t h " ) F i g u r e 5 . 1 5 : L i n e w e a v e r - B u r k p l o t f o r C a s e 3 ( e x c e s s , i n h i b i t i n g H , O , ) o f t h e L I P / V A k i n e t i c e x p e r i m e n t s . T h e i n t e r c e p t s a r e n o t s t a t i s t i e a l l y d i f f e r e n t w i t h i n 9 5 % c o n fi d e n c e , i n d i c a t i n g c o m p e t i t i v e s u b s t r a t e i n h i b i t i o n . H , O , c o n c e n t r a t i o n s a r e l i s t e d i n t h e l e g e n d b o x , a l o n g w i t h t h e c o r r e s p o n d i n g fi t s . l l L I U l n i m l e p o l S o 0 . 4 0 . [ 8 P e r o x i d e ] l l . 2 1 i 1 . 6 2 1 3 8 I D a t a — F i t 1 8 0 ' 1 6 0 ‘ 1 4 0 ' - 1 2 0 ' 1 0 0 I I F i g u r e 5 . 1 6 : S e c o n d s ? s l o p e p l o t f o r C a s e 3 ( e x c e s s , i n h i b i t i n g H , O , ) o f t h e L I P / V A k i n e t i c e x p e r i m e n t s . f o r t h e fi t w a s 0 . 9 2 9 . 1 3 9 5 . 5 M N P / M n ( I I ) a n d M n ( I I I ) K i n e t i c s R e c o r d e r t r a c e s f r o m t h e M N P k i n e t i c e x p e r i m e n t s w e r e c o n v e r t e d t o n u m e r i c a l d a t a u s i n g a n e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t o f 6 5 0 0 M “ c m " , t h e c h a r t s p e e d , a n d t h e f u l l s c a l e O D t o y i e l d r a t e v e r s u s c o n c e n t r a t i o n d a t a f o r e a c h s o u r c e o f M N P d e s c r i b e d i n C h a p t e r I V . T h e r e c i p r o c a l s o f e a c h d a t a p o i n t w e r e c a l c u l a t e d a n d p l o t t e d i n a L i n e w e a v e r - B u r k a r r a n g e m e n t a s f o r t h e L I P k i n e t i c s ( C a s e 1 ) , w h i c h w a s t h e n u s e d t o c a l c u l a t e t h e k i n e t i c c o n s t a n t s . T h e k i n e t i c r a t e c o n s t a n t f o r [ M n ( I I I ) - t a r t , ] r e d u c t i o n t h r o u g h t h e o x i d a t i o n o f l i g n i n b o n d s w a s e s t i m a t e d f r o m l i t e r a t u r e d a t a , c o m b i n e d w i t h s e v e r a l a s s u m p t i o n s . E a c h c a s e i s d e s c r i b e d i n t u r n b e l o w . 5 . 5 . 1 K i n e t i c s o f M n ( I I ) O x i d a t i o n b y D 5 N o M n M N P ( M N P ) T h e L i n e w e a v e r - B u r k p l o t f o r M N P , i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 1 7 . [ M N P ] f o r t h i s c a s e w a s 1 0 0 0 U / L ( b y M N P A s s a y # 1 ) , w i t h [ M n ( I I ) ] a t 2 . 0 0 0 m M ; [ H , O , ] w a s v a r i e d f r o m 3 8 . 6 2 t o 4 8 1 . 5 1 1 M . T h e d a t a w e r e fi t t e d t o a l i n e u s i n g l i n e a r r e g r e s s i o n ; t h e s l o p e a n d i n t e r c e p t w e r e 7 6 . 1 5 m i n ( U / L ) a n d 7 4 5 . 8 m i n ( U / L ) / m M , w i t h a n r 2 o f 0 . 9 3 8 . T h e v a l u e o f k 5 , ( c a l c u l a t e d f r o m t h e s l o p e ) w a s t h e n 6 . 5 6 6 x 1 0 3 ( m i n ( U / L ) ) " , a n d t h e v a l u e o f ‘ 1 ' , ( c a l c u l a t e d f r o m t h e i n t e r c e p t ) w a s f o u n d t o b e 2 9 8 3 m i n ( U / L ) / m M . 5 . 5 . 2 K i n e t i e s o f M n ( I I ) O x i d a t i o n b y D 4 H i M n M N P ( M N P , ) T h e L i n e w e a v e r - B u r k p l o t f o r M N P b i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 1 8 . [ M N P ] f o r t h i s c a s e w a s 3 1 6 0 U / L ( b y M N P A s s a y # 1 ) , w i t h [ M n ( I I ) ] a t 2 . 0 0 0 m M ; [ H , O , ] w a s v a r i e d f r o m 1 0 . 5 9 t o 5 4 4 . 7 1 1 M . T h e d a t a w e r e fi t t e d t o a l i n e u s i n g l i n e a r r e g r e s s i o n ; t h e s l o p e a n d i n t e r c e p t w e r e 9 8 . 2 5 m i n ( U / L ) a n d 5 8 4 . 2 m i n ( U / L ) / m M , w i t h a n r 2 o f 0 . 9 5 9 . T h e v a l u e o f k 5 , , ( c a l c u l a t e d f r o m t h e s l o p e ) w a s t h e n 5 . 0 8 9 X 1 0 3 ( m i n ( U / L ) ) “ , a n d t h e v a l u e o f ‘ 1 ' , ( c a l c u l a t e d f r o m t h e i n t e r c e p t ) w a s f o u n d t o b e 2 3 3 7 m i n ( U / L ) / m M . N o t e t h a t t h e k i n e t i c c o n s t a n t s f o r M N P , a n d M N P , a r e d i f f e r e n t - - t h i s i s b e c a u s e t h e M N P f r o m e a c h s o u r c e i s m a d e u p o f d i f f e r e n t r e l a t i v e a m o u n t s o f t h e v a r i o u s M N P i s o e n z y m e s H 3 , H 4 , H 5 , a n d H 9 . E a c h i s o e n z y m e h a s i t s o w n k , a n d ‘ 1 ! v a l u e s , a n d t h e v a l u e s m e a s u r e d a r e i n e f f e c t ” a v e r a g e d " o v e r a l l t h e i s o e n z y m e s . h t i w " . I n i m m v J l a P N M [ 1 4 0 3 6 0 0 - I t h u s 3 0 0 0 - 2 4 0 0 ~ - 1 8 0 0 - 1 2 0 0 - C . l b d b - 1 0 - 5 0 s 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 t P e r o x i d e l “ m m “ ) F i g u r e 5 . 1 7 : L i n e w e a v e r - B u r k p l o t f o r t h e M N P / M n ( I I ) k i n e t i c e x p e r i m e n t s ( e x c e s s M n ( I I ) ) u s i n g D 5 N o M n M N P ( M N P ) . r 1 f o r t h e fi t w a s 0 . 9 3 8 . 1 4 1 1 2 0 0 0 - - I 1 0 0 0 0 - i s 8 0 0 0 ~ s ' 1 1 8 a 6 0 0 0 - 5 5 5 2 0 0 0 - - 1 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 l P e r o x i d e l " t n n M " ) F i g u r e 5 . 1 8 : L i n e w e a v e r - B u r k p l o t f o r t h e M N P / M n ( I I ) k i n e t i c e x p e r i m e n t s ( e x c e s s M n ( I I ) ) u s i n g D 4 H i M n M N P ( M N P Q . r 2 f o r t h e fi t w a s 0 . 9 5 9 . 1 4 2 5 . 5 . 3 K i n e t i c s o f [ M n ( I I I ) - t a m ] R e d u c t i o n A s d e s c r i b e d i n C h a p t e r I V , t h e v a l u e o f k , w a s e s t i m a t e d f r o m v a l u e s p u b l i s h e d p r e v i o u s l y ( W a r i i s h i e r a l . , 1 9 9 2 ) . T h i s w a s d o n e b e c a u s e k , f o r e a c h s u b s t r a t e w i l l b e d i f f e r e n t , a n d t h e s u b s t r a t e f o r t h e r e a c t o r s t u d i e s w a s l i g n i n , a r a n d o m l y p o l y m e r i z e d p h e n y l p r o p a n o i d p o l y m e r ; n o v a l u e s f o r k , f o r l i g n i n b o n d s h a v e b e e n ( o r a r e l i k e l y t o e v e r b e ) m e a s u r e d d u e t o t h i s c o m p l e x i t y . T h e fi n a l v a l u e o f k , ( t h e s a m e v a l u e o f k , i s u s e d f o r b o t h M N P s o u r c e s s i n c e t h e r e d u c t i o n o f [ M n ( I I I ) - t a m ] d o e s n o t d e p e n d o n M N P a c t i v i t y ) w a s e s t i m a t e d f r o m t h e v a l u e g i v e n b y W a r i i s h i e r a l . ( 1 9 9 2 ) f o r v a n i l l y l a l c o h o l . T h e r e a c t i o n w a s f o u n d t o b e s e c o n d o r d e r , w i t h k , ( m y k , ) e q u a l t o 7 2 0 m M ' l m i n " . M u l t i p l y i n g t h e v a l u e o f k , f o r v a n i l l y l a l c o h o l b y a p p r o x i m a t e l y t h e r a t i o o f t h e m o l e c u l a r w e i g h t s ( t h e r a t i o o f t h e m o l e c u l a r w e i g h t s i s 1 . 5 4 x 1 0 “ ; 1 x 1 0 4 w a s u s e d ) g i v e s a v a l u e o f 7 . 2 x 1 0 2 m M “ m i n " f o r k , . S i n c e v a n i l l y l a l c o h o l i s s o l u b l e i n w a t e r b u t t h e l i g n i n u s e d i s n o t , t h e v a l u e o f k , w a s d e c r e a s e d b y a n o t h e r o r d e r o f m a g n i t u d e t o a c c o u n t f o r t h e t i m e i t w o u l d t a k e f o r t h e [ M n ( I I I ) - t a n g c o m p l e x t o d i f f u s e t o a l i g n i n b o n d i n o r d e r t o o x i d i z e i t , g i v i n g a fi n a l v a l u e o f 7 . 2 x 1 0 3 m M " m i n " f o r k , . T h i s w a s t h e v a l u e u s e d i n t h e r e a c t o r s i m u l a t i o n . U s i n g t h i s n u m b e r i n t h e m o d e l , a l o n g w i t h t h e e s t i m a t e d i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n o f l i g n i n b o n d s ( 1 9 3 . 3 m M ) , i t w a s p r e d i c t e d t h a t t h e l i g n i n b o n d s w o u l d b e a b o u t 5 0 % o x i d i z e d o v e r t h e c o u r s e o f a 2 4 h o u r r u n ( t h i s p r e d i c t e d v a l u e i s c o m p l e t e l y a r b i t r a r y , b u t s e e m e d t o b e s u p p o r t e d b y v i s u a l o b s e r v a t i o n s o f t h e l i g n i n a f t e r 6 a n d 1 2 h o u r s o f t r e a t m e n t i n t h e r e a c t o r - M N P a l o n e c a u s e d a l i g n i n c o l o r c h a n g e w h i c h d a r k e n e d o v e r t i m e ) . O f a l l t e r m s i n t h e m o d e l , t h i s t e r m c o n t a i n s t h e m o s t a s s u m p t i o n s . 5 . 6 S t a b i l i t i e s o f 1 1 , 0 , a n d V A a t 3 7 ° C , p H 3 . 5 0 , a n d 3 5 0 s p m T h e s t a b i l i t y o f H , O 2 w a s d e t e r m i n e d b y i n c u b a t i o n a t 3 7 ° C , p H 3 . 5 0 , a n d 3 5 0 8 p m , a n d m e a s u r i n g t h e H , O , c o n c e n t r a t i o n i n s a m p l e s t a k e n o v e r a 2 4 h o u r p e r i o d . T h e r e s u l t s a r e s h o w n i n F i g u r e s 5 . 1 9 a a n d 5 . 1 % . H , 0 , w a s f o u n d t o b e c o m p l e t e l y s t a b l e o v e r t h i s p e r i o d . T h i s r e s u l t w o u l d n o t b e a l l t h a t s u r p r i s i n g f o r V A , w h i c h i s e x p e c t e d 1 4 3 6 0 L N ' ' s o . - + 8 . 2 8 m M _ . + 6 0 0 m M 5 4 1 0 - - 5 . ( a . ) g 3 0 ' C 3 g 2 0 - - a . 1 0 0 . . O i O 4 8 1 2 1 6 2 0 2 4 2 8 t i m e ( h o u r s ) 6 0 0 0 e - 4 0 0 0 . ' + 4 8 4 3 r n M ( b . ) ” 0 0 1 % ; c a + 1 0 1 4 r n M + 2 0 0 4 m M + 2 8 7 6 m M é + 3 8 8 0 m M 5 2 0 0 0 i t ; e : 3 + 4 7 3 8 m M 1 0 0 0 7 1 3 9 . , u r n — 1 - : 1 t i m e ( h o u r s ) F i g u r e 5 . 1 9 : V a r i a t i o n o f t h e c o n c e n t r a t i o n o f H , 0 , w i t h t i m e i n t h e H , O , s t a b i l i t y e x p e r i m e n t s a t 3 7 ° C , p H 3 . 5 0 , a n d 3 5 0 s p m a g i t a t i o n , f o r : ( a . ) L o w i n i t i a l H , 0 , c o n c e n t r a t i o n s , a n d ( b . ) H i g h i n i t i a l H , O , c o n c e n t r a t i o n s . 1 4 4 t o b e s o m e w h a t s t a b l e d u e t o i t s a r o m a t i c s t r u c t u r e ; i n f a c t , V A w a s a s s u m e d t o b e s t a b l e a t 3 7 ° C . F o r H , 0 , , h o w e v e r , i t w a s s o m e w h a t o f a s u r p r i s e . T h e e x p e r i m e n t w a s r e p e a t e d w i t h t h e s a m e r e s u l t ; a p r o b a b l e e x p l a n a t i o n f o r t h i s s t a b i l i t y i s t h a t t h e s t o c k H , O , ( S i g m a ) m u s t b e s t a b i l i z e d i n s o m e w a y . T h i s p r e s u m p t i o n i s s u p p o r t e d b y t h e f a c t t h a t t h e e n t i r e l a b s t a f f h a s b e e n u s i n g t h e s a m e 5 0 0 m L b o t t l e o f H , O , ( s t o r e d a t 4 ° C ) f o r a t l e a s t 6 y e a r s a n d t h e c o n c e n t r a t i o n o f H , O , i n t h i s b o t t l e h a s o n l y d r o p p e d f r o m 9 . 7 1 M t o 7 . 3 7 M o v e r t h i s p e r i o d . 5 . 7 S t a b i l i t y o f D 5 N o M n L I P a t 3 7 ° C , p H 3 . 5 0 , a n d 3 5 0 s p m T h e [ L I P ] v e r s u s t i m e d a t a o b t a i n e d f r o m t h e L I P s t a b i l i t y e x p e r i m e n t s w a s fi t t e d t o v a r i o u s s i m p l e d e c a y m o d e l s , i n c l u d i n g fi r s t o r d e r ( e x p o n e n t i a l ) d e c a y , s e c o n d o r d e r d e c a y , a n d t h i r d o r d e r d e c a y , u s i n g l i n e a r r e g r e s s i o n . N o n e o f t h e s e m o d e l s g a v e a v e r y g o o d fi t t o t h e d a t a ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e n e x t m o d e l s t r i e d w e r e s u m s o f t h e t h r e e s i m p l e d e c a y m o d e l s ; t h e b e s t fi t a t a l l i n i t i a l [ L I P ] l e v e l s w a s o b t a i n e d b y a z e r o o r d e r p l u s fi r s t o r d e r d e c a y m o d e l , s u g g e s t i n g t h a t L I P a c t i v i t y d e c a y i s d u e t o t w o p r o c e s s e s , r a t h e r t h a n j u s t o n e ( i e . d e c a y d u e t o p H m a y h a v e o n e m e c h a n i s m , w h i l e d e c a y d u e t o t e m p e r a t u r e h a s a n o t h e r m e c h a n i s m ) . S i n c e f u r t h e r e x p l o r a t i o n o f t h i s p o i n t w a s b e y o n d t h e s c o p e o f t h i s p r o j e c t , n o f u r t h e r r e s e a r c h w a s d o n e o n t h i s p o i n t , b u t t h e z e r o o r d e r p l u s fi r s t o r d e r d e c a y m o d e l w a s u s e d i n t h e r e a c t o r m o d e l s i n c e i t d e s c r i b e d t h e d a t a w e l l . T h e d e c a y c o n s t a n t s k , " a n d k , , , , w e r e d e t e r m i n e d a s f o l l o w s . E q u a t i o n ( 4 - 2 3 ) w a s s o l v e d f o r [ L I P ] a n d r e a r r a n g e d t o g i v e [ U P I , " a . [ L I P ] , k [ L I P ] , - l n ( 4 " ? ) = k 4 1 2 ‘ ( 5 - 1 4 ) d e t 1 k a r m a , w h e r e [ L I P ] , i s t h e i n i t i a l L I P a c t i v i t y a n d t h e o t h e r p a r a m e t e r s a r e a s p r e v i o u s l y d e fi n e d . T h e l e f t - h a n d - s i d e o f t h e e q u a t i o n w a s d e fi n e d a s ” l h s , " a n d l h s w a s p l o t t e d v e r s u s t i m e 1 4 5 t o o b t a i n a fi t t o t h e e x p e r i m e n t a l d a t a . T h e r e a r e a n i n fi n i t e n u m b e r o f c o m b i n a t i o n s o f k . . . " a n d k m w h i c h w i l l s a t i s f y t h i s e q u a t i o n , s o k 4 , , w a s c h o s e n t o b e o n t h e o r d e r o f m a g n i t u d e o f t h e d e c a y c o n s t a n t s d e t e r m i n e d f o r t h e M N P e n z y m e s ( 1 0 2 t o 1 0 3 ) ; t h i s w a s a n a r b i t r a r y c h o i c e , a n d w a s d o n e b e c a u s e b o t h w e r e fi r s t o r d e r ( e x p o n e n t i a l ) d e c a y c o n s t a n t s f o r s i m i l a r t y p e s o f e n z y m e s . A v a l u e w a s c h o s e n f o r k w , t h e n , w h i c h w o u l d a l l o w a v a l u e o f k m t h a t w a s i n t h e o r d e r o f m a g n i t u d e r a n g e a b o v e ; k m w a s t h e n c h o s e n , t h e d a t a w e r e fi t t e d u s i n g l i n e a r r e g r e s s i o n , a n d t h e s l o p e g a v e a n e w e s t i m a t e f o r k , , , . T h e v a l u e o f k 4 , , w a s c h o s e n i n i t i a l l y s o t h a t t h e fi r s t e s t i m a t e o f k g , w a s e x a c t l y e q u a l t o t h e d e c a y c o n s t a n t c a l c u l a t e d f o r M N P , ( s e e b e l o w ) ; t h i s v a l u e w a s d e t e r m i n e d b y t r i a l a n d e r r o r u s i n g a s h o o t i n g m e t h o d . T h e fi n a l i t e r a t i o n f o r t h i s m e t h o d , w i t h k 4 , , e q u a l t o 1 9 . 1 6 ( U / L ) / h r , a n d k m e q u a l t o 1 . 8 6 7 X 1 0 ’ 2 h r “ , i s s h o w n i n F i g u r e 5 . 2 0 ( r 2 = 0 . 9 6 2 ) . T h e g o o d n e s s o f fi t t o t h e [ L I P ] v e r s u s t i m e d a t a i s s h o w n i n F i g u r e 5 . 2 1 . 5 . 8 S t a b i l i t i e s o f D 5 N o M n a n d D 4 H i M n M N P S a t 3 7 ° C , p H 3 . 5 0 , a n d 3 5 0 s p m T h e s a m e m e t h o d w a s u s e d t o fi n d t h e c o r r e c t d e c a y m o d e l s f o r M N P , a n d M N P , a s w a s u s e d f o r t h e L I P a b o v e . B o t h M N P , a n d M N P , d e c a y r a t e s w e r e f o u n d b e a d e q u a t e l y p r e d i c t e d u s i n g a s i m p l e fi r s t o r d e r ( e x p o n e n t i a l ) d e c a y . T h e d e c a y c o n s t a n t s w e r e d e t e r m i n e d b y l i n e a r i z i n g t h e s o l u t i o n t o t h e fi r s t o r d e r d e c a y e q u a t i o n ( b y t a k i n g t h e l o g a r i t h m o f b o t h s i d e s ) a n d fi t t i n g t h e d a t a t o a l i n e u s i n g l i n e a r r e g r e s s i o n ; t h i s p r o c e d u r e i s a w e l l k n o w n m e t h o d a n d s o i t w i l l n o t b e s h o w n h e r e . T h e g o o d n e s s o f t h e fi t s , h o w e v e r , i s d e m o n s t r a t e d i n F i g u r e s 5 . 2 2 a n d 5 . 2 3 f o r M N P , a n d M N P , ” r e s p e c t i v e l y . T h e d e c a y c o n s t a n t s k 4 , , a n d k 1 , » , c o r r e s p o n d i n g t o M N P , a n d M N P , ” r e s p e c t i v e l y , w e r e f o u n d t o b e 5 . 1 6 8 x 1 0 3 h r ' 1 a n d 2 . 5 3 5 X 1 0 ‘ 2 h r " ( t h e M N P , s e e m s t o b e m o r e s t a b l e t h a n t h e M N P , ) . T h e c o r r e l a t i o n c o e f fi c i e n t s ( r ? ) f o r t h e l i n e a r fi t s w e r e 0 . 9 7 8 a n d 0 . 8 3 0 f o r M N P , a n d M N P , , , r e s p e c t i v e l y . s h l 0 L 0 i 2 i 4 ( h o u r s ) t i m e i 6 i 8 1 4 6 0 . 1 6 ' - l 7 9 5 . 7 U / L D 1 2 1 6 U I L 0 . 1 2 - - o 1 5 8 7 U I L o 2 3 6 5 U I L — F i t 0 . 0 8 ' - 0 . 0 4 ' F i g u r e 5 . 2 0 : l h s v e r s u s t i m e f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f k “ , a n d k “ , f o r L I P s t a b i l i t y . I n i t i a l L I P l e v e l s a r e l i s t e d i n t h e l e g e n d b o x . 1 ' 2 f o r t h e fi t w a s 0 . 9 6 2 . 1 4 7 2 5 0 0 o O 2 0 0 0 - - I 7 9 5 . 7 U / L . a 1 2 1 6 0 1 L E 1 6 0 0 0 e 1 5 8 7 0 1 1 . g o o 2 3 6 6 0 1 1 . E 2 _ ' - — 7 9 5 . 7 U I L 9 - ' . — 1 2 1 6 o n . 1 0 0 0 , — 1 6 8 7 ( M L — 2 3 6 5 U l l . 5 0 0 ~ - 0 I 8 I I 0 2 4 6 8 t i m e ( h o u r s ) F i g u r e 5 . 2 1 : P l o t o f [ L I P ] ( U / L ) v e r s u s t i m e f o r t h e L I P s t a b i l i t y e x p e r i m e n t s a t 3 7 ° C , H 3 . 5 0 , a n d 3 5 0 s p m a g i t a t i o n . T h e c u r v e s s h o w n a r e t h e p r e d i c t e d v a l u e s f r o m t h e i t t o z e r o o r d e r p l u s fi r s t o r d e r d e c a y . I n i t i a l L I P l e v e l s a r e i n d i e a t e d i n t h e l e g e n d b o x . i n d i . 1 4 8 4 0 0 0 3 2 0 0 ~ - I 1 1 1 8 U I L a 1 8 8 9 D A , 2 4 0 0 o 2 3 5 7 U I L § 0 . o 3 6 6 8 o n . . . , , — 1 r 1 8 U I L 5 ' ; ° — 1 8 8 9 o n . g 1 6 0 0 = — 2 3 5 7 u n . : — 3 6 6 8 o n . 8 0 0 - - _ _ O I 8 I 8 0 2 4 6 8 t i m e ( h o u r s ) F i g u r e 5 . 2 2 : P l o t o f [ M N P ] ( U / L ) v e r s u s t i m e f o r t h e M N P , s t a b i l i t y e x p e r i m e n t s a t 3 7 ° C , p H 3 . 5 0 , a n d 3 5 0 s p m a g i t a t i o n . T h e c u r v e s s h o w n a r e t h e p r e d i c t e d v a l u e s f r o m t h e fi t t o a s i m p l e fi r s t o r d e r d e c a y m o d e l ( 1 ' 2 o f 0 . 9 7 8 ) . I n i t i a l M N P l e v e l s a r e i n d i e a t e d i n t h e l e g e n d b o x . F a l c o n . " 1 4 9 6 0 0 0 0 5 0 0 0 0 n 8 9 0 5 U I L ‘ ° ° ° ° ' a 1 6 9 4 9 U I L 0 2 6 2 9 2 U / L 2 0 4 8 6 6 2 U I L a 3 0 0 0 0 - - — 8 9 0 5 u n . E — 1 6 9 4 9 U I L g 0 + ’ — 2 6 2 9 2 U I L 2 0 0 0 0 ' " — 4 8 6 6 2 U I L U D 1 : a _ 1 0 0 0 0 + H — 0 . . : : . 0 2 4 6 8 t i m e ( h o u r s ) F i g u r e 5 . 2 3 : P l o t o f [ M N P ] ( U I L ) v e r s u s t i m e f o r t h e M N P . s t a b i l i t y e x ° m e n t s a t 3 7 ° C , p H 3 . 5 0 , a n d 3 5 0 s p m a g i t a t i o n . T h e c u r v e s s h o w n a r e t h e p ' c t e d v a l u e s f r o m t h e fi t t o a s i m p l e fi r s t o r d e r d e c a y m o d e l ( 1 ' 2 o f 0 . 8 3 0 ) . I n i t i a l M N P l e v e l s a r e i n d i c a t e d i n t h e l e g e n d b o x . 1 5 0 5 . 9 D i a l y s i s R e a c t o r M o d e l - R u n S i m u l a t i o n s T h e r e a c t o r m o d e l s i m u l a t i o n p r o g r a m , R K G . F O R , w a s r u n a n d o p t i m i z e d f o r e a c h e n z y m e m i x t u r e ( L I P a l o n e , M N P a l o n e , a n d L I P + M N P ) , f o r 2 0 m g o f l i g n i n , 1 m L t o t a l i n i t i a l v o l u m e i n e a c h s i d e o f t h e r e a c t o r , a n d u s i n g t h e c o n c e n t r a t i o n r a n g e s s p e c i fi e d b y O l s e n e t a l . ( 1 9 9 1 ) . T h e c o n c e n t r a t i o n s , v o l u m e s , a n d t i m e s o f p u l s e a d d i t i o n s a r e l i s t e d i n T a b l e s 4 . 3 t h r o u g h 4 . 5 i n C h a p t e r I V . 5 . 9 . 1 L I P O n l y T h e H 2 0 2 a n d V A c o n c e n t r a t i o n p r o fi l e s f o r S i d e B a r e s h o w n i n F i g u r e s 5 . 2 4 a n d 5 . 2 5 ; r e f e r t o T a b l e 4 . 3 f o r t h e p u l s e p r o fi l e s f o r S i d e s A a n d B . T h e d a s h e d l i n e s i n F i g u r e s 5 . 2 4 a n d 5 . 2 5 a r e t h e m i n i m u m a n d m a x i m u m c o n c e n t r a t i o n s s p e c i fi e d b y O l s e n e t a l . ( 1 9 9 1 ) , a n d t h e c u r v e s a r e t h e c o n c e n t r a t i o n s o f H 2 0 2 a n d V A i n S i d e B f o r e a c h fi g u r e , r e s p e c t i v e l y . T h e s h a r p v e r t i c a l c h a n g e s i n H 2 0 2 c o n c e n t r a t i o n i n F i g u r e 5 . 2 4 c o r r e s p o n d t o t h e s u d d e n d r o p s i n V A c o n c e n t r a t i o n i n F i g u r e 5 . 2 5 , a n d a r e d u e t o a d d i t i o n s o f H 2 0 2 t o S i d e A t o a d j u s t t h e t r a n s p o r t r a t e o f H 2 0 2 t o S i d e B i n s u c h a w a y t h a t t h e c o n s u m p t i o n r a t e o f V A i n S i d e B w i l l i n c r e a s e . T h e v a r i a t i o n s i n H 2 0 2 c o n c e n t r a t i o n a r e s m a l l , w i t h t h e a v e r a g e c o n c e n t r a t i o n a t a b o u t 1 5 1 4 M . V A c o n c e n t r a t i o n s v a r y m u c h m o r e b e c a u s e t h e v a l u e o f t h e e f f e c t i v e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t f o r V A i s a b o u t a n o r d e r o f m a g n i t u d e s m a l l e r t h a n t h a t f o r H 2 0 2 ; t h u s , V A t r a n s p o r t _ r a t e s d o n o t d r o p a s f a s t a s H 2 0 2 t r a n s p o r t r a t e s . T h e a v e r a g e V A c o n c e n t r a t i o n i n S i d e B o v e r t h e c o u r s e o f t h e r u n w a s a b o u t 3 6 0 u M . T h e S i d e B L I P a c t i v i t y p r o fi l e i s s h o w n i n F i g u r e 5 . 2 6 ; a c t i v i t y i s m a i n t a i n e d n e a r t h e i n i t i a l v a l u e o f 1 0 0 0 U / L f o r t h e e n t i r e c o u r s e o f t h e r u n t h r o u g h e n z y m e a d d i t i o n s t o S i d e B . T h e v a r i a t i o n o f t h e c o n c e n t r a t i o n o f l i g n i n b o n d s i n S i d e B i s s h o w n i n F i g u r e 5 . 2 7 . N o t e t h a t t h e o n l y d e c r e a s e s a r e d u e t o d i l u t i o n s c a u s e d b y e n z y m e a d d i t i o n t o S i d e B . T h i s r e s u l t o c c u r s b e c a u s e t h e c o n s u m p t i o n o f H 2 0 2 d u e t o o x i d a t i o n o f l i g n i n b o n d s w a s n e g l e c t e d s i n c e i t w a s a s s u m e d t o b e s m a l l r e l a t i v e t o t h e r a t e o f o x i d a t i o n o f V A . T h u s , n o o x i d a t i o n o f l i g n i n b o n d s i s p r e d i c t e d b y t h e m o d e l . I M m I e d i x o r e P B e d i S ? I M m I A V 8 n ? o i 1 e d i S : F h r i s n g t d u d e e r r e 5 n e t r e . t 2 T h 5 a e : b e [ l l a l V o 4 A w . ] e 3 . d v ( r a L a r I n i P g a t e i A o l o n f o n w [ i e V t A h e ] t . n . i z . m y e m p e r e c d a i s c e t ) e . d b T y h R e K G p u . p F e O r R a s u d n i l g o w n t e e h r e p d u a l s s h fi n l e e s l i . ° ' 3 ‘ I I I I I l I I I I I I I l I I I I I I I I I I I I I I l l I I P o ‘ i ’ 9 c Q ’ . 0 o 1 t i m e I h r I F i g u r e 5 . 2 4 : [ H 2 0 2 ] , v a r i a t i o n w i t h t i m e p r e d i c t e d b y R K G . F O R u s i n g t h e p u l s e r o fi l e l i s t e d i n T a b l e 4 . 3 ( L I P A l o n e e n z y m e c a s e ) . T h e u p p e r a n d l o w e r d a s h e d h n e s r n d i c e t e t h e a l l o w e d r a n g e o f [ 1 1 , 0 2 ] . . 9 o r . 0 I » 0 2 4 6 8 1 0 1 2 t i m e I h r I I L I U I P I L F h i s g t u e r d e r 5 n . T 2 6 a : b l e [ L 4 I . ] P 3 . ( i v L a I r P a A t l i o o n n w e i e h t n z t y i m e m e p c r a e s e d ) i . c t e d b y R K G . F O R u s i n g t h e p u l s e p r o fi l e ) ‘ " $ M m ( n i n g i L B e d i S 5 F 8 0 9 0 9 1 5 2 1 2 1 0 0 8 0 0 - - é 4 0 0 ' ' 2 0 0 " 0 2 4 6 8 1 O 1 2 t i m e ( h r ) 2 0 0 " a . 0 2 4 6 8 1 0 1 2 t i m e ( h r ) F i g u r e 5 . 2 7 : [ L i g n i n ] , v a r i a t i o n W i t h t i m e p r e d i c t e d b y R K G . F O R u s i n g t h e p u l s e fi l e l i s t e d i n T a b l e 4 . 3 ( L I P A l o n e e n z y m e c a s e ) . B e c a u s e u s e o f H 1 0 2 t o o x i d i z e d ' g n i n i s n e g l e c t e d i n t h e m o d e l , t h e o n l y c h a n g e s i n [ L i g n i n ] . o c c u r b e c a u s e o f d i l u t i o n d u e t o p u l s e s . 1 5 3 F i g u r e s 5 . 2 8 a n d 5 . 2 9 d e p i c t t h e H 2 0 2 a n d V A c o n c e n t r a t i o n p r o fi l e s i n S i d e A ( r e s e r v o i r ) . T h e s h a r p i n c r e a s e s i n e a c h c o r r e s p o n d t o a d d i t i o n s o f e a c h r e s p e c t i v e r e a g e n t t o S i d e A , w h i l e t h e s m a l l d r o p s i n V A c o n c e n t r a t i o n a r e d u e t o d i l u t i o n ( a d d i t i o n o f H 2 0 , b u t n o t V A ) . F i n a l l y , F i g u r e 5 . 3 0 s h o w s t h e v a r i a t i o n o f t h e r a t e s o f s u p p l y a n d c o n s u m p t i o n o f H 2 0 2 a n d V A f o r S i d e B ( s o l i d l i n e i s V A t r a n s p o r t r a t e , d a s h e d l i n e s a r e V A c o n s u m p t i o n ( l a r g e + s m a l l d a s h e s ) , H 2 0 2 s u p p l y ( s m a l l d a s h e s ) a n d H 2 0 2 c o n s u m p t i o n ( l a r g e d a s h e s ) ) . T h e s u p p l y r a t e o f H 2 0 2 a n d t h e c o n s u m p t i o n r a t e s o f b o t h H 2 0 2 a n d V A a r e p r a c t i c a l l y i d e n t i c a l , w h i c h i s w h y t h e y a r e d i f fi c u l t t o t e l l a p a r t i n F i g u r e 5 . 3 0 . T h i s b e h a v i o r o c c u r s b e c a u s e o f t h e f o l l o w i n g : S i n c e H 2 0 2 i s i n m u c h l o w e r c o n c e n t r a t i o n t h a n V A , i t l i m i t s t h e c o n s u m p t i o n r a t e s o f b o t h ( 1 : 1 s t o i c h i o m e t r y ) ; h o w e v e r , t h e H 2 0 2 s u p p l y r a t e i s u s e d t o a d j u s t t h e H 2 0 2 c o n s u m p t i o n r a t e . T h e n e t r e s u l t i s t h e k e y t o h o w t h i s c o n t r o l m e t h o d w o r k s - - b y m a k i n g s u r e t h a t t h e s u p p l y a n d c o n s u m p t i o n r a t e s o f H 2 0 2 a n d V A d o n o t d e v i a t e v e r y f a r f r o m o n e a n o t h e r . 5 . 9 . 2 M N P O n l y T h e H 2 0 2 c o n c e n t r a t i o n p r o fi l e f o r S i d e B i s s h o w n i n F i g u r e 5 . 3 1 ; r e f e r t o T a b l e 4 . 4 f o r t h e p u l s e p r o fi l e s f o r S i d e s A a n d B . T h e d a s h e d l i n e s i n F i g u r e 5 . 3 1 a g a i n r e p r e s e n t t h e m i n i m u m a n d m a x i m u m c o n c e n t r a t i o n s s p e c i fi e d b y O l s e n e r a l . ( 1 9 9 1 ) , a n d t h e c u r v e i s t h e c o n c e n t r a t i o n o f H 2 0 , i n S i d e B . T h e s u d d e n s h a r p i n c r e a s e s i n H 2 0 2 c o n c e n t r a t i o n i n F i g u r e 5 . 3 1 a r e d u e t o a d d i t i o n s o f I - I , O 2 t o S i d e A ( u p w a r d a d j u s t m e n t o f t r a n s p o r t r a t e o f H 2 0 2 t o S i d e B ) . T h e v a r i a t i o n s i n H 2 0 2 c o n c e n t r a t i o n a r e l a r g e r f o r t h i s c a s e , w i t h t h e a v e r a g e c o n c e n t r a t i o n a t a b o u t 4 0 u M . T h e c o n c e n t r a t i o n p r o fi l e s f o r M n s p e c i e s i n S i d e s A a n d B a r e s h o w n i n F i g u r e s 5 . 3 2 a a n d 5 . 3 2 b , r e s p e c t i v e l y . N o t e t h a t n o M n w a s i n i t i a l l y a d d e d t o S i d e A - - b o t h [ M n ( I I I ) - t a r t z ] ( s o l i d c u r v e ) a n d M n ( I I ) ( d a s h e d c u r v e ) i n c r e a s e d i n S i d e A o v e r t i m e f r o m z e r o t o a b o u t 2 8 1 4 M a n d 2 u M , r e s p e c t i v e l y , w h i c h i s c o n s i s t e n t w i t h t h i s f a c t . M n ( I I ) c o n c e n t r a t i o n i n S i d e B i s r e l a t i v e l y c o n s t a n t a t a b o u t 2 - 3 u M , w h i l e [ M n ( I I I ) - t a m ] d r o p s f r o m t h e i n i t i a l v a l u e o f 1 0 0 u M t o a b o u t 6 5 u M o v e r 1 2 h o u r s . I M m I e d i x r o o o r e P A e n 9 d i S 0 2 4 6 e t i m l h r I 8 1 O 1 2 I M m I A V A e d i S F R i K g u G r . e F 2 5 . R O 9 t : o P l n o e t c o s f s e a r ' [ y ] V t A o A m w i i n t t h a a b e t i 0 m 1 e 2 I ( , L ] . 0 i n P a A d n l o W e n M m i e n e t a h s e e ) d e s i p i r r e e d d c r t a e n d g b e s . y m t h 1 5 4 o r 9 p 9 d ‘ ? F i g u r e 5 . 2 8 : P l o t o f [ H , O fl A w i t h t i m e ( L I P A l o n e e n z y m e c a s e ) p r e d i c t e d b y R K G . F O R t o b e n e c e s s a r y t o m a i n t a i n [ H 2 0 2 ] . a n d { V A } . w r t h i n t h e d e s i r e d r a n g e s . 6 0 . - 3 0 ‘ - O 2 4 6 8 1 O 1 2 t i m e ( h r l o 0 Q I M m I e d Q D D ) i o o > t > x o r e P 8 e d i S F i n g e fi u s r l e e r n 5 i r l d . s e 3 t a 1 e t d : e H T [ e a 2 a b 0 l l 2 l e ] o . w 4 e a 4 . v d r r i ( a a t M n i N g o e n P o i t n h w A f i l [ t o 1 h n 1 t 2 i e 1 e 0 2 m 3 e . n z p y r m d e e i c c a t s e e d ) . b y R h K e T G u . p F e p O r R a s u d i l n o n h t e r e d § v u h l e s e d a g 1 5 5 2 0 - * 1 7 . 5 - 1 5 1 i : 2 . \ E 1 2 . 5 ~ - . 3 O E 1 0 q - - - - - - - H 2 0 2 T r a n s p o r t R a t e 7 . 5 . , V A T r a n s p a r t R a t e - - - H 2 0 2 C o n s u m p t i o n R a t s - . - - V A C o n s u m p t i o n R a t e 5 . = . r ' ' 0 2 4 5 3 ' 0 1 2 t i m e i h r i F i g u r e 5 . 3 0 : V a r i a t i o n o f t h e t r a n s p o r t a n d c o n s u m p t i o n r a t e s o f H 2 0 2 a n d V A i n S i d e B ( L I P A l o n e e n z y m e c a s e ) . T h e l i n e t t a p e f o r e a c h i s l i s t e d i n t h e l e g e n d b o x . T h e g a s e s a r e m a i n t a i n e d c l o s e l y t o o n e a n o e r t o a t t e n u a t e t h e l e v e l s o f H 2 0 , a n d V A i n i e B . ’ 8 ’ o o I ? t c - — - = : t ( t i m e ( h r ) 0 2 4 6 e t i m I h r I 8 1 0 1 2 I M m I n o o M 8 e d i S 1 5 6 ( a . ) 0 . 0 3 - 0 . 0 2 5 - S i d e A M n I m M I o - o S b e ' 2 ’ 0 . 0 1 - - 0 . 0 0 5 - t i m e I h r i F i g u r e 5 . 3 2 : . V a r i a t i o n o f M n s p e c i e s w i t h t i m e p r e d i c t e d b y R K G . F O R u s i n g t h e p u l s e p r o fi l e l r s t e d m T a b l e 4 . 4 . ( M N P A l o n e e n z y m e c a s e ) . ( a . ) [ M n ( I I ) ] A ( d a s h e d c u r v e ) a n d [ M n ( I I I ) - t a m ] A ( s o h d c u r v e ) , a n d ( b . ) [ M n ( I I ) ] . ( d a s h e d c u r v e ) a n d [ M n ( I I I ) - t a m ] , ( s o l r d c u r v e ) . 1 5 7 T h e M N P a c t i v i t y p r o fi l e i n S i d e B i s s h o w n i n F i g u r e 5 . 3 3 ; a c t i v i t y i s m a i n t a i n e d n e a r t h e i n i t i a l v a l u e o f 5 6 0 0 0 U / L f o r t h e e n t i r e c o u r s e o f t h e r u n a s f o r L I P a b o v e . T h e v a r i a t i o n o f t h e c o n c e n t r a t i o n o f l i g n i n b o n d s i n S i d e B i s s h o w n i n F i g u r e 5 . 3 4 . T h e s h a r p d r o p s i n t h e o t h e r w i s e s m o o t h d e c l i n e i n l i g n i n b o n d c o n c e n t r a t i o n ( d u e t o o x i d a t i o n b y [ M n ( I I I ) - t a n g ) a r e d u e t o d i l u t i o n w h e n M N P i s a d d e d t o S i d e B . F i g u r e 5 . 3 5 s h o w s t h e H 2 0 2 c o n c e n t r a t i o n p r o fi l e i n S i d e A ( r e s e r v o i r ) . T h e s h a r p i n c r e a s e s a g a i n c o r r e s p o n d t o a d d i t i o n s o f H 2 0 2 . F i n a l l y , F i g u r e 5 . 3 6 s h o w s t h e v a r i a t i o n o f t h e r a t e s o f s u p p l y a n d c o n s u m p t i o n o f H 2 0 2 i n S i d e B ( s o l i d l i n e i s c o n s u m p t i o n r a t e , d a s h e d l i n e i s s u p p l y r a t e ) . F i g u r e 5 . 3 6 a g a i n s h o w s h o w t h e c o n t r o l m e t h o d f o r t h i s c a s e w o r k s - b y m a k i n g s u r e t h a t t h e s u p p l y a n d c o n s u m p t i o n r a t e s o f H 2 0 2 a r e m a i n t a i n e d c l o s e t o o n e a n o t h e r . 5 . 9 . 3 L I P + M N P T h e H 2 0 2 a n d V A c o n c e n t r a t i o n p r o fi l e s f o r S i d e B a r e s h o w n i n F i g u r e s 5 . 3 7 a n d 5 . 3 8 ; r e f e r t o T a b l e 4 . 5 f o r t h e p u l s e p r o fi l e s f o r S i d e s A a n d B . T h e s e fi g u r e s a r e a n a l o g o u s t o F i g u r e s 5 . 2 4 a n d 5 . 2 5 f o r t h e L I P a l o n e c a s e a b o v e . T h e a v e r a g e H 2 0 2 a n d V A c o n c e n t r a t i o n s a r e a b o u t 8 ” M a n d 3 4 0 ” M , r e s p e c t i v e l y , n e g l e c t i n g t h e s p i k e i n H 2 0 2 c o n c e n t r a t i o n a t a b o u t 1 1 h o u r s . T h i s s p i k e w a s u n a v o i d a b l e a n d a p p e a r e d t o b e a c u m u l a t i v e e f f e c t d u e t o t h e a d j u s t m e n t o f L I P a n d M N P a c t i v i t i e s a t t h e s a m e t i m e ; s i n c e t h e H 2 0 2 c o n c e n t r a t i o n s t a y e d w i t h i n t h e b o u n d s s e t b y O l s e n e t a l . ( 1 9 9 1 ) , t h e I H 2 0 2 s p i k e w a s i g n o r e d . T h e c o n c e n t r a t i o n p r o fi l e s f o r M n s p e c i e s i n S i d e s A a n d B a r e s h o w n i n F i g u r e s 5 . 3 9 8 a n d 5 . 3 % , r e s p e c t i v e l y . A g a i n , n o t e t h a t n o M n w a s i n i t i a l l y a d d e d t o S i d e A - - b o t h [ M n ( I I I ) - t a m ] ( s o l i d l i n e ) a n d M n ( I I ) ( d a s h e d l i n e ) i n c r e a s e d o v e r t i m e t o a b o u t 2 5 u M a n d 2 F M , r e s p e c t i v e l y . M n ( I I ) c o n c e n t r a t i o n i n S i d e B i s r e l a t i v e l y c o n s t a n t a t a b o u t 1 - 2 u M , w h i l e [ M n ( I I I ) - t a m ] d r o p s t o a b o u t 6 0 8 M o v e r 1 2 h o u r s . T h e s e fi g u r e s a r e a n a l o g o u s t o F i g u r e s 5 . 3 2 a a n d 5 . 3 2 b f o r M N P a l o n e ( a b o v e ) . T h e S i d e B L I P a c t i v i t y p r o fi l e i s s h o w n i n F i g u r e 5 . 4 0 ; a c t i v i t y i s m a i n t a i n e d n e a r t h e i n i t i a l v a l u e o f 1 0 0 0 U / L f o r t h e e n t i r e c o u r s e o f t h e r u n . T i r e M N P a c t i v i t y 0 2 4 6 8 1 0 1 2 F p i r g o u fi r l e e 5 l i . s 3 t 3 e : d N § I a r - 9 o s ? _ N a M m I n i n g i L B e d i S 0 F i g u r e 5 . 3 4 [ M T a N b n P l J e B 4 . a v 4 r ( i a M n i t N o P w l t i o h n e A t i e m n e z e d p m r e y i c c a s t e e ) d . b y R K G . F O R u s i n g t h e p u l s e 2 4 t i m [ L i g n i n ] , v a r i a t i o n w i t h t i m e 6 e ( p 8 1 0 1 2 h r ) r e d i c t e d b y R K G . F O R u s i n g t h e p u l s e i : 1 5 8 t i m e l h r l ( : 3 9 a . 9 m i c l i s t e d i n T a b l e 4 . 4 ( M N P A l o n e e n z y m e c a s e ) . C h a n g e s i n [ L i g n i n ] , o c c u r u s e o f b o t h o x i d a t i o n b y [ M n ( I I I ) - t a n g a n d b y d i l u t i o n d u e t o p u l s e s . I M m l e d i x D o C r e P A : e a d i S 0 2 4 6 e t i m I h r i 8 1 O 1 2 i h m l l o m u l 0 M 1 5 9 _ s 0 " i . . s N i F i g u r e 5 . 3 5 : P l o t o f [ 1 1 , 0 2 ] , w i t h t i m e ( M N P A l o n e e n z y m e e a s e ) p r e d i c t e d b y R K G . F O R t o b e n e c e s s a r y t o m a i n t a i n [ H , O J B t h e d e s i r e d r a n g e . - - - - - - H 2 0 2 S u p p l y R a t . H 2 0 2 C o n s u m p t i o n R a t e t i m e I h r i F i g u r e 5 . 3 6 : V a r i a t i o n o f t h e t r a n s p o r t a n d c o n s u m p t i o n r a t e s o f H 2 0 , i n S i d e B ( M N P A l o n e e n z y m e c a s e ) . T h e l i n e t y p e f o r e a c h i s l i s t e d i n t h e l e g e n d b o x . T h e r a t e s a r e m a i n t a i n e d c l o s e l y t o o n e a n o t h e r t o a t t e n u a t e t h e l e v e l s o f I 1 2 0 2 m S i d e B . . S o o 9 » o o q - D . 0 o s S i d e 8 P e r o x i d e I m M I t i m e l h r l F i g u r e 5 . 3 7 : [ H 2 0 2 ] . v a r i a t i o n w i t h t i m e p r e d i c t e d b y R K G . F O R u s i n g t h e p u l s e p r o fi l e l i s t e d i n T a b l e 4 . 5 ( L I P + M N P e n z y m e e a s e ) . T h e u p p e r a n d l o w e r d a s h e d l i n e s i n d i e a t e t h e a l l o w e d r a n g e o f [ 1 1 2 0 2 ] . . . 0 . . . 0 . 4 E . 5 . g 0 . 3 a : 6 a 0 . 2 4 " 0 . 1 2 1 b O ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 1 ‘ - - - - - r ‘ — ‘ — ‘ _ “ . ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 4 : 0 2 4 6 8 1 0 1 2 t i m e I h r I F i g u r e 5 . 3 8 : [ V A ] . v a r i a t i o n w i t h t i m e p r e d i c t e d b a R K G F O R u s i n g t h e p u l s e r o fi l e l i s t e d i n T a b l e 4 . 5 ( L I P + M N P e n z y m e e a s e ) . e u p p e r a n d l o w e r d a s h l i n e s i n d i e a t e t h e a l l o w e d r a n g e o f [ V A ] , , . 0 - 0 ( 1 ) . ) 0 0 % : 1 “ E 6 £ 1 g 0 . 1 m 0 . 0 ) 1 . . 2 0 0 2 4 6 e t i m ( h r ) 8 1 0 1 2 K . - 0 . 0 0 0 . . . . r O O O O O O O 0 . 0 . 1 . 0 0 0 . . . c 2 4 o t o - ‘ 0 0 6 e i m l h . r i . . c o c o - 0 " 0 0 . . . . . . 0 1 8 : 1 . 0 - I - I I I J J _ " 0 1 2 1 6 1 ( a . ) S i d e A M n I m M I F i g u r e 5 . 3 9 : V a r i a t i o n o f M n s p e c i e s w i t h t i m e p r e d i c t e d b y R K G . F O R u s i n g t h e p u l s e p r o fi l e l i s t e d i n T a b l e 4 . 5 ( L I P + M N P e n z y m e c a s e ) . ( a . ) [ M n ( I I ) ] A ( d a s h e d c u r v e ) a n d [ M n ( I I I ) - t a m ] A ( s o l i d c u r v e ) , a n d ( b . ) [ M n ( I I ) ] . ( d a s h e d c u r v e ) a n d [ M n ( I I I ) - t a m ] , ( s o l i d c u r v e ) . 0 2 4 6 e t i m I h r i 8 1 0 1 2 I L I U I P I L I L I U I P N M 1 6 2 1 2 0 1 0 0 8 0 0 " 6 0 0 - - 4 0 0 " 2 0 0 ' ' r e 5 . 4 0 : [ L I P ] , v a r i a t i o n w i t h t i m e p r e d i c t e d b y R K G . F O R u s i n g t h e p u l s e p r o fi l e l i s t e d i n T a b l e 4 . 5 ( L I P + M N P e n z y m e e a s e ) . T h e s u d d e n s h a r p d r o p s a r e d u e t o M N P a d d i t i o n w i t h o u t a d d i n g L I P . 6 0 0 0 6 " 4 0 0 0 6 ' 3 0 0 0 6 - 2 0 0 0 6 - 1 0 0 0 6 ' - 0 2 4 6 8 1 0 1 2 t i m e l h r I F i g u r e 5 . 4 1 : . T o t a l [ M N P ] . v a r i a t i o n w i t h t i m e p r e d i c t e d b y R K G . F O R u s i n g t h e p u l s e p r o fi l e l r s t e d m . T a b l e 4 . 5 ( L I P + M N P e n z y m e c a s e ) . T h e s u d d e n s h a r p d r o p s a r e d u e t o L I P a d d r t i o n w i t h o u t a d d i n g s u b s t a n t r a l a m o u n t s o f M N P ( s m a l l a m o u n t s o f M N P , a r e a d d e d ) . 1 6 3 p r o fi l e i n S i d e B i s s h o w n i n F i g u r e 5 . 4 1 ; a c t i v i t y i s m a i n t a i n e d n e a r t h e i n i t i a l v a l u e o f 5 6 0 0 0 U / L f o r t h e e n t i r e c o u r s e o f t h e r u n a s f o r L I P a b o v e . F o r b o t h e n z y m e s , t h e v e r y s m a l l s h a r p d r o p s i n c o n c e n t r a t i o n a r e d u e s i m p l y t o d i l u t i o n w h e n o n e e n z y m e i s a d d e d b u t n o t t h e o t h e r . T h e v a r i a t i o n o f t h e c o n c e n t r a t i o n o f l i g n i n b o n d s i n S i d e B i s s h o w n i n F i g u r e 5 . 4 2 ; a s a b o v e , t h e s h a r p d r o p s i n t h e o t h e r w i s e s m o o t h d e c l i n e i n l i g n i n b o n d c o n c e n t r a t i o n ( d u e t o o x i d a t i o n b y [ M n ( I I I ) - t a n g ) a r e d u e t o d i l u t i o n w h e n L I P a n d / o r M N P a r e a d d e d t o S i d e B . F i g u r e s 5 . 4 3 a n d 5 . 4 4 d e p i c t t h e H 2 0 2 a n d V A c o n c e n t r a t i o n p r o fi l e s i n S i d e A ( r e s e r v o i r ) . T h e s h a r p i n c r e a s e s i n e a c h a g a i n c o r r e s p o n d t o a d d i t i o n s o f e a c h r e s p e c t i v e r e a g e n t t o S i d e A , w h i l e t h e s m a l l d r o p s i n V A c o n c e n t r a t i o n a r e d u e t o d i l u t i o n ( a d d i t i o n o f H 2 0 2 b u t n o t V A ) . F i n a l l y , F i g u r e 5 . 4 5 s h o w s t h e v a r i a t i o n o f t h e r a t e s o f s u p p l y a n d c o n s u m p t i o n o f H 2 0 2 a n d V A f o r S i d e B ( s o l i d l i n e i s V A t r a n s p o r t r a t e , d a s h e d l i n e s a r e V A c o n s u m p t i o n ( l a r g e + s m a l l d a s h e s ) , H 2 0 2 s u p p l y ( s m a l l d a s h e s ) a n d H 2 0 2 c o n s u m p t i o n ( l a r g e d a s h e s ) ) . T h e s u p p l y a n d c o n s u m p t i o n r a t e s o f H 2 0 2 a r e h i g h e r t h a n t h o s e f o r V A b e c a u s e t h e r e i s a n a d d i t i o n a l c o n s u m p t i o n o f H 2 0 2 b y M N P ; h o w e v e r , t h e c o n s u m p t i o n r a t e o f V A i s a t a l l t i m e s p a r a l l e l t o t h a t f o r H 2 0 2 , i n d i c a t i n g t h a t H 2 0 2 i s s t i l l b e i n g u s e d t o c o n t r o l t h e r a t e s o f s u p p l y a n d c o n s u m p t i o n a n d t h u s t h e c o n c e n t r a t i o n s i n S i d e B . H 2 0 , s u p p l y a n d c o n s u m p t i o n r a t e s a r e a g a i n i d e n t i c a l , a n d t h u s t h e y a r e d i f fi c u l t t o t e l l a p a r t i n F i g u r e 5 . 4 5 . I n a n y c a s e , t h e n e t r e s u l t i s t h a t t h e c o n t r o l m e t h o d w o r k s b y m a k i n g t h e s u p p l y a n d c o n s u m p t i o n r a t e s o f H 2 0 2 a n d V A v a r y p r o p o r t i o n a t e l y . 5 . 1 0 D i a l y s i s R e a c t o r M o d e l - P e r t u r b a t i o n A n a l y s e s S i n c e t h e m o d e l w a s n o t t e s t e d b y r u n n i n g t h e r e a c t o r a n d m e a s u r i n g c o n c e n t r a t i o n - t i m e p r o fi l e s f o r e a c h s p e c i e s d u e t o t h e l a r g e a m o u n t s o f e n z y m e s w h i c h w o u l d b e r e q u i r e d ( o n e c o m p l e t e r e a c t o r r u n f o r e a c h t i m e p o i n t ) , i t w a s d e c i d e d t h a t t h e m o d e l s o l u t i o n s w o u l d b e t e s t e d f o r s t a b i l i t y b y s e t t i n g t h e m o d e l p a r a m e t e r s ( o n e a t a t i m e ) e q u a l t o t h e u p p e r a n d l o w e r b o u n d s o f t h e i r c o n fi d e n c e i n t e r v a l s , r e s p e c t i v e l y . I M m I n i n g i L 8 e d i S 1 2 0 . . K n o 9 9 1 9 0 h 9 l l i m ( e d i x r o o o r e P A e d i S F R i K g u G r . e F 5 O . R 4 3 : t o l P e o n t e o e f s s c [ a , H r y b O t J o A m a w i i n t t h a t n i i m [ e H 2 ( 0 L 2 I ] P , + n a d M [ N V P ] A , e n i w z t y h m i e n c h s a e t e d ) e r r e e d d i c r t a e n d g b e s . y s ? 1 6 4 ' 6 ’ d 0 ’ 9 4 : 0 2 4 6 8 1 0 1 2 t i m e I h r ) F i g u r e 5 . 4 2 : [ L i g n i n ] ; v a r i a t i o n w i t h t i m e p r e d i c t e d b y R K G . F O R u s i n g t h e p u l s e p r o fi l e l i s t e d i n T a b l e 4 . 5 ( L I P + M N P e n z y m e c a s e ) . C h a n g e s i n [ L i g n i n ] , o c c u r b e c a u s e o f b o t h o x i d a t i o n b y [ M n ( I I I ) - t a m ] a n d b y d i l u t i o n d u e t o p u l s e s . 2 0 e r - 1 0 ‘ 1 - 0 I L I * I I I I 0 2 4 6 8 1 O 1 2 t i m e I h r I 6 $ I M m I A V A e d i S , m 1 . 1 e t a R 1 6 5 6 0 - 3 0 1 - 0 : : . . . 4 . O 2 4 6 8 1 0 1 2 t i m e I h r i F i g u r e 5 . 4 4 : P l o t o f [ V A ] A w i t h t i m e ( L I P + M N P e n z y m e e a s e ) p r e d i c t e d b y R K G . F O R t o b e n e c e s s a r y t o m a i n t a i n [ H 2 0 2 ] . a n d [ V A ] , w i t h i n t h e d e s r r e d r a n g e s . 2 0 - 1 - - - - - - H 2 0 2 T r a n s p o r t R a t e V A T r e n s p o r t R m 1 7 . 5 - [ - — - - H 2 0 2 ¢ o n s m n o t i o n fl a t e - - - - V A C o n s u m p t i o n fl a t e t i m e i h r l F i g u r e 5 . 4 5 : V a r i a t i o n o f t h e t r a n s p o r t a n d c o n s u m p t i o n r a t e s o f H , a n d V A i n S i d e B ( L I P + M N P e n z y m e e a s e ) . T h e l i n e t y p e f o r e a c h i s l i s t e d i n t h e e g e n d b o x . T h e r a t e s o f H 2 0 , s u p p l a n d c o n s u m p t i o n a r e a b o v e t h o s e f o r V A d u e t o t h e a d d i t i o n a l c o n s u m p t i o n o f H 2 3 ; b y M N P . T h e r a t e s a r e m a i n t a i n e d c l o s e l y t o o n e a n o t h e r t o a t t e n u a t e t h e l e v e l s o f H 2 0 2 a n d V A i n S i d e B . 1 6 6 T h e R K G . F O R p u l s e p r o fi l e r e s u l t s f o r e a c h e n z y m e c a s e w e r e u s e d w i t h t h e p r o g r a m P E R T U R B . F O R , a n d w i t h t h e u p p e r a n d l o w e r b o u n d s o f t h e 9 5 % C o n fi d e n c e I n t e r v a l s f o r e a c h m o d e l p a r a m e t e r , t o d e t e r m i n e w h i c h p a r a m e t e r s w e r e m o s t l i k e l y t o c a u s e t h e m o d e l ’ s p r e d i c t i o n s f o r H 2 0 2 a n d V A c o n c e n t r a t i o n s t o e x c w d t h e l i m i t s s e t f o r t h b y O l s e n e t a l . ( 1 9 9 1 ) . T h e s e s t u d i e s a r e p r e s e n t e d b e l o w . 5 . 1 0 . 1 C o n f i d e n c e I n t e r v a l s o n M o d e l P a r a m e t e r s T h e c o n fi d e n c e i n t e r v a l s o n e a c h r e a c t o r p a r a m e t e r a n d m e a s u r e d c o n s t a n t w e r e d e t e r m i n e d a s d e s c r i b e d i n C h a p t e r I V . T h e r e s u l t s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 5 . 4 ; T a b l e 5 . 4 m a y a l s o b e u s e d h e r e a s a s u m m a r y o f m o d e l c o n s t a n t s , s i n c e a l l a r e l i s t e d t o g e t h e r t h e r e . M a n y o f t h e c o n fi d e n c e i n t e r v a l s w e r e p l u s / m i n u s l e s s t h a n 5 9 6 o f t h e v a l u e o f t h e c o n s t a n t ; h o w e v e r , s o m e w e r e m u c h h i g h e r . T h e c o n fi d e n c e i n t e r v a l s ( C I ) f o r t h e L I P a n d M N P k i n e t i c c o n s t a n t s w e r e t h e l a r g e s t , s i n c e t h e y w e r e c a l c u l a t e d f r o m r e c i p r o c a l s o f s l o p e s a n d i n t e r c e p t s c a l c u l a t e d b y l i n e a r r e g r e s s i o n ( t h i s i s a l s o w h y t h e y a r e n o t c e n t e r e d o n t h e v a l u e o f t h e c o n s t a n t , b u t a r e s k e w e d ) . T h e l a r g e s t C I w a s t h a t f o r K , , a t i 8 7 % . T h e C 1 s f o r k m , a t i 2 3 % , a n d k w , a t + 3 3 % , - 1 7 % , w e r e a l s o q u i t e l a r g e , r e fl e c t i n g t h e l a r g e r a m o u n t o f s c a t t e r i n t h e o r i g i n a l d a t a u s e d i n d e t e r m i n i n g e a c h c o n s t a n t . T h e r e s u l t s o f t h e p e r t u r b a t i o n s t u d i e s f o r e a c h c a s e a r e c o m b i n e d b e l o w , s i n c e t h e m o d e l p a r a m e t e r s a f f e c t e d a l l t h r e e c a s e s i n t h e s a m e w a y s . 5 . 1 0 . 2 P e r t u r b a t i o n A n a l y s e s T h e r e s u l t s o f t h e p e r t u r b a t i o n a n a l y s e s a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 5 . 5 f o r L I P a l o n e , i n T a b l e 5 . 6 f o r L I P + M N P , a n d i n T a b l e 5 . 7 f o r M N P a l o n e . T h e c a s e i n e a c h l i s t e d a s ” b a s e “ i s t h e c a s e i n w h i c h t h e p a r a m e t e r s w e r e u s e d a s m e a s u r e d ( n o p e r t u r b a t i o n ) . V a l u e s p r e s e n t e d a r e t h e m a x i m u m a n d m i n i m u m c o n c e n t r a t i o n s o f [ H , O Z L , a n d [ V A ] B r e a c h e d o v e r t h e c o u r s e o f t h e p e r t u r b a t i o n r u n ( t > 0 ) , u s i n g fi r s t t h e l o w e r e n d o f t h e 9 5 % c o n fi d e n c e i n t e r v a l o f e a c h m o d e l p a r a m e t e r , a n d t h e n t h e h i g h e r e n d , i n s t e a d o f t h e m e a s u r e d m o d e l p a r a m e t e r . S i n c e t h e v a l u e s o f k . a n d D 4 f o r [ M n ( I I I ) - t a m ] w e r e a s s u m e d , i t w a s n o t p o s s i b l e t o d e t e r m i n e 9 5 % c o n fi d e n c e i n t e r v a l s f o r t h e m . T h u s , 1 6 7 T a b l e 5 . 4 : M e a s u r e d v a l u e s o f t h e p h y s i e a l p a r a m e t e r s e x p e r i m e n t a l l y d e t e r m i n e d f o r u s e i n t h e r e a c t o r m o d e l R K G . F O R a n d t h e i r 9 5 9 6 C o n fi d e n c e I n t e r v a l s ( l i s t e d a s : 1 : p e r c e n t a g e s o f t h e i r v a l u e s ) . 9 5 V . 0 . 1 . P a r a m e t e r U n i t s V a l u e - % + % I ) " r ( 1 1 2 0 , ) c m ’ l m i n 1 . 7 0 0 6 0 4 3 . 5 3 3 . 5 3 1 3 ° ( V A ) c m ’ l m i n 4 . 4 9 4 6 - 0 5 2 . 9 8 2 . 9 8 D " ( M n ( I I ) ) c m ’ l m i n 1 3 1 9 6 - 0 4 3 . 7 9 3 . 7 9 6 . m M 6 0 0 . 0 3 3 . 2 0 1 6 . 3 3 8 2 ‘ m M 1 8 0 7 . 7 3 . 1 3 3 . 1 3 k . [ m i n ( U / L ) ] " 2 . 1 4 7 6 - 0 2 1 5 . 2 8 2 1 . 9 8 k g [ m i n ( U / L ) ] " 8 . 1 0 1 6 0 3 8 . 6 3 1 7 . 7 1 1 : . m M I m i n ( U / L ) ] ' 1 . 2 4 6 6 - 0 3 5 . 7 8 5 . 7 8 K , m M 4 . 9 1 8 8 7 . 0 1 8 7 . 0 1 k , . [ m i n ( U / L ) ] " 6 5 6 6 6 - 0 3 2 0 . 8 2 3 5 . 6 8 1 : . . . [ u r i n a l / L N “ 5 . 0 8 9 6 - 0 3 9 . 9 0 1 2 . 3 6 W . - 2 9 8 3 . 2 2 8 . 2 5 2 8 . 2 5 W e - 2 3 3 6 . 8 4 3 . 8 5 4 3 . 8 5 k m ( U l L ) h r " 1 9 . 1 6 1 7 . 2 2 3 2 . 9 3 k m h r " 1 8 6 7 6 - 0 2 7 . 2 8 7 . 2 8 k m . h r " 5 . 1 6 8 6 0 3 5 . 6 5 5 . 6 5 1 6 » h r " 2 . 5 3 5 6 - 0 2 2 3 . 0 4 2 3 . 0 4 A c r n ’ 0 . 2 2 0 6 2 . 5 8 2 . 5 8 1 c m 6 1 3 6 6 - 0 3 5 . 3 9 5 . 3 9 L I P : v . . e m ’ 1 . 0 0 1 . 3 3 1 . 3 3 v . . . c m ’ 1 . 0 0 1 . 5 2 1 . 5 2 M N P : V . . . c m ’ 1 . 0 0 1 . 2 3 1 . 2 3 V . . . c m ’ 1 . 0 0 1 . 6 7 1 . 6 7 L I P + M N P : v . . . c m ’ 1 . 0 0 1 . 2 5 1 . 2 5 v . . . e m ’ 1 . 0 0 1 . 5 1 1 . 5 1 ‘ a ; " a " 1 6 8 T a b l e 5 . 5 : M a x i m u m a n d m i n i m u m c o n c e n t r a t i o n s o f H 2 0 2 a n d o f V A i n t h e L I P A l o n e e n z y m e c a s e p r e d i c t e d b y P E R T U R B . F O R t o b e r e a c h e d i n S i d e B w h e n e a c h p a r a m e t e r m e a s u r e d f o r t h e m o d e l ( fi r s t c o l u m n ) w a s u s e d a t t h e l o w e r ( l s t a n d 2 n d c o l u m n s u n d e r [ H 2 0 2 ] , a n d u n d e r [ V A ] , , ) a n d u r ( 3 r d a n d 4 t h c o l u m n s u n d e r [ 1 1 2 0 , ] . a n d u n d e r [ V A ] , , ) b o u n d s o f r t s 9 5 % C o n 1 d e n c e I n t e r v a l . T h e p u l s e p r o fi l e s u s e d w e r e t h o s e d e t e r m i n e d b y R K G . F O R w i t h t h e m e a s u r e d v a l u e s o f t h e p a r a m e t e r s . [ H z o z l e [ V A l e . 9 5 % c r + 9 5 % c 1 - 9 5 ° / . c r + 9 5 % C I P a r a m e t e r M a x . M i n . M a x . M i n . M a x . M i n . M a x . M i n . B a s e 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 a , 2 . 8 5 5 0 . 0 1 5 0 . 0 1 6 0 . 0 0 9 0 . 3 0 9 0 . 0 2 9 1 . 5 6 0 0 . 1 3 8 a , 0 . 0 7 6 0 . 0 0 9 0 . 0 2 2 0 . 0 0 9 0 . 5 4 5 0 . 0 3 6 0 . 6 3 0 0 . 0 6 1 A 0 . 8 1 2 0 . 0 0 9 0 . 0 2 4 0 . 0 0 9 0 . 5 1 3 0 . 0 3 0 1 . 5 7 8 0 . 0 5 8 1 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 1 . 6 0 2 0 . 0 0 9 2 . 7 9 0 0 . 0 6 0 0 . 4 6 9 0 . 0 2 9 v . . . 0 . 0 2 7 0 . 0 0 9 0 . 0 2 3 0 . 0 0 9 0 . 5 6 3 0 . 0 5 3 0 . 5 5 9 0 . 0 5 8 v . . . 0 . 0 2 2 0 . 0 0 9 0 . 0 3 6 0 . 0 0 9 0 . 6 0 1 0 . 0 6 2 0 . 5 3 3 0 . 0 4 4 D ‘ ( H . 0 , ) 0 . 0 1 5 0 . 0 0 9 0 . 6 3 9 0 . 0 1 0 1 . 3 3 4 0 . 2 3 2 0 . 3 2 6 0 . 0 3 1 D ° ( V A ) 1 . 4 6 5 0 . 0 1 0 0 . 0 1 6 0 0 0 9 0 . 3 3 5 0 . 0 3 0 2 . 3 3 1 0 . 2 0 2 D ‘ ( M n ( 1 1 ) ) 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 1 : . 0 . 0 2 8 0 . 0 1 1 0 . 0 2 2 0 . 0 0 8 0 . 5 6 4 0 . 0 5 9 0 . 5 5 9 0 . 0 5 2 k , 0 . 0 2 7 0 . 0 0 9 0 . 0 2 2 0 . 0 0 9 0 . 5 6 1 0 . 0 5 7 0 . 5 6 1 0 . 0 5 3 1 : . 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 0 2 4 0 . 0 0 9 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 0 . 5 6 1 0 . 0 5 5 K , 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 k , . 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 1 : . . . 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 v . 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 v . 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 k m 0 . 0 2 4 0 . 0 0 9 0 . 0 2 7 0 . 0 0 9 0 . 5 6 1 0 . 0 5 4 0 . 5 6 1 0 . 0 5 7 k m 0 . 0 2 4 0 . 0 0 9 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 5 6 1 0 . 0 5 5 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 k m . 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 k m 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 k . ( 1 0 ° / . ) 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 k . ( 5 0 ° / . ) 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 k . ( x 1 0 ) 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 k . ( x 1 0 ’ ) 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 D " ( W 1 1 1 ) - t a n z l ) 2 , = D ‘ “ ( M n ( 1 1 ) ) 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 = 5 0 ° / . 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 = x 5 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 0 2 5 0 . 0 0 9 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 0 . 5 6 1 0 . 0 5 6 p M T c u [ a o a 1 s m e m 2 N 1 b l r e l P u 0 a d 2 e n ] w 5 s e e t , . n e r z 6 r e a : u n y m m n t d e d h M e u o a e x u a e a r s n s c e d e m 1 i s r [ d 1 r e e d , t [ u p 0 e m f r r 2 V o . e m ] A d r , i ] a i , n c t n ) a e d t h e e n d b m d o d b i y m u b u o n n i y n d d R m P e l d e s K E u r o G R m ( . f T r c V t fi [ i F U o A O s s n t ] c R , 9 R e B c 5 , n o ) w t . l 9 i F r u a 6 t t n d O C a m n h i R ) o t o n n u s p t w fi h e a o m d p b e o s e e f n a e r u c s H 2 r ( e 3 e r a r 0 d I e s e u c d , n d h a t e a t v e a r n a d a d v t n l f 4 l o n i e . e s h d l u i V h w f h S t o T o A d e e c r e t o h n u ( l i B p e t w s m s a t h r h n e e a s e a L n n p m r e d I u o t l u l p e n P fi e a 2 d r l + n c s e e h d . r s 1 6 9 [ 1 1 2 0 ; ] . [ V A ] ; - 9 5 % C I + 9 5 % C I - 9 5 % C I + 9 5 % C I P a r a m e t e r M a x . M i n . M a x . M i n . M a x . M i n . M a x . M i n . 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( x 1 0 ) 1 2 . 3 7 0 . 0 2 8 0 . 0 0 8 0 . 0 0 1 0 . 0 7 3 0 . 0 2 7 3 6 . 0 6 1 . 2 6 9 k . ( x 1 0 ’ ) 1 3 . 9 2 0 . 0 3 8 0 . 0 1 0 0 . 0 0 1 0 . 0 6 1 0 . 0 2 7 4 6 . 0 6 1 . 3 1 1 D ‘ ( I M n ( m ) - W t a ] ) = - D “ ( M n ( I I ) ) 0 . 0 1 5 0 . 0 0 5 0 . 0 7 0 0 . 0 0 5 0 . 6 4 7 0 . 0 6 4 0 . 5 5 7 0 . 0 1 8 ' 5 0 % 0 . 0 1 4 0 . 0 0 5 0 . 8 5 8 0 . 0 0 6 1 . 9 2 6 0 . 0 7 0 0 . 5 2 3 0 . 0 1 7 - x 5 0 . 0 1 4 0 . 0 0 4 3 . 2 9 5 0 . 0 0 8 2 . 9 4 4 0 . 0 7 4 0 . 3 5 4 0 . 0 2 2 1 7 0 T a b l e 5 . 7 : M a x i m u m a n d m i n i m u m c o n c e n t r a t i o n s o f H 2 0 , a n d o f V A i n t h e M N P A l o n e e n z y m e c a s e p r e d i c t e d b y P E R T U R B . F O R t o b e r e a c h e d i n S i d e B w h e n e a c h p a r a m e t e r m e a s u r e d f o r t h e m o d e l ( fi r s t c o l u m n ) w a s u s e d a t t h e l o w e r ( l s t a n d 2 n d c o l u m n s u n d e r [ 1 1 , 0 1 ] . , a n d u n d e r [ V A ] , , ) a n d u p p e r ( 3 r d a n d 4 t h c o l u m n s u n d e r [ 1 1 2 0 , ] , a n d u n d e r [ V A ] , , ) b o u n d s o f i t s 9 5 % C o n fi d e n c e I n t e r v a l . T h e p u l s e p r o fi l e s u s e d w e r e t h o s e d e t e r m i n e d b y R K G . F O R w i t h t h e m e a s u r e d v a l u e s o f t h e p a r a m e t e r s . [ H z o z i s [ V 5 1 8 - 9 5 ' / 0 C I + 9 5 % C I - 9 5 % C I + 9 5 % C I P a r a m e t e r M a x . M i n . M a r e M i n . M a x . M i n . M a x . M i n B a s e 0 . 0 9 3 0 . 0 1 3 0 . 0 9 3 0 . 0 1 3 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 a . 0 . 0 9 3 0 . 0 1 3 0 . 0 9 3 0 . 0 1 3 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 a ; 0 . 0 9 3 0 . 0 1 3 0 . 0 9 3 0 . 0 1 3 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 A 0 . 0 8 4 l E - 0 4 0 . 2 0 6 0 . 0 4 4 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 1 0 . 3 5 0 0 . 0 8 2 0 . 0 7 6 l E - 0 4 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 v . . . 0 . 2 8 8 0 . 0 2 9 0 . 0 8 9 l E - 0 4 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 v . . . 0 . 0 9 3 l E - 0 4 0 . 1 2 1 0 . 0 1 4 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 1 3 " ( 1 1 2 0 1 ) 0 . 0 8 1 2 6 0 4 0 . 2 2 1 0 . 0 5 5 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 D ° ( V A ) 0 . 0 9 3 0 . 0 1 3 0 . 0 9 3 0 . 0 1 3 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 1 3 " ( M n ( I I ) ) 0 . 0 9 3 0 . 0 1 0 0 . 0 9 3 0 . 0 1 3 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 k . 0 . 0 9 3 0 . 0 1 3 0 . 0 9 3 0 . 0 1 3 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 1 : , 0 . 0 9 3 0 . 0 1 3 0 . 0 9 3 0 . 0 1 3 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 1 : . 0 . 0 9 3 0 . 0 1 3 0 . 0 9 3 0 . 0 1 3 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 K ; 0 . 0 9 3 0 . 0 1 3 0 . 0 9 3 0 . 0 1 3 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 k g . 0 . 0 9 3 0 . 0 1 3 0 . 0 9 3 0 . 0 1 3 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 1 6 . 0 . 0 9 3 0 . 0 1 3 0 . 0 9 3 0 . 0 1 3 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 v . 0 . 0 9 3 0 . 0 1 3 0 . 0 9 3 0 . 0 1 3 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 v » 0 . 0 8 8 1 1 5 - 0 4 0 . 2 5 2 0 . 0 3 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 k m 0 . 0 9 3 0 . 0 1 3 0 . 0 9 3 0 . 0 1 3 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 k w 0 . 0 9 3 0 . 0 1 3 0 . 0 9 3 0 . 0 1 3 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 1 : “ . 0 . 0 9 3 0 . 0 1 3 0 . 0 9 3 0 . 0 1 3 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 1 : . . . 0 . 0 9 3 0 . 0 0 2 0 . 0 9 3 0 . 0 1 3 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 k . ( 1 0 - / . ) 1 . 2 9 8 0 . 1 2 5 0 . 0 6 1 i l i - 0 4 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 k . ( 5 0 % ) 6 . 8 9 2 0 . 2 5 5 3 E - 0 4 1 6 0 4 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 1 : . ( x 1 0 ) 1 3 . 6 9 0 . 3 8 9 3 6 . 0 4 l E - 0 4 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 k . ( x 1 0 ’ ) 1 5 . 4 2 0 . 4 2 0 9 . 6 8 4 1 . 4 8 3 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 “ ( M n ( I I I ) - 1 8 n d ) : - D " ( M n ( n ) ) 0 . 0 9 3 1 E - 0 4 0 . 1 4 6 0 . 0 1 3 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 - 5 0 ° / . 0 . 0 9 2 l E - 0 4 0 . 9 8 9 0 . 0 1 8 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 - x 5 0 . 0 9 2 l E - 0 4 3 . 6 5 5 0 . 0 5 4 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 1 7 1 i n s t e a d o f u s i n g c o n fi d e n c e i n t e r v a l s f o r k 8 a n d D 4 f o r [ M n ( I I I ) - t a m ] , p e r t u r b a t i o n a n a l y s e s w e r e r u n a s f o l l o w s : ( 1 . ) k , a t : 1 ; 1 0 % , j ; 5 0 % , x 1 0 , a n d x 1 0 0 ; a n d ( 2 . ) D " f o r [ M n ( I I I ) - t a m ] a t : L - 5 0 % , x 5 , a n d t h e n a t : l ; t h e 9 5 % C o n fi d e n c e I n t e r v a l f o r D " f o r M n ( I I ) ( : 1 : 3 . 7 9 9 6 ) . C o m p a r i s o n o f t h e c o n c e n t r a t i o n v a l u e s l i s t e d i n T a b l e s 5 . 5 - 5 . 7 w i t h t h e c o n c e n t r a t i o n r a n g e l i m i t s f o r [ 1 1 2 0 2 ] ] , a n d [ V A ] B ( m i n i m u m o f 0 . 0 0 5 m M f o r b o t h H 2 0 2 a n d V A , m a x i m u m o f 0 . 1 m M f o r [ 1 1 2 0 2 ] , ” a n d m a x i m u m o f 0 . 6 m M f o r [ V A ] . . ) ( O l s e n e r a l . , 1 9 9 1 ) i n d i c a t e s t h e m o d e l p a r a m e t e r s w h i c h a r e m o s t l i k e l y t o c a u s e e r r o n e o u s m o d e l p r e d i c t i o n s b e c a u s e o f e r r o r s i n m e a s u r e m e n t . T h e m o d e l i s q u i t e s e n s i t i v e , i n g e n e r a l , t o t h e r e a c t o r d e s i g n p a r a m e t e r s A , l , a n d V 3 , , b u t i s o n l y s e n s i t i v e t o V A ‘ , i n t h e c a s e o f V A ; t h e v a l u e s o f A a n d l w e r e m e a s u r e d w i t h c a l i p e r s a n d w e r e t h u s a s a c c u r a t e a s p o s s i b l e , w h i l e v o l u m e s w e r e m e a s u r e d w i t h P i p e t m a n p i p e t s , a n d a r e t h u s l i m i t e d t o t h e a c c u r a c y o f t h e p i p e t s . B o t h o f t h e m e a s u r e d v a l u e s o f e f f e c t i v e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t s , a s w e l l a s t h e c o n s t a n t s f o r t h e V A d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t , w h e n v a r i e d a t t h e u p p e r a n d l o w e r b o u n d s o f t h e i r c o n fi d e n c e i n t e r v a l s , c a u s e t h e m o d e l p r e d i c t i o n s f o r o n e o r a n o t h e r c o m p o n e n t t o e x c e e d t h e s p e c i fi e d l i m i t s ; t h i s i s s u r p r i s i n g , s i n c e t h e c o n fi d e n c e i n t e r v a l s w e r e r e l a t i v e l y n a r r o w ( l a r g e s t a t d ; 3 . 8 9 6 ) . T h e m o d e l i s i n s e n s i t i v e t o a l l e n z y m e s t a b i l i t y p a r a m e t e r s , a s w e l l a s t o L I P k i n e t i c c o n s t a n t s , k , f o r b o t h M N P s , a n d I n ; e v e n t h e i 8 7 % c o n fi d e n c e i n t e r v a l f o r K I c a u s e d l i t t l e c h a n g e i n t h e m o d e l p r e d i c t i o n s . O f t h e k i n e t i c p a r a m e t e r s , o n l y ‘ 1 " , s e e m s t o h a v e m u c h o f a n e f f e c t o n m o d e l s t a b i l i t y , p r o b a b l y s i n c e t h e r e i s s o m u c h M N P . p r e s e n t i n t h e r u n s ( ‘ 1 ' , h a s l i t t l e e f f e c t s i n c e i t i s a m i n o r c o m p o n e n t ) . W h e n t h e e f f e c t i v e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t f o r [ M n ( I I I ) - t a m ] i s v a r i e d a t t h e l i m i t s f o r D " f o r M n ( I I ) , [ 1 1 2 0 2 ] B o n l y s l i g h t l y e x c e e d s t h e u p p e r l i m i t ; h o w e v e r , i f t h e a s s u m e d v a l u e f o r D 4 f o r [ M n ( I I I ) - t a m ] i s m u c h f a r t h e r t h a n t h a t f r o m i t s a s s u m e d v a l u e , l a r g e e r r o r s i n m o d e l p r e d i c t i o n s o c c u r . F i n a l l y , t h e m o d e l i s e x t r e m e l y s e n s i t i v e t o t h e v a l u e o f k g . E v e n j u s t a 1 0 % ‘ v a r i a t i o n i n k . c a u s e s [ 1 1 1 2 0 2 ] B t o e x c e e d i t s m a x i m u m v a l u e o f 0 . 1 m M b y n e a r l y 1 3 0 0 % . T h e c o n c l u s i o n f r o m t h i s e x e r c i s e i s t h a t t h e p a r a m e t e r s o v e r w h i c h 1 7 2 t h e r e c a n b e l i t t l e c o n t r o l i n t h e a c c u r a c y o f m e a s u r e m e n t c a u s e t h e g r e a t e s t v a r i a t i o n s i n t h e m o d e l p r e d i c t i o n s , w i t h t h e e x c e p t i o n o f t h e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t s . 5 . 1 1 T r e a t m e n t o f L i g n i n i n D i a l y s i s R e a c t o r B a s e c a s e s a n d c o n t r o l s w e r e r u n f o r e a c h e n z y m e m i x t u r e a s d e s c r i b e d i n C h a p t e r I V , u s i n g t h e p u l s e p r o fi l e s d e t e r m i n e d b y R K G . F O R ( l i s t e d i n C h a p t e r I V ) . T h e i n i t i a l c o n d i t i o n s ( c o n c e n t r a t i o n s , e t c . ) f o r e a c h r u n a r e l i s t e d i n T a b l e s 5 . 8 a a n d 5 . 8 b . R e f e r t o C h a p t e r I V f o r t h e d e fi n i t i o n s o f t h e a c r o n y m s u s e d f o r e a c h c a s e . T a b l e 5 . 9 l i s t s t h e i n i t i a l , fi n a l , a n d c o r r e c t e d fi n a l ( c o r r e c t e d f o r 9 5 % r e c o v e r y o f s o l i d s ) m a s s e s o f l i g n i n f o r e a c h r e a c t o r r u n . S i n c e n o e n z y m e a c t i v i t y ( a c t i v e e n z y m e p l u s a l l o f t h e r e q u i r e d r e a g e n t s ) w a s p r e s e n t i n a n y c o n t r o l w h i c h c o n t a i n e d l i g n i n , t h e e r r o r o f t h e l i g n i n r e c o v e r y f o r e a c h c a s e w a s c a l c u l a t e d a s t h e v a r i a n c e o f a l l c o n t r o l s c o m b i n e d ( a l l c a s e s ) ; t h e a v e r a g e c o r r e c t e d p e r c e n t r e c o v e r y o f l i g n i n f r o m t h e r e a c t o r c o n t r o l r u n s w a s f o u n d t o b e 9 9 . 5 % : 1 ; 6 . 2 % . T h e u n c e r t a i n t y i n d i c a t e d i s f o r 9 0 9 6 c o n fi d e n c e a s s u m i n g t h e d a t a a r e f r o m a N o r m a l D i s t r i b u t i o n . A 9 0 % c o n fi d e n c e l e v e l ( m e a n : 1 : 1 . 6 4 8 ) w a s u s e d b e c a u s e t h e i n t e r v a l e n c o m p a s s e s a l l b u t o n e d a t a p o i n t , t h a t f o r t h e M N P E ‘ c o n t r o l , w h i c h i s o n l y 0 . 2 % b e l o w t h e i n t e r v a l . C o m p a r i n g t h e b a s e c a s e r e c o v e r i e s f o r e a c h e n z y m e w i t h t h e a v e r a g e r e c o v e r y f o r t h e c o n t r o l s i n d i c a t e s t h a t t h e l i g n i n r e c o v e r y f r o m t h e L I P a l o n e r u n w a s n o t s t a t i s t i c a l l y d i f f e r e n t f r o m t h e c o n t r o l s , t h e M N P a l o n e r u n s l i g h t l y i n c r e a s e d t h e m a s s o f t h e l i g n i n , a n d t h e L I P + M N P r u n r e l e a s e d 1 0 . 3 % o f t h e l i g n i n . P h o t o g r a p h s o f t h e s o l i d l i g n i n w e r e t a k e n ( a f t e r e x t r a c t i o n f o r t h e G C / M S , b u t b e f o r e l y o p h i l i z a t i o n ) i n o r d e r t o c o m p a r e a p p e a r a n c e o f t h e b a s e c a s e ( B C ) l i g n i n w i t h t h a t o f i t s c o n t r o l s . T h e l i g n i n s a m p l e s f r o m t h e L I P a l o n e r u n s a r e s h o w n i n F i g u r e 5 . 4 6 ; s a m p l e s a r e , f r o m l e f t t o r i g h t : B a s e C a s e ( B C ) , N o r e a g e n t c o n t r o l ( R ' ) , N o L I P c o n t r o l ( B ) , A u t o c l a v e d L I P c o n t r o l ( A B ) , a n d N o L I P , N o r e a g e n t c o n t r o l ( E R ' ) . O n l y a s l i g h t c o l o r c h a n g e i s s e e n i n t h e B C v e r s u s t h e c o n t r o l s ( a l l c o n t r o l s a r e i d e n t i c a l ) , i f a n y , w h i c h i s c o n s i s t e n t w i t h t h e l i g n i n r e c o v e r y d a t a a b o v e . E n z y m e ( s ) C 3 5 0 L i ( g m n g n i ) [ ( L U I I P L ] ) [ 1 M ( N U P I L - ) [ J M ( N U P / L I ) 1 7 3 T a b l e 5 . 8 a : I n i t i a l ( t i m e z e r o ) l i g n i n a n d e n z y m e l e v e l s i n S i d e B o f t h e r e a c t o r f o r e a c h B a s e C a s e a n d i t s c o n t r o l s . L I P B C 2 2 . 8 1 0 0 0 . 0 8 9 8 . 7 0 . 0 L I P L 0 . 0 1 0 0 0 . 0 8 9 8 . 7 . 0 . 0 L I P R 2 3 . 1 1 0 0 0 . 0 8 9 8 . 7 0 . 0 L I P E 2 2 . 9 0 . 0 0 . 0 0 . 0 L I P A E 2 3 . 1 . N D ‘ N D 0 . 0 L I P E R 2 2 . 9 0 . 0 0 . 0 0 . 0 L I P + M N P B C 2 2 . 8 1 0 0 0 . 0 8 9 8 . 7 5 5 1 0 1 . 3 L I P + M N P L ' 0 . 0 1 0 0 0 . 0 8 9 8 . 7 5 5 1 0 1 . 3 L I P + M N P R ' 2 2 . 8 1 0 0 0 . 0 8 9 8 . 7 5 5 1 0 1 . 3 L I P + M N P E ‘ 2 3 . 1 0 . 0 0 . 0 0 . 0 L I P + M N P A 6 2 3 . 0 N D N D N D L I P + M N P E R ‘ 2 3 . 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0 M N P B C 2 2 . 8 N D 0 . 0 5 6 0 0 0 . 0 M N P L ‘ 0 . 0 N D 0 . 0 5 6 0 0 0 . 0 M N P 1 1 ° 2 3 . 0 N D 0 . 0 5 6 0 0 0 . 0 M N P E ’ 2 2 . 8 0 . 0 0 . 0 0 . 0 M N P A 6 2 2 . 9 N D 0 . 0 N D M N P E R ' 2 3 . 1 0 . 0 0 . 0 0 . 0 " ' N D = N o n e D e t e c t e d E n z y m e ( s } C L L L L L L L L L L L L M M M M M M I I I I I I I I I I I I N N N N N N P P P P P P P P P P P P P P P P P P + + + + + + M M M M M M N N N N N N P P P P P P ' ' ' a L R 1 R L E L R 5 s C ' ’ E ' C ' ' E C ' E ' ' R R 3 R B B B A A A E E E [ H ( z m e o 3 3 0 0 0 0 4 4 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 A e z M l ) [ V ( A m I M 8 8 . . . . 4 4 . . . . . . . . 1 1 . . 0 1 1 0 . . 0 1 1 0 0 1 1 0 . . 8 8 0 0 0 0 3 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 4 0 0 0 0 7 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 4 1 1 . . . . . . . . . . . . . . A ) 9 9 9 9 0 6 6 0 0 6 6 0 0 0 0 0 0 0 . . e . . 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 9 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 B O [ H ( Z O m Z M J ) [ V ( A m I M B ) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 6 0 6 6 0 6 6 0 6 6 0 0 0 0 0 0 0 o 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ( M ( a m m M i ) e . 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 . 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 7 4 T a b l e 5 . 8 b : I n i t i a l ( t i m e z e r o ) H 2 0 2 a n d V A c o n c e n t r a t i o n s i n S i d e s A a n d B o f t h e r e a c t o r a n d M n ( I I ) i n S i d e B f o r e a c h B a s e C a s e a n d i t s c o n t r o l s . * A d d e d a s [ M n ( I I I ) o t a r t 2 ] . 1 7 5 T a b l e 5 . 9 : I n i t i a l ( t i m e z e r o ) a n d fi n a l ( 1 2 h o u r ) m a s s o f l i g n i n p r e s e n t , a n d t h e fi n a l l r g n r n m a s s a s a p e r c e n t a g e o f t h e i n i t i a l f o r e a c h B a s e C a s e a n d i t s c o n t r o l s . I n i t i a l R e c o v e r e d F i n a l F i n a l L i g n i n L i g n i n L i g n i n L i g n i n E n z y m e ( s ) C a s e ( m g ) ( m g ) ( m g r ( % o f i n i t i a l ) L I P B C 2 2 . 8 2 1 . 2 2 2 . 3 9 7 . 8 L I P R ' 2 3 . 1 2 2 . 2 2 3 . 4 1 0 1 L I P E ’ 2 2 . 9 2 0 . 5 2 1 . 6 9 4 . 3 L I P A 5 2 3 . 1 2 1 . 6 2 2 . 7 9 8 . 3 L I P E R ‘ 2 2 . 9 2 2 . 3 2 3 . 5 1 0 3 L I P + M N P B C 2 2 . 8 1 9 . 3 2 0 . 3 8 9 . 0 L I P + M N P R ‘ 2 2 . 8 2 1 . 6 2 2 . 7 9 9 . 6 L I P + M N P F . ’ 2 3 . 1 2 2 . 9 2 4 . 1 1 0 4 L I P + M N P A E 2 3 . 0 2 2 . 5 2 3 . 7 1 0 3 L I P + M N P E R ' 2 3 . 0 2 1 . 6 2 2 . 7 9 8 . 7 M N P B C 2 2 . 8 2 2 . 9 2 4 . 1 1 0 6 M N P R ' 2 3 . 0 2 2 . 9 2 4 . 1 1 0 5 M N P E ‘ 2 2 . 8 2 0 . 1 2 1 . 2 9 3 . 0 M N P A B 2 2 . 9 2 1 . 0 2 2 . 1 9 6 . 5 M N P E R ’ 2 3 . 1 2 1 . 7 2 2 . 8 9 8 . 7 " C o r r e c t e d f o r 9 5 % r e c o v e r y . 1 7 6 F i g u r e 5 . 4 6 : P h o t o g r a p h o f t h e l i g n i n r e c o v e r e d f r o m t h e L I P A l o n e e n z y m e r u n s , s t i l l i n t h e c o n i c a l v i a l s , a n d u n d e r 1 m L o f d i s t i l l e d w a t e r . F r o m l e f t t o n g h t : B a s e C a s e , N o r e a g e n t c o n t r o l ( R ) , N o L I P c o n t r o l ( E ) , A u t o c l a v e d L I P c o n t r o l ( A E ) , a n d N o r e a g e n t , n o L I P c o n t r o l ( E R ) . 1 7 7 T h e l i g n i n s a m p l e s f o r t h e M N P a l o n e r u n s a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e s 5 . 4 7 8 ( 6 h o u r t r e a t m e n t ) a n d 5 . 4 7 b ( 1 2 h o u r t r e a t m e n t ) ; s a m p l e o r d e r i s a s i n F i g u r e 5 . 4 6 . T h e r e i s a d e fi n i t e d a r k e n i n g o f t h e l i g n i n f r o m t h e b a s e c a s e v e r s u s t h e c o n t r o l s , w h i c h a r e a l l i d e n t i c a l i n c o l o r . T h e d a r k e r c o l o r i s d e fi n i t e l y n o t d u e t o p r e c i p i t a t i o n o f M n O z , s i n c e t h e L “ c o n t r o l ( w h i c h c o n t a i n e d M N P , H 2 0 2 , a n d M n ( I I ) , b u t n o l i g n i n ) d i d n o t f o r m a p r e c i p i t a t e . T h e c o l o r c h a n g e i s c o n s i s t e n t w i t h t h e f o r m a t i o n o f q u i n o n e s t r u c t u r e s ( a k n o w n M N P r e a c t i o n ) i n t h e s o l i d l i g n i n ( f r o m t h e a r o m a t i c r i n g s ) s i n c e q u i n o n e s i n l i g n i n a r e , i n g e n e r a l , d a r k e r i n c o l o r t h a n p h e n o l i c s ( B . H a m e s , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n ) , q u i n o n e f o r m a t i o n b y o x i d a t i o n o f l i g n i n i s a k n o w n r e a c t i o n i n l i g n i n c h e m i s t r y ( S a r k a n e n a n d L u d w i g , 1 9 7 1 ) , a n d q u i n o n e f o r m a t i o n f r o m l i g n i n m o d e l d i m e r s i s a r e a c t i o n k n o w n t o b e c a t a l y z e d b y M N P ( W a r i i s h i e t a l . , 1 9 9 1 ; T u o r e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h i s i s a l s o c o n s i s t e n t w i t h t h e l i g n i n r e c o v e r y d a t a a b o v e , s i n c e o x i d a t i o n o f t h e l i g n i n b y t h e M N P w i t h o u t s i g n i fi c a n t r e l e a s e o f p r o d u c t s w o u l d i n c r e a s e t h e m a s s o f t h e l i g n i n . T h e b a s e c a s e l i g n i n f r o m t h e 1 2 h o u r t r e a t m e n t m a y b e s l i g h t l y d a r k e r t h a n t h a t f o r t h e 6 h o u r t r e a t m e n t , b u t n o t s i g n i fi c a n t l y . F i n a l l y , t h e l i g n i n s a m p l e s f r o m t h e L I P + M N P r u n s a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 4 8 ; a g a i n , t h e o r d e r i s i d e n t i c a l t o t h a t u s e d a b o v e . T h e r e i s l i t t l e c h a n g e i n t h e c o l o r o f t h e b a s e c a s e l i g n i n v e r s u s t h e c o n t r o l s ( a g a i n , a l l i d e n t i c a l ) ; h o w e v e r , o b s e r v a t i o n o f t h e c o l o r o f t h e l i g n i n w h i l e i n t h e r e a c t o r d u r i n g t h e r u n r e v e a l e d t h a t t h e c o l o r o f t h e L I P + M N P b a s e c a s e l i g n i n d a r k e n e d c o n s i d e r a b l y o v e r t h e fi r s t 4 t o 6 h o u r s o f r e a c t i o n , a n d t h e n l i g h t e n e d i n c o l o r o v e r t h e r e m a i n d e r o f t h e r e a c t i o n t i m e . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e M N P fi r s t m o d i fi e d t h e s o l i d l i g n i n b y o x i d a t i o n a n d t h e L I P r e l e a s e d l i g n i n f r a g m e n t s f r o m t h i s m o d i fi e d l i g n i n , l e a v i n g a fi n a l s o l i d l i g n i n t h a t w a s r e l a t i v e l y i n d i s t i n g u i s h a b l e i n a p p e a r a n c e f r o m t h e i n i t i a l l i g n i n . T h i s i s a l s o s u p p o r t e d b y t h e l i g n i n r e c o v e r y d a t a p r e s e n t e d a b o v e , s i n c e t h e L I P + M N P c a s e w a s t h e o n l y c a s e t o s h o w l i g n i n r e m o v a l i n t h e b a s e c a s e . F i n a l l y , t h i s r e s u l t , c o m b i n e d w i t h t h a t f o r t h e M N P a l o n e r u n s f o r 6 a n d 1 2 h o u r s , s u g g e s t t h a t t h e M N P w a s o n l y a c t i v e f o r t h e fi r s t fi g u r e 5 . 4 7 : P h o t o g r a p h s o f t h e l i g n i n r e c o v e r e d f r o m t h e M N P A l o n e e n z y m e r u n s , s t i l l i n t h e c o n i e a l v r a l s , a n d u n d e r 1 m L o f d i s t i l l e d w a t e r . F r o m l e f t t o r r g h t : B a s e C a s e , N o r e a g e n t c o n t r o l ( R ' ) , N o M N P c o n t r o l ( 1 5 ' ) , A u t o c l a v e d M N P c o n t r o l ( A E ) , a n d N o r e a g e n t , n o M N P c o n t r o l ( E R ' ) . ( 8 . ) 6 h o u r t r e a t m e n t t i m e ; a n d ( b . ) 1 2 h o u r t r e a t m e n t t i m e . 1 7 9 F i g u r e 5 . 4 8 : P h o t o g r a p h o f t h e l i g n i n r e c o v e r e d f r o m t h e L I P + M N P e n z y m e r u n s , s t i l l i n t h e c o n i e a l v r a l s , a n d u n d e r 1 m L o f ' d i s t i l l e d w a t e r . F r o m l e f t t o r r g h t z , B a s e C a s e , N o r e a g e n t c o n t r o l ( R ' ) , N o L I P , n o M N P c o n t r o l ( B ) , A u t o c l a v e d L I P , a u t o c l a v e d M N P c o n t r o l ( A E ) , a n d N o r e a g e n t , n o L I P , n o M N P c o n t r o l ( E R ' ) . 1 8 0 6 h o u r s o f t h e r u n , p e r h a p s i n d i c a t i n g t h a t t h e e n z y m e m a y h a v e b e e n i n a c t i v a t e d d u e t o e x c e s s i v e H 2 0 2 a c c u m u l a t i o n i n S i d e B ( d u e t o b r e a k d o w n o f t h e m o d e l p r e d i c t i o n s o v e r a 6 h o u r p e r i o d ) . 5 . 1 2 F T I R / P L S A n a l y s i s o f P e r o x i d a s e T r e a t e d S o l i d L i g n i n K B r p e l l e t s c o n t a i n i n g a b o u t 1 . 5 m g o f d r i e d , e x t r a c t e d l i g n i n f r o m t h e r e a c t o r r u n s w e r e p r e s s e d a n d F T I R s p e c t r a f o r e a c h w e r e m e a s u r e d . T h e s p e c t r a l d a t a fi l e s w e r e s a v e d o n d i s k f o r f u t u r e a n a l y s i s , a n d s e n t t o B o n n i e H a m e s , a n A s s o c i a t e C h e m i s t i n t h e C h e m i c a l C o n v e r s i o n R e s e a r c h B r a n c h a t t h e N a t i o n a l R e n e w a b l e E n e r g y L a b o r a t o r y ( N R E L , G o l d e n , C O ) . T h e d a t a w e r e s u b j e c t e d t o P L S a n a l y s i s ( H a m e s e t a l . , 1 9 9 1 ) t o d e t e r m i n e w h e t h e r c h a n g e s h a d o c c u r r e d i n t h e l i g n i n a n d / o r c a r b o h y d r a t e c o m p o s i t i o n s , m e t h o x y l c o n t e n t s , o r p h e n o l i c h y d r o x y l c o n t e n t s a s a r e s u l t o f t r e a t m e n t w i t h t h e p e r o x i d a s e e n z y m e s a l o n e a n d i n c o m b i n a t i o n . C a l i b r a t i o n o f t h e m e t h o d s w a s b y c h e m i c a l m e a s u r e m e n t o f t h e s e p a r a m e t e r s f o r a r a n g e o f m i l l e d w o o d l i g n i n s ( I - I a m e s e t a l . , 1 9 9 1 ) . P e l l e t l i g n i n c o n c e n t r a t i o n s a n d t h e o r d e r o f m e a s u r e m e n t o f t h e F T I R s p e c t r a a r e l i s t e d i n T a b l e 5 . 1 0 . T h e t r a n s m i s s i o n s p e c t r u m o f t h e K B R b a c k g r o u n d p e l l e t i s s h o w n i f F i g u r e 5 . 4 9 . T h e p e a k s i n t h e s p e c t r u m i n t h e r a n g e 1 8 0 0 - 1 0 0 0 c m ' 1 a r e d u e t o a c o n t a m i n a n t , p e r h a p s s o m e o i l f r o m t h e s u r f a c e o f t h e d i e w h i c h w a s u s e d t o p r e s s t h e p e l l e t ( a n e w d i e , w h i c h w a s a s s u m e d t o b e c l e a n , w a s u s e d ) . T h e s p e c t r u m o f t h e b a c k g r o u n d p e l l e t w a s s u b t r a c t e d f r o m t h e s p e c t r a o f a l l o f t h e s a m p l e p e l l e t s t o r e m o v e a b s o r b a n c e s f r o m t h e s a m p l e p e l l e t m e d i u m . T h e s p e c t r a w e r e a n a l y z e d b y P L S f o r m e t h o x y l c o n t e n t w i t h t h i s b a c k g r o u n d a n d a l s o w i t h a n u n c o n t a m i n a t e d b a c k g r o u n d s p e c t r u m o b t a i n e d a t N R E L s i n c e t h i s i s t h e r e g i o n w h i c h m o s t a f f e c t s t h e p r e d i c t i o n s o f a r o m a t i c m e t h o x y l c o n t e n t ( F a i x , 1 9 9 2 ; B . H a m e s , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n ) ; n o s i g n i fi c a n t c h a n g e i n t h e p r e d i c t i o n s o c c u r r e d b y u s i n g t h e u n c o n t a m i n a t e d b a c k g r o u n d s p e c t r u m , i n d i c a t i n g t h a t t h e c o n t a m i n a n t h a d l i t t l e o r n o e f f e c t o n t h e p r e d i c t i o n s o f t h e P L S t e c h n i q u e ( B . H a m e s , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n ) . T h e r e f o r e , i n o r d e r t o e l i m i n a t e a n y e r r o r s 1 8 1 T a b l e 5 . 1 0 : L i g n i n c o n c e n t r a t i o n s i n t h e K B r p e l l e t s u s e d t o m e a s u r e d t h e F T I R s p e c t r a o f e a c h B a s e C a s e a n d i t s c o n t r o l s . T h e o r d e r o f m e a s u r e m e n t i n d i c a t e s t h e o r d e r 1 n w h r c h t h e I R s p e c t r u m o f e a c h l l e t w a s m e a s u r e d , a n d i s u s e d t o i n d i e a t e w h r c h s p e c t r a w e r e m e a s u r e d m o r e c l o s e y i n t i m e . P e l l e t L i g n i n C o n c e n t r a t i o n O r d e r o f S a m p l e ( % ) M e a s u r e m e n t L I P O n l y B C 0 . 4 9 9 5 1 1 R ' 0 . 4 9 9 7 1 2 E ' 0 . 4 6 6 5 1 3 A E 0 . 4 9 9 3 1 4 E R ' 0 . 5 3 2 6 1 5 L I P + M N P B C 0 . 4 6 3 6 6 R ‘ 0 . 4 6 6 5 7 E ’ 0 . 4 6 6 0 8 A E 0 . 4 6 7 0 9 E R ‘ 0 . 4 6 6 2 1 0 M N P O n l y B C 0 . 5 5 7 6 1 R ‘ 0 . 3 0 6 9 2 1 3 ' 0 . 4 6 9 6 3 A E 0 . 4 6 5 9 4 E R ’ 0 . 4 9 8 8 5 1 8 2 1 0 0 " 9 6 T r a n s m i s s i o n 2 0 ' - 0 i i i i 4 0 0 0 3 5 0 0 3 0 0 0 2 5 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 0 W a v e n u m b e r I i l c m i I F i g u r e 5 . 4 9 : T r a n s m i s s i o n F I ' I R s p e c t r u m f r o m 4 0 0 0 - 7 0 0 w a v e n u m b e r s f o r t h e K B r b a c k g r o u n d p e l l e t . 1 8 3 i n t r o d u c e d i n t o f u t u r e P L S a n a l y s e s d u e t o d i s c r e p a n c i e s i n t h e K B r b a c k g r o u n d s o b t a i n e d h e r e a n d a t N R E L , P L S a n a l y s e s w e r e c o n d u c t e d u s i n g t h e s p e c t r a r a t i o e d w i t h t h e b a c k g r o u n d m e a s u r e d w h e n t h e p e l l e t s w e r e m e a s u r e d . T h e F T I R a b s o r b a n c e s p e c t r a o f t h e t h r e e b a s e c a s e ( B C ) l i g n i n s a n d t h e i r E R ' c o n t r o l s a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 5 0 ( L I P O n l y B C a n d i t s E R ' c o n t r o l ) , F i g u r e 5 . 5 1 ( L I P + M N P B C a n d i t s E R ' c o n t r o l ) , a n d F i g u r e 5 . 5 2 ( M N P O n l y B C a n d i t s E R ’ c o n t r o l ) ; t h e r e m a i n d e r o f t h e s p e c t r a a r e p r e s e n t e d i n A p p e n d i x F i n F i g u r e s F . 1 t h r o u g h F . 9 . T h e a p p e a r a n c e s o f t h e s e s p e c t r a a r e t y p i c a l f o r l i g n i n s ( S c h u l t z e t a l . , 1 9 8 5 ; S c h u l t z a n d G l a s s e r , 1 9 8 6 ; H a m e s e r a l . , 1 9 9 1 ) . N o t m a n y d i f f e r e n c e s a r e s e e n b y v i s u a l c o m p a r i s o n o f t h e s p e c t r a , b u t m i n o r d i f f e r e n c e s i n F T I R s p e c t r a o f t e n i n d i c a t e m a j o r d i f f e r e n c e s i n s t r u c t u r e ( S a r k a n e n a n d L u d w i g , 1 9 7 1 ) . I n i t i a l P L S a n a l y s i s o f t h e s a m p l e s p e c t r a f o r l i g n i n a n d c a r b o h y d r a t e c o n t e n t s i n d i c a t e d t h a t t h e s p e c t r a w o u l d h a v e t o b e n o r m a l i z e d b e c a u s e t h e m a x i m u m a b s o r b a n c e i n e a c h s p e c t r u m d i d n o t p r o p o r t i o n a l l y c o r r e s p o n d w i t h t h e k n o w n s o l i d l i g n i n c o n c e n t r a t i o n s i n t h e p e l l e t a s i s p r e d i c t e d b y B e e r ’ s L a w ( G r i f fi t h s a n d d e H a s e t h , 1 9 8 6 ) ; p o s s i b l e c a u s e s f o r t h i s w i l l b e d i s c u s s e d b e l o w . I n a d d i t i o n , i t a p p e a r e d t h a t t h e t o t a l a b s o r b a n c e fl u c t u a t e d w i t h t i m e ( w h i c h m a k e s t h e o r d e r o f p e l l e t m e a s u r e m e n t i m p o r t a n t ) , p r o b a b l y d u e t o a d e c r e a s e i n t h e e n e r g y o u t p u t o f t h e F T I R i n s t r u m e n t o v e r t i m e . T o m i n i m i z e t h e e f f e c t o f t h i s p r o b l e m , a l l o f t h e s p e c t r a l fi l e s w e r e n o r m a l i z e d s o t h a t t h e a b s o r b a n c e a t a r e f e r e n c e p e a k w a s p r o p o r t i o n a l t o t h e k n o w n s o l i d l i g n i n c o n c e n t r a t i o n i n t h e p e l l e t s ; t h e r e f e r e n c e p e a k w a s c h o s e n a s t h e a b s o r b a n c e p e a k a t 1 1 2 5 . 5 c m " , w h i c h i s d u e i n l a r g e p a r t t o t h e a r o m a t i c C - H i n - p l a n e d e f o r m a t i o n o f s y r i n g y l u n i t s ( F a i x , 1 9 9 2 ) a n d i s t h e h i g h e s t p e a k i n a l l o f t h e s p e c t r a . T h i s p e a k w a s c h o s e n b e c a u s e o n l y i n s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e s ( r e g a r d l e s s o f b a c k g r o u n d u s e d ) w e r e s e e n i n t h e m e t h o x y l c o n t e n t s o f a l l t h e s a m p l e s w h e n t h e y w e r e a n a l y z e d p r e v i o u s l y t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t o f t h e c o n t a m i n a n t i n t h e b a c k g r o u n d p e l l e t ; t h u s , t h i s p e a k s e e m e d t o b e a n i d e a l c h o i c e f o r n o r m a l i z a t i o n b e c a u s e i t i s d u e i n l a r g e p a r t t o t h e a b s o r b a n c e e c n a b r o s b A 0 . 4 " 1 M 1 8 4 ( a . ) F ’ o r I o : U I I U 4 0 0 0 3 5 0 0 3 0 0 0 2 5 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 0 W a v e n u m b e r 1 1 I e m I ( b . ) 0 . 2 - - l l I I I 0 ' 1 - : ' i 1 i 4 0 0 0 3 5 0 0 3 0 0 0 2 5 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 0 W a v e n u m b e r 1 1 I c h F i g u r e 5 . 5 0 : F I ' I R a b s o r b a n c e s p e c t r a f o r ( a . ) L I P A l o n e B C l i g n i n a f t e r t r e a t m e n t f o r 1 2 h o u r s ; a n d ( b . ) N o r e a g e n t , n 0 L I P c o n t r o l ( E R ' ) l i g n i n a f t e r t r e a t m e n t f o r 1 2 h o u r s . e c n a b r o s b A 1 8 5 ( a . ) 0 . 8 " 0 . 6 " 0 . 4 - - 0 . 2 - - 4 0 0 0 3 5 0 0 3 0 0 0 2 5 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 0 W a v e n u m b e r 1 1 I c h ( b . ) 0 . 4 - - 0 . 2 " k m 4 0 0 0 3 5 0 0 3 0 0 0 2 5 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 0 W a v e n u m b e r I 1 I c m 1 F i g u r e 5 . 5 1 : F T I R a b s o r b a n c e s p e c t r a f o r ( a . ) L I P + M N P B C l i g n i n a f t e r t r e a t m e n t f o r 1 2 h o u r s ; a n d ( b . ) N o r e a g e n t , n o L I P , n o M N P c o n t r o l ( E R ‘ ) l i g n i n a f t e r t r e a t m e n t f o r 1 2 h o u r s . e e n a b r o s b A e e n a b r o s b A 4 0 0 0 3 5 0 0 3 0 0 0 2 5 0 0 W a v e n u 0 4 0 0 0 i 5 3 0 0 i 0 3 0 0 i 5 2 0 0 W a v e n - l l I 0 0 1 i 5 0 0 - 1 ‘ 0 1 0 I 2 2 r r e m u b m e b 1 0 0 1 I c m l i 0 I 0 1 0 I c h 5 1 0 0 - 1 1 . 5 0 0 0 0 0 5 0 0 1 8 6 ( a . ) 0 . 8 - ' - 0 . 6 - L 0 . 2 - - - . l I ( b . ) 0 . 8 - - 0 . 6 - - 0 . 4 - - F i g u r e 5 . 5 2 : F T I R a b s o r b a n c e s p e c t r a f o r ( a . ) M N P A l o n e B C l i g n i n a f t e r t r e a t m e n t { o r 1 2 h o u r s ; a n d ( b . ) N o r e a g e n t , n o M N P c o n t r o l ( E R ' ) l i g n i n a f t e r t r e a t m e n t f o r 1 2 o u r s . 1 8 7 o f a r o m a t i c m e t h o x y l g r o u p s ( B . H a m e s , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n ; F a i x , 1 9 9 2 ) . T h e r e s u l t s o f t h e P L S a n a l y s i s o f t h e c o n c e n t r a t i o n - n o r m a l i z e d s p e c t r a f o r l i g n i n a n d c a r b o h y d r a t e c o n t e n t s a r e g i v e n i n T a b l e 5 . 1 1 . L i g n i n c o n t e n t s a r e : 1 ; 3 . 6 0 % , c a r b o h y d r a t e c o n t e n t s a r e 1 ; 7 . 0 0 % , a n d t h e r 2 f o r e a c h o f t h e s e a n a l y s e s a r e 0 . 9 6 8 9 a n d 0 . 9 2 0 5 , r e s p e c t i v e l y . T h e u n c e r t a i n t i e s i n t h e c a r b o h y d r a t e a n a l y s e s a r e m u c h t o o l a r g e t o a l l o w t h e p r e d i c t e d c o n t e n t s t o b e u s e f u l ; t h i s i s n o t s u r p r i s i n g s i n c e t h e P L S p r o g r a m o u t p u t i n d i c a t e d t h a t t h e c a r b o h y d r a t e d a t a w e r e o u t s i d e t h e c a l i b r a t i o n r a n g e . M i l l e d w o o d l i g n i n s ( l o w e r m o l e c u l a r w e i g h t l i g n i n f r a g m e n t s e x t r a c t e d w i t h d i o x a n e ) , w h i c h w e r e u s e d t o c a l i b r a t e t h e P L S t e c h n i q u e , t y p i c a l l y c o n t a i n a f a i r l y h i g h a m o u n t o f c a r b o h y d r a t e s , w h i l e t h i s l i g n i n h a s l i t t l e c a r b o h y d r a t e p r e s e n t , m o s t o f w h i c h i s l i k e l y t o b e c o v a l e n t l y l i n k e d t o t h e l i g n i n b a s e d o n t h e i n a b i l i t y t o r e m o v e i t w i t h s a t u r a t i n g l e v e l s o f c e l l u l a s e . T h e s p e c i fi c r e s u l t s p r e s e n t e d i n T a b l e 5 . 1 1 w i l l b e d i s c u s s e d b e l o w , b u t fi r s t i t i s u s e f u l t o l o o k a t t r e n d s i n t h e l i g n i n c o n t e n t p r e d i c t i o n s f o r t h e c o n t r o l s ( b e t w e e n e n z y m e c a s e s ) . T h e p r e d i c t i o n s o f l i g n i n c o n t e n t s a r e c o n s i s t e n t w i t h i n e a c h s e t o f c o n t r o l s , b u t t h e y a r e n o t c o n s i s t e n t b e t w e e n t h e c o n t r o l s e t s ( n o n e o f t h e c o n t r o l s c o n t a i n e d a l l o f t h e n e c e s s a r y c o m p o n e n t s f o r e n z y m e a c t i v i t y s o t h e i r l i g n i n c o n t e n t s s h o u l d b e v e r y c l o s e t o o n e a n o t h e r ) . I t s h o u l d b e n o t e d h e r e t h a t t h e M y m e a s u r e d l i g n i n a n d c a r b o h y d r a t e c o n t e n t s o f t h e s t a r t i n g m a t e r i a l ( s e e S e c t i o n 5 . 1 ) w e r e 7 4 . 5 % a n d 1 2 . 2 % , r e s p e c t i v e l y . T h e r e i s a s t i l l a n i n c r e a s e i n t h e p r e d i c t e d l i g n i n c o n t e n t s o f t h e c o n t r o l s b e t w e e n s e t s w i t h t h e o r d e r o f m e a s u r e m e n t ( i n c r e a s i n g t i m e o f a n a l y s i s ) o f t h e F T I R s p e c t r a o f t h e s a m p l e p e l l e t s . T h u s , t h e n o r m a l i z a t i o n d i d n o t f u l l y a c c o u n t f o r t h e t i m e d e p e n d e n c e o f t h e a b s o r b e d i n t e n s i t y ; t h i s i n d i c a t e s t h a t e i t h e r t h e r e m u s t h a v e b e e n s o m e s o r t o f d i f f e r e n c e i n t h e w a y t h e s a m p l e s f r o m e a c h s e t w e r e h a n d l e d ( i e . n u m b e r o f t i m e s t h e y w e r e f r o z e n a t - 8 0 ° C a n d t h a w e d b e f o r e a n a l y s i s f o r p h o t o s , e x t r a c t i o n , e t c . , h o w l o n g t h e y s t a y e d f r o z e n , e t c . ) , o r t h e e n e r g y o u t p u t o f t h e F T I R i n s t r u m e n t s i m p l y d e c r e a s e d t o o m u c h o v e r t i m e t o a l l o w a c o n s i s t e n t a m o u n t o f I R r a d i a t i o n t o 1 8 8 T a b l e 5 . 1 1 : L i g n i n a n d c a r b o h y d r a t e c o n t e n t s f o r t h e l i g n i n r e c o v e r e d f r o m t h e r e a c t o r r u n s f o r e a c h B a s e C a s e a n d r t s c o n t r o l s , a s p r e d i c t e d b y t h e F T I R / P L S t e c h n i q u e ( H a m e s e r a l . , 1 9 9 1 ) . T h e s t a n d a r d e r r o r s o f t h e p r e d i c t i o n s a n d t h e r 1 f o r t h e c a l i b r a t i o n s o f t h e m e t h o d s w i t h m i l l e d w o o d l i g n i n s a r e l i s t e d a t t h e b o t t o m o f e a c h 0 0 u m n . L i g n i n C a r b o h y d r a t e S a m p l e / C o n t e n t C o n t e n t C a s e ( % ) ( % ) L I P O n l y B C 6 8 . 2 5 1 4 . 4 5 R ' 7 1 . 8 6 1 1 . 7 4 E ‘ 7 6 . 1 4 6 . 7 1 A E 7 1 . 7 6 1 1 . 4 3 E R ’ 7 6 . 8 9 5 . 2 9 L I P + M N P B C 6 0 . 2 6 2 3 . 2 5 R ‘ 6 8 . 4 6 1 6 . 6 9 E ‘ 6 7 . 8 8 1 8 . 1 1 A E 6 8 . 2 7 1 6 . 3 2 E R ’ 6 7 . 4 1 1 7 . 6 0 M N P O n l y B C 6 7 . 0 5 1 2 . 5 8 R ' 6 4 . 7 4 2 1 . 0 6 E ' 6 5 . 0 0 1 9 . 5 8 A E 6 7 . 5 0 1 7 . 4 3 E R ' 6 6 . 2 0 1 9 . 1 4 S t d . E r r o r 3 . 6 0 7 . 0 0 1 3 0 . 9 6 9 8 0 . 9 2 0 5 1 8 9 r e a c h t h e d e t e c t o r . T h e s e c o n d e x p l a n a t i o n i s t h e m o r e l i k e l y o f t h e t w o , s i n c e t h e d e s i c c a n t f o r t h e w i n d o w o f t h e d e t e c t o r o n t h e F T I R i n s t r u m e n t a t M B I w a s n e a r t h e e n d o f i t s u s e f u l l i f e a n d n e e d e d t o b e r e p l a c e d ( R i c h a r d T u r k , M B I , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n ) ; t h i s w o u l d c e r t a i n l y c a u s e a d e c r e a s e i n t h e a m o u n t o f e n e r g y r e a c h i n g t h e d e t e c t o r o v e r t i m e b e c a u s e i t w o u l d a l l o w f o g g i n g o f t h e d e t e c t o r w i n d o w w i t h m o i s t u r e f r o m t h e a i r . T h e d e s i c c a n t s h o u l d h a v e b e e n r e p l a c e d b e f o r e m e a s u r i n g t h e s a m p l e s ; h o w e v e r , a r e p l a c e m e n t w a s n o t r e a d i l y a v a i l a b l e , a n d t i m e c o n s t r a i n t s p r o h i b i t e d w a i t i n g f o r o n e . N o n e t h e l e s s , s i n c e t h e s a m p l e s w i t h i n e a c h e n z y m e c a s e w e r e m e a s u r e d c o n s e c u t i v e l y a n d c l o s e l y t o g e t h e r i n t i m e , t h e y c a n s t i l l b e c o m p a r e d w i t h a h i g h d e g r e e o f c o n fi d e n c e ( B . H a m e s , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n ) . T h e b o t t o m l i n e f o r t h i s i s t h a t i t l i m i t s t h e u s e o f t h i s d a t a t o i n t e r n a l c o m p a r i s o n s o n l y , i e . c o m p a r i s o n s o f o n e e x p e r i m e n t i n a g i v e n s e t t o a n o t h e r o n e i n i t s s e t . C o m p a r i s o n s b a s e d o n a c t u a l l i g n i n c o n t e n t s b e t w e e n s e t s m a y n o t b e m a d e a c c u r a t e l y w i t h t h i s d a t a ( t h i s w a r n i n g a p p l i e s t o t h e l i g n i n a n d c a r b o h y d r a t e d e t e r m i n a t i o n s o n l y , b e c a u s e n o s u c h t r e n d s w e r e s e e n w i t h t h e o t h e r P L S a n a l y s e s ) ( B . H a m e s , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n ) . T h e l i g n i n a n d c a r b o h y d r a t e c o n t e n t s p r e d i c t e d f o r t h e L I P o n l y B C a r e 6 8 . 2 5 % d : 3 . 6 0 % a n d 1 4 . 4 5 9 6 : 1 : 7 . 0 0 % , r e s p e c t i v e l y , w i t h a v e r a g e c o n t e n t s i n t h e c o n t r o l s o f 7 4 . 1 6 % : 1 ; 5 . 4 6 % ( m e a n : 1 ; 2 s , 9 5 % c o n fi d e n c e ) a n d 8 . 7 9 % i 6 . 5 6 % , r e s p e c t i v e l y . T h e c a r b o h y d r a t e p r e d i c t i o n s w i l l n o t b e c o n s i d e r e d , g i v e n t h e l o w e r b o u n d o f t h e i r u n c e r t a i n t y r a n g e i s v e r y n e a r z e r o . T h e l i g n i n c o n t e n t p r e d i c t i o n s , h o w e v e r , a r e u s e f u l w i t h a h i g h d e g r e e o f c o n fi d e n c e ( B . H a m e s , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n ) . W i t h i n t h e u n c e r t a i n t y r a n g e s o f t h e c o n t r o l s i n T a b l e 5 . 1 1 , t h e r e i s o n l y a s m a l l d e c r e a s e i n l i g n i n c o n t e n t f o r t h e L I P o n l y B C v e r s u s t h e c o n t r o l s ; t h i s i s c o m p l e t e l y c o n s i s t e n t w i t h t h e s o l i d l i g n i n d r y w e i g h t a n a l y s i s r e s u l t s g i v e n a b o v e , i n d i c a t i n g t h a t i f L I P a l o n e d i d r e l e a s e l i g n i n f r o m t h e s o l i d , i t w a s n o t a n a m o u n t s i g n i fi c a n t e n o u g h t o s e e a n e f f e c t w i t h t h e s e m e t h o d s . ‘ T h e l i g n i n a n d c a r b o h y d r a t e c o n t e n t s p r e d i c t e d f o r t h e M N P o n l y B C a r e 6 7 . 0 5 1 9 0 9 6 : 1 ; 3 . 6 0 % a n d 1 2 . 5 8 9 6 i 7 . 0 0 % , r e s p e c t i v e l y , w i t h a v e r a g e c o n t e n t s i n t h e c o n t r o l s o f 6 5 . 8 6 % : l : 2 . 5 2 % a n d 1 9 . 3 0 % : 1 ; 2 . 9 8 % , r e s p e c t i v e l y . N o l i g n i n a p p e a r s t o h a v e b e e n r e l e a s e d b y M N P a l o n e ; t h e l a c k o f l i g n i n r e m o v a l b y M N P a l o n e i s c o m p l e t e l y c o n s i s t e n t w i t h t h e l i g n i n d r y w e i g h t r e c o v e r y a n a l y s i s p r e s e n t e d a b o v e , w h i c h f o u n d a s l i g h t i n c r e a s e i n t h e m a s s o f s o l i d r e c o v e r e d f r o m t h e r e a c t o r . F i n a l l y , t h e l i g n i n a n d c a r b o h y d r a t e c o n t e n t s p r e d i c t e d f o r t h e L I P + M N P B C a r e 6 0 . 2 6 % i 3 . 6 0 % a n d 2 3 . 2 5 % j ; 7 . 0 0 % , r e s p e c t i v e l y , w i t h a v e r a g e c o n t e n t s i n t h e c o n t r o l s o f 6 8 . 0 1 % i 0 . 9 2 % a n d 1 7 . 1 8 % : 1 ; 1 . 6 4 % , r e s p e c t i v e l y . T h e l i g n i n c o n t e n t o f t h e B C i s c l e a r l y l o w e r t h a n t h a t o f i t s c o n t r o l s , e v e n c o n s i d e r i n g t h e e x t r e m e v a l u e s i n t h e u n c e r t a i n t y r a n g e s ; t h i s r e s u l t i s a g a i n c o m p l e t e l y c o n s i s t e n t w i t h t h e l i g n i n d r y w e i g h t r e c o v e r y f r o m t h e r e a c t o r r u n , i n d i c a t i n g t h a t l i g n i n r e m o v a l o c c u r r e d w h e n b o t h e n z y m e s w e r e p r e s e n t a n d a c t i v e . T h e P L S p r e d i c t i o n s f o r t h e m e t h o x y l c o n t e n t p e r C 9 u n i t f o r t h e c o n c e n t r a t i o n - n o r m a l i z e d s p e c t r a a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 5 . 1 2 . T h e s t a n d a r d e r r o r i n t h e p r e d i c t i o n s i s : 1 : 0 . 0 3 , w i t h a n r 2 f o r t h e a n a l y s i s o f 0 . 9 9 3 5 . T h e v a l u e s a n d a v e r a g e s f o r t h e c o n t r o l s f o r e a c h c a s e ( u n c e r t a i n t i e s e s t i m a t e d a s a b o v e ) a r e a s f o l l o w s : ( 1 . ) L I P A l o n e B C : 1 . 3 2 : 1 ; 0 . 0 3 , C o n t r o l s : 1 . 3 4 : 1 ; 0 . 0 3 ( 9 5 % c o n fi d e n c e ) ; ( 2 . ) L I P + M N P B C : 1 . 3 3 i 0 . 0 3 , C o n t r o l s : 1 . 3 4 : 1 ; 0 . 0 3 ; a n d ( 3 . ) M N P A l o n e B C : 1 . 3 1 : 1 ; 0 . 0 3 , C o n t r o l s : 1 . 3 5 : 1 ; 0 . 0 3 . T h u s , t h e r e w a s n o c h a n g e i n t h e m e t h o x y l c o n t e n t f o r a n y e n z y m e c a s e , i n d i c a t i n g t h a t i f l i g n i n w a s r e m o v e d f o r a n y o f t h e e n z y m e B C s , t h e r e m o v a l w a s h o m o g e n e o u s w i t h r e s p e c t t o t h e a m o u n t s o f s y r i n g y l ( 2 m e t h o x y l s p e r u n i t ) a n d g u a i a c y l ( 1 m e t h o x y l p e r u n i t ) u n i t s . U n f o r t u n a t e l y , t h e P L S a n a l y s i s f o r p h e n o l i c h y d r o x y l c o n t e n t s w a s n o t s u c c e s s f u l . T h e p h e n o l i c h y d r o x y l P L S c a l c u l a t i o n i s c a l i b r a t e d , a s w i t h t h e o t h e r p r o g r a m s , w i t h m i l l e d w o o d l i g n i n s , w h i c h a r e n o t g e n e r a l l y e x p e c t e d t o h a v e l o w e r t h a n 0 . 7 0 O H g r o u p s p e r a r o m a t i c u n i t ( t h e l o w e r e n d o f t h e c a l i b r a t i o n r a n g e f o r t h e m i l l e d w o o d l i g n i n s u s e d t o c a l i b r a t e t h e P L S m e t h o d ; B . H a m e s , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n ) ; 1 9 1 T a b l e 5 . 1 2 : M e t h o x y l c o n t e n t s o f t h e l i g n i n r e c o v e r e d f r o m t h e r e a c t o r r u n s f o r e a c h B a s e C a s e a n d i t s c o n t r o l s , a s p r e d i c t e d b y t h e F T I R / P L S t e c h n i q u e ( H a m e s e r a l . , 1 9 9 1 ) . T h e s t a n d a r d e r r o r o f t h e p r e d i c t i o n a n d t h e r 2 f o r t h e c a l i b r a t i o n w i t h m i l l e d w o o d l i g n i n s a r e l i s t e d a t t h e b o t t o m o f t h e c o l u m n . M e t h o x y l S a m p l e ! C o n t e n t C a s e P e r C 9 U n i t L I P O n l y B C 1 . 3 2 R ‘ 1 . 3 5 E ' 1 . 3 4 A B 1 . 3 5 E R “ 1 . 3 2 L I P + M N P B C 1 . 3 3 R ‘ 1 . 3 4 E ’ 1 . 3 3 A B 1 . 3 3 E R ’ 1 . 3 6 M N P O n l y B C 1 . 3 1 R ' 1 . 3 6 E 1 . 3 6 A B 1 . 3 4 E R 1 . 3 3 S t d . E r r o r 0 . 0 3 1 2 0 . 9 9 3 5 1 9 2 t h i s i s b e c a u s e m i l l e d w o o d l i g n i n s a r e s m a l l e r ( d i o x a n e - e x t r a c t a b l e ) l i g n i n f r a g m e n t s , a n d a r e e x p e c t e d t o h a v e a s i g n i fi c a n t n u m b e r o f f r e e p h e n o l i c h y d r o x y l s o n t h e e n d u n i t s o f t h e l i g n i n p o l y m e r ( r e c a l l t h a t t h e m o s t c o m m o n i n t e r m o n o m e r l i g n i n b o n d i s t h e 6 - 0 - 4 e t h e r l i n k a g e , w h i c h u s e s u p t h e r i n g - b o u n d o x y g e n s p a r a - t o t h e a l i p h a t i c s i d e c h a i n w h i c h o t h e r w i s e w o u l d r e m a i n a s h y d r o x y l s ) . T h e r 2 f o r t h e c a l i b r a t i o n o f t h i s P L S m e t h o d i s 0 . 9 8 8 . T h e p r e d i c t e d p h e n o l i c h y d r o x y l c o n t e n t s f o r a l l s a m p l e s w e r e 0 . 0 0 : 1 ; 0 . 0 7 O H g r o u p s p e r a r o m a t i c u n i t , w h i c h i s w e l l b e l o w t h e c a l i b r a t i o n r a n g e . T h e o n l y c o n c l u s i o n t h a t c a n b e d r a w n f r o m t h e p h e n o l i c h y d r o x y l a n a l y s i s , t h e n , i s t h a t t h e p h e n o l i c h y d r o x y l c o n t e n t s a r e b e l o w 0 . 7 0 O H g r o u p s p e r a r o m a t i c u n i t . T h i s , i n t u r n , i n d i c a t e s t h a t a l l o f t h e l i g n i n s a m p l e s a r e h i g h l y p o l y m e r i c , w h i c h i s s u p p o r t e d b y t h e f a c t t h a t a t l e a s t t h e s t a r t i n g m a t e r i a l w a s c o m p l e t e l y i n s o l u b l e i n a n y l i g n i n s o l v e n t . T h i s a l s o i n d i c a t e s t h a t i f a n y s i g n i fi c a n t d e g r a d a t i o n o f t h e l i g n i n o c c u r r e d , i t m u s t h a v e o c c u r r e d n e a r t h e f r e e p h e n o l i c e n d s o f t h e l i g n i n p o l y m e r s o a s n o t t o i n c r e a s e t h e f r e e p h e n o l i c h y d r o x y l c o n t e n t . 5 . 1 3 G C / M S A n a l y s i s o f S o l u b i l i z e d C o m p o u n d s T h e m a s s s p e c t r u m o f t h e i n t e r n a l s t a n d a r d ( 2 - c h l o r o - 5 - t r i fl u o r o m e t h y l b e n z o i c a c i d ( m o n o - T M S e t h e r ) ) i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 5 3 . N o t e t h e c l e a r p r e s e n c e o f c h l o r i n e i n t h e m a s s s p e c t r u m e v i d e n c e d b y t h e 3 " ’ C l / “ C l n a t u r a l a b u n d a n c e i s o t o p e p a t t e r n s f o r t h e f r a g m e n t s a t m / z 2 8 1 , 2 3 7 , 2 0 7 , a n d 1 7 9 . T h e p e a k e l u t e d f r o m t h e D B S - M S c o l u m n i n t h e e a r l y s a m p l e s ( M N P O n l y r u n s ) a t a b o u t 8 ’ 1 5 " ( s c a n n u m b e r 5 5 0 ) , a n d e l u t e d f r o m t h e D B - l c o l u m n i n t h e l a t e r s a m p l e s ( L I P O n l y , L I P + M N P , a n d S T D M i x ) a t a b o u t 7 ’ 3 0 ” ( s c a n n u m b e r 5 0 0 ) . T h i s p e a k w a s u s e d d u r i n g t h e c o m p a r i s o n o f T o t a l I o n C h r o m a t o g r a m s ( T I C s ) f r o m t h e B C s a n d t h e i r c o n t r o l s b o t h a s a n i n t e r n a l s t a n d a r d f o r a p p r o x i m a t e q u a n t i t a t i o n , a n d a s a r e f e r e n c e p e a k t o c o r r e c t f o r s m a l l d i f f e r e n c e s i n r e t e n t i o n t i m e s a m o n g t h e B a s e C a s e e x t r a c t s a n d t h e e x t r a c t s f r o m t h e c o n t r o l s . T h e c o n t r o l s w h i c h w e r e r u n f o r e a c h e n z y m e c a s e ( L I P A l o n e , M N P A l o n e , a n d w o w m n — w < a 1 9 3 C O O H 0 0 5 9 0 - 2 5 6 5 ” 2 6 + 1 . , 3 0 0 1 1 / 2 F i g u r e 5 . 5 3 : E l e c t r o n - i m p a c t m a s s 5 e c t r u m o f t h e i n t e r n a l s t a n d a r d , 2 - c h l o r o - 5 - g r i fl u o r o m e t h y l - b e n z o i c a c i d ( m o n o - S d e r i v a t i v e ) . T h e s p e c t r u m w a s o b t a i n e d o m s c a n 4 9 9 7 ’ 2 8 " ) a f t e r e l u t i o n f r o m t h e D B - l G C c o l u m n . T h e b a c k g r o u n d s u b t r a c t i o n w a s t h e a v e r a g e o f s c a n s 4 9 5 a n d 5 0 1 . 1 9 4 L I P + M N P ; s e e T a b l e s 4 . 6 - 4 . 8 ) w e r e d e s i g n e d s p e c i fi c a l l y t o s c r e e n o u t p r o d u c t s w h i c h w e r e n o t r e l e a s e d f r o m t h e l i g n i n b y t h e a c t i v i t i e s o f t h e p e r o x i d a s e e n z y m e s w h e n a l l n e c e s s a r y r e a g e n t s w e r e p r e s e n t . T h e s e c o n t r o l s i n c l u d e d : ( 1 ) L ‘ C o n t r o l : E n z y m e ( s ) + r e a g e n t s ( 1 1 2 0 2 + / - V A + / - M n ( I I ) ) + 0 2 + b u f f e r , t o s c r e e n o u t p r o d u c t s o f o x i d a t i o n o f V A b y L I P , a n d / o r p r o d u c t s f r o m t h e a c t i o n o f [ M n ( I I I ) - t a m ] o n M N P s o l u t i o n c o n t a m i n a n t s ; ( 2 ) R ' C o n t r o l : E n z y m e ( s ) + l i g n i n + 0 2 + b u f f e r , t o s c r e e n o u t c o m p o u n d s p r o d u c e d b y t h e a c t i o n o f a n y p r o t e i n o r c o m p o u n d p r e s e n t i n t h e e n z y m e m i x t u r e ( s ) o t h e r t h a n t h e p e r o x i d a s e e n z y m e s ( L I P a n d / o r M N P ) ; ( 3 ) E ’ C o n t r o l : L i g n i n + r e a g e n t s + 0 2 + b u f f e r , t o s c r e e n o u t c o m p o u n d s a r i s i n g p u r e l y f r o m t h e a c t i o n o f t h e r e a g e n t s o n t h e l i g n i n o r o n l o w m o l e c u l a r w e i g h t e x t r a c t i v e s s t i l l p r e s e n t i n t h e l i g n i n ; ( 4 ) A E C o n t r o l : A u t o c l a v e d ( i n a c t i v e ) e n z y m e ( s ) + r e a g e n t s + O ; + b u f f e r , t o s c r e e n o u t p r o d u c t s a r i s i n g f r o m t h e a c t i o n o f f r e e ( n o n — e n z y m e — b o u n d ) h e m e ( i n t h e p r e s e n c e o f H 2 0 2 ) ; a n d ( 5 ) E R ' C o n t r o l : L i g n i n + 0 2 + b u f f e r , t o s c r e e n o u t l o w m o l e c u l a r w e i g h t c o m p o u n d s ( e x t r a c t i v e s ) a l r e a d y p r e s e n t i n t h e l i g n i n . T h e s a m p l e s ( l i q u i d a n d s o l i d ) f r o m t h e s e c o n t r o l s w e r e h a n d l e d a n d a n a l y z e d b y G C / M S i n e x a c t l y t h e s a m e m a n n e r a s t h e B a s e C a s e s ( B C s : E n z y m e ( s ) + r e a g e n t s + l i g n i n + O , + b u f f e r ) . I n a d d i t i o n , s e p a r a t e s a m p l e s o f t h e i n t e r n a l s t a n d a r d ( i n e t h y l a c e t a t e ) w e r e a n a l y z e d b y G C / M S t o s c r e e n o u t c o n t a m i n a n t s i n t h e s t o c k s u p p l y o f t h e i n t e r n a l s t a n d a r d ( 2 0 1 1 L o f w h i c h w a s a d d e d t o e a c h e x t r a c t b e f o r e c o n c e n t r a t i o n ) . T h u s , a n y p e a k ( c o m p o u n d ) f o u n d i n a B C e x t r a c t w h i c h w a s u n i q u e t o t h e B C c o u l d o n l y b e a c o m p o u n d r e l e a s e d f r o m t h e l i g n i n b y t h e a c t i v e e n z y m e ( s ) i n t h e p r e s e n c e o f t h e i r r e q u i r e d r e a g e n t s . T h e m a s s s p e c t r a f r o m t h e p e a k s r e m a i n i n g a f t e r c o m p a r i s o n o f t h e T I C s o f t h e B C e x t r a c t s w i t h t h o s e o f t h e e x t r a c t s o f t h e c o n t r o l s w e r e a n a l y z e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r s t r u c t u r e s c o n s i s t e n t w i t h l i g n i n - d e r i v e d p r o d u c t s c o u l d b e e l u c i d a t e d f o r t h e c o m p o u n d s . F o r a l l s p e c t r a e x c e p t o n e s w h i c h w e r e m a t c h e d w i t h s p e c t r a i n t h e N I S T o r W i l e y d a t a b a s e s , o r m a t c h e d w i t h p u b l i s h e d s p e c t r a , a g e n e r a l a p p r o a c h w a s t a k e n d u e t o t h e f a c t t h a t m a n y o f t h e c o m p o u n d s w e r e i n v e r y l o w c o n c e n t r a t i o n s 1 9 5 ( c o n c e n t r a t i o n s e s t i m a t e d f r o m t h e p r o p o r t i o n a l i t y c o n s t a n t w i t h p e a k a r e a f o r t h e i n t e r n a l s t a n d a r d ) a n d t h e i r m a s s s p e c t r a c o n t a i n e d p e a k s w h i c h w e r e d u e t o n o i s e . T h i s p r o c e d u r e i s d e s c r i b e d b e l o w . 5 . 1 3 . 1 S t r u c t u r a l A n a l y s i s P r o c e d u r e T h e fi r s t s t e p i n s t r u c t u r e d e t e r m i n a t i o n w a s t o i d e n t i f y t h e m o l e c u l a r i o n ( a r o m a t i c c o m p o u n d g e n e r a l l y h a v e h i g h a b u n d a n c e m o l e c u l a r i o n s ) . T h e n e x t s t e p w a s t o d e t e r m i n e h o w m a n y T M S e t h e r s w e r e f o r m e d w i t h f r e e h y d r o x y l o r c a r b o x y l g r o u p s p r e s e n t i n t h e c o m p o u n d ( l o s s o f 1 , 2 , a n d 3 S i ( C H 3 ) 3 g r o u p s g i v e s c h a r a c t e r i s t i c p e a k s i n t h e m a s s s p e c t r u m a t 7 3 , 1 4 7 , a n d s o m e t i m e s 2 2 1 , r e s p e c t i v e l y , i n d i c a t i n g t h e d e g r e e o f d e r i v a t i z a t i o n a n d t h e m i n i m u m n u m b e r o f o x y g e n s ) f r o m t h e m a s s s p e c t r u m . I t w a s a s s u m e d t h a t t h e c o m p o u n d s w e r e l i g n i n — d e r i v e d b a s e d o n t h e i r a b s e n c e i n t h e c o n t r o l s ( w h i c h w e r e c a r e f u l l y p l a n n e d t o e l i m i n a t e p r o d u c t s w h i c h w e r e n o t l i g n i n - d e r i v e d p r o d u c t s r e l e a s e d b y p e r o x i d a s e a c t i v i t y ) a n d a s e p a r a t e l y r u n s a m p l e o f t h e i n t e r n a l s t a n d a r d , a n d t h e r e f o r e c o u l d o n l y c o n t a i n C , H , a n d O a t o m s , s o t h e m o l e c u l a r i o n h a d t o b e a n e v e n n u m b e r . N o t e t h a t t h e a d d i t i o n o f n T M S e t h e r s ( M W 7 3 ) t o t h e c o m p o u n d d o e s n o t c h a n g e t h e f a c t t h a t t h e c o m p o u n d m u s t b e e v e n m o l e c u l a r w e i g h t , s i n c e a h y d r o g e n a t o m i s l o s t f o r e a c h T M S e t h e r f o r m e d . A n y p e a k s w i t h c l e a r l y o d d m o l e c u l a r w e i g h t m o l e c u l a r i o n s w e r e d i s c a r d e d . I t s h o u l d b e n o t e d h e r e t h a t n o T M S - d e r i v a t i z e d c o m p o u n d s w e r e s e e n w h i c h d i d n o t h a v e a c l e a r m o l e c u l a r i o n , b u t h a d a c l e a r M * - 1 5 p e a k , c o r r e s p o n d i n g t o t h e l o s s o f a m e t h y l g r o u p f r o m a T M S e t h e r ( t h i s t y p e o f s p e c t r u m w o u l d a p p e a r t o i n d i c a t e a n o d d m o l e c u l a r w e i g h t ) . I t w a s t h e n a s s u m e d t h a t t h e l i g n i n - d e r i v e d p r o d u c t s w o u l d r e t a i n t h e i r r i n g s t r u c t u r e , w h e t h e r i n t h e a r o m a t i c o r q u i n o n e f o r m s . N e x t , p o s s i b l e m o l e c u l a r f o r m u l a s w e r e d e t e r m i n e d b y c h o o s i n g a n u m b e r o f c a r b o n s ( 6 o r h i g h e r ) a n d o x y g e n s ( 1 t o 1 0 f o r d e r i v a t i z e d m o l e c u l a r w e i g h t s 4 0 0 a n d b e l o w , 1 t o 1 5 i f h i g h e r ) a n d c a l c u l a t i n g t h e n u m b e r o f h y d r o g e n s n e c e s s a r y t o c o m p l e t e t h e m o l e c u l a r w e i g h t . A n y m o l e c u l a r f o r m u l a s w i t h l e s s t h a n 1 h y d r o g e n o r 2 n + 2 ( w h e r e n i s t h e n u m b e r o f c a r b o n s ) o r m o r e h y d r o g e n s 1 9 6 ( c o m p l e t e l y s a t u r a t e d h y d r o c a r b o n s h a v e 2 n + 2 h y d r o g e n s ) w e r e d i s c a r d e d . A n y m o l e c u l a r f o r m u l a w h i c h d i d n o t c o n t a i n a t l e a s t a s m a n y o x y g e n s a s t h e n u m b e r o f T M S g r o u p s w a s d i s c a r d e d . T h e n u m b e r o f r i n g s p l u s d o u b l e b o n d s ( h e r e a f t e r r e f e r r e d t o a s ” r + d b " ) ( M c L a f f e r t y , 1 9 7 3 ) w e r e t h e n c a l c u l a t e d a s h a l f o f t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e n u m b e r o f h y d r o g e n a t o m s i n a c o m p l e t e l y s a t u r a t e d h y d r o c a r b o n ( 2 n + 2 ) a n d t h e n u m b e r o f h y d r o g e n s i n t h e m o l e c u l a r f o r m u l a ( i e . f o r b e n z e n e , C o l - I 6 , r + d b i s ( 2 x 6 + 2 - 6 ) + 2 = 4 r + d b , o r 1 r i n g a n d 3 d o u b l e b o n d s ) . A n y p o s s i b i l i t i e s w i t h l e s s t h a n 4 r + d b ( c o u l d n o t b e a r o m a t i c o r q u i n o n e s t r u c t u r e s ) w e r e d i s c a r d e d . N e x t , t h e d e g r e e o f s a t u r a t i o n a n d n u m b e r o f o x y g e n s w e r e e x a m i n e d . A n y f o r m u l a w h i c h d i d n o t h a v e a t l e a s t 2 o x y g e n s p e r C 9 u n i t w e r e d i s c a r d e d ( a n i n s p e c t i o n o f F i g u r e 1 . 1 w i l l v a l i d a t e t h i s ) , a n d a n y f o r m u l a w h i c h h a d s i g n i fi c a n t l y f e w e r h y d r o g e n s t h a n t h e n u m b e r o f c a r b o n s w a s d i s c a r d e d ( e g . C 1 7 H 4 0 6 , w h i c h i s t y p i c a l o f h i g h l y u n s a t u r a t e d n a p h t h a - b a s e d s t r u c t u r e s , b u t n o t l i g n i n - d e r i v e d c o m p o u n d s ) . T h e r e m a i n i n g f o r m u l a s ( u s u a l l y 2 t o 4 p e r m o l e c u l a r w e i g h t p o s s i b i l i t y ) w e r e c o n s i d e r e d t o b e v i a b l e p o s s i b i l i t i e s a n d s t r u c t u r e s w e r e c o n s i d e r e d u s i n g t h e m o l e c u l a r f o r m u l a a n d n u m b e r o f r + d b , a n d a s s u m i n g t h a t t h e b a s e u n i t f o r a n y o f t h e c o m p o u n d s w o u l d b e a s i x m e m b e r e d r i n g w i t h 1 t o 3 c a r b o n - e a r b o n d o u b l e b o n d s a n d w i t h a t l e a s t 2 s u b s t i t u t i o n s t o t h e r i n g ( n o l i g n i n - d e r i v e d m o n o m e r s h o u l d h a v e a n y l e s s ; s e e F i g u r e 1 . 1 ) . I f t h e n u m b e r o f c a r b o n s w a s h i g h e r t h a n 1 0 a n d t h e m o l e c u l a r w e i g h t w a s s u c h t h a t i t w a s c l e a r f r o m t h e n u m b e r o f r + d b t h a t t h e c o m p o u n d c o n t a i n e d o n l y a s i n g l e r i n g , c a r b o n s w e r e g e n e r a l l y a d d e d t o t h e a l i p h a t i c s i d e c h a i n ( u p t o 3 ) , a n d t h e n t o t h e h y d r o x y l a t p o s i t i o n 4 o f t h e r i n g ( i e . o c c u r r i n g v i a a B - O — 4 i n t e r m o n o m e r b o n d ) , a n d fi n a l l y , t h r o u g h a n e t h e r l i n k a g e t o t h e fi - c a r b o n o f t h e p r o p y l s i d e c h a i n ( i e . o c c u r r i n g v i a a n a d d i t i o n a l B — O — 4 o r B - l l i n k e d i n t e r m o n o m e r b o n d ) . A n y f o r m u l a s f o r w h i c h t h e s e c o n s t r a i n t s w e r e n o t p o s s i b l e w e r e d i s c a r d e d . A n y s t r u c t u r e s w h i c h , i n g e n e r a l , d i d n o t c o n f o r m t o t h e g r e a t m a j o r i t y o f t h e s e c o n s t r a i n t s w e r e d i s c a r d e d . T h e s t r u c t u r e s w e r e t h e n c o m p a r e d w i t h t h e m a s s s p e c t r a o b t a i n e d f o r t h a t p e a k f r o m t h e s a m p l e a n a l y s i s . A n y s t r u c t u r e s w h i c h c o n t a i n e d 1 9 7 g r o u p s w h i c h c o u l d n o t p o s s i b l y b e a c c o u n t e d f o r b y m a s s l o s s e s i n t h e m a s s s p e c t r u m w e r e d i s c a r d e d , u n l e s s t h e n o i s e l e v e l i n t h e m a s s s p e c t r u m w a s h i g h e n o u g h t o m a s k l o w l e v e l i o n fi a g m e n t s ; t h i s y i e l d e d t h e fi n a l s e t o f s t r u c t u r a l p o s s i b i l i t i e s . T h e r e s u l t s o f t h e s e a n a l y s e s a r e p r e s e n t e d i n t h i s s e c t i o n , s t a r t i n g w i t h t h e L I P O n l y e n z y m e c a s e . T h e p r o c e d u r e w i l l b e d e s c r i b e d i n d e t a i l o n l y f o r t h e fi r s t u n k n o w n c o m p o u n d ; o n l y t h e r e s u l t s o f t h e p r o c e d u r e w i l l p r e s e n t e d f o r l a t e r s p e c t r a . N o t e t h a t i n t h e f o l l o w i n g s e c t i o n s , s i n c e t h e r e w e r e f o u r e x t r a c t s a n a l y z e d p e r r e a c t o r r u n ( i e . B C a n d e a c h c o n t r o l e x c e p t f o r t h e L ' c o n t r o l s , i n w h i c h t h e r e w e r e o n l y 2 ) , e a c h e x t r a c t w i l l b e d e a l t w i t h s e p a r a t e l y . T h e e x t r a c t s w i l l b e r e f e r r e d t o w i t h s h o r t h a n d n o t a t i o n t o s a v e s p a c e , a s f o l l o w s : ( 1 . ) C h l o r o f o r m e x t r a c t o f l i q u i d p h a s e , L - C ; ( 2 . ) E t h y l a c e t a t e e x t r a c t o f l i q u i d p h a s e , L - E A ; ( 3 . ) C h l o r o f o r m e x t r a c t o f s o l i d , S - C ; a n d ( 4 . ) E t h y l a c e t a t e e x t r a c t o f s o l i d p h a s e , S - E A . F i n a l l y , n o t e t h a t w h e n c o n c e n t r a t i o n e s t i m a t e s a r e g i v e n , t h e y a r e e s t i m a t e s o f t h e c o n c e n t r a t i o n s i n t h e u n c o n c e n t r a t e d e x t r a c t s . S i n c e t h e i n i t i a l v o l u m e s o f t h e e x t r a c t s b e f o r e c o n c e n t r a t i o n r a n g e d f r o m a b o u t 1 5 0 0 - 1 9 0 0 1 1 L , c o n c e n t r a t i o n t o d r y n e s s a n d t h e a d d i t i o n o f 2 5 1 1 L o f B S T F A w o u l d m a k e t h e fi n a l ( c o n c e n t r a t e d ; v a l u e m e a s u r e d b y i n t e g r a t i o n o f t h e T I C ) v a l u e s o f c o n c e n t r a t i o n f r o m a b o u t 5 6 t o 7 6 t i m e s h i g h e r t h a n i n t h e u n c o n c e n t r a t e d e x t r a c t s . T h e e s t i m a t e d c o n c e n t r a t i o n s a r e g i v e n f o r t h e u n c o n c e n t r a t e d e x t r a c t s s i n c e t h i s a l l o w s c o m p a r i s o n o f c o n c e n t r a t i o n s b e t w e e n d i f f e r e n t e x t r a c t s f r o m a s i n g l e s a m p l e , a n d a l s o b e t w e e n e x t r a c t s f r o m o t h e r r e a c t o r r u n s . 5 . 1 3 . 2 L I P O n l y R e a c t o r R u n s A s a n e x a m p l e o f t h e G C o u t p u t o b t a i n e d f o r t h e L I P O n l y B C a n d c o n t r o l s a m p l e s , t h e T I C f o r t h e L I P O n l y S - E A e x t r a c t i s s h o w n i n F i g u r e 5 . 5 4 ; t h e L — C o r L - E A c h r o m a t o g r a m s a r e n o t s h o w n b e c a u s e t h e l a r g e a m o u n t o f V A p r e s e n t ( a b o u t 3 2 2 5 p p m f r o m a d d i t i o n t o t h e r e a c t o r , w h i l e t h i s m e t h o d a c c u r a t e l y d e t e c t s 1 - 7 0 p p m ) c a u s e s t h e y - s c a l e ( a b u n d a n c e ) t o b e s o l a r g e t h a t n o o t h e r p e a k s a r e s e e n i n t h e c o m p l e t e T I C . C l o s e t o 2 0 0 c l e a r p e a k s a r e p r e s e n t i n t h i s c h r o m a t o g r a m , a l t h o u g h s o m e a r e n o t c l e a r " " " " " " " " " " " " " " " 0 1 . 0 1 7 8 7 . 0 3 1 9 8 R . ‘ l ' . M a x 1 7 8 7 . 5 0 3 1 0 1 5 2 0 m a g . a b u n d . 1 0 0 ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ L ‘ ‘ A ‘ A A A A A r r c b 4 1 . 1 J n 8 0 . . d 4 a n 1 c 6 0 ‘ e 4 4 0 ‘ ” 1 | l . 1 , 1 3 m ' ' 1 6 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0 1 4 0 0 S e a n F i g u r e 5 . 5 4 : T o t a l I o n C h r o m a t o g r a m ( T I C ) f o r t h e e t h y l a c e t a t e e x t r a c t o f t h e L I P A l o n e B a s e C a s e s o l i d p h a s e o v e r t h e s c a n r a n g e 2 5 0 - 1 6 0 0 ( 3 ’ 4 4 " t o 2 3 ’ 5 8 " ) . 1 9 9 e v e n h e r e b e c a u s e o f t h e s c a l e . T h e p e a k a t a b o u t s c a n 4 9 5 ( 7 ’ 4 9 " ) i s t h e i n t e r n a l s t a n d a r d , w h i l e t h e p e a k s a t s c a n s 5 9 5 ( 8 ’ 5 3 ” ) a n d 6 9 5 ( 1 0 ’ 2 4 " ) w e r e i d e n t i fi e d u s i n g a u t h e n t i c s t a n d a r d s ( b o t h f r o m A l d r i c h ) a s v e r a t r a l d e h y d e a n d v e r a t r y l a l c o h o l ; t h e i r s p e c t r a a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e s 5 . 5 5 a a n d 5 . 5 5 b , r e s p e c t i v e l y . S y r i n g a l d e h y d e ( s c a n 7 9 5 , 1 1 ’ 5 4 " ) , v a n i l l i c a c i d ( s c a n 8 5 7 , 1 2 ’ 5 0 " ) , a n d s y r i n g i c a c i d ( s c a n 9 5 3 , 1 4 ’ 1 6 " ) w e r e i d e n t i fi e d i n a l l s a m p l e s ( c o n t r o l s i n c l u d e d ) w i t h t h e e x c e p t i o n o f t h e L ’ c o n t r o l e x t r a c t s , i n d i c a t i n g t h a t t h e c o m p o u n d s w e r e p r e s e n t i n t h e l i g n i n i t s e l f a s e x t r a c t i v e s , a l t h o u g h a t v e r y l o w c o n c e n t r a t i o n s ( a t o r b e l o w 0 . 1 p p m i n t h e u n c o n c e n t r a t e d e x t r a c t s ) f o r a l l e x c e p t s y r i n g a l d e h y d e , w h i c h w a s a s h i g h a s 0 . 2 5 p p m i n s o m e c o n t r o l s a m p l e s ( u n c o n c e n t r a t e d e x t r a c t s ) ; t h e y w e r e a l s o i d e n t i fi e d b y a u t h e n t i c s t a n d a r d s ( a l l f r o m A l d r i c h ) , a n d t h e i r s p e c t r a a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e s 5 . 5 6 a - c , r e s p e c t i v e l y . S y r i n g a l d e h y d e w a s p r e s e n t i n m u c h h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s i n t h e c o n t r o l e x t r a c t s t h a n i n t h e B C e x t r a c t s ; t h i s p o i n t w i l l b e d e a l t w i t h i n t h e M N P O n l y s e c t i o n b e l o w . F i n a l l y , 3 , 5 - d i m e t h o x y h y d r o q u i n o n e ( s c a n 7 8 6 , 1 1 ’ 4 6 " ; c o r r e c t l y n a m e d 2 , 6 — d i m e t h o x y - h y d r o q u i n o n e , b u t r e f e r r e d t o h e r e a s 3 , 5 - t o i l l u s t r a t e i t s r e l a t i o n s h i p t o t h e s y r i n g y l - s t r u c t u r e ) a n d 3 - m e t h o x y h y d r o q u i n o n e ( s c a n 6 7 3 , 1 0 ’ 0 4 " ; c o r r e c t l y , 2 - m e t h o x y - h y d r o q u i n o n e , u s e o f 3 - r e f e r s t o g u a i a c y l - s t r u c t u r e ) w e r e a l s o i d e n t i fi e d i n t h e m i x t u r e s , b u t c o m p a r i s o n w i t h p u b l i s h e d s p e c t r a f o r t h e s e c o m p o u n d s ( W a r i i s h i e t a l . , 1 9 8 9 a ; V a l l i e t a l . , 1 9 9 2 b ) . 2 , 6 — d i m e t h o x y h y d r o q u i n o n e w a s p r e s e n t i n a l l s a m p l e s ( a l t h o u g h m u c h m o r e w a s p r e s e n t i n t h e B C e x t r a c t s , w h i l e 2 - m e t h o x y h y d r o q u i n o n e w a s p r e s e n t o n l y i n t h e e t h y l a c e t a t e e x t r a c t o f t h e l i q u i d p h a s e f r o m t h e B C . T h e i r s p e c t r a a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e s 5 . 5 7 a a n d 5 . 5 7 b . T h e p e a k s f o r a l l e x t r a c t s f o r t h e L I P A l o n e B C w h i c h w e r e n o t e l i m i n a t e d b y c o m p a r i s o n w i t h t h e c h r o m a t o g r a m s o f t h e c o n t r o l s a n d t h e s t a n d a r d a l o n e a r e p r e s e n t e d , w i t h c o n c e n t r a t i o n e s t i m a t e s ( c o n c e n t r a t i o n s i n t h e u n c o n c e n t r a t e d e x t r a c t s ) , i n T a b l e 5 . 1 3 . N o n e o f t h e s e p e a k s ( o r t h e i r s p e c t r a ) w e r e p r e s e n t i n a n y e x t r a c t f r o m a n y o f t h e c o n t r o l s , i n d i c a t i n g t h e i r p r o b a b l e o r i g i n a s l i g n i n - d e r i v e d . N o t e t h a t n o u n i q u e p e a k s 2 0 0 ( a . ) 1 0 0 i 1 6 6 a C H O , e l 8 0 " e a 4 t 1 i 1 t V 6 0 ‘ O C H 3 ’ e ‘ 1 O C H 3 ’ A r b 4 0 ‘ r u 1 n d 9 5 a 2 0 ‘ ' n 4 7 7 1 1 1 C 1 5 1 r 6 5 e r 1 5 1 9 1 1 7 I 1 - 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 . 1 1 1 1 1 . 9 1 1 2 1 1 1 . ( I J I I ' 1 1 1 1 1 T : 1 1 Y 1 : 1 fl 1 ' - I ' 1 ' 1 ' r ' r ' V 1 Y 1 r v 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 “ / 2 ( b . ) 1 0 0 1 5 1 R H 2 0 H e 1 8 0 ‘ _ a ‘ . t i ‘ . v 6 0 ‘ O C H 3 2 4 0 h e ‘ 1 ‘ O C H 3 A J b 4 0 ‘ ’ u ‘ r n ‘ 2 0 9 ’ d 7 3 I a 2 0 - _ n 4 2 S 1 4 s 7 o 2 ' . ( . 6 1 _ d n . . . 8 1 % . . . . l l r v l ~ . - _ . 1 . - . , . V 1 1 1 6 , 1 1 , 9 1 . A L - I 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 " / 2 F i g u r e 5 . 5 5 : E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s e c t r a o f : ( a . ) V e r a t r a l d e h ( 1 6 ; a n d ( b . ) V e r a t r y l A l c o h o l ( m o n o - T M S d e r i v a t i v e ) . 6 s p e c t r a w e r e o b t a i n e d o m s c a n s 6 0 4 ( 9 ’ 0 2 ) a n d 6 9 7 ( 1 0 2 6 " ) , r e s p e c t r v e l y , a f t e r e l u t i o n f r o m t h e D B - l G C c o l u m n . T h e b a c k g r o u n d s u b t r a c t i o n s w e r e f r o m s c a n s 5 9 1 a n d 6 8 9 . 2 0 1 1 0 0 1 2 2 4 , a * H O ; e 1 l 0 0 " y . l ‘ , t ‘ b 1 1 . v 6 0 ‘ H 3 C O O C H 3 ' ° 1 2 : 9 ' ( a . ) 1 0 H A ‘ 2 ‘ 4 ’ b 4 0 ‘ 1 I u 4 n i d 1 ' 2 0 ‘ n ‘ 7 3 C e 5 9 1 3 3 1 3 2 9 1 A - . 1 7 . . . n g a l . . . f . L 1 : 1 4 ” ? L + I ' L L . . _ L L I V r f a i n t 1 7 1 3 2 fi fi 1 v 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 1 1 / 2 1 ° ° 2 9 7 J R O O H 3 1 2 e 1 8 0 " a . t 4 i 1 v 6 0 " O C H 3 e 1 2 1 7 ( b . ) O H A 2 1 3 b ‘ ° ‘ 2 2 u 1 7 3 2 3 i n d ' 2 0 ' 1 6 1 3 b n t I 2 . I A S E V V . L L 9 4 ° ' . . 1 , 1 L I I J . L ' 1 , L - l - % , L - ' j - - 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 1 1 / 2 1 0 0 3 2 7 . 8 C O O H 3 2 > e 1 ’ 1 8 0 " r . ‘ > t ‘ ’ 1 . J O 3 1 2 > v w H 3 0 0 O C H 3 - e 1 > ( c . ) . 0 H A ‘ 7 3 b ‘ 0 2 7 u t r n 1 2 3 D d 4 1 ‘ 2 ° ‘ 2 3 2 3 I n 1 1 1 c I 9 1 s . = ' 9 1 1 ‘ 1 1 i - . 6 . - . - _ - - - L - 1 3 . - . - 1 . : A . . . A . - . 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 H / Z F i g u r e 5 . 5 6 : E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r a o f : ( a . ) S y r i n g a l d e h y d e ( m o n o - T M S d e r i v a t i v e g ; ( b . ) V a n i l l i c A c i d ( d i - T M S d e r i v a t i v e ) ; a n d ( 0 . ) S y r i a ' 0 A c i d ( d i - T M S d e r i v a t i v e . T h e s p e c t r a w e r e o b t a i n e d f r o m s c a n s 7 9 5 ( 1 1 ’ 5 4 " ) , 8 5 1 2 ’ 5 0 " ) , a n d 9 5 3 ( 1 4 ’ 1 6 " ) , r e s p e c t i v e l y , a f t e r e l u t i o n f r o m t h e D B - l G C c o l u m n . e b a c k g r o u n d s u b t r a c t i o n s w e r e t h e a v e r a g e s o f s c a n s 7 9 0 a n d 7 9 9 , 8 5 2 a n d 8 6 0 , a n d 9 4 7 a n d 9 5 6 , r e s p e c t i v e l y . 2 0 2 ( a . ) 1 0 0 a O H e 3 1 4 F l 8 0 “ . . a ‘ t i 1 l v 6 0 ‘ H 3 C 0 O C H 3 _ e ; 0 H A b 4 0 ‘ u d n d 7 3 a 2 0 ‘ n 4 2 9 b c 1 l e ; 5 9 8 9 2 1 2 ‘ 2 9 2 4 2 9 P o b 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 a n ( b . ) 1 0 0 ‘ l a C H . e b l 8 0 ‘ 2 E 4 _ a ; t b i l v 5 0 * O C H 3 L e 1 , O H 1 A . b 4 0 ‘ - U . n t d . a 2 0 ‘ 7 3 - n ‘ 2 9 9 F C 1 2 1 7 9 . e 1 n 5 9 3 9 1 3 1 5 1 2 1 2 3 0 ' 5 0 1 0 0 1 5 0 2 5 0 H / Z F i g u r e 5 . 5 7 : E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r a o f : ( a . ) 2 , 6 - d i m e t h o x y h d r o q u i n o n e ( d i - T M S d e r i v a t i v e ; m a t c h e d w i t h t h a t o f W a r i i s h i e t a l . ( 1 9 8 9 a ) ; a n ( b . ) 2 - m e t h o x y - h y d r o q u i n o n e ( d i - T M S d e r i v a t i v e ; m a t c h e d w i t h t h a t o f V i e t a l . ( 1 9 9 2 1 » ) . T h e s c t r a w e r e o b t a i n e d f r o m s c a n s 8 6 0 ( 1 2 5 2 " ) a n d 7 4 4 ( 1 1 ’ 0 8 " ) , r e s p e c t i v e l y , a f t e r e u t i o n f r o m t h e D B S M S G C c o l u m n . T h e b a c k g r o u n d s u b t r a c t i o n f o r ( a . ) w a s f r o m s c a n 8 5 8 , a n d f o r ( b . ) w a s f r o m t h e a v e r a g e o f s c a n s 7 4 2 a n d 7 4 6 . 2 0 3 T a b l e 5 . 1 3 : P e a k s i n t h e L I P A l o n e B C e x t r a c t s s e l e c t e d f o r s t r u c t u r a l a n a l y s i s b y c o m p a r i n g t h e T o t a l I o n C h r o m a t o g r a m s o f t h e B C e x t r a c t s w i t h t h e c o r r e s p o n d i n g e x t r a c t s o f i t s c o n t r o l s . T h e i d e n t i t y o f t h e c o m p o u n d i s l i s t e d i f k n o w n ; i f n o t , t h e p o s s i b l e m o l e c u l a r f o r m u l a s ( b a s e d o n t h e m o l e c u l a r w e i g h t d e t e r m i n e d f r o m t h e m a s s s p e c t r u m ) a r e l i s t e d . E s t . D e r i v a t i z e d N o . S c a n C o n e . M W . . T M S E x t r a c t N o . R T ’ ( n g / u L ) ( g / m o l e ) G r o u p s I d e n t i t y i f k n o w n L - C 1 0 6 9 1 6 0 0 " 0 . 0 2 5 6 3 7 0 ? 2 ? U n k n o w n L - E A 5 4 4 8 ' 0 8 " 0 . 1 6 5 6 1 8 2 0 C J ' I I o O 4 O m e H 1 4 O 3 L - E A 6 0 0 8 ' 5 9 ” 0 . 8 8 2 0 2 2 6 1 C 7 I ' 1 6 0 4 O f C Q H 1 0 0 3 L - E A 6 7 3 1 0 0 4 " 0 . 1 2 0 9 2 8 4 2 2 - m e t h o x y h y d r o q u i n o n e ' L - E A 7 4 5 “ n o " 0 . 0 9 2 5 2 8 2 2 p - h y d r o x y b e n z o i c a c i d " L - E A 7 5 2 l l ' l S " 0 . 9 2 2 6 2 5 6 0 C 9 H 1 2 0 4 + R e t e n t i o n t i m e w i t h D B - l G C c o l u m n a n d 3 . 7 5 m i n s o l v e n t h o l d . " ‘ I d e n t i fi e d b y c o m p a r i s o n w i t h s p e c t r u m o f V a l l i e t a l . ( 1 9 9 2 b ) . " I d e n t i fi e d b y c o m p a r i s o n w i t h s p e c t r u m i n N I S T d a t a b a s e . 2 0 4 w e r e f o u n d i n t h e S - C a n d S — E A e x t r a c t s ; o n e u n i q u e p e a k w a s i d e n t i fi e d i n t h e L - C e x t r a c t , a n d f o u r u n i q u e p e a k s w e r e i d e n t i f i e d i n t h e L - E A e x t r a c t ( 2 - m e t h o x y — h y d r o q u i n o n e w a s n o t u n i q u e t o t h e B C , b u t w a s a l s o p r e s e n t i n a l l o f t h e c o n t r o l s ) . 5 . 1 3 . 2 . 1 P e a k s I n T h e L I P A l o n e B C L - C E x t r a c t T h e m a s s s p e c t r u m f o r t h e l o n e u n i q u e p e a k i d e n t i fi e d i n t h e L - C e x t r a c t o f t h e L I P A l o n e B C a t s c a n 1 0 6 9 ( 1 6 ’ 0 0 ' ) i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 5 8 a , a n d t h e T I C a n d m a s s c h r o m a t o g r a m s f o r f r a g m e n t s o f m a s s e s 3 7 0 , 3 2 7 , 2 3 9 , a n d 1 5 1 o v e r t h e s e a n r a n g e 1 0 4 0 - 1 0 8 0 a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 5 8 b ( t h e m a s s c h r o m a t o g r a m i n d i c a t e s t h e a b u n d a n c e s i n t h e T I C o f f r a g m e n t s o f t h e g i v e n m a s s e s - - a p e a k i n t h e m a s s c h r o m a t o g r a m o f a f r a g m e n t t h a t c o r r e s p o n d s w i t h a p e a k i n t h e T I C i n d i c a t e s t h a t t h a t m a s s i s t r u l y p a r t o f t h e s p e c t r u m ) . T h e m a x i m u m a b u n d a n c e s f o r e a c h m a s s i n t h e m a s s c h r o m a t o g r a m a r e l i s t e d t o t h e r i g h t o f e a c h m a s s p l o t . W h i l e t h i s s p e c t r u m i s c l e a r l y t o o n o i s y t o i d e n t i f y t h e c o m p o u n d , t h e h i g h a b u n d a n c e o f m a s s 1 5 1 i n t h e s p e c t r u m s u g g e s t s a l i g n i n - d e r i v e d o r i g i n ( F a i x , 1 9 9 0 b ) . T h e c o m p o u n d m a y b e m o l e c u l a r w e i g h t 3 7 0 , b u t i t c l e a r l y c o n t a i n s t h e m a s s 1 5 1 f r a g m e n t , a s e v i d e n c e d b y t h e m a s s c h r o m a t o g r a m . 5 . 1 3 . 2 . 2 P e a k s I n T h e L I P A l o n e B C L - E A E x t r a c t a . S c a n 5 4 4 T h e m a s s s p e c t r u m f o r t h e p e a k i n t h e L - E A e x t r a c t a t s c a n 5 4 4 ( 8 ’ 0 8 ” ) i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 5 % ; i t s m a s s c h r o m a t o g r a m a n d t h e T I C i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 5 % o v e r t h e s c a n r a n g e 5 0 0 - 6 0 0 . T h i s s p e c t r u m i s m u c h c l e a n e r t h a n t h e p r e v i o u s s p e c t r u m f o r t h e L - C p e a k , o w i n g t o i t s h i g h e r c o n c e n t r a t i o n ; t h i s i s t h e p e a k f o r w h i c h t h e s t r u c t u r e a n a l y s i s m e t h o d w i l l b e d e m o n s t r a t e d . T h i s c o m p o u n d d o e s n o t c o n t a i n a n y f r e e h y d r o x y l s o r c a r b o x y l i c a c i d g r o u p s , a s e v i d e n c e d b y t h e a b s e n c e o f a p e a k o f m a s s 7 3 ( i f t h e c o m p o u n d i s d e r i v a t i z e d a t a l l , i t s h o u l d h a v e a p e a k o f ‘ s u b s t a n t i a l a b u n d a n c e a t m a s s 7 3 ) . A t fi r s t i n s p e c t i o n , i t d o e s n o t e v e n s e e m t o b e l i g n i n - d e r i v e d , s i n c e i t c o n t a i n s o n l y a n v e r y s m a l l p e a k a t m a s s 2 0 5 ( a . ) 1 0 0 . 1 5 1 l R P e l 1 9 0 ‘ 1 a ‘ , t 4 i l 2 . 9 v 6 0 - e W 1 1 7 9 r A i r b 4 0 1 3 7 0 h u J 6 4 1 ‘ 8 2 1 5 2 7 2 n t 3 7 a 2 0 ‘ 5 7 1 0 1 a 3 ‘ 3 6 b n 4 3 ‘ . c , 9 6 1 9 , e 1 o - . T - 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 “ / 2 0 1 . ) M a x 7 . 1 1 0 5 R . T . - - - . 1 1 5 . - ‘ L . m a g . a b u n d . ‘ r r c b u n , t 1 . o 1 1 0 . 9 4 5 d 1 5 1 a n C ' 1 1 . 0 7 . 1 1 0 5 e 2 3 9 ‘ 1 4 . 1 1 . 7 2 5 1 2 7 1 1 1 7 . 1 0 . 4 1 6 8 3 7 0 - - - , - - - , - j - . 4 f - - - L 1 1 1 4 . 9 0 . 4 7 6 0 1 ° ‘ ° 1 0 5 0 1 0 6 0 1 0 7 0 1 0 8 0 8 F i g u r e 5 . 5 8 : ( a . ) E l e c t r o n - i m a c t m a s s s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m s c a n 1 0 6 9 b a c k g r o u n d a v e r e o f s c a n s 1 7 a n d 1 0 7 0 ) o f t h e T I C f r o m t h e L I P A l o n e B C b e x t r a c t ; a n d ( b . ) C a n d m a s s c h r o m a t o g r a m s f o r i o n s o f m a s s 1 5 1 , 2 3 9 , 3 2 7 , a n d 3 7 0 o v e r t h e s c a n r a n g e 1 0 4 0 - 1 0 8 0 . 5 0 0 - 5 2 0 5 4 0 5 6 0 5 8 0 - - - H 0 6 0 1 . 3 2 7 . 8 8 9 9 2 0 6 ( a . ) 1 0 0 1 1 & 9 ’ “ ‘ : e I - 1 8 0 ‘ 1 5 2 . a ‘ b t 1 5 4 r 1 ‘ 1 1 1 _ v 6 0 ‘ e 1 A b 4 0 7 r u 1 . n ‘ p d . 2 2 0 ‘ 6 9 9 3 ’ 5 3 . . ‘ l | ” 1 l 1 1 5 e . I A l l 1 " ; l ' é l i l v l l l : h e l l l ! l l | n V A v 1 I l l : I ' 1 1 1 ' I 1 1 I [ A V A A v v [ 1 l : v 1 ' . ' v v V ‘ 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 " / 2 ( b . ) M a x 3 7 . 3 3 3 6 R . T . q n a g . a b u n d . A r r c b u n 1 W — v , . 1 . 0 1 3 2 0 . 7 3 d 1 1 1 a n c " 1 . 6 2 3 . 1 3 2 2 8 1 3 9 " 1 . 5 2 5 . 2 5 0 2 _ _ A . j J / \ \ ‘ _ ~ _ ‘ ‘ ” * - 1 . o 3 7 . 3 3 3 6 h ; 1 ’ S c a n F i g u r e 5 . 5 9 : ( a . ) E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m s c a n 5 4 4 ( b a c k g r o u n d a v e r a e o f s c a n s 5 4 2 a n d 5 4 7 ) o f t h e T I C f r o m t h e L I P A l o n e B C L — E A e x t r a c t ; a n d ( b . ) C a n d m a s s c h r o m a t o g r a m s f o r i o n s o f m a s s 1 1 1 , 1 3 9 , 1 5 4 , a n d 1 8 2 o v e r t h e s c a n r a n g e 5 0 0 - 6 0 0 . 2 0 7 1 0 7 . C o m p a r i s o n w i t h t h e s p e c t r u m o f u n d e r i v a t i z e d s y r i n g a l d e h y d e ( F i g u r e 5 . 6 0 ) , o b t a i n e d f r o m t h e N I S T d a t a b a s e , s h o w s s t r i k i n g s i m i l a r i t i e s ; n a m e l y , t h e p e a k s a t 1 3 9 , 1 1 1 , 9 3 , 7 9 , 6 9 , 6 5 , e t c . C l o s e r e x a m i n a t i o n o f t h e s p e c t r u m o f s c a n 5 4 4 i n d i c a t e s a v e r y s m a l l ( a l m o s t u n n o t i c e a b l e ) p e a k a t m a s s 1 6 7 . M o l e c u l a r f o r m u l a s p o s s i b l e f o r t h i s c o m p o u n d , w h i c h i s m o l e c u l a r w e i g h t 1 8 2 a n d d o e s n o t f o r m T M S e t h e r s , a r e ( r + d b i n b r a c e s ) : C 7 I - I 2 0 , { 7 } , C S H O O , { 6 } , € 9 1 1 , 0 0 4 { 5 } , ( 3 , 0 1 1 . 0 , { 4 } , C H H n O z { 3 } , C , , H 2 0 3 { 1 1 } , C a n O { 2 } , C 1 2 H 6 0 2 { 1 0 } , a n d C , , H , o O { 9 } . T h e f o r m u l a s C 7 H 2 0 6 , C n H 2 0 3 , a n d c a r g o , h a v e s i m p l y t o o h i g h a d e g r e e o f u n s a t u r a t i o n t o b e v i a b l e c h o i c e s a s l i g n i n — d e r i v e d p r o d u c t s ; t h u s , t h e y w e r e d i s c a r d e d . T h e f o r m u l a s C H I - 1 , 3 0 2 , C n s z O h a v e f e w e r t h a n 4 r + d b a n d s o c o u l d n o t b e a r o m a t i c o r q u i n o n e s t r u c t u r e s , a n d w e r e t h u s d i s c a r d e d . T h e f o r m u l a C n H l o O h a s t o o f e w o x y g e n s t o b e a l i g n i n - d e r i v e d p r o d u c t , s o i t w a s d i s c a r d e d . F i n a l l y , t h e f o r m u l a C 3 H 6 0 5 , w h i l e i n i t i a l l y s e e m i n g t o b e v a l i d , i s t o o u n s a t u r a t e d ( t o o m a n y r + d b f o r t h e n u m b e r o f c a r b o n s ) g i v e n t h e h i g h n u m b e r o f o x y g e n s a n d t h e l i m i t a t i o n t h a t i t m u s t c o n t a i n a d i - o r t r i - s u b s t i t u t e d s i x - m e m b e r e d a r o m a t i c o r q u i n o n e r i n g . T h u s , C 3 H 6 0 5 w a s d i s c a r d e d . T h a t l e f t o n l y € 9 1 1 , 0 0 4 a n d C w l - I u O 3 f o r f u r t h e r c o n s i d e r a t i o n . T h e m a s s s p e c t r u m i n d i c a t e d t h e p r e s e n c e o f a c a r b o n y l g r o u p ( l o s s o f 2 8 , f r o m 1 8 2 t o 1 5 4 ) , a m e t h y l g r o u p ( 1 5 l o s s f r o m 1 5 4 t o 1 3 9 ) , o r p o s s i b l y a m e t h o x y l g r o u p ( 3 1 l o s s f r o m 1 5 4 t o 1 2 3 ) . T h e c o m p o u n d h a s n o f r e e h y d r o x y l s a n d n o f r e e c a r b o x y l i c a c i d g r o u p s . I f t h e c o m p o u n d i s a r o m a t i c , i t i s n o t l i k e l y t o h a v e a n a l d e h y d e a t C 0 , , b e c a u s e c o m p l e t e l y u n d e r i v a t i z e d a r o m a t i c c o m p o u n d s t h a t c o n t a i n a l d e h y d e s a t C , g e n e r a l l y h a v e a c h a r a c t e r i s t i c a l l y h i g h a b u n d a n c e f r a g m e n t a t M + - 1 , c o r r e s p o n d i n g t o l o s s o f t h e h y d r o g e n a t o m l i n k e d t o t h e c a r b o n y l g r o u p o f t h e a l d e h y d e ( M c L a f f e r t y , 1 9 7 3 ; f o r a d e m o n s t r a t i o n o f t h i s p o i n t , r e f e r t o t h e s p e c t r a o f v e r a t r a l d e h y d e a n d u n d e r i v a t i z e d s y r i n g a l d e h y d e p r e s e n t e d i n F i g u r e s 5 . 5 5 b a n d 5 . 6 0 , r e s p e c t i v e l y ) , a n d t h i s c o m p o u n d d o e s n o t . T h u s t h e c a r b o n y l g r o u p i n d i c a t e d i n t h e m a s s s p e c t r u m m u s t e i t h e r b e f r o m a n a l d e h y d e s o m e w h e r e o t h e r t h a n C , o f a n a r o m a t i c r i n g , f r o m a k e t o g r o u p , o r f r o m 2 0 8 1 0 0 . 1 8 2 5 0 . 5 1 1 1 1 5 5 1 6 7 7 9 9 3 1 3 9 2 9 1 5 3 O . 1 2 3 2 0 4 O 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 ( M l B e n z a l d e h y d e . 4 - h y d r o x y - 3 . 5 - d i m e t h o x y - F i g u r e 5 . 6 0 : E l e c t r o n - i m p a c t m a s s 5 e c t r u m o f u n d e r i v a t i z e d s y r i n g a l d e h y d e o b t a i n f r o m t h e N I S T d a t a b a s e ( p r o v i d e d o r c o m p a r i s o n w i t h F i g u r e 5 . 5 9 a ) . 2 0 9 a n e s t e r g r o u p . P o s s i b l e s t r u c t u r e s a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 6 1 f o r b o t h m o l e c u l a r f o r m u l a s ; u n f o r t u n a t e l y , n o n e o f t h e s e c o m p o u n d s w e r e f o u n d t o b e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e , s o m a t c h i n g w i t h a n a u t h e n t i c s t a n d a r d i s n o t p o s s i b l e u n l e s s t h e c o m p o u n d s a r e s y n t h e s i z e d . S t r u c t u r e I s e e m s a l i k e l y c a n d i d a t e , s i n c e i t r e s e m b l e s a s y r i n g y l u n i t a n d t h e l a c k o f a r o m a t i c i t y i n t h e r i n g c o u l d c a u s e t h e a l d e h y d e f r a g m e n t l o s s o f 1 m a s s u n i t n o t t o a p p e a r ; i t m i g h t a l s o e x p l a i n t h e s i m i l a r i t y o f t h e m a s s s p e c t r u m t o t h a t o f u n d e r i v a t i z e d s y r i n g a l d e h y d e ( s e e F i g u r e 5 . 6 0 ) . S t r u c t u r e 1 1 i s n o t l i k e l y , d u e t o t h e p a r t i a l u n s a t u r a t i o n o f t h e r i n g w h i l e c o n t a i n i n g t w o o x o - g r o u p s o n t h e r i n g ; i n a d d i t i o n , i t i s n o t l i k e l y t h a t o x i d a t i v e r e l e a s e o f a c o m p o u n d c o n t a i n i n g a n u n o x i d i z e d m e t h y l k e t o n e a t C a w o u l d o c c u r f r o m l i g n i n t h r o u g h t h e a c t i v i t y o f L I P ( H a m m e l e t a l . , 1 9 8 5 ) . T h e s t a b i l i t y o f s t r u c t u r e I I I i s q u e s t i o n a b l e ; i t i s m o s t l i k e l y n o t s t a b l e s i n c e t h e r i n g i s s a t u r a t e d . S t r u c t u r e s I V a n d V c o n t a i n a m e t h y l e n e - d i o x y r i n g , p o s s i b l y f o r m e d b y c o n d e n s a t i o n d u r i n g t h e l i g n i n i s o l a t i o n s t e p i n t h e fl o w r e a c t o r ( i t i s w e l l e s t a b l i s h e d t h a t t h e s e s t r u c t u r e s f o r m i n l i g n i n a t h i g h t e m p e r a t u r e s ( S a r k a n e n a n d L u d w i g , 1 9 7 1 ) ) ; i t i s p o s s i b l e t h a t t h e s e c o m p o u n d s w o u l d b e s t a b l e d u e t o t h e s t a b i l i z i n g e f f e c t o f t h e a d d i t i o n a l r i n g , b u t i t i s p r o b a b l y m o r e l i k e l y t h a t m o r e s t a b l e r e s o n a n c e f o r m s o f t h e s e c o m p o u n d s w o u l d b e f o r m e d b y e l i m i n a t i o n o f t h e a l i p h a t i c s i d e c h a i n s t o f o r m q u i n o n e s t r u c t u r e s . S t r u c t u r e V 1 i s n o t l i k e l y b e c a u s e i t c o n t a i n s a c o m p l e t e l y u n o x i d i z e d s i d e c h a i n ; t h i s i s i n c o n s i s t e n t w i t h t h e k n o w n m e c h a n i s m o f C a - C p c l e a v a g e o f l i g n i n m o d e l d i m e r s b y L I P ( H a m m e l e t a l . , 1 9 8 5 ) , w h i c h l e a v e s b o t h c a r b o n a t o m s a t t h e c l e a v a g e s i t e o x i d i z e d . S t r u c t u r e s V I I a n d V I I I a r e u n l i k e l y , s i n c e f o r m a t i o n o f q u i n o n e - l i k e s t r u c t u r e s w i t h b o t h 0 1 a n d C - 4 s a t u r a t e d i s l i k e l y t o b e e n e r g e t i c a l l y u n f a v o r a b l e i f t h e s t a r t i n g c o m p o u n d i s a r o m a t i c ( D r . D o u g l a s G a g e , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n ) . I n a d d i t i o n , t h e u n o x i d i z e d m e t h y l k e t o n e a t C , i s u n l i k e l y t o b e a p r o d u c t o f o x i d a t i v e d e g r a d a t i o n ( s e e c o m m e n t s f o r s t r u c t u r e 1 1 ) . F i n a l l y , s t r u c t u r e I X i s u n l i k e l y n o t o n l y b e c a u s e o f t h e u n o x i d i z e d e t h y l e t h e r , b u t a l s o b e c a u s e o f t h e l a c k o f a n a l i p h a t i c s i d e 2 1 0 C 9 H I o O 4 ° 2 c a n C 0 0 1 3 0 1 2 5 0 1 3 c o c I I 3 c a n “ 3 0 0 0 0 1 3 0 O C H 3 0 o 0 1 1 3 0 0 I 0 0 0 0 0 \ a / ‘ 2 O ‘ C t l z I I I I I I I V V C r o H u O : C fl z c fl a c o c a ; 0 1 2 c m " 3 6 0 0 0 1 3 O C H 3 O C H 3 1 0 6 0 . 0 0 0 0 O C H 3 O C H 3 O C H Z C H 3 V I V I I V I I I I X F i g u r e 5 . 6 1 : P r o p o s e d l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r t h e c o m p o u n d w i t h m a s s s p e c t r u m s h o w n i n F i g u r e 5 . 5 9 a . 2 1 1 c h a i n ( o r a h y d r o x y l g r o u p w h e r e i t u s e d t o b e ; t h i s i s n o t p o s s i b l e b e c a u s e t h e c o m p o u n d d o e s n o t f o r m a T M S e t h e r ) . T h u s , s t r u c t u r e I i s t h e m o s t l i k e l y c a n d i d a t e o f t h e s t r u c t u r e s p r o p o s e d . F o r t h e r e m a i n d e r o f t h e p e a k s a n a l y z e d b e l o w , p l e a s e r e f e r t o t h e p r e c e d i n g a n a l y s i s f o r t h e g e n e r a l m e t h o d o l o g y i n t h e s t r u c t u r e e l u c i d a t i o n p r o c e d u r e . b . S c a n 6 0 0 T h e m a s s s p e c t r u m o f s c a n 6 0 0 ( 8 ’ 5 9 ” ) i n t h e L - E A e x t r a c t i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 6 2 a a n d t h e T I C a n d m a s s c h r o m a t o g r a m s f o r f r a g m e n t s 2 2 6 , 2 1 1 , 1 8 3 , a n d 1 5 3 a r e ' p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 6 2 b . T h e s p e c t r u m c o n t a i n s t h e l i g n i n p e a k s 1 0 7 , 1 5 1 , 1 6 7 , a n d 1 8 1 , i n d i c a t i n g t h e p r o b a b i l i t y t h a t i t i s a s y r i n g y l - t y p e s t r u c t u r e ; i t i s p r e s e n t i n a r e l a t i v e l y h i g h c o n c e n t r a t i o n ( s e e T a b l e 5 . 1 3 ) . T h e c o m p o u n d c o n t a i n s o n e T M S - d e r i v a t i z a b l e g r o u p , a n d p r o b a b l y c o n t a i n s t w o m e t h o x y l g r o u p s d u e t o t h e p r e s e n c e o f 1 8 1 , 1 6 7 , a n d 1 5 1 m a s s f r a g m e n t s ( 1 8 1 a n d 1 5 1 a r e f o r s y r i n g y l - t y p e s t r u c t u r e s , 1 6 7 i s f o r g u a i a c y l - t y p e ) . P o s s i b l e m o l e c u l a r f o r m u l a s { r + d b } a r e ( 2 1 1 6 0 , { 5 } a n d C 3 H 1 0 0 3 { 4 } . P r o p o s e d s t r u c t u r e s a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 6 3 . S t r u c t u r e X , 3 - h y d r o x y - 5 - m e t h o x y - b e n z o q u i n o n e , i s q u i t e l i k e l y g i v e n t h e c o n f i r m e d p r e s e n c e o f 3 , 5 — d i m e t h o x y - h y d r o q u i n o n e s i n c e i t c o u l d b e f o r m e d b y d e m e t h o x y l a t i o n a n d o x i d a t i o n t o t h e q u i n o n e b y L I P ( b o t h k n o w n L I P c a t a l y z e d r e a c t i o n s ( T i e n , 1 9 8 7 ; B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) ) . S t r u c t u r e X I I i s a l s o q u i t e l i k e l y a n d c o u l d a r i s e f r o m a g u a i a c y l u n i t , a n d i s p r o b a b l y m o r e l i k e l y t h a n s t r u c t u r e X g i v e n t h e p r e s e n c e o f t h e m a s s f r a g m e n t s 1 5 1 , 1 6 7 , a n d 1 8 1 , w h i c h i n c l u d e C a , i n t h e m a s s s p e c t r u m . O f t h e s e c o m p o u n d s , o n l y s t r u c t u r e X I , 2 , 6 - d i m e t h o x y p h e n o l ( a n d p o s i t i o n a l i s o m e r s ) a r e a v a i l a b l e c o m m e r c i a l l y ( A l d r i c h ) ; t h i s s t r u c t u r e , h o w e v e r , i s t h e l e a s t l i k e l y o f t h e t h r e e ( s e e d i s c u s s i o n a b o v e f o r c o m p o u n d I X ) . S t r u c t u r e X I , 2 , 6 — d i m e t h o x y p h e n o l , a n d t h e i s o m e r s 3 , 4 - d i m e t h o x y p h e n o l a n d 3 , 5 - d i m e t h o x y p h e n o l w e r e p u r c h a s e d f r o m A l d r i c h a n d G C / M S o f t h e s a m p l e s w a s d o n e w i t h t h e D B — l G C c o l u m n . T h e 2 , 6 — i s o m e r e l u t e d i n s c a n 5 3 6 ( 8 ’ 0 1 " ) , t h e 3 , 5 - i s o m e r e l u t e d i n s c a n 6 2 5 ( 9 ’ 2 1 " ) , a n d t h e 3 , 4 - i s o m e r e l u t e d i n s c a n 5 9 8 ” 0 6 5 . 0 9 3 2 0 0 2 1 2 ( a . ) 1 0 0 . 2 2 6 , 2 1 1 R 1 e F l 8 0 ‘ L a ‘ > t i 7 3 I v 6 0 ‘ r e ‘ > A b 4 0 7 ~ u J n 4 d a 2 0 4 1 - n 1 C 1 5 3 1 8 3 ° 1 5 1 I I I I ‘ I ? I A r “ . 1 “ . . . l r r 1 . I . 1 | . . 1 . . I I . . . | 1 1 ] 1 1 - 1 1 . . 1 . 1 1 l l . . . . . l . 1 . I 1 . 1 “ . 1 . 1 1 1 . - . . 1 I . U 1 . . . . . . v v . I . . . . . . . r v I v . v r a r v v v r . . . r 5 0 1 0 0 ‘ 1 5 0 2 0 0 ” / 2 ( b . ) R . T . fl a x 2 5 4 . 3 5 8 m a g . a b u n d . 4 A A A A A A A A A A 9 A A A _ l A A A A A A A A A A A _ _ N _ _ , _ _ , ’ A \ L , ' 1 . 0 1 3 2 0 . 7 3 . 5 3 i 1 3 3 5 6 0 5 8 0 6 0 0 6 2 0 6 4 0 ' 1 5 . 2 1 6 . 7 7 2 4 ‘ 1 4 . 7 1 7 . 2 9 7 3 2 1 1 ' 1 . 1 2 2 9 . 2 9 1 2 2 6 ' 1 . 0 2 5 4 . 3 5 8 I v v v I S c a n F i g u r e 5 . 6 2 : ( a . ) E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m s c a n 6 0 0 ( b a c k g r o u n d a v e r a e o f s c a n s 5 9 6 a n d 6 0 2 ) o f t h e T I C f r o m t h e L I P A l o n e B C L - E A e x t r a c t ; a n d ( b . ) C a n d m a s s c h r o m a t o g r a m s f o r i o n s o f m a s s 1 5 3 , 1 8 3 , 2 1 1 , a n d 2 2 6 o v e r t h e s c a n r a n g e 5 5 0 - 6 5 0 . 2 1 3 C 7 H 6 0 4 0 A r o m a t i c r i n g n o t p o s s i b l e . H O O C H 3 0 X C O H I O O J C H 2 0 H H 3 C O C H 3 O C H 3 O H 0 X 1 X I I F i g u r e 5 . 6 3 : P r o p o s e d l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r t h e c o m p o u n d w i t h m a s s s p e c t r u m s h o w n i n F i g u r e 5 . 6 2 . 2 1 4 ( 8 ’ 5 7 ” ) ; t h e i r m a s s s p e c t r a a r e s h o w n i n F i g u r e s F . 1 0 t h r o u g h F . 1 2 ( A p p e n d i x F ) , r e s p e c t i v e l y . T h e m a s s s p e c t r u m s h o w n i n F i g u r e F . 1 2 a n d t h e r e t e n t i o n t i m e o f t h a t p e a k m a t c h t h o s e o f s c a n 6 0 0 , s o t h e c o m p o u n d e l u t i n g i n s c a n 6 0 0 i s 3 , 4 - d i m e t h o x y p h e n o l . I t i s d i f fi c u l t t o i m a g i n e h o w a 3 , 4 - m e t h o x y - s u b s t i t u t e d p r o d u c t c o u l d a r i s e f r o m l i g n i n , b u t v e r a t r y l a l c o h o l w a s f o u n d a s a n e x t r a c t i v e i n t h e l i g n i n ( s e e M N P a l o n e c a s e b e l o w ) , a n d t h i s p e a k w a s u n i q u e t o t h e B C e x t r a c t s ( n o t p r e s e n t i n t h e L ' c o n t r o l e x t r a c t s . T h u s , t h i s 3 , 4 - d i m e t h o x y p h e n o l c o u l d n o t h a v e c o m e f r o m a d d e d v e r a t r y l a l c o h o l , b u t m u s t b e a p r o d u c t o f t h e m e t h o x y l a t i o n o f a g u a i a c y l - s u b u n i t b y L I P ( a k n o w n L I P r e a c t i o n ; B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) . c . S c a n 6 7 3 T h e m a s s s p e c t r u m o f s c a n 6 7 3 ( 1 0 ’ 0 4 " ) i n t h e L - E A e x t r a c t w a s p r e s e n t e d p r e v i o u s l y i n F i g u r e 5 . 5 7 b . T h i s p r o d u c t w a s i d e n t i fi e d a s 2 - m e t h o x y h y d r o q u i n o n e b y c o m p a r i s o n w i t h a p u b l i s h e d s p e c t r u m ( V a l l i e t a l . , 1 9 9 2 b ) , a n d a r i s e s f r o m g u a i a c y l - t y p e s t r u c t u r e s . I t s f o r m a t i o n i s c o n s i s t e n t w i t h p u b l i s h e d m e c h a n i s m s o f t h e a c t i o n o f L I P ( B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) . d . S c a n 7 4 5 T h e . m a s s s p e c t r u m o f s c a n 7 4 5 ( 1 1 ’ 1 0 " ) i n t h e L - E A e x t r a c t i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 6 4 a . I t w a s i d e n t i fi e d a s p - h y d r o x y b e n z o i c a c i d b y c o m p a r i s o n w i t h a r e f e r e n c e s p e c t r u m i n t h e N I S T d a t a b a s e ; t h e r e f e r e n c e s p e c t r u m i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 6 4 b . T h i s c o m p o u n d w a s p u r c h a s e d ( A l d r i c h ) a n d G C / M S w a s r u n u s i n g t h e D B - l G C c o l u m n ; t h e a u t h e n t i c s t a n d a r d e l u t e d i n s c a n 7 4 4 ( 1 1 ’ 0 8 ' ) , a n d i t s m a s s s p e c t r u m i s s h o w n i n F i g u r e F . 1 3 ( A p p e n d i x F ) . T h i s p r o d u c t i s c l e a r l y a l i g n i n d e g r a d a t i o n p r o d u c t , a s i t h a s b e e n r e p o r t e d a s a p r o d u c t o f i n v i v a d e g r a d a t i o n o f s p r u c e w o o d b y P . c h r y s o s p o r i u m ( C h e n a n d C h a n g , 1 9 8 2 ) . e . S c a n 7 5 2 T h e m a s s s p e c t r u m o f s c a n 7 5 2 ( 1 1 ’ 1 0 " ) i n t h e L - E A e x t r a c t i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 6 5 a , a n d t h e T I C a n d m a s s c h r o m a t o g r a m s f o r t h e f r a g m e n t s 2 5 6 , 1 5 1 , 1 3 7 , a n d 2 1 5 1 0 0 2 7 . R . C O O H , e 4 l 1 8 0 ‘ . . a 4 t 1 ‘ ( V 6 0 “ . - 1 l ( a . ) e 4 O H 2 : 3 r 1 5 3 A 4 b 4 0 ‘ u 4 b n 2 2 , d i a 2 ° J n t 7 3 l C 6 > 1 e 2 7 r T ' Y ' 1 A 7 1 ‘ “ ‘ L ' fi r ; i J ' ‘ T 1 ‘ 7 # L ' L 4 " l V 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 " / 2 1 0 0 , 2 6 7 0 2 : 3 ( b . ) w . 7 . l 2 2 4 5 1 6 3 1 T 5 2 ? ? o . 5 ’ . . . . . . . . . . . . . L . . . . . . . ‘ . I ? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . W e ' r ' l I l l l ' 4 0 7 0 1 0 0 1 3 0 1 6 0 1 9 0 2 2 0 2 5 0 2 8 0 ( M l B o n z o i c a c i d . 4 - [ 1 t r i m t h y l s i l y l l o x y l - . t r i m h v l s i l y l e s t e r F i g u r e 5 . 6 4 : ( a . ) E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m s c a n 7 4 5 ( b a c k g r o u n d a v e r a g e o f s c a n s 7 4 0 a n d 7 4 8 ) o f t h e T I C f r o m t h e L I P A l o n e B C L - E A e x t r a c t . T h i s c o m p o u n d w a s i d e n t i fi e d a s p - h y d r o x y b e n z o i c a c i d b y c o m p a r i s o n t h e r e f e r e n c e s p e c t r u m o f t h e a u t h e n t i c c o m p o u n d s h o w n i n ( b . ) ( o t a i n e d f r o m t h e N I S T d a t a b a s e ) . T / / / / \ ‘ " 2 4 . 3 3 2 . 3 5 6 2 1 5 1 A 2 1 6 ( a . ) 1 0 0 i 1 5 1 R e P 1 8 0 ‘ . a 4 t ‘ b i l _ v 6 0 ‘ . e 7 F A h b 4 0 ‘ ’ u 4 n d a 2 0 ‘ . n 4 C ‘ 2 5 e 4 7 7 1 0 7 1 3 7 1 5 r A - g u 1 . 4 ~ . u L w L , t - I L A L [ 1 , . 1 . . . ~ . . L . . . , . - . . , . . . . , . . . - , s o 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 1 1 1 2 ( 1 ) . ) M a x 7 8 5 . 6 7 0 R . T . 1 1 m a g . a b u n d . A r I c b D n A , * 1 . 0 1 6 9 8 . 0 7 d 1 0 7 a n j C ‘ “ _ ” ‘ " 2 8 . 6 2 7 . 4 3 3 7 e 1 3 7 * 1 . 0 7 8 5 . 6 7 0 * 1 3 . 4 5 8 . 6 0 1 3 7 0 ° 7 2 0 7 4 0 7 6 0 7 8 0 8 0 0 S c a n F i g u r e 5 . 6 5 : ( a . ) E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m s c a n 7 5 2 ( b a c k g r o u n d a v e r a e o f s c a n s 7 4 5 a n d 7 5 4 ) o f t h e T I C f r o m t h e L I P A l o n e B C L - E A e x t r a c t ; a n d ( b . ) C a n d m a s s c h r o m a t o g r a m s f o r i o n s o f m a s s 1 0 7 , 1 3 7 , 1 5 1 , a n d 2 5 6 o v e r t h e s c a n r a n g e 7 0 0 - 8 0 0 . 2 1 7 1 0 7 a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 6 5 b . T h e c o m p o u n d d o e s n o t s e e m t o b e d e r i v a t i z e d ( n o 7 3 f r a g m e n t ) ; h o w e v e r , t h e l o s s o f 9 0 m a s s u n i t s f r o m t h e m o l e c u l a r i o n ( 2 5 6 ) s u g g e s t s t h e l o s s o f t h e g r o u p H O S i ( C H 3 ) , , a n d s o t h e c o m p o u n d p r o b a b l y d o e s c o n t a i n a T M S e t h e r w h i c h i s p r o b a b l y a t t a c h e d t o a n a l i p h a t i c s i d e c h a i n ( T M S e t h e r s o f p h e n o l s d o n o t u s u a l l y l o s e t h e p h e n o l i c o x y g e n w i t h t h e T M S ( D r . D o u g l a s G a g e , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n ) . T h i s c o m p o u n d i s p r e s e n t i n s u b s t a n t i a l a m o u n t s ( s e e T a b l e 5 . 1 3 ) , s o i t i s p o s s i b l e t h a t i t a r o s e f r o m v e r a t r y l a l c o h o l ; h o w e v e r , i t w a s n o t p r e s e n t i n t h e L ' c o n t r o l e x t r a c t s , i n d i c a t i n g t h a t i t i s p r o b a b l y l i g n i n d e r i v e d . T h e p e a k s i n t h e s p e c t r u m a t 1 0 7 ( a l i p h a t i c s u b s t i t u t e d p h e n o l ) , 1 3 7 ( a l i p h a t i c s u b s t i t u t e d g u a i a c y l ) a n d 1 5 1 ( c a r b o n y l a t C . ) ( F a i x e t a l . , 1 9 9 0 b ) a l s o i n d i c a t e t h a t i t p r o b a b l y l i g n i n - d e r i v e d . P o s s i b l e m o l e c u l a r f o r m u l a s ( 1 d e r i v a t i z a b l e g r o u p ) a r e C 8 H 8 0 5 { 5 } a n d C . , H , 2 0 4 { 4 } . C 3 H 3 0 5 h a s t o o m a n y o x y g e n s t o a l l o w a n a r o m a t i c o r q u i n o n e s t r u c t u r e , l e a v i n g C 9 H 1 2 0 4 . A n a r o m a t i c s t r u c t u r e i s n o t p o s s i b l e f o r t h i s l a s t f o r m u l a ( t o o m a n y r + d b f o r t h e n u m b e r o f o x y g e n s ) . T h e p o s s i b l e s t r u c t u r e s a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 6 6 . S t r u c t u r e X I I I i s p o s s i b l e , b u t i t t h e e n e r g e t i c s o f f o r m a t i o n o f t h i s c o m p o u n d a r e q u e s t i o n a b l e ( s e e d i s c u s s i o n o f s t r u c t u r e s V I I a n d V I I I a b o v e . S t r u c t u r e X I V i s p o s s i b l e , a n d a p p e a r s t o b e t h e b e s t c h o i c e o f t h e p r o p o s e d s t r u c t u r e s , s i n c e i t i s p o s s i b l e t h a t a r e a r r a n g e m e n t o f X I V c o u l d o c c u r i n t h e i n s t r u m e n t t o a c c o u n t f o r t h e p e a k a t 1 5 1 ( c a r b o n y l a t C ) . N o n e o f t h e s e s t r u c t u r e s a r e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e . 5 . 1 3 . 3 L I P + M N P R e a c t o r R u n s A s a n e x a m p l e o f t h e G C o u t p u t o b t a i n e d f o r t h e L I P + M N P B C a n d c o n t r o l s a m p l e s , t h e T I C f o r t h e L I P + M N P B C L - E A e x t r a c t i s s h o w n i n F i g u r e 5 . 6 7 . T h e p e a k a t a b o u t s c a n 4 9 0 ( 7 ’ 4 4 ” ) i s t h e i n t e r n a l s t a n d a r d , t h e p e a k s a t s c a n s 5 9 5 ( 8 ’ 5 3 ” ) a n d 6 9 5 ( 1 0 ’ 2 3 " ) a r e v e r a t r a l d e h y d e a n d v e r a t r y l a l c o h o l ; s y r i n g a l d e h y d e i s a t s c a n 7 8 9 ( 1 1 ’ 4 9 ' ) , v a n i l l i c a c i d i s a t s c a n 8 5 9 , 1 2 ’ 5 9 " ) , s y r i n g i c a c i d i s a t s c a n 9 4 8 ( 1 4 ’ 1 1 ‘ ) , a n d 2 , 6 — d i m e t h o x y h y d r o q u i n o n e i s a t s c a n 7 8 6 ( 1 1 ’ 4 6 ’ ) ; 2 - m e t h o x y h y d r o q u i n o n e w a s n o t f o u n d i n a n y o f t h e s a m p l e s . S e e a b o v e f o r s p e c t r a a n d i d e n t i fi c a t i o n m e t h o d s f o r t h e s e 2 1 8 ( 3 3 1 2 0 4 C O O H C H Z O H O C H 3 H 3 C O O C H 3 O C H 3 0 x 1 1 1 X I V F i g u r e 5 . 6 6 : s e d l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r t h e c o m p o u n d w i t h m a s s s p e c t r u m s h o w n i n F i g u r e . 6 5 . M A D U d n a e n C a x 1 1 1 1 8 4 0 0 A T I . l S C 8 0 4 6 4 2 0 0 0 4 4 i J 4 ‘ ‘ * 0 ‘ ' 4 ' A . A A 1 0 1 A A A . " h 0 I 0 4 ' ' ' ' ' I 6 0 0 ' ' ' I 8 0 0 ' 1 1 0 5 l A A A A 2 0 l A A . ’ I ‘ . R A m a g . a b u n d . ‘ ' v 0 0 ' 1 2 v 0 0 ' ' ' 1 4 I 0 0 ' ' ' 1 6 0 0 ' 1 S . e 0 a n 1 1 1 8 § . 4 2 1 9 F i g u r e 5 . 6 7 : T o t a l I o n C h r o m a t o g r a m ( T I C ) f o r t h e L I P + M N P B C L - E A e x t r a c t o v e r t h e s c a n r a n g e 2 5 0 - 1 6 0 0 ( 3 ’ 4 4 " t o 2 3 ’ 5 8 " ) . 2 2 0 c o m p o u n d s . T h e p e a k s f o r a l l e x t r a c t s f o r t h e L I P + M N P B C w h i c h w e r e n o t e l i m i n a t e d b y c o m p a r i s o n w i t h t h e c h r o m a t o g r a m s o f t h e c o n t r o l s a n d t h e s t a n d a r d a l o n e a r e p r e s e n t e d , w i t h c o n c e n t r a t i o n e s t i m a t e s ( c o n c e n t r a t i o n s i n u n c o n c e n t r a t e d e x t r a c t s ) , i n T a b l e 5 . 1 4 . I n t h e L - E A B C e x t r a c t , s c a n 4 2 6 w a s u n i q u e ; s c a n 9 8 7 a p p e a r e d i n t h e f o l l o w i n g c a s e s : B C : 0 . 1 9 3 3 n g / p L ; L ' c o n t r o l , w a s n o t p r e s e n t ; R ‘ c o n t r o l , 0 . 0 0 6 7 n g / p L ; E ’ c o n t r o l , 0 . 0 2 4 9 n g / u L ; A E c o n t r o l , 0 . 0 4 0 5 n g / p L ; a n d E R ' c o n t r o l , 0 . 0 3 6 1 n g / p L . I n t h e S C B C e x t r a c t , s c a n 6 2 0 a p p e a r e d a t 0 . 0 5 3 2 n g / u L a n d i n t h e R ' c o n t r o l a t 0 . 0 0 6 5 n g / p L , b u t w a s a b s e n t i n a l l o t h e r e x t r a c t s ; s c a n 8 3 4 a p p e a r e d i n t h e f o l l o w i n g c a s e s : B C : 0 . 0 4 5 0 n g / u L ; n o L ' c o n t r o l s i n c e t h i s i s a s o l i d e x t r a c t ; R ' c o n t r o l , w a s n o t p r e s e n t ; E c o n t r o l , 0 . 0 0 5 4 n g / p L ; A E c o n t r o l , 0 . 0 1 1 2 n g / p L ; a n d E R ' c o n t r o l , 0 . 0 0 8 0 n g / u L . F i n a l l y , i n t h e S - E A e x t r a c t , b o t h p e a k s w e r e u n i q u e . T h e i m p l i c a t i o n s o f t h e p r e s e n c e o f t h e c o m p o u n d s i n t h e c o n t r o l s a t s u b s t a n t i a l l y l o w e r c o n c e n t r a t i o n s w i l l b e d i s c u s s e d w i t h e a c h c o m p o u n d . 5 . 1 3 . 3 . 1 P e a k s I n T h e L I P + M N P B C L - E A E x t r a c t a . S c a n 4 2 6 T h e m a s s s p e c t r u m f o r t h e p e a k i n t h e L - E A e x t r a c t a t s c a n 4 2 6 ( 6 ’ 2 2 " ) i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 6 8 . T h i s c o m p o u n d o c c u r s i n f a i r l y l o w c o n c e n t r a t i o n , a n d i t s s p e c t r u m i s n o t v e r y c l e a n ; n o n e t h e l e s s , t h e m o l e c u l a r i o n i s e v i d e n t a t m a s s 2 8 0 . T h e c o m p o u n d i s d e r i v a t i z e d , b u t i t i s n o t c l e a r w h e t h e r o n c e o r t w i c e . W i t h o n e a n d t w o d e r i v a t i z a b l e g r o u p s , t h e p o s s i b l e m o l e c u l a r f o r m u l a s a r e { r + d b } : c , , n . o , { 7 } , C a n O 4 { 6 } , a n d C 1 2 H 1 6 0 3 { 5 } ( o n e T M S ) , a n d C g H g O z { 5 } ( t w o T M S ) . T h e p o s s i b l e s t r u c t u r e s f o r b o t h c a s e s a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 6 9 . I t i s q u i t e l i k e l y t h a t s t r u c t u r e X V c o u l d b e r e l e a s e d f r o m l i g n i n t h a t h a s b e e n t h e r m a l l y t r e a t e d ( s e e c o m m e n t s f o r s t r u c t u r e s I V a n d V a b o v e ) g i v e n t h e m e t h y l e n e - d i o x y r i n g a n d t h e r e s e m b l a n c e t o s i n a p i c a c i d . S t r u c t u r e s X V I a n d X V I I a r e a l s o q u i t e p o s s i b l e , a s p r o d u c t s o f t h e r e l e a s e o f o x i d i z e d c o n i f e r y l a l c o h o l a n d i t s a c i d f o r m . S t r u c t u r e X V I I I i s s i n a p y l a l d e h y d e , a n d a g a i n , i s a l i k e l y + " R T h e B t i e s C n t i c e o x o m n p t r a t o c i u t m n f w e o d r i i t s h t h i i d s e D e n B n t - i z c l y a l m G e t C o c c h s e l o a t . t a u i m n n s a a c n n d 9 3 8 7 . 7 5 ( m i n ” ' 4 7 s " o ) l v o e f n t t h h e o l L d - . E A T a b l e 5 . 1 4 : P e a k s i n t h e L I P + M N P B C e x t r a c t s s e l e c t e d f o r s t r u c t u r a l a n a l y s i s b y c o m p a r i n g t h e T o t a l I o n C h r o m a t o g r a m s o f t h e B C e x t r a c t s w i t h t h e c o r r e s p o n d i n g e x t r a c t s o f i t s c o n t r o l s . T h e i d e n t i t y o f t h e c o m p o u n d i s l i s t e d i f . k n o w n ; i f n o t , t h e p o s s i b l e m o l e c u l a r f o r m u l a s ( b a s e d o n t h e m o l e c u l a r w e i g h t d e t e r m r n e d f r o m t h e m a s s s p e c t r u m ) a r e l i s t e d . 2 2 1 E s t . D e r i v a t i z e d N o . I d e n t i t y i f k n o w n S c a n C o n c . M W . T M S E x t r a c t N o . R ' I " ( n z u L ) ( g / m o l e ) G r o u p s L - E A 4 2 6 6 ' 2 2 “ 0 . 0 2 3 5 2 8 0 l L - E A 9 8 7 1 4 ° 4 7 ” 0 . 1 9 3 3 4 0 0 l 2 3 S C 6 2 0 9 ' l 7 " 0 . 0 5 3 2 3 0 8 1 2 S - C 8 3 4 1 2 2 9 ” 0 . 0 4 5 0 3 7 2 2 3 S — E A 8 0 9 1 2 0 7 " 0 . 0 2 5 2 3 5 6 2 s - E A ' 9 8 6 l 4 ' 4 6 " 0 . 0 5 5 1 4 0 0 i 2 3 C r o H s O s . C r I H r z o c . 0 1 ’ C I Z H N O J C J ‘ L O z C n H r z o r . C r e r s O s . C g fl z o O S , O f m u o l C r a n O r . C r z n r s o s . o r C r s n z o o s 0 1 1 1 . 0 » C . H . O s . o r C o H u O . C r z u r z o s . C u H I s O c . 0 " 0 1 4 3 2 0 0 3 C e n s o r o r C r o H r z o z C t r H r s O s 0 1 ' C u H r z O s C s n o o s 0 f C 1 H s 0 4 ( 3 1 0 3 1 1 2 0 : o r C r r H r s o o € 1 1 1 . 0 3 C n n r z o r . C r e r s O s . C r s t o O s . 0 " C o n z c o c C n H r z o r . C r z H u o s . 0 1 ' C u fl z o o s C 1 H ‘ O ‘ , € 3 1 1 . 0 3 , O f C J ‘ I r z O o 2 2 2 1 0 0 R e 1 8 0 ‘ a 1 t d i 1 V 6 0 ‘ e 1 4 7 3 A . b 4 0 ‘ u l n 1 d 1 2 4 a 2 0 ‘ n 3 7 7 C 8 9 4 1 ° 1 “ 1 1 8 6 A L 1 1 . . 1 U I r 5 0 1 0 0 1 5 0 2 5 0 3 0 0 H / Z F i g u r e 5 . 6 8 : E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m s c a n 4 2 6 ( b a c k g r o u n d s c a n 4 2 8 ) o f t h e T I C f r o m t h e L I P + M N P B C L - E A e x t r a c t . X V X V I X V I I C H I - 1 1 2 0 4 o x v m X I X N o q u i n o n e s t r u c t u r e s p o s s i b l e . O C H 3 C s H s o z 2 2 3 0 H C 1 2 H 1 6 0 3 / O C H z C H 3 X X 0 H / 0 H 2 T M S X X I F i g u r e 5 . 6 9 : P r o p o s e d l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r t h e c o m p o u n d w i t h m a s s s p e c t r u m s h o w n i n F i g u r e 5 . 6 8 . 2 2 4 p r o d u c t o f l i g n i n d e p o l y m e r i z a t i o n . S t r u c t u r e X I X i s 3 , 5 - d i m e t h o x y c i n n a m i c a c i d ; i t i s d o u b t f u l t h a t t h i s c o m p o u n d c o u l d b e r e l e a s e d f r o m l i g n i n b y a n o x i d a t i v e d e g r a d a t i o n d u e t o t h e l a c k o f a h y d r o x y l o r e t h e r a t p o s i t i o n 4 o f t h e r i n g . S t r u c t u r e X X i s u n l i k e l y b e c a u s e t h e e t h y l g r o u p i n t h e e t h e r l i n k a g e t o p o s i t i o n 4 o f t h e r i n g i s n o t o x i d i z e d . I s o m e r s o f s t r u c t u r e X X a r e p o s s i b l e , b u t w i t h o n l y o n e d e r i v a t i z a b l e o x y g e n , t h e y w o u l d s t i l l b e u n l i k e l y c a n d i d a t e s . S t r u c t u r e X X I i s u n l i k e l y s i n c e i t i s n o t p r o b a b l e t h a t t h e h y d r o x y l o n t h e s i d e c h a i n w o u l d r e m a i n a s a h y d r o x y l g r o u p , b u t w o u l d p r o b a b l y b e m o r e s t a b l e a s a n a l d e h y d e ( b o t h o f t h e o x y g e n s a r e r e q u i r e d t o b e d e r i v a t i z e d ) . O f t h e s e c o m p o u n d s , o n l y 3 , 5 - d i m e t h o x y c i n n a m i c a c i d i s c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e ( A l d r i c h ) . T h i s c o m p o u n d a n d i t s 3 , 4 - i s o m e r w e r e p u r c h a s e d a n d a n a l y z e d b y G C / M S u s i n g t h e D B - l G C c o l u m n ; t h e 3 , 5 - d i m e t h o x y c i n n a m i c a c i d e l u t e d i n s c a n 1 0 2 1 ( 1 5 ’ 1 7 " ) , w h i l e t h e 3 , 4 - i s o m e r e l u t e d i n s c a n 1 0 2 1 ( 1 5 ’ 1 6 ' ) ( d i f f e r e n t s a m p l e s w e r e u s e d f o r e a c h ; s e e F i g u r e s F . 1 4 a n d F . 1 5 f o r t h e m a s s s p e c t r a , r e s p e c t i v e l y ) , a n d t h u s t h e c o m p o u n d e l u t i n g i n s c a n 4 2 6 c a n n o t b e o n e o f t h e s e . T h u s , t h e r e a r e s t i l l a t l e a s t f o u r v i a b l e s t r u c t u r e s t h a t a r e p o s s i b l e : s t r u c t u r e s X V , X V I , X V I I , a n d X V I I I . b . S c a n 9 8 7 T h e m a s s s p e c t r u m f o r t h e p e a k i n t h e L - E A e x t r a c t a t s c a n 9 8 7 ( l 4 ’ 4 7 " ) i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 7 0 . A n e x c e l l e n t s p e c t r u m w a s o b t a i n e d f o r t h i s c o m p o u n d . T h i s c o m p o u n d o c c u r s i n f a i r l y h i g h c o n c e n t r a t i o n i n t h e L - E A B C e x t r a c t , a n d a l s o o c c u r s i n l o w e r c o n c e n t r a t i o n i n a l l b u t t h e L ‘ e x t r a c t , i n d i c a t i n g i t s d e fi n i t e o r i g i n a s l i g n i n - d e r i v e d . T h e c o n c e n t r a t i o n o f t h i s c o m p o u n d i n t h e B C e x t r a c t i s n e a r l y 5 t i m e s t h e h i g h e s t o c c u r r e n c e i n t h e c o n t r o l s ( A E c o n t r o l ) , i n d i c a t i n g t h a t i t i s r e l e a s e d f r o m t h e l i g n i n b y t h e L I P a n d / o r M N P e n z y m e s a s w e l l a s b e i n g a m i n o r e x t r a c t i v e i n t h e E C A H l i g n i n s u b s t r a t e . I t i s n o t c l e a r w h e t h e r t h i s c o m p o u n d c o n t a i n s 2 o r 3 T M S e t h e r i fi e d g r o u p s , a s t h e r e a r e o n l y s m a l l m a s s p e a k s p r e s e n t a t 1 4 7 a n d 2 2 1 , b u t i t d e fi n i t e l y h a s a t l e a s t 1 d e r i v a t i z a b l e g r o u p . I n a d d i t i o n , t h e m a s s p e a k s 1 0 7 , 1 3 7 , 1 5 1 , a n d 1 6 7 c l e a r l y i n d i c a t e a l i g n i n o r i g i n . T h e l a r g e s e p a r a t i o n o f t h e b a s e p e a k a t m a s s 2 2 3 a n d R 1 e a t i V e A b u n d a n C e I I 4 ‘ i 1 1 4 3 . 8 6 0 0 ‘ " 4 0 ‘ 2 0 “ 0 2 3 7 3 e 5 r 0 a ‘ 5 ‘ 2 t l — 1 L , * 4 . : L 0 0 1 . ‘ 3 h I ‘ 7 ? “ 5 1 f 0 1 7 0 1 9 3 “ “ “ ‘ 5 ‘ fi ‘ , ‘ 5 v 2 0 0 I . I . 3 2 L 2 5 0 3 r 3 4 1 3 5 0 3 0 0 I - ' ’ r . I . l . Z 4 0 0 3 E 5 4 0 0 H / 2 2 5 F i g u r e 5 . 7 0 : E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m s c a n 9 8 7 ( b a c k g r o u n d s c a n 9 8 3 ) o f t h e T I C f r o m t h e L I P + M N P B C L - E A e x t r a c t . 2 2 6 t h e m o l e c u l a r i o n a t m a s s 4 0 0 s u g g e s t s t h a t t h e c o m p o u n d i s a d i m e r ( b u t d o e s n o t p r o v e i t ) . B a s e d o n t h e o b s e r v a n c e o f p e a k s 2 2 3 a n d 2 5 3 i n t h e s p e c t r a o f T M S - d e r i v a t i z e d s y r i n g i c a n d v a n i l l i c a c i d ( s e e F i g u r e s 5 . 5 6 b a n d 5 . 5 6 c ) , w h i c h a r e f o r m e d b y l o s s o f O S i ( C I - I 3 ) 3 f r o m t h e a - c a r b o x y l i c a c i d s f o r e a c h , s t r u c t u r e s f o r t h e s e m a s s f r a g m e n t s w e r e p r o p o s e d ; t h e s e a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 7 1 . T h e s e a s s i g n m e n t s a r e a n a l o g o u s t o t h e a s s i g n m e n t o f 1 5 1 a n d 1 8 1 t o a - c a r b o n y l g u a i a c y l a n d s y r i n g y l s t r u c t u r e s b y F a i x e t a l . ( 1 9 9 0 b ) , r e s p e c t i v e l y . P o s s i b l e m o l e c u l a r f o r m u l a s { r + d b } a r e : ( a ) l T M S : C 1 7 H 1 2 0 7 { 1 2 } , C m H m Q 5 { 1 1 } , C , , I - 1 2 0 0 5 { 1 0 } , a n d 9 0 1 1 1 2 4 0 4 { 9 } ; ( b ) 2 T M S : C , , H , 2 0 7 { 6 } , C n H w O , { 5 } , a n d C 1 3 H 2 0 0 5 { 4 } ; a n d , ( c ) € 8 1 1 . 0 5 { 5 } a n d C 9 H 1 2 0 . { 4 } . S t r u c t u r a l p o s s i b i l i t i e s a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 7 2 a f o r 1 T M S a n d 5 . 7 2 b f o r 2 a n d 3 T M S . O f t h e s t r u c t u r e s c o n t a i n i n g o n e d e r i v a t i z a b l e g r o u p , o n l y X X V i s a n u n l i k e l y c a n d i d a t e f o r a a n o x i d a t i v e l i g n i n d e g r a d a t i o n p r o d u c t b e c a u s e o f t h e u n o x i d i z e d s i d e c h a i n s a t C - 1 o f b o t h o f t h e r i n g s ; X X I I - X X V a r e q u i t e l i k e l y t o b e d e g r a d a t i o n p r o d u c t s s i n c e t h e y a l l h a v e a b o u t t h e r i g h t d e g r e e o f o x i d a t i o n , a n d c o n t a i n 6 - 0 - 4 l i n k a g e s ( X X I I a n d X X I V ) o r a - c a r b o n y l l i n k a g e s ( X X I I I ; t h e o r i g i n a l b o n d w o u l d b e a n a - a r y l e t h e r l i n k a g e - - o x i d a t i o n o f C a w o u l d b e e x p e c t e d i f t h e s i d e c h a i n o f t h e r i g h t - h a n d m o n o m e r i n X X I I I w e r e c l e a v e d b e t w e e n C , a n d C , b y L I P ( H a m m e l e t a l . , 1 9 8 5 ) ) . A s s u m i n g t h a t t h e a s s i g n m e n t o f t h e m a s s f r a g m e n t s 2 2 3 a n d 2 5 3 a r e c o r r e c t , o n l y X X I I I s h o u l d g i v e b o t h o f t h e s e f r a g m e n t s , m a k i n g i t t h e b e s t p o s s i b i l i t y f o r a s i n g l y - d e r i v a t i z e d d i m e r . A l l o f t h e t w i c e - d e r i v a t i z e d s t r u c t u r e s ( X X V I - X X V I I I ) a r e a l s o l i k e l y t o a r i s e f r o m o x i d a t i v e l i g n i n d e g r a d a t i o n ; a l l t h r e e s t r u c t u r e s s h o u l d g i v e a f r a g m e n t s o f m a s s 2 2 3 a n d 2 5 3 . S t r u c t u r e X X V I c o u l d a r i s e f r o m C a - C , c l e a v a g e o f t w o i n t e r m o n o m e r 8 - 0 - 4 l i n k a g e s . S t r u c t u r e X X V I I i s i d e n t i c a l t o a p r o d u c t r e l e a s e d i n v i t r o f r o m a p h e n o l i c B - a r y l e t h e r l i g n i n m o d e l d i m e r b y M N P ( T u o r e t a l . , 1 9 9 2 ) . O n e m i g h t e x p e c t t h a t t h e r e m i g h t b e a n u n s a t u r a t i o n i n t h e s i d e c h a i n o f X X V I I I i f i t h a d c o m e f r o m l i g n i n , b u t t h a t i s n o t e n o u g h e v i d e n c e t o d i s c a r d i t . S t r u c t u r e s c o n t a i n i n g t h r e e d e r i v a t i z a b l e g r o u p s , X X I X a n d X X X ( 4 - h y d r o x y - h o m o v a n i l l y l a l c o h o l ) , a r e a g a i n l i k e l y d e g r a d a t i o n p r o d u c t s 2 2 7 0 + I I I C m / z 2 2 3 + H m / z 2 5 3 F i g u r e 5 . 7 1 : P r o p o s e d l i ' n - d e r i v e d i o n f r a g m e n t s o f m a s s e s 2 2 3 a n d 2 5 3 , f o r m e d b y l o s s f o r O S i ( C H ) 3 o m a n a - c a r b o x y l i c a c i d w i t h g u a i a c y l - a n d s y r i n g y l - t y p e s t r u c t u r e s , r e s p e c t i v e l y . 2 2 8 I T M S C H O 0 ° ° C n H r z o r . H O O C X X I I O , 0 0 ‘ C H 2 C r e r s O ‘ 0 ' O C H 3 0 A g x x m O I ‘ I C O C H 3 C r s t o o s O H C X X V F i g u r e 5 . 7 2 : P r o p o s e d l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r t h e c o m p o u n d w i t h m a s s s p e c t r u m s h o w n i n F i g u r e 5 . 7 0 . ( 2 . ) S t r u c t u r e s w h i c h f o r m m o n o - T M S d e r i v a t i v e s . 2 W 3 C r r H r z o 7 C a m e o s C r s t o o s 3 W 3 C s H s O s C 9 H 1 2 0 4 2 2 9 . © . . X X V I X X V I I X X V I I I X X I X X X X F i g u r e 5 . 7 2 b : P r o . o s e d 1 i ' - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r t h e c o m p o u n d w i t h m a s s s p e c t r u m s h o w n i n r g u r e 5 . 0 . ( b . ) S t r u c t u r e s w h i c h f o r m d i - o r t r r - T M S d e r i v a t i v e s . 2 3 0 o f l i g n i n ; h o w e v e r , n e i t h e r o f t h e s e s h o u l d g i v e b o t h 2 2 3 a n d 2 5 3 m a s s f r a g m e n t s . B a s e d o n t h e a s s u m p t i o n o f t h e 2 2 3 a n d 2 5 3 m a s s f r a g m e n t s , t h e n , X X I X a n d X X X a r e n o t l i k e l y p o s s i b i l i t i e s . N o t s u r p r i s i n g l y , n o n e o f t h e m o n o - o r d i - T M S - d e r i v a t i z e d c o m p o u n d s a r e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e ; i n a d d i t i o n , n o t w i t h s t a n d i n g t h e i r r e l a t i v e s t r u c t u r a l s i m p l i c i t y , s t r u c t u r e s X X I X a n d X X X a l s o a p p e a r t o n o t b e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e . I n s u m m a r y , s t r u c t u r e s X X I I - X X I V a n d X X V I - X X V I I I a r e a l l l i k e l y p o s s i b i l i t i e s w h i c h s e e m t o fi t t h e m a s s s p e c t r a l e v i d e n c e . 5 . 1 3 . 3 . 2 P e a k s I n T h e L I P + M N P B C S - C E x t r a c t a . S c a n 6 2 0 T h e m a s s s p e c t r u m f o r t h e p e a k i n t h e S - C e x t r a c t a t s c a n 6 2 0 ( 9 ’ 1 7 ” ) i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 7 3 . A r e l a t i v e l y c l e a n s p e c t r u m o f t h i s c o m p o u n d w a s o b t a i n e d , a l t h o u g h i t i s n o t p o s s i b l e t o d i s t i n g u i s h w h e t h e r t h e c o m p o u n d i s d e r i v a t i z e d t w i c e o r j u s t o n c e . T h e c o m p o u n d i s a n a l i p h a t i c s u b s t i t u t e d p h e n o l b a s e d o n t h e p e a k a t m a s s 1 0 7 . I n t h e S - C B C e x t r a c t , s c a n 6 2 0 a p p e a r e d a t 0 . 0 5 3 2 n g / p L a n d i n t h e R ‘ c o n t r o l a t 0 . 0 0 6 5 n g / p L ( c o n c e n t r a t i o n 8 . 2 t i m e s h i g h e r i n t h e B C t h a n i n t h i s c o n t r o l ) , a n d w a s a b s e n t i n a l l o t h e r e x t r a c t s o f t h e c o n t r o l s a n d o t h e r B C e x t r a c t s . T h i s s u g g e s t s p e r h a p s t h a t i t i s a p r o d u c t o f s o m e e n z y m e i n t h e e x t r a c e l l u l a r fl u i d o t h e r t h a n o n e o f t h e p e r o x i d a s e s , w h i c h h a s g r e a t e r a c t i v i t y i n t h e p r e s e n c e o f H 2 0 2 , V A , o r M n ( I I ) / M n ( I I I ) . I t s h o u l d a p p e a r i n t h e L ‘ c o n t r o l i f i t w e r e s i m p l y a p r o d u c t o f p u r e l y c h e m i c a l o x i d a t i o n d u e t o t h e h i g h 0 2 l e v e l s p r e s e n t ; i n a n y c a s e , i t w i l l b e t r e a t e d a s a p r o d u c t o f i n t e r e s t a n d d e a l t w i t h i n C h a p t e r V I . P o s s i b l e m o l e c u l a r f o r m u l a s a r e { r + d b } : C a n O , { 7 } , C H I - 1 , 6 0 4 { 6 } , C M H N O 3 { 5 } ( o n e T M S ) ; a n d C , I - I , O 3 { 6 } a n d C I O H n O , { 5 } ( t w o T M S ) . P o s s i b l e s t r u c t u r e s f o r b o t h o n e a n d t w o T M S - d e r i v a t i z a b l e g r o u p s a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 7 4 . O f t h e s e s t r u c t u r e s , o n l y 4 - c o u m a r i c a c i d ( X X X V ) i s c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e ( A l d r i c h ) . S t r u c t u r e X X X I i s p r o b a b l y n o t l i k e l y d u e t o t h e l a c k o f c o m p l e t e c o n j u g a t i o n i n t h e r i n g . S t r u c t u r e X X X I I , i f t h i s w e r e a n L I P o r M N P c a t a l y z e d r e a c t i o n , w o u l d n o t b e p r o b a b l e d u e t o t h e u n o x i d i z e d e t h y l e n e g r o u p a t p o s i t i o n 4 o f t h e 2 3 1 1 0 0 4 2 3 9 . R e l 8 0 ‘ - a ‘ . t i V 6 0 ‘ ’ e i A b 4 0 4 r - u . 7 3 3 ‘ 8 n d a 2 0 ~ 1 9 ' - “ ‘ 1 7 C ’ 7 7 e . 2 9 2 9 3 1 0 7 1 2 5 U A t 1 ' A A ' [ ' 1 1 . L A ' L H L A ? A l t h ‘ : J I L 1 , J I I J ; _ A _ . L 1 ; l L J L ; _ A ¥ ' A l L l l r n m l r l ‘ . : “ J . _ : g ‘ l E A L L I L A A I A _ 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 " / 2 F i g u r e 5 . 7 3 : E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m s c a n 6 2 0 ( b a c k g r o u n d s c a n 6 1 8 ) o f t h e T I C f r o m t h e L I P + M N P B C S - C e x t r a c t . 2 3 2 l N S ( 3 1 2 3 1 2 0 5 0 0 X X X ] 1 , . “ o n 0 " C 1 3 H 1 6 0 4 ” O K / ( j a m é ” : ) 1 ° " \ , x x x n x x x m C q u o O s X X X “ , O C H 3 X » . . . O H 0 2 T M S C 9 H 8 0 3 O i l O i l O i l X X X V X X X V I O H C o l 0 ‘ H ’ 2 x x x v n O i l F i g u r e 5 . 7 4 : P r o p o s e d l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r t h e c o m p o u n d w i t h m a s s s e c t r u m s h o w n i n F i g u r e 7 3 , i n c l u d i n g s t r u c t u r e s w h i c h f o r m m o n o - o r d i - T M S e r r v a t r v e s . 2 3 3 r i n g . S t r u c t u r e X X X I I I w o u l d b e a v e r y l i k e l y p o s s i b i l i t y , a s w o u l d s t r u c t u r e s X X X I I I , X X X V ( 4 - c o u m a r i c a c i d ) , a n d X X X V I ( 3 , 4 - d i h y d r o x y c i n n a m a l d e h y d e ) . S t r u c t u r e s X X X I V a n d X X X V I I , h o w e v e r , a r e n o t l i k e l y t o b e l i g n i n - d e r i v e d p r o d u c t s d u e t o t h e p r e s e n c e o f 4 - c a r b o n c h a i n s , a n d i n X X X I V , t o t h e u n o x i d i z e d s i d e c h a i n . S t r u c t u r e X X X V , 4 - c o u m a r i c a c i d ( o r 4 - h y d r o x y c i n n a m i c a c i d ) w a s p u r c h a s e d f r o m A l d r i c h , a s w e l l a s i t s i s o m e r 3 - c o u m a r i c a c i d ; t h e s e a u t h e n t i c s t a n d a r d s w e r e a n a l y z e d b y G C / M S u s i n g t h e D B - l G C c o l u m n . T h e 4 - h y d r o x y i s o m e r e l u t e d i n s c a n 9 7 5 ( 1 4 ’ 3 6 ' ) , w h i l e t h e 3 - h y d r o x y i s o m e r e l u t e d i n s c a n 9 2 6 ( 1 3 ’ 5 2 " ) ; t h e i r m a s s s p e c t r a a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e s F . 1 6 a n d F . 1 7 ( A p p e n d i x F ) , r e s p e c t i v e l y . N e i t h e r t h e r e t e n t i o n t i m e s n o r t h e m a s s s p e c t r a m a t c h t h o s e o f t h e p e a k e l u t i n g i n s c a n 6 2 0 ; t h u s , o n l y s t r u c t u r e s X X X I I I a n d X X X V I w e r e k e p t a s p o s s i b l e s t r u c t u r e s . b . S c a n 8 3 4 T h e m a s s s p e c t r u m f o r t h e p e a k i n t h e S - C e x t r a c t a t s c a n 8 3 4 ( 1 2 ’ 2 9 ‘ ) i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 7 5 . T h i s c o m p o u n d a p p e a r e d i n t h e B C a t 0 . 0 4 5 0 1 n g / u L , i n t h e 1 3 ‘ c o n t r o l a t 0 . 0 0 5 4 n g / u L , i n t h e A E c o n t r o l a t 0 . 0 1 1 2 n g / u L , a n d i n t h e E R ’ c o n t r o l a t 0 . 0 0 8 0 n g / u L , b u t n o t i n a n y o t h e r c o n t r o l . S i n c e t h e c o n c e n t r a t i o n i n t h e B C e x t r a c t i s 4 t i m e s t h e h i g h e s t o c c u r r e n c e i n a n y c o n t r o l , t h i s c o m p o u n d i s t h u s a c o m p o u n d w h i c h i s a l o w l e v e l e x t r a c t i v e i n t h e E C ' A H l i g n i n s u b s t r a t e , b u t c a n a l s o b e f o r m e d b y L I P o r M N P a c t i v i t y . T h e c o m p o u n d c o n t a i n s a t l e a s t t w o T M S - d e r i v a t i z a b l e g r o u p s ; i t m a y n o t c o n t a i n t h r e e , d u e t o t h e l a c k o f a p e a k a t 2 2 1 , b u t t h e p e a k a t 2 2 1 d o e s n o t a l w a y s o c c u r w h e n t h r e e T M S g r o u p s a r e p r e s e n t ; i n a d d i t i o n , t h e o d d i s o t o p e p a t t e r n o n t h e m o l e c u l a r i o n ( 3 7 2 ) i n d i c a t e s a l a r g e a m o u n t o f s i l i c o n p r e s e n t ( D r . D o u g l a s G a g e , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n ) . T h e r e f o r e , t h e t h r e e T M S c a s e w i l l a l s o b e t r e a t e d . P o s s i b l e m o l e c u l a r f o r m u l a s a r e { r + d b } : C , , H , , o , { 4 } a n d C u H H O S { 9 } ( t w o T M S ) ; a n d 0 , 1 1 3 0 4 { 4 } ( t h r e e T M S ) . P o s s i b l e s t r u c t u r e s a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 7 6 f o r b o t h c a s e s . S t r u c t u r e s X X X V I I I a n d X X X I X a r e b o t h v e r y l i k e l y c a n d i d a t e s , g i v e n t h e s t r u c t u r e o f l i g n i n ; s t r u c t u r e s X L a n d X L I a r e a l s o b o t h q u i t e p o s s i b l e , a n d X L I I 1 0 0 8 6 4 2 0 0 0 0 4 . . J . . ‘ ‘ 1 . 7 ‘ ‘ ‘ c R e 1 a t 1 v e A b u n d a n e C 7 3 2 9 5 0 1 0 0 1 7 1 5 0 1 ' 9 2 2 0 2 0 2 ' 1 I 2 5 0 . . 2 « 2 I 9 0 3 0 3 7 2 H l " . I _ " ’ P ' r ’ L Z / 3 4 2 3 1 I 7 I 3 5 0 I 3 2 3 4 F i g u r e 5 . 7 5 : E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m s c a n 8 3 4 ( b a c k g r o u n d a v e r a g e o f s c a n s 8 3 1 a n d 8 3 6 ) o f t h e T I C f r o m t h e L I P + M N P B C S - C e x t r a c t . 2 ' l ' l I S ( : 1 1 I 1 1 6 ( ) 5 ( : I 4 I I I Z ( ) S 3 I N S € 7 1 1 . 0 4 F i g u r e 5 . 7 6 : 2 3 5 o n s o H g C O O C H : 0 X X X V I I I O C H a X L X L I I C H 2 0 H H 3 C 0 O C H 3 ‘ \ ” ‘ 0 H X X X I X X L I C H z O H H O O H X L I I I P r o p o s e d l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r t h e c o m p o u n d w i t h m a s s 8 e c t r u m s h o w n i n F i g u r e 5 . 7 5 , i n c l u d i n g s t r u c t u r e s w h i c h f o r m d i - o r t r i - T M S e r i v a t i v e s . 2 3 6 ( 2 , 3 , 5 - t r i h y d r o x y - a n i s o l e ) a n d X L I I I c o u l d a r i s e f r o m t h e o x i d a t i v e d e g r a d a t i o n o f l i g n i n . T h e r e f o r e , n o n e o f t h e s t r u c t u r e s p r o p o s e d c a n b e e l i m i n a t e d , s i n c e a l l c o u l d r e a s o n a b l y b e f o r m e d d u r i n g a n o x i d a t i v e d e g r a d a t i o n o f l i g n i n . N o n e o f t h e c o m p o u n d s i n F i g u r e 5 . 7 6 w e r e f o u n d t o b e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e . 5 . 1 3 . 3 . 3 P e a k s I n T h e L I P + M N P B C S - E A E x t r a c t a . S c a n 8 0 9 T h e m a s s s p e c t r u m f o r t h e p e a k i n t h e S - C e x t r a c t a t s c a n 8 0 9 ( 1 2 ’ 0 7 " ) i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 7 7 . T h i s c o m p o u n d w a s u n i q u e t o t h i s e x t r a c t o f t h e L I P + M N P B C ( a p p e a r e d i n n o n e o f t h e c o n t r o l s ) , i n d i c a t i n g i t s o r i g i n a s a n e n z y m e - r e l e a s e d l i g n i n p r o d u c t . T h i s c o m p o u n d c o n t a i n s a t l e a s t t w o T M S - d e r i v a t i z a b l e g r o u p s , a n d p r o b a b l y t h r e e , n o t o n l y b e c a u s e o f t h e p e a k a t 2 2 1 ( w h i c h m a y j u s t b e n o i s e d u e t o t h e l a c k o f i s o t o p e p e a k s ) , b u t a l s o b e c a u s e o f t h e o d d i s o t o p e p a t t e r n o n t h e m o l e c u l a r i o n ( 3 5 6 ) ( s e e a n a l y s i s o f p r e v i o u s p e a k ) . T h e c o m p o u n d o c c u r r e d i n r e l a t i v e l y l o w c o n c e n t r a t i o n , c o n t r i b u t i n g t o t h e f a i r a m o u n t o f n o i s e i n t h e m a s s s p e c t r u m . T h e s p e c t r u m c o n t a i n s t h e 2 5 3 f r a g m e n t , b u t i t i s u n c l e a r w h e t h e r i t c o u l d b e f r o m t h e s a m e s o u r c e ( a n a - c a r b o x y l i c a c i d ) ; i n a d d i t i o n , t h e s p e c t r u m d o e s n o t c o n t a i n t h e 2 2 3 f r a g m e n t , w h i c h i t s h o u l d i f i t i s a s y r i n g y l s t r u c t u r e ( a s y r i n g y l - t y p e a - c a r b o x y l i c a c i d s h o u l d c o n t a i n b o t h p e a k s i f t h e a s s i g n m e n t o f t h e f r a g m e n t s i s c o r r e c t ( r e f e r t o t h e m a s s s p e c t r u m o f s y r i n g i c a c i d i n F i g u r e 5 . 5 6 c ) ) . P o s s i b l e m o l e c u l a r f o r m u l a s a r e { r + d b } : C m H n O , { 5 } a n d C , , H , , , O 4 { 4 } ( t w o T M S ) ; a n d C - , H , , O 3 { 4 } ( t h r e e T M S ) . P o s s i b l e s t r u c t u r e s a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 7 8 . N o n e o f t h e s e c o m p o u n d s w e r e f o u n d t o b e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e . S t r u c t u r e s X L I V , X L V , X L V I ( h y d r o s i n a p y l a l c o h o l ) , a n d X L V I I a r e a l l r e a s o n a b l e p o s s i b i l i t i e s f o r l i g n i n - d e r i v e d o x i d a t i o n p r o d u c t s . S t r u c t u r e X L V I I ] c o u l d c o m e f r o m v e r a t r y l a l c o h o l o x i d a t i o n b y L I P , b u t i f t h i s p e a k w e r e t h i s c o m p o u n d , t h e p e a k s h o u l d h a v e b e e n p r e s e n t i n t h e L ' c o n t r o l s , a n d i t w a s n o t ; t h e r e f o r e t h e p e a k e i t h e r c a n n o t b e t h i s c o m p o u n d , o r t h e c o m p o u n d i s p r o d u c e d f r o m g u a i a c y l u n i t s b u t n o t f r o m v e r a t r y l a l c o h o l . I t i s w e l l k n o w n t h a t t h e m a j o r p r o d u c t o f o x i d a t i o n o f v e r a t r y l a l c o h o l 2 3 7 1 0 0 1 - 3 5 6 a , 1 7 9 , e ‘ . 1 8 0 ‘ _ a . t 1 . v 6 0 ‘ _ e . 2 : 7 A 7 3 b 4 0 - * - u . n . d . a 2 0 * r n , 1 4 7 c . 1 2 2 1 2 3 3 1 e I 5 9 1 0 3 1 a . 1 7 ' 3 ‘ , ’ 0 ' , I . 1 . : 1 i I I | ~ 1 I I _ _ s o 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 “ / 2 F i g u r e 5 . 7 7 : E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m s c a n 8 0 9 ( b a c k g r o u n d a v e r a g e o f s c a n s 8 0 7 a n d 8 1 1 ) o f t h e T I C f r o m t h e L I P + M N P B C S - E A e x t r a c t . 2 T M S ( : I O I I I Z ( ) S ( 2 1 1 } { 1 6 ( ) 4 3 I N S 0 , 1 1 0 ; 2 3 8 C l l z C O O H H 3 6 0 O C H 3 X L I V O H H 3 C O O C H 3 O H X L V I C O O H X L V O H c h 0 O C H 3 0 H X L V I I C 1 1 2 0 " O H X L V I I ] F i g u r e 5 . 7 8 : P r o p o s e d l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r t h e c o m p o u n d w i t h m a s s 5 e c t r u m s h o w n i n F i g u r e 5 . 7 7 , i n c l u d i n g s t r u c t u r e s w h i c h f o r m d i - o r t r i - T M S e r i v a t i v e s . 2 3 9 b y L I P i s v e r a t r a l d e h y d e ( H a e m m e r l i e t a l . , 1 9 8 7 ; S c h m i d t e t a l . , 1 9 8 9 ) ; i t i s u n k n o w n w h e t h e r t h i s c o m p o u n d i s p r o d u c e d i n a p p r e c i a b l e a m o u n t s , s o t h e s t r u c t u r e w a s r e t a i n e d a s a ' p o s s i b i l i t y . T h u s , a l l o f t h e s t r u c t u r e s X L I V - X L V I I I a r e r e a s o n a b l e p o s s i b i l i t i e s f o r l i g n i n - d e r i v e d d e g r a d a t i o n p r o d u c t s . b . S c a n 9 8 6 T h e m a s s s p e c t r u m f o r t h e p e a k i n t h e S - C e x t r a c t a t s c a n 9 8 6 ( 1 4 ’ 4 6 ' ) i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 7 0 ; i t i s i d e n t i c a l t o t h a t f o u n d i n t h e L - E A e x t r a c t . T h i s c o m p o u n d w a s f o u n d i n t h e S - E A B C e x t r a c t a t 0 . 0 5 5 1 n g / u L , a n d i n t h e F : c o n t r o l a t 0 . 0 0 4 4 n g / t t L ; i t i s p r o b a b l e , b a s e d o n t h e r e s u l t s f o r t h e L - E A e x t r a c t t h a t i t w a s p r e s e n t i n t h e o t h e r c o n t r o l s a l s o , b u t e v i d e n t l y a t l e v e l s l o w e n o u g h t o b e u n d e t e c t a b l e . R e f e r t o t h e t r e a t m e n t o f s c a n 9 8 7 i n t h e L — E A B C e x t r a c t f o r t h i s p e a k . 5 . 1 3 . 4 M N P A l o n e R e a c t o r R u n s A s a n e x a m p l e o f t h e G C o u t p u t o b t a i n e d f o r t h e M N P A l o n e B C a n d c o n t r o l s a m p l e s , t h e T I C f o r t h e M N P O n l y L - C e x t r a c t i s s h o w n i n F i g u r e 5 . 7 9 . T h e p e a k a t a b o u t s c a n 5 5 0 ( 8 ’ 1 4 " ) i s t h e i n t e r n a l s t a n d a r d ; n o t e t h a t t h e r e t e n t i o n t i m e s a r e d i f f e r e n t f o r t h i s c a s e b e c a u s e a d i f f e r e n t G C c o l u m n a n d s o l v e n t h o l d t i m e w a s u s e d . T h e p e a k s a t s c a n s 6 5 2 ( 9 ’ 4 5 ” ) a n d 7 6 7 ( 1 1 ’ 2 9 ‘ ) a r e v e r a t r a l d e h y d e a n d v e r a t r y l a l c o h o l ; V A w a s n o t a d d e d t o t h e r e a c t i o n m i x t u r e , s o t h i s V A h a s t o h a v e c o m e e i t h e r f r o m t h e l i g n i n o r f r o m t h e e n z y m e s o l u t i o n . I t i s k n o w n t h a t t h e D 4 H i M n M N P c o n t a i n e d a b o u t 6 % L I P ( a s t o t a l p r o t e i n ) , s o s i n c e V A a n d H 2 0 2 w e r e b o t h p r e s e n t , t h e p r e s e n c e o f v e r a t r a l d e h y d e i s n o t s u r p r i s i n g . V A w a s a d d e d t o t h e P . C h r y s o s p o r i u m c u l t u r e s i n t h e e n z y m e p r o d u c t i o n r u n s ( t o s t i m u l a t e e n z y m e p r o d u c t i o n ) ; i t i s l i k e l y , t h e n , t h a t t h i s V A w a s c a r r i e d a l o n g t h r o u g h t h e c o n c e n t r a t i o n a n d d i a l y s i s s t e p s , p e r h a p s b o u n d t o t h e e n z y m e p r o t e i n s . I n t h e L - C e x t r a c t , V A o c c u r r e d i n a l l o f t h e e x t r a c t s ( B C a n d c o n t r o l s ) i n t h e f o l l o w i n g a m o u n t s ( c o n c e n t r a t i o n s i n t h e u n c o n c e n t r a t e d e x t r a c t s ) : ( a ) B C , 2 . 7 4 8 n g / u L ; ( b ) L ‘ c o n t r o l , 0 . 0 2 1 5 n g / t t L ; ( c ) R ‘ c o n t r o l , 0 . 2 6 3 3 n g / u L ; ( d ) 1 3 ' c o n t r o l , 0 . 0 4 6 3 n g / i t L ; ( e ) A B c o n t r o l , 2 . 1 0 7 n g / i t L ; a n d ( 1 ) E R ‘ c o n t r o l , 2 4 0 M a x 2 1 4 3 . 2 6 R - T - 5 ? 1 0 1 ‘ 5 2 0 m a g . a b u n d . A 1 0 0 ‘ t * ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ * ‘ ‘ ‘ ‘ r r c b J u 1 " a o ~ d . a 4 n 4 c 6 0 * e 4 0 1 I I 2 0 ‘ W . . - . . - . v - 3 - r * ‘ c ' ' . r . - v ' - - v - . ' 1 . 0 2 1 4 3 . 2 6 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0 1 4 0 0 1 6 0 0 S F i g u r e 5 . 7 9 : T o t a l I o n C h r o m a t o a m T I ( C ) f o r t h e M N P A l o n e B C L - C e x t r a c t o v e r t h e s c a n r a n g e 2 5 0 - 1 6 0 0 ( 3 ’ " t o 2 3 ’ 5 8 " ) . 2 4 1 0 . 0 6 8 3 n g / p L . T h e o t h e r e x t r a c t s c o n t a i n e d d i f f e r e n t a m o u n t s o f V A r e l a t i v e t o t h e L - C e x t r a c t s , b u t t h e r e l a t i v e a m o u n t s f o r e a c h r e a c t o r r u n ( B C a n d c o n t r o l s ) w i t h i n a n e x t r a c t g r o u p w e r e a s a b o v e . T h e s e r e s u l t s c o n fi r m t h a t m o s t o f t h e V A w a s b o u n d t o o r e n t r a i n e d i n t h e e n z y m e p r o t e i n , a n d t h a t e n z y m e a c t i v i t y i n t h e p r e s e n c e o f l i g n i n c a u s e d t h e r e l e a s e o f t h i s V A , a n d a l s o t h a t a s m a l l a m o u n t o f V A i s p r e s e n t a s a n e x t r a c t i v e i n t h e l i g n i n i t s e l f . T h i s i s b e c a u s e : ( 1 . ) T h e p r e s e n c e o f o n l y l o w l e v e l s o f V A i n t h e L ’ c o n t r o l , w h e n c o m b i n e d w i t h t h e f a c t t h a t t h e E c o n t r o l a n d t h e E R ' c o n t r o l a l s o h a d o n l y l o w l e v e l s o f V A , i n d i e a t e s t h a t t h e l i g n i n c o n t a i n s a s m a l l a m o u n t o f V A a s a n e x t r a c t i v e , a n d t h a t l i t t l e V A i s r e l e a s e d f r o m t h e e n z y m e w h e n l i g n i n o r H 2 0 2 a r e n o t p r e s e n t ; ( 2 . ) T h e R ' c o n t r o l h a d a s l i g h t l y h i g h e r V A l e v e l , i n d i c a t i n g t h a t t h e p r e s e n c e o f r e a g e n t s ( 1 1 2 0 2 ) i s r e q u i r e d i n a d d i t i o n t o l i g n i n f o r t h e b u l k o f t h e V A t o b e r e l e a s e d f r o m t h e e n z y m e ; ( 3 . ) T h e f a c t t h a t t h e A E c o n t r o l h a d h i g h l e v e l s o f V A ( n e a r l y a s h i g h a s t h e B C ) , w h i c h c o u l d h a v e b e e n r e l e a s e d b y d i s r u p t i o n o f t h e e n z y m e s t r u c t u r e , w h e n c o m b i n e d w i t h t h e h i g h l e v e l s o f V A p r e s e n t i n t h e B C , i n d i c a t e s t h a t t h e V A i s b o u n d t o t h e e n z y m e a n d t h a t t h e p r e s e n c e o f b o t h l i g n i n a n d H 2 0 2 a r e r e q u i r e d f o r t h e r e l e a s e o f t h e V A f r o m t h e e n z y m e . I t i s p r o b a b l e t h a t t h e L I P p r e s e n t ( l o w l e v e l ) i n t h e D 4 H i M n M N P w a s t h e e n z y m e w h i c h b o u n d t h e V A , s i n c e V A i s a s u b s t r a t e f o r L I P . T h e p e a k a t s c a n 8 6 3 ( 1 2 ’ 5 5 ’ ) i s s y r i n g a l d e h y d e , v a n i l l i c a c i d i s a t s c a n 9 2 5 ( 1 3 ’ 5 7 ' ) , s y r i n g i c a c i d i s a t s c a n 1 0 2 3 ( 1 5 ’ 1 9 " ) , 3 , 5 - d i m e t h o x y - h y d r o q u i n o n e i s a t s c a n 8 6 0 ( 1 2 ’ 5 2 ' ) , a n d 2 - m e t h o x y - h y d r o q u i n o n e i s a t s c a n 7 4 4 ( l l ’ 0 8 ' ) . S e e a b o v e f o r s p e c t r a a n d i d e n t i fi c a t i o n m e t h o d s f o r t h e s e c o m p o u n d s . I n a l l o f t h e c o n t r o l e x t r a c t s ( a l l e x t r a c t s f r o m a l l c o n t r o l r u n s ( e x c e p t f o r t h e L ’ c o n t r o l s ) f o r b o t h t h e M N P A l o n e r u n s a n d t h e L I P + M N P r u n s ) , t h e c o n c e n t r a t i o n o f s y r i n g a l d e h y d e w a s s u b s t a n t i a l l y ( 3 t i m e s o r m o r e ) h i g h e r t h a n t h e c o n c e n t r a t i o n o f 3 , 5 - d i m e t h o x y h y d r o q u i n o n e , w h i c h i s k n o w n t o b e f o r m e d f r o m s y r i n g a l d e h y d e ( W a r i i s h i e t a l . , 1 9 8 9 b ; T u o r e t a l . , 1 9 9 2 ) . I n t h e B C e x t r a c t s , t h e r a t i o s h a d s w i t c h e d ; t h e h y d r o q u i n o n e w a s p r e s e n t i n q u a n t i t i e s h i g h e n o u g h t h a t m o r e h y d r o q u i n o n e w a s p r e s e n t t h a n t h e e x t r a c t i v e l e v e l s o f 2 4 2 s y r i n g a l d e h y d e c o u l d a c c o u n t f o r . A r o u g h m a s s b a l a n c e o v e r a l l o f t h e e x t r a c t s f o r t h e M N P A l o n e B C a n d t h e c o n t r o l w i t h t h e h i g h e s t c o n c e n t r a t i o n s o f b o t h c o m p o u n d s , u s i n g c o n c e n t r a t i o n s e s t i m a t e d f r o m t h e i n t e r n a l s t a n d a r d ’ s p r o p o r t i o n a l i t y w i t h p e a k a r e a ( b a l l - p a r k e s t i m a t e ) , i n d i c a t e d t h a t n e a r l y 2 m o l e s o f h y d r o q u i n o n e w e r e p r e s e n t f o r e v e r y m o l e o f s y r i n g a l d e h y d e l o s t , i n d i c a t i n g t h a t s o m e o f t h e h y d r o q u i n o n e h a d t o b e f o r m e d f r o m s y r i n g y l s t r u c t u r e s r e l e a s e d f r o m t h e l i g n i n . W h a t i s o d d a b o u t t h e p r e s e n c e o f t h e h y d r o q u i n o n e , t h o u g h , i s t h a t t h e m a j o r p r o d u c t o f t h i s r e a c t i o n i s 3 , 5 - d i m e t h o x y - 1 , 4 - b e n z o q u i n o n e ( o n e a d d i t i o n a l o x i d a t i o n s t e p ) a n d t h e h y d r o q u i n o n e i s u s u a l l y a m i n o r p r o d u c t a n d i s n o t g e n e r a l l y p r o d u c e d i n q u a n t i t i e s g r e a t l y e x c e e d i n g t h a t o f t h e q u i n o n e ( W a r i i s h i e t a l . , 1 9 8 9 b ; T u o r e t a l . , 1 9 9 2 ) ; t h e q u i n o n e w a s n o t f o u n d i n a n y o f t h e s a m p l e s ( a n a u t h e n t i c s p e c t r u m o f t h e q u i n o n e h a s b e e n p u b l i s h e d b y T u o r e t a l . , 1 9 9 2 ; t h e T I C s w e r e s e a r c h e d f o r t h e m a j o r i o n f r a g m e n t s i n t h i s s p e c t r u m : { 1 7 0 ( M + + 2 , 1 2 . 5 9 6 ) , 1 6 8 ( M ’ , 5 9 . 8 ) , 1 2 5 ( 1 7 . 1 ) , 8 0 ( 5 0 . 0 ) , 6 9 ( 1 0 0 ) } ) . T h e m o s t p r o b a b l e e x p l a n a t i o n f o r t h i s f a c t i s t h a t t h e q u i n o n e f o r m i s e x t r e m e l y v o l a t i l e , e v e n a t r o o m t e m p e r a t u r e ( D r . M . H . G o l d , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n ) , a n d w o u l d a l m o s t c e r t a i n l y h a v e e v a p o r a t e d w h e n t h e e x t r a c t s w e r e c o n c e n t r a t e d t o d r y n e s s b e f o r e d e r i v a t i z a t i o n f o r G C / M S . T h e h y d r o q u i n o n e i s n o t e s p e c i a l l y s t a b l e i n a n o x i d i z i n g e n v i r o n m e n t a n d e a s i l y c o n v e r t s t o t h e q u i n o n e i n t h e p r e s e n c e o f M n ( I I I ) , a n d s o s h o u l d n o t b e p r e s e n t i n v e r y h i g h a m o u n t s ( D r . M . H . G o l d , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n ) . S i n c e t h e d e r i v a t i z a t i o n s w e r e d o n e i n 1 / 2 d r a m v i a l s a t 6 0 ° C a n d t h e t o t a l l i q u i d v o l u m e w a s o n l y 2 5 p L , i t i s l i k e l y t h a t a n y o f t h e q u i n o n e r e m a i n i n g a f t e r c o n c e n t r a t i o n o f t h e s a m p l e ( v e r y l i t t l e ) w o u l d w i n d u p s t u c k t o t h e s i d e s o f t h e v i a l n e a r t h e t o p , a n d n o t i n t h e s a m p l e . T h e r e f o r e , t h e o b s e r v a t i o n o f t h e p r e s e n c e o f t h e h y d r o q u i n o n e i n t h e s a m p l e s a t a g i v e n c o n c e n t r a t i o n l e a d s t o t h e c o n c l u s i o n t h a t t h e q u i n o n e m u s t h a v e b e e n t h e r e i n m u c h h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s ( D r . M . H . G o l d , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n ) . S i n c e t h e r e i s a l r e a d y m o r e t h a n e n o u g h h y d r o q u i n o n e p r e s e n t t o a c c o u n t f o r t h e d e c r e a s e i n s y r i n g a l d e h y d e c o n c e n t r a t i o n i n t h e c o n t r o l s v e r s u s t h e B C , t h i s a d d i t i o n a l q u i n o n e c o u l d 2 4 3 o n l y h a v e b e e n f o r m e d f r o m t h e l i g n i n ( D r . M . H . G o l d , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n ) . I n o r d e r t o t e s t w h e t h e r t h i s w a s t r u e a l s o f o r t h e 2 - m e t h o x y h y d r o q u i n o n e , v a n i l l i n ( v a n i l l y l a l d e h y d e ) w a s p u r c h a s e d ( A l d r i c h ) a n d a n a l y z e d b y G C / M S u s i n g t h e ' D B - l G C c o l u m n t o g e t a r e f e r e n c e s p e c t r u m . T h e v a n i l l i n e l u t e d t h e c o l u m n i n s c a n 6 4 9 ( 9 ’ 4 3 ” ) ; t h e m a s s s p e c t r u m o f v a n i l l i n i s s h o w n i n F i g u r e F . 1 8 ( A p p e n d i x F ) . F u r t h e r a n a l y s i s i n d i c a t e d t h a t t h e 2 - m e t h o x y h y d r o q u i n o n e c o u l d b e a c c o u n t e d f o r s i m p l y b y e x t r a c t a b l e v a n i l l i n , s i n c e t h e c o n c e n t r a t i o n o f v a n i l l i n w a s s i g n i fi c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t o f t h e 2 - m e t h o x y h y d r o q u i n o n e i n a l l s a m p l e s . T h e p e a k s f o r a l l e x t r a c t s f o r t h e M N P A l o n e B C w h i c h w e r e n o t e l i m i n a t e d b y c o m p a r i s o n w i t h t h e c h r o m a t o g r a m s o f t h e c o n t r o l s a n d t h e s t a n d a r d a l o n e a r e p r e s e n t e d , w i t h c o n c e n t r a t i o n e s t i m a t e s ( c o n c e n t r a t i o n s i n t h e u n c o n c e n t r a t e d e x t r a c t s ) , i n T a b l e 5 . 1 5 . I n t h e L - C B C e x t r a c t , t h r e e u n i q u e p e a k s w e r e i d e n t i fi e d , o n e o f w h i c h w a s i d e n t i c a l t o t h a t i n s c a n 8 3 4 o f t h e S - C e x t r a c t o f t h e L I P + M N P B C . I n t h e L - E A B C e x t r a c t , o n e u n i q u e p e a k w a s f o u n d , i n a d d i t i o n t o t h e c o m p o u n d f o u n d i n s c a n 9 8 7 o f t h e L I P + M N P B C L — E A e x t r a c t . O n e u n i q u e p e a k w a s f o u n d i n t h e S - C e x t r a c t ; o n e u n i q u e p e a k w a s f o u n d i n t h e S - E A e x t r a c t , i n a d d i t i o n t o t h e c o m p o u n d i n s c a n 9 8 7 o f t h e L I P + M N P B C L - E A e x t r a c t . T h e s e p e a k s a r e a n a l y z e d b e l o w . 5 . 1 3 . 4 . 1 P e a k s I n T h e M N P A l o n e B C L - C E x t r a c t a . S c a n 9 0 9 T h e m a s s s p e c t r u m f o r t h e p e a k i n t h e L - C e x t r a c t a t s c a n 9 0 9 ( 1 3 ’ 3 6 ' ) i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 7 5 ; i t i s i d e n t i c a l t o t h a t f o u n d i n s c a n 8 3 4 ( 1 2 ’ 2 9 ' ) o f t h e L I P + M N P B C S - C e x t r a c t . T h i s c o m p o u n d w a s f o u n d i n t h e S - E A B C e x t r a c t a t 0 . 0 2 4 9 n g / t t L , b u t n o t i n a n y o f t h e c o n t r o l s ; i t i s p r o b a b l e , b a s e d o n t h e r e s u l t s f o r t h e L I P + M N P B C L - E A e x t r a c t t h a t i t w a s p r e s e n t i n o t h e r c o n t r o l s a l s o , b u t e v i d e n t l y a t l e v e l s l o w e n o u g h t o b e u n d e t e c t a b l e . I t s p r e s e n c e i n t h e M N P O n l y e n z y m e c a s e i n d i c a t e s t h a t i t i s a n M N P - r e l e a s e d p r o d u c t . R e f e r t o t h e t r e a t m e n t o f s c a n 8 3 4 i n t h e S - C B C e x t r a c t f o r t h i s p e a k . N W N U O — n u b 2 4 4 T a b l e 5 . 1 5 : P e a k s i n t h e M N P A l o n e B C e x t r a c t s s e l e c t e d f o r s t r u c t u r a l a n a l y s i s O b y c o m p a r i n g t h e T o t a l I o n C h r o m a t o g r a m s o f t h e B C e x t r a c t s w i t h t h e c o r r e s p o n d i n g e x t r a c t s o f i t s c o n t r o l s . T h e i d e n t i t y o f t h e c o m p o u n d i s l i s t e d i f k n o w n ; i f n o t , t h e p o s s i b l e m o l e c u l a r f o r m u l a s ( b a s e d o n t h e m o l e c u l a r w e i g h t d e t e r m i n e d f r o m t h e m a s s s p e c t r u m ) a r e l i s t e d . E s t . D e r i v a t i z e d N o . S c a n C o n c . M . W . T M S E x t r a c t N o . R T ’ ( n g f u L ) ( g / m o l e ) G r o u p s I d e n t i t y i f k n o w n C n H i o O s 0 ' C I J ' I r z o s C J ‘ L O s 0 ' C 1 H . O . C 9 H I 0 0 3 0 " C 1 0 H r 4 0 4 C J ' I s O r 0 2 4 1 1 2 2 0 9 C a n n o t 0 " C Z I H I I O ' I C r e r s O r 0 ' C r s n n o c C I I H I O O C O f C 1 2 H 1 4 0 3 n o ’ 9 0 9 1 3 3 6 ' 0 . 0 2 4 9 3 7 2 L - C 1 0 3 0 1 5 2 5 : 0 . 0 4 4 5 3 4 2 L C 1 4 4 4 2 1 3 7 ' 0 . 0 4 9 8 5 2 6 L - E A 6 8 2 1 0 1 2 ' 0 . 0 3 5 8 2 9 0 7 2 ? U n k n o w n " L - E A ' 1 0 6 2 1 5 6 4 - 0 . 1 4 9 9 4 0 0 1 c . , i i . , o , , c . . i i . . o . , C r s n z o o s . 0 1 ’ C n H u 0 4 2 ( 3 1 1 3 1 2 0 7 . C I Z H I O O ‘ n 0 ' C i r H a O s 3 C a r n o t . C a m i . o r C Q H I Z O O S - C 1 4 9 8 2 2 7 6 ' 0 . 0 9 8 8 5 5 2 1 C a n y o n , C u H u O g , 0 1 ’ C n H a o . 2 C a n n o n 0 " 0 1 0 a n 3 C i s n i s o l . C 1 7 H 2 0 0 7 . 0 ' C t t H u O t S - E A 4 3 7 6 . 3 2 . 0 . 0 1 8 9 3 1 8 I C u H a n O l ' C I Q H I ' O J S - E A ' 1 0 6 3 1 5 3 5 ' 0 . 0 9 0 2 4 0 0 1 0 . 7 1 1 . 2 0 7 , c . . 1 i . . o . , C r s fl z o o s . 0 ' C m H 2 4 0 4 2 C i r H u O - i . C r z n r s o c . 0 1 ' ( 3 1 3 1 1 2 0 0 : 3 C 1 I ' L O ‘ , C : H . 0 3 , O l ' C n t h O t + R e t e n t i o n t i m e w i t h D B S - M S G C c o l u m n a n d 2 . 0 0 m i n s o l v e n t h o l d . ‘ T h i s c o m p o u n d i s i d e n t i c a l t o t h a t i n s c a n 8 3 4 ( 1 2 2 9 ' ) o f t h e S - C B C e x t r a c t f o r t h e L I P + M N P e n z y m e c a s e . ” T h e n o i s e l e v e l i n t h e m a s s s p e c t r u m f o r t h i s p e a k i s t o o h i g h t o i d e n t i f y t h e m o l e c u l a r i o n w i t h a h i g h d e g r e e o f c e r t a i n t y . # T h i s c o m p o u n d i s i d e n t i c a l t o t h a t i n s c a n 9 8 7 ( l 4 ' 4 7 ' ) o f t h e L - E A B C e x t r a c t f o r t h e L I P + M N P e n z y m e c a s e 2 4 5 b . S c a n 1 0 3 0 T h e m a s s s p e c t r u m f o r t h e p e a k i n t h e L - C e x t r a c t a t s c a n 1 0 3 0 ( 1 5 ’ 2 5 " ) i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 8 0 a a n d t h e T I C a n d m a s s c h r o m a t o g r a m s f o r m a s s e s 3 4 2 , 3 2 7 , 2 9 7 , a n d 2 5 4 o v e r t h e s c a n r a n g e 9 8 0 t o 1 0 8 0 a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 8 0 b . T h i s p e a k w a s u n i q u e t o t h e M N P A l o n e L - C B C e x t r a c t . T h e d e r i v a t i z e d m o l e c u l a r w e i g h t o f t h i s c o m p o u n d i s 3 4 2 , a n d i t c o n t a i n s a t l e a s t o n e T M S - d e r i v a t i z a b l e g r o u p . B a s e d o n t h e m o l e c u l a r w e i g h t , i t w a s t h o u g h t t h a t t h i s m i g h t b e s y r i n g i c a c i d w h i c h i s a l s o m o l e c u l a r w e i g h t 3 4 2 a n d e l u t e s t h e c o l u m n n e a r t h i s r e t e n t i o n t i m e ; h o w e v e r , s y r i n g i c a c i d w a s l o c a t e d i n t h i s s a m p l e a t s c a n 1 0 2 3 ( 1 5 ’ 1 9 " ) , a n d s o i s a l s o i n t h e T I C a n d m a s s c h r o m a t o g r a m s g i v e n i n F i g u r e 5 . 8 0 b ( i t i s t h e l a r g e p e a k j u s t t o t h e l e f t o f t h e p e a k a t 1 0 3 0 ) . T h u s , t h i s c o m p o u n d i s n o t s y r i n g i c a c i d , b u t m a y r e s e m b l e i t d u e t o t h e a p p e a r a n c e o f m a n y o f t h e s a m e i o n f r a g m e n t s ( r e f e r t o F i g u r e 5 . 5 6 c f o r t h e m a s s s p e c t r u m o f s y r i n g i c a c i d ) . T h e c o m p o u n d c o n t a i n s 2 o r 3 d e r i v a t i z a b l e g r o u p s ( t h e c a s e f o r o n l y 1 d e r i v a t i z a b l e g r o u p w a s c h e c k e d ; n o l i g n i n d e r i v e d s t r u c t u r e s w e r e p o s s i b l e ) . T h e p e a k a t 2 2 3 m a s s u n i t s s u g g e s t s a g u a i a c y l - t y p e s t r u c t u r e . P o s s i b l e m o l e c u l a r f o r m u l a s a r e { r + d b } : C 9 H m O , { 5 } a n d C u i - 1 , 4 0 4 { 4 } ( t w o T M S ) ; a n d C , , I - I . , O 3 { 4 } . T h e p o s s i b l e s t r u c t u r e s f o r b o t h c a s e s ( e x c l u d i n g s y r i n g i c a c i d f o r C J - I l o O , { 5 } ( 2 m s » a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 8 1 . A l l o f t h e s t r u c t u r e s ( X L I X - L V I ) f o r t w o T M S a r e p o s s i b l e l i g n i n - d e r i v e d c o m p o u n d s ; t h e r e i s o n l y o n e p o s s i b i l i t y f o r 3 T M S , 1 , 2 , 4 - t r i h y d r o x y b e n z e n e , w h i c h i s a v a i l a b l e f r o m A l d r i c h ( n o n e o f t h e i s o m e r s a r e n o t l i k e l y t o b e l i g n i n - d e r i v e d ) . N o n e o f t h e o t h e r c o m p o u n d s w e r e f o u n d t o b e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e . O f t h e s e c o m p o u n d s , s t r u c t u r e X L I X m o s t r e s e m b l e s a g u a i a c y l s t r u c t u r e r e l e a s e d o x i d a t i v e l y f r o m l i g n i n , w h i l e s t r u c t u r e L I I m o s t r e s e m b l e s a s y r i n g y l - t y p e s t r u c t u r e ( b e c a u s e i t i s ) a n d a l s o r e s e m b l e s s y r i n g i c a c i d ; t h e p r e s e n c e o f a n M ” - 9 0 f r a g m e n t ( 2 5 2 ) a l s o s u p p o r t s t h i s s t r u c t u r e . F i n a l l y , s t r u c t u r e L V I I ( 1 , 2 , 4 - t r i h y d r o x y b e n z e n e ) i s n o t s u p p o r t e d b y t h e m a s s s p e c t r u m - - i t i s d i f fi c u l t t o i m a g i n e h o w t h i s m o l e c u l e c o u l d l o s e a f r a g m e n t o f m a s s 1 5 f r o m i t s m o l e c u l a r i o n ( e x c e p t f r o m t h e 2 4 6 ( a . ) 1 0 0 . 3 2 7 a . e . 1 8 0 4 . a 1 2 9 7 t 1 v 6 0 ‘ - e 4 i A 4 b 4 0 " 7 3 h u 4 n 1 d . . a 2 0 7 2 ‘ 2 2 I - n 4 1 3 1 ' 3 2 ’ c . s o 9 4 1 9 2 ' 8 2 3 3 1 e 5 5 6 7 1 : 9 1 2 . . , h 4 ‘ . t T l l 0 I ' X I L ' X L X ' 1 - s o 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 n / z ( b . ) . 4 a . r . M a x 3 2 0 6 1 5 1 6 m a g . a b u n d . A r r c b 1 . 1 n . , i 1 . 0 2 3 0 . 6 7 0 d 2 5 4 a n c 1 - 4 . 9 0 . 6 5 6 3 e 2 9 7 ' - 1 . 3 2 . 4 2 4 3 3 2 7 ' ~ 1 . 0 3 . 2 4 0 6 3 4 2 7 - 1 . 3 2 . 4 4 2 3 V ‘ ' I V ' ' T ' v ' I ‘ ' ' I ' ' ' 9 3 0 1 0 0 0 1 0 2 0 1 0 4 0 1 0 6 0 1 0 0 0 S e a n F i g u r e 5 . 8 0 : ( a . ) E l e c t r o n - i m a c t m a s s s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m s c a n 1 0 3 0 ( b a c k g r o u n d a v e r a g e o f s c a n s 1 7 a n d 1 0 3 3 ) o f t h e T I C f r o m t h e M N P A l o n e B C L - C e x t r a c t ; a n d ( b . ) T I C a n d m a s s c h r o m a t o g r a m s f o r i o n s o f m a s s 2 5 4 , 2 9 7 , 3 2 7 , a n d 3 4 2 o v e r t h e s c a n r a n g e 9 8 0 - 1 0 8 0 . 2 4 7 2 W 3 c 0 0 1 1 c 0 0 1 1 0 0 " a n . . . O . . . W E E M 1 6 1 0 0 1 2 0 1 1 0 0 X L I X L 1 , ] 0 1 1 0 " 0 1 1 1 1 0 C 1 0 H 1 4 0 4 1 1 3 c c 0 0 1 3 6 k 0 0 ! : 1 1 0 6 0 0 1 1 3 0 1 1 O C H : 0 L 1 1 L 1 1 ] L I V 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 6 O C H : 6 O C H 3 0 0 W W ] 3 T M S 0 1 1 c . . . g ; 0 1 1 L V I I F i g u r e 5 . 8 1 : P r o p o s e d l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r t h e c o m p o u n d w i t h m a s s s p e c t r u m s h o w n i n F i g u r e 5 . 8 0 , i n c l u d i n g s t r u c t u r e s w h i c h f o r m d i - o r t r i - T M S d e r i v a t i v e s . 2 4 8 T M S g r o u p s ) , o r h a v e a f r a g m e n t o f m a s s 2 2 3 . T h i s c o m p o u n d w a s p u r c h a s e d ( A l d r i c h ) a n d a n a l y z e d b y G C / M S u s i n g t h e D B — l G C c o l u m n ; i t e l u t e d t h e c o l u m n i n s c a n 7 3 2 ( 1 0 ’ 5 2 ' ) , a n d i t s m a s s s p e c t r u m i s s h o w n i n F i g u r e F . 1 9 ( A p p e n d i x F ) . N e i t h e r t h e r e t e n t i o n t i m e n o r t h e m a s s s p e c t r u m m a t c h e s t h a t o f s c a n 1 0 3 0 , s o s c a n 1 0 3 0 c a n n o t b e t h i s c o m p o u n d . W h i l e t h e o t h e r s t r u c t u r e s c a n n o t b e r u l e d o u t b a s e d o n t h i s ( n o i s y ) s p e c t r u m , s t r u c t u r e s X L I X a n d L I I s e e m t o b e t h e m o s t l i k e l y c a n d i d a t e s b e c a u s e t h e y a r e s y r i n g y l - g u a i a c y l - t y p e s t r u c t u r e s w h i c h c o u l d l i k e l y b e r e l e a s e d f r o m l i g n i n . c . S c a n 1 4 4 4 T h e m a s s s p e c t r u m f o r t h e p e a k i n t h e L - C e x t r a c t a t s c a n 1 4 4 4 ( 2 1 ’ 3 7 ’ ) i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 8 2 ; t h i s p e a k w a s u n i q u e t o t h e M N P A l o n e L - C B C e x t r a c t . T h i s c o m p o u n d i s v e r y l a r g e ( d e r i v a t i z e d m o l e c u l a r w e i g h t o f 5 2 6 ) , a n d i s p r o b a b l y a d i m e r o r t r i m e r b a s e d o n i t s l o w v o l a t i l i t y ( l a t e r e t e n t i o n t i m e ) . T h i s c o m p o u n d i s p r e s e n t i n l o w c o n c e n t r a t i o n ( 0 . 0 4 9 8 n g / t t L ) , w h i c h a c c o u n t s f o r t h e f a i r a m o u n t o f n o i s e i n t h e m a s s s p e c t r u m . T h e r e i s a p e a k a t m a s s 4 3 6 ( M ’ - 9 0 ) , s u g g e s t i n g a n t a t - c a r b o x y l i c a c i d i s p r e s e n t ; i n a d d i t i o n , t h e i s o t o p e p a t t e r n o n t h e m o l e c u l a r i o n s u g g e s t s a f a i r a m o u n t o f S i i s p r e s e n t . B a s e d o n i t s m o l e c u l a r w e i g h t , t h i s c o m p o u n d c o u l d c o n t a i n u p t o fi v e d e r i v a t i z a b l e g r o u p s ; i t w a s f o u n d d u r i n g a n a l y s i s t h a t n o l i g n i n - d e r i v e d p r o d u c t s w e r e p o s s i b l e f o r t h e c a s e o f 5 T M S - d e r i v a t i z a b l e g r o u p s . P o s s i b l e m o l e c u l a r f o r m u l a s a r e { r + d b } : ( 2 2 4 1 1 2 2 0 9 { 1 4 } ( o n e T M S ; o t h e r s a r e p r o b a b l y p o s s i b l e , b u t b a s e d o n t h e i s o t o p e p a t t e r n o n t h e m o l e c u l a r i o n , 1 T M S i s n o t p r o b a b l e ) ; C z o i - I M O , { l 4 } a n d C 2 1 H 1 3 0 7 { 1 3 } ( t w o T M S ) ; C , , H , , O 7 { 7 } a n d C M H n O , { 6 } ( t h r e e T M S ) ; a n d fi n a l l y , C H H N O , { 7 } a n d C H H M O , { 6 } . P o s s i b l e s t r u c t u r e a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 8 3 . S t r u c t u r e L V I I I i s u n l i k e l y d u e t o t h e u n o x i d i z e d s i d e c h a i n f r a g m e n t a t t a c h e d t o t h e p a r a o x y g e n o n r i n g 1 ( l e f t - l a n d r i n g ) . S t r u c t u r e L I X i s q u i t e l i k e l y i f t h e c o m p o u n d a r o s e f r o m a n e n d g r o u p i n t h e l i g n i n . S t r u c t u r e L X m a y n o t b e e x i s t ; i t w a s a s s u m e d t h a t t h e h y d r o x y l g r o u p o f t h e e n o l a t C , o f t h e s i d e c h a i n o f r i n g 2 , w h i c h i n t h e a u t h e n t i c c o m p o u n d w o u l d e x i s t a s a n a l d e h y d e , w a s d e r i v a t i z a b l e . T h e s a m e i s t r u e f o r t h e e n o l s p r e s e n t i n s t r u c t u r e s 2 4 9 1 0 0 5 2 4 5 R I e . 1 8 0 ‘ . . a . c i V 6 0 ‘ 7 3 “ e ‘ b . . A i r b 4 0 7 - u 4 > n 5 1 1 d I a 2 0 . - n 1 1 - , 3 7 7 4 1 4 6 t c . 1 1 1 2 3 2 3 5 3 9 4 3 I e . 5 9 1 5 1 8 0 2 6 j : 0 ‘ I X ‘ 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 M M F i g u r e 5 . 8 2 : E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m s c a n 1 4 4 4 b a c k g r o u n d a v e r a g e o f s c a n s 1 4 4 2 a n d 1 4 4 7 ) o f t h e T I C f r o m t h e M N P A l o n e B C C e x t r a c t . 2 5 0 c 1 1 0 1 1 1 1 3 ” * 0 C 2 4 H 2 2 0 9 © © H 3 C 0 O C H 3 o 0 * m o l ‘ l o " ' \ t ' . ' H O L V I I I 0 0 0 1 1 2 T M S ( ‘ a o H u O s 0 1 . 1 - 1 1 . 0 ; H O 0 H O . . . C ) e O H C D Y o m y L I X L X 3 T M S C a l i 0 o n ° " . I ! 7 O i l C q u z O ‘ O H " S m O C H 3 H 3 C O O C H 3 0 0 H O A C H O A ; 0 H L X I L X I I c 0 0 1 1 O H 4 T M S C 1 1 H 1 0 0 6 C 1 2 H 1 4 0 5 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 0 V s O H H O ” 0 " L X I I I L X I V F i g u r e 5 . 8 3 : P r o p o s e d l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r t h e c o m p o u n d w i t h m a s s s p e c t r u m c s i h o w n i n F i g u r e 5 . 8 2 , i n c l u d i n g s t r u c t u r e s w h i c h f o r m m o n o - , d i - , t r i - o r t e t r a - T M S e r i v a t i v e s . 2 5 1 L X I , L X I I I , a n d L X I V . N o t e t h a t t h e a l i p h a t i c s i d e c h a i n s i n s t r u c t u r e s L X I a n d L X I I c o u l d a r i s e f r o m a p i n o r e s i n o l l i n k a g e . T h u s , o f t h e s t r u c t u r e s p r o p o s e d , L I X s e e m s t o b e t h e m o s t l i k e l y t o a r i s e f r o m a n o x i d a t i v e d e g r a d a t i o n o f l i g n i n . N o n e o f t h e s e c o m p o u n d s a r e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e . N o t e t h a t m o s t o f t h e s e s t r u c t u r e s c o n t a i n e n o l i c h y d r o x y l s - - i t c o u l d b e t h a t o n e o f t h e r i n g s i n t h e d i m e r i s a r i n g — o p e n e d p r o d u c t , w h i c h w o u l d a l l o w m o r e p o s s i b i l i t i e s f o r m o l e c u l a r f o r m u l a ( n o r i n g - o p e n e d p o s s i b i l i t i e s w e r e c o n s i d e r e d ) . 5 . 1 3 . 4 . 2 P e a k s I n T h e M N P A l o n e B C L - E A E x t r a c t a . S c a n 6 8 2 T h e m a s s s p e c t r u m f o r t h e p e a k i n t h e L - E A e x t r a c t a t s c a n 6 8 2 ( 1 0 ’ 1 2 " ) i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 8 4 ; t h i s p e a k w a s u n i q u e t o t h e M N P A l o n e B C L - E A e x t r a c t . W h i l e t h i s c o m p o u n d i s i n h i g h e r c o n c e n t r a t i o n ( 0 . 0 3 5 8 n g / u L ) t h a n s o m e c o m p o u n d s f o r w h i c h c l e a n s p e c t r a w e r e o b t a i n e d , t h i s p e a k w a s i n a v e r y n o i s y r e g i o n o f t h e c h r o m a t o g r a m , s o a c l e a n s p e c t r u m w a s n o t p o s s i b l e . T h i s c o m p o u n d i s t h e n t a g g e d a s a n u n k n o w n o f p o s s i b l e m o l e c u l a r w e i g h t 2 9 0 , a n d w i t h t w o T M S - d e r i v a t i z a b l e g r o u p s . b . S c a n 1 0 6 2 T h e m a s s s p e c t r u m f o r t h e p e a k i n t h e L - E A e x t r a c t a t s c a n 1 0 6 2 ( 1 5 ’ 5 4 " ) i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 7 0 ; i t i s i d e n t i c a l t o t h a t f o u n d i n t h e L I P + M N P B C L - E A e x t r a c t i n s c a n 9 8 7 ( l 4 ’ 4 7 ' ) . T h i s c o m p o u n d w a s f o u n d i n t h e L - E A B C e x t r a c t a t 0 . 1 4 9 9 n g / u L , b u t n o t i n a n y o t h e r c o n t r o l s ; i t i s p r o b a b l e , b a s e d o n t h e r e s u l t s f o r t h e L I P + M N P B C L - E A e x t r a c t t h a t i t w a s p r e s e n t i n t h e o t h e r c o n t r o l s a l s o , b u t e v i d e n t l y a t l e v e l s l o w e n o u g h t o b e u n d e t e c t a b l e . R e f e r t o t h e t r e a t m e n t o f s c a n 9 8 7 i n t h e L I P + M N P B C L - E A e x t r a c t f o r t h i s p e a k . 5 . 1 3 . 4 . 3 P e a k s I n T h e M N P A l o n e B C S - C E x t r a c t a . S c a n 1 4 9 8 T h e m a s s s p e c t r u m f o r t h e p e a k i n t h e S - C e x t r a c t a t s c a n 1 4 9 8 ( 2 2 ’ 2 6 " ) i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 8 5 ; t h i s p e a k w a s u n i q u e t o t h e M N P A l o n e S - C B C e x t r a c t . T h i s 2 5 2 1 0 0 1 7 R . e . 1 8 0 ‘ - a . t i v 6 0 ‘ — e 1 2 1 1 5 A b 4 0 ‘ ’ u . 2 4 ’ n r d . 1 a 2 . 0 > a 2 0 . . 2 5 ’ - “ ‘ 6 6 7 5 9 3 1 9 2 0 2 ‘ 2 7 2 0 ° I t s 5 " 8 4 1 ° 1 2 1 2 1 1 ‘ l 1 e 8 9 I o ] . l l _ s o 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 F i g u r e 5 . 8 4 : E l e c t r o n — i m p a c t m a s s s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m s c a n 6 8 2 ( b a c k g r o u n d s c a n 6 8 1 ) o f t h e T I C f r o m t h e M N P A l o n e B C L - E A e x t r a c t . 2 5 3 1 0 0 r 5 5 2 , R t e ‘ ‘ l 8 0 " " a J t i v 6 0 4 L e ‘ L A b 4 0 “ - L “ l n ‘ p d 4 7 3 p a 2 0 - 1 + - S 7 n 1 > C 4 1 8 2 . 2 e t 9 5 1 5 1 7 9 2 3 3 ' 8 3 1 3 2 3 4 ‘ 5 ” 9 5 " 6 0 2 0 0 - r - 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 a n F i g u r e 5 . 8 5 : E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m s c a n 1 4 9 8 ( b a c k g r o u n d a v e r a g e o f s c a n s 1 4 9 6 a n d 1 5 0 0 ) o f t h e T I C f r o m t h e M N P A l o n e B C S - C e x t r a c t . 2 5 4 c o m p o u n d i s a n o t h e r p r o b a b l e d i m e r o r t r i m e r o f d e r i v a t i z e d m o l e c u l a r w e i g h t 5 5 2 . T h e c o m p o u n d c o n t a i n s a t l e a s t o n e a n d c a n h a v e a s m a n y a s 3 T M S - d e r i v a t i z a t i o n s ( 4 a n d 5 T M S a r e n o t s t r u c t u r a l l y p o s s i b l e f o r a l i g n i n - d e r i v e d p r o d u c t ) . T h i s c o m p o u n d c o n t a i n s b o t h 2 2 3 a n d 2 5 3 m a s s f r a g m e n t s , s u g g e s t i n g g u a i a c y l - a n d / o r s y r i n g y l - t y p e s t r u c t u r e s a r e p r e s e n t . T h e p e a k a t m a s s 4 6 2 ( w h i c h c o u l d b e n o i s e ) , m a y s u g g e s t a n a - c a r b o x y l i c a c i d . T h e c o m p o u n d w a s f o u n d i n f a i r l y s u b s t a n t i a l ( c o m p a r a t i v e l y ) c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 0 9 8 8 n g / u L . P o s s i b l e m o l e c u l a r f o r m u l a s a r e { r + d b } : C u H m O w { 1 6 } , ( 2 2 6 1 - 1 2 4 0 9 { 1 5 } , a n d ( 4 7 1 1 2 8 0 8 { 1 4 } ( o n e T M S ) ; C 1 9 1 1 2 0 0 1 0 { 1 0 } a n d C o n z a O s { 9 } ( t w o T M S ) ; a n d C m H m O g { 9 } , C 1 7 H 2 0 0 7 { 8 } , a n d c , , H , , o , { 7 } . P o s s i b l e s t r u c t u r e s a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 8 6 a ( o n e T M S ) , F i g u r e 5 . 8 6 b ( t w o T M S ) , a n d F i g u r e 5 . 8 6 c ( t h r e e T M S ) . N o n e o f t h e s e c o m p o u n d s a r e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e ; n o t e t h a t t h e p r o p o s e d s t r u c t u r e s f o r t h i s c o m p o u n d a r e n o t e x c l u s i v e o f o t h e r p o s s i b i l i t i e s ( n o r i s t h i s t r u e f o r a n y o t h e r p e a k a n a l y z e d ) d u e t o i s o m e r s , e t c . T h e m o n o m e r s i n s t r u c t u r e L X V a r e l i n k e d b y o n e 6 - 0 - 4 l i n k a g e ( o r i g i n a l l y B - O — 4 , n o w o x i d i z e d ) a n d o n e d i p h e n y l e t h e r l i n k a g e ; t h i s i s a r e a s o n a b l e l i g n i n - d e r i v e d p r o d u c t . S t r u c t u r e L X V I i s l i n k e d b y o n e d i p h e n y l e t h e r l i n k a g e a n d o n e ( n o w o x i d i z e d ) a - a r y l e t h e r l i n k a g e , a n d i s a n o t h e r r e a s o n a b l e l i g n i n - d e r i v e d p r o d u c t . S t r u c t u r e L X V I I i s l i n k e d b y t w o B - O — 4 l i n k a g e s ; t h i s s t r u c t u r e m a y n o t b e a c a n d i d a t e d u e t o t h e l a c k o f o x i d a t i o n i n t h e s i d e c h a i n s . S t r u c t u r e s L X V I I I a n d L X I X a r e l i n k e d b y a n a - a r y l e t h e r b o n d ( n o w o x i d i z e d ) , a n d a r e b o t h r e a s o n a b l e l i g n i n - d e r i v e d p r o d u c t s . S t r u c t u r e L X X i s l i n k e d b y a 6 - 0 - 4 l i n k a g e , a n d i s a r e a s o n a b l e p o s s i b i l i t y , a s w e l l a s a r e a n u m b e r o f p o s s i b l e i s o m e r s o f t h i s s t r u c t u r e . S t r u c t u r e L X X I l o o k s o d d a t fi r s t g l a n c e , b u t i n s p e c t i o n o f t h e l i n k a g e b e t w e e n m o n o m e r s 3 a n d 2 , a n d m o n o m e r s 1 3 c a n d 1 4 c i n F i g u r e 1 . 1 w i l l p r o v i d e t h e s o u r c e o f t h e e x t r a s i d e c h a i n a t p o s i t i o n 5 o f t h e r i n g ; i t i s u n k n o w n w h e t h e r t h i s t y p e o f s t r u c t u r e w o u l d b e f o r m e d i n a n o x i d a t i v e d e g r a d a t i o n o f l i g n i n . S t r u c t u r e L X X I I i s a n o t h e r r e a s o n a b l e l i g n i n - d e r i v e d p r o d u c t , a n d i s l i n k e d b y a d i p h e n y l e t h e r b o n d . S t r u c t u r e L X X I I I i s l i n k e d b y a n i n t a c t a - a r y l e t h e r l i n k a g e a n d c o u l d a r i s e f r o m C a - C B 2 5 5 t h i s 0 O C H 3 I 0 © 0 @ C q u o O m H 3 C O L X V Q C H O H O O C H 3 O C H 3 0 2 5 2 . 0 9 0 O H C O H C O C H 3 O C H 3 0 H C n s t O s @ 0 O L X V I I o n e O C H 3 ° C " 3 F i g u r e 5 . 8 6 : P r o p o s e d l i g n i n o d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r t h e c o m p o u n d w i t h m a s s s p e c t r u m s h o w n i n F i g u r e 5 . 8 5 . ( 3 . ) S t r u c t u r e s w h i c h f o r m m o n o - T M S d e r i v a t i v e s . 2 5 6 2 h i s 0 O C H 3 O O C H 3 C t s t o O w L X V I I ] O C H 2 0 H H O O C O C H 3 O C H 3 C H O 3 © 0 C H 3 C 2 0 H 2 4 0 9 L X I X O H O H 2 C © m 0 H O C H 3 ‘ O O O C O C H 3 H O H z C O C H 3 O C H 2 0 H O C H 3 F i g u r e 5 . 8 6 . P r o p o s e d l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r t h e c o m m a s s u n d w i t h s h o w n i n F i g u r e 5 . 8 5 . ( b . ) S t r u c t u r e s w h i c h f o r m d i - T I E I ‘ S d e r i v a t i v e s . s p e c t r u m 2 5 7 3 ' T M S O H H O O C O C H 3 C I G H I G O I o 0 ‘ 3 3 o o c \ O C H H O C H 3 O H L X X I L X X I I 0 H O C H 3 O C H a 0 L X X I I I C t ‘ l e o O ‘ I 0 H H O H 2 C O C H 3 F i g u r e 6 . 8 6 : . P r o p o s e d l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r t h e c o m p o u n d w i t h m a s s s p e c t r u m s h o w n 1 n F i g u r e 5 . 8 5 . ( c . ) S t r u c t u r e s w h i c h f r o m t r i - T M S d e r i v a t i v e s . 2 5 8 c l e a v a g e o f t h e s i d e c h a i n o f r i n g 2 . F i n a l l y , S t r u c t u r e L X X I V l o o k s r e a s o n a b l e ; h o w e v e r , f o r m a t i o n o f r i n g 2 m a y n o t b e e n e r g e t i c a l l y f a v o r a b l e ( s e e a n a l y s i s o f s t r u c t u r e s V I I a n d V I I I a b o v e ) . T h u s , o n l y s t r u c t u r e s L X V I I a n d L X X I V , a n d p r o b a b l y L X X I a r e e x c l u d e d . 5 . 1 3 . 4 . 4 P e a k s I n T h e M N P A l o n e B C S - E A E x t r a c t a . S c a n 4 3 7 T h e m a s s s p e c t r u m f o r t h e p e a k i n t h e S - E A e x t r a c t a t s c a n 4 3 7 ( 6 ’ 3 2 " ) i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 8 7 ; t h i s c o m p o u n d w a s u n i q u e t o t h e M N P A l o n e B C S - E A e x t r a c t . T h i s c o m p o u n d o c c u r r e d i n l o w c o n c e n t r a t i o n ( 0 . 0 1 8 9 n g / p L ) , a n d s o t h e m a s s s p e c t r u m c o n t a i n s a f a i r a m o u n t o f n o i s e . T h e c o m p o u n d m a y b e m o l e c u l a r w e i g h t 3 1 8 ( T M S - d e r i v a t i v e ) , b u t t h i s i s u n c l e a r . N o r e a s o n a b l e c o m p o u n d s w e r e o b t a i n e d f o r t h i s c o m p o u n d u s i n g t h e n o n - r i n g - o p e n e d c r i t e r i o n f o r e x c l u s i o n o f p o s s i b i l i t i e s . T h e r e f o r e , i t i s v e r y p o s s i b l e t h a t t h i s c o m p o u n d i s a r i n g - o p e n e d p r o d u c t . R e g a r d l e s s , i t w i l l b e t r e a t e d h e r e a s a n u n i d e n t i fi a b l e u n k n o w n . b . S c a n 1 0 6 3 T h e m a s s s p e c t r u m f o r t h e p e a k i n t h e S - E A e x t r a c t a t s c a n 1 0 6 3 ( 1 5 ’ 5 5 ' ) i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . 7 0 ; i t i s i d e n t i c a l t o t h a t f o u n d i n t h e L I P + M N P B C L - B A e x t r a c t i n s c a n 9 8 7 ( 1 4 ’ 4 7 ' ) . T h i s c o m p o u n d w a s f o u n d i n t h e S - E A B C e x t r a c t a t 0 . 0 9 0 2 n g / p L a n d i n t h e E R ' e x t r a c t a t 0 . 0 1 7 9 n g / u L , b u t n o t i n a n y o t h e r c o n t r o l s ; i t i s a g a i n p r o b a b l e , b a s e d o n t h e r e s u l t s f o r t h e L I P + M N P B C L - E A e x t r a c t t h a t i t w a s p r e s e n t o t h e r c o n t r o l s a l s o , b u t a t l e v e l s t o o l o w t o b e d e t e c t e d . R e f e r t o t h e t r e a t m e n t o f s c a n 9 8 7 i n t h e L I P + M N P B C L - E A e x t r a c t f o r t h i s p e a k . 5 . 1 3 . 5 S u m m a r y o f G C / M S A n a l y s i s R e s u l t s A n a l y s i s o f t h e e x t r a c t s o f t h e s o l i d a n d l i q u i d p h a s e s f r o m t h e B a s e C a s e r e a c t o r r u n s i n d i c a t e s a n u m b e r o f u n i q u e p e a k s w h i c h c a n b e a t t r i b u t e d t o r e l e a s e f r o m t h e l i g n i n b y a c t i o n o f t h e e n z y m e s , b y v i r t u e o f t h e i r a b s e n c e i n t h e c o n t r o l s a n d i n a s e p a r a t e s a m p l e o f t h e i n t e r n a l s t a n d a r d . T h e s e c o n t r o l s ( s e e T a b l e s 4 . 6 - 4 . 8 ) w e r e 2 5 9 1 0 0 7 3 R 1 4 7 e 1 8 0 ‘ . a ‘ 1 t r i > V 6 0 4 h e 1 1 3 2 4 3 I A r b 4 0 1 r u 1 1 2 . n r 1 7 4 d 3 o i a u 1 - n 2 0 ; 1 7 1 6 2 6 ’ 2 7 c 6 1 7 8 8 7 1 8 ’ 2 . 9 2 4 I 3 2 3 0 e 1 5 0 ‘ 1 ‘ l : 2 . l - 1 1 1 L 6 1 6 } i “ l l . ' I ' . . | l i . _ 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 F i g u r e 5 . 8 7 : E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m s c a n 4 3 7 b a c k g r o u n d a v e r a g e o f s c a n s 4 3 5 a n d 4 3 9 ) o f t h e T I C f r o m t h e M N P A l o n e B C S - A e x t r a c t . 2 6 0 c a r e f u l l y d e s i g n e d t o e l i m i n a t e a n y c o m p o u n d s n o t r e l e a s e d f r o m t h e l i g n i n b y t h e a c t i v i t i e s o f t h e p e r o x i d a s e e n z y m e s w h e n a l l n e c e s s a r y r e a g e n t s w e r e p r e s e n t , a n d t h u s a n y p e a k u n i q u e t o a B C e x t r a c t i s a l m o s t c e r t a i n t o b e a c o m p o u n d r e l e a s e d f r o m t h e l i g n i n b y t h e a c t i v i t i e s o f t h e e n z y m e ( s ) . M a n y s t r u c t u r e s a r e p o s s i b l e f o r t h e s e c o m p o u n d s w h i c h a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e k n o w n m e c h a n i s m s o f b o t h L I P a n d M N P o n l i g n i n m o d e l c o m p o u n d s . S u m m a r i e s o f t h e p r e d i c t e d s t r u c t u r e s ( l i s t e d b y s t r u c t u r e n u m b e r ) a r e g i v e n i n T a b l e s 5 . 1 6 - 5 . 1 8 f o r t h e L I P A l o n e , M N P A l o n e , a n d L I P + M N P B C e x t r a c t s , r e s p e c t i v e l y . N o t e t h a t a n y s t r u c t u r e s w i t h u n c o n j u g a t e d r i n g s l i k e t h a t f o r s t r u c t u r e I a r e n o t c o n s i d e r e d a s p r o b a b l e p r o d u c t s o f f r e e r a d i c a l - m e d i a t e d o x i d a t i o n o f l i g n i n , s i n c e t h e l o s s o f a r o m a t i c i t y a n d c o n j u g a t i o n a r e n o t l i k e l y t o o c c u r w i t h t h i s t y p e o f r e a c t i o n . I n t h e c a s e o f p e a k s f o r w h i c h t h e s e t y p e s o f s t r u c t u r e s a r e t h e o n l y p o s s i b i l i t i e s ( g i v e n t h e a s s u m p t i o n t h a t t h e r i n g i t s e l f w a s i n t a c t ) , i t i s p o s s i b l e t h a t t h e c o m p o u n d s a r e r i n g - o p e n e d p r o d u c t s . L o s s o f t h e r i n g w o u l d a l l o w a g r e a t e r d e g r e e o f f r e e d o m i n p r e d i c t i o n o f o x i d i z e d s t r u c t u r e s c o n s i s t e n t w i t h l i g n i n - d e r i v e d r i n g - o p e n e d p r o d u c t s . T h e s e p e a k s a r e i n d i c a t e d i n T a b l e s 5 . 1 6 - 5 . 1 8 a s r i n g - o p e n e d p r o d u c t s . W h i l e i t i s i m p o s s i b l e t o v e r i f y m o s t o f t h e s t r u c t u r e s w i t h o u t t h e a i d o f o t h e r t e c h n i q u e s b e t t e r s u i t e d t o t h a t t a s k , s u c h a s l 3 C - N M R , w h e n t h e G C / M S r e s u l t s a r e c o m b i n e d w i t h t h e l i g n i n r e c o v e r i e s a n d t h e F T I R / P L S r e s u l t s f o r t h e b a s e c a s e r u n s v e r s u s t h e c o n t r o l s ( s e e F i g u r e 5 . 8 8 ) , i t s e e m s c l e a r t h a t s o m e d e g r a d a t i o n d i d o c c u r d u e t o e n z y m e a c t i v i t y , a t l e a s t w h e n b o t h L I P a n d M N P w e r e p r e s e n t . T h e p r e s e n c e o f u n i q u e , p r o b a b l e l i g n i n - d e r i v e d c o m p o u n d s i n b o t h t h e L I P A l o n e a n d M N P A l o n e B C s m a y i n d i c a t e a v e r y l i m i t e d r e l e a s e o f s o l u b l e f r a g m e n t s f r o m t h e l i g n i n , t o o s m a l l t o b e d e t e c t e d m e r e l y b y w e i g h t l o s s o r b y t h e F T I R / P L S t e c h n i q u e . T h e r e i s a l s o t h e p o s s i b i l i t y t h a t , i n t h e c a s e o f M N P A l o n e , m o r e m o d i fi c a t i o n o f t h e s o l i d o c c u r r e d t h a n w e i g h t l o s s , c a u s i n g a n e t i n c r e a s e i n t h e m a s s o f t h e s o l i d e v e n t h o u g h c o m p o u n d s w e r e s o l u b i l i z e d . I n a n y e v e n t , t h e p r e s e n c e o f u n i q u e s o l u b l e l i g n i n - d e r i v e d c o m p o u n d s i n b o t h t h e L I P A l o n e a n d M N P A l o n e B C s d o e s n o t c o n t r a d i c t t h e r e s u l t s f r o m t h e m a s s E s t . D e r i C n ( o g n / c u . L ) M g ( x t r a c t R T - - - - - C E E E E A A A A 8 8 1 1 1 ' ' 6 0 1 0 0 5 0 1 8 9 0 4 0 " " " " * 0 0 0 0 0 . . . . . 0 1 8 1 0 2 6 8 2 9 5 5 2 0 2 6 6 0 9 5 E L L L L L v . 1 m 7 / 3 2 2 2 a 2 3 8 8 z e d e ) t W o 0 i . l ? N T r G o M o 2 . S u ? p s 2 6 4 2 1 0 2 0 2 P F o o s s r € c 9 . 1 0 1 H . . m 0 i . u 0 b l l e a . o , P r h b e e h n S x e e e x t n n y t y U R R 2 3 p n k n i i , - - n n m 4 h g g e - y - - t d d o i o o h r w p p o m o r u I d d d y o e x n o c t b y u n r z a t p o r i b h e t l e s y e n o o r l o q i u c ' i a n c o i n d e “ e d 2 6 1 T a b l e 5 . 1 6 : S u m m a r y o f p r o b a b l e l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r e a k s i n t h e L I P A l o n e B C e x t r a c t s w h i c h w e r e s e l e c t e d f o r s t r u c t u r a l a n a l y s i s . e s t r u c t u r e s a r e i n d i c a t e d b y n u m b e r ; t h e i d e n t i t y o f t h e c o m p o u n d i s l i s t e d i f v e r i fi e d b y a n a u t h e n t i c s t a n d a r d . P e a k s f o r w h i c h o n l y s t r u c t u r e s t h a t c o n t a i n a s a t u r a t e d c a r b o n i n a n o t h e l r w i s e c o n j u g a t e d r i n g ( i e . l i k e s t r u c t u r e I ) a r e l i s t e d a s p r o b a b l e r i n g - o p e n e d p r o u c t s . L - E A 1 1 ' 1 5 " 0 . 9 2 2 6 2 5 6 C 9 H 1 2 0 4 R i n g - o p e n e d + R e t e n t i o n t i m e w i t h D B - l G C c o l u m n a n d 3 . 7 5 m i n s o l v e n t h o l d . * I d e n t i fi e d b y c o m p a r i s o n w i t h s p e c t r u m o f V a l l i e t a l . ( 1 9 9 2 b ) . " I d e n t i fi e d b y c o m p a r i s o n w i t h s p e c t r u m i n N I S T d a t a b a s e . 2 6 2 T a b l e 5 . 1 7 : S u m o f p r o b a b l e l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r e a k s i n t h e M N P A l o n e B C e x t r a c t s w ' c h w e r e s e l e c t e d f o r s t r u c t u r a l a n a l y s i s . e s t r u c t u r e s a r e i n d i c a t e d b n u m b e r ; t h e i d e n t l i fi y o f t h e c o m p o u n d i s l i s t e d i f v e r i f i e d b y a n a u t h e n t i c s t a n d a r d . I ’ e a k s f o r w h i c h 0 y s t r u c t u r e s t h a t c o n t a i n a s a t u r a t e d c a r b o n i n a n o t h e r w i s e c o n j u g a t e d r i n g ( i e . l i k e s t r u c t u r e I ) a r e l i s t e d a s p r o b a b l e r i n g - o p e n e d p r o d u c t s . E s t . D e r i v a t i z e d N o . P r o b a b l e C o n e . M . W . T M S P o s s i b l e S t r u c t u r e s o r E x t r a c t R T ' ( n z u L ) ( g / m o l e ) G r o u p s F o r m u l a I d e n t i t y L - c ‘ 1 3 3 5 - 0 . 0 2 4 9 3 7 2 - - s e e T a b l e 5 . 1 8 — - L - C 1 5 2 5 ' 0 . 0 4 4 5 3 4 2 2 c a r . . o , x u x 2 C I O H 1 4 0 4 L I I 3 C J L O ; N o n e L - C 2 1 3 7 - 0 . 0 4 9 3 5 2 6 1 C a n O , N o n e 2 0 1 1 1 1 1 9 . L I X 3 C u H q u m 3 c u n n o . a n L - E A 1 0 1 2 ' 0 . 0 3 5 8 2 9 8 ? 2 ? U n k n o w n " L - E A ‘ ” 1 5 6 4 - 0 . 1 4 9 9 4 0 0 - - s e e T a b l e 5 . l B - — $ 3 2 2 2 5 - 0 . 0 9 8 8 5 5 2 1 G u i - 1 3 . 0 . . m 1 0 2 6 1 1 2 4 0 9 L X V ! 2 c a n n o n v a m 2 0 , 1 1 2 . 0 , L X I X . L X X 3 C u H u O . L X X I I 3 c . 1 1 5 0 , L x x n r S - E A 6 ' 3 2 " 0 . 0 1 8 9 3 1 8 1 U n k n o w n “ s - E A ‘ “ 1 5 5 5 ' 0 . 0 9 0 2 4 0 0 m s e e ' l ‘ a b l e 5 . 1 8 - - + R e t e n t i o n t i m e w i t h D B S - M S G C c o l u m n a n d 2 . 0 0 m i n s o l v e n t h o l d . A 3 2 ‘ T h i s c o m p o u n d i s i d e n t i c a l t o t h a t i n s c a n 8 3 4 ( 1 2 7 9 ' ) o f t h e S - C B C e x t r a c t f o r t h e L I P + M N P e n z y m e c a s e . " T h e n o i s e l e v e l i n t h e m a s s s p e c t r u m f o r t h i s p e a k i s t o o h i g h t o i d e n t i f y t h e m o l e c u l a r i o n w i t h a h i g h d e g r e e o f c e r t a i n t y . ‘ ” T h i s c o m p o u n d i s i d e n t i c a l t o t h a t i n s c a n 9 8 7 ( 1 4 ' 4 7 ' ) o f t h e L - E A B C e x t r a c t f o r t h e L I P + M N P e n z y m e c a s e . o — u o — r — e — e — e N N N W N — N O I N U T a b l e 5 . 1 8 : S u m m a r y o f p r o b a b l e l i g n i n - d e r i v e d s t r u c t u r e s f o r p e a k s i n t h e L I P + M N P B C e x t r a c t s w h i c h w e r e s e l e c t e d f o r s t r u c t u r a l a n a l y s i s . T h e s t r u c t u r e s a r e i n d i c a t e d b y n u m b e r ; t h e i d e n t i t y o f t h e c o m p o u n d i s l i s t e d i f v e r i f i e d b y a n a u t h e n t i c s t a n d a r d . P e a k s f o r w h i c h o n l y s t r u c t u r e s t h a t c o n t a i n a s a t u r a t e d c a r b o n i n a n o t h e r w i s e c o n j u g a t e d r i n g ( i e . l i k e s t r u c t u r e I ) a r e l i s t e d a s p r o b a b l e r i n g - o p e n e d p r o d u c t s . 2 6 3 L - E A L - E A S - C S - E A S - E A 6 ’ 2 2 ” 1 0 4 7 * 9 ' 1 7 ” 1 2 ' 2 9 “ 1 2 ' 0 7 “ ” ’ 4 6 “ E s t . C o n e . 0 . 0 2 3 5 0 . 1 9 3 3 0 . 0 5 3 2 0 . 0 4 5 0 0 . 0 2 5 2 0 . 0 5 5 l 2 8 0 4 0 0 3 0 8 3 7 2 3 5 6 4 0 0 D e r i v a t i z e d N o . M . W . 2 2 3 - - s e e T M S P o s s i b l e E x t r a c t R T ‘ ( n E u L ) ( g / m o l e ) G r o u p s F o r m u l a C r o H s o s ( 3 1 1 1 1 1 2 0 4 ( 3 1 7 1 1 1 2 0 1 C r a H r s O s C r s n z o o s ( 3 1 1 3 1 2 0 7 C r z n r s o s C r s n a o o s C I H I O S C 9 H | 2 0 4 C I S H I G O O C e n s o r 0 1 1 1 1 1 . 0 1 C u H r z o s € 1 1 1 . 0 2 C r o H n O s C I I H u O c € 7 1 4 . 0 1 a b o v e - - P r o b a b l e S t r u c t u r e s o r I d e n t i t y X V , X V I , X V I I X L , X L I X L I I X L V I X L V I I I + R e t e n t i o n t i m e w i t h D B - l G C c o l u m n a n d 3 . 7 5 m i n s o l v e n t h o l d . ‘ T h i s c o m p o u n d i s i d e n t i c a l t o t h a t i n s c a n 9 8 7 ( 1 4 ' 4 7 ' ) o f t h e L - E A B C e x t r a c t f o r t h i s e n z y m e c a s e . 2 6 4 S U M M A R Y O F R E S U L T S L I P N I N P L I P + M N P C o l o r C h a n g e ? N O Y E S T R A N S I E N T L o s s o f M a s s ? ( N O ) G A I N Y E S ( 1 1 % ) L o s s o f L i g n i n 2 ( N O ) N O Y E S ( 8 % ) U n i q u e P r o d u c t s Y E S Y E S Y E S S o l u b i l i z e d ? F i g u r e 5 . 8 8 : S u m m a r y o f t h e g e n e r a l r e s u l t s f o r c o l o r c h a n g e s , r e s i d u a l s o l i d m a s s l o s s e s , l i g n i n c o n t e n t s , a n d f o r m a t i o n o f u n i q u e l i g n i n - d e r i v e d r o d u c t s f o r t h e t r e a t m e n t o f i s o l a t e d i n s o l u b l e p o p l a r l i g n i n i n a q u e o u s m e d i a b y 8 A l o n e , M N P S A l o n e , a n d L I P S + M N P S . 2 6 5 r e c o v e r i e s o r t h o s e f r o m t h e F T I R . T h i s i s b e c a u s e t h e r e l e a s e o f s m a l l a m o u n t s o f s o l u b l e p r o d u c t s w o u l d r e p r e s e n t r e l e a s e o f o n l y a v e r y s m a l l p e r c e n t a g e o f t h e t o t a l m a s s o f t h e s o l i d a n d o f t h e l i g n i n ; g i v e n t h e r e l a t i v e l y w i d e u n c e r t a i n t y r a n g e s f o r b o t h m e a s u r e m e n t s f o r t h e L I P A l o n e a n d M N P A l o n e B C s , t h e n , s o l u b i l i z a t i o n o f a s m a l l f r a c t i o n o f t h e l i g n i n c a n n o t b e r u l e d o u t . I n t h e c a s e o f t h e L I P + M N P B C e x t r a c t s , h o w e v e r , t h e G C / M S r e s u l t s a r e c o m p l e t e l y c o n s i s t e n t w i t h t h e p r i o r m e a s u r e m e n t s ( s o l i d r e c o v e r y a n d l i g n i n c o n t e n t ) , i n d i c a t i n g d e g r a d a t i o n o f t h e l i g n i n w h e n b o t h L I P s a n d M N P S a r e p r e s e n t . M I C H I G A N S T Q T E U N I V . L I B R 1 | H | W I 1 1 1 1 H I 1 1 1 1 W i l l 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 2 9 3 0 1 0 1 6 4 5 . . . . 1 . . . 1 i 0 . : 2 . . . . . . . 3 3 . J : . . . 1 3 . L . 3 . : . 1 . . . . . r ‘ t i . 3 5 4 - ’ J ‘ . . 3 . . . 3 . 3 . . 3 I u ) - , V . ‘ $ 3 4 3 5 9 ? “ a A . d : x g , { ' u i ‘ a m z . . . . L ’ fl l 3 1 : z t I a l g t c i i . I ‘ 1 v } 2 . h t . 1 5 . 5 . . . 7 : 3 4 . 3 5 . . a . . . » 1 . 1 . . 1 7 . . \ u 1 " ? ! I 3 g : a ! u : ‘ r ‘ M 9 / M l c L U I h n l l B g v R a e A n r s R i S Y t t a y t e W I I H I I I H U H I I I H M H I U I M I N I H H I I I H I I I I I I H I W I 1 2 9 3 0 1 0 1 6 4 5 3 5 P L A C E l l R E T U R N B O X M M M N W M W M T O A V O I D F I N E S M u n o n « m o d - t a d “ . D A T E D U E D A T E D U E D A T E D U E M S U l o A n N fl r m d l v o A c fl m / E M O p p o r t u o h y 1 m W 1 I N V I I R O D E P O L Y M E R I Z A T I O N O F N A T U R A L I N S O L U B L E L I G N I N I N A Q U E O U S M E D I A B Y T H E E X T R A C E L L U L A R P E R O X I D A S E S O F P H A N E R O C H A E T E C H R Y S O S P O R I U M V o l u m e I I b y D a v i d N e i l T h o m p s o n A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y D e p a r t m e n t o f C h e m i c a l E n g i n e e r i n g 1 9 9 4 C H A P T E R V I : D I S C U S S I O N 6 . 1 S u b s t r a t e T h e p r e f e r r e d s u b s t r a t e f o r u s e i n i n v i t r o l i g n i n d e p o l y m e r i z a t i o n s t u d i e s w i t h e x t r a c e l l u l a r p e r o x i d a s e s i s a n i n s o l u b l e , u n m o d i f i e d , c a r b o h y d r a t e - f r e e l i g n i n w h i c h i s n o t c h e m i c a l l y o r s t r u c t u r a l l y d i f f e r e n t f r o m l i g n i n a s i t o c c u r s i n w o o d ( T i e n , 1 9 8 7 ) . T h e i s o l a t e d l i g n i n s u b s t r a t e w h i c h w a s u s e d i n t h i s « s t u d y a p p r o a c h e s t h i s g o a l , i n t h a t i t h a s a h i g h l i g n i n c o n t e n t , i s l o w i n c a r b o h y d r a t e s , a n d d o e s n o t a p p e a r t o b e v e r y h i g h l y c o n d e n s e d v e r s u s t h e u n m o d i fi e d n a t i v e p o p l a r l i g n i n b e f o r e i s o l a t i o n , b a s e d o n t h e r e s u l t s o f t h e t h i o a c i d o l y s i s t e s t s p e r f o r m e d b y D r . J o h n R . O b s t a t t h e U S D A F o r e s t P r o d u c t s L a b o r a t o r y . T h e s u b s t r a t e s m o s t u s e d i n b o t h m e c h a n i s t i c s t u d i e s a n d i n g e n e r a l d e p o l y m e r i z a t i o n s t u d i e s h a v e b e e n l o w e r m o l e c u l a r w e i g h t , w a t e r - o r a q u e o u s o r g a n i c s o l v e n t - s o l u b l e l i g n i n m o d e l d i m e r s a n d s y n t h e t i c l i g n i n s , b e c a u s e o f t h e a p p a r e n t l a c k o f a c t i v i t y o f b o t h L I P s a n d M N P s o n h i g h m o l e c u l a r w e i g h t , c o m p l e t e l y i n s o l u b l e l i g n i n ( T i e n , 1 9 8 7 ) . T h e l i g n i n u s e d i n t h i s s t u d y i s o f a v e r y h i g h m o l e c u l a r w e i g h t , a s e v i d e n c e d b y i t s c o m p l e t e i n s o l u b i l i t y i n c o n v e n t i o n a l l i g n i n s o l v e n t s , e v e n a f t e r a c e t y l a t i o n ( D r . J o h n R . O b s t , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n ) . I t i s a l s o h i g h l y p o l y m e r i c , a s e v i d e n c e d b y t h e e x t r e m e l y l o w p h e n o l i c h y d r o x y l c o n t e n t d e t e r m i n e d b y F T I R / P L S ( B . H a r n e s , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n ) . F i n a l l y , o n l y a s m a l l a m o u n t o f t h e 8 - 0 - 4 i n t e r m o n o m e r l i n k a g e s , t h e m o s t c o m m o n l i n k a g e t y p e i n l i g n i n , a r e c o n d e n s e d ( t h i o a c i d o l y s i s r e s u l t s ) a n d t h e r e f o r e t h e l i g n i n i s l i k e l y t o b e s t r u c t u r a l l y s i m i l a r t o n a t u r a l l i g n i n . T h u s , w h i l e i t m a y n o t b e i d e n t i c a l i n e v e r y w a y t o u n m o d i fi e d l i g n i n a s i t o c c u r s i n w o o d , t h e s u b s t r a t e u s e d i n t h i s s t u d y i s n o t s u b s t a n t i a l l y d i f f e r e n t f r o m n a t u r a l l i g n i n , a n d r e p r e s e n t s a m a r k e d i m p r o v e m e n t i n c h o i c e o f s u b s t r a t e f o r t h i s t y p e o f p e r o x i d a s e s t u d y . N o t e t h a t n a t i v e ( u n t r e a t e d ) p o p l a r l i g n i n w a s n o t u s e d i n t h i s s t u d y b e c a u s e t h e l a r g e a m o u n t o f c a r b o h y d r a t e s p r e s e n t w o u l d i n t e r f e r e w i t h t h e F I ‘ I R / P L S a n a l y s i s . 2 6 6 2 6 7 6 . 2 R e a c t o r a n d M o d e l T h e l i g n i n d e p o l y m e r i z a t i o n s y s t e m d e v e l o p e d i n t h i s s t u d y i s s i m p l e , i n e x p e n s i v e , a n d p r o v i d e s a b a s i s f o r t h e d e v e l o p m e n t o f m o r e c o m p l i c a t e d o n - l i n e s y s t e m s w h i c h w o u l d m a i n t a i n c o n c e n t r a t i o n s i n a s i m i l a r m a n n e r . T h e s y s t e m p r o v i d e s g o o d m i x i n g , h i g h 0 2 c o n c e n t r a t i o n s , a n d w h e n c o m b i n e d w i t h t h e m o d e l , p r o v i d e s a s i m p l e m e t h o d f o r m a i n t a i n i n g h i g h e n z y m e a c t i v i t i e s a n d l o w , c o n t r o l l a b l e r e a g e n t c o n c e n t r a t i o n s i n c o n t a c t w i t h t h e e n z y m e s . T h e a p p a r e n t s u c c e s s o f l i g n i n d e p o l y m e r i z a t i o n b y U P S a n d M N P s i n t h i s s y s t e m u n d e r s c o r e s t h e i m p o r t a n c e o f m a i n t a i n i n g c o n c e n t r a t i o n s o f H 2 0 2 a n d V A w i t h i n o p t i m a l r a n g e s f o r p e r o x i d a t i v e a c t i v i t y o n h i g h m o l e c u l a r w e i g h t i n s o l u b l e l i g n i n s ( O l s e n e t a 1 . , 1 9 9 1 ; H a m m e l e t a l . , 1 9 9 3 ) . W i t h s o l u b l e s u b s t r a t e s , t h i s c o n s i d e r a t i o n i s n o t a s i m p o r t a n t , b e c a u s e r e a c t i o n r a t e s a r e h i g h e r d u e t o t h e p r o x i m i t y o f t h e s u b s t r a t e m o l e c u l e s t o t h e e n z y m e ( a n d t h e r e f o r e f r e e r a d i c a l s r e l e a s e d f r o m t h e a c t i v e s i t e ) . T h u s , t h e n e e d f o r c o n t r o l o f t h e c o n c e n t r a t i o n s o f H 2 0 2 a n d V A c a n b e a t t r i b u t e d i n d i r e c t l y t o t h e i n c r e a s e d r a t e l i m i t a t i o n s i m p o s e d b y f r e e r a d i c a l d i f f u s i o n a n d s t a b i l i t y c o m b i n e d w i t h t h e n e e d f o r p r o t e c t i o n o f t h e e n z y m e a g a i n s t i n a c t i v a t i o n b y H 2 0 2 . T h e c o n t r o l s c h e m e d e v i s e d f o r t h e r e a c t o r u s i n g t h e m o d e l o f t h e s y s t e m a p p e a r s t o m a i n t a i n t h e c o n c e n t r a t i o n s o f b o t h H 2 0 2 a n d V A w i t h i n r a n g e s i n w h i c h i n v i t r o d e g r a d a t i o n c a n o c c u r , s i n c e p r e v i o u s i n v i t r o a t t e m p t s a t d e g r a d a t i o n o f i n s o l u b l e l i g n i n i n a q u e o u s m e d i a w i t h o u t c o n t r o l o f t h e s e c o n c e n t r a t i o n s h a v e i n v a r i a b l y f a i l e d ( H a m m e l e t a l . , 1 9 9 3 ) . I t i s u n f o r t u n a t e t h a t i t w a s n o t p o s s i b l e t o t e s t t h e m o d e l p r e d i c t i o n s w i t h m e a s u r e d t i m e c o u r s e s o f [ I I 2 0 2 ] B , [ V A ] B , [ M n ( I I ) ] B , [ M n ( I I I ) - t a r t 2 ] n , [ L I P ] 3 , a n d [ M N P ] B , b u t t h e c o s t t o t h e e n z y m e s t o c k s w o u l d s i m p l y h a v e b e e n t o o h i g h g i v e n t h e d i f fi c u l t y i n o b t a i n i n g l a r g e a m o u n t s o f t h e U P S a n d M N P s . T o v e r i f y t h a t c o n t r o l w a s o b t a i n e d a n d t h a t i t w a s n e c e s s a r y f o r d e g r a d a t i o n t o ’ o c c u r , i n l i g h t o f l i m i t e d e n z y m e s u p p l i e s , a “ n e g a t i v e ” c o n t r o l i n w h i c h t h e r e a c t o r r u n s a r e s t a r t e d a t t h e s a m e i n i t i a l c o n d i t i o n s a s t h e B C s b u t n o p u l s e s a r e a d d e d , w i l l b e n e c e s s a r y . A l a c k o f l i g n i n 2 6 8 d e g r a d a t i o n w o u l d i n d i c a t e t h a t c o n t r o l o f [ 1 1 2 0 2 ] . ” [ V A ] B , [ L I P ] . , , a n d [ M N P ] , i s r e q u i r e d f o r l i g n i n d e g r a d a t i o n t o o c c u r . T h e t e r m s i n t h e m o d e l w h i c h a r e m o s t l i k e l y t o c a u s e e r r o r s i n p r e d i c t i o n s a r e t h e t e r m s d e a l i n g w i t h [ M n ( I I D - t a r t z ] d i f f u s i o n , s t a b i l i t y , a n d r e a c t i o n w i t h o x i d i z a b l e l i g n i n b o n d s t o r e c y c l e M n ( I I ) . T h e s t a b i l i t y a n d d i f f u s i o n q u e s t i o n s c a n b e a n s w e r e d w i t h t h e a p p l i c a t i o n o f o n - l i n e s y s t e m s f o r m e a s u r e m e n t o f t h e d e c a y c o n s t a n t s a n d e f f e c t i v e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t ; h o w e v e r , g i v e n t h e c o m p l e x i t y o f l i g n i n a n d i t s o x i d i z a b l e b o n d s , i t i s n o t l i k e l y t h a t v a l u e s o f k . c a n b e d e t e r m i n e d w h i c h w i l l b e a n y t h i n g m o r e t h a n fi r s t - o r d e r e s t i m a t e s ( w h i c h i s e x a c t l y w h a t w a s d o n e h e r e ) . T h e s t a b i l i t y o f t h e m o d e l p r e d i c t i o n s i s m o s t s e n s i t i v e t o e r r o r s i n t h e [ M n ( I I l ) - t a r t Q J - r e l a t e d p a r a m e t e r s , f o l l o w e d b y t h e m e a s u r e d d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t s a n d t h e v o l u m e o f S i d e B ( r e a c t i o n c h a m b e r ) . T h e m o d e l p r e d i c t i o n s a r e r e l a t i v e l y i n s e n s i t i v e t o m e a s u r e d k i n e t i c c o n s t a n t s a n d t o e n z y m e d e c a y c o n s t a n t s . I t s h o u l d b e n o t e d h e r e t h a t a f t e r t h e m o d e l w a s c o m p l e t e d a n d t h e L I P k i n e t i c c o n s t a n t s w e r e d e t e r m i n e d , a n e w e r m e c h a n i s m f o r t h e o x i d a t i o n o f a r o m a t i c s u b s t r a t e s b y L I P w a s p u b l i s h e d ( G o l d e t a 1 . , 1 9 8 9 ; W a r i i s h i e t a l . , 1 9 9 1 ; C a i a n d T i e n , 1 9 9 3 ) , i n d i c a t i n g t h a t o x i d a t i o n o f a r o m a t i c a l c o h o l s , e t c . , b y L I P f o l l o w s e s s e n t i a l l y t h e s a m e p a t h w a y a s o x i d a t i o n o f M n ( I I ) b y M N P , i e . L I P + 1 1 , 0 , i i » u p : + 3 , 0 ( 6 - 1 ) H p , + u p ! < — 1 : : v U P I - H 3 0 , ( 6 . 2 ) u p ! + A H " k l — p u r n + . 4 - ( 6 - 3 ) “ P 1 1 + A H - £ - > L I P + A ' ( 6 - 4 ) w h e r e A H i s t h e o x i d i z a b l e s u b s t r a t e , a n d A ' i s t h e f r e e r a d i c a l s p e c i e s f o r m e d . T h i s i s 2 6 9 t h e L I P c a t a l y t i c m e c h a n i s m p r e s e n t e d i n F i g u r e 2 . 5 . I f t h i s m e c h a n i s m i s c o r r e c t f o r t h e o x i d a t i o n o f V A b y L I P , t h e n e w r a t e e q u a t i o n f o r t h e f o r m a t i o n o f v e r a t r a l d e h y d e b y L I P w o u l d b e 4 m _ _ _ v = m e n t u n m z o m m a : [ 3 , 0 , 1 ( 5 5 ) ” J A M + k l k 3 [ H 2 0 2 ] + k l k ‘ [ H Z O z ] ( 1 + 7 . . . ) I A g a i n , A H r e p r e s e n t s V A . V e r a t r a l d e h y d e w o u l d b e f o r m e d i n t h i s s c h e m e f r o m t h e a d d i t i o n o f a n a c t i v a t e d o x y g e n s p e c i e s t o f r e e r a d i c a l A ' , a n d s u b s e q u e n t l o s s o f ' 0 2 a n i o n + H 1 . C o m p a r i s o n o f t h i s e q u a t i o n w i t h e q u a t i o n ( C - l l ) ( d e r i v e d i n A p p e n d i x C ) i n d i c a t e s t h a t t h e e q u a t i o n s a r e q u i t e s i m i l a r , e x c e p t f o r t h e a p p e a r a n c e o f [ V A ] i n t h e s e c o n d t e r m o f t h e d e n o m i n a t o r , a n d w i t h t h e d i f f e r e n t s t o i c h i o m e t r y i n d i c a t e d b y t h e f a c t o r o f 2 i n t h e n u m e r a t o r . H o w e v e r , i t i s k n o w n t h a t i n t h e o x i d a t i o n o f V A t o v e r a t r a l d e h y d e b y L I P / H 2 0 2 , f o r m a t i o n o f f r e e r a d i c a l s p e c i e s d u r i n g t h e r e a c t i o n d o e s o c c u r ( T i e n e t a l . , 1 9 8 6 ) . I t i s a l s o k n o w n t h a t t h e s t o i c h i o m e t r y f o r V A o x i d a t i o n b y L I P i s o n e V A c o n s u m e d a n d o n e v e r a t r a l d e h y d e f o r m e d p e r H 2 0 2 c o n s u m e d , a n d t h a t t h e o x i d a t i o n o f V A t o v e r a t r a l d e h y d e o c c u r s i n t w o c o n s e c u t i v e o n e - e l e c t r o n o x i d a t i o n s ' b y t h e L I P h e m e ( T i e n e t a l . , 1 9 8 6 ; H a e m m e r l i e t a l . , 1 9 8 7 ; B o n o e t a l . , 1 9 9 0 ) . T h e r e f o r e , t h e m e c h a n i s m u s e d t o d e r i v e t h e k i n e t i c r a t e e q u a t i o n f o r L I P / V A k i n e t i c s i s s u p p o r t e d b y t h e a v a i l a b l e l i t e r a t u r e , w h i l e t h e m e c h a n i s m a b o v e , w i t h 2 s u b s t r a t e m o l e c u l e s o x i d i z e d p e r H 2 0 2 c o n s u m e d , i s n o t . I t s h o u l d b e n o t e d , t h o u g h , t h a t t h e a b o v e m e c h a n i s m i s c o r r e c t f o r o t h e r s u b s t r a t e s s u c h a s m e t h o x y b e n z e n e s a n d o t h e r l i g n i n m o d e l c o m p o u n d s ( T i e n e t a l , 1 9 8 6 ) . I n a n y e v e n t , t h e o r i g i n a l k i n e t i c e q u a t i o n u s e d i s v a l i d f o r u s e i n t h e m o d e l , s i n c e t h e r a t e c o n s t a n t s w e r e d e t e r m i n e d f r o m k i n e t i c d a t a - - i n e f f e c t , a n 9 1 1 1 2 1 3 9 9 1 e q u a t i o n c o u l d h a v e b e e n u s e d j u s t a s e f f e c t i v e l y , a s l o n g a s i t s c o e f fi c i e n t s w e r e d e t e r m i n e d a c c u m m e f r o m r a t e d a t a . I t i s d o u b t f u l t h a t a n y c h a n g e i n t h e k i n e t i c e q u a t i o n s w o u l d a f f e c t t h e m o d e l p r e d i c t i o n s , g i v e n t h e r e l a t i v e 2 7 0 i n s e n s i t i v i t y o f t h e m o d e l t o t h e a c c u r a c y o f t h e r a t e c o n s t a n t s . T h e c o n t r o l s c h e m e f o r t h e d i a l y s i s r e a c t o r s y s t e m p r o v i d e s a s t a r t i n g p o i n t f o r t h e d e v e l o p m e n t o f a n o n - l i n e s y s t e m f o r i n v i t r o d e g r a d a t i o n o f i n s o l u b l e l i g n i n i n a q u e o u s m e d i a b y L I P s a n d M N P s . T h e a p p a r e n t s u c c e s s o f t h e r e a c t o r a n d c o n t r o l s c h e m e i n a c h i e v i n g i n v i t r o l i g n i n d e g r a d a t i o n b y t h e p e r o x i d a s e s m a y i n s o m e m e a s u r e v e r i f y t h a t c o n t r o l i s n e c e s s a r y , b u t i t d o e s n o t i n d i c a t e a n y t h i n g a b o u t t h e a c c u r a c y o f t h e p r e d i c t i o n s o r t h e r e l a t i v e l e n g t h o f t i m e t h a t n o n - p r o h i b i t i v e c o n c e n t r a t i o n s o f H 2 0 2 a n d V A w e r e m a i n t a i n e d . T i m e c o u r s e s o f t h e r e a g e n t c o n c e n t r a t i o n s a n d e n z y m e l e v e l s w i l l b e a b s o l u t e l y n e c e s s a r y b e f o r e a n y o n - l i n e s y s t e m i s d e v e l o p e d , s i n c e v e r i fi c a t i o n t h a t t h e p r e d i c t i o n s a r e a c c u r a t e i s n e c e s s a r y i n o r d e r t o m a i n t a i n p r e c i s e c o n c e n t r a t i o n r a n g e s . s o t h a t m a x i m u m l i g n i n d e p o l y m e r i z a t i o n c a n b e a c h i e v e d i n t h e m i n i m u m l e n g t h o f t i m e . 6 . 3 E n z y m e P r o d u c t i o n R e g u l a t i o n o f t h e p r o d u c t i o n o f L I P a n d M N P b y e x c l u d i n g M n ( I I ) a n d b y a d d i n g h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f M n ( I I ) , r e s p e c t i v e l y , t o t h e P . c h r y s o s p o r i w n c u l t u r e s h a d t h e d e s i r e d e f f e c t o f p r o d u c i n g L I P s t o c k s w h i c h w e r e e s s e n t i a l l y f r e e o f M N P , a n d v i c e v e r s a , a s s h o w n b y t h e F P L C p r o fi l e s o f t h e t w o s t o c k s . T h e i s o e n z y m e p r o fi l e f o r t h e D S N o M n s t o c k w a s t y p i c a l o f p r o d u c t i o n o f p e r o x i d a s e s b y P . c h r y s o s p o n ’ u m i n a c e t a t e b u f f e r e d c u l t u r e w i t h l o w M n ( I I ) . T h e D 4 H i M n c u l t u r e p r o d u c e d h i g h e r t h a n e x p e c t e d l e v e l s o f H 3 r e l a t i v e t o H 4 ; H 4 i s n o r m a l l y t h e m a j o r i s o e n z y m e w h e n t h e f u n g u s i s g r o w n i n a c e t a t e b u f f e r e d c u l t u r e s , w h e r e a s H 3 i s t h e m a j o r i s o e n z y m e i n t h e D 4 H i M n s t o c k . B o n n a r m e a n d J e f f r i e s ( 1 9 9 0 ) o b t a i n e d h i g h e r l e v e l s o f H 3 r e l a t i v e t o H 4 i n t a r t r a t e b u f f e r a f t e r 6 d a y s o f c u l t i v a t i o n i n a g i t a t e d c u l t u r e s , u s i n g b a s a l l e v e l s o f M n ( I I ) ( 1 1 . 1 5 p p m ) , b u t H 4 w a s s t i l l t h e m a j o r i s o e n z y m e p r o d u c e d w h e n n o M n ( I I ) w a s a d d e d . I t i s u n k n o w n w h y t h e p r o d u c t i o n o f H 3 e x c e e d e d t h a t o f H 4 i n t h i s s t u d y ( 1 0 0 p p m M n ( I I ) a d d e d ) ; h o w e v e r , t h i s q u e s t i o n i s b e y o n d t h e s c o p e o f t h i s s t u d y a n d w i l l n o t b e a d d r e s s e d f u r t h e r . 2 7 1 T h e e n z y m e s o l u t i o n s u s e d f o r t h e r e a c t o r s t u d i e s w e r e a l s o a s d e s i r e d , w i t h L I P e s s e n t i a l l y f r e e o f M N P , M N P e s s e n t i a l l y f r e e o f L I P , a n d a m i x t u r e o f t h e t w o w i t h a p p r o x i m a t e l y e q u a l a m o u n t s o f b o t h U P S a n d M N P s ( e q u a l a m o u n t s o f p r o t e i n f r o m e a c h e n z y m e c l a s s , a s m e a s u r e d b y F P L C p e a k a r e a s ) . T h a t s o m e M N P a c t i v i t y w a s p r e s e n t i n t h e D 5 N o M n E F w a s n o t s u r p r i s i n g , a s l o w l e v e l s o f M N P a r e p r o d u c e d e v e n i f n o M n ( I I ) i s a d d e d ( B o n n a r m e a n d J e f f r i e s , 1 9 9 0 ) , p r o b a b l y p a r t i a l l y d u e t o l o w c o n c e n t r a t i o n s o f M n ( I I ) p r e s e n t i n t h e w a t e r u s e d f o r t h e c u l t u r e m e d i a . T h e p r e s e n c e o f L I P i n t h e D 4 H i M n E F w a s a l i t t l e s u r p r i s i n g , h o w e v e r , s i n c e n o L I P a c t i v i t y w a s d e t e c t e d i n t h e c o n c e n t r a t e d , d i a l y z e d E F ( n o d i l u t i o n o f t h e s a m p l e f o r L I P a c t i v i t y m e a s u r e m e n t ) . E v i d e n t l y t h e p r o d u c t i o n o f L I P w a s n o t c o m p l e t e l y s h u t d o w n b y 1 0 0 p p m M n ( I I ) a d d i t i o n ; i t i s p r o b a b l e t h a t h a r v e s t i n g t h e c u l t u r e s o n d a y 3 i n s t e a d o f d a y 4 w o u l d h a v e r e s u l t e d i n e v e n l e s s L I P i n t h e E F , s i n c e L I P p e a k s b e t w e e n d a y s 5 a n d 6 . 6 . 4 I n v i t r o T r e a t m e n t o f L i g n i n i n t h e R e a c t o r T h e e v i d e n c e s u p p l i e d b y t h e v a r i o u s t e c h n i q u e s u s e d t o c h a r a c t e r i z e t h e s o l i d a n d l i q u i d p h a s e s r e c o v e r e d f r o m t h e B a s e C a s e r u n s v e r s u s t h e c o n t r o l s i n d i c a t e t h a t l i g n i n m o d i fi c a t i o n a n d p e r h a p s s o m e v e r y l i m i t e d d e g r a d a t i o n o c c u r r e d w i t h M N P a l o n e , t h a t v e r y l i m i t e d d e g r a d a t i o n m a y h a v e o c c u r r e d w i t h L I P a l o n e , a n d t h a t d e fi n i t e d e g r a d a t i o n o f t h e l i g n i n o c c u r r e d i n t h e L I P + M N P B a s e C a s e . E a c h i n d e p e n d e n t l i n e o f e v i d e n c e w i l l b e d i s c u s s e d , i n t u r n , b e l o w . 6 . 4 . 1 L i g n i n C o l o r C h a n g e C o m p a r i s o n o f t h e c o l o r o f t h e l i g n i n f r o m t h e M N P A l o n e B C w i t h t h a t o f i t s c o n t r o l s i n d i c a t e s t h a t M N P a c t i v i t y c a u s e d a m o d i fi c a t i o n o f t h e l i g n i n , s i n c e t h e c o l o r o f t h e l i g n i n f r o m a l l o f t h e c o n t r o l s i s i d e n t i c a l , w h i l e t h a t o f t h e B C l i g n i n i s d a r k e r . T h e c o n v e r s i o n o f a r o m a t i c n u c l e i t o q u i n o n e s i n l i g n i n b y o x i d a t i o n w i t h m e t a l o x i d e s i s a w e l l k n o w n r e a c t i o n i n l i g n i n c h e m i s t r y ( S a r k a n e n a n d L u d w i g , 1 9 7 1 ) ; p e r h a p s t h e [ M n ( I I I ) - t a r t 2 ] c o m p l e x , w h i c h i s a l s o a n o x i d i z i n g a g e n t , o x i d i z e s t h e l i g n i n i n a s i m i l a r 2 7 2 m a n n e r . I n a d d i t i o n , q u i n o n e f o r m a t i o n i n l i g n i n c a n m a k e t h e c o l o r o f t h e l i g n i n d a r k e r ( B . H a m e s , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n ; D r . K . E . H a m m e l , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n ; D r . J . R . O b s t , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n ) , a l t h o u g h t h i s c o l o r c h a n g e a l o n e d o e s n o t p r o v i d e p r o o f t h a t q u i n o n e s w e r e f o r m e d . T h e c o l o r o f t h e l i g n i n a f t e r t r e a t m e n t w i t h L I P a l o n e i s n o t m u c h d i f f e r e n t f r o m t h a t o f t h e c o n t r o l s , i n d i c a t i n g t h a t L I P m a y n o t m o d i f y t h e s o l i d l i g n i n t o a n y e x t e n t . W h e n b o t h L I P a n d M N P a r e p r e s e n t , h o w e v e r , t h e l i g n i n c o l o r d a r k e n s i n i t i a l l y a n d t h e n l i g h t e n s b a c k t o n e a r i t s o r i g i n a l c o l o r o v e r t i m e , s u g g e s t i n g t h a t t h e m o d i fi e d g r o u p s i n t h e l i g n i n a r e e i t h e r b e i n g c h a n g e d b a c k t o t h e i r o r i g i n a l f o r m s o r r e l e a s e d f r o m t h e l i g n i n p o l y m e r . I n a d d i t i o n , t h i s i n d i c a t e s t h a t M N P p e r f o r m s t h e m o d i fi c a t i o n a n d t h a t L I P i s r e s p o n s i b l e f o r t h e r e t u r n o f t h e c o l o r t o i t s o r i g i n a l s t a t e , s i n c e t h e l i g n i n f r o m t h e M N P A l o n e t r e a t m e n t r e m a i n e d d a r k , w h i l e t h e l i g n i n f r o m t h e L I P + M N P t r e a t m e n t l i g h t e n e d a f t e r i n i t i a l l y d a r k e n i n g . 6 . 4 . 2 L i g n i n R e c o v e r y f r o m t h e R e a c t o r R u n s A c h a n g e o f c o l o r c a n n o t b y i t s e l f b e u s e d t o i n d i c a t e l i g n i n d e g r a d a t i o n , b u t c a n b e u s e d t o i n d i c a t e m o d i fi c a t i o n . T h e s o l i d s r e c o v e r i e s f o r t h e B C s v e r s u s t h e c o n t r o l s , h o w e v e r , p r o v i d e s m o r e d i r e c t e v i d e n c e t h a t d e g r a d a t i o n a n d m o d i fi c a t i o n o c c u r r e d i n c e r t a i n c a s e s . W i t h i n t h e e r r o r o f t h e m e a s u r e m e n t , t h e m a s s o f s o l i d r e c o v e r e d f r o m t h e M N P A l o n e B C i n c r e a s e d o v e r t h e i n i t i a l a m o u n t a d d e d t o t h e r e a c t o r ; n o c h a n g e w a s s e e n i n t h e c o n t r o l s . T h i s r e s u l t i s c o n s i s t e n t w i t h t h e o b s e r v e d c o l o r c h a n g e a n d w i t h o x i d a t i o n a n d m o d i fi c a t i o n o f t h e s o l i d l i g n i n p o l y m e r d u e t o t h e a c t i v i t y o f M N P , s i n c e a d d i t i o n o f o x y g e n t o t h e s o l i d w o u l d i n c r e a s e i t s m a s s . T h e r e s u l t s a y s n o t h i n g a b o u t t h e p u t a t i v e r e l e a s e o f l i g n i n f r a g m e n t s , s i n c e a n i n c r e a s e i n s o l i d m a s s d u e t o t h e a d d i t i o n o f o x y g e n t o t h e p o l y m e r w o u l d i n c r e a s e t h e m a s s , w h i l e r e l e a s e o f f r a g m e n t s w o u l d c a u s e a d e c r e a s e . T h e i n c r e a s e i n m a s s d o e s s u g g e s t , h o w e v e r , t h a t t h e m a i n a c t i v i t y o f t h e M N P o n t h e s o l i d l i g n i n i s t o o x i d a t i v e l y m o d i f y i t . T h e m a s s o f s o l i d r e c o v e r e d f r o m t h e L I P A l o n e B C , w i t h i n t h e e r r o r o f t h e 2 7 3 m e a s u r e m e n t , i n d i c a t e s t h a t l i t t l e o r n o m o d i fi c a t i o n o r r e l e a s e o f l i g n i n f r a g m e n t s o c c u r s w h e n L I P i s u s e d a l o n e . T h i s r e s u l t i s c o n s i s t e n t w i t h t h e l a c k o f c o l o r c h a n g e f o r t h e L I P A l o n e c a s e , a n d i n d i c a t e s t h a t L I P h a s n o r o l e i n t h e m o d i fi c a t i o n o f t h e l i g n i n a s M N P s e e m s t o . W i t h L I P a n d M N P p r e s e n t , h o w e v e r , t h e r e i s a m e a s u r a b l e d e c r e a s e i n t h e m a s s o f t h e s o l i d i n t h e B C v e r s u s t h e c o n t r o l s , e v e n t a k i n g i n t o a c c o u n t t h e u n c e r t a i n t i e s i n t h e w e i g h t m e a s u r e m e n t s , t h e s o l i d r e c o v e r y m e a s u r e m e n t s ( a v e r a g e r e c o v e r y o f s o l i d s f r o m s e v e r a l r e a c t o r t r i a l r u n s i n w h i c h o n l y l i g n i n a n d b u f f e r w e r e a d d e d t o t h e r e a c t o r ) , a n d t h e d r y w e i g h t a n a l y s e s o f t h e i n i t i a l l i g n i n ( t h e l i g n i n w a s a d d e d t o t h e r e a c t o r a s a w e t c a k e t o p r e v e n t a n y c o l l a p s e o f t h e l i g n i n m a t r i x d u e t o d r y i n g ) . I t i s p o s s i b l e t h a t o v e r t h e c o u r s e o f t h e s a m p l e h a n d l i n g , m u c h m o r e m a s s w a s l o s t f r o m t h i s s a m p l e t h a n t h e o t h e r s , b u t t h e c h a n c e t h a t t h i s w o u l d h a p p e n i n o n l y o n e s a m p l e a n d n o t a n y o f t h e 1 4 o t h e r s i s s l i m . T h e l o s s o f m a s s i n t h e L I P + M N P B C i s c o n s i s t e n t w i t h t h e c o l o r c h a n g e o f t h e s o l i d f r o m l i g h t t o d a r k , a n d b a c k t o l i g h t , a n d s u g g e s t s t h a t t h e c o l o r l i g h t e n e d b e c a u s e t h e M N P - m o d i fi e d g r o u p s w e r e r e l e a s e d f r o m t h e l i g n i n . 6 . 4 . 3 F l ‘ I R / P L S A n a l y s i s o f S o l i d L i g n i n D e t e r m i n a t i o n o f t h e l i g n i n c o n t e n t o f t h e M N P A l o n e B C v e r s u s i t s c o n t r o l s b y F T I R / P L S i n d i c a t e s t h a t o n a p e r u n i t m a s s b a s i s , M N P a l o n e a n d L I P a l o n e d i d n o t a l t e r t h e l i g n i n c o n t e n t o f t h e s u b s t r a t e , b u t t o g e t h e r , t h e t w o e n z y m e s s i g n i fi c a n t l y d e c r e a s e d t h e l i g n i n c o n t e n t . W h i l e t h e r e i s q u e s t i o n a s t o t h e v a l i d i t y o f c o m p a r i n g a b s o l u t e p r e d i c t i o n s o f t h e v a l u e s o f t h e l i g n i n c o n t e n t s b e t w e e n s a m p l e s r u n a t w i d e l y d i f f e r i n g t i m e s , t h e p r e d i c t i o n s a r e u s e f u l w i t h a h i g h d e g r e e o f c o n fi d e n c e w i t h i n a s e t o f s a m p l e s m e a s u r e d c l o s e l y t o g e t h e r i n t i m e ( B . H a m e s , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n ) . T h i s i s a n o t h e r i n d e p e n d e n t v e r i fi c a t i o n t h a t r e l e a s e o f l i g n i n f r a g m e n t s o c c u r r e d , a n d o n l y w h e n b o t h e n z y m e s a n d t h e r e a g e n t s n e c e s s a r y f o r t h e i r a c t i v i t y w e r e p r e s e n t . T h e r e s u l t s o f t h e l i g n i n c o n t e n t a n a l y s i s a r e c o m p l e t e l y c o n s i s t e n t w i t h t h o s e o f b o t h t h e l i g n i n c o l o r o b s e r v a t i o n s a n d t h e s o l i d m a s s r e c o v e r i e s f o r t h e B C s v e r s u s t h e c o n t r o l s . T h e 2 7 4 c a r b o h y d r a t e a n a l y s e s w e r e s i m p l y t o o v a r i a b l e t o b e o f m u c h u s e , i n a d d i t i o n t o t h e f a c t t h a t t h e s p e c t r a l i n f o r m a t i o n u s e d w i t h t h e c a r b o h y d r a t e p r e d i c t i o n s w a s o u t s i d e o f t h e c a l i b r a t i o n r a n g e f o r t h e c a r b o h y d r a t e s ( B . H a m e s , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n ) . I t i s i n t e r e s t i n g t o n o t e , h o w e v e r , t h a t t h e p r e d i c t e d c a r b o h y d r a t e c o n t e n t f o r t h e L I P + M N P B C i s s i g n i fi c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t o f i t s c o n t r o l s ( w h i c h a r e c l o s e t o g e t h e r ) , a n d i s n e a r l y o u t s i d e o f t h e u n c e r t a i n t y r a n g e f o r t h e c o n t r o l s ; a h i g h e r c a r b o h y d r a t e c o n t e n t r e l a t i v e t o l i g n i n w o u l d b e e x p e c t e d i f m a s s w a s l o s t d u e t o l i g n i n r e l e a s e . T h e l a c k o f a n y d i f f e r e n c e s i n t h e m e t h o x y l c o n t e n t s o f a n y o f t h e s a m p l e s i n d i c a t e s t h a t a n y d e g r a d a t i o n w h i c h t o o k p l a c e w a s h o m o g e n e o u s w i t h r e s p e c t t o s y r i n g y l a n d g u a i a c y l u n i t s , s i n c e s y r i n g y l - u n i t s c o n t a i n t w o m e t h o x y l s a n d g u a i a c y l u n i t s c o n t a i n o n l y o n e . T h i s r e s u l t a l s o i n d i c a t e s t h a t n o s i g n i fi c a n t d e m e t h o x y l a t i o n o f t h e s o l i d l i g n i n o c c u r r e d , w h i c h i s a k n o w n a c t i v i t y o f L I P w i t h l i g n i n m o d e l s a n d s y n t h e t i c l i g n i n s ( B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) . F i n a l l y , t h e v e r y l o w p h e n o l i c h y d r o x y l c o n t e n t s f o r a l l s a m p l e s i n d i c a t e o n l y t h a t t h e l i g n i n s a m p l e s a r e h i g h l y p o l y m e r i c ; i e . , t h a t t h e r e a r e f e w p h e n o l i c h y d r o x y l s w h i c h a r e n o t i n i n t e r m o n o m e r b o n d s . T h i s r e s u l t s u g g e s t s t h a t i n t e r m o n o m e r b o n d c l e a v a g e d i d n o t o c c u r t o a n y s i g n i fi c a n t d e g r e e i n t h e i n t e r i o r o f t h e p o l y m e r , b u t m u s t h a v e o c c u r r e d n e a r t h e e n d u n i t s w h e r e t h e f r e e p h e n o l i c h y d r o x y l c o n t e n t i s h i g h e s t ( S a r k a n e n a n d L u d w i g , 1 9 7 1 ) . 6 . 4 . 4 G C / M S A n a l y s i s o f S o l u b l e P r o d u c t s T h e p r e s e n c e o f u n i q u e p r o d u c t s i n t h e B a s e C a s e e x t r a c t s f o r a l l t h r e e e n z y m e c a s e s v e r s u s t h e i r c o n t r o l s , w h i c h w e r e c a r e f u l l y d e s i g n e d t o e l i m i n a t e c o m p o u n d s w h i c h c o u l d n o t h a v e b e e n r e l e a s e d f r o m t h e l i g n i n b y t h e e n z y m e s , s u g g e s t s t h a t t h e r e w a s a r e l e a s e o f l i g n i n f r a g m e n t s c a t a l y z e d b y b o t h e n z y m e s o v e r t h e c o u r s e o f t h e 1 2 h o u r r e a c t i o n , a l o n e ( a l t h o u g h t o a l i m i t e d d e g r e e , a s e v i d e n c e d b y t h e m a s s r e c o v e r y d a t a a n d t h e F I ' I R ) a n d i n c o m b i n a t i o n . C o n s i d e r a t i o n o f t h e m a s s s p e c t r a a n d m o l e c u l a r f o r m u l a s p o s s i b l e f o r e a c h c o m p o u n d i n d i c a t e s t h a t r e a s o n a b l e s t r u c t u r e s t h a t c o u l d b e l i g n i n - d e r i v e d a r e p o s s i b l e f o r a l l u n i q u e p r o d u c t s f o u n d i n t h e e x t r a c t s o f a l l t h r e e - 2 7 5 e n z y m e c a s e s . I n t h e c a s e o f L I P a l o n e , t h e p r e s e n c e o f r e l a t i v e l y s u b s t a n t i a l a m o u n t s o f p - h y d r o x y b e n z o i c a c i d ( a k n o w n i n v i v a l i g n i n d e g r a d a t i o n p r o d u c t ; C h e n a n d C h a n g , 1 9 8 2 ) i n t h e B C e x t r a c t s b u t n o t i n t h e c o n t r o l s s u g g e s t s t h a n s o m e d e p o l y m e r i z a t i o n o c c u r r e d , n o t w i t h s t a n d i n g t h e m a s s r e c o v e r y d a t a a n d t h e F T I R / P I S p r e d i c t i o n s o f l i g n i n c o n t e n t . T h e p r e s e n c e o f 2 , 6 — d i m e t h o x y h y d r o q u i n o n e i n b o t h t h e M N P A l o n e a n d L I P + M N P e x t r a c t s i n c o n c e n t r a t i o n s t o o h i g h t o b e a c c o u n t e d f o r s o l e l y b y e x t r a c t a b l e s y r i n g a l d e h y d e , a n d t h e a b s e n c e o f t h e q u i n o n e f o r m ( D r . M . H . G o l d , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n ; s e e C h a p t e r V ) s u g g e s t s t h a t s o m e d e p o l y m e r i z a t i o n o c c u r r e d i n b o t h t h e M N P a n d L I P + M N P e n z y m e c a s e s . I t i s w e l l k n o w n t h a t q u i n o n e s a n d h y d r o q u i n o n e s a r e o f t e n p r e s e n t d u r i n g t h e b i o d e g r a d a t i o n o f l i g n i n ( C h u n g e t a l . , 1 9 9 3 ) , w h i c h p r o v i d e s a d d i t i o n a l s u p p o r t f o r t h e p r e s u m p t i o n t h a t s o m e o f t h e 2 , 6 - d i m e t h o x y h y d r o q u i n o n e a n d i t s q u i n o n e f o r m m a y h a v e o r i g i n a t e d t h r o u g h r e l e a s e b y M N P f r o m t h e s o l i d l i g n i n p o l y m e r . F o r p e a k s f o r w h i c h o n l y q u e s t i o n a b l e s t r u c t u r e s w e r e f o u n d , s u c h a s p a r t i a l l y - f o r m e d q u i n o n e - l i k e s t r u c t u r e s i n w h i c h t h e r e i s a n o x o - g r o u p a t p o s i t i o n 4 o f t h e r i n g a n d a s a t u r a t e d c a r b o n - c a r b o n b o n d a t p o s i t i o n 1 ( t h e s e s t r u c t u r e s m o s t l i k e l y w o u l d n o t b e f o r m e d f r o m a n a r o m a t i c r i n g ) , i t s h o u l d b e n o t e d t h a t o n e o f t h e fi r s t a s s u m p t i o n s m a d e i n t h e s t r u c t u r a l a n a l y s i s w a s t h a t t h e p r o d u c t s h a d t o h a v e a n i n t a c t r i n g w i t h o n e o r m o r e d o u b l e b o n d s w i t h i n t h e r i n g s t r u c t u r e . T h i s a s s u m p t i o n p r e c l u d e s a n y r i n g - o p e n e d s t r u c t u r e s , w h i c h m i g h t a c c o u n t f o r t h e d i f fi c u l t y i n a s s i g n i n g l i g n i n - l i k e s t r u c t u r e s t o s o m e o f t h e s e p r o d u c t s . I t i s i n t e r e s t i n g t h a t t h e p e a k s f o r w h i c h t h e g r e a t m a j o r i t y o f t h e s e t y p e s o f s t r u c t u r e s w e r e p r o p o s e d e l u t e d t h e G C c o l u m n s a t o r b e l o w s c a n s 5 0 0 - 6 0 0 ( c o r r e s p o n d i n g t o r e t e n t i o n t i m e s e a r l i e r t h a n a b o u t 7 . 3 m i n u t e s t o a b o u t 9 m i n u t e s f o r t h e D B - l G C c o l u m n ) . I t w a s n o t e d d u r i n g a n a l y s i s o f t h e G C / M S d a t a t h a t c o m p o u n d s i n w h i c h t h e m o l e c u l a r i o n w a s a l s o t h e b a s e p e a k ( 1 0 0 % a b u n d a n c e ) , w h i c h a r e l i k e l y t o b e a r o m a t i c b e c a u s e o f t h e s t a b i l i t y a f f o r d e d b y t h e c o n j u g a t e d r i n g , d i d n o t t e n d t o e l u t e t h e G C c o l u m n s u n t i l a r o u n d s c a n 6 0 0 o r a f t e r , u n l e s s t h e y w e r e q u i t e v o l a t i l e ( s u c h a s t h e i n t e r n a l s t a n d a r d , 2 - c h l o r o - 5 - 2 7 6 t r i f l u o r o m e t h y l b e n z o i c a c i d , w h i c h i s m o r e v o l a t i l e d u e t o t h e f l u o r i n e a t o m s ) . I t i s p o s s i b l e t h a t t h e u n i q u e p r o d u c t s o b s e r v e d a r e e n z y m e o x i d a t i o n p r o d u c t s o f s o l u b l e l i g n i n e x t r a c t i v e s , s u c h a s s y r i n g a l d e h y d e , w h i c h w e r e n o t c o m p l e t e l y r e m o v e d d u r i n g t h e e x h a u s t i v e s o l v e n t e x t r a c t i o n s o f t h e C A H r e s i d u e t o p r o d u c e t h e E C ' A H l i g n i n s u b s t r a t e ; a c o n t r o l t o e l i m i n a t e t h i s s o r t o f p r o d u c t w a s n o t f o r t h c o m i n g . I t i s e n t i r e l y p o s s i b l e , t h e n , t h a t t h e p r o d u c t s s e e n i n t h e L I P A l o n e a n d M N P A l o n e B C e x t r a c t s a r e t h i s t y p e o f p r o d u c t s i n c e t h e m a s s r e c o v e r y d a t a a n d t h e F I ' I R / P L S a n a l y s e s d o n o t s u p p o r t t h a t s i g n i fi c a n t l i g n i n d e g r a d a t i o n o c c u r r e d ; h o w e v e r , i n t h e c a s e o f t h e L I P + M N P B C e x t r a c t s , b o t h o f t h e a f o r e m e n t i o n e d a n a l y s e s i n d i c a t e d l o s s o f m a s s a s l i g n i n , a n d s o i t i s r e a s o n a b l e t o e x p e c t t h a t t h e u n i q u e p r o d u c t s i d e n t i fi e d i n t h e e x t r a c t s a r e l i g n i n - d e r i v e d a n d a r e r e l e a s e d b y e n z y m e a c t i v i t y . A n o t h e r i n t e r e s t i n g r e s u l t o f t h e G C / M S a n a l y s i s , b u t o n e w h i c h c a n n o t b e u s e d a s p r o o f o f l i g n i n d e g r a d a t i o n , i s t h e m u l t i p l e s i m u l t a n e o u s p e a k s i n t h e T I C s a t o r b e l o w t h e l e v e l o f t h e n o i s e , o f v a r i o u s c o m b i n a t i o n s o f t h e m a s s f r a g m e n t s 1 0 7 , 1 3 7 , 1 5 1 , 1 6 7 , a n d 1 8 1 , w h i c h a r e t y p i c a l e l e c t r o n - i m p a c t i o n f r a g m e n t s o f l i g n i n - d e r i v e d p r o d u c t s . T h e s e o c c u r r e n c e s w e r e m o r e f r e q u e n t i n t h e b a s e c a s e e x t r a c t s t h a n i n t h e c o n t r o l s , s u g g e s t i n g t h a t t h e r e w e r e m a n y p o s s i b l e l i g n i n - d e r i v e d c o m p o u n d s p r e s e n t t h a t w e r e s i m p l y a t t o o l o w o f a c o n c e n t r a t i o n t o b e d e t e c t e d . T h i s s u g g e s t i o n i s s u p p o r t e d b y t h e f a c t t h a t t h e b a s e l i n e i n t h e T I C s o f t h e s o l i d e x t r a c t s o f t h e B C s f o r a l l t h r e e e n z y m e e a s e s r a m p e d u p a t l a t e r r e t e n t i o n t i m e s , s u g g e s t i n g t h e p r e s e n c e o f h i g h e r m o l e c u l a r w e i g h t , l o w c o n c e n t r a t i o n c o m p o u n d s ; m a n y s i m u l t a n e o u s p e a k s o f t h e f r a g m e n t s l i s t e d a b o v e w e r e p r e s e n t , e s p e c i a l l y i n t h i s r e g i o n . W h i l e t h i s p h e n o m e n o n o c c u r r e d t o s o m e e x t e n t i n t h e c o n t r o l s a s w e l l , t h e e f f e c t w a s m o r e p r o n o u n c e d i n t h e B C e x t r a c t s . I t i s q u i t e c l e a r t h a t m o r e i n f o r m a t i o n w i l l b e n e c e s s a r y b e f o r e a n y o f t h e p r o d u c t s f o u n d c a n b e a t t r i b u t e d t o r e l e a s e f r o m t h e l i g n i n . I t w i l l c e r t a i n l y b e n e c e s s a r y t o u s e t o o l s s u c h a s 1 3 C N M R t o c h a r a c t e r i z e t h e c o m p o u n d s , s i n c e G C / M S i s o n l y s u i t e d t o t h a t t a s k i f a u t h e n t i c s t a n d a r d s a r e a v a i l a b l e . I t m i g h t h a v e b e e n b e t t e r t o u s e 1 3 C - r i n g - 2 7 7 l a b e l l e d V A i n t h e r e a c t o r r u n s t o a i d i n t h e e x c l u s i o n o f V A d e r i v e d p r o d u c t s - - t h i s a p p r o a c h w a s i n i t i a l l y c o n s i d e r e d , b u t t h e r i n g - l a b e l l e d c o m p o u n d w o u l d h a v e b e e n s i m p l y t o o e x p e n s i v e t o j u s t i f y t h e c o s t ; i t w a s d e c i d e d i n s t e a d t o u s e a s y s t e m o f c o n t r o l s t o e x c l u d e V A p r o d u c t s . 6 . 5 S i g n i fi c a n c e I t i s u n q u e s t i o n a b l e t h a t b o t h L I P a n d M N P c a n c l e a v e l i g n i n m o d e l d i m e r s i n a q u e o u s m e d i a a n d r e l e a s e f r a g m e n t s f r o m s y n t h e t i c l i g n i n s d i s p e r s e d i n o r g a n i c s o l v e n t s ( H a m m e l e t a l . , 1 9 8 5 ; H a m m e l a n d M o e n , 1 9 9 1 ; H a m m e l e t a l . , 1 9 9 3 ; P e r e z a n d J e f f r i e s , 1 9 9 3 ; T u o r e t a l . , 1 9 9 2 ; B o y l e e t a l . , 1 9 9 2 ) . B e c a u s e d e p o l y m e r i z a t i o n o f a h i g h m o l e c u l a r w e i g h t l i g n i n i n a n a q u e o u s s y s t e m h a s n o t p r e v i o u s l y b e e n d e m o n s t r a t e d ( T i e n , 1 9 8 7 ; B o o m i n a t h a n a n d R e d d y , 1 9 9 2 ) , t h i s b r i n g s i n t o q u e s t i o n w h e t h e r t h e s e e n z y m e s a r e a c t u a l l y i n v o l v e d i n t h e i n v i v a d e g r a d a t i o n o f l i g n i n ( S a r k a n e n e t a l . , 1 9 9 1 ) . I n d e e d , D o r d i c k e t a l . ( 1 9 8 6 ) c l e a r l y d e m o n s t r a t e d t h a t b o t h h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e a n d m i l k l a c t o p e r o x i d a s e , w h i l e u n a b l e t o d e g r a d e e i t h e r s y n t h e t i c o r n a t u r a l l i g n i n s i n a q u e o u s m e d i a , w e r e a b l e t o d e p o l y m e r i z e p o l y c o n i f e r y l a l c o h o l , m i l l e d w o o d l i g n i n , a n d K r a f t p i n e l i g n i n i n d i o x a n e , D M F , o r m e t h y l f o r m a t e c o n t a i n i n g 5 % a q u e o u s b u f f e r . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e i n a b i l i t y o f p e r o x i d a s e s t o d e g r a d e t h e l i g n i n i n a q u e o u s m e d i a i s m o s t p r o b a b l y d u e t o s i m p l e i n a c c e s s i b i l i t y o f t h e e n z y m e s o r t h e a c t i v e o x i d i z i n g s p e c i e s t o c l o s e p r o x i m i t y o f t h e i n s o l u b l e l i g n i n ; i t i s p r o b a b l e t h a t L I P s a n d M N P s w o u l d b e h a v e s i m i l a r l y w h e n i n a q u e o u s m e d i a v e r s u s n o n a q u e o u s m e d i a ( R y u a n d D o r d i c k , 1 9 9 2 ) . T h e s i g n i fi c a n c e o f t h i s s t u d y t o t h e l i g n i n b i o d e g r a d a t i o n fi e l d i s c l e a r , s i n c e i t h a s n o t b e e n p r o v e n t h a t L I P s o r M N P s p o s s e s s t h e a b i l i t y t o t a k e a n a c t i v e r o l e i n t h e i n v i v o d e g r a d a t i o n o f l i g n i n b y w h i t e r o t f u n g i . T h i s i s t h e fi r s t d i r e c t i n v i t r o e v i d e n c e w i t h a n i n s o l u b l e n a t u r a l l i g n i n i n a q u e o u s m e d i a t h a t t h e s e e n z y m e s d o t a k e p a r t i n t h e d e p o l y m e r i z a t i o n o f l i g n i n . W h i l e e a c h s e p a r a t e p i e c e o f e v i d e n c e d o e s n o t p r o v e t h a t l i g n i n w a s d e p o l y m e r i z e d , w h e n c o n s i d e r e d a s a w h o l e , i t s e e m s c l e a r t h a t l i g n i n w a s 2 7 8 d e g r a d e d w h e n b o t h e n z y m e s w e r e p r e s e n t , b u t n o t t o a n y s i g n i fi c a n t e x t e n t w h e n e a c h e n z y m e w a s u s e d s i n g l y . M N P a p p e a r e d t o m o d i f y t h e l i g n i n ( c o l o r c h a n g e c o m b i n e d w i t h i n c r e a s e i n m a s s ) , a n d w h e n L I P w a s a l s o p r e s e n t , t h e c o l o r i n i t i a l l y c h a n g e d b u t l a t e r r e t u r n e d t o n o r m a l a n d l i g n i n w a s r e l e a s e d . T h e s e r e s u l t s s u p p o r t t h e c o n c l u s i o n s o f P e r e z a n d J e f f r i e s ( 1 9 9 2 ) t h a t M N P p e r f o r m s t h e i n i t i a l s t a g e s o f d e p o l y m e r i z a t i o n , b u t t h a t L I P p e r f o r m s t h e b u l k o f t h e d e p o l y m e r i z a t i o n . T h e r e s u l t s o f t h i s s t u d y a l s o s u p p o r t t h e c o n c l u s i o n s o f T u o r e t a l . ( 1 9 9 2 ) , n a m e l y t h a t L I P a n d M N P a c t s y n e r g i s t i c a l l y t o d e g r a d e l i g n i n . T h e r e s u l t s d o n o t , h o w e v e r , s u p p o r t t h e c o n c l u s i o n s o f S a r k a n e n e t a l . ( 1 9 9 1 ) t h a t t h e r o l e o f L I P i n l i g n i n d e g r a d a t i o n i s t o d e t o x i f y a r o m a t i c s r e l e a s e d b y o t h e r e n z y m e s , b y p o l y m e r i z i n g t h e c o m p o u n d s i n t o h i g h m o l e c u l a r w e i g h t , i n s o l u b l e m o l e c u l e s . 6 . 6 C o n c l u s i o n s T h e r e s u l t s o f t h i s s t u d y i n d i c a t e t h a t b o t h t h e U P S a n d M N P s o f P . c h r y s o s p o r i w n t a k e p a r t i n t h e d e p o l y m e r i z a t i o n o f l i g n i n . M N P s a p p e a r t o c a t a l y z e t h e i n i t i a l s t e p s o f t h e d e g r a d a t i o n t h r o u g h m o d i fi c a t i o n o f t h e l i g n i n , p e r h a p s i n t r o d u c i n g f u n c t i o n a l g r o u p s i n t o t h e l i g n i n w h i c h m a k e i t a m o r e s u i t a b l e s u b s t r a t e f o r t h e L I P S . I t i s u n c l e a r w h e t h e r s i n g l y t h e s e e n z y m e s r e l e a s e d a n y s o l u b l e f r a g m e n t s f r o m t h e l i g n i n a t a l l , s i n c e t h e m a s s r e c o v e r y d a t a a n d F T I R / P L S r e s u l t s d i d n o t s h o w a n y l o s s o f s o l i d m a s s o r d e c r e a s e i n l i g n i n c o n t e n t , w h i l e t h e G C / M S d a t a s u g g e s t e d t h a t s o m e f r a g m e n t s m i g h t h a v e b e e n r e l e a s e d . F r o m t h e c o m p l e x i t y o f t h e G C / M S a n a l y s i s , i t i s a l s o c l e a r t h a t n o s o l u b l e p r o d u c t s a r e r e l e a s e d a t h i g h e n o u g h c o n c e n t r a t i o n s t o b e a c c u r a t e l y u s e d s i n g l y a s a n i n d i c a t o r o f t h e e x t e n t o f l i g n i n d e p o l y m e r i z a t i o n f o r u s e i n e n z y m e a c c e s s i b i l i t y s t u d i e s , b u t t h a t s i m p l e l i g n i n c o n t e n t m e a s u r e m e n t s w o u l d p r o b a b l y s u f fi c e . 6 . 7 F u t u r e D i r e c t i o n s T h e n e x t d i r e c t i o n t h a t a c o n t i n u a t i o n o f t h i s w o r k m u s t t a k e i s i n d i r e c t p r o o f t h a t t h e u n i q u e c o m p o u n d s i d e n t i fi e d b y G C / M S a r e i n d e e d l i g n i n f r a g m e n t s , a n d t h a t t h e y a r e r e l e a s e d b y e n z y m e a c t i v i t y a n d a r e n o t m e r e l y p r o d u c t s o f t h e o x i d a t i o n o f s o l u b l e 2 7 9 l i g n i n e x t r a c t i v e s b y t h e e n z y m e s . A v a r i e t y o f a p p r o a c h e s m i g h t b e u s e d f o r t h i s t a s k , s u c h a s t h e a d d i t i o n o f a c o n t r o l i n w h i c h t h e l i g n i n i s fi r s t r u n i n t h e r e a c t o r a s a n E R ' c o n t r o l , a n d t h e n t h e l i q u i d p h a s e r e c o v e r e d i s s u b j e c t e d t o e n z y m e a c t i v i t y . S i m p l e r m e t h o d s f o r t h e e x c l u s i o n o f V A d e r i v e d p r o d u c t s s h o u l d b e d e v e l o p e d , s u c h a s t h e u s e o f n o n l a b e l l e d V A a n d 1 3 C - r i n g - l a b e l l e d l i g n i n t o e x c l u d e p e a k s , o r b y u s i n g “ C - r i n g - l a b e l l e d l i g n i n w i t h r a d i o a c t i v i t y m e a s u r e m e n t s c o u p l e d w i t h G C t o v e r i f y t h a t t h e p r o d u c t s c a m e f r o m t h e l i g n i n . T h e u s e o f m i l l e d w o o d l i g n i n , e i t h e r l a b e l l e d o r u n l a b e l l e d , i n t h e r e a c t o r i n a q u e o u s m e d i a c o u l d p r o v i d e i n f o r m a t i o n o n d e c r e a s e s i n m o l e c u l a r w e i g h t o f t h e p o l y m e r , s i n c e m i l l e d w o o d ~ l i g n i n s a r e i n s o l u b l e i n w a t e r b u t a r e s o l u b l e i n l i g n i n s o l v e n t s . F i n a l l y , p u r i fi e d L I P S a n d M N P s w i l l e v e n t u a l l y h a v e t o b e u s e d i n t h e s y s t e m i n o r d e r t o c o m p l e t e l y e x c l u d e t h e p o s s i b i l i t y t h a t u n i q u e p r o d u c t s p r e s e n t a r e n o t t h e p r o d u c t s o f o t h e r e n z y m e a c t i v i t i e s p r e s e n t . A P P E N D I C E S A P P E N D I X A A s s a y s A . 1 L I P A s s a y T h i s a s s a y m e a s u r e s l i g n i n p e r o x i d a s e a c t i v i t y a s d e s c r i b e d b y T i e n a n d K i r k ( 1 9 8 4 ) . T h i s i s d o n e s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y a t r o o m t e m p e r a t u r e ( 2 3 ° C ) b y m e a s u r i n g t h e r a t e o f v e r a t r a l d e h y d e f o r m a t i o n f r o m v e r a t r y l a l c o h o l i n t h e p r e s e n c e o f H 2 0 2 . O n e U / L o f L I P a c t i v i t y i s t h e n d e fi n e d a s o n e u m o l e o f v e r a t r a l d e h y d e f o r m e d p e r l i t e r p e r m i n u t e a t t h e s e c o n d i t i o n s , u s i n g a n e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t ( T i e n e t a l . , 1 9 8 6 ) o f 9 3 0 0 M “ c m “ . S t o c k s o l u t i o n s a r e a s f o l l o w s : ( A . ) 1 2 5 m M T a r t a r i c A c i d , p H 2 . 5 0 ; ( B . ) 4 0 m M V e r a t r y l A l c o h o l ( V A ) ; a n d ( C . ) 8 m M H 2 0 2 ( m a k e f r e s h d a i l y ) . R e a c t i o n m i x f o r 5 0 a s s a y s i s p r e p a r e d b y m i x i n g 2 0 m L o f S t o c k A , 2 . 5 m L o f S t o c k B , a n d 2 . 5 m L o f S t o c k C . T h e a s s a y i s p e r f o r m e d a s f o l l o w s : ( 1 . ) b l a n k t h e s p e c t r o p h o t o m e t e r a t 3 1 0 n m w i t h w a t e r i n q u a r t z c u v e t s ; ( 2 . ) a d d 0 . 5 m L o f s a m p l e c o n t a i n i n g l i g n i n p e r o x i d a s e t o a n e m p t y q u a r t z c u v e t ; ( 3 . ) a d d 0 . 5 m L o f r e a c t i o n m i x a n d q u i c k l y m i x b y p l a c i n g a p i e c e o f p a r a fi l m o v e r t h e c u v e t a n d i n v e r t i n g s e v e r a l t i m e s ; ( 4 . ) m e a s u r e t h e a b s o r b a n c e c h a n g e w i t h a c h a r t r e c o r d e r f o r a t l e a s t 1 m i n u t e . T y p i c a l c h a r t r e c o r d e r s e t t i n g s a r e 1 0 0 m V a n d 5 c m / m i n f o r a n a c t i v i t y r a n g e o f 5 0 t o 5 0 0 U / L . T h e s l o p e o f t h e r e c o r d e r t r a c e i n ( O D / m i n ) i s t h e n m e a s u r e d a n d t h e L I P a c t i v i t y i s c a l c u l a t e d a s : 0 D 3 1 0 1 , 4 3 7 6 ) x ( l O O O u l J S O O u L ) x ( l O ‘ u m o l / m o l ) ( A - l ) [ L I P K U I I J = _ _ 9 3 0 0 M 1 c m 1 x ( 1 c m ) A . 2 M N P A s s a y # 1 T h i s a s s a y m e a s u r e s m a n g a n e s e p e r o x i d a s e a c t i v i t y b y f o l l o w i n g t h e o x i d a t i o n o f p h e n o l r e d d y e a s d e s c r i b e d b y K u w a h a r a e t a l . ( 1 9 8 4 ) a n d M i c h e l e t a l . ( 1 9 9 1 ) . R e a c t i o n t a k e s p l a c e a t 3 0 ° C f o r 4 m i n u t e s i n t e s t t u b e s . E x t e n t o f r e a c t i o n a f t e r 4 m i n u t e s i s m e a s u r e d s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y a t 6 1 0 n m . O n e U / L o f M N P a c t i v i t y i s t h e n 2 8 0 2 8 1 d e fi n e d a s o n e p m o l e o f p h e n o l r e d o x i d i z e d p e r l i t e r p e r m i n u t e , u s i n g a n e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t o f 4 4 6 0 M " c m “ ( M i c h e l e t a l . , 1 9 9 1 ) . S t o c k s o l u t i o n s a r e a s f o l l o w s : ( A . ) 5 0 0 m M N a - L a c t a t e , p H 4 . 5 0 ; ( B . ) 4 0 0 m M N a - S u c c i n a t e , p H 4 . 5 0 ; ( C . ) 2 9 6 ( w / v ) E g g a l b u m i n ( d i s c a r d e v e r y m o n t h ) ; ( D . ) 0 . 2 % ( w / v ) S o d i u m s a l t o f P h e n o l R e d d y e ; ( E . ) 2 0 m M M n S O . ; a n d ( F . ) 2 0 m M H 2 0 2 ( m a k e f r e s h d a i l y ) . R e a g e n t l i s p r e p a r e d ( 9 9 . 5 m L ) b y a d d i n g 5 m L o f S t o c k s A , B , C , a n d D , 0 . 5 m L o f S t o c k E , a n d 7 9 m L o f d i s t i l l e d w a t e r . R e a c t i o n m i x ( R e a g e n t I I ) f o r 5 0 a s s a y s i s p r e p a r e d b y m i x i n g 4 9 . 7 5 m L o f R e a g e n t I a n d 0 . 2 5 m L o f s o l u t i o n F . R e a g e n t I I s h o u l d b e p r e p a r e d f r e s h d a i l y . T h e a s s a y i s p e r f o r m e d a s f o l l o w s : ( 1 . ) a d d 2 0 t o 4 0 u L o f s a m p l e c o n t a i n i n g m a n g a n e s e p e r o x i d a s e t o a t e s t t u b e ( a l s o p r e p a r e t w o b l a n k s b y a d d i n g 2 0 t o 4 0 p L o f d i s t i l l e d w a t e r ( s a m e v o l u m e a s s a m p l e ) t o t w o t e s t t u b e s ) ; ( 2 . ) a d d 1 m L o f R e a g e n t I I t o e a c h t u b e a n d i n c u b a t e f o r 4 m i n u t e s i n a w a t e r b a t h a t 3 0 ° C ; ( 3 . ) w h e n t h e r e a c t i o n h a s p r o c e e d e d f o r 4 m i n u t e s , a d d 4 0 u L o f 2 N N a O H t o s t o p t h e r e a c t i o n , a n d q u i c k l y m i x t h e t u b e s ; ( 4 . ) t r a n s f e r t h e s a m p l e s t o c u v e t s ( q u a r t z c u v e t s a r e n o t n e c e s s a r y ) a n d b l a n k t h e s p e c t r o p h o t o m e t e r a t 6 1 0 n m w i t h t h e t w o s a m p l e b l a n k s ; ( 5 . ) m e a s u r e t h e a b s o r b a n c e o f t h e s a m p l e a t 6 1 0 n m . T h e M N P a c t i v i t y ( e g . f o r a 2 0 u L s a m p l e ) i s t h e n c a l c u l a t e d a s : A A “ . x ( l O G O u L / Z O u L ) x ( 1 0 ‘ “ m o t / m o ! ) ( A - 2 ) ( 4 m i n ) x 4 4 6 0 M 4 0 1 : ' 1 x ( 1 c m ) [ M N P K U I D = A . 3 M N P A s s a y # 2 T h i s a s s a y m e a s u r e s m a n g a n e s e p e r o x i d a s e a c t i v i t y a s d e s c r i b e d b y O l s e n e t a l . ( 1 9 9 1 ) . T h i s i s d o n e s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y a t r o o m t e m p e r a t u r e ( 2 3 ° C ) b y m e a s u r i n g t h e r a t e o f o x i d a t i o n o f p h e n o l r e d d y e i n t h e p r e s e n c e o f H 2 0 2 . O n e U / L o f M N P a c t i v i t y i s t h e n d e fi n e d a s a n i n c r e a s e o f o n e a b s o r b a n c e u n i t a t 5 3 0 n m p e r m i n u t e p e r l i t e r o f s a m p l e ( O l s e n e t a l . , 1 9 9 1 ) . S t o c k s o l u t i o n s a r e a s f o l l o w s : ( A . ) 0 . 1 1 g / L s o d i u m s a l t o f p h e n o l r e d d y e , 1 . 1 g / L O v a l b u m i n , 2 . 5 m L / L o f 8 5 9 6 L a c t i c A c i d , i n 2 8 2 2 0 m M N a - S u c c i n a t e , p H 4 . 5 0 ; ( B . ) 1 0 m M M n S O , i n 2 0 m M N a - S u c c i n a t e , p H 4 . 5 0 ; a n d ( C . ) 9 . 8 m M H 2 0 , ( p r e p a r e d f r e s h d a i l y ) . T h e a s s a y i s p e r f o r m e d a s f o l l o w s : ( 1 . ) a d d 9 0 0 u L o f S t o c k A t o a q u a r t z c u v e t ; ( 2 . ) a d d 1 0 0 p L o f s a m p l e / d i s t i l l e d w a t e r t o t h e c u v e t ; ( 3 . ) a d d 1 0 u L o f S t o c k B t o t h e c u v e t ; ( 4 . ) m i x t h e c o n t e n t s o f t h e c u v e t b y p l a c i n g a p i e c e o f p a r a fi l m o v e r t h e c u v e t a n d i n v e r t i n g s e v e r a l t i m e s ; ( 5 . ) b l a n k t h e s p e c t r o p h o t o m e t e r w i t h t h i s c u v e t a t 5 3 0 n m ; ( 6 . ) a d d 1 0 u L o f S t o c k C t o t h e c u v e t ; ( 7 . ) i m m e d i a t e l y m i x t h e c o n t e n t s o f t h e c u v e t b y p l a c i n g a p i e c e o f P a r a fi l m o v e r t h e c u v e t a n d i n v e r t i n g s e v e r a l t i m e s ; a n d ( 8 . ) r e c o r d t h e a b s o r b a n c e a t 5 3 0 n m f o r 3 0 s e c o n d s a t r o o m t e m p e r a t u r e ( 2 3 ° C ) o n a c h a r t r e c o r d e r . T h e a b s o r b a n c e c h a n g e i s l i n e a r w i t h i n a r a n g e o f 0 . 0 5 t o 0 . 2 0 O D / m i n ( s a m p l e s s h o u l d b e k e p t w i t h i n t h i s r a n g e ) . T y p i c a l c h a r t r e c o r d e r s e t t i n g s a r e 1 0 m V a n d 5 c m / m i n . T h e a b s o r b a n c e c h a n g e i s t h e n m e a s u r e d f r o m t h e s l o p e o f t h e r e c o r d e r t r a c e i n ( O D / m i n ) a n d t h e M N P a c t i v i t y ( e g . f o r a 1 0 0 u L s a m p l e ) i s c a l c u l a t e d a s : a n ” , x ( 1 0 3 m m , ) ( A 4 , ) ( 0 . 5 m i n ) x ( 0 . 1 0 0 m L ) [ M N P J W I D = A . 4 H 1 0 , A s s a y T h i s a s s a y m e a s u r e s H 2 0 2 b y f o l l o w i n g t h e d e c o l o r i z a t i o n o f R e m a z o l B r i l l i a n t B l u e R d y e a s d e s c r i b e d b y M u h e i m e r a l . ( 1 9 9 0 ) . T h i s i s d o n e s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y a t r o o m t e m p e r a t u r e ( 2 3 ° C ) b y m e a s u r i n g t h e o v e r a l l a b s o r b a n c e c h a n g e a t 5 8 5 n m w h e n R e m a z o l B r i l l i a n t B l u e R d y e i s d e c o l o r i z e d b y H o r s e r a d i s h P e r o x i d a s e i n t h e p r e s e n c e o f H 2 0 2 . S t o c k s o l u t i o n s a r e a s f o l l o w s : ( A . ) 4 0 0 p g / m L H o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e T y p e I I ( H R P ) i n p h o s p h a t e b u f f e r , p H 7 . 0 0 , f r o z e n i n 1 0 1 u L a l i q u o t s i n E p p e n d o r f t u b e s ; ( B . ) 0 . 1 % ( w / v ) R e m a z o l B r i l l i a n t B l u e R d y e ; ( C . ) 2 0 0 m M 2 , 2 - d i m e t h y l s u c c i n i c a c i d ( D M S ) , p H 7 . 0 0 , a n d ( D . ) H 2 0 , s t a n d a r d s r a n g i n g i n c o n c e n t r a t i o n f r o m 5 t o 6 0 1 4 M ( m a k e f r e s h d a i l y ) . B e f o r e p r e p a r i n g t h e r e a c t i o n m i x , t h e f r o z e n H R P i s t h a w e d a n d 8 9 9 “ L o f d i s t i l l e d w a t e r i s a d d e d a n d t h e t u b e m i x e d . 2 8 3 R e a c t i o n m i x f o r 2 0 a s s a y s i s t h e n p r e p a r e d b y m i x i n g t h e d i l u t e d c o n t e n t s o f t h e H R P t u b e w i t h 0 . 5 m L o f S t o c k B , 5 m L o f S t o c k C , a n d 3 . 5 m L o f d i s t i l l e d w a t e r . T h e a s s a y i s p e r f o r m e d a s f o l l o w s : ( 1 . ) b l a n k t h e s p e c t r o p h o t o m e t e r a t 5 8 5 n m w i t h 0 . 5 m L o f r e a c t i o n m i x a n d 0 . 5 m L o f w a t e r ( q u a r t z c u v e t s a r e n o t n e c e s s a r y ) ; ( 2 . ) p l a c e a c u v e t c o n t a i n i n g 0 . 5 m L o f r e a c t i o n m i x i n t o t h e s a m p l e c e l l ; ( 3 . ) a d d 0 . 5 m L o f s a m p l e c o n t a i n i n g H 2 0 , i n t h e r a n g e 3 t o 3 0 ” M ; ( 4 . ) q u i c k l y c l o s e t h e s p e c t r o p h o t o m e t e r l i d a n d m e a s u r e t h e a b s o r b a n c e c h a n g e w i t h a c h a r t r e c o r d e r u n t i l n o t h e r e i s f u r t h e r d e c r e a s e i n a b s o r b a n c e . T y p i c a l c h a r t r e c o r d e r s e t t i n g s a r e 5 0 m V a n d 5 c m / m i n f o r a n H 2 0 2 c o n c e n t r a t i o n r a n g e o f 3 t o 3 0 p M . T h e H 2 0 2 s t a n d a r d s a r e a l s o m e a s u r e d i n t h i s m a n n e r a n d t h e a b s o r b a n c e c h a n g e s fi t v e r s u s H 2 0 2 c o n c e n t r a t i o n u s i n g l i n e a r r e g r e s s i o n . S a m p l e c o n c e n t r a t i o n s a r e t h e n c a l c u l a t e d f r o m t h i s r e l a t i o n s h i p . A . 5 V e r a t r y l A l c o h o l ( V A ) A s s a y T h i s a s s a y m e a s u r e s v e r a t r y l a l c o h o l c o n c e n t r a t i o n s u s i n g l i g n i n p e r o x i d a s e t o c a t a l y z e i t s o x i d a t i o n t o v e r a t r a l d e h y d e , w i t h a m e t h o d s i m i l a r t o t h a t o f L e i s o l a e t a l . ( 1 9 8 6 ) . T h i s i s d o n e s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y a t r o o m t e m p e r a t u r e ( 2 3 ° C ) b y m e a s u r i n g t h e o v e r a l l a b s o r b a n c e c h a n g e a t 3 1 0 n m w h e n v e r a t r y l a l c o h o l i s o x i d i z e d t o v e r a t r a l d e h y d e b y l i g n i n p e r o x i d a s e s f r o m P . c h r y s o s p o r i w n i n t h e p r e s e n c e o f H 2 0 2 . S t o c k s o l u t i o n s a r e a s f o l l o w s : ( A . ) D i a l y z e d c r u d e e x t r a c e l l u l a r fl u i d f r o m a D a y 6 c u l t u r e o f P . c h r y s o s p o r i u m i n 1 0 m M a c e t a t e b u f f e r , p H 6 . 0 0 , c o n t a i n i n g 1 0 0 t o 2 0 0 U / L o f L I P a c t i v i t y a s m e a s u r e d b y t h e L I P A s s a y a b o v e , a n d f r o z e n i n 1 0 m L a l i q u o t s i n t e s t t u b e s ; ( B . ) 1 2 5 m M T a r t a r i c A c i d , p H 2 . 5 0 ; ( C . ) 8 m M H 2 0 2 ; a n d ( D . ) V A s t a n d a r d s r a n g i n g i n c o n c e n t r a t i o n f r o m 0 . 1 t o 1 . 6 m M ( m a k e f r e s h w e e k l y ) . B e f o r e p r e p a r i n g t h e r e a c t i o n m i x , t h e f r o z e n e x t r a c e l l u l a r fl u i d i s t h a w e d . R e a c t i o n m i x f o r 1 0 a s s a y s i s p r e p a r e d b y m i x i n g 4 m L o f S t o c k B w i t h 0 . 5 m L o f S t o c k C . T h e a s s a y i s p e r f o r m e d a s f o l l o w s : ( 1 . ) b l a n k t h e s p e c t r o p h o t o m e t e r a t 3 1 0 n m w i t h w a t e r i n q u a r t z c u v e t s ; ( 2 . ) a d d 4 5 0 p L o f r e a c t i o n m i x t o a n e m p t y q u a r t z c u v e t ; ( 3 . ) a d d 5 0 p L o f s a m p l e c o n t a i n i n g V A i n t h e r a n g e 0 . 1 t o 1 . 6 m M ; ( 4 . ) m i x b y p l a c i n g 2 8 4 a p i e c e o f p a r a fi l m o v e r t h e c u v e t a n d i n v e r t i n g s e v e r a l t i m e s ; ( 5 . ) p l a c e t h e c u v e t i n t o t h e s a m p l e c e l l ; ( 6 . ) a d d 0 . 5 m L o f t h e t h a w e d d i a l y z e d e x t r a c e l l u l a r f l u i d ; ( 4 . ) q u i c k l y c l o s e t h e s p e c t r o p h o t o m e t e r l i d a n d m e a s u r e t h e a b s o r b a n c e c h a n g e w i t h a c h a r t r e c o r d e r u n t i l n o t h e r e i s f u r t h e r i n c r e a s e i n a b s o r b a n c e . T y p i c a l c h a r t r e c o r d e r s e t t i n g s a r e 1 0 0 m V a n d 2 c m / m i n f o r a s a m p l e c o n c e n t r a t i o n r a n g e o f 0 . 1 t o 1 . 6 m M . T h e V A s t a n d a r d s a r e a l s o m e a s u r e d i n t h i s m a n n e r a n d t h e a b s o r b a n c e c h a n g e s fi t v e r s u s V A c o n c e n t r a t i o n u s i n g l i n e a r r e g r e s s i o n . S a m p l e c o n c e n t r a t i o n s a r e t h e n c a l c u l a t e d f r o m t h i s r e l a t i o n s h i p . a n d T = - I V , ( C ‘ - C ’ ) c , d T _ - ( ” W A G C , _ C a ) a ( “ ) B - 5 ) A P P E N D I X B D e r i v a t i o n o f H 2 0 2 a n d V A T r a n s p o r t E q u a t i o n s F o r s i m p l e d i f f u s i o n a c r o s s a m e m b r a n e f r o m S i d e A t o S i d e B , t h e m a s s b a l a n c e s m a y b e w r i t t e n a s d C V _ ‘ = - ( B - 1 ) 4 d , A ! a n d ( 1 6 ‘ v — " = ° ( B - 2 ) I a t A , T h e fl u x j i s g i v e n b y ( 0 ' j = E l i t e , - c . ) ( 3 . 3 ) w h e r e H i s a p a r t i t i o n c o e f fi c i e n t b e t w e e n t h e b u l k fl u i d a n d t h e m e m b r a n e . L e t t i n g H = 1 , w e s e e t h a t T h e s e a r e t h e t r a n s p o r t e q u a t i o n s u s e d d i r e c t l y i n t h e d e r i v a t i o n o f t h e u n s t e a d y s t a t e m o d e l f o r t h e r e a c t o r ( f o r 1 1 - 1 2 0 2 a n d M n ( I I ) ) . E x p e r i m e n t s h o w e d ( s e e R e s u l t s ) t h a t D ‘ " f o r V A d e p e n d e d o n V A c o n c e n t r a t i o n , d u e t o i n c r e a s i n g s o l u t i o n v i s c o s i t y w i t h i n c r e a s i n g V A c o n c e n t r a t i o n ; t h i s d e p e n d e n c e w a s f o u n d t o b e e x p o n e n t i a l . I t w a s a l s o f o u n d ( s e e R e s u l t s ) t h a t t h e V A c o n c e n t r a t i o n v e r s u s t i m e d a t a w e r e a p p r o x i m a t e d b e s t w h e n a n a d d i t i o n a l e x p o n e n t i a l t e r m w a s i n c l u d e d ; t h i s a d d i t i o n a l e x p o n e n t i a l d e p e n d e n c e w a s i n t e r p r e t e d a s b e i n g t h e r e s u l t o f V A a g g r e g a t i o n i n w a t e r ( V A i s r e l a t i v e l y i n s o l u b l e 2 8 5 4 V . 4 d ] : _ - D - — ‘ - m ( A r p . a 4 m ) . _ 4 M ) . a ) ( B - 9 ) 2 8 6 i n w a t e r ) . C o m b i n i n g t h e s e e x p o n e n t i a l r e l a t i o n s h i p s w i t h t h e S t o k e s - E i n s t e i n e q u a t i o n ( B i r d e t a l . , 1 9 6 0 ) g i v e s D - k 1 = k T 6 m 0 1 4 1 ( B - 6 ) 6 x r ‘ e " p ’ e ‘ fl " w h e r e a a n d p ° a r e f r o m t h e fi t o f t h e v i s c o s i t y d a t a , a n d r " a n d a l a r e e m p i r i c a l c o n s t a n t s . I n t h e S t o k e s - E i n s t e i n e q u a t i o n , k i s t h e B o l t z m a n n c o n s t a n t , T i s a b s o l u t e t e m p e r a t u r e , r i s m o l e c u l a r r a d i u s , a n d [ L i s s o l u t i o n v i s c o s i t y . I t s h o u l d b e n o t e d t h a t t h e S t o k e s - E i n s t e i n e q u a t i o n a s o n l y v a l i d f o r d i l u t e s o l u t i o n s ( B i r d e r a l . , 1 9 6 0 ) . S i n c e t h e c o n c e n t r a t i o n s o f V A t o b e u s e d i n t h e r e a c t o r r u n s w e r e l o w , t h e h i g h V A c o n c e n t r a t i o n d a t a f r o m t h e d i f f u s i o n e x p e r i m e n t s w e r e d r o p p e d w h e n t h e e f f e c t i v e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t p a r a m e t e r s f o r V A w e r e c a l c u l a t e d ( s e e b e l o w ) . C o m b i n i n g c o n s t a n t s ( T i s k e p t c o n s t a n t i n t h e e x p e r i m e n t s a t 3 7 ° C ) i n t o 0 ° , a n d c o m b i n i n g t h e e x p o n e n t i a l t e r m s g i v e s D = D ? ! 4 1 7 4 ] H ; B = ( « + 1 ) ( B - 7 ) “ 1 D I M = 6 t r ' p ' F o r p s e u d o s t e a d y s t a t e d i f f u s i o n a c r o s s a m e m b r a n e , V A 4 1 ' = - A m " D ( c ) d t ( I i - 8 ) ( I ! I V , [ V 4 1 4 I n s e r t i n g t h e e x p r e s s i o n f o r t h e e f f e c t i v e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t f o r V A a n d i n t e g r a t i n g g i v e s 2 8 7 T h i s i s t h e f o r m o f t h e V A t r a n s p o r t u s e d i n t h e d e r i v a t i o n o f t h e r e a c t o r m o d e l . C o m b i n i n g e q u a t i o n s ( B - 4 t h r o u g h B - 9 ) w e g e t % ( c , - C ) = a m m o , - c . ) A l l ( 3 ' 1 0 ) 1 = — ( — + — ) I V 4 V . S o l u t i o n o f t h i s e q u a t i o n g i v e s C A ' C , l n ( — — - ) = — 1 0 W t ( B - l l ) C A . - C 3 . , K n o w l e d g e o f t h e c e l l m e a s u r e m e n t s , i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s , a n d c o n c e n t r a t i o n s a t a c e r t a i n t i m e i n t o t h e e x p e r i m e n t a l l o w s c a l c u l a t i o n o f D " ( f o r H 2 0 2 a n d M n ( I I ) ) . F o r V A , i t w a s n e c e s s a r y t o s o l v e e q u a t i o n ( B - 9 ) f o r [ V A ] B a n d fi t t h e s o l u t i o n t o t h e d a t a b y t r i a l a n d e r r o r s i n c e t h e v a l u e s o f 0 ° a n d a l w e r e u n k n o w n ( o r w a s k n o w n f r o m t h e v i s c o s i t y d a t a ) . T h e s o l u t i o n t o e q u a t i o n ( B - 9 ) i s - 1 1 [ V A ] , _ _ _ % h ( m k 1 m m ; W m ( % ‘ fi ) t + t a n h ‘ l ( ¢ 2 m u n - m m ) » B + % ( [ v . 4 ] ; + [ V A ) ; ) ( B - r z ) T h i s e q u a t i o n w a s u s e d i n a t r i a l a n d e r r o r s h o o t i n g m e t h o d t h e fi n d t h e b e s t v a l u e s o f t h e u n k n o w n p a r a m e t e r s . A P P E N D I X C D e r i v a t i o n o f E n z y m e K i n e t i c E q u a t i o n s C . 1 K i n e t i c s o f V e r a t r y l O x i d a t i o n b y L I P T h e r e a c t i o n s p r o p o s e d b y T i e n e t a l . ( 1 9 8 6 ) f o r t h e o x i d a t i o n o f v e r a t r y l a l c o h o l t o v e r a t r a l d e h y d e b y L I P , n a m e l y , t w o s u b s t r a t e p i n g — p o n g k i n e t i c s w i t h c o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n b y H 2 0 2 a n d t w o - s t e p o x i d a t i o n o f v e r a t r y l a l c o h o l a r e ” 2 0 2 + d e 0 — - k - 1 - — > d e l + H 2 0 ( 4 ' 6 ) H 2 0 2 + d e l 4 — k l : v o p a l - 1 1 , 0 , ( 4 - 7 ) V A + d e l J 3 . . . » c d e I - V A - ( 4 - 8 ) W I - V A ' — £ — > V A “ 4 » d e D ( 4 ' 9 ) w h e r e d e O , d e I a n d d e I I r e p r e s e n t t h e d i f f e r e n t o x i d a t i o n s t a t e s o f t h e L I P h e m e , a n d V A “ i s v e r a t r a l d e h y d e ( T i e n e t a l . , 1 9 8 6 ) . T h e r a t e s o f c o n s u m p t i o n o f H 2 0 2 a n d V A , a n d t h e r a t e o f p r o d u c t i o n o f v e r a t r a l d e h y d e a r e H O S L 2 1 1 ; . - , m p n r c a d o r - M H z o l e C P d ' l ( C - l ) + k _ , [ c p d r - H , o , ] _ _ d l e l = — k , I V A H d e n ( 0 2 ) 4 ‘ 2 " ] = J d e I I - V A ' ] ( c - 3 ) 2 8 8 2 8 9 T h e r a t e s o f c h a n g e o f t h e L I P i n t e r m e d i a t e s a r e i c y — " 4 J H 2 0 J t 0 p d o r - h m z o a r 0 p d n « 2 . 4 ) + r t _ , [ c p d 1 - H , o , ] - , [ v a u c p d r ] - H o “ a ” ; ’ ’ J = k e r z o a r c m - h a r e m - H . 0 2 1 ( 9 ' 5 ) 4 C ” : ' V " ' 1 = k , [ V A ] [ c p d n - k J d e I I - V A . 1 ( C - 6 ) A p p l y i n g t h e S t e a d y S t a t e A s s u m p t i o n ( S S A ) t o e a c h o f t h e s e e q u a t i o n s a n d u s i n g a n o v e r a l l e n z y m e b a l a n c e : [ L I P ] . = [ d e o r + r e p a i r + [ c m - H p ; ( m , + [ d e I I - V A ' ] w e g e t r u n . W ” 3 t . % ’ Z _ f a £ § é , . L u g e . ( 0 * ) w h e r e x , = i i ( 0 9 ) W e a l s o fi n d t h a t v = a w n “ ; = _ d [ H , 0 , J = - fl é l ( c - r o ) d t d t d t V " h a l a l V A ] + k 1 k 3 I H 2 0 2 H V A ] k 1 k 4 I H 2 0 2 1 a + [ — H K 3 0 — 1 ‘ ] ) r ( C - l l M N P + 1 + M n ( I I + M n M M N N P P M ! I n 1 ( 2 I 0 ) I I > > — — — 2 — — ) H fi ‘ fi - 5 £ — — M N M N M P ( I P P n N ] I + + + I I ) 2 0 H m m I ) I u I - M + n ( A ( I I I ) + A — > M + > ) ) ) ( ( 4 4 - - 1 1 5 6 ( 4 - 1 7 ) ( 4 ' 1 3 ) 2 9 0 C o m b i n i n g e q u a t i o n s ( C - 2 ) , ( C - 4 ) , ( C - 8 ) , a n d ( C - l O ) , a f t e r r e a r r a n g e m e n t , g i v e s t h e k i n e t i c r a t e e q u a t i o n k 1 k 3 k ‘ [ L I P ] . [ H 2 0 , ] [ V A ] C . 2 K i n e t i c s o f M n ( I I ) O x i d a t i o n b y M N P T h e r e a c t i o n s f o r t h e o x i d a t i o n o f M n ( I I ) t o M n ( I I I ) b y M N P , n a m e l y , t w o s u b s t r a t e p e r o x i d a s e p i n g - p o n g k i n e t i c s ( W a r i i s h i e t a l . , 1 9 8 9 a ) a r e w h e r e M N P , M N P I a n d M N P I I r e p r e s e n t t h e d i f f e r e n t o x i d a t i o n s t a t e s o f t h e M N P h e m e , a n d A H i s o x i d i z a b l e l i g n i n b o n d s . S i n c e t h e k i n e t i c e x p e r i m e n t s t o b e p e r f o r m e d w i t h M N P o n l y e n c o m p a s s e d t h e fi r s t t h r e e r e a c t i o n s , t h e f o u r t h r e a c t i o n i s l e f t o u t o f t h e s e d e r i v a t i o n s . T h e f o r m o f t h e r a t e e q u a t i o n c o n t a i n i n g t h e t e r m f o r t h i s r e a c t i o n i s p r e s e n t e d a t t h e e n d o f t h e d e r i v a t i o n . T h e r a t e s o f c o n s u m p t i o n o f H 2 0 2 a n d M n ( I I ) , a n d t h e r a t e o f p r o d u c t i o n o f M n ( I I I ) a r e 5 5 3 9 1 ] — = - , [ H p m u m ( C - 1 2 ) , = d I M n d t : I m r = _ d [ M u l ) l _ 2 4 3 ( d I t 2 ] : d 0 : ( C - 1 9 ) 2 9 1 _ _ _ — ‘ 1 ” $ 1 1 ) ] = k J M N P I fl M n U m — u m m w w m _ ( C - 1 3 ) M f g fl = k J M N P I ] [ M n ( 1 1 ) ] + k , [ M N P I I ] [ M n ( I I ) ] ( 0 1 4 ) T h e r a t e s o f c h a n g e o f t h e M N P i n t e r m e d i a t e s a r e 4 m m ] = , H , 0 , ] [ M N 1 1 - k J M N P I ] [ M n ( 1 1 ) ] ( C - 1 5 ) fl — M i l ’ fl = J M N P m M n m ] - k , [ M N P I I ] [ M n ( I I ) ] ( C - 1 6 ) A p p l y i n g t h e S t e a d y S t a t e A s s u m p t i o n ( S S A ) t o e a c h o f t h e s e e q u a t i o n s a n d u s i n g a n o v e r a l l e n z y m e b a l a n c e : ( m m , = [ M N P ] + [ M N P I I + [ M N P I I ] ( C - 1 7 ) w e g e t [ M N P ] . [ m M ’ + r a m p ; + k , [ H , o , ] ( C - 1 8 ) h u m a n ] m u n c h ] W e a l s o fi n d t h a t C o m b i n i n g e q u a t i o n s ( C - 1 3 ) , ( C - 1 5 ) , ( C - 1 8 ) , a n d ( 0 1 9 ) , a f t e r r e a r r a n g e m e n t , g i v e s t h e k i n e t i c r a t e e q u a t i o n 2 9 2 ' _ 2 I t , k ‘ k , [ M N n , [ H , o , ] [ M u ( m ] ( C _ 2 0 ) k s k J M n ( 1 1 ) ] + I t , ( k , + L , ) [ H , 0 , J S i n c e k . a n d k 7 a p p e a r b o t h a s a p r o d u c t a n d a s a s u m i n t h i s r a t e e q u a t i o n , n e i t h e r c a n b e d e t e r m i n e d f r o m s i m p l e k i n e t i c e x p e r i m e n t s e n c o m p a s s i n g t h e fi r s t t h r e e r e a c t i o n s . T h u s , a p a r a m e t e r , ‘ 1 ' , w a s d e fi n e d t o r e m o v e t h e m f r o m t h e e q u a t i o n a n d a l l o w t h e r a t i o o f t h e s u m a n d t h e p r o d u c t o f k g a n d k 7 t o b e c a l c u l a t e d f r o m t h e i n t e r c e p t o f a d o u b l e r e c i p r o c a l p l o t o f r a t e v e r s u s i n v e r s e c o n c e n t r a t i o n d a t a . T h e p a r a m e t e r ‘ 1 ' i s d e fi n e d , t h e n , a s k ‘ + L , V = ‘ 1 ‘ : — ( 0 2 0 S o l v i n g t h i s r e l a t i o n s h i p f o r k , k - , a n d i n s e r t i n g t h e s o l u t i o n i n t o t h e a b o v e r a t e e q u a t i o n g i v e s v _ 2 k , [ M N P ] ' [ H 1 0 J [ M u ( l l ) ] ( € 4 2 ) [ M n ( I I ) ] « k a r m a ; T h i s i s t h e f o r m o f t h e r a t e e q u a t i o n u s e d f o r t h e k i n e t i c s t u d i e s f o r M N P . N o t e t h a t t h e " 4 " i n t h e d e n o m i n a t o r c o m e s f r o m t h e u s e o f 2 m M M n S O . i n t h e k i n e t i c e x p e r i m e n t s ( s e e C h a p t e r I V ) . T h e f o r m o f t h e r a t e e q u a t i o n u s e d i n t h e r e a c t o r m o d e l i n c l u d e d t h e f o u r t h ( n o n - M N P d e p e n d e n t ) r e a c t i o n . W i t h t h i s r e a c t i o n i n c l u d e d , t h e r a t e e q u a t i o n b e c o m e s v _ 2 k , [ M N n , [ H , o , J [ M n ( 1 1 ) ] " ‘ [ M n ( I I ) ] m a m a . ) - k , [ M n ( I r r ) ] [ A H ] ( 0 2 3 ) A P P E N D I X D F O R T R A N P R O G R A M S D . 1 F O R T R A N S i m u l a t i o n o f R e a c t o r D . 1 . 1 V a r i a b l e s U s e d I n F O R T R A N P r o g r a m R K G . F O R a . D o u b l e P r e c i s i o n V a r i a b l e s V a r i a b l e a a a a h a h ( 2 ) a h c o n c a l p a p v o l a r a n g e a r e a a 1 a 2 b b b p v o l b r a n g e b t a d e l t a d f p v d m d m 3 d p d v c o n v r t e e e p s f p v f r a c l f r a c 2 f r l p c t f r 2 p c t f r 3 p c t f 1 f 2 f 2 0 v f 1 f 3 f 4 8 U n i t s m M / ( U / L ) c m ’ l m i n c m ‘ 2 / m i n c m ’ l m i n c m ’ l m i n ( U O / L ) / ( U P / L ) m M / ( U / L ) m M / ( U / L ) 9 6 / 1 0 0 9 6 / 1 0 0 9 6 / 1 0 0 D e s c r i p t i o n T e m p o r a r y v a l u e o f a l p T e m p o r a r y v a l u e o f a h ( 2 ) C o n c e n t r a t i o n o f o x i d i z a b l e l i g n i n b o n d s V a r i a b l e u s e d i n d i l u t i o n c a l c u l a t i o n s f o r o x i d i z a b l e l i g n i n b o n d s R a t i o o f m a x i m u m [ H 2 0 2 ] B t o m a x i m u m [ L I P ] V o l u m e p u l s e d t o S i d e A F r a c t i o n o v e r m i n i m u m [ H 2 0 2 ] B f o r p u l s e C r o s s - s e c t i o n a l a r e a f o r t r a n s p o r t R a d i u s e x p o n e n t f r o m D e f f ( V A ) V i s c o s i t y e x p o n e n t f r o m D e f f ( V A ) T e m p o r a r y v a l u e o f b t a V o l u m e p u l s e d t o S i d e B F r a c t i o n u n d e r m a x i m u m [ V A ] B f o r p u l s e R a t i o o f m a x i m u m [ V A ] B t o m a x i m u m [ L I P ] F r a c t i o n a l c o r r e c t i o n t o t r a n s p o r t r a t e s D e r i v a t i v e o f f u n c t i o n f o r N e w t o n ’ s M e t h o d E f f e c t i v e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t f o r M n ( I I ) E f f e c t i v e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t f o r [ M n ( I I I ) - ( t a r t ) 2 ] c o m p l e x E f f e c t i v e d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t f o r H 2 0 2 D i f f u s i o n c o e f fi c i e n t f o r V A a t i n fi n i t e d fl u fi o n C o n v e r s i o n f a c t o r f r o m t h e P a t e n t U / L M N P t o o u r U / L M N P T e m p o r a r y v a l u e o f e p s ‘ R a t i o o f m a x i m u m M n ( I I ) t o m a x i m u m M N P F u n c t i o n f o r N e w t o n ’ s M e t h o d F r a c t i o n o f g 2 / ( f 2 / f 1 ) t o m a k e g 1 F r a c t i o n o f f 2 t o m a k e g 2 I n c r e a s e o f g 1 p e r c o n s e c u t i v e p u l s e D e c r e a s e o f g 2 p e r c o n s e c u t i v e p u l s e D e c r e a s e o f g 3 p e r c o n s e c u t i v e p u l s e R a t i o o f i n i t i a l r a t e s o f V A t r a n s p o r t t o V A c o n s u m p t i o n R a t i o o f i n i t i a l r a t e s o f p e r o x i d e t r a n s p o r t t o p e r o x i d e c o n s u m p t i o n R a t i o o f 1 2 t o f 1 R a t i o o f [ H 2 0 2 ] A a f t e r p u l s e t o i n i t i a l [ H 2 0 2 ] A ( n o e n z y m e a d d e d ) A d d i t i o n a l f r a c t i o n o f f 3 ( e n z y m e a d d e d ) G u e s s u s e d i n N e w t o n ’ s M e t h o d 2 9 3 g m a g 3 h i n i t l o i n i m o l i n i m o 2 k a h ( 4 ) k d l l k d 1 2 k d m a k d m b k i k m a ( 4 ) k m b ( 4 ) k m 3 a ( 4 ) k m 3 b ( 4 ) k v a ( 4 ) k v b ( 4 ) k v a ( 4 ) k v b ( 4 ) k l k 3 k 4 k 5 a k a m M ’ l m L [ m i n ( U / L ) ] " [ m i n ( U / L ) ] " m M [ m i n ( U / L ) ] ' l [ m i n ( U / L ) ] ' l [ m i n ( U / L ) ] ‘ l [ m i n m M ] " U / L U / L U / L % / 1 0 0 c m 2 9 4 E x p o n e n t i n V A d i f f u s i o n c o e f fi c i e n t ( = l / a l + N a , ) T e m p o r a r y v a l u e o f g R a t i o o f r a t e s o f V A t r a n s p o r t t o V A c o n s u m p t i o n a f t e r p u l s e R a t i o o f r a t e s o f p e r o x i d e t r a n s p o r t t o p e r o x i d e c o n s u m p t i o n a f t e r p u l s e ( L I P p u l s e d a l o n e ) R a t i o o f r a t e s o f p e r o x i d e t r a n s p o r t t o p e r o x i d e c o n s u m p t i o n a f t e r p u l s e ( L I P a n d M N P p u l s e d t o g e t h e r ) T i m e s t e p s i z e I n i t i a l [ L I P ] a c t i v i t y I n i t i a l D 5 N o M n [ M N P ] a c t i v i t y I n i t i a l D 4 H i M n [ M N P ] a c t i v i t y R u n g e - K u t t a - G i l l a p p r o x i m a t i o n c o n s t a n t s f o r o x i d i z a b l e l i g n i n b o n d s Z e r o - o r d e r d e c a y c o n s t a n t f o r L I P F i r s t - o r d e r d e c a y c o n s t a n t f o r L I P F i r s t - o r d e r d e c a y c o n s t a n t f o r D 5 N o M n M N P F i r s t - o r d e r d e c a y c o n s t a n t f o r D 4 H i M n M N P I n h i b i t i o n c o n s t a n t f o r p e r o x i d e i n L I P / V A k i n e t i c s R u n g e - K u t t a — G i l l a p p r o x i m a t i o n c o n s t a n t s f o r S i d e A M n ( I I ) R u n g e - K u t t a - G i l l a p p r o x i m a t i o n c o n s t a n t s f o r S i d e B M n ( I I ) R u n g e - K u t t a — G i l l a p p r o x i m a t i o n c o n s t a n t s f o r S i d e A [ M n ( I I I ) - ( t a r t ) 2 ] c o m p l e x R u n g e — K u t t a — G i l l a p p r o x i m a t i o n c o n s t a n t s f o r S i d e B [ M n ( I I I ) - ( t a r t ) 2 ] c o m p l e x R u n g e — K u t t a - G i l l a p p r o x i m a t i o n c o n s t a n t s f o r S i d e A p e r o x i d e R u n g e - K u t t a - G i l l a p p r o x i m a t i o n c o n s t a n t s f o r S i d e B p e r o x i d e R u n g e - K u t t a — G i l l a p p r o x i m a t i o n c o n s t a n t s f o r S i d e A V A R u n g e - K u t t a - G i l l a p p r o x i m a t i o n c o n s t a n t s f 8 0 r S i d e A V A ‘ R a t e c o n s t a n t f o r 1 s t s t e p i n L I P / V A k i n e t i c s R a t e c o n s t a n t f o r 2 n d s t e p i n L I P / V A k i n e t i c s R a t e c o n s t a n t f o r 3 r d s t e p i n L I P / V A k i n e t i c s R a t e c o n s t a n t f o r l s t s t e p i n M N P / M N ( I l ) k i n e t i c s ( f o r D 5 N o M n M N P ) R a t e c o n s t a n t f o r l s t s t e p i n M N P / M n ( I I ) k i n e t i c s ( f o r D 4 H i M n M N P ) R a t e c o n s t a n t f o r o x i d a t i o n o f l i g n i n b o n d s b y [ M n ( I I I ) - ( t a r t ) 2 ] c o m p l e x [ L I P ] a c t i v i t y a t t i m e t [ L I P ] a c t i v i t y a t r e f e r e n c e t i m e z e r o T e m p o r a r y v a l u e o f l o R a t i o o f m i n i m u m [ L I P ] t o i n i t i a l [ L I P ] W e t m e m b r a n e t h i c k n e s s m a ( 2 ) m a c o n c m 3 a c n c m b ( 2 ) m m a m m b m m 3 a m m 3 b m n p m n p l m n p 2 m o m o l m 0 2 m o l t m p m o 2 t m p m r a n g e m 3 a ( 2 ) m 3 b ( 2 ) p s i b 1 ’ m e m M m M m M m M m M 2 9 5 C o n c e n t r a t i o n o f M n ( I I ) i n S i d e A V a r i a b l e u s e d i n d i l u t i o n c a l c u l a t i o n s f o r M n ( I I ) i n S i d e A V a r i a b l e u s e d i n d i l u t i o n c a l c u l a t i o n s f o r [ M n ( I I I ) - ( t a r t ) 2 ] c o m p l e x i n S i d e A C o n c e n t r a t i o n o f M n ( I I ) i n S i d e B T e m p o r a r y v a l u e o f M n ( I I ) i n S i d e A , u s e d i n R u n g e - K u t t a - G i l l s o l u t i o n T e m p o r a r y v a l u e o f M n ( I I ) i n S i d e B , u s e d i n R u n g e - K u t t a - G i l l s o l u t i o n T e m p o r a r y v a l u e o f [ M n ( I I I ) - ( t a r t ) 2 ] c o m p l e x i n S i d e A , u s e d i n R u n g e - K u t t a - G i l l s o l u t i o n T e m p o r a r y v o l u e o f [ M n ( I I I ) - ( t a r t ) 2 ] c o m p l e x i n S i d e A , u s e d i n R u n g e - K u t t a — G i l l s o l u t i o n T o t a l [ M N P ] a c t i v i t y a t t i m e t D 5 N o M n [ M N P ] a c t i v i t y a t t i m e t D 4 H i M n [ M N P ] a c t i v i t y a t t i m e t T o t a l [ M N P ] a c t i v i t y a t r e f e r e n c e t i m e z e r o D 5 N o M n [ M N P ] a c t i v i t y a t r e f e r e n c e t i m e z e r o D 4 H i M n [ M N P ] a c t i v i t y a t r e f e r e n c e t i m e z e r o T e m p o r a r y v a l u e o f m o l T e m p o r a r y v a l u e o f m o 2 R a t i o o f m i n i m u m [ M N P ] t o i n i t i a l [ M N P ] C o n c e n t r a t i o n o f [ M n ( I I I ) - ( t a r t ) 2 ] c o m p l e x i n S i d e A C o n c e n t r a t i o n o f [ M n ( I I I ) - ( t a r t ) 2 ] c o m p l e x i n S i d e B I n i t i a l v a l u e o f p a ( 2 ) C o n c e n t r a t i o n o f p e r o x i d e i n S i d e A V a r i a b l e u s e d i n p u l s e c o n c e n t r a t i o n c a l c u - l a t i o n s f o r H 2 0 2 i n S i d e A T e m p o r a r y v a l u e o f p a t e m p S t a n d a r d ( r e p e t i t i v e ) H 2 0 2 p u l s e c o n c e n t r a t i o n f o r p u l s e s t o S i d e A C o n c e n t r a t i o n o f p e r o x i d e i n S i d e B M a x i m u m c o n c e n t r a t i o n o f H 2 0 2 i n S i d e B M i n i m u m c o n c e n t r a t i o n o f H 2 0 2 i n S i d e B [ L I P ] p u l s e c o n c e n t r a t i o n f o r S i d e B T e m p o r a r y v a l u e o f p l c o n c T o t a l [ M N P ] p u l s e c o n c e n t r a t i o n f o r S i d e B D 5 N o M n [ M N P ] p u l s e c o n c e n t r a t i o n f o r S i d e B D 4 H i M n [ M N P ] p u l s e c o n c e n t r a t i o n f o r S i d e B T e m p o r a r y v a l u e o f p m l c n c T e m p o r a r y v a l u e o f p m 2 c n c T e m p o r a r y v a l u e o f H 2 0 2 i n S i d e A , u s e d i n R u n g e - K u t t a - G i l l s o l u t i o n T e m p o r a r y v a l u e o f H 2 0 2 i n S i d e B , u s e d i n R u n g e - K u t t a - G i l l s o l u t i o n R a t i o o f ( k 6 + k 7 ) / ( k 6 k 7 ) f o r D 5 N o M n M N P R a t i o o f ( k 6 + k 7 ) / ( k 6 k 7 ) f o r D 4 H i M n M N P O u t p u t p u l s e c o n c e n t r a t i o n o f p e r o x i d e 3 : 3 3 p t e m p 2 p v o l r a t e p r a t e r p r a t e r v r a t e v r k a r k b r k c r k d r r a n g e s i g t a c t t d e l a y t e m p t e m p 2 t p l s v a ( 2 ) v a c o n c v b ( 2 ) v b m a x v b m i n v o l v o l a v o l b t , v t e m p v t e m p 2 v v a v v b d e l a y fl a g fl a g 2 fl a g 3 fl a g 4 u L m L ” m o l / h r ” m o l / h r u m o l / h r u m o l / h r “ 3 3 2 % b . I n t e g e r V a r i a b l e s V a r i a b l e U n i t s 2 9 6 f o r S i d e A T e m p o r a r y v a l u e o f p t e m p S t a n d a r d p u l s e v o l u m e m u l t i p l e ( 0 . 0 1 0 m L ) f o r e n z y m e p u l s e s R a t e o f p e r o x i d e t r a n s p o r t R a t e o f p e r o x i d e c o n s u m p t i o n R a t e o f V A t r a n s p o r t R a t e o f V A c o n s u m p t i o n R u n g e - K u t t a — G i l l d e r i v a t i v e a p p r o x i m a t i o n w e i g h t i n g c o n s t a n t R u n g e - K u t t a - G i l l d e r i v a t i v e a p p r o x i m a t i o n w e i g h t i n g c o n s t a n t R u n g e - K u t t a - G i l l d e r i v a t i v e a p p r o x i m a t i o n w e i g h t i n g c o n s t a n t R u n g e - K u t t a - G i l l d e r i v a t i v e a p p r o x i m a t i o n w e i g h t i n g c o n s t a n t R a t i o o f r a t e o f t r a n s p o r t o f p e r o x i d e t o r a t e o f t r a n s p o r t o f V A b e f o r e p u l s e R a t i o o f m a x i m u m H 2 0 2 t o m a x i m u m M N P A c t u a l c u m u l a t i v e t i m e C o n c e n t r a t i o n o f t a r t r a t e i n b o t h s i d e s C o u n t e r f o r p u l s e t i m e d e l a y T e m p o r a r y c a l c u l a t i o n v a r i a b l e T e m p o r a r y c a l c u l a t i o n v a r i a b l e T i m e a t w h i c h p u l s e i s a d d e d t o e i t h e r s i d e E n z y m e a c t i v i t y r e f e r e n c e t i m e C o n c e n t r a t i o n o f V A i n S i d e A V a r i a b l e u s e d i n p u l s e c o n c e n t r a t i o n c a l c u - l a t i o n s a n d d i l u t i o n c a l c u l a t i o n s f o r V A i n S i d e A C o n c e n t r a t i o n o f V A i n S i d e B M a x i m u m c o n c e n t r a t i o n o f V A i n S i d e B M i n i m u m c o n c e n t r a t i o n o f V A i n S i d e B V o l u m e o f S i d e B V o l u m e o f S i d e A T e m p o r a r y v a l u e o f v o l O u t p u t p u l s e c o n c e n t r a t i o n o f V A f o r S i d e A T e m p o r a r y v a l u e o f v t e m p T e m p o r a r y v a l u e o f V A i n S i d e A , u s e d i n R u n g e - K u t t a - G i l l s o l u t i o n T e m p o r a r y v a l u e o f V A i n S i d e B , u s e d i n R u n g e - K u t t a - G i l l s o l u t i o n D e s c r i p t i o n V a r i a b l e u s e d i n c o u n t i n g p u l s e t i m e d e l a y F l a g w h i c h i n d i c a t e s e n z y m e s p r e s e n t F l a g w h i c h d i f f e r e n t i a t e s b e t w e e n p u l s e t y p e s F l a g w h i c h d i f f e r e n t i a t e s b e t w e e n p u l s e t y p e s F l a g w h i c h d i f f e r e n t i a t e s b e t w e e n p u l s e t y p e s 2 9 7 fl a g 5 - - - F l a g w h i c h i n d i c a t e s t h a t a p u l s e h a s j u s t o c c u r r e d ( a n d d o e s n o t a l l o w a n o t h e r ) i - - - L o o p c o u n t e r j - - - L o o p c o u n t e r 1 1 - - - M a i n t i m e s t e p l o o p c o u n t e r n p r i n t - - - D a t a o u t p u t s t e p i n c r e m e n t n t o t a l - - - T o t a l n u m b e r o f t i m e s t e p s t c o u n t - - - P u l s e d e l a y t i m e s t e p c o u n t e r p c o u n t - - - T e m p o r a r y v a l u e o f t c o u n t x - - L o o p c o u n t e r f o r N e w t o n ’ s M e t h o d D . 1 . 2 F O R T R A N P r o g r a m R K G . F O R C : * * * * * * * * # * * * * * * * * * ¥ t * * * * * * * * * * * * * * * * * * * # * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * C C P R O G R A M R K G . F O R R e a c t o r M o d e l S i m u l a t i o n P r o g r a m * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * d o u b l e p r e c i s i o n a a , a a h , a h ( 2 ) , a h c o n c , a l p , a p v o l d o u b l e p r e c i s i o n a r a n g e , a r e a , a 1 , d o u b l e p r e c i s i o n b b , b p v o l , b r a n g e , b t a d o u b l e p r e c i s i o n d e l t a , d f p v , d m , d m 3 , d p , d v d o u b l e p r e c i s i o n c o n v r t d o u b l e p r e c i s i o n e e , e p s d o u b l e p r e c i s i o n f p v , f r a c l , f r a c 2 , f r l p c t , f r 2 p c t , f r 3 p c t d o u b l e p r e c i s i o n f l , f 2 , f 2 0 v f 1 , f 3 , f 4 d o u b l e p r e c i s i o n g , g m a , g t , g 1 , g 2 , g 3 d o u b l e p r e c i s i o n h . d o u b l e p r e c i s i o n i n i t l o , i n i m o l , i n i m 0 2 d o u b l e p r e c i s i o n k a h ( 4 ) , k d l l , k d 1 2 , k d m a , k d m b , k i , k m a ( 4 ) . d o u b l e p r e c i s i o n k m b ( 4 ) , k m 3 a ( 4 ) , k m 3 b ( 4 ) , k p a ( 4 ) , k p b ( 4 ) d o u b l e p r e c i s i o n k v a ( 4 ) , k v b ( 4 ) , k l , k 3 , k 4 , k 5 a , k 5 b , k 8 d o u b l e p r e c i s i o n l i p , 1 0 , l o t m p , l r a n g e , 1 t h d o u b l e p r e c i s i o n m a ( 2 ) , m a c o n c , m 3 a c n c , m b ( 2 ) , m m a , m m b , m m 3 a d o u b l e p r e c i s i o n m m 3 b , m n p , m n p l , m n 2 , m o , m o l , m o 2 , m o l t m p d o u b l e p r e c i s i o n m 0 2 t m p , m r a n g e , m 3 a ( ) , m 3 b ( 2 ) d o u b l e p r e c i s i o n p a o , p a ( 2 ) , p a c o n c , p a s t n d , p a t e m p , p b ( 2 ) d o u b l e p r e c i s i o n p b m a x , p b m i n , p l c o n c , p l t e m p , p l t m p 2 , p m c o n c d o u b l e p r e c i s i o n p m l c n c , p m 2 c n c , p m l t m p , p m 2 t m p , p m l t p 2 , p m 2 t p 2 d o u b l e p r e c i s i o n p p a , p p b , p s i a , p s i b , p t e m p , p t e m p 2 , p v o l d o u b l e p r e c i s i o n r a t e p , r a t e r p , r a t e r v , r a t e v , r k a , r k b , r k c d o u b l e p r e c i s i o n r k d , r r a n g e d o u b l e p r e c i s i o n s i g d o u b l e p r e c i s i o n t a c t , t a r t , t d e l a y , t e m p , t e m p 2 d o u b l e p r e c i s i o n t p l s , t r e f d o u b l e p r e c i s i o n v a ( 2 ) , v a c o n c , v b ( 2 ) , v b m a x , v b m i n , v o l , v o l a d o u b l e p r e c i s i o n v o l b t , v t e m p , v t e m p 2 , v v a , w b i n t e g e r d e l a y , fl a g , fl a g 2 , fl a g 3 , fl a g 4 , fl a g 5 , fl a g 6 , i , j , n i n t e g e r n p r i n t , n t o t a l , t c o u n t , p c o u n t , x c o m m o n I l i p k i n / k 1 , k 3 , k 4 , k i c o m m o n l m n p k i n / k 5 a , p s i a , k 5 b , p s i b , k 8 C C C C 2 9 8 c o m m o n l t r a n s / d p , d v , d m , d m 3 , a 1 , a 2 , g m a c o m m o n l s t a b l e / k d l l , k d 1 2 , k d m a , k d m b c o m m o n / r x t r / 1 t h , v o l , v o l a , a r e a , 1 0 , m o l , m o 2 , h c o m m o n I c o n c l l p a , p b , v a , v b , m a , m b c o m m o n / c o n c 2 / m 3 a , m 3 b , a h , l i p , m n p c o m m o n / c o n c 3 / p b m i n , p b m a x , v b m a x c o m m o n I r a t e / r a t e p , r a t e v , r a t e r p , r a t e r v c o m m o n l a p u l s e / a p v o l , p t e m p , v t e m p c o m m o n f b p u l s e / b p v o l , p t e m p 2 , v t e m p 2 c o m m o n l e p u l s e / p l c o n c , p m l c n c , p m 2 c n c fl a g = 0 fl a g 2 = 0 fl a g 3 = 0 fl a g 4 = 0 fl a g 5 = 0 fl a g 6 = 0 g 3 = 0 . d 0 c o n v r t = 1 6 . 6 7 9 d 0 r k a = ( 2 . d 0 * * 0 . 5 d 0 — 1 . d 0 ) / 2 . d 0 r k b = ( 2 . d 0 - 2 . d 0 * " ‘ 0 . 5 d 0 ) / 2 . d 0 r k c = - ( 2 . d 0 * * . 5 d 0 ) / 2 . d 0 C r k d = 1 . d 0 + ( 2 . d 0 " 0 . 5 d 0 ) / 2 . d 0 C * * * S E T M O D E L P A R A M E T E R S * * * C a r e a = 0 . 2 2 0 6 d 0 l t h = 6 . 1 3 6 d - 3 v o l = 1 . 0 d 0 v o l a = l . d 0 d p = 1 . 7 0 0 0 d - 4 d v = 4 . 4 9 3 5 d - 5 d m = 1 . 3 1 9 d - 4 d m 3 = 2 . 0 2 0 d - 5 a 1 = 6 0 0 . d 0 a 2 = 1 8 0 7 . 6 8 d 0 C g m a = 1 . d 0 / a l + l . d 0 / a 2 c * * * S E T K I N E T I C C O N S T A N T S * * * C k l = 2 . 1 4 7 d - 2 k 3 = 8 . 1 0 1 d - 3 k 4 = 1 . 2 4 6 d - 3 k i = 4 . 9 1 8 d 0 k 5 a = 6 . 5 6 6 d - 3 k 5 b = 5 . 0 8 9 d - 3 k 8 = 7 . 2 d - 3 p s i a = 2 9 8 3 . 2 d 0 p s i b = 2 3 3 6 . 8 d 0 C C * " ‘ * S E T S T A B I L I T Y C O N S T A N T S * * * C k d l l = 1 9 . 1 6 d 0 k d 1 2 = 1 . 8 6 7 d - 2 2 9 9 k d m a = 5 . l 6 8 d - 2 k d m b = 2 . 5 3 5 d - 2 t a r t = 2 0 . d 0 p a o = 0 . d 0 p t e m p = 0 . d 0 v t e m p = 0 . d 0 p t e m p 2 = 0 . d 0 v t e m p 2 = 0 . d 0 p a s t n d = 0 . d 0 p a c o n c = 0 . d 0 p m c o n c = 0 . d 0 p b c o n c = 0 . d 0 m a c o n c = 0 . d 0 m 3 a c n c = 0 . d 0 a h c o n c = 0 . d 0 a r a n g e = 0 . d 0 b r a n g e = 0 . d 0 C p a t e m p = 0 . d 0 C " * I N P U T S T E P S I Z E , R A T E C O R R E C T I O N F R A C T I O N S , E T C . * * " ‘ C w r i t e ( * , " ‘ ) ’ I N P U T D A T A : ’ w r i t e ( * , * ) ’ S t e p S i z e h , # o f S t e p s , P r . 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( fl a g 3 . e q . 9 9 9 ) . o r . + ( f l a g 3 . e q . 1 0 0 0 ) ) t h e n C * * * I N C R E M E N T P U L S E D E L A Y C O U N T E R * * * t c o u n t = t c o u n t + 1 e n d i f t d e l a y = h * d b l e ( t c o u n t ) d e l a y = i d n i n t ( t d e l a y * 1 0 0 . d 0 ) p a ( 2 ) = p a ( 1 ) + ( k p a ( 1 ) + k p a ( 4 ) ) / 6 . d 0 + ( r k b * k p a ( 2 ) + r k d * k p a ( 3 ) ) / 3 . d 0 p b ( 2 ) = p b ( 1 ) + ( k p b ( 1 ) + k p b ( 4 ) ) / 6 . d 0 + ( r k b * k p b ( 2 ) + r k d * k p b ( 3 ) ) / 3 . d 0 v a ( 2 ) = v a ( l ) + ( k v a ( l ) + k v a ( 4 ) ) l 6 . d 0 + ( r k b * k v a ( 2 ) + r k d * k v a ( 3 ) ) l 3 . d 0 v b ( 2 ) = v b ( 1 ) + ( k v b ( 1 ) + k v b ( 4 ) ) l 6 . d 0 + ( r k b * k v b ( 2 ) + r k d * k v b ( 3 ) ) / 3 . d 0 m a ( 2 ) = m a ( 1 ) + ( k m a ( 1 ) + k m a ( 4 ) ) / 6 . d 0 + ( r k b * k m a ( 2 ) + r k d * k m a ( 3 ) ) / 3 . d 0 m b ( 2 ) = m b ( l ) + ( k m b ( 1 ) + k m b ( 4 ) ) / 6 . d 0 + ( r k b * k m b ( 2 ) + r k d * k m b ( 3 ) ) / 3 . d 0 m 3 a ( 2 ) = m 3 a ( l ) + ( k m 3 a ( l ) + k m 3 a ( 4 ) ) / 6 . d 0 + ( r k b * k m 3 a ( 2 ) + r k d * k m 3 a ( 3 ) ) / 3 . d 0 m 3 b ( 2 ) = m 3 b ( 1 ) + ( k m 3 b ( 1 ) + k m 3 b ( 4 ) ) / 6 . d 0 + ( r k b * k m 3 b ( 2 ) + r k d * k m 3 b ( 3 ) ) / 3 . d 0 a h ( 2 ) = a h ( 1 ) + ( k a h ( l ) + k a h ( 4 ) ) / 6 . d 0 + ( r k b * k a h ( 2 ) + r k d * k a h ( 3 ) ) / 3 . d 0 i f ( m a ( 2 ) . l t . 0 . d 0 ) t h e n m a ( 2 ) = 0 . d 0 e l s e i f ( m b ( 2 ) . l t . 0 . d 0 ) t h e n m b ( 2 ) = 0 . d 0 e l s e i f ( m 3 a ( 2 ) . l t . 0 . d 0 ) t h e n m 3 a ( 2 ) = 0 . d 0 e l s e i f ( m 3 b ( 2 ) . l t . 0 . d 0 ) t h e n m 3 b ( 2 ) = 0 . d 0 e l s e i f ( a h ( 2 ) . l t . 0 . d 0 ) t h e n a h ( 2 ) = 0 . d 0 e n d i f C C * * * C A L C U L A T E N E W M A X I M A A N D M I N I M A ; C H E C K R A T E C R I T E R I A * * * C 3 0 6 1 i p = ( k d l l / k d 1 2 + l o ) * d e x p ( - k d l 2 * t r e f / 6 0 . d 0 ) - k d l 1 / k d 1 2 i f ( l i p . l t . 0 . d 0 ) t h e n l i p = 0 . d 0 e n d i f m n p l = m o l * d e x p ( — k d m a * t r e f / 6 0 . d 0 ) m n p 2 = m 0 2 * d e x p ( - k d m b * t r e f / 6 0 . d 0 ) m n p = m n p 1 + m n p 2 i f ( fl a g . e q . 9 9 9 ) t h e n p b m a x = 0 . 1 d 0 / m n p 2 * m n p 2 p b m i n = 5 . 0 d - 3 / m n p 2 * m n p 2 e l s e p b m a x = 0 . 1 d 0 / 1 i p * l i p p b m i n = 5 . 0 d - 3 / l i p * l i p e n d i f i f ( fl a g . n e . 9 9 9 ) t h e n v b m a x = 0 . 6 0 / l i p * l i p v b m i n = 5 . 0 d - 3 / l i p * l i p e l s e v b m a x = 0 . d 0 v b m i n = 0 . d 0 e n d i f c a l l r a t e S ( t r e f . p a ( 2 ) . p b ( 2 ) . v a ( 2 ) . V b ( 2 ) . m b ( 2 ) . r a t e p , r a t e v , r a t e r p , r a t e r v ) i f ( j . e q . n p r i n t ) t h e n c a l l o u t 1 ( t a c t ) i = 0 e n d i f C * * * D E T E R M I N E P U L S E S N E E D E D A N D T H E I R C O N C E N T R A T I O N S * * * C i f ( fl a g . e q . 1 0 0 1 ) t h e n p a c o n c = 0 . d 0 v a c o n c = 0 . d 0 e n d i f m a c o n c = 0 . d 0 m 3 a c n c = 0 . d 0 a h c o n c = 0 . d 0 p 1 c o n c = 0 . d 0 p m c o n c = 0 . d 0 p m l c n c = 0 . d 0 m 2 c n c = 0 . d 0 1 f ( fl a g . e q . 1 0 0 1 ) t h e n * * * L I P I S P R E S E N T , S O P U L S E B Y L I P M E T H O D * * * i f ( ( fl a g 2 . e q . 0 ) . a n d . ( fl a g 3 . e q . 0 ) ) t h e n i f ( fl a g 5 . g t . 0 ) t h e n i f ( fl a g 5 . g t . 5 0 ) t h e n fl a g 5 = 0 e n d i f i f « v b ( 2 ) . g e . b r a n g e * v b m a x ) . a n d . ( fl a g 5 . e q . 0 ) . a n d . ( t a c t . g t . 2 0 . d 0 ) ) t h e n 3 0 7 C * * * H 2 0 2 I N S I D E A N E E D S P U L S E D * * * fl a g 5 = fl a g 5 + 1 t p l s = t a c t a p v o l = 0 . d 0 b p v o l = 0 . d 0 i f ( l i p . g t . l r a n g e * i n i t l o ) t h e n C * * * L I P D O E S N O T N E E D P U L S E D * * * C * * * P U L S E A W I T H P E R O X I D E * * * p a c o n c = p a t e m p p t e m p = p a c o n c v t e m p = 0 . d 0 C C * * * S O L V E F O R P U L S E V O L U M E U S I N G N E W T O N ’ S M E T H O D * * * C g = p v o l d o 1 x = 1 , 1 0 0 0 0 0 f p v = d v * d e l t a / d p * d e x p ( - g m a * v a ( 2 ) * ( ( v o l - g ) + l v o l ) ) f p v = f p v / g m a + ( p a c o n c - p a ( 2 ) ) * g / v o l + p a ( 2 ) - p b ( 2 ) f p v = f p v - d v * d e l t a / d p / g m a * d e x p ( - g m a * v b ( 2 ) ) d f p v = d v ‘ d e l t a / d p * d e x p ( - g m a * v a ( 2 ) * ( ( v o l - g ) + / v o l ) ) d f p v = d f p v * v a ( 2 ) / v o l + ( p a c o n c - p a ( 2 ) ) l v o l g = g - f p v / d f p v i f ( d a b s ( g - g t ) . l t . 1 . d - 5 ) t h e n g o t o 2 e n d i f 1 c o n t i n u e 2 a p v o l = g a p v o l = d n i n t ( a p v o l * 1 . d 5 ) / 1 . d 5 v o l a = v o l a - a p v o l c a l l m t e S ( t r e f . P a ( 2 ) . P b ( 2 ) . v a ( 2 ) . v b ( 2 ) . + m b ( 2 ) , r a t e p , r a t e v , r a t e r p , r a t e r v ) m n p = m n p l + m n p 2 c a l l o u t 1 ( t a c t ) C * * * S E T P U L S E D E L A Y F L A G * * * fl a g 2 = 9 9 9 t c o u n t = 0 e l s e i f ( l i p . l e . h a n g e ‘ i n i t l o ) t h e n C * * * P U L S E A W I T H P E R O X I D E A N D V A * * * v o l a = v o l a - 2 . d 0 * p v o l c a l l r a t e s u r e fi p a a ) . p b ( 2 ) . v a ( 2 ) . v b ( 2 ) . + m b ( 2 ) , r a t e p , r a t e v , r a t e r p , r a t e r v ) m n p = m n p 1 + m n p 2 c a l l o u t 1 ( t a c t ) C * * * S E T P U L S E D E L A Y F L A G * * * fl a g 3 = 9 9 9 t c o u n t = 0 e n d i f e n d i f e l s e i f ( ( fl a g 2 . e q . 9 9 9 ) . a n d . ( d e l a y . e q . 3 0 ) ) t h e n C * * * A D D D E L A Y E D H 2 0 2 P U L S E ( N O L I P P U L S E L A T E R ) * * * 3 0 8 v o l a = v o l a + a p v o l p a ( 2 ) = ( p a ( 2 ) * ( v o l a - a p v o l ) + p t e m p * a p v o 1 ) / v o l a v a ( 2 ) = v a ( 2 ) * ( v o l a - a p v o l ) / v o l a m a ( 2 ) = m a ( 2 ) * ( v o l a - a p v o l ) / v o l a m 3 a ( 2 ) = m 3 a ( 2 ) * ( v o l a - a p v o l ) / v o l a a p v o l = a p v o l * 1 0 0 0 . d 0 c a l l r a t e s a m f m a a ) m b ( 2 ) , V a ( 2 ) . v b ( 2 ) . m b ( 2 ) . r a t e p , r a t e v , r a t e r p , r a t e r v ) m n p = m n p l + m n p 2 c a l l o u t l ( t a c t ) c a l l o u t 2 ( t p l s ) fl a g 2 = 0 t c o u n t = 0 e l s e i f ( ( fl a g 3 . e q . 9 9 9 ) . a n d . ( d e l a y . e q . 3 0 ) ) t h e n * * * A D D D E L A Y E D H 2 0 2 / V A P U L S E ( L I P P U L S E L A T E R ) * * * v o l a = v o l a + 4 . d 0 * p v o l p a c o n c = p a ( 2 ) * ( v o l a - 4 . d 0 * p v o l ) m a c o n c = m a ( 2 ) * ( v o l a - 4 . d 0 * p v o l ) m 3 a c n c = m 3 a ( 2 ) * ( v o l a - 4 . d 0 * p v o l ) v a c o n c = v a ( 2 ) * ( v o l a - 4 . d 0 " p v o l ) p l c o n c = p l t e m p p m l c n c = p m 1 t m p p m 2 c n c = p m 2 t m p v o l b t = v o l + 2 . d 0 * p v o l l o t m p = ( l i p * v o l + p l t e m p * 2 . d 0 * p v o l ) / v o l b t m o l t m p = ( m n p 1 * v o l + p m 1 t m p * 2 . d 0 * p v o l ) / v o l b t m o 2 t m p = ( m n p 2 * v o l + p m 2 t m p * 2 . d 0 * p v o l ) / v o l b t a a = 0 . l d 0 / l o t m p b b = 0 . 6 d 0 / l o t m p i f ( fl a g . n e . 1 0 0 1 ) t h e n e e = 0 . 1 d 0 / ( m o l t m p + m o 2 t m p ) e l s e e e = 1 . d 0 e n d i f p a ( 2 ) = d p * a r e a * ( k l * a a * l o t m p * ( k 3 * b b + k 4 * a a / k i ) + k 4 * ( k 1 * a + k 3 * b b ) ) p a ( 2 ) = ( k l * k 3 * k 4 * a a * b b * l t h * v o l b t * l o t m p * * 2 ) / p a ( 2 ) t e m p 2 = k 5 a * a a * e e * l t h * v o l b t * l o t m p * m o l t m p * ( m o l t m p + m 0 2 t m p ) t e m p 2 = t e m p 2 / ( d p * a r e a * ( e e * ( m o 1 t m p + m o 2 t m p ) + k 5 a * a a * p s i a * l o t m p ) ) p a ( 2 ) = p a ( 2 ) + t e m p 2 t e m p 2 = k 5 b * a a ‘ e e ' fl t h * v o l b t * l o t m p * m o 2 t m * ( m o l t m p + m o 2 t m p ) t e m p 2 = t e m p 2 / ( d p * a r e a * ( e e * ( m o 1 t m p + m o t m p ) + k 5 b * a a " " p s i b * l o t m p ) ) p a ( 2 ) = g 2 * ( p a ( 2 ) + t e m p 2 ) + a a * l o t m p v a ( 2 ) = k 1 * a a * l o t m p * ( k 3 * b b + k 4 * a a / k i ) v a ( 2 ) = d v * a r e a * ( v a ( 2 ) + k 4 * ( k 1 * a a + k 3 * b b ) ) v a ( 2 ) = g 1 * k 1 * k 3 * k 4 * a a * b b * g m a * l t h * v o l b t * l o t m p * * 2 / v a ( 2 ) v a ( 2 ) = - 1 . d 0 / g m a * d l o g ( d e x p ( - b b * g m a * l o t m p ) - v a ( 2 ) ) m a ( 2 ) = ( m a c o n c / v o l a ) m 3 a ( 2 ) = ( m 3 a c n c / v o l a ) p a c o n c = ( p a ( 2 ) * v o l a - p a c o n c ) / ( 4 . d 0 * p v o l ) v a c o n c = ( v a ( 2 ) * v o l a - v a c o n c ) / ( 4 . d 0 * p v o l ) 3 0 9 p t e m p = p a c o n c p t e m p = d n i n t ( p t e m p * 1 . d 3 ) / 1 . d 3 v t e m p = v a c o n c v t e m p = d n i n t ( v t e m p * 1 . d 3 ) / 1 . d 3 a p v o l = 4 . d 0 * p v o l a p v o l = a p v o l * 1 0 0 0 . d 0 a p v o l = d n i n t ( a p v o l * 1 0 0 . d 0 ) / 1 0 0 . d 0 c a l l r a t 6 8 ( t r e f . p a ( 2 ) . p b ( 2 ) . v a ( 2 ) . v b ( 2 ) . m b ( 2 ) , + r a t e p , r a t e v , r a t e r p , r a t e r v ) m n p = m n p 1 + m n p 2 c a l l o u t l ( t a c t ) e l s e i f ( ( fl a g 3 . e q . 9 9 9 ) . a n d . ( d e l a y . e q . 7 0 ) ) t h e n C * * * A D D D E L A Y E D L I P P U L S E * * * t r e f = 0 . d 0 p l c o n c = p l t e m p p m l c n c = p m 1 t m p p m 2 c n c = p m 2 t m p 1 0 = ( l i p * v o l + p l t e m p * 2 . d 0 * p v o l ) / ( v o l + 2 . d 0 * p v o l ) m o l = ( m n p 1 * v o l + p m l t m p * 2 . d 0 * p v o l ) / ( v o l + 2 . d 0 * p v o l ) m o 2 = ( m n p 2 * v o l + p m 2 t m p * 2 . d 0 * p v o l ) / ( v o l + 2 . d 0 * p v o l ) v o l = v o l + 2 . d 0 * p v o l l i p = l o m n p l = m o l m n p 2 = m 0 2 a l p = 0 . 1 d 0 / l o b t a = 0 . 6 d 0 / l o i f ( fl a g . n e . 1 0 0 1 ) t h e n e p s = 0 . l d 0 / ( m o l + m 0 2 ) e l s e e p s = l . d 0 e n d i f p b m a x = a l p * l i p v b m a x = b t a * l i p p b m i n = 5 . 0 d - 3 / 1 i p * l i p v b m i n = 5 . 0 d - 3 / l i p * l i p p b ( 2 ) = p b ( 2 ) * ( v o l - 2 . d 0 * p v o l ) / v o l v b ( 2 ) = v b ( 2 ) * ( v o l — 2 . d 0 * p v o l ) / v o l m b ( 2 ) = m b ( 2 ) * ( v o l - 2 . d 0 * p v o l ) / v o l m 3 b ( 2 ) = m 3 b ( 2 ) * ( v o l - 2 . d 0 * p v o l ) / v o l a h ( 2 ) = a h ( 2 ) * ( v o l - 2 . d 0 * p v o l ) / v o l b p v o l = 2 . d 0 * p v o l b p v o l = b p v o l * 1 0 0 0 . d 0 b p v o l = d n i n t ( b p v o l * 1 0 0 . d 0 ) / 1 0 0 . d 0 c a n r a t e s < t r e f . p a ( 2 ) , p b t z ) . v a ( 2 ) , v b ( 2 ) , m b ( 2 ) , + r a t e p , r a t e v , r a t e r p , r a t e r v ) m n p = m n p l + m n p 2 c a l l o u t l ( t a c t ) c a l l o u t 2 ( t p l s ) fl a g 3 = 0 t c o u n t = 0 e n d i f e l s e i f ( fl a g . e q . 0 ) t h e n C * * * L I P A N D M N P A R E P R E S E N T , S O P U L S E B Y L I P - t - M N P M E T H O D * * * 0 0 0 C 3 1 0 m n p = m n p l + m n p 2 i n i t m o = i n i m o l + i n i m 0 2 i f ( ( fl a g 2 . e q . 0 ) . a n d . ( fl a g 3 . e q . 0 ) a n . d . ( fl a g 4 . . e q 0 ) ) t h e n t e m p 2 = r a t e r p - r a t e r v i f ( fl a g 5 . . . g t 0 ) t h e n fl a g 5 = a g 5 + 1 e n d i f i f ( fl a g 5 . g t . 5 0 0 ) t h e n fl a g 5 = 0 e n d i f i f ( ( v b ( 2 ) . g e . b r a n g e * v b m a x ) . a n d . 5 . e q . 0 ) . a n d . ( t a c t . g t . 2 0 . d 0 ) ) t h e n * * * H 2 0 2 I N S I D E A N E E D S P U L S E D * * * fl a g 5 = fl a g 5 + 1 * * * H 2 0 2 I N S I D E A N E E D S P U L S E D * * * t p l s = t a c t a p v o l = 0 . d 0 b p v o l = 0 . d 0 m n p = m n p 1 + m n p 2 m o = m o 1 + m o 2 i f ( ( 1 1 p . l t . 0 . 9 7 d 0 * i n i t l o ) . a n d . ( m n p . l t . m r a n g e * i n i t m o ) ) t h e n fl a g 6 = 9 9 9 e n d i f i f ( ( l i p g t . l r a n g e * i n i t l o ) . . a n d ( m n p . . g t m r a n g e * i n i t m o ) ) t h e n * * * L I P D O E S N O T N E E D P U L S E D * * * * * * M N P D O E S N O T N E E D P U L S E D * * * * * * P U L S E A W I T H P E R O X I D E * * * p a c o n c = p a t e m p p t e m p = p a c o n c v t e m p = 0 . d 0 C * * * S O L V E F O R P U L S E V O L U M E U S I N G N E W T O N ’ S M E T H O D * * * C g = p v o l d o 3 x = 1 , 1 0 0 0 0 0 f p v = d / v * 1 e l t a / d p * d e x p ( - g m a * v a ( 2 ) * ( ( v o l - g ) v 0 ) ) f p v = f p v / g m a + ( p a c o n c - p a ( 2 ) ) * g / v o l + p a ( 2 ) f p v = f p v - 1 t h * v o l a / d p / a r e a * t e m p 2 / v o l / 6 0 . d 0 f p v = f p v - d v * d e l t a / d p / g m a * d e x p ( - g m a * v b ( 2 ) ) f p v = f p v - p b ( 2 ) d f p v = l d v ‘ l ‘ d e l t a / d p * d e x p ( - g m a * v a ( 2 ) * ( ( v o l - g ) v 0 ) ) d f p v = d f p v * v a ( 2 ) / v o l + ( p a c o n c - p a ( 2 ) ) l v o l g t = g g = g - f p v / d f p v i f ( d a b s ( g - g t ) . l t . l . d - 5 ) t h e n g o t o 4 e n d i f c o n t i n u e 0 0 0 0 0 0 + + 3 1 1 a p v o l = g a p v o l = d n i n t ( a p v o l * 1 . d 5 ) / 1 . d 5 v o l a = v o l a - a p v o l c a l l r a t C S ( t r e f . p a ( 2 ) , P b ( 2 ) . v a ( 2 ) m b ( 2 ) . m b ( 2 ) , r a t e p , r a t e v , r a t e r p , r a t e r v ) m n p = m n p l + m n p 2 c a l l o u t l ( t a c t ) * * * S E T P U L S E D E L A Y F L A G * * * fl a g 2 = 9 9 9 t c o u n t = 0 e l s e i f ( ( l i p . l e . l r a n g e * i n i t l o ) . a n d . ( m n p . g t . m r a n g e * i n i t m o ) ) t h e n * * * P U L S E A W I T H P E R O X I D E A N D V A * * * * * * L I P N E E D S P U L S E D A L S O * * * v o l a = v o l a - 2 . d 0 * p v o l m n p = m n p 1 + m n p 2 c a l l r a t e S ( t r e f . P a ( 2 ) . p b ( 2 ) , V 8 1 ( 2 ) . V b ( 2 ) , m b ( 2 ) , r a t e p , r a t e v , r a t e r p , r a t e r v ) c a l l o u t l ( t a c t ) * * * S E T P U L S E D E L A Y F L A G * * * fl a g 3 = 9 9 9 fl a g 4 = 9 9 9 t c o u n t = 0 e l s e i f ( ( ( l i p . g t . l r a n g e * i n i t l o ) . a n d . ( fl a g 6 . e q . 0 ) ) . a n d . ( m n p . l e . m r a n g e * i n i t m o ) ) t h e n * * * P U L S E A W I T H P E R O X I D E O N L Y * * * * * * M N P N E E D S P U L S E D A L S O * * * * * * A D D D E L A Y E D H 2 0 2 P U L S E * * * * * * M N P P U L S E L A T E R * * * p a c o n c = p a ( 2 ) * v o l a p l c o n c = 0 . d 0 p m l c n c = 0 . d 0 p m 2 c n c = p m 2 1 m p v o l a = v o l a + 2 . d 0 * p v o l a p v o l = 2 . d 0 * p v o l t e m p 2 = r a t e r p - r a t e r v v a ( 2 ) = v a ( 2 ) * ( v o l a — a p v o l ) / v o l a m a ( 2 ) = m a ( 2 ) * ( v o l a - a p v o l ) / v o l a m 3 a ( 2 ) = m 3 a ( 2 ) * ( v o l a - a p v o l ) / v o l a p a ( 2 ) = d v * d e l t a / d p / g m a * ( d e x p ( - g m a * v b ( 2 ) ) - d e x p ( - g m a * v a ( 2 ) ) ) + 1 t h * v o l a / d p / a r e a * t e m p 2 / v o l / 6 0 . d 0 v a ( 2 ) = P a ( 2 ) + P b ( 2 ) a p v o l = a p v o l * 1 0 0 0 . d 0 p a c o n c = ( p a ( 2 ) * v o l a - p a c o n c ) / ( 2 . d 0 * p v o l ) p t e m p = p a c o n c v t e m p = 0 . d 0 m n p = m n p l + m n p 2 c a l l r a t e 8 ( t r e f . p a ( 2 ) , p b ( 2 ) . ~ a ( 2 ) . v b ( 2 ) . m b ( 2 ) , r a t e p , r a t e v , r a t e r p , r a t e r v ) c a l l o u t l ( t a c t ) * * * S E T P U L S E D E L A Y F L A G * * * fl a g 3 = 9 9 9 + + + + 0 0 3 1 2 fl a g 4 = 1 0 0 1 t c o u n t = 0 e l s e i f ( ( ( l i p . l e . l r a n g e * i n i t l o ) . a n d . ( m n p . l e . m r a n g e * i n i t m o ) ) . o r . « fl i p . g t . l r a n g e * i n i t l o ) . a n d . ( fl a g 6 . e q . 9 9 9 ) ) . a n d . ( m n p . l e . m r a n g e * i n i t m o ) ) ) t h e n * * * P U L S E A W I T H P E R O X I D E A N D V A * * * * * * L I P N E E D S P U L S E D A L S O * * * * * * M N P N E E D S P U L S E D A L S O * * * * * * A D D D E L A Y E D H 2 0 2 / V A P U L S E * * * * * * L I P P U L S E L A T E R * * * v o l a = v o l a - l . d 0 * p v o l m n p = m n p 1 + m n p 2 c a l l r a t e S ( t r e f . p a ( 2 ) , p b ( 2 ) . v a ( 2 ) , v b ( 2 ) . + m b ( 2 ) , r a t e p , r a t e v , r a t e r p , r a t e r v ) c a l l o u t l ( t a c t ) C * * * S E T P U L S E D E L A Y F L A G * * * fl a g 3 = 1 0 0 0 i f ( fl a g 6 . e q . 9 9 9 ) t h e n fl a g 6 = 0 e n d i f t c o u n t = 0 e n d i f e n d i f e l s e i f ( ( fl a g 2 . e q . 9 9 9 ) . a n d . ( d e l a y . e q . 3 0 ) ) t h e n * * * A D D D E L A Y E D H 2 0 2 P U L S E * * * * * * N O L I P O R M N P P U L S E S L A T E R * * * v o l a = v o l a + a p v o l p a ( 2 ) = ( p a ( 2 ) * ( v o l a — a p v o l ) + p t e m p * a p v o l ) / v o l a v a ( 2 ) = v a ( 2 ) * ( v o l a — a p v o l ) / v o l a m a ( 2 ) = m a ( 2 ) * ( v o l a - a p v o l ) / v o l a m 3 a ( 2 ) = m 3 a ( 2 ) * ( v o l a - a p v o l ) / v o l a a p v o l = a p v o l * 1 0 0 0 . d 0 c a l l r a t e 8 ( t r e f . p a ( 2 ) m b ( 2 ) . v a ( 2 ) . v b ( 2 ) , m b ( 2 ) . + r a t e p , r a t e v , r a t e r p , r a t e r v ) m n p = m n p 1 + m n p 2 c a l l o u t l ( t a c t ) c a l l o u t Z ( t p l s ) fl a g 2 = 0 t c o u n t = 0 e l s e i f ( ( fl a g 3 . e q . 9 9 9 ) . a n d . ( d e l a y . e q . 3 0 ) . a n d . + ( fl a g 4 . e q . 9 9 9 ) ) t h e n C * * * A D D D E L A Y E D H 2 0 2 / V A P U L S E * * * C * * * L I P P U L S E L A T E R * * * v o l a = v o l a + 4 . d 0 * p v o l p a c o n c = p a ( 2 ) * ( v o l a - 4 . d 0 * p v o l ) m a c o n c = m a ( 2 ) * ( v o l a - 4 . d 0 * p v o l ) m 3 a c n c = m 3 a ( 2 ) * ( v o l a - 4 . d 0 * p v o l ) v a c o n c = v a ( 2 ) * ( v o l a - 4 . d 0 * p v o l ) p l c o n c = p l t e m p p m l c n c = p m l t m p 0 0 0 0 6 1 0 0 0 0 3 1 3 p m 2 c n c = 0 . d 0 v o l b t = v o 1 + 2 . d 0 * p v o l l o t m p = ( l i p * v o l + p l t e m p * 2 . d 0 * p v o l ) / v o l b t m o l t m p = ( m n p 1 * v o l + p m l t m p * 2 . d 0 * p v o l ) / v o l b t m o 2 t m p = m n p 2 * v o l / v o l b t a a = 0 . 1 d 0 / l o t m p b b = 0 . 6 d 0 / l o t m p e e = m b ( 2 ) * v o l / v o l b t p a ( 2 ) = d p * a r e a * ( k 1 * a a * l o t m p * ( k B * b b + k 4 * a a / k i ) + k 4 * ( k l * a a + k 3 * b b ) ) p a ( 2 ) = ( k 1 * k 3 * k 4 * a a * b b * 1 t h * v o l b t * l o t m p * * 2 ) / p a ( 2 ) t e m p 2 = 0 . d 0 p a ( 2 ) = g 2 * ( p a ( 2 ) + t e m p 2 ) + a a * l o t m p v a ( 2 ) = k l * a a * l o t m p * ( k 3 * b b + k 4 * a a / k i ) v a ( 2 ) = d v * a r e a * ( v a ( 2 ) + k 4 * ( k 1 * a a + k 3 * b b ) ) v a ( 2 ) = g 1 * k l * 1 6 * k 4 * a a * b b * g m a * l t h * v o l b t * l o t m p * * 2 / v a ( 2 ) v a ( 2 ) = - 1 . d 0 / g m a * d l o g ( d e x p ( - b b * g m a * l o t m p ) - v a ( 2 ) ) m a ( 2 ) = ( m a c o n c / v o l a ) m 3 a ( 2 ) = ( m 3 a c n c / v o l a ) p a c o n c = ( p a ( 2 ) * v o l a - p a c o n c ) / ( 4 . d 0 * p v o l ) t e m p 2 = ( v a ( 2 ) * v o l a - v a c o n c ) / ( 4 . d 0 * p v o l ) i f ( t e m p 2 . l t . 0 . d 0 ) t h e n v a ( 2 ) = v a c o n c / ( v o l a - 4 . d 0 * p v o l ) v t e m p = 0 . d 0 e l s e v t e m p = t e m p 2 e n d i f p t e m p = p a c o n c p t e m p = - d n i n t ( p t e m p * 1 . d 3 ) / 1 . d 3 v t e m p = - d n i n t ( v t e m p * 1 . d 3 ) / 1 . d 3 a p v o l = 4 . d 0 * p v o l * 1 0 0 0 . d 0 a p v o l = d n i n t ( a p v o l * 1 0 0 . d 0 ) / 1 0 0 . d 0 m n p = m n p l + m n p 2 c a l l t h S ( t r e f . P a ( 2 ) . P b ( 2 ) . V a ( 2 ) . v b ( 2 ) . m b ( 2 ) . r a t e p , r a t e v , r a t e r p , r a t e r v ) c a l l o u t l ( t a c t ) e l s e i f ( ( fl a g 3 . e q . 1 0 0 0 ) . a n d . ( d e l a y . e q . 3 0 ) ) t h e n * * * A D D D E L A Y E D H 2 0 2 / V A P U L S E * * * * * * L I P P U L S E L A T E R * * * * * * M N P P U L S E L A T E R Y E T * * * v o l a = v o l a + 4 . d 0 * p v o l p a c o n c = p a ( 2 ) * ( v o l a - 4 . d 0 * p v o l ) m a c o n c = m a ( 2 ) * ( v o l a - 4 . d 0 * p v o l ) m 3 a c n c = m 3 a ( 2 ) * ( v o l a - 4 . d 0 * p v o l ) v a c o n c = v a ( 2 ) * ( v o l a - 4 . d 0 * p v o l ) p l c o n c = p l t m p 2 p m l c n c = p m l t p 2 p m 2 c n c = p m 2 1 p 2 v o l b t = v o l + 3 . d 0 * p v o l l o t m p = ( l i p * v o l + p l t m p 2 * 3 . d 0 * p v o l ) / v o l b t m o l t m p = ( m n p 1 * v o l + p m 1 t p 2 * 3 . d 0 * p v o l ) / v o l b t m o 2 t m p = ( m n p 2 * v o l + p m 2 t p 2 * 3 . d 0 * p v o l ) / v o l b t a a = 0 . l d 0 / l o t m p C + + 3 1 4 b b = 0 . 6 d 0 / l o t m p e e = m b ( 2 ) * v o l / v o l b t p a ( 2 ) = d p * a r e a * ( k 1 * a a * l o t m p * ( k 3 * b b + k 4 * a a / k i ) + k 4 * ( k l * a a + k 3 * b b ) ) p a ( 2 ) = ( k l * k 3 * k 4 * a a * b b * l t h * v o l b t * l o t m p * * 2 ) / p a ( 2 ) t e m p 2 = 0 . d 0 p a ( 2 ) = g 3 * ( p a ( 2 ) + t e m p 2 ) + a a * l o t m p v a ( 2 ) = k 1 * a a * l o t m p * ( k 3 * b b + k 4 * a a / k i ) v a ( 2 ) = d v * a r e a * ( v a ( 2 ) + k 4 * ( k 1 * a + k 3 * b b ) ) v a ( 2 ) = g 1 * k 1 * k 3 * k 4 * a a * b b * g m a * l t h * v o l b t * l o t m p * * 2 / v a ( 2 ) v a ( 2 ) = - 1 . d 0 / g m a * d l o g ( d e x p ( — b b * g m a * l o t m p ) - v a ( 2 ) ) m a ( 2 ) = ( m a c o n c / v o l a ) m 3 a ( 2 ) = ( m 3 a c n c / v o l a ) p a c o n c = ( p a ( 2 ) * v o l a - p a c o n c ) / ( 4 . d 0 * p v o l ) t e m p 2 = ( v a ( 2 ) * v o l a - v a c o n c ) / ( 4 . d 0 * p v o l ) i f ( t e m p 2 . l t . 0 . d 0 ) t h e n v a ( 2 ) = v a c o n c / ( v o l a - 4 . d 0 * p v o l ) v t e m p = 0 . d 0 e l s e v t e m p = t e m p 2 e n d i f p t e m p = p a c o n c p t e m p = d n i n t ( p t e m p * l . d 3 ) / 1 . d 3 v t e m p = d n i n t ( v t e m p * l . d 3 ) / 1 . d 3 a p v o l = 4 . d 0 * p v o l * 1 0 0 0 . d 0 a p v o l = d n i n t ( a p v o l * 1 0 0 . d 0 ) / 1 0 0 . d 0 m n p = m n p l + m n p 2 c a l l r a t e S ( t r e f , P a ( 2 ) , p b ( 2 ) , V a ( 2 ) . v b ( 2 ) , m b ( 2 ) , r a t e p , r a t e v , r a t e r p , r a t e r v ) c a l l o u t l ( t a c t ) e l s e i f ( ( fl a g 3 . e q . 9 9 9 ) . a n d . ( d e l a y . e q . 4 0 ) . a n d . ( fl a g 4 . e q . 1 0 0 1 ) ) t h e n * * * A D D D E L A Y E D M N P P U L S E * * * p l c o n c = 0 . d 0 p m l c n c = 0 . d 0 p m 2 c n c = p m 2 t m p l o = l i p * v o l / ( v o l + 2 . d 0 * p v o l ) m o l = m n p l * v o l / ( v o l + 2 . d 0 * p v o l ) m o 2 = ( m n p 2 * v o l + p m 2 t m p * 2 . d 0 * p v o l ) / ( v o l + 2 . d 0 * p v o l ) l i p = l o m n p l = m o l m n p 2 = m o 2 t r e f = 0 . d 0 v o l = v o l + 2 . d 0 * p v o l a l p = 0 . l d 0 / l i p b t a = 0 . 6 d 0 / l i p i f ( fl a g . n e . 1 0 0 1 ) t h e n e p s = 0 . 5 d 0 / ( m n p l + m n p 2 ) e l s e e p s = l . d 0 e n d i f p b m a x = a l p * l i p C 3 1 5 v b m a x = b t a * l i p p b m i n = 5 . 0 d - 3 / l i p * l i p v b m i n = 5 . 0 d - 3 / l i p * l i p p b ( 2 ) = p b ( 2 ) * ( v o l - 2 . d 0 * p v o l ) / v o l v b ( 2 ) = v b ( 2 ) * ( v o l - 2 . d 0 * p v o l ) / v o l m b ( 2 ) = m b ( 2 ) * ( v o l - 2 . d 0 * p v o l ) / v o l m 3 b ( 2 ) = m 3 b ( 2 ) * ( v o l - 2 . d 0 * p v o l ) / v o l a h ( 2 ) = a h ( 2 ) * ( v o l - 2 . d 0 * p v o l ) / v o l b p v o l = 2 . d 0 * p v o l * 1 0 0 0 . d 0 b p v o l = d n i n t ( b p v o l * 1 0 0 . d 0 ) / 1 0 0 . d 0 m n p = m n p l + m n p 2 c a l l r a t e s ( t r e f , p a ( 2 ) . p b ( 2 ) . v a ( 2 ) . v b ( 2 ) , m b ( 2 ) , r a t e p , r a t e v , r a t e r p , r a t e r v ) c a l l o u t l ( t a c t ) c a l l o u t 2 ( t p l s ) fl a g 3 = 0 fl a g 4 = 0 t c o u n t = 0 e l s e i f ( ( fl a g 3 . e q . 9 9 9 ) . a n d . ( d e l a y . e q . 7 0 ) . a n d . ( fl a g 4 . e q . 9 9 9 ) ) t h e n * * * A D D D E L A Y E D L I P P U L S E * * * p l c o n c = p l t e m p p m l c n c = p m l t m p p m 2 c n c = 0 . d 0 l o = ( l i p * v o l + p l t e m p * 2 . d 0 * p v o l ) / ( v o l + 2 . d 0 * p v o l ) m o l = ( m n p 1 * v o l + p m 1 t m p * 2 . d 0 * p v o l ) / ( v o l + 2 . d 0 * p v o l ) m o 2 = m n p 2 * v o l / ( v o l + 2 . d 0 * p v o l ) l i p = l o m n p l = m o l m n p 2 = m 0 2 t r e f = 0 . d 0 v o l = v o l + 2 . d 0 * p v o l a l p = 0 . l d O / l i p b t a = 0 . 6 d 0 / l i p i f ( fl a g . n e . 1 0 0 1 ) t h e n e p s = 0 . 5 d 0 / ( m n p 1 + m n p 2 ) e l s e e p s = 1 . d 0 e n d i f p b m a x = a l p * l i p v b m a x = b t a * l i p p b m i n = 5 . 0 d - 3 / l i p * l i p v b m i n = 5 . 0 d - 3 / l i p * 1 i p p b ( 2 ) = p b ( 2 ) * ( v o l - 2 . d 0 * p v o l ) / v o l v b ( 2 ) = v b ( 2 ) * ( v o l - 2 . d 0 * p v o l ) / v o l m b ( 2 ) = m b ( 2 ) * ( v o l - 2 . d 0 * p v o l ) / v o l m 3 b ( 2 ) = m 3 b ( 2 ) * ( v o l - 2 . d 0 * p v o l ) / v o l a h ( 2 ) = a h ( 2 ) * ( v o l - 2 . d 0 * p v o l ) / v o l b p v o l = 2 . d 0 * p v o l * 1 0 0 0 . d 0 b p v o l = d n i n t ( b p v o l * 1 0 0 . d 0 ) / 1 0 0 . d 0 m n p = m n p l + m n p 2 c a n r a t e s t t r e f . p a ( 2 ) , p b ( 2 ) . v a ( 2 1 . v b ( 2 ) . m b t z ) , r a t e p , r a t e v , r a t e r p , r a t e r v ) 3 1 6 c a l l o u t l ( t a c t ) c a l l o u t 2 ( t p l s ) f r a c 2 = f r a c 2 * ( 1 . d 0 - f r 2 p c t ) g 2 = f 2 * f r a c 2 g 1 = g 2 / f 2 0 v f l * ( l . d 0 + f r l p c t ) 3 = 0 fl a g 4 = 0 t c o u n t = 0 e l s e i f ( ( fl a g 3 . e q . 1 0 0 0 ) . a n d . ( d e l a y . e q . 7 0 ) ) t h e n * * * A D D D E L A Y E D L I P / M N P P U L S E * * * p l c o n c = p l t m p Z p m l c n c = p m l t p 2 p m 2 c n c = p m 2 t p 2 1 0 = ( l i p * v o l + p l t m p 2 * 3 . d 0 * p v o l ) / ( v o l + 3 . d 0 * p v o l ) m o l = ( m n p 1 * v o l + p m 1 t p 2 * 3 . d 0 * p v o l ) / ( v o l + 3 . d 0 * p v o l ) m o 2 = ( m n p 2 * v o l + p m 2 1 p 2 * 3 . d 0 * p v o l ) / ( v o l + 3 . d 0 * p v o l ) 1 i p = l o m n p l = m o l m n p 2 = m o 2 t r e f = 0 . d 0 v o l = v o l + 3 . d 0 * p v o l a l p = 0 . 1 d 0 / 1 i p b t a = 0 . 6 d 0 / l i p i f ( fl a g . n e . 1 0 0 1 ) t h e n e p s = 0 . 5 d 0 / ( m n p 1 + m n p 2 ) e l s e e p s = l . d 0 e n d i f p b m a x = a l p * l i p v b m a x = b t a * l i p p b m i n = 5 . 0 d - 3 / l i p * 1 i p v b m i n = 5 . 0 d - 3 / l i p * l i p p b ( 2 ) = p b ( 2 ) * ( v o l - 3 . d 0 * p v o l ) / v o l v b ( 2 ) = v b ( 2 ) * ( v o l - 3 . d 0 * p v o l ) / v o l m b ( 2 ) = m b ( 2 ) * ( v o l - 3 . d 0 * p v o l ) / v o l m 3 b ( 2 ) = m 3 b ( 2 ) * ( v o l - 3 . d 0 * p v o l ) / v o l a h ( 2 ) = a h ( 2 ) * ( v o l ~ 3 . d 0 * p v o l ) / v o l b p v o l = 3 . d 0 * p v o l * 1 0 0 0 . d 0 b p v o l = d n i n t ( b p v o l * 1 0 0 . d 0 ) / 1 0 0 . d 0 m n p = m n p 1 + m n p 2 c a l l r a t e S ( t r e f . P a ( 2 ) m b ( 2 ) , V a ( 2 ) . v b ( 2 ) , m b ( 2 ) , r a t e p , r a t e v , r a t e r p , r a t e r v ) c a l l o u t l ( t a c t ) c a l l o u t 2 ( t p l s ) f r a c 2 = f r a c 2 * ( 1 . d 0 - f r 2 p c t ) g 2 = f 2 * f r a c 2 g 1 = g 2 / f 2 0 v f l * ( 1 . d 0 + f r 1 p c t ) g 3 = g 3 * ( 1 . d 0 — f r 3 p c t ) fl a g 3 = 0 t c o u n t = 0 e n d i f e l s e i f ( fl a g . e q . 9 9 9 ) t h e n * * * L I P I S N O T P R E S E N T , S O P U L S E B Y M N P M E T H O D * * * O O C 0 0 0 0 3 1 7 i f ( ( fl a g 2 . e q . 0 ) . a n d . ( fl a g 3 . e q . 0 ) ) t h e n m n p l = m o l * d e x p ( - k d m a * t r e f / 6 0 . d 0 ) m n p 2 = m 0 2 * d e x p ( - k d m b * t r e f / 6 0 . d 0 ) m n p = m n p l + m n p 2 i n i t m o = i n i m o l + i n i m 0 2 i f ( fl a g 5 . g t . 0 ) t h e n fl a g 5 = fl a g 5 + 1 e n d i f i f ( fl a g 5 . g t . 5 0 0 ) t h e n fl a g 5 = 0 e n d i f i f ( ( p b ( 2 ) . l e . ( p b m i n + a r a n g e * ( p b m a x - p b m i n ) ) ) . a n d . ( fl a g s . e q . 0 ) ) t h e n * * * H 2 0 2 I N S I D E A N E E D S P U L S E D * * * fl a g 5 = fl a g 5 + l t p l s = t a c t a p v o l = 0 . d 0 b p v o l = 0 . d 0 i f ( m n p . g t . m r a n g e * i n i t m o ) t h e n * * * M N P D O E S N O T N E E D P U L S E D * * * * * * H 2 0 2 N E E D S P U L S E D * * * * * * P U L S E A W I T H P E R O X I D E * * * t e m p 2 = p a o * f 3 a p v o l = ( t e m p 2 - p a ( 2 ) ) / ( p a t e m p - p a ( 2 ) ) * v o l a a p v o l = d n i n t ( a p v o l * 1 . d 5 ) / 1 . d 5 v o l a = v o l a - a p v o l c a l l r a t C S ( t r e f . P a ( 2 ) . P b ( 2 ) . v a ( 2 ) , v b ( 2 ) . m b ( 2 ) , r a t e p , r a t e v , r a t e r p , r a t e r v ) c a l l o u t l ( t a c t ) * * * S E T P U L S E D E L A Y F L A G * * * fl a g 2 = 9 9 9 t c o u n t = 0 e l s e i f ( m n p . l e . m r a n g e * i n i t m o ) t h e n * * * M N P N E E D S P U L S E D * * * * * * H 2 0 2 N E E D S P U L S E D * * * * * * A D D D E L A Y E D H 2 0 2 P U L S E * * * * * * M N P P U L S E L A T E R * * * p a c o n c = p a ( 2 ) * v o l a a p v o l = 2 . d 0 * p v o l v o l a = v o l a + 2 . d 0 * p v o l m n p l = m o l * d e x p ( - k d m a * t r e f / 6 0 . d 0 ) m n p 2 = m 0 2 * d e x p ( - k d m b * t r e f / 6 0 . d 0 ) v a ( 2 ) = v a ( 2 ) * ( v o l a - a p v o 1 ) / v o l a m a ( 2 ) = m a ( 2 ) * ( v o l a - a p v o l ) / v o l a m 3 a ( 2 ) = m 3 a ( 2 ) * ( v o l a - a p v o l ) / v o l a p a ( 2 ) = p a o * f 3 * f 4 a p v o l = a p v o l * 1 0 0 0 . d 0 a p v o l = d n i n t ( a p v o l * 1 0 0 . d 0 ) / 1 0 0 . d 0 p a c o n c = ( p a ( 2 ) * v o l a - p a c o n c ) / ( 2 . d 0 * p v o l ) p t e m p = p a c o n c v t e m p = 0 . d 0 p t e m p = d n i n t ( p t e m p * 1 . d 3 ) / 1 . d 3 v t e m p = d n i n t ( v t e m p * l . d 3 ) / 1 . d 3 D O 3 1 8 m n j p = m n p 1 + m n p 2 c a l l r a t e s ( t r e f , p a ( 2 ) , p b ( 2 ) , v a ( 2 ) , v b ( 2 ) , m b ( 2 ) , r a t e p , r a t e v , r a t e r p , r a t e r v ) c a l l o u t l ( t a c t ) * * * S E T P U L S E D E L A Y F L A G * * * fl a g 3 = 9 9 9 t c o u n t = 0 e n d i f e n d i f e l s e i f ( ( fl a g 2 . e q . 9 9 9 ) . a n d . ( d e l a y . e q . 3 0 ) ) t h e n * * * A D D D E L A Y E D H 2 0 2 P U L S E * * * * * * N O M N P P U L S E L A T E R * * * v o l a = v o l a + a p v o l p a c o n c = p a t e m p p t e m p = p a c o n c v t e m p = 0 . d 0 p a ( 2 ) = ( p a ( 2 ) * ( v o l a - a p v o l ) + p t e m p * a p v o l ) / v o l a v a ( 2 ) = v a ( 2 ) * ( v o l a - a p v o l ) / v o l a m a ( 2 ) = m a ( 2 ) * ( v o l a - a p v o l ) / v o l a m 3 a ( 2 ) = m 3 a ( 2 ) * ( v o l a - a p v o l ) / v o l a a p v o l = a p v o l * 1 0 0 0 . d 0 a p v o l = d n i n t ( a p v o l * 1 0 0 . d 0 ) / 1 0 0 . d 0 c a l l r a t e r » ( t r e f . p a ( 2 ) . p b ( 2 ) . v a ( 2 ) . v b ( 2 ) . m b ( 2 ) . r a t e p , r a t e v , r a t e r p , r a t e r v ) c a l l o u t l ( t a c t ) c a l l o u t 2 ( t p l s ) fl a g 2 = 0 t c o u n t = 0 f 3 = f 3 * ( 1 . d 0 — f r 2 p c t ) e l s e i f ( ( fl a g 3 . e q . 9 9 9 ) . a n d . ( d e l a y . e q . 4 0 ) ) t h e n * * * A D D D E L A Y E D M N P P U L S E * * * t r e f = 0 . d 0 p l c o n c = 0 . d 0 p m l c n c = 0 . d 0 p m 2 c n c = p m 2 1 m p l o = l i p * v o l / ( v o l + 2 . d 0 * p v o l ) m o l = m n p l * v o l / ( v o l + 2 . d 0 * p v o l ) m 0 2 = ( m n p 2 * v o l + p m 2 t m p * 2 . d 0 * p v o l ) / ( v o l + 2 . d 0 * p v o l ) v o l = v o l + 2 . d 0 * p v o l 1 i p = l o m n p l = m o l m n 1 1 2 = m o 2 i f ( f l a g . n e . 1 0 0 1 ) t h e n e p s = 0 . 1 d 0 / ( m n p l + m n p 2 ) s i g = 0 . 1 d 0 / ( m n p 1 + m n p 2 ) e l s e e p s = 1 . d 0 s i g = 1 . d 0 e n d i f p b m a x = s i g * m n p 2 p b m i n = 5 . 0 d - 3 / ( m n p 1 + m n p 2 ) * ( m n p l + m n p 2 ) p b ( 2 ) = p b ( 2 ) * ( v o l - 2 . d 0 * p v o l ) / v o l v b ( 2 ) = v b ( 2 ) * ( v o l - 2 . d 0 * p v o l ) / v o l 3 1 9 m b ( 2 ) = m b ( 2 ) * ( v o l - 2 . d 0 * p v o l ) / v o l m 3 b ( 2 ) = m 3 b ( 2 ) * ( v o l - 2 . d 0 * p v o l ) / v o l a h ( = 2 ) a h ( 2 ) * ( v o l - 2 . d 0 * p v o l ) / v o l b p v o l = 2 . d 0 * p v o l * 1 0 0 0 . d 0 b p v o l = d n i n t ( b p v o l * 1 0 0 . d 0 ) / 1 0 0 . d 0 m n p = - m n p 1 + m n p 2 c a l l r a t e s ( t r e f , p a ( 2 ) , p b ( 2 ) , v a ( 2 ) , v b ( 2 ) , m b ( 2 ) , + r a t e p , r a t e v , r a t e r p , r a t e r v ) c a l l o u t l ( t a c t ) c a l l o u t 2 ( t p l s ) fl a g 3 = 0 t c o u n t = 0 f 3 = f 3 * ( l . d 0 - f r 2 p c t ) e n d i f e n d i f v a ( l ) = v a ( 2 ) P b ( 1 ) = P b ( 2 ) v a ( l ) = v a ( 2 ) v b ( l ) = v b ( 2 ) m a ( 1 ) = m a ( 2 ) m b ( 1 ) = m b ( 2 ) m 3 a ( 1 ) = m 3 a ( 2 ) m 3 b ( 1 ) = m 3 b ( 2 ) a h ( l ) = a h ( 2 ) 1 0 c o n t i n u e c l o s e ( 2 ) c l o s e ( 3 ) c l o s e ( 4 ) c l o s e ( 5 ) c l o s e ( 6 ) c l o s e ( 7 ) c l o s e ( 8 ) 1 0 0 f o r m a t ( f 8 . 3 , 2 ( l x , f 8 . 4 ) , 1 x , f 1 0 . 4 , 1 x , f 8 . 4 ) 1 0 1 f o r m a t ( f 8 . 3 , 3 ( 1 x , f 8 . 4 ) , 1 x , f 8 . 2 , l x , f 1 0 . 2 ) 1 0 2 f o r m a t ( f 8 . 3 , 4 ( l x , f 8 . 6 ) , 1 x , f 8 . 4 ) 1 0 3 f o r m a t ( f 8 . 3 , 4 ( l x , f 7 . 3 ) ) S t o p e n d C C * * * O U T P U T S U B R O U T I N E # 1 * * * C s u b r o u t i n e o u t l ( t a ) d o u b l e p r e c i s i o n t a , p a ( 2 ) , p b ( 2 ) , v a ( 2 ) , v b ( 2 ) , m a ( 2 ) d o u b l e p r e c i s i o n m b ( 2 ) , m 3 a ( 2 ) , m 3 b ( 2 ) , a h ( 2 ) , l , 1 1 1 d o u b l e p r e c i s i o n p m n , p m x , v m x , r p , r v , r r p , r r v c o m m o n / c o n c 1 / p a , p b , v a , v b , m a , m b c o m m o n I c o n c 2 / m 3 a , m 3 b , a h , I , m c o m m o n / c o n c 3 / p m n , p m x , v m x c o m m o n I r a t e ! r p , r v , r r p , r r v w r i t e ( Z 1 ) t a p a ( 2 ) . p b ( 2 ) . v a ( 2 ) . v b ( 2 ) w r i t e ( 3 , 2 ) t a , p m n , p m x , v m x , 1 , m w r i t e ( 8 , 3 ) t a , m a ( 2 ) , m b ( 2 ) , m 3 a ( 2 ) , m 3 b ( 2 ) , a h ( 2 ) w r i t e ( 6 , 4 ) t a , r p , r v , r r p , r r v 3 2 0 1 f o r m a t ( f 8 . 3 , 2 ( l x , f 8 . 4 ) , 1 x , f 1 0 . 4 , 1 x , f 8 . 4 ) 2 f o r m a t ( f 8 . 3 , 3 ( 1 x , f 8 . 4 ) , 1 x , f 8 . 2 , l x , f 1 0 . 2 ) 3 f o r m a t ( f 8 . 3 , 4 ( 1 x , f 8 . 6 ) , 1 x , f 8 . 4 ) 4 f o r m a t ( f 8 . 3 , 4 ( 1 x , f 7 . 3 ) ) r e t u r n e n d C C * * * O U T P U T S U B R O U T I N E # 2 * * * C s u b r o u t i n e o u t 2 ( t p ) d o u b l e p r e c i s i o n t p , a p v , p t m p , v t m p , b p v , p t m p 2 d o u b l e p r e c i s i o n v t m p 2 , p l c , p m l c , p m 2 c , l t h , v o l d o u b l e p r e c i s i o n v o l a , a r e a , l o , m o l , m o 2 , h c o m m o n l r x t r / l t h , v o l , v o l a , a r e a , 1 0 , m o l , m o 2 , h c o m m o n l a p u l s e / a p v , p t m p , v t m p c o m m o n l b p u l s e / b p v , p t m p 2 , v t m p 2 c o m m o n l e p u l s e / p l c , p m l c , p m 2 c w r i t e ( 4 , 1 ) t p , a p v , p t m p , v t m p , v o l a w r i t e ( 5 , 2 ) t p , b p v , p t m p 2 , v t m p 2 , v o l w r i t e ( 7 , 3 ) t p , b p v , p l c , p m l c , p m 2 c l f o r m a t ( l 0 x , f 8 . 3 , 5 x , f 5 . 2 , 5 x , f 8 . 3 , 4 x , f 1 0 . 3 , 5 x , f 5 . 2 ) 2 f o r m a t ( l e , f 8 . 3 , 5 x , f 5 . 1 , 5 x , f 8 . 3 , 4 x , f 8 . 3 , 5 x , f 5 . 2 ) 3 f o r m a t ( l e , f 8 . 3 , 3 x , f 5 . 1 , 3 x , f 1 0 . 3 , 2 ( 3 x , f 1 0 . 3 ) ) r e t u r n e n d C C “ * * * R U N G E - K U ' I ' I ‘ A - G I L L D E R I V A T I V E E V A L U A T I O N S U B R O U T I N E S “ * * * g * * * C A L C U L A T E R A T E O F H 2 0 2 S U P P L Y T O S I D E B A T T I M E T * * * s u b r o u t i n e f u n c 1 h ( t , p a , p b , k ) d o u b l e p r e c i s i o n t , p a , p b , k , f , h d o u b l e p r e c i s i o n d p , d v , d m , a 1 , a 2 , g m a , d m 3 d o u b l e p r e c i s i o n l t h , v o l , v o l a , a r e a , 1 0 , m o l , m o 2 c o m m o n / t r a n s / d p , d v , d m , d m 3 , a 1 , a 2 , g m a c o m m o n / e r I l t h , v o l , v o l a , a r e a , 1 0 , m o l , m o 2 , h f = - d p * a r e a / ( l t h * v o l a ) * ( p a - p b ) k = h * f r e t u r n C e n d C * * * C A L C U L A T E R A T E O F V A S U P P L Y T O S I D E B A T T I M E T * * * C s u b r o u t i n e f u n c 2 h ( t , v a , v b , k ) d o u b l e p r e c i s i o n t , v a , v b , k , f , h d o u b l e p r e c i s i o n d p , d v , d m , a 1 , a 2 , g m a , d m 3 d o u b l e p r e c i s i o n l t h , v o l , v o l a , a r e a , 1 0 , m o l , m o 2 c o m m o n l t r a n s / d p , d v , d m , d m 3 , a 1 , a 2 , g m a c o m m o n l r x t r / l t h , v o l , v o l a , a r e a , 1 0 , m o l , m 0 2 , h l f ‘ = - l : 1 v f * a r e a / ( g m a * l t h * v o l a ) " ‘ ( d e x p ( ~ g m a * v b ) - d e x p ( - g m a * v a ) ) = a : r e t u r n e n d 3 2 1 C * * * C A L C U L A T E R A T E O F A C C U M U L A T I O N O F H 2 0 2 I N S I D E B * * * C * * * A T T I M E T * * * C s u b r o u t i n e f u n c 3 h ( t , p b , p a , v b , m b , k ) d o u b l e p r e c i s i o n 1 , p b , p a , v b , m b , k , f , h d o u b l e p r e c i s i o n d p , d v , d m , a 1 , a 2 , g m a , d m 3 d o u b l e p r e c i s i o n 1 t h , v o l , v o l a , a r e a , 1 0 , m o l , m o 2 d o u b l e p r e c i s i o n k l , k 3 , k 4 , k i d o u b l e p r e c i s i o n k 5 a , p s i a , k 5 b , p s i b , k 8 d o u b l e p r e c i s i o n k d l l , k d 1 2 , k d m a , k d m b d o u b l e p r e c i s i o n l i p , m n p l , m n p 2 c o m m o n / l i p k i n / k 1 , k 3 , k 4 , k i c o m m o n / m n p k i n / k 5 a , p s i a , k 5 b , p s i b , k 8 c o m m o n l t r a n s / d p , d v , d m , d m 3 , a 1 , a 2 , g m a c o m m o n / s t a b l e / k d l l , k d 1 2 , k d m a , k d m b c o m m o n l r x t r / l t h , v o l , v o l a , a r e a , 1 0 , m o l , m 0 2 , h l i p = ( k d l l / k d 1 2 + l o ) * d e x p ( - k d 1 2 * t / 6 0 . d 0 ) - k d l l / k d l 2 i f ( l i p . l t . 0 . d 0 ) t h e n l i p = 0 . d 0 e n d i f m n p l = m o l * d e x p ( - k d m a * t / 6 0 . d 0 ) m n p 2 = m o 2 * d e x p ( - k d m b * t / 6 0 . d 0 ) f = k 3 * k 4 * v b + k l * k 3 * p b * v b + k 1 * k 4 * p b * ( l . d 0 + p b / k i ) f = k 1 * k 3 * k 4 * p b * v b * l i p / f f = f + k 5 a * m n p 1 * p b * m b / ( m b + k 5 a * p s i a * p b ) f = f + k 5 b * m n ; p 2 * p b * m b / ( m b + k 5 b * p s i b * p b ) f = d p * a r e a / ( l t h * v o l ) * ( p a - p b ) - f k = h * f r e t u r n e n d C C * * * C A L C U L A T E R A T E O F A C C U M U L A T I O N O F V A I N S I D E B * * * C * * * A T T I M E T * * * C s u b r o u t i n e f u n c 4 h ( t , v b , v a , p b , k ) d o u b l e p r e c i s i o n t , v b , v a , p b , k , f , h d o u b l e p r e c i s i o n d p , d v , d m , a 1 , a 2 , g m a , d m 3 d o u b l e p r e c i s i o n l t h , v o l , v o l a , a r e a , 1 0 , m o l , m o 2 d o u b l e p r e c i s i o n k l , k 3 , k 4 , k i d o u b l e p r e c i s i o n k d l l , k d 1 2 , k d m a , k d m b d o u b l e p r e c i s i o n l i p c o m m o n I l i p k i n / k 1 , k 3 , k 4 , k i c o m m o n / t r a n s / d p , d v , d m , d m 3 , a 1 , a 2 , g m a c o m m o n l s t a b l e / k d l l , k d 1 2 , k d m a , k d m b c o m m o n l r x t r / l t h , v o l , v o l a , a r e a , 1 0 , m o l , m 0 2 , h l i ‘ p ( l l — ( k d 1 1 / k d 1 2 + l o ) * d e x p ( - 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G i l l a p p r o x i m a t i o n c o n s t a n t s f o r S i d e A V A R u n g e - K u t t a — G i l l a p p r o x i m a t i o n c o n s t a n t s f o r S i d e A V A R a t e c o n s t a n t f o r 1 s t s t e p i n L I P / V A k i n e t i c s R a t e c o n s t a n t f o r 2 n d s t e p i n L I P / V A k i n e t i c s R a t e c o n s t a n t f o r 3 r d s t e p i n L I P / V A k i n e t i c s R a t e c o n s t a n t f o r 1 s t s t e p i n M N P / M N O I ) k i n e t i c s ( f o r D 5 N o M n M N P ) R a t e c o n s t a n t f o r l s t s t e p i n M N P / M n ( I I ) k i n e t i c s ( f o r D 4 H i M n M N P R a t e c o n s t a n t f o r o x i d a t i o n o f l i g n i n b o n d s b y [ M n ( I I I ) — ( t a r t ) 2 ] c o m p l e x [ L I P ] a c t i v i t y a t t i m e t [ L I P ] a c t i v i t y a t r e f e r e n c e t i m e z e r o W e t m e m b r a n e t h i c k n e s s C o n c e n t r a t i o n o f M n ( I I ) i n S i d e A C o n c e n t r a t i o n o f M n ( I I ) i n S i d e B T e m p o r a r y v a l u e o f M n ( I I ) i n S i d e A , u s e d i n R u n g e - K u t t a - G i l l s o l u t i o n T e m p o r a r y v a l u e o f M n ( I I ) i n S i d e B , u s e d i n R u n g e - K u t t a - G i l l s o l u t i o n T e m p o r a r y v a l u e o f [ M n ( I I I ) - ( t a r t ) 2 ] c o m p l e x i n S i d e A , u s e d i n R u n g e — K u t t a - G i l l s o l u t i o n T e m p o r a r y v o l u e o f [ M n ( I I I ) - ( t a r t ) 2 ] c o m p l e x i n S i d e A , u s e d i n R u n g e - K u t t a — G i l l s o l u t i o n T o t a l [ M N P ] a c t i v i t y a t t i m e t D 5 N o M n [ M N P ] a c t i v i t y a t t i m e t D 4 H i M n [ M N P ] a c t i v i t y a t t i m e t D 5 N o M n [ M N P ] a c t i v i t y a t r e f e r e n c e t i m e z e r o m 0 2 m 3 a ( 2 ) m 3 b ( 2 ) n p t p a ( 2 ) p a c o n c p b ( 2 ) p l c o n c p m l c n c p m 2 c n c P P a p p b p s i a p s i b p u l s e ( 1 , l 6 ) p v o l p z l p 1 2 r k a r k b r k c r k d t a c t t d e l a y t e m p t e m p 2 v a ( 2 ) v a c o n c v b ( 2 ) v o l v o l a v v a v v b V a r i a b l e U / L m M m M m i n m M m M m M U / L U / L U / L m M m L m L m M m M b . I n t e g e r V a r i a b l e s U n i t s 3 2 6 D 4 H i M n [ M N P ] a c t i v i t y a t r e f e r e n c e t i m e z e r o C o n c e n t r a t i o n o f [ M n ( I I I ) - ( t a r t ) 2 ] c o m p l e x i n S i d e A C o n c e n t r a t i o n o f [ M n ( I I I ) - ( t a r t ) 2 ] c o m p l e x i n S i d e B P u l s e t i m e C o n c e n t r a t i o n o f p e r o x i d e i n S i d e A V a r i a b l e u s e d i n p u l s e c o n c e n t r a t i o n c a l c u - l a t i o n s f o r H 2 0 2 i n S i d e A C o n c e n t r a t i o n o f p e r o x i d e i n S i d e B [ L I P ] p u l s e c o n c e n t r a t i o n f o r S i d e B D 5 N o M n [ M N P ] p u l s e c o n c e n t r a t i o n f o r S i d e B D 4 H i M n [ M N P ] p u l s e c o n c e n t r a t i o n f o r S i d e B T e m p o r a r y v a l u e o f H 2 0 2 i n S i d e A , u s e d i n R u n g e - K u t t a - G i l l s o l u t i o n T e m p o r a r y v a l u e o f H 2 0 2 i n S i d e B , u s e d i n R u n g e — K u t t a — G i l l s o l u t i o n R a t i o o f ( k 6 + k 7 ) / ( k 6 k 7 ) f o r D 5 N o M n M N P R a t i o o f ( k 6 + k 7 ) / ( k 6 k 7 ) f o r D 4 H i M n M N P A r r a y c o n t a i n i n g p u l s e t i m e s S t a n d a r d p u l s e v o l u m e m u l t i p l e ( 0 . 0 1 0 m L ) f o r e n z y m e p u l s e s P e r c e n t u n d e r m e a s u r e d p a r a m e t e r v a l u e t o v a r y P e r c e n t o v e r m e a s u r e d p a r a m e t e r v a l u e t o v a r y R u n g e — K u t t a - G i l l d e r i v a t i v e a p p r o x i m a t i o n w e i g h t i n g c o n s t a n t R u n g e - K u t t a - G i l l d e r i v a t i v e a p p r o x i m a t i o n w e i g h t i n g c o n s t a n t R u n g e - K u t t a - G i l l d e r i v a t i v e a p p r o x i m a t i o n w e i g h t i n g c o n s t a n t R u n g e - K u t t a - G i l l d e r i v a t i v e a p p r o x i m a t i o n w e i g h t i n g c o n s t a n t A c t u a l c u m u l a t i v e t i m e C o u n t e r f o r p u l s e t i m e d e l a y T e m p o r a r y c a l c u l a t i o n v a r i a b l e T e m p o r a r y c a l c u l a t i o n v a r i a b l e E n z y m e a c t i v i t y r e f e r e n c e t i m e C o n c e n t r a t i o n o f V A i n S i d e A V a r i a b l e u s e d i n p u l s e c o n c e n t r a t i o n c a l c u - l a t i o n s a n d d i l u t i o n c a l c u l a t i o n s f o r V A i n S i d e A C o n c e n t r a t i o n o f V A i n S i d e B V o l u m e o f S i d e B V o l u m e o f S i d e A T e m p o r a r y v a l u e o f V A i n S i d e A , u s e d i n R u n g e - K u t t a - G i l l s o l u t i o n T e m p o r a r y v a l u e o f V A i n S i d e B , u s e d i n R u n g e - K u t t a - G i l l s o l u t i o n D e s c r i p t i o n C C C C C C C C 3 2 7 f l a g - - - F l a g w h i c h i n d i c a t e s e n z y m e s p r e s e n t i - - - L o o p c o u n t e r j - - - L o o p c o u n t e r k - - - L o o p c o u n t e r 1 - - - L o o p c o u n t e r 1 1 - - - M a i n t i m e s t e p l o o p c o u n t e r n p r i n t - - - D a t a o u t p u t s t e p i n c r e m e n t n p u l s e - - - C o u n t s n u m b e r o f p u l s e s a l r e a d y d o n e n t o t a l - - - T o t a l n u m b e r o f t i m e s t e p s t c o u n t - - - P u l s e d e l a y t i m e s t e p c o u n t e r y - - - N u m b e r i n d i c a t i o n c h o i c e o f e n z y m e m i x t u r e s z - - - N u m b e r i n d i c a t i n g c h o i c e o f p a r a m e t e r t o v a r y D . 2 . 2 F O R T R A N P r o g r a m P E R T U R B . F O R * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * # * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * P R O G R A M P E R T U R B . F O R R e a c t o r M o d e l P e r t u r b a t i o n P r o g r a m * * * * * * * * * * 8 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * d o u b l e p r e c i s i o n a a h , a h ( 2 ) , a p v o l , a r e a , a 1 , a 2 d o u b l e p r e c i s i o n b p v o l , c o n s t ( 2 , 2 5 ) , d a t a ( 1 6 , 8 ) d o u b l e p r e c i s i o n d e l a y , d m , d m 3 , d p , d v , g m a , h d o u b l e p r e c i s i o n i l o , i m o l , i m 0 2 , i n i t l o , i n i m o l , i n i m o 2 d o u b l e p r e c i s i o n k a h ( 4 ) , k d l l , k d 1 2 , k d m a , k d m b , k i , k m a ( 4 ) d o u b l e p r e c i s i o n k m b ( 4 ) , k m 3 a ( 4 ) , k m 3 b ( 4 ) , k p a ( 4 ) , k p b ( 4 ) d o u b l e p r e c i s i o n k v a ( 4 ) , k v b ( 4 ) , k 1 , k 3 , k 4 , k 5 a , k 5 b , k 8 d o u b l e p r e c i s i o n l i p , 1 0 , l t h d o u b l e p r e c i s i o n m a ( 2 ) , m b ( 2 ) , m m a , m m b , m m 3 a , m m 3 b , m n p , m n p l d o u b l e p r e c i s i o n m n p 2 , m o l , m 0 2 , m 3 a ( 2 ) , m 3 b ( 2 ) , n p t d o u b l e p r e c i s i o n p a ( 2 ) , p a c o n c , p b ( 2 ) , p l c o n c , p m l c n c d o u b l e p r e c i s i o n p m 2 c n c , p p a , p p b , p s i a , p s i b , p u l s e ( l , 1 6 ) d o u b l e p r e c i s i o n p v o l , p z l , p z 2 , r k a , r k b , r k c , r k d d o u b l e p r e c i s i o n t a c t , t d e l a y , t e m p , t e m p 2 , t r e f d o u b l e p r e c i s i o n v a ( 2 ) , v a c o n c , v b ( 2 ) , v o l , v o l a , w a , v v b i n t e g e r fl a g , i , j , k , l , n , n p r i n t , n p u l s e i n t e g e r n t o t a l , t c o u n t , y , 2 c o m m o n / t r a n s / d p , d v , d m , d m 3 , a 1 , a 2 , g m a c o m m o n / r x t r / l t h , v o l , v o l a , a r e a , l o , m o l , m o 2 , h c o m m o n / l i p k i n / k l , k 3 , k 4 , k i c o m m o n / m n p k i n / k 5 a , p s i a , k 5 b , p s i b , k 8 c o m m o n / s t a b l e / k d l l , k d 1 2 , k d m a , k d m b r k a = ( 2 . d 0 * * 0 . 5 d 0 - 1 . d 0 ) / 2 . d 0 r k b = ( 2 . d 0 - 2 . d 0 * * 0 . 5 d 0 ) / 2 . d 0 r k c = - ( 2 . d 0 * * . 5 d 0 ) / 2 . d 0 r k d = 1 . d 0 + ( 2 . d 0 * * 0 . 5 d 0 ) / 2 . d 0 c * * * I N P U T S T E P S I Z E & E N Z Y M E M I X T U R E * * * C w r i t e ( * , * ) ’ I N P U T # O F I N I T I A L E N Z Y M E M I X T U R E : ’ w r i t B ( * . * ) C 3 2 8 w r i t e ( * , * ) ’ 1 . L I P a l o n e ’ w r i t e ( * , * ) ’ 2 . L I P + M N P ’ w r i t e ( * , * ) ’ 3 . M N P a l o n e ’ ' I ! # 1 w n t e ( . ) r e a d ( * . * ) y i f . e q . 1 ) t h e n ' o = 1 0 0 0 . d 0 i m o l = - l . d O i m o 2 = - 1 . d 0 e l s e i f ( y . e q . 2 ) t h e n i l o = 1 0 0 0 . d 0 i m o l = 1 2 0 0 . d 0 i m 0 2 = 5 4 8 0 0 . d 0 e l s e i l o = - 1 . d 0 i m o l = - 1 . d 0 i m o 2 = 5 6 0 0 0 . d 0 e n d i f o p e n ( 2 , fi l e = ’ s i d e b . p r n ’ , s t a t u s = ’ n e w ’ ) w r i t e ( 2 , * ) ’ B A S E C A S E M I N U S V A R I A N C E ’ o p e n ( 4 , fi l e = ’ c o n s t . p r n ’ , s t a t u s = ’ o l d ’ ) d o 5 j = 0 , 4 m d ( 4 . * ) ( c o n s t ( 1 . k ) . k = ( 1 + 5 * j ) . ( 5 + 5 * j ) ) 5 c o n t i n u e c l o s e ( 4 ) d o 6 k = l , 2 5 c o n s t ( 2 , k ) = c o n s t ( 1 , k ) 6 c o n t i n u e w r i t e ( * , * ) ’ E N T E R T H E N U M B E R O F T H E C O N S T A N T T O V A R Y : ’ w r i t e ( * , * ) w r i t e ( * , * ) ’ 1 . a r e a 6 . d v 1 1 . k 1 1 6 . k a 2 1 . k d l 2 ’ w r i t e ( * , * ) ’ 2 . l t h 7 . d m 1 2 . k 3 1 7 . k 8 2 2 . k d m a ’ w r i t e ( * , * ) ’ 3 . v o l 8 . d m 3 1 3 . k 4 l 8 . p s i a 2 3 . k d m b ’ w r i t e ( * , * ) ’ 4 . v o l a 9 . a 1 1 4 . k i 1 9 . p s i b 2 4 . ’ w r i t e ( * , * ) ’ 5 . d p 1 0 . a 2 1 5 . k 5 a 2 0 . k d l l 2 5 . ’ w r i t e ( * , * ) 1 ’ t t l l d ( " ' . " ‘ ) 2 w r i t e ( * , * ) w r i t e ( * , * ) ’ E N T E R [ - % ] a n d [ + % ] ( w i t h s i g n s ) T O V A R Y : ’ w r i t e ( * , * r e u d ( * . * ) p z l . p 2 2 1 - 1 7 i f ( l . e q . 1 ) t h e n c o n s t ( l , z ) = c o n s t ( 1 , z ) * ( l . d 0 + p z l / 1 0 0 . d 0 ) e l s e c o n s t ( 1 , z ) = c o n s t ( 2 , z ) * ( l . d O + p 2 2 / 1 0 0 . d 0 ) C * * * S E T I N I T I A L C O N D I T I O N S * * * C i f ( i l o . e q . - 1 . d 0 ) t h e n C 3 2 9 o p e n ( 5 , fi l e = ’ m n p . p r n ’ , s t a t u s = ’ o l d ’ ) i n i t l o = 0 . d 0 i n i m o l = 0 . d 0 i n i m 0 2 = i m o 2 h = 0 . 0 1 d 0 n t o t a l = 7 2 0 0 0 n p r i n t = 5 0 0 e l s e i f ( i m 0 2 . e q . - l . d 0 ) t h e n o p e n ( 5 , fi l e = ’ l i p . p r n ’ , s t a t u s = ’ o l d ’ ) i n i t l o = i l o i n i m o l = 0 . d 0 i n i m o 2 = 0 . d 0 h = 0 . 1 d 0 n t o t a l = 7 2 0 0 n p r i n t = 5 0 e l s e o p e n ( 5 , fi l e = ’ 1 i p m n p . p r n ’ , s t a t u s = ’ o l d ’ ) i n i t l o = i l o i n i m o l = i m o l i n i m 0 2 = i m o 2 h = 0 . 0 1 d 0 n t o t a l = 7 2 0 0 0 n p r i n t = 5 0 0 e n d i f r e a d ( 5 , * ) 1 3 3 0 ) . W C ) . m a ( l ) , m 3 a ( 1 ) m d ( 5 , * ) p b ( 1 ) . v b ( l ) . m b ( l ) , m 3 b ( 1 ) r e a d ( 5 , * ) ( p u l s e ( l , k ) , k = 1 , 8 ) r e a d ( 5 , * ) ( p u l s e ( l , k + 8 ) , k = 1 , 8 ) C * * * S E T M O D E L P A R A M E T E R S * * * C C a r e a = c o n s t ( l , 1 ) l t h = c o n s t ( 1 , 2 ) v o l = c o n s t ( 1 , 3 ) v o l a = c o n s t ( 1 , 4 ) d p = c o n s t ( 1 , 5 ) d v = c o n s t ( 1 , 6 ) d m = c o n s t ( 1 , 7 ) d m 3 = c o n s t ( 1 , 8 ) a 1 = c o n s t ( 1 , 9 ) a 2 = c o n s t ( 1 , 1 0 ) g m a = 1 . d 0 / a 1 + 1 . d 0 / a 2 C * * * S E T K I N E T I C C O N S T A N T S * * * C k l = c o n s t ( 1 , 1 1 ) k 3 = c o n s t ( 1 , 1 2 ) k 4 = c o n s t ( l , 1 3 ) k i = c o n s t ( l , 1 4 ) k 5 a = c o n s t ( 1 , 1 5 ) k 5 b = c o n s t ( 1 , l 6 ) k 8 = c o n s t ( l , l 7 ) p s i a = c o n s t ( 1 , 1 8 ) 3 3 0 p s i b = c o n s t ( 1 , 1 9 ) C * * * S E T S T A B I L I T Y C O N S T A N T S * * * C k d l l = c o n s t ( 1 , 2 0 ) k d 1 2 = c o n s t ( 1 , 2 1 ) k d m a = c o n s t ( l , 2 2 ) k d m b = c o n s t ( 1 , 2 3 ) a h ( l ) = 0 . 0 2 d 0 * 2 . d 0 / 2 0 6 . 9 d 0 * 1 . d 6 l o = i n i t l o m o l = i n i m o l m o 2 = i n i m 0 2 l i p = l o m n p l = m o l m n p 2 = m 0 2 m n p = m n p l + m n p 2 p v o l = 0 . 0 1 d 0 t r e f = 0 . d 0 t a c t = 0 . d 0 t c o u n t = 0 C t d e l a y = 0 . d 0 C * * * O P E N O U T P U T F I L E S A N D I N I T I A L I Z E * * * C w r i t e ( 2 , * ) ’ t ( m i n ) , P b , V b ( a l l i n m M ) ’ w r i t e ( 2 , 1 0 0 ) t a c t , p b ( l ) , v b ( l ) C C * * * M A I N L O O P - S O L V E S B Y 4 T H O R D E R R U N G E - K U T T A - G I L L * * * C i = 0 d o 1 0 n = 1 , n t o t a l j = j + 1 p p a = p a ( 1 ) p p b = = p b ( 1 ) v v a = v a ( l ) v v b = v b ( 1 ) m m a = m a ( 1 ) m m b = m b ( 1 ) m m 3 a = m 3 a ( 1 ) m m 3 b = m 3 b ( l ) a a h = a h ( 1 ) t e m p = t r e f d o 2 0 i = . 1 , 4 c a l l f u n c 1 h ( t e m p . p p a , p p b . k p a ( i ) ) c a l l f u n c 2 h ( t e m p , v v a , w b , k v a ( i ) ) c a l l f u n c 3 h ( t e m p , p p b , p p a , v v b , m m b , k p b ( i ) ) c a l l f u n c 4 h ( t e m p , v v b , v v a , p p b , k v b ( i ) ) c a l l f u n c 5 h ( t e m p , m m a , m m b , k m a ( i ) ) c a l l f u n c 6 h ( t e m p , m m a , m m b , m m 3 b , a a h , p p b , k m b ( i ) ) c a l l f u n c 7 h ( t e m p , m m 3 a , m m 3 b , k m 3 a ( i ) ) c a l l f u n c 8 h ( t e m p , m m 3 a , m m 3 b , p p b , m m b , a a h , k m 3 b ( i ) ) c a l l f u n c 9 h ( t e m p , a a h , m m 3 b , k a h ( i ) ) i f ( i . e q . 1 ) t h e n 3 3 1 t e m p = t r e f + 0 . 5 d 0 * h p p a = p a ( 1 ) + 0 . 5 d 0 * k p a ( i ) p p b = p b ( 1 ) + 0 . 5 d 0 * k p b ( i ) w a = v a ( 1 ) + 0 . 5 d 0 * k v a ( i ) v v b = v b ( 1 ) + 0 . 5 d 0 * k v b ( i ) m m a = m a ( 1 ) + 0 . 5 d 0 * k m a ( i ) m m b = m b ( 1 ) + 0 . 5 d 0 * k m b ( i ) m m 3 a = m 3 a ( l ) + 0 . 5 d 0 * k m 3 a ( i ) m m 3 b = m 3 b ( 1 ) + 0 . 5 d 0 * k m 3 b ( i ) a a h = a h ( 1 ) + 0 . 5 d 0 * k a h ( i ) e l s e i f ( i . e q . 2 ) t h e n t e m p = t r e f + 0 . 5 d 0 * h p p a = p a ( 1 ) + r k a * k p a ( i - l ) + r k b * k p a ( i ) p p b = p b ( 1 ) + r k a * k p b ( i - l ) + r k b * k p b ( i ) v v a = v a ( l ) + r k a * k v a ( i - l ) + r k b * k v a ( i ) v v b = v b ( l ) + r k a * k v b ( i - 1 ) + r k b * k v b ( i ) m m a = m a ( 1 ) + r k a * k m a ( i - l ) + r k b * k m a ( i ) m m b = m b ( 1 ) + r k a * k m b ( i - 1 ) + r k b * k m b ( i ) m m 3 a = m 3 a ( l ) + r k a * k m 3 a ( i - l ) + r k b * k m 3 a ( i ) m m 3 b = m 3 b ( 1 ) + r k a * k m 3 b ( i - 1 ) + r k b * k m 3 b ( i ) a a h = a h ( 1 ) + r k a * k a h ( i - l ) + r k b * k a h ( i ) e l s e i f ( i . e q . 3 ) t h e n t e m p = t r e f + h p p a = p a ( l ) + r k c * k p a ( i - l ) + r k d * k p a ( i ) p p b = p b ( 1 ) + r k c * k p b ( i - l ) + r k d * k p b ( i ) w a = v a ( 1 ) + r k c * k v a ( i - 1 ) + r k d * k v a ( i ) w b = v b ( l ) + r k c * k v b ( i - 1 ) + r k d * k v b ( i ) m m a = m a ( 1 ) + r k c * k m a ( i - l ) + r k d * k m a ( i ) m m b = m b ( 1 ) + r k c * k m b ( i - 1 ) + r k d * k m b ( i ) m m 3 a = m 3 a ( 1 ) + r k c * k m 3 a ( i - 1 ) + r k d * k m 3 a ( i ) m m 3 b = m 3 b ( 1 ) + r k c * k m 3 b ( i - 1 ) + r k d * k m 3 b ( i ) a a h = a h ( 1 ) + r k c * k a h ( i - 1 ) + r k d * k a h ( i ) e n d i f 2 0 c o n t i n u e t r e f = t r e f + h t a c t = t a c t + h i f ( fl a g . e q . 9 9 9 ) t h e n * * * I N C R E M E N T P U L S E D E L A Y C O U N T E R * * * t c o u n t = t c o u n t + 1 e n d i f t d e l a y = h * d b l e ( t c o u n t ) d e l a y = i d n i n t ( t d e l a y * 1 0 0 . d 0 ) p a ( 2 ) = p a ( 1 ) + ( k p a ( 1 ) + k p a ( 4 ) ) l 6 . d 0 + ( r k b * k p a ( 2 ) + r k d * k p a ( 3 ) ) l 3 . d 0 p b ( 2 ) = p b ( 1 ) + ( k p b ( l ) + k p b ( 4 ) ) / 6 . d 0 + ( r k b * k p b ( 2 ) + r k d * k p b ( 3 ) ) / 3 . d 0 v a ( 2 ) = v a ( l ) + ( k v a ( 1 ) + k v a ( 4 ) ) / 6 . d 0 + ( r k b * k v a ( 2 ) + r k d * k v a ( 3 ) ) l 3 . d 0 v b ( 2 ) = v b ( 1 ) + ( k v b ( 1 ) + k v b ( 4 ) ) / 6 . d 0 + ( r k b * k v b ( 2 ) + r k d * k v b ( 3 ) ) / 3 . d 0 m a ( 2 ) = m a ( 1 ) + ( k m a ( 1 ) + k m a ( 4 ) ) l 6 . d 0 + ( r k b * k m a ( 2 ) + r k d * k m a ( 3 ) ) / 3 . d 0 m b ( 2 ) = m b ( 1 ) + ( k m b ( 1 ) + k m b ( 4 ) ) l 6 . d 0 + ( r k b * k m b ( 2 ) + r k d * k m b ( 3 ) ) / 3 . d 0 m 3 a ( 2 ) = m 3 a ( 1 ) + ( k m 3 a ( l ) + k m 3 a ( 4 ) ) / 6 . d 0 + ( r k b * k m 3 a ( 2 ) + r k d * k m 3 a ( 3 ) ) / 3 . d 0 m 3 b ( 2 ) = m 3 b ( 1 ) + ( k m 3 b ( l ) + k m 3 b ( 4 ) ) l 6 . d 0 + ( r k b * k m 3 b ( 2 ) + r k d * k m 3 b ( 3 ) ) l 3 . d 0 a h ( 2 ) = a h ( 1 ) + ( k a h ( l ) + k a h ( 4 ) ) / 6 . d 0 + ( r k b * k a h ( 2 ) + r k d * k a h ( 3 ) ) / 3 . d 0 3 3 2 i f ( m a ( 2 ) . l t . 0 . d 0 ) t h e n m a ( 2 ) = 0 . d 0 e l s e i f ( m b ( 2 ) . l t . 0 . d 0 ) t h e n m b ( 2 ) = 0 . d 0 e l s e i f ( m 3 a ( 2 ) . l t . 0 . d 0 ) t h e n m 3 a ( 2 ) = 0 . d 0 e l s e i f ( m 3 b ( 2 ) . l t . 0 . d 0 ) t h e n m 3 b ( 2 ) = 0 . d 0 e l s e i f ( a h ( 2 ) . l t . 0 . d 0 ) t h e n a h ( 2 ) = 0 . d 0 e n d i f C C * * * C A L C U L A T E N E W M A X I M A A N D M I N I M A ; C H E C K R A T E C R I T E R I A * * * C l i t p = ( k d — l l / k d 1 2 + l o ) * d e x p ( - - . k d 1 2 * t r e f / 6 0 d 0 ) - - k d l l / k d 1 2 ( l i p . l t . 0 . d 0 ) t h e n l i p = 0 . O d e n d i f m n p l = m o l * d e x p ( - k d m a * t r e f / 6 0 . d 0 ) m n p 2 = m 0 2 * d e x p ( - k d m b * t r e f / 6 0 . d 0 ) m n p = m n p 1 + m n p 2 i f ( j . e q . n p r i n t ) t h e n w r i é e ( 2 , 1 0 0 ) t a c t , p b ( 2 ) , v b ( 2 ) J = e n d i f t e m p 2 = d b l e ( i d n i n t ( t a c t * 1 0 0 . d 0 ) ) / 1 0 0 . d 0 i f ( t e m p 2 . e q . p u l s e ( 1 , n p u l s e ) ) t h e n r e a d ( 5 , * ) ( d a t a ( n p u l s e , k ) , k = 1 , 8 ) fl a g = 9 9 9 n t = d a t a ( n p u l s e , l ) i ( n p t . e q . - l . d 0 ) t h e n n p u l s e = n p u l s e - l e n d i f a p v o l = d a t a ( n p u l s e , 2 ) p a c o n c = d a t a ( n p u l s e , 3 ) v a c o n c = d a t a ( n p u l s e , 4 ) b p v o l = d a t a ( n p u l s e , 5 ) p l c o n c = d a t a ( n p u l s e , 6 ) p m l c n c = d a t a ( n p u l s e , 7 ) p m 2 c n c = d a t a ( n p u l s e , 8 ) e n d i f i f ( fl a g . e q . 9 9 9 ) t h e n i f ( ( a p v o l . n e . 4 0 . d 0 ) . a n d . ( a p v o l . n e . 2 0 . d 0 ) . a n d . + ( t e m p 2 . e q . n p t ) ) t h e n w r i t e ( 2 , 1 0 0 ) t a c t , p b ( 2 ) , v b ( 2 ) v o l a = v o l a - a p v o l / 1 . d 3 t c o u n t = 0 e l s e i f ( ( a p v o l . . e q 4 0 . d 0 ) . a n d . ( t e m p 2 . . e q n p t ) ) t h e n v o l a = v o l a - 2 . d 0 * p v o l w r i t e ( 2 , 1 0 0 ) t a c t , p b ( 2 ) , v b ( 2 ) t c o u n t = 0 e l s e i f ( ( a p v o l . . e q 2 0 . d 0 ) . a n d . ( t e m p 2 . . e q n p t ) ) t h e n p a ( 2 ) = ( p a ( 2 ) * v o l a + p a c o n c * a p v o l / l . d 3 ) / ( v o l a + a p v o l / 1 . d 3 ) 3 3 3 v a ( 2 ) = v a ( 2 ) * ( v o l a / ( v o l a + a p v o l / 1 . d 3 ) ) m a ( 2 ) = m a ( 2 ) * ( v o l a / ( v o l a + a p v o l / 1 . d 3 ) ) m 3 a ( 2 ) = m 3 a ( 2 ) * ( v o l a / ( v o l a + a p v o l / 1 . d 3 ) ) w r i t e ( 2 , 1 0 0 ) t a c t , p b ( 2 ) , v b ( 2 ) v o l a = v o l a + a p v o l / 1 . d 3 t c o u n t = 0 e l s e i f ( ( d e l a y . e q . 3 0 ) . a n d . ( a p v o l . n e . 2 0 . d 0 ) ) t h e n p a ( 2 ) = ( p a ( 2 ) * v o l a + p a c o n c * a p v o l / 1 . d 3 ) / ( v o l a + a p v o l / l . d 3 ) v a ( 2 ) = ( v a ( 2 ) * v o l a + v a c o n c * a p v o l / l . d 3 ) / ( v o l a + a p v o l / l . d 3 ) m a ( 2 ) = m a ( 2 ) * ( v o l a / ( v o l a + a p v o l / 1 . d 3 ) ) m 3 a ( 2 ) = m 3 a ( 2 ) * ( v o 1 a / ( v o l a + a p v o l / 1 . d 3 ) ) w r i t e ( 2 , 1 0 0 ) t a c t , p b ( 2 ) , v b ( 2 ) v o l a = v o l a + a p v o l / 1 . d 3 i f ( a p v o l . n e . 4 0 . d 0 ) t h e n fl a g = 0 t c o u n t = 0 n p u l s e = n p u l s e + 1 e n d i f e l s e i f ( ( ( d e l a y . e q . 4 0 ) . a n d . ( a p v o l . e q . 2 0 . d 0 ) ) . o r . + ( ( d e l a y . e q . 7 0 ) . a n d . ( a p v o l . e q . 4 0 . d 0 ) ) ) t h e n t r e f = 0 . d 0 1 0 = ( 1 i p * v o l + p l c o n c * b p v o l / 1 . d 3 ) / ( v o l + b p v o l / 1 . d 3 ) m o l = ( m n p 1 * v o l + p m l c n c * b p v o l / l . d 3 ) / ( v o l + b p v o l / 1 . d 3 ) l 1 : 1 0 2 1 = ( m n p 2 * v o l + p m 2 c n c * b p v o l / 1 . d 3 ) / ( v o l + b p v o l / 1 . d 3 ) P = 0 m n p l = m o l m n p 2 = m o 2 p b ( 2 ) = p b ( 2 ) * ( v o l / ( v o l + b p v o l / 1 . d 3 ) ) v b ( 2 ) = v b ( 2 ) * ( v o l / ( v o l + b p v o l / 1 . d 3 ) ) m b ( 2 ) = m b ( 2 ) * ( v o l / ( v o l + b p v o l / 1 . d 3 ) ) m 3 b ( 2 ) = m 3 b ( 2 ) * ( v o l / ( v o l + b p v o l / 1 . d 3 ) ) a h ( 2 ) = a h ( 2 ) * ( v o l / ( v o l + b p v o l / l . d 3 ) ) w r i t e ( 2 , 1 0 0 ) t a c t , p b ( 2 ) , v b ( 2 ) v o l = v o l + b p v o l / 1 . d 3 n p u l s e = n p u l s e + 1 e n d i f e n d i f v a ( l ) = v a ( 2 ) v b ( l ) = v b ( 2 ) v a ( 1 ) = v a ( 2 ) v b ( 1 ) = v b ( 2 ) m a ( l ) = m a ( 2 ) m b ( l ) = m b ( 2 ) m 3 a ( 1 ) = m 3 a ( 2 ) m 3 b ( 1 ) = m 3 b ( 2 ) a h ( 1 ) = a h ( 2 ) 1 0 c o n t i n u e c l o s e ( 5 ) I v r i l t e ( 1 2 , * ) ’ B A S E C A S E P L U S V A R I A N C E ’ = + i f ( 1 . g t . 2 ) t h e n 3 3 4 g o t o 8 e l s e g o t o 7 e n d i f 8 c l o s e ( 2 ) 1 0 0 f o r m a t ( f 8 . 3 , 2 ( l x , 1 8 . 4 ) ) S t o p e n d C C " * * * R U N G E — K U T T A - G I L L D E R I V A T I V E E V A L U A T I O N S U B R O U T I N E S " * * * C * * * C A L C U L A T E R A T E O F H 2 0 2 S U P P L Y T O S I D E B A T T I M E T * * * C s u b r o u t i n e f u n c 1 h ( t , p a , p b , k ) d o u b l e p r e c i s i o n t , p a , p b , k , f , h d o u b l e p r e c i s i o n d p , d v , d m , a 1 , a 2 , g m a , d m 3 d o u b l e p r e c i s i o n l t h , v o l , v o l a , a r e a , 1 0 , m o l , m 0 2 c o m m o n / t r a n s / d p , d v , d m , d m 3 , a 1 , a 2 , g m a ' c o m m o n / r x t r / l t h , v o l , v o l a , a r e a , 1 0 , m o l , m 0 2 , h f = - d p * a r e a / ( 1 t h * v o l a ) * ( p a - p b ) k = h * f r e t u r n C e n d C * * * C A L C U L A T E R A T E O F V A S U P P L Y T O S I D E B A T T I M E T * * * C s u b r o u t i n e f u n c 2 h ( t , v a , v b , k ) d o u b l e p r e c i s i o n t , v a , v b , k , f , h d o u b l e p r e c i s i o n d p , d v , d m , a 1 , a 2 , g m a , d m 3 d o u b l e p r e c i s i o n l t h , v o l , v o l a , a r e a , 1 0 , m o l , m o 2 c o m m o n / t r a n s / d p , d v , d m , d m 3 , a l , a 2 , g m a c o m m o n / r x t r / l t h , v o l , v o l a , a r e a , l o , m o l , m 0 2 , h f = - d v * a r e a / ( g m a * l t h * v o l a ) * ( d e x p ( - g m a * v b ) - d e x p ( - g m a * v a ) ) k = h * f r e t u r n e n d C C * * * C A L C U L A T E R A T E O F A C C U M U L A T I O N O F H 2 0 2 I N S I D E B * * * C * * * A T T I M E T * * * C s u b r o u t i n e f u n c 3 h ( t , p b , p a , v b , m b , k ) d o u b l e p r e c i s i o n t , p b , p a , v b , m b , k , f , h d o u b l e p r e c i s i o n d p , d v , d m , a 1 , a 2 , g m a , d m 3 d o u b l e p r e c i s i o n l t h , v o l , v o l a , a r e a , 1 0 , m o l , m o 2 d o u b l e p r e c i s i o n k 1 , k 3 , k 4 , k i d o u b l e p r e c i s i o n k 5 a , p s i a , k 5 b , p s i b , k 8 d o u b l e p r e c i s i o n k d l l , k d 1 2 , k d m a , k d m b d o u b l e p r e c i s i o n l i p , m n p l , m n p 2 c o m m o n / l i p k i n / k l , k 3 , k 4 , k i c o m m o n / m n p k i n / k 5 a , p s i a , k 5 b , p s i b , k 8 c o m m o n / t r a n s / d p , d v , d m , d m 3 , a 1 , a 2 , g m a c o m m o n l s t a b l e / k d l l , k d 1 2 , k d m a , k d m b c o m m o n / r x t r / l t h , v o l , v o l a , a r e a , l o , m o l , m 0 2 , h 1 i p = ( k d l l / k d 1 2 + l o ) * d e x p ( - k d 1 2 * t / 6 0 . d 0 ) - k d l l / k d 1 2 3 3 5 i f ( l i p . l t . 0 . d 0 ) t h e n l i p = 0 . d 0 e n d i f m n p l = m o l * d e x p ( - k d m a * t / 6 0 . d 0 ) m n p 2 = m o 2 * d e x p ( — k d m b * t / 6 0 . d 0 ) = 1 1 3 * k 4 * v b + k 1 * k 3 * p b * v b + k l * k 4 * p b * ( l . d 0 + p b / l d ) f = k 1 * k 3 * k 4 * p b * v b * 1 i p / f f = f + k S a * m n p l * p b * m b / ( m b + k 5 a * p s i a * p b ) f = f + k 5 b * m n ; p 2 * p b * m b / ( m b + k 5 b * p s i b * p b ) f = d p * a r e a / ( 1 t h * v o 1 ) * ( p a - p b ) - f k = h * f r e t u r n e n d C C * * * C A L C U L A T E R A T E O F A C C U M U L A T I O N O F V A I N S I D E B * * * C * * * A T T I M E T * * * C C s u b r o u t i n e f u n c 4 h ( t , v b , v a , p b , k ) d o u b l e p r e c i s i o n t , v b , v a , p b , k , f , h d o u b l e p r e c i s i o n d p , d v , d m , a 1 , a 2 , g m a , d m 3 d o u b l e p r e c i s i o n l t h , v o l , v o l a , a r e a , 1 0 , m o l , m 0 2 d o u b l e p r e c i s i o n k 1 , k 3 , k 4 , k i d o u b l e p r e c i s i o n k d l l , k d 1 2 , k d m a , k d m b d o u b l e p r e c i s i o n l i p c o m m o n l l i p k i n / k l , k 3 , k 4 , k i c o m m o n / t r a n s / d p , d v , d m , d m 3 , a 1 , a 2 , g m a c o m m o n l s t a b l e / k d l l , k d 1 2 , k d m a , k d m b c o m m o n / r x t r / l t h , v o l , v o l a , a r e a , 1 0 , m o l , m o 2 , h 1 1 ; p = ( k d l l l k d 1 2 + l o ) * d e x p ( - k d 1 2 * t / 6 0 . d 0 ) - k d 1 l / k d 1 2 i ( l i p . l t . 0 . d 0 ) t h e n l i p = 0 . d 0 e n d i f f = k 3 * k 4 * v b + k l * k 3 * p b * v b + k l * k 4 * p b * ( l . d 0 + p b / k i ) f = k 1 * k 3 * k 4 * p b * v b * l i p / f £ = % v ; 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F O R a . D o u b l e P r e c i s i o n V a r i a b l e s V a r i a b l e D e s c r i p t i o n b ( n c o l x , n c o l § V e c t o r o f m o d e l c o e f fi c i e n t s b t ( n c o l y , n c o ) T r a n s p o s e o f v e c t o r b = ( x t i n v * x t y ) e ( n u m p t , n c o l y ) V e c t o r c o n t a i n i n g r e s i d u a l e r r o r s m s e M e a n s q u a r e r e s i d u a l e r r o r r e l R e l a t i v e e r r o r s ( 1 , 1 ) T o t a l s u m o f s q u a r e s s m ( l , 1 ) M o d e l s u m o f s q u a r e s s u m T e m p o r a r y v a r i a b l e u s e d t o a d d r e s i d u a l e r r o r s y ( n u m p t , n c o l y ) V e c t o r o f r e s p o n s e s y p r e d ( n u m p t , n c o l y ) V e c t o r o f p r e d i c t e d r e s p o n s e s y t ( n c o l y , n u m p t ) x ( n u m p t , n c o l x ) x t ( n c o l x , n u m p t ) x t i n v ( n c o l x , n c o l x ) x t x ( n c o l x , n c o l x ) x t y ( n c o l x , n c o l y ) b . I n t e g e r V a r i a b l e s V a r i a b l e i J n c o l x T r a n s p o s e o f v e c t o r y M a t r i x o f i n d p e n d e n t v a r i a b l e s / f a c t o r s T r a n s p o s e o f m a t r i x x I n v e r s e o f m a t r i x x t x M a t r i x x t * M a t r i x x M a t r i x x t * M a t r i x y D e s c r i p t i o n L o o p c o u n t e r l o o p c o u n t e r N u m b e r o f c o l u m n s i n m a t r i x x OC 3 3 8 n c o l y N u m b e r o f c o l u m n s i n v e c t o r y n u m p t N u m b e r o f ( x , y ) d a t a p a i r s D . 3 . 2 F O R T R A N P r o g r a m L I N R E G . F O R c : * * * * * * * * * * * * * * * * * * # * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * P R O G R A M L I N R E G . F O R * * * * * * * * * # * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * t * * * * * * * ¥ * * * * * * * * * * * * * * * * * * * C C L i n e a r R e g r e s s i o n P r o g r a m C C i n t e g e r n u m p t , n c o l x , n c o l y , i , j p a r a m e t e r ( n u m p t = — 2 4 9 , n c o l x = 1 1 , n c o l y = 1 ) d o u b l e p r e c i s i o n x ( n u m p t , n c o l x ) , y ( n u m p t , n c O I Y ) . x t ( n c o l x , n u m p t ) d o u b l e p r e c i s i o n x t x ( n c o l x , n c o l x ) , x t y ( n c o l x , n c o l y ) d o u b l e p r e c i s i o n x t i n v ( n c o l x , n c o l x ) , b ( n c o l x , n c o l y ) d o u b l e p r e c i s i o n b t ( n c o l y , n c o l x ) , y t ( n c o l y , n u m p t ) d o u b l e p r e c i s i o n S ( 1 , l ) , s m ( l , 1 ) , e ( n u m p t , n c o l y ) d o u b l e p r e c i s i o n y p r e d ( n u m p t , n c o l Y ) , s u m , r e l , m s e o p e n ( 2 , fi l e = ’ d a t a . c s v ’ , s t a t u s = ’ o l d ’ ) o p e n ( l , fi l e = ’ r e s u l t s ’ , s t a t u s = ’ n e w ’ ) d o 1 0 i = 1 , n u m p t r e a d ( 2 , * ) ( X ( i . j ) . j = 1 . 1 1 0 0 1 1 1 ) 1 0 c o n t i n u e d o 2 0 1 = l , n u m p t r e a d ( 2 , * ) y ( i , n c o l y ) 2 0 c o n t i n u e c l o s e ( 2 ) c a l l t r a n s ( x , x t , n u m p t , n c o l x ) c a l l m u l t ( x t , x , x t x , n c o l x , n u m p t , n u m p t , n c o l x , n c o l x , n c o l x ) c a l l i n v e r s ( x t x , x t i n v , n c o l x ) c a l l m u l t ( x t , y , x t y , n c o l x , n u m p t , n u m p t , n c o l y , n c o l x , n c o l y ) c a l l m u l t ( x t i n v , x t y , b , n c o l x , n c o l x , n c o l x , n c o l y , n c o l x , n c o l y ) c a l l t r a n s ( b , b t , n c o l x , n c o l y ) c a l l t r a n s ( y , y t , n u m p t , n c o l y ) c a l l m u l t ( y t , y , s , n c o l y , n u m p t , n u m p t , n c o l y , 1 , l ) c a l l m u l t ( b t , x t y , s m , n c o l y , n c o l x , n c o l x , n c o l y , 1 , 1 ) c a l l m u l t ( x , b , y p r e d , n u m p t , n c o l x , n c o l x , n c o l y , n u m p t , n c o l y ) s u m = 0 . d 0 d o 3 0 1 = 1 , n u m p t e ( i , l ) = a b s ( y ( i , 1 ) - y p r e d ( i , 1 ) ) / y ( i , 1 ) s u m = s u m + e ( i , 1 ) 3 0 c o n t i n u e s u m = s u m / n u m p t * 1 0 0 . d 0 m s e = ( ( s ( l , 1 ) - s m ( 1 , 1 ) ) / ( n u m p t - n c o l x ) ) * * . 5 d 0 r e l = ( ( S ( 1 , 1 ) - s = m ( 1 , 1 ) ) / s ( 1 , 1 ) ) * * . 5 d 0 w r i t e ( l , * ) ’ b c a l l p r i n t ( b , n c o l x , n c o l y ) w r i t e ( L " ) w r i t e ( 1 . * ) ’ S = ’ , S ( 1 . 1 ) w r i t e ( l , * ) ’ S m = ’ , s m ( l , l ) 3 3 9 w r i t e ( l , * ) ’ M S E = ’ , m s e w r i t e ( l , * ) ’ R E L = ’ , r e l w r i t e ( l , * ) ’ % D I F F = ’ , s u m c l o s e ( l ) s t o p e n d c c * * * M U L T I P L I C A T I O N S U B R O U T I N E * * * c s u b r o u t i n e m u l t ( a , b , c , r a , c a , r b , c b , r c , c c ) i n t e g e r r a , r b , r c , c a , c b , c c , i , j , k d o u b l e p r e c i s i o n s u m , a ( r a , c a ) , b ( r b , c b ) , c ( r c , c c ) d o 1 0 1 = 1 , r a d o 2 0 j = 1 , c h s u m = 0 . d 0 d o 3 0 k = 1 , c a s u m = s u m + ( a ( i , k ) * b ( k , j ) ) 3 0 c o n t i n u e c ( i , j ) = s u m 2 0 c o n t i n u e 1 0 c o n t i n u e r e t u r n e n d c c * * * T R A N S P O S E S U B R O U T I N E * * * c s u b r o u t i n e t r a n s ( a , b , r a , c a ) i n t e g e r r a , c a , i , j d o u b l e p r e c i s i o n a ( r a , c a ) , b ( c a , r a ) d o 1 0 i = 1 , r a d o 2 9 . 1 = 1 . . . b ( r , 1 ) = a ( 1 . 1 ) 2 0 c o n t r n u e 1 0 c o n t i n u e r e t u r n e n d c c * * * I N V E R S I O N S U B R O U T I N E * * * c c * * N o t e : I f n c o l x > 1 0 , c h a n g e t h e d i m e n s i o n s o f t h e m a t r i x 1 t o : c r ( n c o l x , 2 * n c o l x ) c s u b r o u t i n e i n v e r s ( a , b , c ) i n t e g e r c , i , j , k d o u b l e p r e c i s i o n a ( c , c ) , b ( c , c ) , r ( 2 0 , 4 0 ) , c o n s t d o 1 0 1 = 1 , e d o 2 0 j = 1 , c r ( i J ) = a ( i . j ) i f ( 1 . . e q j ) t h e n r ( 1 , j + c ) 1 . d 0 e l s e r ( i , j + ¢ ) = 0 . d 0 e n d i f é ' 1 3 4 0 2 0 c o n t i n u e 1 0 c o n t i n u e d o 3 0 k = l , e d o 4 0 i = k , e d o 5 0 j = 2 * c , l , - 1 r ( i J ) = r ( i . J ' ) / r ( i , k ) 5 0 c o n t i n u e 4 0 c o n t i n u e i f ( k . . c ) t h e n g o t o 0 e n d i f d o 6 0 i = k + l , c d o 7 . 0 . j = . 1 1 2 " : . r ( l g ) = r ( 1 . J ) - r ( k . r ) 7 0 c o n t r n u e 6 0 c o n t i n u e 3 0 c o n t i n u e d o 8 0 k = 2 , c d o 9 0 i = l , k — l i f ( ( r ( i , k ) - r ( i , k ) * r ( k , k ) ) . e q . 0 . d 0 ) t h e n c o n s t = 1 . d 0 e l s e c o n s t = - 1 . d 0 e n d i f d o 1 0 0 j = 2 * c , k , - l r ( i , j ) = r ( i , j ) - c o n s t * r ( i , k ) * r ( k , j ) 1 0 0 c o n t r n u e 9 0 c o n t i n u e 8 0 c o n t i n u e d o 1 1 0 i = 1 , e d o 1 2 0 j = l , c b ( i , j ) = r ( i , j + c ) 1 2 0 c o n t i n u e 1 1 0 c o n t i n u e r e t u r n e n d c c * * * P R I N T S U B R O U T I N E * * * c s u b r o u t i n e p r i n t ( a , r a , c a ) i n t e g e r r a , c a , i , j d o u b l e p r e c i s i o n a ( r a , c a ) d o 1 0 i = 1 , r a w r i t e ( l , * ) ( a ( i J ) . j = l . c a ) 1 0 c o n t i n u e r e t u r n e n d A P P E N D I X E T A B U L A T E D D A T A T a b l e E . 1 : D a t a f o r F i g u r e 5 . 4 . 3 4 1 [ H 2 0 2 ] i n M e m b r a n e ( m M ) x / l . 0 0 2 m i n . 0 0 5 m i n . 0 1 0 m i n . 0 2 0 m i n . 0 4 0 m i n 0 . 0 0 0 . 0 5 0 . 1 0 0 . 1 5 0 . 2 0 0 . 2 5 0 . 3 0 0 . 3 5 0 . 4 0 0 . 4 5 0 . 5 0 0 . 5 5 0 . 6 0 0 . 6 5 0 . 7 0 0 . 7 5 0 . 8 0 0 . 8 5 0 . 9 0 0 . 9 5 1 . 0 0 5 0 . 0 1 3 3 5 . 5 0 9 2 2 . 8 5 9 1 3 . 2 3 7 6 . 8 5 5 3 . 1 6 3 1 . 3 0 0 0 . 4 8 1 0 . 1 6 6 0 . 0 6 1 0 . 0 3 2 0 . 0 3 1 0 . 0 5 0 0 . 1 1 2 0 . 2 7 6 0 . 6 4 9 1 . 3 8 7 2 . 6 6 4 4 . 5 8 8 7 . 1 1 8 1 0 . 0 1 9 5 0 . 0 0 9 4 0 . 7 1 1 3 1 . 9 1 1 2 4 . 0 2 9 1 7 . 3 4 9 1 1 . 9 9 2 7 . 9 2 9 5 . 0 1 8 3 . 0 5 6 1 . 8 2 6 1 . 1 3 7 0 . 8 4 4 0 . 8 5 5 1 . 1 2 7 1 . 6 4 9 2 . 4 3 5 3 . 4 9 4 4 . 8 2 5 6 . 3 9 9 8 . 1 5 9 1 0 . 0 1 8 5 0 . 0 0 4 4 3 . 4 1 1 3 7 . 0 0 0 3 0 . 9 4 1 2 5 . 3 7 6 2 0 . 4 1 3 1 6 . 1 2 1 1 2 . 5 3 0 9 . 6 3 5 7 . 4 0 5 5 . 7 8 8 4 . 7 2 3 4 . 1 4 4 3 . 9 8 8 4 . 1 9 2 4 . 7 0 1 5 . 4 6 1 6 . 4 2 3 7 . 5 3 6 8 . 7 5 1 1 0 . 0 1 7 4 9 . 9 9 7 4 5 . 4 3 7 4 0 . 9 4 7 3 6 . 5 9 8 3 2 . 4 5 3 2 8 . 5 6 9 2 4 . 9 9 4 2 1 . 7 6 4 1 8 . 9 0 6 1 6 . 4 3 5 1 4 . 3 5 4 1 2 . 6 5 9 1 1 . 3 3 2 1 0 . 3 5 1 9 . 6 8 5 9 . 2 9 7 9 . 1 4 8 9 . 1 9 2 9 . 3 8 4 9 . 6 7 5 1 0 . 0 1 6 4 9 . 9 8 8 4 6 . 9 8 3 4 4 . 0 0 3 4 1 . 0 7 2 3 8 . 2 1 3 3 5 . 4 4 8 3 2 . 7 9 6 3 0 . 2 7 2 2 7 . 8 9 0 2 5 . 6 5 9 2 3 . 5 8 5 2 1 . 6 6 8 1 9 . 9 0 7 1 8 . 2 9 6 1 6 . 8 2 5 1 5 . 4 8 1 1 4 . 2 4 8 1 3 . 1 0 7 1 2 . 0 3 6 1 1 . 0 1 4 1 0 . 0 1 7 4 9 . 9 8 2 4 7 . 5 7 3 4 5 . 1 7 3 4 2 . 7 9 4 4 0 . 4 4 4 3 8 . 1 3 2 3 5 . 8 6 5 3 3 . 6 5 2 3 1 . 4 9 5 2 9 . 4 0 1 2 7 . 3 7 0 2 5 . 4 0 4 2 3 . 5 0 2 2 1 . 6 6 2 1 9 . 8 8 0 1 8 . 1 5 0 1 6 . 4 6 6 1 4 . 8 2 0 1 3 . 2 0 3 1 1 . 6 0 7 1 0 . 0 2 0 4 9 . 9 7 6 4 7 . 8 1 0 4 5 . 6 4 9 4 3 . 4 9 5 4 1 . 3 5 3 3 9 . 2 2 7 3 7 . 1 1 9 3 5 . 0 3 3 3 2 . 9 7 0 3 0 . 9 3 3 2 8 . 9 2 2 2 6 . 9 3 7 2 4 . 9 7 9 2 3 . 0 4 6 2 1 . 1 3 7 1 9 . 2 4 9 1 7 . 3 8 0 1 5 . 5 2 7 1 3 . 6 8 6 1 1 . 8 5 3 1 0 . 0 2 5 . 0 6 0 m i n . 0 8 0 m i n . 5 0 0 m i n 4 9 . 8 7 4 4 7 . 8 8 7 4 5 . 9 0 0 4 3 . 9 1 2 4 1 . 9 2 5 3 9 . 9 3 8 3 7 . 9 5 0 3 5 . 9 6 3 3 3 . 9 7 5 3 1 . 9 8 8 3 0 . 0 0 0 2 8 . 0 1 2 2 6 . 0 2 5 2 4 . 0 3 7 2 2 . 0 5 0 2 0 . 0 6 2 1 8 . 0 7 5 1 6 . 0 8 8 1 4 . 1 0 0 1 2 . 1 1 3 1 0 . 1 2 6 3 4 2 T a b l e 1 3 . 2 : D a t a f o r F i g u r e 5 . 5 . L e fl - H a n d - S i d e ( l h s ) f o r [ H Z O Z ] A 0 o f t i m e ( m i n ) 5 0 m M 5 0 0 m M 1 0 0 0 m M 2 5 0 0 m M 5 0 0 0 m M 0 . 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 1 . 0 1 . 6 1 3 2 . 0 3 . 6 1 6 1 . 9 7 6 2 . 2 4 2 2 . 4 8 8 2 . 3 1 9 2 . 0 2 . 1 7 8 2 . 3 4 9 1 . 8 9 4 2 . 3 3 3 2 . 0 1 . 8 4 1 1 . 5 4 5 2 . 1 5 6 1 . 9 9 3 2 . 0 1 . 5 7 7 1 . 8 5 4 4 . 0 4 . 1 8 8 8 . 0 7 . 3 9 8 7 . 4 5 2 8 . 2 8 1 9 . 8 8 4 8 . 8 4 0 8 . 0 7 . 9 6 3 8 . 5 1 6 8 . 3 5 7 8 . 8 7 5 8 . 0 5 . 6 2 9 6 . 1 9 5 7 . 5 0 9 9 . 0 0 0 8 . 6 8 7 8 . 0 6 . 9 8 5 8 . 2 3 9 1 2 . 0 9 . 5 5 5 1 1 . 3 4 1 1 3 . 2 3 4 1 5 . 4 5 2 1 4 . 4 6 6 1 2 . 0 1 0 . 9 0 4 1 1 . 5 8 9 1 2 . 5 9 4 1 4 . 5 8 6 1 5 . 1 9 2 1 2 . 0 9 . 1 2 3 1 2 . 0 1 9 1 4 . 8 3 7 1 4 . 0 7 6 1 2 . 0 1 0 . 6 8 7 1 4 . 0 9 3 2 4 . 0 2 8 . 0 7 9 2 4 . 2 3 2 2 6 . 1 4 5 3 4 3 T a b l e E . 3 : D a t a f o r F i g u r e 5 . 6 . t i m e ( m i n ) l b s 0 . 0 0 0 . 0 0 0 0 0 8 4 . 0 0 - 0 . 0 1 1 5 0 1 3 9 . 5 0 - 0 . 0 1 7 6 4 2 9 0 . 5 2 - 0 . 0 3 8 5 6 3 0 0 . 0 0 T a b l e E . 4 : D a t a f o r F i g u r e 5 . 7 . D “ 7 f o r [ V A ] V A ( m M ) ( c m ’ l m i n ) 4 8 . 0 4 . 5 2 0 1 3 - 0 5 4 8 . 0 4 . 8 5 0 E - 0 5 4 8 . 0 3 . 2 7 0 E - 0 5 4 8 . 0 4 . 4 9 0 E - 0 5 4 8 . 0 4 . 2 9 0 E - 0 5 4 8 . 0 4 . 0 3 O E - 0 5 4 8 . 0 4 . 7 5 0 5 — 0 5 9 6 . 0 3 . 3 7 0 E - 0 5 9 6 . 0 3 . 5 7 0 E - 0 5 9 6 . 0 3 . 8 4 0 E - 0 5 9 6 . 0 4 . 4 2 0 E - 0 5 9 6 . 0 3 . 5 0 0 E - 0 5 9 6 . 0 4 . 6 8 0 E - 0 5 2 4 0 . 0 2 . 8 5 0 E - 0 5 2 4 0 . 0 4 . 2 0 0 E - 0 5 4 8 0 . 0 2 . 8 6 O E - 0 5 4 8 0 . 0 2 . 8 0 0 1 3 - 0 5 4 8 0 . 0 ' 2 . 9 9 0 5 - 0 5 4 8 0 . 0 3 . 2 0 0 E - 0 5 4 8 0 . 0 3 . 3 8 0 E - 0 5 4 8 0 . 0 2 . 9 5 0 E - 0 5 4 8 0 . 0 3 . 3 3 0 E - 0 5 7 2 0 . 0 2 . 1 0 0 1 3 - 0 5 3 4 4 D “ f o r [ V A ] V A ( m M ) ( c m ’ l m i n ) 7 2 0 . 0 2 . 0 6 0 E - 0 5 7 2 0 . 0 2 . 1 3 0 E - 0 5 7 2 0 . 0 2 2 2 0 1 3 - 0 5 7 2 0 . 0 2 . 1 2 0 E - 0 5 9 6 0 . 0 1 . 6 4 0 E - 0 5 9 6 0 . 0 1 . 7 3 0 E - 0 5 9 6 0 . 0 1 . 5 7 0 E - 0 5 9 6 0 . 0 1 . 6 0 0 5 - 0 5 9 6 0 . 0 1 . 5 9 0 E - 0 5 1 4 4 0 . 0 1 . 0 3 0 E - 0 5 1 4 4 0 . 0 1 . 3 4 O E - 0 5 1 4 4 0 . 0 1 3 2 0 1 3 - 0 5 1 4 4 0 . 0 1 0 2 0 1 3 - 0 5 1 4 4 0 . 0 1 . 1 3 O E - 0 5 1 4 4 0 . 0 1 . 2 1 0 E - 0 5 1 4 4 0 . 0 1 . 1 2 0 E - 0 5 1 4 4 0 . 0 1 . 2 6 0 E - 0 5 1 4 4 0 . 0 1 . 2 6 O E - 0 5 1 4 4 0 . 0 1 . 2 8 0 E - 0 5 2 4 0 0 . 0 1 . 0 8 0 E - 0 5 2 4 0 0 . 0 1 . 0 8 0 E - 0 5 2 4 0 0 . 0 5 6 0 0 1 5 - 0 6 2 4 0 0 . 0 5 . 6 0 0 E - 0 6 T a b l e 1 3 . 5 : D a t a f o r F i g u r e 5 . 8 . 3 4 5 [ V A ] i n M e m b r a n e ( m M ) x / l . 0 1 0 m i n . 0 2 0 m i n . 0 4 0 m i n . 0 6 0 m i n . 0 8 0 m i n . 1 0 0 m i r 1 . 5 0 0 m i r 1 2 . 0 0 m i n 0 . 0 0 0 . 0 5 0 . 1 0 0 . 1 5 0 . 2 0 0 . 2 5 0 . 3 0 0 . 3 5 0 . 4 0 0 . 4 5 0 . 5 0 0 . 5 5 0 . 6 0 0 . 6 5 0 . 7 0 0 . 7 5 0 . 8 0 0 . 8 5 0 . 9 0 0 . 9 5 1 . 0 0 9 6 . 0 2 0 7 1 . 3 3 3 4 9 . 1 4 4 3 1 . 2 1 9 1 8 . 2 0 6 9 . 7 1 4 4 . 7 3 5 2 . 1 1 0 0 . 8 6 7 0 . 3 4 0 0 . 1 4 5 0 . 0 9 5 0 . 1 2 7 0 . 2 4 5 0 . 5 0 6 1 . 0 0 4 1 . 8 5 3 3 . 1 5 4 4 . 9 4 7 7 . 1 6 5 9 . 6 3 4 9 6 . 0 1 3 7 8 . 4 0 3 6 1 . 7 1 1 4 6 . 7 1 6 3 3 . 9 4 9 2 3 . 6 4 8 1 5 . 7 7 2 1 0 . 0 7 2 6 . 1 7 2 3 . 6 6 7 2 . 1 8 1 1 . 4 1 5 1 . 1 5 9 1 . 2 8 2 1 . 7 2 0 2 . 4 4 4 3 . 4 4 7 4 . 7 1 1 6 . 2 0 6 7 . 8 7 3 9 . 6 3 3 9 6 . 0 0 4 8 3 . 5 1 0 7 1 . 3 5 0 5 9 . 8 3 3 4 9 . 2 2 0 3 9 . 7 0 8 3 1 . 4 2 3 2 4 . 4 1 6 1 8 . 6 7 4 1 4 . 1 3 0 1 0 . 6 8 1 8 . 2 0 0 6 . 5 5 1 5 . 6 0 1 5 . 2 2 6 5 . 3 1 5 5 . 7 6 9 6 . 5 0 2 7 . 4 3 7 8 . 5 0 2 9 . 6 3 3 9 5 . 9 9 7 8 5 . 8 2 9 7 5 . 8 4 9 6 6 . 2 3 5 5 7 . 1 4 7 4 8 . 7 2 2 4 1 . 0 6 4 3 4 . 2 4 6 2 8 . 3 0 7 2 3 . 2 5 4 1 9 . 0 6 8 1 5 . 7 0 3 1 3 . 0 9 9 1 1 . 1 7 9 9 . 8 6 0 9 . 0 5 3 8 . 6 7 0 8 . 6 2 2 8 . 8 2 2 9 . 1 8 6 9 . 6 3 2 9 5 . 9 9 1 8 7 . 2 5 1 7 8 . 6 3 6 7 0 . 2 6 6 6 2 . 2 5 4 5 4 . 6 9 6 4 7 . 6 7 6 4 1 . 2 5 7 3 5 . 4 8 3 3 0 . 3 7 8 2 5 . 9 4 7 2 2 . 1 7 6 1 9 . 0 3 6 1 6 . 4 8 5 1 4 . 4 6 7 1 2 . 9 2 0 1 1 . 7 7 2 1 0 . 9 4 9 1 0 . 3 7 3 9 . 9 6 1 9 . 6 3 2 9 5 . 9 8 6 8 8 . 2 4 0 8 0 . 5 8 4 7 3 . 1 0 7 6 5 . 8 9 1 5 9 . 0 1 0 5 2 . 5 2 9 4 6 . 4 9 9 4 0 . 9 6 1 3 5 . 9 3 8 3 1 . 4 4 4 2 7 . 4 7 6 2 4 . 0 1 9 2 1 . 0 4 6 1 8 . 5 1 9 1 6 . 3 9 2 1 4 . 6 1 0 1 3 . 1 1 1 1 1 . 8 2 9 1 0 . 6 9 4 9 . 6 3 2 9 5 . 9 2 3 9 1 . 5 7 7 8 7 . 2 3 2 8 2 . 8 8 9 7 8 . 5 4 7 7 4 . 2 0 9 6 9 . 8 7 4 6 5 . 5 4 4 6 1 . 2 1 8 5 6 . 8 9 7 5 2 . 5 8 2 4 8 . 2 7 2 4 3 . 9 6 7 3 9 . 6 6 8 3 5 . 3 7 3 3 1 . 0 8 3 2 6 . 7 9 7 2 2 . 5 1 4 1 8 . 2 3 3 1 3 . 9 5 5 9 . 6 7 8 9 5 . 7 2 0 9 1 . 4 2 9 8 7 . 1 3 7 8 2 . 8 4 6 7 8 . 5 5 4 7 4 . 2 6 2 6 9 . 9 7 0 6 5 . 6 7 7 6 1 . 3 8 5 5 7 . 0 9 2 5 2 . 8 0 0 4 8 . 5 0 8 4 4 . 2 1 5 3 9 . 9 2 3 3 5 . 6 3 0 3 1 . 3 3 8 2 7 . 0 4 6 2 2 . 7 5 4 1 8 . 4 6 3 1 4 . 1 7 1 9 . 8 8 0 T a b l e E . 6 : D a t a f o r F i g u r e 5 . 9 . 3 4 6 [ V A ] i n M e m b r a n e ( m M ) # 1 . 0 1 0 m i n . 0 2 0 m i n . 0 4 0 m i n . 0 6 0 m i n . 0 8 0 m i n . 1 0 0 m i n . 5 0 0 m i n 2 . 0 0 m i n 0 . 0 0 0 . 0 5 0 . 1 0 0 . 1 5 0 . 2 0 0 . 2 5 0 . 3 0 0 . 3 5 0 . 4 0 0 . 4 5 0 . 5 0 0 . 5 5 0 . 6 0 0 . 6 5 0 . 7 0 0 . 7 5 0 . 8 0 0 . 8 5 0 . 9 0 0 . 9 5 1 . 0 0 9 6 . 0 2 8 4 7 . 3 3 2 1 6 . 3 6 0 3 . 8 3 6 0 . 6 1 8 0 . 0 9 4 0 . 0 3 9 0 . 0 3 6 0 . 0 3 6 0 . 0 3 6 0 . 0 3 6 0 . 0 3 6 0 . 0 3 6 0 . 0 3 6 0 . 0 3 6 0 . 0 4 2 0 . 0 9 4 0 . 4 1 6 1 . 6 6 8 4 . 7 6 5 9 . 6 3 5 9 6 . 0 2 5 6 0 . 2 8 1 3 1 . 9 0 1 1 4 . 0 1 2 5 . 0 6 0 1 . 5 0 3 0 . 3 8 2 0 . 1 0 1 0 . 0 4 6 0 . 0 3 7 0 . 0 3 6 0 . 0 3 6 0 . 0 3 7 0 . 0 4 2 0 . 0 7 0 0 . 1 8 2 0 . 5 3 8 1 . 4 3 3 3 . 2 2 2 6 . 0 6 0 9 . 6 3 5 9 6 . 0 2 1 7 0 . 2 5 9 4 7 . 3 2 9 2 9 . 1 6 5 1 6 . 3 5 9 8 . 3 2 3 3 . 8 3 5 1 . 6 0 5 0 . 6 1 9 0 . 2 3 1 0 . 0 9 9 0 . 0 7 1 0 . 0 9 8 0 . 1 9 3 0 . 4 1 6 0 . 8 6 4 1 . 6 6 8 2 . 9 4 9 4 . 7 6 5 7 . 0 5 8 9 . 6 3 4 9 6 . 0 1 7 7 4 . 8 4 8 5 5 . 2 5 4 3 8 . 5 0 7 2 5 . 2 4 2 1 5 . 5 3 0 8 . 9 5 2 4 . 8 3 2 2 . 4 4 8 1 . 1 8 0 0 . 5 7 4 0 . 3 4 6 0 . 3 5 1 0 . 5 4 1 0 . 9 3 6 1 . 5 8 8 2 . 5 5 7 3 . 8 8 3 5 . 5 5 9 7 . 5 1 7 9 . 6 3 4 9 6 . 0 1 4 7 7 . 6 2 2 6 0 . 2 7 6 4 4 . 8 4 5 3 1 . 9 0 0 2 1 . 6 5 8 1 4 . 0 1 7 8 . 6 4 6 5 . 0 9 4 2 . 8 9 7 1 . 6 5 0 1 . 0 4 7 0 . 8 8 4 1 . 0 5 0 1 . 4 9 9 2 . 2 2 4 3 . 2 3 2 4 . 5 2 0 6 . 0 6 1 7 . 7 9 5 9 . 6 3 4 9 6 . 0 1 2 7 9 . 5 3 1 6 3 . 8 0 3 4 9 . 4 8 4 3 7 . 0 4 5 2 6 . 7 3 6 1 8 . 5 8 8 1 2 . 4 5 1 8 . 0 5 8 5 . 0 8 3 3 . 2 0 9 2 . 1 5 8 1 . 7 1 5 1 . 7 3 3 2 . 1 1 8 2 . 8 1 4 3 . 7 8 6 5 . 0 0 2 6 . 4 2 1 7 . 9 8 8 9 . 6 3 3 9 5 . 9 8 3 8 8 . 7 8 8 8 1 . 6 6 7 7 4 . 6 9 2 6 7 . 9 3 1 6 1 . 4 4 5 5 5 . 2 8 9 4 9 . 5 0 7 4 4 . 1 3 3 3 9 . 1 9 2 3 4 . 6 9 6 3 0 . 6 4 6 2 7 . 0 3 2 2 3 . 8 3 4 2 1 . 0 2 2 1 8 . 5 5 7 1 6 . 3 9 4 1 4 . 4 7 9 1 2 . 7 5 6 1 1 . 1 6 2 9 . 6 3 3 9 5 . 9 2 8 9 1 . 5 6 1 8 7 . 1 9 5 8 2 . 8 3 1 7 8 . 4 7 1 7 4 . 1 1 6 6 9 . 7 6 6 6 5 . 4 2 4 6 1 . 0 9 0 5 6 . 7 6 4 5 2 . 4 4 6 4 8 . 1 3 7 4 3 . 8 3 7 3 9 . 5 4 5 3 5 . 2 6 1 3 0 . 9 8 4 2 6 . 7 1 3 2 2 . 4 4 8 1 8 . 1 8 7 1 3 . 9 2 9 9 . 6 7 2 T a b l e E . 7 : D a t a f o r F i g u r e 5 . 1 0 . 3 4 7 [ V A ] 1 1 ( m M ) ( G P ) 0 . 0 0 0 0 . 6 4 9 1 1 0 . 6 1 4 0 . 6 5 2 2 4 6 . 8 5 3 0 . 6 6 8 9 9 6 . 4 3 2 0 . 6 7 6 0 4 8 0 . 0 5 8 0 . 8 7 5 1 7 2 0 . 0 0 0 1 . 0 0 0 0 9 6 1 . 9 2 0 1 . 0 8 2 9 1 4 4 0 . 0 0 0 1 . 4 7 2 1 1 9 1 5 . 3 9 2 1 . 8 4 3 8 2 3 9 5 . 0 0 8 2 . 4 7 2 5 3 4 8 T a b l e 1 1 . 8 : D a t a f o r F i g u r e 5 . 1 1 . L e fi - H a n d - S i d e f o r W M » o f t i m e ( m i n ) 4 8 m M 9 6 m M 4 8 0 m M 7 2 0 m M 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 0 . 0 0 0 0 0 . 0 0 0 0 0 . 0 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 0 . 0 0 0 0 0 . 0 0 0 0 0 . 0 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 0 . 0 0 0 0 0 . 0 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 0 . 0 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 4 . 0 0 0 0 . 2 1 9 0 0 . 1 6 7 5 4 . 0 0 0 0 . 1 0 0 3 0 . 1 9 6 4 0 . 1 8 0 5 4 . 0 0 0 0 . 2 2 2 3 0 . 1 9 9 4 4 . 0 0 0 1 0 . 0 0 0 0 . 4 6 0 3 0 . 4 3 1 7 1 0 . 0 0 0 0 . 5 0 8 5 0 . 4 7 0 8 0 . 4 2 5 7 1 0 . 0 0 0 0 . 2 7 8 2 0 . 4 8 5 4 0 . 4 3 3 6 1 0 . 0 0 0 2 3 . 0 8 3 0 . 8 7 3 6 2 3 . 7 5 0 1 . 1 7 8 1 3 0 . 0 0 0 1 . 0 4 0 2 3 0 . 0 0 0 1 . 2 8 4 3 4 0 . 0 0 0 1 . 7 6 9 2 4 0 . 0 0 0 1 . 6 0 1 4 4 5 . 0 0 0 2 . 3 1 3 3 4 5 . 0 0 0 2 . 0 4 9 3 6 0 . 0 0 0 2 . 8 5 5 9 3 . 1 5 4 6 6 0 . 0 0 0 2 . 8 7 6 6 2 . 5 8 5 6 T a b l e E . 9 : D a t a f o r F i g u r e 5 . 1 2 . 3 4 9 [ V A ] ( m M ) r / r ° 0 . 0 1 . 0 0 0 0 1 0 . 0 1 . 0 1 6 8 2 0 . 0 1 . 0 3 3 9 3 0 . 0 1 . 0 5 1 3 4 0 . 0 1 . 0 6 8 9 5 0 . 0 1 . 0 8 6 9 6 0 . 0 1 . 1 0 5 2 7 0 . 0 1 . 1 2 3 7 8 0 . 0 1 . 1 4 2 6 9 0 . 0 1 . 1 6 1 8 1 0 0 . 0 1 . 1 8 1 4 1 1 0 . 0 1 . 2 0 1 2 1 2 0 . 0 1 . 2 2 1 4 1 3 0 . 0 1 . 2 4 1 9 1 4 0 . 0 1 . 2 6 2 8 1 5 0 . 0 1 . 2 8 4 0 1 6 0 . 0 1 . 3 0 5 6 1 7 0 . 0 1 . 3 2 7 5 1 8 0 . 0 1 . 3 4 9 9 1 9 0 . 0 1 . 3 7 2 5 2 0 0 . 0 1 . 3 9 5 6 2 1 0 . 0 1 . 4 1 9 1 2 2 0 . 0 1 . 4 4 2 9 2 3 0 . 0 1 . 4 6 7 2 2 4 0 . 0 1 . 4 9 1 8 2 5 0 . 0 1 . 5 1 6 9 [ V A ] ( m M ) r / r " 2 6 0 . 0 1 . 5 4 2 4 2 7 0 . 0 1 . 5 6 8 3 2 8 0 . 0 1 . 5 9 4 7 2 9 0 . 0 1 . 6 2 1 5 V 3 0 0 . 0 1 . 6 4 8 7 3 1 0 . 0 1 . 6 7 6 4 3 2 0 . 0 1 . 7 0 4 6 3 3 0 . 0 1 . 7 3 3 3 3 4 0 . 0 1 . 7 6 2 4 3 5 0 . 0 1 . 7 9 2 0 3 6 0 . 0 1 . 8 2 2 1 3 7 0 . 0 1 . 8 5 2 7 3 8 0 . 0 1 . 8 8 3 9 3 9 0 . 0 1 . 9 1 5 5 4 0 0 . 0 1 . 9 4 7 7 4 1 0 . 0 1 . 9 8 0 5 4 2 0 . 0 2 . 0 1 3 8 4 3 0 . 0 2 . 0 4 7 6 4 4 0 . 0 2 . 0 8 2 0 4 5 0 . 0 2 . 1 1 7 0 4 6 0 . 0 2 . 1 5 2 6 4 7 0 . 0 2 . 1 8 8 8 4 8 0 . 0 2 . 2 2 5 5 4 9 0 . 0 2 . 2 6 2 9 5 0 0 . 0 2 . 3 0 1 0 5 1 0 . 0 2 . 3 3 9 6 [ V A ] ( m M ) r / r ° 5 2 0 . 0 2 . 3 7 9 0 5 3 0 . 0 2 . 4 1 8 9 5 4 0 . 0 2 . 4 5 9 6 5 5 0 . 0 2 . 5 0 0 9 5 6 0 . 0 2 . 5 4 3 0 5 7 0 . 0 2 . 5 8 5 7 5 8 0 . 0 2 . 6 2 9 2 5 9 0 . 0 2 . 6 7 3 4 6 0 0 . 0 2 . 7 1 8 3 6 1 0 . 0 2 . 7 6 4 0 6 2 0 . 0 2 . 8 1 0 4 6 3 0 . 0 2 . 8 5 7 7 6 4 0 . 0 2 . 9 0 5 7 6 5 0 . 0 2 . 9 5 4 5 6 6 0 . 0 3 . 0 0 4 2 6 7 0 . 0 3 . 0 5 4 7 6 8 0 . 0 3 . 1 0 6 0 6 9 0 . 0 3 . 1 5 8 2 7 0 0 . 0 3 . 2 1 1 3 7 1 0 . 0 3 . 2 6 5 2 7 2 0 . 0 3 . 3 2 0 1 3 5 0 T a b l e E . 1 0 : D a t a f o r F i g u r e 5 . 1 3 . 1 2 0 1 . 2 [ L I P J J V [ 1 1 2 0 1 ] . l ( 1 1 m m ( m M ‘ ) 2 0 5 2 . 4 2 5 . 8 9 6 1 7 3 0 . 9 1 7 . 4 9 7 1 4 6 6 . 0 1 7 . 4 9 7 1 5 1 2 . 3 1 7 . 4 9 7 1 5 1 2 . 3 1 2 . 9 5 2 1 3 6 8 . 3 1 2 . 9 5 2 1 3 6 8 . 3 1 2 . 9 5 2 1 2 8 2 . 7 1 0 . 3 9 6 1 2 7 1 . 4 1 0 . 3 9 6 1 3 6 0 . 5 1 0 . 3 9 6 8 9 2 . 3 4 2 . 0 7 6 7 8 8 4 . 6 5 2 . 0 7 6 7 9 4 5 . 1 8 1 . 0 6 3 4 1 0 2 9 . 1 1 . 0 6 3 4 1 0 4 1 . 1 1 . 0 6 3 4 1 2 4 2 . 8 0 . 5 2 5 0 1 1 7 3 . 7 0 . 5 2 5 0 0 . 5 2 5 0 3 5 1 T a b l e E . 1 1 : D a t a f o r F i g u r e 5 . 1 4 . 1 1 5 4 . 4 [ L I P J J V [ V A T ' ( U m i n / L m M ) ( m M ‘ ) 3 2 1 8 . 3 1 7 . 2 6 7 3 1 6 1 . 3 1 7 . 2 6 7 3 1 6 1 . 3 1 7 . 2 6 7 2 0 4 8 . 2 8 . 6 3 3 4 2 0 4 8 . 2 8 . 6 3 3 4 2 2 0 4 . 8 8 . 6 3 3 4 1 1 6 9 . 4 1 . 7 2 6 7 1 1 3 2 . 6 1 . 7 2 6 7 1 . 7 2 6 7 3 5 2 T a b l e E . 1 2 : D a t a f o r F i g u r e 5 . 1 5 . 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[ 1 1 2 0 2 ] " [ W I P J J V ( m M ‘ ) ( U n fi n / L m M ) 2 5 . 8 9 6 2 6 6 4 . 7 2 5 . 8 9 6 2 7 7 9 . 6 2 5 . 8 9 6 2 6 6 4 . 7 1 2 . 9 5 2 1 7 9 8 . 5 1 2 . 9 5 2 1 5 8 6 . 9 1 0 . 3 9 6 1 5 4 1 . 6 1 0 . 3 9 6 1 5 8 6 . 9 1 0 . 3 9 6 1 5 8 6 . 9 2 . 0 7 6 7 8 7 9 . 7 0 3 5 5 T a b l e E . l S : D a t a f o r F i g u r e 5 . 1 8 . [ 1 1 2 0 2 1 . l [ M N P U V ( m M ' ) ( l J n fi n / L m M ) 9 4 . 4 7 3 1 0 8 2 6 4 7 . 3 1 1 5 8 4 3 . 2 4 7 . 3 1 1 4 7 5 6 . 1 4 7 . 3 1 1 5 0 8 7 . 4 2 3 . 4 0 1 2 5 6 7 . 0 2 3 . 4 0 1 3 3 8 3 . 0 2 3 . 4 0 1 2 9 1 9 . 1 2 3 . 4 0 1 3 3 1 7 . 1 1 5 . 7 0 6 2 0 2 7 . 1 1 5 . 7 0 6 1 8 2 4 . 4 1 1 . 6 6 2 1 5 5 4 . 2 1 1 . 6 6 2 1 5 5 4 . 2 1 1 . 6 6 2 1 6 3 1 . 9 1 1 . 6 6 2 1 6 5 2 . 6 9 . 3 2 8 2 1 2 3 1 . 6 9 . 3 2 8 2 1 3 8 8 . 9 1 . 8 3 5 9 9 8 7 . 1 7 1 . 8 3 5 9 9 8 7 . 1 7 1 . 8 3 5 9 9 8 7 . 1 7 3 5 6 T a b l e E . l 6 : D a t a f o r F i g u r e s 5 . 1 9 8 a n d 5 . 1 % . 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[ M N P ] ( U / L ) f o r A v e r a g e [ M N P Q o a t t i m e 8 9 0 5 1 6 9 4 9 2 6 2 9 2 4 8 6 6 3 ( h r ) ( U / L ) ( U / L ) ( U / L ) ( U / L ) 0 . 0 0 0 8 7 9 3 . 7 1 7 5 8 7 2 8 3 4 2 5 2 5 2 5 0 . 0 0 0 9 0 1 6 . 5 1 6 3 1 0 2 4 2 4 2 4 4 8 0 0 1 . 0 0 0 8 3 9 2 . 7 1 5 7 1 6 2 4 1 0 8 4 1 3 5 4 1 . 0 0 0 8 5 5 6 . 1 1 5 7 4 6 5 5 0 2 0 3 . 0 0 0 7 7 9 8 . 5 1 3 5 7 7 2 4 3 3 1 5 0 9 8 0 3 . 0 0 0 8 3 7 7 . 8 1 6 8 1 5 2 4 3 7 6 5 2 2 8 7 6 . 1 3 3 7 6 3 5 . 1 1 3 1 6 1 2 2 0 1 4 3 7 7 8 9 6 . 1 3 3 7 5 6 0 . 8 1 3 2 2 0 2 4 9 1 1 4 1 2 3 5 A P P E N D I X F F I G U R E S N O T S H O W N I N T E X T e e n a b r o s b A 3 6 1 0 . 8 7 - J 4 0 0 0 3 5 0 0 3 0 0 0 2 5 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 0 W a v e n u m b e r l 1 l c m l F i g u r e F . l : P T I R a b s o r b a n c e s p e c t r u m o f t h e L I P A l o n e , N o r e a g e n t c o n t r o l ( R ' ) n g n i n a f t e r t r e a t m e n t f o r 1 2 h o u r s . e e n a b r o s b A O O # N 3 6 2 . 0 a : 4 0 0 0 3 5 0 0 3 0 0 0 2 5 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 0 W a v e n u m b e r l 1 l e m l F i g u r e F 2 : F I ' I R a b s o r b a n c e s p e c t r u m o f t h e L I P A l o n e , N o L I P c o n t r o l ( E ' ) l i g n i n a f t e r t r e a t m e n t f o r 1 2 h o u r s . 3 6 3 4 0 0 0 3 5 0 0 3 0 0 0 2 5 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 0 W a v e n u m b e r l 1 l c m l F E N F Q : F I ' I R a b s o r b a n c e s p e c t r u m o f t h e L I P A l o n e , A u t o c l a v e d L I P c o n t r o l ( ) l l g m n a f t e r t r e a t m e n t f o r 1 2 h o u r s . 3 6 4 1 q 0 . 1 3 - - g 0 . 6 8 3 o 4 0 2 \ J V 0 I I I I I 4 0 0 0 3 5 0 0 3 0 0 0 2 5 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 0 W a v e n u m b e r 1 1 I c m l F i g u r e F A : F I ' I R a b s o r b a n c e s p e c t r u m o f t h e L I P + M N P , N o r e a g e n t c o n t r o l ( R ' ) l i g n i n a f t e r t r e a t m e n t f o r 1 2 h o u r s . e e n a b r c a b A 4 0 0 0 3 5 0 0 3 0 0 0 F ( i E g ' u ) r l e i F g . n S i : n F f a I t ' e I r R t a r b e n s a o t r m e b n a t c f e o s r p 1 e 2 c t o h 2 r 5 0 0 W a v u r u m s e . 2 0 l 0 1 0 l e m l n u m b e r 1 5 0 0 1 o f t h e L I P + M N P N o L I ’ 0 P 0 0 5 0 0 M N P ’ n o c o n t r o l 3 6 5 ‘ l T 0 . 8 " - 0 . 6 " 0 . 4 - - 0 . 2 - - : 9 a e e n a b r o s b 0 . 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I : l ‘ l ‘ ! ‘ - . i fl l f 1 % 1 1 1 : r . . . 1 1 . v i . 1 1 1 . . 3 4 J 1 1 . . + - . 2 ‘ . 1 I ‘ . ‘ - 5 5 1 . 8 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 “ / 2 F i g u r e F . 1 2 : E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o f 3 , 4 - d i m e t h o h e n o l ( A l d r i c h ) o b t a i n e d f r o m s c a n 5 9 8 ( b a c k g r o u n d a v e r a e o f s c a n s 5 9 6 a n d 6 0 0 5 , o f t h e T I C f r o m a n a u t h e n t i c s t a n d a r d a n a l y z e d w i t h t h e D - 1 C C c o l u m n . T v v 3 7 3 1 0 0 R e 1 8 0 " a r t i v 6 0 * e l A b 4 0 ‘ u 4 n d a 2 0 - 4 n t C 4 e . 0 ' 5 0 5 9 ' 7 3 1 0 0 C O O H 1 5 1 9 1 5 0 1 7 9 1 5 1 3 2 2 3 1 v I v r V ‘ v fi f T v M / Z F i g u r e F . 1 3 : E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o f p - h d r o x y b e n z o i c a c i d ( A l d r i c h ) o b t a i n e d f r o m s c a n 7 4 4 ( b a c k g r o u n d s c a n 7 4 5 ) o f t h e a n a l y z e d w i t h t h e D B - l G C c o l u m n . C f r o m a n a u t h e n t i c s t a n d a r d 3 7 4 0 2 5 5 2 3 0 . R 1 V O H e ‘ 1 1 8 0 ‘ / 1 9 1 a . E 1 2 2 1 1 V 6 0 “ ° 1 H 3 C O O C H 3 A 7 5 b 4 0 ‘ u 4 n 1 d 1 1 8 a 2 0 4 n 4 C . 8 9 1 3 1 0 1 3 1 3 2 ' 5 ° . 5 1 1 9 ” 5 2 9 o . 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 H z F i g u r e F . 1 4 : E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o f 3 , 5 - d i m e t h o x y c i n n a m i c a c i d ( A l d r i c h o b t a i n e d f r o m s c a n 1 0 2 1 ( b a c k g f r o m a n a u t h e n t i c s t a n d a r d a n a l { r o u n d a v e r a g e o f s c a n s 1 0 1 8 a n d 1 0 2 2 ) o f t h e T I l y z e d w i t h t h e D B - l G C c o l u m n . 3 7 5 1 0 0 . 0 1 5 1 2 b 0 V O H R e 1 8 0 1 a . F 1 2 ( 5 1 . ° j O C H 3 2 : 1 1 A b 4 0 ‘ O C H 3 u 4 n d a 2 0 ' n . 7 5 1 7 1 3 c . 1 3 e ‘ 5 1 5 5 8 9 1 2 1 9 1 7 5 2 5 2 9 0 s o 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 a n F i g u r e F . 1 5 : E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o f 3 , 4 - d i m e t h o x y c i n n a m i c a c i d ( A l d r i c h o b t a i n e d f r o m s c a n 1 0 2 0 ( b a c k o u n d a v e r a g e o f s c a n s 1 0 1 8 a n d 1 0 2 2 ) o f t h e T I f r o m a n a u t h e n t i c s t a n d a r d a n y z e d w i t h t h e D B - l G C c o l u m n . 3 7 6 1 0 0 1 0 O H 2 1 9 3 3 0 9 R e 1 3 ° : 2 1 9 a t 1 v 6 0 ‘ 7 3 e 2 4 9 A b 4 0 . 0 1 1 u . n . d > a . 1 I - n 2 0 ‘ 1 7 9 . ° ‘ 1 1 1 1 * e < 1 2 1 5 1 3 1 2 3 ’ 0 s o 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 H / Z F i r e F . 1 6 : E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o f 4 - c o u m a r i c a c i d ( 4 - h y d r o x y c i n n a m i c a c 1 d ; A l d r i c h ) o b t a i n e d f r o m s c a n 9 7 5 ( b a c k g r o u n d a v e r a e o f s c a n s 9 7 2 a n d 9 7 7 ) o f t h e T I C f r o m a n a u t h e n t i c s t a n d a r d a n a l y z e d w i t h t h e D - 1 G C c o l u m n . 3 7 7 1 0 0 3 0 8 0 0 1 1 2 < > 3 R e 1 8 0 ‘ a . t . i . e ‘ O H 2 C 3 . 2 4 9 A b u n d a n c e 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 ” / 2 F i r e F . 1 7 : E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o f 3 - c o u m a r i c a c i d ( 3 - h y d r o x y c i n n a m i c a c l d ; A l d r i c h ) o b t a i n e d f r o m s c a n 9 2 6 ( b a c k g r o u n d a v e r a e o f s c a n s 9 2 3 a n d 9 2 9 ) o f t h e T I C f r o m a n a u t h e n t i c s t a n d a r d a n a l y z e d w i t h t h e D - 1 G C c o l u m n . 3 7 8 1 0 0 , 1 1 9 ‘ b R C H O r e 1 1 8 0 ‘ - a J t 1 i 4 v 6 0 ' 1 O C H 3 2 C 9 e 4 0 H A b 4 o ~ 2 2 4 . U , n 1 d r a 2 0 4 r - n . > 7 3 c ‘ 1 5 1 7 9 I 1 e 4 5 9 8 9 1 1 7 1 1 L L L - - 1 - . 1 1 . 1 1 1 1 . 1 . 1 . 1 1 1 l 1 . . 1 - 1 . 1 1 1 . T 1 3 . l l 1 . w . . I I . ' v 1 I . v I . v r . I . U . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 a n F i g u r e F . 1 8 : E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o f v a n i l l i n ( v a n i l l y l a l d e h y d e ; A l d r i c h ) o b t a i n e d f r o m s c a n 6 4 9 ( b a c k g r o u n d a v e r a e o f s c a n s 6 4 7 a n d 6 5 1 ) o f t h e T I C f r o m a n a u t h e n t i c s t a n d a r d a n a l y z e d w i t h t h e D - 1 G C c o l u m n . W O ‘ - f D ' r ' P C G ’ U C S Q D fi O D ( 3 7 9 4 0 " 2 0 " 0 . 0 H 7 9 2 1 c o l u m n . . 1 1 ‘ , , . 1 1 , 1 1 1 1 . 2 . . . 1 1 3 . 5 1 1 . 1 9 4 1 . 1 1 : ' _ 1 . 1 : . W W A L L ‘ A I A fi . 1 1 . ” v v v v v v v v 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 3 0 0 7 I 2 3 5 0 “ / 2 t r i i fi u m F . 1 9 : E l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r u m o f 1 , 2 , 4 - b e n z e n e t r i o l ( 1 , 2 , 4 - y x y d r o b e n z e n e , A l d r i c h ) o b t a i n e d f r o m s c a n 7 3 2 ( b a c k g r o u n d a v e r a g e o f s c a n s 7 3 0 y a n d 7 3 5 ) o f t h e T I C f r o m a n a u t h e n t i c s t a n d a r d a n a l y z e d w i t h t h e D B - l G C B I B L I O G R A P H Y A d l e r , E . 1 9 7 7 . L i g n i n c h e m i s t r y - p a s t , p r e s e n t , a n d f u t u r e . W o o d S c i . T e c h n o ] . 1 1 : 1 6 9 - 2 1 8 . A i t k e n , M . D . a n d R . L . I r v i n e . 1 9 9 0 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f r e a c t i o n s c a t a l z e d b y m a n g a n e s e p e r o x i d a s e f r o m P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i w n . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 2 7 6 : 4 0 5 - 4 1 4 . A l l e n , D . C . , H . E . G r e t h l e i n a n d A . O . C o n v e r s e . 1 9 8 3 . P r o c e s s s t u d i e s f o r e n z y m a t i c h y d r o l y s i s u s i n g h i g h s o l i d s s l u r r i e s o f a c i d p r e t r e a t e d m i x e d h a r d w o o d . B i a t e c h . B i a e n g . S y m p . 1 3 : 9 9 . A n d e r , P . a n d K . E . E r i k s s o n . 1 9 7 8 . L i g n i n d e g r a d a t i o n a n d u t i l i z a t i o n b y m i c r o o r g a n i s m s . P r a g . I n d . M i c r o b i a l . 1 4 : 1 . A n d e r s s o n , L . A . , V . R e n g a n a t h a n , A . A . C h i u , T . M . L o e h r a n d M . H . G o l d . 1 9 8 5 . S p e c t r a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f a d i a r y l p r o p a n e o x y g e n a s e , a n o v e l p e r o x i d e - d e p e n d e n t , l i g n i n d e g r a d i n g h e m e e n z y m e . J . B i o l . C h e m . 2 6 0 : 6 0 8 0 . A n t a i , S . P . a n d D . L . C r a w f o r d . 1 9 8 1 . D e g r a d a t i o n o f s o f t w o o d , h a r d w o o d , a n d g r a s s l i g n o c e l l u l o s e s b y t w o S t r e p t o m y c e s s t r a i n s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i a l . 4 2 : 3 7 8 - 3 8 0 . B a g b y , M . 0 . , R . L . C u n n i n g h a m a n d R . L . M a l o n e y . 1 9 7 3 . U l t r a v i o l e t s p e c t r a l d e t e r m i n a t i o n o f l i g n i n . T a p p i . 5 6 : 1 6 2 - 1 6 3 . B a i l e y , J . E . a n d D . F . O l l i s . 1 9 8 6 . B i o c h e m i c a l E n g i n e e r i n g F u n d a m e n t a l s , 2 n d e d . M c G r a w - H i l l , I n c . , N e w Y o r k . B a r t u s k a , V . J . , G . E . M a c i e l , H . I . B o l k e r a n d B . I . F l e m i n g . 1 9 8 0 . S t r u c t u r a l s t u d i e s o f l i g n i n i s o l a t i o n p r o c e d u r e s b y l 3 C N M R . H a l z f a r s c h u n g . 3 4 : 2 1 4 - 2 1 7 . B e l l , C . F . 1 9 7 7 . P r i n c i p l e s a n d A p p l i c a t i o n s o f M e t a l C h e l a t i o n . A t k i n s , P . W . , J . S . E . H o l k e r a n d A . K . H o l l i d a y . ( e d s . ) . O x f o r d U n i v e r s i t y P r e s s , N e w Y o r k . B i r d , R . B . , W . E . S t e w a r t , E . N . L i g h t f o o t . 1 9 6 0 . T r a n s p o r t P h e n o m e n a . J o h n W i l e y a n d S o n s , N e w Y o r k . B l a n c h e t t e , R . A . 1 9 8 4 . S c r e e n i n g w o o d d e c a y e d b y w h i t e - r o t f u n g i f o r p r e f e r e n t i a l l i g n i n d e g r a d a t i o n . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i a l . 4 8 : 6 4 7 - 6 5 3 . B l a n c h e t t e , R . A . , A . R . A b a d , R . L . F a r r e l l a n d T . D . L e a t h e r s . 1 9 8 9 . D e t e c t i o n o f l i g n i n p e r o x i d a s e a n d x y l a n a s e b y i m m u n o c y t o c h e m i c a l l a b e l l i n g i n w o o d d e c a y e d b y b a s i d i o m y c e t e s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i a l . 5 5 : 1 4 5 7 - 1 4 6 5 . 3 8 0 3 8 1 B l a n c h e t t e , R . A . a n d I . D . R e i d . 1 9 8 6 . U l t r a s t r u c t u r a l a s p e c t s o f w o o d d e l i g n i fi c a t i o n b y P h l e b i a ( M e n d i u s ) t r e m e l l o s u s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i a l . 5 2 : 2 3 9 - 2 4 5 . B l a u , K . a n d G . S . K i n g ( e d s . ) . 1 9 7 8 . I n H a n d b o o k o f D e r i v a t i v e s f o r C h r o m a t o g r a p h y . H e y d e n , a n d S o n I n c . , P h i l a d e l p h i a , P A . B o n n a r m e , P . a n d T . W . J e f f r i e s . 1 9 9 0 . M n ( I I ) r e g u l a t i o n o f l i g n i n p e r o x i d a s e s a n d m a n g a n e s e - d e p e n d e n t p e r o x i d a s s f r o m l i g i n i n - d e g r a d i n g w h i t e r o t f u n g i . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i a l . 5 6 : 2 1 0 - 2 1 7 . B o o m i n a t h a n , K . a n d C . A . R e d d y . 1 9 9 2 . F u n g a l d e g r a d a t i o n o f l i g n i n : B i o t e c h n o l o g i c a l a p p l i c a t i o n s . I n H a n d b o o k o f A p p l i e d M y c o l o g y . A r o r a , D . K . , R . P . E l a n d e r a n d K . G . M u k e r j i . ( e d s . ) . M a r c e l D e k k e r , N e w Y o r k . 4 : F u n g a l B i o t e c h n o l o g y : 7 6 3 - 8 2 2 . B o n o , J . - J . , P . G o u l a s , J . - F . B o e , N . P o r t e t , a n d J . - L . S e r i s . 1 9 9 0 . E f f e c t o f M n ( I I ) o n r e a c t i o n s c a t a l y z e d b y l i g n i n p e r o x i d a s e f r o m P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o n ’ w n . E u r . J . B i o c h e m . 1 9 2 : 1 8 9 - 1 9 3 . B o o n , J . J . , A . D . P o u w e l s a n d G . B . E i j k e l . 1 9 8 7 . P y r o l y s i s h i g h - r e s o l u t i o n g a s c h r o m a t o g r a p h y - m a s s s p e c t r o m e t r y s t u d i e s o n b e e c h w o o d : c a p i l l a r y h i g h - r e s o l u t i o n m a s s s p e c t r o m e t r y o f a b e e c h l i g n i n f r a c t i o n . B i o c h e m . S o c . T r a n s . 1 5 : 1 7 0 - 1 7 4 . B o u t e l j e , J . a n d I . E r i k s s o n . 1 9 8 4 . A n a l y s i s o f l i g n i n i n f r a g m e n t s f r o m t h e g m g m e c h a n i c a l s p r u c e p u l p b y u l t r a v i o l e t m i c r o s c o p y . H o l z f a r s c h u n g . 3 8 : 4 - 2 5 2 . B o u t e l j e , J . a n d I . E r i k s s o n . 1 9 8 2 . A n U V - m i c r o s c o p y s t u d y o f l i g n i n i n m i d d l e l a m e l l a f r a g m e n t s f r o m fi b e r s o f m e c h a n i c a l p u l p o f s p r u c e . S v e n s k . P a p p e r s t i d n . 8 5 : R 3 9 - R 4 2 . B o y l e , C . D . , B . R . K r o p p a n d I . D . R e i d . 1 9 9 2 . S o l u b i l i z a t i o n a n d m i n e r a l i z a t i o n o f l i g n i n b y w h i t e r o t f u n g i . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i a l . 5 8 : 3 2 1 7 - 3 2 2 4 . B r a d f o r d , M . M . 1 9 7 6 . A r a p i d a n d s e n s i t i v e m e t h o d f o r t h e q u a n t i fi c a t i o n o f m i c r o g r a m q u a n t i t i e s o f p r o t e i n u s i n g t h e p r i n c i p l e o f p r o t e i n - d y e b i n d i n g . A n a l . B i o c h e m . 7 2 : 2 4 8 - 2 5 4 . B r e n e m a n , W . E . , J . W . W e s t b e r g a n d R . W . D u e r s t . 1 9 8 9 . A r a p i d m e t h o d f o r § 3 r e p a n 2 6 h 7 g 2 K B r w a f e r s f o r i n f r a r e d s p e c t r o s c o p y . A p p ] . S p e c t r o s c o p y . : 7 7 . B r o w n , J . A . , J . K . G l e n n a n d M . H . G o l d . 1 9 9 0 . M a n g a n e s e r e g u l a t e s e x p r e s s i o n o f m a n g a n e s e p e r o x i d a s e b y P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m . J . B a c t e r i a ] . 1 7 2 : 3 1 2 5 - 3 1 3 0 . B u d d e , W . L . , T . D . B e h y m e r , T . A . B e l l a r a n d J . 8 . H o . 1 9 9 0 . L i q u i d c h r o m a t o g r a p h y - m a s s s p e c t r o m e t r y : A n e m e r g i n g t e c h n o l o g y f o r n o n v o l a t i l e c o m p o u n d s . J . A m . W a t e r W o r k s A s s o c . 8 2 : 6 0 - 6 5 . B u m p u s , J . A . , M . T i e n , D . W r i g h t a n d S . D . A u s t . 1 9 8 5 . O x i d a t i o n o f p e r s i s t e n t e n v i r o n m e n t a l p o l l u t a n t s b y a w h i t e - r o t f u n g u s . S c i e n c e . 2 2 8 : 1 4 3 4 - 1 4 3 6 . 3 8 2 B u s w e l l , J . A . 1 9 9 1 . F u n g a l d e g r a d a t i o n o f l i g n i n . I n H a n d b o o k o f A p p l i e d M y c o l o g y V a ] . 1 : S o i l a n d p l a n t s . A r o r a , D . K . , B h a r a t R a i , K . G . M u k e l e a n d G . K n u d s e n . ( e d s . ) . M a r c e l D e k k e r , N e w Y o r k . B u s w e l l , J . A . a n d E . O d i e r . 1 9 8 7 . L i g n i n b i o d e g r a d a t i o n . C R C C r i t . R e v . B i a t e c h n a l . 6 : 1 - 6 0 . C a t t l o w , D . A . a n d M . E . R o s e . 1 9 8 9 . A n a l y s i s o f m i x t u r e s b y m a s s s p e c t r o m e t r y . P a r t 1 : T e c h n i q u e s o t h e r t h a n g a s c h r o m a t o g r a p h y / m a s s s p e c t r o m e t r y . M a s s S p e c t r o m . 1 0 : 2 2 2 - 2 5 2 . C h e n , C . L . 1 9 8 8 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f l i g n i n b y o x i d a t i v e d e g r a d a t i o n : U s e o f g a s c h r o m a t o g r a p h y - m a s s s p e c t r o m e t r y t e c h n i q u e . I n M e t h o d s i n E n z y m a l a g y . C o l o w i c k , S . P . a n d N . 0 . K a p l a n . ( e d s . ) . A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k . 1 6 1 : 1 1 0 - 1 3 6 . C h e n , C . L . a n d H . M . C h a n g . 1 9 8 2 . A r o m a t i c a c i d s p r o d u c e d d r u i n g d e g r a d a t i o n o f l i g n i n i n s p r u c e w o o d b y P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m . H a l z f a r s c h u n g . 3 6 : 3 - 9 . C h e n , C . L . , M . G . S . C h u a , J . E v a n s a n d H . M . C h a n g . 1 9 8 2 . ‘ 3 C N M R s p e c t r o s c o p i c s t u d y o f s p r u c e l i g n i n d e g r a d e d b y P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m : 1 1 . S y n t h e s i s a n d c h e m i c a l s h i f t s o f m o d e l c o m p o u n d s . H a l z f a r s c h u n g . 3 6 : 2 3 9 - 2 4 7 . C h u a , M . G . S . , C . L . C h e n a n d H . M . C h a n g . 1 9 8 2 . 1 3 C N M R s p e c t r o s c o p i c s t u d y o f s p r u c e l i g n i n d e g r a d e d b y P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m : I . N e w s t r u c t u r e s . H a l z f a r s c h u n g . 3 6 : 1 6 5 - 1 7 2 . C h u n g , N . , M . M . S h a h , T . A . G r o v e r , a n d S . D . A u s t . 1 9 9 3 . R e d u c t i v e a c t i v i t y o f a m a n g a n e s e - d e p e n d e n t p e r o x i d a s e f r o m P h a n e r o c h a e t e c h t y s o s p o r i u m . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 3 0 6 : 7 0 - 7 5 . C l e s c e r i , L . S . , A . E . G r e e n b e r g , R . R . T r u s s e l l a n d M . A . H . F r a n s a n ( e d s . ) . 1 9 8 9 . E D T A T i t r i m e t r i c M e t h o d . I n S t a n d a r d M e t h o d s f o r t h e E x a m i n a t i o n o f W a t e r a n d W a s t e w a t e r . P o r t C i t y P r e s s , B a l t i m o r e , M D . 3 - 8 5 t o 3 - 8 7 . C o n c i n , R . , P . B u r t s c h e r , E . B u r t s c h e r a n d O . B o b l e t e r . 1 9 8 3 . S e p a r a t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n o f m o n o m e r i c l i g n i n d e g r a d a t i o n p r o d u c t s b y G . L . C . - m a s s s p e c t r o m e t r y . I n t . J . M a s s S p e c t r o m . I a n P h y s . 4 8 : 6 3 - 6 6 . C o n n o r s , W . J . , S . S a r k a n e n a n d J . L . M c C a r t h y . 1 9 8 0 . G e l c h r o m a t o g r a p h y a n d a s s o c i a t i o n c o m p l e x e s o f l i g n i n . H a l z f a r s c h u n g . 3 4 : 8 0 - 8 5 . C r a w f o r d , D . L . , M . J . B a r d e r , A . L . P o m e t t o , I I I a n d R . L . C r a w f o r d . 1 9 8 2 . C h e m i s t r y o f s o f t w o o d l i g n i n d e g r a d a t i o n b y S t e p t o m y c e s v i r i d o s p o m s . A r c h . M i c r o b i a l . 1 3 1 : 1 4 0 - 1 4 5 . C r a w f o r d , R . L . L i g n i n b i o d e g r a d a t i o n a n d t r a n s f o r m a t i o n . W i l e y - I n t e r s c i e n c e , N e w Y o r k . C u i , F . a n d D . D o l p h i n . 1 9 9 1 . V e r a t r y l a l c o h o l a s a m e d i a t o r i n l i g n i n m o d e l c o m p o u n d b i o d e g r a d a t i o n . H a l z f a r s c h u n g . 4 5 : 3 1 - 3 5 . 3 8 3 C u s s l e r , E . L . 1 9 8 6 . D i f f u s i o n : M a s s T r a n s f e r i n F l u i d S y s t e m s . C a m b r i d g e U n i v e r s i t y P r e s s , N e w Y o r k . D a n i e l , G . , T . N i l s s o n a n d B . P e t t e r s s o n . 1 9 8 9 . I n t r a - a n d e x t r a c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n o f l i g n i n p e r o x i d a s e d u r i n g t h e d e g r a d a t i o n o f s o l i d w o o d a n d w o o d f r a g m e n t s b y P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m b y u s i n g t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y a n d i m m u n o - g o l d l a b e l i n g . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i a l . 5 5 : 8 7 1 - 8 8 1 . D a s s , S . B . a n d C . A . R e d d y . 1 9 9 0 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f e x t r a c e l l u l a r p e r o x i d a s e s p r o d u c e d b y a c e t a t e - b u f f e r e d c u l t u r e s o f t h e l i g n i n — d e g r a d i n g b a s r d i o m y c e t e , P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i w n . F E M S M i c r o b i a l . L e t t . 6 9 : 2 2 1 - 2 2 4 . d e J o n g , E . , F . P . d e V r i e s , J . A . F i e l d , R . P . V a n d e r Z w a n a n d J . A . M . d e B o n t . 1 9 9 2 . I s o l a t i o n a n d s c r e e n i n g o f b a s i d i o m y c e t e s w i t h h i g h p e r o x i d a t i v e a c t i v i t y . M y c a ] . R e s . 9 6 : 1 0 9 8 - 1 1 0 4 . d e J o n g , E . , J . A . F i e l d a n d J . A . M . d e B o u t . 1 9 9 4 . A r y l a l c o h o l s i n t h e p h y s i o l o g y o f l i g n i n o l y t i c f u n g i . F E M S M i c r o b i a l . R e v . 1 3 : 1 5 3 - 1 8 8 . D o r d i c k , J . S . , M . A . M a r l e t t a a n d A . M . K l i b a n o v . 1 9 8 6 . P e r o x i d a s e s d l y m e r i z e l i g n i n i n o r g a n i c m e d i a b u t n o t i n w a t e r . P r a c . N a t l . A c a d . i . U S A . 8 3 : 6 2 5 5 - 6 2 5 7 . D o s o r e t z , C . G . a n d H . E . G r e t h l e i n . 1 9 9 1 . P h y s i o l o g i c a l a s p e c t s o f t h e r e g u l a t i o n o f e x t r a c e l l u l a r e n z y m e s o f P h a n e r o c h a e t e C h r y s o s p o r i w n . A p p l . B i o c h e m . B i a t e c h n a l . 2 8 / 2 9 z 2 5 3 - 2 6 5 . D r a w e r t , F . a n d G . L e u p o l d . 1 9 7 6 . G a s - c h r o m a t o g r a p h i s c h e a n a l y s e d e r t r i g n o e t h l s i l y l - d e n ' v a t i v e p h e n o l i s c h e r v e r b i n d u n g e n . C h r o m a t o g r a p h i a . 9 : 5 - 1 0 . E r i k s s o n , K . E . L . 1 9 9 4 . W h e r e d o w e s t a n d a n d w h e r e a r e w e g o i n g ? L i g n i n b i o d e g r a d a t i o n a n d p r a t i c a l u t i l i z a t i o n . F E M S M i c r o b i a l . R e v . 1 3 : 1 4 9 - 1 5 . E r i k s s o n , K . E . a n d T . K . K i r k . 1 9 8 5 . B i o p u l p i n g , b i o b l e a c h i n g a n d t r e a t m e n t o f k r a f t b l e a c h i n g e f fl u e n t s w i t h w h i t e - r o t f u n g i . I n C o m p r e h e n s i v e B i o t e c h n o l o g y . C o o n e y , C . L . a n d A . E . H u m p h r e y . ( e d s . ) . P e r g a m o n P r e s s , 3 : 2 7 1 - 2 9 4 . E v a n s , C . S . , M . V . D u t t o n , F . G u i l l e n a n d R . G . V e n e s s . 1 9 9 4 . E n z y m e s a n d s m a l l m o l e c u l a r m a s s a g e n t s i n v o l v e d w i t h l i g n o c e l l u l o s e d e g r a d a t i o n . F E M S M i c r o b i a l . R e v . 1 3 : 2 3 5 - 2 4 0 . E v e r s h e d , R . P . 1 9 8 9 . A n a l y s i s o f m i x t u r e s b y m a s s s p e c t r o m e t r y . P a r t I : D e v e l o p m e n t s i n g a s c h r o m a t o g r a p h y - m a s s s p e c t r o m e t r y . M a s s S p e c t r o m . 1 0 : 1 8 1 - 2 2 1 . E v l i y a , H . 1 9 8 9 . 0 1 3 N M R s t u d i e s o f a d e h y d r o p o l y m e r ( D I - 1 P ) f r o m i s o e u g e n o l ; c o m p a r i s o n w i t h s p r u c e l i g n i n . H a l z f a r s c h u n g . 4 3 : 6 1 - 6 4 . F a i s o n , B . D . , T . K . K i r k a n d R . L . F a r r e l l . 1 9 8 6 . R o l e o f v e r a t r y l a l c o h o l i n r e g u l a t i n g l i g n i n a s e a c t i v i t y i n P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i a l . 5 2 : 2 5 1 - 2 5 4 . 3 8 4 F a i x , O . 1 9 9 2 . F o u r i e r t r a n s f o r m i n f r a r e d s p e c t r o s c o p y . I n M e t h o d s i n L i g n i n C h e m i s t r y . L i n , S . Y . a n d C . W . D e n c e . ( e d s . ) . S p r i n g e r - V e r l a g , N e w Y o r k . 8 3 - 1 0 9 . F a i x , 0 . , D . M e i e r a n d I . F o r t m a n n . 1 9 8 8 . P y r o l y s i s - g a s c h r o m a t o g r a p h y - m a s s s p e c t r o m e t r y o f t w o t r i m e r i c l i g n i n m o d e l c o m p o u n d s w i t h a l k y l - a r y l e t h e r s t r u c t u r e . J . A n a l . A p p l . P y r a ] . 1 4 : 1 3 5 - 1 4 8 . F a i x , 0 . , D . M e i e r a n d I . G r o b e . 1 9 8 7 . S t u d i e s o n i s o l a t e d l i g n i n s a n d l i g n i n s i n w o o d y m a t e r i a l s b y p y r o l y s i s - g a s c h r o m a t o g r a p h y - m a s s s p e c t r o m e t r y a n d o f f - l i n e p y r o l y s i s - g a s c h r o m a t o g r a p h y w i t h fl a m e i o n i z a t i o n d e t e c t i o n . J . A n a l . A p p l . P y r a ] . 1 1 : 4 0 3 - 4 1 6 . F a i x , 0 . , D . M e i e r a n d I . F o r t m a n n . 1 9 9 0 a . T h e r m a l d e g r a d a t i o n p r o d u c t s o f w o o d : G a s c h r o m a t o g r a p h i c s e p a r a t i o n a n d m a s s s p e c t r o m e t r i c c h a r a c t e r i z a t i o n o f m o n o m e r i c l i g n i n d e r i v e d p r o d u c t s . H a l z A l s R a h - u n d W e r k s t a f f . 4 8 : 2 8 1 - 2 8 5 . F a i x , 0 . , D . M e i e r a n d I . F o r t m a n n . 1 9 9 0 b . T h e r m a l d e g r a d a t i o n p r o d u c t s o f w o o d : A c o l l e c t i o n o f e l e c t r o n - i m p a c t ( E I ) m a s s s p e c t r a o f m o n o m e r i c l i g n i n d e r i v e d p r o d u c t s . H a l z a l s R a h - u n d W e r k s t a f f . 4 8 : 3 5 1 - 3 5 4 . _ F e r g u s , B . J . , A . R . P r o c t e r , J . A . N . S c o t t a n d D . A . I . G o r i n g . 1 9 6 9 . T h e d i s t r i b u t i o n o f l i g n i n i n s p r u c e w o o d a s d e t e r m i n e d b y u l t r a v i o l e t m i c r o s c o p y . W o o d S c i . T e c h n o l . 3 : 1 1 7 - 1 3 8 . F e r r e r , I . , M . D e z o t t i a n d N . D u r a n . 1 9 9 1 . D e c o l o r i z a t i o n o f k r a f t e f fl u e n t b y f r e e a n d i m m o b i l i z e d l i g n i n p e r o x i d a s e s a n d h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e . B i a t e c h n a ] L e t t . 1 3 : 5 7 7 - 5 8 2 . F i e c h t e r , A . 1 9 9 3 . F u n c t i o n a n d s y n t h e s i s o f e n z y m e s i n v o l v e d i n l i g n i n d e g r a d a t i o n . J . B i a t e c h n a l . 3 0 1 : 4 9 - 5 5 . F i n l a y s o n , B . A . 1 9 8 0 . N o n l i n e a r A n a l y s i s i n C h e m i c a l E n g i n e e r i n g . M c G r a w - H i l l , I n c . , N e w Y o r k . F l e m i n g , B . I . a n d H . I . B o l k e r . 1 9 8 0 . C a r b o n - 1 3 N M R s p e c t r a o f s o l i d l i g n i n p r e p a r a t i o n s . P u l p a n d p a p e r r e p o r t s ; P u l p a n d p a p e r r e s e a r c h i n s t i t u t e o f C a n a d a . P P R 2 9 3 : . F r e u d e n b e r g , K . , A . J a n s o n , E . K n o p f a n d A . H a a g . 1 9 3 6 . Z u r K e n n t n i s d e s l i g n i n s . C h e m . B e r . 6 9 : 1 4 1 5 - 1 4 2 5 . ' F r e u d e n b e r g , K . , W . L a u t s c h a n d K . E n g l e r . 1 9 4 0 . C h e m . B e r . 7 3 : 1 6 7 . F r i t z , J . O . a n d K . J . M o o r e . 1 9 8 7 . S e p a r a t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n o f l i g n i n - d e r i v e d p h e n o l i c m o n o m e r s u s i n g h i g h - r e s o l u t i o n g a s c h r o m a t o g r a p h y . J . A g r i c . F o o d C h e m . 3 5 : 7 1 0 - 7 1 3 . F u l l e r , M . P . , G . L . R i t t e r a n d C . S . D r a p e r . 1 9 8 8 a . P a r t i a l l e a s t s q u a r e s q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f i n f r a r e d s p e c t r o s c o p i c d a t a . P a r t I . A l g o r i t h m i m p l e m e n t a t i o n . A p p ] . S p e c t r o s c o p y . 4 2 : 2 1 7 - 2 2 7 . 3 8 5 F u l l e r , M . P . , G . L . R i t t e r a n d C . S . D r a p e r . 1 9 8 8 b . P a r t i a l l e a s t s q u a r e s q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f i n f r a r e d s p e c t r o s c i p i c d a t a . P a r t 1 1 . A p p l i c a t i o n t o d e t e r g e n t a n a l y s i s . A p p ] . S p e c t r o s c o p y . 4 2 : 2 2 8 - 2 3 6 . F u l l e r t o n , T . J . a n d R . A . F r a n i c h . 1 9 8 3 . L i g n i n a n a l y s i s b y p y r o l y s i s - G C - M S : c h a r a c t e r i s a t i o n o f e t h a n o l l i g n i n p y r o l y s a t e s a n d i d e n t i fi c a t i o n o f s y r i n g y l u n i t s i n P i n u s r a d i a t a m i l l e d w o o d l i g n r n . H a l z f a r s c h u n g . 3 7 : 2 6 7 - 2 6 9 . G a s k e l l , J . a n d D . C u l l e n . 1 9 9 3 . R e c e n t a d v a n c e s i n t h e o r g a n i z a t i o n a n d r e g u l a t i o n o f l i g n i n p e r o x i d a s e g e n e s o f P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i w n . J . B i a t e c h n a l . 3 0 : 1 0 9 - 1 1 4 . G e l l e r s t e d t , G . 1 9 9 2 . C h e m i c a l d e g r a d a t i o n m e t h o d s : P e r m a n g a n a t e o x i d a t i o n . I n M e t h o d s i n L i g n i n C h e m i s t r y . S . Y . L i n a n d C . W . D e n c e . ( e d s . ) . S p r i n g e r - V e r l a g , N e w Y o r k . 3 2 2 - 3 3 3 . G e n u i t , W . , J . J . B o o n a n d O . F a i x . 1 9 8 7 . c h a r a c t e r i z a t i o n o f b e e c h m i l l e d w o o d l i g n i n b p y r o l s i s - g a s c h r o m a t o g r a p h y - p h o t o i o n i z a t i o n m a s s s p e c t r o m e t r y . A n a l . C e m . 5 : 5 0 - 5 1 3 . G l e n n , J . K . , L . A k i l e s w a r a n a n d M . H . G o l d . 1 9 8 6 . M n ( I I ) o x i d a t i o n i s t h e p r i n c i p a l f u n c t i o n o f e x t r a c e l l u l a r M n - p e r o x i d a s e f r o m P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 2 5 1 : 6 8 8 - 6 9 6 . G l e n n , J . K . a n d M . H . G o l d . 1 9 8 5 . P u r i fi c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a n e x t r a c e l l u l a r M n ( I I ) - d e p e n d e n t p e r o x i d a s e f r o m t h e l i g n i n - d e g r a d i n g g g s i d g g g r y c e é m P h a n e r o c h a e t e c h l y s o s p o r i w n . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 2 : - 4 . G o l d , M . H . a n d M . A l i c . 1 9 9 3 . M o l e c u l a r b i o l o g y o f t h e l i g n i n - d e g r a d i n g b a s i d i o m y c e t e P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m . M i c r o b i o l . R e v . 5 7 : 6 0 5 - 6 2 2 . G o l d , M . H . , H . W a r i i s h i a n d K . V a l l i . 1 9 8 9 . E x t r a c e l l u l a r p e r o x i d a s e s i n v o l v e d i n l i g n i n d e g r a d a t i o n b y t h e w h i t e r o t b a s i d i o m y c e t e P h a n e r a c h a e t e c h r y s o s p o n ' u m . I n B i a c a t a l y s i s a n d A g r i c u l t u r a l B i o t e c h n o l o g y . W h i t a k e r , J . a n d P . E . S o n n e t . ( e d s . ) . A . C . S . , W a s h i n g t o n D . C . 1 2 7 - 1 4 0 . G r i f fi t h s , P . R . a n d J . A . d e H a s e t h . 1 9 8 6 . F o u r i e r t r a n s f o r m i n f r a r e d s p e c t r o m e . I n C h e m i c a l A n a l y s i s . E l v i n g , P . J . , J . D . W i n e f o r d n e v a n d I . M . K o l t h o . ( e d s . ) . J o h n W i l e y a n d S o n s , N e w Y o r k . 8 3 : G r o u s , W . R . , A . O . C o n v e r s e a n d H . E . G r e t h l e i n . 1 9 8 6 . T h e e f f e c t o f s t e a m e x p l o s i o n p r e t r e a t m e n t o n p o r e s i z e a n d e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f p o p l a r . E n z y m e M i c r a b . T e c h n o ] . 8 : 2 7 4 - 2 8 0 . H a d a r , Y . , Z . K e r e m a n d B . B o r o d e c k i . 1 9 9 3 . b i o d e g r a d a t i o n o f l i g n o c e l l u l o s i c a g r i c u l t u r a l w a s t e s b y P l e u r o t u s o s t r e a t u s . J . B i a t e c h n a ] . 3 0 : 1 3 3 - 1 3 9 . H a e m m e r l i , S . D . , M . S . A . L e i s o l a a n d A . F e i c h t e r . 1 9 8 6 . P o l y m e r i s a t i o n o f l i g n i n 1 3 > y 3 l i 3 g § r i 6 n a s e s f r o m P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m . F E M S M i c r o b i a l . L e t t . 5 : - . 3 8 6 H a e m m e r l i , S . D . , H . E . S c h o e m a k e r , H . W . H . S c h m i d t a n d M . S . A . L e i s o l a . 1 9 8 7 . O x i d a t i o n o f v e r a t r y l a l c o h o l b y t h e l i g n i n p e r o x i d a s e o f P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m . F E B S L e t t . 2 2 0 : 1 4 9 - 1 5 4 . H a i d e r , K . a n d J . T r o j a n o w s k i . 1 9 8 0 . A c o m p a r i s o n o f t h e d e g r a d a t i o n o f “ C l a b e l e d D H P a n d c o r n s t a l k l i g n i n b y m i c r o - a n d m a c r o f u n g i a n d b a c t e r i a . I n L i g n i n B i a d e g r a d a t i a n : M i c r o b i o l o g y , C h e m i s t r y , a n d P o t e n t i a l A p p l i c a t i o n s . K i r k , T . K . , T . H i g u c h i a n d H . M . C h a n g . ( e d s . ) . C R C P r e s s , B o c a R a t o n , F L . 1 : 1 1 1 - 1 3 4 . H a m e s , B . , S . K . B l a c k , F . A g b l e u o r , R . E v a n s , D . K . J o h n s o n a n d H . L . C h u m . 1 9 1 0 , A p r i l 2 5 . M e a s u r e m e n t o f t h e f u n c t i o n a l g r o u p c o n t e n t s o f l i g n i n s u s i n g F T I R a n d p a r t i a l l e a s t s q u a r e s r e g r e s s i o n . P a p e r p r e s e n t e d a t t h e 4 5 t h A P P I T A G e n e r a l C o n f e r e n c e a n d E x h i b i t i o n , 6 t h I n t e r n a t i o n a l S y m p o s i u m o n W o o d a n d P u l p i n g C h e m i s t r y . M e l b o u r n e , A u s t r a l i a . H a m m e l , K . E . , K . A . J r J e n s e n , M . D . M o z u c h , L . L . L a n d u c c i , M . T i e n a n d E . A . P e a s e . 1 9 9 3 . L i g n i n o l y s i s b y a p u r i fi e d l i g n i n p e r o x i d a s e . J . B i o l . C h e m . 2 6 8 : 1 2 2 7 4 - 1 2 2 8 1 . H a m m e l , K . E . a n d M . A . M o e n . 1 9 9 1 . D e p o l y m e r i z a t i o n o f a s y n t h e t i c l i g n i n i n v i t r o b y l i g n i n p e r o x i d a s e . E n z y m e M i c r a b . T e c h n o ] . 1 3 : 1 5 - 1 8 . H a m m e l , K . E . , M . T i e n , B . K a l y a n a r a m a n a n d T . K . K i r k . 1 9 8 5 . M e c h a n i s m s o f o x i d a t i v e C a - C g c l e a v a g e o f a l i g n i n m o d e l d i m e r b y P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i w n h g n i n a s e . J . B i o l . C h e m . 2 6 0 : 8 3 4 8 . H a m m i n g , M . C . a n d N . G . F o s t e r . 1 9 7 2 . I n t e r p r e t a t i o n o f M a s s S p e c t r a o f O r g a n i c C o m p o u n d s . A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k . H a r r i s , D . C . 1 9 8 2 . E D T A T i t r a t i o n s . I n Q u a n t i t a t i v e C h e m i c a l A n a l y s i s . V a p n e k , P . C . a n d D . J . C r o s s . ( e d s . ) . W . H . F r e e m a n a n d C o . , S a n F r a n c i s c o , C A . C h a p t e r 1 4 : 2 7 1 - 2 8 9 . H a r t l e y , R . D . a n d H . B u c h a n . 1 9 7 9 . H i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y o f p h e n o l i c a c i d s a n d a l d e h y d e s d e r i v e d f r o m p l a n t s o r f r o m t h e d e c o m p o s i t i o n o f o r g a n i c m a t t e r i n s o i l . J . C h r o m a t a g . 1 8 0 : 1 3 9 — 1 4 3 . H a r v e y , P . J . , G . F . G i l a r d i , M . L . G a b l e a n d J . M . P a l m e r . 1 9 9 3 . C h a r g e t r a n s f e r r e a c t i o n s a n d f e e d b a c k c o n t r o l o f l i g n i n p e r o x i d a s e b y p h e n o l i c c o m p o u n d s : S i g n i fi c a n c e i n l i g n i n d e g r a d a t i o n . J . B i a t e c h n a ] . 3 0 : 5 7 - 6 9 . H a r v e y , P . J . , H . E . S c h o e m a k e r a n d J . M . P a l m e r . 1 9 8 6 . V e r a t r y l a l c o h o l a s a m e d i a t o r a n d t h e r o l e o f r a d i c a l c a t i o n s i n l i g n i n b i o d e g r a d a t i o n b y P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o n ‘ w n . F E B S L e t t . 1 9 5 : 2 4 2 - 2 4 6 . H a t a k k a , A . 1 9 9 4 . L i g n i n - m o d i f y i n g e n z y m e s f r o m s e l e c t e d w h i t e - r o t f u n g i : P r o d u c t i o n a n d r o l e i n l i g n i n d e g r a d a t i o n . F E M S M i c r o b i a l . R e v . 1 3 : 1 2 5 - 1 3 5 . H i g u c h i , T . 1 9 9 0 . L i g n i n b i o c h e m i s t r y : B i o c h e m i s t r y a n d b i o d e g r a d a t i o n . W o o d S c i . T e c h n o l . 2 4 : 2 3 - 6 3 . 3 8 7 H i g u c h i , T . 1 9 9 3 . B i o d e g r a d a t i o n m e c h a n i s m o f l i g n i n b y w h i t e - r o t b a s i d i o m y c e t e s . J . B i a t e c h n o ] . 3 0 : 1 - 8 . H i g u c h i , T . , H . M . C h a n g a n d T . K . K i r k . 1 9 8 3 . R e c e n t a d v a n c e s i n l i g n i n b i o d e g r a d a t i o n r e s e a r c h . T o k y o U n i v . H o f f m a n n , G . a n d L . S w e e t m a n . 1 9 8 7 . O — ( 2 , 3 , 4 , 5 , 6 - p e n t a fl u o r o b e n z y l ) o x i m e - t r i - m e t h y l s i l y l e s t e r d e r i v a t i v e s f o r q u a n t i t a t i v e g a s c h r o m a t o g r a p h i c a n d g a s g a s c h r o m a t o g r a p h i c - m a s s s p e c t r o m e t r i c s t u d i e s o f a l d e h y d e s , k e t o n e s , a n d o x o a c i d s . J . C h r o m a t a g . 4 2 1 : 3 3 6 - 3 4 3 . H y a t t , J . A . 1 9 8 9 . H g d r o x y p r o p y l l i g n i n a n d m o d e l c o m p o u n d s : S y n t h e s i s a n d c h a r a c t e r i z a t i o n e l e c t r o n - i m p a c t m a s s s p e c t r o m e t r y . I n L i g n i n : P r o p e r t i e s a n d M a t e r i a l s . l a s s e r , W . G . a n d S . S a r k a n e n . ( e d s . ) . A C S S y m p . S e r . , 3 9 7 : 4 2 5 - 4 3 5 . J a n s h e k a r , H . , C . B r o w n a n d A . F i e c h t e r . 1 9 8 1 . D e t e r m i n a t i o n o f b i o d e g r a d e d l i g n i n b y u l t r a v i o l e t s p e c t r o p h o t o m e t r y . A n a l . C h i m . A c t a . 1 3 0 : 8 1 - 9 1 . J o s h i , D . K . a n d M . H . G o l d . 1 9 9 3 . D e g r a d a t i o n o f 2 , 4 , 5 - t r i c h l o r o p h e n o l b y t h e l i g n i n - d e g r a d i n g b a s i d i o m y c e t e P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m . A p p ] . E n v i r o n . M i c r o b i a l . 5 9 : 1 7 7 9 - 1 7 8 5 . K a t a y a r n a , Y . , T . N i s h i d a , N . M o r o h o s h i a n d K . K u r o d a . 1 9 8 9 . T h e m e t a b o l i s m o f b i p h e n y l s t r u c t u r e s i n l i g n i n b y t h e w o o d - r o t t i n g f u n g u s C o r i o l u s v e r s i c o l o r . F E M S M i c r o b i a l . L e t t . 6 1 : 3 0 7 - 3 1 4 . K e r s t e n , P . J . , M . T i e n , B . K a l y a n a r a m a n a n d T . K . K i r k . 1 9 8 5 . T h e l i g n i n a s e o f P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m g e n e r a t e s a c t i o n r a d i c a l s f r o m m e t h o x y b e n z e n e s . J . B i o l . C h e m . 2 6 0 : 2 6 0 9 . K i m , K . R . , M . K . H a h n , A . Z l a t k i s , E . C . H o m i n g a n d B . S . M i d d l e d i t c h . 1 9 8 9 . S i m u l t a n e o u s g a s c h r o m a t o g r a p h y o f v o l a t i l e a n d n o n v o l a t i l e c a r b o x y l i c a c i d s a s t e n - b u t y l d i m e t h y l s i l y l d e r i v a t i v e s . J . C h r o m a t a g . 4 6 8 : 2 8 9 - 3 0 1 . K i r k , T . K . 1 9 8 4 . D e g r a d a t i o n o f l i g n i n . I n M i c r o b i a l D e g r a d a t i o n o f O r g a n i c C o m p o u n d s . G i b s o n , D . T . ( e d . ) . D e k k e r , N e w Y o r k . 3 9 9 - 4 3 7 . K i r k , T . K . , W . J . C o n n o r s , R . D . B l e a m , W . F . H a c k e t t a n d J . G . Z e i k u s . 1 9 7 5 . P r e p a r a t i o n a n d m i c r o b i a l d e c o m p o s i t i o n o f s y n t h e t i c l ‘ C l i g n i n s . P r a c . N a t l . A c a d . S c i . U S A . 7 2 : 2 5 1 5 - 2 5 1 9 . K i r k , T . K . , W . J . C o n n o r s a n d J . G . Z e i k u s . 1 9 7 6 . R e q u i r e m e n t o f a g r o w t h s u b s t r a t e d u r i n g l i g n i n d e g r a d a t i o n b y t w o w o o d r o t t i n g f u n g i . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 3 2 : 1 9 2 - 1 9 6 . K i r k , T . K . a n d E . B . C o w l i n g . 1 9 8 4 . B i o l o g i c a l d e c o m p o s i t i o n o f s o l i d w o o d . A d v . C h e m . S e r . 2 0 7 : 4 5 5 - 4 8 7 . K i r k , T . K . , S . C r o a n , M . T i e n , K . E . M u r t a g h a n d R . L . F a r r e l l . 1 9 8 6 a . P r o d u c t i o n o f m u l t i p l e l i g n i n a s e s b y P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m : E f f e c t o f s e l e c t e d g r o w t h c o n d i t i o n s a n d u s e o f a m u t a n t s t r a i n . E n z . M i c r a b . T e c h n o ] . 8 : 2 7 - 3 2 . Q 3 8 8 K i r k , T . K . a n d R . L . F a r r e l l . 1 9 8 7 . E n z y m a t i c ” c o m b u s t i o n " : T h e m i c r o b i a l d e g r a d a t i o n o f l i g n i n . A n n . R e v . M i c r o b i a l . 4 1 : 4 6 5 - 5 0 5 . K i r k , T . K . , M . T i e n , S . C r o a n , T . M c D o n a g h a n d R . L . F a r r e l l . 1 9 8 6 b . P r o d u c t i o n o f m u l t i p l e l i g n i n a s e s b y P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m . P r a c . 3 r d I n t . C o n g r e s s o n B i o t e c h n o l o g y i n t h e P u l p a n d P a p e r I n d u s t r y . S t o c k h o l m . p p . 5 - 6 . K o l o d z i e j s k i , W . , J . S . F r y e a n d G . E . M a c i e l . 1 9 8 2 . C a r b o n - 1 3 n u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e s p e c t r o m e t r y w i t h c r o s s p o l a r i z a t i o n a n d m a g i c - a n g l e s p i n n i n g f o r a n a l y s i s o f l o d g e p o l e p i n e w o o d . A n a l . C h e m . 5 4 : 1 4 1 9 — 1 4 2 4 . K r e y s z i g , E . 1 9 8 8 . A d v a n c e d E n g i n e e r i n g M a t h e m a t i c s , 6 t h e d . P i r t l e , R . a n d J . G a z i s . ( e d s . ) . J o h n W i l e y a n d S o n s , N e w Y o r k . K r i n g s t a d , K . P . a n d R . M o r c k . 1 9 8 3 . ” C N M R s p e c t r a o f k r a f t l i g n i n s . H a l z f a r s c h u n g . 3 7 : 2 3 7 - 2 4 4 . K u w a h a r a , M . , J . K . G l e n n , M . A . M o r g a n a n d M . H . G o l d . 1 9 8 4 . S e p a r a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t w o e x t r a c e l l u l a r H 2 0 2 — d e p e n d e n t o x i d a s e s f r o m l i g n i n o l y t i c c u l t u r e s o f P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m . F E B S L e t t . 1 6 9 : 2 4 7 - 2 5 0 . L a c k n e r , R . , E . S r e b o t n i k a n d K . M e s s n e r . 1 9 9 1 . O x i d a t i v e d e g r a d a t i o n o f h i g h m o l e c u l a r w e i g h t c h l o r o l i g n i n b y m a n g a n e s e p e r o x i d a s e o f P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m . B i o c h e m . B i o p h y s R e s . C o m m u n . 1 7 8 : 1 0 9 2 - 1 0 9 8 . L a p i e r r e , C . , J . Y . L e l l e m a n d a n d B . M o n t i e s . 1 9 8 2 . E v i d e n c e o f p a l a r l i g n i n h e t e r o g e n e i t y b y c o m b i n a t i o n o f 1 3 C a n d 1 H N M R s p e c t r o s c o p y . H a l z a r s c h u n g . 3 6 : 2 7 5 - 2 8 2 . L a p i e r r e , C . a n d B . M o n t i e s . 1 9 8 4 . P h o t o s y n t h e t i c a l l y 1 3 C - l a b e l l e d p o p l a r l i g n i n s : 1 3 C N M R e x p e r i m e n t s . H a l z f a r s c h u n g . 3 8 : 3 3 3 - 3 4 2 . L e a r y , G . J . , J . A . L l o y d a n d K . R . M o r g a n . 1 9 8 8 . A 1 3 C C P / M A S N M R s t u d y o f r e s i d u a l l i g n i n i n k r a f t p u l p s . H a l z f a r s c h u n g . 4 2 : 1 9 9 - 2 0 2 . L e i s o l a , M . S . A . , B . K o z u l i c , F . M e u s s d o e r f f e r a n d A . F i e c h t e r . 1 9 8 7 . H o m o l o g y a m o n g m u l t i p l e e x t r a c e l l u l a r p e r o x i d a s e s f r o m P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m . J . B i o l . C h e m . 2 6 2 : 4 1 9 - 4 2 4 . L e i s o l a , M . S . A . , B . S c h m i d t a n d A . F i e c h t e r . 1 9 8 6 . E n z y m a t i c d e t e r m i n a t i o n o f v e r a t r y l a l c o h o l . A n a l . B i o c h e m . 1 5 5 : 1 0 8 - 1 1 1 . L i e b e s k i n d , M . , H . H a c k e r , C . W a n d r e y a n d A . G . J a g e r . 1 9 9 0 . S t r a t e g i e s f o r i m p r o v e d l i g n i n p e r o x i d a s e p r o d u c t i o n i n a g i t a t e d p e l l e t c u l t u r e s o f P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m a n d t h e u s e o f a n o v e l i n d u c e r . F E M S M i c r o b i a l . L e t t . 7 1 : 3 2 5 - 3 3 0 . L i n d s t r o m , K . a n d F . O s t e r b e r g . 1 9 8 4 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e h i g h m o l e c u l a r m a s s c h l o r i n a t e d m a t t e r i n s p e n t b l e a c h l i q u o r s ( S B L ) . P a r t 1 : A l k a l i n e S B L . H a l z f a r s c h u n g . 3 8 : 2 0 1 - 2 1 2 . 3 8 9 M a r s d e n , W . L . a n d P . P . G r a y . 1 9 8 6 . E n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f c e l l u l o s e i n l i g n o c e l l u l o s i c m a t e r i a l s . I n C r i t i c a l R e v i e w s i n B i o t e c h n o l o g y . S t e w a r t , G . G . a n d I . R u s s e l . ( e d s . ) . C R C P r e s s , B o c a R a t o n . 3 : 2 3 5 - 2 7 6 . M a r t i n , F . , C . S a i z - J i m e n e z a n d F . J . G o n z a l e s - V i l a . 1 9 7 9 . o l y s i s - g a s c h r o m a t o g r a p h y - m a s s s p e c t r o m e t r y o f l i g n i n s . H a l z f a r s c h u n g . 3 3 : 1 0 - 2 1 2 . M c C a r t h y , A . J . a n d P . B r o d a . 1 9 8 4 . S c r e e n i n g f o r l i g n i n - d e g r a d i n g a c t i n o m y c e t e s a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e i r a c t i v i t y a g a i n s t [ “ C ] - l i g n i n - l a b e l l e d w h e a t l i g n o c e l l u l o s e . J . G e n . M i c r o b i a l . 1 3 0 : 2 9 0 5 - 2 9 1 3 . M c L a f f e r t y , F . W . 1 9 7 3 . I n t e r p r e t a t i o n o f M a s s S p e c t r a , 2 n d e d . W . A . B e n j a m i n I n c . , R e a d i n g , M A . M e l l o r , D . P . 1 9 7 9 . C h e m i s t r y o f c h e l a t i o n a n d c h e l a t i n g a g e n t s . I n T h e C h e l a t i a n o f H e a v y M e t a l s : I n t e r n a t i o n a l E n c y c l o p e d i a o f P h a r m a c o l o g y a n d T h e r a p e u t i c s . S a r t o r e l l i , A . C . a n d W . G . L e v i n e . ( e d s . ) . P e r g a m o n P r e s s , N e w Y o r k . 1 - 1 0 5 . M e s s n e r , K . a n d E . S r e b o t n i k . 1 9 9 4 . B i o p u l p i n g : A n o v e r v i e w o f d e v e l o p m e n t s i n a n e n v i r o n m e n t a l l y s a f e p a p e r - m a k i n g t e c h n o l o g y . F E M S M i c r o b i o l . R e v . 1 3 : 3 5 1 - 3 6 4 . M i c h e l , F . C . J r . 1 9 9 1 . T h e p e r o x i d a s e s o f P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m : C u l t u r e m o d e l l i n g a n d a p p l i c a t i o n . D o c t o r a l D i s s e r t a t i o n . M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y , E a s t L a n s i n g , M I . M i c h e l , F . C . J r , S . B . D a s s , E . A . G r u l k e a n d C . A . R e d d y . 1 9 9 1 . R o l e o f m a n g a n e s e p e r o x i d a s e s a n d l i g n i n p e r o x i d a s e s o f P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m i n t h e d e c o l o r i z a t i o n o f k r a f t b l e a c h p l a n t e f f l u e n t . A p p l . E n v i r o n . M i c a r b i a l . 5 7 : 2 3 6 8 . M o r c k , R . , H . Y o s h i d a a n d K . P . K r i n g s t a d . 1 9 8 6 . F r a c t i o n a t i o n o f k r a f t l i g n i n b y s u c c e s s i v e e x t r a c t i o n w i t h o r g a n i c s o l v e n t s : I . F u n c t i o n a l g r o u p s , l 3 C - N M R - s p e c t r a a n d m o l e c u l a r w e i g h t d i s t r i b u t i o n . H a l z f a r s c h u n g . M u h e i m , A . , R . W a l d n e r , M . S . A . L e i s o l a a n d A . F i e c h t e r . 1 9 9 0 . A n e x t r a c e l l u l a r a r y - a l c o h o l o x i d a s e f r o m t h e w h i t e - r o t f u n g u s B j e r k a n d e r a a d u s t a . E n z y m e M i c r a b . T e c h n o ] . 1 2 : 2 0 4 - 2 0 9 . N i c h o l l s , D . 1 9 7 4 . C o m p l e x e s a n d F i r s t - R a w T r a n s i t i o n E l e m e n t s . S y k e s , P . ( e d . ) . M a c m i l l a n P r e s s L T D . , L o n d o n . 1 6 9 - 1 7 0 . N i e m e l a , K . 1 9 8 8 a . G L C - M S s t u d i e s o n p i n e k r a f t b l a c k l i q u o r s . P a r t I : I d e n t i fi c a t i o n o f m o n o m e r i c c o m p o u n d s . H a l z f a r s c h u n g . 4 2 : 1 6 9 - 1 7 3 . N i e m e l a , K . 1 9 8 8 b . G L C - M S s t u d i e s o n p i n e k r a f t b l a c k l i q u o r s . P a r t I I : I d e n t i fi c a t i o n o f h y d r o x y a c i d s w i t h a s t i l b e n e s t r u c t u r e . H a l z f a r s c h u n g . 4 2 : 1 7 5 - 1 7 6 . 3 9 0 N i e m e l a , K . 1 9 8 9 . G L C - M S s t u d i e s o n p i n e k r a f t b l a c k l i q u o r s . P a r t V : I d e n t i fi c a t i o n o f c a t e c h o l c o m p o u n d s . H a l z f a r s c h u n g . 4 3 : 9 9 - 1 0 3 . N i m z , H . H . , D . R o b e r t , O . F a i x a n d M . N e m r . 1 9 8 1 . C a r b o n - 1 3 N M R s p e c t r a o f l i g n i n s , 8 : S t r u c t u r a l d i f f e r e n c e s b e t w e e n l i g n i n s o f h a r d w o o d s , s o f t w o o d s , g r a s s e s a n d c o m p r e s s i o n w o o d . H a l z f a r s c h u n g . 3 5 : 1 6 — 2 6 . O b s t , J . R . 1 9 8 2 . G u a i a c y l a n d s y r i n g y l l i g n i n c o m p o s i t i o n i n h a r d w o o d c e l l c o m p o n e n t s . H a l z f a r s c h u n g . 3 6 : 1 4 3 - 1 5 2 . O b s t , J . R . a n d L . L . L a n d u c c i . 1 9 8 6 . Q u a n t i t a t i v e I 3 C - N M R o f l i g n i n s - m e t h o x y l z a r y l r a t i o . H a l z f a r s c h u n g . 4 0 ( s u p p l . ) : 8 7 - 9 2 . O b s t , J . R . a n d J . R a l p h . 1 9 8 3 . c h a r a c t e r i z a t i o n o f h a r d w o o d l i g n i n : I n v e s t i g a t i o n o f s y r i n g y l / g u a i a c y l c o m p o s i t i o n b y B C n u c l e a r m a g n e t i c r e s o o n a n c e s p e c t r o s c o p y . H a l z f a r s c h u n g . 3 7 : 2 9 7 - 3 0 2 . O l s e n , W . L . , H . P . G a l l a g h e r , K . A . B u r r i s , S . S . B h a t t a c h a r j e e , J . P . S l o c o m b a n d D . M . D e w i t t . 1 9 9 1 . E n z y m a t i c d e l i g n i n i fi c a t i o n o f l i g n o c e l l u l o s i c m a t e r i a l . E u r o p e a n P a t e n t A p p l i c a t i o n N o . 9 0 1 1 1 6 2 0 2 . P u b l i c a t i o n N o . 0 4 0 6 6 1 7 A 2 : . O r t h , A . B . , D . J . R o y s e a n d M . T i e n . 1 9 9 3 . U b i q u i t y o f l i g n i n - d e g r a d i n g p e r o x i d a s e s 2 a m o n g v a r i o u s w o o d - d e g r a d i n g f u n g i . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 9 : 4 0 1 7 - 4 3 . O s t e r b e r g , F . a n d K . L i n d s t r o m . 1 9 8 5 a . C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e h i g h m o l e c u l a r m a s s c h l o r i n a t e d m a t t e r i n s p e n t b l e a c h l i q u e r s ( S B L ) . P a r t I I : A c i d i c S B L . H a l z f a r s c h u n g . 3 9 : 1 4 9 - 1 5 8 . O s t e r b e r g , F . a n d K . L i n d s t r o m . 1 9 8 5 b . C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e h i g h m o l e c u l a r m a s s c h l o r i n a t e d m a t t e r i n s p e n t b l e a c h l i q u e r s ( S B L ) . 3 - m a s s s p e c t r o m e t r i c i z r b t e q a g e t a z t i o n o f a r o m a t i c d e g r a d a t i o n p r o d u c t s i n S B L . O r g . M a s s S p e c t r o m . : 5 1 - 5 4 . O t j e n , L . a n d R . A . B l a n c h e t t e . 1 9 8 6 . A d i s c u s s i o n o f m i c r o s t r u c t u r a l c h a n g e s i n w o o d d u r i n g d e c o m p o s i t i o n b y w h i t e - r o t b a s i d i o m y c e t e s . C a n . J . B o t . 6 4 : 9 0 5 - 9 1 1 . P a s z c z y n s k i , A . , R . L . C r a w f o r d a n d V . B . H u y n h . 1 9 8 8 . M a n g a n e s e p e r o x i d a s e o f P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m : P u r i fi c a t i o n . I n M e t h o d s i n s z y m a l a g y . ( 2 2 1 0 5 2 2 1 3 3 . P . a n d N . 0 . K a p l a n . ( e d s . ) . A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k . 1 1 : - 7 . P a s z c z y n s k i , A . , V . B . H u y n h a n d R . L . C r a w f o r d . 1 9 9 1 . E n z y m a t i c a c t i v i t i e s o f a n e x t r a c e l l u l a r m a n g a n e s e - d e p e n d e n t p e r o x i d a s e f r o m P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o n ’ u m . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 1 7 8 : 1 0 9 2 - 1 0 9 8 . P e r e z , J . a n d T . W . J e f f r i e s . 1 9 9 0 . M i n e r a l i z a t i o n o f l ‘ C - r i n g l a b e l e d s y n t h e t i c l i g n i n c o r r e l a t e s w i t h t h e p r o d u c t i o n o f l i g n i n p e r o x i d a s e n o t o f m a n g a n e s e p e r o x i d a s e o r l a c c a s e . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i a . 5 6 : 1 8 0 6 — 1 8 1 2 . P e r e z , J . a n d T . W . J e f f r i e s . 1 9 9 2 . R o l e s o f m a n g a n e s e a n d o r g a n i c a c i d c h e l a t o r s i n r e g u l a t i n g l i g n i n d e g r a d a t i o n a n d b i o s y n t h e s i s o f p e r o x i d a s e s b y P h a n e r o c h a e t e C h r y s o s p o r i w n . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i a l . 5 8 : 2 4 0 2 - 2 4 0 9 . 3 9 1 P e r e z , J . a n d T . W . J e f f r i e s . 1 9 9 3 . R o l e s o f o r g a n i c a c i d c h e l a t o r s i n m a n g a n e s e r e g u l a t i o n o f l i g n i n d e g r a d a t i o n b y P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i w n . A p p ] . B i o c h e m . B i a t e c h n a l . 3 9 / 4 0 : 2 2 7 - 2 3 8 . P h i l p , R . P . , N . J . R u s s e l l , T . D . G i l b e r t a n d J . M . F r i e d r i c h . 1 9 8 2 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f V i c t o r i a n s o f t b r o w n c o a l w o o d b y m i c r o s c o p i c t e c h n i q u e s a n d C u r i e - p o i n t p y r o l y s i s c o m b i n e d w i t h g a s c h r o m a t o g r a p h y - m a s s s p e c t r o m e t r y . J . A n a l . A p p l . P y r o l . 4 : 1 4 3 - 1 6 1 . P i c k , E . a n d Y . K e i s a r i . 1 9 8 0 . A s i m p l e c o l o r i m e t r i c m e t h o d f o r t h e m e a s u r e m e n t o f h y d r o g e n p e r o x i d e p r o d u c e d b y c e l l s i n c u l t u r e . J . I m m u n o l . M e t h . 3 8 : 1 6 1 - 1 7 0 . P o m e t t o , A . L . , 1 1 1 a n d D . L . C r a w f o r d . 1 9 8 8 a . G a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y o f a r o m a t i c f r a g m e n t s f r o m l i g n i n d e g r a d a t i o n . I n M e t h o d s i n E n z y m a l a g y . C o l o w i c k , S . P . a n d N . 0 . K a p l a n . ( e d s . ) . A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k . 1 6 1 : 1 7 5 - 1 8 3 . P o m e t t o , A . L . , 1 1 1 a n d D . L . C r a w f o r d . 1 9 8 8 b . H i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y o f a r o m a t i c f r a g m e n t s f r o m l i g n i n d e g r a d a t i o n . I n M e t h o d s i n E n z y m a l a g y . C o l o w i c k , S . P . a n d N . 0 . K a p l a n . ( e d s . ) . A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k . 1 6 1 : 1 8 3 - 1 9 0 . P o u w e l s , A . D . a n d J . J . B o o n . 1 9 8 7 . A n a l y s i s o f l i g n i n a n d c h l o r o l i g n i n r e s i d u e s i n a b e e c h x y l a n f r a c t i o n b y p y r o l y s i s g a s c h r o m a t o g r a p h y m a s s s p e c t r o m e t r y . J . W o o d C h e m . T e c h n o l . 7 : 1 9 7 - 2 1 3 . R a m a l o i s h n a n , V . a n d J . M . T . M a r o o r . 1 9 8 8 . I R a n d r a m a n s t u d i e s o f g e l g r o w n m a n g a n e s e t a r t r a t e . I n f r a r e d P h y s . 2 8 : 2 0 1 - 2 0 4 . R e d d y , C . A . a n d T . M . D ’ S o u z a . 1 9 9 4 . P h y s i o l o g y a n d m o l e c u l a r b i o l o g y o f t h e l i g n i n p e r g x i d a s e o f P h a n e r o c h a e t e C h r y s o s p o r i w n . F E M S M i c r o b i a l . R e v . 1 3 : 1 3 7 - 1 5 . R e i d , 1 . D . a n d M . G . P a i c e . 1 9 9 4 . B i o l o g i c a l b l e a c h i n g o f k r a f t p u l p s b y w h i t e - r o t f u n g i a n d t h e i r e n z y m e s . F E M S M i c r o b i a l . R e v . 1 3 : 3 6 9 - 3 7 6 . R o b e r t , D . 1 9 8 9 . B i o d e g r a d a t i o n o f l i g n i n i n s p r u c e w o o d b y P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o n ' u m : q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f b i o d e g r a d e d s p r u c e l i g n i n s b y 1 3 C N M R s p e c t r o s c o p y . H a l z f a r s c h u n g . 4 3 : 3 2 3 - 3 3 2 . R o b e r t , D . R . a n d G . G r u n o w . 1 9 8 4 . Q u a n t i t a t i v e e s t i m a t i o n o f h y d r o x y l g r o u p s i n m i l l e d w o o d l i g n i n f r o m s p r u c e a n d i n a d e h y d r o g e n a t i o n p o l y m e r f r o m c o n i f e r y l a l c o h o l u s i n g l 3 C N M R s p e c t r o s c o p y . H a l z f a r s c h u n g . 3 8 : 8 5 - 9 0 . R o l a n d o , C . , B . M o n t i e s a n d C . L a p i e r r e . 1 9 9 2 . T h i o a c i d o l y s i s . I n M e t h o d s i n L i g r l i i n C h e m i s t r y . L i n , S . Y . a n d C . W . D e n c e . ( e d s . ) . S p r i n g e r - V e r l a g , N e w Y o r . R u e l , K . a n d F . B a m o u d . 1 9 8 5 . D e g r a d a t i o n o f w o o d b y m i c r o o r g a n i s m s . I n B i a s y n t h e s i s a n d B i o d e g r a d a t i o n o f W o o d . H i g u c h i , T . ( e d s . ) . A c a d e m i c P r e s s , S a n D i e g o , C A . 4 4 1 - 4 6 7 . 3 9 2 R y u , K . a n d J . S . D o r d i c k . 1 9 9 2 . H o w d o o r g a n i c s o l v e n t s a f f e c t p e r o x i d a s e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n ? B i o c h e m i s t r y . 3 1 : 2 5 8 8 - 5 9 8 . S a e m a n , J . F . , J . L . B u b l a n d E . E . H a r r i s . 1 9 4 5 . Q u a n t i t a t i v e s a c c a r i fi c a t i o n o f w o o d a n d c e l l u l o s e . I n d . E n g . C h e m . 1 7 : 3 5 . S a i z - J i m e n e z , C . a n d J . W . d e L e e u w . 1 9 8 4 . P y r o l y s i s - g a s c h r o m a t o g r a p h y - m a s s s p e c t r o m e t r y o f i s o l a t e d , s y n t h e t i c , a n d d e g r a d e d l i g n i n s . O r g . G e a c h e m . 6 : 4 1 7 - 4 2 2 . S a k a , S . , P . W h i t i n g , K . F u k a z a w a a n d D . A . I . G o r i n g . 1 9 8 2 . C o m p a r a t i v e s t u d i e s o n l i g n i n d i s t r i b u t i o n b y U V m i c r o s c o p y a n d b r o m i n a t i o n c o m b i n e d w i t h E D X A . W o o d S c i . T e c h n o l . 1 6 : 2 6 9 - 2 7 7 . S a l o m o n s s o n , A . C . , O . T h e a n d e r a n d P . A m a n . 1 9 7 8 . Q u a n t i t a t i v e d e t e r m i n a t i o n b y G L C o f p h e n o l i c a c i d s a s e t h y l d e r i v a t i v e s i n c e r e a l s t r a w s . J . A g r i c . F o o d C h e m . 2 6 : 8 3 0 - 8 3 5 . S a n g l a r d , D . , M . S . A . L e i s o l a a n d A . F i e c h t e r . 1 9 8 6 . R o l e o f e x t r a c e l l u l a r l i g n i n a s e s i n b i o d e g r a d a t i o n o f b e n z o ( a ) p y r e n e b y P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i w n . E n z . M i c r a b . T e c h n o ] . 8 : 2 0 9 - 2 1 2 . S a r k a n e n , K . V . a n d C . H . L u d w i g . 1 9 7 1 . L i g n i n s : O c c u r r e n c e , f o r m a t i o n , s t r u c t u r e , a n d r e a c t i o n s . W i l e y - I n t e r s c i e n c e , N e w Y o r k . S a r k a n e n , S . , R . A . R a z a l , T . P i c c a r i e l l o , E . Y a m a m o t o a n d N . G . L e w i s . 1 9 9 1 . L i g n i n p e r o x i d a s e : T o w a r d a c l a r i fi c a t i o n o f i t s r o l e i n v i v o . J . B i o l . C h e m . 2 6 6 : 3 6 3 6 - 3 6 4 3 . S c h o e m a k e r , H . E . , T . K . L u n d e l l , A . I . H a t a k k a a n d K . P i o n t e k . 1 9 9 4 . T h e o x i d a t i o n o f v e r a t r y l a l c o h o l , d i m e r i c l i g n i n m o d e l s a n d l i g n i n b y l i g n i n p e r o x i d a s e : T h e r e d o x c y c l e r e v i s i t e d . F E M S M i c r o b i a l . R e v . 1 3 : 3 2 1 - 3 3 2 . S c h m i d t , H . W . H . , S . D . H a e m m e r l i , H . E . S c h o e m a k e r a n d M . S . A . L e i s o l a . 1 9 8 9 . O x i d a t i v e d e g r a d a t i o n o f 2 , 3 - d i m t h o x y b e n 1 a l c o h o l a n d i t s m e t h y l e t h e r 3 % l t h ; é _ l i _ g / r g r i 3 n p e r o x i d a s e o f P h a n e r o c h a e t e c r y s o s p o r i w n . B i o c h e m i s t r y . : 1 . S c h u l t z , T . P . a n d W . G . G l a s s e r . 1 9 8 6 . Q u a n t i t a t i v e s t r u c t u r a l a n a l y s i s o f l i g n i n b y d i f f u s e r e fl e c t a n c e i n fi a r e d s p e c t r o m e t r y . H a l z f a r s c h u n g . 4 0 ( s u p p l . ) : 3 7 - 4 4 . S c h u l t z , T . P . , M . C . T e m p l e t o n a n d G . D . M c G i n n i s . 1 9 8 5 . R a p i d d e t e r m i n a t i o n o f l i g n o c e l l u l o s e b y d i f f u s e r e fl e c t a n c e f o u r i e r t r a n s f o r m i n f r a r e d s p e c t r o m e t r y . A n a l . C h e m . 5 7 : 2 8 6 7 - 2 8 6 9 . S e d g w i c k , R . D . a n d D . M . H i n d e n l a n g . 1 9 8 8 . M a s s S p e c t r o m e t r y . I n M a t e r i a l s C h a r a c t e r i z a t i o n a n d C h e m i c a l A n a l y s i s . S i b l i a , J . P . ( e d . ) . V C H , N e w Y o r k . C h a p t e r 3 : 4 5 - 6 0 . S h i m a d a , M . F . , F . N a k a t s u b a , T . K . K i r k a n d T . H i g u c h i . 1 9 8 1 . B i o s y n t h e s i s o f t h e s e c o n d a r y m e t a b o l i t e v e r a t r y l a l c o h o l i n r e l a t i o n t o l i g n i n d e g r a d a t i o n i n P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m . A r c h . M i c r o b i o l . 1 2 9 : 3 2 1 - 3 2 4 . 3 9 3 S j é s t r é m , J . a n d M . R e u n a n e n . 1 9 9 0 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f l i g n i n a n d c a r b o h y d r a t e s d i s s o l v e d i n g r o u n d w o o d p u l p i n g b y p y r o l y s i s - g a s c h r o m a t o g r a p h y / m a s s s p e c t r o m e t r y . J . A n a l . A p p l . P y r o l . 1 7 : 3 0 5 - 3 1 8 . S u s m e l , P . a n d B . S t e f a n o n . 1 9 9 3 . A s p e c t s o f l i g n i n d e g r a d a t i o n b y r u m e n m i c r o o r g a n i s m s . J . B i a t e c h n a ] . 3 0 : 1 4 1 - 1 4 8 . T a n a h a s h i , M . a n d T . H i g u c h i . 1 9 8 8 . C h e m i c a l d e g r a d a t i o n m e t h o d s f o r c h a r a c t e r i z a t i o n o f l i g n i n s . I n M e t h o d s i n E n z y m a l a g y . C o l o w i c k , S . P . a n d N . 0 . K a p l a n . ( e d s . ) . A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k . 1 6 1 : 1 0 1 - 1 0 9 . T a y l o r , J . R . 1 9 8 2 . A n I n t r o d u c t i o n t o E r r o r A n a l y s i s : T h e S t u d y o f U n c e r t a i n t i e s i n P h y s i c a l M e a s u r e m e n t s . C o m m i n s , E . D . ( e d . ) . U n i v e r s i t y S c i e n c e B o o k s , M i l l V a l l e y , C A . T a y l o r , M . G . , Y . D e s l a n d e s , T . B l u h m , R . H . M a r c h e s s a u l t , M . V i n c e n d o n a n d J . S a i n t - G e r m a i n . 1 9 8 3 . S o l i d s t a t e ‘ C - N M R c h a r a c t e r i z a t i o n o f w o o d . T a p p i J . 6 6 : 9 2 - 9 4 . T h o m p s o n , D . N . 1 9 8 9 . T h e e f f e c t s o f p h y s i c a l a n d c h e m i c a l c o n s t r a i n t s o n t h e e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f l i g n o c e l l u l o s r c m a t e r i a l s . M . S . T h e s i s . M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y , E a s t L a n s i n g , M I . T h o m p s o n , D . N . , H . C . C h e n a n d H . E . G r e t h l e i n . 1 9 9 2 . C o m p a r i s o n o f p r e t e a t m e n t m e t h o d s o n t h e b a s i s o f a v a i l a b l e s u r f a c e a r e a . B i o r e s a u r c e T e c h n o l o g y . 3 9 : 1 5 5 - 1 6 3 . T i e n , M . 1 9 8 7 . P r o p e r t i e s o f l i g n i n a s e f r o m P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m a n d p o s s i b l e a p p l i c a t i o n s . C R C C r i t . R e v . M i c r o b i a l . 1 5 : 1 4 1 . T i e n , M . a n d T . K . K i r k . 1 9 8 8 . L i g n i n p e r o x i d a s e o f P h a n e r a c h a e t e c h r y s o s p o n ' u m . I n M e t h o d s i n E n z y m a l a g y . C o l o w i c k , S . P . a n d N . 0 . K a p l a n . ( e d s . ) . A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k . 1 6 1 : 2 3 8 - 2 4 9 . T i e n , M . a n d T . K . K i r k . 1 9 8 4 . L i g n i n - d e g r a d i n g e n z y m e f r o m P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i w n . P u r i fi c a t i o n , c h a r a c t e r i z a t i o n a n d c a t a l y t i c p r o p e r t i e s o f a u n i q u e H 2 0 2 - r e q u i r i n g o x y g e n a s e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A . 8 1 : 2 2 8 0 - 2 2 8 4 . T i e n , M . , T . K . K i r k , C . B u l l a n d J . A . F e e . 1 9 8 6 . S t e a d y - s t a t e a n d t r a n s i e n t - s t a t e k i n e t i c s t u d i e s o n t h e o x i d a t i o n o f 3 , 4 - d i m e t h o x y b e n z y l a l c o h o l c a t a l y z e d b y t h e l i g n i n a s e o f P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m B u r d s . J . B i o l . C h e m . 2 6 1 : 1 6 8 7 - 1 6 9 3 . T s a o , G . T . , M . R . L a d i s c h a n d H . R . B u n g a y . 1 9 8 7 . B i o m a s s r e fi n i n g . I n A d v a n c e d B i o c h e m i c a l E n g i n e e r i n g . B u n g a y , H . R . a n d G . B e l f o r t . ( e d s . ) . W i l e y I n t e r s c i e n c e , N e w Y o r k . 7 9 — 1 0 1 . T u o r , U . , H . W a r i i s h i , H . E . S c h o e m a k e r a n d M . H . G o l d . 1 9 9 2 . O x i d a t i o n o f p h e n o l i c a r y l g l y c e r o l B - a r y l e t h e r l i g n i n m o d e l c o m p o u n d s b y m a n g a n e s e p e r o x i d a s e f r o m P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m : O x i d a t i v e c l e a v a g e o f a c u r - c a r b o n y l m o d e l c o m p o u n d . B i o c h e m i s t r y . 3 1 : 4 9 8 6 — 4 9 9 5 . 3 9 4 U m e z a w a , T . a n d T . H i g u c h i . 1 9 8 8 . A n a l y s i s o f l i g n i n d e g r a d a t i o n i n t e r m e d i a t e s b y t h i n - l a y e r c h r o m a t o g r a p h y a n d g a s c h r o m a t o g r a p h y - m a s s s p e c t r o m e t r y . I n M e t h o d s i n E n z y m a l a g y . C o l o w i c k , S . P . a n d N . 0 . K a p l a n . ( e d s . ) . A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k . 1 6 1 : 2 0 0 - 2 1 1 . V a l l i , K . , B . J . B r o c k , D . K . J o s h i a n d M . H . G o l d . 1 9 9 2 b . D e g r a d a t i o n o f 2 , 4 - d i n i t r o t o l u e n e b y t h e l i g n i n - d e g r a d i n g f u n g u s P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m . A p p ] . E n v i r o n . M i c r o b i a l . 5 8 : 1 2 2 1 - 1 2 2 8 . V a l l i , K . a n d M . H . G o l d . 1 9 9 1 . D e g r a d a t i o n o f 2 , 4 - d i c h l o r o p h e n o l b y t h e l i g n i n - d e g r a d i n g f u n g u s P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m . J . B a t e r i a l . 1 7 3 : 3 4 5 - 3 5 2 . V a l l i , K . , H . W a r i i s h i a n d M . H . G o l d . 1 9 9 2 a . D e g r a d a t i o n o f 2 , 7 - d i c h l o r o d i b e n z o — p - d i o x i n b y t h e l i g n i n - d e g r a d i n g b a s i d i o m y c e t e P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i w n . J . B a c t e r i a l . 1 7 4 : 2 1 3 1 - 2 1 3 7 . V a n d e r H a g e , E . R . E . , M . M . M u l d e r a n d J . J . B o o n . 1 9 9 3 . S t r u c t u r a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f l i g n i n p o l y m e r s b y t e m p e r a t u r e - r e s o l v e d i n - s o u r c e p y r o l y s i s - m a s s s p e c t r o m e t r y a n d C u r i e - p o i n t p y r o l y s i s - g a s c h r o m a t o g r a p h y / m a s s s p e c t r o m e t r y . J . A n a l . A p p ] . P y r a l . 2 5 : 1 4 9 - 1 8 3 . V a n d e r K l a s h o r s t , G . H . 1 9 8 8 . L o w M o l e c u l a r w e i g h t m a s s l i g n i n f r a g m e n t s p r e s e n t i n i n d u s t r i a l k r a f t p i n e s p e n t l i q u o r . H a l z f a r s c h u n g . 4 2 : 6 5 - 6 6 . W a r i i s h i , H . , L . A k i l e s w a r a n a n d M . H . G o l d . 1 9 8 8 . M a n g a n e s e p e r o x i d a s e f r o m t h e b a s i d i o m y c e t e , P h a n e r o c h a e t e C h r y s o s p o r i u m : S p e c t r a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e o x i d i z e d s t a t e s a n d t h e c a t a l y t i c c y c l e . B i o c h e m i s t r y . 2 7 : 5 3 6 5 - 5 3 7 0 . W a r i i s h i , H . , H . B . D u n f o r d , I . D . M a c D o n a l d a n d M . H . G o l d . 1 9 8 9 a . M a n g a n e s e p e r o x i d a s e f r o m t h e l i g n i n - d e g r a d i n g b a s i d i o m y c e t e P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m : T r a n s i e n t s t a t e k i n e t i c s a n d r e a c t i o n m e c h a n i s m . J . B i o l . C h e m . 2 6 4 : 3 3 3 5 - 3 3 4 0 . W a r i i s h i , H . , K . V a l l i a n d M . H . G o l d . 1 9 9 1 . I n v i t r o d e p o l y m e r i z a t i o n o f l i g n i n b y m a n g a n e s e p e r o x i d a s e o f P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 1 7 6 : 2 6 9 - 2 7 5 . W a r i i s h i , H . , K . V a l l i a n d M . H . G o l d . 1 9 9 2 . M a n g a n e s e ( I I ) o x i d a t i o n b y m a n g a n e s e p e r o x i d a s e f r o m t h e b a s i d i o m y c e t e P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m : K i n e t i c m e c h a n i s m a n d r o l e o f c h e l a t o r s . J . B i o l . C h e m . 2 6 7 : 2 3 6 8 8 - 2 3 6 9 5 . W a r i i s h i , H . , K . V a l l i , a n d M . H . G o l d . 1 9 8 9 b . O x i d a t i v e c l e a v a g e o f a p h e n o l i c d i a r y l p r o p a n e l i g n i n m o d e l d i m e r b y m a n g a n e s e p e r o x i d a s e f r o m P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m . B i o c h e m i s t r y . 2 8 : 6 0 1 7 - 6 0 2 3 . W a t s o n , J . T . 1 9 8 5 . I n t r o d u c t i o n t o M a s s S p e c t r o m e t r y , 2 n d e d . R a v e n P r e s s , N e w Y o r k . C h a p t e r 9 . Y a n g , J . M . a n d D . A . I . G o r i n g . 1 9 8 0 . T h e p h e n o l i c h y d r o z y l c o n t e n t o f s p r u c e w o o d . C a n . J . C h e m . 5 8 : 2 4 1 1 - 2 4 1 4 . Y a n n o n i , C . S . 1 9 8 2 . H i g h - r e s o l u t i o n N M R i n s o l i d s : T h e C P M A S e x p e r i m e n t . A c c . C h e m . R e s . 1 5 : 2 0 1 - 2 0 8 . H I C H I G R N S T A T E U N I V . L I B R Q R I E S l l H l H l l l W l l l l l l l l l l W l l H l l i l H l l l l l l l l l l l l l l l l l fl l l 3 1 2 9 3 0 1 0 1 6 4 5 3 5