: x . 3 5 ‘ I - ‘ . . v w . . . 5 2 5 n 1 . : I : . i . i . v 1 : I . . . . I : 7 . . . . n 1 I . 2 . 7 2 i , Z l i w z u q r f . J : 1 v , . . t . 2 4 u i $ \ = u t . . L V r 1 9 h ” : n . u p “ . . . . 3 » ? u . 1 . 1 1 ) . r . 5 l A . : 5 ? 4 . h a s 4 \lllililiilll 0 1 0 3 1 2 9 3 \\\\\\\\Ll\\\\l 2 3 3 ll 1 9 B R A R I E S U N I V E R S I T Y \ I ‘ I T h i s i s t o c e r t i f y t h a t t h e d i s s e r t a t i o n e n t i t l e d T h e D e v e l o p m e n t o f a n I n t e l l i g e n t A u t o m a t e d H i g h P e r f o r m a n c e L i q u i d C h r o m a t o g r a p h i c S y s t e m p r e s e n t e d b y S t e p h e n V a n c e M e d l i n h a s b e e n a c c e p t e d t o w a r d s f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r P h 1 D ; d e g r e e i n m W / é z / D a t e J u n e : 3 “ , I 9 9 3 M S U i s a n A f fi r m a t i v e A c t i o n / E q u a l O p p o r t u n i t y I n s t i t u t i o n M a j o r p r o f e s s o r L I B R A R Y M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y P L A C E I N R E T U R N B O X t o r e m o v e t h i s c h e c k o u t f r o m y o u r r e c o r d . T O A V O I D F I N E S r e t u r n o n o r b e f o r e d a t e d u e . D A T E D U E D A T E D U E D A T E D U E M S U i s A n A f f i r m a t i v e A c t i o n / E q u a l O p p o r t u n i t y i n s t i t u t i o n c h i m e r a s - n 1 D E V E L O P M E N T O F A N I N T E L L I G E N T A U T O M A T E D H I G H P E R F O R M A N C E L I Q U I D C H R O M A T O G R A P H Y S Y S T E M V o l u m e I B Y S t e p h e n V a n c e M e d l i n A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l f i l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y D e p a r t m e n t o f C h e m i s t r y 1 9 9 3 M . c ° m p l e x a D P F O p r i a a U i o m a t e : C ° m D i e x i r T h B X p e n s y s s o i u m s ) ‘ i n t e r a Q i O n c o l u m n . I h T h e i E C ( ) r , - m . . e n c S u g g e s t i n g s u c c e s S V i a T h e S o f t w a r e ‘ A A B S T R A C T D E V E L O P M E N T O F A N A U T O M A T E D , I N T E L L I G E N T H I G H P E R F O R M A N C E L I Q U I D C H R O M A T O G R A P H Y S Y S T E M B Y S t e p h e n V a n c e M e d l i n M e t h o d s d e v e l o p m e n t f o r h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( H P L C ) i s a c o m p l e x p r o c e s s . A n e x p e r t s y s t e m h a s b e e n c r e a t e d t o a s s i s t i n c h o o s i n g a n a p p r o p r i a t e c o l u m n , d e t e c t o r , a n d m o b i l e p h a s e . T h e H P L C i n s t r u m e n t h a s b e e n a u t o m a t e d t o p r o v i d e t h e a b i l i t y t o p e r f o r m c o l u m n s w i t c h i n g f o r s a m p l e s o f s u f f i c i e n t c o m p l e x i t y t h a t m u l t i p l e c o l u m n s m a y b e r e q u i r e d t o s e p a r a t e t h e s o l u t e s . T h e e x p e r t s y s t e m u s e s a fi r s t p r i n c i p l e a p p r o a c h t o d e d u c e a m e t h o d ( s ) . T h e e x p e r t s y s t e m q u e r i e s t h e u s e r w i t h r e s p e c t t o t h e c h e m i c a l a n d p h y s i c a l n a t u r e o f t h e s o i u t e ( s ) . T h e e x p e r t s y s t e m p r o p o s e s a m e t h o d b a s e d o n t h e p o s s i b l e c h e m i c a l i n t e r a c t i o n s b e t w e e n a n a l y t e ( s ) a n d s t a t i o n a r y p h a s e s . A f t e r r e c o m m e n d a t i o n o f a c o l u m n , t h e e x p e r t s y s t e m r e c o m m e n d s a n a p p r o p r i a t e d e t e c t o r a n d m o b i l e p h a s e . T h e e x p e r t s y s t e m u s e s c o n f i d e n c e f a c t o r s t o r a n k t h e d i f f e r e n t r e c o m m e n d a t i o n s . V a l i d a t i o n s t u d i e s a r e p r e s e n t e d t o d e m o n s t r a t e t h e f i r s t l e v e l o f s u g g e s t i n g a p p r o p r i a t e m e t h o d s a n d p r o v i d i n g a n u m e r i c a l r a n k i n g o f t h e e x p e c t e d s u c c e s s v i a t h e u s e o f c o n fi d e n c e f a c t o r s . T h e H P L C i n s t r u m e n t h a s b e e n a u t o m a t e d v i a a c o m b i n a t i o n o f h a r d w a r e a n d s o f t w a r e . A m o d u l a r s o f t w a r e s y s t e m h a s b e e n w r i t t e n w h i c h a l l o w s t h e u s e r t o c r e a t e a m e t h o d f < s w i t c h i n g a c h i e v e d s e l e c t i o n I R e : c o n s u l t a t i c p e r f o r m t i a b i l i t y t o p m e t h o d f o r s e p a r a t i n g t h e s a m p l e . T h e s o f t w a r e p r o v i d e s t h e a b i l i t y t o p e r f o r m c o l u m n s w i t c h i n g b a s e d u p o n t i m e c r i t e r i a o r t h e e l u t i o n o f s a m p l e . C o l u m n s w i t c h i n g i s a c h i e v e d t h r o u g h t h e a u t o m a t i o n o f t w o s i x - p o r t v a l v e s a n d a s i x - p o s i t i o n c o l u m n s e l e c t i o n v a l v e . R e s u l t s a r e p r e s e n t e d w h i c h d e m o n s t r a t e t h e a b i l i t y t o d e v e l o p a m e t h o d f r o m c o n s u l t a t i o n w i t h t h e e x p e r t s y s t e m a n d t h e n p r o g r a m m i n g t h e H P L C i n s t r u m e n t t o p e r f o r m t h e e x p e r i m e n t . P r e l i m i n a r y r e s u l t s a r e a l s o p r e s e n t e d w h i c h d e m o n s t r a t e t h e a b i l i t y t o p e r f o r m r e p r o d u c i b l e a n d c o m p l e x c o l u m n s w i t c h i n g . T o - K e l l y , w h o - a h u a y y t a r m a c / f o r m e ; i v d e v e l o ; s o p p o n J F r o m l a t D T O d d e d i n s t r u m e C O l e J t e u s i n g a f , E r j o y s " o f . « a b o u t t h e l e a s t i h a t W o n ' t e \ I e r r e t u r n t h e , I w f r i e n d s h i p A c k n o w l e d g e m e n t s G r e a t d i s c o v e r i e s a n d i m p r o v e m e n t s i n v a r i a b l y i n v o l v e t h e c o o p e r a t i o n o f m a n y m i n d s . I m a y b e g i v e n c r e d i t f o r h a v i n g b l a z e d t h e t r a i l b u t w h e n I l o o k a t t h e s u b s e q u e n t d e v e l o p m e n t s I f e e l t h e c r e d i t i s d u e t o o t h e r s r a t h e r t h a n t o m y s e l f . A l e x a n d e r G r a h a m B e l l I w o u l d l i k e t o D r . A d r i a n W a d e w h o i n t r o d u c e d m e t o e x p e r t s y s t e m s a n d w h o d e v e l o p e d t h e p r o t o t y p e e x p e r t s y s t e m . I w o u l d a l s o l i k e t o t h a n k A d r i a n f o r h i s s u p p o r t a n d h e l p t h a t h e h a s a l w a y s s h o w n m e . J i m R i d g e a n d I s p e n t a l i f e t i m e , i t s e e m s , t o g e t h e r i n t h e C h e m i s t r y B u i l d i n g . F r o m l a t e n i g h t e x p e r i m e n t s a t 4 : 0 0 a . m . t o e a r l y b r e a k f a s t s a t T h e i o s , J i m h a s h e l p e d , p r o d d e d , a n d s u p p o r t e d m y r e s e a r c h . J i m ' s e x p e r t i s e w i t h e l e c t r o n i c s a n d i n s t r u m e n t a t i o n h e l p e d g e t b a l k y e q u i p m e n t t o w o r k . I a m a l s o t h a n k f u l f o r J i m ' s 4 8 6 c o m p u t e r — w r i t i n g a d i s s e r t a t i o n w a s m a d e a l i t t l e ( j u s t a l i t t l e ) m o r e t o l e r a b l e w h e n u s i n g a f a s t c o m p u t e r . T h a n k s a l s o f o r t h e d a r t , r a c q u e t b a l l , a n d b a s k e t b a l l g a m e s . E r i c H e m e n w a y , t h e c o m p u t e r g u r u o f t h e d e p a r t m e n t , i n t r o d u c e d m e t o t h e " j o y s " o f a s s e m b l y l a n g u a g e . E r i c w a s a l w a y s t h e r e t o h e l p m e d e b u g m y s o f t w a r e , t a l k a b o u t t h e f u t u r e o f c o m p u t e r s , o r t o p l a y a g a m e o f o n e - o n - o n e . E r i c a l s o d o n a t e d ( a t l e a s t I h a v e n ' t r e c e i v e d a b i l l y e t ) h i s c o m p u t e r f o r m e t o u s e a s t h e H P L C c o n t r o l l e r . I w o n ' t e v e n m e n t i o n a l l t h e r e f e r e n c e b o o k s a n d m a t e r i a l s t h a t I b o r r o w e d f r o m h i m ( I d i d r e t u r n t h e m a l l , d i d n ' t I ? ) . I w o u l d l i k e t o t h a n k s e v e r a l p e o p l e w h o a r e m y f r i e n d s . I n g r a d u a t e s c h o o l , f r i e n d s h i p g o e s a l o n g w a y t o r e d u c i n g s t r e s s . J o h n J u d g e , D & D g u r u a n d a l l - a r o u n d V g o o c w h a t p r e s r k n o w t h e p s u p p K h n d e v e l s e n d . d i s s e r U n w m q I h a d r g o o d f r i e n d , w a s a l w a y s t h e r e f o r m e w h e n e v e r I n e e d e d t o t a l k , a s k q u e s t i o n s , o r w h a t e v e r . I a l s o a p p r e c i a t e t h e f r i e n d s h i p o f t h e C r o u c h g r o u p m e m b e r s , p a s t a n d p r e s e n t . O f c o u r s e , t h e p r o j e c t w o u l d n e v e r h a v e o c c u r r e d w i t h o u t t h e i n p u t f r o m t h e k n o w l e d g e a c q u i s i t i o n t e a m . D r . C r o u c h , m y r e s e a r c h p r e c e p t o r , w a s t h e t e a m l e a d e r o f t h e p r o j e c t a n d k e p t o u r p r o j e c t o n t r a c k a n d f o c u s e d . H e a l s o p r o v i d e d g u i d a n c e a n d s u p p o r t o f m e a s a g r a d u a t e s t u d e n t . D r . M c G u f fi n w a s o u r r e s i d e n t H P L C e x p e r t . D r s . K i m R a t a n a t h a n a w o n g s a n d C h r i s E v a n s p r o v i d e d a d d i t i o n a l i n p u t i n t o t h e e a r l y d e v e l o p m e n t s t a g e s . F i n a l l y , D r . W a d e w a s t h e i n i t i a l k n o w l e d g e e n g i n e e r . F i n a l l y , I w o u l d l i k e t o t h a n k m y f a m i l y m e m b e r s . M y w i f e , K e l l y , w a s a G o d - s e n d . N o t o n l y d i d s h e s u p p o r t m e e m o t i o n a l l y , s h e p r o o f r e a d a n d e d i t e d m y d i s s e r a t a t i o n . M y p a r e n t s h a v e b e e n s u p p o r t i v e d u r i n g m y t e n u r e a t M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y . I t h i n k t h a t t h e y w e r e a s h a p p y , i f n o t m o r e s o , w h e n I fi n a l l y t o l d t h e m t h a t I h a d m y P h . D . O c c a s i o n a l l y i n l i f e t h e r e a r e t h o s e m o m e n t s o f u n u t t e r a b l e f u l fi l l m e n t w h i c h c a n n o t b e c o m p l e t e l y e x p l a i n e d b y t h o s e s y m b o l s c a l l e d w o r d s . T h e i r m e a n i n g s c a n o n l y b e a r t i c u l a t e d b y t h e i n a u d i b l e l a n g u a g e o f t h e h e a r t . M a r t i n L u t h e r K i n g , J r . L B T L B T C H A F T A B L E O F C O N T E N T S L I S T O F T A B L E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x v L I S T O F F I G U R E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x v i i C H A P T E R I . M O T I V A T I O N F O R T H E D E V E L O P M E N T O F A N I N T E L L I G E N T A U T O M A T E D H I G H - P E R F O R M A N C E L I Q U I D C H R O M A T O G R A P H Y S Y S T E M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 S e c t i o n 1 . 1 . I n t r o d u c t i o n 1 S e c t i o n 1 . 2 . U s e o f C o m p u t e r s i n C h r o m a t o g r a p h y — O v e r v i e w 3 S e c t i o n 1 . 2 . 1 . P r e d i c t i o n , S i m u l a t i o n , a n d O p t i m i z a t i o n 3 S e c t i o n 1 . 2 . 2 . S u g g e s t i o n o f I n i t i a l H P L C C o n d i t i o n s a n d A u t o m a t i o n 9 S e c t i o n 1 . 3 . E x p e r t S y s t e m a s a n H P L C T o o l — O v e r v i e w 1 0 S e c t i o n 1 . 4 . R e q u i r e d I n f o r m a t i o n t o I m p l e m e n t t h e E x p e r t S y s t e m . . . . 1 l S e c t i o n 1 . 5 . O u t p u t f r o m t h e E x p e r t S y s t e m 1 2 S e c t i o n 1 . 6 . A u t o m a t i o n a s a n H P L C T o o l 1 4 S e c t i o n 1 . 7 . A u t o m a t i n g t h e H P L C 1 6 l i s t o f R e f e r e n c e s 1 8 C H A P T E R 2 . H I S T O R Y A N D T H E O R Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 S e c t i o n 2 . 1 . A r t i f i c i a l I n t e l l i g e n c e - 2 0 S e c t i o n 2 . 2 . B a c k g r o u n d o n E x p e r t S y s t e m s - - 2 3 S e c t i o n 2 . 3 . T e r m i n o l o g y 2 6 S e c t i o n 2 . 3 . 1 . K n o w l e d g e a n d F a c t B a s e s 2 6 S e c t i o n 2 . 3 . 2 . I n f e r e n c e E n g i n e 2 9 S e c t i o n 2 . 3 . 3 . U s e r I n t e r f a c e 3 0 S e c t i o n 2 . 4 . H i s t o r i c a l l y I m p o r t a n t E x p e r t S y s t e m s 3 1 S e c t i o n 2 . 5 . E x p e r t S y s t e m A p p l i c a t i o n s i n A n a l y t i c a l C h e m i s t r y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 S e c t i o n 2 . 5 . 1 . N o n - H P L C E x p e r t S y s t e m s . - - 3 4 S e c t i o n 2 . 5 . 2 . H P L C E x p e r t S y s t e m s 3 5 S e c t i o n 2 . 6 . I m p l e m e n t a t i o n o f E x p e r t S y s t e m s 3 8 S e c t i o n 2 . 6 . 1 . G o a l D e t e r m i n a t i o n 3 8 S e c t i o n 2 . 6 . 2 . K n o w l e d g e A c q u i s i t i o n 3 9 S e c t i o n 2 . 6 . 2 . 1 . M e t h o d s f o r K n o w l e d g e A c q u i s i t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 S e c t i o n 2 . 6 . 2 . 2 . P e r s o n n e l a n d R o l e s 4 0 S e c t i o n 2 . 6 . 3 . E n c o d i n g 4 1 S e c t i o n 2 . 6 . 3 . 1 . A I a n d E x p e r t S y s t e m L a n g u a g e s 4 1 S e c t i o n 2 . 6 . 3 . 2 . P r o t o t y p i n g o f t h e E x p e r t S y s t e m 4 2 S e c t i o n 2 . 7 . C o n f i d e n c e F a c t o r s 4 2 S e c t i o n 2 . 7 . 1 . C o m p a r i s o n o f P r o b a b i l i t y a n d P o s s i b i l i t y 4 2 S e c t i o n 2 . 7 . 2 . F u z z y L o g i c 4 4 S e c t i o n 2 . 7 . 3 . C e r t a i n t y T h e o r y 4 5 S e c t i o n 2 . 8 . C o n c l u s i o n s o f E x p e r t S y s t e m s a n d C e r t a i n t y T h e o r y . . . . . . . . 4 7 S e c t i o n 2 . 9 M u l t i d e m e n s i o n a l H i g h P e r f o r m a n c e l i q u i d C h r o m a t o g r a p h y ( M D - H P L C ) 4 9 S e c t i o n 2 . 9 . 1 D e f i n i t i o n a n d T h e o r y 4 9 S e c t i o n 2 . 9 . 2 A p p l i c a t i o n s o f M D - H P L C 5 1 l i s t o f R e f e r e n c e s 5 5 C H / C H A P T C H A P T E R 3 . I N S T R U M E N T A T I O N A N D S O F T W A R E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 9 S e c t i o n 3 . 1 . E x p e r t S y s t e m - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 9 S e c t i o n 3 . 1 . 1 . A I L a n g u a g e s V e r s u s C o m m e r c i a l S h e l l s . . . . . . - - - . 5 9 S e c t i o n 3 . 1 . 2 . M l E x p e r t S y s t e m S h e l l 6 4 S e c t i o n 3 . 1 . 3 . V P - E x p e r t E x p e r t S y s t e m S h e l l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 5 S e c t i o n 3 . 1 . 4 . A d d i t i o n a l S o f t w a r e S u p p o r t - - - - - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 9 S e c t i o n 3 . 2 . H P L C E q u i p m e n t a n d S u p p l i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 9 S e c t i o n 3 . 2 . 1 . I n s t r u m e n t a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - - 7 0 S e c t i o n 3 . 2 . 2 S o l v e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 0 S e c t i o n 3 . 2 . 3 C o l u m n s - - . . . . . . . . . . . . - 7 0 S e c t i o n 3 . 3 . C o m p u t e r C o n t r o l a n d A u t o m a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1 S e c t i o n 3 . 3 . 1 . S i x P o r t R h e o d y n e V a l v e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1 S e c t i o n 3 . 3 . 2 . C o l u m n S e l e c t i o n V a l v e - - - - - - - - - - 7 2 S e c t i o n 3 . 3 . 3 . V a l v e S e n s o r s - - 7 2 S e c t i o n 3 . 3 . 4 . P i l o t V a l v e s 7 5 S e c t i o n 3 . 3 . 5 . A c t u a t o r s , S o l e n o i d s , a n d R e l a y s 7 6 S e c t i o n 3 . 3 . 6 C o m p u t e r H a r d w a r e t o C o n t r o l t h e H P L C I n s t r u m e n t . . . . . . 7 7 S e c t i o n 3 . 3 . 6 . 1 P r o t o t y p e B o a r d 7 7 S e c t i o n 3 . 3 . 6 . 2 P r o g r a m m a b l e P a r a l l e l I n t e r f a c e B o a r d - - 7 7 S e c t i o n 3 . 3 . 6 . 3 T i m i n g C i r c u i t 7 9 S e c t i o n 3 . 3 . 6 . 4 D a t a A c q u i s i t i o n B o a r d - - - 8 0 S e c t i o n 3 . 3 . 7 I n t e r f a c e B o x - 8 0 S e c t i o n 3 . 3 . 8 S o f t w a r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 0 L i s t o f R e f e r e n c e s - - . . . . . . . . . . . . . 8 4 C H A P T E R 4 . E X P E R T S Y S T E M : C O L U M N S E L E C T I O N A N D V A L I D A T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 5 S e c t i o n 4 . 1 . I n t r o d u c t i o n - - - - - 8 5 S e c t i o n 4 . 2 . G o a l s o f R e s e a r c h - 8 5 S e c t i o n 4 . 2 . 1 . O f f - l i n e T o o l f o r H P L C M e t h o d s D e v e l o m e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 5 S e c t i o n 4 . 2 . 1 . 1 . E n d - U s e r - - - 8 6 i x S e c t i o n 4 . 2 . 1 . 2 . T y p e o f A p p l i c a t i o n S e c t i o n 4 . 2 . 1 . 3 . F i r s t P r i n c i p l e A p p r o a c h 8 7 8 8 S e c t i o n 4 . 2 . 2 . T u t o r i a l a n d T r a i n i n g T o o l 9 0 S e c t i o n 4 . 2 . 3 . O n - I i n e T o o l f o r A u t o m a t e d I n t e l l i g e n t H P L C I n s t r u m e n t a t i o n 9 1 S e c t i o n 4 . 3 . K n o w l e d g e A c q u i s i t i o n 9 1 S e c t i o n 4 . 3 . 1 . P e r s o n n e l a n d R o l e s 9 2 S e c t i o n 4 . 3 . 2 . K n o w l e d g e A c q u i s i t i o n S e s s i o n F o r m a t 9 2 S e c t i o n 4 . 3 . 3 . A d d i t i o n a l S o u r c e s o f I n f o r m a t i o n S e c t i o n 4 . 3 . 3 . 1 . T y p e s o f D a t a U s e d 9 6 9 6 S e c t i o n 4 . 4 . A c t i o n B l o c k 9 9 S e c t i o n 4 . 4 . 1 . D e t e r m i n a t i o n o f S u i t a b i l i t y S e c t i o n 4 . 4 . 2 . D e t e r m i n a t i o n o f S a m p l e P r e - T r e a t m e n t S e c t i o n 4 . 4 . 3 . D e t e r m i n a t i o n o f C l a s s o f S e p a r a t i o n S e c t i o n 4 . 4 . 4 . D e t e r m i n a t i o n o f C o l u m n a n d M o d e S e c t i o n 4 . 4 . 4 . 1 . P h y s i c a l P r o p e r t i e s S e c t i o n 4 . 4 . 4 . 2 . C h e m i c a l P r o p e r t i e s S e c t i o n 4 . 5 . R u l e s S e c t i o n 4 . 5 . 1 . O r d e r o f R u l e s S e c t i o n 4 . 5 . 2 . F o r w a r d C h a i n i n g S e c t i o n 4 . 5 . 3 . S e l f - D e t e r m i n i n g R u l e s S e c t i o n 4 . 6 . U s e r I n t e r f a c e S e c t i o n 4 . 7 . P r e l i m i n a r y V a l i d a t i o n o f t h e M 1 P r o t o t y p e E x p e r t S y s t e m S e c t i o n 4 . 7 . 1 . E s t r o g e n s T e s t C a s e — M 1 P r o t o t y p e S e c t i o n 4 . 7 . 2 . V a l i d a t i o n o f B V i t a m i n s - M l P r o t o t y p e S e c t i o n 4 . 7 . 3 . V a l i d a t i o n o f a H y p o t h e t i c a l C a s e — M 1 P r o t o t y p e S e c t i o n 4 . 8 . S e c o n d a r y V a l i d a t i o n o f t h e V P — E x p e r t E x p e r t S y s t e m S e c t i o n 4 . 8 . 1 . E s t r o g e n s T e s t C a s e — V P - E x p e r t S e c t i o n 4 . 8 . 2 . B V i t a m i n s T e s t C a s e — V P - E x p e r t S e c t i o n 4 . 8 . 3 . H y p o t h e t i c a l T e s t C a s e — V P - E x p e r t S e c t i o n 4 . 8 . 4 . C o n c l u s i o n s o f V a l i d a t i o n S t u d i e s 1 0 2 1 0 6 1 0 6 1 0 8 1 0 9 1 1 2 1 1 6 1 1 6 1 1 9 1 2 1 1 2 2 1 2 2 1 2 4 1 2 9 1 3 1 1 3 1 1 3 3 1 3 7 1 4 0 1 4 5 C H A S e c t i o n 4 . 9 . C o n f i d e n c e F a c t o r s 1 4 8 S e c t i o n 4 . 9 . 1 . M o t i v a t i o n s f o r U s i n g C o n f i d e n c e F a c t o r s 1 4 8 S e c t i o n 4 . 9 . 1 . 1 . F u z z y I n p u t 1 4 8 S e c t i o n 4 . 9 . 1 . 2 . A p p r o p r i a t e V a l u e s f o r C o n f i d e n c e F a c t o r s 1 4 9 S e c t i o n 4 . 1 0 . A n c i l l a r y F i l e s — T e x t , H e l p F i l e s , a n d D a t a B a s e s . 1 4 3 L i s t o f R e f e r e n c e s 1 5 5 C H A P T E R 5 . E X P E R T S Y S T E M : D E T E C T O R A N D M O B I L E P H A S E S E L E C T I O N A N D V A L I D A T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . l 5 7 P a r t I : R e c o m m e n d a t i o n o f D e t e c t o r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 8 S e c t i o n 5 . 1 . O v e r v i e w o f t h e D e t e c t o r M o d u l e - - - - - - - - - - - - 1 5 9 S e c t i o n 5 . 1 . 1 . G o a l s o f t h e D e t e c t o r M o d u l e 1 5 9 S e c t i o n 5 . 1 . 2 . D e t e c t o r s r e c o m m e n d e d b y t h e E x p e r t S y s t e m 1 6 0 S e c t i o n 5 . 1 . 3 . F o r m a t o f t h e P r e s e n t a t i o n o f t h e D i f f e r e n t D e t e c t o r s 1 6 1 S e c t i o n 5 . 2 . C o n fi d e n c e F a c t o r s B a s e d o n C o n c e n t r a t i o n 1 6 2 S e c t i o n 5 . 3 . U V - V i s i b l e D e t e c t o r s 1 6 8 S e c t i o n 5 . 3 . 1 . O v e r v i e w 1 6 8 S e c t i o n 5 . 3 . 2 . D e t e r m i n a t i o n o f C h r o m o p h o r e s 1 6 9 S e c t i o n 5 . 3 . 3 . D e t e r m i n a t i o n o f O p t i m u m W a v e l e n g t h 1 7 2 S e c t i o n 5 . 3 . 4 . D e t e r m i n a t i o n o f C o n c e n t r a t i o n R a n g e 1 7 3 S e c t i o n 5 . 4 . F l u o r e s c e n c e D e t e c t o r s 1 7 4 S e c t i o n 5 . 4 . 1 . O v e r v i e w 1 7 4 S e c t i o n 5 . 4 . 2 . D e t e r m i n a t i o n o f F l u o r o p h o r e s 1 7 4 S e c t i o n 5 . 4 . 3 . D e t e r m i n a t i o n o f C o n c e n t r a t i o n R a n g e a n d C N F 1 7 5 S e c t i o n 5 . 5 . E l e c t r o c h e m i c a l D e t e c t o r s 1 7 7 S e c t i o n 5 . 5 . 1 . O v e r v i e w a n d D e t e r m i n a t i o n i f S p e c i e s a r e E l e c t r o c h e m i c a l l y A c t i v e 1 7 7 x i S e c t i o n 5 . 5 . 2 . D e t e r m i n a t i o n o f C o n c e n t r a t i o n R a n g e - 1 7 7 S e c t i o n 5 . 6 . A t o m i c S p e c t r o s c o p y D e t e c t o r s 1 7 9 S e c t i o n 5 . 6 . 1 . O v e r v i e w - - 1 7 9 S e c t i o n 5 . 6 . 2 . D e t e r m i n a t i o n o f C o n c e n t r a t i o n R a n g e - . . . . . . . . . 1 7 9 S e c t i o n 5 . 7 . R e f r a c t i v e I n d e x D e t e c t o r s - - - - - - . . . . . 1 8 1 S e c t i o n 5 . 8 . C o n d u c t i v i t y D e t e c t o r s - . . . . . . . . . . . . - - 1 8 1 S e c t i o n 5 . 8 . 1 . O v e r v i e w - - 1 8 1 S e c t i o n 5 . 8 . 2 . D e t e r m i n a t i o n o f C o n c e n t r a t i o n R a n g e 1 8 1 S e c t i o n 5 . 9 . l i g h t S c a t t e r i n g D e t e c t o r 1 8 5 P a r t 2 : R e c o m m e n d a t i o n o f M o b i l e P h a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 7 S e c t i o n 5 . 1 0 . O v e r v i e w o f M o b i l e P h a s e S e l e c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 8 S e c t i o n 5 . 1 0 . 1 . G o a l s o f M o b i l e P h a s e M o d u l e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 8 S e c t i o n 5 . 1 0 . 2 . D a t a b a s e s U s e d b y t h e M o b i l e P h a s e M o d u l e - - - - 1 8 8 S e c t i o n 5 . 1 0 . 3 . D e t e c t o r C o m p a t i b i l i t y R u l e s 1 8 9 S e c t i o n 5 . 1 1 . S e l e c t i o n o f M o b i l e P h a s e s f o r t h e D i f f e r e n t S e p a r a t i o n M o d e s 1 9 2 S e c t i o n 5 . 1 1 . 1 . O v e r v i e w 1 9 2 S e c t i o n 5 . 1 1 . 2 . M o b i l e P h a s e R e c o m m e n d a t i o n s f o r N o r m a l - P h a s e B o n d e d C h r o m a t o g r a p h y - - 1 9 3 S e c t i o n 5 . 1 1 . 3 . M o b i l e P h a s e R e c o m m e n d a t i o n s f o r R e v e r s e - P h a s e B o n d e d C h r o m a t o g r a p h y 1 9 5 S e c t i o n 5 . 1 1 . 4 . M o b i l e P h a s e R e c o m m e n d a t i o n s f o r N o r m a l - P h a s e A d s o r p t i o n C h r o m a t o g r a p h y 1 9 5 S e c t i o n 5 . 1 1 . 5 . M o b i l e P h a s e R e c o m m e n d a t i o n s f o r I o n E x c h a n g e a n d I o n _ C h r o m a t o g r a p h y - - - 1 9 8 S e c t i o n 5 . 1 1 . 6 . M o b i l e P h a s e R e c o m m e n d a t i o n s f o r S i z e E x c l u s i o n C h r o m a t o g r a p h y 2 0 0 S e c t i o n 5 . 1 1 . 7 . M o b i l e P h a s e R e c o m m e n d a t i o n s f o r I o n - P a i r C h r o m a t o g r a p h y 2 0 1 P a r t 3 : V a l i d a t i o n S t u d i e s o f D e t e c t o r a n d M o b i l e P h a s e . . 2 0 6 S e c t i o n 5 . 1 2 . V a l i d a t i o n S t u d i e s o f t h e D e t e c t o r a n d M o b i l e P h a s e M o d u l e s 2 0 7 C H A P I S t S e . S e t S E C S e c t i o n 5 . 1 2 . 1 . P h t h a l a t e V a l i d a t i o n S t u d y 7 0 7 S e c t i o n 5 . 1 2 . 2 . A r o m a t i c V a l i d a t i o n S t u d y 7 0 9 P a r t 4 : C o n c l u s i o n s a n d S u m m a r y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 3 S e c t i o n 5 . 1 3 . S u m m a r y o f V a l i d a t i o n S t u d i e s - - - 2 1 4 l i s t o f R e f e r e n c e s 7 1 6 C H A P T E R 6 . A U T O M A T I O N O F T H E H I G H - P E R F O R M A N C E L I Q U I D C H R R O M A T O G R A P H Y S Y S T E M I N S T R U M E N T . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 7 S e c t i o n 6 . 1 . I n t r o d u c t i o n - . . 2 1 7 P a r t I : H a r d w a r e a n d S o f t w a r e U s e d f o r A u t o m a t i o n . . . . . . . . . 2 1 9 S e c t i o n 6 . 2 . I n i t i a l C o n t r o l l e r S o f t w a r e - - - 2 2 0 S e c t i o n 6 . 2 . 1 . O b j e c t i v e s 2 2 0 S e c t i o n 6 . 2 . 2 . D a t a A c q u i s i t i o n 2 2 0 S e c t i o n 6 . 2 . 3 . C o n t r o l o f T w o S i x P o r t V a l v e s 7 2 7 S e c t i o n 6 . 2 . 4 . R e c y c l e H e a r t c u t C h r o m a t o g r a p h y 2 2 7 S e c t i o n 6 . 3 . S e c o n d L e v e l C o n t r o l l e r S o f t w a r e — A n O v e r v i e w 7 3 0 S e c t i o n 6 . 3 . 1 . S w i t V a l v . B a s P r o g r a m 7 3 2 S e c t i o n 6 . 3 . 2 . H P L C - C o n . B a s P r o g r a m 2 3 9 S e c t i o n 6 . 3 . 3 . L C M e t h o d . B a s P r o g r a m 2 3 9 S e c t i o n 6 . 3 . 4 . P r o g S D S . B a s P r o g r a m 2 4 1 S e c t i o n 6 . 4 . A s s e m b l y L a n g u a g e R o u t i n e 2 4 2 S e c t i o n 6 . 5 . P r o g r a m m a b l e P a r a l l e l I n t e r f a c e P r o t o t y p e B o a r d 7 4 3 S e c t i o n 6 . 6 . P n e u m a t i c A m p l i f i e r 2 4 7 S e c t i o n 6 . 6 . 1 . M o t i v a t i o n f o r U s e 2 4 7 S e c t i o n 6 . 6 . 2 . I n i t i a l S o f t w a r e C o n t r o l 2 4 8 S e c t i o n 6 . 6 . 3 . T i m i n g C i r c u i t 2 4 9 C H A F A P P E P a r t 2 : P r e l i m i n a r y A p p l i c a t i o n s o f t h e C o n t r o l l e r S o f t w a r e f o r H P L C S e p a r a t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 5 S e c t i o n 6 . 7 . I n t e g r a t i o n o f t h e E x p e r t S y s t e m a n d H P L C C o n t r o l l e r . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 6 S e c t i o n 6 . 7 . 1 . D e t e r m i n a t i o n o f H P L C C o n t r o l l e r P a r a m e t e r s . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 6 S e c t i o n 6 . 7 . 1 . 1 . P e a k D e t e c t i o n T h r e s h o l d s 7 5 6 S e c t i o n 6 . 7 . 2 . V a l i d a t i o n S t u d y o f B e n z a l d e h y e , B i p h e n y l , a n d N a p h t h a l e n e 2 6 9 S e c t i o n 6 . 7 . 3 . V a l i d a t i o n S t u d y o f B e n z o i c A c i d , p - A m i n o b e n z o i c A c i d , 2 , 4 - D i n i t r o p h e n o l , A n t h r a c e n e , a n d P y r e n e 7 7 0 P a r t 3 : C o n c l u s i o n s B a s e d o n t h e A u t o m a t i o n o f t h e H P L C I n s t r u m e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 2 S e c t i o n 6 . 8 . C o n c l u s i o n s o f t h e A u t o m a t i o n o f t h e H P L C I n s t r u m e n t . . . . . . . . . . . 2 7 3 l i s t o f R e f e r e n c e s 2 7 5 C H A P T E R 7 . C O N C L U S I O N S A N D F U T U R E P R O S P E C T S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 6 S e c t i o n 7 . 1 . I n t r o d u c t i o n - 2 7 6 S e c t i o n 7 . 2 . C o n c l u s i o n s 2 7 6 S e c t i o n 7 . 3 . F u t u r e W o r k 2 8 0 L i s t o f R e f e r e n c e s 2 8 2 A P P E N D I X A F L O W C H A R T S F O R T H E D E T E R M I N A T I O N O F A N A P P R O P R I A T E C O L U M N ( S ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 3 x i v T A B 3 . 1 T A B L E 3 . 1 3 . 2 3 . 3 3 . 4 3 . 5 4 . 1 4 . 2 4 . 3 4 . 4 4 . 5 4 . 6 4 . 7 4 . 8 4 . 9 4 . 1 0 5 . 1 5 . 2 5 . 3 5 . 4 L I S T O F T A B L E S C o m p a r i s o n o f S h e l l s W r i t t e n f r o m A l L a n g u a g e s v e r s u s C o m m e r c i a l l y - A v a i l a b l e S h e l l s C o m p a r i s o n o f D i f f e r e n t E x p e r t S y s t e m s S u m m a r y o f F e a t u r e s o f V P - E x p e r t H P L C C o l u m n s a n d t h e i r P a r a m e t e r s U s e d i n t h i s R e s e a r c h D i g i t a l I n p u t / O u t p u t L i n e s U s e d F r o m t h e P P I C h i p E x c e r p t f r o m K n o w l e d g e A c q u i s i t i o n M e e t i n g A c t i o n B l o c k f o r F i r s t M o d u l e A c t i o n B l o c k f o r S e c o n d M o d u l e P o s s i b l e S u b - M o d e s t h a t m a y b e R e c o m m e n d e d b y t h e E x p e r t S y s t e m D e t e r m i n a t i o n o f S u b - M o d e s D i a l o g f o r t h e E s t r o g e n C o n s u l t a t i o n R e s u l t s o f t h e V a l i d a t i o n S t u d y f o r t h e E s t r o g e n C o m p o n e n t s U s i n g t h e V P - E x p e r t V e r s i o n O u t p u t f r o m V a l i d a t i o n S t u d y o f H y p o t h e t i c a l C a s e : V P - E x p e r t V e r s i o n T r u t h T h r e s h o l d V a l u e s A s s i g n m e n t o f C N F f o r S E C b a s e d u p o n C o m p e t i n g M e c h a n i s m s D e t e c t o r s R e c o m m e n d e d b y t h e E x p e r t S y s t e m D e t e r m i n a t i o n o f t h e O p t i m u m M e t h o d t o C a l c u l a t e t h e C N F b a s e d o n t h e C N F s o f T w o D i f f e r e n t C o n c e n t r a t i o n s U V - V i s i b i l e C h r o m o p h o r e s A s s i g n e d b y t h e E x p e r t S y s t e m S t r u c t u r e s o f t h e M o b i l e P h a s e D a t a b a s e s u s e d b y H P L C A d v i s o r P A G E 6 1 6 6 6 8 7 1 8 1 9 5 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 7 1 2 7 1 3 5 1 4 5 1 5 0 1 5 1 1 6 2 1 7 0 1 7 2 1 9 0 T A B L E 5 . 5 5 . 6 5 . 7 5 . 8 5 . 9 5 . 1 0 5 . 1 1 5 . 1 2 6 . 1 6 . 2 6 . 3 6 . 4 6 . 5 A . l A . 2 M o b i l e P h a s e M o d i fi e r s f o r N o r m a l - P h a s e B o n d e d C h r o m a t o g r a p h y M o b i l e P h a s e M o d i f i e r s f o r R e v e r s e - P h a s e B o n d e d C h r o m a t o g r a p h y R e c o m m e n d e d M o b i l e P h a s e I o n s f o r I o n E x c h a n g e a n d I o n C h r o m a t o g r a p h y E f f e c t s o f D i f f e r e n t M o b i l e P h a s e P a r a m e t e r s o n I P C S e p a r a t i o n s P h y s i c a l a n d C h e m i c a l P r o p e r t i e s o f t h e C o m p o n e n t s o f t h e P h t h a l a t e T e s t S a m p l e R e s u l t s o f t h e V a l i d a t i o n S t u d y o f t h e P h t h a l a t e T e s t C a s e P h y s i c a l a n d C h e m i c a l P r o p e r t i e s o f t h e C o m p o n e n t s o f t h e A r o m a t i c T e s t S a m p l e R e s u l t s o f t h e A r o m a t i c V a l i d a t i o n T e s t F o r m a t f o r t h e E n c o d e d l i n k L i s t A r r a y , L i n k F i l e O D i g i t a l I n p u t / O u t p u t L i n e s N e e d e d f o r t h e S e c o n d G e n e r a t i o n C o n t r o l l e r L o g i c T a b l e f o r t h e 7 4 1 5 2 2 1 D u a l M o n o s t a b l e R e s u l t s f r o m t h e O p t i m i z a t i o n o f S w i t c h i n g T i m e s a n d P r e s s u r e s f o r t h e P i l o t V a l v e E x p e r i m e n t a l P a r a m e t e r s f o r t h e A n a l y s i s o f B e n z a l d e h y d e a n d B i p h e n y l C r i t e r i a U s e d t o R e c o m m e n d N o r m a l - P h a s e S i z e E x c l u s i o n C h r o m a t o g r a p h y C r i t e r i a U s e d t o R e c o m m e n d R e v e r s e - P h a s e S i z e E x c l u s i o n C h r o m a t o g r a p h y P A G E 1 9 3 1 9 5 2 0 0 2 0 4 2 0 8 2 0 9 2 1 1 2 1 2 2 4 0 2 4 5 2 5 2 2 5 4 2 6 0 2 8 5 2 8 5 F I ( 4 . 6 ; 4 . 6 b 5 . 2 5 . 3 L I S T O F F I G U R E S F I G U R E P A G E 3 . 1 S e v e r a l C o n f i g u r a t i o n s o f t h e T w o R h e o d y n e V a l v e s t h a t 7 4 C a n B e U s e d 3 . 2 S e n s o r C o n n e c t i o n s F o r t h e C o l u m n S e l e c t i o n V a l v e 7 5 3 . 3 P i l o t V a l v e C o n f i g u r a t i o n 7 6 3 . 4 C o m p l e t e V a l v e A r r a n g e m e n t o f t h e T w o R h e o d y n e V a l v e s , 7 8 C o l u m n S e l e c t i o n V a l v e , a n d P i l o t V a l v e s 3 . 5 7 4 1 5 2 2 1 D u a l M o n o s t a b l e T i m i n g C i r c u i t 8 2 3 . 6 I n t e r f a c e B o x f o r t h e R T I 8 0 0 / 8 1 5 B o a r d 8 3 4 . 1 F l o w C h a r t f o r C h o o s i n g a n H P L C C o l u m n 1 0 0 4 . 2 E x a m p l e o f D i a l o g t h a t D e t e r m i n e s t h e S e p a r a t i o n P r o p e r t y 1 1 4 4 . 3 S t r u c t u r e s o f t h e C o n j u g a t e E s t r o g e n s U s e d i n t h e 1 2 6 V a l i d a t i o n S t u d y 4 . 4 S t r u c t u r e o f F o u r B V i t a m i n s : N i a c i n , N i a c i n a m i d e , 1 3 0 R i b o fl a v i n , a n d P y r i d o x i n e H C l 4 . 5 F l o w C h a r t f o r t h e D e t e r m i n a t i o n o f I o n C h r o m a t o g r a p h y 1 4 1 T e c h n i q u e s : M 1 V e r s i o n 4 . 6 a F l o w C h a r t f o r t h e D e t e r m i n a t i o n o f I o n C h r o m a t o g r a p h y 1 4 2 T e c h n i q u e s f o r S m a l l M o l e c u l e s : V P - E x p e r t V e r s i o n 4 . 6 b F l o w C h a r t f o r t h e D e t e r m i n a t i o n o f I o n C h r o m a t o g r a p h y 1 4 3 T e c h n i q u e s f o r L a r g e M o l e c u l e s : V P - E x p e r t V e r s i o n 5 . 1 T r a p e z o i d a l F u n c t i o n f o r t h e C a l c u l a t i o n o f C o n c e n t r a t i o n 1 6 6 C o n f i d e n c e F a c t o r s 5 . 2 D i f f e r e n t C o n c e n t r a t i o n V a l u e s t o D e t e r m i n e O p t i m u m 1 6 8 C N F T o t a l C a l c u l a t i o n 5 . 3 F l o w C h a r t t o D e t e r m i n e i f a U V - V i s i b l e D e t e c t o r i s a n 1 7 1 A p p r o p r i a t e C h o i c e 1 U U 1 F I G U R E 5 . 4 5 . 5 5 . 6 5 . 7 5 . 8 5 . 9 5 . 1 0 5 . 1 1 5 . 1 2 5 . 1 3 5 . 1 4 5 . 1 5 5 . 1 6 5 . 1 7 6 . 1 6 . 2 6 . 3 F l o w C h a r t t o D e t e r m i n e i f a F l u o r e s c e n t D e t e c t o r i s a n A p p r o p r i a t e C h o i c e F l o w C h a r t t o D e t e r m i n e i f a E l e c t r o c h e m i c a l D e t e c t o r i s a n A p p r o p r i a t e C h o i c e F l o w C h a r t t o D e t e r m i n e i f a A t o m i c S p e c t r o s c o p y D e t e c t o r i s a n A p p r o p r i a t e C h o i c e F l o w C h a r t t o D e t e r m i n e i f a R e f r a c t i v e I n d e x D e t e c t o r i s a n A p p r o p r i a t e C h o i c e F l o w C h a r t t o D e t e r m i n e i f a C o n d u c t i v i t y D e t e c t o r i s a n A p p r o p r i a t e C h o i c e F l o w C h a r t t o D e t e r m i n e i f a L i g h t S c a t t e r i n g D e t e c t o r i s a n A p p r o p r i a t e C h o i c e F l o w C h a r t t o D e t e r m i n e i f M o b i l e P h a s e M o d i f i e r s a r e C o m p a t i b i l e w i t h D i f f e r e n t D e t e c t o r s F l o w C h a r t f o r t h e D e t e r m i n a t i o n o f M o b i l e P h a s e M o d i f i e r s f o r N o r m a l - P h a s e B o n d e d C h r o m a t o g r a p h y F l o w C h a r t f o r t h e D e t e r m i n a t i o n o f M o b i l e P h a s e M o d i f i e r s f o r R e v e r s e - P h a s e B o n d e d C h r o m a t o g r a p h y F l o w C h a r t f o r t h e D e t e r m i n a t i o n o f M o b i l e P h a s e M o d i f i e r s f o r N o r m a l - P h a s e A d s o r p t i o n C h r o m a t o g r a p h y F l o w C h a r t f o r t h e D e t e r m i n a t i o n o f M o b i l e P h a s e M o d i f i e r s f o r I o n E x c h a n g e a n d I o n C h r o m a t o g r a p h y F l o w C h a r t f o r t h e D e t e r m i n a t i o n o f M o b i l e P h a s e M o d i f i e r s f o r S i z e E x c l u s i o n C h r o m a t o g r a p h y F l o w C h a r t f o r t h e D e t e r m i n a t i o n o f M o b i l e P h a s e M o d i f i e r s f o r I o n - P a i r e d C h r o m a t o g r a p h y C h r o m a t o g r a p h i c S e p a r a t i o n o f P h t h a l a t e S a m p l e E n v i s i o n e d S y s t e m I n v o l v i n g M u l t i p l e D e t e c t o r s a n d V a l v e s U n d e r C o m p u t e r C o n t r o l V a l v e C o n f i g u r a t i o n f o r R e c y c l e H e a r t c u t C h r o m a t o g r a p h y S e l e c t i v i t y E n h a n c e m e n t s u s i n g R e c y c l e H e a r t c u t C h r o m a t o g r a p h y : N a p h t h a l e n e a n d B i p h e n y l P A G E 1 7 6 1 7 8 1 8 0 1 8 3 1 8 4 1 8 6 1 9 1 1 9 4 1 9 6 1 9 7 1 9 9 2 0 2 2 0 5 2 1 0 2 2 1 2 2 8 2 3 1 A . 3 A 4 F I G U R E 6 . 4 6 . 5 6 . 6 6 . 7 6 . 8 6 . 9 6 . 1 0 6 . 1 1 6 . 1 2 A 6 . 1 2 B 6 . 1 3 6 . 1 4 6 . 1 5 6 . 1 6 6 . 1 7 A . 1 A 2 A 3 A . 4 O v e r v i e w o f t h e M o d u l e s u s e d i n t h e S e c o n d G e n e r a t i o n o f t h e C o n t r o l l e r S o f t w a r e G a t e C i r c u i t t o C o n t r o l T i m e r C o u n t e r s 3 a n d 4 F o r m a t o f t h e M a s t e r F i l e D i g i t a l I / O C o n n e c t i o n s f r o m t h e P r o g r a m m a b l e P a r a l l e l I n t e r f a c e S c h e m a t i c o f P i l o t V a l v e 7 4 1 5 2 2 1 D u a l M o n o s t a b l e C i r c u i t T i m i n g S c h e m e u s e d t o S w i t c h t h e C o l u m n S e l e c t i o n V a l v e v i a t h e 7 4 1 3 2 2 1 T i m i n g C i r c u i t B i p h e n y l a n d B e n z a l d e h y d e C h r o m a t o g r a m R a t e o f 1 A c q u i s i t i o n / S e c o n d B i p h e n y l a n d B e n z a l d e h y d e C h r o m a t o g r a m R a t e o f 1 0 A c q u i s i t i o n s / S e c o n d B i p h e n y l a n d B e n z a l d e h y d e C h r o m a t o g r a m R a t e o f 1 0 A c q u i s i t i o n s / S e c o n d P l o t o f S l o p e V e r s u s T i m e f o r R a t e o f l A c q u i s i t i o n / S e c o n d P l o t o f S l o p e V e r s u s T i m e f o r R a t e o f 1 0 A c q u i s i t i o n s / S e c o n d I n s e t o f t h e S l o p e f o r t h e R a t e o f 1 0 A c q u i s i t i o n s / S e c o n d C i r c u i t t o P r o v i d e a G a i n o f 5 t o t h e H P L C D e t e c t o r O u t p u t C h r o m a t o g r a m o f B e n z a l d e h y d e , N a p h t h a l e n e , a n d B i p h e n y l F l o w C h a r t f o r t h e D e t e r m i n a t i o n o f S e p a r a t i o n P r o p e r t y . F l o w C h a r t f o r t h e D e t e r m i n a t i o n o f M o d e f o r N o r m a l P h a s e A d s o r p t i o n ( P a r t 1 ) F l o w C h a r t f o r t h e D e t e r m i n a t i o n o f M o d e f o r N o r m a l P h a s e A d s o r p t i o n ( P a r t 2 ) F l o w C h a r t f o r t h e R e c o m m e n d a t i o n o f P a c k i n g M a t e r i a l P A G E 2 3 3 2 3 5 2 3 6 2 4 6 2 5 0 2 5 1 2 5 3 2 6 1 2 6 2 2 6 3 2 6 5 2 6 6 2 6 7 2 6 8 2 7 1 2 8 6 2 8 7 2 8 8 2 8 9 S e c t i C H A P T E R I M O T I V A T I O N F O R T H E D E V E L O P M E N T O F A N I N T E L L I G E N T A U T O M A T E D H I G H - P E R F O R M A N C E L I Q U I D C H R O M A T O G R A P H Y S Y S T E M [ A c o m p u t e r i s ] l i k e a n O l d T e s t a m e n t g o d , w i t h a l o t o f r u l e s a n d n o m e r c y . J o s e p h C a m p b e l l S e c t i o n 1 . 1 I n t r o d u c t i o n M e t h o d d e v e l o p m e n t i s a d i f f i c u l t a n d t i m e - c o n s u m i n g p r o c e s s d u e t o t h e n u m b e r o f p a r a m e t e r s t h a t m u s t b e o p t i m i z e d . l O n e a p p r o a c h t o a s s i s t i n m e t h o d s d e v e l o p m e n t h a s b e e n t o a u t o m a t e p a r t s o f t h e p r o c e d u r e . T h e u s e o f a u t o m a t i o n c a n l e a d t o i n c r e a s e s i n p r o d u c t i v i t y a n d s p e e d a n d c a n d e c r e a s e t h e c o m p l e x i t y o f m e t h o d s d e v e l o p m e n t . A u t o m a t i o n h a s b e e n a p p l i e d i n p a r t i c u l a r t o t r y t o r e m o v e t h e b o t t l e n e c k t h a t a r i s e s f r o m b o t h s a m p l e p r e p a r a t i o n a n d f r o m d a t a c o l l e c t i o n a n d i n t e r p r e t a t i o n . A u t o m a t i o n h a s b e e n a c c o m p l i s h e d v i a r o b o t i c s , a u t o s a m p l e r s , d a t a i n t e g r a t o r s , a l o n g w i t h p r o c e d u r e s s u c h a s s i m p l e x o p t i m i z a t i o n a n d f a c t o r a n a l y s i s , a m o n g o t h e r s . I n t h e s e p a r a t i o n s c i e n c e s , e x p e r i e n c e d c h r o m a t o g r a p h e r s r e m o v e u n p r o d u c t i v e p a t h w a y s f r o m b e i n g c o n s i d e r e d w h e n t h e y c h o o s e a p p r o p r i a t e p a r a m e t e r s f o r a s e p a r a t i o n . T h e r e s u l t a n t m i n i m i z e d s e a r c h f i e l d l i m i t s t h e t o t a l n u m b e r o f c h o i c e s t h a t m u s t b e c o n s i d e r e d a n d t e s t e d w h e n d o i n g m e t h o d d e v e l o p m e n t . H o w e v e r , t h e r e a r e f e w e x p e r t s a v a i l a b l e , a n d t h e i r e x p e r t i s e i s n o t w i d e l y a c c e s s i b l e . I n e c o n o m i c t e r m s ( w h i c h i s o f t e n t h e h i g h e s t p r i o r i t y i n t h e d e c i s i o n - m a k i n g p r o c e s s ) , h u m a n e x p e r t s s h o u l d b e s o l v i n g t h e m o r e d i f f i c u l t a n d n o n - r o u t i n e p r o b l e m s . T h e s e e x p e r t s a r e o f t e n n o t 5 Q X P C I a n d 2 k i n d s W e i u s e r 1 ' ; W i l l u s S p e c m t o o l . n o t a s i n t e r e s t e d i n a n s w e r i n g r o u t i n e q u e s t i o n s w h i c h c o m e f r o m n o n - e x p e r t s . H u m a n e x p e r t s a r e n o t c o s t - e f f e c t i v e w h e n d i v e r t e d f r o m p r o b l e m - s o l v i n g t o r o u t i n e q u e s t i o n a n d a n s w e r s e s s i o n s w i t h o t h e r c h r o m a t o g r a p h y u s e r s . T h e r e i s a n e e d t o a s s i s t t w o k i n d s o f n o n - e x p e r t h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( H P L C ) u s e r s . T h e f i r s t t y p e i s t h e t e c h n i c i a n w h o r o u t i n e l y o b t a i n s m e t h o d s f r o m t h e H P L C e x p e r t . T h e s e c o n d u s e r i s a n e x p e r t ( e . g . , P h . D . l e v e l ) i n s o m e o t h e r a r e a , s u c h a s m a s s s p e c t r o m e t r y , w h o w i l l u s e H P L C i n c o n j u n c t i o n w i t h t h e i r f i e l d o f e x p e r t i s e , s u c h a s t a n d e m H P L C — m a s s s p e c t r o m e t r y ( L C - M S ) . E a c h t y p e o f u s e r w i l l h a v e d i f f e r e n t e x p e c t a t i o n s f r o m t h e H P L C t o o l . T h e r e s e a r c h i n t h i s d i s s e r t a t i o n d e s c r i b e s a n i n t e l l i g e n t , a u t o m a t e d h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y s y s t e m . A m e d i u m s i z e d e x p e r t s y s t e m h a s b e e n d e v e l o p e d t h a t a s s i s t s a n a l y t i c a l c h e m i s t s i n c h o o s i n g v i a b l e h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h i c m e t h o d s . T h e e x p e r t s y s t e m ' s k n o w l e d g e b a s e i s c o m p o s e d o f i n f o r m a t i o n o b t a i n e d f r o m a h u m a n e x p e r t a n d f r o m l i t e r a t u r e s o u r c e s . T h e e x p e r t s y s t e m i s i m p l e m e n t e d u s i n g V P - E x p e r t w h i c h i s a c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e e x p e r t s y s t e m s h e l l . V P - E x p e r t c a n b e u s e d o n m a c h i n e s o f t h e P C X T c l a s s a n d h i g h e r u n d e r t h e M S - D O S o p e r a t i n g s y s t e m . T h e k n o w l e d g e b a s e h a s b e e n v a l i d a t e d v i a c o m p a r i s o n w i t h l i t e r a t u r e m e t h o d s a n d f r o m f u r t h e r c o n s u l t a t i o n s w i t h t h e e x p e r t . A u t o m a t i o n o f t h e H P L C i n s t r u m e n t i s a c c o m p l i s h e d v i a a c o m b i n a t i o n o f h a r d w a r e a n d s o f t w a r e . T h e a u t o m a t i o n p r o v i d e s t h e a b i l i t y t o g e n e r a t e a m e t h o d s f i l e t h a t c o n t a i n s H P L C p a r a m e t e r s ( e . g . , f l o w r a t e s a n d m o b i l e p h a s e c o m p o s i t i o n s ) . T h e c o m p u t e r t h e n p e r f o r m s t h e e x p e r i m e n t b a s e d o n t h e s e m e t h o d f i l e s . T h e a u t o m a t i o n p r o g r a m a l s o p r o v i d e s a m e t h o d t o p e r f o r m a c c u r a t e a n d r e p r o d u c i b l e c o l u m n s w i t c h i n g . T h e n e x t s e c t i o n d e s c r i b e s s o m e o f t h e p r e v i o u s w o r k u s i n g c o m p u t e r s i n t h e a n a l y t i c a l c h e m i c a l a n d H P L C f i e l d s . m a m a - 0 n , 0 1 S e l A s 5 o f C r r e p l a H P L C ” 1 ° 1 3 “ ? o h . S c h e m e s O I fl o w r a t e 0 1 o f S t a l l o n a r s e p a r a D ' O n s S e c t i o n 1 . 2 U s e o f C o m p u t e r s i n C h r o m a t o g r a p h y — O v e r v i e w C o m p u t e r s h a v e p l a y e d a n i m p o r t a n t p o s i t i o n i n t h e d e v e l o p m e n t o f H P L C . E a r l y a p p l i c a t i o n s o f c o m p u t e r — l i k e t o o l s w e r e s i m p l e i n t e g r a t o r s a n d d a t a c o l l e c t o r s . A s s a m p l e s a n d i n s t r u m e n t a t i o n i n c r e a s e d i n c o m p l e x i t y , a c o n c o m i t a n t i n c r e a s e i n u s e o f c o m p u t e r s h a s b e e n s e e n . T h e e x p e r i m e n t a l a p p r o a c h t o o p t i m i z a t i o n i s b e i n g r e p l a c e d b y o n - l i n e , a u t o m a t e d c o m p u t e r o p t i m i z a t i o n s . 2 T h e u s e o f c o m p u t e r s i n H P L C c a n f a l l i n t o s e v e r a l b r o a d c a t e g o r i e s : 3 a c q u i s i t i o n a n d m a n i p u l a t i o n o f c h r o m a t o g r a p h i c d a t a s u g g e s t i o n o f i n i t i a l H P L C c o n d i t i o n s p r e d i c t i o n , s i m u l a t i o n , a n d o p t i m i z a t i o n o f t h e H P L C r e s u l t s a u t o m a t i o n o f c h r o m a t o g r a p h i c i n s t r u m e n t a t i o n T h e s e a r e a s w i l l b e d e s c r i b e d b e l o w t o p r e s e n t a s u r v e y o f c o m p u t e r u s a g e . C o m p u t e r s , a s i n t e g r a t o r s , w e r e f i r s t u s e d t o a c q u i r e a n d m a n i p u l a t e c h r o m a t o g r a p h i c d a t a . T h e s e i n t e g r a t o r s h a d l i m i t e d a b i l i t y ; t h e i r p r i m a r y p u r p o s e w a s t o p r o v i d e p e a k a r e a a n d r e t e n t i o n t i m e s . T h e d i s c u s s i o n o f c o m p u t e r i n t e g r a t o r s w i l l n o t b e d i s c u s s e d i n d e t a i l s i n c e i n t e g r a t o r s a r e r o u t i n e i n m o d e r n H P L C i n s t r u m e n t a t i o n . S e c t i o n 1 . 2 . 1 P r e d i c t i o n , S i m u l a t i o n , a n d O p t i m i z a t i o n T h e n e x t l e v e l o f c o m p u t e r - H P L C i n t e r a c t i o n i s a p r o g r a m t h a t c a n a s s i s t i n t h e d e t e r m i n a t i o n a n d c o n t r o l o f p a r a m e t e r s t h a t a f f e c t t h e H P L C s e p a r a t i o n . S i n c e t h e m o b i l e p h a s e e x e r t s a s i g n i f i c a n t e f f e c t o n t h e s e p a r a t i o n o f a s a m p l e , o p t i m i z a t i o n s c h e m e s o f t e n f o c u s o n t h e c h o i c e o f s o l v e n t s , t h e r e s u l t a n t s o l v e n t s t r e n g t h , a n d t h e f l o w r a t e o f t h e m o b i l e p h a s e . A d d i t i o n a l p a r a m e t e r s t h a t a r e o p t i m i z e d i n c l u d e c h o i c e o f s t a t i o n a r y p h a s e a n d p a r t i c l e s i z e s , c o l u m n d i m e n s i o n s , a n d d e t e c t o r s . D i f fi t h s e p a r a t i o n s r e q u i r e v a r i a t i o n o f t h e s e p a r a m e t e r s t o o p t i m i z e e i t h e r t h e a n a l y s i s t i m e , r e s o l u t i o n , o r s o m e o t h e r c r i t e r i a t h a t i s o f i n t e r e s t t o t h e u s e r . 2 o p t i W h e P a i r . t i t h e t e r m m m b y t l i « i t h C O F T h e o b j e c t i v e s o f o p t i m i z a t i o n a r e t o d e t e r m i n e t h e b e s t c o n d i t i o n s t o a c h i e v e t h e b e s t s e p a r a t i o n . A s y s t e m a t i c o p t i m i z a t i o n s t r a t e g y w i l l n e e d a m a t h e m a t i c a l d e f i n i t i o n o f " b e s t " i n o r d e r t o o p t i m i z e t h e s e p a r a t i o n . B e r r i d g e 2 p r e s e n t s a r e v i e w o f t h e d i f f e r e n t C h r o m a t o g r a p h i c R e s p o n s e a n d C h r o m a t o g r a p h i c O p t i m i z a t i o n F u n c t i o n s ( C R F a n d C O F ) w h i c h h a v e b e e n u s e d t o d e f i n e t h e q u a l i t y o f a s e p a r a t i o n . T h e s e f u n c t i o n s c a n b e e s t a b l i s h e d s u c h t h a t t h e y a p p r o a c h e i t h e r z e r o o r i n f i n i t y a s t h e o p t i m u m s e p a r a t i o n i s r e a c h e d . F o r e x a m p l e , G l a j c h ' s C O F i s : c o r = X A i l n ( R i / R i d ) + B ( t m - t n ) E q u a t i o n 1 . 1 w h e r e R , i s t h e r e s o l u t i o n f o r t h e i t h p a i r a n d R i d i s t h e d e s i r e d r e s o l u t i o n f o r t h e 1 t h p a i r . T h e t i m e t e r m s , t m a n d t n , r e f e r t o t h e d e s i r e d m a x i m u m a n a l y s i s t i m e a n d t h e t i m e o f t h e o f t h e l a s t d e t e c t e d p e a k , r e s p e c t i v e l y . T h e A a n d B t e r m s a r e w e i g h t i n g t e r m s t o a l l o w t h e u s e r t o s p e c i f y t h e i m p o r t a n c e o f t i m e a n d r e s o l u t i o n f o r t h e p a r t i c u l a r C O F . A s t h e s e p a r a t i o n a p p r o a c h e s t h e o p t i m u m s e p a r a t i o n ( a s d e t e r m i n e d b y t h e R i d a n d t m t e r m s ) , G l a j c h ' s C O F a p p r o a c h e s z e r o a n d b e c o m e s m o r e n e g a t i v e w i t h a d e c r e a s e i n t h e q u a l i t y o f t h e s e p a r a t i o n . O p t i m i z a t i o n s t r a t e g i e s c a n u s e t h i s C O F t o a p p r o a c h t h e o p t i m u m b y v a r y i n g t h e p a r a m e t e r s t o m a x i m i z e t h e C O F . O t h e r C O F / C R F d e f i n i t i o n s c a n b e u s e d t o a l l o w o p t i m i z a t i o n b a s e d o n o t h e r d e s i r e d c h a r a c t e r i s t i c s ( e . g . , e v e n l y s p a c e d p e a k s i n a C h r o m a t o g r a m , d e t e r m i n a t i o n o f t h e m a x i m u m n u m b e r o f u n k n o w n c o m p o n e n t s w i t h i n a s a m p l e , c o s t ) . 2 T h e c o m p u t e r i z e d a p p r o a c h e s d e s c r i b e d b e l o w u s e t h e s e C R F / C O F f u n c t i o n s t o p r o v i d e a m a t h e m a t i c a l m e a n s f o r t h e c o m p u t e r t o e v a l u a t e r e s u l t s a n d t o p r e d i c t a n e w s e t o f p a r a m e t e r s t h a t w i l l p r o v i d e a n i m p r o v e d C R F / C O F . B i l l i e t a n d d e G a l a n “ h a v e r e v i e w e d t h e o p t i m i z a t i o n o f t h e m o b i l e p h a s e f o r r e v e r s e - p h a s e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y a n d r e v e r s e - p h a s e i o n p a i r c h r o m a t o g r a p h y . I n p a r t i c u l a r , t h e y d i s c u s s a p p r o a c h e s t h a t u t i l i z e d e s i g n s s u c h a s p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s ( P C A ) . T h i s a p p r o a c h a t t e m p t s t o d e t e r m i n e t h o s e f a c t o r s t h a t h a v e t h e S t ] 1 1 0 r e s C O T } a c c r T E C C H J U I S Q D I S Y S t t t h a t C o u n t a n d ‘ h a x i n b e e n P e a k s s t r o n g e s t e f f e c t o n t h e o p t i m i z a t i o n o f t h e c h r o m a t o g r a p h y , s u c h a s c o l u m n l e n g t h , f l o w r a t e , a n d m o b i l e p h a s e c o m p o s i t i o n . T h i s m e t h o d a s s u m e s t h a t : ( 1 ) s o l u t e s h a v e a e n o u g h s p e c t r a l d i f f e r e n c e t o d i f f e r e n t i a t e b e t w e e n t h e s o l u t e s , ( 2 ) t h e s p e c t r a l c h a r a c t e r i s t i c s a r e c o n s t a n t , a n d ( 3 ) t h e l o g a r i t h m o f t h e c a p a c i t y f a c t o r i s l i n e a r w i t h r e s p e c t t o t h e m i x i n g r a t e o f b i n a r y m o b i l e p h a s e s . T h e a p p r o a c h i s f i r s t t o p e r f o r m t h e s e p a r a t i o n u n d e r g r a d i e n t e l u t i o n c o n d i t i o n s a n d a p p l y P C A t o d e t e r m i n e t h e n u m b e r o f c o m p o n e n t s i n a s a m p l e . P C A i s a c c o m p l i s h e d b y t h e f o l l o w i n g s t e p s : ( 1 ) A m u l t i w a v e l e n g t h d e t e c t o r ( e . g . , a p h o t o d i o d e ) r e c o r d s t h e s p e c t r a o f t h e e l u t i n g c o m p o n e n t s . ( 2 ) T h e c h r o m a t o g r a m i s d i v i d e d i n t o m u t u a l l y w e l l s e p a r a t e d p e a k s ( i . e . , c l u s t e r s ) . ( 3 ) T h e s p e c t r a a r e n o r m a l i z e d t o m i n i m i z e c o n c e n t r a t i o n e f f e c t s . ( 4 ) P C A i s p e r f o r m e d o n t h e s p e c t r a t o c r e a t e a l i s t o f s i g n i f i c a n t c o m p o n e n t s t h a t d e s c r i b e t h e s p e c t r a a n d t h o s e w h i c h d e s c r i b e n o i s e i n t h e s y s t e m . ( 5 ) I t e r a t i v e T a r g e t T r a n s f o r m a t i o n F a c t o r A n a l y s i s i s a p p l i e d t o p e a k p r o f i l e s t h a t a r e s p e c t r a l l y i m p u r e . ( 6 ) T h e s p e c t r a o f e a c h p e a k i s t h e n c o m p a r e d w i t h l i n e a r c o m b i n a t i o n s o f k n o w n s p e c t r a t o d e t e r m i n e i f t h e r e i s m a t c h b e t w e e n t h e u n k n o w n a n d t h e k n o w n s p e c t r a . I f t h e r e i s s i g n i f i c a n t o v e r l a p i n t h e c o m p a r i s o n s , d e f i n e d a s h a v i n g a c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t g r e a t e r t h a n 0 . 9 9 , t h e c o m p o n e n t ( s ) i n t h a t p e a k h a v e b e e n i d e n t i f i e d . ( 7 ) T a r g e t F a c t o r A n a l y s i s ( T F A ) i s a p p l i e d t o i d e n t i f y u n i d e n t i f i e d p e a k s . T F A r e q u i r e s t h a t t e s t s p e c t r a b e a v a i l a b l e t o d e t e r m i n e t h e i d e n t i t y o f t h e u n k n o w n . T F A d e t e r m i n e s t h e i d e n t i f y b y u s i n g P C A t o o b t a i n a n u m b e r o f a b s t r a c t s p e c t r a t h a t c a n b e l i n e a r l y c o m b i n e d t o r e c o n s t r u c t t h e s p e c t r a o f t h e u n k n o w n . T h e l i n e a r c o m b i n a t i o n i s u s e d t o r e c o n s t r u c t t h e u n k n o w n , r e s u l t i n g i n a n e s t i m a t e d s p e c t r a . T F A c o m p a r e s e s t i m a t e d a n d u n k n o w n s p e c t r a t o d e t e r m i n e i f t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o s p e c t r a i s l a r g e r t h a n t h e n o i s e l e v e l . A m a t c h i s o b t a i n e d w h e n t h e d i f f e r e n c e i s s m a l l e r t h a n t h e n o i s e l e v e l . 4 p e a k s e l e c t d o n o r c o m b ; h e x a n s e p a r e t h e s o l e m a j j t h e i n t . A f t e r t h e n u m b e r o f p e a k s h a s b e e n d e t e r m i n e d i n t h e g r a d i e n t r u n , t h e r e q u i r e d p e a k c a p a c i t y n e e d e d t o s o l v e t h e s e p a r a t i o n p r o b l e m c a n b e p r e d i c t e d . A s o l v e n t s e l e c t i v i t y t r i a n g l e 2 c o m p o s e d o f t h r e e m o b i l e p h a s e s , o n e e a c h f r o m a g r o u p o f p r o t o n d o n o r , p r o t o n a c c e p t o r , a n d d i p o l e - d i p o l e s o l v e n t g r o u p s , i s g e n e r a t e d . B i n a r y c o m b i n a t i o n s o f t h e s e t h r e e s o l v e n t s a r e m i x e d w i t h a n a p p r o p r i a t e d i l u e n t ( e . g . , n - h e x a n e a n d w a t e r f o r n o r m a l - o r r e v e r s e d - p h a s e c h r o m a t o g r a p h y , r e s p e c t i v e l y ) a n d t h e s e p a r a t i o n s u s i n g t h e s e b i n a r y m i x t u r e s a r e p e r f o r m e d o n t h e H P L C . T h e l o g a r i t h m s o f t h e s o l u t e c a p a c i t y f a c t o r s m e a s u r e d i n t h e t h r e e b i n a r y m i x t u r e s a r e p l o t t e d o v e r t h e t e r n a r y e l u e n t c o m p o s i t i o n a n d a n o p t i m u m m o b i l e p h a s e c a n b e s e l e c t e d b a s e d u p o n t h e i n t e r p o l a t i o n o f t h e s e r u n s u s i n g a l i n e a r r e t e n t i o n m o d e l . 4 B i l l i e t a n d D e G a l a n p e r f o r m e d a n o p t i m i z a t i o n o n a n i n e - c o m p o n e n t m i x t u r e . P C A d e t e r m i n e d t h e p r e s e n c e o f t h e n i n e c o m p o n e n t s , o f w h i c h f i v e o f t h e c o m p o n e n t s w e r e u n a m b i g u o u s l y d e t e r m i n e d . T F A w a s a p p l i e d a n d t h e r e m a i n i n g f o u r c o m p o n e n t s w e r e r e c o g n i z e d . T h i s i n f o r m a t i o n w a s u s e d w i t h r e s u l t s f r o m c h r o m a t o g r a p h i c r u n s u s i n g t h r e e d i f f e r e n t b i n a r y m i x t u r e s t o p r e d i c t a n i n i t i a l s e t o f o p t i m u m c o n d i t i o n s . T h e r e t e n t i o n d a t a o b t a i n e d f r o m t h e c h r o m a t o g r a p h i c d a t a w a s u s e d t o r e f i n e t h e l i n e a r r e t e n t i o n m o d e l a n d t o p r e d i c t a n e w s e t o f o p t i m u m c o n d i t i o n s . T h i s p r o c e s s i s r e p e a t e d u n t i l n o f u r t h e r i m p r o v e m e n t i n t h e s e p a r a t i o n w a s n o t e d ( b a s e d o n t h e C R F u s e d b y B i l l i e t a n d D e G a l a n ) . T h i s p r o c e s s i s l i m i t e d ( b e s i d e s t h e a s s u m p t i o n s u p o n w h i c h t h e a p p r o a c h i s b a s e d ) t o t h e o p t i m i z a t i o n o f o n l y t h r e e o r f o u r p a r a m e t e r s . T h i s l i m i t i s d u e t o t h e n u m b e r o f i n i t i a l e x p e r i m e n t s t h a t m u s t b e p e r f o r m e d ( b i n a r y c o m b i n a t i o n s o f t h e p a r a m e t e r s m u s t b e p e r f o r m e d ) a n d d u e t o t h e i n c r e a s e i n c o m p u t a t i o n t i m e . A s t h e d i f f e r e n t b i n a r y m i x t u r e s a r e u s e d , t h e p e a k o r d e r o f t h e d i f f e r e n t c o m p o n e n t s m a y c h a n g e . T h i s b a n d c r o s s i n g c o m p l i c a t e s t h e a n a l y s i s o f c h r o m a t o g r a m s , a n d t h e r e f o r e p e a k t r a c k i n g a l g o r i t h m s a r e a n i m p o r t a n t d e v e l o p m e n t i n c c ( s e e a P P P m a t h o n m D r y b m e t h c u s i n g r e s p o p m a x i m W i l l b e b i l l b e r a n k e d t h e m u b e r u n . e * “ i P E I ' i m r e S D O H S E r e S p O n S e i n c o m p u t e r o p t i m i z a t i o n . L a n k m a y r , e t a ] . 5 p r e s e n t e d a n a p p r o a c h u s i n g f u z z y t h e o r y ( s e e C h a p t e r 2 o f t h i s t h e s i s f o r a n i n t r o d u c t i o n t o f u z z y t h e o r y ) t o t r a c k p e a k s . T h i s a p p r o a c h e n a b l e s t h e u n c e r t a i n t i e s i n p e a k a r e a s t o b e t r e a t e d i n a r i g o r o u s m a t h e m a t i c a l m a n n e r . M o l n a r , e t a l . 6 d e v e l o p e d a n a p p r o a c h f o r p e a k t r a c k i n g b a s e d o n n o r m a l i z e d b a n d a r e a s . I n p a r t i c u l a r , t h e y u s e d t h i s a p p r o a c h i n c o n j u n c t i o n w i t h D r y L a b , a s i m u l a t i o n p r o g r a m t h a t w i l l b e d e s c r i b e d b e l o w . A s e c o n d a p p r o a c h f o r o p t i m i z a t i o n i s s i m p l e x o p t i m i z a t i o n . W h e r e a s t h e a b o v e m e t h o d r e q u i r e s m a t h e m a t i c a l a n a l y s i s , t h e s i m p l e x a p p r o a c h e m p i r i c a l l y o p t i m i z e s b y u s i n g a h i l l - c l i m b i n g m e t h o d b a s e d u p o n r a n k e d r e s p o n s e s . 7 ' 8 A n a p p r o p r i a t e r e s p o n s e f u n c t i o n i s s e l e c t e d , w h i c h m a y b e a f u n c t i o n o f r e s o l u t i o n , p e a k s h a p e s , a n d m a x i m u m r e t e n t i o n t i m e s . T h e u s e r t h e n d e t e r m i n e s t h e n u m b e r o f v a r i a b l e s , n , t h a t w i l l b e o p t i m i z e d . T h e u s e r r u n s ( n + 1 ) e x p e r i m e n t s t o c r e a t e t h e i n i t i a l r e s p o n s e s t h a t w i l l b e u s e d i n t h e o p t i m i z a t i o n . T h e r e s p o n s e f u n c t i o n s f o r t h e ( n + 1 ) e x p e r i m e n t s a r e r a n k e d f r o m w o r s t t o b e s t , a n d t h e c o n d i t i o n s f o r t h e w o r s t p o i n t a r e r e f l e c t e d t h r o u g h t h e n - t u p l e f i g u r e o f t h e o t h e r p o i n t s t o d e t e r m i n e t h e n e x t s e t o f p a r a m e t e r s t h a t w i l l b e r u n . I n t h i s f a s h i o n r e s u l t s f r o m p r e v i o u s e x p e r i m e n t s a r e u s e d t o d e f i n e f u t u r e e x p e r i m e n t s . T h e p r o c e s s i s r e p e a t e d a n d t h e s i m p l e x c l i m b s ( o r d e s c e n d s , i f t h e r e s p o n s e f u n c t i o n i s d e s i g n e d t o b e m i n i m i z e d ) t h e r e s p o n s e s u r f a c e t o a n o p t i m u m r e s p o n s e . T h e a d v a n t a g e s o f s i m p l e x o p t i m i z a t i o n o v e r t h e r e g r e s s i o n m e t h o d s a r e : c s i m p l e x o p t i m i z a t i o n i s b a s e d u p o n a n e m p i r i c a l m e t h o d ; i t d o e s n o t r e q u i r e t h a t a m o d e l b e c r e a t e d , 0 a n y c o r r e l a t i o n b e t w e e n p a r a m e t e r s i s t a k e n i n t o c o n s i d e r a t i o n , 0 t h e r e i s n o r e q u i r e m e n t f o r p e a k t r a c k i n g , 0 t h e c a l c u l a t i o n s a r e s i m p l e a n d n o n - i n t e n s i v e . T h e d i s a d v a n t a g e s a r e : c t h e r e s p o n s e f u n c t i o n o f t e n c o n v e r g e s a t l o c a l o p t i m a r a t h e r t h a n g l o b a l o p t i m a , R e d e r e t w h s o l S t i ' t t o : “ h e t e r n o f I r D e a l d e t e T h e l a g " 5 0 m , a n d h a \ r e ( ) a n o n o m o d e l i s g e n e r a t e d t o p r o v i d e f u n d a m e n t a l i n f o r m a t i o n o f t h e s y s t e m , - a l a r g e n u m b e r o f e x p e r i m e n t s m a y b e r e q u i r e d . O n e o f t h e m o s t p r o m i n e n t s i m u l a t i o n p r o g r a m i s D r y L a b , m a r k e t e d b y L C R e s o u r c e s ( L a f a y e t t e , C A ) . D r y L a b Q ' l o u s e s t h e r e s u l t s f r o m t w o g r a d i e n t e l u t i o n s t o d e t e r m i n e a n e m p i r i c a l r e l a t i o n s h i p b e t w e e n m o b i l e p h a s e c o m p o s i t i o n a n d t h e r e t e n t i o n t i m e s o f s o l u t e s . E m p i r i c a l l y , i t h a s b e e n s h o w n t h a t i l o g k ' - l o g k w - S q ) w h e r e k ' i s t h e c a p a c i t y f a c t o r o f t h e s o l u t e , ( p i s t h e v o l u m e f r a c t i o n o f t h e s t r o n g s o l v e n t i n t h e m o b i l e p h a s e , a n d R W a n d S a r e c o n s t a n t s t h a t a r e c h a r a c t e r i s t i c o f t h e s t r o n g s o l v e n t a n d s o l u t e ( i . e . , f i t t i n g p a r a m e t e r s ) . T h i s r e l a t i o n s h i p c a n b e g e n e r a l i z e d t o : l o g k ' a : A - B x w h e r e x i s a n y o f t h e c o m m o n p a r a m e t e r s u s e d t o a d j u s t H P L C r e t e n t i o n , s u c h a s t e m p e r a t u r e , p H , a n d m o b i l e p h a s e c o m p o s i t i o n . T h i s m o d e l a s s u m e s a l i n e a r r e s p o n s e o f l o g k ' t o t h e d i f f e r e n t p a r a m e t e r s . D r y L a b a l s o d o e s n o t a s s i s t w i t h t h e p r o b l e m o f p e a k t r a c k i n g ; i n s t e a d , i t r e l i e s o n t h e u s e r b e i n g a b l e t o a p p l y s c i e n t i f i c r e a s o n i n g i n d e t e r m i n i n g i f p e a k s h a v e s w i t c h e d . A f t e r t h e g r a d i e n t s h a v e b e e n r u n , t h e s o f t w a r e c a n d e r i v e v a l u e s f o r K W a n d S . T h e s o f t w a r e c a l c u l a t e s t h e e f f e c t s o f v a r y i n g t h e m o b i l e p h a s e , c o l u m n c h a r a c t e r i s t i c s ( e . g . , p a r t i c l e s i z e , c o l u m n l e n g t h ) a n d s h o w s t h e r e s u l t a n t s i m u l a t e d c h r o m a t o g r a m . S o m e o f t h e a p p l i c a t i o n s o f D r y L a b t o H P L C s e p a r a t i o n s c a n b e f o u n d i n r e f e r e n c e s 1 1 a n d 1 2 . T h e r e a r e m a n y o t h e r t e c h n i q u e s f o r o p t i m i z a t i o n a n d s i m u l a t i o n . R e f e r e n c e 1 2 d i s c u s s e s m a n y o t h e r a p p r o a c h e s t h a t h a v e b e e n u s e d . T h e o n e s i n t h i s d i s s e r t a t i o n h a v e b e e n p r e s e n t e d a s a r e p r e s e n t a t i v e s a m p l i n g o f t h e a b i l i t y t o u s e c o m p u t e r s f o r o p t i m i z a t i o n . t h e I a p r : c o n d s y s t e i W o r k S e c t i o d e V e l o P o l a r S e c t i o n 1 . 2 . 2 S u g g e s t i o n o f I n i t i a l H P L C C o n d i t i o n s a n d A u t o m a t i o n O n e o f t h e m o r e e x c i t i n g a n d c o m p l e t e u s e s o f c o m p u t e r s h a s b e e n t o a s s i s t i n t h e c h o i c e o f t h e H P L C m e t h o d . W h e r e a s o p t i m i z a t i o n p r o v i d e s a " b e s t s e p a r a t i o n “ f o r a p r e v i o u s l y c h o s e n m e t h o d , t h i s s e c o n d u s e o f c o m p u t e r s i s t o p r o v i d e t h e s t a r t i n g c o n d i t i o n s ( e . g . , t h e c h o i c e o f c o l u m n , d e t e c t o r , d e r i v i t i z a t i o n s c h e m e s ) w h i c h m a y b e f u r t h e r o p t i m i z e d u s i n g t h e p r e v i o u s l y d e s c r i b e d c o m p u t e r t e c h n i q u e s . T h e c u l m i n a t i o n o f t h e i n t e g r a t i o n o f c o m p u t e r s a n d H P L C i s t h e e x p e r t s y s t e m . 3 E x p e r t s y s t e m s w i l l n o t b e d i s c u s s e d i n t h i s o v e r v i e w s e c t i o n s i n c e t h e y a r e t h e f o c u s o f t h i s w o r k a n d a r e d e s c r i b e d i n g r e a t e r d e t a i l t h r o u g h o u t t h e r e s t o f t h i s d i s s e r t a t i o n . T h i s s e c t i o n b r i e f l y d e s c r i b e s t h e u s e o f c o m p u t e r s t o a u t o m a t e H P L C i n s t r u m e n t s . C o l g a n a n d P o l l a r d , 1 3 e v a l u a t e d P e r k i n - E l m e r ' s P E S O S a s a t o o l t o a s s i s t i n t h e d e v e l o p m e n t a n d a u d i t i n g o f H P L C m e t h o d s f o r t h e a n a l y s i s o f s t a r t i n g m a t e r i a l s f o r a d r u g s y n t h e s i s . P E S O S i s a u n i f i e d p r o g r a m t h a t i n c l u d e s D r y L a b a n d L C A n a l y s t E x p e r t . D r y L a b a s s i s t s i n o p t i m i z i n g t h e m o b i l e p h a s e a n d t h e L C A n a l y s t c o m p o n e n t w i l l r u n t h e s u g g e s t e d D r y L a b e x p e r i m e n t . T h e a u t o m a t i o n c o m p o n e n t o f P E S O S a l l o w s a l a r g e r t h r o u g h p u t i n t h e n u m b e r o f e x p e r i m e n t s t h a t c a n b e r u n . P r o D i g e s t - L C 1 4 i s a c o m p u t e r p r o g r a m t h a t i s u s e d t o d e v e l o p m e t h o d s f o r t h e s e p a r a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f p e p t i d e s a n d p r o t e i n s . T h e p r o g r a m p r e d i c t s r e t e n t i o n b e h a v i o r a n d s i m u l a t e s t h e e l u t i o n p r o f i l e s o f 2 - 5 0 a m i n o a c i d r e s i d u e s . T h e p r o g r a m a l s o a s s i s t s i n t h e c h o i c e o f c o l u m n s ( c h o s e n f r o m s i z e e x c l u s i o n , c a t i o n e x c h a n g e , a n d r e v e r s e - p h a s e L C ) . P e r k i n - E l m e r l s h a s a l s o d e v e l o p e d a n H P L C i n s t r u m e n t w i t h a n i n t e g r a t e d c o l u m n - s w i t c h i n g a c c e s s o r y . T h i s s y s t e m a l l o w s f o r r a p i d a n a l y s i s o f m u l t i p l e s a m p l e s t h r o u g h d i f f e r e n t c o l u m n s . d e t a i l m S e c t i O n c e f r e q u e o n h e r c o m b i i r e s u l t i r s y s t e m m g i n e e n g i n e e S Y S t e m . l e g " l h I n f e r e n , e n g i n e r o f t h e n c o m p u t r i n f o r m a u m a s k 1 m p p m - t i a d ‘ T c e T W O g e n 1 0 S e c t i o n 1 . 3 E x p e r t S y s t e m a s a n H P L C T o o l — O v e r v i e w T o d e v e l o p e x p e r t s y s t e m s o n e m u s t g l e a n r e l e v a n t i n f o r m a t i o n f r o m a n e x p e r t . O n c e t h i s i n f o r m a t i o n i s e n c o d e d , i t c a n t h e n b e d i s s e m i n a t e d m o r e e a s i l y a n d f r e q u e n t l y . T h e i n f o r m a t i o n , o f t e n o f h e u r i s t i c n a t u r e ( s e e C h a p t e r 2 f o r m o r e i n f o r m a t i o n o n h e u r i s t i c s ) , i s o b t a i n e d d u r i n g k n o w l e d g e a c q u i s i t i o n m e e t i n g s w i t h a n e x p e r t a n d i s c o m b i n e d w i t h i n f o r m a t i o n o b t a i n e d f r o m o t h e r s o u r c e s ( e . g . , l i t e r a t u r e , d a t a b a s e s ) . O n c e t h e i n f o r m a t i o n i s o b t a i n e d , i t i s t h e n e n c o d e d i n t o a p r o p e r f o r m a t . T h e r e s u l t i n g e n c o d e d i n f o r m a t i o n i s c a l l e d a k n o w l e d g e o r i n f o r m a t i o n b a s e . T h e e x p e r t s y s t e m d e v e l o p e r o r k n o w l e d g e e n g i n e e r m u s t d e t e r m i n e a n a p p r o p r i a t e i n f e r e n c e e n g i n e ( w h e t h e r i t i s c o m m e r c i a l s o f t w a r e o r w r i t t e n d e v e l o p e d b y t h e k n o w l e d g e e n g i n e e r ) w h i c h w i l l b e a b l e t o a p p l y t h e k n o w l e d g e f r o m t h e k n o w l e d g e b a s e i n a s y s t e m a t i c m a n n e r , t o i n f e r , t o r e a c h a c o n c l u s i o n o f t h e g o a l ( s ) o f t h e e x p e r t s y s t e m ( e . g . , t h e a p p r o p r i a t e H P L C c o l u m n t o u s e f o r a p a r t i c u l a r s e p a r a t i o n ) . T h e c h o i c e o f i n f e r e n c e e n g i n e w i l l d i c t a t e t h e f o r m a t o f t h e i n f o r m a t i o n e n c o d i n g . T h e k n o w l e d g e m u s t b e o r g a n i z e d w i t h i n t h e e x p e r t s y s t e m s o t h a t t h e i n f e r e n c e e n g i n e w i l l b e a b l e t o f o l l o w a l o g i c a l p a t h w a y t h r o u g h t h e k n o w l e d g e b a s e . T h e o r d e r o f t h e i n f o r m a t i o n h a s l i t t l e s i g n i f i c a n c e w i t h r e s p e c t t o t h e i n f e r e n c e e n g i n e s i n c e t h e c o m p u t e r w i l l b e a b l e t o s e a r c h t h e c o m p l e t e k n o w l e d g e b a s e t o f i n d t h e r e l e v a n t i n f o r m a t i o n . H o w e v e r , t h e i n f o r m a t i o n s h o u l d b e a r r a n g e d s o t h a t t h e e x p e r t s y s t e m w i l l a s k t h e a p p r o p r i a t e q u e s t i o n s i n t h e c o r r e c t o r d e r . T h i s i s d i s c u s s e d i n g r e a t e r d e t a i l i n C h a p t e r 4 . T h e k n o w l e d g e e n g i n e e r d e v e l o p s a u s e r - i n t e r f a c e t o q u e r y t h e u s e r f o r s u p p o r t i n g d a t a a n d e v i d e n c e t o b e c o m b i n e d w i t h t h e k n o w l e d g e b a s e t o d e v e l o p a d v i c e . T h e r e a r e d i f f e r e n t m e t h o d s t o e x c h a n g e i n f o r m a t i o n t o a n d f r o m t h e u s e r . T w o g e n e r a l m e t h o d s a r e D i a l o g i c a n d " S m a r t F o r m s . ” D i a l o g i c , t h e m o r e t r a d i t i o n a l m e t a n s r S U ' U ' ' s z f i e l d : c a p e r l n c I u r a n d s a p p e a S e c t h 1 1 m e t h o d , i n v o l v e s p r e s e n t i n g q u e s t i o n s t o t h e u s e r a n d h a v i n g t h e u s e r r e s p o n d w i t h a n s w e r s . T h i s m e t h o d i s e a s y t o i m p l e m e n t a n d a l l o w s t h e k n o w l e d g e e n g i n e e r t o s t r u c t u r e t h e f l o w o f t h e q u e s t i o n s t o t h e u s e r . T h e s e c o n d f o r m a t , w h i c h i s c a l l e d ” S m a r t F o r m s ” i n t h e e x p e r t s y s t e m u s e d f o r t h i s p r o j e c t , i n v o l v e s a g r a p h i c a l a p p r o a c h . T h e k n o w l e d g e e n g i n e e r c r e a t e s a s c r e e n t h a t w i l l c o n t a i n d i f f e r e n t q u e s t i o n s ( i . e . , f i e l d s ) . T h e u s e r t h e n m a y s e l e c t a p a r t i c u l a r f i e l d ( v i a m o u s e o r k e y b o a r d ) a n d t h e e x p e r t s y s t e m w i l l p r e s e n t c h o i c e s f o r t h e u s e r i n s o m e f o r m o f d i a l o g b o x w h i c h m i g h t i n c l u d e d r o p - d o w n m e n u s , o p t i o n b u t t o n s , a n d s o f o r t h . T h e u s e r c h o o s e s a r e s p o n s e a n d s e l e c t s a n o t h e r f i e l d t o c o n t i n u e e n t e r i n g m o r e i n f o r m a t i o n . O f t e n o t h e r f i e l d s w i l l a p p e a r b a s e d o n i n p u t t o p r e v i o u s f i e l d s . T h e s e a r e d i s c u s s e d i n m o r e d e t a i l i n C h a p t e r 3 . S e c t i o n 1 . 4 R e q u i r e d I n f o r m a t i o n t o I m p l e m e n t t h e E x p e r t S y s t e m T h e e x p e r t s y s t e m d e s c r i b e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n r e q u i r e s s e v e r a l t y p e s o f i n f o r m a t i o n f r o m t h e u s e r . T h i s i n f o r m a t i o n c a n b e c h a r a c t e r i z e d a s p h y s i c a l a n d c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f t h e a n a l y t e a n d s a m p l e . B o t h t y p e s o f i n f o r m a t i o n p r o v i d e s u p p o r t i n g e v i d e n c e f o r t h e p r o p o s e d s o l u t i o n ( s ) t o t h e g o a l o f d e t e r m i n i n g a n H P L C s e p a r a t i o n m e t h o d . P h y s i c a l i n f o r m a t i o n a l l o w s c o n c l u s i o n s t o b e m a d e o n t h e s a m p l e p r e p a r a t i o n a n d t h e s e p a r a t i o n m e t h o d f o r t h a t a n a l y t e i n a p a r t i c u l a r m a t r i x . I n f o r m a t i o n c o n c e r n i n g p r o p e r t i e s s u c h a s b o i l i n g p o i n t a n d p h y s i c a l s t a b i l i t i e s ( e . g . , e x p l o s i v e a t h i g h t e m p e r a t u r e s o r p r e s s u r e s ) i s u s e d t o h e l p d e t e r m i n e w h e t h e r H P L C i s a s u i t a b l e t e c h n i q u e . T h e p h y s i c a l n a t u r e o f t h e a n a l y t e m i g h t e l i m i n a t e t h e n e e d f o r H P L C b e c a u s e t h e a n a l y t e m i g h t b e d i r e c t l y d e t e c t a b l e w i t h o u t a s e p a r a t i o n s t e p . D e s c r i p t o r s o f t h e s a m p l e , i n c l u d i n g t h e p r e s e n c e ( o r a b s e n c e ) o f p a r t i c u l a t e m a t t e r o r n o n - h o m o g e n e o u s l a y e r s , a l l o w t h e e x p e r t s y s t e m t o s u g g e s t s a m p l e t r e a t m e n t . T h e e x p e r t s y s t e m u p i s n r d e t e r m ‘ s e p a r a t : g r o u p s . s y s t e m i n f o r m a W h e t h e r I r 8 ( w i r e d i n t h e g r i s S o m e a n s w e r c d e t a j j i n t o e m p h ; “ ” 1 S a y ‘ . c fi l l e d F u u n c e r t a i n e r i C a t j S E C I I O n S a m d i f 1 2 s y s t e m i s a b l e t o s u g g e s t w h a t p a r t o f t h e s a m p l e t o a n a l y z e a n d w h e t h e r s a m p l e c l e a n - u p i s n e e d e d . F i n a l l y , s o l u b i l i t y , m o l e c u l a r w e i g h t , a n d s h a p e o f t h e a n a l y t e s a r e u s e d t o d e t e r m i n e a c t u a l s e p a r a t i o n m e t h o d s . C h e m i c a l i n f o r m a t i o n i s u s e d p r e d o m i n a t e l y t o p r o v i d e a b a s i s t o r e s o l v e a n d s e p a r a t e t h e s a m p l e . T h e u s e r m u s t p r o v i d e i n f o r m a t i o n o n p o l a r i t i e s , s u b s t i t u e n t g r o u p s , c h a r g e t r a n s f e r c h a r a c t e r i s t i c s , a r o m a t i c i t y , a n d s o f o r t h t o a l l o w t h e e x p e r t s y s t e m t o p r o p o s e , b y i n d u c t i o n , a w a y t o s e p a r a t e t h e c o m p o n e n t s . I n a d d i t i o n , t h i s i n f o r m a t i o n c a n b e u s e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r a p a r t i c u l a r d e t e c t o r i s r e q u i r e d o r w h e t h e r a p a r t i c u l a r c o m p o u n d m i g h t i r r e v e r s i b l y b i n d t o a s p e c i f i c s t a t i o n a r y p h a s e . T h e r e q u i r e d i n f o r m a t i o n c a n b e g i v e n i n r e l a t i v e t e r m s ; t h a t i s , t h e u s e r i s n o t r e q u i r e d t o k n o w a c t u a l p o l a r i t i e s , b o i l i n g p o i n t s , o r s o f o r t h . M o s t q u e s t i o n s a r e a s k e d i n t h e g e n e r a l i z e d f o r m , ” I S Y O U R C O M P O U N D < P A R A M E T E R > " ( w h e r e P A R A M E T E R i s s o m e p h y s i c a l o r c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c ) . T h e u s e r m a y s i m p l y p r o v i d e a y e s / n o a n s w e r o r m a y p r o v i d e a n a n s w e r w e i g h t e d b y c o n f i d e n c e f a c t o r s ( d e s c r i b e d i n g r e a t e r d e t a i l i n C h a p t e r s 2 a n d 4 ) t o a l l o w f o r e i t h e r c e r t a i n t y / u n c e r t a i n t y o n t h e u s e r ' s p a r t o r t o e m p h a s i s / d e - e m p h a s i s a n a n s w e r ( e . g . , " M y c o m p o u n d i s s l i g h t l y p o l a r , t h e r e f o r e , I w i l l s a y Y E S w i t h a w e i g h t i n g o f o n l y 7 0 " ) . T h i s ” g r a y - s c a l e " l o g i c , o r m o r e a c c u r a t e l y c a l l e d F u z z y L o g i c , a l l o w s t h e e x p e r t s y s t e m t o d r a w c o n c l u s i o n s b a s e d o n m i s s i n g o r u n c e r t a i n d a t a . T h e r e s u l t i n g c o n c l u s i o n ( s ) w i l l a l s o b e w e i g h t e d t o r e f l e c t t h e r a m i f i c a t i o n s o f t h e f u z z y i n p u t . S e c t i o n 1 . 5 O u t p u t f r o m t h e E x p e r t S y s t e m T h e p r e s e n t v e r s i o n o f t h e e x p e r t s y s t e m d e s c r i b e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n p r o v i d e s s e v e r a l d i f f e r e n t r e s u l t s . E a c h m o d u l e , o r s t a g e , m a y b e b y - p a s s e d b y t h e u s e r . s o l u t i o r t h a t H P } l I T h e s e t c o m p l e ) ( I n p a r t W h i C h c ; ( P r o x i d e S i m p l e t P r e S e n t U n s u r e , a n d p a r 1 i n f ( “ T h e C o n s u l t . i n f o r m ; a l l o w t l l a b o r a n t h a t l a t S Y S t e m 1 3 T h e f i r s t s t e p i s t o d e t e r m i n e t h e s u i t a b i l i t y o f H P L C a s a t e c h n i q u e f o r t h e s o l u t i o n o f a s p e c i f i c a n a l y t i c a l p r o b l e m . T h e a p p r o a c h i s t o a s s u m e t h e n u l l h y p o t h e s i s t h a t H P L C i s N O T a s u i t a b l e t e c h n i q u e s i n c e : ( 1 ) n o s e p a r a t i o n i s n e e d e d o r ( 2 ) o t h e r t e c h n i q u e s a r e e i t h e r f a s t e r o r s i m p l e r . T h e s e t w o c r i t e r i a w e r e c h o s e n w i t h t h e i d e a t h a t H P L C i s b o t h t i m e i n t e n s i v e a n d c o m p l e x . H P L C i s r e c o m m e n d e d o n l y i f a s e p a r a t i o n i s n e e d e d a n d i f o t h e r t e c h n i q u e s ( i n p a r t i c u l a r g a s c h r o m a t o g r a p h y ( G C ) o r s u p e r c r i t i c a l f l u i d c h r o m a t o g r a p h y ( S F C ) w h i c h c a n p r o v i d e f a s t e r r e s u l t s ) a r e n o t s u i t a b l e . O n c e H P L C h a s b e e n s e l e c t e d a s a n a p p r o p r i a t e t e c h n i q u e , t h e e x p e r t s y s t e m w i l l p r o v i d e a d v i c e r e g a r d i n g s a m p l e p r e p a r a t i o n a n d t r e a t m e n t . T h i s d e c i s i o n i s f a i r l y s i m p l e s i n c e t h e u s e r s h o u l d k n o w w h e t h e r p a r t i c u l a t e s o r i n h o m o g e n e o u s s a m p l e s a r e p r e s e n t a n d i f t h e a n a l y t e i s p r e s e n t i n t h e p a r t i c u l a t e s o r d i f f e r e n t l a y e r s . I f t h e u s e r i s u n s u r e o f t h e l o c a t i o n o f t h e a n a l y t e , t h e e x p e r t s y s t e m s u g g e s t s s a m p l i n g a l l t h e l a y e r s a n d p a r t i c u l a t e m a t t e r . F i n a l l y , t h e e x p e r t s y s t e m p r o v i d e s a d v i c e o n a p p r o p r i a t e c o l u m n s b a s e d o n i n f o r m a t i o n c o n c e r n i n g t h e p h y s i c a l a n d c h e m i c a l n a t u r e o f t h e s a m p l e . D u r i n g t h e c o n s u l t a t i o n w i t h t h e e x p e r t s y s t e m , d a t a b a s e s a r e a c c e s s e d t o p r o v i d e a d d i t i o n a l i n f o r m a t i o n , s u c h a s a p p r o p r i a t e s o l v e n t s a n d d e t e c t o r s . T h e u s o f d a t a b a s e w i l l a l l o w t h e e x p e r t s y s t e m t o m a k e r e c o m m e n d a t i o n s t h a t c a n b e t a i l o r e d f o r a s p e c i f i c l a b o r a t o r y . I n t h i s f a s h i o n , g e n e r a l i z e d c o n s u l t a t i o n s c a n b e m a d e m o r e s p e c i f i c f o r t h a t l a b o r a t o r y ( e . g . , a v a i l a b l e c o l u m n s c a n b e s t o r e d i n t h e d a t a b a s e a n d t h e e x p e r t s y s t e m w i l l t h e n r e c o m m e n d s p e c i f i c c o l u m n s r a t h e r t h a n g e n e r i c l i s t i n g s ) . S e c t i m i n s t r u m A d d i t i o r c o l u m n - e x t e n s i v c o n s t i t u U p e s o f d e v e l o p m a i n t a i n C h r o m a n H P L C p a C l a s s e s 2 1 i n J e t t e d . T . m l e c fi o n f o l l o w e d V e r s i o n c S a m p l e C t c o l l e g e ] . € S i n c e l e s s 1 4 S e c t i o n 1 . 6 A u t o m a t i o n a s a n H P L C T o o l T h e s e c o n d p a r t o f t h i s r e s e a r c h i n v o l v e s d e v e l o p i n g a n a u t o m a t e d H P L C i n s t r u m e n t . T h e i n s t r u m e n t a s s i s t s t h e u s e r i n d e v e l o p i n g a n d r u n n i n g H P L C m e t h o d s . A d d i t i o n a l l y , t h e f i n a l o b j e c t i v e o f t h i s p r o j e c t w a s t o d e v e l o p a s y s t e m t o p e r f o r m c o l u m n - s w i t c h i n g . M a n y s a m p l e s a r e q u i t e c o m p l e x . C o m p l e x s a m p l e s m a y r e q u i r e e x t e n s i v e s a m p l e p r e p a r a t i o n a n d m e t h o d d e v e l o p m e n t t o b e a b l e t o s e p a r a t e a l l t h e c o n s t i t u e n t s i n a s a m p l e . O f t e n , c o m p l e x s a m p l e s w i l l a l s o c o n t a i n d i f f e r e n t c l a s s e s o r t y p e s o f c o m p o n e n t s . T o c o m p l e t e l y s e p a r a t e a l l t h e c o m p o n e n t s , i t i s n e c e s s a r y t o d e v e l o p a m e t h o d t h a t w i l l p r o v i d e s e p a r a t i o n o f t h e c o m p o n e n t s w i t h i n a c l a s s a n d s t i l l m a i n t a i n t h e i n i t i a l f r a c t i o n a t i o n o f t h e c l a s s e s . W i t h t r a d i t i o n a l o n e - c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y , s e p a r a t i o n m a y r e q u i r e e x t e n s i v e t i m e t o o p t i m i z e s o l v e n t s a n d o t h e r H P L C p a r a m e t e r s . A n o t h e r a p p r o a c h i s t o f r a c t i o n a t e t h e s a m p l e i n t o t h e d i f f e r e n t c l a s s e s a n d c o l l e c t t h e s e f r a c t i o n s o f f - l i n e a s t h e y e l u t e . T h e s e f r a c t i o n s c a n t h e n b e r e - i n j e c t e d o n t o m o r e s p e c i a l i z e d o r d i f f e r e n t c o l u m n s t o p r o v i d e a d d i t i o n a l s e p a r a t i o n . T h e a p p r o a c h u s e d i n t h i s r e s e a r c h w a s t o d e v e l o p t h i s f r a c t i o n a t i o n a n d r e - i n j e c t i o n s c h e m e i n t o a s i n g l e s y s t e m i n v o l v i n g a p r e l i m i n a r y " f r a c t i o n a t i n g " c o l u m n f o l l o w e d b y s e l e c t i v e l y d i r e c t i n g t h e f r a c t i o n s o n t o o t h e r c o l u m n s t o p r o v i d e a n o n - l i n e v e r s i o n o f t h e m a n u a l s y s t e m d e s c r i b e d a b o v e . T h i s o n - l i n e a p p r o a c h m i n i m i z e s s a m p l e c o n s u m p t i o n , d e c r e a s e s a n a l y s i s t i m e ( s i n c e t h e r e i s n o n e e d t o h a v e a f r a c t i o n c o l l e c t o r a n d t h e n h a v e t o r e - i n j e c t t h e s a m p l e s ) , a n d i n c r e a s e s a c c u r a c y a n d p r e c i s i o n s i n c e l e s s s a m p l e . h a n d l i n g w i l l b e i n v o l v e d . M a j o r s 1 6 r e c o g n i z e d a n d p r e s e n t e d t h e a d v a n t a g e s o f o n - l i n e s e p a r a t i o n s a s c o m p a r e d t o a n o f f - l i n e a p p r o a c h i n a n e a r l y s e m i n a l p a p e r . T h e r e s e a r c h p r e s e n t e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n p r o v i d e s a v e r y f l e x i b l e a n d m o d i f i a b l e s y s t e m t o p e r f o r m t h e m u l t i - c o l u m n s e p a r a t i o n s . T h e s o f t w a r e a n d h a r d w a r e s y s t e m d e s c r i b e d i n t h e s u b s e q u e n t c h a p t e r s w i l l a l l o w t h e e x p e r t s y s t e m t o s u g g e : i n s t r u i m o n i t t b a s e d c o m p e l c r i t i c a l a r e r e d d e v e l o p m o n i t o r F i r s t , C C C o o r d i n z a b l e t o c s o l v e n t ( ( a t l e a s t U t i l i z e d i n s t r u m ¢ a n d r e p ; m e t h o d s F O U r t h , . S i m I D l e ¢ m e t h o d d e v d o p e 1 5 s u g g e s t c o l u m n s a n d m o b i l e p h a s e s . T h e a d v i c e m a y t h e n b e r u n o n t h e a u t o m a t e d i n s t r u m e n t t o p r o v i d e t h e d e s i r e d i n t e l l i g e n t , a u t o m a t e d s y s t e m . T h e s o f t w a r e m o n i t o r s t h e r e s p o n s e f r o m m u l t i p l e d e t e c t o r s a n d c o n t r o l t h e v a l v e c o n fi g u r a t i o n s a s b a s e d o n t h e e l u t i o n o f s a m p l e s . C o m p l e t e a u t o m a t i o n o f a l l t h e H P L C i n s t r u m e n t a l c o m p o n e n t s i s t h e f i r s t r e q u i s i t e i n d e v e l o p i n g t h i s i n t e l l i g e n t i n s t r u m e n t . T o a c h i e v e t h e b e n e f i t s o f o n - l i n e f r a c t i o n a t i o n a n d f u r t h e r s e p a r a t i o n , i t i s c r i t i c a l t o b e a b l e t o m o n i t o r a n d t o c o n t r o l a c c u r a t e l y a n d p r e c i s e l y w h e n t h e f r a c t i o n s a r e r e - d i r e c t e d o n t o a d d i t i o n a l c o l u m n s . A n e s s e n t i a l p a r t o f t h i s r e s e a r c h w a s t o d e v e l o p a n a u t o m a t e d H P L C i n s t r u m e n t t h a t c o u l d p r o v i d e c o l u m n s w i t c h i n g a n d m o n i t o r i n g c a p a b i l i t i e s . C o m p u t e r c o n t r o l o f t h e i n s t r u m e n t p r o v i d e s s e v e r a l b e n e f i t s . F i r s t , c o m p u t e r - c o n t r o l l e d v a l v e s w i t c h i n g i s a c c u r a t e a n d r e p r o d u c i b l e a n d c a n b e c o o r d i n a t e d w i t h e v e n t s s u c h a s a d e t e c t e d p e a k o r a s p e c i f i c t i m e . S e c o n d , t h e u s e r i s a b l e t o c o n t r o l m a n y d i f f e r e n t e v e n t s — s u c h a s v a l v e c h a n g e s , d a t a a c q u i s i t i o n , t h e H P L C s o l v e n t d e l i v e r y s y s t e m p a r a m e t e r s s u c h a s m o b i l e p h a s e c o m p o s i t i o n — s i m u l t a n e o u s l y ( a t l e a s t v e r y r a p i d l y o n t h e H P L C t i m e s c a l e ) . T h i s a l l o w s v e r y c o m p l e x m e t h o d s t o b e u t i l i z e d w i t h o u t a n i n c r e a s e i n c o m p l e x i t y t o t h e u s e r . T h i r d , c o m p u t e r c o n t r o l o f t h e i n s t r u m e n t a t i o n , a l l o w s t h e u s e r t o m o r e e a s i l y a u d i t t h e H P L C m e t h o d f o r r u g g e d n e s s a n d r e p r o d u c i b i l i t y s i n c e e a c h H P L C e v e n t , s u c h a s a v a l v e c h a n g e , c a n b e s t o r e d i n a m e t h o d s f i l e a l o n g w i t h a d a t e / t i m e s t a m p a n d a u s e r - p r o v i d e d c o m m e n t s e c t i o n . F o u r t h , t h e s o l v e n t d e l i v e r y s y s t e m u s e d i n t h i s p r o j e c t ( S p e c t r a P h y s i c s 8 7 0 0 ) i s o f s i m p l e d e s i g n a n d c a n o n l y c o n t a i n s e v e n d i f f e r e n t e v e n t s p e r m e t h o d f i l e a n d t e n m e t h o d f i l e s t o t a l . T h i s l i m i t i s e a s i l y r e a c h e d w h e n e i t h e r a c o m p l e x m e t h o d i s d e v e l o p e d o r w h e n d i f f e r e n t c o l u m n s ( a n d t h e r e f o r e d i f f e r e n t p a r a m e t e r s p e r c o l u m n ) a r e u s e d i n c o l u m n - s w i t c h i n g m o d e . W h i l e t w o o r m o r e o f t h e s e m e t h o d f i l e s m a y b e l i n k e d , a p e r s o n m u s t b e p r e s e n t t o l i n k t h e n e x t f i l e a t a n a p p r o p r i a t e t i m e w h e n t h e s y s t e m i s n o t u n d e r c o m p u t e r c o n t r o l . A l l o w i n g t h e c o m p u t e r t o p r o g r a m t h e m e t h o d s d e v e l o r a n d t o a d d i t i r s o l v e n i n s t r u r p l a n s 1 o t h e r p a n d d a 0 f t h e S e c t i o 1 6 a n d t o m o n i t o r w h i c h m e t h o d i s b e i n g u s e d a l l o w s u n a t t e n d e d l i n k a g e o f t h e s e f i l e s . I n a d d i t i o n , t h e c o m p u t e r c a n s t o r e a d d i t i o n a l m e t h o d s i n m e m o r y a n d t h e n p r o g r a m t h e s o l v e n t d e l i v e r y s y s t e m w i t h n e w m e t h o d s a f t e r o l d m e t h o d s h a v e b e e n e x e c u t e d . F i n a l l y , a n a u t o m a t e d s y s t e m f a c i l i t a t e s t h e d e v e l o p m e n t o f a n i n t e l l i g e n t H P L C i n s t r u m e n t t h a t w i l l b e a b l e t o o p t i m i z e t h e s e p a r a t i o n ( i . e . , t i m e a n d r e s o l u t i o n ) . F u t u r e p l a n s i n c l u d e h a v i n g t h e H P L C c o n t r o l l e r p r o g r a m r e t u r n t h e r e s u l t s o f t h e H P L C r u n t o o t h e r p r o g r a m s ( w h i c h m i g h t i n c l u d e t h e e x p e r t s y s t e m , s o l v e n t o p t i m i z a t i o n p r o g r a m s , a n d d a t a m a n i p u l a t i o n p r o g r a m s ) . T h e s e p r o g r a m s c a n t h e n a s s i s t i n t h e i n t e r p r e t a t i o n o f t h e r u n a n d p r o v i d e f e e d b a c k t o t h e c o n t r o l l e r p r o g r a m f o r f u r t h e r m e t h o d s d e v e l o p m e n t . S e c t i o n 1 . 7 A u t o m a t i n g t h e H P L C C h a p t e r s 3 a n d 6 d e s c r i b e t h e e q u i p m e n t a n d c i r c u i t s u s e d t o a u t o m a t e t h e H P L C i n s t r u m e n t . A b r i e f i n t r o d u c t i o n i s p r e s e n t e d h e r e a s a n o v e r v i e w o f t h e H P L C s e t u p . I n i t i a l a u t o m a t i o n o f t h e i n s t r u m e n t i n v o l v e d w r i t i n g a c o n t r o l l e r p r o g r a m i n M i c r o s o f t Q u i c k B a s i c , v e r s i o n 4 . 0 ( M i c r o s o f t C o . R e d m o n d , W A ) . T h i s p r o g r a m a c q u i r e d d a t a f r o m t h e H P L C d e t e c t o r v i a a d a t a a c q u i s i t i o n b o a r d . I n a d d i t i o n , t h e p r o g r a m c o n t r o l l e d t w o s i x - p o r t v a l v e s . T h e fi r s t v e r s i o n o f t h e p r o g r a m w a s u s e d f o r t h e s t u d y o f r e c y c l e h e a r t c u t c h r o m a t o g r a p h y ( R H C ) a n d b a c k f l u s h i n g . T h e s e c o n d s t a g e o f a u t o m a t i o n w a s t h e e x t e n s i o n o f t h e s o f t w a r e d e s c r i b e d a b o v e t o c o n t r o l a d d i t i o n a l v a l v e s a n d a s e c o n d i n t e r f a c e b o a r d . A n i n - h o u s e b u i l t p r o t o t y p e b o a r d w a s d e v e l o p e d t o a l l o w t h e p r o g r a m t o c o n t r o l a s i x - c o l u m n s e l e c t i o n v a l v e ( C S V ) a n d t o p r o g r a m t h e H P L C s o l v e n t d e l i v e r y s y s t e m ( S D S ) . S e v e r a l c i r c u i t s w e r e b u i l t t o i n t e r f a c e t h e p r o t o t y p e b o a r d t o b o t h t h e S D S a n d t h e C S V . T h e s e c i r c u i t s a l l o w r a p i d a n d c o m p u t e r - i n d e p e n d e n t c o n t r o l o f t h e C S V . T m o r e d e t i n t o t h e s T c o l u m n T h e s o f t f r o m a ' T E - d i r e t P r o g r a ; E a c h 1 a s $ 0 ] i s d e 8 “ t h a n d , t a n k a S Q t h e D T Q 1 7 T h e s o f t w a r e w a s a l s o e x t e n d e d t o a l l o w s e q u e n t i a l d a t a a c q u i s i t i o n f r o m t w o o r m o r e d e t e c t o r s c o n n e c t e d t o t h e R T I b o a r d . A n a s s e m b l y l e v e l r o u t i n e w a s i n c o r p o r a t e d i n t o t h e s o f t w a r e t o a l l o w t h e s c a n n i n g o f a s m a l l e r ( u s e r - s e l e c t e d ) n u m b e r o f c h a n n e l s . T h e s o f t w a r e i s d e s i g n e d t o c o n t r o l a s e r i e s o f e x p e r i m e n t s t h a t w o u l d i n v o l v e c o l u m n s w i t c h i n g . T h i s i s a c c o m p l i s h e d b y d e s i g n i n g a n o v e r a l l m e t h o d ( t h e ” m a s t e r " ) . T h e s o f t w a r e a s s i s t s t h e u s e r i n e s t a b l i s h i n g t h e n u m b e r o f f r a c t i o n s t h a t w i l l b e e l u t i n g f r o m a p r e l i m i n a r y c o l u m n . T h e u s e r t h e n i n d i c a t e s w h i c h f r a c t i o n , o r p e a k ( s ) , w i l l b e r e - d i r e c t e d f r o m t h e f r a c t i o n a t i n g c o l u m n t o m o r e s e l e c t i v e c o l u m n s . A m a s t e r p r o g r a m m i g h t s p e c i f y : o A C 8 c o l u m n s e r v e s a s t h e f r a c t i o n a t i n g c o l u m n . . P e a k o n e i s s w i t c h e d t o a C 1 8 c o l u m n f o r f u r t h e r s e p a r a t i o n o f a l k a n e s . . P e a k 2 i s s w i t c h e d t o a p h e n y l c o l u m n t o s e p a r a t e a r o m a t i c s . . T h e n e x t 1 0 m i n u t e s o f t h e r u n w i l l b e d i r e c t e d t o w a s t e ( t h i s m i g h t b e a s e c t i o n o f t h e c h r o m a t o g r a m w h e r e t h e r e a r e n o p e a k s o f i n t e r e s t ) . A f t e r p r o g r a m m i n g t h e m a s t e r m e t h o d , t h e u s e r t h e n e s t a b l i s h e s a m e t h o d f o r e a c h f r a c t i o n . I t i s a t t h i s s t a g e w h e r e t h e u s e r w i l l p r o g r a m t h e H P L C p a r a m e t e r s ( s u c h a s s o l v e n t c o m p o s i t i o n , f l o w r a t e s , a n d s o f o r t h ) . A t t h e a p p r o p r i a t e t i m e s ( w h e n a p e a k i s d e t e c t e d o r t h e c o r r e c t a m o u n t o f t i m e h a s e l a p s e d ) , t h e c o n t r o l l e r s o f t w a r e w i l l s w i t c h v a l v e s , c h a n g e H P L C p a r a m e t e r s , b y — p a s s c o l u m n s t o i n t r o d u c e a n e w s o l v e n t , a n d s o f o r t h . F u t u r e d e v e l o p m e n t o f t h e s o f t w a r e w i l l i n c l u d e a u t o m a t e d o p t i m i z a t i o n o f t h e r u n v i a a n a p p r o p r i a t e a l g o r i t h m ( e . g . , s i m p l e x o r f a c t o r a n a l y s i s ) . T h i s f u r t h e r a u t o m a t i o n o f t h e o p t i m i z a t i o n s t a g e s c o u l d b e a c c o m p l i s h e d b y f e e d i n g t h e r e s u l t s t o a s e c o n d e x p e r t s y s t e m t h a t w o u l d e v a l u a t e t h e r u n a n d s u g g e s t f u r t h e r r e f i n e m e n t s t o t h e m e t h o d ( o r t o u s e a n o t h e r m e t h o d t h a t t h e f i r s t e x p e r t s y s t e m m i g h t h a v e p r o p o s e d ) . L I S T O F R E F E R E N C E S w y o t S ! U $ 3 A ( 1 % L R I . “ N C Q m C h n e S } C h r o A . T . 1 0 l l 1 2 1 3 1 4 1 5 L I S T O F R E F E R E N C E S 5 . S . W i l l i a m s , J . F . K a r n i c k y , J . - I . . E x c o f f i e r , a n d S . R . A b b o t t , ' E x p e r t S y s t e m P r o g r a m f o r A s s i s t a n c e i n H i g h P e r f o r m a n c e L i q u i d C h r o m a t o g r a p h i c M e t h o d D e v e l o p m e n t ' i n C o m p u t e r - A s s i s t e d M e t h o d D e v e l o p m e n t f o r H i g h - P e r f o r m a n c e L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y , J . L . G l a j c h a n d L R . S n y d e r , e d s . , E l s e v i e r S c i e n c e P u b l i s h e r s , 1 9 8 9 , 2 6 7 . J . C . B e r r i d g e , T e c h n i q u e s f o r t h e A u t o m a t e d O p t i m i z a t i o n o f H P L C S e p a r a t i o n s W i l e y - I n t e r s c i e n c e P u b . C h i c h e s t e r , G r e a t B r i t i a n , 1 9 8 5 , 1 . J . L . G l a i c h a n d L . R . S n y d e r , ' C o m p u t e r - A s s i s t e d M e t h o d D e v e l o p m e n t f o r H i g h - P e r f o r m a n c e l i q u i d C h r o m a t o g r a p h y ' i n C o m p u t e r - A s s i s t e d M e t h o d D e v e l o p m e n t f o r H i g h - P e r f o r m a n c e L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y , J . L . G l a i c h a n d L . R . S n y d e r , e d s . , E l s e v i e r S c i e n c e P u b l i s h i n g C o . , I n c . , T h e N e t h e r l a n d s , 1 9 9 0 , i x . H . A . H . B i l l i e t a n d L . D e G a l a n , J . C h r o m a t o g r . 1 9 8 9 , 4 8 5 , 2 7 . E . P . L a n k m a y r , W . W e g s c h e i d e r , a n d J . D a n i e l - I v a d , J . C h r o m a t o g r . 1 9 8 9 , 4 8 5 , 5 5 7 . I . M o l n a r , R . B o y s e n , a n d P . J e k o w , J . C h r o m a t o g r . 1 9 8 9 , 4 8 5 , 5 6 9 . A . G . W r i g h t , A . F . F e l l , a n d J . C . B e r r i d g e , C h r o m a t o g r a p h i a 1 9 8 7 , 4 2 4 , 5 3 3 - 4 0 . J o h n C . B e r r i d g e J . C h r o m a t o g . 1 9 8 9 , 4 8 5 , 3 . L . R . S n y d e r , J . W . D o l a n , a n d D . C . L o m m e n , J . C h r o m a t o g r . 1 9 8 9 , 4 8 5 , 6 5 . J . W . D o l a n , D . C . L o m m e n , a n d L R . S n y d e r , J . C h r o m a t o g r . 1 9 8 9 , 4 8 5 , 9 1 . N . G . M e l l i s h , L C - G C 1 9 9 1 , 9 ( 1 2 ) , 8 4 5 . C o m p u t e r - A s s i s t e d M e t h o d D e v e l o p m e n t f o r H i g h - P e r f o r m a n c e L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y , J . I . . . G l a i c h a n d L . R . S n y d e r , e d s . , E l s e v i e r S c i e n c e P u b . C o . , T h e N e t h e r l a n d s , 1 9 9 0 , p p . 6 5 , 9 1 , 1 8 3 , 4 2 1 , 5 3 3 , 5 6 9 , 5 8 1 , 5 9 7 , 6 0 7 , 6 5 7 . S . T . C o l g a n a n d E . B . P o l l a r d L C - G C 1 9 9 1 , 9 ( 1 1 ) , 7 7 2 . C . T . M a n t , T . W . L o r n e B u r k e , N . [ - 2 . Z h o u , J . M . R . P a r k e r , a n d R . S . H o d g e s , J . C h r o m a t o g r . 1 9 9 0 , 4 8 5 , 3 6 5 . A . T . R h y s W i l l i a m s A m e r i c a n L a b . 1 9 9 2 , 2 4 ( 1 4 ) , 4 6 . 1 8 1 9 1 6 R . M a j o r s , J . C h r o m a t o g r . S c i , 1 9 8 0 , 1 8 , 5 7 1 . S e c t i c 3 5 8 3 1 m a k i n g C H A P T E R 2 H I S T O R Y A N D T H E O R Y W h e r e a c a l c u l a t o r o n t h e E N I A C i s e q u p p e d w i t h 1 8 , 0 0 0 v a c c u u m t u b e s a n d w e i g h s 3 0 t o n s , c o m p u t e r s i n t h e f u t u r e m a y h a v e o n l y 1 , 0 0 0 v a c c u u m t u b e s a n d p e r h a p s w e i g h 1 1 / 2 t o n s . P o p u l a r M e c h a n i c s , M a r c h 1 9 4 9 S e c t i o n 2 . ] A r t i f i c i a l I n t e l l i g e n c e T o u n d e r s t a n d e x p e r t s y s t e m s , i t i s n e c e s s a r y t o u n d e r s t a n d t h e i r d e v e l o p m e n t a s a s u b - f i e l d o f a r t i f i c i a l i n t e l l i g e n c e ( A I ) . B y u n d e r s t a n d i n g t h e h i s t o r y o f A l , t h e d r i v i n g f a c t o r s a n d c o n c e r n s t h a t l e d t o t h e c r e a t i o n o f t o o l s t h a t a i d i n h u m a n - d e c i s i o n m a k i n g c a n b e u n d e r s t o o d . A I h a s b e e n d e f i n e d a s : 1 ” T h e s c i e n t i f i c d i s c i p l i n e w h i c h a t t e m p t s t o e n d o w c o m p u t e r s a n d c o m p u t e r - c o n t r o l l e d m a c h i n e r y w i t h t h e a b i l i t y f o r a c t i o n s , w h i c h , i f c a r r i e d o u t b y a h u m a n b e i n g , w o u l d b e t h o u g h t t o r e q u i r e i n t e l l i g e n c e ” I n t r i n s i c w i t h i n t h i s d e f i n i t i o n , a c o m p u t e r w i t h a r t i f i c i a l i n t e l l i g e n c e s h o u l d b e a b l e t o m o d i f y i t s e l f i n a d y n a m i c m a n n e r t o c h a n g i n g c o n d i t i o n s ; o t h e r w i s e , t h e p r o g r a m i s s t a t i c i n n a t u r e a n d n o t i n t e l l i g e n t . A d i f f e r e n t a p p r o a c h i s u s e d i n A 1 i n c o n v e n t i o n a l V o n N e u m a n n p r o g r a m s ( e . g . , F O R T R A N a n d B A S I C ) . A l t h o u g h r e s e a r c h e r s d e m o n s t r a t e d t h e p o t e n t i a l t o u s e c o m p u t e r s a s e f f i c i e n t c a l c u l a t i n g d e v i c e s t o m a n i p u l a t e d i m e n s i o n e d , d e f i n e d d a t a s t r u c t u r e s , c o m p u t e r s w e r e n o t " i n t e l l i g e n t . " V o n N e u m a n n p r o g r a m s r e q u i r e c o m p l e t e d a t a i n p u t ; m i s s i n g p a r a m e t e r s w o u l d c a u s e t h e p r o g r a m t o a b o r t p r e m a t u r e l y . T h e s e l a n g u a g e s w e r e a l s o u n a b l e t o d e a l w i t h a b s t r a c t s t r u c t u r e s o r c o n c e p t s . V o n N e u m a n n p r o g r a m s a r e g o a l - o r i e n t e d a n d h a v e d i s c r e t e 2 0 b o u n ' n u m b S o m e b e a p s o l v e 1 a c c e p t s o l u t i o V a l u e s ) f r o m o ; m a C h i n n o t h a t m o r e ‘ 2 1 b o u n d a r i e s . T h e p r o g r a m i s w r i t t e n t o a c c e p t o n l y p r e - d e f i n e d d a t a s u c h a s f a c t s a n d n u m b e r s . T h e p r o g r a m t h e n a p p l i e s f i x e d a l g o r i t h m s t o t h e d a t a t o d e r i v e s o l u t i o n s . S o m e s l i g h t v a r i a t i o n i n t h e a l l o w a b l e r a n g e i s a c h i e v a b l e ; h o w e v e r , t h e r a n g e s t i l l m u s t b e a p r e d e f i n e d t y p e . 2 ' 3 C o n n ' a s t e d w i t h V o n N e u m a n n p r o g r a m s , A I p r o g r a m s e x h i b i t t h e c a p a b i l i t y t o s o l v e p r o b l e m s t h a t m i g h t b e o u t s i d e t h e o r i g i n a l r e a l m o f t h e d e f i n e d g o a l . T h e y c a n a c c e p t i n c o m p l e t e o r m i s s i n g d a t a a n d m a y s t i l l b e a b l e t o a r r i v e a t a s o l u t i o n . T h i s s o l u t i o n m i g h t b e f r o m m a n y d i f f e r e n t d o m a i n s ( e . g . , n u m e r i c a l , l o g i c a l , o r s y m b o l i c v a l u e s ) . B y d e a l i n g w i t h b o t h i n c o m p l e t e d a t a a n d d a t a d o m a i n s w h i c h m a y b e d i f f e r e n t f r o m o n e a p p l i c a t i o n t o t h e n e x t , A I h a s t h e p o t e n t i a l a b i l i t y t o l e a r n . A s m e n t i o n e d a b o v e , i n i t i a l u s e s o f c o m p u t e r s w e r e a s h i g h - s p e e d c o m p u t i n g m a c h i n e s . 4 T h e r o l e o f t h e c o m p u t e r a s a s y m b o l p r o c e s s o r w a s i g n o r e d s i n c e t h e y d i d n o t h a v e t h e p r o c e s s i n g p o w e r t o d o s y m b o l i c m a n i p u l a t i o n . A s c o m p u t e r s b e c a m e m o r e w i d e - s p r e a d , s c i e n t i s t s s t a r t e d c r e a t i n g ” i n t e r e s t i n g p r o g r a m s ” o r " s m a r t p r o g r a m s , ” a s t h e y w e r e r e f e r r e d , t h a t s o l v e d n o n - c o m p u t a t i o n a l p r o b l e m s s u c h a s p l a y i n g g a m e s , p r o v i n g t h e o r e m s , a n d s o f o r t h . A r t i f i c i a l i n t e l l i g e n c e m u s t b e a b l e t o d o s y m b o l i c p r o g r a m m i n g ; t h a t i s , i t m u s t b e a b l e t o d e a l w i t h c o n c e p t s . S i m o n , i n 1 9 8 1 , 5 d e v e l o p e d t h e P h y s i c a l S y m b o l H y p o t h e s i s w h i c h s t a t e s t h a t : a . T h o u g h t s c o r r e s p o n d t o l a n g u a g e . b . l a n g u a g e c a n b e c a p t u r e d i n s y m b o l s . c B y m a n i p u l a t i n g s y m b o l s o n a c o m p u t e r , o n e c a n s i m u l a t e t h e t h i n k i n g p r o c e s s . ” T h e f i r s t a t t e m p t s a t a r t i fi c i a l i n t e l l i g e n c e i n v o l v e d m a n i p u l a t i n g c o m p u t e r s t r u c t u r e s c a l l e d a t o m s . T h e s e a t o m s w e r e b i n a r y r e p r e s e n t a t i o n s o f c o n c e p t s . T h r o u g h s y m b o l i c p r o g r a m m i n g , t h e s e a t o m s w o u l d t h e n b e m a n i p u l a t e d t o f o r m m o r e c o m p l e x s t r u c t u r e s , s u c h a s l i s t s , s e n t e n c e s , a n d s o f o r t h , t o e m u l a t e h u m a n i n t e l l i g e n c e . 6 B y u s i n g a t o m s t o b u i l d m o r e c o m p l e x u n i t s , s y m b o l i c p r o g r a m m i n g c a n b e u s e n e w e ) m a n i p 1 a c t i o n . m e m o r P r o g r e s d e c r e a s d i s c o v e a n d r e ; l a t e r , t ; r o l e u t h r e q u i ' s i t 2 2 b e u s e d w i t h u n p r e d i c t a b l e d i m e n s i o n s , c o m p l e x a n d / o r m i x e d s t r u c t u r e s , a n d t o c r e a t e n e w e x p r e s s i o n s f r o m p r e v i o u s l y d e f i n e d a t o m s . O n c e t h e c o m p u t e r b e c a m e a s y m b o l m a n i p u l a t o r , i t n o w ” . . . h a s t h e n e c e s s a r y a n d s u f f i c i e n t m e a n s f o r g e n e r a t i n g i n t e l l i g e n t a c t i o n . " 1 A l t h o u g h t h i s h y p o t h e s i s p r o p o s e d m o r e s e r i o u s r e s e a r c h i n A 1 , l i m i t a t i o n s i n m e m o r y a n d i n t h e s p e e d o f t h e c e n t r a l p r o c e s s i n g u n i t ( C P U ) s e e m e d t o i m p e d e p r o g r e s s i n d e v e l o p i n g A I p r o g r a m s . A s C P U s p e e d i n c r e a s e d a n d m e m o r y c o s t d e c r e a s e d , r e s e a r c h e r s e x p e c t e d A l t o c o m e i n t o f r u i t i o n . H o w e v e r , r e s e a r c h e r s d i s c o v e r e d t h a t t h e p r i n c i p a l o b s t r u c t i o n i n d e v e l o p i n g A I a p p l i c a t i o n s w a s i n o b t a i n i n g a n d r e p r e s e n t i n g t h e k n o w l e d g e r e q u i r e d t o s o l v e t h a t p r o b l e m . A s w i l l b e d i s c u s s e d l a t e r , t h i s o b s t a c l e , o r b o t t l e n e c k , l e d t o t h e d e v e l o p m e n t o f a n e w o c c u p a t i o n a l r o l e — t h a t o f t h e k n o w l e d g e e n g i n e e r . T h e k n o w l e d g e e n g i n e e r ' s r o l e i s t o e l u c i d a t e t h e r e q u i s i t e i n f o r m a t i o n a n d t o e n c o d e e f f i c i e n t l y t h i s k n o w l e d g e i n t o a n a p p r o p r i a t e c o m p u t e r f o r m a t . H u m a n e x p e r t s w e r e o f t e n f o u n d t o b e u n w i l l i n g o r u n a b l e t o d i s s e m i n a t e t h e i n f o r m a t i o n . 5 ' 7 ' 8 O f t e n t h i s u n w i l l i n g n e s s c a m e f r o m t h e f e a r o r c o n c e r n t h a t s h e / h e w o u l d b e r e p l a c e d b y t h e c o m p u t e r . A t o t h e r t i m e s , t h e e x p e r t i s u n a b l e t o a r t i c u l a t e t h e m a n n e r i n w h i c h s h e / h e a p p r o a c h e d t h e p r o b l e m . T h e k n o w l e d g e e n g i n e e r i n g f i e l d h a s d e v e l o p e d m e t h o d s 7 t o e x t r a c t t h i s i n f o r m a t i o n f r o m t h e e x p e r t . T h e s e m e t h o d s i n v o l v e d e v e l o p i n g a p p r o p r i a t e q u e s t i o n s t h a t w o u l d e x t r a c t t h e i n f o r m a t i o n f r o m t h e e x p e r t . B y d e v e l o p i n g r e a s s u r i n g a n d e f f i c i e n t k n o w l e d g e a c q u i s i t i o n s e s s i o n s , t h e e x p e r t s ' f e a r s w e r e a l l a y e d a n d t h e e x p e r t s w e r e a f f i r m e d t h a t t h e y w e r e a v i t a l p a r t o f t h e p r o c e s s . 7 ' 8 T h e o f f i c i a l i n c e p t i o n o f A I a s a n a c c e p t e d d i s c i p l i n e h a s b e e n a s s i g n e d t o 1 9 5 6 d u r i n g t h e S u m m e r R e s e a r c h P r o j e c t a t D a r t m o u t h C o l l e g e . 5 T h i s p r o j e c t c o n s o l i d a t e d t h e i d e a s o f m a n y d i f f e r e n t r e s e a r c h e r s r e g a r d i n g A I . I t w a s d u r i n g t h i s p e r i o d t h a t J o h n M c C a r t h y c o i n e d t h e t e r m " A r t i f i c i a l I n t e l l i g e n c e . " 2 3 M o s t f u n d a m e n t a l r e s e a r c h i n A l h a s b e e n i n t r y i n g t o m i m i c t h e h u m a n b r a i n . O n e a t t e m p t h a s b e e n t o c r e a t e c o m p u t e r m o d e l s ( i n s o f t w a r e ) b a s e d o n t h e h u m a n n e u r a l n e t w o r k . 9 O t h e r a p p r o a c h e s h a v e i n v o l v e d h a r d w a r e a p p r o x i m a t i o n s o f t h e h u m a n b r a i n v i a i n t e r c o n n e c t i n g p r o c e s s o r s t h a t s i m u l a t e h u m a n n e u r a l c o n n e c t i o n s . l o O n e l i m i t a t i o n i s t h a t t h e n u m b e r o f p r o c e s s o r s a n d c o n n e c t i o n s n e e d e d t o a p p r o a c h t h e n u m b e r i n t h e h u m a n b r a i n i s b e y o n d b o t h t h e c u r r e n t s c i e n t i f i c a n d e c o n o m i c p r a c t i c a l i t i e s . P r e s e n t l y , A I h a s d e v e l o p e d s e v e r a l s u b - c l a s s e s b e y o n d t h e o r i g i n a l f o c u s . T h e s e s u b - c l a s s e s i n c l u d e : . M a c h i n e V i s i o n , w h i c h a t t e m p t s t o r e c o g n i z e a n d i d e n t i f y d i f f e r e n t p a t t e r n s , . R o b o t i c s , w h i c h f o c u s e s o n p r o d u c i n g m e c h a n i c a l d e v i c e s t h a t a r e a b l e t o m i m i c h u m a n a c t i o n s ( e . g . , m o v e m e n t ) , . S p e e c h P r o c e s s i n g , w h i c h a t t e m p t s t o b o t h s p e a k a n d r e c o g n i z e h u m a n l a n g u a g e , . P a t t e r n R e c o g n i t i o n , w h i c h t r i e s t o a r r a n g e a n d o r g a n i z e o b j e c t s i n t o l o g i c a l p a t t e r n s , 0 M a c h i n e L e a r n i n g , w h i c h a i m s t o i n c r e a s e i n c r e m e n t a l l y t h e c o m p u t e r ' s k n o w l e d g e b y o b s e r v i n g e x a m p l e s , 0 E x p e r t S y s t e m s , w h i c h p r o v i d e s a d v i c e o n a p a r t i c u l a r a p p l i c a t i o n b y t h e u s e o f e n c o d e d i n f o r m a t i o n . S e c t i o n 2 . 2 B a c k g r o u n d o n E x p e r t S y s t e m s O n e p a r t i c u l a r s u b - c l a s s o f A I i s E X p e r t S y s t e m s . T h e f i e l d o f e x p e r t s y s t e m s i s t h e b r a n c h o f A I t h a t i s f o c u s e d o n g e n e r a l p r o b l e m - s o l v i n g . T h i s f i e l d i s f u n d a m e n t a l i n n a t u r e a n d a p p l i c a t i o n - o r i e n t e d t h a n t h e o t h e r A I s u b — f i e l d s m e n t i o n e d a b o v e . E x p e r t S y s t e m s c a n b e d e f i n e d a s p r o g r a m s t h a t s o l v e p r o b l e m s t h a t s e e m t o r e q u i r e h u m a n k n o w l e d g e . I t i s i m p o r t a n t t o h a v e a c o n c i s e a n d c o m p l e t e d e f i n i t i o n o f e x p e r t s y s t e m s . 2 4 S u c h a d e f i n i t i o n w i l l a l l o w o n e t o c o n s i d e r t h e r e q u i r e d a s p e c t s o f e x p e r t s y s t e m s . A n e x p e r t s y s t e m h a s b e e n d e f i n e d a s : . . . a p r o g r a m t h a t s o l v e s p r o b l e m s c o m p e t e n t l y a t a n e x p e r t l e v e l i n a p a r t i c u l a r d o m a i n . T h e s y s t e m u s e s a k n o w l e d g e b a s e , w h i c h i s s e p a r a t e f r o m t h e m a i n p a r t o f t h e p r o g r a m ( t h e p a r t t h a t d o e s i n f e r e n c i n g u s i n g t h e k n o w l e d g e b a s e ) . T h e p r o g r a m m u s t b e c a p a b l e o f d e a l i n g w i t h i n c o m p l e t e k n o w l e d g e a n d s h o u l d b e a b l e t o e x p l a i n i t s r e a s o n i n g a n d c o n c l u s i o n s . 1 1 E x p e r t s y s t e m s w e r e n o t a s p e c i f i e d o b j e c t i v e b y A I r e s e a r c h e r s . E x p e r t s y s t e m s a r o s e f r o m t h e r e a l i z a t i o n t h a t c o m p u t e r h a r d w a r e a n d s o f t w a r e l i m i t a t i o n s p r e c l u d e d s o l v i n g e x t r e m e l y c o m p l e x , g l o b a l p r o b l e m s . R e s e a r c h e r s d i s c o v e r e d t h a t s o l v i n g s m a l l - d o m a i n p r o b l e m s w a s f e a s i b l e . S i n c e t h e s e t y p e s o f p r o b l e m s r e q u i r e d l i m i t e d k n o w l e d g e , a s c o m p a r e d t o g l o b a l p r o b l e m s , t h e s e a p p l i c a t i o n s a l l e v i a t e d t h e p r o b l e m o f s t o r i n g m a s s i v e a m o u n t s o f d a t a . A l s o , p r o b l e m s i n s m a l l d o m a i n s l e a d t o e a s i e r e l u c i d a t i o n o f i n f o r m a t i o n f r o m t h e h u m a n e x p e r t s . K n o w l e d g e e n g i n e e r s d i s c o v e r e d t h a t t h e s e s m a l l p r o b l e m s w e r e o f t e n s o l v e d b y a h e u r i s t i c a p p r o a c h r a t h e r t h a n u s i n g c o m p l e x a l g o r i t h m i c m e t h o d s ( f o r e x a m p l e , c h o o s i n g a n a p p r o p r i a t e t a x - p r e p a r a t i o n m e t h o d v e r s u s f l u i d d y n a m i c c a l c u l a t i o n s f o r t h e d e s i g n o f a i r p l a n e s ) . A h e u r i s t i c a p p r o a c h i s d e f i n e d a s O f , r e l a t i n g t o , o r c o n s t i t u t i n g a n e d u c a t i o n a l m e t h o d i n w h i c h l e a r n i n g t a k e s p l a c e t h r o u g h d i s c o v e r i e s t h a t r e s u l t f r o m i n v e s t i g a t i o n s m a d e b y t h e s t u d e n t . 1 2 H e u r i s t i c s a r e u s e d e i t h e r t o s o l v e p r o b l e m s d i r e c t l y o r t o m i n i m i z e t h e s e a r c h f i e l d t h a t m u s t b e c o n s i d e r e d w h e n c h o o s i n g a n a p p r o p r i a t e a n s w e r o r r e s p o n s e . H e u r i s t i c s a r e o f t e n b a s e d o n e m p i r i c a l d a t a a n d p r e v i o u s e x p e r i e n c e s o f t h e e x p e r t . T h i s a p p r o a c h d o e s n o t p r e c l u d e h e u r i s t i c s f r o m b e i n g l i n k e d t o f u n d a m e n t a l o r m a t h e m a t i c a l t h e o r y . O f t e n t h e p r o c e s s o f o b t a i n i n g a n d e n c o d i n g t h e s e h e u r i s t i c s w i l l l e a d t o f u n d a m e n t a l r e s e a r c h . S i n c e t h e e n c o d i n g r e q u i r e s t h a t t h e h e u r i s t i c i n f o r m a t i o n b e p u t i n t o s o m e 2 5 f o r m o f c o m p u t e r f o r m a t s u c h a s I F - T H E N s t a t e m e n t s ( s e e l a t e r ) , a l i n k b e t w e e n t h e p r o p e r h e u r i s t i c r e s p o n s e a n d e x p e r i m e n t a l d a t a m u s t b e m a d e . T h u s , t h e k n o w l e d g e e n g i n e e r a n d h u m a n e x p e r t m u s t d i s c o v e r o r d e t e r m i n e t h e f u n d a m e n t a l r e a s o n s f o r w h i c h t h e h e u r i s t i c a p p r o a c h w o r k s . F o r e x a m p l e , i f a p a r t i c u l a r r e a g e n t s e e m s t o c a u s e d e c o m p o s i t i o n , t h i s i n f o r m a t i o n m u s t b e e n c o d e d w i t h e m p h a s i s o n t h e e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s u n d e r w h i c h t h i s r e a c t i o n i s o b s e r v e d . T h i s t h o u g h t p r o c e s s o f t e n l e a d s t o a s k i n g ' w h y " t y p e s o f q u e s t i o n s r a t h e r t h a n a l o w e r l e v e l q u e s t i o n o f s i m p l y " w h e n " o r ” w h a t . ” I n p a r t i c u l a r , t h e d e v e l o p m e n t o f e x p e r t s y s t e m s h a s h e l p e d t o f o r m u l a t e r u l e s t h a t d e s c r i b e c h r o m a t o g r a p h y . W h i l e t h e k n o w l e d g e b a s e f o r c h r o m a t o g r a p h y i s s t i l l i n c o m p l e t e , t h e p r o c e s s o f f o r m u l a t i n g t h e s e r u l e s h a s l e d t o a n i n c r e a s e i n t h e u n d e r s t a n d i n g o f t h e s c i e n c e o f c h r o m a t o g r a p h y . T o b e a b l e t o i n c o r p o r a t e H P L C r u l e s , o n e m u s t u n d e r s t a n d t h e f u n d a m e n t a l s o f c h r o m a t o g r a p h y . A n e x a m p l e o f i n c o r p o r a t i n g H P L C r u l e s w o u l d b e w h e n a n e x p e r t s t a t e s ” I c h o o s e a c y a n o c o l u m n f o r t h i s p a r t i c u l a r s e t o f c o n d i t i o n s . ” T h i s s t a t e m e n t d o e s n o t p r o v i d e t h e t y p e o f i n f o r m a t i o n t h a t c a n b e e n c o d e d i n t o c o m p u t e r f o r m a t . T h e e x p e r t m u s t b e q u e r i e d b y t h e k n o w l e d g e e n g i n e e r t o d e t e r m i n e w h a t c o n d i t i o n s ( a n d w h y ) m u s t e x i s t t o s u p p o r t a p a r t i c u l a r c o n c l u s i o n . I f t h e e n g i n e e r o n l y o b t a i n s i n f o r m a t i o n c o n c e r n i n g t h e c o n d i t i o n s u n d e r w h i c h t h e d e c i s i o n i s m a d e , t h e n t h e k n o w l e d g e e n g i n e e r h a s o n l y d e v e l o p e d a d a t a b a s e t h a t l i n k s a p a r t i c u l a r c o l u m n w i t h a s e t c o n d i t i o n . T h e o b j e c t i v e i s t o d e v e l o p a m o r e g e n e r a l i z e d m e t h o d t h a t i s a b l e t o e x t e n d t h e d e c i s i o n t o o t h e r c o n d i t i o n s w h e r e a p a r t i c u l a r c o l u m n o r m e t h o d i s a p p r o p r i a t e . T o . d o t h i s , t h e e n g i n e e r m u s t o b t a i n t h e " w h y ” a n d n o t j u s t t h e " w h a t " o r " w h e n . " T h e s e a n s w e r s w i l l a l l o w t h e e x p e r t s y s t e m t o w o r k i n a s i t u a t i o n t h a t h a s n o t b e e n “ h a r d w i r e d " i n t o t h e k n o w l e d g e b a s e . B e i n g a b l e t o d r a w i n f e r e n c e s a n d e x t e n s i o n s , t h e p r o g r a m a p p e a r s " i n t e l l i g e n t . " 2 6 E x t r a c t i n g t h e h e u r i s t i c s , o r k n o w l e d g e a c q u i s i t i o n , h a s o f t e n b e e n t h e m a j o r b o t t l e n e c k i n d e v e l o p i n g e x p e r t s y s t e m s . 1 3 K n o w l e d g e a c q u i s i t i o n i s " t h e t r a n s f e r a n d t r a n s f o r m a t i o n o f p o t e n t i a l p r o b l e m — s o l v i n g e x p e r t i s e f r o m s o m e k n o w l e d g e s o u r c e t o a p r o g r a m . " 1 3 O f t e n h u m a n e x p e r t s h a v e n o t e x t e r n a l i z e d t h e i r t h o u g h t p r o c e s s o r a r e r e l u c t a n t t o d o $ 0 . 8 K n o w l e d g e a c q u i s i t i o n m e e t i n g s i n t r i n s i c a l l y h a v e v a l u e o t h e r t h a n s i m p l y o b t a i n i n g t h e i n p u t f o r t h e k n o w l e d g e b a s e . O n e o b j e c t i v e o f d e v e l o p i n g a n e x p e r t s y s t e m i s ” . . . t o c o d i f y a n d t h e r e b y r e n d e r e x p l i c i t l y t h e v a l u a b l e k n o w l e d g e t h a t m a n y e x p e r t s p o s s e s s . . . . " 3 T h i s o f t e n w i l l l e a d t o a m o r e f u n d a m e n t a l u n d e r s t a n d i n g o f t h e p r o b l e m a r e a . 1 4 I n a d d i t i o n , s i n c e e x p e r t s y s t e m s s y s t e m a t i c a l l y s e a r c h A L L o f t h e k n o w l e d g e b a s e f o r p o s s i b l e s o l u t i o n s t o a p r o b l e m ( m u c h f a s t e r t h a n a h u m a n ) , t h e y o f t e n e x h i b i t a s u c c e s s r a t e a p p r o a c h i n g , a n d s o m e t i m e s s u r p a s s i n g , t h a t o f h u m a n . 5 S e c t i o n 2 . 3 T e r m i n o l o g y T h e d e f i n i t i o n o f e x p e r t s y s t e m s u s e d p r e v i o u s l y 1 1 i n t r o d u c e d s e v e r a l t e r m s t h a t n e e d t o b e d e f i n e d . A n e x p e r t s y s t e m i s c o m p o s e d o f t h r e e b a s i c c o m p o n e n t s : 1 5 ' 1 6 o t h e k n o w l e d g e / f a c t b a s e , . t h e i n f e r e n c e e n g i n e , a n d o t h e m a n - m a c h i n e i n t e r f a c e . T h e s e t e r m s a r e d e s c r i b e d i n g r e a t e r d e t a i l w i t h r e s p e c t t o t h e i m p l e m e n t a t i o n o f t h e e x p e r t s y s t e m d e v e l o p e d i n t h i s p r o j e c t ( s e e C h a p t e r 4 ) . S e c t i o n 2 . 3 . ! K n o w l e d g e a n d F a c t B a s e s T h e f i r s t c o n s i d e r a t i o n i s t h e k n o w l e d g e a n d / o r f a c t b a s e . S i n c e k n o w l e d g e i s " i n f o r m a t i o n a b o u t t h e w o r l d t h a t a l l o w s a n e x p e r t t o m a k e d e c i s i o n s , " 5 i t i s e s s e n t i a l 2 7 t h a t i n f o r m a t i o n i s n o t o n l y a v a i l a b l e t o t h e c o m p u t e r b u t t h a t t h e i n f o r m a t i o n c a n b e e x p r e s s e d i n t h e p r o p e r s y n t a x a n d s t r u c t u r e b e f o r e a n e x p e r t s y s t e m c a n b e b u i l t . T h e r e a r e t w o d i f f e r e n t t y p e s o f k n o w l e d g e : f a c t s a n d r u l e s . 5 F a c t s a r e a s s e r t e d a s b e i n g t r u e ( o r a s h a v i n g a p a r t i c u l a r v a l u e ) . T h e v a l u e s o f t h e f a c t s d o n o t c h a n g e d u r i n g a c o n s u l t a t i o n w i t h a n e x p e r t s y s t e m r e g a r d l e s s o f t h e d y n a m i c n a t u r e o f o t h e r i n f o r m a t i o n i n t h e e x p e r t s y s t e m . S o m e e x a m p l e s o f f a c t s m i g h t b e : E x a m p l e o f F a c t s M a x i m u m a l l o w a b l e p H = 1 2 C o d e 2 . 1 M a x i m u m P r e s s u r e = 6 0 0 0 p s i F a c t s a r e s t a t e m e n t s t h a t u s u a l l y a r e s p e c i f i c t o t h e a p p l i c a t i o n . F a c t s a r e o f t e n t r a n s i t o r y f r o m o n e c o n s u l t a t i o n t o t h e n e x t ; a l t h o u g h , d u r i n g a p a r t i c u l a r c o n s u l t a t i o n t h e y a r e c o n s i s t e n t ) . F a c t s a r e a n a l o g o u s t o C O N S T A N T S i n t r a d i t i o n a l p r o g r a m m i n g l a n g u a g e s a n d a r e t h e f u n d a m e n t a l i n f o r m a t i o n i n a n e x p e r t s y s t e m s i n c e t h e r e s u l t s o f r u l e s o r i g i n a t e f r o m t h e s y n e r g i s m o f t h e f a c t s t o f o r m c o n c l u s i o n s . F a c t s c a n b e o b t a i n e d f r o m t h e k n o w l e d g e b a s e , o r s u p p l i e d b y t h e u s e r d u r i n g a c o n s u l t a t i o n w i t h t h e e x p e r t s y s t e m . T h e s e c o n d t y p e o f k n o w l e d g e , r u l e s , c o n t a i n t h e k n o w l e d g e , o r h e u r i s t i c s , o f t h e a p p l i c a t i o n d o m a i n . R u l e s r e l a t e t h e f a c t s t h a t h a v e b e e n o b t a i n e d w i t h p a r t i c u l a r c o n c l u s i o n s . R u l e s m a y b e s t o r e d i n a f o r m c a l l e d p r o d u c t i o n r u l e s ( e . g . , l F - T H E N f o r m a t ) ; a l t h o u g h , t h i s t y p e o f k n o w l e d g e i s n o t l i m i t e d t o l F - T h e n f o r m a t . T h e t e r m , R U L E S , w i l l b e u s e d t o d e n o t e i n f o r m a t i o n t h a t u s e s f a c t s t o r e a c h a p a r t i c u l a r g o a l o r c o n c l u s i o n . T h e v a l u e o f a r u l e i s d e p e n d e n t u p o n t h e v a l u e s o f f a c t s a n d o t h e r d a t a ; t h e r e f o r e , t h e y a r e v e r y d y n a m i c i n n a t u r e . T h e e x a m p l e t h a t f o l l o w s s h o w s o n e r u l e t h a t i n d i r e c t l y d e t e r m i n e s a s e p a r a t i o n m o d e f o r a n H P L C m e t h o d . H e r e , t h e r u l e i s a s c e r t a i n i n g w h e t h e r a c o m p o u n d o f i n t e r e s t i s i o n i c , n o n - i o n i c , o r i s i o n i c b u t c a n b e s h i f t e d t o a n o n - i o n i c f o r m b y a d j u s t m e n t o f t h e p H . T o s u c j I O g j ( d a t a s o l u t a C C Q S S U b S I i s a n I Q h a I n f e r t 2 8 E x a m p l e o f R u l e S t r u c t u r e I F I o n i c : - Y e s A N D C o d e 2 . 2 R e q u i r e d - p H _ T o _ N e u t r a l i z e < M i n _ p H O R R e q u i r e d _ p I - I _ T o _ N e u t r a I i z e > M a x _ p H O R D e t e c t _ N o n i o n i c _ F o r m - N o T H E N I o n i c i t y - I o n i c T o d e t e r m i n e i f t h e c o m p o u n d i s i o n i c , t h e r u l e c o m p a r e s f a c t s o b t a i n e d f r o m t h e u s e r , s u c h a s t h e p H r e q u i r e d t o n e u t r a l i z e t h e c o m p o u n d , — t o i n t e r n a l f a c t s s u c h a s t h e m i n i m u m a n d m a x i m u m p H a l l o w e d f o r a n H P L C i n s t r u m e n t / e x p e r i m e n t . A s p e c i a l t y p e o f r u l e i s c a l l e d a m e t a - r u l e . S M e t a - r u l e s a r e u s e d t o c o n t r o l t h e l o g i c f l o w i n a n e x p e r t s y s t e m . T h e m e t a - r u l e s m i g h t d e t e r m i n e w h i c h p a r t i c u l a r d a t a b a s e ( s ) t o l o a d b a s e d u p o n t h e u s e r ' s i n p u t . A l t h o u g h m e t a - r u l e s d o n o t l e a d t o t h e s o l u t i o n o f t h e p r o b l e m a d d r e s s e d b y t h e e x p e r t s y s t e m , t h e y a l l o w t h e e x p e r t s y s t e m t o a c c e s s t h e c o r r e c t i n f o r m a t i o n t o s o l v e t h e p r o b l e m . A n e x a m p l e o f a m e t a - r u l e i s p r o v i d e d i n C o d e 2 . 3 . T h i s r u l e d e t e r m i n e s t h e s u b s e q u e n t g o a l s o f t h e e x p e r t s y s t e m . W h e n t h e e x p e r t s y s t e m d e t e r m i n e s t h a t H P L C i s a n a p p r o p r i a t e t e c h n i q u e f o r t h e p a r t i c u l a r a p p l i c a t i o n a n d t h e u s e r i n d i c a t e s a d e s i r e t o h a v e t h e e x p e r t s y s t e m p r o p o s e a m e t h o d ( s ) , t h i s s p e c i f i c m e t a - r u l e w i l l c a u s e t h e i n f e r e n c e e n g i n e t o d e t e r m i n e s a m p l e p r e - t r e a t m e n t , c o l u m n , a n d s o l v e n t . E a c h t y p e o f r u l e h a s s e v e r a l d i f f e r e n t m e t h o d s b y w h i c h i t c a n b e r e p r e s e n t e d i n a n e x p e r t s y s t e m . S o m e o f t h e s e d i f f e r e n t f o r m a t s a r e d i s c u s s e d i n S e c t i o n 2 . 6 . 2 9 E x a m p l e o f a M e t a - R u l e R u l e C o n t i n u e Z C o d e 2 . 3 I F H P L C _ S u i t e d = Y e s A N D C h e c k _ F o r - M e t h o d s = Y e s T H E N C o n t i n u e = Y e s F I N D S c u z z - C h e c k e d F I N D H o m o g e n e i t y _ C h e c k e d F I N D R e v - P h a s e _ O K F I N D N o r m a I _ P h a s e _ O K F I N D M o d e F I N D C o l u m n F I N D S o l v e n t ; A u n i q u e f e a t u r e o f e x p e r t s y s t e m s i s t h e a s s o c i a t i o n o f c o n f i d e n c e f a c t o r s ( C N F ) w i t h f a c t s a n d r u l e s . S i n c e e x p e r t s y s t e m s m u s t d e a l w i t h u n c e r t a i n t y , t h e y m u s t b e a b l e t o a s s o c i a t e a n u m e r i c a l v a l u e t o t h e c e r t a i n t y o r v a l i d i t y o f a f a c t o r r e s u l t . A C N F o f 1 0 0 a s s e r t s a b s o l u t e v a l i d i t y o f t h e f a c t a n d a C N F o f 0 s t a t e s t h a t a f a c t o r r e s u l t i s a b s o l u t e l y f a l s e . A l l v a l u e s b e t w e e n 0 a n d 1 0 0 i n d i c a t e a g r a d u a t i o n b e t w e e n a b s o l u t e c e r t a i n t y a n d a b s o l u t e f a l s i t y . A s w i l l b e d i s c u s s e d l a t e r , c o n f i d e n c e f a c t o r s a r e d i s t i n c t l y d i f f e r e n t f r o m s t a t i s t i c a l p r o b a b i l i t i e s ; r a t h e r , C N F s a r e a s u b - f i e l d o f f u z z y - l o g i c . S e c t i o n 2 . 3 . 2 l n f e r e n c e E n g i n e T h e s e c o n d , a n d m a j o r , c o m p o n e n t o f a n e x p e r t s y s t e m i s t h e i n f e r e n c e e n g i n e . A n a n a l o g y c a n b e m a d e b e t w e e n t h e i n f e r e n c e e n g i n e o f e x p e r t s y s t e m s a n d t h e c o m p i l e r o f t r a d i t i o n a l p r o g r a m m i n g l a n g u a g e s . T h e i n f e r e n c e e n g i n e i s t h e c o m p o n e n t t h a t d e r i v e s s o l u t i o n s t o t h e g o a l s o f t h e e x p e r t s y s t e m s b a s e d u p o n t h e l i n k i n g , o r i n f e r e n c e , o f a l l t h e r u l e s , f a c t s , a n d u s e r i n p u t . T h i s l i n k i n g i s a c c o m p l i s h e d b y t w o m o d e s : f o r w a r d c h a i n i n g a n d b a c k w a r d c h a i n i n g . I n f o r w a r d c h a i n i n g , a l l r u l e s a r e c o m p a r e d w i t h t h e a v a i l a b l e f a c t s t o g e n e r a t e a n i n i t i a l s e t o f c o n c l u s i o n s . T h e s e c o n c l u s i o n s a r e a d d e d t o t h e f a c t b a s e t o 3 0 b e u s e d b y t h e i n f e r e n c e e n g i n e a s i t r e - i t e r a t e d t h r o u g h t h e k n o w l e d g e b a s e t o g e n e r a t e a s e c o n d s e t o f c o n c l u s i o n s . T h i s p r o c e s s i s i t e r a t e d u n t i l a f i n a l , c o m p l e t e s e t o f c o n c l u s i o n s h a s b e e n g e n e r a t e d . A t t h i s p o i n t , t h e d e d u c e d c o n c l u s i o n s a r e c o m p a r e d t o t h e g o a l s o f t h e e x p e r t s y s t e m t o s e e i f o n e , o r m o r e , o f t h e c o n c l u s i o n s i s t h e s o l u t i o n t o t h e o b j e c t i v e . T h e f o r w a r d c h a i n i n g a p p r o a c h i s o f t e n c a l l e d " d a t a - d r i v e n " s i n c e a l l t h e d a t a a r e u s e d t o d e r i v e a l l t h e p o s s i b l e c o n c l u s i o n s w i t h o u t a n y c o n s i d e r a t i o n f o r t h e g o a l t h a t i s b e i n g s o l v e d . I t s p r i n c i p l e u s e i s i n i n s t r u m e n t c o n t r o l , p l a n n i n g , a n d s c h e d u l i n g . 5 T h e s e c o n d s e a r c h s t r a t e g y i s b a c k w a r d c h a i n i n g i n w h i c h t h e i n f e r e n c e e n g i n e f i r s t d e t e r m i n e s t h e g o a l ( s ) o f t h e e x p e r t s y s t e m . T h e i n f e r e n c e e n g i n e s e a r c h e s t h r o u g h i t s k n o w l e d g e b a s e u n t i l i t f i n d s a r u l e t h a t h a s a c o n c l u s i o n t h a t m a t c h e s t h e g o a l ( s ) . O n c e s u c h a r u l e i s f o u n d , t h e i n f e r e n c e e n g i n e a t t e m p t s t o d e t e r m i n e t h e v a l i d i t y o f t h e p r e m i s e o f t h e r u l e . I f t h e p r e m i s e i s t r u e , t h e r u l e " p a s s e s ” o r " f i r e s . ” B a c k w a r d c h a i n i n g i s g o a l - o r i e n t e d A n d i s u s e d w h e n o n l y p a r t i c u l a r s o l u t i o n s a r e t o b e c o n s i d e r e d a n d n o t a l l t h e r a m i f i c a t i o n s o f t h e a v a i l a b l e d a t a . S e c t i o n 2 . 3 . 3 U s e r I n t e r f a c e T h e p r i m a r y f u n c t i o n o f t h e u s e r i n t e r f a c e i s t o o b t a i n i n f o r m a t i o n f r o m t h e u s e r . O n c e t h e i n f e r e n c e e n g i n e h a s i n d u c e d a s o l u t i o n ( s ) , t h e i n t e r f a c e p r o v i d e s a m e t h o d t o p r e s e n t t h e r e s u l t s b a c k t o t h e u s e r . T h e u s e r i n t e r f a c e a l s o i s r e s p o n s i b l e f o r t h e H e l p a n d E x p l a n a t i o n c o m p o n e n t s . T h e r o l e o f t h e H e l p f a c i l i t y i s s e l f - e x p l a n a t o r y . T h e E x p l a n a t i o n f a c i l i t y a l l o w s t h e u s e r t o q u e r y t h e s y s t e m a s t o b o t h W H Y a n d H O W a s o l u t i o n w a s i n d u c e d . T h e s e t w o f e a t u r e s a l l o w t h e u s e r t o d e t e r m i n e t h e r a t i o n a l e b e h i n d a q u e s t i o n t h a t i s b e i n g a s k e d d u r i n g a c o n s u l t a t i o n . O n c e t h e u s e r i s a w a r e o f t h e r a t i o n a l e , s h e / h e m a y s u p p l y a n a n s w e r i n t h e c o r r e c t c o n t e x t o f t h e 3 1 q u e s t i o n . T h e H o w p a r t o f t h e f a c i l i t y n o t o n l y a l l o w s t h e k n o w l e d g e e n g i n e e r t o t e s t a n d d e b u g t h e s y s t e m b u t a l s o a l l o w s t h e u s e r t o l e a r n f r o m t h e s y s t e m . T h e E X p l a n a t i o n f a c i l i t y a l l o w s t h e k n o w l e d g e e n g i n e e r t o e x t e n d f u r t h e r t h e k n o w l e d g e b a s e , a n d i m p r o v e s t h e u s e r ' s c o n f i d e n c e i n t h e s y s t e m w h e n s h e / h e c a n c h e c k t h e i n d u c t i o n p a t h o f t h e c o n c l u s i o n s . S e c t i o n 2 . 4 H i s t o r i c a l l y I m p o r t a n t E x p e r t S y s t e m s T h e f i r s t e x p e r t s y s t e m o f n o t e w a s t h e D E N D R A L e x p e r t s y s t e m t h a t w a s d e v e l o p e d i n 1 9 6 4 b y L i n d s a y , e t a l l 7 N A S A S ' 1 8 p r o v i d e d f u n d s t o t h e s e r e s e a r c h e r s t o d e v e l o p a p r o g r a m t h a t w o u l d i n t e r p r e t d a t a o b t a i n e d f r o m m a s s s p e c t r a o f M a r t i a n s o i l . T h e o b j e c t i v e w a s t o p l a c e b o t h a m a s s s p e c t r o m e t e r a n d t h e e x p e r t s y s t e m o n t o a s p a c e v e h i c l e . R e s e a r c h e r s l i m i t e d D E N D R A L ' s s c o p e t o t h e a n a l y s i s o f o n l y s i m p l e m o n o f u n c t i o n a l c o m p o u n d s . T h e p r o g r a m u s e d a c e n t r o i d ( a s p e c i f i c a t o m o r b o n d ) a n d g e n e r a t e d a l l p o s s i b l e s t r u c t u r e s b y s y s t e m a t i c a l l y a r r a n g i n g c o n s t i t u e n t r a d i c a l s a r o u n d t h e c e n t r o i d . T h e p r e d i c t e d s p e c t r a w e r e t h e n c o m p a r e d t o t h e e x p e r i m e n t a l s p e c t r o g r a m . A m a t c h t h u s i d e n t i f i e d t h e c o m p o u n d . O b v i o u s l y a n e a r - i n f i n i t e s e a r c h a r e a w o u l d b e c r e a t e d f r o m t h e g e n e r a t i o n o f a l l p o s s i b l e s t r u c t u r e s a r o u n d t h e c e n t r o i d . T h e e x p e r t p a r t o f t h e s y s t e m w a s t h e u s e o f r u l e s t h a t l i m i t e d t h e n u m b e r o f p o s s i b i l i t i e s t h a t w o u l d b e g e n e r a t e d t o o n l y t h o s e t h a t w e r e l o g i c a l l y p l a u s i b l e . T h e s e r u l e s w e r e d e r i v e d f r o m h e u r i s t i c s s u p p l i e d b y h u m a n e x p e r t s o r f r o m a n a s s o c i a t e d p r o g r a m , m e t a - D E N D R A L , w h i c h a n a l y z e d t h e m a s s s p e c t r a o f c l a s s e s o f c o m p o u n d s a n d f o r m u l a t e d p r o b a b l e f r a g m e n t a t i o n r u l e s b a s e d u p o n t h e s p e c t r a . D u f f i e l d , S c h r o l l , a n d B u c k s 1 9 v a l i d a t e d D E N D R A L a n d d e t e r m i n e d t h a t g e n e r a l h e u r i s t i c s a l o n e w e r e n o t p o w e r f u l e n o u g h t o s o l v e t h i s c o m p l e x p r o b l e m a n d s p e c i f i c i n f o r m a t i o n f r o m a m a s s s p e c t r o m e t r y e x p e r t w a s n e e d e d . A l t h o u g h D E N D R A L o f t e n 3 2 p r o v i d e d l e s s i n f O r m a t i o n t h a n t h e e q u i v a l e n t h u m a n e x p e r t , l 3 ' 2 0 D E N D R A L w a s u s e f u l f o r s e a r c h i n g i n t e l l i g e n t l y t h r o u g h a l l p o s s i b i l i t i e s a n d l i m i t i n g t h e r e s u l t s t o m e a n i n g f u l s o l u t i o n s . S i n c e t h i s s e a r c h c a n b e a c c o m p l i s h e d m u c h f a s t e r o n a c o m p u t e r t h a n b y a h u m a n , a p o w e r f u l t o o l w a s p r o v i d e d f o r t h e h u m a n e x p e r t . T h e n e x t m a j o r d e v e l o p m e n t i n A l a n d e x p e r t s y s t e m s w a s t h e w o r k d o n e b y S l a g e a n d c o - w o r k e r s a t M I T d u r i n g t h e m i d 1 9 6 0 1 ? " 1 9 t o d e v e l o p a n e x p e r t s y s t e m , c a l l e d M A C S Y M A , t h a t c o u l d e v a l u a t e s y m b o l i c m a t h e m a t i c a l e x p r e s s i o n s . T h i s w o r k d e m o n s t r a t e d t h a t t h e p r o g r a m m u s t e n c o d e n o t o n l y t h e m a t h e m a t i c a l r u l e s , t h e m s e l v e s , b u t a l s o t h e m e t a - r u l e s t h a t d i c t a t e w h e n a n d h o w t h e s e m a t h e m a t i c a l r u l e s a r e a p p l i e d . M A C S Y M A , u s i n g s y m b o l i c f o r m , c o u l d s o l v e o v e r f i v e h u n d r e d d i s t i n c t m a t h e m a t i c a l o p e r a t i o n s s u c h a s i n t e g r a t i o n , d i f f e r e n t i a t i o n , a n d T a y l o r s e r i e s . S h o r t l i f f e a t S t a n f o r d i n t h e 1 9 7 0 s d e v e l o p e d t h e M Y C I N p r o g r a m . 5 ' 1 3 ' 1 9 M Y C l N w a s o n e o f t h e f i r s t r u l e - b a s e d s y s t e m s a n d i t s c r e a t i o n p r o v i d e d a d i r e c t i o n t o t h e f u r t h e r d e v e l o p m e n t o f e x p e r t s y s t e m s ; i n p a r t i c u l a r , t h e u s e o f e x p e r t s y s t e m s h e l l s t h a t a r e d e s c r i b e d b e l o w . M Y C l N p r o v i d e d r e c o m m e n d a t i o n s f o r a p p r o p r i a t e a n t i m i c r o b i a l r e g i m e n s f o r b a c t e r i a l i n f e c t i o n s . T h e p h y s i c i a n c o u l d i n p u t t h e s y m p t o m s , c a u s a l o r g a n i s m s , a n d t h e d r u g s e n s i t i v i t y o f t h e p a t i e n t i n t o t h e M Y C l N p r o g r a m . F o r v e r y i l l p a t i e n t s , a n t i b i o t i c s m u s t o f t e n b e p r e s c r i b e d b e f o r e t h e e x a c t o r g a n i s m r e s p o n s i b l e f o r t h e i n f e c t i o n i s i d e n t i f i e d . T h i s i n c o m p l e t e , o r ” f u z z y , ” d a t a i s a p r i m e c a n d i d a t e f o r a h e u r i s t i c a p p r o a c h . H o w e v e r , t h e s y s t e m n e e d s t o p r o v i d e s o m e t y p e o f r e l i a b i l i t y o r c o n f i d e n c e f o r t h e s o l u t i o n s s o t h a t t h e p h y s i c i a n c a n e v a l u a t e a n d c h o o s e t h e a p p r o p r i a t e c o u r s e o f a c t i o n . T h i s l e d t o t h e d e v e l o p m e n t o f c o n f i d e n c e f a c t o r s , w h i c h a r e d i s c u s s e d i n d e t a i l l a t e r i n t h i s c h a p t e r . M Y C I N w a s v a l i d a t e d i n b l i n d f i e l d t e s t s a n d s h o w n t o p r o v i d e c o r r e c t r e c o m m e n d a t i o n s , ” b u t s e v e r a l f a c t o r s l e d t o i t s " f a i l u r e . ” S h o r t l i f f e l o s t t h e k n o w l e d g e s o u r c e a f t e r t h e r e s i d e n t e x p e r t l e f t t h e p r o j e c t . I n a d d i t i o n , M Y C I N w a s i m p l e m e n t e d 3 3 o n a h e a v i l y u s e d m a i n f r a m e c o m p u t e r w h i c h p r e c l u d e d f a s t c o n s u l t a t i o n s . I f t h e c o n s u l t a t i o n c o u l d n o t b e a c c o m p l i s h e d i n a f a i r l y s h o r t s e s s i o n , u s e r s w e r e n o t a s i n c l i n e d t o u s e t h e s y s t e m . A s d i s c u s s e d l a t e r , t h e n e e d f o r f a s t e x p e r t s y s t e m s a n d f a s t c o m p u t e r s w a s a c o n c e r n i n t h e r e s e a r c h p r o j e c t d e s c r i b e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n . B e f o r e M Y C l N , e a c h e x p e r t s y s t e m h a d b e e n c r e a t e d p r i m a r i l y a s f u n d a m e n t a l r e s e a r c h . E a c h r e s e a r c h e r w o u l d c o m p l e t e l y w r i t e t h e c o d e f o r t h e r e s e a r c h p r o j e c t w i t h o u t u s i n g a n y s h a r e d c o d e f r o m o t h e r A I p r o j e c t s . T h e n e x t s t e p i n e x p e r t s y s t e m s w a s t o e x t e n d t h e e x i s t i n g e x p e r t s y s t e m f r a m e w o r k . I n 1 9 8 0 , v a n M e l l e 1 9 d e v e l o p e d E M Y C I N ( w e r e t h e " E " s t o o d f o r E m p t y ) w h i c h c o n s i s t e d o f t h e M Y C I N i n f e r e n c e m e c h a n i s m w i t h t h e k n o w l e d g e b a s e f o r t h e i n f e c t i o u s d i s e a s e s r e m o v e d . T h i s a p p r o a c h p r e s e r v e d t h e w o r k a l r e a d y a c c o m p l i s h e d a n d f a c i l i t a t e d t h e r a p i d d e v e l o p m e n t o f n e w e x p e r t s y s t e m s b y r e - u s i n g : - t h e c o m p o n e n t t h a t g e n e r a t e d t h e s o l u t i o n s b a s e d u p o n t h e i n p u t ( t h e i n f e r e n c e e n g i n e ) , a n d . t h e m a n - m a c h i n e i n t e r f a c e . E M Y C I N s t i l l m a i n t a i n e d i t s a b i l i t y t o i n t e r a c t w i t h t h e u s e r t o p r o v i d e a d v i c e a n d t o p r o v i d e a l s o a f e e d b a c k t o t h e u s e r t o i n d i c a t e h o w s u c h a d v i c e h a d b e e n g e n e r a t e d . A n e w d e v e l o p e r o n l y h a d t o i n s t a l l t h e a p p r o p r i a t e k n o w l e d g e b a s e f o r a n e w p r o b l e m i n t o t h e E M Y C I N f r a m e w o r k . T h i s a b i l i t y t o b u i l d o n t o e x i s t i n g s y s t e m s l e d t o t h e d e v e l o p m e n t o f " I n f e r e n c e E n g i n e s ” o r ” S h e l l s " , w h i c h l e d t o t h e i m p l e m e n t a t i o n o f m o d u l a r s y s t e m s . 2 0 ' 2 1 ' 2 2 E M Y C l N w a s u s e d t o d e v e l o p P U F F , 2 3 a n e x p e r t s y s t e m t h a t u s e d fi f t y - f i v e r u l e s t o d i a g n o s e p u l m o n a r y d y s f u n c t i o n s . T h i s a p p r o a c h w a s u s e d t o d e v e l o p o t h e r i n s t a n t e x p e r t s y s t e m s s u c h a s S A C O N , 2 4 a s t r u c t u r e a n a l y s i s p r o g r a m . T h e k n o w l e d g e o b t a i n e d d u r i n g t h e c o n s t r u c t i o n o f E M Y C I N w a s u s e d t o d e v e l o p G u i a l o n , 2 5 a n ‘ l . 1 . . I . 3 4 i n s t r u c t i o n a l e x p e r t s y s t e m t h a t t e a c h e s m e d i c a l s t u d e n t s a b o u t i n f e c t i o u s d i s e a s e s . G a i d o n d e m o n s t r a t e s t h e a p p l i c a b i l i t y o f e x p e r t s y s t e m s a s t u t o r i a l t o o l s . S e c t i o n 2 . 5 E x p e r t S y s t e m A p p l i c a t i o n s i n A n a l y t i c a l C h e m i s t r y S e c t i o n 2 . 5 . 1 N o n - H P L C E x p e r t S y s t e m s E x p e r t s y s t e m a p p l i c a t i o n s i n a n a l y t i c a l c h e m i s t r y c a n b e d i v i d e d i n t o t w o b r o a d t y p e s . 1 4 ' 2 6 T h e f i r s t t y p e i s s y s t e m s t o i n t e r p r e t c o m p l e x e x p e r i m e n t a l d a t a , s u c h a s t h o s e r e s u l t i n g f r o m n u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e ( N M R ) , i n f r a r e d s p e c t r o s c o p y ( I R ) , o r m a s s s p e c t r o m e t r y ( M S ) , o r c o m b i n a t i o n s o f t h e s e t e c h n i q u e s . T h e D E N D R A L p r o j e c t , a s m e n t i o n e d e a r l i e r , i s a n e x a m p l e o f t h i s a p p r o a c h . T h e s e c o n d t y p e i s s y s t e m s t h a t g u i d e t h e a n a l y t i c a l c h e m i s t i n m e t h o d s d e v e l o p m e n t . T h e e x a m p l e s o f e x p e r t s y s t e m s f o r H P L C a p p l i c a t i o n s t h a t a r e d e s c r i b e d l a t e r ( a n d t h e s y s t e m d e v e l o p e d f o r t h i s d i s s e r t a t i o n ) w i l l d e m o n s t r a t e t h i s s e c o n d a p p r o a c h . P r e s e n t e d b e l o w a r e s e v e r a l d i f f e r e n t e x p e r t s y s t e m s t h a t h a v e b e e n d e s c r i b e d i n t h e l i t e r a t u r e . T h e s e e x a m p l e s o f e x p e r t s y s t e m s a r e p r e s e n t e d t o d e m o n s t r a t e s e v e r a l o f t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f e x p e r t s y s t e m s . S e t t l e ” h a s d e v e l o p e d s e v e r a l e x p e r t s y s t e m s t o a i d g e n e r a l c h e m i s t r y s t u d e n t s i n a n a l y z i n g t h e i r s a m p l e s . T h e e x p e r t s y s t e m a c c e p t s p h y s i c a l a n d c h e m i c a l i n f o r m a t i o n s u c h a s m e l t i n g p o i n t s , l i t m u s t e s t s , a n d s o f o r t h , t o a s c e r t a i n t h e p r o b a b l e c o m p o n e n t s . T h e s e t y p e s o f e x p e r t s y s t e m a p p l i c a t i o n s d e m o n s t r a t e t h e t u t o r i a l p o t e n t i a l o f e x p e r t s y s t e m s . B e t t e r i d g e , e t a l . 2 8 d e v e l o p e d a s y s t e m t o a i d i n t h e c o r r e c t d e t e r m i n a t i o n o f s a m p l i n g p o i n t s f o r w a t e r c o n t e n t o f v a r i o u s p e t r o l e u m s t r e a m s o n a N o r t h S e a o i l p l a t f o r m . T h i s e x p e r t s y s t e m w a s i m p l e m e n t e d t o m a i n t a i n t h e i r c u r r e n t e x p e r t i s e i n s a m p l i n g a n d m o i s t u r e a n a l y s i s a n d t o t r a i n n e w e x p e r t s . T . 3 5 S e c t i o n 2 . 5 . 2 H P L C E x p e r t S y s t e m s E x p e r t s y s t e m s i n c h r o m a t o g r a p h y p r o v i d e t h e u s e r w i t h a s y s t e m a t i c t o o l f o r m e t h o d s d e v e l o p m e n t . R e s e a r c h e r s i n t h i s a r e a h a v e u s e d t w o d i s t i n c t a p p r o a c h e s t o c o n s t r u c t t o o l s t o a s s i s t i n m e t h o d s d e v e l o p m e n t . T h e f i r s t a p p r o a c h i s t o u s e a l i m i t e d a p p l i c a t i o n s u c h a s a p a r t i c u l a r c l a s s o f p h a r m a c e u t i c a l c o m p o u n d s o r a p a r t i c u l a r a s p e c t o f m e t h o d s d e v e l o p m e n t s u c h a s t h e d e t e c t i o n o f a c l a s s o f c o m p o u n d s . T h i s a p p r o a c h p r o v i d e s a n a r r o w s c o p e w i t h a h i g h l y s p e c i f i c k n o w l e d g e d o m a i n w h i c h e n s u r e s s u c c e s s f u l s o l u t i o n s i n r e a l - t i m e . F e l l , e t a l . 2 9 h a v e d e v e l o p e d a n e x p e r t s y s t e m t h a t o p t i m i z e s t h e m o b i l e p h a s e i n a n H P L C s y s t e m w i t h a p h o t o d i o d e a r r a y d e t e c t o r . T h e e x p e r t s y s t e m u s e s d a t a o b t a i n e d f r o m a n i n i t i a l g r a d i e n t e l u t i o n e x p e r i m e n t a n d t h e s p e c t r a l p r o f i l e s o f t h e c o m p o n e n t s o b t a i n e d f r o m t h e p h o t o d i o d e a r r a y d e t e c t o r t o g e n e r a t e a m o d e l o f t h e m o b i l e p h a s e - s o l u t e i n t e r a c t i o n s . T h e e x p e r t s y s t e m a n d a s i m p l e x i m p l e m e n t a t i o n 3 0 t o g e t h e r p r o p o s e s u b s e q u e n t e x p e r i m e n t s t o p e r f o r m f o r o p t i m i z a t i o n u s i n g t h e m o d e l . O t h e r s p e c i f i c a p p l i c a t i o n s o f e x p e r t s y s t e m s f o r H P L C i n c l u d e : 1 . s e l e c t i n g m e t h o d s f o r p h a r m a c e u t i c a l a n a l y s i s , 3 l ' 3 2 ' 3 3 a n d s t e r o i d s , 3 4 2 . t r o u b l e s h o o t i n g H P L C a s s a y m e t h o d s , 3 5 a n d 3 . d e v e l o p i n g i n t e l l i g e n t s p r e a d s h e e t s 3 6 t o e v a l u a t e t h e p r e c i s i o n o f H P L C m e t h o d s . T h e s e c o n d a p p r o a c h i s t o a s s i s t i n d e v e l o p i n g H P L C m e t h o d s f o r g e n e r i c s y s t e m s a n d a p p l i c a t i o n s . T h e s e e x p e r t s y s t e m s i n v o l v e m o r e o f a f i r s t - p r i n c i p l e a p p r o a c h a n d u s e g e n e r a l i z e d H P L C h e u r i s t i c s . A b b o t t a n d c o - w o r k e r s 3 7 ' 3 8 h a v e w r i t t e n a n e x p e r t s y s t e m t h a t d e v e l o p s m e t h o d s b a s e d o n t h e p h y s i c a l a n d c h e m i c a l n a t u r e s o f g e n e r a l c l a s s e s o f c o m p o u n d s ( E C A T — E x p e r t C h r o m a t o g r a p h i c A s s i s t a n c e T e a m ) . E C A T i s t h e p r o j e c t m o s t s i m i l a r t o t h e r e s e a r c h d e s c r i b e d i n t h i s t h e s i s . A s 3 6 s u c h , m o r e d e t a i l w i l l b e p r o v i d e d t o d r a w c o m p a r i s o n s a n d d i f f e r e n c e s b e t w e e n E C A T a n d t h i s w o r k . E C A T c o n s i s t s o f f o u r m o d u l e s . T h e C o l u m n a n d M o b i l e P h a s e M o d u l e d e t e r m i n e s t h e p a c k i n g m a t e r i a l , c o l u m n d i m e n s i o n s , m o b i l e p h a s e , a n d m o d i f i e r s . T h e M e t h o d O p t i m i z a t i o n M o d u l e o p t i m i z e s t h e m e t h o d b a s e d o n r e s o l u t i o n a n d t o t a l a n a l y s i s t i m e . T h e S a m p l e P r e p a r a t i o n M o d u l e d e t e r m i n e s i f s a m p l e p r e - t r e a t r n e n t i s n e e d e d t o e n h a n c e c e r t a i n a s p e c t s o f t h e m e t h o d ( s e p a r a t i o n , r e s o l u t i o n , d e l e c t a b i l i t y , e t c . ) . F i n a l l y t h e F a c t u a l I n f o r m a t i o n M o d u l e c o n t a i n s i n f o r m a t i o n o n s p e c i f i c c h e m i c a l s a n d c l a s s e s o f c h e m i c a l s . T h e f a c t s a r e s t o r e d i n p r e d i c a t e l o g i c f o r m a t , w h i c h i s a d i f f e r e n t f o r m a t t h a n p r o d u c t i o n r u l e s ( P R E D I C A T E S U B J E C T [ P R O P E R T Y - I ] [ P R O P E R T Y - 2 ] ) . A n e x a m p l e o f p r e d i c a t e l o g i c u s e d t o s t o r e a c i d d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s i n t h e f o r m p K a v a l u e s , a s u s e d i n t h e E C A T s y s t e m , i s : ( h a s - p K a b e n z o i c - a c i d 4 . 2 ) . A f t e r t h e p r o g r a m i s p r o v i d e d i n f o r m a t i o n a b o u t t h e a n a l y t e c l a s s , i t t h e n a p p l i e s f o r w a r d c h a i n i n g t o d e v e l o p a m o r e g e n e r a l i d e n t i f i c a t i o n o f t h e c l a s s a n d p r o p e r t i e s o f t h e a n a l y t e . I f t h e c o m p o u n d i s u n k n o w n t o t h e m o d u l e o r d a t a b a s e , f u n d a m e n t a l p r o p e r t i e s a r e d e t e r m i n e d b y a s k i n g t h e u s e r t o p r o v i d e t h e i n f o r m a t i o n d i r e c t l y , r a t h e r t h a n b y a t t e m p t i n g t o i n f e r t h e i n f o r m a t i o n f r o m s u p p o r t i n g d a t a . N o r m a l - p h a s e a n d h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n m o d e s a r e n e v e r s e l e c t e d b y t h e r u l e s w h i l e C 1 8 b o n d e d p h a s e i s c h o s e n f o r m o s t r e v e r s e d - p h a s e s e p a r a t i o n s . E C A T a l s o s u g g e s t s C 4 c o l u m n s f o r m e m b r a n e p r o t e i n s , c y a n o p h a s e f o r s m a l l m o l e c u l e s , a n d s t r o n g c a t i o n - a n d a n i o n e x c h a n g e p h a s e s f o r t h e s e p a r a t i o n o f i o n i c s p e c i e s . O n l y s e v e n r u l e s e f f e c t t h e s e l e c t i o n o f a s e p a r a t i o n m o d e w h i l e n i n e t y o t h e r r u l e s a r e u s e d t o d e t e r m i n e c o l u m n a n d m o b i l e p h a s e p a r a m e t e r s . A d d i t i v e s — s u c h a s b u f f e r s , s a l t s , a n d c o m p e t i n g a c i d s / b a s e s — a r e s p e c i f i e d a f t e r o t h e r p a r a m e t e r s h a v e b e e n d e t e r m i n e d . T h i s l i m i t e d n u m b e r o f r u l e s t o d e t e r m i n e t h e s e p a r a t i o n m o d e d e m o n s t r a t e s t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n E C A T a n d t h e e x p e r t s y s t e m d e s c r i b e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n . T h e f i r s t p r i n c i p l e a p p r o a c h u s e d i n t h e 3 7 e x p e r t s y s t e m d e s c r i b e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n a p p l i e s m o r e r u l e s t o e l i c i t c h e m i c a l a n d p h y s i c a l p r o p e r t i e s o f t h e a n a l y t e , a n d t h e r e c o m m e n d e d m e t h o d i s b a s e d u p o n t h e s e p r o p e r t i e s . S i n c e E C A T c l a s s i fi e s t h e a n a l y t e i n t o d i f f e r e n t c h e m i c a l f a m i l i e s a n d r e c o m m e n d s a m e t h o d t h a t i s a s s o c i a t e d w i t h t h e c h e m i c a l f a m i l y , E C A T r e q u i r e s l e s s r u l e s f o r t h i s p a r t o f t h e e x p e r t s y s t e m . P e i c h a n g a n d H o n g x i n 3 9 h a v e d e v e l o p e d a n e x p e r t s y s t e m t h a t a l s o i n c o r p o r a t e s a d v a n c e d a l g o r i t h m s t o s u g g e s t c o l u m n s , m o b i l e p h a s e s , a n d o t h e r f a c t o r s b a s e d u p o n u s e r - p r o v i d e d c o m p o u n d c l a s s e s . T h e i r s y s t e m a l s o g e n e r a t e s a r e p r e s e n t a t i v e c h r o m a t o g r a m o f t h e a n a l y t e c l a s s o r c o m p o u n d , w h i c h c a n a s s i s t t h e c h r o m a t o g r a p h e r t o d e c i d e i f t h e i n f e r e n c e m e c h a n i s m p r o p o s e d a v a l i d m e t h o d . P e i c h a n g a n d H o n g x i n ' s e x p e r t s y s t e m s t i l l r e q u i r e s i n f o r m a t i o n t o c a t e g o r i z e t h e a n a l y t e . T h e u s e r m a y p r o v i d e ( 1 ) t h e m o l e c u l a r s t r u c t u r e , ( 2 ) c o m m e r c i a l n a m e o f t h e s a m p l e , o r ( 3 ) t h e a n a l y t e c l a s s , s u c h a s p h e n y l t h i o h y d a n t o i n ( P T H ) - a m i n o a c i d . T h i s e x p e r t s y s t e m p r o p o s e s t h e m o l e c u l a r i n t e r a c t i o n s b a s e d o n t h e c l a s s i f i c a t i o n o f t h e a n a l y t e b u t d o e s n o t u s e a f i r s t - p r i n c i p l e a p p r o a c h . O t h e r a p p l i c a t i o n s o f e x p e r t s y s t e m s f o r H P L C i n c l u d e w o r k b y F o x a n d T ‘ i s c h l e r 4 0 o n m e t h o d s d e v e l o p m e n t . K a t e m a n , e t a l . 4 1 h a v e d e v e l o p e d a n e x p e r t s y s t e m t h a t h e l p s t o d e t e r m i n e t h e r u g g e d n e s s o f H P L C m e t h o d s b e f o r e e x p e n s i v e m e t h o d s v a l i d a t i o n o f c o s t l y c o m p o u n d s . P r e s e n t w o r k w i t h e x p e r t s y s t e m s i n c l u d e s d e v e l o p i n g r u l e - b u i l d i n g e x p e r t s y s t e m s 2 1 ' 4 2 ' 4 3 t h a t h e l p t o a l l e v i a t e t h e d i f f i c u l t i e s o f k n o w l e d g e a c q u i s i t i o n a n d t h e s u b s e q u e n t e n c o d i n g o f t h i s i n f o r m a t i o n i n t o c o m p u t e r f o r m a t . E x p e r t s y s t e m s a r e 4 4 . 4 5 . 4 6 a n d b e i n g d e v e l o p e d t h a t a r e a b l e t o a c c e s s c o n v e n t i o n a l c o m p u t e r l a n g u a g e s p r o g r a m s s u c h a s d a t a b a s e s a n d s p r e a d s h e e t s . 5 ' 3 9 ' 4 7 ' 4 8 T h e s y n e r g i s m b e t w e e n c o n v e n t i o n a l p r o g r a m s a n d e x p e r t s y s t e m s c a n p r o v i d e a c o m p l e t e s y s t e m w h e r e t h e t r a d i t i o n a l w e a k n e s s e s o f e x p e r t s y s t e m s ( e . g . , g r a p h i c s a n d n u m e r i c a l c o m p u t a t i o n s ) 3 8 a r e s u p p l e m e n t e d b y e x t e r n a l p r o g r a m s , s u c h a s d a t a b a s e s a n d a l g o r i t h m i c - b a s e d p r o g r a m s . D a t a b a s e s a n d s p r e a d s h e e t s p r o v i d e a m e a n s f o r c o n c i s e l y s t o r i n g f a c t s t h a t c a n b e u p d a t e d r a p i d l y a n d e a s i l y . S e c t i o n 2 . 6 I m p l e m e n t a t i o n o f E x p e r t S y s t e m s M a n y a t t e m p t s t o d e v e l o p e x p e r t s y s t e m s h a v e f a i l e d b e c a u s e o f i n a d e q u a t e c o n s i d e r a t i o n s o f t h e r e q u i r e m e n t s t o d e v e l o p a s u c c e s s f u l s y s t e m ] A n o v e r v i e w o f t h e s e s t e p s i s p r e s e n t e d b e l o w , 7 ' 8 a n d a r e d e s c r i b e d i n g r e a t e r d e t a i l i n C h a p t e r s 3 a n d 4 o f t h i s t h e s i s . I n p a r t i c u l a r , t h e s e t w o c h a p t e r s w i l l d i s c u s s t h e s t e p s t h a t w e r e t a k e n d u r i n g t h e d e v e l o p m e n t o f t h e e x p e r t s y s t e m d e s c r i b e d i n t h i s t h e s i s . S e c t i o n 2 . 6 . 1 G o a l D e t e r m i n a t i o n T h e f i r s t c o n s i d e r a t i o n i s t o d e t e r m i n e t h e a p p r o p r i a t e n e s s o f t h e p r o b l e m t o a n e x p e r t s y s t e m . I f i t i s n o t a m e n a b l e t o e x p e r t s y s t e m s , t h e p r o j e c t w i l l f a i l . T h e p r o j e c t s h o u l d n o t b e s o l v a b l e b y a n a l g o r i t h m i c a p p r o a c h s i n c e t h i s t y p e o f p r o b l e m i s m o s t e f f i c i e n t l y s o l v e d b y t r a d i t i o n a l , n u m e r i c a l p r o g r a m s . R a t h e r , t h e p r o b l e m s h o u l d b e h e u r i s t i c o r s y m b o l i c i n n a t u r e . T h e p r o b l e m m u s t b e r e l e v a n t s o t h a t i n t e r e s t a n d s u p p o r t c a n b e g e n e r a t e d f o r t h e p r o j e c t . O n c e a r e l e v a n t p r o b l e m h a s b e e n d e t e r m i n e d , a n e x p e r t ( s ) m u s t b e a v a i l a b l e w h o h a s s u f f i c i e n t k n o w l e d g e t o a i d i n s o l v i n g t h a t p r o b l e m . T h e i n f o r m a t i o n n e e d e d t o s o l v e t h e p r o b l e m m u s t b e f a i r l y l i m i t e d i n s c o p e . A h e u r i s t i c t h a t c a n b e s t a t e d 1 8 : 4 9 ’ 5 1 I F t h e p r o b l e m c a n b e s o l v e d b y a n a p p r o x i m a t e h a l f - h o u r t e l e p h o n e c o n v e r s a t i o n w i t h a n e x p e r t , T H E N a n e x p e r t s y s t e m a p p r o a c h i s p o s s i b l e . 3 9 A n a p p r o p r i a t e e x p e r t s y s t e m i s o n e t h a t r e q u i r e s a d e s c r i p t i v e a n a l y s i s o f t h e p r o b l e m w i t h o u t o n - s i t e a n a l y s i s ( e . g . , s o l v a b l e b y t e l e p h o n e ) . A h e u r i s t i c s o l u t i o n m u s t b e s t a t e d b r i e fl y a n d r e l a t i v e l y s i m p l y s o t h a t t h e s o l u t i o n c a n b e t r a n s p o s e d i n t o c o m p u t e r f o r m a t . A v a l i d c o n c l u s i o n c a n b e r e a c h e d i f e n o u g h r u l e s a r e a p p l i e d t o e l i m i n a t e t h e i n v a l i d c o n c l u s i o n s . T h e e l i m i n a t i o n o f i n v a l i d c o n c l u s i o n s l i m i t s t h e s c o p e o f t h e p r o b l e m s o t h a t a k n o w l e d g e b a s e c a n b e g e n e r a t e d f r o m w h i c h t o i n f e r a n s w e r s . A s t h e n u m b e r o f p o s s i b l e s o l u t i o n s i n c r e a s e s , t h e i n f e r e n c e e n g i n e c a n b e c o m e s l u g g i s h a n d r e s u l t s w i t h l o w c o n f i d e n c e l i m i t s c a n b e r e t u r n e d m ' s o ' 5 1 A f t e r a n a p p r o p r i a t e a p p l i c a t i o n i s c h o s e n b u t b e f o r e t h e e x p e r t s y s t e m i s e n c o d e d , t h e g o a l s a n d t h e e n d - u s e r o f t h e e x p e r t s y s t e m m u s t b e c l e a r l y i d e n t i f i e d . A n e x p e r t s y s t e m w r i t t e n f o r t h e u s e o f t e c h n i c i a n s w i l l r e q u i r e a d i f f e r e n t a m o u n t o f a p r i o r i k n o w l e d g e t h a n a s i m i l a r e x p e r t s y s t e m w r i t t e n a s a t u t o r i a l t o o l f o r a s t u d e n t . I f a n e x p e r t s y s t e m i s e n c o d e d w i t h o u t c o n s i d e r a t i o n o f t h e e n d - u s e r , t h e s y s t e m m i g h t b e ” . . . s o f o r e i g n t h a t n o e n d u s e r w i l l u n d e r s t a n d o r b e a b l e t o u s e i t . " 7 I d e n t i f i c a t i o n o f t h e e n d u s e r p r i o r t o e n c o d i n g t h e e x p e r t s y s t e m m a y a l s o d i c t a t e t h e t y p e o f u s e r - i n t e r f a c e t o u s e ; t h a t i s , w h e t h e r t h e e x p e r t s y s t e m u s e s a g r a p h i c a l i n t e r f a c e t o r e p r e s e n t i n s t r u m e n t a t i o n o r a d a t a i n p u t f o r m a t t h a t m i m i c s f o r m s u s e d b y a c e r t a i n p r o f e s s i o n a l f i e l d ( e . g . , m e d i c a l c h a r t s ) . S e c t i o n 2 . 6 . 2 K n o w l e d g e A c q u i s i t i o n S e c t i o n 2 . 6 . 2 . ] M e t h o d s f o r K n o w l e d g e A c q u i s i t i o n T h e r e a r e s e v e r a l d i f f e r e n t v i e w p o i n t s o n t h e b e s t a p p r o a c h t o u s e t o o b t a i n t h e i n f o r m a t i o n . 8 S o m e a p p r o a c h e s u s e a s i n g l e h u m a n e x p e r t t o m a i n t a i n c o n s i s t e n c y i n t h e k n o w l e d g e b a s e w h i l e o t h e r s u s e m u l t i p l e e x p e r t s t o m i n i m i z e p e r s o n a l b i a s e s a n d t o o b t a i n a b r o a d e r r a n g e o f i n f o r m a t i o n . H o w e v e r , t h e k n o w l e d g e e n g i n e e r m a y o f t e n h a v e t o a r b i t r a t e b e t w e e n t w o , p e r h a p s c o n f l i c t i n g , p i e c e s o f h e u r i s t i c s t h a t m a y c o m e 4 0 f r o m t h e e x p e r t s . T h e k n o w l e d g e e n g i n e e r m a y a l s o u s e a d d i t i o n a l s o u r c e s o f i n f o r m a t i o n s u c h a s r e f e r e n c e s , b o o k s , a n d s o f o r t h ; a l t h o u g h , t h e k n o w l e d g e e n g i n e e r m u s t b e f a m i l i a r w i t h t h e a r e a o f e x p e r t i s e s o t h a t h e / s h e i s a b l e t o d e c i p h e r a n d a p p l y t h e i n f o r m a t i o n o b t a i n e d f r o m a l t e r n a t i v e s o u r c e s . M o s t k n o w l e d g e i s g a i n e d b y c o n s u l t a t i o n d u r i n g k n o w l e d g e a c q u i s i t i o n m e e t i n g s . T h e s e m e e t i n g s a r e n o r m a l l y a t t e n d e d b y t h e e x p e r t , t h e k n o w l e d g e e n g i n e e r , a " c h a m p i o n " , a s w e l l a s s e v e r a l e n d - u s e r s . 7 I t i s t y p i c a l t o i n c l u d e a t r a i n e e k n o w l e d g e e n g i n e e r a s a m e m b e r o f t h e k n o w l e d g e a c q u i s i t i o n t e a m i n o r d e r t o i n c r e a s e t h e n u m b e r o f k n o w l e d g e e n g i n e e r s . S i n c e o n l y a s e l e c t e d f e w u n i v e r s i t i e s , s u c h a s t h e U n i v e r s i t y o f M i c h i g a n a n d t h e U n i v e r s i t y o f S w e d e n , t e a c h t h e t h e o r y b e h i n d k n o w l e d g e - b a s e d s y s t e m s , a n d n e w k n o w l e d g e e n g i n e e r s m u s t b e d e v e l o p e d u s i n g a n a p p r e n t i c e s h i p a p p r o a c h . 7 S e c t i o n 2 . 6 . 2 . 2 P e r s o n n e l a n d R o l e s A s a l l u d e d t o i n C h a p t e r 1 , t h e k n o w l e d g e e n g i n e e r i s t h e b r i d g e b e t w e e n t h e e x p e r t a n d t h e e n c o d i n g o f t h e i n f o r m a t i o n . I n i t i a l l y , k n o w l e d g e e n g i n e e r s w e r e u s u a l l y c o m p u t e r s c i e n t i s t s p r o f i c i e n t i n a n A I l a n g u a g e s u c h a s L I S P s i n c e e x p e r t s y s t e m t o o l s w e r e v e r y r u d i m e n t a r y a n d r e q u i r e d s u c h a p r o g r a m m e r . W i t h t h e a d v a n c e o f e x p e r t s y s t e m t o o l s t h a t f a c i l i t a t e e x p e r t s y s t e m d e v e l o p m e n t , i t i s o f t e n b e t t e r t o h a v e t h e k n o w l e d g e e n g i n e e r , w h o m a y n o w b e t h e e x p e r t , w h o i s f a m i l i a r w i t h t h e a r e a o f d e v e l o p m e n t . T h i s f a c i l i t a t e s t h e d e v e l o p m e n t o f t h e e x p e r t s y s t e m s i n c e t h e e n g i n e e r i s n o w f a m i l i a r w i t h t h e l a n g u a g e a n d s c i e n c e o f t h e i n t e n d e d a p p l i c a t i o n . T h e c h a m p i o n ' s r o l e i s t o b e n o t o n l y t h e s u p p o r t e r o f t h e p r o j e c t b u t t o p r o v i d e a b r o a d b a c k g r o u n d i n s e v e r a l d i s c i p l i n e s t o f a c i l i t a t e t h e i n c o r p o r a t i o n o f i n f o r m a t i o n i n t o t h e e x p e r t s y s t e m . T h e p r e s e n c e o f o n e o r t w o e n d - u s e r s i n s u r e s t h a t t h e d e v e l o p e d s y s t e m i s u s a b l e . F i n a l l y , t h e t r a i n e e k n o w l e d g e e n g i n e e r w i l l b e t h e p e r s o n 4 1 w h o c o m p l e t e s t h e p r o j e c t a n d m a i n t a i n s i t a f t e r h e l p i n g t o d e v e l o p t h e e x p e r t s y s t e m p r o t o t y p e ] S e c t i o n 2 . 6 . 3 E n c o d i n g S e c t i o n 2 . 6 . 3 . ] A I a n d E x p e r t S y s t e m L a n g u a g e s A f t e r t h e i n i t i a l k n o w l e d g e i s o b t a i n e d , t h e k n o w l e d g e e n g i n e e r m u s t c h o o s e t h e a p p r o p r i a t e m e t h o d t o i m p l e m e n t t h e e x p e r t s y s t e m . E x p e r t s y s t e m s m a y b e i m p l e m e n t e d b y u s i n g a n A r t i f i c i a l I n t e l l i g e n c e l a n g u a g e ( s u c h a s P r o l o g o r L I S P ) o r b y e m p l o y i n g a c o m m e r c i a l s h e l l t o c r e a t e t h e e x p e r t s y s t e m . D e t a i l e d c o m p a r i s o n s o f s h e l l s v e r s u s A I l a n g u a g e s h a v e b e e n m a d e e l s e w h e r e s ' 5 2 I n g e n e r a l , s h e l l s p r o v i d e a c o n s i s t e n t m e t h o d t o d e v e l o p f a s t e x p e r t s y s t e m s ; h o w e v e r , s h e l l s a r e n o t a s fl e x i b l e o r a s o p t i m i z a b l e a s a n a p p l i c a t i o n - s p e c i f i c ( c u s t o m i z e d ) s h e l l s d e v e l o p e d f r o m a n A I l a n g u a g e . T h e n e x t t w o s t e p s a r e t o c h o o s e a n a p p r o p r i a t e s h e l l ( i f t h i s i s t h e d i r e c t i o n t a k e n ) a n d t o f o r m a l i z e t h e k n o w l e d g e i n t o t h e a p p r o p r i a t e f o r m a t . D i f f e r e n t c o m m e r c i a l s h e l l s w i l l a l l o w o n e t o e n c o d e t h e i n f o r m a t i o n i n d i f f e r e n t f o r m a t s . T h e r e a r e t h r e e m a j o r w a y s t o e n c o d e t h e i n f o r m a t i o n . T h e f i r s t m e t h o d i s t o u s e s o m e t y p e o f r u l e f o r m a t s u c h a s p r o d u c t i o n r u l e s o r p r e d i c a t e l o g i c . T h e s e c o n d a n d t h i r d t y p e s o f k n o w l e d g e r e p r e s e n t a t i o n a r e F r a m e s A n d O b j e c t s . F r a m e s a n d O b j e c t s a l l o w r e p r e s e n t a t i o n o f i n f o r m a t i o n t h a t i n c o r p o r a t e s c h a r a c t e r i s t i c s , o r a t t r i b u t e s , o f t h a t o b j e c t . E a c h f r a m e o r o b j e c t e x h i b i t i n h e r i t a n c e w i t h h i g h e r / l o w e r h i e r a r c h i e s o f f r a m e s / o b j e c t s . F u r t h e r d i s c u s s i o n o f f r a m e s a n d o b j e c t s i s b e y o n d t h e s c o p e o f t h i s d i s s e r t a t i o n . ( F o r f u r t h e r i n f o r m a t i o n o n t h e s e t y p e s o f k n o w l e d g e r e p r e s e n t a t i o n s , s e e r e f e r e n c e 5 , p a g e s 4 8 - 5 7 , 1 4 0 - 1 4 1 , a n d a l l o f C h a p t e r 5 . ) 4 2 S e c t i o n 2 . 6 . 3 . 2 P r o t o t y p i n g o f t h e E x p e r t S y s t e m T h e f i n a l s t e p s i n t h e d e v e l o p m e n t o f a n e x p e r t s y s t e m i n v o l v e t h e c r e a t i o n a n d v a l i d a t i o n o f a p r o t o t y p e b a s e d u p o n t h e i n i t i a l d a t a . A f t e r t h e p r o t o t y p e i s g e n e r a t e d , t h e s y s t e m i s m o d i f i e d u n t i l a r o b u s t s y s t e m i s g e n e r a t e d . A f t e r t h i s s t a g e t h e e x p e r t s y s t e m c a n n o w b e u s e d a n d t h e o n l y s t e p s l e f t a r e t h e m a i n t e n a n c e s t a g e s . D u r i n g t h e u s a g e o f t h e e x p e r t s y s t e m , n e w i n f o r m a t i o n m i g h t b e i n c o r p o r a t e d i n t o t h e s y s t e m . S i n c e t h e k n o w l e d g e b a s e i s m o d u l a r i n n a t u r e ( i . e . , s e p a r a t e f r o m t h e i n f e r e n c e e n g i n e a n d u s e r i n t e r f a c e ) , i t i s f a i r l y s i m p l e t o i n c o r p o r a t e n e w i n f o r m a t i o n i n t o t h e s y s t e m . I f e x t e r n a l k n o w l e d g e b a s e s h a v e b e e n c r e a t e d ( e . g . , d a t a b a s e s , s p r e a d s h e e t s , a n d t e x t f i l e s ) , t h i s i n f o r m a t i o n c a n o f t e n b e i n c o r p o r a t e d t h r o u g h a t h i r d p a r t y p r o g r a m ( a d a t a b a s e p r o g r a m , f o r e x a m p l e ) w i t h o u t h a v i n g t o c h a n g e t h e e x i s t i n g r u l e s / f r a m e s o f t h e e x p e r t s y s t e m . S e c t i o n 2 . 7 C o n f i d e n c e F a c t o r s E x p e r t s y s t e m s a r e a b l e t o d e a l w i t h f a c t s t h a t h a v e v a r y i n g d e g r e e s o f c o n f i d e n c e o r v a l i d i t y t h a t m a y b e d e p e n d e n t u p o n a p a r t i c u l a r t i m e o f u s e o r o n t h e b e l i e f s y s t e m o f t h e d i f f e r e n t u s e r s . A s s u c h , i n c l u s i o n o f s o m e n u m e r i c a l v a l u e m u s t b e c o n s i d e r e d t h a t r e fl e c t s t h e c e r t a i n t y o r f a i t h i n t h e s e f a c t s a n d t h e s u b s e q u e n t c e r t a i n t y o f t h e c o n c l u s i o n s b a s e d u p o n t h e s e f a c t s . S e c t i o n 2 . 7 . I C o m p a r i s o n o f P r o b a b i l i t y a n d P o s s i b i l i t y P r o b a b i l i t y i s b a s e d u p o n t h e r e l a t i v e f r e q u e n c y d i s t r i b u t i o n o f s o m e e v e n t ( s ) o v e r a l o n g e n o u g h p e r i o d t o o b t a i n a r e p r e s e n t a t i v e d i s t r i b u t i o n . A f o r m a l d e f i n i t i o n o f p r o b a b i l i t y i s : T h e c h a n c e t h a t a p a r t i c u l a r e v e n t w i l l o c c u r i s e q u a l t o t h e n u m b e r o f w a y s t h e e v e n t c a n o c c u r d i v i d e d b y t h e n u m b e r o f w a y s a l l p o s s i b l e e v e n t s ( i n c l u d i n g t h e p a r t i c u l a r e v e n t o f i n t e r e s t ) c a n o c c u r . 4 3 T h i s c l a s s i c a l , n u m e r i c a l a p p r o a c h t o d e t e r m i n e t h e c e r t a i n t y o f a n e v e n t i s v e r y a p p r o p r i a t e f o r s y s t e m s w h e r e t h e c a u s a l i t y , o r m o d e l , i s w e l l u n d e r s t o o d ( e . g . , g a m b l i n g ) o r s y s t e m s t h a t h a v e s u f f i c i e n t s t a t i s t i c a l r e c o r d s t h a t e x i s t s u c h t h a t t h e c e r t a i n t y o f a n e v e n t a p p r o a c h e s t h e n u m e r i c a l p r o b a b i l i t y o f s a i d e v e n t . I f t h e s e c r i t e r i a a r e m e t , p r o b a b i l i t y t h e o r y i s a p o w e r f u l t o o l t o a s s i g n a n u m e r i c a l v a l u e t o t h e v a l i d i t y o f t h e f a c t s i n a n e x p e r t s y s t e r r r . E x p e r t s y s t e m s a r e u s u a l l y d e v e l o p e d i n a r e a s t h a t a r e n o t a m e n a b l e t o n u m e r i c a l , a l g o r i t h m i c s o l u t i o n s . O f t e n t h e s e a p p l i c a t i o n s i n v o l v e h e u r i s t i c s t h a t d o n o t h a v e e x p l i c i t c a u s a l i t i e s , a n d / o r a p p l i c a t i o n s t h a t h a v e n o n - f o r m a l i z e d e m p i r i c i s m s . O t h e r a p p l i c a t i o n s m a y l a c k s u f f i c i e n t r e c o r d s s u c h t h a t a s t a t i s t i c a l t r e a t m e n t o f t h e d a t a i s n o t p o s s i b l e a n d t h e r e f o r e p r e c l u d e s u s i n g p r o b a b i l i t y t h e o r y . T h e r e a r e a l s o t w o o t h e r c o n c e r n s t h a t h a v e t e m p e r e d t h e u s e o f p r o b a b i l i t y t h e o r y i n e x p e r t s y s t e m s . T h e f i r s t i s t h a t p r o b a b i l i t y t h e o r y d o e s n o t i n c l u d e t h e p r i o r b e l i e f s y s t e m s o f t h e u s e r . T h e s e c o n d p r o b l e m i s t h a t t h e c e r t a i n t y o f a n e v e n t d e c r e a s e s w i t h s u p p o r t i n g e v i d e n c e . F o r e x a m p l e , : I F C O N D I T I O N 1 A N D C O N D I T I O N 2 T H E N C O N C L U S I O N I f C O N D I T I O N 1 a n d C O N D I T I O N 2 h a v e a p r o b a b i l i t y o f b e i n g t r u e o f 0 . 8 0 ( t h a t i s , P ( E v e n t ) = - 0 . 8 0 ) , C O N C L U S I O N h a s a c e r t a i n t y o f 0 . 6 4 . T h e A N D f u n c t i o n i n d i c a t e s t h a t t h e t w o p r o b a b i l i t i e s s h o u l d b e m u l t i p l i e d t o g e t h e r : H C O N C L U S I O N F H C O N D I T I O N 1 ) * P ( C O N D I T I O N 2 ) . I f t h i s a n a l o g y w e r e e x t e n d e d t o a r u l e w i t h f i v e c o n d i t i o n s i n t h e p r e m i s e , e a c h c o n d i t i o n h a v i n g a P ( E v e n t ) = 0 . 8 0 , t h e n t h e c o n c l u s i o n w o u l d h a v e a c e r t a i n t y o f 0 . 3 3 ( P ( C o n c l u s i o n ) a ( 0 . 8 0 ) 5 ) w h i c h m e a n s t h a t t h e c o n c l u s i o n i s f a l s e . T h i s p r o b l e m a l s o o c c u r s w i t h O R s i t u a t i o n s ( e . g . , I F A O R B T H E N 4 4 C ) . P r o b a b i l i t y t h e o r y d o e s n o t a l l o w t h e c e r t a i n t y o f C t o i n c r e a s e i f b o t h A a n d B a r e t r u e . S e c t i o n 2 . 7 . 2 F u z z y L o g i c T h i s p r o b l e m h a s l e d t o t h e d e v e l o p m e n t o f B a y e s i a n a n d o t h e r a l t e r n a t i v e a p p r o a c h e s t o d e a l w i t h c e r t a i n t y . 5 ' 7 T h e B a y e s i a n d e f i n i t i o n o f p r o b a b i l i t y s t a t e s : A p r o b a b i l i t y i s a d e g r e e o f b e l i e f h e l d b y a p e r s o n a b o u t s o m e h y p o t h e s i s , e v e n t , o r u n c e r t a i n q u a n t i t y . T h i s d e f i n i t i o n a l l o w s s u b j e c t i v e e v a l u a t i o n o f a u s e r ' s b e l i e f i n t h e t r u t h o f a p a r t i c u l a r r e s p o n s e a n d a l l o w s t h e u s e r t o i n c o r p o r a t e t h e p r i o r s u c c e s s o f a s o l u t i o n a l o n g w i t h t h e c u r r e n t e v i d e n c e t o d e d u c e t h e r e s u l t ' 5 T h e e x t e n s i o n o f B a y e s i a n l o g i c h a s l e d t o t h e d e v e l o p m e n t o f f u z z y l o g i c . F u z z y l o g i c i s b a s e d o n s e t t h e o r y ; t h a t i s , t h e c e r t a i n t y o f a p a r t i c u l a r e v e n t i s d e f i n e d a s a m e m b e r s h i p f u n c t i o n o f a c e r t a i n s e t o f c i r c u m s t a n c e s . F u z z y l o g i c a l l o w s v a g u e t e r m s t o b e u s e d t o d e s c r i b e d s u c h a n e v e n t . A n e x a m p l e o f f u z z y l o g i c w o u l d b e t h e s t a t e m e n t , ” I a m 8 0 % c e r t a i n t h a t a C y a n o c o l u m n i s t h e a p p r o p r i a t e c o l u m n . ” P r o b a b i l i t y t h e o r y w o u l d s t a t e t h a t t h e r e i s a n 8 0 % c h a n c e t h a t a c y a n o c o l u m n i s t h e c o r r e c t c o l u m n a n d t h e u n c e r t a i n t y i s b a s e d u p o n t h e e r r o r o f t h e d a t a u s e d t o d e r i v e t h a t c o n c l u s i o n . I n f u z z y l o g i c , t h i s w o u l d t r a n s l a t e i n t o c y a n o c o l u m n s h a v i n g a d e g r e e o f m e m b e r s h i p i n t h e ” C O R R E C T C O L U M N ” s e t o f 0 . 8 0 . T h e u n c e r t a i n t y i s a n i n h e r e n t c o m p o n e n t o f t h e c h o i c e o f a c o l u m n a n d d o e s n o t r e fl e c t t h e u n c e r t a i n t y o f t h e d a t a u s e d t o d e t e r m i n e t h e c o r r e c t c o l u m n . 5 T h e s u m o f a l l t h e c e r t a i n t i e s i n f u z z y l o g i c d o e s n o t h a v e t o a d d u p t o 1 . 0 0 a s i t m u s t i n p r o b a b i l i t y t h e o r y . T h i s a l l o w s a s u b j e c t i v e e v a l u a t i o n o f f i t n e s s f o r e v e r y e v e n t r e g a r d l e s s o f o t h e r e v e n t s . F u z z y l o g i c c a n b e s t a t e d i n m a t h e m a t i c a l f o r m a s f o l l o w s : 5 ' 5 3 1 . T h e i n t e r s e c t i o n o f e v e n t s A a n d B y i e l d a c o n c l u s i o n w i t h c e r t a i n t y o f 4 5 P ( C o n c l u s i o n ) 3 M I N [ P ( A ) , P ( B ) ] E q u a t i o n 2 . 1 T h u s , i n a r u l e w h i c h s t a t e s : I F A A N D 8 T H E N C , t h e c o n f i d e n c e i n C w o u l d b e l i m i t e d b y t h e m i n i m u m v a l u e o f t h e c e r t a i n t y i n p r e m i s e A a n d B . 2 . T h e u n i o n o f e v e n t s A a n d B y i e l d s a c o n c l u s i o n w i t h c e r t a i n t y o f P ( C o n c l u s i o n ) - M A X [ P ( A ) , P ( B ) ] E q u a t i o n 2 . 2 I n l o g i c a l s y n t a x , I F A O R 8 T H E N C , t h e c o n c l u s i o n , C , w o u l d h a v e a c e r t a i n t y e q u a l t o t h e m a x i m u m c e r t a i n t y o f A o r B . S i n c e t h e c e r t a i n t y o f C d e p e n d s o n l y o n e i t h e r A o r B b e i n g t r u e , t h e p r e m i s e w i t h t h e h i g h e s t d e g r e e o f s u p p o r t f o r t h e c o n c l u s i o n d e t e r m i n e s t h e c e r t a i n t y o f t h e c o n c l u s i o n . S e c t i o n 2 . 7 . 3 C e r t a i n t y T h e o r y T h e s e t w o r u l e s o f f u z z y l o g i c i n s u r e t h a t a c o n c l u s i o n ' s c e r t a i n t y d o e s n o t a p p r o a c h z e r o a s t h e n u m b e r o f p r e m i s e s i n c r e a s e s . H o w e v e r , f u z z y l o g i c d o e s n o t p r o v i d e f o r a n i n c r e a s e i n c e r t a i n t y i n c o n c l u s i o n C i f b o t h A a n d B a r e t r u e f o r t h e u n i o n o f A a n d B . T h e O R s t a t e m e n t i s m a t h e m a t i c a l l y h a n d l e d b y E q u a t i o n 2 . 2 w h i c h l i m i t s t h e c e r t a i n t y o f t h e c o n c l u s i o n t o t h e m o s t r e l i a b l e p r e m i s e . T h e s o l u t i o n t o t h i s p r o b l e m i s a n e x t e n s i o n o f t h e l o g i c t o f o r m a s u b - d i v i s i o n o f f u z z y l o g i c , c a l l e d c e r t a i n t y t h e o r y . T h e m a t h e m a t i c s o f c e r t a i n t y t h e o r y a r e p r e s e n t e d b e l o w . C e r t a i n t y t h e o r y a l s o i n c o r p o r a t e s E q u a t i o n s 2 . 1 a n d 2 . 2 . ‘ 1 . F o r a r u l e i n t h e f o r m a t w h e r e C N F a a n d C N F c s i g n i f y t h e c o n f i d e n c e o f t h e p r e m i s e a n d r u l e , r e s p e c t i v e l y : I F A C N F a T H E N C C N F c , t h e c e r t a i n t y o f t h e c o n c l u s i o n i s t h e p r o d u c t o f t h e c e r t a i n t i e s o f t h e p r e m i s e a n d t h e r u l e : C N F ( C o n c l u s i o n ) = C N F c * C N F a E q u a t i o n 2 . 3 2 . S i m p l e l o g i c a l A N D s t a t e m e n t s a r e u s e d a s i n E q u a t i o n 2 . 1 , s o t h a t t h e c o n f i d e n c e f a c t o r i s t h e m i n i m u m c o n f i d e n c e f a c t o r o f a l l p r e m i s e s . 3 . F o r l o g i c c o m b i n a t i o n s i n v o l v i n g t h e O R f u n c t i o n : C N F T M , = C N F 1 + C N F Z - C N F l * C N F 2 E q u a t i o n 2 . 4 4 6 w h e r e C N F 1 a n d C N F a r e t h e i n d i v i d u a l c o m p o n e n t s o f t h e h y p o t h e s i s a n d a r e c a l c u l a t e d v i a E q u a t i o n 2 . 3 a b o v e . F o r e x a m p l e , I F A C N F a O R B C N F b T H E N C C N F c C N F ] a n d C N F 2 w o u l d b e t h e c e r t a i n t y o f t h e c o n c l u s i o n i s t h e r u l e w a s w r i t t e n i n t o t w o s e p a r a t e r u l e s w i t h s e p a r a t e p r e m i s e s A a n d B : I F A C N F a I F B C N F b T H E N C C N F c T H E N C C N F c T h e v a l u e s f o r C N F a n d C N F w o u l d b e d e t e r m i n e d f r o m P ( C N F l ) - ( C N F a ) * ( C N F c ) a n d P ( C N F Z ) - ( C N F b ) * ( C N F c ) . T h e s u b t r a c t i o n t e r m a c c o u n t s f o r t h e f a c t t h a t t h e c u r l a n d c m : 2 a r e b e i n g a d d e d . 5 T h e t o t a l c o n f i d e n c e f a c t o r c a n b e l a r g e r t h a n t h e i n d i v i d u a l c o n f i d e n c e f a c t o r s t o a l l o w f o r a n i n c r e a s e i n c e r t a i n t y w h e n b o t h p a r t s o f t h e s u p p o r t i n g e v i d e n c e a r e t r u e . F o r c o m p l e x l o g i c c o m b i n a t i o n s i n v o l v i n g A N D a n d O R , t h e r u l e i s r e - w r i t t e n i n t o t w o , o r m o r e , p a r t s i n v o l v i n g t h e A N D . T h e C N F s o f t h e t w o r u l e s a r e c a l c u l a t e d u s i n g E q u a t i o n s 2 . 2 a n d 2 . 1 a b o v e . T h e n t h e t w o C N F s a r e c o m b i n e d u s i n g t h e O R f u n c t i o n o f E q u a t i o n 2 . 4 a b o v e . A c a l c u l a t i o n d e m o n s t r a t i n g t h i s d e f i n i t i o n i s g i v e n b e l o w f o r a r u l e t h a t c o n t a i n s t w o c o n c l u s i o n s : I F A C N F 8 0 A N D B C N F 7 0 O R C C N F 9 0 T H E N D C N F 9 0 E C N F 7 0 ; F i r s t , t h i s r u l e h a s t o b e r e - w r i t t e n i n t o t w o c o m p o n e n t s s e p a r a t e d a t t h e O R f u n c t i o n : P a r t I P a r t 2 I F A C N F 8 0 a n d I F A C N F 8 0 a n d B C N F 7 0 C C N F 9 0 T h e n D C N F 9 0 T h e n D C N F 9 0 E C N F 7 0 ; E C N F 7 0 ; N e x t , t h e a p p r o p r i a t e e q u a t i o n s a r e a p p l i e d P a r t 1 a n d 2 ( a n d c o n v e r t i n g t h e p e r c e n t c o n f i d e n c e s i n t o d e c i m a l e q u i v a l e n t s ) : 4 7 P a r t I P a r t 2 P ( D ) = M I N ( 0 . 8 0 , 0 . 7 0 ) * 0 . 9 0 P ( D ) = M I N ( 0 . 8 0 , 0 . 9 0 ) * 0 . 9 0 P ( E ) = M I N ( 0 . 8 0 , 0 . 7 0 ) * 0 . 7 0 P ( E ) = M I N ( 0 . 8 0 , 0 . 9 0 ) * 0 . 7 0 P ( D ) = 0 . 7 0 * 0 . 9 0 = 0 . 6 3 P ( D ) = 0 . 8 0 * 0 . 9 0 = 0 . 7 2 P ( E ) = 0 . 7 0 * 0 . 7 0 = 0 . 4 9 P ( E ) = 0 . 8 0 * 0 . 7 0 = 0 . 5 6 T h e n e x t s t e p i s t o r e c o m b i n e t h e t w o p a r t s a b o v e i n t o t h e o r i g i n a l O R f o r m a n d t h e n c a l c u l a t e t h e f i n a l c e r t a i n t y u s i n g E q u a t i o n 2 . 4 . R u l e C a l c u l a t i o n I F P a r t l C N F 0 . 6 3 O R P ( D ) = 0 . 6 3 + 0 . 7 2 - ( 0 . 6 3 * 0 . 7 2 ) P a r t 2 C N F 0 . 7 2 P ( D ) = 0 . 8 9 6 = 8 9 . 6 T H E N D I F P a r t l C N F 0 . 4 9 O R P ( E ) = 0 . 4 9 + 0 . 5 6 - ( 0 . 4 9 * 0 . 5 6 ) P a r t 2 C N F 0 . 5 6 P ( E ) = 0 . 7 7 6 = 7 7 . 6 T H E N E T h i s e x a m p l e d e m o n s t r a t e s t h a t w h e n b o t h p r e m i s e s A a n d B a r e t r u e , t h e r e s u l t i n g c e r t a i n t y o f c o n c l u s i o n s D a n d E i s h i g h e r t h a n t h e i n d i v i d u a l C N F s o f A a n d B . C e r t a i n t y t h e o r y p r o v i d e s t h e d e s i r e d r e s p o n s e o f a n i n c r e a s e i n c e r t a i n t y a s m o r e d a t a s u p p o r t t h e c o n c l u s i o n s . S e c t i o n 2 . 8 C o n c l u s i o n s o f E x p e r t S y s t e m s a n d C e r t a i n t y T h e o r y T h e p r e v i o u s s e c t i o n s d e s c r i b e d t h e d e v e l o p m e n t o f e x p e r t s y s t e m s a s a s u b - f i e l d o f A I . E x p e r t s y s t e m s p r o v i d e a m e a n s t o i n c o r p o r a t e h u m a n e x p e r t i s e i n t o c o m p u t e r f o r m a t s o t h a t t h e i n f o r m a t i o n c a n b e d i s s e m i n a t e d a n d u s e d b y a l a r g e r n u m b e r o f p e o p l e . E x p e r t s y s t e m s u s e h e u r i s t i c s t h a t a r e t y p i c a l l y e n c o d e d i n t o r u l e f o r m a t a n d a n i n f e r e n c e e n g i n e a p p l i e s e i t h e r f o r w a r d o r b a c k w a r d c h a i n i n g ( o r a c o m b i n a t i o n o f t h e t w o m e c h a n i s m s ) t o p r o p o s e a s o l u t i o n f o r s o m e g o a l . S e v e r a l 4 8 r e p r e s e n t a t i v e e x p e r t s y s t e m s a r e d e s c r i b e d t o d e m o n s t r a t e t h e c a p a b i l i t i e s o f e x p e r t s y s t e m s t o a s s i s t i n t h e s o l u t i o n o f c o m p l e x p r o b l e m s . T y p i c a l l y , e x p e r t s y s t e m s a r e t h e m o s t s u c c e s s f u l f o r s m a l l - d o m a i n a r e a s w h e r e t h e i n f o r m a t i o n r e q u i r e d t o s o l v e t h e g o a l i s l i m i t e d i n n a t u r e a n d c a n b e s t a t e d i n c o n c i s e , h e u r i s t i c f o r m a t . T h e e x p e r t s y s t e m s t h a t a r e t y p i c a l l y u s e d f o r H P L C a p p l i c a t i o n s a r e e i t h e r s p e c i f i c t o a s m a l l p r o b l e m , s u c h a s t h e c h o i c e o f m e t h o d f o r t h e a n a l y s i s o f p h a r m a c e u t i c a l c o m p o u n d s , o r p r o v i d e s o l u t i o n s f o r a l a r g e r , m o r e g e n e r a l i z e d , d o m a i n . T h e e x p e r t s y s t e m s d e s c r i b e d i n t h e l i t e r a t u r e d o n o t a p p l y a f i r s t - p r i n c i p l e a p p r o a c h . R a t h e r , t h e y t y p i c a l l y c a t e g o r i z e t h e s a m p l e i n t o d i f f e r e n t c l a s s e s o f c o m p o u n d s , a n d t h e n p r o p o s e t h e m e t h o d t h a t h a s b e e n a s s o c i a t e d w i t h t h a t c l a s s o f c o m p o u n d . W h i l e t h i s a l l o w s f o r v e r y s p e c i f i c a d v i c e t o b e p r o v i d e d , t h e e x p e r t s y s t e m d e s c r i b e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n u s e s a f i r s t - p r i n c i p l e a p p r o a c h ( a s d e s c r i b e d i n C h a p t e r 4 ) . T h e e x p e r t s y s t e m u s e s t h e s a m p l e ' s c h e m i c a l a n d p h y s i c a l p r o p e r t i e s t o p r o p o s e a n H P L C m e t h o d . T h i s a p p r o a c h a l l o w s t h e e x p e r t s y s t e m t o p r o p o s e a m e t h o d f o r a n y c o m p o u n d , r e g a r d l e s s o f i t s t y p e o r c l a s s , p r o v i d e d t h e u s e r k n o w s s o m e c h e m i c a l o r p h y s i c a l p r o p e r t y o f t h e s a m p l e . C o n f i d e n c e f a c t o r s h a v e b e e n d e s c r i b e d i n t h i s c h a p t e r . C o n f i d e n c e f a c t o r s p r o v i d e a m e a n s f o r t h e u s e r t o i n d i c a t e t h e r e l i a b i l i t y o f t h e i n f o r m a t i o n t h a t h e / s h e p r o v i d e s t o t h e e x p e r t s y s t e m . T h e e x p e r t s y s t e m c a n t h e n u s e c e r t a i n t y t h e o r y ( o r s o m e o t h e r f o r m o f f u z z y l o g i c ) t o d e t e r m i n e t h e c e r t a i n t y o f t h e p r o p o s e d m e t h o d s . M o s t o f t h e e x p e r t s y s t e m s i n t h e H P L C l i t e r a t u r e d o n o t u t i l i z e c o n f i d e n c e f a c t o r s . C o n f i d e n c e f a c t o r s h a v e b e e n i n c o r p o r a t e d i n t o t h e e x p e r t s y s t e m o f t h i s d i s s e r t a t i o n . A s d e m o n s t r a t e d i n C h a p t e r 4 , c o n f i d e n c e f a c t o r s a l l o w t h e e x p e r t s y s t e m t o p r o v i d e a r a n k e d r e s p o n s e . T h e u s e r m a y t h e n s e l e c t t h e a p p r o p r i a t e m e t h o d b y c o n s i d e r i n g t h e c o n f i d e n c e f a c t o r s o f t h e d i f f e r e n t p r o p o s a l s . T h e e n v i s i o n e d s y s t e m o f t h i s r e s e a r c h i s a n i n t e l l i g e n t , a u t o m a t e d H P L C i n s t r u m e n t w h i c h h a s t h e c a p a b i l i t i e s t o p e r f o r m s e p a r a t i o n s t h a t m a y n e c e s s i t a t e t h e 4 9 u s e o f c o l u m n s w i t c h i n g . C o l u m n s w i t c h i n g i s a t e c h n i q u e i n w h i c h e l u t i n g c o m p o n e n t s f r o m a f i r s t c o l u m n a r e r e - d i r e c t e d o n t o a s e c o n d c o l u m n . C o l u m n s w i t c h i n g p r o v i d e s t h e m e a n s t o s e p a r a t e v e r y c o m p l e x s a m p l e s b y u s i n g t w o , o r m o r e c o l u m n s , t h a t a r e s e l e c t i v e f o r d i f f e r e n t c l a s s e s o f c o m p o u n d s i n t h e c o m p l e x m a t r i x . T h e n e x t s e c t i o n o f t h i s c h a p t e r d e s c r i b e s t h e t h e o r e t i c a l c o n s i d e r a t i o n s o f m u l t i d i m e n s i o n a l H P L C . W h i l e t h e r e s e a r c h d e s c r i b e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n d o e s n o t u s e m u l t i d i m e n s i o n a l , a n a u t o m a t e d s y s t e m h a s b e e n d e v e l o p e d t o p r o v i d e f o r t h i s c a p a b i l i t y . I t i s e n v i s i o n e d t h a t t h e e x p e r t s y s t e m d e s c r i b e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n w i l l b e e x p a n d e d t o p r o v i d e a m e t h o d ( s ) f o r m u l t i d i m e n s i o n a l s e p a r a t i o n s . T h e a u t o m a t i o n , v i a s o f t w a r e a n d h a r d w a r e , p r o v i d e s a m e a n s t o a u t o m a t e t h e s e p a r a t i o n . T h e c o m b i n a t i o n o f a u t o m a t i o n a n d e x p e r t s y s t e m p r o v i d e s t h e f i r s t g e n e r a t i o n o f a n i n t e l l i g e n t , a u t o m a t e d i n s t r u m e n t . S e c t i o n 2 . 9 M u l t i d i m e n s i o n a l H i g h P e r f o r m a n c e L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y ( M D - H P L C ) A s i m p l e h e u r i s t i c c a n b e p o s t u l a t e d t h a t r e l a t e s s o c i e t y , a n a l y t i c a l p r o b l e m s , a n d c o m p l e x i t y : A n i n c r e a s i n g l y c o m p l e x , t e c h n o l o g i c a l w o r l d c r e a t e s c o m p l e x p r o b l e m s t h a t c a n b e s o l v e d o n l y b y p o w e r f u l ( a n d h e n c e , c o m p l e x ) t o o l s a n d t e c h n i q u e s . I n a f a i r l y r e c e n t s u r v e y o f l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y e x p e r t s , 5 4 J o s e p h G l a j c h s t a t e s , W i t h t h e i n c r e a s i n g c o m p l e x i t y o f s a m p l e s e n c o u n t e r e d , e s p e c i a l l y i n b i o l o g i c a l a n d e n v i r o n m e n t a l a r e a s , t h e a d d i t i o n a l e f f i c i e n c y o f n e w e r L C c o l u m n s w i l l n e v e r b e s u f f i c i e n t . M u l t i d i m e n s i o n a l a p p r o a c h e s w i l l l e a d t o o v e r a l l b e t t e r r e s o l u t i o n i n s h o r t e r t i m e . S e c t i o n 2 . 9 . 1 D e f i n i t i o n a n d T h e o r y T h i s t h e s i s w i l l u s e a n e x t e n d e d v e r s i o n o f J . C . G i d d i n g s ' s d e f i n i t i o n o f m u l t i d i m e n s i o n a l i t y . 5 5 G i d d i n g s d e f i n e s m u l t i d i m e n s i o n a l s e p a r a t i o n s a s s e p a r a t i o n s 5 0 t h a t m u s t e x p e r i e n c e t w o o r m o r e o r t h o g o n a l s e p a r a t i v e d i s p l a c e m e n t s . T h e s e p a r a t i o n m u s t b e d e v e l o p e d s u c h t h a t t h e r e s o l u t i o n a c h i e v e d b y t h e fi r s t d i s p l a c e m e n t i s n o t d e g r a d e d b y t h e s u b s e q u e n t d i s p l a c e m e n t ( s ) . T h i s c r i t e r i o n e l i m i n a t e s p u r e l y t a n d e m a r r a n g e m e n t s o f c o l u m n s s i n c e t h e r e s o l u t i o n a c h i e v e d b y . t h e f i r s t c o l u m n c a n b e c o m p l e t e l y e l i m i n a t e d b y t h e s e c o n d c o l u m n . M u l t i d i m e n s i o n a l i t y c a n b e s u b - d i v i d e i n t o s o c a l l e d ” h y p h e n a t e d ” t e c h n i q u e s ( e . g . , G C - M S , L C - N M R ) , a n d m u l t i - m o d a l t e c h n i q u e s w h e r e o n e p a r t i c u l a r i n s t r u m e n t i s u s e d i n v a r i o u s m o d e s ( e . g . , d i f f e r e n t c o l u m n s ) . T h i s w i l l a l l o w t e c h n i q u e s s u c h a s c o l u m n - s w i t c h i n g a n d r e c y c l e c h r o m a t o g r a p h y t o b e i n c l u d e d i n t h i s d i s c u s s i o n . M u l t i d i m e n s i o n a l s e p a r a t i o n s a r e i m p l e m e n t e d b y w a y o f c o l u m n s w i t c h i n g . I n c o l u m n s w i t c h i n g , 5 5 ' 5 6 ' S 7 a s m a l l c u t , A t , f r o m a p r i m a r y c o l u m n i s p l a c e d o n t o s e c o n d a r y c o l u m n s . I f A t i s s u f fi c i e n t l y s m a l l , t h e r e s o l u t i o n a c h i e v e d o n t h e fi r s t c o l u m n i s n o t d e g r a d e d b y t h e s e c o n d c o l u m n . T h e c u t f r o m p r i m a r y t o s e c o n d a r y c o l u m n s c a n b e d o n e e i t h e r o n - o r o f f - l i n e . M a j o r s 5 8 r e v i e w s t h e a d v a n t a g e s a n d d i s a d v a n t a g e s o f o n - a n d o f f - l i n e c o u p l i n g . W i t h t h e a d v e n t o f c o m p u t e r s , i m p r o v e d p r e c i s i o n a n d r e p r o d u c i b i l i t y i s a c h i e v e d w h i c h b e n e fi t s o n - l i n e t e c h n i q u e s . T h i s l e a d s t o a d e c r e a s e i n s a m p l e l o s s a n d a n a l y s i s t i m e . O t h e r a r t i c l e s 5 9 ' 6 0 ' 6 1 ' 6 2 d e m o n s t r a t e t h e i m p o r t a n c e a n d n e c e s s i t y o f a u t o m a t i o n w h e n u s i n g m u l t i d i m e n s i o n a l c h r o m a t o g r a p h y b y i n c o r p o r a t i n g t h e w o r d a u t o m a t i o n i n t o t h e t i t l e . T h e m o t i v a t i o n f o r t h e d e v e l o p m e n t o f t h e m u l t i d i m e n s i o n a l t e c h n i q u e s c o m e s f r o m s e v e r a l c o r r e l a t i n g f a c t o r s . S 4 S t a t i s t i c a l t r e a t m e n t c o n c l u d e s t h a t , w i t h o u t a p r i o r i i n f o r m a t i o n , t h e r e a r e a p p r o x i m a t e l y fi v e t o s i x m i l l i o n p o s s i b l e c o m p o u n d s t h a t e v e r y t e c h n i q u e m u s t b e a b l e t o d i f f e r e n t i a t e t o p r o v i d e c o m p r e h e n s i v e q u a l i t a t i v e a n a l y s i s . J u d i c i o u s a p p l i c a t i o n o f k n o w l e d g e a b o u t t h e s a m p l e c a n m i n i m i z e t h e s a m p l e s e t T h e p e a k c a p a c i t y , 5 6 ' 6 3 6 , f o r a s i n g l e m o d e o f s e p a r a t i o n i s g i v e n b y : 5 1 N 5 l n ( 1 + k h ) m 0 - 1 + E q u a t i o n 2 . 5 w h e r e N i s t h e n u m b e r o f t h e o r e t i c a l p l a t e s , k n . i s t h e c a p a c i t y f a c t o r f o r t h e l a s t m e m b e r o f a s e r i e s o f e l u i t e s , a n d m - 4 ( 4 a ) i s u n i t r e s o l u t i o n . F o r a s e r i e s o f c o n s e c u t i v e c o l u m n s w i t h i n d e p e n d e n t , o r t h o g o n a l m o d e s , E q u a t i o n 2 . 5 r e d u c e s t o : O — ( 9 1 9 2 9 3 . . . 9 " ) E q u a t i o n 2 . 6 F o r a s e r i e s o f n i d e n t i c a l c o l u m n s E q u a t i o n 2 . 5 r e d u c e s t o : O - n % @ n E q u a t i o n 2 . 7 C o m p a r i s o n o f E q u a t i o n s 2 . 6 a n d 2 . 7 s h o w s t h e e x p o n e n t i a l i n c r e a s e i n p e a k c a p a c i t y t h a t a r i s e s f r o m c o l u m n ( m o d e ) s w i t c h i n g . S n y d e r 6 4 p r e s e n t e d a d e t a i l e d c o m p a r i s o n o f n o r m a l e l u t i o n ; c o u p l e d c o l u m n s ; a n d s o l v e n t - , fl o w - , a n d t e m p e r a t u r e - p r o g r a m m i n g i n l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y . H e c o n c l u d e d t h a t c o u p l e d c o l u m n s h a v e a d v a n t a g e s f o r a l a r g e c l a s s o f s e p a r a t i o n s , p a r t i c u l a r l y t h o s e i n v o l v i n g r e p e t i t i v e , h i g h e f fi c i e n c y l i q u i d c h r o m a t o g r a m s . S n y d e r a l s o d i s c u s s e d t h e b e n e fi t s o f c o u p l e d c o l u m n s t o p r o v i d e s h a r p l y i n c r e a s e d r e s o l u t i o n a t s p e c i fi c p o i n t s i n t h e c h r o m a t o g r a m . S e c t i o n 2 . 9 . 2 A p p l i c a t i o n s o f M D - H P L C S o m e o f t h e i n i t i a l a p p l i c a t i o n s o f m u l t i d i m e n s i o n a l c h r o m a t o g r a p h y h a v e b e e n i n t h e a n a l y s i s o f p o l y c y c l i c a r o m a t i c c o m p o u n d s ( P A C ) i n c o m p l e x m a t r i c e s . I n c r e a s i n g c o n c e r n o v e r e n v i r o n m e n t a l a n d s a f e t y i m p a c t s h a s l e d t o d e t a i l e d s t u d y o n P A C ' s . T h e d e t e r m i n a t i o n o f P A C ' s h a s p r o v e n t o b e a d i f fi c u l t p r o b l e m . T y p i c a l l y t h e r e i s a l a r g e n u m b e r o f c o m p o n e n t s w i t h w i d e l y v a r y i n g c h e m i c a l p r o p e r t i e s , a n d h e n c e w i d e l y v a r y i n g c a p a c i t y f a c t o r s , i n a d i r t y s a m p l e . S o n n e f e l d a n d c o - w o r k e r s 6 5 d e s c r i b e d t h e o n - l i n e c o u p l i n g o f b o t h a n o r m a l p h a s e s y s t e m a n d a r e v e r s e p h a s e s y s t e m f o r t h e a n a l y s i s o f o r g a n i c c o m p o u n d s i n s h a l e o i l . T h e s a m p l e w a s p a s s e d t h r o u g h a n o r m a l 5 2 p h a s e a m i n o s i l a n e c o l u m n , a n d t h e d e s i r e d f r a c t i o n w a s s w i t c h e d o n t o a d i a r r r i n e c o l u m n f o r o n - c o l u m n c o n c e n t r a t i o n . T h e c o n c e n t r a t o r c o l u m n ( i . e . , t h e d i a m i n e c o l u m n ) w a s t h e n p l a c e d i n - l i n e w i t h a n a n a l y t i c a l O D S c o l u m n a n d t h e s a m p l e f o c u s e d b y g r a d i e n t e l u t i o n . T h e o n - l i n e m e t h o d g a v e c o m p a r a b l e r e s u l t s t o t h e i r p r e v i o u s s e q u e n t i a l H P L C m e t h o d b u t o f f e r e d s e v e r a l a d v a n t a g e s . T h e o n - l i n e s y s t e m w a s r e a d i l y a u t o m a t e d , m i n i m i z e d s a m p l e l o s s , a n d y i e l d e d l o w e r d e t e c t i o n l i m i t s . P e a r s o n a n d G h a r f e h s 6 u s e d t h r e e c o l u m n s — a c y a n o a n d t w o a m i n o - c y a n o c o l u m n s — t o a c h i e v e g r o u p - t y p e d e t e r m i n a t i o n o f h y d r o c a r b o n t y p e s i n c r u d e o i l r e s i d u e s . T h e c y a n o c o l u m n r e t a i n e d t h e r e s i n s w h i l e t h e a m i n o c y a n o c o l u m n s s e p a r a t e d t h e a r o m a t i c s a n d s a t u r a t e s . T h e s t r o n g l y r e t a i n e d c o m p o n e n t s ( t h e r e s i n s ) w e r e b a c k fl u s h e d o f f t h e c y a n o c o l u m n t o d e c r e a s e a n a l y s i s t i m e a n d t o i m p r o v e p e a k s h a p e . W i t h o u t t h e m u l t i p l e c o l u m n s , P e a r s o n a n d G h a r f e h w e r e u n a b l e t o r e s o l v e t h e t h r e e f r a c t i o n s . T h e a n a l y s i s w a s r a p i d , c l e a n , a n d r e a d i l y a u t o m a t e d . B a r t l e , e t a l . 6 2 u s e d a n o n - l i n e m u l t i d i m e n s i o n a l l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y i n s t r u m e n t c o u p l e d t o a c a p i l l a r y g a s c h r o m a t o g r a p h y i n s t r u m e n t t o i s o l a t e a n d d e t e c t t r a c t l e v e l P A C ' s i n d i e s e l e x h a u s t p a r t i c u l a t e s a m p l e s . T h e L C u s e d a n a m i n o s i l a n e a n d a s i l i c a m i c r o b o r e c o l u m n t o c l e a n t h e s a m p l e a n d f r a c t i o n a t e t h e a r o m a t i c s . B y b a c k fl u s h i n g t h e L C c o l u m n s , t h e a r o m a t i c s w e r e t h e n d i r e c t l y i n t r o d u c e d i n t o t h e G C w i t h m i n i m a l L C s o l v e n t ( i . e . , n o d i l u t i o n ) a n d n o i n t e r m e d i a t e s a m p l e p r e - t r e a t m e n t w a s n e e d e d . T h e y r e p o r t e d b e t t e r s e n s i t i v i t y , r e p r o d u c i b i l i t y , a n d e a s e o f o p e r a t i o n a s c o m p a r e d t o t h e e q u i v a l e n t o f f - l i n e , n o n - c o u p l e d , s y s t e m s . C o r t e s a n d c o - w o r k e r s 6 0 d e m o n s t r a t e d t h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f p o l y m e r s b y t h e c o m b i n a t i o n o f s i z e e x c l u s i o n c h r o m a t o g r a p h y ( S E C ) a n d p y r o l y s i s g a s c h r o m a t o g r a p h y . S E C p r o v i d e d m o l e c u l a r w e i g h t i n f o r m a t i o n w h e r e a s t h e p y r o l y s i s G C p r o v i d e d p o l y m e r i n f o r m a t i o n . T h i s a p p l i c a t i o n i s a p p l i c a b l e t o o t h e r n o n v o l a t i l e s a m p l e s , s u c h a s b a c t e r i a , p r o t e i n s , a n d c o m p l e x c a r b o h y d r a t e s . 5 3 S e v e r a l p a p e r s d e s c r i b e u s i n g m u l t i d i m e n s i o n a l c h r o m a t o g r a p h y f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f d r u g s i n p l a s m a . S a m p l e p r e p a r a t i o n h a s b e c o m e t h e l i m i t i n g s t e p i n t h e d e t e r m i n a t i o n o f b i o l o g i c a l s a m p l e s . T a k a h a g i , H o r i g u c h i , a n d c o - w o r k e r s 6 7 h a v e d e v e l o p e d a c o l u m n s w i t c h i n g t e c h n i q u e t h a t c o m b i n e s a q u e o u s g e l c h r o m a t o g r a p h y a l o n g w i t h r e v e r s e p h a s e c h r o m a t o g r a p h y u s i n g a n O D S c o l u m n . T h i s c o m b i n a t i o n a l l o w e d d i r e c t i n j e c t i o n o f p l a s m a w i t h o u t t h e t r a d i t i o n a l p r e - t r e a t m e n t , s u c h a s d e p r o t e i n i z a t i o n o r e x t r a c t i o n . T h i s a u t o m a t e d t e c h n i q u e l i n k e d s a m p l e p r e - t r e a t m e n t , c o n c e n t r a t i o n , a n d c h r o m a t o g r a p h i c s e p a r a t i o n i n t o o n e p r o c e s s . O t h e r r e f e r e n c e s d e s c r i b e a p p l i c a t i o n s u s i n g m u l t i d i m e n s i o n a l c h r o m a t o g r a p h y a n d s p e c i fi c d e t e c t o r s s u c h a s fl u o r i m e t e r s 6 8 a n d m a s s s p e c t r o m e t e r s 6 9 t o p r o v i d e c o m p l e x s e p a r a t i o n s c o u p l e d w i t h " i n f o r m a t i o n - r i c h ” d e t e c t o r s t o s p e c i a t e p l a s m a s a m p l e s . M u l t i d i m e n s i o n a l c h r o m a t o g r a p h y i s a l s o f i n d i n g a p p l i c a b i l i t y i n f o o d d e t e r m i n a t i o n s . S t r i n g e n t l a b e l i n g l a w s a n d c o n s u m e r a w a r e n e s s h a v e c r e a t e d a n i m p e t u s t o p r o v i d e d e t a i l e d i n f o r m a t i o n o n f o o d s a m p l e s a n d p r o c e s s i n g , a n d o n f e e d s t o c k s f o r a n i m a l s . M a j o r s 5 8 ' 7 o d e t e r m i n e d t h e c o n c e n t r a t i o n o f m a l a t h i o n o n t o m a t o p l a n t s v i a g e l p e r m e a t i o n c h r o m a t o g r a p h y ( G P C ) a n d r e v e r s e p h a s e c h r o m a t o g r a p h y . T h e t o m a t o f r o n d s w e r e m a c e r a t e d , e x t r a c t e d , a n d d i s s o l v e d i n T H F . T h e r e s u l t i n g e x t r a c t w a s i n j e c t e d o n t o a G P C c o l u m n , a n d t h e r e s u l t i n g m a l a t h i o n f r a c t i o n w a s h e a r t c u t o n t o a r e v e r s e p h a s e c o l u m n w i t h g o o d r e c o v e r y a n d r e s o l u t i o n . M a j o r s 5 8 a l s o a n a l y z e d a p r o t e i n f o o d s u p p l e m e n t f o r t h e c o n c e n t r a t i o n o f B v i t a m i n s . T h e a q u e o u s s i z e e x c l u s i o n c h r o m a t o g r a m e x h i b i t e d b r o a d , m u l t i - b a n d e d p e a k s . T h e a p p r o p r i a t e b a n d w a s t h e n s w i t c h e d o n t o a r e v e r s e p h a s e c o l u m n . T h e c o m p o s i t e c h r o m a t o g r a m e x h i b i t e d r e s o l v e d v i t a m i n s f r o m t h e e x c i p i e n t s . T h e S E C c o l u m n c o m b i n e d w i t h 5 4 s e l e c t i v e c u t t i n g p r e v e n t e d p r o t e i n s f r o m p a s s i n g o n t o t h e R P c o l u m n a n d b e i n g i r r e v e r s i b l y r e t a i n e d . S t e r i g m a t o c y s t i n i s a r e c o g n i z e d c a r c i n o g e n a n d c a u s e s d e a t h t o d a i r y c a t t l e . P r e v i o u s d e t e r m i n a t i o n s w e r e u n s u c c e s s f u l d u e t o i n t e r f e r i n g c o m p o u n d s i n t h e f e e d s t o c k . L e p o m 7 1 d e v e l o p e d a m u l t i d i m e n s i o n a l m e t h o d t o a n a l y z e f o r s t e r i g r n a t o c y s t i n i n f e e d s t o c k s a t p p b l e v e l s w i t h o u t i n t e r f e r e n c e . L e p o m a l s o d i s c o v e r e d t h a t h i s a n a l y t i c a l c o l u m n l i f e w a s e x t e n d e d s i g n i fi c a n t l y b y u s i n g h i s m u l t i d i m e n s i o n a l m e t h o d . A d d i t i o n a l f o o d s a m p l e s a n a l y z e d b y c o m b i n a t i o n m u l t i d i m e n s i o n a l c h r o m a t o g r a p h y a n d / o r h y p h e n a t e d t e c h n i q u e s i n c l u d e c a f f e i n e b y H P L C , 7 2 p e a r s u g a r s a n d a c i d s b y G C - M S , 7 3 r u m fl a v o r s v i a G a s - l i q u i d C h r o m a t o g r a p h y - M S , 7 4 a n d t r a c e m e t a l s i n n a t u r a l w a t e r s . 6 1 M a j o r s 5 8 a l s o l i s t s a p p r o x i m a t e l y t h i r t e e n o t h e r m u l t i - d i m e n s i o n a l a p p l i c a t i o n s f o r f o o d s a m p l e s , a n d a r e c e n t r e v i e w 7 5 o n m u l t i d i m e n s i o n a l l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y l i s t s a d d i t i o n a l r e f e r e n c e s . L I S T O F R E F E R E N C E S 1 0 l l 1 2 l 3 1 4 1 5 1 6 L I S T O F R E F E R E N C E S N . G r a h a m ; A r t i fi c i a l I n t e l l i g e n c e - M a k i n g M a c h i n e s ' ’ T h i n k ' 1 9 7 9 , T A B B o o k s I n c . C . G . E n k e , A . P . W a d e , P . T . P a l m e r , K . J . H a r t , A n a l . C h e m . , 1 9 8 7 , 5 9 , 1 3 6 3 A . A n a l . C h e m , 1 9 8 8 , 6 0 , 1 5 3 4 . S . S . W i l l i a m s , J . F . K a r n i c k y , J . - L . E x c o f fi e r , a n d S . R . A b b o t t , E x p e r t S y s t g n P r o g r a m f 2 : A s s i s t a n c e i n H i g h P e r f o r m a n c e l i q u i d C h r o m a t o g r a p h i c M e t h g g l D e v e l o p m e n t i n C o m p u t e r - A s s i s t e d M e t h o d D e v e l o p m e n t f o r H i g h - P e r f o r m a n c e L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y , J . L . G l a j c h a n d L R . S n y d e r , e d i t o r s , E l s e v i e r S c i e n c e P u b l i s h e r s , 1 9 8 9 , 2 6 7 . K . P a r s a y e , M . C h i g n e l l ; E x p e r t S y s t e m s f o r E t p e r t s , J o h n W i l e y & S o n s , I n c . 1 9 8 8 . P . - H . W i n s t o n ; L I S P , A d d i s o n - W e s l e y P u b l i s h i n g C o m p a n y , 1 9 8 6 . J . R . W a l t e r s a n d N . R N i e l s e n , C r a f t i n g K n o w l e d g e - B a s e d S y s t e m s E x p e r t S y s t e m s M a d e R e a l i s t i c , J o h n W i l e y & S o n s , I n c . , 1 9 8 8 , C h a p t e r 5 . A . P . W a d e , S . R . C r o u c h , a n d D . B e t t e r i d g e , T r A C , 1 9 8 8 , 7 ( 1 0 ) , 3 5 8 . D . H . A c k l e y G . E . H i n t o n , a n d T . J . S e j n o w s k i , C o g n i t i v e S c i e n c e , 1 9 8 5 , 9 , 1 4 7 . J . J . H o p fi e l d , ' N e u r a l N e t w o r k s a n d P h y s i c a l S y s t e m s w i t h E m e r g e n t C o l l e c t i v e C o m p u t a t i o n a l A b i l i t i e s , ‘ P r o c e e d i n g s o f t h e N a t i o n a l A c a d e m y o f S c i e n c e s , U S A , 1 9 8 2 , 2 5 5 4 . A . l a n e , P C A ] , 1 9 8 9 , 3 ( 6 ) , 2 0 . T h e A m e r i c a n H e r i t a g e D i c t i o n a r y , s o f t w a r e r e l e a s e 1 . 1 , H o u g h t o n M i f fl i n C o . , 1 9 9 2 . P . J a c k s o n ; I n t r o d u c t i o n t o B t p e r t S y s t e m s , A d d i s o n - W e s l e y P u b l i s h i n g C o . W o k i n g h a m , E n g l a n d , 1 9 8 6 . T . P . B r i d g e , M . I - I . W i l l i a m s , a n d A . P . F e l l , C h e m . B r i . 1 9 8 7 , 2 3 ( 1 1 ) , 1 0 8 5 . D . H . S m i t h , ‘ A r t i f i c i a l I n t e l l i g e n c e : T h e T e c h n o l o g y o f E x p e r t S y s t e m s ' i n A r t i fi c i a l I n t e l l i g e n c e A p p l i c a t i o n s i n C h e m i s t r y , T . H . P i e r c e , B r u c e A . H o h n e , e d s . 1 9 8 6 , 1 . F A . S e t t l e a n d M A P l e v a , A m e r i c a n L a b . , 1 9 8 8 , 2 0 ( 1 0 ) , 6 4 - 7 9 . 5 5 1 7 1 8 1 9 2 0 2 1 2 2 2 3 2 4 2 5 2 6 2 7 2 8 2 9 3 0 3 1 3 2 3 3 3 4 3 5 3 6 5 6 J . M c C a r t h y ; L I S P - N o t e s o n i t s P a s t a n d F u t u r e , C o n f e r e n c e R e c o r d o f t h e 1 9 8 0 L I S P C o n f e r e n c e , S t a n f o r d U n i v e r s i t y , A u g u s t 2 5 - 2 7 , 1 9 8 0 . N . A . B . G r a y ; C o m p u t e r A s s i s t e d S t r u c t u r e E l u c i d a t i o n , 1 9 8 6 , W i l e y - I n t e r s c i e n c e , 1 6 6 . B a r r a n d E . A . F e i g e n b a u m , T h e H a n d b o o k o f A I , W i l l i a m K a u f m a n n , I n c . , 1 9 8 2 . P . - H . W i n s t o n ; A r t i fi c i a l I n t e l l i g e n c e , A d d i s o n - W e s l e y P u b l i s h i n g C o . 1 9 8 6 . M . P . D e r d e , L . B u y d e n s , C . G u n s , D . L . M a r r a t , a n d P . K . H o p k e , A n a l . C h e m . 1 9 8 7 , 5 9 , 1 8 6 8 . T I U s e r s G u i d e , T e c k n o w l e d g e , I n c . , P a l o A l t o , C A 1 9 8 4 . E . A . F e i g e n b a u m , P r o c e e d i n g s o f t h e 5 ‘ h I n t e r n a t i o n a l J o i n t C o n f e r e n c e o n A r t i f i c i a l I n t e l l i g e n c e , 1 9 7 7 , 1 0 1 4 . J . S . B e n n e t a n d R . S . E n g e l m o r e , P r o c e e d i n g s o f t h e 6 t h I n t e r n a t i o n a l J o i n t c o n f e r e n c e o n A r t i fi c i a l I n t e l l i g e n c e , 1 9 7 7 , 1 0 1 4 . W . J . C l a n c e y , fl r _ e E p i s t e m o l o g y g t _ a R u l e - B a s e d m S y s t e m — A F r a m e w o r k [ g r W i n A r t i fi c i a l I n t e l l i g e n c e , 1 9 8 3 , 2 0 , 2 1 5 . B . J . W y t h o f f a n d S . A . T o m e l l i n i , R e s e a r c h a n d D e v e l o p m e n t , 1 9 8 9 , 3 1 ( 4 ) , 5 2 . F . A . s e t t l e , J r . , J . C h e m . E d . , 1 9 8 7 , 6 4 ( 4 ) 3 4 0 . D . B e t t e r i d e , R . M a c k i s o n , C . M . M o t t e r s h e a d , A . F . T a y l o r , a n d A . P . W a d e , A n a l . C h e m . 1 9 8 8 , 6 0 , 1 5 3 4 . T . P . B r i d g e , M . H . W i l l i a m s , 6 . 6 . R . S e a t o n , a n d A . r . F e l l , C h r o m a t o g r . 1 9 8 7 , 2 4 , 6 9 1 . A . G . W r i g h t , A . F . F e l l , a n d J . C . B e r r i d g e , C h r o m a t o g r . 1 9 8 7 , 2 4 , 5 3 3 . M . D e S m e t , A . P e e t e r s , L . B u y d e n s , a n d D . L . M a s s a r t , J . C h r o m a t o g r . 1 9 8 8 , 4 5 7 , 2 5 . R . H i n d r i k s , F . M a r i s , J . V i n k , A . P e e t e r s , M . D e S m e t , D . L M a s s a r t , a n d L . B u y d e n s , J . C h r o m a t o g r . , 1 9 8 9 , 4 8 5 , 2 5 5 . M a r i n a D e S m e t , G r e e t M u s c h , A n n e P e e t e r s , L u t g a r d e B u y d e n s , a n d D e s i r e L . M a s s a r t , J . C h r o m a t o g r . 1 9 8 9 , 4 8 5 , 2 3 7 . H . G u n a s i n g h a m , B . S r i n i v a s a n , A . l . A n a n d a , A n a l . C h i m . A c t a , 1 9 8 6 , 1 8 2 , 1 8 3 . K . T s u j i a n d K . M . J e n s i n s , J . C h r o m a t o g r . 1 9 8 9 , 4 8 5 , 2 9 7 . M . M u l h o l l a n d , J . A . V a n L e e u w e n , a n d B . V a n d e g i n s t e , A n a l . C h i m . A c t a , 1 9 8 9 , 2 2 3 ( 1 ) . 1 8 3 . 3 7 3 8 3 9 4 0 4 1 4 2 4 3 4 4 4 5 4 6 4 7 4 8 4 9 5 0 5 1 5 2 5 3 5 4 5 5 5 6 5 7 5 7 R . B a c h , J . K a r n i c k y , a n d 5 . A b b o t t , ‘ A n E x p e r t S y s t e m f o r H i g h P e r f o r m a n c e l i q u i d C h r o m a t o g r a p h y M e t h o d s D e v e l o p m e n t ' i n A r t i fi c i a l I n t e l l i g e n c e A p p l i c a t i o n s i n C h e m i s t r y , T h o m a s P i e r c e , e d . , A C S S y m p o s i u m s S e r i e s ; 3 0 6 , 1 9 8 6 , 2 7 8 . 5 . 5 . W i l l i a m s J . F . K a r n i c k y , J . - I . . E x c o f fi e r , a n d S . R . A b b o t t , ‘ E x p e r t S y s t e m P r o g r a m f o r A s s i s t a n c e i n H i g h - P e r f o r m a n c e l i q u i d C h r o m a t o g r a p h i c M e t h o d D e v e l o p m e n t , ‘ i n C o m p u t e r - A s s i s t e d M e t h o d D e v e l o p m e n t f o r H i g h - P e r f o r m a n c e L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y , J . L . G l a j c h a n d 1 . . R . S n y d e r , e d s . E l s e v i e r , 1 9 9 0 , 2 6 7 . L . P e i c h a n g a n d H . H o n g x i n , J . C h r o m a t o g r . 1 9 8 8 , 4 5 2 , 1 7 5 . M . A . T i s c h l e r a n d E . A . F o x , C o m p u t . C h e m . 1 9 8 7 , 1 1 ( 4 ) , 2 3 5 . J . A . V a n L e e u w a n , B . G . M . V a n d e g i n s t e , a n d G . K a t e m a n , A n a l . C h i m . A c t a , 1 9 9 0 , 2 2 8 , 1 4 5 . P . d e B . H a r r i n g t o n a n d K . J . V o o r h e e s , A n a l . C h e m . 1 9 9 0 , 6 2 , 7 2 9 . P . d e B . H a r r i n g t o n , T . E . S t r e e t , K . J . V o o r h e e s , F . R . d i B r o z o l o , a n d R . W . O d o m , A n a l . C h e m . 1 9 8 9 , 6 1 , 7 1 5 . K . P e d e r s e n , A I E x p e r t 1 9 8 8 , 3 ( 5 ) , 2 6 . D . M e r r i t t , P C A I , 1 9 8 8 , 2 ( 3 ) , 5 1 . M . C . P a x t o n , A I E x p e r t 1 9 8 8 , 3 0 0 ) , 5 5 . K . P a r s a y e , M . C h i g n e l l , S . K h o s h a fi a n , a n d H . W o n g , I n t e l l i g e n t D a t a b a s e s , J o h n W i l e y a n d S o n s , I n c . , N e w Y o r k 1 9 8 9 , p p s . 1 6 4 , 4 4 0 . K . P a r s a y e , M . C h i g n e l l , S . K h o s h a fi a n , a n d H . W o n g , A I E X p e r t 1 9 9 0 , 6 2 , 3 8 . D . P . W e b b a n d E . D . S a l i n I n t e l l i g e n t I n s t r u m e n t s a n d C o m p u t e r s 1 9 9 1 ( i s s u e d 1 9 9 2 ) . 9 ( 5 ) , 1 8 5 . M ! S a m p l e K n o w l e d g e S y s t e m s , T e k n o w l e d g e l n c . , P a l o A l t o , C a . , 1 9 8 4 . M 1 R e f e r e n c e M a n u a l , T e k n o w l e d g e I n c . , P a l o A l t o , C a . , 1 9 8 4 . T . J . L a f f e y , B y t e , 1 9 9 1 , 1 6 ( 1 ) , 2 5 9 . L . A . Z a d e h , A I E x p e r t 1 9 9 2 , 7 ( 3 ) , 2 3 - 7 . R . E . M a j o r s , L C - G C , 1 9 8 7 , 5 ( 6 ) , 4 5 4 . J . C . G i d d i n g s , J . H i g h R e s o l u t . C h r o m a t o g r . C h r o m a t o g r . C o m m . 1 9 8 7 , 1 0 , 3 1 9 . D . H . F r e e m a n , A n a l . C h e m . 1 9 8 1 , 5 3 , 2 . P o o l e a n d S c h u e t t e , C o n t e m p o r a r y P r a c t i c e o f C h r o m a t o g r a p h y , E l s e v i e r S c i e n c e P u b . , N e t h e r l a n d s , 1 9 8 4 , 3 3 4 . 5 8 5 9 6 0 6 1 6 2 6 3 6 5 6 6 6 7 6 8 6 9 7 0 7 1 7 2 7 3 7 4 7 5 5 8 R . M a j o r s , J . C h r o m a t o g r . S c i . 1 9 8 0 , 1 8 , 5 7 1 . M . M . B u s h e y a n d J . W . J o r g e n s o n , A n a l . C h e m . 1 9 9 0 , 6 2 , 1 6 1 . H . J . C o r t e s , G . L . J e w e t t , C . D . P f e i f f e r , S . M a r t i n , a n d C . S m i t h , A n a l . C h e m . 1 9 8 9 , 6 1 , 9 6 1 . Y . L i u a n d J . D . I n g l e , J r . , A n a l . C h e m . 1 9 8 9 , 6 1 , 5 2 5 . I . L . D a v i e s , M . W . R a y n o r , P . T . W i l l i a m s , G . E . A n d r e w s , a n d K . D . B a r t l e , A n a l . C h e m . 1 9 8 7 , 5 9 , 2 5 7 9 . J . C . G i d d i n g s , A n a l . C h e m . 1 9 6 4 , 3 9 , 1 0 2 7 . L . R . S n y d e r , J . C h r o m a t o g r . S c i . 1 9 7 0 , 8 , 6 9 2 . W . J . S o n n e f e l d , W . H . z o l l e r , W . B . M a y , a n d S . A . W i s e , A n a l . C h e m . 1 9 8 2 , 5 4 , 7 2 3 . C . D . P e a r s o n a n d S . G . G h a r f e h , A n a l . C h e m . 1 9 8 6 , 5 8 , 3 0 7 . H . T a k a h a g i , K . I n o u e , a n d M . H o r i g u c h i , J . L i q . C h r o m a t o g r . 1 9 8 6 , 3 6 2 , 3 6 9 . C . A . P a l m e r i n i , M . G . C a n t e l m i , A . M i n e l l i , a n d C . F i r r i , J . C h r o m a t o g r . 1 9 8 7 , 4 1 7 , 3 7 8 . M . S . L a n t a n d J . O x f o r d , J . C h r o m a t o g r . 1 9 8 7 , 3 9 4 , 2 2 3 . E . L . J o h n s o n , R . G 1 0 0 , a n d R . E . M a j o r s , J . C h r o m a t o g r . 1 9 7 8 , 1 4 9 , 5 7 1 . P . L e p o m , J . C h r o m a t o g r . 1 9 8 6 , 3 5 4 , 5 1 8 . J . V a n D u i j n a n d G . H . D . v a n D e r S t e g e n , J . C h r o m a t o g r . 1 9 7 9 , 1 7 9 , 1 9 9 . I . A k h a v a n , R . E . W r o l s t a d , a n d D . G . R i c h a r d s o n , J . C h r o m a t o g r . 1 9 8 0 , 1 9 0 , 4 5 2 . H . M . l i e b i c h , W . A . K o e n i g , a n d E . B a y e r , J . C h r o m a t o g r . S c i . 1 9 7 0 , 8 , 5 2 7 . H . G . B a r t h , W . E . B a r b e r , C . H . L o c k m u l l e r , R . E . M a j o r s , a n d F . E . R e g n i e r , A n a l . C h e m . 1 9 8 8 , 6 0 , 4 0 7 R . C H A P T E R 3 I N S T R U M E N T A T I O N A N D S O F T W A R E M a n h a s r e c e i v e d d i r e c t f r o m G o d o n l y o n e i n s t r u m e n t w h e r e w i t h t o k n o w h i m s e l f a n d t o k n o w h i s r e l a t i o n t o t h e u n i v e r s e - h e h a s n o o t h e r - - a n d t h a t i n s t r u m e n t i s r e a s o n . L e o T o l s t o i A c o m b i n a t i o n o f i n s t r u m e n t a t i o n , s o f t w a r e , a n d e l e c t r i c a l c i r c u i t s i n u s e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n . A h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y i n s t r u m e n t i s i n t e r f a c e d t o a c o m p u t e r b y b o t h a c o m m e r c i a l a n a l o g / d i g i t a l i n t e r f a c e b o a r d a n d a p r o t o t y p e b o a r d , b u i l t i n - h o u s e , w h i c h c o n t a i n e d a p r o g r a m m a b l e p a r a l l e l i n t e r f a c e c h i p . T h i s c h a p t e r d e s c r i b e s b o t h t h e h a r d w a r e ( c o m p u t e r , H P L C i n s t r u m e n t , c i r c u i t s , a n d s u p p o r t i n g p e r i p h e r a l s ) a n d t h e s o f t w a r e ( e x p e r t s y s t e m a n d o t h e r s o f t w a r e ) u s e d i n t h i s r e s e a r c h . S e c t i o n 3 . ] E x p e r t S y s t e m S e c t i o n 3 . I . I A I L a n g u a g e s V e r s u s C o m m e r c i a l S h e l l s A s m e n t i o n e d i n C h a p t e r 2 , t h e r e a r e t w o a p p r o a c h e s t h a t c a n b e u s e d w h e n d e v e l o p i n g a n e x p e r t s y s t e m . T h e fi r s t a p p r o a c h i s t o w r i t e t h e s h e l l , c o n t a i n i n g t h e i n f e r e n c e e n g i n e a n d m a n - m a c h i n e i n t e r f a c e , f r o m s o m e o t h e r l o w e r - l e v e l c o m p u t e r l a n g u a g e s u c h a s C o r P r o l o g . T h e A I l a n g u a g e a p p r o a c h p r o v i d e s f a s t e r e x e c u t i o n s p e e d s a n d b e t t e r c u s t o m i z a b i l i t y o f t h e e x p e r t s y s t e m f o r t h e p a r t i c u l a r a p p l i c a t i o n . T h i s a p p r o a c h d o e s r e q u i r e m o r e t i m e a n d k n o w l e d g e o n t h e p a r t o f t h e k n o w l e d g e e n g i n e e r . T h e l a n g u a g e a p p r o a c h r e q u i r e s t h a t t h e k n o w l e d g e e n g i n e e r b e p r o fi c i e n t i n 5 9 6 0 b o t h p r o g r a m m i n g t e c h n i q u e s a n d i n t h e s k i l l s o f t h e k n o w l e d g e e n g i n e e r p o s i t i o n i t s e l f . W h i l e t h i s c o m p u t e r p r o fi c i e n c y h a s b e e n r e q u i r e d i n t h e p a s t w h e n c o m m e r c i a l s h e l l s w e r e u n a v a i l a b l e , k n o w l e d g e e n g i n e e r s a r e n o w e x p e c t e d t o h a v e s k i l l s w i t h t h e a p p l i c a t i o n i t s e l f . 1 T h i s f a m i l i a r i t y w i t h t h e a r e a o f t h e a p p l i c a t i o n a l l o w s f o r a m o r e r a p i d i m p l e m e n t a t i o n o f t h e e x p e r t s y s t e m a n d a d e c r e a s e i n t r a i n i n g t i m e f o r t h e k n o w l e d g e e n g i n e e r , w h o n o w c o u l d a l s o b e t h e e x p e r t , t h a t i s n e e d e d t o b e c o m e k n o w l e d g e a b l e i n t h e l a n g u a g e a n d r e q u i r e d s k i l l s o f t h e a p p l i c a t i o n . T o p r o v i d e t h e k n o w l e d g e e n g i n e e r w i t h m o r e t i m e t o b e c o m e f a m i l i a r w i t h t h e k n o w l e d g e d o m a i n o f t h e a p p l i c a t i o n , e x p e r t s y s t e m t o o l s , s u c h a s c o m m e r c i a l s h e l l s , m u s t b e d e v e l o p e d t h a t a l l o w h i m / h e r t o c r e a t e t h e e x p e r t s y s t e m w i t h m i n i m a l p r o g r a m m i n g . M o s t c o m m e r c i a l s h e l l s c o n t a i n a f r a m e w o r k t h a t i n c o r p o r a t e s a d v a n c e d d a t a b a s e a n d i n f e r e n c e t e c h n i q u e s , a n d p r o v i d e s s o p h i s t i c a t e d u s e r i n t e r f a c e s . 2 T h e k n o w l e d g e e n g i n e e r c a n r a p i d l y d e v e l o p a n d d i s t r i b u t e t h e e x p e r t s y s t e m c a n b e m o r e q u i c k l y p r o t o t y p e d . A d d i t i o n a l l y , o t h e r e x p e r t s y s t e m s d e v e l o p e d f r o m t h e s a m e s h e l l w i l l b e s i m i l a r i n d e s i g n . T h i s i s a v e r y i m p o r t a n t a s p e c t t o c o n s i d e r i n i n d u s t r y w h e r e a c o n c e r n o f m a n a g e m e n t i s t h e c o s t r e q u i r e d t o t r a i n e m p l o y e e s t o u s e d i f f e r e n t c o m p u t e r t o o l s . W h i l e s h e l l s a r e a p o w e r f u l t o o l , t h e r e s u l t a n t e x p e r t s y s t e m b a s e d o n a c o m m e r c i a l s h e l l i s o f t e n l e s s e x t e n d i b l e a n d i s s l o w e r t h a n a n e x p e r t s y s t e m b a s e d o n a n A I l a n g u a g e . W a d e , C r o u c h , a n d B e t t e r i d g e h a v e c o m p a r e d b o t h A I l a n g u a g e s a n d c o m m e r c i a l s h e l l s . 3 L a f f e y 4 h a s a l s o e v a l u a t e d t r a d i t i o n a l s h e l l s a s a p p l i e d t o s y s t e m s t h a t m o n i t o r a n d c o n t r o l c o m p l e x i n s t r u m e n t s a n d o t h e r s y s t e m s i n r e a l - t i m e . A s u m m a r y o f t h e i r c o n c l u s i o n s i s p r e s e n t e d i n T a b l e 3 . 1 ; h o w e v e r , s o m e o f t h e c o m p a r i s o n s h a v e c h a n g e d a s t h e c o m m e r c i a l s h e l l s h a v e e v o l v e d . 6 1 T a b l e 3 . 1 C o m p a r i s o n o f S h e l l s W r i t t e n f r o m a n A l L a n g u a g e s v e r s u s C o m m e r c i a l l y - A v a i l a b l e S h e l l s R e m a r k A I L a n g u a g e s S h e l l s H a n d - c r a f t e d b y l o c a l C o m m e r c i a l S y s t e m . T p r o g r a m m e r . S o u r c e c o d e a v a i l a b l e a n d S o u r c e c o d e u s u a l l y n o t a v a i l a b l e . f m o d i f i a b l e } C o m m a n d s e t a n d k n o w l e d g e L i m i t e d t o s u p p l i e d c o m m a n d s . * 1 f o r m a l i s m a r e e x t e n s i b l e . I S u p p o r t o f s o u n d , c o l o r , a n d S u p p o r t o f g r a p h i c s , m o u s e , e t c . 2 g r a p h i c s l i m i t e d o n l y b y r o u t i n e l y a d d e d . * p r o g r a m m e r . S l o w i m p l e m e n t a t i o n o f e x p e r t F a s t d e v e l o p m e n t o f t h e s y s t e m } ; s y s t e m . F l e x i b l e / m o d i f i a b l e u s e r i n t e r f a c e . 1 r M o r e l i m i t e d i n t e r f a c e , b u t s o m e 3 c o n t r o l o f f e r e d t o e n g i n e e r . U s e r i n t e r f a c e / e r r o r c h e c k i n g U s e r i n t e r f a c e u s u a l l y i n c l u d e d . r o u t i n e s m u s t b e w r i t t e n } E r r o r c h e c k i n g p o s s i b l e . C o n s i s t e n t i n t e r f a c e . N o e x t e r n a l s u p p o r t f o r s y s t e m : r S y s t e m s u p p o r t e d b y v e n d o r } R o u t i n e s t o a c c e s s o f e x t e r n a l I n t r i n s i c s u p p o r t o f e x t e r n a l 4 p r o g r a m s m u s t b e w r i t t e n . p r o g r a m s . l i m i t e d t o t h e s u p p l i e d l i m i t e d o n l y b y p r o g r a m m e r . c a l l s o f t h e c o m m a n d s e t . * F a s t e x e c u t i o n , a m e n a b l e t o r e a l - S l o w , n o t o p t i m i z e d f o r p a r t i c u l a r t i m e a p p l i c a t i o n s . “ a p p l i c a t i o n s . “ I n p u t f r o m n o n - h u m a n s o u r c e s N o t o f t e n i m p l e m e n t e d . l i m i t s p o s s i b l e . A l l o w s i m p l e m e n t a t i o n f o r r e a l - t i m e m o n i t o r i n g / c o n t r o l o f s y s t e m s . “ a p p l i c a t i o n s . 1 m L e g e n d 1 - f r o m W a d e , C r o u c h , a n d B e t t e r i d g e # i n c l u d e s p r o p o s e d r e v i s i o n s b y t h e a u t h o r t o W a d e , C r o u c h , a n d B e t t e r i d g e 3 n f r o m l a f f e y D i s c u s s i o n o f t h e s u g g e s t e d c h a n g e s i s b a s e d o n t h e s h e l l u s e d i n t h i s t h e s i s , n a m e l y V P - E x p e r t , v e r s i o n s 2 . 0 a n d 3 . 0 ( W o r d T e c h S y s t e m s , I n c . , O r i n d a , C A ) . S o m e c o m p a r i s o n s t o o t h e r s y s t e m s w i l l b e m e n t i o n e d b r i e fl y . 1 . A l t h o u g h u s e r s a r e l i m i t e d t o t h e s u p p l i e d c o m m a n d s , t h e c o m m a n d s e t f o r c o m m e r c i a l s h e l l s h a s b e c o m e q u i t e r i c h a n d d i v e r s e . C u r r e n t c o m m a n d s t h a t 6 2 a r e i m p l e m e n t e d i n V P - E x p e r t i n c l u d e : f o r w a r d / b a c k w a r d c h a i n i n g , l o o p c o n s t r u c t i o n s ( F O R , W H I L E T ' R U E , W H I L E K N O W N ) , f i l e m a n i p u l a t i o n ( t e x t , d a t a b a s e , s p r e a d s h e e t ) , g r a p h i c s , a n d s t r i n g h a n d l i n g , a m o n g o t h e r s . E x t r a f e a t u r e s a r e a v a i l a b l e v i a e x t e r n a l p r o g r a m ( s e e p o i n t 4 ) . V P - E x p e r t h a s s u p p o r t e d m o u s e c o n t r o l , c o l o r , a n d g r a p h i c s s i n c e v e r s i o n 1 . 1 ( 1 9 8 8 ) . l a t e r i m p l e m e n t a t i o n s a l l o w t h e c r e a t i o n o f d y n a m i c i m a g e s w h i c h a r e p r e - d e f i n e d g r a p h i c a l c o n s t r u c t s t h a t a r e d y n a m i c a l l y l i n k e d t o t h e v a l u e o f a p a r t i c u l a r v a r i a b l e . T h e g r a p h i c a l o b j e c t i s u p d a t e d a s t h e v a l u e o f t h e v a r i a b l e c h a n g e s . 5 E x a m p l e s o f d y n a r r r i c i m a g e s w o u l d b e g a u g e s , b u t t o n s , a n d g r a p h s . T h e s e d y n a m i c i m a g e s c a n b e c o m b i n e d t o c r e a t e v i s u a l r e p r e s e n t a t i o n s o f i n s t r u m e n t a t i o n , p r e s e n t r e s u l t s g r a p h i c a l l y , s u c h a s c h r o m a t o g r a m s , a n d s o f o r t h . O n e a p p l i c a t i o n o f d y n a m i c i m a g e s w o u l d b e t o c r e a t e a d i a g r a m o f a n H P L C i n s t r u m e n t i n w h i c h t h e u s e r w o u l d b e a b l e t o s e l e c t d i f f e r e n t p o i n t s ( e . g . , i n j e c t o r s i t e ) o n t h e d i a g r a m t o d i r e c t t h e e x p e r t s y s t e m t o p r o v i d e d i a g n o s t i c i n f o r m a t i o n c o n c e r n i n g t h a t a r e a . I n a d d i t i o n t o d y n a m i c i m a g e s , V P - F x p e r t v e r s i o n 3 . 0 c a n r e a d g r a p h i c fi l e s s t o r e d i n P C X f o r m a t f r o m s o m e d e v i c e , s u c h a s a h a r d d i s k , a n d d i s p l a y i t o n s c r e e n . T h i s c a p a b i l i t y w o u l d a l l o w r e p r e s e n t a t i v e c h r o m a t o g r a m s t o b e d i s p l a y e d . T a b l e 3 . 2 p r o v i d e s a l i s t o f t h e g r a p h i c f o r m a t s t h a t o t h e r e x p e r t s y s t e m s h e l l s a r e a b l e t o i m p o r t . V P - E x p e r t s u p p o r t s t h e c r e a t i o n o f " s m a r t f o r m s , " d i s p l a y s c r e e n s t h a t r e s e m b l e r e g u l a r p a p e r f o r m s . I n t e g r a l t o t h e s e s m a r t f o r m s a r e g r a p h i c a l c o n s t r u c t s c a l l e d ” F o r m f i e l d s . ” F o r m fi e l d s a r e r e c t a n g u l a r b o x e s c o n t a i n i n g t h e v a l u e o f a n a s s o c i a t e d v a r i a b l e . A u s e r m a y s e l e c t t h e f o r m fi e l d a n d a p u l l - d o w n m e n u 6 3 a p p e a r s f r o m w h i c h t h e u s e r m a y s e l e c t a l e g a l r e s p o n s e t o t h e v a r i a b l e . S m a r t f o r m s m a y b e u s e d c o n j u n c t i o n w i t h t h e o t h e r g r a p h i c a l d y n a m i c i m a g e s m e n t i o n e d a b o v e t o a l l o w t h e k n o w l e d g e e n g i n e e r t o h a v e c o n t r o l o f t h e f o r m a t o f t h e i n t e r f a c e . T h e u s e r s u p p l i e s a n s w e r s t o a l l t h e a n s w e r s o n t h e s c r e e n a n d e v e n t u a l l y s e l e c t s a n " A L L D O N E " b u t t o n t o e n t e r t h i s i n f o r m a t i o n i n t o t h e c o m p u t e r . T h e u s e r m a y a n s w e r m a n y q u e s t i o n s a t o n c e a n d e d i t t h e a n s w e r s b e f o r e s u b m i t t i n g t h e m t o t h e e x p e r t s y s t e m . V i a a s m a r t f o r m , a k n o w l e d g e e n g i n e e r c a n c r e a t e a n i n t e r f a c e t h a t m i r r r i c s f o r m s w i t h w h i c h t h e u s e r m i g h t a l r e a d y b e f a m i l i a r ( e . g . , m e d i c a l d i a g n o s t i c f o r m s ) . S m a r f o r m s d o r e q u i r e t h a t t h e e n g i n e e r w r i t e m o r e c o m p l e x c o d e t o c r e a t e v i s u a l l y a p p e a l i n g f o r m s . T h e k n o w l e d g e e n g i n e e r m a y a l s o u s e s i m u l t a n e o u s l y t r a d i t i o n a l q u e s t i o n - r e s p o n s e f o r m a t ( d i a l o g i c ) t o g e n e r a t e a w i d e v a r i e t y o f u s e r - i n t e r f a c e s . 4 . V P - E x p e r t s u p p o r t s d i r e c t c a l l s t o L o t u s - a n d D B a s e - c o m p a t i b l e s p r e a d s h e e t s a n d d a t a b a s e s , r e s p e c t i v e l y . V P - E x p e r t a l s o m a y d i r e c t l y i n v o k e e x t e r n a l e x e c u t a b l e f i l e s ( * . E X E , * . C O M , a n d * . B A T ) ; l i m i t e d o n l y b y t h e a v a i l a b l e c o m p u t e r m e m o r y . T h i s f e a t u r e a l l o w s t h e k n o w l e d g e e n g i n e e r t o w r i t e , o r u s e p r e - e x i s t i n g , s u p p o r t i n g s o f t w a r e i n m o r e a p p r o p r i a t e l a n g u a g e s ( e . g . , d a t a m a n i p u l a t i o n i n a l a n g u a g e s u c h a s C o r B A S I C ) . T a b l e 3 . 2 , a d a p t e d f r o m T w a y a n d R i e d e l , 6 p r e s e n t s s o m e o f t h e f e a t u r e s o f d i f f e r e n t e x p e r t s y s t e m s a n d A I l a n g u a g e s t h a t a r e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e . T h e fi r s t t w o c o l u m n s g i v e t h e s o f t w a r e n a m e a n d c o m p a n y . T h e H y p e r t e x t , a n d G r a p h i c s , a n d D a t a A c c e s s c o l u m n s p r o v i d e s i n f o r m a t i o n o n w h e t h e r t h e s e f e a t u r e s , a n d f o r m a t , a r e d i r e c t l y s u p p o r t e d i n t h e p a c k a g e . P r i c e s l i s t e d i n p a r e n t h e s i s i n d i c a t e a d d i t i o n a l c o s t s t h a t a r e r e q u i r e d t o o b t a i n t h a t s p e c i f i c f e a t u r e . T h i s t a b l e l i s t s t h e d i f f e r e n t f e a t u r e s 6 4 t h a t a r e a v a i l a b l e a n d s h o w s t h a t V P - E x p e r t i s a n a p p r o p r i a t e c h o i c e f o r d e v e l o p i n g s m a l l - t o m e d i u m - s i z e d e x p e r t s y s t e m s . B a s e d u p o n t h e a b o v e c o n s i d e r a t i o n s i n T a b l e 3 . 1 a n d t h e s u b s e q u e n t d i s c u s s i o n , t h e d e c i s i o n w a s m a d e t o i m p l e m e n t t h e e x p e r t s y s t e m d e s c r i b e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n u s i n g o n e o f t h e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e s h e l l s . T h i s d e c i s i o n a l l o w e d t h e p r o j e c t t o b e d e v e l o p e d b y c h e m i s t r y s p e c i a l i s t s w h o o t h e r w i s e d i d n o t h a v e t h e e x p e r i e n c e a n d / o r e x p e r t i s e i n d e v e l o p i n g a c o m p l e x e x p e r t s y s t e m s h e l l . T h e p r o t o t y p e e x p e r t s y s t e m w a s i m p l e m e n t e d u s i n g M - 1 a n d t h e n a d a p t e d t o V P - E x p e r t . S e c t i o n 3 . I . 2 M I E x p e r t S y s t e m S h e l l T h e p r o t o t y p e H P L C e x p e r t s y s t e m w a s d e v e l o p e d u s i n g t h e c o m m e r c i a l s h e l l , M 1 , v e r s i o n 1 . 0 ( 1 ‘ e k n o w l e d g e , I n c . , P a l o A l t o , C A ) . M 1 w a s d e v e l o p e d i n i t i a l l y f o r u s e o n m a i n f r a m e c o m p u t e r s a n d w a s s u b s e q u e n t l y p o r t e d t o t h e P C e n v i r o n m e n t , w h i c h c o u l d h a v e c a u s e d s o m e o f i t s l i m i t a t i o n s d e s c r i b e d b e l o w . l T h e i n i t i a l v e r s i o n o f M 1 w a s v e r y e x p e n s i v e ( $ 1 0 , 0 0 0 ) a n d h a d s l o w e x e c u t i o n s p e e d s d u e t o b e i n g e n c o d e d i n t h e P r o l o g l a n g u a g e . B e c a u s e o f l i m i t e d m e m o r y , t h e k n o w l e d g e b a s e w a s r e s t r i c t e d t o a m a x i m u m o f 2 5 0 r u l e s . M 1 w a s a l s o u n a b l e t o s u p p o r t a l l o f t h e a v a i l a b l e m e m o r y , s u c h a s e x p a n d e d o r e x t e n d e d m e m o r y , o f a P C . V e r s i o n 2 . 0 w a s r e - c o d e d i n t h e C p r o g r a m m i n g l a n g u a g e t o i m p r o v e s p e e d a n d t o m i n i m i z e m e m o r y c o n s t r a i n t s s u c h t h a t t h e k n o w l e d g e b a s e w a s i n c r e a s e d t o 1 0 0 0 r u l e s . W i t h t h e l i m i t o f 1 0 0 0 r u l e s , t h e k n o w l e d g e b a s e o f t h e p r o t o t y p e s t i l l e x c e e d e d t h e a v a i l a b l e s p a c e . T h e s p a c e l i m i t a t i o n s n e c e s s i t a t e d b r e a k i n g t h e k n o w l e d g e b a s e i n t o s e v e r a l p a r t s w h i c h r e q u i r e d t h a t a l l i m p o r t a n t p a r a m e t e r s ( v a r i a b l e s , i n t e r m e d i a t e r e s u l t s , a n d s o f o r t h ) w e r e p r e s e r v e d b e t w e e n c a l l s f r o m o n e k n o w l e d g e b a s e fi l e t o t h e n e x t f i l e . T h e s e a d a p t a t i o n s c r e a t e d a d d i t i o n a l o v e r h e a d i n e x e c u t i o n t i m e . T h e u s e r i n t e r f a c e w a s a l s o f o u n d t o b e q u i t e d i f f i c u l t t o u s e . F i n a l l y , d i r e c t c o m m u n i c a t i o n w i t h 6 5 d a t a b a s e s , s p r e a d s h e e t s , a n d e x e c u t a b l e p r o g r a m s w a s n o t p o s s i b l e , a l t h o u g h a n e x t e n s i o n , o r b o o k , i n t h e M 1 s y s t e m a l l o w e d p r o g r a m m e r s t o w r i t e i n t e r f a c e s i n C t o c o m m u n i c a t e w i t h t h e s e p r o g r a m s . S i n c e m u l t i p l e c a l l s t o e x t e r n a l p r o g r a m s w e r e e n v i s i o n e d i n t h e fi n a l v e r s i o n o f t h i s e x p e r t s y s t e m , t h e d e c i s i o n w a s m a d e t o t r a n s f e r t h e e x p e r t s y s t e m t o a p r o g r a m t h a t s u p p o r t e d t h e s e c a l l s i n t r i n s i c a l l y . s o t h a t f a s t e r , a n d e a s i e r , c a l l s c o u l d b e m a d e . S e c t i o n 3 . 1 . 3 V P - E x p e r t E x p e r t S y s t e m S h e l l S u b s e q u e n t d e v e l o p m e n t o f t h e e x p e r t s y s t e m d e s c r i b e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n w a s a c c o m p l i s h e d u s i n g V P - E x p e r t ( P a p e r B a c k S o f t w a r e , B e r k e l e y , C A ) . P r e l i m i n a r y p r o t o t y p i n g w a s a c c o m p l i s h e d u s i n g v e r s i o n 1 . 0 w i t h a m a j o r i t y o f t h e e x p e r t s y s t e m c o m p l e t e d u s i n g v e r s i o n 2 . 0 . T h e f i n a l v e r s i o n u s e s v e r s i o n 3 . 0 ( W o r d T e c h S y s t e m s , I n c . O r i n d a , C A ) . M a n y o f t h e a d v a n c e d f e a t u r e s o f V P - E x p e r t w e r e n o t i m p l e m e n t e d . T h e s e c a p a b i l i t i e s w i l l b e d i s c u s s e d i n C h a p t e r 7 w i t h r e s p e c t t o t h e f u t u r e d e v e l o p m e n t o f t h e s y s t e m . O n e g o a l o f t h e w o r k d e s c r i b e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n w a s t o c r e a t e a s y s t e m t h a t c o u l d b e r u n b y t h e w i d e s t v a r i e t y o f P C - c o m p a t i b l e s y s t e m s . M a n y s h e l l s a r e s t i l l q u i t e e x p e n s i v e a n d / o r r e q u i r e e x p e n s i v e c o m p u t e r h a r d w a r e a n d s o f t w a r e , w h i c h w o u l d m i n i m i z e t h e u s e o f s u c h a s y s t e m a n d i n a c a d e m i a , w h e r e t h e e x p e r t s y s t e m w a s e n v i s i o n e d t o b e p r i m a r i l y u s e d . A s m e n t i o n e d i n C h a p t e r s 1 a n d 4 , o n e o b j e c t i v e o f t h i s s y s t e m i s f o r t h e e x p e r t s y s t e m t o s e r v e a s a t e a c h i n g t o o l . 6 6 T a b l e 3 . 2 C o m p a r i s o n o f D i f f e r e n t E x p e r t S y s t e m s T a b l e a d a p t e d f r o m T w a y a n d R i e d e l 6 S o f t w a r e C o m p a n y D O S n d o w s H y p e r - G r a p h i c s D a t a C o s t C o s t t e x t A c c e s s 9 5 Y 7 9 A D Y 2 , 4 ( $ 1 7 9 ) ( $ 1 7 9 D O S ) 2 4 9 W I N ( D O S ) 2 , 4 5 N A ( D O S ) D e v e l . C e n t e r L e g e n d G r a p h i c s D a t a A c c e s s O t h e r 1 S c r e e n C a p t u r e A A S C I I E x t r a c o s t s f o r t h e 2 B M P F o r m a t D d B A S E d i f f e r e n t f u n c t i o n s a r e 3 T I F F F o r m a t E E x c e l g i v e n i n p a r e n t h e s i s 4 P C X F o r m a t I I n g r e s u n d e r t h e c o l u m n s 5 C l i p b o a r d L L o t u s w h e r e e x t r a m o d u l e s / 0 O r a c l e v e r s i o n s a r e n e e d e d . P P a r a d o x q Q u a t r o P r o 6 7 V P - E x p e r t i s c o m p i l e d i n M i c r o s o f t C v e r s i o n 6 . 0 ( R e d m o n d , W A ) w h i c h a l l o w s f a s t e x e c u t i o n . V P - E x p e r t a l l o w s m i x e d m o d e s o f b o t h f o r w a r d a n d b a c k w a r d c h a i n i n g . R u l e s a r e e n c o d e d i n p r o d u c t i o n r u l e f o r m a t ( I F T H E N f o r m a t ) b u t d o n o t s u p p o r t a d v a n c e d f e a t u r e s s u c h a s o b j e c t s a n d f r a m e s . T h e p r o g r a m d i r e c t l y s u p p o r t s s p r e a d s h e e t s M K ] a n d W K S f o r m a t ) a n d d a t a b a s e s ( d B a s e I I , 1 1 1 , 1 1 1 + f o r m a t ) . T h e p r o g r a m h a s a n i n t e g r a t e d e d i t i n g a n d d e b u g g i n g f a c i l i t y t o a s s i s t i n g e n e r a t i n g c o r r e c t s y n t a x . I n a d d i t i o n , t h e p r o g r a m g e n e r a t e s b o t h t r a c e s a n d r e p o r t s t o s h o w t h e i n d u c t i o n p a t h t h a t w a s t a k e n . A t r a c e i s a n o u t p u t t h a t s h o w s t h e d i f f e r e n t r u l e s t h a t w e r e u s e d b y t h e i n f e r e n c e e n g i n e t o o b t a i n t h e v a l u e s f o r t h e g o a l s s p e c i fi e d i n t h e e x p e r t s y s t e m . A r e p o r t i s a f i l e t h a t c o n t a i n s t h e e x p l a n a t o r y t e x t c o n t a i n e d i n t h e B E C A U S E c l a u s e s o f e v e r y r u l e t h a t w a s i n v o k e d . T h e r e p o r t f e a t u r e f a c i l i t a t e s i n d e b u g g i n g t h e s y s t e m a n d i n u s i n g t h e e x p e r t s y s t e m a s a t u t o r i a l t o o l . R e v i e w s o f V P - E x p e r t p r o v i d e a d d i t i o n a l d e s c r i p t i o n s a n d c r i t e r i a t h a t w e r e u s e d i n c h o o s i n g t h i s s h e l l . 7 ' 8 ' 9 P r e s e n t e d b e l o w i n T a b l e 3 . 3 a r e t h e r e q u i r e m e n t s a n d f e a t u r e s o f V P - E x p e r t . S o m e o f t h e f e a t u r e s i n T a b l e 3 . 3 d e s e r v e s p e c i a l m e n t i o n . W h i l e i t i s p o s s i b l e t o u s e o t h e r e d i t o r s ( e . g . , w o r d p r o c e s s o r s ) , a n i n t e g r a t e d e d i t o r a l l o w s t h e i n f e r e n c e e n g i n e t o c h e c k t h e s y n t a x o f t h e c o d e a n d s h o w w h e r e a n e r r o r o c c u r s . W h i l e o f t e n o v e r l o o k e d , s h o w i n g t h e p o s i t i o n o f a n e r r o r c a n b e a n e s s e n t i a l f e a t u r e f o r t h e n o v i c e k n o w l e d g e e n g i n e e r . V P - E x p e r t p r e s e n t s t h e t r a c e m o d e i n b o t h a t e x t a n d a g r a p h i c s m o d e . T h e t r a c e m o d e i s h e l p f u l , b u t i t i s n o t a s e l a b o r a t e o r “ u s e r - f r i e n d l y " a s s o m e o f t h e m o r e e x p e n s i v e / c o m p l e x e x p e r t s y s t e m s ( p a r t i c u l a r l y t h e W i n d o w s - b a s e d o n e s ) . 6 8 T a b l e 3 . 3 S u m m a r y o f F e a t u r e s o f V P - E x p e r t I t e m W C o m p u t e r I B M P C , X T , o r h i g h e r R A M 0 5 1 2 K . E x t e n d e d a n d E x p a n d e d M e m o r y S u p p o r t e d G r a p h i c s S u p p o r t e d H e r c u l e s ! C G A , E G A , V G A M o u s e S u p p o r t e d ( R e q u i r e d f o r G r a p h i c s o p e r a t i o n s ) I n f e r e n c e E n g i n e F o r w a r d / B a c k w a r d C h a i n i n g E x t e r n a l P r o g r a m s . E x e c u t a b l e P r o g r a m s ( . E X E , . C O M , . B A T ) . D a t a b a s e ( d B a s e I I , I I I , I I l + c o m p a t i b l e ) 0 S p r e a d s h e e t ( W K S f o r m a t ) a T e x t a n d H y p e r T e x t F i l e s G r a p h i c s o D y n a m i c i m a g e s ( m e t e r s , g a u g e s , b u t t o n s ) o G r a p h i c P r i m i t i v e s P C X f o r m a t f i l e s D e b u g g i n g l r l r l t e g r k i i g e d E d i t o r w i t h S y n t a x c e c g T r a c e M o d e ( T e x t / G r a p h i c s ) " W H A T I F " f e a t u r e s W H Y a n d H O W s u p p o r t e d R e p o r t G e n e r a t i o n T h e W H Y a n d H O W f u n c t i o n s w e r e d e s c r i b e d i n C h a p t e r 2 . T h e " W H A T I F " c a p a b i l i t y a l l o w s t h e u s e r t o c h a n g e t h e v a l u e o f o n e o f t h e v a r i a b l e s a f t e r t h e c o n s u l t a t i o n i s c o m p l e t e d . T h e o b v i o u s u t i l i t y o f t h i s p r o c e d u r e i s t o a l l o w t h e u s e r t o c o r r e c t a n i n v a l i d r e s p o n s e t h a t t h e u s e r p r o v i d e d d u r i n g t h e c o n s u l t a t i o n . T h e m o r e i n t r i g u i n g a p p l i c a t i o n i s t o u s e t h i s f u n c t i o n a s a l e a r n i n g t o o l . T h e u s e r c a n c h a n g e t h e v a l u e s o f d i f f e r e n t v a r i a b l e s a n d c a n o b s e r v e t h e e f f e c t t h e c h a n g e s h a v e o n t h e r e s u l t s 6 9 o f t h e c o n s u l t a t i o n . T h e u s e r c a n d e d u c e t h e i m p o r t a n c e a n d i n t e r a c t i o n o f d i f f e r e n t f a c t s . T h i s o b s e r v a t i o n a l l o w s t h e e x p e r t s y s t e m t o s e r v e a s a t u t o r i a l t o o l . S e c t i o n 3 . 1 . 4 A d d i t i o n a l S o f t w a r e S u p p o r t E f fi c i e n t e x p e r t s y s t e m s a r e g e n e r a t e d w h e n d y n a m i c i n f o r m a t i o n i s s t o r e d i n a f o r m a t t h a t a l l o w s r a p i d a n d e a s y e d i t i n g o f t h e d a t a . E x p e r t s y s t e m s a r e a l s o t h e m o s t p o w e r f u l w h e n t h e y c a n a c c e s s t h e l a r g e b o d y o f t h e i n f o r m a t i o n t h a t m a y b e a l r e a d y a v a i l a b l e . T o i m p l e m e n t t h i s i d e a , m o s t o f t h e f a c t s f o r t h e p r o j e c t d e s c r i b e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n a r e s t o r e d i n d a t a b a s e s a n d t e x t f i l e s . I t w a s d e c i d e d t h a t t h e m o s t e f fi c i e n t s t o r a g e o f i n f o r m a t i o n i n t h i s c a s e w o u l d b e v i a a d a t a b a s e p r o g r a m , V P - I n f o ( P a p e r B a c k S o f t w a r e , B e r k e l e y , C A ) . T e x t f i l e s w e r e c r e a t e d u s i n g W o r d 5 . 0 ( M i c r o s o f t C o r p . , R e d m o n d , W A ) a n d s t o r e d i n A S C I I f o r m a t . S o m e o f t h e s e t e x t f i l e s w e r e t h e n c o n v e r t e d i n t o h y p e r t e x t f o r m a t . H y p e r t e x t f o r m a t a l l o w s c r o s s - r e f e r e n c i n g o f w o r d s v i a I N D E X E R . C O M , a n a n c i l l a r y p r o g r a m i n c l u d e d w i t h V P - E x p e r t . T h i s f o r m a t a l l o w s c o m p r e h e n s i v e h e l p fi l e s a n d e x p l a n a t o r y i n f o r m a t i o n t o b e a v a i l a b l e w i t h o u t s t o r i n g t e x t i n s i d e t h e k n o w l e d g e b a s e i t s e l f . S e c t i o n 3 . 2 H P L C E q u i p m e n t a n d S u p p l i e s T h i s s e c t i o n d e s c r i b e s t h e H P L C i n s t r u m e n t a t i o n u s e d i n t h i s r e s e a r c h . I n a d d i t i o n t o t h e p r e r e q u i s i t e p u m p , i n j e c t o r v a l v e , c o l u m n , a n d d e t e c t o r , s e v e r a l a d d i t i o n a l v a l v e s w e r e u s e d . 7 0 S e c t i o n 3 . 2 . 1 I n s t r u m e n t a t i o n A S p e c t r a P h y s i c s 8 7 0 0 T e r n a r y S o l v e n t D e l i v e r y S y s t e m ( F r e e m o n t , C A ) w a s u s e d f o r t h i s r e s e a r c h . T h e s o l v e n t d e l i v e r y s y s t e m c a n b e c o n t r o l l e d e i t h e r m a n u a l l y o r b y c o m p u t e r ( f u r t h e r d e t a i l s a r e g i v e n i n C h a p t e r 6 ) . F o r t h e r e c y c l e h e a r t c u t e x p e r i m e n t s , a C h r o m a t r o n i x M o d e l 2 2 5 M i x e d W a v e l e n g t h A b s o r b a n c e D e t e c t o r ( B e r k e l e y , C A ) w a s c o n n e c t e d t o a C h r o m a t r o n i x M o d e l 2 2 0 A b s o r b a n c e C o n t r o l l e r ( B e r k e l e y , C A ) t o p r o v i d e d e t e c t a b i l i t y a t w a v e l e n g t h s 1 . 1 , 1 . 2 , 1 . 1 - 1 . 2 , a n d 1 . 2 - 1 1 ( w h e r e 1 . 1 a n d l 2 a r e 2 5 4 a n d 2 8 0 n m , r e s p e c t i v e l y ) . O u t p u t w a s c o n n e c t e d t o t h e c o m p u t e r v i a a n i n - h o u s e d e s i g n e d i n t e r f a c e c o n n e c t o r ( v i d e i n f r a ) a n d a l s o c o n n e c t e d t o a H e a t h S c h l u m b e r g e r M o d e l E U - 2 0 0 - 0 1 P o t e n t i o m e t r i c A m p l i fi e r . A d d i t i o n a l H P L C e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d u s i n g a S y s t e m G o l d P r o g r a m m a b l e D e t e c t o r , M o d u l e 1 6 6 ( B e c k m a n I n s t r u m e n t s , A r l i n g t o n H e i g h t s , I L ) . T h e d e t e c t o r i s c o n n e c t e d t o a N E C P 0 8 3 0 0 c o m p u t e r c o n t r o l l e r ( N E C E l e c t r o n i c s , I n c . , 7 5 0 1 F o o t h i l l s B l v d . , R o s e v i l l e , C A ) v i a a S y s t e m G o l d A n a l o g I n t e r f a c e , M o d u l e 4 0 6 ( B e c k m a n I n s t r u m e n t s , A r l i n g t o n H e i g h t s , 1 1 . ) . S e c t i o n 3 . 2 . 2 S o l v e n t s S o l v e n t s i n t h i s r e s e a r c h w e r e s p e c t r o p h o t o m e t r i c g r a d e f r o m v a r i o u s s o u r c e s . A l l s o l v e n t s w e r e v a c u u m f i l t e r e d w i t h a M i l l i p o r e fi l t r a t i o n s y s t e m u s i n g S a r t o r i u s # 2 0 0 0 6 4 7 - N 0 . 4 5 u m n y l o n f i l t e r p a p e r ( G 6 t t i n g e n , G e r m a n y ) . T a p w a t e r w a s p a s s e d t h r o u g h a C o r n i n g M e g a - P u r e D 2 S y s t e m c o n t a i n i n g o r g a n i c a n d i o n i c fi l t e r c a r t r i d g e s a n d t h e n r e - d i s t i l l e d i n g l a s s . S e c t i o n 3 . 2 . 3 C o l u m n s D i f f e r e n t c o l u m n s a r e a v a i l a b l e v i a t h e c o l u m n s e l e c t i o n v a l v e . T h e o n e s t h a t a r e u s e d f o r t h e d i f f e r e n t e x p e r i m e n t s a r e l i s t e d i n T a b l e 3 . 4 . 7 1 S e c t i o n 3 . 3 C o m p u t e r C o n t r o l a n d A u t o m a t i o n A P C - D e s i g n s F D - I O O O X T - c l a s s c o m p u t e r w a s i n i t i a l l y u s e d t o c o n t r o l t h e H P L C s y s t e m . T h e X T ‘ c o m p u t e r w a s u p g r a d e d t o a 1 2 M I - I z A T c l a s s c o m p u t e r ( 8 0 2 8 6 ) . T h e c o m p u t e r w a s u s e d t o c o n t r o l t h e p o s i t i o n s o f t w o s i x — p o r t v a l v e s a n d a c o l u m n s e l e c t i o n v a l v e s . T h e p o s i t i o n s o f t h e v a l v e s w e r e r e a d f r o m a s e t o f v a l v e s e n s o r d e v i c e s . T h e c o m p u t e r w a s a l s o u s e d t o p r o g r a m a n d m o n i t o r t h e H P L C s o l v e n t d e l i v e r y s y s t e m . T a b l e 3 . 4 H P L C C o l u m n s a n d t h e i r P a r a m e t e r s U s e d i n t h i s R e s e a r c h M a n u f a c t u r e r T r a d e N a m e P a c k i n g L e n g t h ( c m ) P a r t i c l e S i z e M a t e r i a l D i a m e t e r ( m m ) ( E m ) ‘ W a t e r s u B o n d a P a k P h e n y l 2 5 x 4 . 6 5 I n H o u s e P e l l i c u l a r N H 2 1 0 x 4 . 6 5 A I l t e c h S p h e r i s o r b N H 2 2 5 x 4 . 6 S Z o r b a x C 8 2 5 x 4 . 6 5 A p p l i e d S c i e n c e s C 1 8 2 5 x 4 . 6 5 Z o r b a x C 1 8 2 5 x 4 . 6 S S e c t i o n 3 . 3 . 1 S i x P o r t R h e o d y n e V a l v e s T w o R h e o d y n e M o d e l 7 0 4 0 a n d 7 0 1 0 s i x - p o r t v a l v e s ( C o t a t i , C A ) w e r e u s e d i n c o n j u n c t i o n w i t h t h e c o l u m n s e l e c t i o n v a l v e ( C S V ) t o p r o v i d e t h e a b i l i t y t o b y p a s s d i f f e r e n t c o l u m n s . O n e p o s s i b l e c o n fi g u r a t i o n u s e d i s p r e s e n t e d b e l o w i n F i g u r e s 3 . 1 ( A - C ) . I n t h e fi r s t c o n fi g u r a t i o n ( F i g u r e 3 . 1 A ) , t h e fl o w i s d i r e c t e d t h r o u g h t h e p r i m a r y c o l u m n a n d o u t t o w a s t e . W h e n t h e v a l v e p o s i t i o n s a r e c h a n g e d t o t h e c o n f i g u r a t i o n s e e n i n F i g u r e 3 . 1 B , t h e e l u i t e c a n b e c o l l e c t e d i n t h e c o l l e c t i o n l o o p t o b e r e c y c l e d b a c k t h r o u g h . c o l u m n : A l o o p w a s u t i l i z e a l o a d t o a c q u i s i t i ) ( H o u s t o - S e Q u e n t t w o a n - V a l v e w I 3 6 0 d E g a C c e s s e . T h e r m ] " ” 0 p u i 7 2 t h r o u g h a s e c o n d c o l u m n ( i f d e s i r e d ) c o n n e c t e d t o t h e C S V . t h r o u g h t h e p r i m a r y c o l u m n , a n d e v e n t u a l l y t o w a s t e . A R h e o d y n e M o d e l 7 1 2 5 s i x p o r t i n j e c t i o n v a l v e ( C o t a t i , C A ) w i t h a 2 0 p l s a m p l e l o o p w a s u s e d . T h e i n j e c t i o n v a l v e i s n o t u n d e r c o m p u t e r c o n t r o l ; h o w e v e r , i t d i d u t i l i z e a r e e d v a l v e a s s e m b l y t o s e n d a m s i g n a l w h e n t h e v a l v e w a s t u r n e d f r o m t h e L o a d t o I n j e c t p o s i t i o n . T h e T ' I ' L s i g n a l w a s u s e d t o i n i t i a t e t h e c o n t r o l l e r a n d d a t a a c q u i s i t i o n s o f t w a r e . S e c t i o n 3 . 3 . 2 C o l u m n S e l e c t i o n V a l v e A p n e u m a t i c a l l y - a c t u a t e d V a l c o m o d e l A C S T 6 U W m u l t i p l e p o s i t i o n v a l v e ( H o u s t o n , T X ) w a s u s e d t o p r o v i d e c o l u m n s e l e c t i o n c a p a b i l i t y . T h i s v a l v e a l l o w s s e q u e n t i a l ( c o u n t e r - c l o c k w i s e o n l y ) a c c e s s t o o n e o f s i x c o l u m n s . T h i s v a l v e r e q u i r e s t w o a i r p u l s e s f o r e v e r y v a l v e p o s i t i o n c h a n g e . T h e f i r s t a i r p u l s e r a t c h e t s , o r a r m s , t h e v a l v e w h i l e t h e s e c o n d a i r p u l s e t h e n c h a n g e s t h e v a l v e . T h e v a l v e i s d e s i g n e d s o t h a t a 3 6 0 d e g r e e t r a n s l a t i o n w i l l i n v o l v e t w e l v e c o l u m n s w i t c h e s ; t h a t i s , e a c h c o l u m n w i l l b e a c c e s s e d t w i c e w i t h i n 3 6 0 d e g r e e s . T w o T I T . s i g n a l s f r o m t h e c o m p u t e r a r e s e n t t o a t i m i n g c i r c u i t ( S e c t i o n 3 . 3 . 6 . 1 ) . T h e t i m i n g c i r c u i t t h e n s e n d s t w o T T ' L p u l s e s o f c o n t r o l l e d d u r a t i o n t o t h e C S V . T h e s e t w o p u l s e s a r m a n d c h a n g e t h e C S V . S e c t i o n 3 . 3 . 3 V a l v e S e n s o r s A l l v a l v e s u s e d i n t h i s r e s e a r c h a r e c o n n e c t e d t o a s w i t c h t o p r o v i d e s t a t u s i n f o r m a t i o n t o t h e c o m p u t e r . T h e R h e o d y n e v a l v e s u s e s a r e e d s w i t c h t o p r o v i d e a T I ' L s i g n a l t o t h e c o m p u t e r t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e v a l v e w a s c l o c k w i s e ( C W ) o r c o u n t e r c l o c k w i s e ( C C W ) . M a g n e t s a t t a c h e d t o t h e r o t o r s o f t h e v a l v e s a r e u s e d t o m a k e e l p o s i t i o r . a n d c o r c h a n g e s p o i n t s . 8 0 t h r o i n i t i a l 1 t h e n C l P o s i t i o . s e v e n I i n p u t s 1 T o m t i r a s i d u ' S i g n e d : i n n - E a . I ‘ e h a b i 7 3 m a k e e l e c t r i c a l c o n t a c t o f t h e s w i t c h e s w h e n t h e v a l v e s a r e s w i t c h e d f r o m C C W t o C W p o s i t i o n . T h e c o l u m n s e l e c t i o n v a l v e ( v i d e i n f r a ) i n c l u d e d a s t a n d o f f c o n t a i n i n g a b u s h i n g a n d c o n t a c t s ( s e e F i g u r e 3 . 2 ) . A s t h e v a l v e p o s i t i o n c h a n g e s , t h e c o n t a c t r o t a t e s a n d c h a n g e s t h e e l e c t r i c a l c o n n e c t i o n b e t w e e n t h e i n i t i a l p o i n t a n d t h e d i f f e r e n t c o n t a c t p o i n t s . T w o p o i n t s a r e p r o v i d e d f o r e a c h v a l v e p o s i t i o n s i n c e a 3 6 0 d e g r e e r o t a t i o n w i l l g o t h r o u g h t w o c o m p l e t e s e t s o f v a l v e c h a n g e s . A fi v e v o l t s i g n a l i s c o n n e c t e d t o t h e i n i t i a l p o i n t a n d t w e l v e w i r e s a r e c o n n e c t e d t o t h e c o n t a c t p o i n t s . T h e fi r s t s i x l i n e s a r e t h e n c o n n e c t e d t o t h e s e v e n t h t h r o u g h t w e l f t h l i n e s s o t h a t e a c h e q u i v a l e n t v a l v e p o s i t i o n ( r e c a l l t h a t t w o v a l v e c h a n g e s / 3 6 0 d e g r e e s ) i s t i e d t o g e t h e r ( e . g . , l i n e s o n e a n d s e v e n w e r e c o n n e c t e d ) . T h e s i x l i n e s a r e t h e n c o n n e c t e d t o o n e g r o u p o f t h e d i g i t a l i n p u t s o f t h e P r o g r a m m a b l e P a r a l l e l I n t e r f a c e ( P P I ) b o a r d ( v i d e i n f r a ) . P u l l - d o w n r e s i s t o r s ( 4 7 K 0 ) o n t h e n e g a t i v e s i d e o f t h e c o n t a c t ( t h e s i d e f a r t h e s t f r o m t h e c o m p u t e r / T I L s i g n a l ) a r e c o n n e c t e d t o g r o u n d . T h e r e s i s t o r s i n s u r e d t h a t n o r e s i d u a l s i g n a l w o u l d a p p e a r o n t h e s e n s o r / r e l a y d u e t o i n d u c t i o n a n d t h a t t h e a p p l i e d s i g n a l s f r o m t h e c o m p u t e r w o u l d b e d i s s i p a t e d t o g r o u n d m u c h f a s t e r . T h i s l e d t o a n i n c r e a s e i n r e s p o n s e t i m e ( ~ 2 s e c o n d s t o l e s s t h a n m i l l i s e c o n d s ) a n d a n i m p r o v e m e n t i n r e l i a b i l i t y . P u m p : ~ ( : 1 . I e s . - P u m 7 4 F i g u r e 3 . 1 A : T h r o u g h P r i m a r y C o l u m n t o W a s t e W a s t e , r 0 t . ' . ' 5 C " 5 C . " ) ' L ‘ T C T ) ' ( . J R l / R Z R h e o d y n e 6 - P o r ' t V a l v e s D H P L C D e t e c t o r C L C o l l e c t i o n L o o p C H P L C C o l u m n C S V C o l u m n S e l e c t i o n V a l v e F i g u r e 3 . 1 8 : C o l l e c t i o n o f S a m p l e W a s t e C S V V F i g u r e 3 . 1 C : R e c y c l e o n t o P r i m a r y C o l u m n W a s t e . m ’ ’ 8 2 . ‘ fl C S V \ J F i g u r e 3 . 1 S e v e r a l C o n f i g u r a t i o n s o f t h e T w o R h e o d y n e V a l v e s t h a t C a n B e U s e d 7 5 C o l u m n s B u s h i n g s t o m i t e 8 2 5 5 C h i p e l e c t r i c a l c o n t a c t P u l l D o w n R e s I s t o r s F i g u r e 3 . 2 S e n s o r C o n n e c t i o n s F o r t h e C o l u m n S e l e c t i o n V a l v e S e c t i o n 3 . 3 . 4 P i l o t V a l v e s E v e r y t i m e a v a l v e s w i t c h o c c u r s , a p r e s s u r e s h o c k w a v e i s c r e a t e d w ' l l T h i s s h o c k w a v e c a n c r e a t e d i s t u r b a n c e s i n t h e fl o w p a t t e r n , p h y s i c a l s t r e s s o n t h e p a c k i n g m a t e r i a l , a n d c h a n g e s i n t h e r e f r a c t i v e i n d e x o f t h e s o l v e n t a n d t h e c o n c o m i t a n t c h a n g e i n t h e d e t e c t o r r e s p o n s e . H a r v e y a n d S t e a m s l o ' 1 1 h a v e d e m o n s t r a t e d t h e p r e s s u r e d r o p a s s o c i a t e d w i t h d i f f e r e n t v a l v e s w i t c h i n g t i m e s . I n a d d i t i o n , s l o w v a l v e c h a n g e s m a y p o t e n t i a l l y s p l i t a c h r o m a t o g r a p h i c p e a k b e t w e e n t w o , o r m o r e , c o l u m n s . T h u s , a f a s t e r v a l v e s w i t c h e s w i l l m i n i m i z e t h e e f f e c t o f t h e s e s t r e s s e s t h a t a r e i m p o s e d o n t h e s y s t e m . S i n c e t h e r e a r e o c c a s i o n s t o r e q u i r e u p t o fi v e c o n s e c u t i v e v a l v e c h a n g e s ( e . g . , s w i t c h i n g f r o m p o s i t i o n 1 t o p o s i t i o n 6 o n t h e C S V ) , a V a l c o H i g h S p e e d S w i t c h i n g A c c e s s o r y K i t ( H o u s t o n , T X ) , c o m p o s e d o f t w o H u m p h r e y P r o d u c t s 1 2 5 A P i l o t V a l v e s ( K a l a m a z o o , M I ) , i s u s e d t o a c c e l e r a t e t h e v a l v e c h a n g e s . F i g u r e 3 . 3 s h o w s t h e c o n fi g u r a t i o n o f t h e p i l o t v a l v e s . 7 6 1 ( 4 " O . D . T u b i n g _ 1 / 8 " 0 . 0 T u b i n g ( ’ A ‘ : L _ _ | F I F / _ _ ‘ \ ‘ _ _ , I J , \ I ‘ — J B I f ‘ 1 3 E Q U D D ( 1 5 : ) I V a l v e / A c t u a t o r L e g e n d A G a s T a n k f o r P i l o t V a l v e s C 2 P i l o t V a l v e ( F i r e ) B A c t u a t o r D Q u i c k E x h a u s t C 1 P i l o t V a l v e ( A r m ) E G a s T a n k f o r A c t u a t o r F i g u r e 3 . 3 P i l o t V a l v e C o n f i g u r a t i o n S e c t i o n 3 . 3 . 5 A c t u a t o r s , S o l e n o i d s , a n d R e l a y s T h e v a l v e s d e s c r i b e d a b o v e a r e a l l a i r a c t u a t e d . T h e t w o s i x - p o r t R h e o d y n e v a l v e s a r e c o n n e c t e d t o t w o S c h r a d e r M o d e l 4 1 - 1 1 1 5 p n e u m a t i c a c t u a t o r s ( W a k e F o r e s t , N C ) . T h e a c t u a t o r s a r e c o n t r o l l e d b y s e n d i n g a H i g h T T L s i g n a l f r o m t h e R T T - 8 0 0 / 8 1 5 i n t e r f a c e b o a r d ( v i d e i n f r a ) . S i n c e t h e a c t u a t o r s a r e a c t i v e L O W , t h e R T T 8 0 0 / 8 1 5 i n t e r f a c e b o a r d i n v e r t s t h e H I G H T I T . s i g n a l t o a L O W t o m a i n t a i n c o m p a t i b i l i t y w i t h t h e a c t u a t o r s . T h e C S V w a s c o n t r o l l e d b y s e n d i n g H I G H T T L s i g n a l s t o t w o O p t o - 2 2 l 7 8 1 - 0 A S S s i n g l e p o i n t I / O o p t i c a l l y i s o l a t e d r e l a y s ( K e n d a l l E l e c t r o n i c s , L a n s i n g , M I ) . T h e t w o r e l a y s ‘ 8 6 1 5 b d e s c r i h r e l a y s ( t h e H ] a c q u i s i b u i l t p r I n t e r f a t g T O U D S o 7 7 r e l a y s t h e n p o w e r e d a f o u r w a y , t h r e e p o s i t i o n ( c e n t e r e x h a u s t ) S c h r a d e r M o d e l 5 2 0 0 0 8 6 1 5 b e l l o w s s o l e n o i d ( W a k e F o r e s t , N C ) w h i c h d i r e c t e d t h e a i r p u l s e s t o t h e p i l o t v a l v e s d e s c r i b e d a b o v e . T h e t w o R h e o d y n e v a l v e s w e r e c o n t r o l l e d b y t w o 6 1 1 - 3 T e l e d y n e r e l a y s ( H a w t h o r n e , C A ) . F i g u r e 3 . 4 s h o w s t h e c o m p l e t e v a l v e a r r a n g e m e n t . S e c t i o n 3 . 3 . 6 C o m p u t e r H a r d w a r e t o C o n t r o l t h e H P L C I n s t r u m e n t T h e n e x t s e c t i o n d e s c r i b e s t h e t w o i n t e r f a c e b o a r d s t h a t w e r e u s e d t o a u t o m a t e t h e H P L C i n s t r u m e n t . T h e f i r s t b o a r d i s a c o m m e r c i a l m u l t i f u n c t i o n d a t a a c q u i s i t i o n / i n t e r f a c e b o a r d f r o m A n a l o g D e v i c e s . T h e s e c o n d b o a r d w a s a n i n - h o u s e b u i l t p r o t o t y p e b o a r d f r o m J D R D e v i c e s c o n f i g u r e d w i t h a n 8 2 5 5 P r o g r a m m a b l e P a r a l l e l I n t e r f a c e ( P P I ) d e v i c e . T h e s e t w o d i f f e r e n t b o a r d s a r e d e s c r i b e d b e l o w . S e c t i o n 3 . 3 . 6 . 1 P r o t o t y p e B o a r d A J D R M i c r o d e v i c e s M o d e l I B M - P R 2 W i r e w r a p P r o t o t y p e C a r d w i t h I n p u t / O u t p u t D e c o d i n g f o r X T c l a s s c o m p u t e r s ( L o s G a t o s , C A ) w a s u s e d t o d e v e l o p a c o m p u t e r b o a r d f o r i n p u t a n d o u t p u t t o d i f f e r e n t p e r i p h e r a l s . T h i s b o a r d p r o v i d e s d e c o d i n g s u p p o r t f o r e i g h t d i f f e r e n t d e v i c e s t o b e a d d r e s s e d t h r o u g h t h e c o m p u t e r b u s . T h e c h i p s t o s u p p o r t t h e a d d r e s s a n d m u l t i p l e x i n g l o g i c w e r e p u r c h a s e d f r o m v a r i o u s s o u r c e s . T h e p r i m a r y c h i p o n t h i s b o a r d i s t h e P P I d e v i c e . S e c t i o n 3 . 3 . 6 . 2 P r o g r a m m a b l e P a r a l l e l I n t e r f a c e B o a r d A n 8 2 5 5 - S A P P I c h i p w a s u s e d t o c o n t r o l b o t h t h e s o l v e n t d e l i v e r y s y s t e m a n d t h e C S V . T h e P P I a l l o w s u p t o 2 4 d i g i t a l i n p u t / o u t p u t l i n e s t o b e u s e d . 2 . T h e P P I i s p r o g r a m m a b l e a n d p r o v i d e s s u f fi c i e n t d i g i t a l l i n e s t o c o n t r o l s o l v e n t d e l i v e r y s y s t e m ( S D S ) o f t h e H P L C a n d t h e c o l u m n s e l e c t i o n v a l v e ( C S V ) . T h e 2 4 l i n e s a r e g a t h e r e d i n t o t h r e e g r o u p s : G r o u p s A a n d B e a c h a r e 8 b i t s w i d e , w h i l e G r o u p C i s s p l i t i n t o t w o g r o u p s o f 4 b i t s . T h e c h i p m a y b e p r o g r a m m e d i n t h r e e d i f f e r e n t m o d e s o f o p e r a t i o n . M r — E a n d a r e c o u n t e c t . S i g n a l W S t a t u s C 7 8 W a s t e ( 3 3 ' P r e s s u r e W t P r e l i m i n a r y C o l u m n R e s t r i c t o r “ ' 3 - 0 0 . - . ’ R 1 . R 2 . ‘ C S V ( 5 C o l u m n s / 1 B - P a s s L i n e ) P r e s s u r e R e s t r i c t o r L e g e n d D D e t e c t o r ( s ) P P i l o t V a l v e s R R h e o d y n e V a l v e s F i g u r e 3 . 4 C o m p l e t e V a l v e A r r a n g e m e n t o f t h e T w o R h e o d y n e V a l v e s , C o l u m n S e l e c t i o n V a l v e , a n d P i l o t V a l v e s T h e P P I i s c o n fi g u r e d s o t h a t s i x l i n e s f r o m G r o u p A w e r e c o n fi g u r e d a s I N P U T a n d a r e u s e d a s t h e s e n s o r s f o r t h e p o s i t i o n o f t h e C S V . A s e v e n t h l i n e f r o m G r o u p A i s c o n n e c t e d t o t h e F l o w R e a d y s i g n a l o f t h e S D S . T h e S D S s e n d s o u t a T T L H i g h t o L o w s i g n a l w h e n a p r o g r a m m e d fl o w r a t e h a s b e e n r e a c h e d . T h i s s i g n a l i s u s e d t o s e n s e t h e s t a t u s o f t h e S D S . T h e s o f t w a r e p a u s e s d a t a a c q u i s i t i o n a n d r e - d i r e c t s t h e e l u a n t t h r o u g f i n d i c a t T w o 0 c o n n e c G r o u p t h e R T c o n n e c f r o m a r e c e i v e s l o w a ‘ 0 e n s r P r o c e s l a t t e r 5 D r o v i d W i d t h s “ D o n U a n d R 2 2 , Q X t 1 w i d t h . 7 9 t h r o u g h a s e r i e s o f b y - p a s s p l u m b i n g l i n e s u n t i l t h e s i g n a l o f t h e F l o w R e a d y l i n e i n d i c a t e s t h a t t h e fl o w i s r e a d y . S i x l i n e s f r o m G r o u p B a r e c o n f i g u r e d a s O U T P U T a n d u s e d t o c o n t r o l t h e S D S . T w o o f t h e l o w e r f o u r b i t s f r o m G r o u p C a r e p r o g r a m m e d a s O U T P U T a n d a r e c o n n e c t e d t o t h e t w o O p t o - 2 2 ' s w h i c h c o n t r o l s t h e C S V . A t h i r d b i t f r o m t h e l o w e r G r o u p C i s c o n n e c t e d t o a 7 4 l S O O c h i p ( a N A N D c h i p ) . T h e N A N D c h i p i s u s e d t o g a t e t h e R T T 8 0 0 b o a r d . T h i s a l l o w s t h e s o f t w a r e t o p a u s e t h e d a t a a c q u i s i t i o n . F i n a l l y , o n e o f t h e u p p e r f o u r b i t s f r o m G r o u p C a r e s e t u p a s I N P U T a n d c o n n e c t e d t o t h e S D S a s a n a c k n o w l e d g m e n t l i n e ( A C K ) . T h e S D S s e n d s o u t a T T L p u l s e f r o m a m o n o s t a b l e 1 2 c h i p t o i n d i c a t e t h a t a c o n t r o l w o r d f r o m a c o m p u t e r h a d b e e n r e c e i v e d . U n f o r t u n a t e l y , t h e X T - c l a s s c o m p u t e r t h a t w a s i n t e r f a c e d t o t h e S D S w a s t o o s l o w a n d p r o v e d u n r e l i a b l e t o r e a d t h e T T L p u l s e . A s s u c h , a s o f t w a r e p a u s e w a s u s e d t o e n s u r e t h a t t h e c o m p u t e r s e n t o u t c o n t r o l w o r d s t o t h e S D S a t a n a p p r o p r i a t e r a t e t o p r o c e s s t h e c o m m a n d . A n A T - c l a s s c o m p u t e r w a s c o n n e c t e d t o t h e s y s t e m d u r i n g t h e l a t t e r s t a g e s o f t h i s r e s e a r c h a n d w o u l d h a v e b e e n a b l e t o r e a d t h e A C K s i g n a l . D e t a i l s o f p r o g r a m m i n g a n d u s i n g t h i s c h i p a r e g i v e n i n C h a p t e r 6 . T a b l e 3 . 5 p r o v i d e s a s y n o p s i s o f t h e d i g i t a l l i n e s u s e d f r o m t h e P P I . S e c t i o n 3 . 3 . 6 . 3 T i m i n g C i r c u i t A 7 4 1 5 2 2 1 d u a l m o n o s t a b l e m u l t i v i b r a t o r c i r c u i t w a s b u i l t t o c o n t r o l p u l s e w i d t h s s e n t t o t h e O p t o - 2 2 r e l a y s . T h e c i r c u i t g e n e r a t e s c o n t r o l l e d p u l s e w i d t h s b a s e d u p o n t h e s e l e c t i o n o f e x t e r n a l c a p a c i t o r s ( C l , e x t a n d C 2 , e x t ) a n d e x t e r n a l r e s i s t o r s ( R 1 , e x t a n d R 2 , “ ) . T h e 7 4 1 5 2 2 1 i s t r i g g e r e d b y a p p r o p r i a t e T T L s i g n a l s f r o m t h e P P I , w h i c h , i n t u r n , g e n e r a t e s s p e c i f i e d p u l s e s t o t h e r e l a y . V a r i a b l e r e s i s t o r s w e r e u s e d f o r R 1 , e x t a n d R 2 , e x t t o a l l o w t h e p u l s e w i d t h s t o b e t u n e d t o t h e o p t i m u m v a l u e s . B a s e d u p o n p u l s e w i d t h m e a s u r e m e n t s o b t a i n e d f r o m a n o s c i l l o s c o p e a n d t h e m e a s u r e d v a l u e s o f t h e r e s i s t a i d e t e r m F i g u r e B o a r d ( Q I n a d d i p o s i t i o i A d d r e s S t o r a g e Q I S Q W h i H P L C p b e t w e E ] M j C l ‘ o s ( l O C a t e d 8 O r e s i s t a n c e s , t h e c a p a c i t a n c e s w e r e d e t e r m i n e d . E q u a t i o n 3 . 1 c a n t h e n b e u s e d t o d e t e r m i n e t h e p u l s e w i d t h s f o r d i f f e r e n t v a l u e s o f R . t W = R e m C e x t m ( 2 ) E q u a t i o n 3 . 1 F i g u r e 3 . 5 p r o v i d e s t h e c i r c u i t t h a t w a s b u i l t . D i s c u s s i o n o n t h e a p p l i c a t i o n o f t h i s c i r c u i t i s p r e s e n t e d i n C h a p t e r 6 . S e c t i o n 3 . 3 . 6 . 4 D a t a A c q u i s i t i o n B o a r d A n A n a l o g D e v i c e s R T T 8 0 0 / 8 1 5 M u l t i f u n c t i o n A n a l o g / D i g i t a l I n p u t / O u t p u t B o a r d ( N o r w o o d , M A ) w a s u s e d t o a c q u i r e d a t a f r o m t h e U V - V i s i b l e a b s o r b a n c e d e t e c t o r . I n a d d i t i o n , t h i s b o a r d c o n t r o l l e d t h e t w o s i x - p o r t R h e o d y n e v a l v e s a n d m o n i t o r e d t h e p o s i t i o n o f t h e i n j e c t i o n v a l v e . T h e R T T b o a r d c o n t a i n s a n 8 2 3 7 A D i r e c t M e m o r y A d d r e s s c o n t r o l l e r a n d a A M 9 5 1 3 c o u n t e r - t i m e r c h i p f o r f a s t d a t a a c q u i s i t i o n a n d s t o r a g e . D e t a i l e d d e s c r i p t i o n s o f t h e R T T b o a r d a n d t h e A M 9 5 1 3 c h i p a r e f o u n d e l s e w h e r e . 1 3 ' l 4 S e c t i o n 3 . 3 . 7 I n t e r f a c e B o x A n i n - h o u s e i n t e r f a c e b o x w a s m a d e t o c o n n e c t t h e c o m p u t e r t o t h e d i f f e r e n t H P L C p e r i p h e r a l s . F i g u r e 3 . 6 s h o w s t h e i n t e r f a c e b o x w h i c h p r o v i d e s t h e c o n n e c t i o n s b e t w e e n t h e R T I b o a r d a n d t h e H P L C i n s t r u m e n t a t i o n . S e c t i o n 3 . 3 . 8 S o f t w a r e T h e s o f t w a r e t o c o n t r o l t h e H P L C e q u i p m e n t a n d t o a c q u i r e d a t a w a s w r i t t e n i n M i c r o s o f t Q u i c k B a s i c v e r s i o n 4 . 0 ( R e d m o n d , W A ) . F u r t h e r d i s c u s s i o n o f t h e s o f t w a r e i s l o c a t e d i n C h a p t e r 6 . E 5 : 5 . : E E E S : H h H H H H H H O 8 1 T a b l e 3 . 5 D i g i t a l I n p u t / O u t p u t L i n e s U s e d F r o m t h e P P I C h i p C o n n e c t i o n 1 s e n s o r o l u m n 2 s e n s o r C o l u m n 3 s e n s o r u m n 4 s e n s o r u m n s e n s o r o l u m n 6 s e n s o r F l o w R e a d n o t u s e d C o n t r o l C o n t r o l o n t r o l o n t r o l S D S C o n t r o l t r o l n o t u s e d n o t u s e d 2 2 o 2 2 t r o l 7 4 n o t u s e d A c k n o w l e n o t u s e d c u r r e n t l n o t u s e d c u r r e n t l n o t u s e d 8 2 A R M m 1 m 1 Q F — i I — H V c c R 1 c 1 Q 1 6 2 c t n z 3 2 A 2 7 4 1 . 3 2 2 1 D u a l M o n o s t a b l e A 1 3 1 c u t 6 1 0 2 c 2 R 2 G N D F i g u r e 3 . 5 7 4 L 5 2 2 1 D u a l M o n o s t a b l e T i m i n g C i r c u i t 0 o ' 0 0 — — ) P M T T L 2 T T L 1 F i r e D i n ? D I D ] D i n o D O u l 3 0 0 s t ! 2 D O u t I 0 0 ' . " 0 4 p i n ) D B 3 7 : G : I : C C : — — t — - — — o — ( — t C : G G — C c I I — — I — — — — — t C : D m o D 0 c 0 c ° + 1 r r u O 0 0 o ° s u n u ‘ 0 v a ° t " ! m " O M 2 l T M m i r 7 3 2 I t — - — ' G G G G G — — — 1 n ‘ : o g o A m A A A M b C l 1 1 e n e . 1 1 1 3 0 1 3 . ( 2 1 3 s 0 a 9 7 s a 3 r 7 5 1 2 2 . 3 s 4 a 3 s 7 ( 0 o 3 s 3 } , } : : 2 — } D D H H I 3 ' t 2 3 ? 5 0 . 3 “ P ? n ) i » I n ? — 3 3 % — e — f t — r — — — C E ] ‘ a c e fi ‘ d C B ] I : i { : ] I : 8 0 1 o 1 2 . 3 ' — fi t C fi — fl fl : 4 t C 1 l s 6 4 o 7 5 a r 2 5 7 3 3 0 3 0 ” 7 . ” C [ I E t W [ 2 I } , I : 1 : : 1 t [ D 1 : 0 , . . 3 s 7 s s 5 n a a r : 1 1 1 H 2 : ] : 2 fl fl * F % P t I . 3 5 D B 2 a ‘ ° 0 4 2 o 1 2 2 2 n n u I l 3 W v V V : 2 ? s C : 1 a o n G r o u n d i n g D i : D m t e t e c t o r — m n D — — — t C P o i o n " n : 1 — i F — “ M . ‘ D [ D " " _ I — 2 5 ' ' — J o a r — ) — C — I € a C N m — B “ r _ d I I B o x f o t h e R T I 8 0 0 / 8 1 5 8 3 I n t e r - f l e e B o x C A a n F i g u r e 3 . 6 L I S T O F R E F E R E N C E S ! f I n I A 1 0 1 1 1 2 \ 3 1 4 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 L I S T O F R E F E R E N C E S F . A . S e t t l e , J r . a n d M A . P l e v a , A m e r . L a b . 1 9 8 8 , 2 0 ( 1 0 ) , 6 4 - 7 9 . S . A . T o m e l l i n i , B . J . W y t h o f f , a n d H . B . W o o d r u f f , ' D e v e l o p i n g K n o w l e d g e - B a s e d S y s t e m s ' i n E x p e r t S y s t e m A p p l i c a t i o n s i n C h e m i s t r y , B . A . H o h n e a n d T . H . P i e r c e , e d s . A m e r i c a n C h e r r r i c a l S o c i e t y , W a s h i n g t o n , D . C . , 1 9 8 9 , 2 3 6 . A . P . W a d e , S . R . C r o u c h , a n d D . B e t t e r i d g e , ' I ‘ r A C , 1 9 8 8 , 7 ( 1 0 ) , 3 5 8 . T h o m a s J . L a f f e y , ‘ T h e R e a l - T i m e E x p e r t ' i n B y t e 1 9 9 1 , 1 6 ( 1 ) , 2 5 9 . A n n e M o o s e , T e r r y S c h u s s l e r , a n d D a n S h a f e r , V P - E X p e r t R u l e - B a s d E x p e r t S y s t e m D e v e l o p m e n t T o o l , 1 9 8 9 , W o r d T e c h S y s t e m s , I n c . , O r i n d a , C A , 7 . L . E . T w a y a n d W . R . R i e d e l , P C A 1 1 9 9 2 , 6 ( 4 ) . 5 2 D o n S h a f e r , P C A 1 , 1 9 8 8 , 2 ( 3 ) , 5 4 . J o a n S t o d d a r d , A I E X p e r t , 1 9 8 8 , O c t o b e r J . S c h m u l l e r a n d Y . M i , P C A I , 1 9 9 0 , 4 ( 3 ) , 5 2 . M . C . H a r v e y a n d S . D . S t e a m s , A n a l . C h e m . 1 9 8 4 , 5 6 , 8 3 7 . M . H a r v e y a n d S . D . S t e a m s , ‘ H P L C S a m p l e I n j e c t i o n a n d C o l u m n S w i t c h i n g ' i n L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y i n E n v i r o n m e n t a l A n a l y s i s , J a m e s F . L a w r e n c e , e d . , T h e H u m a n a P r e s s , 1 9 8 3 , 3 0 1 - 4 0 . P . W i e g a n d , P h . D . T h e s i s , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y , E a s t L a n s i n g , M i c h i g a n , 1 9 8 5 . R T I - 8 0 0 / 8 1 5 U s e r ' s M a n u a l , A n a l o g D e v i c e s , 1 5 0 0 S p a c e P a r k D r i v e , S a n t a C l a r a , C A , 1 9 8 6 . A M 9 5 1 3 / i S y s t e m T i m i n g C o n t r o l l e r H a n d b o o k , A d v a n c e d M i c r o D e v i c e s , I n c . , 9 0 1 T h o m p s o n P l a c e , P . O . B o x 4 5 3 , S u n n y v a l e , C A , 1 9 8 6 . 8 4 E X F C V S e c t i o n o f o b t a i d e s c r i b e a p p m p r c o l u m n D I E S e m o f a H i S e c t i c d e s m i t h e S e 1 a d v - 1 Q , C H A P T E R 4 E X P E R T S Y S T E M : C O L U M N S E L E C T I O N A N D V A L I D A T I O N Y o u t h i n k y o u k n o w w h e n y o u l e a r n , a r e m o r e s u r e w h e n y o u c a n w r i t e , e v e n m o r e w h e n y o u c a n t e a c h , b u t c e r t a i n w h e n y o u c a n p r o g r a m . A l a n J . P e r l i s S e c t i o n 4 . 1 I n t r o d u c t i o n T h i s c h a p t e r d e s c r i b e s t h e d y n a m i c s o f e x p e r t s y s t e m s . T h e g e n e r a l p r o c e s s e s o f o b t a i n i n g , e n c o d i n g , a n d v a l i d a t i o n o f t h e e x p e r t s y s t e m ( c a l l e d H P L C A d v i s o r ) d e s c r i b e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n i s p r e s e n t e d . H P L C A d v i s o r p r o v i d e s r e c o m m e n d a t i o n s o f a p p r o p r i a t e c o l u m n ( s ) , d e t e c t o r ( s ) , a n d m o b i l e p h a s e s . T h i s c h a p t e r p r e s e n t s t h e c o l u m n s e l e c t i o n m o d u l e a n d s h o w s v a l i d a t i o n s t u d i e s o f t h i s m o d u l e . C h a p t e r 5 p r e s e n t s t h e d e t e c t o r a n d m o b i l e p h a s e m o d u l e s . C h a p t e r 6 d e s c r i b e s t h e a u t o m a t i o n o f a H i g h P e r f o r m a n c e l i q u i d C h r o m a t o g r a p h y s y s t e m a n d s h o w s s o m e o f r e s u l t i n g s e p a r a t i o n s b a s e d u p o n t h e r e c o m m e n d a t i o n s o f H P L C A d v i s o r . S e c t i o n 4 . 2 G o a l s o f R e s e a r c h T h r e e d i s t i n c t i v e o b j e c t i v e s f o r t h e d e v e l o p m e n t o f t h e e x p e r t s y s t e m w e r e d e s c r i b e d i n C h a p t e r 1 a n d a r e d i s c u s s e d i n m o r e d e t a i l i n t h i s s e c t i o n . I n m a n y w a y s , t h e s e g o a l s d e t e r m i n e d t h e fi n a l e x p e r t s y s t e m . S e c t i o n 4 . 2 . 1 O f f - L i n e T o o l f o r H P L C M e t h o d s D e v e l o p m e n t T h e m a i n g o a l o f t h e p r o j e c t w a s t o d e v e l o p a t o o l t h a t w o u l d p r o v i d e i n t e l l i g e n t a d v i c e f o r a u s e r . I t w a s d e c i d e d t h a t p e r s o n a l c o m p u t e r s w e r e n o t p o w e r f u l e n o u g h t o 8 5 8 6 b e a b l e t o r u n s i m u l t a n e o u s l y t h e e x p e r t s y s t e m a n d t h e d a t a a c q u i s i t i o n / c o m p u t e r c o n t r o l p r o g r a m . L a t e r d e v e l o p m e n t s o f o p e r a t i n g s y s t e m s s u c h a s M i c r o s o f t W i n d o w s v e r s i o n 3 . 0 ( a n d h i g h e r ) h a v e e n a b l e d m u l t i t a s k i n g t o b e f e a s i b l e . H o w e v e r , s i n c e t h e e x p e r t s y s t e m a n d t h e H P L C c o n t r o l l e r a r e s e p a r a t e p r o g r a m s b o t h o f t h e p r o g r a m s c a n b e o p t i m i z e d s e p a r a t e l y . T h e e x p e r t s y s t e m c a n b e u s e d i n d e p e n d e n t l y a s a t u t o r i a l t o o l ( v i d e i n f r a ) . I n m a k i n g a v i a b l e e x p e r t s y s t e m , t h e r e a r e s e v e r a l t h i n g s t o c o n s i d e r : 1 ) t h e e n d - u s e r , 2 ) t h e t y p e o f a p p l i c a t i o n ( u n i v e r s a l o r s p e c i f i c ) , a n d 3 ) t h e l e v e l o f e x p e r t i s e t h a t t h e e x p e r t s y s t e m u s e s t o s o l v e t h e p r o b l e m . T h e s e c r i t e r i a a r e d i s c u s s e d b e l o w . S e c t i o n 4 . 2 . 1 . 1 E n d - U s e r A s m e n t i o n e d i n p r e v i o u s c h a p t e r s , d e t e r m i n a t i o n o f t h e e n d - u s e r i s c r i t i c a l . T h i s d e t e r m i n a t i o n d i c t a t e s t h e t y p e o f i n f o r m a t i o n t h a t m u s t b e e n c o d e d i n t h e e x p e r t s y s t e m , a n d t h e l e v e l o f k n o w l e d g e t h a t m u s t b e e x p e c t e d f r o m t h e u s e r . W e e n v i s i o n e d t w o d i f f e r e n t e n d - u s e r s f o r t h i s s y s t e m : a t e c h n i c i a n w h o i s f a m i l i a r w i t h s o m e a s p e c t s o f H P L C , a n d n o n - H P L C e x p e r t . T h e l a t t e r i s a n e x p e r t i n a n o t h e r fi e l d ( e . g . , m a s s s p e c t r o m e t r y ) w h o m i g h t , o n o c c a s i o n , h a v e a n e e d t o u s e H P L C . T h e t e c h n i c i a n w o u l d b e f a m i l i a r w i t h H P L C t e r m i n o l o g y , a n d t h e s e c o n d t y p e o f u s e r w o u l d h a v e a g o o d b a c k g r o u n d k n o w l e d g e o f f u n d a m e n t a l c h e m i s t r y . A s s u c h , b o t h p r i n c i p a l u s e r s w o u l d b e a b l e t o a n s w e r t h e q u e s t i o n s a s k e d o f t h e m b y t h e e x p e r t s y s t e m w i t h l i t t l e n e e d t o o b t a i n a n s w e r s f r o m o u t s i d e s o u r c e s . T h i s e x p e r t s y s t e m p r o v i d e s i n i t i a l a d v i c e w h i c h t h e t e c h n i c i a n c a n u s e t o i n i t i a t e t h e d e v e l o p m e n t o f n e w m e t h o d s . T h e e x p e r t s y s t e m w i l l a l s o a l l o w t h e e n d - u s e r t o b e t t e r o b t a i n p r e l i m i n a r y i n f o r m a t i o n a b o u t t h e s a m p l e a n d a p p r o p r i a t e m e t h o d ( s ) t o s e p a r a t e t h e c o m p o n e n t s w h e n h e / s h e a p p r o a c h e s t h e H P L C e x p e r t . B y b e i n g b e t t e r i n f o r m e d , t h e m e e t i n g b e t w e e n H P L C t e c h n i c i a n ( o r e x p e r t ) a n d t h e e n d - u s e r s h o u l d b e m o r e i n f o r m a t i v e a n d p r o d u c t i v e . 8 7 T h e t y p e o f e n d - u s e r n e c e s s i t a t e s t h a t t h e l a n g u a g e o f t h e e x p e r t s y s t e m b e o n a f a i r l y h i g h l e v e l ; t h a t i s , a f a m i l i a r i t y w i t h c o m m o n s c i e n t i f i c t e r m i n o l o g y i s e x p e c t e d . H o w e v e r , t h e e x p e r t s y s t e m d o e s p r o v i d e a d d i t i o n a l h e l p t h a n a n H P L C e x p e r t m i g h t r e q u i r e . F o r e x a m p l e , a n i n i t i a l g o a l o f t h e s y s t e m i s t o d e t e r m i n e t h e s u i t a b i l i t y o f H P L C f o r a p a r t i c u l a r s e p a r a t i o n A d i a l o g i s h e l d b e t w e e n t h e e x p e r t s y s t e m a n d t h e u s e r t o d e t e r m i n e w h e t h e r a s e p a r a t i o n i s e v e n n e e d e d a n d / o r i f a d i f f e r e n t t e c h n i q u e m i g h t b e b e t t e r s u i t e d ( e . g . , g a s c h r o m a t o g r a p h y , G C , o r s u p e r c r i t i c a l fl u i d c h r o m a t o g r a p h y , S C ) . W h i l e t h i s i n f o r m a t i o n m i g h t b e e s s e n t i a l f o r t h e n o n - H P L C e x p e r t , i t c a n b e q u i t e t i m e - c o n s u m i n g a n d a g g r a v a t i n g f o r t h e H P L C e x p e r t w h o w o u l d b e u s i n g t h e s y s t e m . A s s u c h , t h e r e a r e s t a g e s i n t h e c o n s u l t a t i o n w h e r e t h e u s e r c a n b y p a s s p a r t i c u l a r s e c t i o n s , s u c h a s t h e H P L C s u i t a b i l i t y d e t e r m i n a t i o n . T h i s f e a t u r e a l l o w s t h e s y s t e m t o b e u s e d b y b o t h e x p e r t a n d n o n - e x p e r t a l i k e . S e c t i o n 4 . 2 . 1 . 2 T y p e o f A p p l i c a t i o n A r e v i e w o f e x p e r t s y s t e m s t h a t h a v e b e e n u s e d i n a n a l y t i c a l c h e m i s t r y s h o w s t h a t t h e r e a r e t y p i c a l l y t w o t y p e s : g e n e r a l a n d s p e c i fi c a p p l i c a t i o n s ( s e e r e f e r e n c e s i n c h a p t e r 2 ) . T h e s e t w o t y p e s h a v e s p e c i fi c a d v a n t a g e s t h a t w e r e c o n s i d e r e d w h e n d e v e l o p i n g t h e e x p e r t s y s t e m d e s c r i b e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n . S p e c i fi c a p p l i c a t i o n s a r e v e r y d o m a i n - s p e c i fi c ; t h e y p r o v i d e a d v i c e f o r a s u b - a r e a o f t h e a p p l i c a t i o n . E x a m p l e s i n t h e c h r o m a t o g r a p h y a r e a i n c l u d e e x p e r t s y s t e m s t h a t : 0 d e t e r m i n e a m e t h o d f o r p h a r m a c e u t i c a l s t h a t c o n t a i n o n e t o f i v e a c t i v e c o m p o u n d s , l o o p t i m i z e p a r a m e t e r s f o r s y s t e m s u s i n g a p h o t o d i o d e a r r a y d e t e c t o r , 2 a n d 0 d e t e r m i n e c o n d i t i o n s t h a t w i l l i m p r o v e t h e r u g g e d n e s s o f a n H P L C m e t h o d . 3 T h e s e s p e c i a l i z e d e x p e r t s y s t e m s a l l o w f o r c o n c i s e a n d t h o r o u g h k n o w l e d g e b a s e s . B e c a u s e t h e a p p l i c a t i o n s a r e s p e c i a l i z e d , t h e a s s u m p t i o n s o f t h e k n o w l e d g e a n d e x p e r i e n c e o f t h e e n d - u s e r c a n b e m o r e s t r i n g e n t . S p e c i a l i z e d a p p l i c a t i o n s t y p i c a l l y 8 8 a l l o w f o r f a s t a n d s m a l l s y s t e m s t o b e d e v e l o p e d . O n e o b v i o u s d i s a d v a n t a g e i s t h a t t h e s y s t e m i s l i m i t e d i n i t s a p p l i c a b i l i t y . T h e s e c o n d t y p e o f e x p e r t s y s t e m i s t h e m o r e g e n e r a l i z e d s y s t e m . T h e s e s y s t e m s u s u a l l y a t t e m p t t o e s t a b l i s h a g e n e r a l m e t h o d o r a s o l u t i o n f o r a b r o a d r a n g e o f a p p l i c a t i o n s . S u c h s y s t e m s a l l o w t h e s y s t e m t o b e u t i l i z e d b y m o r e a n d v a r i e d u s e r s . H o w e v e r , t h e s e a p p l i c a t i o n s t y p i c a l l y r e q u i r e a l a r g e r k n o w l e d g e / d a t a b a s e a n d o f t e n a r e n o t a s a c c u r a t e a s t h e m o r e l i m i t e d a p p r o a c h . E x a m p l e s o f t h e s e s y s t e m s a r e m e n t i o n e d i n C h a p t e r 2 . T h e s e c o n d a p p r o a c h i s u s e d f o r t h i s p r o j e c t t o p r o v i d e a t o o l f o r g e n e r a l m e t h o d s d e v e l o p m e n t a n d p r o v i d e o n l y l i m i t e d a d v i c e f o r e s o t e r i c m e t h o d s . F o r e x a m p l e , m e t h o d o l o g y f o r c h i r a l s e p a r a t i o n s i s v e r y c o m p l e x a n d i s a l m o s t a s e p a r a t e a r e a o f e x p e r t i s e i n i t s e l f . W h e n t h e e x p e r t s y s t e m d e t e r m i n e s t h a t a s e p a r a t i o n s h o u l d b e m a d e o n t h e b a s i s o f c h i r a l i t y , t h e u s e r i s i n f o r m e d a n d a n i n i t i a l r e c o m m e n d a t i o n f o r a c o l u m n m a y b e p r o v i d e d . H o w e v e r , t h e a d v i c e f o r t h e s e t y p e s o f s a m p l e s i s m u c h m o r e l i m i t e d t h a n t h e a d v i c e f o r m o r e r o u t i n e s a m p l e s . S e c t i o n 4 . 2 . 1 . 3 F i r s t P r i n c i p l e A p p r o a c h O n c e t h e u s e r a n d t h e a p p l i c a t i o n w e r e d e t e r m i n e d , i t w a s t h e n n e c e s s a r y t o d e t e r m i n e h o w t o i m p l e m e n t t h i s e x p e r t s y s t e m . T h e r e a r e a s m a n y w a y s t o i m p l e m e n t s u c h a n e x p e r t s y s t e m a s t h e r e a r e d i f f e r e n t H P L C e x p e r t s . S e v e r a l o f t h e r e f e r e n c e s i n C h a p t e r 2 h a v e u s e d d i f f e r e n t a p p r o a c h e s t h a t d e s e r v e m e n t i o n i n g h e r e . I n t h e E C A T p r o j e c t , A b b o t t e t a l . 4 ' 5 u s e s a d a t a b a s e a p p r o a c h t o p r o p o s e a m e t h o d . T h i s a p p r o a c h i s d e m o n s t r a t e d i n a s a m p l e s e s s i o n . W h e n d e v e l o p i n g a m e t h o d f o r p h t h a l a t e s , t h e e x p e r t s y s t e m fi r s t s e a r c h e s i t s k n o w l e d g e b a s e t o s e e i f a m e t h o d a l r e a d y e x i s t s . I f t h e e x p e r t s y s t e m d e t e r m i n e s t h a t s u c h a m e t h o d i s n o t a v a i l a b l e , i t t h e n q u e r i e s t h e u s e r t o s e e i f t h e p h t h a l a t e c l a s s h a s b e e n s t o r e d i n a 8 9 s l i g h t l y d i f f e r e n t f a s h i o n ( e . g . , a g l o s s a r y o f e n t r i e s a n d k e y w o r d s ) . I f t h e u s e r i n d i c a t e s t h a t t h e s a m p l e i s a n e w c l a s s o f c o m p o u n d s , t h e e x p e r t s y s t e m a s k s f o r t h e s a m p l e s i z e t o d e t e r m i n e c o l u m n g e o m e t r i e s a n d d e t e c t o r c r i t e r i a . E C A T t h e n q u e r i e s f o r g e n e r a l m o l e c u l a r w e i g h t i n f o r m a t i o n a n d s i z e , o b t a i n s a s p e c i fi c n a m e o f t h e c o m p o u n d ( s ) , a n d d e t e r m i n e s t h e a c i d - b a s e c h a r a c t e r i s t i c o f t h e c o m p o u n d c l a s s . F r o m t h i s a p p r o a c h o f c a t e g o r i z i n g t h e c o m p o u n d i n t o a p a r t i c u l a r c l a s s , E C A T d e v e l o p s t h e m e t h o d . I n c o n t r a s t t o E C A T , t h e e x p e r t s y s t e m i n t h i s p r o j e c t u t i l i z e s a fi r s t p r i n c i p l e s ' a p p r o a c h . T h e u s e r m u s t a n s w e r m o r e q u e s t i o n s a b o u t t h e c h e m i c a l a n d p h y s i c a l n a t u r e o f t h e c o m p o u n d . T h i s a p p r o a c h a l l o w s t h e m e t h o d d e v e l o p m e n t t o b e b a s e d u p o n t h e c h e m i c a l i n t e r a c t i o n s o f t h e a n a l y t e w i t h t h e c o l u m n . T h e p r e s e n t a p p r o a c h r e q u i r e s m a n y m o r e r u l e s t o d e t e r m i n e t h e m e t h o d o f s e p a r a t i o n . M o s t o f t h e d i f f e r e n t e x p e r t s y s t e m s p r e s e n t e d d o n o t p r e s e n t t h e u s e o f c o n fi d e n c e f a c t o r s a s p a r t o f t h e s y s t e m . T h e e x p e r t s y s t e m i n t h i s p r o j e c t m u s t b e a b l e t o s o l v e a w i d e v a r i e t y o f p r o b l e m s , b u t i t i s n o t o p t i m i z e d f o r a p a r t i c u l a r s u b - s e t o f c h r o m a t o g r a p h y a p p l i c a t i o n s . 5 0 t h a t t h e u s e r m i g h t a p p l y e x t e r n a l c r i t e r i a , b y e i t h e r s u p p l y i n g a d d i t i o n a l i n f o r m a t i o n o r b y c o n s u l t i n g w i t h a n H P L C e x p e r t , i t w a s d e c i d e d t h a t c o n fi d e n c e f a c t o r s ( C N F ) m u s t b e a n i n t e g r a l p a r t o f t h e s y s t e m . B y p r e s e n t i n g a l l o f t h e m e t h o d s t h a t p a s s a t r u t h t h r e s h o l d ( a v a l u e e s t a b l i s h e d b y t h e k n o w l e d g e e n g i n e e r t h a t d e t e r m i n e s t h e m i n i m u m v a l u e o f t h e C N F b e f o r e a r u l e i s c o n s i d e r e d t o b e t r u e ) , t h e u s e r i s a b l e t o s e l e c t a l t e r n a t i v e m e t h o d s b a s e d o n o t h e r c r i t e r i a t h a t m i g h t n o t b e i n c o r p o r a t e d i n t h e e x p e r t s y s t e m ( e . g . , t h e b e s t c o l u m n h a s b e e n l o a n e d t o a n o t h e r r e s e a r c h g r o u p a n d i s c u r r e n t l y u n a v a i l a b l e ) . B a s e d o n t h e C N F o f d i f f e r e n t s o l u t i o n s , t h e u s e r i s a b l e t o e v a l u a t e t h e r e l i a b i l i t y o f t h e p r o p o s e d m e t h o d ( s ) . E C A T n e v e r s e l e c t s m e t h o d s b a s e d o n n o r m a l p h a s e a n d h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s m o d e s a n d i s b i a s e d t o w a r d s C 1 8 c o l u m n s . 4 T h e e x p e r t s y s t e m i n t h i s 9 0 d i s s e r t a t i o n i s m o r e g e n e r a l i z e d i n t h e e a r l y s t a g e s o f t h e m e t h o d s d e v e l o p m e n t . T h e o p p o r t u n i t y t o p u r s u e s e v e r a l d i f f e r e n t l i n e s o f i n f e r e n c e i s p r o v i d e d b e f o r e e l i m i n a t i n g a n y c o m p e t i t i v e t e c h n i q u e s . S e c t i o n 4 . 2 . 2 T u t o r i a l a n d T r a i n i n g T o o l E x p e r t s y s t e m s h a v e b e e n p r e d i c t e d t o b e c o m e u b i q u i t o u s a n d t r a n s p a r e n t . 6 M a n y s y s t e m s w i l l b e c o m e e m b e d d e d i n d i f f e r e n t i n s t r u m e n t s t o p r o v i d e s y s t e m 6 A n o t h e r u s e f o r a n d i a g n o s t i c s / m o n i t o r i n g a n d t o s e r v e a s o n - l i n e d o c u m e n t a t i o n . e x p e r t s y s t e m w i l l b e a s a t u t o r i a l a n d t r a i n i n g t o o l . E x p e r t s y s t e m s b e c o m e a v e r y p o w e r f u l t e a c h i n g t o o l w h e n t h e y a r e l i n k e d w i t h s i m u l a t o r s ] S c h a e f e r e t a l . 8 p r o p o s e s t h a t a d e v e l o p e d e x p e r t s y s t e m c a n b e c o n v e r t e d i n t o a c o m p u t e r - b a s e d t r a i n i n g p r o g r a m . W i t h s u c h i n m i n d , S c h a e f e r a n d c o - w o r k e r s d e v e l o p e d A C Q U I R E - I T S , a p r o g r a m t h a t c o n v e r t s a c o m p l e t e d k n o w l e d g e b a s e i n t o a n i n t e l l i g e n t t r a i n i n g s y s t e m ( I T S ) . T w o m o d e s o f t r a i n i n g a r e p o s s i b l e , l e a r n a n d e x p l o r e . T h e l e a r n m o d e p r e s e n t s a s e r i e s o f l e s s o n s t o t h e s t u d e n t a n d e v a l u a t e s t h e p r o g r e s s o f t h e s t u d e n t , a p p l y i n g e x p e r t s y s t e m t e c h n i q u e s t o a s s i s t i n t h e l e a r n i n g p r o c e s s . T h e s e c o n d m o d e , t h e e x p l o r e m o d e , a l l o w s t h e s t u d e n t t o i n s p e c t t h e k n o w l e d g e b a s e a n d t o r u n t h e s t u d e n t ' s o w n s c e n a r i o t o c o m p a r e t h e r e s u l t s f r o m t h e e x p e r t s y s t e m w i t h t h e s t u d e n t ' s p r e d i c t e d a n s w e r . W h i l e t h e l e a r n m o d e i s b e y o n d t h e s c o p e o f t h e r e s e a r c h i n t h i s p r o j e c t , t h e e x p l o r e m o d e w a s d e t e r m i n e d t o b e a s u i t a b l e a p p l i c a t i o n f o r t h e e x p e r t s y s t e m i n t h i s d i s s e r t a t i o n . T o a c h i e v e t h i s g o a l , d e t a i l e d t e x t f i l e s w e r e i n c o r p o r a t e d i n t o t h e e x p e r t s y s t e m t o p r o v i d e f e e d b a c k t o t h e u s e r . I n g e n e r a l , t o a c h i e v e t h e s u b - g o a l o f u s i n g t h i s e x p e r t s y s t e m a s a t r a i n i n g t o o l , m u c h m o r e e x p l i c i t h e l p a n d t e x t w a s p r o v i d e d . I n c o r p o r a t i o n o f t h i s e x p e r t s y s t e m , b e s i d e s u s i n g a t o o l s u c h a s A C Q U I R E - I T S t o c o n v e r t i t i n t o a i n t e l l i g e n t t r a i n i n g s y s t e m , i n t o a c o u r s e c o u l d b e a c h i e v e d b y g i v i n g s t u d e n t s 9 1 d i f f e r e n t s y s t e m s t o p r e d i c t a m e t h o d a n d t h e n c o m p a r i n g t h e i r r e s u l t s t o t h o s e o b t a i n e d f r o m t h e e x p e r t s y s t e m . S e c t i o n 4 . 2 . 3 O n - L i n e T o o l f o r A u t o m a t e d I n t e l l i g e n t H P L C I n s t r u m e n t a t i o n T h e fi n a l o b j e c t i v e o f t h i s r e s e a r c h i s t o d e v e l o p a c o m p l e t e i n t e l l i g e n t H P L C i n s t r u m e n t i n w h i c h a m e t h o d ( a n d p o s s i b l e a l t e r n a t i v e s ) w o u l d b e d e v e l o p e d d u r i n g a c o n s u l t a t i o n w i t h a n e x p e r t s y s t e m . T h e c o n t r o l l e r p r o g r a m w o u l d p e r f o r m t h e p r o p o s e d m e t h o d a n d e v a l u a t e t h e r e s u l t s o f t h e H P L C r u n ( w i t h r e s p e c t t o r e s o l u t i o n , p e a k s h a p e , a n d s o f o r t h ) a n d c o n s u l t w i t h a n o t h e r e x p e r t s y s t e m t o f u r t h e r o p t i m i z e t h e m e t h o d . W h i l e t h i s o b j e c t i v e i s e n v i s i o n e d t o b e p o s s i b l e , i t w a s d e e m e d n o t f e a s i b l e a t t h e c u r r e n t t i m e — p r e d o m i n a t e l y d u e t o c o m p u t e r r e q u i r e m e n t s . T h e D O S e n v i r o n m e n t i s o n l y a s i n g l e - t a s k i n g e n v i r o n m e n t a n d i s t o o c o n s t r a i n e d i n t e r m s o f m e m o r y t o m a k e p o s s i b l e a c o m p l e t e s y s t e m t h a t w o u l d h a v e d i f f e r e n t p r o g r a m s r u n n i n g s i m u l t a n e o u s l y . S i n c e V P - E x p e r t i s a D O S p r o g r a m , t h e c u r r e n t s t a t u s o f t h i s p r o j e c t i s t h a t t h e e x p e r t s y s t e m i s r u n o f f - l i n e f r o m t h e c o n t r o l l e r s o f t w a r e ( a l b e i t o n t h e s a m e c o m p u t e r a s t h e o n e t h a t c o n t r o l s t h e H P L C i n s t r u m e n t a t i o n ) . T h e m e t h o d s g e n e r a t e d f r o m t h e c o n s u l t a t i o n w i t h t h e e x p e r t s y s t e m a r e t h e n m a n u a l l y e n t e r e d i n t o t h e c o n t r o l l e r p r o g r a m . F e e d b a c k f r o m t h e H P L C r u n i s n o t p a s s e d b a c k i n t o t h e e x p e r t s y s t e m f o r f u r t h e r o p t i m i z a t i o n ; h o w e v e r , s u c h a f e a t u r e i s p o s s i b l e w i t h a p p r o p r i a t e a d d i t i o n s t o t h e k n o w l e d g e b a s e s . S e c t i o n 4 . 3 K n o w l e d g e A c q u i s i t i o n T w o d i f f e r e n t i n f o r m a t i o n s o u r c e s w e r e u s e d t o d e v e l o p t h e e x p e r t s y s t e m i n t h i s d i s s e r t a t i o n . T h e p r e l i m i n a r y i n f o r m a t i o n w a s o b t a i n e d f r o m t h e r e s i d e n t H P L C 9 2 e x p e r t d u r i n g k n o w l e d g e a c q u i s i t i o n m e e t i n g s a n d t h e n s u p p l e m e n t e d w i t h i n f o r m a t i o n o b t a i n e d f r o m b o t h t h e c h r o m a t o g r a p h y l i t e r a t u r e a n d f r o m H P L C m a n u f a c t u r e r s ‘ l i t e r a t u r e . T h e m a n u f a c t u r e r s ' l i t e r a t u r e w a s u s e d p r i m a r i l y i n t h e d e v e l o p o f t h e a n c i l l a r y d a t a b a s e s t o p r o v i d e t h e u s e r w i t h i n f o r m a t i o n a b o u t t h e d i f f e r e n t c o l u m n s t h a t w e r e a v a i l a b l e . S e c t i o n 4 . 3 . 1 P e r s o n n e l a n d R o l e s T h e g r o u p c o m p o s e d t o c r e a t e t h i s e x p e r t s y s t e m c o n s i s t e d o f t h e c h r o m a t o g r a p h y e x p e r t , t h e c h a m p i o n , k n o w l e d g e e n g i n e e r , a s s i s t a n t k n o w l e d g e e n g i n e e r , a n d t w o u s e r s . T h e c h r o m a t o g r a p h y e x p e r t w a s D r . V . L . M c G u f f i n w h o p r o v i d e d t h e h e u r i s t i c s t h a t w e r e e n c o d e d i n t o t h i s e x p e r t s y s t e m . T h e c h a m p i o n , D r . S . R . C r o u c h , p r o v i d e d a d d i t i o n a l s u p p o r t a n d e x p e r i e n c e . D r . A . P . W a d e , a p o s t d o c t o r a l a s s o c i a t e i n t h i s r e s e a r c h g r o u p , s e r v e d a s t h e k n o w l e d g e e n g i n e e r a n d p r o v i d e d e x p e r i e n c e a n d g u i d a n c e i n t h e e a r l y s t a g e s o f t h e p r o j e c t . D r . W a d e a l s o t r a i n e d t h i s r e s e a r c h e r t o c o n t i n u e w i t h t h e p r o j e c t a f t e r h i s d e p a r t u r e . T h e t w o u s e r s a s s i s t e d i n t e s t i n g a n d e v a l u a t i n g t h e i n i t i a l p r o t o t y p e ; i n p a r t i c u l a r , t h e y e v a l u a t e d t h e u s e r - f r i e n d l i n e s s a n d l u c i d i t y o f t h e s y s t e m . F i n a l l y , t h i s r e s e a r c h e r s e r v e d a s t h e a s s i s t a n t k n o w l e d g e e n g i n e e r i n t h e e a r l y s t a g e s o f t h e p r o j e c t a n d h a s c o n t i n u e d t h e p r o j e c t i n c o n j u n c t i o n w i t h t h e a u t o m a t i o n o f t h e H P L C i n s t r u m e n t a t i o n . S e c t i o n 4 . 3 . 2 K n o w l e d g e A c q u i s i t i o n S e s s i o n F o r m a t D e s s e r t 9 p r o v i d e s a c a s e s t u d y i n e l u c i d a t i n g i n f o r m a t i o n d u r i n g a k n o w l e d g e a c q u i s i t i o n m e e t i n g . A s i m i l a r a p p r o a c h f o r t h e e x p e r t s y s t e m i n t h i s d i s s e r t a t i o n w a s u s e d . T h e s e m e e t i n g s c o n s i s t e d i n i t i a l l y o f t h e k n o w l e d g e a c q u i s i t i o n t e a m m e e t i n g a t a s c h e d u l e d t i m e f o r a p p r o x i m a t e l y 1 t o 1 . 5 h o u r s . T h e s e p r e l i m i n a r y m e e t i n g s t o o k t h e f o r m a t o f b r a i n - s t o r m i n g s e s s i o n s i n w h i c h g e n e r a l p e r c e p t i o n s o f t h e i n t e n d e d e x p e r t 9 3 s y s t e m w e r e d i s c u s s e d . I t w a s i n t h e s e m e e t i n g s t h a t t h e g o a l s a n d e n d - u s e r s o f t h e e x p e r t s y s t e m w e r e f o r m u l a t e d . A s t h e f o c u s o f t h e e x p e r t s y s t e m w a s g e n e r a t e d , t h e s e m e e t i n g s t h e n t o o k o n t h e a d d i t i o n a l r o l e o f e l i c i t i n g t h e H P L C h e u r i s t i c s t h a t w e r e i n c o r p o r a t e d i n t o t h e e x p e r t s y s t e m . T h e s e k n o w l e d g e a c q u i s i t i o n m e e t i n g s w e r e r e c o r d e d o n a u d i o t a p e a n d t h e n w e r e t r a n s c r i b e d i n t o m i n u t e s s o t h a t t h e i n f o r m a t i o n c o u l d b e e x t r a c t e d a n d p l a c e d i n t o t h e k n o w l e d g e b a s e o f t h e e x p e r t s y s t e m . I n i t i a l l y , o n e o f t h e s e c r e t a r i e s i n t h e c h e m i s t r y d e p a r t m e n t t r a n s c r i b e d t h e m i n u t e s f r o m t h e m e e t i n g . M u c h o f t h e i n f o r m a t i o n w a s l o s t w h e n t h e s e c r e t a r y a t t e m p t e d t o n o t o n l y u n d e r s t a n d t h e v e r n a c u l a r o f H P L C , b u t t o a l s o d e c i p h e r t h e i m p o r t a n t i n f o r m a t i o n f r o m r e s i d u a l e n v i r o n m e n t a l n o i s e s ( e . g . , c o u g h s , c h a i r s c r a p i n g s ) . T o i m p r o v e t h e k n o w l e d g e a c q u i s i t i o n p r o c e s s , i t w a s d e c i d e d t o u s e a c h e m i s t ( i n p a r t i c u l a r , t h i s r e s e a r c h e r ) t o t r a n s c r i b e t h e a u d i o r e c o r d i n g o f t h e m e e t i n g s . I n t h i s f a s h i o n , d e d u c t i v e r e a s o n i n g c o u l d b e u s e d t o e x t r a p o l a t e t h e i n f o r m a t i o n f r o m b a c k g r o u n d c l u t t e r . T o p r e v e n t b i a s , a s t r o n g a t t e m p t w a s m a d e t o p e r f o r m a v e r b a t i m t r a n s c r i p t i o n w i t h n o e d i t i n g a t t h i s s t a g e . T o i n s u r e a c c u r a t e t r a n s c r i p t i o n s , t h e t a p e s a n d m i n u t e s w e r e c h e c k e d b y t h e o t h e r k n o w l e d g e e n g i n e e r . T h e t h i r d s t a g e o f t h e m e e t i n g s i n v o l v e d t h e a n a l y s i s o f t h e e x p e r t s y s t e m . A s t h e h e u r i s t i c s w e r e e n c o d e d , i n c o m p l e t e n e s s a n d m i s u n d e r s t a n d i n g o f t h e i n f o r m a t i o n w e r e a s s e s s e d b y t h e k n o w l e d g e e n g i n e e r s . Q u e s t i o n s b a s e d o n t h e a n a l y s i s o f t h e i n f o r m a t i o n w e r e t h e n c o m p i l e d a n d i n c l u d e d w i t h a c o p y o f t h e t r a n s c r i p t s . T h e t r a n s c r i p t s w e r e t h e n d i s t r i b u t e d t o t h e a c q u i s i t i o n t e a m b e f o r e t h e n e x t m e e t i n g t o e v a l u a t e t h e i n f o r m a t i o n . D u r i n g t h e s u b s e q u e n t m e e t i n g s , t h e s e q u e s t i o n s w e r e t h e n d i s c u s s e d a n d s o l v e d . I n T a b l e 4 . 1 , e x c e r p t s f r o m o n e o f t h e a c q u i s i t i o n m e e t i n g s a r e s h o w n . T w o g e n e r a l t y p e s o f q u e s t i o n s w e r e p r e s e n t e d . T h e fi r s t t y p e o f q u e s t i o n i n v o l v e s e l u c i d a t i o n o f m a t e r i a l t h a t m i g h t n o t h a v e b e e n u n d e r s t o o d f r o m a p r i o r 9 4 m e e t i n g . T h e s e u s u a l l y t a k e t h e f o r m o f " P l e a s e e x p l a i n t h i s s t a t e m e n t y o u m a d e a t t h e p r e v i o u s k n o w l e d g e a c q u i s i t i o n m e e t i n g . " T h e s e c o n d t y p e i s a t t e m p t s t o o b t a i n a c l e a r e r u n d e r s t a n d i n g o f t h e h e u r i s t i c s . A s m e n t i o n e d i n C h a p t e r 2 , e x p e r t s o f t e n d o n o t c o n s i d e r _ o r v o c a l i z e t h e t h o u g h t p r o c e s s e s t h a t w e r e u s e d t o d e r i v e t h e i r a d v i c e . T h i s s e c o n d t y p e o f q u e s t i o n a t t e m p t s t o d i r e c t t h e e x p e r t a t p r o v i d i n g m o r e s u c c i n c t a n d c l a r i fi e d r e a s o n s b e h i n d t h e a d v i c e . T h e e x p e r t i s d i r e c t e d t o d e fi n e t h e h e u r i s t i c s a n d d i s c u s s t h e i n t e r a c t i o n s a n d r a m i fi c a t i o n s w i t h o t h e r h e u r i s t i c s . T h i s q u e s t i o n i n g w i l l o f t e n l e a d t o t h e d e v e l o p m e n t o f f u r t h e r h e u r i s t i c s . T h e k n o w l e d g e e n g i n e e r s h o u l d i n t e r a c t i v e l y a s k t h r e e q u e s t i o n s o f t h e e x p e r t : I . W h a t d o y o u d o n e x t ? 2 . W h a t d o e s t h a t m e a n ? 3 . W h y d o y o u d o t h a t ? T h e l a s t s t a g e o f t h e m e e t i n g s i n v o l v e d e v a l u a t i o n o f t h e p r o t o t y p e e x p e r t s y s t e m t o d e t e r m i n e i f t h e s y s t e m w a s c o n c i s e a n d l o g i c a l . T h e m e m b e r s m a d e n o t e s w h i l e r u n n i n g t h e s y s t e m a n d r e p o r t e d t h e s e c o n c e r n s a t t h e n e x t m e e t i n g . T h e s e c o n c e r n s w e r e t h e n a d d r e s s e d a s e i t h e r l i m i t a t i o n s o f t h e s o f t w a r e o r w e r e c o r r e c t e d i n t h e n e x t v e r s i o n o f t h e e x p e r t s y s t e m . 9 5 T a b l e 4 . 1 E x c e r p t f r o m K n o w l e d g e A c q u i s i t i o n M e e t i n g M e e t i n g N o . 3 - 1 9 t h F e b r u a r y 1 9 8 6 T h o s e P r e s e n t ; 5 : S t a n C r o u c h V : V i c k i M c G u f f i n A : A d r i a n W a d e C : C h r i s t i n e E v a n s K : K i m R a t a n a t h a n a w o n g s M : S t e p h e n M e d l i n A i m o f M e e t i n g : T o d e t e r m i n e a n s w e r s t o t h e a b o v e a t t a c h e d q u e s t i o n s a n d t o d e t e r m i n e c o r r e c t i o n s / e r r o r s t o t h e e x p e r t s y s t e m I n i t s p r e s e n t c o n d i t i o n . Q U E S T I O N S 1 . W h a t s o l v e n t s s h o u l d / s h o u l d n o t b e u s e d w i t h p h e n y l c o l u m n s ? 2 . Y o u s u g g e s t u s e o f g a s c h r o m a t o g r a p h y i n p r e f e r e n c e t o H P L C w h e n e v e r p o s s i b l e . W o u l d y o u g o a s f a r a s t o s u g g e s t u s e o f s o l i d l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y w h e n e v e r g e o m e t r i c i s o m e r s a r e p r e s e n t ? 3 . W h a t s y s t e m s h o u l d b e u s e d f o r ” p o l a r i t y o n l y ” s e p a r a t i o n s ? ( S i l i c a G e l ? - I s t h i s t h e s a m e a s ” s i l i c a " ? - W h y n o t a l u m i n a t o o ? ) V : A n o t h e r s t a t i o n a r y p h a s e t h a t h a s b e e n u s e d f o r g e o m e t r i c i s o m e r s a r e s o m e o f t h e c h a r g e t r a n s f e r c o m p l e x e s . T h e y s e l e c t i v e l y f o r m c o m p l e x e s w i t h c e r t a i n o f t h e g e o m e t r i c i s o m e r s w h i c h o t h e r w i s e m i g h t n o t b e e l e c t r o n i c a l l y s u i t e d t o b i n d t o t h e c h a r g e t r a n s f e r p h a s e a n d t h a t i s a n o t h e r a p p r o a c h . A : W h a t m o d e o f H P L C w o u l d y o u t e r m t h a t ? C : O b t u s e ! V : O b t u s e i s n ' t b a d . H o w d o y o u w a n t i t d i v i d e d ? I n o t h e r w o r d s w h i c h c a t e g o r i e s d o y o u w a n t t o u s e ? A : I s i t r e v e r s e o r n o r m a l p h a s e f o r a s t a r t ? L i k e . . . V : I t c a n b e e i t h e r o n e b e c a u s e t h e i n t e r a c t i o n i n t h i s c a s e i s a n e l e c t r o n i c i n t e r a c t i o n . A n d s o y o u c o u l d d o i t i n n o r m a l o r r e v e r s e p h a s e l i k e c y a n o . C y a n o p h a s e i s a n e l e c t r o n i c i n t e r a c t i o n . A : W o u l d y o u . . . N o w i n t e r m s o f m o l e c u l a r s i z e u l a r g e o r s m a l l ? V : C o u l d b e e i t h e r o n e b u t p r o b a b l y s m a l l e r b e c a u s e t h e s t a t i o n a r y p h a s e t h a t y o u a r e d e a l i n g w i t h h a s o n e g r o u p t h a t h a s b e e n d e s i g n e d t o I n t e r a c t w i t h t h i s m o l e c u l e a n d i t m i g h t r e a c t w i t h a p a r t o f t h a t m o l e c u l e b u t I w o u l d s a y i n g e n e r a l i t w o u l d b e s m a l l . A : A n d w h i c h s o l v e n t s w o u l d y o u u s e ? 9 6 S e c t i o n 4 . 3 . 3 A d d i t i o n a l S o u r c e s o f I n f o r m a t i o n A s a f o r e w a r n i n g , k n o w l e d g e e n g i n e e r s m u s t n o t a s s u m e t h a t t h e y c a n o m i t t h e h u m a n e x p e r t a n d g o t o t h e l i t e r a t u r e d i r e c t l y f o r t h e p u r p o s e o f d e v e l o p i n g t h e e x p e r t s y s t e m . M o s t o f t h e l i t e r a t u r e i s , b y n a t u r e , f a i r l y t e r s e . M a n y o f t h e h e u r i s t i c s t h a t w e r e a p p l i e d b y t h e a u t h o r s o f s c i e n t i fi c p a p e r s i n d e v e l o p i n g a p a r t i c u l a r m e t h o d a r e n o t e x p l a i n e d i n t h e l i t e r a t u r e . T h e r e f o r e , i t i s c a n b e d i f f i c u l t t o d e v e l o p a n e x p e r t s y s t e m b a s e d s o l e l y o n t h e l i t e r a t u r e ; s u c h a ' s y s t e m c o u l d b e c o m e s i m p l y a d a t a b a s e o f m e t h o d s . W h i l e t h e d a t a b a s e w o u l d h a v e u t i h t y i n i t s e l f , i t i s d e s i r a b l e t o h a v e t h e e x p e r t s y s t e m b e a b l e t o e x t e n d t h e p r i n c i p l e s u s e d i n t h e l i t e r a t u r e t o d i f f e r e n t a p p l i c a t i o n s . I n t h i s f a s h i o n , t h e e x p e r t s y s t e m a p p e a r s t o b e i n t e l l i g e n t a n d c a n p r o v i d e r e c o m m e n d a t i o n s f o r a p p l i c a t i o n s t h a t m i g h t b e d i f f e r e n t f r o m t h e o r i g i n a l . T h i s t y p e o f e x p e r t s y s t e m c a n o n l y b e d e v e l o p e d w h e n t h e h e u r i s t i c s o f t h e o r i g i n a l m e t h o d c a n b e o b t a i n e d a n d e n c o d e d t o a l l o w t h e e x p e r t s y s t e m t o a p p l y fi r s t p r i n c i p l e s i n e x t e n d i n g t h e r e c o m m e n d a t i o n s t o o t h e r a r e a s . S e c t i o n 4 . 3 . 3 . 1 T y p e s o f D a t a U s e d T h e fi r s t t y p e o f d a t a u s e d w a s d i f f e r e n t j o u r n a l a r t i c l e s t o d e t e r m i n e s o m e o f t h e d i f f e r e n t u s e s f o r s i z e e x c l u s i o n c h r o m a t o g r a p h y . T h e p r o t o t y p e e x p e r t s y s t e m w a s b a s e d u p o n a W a t e r s C h r o m a t o g r a p h y fl o w c h a r t 1 0 ( F i g u r e 4 . 1 ) w h i c h p r o v i d e d a l o g i c c h a r t t o d e t e r m i n e w h i c h t y p e o f c o l u m n t o u s e w h e n d e v e l o p i n g a m e t h o d . F i g u r e 4 . 1 , a d a p t e d f r o m W a t e r s , d o e s n o t i n c l u d e t h e d i f f e r e n t p a c k i n g m a t e r i a l s , s u c h a s a m i n e o r p h e n y l c o l u m n s . T h e fi r s t s t a g e i s t o c l a s s i f y t h e s o l u t e s b a s e d u p o n t h e i r a v e r a g e m o l e c u l a r m a s s , w h i c h p r o v i d e s i n f o r m a t i o n o n t h e r e q u i r e d p o r e s i z e s o f t h e s t a t i o n a r y p h a s e . T h e s o l u b i l i t y o f t h e s a m p l e w i l l i n d i c a t e t h e t y p e o f c h r o m a t o g r a p h y ( n o r m a l - v e r s u s r e v e r s e d - p h a s e ) t h a t w i l l b e u s e d . I n t h e W a t e r s C h a r t , t h e i o n i c n a t u r e 9 7 o f t h e c o m p o u n d ( s ) i s u s e d t o d i s c r i m i n a t e b e t w e e n c o l u m n s b a s e d o n s e p a r a t i o n o f i o n i c s p e c i e s a n d t h e r e m a i n d e r o f t h e c o l u m n s . T h i s c h a r t d i s c r i m i n a t e d a g a i n s t b o t h s i z e e x c l u s i o n c h r o m a t o g r a p h y ( S E C ) a n d a l s o m a n y f o r m s o f n o r m a l p h a s e c h r o m a t o g r a p h y . S n y d e r a n d K i r k l a n d ‘ s fl o w c h a r t 1 1 e m p h a s i z e s u s i n g S E C a s a b o t h p r e l i m i n a r y s a m p l e c l e a n - u p t e c h n i q u e a n d a l s o a m e t h o d t o f r a c t i o n a t e t h e s a m p l e . A s t h e fi n a l o b j e c t i v e o f t h i s r e s e a r c h i n c l u d e s c o l u m n s w i t c h i n g , r u l e s b a s e d o n p r i n c i p l e s o f S E C w e r e i n c o r p o r a t e d i n t o t h e e x p e r t s y s t e m . I n a d d i t i o n , F i g u r e 4 . 1 d o e s n o t i n c l u d e a n y a d d i t i o n a l c r i t e r i a t h a t i s u s e d t o c h o o s e b e t w e e n t h e d i f f e r e n t r e c o m m e n d a t i o n s ( e . g . , R e v e r s e d - P h a s e w i t h I o n i z a t i o n C o n t r o l , R e v e r s e d - P h a s e I P C , I E C , o r I o n C h r o m a t o g r a p h y f o r s m a l l i o n i c c o m p o u n d s ) . E a c h o f t h e s e s p e c i e s w i l l b e m o r e a p p r o p r i a t e f o r d i f f e r e n t s p e c i e s t h a n t h e o t h e r . F i n a l l y , t h i s fi g u r e d o e s n o t i n d i c a t e a n y c r i t e r i a t h a t i s u s e d t o c h o o s e t h e d i f f e r e n t p a c k i n g m a t e r i a l s ( e . g . , p h e n y l , a m i n e b a s e d s t a t i o n a r y p h a s e s ) . T h e p r o t o t y p e e x p e r t s y s t e m a l s o d i d n o t d i f f e r e n t i a t e b e t w e e n t h e d i f f e r e n t m e t h o d s b a s e d o n i o n i c p r o p e r t i e s . T h e p r o t o t y p e e x p e r t s y s t e m s u g g e s t e d t h a t t h e p H b e c h a n g e d t o s h i f t t h e i o n s i n t o t h e n e u t r a l p h a s e , i f p o s s i b l e , o r t h a t g e n e r i c i o n c h r o m a t o g r a p h y b e u s e d . l i t e r a t u r e o n i o n i c s e p a r a t i o n s w a s r e a d a n d i n c o r p o r a t e d i n t o t h e e x p e r t s y s t e m . T h i s a l l o w e d a m o r e d e t a i l e d r e c o m m e n d a t i o n o n w h e n t o u s e i o n c h r o m a t o g r a p h y ; t o b e u s e d e v e n w h e n t h e s o l u t e m i g h t b e s h i f t e d i n t o t h e n e u t r a l p h a s e . I n p a r t i c u l a r , i f t h e r e a r e n o o t h e r s e p a r a t i o n m o d e s a v a i l a b l e , o r i f t h e s o l u t e ( s ) a r e h i g h l y i o n i c ( o r m u l t i p l y i o n i c ) , i t m i g h t b e a d v a n t a g e o u s t o u s e o n e o f t h e i o n i c t e c h n i q u e s s u c h a s I o n - P a i r C h r o m a t o g r a p h y ( I P C ) , I o n E x c h a n g e ( I E C ) , o r I o n c h r o m a t o g r a p h y ( 1 C ) . T h e k n o w l e d g e b a s e w a s e x p a n d e d t o p r o v i d e r u l e s t o d e t e r m i n e w h i c h o f t h e i o n i c t e c h n i q u e s w o u l d b e a p p r o p r i a t e ( b a s e d u p o n t h e r e l a t i v e c h a r g e , s i z e , a n d t y p e o f i o n ) . T h e s e r u l e s t h e n a r e k e p t i n c o n s i d e r a t i o n a n d a r e w e i g h t e d w i t h t h e a p p r o p r i a t e r a n g e o f c o n fi d e n c e s . T h i s a l l o w s t h e e x p e r t s y s t e m t o c o n s i d e r a l l 9 8 m e t h o d s t h r o u g h o u t t h e c o m p l e t e c o n s u l t a t i o n . E l i m i n a t i o n o f m e t h o d s i s o n l y d o n e a t t h e e n d o f t h e c o n s u l t a t i o n w h e n c r i t e r i a s u c h a s n o t h a v i n g a c a t i o n e x c h a n g e c o l u m n o r n o t h a v i n g a d e t e c t o r t h a t r e s p o n d s t o i o n s p r e c l u d e s u s i n g i o n c h r o m a t o g r a p h y . ( A s a n a s i d e , t h i s a p p r o a c h o f e l i m i n a t i n g o n l y a t t h e e n d o f t h e c o n s u l t a t i o n i s a l s o u s e d f o r t h e o t h e r m o d e s o f s e p a r a t i o n . ) T h e r e a r e s e v e r a l d i f f e r e n t s p e c i a l t y c o l u m n s t h a t a r e a v a i l a b l e , s u c h a s c o l u m n s t h a t s e p a r a t e s p e c i fi c a l l y p r o t e i n s , c a r b o h y d r a t e s , a n d c h i r a l c o m p o u n d s . S i n c e t h e s e a r e f a i r l y s p e c i fi c i n n a t u r e t o t h e m a n u f a c t u r e r s , l i t e r a t u r e f r o m H P L C c o m p a n i e s w a s u s e d t o p r o v i d e s e v e r a l r u l e s d e a l i n g w i t h t h e s e c o l u m n s . T h e u s e r i s i n f o r m e d a b o u t t h e p r e s e n c e o f s u c h c o l u m n s a n d a s k e d t o d o f u r t h e r r e a d i n g t o u s e t h e s e m e t h o d s . I t m u s t b e r e c a l l e d t h a t o n e g o a l o f t h i s e x p e r t s y s t e m i s t o r e m a i n a s g e n e r a l i z e d a s p o s s i b l e . T h u s , t h e e x p e r t s y s t e m d o e s k n o w o f t h e s e c o l u m n s a n d k n o w s w h e n t o r e c o m m e n d t h e m , b u t t h e a d v i c e o n t h e i r u s e i s k e p t l i m i t e d . T h e r e a s o n i n g b e h i n d t h i s d e c i s i o n i s t h a t a c o m p l e t e e x p e r t s y s t e m c o u l d b e d e v e l o p e d b a s e d o n a s i n g l e o n e o f t h e s e a r e a s o f c h r o m a t o g r a p h y , i n p a r t i c u l a r , t h e s e p a r a t i o n o f g e o m e t r i c a n d o p t i c a l i s o m e r s . T h e r e f o r e , t h e i n f o r m a t i o n o n t h e s e c o l u m n s i s l i m i t e d i n n a t u r e t o a v o i d a n e x c e s s i v e l y l o n g a n d s l o w c o n s u l t a t i o n w i t h t h e u s e r . F i n a l l y t y p i c a l c o l u m n p a r a m e t e r s s u c h a s t h e a v e r a g e n u m b e r o f t h e o r e t i c a l p l a t e s , m a x i m u m o p e r a t i n g p r e s s u r e s a n d p H s , a n d s o o n , h a v e b e e n o b t a i n e d f r o m t h e m a n u f a c t u r e r s l i t e r a t u r e o f r e p r e s e n t a t i v e c o m p a n i e s a n d p l a c e d i n t o a d a t a b a s e . T h e m o t i v a t i o n b e h i n d t h i s w a s t o b e a b l e t o s u g g e s t d i f f e r e n t c o l u m n s t h a t m i g h t s o l v e a p a r t i c u l a r p r o b l e m w h e r e t h e u s e r d o e s n o t h a v e t h a t s p e c i fi c c o l u m n i n h i s / h e r l a b o r a t o r y . I n t h i s f a s h i o n , t h e u s e r c a n b e d i r e c t e d t o a t l e a s t o n e c o m p a n y t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e p u r c h a s e o f a p a r t i c u l a r c o l u m n m i g h t b e w a r r a n t e d . I n a d d i t i o n , t h e u s e r m a y t h e n p r o v i d e t h e p a r a m e t e r s o f t h e c o l u m n s t h a t a r e c u r r e n t l y 9 9 a v a i l a b l e i n t h e l a b o r a t o r y . T h i s a l l o w s t h e e x p e r t s y s t e m t o p r o v i d e m u c h m o r e d e t a i l e d a n d t a i l o r e d r e c o m m e n d a t i o n s f o r t h a t l a b o r a t o r y . S e c t i o n 4 . 4 A c t i o n B l o c k V P - E x p e r t i s w r i t t e n s u c h t h a t t h e h i g h e s t l e v e l o f c o d e i s t h e A C T I O N B L O C K . T h e A c t i o n B l o c k i s w h e r e t h e o b j e c t i v e s o f t h e e x p e r t s y s t e m a r e s p e c i f i e d . T h e A c t i o n B l o c k a l s o c o n t a i n s t h e c o d e t h a t e s t a b l i s h e s t h e u s e r - i n t e r f a c e , a n y g r a p h i c a l c o n s t r u c t s , a n d s o f o r t h . T h e r e s t o f t h e k n o w l e d g e b a s e c o n s i s t s p r i m a r i l y o f t h e r u l e s a n d f a c t s . A n a b r i d g e d c o p y o f t h e A c t i o n B l o c k s u s e d i n t h i s e x p e r t s y s t e m i s p r e s e n t e d i n T a b l e s 4 . 2 a n d 4 . 3 . ( A c o m p l e t e l i s t i n g o f t h e k n o w l e d g e b a s e i s a v a i l a b l e i n a s e p a r a t e d o c u m e n t a n d c a n b e o b t a i n e d b y c o n t a c t i n g e i t h e r t h e l a b o r a t o r y o r t h e a u t h o r o f t h i s d i s s e r t a t i o n . ) T h e f o l l o w i n g s e c t i o n s w i l l r e f e r e n c e t h i s s e c t i o n o f c o d e t o d e s c r i b e t h e s p e c i fi c g o a l s a n d a p p r o a c h o f t h i s e x p e r t s y s t e m . T h e e a r l i e r v e r s i o n s o f t h e e x p e r t s y s t e m w e r e b r o k e n i n t o t w o d i f f e r e n t m o d u l e s , d u e t o V P - E x p e r t ' s l i m i t a t i o n i n t h e u t i l i z a t i o n o f a v a i l a b l e m e m o r y . W i t h t h e c u r r e n t v e r s i o n o f V P - E x p e r t , b o t h m o d u l e s c o u l d b e c o m b i n e d i n t o o n e l a r g e r k n o w l e d g e b a s e ; h o w e v e r b o t h m o d u l e s a r e m a i n t a i n e d s e p a r a t e l y t o i m p r o v e t h e p e r f o r m a n c e o f t h e e x p e r t s y s t e m . T h e t w o m o d u l e s w e r e d i v i d e d l o g i c a l l y i n t o t h e fi r s t m o d u l e , w h i c h d e t e r m i n e s t h e s e p a r a t i o n m o d e ( e . g . , s i z e e x c l u s i o n c h r o m a t o g r a p h y ) , a n d t h e s e c o n d m o d u l e , w h i c h a c c e s s e s t h e d a t a b a s e t o p r e s e n t p a r t i c u l a r c o l u m n s , s o l v e n t s , d e t e c t o r s , a n d s o f o r t h . I n t h i s f a s h i o n , t h e s e c o n d m o d u l e s e r v e s p r i m a r i l y a s t h e u s e r - i n t e r f a c e f o r t h e r e c o m m e n d a t i o n s . T h i s w i l l a l l o w d i f f e r e n t p r e s e n t a t i o n s t o b e u s e d b y c h a n g i n g o n l y t h e s e c o n d m o d u l e . 1 0 0 N M W > Y 2 0 0 0 Y W a t e r N Y W a t e r N S o l u b l e S o l u b l e N Y Y S o l u b l e N 2 1 3 0 1 . n e t : G P I o m C _ ‘ i n P o l a r I E C S o l v e n t s H y d r o p h o b i c N P B o n d e d R P B o n d e d ” f l ” c a m “ ) T H E N . E E K R P B o n d e d S o l u b l e N P A d s o r p t i o n r c Y G P C L e g e n d R P R e v e r s e d - P h a s e N P N o r m a l - P h a s e I P C I o n P a i r e d C h r o m a t o g r a p h y I E C I o n E x c h a n g e C h r o m a t o g r a p h y G P C G e l P e r m e a t i o n C h r o m a t o g r a p h y F i g u r e 4 . 1 F l o w C h a r t f o r C h o o s i n g a n H P L C C o l u m n 1 0 1 T a b l e 4 . 2 A c t i o n B l o c k f o r F i r s t M o d u l e A C T I O N S M a x _ p H _ % = 8 M i n _ p H . % = 2 < 5 u s d é £ t a b F I N D H P L C - S u i t e d F I N D S c u Z L C h e c k e d F I N D H o m o g e n e i t y - C h e c k e d F I N D C o n t i n u e F i n d L o _ p H _ % F I N D H L p H J ‘ S A V E F A C T S c o n t h x T a b l e 4 . 3 A c t i o n B l o c k f o r S e c o n d M o d u l e A C I ' I O N S L o a d f a c t s c o n t _ l c x D i s p l a y ” M o d u l e 2 L o a d e d ” L o o p - C o u n t - 1 W H I L E T R U E L o o p - C o u n t < - ( M a x c o u n t e r ) A N D M o d e < > N o t _ C h e c k e d O R M o d e < > U N K N O W N . T H E N D I S P L A Y " A d v i c e r e s u l t s a r e # { L o o p - C o u n t } { A d v i c e [ L o o p _ C o u n t ] } " L o o p _ C o u n t - ( L o o p _ C o u n t + 1 ) E N D S O R T M o d e d i s p l a y ” T h e v a l u e s o f m o d e a r e : { # M o d e } T h e v a l u e s o f p a c k i n g a r e : { P a c k i n g _ T Y P E } " P o p M o d e , M o d e _ t m p W H I L E T R U E M o d e _ t m p < > U n k n o w n a n d M o d e - t m p < > N o t _ S ‘ u i t e d a n d M o d e _ T m p < > N o t - C h e c k e d T H E N D I S P L A Y " T h e c o l u m n s c h o s e n f o r { # M o d e _ T M P ) : " F I N D C o l u m n R E S E T M o d e _ t m p P o p M o d e , M o d e _ t m p E N D S a v e f a c t s c o n t - I c Z ; 1 0 2 I n T a b l e 4 . 2 , t h e fi r s t s e v e r a l l i n e s a r e f a c t s f o r t h e e x p e r t s y s t e m . F o r e x a m p l e , t h e m a x i m u m a l l o w a b l e p H i s s e t t o 8 ( M a x _ p H - % = 8 ) . T h i s v a l u e i s u s e d i n c o n j u n c t i o n w i t h o t h e r r u l e s t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e p H r e q u i r e d t o n e u t r a l i z e t h e i o n i c s p e c i e s i s o u t s i d e o f t h e o p e r a t i n g p a r a m e t e r s . T h i s f a c t i s t h e r e f o r e u s e d a l s o i n d e t e r m i n i n g t h e a p p r o p r i a t e c o l u m n f o r i o n i c s p e c i e s . T h e s e v a l u e s a r e e a s i l y c h a n g e a b l e a n d a l l o w t h e t o t a l k n o w l e d g e b a s e t o b e e d i t e d b y c h a n g i n g t h e f a c t s . O t h e r f a c t s ( n o t s h o w n ) a r e u s e d t o i m p r o v e t h e r e a d a b i l i t y o f t h e e x p e r t s y s t e m b y u s i n g m n e m o n i c s r a t h e r t h a n n u m b e r s ( e . g . , f o r p o i n t e r s i n a r r a y s ) . A s e c o n d f e a t u r e o f V P - E x p e r t i s t h e u s e o f P L U R A L v a r i a b l e s . A p l u r a l v a r i a b l e i s s i m i l a r t o a m e m o r y s t a c k i n t h a t m u l t i p l e v a l u e s m a y b e a s s i g n e d t o t h e v a r i a b l e . I n t h i s f a s h i o n , o n e o r m o r e r e s u l t s m a y b e p l a c e d i n t o t h e v a r i a b l e a n d m u l t i p l e c o n c l u s i o n s c a n t h e n b e d r a w n . W h i l e a l l v a l u e s o f t h e p l u r a l v a r i a b l e a r e s i m u l t a n e o u s l y a v a i l a b l e , i t i s n e c e s s a r y t o P O P t h e p l u r a l v a r i a b l e w h e n m a n i p u l a t i n g a s i n g l e v a l u e o f t h e v a r i a b l e . S e c t i o n 4 . 4 . 1 D e t e r m i n a t i o n o f S u i t a b i l i t y T h e f i r s t g o a l o f t h e e x p e r t s y s t e m i s t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e p r o b l e m i s a m e n a b l e t o a n H P L C s o l u t i o n . H P L C c a n b e a n e x p e n s i v e t e c h n i q u e t o e m p l o y — b o t h i n t e r m s o f c o s t , t i m e , a n d c o m p l e x i t y . I f t h e s a m p l e c a n b e s e p a r a t e d o r a n a l y z e d w i t h o u t u s i n g H P L C , t h e e x p e r t s y s t e m s u g g e s t s t h a t t h e u s e r s e e k a n a l t e r n a t i v e t e c h n i q u e . T h e fi r s t s e r i e s o f q u e s t i o n s d e t e r m i n e s i f a s e p a r a t i o n i s r e q u i r e d v i a f o u r q u e s t i o n s . T h e s e q u e s t i o n s a s k i f t h e s a m p l e c o u l d b e a s s a y e d b y a p h y s i c a l t e c h n i q u e s u c h a s a v i s u a l d e t e r m i n a t i o n , w e i g h i n g s , a n d s o f o r t h . T h e e x p e r t s y s t e m m a y s u g g e s t t h a t a s e p a r a t i o n i s n e e d e d w h e n t h e u s e r k n o w s o n l y t h e m o t i v e f o r a p o t e n t i a l s e p a r a t i o n . F o r e x a m p l e , i f t h e u s e r m u s t p u r i f y l a r g e q u a n t i t i e s o f a s a m p l e i n w h i c h 1 0 3 h e / s h e k n o w s t h e c o m p o n e n t s , t h e n a s e p a r a t i o n i s n e e d e d ( i . e . , P r e p - S c a l e c h r o m a t o g r a p h y ) . A n e x a m p l e i s s h o w n i n C o d e 4 . 1 . T h i s c o d e e x a m p l e d e m o n s t r a t e s t w o d i f f e r e n t e x p e r t s y s t e m p r i n c i p l e s . T h e fi r s t p r i n c i p l e i s t h e a b i l i t y o f t h e e x p e r t s y s t e m t o d e a l w i t h i n c o m p l e t e o r m i s s i n g d a t a . I n t h i s c o d e s e g m e n t , i f t h e u s e r h a s i n d i c a t e d t h a t h e o r s h e d o e s n o t k n o w i f a d i r e c t a n a l y s i s i s p o s s i b l e ( D i r e c t fi n a l y s l s = U n k n o w n ) , t h e e x p e r t s y s t e m c a n a p p l y a d d i t i o n a l i n f o r m a t i o n t o d e t e r m i n e w h e t h e r t o p r o c e e d w i t h t h e c o n s u l t a t i o n . T h e s e c o n d p r i n c i p l e i s t h e u s e o f c o n f i d e n c e f a c t o r s ( e . g . , C N F 9 0 ) . T h e u s e o f a c o n f i d e n c e f a c t o r r e fl e c t s t h e l a c k o f i n f o r m a t i o n r e g a r d i n g d i r e c t a n a l y s i s o f t h e s a m p l e . C o d e E x a m p l e t o D e t e r m i n e i f S e p a r a t i o n N e e d e d R u l e S e p _ N e e d e d 3 I F D i r e c t _ A n a l y s i s 2 U n k n o w n O R C o d e 4 . 1 D i r e c t J n a l y s i s a : N o A N D S e p a r a t i o n _ R e a s o n = A n a l y t i c a l O R S e p a r a t i o n - R e a s o n = P r e p a r a t i v e T H E N S e p a r a t i o n _ N e e d e d = Y e s C N F 9 0 ; I f t h e s a m p l e m u s t b e s e p a r a t e d , t h e e x p e r t s y s t e m u s e s t w e n t y - f o u r r u l e s t o a s c e r t a i n t h e i m m e d i a t e c h e m i c a l a n d p h y s i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e s a m p l e t h a t p r e c l u d e o r n e c e s s i t a t e t h e u s e o f H P L C . I f t h e s a m p l e i s u n s t a b l e ( l a b i l e o r r e a c t i v e c o m p o u n d s s u c h a s e x p l o s i v e s o r l a r g e , f r a g i l e p r o t e i n s ) . T h e e x p e r t s y s t e m w i l l a s s i s t t h e u s e r i n d e t e r m i n i n g t h e " v a l u e s " t o t h e s e q u e s t i o n s b y a s k i n g t h e u s e r a d d i t i o n a l q u e s t i o n s t o e l u c i d a t e i n f o r m a t i o n a n d b y p r e s e n t i n g a l i s t o f l a b i l e c o m p o n e n t s t h a t t y p i c a l l y m u s t b e s e p a r a t e d b y H P L C r a t h e r t h a n G C . T h e e x p e r t s y s t e m a l s o d e t e r m i n e s i f t h e b o i l i n g p o i n t o f t h e s a m p l e i s r e l a t i v e l y h i g h ( g r e a t e r t h a n 1 0 0 ° C ) . A s a m p l e t h a t h a s a l o w b o i l i n g p o i n t i s b e t t e r s u i t e d t o G C o r S F C . 1 0 4 T h e fi n a l s t e p n e e d e d i n d e t e r m i n i n g t h e s u i t a b i l i t y o f H P L C i s t o d e t e r m i n e i f a d e t e c t o r i s a v a i l a b l e a n d c a p a b l e o f r e s p o n d i n g t o t h e a n a l y t e s . E i g h t e e n q u e s t i o n s a r e u s e d t o d e t e r m i n e t h e a n s w e r t o t h i s q u e s t i o n . C o d e s 4 . 2 a n d 4 . 3 d e m o n s t r a t e t h e d e t e r m i n a t i o n i f t h e d e t e c t o r c h o s e n b y t h e u s e r i s s u i t a b l e f o r t h e s a m p l e . C o d e 4 . 2 i s t h e “ m a s t e r ” r u l e t h a t i s u s e d t o d e t e r m i n e t h e o v e r a l l s u i t a b i l i t y o f H P L C . W i t h i n t h i s r u l e a r e t w o s u b - g o a l s , D e t e c t o r _ S u i t a b I e a n d C o r r e c t _ C o n c _ R a n g e , w h i c h m u s t b e d e t e r m i n e d b e f o r e a s s i g n i n g a v a l u e t o H P L C - D e t e c t o r _ S u i t a b l e . T h e fi r s t s u b - g o a l a s s i s t s t h e u s e r i n c h o o s i n g a d e t e c t o r s u i t a b l e w h i l e t h e s e c o n d g o a l i n s u r e s t h a t t h e d e t e c t o r w i l l r e s p o n d t o t h e c o n c e n t r a t i o n r a n g e o f t h e a n a l y t e . C o d e 4 . 3 d e t e r m i n e s i f a d e t e c t o r i s a v a i l a b l e f o r i o n i c c o m p o u n d s . T h i s r u l e w i l l a s s i g n ' Y e s " t o D e t e c t o r _ S u i t a b I e o n l y i f t h e a n a l y t e i s i o n i c ( a n d c a n n o t b e s h i f t e d i n t o i t s n e u t r a l f o r m v i a a n a p p r o p r i a t e c h a n g e i n t h e p H ) a n d t h e s p e c i e s c a n b e d e t e c t e d e i t h e r b y a n i o n i c - s e n s i t i v e d e t e c t o r o r b y a d e t e c t o r t h a t c a n d e t e c t t h e n o n - i o n i c f o r m . T h e B E C A U S E p a r t o f t h e r u l e i s u s e d b y t h e e x p e r t s y s t e m ( u p o n r e q u e s t b y t h e u s e r ) t o g e n e r a t e a r e p o r t o f t h e s e s s i o n . T h i s r e p o r t w i l l c o n t a i n t h e t e x t o f t h e B E C A U S E c l a u s e s f o r e v e r y r u l e t h a t p a s s e d . I n t h i s f a s h i o n , t h e u s e r c a n t h e n d e t e r m i n e t h e i n d u c t i o n p a t h o f t h e c o n s u l t a t i o n . D u r i n g t h e c o n s u l t a t i o n , t h e u s e r c a n e i t h e r q u e r y t h e i n f e r e n c e e n g i n e t o t h e r e a s o n i n g b e h i n d a q u e s t i o n ( " W I - I Y ‘ ) o r r e q u e s t i n f o r m a t i o n o n h o w a v a l u e w a s a s s i g n e d t o a v a r i a b l e s u c h a s D e t e c t o r . S u i t a b l e ( “ H O W “ ) . T h e i n f e r e n c e e n g i n e w i l l r e s p o n d w i t h t h e t e x t f r o m t h e B E C A U S E c l a u s e . I f a r u l e d o e s n o t h a v e a B E C A U S E c l a u s e , t h e i n f e r e n c e e n g i n e o n l y d i s p l a y s t h e r u l e t h a t i s b e i n g a s k e d o r t h e r u l e t h a t a s s i g n e d t h e v a l u e t o t h e v a r i a b l e . C o d e 4 . 3 a g a i n s h o w s t h e i n t e r r e l a t e d n a t u r e o f d a t a . T h e c h e m i c a l n a t u r e o f t h e a n a l y t e s ( e . g . , i o n i c ) i s u s e d t o s o l v e d i f f e r e n t p r o b l e m s . I n t h i s c a s e , i t i s u s e d t o d e t e r m i n e t h e s u i t a b i l i t y o f H P L C w i t h r e g a r d s t o d e l e c t a b i l i t y a n d t o c h o o s e a c o l u m n . T h e i n f e r e n c e e n g i n e c a n m a k e i n d u c t i o n s b a s e d o n d a t a o b t a i n e d f r o m e a r l i e r 1 0 5 q u e s t i o n s a n d a p p l y t h e m t o a d d i t i o n a l g o a l s . A s e c o n d e x a m p l e o f t h i s i s t h e e a r l i e r d e t e r m i n a t i o n o f w h e t h e r C C o r S F C s h o u l d b e p r e c l u d e d . I f t h e u s e r n e e d s a s s i s t a n c e i n d e t e r m i n i n g i f t h e s a m p l e i s s t a b i l e a n d t h e u s e r c h o o s e s p r o t e i n s f r o m t h i s l i s t ( o r a s a n a n s w e r t o o t h e r q u e s t i o n s a s k e d b y t h e e x p e r t s y s t e m ) , t h e r u l e s a r e w r i t t e n s u c h t h a t t h i s i n f o r m a t i o n i s s t o r e d a n d u s e d i n d e t e r m i n i n g a n a p p r o p r i a t e c o l u m n a n d s e p a r a t i o n m e t h o d . B y u s i n g r e s u l t s f r o m p r e v i o u s g o a l s , t h e e x p e r t s y s t e m e x h i b i t s f a s t e r c o n s u l t a t i o n s a n d a p p e a r s t o b e i n t e l l i g e n t b y a p p l y i n g d a t a u s e d i n t h e d e t e r m i n a t i o n o f o n e g o a l ( e . g . , d e t e r m i n i n g i f H P L C i s s u i t a b l e ) t o t h e d e t e r m i n a t i o n o f a n a p p r o p r i a t e c o l u m n . A t a n y p o i n t d u r i n g t h e c o n s u l t a t i o n , t h e u s e r m a y c h o o s e t o b y - p a s s t h i s m o d u l e o r t o o v e r r i d e t h e s u g g e s t i o n f r o m t h e e x p e r t s y s t e m b y t w o d i f f e r e n t a p p r o a c h e s . T h e fi r s t a p p r o a c h e x p l i c i t l y a s k s i f t h e u s e r w a n t s t o a s c e r t a i n t h e s u i t a b i l i t y o f H P L C t o t h e p r o b l e m . S i n c e t h e e n d - u s e r f o r t h i s e x p e r t s y s t e m w i l l b e b o t h n o v i c e a n d s e m i - e x p e r t u s e r s , t h e u s e r i s g i v e n t h e c h o i c e t o h a v e t h e e x p e r t s y s t e m i g n o r e t h e H P L C s u i t a b i l i t y d e t e r m i n a t i o n . T h e s e c o n d m e t h o d e x p l i c i t l y a s k s i f t h e u s e r k n o w s o f a n y r e a s o n N O T t o u s e C C o r S F C . T h i s m e t h o d a l l o w s t h e u s e r t o f o r c e t h e c o n s u l t a t i o n t o c o n c l u d e t h a t H P L C i s s u i t a b l e . C o d e t o D e t e r m i n e i f D e t e c t o r i s S u i t a b l e u l e D e t e c t o r - S u i t a b l e 1 I F D e t e c t o r _ 5 u i t a b l e a Y e s A N D C o d e 4 . C o r r e c t - C o n c - R a n g e a Y e s T H E N H P L C - D e t e c t o r - S u i t a b I e I : Y e s E L S E H P L C - D e t e c t o r J _ S u i t a b l e - N o ; C o d e t o D e t e r m i n e D e t e c t o r F o r I o n i c C o m p o u n d s U L E D e t e c t o r _ S u i t a b I e 5 I F I o n i c i t y = I o n i c A N D C o d e 4 . D e t e c t J o n s a Y e s O R D e t e c t _ D i r e c t a Y e s T H E N D e t e c t o r _ 5 u i t a b l e - Y e s E L S E D e t e c t o r - 5 u i t a b l e . = N o t . B E C A U S E " f y o u r s o l u t e i s i o n i c a n d y o u c a n n o t s h i f t t h e s o l u t e i n t o i t s a n i o n i c f o r m t h e n y o u m u s t b e a b l e t o d e t e c t t h e i o n i c f o r m " ; 1 0 6 S e c t i o n 4 . 4 . 2 D e t e r m i n a t i o n o f S a m p l e P r e - T r e a t m e n t T h e n e x t s t a g e o f t h e c o n s u l t a t i o n d e t e r m i n e s i f a n y s a m p l e p r e - t r e a t r n e n t i s r e q u i r e d . T h e c u r r e n t i m p l e m e n t a t i o n o f t h e e x p e r t s y s t e m u s e s t w e n t y - o n e r u l e s t o p r o v i d e a s s i s t a n c e . T h e e x p e r t s y s t e m d e t e r m i n e s i f t h e r e a r e o b v i o u s p r o b l e m s w i t h t h e s a m p l e t h a t w o u l d c a u s e e i t h e r s y s t e m f a i l u r e ( e . g . , o b s t r u c t i n g t h e c o l u m n o r s c o r i n g t h e i n s t r u m e n t c o m p o n e n t s ) . T h e s y s t e m a s s i s t s i n d e t e r m i n i n g w h i c h l a y e r o f a b i - , t r i - , m u l t i l a y e r t o s a m p l e . T h e c u r r e n t i m p l e m e n t a t i o n a l s o s u g g e s t s s i m p l e s t e p s s u c h a s v a r y i n g t h e p H t o s h i f t t h e s p e c i e s o f i n t e r e s t f r o m o n e l a y e r t o t h e d e s i r e d l a y e r . A d d i t i o n a l r u l e s p r o m p t t h e u s e r t o d e t e r m i n e i f c h a n g i n g p a r a m e t e r s s u c h a s p H w i l l c a u s e d e g r a d a t i o n o r l o s s o f s p e c i a t i o n o f t h e a n a l y t e s . S e c t i o n 4 . 4 . 3 D e t e r m i n a t i o n o f C l a s s o f S e p a r a t i o n T h e r e a r e t w o m a j o r t y p e s o f c l a s s e s o f c h r o m a t o g r a p h i c s e p a r a t i o n s , n o r m a l - a n d r e v e r s e - p h a s e . S i m p l y , n o r m a l - p h a s e c h r o m a t o g r a p h y u s e s m o b i l e p h a s e s t h a t a r e l e s s p o l a r t h a n t h e s t a t i o n a r y p h a s e a n d r e v e r s e - p h a s e u s e s t h e o p p o s i t e a r r a n g e m e n t . W h i l e i t m i g h t s e e m f a i r l y s i m p l e t o d e t e r m i n e t h e t y p e b a s e d o n t h e s o l u b i l i t y o f t h e a n a l y t e s , t h e c h o i c e o f s e p a r a t i o n t y p e w i l l d i c t a t e t h e c h o i c e o f c o l u m n t o u s e . F o r s o l u t e s a r e o n l y s o l u b l e i n p o l a r o r n o n - p o l a r m o b i l e p h a s e s , t h e c h o i c e i s s i m p l i fi e d f o r t h e u s e r . F o r t h e s o l u t e s t h a t a r e s o l u b l e t o s o m e e x t e n t i n b o t h c l a s s e s o f m o b i l e p h a s e s , i t b e c o m e s n e c e s s a r y t o c h o o s e t h e m o s t a p p r o p r i a t e o n e . R e v e r s e - p h a s e ( R P - H P L C ) i s t h e m o r e c o m m o n m o d e o f o p e r a t i o n , b u t t h e r e a r e m a n y n o r m a l p h a s e m o d e s ( N P - H P L C ) w h i c h p r o v i d e u n i q u e r e s o l v i n g p o w e r s . F o r t h e c a s e i n w h i c h t h e s o l u t e i s s o l u b l e i n o n l y o n e t y p e o f m o b i l e p h a s e , t h e e x p e r t s y s t e m c h o o s e s t h a t t y p e o f c h r o m a t o g r a p h y ( i . e . , n o r m a l - p h a s e ) . F o r t h e o t h e r c a s e s , t h e e x p e r t s y s t e m u s e s s o l u b i l i t y i n f o r m a t i o n i n c o n j u n c t i o n w i t h a d d i t i o n a l r u l e s t o c h o o s e a n a p p r o p r i a t e c o l u m n . E i t h e r m e t h o d i s n o t e x c l u d e d a t t h e e a r l y 1 0 7 s t a g e s o f t h e c o n s u l t a t i o n , a n d t h e fi n a l c h o i c e o f t h e v a l u e s o f P h a s e ( N o r m a l v e r s u s R e v e r s e ) d o n o t e x c l u d e a n y c o l u m n u n t i l t h e fi n a l d a t a a r e i n p u t i n t o t h e c o m p u t e r . T h e n t h e i n f o r m a t i o n o n t h e m o d e i s c o m b i n e d w i t h o t h e r i n f o r m a t i o n t o m a k e t h e f i n a l r e c o m m e n d a t i o n . A t o t a l o f s i x t e e n r u l e s a r e u s e d t o d e t e r m i n e t h e p h a s e . T h e s e r u l e s u s e b o t h s o l u b i l i t y d a t a a n d s e p a r a t i o n p r o p e r t i e s t o d e t e r m i n e t h e a p p r o p r i a t e p h a s e . C o d e 4 . 4 p r o v i d e s a n e x a m p l e o f a r u l e t h a t d e t e r m i n e s i f r e v e r s e d p h a s e i s a p p r o p r i a t e . I n t h i s e x a m p l e , f o r s o l u t e s t h a t d i f f e r b y b o t h p o l a r i t y a n d s i z e a n d t h e r e i s n o r e a s o n t o p r e c l u d e u s i n g r e v e r s e - p h a s e , r e v e r s e p h a s e i s a p p r o p r i a t e . T h e c o n fi d e n c e f a c t o r i s l o w e r e d t o r e p r e s e n t t h e p o s s i b i l i t y o f u s i n g n o r m a l p h a s e c h r o m a t o g r a p h y f o r p o l a r c o m p o n e n t s . T h e i n d i v i d u a l m o d e s o f R P - L C ( e . g . , c y a n o - b a s e d R P - L C ) a r e a s s i g n e d a d d i t i o n a l c o n f i d e n c e f a c t o r s a t a l a t e r s t a g e d u r i n g t h e c o n s u l t a t i o n t o r e fl e c t a d i s c r i m i n a t i o n b e t w e e n t h e m o d e s . T w o d i f f e r e n t t y p e s o f d a t a a r e u s e d t o d e t e r m i n e t h e m o d e . T h e fi r s t t y p e i n v o l v e s i n f o r m a t i o n o f t h e d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e c o m p o n e n t s o f t h e s a m p l e ( t h e S e p a r a t i o n _ P r o p e r t y v a r i a b l e ) . T h i s i n f o r m a t i o n h a s b e e n o b t a i n e d f r o m t w e n t y - s e v e n e a r l i e r r u l e s . T h e s e d a t a w i l l b e c o m b i n e d w i t h t h e m o d e ( r e v e r s e d v e r s u s n o r m a l p h a s e ) a n d a d d i t i o n a l r u l e s a n d d a t a t o d e t e r m i n e t h e c o r r e c t c o l u m n i n t h e n e x t s t a g e o f t h e c o n s u l t a t i o n . T h e s e c o n d i n f o r m a t i o n t y p e i s r e p r e s e n t e d b y t h e P r e c l u d e - R e v - P h a s e ( a n d t h e P r e c l u d e _ N o r m a l _ P h a s e ) v a r i a b l e . T h e v a l u e s o f t h e s e v a r i a b l e s a r e a s s i g n e d b a s e d o n i n c o m p a t i b i l i t i e s a n d s o l u b i l i t i e s . T h e e x p e r t s y s t e m f o c u s e s o n t h e s o l u b i l i t y a s p e c t w h e n a s s i g n i n g a v a l u e t o t h e s e t w o v a r i a b l e s . I t i s e n v i s i o n e d t h a t t h e f u t u r e v e r s i o n o f t h i s e x p e r t s y s t e m w i l l u s e t h i s v a r i a b l e t o d e t e r m i n e t h e c o m p a t i b i l i t y b e t w e e n d i f f e r e n t c o l u m n s a n d m o b i l e p h a s e s w h e n i m p l e m e n t i n g m u l t i d i m e n s i o n a l c h r o m a t o g r a p h y v i a c o l u m n s w i t c h i n g . 1 0 8 C o d e t o D e t e r m i n e t h e A p p r o p r i a t e P h a s e U L E P h a s e I 1 I F S e p a r a t i o n _ P r o p e r t y - P o l a r i t y A N D C o d e 4 . 4 S e p a r a t i o n _ P r o p e r t y s S i z e A N D P r e c l u d e _ R e v _ P h a s e s N o T H E N R e v : P h a s e : O K a Y e s C N F 8 0 ; S e c t i o n 4 . 4 . 4 D e t e r m i n a t i o n o f C o l u m n a n d M o d e A s t h e fi n a l v e r s i o n o f t h i s e x p e r t s y s t e m i s e n v i s i o n e d a s a t o o l t o a s s i s t i n t h e d e v e l o p m e n t o f m e t h o d s f o r s a m p l e s w h i c h m i g h t r e q u i r e c o l u m n s w i t c h i n g , t h e c h o i c e o f c o l u m n s i s t h e p r i n c i p a l o b j e c t i v e f o r t h i s e x p e r t s y s t e m . T h e r e a r e t w o s u b - g o a l s t h a t a r e s o l v e d i n t h e p r o c e s s o f c h o o s i n g a c o l u m n . T h e f i r s t s u b - g o a l i s t h e d e t e r m i n a t i o n o f m o d e . I n t h e v e r n a c u l a r o f t h e e x p e r t s y s t e m i n t h i s p r o j e c t , m o d e r e f e r s t o t h e s e p a r a t i o n m e c h a n i s m a n d i n c o r p o r a t e s t h e r e s u l t s f r o m t h e a s s i g n m e n t o f n o r m a l - a n d r e v e r s e - p h a s e t e c h n i q u e s . T h e m o d e s t h a t a r e a s s i g n e d i n t h i s e x p e r t s y s t e m a r e g i v e n i n T a b l e 4 . 4 . T h e m o d e n a m e i s g i v e n i n t h e fi r s t c o l u m n t o s e r v e a s a g l o s s a r y w h e n d i s c u s s i n g t h e k n o w l e d g e b a s e c o d e . T h e s e c o n d c o l u m n g i v e s a d e s c r i p t i o n o f t h e m o d e , a n d t h e t h i r d c o l u m n g i v e s t h e a d d i t i o n a l s u b - m o d e s t h a t a r e a s c e r t a i n e d b y t h e e x p e r t s y s t e m . B o t h i m p l i c i t a n d e x p l i c i t i n f o r m a t i o n i s u s e d i n d e r i v i n g a r e c o m m e n d a t i o n f o r t h e c o l u m n . I m p l i c i t i n f o r m a t i o n r e s u l t s f r o m d a t a t h a t w e r e u s e d t o s o l v e e a r l i e r o b j e c t i v e s . F o r e x a m p l e , o n e r u l e u s e d i n t h e d e t e r m i n a t i o n o f H P L C a s b e i n g s u i t a b l e d e t e r m i n e s i f a n H P L C d e t e c t o r i s a v a i l a b l e f o r t h e d e t e c t i o n o f i o n i c s p e c i e s . T h i s d a t a i s t h e n a p p l i e d t o d e t e r m i n e t h e c h o i c e o f c o l u m n . T h e r e a r e a l s o t w e n t y - s e v e n e x p l i c i t r u l e s t h a t a r e u s e d t o c h o o s e b e t w e e n n o r m a l a n d r e v e r s e d p h a s e c h r o m a t o g r a p h y . T h e s e r u l e s a l s o a s s i s t i n t h e c h o i c e o f m o d e . 1 0 9 T h e r e a r e a l s o f o r t y - r u l e s t h a t a r e u s e d t o s p e c i fi c a l l y s e l e c t t h e c o r r e c t m o d e . S e v e r a l p h y s i c a l a n d c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s w e r e u s e d d u r i n g t h i s s t a g e a n d e a c h i s p r e s e n t e d b e l o w . S e c t i o n 4 . 4 . 4 . 1 P h y s i c a l P r o p e r t i e s T h e fi r s t c h a r a c t e r i s t i c s a r e t h e p h y s i c a l s i z e a n d s h a p e o f t h e a n a l y t e ( s ) . O n e u n i q u e a p p r o a c h t a k e n b y t h i s e x p e r t s y s t e m i s t h e u s e o f c o n fi d e n c e f a c t o r s t o d e s c r i b e t h e p r i o r i t y o f s i z e a s a d i s c r i m i n a t i n g f a c t o r a m o n g t h e c o m p o n e n t s o f t h e s a m p l e . I n p a r t i c u l a r , t h i s e x p e r t s y s t e m a t t e m p t s t o a s s i g n a c o n fi d e n c e f a c t o r t h a t d e s c r i b e s b o t h t h e s i z e d i s t r i b u t i o n o f t h e a n a l y t e s a n d t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f c o m p e t i n g s e p a r a t i o n e f f e c t s , s u c h a s p o l a r i t y . T h e d i s t r i b u t i o n o f s i z e s i s d e t e r m i n e d u s i n g f o r w a r d - c h a i n i n g r u l e s . A f o r w a r d - c h a i n i n g r u l e i s i m p l e m e n t e d i n V P - F x p e r t b y t h e u s e o f W H E N E V E R r u l e s . W h e n t h e v a l u e ( s ) o f t h e p r e m i s e ( s ) c h a n g e , W H E N E V E R r u l e s a r e a c t i v a t e d . W H E N E V E R r u l e s a r e a n a l o g o u s t o c o m p u t e r i n t e r r u p t s i n t h a t t h e y t a k e o v e r i m m e d i a t e c o n t r o l o f t h e p r o g r a m . I n t h i s f a s h i o n , t h e l o g i c fl o w o f t h e e x p e r t s y s t e m c a n b e c h a n g e d t o r e fl e c t t h e a p p e a r a n c e o f n e w d a t a . C o d e s 4 . 5 a n d 4 . 6 a r e t w o o f t h e t w e l v e r u l e s t h a t e s t a b l i s h t h e d i s t r i b u t i o n o f s i z e a n d c a l c u l a t e a c o n fi d e n c e f a c t o r b a s e d u p o n t h e d i s t r i b u t i o n . T h e r u l e i n C o d e 4 . 5 i s a c t i v a t e d w h e n e v e r t h e s i z e d i s t r i b u t i o n ( W t _ R a n g e _ % ) l i e s b e t w e e n 0 . 1 0 a n d 0 . 1 5 . T h i s r u l e a s s i g n s t o t h e v a r i a b l e , S o l u t e - S i z e _ D i s t r i b u t i o n , t h e v a l u e o f W i d e - D i s t r i b u t i o n w i t h a c o n fi d e n c e f a c t o r e q u a l t o t h e v a l u e o f D i s t - C N F . % . B o t h W t _ R a n g e _ % a n d D i s t _ C N F . % a r e a s s i g n e d b y a p r e v i o u s r u l e , a s s e e n i n C o d e 4 . 6 . 1 1 0 T a b l e 4 . 4 P o s s i b l e S u b - M o d e s t h a t m a y b e R e c o m m e n d e d b y t h e E x p e r t S y s t e m N a m e o f M o d e D e s c r i p t i o n P a c k i a n — w N P _ A d s N o r m a l - P h a s e A d s o r p t i o n S i l i c a A l u m i n a N P . B o n d e d B o n d e d N o r m a l - P h a s e A m i n e C y a n o P h e n y l G e o m e t r i c / O p t i c a l G e o m e t r i c a n d o p t i c a l i s o m e r s V a r i o u s m a t e r i a l s N P _ S E C N o r m a l - P h a s e S i z e E x c l u s i o n V a r i o u s m a t e r i a l s b a s e d o n s i z e o f a n a l m s N P J P C N o r m a l - P h a s e I o n - P a i r e d S p e c i a l m a t e r i a l s d e s i g n e d f o r C h r o m a t o g r a p h y N P - I P C R e v _ B o n d e d B o n d e d R e v e r s e P h a s e A l k y I - S i l a n e s ( e . g . , C 1 8 ) A m i n e C y a n o P h e n y l R e v - S E C R e v e r s e d - P h a s e S i z e V a r i o u s p o r e s i z e E x c l u s i o n p o l y m e r s / g e l s R e v J E C I o n - E x c h a n g e A n i o n a n d C a t i o n E x c h a n g e C h r o m a t o g r a p h y R e s i n s R e v _ l P C R e v e r s e d - P h a s e I o n P a i r C 1 8 c o l u m n s S p e c i a l t y c o l u m n s R e v _ l o n _ C h r o m I o n C h r o m a t o g r a p h y A n i o n a n d C a t i o n E x c h a n g e R e s i n s P e p t m i g R e v = B o n d e d S p e c i a l i t y c o l u m n s P e p t i d e S p e c i a l t y C o l u m n G l y c o p h a s e _ C P G S p e c i a l i t y c o l u m n s p o l y a m i n o a c i d s / p e p t i d e s s p e c i a l t y c o l u m n s R P . B o n d e d _ P h o s p h a t e S p e c i a l i t y c o l u m n s p o l y a m i n o a c i d s / p e p t i d e s s p e c i a l t y c o l u m n s 1 1 1 W h e n e v e r t h e e x p e r t s y s t e m d e t e r m i n e s t h a t s i z e i s a d i s c r i m i n a t i n g p r o p e r t y , W h e n e v e r S i z e - D i s t r i b u t i o n 1 i s a c t i v a t e d . T h e k n o w l e d g e b a s e i s s e t u p s u c h t h a t m u l t i p l e r u l e s m i g h t d e t e r m i n e t h a t t h e s e p a r a t i o n c a n b e b a s e d u p o n s i z e ; t h e r e f o r e t h e S i z e _ F i r e d v a r i a b l e i n s u r e s t h a t t h i s r u l e w i l l o n l y fi r e o n e t i m e ( b e c a u s e S i z e _ F i r e d i s a s s i g n e d t h e v a l u e o f Y e s a f t e r t h e f i r s t t i m e t h a t t h e r u l e i s a c c e s s e d ) . U p o n a c t i v a t i o n o f t h i s r u l e , t h e w e i g h t d i s t r i b u t i o n i s c a l c u l a t e d . A c c o r d i n g t o S n y d e r a n d K i r k l a n d , 1 1 s i z e e x c l u s i o n c h r o m a t o g r a p h y i s m o s t e f f e c t i v e f o r c o m p o n e n t s t h a t h a v e d i s t r i b u t i o n s g r e a t e r t h a n 1 5 % a n d i s l e a s t e f f e c t i v e f o r c o m p o n e n t s w i t h a d i s t r i b u t i o n u n d e r 1 0 % . T h e r e f o r e , D i s t _ C N F . % i s c a l c u l a t e d t o p r o v i d e a c o n fi d e n c e o f 1 0 0 % f o r c o m p o n e n t s w i t h a d i s t r i b u t i o n g r e a t e r t h a n 1 5 % a n d t o g i v e a c o n fi d e n c e o f 8 0 % f o r a d i s t r i b u t i o n o f 1 0 % . A s i s d i s c u s s e d i n S e c t i o n 4 . 4 . 9 . 1 . 2 ( P a g e 1 4 9 ) , c o n fi d e n c e f a c t o r s m u s t b e c h o s e n s u c h t h a t t h e c o n fi d e n c e i s n o t d r o p p e d t o z e r o a s i t p r o p a g a t e s t h r o u g h t h e k n o w l e d g e b a s e . W i t h t h i s i n m i n d , a d i s t r i b u t i o n o f 1 0 % w a s g i v e n t h e r e l a t i v e l y h i g h c o n fi d e n c e v a l u e o f 8 0 % . T h i s c o n fi d e n c e f a c t o r s p r e v e n t s s i z e e x c l u s i o n f r o m b e i n g r e j e c t e d a t t o o e a r l y o f a s t a g e i n t h e c o n s u l t a t i o n . T h i s d i s t r i b u t i o n c o n f i d e n c e f a c t o r i s a l s o c o m b i n e d w i t h a d d i t i o n a l r u l e s t o d e t e r m i n e t h e s e l e c t i o n b a s e d o n s i z e . T h e s e r u l e s a r e d i s c u s s e d i n g r e a t e r d e t a i l i n S e c t i o n 4 . 7 a n d 4 . 8 , v a l i d a t i o n o f t h e M 1 p r o t o t y p e a n d t h e V P - E x p e r t b a s e d e x p e r t s y s t e m s . C o d e t o C a l c u l a t e o f S i z e D i s t r i b u t i o n H E N E V E R S i z e _ D i s t r i b u t i o n S I F W t - R a n g e _ % < 0 . 1 5 A N D C o d e 4 . W t - R a n g e _ % > 0 . 1 0 T H E N S o l u t e _ S i z e _ D i s t r i b u t i o n = W i d e ; D i s t r i b u t i o n C N F D i L t - C N F . _ . % 1 1 2 C o d e t o C a l c u l e C o n f i d e n c e F a c t o r s f o r S i z e D i s t r i b u t i o n W H E N E V E R S i z e - D i s t r i b u t i o n 1 I F S e p a r a t i o n _ P r o p e r t y a S i z e A N D C o d e 4 . S i z e _ F i r e d = N o T H E N W t - R a n g e _ % - ( ( H i _ W t - % - L o w _ W t _ % ) / I - I i - W t _ % ) D i s t _ C N F - % a ( 4 0 0 * W t _ R a n g e - % + 4 0 ) W t _ A v g - % - ( ( H i - W t _ % + L o _ W t _ % ) / 2 S i z e _ _ . F i r e d a : Y e s ; S e c t i o n 4 . 4 . 4 . 2 C h e m i c a l P r o p e r t i e s T h e s i g n i f i c a n t p r o p e r t y u s e d t o d e t e r m i n e t h e a p p r o p r i a t e m o d e a n d c o l u m n i s t h e c h e m i c a l n a t u r e o f t h e s o l u t e s . T h e c h e m i c a l n a t u r e o f t h e s o l u t e d e t e r m i n e s t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e s o l u t e a n d t h e m o b i l e a n d s t a t i o n a r y p h a s e s . T h e r e a r e s e v e r a l d i f f e r e n t s e t s o f r u l e s t h a t a r e u s e d i n d e t e r m i n i n g t h e a p p r o p r i a t e c o l u m n . T h e f i r s t s e t o f r u l e s i s l a b e l e d w i t h t h e r u l e n a m e o f S e p a r a t i o n _ P r o p e r t y a n d a s c e r t a i n t h e c h e m i c a l d i s t i n c t i o n ( s ) o f t h e d i f f e r e n t s o l u t e s . F o r e x a m p l e , a r u l e d e t e r m i n e s i f t h e r e i s a d i s t i n c t i o n i n t h e p o l a r i t y o f t h e c o m p o n e n t s o f t h e s a m p l e . T h e r e a r e t w o a p p r o a c h e s t a k e n i n s o l v i n g f o r t h e v a r i a b l e , S e p a r a t i o n _ P r o p e r t y . T h e fi r s t a p p r o a c h a l l o w s t h e u s e r t o s e l e c t d i r e c t l y t h e d i f f e r e n t p r o p e r t y ( i e s ) i n a s i n g l e q u e s t i o n . T h i s a p p r o a c h a l l o w s t h e u s e r t o a c c e s s m o r e q u i c k l y t h e r e c o m m e n d a t i o n s f r o m e x p e r t s y s t e m w i t h o u t h a v i n g t o a n s w e r a d d i t i o n a l q u e s t i o n s . I f t h e u s e r s e l e c t s S E E K f r o m t h e c h o i c e s o f f e r e d , t h e s e c o n d a p p r o a c h u s e s a d d i t i o n a l r u l e s a n d q u e s t i o n s t o d e t e r m i n e t h e s e p r o p e r t i e s . T h i s s e c o n d a p p r o a c h p r o v i d e s s u p p o r t i n g t e x t t o a s s i s t t h e u s e r i n c h o o s i n g t h e a p p r o p r i a t e p r o p e r t i e s . C o d e s 4 . 7 a n d 4 . 8 d e m o n s t r a t e t h e s e t w o t y p e s o f a p p r o a c h e s w h i l e F i g u r e 4 . 2 p r o v i d e s a n e x a m p l e o f a d i a l o g t h a t t h e u s e r w i l l s e e i f t h e h y p o t h e s e s t o t h e s e r u l e s a r e t r u e . T h e t e x t i n t h e t w o p a r e n t h e s e s a r e c o m m e n t s t o t h e r e a d e r a n d a r e n o t p a r t o f t h e k n o w l e d g e b a s e . T h e P O P f u n c t i o n p r o v i d e s t h e a b i l i t y t o s e q u e n t i a l l y a c c e s s t h e m u l t i p l e v a l u e s t h a t m a y h a v e b e e n a s s i g n e d t o t h e P L U R A L v a r i a b l e 1 1 3 S e p a r a t i o n _ A s s e s s m e n t . I f t h e u s e r c h o o s e s U N K N O W N t o t h e q u e s t i o n , r u l e S e p a r a t i o n . P r o p e r t y 2 w i l l f o r c e t h e u s e r t o c h o o s e S E E K . O n c e t h e u s e r s e l e c t s S E E K , a d d i t i o n a l r u l e s a s s i s t t h e u s e r i n d e t e r m i n i n g a r e s p o n s e t o t h i s q u e s t i o n . T h e r u l e i n C o d e 4 . 8 p r o v i d e s a n e x a m p l e o f r u l e s t h a t m a y b e u s e d t o o b t a i n a d d i t i o n a l i n f o r m a t i o n f r o m t h e u s e r . T h e r e a r e a p p r o x i m a t e l y f o r t y - t h r e e r u l e s t h a t a r e u s e d t o e s t a b l i s h t h e s e p a r a t i o n p r o p e r t y ( i e s ) . T h e s e p r o p e r t i e s i n c l u d e t h e i o n i c n a t u r e , a c i d i t y / b a s i c i t y , t h e p r e s e n c e o f d i f f e r e n t f u n c t i o n a l g r o u p s , a n d s o f o r t h . M a n y o f t h e s e c h e m i c a l p r o p e r t i e s a r e d i s c u s s e d i n f u r t h e r d e t a i l b e l o w i n t h e c h o i c e o f M o d e a n d C o l u m n . C o d e t o S e l e c t C h e m i c a l P r o p e r t i e s D i r e c t l y f r o m M e n u I R U L E S e p a r a t i o n _ P r o p e r t y I I F S e p a r a t i o n _ A s s e s s m e n t < > U N K N O W N A N D C o d e 4 . S e p a r a t i o n _ A s s e s s m e n t 0 S e e k T H E N S e p a r a t i o n _ P r o p e r t y = ( S e p a r a t i o n . A s s e s s m e n t ) P O P S e p a r a t i o n _ A s s e s s m e n t , S e p a r a t i o n - P r o p e r t y W H I L E T R U E S e p a r a t i o n _ A s s e s s m e n t < > U n k n o w n T H E N P O P S e p a r a t i o a n s e s s m e n t S e p a r a t i o m P r o p e r t y E N D S t o p - S e p - P r o p - C y c l e a Y e s ; R U L E S e p a r a t i o n - P r o p e r t y 2 I F S e p a r a t i o n _ A s s e s s m e n t : 3 U N K N O W N A N D S t o p _ S e p _ P r o p _ C y c I e - N o T H E N S e p a r a t i o n _ P r o p e r t y 2 T e m p R E S E T S e p a r a t i o n - P r o p e r t y R E S E T S e p a r a t i o n _ A s s e s s m e n t D I S P L A Y I f y o u a r e u n s u r e o f t h e s e p a r a t i o n p r o p e r t y , P l e a s e s e l e c t ' S E E K ‘ a t h e r t h a n e n t e r i n g a q u e s t i o n m a r k ( i . e . , U N K N O W N ) . " F I N D S e p a r a t i o n _ P r o p e r t y ; C o d e t o A s s i s t i n t h e S e l e c t i o n o f C h e m i c a l P r o p e r t i e s I R U L E S e p a r a t i o n _ P r o p e r t y 1 4 I F S e p a r a t i o n _ A s s e s s m e n t = S e e k A N D C o d e 4 . 8 D i f f e r i n g _ 0 p t i c a I . A c t i v i t y = Y e s T H E N S e p a r a t i o n _ P r o p e r t y = O p t i c a I . A c t i v i t y D I S P L A Y " e p a r a t i o n b a s e d o n o p t i c a l a c t i v i t y i s s o m e t i m e s p o s s i b l e u t i s v e r y d i f f i c u l t . A n a l t e r n a t i v e m i g h t b e t o u s e L i q u i d o l i d C h r o m a t o g r a p h y . " ; 1 1 4 W h a t i s y o u r a s s e s s m e n t o f l i k e l y s e p a r a t i o n m e c h a n i s m s — C h o o s e O N E o r M o r e o f t h e f o l l o w i n g r e s p o n s e s . I f y o u a r e n o t s u r e , s e l e c t i n g S E E K w i l l m a k e t h e s y s t e m h e l p y o u d e t e r m i n e a n a n s w e r ( s ) . D o e s y o u r s a m p l e d i f f e r i n : S i z e P o l a r i t y O p t i c a l A c t i v i t y A r o m a t i c i t y D i f f S u b s t i t u e n t s G e o m e t r i c I s o m e r s S e e k ( T h e u s e r w o u l d s e l e c t o n e o r m o r e o f t h e s e c h o i c e s u s i n g t h e c u r s o r . T h e u s e r m a y a l s o e n t e r a c e r t a i n t y f o r e a c h i n d i v i d u a l c h o i c e . A s s u m e i n t h i s c a s e t h a t t h e u s e r c h o s e o n l y S E E K . T h e r e s t o f t h e d i a l o g w o u l d c o n t i n u e , e v e n t u a l l y a s k i n g . . . ) I s t h e r e a d i f f e r e n c e I n t h e o p t i c a l a c t i v i t y o f y o u r s o l u t e s p e c i e s ( e . g . , a r e y o u t r y i n g t o s e p a r a t e o p t i c a l i s o m e r s ? Y e s N o ( T h e u s e r w o u l d o n c e a g a i n s e l e c t e i t h e r Y e s o r N o o r c h o o s e U n k n o w n a s t h e r e s p o n s e . F u r t h e r q u e s t i o n s w o u l d c o n t i n u e . ) F i g u r e 4 . 2 E x a m p l e o f D i a l o g t h a t D e t e r m i n e s t h e S e p a r a t i o n P r o p e r t y T h e s e c o n d s e t o f r u l e s u s e d i n d e t e r m i n i n g a c o r r e c t c o l u m n a n d m o d e a r e t h e r u l e s u s e d t o d e t e r m i n e t h e u s e o f r e v e r s e d - v e r s u s n o r m a l - p h a s e c h r o m a t o g r a p h y . T h e c h e m i c a l a n d p h y s i c a l i n f o r m a t i o n c o n t a i n e d i n t h e c h o i c e o f t h e p h a s e i s c o m b i n e d w i t h t h e r u l e s u s e d t o d e t e r m i n e e x p l i c i t l y t h e s e p a r a t i o n p r o p e r t y ( i e s ) . O n c e t h e e x p e r t s y s t e m h a s a s c e r t a i n e d t h e p r o p e r t i e s t h a t d i f f e r e n t i a t e t h e s o l u t e s , t h e n e x t s t a g e i s t o p r o v i d e m o r e d e t a i l e d a d v i c e . T w e n t y - o n e M O D E r u l e s i n t h e k n o w l e d g e b a s e a t t e m p t t o f u r t h e r c l a s s i f y t h e m o d e i n t o d i f f e r e n t s u b - fi e l d s t h a t a r e l i s t e d i n T a b l e 4 . 4 ( p a g e 1 1 0 ) . T h e s e m o d e s a r e d e t e r m i n e d b y t h e s e p a r a t i o n p r o p e r t i e s a n d b y t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f p a r t i c u l a r c o m p o u n d s . A d e s c r i p t i o n o f t h e s u b - m o d e s a n d h o w t h e y a r e d e t e r m i n e d i s g i v e n i n T a b l e 4 . 5 . W h i l e n o t c o m p r e h e n s i v e , T a b l e 4 . 5 d o e s p r o v i d e a n o v e r v i e w o f t h e s u b - m o d e s t h a t a r e a s s i g n e d . 1 1 5 N o t m e n t i o n e d i n t h i s t a b l e a r e t h e s p e c i a l t y m o d e s t h a t a r e d e t e r m i n e d ( e . g . , s p e c i a l c o l u m n s o p t i m i z e d f o r c h i r a l , p r o t e i n , c a r b o h y d r a t e s a m p l e s ) . T h e fi r s t c o l u m n i n T a b l e 4 . 5 p r o v i d e s t h e d i f f e r e n t s u b - m o d e s t h a t w i l l b e d e t e r m i n e d . T h e s e c o n d c o l u m n g i v e s d i f f e r e n t c o n d i t i o n s t h a t m u s t b e m e t b e f o r e t h e s u b - m o d e i s a s s i g n e d . T h i s c o l u m n i s s t r u c t u r e d s o t h a t u p p e r l e v e l e n t r i e s i n d i c a t e a c o n c i s e r e s p o n s e o r d e t e r m i n a t i o n f r o m t h e u s e r o r e x p e r t s y s t e m . A n e x a m p l e i s t h e C y a n o e n t r y . I f t h e u s e r i n d i c a t e s t h a t t h e s o l u t e s h a v e a n e t d i p o l e m o m e n t , t h e e x p e r t s y s t e m w i l l a s s i g n C Y A N O t o t h e v a r i a b l e P A C K I N G . A n o t h e r r u l e w i l l a s s i s t t h e u s e r i f h e / s h e r e p l i e s w i t h U N K N O W N t o t h e q u e s t i o n r e g a r d i n g t h e p r e s e n c e o f d i p o l e m o m e n t s . I n t h i s c a s e , t h e e x p e r t s y s t e m w i l l d e t e r m i n e i f e i t h e r k e t o n e s , a l d e h y d e s , o r n i t r o g r o u p s a r e p r e s e n t ( b y e x p l i c i t l y r e q u e s t i n g f o r t h i s i n f o r m a t i o n f r o m t h e u s e r o r p r e v i o u s d i a l o g ) . I f t h e s e f u n c t i o n a l g r o u p s a r e p r e s e n t , t h e e x p e r t s y s t e m w i l l d e c i d e t h a t d i p o l e i n t e r a c t i o n s a r e p r e s e n t . T h e s e s e c o n d a r y c o n d i t i o n s a r e i n d i c a t e d w i t h i n t h e s e c o n d c o l u m n i n B o o l e a n L o g i c f o r m a t ( e . g . , A R O M A T I C W I T H ( D I F F E R E N T S U B S T I T U E N T S O R A M I N E S O R N I T R O G R O U P S 0 R P H E N O L S ) ) . I o n i c m o d e s a r e n o t m e n t i o n e d i n t h i s t a b l e s i n c e t h e a s s i g n m e n t o f i o n i c m o d e s i s d i s c u s s e d i n d e t a i l i n t h e v a l i d a t i o n s t u d i e s ( S e c t i o n s 4 . 7 a n d 4 . 8 ) . T h e t h i r d c o l u m n i n d i c a t e s c o n d i t i o n s u n d e r w h i c h w i l l t h e c h o i c e o f t h a t p a c k i n g o r s u b - m o d e i s p r o h i b i t e d . T h e s e e x c l u s i o n s t y p i c a l l y i n v o l v e s o l u t e s w h i c h c a n i r r e v e r s i b l y b i n d , o r e x h i b i t u n d e s i r a b l e H P L C c h a r a c t e r i s t i c s s u c h a s l o n g r e t e n t i o n t i m e s o r p e a k t a i l i n g , w i t h t h e p a c k i n g m a t e r i a l . E a c h m o d e h a s a s s o c i a t e d w i t h i t a v a r i a b l e w h i c h i n d i c a t e s i f t h a t p a c k i n g m a t e r i a l s h o u l d b e e x c l u d e d ( e . g . , e x c l u d e a m i n e c o l u m n s i f c a r b o x y l i c a c i d s a r e p r e s e n t ) . I f a v a l u e h a s n o t b e e n e x p l i c i t l y a s s i g n e d t o t h e P A C K I N G v a r i a b l e a n d t h e p a c k i n g m a t e r i a l h a s n o t b e e n d e t e r m i n e d t o b e i n a p p r o p r i a t e f r o m o t h e r r u l e s , t h e e x p e r t s y s t e m w i l l s t i l l s u g g e s t t h e s e p a c k i n g m a t e r i a l s , w i t h a r e s u l t i n g d e c r e a s e i n t h e C N F . S e v e r a l e x a m p l e s o f t h e s e a r e i n d i c a t e d 1 1 6 i n T a b l e 4 . 5 w i t h t h e e n t r y , * D o n ' t E x c l u d e . T a b l e 4 . 5 l i s t s t h e c o n f i d e n c e f a c t o r s t h a t w i l l b e a s s o c i a t e d w i t h t h e p a c k i n g m a t e r i a l i f t h e r e q u i r e d a n d e x c l u d e d c o n d i t i o n s a r e m e t . S e c t i o n 4 . 5 R u l e s T h i s s e c t i o n d e s c r i b e s a f e w s p e c i a l a s p e c t s o f t h e r u l e s u s e d i n t h e e x p e r t s y s t e m . T h e m a j o r f o c u s o f t h i s s e c t i o n i s o n s e l f - d e t e r m i n i n g r u l e s t h a t . S e l f - d e t e r m i n i n g r u l e s a r e d e fi n e d a s t h o s e w h i c h a r e a b l e t o p r e d i c t a n s w e r s b a s e d u p o n d a t a o b t a i n e d d u r i n g t h e c o n s u l t a t i o n w i t h t h e e x p e r t s y s t e m . T h i s s e c t i o n a l s o d e s c r i b e s t h e i m p o r t a n c e o f t h e o r d e r o f r u l e s w i t h i n t h e k n o w l e d g e b a s e a n d t h e i m p l e m e n t a t i o n a n d u s e o f f o r w a r d - c h a i n i n g r u l e s . F l o w c h a r t s a n d d i s c u s s i o n o f t h e l o g i c u s e d t o r e c o m m e n d a n a p p r o p r i a t e c o l u m n ( s ) a r e p r e s e n t e d i n A p p e n d i x A : F l o w C h a r t s f o r t h e D e t e r m i n a t i o n o f a n A p p r o p r i a t e C o l u m n ( s ) . T h e r e m a i n d e r o f t h i s c h a p t e r d e s c r i b e s t h e r e c o m m e n d a t i o n o f a c o l u m n i n m o r e g e n e r a l t e r m s . P l e a s e r e f e r t o A p p e n d i x A f o r m o r e d e t a i l e d e x p l a n a t i o n o f t h e i n f e r e n c e p r o c e s s e s . S e c t i o n 4 . 5 . 1 O r d e r o f R u l e s T h e r a n d o m a r r a n g e m e n t o f t h e i n f o r m a t i o n a n d r u l e s i n t h e e x p e r t s y s t e m w i l l n o t u s u a l l y a f f e c t t h e e n d r e s u l t . T h e r e a r e t h r e e c o n s i d e r a t i o n s t h a t d i c t a t e w h y t h e k n o w l e d g e b a s e s h o u l d b e c o m p o s e d i n a s t r u c t u r e d f o r m a t . T a b l e 4 . 5 D e t e r m i n a t i o n o f S u b - M o d e s S u b - R e q u i r e d E x c l u d e d C N F M o d e C o n d i t i o n s C o n d i t i o n s A l k y l - N e u t r a l s S i l a n e H o m o l o g o u s S e r i e s I o n - P a i r e d S p e c i e s C y a n o D i p o l e s 1 0 0 K e t o n e s o r A l d e h y d e s o r N i t r o g r o u p s P h e n y I C h a r g e T r a n s f e r A r o m a t i c w i t h ( S u b s t i t u e n t s o r A m i n e o r N i t r o g r o u p s o r P h e n o l s ) A m i n e P r o t o n D o n o r K e t o n e s 1 0 0 T h i o l s o r A l d e h y d e s P h e n o l s C a r b o x y l i c a c i d s A l i p h a t i c A l c o h o l s A m i n e U n k n o w n o r K e t o n e s 7 0 N o t a P r o t o n D o n o r a n d A l d e h y d e s A r o m a t i c o r C a r b o x y l i c a c i d s P r o t e i n o r N i t r o G r o u p s A l u m i n a A r o m a t i c C a r b o x y l i c a c i d s 1 0 0 N e t D i p o l e M o m e n t s P h e n o l s A l u m i n a * D o n ' t E x c l u d e C a r b o x y l i c a c i d s 5 0 P h e n o l s s i l i c a G e o m e t r i c o r S t r o n g l y i o n i c 1 0 0 S t e r i c I s o m e r s S i l i c a * D o n ' t E x c l u d e 9 0 I o n i c I o n i c G r o u p s p K L V a l u e s 1 1 8 T h e f i r s t c o n s i d e r a t i o n i s t h e a b i l i t y t o e d i t a n d m a i n t a i n t h e k n o w l e d g e b a s e . W h e n t h e k n o w l e d g e b a s e i s o r g a n i z e d s u c h t h a t t h e r u l e s a s s o c i a t e d w i t h a p a r t i c u l a r g o a l o r a s p e c t o f t h e g o a l a r e a r r a n g e d t o g e t h e r , t h e k n o w l e d g e e n g i n e e r w i l l b e a b l e t o s e e t h e i n t e r r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e r u l e s . I t w i l l a l s o b e e a s i e r t o e d i t t h e s e r u l e s w h e n n e w i n f o r m a t i o n b e c o m e s a v a i l a b l e . I d e a l l y , t h e k n o w l e d g e b a s e s h o u l d b e c o m p l e t e l y m o d u l a r b y h a v i n g e a c h g o a l b e s e l f - c o n t a i n e d w i t h i n i t s o w n k n o w l e d g e b a s e . H o w e v e r , t h i s a p p r o a c h r e q u i r e s t h a t t h e i n f e r e n c e e n g i n e p e r f o r m a d d i t i o n a l w o r k s i n c e t h e i n f e r e n c e e n g i n e m u s t s a v e t h e s t a t e o f a l l v a r i a b l e s , l o a d t h e n e w k n o w l e d g e b a s e , r e - l o a d t h e v a l u e s o f t h e v a r i a b l e s , a n d c o n t i n u e p r o c e s s i n g . W h i l e t h i s t i m e w o u l d b e n e g l i g i b l e o n m o d e r n c o m p u t e r s , t h e c o m p u t e r s u s e d i n t h i s r e s e a r c h a r e s l o w e r m a c h i n e s . T h e r e f o r e , t h e m o d u l a r i t y i s o b t a i n e d b y g r o u p i n g s i m i l a r r u l e s t o g e t h e r a n d p r o v i d i n g t h e r u l e s w i t h c o n s i s t e n t n a m e s ( e . g . , S e p - P r o p e r t y 1 , S e p - P r o p e r t y 2 ) . T h e s e c o n d c o n s i d e r a t i o n i n a r r a n g i n g t h e k n o w l e d g e b a s e i s t o m i n i m i z e s t h e t i m e t h a t t h e i n f e r e n c e e n g i n e d e d i c a t e s t o s e a r c h i n g t h e k n o w l e d g e b a s e . S i n c e t h e i n f e r e n c e e n g i n e w i l l s e q u e n t i a l l y r e a d t h e k n o w l e d g e b a s e t o f i n d r u l e s t h a t h a v e h y p o t h e s e s m a t c h i n g t h e g o a l ( f o r b a c k w a r d c h a i n i n g m e c h a n i s m s ) , t h e i n f e r e n c e e n g i n e w i l l fi n d t h e r u l e s m o r e r a p i d l y w h e n t h e r u l e s a r e a r r a n g e d i n c o n t i g u o u s f a s h i o n . T h e t h i r d c o n s i d e r a t i o n i n t h e a r r a n g e m e n t o f t h e r u l e s i s t o p r o v i d e a c l e a r a n d l o g i c a l d i a l o g s e s s i o n w i t h t h e u s e r . I f t h e k n o w l e d g e b a s e i s r a n d o m l y a r r a n g e d , t h e ' u s e r w i l l o f t e n b e a s k e d q u e s t i o n s t h a t a p p e a r t o b e n o n - s e q u i t u r s d u e t o t h e s e q u e n t i a l s e a r c h p r o c e d u r e . A n e a r l y v e r s i o n o f t h i s e x p e r t s y s t e m a s k e d t h e u s e r t h e f o l l o w i n g s e r i e s o f q u e s t i o n s : I s t h e s o l u t e c o n c e n t r a t e d e n o u g h f o r y o u r d e t e c t o r ? C a n y o u d i l u t e t h e s a m p l e t o m a t c h t h e c o n c e n t r a t i o n r a n g e o f y o u r d e t e c t o r ? I s s o l u t e c o n c e n t r a t i o n s o h i g h t h a t y o u w i l l s a t u r a t e t h e d e t e c t o r ? 1 1 9 T h e s e q u e s t i o n s a r e a s k e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e s o l u t e c o n c e n t r a t i o n i s w i t h i n t h e l i n e a r o p e r a t i n g r a n g e o f t h e c h o s e n d e t e c t o r . T h e a b o v e s e r i e s o f q u e s t i o n s d o n o t f o l l o w a l o g i c a l t h o u g h t p r o c e s s . T h e fi r s t r u l e d e t e r m i n e d i f t h e s o l u t e c o n c e n t r a t i o n w a s g r e a t e r t h a n t h e l i m i t o f d e t e c t i o n f o r t h e d e t e c t o r . T h e s e c o n d r u l e t r i e d t o d e t e r m i n e i f t h e s a m p l e c o u l d b e d i l u t e d i f i t w a s t o o c o n c e n t r a t e d . T h e t h i r d r u l e d e t e r m i n e d i f t h e s a m p l e w a s t o o c o n c e n t r a t e d . W h i l e t h e e x p e r t s y s t e m s t i l l o b t a i n e d t h e c o r r e c t r e c o m m e n d a t i o n , t h e u s e r m a y b e p e r p l e x e d w h e n a s k e d t h e s e c o n d q u e s t i o n p r i o r t o b e i n g a s k e d t h e t h i r d q u e s t i o n . B y c h a n g i n g t h e o r d e r o f t h e s e c o n d a n d t h i r d r u l e s t h e i n f e r e n c e e n g i n e fi r s t d e t e r m i n e d i f t h e s a m p l e w a s t o o c o n c e n t r a t e d b e f o r e a s k i n g i f d i l u t i o n i s p o s s i b l e . T h e d i a l o g s e s s i o n b e t w e e n u s e r a n d e x p e r t s y s t e m i s n o w m o r e l o g i c a l , a n d t h e u s e r w i l l r e a l i z e t h e c o r r e c t c o n t e x t b e h i n d a p a r t i c u l a r q u e s t i o n . T h e r u l e s i n t h i s k n o w l e d g e b a s e h a v e b e e n a r r a n g e d i n a l o g i c a l o r d e r a s m u c h a s p o s s i b l e , b u t t h e a r r a n g e m e n t c a n n o t b e c o m p l e t e l y e n f o r c e d i n t h i s e x p e r t s y s t e m s i n c e m u c h o f t h e i n f o r m a t i o n i s i n t e r r e l a t e d . T h a t i s , t h e d a t a f o r o n e g o a l c a n b e t h e s o l u t i o n t o a n o t h e r g o a l a n d t h e i n f e r e n c e e n g i n e c a n b e f o r c e d , a t t i m e s , t o a s k q u e s t i o n s t h a t m i g h t s e e m i l l o g i c a l . T h e s o l u t i o n t o t h i s p r o b l e m i s t o w r i t e t h e q u e s t i o n s s u c h t h a t t h e y c o n v e y t h e r e a s o n i n g b e h i n d t h e q u e s t i o n . S e c t i o n 4 . 5 . 2 F o r w a r d C h a i n i n g C h a p t e r s 2 a n d 3 o f t h i s d i s s e r t a t i o n d e s c r i b e d t h e t w o t y p e s o f i n f e r e n c e m e c h a n i s m s t h a t a r e a v a i l a b l e . M o s t o f t h e r u l e s d e s c r i b e d i n t h i s c h a p t e r h a v e i n v o l v e d b a c k w a r d - c h a i r r i n g r u l e s . T h i s s e c t i o n d e s c r i b e s t h e u s e o f f o r w a r d c h a i n i n g r u l e s . 1 2 0 T h e p r i n c i p a l u s e o f f o r w a r d c h a i n i n g i s i n t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e s e p a r a t i o n m o d e . T h e r e a r e t w o d i f f e r e n t w a y s t h a t f o r w a r d c h a i n i n g c a n b e i n i t i a t e d . A n i m p l i c i t f o r w a r d - c h a i n i n g m e c h a n i s m i s t h e F I N D < V A R I A B L E > c l a u s e . W h e n t h e h y p o t h e s i s i s t r u e f o r a r u l e c o n t a i n i n g a F I N D c l a u s e i n t h e c o n c l u s i o n , t h e i n f e r e n c e e n g i n e i s f o r c e d t o d e t e r m i n e a v a l u e f o r < V A R I A B L E > . A n e x a m p l e o f t h i s m e c h a n i s m c a n b e s e e n i n C o d e 4 . 9 . I f t h e u s e r r e q u e s t s a d v i c e f o r a m e t h o d , t h e r u l e w i l l f o r c e t h e e x p e r t s y s t e m t o d e t e r m i n e t h e s e p a r a t i o n p r o p e r t y , c l a s s , m o d e , a n d p a c k i n g t y p e . T h i s m e t a - r u l e r e - d i r e c t s t h e e x p e r t s y s t e m t h r o u g h a d i f f e r e n t l o g i c p a t h . V P - E x p e r t i m p l e m e n t s e x p l i c i t f o r w a r d - c h a i n i n g b y t h e W H E N E V E R c o m m a n d . A n e x a m p l e o f t h i s r u l e c a n b e s e e n i n C o d e 4 . 5 o n p a g e 1 1 1 . T h i s r u l e w i l l e x e c u t e a u t o m a t i c a l l y w h e n e v e r t h e c o n d i t i o n s w i t h i n t h e p r e m i s e b e c o m e t r u e . I n t h i s c a s e , w h e n e v e r a m o l e c u l a r w e i g h t r a n g e b e t w e e n 1 0 a n d 1 5 % h a s b e e n a s s i g n e d , t h e r u l e w i l l d e t e r m i n e t h a t a w i d e m o l e c u l a r w e i g h t d i s t r i b u t i o n e x i s t s . T h i s c o n c l u s i o n w i l l t h e n b e u s e d i n d e t e r m i n i n g i f s i z e e x c l u s i o n c h r o m a t o g r a p h y ( S E C ) i s a v i a b l e t e c h n i q u e . T h e ” W H E N E V E R ” t y p e o f r u l e p r o v i d e s w h a t i s k n o w n i n t h e A I v e r n a c u l a r a s a ” d e m o n ; " t h a t i s , t h e i n f e r e n c e e n g i n e w i l l m o n i t o r t h e s t a t u s o f v a r i a b l e s w i t h i n t h e p r e m i s e a n d w i l l p r e - e m p t t h e e x e c u t i o n o f o t h e r r u l e s w h e n e v e r t h e v a r i a b l e s b e c o m e t r u e . T h e d e m o n w i l l t h e n c h a n g e t h e l o g i c p a t h t h a t t h e i n f e r e n c e e n g i n e w i l l f o l l o w . F o r w a r d c h a i n i n g i s u s e d i n t h i s e x p e r t s y s t e m t o f a c i l i t a t e t h e d e t e r m i n a t i o n o f s i z e a s a s e p a r a t i n g f a c t o r . S E C i s a p o w e r f u l t e c h n i q u e , p a r t i c u l a r l y w h e n t h e r e i s a l a r g e d i s t r i b u t i o n o f s i z e s a n d t h e r e a r e n o , o r f e w , c o m p e t i n g s e p a r a t i o n m e c h a n i s m s o c c u r r i n g . W i t h o u t f o r w a r d - c h a i n i n g r u l e s , t h e e x p e r t s y s t e m w o u l d a l w a y s h a v e t o a s k t h e u s e r t o s u p p l y v a l u e s f o r t h e m o l e c u l a r w e i g h t d i s t r i b u t i o n . S E C c a n b e p o s t u l a t e d b a s e d u p o n d a t a s u p p l i e d d i r e c t l y b y t h e u s e r ( i . e . , t h e u s e r h a s i n d i c a t e d t h a t s i z e i s a n a p p r o p r i a t e s e p a r a t i o n m e c h a n i s m ) o r c a n b e i n f e r r e d f r o m o t h e r i n f o r m a t i o n . F o r e x a m p l e , t h e e x p e r t s y s t e m a s k s t h e u s e r i f t h e s o l u t e s c o m p r i s e a h o m o l o g o u s s e r i e s . 1 2 1 I f t h e u s e r i n d i c a t e s t h a t t h e s o l u t e s d o f o r m a h o m o l o g o u s s e r i e s t h a t i n c r e a s e i n m o l e c u l a r w e i g h t o r s i z e , t h e e x p e r t s y s t e m w i l l i n f e r t h a t S E C m i g h t b e a u s e f u l t e c h n i q u e e v e n i f t h e u s e r d i d n o t o r i g i n a l l y c h o o s e s i z e . W i t h o u t t h e f o r w a r d - c h a i n i n g r u l e s , t h e e x p e r t s y s t e m d o e s n o t h a v e a m e c h a n i s m t o d e t e r m i n e t h e d i s t r i b u t i o n o f t h e s i z e s . F o r w a r d C h a i n i n g C o d e V i a F i n d S t a t e m e n t I R U L E C o n t i n u e 2 I F H P L C _ S u i t e d = Y e s A N D C o d e 4 . 9 C h e c k _ F o r _ M e t h o d s a : Y e s T H E N C o n t i n u e 2 Y e s F I N D S e p a r a t i o n _ P r o p e r t y F I N D R e v _ P h a s e _ O k F I N D N o r m a l _ P h a s e _ O K F I N D M o d e F I N D P a c k i n g _ T y p e ; S e c t i o n 4 . 5 . 3 S e l f - D e t e r m i n i n g R u l e s T h e e x p e r t s y s t e m s h o u l d b e a b l e t o i n f e r a s m u c h o f t h e s o l u t i o n a s p o s s i b l e a s i n f o r m a t i o n b e c a m e a v a i l a b l e . B y h a v i n g t h e r u l e s b e ” s e l f - d e t e r m i n i n g , ” t h e e x p e r t s y s t e m a p p e a r s t o b e i n t e l l i g e n t . T h e u s e r d o e s n o t h a v e t o r e - a n s w e r q u e s t i o n s t h a t w e r e d e t e r m i n a b l e f r o m p r e v i o u s d a t a e n t r i e s . W i t h o u t t h i s a b i l i t y , t h e u s e r m a y b e c o m e i r r i t a t e d w h e n h e / s h e h a s t o e n t e r a n s w e r s m o r e t h a n o n c e . W i t h s e l f - d e t e r m i n i n g r u l e s , t h e n u m b e r o f q u e s t i o n s a s k e d o f t h e u s e r i s d e c r e a s e d . T h e s p e e d o f t h e e x p e r t s y s t e m i s i n c r e a s e d d u e t o a d e c r e a s e d n u m b e r o f q u e s t i o n s a s k e d a n d t h e d e c r e a s e i n t h e r e s p o n s e t i m e o f t h e u s e r t o r e a d , t h i n k , a n d p r o v i d e a r e s p o n s e t o t h e q u e s t i o n s . T h e r e a r e s e v e r a l p l a c e s w h e r e s e l f - d e t e r m i n i n g r u l e s a r e i m p l e m e n t e d . T h e fi r s t c a s e i s w h e r e t h e e x p e r t s y s t e m d e t e r m i n e s t h e s i g n i f i c a n c e o f s i z e i n c h o o s i n g a s e p a r a t i o n m e c h a n i s m . T h e e x p e r t s y s t e m c a n a s k r e l e v a n t q u e s t i o n s t o d e t e r m i n e t h e 1 2 2 s i z e d i s t r i b u t i o n a n d c a l c u l a t e a c o n fi d e n c e f a c t o r f o r t h e c e r t a i n t y o f s u c c e s s o f u s i n g S E C . M a n y o f t h e s e s e l f - d e t e r m i n i n g r u l e s o c c u r d u r i n g t h e d e t e r m i n a t i o n o f f u n c t i o n a l g r o u p s t h a t m i g h t b e p r e s e n t . T h e e x p e r t s y s t e m i s a b l e t o i n f e r i f t h e r e a r e d i p o l e , c h a r g e t r a n s f e r , o r h y d r o g e n b o n d i n g i n t e r a c t i o n s p r e s e n t . T h r o u g h o u t t h e r e s t o f t h e c h a p t e r , s e l f - d e t e r m i n i n g r u l e s w i l l b e d e s c r i b e d i n a d d i t i o n t o t h e e x a m p l e s c i t e d a b o v e . S e c t i o n 4 . 6 U s e r I n t e r f a c e T h e u s e r i n t e r f a c e f o r t h e e x p e r t s y s t e m b a s e d u p o n V P - E x p e r t i s p r o v i d e s t h e u s e r w i t h a m e n u o f l e g a l r e s p o n s e s t o q u e s t i o n s . T h e s e c h o i c e s a r e s e l e c t e d w i t h t h e c u r s o r k e y s i n o r d e r t o m i n i m i z e t y p i n g a n d i n s u r e a c c u r a t e e n t r y o f d a t a . D i s p l a y t e x t i s w r i t t e n t o p r o v i d e c o n t e x t u a l i n f o r m a t i o n t h a t w o u l d a n s w e r b o t h H O W a n d W H Y q u e s t i o n s t h a t t h e u s e r m a y r e q u i r e . D a t a b a s e a c c e s s i s a c c o m p l i s h e d b y a s i m i l a r m e n u s y s t e m . T h e e x p e r t s y s t e m a c c e s s e s t h e d a t a b a s e w i t h t h e p r o p e r s y n t a x a n d r e p o r t s t h e r e s p o n s e s b a c k t o t h e u s e r w h o m a y s e l e c t f r o m t h e e n t r i e s . T h e e x p e r t s y s t e m a l s o u s e s a d a t a b a s e t o p r o v i d e a d v i c e t h a t i s s p e c i a l i z e d f o r t h a t p a r t i c u l a r l a b o r a t o r y . T h e e x p e r t s y s t e m h a s t h e c a p a b i l i t y t o a u t o m a t e e n t r y o f d a t a i n t o t h i s d a t a b a s e , b u t t h i s f e a t u r e i s n o t i m p l e m e n t e d . A s s u c h , t h e u s e r m u s t m o d i f y d i r e c t l y t h e d a t a b a s e t o a d d i n f o r m a t i o n s u c h a s a v a i l a b l e c o l u m n s a n d t h e i r p r o p e r t i e s ( e . g . , d i m e n s i o n s , m a x i m u m p r e s s u r e ) . S e c t i o n 4 . 7 P r e l i m i n a r y V a l i d a t i o n o f t h e M 1 P r o t o t y p e E x p e r t S y s t e m V a l i d a t i o n s t u d i e s p r o v i d e a m e t h o d t o d e t e r m i n e i f t h e e x p e r t s y s t e m p r o v i d e s t h e c o r r e c t c o n c l u s i o n s . 1 2 T h e v a l i d a t i o n s t u d i e s d e m o n s t r a t e t h a t : 1 2 3 ( 1 ) p a r t i c u l a r s e c t i o n s o f t h e l o g i c a r e p e r f o r m a s e x p e c t e d ( e . g . , c o n fi d e n c e f a c t o r s a r e c a l c u l a t e d c o r r e c t l y ) . ( 2 ) f u n c t i o n s o f t h e e x p e r t s y s t e m o p e r a t e a s e x p e c t e d ( e . g . , m e n u c h o i c e s a r e c o r r e c t a n d a r e v i s u a l l y a p p e a l i n g ) . ( 3 ) r e p r e s e n t a t i v e p r o b l e m s a r e t r e a t e d c o r r e c t l y . ( 4 ) d i f f i c u l t p r o b l e m s c a n b e s o l v e d . ( 5 ) t h a t t h e e x p e r t s y s t e m i s r o b u s t a n d c a n p r o v i d e a d v i c e f o r ” t r i c k ” p r o b l e m s . T h e fi r s t t w o o b j e c t i v e s w e r e m o n i t o r e d r e p e t i t i v e l y d u r i n g t h e d e v e l o p m e n t o f t h e e x p e r t s y s t e m i n t h i s d i s s e r t a t i o n . A s n e w i n f o r m a t i o n a n d m o d u l e s w e r e a d d e d , t h e y w e r e t e s t e d t o a s c e r t a i n t h a t t h e e x p e r t s y s t e m w a s f u n c t i o n i n g c o r r e c t l y . T h e r e s u l t s f r o m t h e s e i n t e r i m t e s t s a r e n o t p r e s e n t e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n . T h e l a s t t h r e e o b j e c t i v e s a r e d e m o n s t r a t e d i n t h e f o l l o w i n g v a l i d a t i o n s t u d i e s . T h e r e a r e s e v e r a l d i f f e r e n t w a y s t o d e v e l o p t e s t c a s e s . T h e s e i n c l u d e : 1 2 ( 1 ) H i s t o r i c a l D a t a : T h i s t e s t c a s e a l l o w s t h e k n o w l e d g e e n g i n e e r t o s e l e c t c a s e s w h i c h e x h i b i t s p e c i fi c p r o p e r t i e s . I n a d d i t i o n , t h e k n o w l e d g e e n g i n e e r c a n e v a l u a t e t h e s o l u t i o n ( s ) p r o p o s e d b y t h e e x p e r t s y s t e m t o t h e a c c e p t e d , o r e x p e c t e d , m e t h o d . ( 2 ) C o l l e c t e d D a t a : T h i s a p p r o a c h u s e s c u r r e n t r e s e a r c h a s t h e t e s t c a s e t o a l l o w o p t i m i z a t i o n o f t h e e x p e r t s y s t e m f o r t h e e x p e c t e d a p p l i c a t i o n s f o r w h i c h t h e e x p e r t s y s t e m w i l l b e u s e d . ( 3 ) G e n e r a t e d D a t a : A r t i fi c i a l t e s t c a s e s a r e c r e a t e d t o t e s t p a r t i c u l a r a s p e c t s o f t h e e x p e r t s y s t e m . T h e s e c a s e s m a y c o n t a i n c o n fl i c t i n g o r m i s s i n g d a t a t o t e s t p r o p e r t i e s s u c h a s t h e r O b u s t n e s s a n d c o m p l e t e n e s s o f t h e k n o w l e d g e b a s e . T h e v a l i d a t i o n s t u d i e s f o r t h i s e x p e r t s y s t e m u s e m i x t u r e s o f a l l t h r e e t y p e s o f t e s t c a s e s . T h e m a j o r t e s t c a s e s u s e h i s t o r i c a l d a t a o b t a i n e d f r o m l i t e r a t u r e . I n a d d i t i o n , t h e a u t h o r s o f t h e l i t e r a t u r e u s e d f o r t h e s e t e s t c a s e s t y p i c a l l y p r o v i d e d a r e a s o n i n g b e h i n d t h e i r c h o i c e o f m e t h o d . O n e v a l i d a t i o n s t u d y b a s e d o n g e n e r a t e d d a t a i s p r e s e n t e d t o d e m o n s t r a t e t h e a b i l i t y t o h a n d l e a c a s e t h a t i s d i f fi c u l t a n d c o n t a i n s c o n fl i c t i n g d a t a . T h e c o l l e c t e d d a t a a p p r o a c h i n v o l v e s v a l i d a t i o n s t u d i e s w h i c h w e r e t h e n r u n o n t h e H P L C i n s t r u m e n t , a s d e s c r i b e d i n t h e C h a p t e r 6 o f t h i s d i s s e r t a t i o n . 1 2 4 T h e fi r s t v a l i d a t i o n s t u d i e s w e r e p e r f o r m e d u s i n g t h e p r o t o t y p e e x p e r t s y s t e m t h a t w a s b a s e d o n t h e M 1 s h e l l . T h e s e v a l i d a t i o n s t u d i e s d e m o n s t r a t e t h e f u n c t i o n a l i t y a n d l i m i t a t i o n s o f t h e p r o t o t y p e . T h e t e s t c a s e s a r e d e s c r i b e d a n d t h e d a t a u s e d a s i n p u t f o r t h e e x p e r t s y s t e m i s d i s c u s s e d . R e s u l t s f r o m t h e c o n s u l t a t i o n a r e p r e s e n t e d f o r e a c h i n d i v i d u a l s t u d y . D i s c u s s i o n o f t h e s e r e s u l t s i s p r e s e n t e d i n S e c t i o n 4 . 8 t o g e t h e r w i t h t h e r e s u l t s f o r t h e v a l i d a t i o n s t u d i e s u s i n g t h e V P - E x p e r t v e r s i o n o f t h e e x p e r t s y s t e m . S e c t i o n 4 . 7 . 1 E s t r o g e n s T e s t C a s e — M 1 P r o t o t y p e T h e fi r s t t e s t c a s e d e s c r i b e d h e r e i n v o l v e s t h e s e p a r a t i o n o f t h r e e w a t e r - s o l u b l e e s t r o g e n s , e q u i l e n i n s o d i u m s u l f a t e , e q u i l i n s o d i u m s u l f a t e , a n d e s t r o n e s o d i u m s u l f a t e . T h e s t r u c t u r e s o f t h e s e c o m p o u n d s a r e g i v e n i n F i g u r e 4 . 3 . T h i s v a l i d a t i o n s t u d y w a s u s e d b e c a u s e t h e d e v e l o p m e n t o f t h e a c c e p t e d m e t h o d w a s d e t a i l e d a n d p r o v i d e d t h e d a t a t h a t c o u l d b e u s e d a s i n p u t f o r t h e e x p e r t s y s t e m . T h e a c c e p t e d m e t h o d s l 3 ' 1 4 a c k n o w l e d g e d o f t h e i o n i c n a t u r e o f t h e c o m p o u n d s ; h o w e v e r , t h e p H o f t h e t h r e e e s t r o g e n s i s e a s i l y a d j u s t e d s o t h a t t h e t h r e e e s t r o g e n c o n j u g a t e s a r e n e u t r a l . T h e r e a r e s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e s i n t h e a r o m a t i c i t y a n d p o l a r i t y o f e a c h ( e a c h c o m p o n e n t h a s d e c r e a s i n g a m o u n t s o f c o n j u g a t i o n ) . T h e d i f f e r e n c e s i n t h e c h a r g e t r a n s f e r c h a r a c t e r i s t i c s a n d p o l a r i t i e s o f t h e t h r e e e s t r o g e n s m a y b e u s e d a s a p p r o p r i a t e s e p a r a t i o n m e c h a n i s m s a n d a p h e n y l c o l u m n w o u l d s e p a r a t e t h e t h r e e e s t r o g e n s . I n t h i s m e t h o d d e v e l o p m e n t , a p h e n y l c o l u m n w a s n o t r e a d i l y a v a i l a b l e , a n d a m e t h o d b a s e d u p o n r e v e r s e d - p h a s e c h r o m a t o g r a p h y w a s c h o s e n . A m e t h a n o l / w a t e r m o b i l e p h a s e w a s s u g g e s t e d a n d p h o s p h o r i c a c i d w a s a d d e d t o m a i n t a i n n e u t r a l i t y o f t h e e s t r o g e n c o n j u g a t e s . T h e i n p u t t o t h e e x p e r t s y s t e m f o r t h i s v a l i d a t i o n s t u d y i s a s f o l l o w s : 0 w a t e r s o l u b l e 1 2 5 o a r o m a t i c m o l e c u l e s 0 a m o l e c u l a r w e i g h t l e s s t h a n 2 0 0 0 g / m o l e . k e t o n e f u n c t i o n a l g r o u p s p r e s e n t . l a r g e o r g a n i c i o n i c s p e c i e s ( m o r e t h a n S c a r b o n s ) w i t h s m a l l i n o r g a n i c i o n s a l s o p r e s e n t 0 t h e p K s o f t h e s p e c i e s i n d i c a t e t h a t t h e y c o u l d b e n e u t r a l i z e d a t a p H w i t h i n a r e t y p i c a l o p e r a t i n g r a n g e o f H P L C T h e a b b r e v i a t e d d i a l o g f o r t h i s c o n s u l t a t i o n c a n b e s e e n i n T a b l e 4 . 6 . T h e r e s p o n s e f r o m t h e u s e r i s p r e f a c e d w i t h a > > p r o m p t . T h e e x p e r t s y s t e m r e c o m m e n d e d : a r e v e r s e d - p h a s e i o n p a i r c h r o m a t o g r a p h y ( I P C ) . r e v e r s e d - p h a s e w i t h a n a l k y l s i l a n e p a c k i n g m a t e r i a l . r e v e r s e d - p h a s e w i t h a c y a n o p a c k i n g m a t e r i a l 1 2 6 N 8 8 0 ? J \ E s t r o n e S o d i u m S u l f a t e N a S O E q u i l i n S o d i u m S u l f a t e F i g u r e 4 . 3 S t r u c t u r e s o f t h e C o n j u g a t e E s t r o g e n s U s e d i n t h e V a l i d a t i o n S t u d y 1 2 7 T a b l e 4 . 6 D i a l o g f o r t h e E s t r o g e n C o n s u l t a t i o n I s t h e m o l e c u l a r w e i g h t o f t h e s o l u t e l a r g e ( i . e . > 2 0 0 0 ) o r s m a l l ( L e . < = 2 0 0 0 ) 7 > > s m a l l I s t h e s o l u t e s o l u b l e i n o r g a n i c s o i v e n t ( s ) 7 > > U E r r o r 2 2 2 . R e s p o n s e s t h a t b e g i n w i t h a c a p i t a l l e t t e r a r e n o t a l l o w e d . T r y r e t y p i n g t h e e n t r y i n l o w e r c a s e o r e n c l o s e i t w i t h i n ' q u o t e s ' . Y o u r r e s p o n s e m u s t b e c h o s e n f r o m t h e f o l l o w i n g : y e s , n o . N o w c o n s i d e r t h e i o n i c c h a r a c t e r o f y o u r s o l u t e . I n t h e n o r m a l p H r a n g e f o r H P L C ( p l - l 2 - 8 ) i s y o u r s o l u t e l - i o n i c n - n o n i o n i c o r i , n - i o n i c , b u t c o u l d b e m a d e n o n i o n i c b y a p p r o p r i a t e p H o r o t h e r c h a n g e 7 ( N o t e : I f y o u h a v e t h e c h o i c e , a n d y o u r s o l u t e m o l e c u l e s c a n b e m a d e n o n - i o n i c , t h e n y o u s h o u l d m a k e t h e m s o - s e p a r a t i o n o f i o n s i s a m u c h m o r e d i f f i c u l t p r o b l e m ) > > i , n A s s e s s m e n t o f l i k e l y s e p a r a t i o n m e c h a n i s m s . E n t e r o n e o r m o r e o f t h e f o l l o w i n g r e s p o n s e s . I f y o u d o n o t k n o w t h e a n s w e r , o r d o n o t u n d e r s t a n d t h e t e r m s , t y p e " u . " f o r " u n k n o w n . T h e c o m p o n e n t s y o u w i s h t o s e p a r a t e s - d i f f e r i n s i z e o n l y p - d i f f e r i n p o l a r i t y o n l y b - d i f f e r i n b o t h p o l a r i t y a n d s i z e ; 0 - d i f f e r i n o p t i c a l a c t i v i t y a - h a v e a r o m a t i c c h a r a c t e r d - a r e a r o m a t i c a n d h a v e d i f f e r e n t s u b s t i t u e n t s g - c o n t a i n g e o m e t r i c i s o m e r s > > u D o e s t h e s o l u t e c o n t a i n l a r g e o r g a n i c i o n s 7 > > y W h a t p H w o u l d b e r e q u i r e d t o m a k e s o l u t e s p e c i e s n e u t r a l 7 > > a c l d E r r o r 9 0 . A n o n - n u m e r i c t e r m i s f o u n d w h e r e a n u m b e r s h o u l d b e . C h e c k f o r a r i t h m e t i c t h a t m i x e s n u m b e r s w i t h a t o m s . I s t h e s o l u t e s o l u b l e i n w a t e r m i x e d w i t h m e t h a n o l , t e t r a h y d r o f u r a n o r a c e t o n l t r i l e 7 > > y D o e s t h e s o l u t e c o n t a i n i n o r g a n i c I o n s 7 > > y D o e s t h e s o l u t e c o n t a i n v e r y s m a l l o r g a n i c i o n s ( i . e . l e s s t h a n 3 - 4 c a r b o n a t o m s ) 7 > > I t D o e s t h e s o l u t e c o n t a i n p - p e p t i d e s , s - s m a l l _ p r o t e l n s , o - o l i g o n u c l e o t i d e s o r n - n o n e o f t h e s e 7 1 2 8 T a b l e 4 . 6 ( c o n t i n u e d ) D i a l o g f o r t h e E s t r o g e n C o n s u l t a t i o n > > n D o e s y o u r s o l u t e c o n t a i n : c - c a r b o x y l i c a c i d s , p - p h e n o l s , k - k e t o n e s , n - n i t r o - g r o u p s , t - t h i o l s o r a - a l i p h a t i c - a l c o h o l s 7 > > I t D o y o u h a v e , o r c o u l d y o u o b t a i n , a c o l u m n w i t h p a c k i n g : a l k y L s i i a n e 7 > > y D o e s y o u r s o l u t e h a v e t h e c a p a b i l i t y f o r d i p o l e i n t e r a c t i o n w i t h t h e c o l u m n p a c k i n g 7 ( t h i s d e p e n d s o n w h a t p o l a r g r o u p s a r e p r e s e n t - I f i t h a s k e t o n e , a l d e h y d e , o r n i t r o g r o u p s p r e s e n t , o r i s a r o m a t i c t h e n i t p r o b a b l y d o e s ) . > > y D o y o u h a v e , o r c o u l d y o u o b t a i n , a c o l u m n w i t h p a c k i n g : c y a n o 7 > > y D o e s y o u r s o l u t e h a v e t h e c a p a b i l i t y o f c h a r g e t r a n s f e r w i t h a c h a r g e - d o n a t i n g o r c h a r g e - a c c e p t i n g s t a t i o n a r y p h a s e ( e . g . a r o m a t i c s w i t h s e v e r a l e l e c t r o n d o n a t i n g s u b s t i t u e n t s w o u l d h a v e t h i s c a p a b i l i t y ) . > > u R e c o m m e n d e d s e p a r a t i o n m o d e : r e v e r s e _ p h a s e _ p a i r e d J o n I f t h e r e q u i r e d p H f o r s o l u t e n e u t r a l i t y < p H 2 o r > p H 8 t h e n y o u M U S T u s e i o n p a i r i n g r e a g e n t s e . g . T M A . T B A , s u l f o n a t e . I o n p a i r i n g M A Y a l s o b e u s e d w i t h i n t h e p H 2 - 8 r a n g e . S u g g e s t e d p a c k i n g : a l k y l - s l l a n e ' l l ' h i s p a c k i n g s e p a r a t e s p r i m a r i l y o n t h e b a s i s o f s i z e , b u t l e s s p o l a r ( o v e r a l l p o l a r i t y ) s o l u t e s w i l l b e r e t a i n e d l o n g e r . R e c o m m e n d e d s e p a r a t i o n m o d e : r e v e r s e - p h a s e _ p a i r e d - i o n S u g g e s t e d p a c k i n g : c y a n o T h i s p a c k i n g s e p a r a t e s o n t h e b a s i s o f d i p o l e I n t e r a c t i o n w i t h t h e c y a n o n i t r o g e n l o n e p a i r o f e l e c t r o n s . A s s u c h i t i s b e t t e r a t d i p o l e i n t e r a c t i o n t h a n p h e n y l p a c k i n g . I t s e f f i c a c y d e p e n d s o n t h e p o l a r g r o u p p r e s e n t o n t h e s o l u t e . I t i s s u i t a b l e f o r s e p a r a t i n g ( e . g . ) k e t o n e s , a l d e h y d e s , a r o m a t i c s a n d n i t r o c o m p o u n d s . R e c o m m e n d e d s e p a r a t i o n m o d e : r e v e r s e _ p h a s e _ b o n d e d S u g g e s t e d p a c k i n g : a l k y L s I l a n e R e c o m m e n d e d s e p a r a t i o n m o d e : r e v e r s e - p h a s e - b o n d e d S u g g e s t e d p a c k i n g : c y a n o 1 2 9 S e c t i o n 4 . 7 . 2 V a l i d a t i o n o f B V i t a m i n s — M i P r o t o t y p e T h e n e x t v a l i d a t i o n s t u d y w a s a s a m p l e c o n t a i n i n g f o u r w a t e r s o l u b l e B v i t a m i n s , n i a c i n , n i a c i n a m i d e , r i b o fl a v i n , a n d p y r i d o x i n e H C l ( s e e F i g u r e 4 . 4 ) . A c c e p t e d m e t h o d s 1 5 e m p h a s i z e t h e i o n i c n a t u r e o f t h e v i t a m i n s . A s s u c h , t h e a c c e p t e d m e t h o d s i n v o l v e i o n e x c h a n g e ( I E C ) o r i o n - p a i r e d ( I P C ) c h r o m a t o g r a p h y . R e v e r s e - p h a s e c h r o m a t o g r a p h y u s i n g i o n i z a t i o n c o n t r o l w a s a l s o r e c o m m e n d e d a s a n _ a p p r o p r i a t e m e t h o d . A n A m i n e x A - 2 S a m i n e c o l u m n ( t y p i c a l l y u s e d f o r a n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y ) a t a p H o f 1 0 w a s a l s o r e c o m m e n d e d . 1 5 A t a p H o f 1 0 , t h e v i t a m i n s a r e n o n - i o n i c a n d t h e p r o b a b l e s e p a r a t i o n m e c h a n i s m i s v i a p a r t i t i o n c h r o m a t o g r a p h y b e t w e e n t h e a m i n e p a c k i n g m a t e r i a l a n d t h e p o l a r f u n c t i o n a l g r o u p s o f t h e v i t a m i n s . O n e o b j e c t i v e o f t h i s v a l i d a t i o n s t u d y w a s t o t e s t a d d i t i o n a l r u l e s w h i c h h a d b e e n i n c l u d e d t o d i f f e r e n t i a t e b e t w e e n t h e v a r i o u s i o n c h r o m a t o g r a p h y t e c h n i q u e s . T h e d a t a f o r t h i s v a l i d a t i o n s t u d y i s a s f o l l o w s : s o l u b l e i n w a t e r m o l e c u l a r w e i g h t s l e s s t h a n 2 0 0 0 g / m o l e c o n t a i n k e t o n e g r o u p s l a r g e o r g a n i c i o n i c s p e c i e s ( m o r e t h a n 3 - 4 c a r b o n a t o m s ) w i t h i n o r g a n i c i o n s p r e s e n t t h e s p e c i e s c a n b e n e u t r a l i z e d a t a p H w i t h i n t h e t y p i c a l o p e r a t i n g r a n g e o f H P L C T h e e x p e r t s y s t e m p r o p o s e d i n i t i a l l y o n l y r e v e r s e d - p h a s e i o n p a i r c h r o m a t o g r a p h y . S u b s e q u e n t v a l i d a t i o n s w i t h t h e s a m e t e s t c a s e p r o v i d e d i o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y a s a r e c o m m e n d a t i o n o n l y w h e n t h e e x p e r t s y s t e m w a s i n f o r m e d t h a t t h e p H r e q u i r e d t o s h i f t t h e s o l u t e s i n t o t h e i r n e u t r a l f o r m w a s e x c e s s i v e l y h i g h . 1 3 0 N i a c i n H — — — H H — — — - O H H O H H O H O H R i b o fl a v i n F i g u r e 4 . 4 S t r u c t u r e o f F o u r 8 V i t a m i n s : N i a c i n , N i a c i n a m i d e , R i b o f l a v i n , a n d P y r i d o x i n e H C I 1 3 1 S e c t i o n 4 . 7 . 3 V a l i d a t i o n o f a H y p o t h e t i c a l C a s e - M l P r o t o t y p e T h e f i n a l v a l i d a t i o n s t u d y p r e s e n t e d h e r e i s a h y p o t h e t i c a l c a s e t h a t i n c l u d e d a v e r y c o m p l e x m i x t u r e w i t h v a r i o u s p r o p e r t i e s . T h i s t e s t c a s e c o n t a i n s w h a t m i g h t a p p e a r t o b e c o n f l i c t i n g c h a r a c t e r i s t i c s . H o w e v e r , t h i s i s a n a t t e m p t t o a s c e r t a i n h o w w e l l t h e e x p e r t s y s t e m w o u l d b e a b l e t o t r e a t m o r e d i f f i c u l t c a s e s . T h e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h i s s a m p l e a r e : . s o l u b l e i n b o t h a q u e o u s a n d o r g a n i c s o l v e n t s . m o l e c u l a r w e i g h t s g r e a t e r t h a n 2 0 0 0 g / m o l e . t h e s a m p l e i s a h o m o l o g o u s s e r i e s i n w h i c h t h e s p e c i e s i n c r e a s e i n s i z e a n d p o l a r i t y . . s t r o n g l y i o n i c s p e c i e s w i t h m u l t i p l e i o n i c s i t e s p r e s e n t . . A p H o f 7 i s r e q u i r e d t o s h i f t t h e s p e c i e s i n t o t h e n e u t r a l f o r m s . T h e r e c o m m e n d a t i o n s f r o m t h e M 1 p r o t o t y p e e x p e r t s y s t e m p r o v i d e d o n l y t w o s u g g e s t i o n s : n o r m a l - p h a s e S E C a n d r e v e r s e - p h a s e a l k y l - s i l a n e . S e c t i o n 4 . 8 S e c o n d a r y V a l i d a t i o n o f V P - E x p e r t E x p e r t S y s t e m T h i s s e c t i o n d i s c u s s e s t h e r e s u l t s o f t h e p r e l i m i n a r y v a l i d a t i o n o f t h e e x p e r t s y s t e m . T h e s e d i s c u s s i o n s a r e d e s c r i b e d i n c o n t e x t o f t h e s e c o n d a r y v a l i d a t i o n o f t h e e x p e r t s y s t e m t h a t i s b a s e d o n t h e V P - E x p e r t s h e l l . T h e s e s e c o n d a r y v a l i d a t i o n s t u d i e s a r e p e r f o r m e d u s i n g t h e s a m e t e s t c a s e s d e s c r i b e d a b o v e . T h e p r o t o t y p e e x p e r t s y s t e m a t t e m p t s t o m i n i m i z e o r r e m o v e a n y r e c o m m e n d a t i o n t h a t i n v o l v e s a n y t y p e o f i o n c h r o m a t o g r a p h y . T h i s a p p r o a c h p r o v i d e s i n a d e q u a t e r e c o m m e n d a t i o n s f o r s a m p l e s i n w h i c h t h e i o n i c n a t u r e s o f t h e e l u i t e s c a n p r o v i d e a n a p p r o p r i a t e s e p a r a t i o n m e c h a n i s m . 1 3 2 T h e M 1 v e r s i o n d o e s n o t p r o v i d e a n y a d d i t i o n a l r u l e s t o h e l p d e t e r m i n e t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e c h a r g e t r a n s f e r c h a r a c t e r i s t i c s a n d d i p o l a r i n t e r a c t i o n s w h e n e v e r t h e u s e r r e s p o n d s w i t h a n u n k n o w n r e p l y . T h e M 1 v e r s i o n a l s o d o e s n o t p r o v i d e a r a n k i n g o f t h e p r o p o s e d s o l u t i o n s t o a l l o w t h e u s e r t o d e t e r m i n e w h i c h o f t h e s u g g e s t i o n s i s t h e m o s t l i k e l y t o s u c c e e d . T h e r e c o m m e n d a t i o n s a r e r e t u r n e d o n l y i n t h e o r d e r t h a t t h e y a r e a s s i g n e d i n t h e k n o w l e d g e b a s e . F i n a l l y , s e v e r a l p r o b l e m s w i t h t h e u s e r i n t e r f a c e w e r e d i s c o v e r e d . T h e M 1 v e r s i o n d i d n o t p r o v i d e t h e u s e r w i t h t h e a c c e p t a b l e r e s p o n s e s f o r a q u e s t i o n u n l e s s a n i n v a l i d r e s p o n s e i s e n t e r e d . A t t h a t p o i n t t h e e x p e r t s y s t e m r e s p o n d e d w i t h a n e r r o r m e s s a g e a n d s u p p l i e d t h e c o r r e c t c h o i c e s . T h e e x p e r t s y s t e m a l s o r e q u i r e d t h a t t h e r e s p o n s e s b e e n t e r e d w i t h c o r r e c t s p e l l i n g a n d w i t h a l l l o w e r - c a s e l e t t e r s . I n a d d i t i o n t h e e x p e r t s y s t e m a l l o w e d a r e s p o n s e f r o m t h e u s e r o f A C I D w h e n a s k e d f o r t h e n u m e r i c v a l u e o f a p H t h a t w o u l d r e s u l t i n a n e u t r a l i z a t i o n o f t h e i o n i c s p e c i e s . T h e o b j e c t i v e s a r i s i n g f r o m t h i s v a l i d a t i o n s t u d y w e r e t o i m p r o v e t h e s e c o n d g e n e r a t i o n o f t h e e x p e r t s y s t e m s u c h t h a t t h e e x p e r t s y s t e m p r o v i d e s : ( 1 ) a m o r e u s e r - f r i e n d l y e n v i r o n m e n t ( 2 ) e r r o r c h e c k i n g o n d a t a p r o v i d e d b y t h e u s e r ( 3 ) a b i l i t y t o p r e d i c t i n t e r a c t i o n s w h e n t h e u s e r r e s p o n d s U N K N O W N ( 4 ) a r a n k i n g o f t h e r e c o m m e n d a t i o n s w i t h s o m e n u m e r i c a l v a l u e t o c o n n o t e t h e c e r t a i n t y o f t h e r e c o m m e n d a t i o n s ( 5 ) a n i n c r e a s e i n t h e l o g i c p a t h w a y s f r o m w h i c h t h e e x p e r t s y s t e m m a y p r e d i c t p o s s i b l e s e p a r a t i o n m e c h a n i s m s T h e V P - E x p e r t s h e l l w a s c h o s e n t o r e p l a c e M 1 a s t h e i n f e r e n c e e n g i n e b e c a u s e V P - E x p e r t i s m o r e i n t r i n s i c a l l y u s e r - f r i e n d l y . E v e r y q u e s t i o n i n t h e V P - E x p e r t k n o w l e d g e b a s e h a s a n a s s o c i a t e d C H O I C E S c o m m a n d . T h e C H O I C E S c o m m a n d p r e s e n t s t h e a l l o w e d v a l u e s f o r t h e q u e s t i o n , a n d t h e u s e r n e e d o n l y u s e t h e c u r s o r k e y s t o s e l e c t t h e 1 3 3 a n s w e r ( s ) . V a r i a b l e s t h a t h a v e a n u m e r i c a l v a l u e m a y b e c o n t r o l l e d b y a V P - E x p e r t c o m m a n d , R A N G E , w h i c h a l l o w s o n l y n u m e r i c a l e n t r i e s b e t w e e n s p e c i f i e d m i n i m u m a n d m a x i m u m v a l u e s . T h e r e s u l t o f t h e s e a d d i t i o n s t o t h e k n o w l e d g e b a s e i s a n i n c r e a s e i n v a l i d e n t r i e s a n d a d e c r e a s e i n t h e c o m p l e x i t y o f u s i n g t h e e x p e r t s y s t e m . T h e k n o w l e d g e b a s e w a s a l s o e x p a n d e d t o a l l o w t h e i n f e r e n c e e n g i n e t o h a n d l e u n k n o w n v a l u e s a n d t o p r o m p t t h e u s e r w i t h f u r t h e r q u e s t i o n s . T h e k n o w l e d g e b a s e c o n t a i n s a d d i t i o n a l r u l e s w h i c h p r e d i c t t h e v a l u e s f o r v a r i a b l e s b a s e d u p o n s u p p o r t i n g e v i d e n c e ( i . e . , t h e s e l f - d e t e r m i n i n g r u l e s m e n t i o n e d e a r l i e r ) . F o r e x a m p l e , r u l e s w e r e a d d e d w h i c h p r e d i c t a d i p o l a r i n t e r a c t i o n b a s e d u p o n t h e p r e s e n c e o f k e t o n e g r o u p s a n d t o p r e d i c t c h a r g e t r a n s f e r i n t e r a c t i o n s d u e t o t h e p r e s e n c e o f a r o m a t i c r i n g s w i t h s u b s t i t u e n t s . O n e e x a m p l e o f t h i s a p p r o a c h i s s e e n i n C o d e 4 . 1 0 t h a t p r o v i d e s a n r e c o m m e n d a t i o n b a s e d u p o n p r e v i o u s l y e n t e r e d d a t a . A n a d d i t i o n a l o b j e c t i v e w a s t o m a k e t h e e x p e r t s y s t e m e a s i e r t o u s e b y p r o v i d i n g a d d i t i o n a l h e l p b y i n c o r p o r a t i n g d e t a i l e d t e x t v i a t h e D I S P L A Y c o m m a n d a n d a l s o b y t h e B E C A U S E c o m m a n d ( w h i c h a l l o w s t h e u s e r t o a s k t h e e x p e r t s y s t e m W H Y a n d H O W ) . T h e a d d i t i o n o f a r a n k i n g m e c h a n i s m t o p r o v i d e a n a s s u r a n c e f a c t o r t o t h e u s e r w a s a c c o m p l i s h e d b y t h e i n c l u s i o n o f c o n fi d e n c e f a c t o r s . T h i s a d d i t i o n t o t h e e x p e r t s y s t e m i s d i s c u s s e d i n S e c t i o n 4 . 9 . F i n a l l y , t h e i n c r e a s e i n a l l o w e d s e p a r a t i o n m e c h a n i s m s i s d e s c r i b e d i n S e c t i o n 4 . 9 a n d i n t h e f o l l o w i n g v a l i d a t i o n s t u d i e s . S e c t i o n 4 . 8 . 1 E s t r o g e n s T e s t C a s e - V P - E x p e r t T h e e s t r o g e n t e s t w a s c h o s e n t o t e s t t h e a b i l i t y o f t h e e x p e r t s y s t e m t o t r e a t a r e v e r s e d - p h a s e s e p a r a t i o n . S o l u t e c h a r a c t e r i s t i c s f o r t h e V P - E x p e r t s y s t e m w e r e s i m i l a r t o t h e M 1 v e r s i o n w i t h s e v e r a l d i f f e r e n c e s . T h e m o l e c u l e s w e r e d e s c r i b e d a s o r g a n i c i o n s c o n t a i n i n g k e t o n e g r o u p s . ” n m u y m n " J ' . ‘ 1 ' 1 1 3 4 C o d e t o D e t e r m e D i p o l e I n t e r a c t i o n s R u l e P a c k i n g 7 A I f C h a r g e . T r a n s f e r = U n k n o w n A N D C o d e 4 . 1 0 A r o m a t i c - S o l u t e = Y e s A N D S e p a r a t i o n _ P r o p e r t y = D i f f e r r i n g - S u b s t i t u e n t s A N D F u n c t i o n a l i t i e s : 2 A m i n e _ G r o u p s O R F u n c t i o n a l i t i e s a N i t r o - G r o u p s O R F u n c t i o n a l i t i e s = A l c o h o l s O R F u n c t i o n a l i t i e s a P h e n o l s T h e n C h a r g e . T r a n s f e r a : Y e s D i s p l a y " Y o u h a v e a n a r o m a t i c w i t h c h a r g e t r a n s f e r g r o u p s p r e s e n t o n t h e i n g . T h e f u n c t i o n a l g r o u p s h a v e a l o n e p a i r o f e l e c t r o n s w h i c h a r e o n a t i n g t o t h e a r o m a t i c r i n g . T h i s c r e a t e s a c o m p o u n d w h i c h w i l l a v e c h a r g e t r a n s f e r c h a r a c t e r i s t i c s . ” B E C A U S E " e a r e t r y i n g t o d e t e r m i n e i f t h e s o l u t e h a s c h a r g e t r a n s f e r h a r a c t e r i s t i c s . I f t h e u s e r d o e s n o t k n o w t h e a n s w e r , t h e n w e w i l l a s e t h e a n s w e r o n w h e t h e r t h e r e i s a n a r o m a t i c r i n g w i t h e l e c t r o n o n a t i n g s u b s t i t u e n t s p r e s e n t " ; T h e m o l e c u l e s w e r e a l s o d e s c r i b e d a s c o n t a i n i n g a d i s t i n c t i v e s i z e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e s p e c i e s . T h i s d e s c r i p t i o n s w a s a n i n t e n t i o n a l m i s t a k e t o d e t e r m i n e i f e r r o r c o r r e c t i o n r u l e s a d d e d t o t h e k n o w l e d g e b a s e w o u l d q u e r y t h e u s e r s u f f i c i e n t l y t o d e t e r m i n e i f t h e r e w a s a s i z e d i f f e r e n c e i n t h e s o l u t e s . T h e g o a l w a s t o a d d r u l e s t h a t e m p l o y f o r w a r d - c h a i n i n g i n f e r e n c e m e c h a n i s m s t h a t w o u l d a u t o m a t i c a l l y b e a c c e s s e d w h e n t h e u s e r s u g g e s t s t h a t s i z e i s a d i s c r i m i n a t i n g f a c t o r . T h e s e r u l e s w o u l d t h e n a s c e r t a i n t h e m o l e c u l a r w e i g h t r a n g e o f t h e s p e c i e s a n d o v e r r i d e t h e u s e r ' s i n p u t i f t h e d i f f e r e n c e w a s n o t s u f f i c i e n t l y s i g n i f i c a n t t o i n s u r e a s e p a r a t i o n b a s e d o n s i z e a l o n e . A U N K N O W N r e s p o n s e w a s g i v e n w h e n t h e e x p e r t s y s t e m a s k e d i f t h e s o l u t e s h a v e t h e c a p a b i l i t y o f d i p o l a r a n d c h a r g e t r a n s f e r i n t e r a c t i o n s w i t h t h e s t a t i o n a r y p h a s e . T h i s r e s p o n s e t e s t e d t h e a d d i t i o n o f t h e r u l e s s i m i l a r t o C o d e 4 . 1 0 . T h e o u t p u t f o r t h i s t e s t c a s e i s s e e n i n T a b l e 4 . 7 . T h e i n c l u s i o n o f c o n f i d e n c e f a c t o r s d e l i n e a t e s t h e r e c o m m e n d e d s e p a r a t i o n m o d e s i n t o d i f f e r e n t l e v e l s o f c e r t a i n t y . I P C w a s r a n k e d a t a l o w e r c o n f i d e n c e f a c t o r ( 7 0 ) s i n c e t h e s p e c i e s w e r e c o u l d b e n e u t r a l i z e d w i t h t h e a p p r o p r i a t e p H . T h e r e f o r e , t h e 1 3 5 e x p e r t s y s t e m i n f e r r e d t h a t a s e p a r a t i o n c o u l d b e b a s e d u p o n t h e i o n i c n a t u r e o f t h e s o l u t e s , b u t o n e o f t h e o t h e r t e c h n i q u e s w o u l d b e b e t t e r s u i t e d . T a b l e 4 . 7 R e s u l t s o f t h e V a l i d a t i o n S t u d y f o r t h e E s t r o g e n C o m p o n e n t s U s i n g t h e V P - E x p e r t V e r s i o n M o d e C o l u m n C o n fi d e n c e F a c t o r R e v e r s e - p h a s e w i t h I o n i z a t i o n R P - 1 8 S p h e r i - S 1 0 0 C o n t r o l R e v e r s e d - p h a s e P h e n y l B o n d a P a k 1 0 0 R e v e r s e d - p h a s e C y a n o B o n d a P a k 1 0 0 R e v e r s e d p h a s e i o n p a i r n o n e i n d a t a b a s e 7 0 C h r o m a t o g r a p h y T h e e x p e r t s y s t e m a l s o d e c i d e d a g a i n s t u s i n g S E C . T h i s d e c i s i o n i s b a s e d o n t h e s i z e d i s t r i b u t i o n , a v e r a g e m o l e c u l a r w e i g h t , a n d t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f a l t e r n a t i v e s e p a r a t i o n m e t h o d s . T h e s e r u l e s c a l c u l a t e a c o n f i d e n c e f a c t o r t o p r o v i d e a n u m e r i c a l d e s c r i p t o r t o t h e a b i l i t y t o s e p a r a t e b a s e d o n s i z e , a s d i s c u s s e d i n S e c t i o n 4 . 4 . 4 . 1 o n p a g e 1 0 9 . T h e a v e r a g e m a s s ( d e f i n e d a s s m a l l i f l e s s t h a n 2 0 0 0 g / m o l e ) i s a l s o c a l c u l a t e d d u r i n g t h i s p r o c e s s . S E C i s m o s t e f f i c i e n t f o r l a r g e m o l e c u l e s s i n c e s m a l l m o l e c u l e s r e q u i r e t h e u s e o f g e l p e r m e a t i o n s t a t i o n a r y p h a s e s . T h e s e c o n d s e t o f r u l e s d e t e r m i n e s i f t h e r e a r e a l t e r n a t i v e s e p a r a t i o n p r o p e r t i e s t h a t a r e p r e s e n t . I f t h e s o l u t e s h a v e a d d i t i o n a l p r o p e r t i e s ( e . g . , p o l a r i t y , i o n i c ) , t h e s e r u l e s w i l l d e c r e a s e t h e c e r t a i n t y o f u s i n g S E C f r o m 1 0 0 % C N F ( s i z e i s t h e s o l e d i s c r i m i n a t i n g f a c t o r ) t o 5 0 % ( e v e r y o t h e r m o d e i s p r e s e n t ) . A n e x a m p l e o f t h i s r u l e i s p r o v i d e d i n C o d e 4 . 1 1 . I f t h e s a m p l e i s l a b i l e , t h e s e r u l e s i n c r e a s e t h e c o n f i d e n c e f a c t o r s i n c e S E C i s a g e n t l e t e c h n i q u e . T h e s e 1 3 6 r u l e s a r e d i s c u s s e d i n f u r t h e r d e t a i l i n S e c t i o n 4 . 9 , p a g e 1 4 8 . T h e e x p e r t s y s t e m a p p l i e d a l l o f t h e s e r u l e s a n d d e t e r m i n e d t h a t : ( 1 ) T h e d i f f e r e n c e b e t w e e n l a r g e a n d s m a l l m o l e c u l e s w a s t o o s m a l l t o p r o v i d e a p o s s i b l e s e p a r a t i o n m e c h a n i s m . ( 2 ) T h e a v e r a g e m o l e c u l a r w e i g h t w a s s m a l l . ( 3 ) D i p o l e , c h a r g e t r a n s f e r , a n d i o n i c c h a r a c t e r i s t i c s a r e p r e s e n t . ( 4 ) C o m b i n i n g t h e a b o v e t h r e e c o n c l u s i o n s , s i z e w a s d i s c o u n t e d a s a f a c t o r . U n k n o w n v a l u e s f o r d i p o l e a n d c h a r g e t r a n s f e r w e r e h a n d l e d b y t h e e x t r a r u l e s t o a s s i g n t h e p r o p e r v a l u e f o r t h e s e v a r i a b l e s . T h e e x p e r t s y s t e m p r o v i d e d t h e a c c e p t e d r e s p o n s e s o f R e v e r s e - P h a s e a l k y l - s i l a n e w i t h i o n i z a t i o n c o n t r o l , a n d a r e v e r s e d - p h a s e p h e n y l c o l u m n . I n a d d i t i o n , t h e e x p e r t s y s t e m s u g g e s t e d a c y a n o c o l u m n . I P C w a s r e c o m m e n d e d a s a p o s s i b l e a l t e r n a t i v e . C o d e t h a t D e t e r m i n e s t h e P r i o r i t y f o r S i z e D i s c r i m i n a t i o n R U L E S i z e _ C o n s i d e r a t i o n 4 l F S e p a r a t i o n _ P r o p e r t y - S i z e A N D C o d e 4 . 1 1 L a b i l e a N o A N D S e p a r a t i o n _ P r o p e r t y < > P o l a r i t y A N D S e p a r a t i o n - P r o p e r t y < > A r o m a t i c i t y A N D l o n i c i t y a N o n l o n i c T H E N S i z e = C o n s i d e r a t i o n - S i z e i O n l y C N F 8 5 ; T h e e x p e r t s y s t e m a l s o s u g g e s t s p a r t i c u l a r b r a n d n a m e s o f c o l u m n s t o u s e . T h e e x p e r t s y s t e m i n c o r p o r a t e s a d a t a b a s e t h a t m a i n t a i n s a l i s t i n g o f r e p r e s e n t a t i v e c o l u m n s . T h i s d a t a b a s e c o n t a i n s , a m o n g i t s d i f f e r e n t f i e l d s , i n f o r m a t i o n o n w h e t h e r t h i s c o l u m n i s a v a i l a b l e i n t h e l a b o r a t o r y o f t h e s p e c i f i c u s e r , c o l u m n g e o m e t r i e s , a n d s o f o r t h . T h i s d a t a b a s e a l l o w s t h e e x p e r t s y s t e m t o m a k e r e c o m m e n d a t i o n s w i t h c o n s i d e r a t i o n o f t h e p a r t i c u l a r a b i l i t i e s o f t h e l a b o r a t o r y . T h e e x p e r t s y s t e m w i l l s u g g e s t o n l y a v a i l a b l e c o l u m n s , i f s o d i r e c t e d , a n d w i l l a l s o s u g g e s t t h e a p p r o p r i a t e s i z e o f c o l u m n ( e . g . , p r e p a r a t o r y v e r s u s a n a l y t i c a l s c a l e ) d e p e n d i n g u p o n t h e p a r t i c u l a r 1 3 7 a p p l i c a t i o n a s d e t e r m i n e d i n a n e a r l i e r s t a g e w h i c h a s s i s t s t h e u s e r i n d e c i d i n g i f H P L C i s a s u i t a b l e t e c h n i q u e . N o t p r o v i d e d i n T a b l e 4 . 7 i s t h e e x p l a n a t o r y t e x t t h a t i s g i v e n a t t h e e n d o f t h e c o n s u l t a t i o n . A f t e r a m e t h o d h a s b e e n p r o p o s e d , t h e e x p e r t s y s t e m w i l l a c c e s s a h y p e r t e x t f i l e a n d d i s p l a y i n f o r m a t i o n t h a t e x p l a i n s w h y t h a t m e t h o d w a s c h o s e n . A s h o r t p o r t i o n o f t h e f i l e i s p r o v i d e d b e l o w i n C o d e 4 . 1 2 . T h e d a t a b a s e s a n d h y p e r t e x t f i l e s a r e d e s c r i b e d i n m o r e d e t a i l i n S e c t i o n 4 . 1 0 o f t h i s c h a p t e r . H y p e r t e x t E n t r y t o P r o v i d e a D e s c r i p t i o n f o r t h e S e l e c t e d M e t h o d E a e v _ C y a n o C o d e 4 . 1 2 H t o l u m n t o u s e : R e v e r s e P h a s e C y a n o C o l u m n h i s c o l u m n w i l l s e p a r a t e b a s e d o n p a r t i t i o n i n g b e t w e e n t h e m o b i l e h a s e a n d t h e c y a n o s t a t i o n a r y p h a s e . T h e c y a n o g r o u p w i l l i n t e r a c n s e v e r a l w a y s w i t h s o l u t e s . F i r s t , i t i s a m o d e r a t e l y p o l a r g r o u p l e s s t h a n t h e a m i n e ) s o i t w i l l i n t e r a c t w i t h a l d e h y d e s , k e t o n e s , a n d a l i d e s . I t a l s o h a s a d i p o l e w h i c h w i l l t h e n i n t e r a c t w i t h o m p o u n d s c o n t a i n i n g d i p o l e s . I t i s s e l e c t i v e f o r a r o m a t i c s t h a t a v e e l e c t r o n d o n a t i n g s u b s t i t u e n t s . S e c t i o n 4 . 8 . 2 B V i t a m i n s T e s t C a s e — V P - E x p e r t T h e e s t r o g e n v a l i d a t i o n s t u d y d e m o n s t r a t e d t h e i m p o r t a n c e o f h a v i n g t h e e x p e r t s y s t e m c o n s i d e r a l l o f t h e p o s s i b l e m o d e s o f s e p a r a t i o n . T h e p r o t o t y p e m i n i m i z e d i o n c h r o m a t o g r a p h y t e c h n i q u e s . O n e o b j e c t i v e i n t h e v i t a m i n s v a l i d a t i o n s t u d y w a s t o t e s t t h e i n c l u s i o n o f a d d i t i o n a l r u l e s t o d e l i n e a t e b e t w e e n t h e d i f f e r e n t i o n c h r o m a t o g r a p h y t e c h n i q u e s . T h e a c c e p t e d m e t h o d f o r t h e s e B v i t a m i n s i n c l u d e d c a t i o n e x c h a n g e a n d i o n p a i r e d c h r o m a t o g r a p h y . F i g u r e 4 . 4 o n P a g e 1 3 0 g i v e s t h e s t r u c t u r e s o f t h e f o u r v i t a m i n s . O n e c a n s e e t h e d i f f e r e n t i o n i c s i t e s w h i c h a r e p r e s e n t o n t h e v i t a m i n s . 1 3 8 T h e r e a r e s e v e r a l d i f f e r e n t m o d e s t h a t c a n b e u s e d f o r t h e c h r o m a t o g r a p h i c s e p a r a t i o n o f i o n i c s p e c i e s . I o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y ( I E C ) i s t y p i c a l l y u s e d t o s e p a r a t e s t r o n g o r g a n i c a c i d s a n d b a s e s . T h e r e t e n t i o n m e c h a n i s m i n v o l v e s i o n e x c h a n g e b e t w e e n t h e s a m p l e i o n s a n d t h e m o b i l e c o u n t e r - i o n o f t h e p a c k i n g m a t e r i a l . C o n d u c t i v i t y d e t e c t o r s a r e t y p i c a l l y u s e d t o m o n i t o r t h e I E C e f f l u e n t s . I E C p a c k i n g m a t e r i a l s a r e n o t a s e f f i c i e n t , l e s s r e p r o d u c i b l e , a n d l e s s s t a b l e , p a r t i c u l a r l y f o r a n i o n e x c h a n g e , a s o t h e r t e c h n i q u e s . 1 1 I n a d d i t i o n , t h e l a r g e b a c k g r o u n d s i g n a l r e s u l t i n g f r o m t h e m o b i l e p h a s e e l e c t r o l y t e c a n d e c r e a s e t h e s i g n a l - t o - n o i s e r a t i o o f t h e c o n d u c t i v i t y d e t e c t o r . 3 I o n C h r o m a t o g r a p h y ( I C ) i s a s p e c i a l i z e d f o r m o f I E C t h a t u s u a l l y e m p l o y s c o n d u c t i m e t r i c d e t e c t i o n . T h e t e c h n i q u e u s e s a c o m b i n a t i o n o f I E C r e s i n s t o r e m o v e t h e l a r g e b a c k g r o u n d s i g n a l f r o m t h e e l e c t r o l y t e t o a l l o w t h e u s e o f t h e c o n d u c t i m e t r i c d e t e c t o r . T h e s a m p l e p a s s e s t h r o u g h a s e p a r a t i o n c o l u m n w h e r e t h e i o n s a r e r e s o l v e d b a s e d p r i m a r i l y o n i o n i c d e n s i t y . T h e s e p a r a t e d i o n s t h e n p a s s t h r o u g h a s t r i p p e r c o l u m n w h e r e t h e e l u a n t i s n e u t r a l i z e d a n d t h e s a m p l e e l u t e s i n a b a c k g r o u n d o f d e i o n i z e d w a t e r . T h i s p r o c e d u r e s a l l o w s I C t o b e u s e d f o r t r a c e a n a l y s i s . I o n p a i r c h r o m a t o g r a p h y ( I P C ) i s a n o t h e r c h r o m a t o g r a p h i c t e c h n i q u e t o s e p a r a t e i o n i c s p e c i e s . I n I P C a c o u n t e r - i o n i s a d d e d t o t h e m o b i l e p h a s e t o f o r m a n i o n p a i r w i t h t h e a n a l y t e ( s ) . I P C c a n b e p e r f o r m e d i n b o t h n o r m a l - p h a s e a n d r e v e r s e d - p h a s e ; h o w e v e r , t h e r e v e r s e d - p h a s e m o d e w i l l b e d i s c u s s e d h e r e . T h e s t a t i o n a r y p h a s e t y p i c a l l y c o n s i s t s o f a n a l k y l - s i l a n e p a c k i n g m a t e r i a l s u c h a s a C 8 o r C 1 8 b o n d e d p h a s e . F o r n o r m a l - p h a s e o p e r a t i o n , a p o r o u s s i l i c a s u p p o r t c o n t a i n i n g a m e c h a n i c a l l y h e l d a q u e o u s s o l u t i o n o f b u f f e r a n d c o u n t e r - i o n i s u s e d f o r t h e s t a t i o n a r y p h a s e . 1 1 I n r e v e r s e d - p h a s e o p e r a t i o n , t h e i o n p a i r w i l l b e r e t a i n e d o n t h e n o n - p o l a r c o l u m n w h i l e t h e f r e e i o n f o r m s p a r t i t i o n i n t o t h e m o b i l e p h a s e . T h e r e f o r e , t h e p a r t i t i o n c o e f f i c i e n t i s a f u n c t i o n o f e q u i l i b r i u m c o n s t a n t f o r t h e i o n p a i r f o r m a t i o n . I P C i s p a r t i c u l a r l y 1 3 9 s u i t a b l e f o r p o l a r s a m p l e s s u c h a s b a s e s , s p e c i e s w i t h m u l t i p l e , i o n i z a b l e g r o u p s , a n d f o r s p e c i e s i n w h i c h t h e p H t o n e u t r a l i z e t h e i o n i c s p e c i e s m a y c a u s e d e g r a d a t i o n o f t h e H P L C c o l u m n p a c k i n g m a t e r i a l . S p e c i a l t y c o l u m n s e x i s t f o r I P C w h i c h c o n t a i n a w a t e r - i r n m i s c i b l e i o n e x c h a n g e r w h i c h s e r v e s a s t h e c o u n t e r i o n . T h e p r o t o t y p e e x p e r t s y s t e m d i d n o t d i f f e r e n t i a t e b e t w e e n t h e s e d i f f e r e n t m e t h o d s t o c h r o m a t o g r a p h i c a l l y s e p a r a t e i o n i c s p e c i e s . A s d e m o n s t r a t e d i n t h e M 1 v a l i d a t i o n s t u d y , i o n s e p a r a t i o n t e c h n i q u e s w e r e o n l y r e c o m m e n d e d w h e n t h e r e q u i r e d p H t o n e u t r a l i z e t h e a c i d f o r m s w a s e x c e s s i v e l y a c i d i c o r b a s i c . F i g u r e s 4 . 5 , 4 . 6 a , a n d 4 . 6 b p r o v i d e a l o g i c f l o w c h a r t f o r t h e M 1 a n d V P - E x p e r t e x p e r t s y s t e m s , r e s p e c t i v e l y . T h e n u m b e r o f d i f f e r e n t p a t h s t h a t t h e i n f e r e n c e e n g i n e c a n a c c e s s t o r e a c h a m o d e t o s e p a r a t e i o n s h a s b e e n i n c r e a s e d i n t h e V P - E x p e r t v e r s i o n ( H P L C A d v i s o r ) . B e c a u s e b a c k w a r d - c h a i n i n g i s u s e d t o d e t e r m i n e t h e m o d e a n d c o l u m n , H P L C A d v i s o r c a n a t t e m p t e v e r y i n d u c t i o n p a t h a n d c a n r e c a l l t h o s e t h a t w e r e s u c c e s s f u l . T h e n u m b e r s f o l l o w i n g t h e d i f f e r e n t m o d e s i n d i c a t e t h e C N F t h a t a r e a s s i g n e d t o t h a t m o d e v i a t h a t p a r t i c u l a r p a t h . T h e m o d e s w i t h o u t a n u m b e r h a v e a C N F o f 1 0 0 % . T h e v a l u e s f o r t h e s e C N F a r e d e s c r i b e d l a t e r i n S e c t i o n 4 . 9 T h e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e B v i t a m i n s u s e d a s t h e i n p u t f o r H P L C A D V I S O R w e r e s i m i l a r t o t h e M 1 v a l i d a t i o n c a s e w i t h t h e a d d i t i o n t h a t t h e s o l u t e s w e r e s t r o n g l y i o n i c a n d c o n t a i n e d a l c o h o l a n d a m i n e f u n c t i o n a l g r o u p s . H P L C A D V I S O R r e c o m m e n d e d : - i o n - p a i r c h r o m a t o g r a p h y C N F 1 0 0 . c a t i o n e x c h a n g e C N F 1 0 0 . r e v e r s e d - p h a s e a m i n e C N F 8 0 T h e r e c o m m e n d a t i o n t o u s e a n a m i n e c o l u m n w a s s u r p r i s i n g s i n c e t h i s r e c o m m e n d a t i o n w a s n o t o n e o f t h e o r i g i n a l a c c e p t e d m e t h o d s . A n a d d i t i o n a l l i t e r a t u r e s e a r c h f o u n d t h a t o t h e r r e s e a r c h e r s h a v e u s e d a n a m i n e c o l u m n f o r t h e s e p a r a t i o n o f B v i t a m i n s . T h e r e c o m m e n d a t i o n o f a n a m i n e c o l u m n i s b a s e d u p o n t h e p o l a r n a t u r e o f 1 4 0 t h e B v i t a m i n s a n d d i p o l a r i n t e r a c t i o n s o f t h e f u n c t i o n a l g r o u p s p r e s e n t w i t h t h e a m i n e s t a t i o n a r y p h a s e . S e c t i o n 4 . 8 . 3 H y p o t h e t i c a l T e s t C a s e — V P - E x p e r t T h e o b j e c t i v e o f t h e h y p o t h e t i c a l t e s t c a s e i s t o p r o v i d e a v e r y c o m p l e x c a s e a n d s e e i f t h e e x p e r t s y s t e m i s a b l e t o p r o v i d e a l l p o s s i b l e s o l u t i o n s w i t h a p p r o p r i a t e C N F . A s a r e m i n d e r , t h e c a s e i n v o l v e d : ( I ) A q u e o u s a n d O r g a n i c S o l u b l e c o m p o n e n t s ( 2 ) L a r g e m o l e c u l e s ( > S O O O D a l t o n s ) ( 3 ) H o m o l o g o u s S e r i e s i n w h i c h b o t h s i z e a n d p o l a r i t y i n c r e a s e f o r e a c h m e m b e r o f t h e s e r i e s . D i f f e r e n c e o f 1 2 % b e t w e e n l o w a n d h i g h m o l e c u l a r w e i g h t s p e c i e s . ( 4 ) S t r o n g l y I o n i c w i t h m u l t i p l e i o n i c s i t e s . A p H o f 7 w i l l c h a n g e t h e s p e c i e s i n t o t h e n o n - I o n i c f o r m s P o i n t s 3 a n d 4 i n d i c a t e c o n d i t i o n s t h a t t h e M 1 v e r s i o n d o e s n o t h a v e r u l e s w i t h w h i c h t o a s s i s t . T h i s t e s t c a s e d e t e r m i n e s t h e b e h a v i o r o f t h e e x p e r t s y s t e m o n s e v e r a l p o i n t s . T h e f i r s t i s t o s e e i f a p r o p e r r e s p o n s e f o r s i z e w i l l b e d e t e r m i n e d . A s m e n t i o n e d e a r l i e r , H P L C A D V I S O R w i l l d e t e r m i n e t h a t S E C i s a v i a b l e s o l u t i o n o n l y i f t h e s p e c i e s h a v e a l a r g e w e i g h t d i s t r i b u t i o n a n d t h e r e a r e f e w o r n o c o m p e t i n g t e c h n i q u e s . I n t h i s t e s t c a s e , t h e d i s t r i b u t i o n i s f a i r l y l a r g e , b u t t h e r e a r e p o l a r i t y a n d i o n i c c h a r a c t e r i s t i c s t h a t c o m p e t e . S E C i s a c o m p l e x a n d e x p e n s i v e t e c h n i q u e ( c o l u m n s a r e e x p e n s i v e a n d f r a g i l e ) . T y p i c a l S E C c o l u m n s a l s o h a v e l o w c a p a c i t y f a c t o r s w h i c h i n d i c a t e s t h a t t h e y w i l l n o t b e a b l e t o r e s o l v e a l a r g e n u m b e r o f c o m p o n e n t s ( r e c a l l t h a t t h e 1 0 % d i f f e r e n c e c r i t e r i a a p p l i e s n o t o n l y t o t h e h i g h e s t a n d l o w e s t m o l e c u l a r w e i g h t s , b u t a l s o t o a d j a c e n t m o l e c u l e s i n t h e s i z e d i s t r i b u t i o n p r o fi l e ) . T h e r e f o r e , i f o t h e r t e c h n i q u e s w i l l d o t h e j o b , t h e e x p e r t s y s t e m s h o u l d w e i g h t t h o s e r e s p o n s e s h i g h e r . 1 4 1 F i g u r e 4 . 5 F l o w C h a r t f o r t h e D e t e r m i n a t i o n o f I o n C h r o m a t o g r a p h y T e c h n i q u e s : M 1 V e r s i o n 1 4 2 N P N 0 C o n t i n u e I P C I E C Y e s 1 C N u m b e r s K e y R e v e r s e - P h a s e N o r m a l - P h a s e I o n - P a i r e d C h r o m a t o g r a p h y I o n E x c h a n g e C h r o m a t o g r a p h y I o n C h r o m a t o g r a p h y A s s o c i a t e d C o n f i d e n c e F a c t o r s R P I I I I I N o Y e s — . l o r i z a t ‘ o n C o n t d I o n i c O r g a n i c I o n 1 0 0 Y e s ¢ I P C O O I P C 1 0 0 l I E C G O . . m . . . . . . _ . Y e s Y e s , _ _ L _ i I C 1 0 0 I C 7 O l E C 7 0 I E C 1 0 0 F i g u r e 4 . 6 a F l o w C h a r t f o r t h e D e t e r m i n a t i o n o f I o n C h r o m a t o g r a p h y T e c h n i q u e s f o r S m a l l M o l e c u l e s : V P - E x p e r t V e r s i o n " : 1 m e Y a " — Y e s — a l S E C 1 0 0 0 5 O 1 4 3 N o Y e s R P B o n d e d 1 0 0 s n u g l y I P C 1 0 0 I o n i c Y ” r e c 7 0 Y e s r e c 1 0 0 l P C 7 0 K e y R P R e v e r s e - P h a s e I P C I o n - P a i r e d C h r o m a t o g r a p h y I E C I o n E x c h a n g e C h r o m a t o g r a p h y S E C S i z e E x c l u s i o n C h r o m a t o g r a p h y N u m b e r s A s s o c i a t e d C o n f i d e n c e F a c t o r s F i g u r e 4 . 6 b F l o w C h a r t f o r t h e D e t e r m i n a t i o n o f I o n C h r o m a t o g r a p h y T e c h n i q u e s f o r L a r g e M o l e c u l e s : V P - E x p e r t V e r s i o n 1 4 4 T h e t e s t c a s e a l s o t e s t s t h e r u l e s w h i c h d e a l w i t h i o n c h r o m a t o g r a p h y . T h e s p e c i e s a r e l a r g e a n d h a v e s t r o n g m u l t i p l e i o n i c s i t e s . T y p i c a l l y a v e r y l a r g e p H e x t r e m e ( b a s i c o r a c i d i c ) w o u l d b e r e q u i r e d t o n e u t r a l i z e e a c h i o n i c s i t e ; t h e r e f o r e , n e c e s s i t a t i n g t h e u s e o f I P C o r o t h e r i o n i c t e c h n i q u e . T h i s c a s e s t i l l t e s t s t h e t r e a t m e n t o f a v e r y i o n i c m o l e c u l e w h i c h c a n e a s i l y b e n e u t r a l i z e d . W h i l e t h i s s e e m s i l l o g i c a l , r e c a l l t h a t t h e s e t y p e s o f c a s e s a r e m e a n t t o t e s t t h e k n o w l e d g e b a s e f o r t r i c k s a m p l e s . A s s u c h , t h e e x p e c t e d a n s w e r s h o u l d b e R e v e r s e p h a s e w i t h i o n c o n t r o l , p e r h a p s f o l l o w e d b y I P C . I E C w i l l n o t l i k e l y b e a r e c o m m e n d a t i o n s i n c e I E C i s t y p i c a l l y u s e d f o r s m a l l e r m o l e c u l e s w h i c h c a n e a s i l y e x c h a n g e w i t h t h e c o u n t e r i o n o f t h e r e s i n . I f t h e s p e c i e s i s a r e v e r y i o n i c , t h e s e c o m p o n e n t s a r e r e t a i n e d f o r v e r y l o n g p e r i o d s . A l s o l a r g e m o l e c u l e s o f t e n a r e u n a b l e t o p e n e t r a t e t h e r e s i n m a t e r i a l t o e x c h a n g e w i t h t h e c o u n t e r i o n s , a n d t h e s a m p l e m a y n o t a d e q u a t e l y r e s o l v e d . T h e o u t p u t f o r t h i s t e s t c a s e i s g i v e n i n T a b l e 4 . 8 . T h e r e i s a d i f f e r e n c e o f 1 0 b e t w e e n t h e C N F o f N o r m a l P h a s e a n d R e v e r s e p h a s e b o n d e d . T h e s e C N F a r e m e a n t t o b e o n l y a n i n d i c a t o r o f t h e c e r t a i n t y o f t h e r e c o m m e n d a t i o n . W i t h t h i s i n m i n d , t h e C N F o f H P L C A D V I S O R w e r e s e t u p i n i n c r e m e n t s t o r e p r e s e n t a c e r t a i n t y o f s u c c e s s ( p l e a s e s e e S e c t i o n 4 . 9 ) . I n t h i s i m p l e m e n t a t i o n , a r a n g e o f 1 0 0 t o 9 0 i n d i c a t e s t h e b e s t c h o i c e ( s ) . T h e t e s t c a s e d i d n o t p r o v i d e e n o u g h i n f o r m a t i o n t o a l l o w t h e 1 0 % d i f f e r e n c e t o b e s i g n i f i c a n t . T h e r e f o r e , t h i s d i f f e r e n c e i s o n l y t h e r e s u l t o f t h e p r o p a g a t i o n o f d i f f e r e n t C N F t h r o u g h o u t t h e k n o w l e d g e b a s e . R e v e r s e p h a s e w a s a l s o s l i g h t l y l o w e r s i n c e t h e r e a r e c o m p e t i n g t e c h n i q u e s t h a t m i g h t s e r v e a s w e l l ( S E C , I P C ) . T h i s s e r v e d t o s l i g h t l y d e c r e a s e t h e r e s u l t a n t C N F . H o w e v e r , t h e f i r s t t w o r e c o m m e n d a t i o n s a r e t h e e x p e c t e d o n e s . T h e n e x t r e c o m m e n d a t i o n i s I P C w i t h a C N F o f 7 0 . T h i s v a l u e o f t h e C N F c o n n o t e s a g o o d c h o i c e ( u s u a l l y a s e c o n d c h o i c e i f t h e f i r s t c h o i c e s a r e n o t a v a i l a b l e ) . S E C a n d I E C w e r e t h i r d w i t h i n d i v i d u a l C N F o f 6 0 . T h i s v a l u e o f a C N F s u g g e s t s ( a s 1 4 S p r o g r a m m e d i n t o t h e k n o w l e d g e b a s e ) a c h o i c e t h a t i s n o t l i k e l y t o p r o v i d e a g o o d s e p a r a t i o n o r m i g h t r e q u i r e e x t e n s i v e o p t i m i z a t i o n t o a c h i e v e s e p a r a t i o n a n d r e s o l u t i o n . T h e s e a r e s t i l l v i a b l e t e c h n i q u e s s i n c e t h e y h a v e a C N F t h a t i s a b o v e t h e T r u t h T h r e s h o l d v a l u e o f 5 0 . T a b l e 4 . 8 O u t p u t f r o m V a l i d a t i o n S t u d y o f t h e H y p o t h e t i c a l C a s e : V P - E x p e r t V e r s i o n R e c o m m e n d M o d e C o n f i d e n c e F a c t o r L a r g e P o r e N o r m a l P h a s e B o n d e d 1 0 0 L a r g e P o r e R e v e r s e P h a s e B o n d e d 9 0 L a r g : P o r e R e v e r s e P h a s e I P C 7 0 L a r g e P o r e R e v e r s e P h a s e S E C 6 0 L a r g e P o r e I E C 6 0 S e c t i o n 4 . 8 . 4 C o n c l u s i o n s o f V a l i d a t i o n S t u d i e s T h e s e t e s t c a s e s w e r e c h o s e n t o t e s t r e p r e s e n t a t i v e c o m p o n e n t s o f t h e e x p e r t s y s t e m / k n o w l e d g e b a s e . A d d i t i o n a l v a l i d a t i o n s t u d i e s w e r e d o n e t o t e s t d i f f e r e n t s u b - m o d e s o f t h e s y s t e m . W h i l e t h e s e a r e n o t p r e s e n t e d i n t h i s t h e s i s , t h e y w e r e f a i r l y s u c c e s s f u l . T y p i c a l l y , t h e t e s t c a s e s o f t e n d e m o n s t r a t e d h o l e s i n t h e k n o w l e d g e b a s e o r s y n t a x e r r o r s . A g e n e r a l c o n c l u s i o n c a n b e m a d e t h a t t h e e x p e r t s y s t e m w i l l p m v i d e t h e o p t i m u m m e t h o d a s o n e o f t h e f i r s t c o u p l e o f p r o p o s e d s o l u t i o n s . A d d i t i o n a l m o d e s w i l l b e r e c o m m e n d e d t h a t h a v e a l o g i c t o t h e m . T h e e v o l u t i o n o f t h e e x p e r t s y s t e m f r o m M 1 t o H P L C A D V I S O R h a s s e e n s o m e i m p o r t a n t i m p r o v e m e n t s i n t h e k n o w l e d g e b a s e a n d i n f e r e n c e e n g i n e . H P L C A D V I S O R 1 4 6 p r o v i d e s a f a s t e r a n d m o r e e f f i c i e n t i n f e r e n c e e n g i n e . E v e n w i t h t h e a d d i t i o n o f n e w r u l e s , t h e t h r e e k n o w l e d g e b a s e s f r o m M 1 w e r e c o n d e n s e d i n t o t w o k n o w l e d g e b a s e s ( H P L C A D V I S O R , v e r s i o n 3 . 0 a l l o w e d t h e c o n s o l i d a t i o n i n t o o n e k n o w l e d g e b a s e , b u t t h i s w a s n o t d o n e a s m e n t i o n e d e a r l i e r ) . H P L C A D V I S O R i s a p p r o x i m a t e l y t w o t i m e s f a s t e r t h a n M ] . A b s o l u t e s p e e d c o m p a r i s o n s a r e d i f f i c u l t t o m a k e s i n c e t h e t w o i n f e r e n c e e n g i n e s r e q u i r e d i f f e r e n t k n o w l e d g e b a s e f o r m a t s , a n d t h e k n o w l e d g e b a s e s t h e m s e l v e s q u i c k l y e v o l v e d i n t o t w o d i f f e r e n t s y s t e m s . T h e e v o l u t i o n o f t h e k n o w l e d g e b a s e i t s e l f i s e v e n m o r e i m p o r t a n t t h a n t h e i m p r o v e m e n t s t h a t o c c u r r e d w h e n s w i t c h i n g f r o m M 1 t o H P L C A D V I S O R . S e l f - p r e d i c t i v e r u l e s a l l o w f o r b e t t e r t r e a t m e n t o f U N K N O W N r e s p o n s e s f r o m t h e u s e r a n d a l s o a l l o w t h e e x p e r t s y s t e m t o u s e d a t a a l l r e a d y s t o r e d d u r i n g t h e c o n s u l t a t i o n . T h e s e s e l f - p r e d i c t i v e r u l e s e n c o m p a s s : 0 t h e d e t e r m i n a t i o n o f l a b i l e c o m p o n e n t s ( w i t h t h e i n c r e a s e i n t h e C N F f o r S E C a s a p o s s i b l e m o d e s i n c e S E C i s t h e g e n t l e s t t e c h n i q u e ) ; 0 p r e d i c t i o n o f p r o t e i n s , d i p o l e s , c h a r g e t r a n s f e r , a n d s o f o r t h ; 0 d e t e r m i n a t i o n o f t h e p r e s e n c e o f h o m o l o g o u s s e r i e s a n d t h e a p p r o p r i a t e m e t h o d s t o u s e f o r t h e m ; 0 c a l c u l a t i o n o f S E C b a s e d o n m o l e c u l a r w e i g h t d i s t r i b u t i o n , a v e r a g e M W , a n d c o m p e t i n g m o d e s ; 0 d e t e r m i n e t h e s i g n i f i c a n c e a n d r e l e v a n c e o f p a r t i c u l a t e m a t t e r i n t h e c h o i c e o f b o t h s a m p l e p r e - t r e a t m e n t a n d s t a t i o n a r y p h a s e p a r t i c l e d i a m e t e r s ( d i r t y c o m p o u n d s s h o u l d n o t b e u s e d o n v e r y s m a l l a n a l y t i c a l c o l u m n s d u e t o t h e p o t e n t i a l f o r c l o g g i n g ) . A d d i t i o n a l r u l e s a l s o " f i n e t u n e ” t h e r e c o m m e n d a t i o n s t o p r o v i d e m o r e a s s i s t a n c e f o r t h e d i f f e r e n t s e p a r a t i o n m o d e s . D u r i n g t h e d e v e l o p m e n t , t h e d e f i n i t i o n o f w h o m t h e e n d - u s e r w o u l d b e w a s r e d e f i n e d . I t w a s d e c i d e d t h a t t h e e x p e r t s y s t e m 1 4 7 s h o u l d p r o v i d e h e l p f o r t h o s e w h o a r e l e s s v e r s e d w i t h H P L C . B e c a u s e o f t h i s i t i s n e c e s s a r y t o p r o v i d e a d d i t i o n a l h e l p i n s e l e c t i n g a p p r o p r i a t e a n s w e r s . T h i s w a s a c c o m p l i s h e d b y t h e i n c l u s i o n o f m o r e d e s c r i p t i v e q u e s t i o n s , B E C A U S E t e x t ( H O W a n d W H Y f a c i l i t y ) , a n d h y p e r t e x t f i l e s t o g i v e t h e u s e r s o m e f u n d a m e n t a l i n f o r m a t i o n o n h o w t h e r e c o m m e n d e d m o d e s o p e r a t e . T h e i n c l u s i o n o f d a t a b a s e s a n d t e x t f i l e s a l s o a l l o w t h e e x p e r t s y s t e m t o p r o v i d e d e t a i l e d i n f o r m a t i o n t h a t i s t a i l o r e d f o r t h a t s p e c i f i c l a b o r a t o r y . F u t u r e e x p a n s i o n o f t h e d a t a b a s e s w i l l p r o v i d e e v e n m o r e p o w e r t o t h e e x p e r t s y s t e m . F i n a l l y , t h e i n c l u s i o n o f c o n f i d e n c e f a c t o r s p r o v i d e a m e a s u r e o f r e l i a b i l i t y t o t h e e x p e r t s y s t e m . F o r e x p e r t s y s t e m s t o b e u s e d , t h e u s e r m u s t b e a b l e t o t r u s t t h e r e c o m m e n d a t i o n s . I n c l u s i o n o f t h e C N F a l l a y f e a r s t h a t t h e m e t h o d s a r e r e l i a b l e . T h e u s e r m a y a l s o ” h e d g e " h i s / h e r r e s p o n s e s t o q u e s t i o n s w h e n u n s u r e a n d s e e a r e s u l t i n g d e c r e a s e i n c e r t a i n t y . T h i s c a n e n c o u r a g e t h e u s e r t o s e e k a d d i t i o n a l i n f o r m a t i o n w h e n a p r o p o s e d m e t h o d h a s l o w C N F . T h e s e C N F c a n a l s o d e c r e a s e t h e u s a g e o f t h e e x p e r t s y s t e m i f t h e C N F d o n o t r e fl e c t t h e r e a l p r o b a b i l i t y o f s u c c e s s . T h i s d o u b l e - e d g e s w o r d r e q u i r e s t h a t t h e e x p e r t s y s t e m b e m o n i t o r e d a n d r e f i n e d a s i t i s u s e d . T h e r e f o r e , t h e e x i s t e n c e o f a t h e s i s d e s c r i b i n g t h e e x p e r t s y s t e m s h o u l d n o t i n d i c a t e t h a t t h e e x p e r t s y s t e m i s n o w c o m p l e t e l y s t a b l e a n d o m n i s c i e n t . W i t h t h e e m p h a s i s o n C N F t h r o u g h o u t t h i s c h a p t e r , t h e f i n a l s e c t i o n o f t h i s c h a p t e r w i l l d i s c u s s a d d i t i o n a l i n f o r m a t i o n r e g a r d i n g t h e i n c o r p o r a t i o n o f C N F . T h i s s e c t i o n w i l l b e b r i e f s i n c e m u c h d i s c u s s i o n o f c e r t a i n t y t h e o r y a n d i t s a p p l i c a t i o n i n t h i s e x p e r t s y s t e m h a s b e e n m e n t i o n e d i n a l l o f t h e p r e v i o u s c h a p t e r s . 1 4 8 S e c t i o n 4 . 9 C o n f i d e n c e F a c t o r s C o n f i d e n c e f a c t o r s w e r e n o t i n i t i a l l y u s e d i n t h e p r o t o t y p e o f t h e e x p e r t s y s t e m . O n c e t h e e x p e r t s y s t e m w a s t r a n s f e r r e d t o V P - E x p e r t , i t w a s d e c i d e d t o i m p l e m e n t c o n f i d e n c e f a c t o r s f o r s e v e r a l r e a s o n s . C o n f i d e n c e f a c t o r s p r o v i d e : 0 A p p l i c a t i o n s o f f u z z y l o g i c t o t h e d a t a t h a t i s i n p u t d u r i n g t h e c o n s u l t a t i o n . 0 C o n d e n s a t i o n o f m u l t i p l e r u l e s i n t o f e w e r r u l e s . 0 C o n s i d e r a t i o n o f a l l p o s s i b i l i t i e s t h r o u g h o u t t h e c o n s u l t a t i o n . 0 I n t e r n a l m e t h o d t o d e t e r m i n e g o a l s . . R a n k e d p r e s e n t a t i o n o f a l l p o s s i b i l i t i e s : o A n u m e r i c a l d e s c r i p t o r o f t h e r e l i a b i l i t y o f t h e a d v i c e . T h e s e m o t i v a t i o n s f o r u s i n g c o n f i d e n c e f a c t o r s a r e p r e s e n t e d b e l o w . F o l l o w i n g t h a t w i l l b e a d e s c r i p t i o n o f h o w c o n f i d e n c e f a c t o r s w e r e i m p l e m e n t e d i n t h i s p r o j e c t . S e c t i o n 4 . 9 . 1 M o t i v a t i o n s f o r U s i n g C o n f i d e n c e F a c t o r s S e c t i o n 4 . 9 . 1 . ] F u z z y I n p u t I t i s n e c e s s a r y t h a t t h e u s e r b e a b l e t o i n d i c a t e a r e l i a b i l i t y t o t h e a n s w e r s t h a t h e / s h e s u p p l i e s t o t h e q u e r i e s f r o m t h e e x p e r t s y s t e m . V P - E x p e r t a l l o w s t h e u s e r t o s u p p l y c o n f i d e n c e s t o e v e r y i n p u t . T h i s i s a c c o m p l i s h e d b y h i t t i n g t h e H O M E k e y a t a n y i n p u t p r o m p t . C o n f i d e n c e f a c t o r s a r e i m p l e m e n t e d i n V P - E x p e r t u s i n g a s c a l e f r o m O t o 1 0 0 ( w h e r e 1 0 0 i s a b s o l u t e l y t r u e a n d 0 i s a b s o l u t e l y f a l s e ) . T h e d e m a r c a t i o n b e t w e e n t r u e a n d f a l s e i s e s t a b l i s h e d b y t h e V P - E x p e r t c o m m a n d , T R U T H T H R E S H . A v a l u e o f 5 0 w a s u s e d f o r T r u t h T h r e s h ( t h e d e f a u l t v a l u e i n v e r s i o n 1 . 1 w a s 7 0 ) . T h i s i n d i c a t e s t h a t a n y r u l e w h i c h h a s a t o t a l c o n f i d e n c e o f g r e a t e r t h a n o r e q u a l t o 5 0 w i l l p a s s a n d t h e c o n c l u s i o n ( t h e " T h e n ” p a r t o f t h e r u l e ) w i l l b e e x e c u t e d . 1 4 9 S e c t i o n 4 . 9 . 1 . 2 A p p r o p r i a t e V a l u e s f o r C o n fi d e n c e F a c t o r s T h o u g h f u z z y l o g i c i n d i c a t e s t h a t c o n f i d e n c e s s h o u l d n o t d e c r e a s e a s s u p p o r t i n g e v i d e n c e i s a d d e d ( s e e C h a p t e r 2 ) , i n i t i a l d e v e l o p m e n t o f t h e e x p e r t s y s t e m d e m o n s t r a t e d t h a t a s s i g n i n g t o o l o w o f i n i t i a l c o n f i d e n c e s c a u s e d r u l e s t o n o t f i r e w h e n t h e y w e r e e x p e c t e d t o d o s o . T h i s p r o b l e m a r o s e f r o m t h e w a y t h a t c o n f i d e n c e f a c t o r s a r e c a l c u l a t e d ( v i d e i n f r a ) . T h e c o n f i d e n c e o f t h e c o n c l u s i o n i s b a s e d u p o n t h e c o n f i d e n c e o f t h e c o n c l u s i o n m u l t i p l i e d b y t h e c o n fi d e n c e o f t h e p r e m i s e s . S o m e r u l e s h a d c o n c l u s i o n s t h a t w e r e w e i g h t e d w i t h l o w e r c o n f i d e n c e f a c t o r s s o t h a t s e v e r a l r u l e s c o u l d b e c o m b i n e d i n t o o n e . W h e n t h e p r e m i s e o f a r u l e b e c a m e f a i r l y l o w , t h e r e s u l t i n g c o n c l u s i o n w o u l d e n d u p h a v i n g a c o n f i d e n c e t h a t w o u l d b e b e l o w t h e t r u t h t h r e s h o l d . A n y f u r t h e r r u l e s t h a t u s e d t h e v a l u e o f t h i s c o n c l u s i o n w o u l d n o l o n g e r p a s s . E x p e r i m e n t a l l y , a s c a l e w a s e s t a b l i s h e d t o m a i n t a i n c o n s i s t e n t " t r u t h s " a s s e e n i n T a b l e 4 . 9 T h e r a n g e s a r e s u b j e c t i v e a n d a r e e s t a b l i s h e d s o t h a t t h e c o n f i d e n c e s o f t e s t c a s e s w o u l d b e a c c u r a t e . T h a t i s , t e s t c a s e s w i t h k n o w n m e t h o d s w e r e f e d i n t o t h e s y s t e m a n d t h e c o n f i d e n c e s o f t h e r u l e s w o u l d b e c h a n g e d s o t h a t r e a s o n a b l e a n d c o n s i s t e n t c o n f i d e n c e f a c t o r s w o u l d b e g e n e r a t e d . C o n f i d e n c e f a c t o r s h a v e b e e n i m p l e m e n t e d f o r a l l o f t h e d i f f e r e n t m o d e s t h a t H P L C A D V I S O R r e c o m m e n d s . T h e m o s t e x t e n s i v e o f u s e o f C N F h a s b e e n f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f S E C a s a p o s s i b l e s o l u t i o n t o a g i v e n c o n s u l t a t i o n . T h e a d d i t i o n o f r u l e s f o r S E C a l s o r e q u i r e d t h a t a w e i g h t i n g f a c t o r t o b e a p p l i e d t o t h e r e c o m m e n d a t i o n s i n c e S E C d e p e n d s o n l y o n s i z e d i f f e r e n c e s a m o n g t h e s a m p l e c o m p o n e n t s . W h i l e o t h e r m o d e s s u c h a s p o l a r i t y a r e a l l o w a b l e , t h e p r e d i c t i v e n a t u r e o f t h e S E C t e c h n i q u e — w h e r e t h e l a r g e s t e l u i t e e l u t e s f i r s t — r e q u i r e s t h a t s i z e b e t h e o n l y s e p a r a t i o n f a c t o r . S i n c e c o m p o n e n t s m a y h a v e a d d i t i o n a l d i f f e r e n c e s , i t i s n e c e s s a r y t h a t a w e i g h t e d r e c o m m e n d a t i o n ( v i a c o n f i d e n c e f a c t o r s ) o f S E C b e i n c l u d e d t o a c c o u n t f o r t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f o t h e r m o d e s o f s e p a r a t i o n . 1 5 0 T h e m e t h o d o f i m p l e m e n t i n g C N F f o r S E C h a s a l l r e a d y b e e n d e s c r i b e d . P r e s e n t e d i n T a b l e 4 . 1 0 i s t h e a s s i g n m e n t o f d i f f e r e n t C N F d e p e n d i n g o n d i f f e r e n t m o d e s o f s e p a r a t i o n b e i n g p r e s e n t . A s d i f f e r e n t e f f e c t s a p p e a r , S E C b e c o m e s l e s s d e s i r a b l e . T h i s m a y b e d u e t o a d i f f e r e n t m o d e b e i n g e a s i e r , f a s t e r , a n d b e t t e r t h a n S E C ( e . g . , c h a r g e t r a n s f e r e f f e c t s o f p a r t i c u l a r s u b s t i t u e n t s o n a n a r o m a t i c r i n g ) o r b e c a u s e t h e s e d i f f e r e n t e f f e c t s w i l l c a u s e t h e S E C m e c h a n i s m t o n o t p r e d o m i n a t e ( e . g . , S E C s e p a r a t e s b a s e d o n s i z e a n d s h a p e ; p o l a r c o m p o n e n t s m a y h a v e a d i f f e r e n t p a r t i t i o n 1 e f f e c t w i t h t h e s t a t i o n a r y p h a s e a n d t h e r e s u l t i s t h a t t h e l a r g e s t a n a l y t e s m a y n o t e l u t e ! i f i r s t ) . T a b l e 4 . 9 T r u t h T h r e s h o l d V a l u e s R a n g e S u b j e c t i v e E v a l u a t i o n o f I n p u t S u b j e c t i v e E v a l u a t i o n o f O u t p u t 1 0 0 - 9 0 A k n o w n f a c t f o r t h e u s e r F i r s t o r B e s t C h o i c e o f a c t i o n 9 0 - 7 5 T h e u s e r i s c e r t a i n o f t h e i n f o r m a t i o n . T h e u s e r w o u l d o n l y o b t a i n c o n f i r m a t i o n o f t h e i n f o r m a t i o n i f s h e / h e c h e c k e d w i t h a m o r e k n o w l e d g e s o u r c e . G o o d a l t e r n a t i v e . W i l l p r o v i d e t h e r e q u i r e d s e p a r a t i o n i f t h e f i r s t c h o i c e i s n o t a v a i l a b l e . 7 5 - 5 0 T h e u s e i s u n s u r e o f t h e v a l i d i t y o f t h e i n f o r m a t i o n . T h e u s e r n e e d s t o c o n f i r m t h e v a l i d i t y o f t h i s d a t a . T h e r e c o m m e n d a t i o n i s q u e s t i o n a b l e . A d d i t i o n a l i n f o r m a t i o n i s n e e d e d ( i . e . , f u r t h e r e x p e r i m e n t a t i o n ) . U s e t h i s m e t h o d i f a l l o t h e r c h o i c e s a r e n o t a v a i l a b l e o r d o n o t w o r k 5 0 - 0 T h e d a t a i s i n v a l i d . M e t h o d i s u n l i k e l y t o s u c c e e d . M o s t c o n s u l t a t i o n s w i l l n o t p r e s e n t a n y s o l u t i o n s b e l o w 5 0 ( o r t h e T r u t h t h r e s h o l d v a l u e ) . 1 5 1 T a b l e 4 . 1 0 A s s i g n m e n t o f C N F f o r S E C b a s e d u p o n C o m p e t i n g M e c h a n i s m s S i z e P o l a r A r o m S u b G e o O p t I o n L a b C N F Y N N N N N N N 1 0 0 Y N N N — — N Y 9 0 Y N N N Y Y N N 8 5 Y N N Y Y Y N N 8 0 Y N N Y Y Y C N 7 5 Y N Y Y Y Y N Y 7 0 Y N Y Y Y Y I N 6 5 Y Y Y Y Y Y N Y 6 0 Y Y Y Y Y Y N I Y 5 0 L e g e n d a n d R e m a r k s : l i m i n g e s t i o n o m m e n t S i z e S i z e I n t h i s s e t u p , a l l e n t r i e s h a s s o m e s i z e c h a r a c t e r i s t i c s . P O L P o l a r I s t h e r e a d i f f e r e n c e i n t h e p o l a r i t y o f t h e s a m p l e s . A R O M A r o m a t i c S a m p l e c o n t a i n s a r o m a t i c i t y . S U B S u b s t i t u e n t s S u b s t i t u e n t s a r e p r e s e n t w h i c h w i l l l e a d t o a r e c o m m e n d a t i o n t o u s e p a c k i n g s s u c h a s c y a n o . 1 m m G E O O P T I O N G e o m e t r i c O p t i c a l I o n i c L a b i l e 1 5 2 L e g e n d a n d R e m a r k s ( c o n t i n u e d ) D e s c r i p t i o n O I T l I T l E I T t P r e s e n c e o f g e o m e t r i c i s o m e r s . T y p i c a l l y , t h e r e w i l l n o t b e a n y s i z e d i f f e r e n c e s f o r g e o m e t r i c i s o m e r s ; h o w e v e r , t h e r e c o u l d b e s a m p l e s w h i c h h a v e l a r g e M W d i f f e r e n c e s a n d h a v e g e o m e t r i c i s o m e r s a t t h e s a m e t i m e . Y o u w i l l n o t e t h a t t h i s c o l u m n d o e s n o t a f f e c t t h e C N F ' s v e r y m u c h O p t i c a l i s o m e r s p r e s e n t . S a m e c o m m e n t s t h a t a p p l y f o r g e o m e t r i c i s o m e r s a p p l y h e r e a l s o . N : N o n - i o n i c . C : I o n i c b u t t h e p H c a n b e a d j u s t e d t o l e a v e t h e s p e c i e s i n t h e i r n e u t r a l f o r m . I : I o n i c . A r e t h e r e l a b i l e c o m p o u n d s p r e s e n t . T h i s s e r v e s t o r a i s e t h e C N F s i n c e S E C i s a g e n t l e t e c h n i q u e . D o e s n o t d e n a t u r e p r o t e i n s , f o r e x a m p l e . W h i l e t h i s t a b l e i s n o t c o m p l e t e , i t d o e s c o v e r m o s t o f t h e d i f f e r e n t p o s s i b i l i t i e s . O n e l i m i t a t i o n t o t h i s a p p r o a c h i s t h a t t h e k n o w l e d g e b a s e m u s t c o n t a i n a r u l e f o r e a c h c o m b i n a t i o n i n t h e t a b l e . T h i s l e a d t o a m a n y r u l e s w h i c h h a d s l i g h t v a r i a t i o n s i n t h e m . O n e p o s s i b i l i t y i s t o u s e s o m e o f n e w f e a t u r e s o f H P L C A D V I S O R , v e r s i o n 3 . 0 . T w o n e w c o m m a n d s , G E T C N F , a n d M O D C N F , a l l o w t h e c o n f i d e n c e f a c t o r s o f d i f f e r e n t v a r i a b l e s t o b e o b t a i n e d , m a t h e m a t i c a l l y m o d i f i e d , a n d r e - a s s i g n e d t o t h e v a r i a b l e s . O n e c o u l d d e t e r m i n e t h e C N F t h a t h a s b e e n a s s i g n e d t o t h e d i f f e r e n t m o d e s a n d t h e n p e r f o r m a w e i g h t e d s u b t r a c t i o n o f t h e s e C N F f r o m t h e c u r r e n t C N F o f S E C . A w e i g h t e d s u b t r a c t i o n i s n e c e s s a r y s i n c e d i f f e r e n t c o m p e t i n g m o d e s w i l l o v e r - r i d e S E C d i f f e r e n t l y ( e . g . , P o l a r e f f e c t s h a v e t h e l a r g e s t e f f e c t o n t h e m e c h a n i s m i n v o l v e d i n S E C ) . 1 5 3 S e c t i o n 4 . 1 0 A n c i l l a r y F i l e s — T e x t , H e l p F i l e s , a n d D a t a B a s e s N e w m e t h o d s a l s o a p p l y m o r e t h a n k n o w l e d g e b a s e - — u s e f a c t b a s e s , t e x t b a s e s , e t c . T h i s a l l o w s i n f o r m a t i o n t o b e s t o r e d i n m o r e a p p r o p r i a t e f o r m a t s ( m o r e c o n d e n s e d , e a s i e r t o c h a n g e , m o r e d y n a m i c ) . G e n e r a l r u l e s ( h e u r i s t i c s ) w h i c h a r e g l o b a l i n f o r m a t i o n , m o r e s t a t i c i n n a t u r e , c a n b e e n c o d e d i n t h e k n o w l e d g e b a s e i n t h e f o r m a t o f I F - T H E N r u l e s . T h e s e f o r m t h e s k e l e t o n o f t h e k n o w l e d g e b a s e . T h e n o n t o p o f t h a t e x i s t s t h e d a t a b a s e s ( u s u a l l y i n t h e f o r m o f d a t a b a s e s o r s p r e a d s h e e t s ) . T h e s e d a t a b a s e s w o u l d b e c r e a t e d f r o m a s e p a r a t e p r o g r a m ( e . g . , L o t u s , D B A S E ) . T h e y w o u l d i n c o r p o r a t e d y n a m i c i n f o r m a t i o n t h a t m i g h t b e m o r e l o c a l i n n a t u r e . F o r e x a m p l e , a d a t a b a s e c o u l d h o l d i n f o r m a t i o n c o n c e r n i n g t h e H P L C c o l u m n s t h a t a r e a v a i l a b l e . T h e e x p e r t s y s t e m w o u l d t h e n u s e t h i s i n f o r m a t i o n t o g e n e r a t e a s o l u t i o n ( m e t h o d ) t h a t w o u l d b e o p t i m i z e d f o r t h a t l a b l o c a t i o n . T h e r e w o u l d b e n o n e e d t o s u g g e s t a p a r t i c u l a r c o l u m n i f i t w e r e n o t a v a i l a b l e . O r b e t t e r y e t , t o s u g g e s t w i t h a h i g h e r c o n f i d e n c e t h e b e s t c o l u m n w h i l e g i v i n g a s o l u t i o n t h a t w o u l d w o r k w i t h t h e c o l u m n s t h a t a r e a v a i l a b l e . T h i s w o u l d a l l o w t h e u s e r t o d e c i d e w h e t h e r a o n e - t i m e s e p a r a t i o n c o u l d b e a c c o m p l i s h e d o n t h e c o l u m n s t h a t h e / s h e h a s o r w h e t h e r a p a r t i c u l a r c o l u m n m i g h t b e a g o o d i n v e s t m e n t . T h e i n c o r p o r a t i o n o f c o n f i d e n c e f a c t o r s w i l l a l s o a l l o w t h e u s e r t o d e c i d e i f t h e a v a i l a b l e c o l u m n w i l l s u f f i c e . O t h e r s u p p o r t i n g f i l e s a r e t e x t f i l e s . T h e s e i n c o r p o r a t e h e l p s c r e e n s w h e n t h e u s e r r e q u e s t s a m o r e ” w o r d y " e x p l a n a t i o n o r a q u e s t i o n i n a l e s s t e r s e f a s h i o n . T h e h e l p s c r e e n s w o u l d a l s o i n c l u d e r e f e r e n c e m a t e r i a l o r p e r h a p s e x p e r i m e n t a l p r o c e d u r e s ( e . g . , p r e / p o s t - c o l u m n d e r i v i t i z a t i o n s c h e m e s ) . B y s e p a r a t i n g t h e s e t e x t f i l e s o u t s i d e o f t h e k n o w l e d g e b a s e , t h e k n o w l e d g e b a s e b e c o m e s m u c h s m a l l e r . T h i s a l l o w s t h e i n f e r e n c e m a c h i n e ( a n d h e n c e t h e e x p e r t s y s t e m i t s e l f ) t o b e m u c h f a s t e r . O n e p r i m e c o n s i d e r a t i o n i n d e v e l o p i n g a n e x p e r t s y s t e m t h a t w i l l b e a u s e f u l t o o l i s t h a t t h e w h o l e p r o c e s s o f d e v e l o p i n g a m e t h o d s h o u l d b e a r o u n d 3 0 m i n u t e s o r l e s s i n t i m e . M u c h — “ “ _ ‘ f l e t ? 1 5 4 l o n g e r t h a n t h i s a n d t h e u s e r b e c o m e s i m p a t i e n t w i t h t h e p r o c e s s a n d i s l e s s l i k e l y t o u s e t h e t o o l . B y h a v i n g a s m a l l e r k n o w l e d g e b a s e , t h e k n o w l e d g e e n g i n e e r w i l l b e a b l e t o m a i n t a i n t h e s y s t e m m u c h e a s i e r . T h e t e x t f i l e s c a n t h e n b e p u t t o g e t h e r b y m o r e p r o d u c t i v e t o o l s s u c h a s w o r d p r o c e s s o r s . S i n c e t h e y w i l l n o t c r e a t e " b u g s ” , t h e y c a n b e p u t i n t o t h e s y s t e m a t a l a t e r d a t e , c a n b e c h a n g e d m u c h e a s i e r , a n d u s e r - f r i e n d l y f e a t u r e s s u c h a s c o r r e c t s p e l l i n g s / g r a m m a r v i a s p e l l i n g a n d g r a m m a r c h e c k e r s c a n b e u s e d t o m a k e t h e t e x t ” e a s i e r " o n t h e e y e s . L I S T O F R E F E R E N C E S 1 0 l l 1 2 1 3 1 4 L I S T O F R E F E R E N C E S M . D e S m e t , A . P e e t e r s , L . B u y d e n s , a n d D . I . . M a s s a r t , J . C h r o m a t o g r . , 1 9 8 8 , 4 5 7 , 2 5 . T . P . B r i d g e , M . H . W i l l i a m s , G . G . R . S e a t o n , a n d A . P . F e l l , C h r o m a t o g r . 1 9 8 7 , 2 4 , 6 9 1 . J . A . V a n L e e u w e n , B . G . M . V a n d e g i n s t e , a n d G . K a t e m a n , A n a l . C h i m . A c t a 1 9 9 0 , 2 2 8 , 1 4 5 . S . S . W i l l i a m s , J . F . K a r n i c k y , J . - L . E x c o f fl e r , a n d S . R . A b b o t t ' E x p e r t S y s t e m P r o g r a m f o r A s s i s t a n c e i n I - I I g h - P e r f o r m a n c e l i q u i d C h r o m a t o g r a p h i c M e t h o d D e v e l o p m e n t ' i n C o m p u t e r - A s s i s t e d M e t h o d D e v e l o p m e n t f o r H i g h - P e r f o r m a n c e L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y J . L . G l a j c h a n d L . R . S n y d e r , e d s . E l s e v i e r S c i e n c e P u b . , A m s t e r d a m , T h e N e t h e r l a n d s , 1 9 9 0 , 2 6 7 . R . B a c h , J . K a r n i c k y , a n d S . A b b o t t , i n A r t i fi c i a l I n t e l l i g e n c e A p p l i c a t i o n s i n C h e m i s t r y , T . H . P i e r c e a n d B . A . H o h n e , e d s . , W i l e y - I n t e r s c i e n c e , N e w Y o r k , 1 9 8 8 . E . D . S a l i n a n d P . H . W i n s t o n A n a l . C h e m . 1 9 9 2 , 6 4 , 4 9 A . C . C a c h e t , D . C a b r o l , a n d A . M i l l e l i r i J . C h e m . E d . 1 9 8 9 , 6 6 ( 7 ) , 5 5 3 . B . S c h a e f e r , R . S i d e , a n d I . M o r r i s o n P C A 1 1 9 9 2 , 6 ( 4 ) , 2 0 . R E . D e s s e r t A l E x p e r t 1 9 9 1 , 6 ( 1 2 ) , 3 6 . W a t e r s S o u r c e b o o k o f C h r o m a t o g r a p h y , M i l l i p o r e C o r p o r a t i o n , M i l f o r d , M A , 1 9 9 2 . l . R . S n y d e r a n d J . J . K i r k l a n d , I n t r o d u c t i o n t o M o d e r n L i q u i d C h r o m a t o g r a p y , J o h n W i l e y a n d S o n s , I n c . , N e w Y o r k , 1 9 7 9 . J o h n R . W a l t e r s a n d N o r m a n R . N i e l s e n C r a f t i n g K n o w l e d g e - B a s e d S y s t e m s ( E x p e r t S y s t e m s M a d e R e a l i s t i c ) W i l e y - I n t e r s c i e n c e P u b . , N e w Y o r k 1 9 8 8 , 1 2 1 - 4 3 . L e c t u r e a n d s l i d e n o t e s . S e p a r a t i o n s C o u r s e , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y , E a s t L a n s i n g , M i c h i g a n . G . S c h m i d t ' A n a l y s i s o f E s t r o g e n s b y H P L C i n S t e r o i d A n a l y s i s b y H P L C , M . P . K a u t s k y , e d . C h r o m a t o g r a p h i c S c i e n c e S e r i e s V o l . 1 6 M a r c e l D e k k e r , N Y ( 1 9 8 1 ) 1 4 5 . 1 5 5 1 5 6 1 5 M o d e r n C h r o m a t o g r a p h i c A n a l y s i s o f V i t a m i n s , A . P . D e L e e n h e e r , W . E . L a m b e r t , a n d H . J . N e l i s , e d s . M a r c e l D e k k e r , I n c . N e w Y o r k ( 1 9 9 2 ) . " i l l l i l l l " l i l i l l l i i u g w fl m u m w fi u fl : \ 1 ; % 3 3 “ I n 1 2 . . I ! . L v t : | \ 3 . ! 3 . 3 . 1 : . - : ~ : \ . . I . . u . 1 1 “ . . . W : ‘ 2 * . W e i i i : P L A C E I N R E T U R N B O X t o r e m o v e t h i s c h e c k o u t f r o m y o u r r e c o r d . T O A V O I D F I N E S r e t u r n o n o r b e f o r e d a t e d u e . D A T E D U E D A T E D U E D A T E D U E ‘ fl L _ _ J l i — W i M S U i s A n A f f i r m a t i v e A c t i o n / E q u a l O p p o r t u n i t y I n s t i t u t i o n v o h M o m S - e t D E V E L O P M E N T O F A N I N T E L L I G E N T A U T O M A T E D H I G H P E R F O R M A N C E L I Q U I D C H R O M A T O G R A P H Y S Y S T E M - V o l u m e 1 1 B Y S t e p h e n V a n c e M e d l i n A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l f i l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y D e p a r t m e n t o f C h e m i s t r y 1 9 9 3 r e c o n 1 0 n g a n d c P h a s e m o b i j C H A P T E R 5 E X P E R T S Y S T E M : D E T E C T O R A N D M O B I L E P H A S E S E L E C T I O N A N D V A L I D A T I O N A s s o o n a s w e s t a r t e d p r o g r a m m i n g , w e f o u n d t o o u r s u r p r i s e t h a t i t w a s n ' t a s e a s y t o g e t p r o g r a m s r i g h t a s w e h a d t h o u g h t . D e b u g g i n g h a d t o b e d i s c o v e r e d . I c a n r e m e m b e r t h e e x a c t i n s t a n t w h e n I r e a l i z e d t h a t a l a r g e p a r t o f m y l i f e f r o m t h e n o n w a s g o i n g t o b e s p e n t i n f i n d i n g m i s t a k e s i n m y o w n p r o g r a m s . M a u r i c e W i l k e s d i s c o v e r s d e b u g g i n g , 1 9 4 9 T h i s c h a p t e r i s d i v i d e d i n t o f o u r p a r t s . T h e f i r s t p a r t d e t a i l s t h e r e c o m m e n d a t i o n s o f a n a p p r o p r i a t e d e t e c t o r . T h e s e c o n d p a r t d e s c r i b e s t h e r u l e s a n d l o g i c u s e d t o r e c o m m e n d m o b i l e p h a s e b a s e d u p o n t h e r e c o m m e n d a t i o n o f a c o l u m n a n d d e t e c t o r . T h e t h i r d p a r t p r e s e n t s v a l i d a t i o n s t u d i e s f o r b o t h d e t e c t o r a n d m o b i l e p h a s e . C o n c l u s i o n s b a s e d o n t h e d e v e l o p m e n t a n d v a l i d a t i o n o f t h e d e t e c t o r a n d m o b i l e p h a s e m o d u l e s a r e p r e s e n t e d i n t h e f i n a l p a r t . 1 5 7 P A R T I : R E C O M M E N D A T I O N O F D E T E C T O R S c i e n c e w i t h o u t r e l i g i o n i s l a m e ; r e l i g i o n w i t h o u t s c i e n c e i s b l i n d . A l b e r t E i n s t e i n 1 5 8 S e 3 P ( 1 ] . C 0 d e d e t h e d e l W 0 h a \ i i h O b i t e n Q I U . “ d c 1 5 9 S e c t i o n 5 . 1 O v e r v i e w o f t h e D e t e c t o r M o d u l e T h e p r e v i o u s s e c t i o n s h a v e d e s c r i b e d t h e s e l e c t i o n a n d r e c o m m e n d a t i o n o f a n a p p r o p r i a t e c o l u m n . T h i s s e c t i o n d e s c r i b e s t h e e x p e r t s y s t e m m o d u l e w h i c h a s s i s t s i n t h e s e l e c t i o n o f a n a p p r o p r i a t e d e t e c t o r . T h e i n f o r m a t i o n u s e d t o p r o p o s e a s u i t a b l e c o l u m n i s a l s o u t i l i z e d f o r t h e s e l e c t i o n o f t h e d e t e c t o r . D a t a b a s e s t h a t c o n t a i n f u n c t i o n a l g r o u p s p r o p e r t i e s s u c h a s m o l a r a b s o r p t i v i t i e s , q u a n t u m e f f i c i e n c i e s , a n d e l e c t r o c h e m i c a l p o t e n t i a l s a r e i n t e g r a t e d i n t o t h e i n f e r e n c e p r o c e s s . T h e e x p e r t s y s t e m d e t e r m i n e s c o n f i d e n c e f a c t o r s b a s e d o n c o n c e n t r a t i o n o f s o l u t e s a n d d e t e c t o r r e s p o n s e . S e c t i o n 5 . 1 . ! G o a l s o f t h e D e t e c t o r M o d u l e T h e p r i n c i p l e o b j e c t i v e o f t h e d e t e c t o r m o d u l e i s t o r e c o m m e n d a n a p p r o p r i a t e d e t e c t o r f o r t h e q u a n t i t a t i v e a n d q u a l i t a t i v e a n a l y s i s o f t h e s o l u t e s i n a p a r t i c u l a r s a m p l e . S e v e r a l s e c o n d a r y o b j e c t i v e s w e r e s e t t o a c h i e v e t h e m a i n o b j e c t i v e . T h e f i r s t o b j e c t i v e w a s t o h a v e t h e e x p e r t s y s t e m i n c o r p o r a t e t h e i n f o r m a t i o n t h a t w a s u s e d t o r e c o m m e n d t h e c o l u m n i n t o t h e d e t e c t o r s e l e c t i o n p r o c e s s . I t w a s d e t e r m i n e d t h a t m u c h o f t h e i n f o r m a t i o n t h a t i s r e q u i r e d t o r e c o m m e n d a d e t e c t o r i s a l r e a d y o b t a i n e d d u r i n g t h e s e l e c t i o n o f t h e c o l u m n . I t w a s r e a s o n e d t h a t t h e u s e r w o u l d p r e f e r t o s u p p l y m o s t o f t h e i n f o r m a t i o n e a r l y d u r i n g t h e c o n s u l t a t i o n a n d t h e n h a v e t h e e x p e r t s y s t e m u s e t h e s e d a t a d u r i n g t h e d e t e c t o r r e c o m m e n d a t i o n s t a g e . W h i l e a d d i t i o n a l q u e s t i o n s a r e s t i l l r e q u i r e d , m o s t o f t h e r e q u i r e d i n f o r m a t i o n w a s o b t a i n e d b y e d i t i n g a n d e x p a n d i n g t h e q u e s t i o n s u s e d e a r l i e r i n t h e c o n s u l t a t i o n . T h e r e m a i n i n g i n f o r m a t i o n t h a t w a s n e e d e d f o r t h e d e t e c t o r m o d u l e c o n s i s t e d p r i m a r i l y o f e l u c i d a t i n g t h e c h e m i c a l n a t u r e o f t h e s o l u t e s . F o r e x a m p l e , i f t h e u s e r i n d i c a t e s t h a t a s a m p l e c o n t a i n s a l d e h y d e s , t h e d e t e c t o r m o d u l e q u e r i e s t h e u s e r t o d e t e r m i n e i f t h e a l d e h y d e s a r e c o n j u g a t e d w i t h c a r b o n - c a r b o n d o u b l e o r t r i p l e b o n d s . T h i s e l u c i d a t i o n 1 6 0 m a y b e u s e d t o d e t e r m i n e o p t i m u m w a v e l e n g t h s a n d m o l a r a b s o r p t i v i t i e s f o r U V - V i s i b l e d e t e c t o r s . T h e e x p e r t s y s t e m s h o u l d p r o p o s e c o n f i d e n c e f a c t o r s t h a t u s e f u n d a m e n t a l s o l u t e i n f o r m a t i o n i n a d d i t i o n t o t h e s u b j e c t i v e i n p u t f r o m t h e u s e r . I n o u r a p p r o a c h , t h e e x p e r t s y s t e m u s e s c o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e f u n c t i o n s , s u c h a s B e e r ' s L a w , t h a t a r e u s e d t o i n d i c a t e a c c e p t a b l e c o n c e n t r a t i o n r a n g e s f o r e a c h d e t e c t o r . T h e e x p e r t s y s t e m g e n e r a t e s c o n f i d e n c e f a c t o r s t h a t r e f l e c t t h e e x t e n t t h a t t h e s o l u t e c o n c e n t r a t i o n s a r e w i t h i n t h e c o n c e n t r a t i o n r a n g e o f t h e d e t e c t o r . F i n a l l y , w e w a n t t h e e x p e r t s y s t e m t o r e m a i n h e u r i s t i c a l l y - b a s e d . T h i s g o a l a l l o w s t h e e x p e r t s y s t e m t o m a k e r e c o m m e n d a t i o n s f o r a n y c h e m i c a l s y s t e m s — p r o v i d e d t h e u s e r h a s c h e m i c a l a n d p h y s i c a l i n f o r m a t i o n a b o u t t h e s o l u t e s . T o a c h i e v e t h i s g o a l , t h e e x p e r t s y s t e m ( H P L C A d v i s e r ) u s e s f u n c t i o n a l g r o u p i n f o r m a t i o n . F o r e x a m p l e , i t w i l l r e c o m m e n d s p e c i f i c w a v e l e n g t h s f o r U V - V i s i b l e d e t e c t o r s b a s e d u p o n t h e g e n e r a l m o l a r a b s o r p t i v i t i e s o f d i f f e r e n t f u n c t i o n a l g r o u p s . W h i l e t h e s e g e n e r a l i z e d f u n c t i o n a l g r o u p p a r a m e t e r s a r e n o t a s a c c u r a t e a s t a b u l a t e d v a l u e s f o r s p e c i f i c c o m p o u n d s , H P L C A d v i s e r w i l l s t i l l b e a b l e t o m a k e r e c o m m e n d a t i o n s f o r s o l u t e s t h a t a r e n o t s p e c i f i c a l l y i n t h e r e l e v a n t d a t a b a s e s a n d k n o w l e d g e b a s e s . S e c t i o n 5 . 1 . 2 D e t e c t o r s r e c o m m e n d e d b y t h e E x p e r t S y s t e m T h e f i r s t s t e p i n d e v e l o p i n g t h e d e t e c t o r m o d u l e w a s t o d e t e r m i n e w h i c h o f t h e d i f f e r e n t H P L C d e t e c t o r s w o u l d b e r e c o m m e n d e d b y t h e e x p e r t s y s t e m . T a b l e 5 . 1 l i s t s t h e s e d e t e c t o r s . A t o m i c e m i s s i o n , a b s o r p t i o n , a n d fl u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p i c d e t e c t o r s a r e g r o u p e d i n t o t h e c o m p r e h e n s i v e c a t e g o r y o f A t o m i c . A m p e r o m e t r i c a n d v o l t a i c e l e c t r o c h e m i c a l d e t e c t i o n m o d e s a r e a l s o g r o u p e d i n t o t h e s i n g l e c a t e g o r y o f E C h e m . I t 1 6 1 w a s d e c i d e d t h a t t h e i n t e n d e d a u d i e n c e w o u l d n o t h a v e t h e k n o w l e d g e r e q u i r e d t o s u b - c l a s s i f y t h e s e c a t e g o r i e s . T h e s e v e n d e t e c t o r s i n T a b l e 5 . 1 w e r e c h o s e n f o r s e v e r a l r e a s o n s . T h e y a r e r e p r e s e n t a t i v e d e t e c t o r s f r o m b o t h b u l k - a n d s p e c i f i c - p r o p e r t y c l a s s e s . T h e e x p e r t s y s t e m a t t e m p t s t o r e c o m m e n d a s p e c i f i c d e t e c t o r , p r o v i d e d t h a t t h e s o l u t e s a r e a l l a c t i v e f o r t h a t d e t e c t o r ; o t h e r w i s e , t h e e x p e r t s y s t e m i s s t i l l a b l e t o r e c o m m e n d o n e o f t h e b u l k d e t e c t o r s . F o r e x a m p l e , U V - V i s i s r e c o m m e n d e d o n l y i f a l l o f t h e s o l u t e s a b s o r b U V - V i s i b l e r a d i a t i o n . I f t h e r e a r e s o l u t e s w h i c h d o n o t a b s o r b l i g h t t o a s i g n i f i c a n t e x t e n t , t h e e x p e r t s y s t e m i s s t i l l a b l e t o r e c o m m e n d o n e o f t h e b u l k d e t e c t o r s ( p r o v i d e d t h e s o l u t e s m e e t t h e c r i t e r i a f o r t h e b u l k d e t e c t o r s ) . T h e s e t o f d e t e c t o r s w e r e c h o s e n t o p r o v i d e d e t e c t i o n c a p a b i l i t i e s f o r a l l o f t h e d i f f e r e n t c o l u m n s t h a t m a y b e r e c o m m e n d e d b y H P L C A d v i s o r . T h e s e c r i t e r i a l e d t o t h e i n c l u s i o n o f A t o m i c d e t e c t o r s t o p r o v i d e d e t e c t i o n o f m e t a l s p e c i e s ( i . e . , I o n E x c h a n g e c o l u m n s ) , S c a t t e r f o r l a r g e m o l e c u l e s ( S E C ) , a n d s o o n . T w o a d d i t i o n a l c r i t e r i a u s e d t o s e l e c t t h e s e t o f d e t e c t o r s t h a t w o u l d b e r e c o m m e n d e d a r e t h e a v a i l a b i l i t y o f t h e d e t e c t o r a n d t h e a m o u n t o f i n f o r m a t i o n n e e d e d t o r e c o m m e n d t h e d e t e c t o r . I t w a s d e c i d e d t o n o t i n c l u d e m a s s s p e c t r o m e t r y ( M S ) d e t e c t o r s d u e t o t h e c o s t , a v a i l a b i l i t y , a n d c o m p l e x i t y o f M S i n s t r u m e n t s . S o m e o f t h e o b s o l e t e d e t e c t o r s , s u c h a s m o v i n g w i r e , w e r e e x c l u d e d a s w e r e d e t e c t o r s t h a t a r e s t i l l i n t h e r e s e a r c h s t a g e a n d t h u s n o t c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e . S e c t i o n 5 . i . 3 F o r m a t o f t h e P r e s e n t a t i o n o f t h e D i f f e r e n t D e t e c t o r s T h e f o l l o w i n g s e c t i o n d e s c r i b e s a n o v e r v i e w o f t h e m e t h o d o l o g y t o c a l c u l a t e c o n f i d e n c e f a c t o r s . T h e s p e c i f i c s o f t h e s e c a l c u l a t i o n s f o r e a c h d e t e c t o r a r e g i v e n i n t h e r e l e v a n t s e c t i o n f o r t h a t d e t e c t o r . I t 1 6 2 T a b l e 5 . ] D e t e c t o r s R e c o m m e n d e d b y t h e E x p e r t S y s t e m D e t e c t o r A b b r e v i a t i o n D e t e c t o r C l a s s R e f r a c t i v e I n d e x R I B u l k U V - V i s i b l e U V - V i s S p e c i fi c F l u o r e s c e n c e F l u o r S p e c i fi c A t o m i c S p e c t r o s c o p y A t o m i c S p e c i fi c C o n d u c t i v i t y C o n d u c t 8 q u E l e c t r o c h e m i c a l E C h e m S p e c i f i c L i g h t S c a t t e r S c a t t e r B u l k T h e d i f f e r e n t d e t e c t o r s t h a t a r e r e c o m m e n d e d h a v e b o t h s i m i l a r a n d u n i q u e a s p e c t s . A s s u c h , e a c h d e t e c t o r i s p r e s e n t e d s e p a r a t e l y . A f l o w c h a r t o f t h e d e c i s i o n p r o c e s s e s t h a t t h e e x p e r t s y s t e m u s e s t o r e c o m m e n d t h e d e t e c t o r i s p r e s e n t e d a n d d e s c r i b e d . T h e d a t a b a s e s u s e d f o r e a c h d e t e c t o r a r e a l s o p r e s e n t e d . T h e s e c t i o n o n U V - V i s i b l e d e t e c t o r s i s t h e m o s t d e t a i l e d ; s u b s e q u e n t d e s c r i p t i o n s d e s c r i b e a n y d i f f e r e n c e s f r o m t h e a p p r o a c h u s e d f o r t h e s e l e c t i o n o f U V - V i s i b l e d e t e c t o r s . S e c t i o n 5 . 2 C o n f i d e n c e F a c t o r s B a s e d o n C o n c e n t r a t i o n C o n f i d e n c e f a c t o r s f o r c o l u m n s e l e c t i o n a r e e m p i r i c a l l y - b a s e d . T h e c h o i c e o f d e t e c t o r d e p e n d s u p o n s e v e r a l f a c t o r s . F i r s t , a l l s o l u t e s m u s t b e d e t e c t a b l e ( i . e . , a c t i v e ) b y a p a r t i c u l a r d e t e c t o r . O n c e H P L C A d v i s e r h a s d e t e r m i n e d t h a t t h e s p e c i e s a r e a l l a c t i v e f o r t h a t d e t e c t o r , i t t h e n d e t e r m i n e s i f t h e s o l u t e c o n c e n t r a t i o n s a r e i n t h e l i n e a r o p e r a t i n g r a n g e . i t w a s d e c i d e d t o a p p l y a m o r e f u n d a m e n t a l d e t e r m i n a t i o n o f c o n f i d e n c e f a c t o r s b a s e d o n t h i s c o n c e n t r a t i o n r e q u i r e m e n t . T h e f i r s t d e c i s i o n w a s t o d e t e r m i n e a n a p p r o p r i a t e r e s p o n s e f u n c t i o n f o r e a c h d e t e c t o r , i f p o s s i b l e . W h i l e s o m e f u n c t i o n s w e r e o b v i o u s ( e . g . , B e e r ' s l a w ) , a d d i t i o n a l a \ C C \ ‘ l 1 6 3 c r i t e r i a w e r e c o n s i d e r e d . F i r s t , t h e r e q u i r e d p a r a m e t e r s f o r t h e f u n c t i o n m u s t b e a v a i l a b l e t o t h e e x p e r t s y s t e m v i a a d a t a b a s e o r a u s e r - s u p p l i e d r e s p o n s e . T h e r e f o r e , t h e p a r a m e t e r s m u s t b e w e l l d o c u m e n t e d a n d s h o u l d b e i n f o r m a t i o n a j u n i o r / s e n i o r c o l l e g e c h e m i s t r y s t u d e n t w o u l d k n o w . D u e t o t h e l i m i t e d m a t h e m a t i c a l f e a t u r e s e t o f V P - E x p e r t , t h e f u n c t i o n s s h o u l d n o t b e m a t h e m a t i c a l l y i n t e n s i v e . F i n a l l y , t h e f u n c t i o n s s h o u l d u s e p a r a m e t e r s b a s e d o n f u n c t i o n a l g r o u p p r o p e r t i e s t o m a i n t a i n a h e u r i s t i c a p p r o a c h . T h e s e c o n s i d e r a t i o n s l e d t o s i m p l i f i c a t i o n o f m a n y o f t h e f u n c t i o n s t h a t a r e u s e d . E a c h f u n c t i o n i s d e t a i l e d i n t h e f o l l o w i n g s e c t i o n s . O n c e a n a p p r o p r i a t e r e s p o n s e f u n c t i o n w a s d e t e r m i n e d , i t w a s c o r r e l a t e d t o a p a r t i c u l a r c o n f i d e n c e f a c t o r ( C N F ) . T h e C N F s h o u l d h a v e s e v e r a l f e a t u r e s . T h e C N F s h o u l d h a v e a v a l u e o f 1 0 0 w h e n t h e c o n c e n t r a t i o n s o f t h e s o l u t e s a r e w i t h i n t h e o p t i m u m c o n c e n t r a t i o n r a n g e o f t h e d e t e c t o r . T h e C N F s h o u l d t h e n d e c r e a s e a s t h e c o n c e n t r a t i o n s v a r y f r o m t h i s o p t i m u m r a n g e u n t i l a C N F o f 5 0 ( o r t h e v a l u e o f t h e t r u t h t h r e s h o l d ) w h e n t h e c o n c e n t r a t i o n s a r e b e y o n d t h e l i n e a r o p e r a t i n g r a n g e o f t h e d e t e c t o r . R a t h e r t h a n u s i n g a n a v e r a g e s o l u t e c o n c e n t r a t i o n , i t w a s d e c i d e d t o u s e t h e u p p e r a n d l o w e r c o n c e n t r a t i o n s t o d e t e r m i n e t h e C N F . T h e u s e r m a y n o t k n o w a l l o f t h e c o n c e n t r a t i o n s o f t h e s o l u t e s , b u t m a y h a v e a e s t i m a t i o n o f t h e c o n c e n t r a t i o n r a n g e . T h e m o s t a n d l e a s t c o n c e n t r a t e d s o l u t e s p r o v i d e w o r s t c a s e s c e n a r i o s t o i n s u r e t h a t t h e d e t e c t o r w i l l b e a b l e t o d e t e c t a l l o f t h e s o l u t e s . F i n a l l y , t h e t w o d i f f e r e n t C N F v a l u e s b a s e d o n t h e m o s t a n d l e a s t c o n c e n t r a t e d s o l u t e s m u s t b e c o m b i n e d i n t o a t o t a l C N F v a l u e f o r a l l o f t h e s o l u t e s . A t r a p e z o i d a l f u n c t i o n w a s c h o s e n w h e r e t h e v e r t i c e s o f t h e f u n c t i o n a r e r e l a t e d t o t h e a b s o l u t e m a x i m u m a n d m i n i m u m c o n c e n t r a t i o n s , a n d t y p i c a l m i n i m u m a n d m a x i m u m c o n c e n t r a t i o n s . T h e s e a b s o l u t e c o n c e n t r a t i o n p o i n t s d e f i n e t h e p o i n t a t w h i c h t h e C N F i s 5 0 . T h e a b s o l u t e m a x i m u m a n d m i n i m u m c o n c e n t r a t i o n s “ M a x a n d C m “ ) a r e d e t e r m i n e d b y e i t h e r a c c e s s i n g a d a t a b a s e t o o b t a i n t h e v a l u e s o r b y 1 6 4 c a l c u l a t i n g v a l u e s b a s e d o n t h e m i n i m u m a n d m a x i m u m r e s p o n s e v a l u e s ( R M i n a n d R M a x ) o f t h e d e t e c t o r a n d o n s o l u t e f u n c t i o n a l g r o u p i n f o r m a t i o n . T h e t y p i c a l m i n i m u m a n d m a x i m u m c o n c e n t r a t i o n s , o b t a i n e d f r o m a d a t a b a s e , e s t a b l i s h t h e p l a t e a u r e g i o n t h a t d e f i n e s a c o n c e n t r a t i o n r a n g e i n w h i c h t h e C N F h a s a v a l u e o f 1 0 0 . A l i n e a r e q u a t i o n i s d e r i v e d b e t w e e n t h e C M i n t o t y p i c a l m i n i m u m c o n c e n t r a t i o n p o i n t s a n d a s e c o n d l i n e a r e q u a t i o n i s d e r i v e d f o r t h e c o r r e s p o n d i n g m a x i m u m p o i n t s t o g i v e l i n e a r e q u a t i o n s ( A l a n d A 2 ) . T h e s e e q u a t i o n s a r e u s e d t o c a l c u l a t e a C N F f o r t h e l o w a n d h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f t h e s o l u t e s . F i g u r e 5 . 1 s h o w s a p i c t o r i a l r e p r e s e n t a t i o n o f t h e C N F v e r s u s c o n c e n t r a t i o n r e l a t i o n s h i p . T h i s a p p r o a c h a l l o w s t h e e x p e r t s y s t e m t o a p p l y a C N F a d j u s t m e n t f o r s p e c i e s t h a t a r e n e a r t h e d e t e c t i o n l i m i t o r n e a r t h e n o n - l i n e a r c o n c e n t r a t i o n r a n g e . C N F v a l u e s t h a t a r e b e l o w 5 0 o r a b o v e 1 0 0 a r e a d j u s t e d t o 5 0 a n d 1 0 0 . A f t e r t h e e x p e r t s y s t e m h a s d e t e r m i n e d C N F v a l u e s f o r t h e t w o o u t l i e r c o n c e n t r a t i o n s , t h e e x p e r t s y s t e m c o m b i n e s t h e s e t w o v a l u e s ( C N F L a n d C N F " ) i n t o a t o t a l C N F ( C N F T o t a i ) ' S e v e r a l d i f f e r e n t m e t h o d s c a n b e u s e d t o d e t e r m i n e C N F T o t a l ' T h e f i r s t a p p r o a c h i s t o a v e r a g e t h e l o w ( C L ) a n d h i g h ( C H ) c o n c e n t r a t i o n s a n d t h e n u s e t h e r e l e v a n t A 1 o r A 2 e q u a t i o n t o c a l c u l a t e C N F T o t a l ( E q u a t i o n 5 . 1 ) . A s e c o n d a p p r o a c h i s t o a v e r a g e t h e C N F L a n d C N F H ( E q u a t i o n 5 . 2 ) . F i n a l l y , C N F L a n d C N F H c a n b e c o m b i n e d u s i n g t h e m e t h o d t h a t V P - E x p e r t c o m b i n e s C N F v a l u e s a s s h o w i n E q u a t i o n 5 . 3 . T o d e t e r m i n e e m p i r i c a l l y w h i c h m e t h o d w i l l p r o v i d e t h e d e s i r e d C N F T o t a i ' a s e r i e s o f c a l c u l a t i o n s w a s p e r f o r m e d c o m p a r i n g t h e t h r e e a p p r o a c h e s a b o v e . F i v e d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s w e r e c h o s e n f o r t h e l o w e s t c o n c e n t r a t e d s p e c i e s , d e n o t e d v e r y l o w ( V L ) , l o w ( L ) , m e d i u m ( M ) , h i g h ( H ) , a n d v e r y h i g h ( V T - l ) . T h e v a l u e s o f V I . a n d V B a r e 1 0 % o f t h e t h r e s h o l d c o n c e n t r a t i o n s t h a t g i v e a C N F o f 5 0 a n d 1 0 0 , r e s p e c t i v e l y . I . i s 3 3 % a n d H i s 6 6 % o f t h e c o n c e n t r a t i o n r a n g e t h a t d e l i n e a t e s t h e l i n e a r ( e . g . , A 1 ) 1 6 5 i n c r e a s e f r o m a C N F o f 5 0 t o 1 0 0 . M i s 5 0 % o f t h i s c o n c e n t r a t i o n r a n g e . T h e s a m e s e t o f c o n c e n t r a t i o n s w e r e c h o s e n f o r t h e m o s t c o n c e n t r a t e d s p e c i e s . T h e s e t o f c o n c e n t r a t i o n s c a n b e s e e n g r a p h i c a l l y i n F i g u r e 5 . 2 . C N F T o t a i = A 1 o r A 2 u s i n g [ A v e r a g e ( C L , C H ) ] E q u a t i o n 5 . 1 C N F T o t a l = A v e r a g d C N F L , C N F ” ) E q u a t i o n 5 . 2 T h e e x t r e m e v a l u e s o f V I . a n d V H t e s t t h e e f f e c t o f h a v i n g c o m p o u n d s w h o s e c o n c e n t r a t i o n s h a v e t h e m o s t s i g n i f i c a n t e f f e c t o n C N F T o t a l ' L , M , a n d H a r e t y p i c a l c a s e s w h e r e t h e c o n c e n t r a t i o n i s i m p o r t a n t . C o m b i n a t i o n s o f V L t o V H f o r b o t h t h e C L a n d C H w e r e u s e d t o d e t e r m i n e w h i c h m e t h o d ( E q u a t i o n s 5 . 1 - 5 . 3 ) w o u l d p r o v i d e t h e d e s i r e d C N F T o t a l ' T h e c o n c e n t r a t i o n v a l u e s u s e d f o r t h e t h r e s h o l d s ( A b s o l u t e M i n i m u m / M a x i m u m a n d T y p i c a l M i n i m u m / M a x i m u m ) a r e l , 1 0 , 1 0 0 , a n d 1 0 0 0 0 1 1 M . T h e r e s u l t s o f t h e s e c a l c u l a t i o n s a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 5 . 2 . M e t h o d s 1 - 3 r e f e r t o C N F T o t a l c a l c u l a t i o n s b a s e d o n E q u a t i o n s 5 . 1 - 5 . 3 . 1 6 6 1 0 0 — — l u . E Z : U : 5 0 , i A B C o n c e n t r a t i o n A A b s o l u t e M i n i m u m C o n c e n t r a t i o n , C M i n B T y p i c a l M i n i m u m C o n c e n t r a t i o n C T y p i c a l M a x i m u m C o n c e n t r a t i o n D A b s o l u t e M a x i m u m C o n c e n t r a t i o n , C m x F i g u r e 5 . 1 T r a p e z o i d a l F u n c t i o n f o r t h e C a l c u l a t i o n o f C o n c e n t r a t i o n C o n f i d e n c e F a c t o r s 1 6 7 T h e c o n c l u s i o n w a s t h a t E q u a t i o n 5 . 2 ( a n a v e r a g e o f C N F L a n d C N F H ) p r o v i d e s t h e d e s i r e d e f f e c t . E q u a t i o n s 5 . 1 a n d 5 . 3 g i v e t o o l a r g e a v a l u e f o r C N F T o t a l w h e n C L o r C H i s e i t h e r V H o r V L . O n e d i s a d v a n t a g e t o E q u a t i o n 5 . 2 i s t h a t i t d o e s n o t c o n s i d e r t h e d i s t r i b u t i o n o f a l l o f t h e c o n c e n t r a t i o n s . I n t h e c a s e w h e r e V I . o r V B i s a n o u t l i e r a n d t h e r e s t o f t h e c o n c e n t r a t i o n s o f t h e s o l u t e s a r e w i t h i n t h e l i n e a r r a n g e o f t h e d e t e c t o r , m e t h o d s 1 a n d 3 m a y r e fl e c t t h e m o r e d e s i r e d c o n d i t i o n i n w h i c h o n e c o n c e n t r a t i o n w o u l d n o t l o w e r t h e t o t a l C N F . T h r e e p o i n t s w e r e m a d e t o c o u n t e r t h i s a r g u m e n t : ( 1 ) T y p i c a l l y , c o n c e n t r a t i o n s a r e g o i n g t o b e m o r e e v e n l y d i s t r i b u t e d b e t w e e n t h e h i g h a n d l o w c o n c e n t r a t i o n s , ( 2 ) T h e u s e r m a y n o t k n o w t h e c o n c e n t r a t i o n s o f a l l t h e s p e c i e s t o c a l c u l a t e a n a v e r a g e C , a n d ( 3 ) I f t h e C L o r C H s p e c i e s i s o f i n t e r e s t , t h e n t h e C N F m u s t r e fl e c t t h e d e s i r e t o d e t e c t a l l s p e c i e s o f i n t e r e s t — t h u s , a n o u t l i e r s h o u l d s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e C N F T o t a i ' T h e e x p e r t s y s t e m a l s o a p p l i e s a c o n c e n t r a t i o n t h r e s h o l d . I f C 1 . o r C H i s b e l o w o r a b o v e t h e t h r e s h o l d , t h e e x p e r t s y s t e m i n d i c a t e s t h a t t h e c o n c e n t r a t i o n r a n g e i s i n a p p r o p r i a t e f o r t h e s p e c i f i e d d e t e c t o r . I f C N F L o r C N F H h a s a v a l u e b e l o w t h e t h r e s h o l d , b u t t h e o t h e r o u t l i e r h a s a C N F o f ~ 1 0 0 % , t h e C N F T o t a l m a y b e g r e a t e r t h a n 5 0 % . T h e t h r e s h o l d l i m i t i n s u r e s t h a t t h i s d e t e c t o r s h o u l d n o t b e u s e d ( p r o v i d e d t h a t d i l u t i o n / p r e - c o n c e n t r a t i o n i s n o t a n o p t i o n ) . S . t o F e C C 1 6 8 1 0 0 C N F 5 0 I l C o n c ( u M ) I I 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 F i g u r e 5 . 2 D i f f e r e n t C o n c e n t r a t i o n V a l u e s t o D e t e r m i n e O p t i m u m C N F T o m l C a l c u l a t i o n S e c t i o n 5 . 3 U V - V i s i b l e D e t e c t o r s S e c t i o n 5 . 3 . 1 O v e r v i e w T h i s s e c t i o n d e s c r i b e s t h e c r i t e r i a t h a t m u s t b e m e t b e f o r e t h e e x p e r t s y s t e m i s a b l e t o r e c o m m e n d U V - V i s i b l e d e t e c t o r s . H P L C A d v i s e r f i r s t d e t e r m i n e s t h e d i f f e r e n t t y p e s o f U V - V i s i b l e f u n c t i o n a l g r o u p c h r o m o p h o r e s t h a t a r e p r e s e n t a n d u s e s a d a t a b a s e t o o b t a i n m o l a r a b s o r p t i v i t i e s , 8 , f o r e a c h c h r o m o p h o r e a t s i x d i f f e r e n t w a v e l e n g t h r e g i o n s f r o m 1 9 0 n m t o > 3 2 5 n m . T h e e x p e r t s y s t e m d e t e r m i n e s a n o p t i m u m w a v e l e n g t h a n d u s e s t h e 8 v a l u e s f o r t h a t w a v e l e n g t h t o c a l c u l a t e t h e C N F a n d c o n c e n t r a t i o n t h r e s h o l d s . F i g u r e 5 . 3 p r o v i d e s a n a b b r e v i a t e d fl o w c h a r t o f t h e l o g i c t h a t i s u s e d t o d e t e r m i n e i f U V - V i s i b l e i s a n a p p r o p r i a t e d e t e c t o r . 1 6 9 S e c t i o n 5 . 3 . 2 D e t e r m i n a t i o n o f C h r o m o p h o r e s D u r i n g t h e c o l u m n s e l e c t i o n p r o c e s s t h e e x p e r t s y s t e m d e t e r m i n e s t h e d i f f e r e n t f u n c t i o n a l g r o u p s p r e s e n t o n t h e s o l u t e s . T h e e x p e r t s y s t e m u s e s t h i s i n f o r m a t i o n a n d a s k s a d d i t i o n a l q u e s t i o n s t o d e f i n e f u r t h e r t h e d i f f e r e n t f u n c t i o n a l g r o u p s t h a t a r e p r e s e n t . F o r e x a m p l e , i f t h e u s e r i n d i c a t e d t h a t t h e s a m p l e c o n t a i n s a l i p h a t i c a l d e h y d e s , t h e e x p e r t s y s t e m w i l l q u e r y t h e u s e r t o d e t e r m i n e i f t h e s e a l d e h y d e s a r e c o n j u g a t e d w i t h c a r b o n / c a r b o n d o u b l e o r t r i p l e b o n d s . T h e m o l a r a b s o r p t i v i t i e s o f c o n j u g a t e d a l d e h y d e s a r e d i f f e r e n t t h a n t h a t o f u n c o n j u g a t e d a l d e h y d e s . T h e p o s s i b l e f u n c t i o n a l g r o u p s t h a t t h e e x p e r t s y s t e m c a n a s s i g n a s U V - V i s i b l e c h r o m o p h o r e s a r e l i s t e d i n T a b l e 5 . 3 . T h e a l i p h a t i c a n d a r o m a t i c f o r m s a r e l i s t e d a l o n g w i t h t h e n u m b e r o f c o n j u g a t e d f o r m s ( i f a n y ) o f t h e a l i p h a t i c f o r m o f t h e c h r o m o p h o r e . H P L C A d v i s e r a l s o i n s u r e s t h a t a l l o f t h e s o l u t e s a b s o r b r a d i a t i o n . 1 7 0 T a b l e 5 . 2 D e t e r m i n a t i o n o f t h e O p t i m u m M e t h o d t o C a l c u l a t e t h e C N F b a s e d o n t h e C N F s o f T w o D i f f e r e n t C o n c e n t r a t i o n s C o n c e n t r a t i o n C o m b i n a t i o n s C L C H C N F L C N F H M e t h o d 1 M e t h o d 2 M e t h o d 3 V L , V L 1 . 1 9 0 0 0 5 0 . 5 5 4 . 6 7 7 . 6 5 2 . 6 7 7 . 5 V L , L 1 . 1 6 6 3 3 5 0 . 5 6 6 . 7 8 3 . 6 5 8 . 6 8 3 . 5 V L , M 1 . 1 5 0 5 0 5 0 . 5 7 4 . 8 8 7 . 6 6 2 . 6 8 7 . 5 V L , H 1 . 1 3 4 6 7 5 0 . 5 8 2 . 8 9 1 . 7 6 6 . 7 9 1 . 5 V L , V H 1 . 1 1 1 0 5 0 . 5 9 9 . 9 1 0 0 . 0 7 5 . 2 1 0 0 . 0 L , V L 3 9 0 0 0 6 1 . 1 5 4 . 6 7 7 . 6 5 7 . 8 8 2 . 3 L , L 3 6 6 3 3 6 1 . 1 6 6 . 7 8 3 . 6 6 3 . 9 8 7 . 0 L , M 3 5 0 5 0 6 1 . 1 7 4 . 8 8 7 . 6 6 7 . 9 9 0 . 2 L , H 3 3 4 6 7 6 1 . 1 8 2 . 8 9 1 . 7 7 2 . 0 9 3 . 3 L , V H 3 1 1 0 6 1 . 1 9 9 . 9 1 0 0 . 0 8 0 . 5 1 0 0 . 0 M , V L 5 9 0 0 0 7 2 . 2 5 4 . 6 7 7 . 5 6 3 . 4 8 7 . 4 M , L 5 6 6 3 3 7 2 . 2 6 6 . 7 8 3 . 6 6 9 . 4 9 0 . 7 M , M 5 5 0 5 0 7 2 . 2 7 4 . 8 8 7 . 6 7 3 . 5 9 3 . 0 M , H 5 3 4 6 7 7 2 . 2 8 2 . 8 9 1 . 7 7 7 . 5 9 5 . 2 M , V H 5 1 1 0 7 2 . 2 9 9 . 9 1 0 0 . 0 8 6 . 1 1 0 0 . 0 H , V L 7 9 0 0 0 8 3 . 3 5 4 . 6 7 7 . 5 6 9 . 0 9 2 . 4 H , L 7 6 6 3 3 8 3 . 3 6 6 . 7 8 3 . 6 7 5 . 0 9 4 . 4 H , M 7 5 0 5 0 8 3 . 3 7 4 . 8 8 7 . 6 7 9 . 0 9 5 . 8 H , H 7 3 4 6 7 8 3 . 3 8 2 . 8 9 1 . 7 8 3 . 1 9 7 . 1 H , V B 7 1 1 0 8 3 . 3 9 9 . 9 1 0 0 . 0 9 1 . 6 1 0 0 . 0 V H , V L 9 . 9 9 0 0 0 9 9 . 4 5 4 . 6 7 7 . 5 7 7 . 0 9 9 . 7 V H , L 9 . 9 6 6 3 3 9 9 . 4 6 6 . 7 8 3 . 6 8 3 . 1 9 9 . 8 V H , M 9 . 9 5 0 5 0 9 9 . 4 7 4 . 8 8 7 . 6 8 7 . 1 9 9 . 9 V H , H 9 . 9 3 4 6 7 9 9 . 4 8 2 . 8 9 1 . 6 9 1 . 1 9 9 . 9 V H , V H 9 . 9 1 1 0 9 9 . 4 9 9 . 9 1 0 0 . 0 9 9 . 7 1 0 0 . 0 . 0 - S e a D D a r D c e W S e U a V r c D h B d e F Y e N o W a v e l e F o Y u e s n s t h n g d h a t U a V b I e m e v t e r e l - n a s i g n t t e r m i n V i s i b l e e e e h I F l o w C h a r t t i o s D a e n t e A r m p p r i o n p e r i i f a a t e U V C - h V o i i s c i e b l e D e t e c t o r l 7 l F r o m C o l u m n M o d u l e a n d A d d i t i o n a l U s e r I n p u t C h r o m o p h o r e s F o u n d Y e s C o n c e n t r a t i o n M i n i m u m l M a x i m u m N o O k a y I Y e s A i l S o l u t e s A b s o r b U V - V i s i b l e N o Y e s _ . L _ D i s p l a y R e c o m m e n d a t i o n , C o n c e n t r a t i o n s , C N F f r o m D e t e c t o r D a t a b a s e S h o w T e x t F i l e I n f o r m a t i o n , e t c . \ _ / \ F i g u r e 5 . 3 \ / \ 1 7 2 T a b l e 5 . 3 U V - V i s i b l e C h r o m o p h o r e s A s s i g n e d b y t h e E x p e r t S y s t e m C o n j u g a t e d A l i p h a t i c F o r m A l i p h a t i c F o r m A r o m a t i c F o r m C a r b o x y l i c A c i d s C a r b o x y l i c A c i d s 2 t o > 5 C o n j u g a t e d - N A - B e n z e n e - N A - - N A - 2 t o > 5 F u s e d R i n g s - N A - A l c o h o l s A l c o h o l s - N A - A l d e h y d e s A l d e h y d e s 2 t o > 5 C o n j u g a t e d K e t o n e s K e t o n e s 2 t o > 5 C o n j u g a t e d A m i n e s A m i n e s - N A - C y a n o C y a n o - N A - A l k a n e s - N A - N A - A l k e n e s - N A - 2 t o > 5 C o n j u g a t i o n N i t r o G r o u p s N i t r o G r o u p s - N A - T h i o l s T h i o l s - N A - S e c t i o n 5 . 3 . 3 D e t e r m i n a t i o n o f O p t i m u m W a v e l e n g t h O n c e H P L C A d v i s e r h a s d e t e r m i n e d t h e c h r o m o p h o r e s p r e s e n t , i t a c c e s s e s t h e U V _ V I S . D B F d a t a b a s e w h i c h c o n t a i n s m o l a r a b s o r p t i v i t i e s . T h e s p e c t r a l r e g i o n f r o m 1 9 0 t o 3 2 5 n m i s d i v i d e d i n t o s i x w a v e l e n g t h r e g i o n s . E a c h r e g i o n i s 3 0 n m w i d e a n d c e n t e r e d a t 1 9 0 , 2 2 0 , 2 5 0 , 2 8 0 , 3 1 0 , a n d > 3 2 5 n m . E a c h c h r o m o p h o r e h a s a m o l a r a b s o r p t i v i t y v a l u e , 8 , f o r e a c h w a v e l e n g t h r e g i o n . T h e e x p e r t s y s t e m o b t a i n s t h e m o l a r a b s o r p t i v i t i e s o f e a c h c h r o m o p h o r e a n d a p p l i e s a n e m p i r i c a l o p t i m i z a t i o n f u n c t i o n , E O F ( f o r g O p t i m i z a t i o n f u n c t i o n ) t o e a c h w a v e l e n g t h r e g i o n ( s i x E O F v a l u e s a r e c a l c u l a t e d ) . T h e E O F i s g i v e n i n E q u a t i o n 5 . 4 . A t h r e s h o l d 8 ( S T h r e s h o l d ) d e t e r m i n e s a m i n i m u m m o l a r a b s o r p t i v i t y t h a t w i l l g i v e a s i g n i f i c a n t a b s o r p t i o n . A n y 8 v a l u e s b e l o w t h e 1 7 3 t h r e s h o l d a r e i n c r e m e n t e d b y 1 a b o v e e r h r e s h o l d s o t h a t a l l E O F v a l u e s a r e p o s i t i v e a n d d e f i n e d . I n t h e c a l c u l a t i o n o f E O F , s m a l l e r 8 v a l u e s c o n t r i b u t e m o r e s i g n i f i c a n t l y t h a n l a r g e 8 v a l u e s . T h e E O F v a l u e s r e fl e c t , t h e r e f o r e , t h e i m p o r t a n c e o f t h e m o r e w e a k l y a b s o r b i n g c h r o m o p h o r e s i n d e t e r m i n i n g o p t i m u m w a v e l e n g t h s i n w h i c h a l l o f t h e c h r o m o p h o r e s a b s o r b . A f t e r a n E O F i s c a l c u l a t e d f o r e a c h w a v e l e n g t h r e g i o n , t h e e x p e r t s y s t e m s o r t s t h e E O F v a l u e s f r o m o p t i m u m ( m i n i m u m E O F ) t o w o r s t ( m a x i m u m E O F ) . H P L C A d v i s e r t h e n o b t a i n s t h e m i n i m u m a n d m a x i m u m 8 v a l u e f o r e a c h ( s o r t e d ) w a v e l e n g t h r e g i o n a n d d e t e r m i n e s t h e a b s o l u t e m i n i m u m a n d m a x i m u m c o n c e n t r a t i o n s t h a t c a n b e a n a l y z e d w i t h a p a r t i c u l a r d e t e c t o r ( d e s c r i b e d b e l o w ) . E O F = i [ ( 1 ] 1 5 " a T h r e s h o l d ) n = N u m b e r o f C h r o m o p h o r e s E q u a t i o n 5 . 4 S e c t i o n 5 . 3 . 4 D e t e r m i n a t i o n o f C o n c e n t r a t i o n R a n g e T h e e x p e r t s y s t e m d e t e r m i n e s i f t h e c o n c e n t r a t i o n r a n g e o f t h e s o l u t e s o f a s a m p l e a r e w i t h i n t h e d y n a m i c r a n g e o f t h e d e t e c t o r . I t c a l c u l a t e s a C N F v a l u e t h a t r e fl e c t s t h e c e r t a i n t y t h a t t h e s o l u t e s w i l l b e d e t e c t e d b y a U V - V i s i b l e d e t e c t o r . T h e f i r s t s t e p i n c a l c u l a t i n g t h e m i n i m u m a n d m a x i m u m c o n c e n t r a t i o n s i s t o o b t a i n d e t e c t o r p a r a m e t e r s f r o m t h e D E T E C T O R D B F f i l e . T h i s d a t a b a s e c o n t a i n s i n f o r m a t i o n r e g a r d i n g R M i n a n d R M a x o f d e t e c t o r s , t y p i c a l m i n i m u m a n d m a x i m u m c o n c e n t r a t i o n s , a n d m a n u f a c t u r e r ' s i n f o r m a t i o n ( e . g . , m o d e l n a m e , c o m p a n y ) . B e e r ' s L a w ( A - b S C w i t h a u n i t p a t h l e n g t h a s s u m e d ) i s u s e d t o c a l c u l a t e C M i n a n d C M “ . T h e a b s o r b a n c e , A , i s e i t h e r R M i n a n d R M a x a n d t h e m o l a r a b s o r p t i v i t i e s a r e t h e m i n i m u m a n d m a x i m u m 8 v a l u e s i n t h e w a v e l e n g t h r e g i o n . T h e e x p e r t s y s t e m c o m p a r e s t h e 1 7 4 s o l u t e c o n c e n t r a t i o n s , C L a n d C H ' t o C M i n a n d C M a x ' I f a w a v e l e n g t h r e g i o n h a s 8 v a l u e s t h a t g i v e C i . a n d C H v a l u e s b e t w e e n C M i n a n d C M “ , H P L C A d v i s e r r e c o m m e n d s U V - V i s i b l e d e t e c t o r s . S e c t i o n 5 . 4 F l u o r e s c e n c e D e t e c t o r s S e c t i o n 5 . 4 . 1 O v e r v i e w F l u o r e s c e n c e d e t e c t o r s a r e h i g h l y s e l e c t i v e a n d s e n s i t i v e d e t e c t o r s . B e f o r e r e c o m m e n d i n g fl u o r e s c e n t d e t e c t o r s , t h e e x p e r t s y s t e m m u s t d e t e r m i n e i f a l l s p e c i e s a r e fl u o r e s c e n t a n d i f t h e c o n c e n t r a t i o n s o f t h e s o l u t e s a r e w i t h i n t h e d y n a m i c r a n g e o f t h e d e t e c t o r . T h e e x p e r t s y s t e m u s e s t w o d a t a b a s e s f o r t h i s d e t e r m i n a t i o n . T h e fi r s t d a t a b a s e , F L U O R . D B F , c o n t a i n s t h e s a m e c h r o m o p h o r e s t h a t a r e l i s t e d i n U V - V I S . D B F a n d h a s f i e l d s t h a t i n d i c a t e i f t h e f u n c t i o n a l g r o u p s a r e fl u o r e s c e n t a n d t h e a p p r o x i m a t e q u a n t u m y i e l d o f t h e g r o u p . Q u a n t u m y i e l d s a r e d e p e n d e n t u p o n p H , m o b i l e p h a s e , a n d o t h e r p a r a m e t e r s ; t h e r e f o r e , t h e q u a n t u m y i e l d s a r e a v e r a g e v a l u e s f o r t h e f u n c t i o n a l g r o u p s . T h e s e c o n d d a t a b a s e , D E T E C T O R D B F , p r o v i d e s i n s t r u m e n t a l f i g u r e s o f m e r i t f o r d i f f e r e n t fl u o r e s c e n c e d e t e c t o r s . F i g u r e 5 . 4 s h o w s a n a b b r e v i a t e d p i c t o r i a l r e p r e s e n t a t i o n o f t h e l o g i c u s e d t o a s s i g n a fl u o r e s c e n c e d e t e c t o r . S e c t i o n 5 . 4 . 2 D e t e r m i n a t i o n o f F l u o r o p h o r e s H P L C A d v i s e r u s e s t h e U V - V i s c h r o m o p h o r e s i n f o r m a t i o n f o r t h e fl u o r e s c e n c e d e t e c t o r r u l e s . A d a t a b a s e , F L U O R D B F , c o n t a i n s a f i e l d t h a t i n d i c a t e s i f t h e f u n c t i o n a l g r o u p s a r e fl u o r e s c e n t . T h e e x p e r t s y s t e m d e t e r m i n e s i f t h e s a m p l e c o n t a i n s o t h e r n o n - fl u o r e s c e n t s p e c i e s , s u c h a s p r o t e i n s a n d m e t a l s . S i n c e fl u o r e s c e n c e i s d e p e n d e n t o n t h e m o b i l e p h a s e a n d p H , H P L C A d v i s e r s t o r e s a n y f u n c t i o n a l g r o u p s / s o l u t e s t h a t a r e d e t e r m i n e d t o b e n o n - fl u o r e s c e n t . A f t e r c h e c k i n g t h e c o n c e n t r a t i o n r a n g e s f o r t h e 1 7 5 fl u o r e s c e n t s p e c i e s , H P L C A d v i s e r r e p o r t s w h i c h s p e c i e s a r e n o n - fl u o r e s c e n t . T h i s a l l o w s t h e u s e r t o d e c i d e o n w h e t h e r t o p r e c e d e w i t h u s i n g fl u o r e s c e n c e d e t e c t o r s b a s e d o n a d d i t i o n a l i n f o r m a t i o n n o t a v a i l a b l e t o t h e e x p e r t s y s t e m . S e c t i o n 5 . 4 . 3 D e t e r m i n a t i o n o f C o n c e n t r a t i o n R a n g e a n d C N F T w o d i f f e r e n t e q u a t i o n s l r 2 a r e u s e d t o r e l a t e m i n i m u m / m a x i m u m c o n c e n t r a t i o n w i t h t h e d e t e c t o r r e s p o n s e . E q u a t i o n s 5 . 5 a n d 5 . 6 a r e u s e d t o c a l c u l a t e C M i n a n d C M “ . I n t h e s e e q u a t i o n s , 8 m n a n d 8 M a x a r e t h e m i n i m u m a n d m a x i m u m m o l a r a b s o r p t i v i t i e s d e t e r m i n e d b y t h e U V - V I S r u l e s , a s s u m i n g t h a t t h e o p t i m u m w a v e l e n g t h i s u s e d f o r t h e fl u o r e s c e n t a b s o r p t i o n w a v e l e n g t h . Y M i n i s t h e m i n i m u m q u a n t u m y i e l d . C M i n i s m u l t i p l i e d b y 1 0 t o i n s u r e t h a t g o o d p r e c i s i o n i s o b t a i n e d ( s e e r e f e r e n c e 1 , p a g e 1 0 ) . . 3 C M i n = 2 x 1 0 x 1 0 E q u a t i o n 5 . 5 3 M i n x Y M i n C M a x = 2 3 0 — 5 E q u a t i o n 5 . 6 l 5 M a x U t V o V - r i R s u i l b e e l s N . g i z g t h m N r e s c e n t m e h c g F r D e S t o r f F h l g u t t o o - N l l A r F l u o n t Y 0 3 Y i 2 e ” l % d ; s S e a r c h D a F t l a u b o a r e s s e L a r r t o o e s b D M x p n m i i o n D . l c e u a t , a s e a c s i u a s t e e e a u m m s n ) b F D e ( t e g M . e R e m t c e n t g a s e ] 1 7 6 Y e s h e r S o l u t t h a t a r e N O T F l u o r e s e c e w . N o l D i s p l a y R e c o m m e n d a t i o n , l n f o r r n a t i o n , e t c . S h o w T e x t F i l e w F i g u r e 5 . 4 F l o w C h a r t t o D e t e r m i n e i f a F l u o r e s c e n t D e t e c t o r i s a n A p p r o p r i a t e C h o i c e 1 7 7 S e c t i o n 5 . 5 E l e c t r o c h e m i c a l D e t e c t o r s S e c t i o n 5 . 5 . 1 O v e r v i e w a n d D e t e r m i n a t i o n i f S p e c i e s a r e E l e c t r o c h e m i c a l l y A c t i v e F i g u r e 5 . 5 s h o w s t h e l o g i c t r e e u s e d t o a s s i g n e l e c t r o c h e m i c a l d e t e c t o r s . M u c h o f t h e l o g i c i s s i m i l a r t o t h e d e t e c t o r s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y . H P L C A d v i s e r u s e s a d a t a b a s e , E C H E M . D B F , w h i c h c o n t a i n s r e d u c t i o n p o t e n t i a l s o f f u n c t i o n a l g r o u p s . T h i s d a t a b a s e a l s o i n d i c a t e s i f t h e f u n c t i o n a l g r o u p u n d e r g o e s r e d u c t i o n o r o x i d a t i o n . M o s t H P L C e l e c t r o c h e m i c a l d e t e c t o r s a r e u s e d w i t h r e v e r s e d - p h a s e s o l v e n t s . 3 T h e e x p e r t s y s t e m d o e s n o t e x c l u d e e l e c t r o c h e m i c a l d e t e c t i o n i f r e v e r s e d - p h a s e s o l v e n t s a r e n o t u s e d , b u t i t d o e s p r o v i d e a d d i t i o n a l a d v i c e t o i n f o r m t h e u s e r o f t h e n e c e s s i t y t o a d d a s u p p o r t i n g e l e c t r o l y t e t o t h e m o b i l e p h a s e . S e c t i o n 5 . 5 . 2 D e t e r m i n a t i o n o f C o n c e n t r a t i o n R a n g e T h e e x p e r t s y s t e m u s e s F a r a d a y ’ s L a w ( E q u a t i o n 5 . 7 ) t o d e v e l o p a r e l a t i o n s h i p b e t w e e n c o n c e n t r a t i o n a n d r e s p o n s e . R e a r r a n g e m e n t a n d i n c o r p o r a t i o n o f fl o w r a t e s a n d i n s t r u m e n t a l e f f i c i e n c i e s g i v e E q u a t i o n 5 . 8 . T o s i m p l i f y t h i s e q u a t i o n , a fl o w r a t e o f 5 . 0 m L / m i n a n d a t w o e l e c t r o n t r a n s f e r a r e a s s u m e d . T h i s s h o u l d p r o v i d e a r e a s o n a b l e e s t i m a t e o f C M i n ' T h e m a x i m u m c o n c e n t r a t i o n i s o b t a i n e d f r o m t h e e l e c t r o c h e m i c a l d a t a b a s e . T h e e f f i c i e n c y t e r m ( 5 % ) i s t h e r e d u c t i o n / o x i d a t i o n c o n v e r s i o n e f f i c i e n c y o f . d n . — 7 1 1 1 2 ? ) E q u a t i o n 5 . 7 , = f i r m 1 C M ‘ ” 9 6 5 0 0 x F I O W X n x ( e f fi c i e n c y ) m o s t e l e c t r o c h e m i c a l d e t e c t o r s . 3 E q u a t i o n 5 . 8 S e a r c h E C H E M D a t a b a s e O b t a i n F r o m P r e v i o u s F u n c h o n a l ’ N o W . . . ® G r o u p s - Y e s S t o r e F u n c t i o n a l i s G r o u p s t h a t a r e n o t n — N o E l e c t r o - E l e c t r o c h e m c i a l l y c h e m i c a l l y A c t i v e A c t i v e Y e s C o n c e n t r a t i o n ! E O H E M D a t a b a s e C N F O k a y Y e s ( e . g . , M i n i m u m ! M a x i m u m R e s p o n s e s ) A l l S o l u t e s a r e . N o - Y e s N o R e v e r s e d - P h a s e O k a y Y e s A D i s p l a y I n f o r m a t i o n D i s p l a y W R e c o m m e n d a t i o n , m o b fl e P h i ” I n f o r m a t i o n , e t c . F i g u r e 5 . 5 S h o w T e x t F l o F l o w C h a r t t o D e t e r m i n e i f a n E l e c t r o c h e m i c a l D e t e c t o r i s a n A p p r o p r i a t e C h o i c e 1 7 9 S e c t i o n 5 . 6 A t o m i c S p e c t r o s c o p y D e t e c t o r s S e c t i o n 5 . 6 . 1 O v e r v i e w A t o m i c s p e c t r o s c o p y w a s c h o s e n t o p r o v i d e a d e t e c t o r f o r m e t a l c o n t a i n i n g s o l u t e s . I f t h e s a m p l e c o n t a i n s m e t a l s , t h e e x p e r t s y s t e m a s k 3 t h e u s e r q u e s t i o n s t o d e t e r m i n e i f a s e c o n d d e t e c t o r i s r e q u i r e d . A s e c o n d d e t e c t o r i s n e c e s s a r y i f t h e r e a r e o t h e r n o n - m e t a l s o l u t e s t h a t t h e u s e r w a n t s t o d e t e c t . I f t h e u s e r h a s i n d i c a t e d t h a t t h e s a m p l e n e e d s t o b e r e c o v e r e d , t h e e x p e r t s y s t e m p r o v i d e s a n e x p l a n a t i o n o f t h e u s e o f s p l i t t e r s w h e n u s i n g a d e s t r u c t i v e d e t e c t o r s u c h a s a n a t o m i c s p e c t r o s c o p y d e t e c t o r . S e c t i o n 5 . 6 . 2 D e t e r m i n a t i o n o f C o n c e n t r a t i o n R a n g e T h e d e t e c t i o n l i m i t s f o r m e t a l s b y a t o m i c s p e c t r o s c o p i c t e c h n i q u e s d e p e n d u p o n t h e m e t a l t o b e d e t e r m i n e d a n d t h e t y p e ( e m i s s i o n , a b s o r p t i o n , o r fl u o r e s c e n c e ) o f a t o m i c t e c h n i q u e t h a t i s u s e d . A d d i t i o n a l l y , t h e r e s p o n s e f u n c t i o n f o r t h e s e t e c h n i q u e s d e p e n d s o n t h e s a m p l e m a t r i x , n e b u l i z e r e f f i c i e n c i e s , a n d s o f o r t h . I t w a s d e c i d e d t h a t r a t h e r t h a n u s i n g a r e s p o n s e f u n c t i o n t o d e t e r m i n e C M i n a n d C M a x ' w e w o u l d u s e a t y p i c a l m i n i m u m / m a x i m u m c o n c e n t r a t i o n r a n g e f o r a t o m i c s p e c t r o s c o p i c d e t e c t o r s . T h e s e v a l u e s a r e o b t a i n e d f r o m t h e D E T E C T O R D B F d a t a b a s e f i l e . M e t a l S o l u t e s N o - F l o w C h a r D t e t e o c t D t e o t r e i r s m a n i n e A p i p f r a o n p A i r t a o t m e i c C h S o p i e c c e t r o s c o p y F r o m P r e v i o u s M o d u l e s / R u l e s M y R e c o m m e n d a t i o n l r i o r m a t i o n , e t c . ' Y e s § m » - Y e a D e t e c t o r D a t a b a s e C o n c e n t a t i o n ( e . g . , M i n i m u m ! O k a y M a x i m u m R e s p o n s e s ) Y e s O k a y t o u s e D i s p l a y I n f o r m a t i o n D e s t r u c t i v e N o — d o n U s i n g . S p l i t t e r S W 7 “ F “ D e t e c t o r Y a w D i s p l a y " f o r m a t i o n A l l S a l u t e s o n U s i n g M o r e t h e n m A " N o - - 1 D e t e c t o r t o d e t e c t M T “ F “ t h e N o n - m e t a l s m W D i s p l a y " f o r m a t i o n 8 - o n U s i n g M o r e t h a n p o d - t r o n “ . 4 1 o I I ' 0 ' S h o w T e x t F i l e S p e c i a t i o n D a t a Y ” : w 1 D i s p l a y R e c o m m e n d a t i o n S h o w T e x t F i l e i n f o r m a t i o n , e t c . F i g u r e 5 . 6 1 8 1 S e c t i o n 5 . 7 R e f r a c t i v e I n d e x D e t e c t o r s R e f r a c t i v e I n d e x ( R I ) d e t e c t o r s p r o v i d e a l m o s t u n i v e r s a l d e t e c t i o n , b u t w i t h l o w s e n s i t i v i t y . T h e e x p e r t s y s t e m f i r s t o b t a i n s c o n c e n t r a t i o n r a n g e s f r o m D E T E C T O R D B F a n d u s e s t h e s e c o n c e n t r a t i o n v a l u e s t o d e t e r m i n e i f t h e c o n c e n t r a t i o n s o f t h e s o l u t e s a r e w i t h i n t h e o p e r a t i n g r a n g e o f t h e R I d e t e c t o r . D u e t o t h e l a c k o f s e n s i t i v i t y o f R I d e t e c t o r s , t h e c o n f i d e n c e f a c t o r f o r R 1 d e t e c t o r s w i l l b e i n c r e a s e d i f t h e e x p e r t s y s t e m w a s u n a b l e t o p r o p o s e o t h e r , m o r e s e n s i t i v e , d e t e c t o r s . T h e l o g i c p a t h t h a t t h e e x p e r t s y s t e m u s e s i n a s s i g n i n g R I d e t e c t i o n i s s h o w n i n F i g u r e 5 . 7 . S e c t i o n 5 . 8 C o n d u c t i v i t y D e t e c t o r s S e c t i o n 5 . 8 . 1 O v e r v i e w C o n d u c t i v i t y d e t e c t o r s w i l l b e c o n s i d e r e d i f t h e r e a r e i o n i c s o l u t e s . A d a t a b a s e , C O N D U C T . D B F , c o n t a i n s d i f f e r e n t i o n i c c o m p o u n d s a n d t h e r e s p e c t i v e e q u i v a l e n t i o n i c c o n d u c t a n c e s , A . T h e K v a l u e s a r e u s e d t o c a l c u l a t e C M i n ’ a s d e s c r i b e d b e l o w . T h e l o g i c r e q u i r e d t o a s s i g n c o n d u c t i v i t y d e t e c t o r s i s s h o w n i n F i g u r e 5 . 8 . S e c t i o n 5 . 8 . 2 D e t e r m i n a t i o n o f C o n c e n t r a t i o n R a n g e T h e e x p e r t s y s t e m q u e r i e s t h e u s e r t o d e t e r m i n e w h a t i o n i c s p e c i e s a r e p r e s e n t . I f t h e i o n i c s p e c i e s a r e n o t p r e s e n t i n t h e c o n d u c t i v i t y d e t e c t o r , t h e e x p e r t s y s t e m u s e s a v e r a g e o f t h e K . v a l u e s ( a n i o n i c o r c a t i o n i c ) . T h e r e s p o n s e f u n c t i o n t h a t r e l a t e s c o n c e n t r a t i o n a n d d e t e c t o r r e s p o n s e i s g i v e n b y E q u a t i o n 5 . 9 . 4 I n t h i s e q u a t i o n A G i s t h e c h a n g e i n c o n d u c t a n c e a n d i s o b t a i n e d b y u s i n g t h e v a l u e o f t h e m i n i m u m r e s p o n s e f i e l d f r o m t h e D E T E C T O R D B F d a t a b a s e . K i s t h e c e l l c o n s t a n t . A v a l u e o f 3 3 f o r K ( a t y p i c a l v a l u e f o r c o m m e r c i a l d e t e c t o r s ) 4 i s u s e d f o r t h i s e x p e r t s y s t e m . 1 8 i s t h e e q u i v a l e n t c o n d u c t a n c e o f t h e s a m p l e i o n a n d h e i s t h e e q u i v a l e n t c o n d u c t a n c e f o r t h e 1 8 2 e l u a n t c o u n t e r - i o n . T h e e x p e r t s y s t e m u s e s t h e m a x i m u m 2 . f o r t h e 1 8 v a l u e i n E q u a t i o n 5 . 9 . F o r s i m p l i f i c a t i o n p u r p o s e s , O H ‘ i s a s s u m e d t o b e t h e e l u a n t c o u n t e r - i o n . C m _ _ _ ( A G ) 1 0 0 0 K ( ' 1 3 T 1 e ) E q u a t i o n 5 . 9 D e t C e N c t F o r 1 0 = 0 R 1 5 ' 1 0 “ “ . u e r D e t e C c N o t F r s = o R I 1 8 3 O b t a i n D e t e c t o r P a r a m e t e r s D e t e c t o r D a t a b a s e F i l e Y e s C o n c e n - t r a t i o n O k a y Y e s O t h e r D e t e c t o r s R e c o m - m e n d e d N o Y e s F i g u r e 5 . 7 F l o w C h a r t t o D e t e r m i n e i f a R e f r a c t i v e I n d e x D e t e c t o r i s a n A p p r o p r i a t e C h o i c e F l o w C e h t a e r c t t o D t r o i D s e a t n e r A m p i p n r e o p i r f i a a o C e t n C d h u o c i t c i e v i t y P r e v i o u s I n f o r m a t i o n 1 8 4 U s e r S e l e c t e d O b t a i n I o n s t o b e D e t e c t e d Y e s t o . . . N . _ _ . . Y e s O b t a i n D e t e c t o r P a r a m e t e r s D e t e c t o r D a t a b a s e Y e s O b t a i n S o l u t e C o n d u c t i v i t e s C o n d u c t i v i t y D e t e c t o r Y e s ~ o — ~ . Y e s m L D i s p l a y I n f o r m a t i o n a b o u t R I D e t e c t o r F i g u r e 5 . 8 S h o w T e x t F i l e 1 8 5 S e c t i o n 5 . 9 L i g h t S c a t t e r i n g D e t e c t o r L i g h t s c a t t e r i n g d e t e c t o r s r e q u i r e t h a t t h e s o l u t e s h a v e a s u f f i c i e n t p h y s i c a l s i z e t o s c a t t e r s i g n i f i c a n t l y t h e i n c i d e n t r a d i a t i o n . W h i l e t h e r e s p o n s e f u n c t i o n d e p e n d s u p o n t h e s i z e o f t h e s o l u t e s , m o l e c u l a r w e i g h t i s a g o o d s i z e i n d i c a t o r . S c a t t e r i n g r e s p o n s e f u n c t i o n s a r e q u i t e c o m p l e x a n d i n c o r p o r a t e p a r a m e t e r s t h a t , a m o n g o t h e r s , d e s c r i b e t h e a r r a n g e m e n t ( e . g . , c o i l e d o r l i n e a r ) o f t h e s o l u t e s . 5 T h e e x p e r t s y s t e m f i r s t d e t e r m i n e s a m i n i m u m m o l e c u l a r w e i g h t b a s e d o n R - K C M , w h e r e K i s a c o m p l e x p a r a m e t e r t h a t i n c o r p o r a t e s s u c h p a r a m e t e r s a s s h a p e , R i s t h e d e t e c t o r r e s p o n s e , C i s t h e c o n c e n t r a t i o n , a n d M i s t h e m o l e c u l a r w e i g h t . T h i s f u n c t i o n i s u s e d t o c a l c u l a t e a m i n i m u m m o l e c u l a r w e i g h t r e q u i r e d f o r e f f i c i e n t s c a t t e r i n g . I f t h e s m a l l e s t m o l e c u l a r w e i g h t ( d e t e r m i n e d i n t h e c o l u m n m o d u l e ) i s l a r g e r t h a n t h e m i n i m u m v a l u e , t h e e x p e r t s y s t e m c o m p a r e s t h e s o l u t e c o n c e n t r a t i o n s t o t h e m i n i m u m / m a x i m u m c o n c e n t r a t i o n s t h a t a r e o b t a i n e d f r o m t h e D E T E C T O R D B F f i l e . F i g u r e 5 . 9 s h o w s t h e l o g i c u s e d t o a s s i g n s c a t t e r i n g d e t e c t o r s . 1 8 6 P r e v i o u s N . I n f o r m a t i o n D e t e c t o r D a t a b a s e F i l e Y e s i D i s p l a y I n f o r m a t i o n a b o u t ‘ S h o w T e x t F i l e S c a t t e r D e t e c t o r \ / \ \ _ / \ F i g u r e 5 . 9 F l o w C h a r t t o D e t e r m i n e i f a L i g h t S c a t t e r i n g D e t e c t o r i s a n A p p r o p r i a t e C h o i c e P A R T 2 : R E C O M M E N D A T I O N O F M O B I L E P H A S E T h e m o r e e f f i c i e n t c o m p u t e r s b e c o m e a t i n d u c i n g n e w k n o w l e d g e , t h e m o r e w i d e l y t h a t k n o w l e d g e w i l l b e a p p l i e d , e v e n i n m a t t e r s o f l i f e a n d d e a t h . I t i s e s s e n t i a l t h a t s u c h k n o w l e d g e b e o p e n t o i n s p e c t i o n . T h i s m e a n s t h a t d e s i g n e r s o f l e a r n i n g s y s t e m s h a v e a p u b l i c d u t y t o u s e c o m p r e h e n s i b l e d e s c r i p t i o n l a n g u a g e s — e v e n i f t h a t m e a n s s a c r i f i c i n g p e r f o r m a n c e . O t h e r w i s e w e r u n t h e r i s k o f g e n e r a t i n g t r u l y " u n k n o w a b l e k n o w l e d g e . ” R i c h a r d F o r s y t h M a c h i n e L e a r n i n g f o r E x p e r t S y s t e m s 1 8 7 1 8 8 S e c t i o n 5 . 1 0 O v e r v i e w o f M o b i l e P h a s e S e l e c t i o n T o d e s i g n a s u c c e s s f u l H P L C s e p a r a t i o n , a c o r r e c t m o b i l e p h a s e m u s t b e m a t c h e d t o t h e c h o i c e o f c o l u m n a n d s a m p l e . 6 I t w a s d e c i d e d t h a t H P L C A d v i s e r s h o u l d r e c o m m e n d a s u i t a b l e m o b i l e p h a s e b a s e d u p o n t h e c h o i c e o f c o l u m n a n d s o l u t e ( s ) p r o p e r t i e s . H P L C A d v i s e r w i l l r e c o m m e n d o n l y i n i t i a l m o b i l e p h a s e s a n d t h e u s e r c a n a p p l y a d d i t i o n a l t e c h n i q u e s f o r s o l v e n t o p t i m i z a t i o n . 7 ' 8 S e c t i o n 5 . 1 0 . 1 G o a l s o f t h e M o b i l e P h a s e M o d u l e T h e p r i n c i p a l g o a l o f H P L C A d v i s o r i s t o r e c o m m e n d b o t h t h e m a i n s o l v e n t a n d p o s s i b l e m o b i l e p h a s e m o d i f i e r s . P o s s i b l e c h e m i c a l i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e s o l u t e ( s ) a n d m o b i l e p h a s e , s u c h a s d i p o l a r a n d p r o t o n - d o n a t i n g c h a r a c t e r i s t i c s , a r e u s e d t o d e t e r m i n e t h e s o l v e n t m o d i f i e r s r e c o m m e n d e d b y H P L C A d v i s o r . A s e c o n d a r y g o a l i s t o m i n i m i z e t h e n u m b e r o f q u e s t i o n s a s k e d o f t h e u s e r . M o s t o f t h e r e l e v a n t i n f o r m a t i o n i s o b t a i n e d i n t h e c o l u m n a n d d e t e c t o r m o d u l e s . T h e c u r r e n t v e r s i o n o f t h e m o b i l e p h a s e m o d u l e c o n t a i n s 3 4 m o b i l e p h a s e r u l e s a n d d o e s n o t r e q u i r e a n y a d d i t i o n a l i n p u t f r o m t h e u s e r . T h e r u l e s u s e d f o r r e c o m m e n d i n g t h e s o l v e n t ( s ) a r e d e s c r i b e d b e l o w . A f t e r a m o b i l e p h a s e h a s b e e n r e c o m m e n d e d , H P L C A d v i s e r d e t e r m i n e s i f t h e i n i t i a l l y - r e c o m m e n d e d s o l v e n t s a r e c o m p a t i b l e w i t h t h e r e c o m m e n d e d d e t e c t o r ( s ) . I f a s o l v e n t i s i n c o m p a t i b l e , H P L C A d v i s e r r e c o m m e n d s a n a l t e r n a t i v e s o l v e n t t h a t i s c o m p a t i b l e w i t h t h e d e t e c t o r . S e c t i o n 5 . 1 0 . 2 D a t a b a s e s U s e d b y t h e M o b i l e P h a s e M o d u l e H P L C A d v i s e r m a i n t a i n s r e l e v a n t m o b i l e p h a s e i n f o r m a t i o n i n s e v e r a l d a t a b a s e s . T h i s a l l o w s t h e i n f o r m a t i o n t o b e s t o r e d i n a n e f f i c i e n t f o r m a t s e p a r a t e f r o m t h e 1 8 9 k n o w l e d g e b a s e . T a b l e 5 . 4 p r o v i d e s a l i s t i n g o f t h e d i f f e r e n t d a t a b a s e s a n d t h e f i e l d s / i n f o r m a t i o n c o n t a i n e d i n t h e d a t a b a s e s . ( T h e e x a c t f i e l d n a m e s a r e n o t g i v e n ; r a t h e r , a n e x p a n d e d f o r m o f t h e f i e l d s i s g i v e n i n t h e t a b l e . ) T h e p r i n c i p a l d a t a b a s e u s e d b y H P L C A d v i s o r i s t h e m o b i l e p h a s e d a t a b a s e , M P _ D B E D B F . T h e d i f f e r e n t s o l v e n t s a r e l i s t e d w i t h t h e i r U V - V i s i b l e c u t o f f w a v e l e n g t h s . T h e S O L U B L E f i e l d i n d i c a t e s i f t h e s o l v e n t i s m i s c i b l e w i t h w a t e r , h y d r o c a r b o n s ( h e x a n e ) , o r b o t h . T h e F L U O R E S C E N T f i e l d i n d i c a t e s i f t h e s o l v e n t i s fl u o r e s c e n t . T h e S O L V E N T G R O U P f i e l d i s S n y d e r a n d K i r k l a n d ' s s o l v e n t g r o u p n u m b e r . 6 T h e R E F R A C T I V E I N D E X f i e l d i s p r o v i d e d f o r f u t u r e u s e . T h e S E C _ M P d a t a b a s e c o n t a i n s s o l v e n t s t y p i c a l l y u s e d f o r S i z e E x c l u s i o n C h r o m a t o g r a p h y ( S E C ) . A l l o f t h e f i e l d s i n S E C _ M P p r o v i d e t h e s a m e f u n c t i o n a l i t y a s M P _ D B F . T h e l a s t t h r e e d a t a b a s e s a r e u s e d f o r n o r m a l - p h a s e a d s o r p t i o n c o l u m n s . A d s o r p t i o n e n e r g i e s o f d i f f e r e n t f u n c t i o n a l g r o u p s ( F U N C T I O N A L G R O U P ) o n b o t h S i l i c a a n d A l u m i n a i s c o n t a i n e d i n t h e d a t a b a s e , A B S _ H V . T h i s d a t a b a s e i s u s e d b y t h e c o l u m n m o d u l e o f H P L C A d v i s o r . T h e t w o d a t a b a s e s , S I L I C A a n d A L U M I N A , c o n t a i n a d s o r p t i o n e n e r g i e s o f d i f f e r e n t s o l v e n t s o n t h e r e s p e c t i v e a b s o r b e n t . T h e S O L U B L E f i e l d s c o n t a i n m i s c i b i l i t y i n f o r m a t i o n . S e c t i o n 5 . 1 0 . 3 D e t e c t o r C o m p a t i b i l i t y R u l e s A f t e r t h e i n i t i a l m o b i l e p h a s e i s r e c o m m e n d e d , H P L C A d v i s e r d e t e r m i n e s i f t h e s e m o b i l e p h a s e s a r e c o m p a t i b l e w i t h t h e d i f f e r e n t d e t e c t o r s r e c o m m e n d e d . A l s o , H P L C A d v i s e r d e t e r m i n e s i f t h e s o l v e n t s a r e c o m p a t i b l e w i t h o n l y U V - V i s i b l e a n d fl u o r e s c e n c e d e t e c t o r s . T h e d a t a b a s e s d o n o t c o n t a i n m o b i l e p h a s e s t h a t u n d e r g o e l e c t r o c h e m i c a l r e a c t i o n s ; t h e r e f o r e , t h e e x p e r t s y s t e m d o e s n o t p e r f o r m a c o m p a t i b i l i t y 1 9 0 c h e c k w i t h e l e c t r o c h e m i c a l d e t e c t o r s . T h e l o g i c u s e d i n d e t e r m i n i n g c o m p a t i b i l i t y i s p r e s e n t e d b e l o w a n d s h o w n p i c t o r i a l l y i n F i g u r e 5 . 1 0 . T a b l e 5 . 4 S t r u c t u r e s o f t h e M o b i l e P h a s e D a t a b a s e s u s e d b y H P L C A d v i s e r F i l e F i e l d 1 F i e l d 2 F i e l d 3 F i e l d 4 F i e l d 5 F i e l d 6 M P . D B F S o l v e n t U V C u t o f f S o l u b l e F l u o r e s c e n t R e f r a c t i v e S o l v e n t I n d e x G r o u p S E C - M P S o l v e n t U V C u t o f f S o l u b l e F l u o r e s c e n t R e f r a c t i v e I n d e x S i l i c a A d s o r p t i o n S o l u b l e E n e r g y A l u m i n a A d s o r p t i o n S o l u b l e E n e r g y A b s - H V F u n c t i o n a l A l u m i n a S i l i c a G r o u p R e f r a c t i v e i n d e x ( R I ) a n d l i g h t s c a t t e r i n g d e t e c t o r s m e a s u r e d i f f e r e n c e s i n t r a n s m i s s i o n o f l i g h t t h r o u g h t h e s o l v e n t . T h e m a i n r e q u i r e m e n t o f R I a n d l i g h t s c a t t e r d e t e c t o r s i s t h a t t h e s o l v e n t s d o n o t a b s o r b a s i g n i f i c a n t p o r t i o n o f t h e i n c i d e n t r a d i a t i o n . A n y a d s o r p t i o n i s a d j u s t e d s u c h t h a t t h e o n l y t h e c h a n g e i n l i g h t i n t e n s i t y i s d u e t o r e f r a c t i o n o r s c a t t e r i n g o f t h e i n c i d e n t r a d i a t i o n . T h e s o l v e n t s i n M P - D B F a r e c o m p a t i b l e w i t h t h i s c r i t e r i o n . N e x t , H P L C A d v i s e r o b t a i n s t h e r e l e v a n t s o l v e n t p r o p e r t i e s f r o m t h e M P _ D B F d a t a b a s e . F o r e a c h r e c o m m e n d e d d e t e c t o r , H P L C A d v i s e r i n v o k e s a s p e c i f i c r u l e t h a t d e t e r m i n e s i f t h e m o b i l e p h a s e ( s ) i s c o m p a t i b l e w i t h t h e r e c o m m e n d e d d e t e c t o r . O b I ‘ n P f fi a l o r g r a f d m m f a e ‘ t t i i e l o r g n s m e ] M F P l . u D ( r U o B V e - F s D C u e c t a n o t t f a , b f e a , t s c e . ) l l A 1 9 1 D e t e c t o r - U V - V i s l b l e N o I O b t a i n R e p l a c e m e n t M o d i fi e r i M P . D B F D a t a b a s e M o d i f i e r i s F l u o r e s c e n t D e t e c t o r - F l u o r e s c e n c e O b t a i n R e p l a c e m e n t M o d i f i e r ' e t u m C o m p a t i b l e o d i f i e r F i g u r e 5 . 1 0 M P - D B F D a t a b a s e F l o w C h a r t t o D e t e r m i n e i f M o b i l e P h a s e M o d i f i e r s a r e C o m p a t i b l e w i t h D i f f e r e n t D e t e c t o r s 1 9 2 I f a U V - V i s i b l e d e t e c t o r i s r e c o m m e n d e d , H P L C A d v i s e r c o m p a r e s t h e c u t o f f w a v e l e n g t h , A c u t o f f , f o r t h e m o d i f i e r w i t h t h e o p t i m u m w a v e l e n g t h , 3 . 0 m t h a t t h e d e t e c t o r m o d u l e r e c o m m e n d e d . I f A c u t o f f i s g r e a t e r t h a n ( 1 . 0 m — - 1 5 ) n m , H P L C A d v i s e r o b t a i n s a n a l t e r n a t i v e m o d i f i e r f r o m M P - D B F t h a t i s f r o m t h e s a m e s o l v e n t g r o u p b u t h a s a A c u t o f f t h a t i s a t l e a s t 1 5 n m l e s s t h a n I ‘ O p t ' E i t h e r t h e i n i t i a l r e c o m m e n d e d s o l v e n t o r t h e a l t e r n a t i v e i s p r e s e n t e d a s a v i a b l e m o b i l e p h a s e . I f a fl u o r e s c e n c e d e t e c t o r i s r e c o m m e n d e d , H P L C A d v i s e r a p p l i e s s i m i l a r r u l e s t o o b t a i n a m o b i l e p h a s e t h a t i s n o t fl u o r e s c e n t . E a c h m o d i fi e r i s c h e c k e d f o r c o m p a t i b i l i t y w i t h t h e r e c o m m e n d e d d e t e c t o r s , H P L C A d v i s e r r e p o r t s t h e r e c o m m e n d e d m o b i l e p h a s e t o t h e u s e r . S e c t i o n 5 . 1 1 S e l e c t i o n o f M o b i l e P h a s e s f o r t h e D i f f e r e n t S e p a r a t i o n M o d e s S e c t i o n 5 . 1 1 . 1 O v e r v i e w A s d i s c u s s e d a b o v e , H P L C A d v i s e r r e c o m m e n d s m o b i l e p h a s e s b a s e d u p o n t h e p a r t i c u l a r s e p a r a t i o n m o d e ( e . g . , N o r m a l - P h a s e A d s o r p t i o n ) a n d t h e p r o p e r t i e s o f t h e s o l u t e s w i t h t h e s t a t i o n a r y p h a s e ( e . g . , d i p o l a r i n t e r a c t i o n s ) . R e c o m m e n d a t i o n s o f s o l v e n t s f o r d i f f e r e n t c o l u m n s a n d s e p a r a t i o n m o d e s i s b a s e d u p o n i n f o r m a t i o n f r o m S n y d e r a n d K i r k l a n d . 6 T h e f o l l o w i n g s e c t i o n s d e s c r i b e t h e r u l e s u s e d t o r e c o m m e n d p a r t i c u l a r s o l v e n t s . A b b r e v i a t e d fl o w c h a r t s a r e p r e s e n t e d t o c l a r i f y t h e d e c i s i o n p r o c e s s e s . F r o m z e r o t o t h r e e d i f f e r e n t m o b i l e p h a s e m o d i f i e r s c a n b e r e c o m m e n d e d b y t h e e x p e r t s y s t e m . T h e s e r e c o m m e n d a t i o n s a r e b a s e d u p o n t h e p r e s e n c e o f d i p o l a r , p r o t o n d o n a t i n g , o r p r o t o n a c c e p t i n g c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e s o l u t e s . H P L C A d v i s e r r e p o r t s a l l p o s s i b l e m o d i f i e r s a n d i n d i c a t e s t h a t t h e u s e r c a n u s e a c o m b i n a t i o n o f t h e m a i n 1 9 3 s o l v e n t a n d z e r o t o a l l o f t h e r e c o m m e n d e d m o d i f i e r s . T h e u s e r m u s t p e r f o r m e x p e r i m e n t s a n d u s e s o l v e n t o p t i m i z a t i o n r o u t i n e s , s u c h a s t h o s e d e s c r i b e d i n C h a p t e r 2 , t o d e t e r m i n e w h i c h o f t h e m o d i f i e r s p r o v i d e s t h e d e s i r e d s e p a r a t i o n . S e c t i o n 5 . 1 1 . 2 M o b i l e P h a s e R e c o m m e n d a t i o n s f o r N o r m a l - P h a s e B o n d e d C h r o m a t o g r a p h y F o r n o r m a l - p h a s e b o n d e d c h r o m a t o g r a p h y , H P L C A d v i s e r r e c o m m e n d s a h y d r o c a r b o n , h e x a n e i n p a r t i c u l a r , a s t h e m a i n s o l v e n t . D e p e n d i n g u p o n t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e s o l u t e s p r e s e n t , t h e e x p e r t s y s t e m r e c o m m e n d s d i f f e r e n t p o l a r s o l v e n t m o d i f i e r s . F o r e x a m p l e , p r o t o n - a c c e p t i n g s o l v e n t s a r e r e c o m m e n d e d f o r s o l u t e s t h a t a r e p r o t o n - d o n o r s . T a b l e 5 . 5 l i s t s t h e d i f f e r e n t s o l v e n t m o d i f i e r s a n d s o l v e n t g r o u p n u m b e r s t h a t a r e r e c o m m e n d e d . F i g u r e 5 . 1 1 s h o w s t h e l o g i c fl o w c h a r t f o r n o r m a l - p h a s e b o n d e d c h r o m a t o g r a p h y . T a b l e 5 . 5 M o b i l e P h a s e M o d i f i e r s f o r N o r m a l - P h a s e B o n d e d C h r o m a t o g r a p h y S o l u t e - S t a t i o n a r y P h a s e M o d i f i e r S o l v e n t G r o u p I n t e r a c t i o n s D i p o l e M e t h y l e n e C h l o r i d e 5 P r o t o n D o n o r - i - P r o p y l E t h e r 1 P r o t o n A c c e p t o r C h l o r o f e r m 8 N e Q o n t i n u e D M o d i f i e 0 r . . Y Y e s — s M o d i f i e r = e s — — — s ( M o d i f i e r = ’ 1 3 C o n t i = i . I - C I M . p h n e r . l t . o o p u h y l y l r o e e f e n e t h e r e r m ) . N i L N o e o fi e e r s M o d 1 9 4 o r m a l P h a s B o n d e d Y e s I M a i n S o l v e n t - H e x a n e N o e D e t e c t o r C o m p a t i b i l i t y R u l e s M o d i fi e r C o m p a t i b i l i t y K L C h e c k D i s p l a y C o m e a t i b l e F i g u r e 5 . 1 ] F l o w C h a r t f o r t h e D e t e r m i n a t i o n o f M o b i l e P h a s e M o d i f i e r s f o r N o r m a l - P h a s e B o n d e d C h r o m a t o g r a p h y 1 9 5 S e c t i o n 5 . 1 1 . 3 M o b i l e P h a s e R e c o m m e n d a t i o n s f o r R e v e r s e - P h a s e B o n d e d C h r o m a t o g r a p h y F o r r e v e r s e - p h a s e b o n d e d c h r o m a t o g r a p h y , H P L C A d v i s e r r e c o m m e n d s w a t e r a s t h e m a i n s o l v e n t . D e p e n d i n g u p o n t h e t y p e s o f s o l u t e s p r e s e n t , t h e e x p e r t s y s t e m r e c o m m e n d s d i f f e r e n t m i s c i b l e o r g a n i c m o d i f i e r s . T a b l e 5 . 6 l i s t s t h e p o s s i b l e r e c o m m e n d e d s o l v e n t m o d i f i e r s . F i g u r e 5 . 1 2 s h o w s t h e l o g i c fl o w c h a r t f o r r e v e r s e - p h a s e b o n d e d c h r o m a t o g r a p h y . T a b l e 5 . 6 M o b i l e P h a s e M o d i f i e r s f o r R e v e r s e - P h a s e B o n d e d C h r o m a t o g r a p h y S o l u t e - S t a t i o n a r y P h a s e I n t e r a c t i o n s M o d i f i e r S o l v e n t G r o u p D i p o l e A c e t o n i t r i l e ~ 6 P r o t o n D o n o r T e t r a h y d r o f u r a n 3 P r o t o n A c c e p t o r M e t h a n o l 2 S e c t i o n 5 . 1 1 . 4 M o b i l e P h a s e R e c o m m e n d a t i o n s f o r N o r m a l - P h a s e A d s o r p t i o n C h r o m a t o g r a p h y F o r n o r m a l - p h a s e a d s o r p t i o n c h r o m a t o g r a p h y , H P L C A d v i s e r r e c o m m e n d s h e x a n e a s t h e m a i n s o l v e n t . H P L C A d v i s e r i n f o r m s t h e u s e r t o s e l e c t a m o d i f i e r w h i c h d i s s o l v e s t h e s a m p l e a n d h a s a n a d s o r p t i o n e n e r g y f o r t h e s t a t i o n a r y p h a s e ( e i t h e r s i l i c a o r a l u m i n a ) t h a t i s s l i g h t l y l e s s t h a n t h e l a r g e s t a d s o r p t i o n e n e r g y o f y o u r s o l u t e ( s ) . T h i s v e r s i o n o f H P L C A d v i s e r d o e s n o t r e c o m m e n d t h e m o d i f i e r b e c a u s e t h e c o l u m n s e l e c t i o n m o d u l e u s e s h e u r i s t i c s t o r e c o m m e n d s i l i c a v e r s u s a l u m i n a . F i g u r e 5 . 1 3 s h o w s t h e l o g i c fl o w c h a r t f o r n o r m a l - p h a s e a d s o r p t i o n c h r o m a t o g r a p h y . > " 4 7 . . < 1 9 6 N c ( C o n t i n u e > R e v . P h a s e B o n d e d Y e s I I M a i n S o l v e n t = W a t e r Y e s — e M o d i f i e r = A c e t o n i t r i l e N o 4 « Y e s - fl M o d i f i e r = M e t h a n o l . . l N N o e I Y e s — a M o d i f i e r = T e t r a h y d r o f u r a n D e t e c t o r C o m p a t i b i l i t y R u l e s M o d i f i e r C o m p a t i b i l i t y C h e c k D i s p l a y C o m p a t i b l e f . M o d i f i e r s \ C o n t i n u e D F i g u r e 5 . 1 2 F l o w C h a r t f o r t h e D e t e r m i n a t i o n o f M o b i l e P h a s e M o d i f i e r s f o r R e v e r s e - P h a s e B o n d e d C h r o m a t o g r a p h y S i l i c a / A l u m i n a D a t a b a s e s 1 9 7 N o r m a l P h a s e N o C o n t i n u e A d s . M a i n S o l v e n t a W a t e r ( F u t u r e : M o d i f i e r s D i s p l a y B a s e d o n M o d i f i e r a d s o r p t i o n e n e r g i e s ) w F i g u r e 5 . 1 3 F l o w C h a r t f o r t h e D e t e r m i n a t i o n o f M o b i l e P h a s e M o d i f i e r s f o r N o r m a l - P h a s e A d s o r p t i o n C h r o m a t o g r a p h y 1 9 8 S e c t i o n 5 . 1 1 . 5 M o b i l e P h a s e R e c o m m e n d a t i o n s f o r I o n E x c h a n g e a n d I a n C h r o m a t o g r a p h y F o r i o n e x c h a n g e ( I E C ) a n d i o n c h r o m a t o g r a p h y ( I C ) , H P L C A d v i s e r r e c o m m e n d s w a t e r a n d t e t r a h y d r o f u r a n ( T I - I F ) a s t h e m a i n s o l v e n t f o r r e v e r s e - p h a s e a n d n o r m a l - p h a s e s e p a r a t i o n s r e s p e c t i v e l y . T h e s e t w o s o l v e n t s d i s s o l v e t h e i o n i c s o l u t e s . F i g u r e 5 . 1 4 s h o w s t h e l o g i c fl o w c h a r t f o r t h e s e t w o s e p a r a t i o n m o d e s . T h e e x p e r t s y s t e m t h e n r e c o m m e n d s a p p r o p r i a t e c a t i o n i c o r a n i o n i c c o u n t e r - i o n s t o a d d t o t h e m o b i l e p h a s e . T h e s e p a r a t i o n m e c h a n i s m f o r I E C a n d 1 C i s i o n e x c h a n g e b e t w e e n t h e i o n i c s o l u t e s a n d t h e s o l v e n t i o n s w i t h t h e i o n i c f u n c t i o n a l g r o u p s a t t a c h e d t o t h e s t a t i o n a r y p h a s e . T h e e q u i l i b r i u m f o r a n i o n a n d c a t i o n e x c h a n g e a r e d e p i c t e d i n E q u a t i o n s 5 . 1 0 a n d 5 . 1 1 , w h e r e X i s t h e s o l u t e i o n , R i s t h e s t a t i o n a r y p h a s e i o n i c f u n c t i o n a l g r o u p , a n d Y i s t h e s o l v e n t i o n . X - + R + Y - H Y ’ + R + X ' ( A n i o n E x c h a n g e ) E q u a t i o n 5 . 1 0 X I + R ' Y + H Y + + R ' X + ( C a t i o n E x c h a n g e ) E q u a t i o n 5 . 1 ] H P L C A d v i s e r l i s t s , f r o m w e a k e s t t o s t r o n g e s t s o l v a t i n g s t r e n g t h , t h e d i f f e r e n t c h o i c e s o f t h e s o l v e n t c o u n t e r - i o n , Y . W e a k e r s o l v e n t c o u n t e r - i o n s g i v e l o n g e r r e t e n t i o n t i m e s . T h e u s e r i s i n f o r m e d t o u s e i n i t i a l l y t h e w e a k e s t m o b i l e p h a s e i o n . I f t h e d e s i r e d s e p a r a t i o n i s n o t a c h i e v e d , t h e u s e r i s r e c o m m e n d e d t o u s e t h e n e x t s t r o n g e r s o l v e n t c o u n t e r - i o n . T y p i c a l m o b i l e p h a s e i o n c o n c e n t r a t i o n s a r e 0 . 0 0 1 t o 0 . 5 M o l a r . T a b l e 5 . 7 l i s t s t h e d i f f e r e n t s o l v e n t i o n s t h a t a r e r e c o m m e n d e d . 1 9 9 I E C o r I o n C h r o m . N . M a i n S o l v e n t - N o r m a l R e v e r s e M a i n S o l v e n t s T e t r a h y d r o f u r a n I " P h a s e P h a s e T y p e P h a s e — ’ W a t e r I o n T y p e C a t i o n s A n i o n s D i s p l a y A n i o n i c l D i s p l a y C a t i o n i c M o d i f i e r s / p H ‘ M o d i f i e r s / p H C o n t r o l S h o w T e x t F i l e C o n t r o l A 1 F i g u r e 5 . 1 4 F l o w C h a r t f o r t h e D e t e r m i n a t i o n o f M o b i l e P h a s e M o d i f i e r s f o r I o n E x c h a n g e a n d I o n C h r o m a t o g r a p h y 2 0 0 T a b l e 5 . 7 R e c o m m e n d e d M o b i l e P h a s e l e n s f o r I o n E x c h a n g e a n d I o n C h r o m a t o g r a p h y M o b i l e P h a s e S t r e n g t h M o b i l e P h a s e A n i o n s M o b i l e P h a s e C a t i o n s W e a k e s t H y d r o x y l l i t h i u m A c e t a t e H y d r o g e n F e r m a t e S o d i u m C h l o r i d e A m m o n i u m T h i o c y n a t e P o t a s s i u m N i t r a t e M a g n e s i u m S u l f a t e Z i n c C o p p e r C a l c i u m S t r o n g e s t B a r i u m H P L C A d v i s e r i n f o r m s t h e u s e r o f t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n s a m p l e r e t e n t i o n a n d p H . A s p l - l c h a n g e s , t h e e q u i l i b r i a i n E q u a t i o n s 5 . 1 0 a n d 5 . 1 1 a r e s h i f t e d . F o r a n i o n s e p a r a t i o n s , t h e r e t e n t i o n i n c r e a s e s a s p H i n c r e a s e s s i n c e t h e b a s i c s o l u t i o n w i l l c a u s e i o n i z a t i o n o f t h e s o l u t e ( s ) . F o r c a t i o n s e p a r a t i o n s , t h e r e t e n t i o n i n c r e a s e s a s p H d e c r e a s e s . S e c t i o n 5 . 1 1 . 6 M o b i l e P h a s e R e c o m m e n d a t i o n s f o r S i z e E x c l u s i o n C h r o m a t o g r a p h y M o b i l e p h a s e s i n s i z e e x c l u s i o n c h r o m a t o g r a p h y ( S E C ) a r e n o t a d j u s t e d ; r a t h e r , S E C s o l v e n t s h a v e l o w a n a p p r o p r i a t e m o b i l e p h a s e d i s s o l v e s a l l o f t h e s o l u t e s . v i s c o s i t i e s a t t h e e l e v a t e d t e m p e r a t u r e s o f t e n u s e d f o r t h e s e p a r a t i o n . I n a d d i t i o n , v e r y 2 0 1 p o l a r s o l v e n t s a r e n o t r e c o m m e n d e d f o r S E C c o l u m n s c o m p o s e d o f p o l y s t y r e n e p a c k i n g m a t e r i a l s . 6 F i g u r e 5 . 1 5 s h o w s t h e fl o w c h a r t o f t h e l o g i c u s e d t o r e c o m m e n d a S E C m o b i l e p h a s e . H P L C A d v i s e r u s e s a d a t a b a s e t h a t c o n t a i n s m o b i l e p h a s e s t y p i c a l l y c o m p a t i b l e w i t h S E C c o l u m n s . 6 T h i s d a t a b a s e c o n t a i n s b o t h w a t e r a n d h e x a n e m i s c i b l e s o l v e n t s . H P L C A d v i s e r c h o o s e s a n a p p r o p r i a t e s o l v e n t b a s e d o n s o l u t e s o l u b i l i t y a n d d e t e c t o r c o m p a t i b i l i t y . T h e e x p e r t s y s t e m a l s o s u g g e s t s a n a p p r o p r i a t e i o n i c s t r e n g t h a n d m o b i l e p h a s e p H . S a l t s ( s o l u b l e i n t h e m o b i l e p h a s e ) a r e a d d e d t o t h e m o b i l e p h a s e t o m i n i m i z e a d s o r p t i o n e f f e c t s t h a t c a n o c c u r o n s i l i c a - b a s e d S E C c o l u m n s . N o r m a l l y , t h e i o n i c s t r e n g t h i s b e t w e e n 0 . 0 5 a n d 0 . 1 M o l a r . S i n c e t h e e x a c t e f f e c t o f m o b i l e p h a s e i o n i c s t r e n g t h o n t h e r e t e n t i o n t i m e s i s n o t p r e d i c t a b l e , H P L C A d v i s e r r e c o m m e n d s t h a t t h e u s e r e x p e r i m e n t a l l y d e t e r m i n e t h e o p t i m u m i o n i c s t r e n g t h . A p H o f 2 - 8 i s t y p i c a l l y u s e d t o m i n i m i z e d e g r a d a t i o n o f t h e s t a t i o n a r y p h a s e m a t e r i a l . 6 S e c t i o n 5 . 1 1 . 7 M o b i l e P h a s e R e c o m m e n d a t i o n s f o r I o n - P a i r C h r o m a t o g r a p h y M o b i l e p h a s e s f o r I o n - P a i r C h r o m a t o g r a p h y ( I P C ) c o n t a i n a m a i n s o l v e n t t o w h i c h a c o u n t e r - i o n o f o p p o s i t e c h a r g e t o t h e s o l u t e s i s a d d e d . T h e c o u n t e r - i o n f o r m s a n i o n p a i r w i t h t h e i o n i c s o l u t e s . F o r r e v e r s e - p h a s e c h r o m a t o g r a p h y , t h e i o n p a i r h a s a n i n c r e a s e d a f f i n i t y f o r t h e s t a t i o n a r y p h a s e , w h i l e t h e i o n p a i r h a s a n i n c r e a s e d a f f i n i t y f o r t h e m o b i l e p h a s e i n n o r m a l - p h a s e o p e r a t i o n . T h e f i r s t s t e p i s t h e r e c o m m e n d a t i o n o f t h e a p p r o p r i a t e m a i n s o l v e n t . H P L C A d v i s e r r e c o m m e n d s p e n t a n o l a n d w a t e r f o r n o r m a l - a n d r e v e r s e - p h a s e o p e r a t i o n s , r e s p e c t i v e l y . T h e s e t w o s o l v e n t s p r o v i d e s u i t a b l e s o l u b i l i t y o f t h e i o n - p a i r s a n d a r e c o m p a t i b l e w i t h t h e r e s p e c t i v e c o l u m n p a c k i n g m a t e r i a l s . O t h e r a l c o h o l s h a v e b e e n u s e d f o r N o r m a l - P h a s e I P C . 6 2 0 2 Y e s I S E C _ M P D a t a b a s e O b t a i n P o s s i b l e S o l v e n t s e ( B o t h R e v e r s e d - a n d N o r m a l - P h a s e ) D e t e r m i n e i f C o m p a t i b l e . . w i t h D e t e c t o r s l a C o m p a t i b l r t y R u l e s D i s p l a y R e c o m m e n d a t i o n s ‘ S h o w T e x t F i l e \ _ / ‘ \ \ _ / ‘ \ F i g u r e 5 . 1 5 F l o w C h a r t f o r t h e D e t e r m i n a t i o n o f M o b i l e P h a s e M o d i f i e r s f o r S i z e E x c l u s i o n C h r o m a t o g r a p h y 2 0 3 O r g a n i c m o d i f i e r s c a n a l s o b e a d d e d t o t h e m o b i l e p h a s e t o c o n t r o l t h e s e p a r a t i o n . H P L C A d v i s e r u s e s t h e s a m e r u l e s f o r n o r m a l - p h a s e a n d r e v e r s e - p h a s e b o n d e d c h r o m a t o g r a p h y t o r e c o m m e n d s u i t a b l e o r g a n i c m o d i f i e r s . H P L C A d v i s e r a l s o d i s p l a y s i n f o r m a t i o n t h a t a s s i s t s t h e u s e r i n o p t i m i z i n g t h e s e p a r a t i o n . T h e s e p a r a t i o n i s c o n t r o l l e d v i a t h e a d d i t i o n o f o r g a n i c m o d i f i e r s , c h a n g e s i n t h e c o u n t e r - i o n , a n d p H . F o r t h e d i s t r i b u t i o n o f a n a n i o n i c a n a l y t e i o n , R ' , b e t w e e n t h e a q u e o u s ( i . e . , i o n i c ) a n d i o n p a i r p h a s e s ( E q u a t i o n 5 . 1 2 ) , t h e c a p a c i t y f a c t o r , k ' , i s g i v e n b y E q u a t i o n s 5 . 1 3 a n d 5 . 1 4 . 6 E i s a n e x t r a c t i o n c o n s t a n t ( E q u a t i o n 5 . 1 5 ) . I n t h e s e e q u a t i o n s , X 4 " i s t h e c o u n t e r - i o n , V 8 a n d V m a r e t h e s t a t i o n a r y p h a s e a n d m o b i l e p h a s e v o l u m e s , r e s p e c t i v e l y , C + a n d C - a r e t h e c a t i o n i c / a n i o n i c c o u n t e r - i o n c o n c e n t r a t i o n s , a n d n i s t h e v a l e n c e o f t h e c o u n t e r - i o n . B a s e d u p o n t h e s e e q u i l i b r i a , a n i n c r e a s e i n t h e c o u n t e r - i o n c o n c e n t r a t i o n i n c r e a s e s t h e c a p a c i t y f a c t o r f o r r e v e r s e - p h a s e [ P C a n d d e c r e a s e s t h e c a p a c i t y f a c t o r f o r n o r m a l - p h a s e I P C . R ’ + X + < — ) R ’ X + a q a q 0 ’ 9 E q u a t i o n 5 . 1 2 A q u e o u s 9 I o n P a i r k ' = X I I — [ ‘ 1 - E ( C + ) " ( A n i o n i c s a m p l e s ) E q u a t i o n 5 . 1 3 m 1 V S - n e . . k = - V — - E ( C ) ( C a t i o n i c s a m p l e s ) E q u a t i o n 5 . 1 4 m < R ' X * > . . g _ = _ + E q u a t i o n 5 . 1 5 ( R ) 0 t h l a , 2 0 4 H P L C A d v i s e r p r o v i d e s a d d i t i o n a l i n f o r m a t i o n r e g a r d i n g t h e e f f e c t o f d i f f e r e n t p a r a m e t e r s o n t h e s e p a r a t i o n o f a s a m p l e . S o m e o f t h e s e e f f e c t s a r e l i s t e d i n T a b l e 5 . 8 . F i g u r e 1 6 s h o w s a p i c t o r i a l v e r s i o n o f t h e l o g i c u s e d t o r e c o m m e n d m o b i l e p h a s e s f o r I P C c o l u m n s . T a b l e 5 . 8 E f f e c t s o f D i f f e r e n t M o b i l e P h a s e P a r a m e t e r s o n I P C S e p a r a t i o n s ( R P = R e v e r s e P h a s e N P = N o r m a l P h a s e ) E f f e c t o n S o l v e n t V a r i a b l e E f f e c t o n k ' S e l e c t i v i t y C o u n t e r I o n I n c r e a s e C o n c e n t r a t i o n I n c r e a s e ( R P ) N o E f f e c t D e c r e a s e ( N P ) N o E f f e c t C h a n g e ( I n c r e a s e - C H 2 - ) I n c r e a s e ( R P ) D e c r e a s e ( N P ) I n c r e a s e p H D e c r e a s e ( R P ) L a r g e e f f e c t I n c r e a s e ( N P ) L a r g e E f f e c t O r g a n i c M o d i fi e r I n c r e a s e C o n c e n t r a t i o n D e c r e a s e ( R P ) S m a l l E f f e c t I n c r e a s e ( N P ) S m a l l E f f e c t H P L C A d v i s e r s u g g e s t s a c o u n t e r - i o n c o n c e n t r a t i o n r a n g e o f 0 . 0 0 5 t o 0 . 0 5 M o l a r . T h i s c o n c e n t r a t i o n r a n g e m i n i m i z e s m i c e l l e f o r m a t i o n . F o r e x a m p l e , t h e c r i t i c a l m i c e l l e c o n c e n t r a t i o n , C M C , o f d o d e c y l s u l f a t e a n i o n i s 0 . 0 5 M o l a r . M a n i P S n r t - e e p n t i a c l a v n o L I n A o e c o n e i t - n l “ I . N a C o P r h t i m a o s n l a e s = d P h a s e T y p e ‘ R e P v h e a r s s e e T l M a i n S a W l e e v r o t I A n i n s o ‘ - C u B o t u y n i C t e A h r m l o - m r i o o i n n d e i - I . n = t u t - m 7 C S o u H u l n f e t o N o r e m i a e r i s f O b P h a t o i R a r s e n e M D i s p l a y v o M e d o d i f i r l e s r S e e F i g y D i s p l a P r e v i o u s e s u r . M o d i f i e r 2 0 5 N H . Y e s ® F i g u r e 5 . 1 6 F l o w C h a r t f o r t h e D e t e r m i n a t i o n o f M o b i l e P h a s e M o d i f i e r s f o r I o n - P a i r e d C h r o m a t o g r a p h y P A R T 3 : V A L I D A T I O N S T U D I E S O F D E T E C T O R A N D M O B I L E P H A S E O n t w o o c c a s i o n s I h a v e b e e n a s k e d [ b y m e m b e r s o f p a r l i a m e n t l l , ' P r a y , M r . B a b b a g e , i f y o u p u t i n t o t h e m a c h i n e w r o n g f i g u r e s , w i l l t h e r i g h t a n s w e r s c o m e o u t ? ’ I a m n o t a b l e r i g h t l y t o a p p r e h e n d t h e k i n d o f c o n f u s i o n o f i d e a s t h a t c o u l d p r o v o k e s u c h a q u e s t i o n . C h a r l e s B a b b a g e 2 0 6 2 0 7 S e c t i o n 5 . 1 2 V a l i d a t i o n S t u d i e s o f t h e D e t e c t o r a n d M o b i l e P h a s e M o d u l e s S e v e r a l v a l i d a t i o n s t u d i e s a r e p r e s e n t e d b e l o w t h a t d e t e r m i n e i f H P L C A d v i s o r i s a b l e t o r e c o m m e n d a n a p p r o p r i a t e d e t e c t o r ( s ) a n d m o b i l e p h a s e . S i n c e t h e d e t e c t o r a n d m o b i l e p h a s e m o d u l e s r e q u i r e t h e i n f o r m a t i o n a n d c o n c l u s i o n s t h a t a r e o b t a i n e d f r o m t h e f i r s t m o d u l e , t h e c o l u m n r e c o m m e n d a t i o n s a r e a l s o p r e s e n t e d . S i n c e p r e v i o u s i n f o r m a t i o n i n t h i s d i s s e r t a t i o n h a s d e s c r i b e d t h e p r o c e s s o f v a l i d a t i o n s t u d i e s , t h e s e v a l i d a t i o n s t u d i e s a r e p r e s e n t e d b r i e fl y h e r e . S e c t i o n 5 . 1 2 . 1 P h t h a l a t e V a l i d a t i o n S t u d y T h e f i r s t v a l i d a t i o n c a s e t h a t i s p r e s e n t e d h e r e i s a m i x t u r e o f p h t h l a t e s t h a t i s A l l t e c h ' s s t a n d a r d t e s t m i x t u r e f o r n o r m a l p h a s e c o l u r r m s . T h i s t e s t c a s e w a s c h o s e n s i n c e a r e p r e s e n t a t i v e c h r o m a t o g r a m w a s i n c l u d e d w i t h t h e c o l u m n s . T h e m i x t u r e c o n t a i n e d t h r e e c o m p o u n d s : T o l u e n e , D i e t h y l P h t h a l a t e , a n d D i r n e t h y l P h t h a l a t e . P h y s i c a l a n d c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e s e t h r e e c o m p o u n d s a r e g i v e n i n T a b l e 5 . 9 . T h i s i n f o r m a t i o n , i n a d d i t i o n t o i n f o r m a t i o n p r e s e n t e d b e l o w , w a s u s e d a s t h e i n p u t d a t a f o r t h e v a l i d a t i o n s t u d y o f t h e c o l u m n , d e t e c t o r , a n d m o b i l e p h a s e m o d u l e s o f H P L C A d v i s o r . T h e v e r s i o n o f H P L C A d v i s e r u s e d f o r t h e p r e l i m i n a r y v a l i d a t i o n o f t h i s s a m p l e d i d n o t h a v e a r o m a t i c e s t e r s a s a p o s s i b l e s e l e c t i o n . S i n c e t h e U V - V i s i b l e s p e c t r a o f e s t e r s a r e s i m i l a r t o t h e p a r e n t c a r b o x y l i c a c i d , t h e m o l e c u l e s w e r e d e s c r i b e d a s a r o m a t i c c a r b o x y l i c a c i d s . A s d e s c r i b e d b e l o w , t h i s i n p u t l e d t o t h e r e c o m m e n d a t i o n o f c o l u m n s s u c h a s i o n e x c h a n g e . T o m i n i m i z e t h e s i g n i f i c a n c e o f i o n i c p r o p e r t i e s , H P L C A d v i s e r w a s i n f o r m e d t h a t t h e s p e c i e s c o u l d b e n e u t r a l i z e d a t a p H o f 7 . 0 0 . T h e s p e c i e s w e r e a l s o d e s c r i b e d a s h a v i n g d i f f e r e n c e s i n p o l a r i t y a n d c o n t a i n e d d i f f e r e n t s u b s t i t u e n t s o n t h e a r o m a t i c r i n g ( w i t h a C N F o f 7 0 t o i n d i c a t e t h a t t h e t w o p h t h l a t e s 2 0 8 c o n t a i n e d s i m i l a r f u n c t i o n a l g r o u p s ) . A d d i t i o n a l i n p u t t o H P L C A d v i s e r d e s c r i b e d o t h e r r e l e v a n t i n f o r m a t i o n ( e . g . , t h e a b s e n c e o f f u s e d a r o m a t i c r i n g s ) . T a b l e 5 . 9 P h y s i c a l a n d C h e m i c a l P r o p e r t i e s o f t h e C o m p o n e n t s o f t h e P h t h a l a t e T e s t S a m p l e P r o p e r t y T o l u e n e D i e t h y l P h t h a l a t e D i m e t h y l P h t h a l a t e M o l e c u l a r W e i g h t 9 2 . ] 4 2 2 2 . 2 4 I S I . I I B o i l i n g P o i n t I I I ° c 2 9 8 ° c 2 8 4 ° c S o l u b i l i t y W a t e r 0 . 0 5 % I n s o l u b l e 0 . 4 3 % A l c o h o l S o l u b l e S o l u b l e S o l u b l e B e n z e n e S o l u b l e S o l u b l e S o l u b l e H e x a n e S o l u b l e M o d e r a t e S o l u b l e C o n c e n t r a t i o n ( M ) 0 . 0 1 0 9 0 . 0 0 4 4 0 . 0 0 6 6 2 R e c o m m e n d a t i o n s f r o m H P L C A d v i s e r a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 5 . 1 0 . H P L C A d v i s e r d i d n o t r e c o m m e n d fl u o r e s c e n t d e t e c t o r s s i n c e e s t e r s a r e n o t fl u o r e s c e n t . S c a t t e r d e t e c t o r s a l s o w e r e n o t r e c o m m e n d e d d u e t o t h e s m a l l m o l e c u l a r w e i g h t o f t h e s o l u t e s . E l e c t r o c h e m i c a l d e t e c t o r s w e r e r e c o m m e n d e d w i t h a c o n f i d e n c e f a c t o r b e l o w t h e t r u t h t h r e s h o l d . T h e v e r s i o n o f H P L C A d v i s e r u s e d f o r t h i s v a l i d a t i o n s t u d y d i d n o t p r o v i d e e s t e r s a s a f u n c t i o n a l g r o u p o p t i o n f o r t h e u s e r t o s e l e c t . A s s u c h , a r o m a t i c c a r b o x y l i c a c i d s w e r e s e l e c t e d t o i n d i c a t e t h a t e s t e r s a r e p r e s e n t . S i n c e c a r b o x y l i c a c i d s m a y f o r m i r r e v e r s i b l e S c h i f f B a s e s w i t h t h e a m i n e g r o u p s , H P L C A d v i s e r d i d n o t r e c o m m e n d t h e a m i n e c o l u m n . T h e n e x t v e r s i o n o f H P L C A d v i s e r i n c l u d e d e s t e r s a s a p o s s i b l e s e l e c t i o n . E s t e r s h a v e s i m i l a r m o l a r a b s o r p t i v i t i e s a s t h e p a r e n t c a r b o x y l i c a c i d s ; 9 t h e r e f o r e , t h e m o d i f i c a t i o n s t o t h e k n o w l e d g e b a s e o f H P L C A d v i s o r o n l y 2 0 9 r e q u i r e d t h a t t h e e x p e r t s y s t e m u s e t h e m o l a r a b s o r p t i v i t y d a t a o f t h e c o r r e s p o n d i n g ( a l i p h a t i c o r a r o m a t i c ) c a r b o x y l i c a c i d . T a b l e 5 . 1 0 R e s u l t s o f t h e V a l i d a t i o n S t u d y o f t h e P h t h a l a t e T e s t C a s e C o l u m n D e t e c t o r / M o b i l e P h a s e A R e c o m m e n d a t i o n s N o r m a l P h a s e C y a n o U V - V i s i b l e C N F 1 0 0 H e x a n e 1 7 5 _ 2 0 5 i - p r o p y l e t h e r 2 0 5 - 2 3 5 2 6 5 - 2 9 5 2 9 5 - 3 2 5 g 3 2 5 2 3 5 - 2 6 5 N o r m a l P h a s e A m i n e R e f r a c t i v e I n d e x C N F 6 5 H e x a n e i - p r o p y l e t h e r F i g u r e 5 . 1 7 s h o w s t h e r e s u l t i n g s e p a r a t i o n o f t h e p h t h a l a t e s a m p l e u s i n g a n A l l t e c h E c o n o s i l a m i n e c o l u m n ( 2 5 c m x 4 . 6 m m ) o p e r a t e d i n n o r m a l - p h a s e m o d e u s i n g 1 . 0 0 m L / m i n h e x a n e a s t h e m o b i l e p h a s e . A U V - V i s i b l e d e t e c t o r a t 2 5 0 n m a n d 0 . 0 0 5 a b s o r p t i o n u n i t s f u l l s c a l e w a s u s e d . P e r f o r m a n c e o f t h e c o l u m n w a s s i m i l a r t o t h e t e s t m i x t u r e s c h r o m a t o g r a m p r o v i d e d b y t h e m a n u f a c t u r e r . S e c t i o n 5 . 1 2 . 2 A r o m a t i c V a l i d a t i o n S t u d y T h e s e c o n d v a l i d a t i o n c a s e t h a t i s p r e s e n t e d h e r e i s a m i x t u r e c o n t a i n i n g B e n z a l d e h y d e , B e n z o i c A c i d , a n d p - A m i n o b e n z o i c A c i d . P h y s i c a l a n d c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e s e t h r e e c o m p o u n d s a r e g i v e n i n T a b l e 5 . 1 1 . T h i s i n f o r m a t i o n , i n 2 1 0 a d d i t i o n t o i n f o r m a t i o n p r e s e n t e d b e l o w , w a s u s e d a s t h e i n p u t d a t a f o r t h e v a l i d a t i o n s t u d y o f t h e c o l u m n , d e t e c t o r , a n d m o b i l e p h a s e m o d u l e s o f H P L C A d v i s o r . 1 . 7 1 . 1 . 5 - - 1 . 2 - l 1 . 1 . _ . 0 . 0 0 5 . 0 0 1 0 . 0 ) 1 5 4 ! ) c o m 2 5 . “ ) e a r n : 5 4 ! ) I n a I m h l F i g u r e S J 7 C h r o m a t o g r a p h i c S e p a r a t i o n o f P h t h a l a t e S a m p l e I n a d d i t i o n t o t h e d a t a i n T a b l e 5 . 1 1 , i n p u t f o r H P L C A d v i s e r i n d i c a t e d t h a t t h e s o l u t e s w e r e a r o m a t i c a l d e h y d e s , a m i n e s , a n d c a r b o x y l i c a c i d s a n d t h a t t h e a r o m a t i c r i n g s c o n t a i n d i f f e r e n t f u n c t i o n a l g r o u p s . A p H o f ~ 2 i s r e q u i r e d t o n e u t r a l i z e t h e c a r b o x y l i c a c i d s ( p K a o f 4 . 1 8 9 ) . T h e s o l u t e s w e r e d e s c r i b e d a s b e i n g s o l u b l e i n w a t e r ( C N F o f 8 0 ) a n d h e x a n e . 2 1 1 T a b l e 5 . 1 1 P h y s i c a l a n d C h e m i c a l P r o p e r t i e s o f t h e C o m p o n e n t s o f t h e A r o m a t i c T e s t S a m p l e P r o p e r t y B e n z a l d e h y d e p - A m i n o b e n z o i c B e n z o i c A c i d A c i d M o l e c u l a r W e i g h t 1 0 6 . 1 2 1 3 7 . 1 4 1 2 2 . 1 2 B o i l i n g P o i n t 1 7 8 ° c > 1 8 7 ° c 2 8 4 “ c S o l u b i l i t y W a t e r 0 . 2 9 % 0 . 6 % 2 . 9 % A l c o h o l S o l u b l e S o l u b l e S o l u b l e B e n z e n e S o l u b l e S l i g h t l y S o l u b l e S o l u b l e H e x a n e S o l u b l e S o l u b l e S o l u b l e C o n c e n t r a t i o n ( M ) ~ 1 0 ' 4 ~ 1 0 ’ 4 ~ 1 0 ’ 4 “ B I S ; - N A - > 4 . 2 4 . 1 8 9 H P L C A d v i s e r d e t e r m i n e d t h a t t h e s o l u t e s h a v e p o s s i b l e d i p o l a r i n t e r a c t i o n s w i t h s t a t i o n a r y p h a s e s a n d a l s o h a s p r o t o n - d o n a t i n g g r o u p s . H P L C A d v i s e r i n d i c a t e d t h a t a m i n e c o l u m n s a r e u s e d w h e n t h e r e a r e d i f f e r e n c e s i n p o l a r i t y o f t h e s o l u t e s ; h o w e v e r , H P L C A d v i s e r i n d i c a t e d t h a t S c h i f f B a s e s m a y f o r m w i t h t h e c a r b o x y l i c a c i d s . A d d i t i o n a l r e c o m m e n d a t i o n s f r o m H P L C A d v i s e r a r e i n d i c a t e d i n T a b l e 5 . 1 2 . 2 1 2 T a b l e 5 . 1 2 R e s u l t s o f t h e A r o m a t i c V a l i d a t i o n T e s t C o l u m n M o b i l e P h a s e D e t e c t o r R e v e r s e - P h a s e B o n d e d C N F W a t e r U V - V i s i b l e C N F 1 0 0 9 3 M e t h a n o l R I C N F 6 8 P h e n y l A c e t o n i t r i l e C y a n o A l k y l S i l a n e N o r m a l - P h a s e B o n d e d H e x a n e C N F 8 9 i - P r o p y l E t h e r P h e n y l C y a n o A r o m a t i c C N F 8 0 C o l u m n S p e c i fi c R e v e r s e - P h a s e A n i o n W a t e r E x c h a n g e C N F 7 2 P A R T 4 : C O N C L U S I O N S A N D S U M M A R Y I f y o u f o l l o w r e a s o n f a r e n o u g h i t a l w a y s l e a d s t o c o n c l u s i o n s t h a t a r e c o n t r a r y t o r e a s o n . S a m u e l B u t l e r 2 1 3 2 1 4 S e c t i o n 5 . 1 3 S u m m a r y o f V a l i d a t i o n S t u d i e s D u r i n g t h e v a l i d a t i o n s t u d i e s o f H P L C A d v i s e r , s e v e r a l l i m i t a t i o n s o f V P - E x p e r t ( v e r s i o n 3 . 0 ) b e c a m e a p p a r e n t . T h e m a j o r p r o b l e m i s t h a t V P - E x p e r t d o e s n o t s u p p o r t c o m p l e t e l y s c i e n t i f i c n o t a t i o n . W h i l e i t i s p o s s i b l e t o i n p u t s c i e n t i f i c n o t a t i o n , a n y f u r t h e r c a l c u l a t i o n s b a s e d o n t h e i n p u t i s c o n v e r t e d t o fl o a t i n g p o i n t r e p r e s e n t a t i o n . I n a d d i t i o n V P - E x p e r t h a s a p r e c i s i o n o f 1 p a r t / m i l l i o n . A n y v a l u e s m a l l e r t h a n 1 0 ' 6 i s d i s p l a y e d a s z e r o a n d a n y v a l u e s m a l l e r t h a n 1 0 ’ 1 0 i s t r u n c a t e d t o z e r o . S i n c e m a n y o f t h e c o n c e n t r a t i o n v a l u e s ( b o t h s o l u t e c o n c e n t r a t i o n s a n d t h e c a l c u l a t e d m i n i m u m , m a x i m u m , a n d t y p i c a l c o n c e n t r a t i o n v a l u e s u s e d t o c a l c u l a t e t h e c o n c e n t r a t i o n C N F ) a r e s m a l l e r t h a n t h e s e l i m i t s , V P - E x p e r t r o u n d e d t h e n u m b e r s t o z e r o . T h i s p r e v e n t e d H P L C A d v i s e r f r o m d e t e r m i n i n g c o r r e c t c o n c e n t r a t i o n C N F v a l u e s i n t h a t H P L C A d v i s e r r e p o r t e d t h e c o n f i d e n c e f a c t o r a s e i t h e r 1 0 0 o r 5 0 . A t e m p o r a r y s o l u t i o n h a s b e e n t o m u l t i p l y a l l c o n c e n t r a t i o n s b y s o m e m u l t i p l i e r ( i n t h i s . c a s e , 1 0 6 ) t o c o n v e r t a l l c o n c e n t r a t i o n v a l u e s i n t o m i c r o m o l a r . V P - F x p e r t a l s o d o e s n o t t r a n s f e r s i g n i f i c a n t f i g u r e s c o r r e c t l y w h e n m a t h e m a t i c a l l y m a n i p u l a t i n g t h e s e n u m b e r s . F o r e x a m p l e , i f t h e v a l u e o f s o m e i n p u t , X , i s e q u a l t o 1 x 1 0 ’ 8 a n d s o m e i n t e r i m v a r i a b l e , Y , h a s a v a l u e t h a t i s b a s e d o n X ( s u c h a s Y = X * 1 0 ) , t h e n V P - E x p e r t w i l l r e p o r t t h a t t h e v a l u e o f Y i s z e r o ( s i n c e X i s c o n v e r t e d t o fl o a t i n g p o i n t f i r s t a n d V P - E x p e r t t r u n c a t e s t h e v a l u e o f 1 x 1 0 ' 7 t o z e r o ) . V P - E x p e r t a l s o h a s p r o b l e m s w i t h m e m o r y m a n a g e m e n t . O n c e a k n o w l e d g e b a s e e x c e e d s a p p r o x i m a t e l y 7 0 K B i n s i z e , m a n y o f t h e f e a t u r e s o f V P - E x p e r t b e c a m e u n s t a b l e a n d l e a d t o t h e s y s t e m c r a s h i n g . T h i s n e c e s s i t a t e d d i s a b l i n g t h e s e f e a t u r e s ( e . g . , R E P O R T f e a t u r e , T R A C E S , a n d s o f o r t h ) . S i n c e V P - E x p e r t i s i n t e n d e d t o b e u s e d a s a t e a c h i n g t o o l , t h e l a c k o f t h e s e f e a t u r e s m i n i m i z e s t h e a b i l i t y o f t h e s t u d e n t t o s e e t h e l o g i c u s e d i n a s s i g n i n g a r e c o m m e n d a t i o n . O f c o u r s e , t h i s e x a c e r b a t e d t h e p r o b l e m o f d e b u g g i n g t h e e x p e r t s y s t e m . 2 1 5 I n g e n e r a l , H P L C A d v i s o r i s a b l e t o r e c o m m e n d a l o g i c a l d e t e c t o r a n d m o b i l e p h a s e . Q u i t e a f e w p r o b l e m s a r o s e w h e n H P L C A d v i s e r w o u l d a c c e s s a p p r o p r i a t e d a t a b a s e s t o d e t e r m i n e d e t e c t o r a n d m o b i l e p h a s e p a r a m e t e r s . M o s t o f t h e s e l i m i t a t i o n s a r e b a s e d o n t h e a b o v e d e s c r i b e d m a t h e m a t i c a l l i m i t a t i o n s o f V P - E x p e r t . V a l i d a t i o n s t u d i e s d u r i n g t h e d e v e l o p m e n t o f H P L C A d v i s e r d e m o n s t r a t e t h a t H P L C A d v i s o r i s a b l e t o r e c o m m e n d a n a p p r o p r i a t e d e t e c t o r a n d t o r e c o m m e n d a C N F v a l u e b a s e d o n t h e c o n c e n t r a t i o n s o f t h e s o l u t e s . T h e s e i n t e r m e d i a t e v a l i d a t i o n s t u d i e s u s e d v e r y l a r g e c o n c e n t r a t i o n s s u c h t h a t t h e m a t h e m a t i c a l l i m i t a t i o n s d e s c r i b e d a b o v e w e r e n o t a c o n s i d e r a t i o n . T h e l o g i c o f t h e k n o w l e d g e b a s e s i s c o n s i s t e n t F u r t h e r d e v e l o p m e n t o f t h i s e x p e r t s y s t e m s h o u l d b e a c c o m p l i s h e d u s i n g e i t h e r a n e w e r v e r s i o n o f V P - E x p e r t ( w h e n i t b e c o m e s a v a i l a b l e ) o r p o r t e d t o a n e w e r o p e r a t i n g s y s t e m a n d i n f e r e n c e e n g i n e . T h e b e s t r e c o u r s e w o u l d b e t o u s e o n e o f t h e n e w e r W i n d o w s - b a s e d e x p e r t s y s t e m s . T h i s w o u l d a l l o w f u l l u s a g e o f a v a i l a b l e m e m o r y , a c c u r a t e m a n i p u l a t i o n o f n u m b e r s , a n d b e t t e r s u p p o r t o f m o d e r n d a t a b a s e s a n d s p r e a d s h e e t s . L I S T O F R E F E R E N C E S L I S T O F R E F E R E N C E S J . D . I n g l e a n d S . R . C r o u c h , S p e c t r o c h e m i c a l A n a l y s i s , P r e n t i c e H a l l , N e w J e r s e y , 1 9 8 8 , 4 6 0 . D . A . S k o o g , P r i n c i p l e s o f I n s t r u m e n t a l A n a l y s i s 3 ' " I e d . , S a u n d e r s C o l l e g e P u b l i s h i n g , N e w Y o r k , 1 9 8 5 , 2 3 5 . P . T . K i s s i n g e r ' E l e c t r o c h e m i c a l D e t e c t o r s ' i n L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y D e t e c t o r s , T . M . V i c k r e y , e d . , V o l . 2 3 , M a r c e l D e k k e r , I n c . , N . Y . , 1 9 8 3 , 1 2 5 . E . S . Y e u n g , C h a p t e r 9 o f D e t e c t o r s f o r L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y , W i l e y - l n s t e r s c i e n c e , N . Y . , v o l . 8 9 , 1 9 8 6 , 3 3 1 . P . J . W y a t t , A n a l . C h i m . A c t a . , 2 7 2 , 1 9 9 3 , 1 . L R . S n y d e r a n d J . J . K i r k l a n d , I n t r o d u c t i o n t o M o d e r n L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y , 2 n d e d . , W i l e y - I n t e r s c i e n c e , N . Y . , 1 9 7 9 . J . C . B e r r i d g e T e c h n i q u e s f o r t h e A u t o m a t e d O p t i m i z a t i o n o f H P L C S e p a r a t i o n s , J o h n W i l e y a n d S o n s , N e w Y o r k ( 1 9 8 5 ) . L . R . S n y d e r , J . W . D o l a n , a n d D . C . L o m m e n , J . C h r o m a t o g r . , 4 8 5 ( 1 9 8 9 ) 6 5 . R . M . S i l v e r s t e i n , G . C . B a s s l e r , a n d T . C . M e r r i l l , S p e c t r o m e t r i c I d e n t i fi c a t i o n o f O r g a n i c C o m p o u n d s , 4 t h e d . , J o h n W i l e y a n d S o n s , N e w Y o r k 1 9 8 1 . 2 1 6 C H A P T E R 6 A U T O M A T I O N O F T H E H I G H - P E R F O R M A N C E L I Q U I D C H R O M A T O G R A P H Y S Y S T E M I N S T R U M E N T A t o o l i s b u t t h e e x t e n s i o n o f a m a n ' s h a n d , a n d a m a c h i n e i s b u t a c o m p l e x t o o l . H e t h a t i n v e n t s a m a c h i n e a u g m e n t s t h e p o w e r o f m a n a n d t h e w e l l - b e i n g o f m a n k i n d . H e n r y W a r d B e e c h e r S e c t i o n 6 . 1 I n t r o d u c t i o n I n s t r u m e n t a t i o n h a s b e c o m e i n c r e a s i n g l y m o r e c o m p l e x a n d , i n s o m e c a s e s , m o r e d i f fi c u l t t o u s e . A l o n g w i t h a n i n c r e a s e i n t h e c o m p l e x i t y o f i n s t r u m e n t a t i o n , t h e n u m b e r o f t e c h n i c a l l y t r a i n e d p e o p l e t o o p e r a t e i n s t r u m e n t s h a s d e c r e a s e d . T h e s e t w o f a c t o r s a r e a m o n g t h o s e t h a t h a v e l e d t o t h e d e v e l o p m e n t o f a u t o m a t e d i n s t r u m e n t a t i o n . T h e n e x t e v o l u t i o n a r y p h a s e o f i n s t r u m e n t a t i o n i s t o w a r d s t h e i n t r o d u c t i o n o f i n t e l l i g e n c e i n t o a u t o m a t e d i n s t r u m e n t a l r z r 3 I n t e l l i g e n t i n s t r u m e n t a t i o n c a n m o n i t o r a n d d i a g n o s e i t s e l f a n d c a n a l l e v i a t e t h e c o m p l e x i t y o f u s i n g t h e i n s t r u m e n t b y a s s i s t i n g t h e u s e r i n c h o o s i n g t h e a p p r o p r i a t e c o u r s e ( s ) o f a c t i o n ( s ) . T h i s c h a p t e r d e s c r i b e s t h e i n i t i a l s t a g e i n a u t o m a t i n g t h e H i g h P e r f o r m a n c e L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y ( H P L C ) i n s t r u m e n t a t i o n . T h e i n t e l l i g e n c e c o m p o n e n t e x i s t s i n t h e f o r m o f t h e s t a n d - a l o n e e x p e r t s y s t e m d e s c r i b e d i n t h e C h a p t e r s 4 a n d 5 o f t h i s d i s s e r t a t i o n . A u t o m a t i o n h a s b e e n a c c o m p l i s h e d b y c r e a t i n g s o f t w a r e a n d h a r d w a r e t o a s s i s t t h e u s e r i n o p e r a t i n g a n H P L C i n s t r u m e n t . M u c h o f t h e w o r k d e s c r i b e d i n t h i s c h a p t e r i s i n t h e p r o t o t y p e s t a g e ; h o w e v e r , i t d o e s s h o w t h e u t i l i t y o f a u t o m a t i o n . 2 1 7 c o l u n e i t h e r S e l e c t a n d s P r e l i r r d e s c r i i n s t r u 2 1 8 M o s t o f t h e f o c u s o f t h i s p a r t o f t h e p r o j e c t h a s b e e n t h e a u t o m a t i o n o f t h e c o l u m n s e l e c t i o n p a r t o f t h e e x p e r t s y s t e m . T h e d e t e c t o r s u s e d i n t h i s r e s e a r c h a r e e i t h e r u n d e r i n d e p e n d e n t c o m p u t e r c o n t r o l o r a r e n o t a m e n a b l e t o a u t o m a t i o n . S e l e c t i o n o f m o b i l e p h a s e r e q u i r e s m a n u a l m a n i p u l a t i o n s u c h a s f i l t e r i n g , s p a r g i n g , p r i m i n g t h e p u m p , a n d u s i n g i n t e r m e d i a t e m o b i l e p h a s e s w h e n a n e w m o b i l e p h a s e i s i m m i s c i b l e w i t h a p r e v i o u s m o b i l e p h a s e . T h i s c h a p t e r i s d i v i d e d i n t o t h r e e p a r t s . T h e f i r s t p a r t d e s c r i b e s t h e h a r d w a r e a n d s o f t w a r e u s e d t o a u t o m a t e t h e H P L C i n s t r u m e n t . T h e s e c o n d p a r t d e s c r i b e s p r e l i m i n a r y a p p l i c a t i o n s o f t h e c o n t r o l l e r s o f t w a r e f o r H P L C s e p a r a t i o n s . T h e f i n a l p a r t d e s c r i b e s c o n c l u s i o n s r e a c h e d d u r i n g t h e d e v e l o p m e n t o f t h e a u t o m a t e d H P L C i n s t r u m e n t . P A R T I : H A R D W A R E A N D S O F T W A R E U S E D F O R A U T O M A T I O N T o m e , t h e r e i s s o m e t h i n g s u p e r b l y s y m b o l i c i n t h e f a c t t h a t a n a s t r o n a u t , s e n t u p a s a s s i s t a n t t o a s e r i e s o f c o m p u t e r s , f o u n d t h a t h e w o r k e d m o r e a c c u r a t e l y a n d m o r e i n t e l l i g e n t l y t h a n t h e y . I n s i d e t h e c a p s u l e , m a n i s s t i l l i n c h a r g e . A d l a i E S t e v e n s o n 2 1 9 2 2 0 S e c t i o n 6 . 2 I n i t i a l C o n t r o l l e r S o f t w a r e S e c t i o n 6 . 2 . 1 O b j e c t i v e s T h e i n i t i a l o b j e c t i v e s o f t h e s o f t w a r e t h a t w a s d e v e l o p e d t o c o n t r o l t h e H P L C i n s t r u m e n t w e r e r e l a t i v e l y s i m p l e . T h e c o n t r o l l e r p r o g r a m a c q u i r e d d a t a f r o m t h e H P L C U V - V i s i b l e d e t e c t o r a n d p r o v i d e d s i m p l e c o n t r o l o f t w o s i x - p o r t v a l v e s . T h e c o n t r o l o f t h e v a l v e s a l l o w e d t h e s t u d y o f t h e a p p l i c a t i o n o f r e c y c l e h e a r t c u t c h r o m a t o g r a p h y ( l u r e ) . 4 I t w a s e n v i s i o n e d t h a t t h e s o f t w a r e w o u l d d e v e l o p i n t o a c o n t r o l l e r p r o g r a m t h a t w o u l d m o n i t o r m u l t i p l e d e t e c t o r s , c h a n g e m u l t i p l e v a l v e c o n f i g u r a t i o n s , p r o g r a m t h e H P L C s o l v e n t d e l i v e r y s y s t e m , a n d s o f o r t h , a s s e e n i n F i g u r e 6 . 1 . A n e x p e r t s y s t e m , a s d e s c r i b e d i n C h a p t e r s 4 a n d 5 , w o u l d a s s i s t i n d e v e l o p i n g a m e t h o d t h a t t h e c o n t r o l l e r w o u l d i m p l e m e n t . B e c a u s e t h e s o f t w a r e w o u l d b e c o n t r o l l i n g m u l t i p l e c o m p o n e n t s , t h e d a t a a c q u i s i t i o n p r o c e s s s h o u l d r e l y a s l i t t l e a s p o s s i b l e o n t h e c e n t r a l p r o c e s s i n g u n i t ( C P U ) . T h e s e t w o o b j e c t i v e s a r e d e s c r i b e d i n t h e f o l l o w i n g t w o s e c t i o n s . D a t a f r o m t h e R H C e x p e r i m e n t s a r e a l s o p r e s e n t e d t o d e m o n s t r a t e t h e a b i l i t y o f t h e s o f t w a r e t o s w i t c h v a l v e s . S e c t i o n 6 . 2 . 2 D a t a A c q u i s i t i o n D a t a a c q u i s i t i o n t e c h n i q u e s t y p i c a l l y i n v o l v e t h e f o l l o w i n g s t e p s . A f t e r s o m e e v e n t i n i t i a t e s t h e a c q u i s i t i o n p r o c e s s , t h e a c q u i s i t i o n h a r d w a r e s a m p l e s a n d d i g i t i z e s t h e s a m p l e . T h e h a r d w a r e s i g n a l s t o t h e s o f t w a r e ( o r o t h e r h a r d w a r e ) t h a t a n a n a l o g t o d i g i t a l c o n v e r s i o n h a s o c c u r r e d . T h e s o f t w a r e a n d h a r d w a r e m u s t r e a d a n d s t o r e t h e 2 2 1 W a r e ' P r e s s u r e R e s t r i c t o r W a s t e - , " " " ' « @ C S V ( 5 C o l u m n s / 1 B y P a s e L i n e ) ( _ _ _ — C o m p u t e r C o n t r o l l e r E x p e r t S y s t e m _ _ _ — _ _ _ ) S o f t w a r e H ' s - s a u t e R e s t r i c t o r F i g u r e 6 . 1 E n v i s i o n e d S y s t e m I n v o l v i n g M u l t i p l e D e t e c t o r s a n d V a l v e s U n d e r C o m p u t e r C o n t r o l d i g i t i z e d v a l u e i n a n a p p r o p r i a t e m e m o r y l o c a t i o n . T h e a c q u i s i t i o n h a r d w a r e i s r e - s e t a n d w a i t s f o r t h e n e x t e v e n t t h a t w i l l r e - i n i t i a t e t h e a c q u i s i t i o n p r o c e s s . T h e e v e n t t h a t i n i t i a t e s t h e a c q u i s i t i o n c a n b e a s o f t w a r e c o m m a n d t h a t i n s t r u c t s a s i g n a l t o b e a c q u i r e d . M o r e o f t e n , s o m e r e p e t i t i v e s i g n a l , s u c h a s a h i g h p r e c i s i o n c l o c k , i s u s e d t o a c q u i r e t h e d a t a a t s o m e f i x e d f r e q u e n c y . D a t a a c q u i s i t i o n c a n b e s u b - d i v i d e d i n t o t h r e e t y p e s : s o f t w a r e d r i v e n , i n t e r r u p t d r i v e n , a n d d i r e c t m e m o r y a d d r e s s d r i v e n . T h e s e s u b - d i v i s i o n s a r e b a s e d o n t h e m a n n e r i n w h i c h t h e a c q u i s i t i o n h a r d w a r e s i g n a l s t h e e n d o f a c o n v e r s i o n a n d o n t h e m e t h o d t h a t i s u s e d t o m o v e t h e d i g i t i z e d s i g n a l t o m e m o r y . 2 2 2 I n s o f t w a r e d r i v e n a c q u i s i t i o n , a n e v e n t , s u c h a s a s o f t w a r e c o m m a n d o r a c l o c k s i g n a l , i n i t i a t e s t h e d a t a a c q u i s i t i o n ( v i d e i n f r a ) . T h e s o f t w a r e m o n i t o r s t h e s t a t u s o f t h e a n a l o g t o d i g i t a l c o n v e r s i o n ( A D C ) . O n c e t h e c o n v e r s i o n i s c o m p l e t e d , t h e s o f t w a r e r e a d s t h e d i g i t i z e d v a l u e a n d s t o r e s i t i n a n a p p r o p r i a t e m e m o r y l o c a t i o n , s u c h a s R a n d o m A c c e s s M e m o r y ( R A M ) o r o n t h e h a r d d i s k . S o f t w a r e d r i v e n a c q u i s i t i o n i s s i m p l e t o i m p l e m e n t a n d a l l o w s t h e a c q u i s i t i o n o f l a r g e a m o u n t s o f d a t a ( l i m i t e d o n l y b y t h e a v a i l a b l e a m o u n t o f R A M o r h a r d d i s k s p a c e ) . T h e c e n t r a l p r o c e s s i n g u n i t ( C P U ) , h o w e v e r , m u s t d e v o t e v a l u a b l e c l o c k c y c l e s t o s e n d o u t t h e a p p r o p r i a t e c o n t r o l s t o t h e d a t a a c q u i s i t i o n b o a r d a n d s t o r e t h e s i g n a l s . D u r i n g t h e s e a c q u i s i t i o n t i m e s , t h e C P U c a n n o t p r o c e s s o t h e r e v e n t s ( e . g . , v a l v e c h a n g e s , m o n i t o r i n g t h e s t a t u s o f t h e H P L C r u n ) . S o f t w a r e d r i v e n a c q u i s i t i o n i s a l s o t h e s l o w e s t m e t h o d t o o b t a i n d a t a . I n t e r r u p t - d r i v e n d a t a a c q u i s i t i o n i s a s e c o n d a p p r o a c h t h a t c a n b e t a k e n . T h e R T T 8 0 0 / 8 1 5 d a t a a c q u i s i t i o n b o a r d u s e d i n t h i s w o r k ( s e e C h a p t e r 3 ) c a n b e p r o g r a m m e d t o c a u s e a n I n t e r r u p t R e q u e s t ( I R Q ) w h e n e v e r a c o n v e r s i o n h a s o c c u r r e d . A n I R Q s e r v i c e r o u t i n e c a n b e w r i t t e n t o r e a d t h e d i g i t i z e d v a l u e f r o m t h e R T 1 b o a r d , c o n v e r t t h e v a l u e f r o m t w o 8 b y t e v a l u e s ( a h i g h a n d l o w b y t e r e p r e s e n t a t i o n , v i d e i n f r a ) i n t o a n u m b e r , a n d s t o r e t h e d a t a i n t h e d e s i r e d m e m o r y l o c a t i o n . W i t h i n t e r r u p t - d r i v e n d a t a a c q u i s i t i o n , t h e C P U d o e s n o t h a v e t o p o l l c o n t i n u o u s l y t h e s t a t u s o f t h e a n a l o g t o d i g i t a l c o n v e r t e r ; t h e C P U i s i n v o l v e d w i t h t h e a c q u i s i t i o n p r o c e s s o n l y w h e n t h e c o n v e r s i o n h a s o c c u r r e d . T h i s p r o c e s s r e s u l t s i n f a s t e r a c q u i s i t i o n s , a n d a m o r e e f fi c i e n t u t i l i z a t i o n o f t h e C P U f o r o t h e r p r o c e s s e s s u c h a s v a l v e c h a n g e s . H o w e v e r , t h e C P U i s s t i l l i n v o l v e d i n t h e p r o c e s s o f h a n d l i n g t h e I R Q s e r v i c e a n d s t o r i n g t h e d a t a . W h i l e I R Q s e r v i c e w a s n o t u s e d f o r t h e a c q u i s i t i o n , a n I R Q s e r v i c e w a s w r i t t e n t o a c q u i r e s e q u e n t i a l l y d a t a f r o m m u l t i p l e d e t e c t o r s . T h i s I R Q s e r v i c e i s d e s c r i b e d i n S e c t i o n 6 . 4 . A f t e r c o n s i d e r i n g t h e a d v a n t a g e s a n d d i s a d v a n t a g e s o f t h e t w o d a t a a c q u i s i t i o n a p p r o a c h e s m e n t i o n e d , t h e d e c i s i o n w a s m a d e t o u s e t h e t h i r d a p p r o a c h , d i r e c t m e m o r y 2 2 3 a d d r e s s i n g ( D M A ) . T y p i c a l l y , D M A i s u s e d f o r h i g h s p e e d a c q u i s i t i o n . W h i l e t h e a c q u i s i t i o n r a t e s u s e d i n a c q u i r i n g t y p i c a l H P L C d a t a d o n o t n e c e s s a r i l y r e q u i r e t h e s p e e d a d v a n t a g e s o f D M A , D M A p r o v i d e s a s e c o n d a d v a n t a g e . T h e t w o p r e v i o u s t e c h n i q u e s ( s o f t w a r e a n d i n t e r r u p t d r i v e n a c q u i s i t i o n ) r e q u i r e t h a t t h e C P U b e i n v o l v e d i n t h e a c q u i s i t i o n p r o c e s s . T h e c o n t r o l l e r s o f t w a r e d e s c r i b e d i n t h i s c h a p t e r a l r e a d y r e q u i r e s f a i r l y i n t e n s i v e C P U u s a g e . T h e C P U m u s t m o n i t o r t h e s t a t u s o f t h e r u n , d i s p l a y s c r e e n i n f o r m a t i o n , d e t e r m i n e i f a p e a k h a s b e e n d e t e c t e d a t o n e o f t h e d e t e c t o r s , a n d s w i t c h v a l v e s . T h i s i s a s i g n i f i c a n t l o a d o n t h e c o m p u t e r s t h a t a r e u s e d t o c o n t r o l t h e H P L C ( a 1 0 M H z 8 0 8 8 X T c l a s s m a c h i n e , a n d a 1 2 M H z A T c l a s s c o m p u t e r ) . D M A , a s d e s c r i b e d b e l o w , d o e s n o t r e q u i r e C P U i n v o l v e m e n t i n t h e a c q u i s i t i o n a n d t r a n s f e r p r o c e s s . D M A i s a t e c h n i q u e i n w h i c h a n 8 2 3 7 A D M A c o n t r o l l e r c h i p ( o r s i m i l a r c h i p ) c o n t r o l s t h e t r a n s f e r o f d a t a . T h e D M A w r i t e s t h e d i g i t i z e d d a t a d i r e c t l y f r o m t h e R T I b o a r d t o a s p e c i f i e d m e m o r y l o c a t i o n . B e c a u s e t h e d a t a t r a n s f e r r u n s t r a n s p a r e n t l y , t h e C P U i s a b l e t o p r o c e s s o t h e r i n s t r u c t i o n s . T h e n e t e f f e c t i s a h i g h e r d a t a a c q u i s i t i o n r a t e a n d a d e c r e a s e d C P U l o a d . T h e c u r r e n t l i m i t a t i o n i s t h a t t h e D M A c a n o n l y b e p r o g r a m m e d t o t r a n s f e r a m a x i m u m o f 6 4 k i l o b y t e s ( K B ) o f d a t a b e f o r e t h e D M A h a s t o b e r e p r o g r a m m e d . T h i s l i m i t a t i o n i s d u e t o t w o c a u s e s . X T - c l a s s p e r s o n a l c o m p u t e r s ( 8 0 8 8 C P U s ) u s e o n l y 1 6 b i t a d d r e s s i n g w h i c h l i m i t s t h e a d d r e s s i n g t o o n l y 6 4 K B . N e w e r D M A c h i p s ( f o u n d i n A T ‘ c l a s s m a c h i n e s a n d h i g h e r ) c o n t a i n 2 4 b i t , a n d h i g h e r , a d d r e s s i n g c a p a b i l i t i e s . E v e n w i t h a l a r g e r a d d r e s s s p a c e , D M A i s s t i l l l i m i t e d t o 6 4 K B d u e t o t h e p r o g r a m m i n g l a n g u a g e u s e d t o w r i t e t h e c o n t r o l l e r s o f t w a r e . Q u i c k B a s i c ( a s m o s t o t h e r B A S I C c o m p i l e r s ) h a s a 6 4 K B l i m i t a t i o n o n t h e s i z e o f v a r i a b l e a r r a y s . E x p a n s i o n f o r l a r g e r d a t a c o l l e c t i o n s e t s w o u l d r e q u i r e p o r t i n g t h e c o n t r o l l e r s o f t w a r e t o a n e w e r l a n g u a g e , s u c h a s C . E v e n w i t h t h e 6 4 K B l i m i t a t i o n , D M A s t i l l p r o v i d e s f o r l D a t a P o i n t * l l n t e g e r , , 6 5 5 3 6 B y t e s * 0 . 1 s e c = 3 2 7 6 . 8 s e c 2 2 4 u p t o 5 4 . 6 m i n u t e s o f c o n t i n u o u s d a t a a c q u i s i t i o n , a s s u m i n g a n a c q u i s i t i o n r a t e o f 1 d a t a p o i n t p e r 0 . 1 s e c o n d s ( a s s e e n i n E q u a t i o n 6 . 1 ) : l l n t e g e r 2 B y t e s D a t a P o i n t E q u a t i o n 6 . 1 3 2 7 6 . 8 3 e c = 5 4 . 6 m m S i n c e t h i s t i m e i s o f s u f f i c i e n t d u r a t i o n f o r m o s t H P L C e x p e r i m e n t , i t w a s d e c i d e d t h a t e x t r a o r d i n a r y m e a s u r e s w e r e u n n e c e s s a r y . F o r c h r o m a t o g r a p h i c s e p a r a t i o n s t h a t r e q u i r e m o r e t h a n 5 5 m i n u t e s , t h e u s e r m a y s e l e c t a n a c q u i s i t i o n r a t e o f 1 / s e c o n d w h i c h w i l l e x t e n d t h e m a x i m u m r u n t i m e t o 5 4 6 m i n u t e s ( 9 h o u r s ) . A s e c o n d a p p r o a c h w o u l d b e t o a c q u i r e d a t a a t t h e m a x i m u m r a t e d e s i r e d . O n c e t h e 6 4 K B l i m i t i s r e a c h e d , t h e c o n t r o l l e r s o f t w a r e c a n p a u s e t h e c h r o m a t o g r a p h i c e x p e r i m e n t , t r a n s f e r t h e a c q u i r e d d a t a t o a h a r d d r i v e ( o r fl o p P Y ) . r e - p r o g r a m t h e D M A f o r f u r t h e r d a t a a c q u i s i t i o n , a n d c o n t i n u e t h e e x p e r i m e n t . P r o v i s i o n s f o r s t o p p i n g b o t h t h e H P L C i n s t r u m e n t a n d R T ' I b o a r d a r e a l r e a d y i m p l e m e n t e d . T w o m a j o r s t e p s m u s t o c c u r w h e n D M A i s u s e d . T h e f i r s t s t e p i s t o a p p l y a p a c i n g s i g n a l t o t h e A D C c o m p o n e n t o f t h e R T I b o a r d . T h i s p a c i n g s i g n a l p r o v i d e s a s y n c h r o n i z e d p u l s e t h a t i n i t i a t e s a n a n a l o g t o d i g i t a l c o n v e r s i o n . T h e R T ' I b o a r d c o n t a i n s a A M 9 5 1 3 t i m e r / c o u n t e r c h i p w h i c h p r o v i d e s f i v e 1 6 - b i t c o u n t e r s o f w h i c h t h r e e a r e s o f t w a r e c o n t r o l l a b l e . T i m e r C o u n t e r 4 ( T C N 4 ) i s p r o g r a m m e d t o p r o v i d e t h e p a c i n g f o r t h e A D C . T h i s i s a c c o m p l i s h e d b y t a k i n g t h e d e s i r e d a c q u i s i t i o n r a t e ( i n m i c r o s e c o n d s ) a n d c o n v e r t i n g i t i n t o a r a n g e a n d m u l t i p l i e r . T h e 9 5 1 3 c o n t a i n s a 1 M H z o s c i l l a t o r t h a t i s d i v i d e d i n t o 5 s u b - f r e q u e n c i e s o f 1 M H z , 1 0 0 , 1 0 , a n d 1 K H z , a n d 1 0 0 H z ( F 1 , F 2 , F 3 , F 4 , a n d F 5 , r e s p e c t i v e l y ) . T h e d e s i r e d r a t e i s s u c c e s s i v e l y d i v i d e d b y F l - F S u n t i l t h e r e m a i n d e r ( t h e m u l t i p l i e r ) i s s m a l l e r t h a n 3 2 7 6 7 ( t h e n u m b e r , 3 2 7 6 7 , i s d u e t o m a x i m u m v a l u e t h a t c a n b e a s s i g n e d t o a v a r i a b l e o f I N T E G E R t y p e ) . S i n c e t h e 2 2 5 p r e c i s i o n o f p a c i n g i s : t 1 c o u n t , t h i s a p p r o a c h i n s u r e s t h a t t h e l a r g e s t v a l u e w i l l b e u s e d t o g i v e t h e s m a l l e s t r e l a t i v e p r e c i s i o n . T h e d e t e r m i n a t i o n f o r r a n g e a n d m u l t i p l i e r i s c a l c u l a t e d f r o m : A c q u i s i t i o n R a t e = = M u l t i p l i e r " 1 0 I R a n g e ’ 1 ) E q u a t i o n 6 . 2 I n t h i s e q u a t i o n , t h e R a n g e c o r r e s p o n d s t o F l - F S ( e . g . , a R a n g e o f 1 c o r r e s p o n d s t o F 1 ) . F o r a d e s i r e d a c q u i s i t i o n r a t e o f 2 s e c o n d s ( . 5 H z ) : M u l t i p l i e r _ _ _ A c q R a t e ( m s ) E q u a t i o n 6 . 3 1 0 ( R a n g e - 1 ) 6 F o r R a n g e = 1 M u l t i p l i e r = 2 5 0 % = 2 * 1 0 6 > 3 2 7 6 7 . . 2 * 1 0 6 * 5 F o r R a n g e - = 2 M u l t i p l i e r = 1 0 ( 1 ) = 2 1 0 > 3 2 7 6 7 . . 2 * 1 0 6 , , 4 F o r R a n g e = 3 M u l t i p l i e r = 1 0 2 = 2 1 0 < 3 2 7 6 7 M u l t i p l i e r = 2 * 1 0 4 , R a n g e = 3 = F 3 = 1 0 K I - I z R S D = I 4 * 1 0 0 = 0 . 0 0 5 % 2 * 1 0 T h e m u l t i p l i e r ( 2 * 1 0 4 , i n t h e a b o v e e x a m p l e ) i s t h e n l o a d e d i n t o t h e L O A D r e g i s t e r o f T C N 4 . T h e s o u r c e f o r T C N 4 i s g i v e n b y t h e r a n g e , R a n g e = 3 2 1 0 K H z . T C N 4 w i l l t h e n c o u n t r e p e t i t i v e l y d o w n f r o m t h e v a l u e s t o r e d i n t h e L O A D r e g i s t e r , w h e r e e a c h c o u n t i s t r i g g e r e d b y t h e T 1 1 f r o m t h e s u b - f r e q u e n c y . U p o n r e a c h i n g t e r m i n a l c o u n t ( i n t h i s c a s e , 1 ) , T C N 4 w i l l g e n e r a t e a t e r m i n a l c o u n t ( T C ) p u l s e . T h e T C p u l s e t r i g g e r s a n a n a l o g t o d i g i t a l c o n v e r s i o n a t t h e d e s i r e d a c q u i s i t i o n r a t e . T h e s e c o n d s t e p i n u s i n g D M A i s t o s e t - u p t h e R T I b o a r d a n d t h e D M A c o n t r o l l e r . P r o g r a m m i n g t h e R T I b o a r d s i m p l y r e q u i r e s p u t t i n g a 1 i n t h e a p p r o p r i a t e b i t o f t h e R T I S t a t u s r e g i s t e r . T h e R T I b o a r d w i l l t h e n s e n d t h e a p p r o p r i a t e i n t e r r u p t t o 2 2 6 t h e D M A c o n t r o l l e r u p o n t h e e n d o f e a c h d i g i t i z a t i o n . T h e h a r d e r p a r t i s t o p r o g r a m t h e D M A i t s e l f . T h e D M A r e q u i r e s t w o d i f f e r e n t t y p e s o f i n f o r m a t i o n . T h e f i r s t p l a c e s t h e D M A c o n t r o l l e r i n t o t h e c o r r e c t o p e r a t i o n m o d e . T h e s o f t w a r e d e v e l o p e d h e r e u s e d D M A c h a n n e l 1 . C h a n n e l 1 i s c o n f i g u r e d a s : W R I T E m o d e I n s t r u c t s t h e D M A t o w r i t e t o t h e m e m o r y a d d r e s s . A u t o i n i t i a l i z e U p o n r e a c h i n g t e r m i n a l c o u n t , t h e D M A w i l l r e l o a d t h e n u m b e r o f d a t a a c q u i s i t i o n s t o b e t a k e n . I n c r e m e n t T h e M e m o r y A d d r e s s i s a u t o m a t i c a l l y i n c r e m e n t e d u p o n e a c h D M A t r a n s f e r . T h i s m o d e i s p r o g r a m m e d b y s e n d i n g o u t H e x 4 5 t o p o r t a d d r e s s 0 B ( H e x ) . T h e s e c o n d s t e p i n p r o g r a m m i n g t h e D M A i s t o i n d i c a t e t h e m e m o r y l o c a t i o n w h e r e t h e t r a n s f e r s a r e t o t a k e p l a c e . T h e c o n t r o l l e r s o f t w a r e r e s e r v e s , b y w a y o f t h e d i m e n s i o n a r r a y c o m m a n d , a b l o c k o f m e m o r y t h a t w i l l b e u s e d f o r t h e d a t a f r o m t h e d e t e c t o r ( s ) . T h e 2 0 b i t a d d r e s s o f t h e v a r i a b l e i s b r o k e n i n t o a 4 b i t p a g e a d d r e s s . T h e r e m a i n i n g 1 6 b i t s a r e b r o k e n i n t o t w o 8 - b i t h i g h a n d l o w o f f s e t s w i t h i n t h e p a g e a d d r e s s . T h e p a g e a d d r e s s a n d t h e h i g h / l o w o f f s e t s a r e s t o r e d i n t h e p a g e a n d b a s e a d d r e s s r e g i s t e r s o f t h e D M A . A t t h i s p o i n t , t h e D M A k n o w s t h e s t a r t i n g a d d r e s s f o r t h e m e m o r y t r a n s f e r s . T h e r e m a i n i n g s t e p i s t o p r o g r a m t h e C O U N T r e g i s t e r o f t h e D M A w i t h t h e n u m b e r o f t r a n s f e r s t h a t a r e t o t a k e p l a c e . T h e n u m b e r o f t r a n s f e r s i s a f u n c t i o n o f t h e n u m b e r o f d a t a p o i n t s ( l e n g t h o f c h r o m a t o g r a p h i c r u n t i m e s t h e d a t a a c q u i s i t i o n r a t e ) a n d t h e t y p e o f d a t a t h a t w i l l b e t r a n s f e r r e d . T h e s o f t w a r e t r a n s f e r s i n t e g e r v a l u e s w h i c h r e q u i r e t w o b y t e s p e r v a l u e . T h e r e f o r e , t h e C O U N T r e g i s t e r w i l l c o n t a i n a v a l u e e q u a l t o : C O U N T S a 2 * ( D a t a R u n L e n g t h ) * ( D a t a A c q u i s i t i o n R a t e ) E q u a t i o n 6 . 4 D u r i n g t h e d a t a a c q u i s i t i o n , t h e c o n t r o l l e r s o f t w a r e a c c e s s e s t h e C U R R E N T r e g i s t e r o f t h e D M A . T h e v a l u e t h a t i s s t o r e d i n t h i s r e g i s t e r c o n t a i n s t h e c u r r e n t n u m b e r o f d a t a p o i n t s t h a t h a s b e e n t r a n s f e r r e d . T h i s v a l u e i s u s e d t o d e t e r m i n e i f a v a l v e c h a n g e i s n e e d e d . 2 2 7 S e c t i o n 6 . 2 . 3 C o n t r o l o f T w o S i x P o r t V a l v e s T h e s o f t w a r e a l s o c o n t r o l s t w o 6 - p o r t R h e o d y n e v a l v e s . T h e s e v a l v e s w e r e i n i t i a l l y u s e d t o p e r f o r m r e c y c l e h e a r t c u t c h r o m a t o g r a p h y ( R H C ) . F i g u r e 6 . 2 p r o v i d e s t h e v a l v e c o n fi g u r a t i o n u s e d f o r R H C . T h e t w o v a l v e s a r e c o n t r o l l e d b y s e n d i n g a T T L s i g n a l t h r o u g h t h e d i g i t a l o u t p u t l i n e s o f t h e R T I b o a r d . T h e s o f t w a r e m o n i t o r s t h e p o s i t i o n o f t h e v a l v e s t h r o u g h t h e d i g i t a l i n p u t l i n e s o f t h e R T I b o a r d . A f i v e v o l t s i g n a l i s c o n n e c t e d t o a r e e d s w i t c h . W h e n t h e v a l v e i s i n t h e c l o c k w i s e p o s i t i o n , a m a g n e t m o u n t e d o n t h e b o d y o f t h e a c t u a t o r m o v e s o v e r t h e r e e d s w i t c h , w h i c h c l o s e s t h e r e e d s w i t c h . T h e 5 V s i g n a l t h e n a p p e a r s a s a m h i g h o n t h e a p p r o p r i a t e d i g i t a l i n p u t l i n e . A s i m i l a r s w i t c h i s m o u n t e d o n t h e i n j e c t i o n v a l v e . T h e i n j e c t o r i s n o t a u t o m a t e d ; h o w e v e r , t h e c o n t r o l l e r s o f t w a r e m o n i t o r s t h e s t a t u s o f t h e i n j e c t i o n v a l v e . W h e n t h e r e e d s w i t c h i s c l o s e d ( i n j e c t p o s i t i o n ) , t h e s o f t w a r e n o t e s t h a t a n i n j e c t i o n h a s b e e n m a d e , a n d t h e s o f t w a r e s t a r t s t h e d a t a a c q u i s i t i o n p r o c e s s . . S e c t i o n 6 . 2 . 4 R e c y c l e H e a r t c u t C h r o m a t o g r a p h y R e c y c l e h e a r t c u t c h r o m a t o g r a p h y ( R H C ) i s a t e c h n i q u e t h a t a t t e m p t s t o m a x i m i z e t h e s e p a r a t i o n o f t w o o r m o r e c o m p o n e n t s . W h e n t w o p e a k s e l u t e w i t h v e r y s i m i l a r r e t e n t i o n t i m e s , s e v e r a l p r o c e d u r e s c a n b e t a k e n t o i m p r o v e t h e r e s o l u t i o n . S o l v e n t o p t i m i z a t i o n o r a n e w m o b i l e p h a s e c a n b e c h o s e n t o c h a n g e t h e c a p a c i t y f a c t o r ( s ) , k , o f t h e c l o s e l y e l u t i n g p e a k s . l i k e w i s e , a c o l u m n w i t h a d i f f e r e n t s e l e c t i v i t y f a c t o r , a , m a y r e s o l v e t h e c o m p o n e n t s . I m p r o v i n g t h e c a p a c i t y f a c t o r o r s e l e c t i v i t y f a c t o r w i l l i m p r o v e r e s o l u t i o n s R 8 , , a c c o r d i n g t o e q u a t i o n 6 . 5 : R , = ( ” ( o - 1 ) J N ( l — : k — ) E q u a t i o n 6 . 5 2 2 8 W a s t e R l / R 2 R h e o d y n e 6 - P o r t V a l v e s D H P L C D e t e c t o r C L C o l l e c t i o n L o o p C H P L C C o l u m n F i g u r e 6 . 2 V a l v e C o n f i g u r a t i o n f o r R e c y c l e H e a r t c u t C h r o m a t o g r a p h y A t h i r d a p p r o a c h t o i m p r o v i n g t h e r e s o l u t i o n i s t o i n c r e a s e N , t h e n u m b e r o f t h e o r e t i c a l p l a t e s . O n e w a y t o i n c r e a s e N i s t o r e c y c l e t h e u n r e s o l v e d c o m p o n e n t s t h r o u g h t h e s a m e c o l u m n ( e . g . , R H C ) . 6 ' 8 R H C a s s u m e s t h a t i f t h e n o n - r e s o l v e d c o m p o n e n t s a r e e x t r a c t e d ( h e a r t c u t ) a n d r e - d i r e c t e d b a c k o n t o t h e c o l u m n , t h e y w i l l e x p e r i e n c e f u r t h e r s e p a r a t i o n . B y r e c y c l i n g t h e c o m p o n e n t s b a c k o n t o t h e c o l u m n , t h e e f f e c t i v e c o l u m n l e n g t h i s i n c r e a s e d . T h e r e a r e s e v e r a l a d v a n t a g e s t o t h i s a p p r o a c h . 7 T h e p r e s s u r e d r o p a c r o s s t h e c o l u m n i s m i n i m i z e d c o m p a r e d t o u s i n g a n a c t u a l l o n g e r c o l u m n . A s i n g l e c o l u m n h a s t h e s a m e c h a r a c t e r i s t i c s t h a t a l l o w f o r e a s i e r o p t i m i z a t i o n . F i n a l l y , b y s e l e c t i v e h e a r t c u t t i n g , c o m p o n e n t s t h a t a r e n o t o f i n t e r e s t c a n b e r e m o v e d . 2 2 9 T h e r e a r e s e v e r a l d i s a d v a n t a g e s t o R H C . T h e f i r s t i s t h a t m u l t i p l e p a s s e s m a y b e r e q u i r e d t o r e s o l v e t h e c o m p o n e n t s . E a c h r e c y c l e r e q u i r e s t h a t t h e h e a r t c u t p l u g b e s t o r e d w h i l e t h e r e m a i n i n g c o m p o n e n t s e l u t e . A f t e r m u l t i p l e r e c y c l e s , t h e v o l u m e o f t h e r e c y c l e p l u g e q u a l s o r e x c e e d s t h e d e a d v o l u m e o f t h e c o l u m n . A t t h i s p o i n t a n y f u r t h e r r e c y c l e s w o u l d r e q u i r e t h a t a r e c y c l e b e s t a r t e d b e f o r e t h e c o m p l e t e e l u t i o n o f t h e r e c y c l e p l u g . 4 T h e p r e s e n c e o f e v e r l o n g e r t u b i n g s t o s t o r e t h e c u t i n c r e a s e s t h e d i s p e r s i o n . T h e r e s u l t i s a n e v e n t u a l d e c r e a s e i n d e t e c t o r s i g n a l a s t h e s a m p l e i s d i s p e r s e d . A s e c o n d l i m i t a t i o n i s t h a t i f t h e u n r e s o l v e d p e a k s a r e c o m p l e x , t h e r e s o l v i n g p o w e r o f t h e c o l u m n m a y n e v e r b e l a r g e e n o u g h t o s e p a r a t e c o m p l e t e l y t h e c o m p o n e n t s . A t t h i s p o i n t , a c o m p l e t e c h a n g e i n t h e c h r o m a t o g r a p h y i s r e q u i r e d . R H C i s i m p l e m e n t e d b y c h a n g i n g t h e v a l v e c o n f i g u r a t i o n s f o r R 1 a n d R 2 ( s e e F i g u r e 6 . 2 ) . A t t h e b e g i n n i n g o f t h e c h r o m a t o g r a p h i c e x p e r i m e n t , b o t h R 1 a n d R 2 a r e i n t h e c l o c k w i s e c o n f i g u r a t i o n ( C W ) . W h e n t h e c o m p o n e n t s o f i n t e r e s t s t a r t t o e l u t e , R 1 i s l e f t i n t h e C W c o n f i g u r a t i o n w h i l e R 2 i s p l a c e d i n t o t h e c o u n t e r - c l o c k w i s e p o s i t i o n ( C C W ) . T h i s d i r e c t s t h e fl o w f r o m t h e c o l u m n t h r o u g h t h e c o l l e c t i o n l o o p ( C L i n F i g u r e 6 . 2 ) . T h e c o l l e c t i o n l o o p i s a c o i l e d t u b e o f a p a r t i c u l a r v o l u m e n e e d e d t o c o l l e c t a c e r t a i n e l u t i o n v o l u m e . D i s p e r s i o n i s m i n i m i z e d b y u s i n g a c o i l e d C L t u b e . 4 T h e c o i l e d t u b e b r e a k s u p , v i a t h e C o r i o l i s e f f e c t , t h e l a m i n a r p r o f i l e t h a t l e a d s t o l o n g i t u d i n a l d i s p e r s i o n . A f t e r t h e c o m p o n e n t s o f i n t e r e s t h a v e b e e n c o l l e c t e d , R 1 a n d R 2 a r e c h a n g e d b a c k t o t h e C W c o n fi g u r a t i o n s t o a l l o w t h e c o n t i n u e d e l u t i o n o f t h e r e m a i n d e r o f t h e s a m p l e . A f t e r a s u f f i c i e n t t i m e t o e l u t e t h e r e s t o f t h e s a m p l e , R 1 i s p l a c e d i n t h e C C W c o n f i g u r a t i o n . T h e fl o w i s t h e n d i r e c t e d t h r o u g h t h e c o l l e c t i o n l o o p a n d b a c k o n t o t h e c o l u m n . T h e s e p a r a t i o n e n h a n c e m e n t o f a m i x t u r e o f n a p h t h a l e n e ( 2 5 0 u M ) a n d b i p h e n y l ( 2 0 0 M ) u s i n g R H C i s s h o w n i n F i g u r e 6 . 3 . ‘ I T h e s e p a r a t i o n w a s a c c o m p l i s h e d o n a 2 3 0 D u p o n t 4 . 6 m m x 2 5 c m Z o r b a x O D S c o l u m n u s i n g i s o c r a t i c e l u t i o n w i t h 9 2 . 5 % m e t h a n o l a t 1 m l / m i n . A f t e r t h e f i r s t p a s s , t h e t w o c o m p o n e n t s a r e n o t c o m p l e t e l y r e s o l v e d . T h e h i g h e r r e s p o n s e o f t h e d e t e c t o r t o t h e b i p h e n y l p e a k h a s m a d e i t d i f f i c u l t t o q u a n t i f y t h e n a p h t h a l e n e p e a k . A h e a r t c u t w a s m a d e t o d i s c r i m i n a t e a g a i n s t t h e b i p h e n y l p e a k , a s s e e n i n t h e s e c o n d p a s s . R e s o l u t i o n h a s b e e n i n c r e a s e d a n d t h e r e s p o n s e t o t h e b i p h e n y l p e a k d o e s n o t p r e d o m i n a t e t h e c h r o m a t o g r a m . A s e c o n d c u t w a s m a d e t o p r o v i d e a d d i t i o n a l s e l e c t i v i t y e n h a n c e m e n t t o w a r d s t h e n a p h t h a l e n e p e a k . T h e r e s u l t s o f t h i s c u t a r e s e e n f o r t h e t h i r d p a s s . A t t h i s p o i n t t h e r e m a i n i n g c o m p o n e n t i s p r e d o m i n a t e l y n a p h t h a l e n e . T h e i n c l u s i o n o f t h i s c h r o m a t o g r a m d e m o n s t r a t e s t h e p o t e n t i a l f o r u s i n g a u t o m a t i o n . A r e p r o d u c i b l e m e t h o d o f a u t o m a t e d c o n t r o l o v e r v a l v e s w i t c h i n g i s r e q u i r e d t o o b t a i n g o o d p r e c i s i o n . 4 W i t h o u t t h e a u t o m a t i o n o f t h e i n s t r u m e n t , i t w o u l d h a v e b e e n d i f f i c u l t t o s w i t c h t h e v a l v e s q u i c k l y e n o u g h t o a l l o w t h i s t e c h n i q u e t o w o r k . T h e c o n t r o l l e r s o f t w a r e w r i t t e n b y t h e a u t h o r s w i t c h e d v a l v e s b a s e d o n t i m e o n l y . T h e s o f t w a r e w a s m o d i f i e d t o a l l o w t h e o p e r a t o r t o c h a n g e t h e v a l v e s a t h i s / h e r d i s c r e t i o n t o p e r f o r m R H C . T h e c u r r e n t v e r s i o n o f t h e s o f t w a r e c o n t r o l l e r a l l o w s s w i t c h i n g b a s e d u p o n t h e p e a k d e t e c t i o n . T h i s d e v e l o p m e n t w o u l d i m p r o v e t h e a u t o m a t e d R H C t e c h n i q u e s u c h t h a t t h e h e a r t c u t t i n g c o u l d b e m o r e r e p r o d u c i b l e . S e c t i o n 6 . 3 S e c o n d L e v e l C o n t r o l l e r S o f t w a r e — A n O v e r v i e w T h e n e x t s t a g e o f d e v e l o p m e n t o f t h e c o n t r o l l e r s o f t w a r e i n c o r p o r a t e d s i g n i fi c a n t c h a n g e s . T h e o b j e c t i v e s i n d e v e l o p i n g t h i s s e c o n d g e n e r a t i o n o f t h e c o n t r o l l e r p r o g r a m a r e : 2 3 1 W A 2 0 0 . 3 0 0 . 4 0 0 . T i m e ( s e c ) F i g u r e 6 . 3 S e l e c t i v i t y E n h a n c e m e n t s u s i n g R e c y c l e H e a r t c u t C h r o m a t o g r a p h y : N a p h t h a l e n e a n d B i p h e n y l 2 3 2 ( 1 ) P r o g r a m m e t h o d s f o r t h e s o l v e n t d e l i v e r y s y s t e m ( 2 ) M o n i t o r t h e s o l v e n t d e l i v e r y s y s t e m ( 3 ) C o n t r o l t h e c o l u m n s e l e c t i o n v a l v e a n d t h e t w o R h e o d y n e v a l v e s ( 4 ) P r o v i d e s u p p o r t f o r m u l t i p l e d e t e c t o r s A b l o c k d i a g r a m o f t h e s o f t w a r e i s p r o v i d e d b e l o w i n F i g u r e 6 . 4 . P r o v i d e d w i t h e a c h m o d u l e i s t h e a p p r o m m a t e s i z e , i n K i l o b y t e s , o f e a c h m o d u l e . M o d u l a r p r o g r a m m i n g a l l o w s i n d e p e n d e n t d e v e l o p m e n t o f e a c h c o m p o n e n t o f t h e s o f t w a r e . Q u i c k B a s i c a l s o l i m i t s t h e s i z e o f a s i n g l e m o d u l e t o 6 4 K i l o b y t e s ( K B ) . T h e t o t a l c o d e f o r t h e s e m o d u l e s w o u l d n o t fi t i n t o a s i n g l e 6 4 K B c o d e s e g m e n t . E a c h m o d u l e w i l l b e b r i e fl y d i s c u s s e d . S e c t i o n 6 . 3 . 1 S w i t V a l v . B a s P r o g r a m T h e m a i n m o d u l e i s t h e S w i t V a l v . B a s p r o g r a m . S w i t V a l v c a l l s t h e o t h e r m o d u l e s t o s e t u p H P L C r u n p a r a m e t e r s a n d v a l v e c o n f i g u r a t i o n s . S w i t V a l v fi r s t i n i t i a l i z e s t h e D M A a n d o b t a i n s t h e l e n g t h o f c h r o m a t o g r a p h i c e x p e r i m e n t a n d t h e d a t a a c q u i s i t i o n r a t e . A f t e r p r o g r a m m i n g t h e D M A , S w i t V a l v p r o g r a m s t h e t h r e e t i m e r c o u n t e r s , T C N ] , T C N 2 , a n d T C N 4 . T C N 4 h a s a l r e a d y b e e n d e s c r i b e d . T C N I a n d T C N 2 a r e u s e d t o p r o v i d e a c c u r a t e a n d p r e c i s e t i m i n g o f t h e c h r o m a t o g r a p h i c e x p e r i m e n t . T h e s o u r c e f o r T C N l i s F 4 , w h i c h h a s a f r e q u e n c y o f l K H z . T h i s a l l o w s T C N ] t o c o u n t i n m i l l i s e c o n d s . W h e n T C N ] r e a c h e s t e r m i n a l c o u n t ( 6 5 5 3 6 ) i t g e n e r a t e s a t e r m i n a l c o u n t p u l s e , r e s e t s i t s e l f , a n d c o n t i n u e s c o u n t i n g . T h i s T T L p u l s e f r o m T C N ] s e r v e s a s t h e s o u r c e f o r T C N 2 . T o g e t h e r , T C N 1 a n d T C N 2 a l l o w t h e s o f t w a r e t o c o u n t f o r a m a x i m u m o f 4 9 . 7 d a y s . T C N ] a n d T C N 2 a r e u s e d f o r s e v e r a l v i t a l p u r p o s e s . T h e s e t w o c o u n t e r s p r o v i d e a h i g h p r e c i s i o n c l o c k f o r a c c u r a t e a n d r e p r o d u c i b l e v a l v e s w i t c h e s w h i c h m a y b e p r o g r a m m e d t o c h a n g e a t a p a r t i c u l a r t i m e d u r i n g t h e r u n . T h e r u n t i m e i s a l s o d i s p l a y e d o n t h e s c r e e n t o p r o v i d e f e e d b a c k f o r t h e u s e r . P r o D g 4 S 6 . S K . B B a s H e l . 8 p 7 F K i l e s B , L C M e t 5 h 3 o K d B . B a s 2 3 3 S w i t V a l v . B a s 3 8 K B H P L C - C o n . B a s 1 3 K B H P L C _ C o n . Q L B 5 K B I n c l u d e F i l e s 5 . 8 K B F i g u r e 6 . 4 O v e r v i e w o f t h e M o d u l e s u s e d i n t h e S e c o n d G e n e r a t i o n o f t h e C o n t r o l l e r S o f t w a r e 2 3 4 T h e u s e o f c o l u m n s w i t c h i n g r e q u i r e s t h a t t h e H P L C b e p l a c e d i n a s t a n d - b y m o d e w h e n e v e r a v a l v e s w i t c h i s m a d e . T h i s p a u s e m a y b e d u e t o a c h a n g e i n m o b i l e p h a s e o r fl o w r a t e . T h e r e f o r e , a g a t e m u s t b e a p p l i e d t o T C N I a n d T C N 4 t o s t o p t h e d a t a a c q u i s i t i o n a n d c l o c k w h i l e t h e c o n t r o l l e r p r o g r a m a l l o w s t h e c o l u m n s , m o b i l e p h a s e , a n d fl o w r a t e s t o e q u i l i b r a t e . T h e g a t e i s p r o v i d e d b y s e n d i n g a T T L H i g h t o a g a t e c i r c u i t c o m p o s e d o f a 7 4 1 5 0 0 c h i p ( Q u a d N A N D g a t e ) . T h e T I T . s i g n a l i s s e n t f r o m o n e o f t h e d i g i t a l o u t p u t s o f t h e p r o g r a m m a b l e p a r a l l e l i n t e r f a c e c h i p ( v i d e i n f r a ) . T h e o u t p u t f r o m t h e c h i p i s t h e n s e n t t h r o u g h t h e g a t e i n p u t f o r T C N l a n d T C N 4 . T C N 2 d o e s n o t n e e d t o b e g a t e d s i n c e t h e s o u r c e f o r T C N 2 i s t h e t e r m i n a l c o u n t p u l s e f r o m T C N 1 . T h e c i r c u i t f o r t h i s g a t e i s s h o w n i n F i g u r e 6 . 5 . W h e n a H i g h s i g n a l i s a p p l i e d t o t h e N A N D g a t e , t h e o u t p u t f r o m t h e c h i p i s a l o g i c l e v e l L o w . T h e 5 V i n t e r n a l s i g n a l f r o m t h e R H b o a r d i s p u l l e d t o a l o g i c L o w . S i n c e T C N ] a n d T C N 4 a r e p r o g r a m m e d t o b e A c t i v e H i g h g a t e d , t h e c o u n t e r s a r e s t o p p e d . S w i t V a l v n e x t o b t a i n s t h e M a s t e r F i l e ( w h i c h m u s t a l r e a d y e x i s t b e f o r e r u n n i n g t h e p r o g r a m ) . T h i s M a s t e r F i l e i s a n A S C I I t e x t fi l e t h a t c o n t a i n s t h e d e s i r e d v a l v e c o n fi g u r a t i o n s f o r t h e R h e o d y n e v a l v e s a n d t h e c o l u m n s e l e c t i o n v a l v e . T h e f o r m a t o f t h i s M a s t e r f i l e i s p r o v i d e d i n F i g u r e 6 . 6 . U p t o t e n l i n e s o f d e s c r i p t i o n c a n b e i n c l u d e d . T h e n e x t l i n e m u s t c o n t a i n , a s t h e fi r s t c h a r a c t e r s , < E N D C O M M E N T S > . F o l l o w i n g t h i s e n t r y i s a l i n e w h i c h c o n t a i n s t h e t o t a l n u m b e r o f d i f f e r e n t v a l v e c o n fi g u r a t i o n s t h a t w i l l b e u s e d d u r i n g t h e r u n . T h e n e x t l i n e i s s i m p l y a h e a d e r l i n e t o p r o v i d e r e a d a b i l i t y t o t h e fi l e . T h e r e m a i n i n g l i n e s o f t h e fi l e c o n t a i n t h e v a l u e s f o r t h e fi e l d s ( t a b , c o m m a , o r s p a c e d e l i m i t e d f o r m a t ) . T h e E v e n t fi e l d c o n t a i n s a c o d e t h a t s p e c i fi e s w h e n t h a t v a l v e c o n fi g u r a t i o n w i l l b e i m p l e m e n t e d . F o r e x a m p l e , T T s p e c i fi e s t h a t a f t e r a s p e c i f i e d t o t a l r u n t i m e t h e v a l v e c o n fi g u r a t i o n w i l l b e c h a n g e d . T h e v a l v e c a n b e c h a n g e d a t a p a r t i c u l a r t i m e o r l i L 2 3 5 a f t e r a c e r t a i n n u m b e r o f p e a k s h a v e b e e n d e t e c t e d . " E L A P S E D " r e f e r s t o t h e t i m e a n d n u m b e r o f p e a k s d u r i n g a p a r t i c u l a r v a l v e c o n fi g u r a t i o n ; t h e t i m e a n d n u m b e r o f p e a k s d e t e c t e d a r e r e - s e t t o z e r o a f t e r e v e r y v a l v e c h a n g e . T h e t o t a l t i m e a n d n u m b e r o f p e a k s d e t e c t e d i s k e p t a n d c a n b e u s e d a s s e l e c t i o n c r i t e r i a . I n t e r f a c e B o x F M G a t e C i r c u i t R T I G a t e I n p u t s 1 T T L f r o n b _ P P I ‘ 7 4 1 3 0 8 I O ) ) 7 4 5 0 0 9 G a t e 1 g / K ( 1 _ Q G . — ) ) ( ( F i g u r e 6 . 5 G a t e C i r c u i t t o C o n t r o l T i m e r C o u n t e r s 3 a n d 4 T h e V a l u e fi e l d i s t h e v a l u e t o u s e f o r t h e e v e n t . F o r a t i m e d e v e n t , t h e v a l u e fi e l d w i l l b e t i m e ( i n m i n u t e s ) . F o r a s w i t c h b a s e d o n a p e a k c o u n t , V a l u e c o n t a i n s t h e n u m b e r o f p e a k s f o r w h i c h t o l o o k . T h e v a l v e c h a n g e c a n b e b a s e d u p o n t h e e m e r g e n c e o f a p e a k o r t h e t o t a l n u m b e r o f p e a k s t h a t h a v e o c c u r r e d . S w i t c h i n g b a s e d u p o n a p e a k e m e r g e n c e a l l o w s t h e c o n t r o l l e r s o f t w a r e t o c u t a p a r t i c u l a r p e a k ( s ) o n t o a s e c o n d 2 3 6 c o l u m n . S w i t c h i n g a f t e r a c e r t a i n n u m b e r o f p e a k s h a v e b e e n d e t e c t e d c a n b e u s e d t o i n s u r e t h a t a l l t h e p e a k s h a v e b e e n e l u t e d f r o m t h e c o l u m n . T h e D e t e c t o r fi e l d i n d i c a t e s w h i c h d e t e c t o r o u t p u t i s u s e d t o m o n i t o r w h e n t h e v a l v e c h a n g e i s b a s e d u p o n p e a k d e t e c t i o n . T h i s v a l u e i s n e e d e d s i n c e d i f f e r e n t v a l v e c o n fi g u r a t i o n s w i l l p l a c e c e r t a i n d e t e c t o r s o n - o r o f f - l i n e . T h e D e t e c t o r fi e l d a l s o p r o v i d e s a d d i t i o n a l fl e x i b i l i t y f o r t h e u s e r o f t h e s o f t w a r e s i n c e d i f f e r e n t d e t e c t o r s c a n b e m o n i t o r e d . F i n a l l y , t h e l a s t t h r e e fi e l d s a r e t h e p o s i t i o n s f o r t h e t h r e e d i f f e r e n t v a l v e s t h a t a r e u s e d . T h e fi r s t t w o fi e l d s a r e f o r t h e R h e o d y n e v a l v e s w h e r e a I i n t h e fi e l d s i n d i c a t e s t h a t t h e v a l v e ( s ) w i l l b e p l a c e d i n a c l o c k w i s e p o s i t i o n a n d a 0 r e f e r s t o t h e c o u n t e r - c l o c k w i s e p o s i t i o n . F o r t h e c o l u m n s e l e c t i o n v a l v e ( C S V ) , t h e l e g a l v a l u e i s a n . i n t e g e r i s b e t w e e n 0 a n d 5 , i n c l u s i v e , w h i c h i n d i c a t e s o n e o f t h e s i x d i f f e r e n t fl o w p a t h s t h r o u g h t h i s v a l v e . T h e C S V h a s b e e n d e s c r i b e d i n C h a p t e r 3 . T h i s i s a n e x a m p l e M a s t e r F i l e . T h e r e a r e t h r e e l i n e s o f c o m m e n t s i n t h i s fi l e . D a t e : 1 0 / 2 8 / 9 2 A u t h o r : S t e p h e n M e d l i n < E N D C o m m e n t s > 3 E v e n t V a l u e D e t e c t o r V 1 V 2 C S V S P E 2 1 l l 4 E P E 2 2 0 l 2 1 1 ' 1 4 . 3 1 l 1 3 L e g e n d T T S w i t c h a f t e r a t o t a l r u n t i m e T ' E S w i t c h a f t e r a n e l a p s e d t i m e o n t h a t c o l u m n S P T S w i t c h a t t h e s t a r t o f p e a k ( T o t a l c o u n t ) E P T S w i t c h a t e n d o f p e a k ( T o t a l C o u n t ) S P E S w i t c h a t s t a r t o f P e a k ( E l a p s e d ) E P E S w i t c h a t e n d o f P e a k ( E l a p s e d ) D n U s e D e t e c t o r n f o r t h e p e a k c o u n t i n g ( 0 . . N u m C h a n n e l s - 1 ) F i g u r e 6 . 6 F o r m a t o f t h e M a s t e r F i l e 2 3 7 S w i t V a l v p a s s e s c o n t r o l t o t h e l - I P L C - C o n . B a s m o d u l e . H P L C - C o n c r e a t e s H P L C p a r a m e t e r fi l e s f o r e a c h v a l v e c o n fi g u r a t i o n . T h i s m o d u l e i s d e s c r i b e d b e l o w . H P L C - C o n p a s s e s b a c k t w o s e t s o f i n f o r m a t i o n . T h e fi r s t i s a t w o d i m e n s i o n a l a r r a y t h a t c o n t a i n s t h e H P L C p a r a m e t e r s f o r e v e r y v a l v e c o n fi g u r a t i o n . E a c h e l e m e n t o f t h e a r r a y i s a c o m p l e x v a r i a b l e t y p e o f t h e f o r m : L C R u n ( C q u m n _ N u m b e r , E v e n t ) . T i m e . F I o w . P e r A . P e r B . P e r C . M a x P w h e r e : C o l u m n . N u m b e r i s a n i n d e x t o r e p r e s e n t a p a r t i c u l a r v a l v e s e t - u p 2 . E v e n t i s a n i n d e x t h a t i n d i c a t e s a d i f f e r e n t p o i n t o f t h e r u n f o r t h a t c o n f i g u r a t i o n ( e . g . , t h e d i f f e r e n t p o i n t s d u r i n g a g r a d i e n t r u n w h e r e t h e H P L C c h a n g e s t h e m o b i l e p h a s e o r fl o w r a t e ) . 3 . T i m e i n d i c a t e s t h e e l a p s e d r u n t i m e w h e n t h e H P L C s o l v e n t d e l i v e r y s y s t e m w i l l b e c h a n g i n g t h e c o n d i t i o n s . F l o w p r o v i d e s t h e fl o w r a t e f o r t h a t p o i n t i n t h e e l u t i o n . 5 . P e r A , P e r B , a n d P e r C a r e t h e m o b i l e p h a s e c o m p o s i t i o n s ( i n p e r c e n t a g e s ) f o r u p t o t h r e e d i f f e r e n t s o l v e n t s . 6 . M a x P i n d i c a t e s t h e m a x i m u m p r e s s u r e l i m i t t o w h i c h a p a r t i c u l a r c o l u m n w i l l b e e x p o s e d ' T h e s e c o n d p a r a m e t e r t h a t i s r e t u r n e d t o S w i t V a l v i s a t w o d i m e n s i o n a l a r r a y , L I N K F I L E . T h i s a r r a y i s a n e n c o d e d l i n k e d l i s t t h a t i n d i c a t e s w h i c h H P L C p a r a m e t e r f i l e i s a s s o c i a t e d w i t h e a c h v a l v e c o n f i g u r a t i o n . T h e S p e c t r a P h y s i c s S P 8 7 0 0 s o l v e n t d e l i v e r y s y s t e m ( S D S ) c a n s t o r e a m a x i m u m o f t e n p a r a m e t e r f i l e s , w i t h e a c h fi l e c o n t a i n i n g o n l y s e v e n l i n e s o f p r o g r a m m i n g . W h i l e t h e S D S a l l o w s p a r a m e t e r fi l e s t o b e l i n k e d , i t i s e a s y t o u s e a l l o f t h e p a r a m e t e r fi l e s w h e n p e r f o r m i n g a l a r g e n u m b e r o f c o l u m n s w i t c h e s . T h e a u t o m a t e d i n s t r u m e n t i s a l s o a b l e t o l i n k t h e a p p r o p r i a t e fi l e s v i a t h e L I N K F I L E a r r a y . T h e v a l u e s o f L I N K F I L E i n d i c a t e w h i c h S P 8 7 0 0 fi l e s a r e a s s o c i a t e d w i t h t h e m e t h o d o r t h e p a r t i c u l a r v a l v e c o n fi g u r a t i o n s . T h e fi r s t d i m e n s i o n o f L I N K F I L E i n d i c a t e s t h e o r d e r o f t h e v a l v e c o n fi g u r a t i o n . T h e s e c o n d d i m e n s i o n c o n t a i n s t h e e n c o d e d l i n k l i s t i n f o r m a t i o n . T a b l e 6 . 1 g i v e s t h e f o r m a t o f t h e i n f o r m a t i o n s t o r e d i n t h i s a r r a y . 2 3 8 A f t e r a l l t h e m e t h o d s h a v e b e e n p r o g r a m m e d a n d c o n t r o l r e t u r n s t o S w i t V a l v , S w i t V a l v r u n s t h e H P L C i n s t r u m e n t . T h e p r o g r a m c o n t i n u o u s l y p r o v i d e s a n u p d a t e d s c r e e n d i s p l a y i n d i c a t i n g t h e r u n t i m e , t h e n e x t e v e n t f o r t h e n e x t v a l v e c h a n g e , t h e c u r r e n t d i g i t a l v a l u e f r o m t h e d e t e c t o r , a n d w h i c h d e t e c t o r i s b e i n g s c a n n e d . S w i t V a l v a l s o d e t e r m i n e s i f a c o m p o n e n t i s e l u t i n g b y p e r f o r m i n g a l i n e a r r e g r e s s i o n u p o n t h e l a s t s e v e n d a t a p o i n t s t h a t w e r e a c q u i r e d . W h e n a p o s i t i v e s l o p e g r e a t e r t h a n s o m e u s e r - d e fi n e d t h r e s h o l d i s o b s e r v e d a n d t h e a v e r a g e o f t h e s e v e n d a t a p o i n t s i s l a r g e r t h a n a s e c o n d t h r e s h o l d , t h e c o m p u t e r i n d i c a t e s t h e b e g i n n i n g o f a p e a k . T h e p r o g r a m d e t e r m i n e s t h e e n d o f t h e p e a k w h e n t w o c r i t e r i a a r e m e t . F i r s t , a p e a k m u s t h a v e b e e n o b s e r v e d ( a p o s i t i v e s l o p e c h a n g e ) . T h e n , a n e g a t i v e s l o p e m u s t b e o b s e r v e d ; f o l l o w e d b y a s l o p e a n d a v e r a g e v a l u e t h a t i s l e s s t h a n t h e t w o r e l e v a n t t h r e s h o l d s ( i . e . , t h e p e a k h a s r e t u r n e d t o b a s e l i n e ) . I f a v a l v e c h a n g e s h o u l d b e i n i t i a t e d ( b a s e d o n t i m e o r p e a k ) , S w i t V a l v m o v e s t h e v a l v e s i n t o t h e a p p r o p r i a t e p o s i t i o n s . T h e R h e o d y n e v a l v e s a r e s w i t c h e d b y s e n d i n g o u t t h e a p p r o p r i a t e T I T . s i g n a l v i a t h e R T I b o a r d . T h e C S V i s m o v e d b y s e n d i n g o u t t h e a p p r o p r i a t e n u m b e r o f T T L s i g n a l s v i a t h e 8 2 5 5 P r o t o t y p e b o a r d . A f t e r a d e l a y t i m e t o a l l o w t h e v a l v e s t o s w i t c h , t h e p r o g r a m d e t e r m i n e s t h e s t a t u s o f t h e v a l v e s t o m a k e s u r e t h a t t h e y a r e i n t h e d e s i r e d p o s i t i o n . I f t h e y a r e n o t , t h e p r o g r a m w i l l t r y u p t o t w o m o r e t i m e s t o s w i t c h t h e v a l v e s b e f o r e c a l l i n g a n e r r o r r o u t i n e . A f t e r e v e r y s w i t c h , t h e p r o g r a m w i l l s t o r e t h e t i m e a n d p e a k c o u n t w h e n t h e v a l v e s w e r e s w i t c h e d . I f a s o l v e n t p a r a m e t e r ( F l o w o r m o b i l e p h a s e c o m p o s i t i o n ) c h a n g e s f o r t h e n e w v a l v e / c o l u m n c o n fi g u r a t i o n , t h e p r o g r a m s e n d s o u t a T T L s i g n a l t o g a t e o f f t h e D M A a n d t i m e r s . T h e p r o g r a m s w i t c h e s t h e R h e o d y n e a n d C S V v a l v e s t o b y p a s s m o d e ( t h e C S V h a s s i m p l e t u b i n g a s o n e o f t h e 6 fl o w p a t h s s o t h a t t h e fl o w w i l l n o t g o t h r o u g h a n y o f t h e c o l u m n s o n t h e C S V ) , a n d c h a n g e s t h e m o b i l e p h a s e a n d fl o w r a t e t o t h e n e w v a l u e s . T h e S D S h a s a T T L l i n e t h a t g o e s L o w w h e n t h e d e s i r e d fl o w 2 3 9 r a t e h a s b e e n m e t . A f t e r a u s e r - d e fi n e d t i m e t o p u r g e t h e p l u m b i n g o f t h e o l d m o b i l e p h a s e w i t h t h e n e w , t h e p r o g r a m s e n d s o u t a L o w t o t h e g a t e t o r e - s t a r t d a t a a c q u i s i t i o n . T h e s t e p s o f m o n i t o r i n g , d i s p l a y i n g , a n d c h a n g i n g v a l v e s a r e i t e r a t e d u n t i l s e v e r a l c o n d i t i o n s a r e m e t . T h e fi r s t c o n d i t i o n i s t h a t a l l t h e d a t a p o i n t s h a v e b e e n c o l l e c t e d a n d t h e D M A c o n t r o l l e r c h a n g e s t h e s t a t u s b i t o f t h e R T I b o a r d t o i n d i c a t e t h a t T e r m i n a l C o u n t h a s b e e n r e a c h e d . T h e s e c o n d c o n d i t i o n i s a u s e r - i n i t i a t e d a b o r t w h i c h i s a c c o m p l i s h e d b y t h e u s e r h i t t i n g a c a p i t a l S d u r i n g t h e r u n . T h e p r o g r a m s t o r e s t h e a c q u i r e d d a t a t o t h a t p o i n t ; T h e p r o g r a m c l o s e s a n y o p e n fi l e s a n d s t o p s t h e r u n . S e c t i o n 6 . 3 . 2 H P L C - C o n . B a s P r o g r a m T h i s m o d u l e i s t h e i n t e r f a c e b e t w e e n t h e m a s t e r m o d u l e , S w i t V a l v , a n d t h e m o d u l e s t h a t a s s i s t i n c r e a t i n g a n d p r o g r a m m i n g t h e S P 8 7 0 0 m e t h o d f i l e s . H P L C - C o n c a l l s t w o s u b - m o d u l e s , L C M e t h o d . B a s a n d P r o g S D S . B a s . T h e p r o g r a m r e t u r n s t h e p r o g r a m m e d m e t h o d s i n t h e a r r a y , L C R u n , a n d t h e l i n k e d l i s t i n l i n k F i l e . S e c t i o n 6 . 3 . 3 L C M e t h o d . B A S P r o g r a m T h e p u r p o s e o f t h i s m o d u l e i s t o o b t a i n a S P 8 7 0 0 p a r a m e t e r fi l e c o n t a i n i n g v a l i d e n t r i e s . T h e m o d u l e e i t h e r r e a d s i n a m e t h o d fi l e t h a t h a s b e e n p r e v i o u s l y c r e a t e d ( a s s u m e d t o b e c r e a t e d v i a L C M e t h o d a n d t h e r e f o r e c o n t a i n i n g v a l i d e n t r i e s ) o r a s s i s t s i n c r e a t i n g t h e m e t h o d . T h e p r o g r a m i s u s e r - f r i e n d l y a n d p r o v i d e s e r r o r c h e c k i n g , e r r o r m e s s a g e s , a n d h e l p f i l e s t o a s s i s t t h e u s e r i n d e v e l o p i n g a n S P 8 7 0 0 p a r a m e t e r fi l e . T h e p r o g r a m a l l o w s t h e u s e r t o e n t e r t h e t i m e f o r a p a r t i c u l a r c h a n g e i n t h e o p e r a t i n g c o n d i t i o n s t o b e m a d e ( e . g . , d e v e l o p i n g t h e d i f f e r e n t p a r t s o f a g r a d i e n t e l u t i o n p r o fi l e ) . T h e t i m e s a r e e n t e r e d a s e l a p s e d t i m e s r a t h e r t h a n a s t o t a l t i m e , w h i c h t h e S P 8 7 0 0 e v e n t u a l l y r e q u i r e s . T h e p r o g r a m a l s o a l l o w s t h e u s e r t o e n t e r a t i m e t o 2 4 0 h o l d t h e e l u t i o n p r o f i l e . A f t e r t h e u s e r h a s e n t e r e d t h e t i m e , t h e p r o g r a m o b t a i n s v a l i d e n t r i e s f o r t h e m o b i l e p h a s e c o m p o s i t i o n , fl o w r a t e , a n d m a x i m u m o p e r a t i n g p r e s s u r e . T h e p r o g r a m c o n v e r t s t h e e l a p s e d t i m e s i n t o c u m u l a t i v e t i m e s . A f t e r e n t r y o f t h e m e t h o d , t h e p r o g r a m d i s p l a y s t h e e n t e r e d m e t h o d i n a s c r o l l a b l e m a n n e r a n d a l l o w s t h e o p e r a t o r t o e d i t t h e m e t h o d . T a b l e 6 . 1 F o r m a t f o r t h e E n c o d e d L i n k L i s t A r r a y , L i n k F i l e O A r r a y I n d i c e s V a l u e o f E x p l a n a t i o n ( m fl L 1 1 I n d e x ( m , 1 ) - 1 N o o p e n S P 8 7 0 0 fi l e s a r e a v a i l a b l e . S w i t V a l v m o d u l e m u s t t h e n m o n i t o r w h e n a m e t h o d h a s b e e n r u n a n d p r o g r a m t h e c o m p l e t e m e t h o d i n t o t h e S D S . ( m , n ) 0 . . 9 T h e n u m b e r I n d i c a t e s t h e o r d e r o f t h e S P 8 7 0 0 fi l e . F o r e x a m p l e , i f l i n k F i l e ( 3 , 2 ) - 4 , t h e n t h e s e c o n d l i n k e d f i l e f o r t h e t h i r d v a l v e c o n fi g u r a t i o n i s S P 8 7 0 0 fi l e n u m b e r 4 . ( m , n > 0 ) - 1 L a s t l i n k e d f i l e . T h e m e t h o d w a s c o m p l e t e l y p r o g r a m m e d i n t o t h e S P 8 7 0 0 S D S . ( m , n > 0 ) > 1 0 0 A p a r t i a l f i l e w a s l o a d e d i n t o t h e S P 8 7 0 0 . T h e m o s t s i g n i fi c a n t d i g i t i n d i c a t e s t h a t a p a r t i a l f i l e w a s l o a d e d w h i l e t h e r e m a i n i n g d i g i t s i n d i c a t e w h i c h w a s t h e l a s t l i n e p r o g r a m m e d i n t o t h e S D S . F o r e x a m p l e , i f l i n k F i l e ( 2 , 6 ) = 1 2 3 , l i n e # 2 3 o f t h e m e t h o d w a s t h e l a s t l i n e p r o g r a m m e d . W h e n a n S P 8 7 0 0 f i l e b e c o m e s a v a i l a b l e , l i n e s 2 4 t o t h e e n d m u s t b e p r o g r a m m e d i n t o t h e S D S . O n c e t h e m e t h o d h a s b e e n p r o g r a m m e d , t h e p r o g r a m a l l o w s t h e m e t h o d t o b e w r i t t e n t o a f i l e , a l o n g w i t h a p p r o p r i a t e c o m m e n t s , h e a d e r s , d a t e s , a n d t i m e s . T h i s a p p r o a c h a l l o w s m e t h o d s t o b e g e n e r a t e d a n d s t o r e d f o r l a t e r r e c a l l a n d r e u s e . L C M e t h o d r e t u r n s t h e p a r a m e t e r fi l e t o t h e H P L C - C o n m o d u l e t h a t c o m b i n e s t h e p a r a m e t e r fi l e w i t h t h e o t h e r p a r a m e t e r fi l e s f o r t h e d i f f e r e n t v a l v e c h a n g e s . 2 4 1 T h i s m o d u l e w a s w r i t t e n t o i m p r o v e t h e u s e r - f r i e n d l i n e s s o f t h e H P L C i n s t r u m e n t . T h e p r o g r a m a s s u r e s t h a t t h e t i m e s a r e c a l c u l a t e d c o r r e c t l y a n d t h a t t h e d i f f e r e n t p a r a m e t e r s a r e e n t e r e d c o r r e c t l y . T h e p r o g r a m p r o v i d e s f a i r l y d e t a i l e d h e l p i n t h e f o r m o f s c r o l l e d t e x t fi l e s . T h e fi r s t t i m e t h r o u g h t h e m o d u l e , t h e p r o g r a m d i s p l a y s t h e h e l p fi l e s . S u b s e q u e n t u s e s o f t h e m o d u l e r e m o v e t h e h e l p fi l e s s o t h a t t h e u s e r m a y q u i c k l y e n t e r t h e p a r a m e t e r s . B y s a v i n g t h e m e t h o d t o a fi l e , t h e p r o d u c t i v i t y o f t h e o p e r a t o r c a n b e i m p r o v e d s i n c e c o m p l e x m e t h o d s c a n b e r e - c a l l e d a n d r e - u s e d . S e c t i o n 6 . 3 . 4 P r o g S D S . B a s P r o g r a m T h e fi n a l m o d u l e i n t h e H P L C c o n t r o l l e r p r o g r a m i s P r o g S D S . T h i s m o d u l e i s c a l l e d f r o m H P L C - C o n . B a s a f t e r e a c h m e t h o d fi l e h a s b e e n g e n e r a t e d ( o r r e a d i n f r o m a fi l e ) v i a t h e L C M e t h o d . B a s m o d u l e . T h i s m o d u l e h a s t w o p r i n c i p a l o b j e c t i v e s . T h e p r o g r a m fi r s t s e n d s o u t t h e p a r a m e t e r s t o t h e S P 8 7 0 0 S D S . T h e p r o g r a m c a n s e n d o u t a c o m m a n d a s f a s t a s 0 . 2 s e c o n d s p e r c o m m a n d f o r r a p i d a n d e r r o r f r e e p r o g r a m m i n g o f t h e S D S . A w a i t s t a t e o f 0 . 2 w a s i m p o s e d s i n c e t h e p r o g r a m i s a b l e t o s e n d o u t c o m m a n d s f a s t e r t h a n t h e S P 8 7 0 0 i s a b l e t o a c c e p t . T h e c o m m a n d s w e r e s e n t v i a s i x d i g i t a l l i n e s f r o m t h e 8 2 5 5 P r o t o t y p e b o a r d . T h e a b i l i t y o f a c o m p u t e r t o s e r v e a s a k e y p a d e m u l a t o r f o r t h e S P 8 7 0 0 h a s b e e n d e s c r i b e d p r e v i o u s l y . 8 ' 9 T h i s m o d u l e a l s o m o n i t o r e d t h e a v a i l a b i l i t y o f t h e S P 8 7 0 0 fi l e s a n d r e p o r t e d w h i c h fi l e s w e r e i n u s e o r v a c a n t t o t h e H P L C - C o n m o d u l e . T h e m o d u l e a l s o e n c o d e s t h e l i n k F i l e a r r a y t o i n d i c a t e t h e s t a t u s o f p r o g r a m m i n g t h e m e t h o d s i n t o t h e S D S . 2 4 2 S e c t i o n 6 . 4 A s s e m b l y L a n g u a g e R o u t i n e T h e fi n a l s o f t w a r e t h a t w a s w r i t t e n t o a u t o m a t e t h e H P L C i s a n a s s e m b l y l a n g u a g e p r o g r a m w h i c h s e r v e s a s a n i n t e r r u p t r e q u e s t ( I R Q ) s e r v i c e r o u t i n e . O n e g o a l o f t h e c o n t r o l l e r s o f t w a r e i s t h a t i t b e a b l e t o m o n i t o r m u l t i p l e d e t e c t o r s . A d e t e c t o r i s p l a c e d a f t e r t h e p r e l i m i n a r y c o l u m n w h i l e a s e c o n d d e t e c t o r i s p l a c e d a f t e r t h e C S V . T h e p r e s e n c e o f t h e s e t w o , o r m o r e ( u p t o 1 6 ) , d e t e c t o r s a l l o w s t h e p r o g r a m t o m o n i t o r t h e e l u t i o n f r o m t w o d i f f e r e n t c o l u m n s . T o m o n i t o r t w o d i f f e r e n t d e t e c t o r s , t h e R T I a n d D M A c o n t r o l l e r m u s t b e a b l e t o r e a d t h e d e t e c t o r s i g n a l s a t t w o , o r m o r e , d i f f e r e n t a n a l o g i n p u t c h a n n e l s . T h e R T I 8 0 0 / 8 1 5 b o a r d c a n b e p r o g r a m m e d t o s c a n s e q u e n t i a l l y t h e d i f f e r e n t a n a l o g c h a n n e l i n p u t s ; h o w e v e r , i t s c a n s a l l s i x t e e n c h a n n e l s . T o o v e r c o m e t h e i n fl e x i b i l i t y o f t h e R T I b o a r d , a n i n t e r r u p t p r o c e d u r e w a s w r i t t e n t h a t s e q u e n t i a l l y i n c r e m e n t t h e m u l t i p l e x e r r e g i s t e r ( t h e m u l t i p l e x e r r e g i s t e r d e t e r m i n e s w h i c h a n a l o g c h a n n e l i s r e a d a n d d i g i t i z e d ) . A f t e r r e a d i n g a l l n - d e t e c t o r s , t h e a s s e m b l y l a n g u a g e p r o g r a m w r a p s a r o u n d t o t h e fi r s t c h a n n e l . T h e R T I b o a r d i s p r o g r a m m e d t o g e n e r a t e a n I n t e r r u p t o n I R Q 2 ( o r I R Q 9 f o r A T c l a s s m a c h i n e s a n d a b o v e ) w h e n a n a n a l o g t o d i g i t a l c o n v e r s i o n i s c o m p l e t e d . T h e fi r s t p a r t o f t h e a s s e m b l y p r o g r a m i s t h e l e a d e r . W h e n e v e r t h e o p e r a t o r u s e s m o r e t h a n o n e d e t e c t o r , S w i t V a l v c a l l s t h e l e a d e r . T h e l e a d e r s t o r e s a n d r e p l a c e s t h e c u r r e n t i n t e r r u p t s e r v i c e r o u t i n e f o r I R Q 2 / 9 w i t h t h e n e w r o u t i n e . W h e n t h e a c q u i s i t i o n i s c o m p l e t e d , S w i t V a l v c a l l s a s e c o n d p r o c e d u r e t o r e s t o r e t h e o r i g i n a l s e r v i c e r o u t i n e . T h e I R Q r o u t i n e i s c a l l e d a f t e r e a c h a n a l o g t o d i g i t a l c o n v e r s i o n . T h e p r o g r a m r e a d s t h e c u r r e n t v a l u e o f t h e m u l t i p l e x e r , i n c r e m e n t s i t b y o n e , a n d w r a p s b a c k t o t h e fi r s t c h a n n e l i f t h e m u l t i p l e x e r w a s r e a d i n g t h e f i n a l ( n t h ) d e t e c t o r . T h e p r o g r a m t h e n r e - p r o g r a m s t h e m u l t i p l e x e r r e g i s t e r o f t h e R T I b o a r d . B y s c a n n i n g t h e c h a n n e l s , S w i t V a l v m u s t d e - c o n v o l u t e t h e d a t a w h e n s a v i n g t h e d a t a o r w h e n d e t e r m i n i n g i f a c o m p o n e n t i s e l u t i n g . T h i s i s a s i m p l e p r o c e s s o f t a k i n g 2 4 3 t h e c u r r e n t d a t a p o i n t ( o b t a i n e d f r o m t h e D M A c u r r e n t w o r d r e g i s t e r ) a n d d i v i d i n g i t b y t h e n u m b e r o f d e t e c t o r s . T h e m o d u l u s o f t h e d i v i s i o n i n d i c a t e s w h i c h d e t e c t o r i s b e i n g u s e d . T o o b t a i n t h e c u r r e n t d a t a f r o m a p a r t i c u l a r d e t e c t o r , t h e m o d u l u s a n d d e s i r e d c h a n n e l n u m b e r a r e s u b t r a c t e d f r o m t h e c u r r e n t w o r d . T h e m o d u l u s i s s u b t r a c t e d r e p e t i t i v e l y t o o b t a i n t h e l a t e s t s e v e n d a t a p o i n t s f r o m t h e d e s i r e d d e t e c t o r . T h e s e d a t a p o i n t s a r e u s e d i n t h e l i n e a r r e g r e s s i o n d e t e r m i n a t i o n o f s l o p e . F o r e x a m p l e , a s s u m e t h r e e d e t e c t o r s a r e b e i n g u s e d , t h e c u r r e n t d a t a p o i n t i s t h e 1 0 0 t h , a n d i n f o r m a t i o n f r o m t h e s e c o n d d e t e c t o r i s d e s i r e d . 1 0 0 M o d 3 - 1 T h e v a l u e o f 1 i n d i c a t e s t h a t t h e 1 0 0 t h d a t a p o i n t c a m e f r o m t h e s e c o n d d e t e c t o r ( t h e fi r s t d e t e c t o r i s l a b e l e d a s d e t e c t o r 0 o n t h e R T I b o a r d ) . T h e r e f o r e t h e l a s t s e v e n d a t a p o i n t s f o r t h e s e c o n d d e t e c t o r a r e : 1 0 0 — 0 — 2 ( 0 ) - 1 0 0 1 0 0 — 0 — 2 ( l ) - 9 8 1 0 0 — 0 — 2 ( 2 ) - 9 6 a n d s o f o r t h . I n t h e c a l c u l a t i o n s , z e r o i s t h e m o d u l u s , t h e v a l u e o f t w o i n d i c a t e s t h a t t h e d a t a i s t o b e t a k e n f r o m t h e s e c o n d d e t e c t o r , a n d t h e m u l t i p l i e r o f 2 ( e . g . , 0 , 1 , 2 , 6 ) p r o v i d e s t h e s e v e n s u c c e s s i v e d a t a p o i n t s . S e c t i o n 6 . 5 P r o g r a m m a b l e P a r a l l e l I n t e r f a c e P r o t o t y p e B o a r d T h e p r e v i o u s s e c t i o n d e s c r i b e d t h e s o f t w a r e t h a t w a s w r i t t e n t o p r o v i d e a n a u t o m a t e d i n s t r u m e n t . T h i s s e c t i o n d e s c r i b e s t h e h a r d w a r e u s e d t o p r o v i d e a d d i t i o n a l a u t o m a t i o n f o r t h e H P L C i n s t r u m e n t . I n p a r t i c u l a r , t h i s s e c t i o n d e s c r i b e s a p r o t o t y p e c a r d c o n t a i n i n g a n 8 2 5 5 - 5 P r o g r a m m a b l e P a r a l l e l I n t e r f a c e c h i p . T h e i n i t i a l c o n t r o l l e r p r o g r a m u s e d t h e d i g i t a l i n p u t / o u t p u t l i n e s o n t h e A n a l o g D e v i c e s R T I 8 0 0 / 8 1 5 d a t a a c q u i s i t i o n b o a r d t o c o n t r o l t h e d i f f e r e n t d e v i c e s . A t t h a t t i m e , t h e c a p a b i l i t i e s o f t h e b o a r d w e r e s u f fi c i e n t t o p r o v i d e a l l t h e d i g i t a l i n p u t / o u t p u t 2 4 4 ( 1 / 0 ) l i n e s t h a t w e r e n e e d e d . T h e R T I b o a r d h a s 8 i n p u t a n d 8 o u t p u t l i n e s t h a t c a n b e u s e d . O f t h e s e , t w o o u t p u t s w e r e u s e d t o c o n t r o l t h e t w o R h e o d y n e v a l v e s a n d t h r e e i n p u t l i n e s w e r e u s e d t o m o n i t o r t h e p o s i t i o n o f t h e t w o R h e o d y n e v a l v e s a n d t h e i n j e c t i o n v a l v e . T h e s e c o n d g e n e r a t i o n o f t h e c o n t r o l l e r p r o g r a m e x c e e d e d t h e n u m b e r o f d i g i t a l I / O l i n e s t h a t w e r e a v a i l a b l e . T a b l e 6 . 2 d e s c r i b e s t h e d i g i t a l l i n e s t h a t a r e n e e d e d . T h e e n t r i e s m a r k e d w i t h a n a s t e r i s k a r e a l r e a d y p r o v i d e d b y t h e R T I b o a r d . S i n c e t h e c o n t r o l l e r p r o g r a m n o w r e q u i r e s s e v e n t e e n a d d i t i o n a l I / O l i n e s , i n a d d i t i o n t o t h e fi v e l i n e s a l r e a d y i n u s e , t h e P P I p r o t o t y p e b o a r d w a s d e v e l o p e d . A W i r e w r a p P r o t o t y p e C a r d , M o d e l I B M - P R 2 , w a s p u r c h a s e d f r o m J D R M i c r o d e v i c e s ( L o s G a t o s , C A ) . T h i s b o a r d c o n t a i n s t h e a d d r e s s e n c o d i n g h a r d w a r e w i r e d o n t h e b o a r d . T h e b o a r d r e q u i r e s o n l y t h a t t h e s u p p o r t c h i p s b e s o l d e r e d o n t o t h e b o a r d . T h e s e s u p p o r t c h i p s e n a b l e a d d r e s s i n g o f b o t h t h e b o a r d a n d u p t o e i g h t p e r i p h e r a l c h i p s o n t h e b o a r d . C o m m u n i c a t i o n w i t h t h e b o a r d i s a c c o m p l i s h e d b y s e t t i n g a d d r e s s l i n e s A 8 - A 5 , v i a a D I P s w i t c h , t o a n u n u s e d p o r t a d d r e s s ( A 9 i s h a r d w i r e d t o a 1 ) . A d d r e s s l i n e s A 4 - A 2 a r e u s e d t o s e l e c t o n e o f t h e e i g h t p o s s i b l e p e r i p h e r a l c h i p s . A l a n d A 0 a r e u s e d a s c o n t r o l w o r d s f o r t h e P P I c h i p . P o r t a d d r e s s 3 4 0 ( h e x a d e c i m a l ) i s c u r r e n t l y u s e d b y t h e P r o t o t y p e b o a r d . T h e P P I c h i p ( 8 2 5 5 A - 5 ) i s a 4 0 p i n , V L S I ( v e r y l a r g e s c a l e i n t e g r a t e d ) c h i p w h i c h p r o v i d e s t w e n t y - f o u r p r o g r a m m a b l e T T L I / O l i n e s w i t h v e r y g o o d D C d r i v i n g c a p a b i l i t y m r l l T h e I n p u t s a r e n o t l a t c h e d w h i l e t h e o u t p u t l i n e s a r e l a t c h e d . T h e P P I h a s t h r e e m o d e s o f o p e r a t i o n . I n M o d e 0 , g r o u p s A a n d B a r e 8 b i t s w i d e w h i l e g r o u p C i s d i v i d e d i n t o t w o s u b - g r o u p s , C H i g h a n d C L o w ' e a c h 4 b i t s w i d e . A , B , a n d t h e t w o C g r o u p s c a n b e i n d e p e n d e n t l y p r o g r a m m e d t o b e e i t h e r i n p u t s o r o u t p u t s . I n M o d e 1 G r o u p s A a n d B a r e e i t h e r i n p u t s o r o u t p u t s a n d G r o u p C i s u s e d a s a c o n t r o l f o r h a n d s h a k i n g . M o d e 2 u s e s o n e 8 b i t w i d e b i - d i r e c t i o n a l p o r t a n d o n e S - b i t c o n t r o l p o r t . 2 4 5 G r o u p A a n d B c a n b e p r o g r a m m e d i n a n y o n e o f t h e t h r e e m o d e s i n d e p e n d e n t o f t h e o t h e r . T h e P P I c a n r e a d t h e p o r t s f a s t e r t h a n 2 5 0 n a n o s e c o n d s . T h e fl e x i b i l i t y o f t h e P P I a l l o w s f o r a w i d e p o s s i b l e u s e t o c o n t r o l d e v i c e s . T a b l e 6 . 2 D i g i t a l I n p u t / O u t p u t L i n e s N e e d e d f o r t h e S e c o n d G e n e r a t i o n C o n t r o l l e r U s e N u m b e r o f I / O l i n e s I n p u t / O u t p u t R e q u i r e d S D S C o n t r o l 7 I O u t p u t C S V C o n t r o l 2 O u t p u t C S V S t a t u s 6 I n p u t F l o w R e a d y S t a t u s l i n e 1 I n p u t G a t e C o n t r o l f o r T i r n e r - C o u n t e r s 1 O u t p u t * C o n t r o l R h e o d y n e V a l v e s 2 O u t p u t * R h e o d y n e / l n j e c t o r S t a t u s 3 I n p u t I n t h i s r e s e a r c h p r o j e c t , t h e F F ] i s p r o g r a m m e d t o M o d e 0 t o p r o v i d e t h e l a r g e s t n u m b e r o f I / O l i n e s . G r o u p A i s p r o g r a m m e d a s I n p u t a n d i s c o n n e c t e d t o t h e C S V t o m o n i t o r t h e p o s i t i o n o f t h e v a l v e . G r o u p B i s s e t t o O u t p u t m o d e a n d i s c o n n e c t e d t o t h e S D S t o a l l o w t h e c o n t r o l l e r s o f t w a r e t o p r o g r a m t h e S D S . G r o u p C L O “ , o p e r a t e s i n O u t p u t m o d e . T w o o f t h e f o u r h i t s a r e c o n n e c t e d t o t h e 7 4 1 5 2 2 1 m o n o s t a b l e c i r c u i t ( v i d e i n f r a ) w h i c h c o n t r o l s t h e C S V . O n e o t h e r b i t i s c o n n e c t e d t o t h e g a t e c i r c u i t . G r o u p C H i g h i s s e t u p i n i n p u t m o d e a n d i s u s e d t o m o n i t o r t h e F l o w R e a d y s i g n a l f r o m t h e S D S . T h e s e c o n n e c t i o n s a r e s h o w n i n F i g u r e 6 . 7 . P o r t A I n p u t P o r t C ( L o w ) O u t p u t P o r t B O u t p u t P o r t C ( H i ) I n p u t 2 4 6 8 8 % . C S V S t a t u s L i n e s g 4 . 7 K Q ' 7 4 L 8 2 2 1 C S V C o n t r o l C S o l e n o i d s H G a t e S i g n a l H P L C S D S \ i i i ? ? ? " " F l o w R e a d y L i n e F i g u r e 6 . 7 D i g i t a l I / O C o n n e c t i o n s f r o m t h e P r o g r a m m a b l e P a r a l l e l I n t e r f a c e 2 4 7 D u r i n g t e s t i n g o f t h e c i r c u i t r y , i t w a s d e t e r m i n e d t h a t p u l l d o w n r e s i s t o r s w e r e r e q u i r e d . T h e h i g h i m p e d a n c e o f t h e P P I a c t e d a s a c a p a c i t o r w h i c h c a u s e d e r r a t i c a n d f a l s e s i g n a l s t o a p p e a r o n t h e d i g i t a l l i n e s . A p p l y i n g a m o m e n t a r y h i g h t o o n e o f t h e C S V s t a t u s l i n e s t o o k a p p r o x i m a t e l y t w o s e c o n d s b e f o r e t h e v o l t a g e d r o p p e d b a c k t o a l o w s i g n a l . W h e n t h e c o m p u t e r w a s fi r s t t u r n e d o n , r e s i d u a l v o l t a g e s a p p e a r e d o n t h e C S V c o n t r o l l i n e s , w h i c h c a u s e d t h e C S V i m m e d i a t e l y t o f i r e . T h e 7 4 1 3 2 2 1 c i r c u i t w o u l d w o r k o n l y 8 0 % o f t h e t i m e s i n c e t h e T T L s i g n a l s t h a t w e r e a p p l i e d t o t h e c i r c u i t w o u l d n o t g o t o a L o w a f t e r t h e s i g n a l w a s r e m o v e d . T h e s o l u t i o n w a s t o p u t a c u r r e n t l i m i t i n g r e s i s t o r t i e d t o g r o u n d o n e a c h 1 / 0 l i n e . T h i s p u l l d o w n r e s i s t o r p r o v i d e s a d i s c h a r g e p a t h a n d a l l o w s t h e v o l t a g e o n t h e 1 / 0 l i n e t o r e t u r n t o z e r o v o l t s ( g r o u n d ) s h o r t l y a f t e r t h e T T L H i g h s i g n a l i s r e m o v e d . A s e c o n d p r o b l e m t h a t o c c u r r e d w a s i n c o n s i s t e n t v a l v e s w i t c h i n g d u e t o g r o u n d l o o p p r o b l e m s . T h e p r o b l e m s t e m m e d f r o m t h e c o m p u t e r , H P L C , a n d v a l v e s n o t b e i n g a t t h e s a m e c o m m o n v o l t a g e . A s i n g l e c o m m o n p o i n t w a s m a d e o n t h e i n t e r f a c e b o x t h a t c o n n e c t s t h e R T ' I b o a r d t o t h e H P L C c o m p o n e n t s a n d a c o m m o n l i n e w a s b r o u g h t f r o m e v e r y c o m p o n e n t t o t h i s c o m m o n p o i n t . T h e i n c o n s i s t e n c y p r o b l e m w a s r e s o l v e d b y t h i s p r o c e d u r e . S e c t i o n 6 . 6 P n e u m a t i c A m p l i f i e r S e c t i o n 6 . 6 . 1 M o t i v a t i o n f o r U s e D u r i n g a v a l v e c h a n g e , t h e fl o w o f t h e m o b i l e p h a s e i s p e r t u r b e d w h i l e t h e v a l v e m o v e s f r o m o n e p o s i t i o n t o t h e n e x t . T h e p e r t u r b a t i o n c a n c r e a t e a s h o c k w a v e t h a t t r a v e l s d o w n t h e c o l u m n . T h i s p u l s e c a n s h o r t e n t h e l i f e t i m e o f t h e c o l u m n ; t h e r e f o r e , i t i s d e s i r a b l e t o d e c r e a s e t h e t r a n s i t i o n t i m e b e t w e e n p o s i t i o n s o f t h e v a l v e t o m i n i m i z e t h e p r e s s u r e w a v e . F o r c o l u m n s w i t c h i n g , v a l v e c h a n g e s h a v e t h e u n d e s i r a b l e p o t e n t i a l 2 4 8 t o c a u s e e l u a n t s t o b e s p l i t b e t w e e n t w o , o r m o r e , c o l u m n s i f t h e v a l v e s w i t c h i n g i s t o o s l o w . H a r v e y a n d S t e a r n s l 2 p r e s e n t e d a m e t h o d t o i n c r e a s e t h e s p e e d o f v a l v e s w i t c h i n g b y u s i n g a p i l o t v a l v e . A p i l o t v a l v e p u t s a h i g h e r fl o w o f g a s t o a n a c t u a t o r t o a m p l i f y i n g p n e u m a t i c a l l y t h e a i r p u l s e u s e d t o a c t u a t e t h e v a l v e . A f t e r d i s c u s s i o n w i t h H a r v e y , 1 3 i t w a s d e c i d e d t h a t a p i l o t v a l v e w o u l d b e a p p r o p r i a t e i n c o n j u n c t i o n w i t h t h e C S V u s e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n . F i g u r e 6 . 8 p r o v i d e s a s c h e m a t i c o f t h e p i l o t v a l v e . A T T L s i g n a l i s a p p l i e d t o t h e O p t o - 2 0 o p t i c a l l y i s o l a t e d r e l a y t h a t a p p l i e s a 1 1 0 V s i g n a l t o t h e s o l e n o i d . T h e s o l e n o i d t h e n s e n d s a n a i r p u l s e t o t h e p i l o t v a l v e s . T h e p i l o t v a l v e s a r e i n t u r n a c t u a t e d a n d o p e n t h e v a l v e t o t h e h i g h p r e s s u r e g a s . T h e C S V r e q u i r e s t w o d i f f e r e n t e v e n t s t o i n i t i a t e a v a l v e c h a n g e . F i r s t , t h e C S V m u s t b e r a t c h e t e d , o r a r m e d . A f t e r b e i n g a r m e d , a s e c o n d a i r p u l s e m o v e s t h e v a l v e . S e c t i o n 6 . 6 . 2 I n i t i a l S o f t w a r e C o n t r o l I n i t i a l l y t h e C S V a n d p i l o t v a l v e a s s e m b l y w e r e c o n t r o l l e d b y s e n d i n g o u t t w o T I T . s i g n a l s t o t h e t w o O p t o - 2 2 ' s c o n n e c t e d t o t h e A R M a n d F I R E p o r t s o f t h e C S V . S o f t w a r e p a u s e s w e r e r e q u i r e d b e t w e e n a r m i n g a n d fi r i n g t h e v a l v e . T h e s e p a u s e s w e r e a c c o m p l i s h e d b y p u t t i n g a d u m m y l o o p s t r u c t u r e i n t o t h e c o d e : F O R X = 1 T O 1 0 0 0 X - X N E X T X T h e d u m m y s t r u c t u r e c r e a t e d a 0 . 1 2 3 s e c o n d t r a n s i t i o n t i m e b e t w e e n p o s i t i o n s o f t h e C S V . T h e t r a n s i t i o n t i m e w a s d e e m e d t o b e u n a c c e p t a b l e s i n c e a t o t a l t r a n s i t i o n t i m e t o s w i t c h f r o m p o s i t i o n 1 t o 6 w o u l d r e q u i r e 0 . 6 1 5 s e c o n d s . A l s o , w h i l e t h e C P U i s o c c u p i e d w i t h e x e c u d n g t h e d u m m y l o o p , a p e a k m a y n o t b e d e t e c t e d o r a v a l v e c h a n g e m a y b e m i s s e d . O n e f i n a l c o n c e r n i s t h a t t h e r e p r o d u c i b i l i t y o f v a l v e s w i t c h i n g i s d e c r e a s e d s i n c e t h e t i m e b e t w e e n s w i t c h i n g i s n o w d e t e r m i n e d b y t h e C P U . I f a 2 4 9 d i f f e r e n t c o m p u t e r i s u s e d , t h e c o d e m u s t b e c h a n g e d t o a n e w l o o p t i m e . A l s o , t h e t i m e r e q u i r e d t o i t e r a t e t h e a b o v e l o o p v a r i e s e v e n o n t h e s a m e c o m p u t e r . T h i s i s d u e t o t h e I n t e r r u p t R e q u e s t s e r v i c e r o u t i n e a n d D M A c o n t r o l l e r t a k i n g c o n t r o l o f t h e C P U a n d / o r t h e d a t a b u s ( e v e n a m b i e n t t e m p e r a t u r e a f f e c t s t h e C P U s p e e d ) . T h e n e x t d e v e l o p m e n t w a s t o c r e a t e a h a r d w a r e c i r c u i t t h a t w o u l d g e n e r a t e v e r y f a s t a n d r e p r o d u c i b l e T T L p u l s e s . U s i n g h a r d w a r e t o c o n t r o l t h e p u l s e s m a k e s t h e v a l v e s w i t c h i n g i n d e p e n d e n t o f t h e c o m p u t e r u s e d . T h i s c i r c u i t i s d e s c r i b e d i n t h e n e x t s e c t i o n . S e c t i o n 6 . 6 . 3 T i m i n g C i r c u i t A t i m i n g c i r c u i t u s i n g a 7 4 1 5 2 2 1 d u a l m o n o s t a b l e w a s m a d e . T h i s c i r c u i t i s g i v e n i n F i g u r e 6 . 9 . T h e t w o i n p u t s , T T L 1 a n d T T L 2 , a r e s u p p l i e d f r o m t h e p r o t o t y p e b o a r d . T h e o u t p u t , Q 1 , i s u s e d t o A R M , o r r a t c h e t , t h e C S V a n d a s a n i n p u t t o t h e s e c o n d m o n o s t a b l e . O u t p u t Q 2 i s u s e d t o F I R E , o r m o v e , t h e C S V . T h e w i d t h o f t h e p e a k g e n e r a t e d c a n b e c a l c u l a t e d f r o m t w - R m C e x t l n 2 E q u a t i o n 6 . 6 w h e r e R e m a n d C e x t a r e t h e e x t e r n a l r e s i s t a n c e a n d c a p a c i t a n c e f o r e a c h m o n o s t a b l e . T a b l e 6 . 3 p r o v i d e s t h e t r u t h t a b l e f o r t h e m o n o s t a b l e . F i g u r e 6 . 1 0 g i v e s t h e t i m i n g s c h e m e t h a t i s u s e d t o g e n e r a t e t w o p u l s e s . T h e f a l l i n g e d g e o f Q 1 i s u s e d t o t r i g g e r t h e o u t p u t f r o m Q 2 . I n t h i s f a s h i o n , t w o s u c c e s s i v e p e a k s a r e g e n e r a t e d s o t h a t t h e C S V h a s t i m e t o A R M a n d t h e n i m m e d i a t e l y F I R E — / 4 " O . . D 7 T u b _ \ r — 1 1 . c 1 ' D V a l v e / A c t u { : c 2 g i a n t o r g n E 1 / 8 D " 0 . . T u b i 1 I R ( Z H B E ; ) 2 5 0 F i g u r e 6 . 8 S c h e m a t i c o f P i l o t V a l v e 2 5 1 A R M T T L 1 T T L 1 ‘ W H { — 1 1 ( I ? I ) ( I ) V c c R 1 c 1 Q 1 6 2 C L R 2 1 1 2 A 2 7 4 1 . 5 2 2 1 D u a l M o n o s t a b l e A 1 B I a m ( 1 1 ( 1 2 c 2 R 2 G N D 8 . . ” H e / H e T T L 2 T T L 1 F i r e F i g u r e 6 . 9 7 4 L S Z Z I D u a l M o n o s t a b l e C i r c u i t 2 5 2 T a b l e 6 . 3 L o g i c T a b l e f o r t h e 7 4 L S Z Z I D u a l M o n o s t a b l e C I R A I n p u t B I n p u t Q O u t p u t 6 O u t p u t H H H U U J : : : - ~ _ i L H H H L _ J U _ _ I R i s i n g E d g e 1 F a l l i n g E d g e — D o e s N o t M a t t e r A s e r i e s o f e x p e r i m e n t s w a s d o n e t o d e t e r m i n e t h e f a s t e s t p o s s i b l e s w i t c h i n g t i m e . D i f f e r e n t r e s i s t o r s w e r e c h o s e n t o g i v e s m a l l e r p u l s e w i d t h s f o r A R M a n d F I R E , a n d a t l e a s t t w e n t y - f o u r v a l v e s w i t c h e s w e r e m a d e f o r t h a t c o m b i n a t i o n o f p u l s e w i d t h s . W h e n t h e C S V s t a r t e d n o t t o m a k e t h e v a l v e s w i t c h e s , t h e g a s p r e s s u r e t o t h e p i l o t v a l v e s w a s i n c r e a s e o r t h e r a t i o o f A R M t o F I R E p u l s e w i d t h w a s c h a n g e d . T h e r e s u l t s o f t h e s e e x p e r i m e n t s a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 6 . 4 . A l l t i m e s a r e i n m i l l i s e c o n d s a n d g a s t a n k p r e s s u r e s a r e i n p s i . P s o l e n o i d a n d P p i l o t r e f e r t o p r e s s u r e s ( a n d g a s t y p e s ) u s e d f o r t h e s o l e n o i d a n d t h e p i l o t v a l v e s , r e s p e c t i v e l y . N o t i n c l u d e d i n t h i s t a b l e a r e a s e r i e s o f e x p e r i m e n t s i n w h i c h t a r m w a s m u c h s m a l l e r t h a n t f i r e s i n c e t h e a r m i n g t i m e w a s d e t e r m i n e d t o r e q u i r e a t l e a s t e q u a l t o , o r l o n g e r , t i m e t h a n t h e fi r i n g t i m e ; o t h e r w i s e , t h e v a l v e w i l l n o t s w i t c h a t a l l . I W W 2 5 3 T T L 1 I H i g h L e v e l T r i g g e r T 1 1 2 C L R 1 , 2 I A l a - 6 N D R i s i n g E d g e T r i g g e r A 2 ( Q 1 ) I I Q 1 T 1 Q 2 l 1 F i g u r e 6 . 1 0 T i m i n g S c h e m e u s e d t o S w i t c h t h e C o l u m n S e l e c t i o n V a l v e v i a t h e 7 4 L S Z Z I T i m i n g C i r c u i t > P r e s s u r e a n d g a s c h o i c e a f f e c t s i g n i fi c a n t l y t h e s w i t c h i n g t i m e s . O n c e t h e s o l e n o i d s a r e f i r e d , a h i g h e r p r e s s u r e a l l o w s t h e a i r p u l s e t o t r a v e r s e m o r e q u i c k l y f r o m t h e g a s t a n k t o t h e p i l o t v a l v e a n d C S V . S w i t c h i n g t o h e l i u m f o r b o t h t h e s o l e n o i d a n d t h e p i l o t v a l v e a l s o i m p r o v e d s w i t c h i n g t i m e s . T h i s f o l l o w s f r o m G r a h a m ' s L a w t h a t s t a t e s t h a t g a s v e l o c i t y i s i n v e r s e l y r e l a t e d t o t h e s q u a r e r o o t o f t h e m o l e c u l a r m a s s o f t h e g a s . H e s h o u l d b e a p p r o x i m a t e l y 2 . 6 t i m e s f a s t e r t h a n n i t r o g e n . T h i s s p e e d i n c r e a s e c a n b e s e e n i n t h e d r o p f r o m a m i n i m u m s w i t c h i n g t i m e o f a p p r o x i m a t e l y 5 0 m i l l i s e c o n d s t o a p p r o x i m a t e l y 3 5 m i l l i s e c o n d s . U n f o r t u n a t e l y , t h e m a x i m u m p r e s s u r e i s l 5 0 p s i ( r a t e d a t 1 0 0 p s i ) w h i c h l i m i t s t h e f a s t e s t s w i t c h i n g t i m e t o a p p r o x i m a t e l y 3 5 m i l l i s e c o n d s . T h i s l i m i t a t i o n g i v e s a m a x i m u m t r a n s i t i o n t i m e ( s w i t c h i n g f r o m p o s i t i o n 0 t o 5 ) o f 1 7 5 m i l l i s e c o n d s . 2 5 4 T a b l e 6 . 4 R e s u l t s f r o m t h e O p t i m i z a t i o n o f S w i t c h i n g T i m e s a n d P r e s s u r e s f o r t h e P i l o t V a l v e P s o l e n o i d P p i l o t t a r m t fi r e t t o t a l R e m a r k s 5 0 ( N ) 5 0 ( H e ) 2 3 0 4 0 2 7 0 W o r k s 5 0 0 3 2 ) s o ( H e ) 7 0 4 0 1 1 0 W o r k s 5 0 ( N 2 ) 5 0 ( H e ) 2 3 4 0 6 3 F a i l e d 5 0 ( N 2 ) 5 0 ( H e ) 7 0 1 8 8 8 F a i l e d 8 5 ( N ) 9 0 ( H e ) 3 2 1 8 5 0 W o r k e d 1 0 0 ( N 2 ) 1 0 0 ( H e ) 2 3 1 8 4 1 W o r k e d o n l y 5 0 % o f t h e t i m e 1 0 0 ( H e ) 1 0 0 ( H e ) 2 2 . 7 2 3 4 5 . 3 W o r k e d 9 4 % o f t h e t i m e 1 2 0 ( H e ) 1 2 0 ( H e ) 1 7 1 9 . 4 3 6 . 8 8 0 % s u c c e s s P r i v a t e c o m m u n i c a t i o n w i t h D r . H a r v e y p r o v i d e d i n f o r m a t i o n t h a t t h i s r e s e a r c h w a s t h e fi r s t t o h a v e t h e C S V s w i t c h t h i s f a s t . H a r v e y s u g g e s t e d t h a t a p o t e n t i a l i m p r o v e m e n t o f 2 0 t o 3 0 % c o u l d b e a c h i e v e d b y r e - b o r i n g t h e p i l o t v a l v e s . A r e d u c e r b u s h i n g w h i c h c o n n e c t s t h e p i l o t v a l v e s t o t h e C S V i s t h e m a i n c o n s t r i c t i o n f o r t h e g a s fl o w w h e n o p e r a t i n g t h e C S V a t t h i s h i g h o f a s p e e d . T h e C S V h a s n o t b e e n r e - b o r e d a t t h i s t i m e , b u t i t i s p o s s i b l e t o d r o p t h e m a x i m u m t r a n s i t i o n t i m e t o 1 2 0 - 1 4 0 m i l l i s e c o n d s . P A R T 2 : P R E L I M I N A R Y A P P L I C A T I O N S O F T H E C O N T R O L L E R S O F T W A R E F O R H P L C S E P A R A T I O N S T h e m o s t d a n g e r o u s t h i n g i n t h e w o r l d i s t o t r y t o l e a p a c h a s m i n t w o j u m p s . W i l l i a m l l o y d G e o r g e T h e o n l y t i m e y o u d o n ' t f a l l i s t h e l a s t t i m e y o u t r y a n y t h i n g - a n d i t w o r k s . W i l l i a m S t r o n g 2 5 5 2 5 6 S e c t i o n 6 . 7 I n t e g r a t i o n o f t h e E x p e r t S y s t e m a n d H P L C C o n t r o l l e r T h i s s e c t i o n d e s c r i b e s t w o d i f f e r e n t s e t s o f e x p e r i m e n t s t h a t w e r e p e r f o r m e d u s i n g t h e H P L C c o n t r o l l e r s o f t w a r e . T h e f i r s t s e t o f e x p e r i m e n t s d e m o n s t r a t e s t h e fi r s t l e v e l o f o b t a i n i n g a n i n t e l l i g e n t a u t o m a t e d H P L C i n s t r u m e n t . C o n s u l t a t i o n w i t h t h e e x p e r t s y s t e m p r o p o s e d s e v e r a l m e t h o d s f o r t h e s e p a r a t i o n o f t h e d i f f e r e n t s a m p l e s . T h e p r o p o s e d m e t h o d s a r e t h e n p r o g r a m m e d i n t o t h e H P L C i n s t r u m e n t a n d t h e c o n t r o l l e r s o f t w a r e r a n t h e e x p e r i m e n t s . T h e s e e x p e r i m e n t s d e m o n s t r a t e t h e a b i l i t y o f t h e e x p e r t s y s t e m t o p r o p o s e a m e t h o d ( s ) f o r t h e s e p a r a t i o n o f s a m p l e s . T h e s e c o n d s e t o f e x p e r i m e n t s d e m o n s t r a t e s t h e a b i l i t y o f t h e s o f t w a r e t o p e r f o r m c o l u m n s w i t c h i n g b a s e d u p o n t h e p e a k d e t e c t i o n . P r e l i m i n a r y s t u d i e s a r e s h o w n t h a t d e m o n s t r a t e t h e a b i l i t y o f t h e c o n t r o l l e r s o f t w a r e t o p e r f o r m r e p r o d u c i b l e v a l v e c h a n g i n g . T h e s e e x p e r i m e n t s d o n o t d e m o n s t r a t e m u l t i d i m e n s i o n a l c h r o m a t o g r a p h y , b u t d o d e m o n s t r a t e t h e p o t e n t i a l , f o r m u l t i d i m e n s i o n a l c h r o m a t o g r a p h y v i a t h e e x t e n s i o n o f t h e e x p e r t s y s t e m ( s e e C h a p t e r 7 ) a n d t h e c u r r e n t H P L C c o n t r o l l e r s o f t w a r e . T h i s s e c t i o n d e s c r i b e s t h e fi r s t g e n e r a t i o n o f e x p e r t s y s t e m i n t e g r a t i o n w i t h t h e H P L C c o n t r o l l e r s o f t w a r e . T h e r e c o m m e n d a t i o n s o f t h e e x p e r t s y s t e m a r e m a n u a l l y p r o g r a m m e d i n t o t h e c o n t r o l l e r s o f t w a r e a n d t h e c o n t r o l l e r p r o g r a m p e r f o r m s t h e e x p e r i m e n t . T w o a d d i t i o n a l v a l i d a t i o n s t u d i e s a r e p r e s e n t e d t o s h o w t h e i n t e g r a t i o n o f H P L C A d v i s e r w i t h t h e c o n t r o l l e r s o f t w a r e . T h e v a l i d a t i o n s t u d i e s i n c o r p o r a t e d o n l y t h e c o l u m n s e l e c t i o n m o d u l e o f t h e e x p e r t s y s t e m . S e c t i o n 6 . 7 . 1 D e t e r m i n a t i o n o f H P L C C o n t r o l l e r P a r a m e t e r s S e c t i o n 6 . 7 . 1 . 1 P e a k D e t e c t i o n T h r e s h o l d s T h e c o n t r o l l e r s o f t w a r e c o n t a i n s a p e a k d e t e c t i o n r o u t i n e t o d e t e r m i n e t h e e l u t i o n o f c o m p o n e n t s . A p e a k d e t e r m i n a t i o n o c c u r s b a s e d u p o n t w o c r i t e r i a . T h e f i r s t 2 5 7 c r i t e r i o n u s e s a s e v e n p o i n t l i n e a r r e g r e s s i o n r o u t i n e t o d e t e r m i n e t h e s l o p e o f t h e o u t p u t f r o m t h e d e t e c t o r . T h e s l o p e o f t h e l i n e a r r e g r e s s i o n i s g i v e n b y E q u a t i o n 6 . 7 . 1 4 b = I E q u a t i o n 6 . 7 T h e a b s o l u t e v a l u e o f t h e s l o p e i s n o t i m p o r t a n t ; o n l y t h e r e l a t i v e s l o p e i s i m p o r t a n t . S i n c e t h e s e v e n d a t a p o i n t s a r e t a k e n a t r e g u l a r i n c r e m e n t s , t h e v a l u e s f o r x i c a n b e g i v e n a s i n t e g e r v a l u e s f r o m 0 t o 6 . T h e s e v a l u e s f o r x i c a n b e s u b s t i t u t e d i n t o E q u a t i o n 6 . 7 , a n d t h e r e l a t i v e l i n e a r r e g r e s s i o n e q u a t i o n c a n b e m a t h e m a t i c a l l y r e d u c e d t o t h e f o r m g i v e n i n E q u a t i o n 6 . 8 . T h i s f o r m i s c o m p u t a t i o n a l l y s i m p l e r a n d r e q u i r e s l e s s C P U t i m e t o b e c a l c u l a t e d . T h e v a l u e o f t h e c a l c u l a t e d s l o p e i s c o m p a r e d t o s o m e u s e r - d e fi n e d s l o p e t h r e s h o l d v a l u e . O n c e t h e c a l c u l a t e d s l o p e e x c e e d s t h i s t h r e s h o l d , t h e fi r s t c r i t e r i o n f o r p e a k d e t e c t i o n h a s b e e n m e t . T h e s e c o n d c r i t e r i o n t h a t m u s t b e m e t i s t h a t t h e a v e r a g e o f t h e s e v e n d a t a p o i n t s m u s t b e l a r g e r t h a n a s e c o n d h e i g h t t h r e s h o l d . T h i s t h r e s h o l d i n s u r e s t h a t a n o i s y s i g n a l t h a t m a y h a v e t h e r e f o r e a s l o p e g r e a t e r t h a n t h e s l o p e t h r e s h o l d w i l l n o t b e e r r o n e o u s l y c o u n t e d a s a p e a k . b s 3 ( y 6 - y o ) + 2 ( y 5 - Y 1 ) + ( y , - y 2 ) E q u a t i o n 6 . 8 T h e c o m p l e t e a l g o r i t h m f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f a p e a k r e q u i r e s t h r e e e v e n t s . T h e fi r s t e v e n t i s t h a t t h e c a l c u l a t e d s l o p e a n d a v e r a g e i s l a r g e r t h a n t h e r e s p e c t i v e t h r e s h o l d s . T h i s fi r s t e v e n t i n d i c a t e s t h e s t a r t o f a p e a k . T h e s e c o n d e v e n t r e q u i r e s t h a t a n e g a t i v e s l o p e i s c a l c u l a t e d w h i c h h a s a v a l u e l e s s t h a n t h e n e g a t i v e v a l u e o f t h e s l o p e t h r e s h o l d . T h i s e v e n t o c c u r s a t , o r s l i g h t l y a f t e r , t h e c r e s t o f t h e p e a k h a s 2 5 8 o c c u r r e d , a n d i s u s e d i n c o n j u n c t i o n w i t h t h e t h i r d e v e n t t o d e t e r m i n e t h e e n d o f t h e p e a k . T h e t h i r d e v e n t o c c u r s w h e n a n e g a t i v e s l o p e h a s o c c u r r e d ( a s d e t e r m i n e d b y t h e s e c o n d e v e n t ) a n d t h e c a l c u l a t e d s l o p e i s l e s s t h a n t h e t h r e s h o l d . T h e a l g o r i t h m h a s b e e n w r i t t e n s u c h t h a t t h e d e t e c t i o n o f a s t a r t o f a p e a k i s d i s a b l e d u n t i l t h e c o m p l e t e s e q u e n c e o f e v e n t s 2 a n d 3 h a v e o c c u r r e d . W i t h o u t t h i s a b i l i t y , t h e a l g o r i t h m w o u l d i n d i c a t e a s t a r t o f a p e a k f o r e v e r y p o i n t d u r i n g t h e u p s l o p e o f t h e p e a k . T h i s s c h e m e f o r c e s a s t a r t , c r e s t , a n d e n d o f t h e p e a k t o o c c u r . T h i s a p p r o a c h i s u s e d a l s o t o p r o v i d e a d d i t i o n a l fl e x i b i l i t y f o r t h e H P L C c o n t r o l l e r s o f t w a r e . T h e s o f t w a r e i s w r i t t e n t o a l l o w t h e u s e r t o s w i t c h c o l u m n s a n d v a l v e s a t t h e b e g i n n i n g o r e n d o f t h e e l u t i o n o f a c o m p o n e n t o f t h e s a m p l e . A s e r i e s o f e x p e r i m e n t s w a s c o n d u c t e d t o d e t e r m i n e a p p r o p r i a t e t h r e s h o l d v a l u e s f o r t h e s l o p e a n d p e a k h e i g h t . T h e s a m p l e c o n t a i n e d b e n z a l d e h y d e a n d b i p h e n y l a n d t h e H P L C c o n d i t i o n s u s e d d u r i n g t h e s e p a r a t i o n a r e g i v e n i n T a b l e 6 . 5 . T w o d i f f e r e n t d a t a a c q u i s i t i o n r a t e s w e r e u s e d . T h e d a t a f o r o n e s e t o f e x p e r i m e n t s w e r e c o l l e c t e d a t 1 d a t a a c q u i s i t i o n / s e c o n d , a n d t h e s e c o n d s e t w a s c o l l e c t e d a t 1 0 a c q u i s i t i o n s / s e c o n d . T h e r e s u l t i n g c h r o m a t o g r a m s a r e s h o w n i n F i g u r e s 6 . 1 1 , 6 . 1 2 A , a n d 6 . 1 2 B . ( T h e c h r o m a t o g r a m t a k e n a t 1 0 a c q u i s i t i o n s / s e c o n d h a d t o b e m a d e i n t o t w o p a r t s t o a l l o w i m p o r t a t i o n i n t o a n E x c e l s p r e a d s h e e t f o r d a t a i n t e r p r e t a t i o n . ) F i g u r e s 6 . 1 3 a n d 6 . 1 4 s h o w p l o t s o f t h e c a l c u l a t e d s l o p e s v e r s u s t i m e . I t w a s n o t e d t h a t t h e p e a k d e t e c t i o n a l g o r i t h m w a s u n a b l e t o r e p r o d u c i b i l i t y d e t e c t a p e a k f o r t h e e x p e r i m e n t s t a k e n a t t h e f a s t e r a c q u i s i t i o n r a t e s . F i g u r e 6 . 1 3 , f o r t h e a c q u i s i t i o n r a t e o f l / s e c o n d , s h o w s t h a t t h e s l o p e s o f t h e t w o p e a k s a r e s h a r p a n d d i s t i n c t i v e . T h e b a s e l i n e s l o p e s a r e s m a l l a n d a s l o p e o f 0 . 0 0 5 i s a t l e a s t t w o t i m e s t h e s l o p e o f t h e b a s e l i n e . F i g u r e 6 . 1 4 p r o v i d e s a s i m i l a r p l o t o f t h e s l o p e f o r t h e d a t a c o l l e c t e d a t 1 0 a c q u i s i t i o n s / s e c o n d . T h e fi r s t p e a k , w h i c h i s a s h a r p e r p e a k , w a s c o r r e c t l y d e t e c t e d , 2 5 9 b u t b r o a d e r p e a k s w e r e n o t d e t e c t e d o r n o t d e t e c t e d e a r l y i n t i m e . F i g u r e 6 . 1 4 s h o w s t h e s l o p e f r o m 4 0 0 s e c o n d s t o t h e e n d o f t h e e x p e r i m e n t . I n t h i s c a s e , t h e b a s e l i n e i s n o i s i e r a n d p r o v i d e s e r r o n e o u s p e a k r e p o r t i n g . S i n c e t h e r e a r e m o r e p o i n t s p e r s e c o n d , F i g u r e 6 . 1 5 s h o w s a n e x p a n s i o n f r o m 4 4 0 t o 4 5 0 s e c o n d s . T h i s fi g u r e d e m o n s t r a t e s t h a t t h e a c q u i s i t i o n r a t e i s f a s t e r t h a n t h e c h a n g e s i n t h e s i g n a l f r o m t h e d e t e c t o r ( t h e e f f e c t o f t h e a c q u i s i t i o n r a t e i s d e s c r i b e d i n m o r e d e t a i l b e l o w ) . T h e e f f e c t s o f s m a l l c h a n g e s i n t h e v o l t a g e o f t h e d e t e c t o r a l s o c a u s e d i f fi c u l t y i n p e a k d e t e c t i o n , a s c a n b e s e e n a t t h e p o i n t s i n d i c a t e d b y t h e a r r o w s . H e r e , t h e s l o p e e x p e r i e n c e s a s i g n i fi c a n t d e c r e a s e i n t h e s l o p e , w h i c h m a y b e b e l o w t h e t h r e s h o l d . F o r e v e n b r o a d e r o r m o r e g r a d u a l p e a k s o f o t h e r d a t a , t h e a l g o r i t h m m i s s e d t h e p e a k a l l t o g e t h e r . I f i t i s d e s i r e d t o a c q u i r e d a t a a t r a t e s f a s t e r t h a n 0 . 1 / s e c o n d , t h e p e a k a l g o r i t h m m u s t b e m o d i f i e d t o e i t h e r u s e m o r e t h a n s e v e n d a t a p o i n t s i n t h e r e g r e s s i o n o r t o a v e r a g e s e v e n p o i n t s a n d t a k e t h e l i n e a r r e g r e s s i o n o f s e v e n a v e r a g e p o i n t s . A s d i s c u s s e d i n t h e n e x t s e c t i o n , a n a c q u i s i t i o n r a t e o f l / s e c o n d i s s u f f i c i e n t f o r m o s t e x p e r i m e n t s a n d t h e a b o v e m o d i fi c a t i o n s a r e n o t n e e d e d . 2 6 0 T a b l e 6 . 5 E x p e r i m e n t a l P a r a m e t e r s f o r t h e A n a l y s i s o f B e n z a l d e h y d a n d B i p h e n y l P a r a m e t e r V a l u e C o l u m n D u p o n t Z o r b a x C 1 8 L e n g t h ( c m ) 2 5 D i a m e t e r ( m m ) 5 . 6 P a r t i c l e S i z e ( p m ) 5 M o b i l e P h a s e 1 0 0 % M e t h a n o l F l o w R a t e ( m L / m i n ) 0 . 5 0 D e t e c t o r T y p e B e c k m a n G o l d U V - V i s i b l e W a v e l e n g t h ( n m ) 2 5 4 R a n g e J A U F S ) 0 . 0 5 0 P e a k T h r e s h o l d s S l o p e 0 . 0 0 5 P e a k H e i g h t 0 . 1 0 0 ) s t l o V ( e s n o p s e R r o t c e t e D 2 p M Q o n Q \ I D O ) 9 V I 9 A p w 2 6 1 - . 4 - 1 0 0 2 0 0 3 ( 1 ) 4 ( 1 ) 5 0 0 T i m e ( S e c o n d s ) F i g u r e 6 . 1 1 B i p h e n y l a n d B e n z a l d e h y d e C h r o m a t o g r a m R a t e o f 1 A c q u i s i t i o n / S e c o n d 2 6 2 P a r t 1 o f C h r o m a t o g r a m ( 0 t o 4 0 0 s e c o n d s ) 0 . 2 5 V A 0 . 2 2 ’ . ' 6 2 g 0 . 1 5 « » 8 3 J I 5 0 . 1 ‘ 8 O 2 0 . 0 5 4 - 0 i i i i H . i 1 r i 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 T i m e ( s e c o n d s ) F i g u r e 6 . 1 2 A B i p h e n y l a n d B e n z a l d e h y d e C h r o m a t o g r a m R a t e o f 1 0 A c q u i s i t i o n s / S e c o n d p U ! D e t e c t o r R e s p o n s e ( V o l t s ) D 9 w . B 2 6 3 P a t 2 o f C h r o m a t o g r a m ( 4 0 0 - 7 0 0 s e c o n d s ) 4 5 0 5 0 0 5 5 0 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 T i m e ( s e c o n d s ) F i g u r e 6 . 1 2 8 B i p h e n y l a n d B e n z a l d e h y d e C h r o m a t o g r a m R a t e o f 1 0 A c q u i s i t i o n s / S e c o n d 2 6 4 A s e c o n d m o d i fi c a t i o n w a s m a d e t o t h e s y s t e m a f t e r c o m p a r i n g t h e d e t e c t o r r e s p o n s e a n d t h e d i g i t i z e d v a l u e s s t o r e d b y t h e c o m p u t e r . T h e B e c k m a n S y s t e m G o l d U V - V i s i b l e D e t e c t o r h a s a n o u t p u t o f i 1 V o l t F u l l S c a l e , w h i l e t h e R T I 8 0 0 / 8 1 5 d a t a a c q u i s i t i o n b o a r d h a s a m i n i m u m f u l l s c a l e o f 1 5 V o l t s f u l l s c a l e . T h i s n o n - e q u a l i t y b e t w e e n t h e d e t e c t o r a n d R T T b o a r d c a u s e d a n 8 0 % d e c r e a s e i n t h e r e s o l u t i o n o f t h e a n a l o g t o d i g i t a l c o n v e r s i o n . T o i m p r o v e t h e r e s o l u t i o n r e q u i r e s t h a t t h e f u l l 1 2 b i t s o f t h e R T I b o a r d h e u s e d . T h i s i m p r o v e m e n t i s a c h i e v e d b y t a k i n g t h e o u t p u t f r o m t h e d e t e c t o r a n d a m p l i f y i n g t h e o u t p u t t o 5 V o l t s t h r o u g h a L F 3 5 1 O p - A m p . T h e s c h e m a t i c f o r t h e a m p l i fi c a t i o n c i r c u i t i s g i v e n i n F i g u r e 6 . 1 6 . T h e a m p l i fi c a t i o n , i n a d d i t i o n t o i n c r e a s i n g t h e p r e c i s i o n o f t h e d a t a , i m p r o v e s t h e p e a k d e t e c t i o n r o u t i n e s i n c e t h e s l o p e s w i l l b e m u l t i p l i e d b y a f a c t o r o f 5 w h i c h a l l o w s t h e s l o p e s o f g r a d u a l c h a n g e s t o b e a m p l i fi e d . e p o l S P R l a o t t e o f o f S l 1 o A p c e q V u e i r s s u i t i s o T n i / m S e e c f o o n r d 2 6 5 0 . 0 4 T 0 . 0 3 H 0 . 0 2 4 - 0 . 0 1 - ~ 0 1 1 - - A A A A L A A : A r a . M A I L - . . H 1 . 1 1 1 - 4 - A A L A . r r ‘ V Y V ' T W V V V V ‘ v V ‘ T ' V V V ‘ V V V ' W V V V V ' W “ I V I j 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 - 0 . 0 1 a - - 0 . 0 2 J - T i m e ( s e c o n d s ) F i g u r e 6 . 1 3 e p o l S ' m 4 6 I I " W W W . l n l i T i m P a l t t o e R f o f o S 1 l 0 F o i p u g e A c q r V u i i e e e i n m ( " S 6 i s . t r s i i . l r e c o 1 u i n 4 s d o | s , . j i j I . i I i i . ’ i . g ' I 1 I . 1 E 1 “ . I “ . I w t . [ ' , j . . a 0 , ” 9 . ‘ ” “ 1 I ' v I ) T n i s m / S e e f c o o r n d 2 6 6 . 0 - 0 0 7 0 0 6 0 0 5 0 0 4 S l o p e 0 0 3 0 0 2 0 0 1 4 4 0 4 4 1 2 6 7 i t 1 i I l 1 l I I I I I T d i - 4 4 2 4 4 3 4 4 4 4 4 5 4 4 6 4 4 7 4 4 8 T i m e ( s e c o n d s ) F i g u r e 6 . 1 5 I n s e t o f t h e S l o p e f o r t h e R a t e o f 1 0 A c q u i s i t i o n s / S e c o n d l I I l 4 4 9 4 5 0 2 6 8 O u t p u t t o R 1 " ! T o a r c ! + 1 5 V o l t L F 3 5 1 N D e t e c t o r I n p u t W 3 . 2 3 K 0 F i g u r e 6 . 1 6 C i r c u i t t o P r o v i d e a G a i n o f 5 t o t h e H P L C D e t e c t o r O u t p u t - 1 5 V o l t 2 6 9 S e c t i o n 6 . 7 . 2 V a l i d a t i o n S t u d y o f B e n z a l d e h y d e , B i p h e n y l , a n d N a p h t h a l e n e A s a m p l e c o n t a i n i n g 1 . 3 1 x 1 0 ' 3 M B e n z a l d e h y d e , 3 . 8 3 x 1 0 ' 3 M N a p h t h a l e n e , a n d 8 . 3 3 x 1 0 ’ 4 M B i p h e n y l w a s m a d e . T h e s a m p l e w a s d e s c r i b e d a s a r o m a t i c m o l e c u l e s c o n t a i n i n g d i f f e r e n t s u b s t i t u e n t s a s p a r t o f t h e r i n g . T h e m o l e c u l e s w e r e a l s o d e s c r i b e d a s h a v i n g d i f f e r e n t p o l a r i t i e s w i t h a c o n f i d e n c e o f 8 0 % . T h e 8 0 C N F w a s u s e d t o s u b j e c t i v e l y d e s c r i b e d t h a t o n l y o n e o f t h e m o l e c u l e s , b e n z a l d e h y d e , w a s p o l a r w h i l e t h e o t h e r t w o s p e c i e s h a v e s i m i l a r p o l a r i t i e s . T h e m o l e c u l e s w e r e d e s c r i b e d a s c o n t a i n i n g a l d e h y d e s , w e r e s m a l l ( l e s s t h a n 2 0 0 0 g / m e l e ) , a n d w e r e s o l u b l e i n h e x a n e a n d m e t h a n o l / w a t e r . F i n a l l y , t h e e x p e r t s y s t e m w a s a l l o w e d t o d e t e r m i n e t h a t t h e s p e c i e s h a d a d i p o l e m o m e n t a n d e x h i b i t e d c h a r g e t r a n s f e r c h a r a c t e r i s t i c s . T h e e x p e r t s y s t e m r e c o m m e n d e d e R e v e r s e d - p h a s e w i t h a n a l k y l S i l a n e s t a t i o n a r y p h a s e C N F 1 0 0 o R e v e r s e d - p h a s e w i t h c y a n o p a c k i n g m a t e r i a l I C N F 1 0 0 e N o r m a l - p h a s e a d s o r p t i o n C N F 9 7 0 N o r m a l p h a s e b o n d e d w i t h c y a n o p a c k i n g m a t e r i a l C N F 9 2 . A s p e c i a l t y c o l u m n f o r a r o m a t i c s C N F 8 0 T h e s a m p l e w a s t h e n i n j e c t e d , a n d t h e d a t a a c q u i r e d u s i n g t h e H P L C c o n t r o l l e r s o f t w a r e . T h e a r r o w i n d i c a t e s a s h o u l d e r t h a t i s d i f f i c u l t t o s e e d u e t o t h e d i g i t i z a t i o n o f t h e d a t a . T h e s h o u l d e r s h o u l d b e t h e n a p h t h a l e n e , w h i c h e l u t e s w i t h a p p r o x i m a t e l y t h e s a m e e l u t i o n t i m e a s t h e b i p h e n y l ( r e f e r t o t h e r e c y c l e h e a r t c u t c h r o m a t o g r a p h y e x p e r i m e n t e a r l i e r i n t h i s c h a p t e r ) . U n f o r t u n a t e l y , t h e a v a i l a b l e c o l u m n s i n t h i s l a b o r a t o r y w e r e o l d a n d d i d n o t p r o v i d e a v e r y g o o d s e p a r a t i o n . D i f f e r e n t c o n d i t i o n s a n d c o l u m n s w e r e u s e d , b u t t h e s e c o l u m n s a l s o w e r e o l d a n d u n a b l e t o p r o v i d e a d d i t i o n a l s e p a r a t i o n s . 2 7 0 H o w e v e r , t h i s d a t a d o e s s h o w t h e u t i l i t y o f u s i n g t h e e x p e r t s y s t e m i n c o n j u n c t i o n w i t h t h e c o n t r o l l e r s o f t w a r e t o d e v e l o p a n a u t o m a t e d , i n t e l l i g e n t i n s t r u m e n t . O n e a d d i t i o n a l v a l i d a t i o n s t u d y i s p r e s e n t e d b e l o w . W h i l e u n a b l e t o s e p a r a t e t h e m i x t u r e s o n t h e a v a i l a b l e c o l u m n s , a s e p a r a t i o n o n t h e s e s p e c i e s ( v i d e i n f r a ) w a s d e m o n s t r a t e d i n S n y d e r a n d K i r k l a n d . S S e c t i o n 6 . 7 . 3 V a l i d a t i o n S t u d y o f B e n z o i c A c i d , p - A m i n o b e n z o i c a c i d , 2 , 4 - D i n i t r o p h e n o l , A n t h r a c e n e , a n d P y r e n e A v a l i d a t i o n s t u d y o f t h e e x p e r t s y s t e m w a s a c c o m p l i s h e d u s i n g a m i x t u r e o f b e n z o i c a c i d , p - a m i n o b e n z o i c a c i d , 2 , 4 - d i n i t r o p h e n o l , a n t h r a c e n e , a n d p y r e n e . I n p u t f o r t h e e x p e r t s y s t e m w a s : T h e s p e c i e s a r e s o l u b l e i n o r g a n i c , a q u e o u s / o r g a n i c s o l v e n t s . T h e s p e c i e s a r e s m a l l ( M W < 2 0 0 0 ) a n d o r g a n i c ( a c i d / b a s e ) i o n i c s p e c i e s , b u t a p H o f 4 , C N F 8 0 , w o u l d n e u t r a l i z e t h e t w o a c i d s i n t h e s a m p l e . T h e s p e c i e s w e r e d e s c r i b e d a s a r o m a t i c s p e c i e s t h a t h a v e d i f f e r e n t s u b s t i t u e n t s ( c a r b o x y l i c a c i d s , p h e n o l s , n i t r o g r o u p s , a n d a m i n e g r o u p s ) o n t h e a r o m a t i c r i n g . T h e c o m p o n e n t s i n t h e s a m p l e a r e a l s o d e s c r i b e d a s h a v i n g d i f f e r e n t p o l a r i t i e s . T h e e x p e r t s y s t e m w a s a b l e t o p r e d i c t d i p o l e i n t e r a c t i o n s b a s e d u p o n t h e t y p e s o f f u n c t i o n a l g r o u p s p r e s e n t . I n a d d i t i o n , t h e e x p e r t s y s t e m a l s o p r e d i c t e d t h a t t h e s p e c i e s s h o u l d f o r m c h a r g e t r a n s f e r c o m p l e x e s w i t h t h e s t a t i o n a r y p h a s e s b a s e d u p o n t h e p r e s e n c e o f t h e a r o m a t i c r i n g w i t h e l e c t r o n - w i t h d r a w i n g g r o u p s ( e . g . , t h e n i t r o g r o u p s ) . T h e e x p e r t s y s t e m p r e d i c t e d t h e u s e d o f r e v e r s e d - p h a s e c y a n o c o l u m n s C N F 9 5 , r e v e r s e d - p h a s e a l k l y s i l a n e c o l u m n s ( e . g . , C 1 8 ) C N F 9 5 , r e v e r s e d - p h a s e a n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y C N F 8 0 , a n d a s p e c i a l t y a r o m a t i c c o l u m n C N F 8 0 . ) s t l o V ( e s n o p s e R r o t c e t e D 0 . 4 5 0 . 4 0 3 5 0 . 3 0 . 2 5 0 . 2 0 . 1 5 0 . 1 0 . 0 5 2 7 1 , . - M I M I . “ 1 ( X ) 2 0 0 3 ( 1 ) 4 ( 1 ) S C I ) 6 ( 1 ) 7 ( 1 ) 8 m T i m e ( s e c o n d s ) F i g u r e 6 . 1 7 C h r o m a t o g r a m o f B e n z a l d e h y d e , N a p h t h a l e n e , a n d B i p h e n y l P A R T 3 : C O N C L U S I O N S B A S E D O N T H E A U T O M A T I O N O F T H E H P L C I N S T R U M E N T I h a v e b u t o n e l a m p b y w h i c h m y f e e t a r e g u i d e d ; a n d t h a t i s t h e l a m p o f e x p e r i e n c e . I k n o w o f n o w a y o f j u d g i n g t h e f u t u r e b u t b y t h e p a s t . P a t r i c k H e n r y 2 7 2 2 7 3 S e c t i o n 6 . 8 C o n c l u s i o n s o f t h e A u t o m a t i o n o f t h e H P L C I n s t r u m e n t T h i s c h a p t e r d e s c r i b e s t h e s o f t w a r e a n d h a r d w a r e t h a t w a s c r e a t e d t o a l l o w f o r t h e a u t o m a t i o n o f t h e H P L C i n s t r u m e n t . T h e s o f t w a r e i s f a i r l y e x t e n s i b l e a n d p r o v i d e s a u s e r - f r i e n d l y i n t e r f a c e . T h e f r a m e w o r k i s i n p l a c e f o r t h e n e x t d e v e l o p m e n t o f t h e i n s t r u m e n t a t i o n ; t h a t i s , a n i n t e l l i g e n t a u t o m a t e d i n s t r u m e n t . T h e e x p e r t s y s t e m c a n g e n e r a t e a d v i c e t h a t c a n b e s t o r e d i n a n A S C I I f i l e . A s i m p l e a d d i t i o n t o t h e c o n t r o l l e r s o f t w a r e c a n b e m a d e t o r e a d i n t h i s a d v i c e f i l e , w h i c h w o u l d c o n t a i n c o l u m n a n d s o l v e n t a d v i c e . T h e o p e r a t o r m a y g e n e r a t e a n L C M e t h o d f i l e f o r e a c h v a l v e c o n fi g u r a t i o n t h a t w i l l b e u s e d o r t h e c o n t r o l l e r s o f t w a r e c a n u s e p r e v i o u s l y w r i t t e n m e t h o d fi l e s . T h e s o f t w a r e c a n m o n i t o r t h e r u n a n d s w i t c h a t t h e a p p r o p r i a t e t i m e s . O n e l i m i t a t i o n i s t h a t t h e i n j e c t o r v a l v e i s n o t u n d e r c o m p u t e r c o n t r o l w h i c h n e c e s s i t a t e s t h a t t h e o p e r a t o r l o a d a n d i n j e c t t h e s a m p l e . T h e h a r d w a r e p r o v i d e s a f a s t a n d r e l i a b l e w a y t o s w i t c h v a l v e s . T h e P P I s t i l l h a s s e v e r a l d i g i t a l l i n e s r e m a i n i n g t h a t c o u l d b e u s e d t o c o n t r o l c h a r t r e c o r d e r s , a u t e i n j e c t o r s , a n d s o f o r t h . A d d i t i o n a l P P I c h i p s c a n b e a d d e d o n t o t h e p r o t o t y p e b o a r d t o e x t e n d t h e n u m b e r o f c o n t r o l l i n e s t h a t c o u l d b e a v a i l a b l e . O n e l i m i t a t i o n t o t h e s o f t w a r e i s t h a t i t i s w r i t t e n i n Q u i c k B a s i c . T h i s l i m i t s t h e n u m b e r o f d a t a p o i n t s t h a t c a n b e t a k e n t o 3 2 K B . O n e s i m p l e a p p r o a c h w o u l d b e t o s t o p t h e H P L C i n s t r u m e n t , s t o p t h e d a t a a c q u i s i t i o n v i a t h e g a t e c o n t r o l , a n d s a v e t h e 3 2 K B o f d a t a . T h e p r o g r a m c o u l d t h e n c o n t i n u e a c q u i r i n g d a t a s i n c e t h e D M A i s s e t u p f o r a u t o i n i t i a l i z a t i o n . A s e c o n d s o l u t i o n w o u l d b e t o p o r t t h e c o d e t o e i t h e r t h e C p r o g r a m l a n g u a g e o r t o u s e V i s u a l B a s i c ( M i c r o s o f t ' s B a s i c l a n g u a g e f o r t h e W i n d o w s e n v i r o n m e n t ) . C w o u l d p r o v i d e f a s t e r c o n t r o l o v e r t h e i n s t r u m e n t a t i o n w h i l e 2 7 4 V i s u a l B a s i c w o u l d a l l o w t h e c o n t r o l l e r s y s t e m t o a c c e s s o t h e r p r o g r a m s ( e . g . , t h e e x p e r t s y s t e m , d a t a m a n i p u l a t i o n s o f t w a r e , o r o p t i m i z a t i o n p r o g r a m s ) . L I S T O F R E F E R E N C E S 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 L I S T O F R E F E R E N C E S D . P . W e b b a n d E . D . S a l i n , I n t e l l i g e n t I n s t r u m e n t s a n d C o m p u t e r s 1 9 9 1 ( i s s u e d 1 9 9 2 ) , 9 ( 5 ) , 1 8 5 - 9 3 . A . P . W a d e a n d S . R . C r o u c h , S p e c t r o s c o p y , 1 9 8 8 , 3 , 2 4 . S . R . C r o u c h , C h e m . I n t e I I . l a b . S y s t e m 1 9 9 0 , 8 , 2 5 9 . P . D . W e n t z e l l , P h . D . T h e s i s M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y , E a s t L a n s i n g , M I , 1 9 8 7 . L . R . S n y d e r a n d J . J . K i r k l a n d , I n t r o d u c t i o n t o M o d e r n L i q u i d C h r o m a t o g r a p y , J o h n W i l e y a n d S o n s , I n c . , N e w Y o r k , 1 9 7 9 . S . K . R a t a n a t h a n a w o n g s , P h . D . T h e s i s , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y , E a s t L a n s i n g , M i c h i g a n , 1 9 8 6 . M . M a r t i n , F . V e r i l l o n , C . E o n , a n d G . G u i o c h o n , J . C h r o m a t o g r . 1 9 7 6 , 1 2 $ , 1 7 . P . W i e g a n d , P h . D . D i s s e r t a t i o n , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y , E a s t L a n s i n g , M i c h i g a n , 1 9 8 5 . P . M . W i e g a n d a n d S . R . C r o u c h , T a l a n t a , 1 9 8 5 , 3 2 , 3 7 . 1 . . C . E g g e b r e c h t , I n t e r f a c i n g t o t h e E M P e r s o n a l C o m p u t e r , H o w a r d W . S a m s a n d C o . , I n c . , I n d i a n a p o l i s , I N 1 9 8 9 . P . F . G o l d s b r o u g h , M i c r o c o m p u t e r I n t e r f a c i n g w i t h t h e 8 2 5 5 P P I C h i p , H o w a r d W . S a m s , a n d C o . , I n c . , I n d i a n a p o l i s , I N , 1 9 8 0 . M . C . H a r v e y a n d S . D . S t e a m s , A n a l . C h e m . 1 9 8 4 , 5 6 , 8 3 7 . M . C . H a r v e y , P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n . J . C . M i l l e r a n d J . N . M i l l e r , S t a t i s t i c s f o r A n a l y t i c a l C h e m i s t r y , E l l i s H o r w o o d , L t d . N e w Y o r k , 1 9 8 4 , 9 0 . 2 7 5 W e 0 0 S e c t i o n l n t e l h g e x I n t e l l i g e i a p p r o a c ‘ “ 1 0 1 1 1 1 6 1 D a m i e n } r e t u r n “ t h e V a i l C O H C I U E S e C t i c 1 1 0 m 0 C H A P T E R 7 C O N C L U S I O N S A N D F U T U R E P R O S P E C T S W e k n o w n o t h i n g o f w h a t w i l l h a p p e n i n f u t u r e , b u t b y t h e a n a l o g y o f e x p e r i e n c e . A b r a h a m L i n c o l n E x p e r i e n c e i s a c o m b t h a t l i f e g i v e s y o u a f t e r y o u l o s e y o u r h a i r . J u d i t h S t e r n S e c t i o n 7 . 1 I n t r o d u c t i o n T h e p r e c e d i n g c h a p t e r s h a v e d e s c r i b e d t h e d e v e l o p m e n t o f a fi r s t g e n e r a t i o n , i n t e l l i g e n t , a u t o m a t e d , h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y i n s t r u m e n t . T h e i n t e l l i g e n c e a s p e c t h a s b e e n p r o v i d e d b y a n e x p e r t s y s t e m t h a t a p p l i e s a fi r s t p r i n c i p l e a p p r o a c h t o p r o v i d e a u s e r w i t h a r e c o m m e n d a t i o n f o r c o l u m n t y p e , d e t e c t o r , a n d m o b i l e p h a s e . T h e e x p e r t s y s t e m a l s o p r o v i d e s a d v i c e o n t h e s u i t a b i l i t y o f H P L C f o r a p a r t i c u l a r s a m p l e , s a m p l e p r e - t r e a t r n e n t s u g g e s t i o n s , a n d i n f o r m a t i o n o n t h e r e c o m m e n d e d m e t h o d . T h r o u g h s o f t w a r e a n d h a r d w a r e , t o t a l c o n t r o l o v e r t h e H P L C , t h e v a l v e s , a n d t h e d a t a a c q u i s i t i o n s y s t e m i s a c h i e v e d . T h i s c h a p t e r s u m m a r i z e s t h e c o n c l u s i o n s f r o m t h e p r e v i o u s c h a p t e r s a n d p r e s e n t s s u g g e s t i o n s f o r f u t u r e w o r k . S e c t i o n 7 . 2 C o n c l u s i o n s I n C h a p t e r 4 , t h e e x p e r t s y s t e m w a s p r e s e n t e d . T h i s e x p e r t s y s t e m i s d i f f e r e n t f r o m o t h e r H P L C e x p e r t s y s t e m s . T h e e x p e r t s y s t e m d e s c r i b e d h e r e u s e s fi r s t p r i n c i p l e s 2 7 6 t o p r o x i d e d e n i e d p r i n c i p l e s h u r a n n e , s a u n a s p h a n n a c r a m u h m r e c o m m E u n k n o w n t h e e x p o a d i i c e 0 m a k e U p b a s e d u W a n r s a d d i i i o r t h e 0 1 1 1 1 a n d / o r t e c h n j C T h e e ) a p p r o a a S a m ] t h e i n ] 1 0 r e c m a i o r 2 7 7 t o p r o v i d e a d v i c e o n c h r o m a t o g r a p h i c m e t h o d s . R e c o m m e n d a t i o n s a r e b a s e d o n t h e c h e m i c a l a n d p h y s i c a l i n t e r a c t i o n s b e t w e e n s o l u t e a n d s t a t i o n a r y p h a s e . T h e fi r s t p r i n c i p l e s a p p r o a c h , w h i c h i s d i s t i n c t i v e f r o m t h e H P L C e x p e r t s y s t e m s d e s c r i b e d i n t h e l i t e r a t u r e , a l l o w s t h e e x p e r t s y s t e m t o d e a l w i t h a n y t y p e o f s a m p l e . O t h e r e x p e r t s y s t e m s p r o v i d e a d v i c e f o r a s m a l l s u b - s e t o f t h e c h r o m a t o g r a p h i c fi e l d ( e . g . , p h a r m a c e u t i c a l s ) o r p l a c e c o m p o u n d s i n t o c a t e g o r i e s ( e . g . , p h t h a l a t e s ) a n d r e c o m m e n d a m e t h o d f o r p h t h a l a t e s . W h i l e t h e s e t y p e s o f e x p e r t s y s t e m s p r o v i d e v e r y d e t a i l e d r e c o m m e n d a t i o n s , t h e y a r e l i m i t e d i n t h e i r a b i l i t y t o p r o v i d e r e c o m m e n d a t i o n s f o r u n k n o w n s a m p l e s o r s a m p l e s o u t s i d e t h e i r d o m a i n . T h e g o a l f o r t h e d e v e l o p m e n t o f t h e e x p e r t s y s t e m d e s c r i b e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n w a s t o c r e a t e a t o o l t h a t c o u l d p r o v i d e a d v i c e o n a l m o s t a n y p r o b l e m — p r o v i d e d t h e u s e r k n o w s s o m e t h i n g a b o u t t h e c h e m i c a l m a k e u p o r t h e p h y s i c a l p r o p e r t i e s o f t h e s a m p l e . O f t e n e d u c a t e d g u e s s e s c a n b e m a d e b a s e d u p o n w h e r e t h e s a m p l e o r i g i n a t e d . F o r e x a m p l e , a r i v e r w a t e r s a m p l e w o u l d b e w a t e r s o l u b l e a n d m a y c o n t a i n i n o r g a n i c i o n s o r a c i d o r b a s e s . A d a t a b a s e a n d a d d i t i o n a l r u l e s c o u l d b e d e v e l o p e d t h a t w o u l d p r o v i d e a s s i s t a n c e f o r s a m p l e s i n w h i c h t h e o n l y k n o w n i n f o r m a t i o n i s t h e s o u r c e o f t h e s a m p l e s . T h i s e x p e r t s y s t e m d o e s n o t p r o v i d e d e t a i l e d a d v i c e o n t h e m o r e e s o t e r i c a n d / o r s p e c i fi c m e t h o d s s u c h a s c h i r a l s e p a r a t i o n s a n d a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y . T h e s e t e c h n i q u e s t y p i c a l l y u s e p a c k i n g m a t e r i a l s t h a t a r e s e l e c t i v e f o r s p e c i fi c c o m p o u n d s . T h e e x p e r t s y s t e m d e s c r i b e d h e r e c a n p r o v i d e i n i t i a l a d v i c e , b u t w h e n u s i n g t h e s e a p p r o a c h e s t h e u s e r m u s t fi n d t h e c o l u m n t h a t w i l l s e p a r a t e t h e s p e c i fi c c o m p o n e n t s i n a s a m p l e . C h a p t e r 5 p r e s e n t s t h e d e t e c t o r a n d m o b i l e p h a s e m o d u l e s . T h e s e m o d u l e s u s e t h e i n f o r m a t i o n o b t a i n e d d u r i n g t h e c o l u m n r e c o m m e n d a t i o n p h a s e a n d u s e s t h i s d a t a t o r e c o m m e n d a p p r o p r i a t e d e t e c t o r ( s ) a n d m o b i l e p h a s e s . H P L C A d v i s e r u s e s t w o m a j o r c r i t e r i a t o s e l e c t a d e t e c t o r . F i r s t , t h e s p e c i e s m u s t b e d e t e c t a b l e b y t h e d e t e c t o r 2 7 8 a n d t h e c o n c e n t r a t i o n r a n g e o f t h e s o l u t e s m u s t b e w i t h i n t h e l i n e a r o p e r a t i n g r a n g e o f t h e d e t e c t o r . A f t e r r e c o m m e n d a t i o n o f a c o l u m n a n d d e t e c t o r , H P L C A d v i s e r s u g g e s t s a m o b i l e p h a s e w h i c h i s c o m p a t i b l e w i t h b o t h c o l u m n a n d d e t e c t o r . M o b i l e p h a s e m o d i fi e r s a r e r e c o m m e n d e d b a s e d u p o n s o l u t e - s o l v e n t i n t e r a c t i o n s . V a l i d a t i o n s t u d i e s w e r e s h o w n t h a t d e m o n s t r a t e s t h e a b i l i t y o f H P L C A d v i s e r t o p r o v i d e a n a p p r o p r i a t e c o l u m n , d e t e c t o r , a n d a s t a r t i n g m o b i l e p h a s e , . A s e c o n d a s p e c t u n i q u e t o t h i s e x p e r t s y s t e m i s t h e a p p l i c a t i o n o f c o n f i d e n c e f a c t o r s . W h i l e c o n fi d e n c e f a c t o r s t h e m s e l v e s a r e n o t o r i g i n a l , t h e H P L C e x p e r t s y s t e m s i n t h e l i t e r a t u r e d o n o t u s e c o n fi d e n c e f a c t o r s . T h e e x p e r t s y s t e m d e s c r i b e d h e r e u s e s c o n fi d e n c e f a c t o r s i n s e v e r a l u n i q u e w a y s . C o n f i d e n c e f a c t o r s p r o v i d e a m e a n s o f r a n k i n g d i f f e r e n t c o l u m n s w h i c h m a y b e v a l u a b l e t o t h e u s e r . P r o v i d i n g s e v e r a l p o s s i b l e m e t h o d s a l l o w s t h e u s e r t o s e l e c t a m o n g t h e p o s s i b i l i t i e s . T h e u s e r h a s a h i g h e r l e v e l o f t r u s t i n t h e p r o p o s e d m e t h o d s s i n c e e a c h h a s a n u m e r i c a l d e s c r i p t o r o f t h e i r r e l i a b i l i t y . S e l f - c a l c u l a t i n g c o n f i d e n c e f a c t o r s ( C N F ) a l l o w t h e e x p e r t s y s t e m t o a p p l y i n t e l l i g e n c e t o s o l v e t h e p r o b l e m , a n d t h e u s e o f s e l f - c a l c u l a t i n g C N F i s p r e d o m i n a t e l y i l l u s t r a t e d i n t h e c a s e o f s e l e c t i n g s i z e a s a s e p a r a t i o n m e c h a n i s m . T h e e x p e r t s y s t e m i s a b l e t o d e t e r m i n e i f t h e c o m p o n e n t s h a v e a l a r g e e n o u g h s i z e d i f f e r e n t i a l t o w a r r a n t s i z e b e i n g c o n s i d e r e d a n d a s s i g n s a c o n fi d e n c e f a c t o r t o r e fl e c t t h e i m p o r t a n c e o f s i z e . T h e e x p e r t s y s t e m a l s o w e i g h t s t h e s i z e d i f f e r e n t i a l w i t h t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f c o m p e t i n g m e c h a n i s m s . A t h i r d t y p e o f C N F u s e d b y H P L C A d v i s e r a r e t h e c o n c e n t r a t i o n C N F v a l u e s t h a t a r e d e t e r m i n e d f o r t h e d i f f e r e n t d e t e c t o r . T h e s e C N F v a l u e s a r e m o r e f u n d a m e n t a l i n n a t u r e a n d m i n i m i z e t h e e m p i r i c a l o r s u b j e c t i v e n a t u r e o f C N F . T h e c o n c e n t r a t i o n C N F v a l u e s a r e d i r e c t l y r e l a t e d t o f u n d a m e n t a l r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n c o n c e n t r a t i o n a n d r e s p o n s e . I n a d d i t i o n , H P L C A d v i s e r u s e s t h e p a r t i c u l a r c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e a v a i l a b l e ( o r 8 i s i n r e c < d e a s e l l o p l I E C S 0 d a 2 7 9 ( o r g e n e r i c v a l u e s ) o f t h e d e t e c t o r t o t a i l o r t h e r e c o m m e n d a t i o n f o r t h e e q u i p m e n t t h a t i s i n t h e l a b o r a t o r y o f t h e u s e r . V a l i d a t i o n s t u d i e s w e r e p r e s e n t e d t o s h o w t h a t t h e e x p e r t s y s t e m c a n p r o v i d e r e c o m m e n d a t i o n s f o r d i f f e r e n t t y p e s o f s a m p l e s . T h e e x p e r t s y s t e m h a s s o m e a b i l i t y t o d e a l w i t h u n c e r t a i n t i e s b y a s k i n g f u r t h e r q u e s t i o n s t o e l u c i d a t e t h e p r o b l e m o r b y u s i n g s e l f - d e t e r m i n i n g r u l e s t o p r o v i d e a n a n s w e r b a s e d u p o n i n f o r m a t i o n a v a i l a b l e t o t h e e x p e r t s y s t e m . V a l i d a t i o n s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t t h e e x p e r t s y s t e m p r o v i d e s t h e o p t i m u m m e t h o d a s o n e o f t h e fi r s t f e w p r o p o s e d s o l u t i o n s . A d d i t i o n a l s o l u t i o n s a r e r e c o m m e n d e d w h i c h p r o v i d e l o g i c a l a l t e r n a t i v e s . C h a p t e r 6 p r e s e n t s p r e l i m i n a r y w o r k o n a u t o m a t i n g t h e H P L C i n s t r u m e n t . T h e s o f t w a r e a n d h a r d w a r e a r e c a p a b l e o f p r o g r a m m i n g m e t h o d s i n t o t h e H P L C , a c q u i r i n g d a t a f r o m m u l t i p l e d e t e c t o r s , a n d c o n t r o l l i n g t h r e e d i f f e r e n t v a l v e s . T h e s o f t w a r e c a n c h a n g e t h e v a l v e c o n fi g u r a t i o n s b a s e d o n a t i m e c r i t e r i o n o r t h e o c c u r r e n c e o f a s a m p l e e l u t i n g . T h e s e c a p a b i l i t i e s a l l o w t h e s o f t w a r e t o p e r f o r m c o m p l e x c o l u m n s w i t c h i n g a n d r e - p r o g r a m m i n g o f t h e s o l v e n t d e l i v e r y s y s t e m f o r e v e r y v a l v e c h a n g e . P r e l i m i n a r y r e s u l t s a r e p r e s e n t e d t h a t s h o w t h e a d v i c e f r o m t h e e x p e r t s y s t e m b e i n g p e r f o r m e d o n t h e a u t o m a t e d i n s t r u m e n t . T h e c o n t r o l l e r s o f t w a r e s e l e c t s t h e a p p r o p r i a t e c o l u m n a n d p r o g r a m s t h e H P L C . T h e s o f t w a r e m o n i t o r s t h e r u n , c o l l e c t s d a t a , a n d p r e s e n t s a n a u d i t e d r e p o r t a t t h e c o n c l u s i o n o f t h e r u n . P r e l i m i n a r y r e s u l t s s h o w i n g t h e a b i l i t y t o s w i t c h c o l u m n s b a s e d o n t h e e l u t i o n o f a p e a k a r e a l s o p r e s e n t e d . T h e s t u d i e s s h o w t h a t t h e s o f t w a r e c a n p r o v i d e a c c u r a t e a n d r e p r o d u c i b l e s w i t c h i n g . T h e s e r e s u l t s d e m o n s t r a t e t h a t t h e s o f t w a r e c a n b e u s e d f o r t h e a n a l y s i s o f c o m p l e x s a m p l e s t h a t m a y r e q u i r e c o l u m n s w i t c h i n g . S e c b e 1 c o n t h e b e 2 8 0 S e c t i o n 7 . 3 F u t u r e W o r k T h e r e a r e s e v e r a l a s p e c t s o f b o t h t h e a u t o m a t i o n a n d t h e e x p e r t s y s t e m t h a t c a n b e f u r t h e r d e v e l o p e d . T h e fi r s t o b j e c t i v e i s t o h a v e t h e e x p e r t s y s t e m o n - l i n e w i t h t h e c o n t r o l l e r s o f t w a r e . I n t h i s f a s h i o n , a t r u e i n t e l l i g e n t a u t o m a t e d s y s t e m , a s d e s c r i b e d a t t h e b e g i n n i n g o f C h a p t e r 4 , w i l l b e p o s s i b l e . C u r r e n t l y , t h e e x p e r t s y s t e m r e s u l t s m u s t b e e n t e r e d m a n u a l l y i n t o t h e c o n t r o l l e r s o f t w a r e . A n o n - l i n e s y s t e m w i l l b e a b l e t o f e e d t h e r e s u l t s d i r e c t l y t o t h e s o f t w a r e , w h i c h c a n p r o v i d e f e e d b a c k t o t h e e x p e r t s y s t e m f o r f u r t h e r o p t i r n i z a t i e n . T h e k n o w l e d g e b a s e , w h i l e e x p a n d e d s i g n i fi c a n t l y d u r i n g t h i s r e s e a r c h , s t i l l c o n t a i n s a r e a s i n w h i c h f u r t h e r e x p a n s i o n i s d e s i r a b l e . S o l v e n t o p t i m i z a t i o n p r o t o c o l s c o u l d b e a d d e d t o a s s i s t t h e u s e r i n s e l e c t i n g o p t i m u m m o b i l e p h a s e s . T h e a p p r o a c h e n v i s i o n e d w o u l d n o t p e r f o r m t h e o p t i m i z a t i o n ( a t e c h n i q u e b e t t e r s u i t e d t o s p e c i fi c s o f t w a r e c r e a t e d f o r t h a t p u r p o s e , s u c h a s D r y L a b o r f a c t o r a n a l y s i s p r o g r a m s ) , b u t w o u l d a s s i s t t h e u s e r i n p r o v i d i n g t h e c o r r e c t r e s p o n s e s t o a n o p t i m i z a t i o n p r o g r a m . T h e r u l e s t h a t s h o u l d b e a d d e d w o u l d p r o p o s e s o l v e n t s b a s e d o n d e t e c t o r a n d c o l u m n c o m p a t i b i l i t i e s . T h e s o l v e n t s w o u l d t h e n b e u s e d b y t h e e x t e r n a l o p t i m i z a t i o n p r o g r a m s . T h e u s e o f d a t a b a s e s i n t h i s e x p e r t s y s t e m c a n b e e x t e n d e d . A d d i t i o n a l d a t a b a s e s c o u l d b e i n c o r p o r a t e d t o p r o v i d e i n f o r m a t i o n o n c h e m i c a l a n d p h y s i c a l p r o p e r t i e s ( e . g . , e l e c t r o n e g a t i v i t i e s ) o f t h e a n a l y t e ( s ) . W i t h t h e d e v e l o p m e n t o f M i c r o s o f t W i n d o w s a n d o t h e r g r a p h i c a l u s e r i n t e r f a c e s y s t e m s ( G U I ' s ) , m a n y n e w o p t i o n s h a v e b e e n c r e a t e d f o r t h e k n o w l e d g e e n g i n e e r . F o r e x a m p l e , L e v e l S O b j e c t , v e r s i o n 2 . 5 , ( I n f o r m a t i o n B u i l d e r s , I n c . , N e w Y o r k , N Y ) 1 o b t a i n s m e m o r y m a n a g e m e n t a n d g r a p h i c a l a b i l i t i e s t h r o u g h A P I ( A p p l i c a t i o n P r o g r a m I n t e r f a c e ) c a l l s t o W i n d o w s 3 . x . T h i s a l l o w s k n o w l e d g e e n g i n e e r s t o u s e e f f e c t i v e l y i c o n s , d i s p l a y s c r e e n s , a n d o t h e r t o o l s t o c r e a t e v i s u a l l y a p p e a l i n g a n d i n t u i t i v e 2 8 1 i n t e r f a c e s . O n e e x c i t i n g c a p a b i l i t y i s t h e a b i l i t y t o u s e t h e D y n a m i c D a t a E x c h a n g e ( D D E ) a n d O b j e c t l i n k i n g a n d E m b e d d i n g ( O L E ) c a p a b i l i t i e s o f W i n d o w s . T h i s w i l l a l l o w s e a m l e s s i n t e g r a t i o n o f d a t a a n d c o m m u n i c a t i o n w i t h o t h e r p r o g r a m s . I n t h i s f a s h i o n , e x p e r t s y s t e m s w i l l b e a b l e t o a c c e s s a n y W i n d o w s s p r e a d s h e e t s o r d a t a b a s e s . O n c e d a t a a r e e x c h a n g e d t h r o u g h D D E , t h e e x p e r t s y s t e m c a n u s e O L E f o r d a t a m a n i p u l a t i o n b y d a t a a c q u i s i t i o n a n d c o n t r o l p r o g r a m s , s t a t i s t i c a l p a c k a g e s a n d s o f o r t h . W i t h D D E a n d O L E , t h e e x p e r t s y s t e m c a n b e e x t e n d e d b e y o n d i t s i n t r i n s i c c a p a b i l i t i e s b y a c c e s s i n g t h e f e a t u r e s o f o t h e r p r o g r a m s . A s m e n t i o n e d i n p r e v i o u s c h a p t e r s , V P - E x p e r t i s d e fi c i e n t i n m e m o r y m a n a g e m e n t a n d n u m e r i c a l c a p a b i l i t i e s . M a n y o f t h e f e a t u r e s o f V P - E x p e r t v e r s i o n 3 . 0 h a d t o b e r e m o v e d o r d i s a b l e d t o m a i n t a i n a n o p e r a t i n g p r o g r a m . T h e d e t e c t o r m o d u l e o f H P L C A d v i s e r u s e s m u c h m o r e i n t e n s i v e ” n u m b e r c r u n c h i n g " t h a n f o r w h i c h V P - E x p e r t s e e m s t o b e d e s i g n e d . F u r t h e r d e v e l o p m e n t o f t h e e x p e r t s y s t e m s h o u l d e x p l o i t t h e s t r e n g t h s o f a n o t h e r e x p e r t s y s t e m s h e l l ( o r a n e w e r v e r s i o n o f V P - E x p e r t w h e n / i f i t b e c o m e s a v a i l a b l e ) . D e v e l o p m e n t s o f g r a p h i c a l o p e r a t i n g s y s t e m s d e m o n s t r a t e t h e a d v a n t a g e s o f m o v i n g t o a n o n - D O S b a s e d e x p e r t s y s t e m s h e l l . F i n a l d e v e l o p m e n t o f t h e e x p e r t s y s t e m w o u l d i n t r o d u c e a n a d d i t i o n a l ” m a s t e r ” m o d u l e t o p r o v i d e a d v i c e o n m u l t i d i m e n s i o n a l a n d c o l u m n s w i t c h i n g c h r o m a t o g r a p h y . T h e m o d u l e w o u l d h a v e t w o s p e c i f i c g o a l s : ( 1 ) d e t e r m i n e f r a c t i o n s o r c l a s s e s o f c o m p o u n d s i n a c o m p l e x s a m p l e a n d ( 2 ) d e t e r m i n e i n c o m p a t i b i l i t y p r o b l e m s b e t w e e n d i f f e r e n t c o l u m n s , s o l u t e s , a n d m o b i l e p h a s e s . T h e m a s t e r m o d u l e w o u l d p r o p o s e w a y s t o s u b - d i v i d e t h e s a m p l e i n t o f r a c t i o n s a n d t h e n c a l l t h e c u r r e n t e x p e r t s y s t e m ( s l a v e ) t o d e v e l o p a m e t h o d ( s ) t o s e p a r a t e t h e f r a c t i o n s . T h e m a s t e r m o d u l e w o u l d r e p e t i t i v e l y c a l l t h e s l a v e e x p e r t s y s t e m t o p r o p o s e m e t h o d s t o r e s o l v e c o m p o n e n t s w i t h i n t h e f r a c t i o n s . T h e m a s t e r m o d u l e w o u l d a p p l y c o m p a t i b i l i t y r u l e s t o d e v e l o p a m a s t e r s e p a r a t i o n m e t h o d . T h i s w o u l d c o m p l e t e t h e p r o c e s s o f c r e a t i n g a n i n t e l l i g e n t , a u t o m a t e d , ( p s e u d o ) m u l t i d i m e n s i o n a l H P L C i n s t r u m e n t . L I S T O F R E F E R E N C E S L I S T O F R E F E R E N C E S D e n B a r k e r , P C A 1 , 1 9 9 2 , J u l y / A u g u s t , 4 4 - 7 . 2 8 2 A P P E N D I X A P P E N D I X A F l o w C h a r t s f o r t h e D e t e r m i n a t i o n o f a n A p p r o p r i a t e C o l u m n ( s ) T h e r e c o m m e n d a t i o n o f a c o l u m n i n v o l v e s t h r e e m a j o r s t e p s . T h e f i r s t s t e p d e t e r m i n e s t h e s e p a r a t i o n p r o p e r t y . T h e s e p a r a t i o n p r o p e r t y i n d i c a t e s t h e p o s s i b l e c h e m i c a l a n d p h y s i c a l d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e s o l u t e s t h a t m a y p r o v i d e a m e a n s t o s e p a r a t e t h e s o l u t e s . T h e n e x t s t e p i s t o d e t e r m i n e t h e t y p e o f c h r o m a t o g r a p h i c s e p a r a t i o n ( i . e . , n o r m a l - p h a s e a n d r e v e r s e - p h a s e ) . F i n a l l y , t h e e x p e r t s y s t e m d e t e r m i n e s t h e p o s s i b l e p a c k i n g m a t e r i a l s ( e . g . , a m i n e o r s i l i c a f u n c t i o n a l g r o u p s ) . T h e p a c k i n g m a t e r i a l i s b a s e d o n t h e c h e m i c a l a n d p h y s i c a l p r o p e r t i e s o f t h e s o l u t e s . T h i s a p p e n d i x p r o v i d e s fl o w c h a r t s t h a t d e s c r i b e t h e r e c o m m e n d a t i o n o f a n a p p r o p r i a t e c o l u m n . T h e l o g i c p a t h s u s e d b y t h e e x p e r t s y s t e m ( H P L C A d v i s e r ) a r e q u i t e c o m p l e x a n d i n t e r - r e l a t e d . I n a d d i t i o n , H P L C A d v i s e r p r o v i d e s m a n y r u l e s t h a t a s s i s t t h e u s e r i n s e l e c t i n g a n a p p r o p r i a t e r e s p o n s e . D u e t o t h e c o m p l e x i t y o f t h e i n f e r e n c e m e c h a n i s m s , a s i m p l i f i e d v i e w o f t h e l o g i c p a t h s a r e p r e s e n t e d . S o m e o f t h e i n f e r e n c e p a t h s a r e p r e s e n t e d i n t a b u l a r f o r m i n s t e a d . F i g u r e A . 1 p r o v i d e s a s i m p l i f i e d fl o w c h a r t f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f s e p a r a t i o n p r o p e r t y . I n f o r m a t i o n f o r i o n i c s e p a r a t i o n s a r e n o t i n c l u d e d i n t h i s fi g u r e . F i g u r e s 4 . 6 a a n d 4 . 6 b ( C h a p t e r 4 ) c o n t a i n d e t a i l e d fl o w c h a r t s t h a t d e s c r i b e t h e a s s i g n m e n t o f 2 8 3 2 8 4 c o l u m n s f o r i o n i c s e p a r a t i o n s . A s m e n t i o n e d a b o v e , a d d i t i o n a l r u l e s t o p r e d i c t o r a s s i s t t h e u s e r i n a n s w e r i n g t h e q u e s t i o n s c o n t a i n e d i n t h i s fl o w c h a r t . F i g u r e s A . 2 a n d A 3 s h o w t h e l o g i c u s e d t o a s s i g n n o r m a l - p h a s e a d s o r p t i o n m o d e s . T h i s l o g i c i s s i m i l a r t o t h e r u l e s u s e d i n a s s i g n i n g r e v e r s e - p h a s e c o l u m n s . W h e n e v e r H P L C A d v i s e r d e t e r m i n e s t h a t S E P A R A T I O N P R O P E R T Y e q u a l s N E U T R A L , r e v e r s e - p h a s e b o n d e d c h r o m a t o g r a p h y i s a s s i g n e d . T a b l e s A l a n d A . 2 l i s t t h e d i f f e r e n t c o n d i t i o n s t h a t a r e c o n s i d e r e d w h e n a s s i g n i n g s i z e e x c l u s i o n ( S E C ) a s a m o d e f o r n o r m a l - p h a s e ( N P ) a n d r e v e r s e - p h a s e ( R P ) s e p a r a t i o n s . H P L C A d v i s e r r e c o m m e n d s e i t h e r n o r m a l - p h a s e a d s o r p t i o n ( N P A d s ) o r r e v e r s e p h a s e b o n d e d ( R P B o n d ) c h r o m a t o g r a p h y a s a p o s s i b l e a l t e r n a t i v e t o s i z e e x c l u s i o n . T h e c o n f i d e n c e f a c t o r s ( C N F ) f o r b o t h S E C a n d t h e a l t e r n a t i v e a r e g i v e n i n T a b l e s A l a n d A . 2 . F i g u r e A A i s a fl o w c h a r t o f t h e l o g i c u s e d t o d e t e r m i n e t h e a p p r o p r i a t e p a c k i n g m a t e r i a l . N o t d e t a i l e d i n t h i s f i g u r e i s t h e r e c o m m e n d a t i o n o f i o n i c p a c k i n g m a t e r i a l s ( i . e . , c a t i o n o r a n i o n e x c h a n g e r e s i n s ) . T h e s e a r e d e t a i l e d i n C h a p t e r 4 . A d s o r p t i o n c h r o m a t o g r a p h y p a c k i n g m a t e r i a l s ( s i l i c a o r a l u m i n a ) a r e r e c o m m e n d e d e q u a l l y p r o v i d e d t h a t t h e r e a r e n o s o l u t e s w h i c h h a v e e x c e s s i v e b i n d i n g e n e r g y w i t h t h e p a c k i n g m a t e r i a l ( e . g . , c a r b o x y l i c a c i d s o n a l u m i n a ) . 2 8 5 T a b l e A . 1 C r i t e r i a U s e d t o R e c o m m e n d N o r m a l - P h a s e S i z e E x c l u s i o n C h r o m a t o g r a p h y M o l e c u l a r W e i g h t 1 M W D i s t r i b u t i o n N P S E C C N F N P A d s C N F > 5 0 0 0 A N D W i d e D i s t r i b u t i o n 1 0 0 6 0 > 5 0 0 0 O R W i d e D i s t r i b u t i o n 9 0 7 0 2 0 0 0 - 5 0 0 0 A N D W i d e D i s t r i b u t i o n 8 5 8 0 2 0 0 0 - 5 0 0 0 O R N a r r o w D i s t r i b u t i o n 7 0 8 0 < 2 0 0 0 A N D W i d e D i s t r i b u t i o n 8 0 8 5 < 2 0 0 0 A N D N a r r o w D i s t r i b u t i o n 5 0 1 0 0 T a b l e A . 2 C r i t e r i a U s e d t o R e c o m m e n d R e v e r s e - P h a s e S i z e E x c l u s i o n C h r o m a t o g r a p h y M o l e c u l a r W e i g h t / M W D i s t r i b u t i o n R P S E C C N F R P B o n d C N F > 5 0 0 0 A N D W i d e D i s t r i b u t i o n 1 0 0 7 0 > 5 0 0 0 O R W i d e D i s t r i b u t i o n 9 0 7 5 2 0 0 0 - 5 0 0 0 A N D W i d e D i s t r i b u t i o n 8 0 8 0 2 0 0 0 - 5 0 0 0 O R N a r r o w D i s t r i b u t i o n 7 0 9 0 < 2 0 0 0 A N D W i d e D i s t r i b u t i o n 8 0 8 5 < 2 0 0 0 A N D N a r r o w D i s t r i b u t i o n 5 0 1 0 0 2 8 6 D i f f e r e n c e i n . N o — e N e u t r a l P o l a r i t y Y e s — e P o l a r i t y N o 4 0 i f i e r e n c e I I o n i c O p t i c a l Y e s - e O p t i c a l C h a r a c t e r Y e s i o n i c C N F 8 0 N e u t r a l 8 5 . Y e s - e G e o m e t r i c N o i . S i b s t i t u e n t s “ I ' m “ Y ‘ s " A r o m a t i c C N F 8 0 Y e s 2 D i f f e r e n c e i n C a l c u l a t e S i z e C N F . S i z e C a l c u l a t e A v g . M W _ " 5 ‘ 2 “ F i g u r e A . 1 F l o w C h a r t f o r t h e D e t e r m i n a t i o n o f S e p a r a t i o n P r o p e r t y N P O k a y N O — > R e v e h a r R s u e l P s e Y e s S a p P r o p 8 1 2 6 Y e s S e e S i z e R u l s e e s ¢ ¢ Y e s — a M o M d o Y $ fi p a S Y P r o p = a s N 3 9 ° " 9 ’ ° “ F 9 “ O r g M d e e e M o M d o e d a = e N n O : = i G e = O o p . c S o H / P N a W P B m e t r i c a l n t t l t i v e c e r H e x a n e - a M o o d d e M = e = N N P P A B d o s n s d o 8 0 o A n d d s 1 s 0 0 o 2 8 7 N o N o e — N o e H F i g u r e A . 2 F l o w C h a r t f o r t h e D e t e r m i n a t i o n o f M o d e f o r N o r m a l P h a s e A d s o r p t i o n ( P a r t I ) 2 8 8 C o n t i n u e d f r o m P r e v i o u s F i g u r e S a p P r o p = M o d e = A n o m a t i c 8 0 D i f f e r i n g Y e s — e M o d e = D i f f e r i n g S t b s t i t u e n t s S u b s t i t u e n t s N o M o d e = A r o m a t i c N o 4 e Y e s S e e I o n i c S e p a r a t i o n M o d e s i n D i s s e r t a t i o n e M o d e = N P B o n d 7 0 ( S e p P r o p = U n k n o w n ) F i g u r e A . 3 F l o w C h a r t f o r t h e D e t e r m i n a t i o n o f M o d e f o r N o r m a l P h a s e A d s o r p t i o n ( P a r t 2 ) D i p o l e Y e s 2 8 9 I n t e r a c t i o n s F P a c k i n g = 2 j n n : N o 1 O h m " “ a n s ” Y e s a P a c k i n g = P h e n y I I n t e r a c t i o n s N o e P r o t o n [ L e n o r / Y e s Y e s — a P a c k i n o = 0 y a n o P a c k i n g = A m i n e N o 4 4 S e e T e x t f o r A l u m i n a , S i l i c a , a n d I o n i c P a c k i n g M a t e r i a l s F i g u r e A . 4 F l o w C h a r t f o r t h e R e c o m m e n d a t i o n o f P a c k i n g M a t e r i a l M I C H I G A N s r n T E U N I V . L I B R A R I E S I “ I I I I W I H I I l l l I I I I I I I I I I N I W I W I W " I I I I H W I I H I I 3 1 2 9 3 0 1 0 1 9 2 3 2 0