M M " " 2 ? " : l ' f ' y a “ - “ W W H M z . I : . M l . , . . ' : l m l ‘ 1 ' 1 1 . “ t ' l " " Mill/Ill!lllll/lllllllll/llllllll 3 1 2 9 3 0 1 0 8 5 9 8 4 5 “ L L I P T i A R Y L M i r “ i l k - a n S t a t e U n i v e r s i t y T h i s i s t o c e r t i f y t h a t t h e t h e s i s e n t i t l e d P R I N C I P A L C O M P O N E N T A N A L Y S I S O F R A P I D S C A N N I N G S P E C T R O S C O P Y E X P E R I M E N T S I N C H E M I C A L K I N E T I C S p r e s e n t e d b y R o b e r t N . C o c h r a n h a s b e e n a c c e p t e d t o w a r d s f u l f i l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r P h . D . C h e m i s t r y d e g r e e i n g a w k M a j o r p r o f e s s o r D a t e 8 / 4 / 7 7 0 - 7 6 3 9 P R I N C I P A L C O M P O N E N T A N A L Y S I S O F R A P I D S C A N N I N G S P E C T R O S C O P Y E X P E R I M E N T S I N C H E M I C A L K I N E T I C S B y R o b e r t N . C o c h r a n A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l f i l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y D e p a r t m e n t o f C h e m i s t r y 1 9 7 7 ) I ( ’ r ‘ I r n ' r 1 . ‘ [ I . ‘ / 2 C ’ \ ‘ c a I f ’ ' 9 ‘ > I ; 4 4 / A B S T R A C T P R I N C I P A L C O M P O N E N T A N A L Y S I S O F R A P I D S C A N N I N G S P E C T R O S C O P Y E X P E R I M E N T S I N C H E M I C A L K I N E T I C S B y R o b e r t N . C o c h r a n P r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s i s u s e d t o d e v e l o p a p r o c e d u r e f o r e x t r a C t i n g s p e c t r a l a n d k i n e t i c i n f o r m a - t i o n f r o m r a p i d s c a n n i n g k i n e t i c s e x p e r i m e n t s . T h e p r o - c e d u r e i s a p p l i e d t o a r a p i d s c a n n i n g s t o p p e d f l o w s t u d y o f t h e h o r s e l i v e r a l c o h o l d e h y d r o g e n a s e ( L A D H ) c a t a l y z e d r e d u c t i o n o f t h e s u b s t r a t e a n a l o g , p - n i t r o s o - N , N — d i m e t h y l - a n i l i n e ( N D M A ) b y r e d u c e d n i c o t i n a m i d e a d e n i n e d i n u c l e o t i d e ( N A D H ) . T h e f i r s t s t e p o f t h e p r o c e d u r e i s t o d e t e r m i n e , i n d e p e n d e n t l y o f a n y m e c h a n i s t i c a s s u m p t i o n s a n d o f a n y a s s u m p t i o n s a b o u t t h e s p e c t r a l s h a p e s o f l i g h t a b s o r b i n g s p e c i e s , t h e m i n i m u m n u m b e r o f l i g h t a b s o r b i n g s p e c i e s . ( a b s o r b e r s ) i n e a c h s c a n n i n g e x p e r i m e n t . T w o k i n d s o f p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s , M a n a l y s i s a n d S a n a l y s i s , y i e l d , r e s p e c t i v e l y , t h e m i n i m u m n u m b e r m o f a b s o r b e r s i n t h e e x p e r i m e n t a n d t h e m i n i m u m n u m b e r s o f a b s o r b e r s w h o s e c o n c e n t r a t i o n s m u s t h a v e c h a n g e d d u r i n g t h e e x p e r i - m e n t . E r r o r s c a u s e d b y v a r i a t i o n s o f t h e e x p e r i m e n t a l s i g n a l - t o - n o i s e r a t i o w i t h w a v e l e n g t h a n d t i m e a r e R o b e r t N . C o c h r a n e l i m i n a t e d b y s t a t i s t i c a l l y w e i g h t i n g t h e p r i n c i p a l c o m - p o n e n t c a l c u l a t i o n s a c c o r d i n g t o a g e n e r a l m o d e l o f e r r o r v a r i a n c e s . F u r t h e r s t e p s i n t h e p r i n c i p a l c o m p o n e n t p r o - c e d u r e u s e t h e e i g e n v e c t o r s a n d e i g e n v a l u e s f r o m t h e w e i g h t e d M a n d S a n a l y s e s a s t o o l s f o r e x t r a c t i n g f r o m e a c h s c a n n i n g e x p e r i m e n t t h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n — t r a t i o n p r o f i l e s o f i t s a b s o r b e r s w i t h o u t i n v o k i n g m e c h a n - i s t i c a s s u m p t i o n s . A n a l y s i s o f t h e L A D H - N D M A - N A D H e x p e r i m e n t s r e v e a l s t h a t t h e r e a c t i o n h a s a t l e a s t s e v e n a b s o r b e r s o v e r t h e w a v e l e n g t h r a n g e 2 5 0 n m — 6 1 h n m . T h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s e x t r a c t e d b y p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s s h o w t h a t a t l e a s t t h r e e o f t h e s e a b s o r b e r s a r e t r a n s i e n t i n t e r m e d i a t e s i n t h e s e n s e t h a t t h e i r c o n c e n - t r a t i o n s g r o w a n d t h e n d e c a y i n e a c h e x p e r i m e n t . T h e r e s o l v e d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f t h e s e a b s o r b e r s g i v e a s e t o f q u a l i t a t i v e o b s e r v a t i o n s t h a t s h o u l d b e a c c o u n t e d f o r b y m e c h a n i s m s p r o p o s e d f o r t h e r e a c t i o n . I n p a r t i c u l a r , t h e r e s o l v e d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e o f t h e s u b s t r a t e N D M A i n t h e s e e x p e r i m e n t s i s i n c o m p a t i b l e w i t h t h e m e c h a n i s m p r o p o s e d f o r t h e r e a c t i o n b y D u n n a n d B e r n h a r d ( 1 9 7 1 ) . S o m e m e c h a n i s m s t h a t m i g h t b e c o n s i s t e n t w i t h t h e q u a l i - t a t i v e o b s e r v a t i o n s a r e d i s c u s s e d . I n a d d i t i o n , t h e r a t e e q u a t i o n s f o r t h e r e v e r s i b l e M i c h a e l i s - M e n t e n m e c h a n i s m a r e i n t e g r a t e d t o f i r s t o r d e r i n a s i n g u l a r p e r t u r b a t i o n s c h e m e . T h e s o l u t i o n s , w h i c h h o l d f o r t h e e n t i r e t i m e c o u r s e o f t h e r e a c t i o n r e v e a l R o b e r t N . C o c h r a n t h e r a n g e o f v a l i d i t y o f t h e s t e a d y s t a t e a s s u m p t i o n i n e n z y m e k i n e t i c s , a n d t h e y s u g g e s t t h e e x p e r i m e n t a l c o n d i — t i o n s n e c e s s a r y f o r e x t r a c t i n g r a t e c o n s t a n t s f r o m p r e - s t e a d y s t a t e d a t a . T o J a n e 1 1 A C K N O W L E D G M E N T S I w i s h t o t h a n k t h e N a t i o n a l S c i e n c e F o u n d a t i o n a n d t h e D e p a r t m e n t o f C h e m i s t r y f o r f i n a n c i a l s u p p o r t i n t h e f o r m o f r e s e a r c h a n d t e a c h i n g a s s i s t a n t s h i p s . I a m m o s t g r a t e f u l t o D r . F r e d e r i c k H . H o r n e , w h o s e p e r c e p t i v e g u i d a n c e , e n t h u s i a s m , a n d a c t i v e p a r t i c i p a t i o n m a d e t h i s t h e s i s p o s s i b l e . I a m a l s o i n d e b t e d t o D r s . J a m e s L . D y e a n d C l a r e n c e H . S u e l t e r , f o r i n c l u d i n g m e i n t h e i r e n z y m e k i n e t i c s p r o j e c t a n d f o r t h e i r e n c o u r a g e m e n t a n d a c t i v e p a r t i c i p a t i o n i n t h e r e s e a r c h r e p o r t e d h e r e . I w o u l d l i k e t o t h a n k D r . J a m e s V . B e c k f o r h i s e x - c e l l e n t c o u r s e o n p a r a m e t e r e s t i m a t i o n i n e n g i n e e r i n g a n d s c i e n c e , w h i c h s t a r t e d m y i n t e r e s t i n t h e s t a t i s t i c a l d e s i g n a n d a n a l y s i s o f e x p e r i m e n t s . I t h a n k D r . J . S u t h e r l a n d F r a m e f o r h i s s t i m u l a t i n g s e m i n a r s e r i e s o n m a t r i x m o d e l i n g , a n d f o r h e l p f u l d i s c u s s i o n s c o n c e r n i n g t h e m a t r i x m o d e l s i n t h i s t h e s i s . I w o u l d l i k e t o t h a n k D r . J o s e p h C e r a s o f o r h i s a s - s i s t a n c e i n p e r f o r m i n g t h e s t o p p e d f l o w e x p e r i m e n t s i n C h a p t e r u . I a m g r a t e f u l t o D r . W i l l i a m W a l l e r f o r h e l p - f u l d i s c u s s i o n a b o u t t h e c o m p u t e r a s p e c t s o f t h i s w o r k , a n d e s p e c i a l l y f o r p r o v i d i n g h i s m a t r i x d i a g o n a l i z a t i o n s u b r o u t i n g D I A G l . I w i s h t o t h a n k D r . T o m A t k i n s o n f o r p r o v i d i n g p r o g r a m s t h a t t r a n s f e r r e d o u r d a t a f r o m t h e m i n i - c o m p u t e r t o t h e C D C - 6 5 0 0 c o m p u t e r , a n d f o r h e l p i n g m e u s e h i s t w o - d i m e n s i o n a l m u l t i p l e c u r v e p l o t t i n g p a c k a g e M U L P L T i i i t o p r e p a r e m a n y o f t h e f i g u r e s i n C h a p t e r D , a n d M r . D a v i d C o x , w h o p o i n t e d o u t t h e u s e f u l n e s s a n d a v a i l a b i l i t y o f t h e t h r e e d i m e n s i o n a l p l o t t i n g p a c k a g e G E O S Y S . F i n a l l y , I a m g r a t e f u l t o m y w i f e J a n e f o r h e r p a t i e n c e a n d e n c o u r a g e m e n t d u r i n g t h e c o m p l e t i o n o f t h i s t h e s i s , a n d f o r h e r a r t w o r k w h i c h a p p e a r s i n C h a p t e r M . i v T A B L E O F C O N T E N T S C h a p t e r P a g e L I S T O F T A B L E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v i i i L I S T O F F I G U R E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x i 1 . I N T R O D U C T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . l 2 . S T A T I S T I C A L L Y W E I G H T E D P R I N C I P A L C O M P O N E N T A N A L Y S I S O F R A P I D S C A N N I N G W A V E L E N G T H K I N E T I C S E X P E R I M E N T S . . . . . . . . . 8 A . I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . 8 B . T h e P r i n c i p a l C o m p o n e n t M e t h o d . . . . . . . 1 2 C . R u l e s f o r t h e R a n k s o f M a n d S . . . . . . . 2 3 D . E f f e c t o f R a n d o m M e a s u r e m e n t E r r o r s . . . . . 2 9 E . S t a t i s t i c a l l y W e i g h t e d P r i n c i p a l C o m p o n e n t A n a l y s i s . . . . . . . . . . . . . 3 8 3 . E S T I M A T I O N O F S T A T I C S P E C T R A A N D C O N C E N T R A T I O N P R O F I L E S V I A W E I G H T E D P R I N C I P A L C O M P O N E N T A N A L Y S I S . . . . . . . . . . 5 3 A . M A n a l y s i s E s t i m a t e s o f E a n d g . . . . . . . 5 7 B . O n e A b s o r b e r S i m p l i f i c a t i o n s . . . . . . . . 6 7 C . T w o A b s o r b e r S i m p l i f i c a t i o n s . . . . . . . . 6 7 D . T h r e e A b s o r b e r S i m p l i f i c a t i o n s . . . . . . . 7 3 E . S A n a l y s i s E s t i m a t e s o f F , . . . . . . . . . 7 ” F . S t r a t e g y f o r R e s o l v i n g a R a p i d S c a n n i n g K i n e t i c s E x p e r i m e n t . . . . . . . . 8 0 u . A R A P I D S C A N N I N G S T O P P E D F L O W S T U D Y O F T H E L A D H - C A T A L Y Z E D R E D U C T I O N O F N D M A B Y N A D H O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O 8 “ A . I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . 8 A B . M a t e r i a l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 A C . R a p i d S c a n n i n g E x p e r i m e n t s f r o m 2 7 5 n m t o 6 1 “ n m . . . . . . . . . . . . . . 9 5 D . C a l i b r a t i o n s a n d C o r r e c t i o n s . . . . . . . . 1 0 0 E . A b s o r b a n c e - W a v e l e n g t h - T i m e S u r f a c e s . . . . . 1 0 5 Q E . H U ’ I Z J H I - c N ‘ t Z Z A L ’ C - T U h C l \ C h a p t e r ’ 1 1 A n a l y s i s . . . . . . . . . . P r i n c i p a l C o m p o n e n t A n a l y s i s , P r i n c i p a l C o m p o n e n t A n a l y s i s , P r i n c i p a l C o m p o n e n t A n a l y s i s , P r i n c i p a l C o m p o n e n t A n a l y s i s , P r i n c i p a l C o m p o n e n t A n a l y s i s , P r i n c i p a l C o m p o n e n t A n a l y s i s , P r i n c i p a l C o m p o n e n t A n a l y s i s , a n d “ . 1 . O O O O O O O O O 0 R e s o l u t i o n o f E x p e r i m e n t s 2 . 1 , W e i g h t s f o r P r i n c i p a l C o m p o n e n t S t e p 0 . S c a n n i n g E x p e r i m e n t s f r o m 2 5 0 n m t o 3 0 0 n m . . . . . . . P . D i s c u s s i o n . . . . . . . . 5 . F U L L T I M E C O U R S E A N A L Y S I S O F T H E R E V E R S I B L E M I C H A E L I S - M E N T E N M E C H A N I S M . A . I n t r o d u c t i o n . . . . . . . B . S i n g u l a r P e r t u r b a t i o n S o l u t i o n C . P r a c t i c a l R e s u l t s . . . . . . D . D i s c u s s i o n . . . . . . . . . 6 . S U G G E S T I O N S F O R F U R T H E R W O R K A . L A D H — N A D H - N D M A S y s t e m . . . . B . P r i n c i p a l C o m p o n e n t A n a l y s i s A P P E N D I X A : D e m o n s t r a t i o n t h a t A ” , ) = A f o r a n E r r o r l e s s E x p e r i m e n t . ’ A P P E N D I X B : T h e L e a s t S q u a r e s S i g n i f i c a n c e . O f § _ ( r ) . . . . o . . o o . o A P P E N D I X C : E x p e c t e d V a l u e s , V a r i a n c e s , C o v a r i a n c e s , a n d W e i g h t s f o r P r i n c i p a l C o m p o n e n t A n a l y s i s . A P P E N D I X D : D e r i v a t i o n o f S o l u t i o n B a n d s f o r T w o A b s o r b e r E x p e r i m e n t s . v i P a g e 1 1 “ 1 2 0 1 3 7 1 5 3 1 5 6 1 5 7 1 5 9 1 7 8 1 9 1 2 0 A 2 1 7 2 3 3 2 3 3 2 & 2 2 A 8 2 6 9 2 7 “ 2 7 A 2 7 6 2 7 8 2 8 5 2 8 9 3 0 2 C h a p t e r A P P E N D I X E : A P P E N D I X F : A P P E N D I X G : A P P E N D I X H : A P P E N D I X I : R E F E R E N C E S P a g e C o m p u t e r T r a n s f e r a n d C a l i b r a t i o n o f S t o p p e d F l o w R a w D a t a . . . . . . . . 3 1 1 S u b r o u t i n e O R T H P O L . . . . . . . . . . . 3 & 3 D o c u m e n t a t i o n o f P r i n c i p a l C o m p o n e n t C o m p u t e r P r o g r a m s . . . . . . 3 A 8 S i m p l e M i c h a e l i s - M e n t e n M e c h a n i s m S i n g u l a r P e r t u r b a t i o n S o l u t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 6 M a t c h i n g o f t h e I n n e r a n d O u t e r S i n g u l a r P e r t u r b a t i o n S o l u t i o n s . . . . 3 7 3 3 7 6 v i i T a b l e 2 . 1 2 . 2 2 . 3 2 . ” 2 . 5 2 . 6 3 . 1 3 . 2 “ . 1 L I S T O F T A B L E S T h e F i r s t F o u r E i g e n v a l u e s o f M a n d S , M e c h a n i s m I . . . . . . . . . . R u l e s f o r t h e R a n k o f M f o r E r r o r l e s s E x p e r i m e n t s . . . . . . . . . . . . R u l e s f o r t h e R a n k o f ‘ S f o r E r r o r l e s s E x p e r i m e n t s . . . . . . . . . . . . . P o s s i b l e C o m b i n a t i o n s o f r M a n d r S f o r M e c h a n i s m I . . . . . . . . . . M e a n o f t h e L a s t ( p - r ) E i g e n v a l u e s o f M W f o r t h e N o i s y D a t a . . . . . . . Q r / ( N - r ) ( p - r ) f o r W e i g h t e d M A n a l y s i s o f t h e N o i s y D a t a . . . . . . . . . . S o l u t i o n B a n d s f o r N o r m a l i z e d S t a t i c S p e c t r a . . . . . . . . . . . . . . . S o l u t i o n B a n d s f o r N o r m a l i z e d C o n c e n - t r a t i o n V e c t o r s . . . . . . . . . . . M o l a r A b s o r p t i v i t i e s o f L A D H , N A D H , a n d N D M A , a n d C o n c e n t r a t i o n s o f S t o c k S o l u t i o n s . . . . . . . . . . . . . . I n i t i a l C o n d i t i o n s o f t h e 2 7 5 n m - 6 1 “ n m E x p e r i m e n t s . E I L A D H , N = N A D H , S = N D M A . . . . . . . . . . v i i i P a g e 2 0 2 3 2 5 2 8 " 9 5 1 7 1 7 2 9 6 9 8 T a b l e “ . 3 “ . “ “ . 5 “ . 6 “ . 7 “ . 8 “ . 9 “ . 1 0 “ . 1 1 “ . 1 2 “ . 1 3 < “ . 1 “ W a v e l e n g t h C a l i b r a t i o n o f t h e 2 7 5 n m - 6 1 “ n m E x p e r i m e n t s . . . . . . W a v e l e n g t h W e i g h t s , L i , f o r E x p e r i - m e n t 1 . 1 . . . . . . . . . . . . . . . T i m e W e i g h t s T J f o r E x p e r i m e n t s 1 . 1 - “ . 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . M A n a l y s i s M e a n o f N o n - E s s e n t i a l E i g e n v a l u e s . . . . . . . . . . . . . . S A n a l y s i s M e a n o f N o n — E s s e n t i a l E i g e n v a l u e s . . . . . . . . . . . . Q r / [ ( N — r ) ( p - r ) ] M A n a l y s i s . . . . . . Q r / [ ( N - r ) ( p - r ) ] S A n a l y s i s . . . . . . R o t a t i o n M a t r i c e s V , g a n d E i g e n v a l u e M a t r i x 3 ( 5 ) C o m b i n a t i o n ( g t , g é L , g 3 8 , , 6 5 ) . . . . . . . . . . . . . . . C o m b i n a t i o n ( @ i L , § 2 H ’ Q 3 , é “ , g 5 ) E x p e r i m e n t 1 . 1 R o t a t i o n M a t r i c e s V a n d g . . . . . . . . . . . . . . . . S u m m a r y o f A b s o r b e r s 3 - 6 i n E x p e r i - m e n t s 1 . ] . - " 0 1 o o o o o o o o o o o A b s o r b e r s i n E x p e r i m e n t 5 . 1 ( 2 5 0 n m 3 0 0 n m ) . E 1 8 . 6 N 1 5 . 0 8 1 3 . “ ’ ( N + S ) g s ( E ) L i s t o f A b s o r b e r s i n t h e L A D H - N D M A - N A D H R e a c t i o n . . . . . . . . . . . . i x 0 P a g e 1 0 1 . 1 1 7 1 1 9 1 3 5 1 3 6 1 3 8 1 3 9 1 8 2 1 8 3 2 0 5 2 1 6 2 2 2 T a b l e E . 3 P a g e E q u i v a l e n t E x p r e s s i o n s f o r t h e D i m e n s i o n l e s s P a r a m e t e r s f o r t h e A n a l y s i s o f t h e M i c h a e l i s - M e n t e n E q u a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 0 H o l m i u m O x i d e a n d D i d y m i u m O x i d e A b s o r b a n c e P e a k s f o r t h e L A D H - N A D H - N D M A E x p e r i m e n t s v e r s u s W a v e l e n g t h C h a n n e l . . . . . . . . 3 1 8 w a v e n u m b e r s v e r s u s D r u m S e t t i n g s a t Z e r o M i r r o r N u t a t i o n f o r H o l m i u m O x i d e a n d D i d y m i u m O x i d e A b s o r b a n c e P e a k s . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 2 D r u m S e t t i n g s a t Z e r o M i r r o r N u t a t i o n v e r s u s W a v e l e n g t h C h a n n e l f o r t h e H o l m i u m O x i d e a n d D i d y m i u m O x i d e C a l i b r a t i o n S p e c t r a ( I n f o r m a t i o n C o m b i n e d f r o m T a b l e s 1 a n d 2 ) . . . . . . 3 2 “ ' L I S T O F F I G U R E S F i g u r e P a g e 1 . 1 S t r a t e g y f o r a r a p i d s c a n n i n g k i n e t i c s s t u d y . . . . . . . . . . . . . 3 2 . 1 S t a t i c s p e c t r a o f A b s o r b e r s l , 2 , a n d 3 f o r t h e M e c h a n i s m I e x a m p l e . . . . l “ 2 . 2 E r r o r l e s s a b s o l u t e a b s o r b a n c e s u r - f a c e A f o r M e c h a n i s m I . . . . . . . . . 1 5 2 . 3 E r r o r l e s s d i f f e r e n c e s u r f a c e ( 5 7 3 ) f o r M e c h a n i s m I . . . . . . . . . . . . . 1 8 2 . “ O n e p r i n c i p a l c o m p o n e n t e s t i m a t e ( 5 ( 1 ) - § ) o f t h e e r r o r l e s s d i f f e r e n c e s u r f a c e . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 2 . 5 T y p i c a l p l o t o f x i / 2 v e r s u s w a v e - l e n g t h f o r a 5 0 w a v e l e n g t h c h a n n e l e x p e r i m e n t . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 2 . 6 S t a t i c s p e c t r a o f A b s o r b e r s l a n d 2 f o r t h e M e c h a n i s m I I e x a m p l e . . . . . 3 6 2 . 7 E r r o r l e s s a b s o l u t e a b s o r b a n c e s u r - f a c e A _ f o r M e c h a n i s m I I . . . . . . . . . 3 7 2 . 8 x i / z v e r s u s c h a n n e l n u m b e r f o r t h e s i m u l a t e d n o i s y d a t a f o r M e c h a n i s m I I 0 O I O O O O O O O O O O O O O O O O 3 9 2 . 9 N o i s y a b s o l u t e a b s o r b a n c e s u r f a c e A f o r M e c h a n i s m I I . . . . . . . . . . . “ 0 x i F i g u r e 2 . 1 0 2 . 1 1 2 . 1 3 1 1 . 1 “ . 2 P a g e U n w e i g h t e d t w o p r i n c i p a l c o m p o n e n t e s t i m a t e 5 ( 2 ) o f t h e a b s o l u t e a b s o r - b a n c e s u r f a c e t a k e n f r o m t h e n o i s y a b s o r b a n c e s u r f a c e . . . . . . . . . . . “ 1 C o m p a r i s o n o f t h e u n w e i g h t e d e s t i m a t e A ( 2 ) w i t h t h e n o i s y d a t a A _ a t w a v e - l e n g t h c h a n n e l 1 9 . X = n o i s y d a t a A , O = u n w e i g h t e d e s t i m a t e 5 ( 2 ) . . . . . “ 2 C o m p a r i s o n o f t h e w e i g h t e d e s t i m a t e A ( 2 ) w i t h t h e n o i s y d a t a A . a t w a v e - l e n g t h C h a n n e l 1 9 . X = n o i s y d a t a A , O = w e i g h t e d e s t i m a t e 5 ( 2 ) . . . . . . . “ 6 W e i g h t e d t w o p r i n c i p a l c o m p o n e n t e s t i m a t e A ( 2 ) o f t h e a b s o l u t e a b s o r b a n c e s u r f a c e t a k e n f r o m t h e n o i s y a b s o r b a n c e s u r f a c e . . . . . . “ 7 S c h e m a t i c d i a g r a m o f t h e s c a n n i n g s t o p p e d f l o w s p e c t r o m e t e r . . . . . . . . . . . . . . 9 3 W a v e l e n g t h c a l i b r a t i o n f o r t h e 2 7 5 n m - 6 1 “ n m e x p e r i - m e n t s . P o i n t s a r e h o l m i u m o x i d e a n d d i d y m i u m o x i d e c a l i b r a t i o n p e a k s . . . . . . . . . . ' . . . . . . . . 1 0 2 x i i F i g u r e “ . 3 “ . “ “ . 5 “ . 6 “ . 7 “ . 8 “ . 9 P a g e E x p e r i m e n t a l a b s o l u t e a b s o r b a n c e s u r f a c e A , E x p e r i m e n t 1 . 1 , E 7 . 3 9 N 1 5 . 0 8 1 3 “ ’ ( N ) w i t h ( E + S ) . A . F r o n t v i e w . B . R e a r v i e w . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 7 E x p e r i m e n t a l d i f f e r e n c e s u r f a c e ( N ) w i t h ( E + S ) , F r o n t v i e w . . . . . . . . 1 0 9 E x p e r i m e n t a l d i f f e r e n c e s u r f a c e ( 5 7 5 ) , E x p e r i m e n t 1 . 1 , E 7 . 3 9 N 1 5 . O s l 3 . “ ’ ( N ) w i t h ( E + S ) , R e a r v i e w . . . . . . . . . 1 1 0 E x p e r i m e n t a l d i f f e r e n c e s u r f a c e ( £ 7 5 ) : E x p e r i m e n t 2 . 1 , E ( N + S ) 7 . 3 9 N 1 5 . 0 8 1 3 . “ ’ w i t h ( E ) , R e a r v i e w . . . . . . . . . . . . 1 1 1 E x p e r i m e n t a l d i f f e r e n c e s u r f a c e ( A I E ) E x p e r i m e n t 3 . 1 , E 1 8 . 6 N 1 5 . O s l 3 . “ ’ ( N + S ) w i t h ( E ) , R e a r v i e w . . . . . . . . . . . . 1 1 2 E x p e r i m e n t a l d i f f e r e n c e s u r f a c e ( A I E ) : E x p e r i m e n t “ . 1 , E 7 . 3 9 N 6 . O s l 3 . “ ’ ( N + S ) w i t h ( E ) , R e a r v i e w . . . . . . . . . . . . 1 1 3 x i / Z ( s t a n d a r d d e v i a t i o n o f r a n d o m e r r o r s ) v e r s u s w a v e l e n g t h c h a n n e l f o r E x p e r i m e n t s 1 . 1 - “ . 2 . A . 1 . 3 O . D . n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r . B . 0 . 7 O . D . n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r . C . B u f f e r v e r s u s b u f f e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 6 x i i i F i g u r e “ . 1 0 “ . 1 1 “ . 1 2 “ . 1 3 “ . 1 “ “ . 1 5 R e c o n s t r u c t i o n o f e x p e r i m e n t a l d i f - f e r e n c e s u r f a c e a s s u m i n g o n e a b s o r b e r i n E x p e r i m e n t 1 . 1 , R e a r v i e w . R e c o n s t r u c t i o n o f e x p e r i m e n t a l d i f - f e r e n c e s u r f a c e a s s u m i n g t w o a b s o r b e r s i n E x p e r i m e n t 1 . 1 , R e a r v i e w R e c o n s t r u c t i o n o f e x p e r i m e n t a l d i f - f e r e n c e s u r f a c e a s s u m i n g t h r e e a b - s o r b e r s i n E x p e r i m e n t 1 . 1 , R e a r v i e w . . . . . . . . . . . . . . . W e i g h t e d r e s i d u a l s u r f a c e a s s u m - i n g t h r e e a b s o r b e r s i n E x p e r i m e n t 1 . 1 , R e a r v i e w . V e r t i c a l s c a l e f r o m - “ 5 0 . 0 t o + 5 0 0 . 0 w e i g h t e d a b s o r b a n c e u n i t s . . . . . . . . . . . R e c o n s t r u c t i o n o f e x p e r i m e n t a l d i f - f e r e n c e s u r f a c e a s s u m i n g f o u r a b - s o r b e r s i n E x p e r i m e n t 1 . 1 , R e a r v i e w . . . . . . . . . . . . . . W e i g h t e d r e s i d u a l s u r f a c e a s s u m i n g f o u r a b s o r b e r s i n E x p e r i m e n t 1 . 1 , R e a r v i e w . V e r t i c a l s c a l e f r o m ~ 3 0 . 0 t o + 1 0 . 0 w e i g h t e d a b s o r b a n c e u n i t s . x i V » P a g e . 1 2 1 - 1 2 2 1 2 “ 1 2 5 1 2 7 . 1 2 8 F 4 F i g u r e “ . 1 6 “ . 1 7 “ . 1 8 “ . 1 9 “ . 2 0 P a g e R e c o n s t r u c t i o n o f e x p e r i m e n t a l d i f - f e r e n c e s u r f a c e a s s u m i n g f i v e a b — s o r b e r s i n E x p e r i m e n t 1 . 1 , R e a r V i e w 0 O I O I O O O O O I O O O O O O O 1 2 9 W e i g h t e d r e s i d u a l s u r f a c e a s s u m i n g f i v e a b s o r b e r s i n E x p e r i m e n t 1 . 1 , R e a r v i e w . V e r t i c a l s c a l e f r o m ~ 1 0 . 0 t o + 5 . 0 w e i g h t e d a b s o r b a n c e u n i t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 0 A . A ( 5 ) a n d A f o r w a v e l e n g t h c h a n - n e l 1 ( 2 7 5 n m ) , E x p e r i m e n t 1 . 1 . X = A , 0 1 4 ( 5 ) B . 5 ( 6 ) a n d A f o r w a v e l e n g t h c h a n - n e l l ( 2 7 5 n m ) , E x p e r i m e n t 1 . 1 . X = A , 0 : 3 ( 6 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 8 M a n a l y s i s f i t o f t h e m e a s u r e d N D M A s t a t i c s p e c t r u m t o E x p e r i m e n t 1 . 1 . X = m e a s u r e d , 0 = c a l c u l a t e d . V e r t i c a l s c a l e i n a r b i t r a r y a b s o r b a n c e u n i t s . . . l “ l M a n a l y s i s f i t o f t h e m e a s u r e d N D M A s t a t i c s p e c t r u m t o E x p e r i m e n t 2 . 1 . X = m e a s u r e d , 0 = c a l c u l a t e d . V e r t i c a l s c a l e i n a r b i t r a r y a b s o r b a n c e u n i t s . . . 1 “ 2 X V " 1 ' 1 F i g u r e . P a g e “ . 2 1 M a n a l y s i s f i t o f t h e m e a s u r e d N D M A s t a t i c s p e c t r u m t o E x p e r i m e n t 3 . 1 . = m e a s u r e d , 0 = c a l c u l a t e d . V e r t i c a l s c a l e i n a r b i t r a r y a b s o r b a n c e u n i t s . . . 1 “ 3 “ . 2 2 M a n a l y s i s f i t o f t h e m e a s u r e d N D M A s t a t i c s p e c t r u m t o E x p e r i m e n t “ . 1 . X = m e a s u r e d , 0 = c a l c u l a t e d . V e r t i c a l s c a l e i n a r b i t r a r y a b s o r b a n c e u n i t s . . . 1 “ “ “ . 2 3 M a n a l y s i s f i t o f t h e m e a s u r e d N A D H s t a t i c s p e c t r u m t o E x p e r i m e n t 1 . 1 . X = m e a s u r e d , 0 = c a l c u l a t e d . V e r t i c a l s c a l e i n a r b i t r a r y a b s o r b a n c e u n i t s . . . 1 “ 5 “ . 2 “ M a n a l y s i s f i t o f t h e m e a s u r e d L A D H s t a t i c s p e c t r u m t o E x p e r i m e n t 1 . 1 . X = m e a s u r e d , 0 = c a l c u l a t e d . V e r t i c a l s c a l e i n a r b i t r a r y a b s o r b a n c e u n i t s . . . 1 “ 6 “ . 2 5 A b s o r b a n c e s p e c t r a o f N A D H a n d N A D + ( P . L . B i o c h e m i c a l s , 1 9 7 3 ) . . . . . . . . 1 “ 9 “ . 2 6 M a n a l y s i s f i t o f t h e 2 6 0 n m N A D + a b s o r b a n c e b a n d t o E x p e r i m e n t 1 . 1 . X 8 2 6 0 n m N A D + b a n d , 0 = c a l c u l a t e d . V e r t i c a l s c a l e i n a r b i t r a r y a b - s o r b a n c e u n i t s . . . . . . . . . . . . . 1 5 0 x v i F i g u r e “ . 2 7 “ . 2 8 “ . 2 9 “ 0 3 0 “ . 3 1 “ . 3 2 M a n a l y s i s f i t o f t h e 3 “ 0 n m N A D H a b s o r b a n c e b a n d t o E x p e r i m e n t 1 . 1 . X = 3 “ 0 n m N A D H b a n d , 0 = c a l c u l a t e d . _ V e r t i c a l s c a l e i n a r b i t r a r y a b s o r - b a n c e u n i t s . . . . . . . . . . . . . M a n a l y s i s f i t o f t h e 3 “ 0 n m N A D H a b s o r b a n c e b a n d t o E x p e r i m e n t “ . 1 . X = 3 “ 0 n m N A D H b a n d , 0 = c a l c u l a t e d . V e r t i c a l s c a l e i n a r b i t r a r y a b - , s o r b a n c e u n i t s . . . . . . . . . . . . S a n a l y s i s f i t o f t h e m e a s u r e d N D M A s t a t i c s p e c t r u m t o E x p e r i m e n t “ . 1 . X = m e a s u r e d , 0 = c a l c u l a t e d . V e r t i c a l s c a l e i n a r b i t r a r y a b s o r b a n c e u n i t s . S a n a l y s i s f i t o f t h e 3 “ 0 n m N A D H a b s o r b a n c e b a n d t o E x p e r i m e n t “ . 1 . X = 3 “ 0 n m N A D H b a n d , 0 = c a l c u l a t e d . V e r t i c a l s c a l e i n a b s o l u t e a b — s o r b a n c e u n i t s . . . . . . . . . . . . . ( m , s ) p a i r s f o r W a v e l e n g t h S u b - s p a c e s I - I V o f E x p e r i m e n t 1 . 1 . . . . . . S o l u t i o n b a n d s f o r n o r m a l i z e d s t a t i c s p e c t r a i n S u b s p a c e I , E x p e r i m e n t 1 . 1 , L c E J L ’ H = E J H ' A . F i r s t a b s o r b e r . B . S e c o n d a b s o r b e r . . . . . . . . . . . . . . . . x v i i P a g e 1 5 1 1 5 2 1 5 “ 1 5 5 1 5 8 1 6 1 F i g u r e “ . 3 3 1 1 . 3 1 4 “ . 3 5 “ . 3 6 S o l u t i o n b a n d s f o r n o r m a l i z e d s t a t i c s p e c t r a i n S u b s p a c e I , E x p e r i m e n t 1 . 1 , L = A . F i r s t a b s o r b e r . a b s o r b e r S o l u t i o n b a n d s f o r n o r m a l i z e d " v 9 . 3 L . B . S e c o n d H : A C _ J H ° s t a t i c s p e c t r a i n S u b s p a c e I I I , E x p e r i m e n t 1 . 1 , L = A . F i r s t a b s o r b e r . a b s o r b e r . S o l u t i o n b a n d s f o r n o r m a l i z e d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s i n S u b s p a c e I I I , E x p e r i m e n t 1 . 1 , L = é j L ’ A . F i r s t a b s o r b e r . s o r b e r . . . . . A . M a n a l y s i s f i t o f t h e m e a s u r e d A v E J L ’ B . S e c o n d > H = f ' — fi H ' H - A 3 1 1 . B . S e c o n d a b - N D M A s t a t i c s p e c t r u m , S u b s p a c e I I I , E x p e r i m e n t 1 . 1 , X = m e a s u r e d , 0 = c a l c u - l a t e d . a b s o r b a n c e u n i t s . . . B . C o n c e n t r a t i o n p r o f i l e o f t h e f i r s t a b s o r b e r i n S u b s p a c e I I I , E x p e r i m e n t 1 . 1 . c o n c e n t r a t i o n u n i t s . x v i i i V e r t i c a l s c a l e i n a r b i t r a r y V e r t i c a l s c a l e i n a r b i t r a r y P a g e 1 6 “ 1 6 7 1 6 9 1 7 1 1 7 1 ' F i g u r e “ . 3 7 “ . 3 8 “ . 3 9 “ . “ 0 A . M a n a l y s i s f i t o f t h e f i r s t a b s o r b e r ' s s t a t i c s p e c t r u m , S u b s p a c e I I I , E x p e r i m e n t 1 . 1 . X = A f l § ( l ) f r o m l a s t 1 6 c o n s e c u t i v e s p e c t r a , 0 = c a l c u l a t e d M a n a l y s i s f i t u s i n g a l l 6 1 c o n s e c u t i v e s p e c t r a . V e r t i c a l s c a l e i n a r b i t r a r y a b s o r b a n c e u n i t s . . . . . . . . . B . C o n c e n t r a t i o n p r o f i l e o f N D M A i n E x p e r i m e n t 1 . 1 . V e r t i c a l s c a l e i n a r b i t r a r y c o n c e n t r a t i o n u n i t s . . S o l u t i o n b a n d s f o r n o r m a l i z e d c o n - c e n t r a t i o n p r o f i l e s i n w a v e l e n g t h c h a n n e l s “ “ - “ 7 , E x p e r i m e n t 1 . 1 , f l i p H 3 9 5 1 1 ' s o r b e r . B . S e c o n d a b s o r b e r . . . . . L = A . F i r s t a b - S u m m a r y o f s t a t i c s p e c t r a l i n - f o r m a t i o n o b t a i n e d f r o m S u b s p a c e s I , I I I , a n d I V , E x p e r i m e n t 1 . 1 . . . S t a t i c s p e c t r a o f A b s o r b e r s 1 - 5 i n E x p e r i m e n t 1 . 1 , E 7 . 3 9 N 1 5 . 0 8 1 3 . “ ’ ( N ) w i t h ( E + S ) , s c a l e d t o m a x i m u m a b s o r b a n c e i n t h e e x p e r i m e n t . V e r t i - c a l s c a l e s i n a r b i t r a r y a b s o r b a n c e u n i t s x i x P a g e 1 7 “ 1 7 “ 1 7 7 1 7 9 F i g u r e “ . “ 0 “ . “ 1 “ . “ 2 “ . “ 3 P a g e ( C o n t i n u e d ) " r A . A b s o r b e r s 1 a n d 2 f r o m 2 1 L , - 2 L " 1 B . A b s o r b e r s 1 a n d 2 f r o m n g ’ 3 2 L C . A b s o r b e r s 3 , “ , a n d 5 . . . . . . . . 1 8 6 C o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f A b s o r b e r s 1 - 5 i n E x p e r i m e n t 1 . 1 , E 7 . 3 9 N 1 5 . O s l 3 . “ ’ ( N ) w i t h ( E + S ) , f u l l t i m e c o u r s e . " 1 " v A . A b s o r b e r s 1 a n d 2 , 3 1 L ’ 9 2 L B . A b s o r b e r s l a n d 2 , g i n , § 2 L C . A b s o r b e r s 3 , “ , a n d 5 . . . . . . . . 1 8 8 C o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f A b s o r b e r s 1 — 5 i n E x p e r i m e n t 1 . 1 , E 7 . 3 9 N 1 5 0 8 1 3 “ ’ ( N ) w i t h ( E + S ) , e a r l y t i m e c o u r s e . A ' A A . A b s o r b e r s 1 a n d 2 , 9 1 L ’ 9 2 L B . A b s o r b e r s 1 a n d 2 , n g ’ 2 2 L C . A b s o r b e r s 3 , “ , a n d 5 . . . . . . . . 1 9 0 M a n a l y s i s f i t s o f A b s o r b e r s 3 , “ , a n d 5 t o E x p e r i m e n t 2 . 1 , E 7 o 3 9 N 1 5 . O S l 3 . u , ( N + s ) w i t h ( E ) . V e r t i c a l s c a l e s i n a r b i t r a r y a b s o r b a n c e u n i t s . A . A b s o r b e r 3 . B . A b s o r b e r “ . C . A b s o r b e r 5 . . . . . . . . . . . . . 1 9 3 X X l . t o a s C 3 E B r o o 7 , . E i b “ c 3 b r n . x t e , e 9 E p r r n N a e a 5 t 6 r r r 3 , . r l i y . a 0 y m e n a i n b B o d t a 3 1 3 s n t . . r “ p o 6 u . t i m e . b A r i c 1 a b o n o . n s f A u c o i E . r e r l x s V b e e p F u e e e s 1 . t i r n r o r i 1 1 1 i t 5 m f . c s . A e a . b n l . s t t i m o e i n — . s b A e s . s A r . “ . c b . . a e 1 l r . c o u r s e . . . 2 0 1 . . . . . . . . 2 0 3 F i g u r e “ . 1 1 “ “ . “ 5 “ . “ 6 “ . “ 7 “ . “ 8 P a g e C o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f A b s o r b e r s 3 , “ , a n d 5 i n E x p e r i m e n t 2 . 1 , E 7 . 3 9 N 1 5 . 0 8 1 3 . u , ( N + S ) w i t h ( E ) A . F u l l t i m e c o u r s e . B . E a r l y t i m e c o u r s e . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 5 M a n a l y s i s f i t s o f A b s o r b e r s 3 , “ , a n d 5 t o E x p e r i m e n t 3 . 1 , E 1 8 . 6 N 1 5 . O s l 3 . “ ’ ( N + S ) w i t h ( E ) . V e r t i c a l s c a l e s i n a r b i t r a r y a b - s o r b a n c e u n i t s . A . A b s o r b e r 3 . B . A b s o r b e r “ . C . A b s o r b e r . . . . . . . . . . . . . . 1 9 7 C o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f A b s o r b e r s 3 , “ , a n d 5 i n E x p e r i m e n t 3 . 1 , E 1 8 . 6 N 1 5 . O s l 3 . “ ’ ( N + S ) w i t h ( E ) . A . F u l l t i m e c o u r s e . B . E a r l y t i m e c o u r s e . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 8 M a n a l y s i s f i t s o f A b s o r b e r s 3 a n d 5 x x i F i g u r e “ . “ 9 “ . 5 0 “ . 5 1 “ . 5 2 “ . 5 3 “ . 5 “ 5 0 1 P a g e E x p e r i m e n t a l a b s o l u t e a b s o r b a n c e s u r - f a c e A , E x p e r i m e n t 5 . 1 , E 1 8 . 6 N 1 5 . O S I 3 . “ ’ ( N + S ) w i t h ( E ) , w a v e l e n g t h r a n g e 2 5 0 n m - 3 0 0 n m , R e a r v i e w . . . . . . . . . . . . . 2 0 8 M a n a l y s i s f i t o f t h e m e a s u r e d L A D H s t a t i c s p e c t r u m t o E x p e r i m e n t 5 . 1 . = m e a s u r e d , 0 = c a l c u l a t e d . V e r t i c a l s c a l e s i n a r b i t r a r y a b s o r b a n c e u n i t s . . . . . . . 2 0 9 M a n a l y s i s f i t o f t h e N A D H - M A D + 2 6 0 n m a b s o r b a n c e b a n d t o E x p e r i m e n t 5 . 1 . X = m e a s u r e d . 0 = c a l c u l a t e d . V e r t i c a l s c a l e s i n a r b i t r a r y a b s o r b a n c e u n i t s . . . . . . . 2 1 0 C o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s f r o m w a v e l e n g t h c h a n n e l s 1 7 - 2 8 o f E x p e r i m e n t 5 . 1 . A . " L A D H " . B . 2 6 0 n m b a n d o f N A D H - N A D + . V e r t i c a l s c a l e s i n a r b i t r a r y a b s o r b a n c e u n i t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 3 T h i r d a b s o r b e r i n E x p e r i m e n t 5 . 1 . A . S t a t i c s p e c t r u m . B . C o n c e n t r a t i o n p r o - f i l e . V e r t i c a l s c a l e s i n a r b i t r a r y a b - s o r b a n c e u n i t s . . . . . . . . . . . . . . 2 1 5 S c h e m e t o e x p l a i n t h e q u a l i t a t i v e o b s e r v a t i o n s i n E x p e r i m e n t 1 . 1 - 5 . 1 . . . . 2 3 2 D e f i n i t i o n o f V 1 1 , t h e M e t h o d 1 i n i t i a l s u b s t r a t e v e l o c i t y . . . . . . . . 2 3 7 x x i i F i g u r e P a g e 5 . 2 D e f i n i t i o n o f v 3 2 , i n i t i a l s u b s t r a t e v e l o c i t y . . . . . . . . 2 3 9 t h e M e t h o d 2 5 . 3 R : v e r s u s t i m e f o r i r r e v e r s i b l e h y d r o l y s i s o f a c e t y l - L - p h e n y l a l a n i n e e t h y l e s t e r b y c h y m o t r y p s i n . ( A / K ) = 1 0 ’ 2 ( A ) , 1 0 ’ 1 ( B ) . . . . . . . . . . . . 2 5 3 5 . “ E f f e c t o f u o n R : a t s m a l l e x t e n t s o f r e a c t i o n . u = 1 0 ' u ( A ) , 1 0 ' 3 ( B ) , 1 0 - 2 ( C ) , 1 0 - 1 ( D ) . F o r a l l c u r v e s , ( l / K ) = 1 0 ’ 3 , K = 1 . 0 , y [ ( K / l ) - l ] = o . . 2 5 5 5 . 5 E f f e c t o f u o n R 3 a t s m a l l e x t e n t s o f 1 0 ‘ " ( A ) , 1 0 ' 3 ( B ) , l o “ 2 r e a c t i o n . u ( c ) , 1 0 ‘ 1 ( D ) . F o r a l l c u r v e s , ( A / K ) = 1 0 ' 3 , K = 1 . 0 , v f ( K / A ) - l ] . o . . . . . . 2 5 6 5 . 6 E f f e c t o f u o n R ? a t s m a l l e x t e n t s o f 1 0 ' “ ( A ) , 1 0 ' 3 ( B ) , 1 0 " 2 ( c ) , 1 0 ’ 1 ( D ) . F o r a l l c u r v e s , ( A / K ) = r e a c t i o n . u 1 0 ’ 3 , K = 1 . 0 , y [ ( K / l ) - l ] = o . . . . . . 2 5 8 5 . 7 E f f e c t o f u o n R 3 a t s m a l l e x t e n t s o f l o ‘ " ( A ) , 1 0 - 3 ( B ) , 1 0 ‘ 2 r e a c t i o n . u ( C ) , 1 0 - 1 ( D ) . F o r a l l c u r v e s , ( A / K ) = 1 0 ’ 3 , K = 1 . 0 , y [ ( K / A ) - 1 ] = o . . . . . . 2 5 9 5 . 8 R : v e r s u s e x t e n t o f r e a c t i o n f o r u = 0 . 1 , K . 1 . 0 , ( A / K ) = 1 0 ’ 3 , y [ ( K / x ) - 1 ] - o . . 2 6 1 x x i i i P H / : J F i g u r e P a g e 5 . 9 E f f e c t o f K o n R : a t s m a l l e x t e n t s o f r e a c t i o n . K = 1 0 ’ 2 ( A ) , 1 0 ’ 1 ( B ) , 1 . 0 ( C ) , 1 0 . 0 ( D ) . F o r a l l c u r v e s u = 1 0 - 3 , ( A / K ) = 1 0 ‘ 3 , y [ ( K / x ) - l ] = o . . . . . . . . . 2 6 2 5 . 1 0 E f f e c t o f K o n R ? a t s m a l l e x t e n t s o f r e a c t i o n . K = 1 0 ‘ 2 ( A ) , 1 0 - 1 ( B ) , 1 . 0 ( C ) , 1 0 . 0 ( B ) . F o r a l l c u r v e s , u 1 0 ’ 3 , ( l / K ) = 1 0 ‘ 3 , y [ ( K / A ) — 1 1 = O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 3 5 . 1 1 E f f e c t o f K o n R : a n d R E a t l a r g e e x t e n t s o f r e a c t i o n . K = 1 0 - 2 ( A ) , 1 0 - 1 ( B ) , 1 . 0 1 . 0 ( C ) , 1 0 . 0 ( D ) . F o r a l l c u r v e s u = 1 0 ' 3 , ( l / K ) = 1 0 ’ 3 . y [ ( K / l ) - 1 ] = 0 . . . 2 6 “ 5 . 1 2 E f f e c t o f ( A / K ) o n R : a t s m a l l e x t e n t s o f r e a c t i o n . ( A / K ) = 1 0 ' u ( A ) , 1 0 - 3 ( B ) , 1 0 - 2 ( C ) , 1 0 _ 1 ( D ) . F o r a l l c u r v e s u = 1 0 ’ 3 , K = 1 . 0 , y [ ( K / l ) - l ] - o . . . . 2 6 6 5 . 1 3 E f f e c t o f ( l / K ) o n H P a t s m a l l e x t e n t s o f r e a c t i o n . ( l / K ) = 1 0 ‘ " ( A ) , 1 0 ' 3 ( B ) , l o ‘ 2 ( c ) , 1 0 ' 1 ( D ) . F o r a l l c u r v e s u a 1 0 ‘ 3 , K = 1 . 0 y [ ( K / 1 ) - l ] = o . . . . 2 6 7 5 . 1 “ E f f e c t o f ( A / K ) o n R : a t l a r g e e x t e n t s o f r e a c t i o n f o r u = 0 . 2 ( A / K ) = 0 . 5 ( A ) , 0 . 1 ( B ) , 0 . 0 1 ( C ) . F o r a l l c u r v e s K = 1 . 0 , u = 0 . 2 , y [ ( K / l ) - 1 ] = o . . . . . . 2 6 8 x x i v 5 . 1 5 t t E e f x ( A f t / e e K c ) n o f o 0 f . ( 2 A r ( / e A K a ) ) , c t s = o i 0 n o . n 6 H ( i w B a e , h ) n r d e 0 . R k 8 5 - ( a t # ) . 2 C e l 0 a F . r o g r F i g u r e P a g e a l l c u r v e s u = 1 0 - 3 , K = 1 . 0 , y [ ( K / 1 ) - l ] = - l - 2 7 o K e q ‘ - 1 . 0 . o o o o o o o o o o o o o o 5 . 1 6 E f f e c t o f v [ ( K / l ) - l ] - K g ; a t l a r g e e x t e n t s o f r e a c t i o n . 3 o n R 1 a n d R E v t ( K / A > - 1 ] = K g : 9 . 9 9 ( C ) , 1 . 9 8 ( D ) . . . . . . . . . . . . 2 7 1 O . D ( A ) , 0 . 5 0 ( B ) , E . 1 F l o w D i a g r a m f o r D a t a T r a n s f e r a n d C a l i b r a t i o n . . . . . . . . . . . . . 3 1 2 E . 2 T y p i c a l N i n e - T r a c k T a p e D i r e c t o r y . . . . 3 1 “ E . 3 S c h e m a t i c d i a g r a m o f t i m i n g f l a g s f o r a s c a n n i n g e x p e r i m e n t t r i g g e r e d b y t h e s t o p f l a g . T 1 = f l o w t i m e , T 2 = t i m e s h i f t , T 3 = s t o p f l a g t o p l u n g e r s t o p , T “ = s t o p p i n g t i m e . . . . 3 2 8 X X V C H A P T E R 1 I N T R O D U C T I O N T h e a p p l i c a t i o n o f r a p i d s c a n n i n g s p e c t r o s c o p i c m e a s u r e m e n t s t o c h e m i c a l k i n e t i c s e x p e r i m e n t s h a s b e e n a c c e l e r a t e d b y t h e d e v e l o p m e n t o f c o m p u t e r a s s i s t e d d a t a a c q u i s i t i o n s y s t e m s . ( D y e a n d F e l d m a n , 1 9 6 6 ; S a n t i n i , M i l a n o , a n d P a r d u e , 1 9 7 3 ; P a p a d a k i s , C o o l e n , a n d D y e , 1 9 7 5 ; C o o l e n , 3 2 2 A . , 1 9 7 5 3 M i l a n o a n d P a r d u e , 1 9 7 5 ; M i l l e r , e _ t _ 5 1 1 . , 1 9 7 5 ; a n d H o l l a w a y a n d W h i t e , 1 9 7 5 . ) A s i n g l e r a p i d s c a n n i n g k i n e t i c s e x p e r i m e n t g i v e s a t h r e e d i m e n - s i o n a l s u r f a c e o f a s p e c t r o p h o t o m e t r i c r e s p o n s e , s u c h a s a b s o r b a n c e , v e r s u s w a v e l e n g t h a n d t i m e ( s e e F i g u r e “ . 3 ) . E a c h s u r f a c e i s t h e r e s u l t o f c o n t r i b u t i o n s f r o m a b s o r b i n g r e a c t a n t s , p r o d u c t s , c a t a l y s t s , a n d t r a n s i e n t i n t e r m e d i a t e s . T h u s , r a p i d s c a n n i n g s p e c t r o s c o p y c a n b e a p o w e r f u l t o o l f o r s p e c t r a l l y a n d k i n e t i c a l l y c h a r a c t e r i z i n g c o m p l e x r e a c t i n g s y s t e m s , i f w e c a n e x t r a c t t h e s p e c t r a l a n d k i n e t i c i n f o r m a t i o n f r o m e a c h s u r f a c e . I n C h a p t e r s 2 a n d 3 w e d e v e l o p t h e m e t h o d o l o g y f o r e x t r a c t i n g t h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n — t i m e p r o f i l e s o f e a c h a b s o r b e r i n a r a p i d s c a n n i n g k i n e t i c s e x p e r i m e n t , a n d i n C h a p t e r “ w e i l l u s t r a t e t h i s m e t h o d o l o g y b y a p p l y i n g i t t o a r a p i d s c a n n i n g s t o p p e d f l o w s t u d y o f a r e a c t i o n c a t a l y z e d b y t h e e n z y m e h o r s e l i v e r a l c o h o l d e h y d r o g e n a s e ( L A D H ) . I n t h i s i n t r o d u c t o r y c h a p t e r , w e p r e s e n t a n o v e r a l l v i e w o f t h e a n a l y s i s o f r a p i d s c a n n i n g k i n e t i c s d a t a . F i g u r e 1 . 1 s h o w s i n f l o w - d i a g r a m f o r m , t h e s t e p s i n - v o l v e d i n a r a p i d s c a n n i n g k i n e t i c s s t u d y . F i r s t , w e m e a s u r e a b s o r b a n c e v e r s u s t i m e a n d w a v e l e n g t h f o r a v a r i e t y o f i n i t i a l c o n d i t i o n s - t h e m o r e t h e b e t t e r . ‘ T h e v a r i e d i n i t i a l c o n d i t i o n s m a y b e i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n , p H , t e m — p e r a t u r e , a n d a n y o t h e r v a r i a b l e s t h a t m i g h t a f f e c t t h e c o u r s e o f t h e r e a c t i o n . T h e c h o s e n w a v e l e n g t h r a n g e s h o u l d i n c l u d e a l l s u s p e c t e d a b s o r b e r s w h o s e s p e c t r a l a n d k i n e t i c p r o p e r t i e s a r e t o b e c h a r a c t e r i z e d i n t h e s t u d y . E a c h e x p e r i m e n t s h o u l d , i f p o s s i b l e , e x t e n d i n t i m e u n t i l a b s o r b a n c e i s n o t c h a n g i n g a t a n y w a v e l e n g t h i n t h e s c a n n i n g r a n g e o f t h e e x p e r i m e n t . E a c h s u r f a c e m e a s u r e d i n S t e p 1 c o n t a i n s i n f o r m a t i o n a b o u t t h e s t a t i c s p e c t r u m a n d c o n c e n t r a t i o n - t i m e p r o f i l e o f e a c h a b s o r b e r i n t h e r e a c t i o n . T h e u l t i m a t e g o a l o f a r a p i d s c a n n i n g k i n e t i c s s t u d y i s t o i d e n t i f y o n e o r m o r e k i n e t i c m e c h a n i s m s t h a t s a t i s f a c t o r i l y e x p l a i n t h e c o n c e n - t r a t i o n - t i m e p r o f i l e s o f e a c h a b s o r b e r . H o w e v e r , w e m u s t f i r s t e x t r a c t t h e s e c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s f r o m t h e e x p e r i - m e n t s . M o r e o v e r , w e n e e d t o b e a b l e t o e x t r a c t t h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s b e f o r e p r o p o s i n g a s p e c i f i c k i n e t i c m e c h a n i s m s i n c e a k i n e t i c m e c h a n i s m p r e - s u p p o s e s t h a t t h e c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s a r e a l r e a d y k n o w n . T h e r e f o r e , i n S t e p s 2 a n d 3 o f F i g u r e 1 . 1 w e e x t r a c t t h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s S t r a t e g y f o r a r a p i d s c a n n i n g k i n e t i c s s t u d y . I S t a r t 7 J r 1 M e a s u r e a b s o r b a n c e v e r s u s t i m e a n d w a v e l e n g t h i o r d i l i e r e n t i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s 2 D e t e r m i n e n u m b e r o f a b s o r b e r s i n t h e r e a c t i o n u s i n g w e i g h t e d p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s 3 U s e p r i n c i p a l c o m p o n e n t s t o r e s o l v e a b s o r b a n c e s i n t o s t a t i c s p e c t r a o f a b s o r b e r s a n d c o n c e n t r a t i o n - t i m e p r o f i l e s F i g u r e 1 . 1 . 6 P r 0 p o s e b e t t e r m e c h - a n i s m s a n d d e v i s e c r i t i c a l e x p e r i m e n t s t o d i s t i n g u i s h m e c h a n i s m s a n d e s t i m a t e i m p o r t a n t p a r a m e t e r s i 5 P l a u s i b l e m e c h a n i s m l o u n d a n d i m p o r t a n t p a r a m e t e r s e s t i m a t e d ? Y e s . 4 P r o p o s e a n d t e s t k i n e t i c m e c h a n i s m s l o r t h e c o n c e n t r a t i o n - t i m e p r o fi l e s u s i n g n o n l i n e a r l e a s t s q u a r e s f i t t i n g a s t h e c r i t e r i o n S t o p b e f o r e p r o p o s i n g k i n e t i c m e c h a n i s m s i n S t e p “ . W e d o n o t k n o w h o w m a n y a b s o r b e r s o c c u r i n a n e x p e r i - m e n t b e f o r e w e a n a l y z e i t . A l t h o u g h w e u s u a l l y k n o w w h i c h o f t h e c h e m i c a l s i n i t i a l l y m i x e d a r e a b s o r b e r s , a n d a l - t h o u g h w e s o m e t i m e s k n o w w h i c h p r o d u c t s a r e a b s o r b e r s , w e u s u a l l y d o n o t k n o w h o w m a n y l i g h t a b s o r b i n g t r a n s i e n t i n t e r m e d i a t e s o c c u r i n t h e r e a c t i o n . I n S t e p 2 , w e d e - t e r m i n e b y t h e m e t h o d o f w e i g h t e d p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s ( C o c h r a n a n d H o r n e , 1 9 7 7 ) t h e m i n i m u m n u m b e r o f a b s o r b e r s r e q u i r e d t o e x p l a i n e a c h s c a n n i n g e x p e r i m e n t a n d h o w m a n y o f t h e s e c h a n g e c o n c e n t r a t i o n s . T h i s m e t h o d , p r e s e n t e d i n C h a p t e r 2 , r e q u i r e s n o a s s u m p t i o n s a b o u t t h e s p e c t r a l s h a p e s o f t h e a b s o r b e r s o r t h e k i n e t i c m e c h a n i s m o f t h e r e a c t i o n . I n S t e p 3 , w e u s e a n e x t e n s i o n o f t h e w e i g h t e d p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s m e t h o d p r e s e n t e d i n C h a p t e r 3 t o r e s o l v e e a c h s c a n n i n g e x p e r i m e n t i n t o t h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n — c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f i t s a b s o r b e r s . A g a i n , w e a v o i d p r o p o s i n g a p a r t i c u l a r k i n e t i c m e c h a n i s m t o e x t r a c t t h i s i n f o r m a t i o n . I n s t e a d w e r e s o l v e t h e w h o l e e x p e r i m e n t b y u s i n g t h e m e a s u r e d s t a t i c s p e c t r a o f s u s p e c t e d a b s o r b e r s ( r e a c t a n t s , p r o d u c t s , a n d c a t a l y s t s ) p l u s i n f o r m a t i o n o b t a i n e d b y a n a l y z i n g s u b s p a c e s o f w a v e l e n g t h a n d t i m e t h a t h a v e b e e n s h o w n t o c o n t a i n f e w e r a b s o r b e r s t h a n t h e w h o l e e x p e r i m e n t . I n C h a p t e r “ w e a p p l y S t e p s 1 t h r o u g h 3 o f F i g u r e 1 . 1 t o c h a r a c t e r i z e s p e c t r a l l y a n d k i n e t i c a l l y a c o m p l e x r e a c t i o n c a t a l y z e d b y t h e e n z y m e h o r s e l i v e r a l c o h o l d e - h y d r o g e n a s e . W e i g h t e d p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s r e - v e a l s t h a t i n t h e w a v e l e n g t h r a n g e 2 5 0 n m - 6 1 “ n m t h i s r e a c t i o n h a s a t l e a s t s e v e n a b s o r b e r s . T h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s d e t e r m i n e d i n S t e p 3 s h o w t h a t a t l e a s t t h r e e o f t h e s e a b s o r b e r s a r e t r a n s i e n t i n t e r - m e d i a t e s i n t h e s e n s e t h a t t h e i r c o n c e n t r a t i o n s g r o w a n d t h e n d e c a y i n e a c h e x p e r i m e n t . S t e p s “ t h r o u g h 6 a r e t h e a d v a n c e d s t a g e s o f a k i n e t i c s s t u d y . A r m e d w i t h t h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s d e t e r m i n e d i n S t e p s 1 t h r o u g h 3 , w e p r o p o s e a n d t e s t k i n e t i c m e c h a n i s m s . E a c h p r o p o s e d m e c h a n i s m c o n t a i n s a d j u s t a b l e p a r a m e t e r s ( r a t e c o n s t a n t s , a c t i v a t i o n e n e r g i e s , a n d e q u i l i b r i u m c o n s t a n t s . ) T h e c r i t e r i o n f o r w h e t h e r a p r o p o s e d k i n e t i c m e c h a n i s m e x p l a i n s t h e e x p e r i m e n t s i s t o d e t e r m i n e h o w w e l l i t s p r e d i c t e d c o n c e n t r a t i o n s f i t t h e c o n c e n t r a t i o n s e x t r a c t e d f r o m t h e _ e x p e r i m e n t s w h e n t h e p a r a m e t e r s a r e a d j u s t e d b y w e i g h t e d n o n l i n e a r l e a s t s q u a r e s . T h i s s t e p c a n b e p e r f o r m e d w i t h a n o n l i n e a r l e a s t s q u a r e s p r o g r a m s u c h a s K I N F I T ( D y e a n d N i c e l y , 1 9 7 1 ) . H o w e v e r , a t y p i c a l m e c h a n i s m f o r f o u r o r m o r e a b s o r b e r s i n a s i n g l e e x p e r i m e n t m a y c o n t a i n e i g h t o r m o r e a d j u s t a b l e r a t e c o n s t a n t s . A f r e q u e n t l y e n c o u n t e r e d p r o b l e m w i t h s o m a n y a d j u s t a b l e p a r a m e t e r s i s t h a t t h e y c a n n o t a l l b e d e t e r m i n e d s i n c e s o m e o f t h e m a r e c o u p l e d t o e a c h o t h e r . I n s i g h t s i n t o t h e s o l u t i o n o f t h i s c o m m o n a n d t r o u b l e s o m e p r o b l e m c a n b e f o u n d i n t h e t h e o r y o f s e n s i t i v i t y a n a l y s i s a p p l i e d t o p a r a m e t e r e s t i m a t i o n , d i s c u s s e d i n B o x a n d L u c a s ( 1 9 5 9 ) , A t k i n s o n a n d H u n t e r ( 1 9 6 8 ) , H i l l a n d H u n t e r ( 1 9 7 “ ) , B e c k a n d A r n o l d ( 1 9 7 5 ) , H i m m e l b l a u ( 1 9 7 0 ) , C u k i e r , g £ _ g l , ( 1 9 7 3 ) , S c h a i b l y a n d S h u l e r ( 1 9 7 3 ) , a n d C u k i e r , 2 2 . 2 1 - ( 1 9 7 5 ) . I f S t e p 5 i n d i c a t e s t h a t o u r m e c h a n i s m d e s c r i b e s t h e e x p e r i m e n t s a n d t h a t w e h a v e e s t i m a t e d i t s i m p o r t a n t p a r a m e t e r s , w e m a y t e r m i n a t e t h e s t u d y . H o w e v e r , i f w e h a v e s e v e r a l m e c h a n i s m s a l l o f w h i c h d e s c r i b e t h e d a t a , o r i f t h e i m p o r t a n t p a r a m e t e r s i n o u r m e c h a n i s m a r e e s t i - m a t e d p o o r l y f r o m f i t t i n g t h e a v a i l a b l e d a t a , w e p r o c e e d t o S t e p 6 . I n S t e p 6 w e d e s i g n c r i t i c a l e x p e r i m e n t s t o d i s t i n g u i s h b e t w e e n c o m p e t i n g m e c h a n i s m s a n d e s t i m a t e p a r a m e t e r s . S e n s i t i v i t y a n a l y s i s g i v e s a c r i t e r i o n t h a t c a n b e u s e d t o d e s i g n o p t i m a l e x p e r i m e n t s f o r e s t i m a t i n g a l l t h e p a r a m e t e r s o r s u b g r o u p s o f p a r a m e t e r s ( B e c k a n d A r n o l d , 1 9 7 5 ; H i l l a n d H u n t e r , 1 9 7 “ ) . H u n t e r a n d R e i n e r ( 1 9 6 5 ) , B o x a n d H i l l ( 1 9 6 7 ) , a n d H i l l , H u n t e r , a n d W i c h e r n ( 1 9 6 8 ) h a v e d e v i s e d m e t h o d s f o r t h e o p t i m a l d e s i g n o f c r i t i c a l e x p e r i m e n t s t o d i s t i n g u i s h b e t w e e n t w o o r m o r e r i v a l m e c h a n i s m s . U l t i m a t e l y , w e r e t u r n t o S t e p 1 t o r e p e a t t h e c y c l e b y p e r f o r m i n g t h e c r i t i c a l e x p e r i m e n t s d e v i s e d i n S t e p 6 . T h e r e s e a r c h r e p o r t e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n i s c o m p l e t e t h r o u g h S t e p s 1 , 2 , a n d 3 . I n t h e l a s t s e c t i o n o f C h a p t e r “ , w e d i s c u s s c r i t i c a l l y s o m e m e c h a n i s t i c h y p o t h e s e s p r 0 p o s e d b y o t h e r s f o r t h i s e n z y m e s y s t e m , a n d w e s p e c u l a t e o n m e c h a n i s m s w h i c h m i g h t c o n f o r m t o o u r e x p e r i m e n t a l r e s u l t s . S t e p s “ t h r o u g h 6 h a v e n o t b e e n t a k e n . I n C h a p t e r 5 w e t r e a t t h e r e v e r s i b l e , s i m p l e M i c h a e l i s - M e n t e n m e c h a n i s m , t h e s i m p l e s t k i n e t i c m e c h a n i s m u s e d t o d e s c r i b e a n e n z y m e c a t a l y z e d r e a c t i o n . I n p a r t i c u l a r , w e p r e s e n t a s i n g u l a r p e r t u r b a t i o n s o l u t i o n o f t h e n o n l i n e a r , s t i f f d i f f e r e n t i a l e q u a t i o n s t h a t o c c u r . T h e s i n g u l a r p e r t u r b a t i o n m e t h o d g i v e s e x p l i c i t a l g e b r a i c s o l u t i o n s t o t h e s e d i f f e r e n t i a l e q u a t i o n s . I n g e n e r a l , n u m e r i c a l s o l u t i o n s s u c h a s o b t a i n e d w i t h G e a r ' s a l g o r i t h m ( G e a r , 1 9 7 1 ) a r e m o r e p r a c t i c a l t h a n a l g e b r a i c s o l u t i o n s b e c a u s e t h e n u m e r i c a l m e t h o d s a r e e a s i e r t o a p p l y . H o w e v e r , t h e s i n g u l a r p e r t u r b a t i o n s o l u t i o n p r e s e n t e d i n C h a p t e r 5 i s i n s t r u c t i v e i n r e v e a l i n g t h r o u g h i t s d i m e n s i o n a l a n a l y s i s t h e j u s t i f i c a t i o n o f t h e s t e a d y s t a t e a s s u m p t i o n i n e n z y m e k i n e t i c s . T h e e x p l i c i t s o l u t i o n s a l s o s u g g e s t e x p e r i - m e n t a l c o n d i t i o n s n e c e s s a r y f o r e x t r a c t i n g r a t e c o n s t a n t s f r o m p r e - s t e a d y s t a t e d a t a . C H A P T E R 2 S T A T I S T I C A L L Y W E I G H T E D P R I N C I P A L C O M P O N E N T A N A L Y S I S O F R A P I D S C A N N I N G W A V E L E N G T H K I N E T I C S E X P E R I M E N T S A . I N T R O D U C T I O N T h e d e v e I O p m e n t o f s o p h i s t i c a t e d c o m p u t e r i n t e r f a c e d d a t a c o l l e c t i o n s y s t e m s h a s m a d e s c a n n i n g w a v e l e n g t h k i n e t i c s e x p e r i m e n t s p r a c t i c a l f o r t i m e s a s s h o r t a s t h e s t o p p e d f l o w t i m e s c a l e ( S a n t i n i , M i l a n o , a n d P a r d u e , 1 9 7 3 ; P a p a d a k i s , C o o l e n a n d D y e , 1 9 7 5 ; C o o l e n g § | A A . , 1 9 7 5 ; M i l a n o a n d P a r d u e , 1 9 7 5 ; M i l l e r 2 3 . 2 1 - : 1 9 7 5 ; H o l l o w a y a n d W h i t e , 1 9 7 5 ) . I n a t y p i c a l s c a n n i n g w a v e - l e n g t h k i n e t i c s e x p e r i m e n t a s p e c t r a l r e g i o n i s r a p i d l y a n d r e p e a t e d l y s c a n n e d w h i l e a s p e c t r o p h o t o m e t r i c r e s p o n s e s u c h a s a b s o r b a n c e , f l u o r e s c e n c e , o r c h e m i l u m i n e s c e n c e i s m e a s u r e d a t a f i x e d n u m b e r o f w a v e l e n g t h c h a n n e l s a c r o s s t h e s p e c t r u m d u r i n g e a c h s c a n . I f t h e t i m e d u r a - t i o n o f e a c h s c a n i s s h o r t c o m p a r e d t o t h e f a s t e s t s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y d e t e c t a b l e p r o c e s s i n t h e r e a c t i o n , t h e d a t a c a n b e r e g a r d e d a s a s e r i e s - o f N c o n s e c u t i v e , i n s t a n t a n e o u s s p e c t r a m e a s u r e d a t p w a v e l e n g t h c h a n n e l s a n d c a n b e r e p r e s e n t e d b y a ( p r ) m a t r i x A , w h e r e A i d i s t h e s p e c t r o p h o t o m e t r i c r e s p o n s e m e a s u r e d a t w a v e l e n g t h c h a n n e l i a t t h e t i m e o f s c a n j . T h e r e a s o n f o r s a m p l i n g t h i s t h r e e d i m e n s i o n a l s p a c e o f r e s p o n s e - w a v e l e n g t h - t i m e i n s t e a d o f t h e s i m p l e r t w o d i m e n s i o n a l s p a c e o b t a i n e d i n a f i x e d w a v e l e n g t h e x p e r i - m e n t i s t h e n e e d t o c h a r a c t e r i z e k i n e t i c s y s t e m s t h a t c o n t a i n m o r e t h a n o n e a b s o r b i n g , f l u o r e s c i n g , o r c h e m i - l u m i n e s c e n t s o l u t e . W h e t h e r t h e u l t i m a t e g o a l i s t o a s s a y s i m u l t a n e o u s l y s e v e r a l s u c h s o l u t e s i n a k i n e t i c s y s t e m w i t h a k n o w n r a t e l a w , o r t o p r o p o s e a n d t e s t m e c h a n i s m s f o r a c o m p l e x r e a c t i o n s u c h a s a n e n z y m e s y s t e m w i t h d e t e c t a b l e s u b s t r a t e s , p r o d u c t s , e n z y m e s a n d e n z y m e - b o u n d i n t e r m e d i a t e s , a n e c e s s a r y f i r s t s t e p i n d a t a a n a l y s i s i s t o d e t e r m i n e h o w m a n y d e t e c t a b l e s o l u t e s o c c u r i n t h e r e a c t i o n . T h e m u l t i v a r i a t e s t a t i s t i c a l m e t h o d o f p r i n c i - p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s , w h i c h h a s b e e n a p p l i e d t o s p e c t r a l s t u d i e s o f m u l t i c o m p o n e n t e q u i l i b r i u m s y s t e m s ( K a n k a r e , 1 9 7 0 ; H u g u s a n d E l - A w a d y , 1 9 7 1 ; L a w t o n a n d S y l v e s t r e , 1 9 7 1 ; S y l v e s t r e , L a w t o n a n d M a g g i o , 1 9 7 “ ) , b a n d r e s o l u - t i o n o f I R s p e c t r a ( B u l m e r a n d S h u r v e l l , 1 9 7 3 ) , a n a l y s i s o f p o t e n t i o m e t r i c d a t a ( V a d a s d i , 1 9 7 “ ) , a n d a n a l y s i s o f m a s s s p e c t r a ( R o z e t t a n d P e t e r s e n , 1 9 7 5 ; R i t t e r , L o w r y , I s e n h o u r a n d W i l k i n s , 1 9 7 6 ) , i s i d e a l l y s u i t e d f o r d e t e r - m i n i n g t h e n u m b e r o f d e t e c t a b l e s o l u t e s i n r a p i d s c a n n i n g w a v e l e n g t h k i n e t i c s e x p e r i m e n t s . T h e a n a l o g y b e t w e e n s p e c t r a l s t u d i e s o f m u l t i c o m p o n e n t e q u i l i b r i u m s y s t e m s a n d s c a n n i n g w a v e l e n g t h k i n e t i c s e x p e r i m e n t s a n d t h e a p p l i c a b i l i t y o f p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s t o b o t h w a s p o i n t e d o u t a n d d e m o n s t r a t e d b y 1 0 S y l v e s t r e , L a w t o n , a n d M a g g i o ( 1 9 7 “ ) . I n t h i s c h a p t e r w e e x t e n d t h e a p p l i c a t i o n t o k i n e t i c s e x p e r i m e n t s a n d s h o w t h a t t w o k i n d s o f p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s a r e u s e - f u l f o r k i n e t i c s e x p e r i m e n t s . E a c h r e q u i r e s o n l y t h e m a t r i x A , a n d e a c h g i v e s a l o w e r b o u n d s e s t i m a t e o f q , t h e n u m b e r o f s o l u t e s i n t h e r e a c t i o n w i t h a s p e c t r o - p h o t o m e t r i c r e s p o n s e . S e c o n d m o m e n t m a t r i x p r i n c i p a l _ c o m p o n e n t a n a l y s i s , h e r e i n a f t e r c a l l e d A a n a l y s i s , g i v e s f o r q a l o w e r b o u n d s e s t i m a t e t h a t i s s e n s i t i v e t o t h e l i n e a r d e p e n d e n c e o f t h e c o n c e n t r a t i o n s o f t h e d e t e c t - a b l e s p e c i e s . S a m p l e c o v a r i a n c e m a t r i x p r i n c i p a l c o m - p o n e n t a n a l y s i s , h e r e i n a f t e r c a l l e d § a n a l y s i s , g i v e s a n e s t i m a t e t h a t i s s e n s i t i v e t o t h e l i n e a r d e p e n d e n c e o f t h e t i m e r a t e s o f t h e c o n c e n t r a t i o n s . T h e s e t w o e s t i - m a t e s o f q a r e n o t n e c e s s a r i l y t h e s a m e , a n d w e s h o w t h a t a p p l i c a t i o n o f b o t h a n a l y s e s e n a b l e s d i s c r i m i n a t i o n b e t w e e n m e c h a n i s t i c a l t e r n a t i v e s t h a t w o u l d b e i n d i s - t i n g u i s h a b l e w i t h e i t h e r a n a l y s i s a l o n e . W e f i r s t d e v e l o p r u l e s f o r t h e a p p l i c a t i o n o f M a n d S a n a l y s e s t o e r r o r l e s s d a t a . W i t h t h i s s i m p l i f i c a t i o n t h e M a n d S e s t i m a t e s o f q a r e t h e r a n k s o f , r e s p e c t i v e l y , t h e s e c o n d m o m e n t m a t r i x a n d t h e s a m p l e c o v a r i a n c e m a t r i x . W e t h e n d i s c u s s t h e e f f e c t o f r a n d o m m e a s u r e m e n t e r r o r s , a n d i n p a r t i c u l a r t h e c a s e i n w h i c h t h e v a r i a n c e o f t h e m e a s u r e m e n t e r r o r s i s n o t c o n s t a n t t h r o u g h o u t t h e e x p e r i - m e n t . T h e g o a l i s t o i n f e r t h e e s s e n t i a l r a n k s o f t h e t w o m a t r i c e s ; i . e . , t h e r a n k s t h a t w o u l d o b t a i n i f A = E £ . ( 2 . 1 ) 1 1 m e a s u r e m e n t e r r o r s c o u l d b e e l i m i n a t e d . A f t e r d e m o n s t r a t - i n g w i t h a s i m p l e e x a m p l e t h a t t h e u s u a l p r o c e d u r e f o r i n f e r r i n g t h e t w o r a n k s g i v e s i n c o r r e c t r e s u l t s , w e u t i l i z e a g e n e r a l e r r o r v a r i a n c e m o d e l t o d e v e l o p a w e i g h t i n g s c h e m e t h a t g i v e s ( 1 ) c o r r e c t e s t i m a t e s o f t h e e s s e n t i a l r a n k s , ( i i ) a l o w v a r i a n c e e s t i m a t e o f t h e e r r o r - l e s s c h e m i c a l r e a c t i o n c o n t r i b u t i o n t o t h e d a t a m a t r i x , a n d ( i i i ) a s i m p l e c r i t e r i o n f o r i n t e r p r e t i n g t h e e i g e n - v a l u e s o f M a n d A i n t e r m s o f t h e i r e s s e n t i a l r a n k s . T h e w e i g h t i n g s c h e m e i s a p p l i c a b l e t o b o t h k i n e t i c a n d n o n - k i n e t i c c h e m i c a l a p p l i c a t i o n s o f p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s . T h e s t a r t i n g p o i n t f o r b o t h M a n d S a n a l y s e s i s t h e m a t r i x m o d e l o f t h e s p e c t r o p h o t o m e t r i c d a t a . T h e a p - p l i c a b i l i t y o f p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s e s r e q u i r e s o n l y t h a t t h e r e s p o n s e a t e a c h w a v e l e n g t h c h a n n e l b e a l i n e a r f u n c t i o n o f t h e c o n c e n t r a t i o n o f e a c h d e t e c t a b l e s p e c i e s . W e d i s c u s s i n t h i s t h e s i s t h e a n a l y s i s o f a b s o r b a n c e d a t a , w h e r e t h e l i n e a r i t y r e q u i r e m e n t i s s a t i s f i e d i f B e e r ' s L a w h o l d s . S i m i l a r l i n e a r l a w s o c c u r f o r f l u o r e s c e n c e a n d c h e m i l u m i n e s c e n c e , a n d t h e e x t e n s i o n t o t h e s e s y s t e m s i s s t r a i g h t f o r w a r d . F o r e r r o r - l e s s a b s o r b a n c e d a t a i n w h i c h B e e r ' s L a w h o l d s , a n d f r o m w h i c h t h e s o l v e n t b a s e l i n e h a s b e e n s u b t r a c t e d , t h e m a t r i x m o d e l i s 1 2 w h e r e A ’ i s a ( p r ) m a t r i x w h o s e i , j e l e m e n t A 1 3 i s t h e a b s o l u t e a b s o r b a n c e m e a s u r e d a t w a v e l e n g t h c h a n n e l 1 i n t h e s p e c t r u m s c a n n e d a t t i m e j . E ’ i s a ( p x q ) m a t r i x d e f i n e d b y E = ( £ 1 , 3 2 , . . . , f ) , w h e r e : 3 , h e r e i n a f t e r c a l l e d t h e s t a t i c s p e c t r u m 9 : a b s o r b e r j i s a p c o m p o n e n t c o l u m n v e c t o r w h o s e i ' t h e l e m e n t i s t h e p r o d u c t o f t h e c e l l p a t h l e n g t h w i t h t h e m o l a r a b s o r p t i v i t y o f a b s o r b e r j a t w a v e l e n g t h c h a n n e l 1 . g i s a ( q u ) m a t r i x d e f i n e d 9 = ( g l , g z , . . . , g q ) , w h e r e 3 , , h e r e i n a f t e r c a l l e d t h e c o n c e n t r a t i o n v e c t o r 9 3 a b s o r b e r j , i s a n N c o m p o n e n t c o l u m n v e c t o r w h o s e i ' t h e l e m e n t i s c J ( t 1 ) , t h e m o l a r i t y o f a b s o r b e r j d u r i n g s p e c t r u m 1 . P r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s r e q u i r e s t h a t t h e n u m b e r o f w a v e l e n g t h c h a n n e l s p a n d t h e n u m b e r o f c o n s e c u t i v e s p e c t r a N a r e b o t h l a r g e r t h a n t h e n u m b e r o f a b s o r b e r s q . B . T h e P r i n c i p a l C o m p o n e n t M e t h o d T h e f o l l o w i n g e x a m p l e i l l u s t r a t e s t h e a p p l i c a t i o n o f M a n d S a n a l y s e s t o e r r o r l e s s d a t a . C o n s i d e r a t h r e e a b s o r b e r r e a c t i o n t h a t f o l l o w s t h e s i m p l e k i n e t i c m e c h - a n i s m I , k 1 = 3 s e c " 1 k 2 = 3 5 s e c - 1 A 1 ; A 2 , A 3 4 A 2 , ( I ) w h e r e A 1 , A 2 , a n d A 3 r e p r e s e n t a b s o r b e r s o n e , t w o , a n d t h r e e . S u p p o s e t h a t o v e r t h e w a v e l e n g t h r a n g e o f t h e 1 3 e x p e r i m e n t t h e s e t h r e e a b s o r b e r s h a v e t h e s t a t i c s p e c t r a s h o w n i n F i g u r e 2 . 1 . A n e r r o r l e s s e x p e r i m e n t w i t h 5 0 w a v e l e n g t h c h a n n e l s , 6 0 s c a n s a t 1 0 m s e c / s c a n , a n d i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s 0 1 ( 0 ) = 0 3 ( 0 ) = 0 . 0 0 1 M , w o u l d y i e l d t h e a b s o l u t e a b s o r b a n c e s u r f a c e s h o w n i n F i g u r e 2 . 2 . T h e g o a l o f t h e p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s e s i s t o d e t e r m i n e f r o m j u s t t h e i n f o r m a t i o n i n F i g u r e 2 . 2 , w i t h n o p r i o r i n f o r m a t i o n a b o u t t h e k i n e t i c m e c h a n i s m o r t h e s h a p e s o f t h e s t a t i c s p e c t r a , t h e m i n i m u m n u m b e r o f a b s o r b e r s r e - q u i r e d t o m o d e l t h e e x p e r i m e n t , a n d o f t h e s e a b s o r b e r s , t h e m i n i m u m n u m b e r t h a t m u s t c h a n g e c o n c e n t r a t i o n d u r i n g t h e e x p e r i m e n t . S i n c e t h e m a t h e m a t i c a l d e t a i l s o f p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s a r e w e l l d o c u m e n t e d ( A n d e r s o n , 1 9 6 3 ) , w e m e r e l y s u m m a r i z e t h e p r o c e d u r e h e r e . T h e s e c o n d m o m e n t m a t r i x o f A i s t h e ( p x p ) m a t r i x M , d e f i n e d b y t h e e q u a t i o n _ T M . - ( 1 / N ) A A ( 2 . 2 ) F o r a n e r r o r l e s s e x p e r i m e n t , t h e g o a l o f M a n a l y s i s i s t o o b t a i n r M , t h e r a n k o f M , w h i c h b y a s t a n d a r d m a t r i x t h e o r e m ( B e l l m a n , 1 9 7 0 ) e q u a l s r t h e r a n k o f A . S i n c e A , P A 1 q , r M i s a l o w e r l i m i t t o t h e n u m b e r o f a b s o r b e r s i n t h e r e a c t i o n . W e s o l v e t h e e i g e n v a l u e p r o b l e m 1 “ L . L 6 3 L 4 e 5 ° 9 I 2 L X ” g l 2 I I ) - E t . 2 5 5 ( 3 8 e 2 ’ u l C ) _ , ( l 6 ~ 4 £ 2 E 0 . 4 » - C D 0 2 * O l l l l l _ l l l 5 I O I S 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5 \ N A V E L E N G T H C H A N N E L N U M B E R F i g u r e 2 . 1 . S t a t i c s p e c t r a o f a b s o r b e r s l , 2 , a n d 3 f o r t h e M e c h a n i s m I e x a m p l e . 1 6 I 3 | - 6 - l l l - e - I D i . ' 9 ' A = d i a g ( 6 1 , 6 2 , . . . , 6 p ) , 6 1 3 6 2 3 6 3 Z , . . , > 6 ( 2 . 3 ) w h e r e A i s t h e e i g e n v a l u e m a t r i x a n d A i s a ( p x p ) m a t r i x w h o s e c o l u m n s a r e t h e p o r t h o n o r m a l e i g e n v e c t o r s . F o r e r r o r l e s s d a t a , t h e r e a r e t w o w a y s o f o b t a i n i n g r m : ( 1 ) T h e r a n k o f M e q u a l s t h e n u m b e r o f n o n z e r o e i g e n — v a l u e s 6 1 , 6 2 , . . . , 6 r M ; ( i i ) A l s o , r M i s t h e l o w e s t v a l u e o f r f o r w h i c h A ” ) , d e f i n e d b y A = c o r A ( 2 “ ) — ( r ) I — ( r ) — ( r ) - ' i s e x a c t l y e q u a l t o A , w h e r e 2 ( r ) i s t h e ( p x r ) m a t r i x w h o s e r c o l u m n s a r e t h e f i r s t r e i g e n v e c t o r s o f M . £ ( r ) i s c a l l e d p r i n c i p a l c o m p o n e n t e s t i m a t e o f A , W e d e m o n - s t r a t e i n A p p e n d i x A t h a t A ( r M ) = A f o r a n e r r o r l e s s e x p e r i m e n t . T h e s a m p l e c o v a r i a n c e m a t r i x o f A i s d e f i n e d b y § _ = [ l / ( N - 1 ) J ( A _ - _ K _ ) ( A _ - , K _ ) T , ( 2 . 5 ) N w h e r e A 1 3 = ( 1 / N ) k z l A i k ' A n S a n a l y s i s g i v e s r s , t h e r a n k o f g , w h i c h i s a l s o t h e r a n k o f ( A : A ) . F i g u r e 2 . 3 i s t h e ( A g A ) - s u r f a c e f o r o u r e x a m p l e . T h e d a t a p l o t t e d 1 7 i n F i g u r e 2 . 2 a r e p l o t t e d i n F i g u r e 2 . 3 a f t e r f i r s t s u b - t r a c t i n g t h e a v e r a g e o f a l l 6 0 s p e c t r a f r o m e a c h s p e c t r u m . F i g u r e 2 . 3 i s t h u s a d i f f e r e n c e s u r f a c e . G i v e n B e e r ' s L a w a n d e r r o r l e s s m e a s u r e m e n t s , t h e m a t r i x m o d e l o f ( A : A ) i s - T ( _ — _ A ) = E i i , ( 2 . 6 ) w h e r e M i s ; a n ( q u ) m a t r i x d e f i n e d b y M = ( M 1 , A 2 , . . . M q ) , w h e r e — — N — I - ‘ - i = 9 1 “ * C i l ’ C i = l / N 3 : 1 c i < t j ) ’ a n d w h e r e 3 ; i s a n N c o m p o n e n t c o l u m n v e c t o r e a c h o f w h o s e e l e m e n t s e q u a l s o n e . E q u a t i o n ( 3 . 6 ) r e q u i r e s t h a t r ( A - A ) i q , a n d t h u s , r s , l i k e r M , i s a l o w e r b o u n d s e s t i m a t e o f t h e n u m b e r o f a b s o r b e r s . T h e r a n k o f g h a s a f u r t h e r s i g n i f i c a n c e f o r k i n e t i c s , a s f o l l o w s . I f w e a s s u m e t h a t t h e c o n c e n t r a t i o n o f e a c h a b s o r b e r f o l l o w s a n a r b i t r a r y m a s s a c t i o n r a t e l a w , t c i ( t J ) = c i ( o ) + - 4 ? ( d c i / d t ) d t , t h e n h i ( t j ) i s g i v e n b y t N t _ J k h i ( t J ) - j ; ( d c i / d t ) d t - ( 1 / N ) k z l J ; ( d c i / d t ) d t . ( 2 . 7 ) . w . m m H C m H m a o u o q m s q o v . . V w w H O d e m m o u w m o m e Q o m e d w m o m A m i m v w o w Z o o s m s H m a H . 1 8 1 9 T h e r e f o r e , t h e r a n k o f M e q u a l s t h e r a n k o f ( d g / d t ) , a n d f o r a n e r r o r l e s s e x p e r i m e n t , t h e r a n k o f § e q u a l s t h e r a n k o f { ( d g / d t ) . T h e r a n k o f § p i s t h u s n o t o n l y a l o w e r l i m i t t o t h e n u m b e r o f a b s o r b e r s i n t h e r e a c t i o n , b u t a l s o a l o w e r l i m i t t o t h e n u m b e r o f a b s o r b e r s w h o s e c o n c e n t r a t i o n s c h a n g e i n d e p e n d e n t l y o f o n e a n o t h e r d u r i n g t h e r e a c t i o n . I n a n S a n a l y s i s w e s o l v e t h e e i g e n v a l u e p r o b l e m I m i w l l l m K ? t o i w l l I H . | : > l l 0 . . H - ( 1 ) ( I Q A > 1 H U > J N U U > J v V ( 2 . 8 ) T h e r a n k o f g e q u a l s t h e n u m b e r o f n o n z e r o e i g e n v a l u e s o f § _ a n d i s a l s o t h e l o w e s t v a l u e o f r f o r w h i c h ( § ( r ) ' E ) ’ d e f i n e d A - E ) ( 2 . 9 ) A . . = T ( fi e r y ‘ 1 i 3 — ( r ) E m ‘ i s a n e x a c t r p r i n c i p a l c o m p o n e n t e s t i m a t e o f t h e e x p e r i - m e n t a l ( A r A ) d i f f e r e n c e s u r f a c e . W e a p p l y t h e s e a n a l y s e s t o t h e e r r o r l e s s d a t a i n F i g u r e s 2 . 2 a n d 2 . 3 . T a b l e 2 . 1 l i s t s t h e f i r s t f o u r e i g e n v a l u e s o f M a n d A ; t h e r e m a i n i n g “ 6 e i g e n v a l u e s o f M a n d § a r e z e r o . S i n c e t h e r e a r e t h r e e a n d t w o 2 0 T a b l e 2 . 1 T h e F i r s t F o u r E i g e n v a l u e s o f M a n d g , M e c h a n i s m I M s 1 3 5 . 5 8 9 2 9 1 0 . 6 2 8 6 6 2 0 . 5 5 7 5 0 2 0 . 1 7 3 6 1 3 0 . 1 6 7 5 5 3 0 . 0 0 0 0 0 u 0 . 0 0 0 0 0 u 0 . 0 0 0 0 0 n o n z e r o e i g e n v a l u e s o f M a n d g , r e s p e c t i v e l y , w e c o n c l u d e t h a t r M = 3 a n d r S = ' 2 . F i g u r e 2 . “ s h o w s t h e o n e p r i n c i p a l c o m p o n e n t e s t i m a t e o f t h e ( A f A ) d a t a s u r f a c e u s i n g E q u a - t i o n ( 2 . 9 ) . W e n o t e t h a t F i g u r e 2 . “ i s n o t a n e x a c t r e c o n s t r u c t i o n o f t h e d a t a s u r f a c e s h o w n i n F i g u r e 2 . 3 . H o w e v e r , t h e t w o p r i n c i p a l c o m p o n e n t e s t i m a t e , ( A ( 2 ) - A ) , u s i n g E q u a t i o n ( 2 . 9 ) i s a n e x a c t r e c o n s t r u c t i o n o f t h e d a t a s u r f a c e i n F i g u r e 2 . 3 , c o n f i r m i n g t h a t r S = 2 . S i m i l a r l y , b y o b s e r v i n g t h a t t h r e e i s t h e l o w e s t v a l u e o f r f o r w h i c h 3 ( r ) g i v e n b y E q u a t i o n ( 2 . “ ) i s a n e x a c t r e c o n s t r u c t i o n o f t h e a b s o l u t e a b s o r b a n c e s u r f a c e i n F i g u r e 2 . 2 , w e c o n f i r m t h a t r M = 3 . F r o m t h e d a t a a l o n e , w i t h o u t a s s u m i n g a s p e c i f i c k i n e t i c m e c h a n i s m o r a n y t h i n g a b o u t t h e s t a t i c s p e c t r a , w e h a v e d e t e r m i n e d t h a t t h r e e a b s o r b e r s a r e r e q u i r e d t o o O u 0 o ” 0 o n ! 0 0 u H 0 o I O o u u 0 ' O 5 0 o 1 u o : a 5 t o 4 o o o 0 O o 0 § § ~ n 0 i 0 “ 1 ” I u I fl I n I a . H I O O , H O » O O ! O O 0 O O O O “ . ” . 3 0 b m l O . N r _ a o u o q l o s q o V - \ 1 w u m c d m m . = . O n o o w w s o p o m w o o a o o s m s d o m d u a m n m A W A H V I W V o w « s o o d d o w w m m m o u m w m s m S O m o c e a n o m . 2 1 2 2 e x p l a i n t h e a b s o l u t e a b s o r b a n c e s u r f a c e i n F i g u r e 2 . 2 a n d t h a t t h e r e a r e a t l e a s t t w o a b s o r b e r s w h o s e c o n c e n - t r a t i o n s c h a n g e i n d e p e n d e n t l y o f o n e a n o t h e r d u r i n g t h e r e a c t i o n . S i n c e t h i s w a s a s i m u l a t e d e x p e r i m e n t , w e c a n c h e c k t h e s e a n s w e r s a g a i n s t t h e k n o w n f a c t s . T h e r e a r e t h r e e a b s o r b e r s i n t h e r e a c t i o n a n d a l l t h r e e c h a n g e c o n c e n t r a t i o n w i t h t i m e . H o w e v e r , M e c h a n i s m I h a s t h e c o n s t r a i n t d c l / d t + d c 2 / d t + d c 3 / d t = 0 . S i n c e t h i s c o n s t r a i n t s a y s t h a t t h e r a t e o f o n e a b s o r b e r d e p e n d s o n t h e r a t e s o f t h e o t h e r t w o , t h e r e a r e o n l y t w o a b s o r b e r s c h a n g i n g c o n c e n t r a t i o n i n d e p e n d e n t l y . T h u s , f o r t h i s e x a m p l e , t h e e q u a l i t y h o l d s i n r M i q , t h e i n e q u a l i t y h o l d s i n r S : _ q , a n d r S e q u a l s t h e n u m b e r o f a b s o r b e r s c h a n g i n g c o n c e n t r a t i o n i n d e p e n d e n t l y d u r i n g t h e r e a c t i o n . T h e g o a l o f a n a c t u a l e x p e r i m e n t i s o f c o u r s e t h e d e t e r m i n a t i o n o f a m e c h a n i s m a n d i t s r a t e c o n s t a n t s . W h e n p r o p o s i n g m e c h a n i s m s t o e x p l a i n a n e x p e r i m e n t , w e c a n e l i m i n a t e t h o s e m e c h a n i s m s t h a t d o n o t g i v e t h e ( r M , r S ) p a i r o b t a i n e d f r o m t h e M a n d S a n a l y s e s o f t h e e x p e r i m e n t a l d a t a . I n t h e n e x t s e c t i o n w e g i v e r u l e s f o r d e d u c i n g w i t h o u t n u m e r i c a l c o m p u t a t i o n w h a t ( r M , r S ) p a i r w o u l d o c c u r f o r a n e r r o r l e s s e x p e r i m e n t g i v e n a k i n e t i c m e c h a n i s m , a s e t o f r a t e c o n s t a n t s , a s e t o f 2 3 s t a t i c s p e c t r a , a n d a s e t o f i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s . I n t h e f i n a l t w o s e c t i o n s , w e d i s c u s s e s t i m a t i o n o f t h e e s s e n t i a l r a n k s o f M a n d A f r o m d a t a c o n t a i n i n g v a r y i n g a m o u n t s o f r a n d o m e x p e r i m e n t a l e r r o r . T h e s e e s s e n t i a l r a n k s f o l l o w t h e r u l e s g i v e n f o r t h e a c t u a l r a n k s o f M a n d A i n e r r o r l e s s e x p e r i m e n t s . C . R u l e s f o r t h e R a n k s o f M a n d S F r o m E q u a t i o n ( 2 . 1 ) , t h e r a n k o f A d e p e n d s o n r F , t h e r a n k o f A , a n d r 0 , t h e r a n k o f A . T h i s d e p e n d e n c e i s s u m m a r i z e d i n T a b l e 2 . 2 , w h i c h i s o b t a i n e d f r o m s t a n - d a r d t h e o r e m s o n m a t r i c e s . T a b l e 2 . 2 R u l e s f o r t h e R a n k o f M f o r E r r o r l e s s E x p e r i m e n t s C o n d i t i o n s R e s u l t i n g r M = R a n k o f M I P = I ' 0 = q q 2 r F < r 0 = q r F 3 I C < I P = q r ' C “ r C A r F < q A r C 5 r F i I ’ c < q i r P 2 1 + ‘ 2 2 + 2 3 = ( 0 1 ( 0 ) + 0 3 ( 0 ) ) A ( 2 . 1 “ ) 2 “ T o u s e T a b l e 2 . 2 , w e n e e d r u l e s f o r d e d u c i n g r F a n d r 0 . T h e r a n k o f A i s g i v e n b y P F = q - w , ( 2 . 1 0 ) w h e r e w i s t h e n u m b e r o f l i n e a r l y i n d e p e n d e n t h o m o g e n e o u s e q u a t i o n s t h a t c a n b e w r i t t e n a m o n g t h e s t a t i c s p e c t r a o f t h e q a b s o r b e r s , 3 : 1 a i j g j = g , i = 1 , 2 , . . . , w . ( 2 . 1 1 ) S i m i l a r l y , t h e r a n k o f A i s g i v e n b y r C = q - u , ( 2 . 1 2 ) w h e r e u i s t h e n u m b e r o f l i n e a r l y i n d e p e n d e n t h o m o g e n e o u s e q u a t i o n s t h a t c a n b e w r i t t e n a m o n g t h e c o n c e n t r a t i o n v e c t o r s o f t h e q a b s o r b e r s , : 1 b i j g j = g , i = 1 , 2 , . . . , u . ( 2 . 1 3 ) W e u s e t h e s e r u l e s t o p r e d i c t r M f o r t h e e x a m p l e i n t h e p r e v i o u s s e c t i o n . S i n c e n o e q u a t i o n s o f t h e f o r m o f E q u a — t i o n ( 2 . 1 1 ) e x i s t , w e h a v e r F = 3 - 0 = 3 . M a s s b a l a n c e r e q u i r e s t h a t 2 5 w h e r e c l ( 0 ) a n d c 3 ( 0 ) a r e t h e i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s o f a b s o r b e r s o n e a n d t h r e e , r e s p e c t i v e l y . H o w e v e r , E q u a t i o n ( 2 . 1 “ ) i s a n i n h o m o g e n e o u s l i n e a r e q u a t i o n , a n d i s n o t o f t h e f o r m o f E q u a t i o n ( 2 . 1 3 ) . T h u s , w e h a v e r C = 3 - 0 = 3 , a n d , b y R o w 1 o f T a b l e 2 . 2 , r M i s c o r r e c t l y p r e - d i c t e d t o b e t h r e e . T a b l e 2 . 3 R u l e s f o r t h e R a n k o f A f o r E r r o r l e s s E x p e r i m e n t s C o n d i t i o n s R e s u l t i n g r M = R a n k o f M l r F = r é = q q 2 P F < r 6 = q r F 3 r 6 < I P = q r ' c “ r c A r F < q A r é 5 P F A r 6 < q A P F F o r e r r o r l e s s d a t a t h e r a n k o f A d e p e n d s o n t h e r a n k o f E a n d t h e r a n k o f Q = d A / d t . T h i s d e p e n d e n c e i s s u m - m a r i z e d i n T a b l e 2 . 3 . T h e r a n k o f A i s g i v e n b y r ' = q - v ( 2 . 1 5 ) w h e r e v i s t h e n u m b e r o f l i n e a r l y i n d e p e n d e n t h o m o g e n e o u s 2 6 e q u a t i o n s o f t h e f o r m 5 1 3 9 3 = A i = 1 , 2 , . . . , V . ( 2 . 1 6 ) l l M D 3 1 a n d w h e r e A i s a n N c o m p o n e n t r o w v e c t o r w h o s e k ' t h e l e - J m e n t i s t h e r a t e ( d c / d t ) o f i n c r e a s e o f c o n c e n t r a t i o n 3 o f a b s o r b e r j a t t h e t i m e o f s c a n k . T o p r e d i c t r S f o r t h e e x a m p l e i n t h e p r e v i o u s s e c t i o n , w e n o t e t h a t M e c h a n i s m I l e a d s t o t h e c o n s t r a i n t é l + £ 2 + 2 3 = 9 . T h u s , r 6 = 3 - 1 = 2 , a n d s i n c e r F i s 3 , w e c o r r e c t l y o b s e r v e f r o m R o w 2 o f T a b l e 2 . 3 t h a t r i s S 2 . W h e n m o d e l i n g a n e x p e r i m e n t , w e m i g h t p r o p o s e a m e c h a n i s m a n d a s e t o f s t a t i c s p e c t r a f o r w h i c h R o w “ o r 5 o f T a b l e 2 . 2 o r 2 . 3 o c c u r s . W e p r e d i c t r M o r r s f o r s u c h a c a s e b y f o r m i n g a r a n k f a c t o r i z a t i o n o f , r e s p e c t i v e l y , E q u a t i o n ( 2 . 1 ) o r E q u a t i o n ( 2 . 6 ) . F o r e x a m p l e , c o n s i d e r M e c h a n i s m I i n a c a s e w h e r e t h e s t a t i c s p e c t r u m o f t h e p r o d u c t A i s h a l f t h e s u m o f t h e s t a t i c 2 s p e c t r a o f t h e r e a c t a n t s A 1 a n d A 3 . B e c a u s e o f t h i s c o n - s t r a i n t o n t h e s t a t i c s p e c t r a , r F i s 2 , a n d b e c a u s e o f t h e c o n s t r a i n t o n t h e r a t e s , r 6 i s a l s o 2 . F r o m R o w “ o r 5 o f T a b l e 2 . 3 , w e h a v e r S i 2 . T o d e t e r m i n e r s , w e f i r s t n o t e t h a t b y E q u a t i o n ( 2 . 7 ) a n y c o n s t r a i n t a m o n g t h e r a t e s i m p l i e s a c o r r e s p o n d i n g c o n s t r a i n t a m o n g t h e v e c t o r s M 1 . T h u s , t h e c o n s t r a i n t A 1 + A 2 + A 3 = A _ i m - p l i e s t h e c o n s t r a i n t 2 7 h + h 2 + h = A ( 2 . 1 7 ) W e s u b s t i t u t e t h e t w o c o n s t r a i n t s £ 1 - 2 3 2 + A = A a n d 3 E q u a t i o n ( 2 . 1 7 ) i n t o E q u a t i o n ( 2 . 6 ) , a n d r e a r r a n g e t h e r e s u l t s t o o b t a i n — T T ( i i - A ) = ( 3 3 - 3 2 ) ( b _ 2 + 2 g 3 ) . ( 2 . 1 8 ) S i n c e ( A e A ) i s t h e p r o d u c t o f t w o m a t r i c e s o f f u l l r a n k 1 , w e c o n c l u d e t h a t r e q u a l s 1 . S F r o m t h e t w o e x a m p l e s o f M e c h a n i s m I d i s c u s s e d s o f a r , i t i s c l e a r t h a t m o r e t h a n o n e o r d e r e d p a i r ( r M , r S ) c a n o c c u r f o r o n e k i n e t i c m e c h a n i s m . I n f a c t , b y f o l l o w - i n g t h e p r o c e d u r e s d e s c r i b e d a b o v e , w e c a n p r e d i c t a l l o f t h e p a i r s t h a t c a n o c c u r f o r a g i v e n m e c h a n i s m . F o r e x a m p l e , T a b l e 2 . “ l i s t s e v e r y ( r M ’ r S ) p a i r t h a t c a n o c c u r f o r M e c h a n i s m I a s s u m i n g t h r e e a b s o r b e r s . A t l e a s t t w o s e t s o f c o n s t r a i n t s a r e l i s t e d t h a t l e a d t o e a c h ( P M , r S ) p a i r . S e v e r a l i m p o r t a n t a n d g e n e r a l p o i n t s a r e i l l u s t r a t e d b y t h i s t a b l e . T h e r e i s m o r e d i s c r i m i n a t i n g p o w e r i n t h e . c o m b i n a t i o n ( r M , r S ) t h a n i n r M o r r S a l o n e . F o r e x a m p l e , a n e x p e r i m e n t t h a t g i v e s a n ( r M , r S ) p a i r ( 3 , 3 ) , b u t f o r w h i c h o n l y r M i s c a l c u l a t e d c o u l d b e i n c o r r e c t l y t h o u g h t t o f o l l o w M e c h a n i s m I . M o r e o v e r , o f t h e c a s e s t h a t c a n o c c u r g i v e n M e c h a n i s m I , r M b y i t s e l f d i s t i n g u i s h e s t h e t h r e e c a t e g o r i e s r M = 3 , 2 , 1 , a n d r S b y i t s e l f d i s t i n g u i s h e s 2 8 T a b l e 2 . L . P a s s i t l e C o m b i n a t i o n s o f r " a n d r , f o r M e c h a n i s m 1 . r M r s C o n s t r a i n t s i n A d d i t i o n t o £ 1 + £ 2 + £ 3 a E r F r C 6 3 I _ M 9 “ A g d i t i g n a l c o n s t r a i n t s _ 3 , 3 2 2 5 T : + 6 ; ; + v : : - g , c a n d y n o t b o t h z e r o , _ - _ . . 1 1 1 . . 1 0 3 1 } ; - _ 2 3 3 L C - q + a " = Q , a i 0 , g # - 1 2 3 2 2 r . A . + c " . 1 - ( 1 + c ) _ . ' : 7 = Q 2 3 2 - k 1 = L ; 3 2 l J G - 7 + 0 ' ’ E v : 1 I V 1 : ' 9 u a n d Y n o t b o t h z e r o 1 3 Z l E . R 3 = k ? ' A : + 0 3 2 + [ C , ( o ) / c 1 ( 0 ) ] £ 3 = Q a f - [ l + c , ( o ) / c 1 ( o ) ] 2 2 l I . k 1 = R 2 0 A r ‘ ! ~ ‘ . I ‘ 8 , : 1 L J + C 3 1 0 ) / C : ( O ) J ; ? + [ c 3 ( O ) / C 1 ( O ) ] f _ 3 E 2 2 1 i : J . k 1 = ) 1 ; £ 1 + V { c l ( o ) + c . , ( o ) ] / [ c , ( o ) - v c , ( o ) ] £ 2 ‘ Q A ] 4 Y 2 : r A , v I C 1 2 l 2 9 t h e t h r e e c a t e g o r i e s r S = 2 , 1 , 0 , w h e r e a s t h e ( r M , r S ) p a i r d i s t i n g u i s h e s t h e f i v e c a t e g o r i e s ( r M , r S ) = ( 3 , 2 ) , ( 2 , 2 ) , ( 2 , 1 ) , ( 1 , 1 ) , a n d ( 1 , 0 ) . E n t r y F i n T a b l e 2 . “ i l l u s t r a t e s t h a t b y c o l l e c t i n g d a t a o v e r o n l y a s h o r t t i m e w h e r e t h e c o n c e n t r a t i o n - t i m e c u r v e s a r e l i n e a r , a s i s d o n e i n m o s t i n i t i a l r a t e d e — t e r m i n a t i o n s , o n e c a n i n t r o d u c e a c o n s t r a i n t t h a t r e d u c e s P M a n d r s . T h u s , w h e n d e v i s i n g a n a s s a y m e t h o d b a s e d o n i n i t i a l r a t e s , o n e s h o u l d f i r s t m e a s u r e t h e r e a c t i o n o v e r i t s e n t i r e t i m e r a n g e t o i n c r e a s e t h e c h a n c e t h a t r M a n d r S a r e c l o s e t o t h e n u m b e r o f a b s o r b e r s i n t h e r e a c t i o n . F i n a l l y , i t s h o u l d b e n o t e d t h a t a n y s e t o f c o n s t r a i n t s t h a t l e a d s t o r S = 0 , a s i n E n t i r e s I a n d J , r e p r e s e n t s a n e x t r e m e . S i n c e ( A g A ) m u s t t h e n b e t h e n u l l m a t r i x , e v e r y w a v e l e n g t h c h a n n e l i s a n i s o s b e s t i c p o i n t , a n d f r o m t h e a b s o r b a n c e d a t a t h e o c c u r r e n c e o f a r e a c t i o n i s u n - d e t e c t a b l e . D . E f f e c t o f R a n d o m M e a s U r e m e n t E r r o r s E a c h e x p e r i m e n t a l l y m e a s u r e d a b s o r b a n c e h a s a s s o c i a t e d w i t h i t a r a n d o m m e a s u r e m e n t e r r o r . A m o r e r e a l i s t i c m o d e l f o r A t h a n E q u a t i o n ( 2 . 1 ) s h o u l d t h e r e f o r e i n c l u d e m e a s u r e m e n t e r r o r s : A = E Q + 2 . < 2 - 1 9 > c o v ( e = 0 , i f i ¢ k o r j ¢ £ ( 2 . 2 0 ) 3 0 w h e r e A i s t h e m a t r i x o f m e a s u r e d a b s o r b a n c e s , A a n d A a r e t h e s a m e a s b e f o r e a n d a r e r e g a r d e d a s e r r o r l e s s , a n d E i s a ( p r ) m a t r i x w h o s e i , j e l e m e n t 6 1 3 i s t h e r a n d o m m e a s u r e m e n t e r r o r o f t h e a b s o r b a n c e m e a s u r e m e n t A 1 3 . T h e i n c l u s i o n o f E i n E q u a t i o n ( 2 . 1 9 ) i m p l i e s t h a t , i n g e n e r a l , t h e m a t r i c e s M a n d A h a v e n o z e r o e i g e n v a l u e s a n d a r e o f f u l l r a n k p . T h u s , r M a n d r S d o n o t o b e y t h e r u l e s s u m m a r i z e d i n T a b l e s 2 . 2 a n d 2 . 3 . T h e s e r u l e s a r e s t i l l a p p r o p r i a t e , h o w e v e r , i f w e r e p l a c e r M a n d r S w i t h t h e e s s e n t i a l r a n k s m a n d s , r e s p e c t i v e l y , w h e r e m i s t h e r a n k o f M a n d s i s t h e r a n k o f A f o r e r r o r l e s s m e a s u r e - m e n t s . T h e g o a l i s t o i n f e r t h e e s s e n t i a l r a n k s m a n d s f r o m a b s o r b a n c e s t h a t o b e y E q u a t i o n ( 2 . 1 9 ) . T o c o m p l e t e t h i s m o d e l , w e m u s t m a k e s o m e r e a s o n a b l e s t a t i s t i c a l a s s u m p t i o n s a b o u t t h e e r r o r m a t r i x E ° W e a s s u m e t h a t t h e e x p e c t e d v a l u e o f £ 2 d e n o t e d E ( § ) , i s t h e n u l l m a t r i x , a n d t h a t e i s u n c o r r e l a t e d t o a n y o t h e r i J m e a s u r e m e n t e r r o r ; t h u s , i j ’ e k i ) I t i s a l s o n e c e s s a r y t o a s s u m e a m o d e l f o r t h e v a r - i a n c e o f e a c h m e a s u r e m e n t e r r o r , d e f i n e d b y ) _ 2 = E ( e - 0 1 3 v a r ( e i J ) 1 3 2 ( 2 . 2 1 ) w h e r e o i s t h e s t a n d a r d d e v i a t i o n o f E i J ' I n t h e m o s t 1 3 3 1 g e n e r a l m o d e l , e a c h m e a s u r e m e n t w o u l d h a v e i t s o w n a r b i - t r a r y m e a s u r e m e n t e r r o r v a r i a n c e . T o u s e t h i s m o d e l , w e w o u l d t h e r e f o r e n e e d t o s p e c i f y ( p r ) v a r i a n c e s . O n t h e o t h e r h a n d , t h e m o s t r e s t r i c t i v e m o d e l w o u l d r e q u i r e o n l y o n e m e a s u r e m e n t e r r o r v a r i a n c e , v a r ( g i J ) = 0 2 . S y l v e s t r e , L a w t o n , a n d M a g g i o ( 1 9 7 “ ) h a v e d e v e l o p e d s t a t i s t i c a l c r i t e r i a f o r M a n a l y s i s o n t h e s i n g l e v a r i a n c e m o d e l . W e s h o w b y a n e x a m p l e t h a t d e v i a t i o n o f e x p e r i — m e n t a l r e s u l t s f r o m t h e s i n g l e v a r i a n c e m o d e l c a n l e a d t o i n c o r r e c t e s t i m a t e s o f t h e e s s e n t i a l r a n k s m a n d s . T o c o r r e c t t h i s e r r o r , w e d e v e l o p a w e i g h t e d p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s t h a t a c c o m m o d a t e s t h e m o d e l v a r ( e ( 2 . 2 2 ) i j ) = X i n i n w h i c h i t i s a s s u m e d t h a t t h e v a r i a n c e o f e a c h m e a s u r e — m e n t e r r o r i s a p p r o x i m a t e l y f a c t o r a b l e i n t o x 1 , a f u n c t i o n o f t h e w a v e l e n g t h c h a n n e l n u m b e r , t i m e s 2 1 ’ a f u n c t i o n o f t h e s p e c t r u m n u m b e r . T h e m o d e l g i v e n b y E q u a t i o n ( 2 . 2 2 ) h a s ( p + N ) d e g r e e s o f f r e e d o m , a n d a l t h o u g h i t i s n o t a s g e n e r a l a s t h e ( p r ) m o d e l , i t s h o u l d h o l d a s a n a p p r o x i m a t i o n f o r m a n y e x p e r i m e n t a l s i t u a t i o n s . F o r e x a m p l e , i n t h e a p p l i c a t i o n o f E q u a t i o n ( 2 . 2 2 ) t o t h e s c a n n i n g w a v e l e n g t h s t o p p e d f l o w a b s o r b a n c e s p e c - t r o m e t e r d e s c r i b e d b y P a p a d i k i s , C o o l e n a n d D y e ( 1 9 7 5 ) a n d C o o l e n , 2 2 a l . ( 1 9 7 5 ) , t h e x c o n t r i b u t i o n o c c u r s 1 b e c a u s e t h e m e a s u r e m e n t e r r o r v a r i a n c e s c h a n g e w i t h 4 3 ‘ D ( . r , C ) c 3 2 w a v e l e n g t h . F i g u r e 2 . 5 s h o w s a t y p i c a l p l o t o f x i / 2 v e r s u s w a v e l e n g t h f r o m t h e l o w t o h i g h w a v e l e n g t h e n d s o f t h e p h o t o m u l t i p l i e r t u b e r e s p o n s e c u r v e ( 2 5 0 n m t o 6 0 0 n m ) . T h e p o i n t s w e r e d e t e r m i n e d b y m e a s u r i n g a b s o r - b a n c e a t 0 . 0 1 3 3 s e c / s c a n , 5 0 w a v e l e n g t h c h a n n e l s / s c a n , w i t h d i s t i l l e d w a t e r i n t h e s a m p l e a n d r e f e r e n c e c e l l s a n d a 0 . 7 n o m i n a l a b s o r b a n c e q u a r t z n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r i n t h e s a m p l e o p t i c a l p a t h . S i x t y s u c c e s s i v e s p e c t r a w e r e r e c o r d e d , a n d t h e v a r i a n c e s w e r e e s t i m a t e d f r o m t h e s c a t t e r a b o u t t h e m e a n a b s o r b a n c e f o r e a c h w a v e - l e n g t h c h a n n e l w i t h t h e e q u a t i o n 6 0 x = ( 1 / 5 9 ) X ( A - K 1 k = 1 i k 1 ) 2 ( 2 . 2 3 ) N e a r l y i d e n t i c a l d a t a w e r e o b t a i n e d w i t h f o u r d i f f e r e n t n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r s o v e r t h e 0 . 0 t o 1 . 0 a b s o r b a n c e r a n g e . T h e 2 1 c o n t r i b u t i o n i n t h i s i n s t r u m e n t i s a t t r i b u t a b l e t o a f e a t u r e o f i t s d a t a c o l l e c t i o n s c h e m e , w h i c h i s d e s c r i b e d i n d e t a i l b y C o o l e n , 3 3 E l - ( 1 9 7 5 ) . I n o r d e r t o o p t i m i z e t h e a l l o c a t i o n o f a f i n i t e n u m b e r o f c o m p u t e r s t o r a g e l o c a t i o n s a n d t o s a m p l e t h e f u l l d y n a m i c r a n g e o f a r e a c t i o n w i t h a f i x e d s c a n n i n g r a t e s e t t i n g o f t h e m o n o c h r o m a t o r , t h i s i n s t r u m e n t a v e r a g e s a n u m b e r o f c o n s e c u t i v e s c a n s a n d s t o r e s t h e a v e r a g e a s a s i n g l e s p e c t r u m . T h e n u m b e r o f m e a s u r e d s c a n s a v e r a g e d i n t o e a c h s t o r e d s p e c t r u m i s i n c r e a s e d w i t h t i m e d u r i n g t h e Y T I S N E D L A C I T P O , ” ) 0 x 3 3 o o z o Q O I B 0 . 0 1 6 0 £ H 4 O O I Z 0 . 0 l 0 0 . 0 0 8 0 . 0 0 6 0 . 0 0 4 0 . 0 0 2 _ L l l l J 1 L l l l 2 6 0 2 7 0 2 8 0 2 9 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 6 0 0 W A V E L E N G T H ( n m ) F i g u r e 2 . 5 . T y p i c a l P l o t o f x l / 2 v e r s u s w a v e l e n g t h f o r a 5 0 w a v e l e n g t h c h a n n e l e x p e r i m e n t . 3 ” r e a c t i o n , s o t h a t a t e a r l y t i m e s , w h e r e f a s t c h a n g e s o c c u r i n t h e r e a c t i o n , t h e r e i s l i t t l e o r n o a v e r a g i n g , w h i l e a t l o n g t i m e s , w h e n t h e c h a n g e s a r e s l o w , t h e s i g n a l t o n o i s e i s g r e a t l y i m p r o v e d b y i n c r e a s e d a v e r a g i n g w i t h l i t t l e o r n o c o s t i n c u r v e d i s t o r t i o n . I n t e r m s f u l l y d e f i n e d b y C o o l e n _ t § l ° ( 1 9 7 5 ) , t h e z J c o n t r i b u t i o n f o r t h i s i n s t r u m e n t i s g i v e n b y t h e e q u a t i o n 2 1 = 8 ( 1 - n 3 ) , w h e r e g i s t h e g r o u p i n g f a c t o r ( m o d u l u s f o r i n c r e a s i n g t h e a v e r a g i n g ) , a n d n J i s t h e n u m b e r o f t h e c o n s e c u t i v e g r o u p i n w h i c h s t o r e d s p e c t r u m J o c c u r s . F o r a n e x p e r i m e n t t h a t c o n t a i n s r a n d o m m e a s u r e m e n t e r r o r s , a s i n E q u a t i o n ( 2 . 1 9 ) , £ ( r ) g i v e n b y E q u a t i o n ( 2 . “ ) n o l o n g e r e x a c t l y e q u a l s 5 w h e n r = m , a n d ( 3 ( r ) - E ) g i v e n b y E q u a t i o n ( 2 . 9 ) n o l o n g e r e x a c t l y e q u a l s ( 5 : 3 ) w h e n r = 8 . H o w e v e r , a s w e m a t h e m a t i c a l l y d e m o n - s t r a t e i n A p p e n d i x B , 3 ( r ) i n E q u a t i o n ( 2 . “ ) i s t h e o r d i n a r y l e a s t s q u a r e s e s t i m a t e o f t h e e x p e r i m e n t a l s u r - f a c e A c o n s t r u c t e d a s a l i n e a r c o m b i n a t i o n o f t h e f i r s t r e i g e n v e c t o r s o f m , a n d ( § ( r ) - § ) i n E q u a t i o n ( 2 . 9 ) i s t h e o r d i n a r y l e a s t s q u a r e s e s t i m a t e o f t h e e x p e r i m e n t a l s u r f a c e ( fl f g ) c o n s t r u c t e d a s a l i n e a r c o m b i n a t i o n o f t h e f i r s t r e i g e n v e c t o r s o f § . G i v e n t h i s l e a s t s q u a r e s s i g n i f i c a n c e o f E q u a t i o n s ( 2 . u ) a n d ( 2 . 9 ) , i t h a s b e e n s u g g e s t e d i n p r e v i o u s a p p l i - c a t i o n s o f p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s ( K a n k a r e 1 9 7 0 ; L a w t o n a n d S y l v e s t r e 1 9 7 1 ; S y l v e s t r e , L a w t o n a n d M a g g i o 1 9 7 “ ) t h a t , w h e n t h e e x p e r i m e n t c o n t a i n s r a n d o m e r r o r s , 3 5 w e c a n d e t e r m i n e m , t h e e s s e n t i a l r a n k o f E , a s t h e l o w e s t v a l u e o f r f o r w h i c h £ ( r ) i n E q u a t i o n ( 2 . “ ) f i t s t h e e x p e r i m e n t a l s u r f a c e A t o w i t h i n i t s r a n d o m e r r o r s . L i k e w i s e , s , t h e e s s e n t i a l r a n k o f § w o u l d b e t h e l o w e s t r f o r w h i c h ( § ( r ) - § ) i n E q u a t i o n ( 2 . 9 ) f i t s t h e e x p e r i - m e n t a l s u r f a c e ( 5 : 3 ) t o w i t h i n i t s r a n d o m e r r o r s T h e r e a s o n i n g i s t h a t , s i n c e o n l y t h e f i r s t m e i g e n v e c t o r s o f m a r e r e q u i r e d t o e x a c t l y r e c o n s t r u c t A f o r a n e r r o r l e s s e x p e r i m e n t , t h e f i r s t m e i g e n v e c t o r s o f E i n a n e x p e r i m e n t w i t h r a n d o m e r r o r s s h o u l d p r i m a r i l y r e f l e c t t h e n o n - r a n d o m , B e e r ' s L a w c o n t r i b u t i o n , E 9 ? , i n E q u a t i o n ( 2 . 1 9 ) . H o w - e v e r , a s t h e f o l l o w i n g s i m u l a t e d e x a m p l e s h o w s , i f v a r ( e i j ) c h a n g e s s i g n i f i c a n t l y w i t h i a n d J , t h e a b o v e p r o c e d u r e u s i n g E q u a t i o n s ( 2 . ” ) a n d ( 2 . 9 ) c a n f a i l b e c a u s e t h e f i r s t f e w e i g e n v e c t o r s o f g a n d § a r e d o m i n a t e d b y t h e r a n d o m e r r o r t e r m g , i n E q u a t i o n ( 2 . 1 9 ) . C o n s i d e r a n M a n a l y s i s o f a t w o a b s o r b e r r e a c t i o n t h a t f o l l o w s M e c h a n i s m I I k 1 = 2 0 s e c ' l k 2 = 1 0 s e c - l t A e — : D ( I I ) w h e r e D i s a n o n - a b s o r b i n g p r o d u c t . S u p p o s e t h a t A l a n d A h a v e t h e 2 0 w a v e l e n g t h c h a n n e l s t a t i c s p e c t r a 2 s h o w n i n F i g u r e 2 . 6 . F i g u r e 2 . 7 s h o w s t h e a b s o l u t e a b - s o r b a n c e s u r f a c e t h a t w o u l d b e o b t a i n e d i n a n e r r o r l e s s e x p e r i m e n t u n d e r t h e f o l l o w i n g c o n d i t i o n s : 2 0 w a v e l e n g t h c h a n n e l s , 3 6 c o n s e c u t i v e s p e c t r a , 1 0 m s e c / s c a n , a n d R E B M U N . L E N N A H C H T G N E L E e m l ( V ‘ : Q 1 i J a ? a ? N O O O 1 1 “ 2 V O O _ 1 l t o n . O O € _ O I " ( “ ‘ 3 W ) / A J J S N B O W V D I l d O 1 l l ’ 1 l l l l l , 1 6 7 . 8 9 | O l l | 2 | 3 | 4 | 5 l 6 l 7 l 8 I 9 2 0 - w > ~ v - « - m - + N F i g u r e 2 . 6 . S t a t i c s p e c t r a o f a b s o r b e r s l a n d 2 f o r t h e M e c h n i s m I I e x a m p l e . 3 6 5 . 7 . 2 e r u g i F . . . a o u o q m s q o a s n l o s q o 1 0 . U 0 . 0 E r r o r l e s s a b s o l u t e a b s o r b a n c e s u r f a c e A f o r M e c h a n i s m I I . 3 7 3 8 0 1 ( 0 ) = 0 . 0 0 1 M . N o w c o n s i d e r a n e x p e r i m e n t u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s t h a t a l s o c o n t a i n s n o r m a l r a n d o m n o i s e w h o s e v a r i a n c e f o l l o w s E q u a t i o n ( 2 . 2 2 ) w i t h t h e x i f a c t o r s h o w n i n F i g u r e 2 . 8 . L e t t h e 3 6 s p e c t r a o c c u r i n 3 g r o u p s o f 1 2 c o n s e c u t i v e s p e c t r a e a c h , a n d l e t z J b e g i v e n b y z J = 2 ( 1 ' n 3 ) , w h e r e n J i s t h e n u m b e r o f t h e g r o u p i n w h i c h s c a n J o c c u r s . T h e r e s u l t i n g n o i s y a b s o r b a n c e s u r f a c e i s s h o w n i n F i g u r e 2 . 9 . F o r t h i s e x a m p l e , r F = 2 a n d r c = 2 . T h u s , a c c o r d i n g t o T a b l e 2 . 2 , a n M a n a l y s i s o f t h i s n o i s y d a t a s h o u l d g i v e a n e s s e n t i a l r a n k m = 2 ; t h a t i s , A ( 2 ) i n E q u a t i o n ( 2 . H ) s h o u l d f i t t h e d a t a t o w i t h i n i t s r a n d o m n o i s e . F i g u r e 2 . 1 0 s h o w s t h e s u r f a c e A ( 2 ) . F i g u r e 2 . 1 1 i s a t w o - d i m e n s i o n a l p l o t o f t h e n o i s y d a t a p o i n t s a n d t h e e s t i m a t e d a b s o r b a n c e s A ( 2 ) v e r s u s t i m e a t w a v e l e n g t h c h a n - n e l 1 9 . I t i s c l e a r f r o m F i g u r e 2 . 1 1 t h a t A ( 2 ) d o e s n o t f i t A t o w i t h i n t h e r a n d o m n o i s e . T h u s , w e w o u l d i n - c o r r e c t l y c o n c l u d e f r o m t h i s a n a l y s i s o f t h e n o i s y d a t a t h a t m > 2 . I n f a c t , t h e n o i s y d a t a a t c h a n n e l 1 9 a r e n o t f i t t o w i t h i n r a n d o m e r r o r u n t i l m = 1 3 . E . S t a t i s t i c a l l y W e i g h t e d P r i n c i p a l C o m p o n e n t A n a l y s i s W e c a n a v o i d t h i s i n c o r r e c t r e s u l t b y u s i n g t h e v a r i - a n c e m o d e l o f E q u a t i o n ( 2 . 2 2 ) t o w e i g h t t h e a b s o r b a n c e m a t r i x b e f o r e p e r f o r m i n g t h e p r i n c i p a l c o m p o n e n t c a l c u l a t i o n s . r o f a t a d y s i o n ‘ 0 2 9 l 8 1 ' ” 1 6 1 d e t 1 5 | 1 R a E l A B 1 k u M m U i v 1 3 N s v e 1 Q E l , L v 1 H N N A H h t r o V 1 ) C K f v r 1 9 T H V 1 G e N b 8 m E L u v L ' E n 7 V A l v 1 W 6 e v 1 5 a n n 1 4 ‘ h c . I I s 1 3 u 1 2 s m r s e i v n b 9 0 i o - % ‘ “ l a 8 7 6 5 4 2 h . 0 0 0 0 0 o 0 / c m 0 0 0 0 0 0 0 i e A i I S N B O ‘ I v o l l d o ‘ a , , ( ! ) x x M . 8 . 2 e r u g i F l 3 9 0 . 0 2 L Q O I ” e c n a e b h r t o s f b o a ) y 2 s ( i A o n e t e a h m t i t m s o e r f t n n e e n k o a p t m o e c c a l f a r p u i s c n e i c r n p a b o r w o t s b d a e t e . h t e g u c i l a e o f w s r n b u U a s . 0 1 . 2 e r u g i F . 0 a o u q u o s q o a 1 n | o s q o ‘ 0 . o 1 _ 0 . o M l p o = o o o g o o o o 0 q 5 2 x o e 0 , A a t a d y s i o n = o 0 q 0 2 t a X m i ) c t . e s 9 s 1 e m ( O S e I m d l e e i t n T h n . g a ) i h 2 e c ( 1 : fl x w A 0 0 l n h u t e g t e n a h e m t i l e t ” ” 0 5 a o e 0 f v s 0 I b * b " - ’ x w n d o t e s t a i h r A g a i - - ~ O p a e 5 L 5 0 5 0 5 0 5 O 5 0 5 4 3 N N 0 0 o 4 2 2 3 s 0 0 0 0 0 0 o 0 . . . . . 0 £ I 0 0 o 0 0 0 0 0 0 0 0 D 0 m t w o a n C d u . 1 1 . 2 e r u g i F a a u o q m s q v a m l o s q v I c 1 o l O O O 1 " ; I l 0 0 0 0 A 3 0 0 3 5 0 1 ’ 1 _ ( 2 ) w i t h t h e n o i s y N 2 I- I F I 1= “ 3 W e d e f i n e t w o n o n s i n g u l a r d i a g o n a l w e i g h t i n g m a t r i c e s , L , a n d T , a s f o l l o w s : d i a g ( L 1 , L 2 , . . . , L p ) ( 2 . 2 M ) I 6 d i a g ( T 1 , T 2 , . . . , T N ) , w i t h t h e v a l u e s o f L i a n d T J y e t t o b e c h o s e n . W e d e f i n e t h e w e i g h t e d a b s o r b a n c e m a t r i c e s a s A w : A A T a n d ' A w E ; A fl g , r e p l a c e M w i t h M w = ( 1 / N ) A w fl w T a n d S w i t h § w = [ l / ( N - 1 ) ] ( A w — A W ) ( A n g w ) T , a n d p e r f o r m p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s e s u s i n g M W a n d § W ' E q u a t i o n s ( 2 . h ) a n d ( 2 . 9 ) b e c o m e , r e s p e c t i v e l y , A _ - 1 T £ ( r ) ‘ L 2 ( r ) 3 ( r ) £ , fl ( 2 . 2 5 ) ( 5 . 0 . ) - 3 ' ) = 1 : 1 2 0 . , 2 ? . ) L ( A - E ) ( 2 . 2 5 ) w h e r e i n E q u a t i o n s ( 2 . 2 5 ) a n d ( 2 . 2 6 ) g a n d g a r e t h e e i g e n - v e c t o r m a t r i c e s o f M W a n d § W ’ r e s p e c t i v e l y . W e s h a l l a s s i g n v a l u e s t o L a n d 3 , 8 0 t h a t , g i v e n t h e v a r i a n c e m o d e l o f E q u a t i o n ( 2 . 2 2 ) , t h e e i g e n v e c t o r s o f M a n d § W a r e m i n i m a l l y p e r t u r b e d b y t h e r a n d o m m e a s u r e m e n t e r r o r s f r o m t h e v a l u e s t h e y w o u l d h a v e i n a n e r r o r l e s s e x p e r i m e n t . C o n s i d e r t h e e x p e c t e d v a l u e o f M W , d e n o t e d E ( M w ) , w h i c h i s t h e v a l u e M W a p p r o a c h e s a s y m p t o t i c a l l y a s N , t h e n u m b e r o f s p e c t r a i n t h e e x p e r i m e n t , i n c r e a s e s . . n u F o l l o w i n g p r o c e d u r e s g i v e n b y A n d e r s o n ( 1 9 6 3 ) w e h a v e , f o r t h e m o d e l d e s c r i b e d b y E q u a t i o n s ( 2 . 1 9 ) a n d ( 2 . 2 2 ) , E q v g w ) = ( 1 / N ) 1 ; 1 3 ( 5 ) 2 2 1 2 ( A T ) 3 : ; ( 2 . 2 7 ) + ( l / N ) t r ( 3 2 : 7 1 ) _ 2 x _ w h e r e E ( 1 . ) = . 1 : . c . g E d i a g ( z l , z z , . . . , z N ) a n d X 2 d i a g ( x 1 x 2 , . . . , x p ) E q u a t i o n ( 2 . 2 7 ) i s d e r i v e d i n A p p e n d i x C . T h e f i r s t t e r m o n t h e R . H . S . o f E q u a t i o n ( 2 . 2 7 ) i s t h e c o n t r i b u t i o n o f 3 . 9 , a n d i s E ( M w ) f o r a n e r r o r l e s s e x p e r i m e n t . T h e c o n — t r i b u t i o n f r o m t h e m e a s u r e m e n t e r r o r s i s i s o l a t e d i n t h e s e c o n d t e r m , 2 ( l / N ) t r ( _ T _ 2 _ Z _ ) g 3 9 O u r g o a l i n c h o o s i n g L a n d T _ i s t o h a v e t h e e i g e n v e c t o r s H I “ 5 o f E ( M w ) t h e s a m e a s t h e e i g e n v e c t o r s o f ( l / N ) L _ E ( A ) T ? E ( A ¢ ) L . W e a c h i e v e t h i s g o a l b y c h o o s i n g 1 / 2 X - l / 2 2 = a _ ( 2 . 2 8 ) w h e r e a a n d b a r e a r b i t r a r y c o n s t a n t s . W i t h t h i s c h o i c e E q u a t i o n ( 2 . 2 7 ) b e c o m e s M A W ) = ( a b / N ) { “ 2 E ( A ) _ z _ ' 1 H A T ) 9 3 - 1 / 2 + a b l - ( 2 . 2 9 ) S i n c e a n y v e c t o r i s a n e i g e n v e c t o r o f T , t h e e i g e n v e c t o r s o f E ( M w ) a r e t h e e i g e n v e c t o r s o f t h e f i r s t t e r m , A n a n a l o g o u s d e r i v a t i o n s h o w s t h a t E q u a t i o n ( 2 . 2 8 ) i s a l s o t h e b e s t a s s i g n m e n t o f L a n d T f o r w e i g h t e d S a n a l y s i s . F i g u r e 2 . 1 2 c o m p a r e s t h e e s t i m a t e d a b s o r b a n c e s g i v e n b y E q u a t i o n ( 2 . 2 5 ) t o t h e n o i s y d a t a a t w a v e l e n g t h c h a n n e l 1 9 , w h e r e E q u a t i o n ( 2 . 2 8 ) w a s u s e d t o d e f i n e A a n d T w i t h a = b = 1 . T h e d a t a a r e f i t t o w i t h i n t h e r a n d o m n o i s e f o r r ' = 2 . B y s i m i l a r l y o b s e r v i n g t h a t A ( 1 ) w i t h E q u a t i o n ( 2 . 2 5 ) d o e s n o t f i t t h e n o i s y d a t a s u r f a c e a n d t h a t A < 2 > d o e s , w e c o r r e c t l y c o n c l u d e t h a t t h e e s s e n t i a l r a n k m i s t w o . F i g u r e 2 . 1 3 i s t h e s u r f a c e e s t i m a t e d f r o m t h e . ) 2 ( A e t a m i t S e . 2 1 . 2 e r u g i F a a u o q m s q o a m l o s q o C o m p a r i s o n o f t h e w e i g h t e d e s t i m a t e A ( 2 ) w i t h t h e n o i s y d a t a A _ a t w a v e l e n g t h c h a n n e l 1 9 . X = n o i s y d a t a A , 0 = w e i g h t e d A 1 1 6 e t u l . o e s c b a a f r e u h s t e f c o n a ) b 2 r ( o A s b e a 0 5 3 0 0 3 0 1 5 t 2 a y m s i i t o s n e e t h n t e n m 0 l 0 2 ) c e o o s m ( p r m f O o l S e I m c n i e T l k a a p t i 0 c e l 0 n c | i a r f p r u o s w t e c d n e a t b h r g o i s e b W a - * 5 0 5 0 6 0 'J 3 l 0 3 2 2 0 . 0 0 0 1 3 0 0 0 0 0 ( 0 0 1 . 2 e r u g i F l 0 0 5 5 l 0 0 5 0 0 0 4 5 l l O V O , O l l l E D U D Q J O S Q V a w o s q v l < 1 0 l 5 x 0 O X “ 7 M B n o i s y d a t a i n F i g u r e 2 . 9 w i t h E q u a t i o n ( 2 . 2 5 ) . I t i s c l e a r t h a t F i g u r e 2 . 1 3 i s a b e t t e r r e c o n s t r u c t i o n t h a n F i g u r e 2 . 1 0 o f t h e e r r o r l e s s a b s o r b a n c e s u r f a c e i n F i g u r e 2 . 7 . T h u s , w e i g h t e d p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s g i v e s a l o w e r v a r i a n c e e s t i m a t e t h a n u n w e i g h t e d a n a l y s i s o f t h e c h e m i c a l r e a c t i o n ' s c o n t r i b u t i o n t o t h e a b s o r b a n c e d a t a . W i t h w e i g h t e d p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s a n d t h e v a r i a n c e m o d e l o f E q u a t i o n ( 2 . 2 2 ) , w e o b t a i n c o n v e n i e n t c r i t e r i a f o r i n t e r p r e t i n g t h e e i g e n v a l u e s o f M , a n d § , W W ) f i t s A t o w i t h i n e x p e r i m e n t a l A a n d f o r d e t e r m i n i n g w h e n A ( r e r r o r . U s i n g E q u a t i o n ( 2 . 2 8 ) t o d e f i n e A a n d T , a n d c h o o s i n g a = b = l , w e h a v e E m w ) = ( 1 m ) x + 1 ( 2 . 3 0 ) T h e t e r m ( l / N ) f 1 ” m y 5 ' 1 M A T ) 3 5 ' 1 / 2 h a s ( p — m ) z e r o e i g e n v a l u e s . I t f o l l o w s t h a t E ( M W ) h a s ( p - m ) d e g e n e r a t e e i g e n v a l u e s e q u a l t o 1 . T h e r e f o r e t h e m e a n o f t h e l a s t ( p - m ) e i g e n v a l u e s o f M W s h o u l d a p p r o a c h 1 . S i m i l a r a r g u m e n t s s h o w t h a t t h e m e a n o f t h e l a s t ( p - s ) e i g e n v a l u e s o f S W s h o u l d a p p r o a c h 1 . N o s u c h s i m p l e r e l a t i o n s h i p h b l d s f o r t h e e i g e n v a l u e s o f M a n d S . T a b l e 2 . 5 l i s t s t h e m e a n o f t h e l a s t ( p - r ) e i g e n v a l u e s 0 f . fl w w i t h r = 0 , 1 , 2 , a n d 3 f o r t h e a n a l y s i s o f t h e n o i s y d a t a ” 9 T a b l e 2 . 5 M e a n o f t h e L a s t ( p - r ) E i g e n v a l u e s o f M W f o r t h e N o i s y D a t a r [ l / ( p - r ) ] i = E + l 6 1 0 2 9 . 9 9 2 1 6 . 6 0 1 2 1 . 0 1 2 3 0 . 9 1 9 i n F i g u r e 2 . 9 . N o t e t h a t t h e m e a n o f t h e l a s t ( p - r ) e i g e n - v a l u e s a p p r o a c h e s l . 0 f o r r = 2 , w h i c h c o n f i r m s t h a t t h e 2 . e s s e n t i a l r a n k m T h e m o s t s t r a i g h t f o r w a r d p r o c e d u r e f o r d e t e r m i n i n g w h e n £ ( r ) f i t s A t o w i t h i n e x p e r i m e n t a l e r r o r i s t o e x a m i n e p l o t s s i m i l a r t o F i g u r e 2 . 1 2 . W h e n A — ( r ) a n d A a r e c l o s e , o n e c a n e x a m i n e a p l o t o f t h e r e s i d u a l s ( A ( r ) - A ) . T h e r e s i d u a l s s h o u l d n o t b e h i g h l y p a t t e r n e d w h e n p l o t t e d v e r s u s t i m e o r w a v e l e n g t h i f t h e m e a s u r e m e n t e r r o r s a r e t r u l y u n c o r r e l a t e d a n d w e h a v e c h o s e n t h e v a l u e o f r e q u a l t o t h e e s s e n t i a l r a n k . S y l v e s t r e , L a w t o n , a n d M a g g i o ( 1 9 7 4 ) h a v e g i v e n a n e q u a t i o n d e s c r i b i n g t h e s u m o f t h e s q u a r e s o f t h e r e s i d u a l s f o r r = m a n d s i n g l e v a r i a n c e m e a s u r e m e n t 5 0 e r r o r s . W i t h s t a t i s t i c a l l y w e i g h t e d p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s w e c a n e x t e n d t h e i r e q u a t i o n t o t h e n o n u n i f o r m v a r i a n c e e r r o r m o d e l o f E q u a t i o n ( 2 . 2 2 ) . W h e n r = m f o r w e i g h t e d M a n a l y s i s , t h e f u n c t i o n Q r / ( N - r ) ( p - r ) a p p r o a c h e s t h e v a l u e a b , w h e r e Q r i s g i v e n b y p N Q = E Z [ ( 2 ( r ) 2 ? r ) - l ) fl w j i j ( 2 ' 3 1 ) r i = 1 J = l a n d £ ( r ) i s d e f i n e d b y E q u a t i o n ( 2 . 2 5 ) . T h i s f u n c t i o n a l s o a p p r o a c h e s t h e v a l u e a b f o r w e i g h t e d 8 a n a l y s i s w h e n r = s , a n d 2 ( r ) a n d A i n E q u a t i o n ( 2 . 2 8 ) a r e r e p l a c e d W w i t h § ( r ) a n d ( A w — A W ) , r e s p e c t i v e l y . T a b l e 2 . 6 l i s t s t h e v a l u e s o f Q r / ( N - r ) ( p - r ) f o r w e i g h t e d M a n a l y s i s o f t h e n o i s y d a t a i n F i g u r e 2 . 9 , w h e r e a = b = 1 . S i n c e “ = 2 i s t h e l o w e s t v a l u e f o r r f o r w h i c h Q r / ( N - r ) ( p - r ) i s c l o s e t o 1 . 0 , w e w o u l d i n f e r t h a t t h e e s s e n t i a l r a n k m 2 . I n c o n c l u s i o n , w e e m p h a s i z e t h a t t h e w e i g h t i n g m a t r i c e s A a n d T a r e n o t f u d g e f a c t o r s , e s p e c i a l l y w h e n t h e v a r i a n c e m o d e l o f E q u a t i o n ( 2 . 2 2 ) h o l d s a s a n a p p r o x i m a t i o n . T h e i m p r o v e d r e s u l t s o b t a i n e d w i t h t h e w e i g h t s r e q u i r e a d d i - t i o n a l m e a s u r e m e n t s l i k e t h o s e i n F i g u r e 2 . 5 t o d e t e r m i n e t h e e l e m e n t s o f T a n d T . M o r e o v e r , u n w e i g h t e d p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s c a n b e r e g a r d e d a s a s p e c i a l c a s e o f w e i g h t e d a n a l y s i s w h e r e A a n d T a r e a r b i t r a r i l y s e t e q u a l t o i d e n t i t y m a t r i c e s . E v e n w h e n E q u a t i o n ( 2 . 2 2 ) d o e s n o t a c c o m m o d a t e t h e e r r o r v a r i a n c e s , a J u d i c i o u s a p p r o x i m a t e c h o i c e o f T a n d T s h o u l d b e p r e f e r r e d t o t h e a r b i t r a r y 5 1 T a b l e 2 . 6 Q r / ( N - r ) ( p - r ) f o r W e i g h t e d M A n a l y s i s o f t h e N o i s y D a t a r Q r / ( N - r ) ( p - r ) 1 6 . 7 9 0 2 1 . 0 7 1 3 1 . 0 0 3 5 2 c h o i c e o f i d e n t i t y m a t r i c e s . A s w i t h a n y s t a t i s t i c a l t r e a t - m e n t o f e x p e r i m e n t a l m e a s u r e m e n t s c o n t a i n i n g r a n d o m e r r o r s , t h e r e l i a b i l i t y o f t h e r e s u l t s i n c r e a s e s w i t h s a m p l e s i z e , T ; e . , t h e n u m b e r o f w a v e l e n g t h c h a n n e l s a n d t h e n u m b e r o f c o n s e c u t i v e s p e c t r a . T h e r u l e s g i v e n i n T a b l e s 2 . 2 a n d 2 . 3 f o r t h e e s s e n t i a l r a n k s o f M W a n d § W a r e n o t r e s t r i c t e d t o a b s o r b a n c e k i n e t i c e x p e r i m e n t s , a n d a r e a p p l i c a b l e t o a n y s c a n n i n g w a v e l e n g t h k i n e t i c s e x p e r i m e n t w h e r e t h e r e s p o n s e i s a l i n e a r f u n c t i o n o f t h e c o n c e n t r a t i o n s . T h e w e i g h t i n g s c h e m e i s n o t r e - s t r i c t e d t o k i n e t i c s e x p e r i m e n t s . I t i s a p p l i c a b l e t o a n y p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s w h e r e t h e m e a s u r e m e n t e r r o r v a r i a n c e c a n b e a p p r o x i m a t e d b y E q u a t i o n ( 2 . 2 2 ) w h e r e x 1 a n d z J a r e e a c h a f u n c t i o n o f o n e o f t h e t w o i n d e p e n d e n t m e a s u r e m e n t v a r i a b l e s ( t h e a n a l o g s o f w a v e - l e n g t h a n d t i m e i n t h e s c a n n i n g w a v e l e n g t h k i n e t i c s a p p l i - c a t i o n ) . C H A P T E R 3 E S T I M A T I O N O F S T A T I C S P E C T R A A N D C O N C E N T R A T I O N P R O F I L E S V I A W E I G H T E D P R I N C I P A L C O M P O N E N T A N A L Y S I S R a p i d s c a n n i n g s p e c t r o s c o p y i s a p o w e r f u l e x p e r i m e n t a l t o o l f o r c h a r a c t e r i z i n g t h e p r o g r e s s o f r e a c t i o n s t h a t h a v e m o r e t h a n o n e l i g h t a b s o r b i n g s p e c i e s . I n r a p i d s c a n n i n g w a v e l e n g t h a b s o r b a n c e k i n e t i c s e x p e r i m e n t , a b s o r b a n c e i s m e a s u r e d a t p w a v e l e n g t h c h a n n e l s a c r o s s a s p e c t r a l r e g i o n t h a t i s r a p i d l y a n d r e p e a t e d l y s c a n n e d a s t h e r e a c t i o n p r o g r e s s e s . I f t h e s c a n n i n g r a t e i s f a s t c o m p a r e d t o t h e f a s t e s t a b s o r b a n c e c h a n g e i n t h e r e a c t i o n , t h e r e s u l t i n g N c o n s e c u t i v e s p e c t r a m a y b e r e g a r d e d a s i n s t a n t a n e o u s a n d t h e a b s o r b a n c e - w a v e l e n g t h - t i m e s u r f a c e m a y b e r e p r e - s e n t e d b y t h e ( p r ) m a t r i x A , w h e r e A 1 3 i s t h e a b s o r b a n c e m e a s u r e d a t w a v e l e n g t h c h a n n e l 1 a t t h e t i m e o f s c a n J . S i n c e m u l t i c o m p o n e n t r e a c t i o n s i n g e n e r a l p r o d u c e u n s t a b l e i n t e r m e d i a t e s a s w e l l a s u n a n t i c i p a t e d p r o d u c t s , t h e n u m b e r o f a b s o r b e r s i n a r a p i d s c a n n i n g e x p e r i m e n t i s g e n e r a l l y u n k n o w n b e f o r e t h e e x p e r i m e n t i s a n a l y z e d . M o r e o v e r , t h e s p e c t r a o f t h e s e i n t e r m e d i a t e s a n d p r o d u c t s a r e g e n e r a l l y u n k n o w n . T h e p r e c e d i n g c h a p t e r d e a l t w i t h t h e u s e o f s t a t i s - t i c a l l y w e i g h t e d p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s t o d e t e r m i n e t h e n u m b e r o f a b s o r b e r s i n a r a p i d s c a n n i n g k i n e t i c s 5 3 A = § 2 T + s = < 2 , . c _ T > + g . § 3 ’ 1 ( 3 . 1 ) 5 1 4 e x p e r i m e n t . T h e t w o k i n d s o f p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s , M a n a l y s i s a n d S a n a l y s i s , y i e l d , r e s p e c t i v e l y , t h e m i n i - m u m n u m b e r m o f a b s o r b e r s r e q u i r e d t o i n t e r p r e t t h e e x p e r i - m e n t a n d t h e m i n i m u m n u m b e r s o f a b s o r b e r s w h o s e c o n c e n - t r a t i o n s m u s t h a v e c h a n g e d d u r i n g t h e e x p e r i m e n t . I n t h i s c h a p t e r , w e d e v e l o p f u r t h e r t o o l s a n d p r o p o s e a s t r a t e g y f o r i n f e r r i n g f r o m a r a p i d s c a n n i n g e x p e r i m e n t t h e s p e c t r a l a n d k i n e t i c p r o p e r t i e s o f i t s a b s o r b e r s . T h e f i r s t s t e p i n t h e s t r a t e g y i s t h e d e t e r m i n a t i o n o f m a n d s f o r t h e w h o l e e x p e r i m e n t . I f t h e m e a s u r e d s t a t i c s p e c t r a o f k n o w n r e a c t a n t s , p r o d u c t s , a n d c a t a l y s t s f i t a n d a c c o u n t f o r t h e m r e q u i r e d a b s o r b e r s , t h e n w e h a v e r e s o l v e d t h e e x p e r i m e n t . I f , h o w e v e r , w e a r e s t i l l l e f t w i t h i n t e r m e d i a t e s a n d p r o d u c t s w h o s e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n s a r e u n k n o w n , w e e x a m i n e s u b s p a c e s o f w a v e - l e n g t h a n d t i m e t o f i n d p a r t s o f t h e e x p e r i m e n t w h e r e t h e n u m b e r q o f a b s o r b e r s i s s m a l l . W h e n q i s s m a l l , t h e a n a l y s i s i s c o n s i d e r a b l y s i m p l i f i e d , a n d f u r t h e r i n f o r m a - t i o n a b o u t s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n s i s o b t a i n e d f o r e a c h s u b s p a c e . T h e f i n a l s t e p i s t o r e a s s e m b l e t h e i n f o r m a t i o n f r o m t h e s u b s p a c e s i n o r d e r t o e s t i m a t e t h e s t a t i c s p e c t r a a n d t h e c o n c e n t r a t i o n s f o r t h e w h o l e e x p e r i - m e n t . A s b e f o r e , w e a s s u m e t h a t A s a t i s f i e s t h e m o d e l g i v e n b y 5 5 T w h e r e q i s t h e n u m b e r o f a b s o r b e r s , T i s t h e e r r o r l e s s c o n t r i b u t i o n o f B e e r ' s L a w , a n d g i s t h e m a t r i x o f u n c o r - r e l a t e d r a n d o m m e a s u r e m e n t e r r o r s . T h e s t a t i c s p e c t r u m m a t r i x T i s d e f i n e d b y T = ( £ 1 , 3 2 , . . . , T q ) , w h e r e T _ , t h e s t a t i c s p e c t r u m o f a b s o r b e r J , i s a p c o m p o n e n t c o l u m n v e c t o r w h o s e i ' t h e l e m e n t i s t h e p r o d u c t o f t h e a b s o r b a n c e c e l l p a t h l e n g t h a n d t h e m o l a r a b s o r p t i v i t y o f a b s o r b e r J a t w a v e l e n g t h c h a n n e l 1 . T h e c o n c e n t r a t i o n m a t r i x 9 i s d e f i n e d b y g = ( 3 1 , 3 2 , . . . , £ q ) w h e r e 3 3 , t h e c o n c e n t r a - t i o n v e c t o r o f a b s o r b e r J , i s a n N c o m p o n e n t c o l u m n v e c t o r w h o s e i ' t h e l e m e n t i s t h e m o l a r i t y o f a b s o r b e r 3 d u r i n g s p e c t r u m 1 . T h e i , J ' t h e l e m e n t o f g i s a s s u m e d t o h a v e e x p e c t e d v a l u e z e r o a n d v a r i a n c e s a t i s f y i n g t h e m o d e l v a r ( e i j ) = G I J = x i n . ( 3 . 2 ) F r o m t h e e i g e n v e c t o r s a n d e i g e n v a l u e s o f t h e M a n a l y s i s , w e d e v e l o p c r i t e r i a f o r e s t i m a t i n g E a n d g . t o w i t h i n a r - 2 e l e m e n t s b i t r a r y m u l t i p l i c a t i v e c o n s t a n t s . W e f i n d t h a t q o f F a n d / o r 9 s u f f i c e f o r e s t i m a t i n g t h e ( N + p ) q e l e m e n t s o f F a n d g . T h i s i s a g r e a t r e d u c t i o n i n t h e a r b i t r a r i n e s s o f t h e s e m a t r i c e s s i n c e ( N + P ) q i s g e n e r a l l y m u c h l a r g e r t h a n q 2 . M o r e o v e r , w e f i n d a l e a s t s q u a r e s c r i t e r i o n f o r d e c i d i n g , i n d e p e n d e n t l y o f a n y a s s u m p t i o n s a b o u t o t h e r a b s o r b e r s o r k i n e t i c m e c h a n i s m s , w h e t h e r a s i n g l e s u s p e c t e d a b s o r b e r ' s s t a t i c s p e c t r u m o r c o n c e n t r a t i o n v e c t o r f i t s t h e e x p e r i m e n t a l d a t a . E a c h s u s p e c t e d s t a t i c s p e c t r u m 5 6 o r c o n c e n t r a t i o n v e c t o r t h a t f i t s p r o v i d e s q o f t h e q 2 n u m b e r s r e q u i r e d t o e s t i m a t e F a n d g . T h e p r o b l e m o f e s t i m a t i n g E a n d 9 t a k e s s i m p l e r f o r m s w h e n q i s s m a l l . W e p r e s e n t t h e s i m p l i f i c a t i o n s f o r a n e x p e r i m e n t o r a n y p a r t o f a n e x p e r i m e n t t h a t c o n t a i n s o n l y o n e , t w o , o r t h r e e a b s o r b e r s . F o r e x p e r i m e n t s c o n t a i n i n g o n l y t w o a b s o r b e r s , w e p r e s e n t e q u a t i o n s t h a t r e q u i r e n o a d d i t i o n a l i n f o r m a t i o n t o d e f i n e t h e u p p e r a n d l o w e r b o u n d s o f t h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n v e c t o r s . T h e s e e q u a t i o n s a r e e x t e n s i o n s o f t h o s e p r e s e n t e d b y L a w t o n a n d S y l v e s t r e ( 1 9 7 1 ) f o r t h e i n d i v i d u a l s p e c t r a i n t w o a b s o r b e r e q u i l i b r i u m s y s t e m s , a n d a r e s i m i l a r t o t h o s e p r e s e n t e d b y W a r n e r , 3 2 2 1 ° ( 1 9 7 7 ) f o r e m i s s i o n a n d e x c i t a t i o n s p e c t r a i n t w o c o m p o n e n t f l u o r e s c e n c e d a t a . F r o m t h e e i g e n v e c t o r s a n d e i g e n v a l u e s o f t h e S a n a l y s i s , w e d e v e l o p a l e a s t s q u a r e s c r i t e r i o n f o r d e t e r m i n i n g i f a s u s p e c t e d a b s o r b e r w h o s e s t a t i c s p e c t r u m f i t s t h e d a t a h a s a r a t e i n t h e r e a c t i o n t h a t i s l i n e a r l y i n d e p e n d e n t o f t h e r a t e s o f t h e o t h e r ( q - l ) a b s o r b e r s . F i n a l l y , t h e s e n e w t o o l s a r e u t i l i z e d i n a s e v e n - s t e p s t r a t e g y p r o p o s e d f o r r e s o l v i n g r a p i d - s c a n n i n g k i n e t i c s . e x p e r i m e n t s b y p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s . I n t h e f o l l o w i n g c h a p t e r , t h e s t r a t e g y i s a p p l i e d t o a r e a c t i o n c a t a l y z e d b y t h e e n z y m e h o r s e l i v e r a l c o h o l d e h y d r o g e n a s e . T h e a n a l y s i s s h o w s t h a t t h e r e a r e a t l e a s t s e v e n a b s o r b e r s , o f w h i c h f o u r a r e t r a n s i e n t i n t e r m e d i a t e s . b n l 5 m = ( . 1 : $ < r ) $ ( r ) _ I ; > A : i n » ) = ( 1 1 . 1 2 . . . . 1 , > . ( 3 . 5 ) 5 7 A . M A n a l y s i s E s t i m a t e s o f § _ a n d g I n M a n a l y s i s w e f o r m t h e w e i g h t e d s e c o n d m o m e n t m a t r i x M W , d e f i n e d b y . . T . . fl w - ( 1 / N ) A w fl w . £ w - £ £ $ _ - 1 2 _ a l / 2 d i a g ( x l l / Z , x 2 / , . . . , x p l / 2 ) - 2 — - 1 2 - b l / 2 d i a g ( z l l / , z 1 / 2 , . . . , z N / ) 2 ( 3 . 3 ) * 5 I w h e r e a a n d b a r e a r b i t r a r y p o s i t i v e c o n s t a n t s . T h e e i g e n - v a l u e e q u a t i o n t o b e s o l v e d i s 3 6 ( 3 . 1 1 ) T h e e s s e n t i a l r a n k m i s t h e m i n i m u m n u m b e r o f a b s o r b e r s r e q u i r e d t o i n t e r p r e t t h e e x p e r i m e n t a n d i s d e t e r m i n e d b y f i n d i n g t h e l o w e s t v a l u e o f r f o r w h i c h 3 ( r ) ’ d e f i n e d b y > O | 5 8 f i t s t h e e x p e r i m e n t a l m a t r i x A _ t o w i t h i n i t s r a n d o m e r r o r s . A n i d e n t i c a l b u t m o r e u s e f u l e q u a t i o n f o r £ ( r ) i s , . _ — 1 T — 1 5 m " E 3 < r ) 9 - < r ) 3 - ’ - < r > ' - 1 1 ’ 6 1 / 2 Q ( r ) = d i a g ( w 1 , w 2 , . . . , w r ) , w J = + N J — l T 3 m = ( A l l y - n . 1 , . ) = s h a w l ” ) ( 3 . 5 ) I t c a n b e s h o w n ( A p p e n d i x A ) t h a t t h e r c o l u m n s o f 1 ( r ) c o n t a i n t h e f i r s t r e i g e n v e c t o r s o f M W ’ d e f i n e d b y M * = ( 1 / p ) 1 3 1 , . T h e e s s e n t i a l r a n k m i s n o t o n l y t h e m i n i m u m n u m b e r o f a b s o r b e r s , b u t i s a l s o t h e m a x i m u m n u m b e r o f a b s o r b e r s w h o s e s p e c t r a l a n d k i n e t i c p r o p e r t i e s c a n b e d e t e r m i n e d b y a n a l y z i n g a p a r t i c u l a r e x p e r i m e n t . I n s o m e e x p e r i m e n t s t h e r e m a y b e e x t r a a b s o r b e r s t h a t c a n n o t b e d i s t i n g u i s h e d b e c a u s e t h e i r c o n c e n t r a t i o n s o r t h e i r s t a t i c s p e c t r a a r e l i n e a r l y c o u p l e d . A d d i t i o n a l e x p e r i m e n t s , i n w h i c h c o n d i - t i o n s a r e v a r i e d , a r e r e q u i r e d t o d e t e c t a n d c h a r a c t e r i z e s u c h a d d i t i o n a l a b s o r b e r s . W e a s s u m e , f o r a p a r t i c u l a r e x p e r i m e n t , t h a t m i s t h e t o t a l n u m b e r o f a b s o r b e r s , T L Q A , t h a t q e q u a l s m . T h e m o d e l f o r M a n a l y s i s e s t i m a t e s o f F a n d g i s m T = 3 2 1 . § J § § . ( 3 . 7 ) 5 ( m ) = E 5 9 w h e r e A ( m ) i s g i v e n b y E q u a t i o n ( 3 . 6 ) , a n d E ' Q ? i s a n e s t i m a t e o f 3 , 9 ? i n E q u a t i o n ( 3 . 1 ) . W e u s e E q u a t i o n ( 3 . 7 ) t o e s t i m a t e f o r e a c h a b s o r b e r t h e s h a p e o f i t s s t a t i c s p e c t r u m , t h e s h a p e o f i t s c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e , a n d i t s c o n t r i b u t i o n t o t h e m e a s u r e d a b s o r b a n c e — w a v e l e n g t h - t i m e s u r f a c e . i i s d e f i n e d b y E = ( i l , i 2 , . . . , i m ) , w h e r e : 3 A i s a n e s t i m a t e o f a J T J , w i t h a J a n a r b i t r a r y c o n s t a n t . 9 A i s d e f i n e d b y § = ( £ 1 , 3 2 , . . . , § m ) , w h e r e E d i s a n e s t i m a t e o f ( l / a j ) 9 3 ' T h e v e c t o r p r o d u c t i 3 § § i s t h e n a n e s t i - m a t e o f £ 0 m e a s u r e d a b s o r b a n c e s u r f a c e . p g , t h e c o n t r i b u t i o n o f t h e J ' t h a b s o r b e r t o t h e A W h e r e a s T a n d g a r e e r r o r l e s s , E _ a n d g a r e n o t , i n g e n e r a l , e r r o r l e s s . T o s e e t h i s , d e f i n e t h e r e s i d u a l a b s o r b a n c e m a t r i x f o r m a b s o r b e r s a s R = A - A , - ( m ) - - ( m ) T h e t e r m s F Q T a n d E Q ? a r e t h e n r e l a t e d b y 3 . 0 ? = 2 , 9 ? + ( g - 5 ( m ) ) ° I n a n e r r o r l e s s e x p e r i m e n t , w h e r e $ . 1 8 z e r o , t h e t e r m ( g - B ) ) i s a l s o z e r o , a n d E ’ C T e q u a l s E 9 ? . ( m - I n a n e x p e r i m e n t w i t h e r r o r s , w h e r e E i s n o n z e r o , ( g - 5 ( m ) ) i s i n g e n e r a l a l s o n o n z e r o , a n d fi _ § ? d o e s n o t e q u a l E . T . H o w e v e r , i t c a n b e s h o w n ( A p p e n d i x C J ) t h a t ( g - 5 ( m ) ) v a n i s h e s i n a p r o p e r l y w e i g h t e d M a n a l y s i s a s e i t h e r N , t h e n u m b e r o f c o n s e c u t i v e s p e c t r a , o r p , t h e n u m b e r o f w a v e l e n g t h c h a n n e l s , b e c o m e s v e r y l a r g e . T h e r e f o r e , w e t a k e E C T t o b e a n e r r o r - c o n t a i n i n g e s t i m a t e o f E _ Q ? . E q u a t i o n s ( 3 . 6 ) a n d ( 3 . 7 ) t o g e t h e r g i v e T _ — l T - l ‘ E 1 3 ( m ) 8 ( m ) g ( m ) 2 1 ( 3 . 8 ) | w > 1 0 > > = ) 0 [ 0 § _ = ( i l l - l a m ) X . ( 3 . 1 1 ) 6 0 I ' m S o l v e d f o r E q u a t i o n ( 3 . 8 ) g i v e s I w ( fi g m p g . ( 3 . 9 ) w h e r e g i s a n ( m x m ) m a t r i x d e f i n e d b y _ T - 1 * A “ T - 1 Q ‘ Q ( m ) g ( m ) 2 9 ( 9 9 ) ~ ( 3 . 1 0 ) S o l v e d f o r E q u a t i o n ( 3 . 1 0 ) g i v e s w h e r e T i s a n ( m x m ) m a t r i x d e f i n e d b y T - 1 _ A A A T - 1 I ‘ 8 ( m ) 2 ( m ) 2 . E ‘ E F ) ( 3 . 1 2 ) N o t e t h a t E q u a t i o n s ( 3 . 9 ) a n d ( 3 . 1 1 ) a s s u m e , r e s p e c t i v e l y , t h e e x i s t e n c e o f t h e i n v e r s e s ( 9 . 9 . ) - 1 a n d ( E E ? ) - l . T h e s e i n v e r s e s a r e g u a r a n t e e d s i n c e m i s t h e e s s e n t i a l r a n k o f M W . R e s u b s t i t u t i o n o f E q u a t i o n s ( 3 . 9 ) a n d ( 3 . 1 1 ) i n t o E q u a t i o n ( 3 . 8 ) g i v e s t h e f o l l o w i n g c o n d i t i o n o n g a n d 1 T U = _ _ 8 ( m ) ( 3 . 1 3 ) E q u a t i o n s ( 3 . 9 ) t h r o u g h ( 3 . 1 3 ) c o n s i d e r a b l y r e d u c e t h e a r b i t r a r i n e s s o f ‘ i a n d Q . i s a r o t a t i o n o f g f l g ( m ) b y u u > | q p t h e r o t a t i o n m a t r i x Q , a n d i s a r o t a t i o n o f T f l fi ( m ) b y 6 1 t h e r o t a t i o n m a t r i x X , I f t h e m 2 e l e m e n t s o f e i t h e r g o r T a r e k n o w n , t h e u n k n o w n r o t a t i o n m a t r i x i s g i v e n b y E q u a t i o n ( 3 . 1 3 ) , a n d E a n d Q c a n b e c o m p u t e d d i r e c t l y f r o m E q u a t i o n s ( 3 . 9 ) a n d ( 3 . 1 1 ) , r e s p e c t i v e l y . T h u s , t h e s t r a t e g y f o r o b t a i n i n g E a n d 0 i s t o e s t i - m a t e e n o u g h e l e m e n t s o f g a n d T s e p a r a t e l y s o t h a t a l l o f g a n d Z a r e g i v e n b y E q u a t i o n ( 3 . 1 3 ) . T o t h i s e n d , w e p a r t i t i o n g a n d T , . 1 1 ( 2 . 1 3 2 1 2 3 0 ° ° : l e ) Z , ( 1 1 , 1 2 , . . . , y m ) ( 3 . 1 “ ) w h e r e e a c h 2 3 a n d e a c h 2 0 i s a n m c o m p o n e n t c o l u m n v e c t o r . T h e n E q u a t i o n s ( 3 . 9 ) a n d ( 3 . 1 1 ) b e c o m e u m I - - 1 _ J ( 1 " . $ ( m ) ) E j ’ J " 1 : 2 s ° ° ° m 9 A _ - I I - l - £ 3 " ( 2 2 0 , 0 ) 1 3 : J “ 1 : 2 a ° ° ° m s ( 3 ° 1 5 ) w h i c h s h o w t h a t t h e J ' t h c o l u m n s o f g a n d T d e p e n d o n l y o n t h e J ' t h s t a t i c s p e c t r u m a n d c o n c e n t r a t i o n v e c t o r , r e s p e c - t i v e l y . F o r a g i v e n r e a c t i o n t h e r e i s u s u a l l y a s e t o f s u s p e c t e d a b s o r b e r s . F o r e x a m p l e , i n a n e n z y m e - c a t a l y z e d r e a c t i o n t h e s u s p e c t e d a b s o r b e r s a r e a n y l i g h t a b s o r b i n g s u b s t r a t e s , i n h i b i t o r s , a n d e n z y m e s t h a t w e r e m i x e d t o i n i t i a t e t h e m W 1 . 1 . 6 2 r e a c t i o n . E q u a t i o n s ( 3 . 1 5 ) a r e m o d e l s a g a i n s t w h i c h s p e c t r a l a n d k i n e t i c i n f o r m a t i o n a b o u t s u s p e c t e d a b s o r b e r s c a n b e t e s t e d . I f a s u s p e c t e d a b s o r b e r i s o n e o f t h e m l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r s i n t h e e x p e r i m e n t , i t s s t a t i c s p e c t r u m a n d c o n c e n t r a t i o n v e c t o r m u s t s a t i s f y E q u a t i o n s ( 3 . 1 5 ) . W e n o w p r e s e n t l e a s t s q u a r e s e q u a t i o n s , b a s e d o n E q u a - t i o n s ( 3 . 1 5 ) f o r d e t e r m i n i n g w h e t h e r a s u s p e c t e d a b s o r b e r f i t s a s o n e o f t h e m l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r s i n t h e e x p e r i m e n t . S u p p o s e t h e r e a r e p r o p o s e d v a l u e s f o r k w a v e — l e n g t h c h a n n e l s o f T 3 , w i t h m i k 2 . 9 - T h e s e p r o p o s e d v a l u e s m a y c o m e f r o m t h e m e a s u r e d s t a t i c s p e c t r u m o f a s u s p e c t e d a b s o r b e r . D e f i n e t h e p r o p o s e d s t a t i c s p e c t r u m a s t h e p c o m p o n e n t c o l u m n v e c t o r f - d p r o p f o r w h i c h t h e r e a r e p r o p o s e d v a l u e s c o n t a i n t h o s e v a l u e s , , w h e r e t h e k c h a n n e l s a n d w h e r e t h e r e m a i n i n g ( p — k ) w a v e l e n g t h c h a n n e l s c o n t a i n A 2 3 m m i n t h e f i r s t o f E q u a t i o n s ( 3 . 1 5 ) i s g i v e n z e r o e s . T h e l e a s t s q u a r e s l o s s f u n c t i o n f o r u s i n g t o e s t i m a t e E J b y A ( f Q L S = — 3 p r o p - l T “ - l ' E 3 ( m ) 3 3 ) 2 " - I ‘ L f l z l p l r ‘ o p ' 9 - 3 4 m ) 3 5 ) ’ - w - f = d i a g ( W f l , W f 2 ’ o o o , w f p ) ’ ( 3 0 1 6 ) w h e r e w f i i s u n i t y i f t h e r e i s a p r o p o s e d v a l u e f o r c h a n n e l 1 a n d i s z e r o o t h e r w i s e . T h e l e a s t s q u a r e s e s t i m a t e o f 3 3 i s t h e v a l u e f o r w h i c h Q L S i s m i n i m i z e d w i t h r e s p e c t t o 3 3 a n d i s g i v e n b y 5 3 l E J L S 2 f 2 ( m ) £ » E f E fi p r o p T - 2 0 i f ' 9 . 0 1 0 9 . K f 9 ; ( m ) - ( 3 . 1 7 ) T h e n t h e M a n a l y s i s e s t i m a t e o f : 3 o n t h e a s s u m p t i o n t h a t t h e s u s p e c t e d a b s o r b e r f i t s a s o n e o f t h e m a b s o r b e r s i n t h e e x p e r i m e n t , i s g i v e n b y E : ( L ' l ¢ ) fi ( 3 1 8 ) — J L S M - — ( m ) — j L S ° N o t e t h a t w h e r e a s g fl p r o p o n l y k w a v e l e n g t h c h a n n e l s , E J L S M c o n t a i n s e s t i m a t e d v a l u e s c o n t a i n s p r o p o s e d v a l u e s f o r f o r a l l p c h a n n e l s . I f : j L S M f i t s fi fl p r o p t o w i t h i n r a n d o m e r r o r a t t h e k w a v e l e n g t h c h a n n e l s f o r w h i c h b o t h c o n t a i n v a l u e s , t h e n : 5 s a t i s f i e s t h e f i r s t o f E q u a t i o n s ( 3 . 1 5 ) , p r o p a n d w e c o n c l u d e t h a t t h e s u s p e c t e d a b s o r b e r f i t s a s o n e o f t h e m l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r s i n t h e e x p e r i m e n t . M o r e o v e r , E J L S i s t h e n t a k e n t o b e a n e s t i m a t e o f t h e ' A A J t h c o l u m n o f g . I f £ J L S M a n d E j p r o p d o n o t f i t e a c h o t h e r t o w i t h i n r a n d o m e r r o r , t h e n i d d o e s n o t s a t i s f y t h e p r o p f i r s t o f E q u a t i o n s ( 3 . 1 5 ) a n d w e c o n c l u d e t h a t t h e s u s p e c t e d a b s o r b e r d o e s n o t f i t a s o n e o f t h e m l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r s . T h e s e c o n d o f E q u a t i o n s ( 3 . 1 5 ) g i v e s a s i m i l a r l e a s t s q u a r e s e q u a t i o n f o r u s i n g p r o p o s e d v a l u e s f o r k e l e m e n t s o f £ 0 t o d e t e r m i n e w h e t h e r a s u s p e c t e d a b s o r b e r f i t s a s o n e o f t h e m l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r s i n t h e 6 “ e x p e r i m e n t . D e f i n e t h e p r o p o s e d c o n c e n t r a t i o n v e c t o r a s g j p r o p ’ w h e r e t h e k t i m e s f o r w h i c h t h e r e a r e p r o p o s e d v a l u e s c o n t a i n t h o s e v a l u e s , a n d w h e r e t h e r e m a i n i n g ( N - k ) t i m e s c o n t a i n z e r o e s . T h e l e a s t s q u a r e s e s t i m a t e o f i i n t h e s e c o n d o f E q u a t i o n s ( 3 . 1 5 ) i s g i v e n b y J i ; - , j L S = B c - l f - ( m ) g - Z L W - c g j p r o p ’ 3 c a 1 l - ' ( ‘ m ) § - fl 2 y - c i ’ - ( m ) ’ w e = d i a g ( w c l w 0 2 , . . . , c h ) , ( 3 . 1 9 ) W h e r e W C i i s u n i t y i f t h e r e i s a p r o p o s e d v a l u e f o r t i m e i a n d i s z e r o o t h e r w i s e . T h e M a n a l y s i s e s t i m a t e o f 9 1 o n t h e a s s u m p t i o n t h a t t h e s u s p e c t e d a b s o r b e r f i t s a s o n e o f t h e m l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r s i n t h e e x p e r i m e n t i s g i v e n b y 8 = ( T ' l w ) G ( 3 2 0 ) — j L S M — ' - ( m ) — J L S ' I f 8 f i t s — J L S M E J p r o p v a l u e s , w e c o n c l u d e t h a t t h e s u s p e c t e d a b s o r b e r f i t s a s a t t h e k t i m e s f o r w h i c h b o t h c o n t a i n o n e o f t h e m l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r s , a n d w e t a k e X J L S t o b e t h e J ' t h c o l u m n o f 1 . T w o n o t e s o f c a u t i o n a r e n e c e s s a r y r e g a r d i n g t h e c o r - r e c t i n t e r p r e t a t i o n o f t h e s e l e a s t s q u a r e s c r i t e r i a . F i r s t , t h e f i t o f a s u s p e c t e d a b s o r b e r a s o n e o f t h e m ( T ( ‘ 1 ‘ ( D 6 5 l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r s s h o w s t h a t t h e e x p e r i m e n t g a g § g _ i n t e r p r e t e d u s i n g t h e s u s p e c t e d a b s o r b e r a s o n e o f t h e a b s o r b e r s , b u t d o e s n o t 2 3 9 1 2 t h a t t h e s u s p e c t e d a b s o r b e r i s a n a b s o r b e r i n t h e e x p e r i m e n t . S e c o n d l y , i f a s u s p e c t e d a b s o r b e r d o e s n o t f i t a s o n e o f t h e m l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r s , i t m a y s t i l l b e a n a b s o r b e r i n t h e e x p e r i m e n t i f t h e r e a r e a c t u a l l y m o r e t h a n m a b s o r b e r s a n d i f t h e s t a t i c s p e c t r u m o r c o n c e n t r a t i o n v e c t o r o f t h e s u s p e c t e d ; a b s o r b e r i s l i n e a r l y d e p e n d e n t o n t h e s t a t i c s p e c t r a o r c o n c e n t r a t i o n v e c t o r s o f o t h e r a b s o r b e r s . E x a m p l e 1 . A s a n e x a m p l e o f t h e e f f e c t o f l i n e a r d e p e n d e n c e , c o n s i d e r a t w o a b s o r b e r r e a c t i o n t h a t f o l l o w s t h e s i m p l e k i n e t i c m e c h a n i s m k . A 1 + A 2 — — 1 — > n o n a b s o r b i n g p r o d u c t s ( I ) w h e r e t h e i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s o f A 1 a n d A 2 i n t h e e x p e r i - m e n t a r e e q u a l 0 1 ( 0 ) = C 2 ( 0 ) M e c h a n i s m ( I ) i m p o s e s t h e c o n s t r a i n t 9 . 1 3 2 2 9 w h e r e 9 1 = d / d t ( E J ) ’ a n d E q u a t i o n s ( 3 . A ) a n d ( 3 . 8 ) t o — g e t h e r g i v e t h e c o n s t r a i n t 6 6 s o t h a t 3 1 a n d 9 2 a r e l i n e a r l y d e p e n d e n t . A l t h o u g h t h e r e a r e t w o a b s o r b e r s , m i s u n i t y . E v e n i f t h e s t a t i c s p e c t r a £ 1 a n d £ 2 a r e l i n e a r l y i n d e p e n d e n t , t h e y d o n o t i n d i v i d u a l l y s a t i s f y t h e f i r s t o f E q u a t i o n s ( 3 . 1 5 ) , a n d b y t e s t i n g t h e m a s p r o p o s e d s t a t i c s p e c t r a w e w o u l d c o r r e c t l y c o n c l u d e t h a t A l a n d A 2 a r e n o t l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r s i n t h e r e a c t i o n . T h e i n f o r m a t i o n i n t h e e x p e r i m e n t l u m p s A 1 a n d A 2 t o g e t h e r a s o n e a b s o r b e r . T h i s c a n b e s e e n b y n o t i n g t h a t t h e B e e r ' s L a w c o n t r i b u t i o n t o t h i s e x p e r i m e n t m a y b e w r i t t e n a s T = T E 9 ( £ 1 + £ 2 ) E l ( 3 . D ) f r o m w h i c h i t c a n b e s h o w n t h a t t h e c o m b i n a t i o n i j p r o p = ( T 1 + T Q ) w o u l d f i t a s t h e p r o p o s e d s t a t i c s p e c t r u m f o r a n a b s o r b e r . T h e p r o b l e m o f e s t i m a t i n g E a n d g s i m p l i f i e s w h e n t h e n u m b e r o f a b s o r b e r s i s s m a l l . I n t h e n e x t t h r e e s e c t i o n s w e r e v i e w t h e s i m p l i f i c a t i o n s f o r o n e , t w o , a n d t h r e e a b s o r b e r e x p e r i m e n t s . T h e s e s i m p l i f i c a t i o n s a p p l y a l s o t o a n y s u b s p a c e o f w a v e l e n g t h a n d t i m e t h a t c o n t a i n s o n l y o n e , t w o o r t h r e e a b s o r b e r s , e v e n t h o u g h t h e o v e r a l l e x p e r i - m e n t c o n t a i n s m o r e t h a n t h r e e a b s o r b e r s . | P ° 8 1 P l f r T c 0 5 M e ) 0 1 S C [ ‘ 0 t h 6 7 B . O n e A b s o r b e r S i m p l i f i c a t i o n s T h e e s t i m a t i o n o f T a n d g i n a o n e a b s o r b e r e x p e r i m e n t i s t r i v i a l . T h e m a t r i c e s g _ a n d 2 r e d u c e t o s c a l a r s . E q u a t i o n s ( 3 . 1 5 ) a n d ( 3 . 1 3 ) b e c o m e f = ( L ' l g ) u E = ( T - l y ) v u V = w ( 3 2 1 ) - 1 — l 1 1 ’ - l — l 1 1 ’ l l 1 1 1 ' ' S i n c e : 1 i s a n e s t i m a t e o f £ 1 t o w i t h i n a n a r b i t r a r y m u l t i — p l i c a t i v e c o n s t a n t a 1 , w e m a y t a k e : 1 t o b e a n y m u l t i p l e o f A f l g l . A r b i t r a r i l y s e t t i n g ” 1 1 e q u a l t o o n e , w e o b t a i n f r o m E q u a t i o n s ( 3 . 2 1 ) A : 1 = { 1 9 1 . £ 1 = ( l / w l ) T ' l y l . ( 3 . 2 2 ) T o d e t e r m i n e a 1 s o t h a t t h e m o l a r a b s o r p t i v i t i e s a n d c o n - c e n t r a t i o n s o f a b s o r b e r o n e a r e k n o w n r e q u i r e s e i t h e r t h e n o n z e r o m o l a r i t y o f a b s o r b e r o n e a t a n y t i m e d u r i n g t h e e x p e r i m e n t , o r t h e p r o d u c t o f t h e n o n z e r o m o l a r a b s o r p t i v i t y o f a b s o r b e r o n e a t a n y w a v e l e n g t h c h a n n e l t i m e s t h e a b - s o r b a n c e c e l l p a t h l e n g t h . C . T w o A b s o r b e r S i m p l i f i c a t i o n s T h e s i m p l i f i c a t i o n s f o r t w o a b s o r b e r e x p e r i m e n t s g i v e t h e f o l l o w i n g t h r e e r e s u l t s : 1 . W h e n t h e s h a p e o f o n e a b s o r b e r ' s s t a t i c s p e c t r u m 6 8 i s k n o w n , t h e s h a p e o f t h e o t h e r a b s o r b e r ' s c o n c e n - t r a t i o n p r o f i l e c a n b e c o m p u t e d d i r e c t l y . 2 . W h e n t h e s h a p e o f o n e a b s o r b e r ’ s c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e i s k n o w n , t h e s h a p e o f t h e o t h e r a b s o r b e r ' s s t a t i c s p e c t r u m c a n b e c o m p u t e d d i r e c t l y . 3 . E v e n w h e n t h e r e i s n o o u t s i d e i n f o r m a t i o n a b o u t t h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s , t h e i r u p p e r a n d l o w e r b o u n d s c a n b e c o m p u t e d d i r e c t l y f r o m t h e M a n a l y s i s e i g e n v e c t o r s a n d e i g e n v a l u e s . I n a t w o a b s o r b e r e x p e r i m e n t g a n d X a r e t h e ( 2 x 2 ) m a t r i c e s L l u 2 ( 2 1 , 2 2 ) g ( 1 1 1 2 ) 1 1 2 1 u 2 2 V V , I ‘ ( 1 1 . 2 . 2 ) = " ( 1 1 1 2 ) ( 3 . 2 3 ) v 2 1 v 2 2 T h e f o l l o w i n g r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n t h e v e c t o r s i n g a n d X c a n b e d e r i v e d f r o m E q u a t i o n ( 3 . 1 3 ) _ l - [ i / d e t ( _ v ) J s _ 2 _ ( 2 ) ; < _ 1 2 . u 2 = - [ l / d e t ( _ V _ ) ] § 2 _ ( 2 ) . 1 : 1 1 9 1 = ( f l i m fl fl m fi 1 1 . 2 - ( 3 . 2 5 ) 6 9 4 l 5 : : I o 1 ( - 1 o ) ( 3 . 2 “ ) W e a s s u m e t h a t a b s o r b e r s o n e a n d t w o a r e a s s i g n e d s o t h a t I x l l d e t ( g ) a n d d e t ( T ) a r e p o s i t i v e . ( S w i t c h i n g a b s o r b e r s m e r e l y c h a n g e s t h e s i g n s o f t h e s e d e t e r m i n a n t s . ) I f t h e s t a t i c s p e c t r u m o f a b s o r b e r t w o i s k n o w n , A c a n b e e s t i - 2 m a t e d v i a E q u a t i o n ( 3 . 1 7 ) . T h e n , t h e f i r s t o f E q u a t i o n s ( 3 . 2 “ ) g i v e s 1 t o w i t h i n t h e a r b i t r a r y m u l t i p l i c a t i v e l c o n s t a n t [ l / d e t ( g ) ] . T h i s i s s u f f i c i e n t t o e s t i m a t e § 1 s i n c e § _ i t s e l f i s d e f i n e d w i t h t h e a r b i t r a r y m u l t i p l i c a - l t i v e c o n s t a n t ( l / a l ) . A r b i t r a r i l y s e t t i n g [ l / d e t ( g ) ] = l , w e h a v e , f r o m E q u a t i o n s ( 3 . 1 5 ) a n d ( 3 . 2 “ ) , A H e n c e , w e o b t a i n £ 1 f r o m : 2 . L i k e w i s e t h e n e x t t h r e e o f E q u a t i o n s ( 3 . 2 “ ) y i e l d , r e s p e c t i v e l y , £ 2 f r o m T _ , : 1 f r o m £ 2 , a n d : 2 f r o m £ 1 . N o t e f r o m E q u a t i o n s ( 3 . 2 “ ) t h a t i n a t w o a b s o r b e r e x p e r i m e n t t h e s h a p e s o f a s i n g l e a b s o r b e r ' s c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e a n d s t a t i c s p e c t r u m c a n b e v a r i e d i n d e p e n d e n t l y o f o n e a n o t h e r a n d t h e r e f o r e , c o n t a i n n o i n f o r m a t i o n a b o u t e a c h o t h e r . 7 0 P h y s i c a l l y s e n s i b l e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n v e c t o r s m u s t c o n t a i n o n l y n o n n e g a t i v e n u m b e r s . B y a d e r i v a t i o n s i m i l a r t o t h e o n e p r e s e n t e d b y L a w t o n a n d S y l v e s t r e ( 1 9 7 1 ) , w e c a n u s e t h e n o n n e g a t i v e d e f i n i t e n e s s o f t h e e l e m e n t s o f £ 1 , : 2 , £ 1 a n d £ 2 t o d e f i n e s o l u t i o n b a n d s t h a t c o n t a i n t h e s h a p e s o f t h e s e v e c t o r s . S i n c e w e a r e i n t e r e s t e d i n o n l y t h e s h a p e s o f t h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s , w e n o r m a l i z e t h e s e v e c t o r s t o A u n i t l e n g t h . H e n c e , d e f i n e i i , T A , é i , a n d E A w h o s e e l e m e n t s s a t i s f y t h e f o l l o w i n g n o r m a l i z a t i o n e q u a t i o n s a n d i n e q u a l i - t i e s N A A . 2 . t i , = 1 , c i z _ > _ o , i = 1 , 2 , . . . , N ( 3 . 2 6 ) T h e r e s u l t s a r e d i s p l a y e d i n T a b l e s 3 . 1 a n d 3 . 2 . N o t e t h a t i i L a n d i i H d e l i n e a t e r e g i o n s o f a c c e p t a b i l i t y o f : 3 . I n g e n e r a l , i i L a n d i i H c r o s s o v e r i . e . , 2 3 L i s n o t a l w a y s " 1 " v " 1 l e s s t h a n E i H ' T h e s a m e s i t u a t i o n o b t a i n s f o r 9 1 L a n d 3 1 H “ E x a m p l e s m a y b e f o u n d i n C h a p t e r “ . T h e s e s o l u t i o n b a n d s a r e p a r t i c u l a r l y u s e f u l s i n c e 7 1 T a b l e 3 . 1 . S o l u t i o n B a n d s f o r N o r m a l i z e d S t a t i c S p e c t r a . v A : O : 1 m u s t f a l l o n o r b e t w e e n £ 1 L a n d E i H ' A : = ‘ 1 1 A : _ ' 1 ' f - 1 L ( E 3 ( 2 ) ) 2 1 L ’ £ 1 H ‘ ( E 9 ( 2 ) ) 3 1 H “ _ - 1 , A , _ - 1 fl é L " ( £ 4 , 2 ( 2 ) ) E 2 L ’ $ 2 1 . 1 " ' ( L . 2 ( 2 ) ) 3 5 1 - 1 l “ ’ 1 v . . " 1 - - 1 A I - 1 - 1 L ’ ( 3 1 ’ a 2 a 3 ) ’ 3 1 H ‘ ( a l w l + a 2 a u w 2 ) m l 1 3 2 L = ( 9 1 ‘ “ 1 ‘ L a 2 é ‘ s ‘ ” 2 Y - l ’ 2 2 H = ( ‘ 1 ‘ 1 J ’ E ‘ 2 ’ 3 6 r 1 8 5 ( 0 2 8 . 6 P . - 1 - 1 a l 3 2 L i ¢ i l ’ 8 2 ' 1 E 1 L 1 ¢ 1 2 i = 1 3 3 g m i n ( ¢ i l / ¢ 1 2 ) 9 a “ a m 1 n ( w J 2 / ¢ J l ) ¢ i 2 ’ ° ¢ i 2 < ° > o | n u H 7 2 T a b l e 3 . 2 . S o l u t i o n B a n d s f o r N o r m a l i z e d C o n c e n t r a t i o n V e c t o r s . A ' A ' m u s t f a l l o n o r b e t w e e n 9 1 L a n d 3 1 H . - 1 A ' _ - 1 ' A _ 9 1 L " ( 3 3 1 ( 2 ) ) ! 1 L ’ 9 1 H ' ( : 1 1 3 1 ( 2 ) ) 1 1 1 1 A I — - 1 ' A = - ' 3 2 L " ( T - 3 ( 2 ) ) Y - 2 L ’ 9 2 H ( 1 1 ' - 1 ( 2 ) ) l e - 1 1 - 1 m l 1 1 L " ( b i ' b 2 b 3 ) ( b ) ’ 1 1 H ’ ( b 1 “ 1 + b 2 b u ‘ ” 2 ) b ' 3 “ w z w l - 1 1 - l . . 1 = X é L - ( b l w l + b 2 b 5 w 2 ) ( ) 9 1 2 H ( b 1 + b 2 b 6 ) ) . b s w z b 6 N - 1 b 1 2 £ 1 T J w i l ’ b 2 ‘ T i 1 1 2 b 3 m i n ( W J I / W J Q ) ’ b u 3 m i n ( ¢ 1 2 / ¢ 1 1 ) 2 b 5 3 m a X ( ¢ 1 2 / ¢ 1 1 ) , b 6 - m i n l e I / W J Q I w J Z < o 7 3 t h e y d e f i n e t h e r a n g e o f a c c e p t a b l e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n v e c t o r s w i t h o u t r e q u i r i n g a n y a s s u m p t i o n s a b o u t t h e i d e n t i t i e s o f t h e a b s o r b e r s o r t h e k i n e t i c m e c h a n — i s m o f t h e r e a c t i o n . I n g e n e r a l , a s t h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s b e c o m e l e s s l i n e a r l y d e p e n d e n t ( l e s s o v e r l a p p i n g ) , t h e i r s o l u t i o n b a n d s b e c o m e n a r r o w e r , a n d t h e e x p e r i m e n t t h u s m o r e c l e a r l y d e f i n e s t h e i r s h a p e s . D . T h r e e A b s o r b e r S i m p l i f i c a t i o n s S i m p l i f i c a t i o n s f o r t h r e e a b s o r b e r e x p e r i m e n t s g i v e t h e f o l l o w i n g r e s u l t s : 1 . W h e n t h e s h a p e s o f t w o a b s o r b e r s ' s t a t i c s p e c t r a a r e k n o w n , t h e s h a p e o f t h e r e m a i n i n g a b s o r b e r ' s c o n c e n t r a - t i o n p r o f i l e c a n b e c o m p u t e d d i r e c t l y . 2 . W h e n t h e s h a p e s o f t w o a b s o r b e r s ' c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s a r e k n o w n , t h e s h a p e o f t h e r e m a i n i n g a b s o r b e r ' s s t a t i c s p e c t r u m c a n b e c o m p u t e d d i r e c t l y . A s s u m e t h a t a b s o r b e r s o n e t h r o u g h t h r e e a r e a s s i g n e d s o t h a t d e t ( g ) a n d d e t ( y ) a r e p o s i t i v e . E q u a t i o n ( 3 . 1 3 ) g i v e s t h e f o l l o w i n g r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n t h e v e c t o r s i n Q a n d X , 1 a “ “ / d e t ‘ i ’ ” 3 3 ( 3 ) ( 9 - 3 X B y ) 2 a = [ l / d e t ( 2 ) 1 3 ( 3 ) ( 2 8 x 2 7 ) ( 3 . 2 7 ) 7 “ w h e r e t h e s u b s c r i p t s ( a , 8 , y ) a r e t a k e n i n t h e o r d e r ( 1 , 2 , 3 ) , ( 2 , 3 , 1 ) , o r ( 3 , 1 , 2 ) . I f t h e s t a t i c s p e c t r a o f a b s o r b e r s t w o a n d t h r e e a r e k n o w n , t h e f i r s t o f E q u a t i o n s ( 3 . 2 7 ) g i v e s 2 1 t o w i t h i n t h e a r b i t r a r y c o n s t a n t [ l / d e t ( g ) ] . A s i n t h e t w o a b s o r b e r c a s e , w e m a y a r b i t r a r i l y s e t [ l / d e t ( T ) ] = 1 , s o t h a t f r o m E q u a t i o n s 3 . 1 5 ) a n d ( 3 . 2 7 ) £ 1 i s g i v e n b y $ 3 1 = ( L I L - 1 2 ( 3 ) ) Q B ) ( 2 2 X B 3 ) ( 3 . 2 8 ) T h u s , t h e f i r s t o f E q u a t i o n s ( 3 . 2 7 ) g i v e s t h e c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e o f a n y a b s o r b e r f r o m t h e s t a t i c s p e c t r a o f t h e o t h e r t w o a b s o r b e r s . L i k e w i s e , t h e s e c o n d o f E q u a t i o n s ( 3 . 2 7 ) g i v e s t h e s t a t i c s p e c t r u m o f a n y a b s o r b e r f r o m t h e c o n c e n - t r a t i o n p r o f i l e s o f t h e o t h e r t w o a b s o r b e r s . A s i n t h e t w o a b s o r b e r c a s e , t h e s h a p e s o f a s i n g l e a b s o r b e r ' s s t a t i c s p e c t r u m a n d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e c a n b e v a r i e d i n d e — p e n d e n t l y o f o n e a n o t h e r , a n d h e n c e c o n t a i n n o i n f o r m a t i o n a b o u t e a c h o t h e r . E . S . A n a l y s i s E s t i m a t e s o f F S u p p o s e t h a t t h e p r o p o s e d s t a t i c s p e c t r u m i d p r o p f o r a s u s p e c t e d a b s o r b e r f i t s a s b e l o n g i n g t o o n e o f t h e m a b s o r b e r s i n t h e e x p e r i m e n t . I n t h i s s e c t i o n w e p r e s e n t fl : ( E l , g 2 , o o o , D - q ) 7 5 a l e a s t s q u a r e s e q u a t i o n t h a t u s e s t h e S a n a l y s i s e i g e n - v e c t o r s a n d i fi p r o p t o c h a r a c t e r i z e t h e r a t e b e h a v i o r o f a b s o r b e r J i n t h e e x p e r i m e n t . I n w e i g h t e d 8 a n a l y s i s w e a r e c o n c e r n e d w i t h t h e e x p e r i - N m e n t a l l y m e a s u r e d m a t r i x ( A - A ) , w h e r e A . = ( l / N ) Z A - — ’ i J k = l i k ’ a n d f o r w h i c h w e a s s u m e t h e m o d e l q ( A - A ) = _ F _ E + ( _ e - E ) = ( 2 3 3 h ? ) + ( a - E ) 3 : 1 — N 2 3 = E d - l ( l / N ) k g l ° J ( t k ) N E = ( l / N ) e 1 3 k i l 1 k W e f o r m t h e w e i g h t e d s a m p l e c o v a r i a n c e m a t r i x § W ’ d e f i n e d b y s = [ 1 / ( N - 1 ) ] ( A w — E w ) ( A w - E W ) T ( 3 . 3 0 ) w h e r e : x > 4 . u s I » l a . a n d w e s o l v e t h e e i g e n v a l u e e q u a t i o n 7 6 § w § = § A _ A _ = d i a g n l , A 2 , . . . , A p ) , 1 1 3 — “ 2 3 " ” , l e ( 3 . 3 1 ) T h e e s s e n t i a l r a n k s i s t h e m i n i m u m n u m b e r o f a b s o r b e r s w h o s e c o n c e n t r a t i o n s m u s t h a v e c h a n g e d d u r i n g t h e e x p e r i - m e n t . I t i s d e t e r m i n e d b y f i n d i n g t h e l o w e s t v a l u e o f r f o r w h i c h ( A ( r ) - A ) , d e f i n e d b y , . - _ _ - 1 T — ( E H - 1 ) — < 1 s w a m 1 ) ( i i - 1 ) ( 3 . 3 2 ) f i t s t h e e x p e r i m e n t a l m a t r i x ( A f A ) t o w i t h i n i t s r a n d o m e r r o r s . B y t h e s a m e r e a s o n i n g t h a t w a s a p p l i e d t o M a n a l y s i s , w e t a k e f r o m E q u a t i o n ( 3 . 3 2 ) t h e f o l l o w i n g m o d e l f o r e s t i - m a t i n g E a n d A ( A ( S ) - _ A _ ) = E E T = J : 1 ‘ 3 6 , = ( 1 ‘ 1 § ( s ) § ? s , g > ( 1 : 5 ) ( 3 . 3 3 ) N o w 3 c a n n o t e x c e e d m ; T A E A J t h e r e c a n n o t b e m o r e a b s o r b e r s c h a n g i n g c o n c e n t r a t i o n t h a n t h e r e a r e a b s o r b e r s i n t h e e x p e r i m e n t . I f w e a s s u m e , a s b e f o r e , t h a t m i s t h e n u m b e r o f a b s o r b e r s i n t h e e x p e r i m e n t , t h e r e a r e o n l y t w o c a s e s t o c o n s i d e r : C a s e 1 . I f 3 e q u a l s m , t h e c o n c e n t r a t i o n s o f a l l m a b s o r b e r s h a v e c h a n g e d d u r i n g t h e e x p e r i m e n t . M o r e o v e r , t h e r a t e v e c t o r s ( é j , J = 1 , 2 , . . . , m ) f o r m a l i n e a r l y i n - d e p e n d e n t s e t . 7 7 C a s e 2 . I f s i s l e s s t h a n m , t h e n a t l e a s t ( m — s ) a b s o r b e r s h a v e e i t h e r n o t c h a n g e d c o n c e n t r a t i o n d u r i n g t h e e x p e r i m e n t o r h a v e r a t e v e c t o r s t h a t a r e l i n e a r l y d e p e n d e n t o n t h e r a t e v e c t o r s o f o t h e r a b s o r b e r s i n t h e e x p e r i m e n t . I f a b s o r b e r J h a s a n o n z e r o , l i n e a r l y i n d e p e n d e n t r a t e v e c t o r é j ’ t h e n : 3 m u s t s a t i s f y t h e e q u a t i o n i 3 = ( B a g g y ( 3 . 3 1 4 ) w h e r e g J i s a n 5 c o m p o n e n t c o l u m n v e c t o r . I f a b s o r b e r J h a s a z e r o o r l i n e a r l y d e p e n d e n t r a t e v e c t o r , t h e n : 3 d o e s n o t i n g e n e r a l s a t i s f y E q u a t i o n ( 3 . 3 ” ) . M o r e o v e r , w e c a n u s e t h e p r o p o s e d s t a t i c s p e c t r u m t o d e t e r m i n e w h e t h e r o r n o t a b s o r b e r 3 s a t i s f i e s E q u a t i o n 3 ( 3 . 3 U ) . G i v e n f t h e l e a s t s q u a r e s e s t i m a t e o f E 5 - d p r o p ’ i s E U L S ’ d e f i n e d b y - 1 A E J L S = _ P _ S . B _ ( S ) . 1 1 . E S £ J p r o p , T - 2 3 s ‘ = E m a E w fi c s ) ’ E s = d i a g ( w s l ’ w 8 2 $ ° ° ° 9 w s N ) a ( 3 ° 3 5 ) w h e r e w s 1 i s u n i t y i f t h e r e i s a p r o p o s e d v a l u e f o r c h a n n e l 1 a n d i s z e r o o t h e r w i s e . T h e S a n a l y s i s e s t i m a t e o f q fi i s 3 g i v e n b y 7 8 i J L s s = ( E f 1 § ( s ) ) § J L S ( 3 ° 3 6 ) I f a b s o r b e r 3 h a s a n o n z e r o , l i n e a r l y i n d e p e n d e n t r a t e v e c t o r , t h e n E J L S S a n d i j p r o p m u s t b e e q u a l t o w i t h i n r a n d o m e r r o r . O t h e r w i s e , t h e y d o n o t i n g e n e r a l f i t e a c h o t h e r . I f ' 9 : : a b s o r b e r s i n t h e r e a c t i o n , t h e n a n a p p r o p r i a t e l i n e a r i s l i n e a r l y d e p e n d e n t o n t h e r a t e v e c t o r s o f o t h e r c o m b i n a t i o n o f £ 3 a n d t h e s t a t i c s p e c t r a o f t h e s e o t h e r a b s o r b e r s s a t i s f i e s E q u a t i o n ( 3 . 3 “ ) . W e g i v e t w o s i m p l e e x a m p l e s t o i l l u s t r a t e S - a n a l y s i s t e s t i n g o f l i n e a r i n d e - p e n d e n c e . E x a m p l e 2 . C o n s i d e r a t w o a b s o r b e r s y s t e m w h e r e a b - s o r b e r o n e d e c a y s t o n o n - a b s o r b i n g p r o d u c t s v i a t h e m e c h a n i s m k 1 A - r n o n - a b s o r b i n g p r o d u c t s ( I I ) 1 a n d w h e r e a b s o r b e r t w o d o e s n o t c h a n g e c o n c e n t r a t i o n d u r i n g t h e e x p e r i m e n t . I f : 1 a n d £ 2 a r e l i n e a r l y i n d e p e n d e n t , t h e n m = q = 2 . T h e c o n s t r a i n t £ 2 = 9 i m p l i e s t h a t g 2 = 0 . T h e r e f o r e , 5 i s o f r a n k o n e , a n d s = l . W i t h £ 2 = 0 , E q u a — t i o n ( 3 . 3 3 ) f o r t h i s s y s t e m b e c o m e s / A . _ - A A T - _ l T _ _ ( 6 4 1 ) - 9 1 ) ' £ 1 1 1 1 ‘ ( £ 1 E ( 1 ) § ( 1 ) L . ) ( A ' i ) : w h i c h g i v e s A - 1 £ 1 a ( E 3 ( 1 ) ) 5 . 1 _ T - T - l E . 1 " § ( 1 ) £ ( fl - £ ) 9 . 1 0 1 1 3 1 1 ) ' T h u s , : 1 s a t i s f i e s E q u a t i o n ( 3 . 3 “ ) , a s e x p e c t e d , a n d a b - s o r b e r o n e f i t s a s h a v i n g l i n e a r l y i n d e p e n d e n t r a t e s . ( A ( l ) - E ) c o n t a i n s n o i n f o r m a t i o n a b o u t a b s o r b e r t w o . T h u s , A £ 2 , a s e x p e c t e d , d o e s n o t s a t i s f y E q u a t i o n ( 3 . 3 “ ) , a n d a b s o r b e r t w o d o e s n o t f i t a s h a v i n g l i n e a r l y i n d e p e n d e n t r a t e s . E x a m p l e 3 . C o n s i d e r a t w o a b s o r b e r s y s t e m t h a t r e a c t s v i a t h e m e c h a n i s m A + A ( I I I ) w h e r e f a n d : 2 a r e l i n e a r l y i n d e p e n d e n t . F o r t h i s c a s e , 1 m = q = 2 . M e c h a n i s m ( I I I ) h a s t h e c o n s t r a i n t £ 1 + E = 0 w h i c h i m p l i e s t h e c o n s t r a i n t g i s t h u s o f r a n k o n e , a n d s = 1 . E q u a t i o n ( 3 . 3 3 ) f o r t h i s s y s t e m i s 8 0 A - 3 A A T = A A T A A T _ - 1 T ( £ ( l ) - £ ) E . 2 ' 1 . £ 1 3 . 1 1 + 2 2 2 . 2 " ( I : 2 ( 1 ) B ( 1 ) L _ ) : w h i c h c a n n o t b e s o l v e d f o r E s i n c e 3 i s o f r a n k o n e a n d A t h e i n v e r s e ( fi fi ? ) ’ 1 d o e s n o t e x i s t . T h e r e f o r e , : 1 a n d : 2 d o n o t s a t i s f y E q u a t i o n ( 3 . 3 a ) a n d a b s o r b e r s o n e a n d t w o d o n o t f i t a s h a v i n g l i n e a r l y i n d e p e n d e n t r a t e s . S a n a l y s i s l u m p s a b s o r b e r s o n e a n d t w o t o g e t h e r . T o s e e t h i s , n o t e t h a t w i t h h + £ 2 = O , F E c a n b e e x p r e s s e d l a s ( f l - £ 2 ) s a t i s f i e s E q u a t i o n ( 3 . 3 “ ) a n d , t h e r e f o r e , t h e c o m b i n a t i o n f - d p r o p w i t h l i n e a r l y i n d e p e n d e n t r a t e s . = ( E l - £ 2 ) w o u l d f i t a s a n " a b s o r b e r " F . S t r a t e g y f o r R e s o l v i n g a R a p i d S c a n n i n g K i n e t i c s E x p e r i m e n t I n t h i s s e c t i o n w e p r e s e n t a s e v e n s t e p s t r a t e g y f o r a p p l y i n g t h e t o o l s d i s c u s s e d i n C h a p t e r 2 a n d t h e p r e c e d i n g s e c t i o n s o f t h i s C h a p t e r t o r e s o l v e a r a p i d s c a n n i n g k i n e t i c s e x p e r i m e n t i n t o t h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a — t i o n v e c t o r s o f i t s a b s o r b e r s . W e a s s u m e t h a t t h e k i n e t i c m e c h a n i s m o f t h e r e a c t i o n i s n o t a l r e a d y k n o w n . I n d e e d , t h e p r o p o s a l a n d t e s t i n g o f k i n e t i c m e c h a n i s m s a n d e s t i — m a t i o n o f t h e i r r a t e c o n s t a n t s a r e a d v a n c e d g o a l s o f a 8 1 r a p i d s c a n n i n g k i n e t i c s s t u d y , a n d s h o u l d n o t b e u n d e r t a k e n u n t i l t h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n v e c t o r s h a v e f i r s t b e e n e x t r a c t e d f r o m e a c h e x p e r i m e n t . M o s t o f t h e e x t e r n a l i n f o r m a t i o n w i t h w h i c h t h e e x p e r i - m e n t i s t o b e r e s o l v e d c o m e s f r o m m e a s u r e d o r p r o p o s e d s t a t i c s p e c t r a o f s u s p e c t e d a b s o r b e r s . L i t t l e i s a s s u m e d t o b e k n o w n a l r e a d y a b o u t t h e c o n c e n t r a t i o n v e c t o r s , e x c e p t p e r h a p s t h e i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s o f r e a c t a n t s a n d c a t a l y s t s , a d e g r e e o f k n o w l e d g e u s u a l l y t o o s m a l l t o b e o f m u c h v a l u e i n r e s o l v i n g t h e e x p e r i m e n t . S t e p 1 . U s e w e i g h t e d M a n d S a n a l y s e s t o d e t e r m i n e t h e e s s e n t i a l r a n k s m a n d s f o r t h e w h o l e e x p e r i m e n t . T h e r e m u s t b e a t l e a s t m a b s o r b e r s i n t h e e x p e r i m e n t , a n d o f t h e s e , a t l e a s t 3 m u s t c h a n g e c o n c e n t r a t i o n . S t e p 2 . A s s u m e t h a t t h e r e a r e m a b s o r b e r s i n t h e e x - p e r i m e n t . F i t t o t h e M a n a l y s i s e i g e n v e c t o r s f o r t h e w h o l e e x p e r i m e n t t h e m e a s u r e d s t a t i c s p e c t r u m o f e a c h l i g h t a b s o r b i n g r e a c t a n t , c a t a l y s t , a n d k n o w n p r o d u c t . E a c h s p e c t r u m t h a t f i t s m a y b e c o u n t e d a s b e l o n g i n g t o a n a b - s o r b e r i n t h e e x p e r i m e n t . E a c h s p e c t r u m t h a t d o e s n o t f i t i s e i t h e r n o t p r e s e n t i n t h e e x p e r i m e n t , o r r e p r e s e n t s a n a b s o r b e r w h o s e c o n c e n t r a t i o n i s l i n e a r l y d e p e n d e n t o n t h e o t h e r a b s o r b e r s ' c o n c e n t r a t i o n s . I n t h e l a t t e r c a s e , t h e e x p e r i m e n t h a s m o r e t h a n m a b s o r b e r s . U n l e s s t h e r e a r e s t r o n g r e a s o n s t o s u s p e c t l i n e a r d e p e n d e n c e a m o n g t h e c o n c e n t r a t i o n s o r s t a t i c s p e c t r a , m a i n t a i n t h e a s s u m p t i o n t h a t m i s t h e n u m b e r o f a b s o r b e r s i n t h e e x p e r i m e n t . 8 2 S t e p 3 . F i t e a c h m e a s u r e d s t a t i c s p e c t r u m t h a t f i t s i n S t e p 2 t o t h e S a n a l y s i s e i g e n v e c t o r s . E a c h s p e c t r u m t h a t f i t s t h e 8 a n a l y s i s e i g e n v e c t o r s m a y b e c o u n t e d a s b e l o n g i n g t o a n a b s o r b e r w h o s e c o n c e n t r a t i o n c h a n g e d a n d w h o s e r a t e i s l i n e a r l y i n d e p e n d e n t o f t h e r a t e s o f t h e o t h e r a b s o r b e r s . E a c h s p e c t r u m t h a t d o e s n o t f i t r e p r e s e n t s a n a b s o r b e r w h o s e c o n c e n t r a t i o n d i d n o t c h a n g e , o r w h o s e r a t e i s l i n e a r l y d e p e n d e n t o n t h e r a t e s o f t h e o t h e r a b s o r b e r s . S t e p u . I f t h e n u m b e r o f m e a s u r e d s t a t i c s p e c t r a t h a t f i t t h e M a n a l y s i s e i g e n v e c t o r s e q u a l s m , t h e n a l l m c o l - u m n s o f U h a v e b e e n e s t i m a t e d . F o r m 9 a n d o b t a i n X _ f r o m E q u a t i o n ( 3 . 1 3 ) . U s e E ’ t o o b t a i n t h e c o n c e n t r a t i o n v e c t o r s o f t h e m a b s o r b e r s . T h e e x p e r i m e n t h a s b e e n r e s o l v e d . I f t h e n u m b e r o f m e a s u r e d s t a t i c s p e c t r a t h a t f i t t h e M a n a l y s i s e i g e n v e c t o r s i s l e s s t h a n m , t h e r e i s i n s u f - f i c i e n t i n f o r m a t i o n t o r e s o l v e t h e e x p e r i m e n t a t t h i s p o i n t . S o m e o f t h e m a b s o r b e r s m u s t b e i n t e r m e d i a t e s o r u n k n o w n p r o d u c t s o f t h e r e a c t i o n . A l t h o u g h t h e r e a r e n o m e a s u r e d s t a t i c s p e c t r a f o r t h e s e , w e m a y i n f e r s o m e o f t h e i r s p e c t r a l a n d k i n e t i c p r o p e r t i e s i n S t e p 5 . S t e p 5 . P e r f o r m p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s e s o n s u b - s p a c e s o f w a v e l e n g t h a n d t i m e i n h o p e s o f f i n d i n g p a r t s o f t h e e x p e r i m e n t w i t h f e w e r a b s o r b e r s t h a n t h e w h o l e e x p e r i m e n t . S t e p 6 . P a r t i a l l y o r c o m p l e t e l y r e s o l v e s u b s p a c e s t h a t c o n t a i n o n e , t w o , o r t h r e e a b s o r b e r s b y u s i n g t h e o n e , t w o a n d t h r e e a b s o r b e r s i m p l i f i c a t i o n s p l u s i n f o r m a t i o n 8 3 f r o m a b s o r b e r s w h o s e m e a s u r e d s t a t i c s p e c t r a f i t t h e M a n a l y s i s e i g e n v e c t o r s f o r t h e s e s u b s p a c e s . S t e p 7 . E a c h c o n c e n t r a t i o n v e c t o r o b t a i n e d f r o m a s u b - s p a c e o f w a v e l e n g t h s i n S t e p 6 c a n b e f i t t o t h e M a n a l y s i s e i g e n v e c t o r s f o r t h e w h o l e e x p e r i m e n t t o g i v e o n e c o l u m n o f y f o r t h e w h o l e e x p e r i m e n t . L i k e w i s e , e a c h s t a t i c s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m a s u b s p a c e o f t i m e g i v e s o n e c o l u m n o f U f o r t h e w h o l e e x p e r i m e n t . l £ _ e n o u g h i n f o r m a t i o n h a s b e e n o b t a i n e d i n S t e p 6 t o g i v e e i t h e r t h e s t a t i c s p e c t r a o r c o n c e n t r a t i o n v e c t o r s o f t h e r e q u i r e d m i n i m u m n u m b e r o f a b s o r b e r s m f o r t h e w h o l e e x p e r i m e n t , f i t t h i s n e w i n f o r m a - t i o n t o t h e M a n a l y s i s e i g e n v e c t o r s f o r t h e w h o l e e x p e r i - m e n t t o o b t a i n e i t h e r a l l t h e c o l u m n s o f U o r X . T h e r e - m a i n i n g u n k n o w n r o t a t i o n m a t r i x m a y b e o b t a i n e d f r o m E q u a - t i o n ( 3 . 1 3 ) . U s e U a n d E t o o b t a i n F a n d g . T h e e x p e r i - m e n t h a s b e e n r e s o l v e d . T h e f o l l o w i n g C h a p t e r a p p l i e s t h i s s e v e n s t e p s t r a t e g y i n a r a p i d s c a n n i n g k i n e t i c s s t u d y o f a n e n z y m e - c a t a l y z e d r e a c t i o n . C H A P T E R u A R A P I D S C A N N I N G S T O P P E D F L O W S T U D Y O F T H E L A D H - C A T A L Y Z E D R E D U C T I O N O F N D M A B Y N A D H A . I n t r o d u c t i o n I n t h i s c h a p t e r w e a p p l y t h e m e t h o d o f p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s d e s c r i b e d i n t h e t w o p r e c e d i n g c h a p t e r s t o a s c a n n i n g s t o p p e d f l o w s t u d y o f t h e h o r s e l i v e r a l c o h o l d e h y d r o g e n a s e ( L A D H ) c a t a l y z e d r e d u c t i o n o f t h e s u b s t r a t e a n a l o g p - n i t r o s o — N , N - d i m e t h y l a n i l i n e ( N D M A ) b y r e d u c e d n i c o t i n a m i d e a d e n i n e d i n u c l e o t i d e ( N A D H ) . P r e v i o u s s t u d i e s o f t h i s r e a c t i o n b y D u n n a n d B e r n h a r d ( 1 9 7 1 ) , S c h a c k a n d D u n n ( 1 9 7 2 ) , a n d S u e l t e r , g p _ a l . ( 1 9 7 5 ) h a v e i n d i c a t e d t h a t t h e r e a c t i o n i s s p e c t r a l l y c o m p l e x . I t i s t h u s p a r t i c u l a r l y s u i t a b l e f o r a s c a n n i n g k i n e t i c s s t u d y . T h e p u r p o s e o f t h e r e s e a r c h r e p o r t e d h e r e w a s t o m a p o u t f o r t h e f i r s t t i m e t h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f t h e l i g h t a b s o r b i n g s u b s t r a t e s , p r o d u c t s , a n d t r a n s i e n t i n t e r m e d i a t e s t h a t o c c u r i n t h i s r e a c t i o n . L A D H i s a n e x t e n s i v e l y s t u d i e d e n z y m e t h a t c a t a l y z e s t h e m e t a b o l i s m o f i n g e s t e d e t h a n o l t o a c e t a l d e h y d e v i a t h e o v e r a l l r e a c t i o n ( B r a n d e n , g p _ a l . , 1 9 7 5 ) E t h a n o l + N A D + : A c e t a l d e h y d e + N A D H + H + ( I ) 8 “ 8 5 w h e r e N A D + i s o x i d i z e d n i c o t i n a m i d e a d e n i n e d i n u c l e o t i d e . N A D H a n d N A D + b e l o n g t o a s p e c i a l c l a s s o f s u b s t r a t e s a n d p r o d u c t s c a l l e d c o e n z y m e s . T h e y a r e t h e o x i d i z i n g a n d r e d u c i n g a g e n t s i n r e a c t i o n s c a t a l y z e d b y m a n y d e - h y d r o g e n a s e e n z y m e s b e s i d e s L A D H . T h e r e a c t i o n s a n d p r o p e r t i e s o f N A D H a n d N A D + h a v e b e e n r e v i e w e d b y K a p l a n ( 1 9 6 0 ) . T h e r e v i e w a r t i c l e s b y S u n d a n d T h e o r e l l ( 1 9 6 0 ) , B r a n d e n , e _ p a 3 , ( 1 9 7 5 ) , a n d D a l z i e l ( 1 9 7 5 ) d i s c u s s t h e s t r u c t u r a l a n d k i n e t i c a s p e c t s o f L A D H . L A D H i s a d i m e r w i t h t w o c a t a l y t i c s i t e s p e r m o l e c u l e a n d a m o l e c u l a r w e i g h t o f 8 A 0 0 0 ( S u n d a n d T h e o r e l l , 1 9 6 0 ) . P i e t r u s k o , p p 3 1 . ( 1 9 6 6 ) s h o w e d t h a t t h e r e a r e t w o t y p e s o f p r o t e i n c h a i n s f o r L A D H , w h i c h t h e y c a l l e d t h e E a n d S s u b u n i t s . T h e s e g i v e t h r e e p o s s i b l e d i m e r i c f o r m s ( c a l l e d i s o z y m e s ) o f L A D H : E E , S S , a n d E S . T h e E s u b u n i t o c c u r s m o r e f r e - q u e n t l y a n d i s a c t i v e i n t h e o x i d a t i o n o f e t h a n o l ( i p g p , R e a c t i o n I ) . T h e l e s s f r e q u e n t l y o c c u r r i n g s u b u n i t S , i s a c t i v e i n t h e o x i d a t i o n o f s t e r o i d s ( P i e t r u s k o a n d T h e o r e l l , 1 9 6 9 ) . H o w e v e r , S h a s s o m e e t h a n o l a c t i v i t y a n d E h a s s o m e s t e r o i d a c t i v i t y ( B r a n d e n , p p 3 1 . , 1 9 7 5 ) . T h e o r e l l 2 p $ 1 . , ( 1 9 7 0 ) s t u d i e d t h e b i n d i n g o f N A D H t o E E , S S , a n d E S , a n d f o u n d n o e v i d e n c e f o r i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e s u b u n i t s . P i e t r u s k o g p _ a l . ( 1 9 6 6 ) d e t e r m i n e d t h a t c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e p r e p a r a t i o n s o f L A D H c o n t a i n p r e d o m i n a n t l y t h e E B i s o z y m e w i t h 2 - 5 % E S i s o z y m e . S h o r e ( p r i v a t e c o m m u n i c a t i o n ) c l a i m s t h a t t h e L A D H p r e p a r a t i o n 8 6 a v a i l a b l e f r o m t h e B o e h r i n g e r M a n n h e i m C o r p o r a t i o n ( t h e p r e p a r a t i o n u s e d i n o u r s t u d y ) i s o f s u f f i c i e n t l y h i g h E E p u r i t y f o r u s e i n k i n e t i c s t u d i e s w i t h o u t r i s k o f m e a s u r a b l e i n t e r f e r e n c e f r o m t h e E S i s o z y m e . S i n c e t h e c o n c e n t r a t i o n o f H + i s u s u a l l y b u f f e r e d t o b e n e a r l y c o n s t a n t i n k i n e t i c s t u d i e s , R e a c t i o n I i s v i e w e d a s a t w o - s u b s t r a t e , t w o - p r o d u c t r e a c t i o n . C l e l a n d a n d c o l l e a g u e s h a v e d e v e l o p e d a m e t h o d o f s t e a d y — s t a t e - i n i t i a l - r a t e a n a l y s i s f o r t w o s u b s t r a t e e n z y m e r e a c t i o n s [ C l e l a n d ( 1 9 7 0 ) ] t h a t h a s b e e n e x t e n s i v e l y a p p l i e d t o L A D H c a t a l y z e d r e a c t i o n s o f a l i p h a t i c a l c o h o l s a n d a l d e h y d e s i n r e a c t i o n s a n a l o g o u s t o I , [ W r a t t e n a n d C l e l a n d ( 1 9 6 3 ) , D a l z i e l a n d D i c k i n s o n ( 1 9 6 5 ) ] . T h e s e s t u d i e s , r e v i e w e d b y D a l z i e l ( 1 9 7 5 ) , a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e c o n c l u s i o n t h a t i n t h e m o s t l i k e l y m e c h a n i s m f o r R e a c t i o n I , N A D + b i n d s t o t h e a c t i v e s i d e o f L A D H b e f o r e t h e a l c o h o l b i n d s , a n d t h a t t h e a l d e h y d e d i s s o c i a t e s f r o m t h e a c t i v e s i t e b e f o r e N A D H d i s s o c i a t e s . ‘ T h i s c o n c e p t i s c a l l e d t h e " o r d e r e d m e c h a n i s m " o f L A D H [ C l e l a n d ( 1 9 7 0 ) ] s i n c e t h e s u b s t r a t e s a n d p r o d u c t s e n t e r a n d l e a v e i n a f i x e d o r d e r . I n s t e a d y - s t a t e - i n i t i a l - r a t e k i n e t i c s s t u d i e s , t h e t o t a l e n z y m e c o n c e n t r a t i o n i s m u c h s m a l l e r t h a n t h e i n i t i a l s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s , s o t h a t e n z y m e - b o u n d t r a n s i e n t i n t e r m e d i a t e s o f s u b s t r a t e s a n d p r o d u c t s a r e 1 1 1 g e n e r a l n o t s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y d e t e c t a b l e . I n t h e s e e x p e r i m e n t s o n e o b s e r v e s o n l y t h e o v e r a l l c o n v e r s i o n o f e n z y m e - f r e e s u b s t r a t e s t o e n z y m e — f r e e p r o d u c t s . H o w e v e r , i n 8 7 e x p e r i m e n t s w h e r e t h e t o t a l e n z y m e c o n c e n t r a t i o n i s o f m a g n i t u d e c o m p a r a b l e t o t h e i n i t i a l s u b s t r a t e c o n c e n t r a - t i o n s , t h e e n z y m e b o u n d i n t e r m e d i a t e s a r e s p e c t r o p h o t o - m e t r i c a l l y d e t e c t a b l e , p r o v i d i n g t h e i r s p e c t r a a r e d i f - f e r e n t f r o m t h o s e o f t h e f r e e e n z y m e , s u b s t r a t e s , a n d p r o d u c t s . M o r e o v e r , a s i g n i f i c a n t p o r t i o n o f t h e t i m e c o u r s e i n a h i g h e n z y m e c o n c e n t r a t i o n e x p e r i m e n t i n v o l v e s t h e b i n d i n g o f s u b s t r a t e s t o t h e e n z y m e t o f o r m t h e s e t r a n s i e n t i n t e r m e d i a t e s . S t u d i e s w i t h h i g h e n z y m e c o n - c e n t r a t i o n s a r e c a l l e d " t r a n s i e n t p h a s e s t u d i e s " [ D a l z i e l ( 1 9 7 5 ) ] , a n d i n g e n e r a l r e q u i r e f a s t r e a c t i o n t e c h n i q u e s ( g p g p , s t o p p e d f l o w ) . T h e a p p l i c a t i o n o f f a s t r e a c t i o n t e c h n i q u e s t o t r a n s i e n t p h a s e e n z y m e s t u d i e s i s r e v i e w e d b y H a m m e s a n d S c h i m m e l ( 1 9 7 0 ) . L A D H c a t a l y z e d r e a c t i o n s h a v e b e e n e x t e n s i v e l y s t u d i e d b y t h e s t o p p e d f l o w t e c h n i q u e u n d e r c o n d i t i o n s o f h i g h e n z y m e c o n c e n t r a t i o n s b y S h o r e ( 1 9 6 9 ) , S h o r e a n d G u t f r e u n d ( 1 9 7 0 ) , B e r n h a r d , § £ . § l - ( 1 9 7 0 ) , D u n n a n d B e r n h a r d ( 1 9 7 1 ) , B r o o k s , S h o r e , a n d G u t f r e u n d ( 1 9 7 2 ) , L u i s i a n d F a v i l l a ( 1 9 7 2 ) , D u n n ( 1 9 7 2 ) , M c F a r l a n d a n d B e r n h a r d ( 1 9 7 2 ) , D u n n a n d H u t c h i s o n ( 1 9 7 3 ) , S h o r e , p p a ; ( 1 9 7 “ ) , D u n n , B i e l l m a n , a n d B r a n l a n d t ( 1 9 7 5 ) , S h o r e a n d S a n t i a g o ( 1 9 7 5 ) a n d S u e l t e r , p p a 1 . ( 1 9 7 5 ) . S o m e o f t h e s e s t u d i e s h a v e b e e n r e v i w e d b y H o l b r o o k a n d G u t f r e u n d ( 1 9 7 3 ) , D a l z i e l ( 1 9 7 5 ) , a n d B r a n d e n , p p a 1 . ( 1 9 7 5 ) . T h e s t u d i e s o f S h o r e , G u t f r e u n d a n d c o l l e a g u e s h a v e f o c u s e d p r i m a r i l y o n t h e o x i d a t i o n o f e t h a n o l ( R e a c t i o n I ) , a n d t h e s t u d i e s o f D u n n , B e r n h a r d , 8 8 a n d c o l l e a g u e s h a v e f o c u s e d p r i m a r i l y o n t h e r e d u c t i o n o f a n a l o g s o f a c e t a l d e h y d e i n R e a c t i o n 1 . T h e s u b s t r a t e N D M A t h a t i s t h e s u b j e c t o f o u r s t u d y i s a n a c e t a l d e h y d e a n a l o g s u b s t r a t e f i r s t s t u d i e d b y D u n n a n d B e r n h a r d ( 1 9 7 1 ) . T h e y p r o p o s e d t h e f o l l o w i n g o v e r a l l r e a c t i o n f o r t h e L A D H c a t a l y z e d r e d u c t i o n o f N D M A b y N A D H N D M A + N A D H + H + + P + N A D + ( I I ) w h e r e N D M A i s p - n i t r o s o — N , N - d i m e t h y l a n i l i n e , a n d w h e r e P w a s t e n t a t i v e l y a s s i g n e d a s p - N , N - d i m e t h y l a m i n o p h e n y l - . h y d r o x y l a m i n e . N D M A w a s u s e d b e c a u s e o f i t s i n t e n s e A O . D . M ' l c m ' l ) c h r o m o p h o r e a t A A O n m ( A A O = 3 . 5 h x 1 0 a n d w a s i n t e n d e d t o b e a n a n a l o g o f t h e n o n - a b s o r b e r a c e t a l d e h y d e i n t h e b i o l o g i c a l R e a c t i o n I [ D u n n a n d B e r n — h a r d ( l 9 7 l ) ] ; 2 : 3 4 , R e a c t i o n I I i n v o l v e s r e d u c t i o n o f t h e c a r b o n y l g r o u p o f a c e t a l d e h y d e . D u n n a n d B e r n h a r d ( 1 9 7 1 ) m e a s u r e d i n s i n g l e w a v e — l e n g t h s t o p p e d f l o w e x p e r i m e n t s t h e a b s o r b a n c e - t i m e p r o - f i l e s a t 3 3 0 n m a n d R h o n m u n d e r a v a r i e t y o f i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s . T h e i r i n t e r p r e t a t i o n o f t h e r e a c t i o n f o c u s e d p r i m a r i l y o n t h e M A O n m r e s u l t s . T h e y r e p o r t t h a t w h e n [ N D M A J O > [ L A D H ] O > [ N A D H ] 0 ( w h e r e [ L A D H ] O i s t h e i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n o f a c t i v e s i t e s a s s u m i n g t w o a c t i v e s i t e s p e r L A D H m o l e c u l e ) , t h e n t h e a b s o r b a n c e d e c a y a t M A O n m i s b i p h a s i c , w i t h e q u a l a m p l i t u d e a b s o r b a n c e c h a n g e s i n t h e f a s t a n d s l o w p o r t i o n s . 0 n t h e a s s u m p t i o n 8 9 t h a t N D M A i s t h e o n l y a b s o r b e r a t “ N O n m , t h e y c a l c u l a t e d t h a t e a c h p o r t i o n o f t h e b i p h a s i c d e c a y c o r r e s p o n d s t o t h e d i s a p p e a r a n c e o f N D M A e q u a l t o 1 / 2 [ N A D H ] O . T h e y o b s e r v e d b i p h a s i c a b s o r b a n c e d e c a y a t “ M o n m t o a f i n a l v a l u e o f z e r o o p t i c a l d e n s i t y u n d e r t h e c o n d i t i o n s [ L A D H ] O < [ N D M A ] O < [ N A D H ] O . W i t h t h e a s s u m p t i o n t h a t N D M A i s t h e o n l y a b s o r b e r a t H M O n m , t h e y c a l c u l a t e d t h a t t h e a m o u n t o f N D M A t h a t d i s a p p e a r e d i n t h e f a s t p o r t i o n w a s e q u a l t o 1 / 2 [ L A D H ] O . F o r t h e c o n d i t i o n s [ N D M A ] O < [ L A D H ] 0 < < [ N A D H ] 0 , t h e y r e p o r t a s i n g l e r a p i d f i r s t o r d e r d e c a y o f a b s o r b a n c e a t H A D n m t o z e r o o p t i c a l d e n s i t y . T o e x p l a i n t h e i r c a l c u l a t e d r e s u l t s f o r t h e d i s a p - p e a r a n c e o f N D M A , D u n n a n d B e r n h a r d ( 1 9 7 1 ) p r o p o s e d t h e f o l l o w i n g m e c h a n i s m , w h e r e E = L A D H , S = N D M A , a n d X = ( N A D + - P r o d u c t ) c o m p l e x , f a s t f a s t E ( N A D H ) 2 ( S ) I E ( N A D H ) 2 ( S ) 2 I ( I I I ) s l o w + E ( N A D H ) ( S ) ( X ) - * . . . E + 2 N A D + 2 P T h e y a s s u m e t h a t o n l y s p e c i e s c o n t a i n i n g S h a v e a b s o r b a n c e a t ” # 0 n m , a n d t h a t t h e s p e c t r a l c o n t r i b u t i o n o f e a c h S i s t h e s a m e a s f r e e N D M A . I I I h a s b e e n n a m e d t h e " h a l f - o f - t h e - s i t e s r e a c t i v i t y m e c h a n i s m " [ B r a n d e n , g p _ a l . ( 1 9 7 5 ) ] . I t p r e d i c t s t h a t w h e n o n e o f t h e t w o s i t e s o n a n L A D H m o l e c u l e c o n t a i n s t h e N A D + - P r o d u c t c o m p l e x x , c o n v e r s i o n t o N A D + + P r o d u c t o f t h e N A D H - S c o m p l e x o c c u p y i n g 9 0 t h e o t h e r s i t e b e c o m e s v e r y s l o w ; i p g p , t h e p r e s e n c e o f X o n o n e s i t e l o w e r s t h e a c t i v i t y o f t h e o t h e r s i t e . I I I a l s o a s s u m e s t h a t b o t h s i t e s m u s t b e o c c u p i e d b y N A D H b e f o r e e i t h e r s i t e c a n r e d u c e S . T h i s f e a t u r e i s r e q u i r e d t o a c c o u n t f o r D u n n a n d B e r n h a r d ' s c a l c u l a t i o n t h a t , w h e n [ N D M A J O > [ N A D H ] O , t h e a m o u n t o f S c o n v e r t e d t o X i n t h e f a s t p o r t i o n o f t h e b i p h a s i c d e c a y i s 1 / 2 [ N A D H ] O , w i t h a n o t h e r a m o u n t 1 / 2 [ N A D H J O c o n v e r t e d t o P i n t h e s l o w p o r t i o n . D u n n a n d B e r n h a r d ( 1 9 7 1 ) p r o p o s e d t h a t N D M A c a n d i s s o c i a t e r a p i d l y f r o m E ( N A D H ) ( S ) X . T h e r e f o r e , w h e n [ N D M A ] 0 < [ L A D H ] O < < [ N A D H ] O t h e N D M A i s f r e e t o b i n d t o a n e n z y m e m o l e c u l e t h a t d o e s n o t c o n t a i n X , a n d I I I p r e - d i c t s a s i n g l e r a p i d d e c a y o f N D M A . I n p r o p o s i n g I I I , D u n n a n d B e r n h a r d ( 1 9 7 1 ) d i d n o t a s s u m e t h a t t h e t w o s i t e s o f L A D H a r e d i f f e r e n t ; t h e r e i s s t r o n g s t r u c t u r a l e v i d e n c e t h a t t h e f r e e E E i s o z y m e o f L A D H i s a s y m m e t r i c d i m e r [ B r a n d e n , 2 2 . § l - ( 1 9 7 5 ) ] . R a t h e r , t h e y a s s u m e t h a t t h e t w o s i t e s i n t e r a c t w i t h e a c h o t h e r w h e n t h e y a r e o c c u p i e d b y s u b s t r a t e s a n d p r o d u c t s . N o t e t h a t I I I r e q u i r e s i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e s i t e s i n t w o s e n s e s : ( 1 ) B o t h s i t e s m u s t b e o c c u p i e d b y N A D H a n d N D M A b e f o r e a n y p r o d u c t c o m p l e x i s f o r m e d . ( i i ) T h e p r e s e n c e o f X o n o n e s i t e l o w e r s t h e c a t a l y t i c a c t i v i t y o f t h e o t h e r s i t e . I n e a r l i e r s t u d i e s o f t h e L A D H c a t a l y z e d r e d u c t i o n 9 1 o f b e n z a l d e h y d e , B - n a p t h a l d e h y d e , a n d U - ( 2 ' - i m i d a z o l y l a z o ) b e n z a l d e h y d e , B e r n h a r d , p p a 1 . ( 1 9 7 0 ) r e p o r t e d b i p h a s i c d e c a y s o f N A D H a n d e a c h a l d e h y d e w h i c h t h e y i n t e r p r e t e d i n t e r m s o f M e c h a n i s m I I I . H o w e v e r , S h o r e a n d G u t f r e u n d ( 1 9 7 0 ) s t u d i e d t h e t r a n s i e n t p h a s e k i n e t i c s o f R e a c t i o n I w i t h e t h a n o l a s t h e s u b s t r a t e a n d w i t h a c e t a l d e h y d e a s t h e s u b s t r a t e a n d f o u n d n o e v i d e n c e f o r a n y i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e s i t e s o f L A D H . I n a r e v i e w a r t i c l e o n t r a n - s i e n t p h a s e k i n e t i c s t u d i e s o f d e h y d r o g e n a s e s , H o l b r o o k a n d G u t f r e u n d ( 1 9 7 3 ) e x p r e s s t h e v i e w t h a t t h e b i p h a s i c d e c a y s r e p o r t e d b y D u n n a n d B e r n h a r d ( 1 9 7 1 ) r e f l e c t t w o d i s t i n c t s t e p s i n t h e m e c h a n i s m r a t h e r t h a n d i f f e r e n t r e a c t i o n r a t e s f o r t h e i n d i v i d u a l s i t e s . T h e p u r p o s e o f t h e r e s e a r c h r e p o r t e d h e r e i s t h e s p e c t r a l a n d k i n e t i c c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e s u b s t r a t e s , p r o d u c t s a n d t r a n s i e n t i n t e r m e d i a t e s i n t h e s p e c t r a l l y r i c h L A D H - N D M A - N A D H r e a c t i o n s y s t e m , r a t h e r t h a n t h e r e s o l u t i o n o f t h e " h a l f - o f - t h e - s i t e s r e a c t i v i t y " i s s u e . T h e b r o a d - b a n d e d a b s o r b a n c e s p e c t r a o f s u b s t r a t e s e n z y m e a n d p r o d u c t s i n R e a c t i o n I I m a k e t h i s r e a c t i o n s p e c t r a l l y r i c h : N D M A ( A m a x = u u o n m ) , N A D H ( A m a x 1 = 2 6 0 n m , A m a x 2 = 3 u o n m ) , N A D + ( A m a x = 2 6 0 n m ) , L A D H ( A m a x = 2 8 0 n m ) , a n d P ( A m a x = 2 5 5 n m ( D u n n a n d B e r n h a r d , 1 9 7 1 ) ) . D u n n a n d B e r n h a r d ( 1 9 7 1 ) o b s e r v e d t h a t t h e d e c a y o f a b s o r b a n c e a t 3 3 0 n m , w h i c h t h e y a t t r i b u t e d t o t h e 3 H 0 n m b a n d o f N A D H , w a s n o t c o r r e l a t e d t o t h e d e c a y o f a b s o r b a n c e a t “ M O n m , w h i c h t h e y a t t r i b u t e d t o N D M A . S i n c e t h e d e c a y a t 3 3 0 n m 9 2 w a s m u c h s l o w e r t h a n a t “ “ 0 n m , t h e y h y p o t h e s i z e d a n a b - s o r b i n g i n t e r m e d i a t e a t 3 3 0 n m . S c h a c k a n d D u n n ( 1 9 7 2 ) o b s e r v e d a b s o r b a n c e g r o w t h a n d d e c a y a t 5 “ 0 n m , w h i c h t h e y a t t r i b u t e d t o y e t a n o t h e r i n t e r m e d i a t e . S u e l t e r , 2 £ . é l - ( 1 9 7 5 ) o b s e r v e d i n f o u r r e p l i c a t e s c a n n i n g s t o p p e d f l o w e x p e r i m e n t s t h a t t h e d e c a y p o r t i o n s o f t h e a b s o r - b a n c e - t i m e p r o f i l e s a t 3 3 0 n m , 3 5 0 n m , a n d 3 6 0 n m , h a d d i f f e r e n t f i r s t o r d e r d e c a y p a r a m e t e r s . T h e y h y p o t h e s i z e d t w o i n t e r m e d i a t e s p l u s t h e 3 “ 0 n m b a n d o f N A D H a s a b - s o r b e r s a t t h e s e w a v e l e n g t h s . S u e l t e r , § p _ a l . ( 1 9 7 5 ) a l s o o b s e r v e d t h e g r o w t h a n d d e c a y o f a b s o r b a n c e a t 5 “ 0 n m r e p o r t e d p r e v i o u s l y b y S c h a c k a n d D u n n ( 1 9 7 2 ) . T h e s e h i n t s o f s p e c t r a l c o m p l e x i t y a n d t h e o c c u r r e n c e o f p o s - s i b l e t r a n s i e n t i n t e r m e d i a t e s , p l u s t h e p r e v i o u s l a c k o f a s y s t e m a t i c , m e c h a n i s m - i n d e p e n d e n t m e a n s o f s o r t i n g o u t t h e s e i n t e r m e d i a t e s , i n d i c a t e d t o u s t h a t t h e L A D H - N D M A — N A D H r e a c t i o n w a s r i p e f o r a s c a n n i n g k i n e t i c s s t u d y c o u p l e d w i t h p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s . F i g u r e “ . 1 s h o w s a s i m p l i f i e d b l o c k d i a g r a m o f t h e s c a n n i n g s t o p p e d f l o w a b s o r b a n c e s p e c t r o m e t e r u s e d i n t h i s s t u d y . T h e d e s i g n , c o n s t r u c t i o n , a n d c h a r a c t e r i z a - t i o n o f t h e s t o p p e d f l o w s p e c t r o m e t e r w e r e e x e c u t e d a n d r e p o r t e d b y H o ( 1 9 7 6 ) . T h i s i n s t r u m e n t i s a m o d i f i c a - t i o n o f t h e s t o p p e d f l o w s y s t e m r e p o r t e d b y P a p a d a k i s , C o o l e n a n d D y e ( 1 9 7 5 ) a n d w a s s p e c i f i c a l l y d e s i g n e d f o r e n z y m e s t u d i e s . I t f e a t u r e s l o w h o l d i n g v o l u m e s t o m i n i m i z e t h e r e q u i r e d q u a n t i t i e s o f e n z y m e s o l u t i o n s 9 3 X e n o n A r c L a m p ‘ R a p i d S c a n n i n g W a v e l e n g t h M o n o c h r o m a t o r ‘ H ‘ S a m p l e C e l l R e f e r e n c e C e l l _ - _ _ _ — — — — - _ . l P h o t o m u l t i p l i e r l T u b e s L 0 9 A m p l i f i e r I ‘ l l P D P 8 I C o m p u t e r 1 ‘ I V C o m p u t e r I n l e r t a c e a n d D i s p l a y F i g u r e “ . 1 . S c h e m a t i c d i a g r a m o f t h e s c a n n i n g s t o p p e d f l o w s p e c t r o m e t e r . 9 “ a n d i s c o n v e r t i b l e i n t o a s c a n n i n g s t o p p e d f l o w f l u o r e s — c e n c e s p e c t r o m e t e r . T h e d a t a c o l l e c t i o n i n t e r f a c e a n d s o f t w a r e a r e d e s c r i b e d b y C o o l e n , p p p l . ( 1 9 7 5 ) , P a p a d a k i s ( 1 9 7 “ ) , a n d C o o l e n ( 1 9 7 “ ) . B . M a t e r i a l s T h e s o l v e n t f o r a l l s o l u t i o n s i n t h i s s t u d y w a s 0 . 0 5 M N a 2 P 2 0 7 ( M a l l i n c k r o d t A n a l y t i c a l R e a g e n t ) m a d e w i t h q u a r t z d i s t i l l e d H 2 0 a n d t i t r a t e d t o p H 8 . 7 5 w i t h 6 N H C l ( M a l l i n c k r o d t A n a l y t i c a l R e a g e n t ) . H o r s e l i v e r a l c o h o l d e h y d r o g e n a s e ( 1 . 1 . 1 . 1 ) w a s p u r - c h a s e d f r o m t h e B o e h r i n g e r M a n n h e i m C o r p o r a t i o n . A c c o r d - i n g t o t h e l a b e l , t h e s a m p l e c o n t a i n e d a c r y s t a l l i z e d s u s p e n s i o n o f ~ 1 0 0 m g L A D H i n 0 . 0 2 M p h o s p h a t e b u f f e r , p H 7 . 0 , w i t h 1 0 % e t h a n o l . A s p r e p a r a t i o n f o r k i n e t i c s m e a s u r e m e n t s , t h e e n t i r e L A D H s a m p l e w a s c e n t r i f u g e d , t h e s u p e r n a t a n t w a s d i s c a r d e d , t h e p r e c i p i t a t e w a s d i s - s o l v e d i n 1 0 m 1 o f p H 8 . 7 5 b u f f e r , a n d t h i s 1 0 m l s o l u - t i o n w a s d i a l i z e d a g a i n s t t h r e e 2 0 0 0 m l p o r t i o n s o f p H 8 . 7 5 b u f f e r t o r e m o v e t h e e t h a n o l a n d o t h e r l o w m o l e c u l a r w e i g h t i m p u r i t i e s . T h e d i a l i z e d 1 0 m l L A D H s o l u t i o n w a s d i l u t e d t o 3 0 m l w i t h p H 8 . 7 5 b u f f e r t o m a k e t h e L A D H s t o c k s o l u t i o n , w h i c h w a s s t o r e d a t 0 ° C u n t i l u s e d i n t h e k i n e t i c s m e a s u r e m e n t s . N A D H ( N i c o t i n a m i d e a d e n i n e d i n u c l e o t i d e ) w a s p u r c h a s e d T M f r o m P . L . B i o c h e m i c a l s a s C h r o m a t o P u r e C o e n z y m e - l 9 5 ( D P N H ) ( D P N H i s a n o l d e r a b b r e v i a t i o n u s e d i n s t e a d o f N A D H . ) N D M A w a s p u r c h a s e d f r o m t h e A l d r i c h C h e m i c a l C o m p a n y a s A l d r i c h A n a l y z e d N , N - d i m e t h y l - “ - N i t r o s o a n i l i n e . N A D H a n d N D M A w e r e u s e d w i t h o u t f u r t h e r p u r i f i c a t i o n . T h e c o n c e n t r a t i o n s o f t h e L A D H , N A D H , a n d N D M A s t o c k s o l u t i o n s d e t e r m i n e d f r o m a b s o r b a n c e s m e a s u r e d w i t h a C a r y 1 7 s p e c t r o m e t e r a n d l i t e r a t u r e v a l u e s o f m o l a r a b — s o r p t i v i t i e s a r e g i v e n i n T a b l e “ . 1 . T h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f t h e L A D H s t o c k s o l u t i o n i n t h e r e d u c t i o n o f N D M A b y N A D H w a s d e t e r m i n e d t o b e 8 . 5 : 0 . 1 ( m o l e s N D M A / s e c e q u i v L A D H ) a t p H 8 . 7 5 , 2 “ ° C , u n d e r a s s a y c o n d i t i o n s , a n d w i t h s a t u r a t i o n o f L A D H b y N A D H a n d N D M A a n d w h e r e o n e e q u i v a l e n t o f L A D H i s d e f i n e d a s o n e m o l e o f a c t i v e s i t e s , o n t h e a s s u m p t i o n o f t w o a c t i v e s i t e s p e r m o l e c u l e o f L A D H ( B r a n d e n _ p _ p l , , 1 9 7 5 ) . D u n n a n d B e r n h a r d ( 1 9 7 1 ) r e p o r t a s p e c i f i c a c t i v i t y o f 2 “ i 2 ( m o l e s N D M A / s e c e q u i v . L A D H ) f o r t h e s a m e c o n d i t i o n s . C . R a p i d S c a n n i n n g x p e r i m e n t s f r o m 2 7 5 n m t o 6 1 “ n m T h e p u r p o s e o f t h e s e e x p e r i m e n t s w a s t o c h a r a c t e r i z e s p e c t r a l l y a n d k i n e t i c a l l y t h e s u b s t r a t e s , p r o d u c t s , a n d t r a n s i e n t i n t e r m e d i a t e s o f t h e L A D H - N A D H - N D M A r e a c t i o n o v e r a w i d e s p e c t r a l r a n g e . T h e w a v e l e n g t h r a n g e 2 7 5 n m - 6 1 “ n m w a s c h o s e n f o r t w o r e a s o n s : ( i ) T h i s i s t h e w i d e s t r a n g e t h a t c a n b e s c a n n e d i n a s i n g l e e x p e r i m e n t w i t h a d e q u a t e s i g n a l t o n o i s e r a t i o a c r o s s t h e s p e c t r u m 9 6 T a b l e “ . 1 M o l a r A b s o r p t i v i t i e s o f L A D H , N A D H , a n d N D M A a n d C o n c e n t r a t i o n s o f S t o c k S o l u t i o n s C o n c e n t r a t i o n o f - 3 - 1 - 1 e m a x / l o O . D . M c m A m a x / n m S t o c k S o l u t i o n / u M 3 5 . 3 a 2 8 0 3 1 . “ N A D H 6 . 2 2 b 3 u o 1 2 0 . 3 5 . 1 4 C “ n o 1 0 7 . a S u n d a n d T h e o r e l l ( 1 9 6 0 ) . b P . L . B i o c h e m i c a l s ( 1 9 7 3 ) . C D u n n a n d B e r n h a r d ( 1 9 7 1 ) . 9 7 w i t h t h e c u r r e n t s t o p p e d f l o w s p e c t r o m e t e r . ( i i ) T h e r a n g e 2 7 5 n m - 6 1 “ n m i n c l u d e s t h e w a v e l e n g t h s o f m a x i m u m a b s o r b a n c e f o r L A D H ( 2 8 0 n m ) , f o r t h e N A D H n i c o t i n a m i d e a b s o r b a n c e b a n d ( 3 “ 0 n m ) , a n d f o r N D M A ( “ “ 0 n m ) , a n d e x t e n d s b e y o n d 5 “ 0 n m , w h e r e a b s o r b a n c e c h a n g e s o b s e r v e d b y t w o o t h e r g r o u p s o f i n v e s t i g a t o r s ( S c h a c k a n d D u n n , 1 9 7 2 ; S u e l t e r p p p l . , 1 9 7 5 ) h a v e b e e n a t t r i b u t e d t o a t r a n s i e n t i n t e r m e d i a t e . T a b l e “ . 2 s u m m a r i z e s t h e i n i t i a l c o n d i t i o n s o f t h e r a p i d s c a n n i n g k i n e t i c s e x p e r i m e n t s . F o u r s e t s o f i n i t i a l c o n d i - t i o n s w e r e t e s t e d . T h e f i r s t d i g i t o f e a c h e x p e r i m e n t n u m b e r h a s p o s s i b l e v a l u e s o n e t h r o u g h f o u r , i n d i c a t i n g w h i c h o f t h e f o u r s e t s o f i n i t i a l c o n d i t i o n s w a s e m p l o y e d . T h e s e c o n d d i g i t r e p r e s e n t s r e p l i c a t e s f o r a p a r t i c u l a r s e t o f i n i t i a l c o n d i t i o n s . T a b l e “ . 2 a l s o i n t r o d u c e s t h e a b b r e v i a t i o n s y s t e m u s e d i n t h i s c h a p t e r . L A D H i s r e p r e s e n t e d b y E , N A D H b y N , a n d N D M A b y S . T h e a b b r e v i a — t i o n f o r a n e x p e r i m e n t g i v e s t h e s y m b o l f o r e a c h s p e c i e s s u b s c r i p t e d w i t h i t s i n i t i a l m i c r o m o l a r i t y i n t h e e x p e r i - m e n t . T h e i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n o f L A D H i s r e p o r t e d a s m i c r o m o l a r i t y o f a c t i v e s i t e s ( m i c r o n o r m a l i t y ) , o n t h e a s s u m p t i o n o f t w o a c t i v e s i t e s p e r m o l e c u l e o f L A D H ( B r a n d e n , e _ t _ p l ” 1 9 7 5 ) . I n a s c a n n i n g s t o p p e d f l o w e x p e r i m e n t , t h e r e a c t i o n i s i n i t i a t e d b y m i x i n g s o l u t i o n s f r o m t w o p u s h i n g s y r i n g e s . T h u s , i n e a c h e x p e r i m e n t , t w o o f t h e t h r e e r e a c t a n t s L A D H , N A D H , a n d N D M A m u s t b e p r e m i x e d i n o n e o f t h e a r r e t b c u 1 1 m e 6 6 6 n 6 u p N S - N f o . A M M D u N l - l . . . , o “ u “ u S m 1 1 1 1 n 3 3 3 3 , H D A N - D N [ M U O “ 0 0 - N ] . . , H 5 3 5 D 1 1 1 0 , 5 , H D A L - E . s t n e m i r e p A N [ a n u / O 9 9 9 ] 3 3 6 2 H . . . . D 7 7 8 7 A L [ 1 x s E c E E ‘ ( ( ( — ) ) ) o g n n r e h h h _ t t t “ t x w w w i h i i i d E ( 1 i i 0 6 M w r - m n ) ) ) S < S ) * + + " N N h N ( ( ( ( n 5 o 7 2 ) i e C t C C R C C C m a R R . R R a , R e . c . V . . N h i R Q B F E 3 t f A A A F A f t A A L I A e i O O V A O l . i F ( V V H n V G G G n O 1 . G A O A V G o n e d I s n o i t i d n h ' U u , , n 2 3 3 o 1 1 1 u . l o 3 l i 5 3 C 0 s t a 0 0 " . . l i = 5 5 a v 1 1 1 o . 6 i e “ " ” " t r 9 6 o o i n I b 3 . 3 : b . 8 . ' A T 1 7 , a E F “ . t 2 n . “ e r m e i : 1 b e r m . . e u 1 1 . 1 . 1 , “ l b p N a x T E 3 . 1 C V L A B D . R C 3 3 . 3 G U L A B G . R C r : . 4 9 E 3 a N o r m a l i t y , o r ( A c t i v e S i t e C o n c e n t r a t i o n ) u s i n g 2 a c t i v e s i t e s / m o l e e n z y m e . 9 9 p u s h i n g s y r i n g e s . E x p e r i m e n t s 1 . 1 t h r o u g h “ . 2 c o v e r t h r e e s e t s o f i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s . E x p e r i m e n t 2 . 1 r e p e a t s t h e i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s o f E x p e r i m e n t s 1 . 1 a n d 1 . 2 , b u t w i t h N A D H a n d N D M A p r e m i x e d i n o n e p u s h i n g s y r i n g e i n s t e a d o f L A D H a n d N D M A . T h i s w a s d o n e i n o r d e r t o d e t e r m i n e i f L A D H a n d N D M A r e a c t w i t h o u t N A D H i n a w a y t h a t m e a s u r a b l y a l t e r s t h e c o u r s e o f t h e r e a c t i o n a f t e r N A D H i s a d d e d . E x p e r i m e n t s 3 . 1 t h r o u g h “ . 2 h a v e t h e s a m e m i x i n g o r d e r a s E x p e r i m e n t 2 . 1 . F o r u s e a s p r o p o s e d s t a t i c s p e c t r a o f s u s p e c t e d a b - s o r b e r s i n t h e p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s t h a t f o l l o w s , t h e i n d i v i d u a l s t a t i c s p e c t r a o f L A D H ( 7 . 3 9 u N ) , N A D H ( 1 8 . 6 p M ) , a n d N D M A ( 5 . 3 6 p M ) w e r e m e a s u r e d i n t h e s t o p p e d f l o w s p e c t r o m e t e r w i t h t h e s a m e i n s t r u m e n t a l s e t t i n g s a s f o r t h e s c a n n i n g k i n e t i c s e x p e r i m e n t s . E a c h s t a t i c s p e c t r u m i s t h e a v e r a g e o f 2 5 6 s c a n s . A l l o f t h e s c a n n i n g e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d w i t h a s c a n n i n g r a t e o f 3 7 . 5 s c a n s / s e c ( 7 5 s c a n s / s e c w i t h t h e b a c k s c a n d i s c a r d e d ) , 5 “ w a v e l e n g t h c h a n n e l s p e r s c a n , a n d 5 s a m p l e s p e r p o i n t . T h e n u m b e r o f c o n s e c u t i v e s p e c t r a a r e l i s t e d f o r e a c h k i n e t i c s e x p e r i m e n t i n T a b l e “ . 2 . T h e t e m p e r a t u r e i n e a c h e x p e r i m e n t w a s a s s u m e d t o b e t h e a m b i e n t t e m p e r a t u r e o f t h e l a b o r a t o r y , w h i c h w a s 2 3 - 2 “ ° C o v e r t h e c o u r s e o f t h e e x p e r i m e n t s . W i t h a g i v e n v o l t a g e a p p l i e d t o t h e p h o t o m u l t i p l i e r t u b e s , t h e o v e r a l l r e s p o n s e c u r v e o f t h e s t o p p e d f l o w S p e c t r o m e t e r h a s a h i g h e r s i g n a l i n t h e 3 0 0 n m - 6 0 0 n m 1 0 0 r a n g e t h a n b e l o w 3 0 0 n m . T h e r e f o r e , t h e o r d e r t o f l a t t e n t h e r e s p o n s e c u r v e s o t h a t t h e 2 7 5 n m - 6 1 “ n m r a n g e c o u l d b e s c a n n e d i n a s i n g l e e x p e r i m e n t , a l i q u i d o p t i c a l f i l t e r s o l u t i o n o f 0 . 0 9 0 M 0 0 8 0 ” a n d 0 . 0 7 6 M N i S O u i n a “ . 2 c m p a t h l e n g t h q u a r t z c e l l w a s i n s e r t e d b e t w e e n t h e X e n o n l a m p a n d t h e e n t r a n c e s l i t o f t h e m o n o c h r o m a t o r . S o l u - t i o n s o f C 0 8 0 “ a n d N 1 8 0 “ h a v e b r o a d a b s o r b a n c e b a n d s c e n t e r e d a t 5 1 0 n m a n d 3 9 0 n m , r e s p e c t i v e l y , s o t h a t t h e f i l t e r s o l u t i o n r e d u c e s t h e s i g n a l i n t h e 3 0 0 n m - 6 0 0 n m r a n g e t o m a t c h m o r e c l o s e l y t h e s i g n a l b e l o w 3 0 0 n m . D . C a l i b r a t i o n s a n d C o r r e c t i o n s T h e w a v e l e n g t h o f e a c h w a v e l e n g t h c h a n n e l w a s e s t i - m a t e d b y f i t t i n g o b s e r v e d a b s o r b a n c e p e a k s o f h o l m i u m o x i d e a n d d i d y m i u m o x i d e g l a s s e s t o a n e q u a t i o n w h i c h i s a p p r o p r i a t e f o r t h e p a r t i c u l a r s c a n n i n g m o n o c h r o m a t o r a n d t h e d a t a c o l l e c t i o n s y s t e m u s e d . T h e d e t a i l s o f t h i s p r o c e d u r e a r e g i v e n i n A p p e n d i x E . F i g u r e “ . 2 s h o w s t h e w a v e l e n g t h c u r v e o b t a i n e d f r o m t h e c a l i b r a t i o n p r o c e d u r e , a n d T a b l e “ . 3 l i s t s t h e e s t i m a t e d w a v e l e n g t h s o f e a c h c h a n n e l . A b s o r b a n c e s a n d t i m e s f o r e a c h e x p e r i m e n t w e r e e s t i - m a t e d b y t h e p r o g r a m A B C A L f r o m n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r c a l i b r a t i o n d a t a a n d t h e s o f t w a r e c o l l e c t i o n p a r a m e t e r s f o r e a c h e x p e r i m e n t . A p p e n d i x E d e s c r i b e s t h e s e c a l i - b r a t i o n s a n d g i v e s i n s t r u c t i o n s f o r u s i n g A B C A L . T a b l e “ . 3 . 1 0 1 W a v e l e n g t h C a l i b r a t i o n o f t h e 2 7 5 n m — 6 1 “ n m E x p e r i m e n t s . m = W a v e 1 e n g t h m = W a v e 1 e n g t h C h a n n e l l / n m C h a n n e l A / n m l 2 7 “ . 6 2 8 3 6 7 . 9 2 2 7 5 . 2 2 9 3 7 6 . 7 3 2 7 5 . 9 3 0 3 8 “ . 6 “ 2 7 6 . 8 3 1 3 9 3 . 8 5 2 7 7 . 9 3 2 “ 0 3 . “ 6 2 7 9 . 2 3 3 “ 1 3 . 6 7 2 8 0 . 0 3 “ “ 2 “ . 3 8 2 8 2 . 3 3 5 “ 3 5 . 5 9 2 8 “ . 1 3 6 “ “ 7 . 2 1 0 2 8 6 . 1 3 7 “ 5 9 . “ 1 1 2 8 8 . 3 3 8 “ 7 2 . 0 1 2 2 9 0 . 8 3 9 “ 8 “ . 9 1 3 2 9 3 . “ “ 0 “ 9 8 . 0 1 “ 2 9 6 . 3 “ 1 5 1 1 . 3 1 5 2 9 9 . “ “ 2 5 2 “ . 6 1 6 3 0 2 . 8 “ 3 5 3 7 . 6 1 7 3 0 6 . “ “ “ 5 5 0 . “ 1 8 3 1 0 . 3 “ 5 5 6 2 . 6 1 9 3 1 “ . “ “ 6 5 7 “ . O 2 0 3 1 8 . 9 “ 7 5 8 “ . “ 2 1 3 2 3 . 7 “ 8 5 9 3 . 7 2 2 8 2 8 . 8 “ 9 6 0 1 . “ 2 3 3 3 “ . 3 5 0 6 0 7 . 6 2 “ 3 “ 0 . 2 5 1 6 1 2 . 1 2 5 3 “ 6 . 5 5 2 6 1 “ . 6 2 6 3 5 3 . 2 5 3 6 1 5 . 1 3 6 0 . 3 5 “ 6 1 3 . 7 N . 4 1 0 2 6 . 5 0 r 6 0 0 5 5 0 5 0 0 M m ) 4 5 0 4 0 0 3 5 0 3 0 0 2 5 0 _ W a v e l e n g t h C h a n n e l F i g u r e “ . 2 . W a v e l e n g t h c a l i b r a t i o n f o r t h e 2 7 5 n m - 6 1 “ n m e x p e r i m e n t s . P o i n t s a r e h o l m i u m o x i d e a n d d i d y m i u m o x i d e c a l i b r a t i o n p e a k s . 1 0 3 T h e a b s o r b a n c e — w a v e l e n g t h — L i m e d a t a w e r e c o r r e c t e d f o r t w o s o u r c e s o f s y s t e m a t i c e x p e r i m e n t a l e r r o r . T h e f i r s t s o u r c e o f s y s t e m a t i c e r r o r i s t h e f i n i t e s c a n s p e e d o f t h e m o n o c h r o m a t o r . R e c a l l f r o m C h a p t e r 2 t h a t t h e m o d e l f o r t h e a b s o r b a n c e m a t r i x A i n p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s a s s u m e s t h a t e a c h c o n s e c u t i v e s p e c t r u m i s m e a — s u r e d i n s t a n t a n e o u s l y , w h e r e a s , i n t h e s e e x p e r i m e n t s , e a c h s c a n r e q u i r e s 0 . 0 1 3 3 s e c o n d s . T h i s d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e e x p e r i m e n t a n d t h e m o d e l i s i m p o r t a n t i n t h e f i r s t g r o u p o f s p e c t r a , w h e r e t h e h a l f - t i m e s o f a b s o r b a n c e c h a n g e s m a y h a v e m a g n i t u d e s c o m p a r a b l e t o t h e s c a n n i n g p e r i o d . T h e d a t a w e r e c o r r e c t e d f o r t h e f i n i t e s c a n s p e e d e r r o r b y i n t e r p o l a t i n g t h e a b s o r b a n c e s s o t h a t e a c h w a v e l e n g t h c h a n n e l i n a c o r r e c t e d s p e c t r u m c o r r e s p o n d s i n t i m e t o t h e l a s t w a v e l e n g t h c h a n n e l o f t h e s p e c t r u m . I f A 1 3 i s t h e a b s o r b a n c e m e a s u r e d a t w a v e l e n g t h c h a n n e l 1 i n t h e s p e c t r u m J a t t i m e t i j ’ t h e n t h e a b s o r b a n c e c o r r e c t e d f o r f i n i t e s c a n s p e e d i s g i v e n b y ( A i j + l - A 1 J ) ( t p i f t i j ) A i j ( c o r r e c t e d ) = . ( t i j + l - t i j ) i = 1 , 2 , . . . , p J = 1 , 2 , . . . ( N — 1 ) w h e r e t h e p ' t h w a v e l e n g t h c h a n n e l i s t h e l a s t c h a n n e l i n t h e s p e c t r u m ( p = 5 “ ) . T h e N ' t h ( o r l a s t ) c o n s e c u t i v e I l 1 0 “ s p e c t r u m i s n o t c o r r e c t e d f o r f i n i t e s c a n s p e e d . T h e s e c o n d s o u r c e o f s y s t e m a t i c e r r o r i s l i g h t o f w a v e l e n g t h a b o v e N 3 2 0 n m t h a t i s s c a t t e r e d b y t h e m o n o - c h r o m a t o r a n d a r t i f i c i a l l y d e p r e s s e s a b s o r b a n c e s m e a s u r e d b e l o w 3 0 0 n m . A d d i t i o n a l k i n e t i c s e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d t o o b t a i n t h e d a t a n e c e s s a r y t o c o r r e c t a b - s o r b a n c e s f o r s c a t t e r e d l i g h t . A n e x p e r i m e n t w a s p e r - f o r m e d w i t h t h e s a m e i n i t i a l c o n d i t i o n s a s e a c h e x p e r i m e n t i n T a b l e “ . 2 , b u t w i t h a C o r n i n g C 8 0 5 “ C o l o r F i l t e r i n t h e s a m p l e p a t h . T h e C 8 0 5 “ f i l t e r i s a c u t o f f f i l t e r o f a b s o r b a n c e g r e a t e r t h a n 2 f o r w a v e l e n g t h s b e l o w 3 0 0 n m . T h e a b s o r b a n c e c o r r e c t e d f o r s c a t t e r e d l i g h t i s A 1 : , A t = 1 o g 1 0 [ ( 1 - 1 0 ‘ A f ) / ( 1 o ’ A — 1 0 ‘ A 0 ) ] ( “ . 1 ) w h e r e A i s t h e m e a s u r e d a b s o r b a n c e , A i s t h e t r u e a b - t s o r b a n c e , A c i s t h e a b s o r b a n c e m e a s u r e d a t t h e w a v e l e n g t h a n d t i m e c o r r e s p o n d i n g t o A b u t w i t h t h e C 8 0 5 “ f i l t e r i n t h e s a m p l e p a t h , a n d A f i s t h e a b s o r b a n c e o f t h e 0 8 0 5 “ f i l t e r a t t h e s a m e w a v e l e n g t h a s A a n d A c . T h e a b s o r b a n c e s a r e r e l a t e d t o i n t e n s i t i e s b y t h e e q u a t i o n s A = l o g l o [ I o / ( I t + I S ) ] A _ t ' 1 ° 8 1 0 ( I o / I t ) : p I o g l O E I O / ( I t l o - A f + 1 8 ) ] . 1 0 5 w h e r e I 0 i s t h e l i g h t i n t e n s i t y f r o m t h e r e f e r e n c e c e l l , I t i s t h e t r u e i n t e n s i t y f r o m t h e s a m p l e c e l l ( w i t h o u t s c a t t e r e d l i g h t ) , a n d I s i s t h e s c a t t e r e d l i g h t i n t e n s i t y f r o m t h e s a m p l e c e l l . A b s o r b a n c e s f o r w a v e l e n g t h c h a n n e l s 1 - 1 5 ( 2 7 5 n m - 3 0 0 n m ) w e r e c o r r e c t e d f o r s c a t t e r e d l i g h t w i t h E q u a t i o n ( “ . 1 ) . T h e c o r r e c t i o n i n c r e a s e d t h e s e a b s o r b a n c e s b y 0 . 1 - O . 2 o p t i c a l d e n s i t y u n i t s b u t d i d n o t c h a n g e t h e q u a l i t a t i v e s h a p e o f t h e a b s o r b a n c e - t i m e p r o — f i l e a t e a c h w a v e l e n g t h c h a n n e l . E . A b s o r b a n c e - W a v e l e n g t h - T i m e S u r f a c e s I n E x p e r i m e n t s 1 . 1 - “ . 2 , a b s o r b a n c e s f o r w a v e l e n g t h c h a n n e l s “ 8 t h r o u g h 5 “ ( 5 9 “ n m - 6 1 “ n m ) v a r i e d r a n d o m l y a b o u t z e r o . T h e r e f o r e , w e o m i t t h e s e c h a n n e l s f r o m t h e d i s c u s s i o n o f E x p e r i m e n t s 1 . 1 - “ . 2 i n t h e r e m a i n d e r o f t h i s c h a p t e r . F i g u r e “ . 3 s h o w s t w o v i e w s o f t h e c o r r e c t e d a b s o l u t e a b s o r b a n c e s u r f a c e A f o r w a v e l e n g t h c h a n n e l s 1 t h r o u g h “ 7 ( 2 7 5 n m - 5 8 “ n m ) i n E x p e r i m e n t 1 . 1 . N o t e t h a t t h e 6 1 c o n s e c u t i v e s p e c t r a a r e e q u a l l y s p a c e d i n F i g u r e “ . 3 a n d t h a t t h e s c a l e f o r t h e t i m e a x i s i s g e o m e t r i c i n t i m e . T h i s i s b e c a u s e t h e d a t a c o l l e c t i o n s o f t w a r e a v e r a g e s a n u m b e r o f m e a s u r e d s c a n s a n d s t o r e s t h e a v e r a g e a s a s i n g l e c o n s e c u t i v e s p e c t r u m . T h e n u m b e r o f m e a s u r e d s c a n s a v e r a g e d i n t o e a c h s t o r e d s p e c t r u m i s i n c r e a s e d w i t h t i m e d u r i n g t h e r e a c t i o n , s o t h a t , a t e a r l y t i m e s w h e r e f a s t 1 0 6 F i g u r e “ . 3 . E x p e r i m e n t a l a b s o l u t e a b s o r b a n c e s u r f a c e 5 , E x p e r i m e n t 1 . 1 , E 7 . 3 9 N 1 5 . 0 8 1 3 . u , ( N ) w i t h ( E + S ) . A . F r o n t v i e w . B . R e a r v i e w . I : 3 ‘ 0 " 2 fil'lllllg: it I , /; - ’ ‘ . fl 3 , , / ‘ ” . ‘ / 1 ' / / . 4 ’ x r ' O O O O O O O O O O O O O O O O O v " " . . 1 0 8 c h a n g e s o c c u r i n t h e r e a c t i o n , t h e r e i s l i t t l e o r n o a v e r a g i n g , w h i l e a t l a t e t i m e s w h e n c h a n g e s a r e s l o w , t h e r e a r e m a n y m e a s u r e d s c a n s p e r s t o r e d s p e c t r u m . ( S e e C o o l e n _ p _ l . ( 1 9 7 5 ) f o r a d e t a i l e d d e s c r i p t i o n o f t h i s a v e r a g i n g s c h e m e . ) T h e l a s t s p e c t r u m o f a g i v e n e x p e r i - m e n t i s c a l l e d t h e i n f i n i t y s p e c t r u m . T h e o p e r a t o r m a n u a l l y t r i g g e r s t h e m e a s u r e m e n t o f t h e i n f i n i t y s p e c t r u m w h e n a b s o r b a n c e m o n i t o r e d o n a s t o r a g e o s c i l l o s c o p e h a s s t o p p e d c h a n g i n g w i t h t i m e . I n E x p e r i m e n t s 1 . 1 - “ . 2 , t h e t i m e e l a p s e d b e t w e e n t h e ( N — l ) ' t h s p e c t r u m a n d t h e i n f i n i t y s p e c t r u m i s a t l e a s t 3 0 0 s e c o n d s . F i g u r e “ . 3 i s d o m i n a t e d b y l a r g e c o n s t a n t a b s o r b a n c e s t h a t o b s c u r e t h e p r o g r e s s o f t h e r e a c t i o n . T h e d y n a m i c s o f a b s o r b a n c e c h a n g i n g w i t h t i m e a t d i f f e r e n t w a v e l e n g t h s a r e b e t t e r i l l u s t r a t e d f o r E x p e r i m e n t 1 . 1 b y t h e d i f f e r - e n c e s u r f a c e ( p e g ) , t w o v i e w s o f w h i c h a r e s h o w n i n F i g u r e s “ . “ a n d “ . 5 . D a t a p l o t t e d i n F i g u r e “ . 3 a r e p l o t t e d i n F i g u r e s “ . “ a n d “ . 5 a f t e r f i r s t s u b t r a c t i n g t h e a v e r a g e o f a l l 6 1 c o n s e c u t i v e s p e c t r a f r o m e a c h s p e c t r u m . N o t e t h a t , i f a b s o r b a n c e d i d n o t c h a n g e w i t h t i m e d u r i n g a n e x p e r i m e n t , t h e d i f f e r e n c e s u r f a c e ( fi f g ) w o u l d b e a h o r i z o n t a l p l a n e . F i g u r e s “ . 6 , “ . 7 , a n d “ . 8 s h o w t h e d i f f e r e n c e s u r f a c e s ( 5 : 5 ) f o r E x p e r i m e n t s 2 . 1 , 3 . 1 , a n d “ . 1 , r e s p e c t i v e l y . E a c h o f t h e r e p l i c a t e e x p e r i m e n t s 1 . 2 , 3 . 2 , 3 . 3 , a n d “ . 2 , n o t s h o w n h e r e , h a s a d i f f e r e n c e s u r - f a c e s i m i l a r t o t h a t f o r t h e f i r s t e x p e r i m e n t w i t h t h e c o r r e s p o n d i n g i n i t i a l c o n d i t i o n s . 1 0 9 Q S O r - 0 2 5 - A B S O R B A N C E c — i / - 3 0 0 0 * - A - o . I 0 L - ” 2 2 . 1 ' { 4 " g m ” \ ‘ fi “ \ “ w é / a 5 3 0 F i g u r e “ . “ . E x p e r i m e n t a l d i f f e r e n c e s u r f a c e ( 5 7 3 ) , E x p e r i m e n t 1 . 1 , ( N ) w i t h E 7 . 3 9 N 1 5 . O s l 3 . “ ’ ( E + S ) , f r o n t v i e w . E C N A D 3 6 5 8 A A - A 1 1 0 0 2 $ 0 . 0 0 F i g u r e “ . 5 . E x p e r i m e n t a l d i f f e r e n c e s u r f a c e ( 5 5 ; ) , E x - p e r i m e n t 1 . 1 , E 7 . 3 9 N 1 5 . 0 8 1 3 . “ ’ ( N ) w i t h ( E + S ) , R e a r v i e w . 1 1 1 F i g u r e “ . 6 . E x p e r i m e n t a l d i f f e r e n c e s u r f a c e ( 5 5 E ) , E x - p e r i m e n t 2 . 1 , E ( N + S ) w i t h 7 . 3 9 N 1 5 . O s l 3 . “ ’ ( E ) , R e a r v i e w . ll “ “ ” . ‘ t 2 - - n “ ’ , ‘ r 3 t . ? é w . 1 3 s . O 0 $ h O $ 9 g b - % . v ’ w o . , . a . s « o " ' A } '- . - ‘ v . q . e ‘ ; 9 P 0 ‘ c . ~ . 9 o * . ? 1 5 w 4 8 4 O o . § e " 9 0 ! 3 « ~ - r « o I ’ 0 é o . e - ¢ / z 9 fi ' r “ M w o l o l 9 s ’ A - 5 o ” ' n l 0 O : A “ w " . ~ 4 3 g h 7 . 0 o z 7 - ‘ O . % a ‘ ’ v » o c . " ’ ~ W / o h " \ : U w ” o ’ » ’ l \ & . o ’ w v 9 a v ‘ e ‘ \ ' o a ; 3 ‘ v " . . a . 4 . ‘ 9 . g ‘ 9 4 ) . :° o ° . ’ ~ ’ , ” ’ : € = ; : ~h " ; $ \ ‘ o W 0 . § ‘ \ . / 7 , y , s ' ; e ’ , : - 0 $ 0 . 2 ‘ ? e 4 ’ . : . 1 “ y ’ . ’ 0 9 a 9 . ‘ 0 fi . 3 o ‘ ’ ~ . / x M . é - o . g ' a . . W : n ‘ ' . 0 . . o “ - % . . ( . ” V : 0 Q 4 ’ ‘ . . ‘ ’ 3 ’ z T . . . . 5 fi o e 3 a 3 T “ 9 . é " \ 4 ; v ‘ c v . a . “ “ ‘ w \ w e v “ 0 9 t ‘ / ‘ ' v o ‘ . Q o “ “ a ‘ " v : w ‘ ‘ w w o ‘ \ ? u \ - ‘ . ; $ \ v m . ‘ . \ \ . . o } ’ : “ o ‘ ’ ‘ . ’ h . : t “ D ¢ t ‘ o ‘ v ; I . 9 ‘ T . e e ‘ J ’ ! \ “ ; . ‘ “ ‘ » \ 0 . " Q " v a ‘ “ ‘ I . ‘ » . \ 4 ' " m 9 0 ‘ . . ‘ A . ‘ 0 3 " O . 0 ’ “ o o . . “ V 9 W . ! ' M N ’ “ “ 2 5 6 4 0 ; : ” ? M f g ‘ 9 0 ’ 6 o o o “ “ . 9 ” ’ (l ‘ 1 1 2 F i g u r e “ 7 . . E x p p p r i m e n t a l d i f f e r e n c e s u r f a e r C - — m e n t 3 . 1 , E 1 8 6 N S e ( A 5 ) , E x - ( E ) , R e a r v i e w . . 1 5 . 0 1 3 . ” , ( N + S ) W i t h F i g u r e “ . 8 . 1 1 3 " ? / “ e . . . ' o ’ ' V / J " ’ A ‘ ~ ‘ f f f v I I . \ ‘ ” 4 ’ % ¢ M 3 ” W § $ $ ‘ ” ‘ ‘ I o . 0 ” e ’ : ‘ m ‘ ‘ ‘ ‘ . « 3 3 3 " ‘ $ 3 . 0 o 3 3 3 3 3 % fl ¥ 3 £ 3 5 $ ’ " v ~ o " - - ’ f o e ! " ' 6 4 ’ ¢ ' 0 O , ’ 9 : “ ' é g g t . a ” “ * é c c fi d O ’ 2 ' : . fi . E x p e r i m e n t a l d i f f e r e n c e s u r f a c e ( p e p ) , E x - p e r i m e n t “ . 1 , E ( N + S ) w i t h 7 . 3 9 N 6 . 0 3 1 3 . “ ’ ( E ) , R e a r v i e w . 1 1 “ F . W e i g h t s f o r P r i n c i p a l C o m p o n e n t A n a l y s i s N o t e i n F i g u r e s “ . “ - “ . 8 t h a t e a c h e x p e r i m e n t h a s c o n s i d e r a b l y m o r e r a n d o m n o i s e a t l o w w a v e l e n g t h s a n d e a r l y t i m e s t h a n a t h i g h w a v e l e n g t h s a n d l a t e t i m e s . R e c a l l f r o m C h a p t e r 2 t h a t , t o a c c o u n t f o r t h e i m b a l a n c e o f s i g n a l / n o i s e i n p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s , w e d e v i s e d a w e i g h t i n g s c h e m e w h i c h a s s u m e s t h a t 0 1 3 ’ t h e v a r i a n c e o f t h e i , j ' t h m e a s u r e m e n t e r r o r , i s g i v e n b y 1 3 = X 1 3 w h e r e x 1 a n d z J d e s c r i b e t h e c h a n g e o f n o i s e w i t h w a v e - l e n g t h a n d t i m e , r e s p e c t i v e l y . T h e c o n t r i b u t i o n o f X 1 i n E x p e r i m e n t s 1 . 1 - “ . 2 w a s e s t i m a t e d f r o m t h e f o l l o w i n g s e p a r a t e s e r i e s o f e x p e r i - m e n t s . I n e a c h e x p e r i m e n t , 6 3 c o n s e c u t i v e s c a n s w e r e c o l l e c t e d w i t h b u f f e r s o l u t i o n i n b o t h t h e s a m p l e a n d r e f e r e n c e c e l l s , a n d w i t h a n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r i n t h e s a m p l e p a t h t o g i v e a n o m i n a l a b s o r b a n c e l e v e l . T h e v a r i a n c e X w a s e s t i m a t e d f r o m s c a t t e r a b o u t t h e m e a n i a b s o r b a n c e f o r e a c h w a v e l e n g t h c h a n n e l w i t h t h e e q u a t i o n 6 3 = ( 1 / 6 2 ) ( A — K ) 2 x i k z l i k i T h e v a r i a t i o n o f e x p e r i m e n t a l n o i s e w i t h w a v e l e n g t h w a s 1 1 5 d e t e r m i n e d f o r t h e f o l l o w i n g n o m i n a l a b s o r b a n c e l e v e l s : 0 . 0 , 0 . 3 , 0 . 7 , 1 . 0 , a n d 1 . 3 o p t i c a l d e n s i t y u n i t s . F i g - u r e “ . 9 s h o w s x i / 2 v e r s u s w a v e l e n g t h c h a n n e l 1 a t t h r e e a b s o r b a n c e l e v e l s c o v e r i n g t h i s r a n g e o f a b s o r b a n c e s . F o r a g i v e n a b s o r b a n c e l e v e l , t h e h i g h e s t e r r o r v a r i a n c e 1 / 2 1 a n d “ 1 c o r r e s p o n d r e s p e c t i v e l y t o t h e N 1 8 0 “ a n d C 0 3 0 “ o c c u r s a t c h a n n e l o n e . T h e p e a k s o f x a t c h a n n e l s 3 2 a b s o r b a n c e s b a n d s a t 3 9 0 n m a n d 5 1 0 n m , w h i c h r e d u c e t h e s i g n a l a n d t h u s i n c r e a s e t h e a b s o r b a n c e n o i s e a t t h e s e w a v e l e n g t h s . 1 / 2 1 w a v e l e n g t h c h a n n e l 1 . A l t h o u g h t h e w e i g h t i n g s c h e m e d o e s N o t e t h a t x v a r i e s w i t h a b s o r b a n c e a s w e l l a s w i t h n o t h a v e e n o u g h d e g r e e s o f f r e e d o m e x p l i c i t l y t o a c c o u n t f o r t h e v a r i a t i o n o f n o i s e w i t h t h r e e i n d e p e n d e n t v a r i - a b l e s ( w a v e l e n g t h , t i m e , a n d a b s o r b a n c e ) , w e c a n a p p r o x i - m a t e l y i n c l u d e t h e v a r i a t i o n w i t h a b s o r b a n c e b y c h o o s i n g 1 / 2 1 c l o s e s t t o t h e m e a n a b s o r b a n c e m e a s u r e d a t c h a n n e l 1 f o r x t h e v a l u e f o r t h e n o m i n a l a b s o r b a n c e l e v e l i n t h e k i n e t i c s e x p e r i m e n t . W i t h t h i s a p p r o x i m a t i o n , L i , t h e w a v e l e n g t h w e i g h t f o r t h e i ' t h w a v e l e n g t h c h a n n e l , w a s a s s i g n e d b y t h e e q u a t i o n 2 _ L 1 = a 1 / x i l / 2 ( 2 . 2 8 ) w i t h t h e a r b i t r a r y c o n s t a n t a s e t t o u n i t y ( s e e C h a p t e r 2 ) . T a b l e “ . “ l i s t s t h e w a v e l e n g t h w e i g h t s f o r E x p e r i - m e n t 1 . 1 . 1 1 6 0 . 0 2 0 r 0 . 0 1 5 E D 0 U C D . . D 8 0 . 0 1 0 . ‘ 6 < S > . < . 0 . 0 0 5 0 . 0 0 0 4 1 J 1 i J l 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 W a v e l e n g t h C h a n n e l F i g u r e “ . 9 . x i / 2 ( s t a n d a r d d e v i a t i o n o f r a n d o m e r r o r s ) v e r s u s w a v e l e n g t h c h a n n e l f o r E x p e r i m e n t s 1 . 1 - “ . 2 . A . 1 . 3 O . D . n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r . B . 0 . 7 O . D . n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r . C . B u f f e r v e r s u s b u f f e r . 1 1 7 T a b l e “ . “ . W a v e l e n g t h W e i g h t s , L i , f o r E x p e r i m e n t 1 . 1 . W a v e l e n g t h W a v e l e n g t h C h a n n e l 1 L i C h a n n e l 1 L i 1 6 5 . 5 2 5 6 2 0 . 1 2 7 2 . 0 2 6 5 8 1 . 7 3 7 9 . 3 2 7 6 3 8 . 1 “ 6 3 . 8 2 8 “ 7 5 . 0 5 8 8 . “ 2 9 3 9 2 . 8 6 9 0 . 1 3 0 2 6 5 . 3 7 9 “ . 0 3 1 2 2 8 . 1 8 9 3 . 1 3 2 2 7 5 . 6 9 1 0 7 . 6 3 3 “ 6 7 . 9 1 0 1 2 5 . 1 3 “ 5 “ 7 . 9 1 1 1 5 8 . 2 3 5 7 0 “ . “ 1 2 l “ l . 1 3 6 7 5 0 . “ 1 3 1 9 2 . “ 3 7 7 0 2 . 1 1 “ 3 1 1 . 7 3 8 6 9 8 . 8 1 5 3 5 7 . 0 3 9 “ 8 8 . 9 1 6 3 7 5 . 0 “ 0 “ 5 8 . 5 1 7 3 2 “ . 1 “ 1 3 5 9 . 1 1 8 3 8 “ . 0 “ 2 3 1 6 . 9 1 9 3 8 6 . 5 “ 3 6 3 9 . 5 2 0 “ “ 5 . 2 “ “ 9 8 9 . 3 2 1 5 2 1 . “ “ 5 9 1 7 . 0 2 2 “ 6 8 . 0 “ 6 9 0 3 . “ 2 3 “ 8 2 . 7 “ 7 1 1 3 2 . “ 2 “ 5 5 5 . 2 1 1 8 T h e n u m b e r o f m e a s u r e d s c a n s a v e r a g e d a n d s t o r e d a s t h e J ' t h c o n s e c u t i v e s p e c t r u m o f t h e e x p e r i m e n t i s g ( n J " l ) , w h e r e g i s t h e g r o u p i n g f a c t o r a n d n J i s t h e g r o u p n u m b e r o f s p e c t r u m 3 . S e e C o o l e n , p p r 1 . ( 1 9 7 5 ) f o r a d e t a i l e d e x p l a n a t i o n o f t h e s e t e r m s . ) [ I n E x p e r i m e n t s 1 . 1 - 3 . 3 , g = 2 , a n d f o r E x p e r i m e n t s “ . 1 = “ . 2 , g = 3 . ] T h e c o n - t r i b u t i o n o f Z j t o t h e e r r o r v a r i a n c e s h o u l d b e g i v e n b y Z j = g ( 1 - n J ) . H o w e v e r , t h e a b s o r b a n c e d a t a a r e s t o r e d i n t h e P D P B I c o m p u t e r a s f o u r o c t a l b i t w o r d s , a n d t h e d i g i t a l r e s o l u - t i o n o f a b s o r b a n c e s i n E x p e r i m e n t s 1 . 1 - “ . 2 i s m i 0 . 0 0 1 o p t i c a l d e n s i t y u n i t s . T o t a k e a c c o u n t o f t h i s d i g i t a l r e s o l u t i o n l i m i t , z J w a s a s s i g n e d a s s h o w n i n T a b l e “ . 5 , w h e r e i n c r e a s i n g t h e s p e c t r a l a v e r a g i n g b e y o n d 8 o r 9 ( m e a s u r e d s c a n s / s t o r e d s p e c t r u m ) w a s a s s u m e d t o g i v e n o f u r t h e r r e d u c t i o n o f 2 3 ° T h e t i m e w e i g h t s , T 3 , l i s t e d i n T a b l e “ . 5 , w e r e a s s i g n e d b y t h e e q u a t i o n J J w i t h t h e a r b i t r a r y c o n s t a n t b s e t t o u n i t y ( s e e C h a p t e r 2 ) . I n S e c t i o n s 0 t h r o u g h N w e a p p l y t h e s e v e n s t e p s t r a t e g y o f C h a p t e r 3 t o r e s o l v e E x p e r i m e n t s 1 . 1 - “ . 2 i n t o t h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n v e c t o r s o f t h e i r a b s o r b e r s . J L _ T a b l e “ . 5 . T i m e W e i g h t s T J f o r E x p e r i m e n t s 1 . 1 - “ . 2 . 1 1 9 N u m b e r o f S p e c t r a A v e r a g e d 2 1 T J ( O p t i c a l D e n s i t y 1 1 . 0 0 0 1 . 0 0 0 2 0 . 5 0 0 l . “ 1 “ 3 0 . 3 3 3 1 . 7 3 2 “ 0 . 2 5 0 2 . 0 0 0 8 a 0 . 1 2 5 2 . 8 2 8 9 b 0 . 1 1 1 3 . 0 0 0 a G r o u p i n g f a c t o r b G r o u p i n g f a c t o r 1 2 0 G . P r i n c i p a l C o m p o n e n t A n a l y s i s , S t e p 1 I n S t e p 1 w e u s e w e i g h t e d M a n d S a n a l y s e s t o d e t e r - m i n e f o r e a c h c o m p l e t e e x p e r i m e n t , m , t h e m i n i m u m n u m b e r o f a b s o r b e r s , a n d s , t h e m i n i m u m n u m b e r o f a b s o r b e r s w h o s e c o n c e n t r a t i o n s c h a n g e w i t h t i m e . T h e n u m b e r s m a n d s a r e d e t e r m i n e d b y f i n d i n g t h e m i n i m u m n u m b e r o f e i g e n v e c t o r s o f M W a n d S W , r e s p e c t i v e l y , t h a t a r e r e q u i r e d t o r e c o n — s t r u c t t h e e x p e r i m e n t a l a b s o r b a n c e s u r f a c e t o w i t h i n i t s r a n d o m e x p e r i m e n t a l e r r o r . . W e i l l u s t r a t e t h i s p r o c e d u r e w i t h t h e M a n a l y s i s o f E x p e r i m e n t 1 . 1 . F i g u r e “ . 5 i s t h e e x p e r i m e n t a l d i f f e r e n c e s u r f a c e ( 5 3 3 ) f o r E x p e r i m e n t 1 . 1 . F i g u r e “ . 1 0 i s t h e r e c o n s t r u c t i o n o f ( 5 7 ; ) u s i n g o n e e i g e n v e c t o r o f M W a n d i s t h e b e s t l e a s t s q u a r e s f i t o f F i g u r e “ . 5 t h a t c a n b e o b t a i n e d a s s u m i n g t h a t t h e r e i s o n l y o n e a b s o r b e r i n E x p e r i m e n t 1 . 1 , r e g a r d - l e s s o f w h a t w e a s s u m e f o r t h e k i n e t i c m e c h a n i s m o r t h e s t a t i c s p e c t r u m o f t h e a b s o r b e r . S i n c e F i g u r e “ . 1 0 i s a p o o r r e c o n s t r u c t i o n o f F i g u r e “ . 5 , w e c o n c l u d e t h a t E x p e r i m e n t 1 . 1 m u s t h a v e m o r e t h a n o n e a b s o r b e r . F i g u r e “ . 1 1 i s t h e b e s t r e c o n s t r u c t i o n o f ( £ 5 3 ) a s s u m i n g t h a t E x p e r i m e n t 1 . 1 h a s o n l y t w o a b s o r b e r s . A g a i n , F i g u r e “ . 1 1 i s a p o o r r e c o n s t r u c t i o n o f t h e e x p e r i m e n t a l d i f f e r e n c e s u r f a c e i n F i g u r e “ . 5 , s o w e c o n c l u d e t h a t E x p e r i m e n t 1 . 1 m u s t h a v e m o r e t h a n t w o a b s o r b e r s . F i g u r e “ . 1 2 i s t h e b e s t r e c o n s t r u c t i o n o f ( p s i ) 1 2 1 F i g u r e “ . 1 0 . R e c o n s t r u c t i o n o f e x p e r i m e n t a l d i f f e r e n c e s u r f a c e a s s u m i n g o n e a b s o r b e r i n E x p e r i m e n t 1 . 1 , R e a r v i e w . . 3 0 H > p o e m . H . H u c o e fi p o o x m C H n y m p h o m n m 0 3 0 w c H E S m m m o o m M L S m m o n o p o m m a a H m u C o E fi p o n o n o s o a p o s a p m c o o o m . H H . : o p s m fi m 0 o 0 . 0 5 o { a . ; . 0 i ? " 0 0 . 9 ' 0 ' . 1 , . 0 0 O O 0 O . 3 . . 0 O 4 O O t o " . 0 ' o t : 5 - ‘ t 0 . 0 0 ' . 0 9 Q 0 o o : 0 . 0 o I ? 9 . . ' 9 ' 9 o o o 0 9 ' 0 0 a 0 . 0 e o 0 ' : : 9 o ' 0 ’ 0 o . 0 o ' 0 5 e ' 0 9 O O O O O O O 9 0 . 0 . . O ' 9 ( a e . 9 o o . 9 o o 0 o 0 ° : ° o 0 0 ’ 0 O . 0 O . 0 O . 0 O . 0 0 . 0 O O O ' o O ' o O . 3 . . 0 O O . 0 0 O 0 . 0 0 9 0 { N N H 1 2 3 a s s u m i n g t h a t E x p e r i m e n t 1 . 1 h a s o n l y t h r e e a b s o r b e r s . W e o b s e r v e t h a t i t i s q u a l i t a t i v e l y s i m i l a r t o t h e e x p e r i — m e n t a l d i f f e r e n c e s u r f a c e i n F i g u r e “ . 5 . H o w e v e r , t h e r e a r e s o m e s y s t e m a t i c d i f f e r e n c e s . W e n o t e p a r t i c u l a r l y t h a t t h e l a s t s p e c t r u m ( t h e i n f i n i t y s p e c t r u m ) i s n o t c o r r e c t l y r e c o n s t r u c t e d i n F i g u r e “ . 1 2 . T h e i n c o r r e c t - n e s s o f t h i s s i n g l e s p e c t r u m i s s u f f i c i e n t e v i d e n c e f o r u s t o c o n c l u d e t h a t E x p e r i m e n t l . l m u s t h a v e m o r e t h a n t h r e e a b s o r b e r s . H o w e v e r , t h e r e a r e o t h e r s y s t e m a t i c d i f f e r e n c e s b e t w e e n F i g u r e s “ . 1 2 a n d “ . 5 t h a t c a n b e s e e n w i t h t h e a i d o f a w e i g h t e d r e s i d u a l s u r f a c e . T h e w e i g h t e d r e s i d u a l s u r f a c e f o r r e i g e n v e c t o r s i s d e f i n e d b y B - w < r ) = - I - ‘ - ( - A - ( r ) ‘ A ) ? I f t h e r e c o n s t r u c t e d a n d e x p e r i m e n t a l d i f f e r e n c e s u r f a c e s a g r e e t o w i t h i n t h e i r r a n d o m e r r o r s , t h e w e i g h t e d r e s i d u a l s u r f a c e s h o u l d b e r a n d o m . M o r e o v e r , w h e n t h e e r r o r m o d e l 0 1 3 = x i z J e x a c t l y d e s c r i b e s t h e e x p e r i m e n t ( i t a p p r o x i - m a t e l y d e s c r i b e s E x p e r i m e n t 1 . 1 ) a n d w h e n t h e w e i g h t i n g m a t r i c e s p a n d T a r e a s s i g n e d w i t h t h e i r a r b i t r a r y c o n - s t a n t s a a n d 0 s e t e q u a l t o u n i t y , t h e n t h e s a m p l e v a r - i a n c e o f t h e w e i g h t e d r e s i d u a l s , Q r / ( N — r ) ( p - r ) , w i t h Q r d e f i n e d b y E q u a t i o n ( 2 . 3 1 ) , s h o u l d a p p r o a c h u n i t y f o r r e q u a l t o t h e e s s e n t i a l r a n k m . F i g u r e “ . 1 3 i s t h e w e i g h t e d r e s i d u a l s u r f a c e a s s u m i n g t h e r e a r e o n l y t h r e e H m : m w m c n o z . H m . m o o O S m n H C o d H o s o w o x a o a p a o s d m w o p w w o d o s o o m a d w m o o m m m c a p s m a u n o o m U m O d d o m m H 3 m x v o n » : B o s e H . H . m o o n 4 9 0 2 . 1 2 5 F i g u r e “ . 1 3 . W e i g h t e d r e s i d u a l s u r f a c e a s s u m i n g t h r e e a b s o r b e r s i n E x p e r i m e n t 1 . 1 , R e a r v i e w . V e r t i c a l s c a l e f r o m - “ 5 0 . 0 t o + 5 0 0 . 0 w e i g h t e d ' a b s o r b a n c e u n i t s . 1 2 6 a b s o r b e r s i n E x p e r i m e n t 1 . 1 . T h e s y s t e m a t i c a p p e a r a n c e o f t h e w e i g h t e d r e s i d u a l s u r f a c e a n d t h e f a c t t h a t Q 3 / ( N - 3 ) ( p - 3 ) e q u a l s 8 “ . 0 8 s u p p o r t t h e c o n c l u s i o n t h a t E x p e r i m e n t 1 . 1 m u s t h a v e m o r e t h a n t h r e e a b s o r b e r s . F i g u r e “ . 1 “ i s t h e b e s t r e c o n s t r u c t i o n o f ( 5 : 5 ) a s s u m — i n g t h a t E x p e r i m e n t 1 . 1 h a s o n l y f o u r a b s o r b e r s . W e n o t e t h a t t h e i n f i n i t y s p e c t r u m i s n o t a c o r r e c t r e c o n s t r u c t i o n o f t h e e x p e r i m e n t a l i n f i n i t y s p e c t r u m i n F i g u r e “ . 5 , s o w e c o n c l u d e t h a t E x p e r i m e n t 1 . 1 m u s t h a v e m o r e t h a n f o u r a b s o r b e r s . F i g u r e “ . 1 5 i s t h e w e i g h t e d r e s i d u a l s u r f a c e a s s u m i n g t h e r e a r e o n l y f o u r a b s o r b e r s i n E x p e r i m e n t 1 . 1 . W e n o t e t h a t t h e w e i g h t e d r e s i d u a l s a r e m o r e r a n d o m f o r f o u r a b s o r b e r s t h a n f o r t h r e e a b s o r b e r s , b u t t h a t t h e y a r e s t i l l s y s t e m a t i c a t l a t e t i m e , a n d t h a t t h e w e i g h t e d r e s i d u a l s a c r o s s t h e i n f i n i t y s p e c t r u m a r e m u c h l a r g e r t h a n a c r o s s t h e o t h e r s p e c t r a . Q u / ( N - “ ) ( p - “ ) i s 1 0 . 5 7 , a n d t h e w e i g h t e d r e s i d u a l s t h u s s u p p o r t t h e c o n c l u s i o n t h a t E x p e r i m e n t 1 . 1 h a s m o r e t h a n f o u r a b s o r b e r s . F i g u r e “ . 1 6 i s t h e b e s t r e c o n s t r u c t i o n o f ( p e g ) a s s u m - i n g t h a t E x p e r i m e n t 1 . 1 h a s o n l y f i v e a b s o r b e r s . W e n o t e t h a t t h e e x p e r i m e n t a l i n f i n i t y s p e c t r u m i s c o r r e c t l y r e - c o n s t r u c t e d i n F i g u r e “ . 1 6 . F i g u r e “ . 1 7 i s t h e w e i g h t e d r e s i d u a l s u r f a c e f o r f i v e a b s o r b e r s , w h i c h a p p e a r s t o h a v e f e w i f a n y s y s t e m a t i c p a t t e r n s . Q 5 / ( N — 5 ) ( p - 5 ) e q u a l s 2 . 2 “ , w h i c h i s c l o s e t o u n i t y , e s p e c i a l l y c o n s i d e r i n g t h a t t h e e r r o r m o d e l O i J = X i z j o n l y a p p r o x i m a t e l y d e s c r i b e s E x - p e r i m e n t 1 . 1 . _ _ , a g w s i . Z < & x e § § . § i § s % § $ s % } a o x 3 fl § f fi 3 § i $ a b fi ? é fi x fl ? é fi § z fl é 3 a W fi , a Z fi r é fi w p m c m o : . H : . H M N \ t ” 0 " / ’ l f ” / I ! o o 0 0 « t o 5 9 o 0 o n c o 9 o s s o o o . u n u u u t $ 5 5 a o o o . . . . . . . . . - m a g n u m ? m e w w w m w a . ~ . . - ” ~ . m m m . . 0 0 . h a l o 0 0 0 e 0 0 ” c a n ” ? ! 0 0 o o o o e . 0 q u r e c o n . . . e o o u o o o o o fi i a 5 5 ¢ o o o o 0 Q 0 0 0 O ( c u l t O 0 O O ) ’ O O O . Q o 9 o . o n o o o o u d u u c n o x a o v o u o o o o o e o e s o e e o e s o e c l o a n ” o n ” 2 a a u o o o u o o o o o u o u o u é n o o o s o O I O ‘ I a n c e 0 0 . 0 . m M o o n o n e o o e e s u s o u s s o o e c e u I a n 0 . o o e e o n o u / G o o o e s s w s e o s e u s s e s o s s o . . . o u fl n u o u m fl m a w o o o u o u o s c e u o u . J a n n a . u s e . d ~ u o - $ , ” n e w n e s s . . . . 3 . . . . . . a “ . « a . . . . v u ‘ . . . " ‘ / O “ . ” . fl . . l l 0 ” 0 “ . ‘ ~ " w o O O S m d c h d H o s o w o x a o d H B m d d e a u w w o d e Q o m c d w m o o m m m c a u s m m o a n m a m o n d o w m H a m x a o H H a o s d H . H . w o o d < H o z . 1 2 8 F i g u r e “ . 1 5 . W e i g h t e d r e s i d u a l s u r f a c e a s s u m i n g f o u r a b s o r b e r s i n E x p e r i m e n t 1 . 1 , R e a r V i e w . V e r t i c a l s c a l e f r o m - 3 0 . 0 t o + 1 0 . 0 w e i g h t e d a b s o r b a n c e u n i t s . 1 2 9 F i g u r e “ . 1 6 . R e c o n s t r u c t i o n o f e x p e r i m e n t a l d i f f e r e n c e s u r f a c e a s s u m i n g f i v e a b s o r b e r s i n E x p e r i — m e n t 1 . 1 , R e a r v i e w . 1 3 0 R e a r v i e w . - 1 0 . 0 t o + 5 . 0 w e i g h t e d 9 W e i g h t e d r e s i d u a l s u r f a c e a s s u m i n g f i v e a b s o r b e r s i n E x p e r i m e n t 1 . 1 V e r t i c a l s o a l e f r o m a b s o r b a n c e u n i t s . F i g u r e “ . 1 7 . 1 3 1 B e f o r e c o n c l u d i n g t h a t f i v e e i g e n v e c t o r s o f M W a r e s u f f i c i e n t t o r e c o n s t r u c t t h e e x p e r i m e n t a l a b s o r b a n c e s t o w i t h i n r a n d o m e r r o r s , w e e x a m i n e t h e t w o d i m e n s i o n a l p l o t s o f t h e e x p e r i m e n t a l a n d r e c o n s t r u c t e d a b s o r b a n c e s v e r s u s t i m e f o r a l l “ 7 w a v e l e n g t h c h a n n e l s . F i g u r e “ . 1 8 A s h o w s t h e c o m p a r i s o n o f § ( 5 ) a n d A f o r w a v e l e n g t h c h a n n e l 1 . S i m i l a r p l o t s s h o w t h a t 3 ( 5 ) f i t s A e q u a l l y w e l l f o r w a v e l e n g t h c h a n n e l s 2 t h r o u g h “ 7 . N o w , m , t h e e s s e n t i a l r a n k o f M W , i s d e f i n e d a s t h e m i n i m u m n u m b e r o f e i g e n v e c - t o r s r e q u i r e d t o r e c o n s t r u c t t h e e x p e r i m e n t a l a b s o r b a n c e s t o w i t h i n t h e i r r a n d o m e r r o r s . T h e r e f o r e , w e c o n c l u d e t h a t m e q u a l s f i v e i n E x p e r i m e n t 1 . 1 f r o m t h e o b s e r v a - t i o n s t h a t o n e , t w o , t h r e e , o r f o u r e i g e n v e c t o r s d o n o t r e c o n s t r u c t t h e a b s o r b a n c e s t o w i t h i n r a n d o m e r r o r s , w h e r e a s f i v e e i g e n v e c t o r s r e c o n s t r u c t t h e a b s o r b a n c e s t o w i t h i n r a n d o m e r r o r s . T h e o n l y i m p r o v e m e n t i n r e c o n - s t r u c t i n g t h e a b s o r b a n c e s w i t h m o r e t h a n f i v e e i g e n v e c - t o r s i s t o r e c o n s t r u c t t h e r a n d o m e r r o r s t h e m s e l v e s . F i g u r e “ . 1 8 B s h o w s t h e c o m p a r i s o n o f § ( 6 ) a n d A f o r w a v e - l e n g t h c h a n n e l 1 . N o t e t h a t 9 ( 6 ) g i v e s n o i m p r o v e m e n t o v e r 3 ( 5 ) i n r e c o n s t r u c t i n g 5 , e x c e p t a t t h e l e v e l o f t h e r a n d o m e r r o r s . T h u s , w e c o n c l u d e t h a t E x p e r i m e n t 1 . 1 h a s f i v e l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r s . R e c a l l f r o m C h a p t e r 2 a n d A p p e n d i x C t h a t f o r a n i n f i n i t e l y l a r g e e x p e r i m e n t d e s c r i b e d b y t h e e r r o r v a r - i a n c e m o d e l O I J a x 1 2 1 , t h e m e a n o f t h e n o n e s s e n t i a l e i g e n v a l u e s o f M W , d e f i n e d b y 1 3 2 F i g u r e “ . 1 8 . ( A ) é < 5 > a n d p f o r w a v e l e n g t h c h a n n e l 1 ( 2 7 5 n m ) , E x p e r i m e n t 1 . 1 . X = A , O = 5 — ( 5 ) ‘ ( B ) 9 ( 6 ) a n d p f o r w a v e l e n g t h c h a n n e l 1 ( 2 7 5 n m ) , E x p e r i m e n t 1 . 1 . X = p , A O = 5 ( 6 ) . 0 . 8 2 0 l . , " - - . . . . . . . . l l . l 6 O r - o — t - u - h - « t n n 9 . 0 - 4 ” - 4 o - - - $ - - » $ - - - - t - - - - $ — - 4 - " d u o - $ - - - ' 5 . " ~ 0 - - - - | - - - - 0 - ~ ~ $ - - - - | - - - $ l . . . . o ’ . . . . . . - . . . _ . 0 - ’ - . . o ‘ . - . - ‘ o o o o ‘ u l o o s o o i . o o u $ o o . o h n o o ‘ D O - b ‘ o o - C ’ o o o u $ u i o o ‘ o c n o ‘ o a o o ‘ o b o o ’ o o o c ‘ 1 S p e c t r u m N u m b e r 6 1 l . 1 6 0 - - - - 5 - - - - : - - - : $ . : ' . S - - - - S v - - - $ - - v - s - - - ~ S - - - - $ - - - - S - - - - § ~ - - - S ' - - - S - . - o § - - - - S - ° - - $ - - - - S o - - - 5 e - - - S - - - o 9 o . . . . . . O O 8 2 O . _ - - ‘ . - - . ‘ - . . . ’ . - . . ‘ O . . - s - . - . ’ o - - I ’ - - . . ‘ u . - - ‘ 0 ’ - . . ” O O ’ O O C I ’ D C O O ’ - 0 0 " . 0 0 0 ‘ . - . . , - 0 . 0 ’ 0 - - . ; : O - . ’ . . : . ‘ | 1 S p e c t r u m N u m b e r 6 1 F i g u r e “ . 1 8 . 1 3 “ _ P 8 = [ l / ( p - r ) J Z 5 r i = r + 1 1 e q u a l s o n e f o r r = m , m + 1 , . . . , p . T h e r e f o r e , t h e f i r s t v a l u e o f r f o r w h i c h 5 r = 1 i s m , t h e e s s e n t i a l r a n k o f M T h i s 4 w - s u g g e s t s t h a t f o r a f i n i t e s i z e e x p e r i m e n t d e s c r i b e d b y t h e e r r o r v a r i a n c e m o d e l O I J = x i z j , m i s t h e f i r s t v a l u e o f r f o r w h i c h 8 ? a p p r o a c h e s u n i t y . T h e s a m e r u l e a p p l i e s t o t h e m e a n o f t h e n o n e s s e n t i a l e i g e n v a l u e s o f § W w h e n r e q u a l s 5 , t h e e s s e n t i a l r a n k o f § W ' S i n c e t h e v a r i a n c e m o d e l C I ] = x 1 2 . j o n l y a p p r o x i m a t e l y d e s c r i b e s E x p e r i m e n t s 1 . 1 - “ . 2 . , w e d o n o t u s e t h e m e a n o f t h e n o n e s s e n t i a l e i g e n v a l u e s a s a s t r i c t c r i t e r i o n f o r d e t e r m i n i n g m a n d 5 . I n s t e a d , w e u s e a s t h e c r i t e r i o n t h e r e c o n s t r u c t i o n o f t h e e x p e r i m e n t a l a b s o r b a n c e s t o w i t h i n r a n d o m e r r o r s , a s i l l u s t r a t e d a b o v e f o r t h e d e t e r — m i n a t i o n o f m i n E x p e r i m e n t 1 . 1 . N e v e r t h e l e s s , w e l i s t t h e m e a n o f t h e n o n e s s e n t i a l e i g e n v a l u e s f o r M a n d S a n a l y s e s o f E x p e r i m e n t s 1 . 1 - “ . 2 i n T a b l e s “ . 6 a n d “ . 7 , r e s p e c t i v e l y . I n t h e s e t a b l e s , t h e m e a n o f t h e n o n e s — s e n t i a l e i g e n v a l u e s i s u n d e r s c o r e d f o r t h e m i n i m u m n u m b e r o f e i g e n v e c t o r s r e q u i r e d t o r e c o n s t r u c t t h e e x p e r i m e n t a l a b s o r b a n c e s t o w i t h i n r a n d o m e r r o r s . . T h u s , E x p e r i m e n t s 1 . 1 t h r o u g h 3 . 3 h a v e f i v e l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r s ( m = 5 ) , o f w h i c h a t l e a s t f o u r c h a n g e c o n c e n t r a t i o n ( s = “ ) , w h e r e a s E x p e r i m e n t s “ . 1 a n d “ . 2 h a v e s i x l i n e a r l y i n d e p e n - d e n t a b s o r b e r s ( m = 6 ) , o f w h i c h a t l e a s t f i v e c h a n g e c o n c e n t r a t i o n ( s = 5 ) . N o t e t h a t i n a l l t h e s e e x p e r i m e n t s , 1 3 2 3 2 5 5 3 i 2 “ 2 9 “ 3 0 5 r - . . . . . . . . 1 1 1 0 1 1 1 1 8 6 0 7 “ 8 0 0 5 0 1 . . . . . e p x e e h t h N c 2 2 1 2 2 M i . h s f w o s r o t c e v n e 8 5 6 2 7 7 h r 8 5 9 7 7 1 9 t r 0 . . 9 8 . e i . . . 9 0 . . 8 5 2 3 w 1 3 3 r o m s o r d o n t a r g 9 1 2 7 5 “ 6 3 e “ 2 2 “ 3 7 c “ 2 i . . . . . . . . v s E 9 5 1 5 9 6 6 3 n t 7 8 7 1 3 1 i e f g o r e b 0 1 1 9 5 2 2 5 f t 8 9 6 0 6 6 9 6 o i i n e i h m . . . . . . . . w u 5 9 9 1 7 2 6 7 N 5 0 5 8 6 0 2 6 2 3 2 1 = r r e o b t m u d n e t 8 0 1 1 5 6 8 “ m c 3 7 5 6 0 8 u u “ 8 . . . . . . . . m r 6 2 2 5 3 3 2 “ i t “ 2 8 5 7 3 5 6 n s 6 “ 7 5 8 2 “ 9 i n 2 2 m o “ u “ . . . “ “ u c e e h r t s i . . . 3 3 “ “ 3 e 3 3 3 l 1 . . 1 t l l l s 3 8 3 3 a e s s s o 0 0 1 c l c O a . o O . . 8 s i . . . 5 5 5 0 O 5 1 5 5 1 1 . . 1 1 1 N N N 6 6 N N N 6 6 6 N N d f n r i u s “ “ “ . . . “ “ s . . . 8 8 8 . . 7 7 7 1 1 1 7 7 E E E E E E E E e e u c l n a a v b r d o e s r b o a c s l 1 2 1 1 2 3 1 2 r a . . . . . . . . 1 “ 2 3 3 3 1 “ e t d n n e U m a T a b l e “ . 6 . M A n a l y s i s M e a n o f N o n — E s s e n t i a l E i g e n v a l u e s . E x p e r i m e n t A b b r e v i a t i o n l 2 3 “ 5 6 1 3 5 6 1 “ 9 6 6 6 “ 9 8 7 2 9 9 2 2 . . . . . . . . 0 0 0 1 1 0 0 1 - i r e p x e 7 7 9 8 5 5 9 e 3 _ 2 2 9 “ 1 5 h 1 6 4 _ . . . . . . _ t . . 1 1 0 1 1 1 1 ; h c i h w h t i w s t n e n o p m o c f o r e b m u n 5 5 7 8 6 8 6 “ 7 9 2 3 8 0 0 “ . . . . . . . . 0 6 1 8 0 6 8 3 9 9 8 1 1 “ 2 7 0 l 2 3 6 2 2 m 9 0 8 6 5 6 2 0 u . . . . . . . . m 7 3 3 0 5 1 9 2 7 7 “ 9 0 “ 3 5 3 5 2 1 1 1 1 i n i m e h t “ “ “ . . . “ “ “ . . . “ “ 3 3 3 e 3 3 3 . . l l l t l l l 3 3 s s s s s s 1 l o o o o o o . . . 3 s . . . 5 5 5 0 O 5 5 5 1 1 1 . . 1 1 1 N 6 6 N N N N N 6 6 6 N N “ “ “ . . . “ “ . . . 8 8 8 . . 7 7 7 1 1 1 7 7 E E E E E E E E a c i d n i s e u l a v d e r o c s r e d n . 7 . “ e l b a U T a S A n a l y s i s M e a n o f N o n - E s s e n t i a l E i g e n v a l u e s . E x p e r i m e n t A b b r e v i a t i o n 1 " N u m b e r o f E i g e n v e c t o r s o f § W 2 3 1 . 1 1 . 2 2 . 1 3 . 1 3 . 2 3 . 3 “ . 1 “ . 2 1 1 . 2 1 1 2 . 0 0 9 . 9 5 “ . 1 8 “ . 1 1 5 . “ 6 3 . 9 5 3 . 7 8 m e n t a l a b s o r b a n c e s u r f a c e i s r e c o n s t r u c t e d t o w i t h i n i t s r a n d o m e r r o r . 1 3 6 1 3 7 t h e m e a n o f t h e n o n e s s e n t i a l e i g e n v a l u e s i s w i t h i n a n o r d e r o f m a g n i t u d e o f u n i t y f o r t h e c o r r e c t e s s e n t i a l r a n k . O f c o u r s e , t h e m e a n o f t h e n o n e s s e n t i a l e i g e n v a l u e s m u s t e i t h e r d e c r e a s e o r r e m a i n c o n s t a n t a s r i s i n c r e a s e d b e y o n d r n , s i n c e t h e e i g e n v a l u e s a r e a r r a n g e d i n d e c r e a s i n g o r d e r . T a b l e s “ . 8 a n d “ . 9 l i s t t h e s a m p l e v a r i a n c e o f t h e w e i g h t e d r e s i d u a l s , Q r / ( N - r ) ( p ‘ r ) , f o r t h e M a n d S a n a l y s e s o f E x p e r i m e n t s l . l - “ . 2 , w i t h a f o r m a t s i m i l a r t o T a b l e s “ . 6 a n d “ . 7 . N o t e t h a t Q r / ( N - r ) ( p - r ) i s w i t h i n a n o r d e r o f m a g n i t u d e o f u n i t y f o r t h e c o r r e c t e s s e n t i a l r a n k i n e a c h e x p e r i m e n t . W e t a k e a s e v i d e n c e o f t h e p r e c i s i o n o f t h e s c a n n i n g e x p e r i m e n t s t h e r e p r o d u c i b i l i t y o f t h e ( m , s ) p a i r s f o r t h e r e p l i c a t e e x p e r i m e n t s a n d t h e s i m i l a r a p p e a r a n c e o f t h e i r e x p e r i m e n t a l a b s o r b a n c e s u r f a c e s . T h e r e f o r e , i n S t e p s 2 t h r o u g h 7 w e s h a l l d i s c u s s o n l y t h e f i r s t e x p e r i — . m e n t f o r e a c h s e t o f i n i t i a l c o n d i t i o n s , g p p p g E x p e r i m e n t s 1 . 1 , 2 . 1 , 3 . 1 , a n d “ . 1 . H . P r i n c i p a l C o m p o n e n t A n a l y s i s , S t e p 2 I n S t e p 2 w e f i t t o t h e M a n a l y s i s e i g e n v e c t o r s f o r e a c h w h o l e e x p e r i m e n t t h e m e a s u r e d s t a t i c s p e c t r a o f N D M A , N A D H , a n d L A D H . A m e a s u r e d s t a t i c s p e c t r u m t h a t f i t s a p a r t i c u l a r e x p e r i m e n t m a y b e c o u n t e d a s b e l o n g i n g t o I o n e o f t h e m a b s o r b e r s i n t h a t e x p e r i m e n t . “ 5 3 6 9 6 g 9 a 3 3 0 5 “ 1 9 - . . . . . . p p , i 1 1 1 1 l 1 . ; r a “ 2 . 2 e p x e e h . t r o h r c r i e h 7 9 9 3 2 6 7 w m 5 2 5 2 1 “ 7 2 o . . . . . . 1 . 0 1 9 “ “ 5 . 3 1 1 3 h d t n i a w r s s t t i 8 “ 0 0 0 7 3 9 n 0 5 9 5 0 9 2 9 e W M f o s r o t c e v n e g i . . . . . . . . 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I n E x p e r i m e n t s 1 . 1 , 2 . 1 , a n d 3 . 1 , t h e s t a t i c s p e c t r u m o f N D M A f i t s e x c e p t f o r a s h o u l d e r i n t h e c a l c u l a t e d s p e c t r u m c e n t e r e d a p p r o x i - m a t e l y a t w a v e l e n g t h c h a n n e l 2 “ ( 3 “ 0 n m ) . T h i s s u g g e s t s t h a t i n t h e s e e x p e r i m e n t s , t h e c o n c e n t r a t i o n o f N D M A m a y b e l i n e a r l y d e p e n d e n t o n t h e c o n c e n t r a t i o n o f a n o t h e r a b s o r b e r w i t h a n a b s o r b a n c e b a n d a t 3 “ O n m . I f s o , t h e n E x p e r i m e n t s 1 . 1 , 2 . 1 , a n d 3 . 1 a c t u a l l y h a v e s i x a b s o r b e r s , o f w h i c h o n l y f i v e a r e l i n e a r l y i n d e p e n d e n t . F i g u r e s “ . 2 3 a n d “ . 2 “ s h o w t h e M a n a l y s i s f i t s o f t h e m e a s u r e d s t a t i c s p e c t r a o f N A D H a n d L A D H t o E x p e r i m e n t 1 . 1 . N e i t h e r m e a s u r e d s t a t i c s p e c t r u m f i t s a s b e l o n g i n g t o o n e o f t h e f i v e l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r s . S i m i - l a r p o o r M a n a l y s i s f i t s w e r e o b t a i n e d f o r N A D H a n d L A D H i n E x p e r i m e n t s 2 . 1 , 3 . 1 , a n d “ . 1 . S i n c e N A D H a n d L A D H a r e u n d o u b t e d l y p r e s e n t a s c h e m i c a l s p e c i e s i n a l l o f t h e s e e x p e r i m e n t s , t h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t e i t h e r d i f — f e r e n t s p e c t r a l f o r m s f o r N A D H a n d L A D H o c c u r i n t h e r e - a c t i o n , w i t h e f f e c t i v e l y i n s t a n t a n e o u s c o m p l e t e c o n v e r s i o n t o t h e s e f o r m s , o r t h a t t h e s t a t i c s p e c t r a o r c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f N A D H a n d L A D H a r e l i n e a r l y d e p e n d e n t o n t h e s t a t i c s p e c t r a o r c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f t h e o t h e r a b s o r b e r s i n t h e s e e x p e r i m e n t s . 1 “ 1 0 . 3 5 6 i . . . . : 3 . " i t i I ! I I . . . 1 ! . : . i ' 2 ° 3 g c o n v E 1 ( 2 7 5 n m ) “ 7 ( 5 8 “ n m ) W a v e l e n g t h C h a n n e l F i g u r e “ . 1 9 . 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M a n a l y s i s f i t o f t h e m e a s u r e d N A D H s t a t i c s p e c t r u m t o E x p e r i m e n t 1 . 1 . X = m e a s u r e d , 0 a c a l c u l a t e d . V e r t i c a l s c a l e i n a r b i t r a r y a b s o r b a n c e u n i t s . 1 “ 6 0 . 8 2 1 : 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1 l : - . . - I n o 0 o . I l ' 8 . l l ° . I I a g I - - : l 7 l - . , J . ' 2 “ " ' a : ° 3 u . ' . . 3 1 ( 2 7 5 n m ) “ 7 ( 5 8 “ n m ) W a v e l e n g t h C h a n n e l F i g u r e “ . 2 “ . M a n a l y s i s f i t o f t h e m e a s u r e d L A D H s t a t i c s p e c t r u m t o E x p e r i m e n t 1 . 1 . X = m e a s u r e d , 0 = c a l c u l a t e d . V e r t i c a l s c a l e i n a r b i t r a r y a b s o r b a n c e u n i t s . 1 1 : 7 T h e N A D H s i t u a t i o n i s p a r t l y r e s o l v e d b y c o n s i d e r i n g t h e c h a n g e s t h a t o c c u r w h e n N A D H i s o x i d i z e d t o N A D + . F i g u r e “ . 2 5 s h o w s t h e a b s o r b a n c e s p e c t r a o f N A D H a n d N A D + ( P . L . B i o c h e m i c a l s , 1 9 7 3 ) . N A D H h a s t w o a b s o r b a n c e b a n d s , w i t h p e a k s a t 2 6 0 n m a n d 3 “ 0 n m , r e s p e c t i v e l y . T h e 3 “ 0 n m a b s o r p t i o n a r i s e s f r o m t h e r e d u c e d n i c o t i n - a m i d e p o r t i o n o f N A D H ( K a p l a n , 1 9 6 0 ) a n d d i s a p p e a r s w h e n N A D H i s o x i d i z e d t o N A D + . T h e 2 6 0 n m a b s o r p t i o n a r i s e s f r o m t h e a d e n i n e p o r t i o n o f N A D H , a n d i s e n h a n c e d b u t n o t c h a n g e d i n s h a p e b y a n a d d i t i o n a l 2 6 0 n m a b s o r p t i o n f r o m t h e o x i d i z e d n i c o t i n a m i d e p o r t i o n w h e n N A D H i s o x i d i z e d t o N A D + ( K a p l a n , 1 9 6 0 ) . T h u s , t h e t w o a b s o r b a n c e p e a k s o f N A D H s h o u l d m a k e s e p a r a t e B e e r ' s L a w c o n t r i b u t i o n s t o t h e a b s o r b a n c e s u r f a c e . W e t h e r e f o r e f i t s e p a r a t e l y t h e 2 6 0 n m a n d 3 “ 0 n m b a n d s t o t h e M a n a l y s i s e i g e n v e c t o r s o f E x p e r i m e n t s 1 . 1 t h r o u g h “ . 1 . F i g u r e “ . 2 6 s h o w s t h e M a n a l y s i s f i t o f t h e N A D + 2 6 0 n m a b s o r b a n c e b a n d f r o m F i g u r e “ . 2 5 t o E x p e r i m e n t 1 . 1 . T h e f i t i s t o o p o o r t o c o n c l u d e t h a t t h e 2 6 0 n m a b s o r - b a n c e b a n d o f N A D H a n d N A D + f i t s a s a l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r i n E x p e r i m e n t 1 . 1 . T h e s a m e n e g a t i v e r e s u l t w a s o b t a i n e d f o r E x p e r i m e n t s 2 . 1 , 3 . 1 , a n d “ . 1 . ( I n S e c t i o n 0 w e a n a l y z e a s p e c i a l s c a n n i n g e x p e r i m e n t f r o m 2 5 0 n m - 3 0 0 n m t h a t i n c l u d e s t h e N A D H - N A D + a b s o r b a n c e m a x i m u m a t 2 6 0 n m . ) F i g u r e “ . 2 7 s h o w s t h e M a n a l y s i s f i t o f t h e 3 “ 0 n m b a n d o f t h e m e a s u r e d s t a t i c s p e c t r u m o f N A D H t o E x p e r i m e n t 1 “ 8 1 . 1 , f r o m w h i c h w e c o n d l u d e t h a t t t h e 3 “ 0 n m b a n d o f N A D H d o e s n o t b e l o n g t o o n e o f t h e f i v e l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r s i n E x p e r i m e n t 1 . 1 . T h e 3 “ 0 n m b a n d o f N A D H f i t s e q u a l l y p o o r l y i n E x p e r i m e n t s 2 . 1 a n d 3 . 1 . F i g u r e “ . 2 8 s h o w s t h e M a n a l y s i s f o t o f t h e 3 “ 0 n m N A D H b a n d t o E x p e r i m e n t “ . 1 . T h e f i t i s g o o d e x c e p t f o r t h e l a r g e r a n d o m d e v i a t i o n s i n t h e b a s e l i n e b e l o w 3 0 0 n m . T h i s s u g - g e s t s t h a t t h e 3 “ 0 n m b a n d o f N A D H m a y m a k e a s m a l l a b - s o r b a n c e c o n t r i b u t i o n a s t h e s i x t h a b s o r b e r i n E x p e r i m e n t “ . 1 , w h i c h w o u l d b e c o n s i s t e n t w i t h t h e f o l l o w i n g o b s e r v a - t i o n s : 1 . N A D H 3 u O n m f i t s E x p e r i m e n t “ . 1 , b u t n o t E x p e r i - m e n t s 1 . 1 , 2 . 1 , a n d 3 . 1 . 2 . E x p e r i m e n t “ . 1 h a s s i x l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b - s o r b e r s , w h e r e a s E x p e r i m e n t s 1 . 1 , 2 . 1 , a n d 3 . 1 h a v e o n l y f i v e . 3 . E x p e r i m e n t s 1 . 1 , 2 . 1 , a n d 3 . 1 a p p e a r t o h a v e l i n e a r d e p e n d e n c e b e t w e e n t h e c o n c e n t r a t i o n s o f N D M A a n d a n a b s o r b e r w i t h a p e a k n e a r 3 “ 0 n m . O u r i n t e r p r e t a t i o n o f t h e s e o b s e r v a t i o n s i s t h a t i n E x p e r i m e n t “ . 1 N D M A a n d N A D H 3 “ O n m h a v e l i n e a r l y i n d e p e n d e n t c o n c e n t r a t i o n s , w h e r e a s , i n E x p e r i m e n t s 1 . 1 , 2 . 1 , a n d 3 . 1 t h e c o n c e n t r a t i o n s o f N D M A a n d N A D H 3 u o n m a r e l i n e a r l y d e p e n d e n t o n e a c h o t h e r . W e n o t e t h a t E x p e r i m e n t s 1 . 1 , 2 . 1 , a n d 3 . 1 h a v e t h e s a m e r a t i o o f i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s ( [ N D M A J O / [ N A D H ] O ) = 0 . 8 9 , n e a r l y u n i t y , w h e r e a s E x p e r i m e n t 1 . 0 r - 0 . 8 r — 2 D 0 . 6 I - . u C E . 0 0 . 4 ( 0 . 2 I - 0 . 0 l l “ 9 A J L ‘ 4 ‘ l A L 1 . F i g u r e “ . 2 5 . A t m m A b s o r b a n c e o f s p e c t r a o f N A D H a n d N A D ( P . L . B i o c h e m i c a l s , 1 9 7 3 ) . r r L J 2 4 0 2 5 0 2 6 0 2 7 0 2 8 0 2 9 0 3 0 0 3 ‘ 0 3 2 0 3 1 ” 3 4 0 3 5 0 3 6 0 3 7 0 3 3 0 + 0 . “ 7 5 E r m a - « o - - . - . - . . . . , - . . - , - . _ — O O I - 0 . 0 6 0 - ~ c ‘ o . . . ’ " 1 5 0 ° 4 I , L 0 . l g : I I I I I : o ' o o o e g ' I ' l . ‘ : " 0 : : : I ' : : : ' 9 ‘ . - b . . . . . . 0 ~ . . . . . . I . . , 0 . . - ’ . . . . ’ . o - o , u . o $ . . o o ’ . o ¢ + ” o ’ 1 1 l ( 2 7 5 n m ) “ 7 ( 5 8 “ n m ) F i g u r e “ . 2 6 . W a v e l e n g t h C h a n n e l M a n a l y s i s f i t o f t h e 2 6 0 n m N A D + a b s o r - b a n c e b a n d t o E x p e r i m e n t 1 . 1 . X = 2 6 0 n m N A D + b a n d , 0 2 c a l c u l a t e d . V e r t i c a l s c a l e i n a r b i t r a r y a b s o r b a n c e u n i t s . 1 5 1 O . 3 6 0 . . . . . . . . . - s . - . . . . - 4 . e e = = t = e = - . : . z e - . 4 J . ’ J 1 ' 1 o . o J 4 o o ; I a j . ‘ I l I I o : 2 I . J 4 : ‘ - . ” . . . , j o o 0 ’ ‘ 1 o o ' 0 ° 0 o o n ' ' J . I I I I I I t I I I : I I . I I I I I I I I I I I I I I I I J — O , 0 0 9 . . . E . . . . . S - o - - S - - ° - $ - - o - ‘ . : e 2 s - . s e s e e e s - e - . l ( 2 7 5 n m ) ( “ 7 ( 5 8 “ n m ) W a v e l e n g t h C h a n n e l F i g u r e “ . 2 7 . M a n a l y s i s f i t o f t h e 3 “ 0 n m N A D H a b s o r b a n c e b a n d t o E x p e r i m e n t 1 . 1 . X = 3 “ 0 n m N A D H b a n d , 0 = c a l c u l a t e d . V e r t i c a l s c a l e i n a b s o l u t e a b s o r b a n c e u n i t s . 1 5 2 0 . 1 8 7 , . . 1 . . m . m . m - m a m c m m m u m e m h m c m . , " 1 ° : ' . 1 J l J I I . i . . . z . . . g . 3 ” ? ' . . : 2 . . . . : . . . . . I q j ' . ' . i J - l I i I I ” I - O . 2 3 3 . - - . I - . . L e , - . z = s - . 1 ( 2 7 5 n m ) “ 7 ( 5 8 “ n m ) W a v e l e n g t h C h a n n e l F i g u r e “ . 2 8 . M a n a l y s i s f i t o f t h e 3 “ 0 n m N A D H a b s o r b a n c e b a n d t o E x p e r i m e n t “ . 1 . X = 3 “ O n m N A D H b a n d , 0 = c a l c u l a t e d . V e r t i c a l s c a l e i n a r b i t r a r y a b s o r b a n c e u n i t s . 1 5 3 “ . 1 h a s t h e r a t i o ( [ N D M A ) O / [ N A D H ] O ) = 2 . 3 . T h i s s u g g e s t s ( s e e E x a m p l e 3 . 1 ) t h a t t h e l i n e a r d e p e n d e n c e o f N D M A a n d N A D H c o n c e n t r a t i o n s i n E x p e r i m e n t s 1 . 1 , 2 . 1 , a n d 3 . 1 , m a y o c c u r b e c a u s e t h e r a t i o o f t h e i r i n i t i a l c o n c e n t r a - t i o n s i s n e a r t h e r a t i o o f t h e i r s t o i c h i o m e t r i e s i n t h e r e a c t i o n ( a s s u m i n g a 1 : 1 s t o i c h i o m e t r y r a t i o . ) I . P r i n c i p a l C o m p o n e n t A n a l y s i s 1 S t e p 3 I n S t e p 3 w e f i t t o t h e S a n a l y s i s e i g e n v e c t o r s e a c h m e a s u r e d s t a t i c s p e c t r u m t h a t f i t a s a n a b s o r b e r i n S t e p 2 . E a c h s p e c t r u m t h a t f i t s t h e S a n a l y s i s e i g e n v e c t o r s m a y b e c o u n t e d a s b e l o n g i n g t o a n a b s o r b e r w h o s e c o n c e n - t r a t i o n c h a n g e d a n d w h o s e r a t e i s l i n e a r l y i n d e p e n d e n t o f t h e r a t e s o f t h e o t h e r a b s o r b e r s . I n S t e p 2 , w e s h o w e d t h a t t h e m e a s u r e d s t a t i c s p e c t r u m o f N D M A a n d t h e 3 “ 0 n m b a n d o f N A D H f i t a s b e l o n g i n g t o a n a b s o r b e r i n E x p e r i m e n t “ . 1 . F i g u r e s “ . 2 9 a n d “ . 3 0 s h o w t h e S a n a l y s i s f i t s o f N D M A a n d N A D H 3 u 0 n m t o E x p e r i m e n t “ . 1 , f r o m w h i c h w e c o n c l u d e t h a t N D M A a n d t h e 3 “ 0 n m b a n d o f N A D H h a v e l i n e a r l y i n d e p e n d e n t r a t e s i n E x p e r i m e n t “ . 1 . T h e r e a r e n o o t h e r s t a t i c s p e c t r a f r o m S t e p 2 t o t e s t i n S t e p 3 . 1 5 “ 0 . 3 5 6 1 9 s s 5 s s Q s - - . . . s . . . ; Q Q s q u s 3 4 ; J ’ . l . J a L ' - r ° : J : ° . . “ " ’ : 2 . : 7 - o 0 1 2 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . $ . 1 1 : . . . . . . . . . - 2 . “ 1 ( 2 7 5 n m ) “ 7 ( 5 8 “ n m ) F i g u r e “ . 2 9 . W a v e l e n g t h C h a n n e l S a n a l y s i s f i t o f t h e m e a s u r e d N D M A s t a t i c s p e c t r u m t o E x p e r i m e n t “ . 1 . X = m e a s u r e d , 0 = c a l c u l a t e d . V e r t i c a l s c a l e i n a r b i t r a r y a b s o r b a n c e u n i t s . 1 5 5 0 , 1 8 7 . . H " J U . . . . H “ - u u . ” H w n w n n u m u w n m u m u w n m u w u w u w I . I . F 2 ‘ ' - J i . J . : ’ J z t i 5 o : . 4 . I . ' ° . ’ 1 . . - ‘ 0 t 5 J 3 : 1 : 3 1 1 3 a l l - 1 1 ' ' l l l l t l ' l o l j l t I - t J D 1 ( 2 7 5 n m ) “ 7 ( 5 8 “ n m ) W a v e l e n g t h C h a n n e l F i g u r e “ . 3 0 . 8 a n a l y s i s f i t o f t h e 3 “ O n m N A D H a b s o r b a n c e b a n d t o E x p e r i m e n t “ . 1 . X = 3 “ 0 n m N A D H b a n d , 0 = c a l c u l a t e d . V e r t i c a l s c a l e i n a r b i t r a r y a b s o r b a n c e u n i t s . 1 5 6 J . P r i n c i p a l C o m p o n e n t A n a l y s i s , g S t e p “ R e c a l l f r o m S e c t i o n B o f C h a p t e r 3 t h a t e a c h m e a s u r e d s t a t i c s p e c t r u m t h a t f i t s t h e M a n a l y s i s e i g e n v e c t o r s o f a n e x p e r i m e n t g i v e s a n e s t i m a t e f o r o n e c o l u m n o f t h e r o t a t i o n m a t r i x Q . W h e n m c o l u m n s o f g _ h a v e b e e n e s t i m a t e d , w e c a n r e s o l v e t h e e x p e r i m e n t i n t o t h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n v e c t o r s o f i t s m l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b - s o r b e r s . W e h a v e f r o m S t e p 2 t w o c o l u m n s o f g _ f o r E x p e r i m e n t “ . 1 , c o r r e s p o n d i n g t o t h e s u c c e s s f u l M a n a l y s i s f i t t i n g o f t h e s t a t i c s p e c t r a o f N D M A a n d N A D H 3 u 0 n m ' F o u r m o r e c o l u m n s o f g a r e r e q u i r e d t o r e s o l v e E x p e r i m e n t “ . 1 . S o f a r w e h a v e n o e s t i m a t e s f o r t h e f i v e c o l u m n s o f g i n E x p e r i m e n t s 1 . 1 , 2 . 1 , a n d 3 . 1 s i n c e n o m e a s u r e d s t a t i c s p e c t r a f i t t h e s e e x p e r i m e n t s . I n S t e p 2 w e s u g g e s t e d t h a t N D M A a n d N A D H 3 u o n m m a y b e l i n e a r l y d e p e n d e n t a b - s o r b e r s i n E x p e r i m e n t s 1 . 1 , 2 . 1 , a n d 3 . 1 . E v e n i f t h e y a r e , t h e y c o u n t t o g e t h e r a s o n l y o n e l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r i n t h e s e e x p e r i m e n t s , a n d w e a r e s t i l l l e f t w i t h f o u r l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r s t h a t m u s t b e e i t h e r t r a n s i e n t i n t e r m e d i a t e s o r u n k n o w n p r o d u c t s . A l t h o u g h w e h a v e n o m e a s u r e d s t a t i c s p e c t r a f o r t h e s e a b s o r b e r s , w e c a n i n f e r s o m e o f t h e i r s p e c t r a l a n d k i n e t i c p r o p e r t i e s i n S t e p s 5 t h r o u g h 7 , w h i c h w e p e r f o r m f o r E x p e r i m e n t 1 . 1 . W e t h e n t r a n s f e r t h e s p e c t r a l p r o p e r t i e s d e t e r m i n e d f o r E x p e r i m e n t 1 . 1 t o E x p e r i m e n t s 2 . 1 , 3 . 1 , a n d “ . 1 . 1 5 7 K . P r i n c i p a l C o m p o n e n t A n a l y s i s , S t e p , 5 I n S t e p 5 w e p e r f o r m M a n d S a n a l y s i s o n s u b s p a c e s o f w a v e l e n g t h a n d t i m e t o f i n d p a r t s o f E x p e r i m e n t 1 . 1 t h a t c o n t a i n f e w e r t h a n f i v e a b s o r b e r s . F i g u r e “ . 3 1 s h o w s a b r e a k d o w n o f E x p e r i m e n t 1 . 1 i n t o f o u r w a v e l e n g t h s u b s p a c e s , I ( c h a n n e l s 1 - 1 5 ) , I I ( c h a n n e l s 1 6 - 2 9 ) , I I I ( c h a n n e l s 3 0 - 3 8 ) , a n d I V ( c h a n n e l s 3 9 - “ 7 ) . W e p e r f o r m e d M a n d S a n a l y s e s o n e a c h s u b s p a c e , u s i n g a l l 6 1 c o n s e c u t i v e s p e c t r a i n e a c h c a s e . F i g u r e “ . 3 1 s h o w s t h e ( m , s ) p a i r s t h u s o b t a i n e d f o r e a c h s u b s p a c e a n d s e v e r a l c o m b i n a t i o n s o f s u b s p a c e s . W e d r a w t h e f o l l o w i n g c o n c l u s i o n s f r o m F i g u r e 3 1 : 1 . E i t h e r t h e c o n c e n t r a t i o n o f o n e o f t h e t w o a b - s o r b e r s i n I d o e s n o t c h a n g e , o r t h e r a t e s o f t h e t w o a b s o r b e r s i n I a r e l i n e a r l y d e p e n d e n t o n e a c h o t h e r . 2 . I I I a n d I V h a v e o n e a b s o r b e r i n c o m m o n , w h e r e a s t h e t w o a b s o r b e r s i n I d o n o t a b s o r b i n I I I o r I V . 3 . I , I I I , a n d I V a r e t w o - a b s o r b e r s u b s p a c e s t h a t t o g e t h e r h a v e a l l f i v e o f t h e l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r s t h a t a r e i n t h e w h o l e e x p e r i m e n t . T h e r e f o r e , b y s e p a r a t e l y r e s o l v i n g I , I I I , a n d I V w i t h t h e t w o a b s o r b e r s i m p l i f i c a t i o n s o f C h a p t e r . , S e c t i o n D , w e c a n o b t a i n t h e c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f a } : f i v e l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r s . F r o m t h e s e , w e c a n r e s o l v e J > J . 1 . ) 1 m n 4 t 9 n 5 e ( 7 4 m i r 9 e - — — V ) I 3 , + 3 I ( I I — — V I ) . m n 2 7 p x E f o 4 V ( 8 3 - I - I I s I e I ) — m — K n 6 7 c a p s b V I + I ) I ) C 3 u ( S 9 l 2 e n h n t a g h n 4 . I 4 5 + ( . 5 I ( I + I ) 3 1 4 ( J ‘ h I e t I v g e l n a e W ) l m e r n v 9 a 9 W 2 o f ( s 5 1 r i a p ) s , m I I I ( ) m . 1 3 n . ' “ 5 7 2 ( 1 e r u g i F l J < - — — I — — — > | 1 + K — m - é l ( 4 . 4 ) [ 6 ( 2 . 2 ) _ > J K ( 2 . 1 ) ( 2 . 2 ) I I — — — - > J I + I I I + I V J 6 — — m + I V — — — 9 J 1 5 8 1 5 9 t h e w h o l e e x p e r i m e n t t o o b t a i n t h e s t a t i c s p e c t r a o f a l l f i v e l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r s . L . P r i n c i p a l C o m p o n e n t A n a l y s i s J S t e p 6 I n S t e p 6 w e u s e t h e t w o a b s o r b e r s i m p l i f i c a t i o n s o f C h a p t e r 3 , S e c t i o n D , t o r e s o l v e p a r t i a l l y o r c o m p l e t e l y e a c h o f S u b s p a c e s I , I I I , a n d I V . S u b s p a c e I ( 2 1 5 n m - 2 9 9 n m ) I n S t e p 2 , w e s h o w e d t h a t L A D H a n d N A D H , w h i c h a b s o r b b e t w e e n 2 7 5 n m a n d 2 9 9 n m , d o n o t f i t a s l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r s i n E x p e r i — m e n t 1 . 1 . T h e r e f o r e , w e h a v e n o o u t s i d e i n f o r m a t i o n a b o u t t h e s t a t i c s p e c t r a o r c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f t h e t w o a b s o r b e r s i n S u b s p a c e 1 . H o w e v e r , w e c a n o b t a i n t h e r a n g e o f a c c e p t a b l e s h a p e s f o r t h e i r s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s b y a p p l y i n g t h e s o l u t i o n b a n d s f o r t w o a b s o r b e r s d e f i n e d i n C h a p t e r 3 , S e c t i o n D . R e - c a l l t h a t t h e s e s o l u t i o n b a n d s u s e t h e n o n n e g a t i v e d e f i - n i t e n e s s o f t h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s a n d t h e M a n a l y s i s e i g e n v e c t o r s t o d e f i n e t h e u p p e r a n d l o w e r b o u n d s o f t h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s , e a c h n o r m a l i z e d t o u n i t l e n g t h . F i g u r e “ . 3 2 A s h o w s t h e s o l u t i o n b a n d s f o r t h e f i r s t a b s o r b e r ' s n o r m a l i z e d s t a t i c s p e c t r u m , w h i c h m u s t f a l l o n o r b e t w e e n i l L a n d i l H ’ s y m b o l i z e d b y L a n d H , r e s p e c - t i v e l y . N o t e t h a t L a n d H c o r s s , a n d t h u s E I L i s n o t F i g u r e “ . 3 2 . 1 6 0 S o l u t i o n b a n d s f o r n o r m a l i z e d s t a t i c s p e c t r a i n S u b s p a c e I , E x p e r i m e n t 1 . 1 , L = i j L ’ A H = 2 5 H . A . F i r s t a b s o r b e r . E . S e c o n d a b s o r b e r . - n - f O - c _ — - ' O — h k P — _ — - n — ~ _ - P — ~ * ‘ m t 0 . 0 0 0 0 . 1 1 6 0 . 0 0 0 1 ( 2 7 5 n m ) ' 1 5 ( 2 9 9 n m ) l ( 2 7 5 I I I I r I I I I I I I I . p C I I C I I I I I V I I I I I I I I I l ' I I I l I I I I o I I I I I r I I I I ' I I I I i I I I I I I I I I O I I I I I I I I I g I I I I I V I I I I I I I I 4 . I I I ; I n m ) I ' - D — - — h — — . . . — o w ) . . . - A n n . . . ‘ I t . . . . . l W a v e l e n g t h C h a n n e l I p P ' - H _ u . ~ . fl ~ ’ m f w — - - ' M — ' \ 1 5 ( 2 9 9 n m ) W a v e l e n g t h C h a n n e l F i g u r e “ . 3 2 . 1 6 2 a l w a y s l e s s t h a n i l H ' T h i s i s a g e n e r a l s i t u a t i o n t h a t a l s o o b t a i n s f o r t h e c o n c e n t r a t i o n s o l u t i o n b a n d s E S L a n d n g . F r o m F i g u r e “ . 3 2 A w e s e e t h a t t h e a b s o r b a n c e o f t h e f i r s t a b s o r b e r i n I i s s t i l l i n c r e a s i n g w i t h d e c r e a s - i n g w a v e l e n g t h b e t w e e n c h a n n e l s 2 a n d l , a n d t h a t t h i s a b s o r b e r t h u s h a s i t s m a x i m u m a b s o r b a n c e a t a w a v e l e n g t h l e s s t h a n o r e q u a l t o 2 7 5 n m . F i g u r e “ . 3 2 8 s h o w s t h e s o l u t i o n b a n d s f o r t h e s t a t i c s p e c t r u m o f t h e s e c o n d a b s o r b e r i n S u b s p a c e I . T h e s e s o l u t i o n b a n d s a r e n o t a s i n f o r m a t i v e a s t h o s e f o r t h e f i r s t a b s o r b e r , s i n c e t h e y g i v e n o i n d i c a t i o n o f w h e r e t h e s e c o n d a b s o r b e r h a s i t s p e a k a b s o r b a n c e . F i g u r e s “ . 3 3 A a n d “ . 3 3 8 s h o w t h e s o l u t i o n b a n d s f o r t h e n o r m a l i z e d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e o f t h e f i r s t a n d s e c o n d a b s o r b e r s , r e s p e c t i v e l y , i n S u b s p a c e I . ( N o t e t h a t i n t h e s e f i g u r e s t h e t i m e a x i s i s l i n e a r i n s p e c t r u m n u m b e r , a n d n o t i n t i m e . ) T h e n o r m a l i z e d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s m u s t f a l l o n o r b e t w e e n é J L a n d é l H ’ s y m b o l i z e d b y L a n d H , r e s p e c t i v e l y . A c c o r d i n g t o F i g u r e “ . 3 3 A , . t h e f i r s t a b s o r b e r ' s c o n c e n t r a t i o n m a y g r o w a n d t h e n d e c a y ( H ) , d e c a y a n d t h e n g r o w ( L ) , o r r e m a i n c o n s t a n t ( a p o s - s i b i l i t y b e t w e e n L a n d H ) . A c c o r d i n g t o F i g u r e “ . 3 3 8 , t h e s e c o n d a b s o r b e r ' s c o n c e n t r a t i o n m u s t g r o w a n d t h e n d e c a y . S u b s p a c e I I I ( 3 8 5 A n m - “ 7 2 n m ) F i g u r e s “ . 3 “ a n d “ . 3 5 s h o w t h e s o l u t i o n b a n d s f o r t h e n o r m a l i z e d s t a t i c s p e c t r a F i g u r e “ . 3 3 . 1 6 3 S o l u t i o n b a n d s f o r n o r m a l i z e d s t a t i c s p e c t r a i n S u b s p a c e I , E x p e r i m e n t 1 . 1 , L = Q a L , H = é fi H ' A . F i r s t a b s o r b e r . B . S e c o n d a b s o r b e r . 0 . 0 3 3 ; - ~ - - * H = - - - - 4 - . . . ” . . . . - - " - " " . . . - $ ~ - ‘ 1 ‘ V = 9 ‘ ‘ - ‘ - ‘ l S p e c t r u m N u ‘ - . . ’ - . . . ‘ . . . . ‘ - - . . . 6 1 fl g m b 5 e r n I x n A £ I g L ‘ - . - - ‘ . J I 1 1 J J J J J . . J J J J J I I “ I I ! I I . I ‘ L I - I ‘ I I - ~ I J . J 1 J J S p e c t r u m N u m b e r I p I D I I I I I I I I I I I O I I I I I O I I I I I I I I I I o I I I I I H . ‘ ” 0 0 ‘ . - H ‘ . . . - O . . . ’ O . . . ~ O D O O ~ . ‘ - o g o V g 0 . 0 3 2 u n i u n I - I I u a n . I n I L L L L I I I I L “ I L I L I ' \ k l . - ' t u n ‘ I ‘ L I n t I L I t l I L L I t t ' ' J i - n n . . . ‘ _ - - - J I - - a n J I - u - n - n fi - n - n u - j i n n - n u n fl - n - n u l [ i n n - . g u p 0 . 0 0 0 J J J J J ~ : . J j J J . I 3 I I u p } . . . — - I ~ I ~ I F i g u r e “ . 3 3 . 1 6 5 a n d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f t h e t w o a b s o r b e r s i n S u b - s p a c e I I I . A c c o r d i n g t o F i g u r e n . 3 fl A , t h e f i r s t a b s o r - b e r ' s a b s o r b a n c e m a x i m u m i n t h i s s s u b s p a c e i s b e t w e e n 3 8 5 n m a n d N 0 3 n m ( w a v e l e n g t h c h a n n e l s 3 0 - 3 2 ) , a n d a c c o r d i n g t o F i g u r e H . 3 H B , t h e s e c o n d a b s o r b e r ' s a b s o r b a n c e m a x i m u m i s b e t w e e n D Z H n m a n d “ 5 9 n m ( w a v e l e n g t h c h a n n e l s 3 h - 3 7 ) . F r o m F i g u r e n . 3 5 A w e c a n n o t d e t e r m i n e w h e t h e r t h e f i r s t a b s o r b e r ' s c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e i s a b i p h a s i c d e c a y ( H ) o r a g r o w t h f o l l o w e d b y d e c a y ( L ) . F i g u r e n . 3 5 3 s h o w s t h a t t h e s e c o n d a b s o r b e r ' s c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e i s a r a p i d d e c a y . N D M A h a s a n a b s o r b a n c e m a x i m u m a t R h o n m , a n d a s a s u b s t r a t e i n t h e r e a c t i o n , m i g h t b e e x p e c t e d t o d e c a y r a p i d l y . T h e r e f o r e , N D M A i s a l i k e l y c a n d i d a t e f o r t h e s e c o n d a b s o r b e r i n S u b s p a c e I I I . F i g u r e n . 3 6 A s h o w s t h e M a n a l y s i s f i t o f t h e m e a s u r e d s t a t i c s p e c t r u m o f N D M A i n S u b s p a c e I I I , a n d w e c o n c l u d e t h a t N D M A i s t h e s e c o n d a b s o r b e r i n I I I . R e c a l l f r o m C h a p t e r 3 , S e c t i o n D , t h a t i n a t w o a b - s o r b e r s u b s p a c e , w h e n t h e s h a p e o f o n e a b s o r b e r ' s s t a t i c s p e c t r u m i s k n o w n , t h e s h a p e o f t h e o t h e r a b s o r b e r ' s c o n - c e n t r a t i o n p r o f i l e c a n b e c o m p u t e d d i r e c t l y . B y a s s u m i n g t h a t N D M A i s t h e s e c o n d a b s o r b e r , w e c o m p u t e t h e s h a p e o f t h e f i r s t a b s o r b e r ' s c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s h o w n i n F i g u r e h . 3 6 B f r o m t h e s h a p e o f i t s s t a t i c s p e c t r u m a n d t h e M a n a l y s i s e i g e n v e c t o r s . T h u s , t h e f i r s t a b s o r b e r i s a n i n t e r m e d i a t e t h a t g r o w s a n d d e c a y s . F i g u r e H . 3 U . 1 6 6 S o l u t i o n b a n d s f o r n o r m a l i z e d s t a t i c s p e c t r a i n S u b s p a c e I I I , E x p e r i m e n t 1 . 1 , L = i j L ’ H = f j H . A . F i r s t a b s o r b e r . B . S e c o n d a b s o r b e r . 3 0 ( 3 8 5 n m ) W a v e l e n g t h C h a n ( “ 7 2 n m ) 3 n 8 e l O 2 l 6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . s - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - J J J . J J J J J J J J J J J 1 J ; J O ' O 0 O J . . . . . . . . . . . . . . . , . . . g - - . . g . - . - s . - - . g . . - - § . - - - s - - - o \ o - - o ~ - - - - § - - - - $ - - - “ — - - - ‘ - ‘ ° - ‘ - ° ° " - ; - - - - - - - I - - - - - J 3 0 ( 3 8 5 n m ) 3 8 ( “ 7 2 n m ) W a v e l e n g t h C h a n n e l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ‘ Q o o o ‘ O O I O ‘ 0 - . . ‘ . . - - ‘ - . . - ‘ . O O O ‘ O - . 0 ‘ . . . . “ O u ‘ o c o o ’ o o o o ‘ o o u ‘ t o n o “ F i g u r e 4 . 3 ” . F i g u r e “ . 3 5 . 1 6 8 S o l u t i o n b a n d s f o r n o r m a l i z e d c o n c e n t r a — t i o n p r o f i l e s i n S u b s p a c e I I I , E x p e r i m e n t 1 . 1 , _ I g A ! S e c o n d a b s o r b e r . - — — — - . < — ~ — ~ . . . 8 . - . . . — P ~ h . I — — I I . h P I " — " 0 b . “ 1 6 9 0 . 0 0 0 S p e c t r u m N u m b e r 0 . 2 8 9 J . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J I n : l t t t t t K L L L L L L L L L L L L “ fi a t “ : u t h f n . . . . . . . . . 0 . 0 0 0 : . . . . . . . . é i x a b r x ~ a ' 1 ~ : * : * r . . e m e m a m h m S p e c t r u m N u m b e r F i g u r e u . 3 5 . F i g u r e “ . 3 6 . 1 7 0 A . M a n a l y s i s f i t o f t h e m e a s u r e d N D M A s t a t i c s p e c t r u m , S u b s p a c e I I I , E x p e r i m e n t 1 . 1 , X = m e a s u r e d , 0 = c a l c u l a t e d . V e r t i c a l s c a l e i n a r b i t r a r y a b s o r b a n c e u n i t s . B . C o n c e n t r a t i o n p r o f i l e o f t h e f i r s t a b - s o r b e r i n S u b s p a c e I I I , E x p e r i m e n t 1 . 1 . V e r t i c a l s c a l e i n a r b i t r a r y c o n c e n t r a t i o n u n i t s . s o O I . J I l I . l ? 1 0 o a ° 0 s o 0 o s o o 4 o - o o o o s o o n - - - s - - - - s - - - - - - - - - s u n s - « 4 - - - - - - - - - M o . o o o I 0 0 ° ~ . . 0 0 0 q . . 0 o o 0 o I I l \ I l . 0 0 1 5 8 l - . n . - : - - = - . - . : - . : - . - . s s t : n s - n - s - u - s - u - s - u - 2 0 . 3 5 6 0 . 1 3 8 l . U 3 u u u u u u n u u - 1 7 1 l h U . . 3 0 ( 3 8 5 n m ) 3 8 ( 4 7 2 n m ) W a v e l e n g t h C h a n n e l S p e c t r u m N u m b e r F i g u r e ” . 3 6 . 1 7 2 W e s t i l l d o n o t h a v e t h e s h a p e s o f t h e f i r s t a b s o r b e r ' s s t a t i c s p e c t r u m a n d t h e s e c o n d a b s o r b e r ' s ( N D M A ) c o n c e n - t r a t i o n p r o f i l e . W e n o t e , h o w e v e r , f r o m F i g u r e H - 3 5 8 t h a t t h e s e c o n d a b s o r b e r ' s ( N D M A ) c o n c e n t r a t i o n d o e s n o t s i g n i f i c a n t l y c h a n g e d u r i n g t h e l a s t 1 6 c o n s e c u t i v e s p e c t r a , w h e r e a s F i g u r e “ . 3 6 8 s h o w s t h a t t h e f i r s t a b - s o r b e r ' s c o n c e n t r a t i o n c h a n g e s d u r i n g t h e l a s t 1 6 c o n s e c u — t i v e s p e c t r a . F u r t h e r m o r e , a n S a n a l y s i s o f t h e l a s t 1 6 s p e c t r a i n S u b s p a c e I I I g i v e s a n e s s e n t i a l r a n k 3 o f o n e , w h i c h s u p p o r t s o u r o b s e r v a t i o n t h a t o n l y o n e a b s o r b e r c h a n g e s c o n c e n t r a t i o n i n t h e s e s p e c t r a . A s s u m i n g t h a t t h e f i r s t a b s o r b e r c h a n g e s c o n c e n t r a t i o n d u r i n g t h e l a s t 1 6 s p e c t r a , w e o b t a i n i t s s t a t i c s p e c t r a l s h a p e f r o m t h e f i r s t e i g e n v e c t o r o f § W b y t h e e q u a t i o n : 1 = £ 6 1 § ( l ) ' W e o b t a i n t h e c o n t r i b u t i o n o f t h e f i r s t a b s o r b e r t o a l l o f S u b s p a c e I I I b y p e r f o r m i n g a n M a n a l y s i s f i t o f § 7 1 § ( 1 ) t o a l l 6 1 c o n s e c u t i v e s p e c t r a . T h e r e s u l t s a r e s h o w n i n F i g u r e H . 3 7 A . N o t e t h a t t h e f i r s t a b s o r b e r h a s i t s m a x i - m u m a b s o r b a n c e a t 3 9 “ n m ( w a v e l e n g t h c h a n n e l 3 1 ) . T h e c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e o f N D M A ( t h e s e c o n d a b s o r b e r ) c a n b e c o m p u t e d d i r e c t l y f r o m t h e s t a t i c s p e c t r u m o f t h e f i r s t a b s o r b e r , a n d i s s h o w n i n F i g u r e “ . 3 7 8 . T h u s , w e h a v e u s e d t h e t w o a b s o r b e r s i m p l i f i c a t i o n s t o r e s o l v e S u b s p a c e I I I i n t o t h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s d i s p l a y e d i n F i g u r e s “ . 3 6 a n d ” . 3 7 . S u b s p a c e I V ( 3 8 5 n m - 5 8 4 n m ) S u b s p a c e I V s h a r e s o n e o f i t s t w o a b s o r b e r s w i t h S u b s p a c e I I I ( s e e F i g u r e “ . 3 1 ) . F i g u r e H . 3 7 . 1 7 3 A . M a n a l y s i s f i t o f t h e f i r s t a b s o r b e r ' s s t a t i c s p e c t r u m , S u b s p a c e I I I , E x p e r i m e n t 1 . 1 . X = 9 : 1 1 3 “ ) f r o m l a s t 1 6 c o n s e c u t i v e s p e c t r a , 0 = c a l c u l a t e d M a n a l y s i s f i t u s i n g a l l 6 1 c o n s e c u t i v e s p e c t r a . V e r t i c a l s c a l e i n a r b i t r a r y a b s o r b a n c e u n i t s . B . C o n c e n t r a t i o n p r o f i l e o f N D M A i n E x p e r i — m e n t 1 . 1 . V e r t i c a l s c a l e i n a r b i t r a r y c o n - c e n t r a t i o n u n i t s . 3 0 ( 3 8 5 n m ) W a v e l e n g t h C h a n ( “ 7 2 n m ) 3 n 8 e l 3 o u 0 O J a - - . ’ . . . . ’ . . ' " ‘ " " ' " " " " ‘ ° “ 4 - " d o n - s o » 1 7 “ 0 . 1 9 “ l 1 i i " J ! i . i i j i 0 . 0 1 6 I . . . ’ J - ” J . . 0 . 0 ~ O O O . . O 0 . 0 5 9 - . ° ! ° ' ! ' - ° 2 ' ° 2 ° - 2 ‘ - 2 ' - ’ 2 ~ ! " . r ~ r . . 2 1 6 1 _ - n v S p e c t r u m N u m b e r F i g u r e “ . 3 7 . 1 7 5 S i n c e w e h a v e o b t a i n e d t h e c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f b o t h a b s o r b e r s i n I I I , w e n e e d t o o b t a i n f r o m I V o n l y t h e c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e o f t h e a b s o r b e r i t d o e s n o t s h a r e w i t h I I I . W a v e l e n g t h c h a n n e l s “ “ t h r o u g h “ 7 ( 5 5 0 n m - 5 8 “ n m ) i n E x p e r i m e n t 1 . 1 s h o w t h e g r o w t h a n d d e c a y o f a b s o r b a n c e p r e v i o u s l y o b s e r v e d b y t w o o t h e r g r o u p s o f i n v e s t i g a t o r s ( S c h a c k a n d D u n n ( 1 9 7 2 ) , a n d S u e l t e r g t a 1 . ( 1 9 7 5 ) ) . B o t h g r o u p s a t t r i b u t e d t h i s t o a t r a n s i e n t i n t e r - m e d i a t e . A n M a n a l y s i s o f w a v e l e n g t h c h a n n e l s “ “ - “ 7 s h o w s t h a t t h e s e c h a n n e l s h a v e t w o l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r — b e r s ( m = 2 ) . H o w e v e r , t h e s y s t e m a t i c e r r o r s a r e s m a l l f o r r e c o n s t r u c t i n g t h e e x p e r i m e n t a l a b s o r b a n c e a t t h e s e w a v e — l e n g t h c h a n n e l s w i t h o n l y o n e e i g e n v e c t o r o f M W , a n d t h u s w a v e l e n g t h c h a n n e l s “ “ - “ 7 h a v e o n l y a s m a l l c o n t r i b u t i o n f r o m t h e s e c o n d a b s o r b e r . F i g u r e “ . 3 8 s h o w s t h e s o l u t i o n b a n d s f o r t h e n o r m a l i z e d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f t h e t w o a b s o r b e r s i n c h a n n e l s “ “ - “ 7 . T h e n o r m a l i z e d c o n c e n — t r a t i o n p r o f i l e o f t h e f i r s t a b s o r b e r i s w e l l d e f i n e d i n F i g u r e “ . 3 8 A , b u t t h e n o r m a l i z e d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e o f t h e s e c o n d a b s o r b e r , s h o w n i n F i g u r e “ . 3 8 8 , i s p o o r l y d e f i n e d , a n d c o n t a i n s m o s t l y r a n d o m n o i s e . T h u s , t h e f i r s t a b s o r b e r i s t h e p r e d o m i n a n t a b s o r b e r , a n d t h e s e c o n d a b s o r b e r i n c h a n n e l s “ “ - “ 7 a b s o r b s b a r e l y a b o v e t h e l e v e l o f t h e r a n d o m e x p e r i m e n t a l e r r o r s . F i g u r e “ . 3 8 . 1 7 6 S o l u t i o n b a n d s f o r n o r m a l i z e d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s i n w a v e l e n g t h c h a n n e l s “ “ - “ 7 , E x - = " v . “ v p e r i m e n t 1 . 1 , L E J L ’ H E J H ' A . F i r s t a b s o r b e r . B . S e c o n d a b s o r b e r . 0 . 0 2 8 C o o " . - . " I t N t I J ‘ ( j j J - . l 1 ‘ a - . - - - 0 . 0 0 0 A . _ 2 . v % - ‘ v ‘ v 0 I L I n o ' 0 L G ' . v L . I . = . D C L O “ ‘ t O u L ‘ L = t I t t u t L I . . I n . t " v ‘ L ” v ' . ‘ I N I . L U = L . “ 3 a . ' I t I I o n t v " L L ‘ I ; . I u % — " 0 ‘ L I t ‘ o p L . . L 1 ' L k ‘ - L I L I i 0 . t ‘ . l 0 . L ! . $ 5 : ‘ ‘ 2 S S ‘ . $ - - 5 - - . 5 , 1 J ‘ J ‘ I . . L l p S ‘ v — w ' ‘ o . o - ‘ o - - o ’ o o ' o ‘ fi v o o ‘ o o . o ‘ u o o - 5 S p e c t r u m N u m b e r . 0 ‘ . . . . ‘ . - . . ‘ . 0 . . ‘ - . . . ~ . o . - ‘ o o o o ’ o o o o ‘ . . - . . . . . o ‘ o o o 0 ‘ 0 0 . . . O . O I ’ O O O O ‘ O D O O ‘ O O O Q ‘ O O O O ‘ O O O O ‘ O O O O ‘ . . . o ‘ 0 . 0 6 1 [ 3 I i l . . 1 4 ' I J t I . I : r ‘ o b t t k t h I ‘ " * . a ‘ u u ‘ t l u t u t 5 ; u 4 ‘ L ‘ 1 I u 9 . fi t “ ! I n “ . J ” : t t u n I . . . k t i l l . a J I . i t . . u n ” . “ . ' " u u g u t 0 . 0 0 0 . . , . = = _ ' 4 _ _ ' _ _ 1 S p e c t r u m n u m b e r F i g u r e “ . 3 8 . 1 7 8 M . P r i n c i p a l C o m p o n e n t A n a l y s i s , S t e p 7 I n S t e p 7 w e u s e t h e c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o b t a i n e d i n S t e p 6 f r o m S u b s p a c e s I , I I I , a n d I V o f E x p e r i m e n t 1 . 1 t o r e s o l v e t h e w h o l e e x p e r i m e n t . S p e c i f i c a l l y , t h e g o a l i s t o e s t i m a t e a l l f i v e c o l u m n s o f t h e r o t a t i o n m a t r i x ' V f o r t h e w h o l e e x p e r i m e n t . T h e w h o l e e x p e r i m e n t i s t h e n r e s o l v e d i n t o t h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n p r o - f i l e s o f i t s f i v e l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r s . W h e n f i t t o t h e M a n a l y s i s e i g e n v e c t o r s f o r t h e e w h o l e e x p e r i m e n t , e a c h c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e f r o m S u b s p a c e s I , I I I , a n d I V g i v e s o n e c o l u m n o f V , I n S t e p 6 w e r e s o l v e d S u b s p a c e I I I t o o b t a i n t h e c o n - c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f N D M A a n d a n i n t e r m e d i a t e w i t h m a x i m u m a b s o r b a n c e a t 3 9 “ n m . T h e s o l u t i o n b a n d s f o r t h e f i r s t a b s o r b e r i n w a v e l e n g t h c h a n n e l s “ “ - “ 7 o f S u b - s p a c e I V a l m o s t d e f i n e i t s n o r m a l i z e d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e . W e t a k e t h e n o r m a l i z e d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e o f t h e f i r s t a b s o r b e r i n c h a n n e l s “ “ - “ 7 t o b e é l L i n F i g u r e “ . 3 8 A . F r o m s u b s p a c e I w e h a v e o n l y t h e e x t r e m a s h o w n i n F i g u r e “ . 3 3 f o r t h e n o r m a l i z e d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f i t s t w o a b s o r b e r s . F i g u r e “ . 3 9 s h o w s t h e s t a t i c s p e c t r a l i n f o r m a t i o n o b t a i n e d t o t h i s p o i n t i n t h e p r o c e d u r e f o r t h e f i v e l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r s i n E x p e r i m e n t 1 . 1 . T h e n u m b e r i n g s y s t e m f o r t h e f i v e a b s o r b e r s i s : ) m n 4 9 5 ( 7 4 ) m n 2 7 4 ( 8 3 ) m n 6 7 3 ( l 9 e 2 n n a h C h t g n e l e ) v m a n 9 W 9 2 ( 5 1 ) m n 5 7 2 ( 1 a a u q u o s q v F i g u r e “ . 3 9 . S u m m a r y o f s t a t i c s p e c t r a l i n f o r m a t i o n o b t a i n e d f r o m S u b s p a c e I , I I I , a n d I V , E x p e r i m e n t 1 . 1 . 1 7 9 1 8 0 A b s o r b e r 1 - - f i r s t a b s o r b e r i n S u b s p a c e I A b s o r b e r 2 - - s e c o n d a b s o r b e r i n S u b s p a c e I A b s o r b e r 3 - — f i r s t a b s o r b e r i n S u b s p a c e I I I A b s o r b e r “ - - s e c o n d a b s o r b e r i n S u b s p a c e I I I ( N D M A ) A b s o r b e r 5 - - f i r s t a b s o r b e r i n w a v e l e n g t h c h a n n e l s u u - u 7 W e u s e t h e k n o w n c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s t o e s t i m a t e d i r e c t l y c o l u m n s o f V _ a n d c o n s i d e r o n l y t h e e x t r e m a f o r t h e u n k n o w n c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s . T h u s , w e f i t t h e c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s f o r A b s o r b e r s 3 , “ , a n d 5 t o t h e M a n a l y s i s e i g e n v e c t o r s f o r t h e w h o l e e x p e r i m e n t t o e s t i - m a t e c o l u m n s 3 , “ , a n d 5 o f Z , F r o m e a c h o f t h e e x t r e m a A 3 1 L a n d § 1 H V ( F i g u r e “ . 3 3 A ) f o r t h e c o n c e n t r a t i o n p r o - f i l e s o f A b s o r b e r l w e e s t i m a t e t h e c o r r e s p o n d i n g e x t r e m a f o r c o l u m n 1 o f V , S i m i l a r l y , t h e t w o e x t r e m a f o r A b - s o r b e r 2 , § 2 L a n d § 2 H ( F i g u r e “ . 3 3 B ) g i v e t w o e x t r e m a f o r c o l u m n 2 o f X , W e h a v e , t h e n , f o u r e s t i m a t e s o f V c o r r e s p o n d i n g t o e a c h o f t h e f o u r p e r m u t a t i o n s o f k n o w n c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s w i t h t h e e x t r e m a f o r A b s o r b e r s l a n d 2 ; i . e . , ( £ 1 1 , : é é L ’ £ 3 : 2 1 ; : £ 5 ) : ( £ 1 1 3 E H : £ 3 9 . 6 4 4 : 2 5 ) : A A ! A A A A t A ! A A ( 9 . 1 5 . 1 : 9 ' 2 H ’ 9 . 3 : 9 1 4 : 9 . 5 ) : a n d ( 2 1 H : 2 2 H : 2 3 : £ 1 4 , 3 5 ) . E q u a t i o n ( 3 . 1 3 ) g i v e s a n e s t i m a t e o f t h e r o t a t i o n m a t r i x 1 8 1 g _ c o r r e s p o n d i n g t o e a c h e s t i m a t e o f V , a n d E q u a t i o n ( 3 . 9 ) g i v e s f r o m e a c h e s t i m a t e o f y ' a n e s t i m a t e d s t a t i c s p e c t r a m a t r i x F f o r t h e w h o l e e x p e r i m e n t . I n s u m m a r y , a l l f o u r c o m b i n a t i o n s o f c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s g i v e t h e s a m e s t a t i c s p e c t r a f o r A b s o r b e r s 3 , “ , a n d 5 . T h u s , o u r e s t i m a t e s f o r t h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f A b s o r b e r s 3 , “ , a n d 5 a r e i n - s e n s i t i v e t o A b s o r b e r s l a n d 2 o v e r t h e r a n g e o f e x t r e m a f o r t h e c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f A b s o r b e r s l a n d 2 . T h e c o m b i n a t i o n s ( E I L ’ 9 2 H ’ 3 3 , g “ , 3 5 ) a n d ( E I H ’ 3 2 H ’ 9 3 , g ” , 9 5 ) g i v e f o r A b s o r b e r l a p h y s i c a l l y u n r e a s o n a b l e s t a t i c s p e c t r u m t h a t m a k e s l a r g e c o n t r i b u t i o n s o f n e g a t i v e a b s o r b a n c e ( - 0 . 2 O . D . ) t o w a v e l e n g t h c h a n n e l s 1 7 - 2 “ i n E x p e r i m e n t 1 . 1 . T h e c o m b i n a t i o n s ( E I L ’ 9 2 L ’ £ 3 , 9 “ , 3 5 ) a n d ( E I H ’ 9 2 L ’ 2 3 , g “ , 3 5 ) g i v e p h y s i c a l l y r e a s o n a b l e r e s u l t s ( i ; § ; 9 n o n n e g a t i v e s t a t i c s p e c t r a ) . T h e s t a t i c s p e c t r a f o r t h e s e t w o c o m b i n a t i o n s a r e s h o w n i n F i g u r e “ . “ 0 , w h e r e t h e s t a t i c s p e c t r a o f A b s o r b e r s 3 , “ , a n d 5 a r e s h o w n o n l y o n c e s i n c e t h e y a r e t h e s a m e f o r b o t h c o m b i n a t i o n s . T a b l e “ . 1 0 l i s t s t h e m a t r i c e s V _ a n d g f o r t h e c o m b i n a - t i o n ( E l L ’ 9 2 L ’ 9 3 , g “ , 9 5 ) p l u s t h e e i g e n v a l u e s u s e d i n E q u a t i o n ( 3 . 1 3 ) t o c a l c u l a t e g f r o m V , T h e J ' t h c o l u m n o f V _ w a s e s t i m a t e d f r o m t h e c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e f o r t h e J ' t h a b s o r b e r , a n d t h e J ' t h c o l u m n o f g c o r r e s p o n d s t o t h e r e s u l t a n t s t a t i c s p e c t r u m o f t h e J ' t h a b s o r b e r . T a b l e “ . 1 1 l i s t s y _ a n d _ q f o r t h e c o m b i n a t i o n ( E I H ’ 9 — 2 ' L ’ 3 5 ” ' ' 1 2 " ' 0 0 0 1 7 x 7 8 “ 6 8 9 6 8 5 1 0 “ 3 5 8 u 0 9 7 9 2 5 2 2 1 . . . 5 5 0 7 8 8 2 0 l “ 1 5 1 7 2 6 6 . . . . . - “ 5 3 1 1 1 — - A ( n o i t a n ‘ " ‘ ‘ ‘ 1 2 1 l 1 i b m o C ) 5 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 3 2 1 2 “ x 8 2 x x “ 2 3 x x u 7 1 6 l 2 8 l 1 1 1 8 3 . u 5 . . . . 9 9 1 1 “ 0 3 2 0 5 1 3 u 1 9 5 0 6 “ 8 1 2 6 3 “ 7 0 “ 2 5 0 . ( 1 . . . . - - - Q 7 5 - 5 8 — - - x i 0 r 1 t X a 8 1 l l M 7 " " " e 1 1 5 5 7 3 6 3 0 7 o 0 1 1 u x 3 6 8 2 1 “ < < l 7 0 6 6 0 8 5 . > > a 0 7 1 . . . . . 1 8 0 3 7 v 3 1 8 3 5 0 2 1 0 8 n 2 8 “ 3 = “ 1 9 0 7 2 e 3 3 “ 1 1 1 1 9 1 g . . . . - . i w 5 7 7 l 5 E 1 - - d n a U , V s 1 ' 0 0 6 1 1 8 2 6 5 9 x x 8 1 “ 5 3 9 1 0 5 8 2 7 8 “ “ 2 5 3 6 6 “ E . . . . . e 3 2 " 0 3 u 0 9 1 0 8 “ 9 c 0 o 0 6 5 6 0 9 7 0 0 7 “ i 1 1 1 . “ 6 8 “ 6 5 2 1 l - r x x x . . . . . - t 2 9 2 ) 9 3 1 2 “ a 5 5 9 - s M 8 9 3 e 7 5 0 n w 0 0 9 o . . . e i 1 1 6 y t a - g t v o 2 1 ‘ ‘ 0 0 1 1 1 x x R g o 7 u 8 7 6 1 . 0 1 u 5 9 u 3 3 7 7 2 5 2 2 6 1 8 u 9 5 9 3 1 . . . . . . 9 8 5 7 5 “ e l b a T - - ” 2 ” 3 2 w “ = “ . 3 “ 3 “ 0 X 1 0 2 ' 9 1 L , 1 1 1 2 E u u > l - 1 1 1 - 3 B a 2 5 2 2 3 . 8 0 2 1 7 . 7 5 3 6 7 - 1 0 5 . 1 1 0 - 8 1 . 6 5 “ 6 - 3 “ . 5 1 7 “ 5 9 . 6 1 5 1 6 . 6 7 2 6 . g d n a V s e c i r t a M n o i t a t o R 1 . 1 t n e m i r e 3 3 p X a 2 a x E ) 5 § . 0 . 1 ) . 0 “ 1 , . u § , 3 § , H é e “ l b e a l 1 l T b 8 7 3 2 “ a T 3 6 1 9 9 n “ 6 “ “ 9 i ( § 2 2 . . . . 2 . , L i Q ( n o i t a n i b m o C . 1 X a “ 9 7 6 3 . s 1 6 7 3 6 2 a 3 2 1 - - 1 2 2 1 3 - ‘ - - ’ e 0 o 0 0 0 r ) 1 a l 1 1 1 e “ m 1 a 1 s 0 u e . h 1 t = x x x x x 1 8 3 0 6 1 6 b X “ 8 “ 5 7 2 7 3 3 “ 7 9 l “ “ 5 5 l 0 8 “ 1 . . . . . . 1 2 2 3 2 c a “ e l - - - - b = = a T T ( e s e h l T g v 2 a b 1 1 s . n “ m u e l l o b 2 1 S T 3 ? 1 8 3 1 8 “ 3 3 , g ” , 3 5 ) . N o t e t h a t c o l u m n s 2 t h r o u g h 5 o f V _ a r e t h e s a m e i n T a b l e s “ . 1 0 a n d “ . 1 1 s i n c e t h e c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s a s s u m e d f o r A b s o r b e r s 2 t h r o u g h 5 a r e t h e s a m e f o r t h e t w o c o m b i n a t i o n s . N o t e a l s o t h a t c o l u m n s 3 t h r o u g h 5 o f g a r e t h e s a m e i n T a b l e s “ . 1 0 a n d “ . 1 1 s i n c e b o t h c o m b i n a t i o n s o f c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s g i v e t h e s a m e s t a t i c s p e c t r a f o r A b s o r b e r s 3 , “ , a n d 5 . C h a n g i n g t h e c o n c e n - t r a t i o n p r o f i l e o f A b s o r b e r 1 f r o m c ' i n T a b l e “ . 1 0 t o - 1 L i n T a b l e “ . 1 1 c h a n g e s t h e s h a p e o f t h e s t a t i c s p e c t r u m 1 1 H o f A b s o r b e r 2 ( 2 2 i s d i f f e r e n t ) , b u t c h a n g e s 2 1 b y o n l y C a c o n s t a n t m u l t i p l e f a c t o r ; 1 1 2 ; : t h e s h a p e o f t h e s t a t i c s p e c t r u m f o r A b s o r b e r l i s t h e s a m e f o r b o t h c o m b i n a t i o n s . N o t e i n F i g u r e “ . “ 0 t h a t A b s o r b e r “ h a s , i n a d d i t i o n t o t h e “ “ 0 n m a b s o r b a n c e m a x i m u m o f N D M A , a s h o u l d e r w i t h a m a x i m u m n e a r 3 “ 0 n m . T h u s , a s d i s c u s s e d i n S e c t i o n H , A b s o r b e r “ r e p r e s e n t s N D M A a n d N A D H 3 “ 0 n m i n E x p e r i m e n t 1 . 1 . A b s o r b e r 3 h a s a m a x i m u m a b s o r b a n c e a t “ 0 3 n m a n d a s h o u l d e r w i t h a m a x i m u m n e a r 3 2 0 n m . A b s o r b e r 5 h a s t w o a b s o r b a n c e m a x i m a , o n e a t 3 2 0 n m , a n d a n o t h e r b r o a d b a n d c e n t e r e d n e a r 5 5 0 n m . F i g u r e “ . “ 1 s h o w s t h e c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s f o r t h e c o m b i n a t i o n s ( E I L ’ 9 2 L ’ 9 3 , 9 “ ’ £ 5 ) a n d ( E I H ’ 9 2 L ’ 9 3 , g “ , 9 5 ) . ( N o t e t h a t t h e t i m e s c a l e i s l i n e a r w i t h t i m e . ) F i g u r e “ . “ 2 s h o w s t h e e a r l y t i m e p o r t i o n o f t h e s e c o n c e n - t r a t i o n p r o f i l e s . N o t e t h a t A b s o r b e r “ ( N D M A ) r a p i d l y d e c a y s t o z e r o c o n c e n t r a t i o n a n d t h a t d u r i n g t h e s a m e t i m e A b s o r b e r 3 u n d e r g o e s a n i n i t i a l b u r s t t o i t s m a x i m u m 1 8 5 F i g u r e “ . “ 0 . S t a t i c s p e c t r a o f A b s o r b e r s 1 - 5 i n E x p e r i - m e n t 1 . 1 , E 7 . 3 9 N 1 5 0 8 1 3 “ ’ ( N ) w i t h ( E + S ) , s c a l e d t o m a x i m u m a b s o r b a n c e i n t h e e x p e r i - m e n t . A . A b s o r b e r s 1 a n d 2 f r o m g i L , é é L ' B . A b s o r b e r s l a n d 2 f r o m § 1 H ’ § 2 L ' C . A b s o r b e r s 3 , “ , a n d 5 . E C N A B R O S B A . X A W 2 . 0 0 . I " . . . . . . I I t I n u a 1 8 6 2 . 1 . . ‘ . . o 3 . c o o w I u . z . : \ l . - " " O o u . . - o x \ . . . . . . ~ 1 . . . . o a I n 2 . . . " D o . . - " - . . . - - ' ' I e n c l ' - x < x o . c . . 2 a D . - " " " " " " ' - " ? " " ‘ . " - - . . . . . . . . - - o - a . . - . . - _ 1 - - _ — J — — _ . . _ L — ¥ — _ ~ l . 0 * A . . — - — g ~ _ _ i _ ~ 5 . 0 8 0 2 . 3 . . $ . 0 0 ! H A V E L E N S ' N ( N R ) N A V E L E N G ' N ( N H ) x u ' 2 I ' 2 1 0 0 ' u . . . I O . . u ‘ 2 " . . . . : q . . . . ¢ . o a g N . . 0 . ' ~ " - . ' < u o I D I t ' o ‘ O x f ” / 7 - b e . . . ’ . . . . _ . ‘ é . . 0 3 . . . v - . . . . . . . . , ” , . - - . - I . I I I ‘ . . I . u a v u i n m u u m ) n o . 7 F i g u r e “ . “ 0 - F i g u r e “ . “ l . 1 8 7 C o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f A b s o r b e r s 1 - 5 i n E x p e r i m e n t 1 . 1 , E 7 . 3 9 N 1 5 . O S 1 3 “ ’ ( N ) w i t h ( E + S ) , f u l l t i m e c o u r s e . A . A b s o r b e r s l a n d 2 , 8 ' 8 ' , - l L ’ - 2 L ' B . A b s o r b e r s l a n d 2 , A " t n g ’ 9 2 L ° C . A b s o r b e r s 3 , “ , a n d 5 . N O l Y A fl Y N E C N O C I U I I I A M I N O l T A E T N E C N O C - N C l 0 I 0 5 O D 1 8 8 2 . 5 . . ' g . . . . o o o o I - o . — . . . . k z f . o . . . . . . . . . . . o . . . n n E . ' w ! u z . J U C x 3 I x I < i = \ \ z o . . — ‘ \ e u . . ( K c ‘ . . , _ . . . _ z . . ' w ‘ 5 . . . u o . . . " . . . _ 2 _ . . ‘ . _ . . _ . g ' - a - . . . . . . . . - u 9 . 0 U 4 1 x _ n — — — - 4 — - 1 — _ . _ _ . _ _ b _ 1 _ _ _ — — — - — - — - L — ~ — ‘ — ‘ — ~ J - 1 . 3 . ! I . I . D 1 . 9 0 9 I D . Y I N ! ‘ S E C O N D S ) ‘ I H E ( S E C O N D S ) . 2 ' 3 n o I ) . 3 . 3 3 0 ’ 1 o : I < I : _ o z w . ‘ ; " . . — — . - - n o n n o . o o - a u . . - o u \ x . . . - D ' - 3 ' o D n ) - . . I . . x ‘ . . < x C \ z u _ [ \ q < . - 5 I M x = . - 3 S . . . . z . ' ° - - . . o u 0 . . . . 1 I _ 1 - . . I D O 1 . . . . 1 1 " ! ( S E C O N D S ) n o ’ 3 F i g u r e “ . “ 1 . 1 8 9 F i g u r e “ . “ 2 . C o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f A b s o r b e r s 1 — 5 i n E x p e r i m e n t 1 . 1 , E 7 . 3 9 N 1 5 . O S 1 3 “ ’ ( N ) w i t h ( E + S ) , e a r l y t i m e c o u r s e . A A ' A . A b s o r b e r s 1 a n d 2 , 9 1 L ’ 3 2 L ' A . ' B . A b s o r b e r s l a n d 2 , n g ’ 3 2 L . C . A b s o r b e r s 3 , “ , a n d 5 . ( _ . ~ . . - - - | ’ " ' ' N O I J V U I N J D N O Q I fl I I X V H I N O I l V U J N B J N O J é N O I L V U J N B J N O D u n u l x v u l u 0 1 1 v a l w a a n o a O ' O O O ' c t r a o - e : r V r ‘ l T I v x t I l u B ) S 3 3 0 I N I O i ( S r - T r “ 1 T _ 1 T F - { . ‘ 0 0 0 ; % 0 . 0 r 0 0 - 1 2 I I r t ’ l I l l i t J I I I I [ I I I I I I v r ‘ ) 5 3 3 0 N O S ( 9 . 1 0 . r 3 0 “ . . . . 0 . 0 . 0 . 0 0 O o o o o N 0 | 1 V U 1 N 3 3 N 0 3 H n H I X V H / N O I L V U A N 3 3 N 0 3 . ' 0 0 0 r : I t I 1 t 1 r t r I I ‘ t I I I r I t I t I ! T l ° z n ° n a J n S I g ( s a u o a a s ) a u x ; c o o - s 0 0 2 ' . . O C O O O O 0 . 0 . 0 . 0 0 0 . . . “ 4 . 0 8 ' 8 J O O 6 0 g C C O N O 6 I 1 9 1 c o n c e n t r a t i o n , f r o m w h i c h i t s l o w l y d e c a y s t o z e r o c o n - c e n t r a t i o n . A b s o r b e r 5 i s a n i n t e r m e d i a t e w i t h a f a s t g r o w t h c o r r e s p o n d i n g t o t h e r a p i d d e c a y o f N D M A , f o l l o w e d b y a s l o w e r g r o w t h t o i t s m a x i m u m c o n c e n t r a t i o n , f r o m w h i c h i t d e c a y s t o z e r o c o n c e n t r a t i o n . T h u s , d e s p i t e i n c o m p l e t e i n f o r m a t i o n a b o u t A b s o r b e r s l a n d 2 , w e h a v e o b t a i n e d t h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n - t r a t i o n p r o f i l e s o f A b s o r b e r s 3 , “ , a n d 5 a c r o s s t h e e n t i r e s p e c t r a l r a n g e o f E x p e r i m e n t 1 . 1 . S i n c e E x p e r i m e n t s 2 . 1 , 3 . 1 , a n d “ . 1 a r e l i k e l y t o h a v e s o m e a b s o r b e r s i n c o m m o n w i t h E x p e r i m e n t 1 . 1 , w e n o w r e s o l v e t h e s e E x p e r i m e n t s u s i n g t h e s t a t i c s p e c t r a l i n f o r m a t i o n f r o m E x p e r i m e n t 1 . 1 . N . R e s o l u t i o n o f E x p e r i m e n t s 2 . 1 , , 3 . l , a n d “ . l I n t h i s s e c t i o n w e u s e t h e s t a t i c s p e c t r a o b t a i n e d f o r A b s o r b e r s 1 t h r o u g h 5 i n E x p e r i m e n t 1 . 1 ( F i g u r e “ . “ 0 ) t o r e s o l v e E x p e r i m e n t s 2 . 1 , 3 . 1 , a n d “ . 1 . E a c h s t a t i c s p e c t r u m f r o m E x p e r i m e n t 1 . 1 t h a t f i t s t h e M a n a l y s i s e i g e n v e c t o r s o f o n e o f t h e s e e x p e r i m e n t s m a y b e c o u n t e d a s b e l o n g i n g t o a n a b s o r b e r i n t h a t e x p e r i m e n t . E x p e r i m e n t 2 . 1 . F i g u r e “ . “ 3 s h o w s t h e M a n a l y s i s f i t s o f t h e s t a t i c s p e c t r a o f A b s o r b e r s 3 , “ , a n d 5 o b t a i n e d f r o m t h e a n a l y s i s o f E x p e r i m e n t 1 . 1 . T h e t w o c o m b i n a t i o n s o f s t a t i c s p e c t r a f o r A b s o r b e r s l a n d 2 f r o m F i g u r e “ . “ 3 . 1 9 2 M a n a l y s i s f i t s o f A b s o r b e r s 3 , “ , a n d 5 t o E x p e r i m e n t 2 . 1 , E 7 3 9 N 1 5 0 8 1 3 “ ’ ( N + S ) w i t h ( E ) . V e r t i c a l s c a l e s i n a r b i t r a r y a b s o r b a n c e u n i t s . A . A b s o r b e r 3 . B . A b s o r b e r “ . C . A b s o r b e r 5 . . u . g — . — _ — — . _ — ~ — — — “ - . . o C 0 fi . o - — . O _ o a - n ~ - . o . . - n - . . - . . . ~ - — — - — ~ I I O o - ‘ . I I ‘ _ I - . 1 2 9 . 0 0 5 . 2 1 “ . 0 0 9 . 0 3 7 . 0 0 0 1 9 3 W a v e l e n g t h C h a n n e l i n J “ I I I 8 3 I l g I . I . 1 ' . 8 9 1 § fi 2 " 3 ” _ . " 3 3 3 ; l W a v e l e n g t h C h a n n e l “ 7 [ i n i - 3 . i i I . , I I x I I i . " . I J I h “ 1 3 2 % ? ‘ . ' . ' . 7 _ ' : f . 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F i g u r e “ . “ “ s h o w s t h e c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f A b - s o r b e r s 3 , “ , a n d 5 i n E x p e r i m e n t 2 . 1 . N o t e t h a t t h e c o n - c e n t r a t i o n p r o f i l e s f o r t h e s e a b s o r b e r s a r e n e a r l y i d e n t i - c a l i n E x p e r i m e n t s 1 . 1 a n d 2 . 1 . R e c a l l t h a t E x p e r i m e n t s 1 . 1 a n d 2 . 1 h a v e t h e s a m e i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s , b u t d i f f e r e n t p r e m i x i n g o r d e r s o f s u b s t r a t e s a n d e n z y m e ( T a b l e “ . l ) . T h u s w e c o n c l u d e t h a t i n t h e s e e x p e r i m e n t s L A D H a n d N D M A d o n o t r e a c h w i t h o u t N A D H i n a w a y t h a t m e a s u r - a b l y a l t e r s t h e c o u r s e o f t h e r e a c t i o n a f t e r N A D H i s a d d e d . E x p e r i m e n t 3 , 1 . F i g u r e “ . “ 5 s h o w s t h e M a n a l y s i s f i t s o f t h e s t a t i c s p e c t r a o f A b s o r b e r s 3 , “ , a n d 5 , o b t a i n e d f r o m t h e a n a l y s i s o f E x p e r i m e n t 1 . 1 . T h e c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o b t a i n e d f o r A b s o r b e r s 3 , “ , a n d 5 a r e s h o w n i n F i g u r e “ . “ 6 . T h e d e c a y o f A b s o r b e r “ ( N D M A + N A D H 3 , ‘ 0 n m ) o c c u r s m o r e r a p i d l y i n E x p e r i m e n t 3 . 1 t h a n i n E x p e r i m e n t s 1 . 1 a n d 2 . 1 , w h i c h h a v e l o w e r i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n o f L A D H t h a n E x p e r i m e n t 3 . 1 . O t h e r w i s e , t h e c o n c e n t r a t i o n F i g u r e “ . “ “ . 1 9 5 3 . 0 . . ' 8 O - . - ‘ 3 p — 2 m C U _ n — n o o o o o o o g o o . o o o o o a Z O u \ . 3 ; - - - - - 1 ‘ . " . I : ' 0 C 2 A \ I Z O . - < ¢ 5 . o - . . - Z w ' 5 . U . . O . z . O . . 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I 2 8 . - . . _ . . . . . . . . - o 2 A , I , “ 1 . . - . . . . _ . - . . . . - . . . . - - . . - . . . _ . ” ' v ' * 2 . ’ 1 . : 2 w . 4 . . . i - . _ . . . . . . - i i w w w L - , . 8 . 7 1 1 W . a 1 v . e 2 l “ e n g t h C h a n n e l “ 7 1 9 7 W a v e l e n g t h C h a n n e l 0 . 2 1 u . . . . 1 . . - ‘ - - . . " - 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . ~ . . - . a . . . . . . . . n . . . . . . ‘ . . . ; a . - - q . - - + - . . . . . . . . . . . g O I . 4 & 2 ” - 0 . 0 0 9 : 1 8 I A - _ . A A ‘ A A . A - W a v e l e n g t h C h a n n e l 0 . 0 3 5 3 ' " . . . . . . . . . . - _ - i é . - 0 . 0 0 8 1 _ ' ' I F i g u r e “ . “ 5 . - N O I Y A I Y I E C N O C I U N I I A I / N O I T A R T N E C N O C - . N O I Y A R T N E C N O C N U N I I A N I N O I T A H Y N E C N O C - F i g u r e “ . “ 6 . 1 9 8 4 . 3 . 0 3 . 5 “ n u : ( S E C O N D S ) x u " w . - - . . - . - . - . I - - t o ‘ - . . ' ' ' ‘ . » . ' - . " " n . - l - 0 o - - . . n o a o I B 5 . . . . . . ‘ ‘ . . o . . . ‘ . \ . 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F o r A b s o r b e r “ , w e u s e t h e m e a s u r e d s t a t i c s p e c t r u m o f N D M A , w h i c h f i t t h e M a n a l y s i s e i g e n - v e c t o r s f o r E x p e r i m e n t “ . 1 w i t h o u t g i v i n g a s h o u l d e r a t 3 “ 0 n m ( F i g u r e “ . 2 1 ) . F o r A b s o r b e r 6 , w e u s e t h e 3 “ 0 n m a b s o r b a n c e b a n d o f N A D H , w h i c h f i t a s o n e o f t h e s i x l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r s ( F i g u r e “ . 2 8 ) . F i g u r e “ . “ 8 s h o w s t h e c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s f o r A b s o r b e r s 3 , “ , 5 , a n d 6 i n E x p e r i m e n t “ . 1 . T h e N D M A c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e i s a b i p h a s i c d e c a y . N A D H 3 “ 0 n m e x h i b i t s a r a p i d d e c a y t o z e r o c o n c e n t r a t i o n t h a t c o r - r e s p o n d s t o t h e r a p i d p o r t i o n o f t h e b i p h a s i c N D M A d e c a y M o r e o v e r , t h e c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e o f N A D H 3 u 0 n m i s q u a l i t a t i v e l y s i m i l a r t o t h e c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f ( N D M A + N A D H ) i n E x p e r i m e n t s 1 . 1 , 2 . 1 , a n d 3 . 1 . 3 “ 0 n m E x p e r i m e n t “ . 1 i s t h e o n l y e x p e r i m e n t t h a t h a s a h i g h e r i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n o f N D M A t h a n o f N A D H . T h e p r e s e n c e o f e x c e s s N D M A a p p a r e n t l y d e c o u p l e s t h e c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f N D M A a n d N A D H 3 “ 0 n m i n E x p e r i m e n t “ . 1 . T h e c o n c e n t r a t i o n o f A b s o r b e r 3 g r o w s b i p h a s i c a l l y w i t h b o t h p a r t s c o r r e l a t e d t o t h e f a s t a n d s l o w p o r t i o n s o f t h e F i g u r e “ . “ 7 . 2 0 0 M a n a l y s i s f i t s o f A b s o r b e r s 3 a n d 5 t o E x p e r i m e n t “ . 1 . V e r t i c a l s c a l e s i n a r b i t r a r y a b s o r b a n c e u n i t s . A . A b s o r b e r 3 . B . A b s o r b e r 5 . i ‘ fI I i I 3 I : : . ' . . ° " . " 0 o 0 0 2 4 1 9 . 9 . - - - I . I ° = ° . ° ' I ° - ° 3 ’ . H . 0 ° ’ g 0 ' 9 ’ I - I . - - ° " . o ° I ° 2 0 ' - g — n a fl — . . . fl — — . - — ~ . h n u - h - 2 0 1 - 0 . 0 0 1 i v l n i i j m ~ 3 1 2 m - m i m - m a m - m . m i m i m c m i m l m i m “ 7 ( 5 8 “ 1 ( 2 7 5 n m ) W a v e l e n g t h C h a n n e l 1 ( 2 7 5 n m ) W a v e l e n g t h C h a n n e l F i g u r e “ . “ 7 . o O . I o I o 0 0 0 I I , l I I ' 1 ' I ° I I I I I I I I I . “ i i - - - 3 - - - . . 5 - - - g . . . . c ‘ . _ - - a - Q Q ° ‘ n m ) I 2 0 2 F i g u r e H . U 8 . C o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f A b s o r b e r s 3 , h , 5 a n d 6 i n E x p e r i m e n t “ . 1 , E 7 . 3 9 N 6 . 0 8 1 3 . h ' A . F u l l t i m e c o u r s e . B . E a r l y t i m e c m n s e . . / - N O I I A I ' N E C N O C N U M I K A H I N O I T A I T N E C N O C 2 0 3 h . . ' - S _ . . ' . ' ' ‘ n a - . . u . . . I l l l l l l l i l l l l l ‘ l l l l l l l l fl l l l - . C 3 . 0 9 3 I l a : ( s z c o u o s > x l o ' 2 3 . 9 9 . . x . O I — h t . _ _ . . . . . _ _ _ _ < ' ‘ u . . c ' . - . . . z W U l O U x D s Q ~ - . C O : b M - u l u n o o - n o I ‘ ' I \ I 2 O : . . . _ . . . ‘ . . . ‘ . . ‘ 5 . ‘ . . ° " s - - - 2 r " w u z I 3 . fi a - I - O ' o n ' 0 n . - o . . o I l n l I 1 0 . 0 0 . l ~ o . | u o I I I ! ( S E C O N D S ) x 1 0 " F i g u r e N . “ 8 . ' 1 : — . . r V . - . » ~ v o — c n . . » . $ . I : E : m ( - I ; t ‘ A ~ 3 ' : " I . ¥ - “ ” : - £ . I . : ” 1 ’ f _ 5 , 4 . “ H i ” I 9 ° 5 ' I 2 . 1 . 3 2 : 4 : Z : ‘ I “ . . 3 . * V m . fi r 5 ‘ . f 9 ! : { « ' I I o 3 1 - . ' - . “ o t v l l . V ‘ - f ‘ n ‘ . . - . . . . 3 ' 2 I ' - a ” ' . n 1 4 : ; l ( b y - ( L 3 ‘ 1 ’ 1 ‘ _ | . “ » ' . " I . \ O ' I : 5 I } * I : W I } . , ‘ , . r . ¢ A 1 . . . : 4 ' L t k ’ f ' g f l ’ h g l : l : : : ' $ 1 6 } - 4 : : k : ; : { ; 7 W W I . ” : 1 3 h z i ' v v l . ‘ 5 2 ) 1 , I “ I I I " I ' ‘ I “ W m H } ’ 5 ' " 3 i 1 i n D ” 3 " . . , _ , . ' m - l . . . . . . - ” f . , . , 4 9 ‘ . . 3 3 9 2 - I . \ P ~ - > I W I ‘ I . . , . 4 ‘ ‘ ‘ J J ‘ ‘ . 1 ‘ 3 5 - l 3 . Z - . . . . ‘ . - . _ A . . - . . ‘ _ « _ - , . . u A ‘ . . . . . - ' . a V ' — - 1 ! , . . . I . 4 9 » , . . ’ , . . - ‘ A ' > 4 . A . . . . I . 4 . n . . - - . ' , ‘ _ _ . . . - " I . . ' . . . . . A a . ' o . I . ' A . . v . 4 . . _ A . . , . . - . . " " . . f ' A ' u ‘ - . . . . . ‘ - ' _ - . I . u . . . . f [ = 1 ¢ § ‘ u y w . I W I I 3 I I 1 H 2 I U I 3 M N 0 I 1 I W 0 H 8 I M 5 M 9 U I H E 8 W 5 R I 2 L . j a A n r s x R S t t Y a y t e L M i I c U h n B i i R e g v ‘ ‘ ‘ o a 0 " 2 0 H N D M A b i p h a s i c d e c a y . T h e c o n c e n t r a t i o n o f A b s o r b e r 3 t h e n v e r y s l o w l y d e c r e a s e s a f t e r r e a c h i n g i t s m a x i m u m c o n c e n - t r a t i o n . A s i n E x p e r i m e n t s 1 . 1 , 2 . 1 , a n d 3 . 1 , A b s o r b e r 5 h a s a b i p h a s i c g r o w t h f o l l o w e d b y a s l o w d e c a y i n E x p e r i - m e n t “ . 1 . T a b l e ” . 1 2 s u m m a r i z e s t h e a b s o r b a n c e c h a n g e s o f A b s o r b e r s 3 , U , 5 , a n d ( E x p e r i m e n t U . l ) 6 i n E x p e r i m e n t s 1 . 1 , 2 . 1 , 3 . 1 , a n d “ . 1 a t t h e i r w a v e l e n g t h s o f m a x i m u m a b s o r b a n c e . 0 . S c a n n i n g E x p e r i m e n t s f r o m 2 5 0 n m t o 3 0 0 n m P r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s o f E x p e r i m e n t s 1 . 1 - u . 1 g i v e s i n c o m p l e t e i n f o r m a t i o n a b o u t a b s o r b e r s i n t h e w a v e - l e n g t h r a n g e 2 7 5 n m - 3 0 0 n m . T h e s t a t i c s p e c t r u m o f L A D H a n d t h e 2 6 0 n m a b s o r b a n c e b a n d o f N A D H - N A D + d o e s n o t f i t a s b e l o n g i n g t o a b s o r b e r s i n t h e s e e x p e r i m e n t s e v e n t h o u g h t h e i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s o f L A D H a n d N A D H w e r e s u f f i c i e n t l y l a r g e t o c o n t r i b u t e t o a b s o r b a n c e s m e a s u r e d i n t h e 2 7 5 n m - 3 0 0 n m r a n g e . P r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s r e v e a l s t h a t E x p e r i m e n t s 1 . 1 - “ . 1 h a v e t w o a b s o r b e r s , A b s o r b e r s l a n d 2 , i n t h e r a n g e 2 7 5 n m - 3 0 0 n m ( S u b s p a c e I ) . A c c o r d i n g t o t h e s o l u t i o n b a n d s f o r t h e i r n o r m a l i s e d s t a t i c s p e c t r a ( F i g u r e H . 3 2 ) , t h e a b s o r b a n c e m a x i m a o f A b s o r b e r s 1 a n d 2 m a y o c c u r b e l o w 2 7 5 n m , w h i c h i s o u t o f t h e r a n g e o f t h e s c a n . M o r e o v e r , t h e 2 7 5 n m - 3 0 0 n m r a n g e i n c l u d e s o n l y t h e h i g h w a v e l e n g t h w i n g s o f t h e L A D H D O / ) 9 6 8 1 9 3 6 7 0 x 2 0 6 1 2 6 8 6 7 a 2 5 0 2 U 0 1 1 0 . . . . . . . . . 0 0 0 0 0 0 0 0 0 m A ( A A 8 9 8 7 0 7 u 7 5 0 U 0 . . . . 0 0 0 0 . 1 m n 5 5 3 5 6 3 . / : 1 ¢ 1 1 e u 3 6 u 3 6 u 0 3 2 0 3 2 “ A 3 A A 3 - 1 . 1 s h t t n g e k n m a e i e l r e P e v p a x W l e n n a h C E n i 6 e - b r r o s b A 3 s r e b r o s b A 5 1 5 1 3 2 3 2 A u . . 3 ) 3 ) 1 3 1 E f + 5 3 ( o 3 0 0 ( . . o y 5 5 n r 1 s 1 a N v N ) m A u S m . ) . + u 7 N 7 N S E E ( ( . 2 t 1 . ” n e m i e r l e b p a x T E A b b r e v i a t i o n 1 m a x A m a x / 0 D 1 . 1 3 2 0 . 2 6 1 3 2 4 0 3 : 5 A 3 6 1 6 3 2 u 1 3 0 . 2 3 3 E 1 8 . 6 ” 1 5 . 0 3 1 3 . u 3 2 3 5 2 1 0 . 1 9 6 0 . 1 6 7 0 . 0 7 0 2 0 5 2 5 7 6 1 3 2 3 2 7 0 0 . . . . 0 0 0 0 3 6 8 6 3 7 2 3 2 7 0 0 . . . . 0 0 0 0 5 6 3 3 i 1 : 1 3 6 u 0 0 3 2 & A A 3 3 ) G / ) x a m A ( A A D O / h t g k n a e e l P e l e n n a h v C a W r e b r o s b A n u o . i 3 t 1 d a 3 e i 0 u v . n e 6 i r N t b u n b . o A 7 C E . 2 t 1 n . “ e m e r . l e “ i 1 b p a x T E m m a x / n m a x 0 0 - 2 ? a n 3 2 3 5 2 1 2 M 2 0 6 2 0 7 a n d 2 6 0 n m N A D H - N A D + a b s o r b a n c e s p e c t r a . I n o r d e r t o c h a r a c t e r i z e A b s o r b e r s 1 a n d 2 i n E x p e r i - m e n t s 1 . 1 — “ . 1 a n d t o d e t e r m i n e t h e s p e c t r a l c o n t r i b u - t i o n s o f L A D H a n d t h e 2 6 0 n m b a n d o f N A D H - N A D + , w e p e r - f o r m e d a s c a n n i n g e x p e r i m e n t w i t h a s c a n r a n g e o f 2 5 0 n m - 3 0 0 n m . T h i s r a n g e i n c l u d e s t h e l o w a s w e l l a s t h e h i g h w a v e l e n g t h w i n g s o f t h e L A D H a n d 2 6 0 n m N A D H - N A B + a b s o r — b a n c e s p e c t r a . T h e i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s w e r e E 1 8 . 0 N 1 5 . 0 8 1 3 M ’ a n d t h e m i x i n g o r d e r w a s ( N + S ) X E ( E ) , t h e s e w e r e a l s o t h e i n i t i a l c o n d i t i o n s o f E x p e r i m e n t 2 . 1 . T h e a b s o - l u t e a b s o r b a n c e s u r f a c e f o r E x p e r i m e n t 5 . 1 i s s h o w n i n F i g u r e 4 . h 9 . I t c o n t a i n s 2 8 w a v e l e n g t h c h a n n e l s a n d 6 H c o n s e c u t i v e s p e c t r a . W e i g h t e d M a n d S a n a l y s e s o f t h e w h o l e e x p e r i m e n t f i v e a n ( m , s ) p a i r o f ( 3 , 2 ) . T h u s , E x p e r i m e n t 5 . 1 h a s t h r e e l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r s , o f w h i c h a t l e a s t t w o c h a n g e c o n c e n t r a t i o n . F i g u r e s “ . 5 0 a n d “ . 5 1 s h o w t h e M a n a l y s i s f i t s o f t h e m e a s u r e d s t a t i c s p e c t r a o f , r e s p e c t i v e l y , L A D H a n d N A D H ( w h i c h r e p r e s e n t s t h e 2 6 0 n m b a n d o f N A D H - N A D + ) . T h e L A D H s t a t i c s p e c t r u m f i t s w e l l e x c e p t n e a r t h e a b s o r b a n c e m a x i - m u m , w h i c h i s s h i f t e d t o a l o w e r w a v e l e n g t h i n t h e c a l - c u l a t e d s p e c t r u m t h a n o c c u r s i n t h e m e a s u r e d s p e c t r u m . A p o s s i b l e i n t e r p r e t a t i o n i s t h a t L A D H i s a n a b s o r b e r w h o s e a b s o r b a n c e s p e c t r u m d u r i n g t h e r e a c t i o n i s s h i f t e d t o l o w e r w a v e l e n g t h s ( b l u e - s h i f t e d ) b y i t s i n t e r a c t i o n w i t h t h e s u b s t r a t e s a n d p r o d u c t s . T h e m e a — s u r e d s t a t i c s p e c t r u m o f N A D H f i t s w e l l , e x c e p t f o r s o m e F i g u r e u . u 9 . 2 0 8 4 : 3 1 3 . " i : § 2 g \ h fl i t / 3 : ; : 4 . m m : ; 7 & 2 “ w ‘ 1 ‘ { fi l l / 2 A : : V t \ \ . \ \ \ ‘ 5 : 2 5 / 2 4 , 2 5 \ g _ / / / N \ / R \ \ § \ l ‘ \ \ d 3 0 0 n m 2 5 0 n m + 1 E x p e r i m e n t a l a b s o l u t e a b s o r b a n c e s u r f a c e A , E x p e r i m e n t 5 . 1 , E 1 8 . 6 N 1 5 . O s l 3 . h ’ ( N + S ) w i t h ( E ) , w a v e l e n g t h r a n g e 2 5 0 n m - 3 0 0 n m , R e a r v i e w . O o 3 2 7 ‘ 2 2 - = - “ 3 ‘ 5 1 3 3 3 4 . ‘ 7 5 " - 3 ‘ 5 t 1 . 5 ‘ . ‘ . 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Q . o h . n o “ . . . “ “ 0 . . . ‘ o o o o ‘ - 0 - 9 $ o - . 0 ‘ . o c o ‘ . . . . . . . . . ‘ o o o o o o o o o § o o o - " . l I I 1 I g l l - - 1 I 1 ( 2 5 0 n m ) 2 8 ( 3 0 0 n m ) W a v e l e n g t h C h a n n e l i n a r b i t r a r y a b s o r b a n c e u n i t s . 2 1 1 s m a l l s y s t e m a t i c e r r o r i n t h e h i g h w a v e l e n g t h w i n g n e a r 3 0 0 n m . W e c o n c l u d e t h a t t h e 2 6 0 n m a b s o r b a n c e b a n d o f N A D H - N A D + i s o n e o f t h e t h r e e l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b - s o r b e r s i n E x p e r i m e n t 5 . 1 . T h e t h i r d a b s o r b e r i n E x p e r i m e n t 1 . 1 m u s t b e e i t h e r a t r a n s i e n t i n t e r m e d i a t e o r a p r o d u c t f o r w h i c h w e h a v e n o m e a s u r e d s t a t i c s p e c t r u m . T o r e s o l v e t h e w h o l e e x p e r i - m e n t , w e e x a m i n e t w o w a v e l e n g t h s u b s p a c e s ; I ( 2 5 0 n m - 2 7 3 n m , c h a n n e l s 1 - 1 6 ) , a n d I I ( 2 7 5 n m - 3 0 0 n m , c h a n n e l s 1 7 - 2 8 ) . . T h e ( m , s ) p a i r s f o r S u b s p a c e s I a n d I I a r e ( 3 , 2 ) , a n d ( 2 , 1 ) r e s p e c t i v e l y . S i n c e L A D H a n d N A D H a b s o r b a c r o s s t h e e n t i r e s p e c t r a l r a n g e 2 5 0 n m - 3 0 0 n m , w e c o n c l u d e t h a t t h e t h i r d a b s o r b e r a b s o r b s o n l y i n S u b s p a c e I , a n d t h a t o n l y L A D H a n d N A D H - N A D + a b s o r b i n S u b s p a c e I I . M o r e - o v e r , s i n c e S u b s p a c e I I i n E x p e r i m e n t 5 . 1 c o v e r s t h e s a m e w a v e l e n g t h r a n g e a s S u b s p a c e I o f E x p e r i m e n t s 1 . 1 - “ . 1 , w e c o n c l u d e t h a t A b s o r b e r s 1 a n d 2 i n t h e l a t t e r e x p e r i m e n t s a r e b l u e - s h i f t e d L A D H a n d t h e 2 6 0 n m N A D H - N A B + b a n d . T h e m e a s u r e d s t a t i c s p e c t r u m o f L A D H d o e s n o t f i t E x p e r i - m e n t s 1 . 1 - “ . 1 b e c a u s e L A D H i s b l u e - s h i f t e d i n t h e r e - a c t i o n . T h e r a n g e 2 7 5 n m - 5 8 “ n m r a n g e o f E x p e r i m e n t s 1 . 1 - “ . 1 i n c l u d e s o n l y t h e t a i l o f t h e 2 6 0 n m b a n d o f N A D H - N A D + , w h i c h i s a p p a r e n t l y w h y t h e s e e x p e r i m e n t s d i d n o t c o n t a i n s u f f i c i e n t i n f o r m a t i o n t o d i s t i n g u i s h N A D H - N A D + a s a n a b s o r b e r . W e r e s o l v e S u b s p a c e I I o f E x p e r i m e n t 5 . 1 b y u s i n g t h e s t a t i c s p e c t r a o f L A D H a n d N A D H - N A D + . B y f i t t i n g t o 2 1 2 S u b s p a c e I I t h e s t a t i c s p e c t r a o f L A D H a n d N A D H - N A D + t h a t w e r e o b t a i n e d f o r t h e w h o l e e x p e r i m e n t , w e o b t a i n t h e ( 2 x 2 ) m a t r i x Q f o r S u b s p a c e I I . F r o m g b w e o b t a i n K u s i n g E q u a t i o n ( 3 . 1 3 ) . T h e r e s u l t a n t c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f L A D H a n d N A D H - N A D + c a l c u l a t e d f r o m S u b s p a c e I I a r e s h o w n i n F i g u r e s “ . 5 2 A a n d “ . 5 2 B . N o t e t h a t t h e r a t e s o f L A D H a n d N A D H - N A D + a r e l i n e a r l y d e p e n d e n t ( s = 1 i n S u b s p a c e I I ) ; 1 1 2 ; : a s t h e 2 6 0 n m b n a d o f N A D H — N 1 1 1 ) + g r o w s , L A D H d e c a y s . W e u s e t h e t h r e e a b s o r b e r s i m p l i f i c a t i o n s o f C h a p t e r 3 , S e c t i o n E t o o b t a i n t h e c o n t r i b u t i o n o f t h e t h i r d a b s o r b e r i n E x p e r i m e n t 5 . 1 . L e t A b s o r b e r s l , 2 , a n d 3 i n E x p e r i m e n t 5 . 1 b e , r e s p e c t i v e l y , L A D H , N A D H - N A D + , a n d t h e a s y e t u n k n o w n a b s o r b e r . W e f i r s t f i t t h e c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f L A D H a n d N A D H - M A D + t h a t w e o b t a i n e d f r o m S u b - s p a c e I I t o t h e M a n a l y s i s e i g e n v e c t o r s f o r t h e w h o l e e x p e r i m e n t . T h i s g i v e s t h e t w o c o l u m n s o f Z _ i n t h e w h o l e e x p e r i m e n t t h a t c o r r e s p o n d t o L A D H a n d N A D H - N A D + ; i . e . , 1 1 a n d 1 2 . E q u a t i o n ( 3 . 2 7 ) t h e n g i v e s f o r E 3 E 3 = [ l / d e t ( X ) ] g ( 3 ) ( l e 1 2 ) , w h e r e Q ( 3 ) , v 1 , a n d X 2 a r e k n o w n , a n d w h e r e l / d e t ( y ) i s a r b i t r a r i l y s e t t o u n i t y . T h e s t a t i c s p e c t r u m o f A b - s o r b e r 3 i s t h e n g i v e n b y t h e e q u a t i o n . _ _ 1 £ 3 ‘ ( E 9 ( 3 ) ) 3 3 ’ . . . . . . . . . . . . h 2 . 1 1 “ . . . . . . ” . M M . “ . . . . . . " . . M . . . O . ° . . . . . . . . " % % . ° - m . m . m - m . m c m - m . m . m o . " . . . . . . . N . u . - . . m - - . b . . e . . . . . . . . - . - f . f : - 3 2 . 3 - 2 2 . 2 2 . 9 r . % . 0 . . . . . . . p e . c . . . - t - r . . . . u “ . m - . - . ~ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - - - - . - - - - - - - - - - - - - - . . . . . . . . . . . . . . S . $ . I j . I J 1 ‘ 1 0 . 1 7 6 C ) . 1 L ( ) C ) 0 0 - I 1 5 - 1 “ 3 3 l J J ‘ J 1 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I 0 . o n 9 ° . . o ° ° . ” ” . u . . . . p . . . . 2 . 3 . 1 3 1 1 . . . . . . . . . . . . . , , , , , , , , , 1 A B J . i l l J 9 6 . . “ o n l 1 l 1 l I 1 S p e c t r u m N u m b e r F i g u r e “ . 5 2 . C o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s f r o m w a v e l e n g t h c h a n — n e l s 1 7 - 2 8 o f E x p e r i m e n t 5 . 1 . A . " L A D H " . B . 2 6 0 n m b a n d o f N A D H - N A D + . V e r t i c a l s c a l e s i n a r b i t r a r y a b s o r b a n c e u n i t s . 2 1 “ a n d i s s h o w n i n F i g u r e “ . 5 3 A . W e o b t a i n e d t h e f i r s t t w o c o l u m n s o f g f o r t h e w h o l e e x p e r i m e n t w h e n t h e m e a s u r e d s t a t i c s p e c t r a o f L A D H a n d N A D H - N A D + w e r e f i t t e d t o t h e M a n a l y s i s e i g e n v e c t o r s f o r t h e w h o l e e x p e r i m e n t . W i t h t h e t h i r d c o l u m n 2 o b — 3 t a i n e d a b o v e f o r A b s o r b e r 3 , g f o r t h e w h o l e e x p e r i m e n t i s c o m p l e t e . T h e r e f o r e , t h e c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f a l l t h r e e a b s o r b e r s a r e o b t a i n e d b y c a l c u l a t i n g E f r o m 0 u s i n g E q u a t i o n ( 3 . 1 3 ) . T h e r e s u l t a n t c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f A b s o r b e r s 1 a n d 2 ( L A D H a n d N A D H - N A D + ) a r e t h e s a m e a s a l r e a d y s h o w n i n F i g u r e s “ . 5 2 A a n d “ . 5 2 8 . T h e c o n - c e n t r a t i o n p r o f i l e o f A b s o r b e r 3 i s s h o w n i n F i g u r e “ . 5 3 8 T h e t h i r d a b s o r b e r h a s i t s m a x i m u m a b s o r b a n c e n e a r c h a n n e l 1 ( 2 5 0 n m ) , a n d i t s c o n c e n t r a t i o n d e c a y s a f t e r r e m a i n i n g n e a r l y c o n s t a n t f o r t h e f i r s t 3 0 c o n s e c u t i v e s p e c t r a ( 3 s e c ) . I n s u m m a r y , E x p e r i m e n t 5 . 1 h a s t h r e e l i n e a r l y i n d e p e n - d e n t a b s o r b e r s . T h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n s o f b l u e - s h i f t e d L A D H a r e s h o w n i n F i g u r e s “ . 5 0 a n d “ . 5 2 A , r e s p e c t i v e l y . T h e r e s u l t s f o r t h e 2 6 0 n m b a n d o f N A D H - N A D + a r e s h o w n i n F i g u r e s “ . 5 1 a n d “ . 5 2 B a n d t h e r e s u l t s f o r t h e t h i r d , u n i d e n t i f i e d a b s o r b e r s a r e s h o w n i n F i g u r e s “ . 5 3 A a n d “ . 5 3 8 . T a b l e “ . 1 3 s u m m a r i z e s t h e a b s o r b a n c e c h a n g e s o f A b s o r b e r s 1 , 2 , a n d 3 i n E x p e r i m e n t 5 . 1 . 2 1 5 O . 0 2 5 1 I “ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - . - . - . - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . l i ° ° 1 I I ! I A J . l . I o I l . l I l I . . ° . . ° 4 0 . 0 0 3 ! . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 ( 2 5 0 n m ) 2 8 ( 3 0 0 n m ) W a v e l e n g t h C h a n n e l 5 . 0 0 0 J m - - , v ~ ~ - ~ ~ 0 ° 0 o n ' o J I . . o o ‘ i B 3 ° . . J . i l I I 4 - o . u 6 1 ! , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ' ” n g l 6 “ S p e c t r u m N u m b e r F i g u r e “ . 5 3 . T h i r d a b s o r b e r i n E x p e r i m e n t 5 . 1 . A . S t a t i c s p e c t r u m . A r b i t r a r y a b s o r b a n c e u n i t s . B . C o n c e n t r a t i o n p r o f i l e . A r b i t r a r y c o n c e n t r a - t i o n u n i t s . . D . O ) / S ) x a m X ( A A + N ( ’ u . 3 1 8 0 . 5 1 N 6 9 3 6 . 7 3 2 8 5 9 1 1 . . . E 1 0 0 5 5 5 0 2 7 6 — 2 2 0 5 2 h t g n e l l e e v n 2 a n 2 W a h k C a e P . + ) D E ( ) A H M D d - i A H e X r i L D e f A b d i N r e t o t m n s e f n b d i A 0 i h S 6 n ( 2 U 1 2 3 T a b l e “ . 1 3 . A b s o r b e r s i n E x p e r i m e n t 5 . 1 ( 2 5 0 n m - 3 0 0 n m ) . A m a x / n m A m a x / O . D . 1 3 1 - u 0 . 6 7 8 0 . 6 0 7 0 . 1 2 1 2 1 6 2 1 7 P . D i s c u s s i o n 1 . S u m m a r y o f R e s u l t s I n d e p e n d e n t l y o f a n y m e c h a n i s t i c h y p o t h e s e s a n d o f a n y a s s u m p t i o n s a b o u t s p e c t r a l s h a p e s , w e i g h t e d p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s r e v e a l s t h a t i n t h e r a n g e 2 7 5 n m — 5 8 “ n m E x p e r i m e n t s 1 . 3 - 3 . 1 h a v e f i v e l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r s , o f w h i c h f o u r h a v e l i n e a r l y i n d e p e n d e n t r a t e s , w h i l e E x p e r i m e n t h . 1 i n t h e s a m e w a v e l e n g t h r a n g e h a s s i x l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r s , o f w h i c h f i v e h a v e l i n e a r l y i n d e p e n d e n t r a t e s . A p p l i c a t i o n o f t h e s e v e n - s t e p s t r a t e g y o f C h a p t e r 3 g i v e s s o l u t i o n b a n d s f o r t h e n o r m a l i z e d s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f A b s o r b e r s 1 a n d 2 i n E x p e r i m e n t 1 . 1 ( F i g u r e s “ . 3 2 a n d “ . 3 3 ) , a n d g i v e s t h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f A b s o r b e r s 3 , h , a n d 5 i n E x p e r i m e n t s 1 , 1 , 2 . 1 , a n d 3 . 1 ( F i g u r e s H . 4 0 - u . u u , a n d H . 4 6 ) a n d o f A b s o r b e r s 3 , H , 5 , a n d 6 i n E x p e r i - m e n t ” . 1 ( F i g u r e s 4 . 2 2 , “ . 2 8 , u . u 7 , a n d u g u s ) . I n t h i s s u b - s e c t i o n w e s u m m a r i z e t h e s p e c t r a l a n d k i n e t i c c h a r a c t e r i s - t i c s o f t h e s e a b s o r b e r s , a n d w e s u g g e s t c h e m i c a l i d e n t i t i e s f o r s o m e o f t h e m . I n E x p e r i m e n t s 1 . 1 , 2 . 1 , a n d 3 . 1 , w h e r e t h e i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s o f N D M A ( 1 3 . U u M ) a n d N A D H ( 1 5 . 0 u M ) a r e a l m o s t e q u a l , t h e u u o n m b a n d o f N D M A a n d t h e 3 H 0 n m b a n d o f N A D H a r e l u m p e d t o g e t h e r a s o n e a b s o r b e r , A b s o r b e r A . T h i s i s b e c a u s e t h e c o n c e n t r a t i o n s o f N D M A q u n m a n d 2 1 8 N A D H a r e l i n e a r l y d e p e n d e n t o n e a c h o t h e r i n E x p e r i - 3 “ 0 n m m e n t s 1 . 1 , 2 . 1 , a n d 3 . 1 . N D M A q u n m a n d N A D H 3 “ 0 n m r a p i d l y d e c a y t o g e t h e r t o n e a r z e r o c o n c e n t r a t i o n i n t h e s e e x p e r i - m e n t s . I n c o n t r a s t , N D M A q u n m a n d N A D H 3 “ O n m m a k e s e p a r a t e c o n t r i b u t i o n s t o E x p e r i m e n t “ . 1 a s A b s o r b e r “ a n d A b s o r b e r 6 , r e s p e c t i v e l y . I n E x p e r i m e n t “ . 1 , w h e r e t h e i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n o f N D M A ( 1 3 . “ U M ) i s g r e a t e r t h a n t h e i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n o f N A D H ( 6 . 0 u M ) , N A D H 3 u 0 n m s t i l l d e c a y s r a p i d l y t o z e r o a s i t d i d i n E x p e r i m e n t s 1 . 1 - 3 . 1 , b u t N D M A “ “ 0 n m d e c a y s b i p h a s i c a l l y . T h e t o t a l d e c a y o f N A D H 3 “ 0 n m i s c o m p l e t e b y t h e e n d o f t h e r a p i d f i r s t p o r t i o n o f t h e b i p h E S i C N D M A “ “ 0 n m d e c a y . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e r a p i d p o r t i o n o f t h e N D M A “ 0 n m d e c a y a n d t h e e n t i r e r a p i d d e c a y o f N A D H 3 “ 0 n m i n E x p e r i m e n t “ . 1 c o r r e s p o n d t o t h e s a m e f a s t p r o c e s s a s t h e c o n c o m i t a n t d e c a y s o f N D M A “ “ 0 n m a n d N A D H 3 “ 0 n m i n E x p e r i m e n t s 1 . 1 - 3 . 1 . T h e s l o w p o r t i o n o f t h e b i p h a s i c N D M A q u n m d e c a y i n E x p e r i m e n t “ . 1 i s t h e n a s t e p t h a t o c c u r s a f t e r N A D H “ O n m h a s d e c a y e d t o z e r o c o n c e n t r a t i o n . A b s o r b e r 3 h a s t h e s a m e s t a t i c s p e c t r u m i n E x p e r i - m e n t s 1 . 1 - “ . 1 . I t i s t h e c o m b i n a t i o n o f a b a n d w i t h a p e a k a t “ 0 3 n m a n d a s h o u l d e r n e a r 3 2 0 n m . N o t e t h a t t h e “ 0 3 n m b a n d o f A b s o r b e r 3 h a s a s h a p e s i m i l a r t o t h e “ “ 0 n m b a n d o f N D M A ( F i g u r e “ . “ 0 ) . N o t e a l s o t h a t i n E x p e r i - m e n t s 1 . 1 - “ . 1 t h e g r o w t h p o r t i o n o f t h e g r o w t h a n d d e c a y o f A b s o r b e r 3 m i r r o r s t h e d e c a y o f N D M A q u n m ' T h e s e 2 1 9 o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t A b s o r b e r 3 m a y b e a n i n t e r m e d i a t e f o r m o f N D M A t h a t i s f o r m e d u p o n t h e d i s a p p e a r a n c e o f N D M A , “ 4 O n m ' T h e r e i s a s t r i k i n g d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e b e h a v i o r o f A b s o r b e r 3 i n E x p e r i m e n t s 1 . 1 - 3 . 1 a n d i n E x p e r i m e n t “ . 1 . I n E x p e r i m e n t s 1 . 1 - 3 . 1 , A b s o r b e r 3 g r o w s r a p i d l y a s N D M A M O n m a n d N A D H 3 u 0 n m d e c a y t o z e r o , a n d t h e n A b s o r b e r 3 s l o w l y d e c a y s t o z e r o . I n E x p e r i m e n t “ . 1 , A b s o r b e r 3 g r o w s r a p i d l y d u r i n g t h e f a s t N A D H 3 u 0 n m d e c a y a n d t h e r a p i d p o r t i o n o f t h e b i p h a s i c N D M A M O n m d e c a y , b u t t h e n , i n s t e a d o f s l o w l y d e c a y i n g a s i n E x p e r i - m e n t s 1 . 1 — 3 . 1 , A b s o r b e r 3 c o n t i n u e s a s l o w g r o w t h c o r — r e s p o n d i n g t o t h e s l o w p o r t i o n o f t h e N D M A q u n m d e c a y . A b s o r b e r 5 , w h i c h h a s t h e s a m e s t a t i c s p e c t r u m i n E x p e r i m e n t s 1 . 1 — “ . 1 , i s a c o m b i n a t i o n o f a 3 2 0 n m b a n d a n d a 5 5 0 n m b a n d . A b s o r b e r 5 a c c o u n t s f o r m o s t o f t h e a b s o r b a n c e c h a n g e s a t 5 “ 0 n m , a n d c a n t h u s b e i d e n t i f i e d a s t h e i n t e r m e d i a t e h y p o t h e s i z e d b y S c h a c k a n d D u n n ( 1 9 7 2 ) a n d S u e l t e r , g £ _ a l . ( 1 9 7 5 ) t o a c c o u n t f o r t h e g r o w t h a n d d e c a y o f a b s o r b a n c e a t 5 “ 0 n m . P r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s g i v e s t h e n e w i n f o r m a t i o n t h a t t h e 5 “ 0 n m i n t e r - m e d i a t e a l s o h a s a b a n d a t 3 2 0 n m . I n E x p e r i m e n t s 1 . 1 - 3 . 1 , A b s o r b e r 5 i s s t i l l g r o w i n g w h e n A b s o r b e r 3 h a s b e g u n t o d e c a y . T h e g r o w t h o f A b s o r b e r 5 i s b i p h a s i c i n E x p e r i - m e n t s 1 . 1 - “ . 1 . P r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s o f E x p e r i m e n t 5 . 1 , i n t h e r a n g e 2 5 0 n m — 3 0 0 n m , s u g g e s t s t h a t A b s o r b e r s l a n d 2 i n E x p e r i m e n t s 1 . 1 - “ . 1 a r e , r e s p e c t i v e l y , t h e 2 6 0 n m 2 2 0 b a n d o f N A D + — N A D H a n d t h e s t a t i c s p e c t r u m o f L A D H , b l u e — s h i f t e d f r o m 2 8 0 n m t o 2 7 5 n m . T h e r a t e s o f A b s o r b e r s 1 a n d 2 a r e l i n e a r l y d e p e n d e n t i n a l l t h e s c a n n i n g e x p e r i — m e n t s ; i ; g ; , a s t h e 2 6 0 n m b a n d o f N A D + - N A D H g r o w s , ( a s N A D H i s o x i d i z e d t o N A D + ) t h e s h i f t e d L A D H s p e c t r u m d e c a y s . T h e t o t a l a b s o r b a n c e c h a n g e o f A b s o r b e r 2 a t 2 7 5 n m i s 0 . 6 7 8 0 . D . i n E x p e r i m e n t 5 . 1 . F i s h e r , A d i J a a n d C r o s s ( 1 9 6 9 ) r e p o r t s m a l l p e a k s ( 0 . 0 1 0 . D . ) a t 2 7 5 n m - 2 9 5 n m i n d i f f e r e n c e s p e c t r a m e a s u r e d f o r t h e b i n d i n g o f N A D H t o L A D H . T h e y a t t r i b u t e t h e s e c h a n g e s t o b l u e o r r e d s h i f t s o f t y r o s y l a n d t r y p t o p h a n y l r e s i d u e s i n L A D H . T h e l a r g e a b s o r b a n c e c h a n g e ( 0 . 6 7 0 0 . D . ) t h a t w e o b s e r v e f o r A b s o r b e r 2 i n E x p e r i m e n t 5 . 1 w o u l d s e e m t o r e q u i r e a d i r e c t i n t e r - a c t i o n s u c h a s a c h a r g e t r a n s f e r c o m p l e x f o r m a t i o n b e t w e e n t h e e n z y m e c h r o m o p h o r e s a n d s u b s t r a t e o r p r o d u c t s , i f w e a t t r i b u t e a l l o f t h e a b s o r b a n c e o f A b s o r b e r 2 t o e n z y m e c h r o m o p h o r e s . T h e r e i s a n a l t e r n a t i v e e x p l a n a t i o n f o r A b s o r b e r 2 . A b s o r b e r 2 m a y r e p r e s e n t t h e c h r o m o p h o r e s o n L A D H p l u s a c h r o m o p h o r e o f a s u b s t r a t e o r p r o d u c t i n t e r m e d i a t e w h o s e s p e c t r a l s h a p e i s c o i n c i d e n t a l l y s o s i m i l a r t o t h e s p e c t r a l s h a p e o f t h e L A D H c h r o m O p h o r e s t h a t t h e L A D H c h r o m o p h o r e s a n d t h e i n t e r m e d i a t e c h r o m o p h o r e a r e l u m p e d a s o n e l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r i n t h e e x p e r i m e n t . S i n c e w e c a n n o t r e f u t e t h i s p o s s i b i l i t y o n t h e b a s i s o f t h e e x p e r i m e n t s r e p o r t e d h e r e , f u r t h e r e x p e r i m e n t s a r e n e e d e d t o d e t e r m i n e t h e c h e m i c a l i d e n t i t y o f A b s o r b e r 2 . 2 2 1 P r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s o f E x p e r i m e n t 5 . 1 a l s o r e v e a l s a n a b s o r b e r w i t h a n a b s o r b a n c e m a x i m u m b e t w e e n 2 5 0 n m a n d 2 5 5 n m ( F i g u r e s “ . 5 “ a n d “ . 5 5 ) . D u n n a n d B e r n h a r d ( 1 9 7 1 ) p r o p o s e d t h a t t h e p r o d u c t P o f R e a c t i o n I I [ s e e S e c t i o n A ] h a s a n a b s o r b a n c e p e a k a t 2 5 5 n m . H o w e v e r , t h e 2 5 5 n m a b s o r b e r i n E x p e r i m e n t 5 . 1 d e c a y s r a t h e r t h a n g r o w s , s o t h a t i f i t i s t h e p r o d u c t p r o p o s e d b y D u n n a n d B e r n h a r d ( 1 9 7 1 ) , i t i s o n l y a n i n t e r m e d i a t e p r o d u c t . F u r t h e r s c a n n i n g e x p e r i m e n t s i n t h e 2 5 0 n m - 3 0 0 n m r a n g e a r e n e e d e d t o c h a r a c t i z e t h e 2 5 5 n m a b s o r b e r . T a b l e “ . 1 “ l i s t s t h e a b s o r b e r s f o u n d i n t h e r a n g e 2 5 0 n m - 5 8 “ n m . T h e r e a r e i n a l l s e v e n a b s o r b e r s , o f w h i c h t h r e e ( 2 , 3 , a n d 5 ) a r e t r a n s i e n t i n t e r m e d i a t e s i n t h e s e n s e t h a t t h e i r c o n c e n t r a t i o n s g r o w a n d t h e n d e c a y . T a b l e “ . 1 “ a l s o l i s t s t h e f i g u r e s i n C h a p t e r “ t h a t g i v e f i n a l r e s u l t s f o r t h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f t h e s e a b s o r b e r s . 2 . T h e " H a l f - o f - t h e - S i t e s - R e a c t i v i t y M e c h a n i s m " T h e t e s t i n g o f D u n n a n d B e r n h a r d ' s h a l f - o f - t h e - s i t e s - r e a c t i v i t y m e c h a n i s m ( M e c h a n i s m I I I i n S e c t i o n A ) i s n o t t h e p r i m a r y g o a l o f t h i s s t u d y . H o w e v e r , t h e r e s o l v e d s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s f r o m E x p e r i m e n t s 1 . 1 - “ . 1 p r o v i d e n e w i n f o r m a t i o n c o n c e r n i n g t h i s m e c h a n - i s m . F o r t h e c o n d i t i o n s E < S < N , I I I p r e d i c t s b i p h a s i c d e c a y o f 3 “ “ 0 ’ w i t h t h e f a s t p o r t i o n u s i n g a n a m o u n t o f 2 2 2 T a b l e “ . 1 “ . L i s t o f A b s o r b e r s i n t h e L A D H - N D M A - N A D H R e a c t i o n . A b s o r b e r A b s o r b a n c e F i g u r e s G i v i n g N u m b e r M a x i m a . F i n a l R e s u l t s + 1 ( N A D - N A D H ) 2 6 O n m “ . 5 1 , “ . 5 2 B 2 2 7 5 n m “ . 5 0 , “ . 5 2 A 3 “ 0 3 n m “ . “ 0 , “ . “ l , “ . “ 2 u ( N A D H 3 M O m m + N D M A q u n m ) u . “ “ , “ . “ 6 , “ . “ 8 i n E x p e r i m e n t s 1 . 1 — 3 . 1 N D M A q u n m i n E x p . “ . 1 5 3 2 0 n m 5 5 0 n m 6 N A D H 3 “ 0 n m i n E x p . “ . 1 “ . 2 8 , “ . “ 8 7 2 5 5 n m “ . 5 3 2 2 3 S e q u a l t o t h e e n z y m e s i t e c o n c e n t r a t i o n E , a n d w i t h t h e s l o w p o r t i o n u s i n g t h e r e m a i n d e r o f 8 “ “ 0 ' D u n n a n d B e r n - h a r d ( 1 9 7 1 ) o b s e r v e d b i p h a s i c d e c a y o f t o t a l a b s o r b a n c e a t “ “ 0 n m f o r t h e i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s E l . 0 6 N l 5 . 0 8 5 . 0 ° A t t r i b u t i n g a l l t h e m e a s u r e d a b s o r b a n c e a t “ “ 0 n m t o 8 “ “ 0 U t h e y o b t a i n e d r e s u l t s i n a g r e e m e n t w i t h I I I . I n o u r E x - p e r i m e n t s 1 . 1 a n d 2 . 1 , w i t h i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s E 7 . 3 9 N 1 5 . 0 8 1 3 . u , w e o b s e r v e t h a t , i n d e e d , t o t a l a b s o r — b a n c e v s t i m e i s a b i p h a s i c d e c a y “ 0 0 n m t o “ 5 0 n m ( c h a n - n e l s 3 1 - 3 6 ) . H o w e v e r , p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s r e - v e a l s t h a t t h e r e a r e E g g l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r s c o n t r i b u t i n g t o t h e t o t a l a b s o r b a n c e a t t h e s e c h a n n e l s . T h e r e s o l v e d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e o f S I M 0 i n E x p e r i m e n t s 1 . 1 a n d 2 . 1 i s a s i n g l e f a s t d e c a y c o n c o m i t a n t w i t h t h e d e c a y o f N T h e s i n g l e f a s t d e c a y 8 “ “ 0 N 3 “ 0 i n E x p e r i - 3 “ 0 ° m e n t s 1 . 1 a n d 2 . 1 i s i n c o m p a t i b l e w i t h t h e h a l f - o f - t h e - s i t e s r e a c t i v i t y m e c h a n i s m . I n E x p e r i m e n t 3 . 1 , w i t h i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s E 1 8 . 6 N 1 5 . O s l 3 . “ ’ p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s g i v e s a s i n g l e f a s t d e c a y o f 5 “ “ 0 a n d N 3 “ 0 ° D u n n a n d B e r n h a r d ( 1 9 7 1 ) a s s u m e d i n M e c h a n i s m I I I t h a t S i s l a b i l e a n d i s t h e r e f o r e f r e e t o f i n d a n E t h a t i s n o t i n h i b i t e d b y X . W i t h t h i s a s s u m p t i o n , M e c h a n i s m I I I p r e d i c t s f o r t h e c o n d i - t i o n s S < N < E , a s i n g l e f a s t d e c a y o f 8 “ “ 0 ' T h u s , E x p e r i - m e n t 3 . 1 i s c o m p a t i b l e w i t h M e c h a n i s m I I I . H o w e v e r , t h e s i n g l e f a s t d e c a y o f 8 “ “ 0 a n d N 3 “ 0 i n E x p e r i m e n t 3 . 1 d o e s n o t r e q u i r e t h a t t h e s i t e s o f E i n t e r a c t w i t h e a c h o t h e r 2 2 “ a n d s h o u l d t h e r e f o r e b e c o m p a t i b l e w i t h m a n y m e c h a n i s m s t h a t d o n o t a s s u m e i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e s i t e s . F o r E x p e r i m e n t “ . 1 , w i t h i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s E 7 . 3 9 N 6 . O s l 3 . “ ’ p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s g i v e s a b i - p h a s i c d e c a y o f 8 “ “ 0 a n d a s i n g l e d e c a y t o z e r o o f N 3 “ 0 ° I I I p r e d i c t s a b i p h a s i c d e c a y o f 8 “ “ 0 w h e n S > E > N , s o t h a t E x p e r i m e n t “ . 1 a n d I I I q u a l i t a t i v e l y a g r e e . H o w e v e r , I I I p r e d i c t s t h a t t h e f a s t a n d s l o w p o r t i o n s o f t h e b i - p h a s i c 8 “ “ 0 d e c a y e a c h u s e s a n a m o u n t o f S e q u a l t o l / 2 ( S - N ) , s o t h a t t h e t o t a l 8 “ “ 0 d e c a y i s ( S - N ) . I n E x - p e r i m e n t “ . 1 t h e r e s o l v e d 8 “ “ 0 d e c a y u s e s a t o t a l a m o u n t o f S m 1 2 . 9 H M , w h i c h i s a l m o s t t h e e n t i r e i n i t i a l c o n c e n - t r a t i o n S , a n d w h i c h i s s i g n i f i c a n t l y g r e a t e r t h a n ( S - N ) = 7 . “ u M , t h e p r e d i c t i o n o f I I I . T h u s , a l t h o u g h t h e 8 “ “ 0 b i p h a s i c d e c a y q u a l i t a t i v e l y a g r e e s w i t h I I I , t h e q u a n t i - t a t i v e r e s u l t s a r e ' i n c o m p a t i b l e w i t h I I I . T h e s i g n i f i c a n t c o n c l u s i o n f r o m t h e s e r e s u l t s i s t h a t t h e q u a l i t a t i v e o b s e r v a t i o n o f b i p h a s i c d e c a y a t “ “ 0 n m d o e s n o t n e c e s s a r i l y i n d i c a t e b i p h a s i c d e c a y o f 8 “ “ 0 s i n c e 5 “ “ 0 i s o n l y o n e o f t w o l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b - s o r b e r s a t “ “ 0 n m . O u r r e s u l t s a r e i n c o m p a t i b l e w i t h t h e h a l f - o f - t h e - s i t e s - r e a c t i v i t y m e c h a n i s m o f D u n n a n d B e r n h a r d ( 1 9 7 1 ) . I t i s p o s s i b l e , o f c o u r s e , t h a t o u r c h e m i c a l s y s t e m d o e s n o t r e p l i c a t e t h e c h e m i c a l s y s t e m o f D u n n a n d B e r n h a r d ( 1 9 7 1 ) , s o t h a t i n c o m p a r i n g o u r r e s u l t s t o t h e i r s , w e a r e c o m p a r i n g o b s e r v a t i o n s o n t w o d i f f e r e n t r e a c t i o n s y s t e m s . A c l o s e r e x a m i n a t i o n o f t h e h a l f - o f - t h e - 2 2 5 s i t e s r e a c t i v i t y i s s u e r e q u i r e s t h a t t h e e x p e r i m e n t s o f D u n n a n d B e r n h a r d ( 1 9 7 1 ) b e r e p e a t e d w i t h p r i n c i p a l c o m — p o n e n t a n a l y s i s o f r a p i d s c a n n i n g m e a s u r e m e n t s c o v e r i n g a t l e a s t t h e r a n g e “ 0 0 n m - “ 5 0 n m . 3 . S p e c u l a t i o n T h e g o a l o f t h i s s t u d y h a s b e e n t o m a p o u t t h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f t h e a b s o r b i n g s u b - s t r a t e s , p r o d u c t s , a n d t r a n s i e n t i n t e r m e d i a t e s w i t h o u t f i r s t i n v o k i n g a s s u m p t i o n s a b o u t t h e m e c h a n i s m . P r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s p r o v i d e s a m e c h a n i s m - i n d e p e n d e n t m e a n s o f e x t r a c t i n g t h e s p e c t r a l a n d k i n e t i c i n f o r m a t i o n f r o m t h e e x p e r i m e n t s t h e m s e l v e s . H a v i n g o b t a i n e d t h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s i n d e p e n d e n t l y o f m e c h a n i s t i c h y p o t h e s e s , t h e n e x t s t e p i s t o p r o p o s e p l a u s — i b l e m e c h a n i s m s f o r t h e c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s . I n t h i s s u b s e c t i o n , a s i t s t i t l e i m p l i e s , w e m a k e n o p r e t e n s e o f p r o p o s i n g a f u l l k i n e t i c m e c h a n i s m f o r t h e L A D H - N D M A - N A D H r e a c t i o n . R a t h e r , w e i n t e r p r e t o u r r e s u l t s a n d s p e c u l a t e o n p o s s i b l e s c h e m e s ( £ ; g ; , o r d e r s o f e v e n t s i n t h e r e a c t i o n ) t h a t m i g h t b e u s e d a s s t a r t i n g p o i n t s f o r d e v e l o p i n g a n d t e s t i n g m e c h a n i s m s i n a n e x t e n d e d s t u d y o f t h i s c o m p l e x r e a c t i o n . W e a t t e m p t t o a c c o u n t f o r t h e b e h a v i o r o f A b s o r b e r s 3 , “ , 5 , a n d 6 o n l y s i n c e w e h a v e t h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f t h e s e a b s o r b e r s u n d e r f o u r s e t s o f i n i t i a l c o n d i t i o n s . W e h a v e t h e c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s 2 2 6 o f A b s o r b e r s l , 2 , a n d 7 o n l y f o r E x p e r i m e n t 5 . 1 , a n d w e t h e r e f o r e d o n o t a t t e m p t t o a c c o u n t e x p l i c i t l y f o r t h e s e a b s o r b e r s . I n E x p e r i m e n t “ . 1 t h e c o n c e n t r a t i o n o f N D M A q u n m d e c a y s o v e r a l l b y 1 2 . 9 u M , w h i c h i s s i g n i f i c a n t l y g r e a t e r t h a n 6 . 0 u M , t h e a m o u n t o f N A D H 3 u O n m a v a i l a b l e i n i t i a l l y t o r e d u c e N D M A o n t h e a s s u m p t i o n o f a 1 : 1 s t o i c h i o m e t r y b e t w e e n N D M A a n d N A D H . D u n n a n d B e r n h a r d ( 1 9 7 1 ) r e p o r t 1 : 1 s t o i c h i o m e t r y o f N D M A a n d N A D H u n d e r s t e a d y s t a t e c o n d i t i o n s a n d u n d e r t r a n s i e n t p h a s e c o n d i t i o n s . H o w e v e r , i n t h e i r t r a n s i e n t p h a s e s t O p p e d f l o w e x p e r i m e n t s , a s w e h a v e a l r e a d y n o t e d , t h e y a s s u m e d t h a t a l l a b s o r b a n c e a t “ “ 0 n m w a s a t t r i b u t a b l e t o N D M A q u n m ’ T h e y t h u s s e e m t o h a v e u n d e r e s t i m a t e d t h e e x t e n t o f d i s a p p e a r a n c e o f N D M A “ O n m ' T h e a p p a r e n t v i o l a t i o n o f 1 : 1 s t o i c h i o m e t r y i n E x p e r i - m e n t “ . 1 l e a d s u s t o e x a m i n e t h e p o s s i b i l i t y t h a t e t h a n o l n o t r e m o v e d f r o m L A D H d u r i n g d i a l y s i s r e c y c l e s N A D + t o N A D H , w h i c h t h e n r e d u c e s t h e e x c e s s N D M A . H o w e v e r , t h i s s e e m s u n l i k e l y f o r t w o r e a s o n s : ( i ) T h e i n i t i a l c o n c e n t r a - t i o n o f e t h a n o l i n E x p e r i m e n t “ . 1 w o u l d h a v e t o b e a t l e a s t 6 . 9 p M i n o r d e r t o a c c o u n t f o r t h e e x c e s s N D M A q u n m d e c a y . I f w e a s s u m e t h a t 1 m l o f 1 0 % e t h a n o l w a s c a r r i e d o v e r w i t h t h e L A D H p r e c i p i t a t e i n t o t h e f i r s t d i a l y s i s o f L A D H , t h a t e a c h o f t h e 2 0 0 0 m l d i a l y s i s s t e p s r e a c h e d e q u i l i b r a t i o n w i t h r e s p e c t t o e t h a n o l , a n d t h a t e t h a n o l i s n o t h e l d i n a t i g h t c o m p l e x w i t h L A D H , t h e i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n o f e t h a n o l i n E x p e r i m e n t “ . 1 w o u l d b e o f 2 2 7 t h e o r d e r 1 0 - 3 M , w h i c h i s f a r t o o s m a l l t o a c c o u n t f o r t h e e x c e s s N D M A q u n m d e c a y . ( i i ) T h e e x c e s s N D M A q u n m d e c a y i n E x p e r i m e n t “ . 1 r e s u l t s i n m o r e g r o w t h o f A b s o r b e r 3 . A f t e r t h e N D M A q u n m d e c a y i s f i n i s h e d , t h e c o n c e n t r a ~ t i o n o f A b s o r b e r 3 r e m a i n s n e a r l y c o n s t a n t . I f r e c y c l e d N A D H w e r e r e s p o n s i b l e f o r t h e e x c e s s N D M A q u n m d e c a y , w e w o u l d e x p e c t A b s o r b e r 3 t o d e c a y a f t e r t h e N D M A “ “ O n m d e c a y i s f i n i s h e d , a s i t d o e s i n E x p e r i m e n t s 1 . 1 - 3 . 1 . T h u s , e t h a n o l r e c y c l i n g N A D + t o N A D H d o e s n o t e x p l a i n t h e q u a l i t a t i v e o b s e r v a t i o n t h a t A b s o r b e r 3 a p p e a r s t o b e a d e a d e n d i n t e r m e d i a t e i n E x p e r i m e n t “ . 1 , b u t n o t i n E x - p e r i m e n t s 1 . 1 - 3 . 1 . A s c h e m e t h a t e x p l a i n s E x p e r i m e n t s 1 . 1 - 5 . 1 s h o u l d a c c o u n t f o r t h e f o l l o w i n g q u a l i t a t i v e o b s e r v a t i o n s : ( 1 ) W h e n [ N D M A J O _ > _ [ N A D H ] O , N D M A q u n m a n d N A D H 3 1 m n m d e c a y r a p i d l y u n t i l a l l N A D H h a s d i s a p p e a r e d . 3 “ 0 n m ( 2 ) W h e n N D M A q u n m i s i n i t i a l l y i n e x c e s s o f N A D H 3 u O n m ’ t h e e x c e s s N D M A M O n m d e c a y s v i a a s l o w p r o c e s s . ( 3 ) T h e g r o w t h o f A b s o r b e r 3 m i r r o r s t h e d e c a y o f N D M A M 0 n m ' W h e n N D M A “ O n m i s n o t i n i t i a l l y i n e x c e s s o f N A D H A b s o r b e r 3 d e c a y s s l o w l y f o l l o w i n g a n 3 “ 0 n m ’ i n i t i a l r a p i d g r o w t h . W h e n N D M A “ “ 0 n m e x c e s s o f N A D H - 9 ’ “ O n m ’ A b s o r b e r 3 c o n t i n u e s t o g r o w a s t h e i s i n i t i a l l y i n e x c e s s N D M A q u n m s l o w l y d e c a y s . T h e n A b s o r b e r 3 r e m a i n s a t a n e a r l y c o n s t a n t c o n c e n t r a t i o n a f t e r t h e e x c e s s N D M A “ “ d e c a y i s f i n i s h e d . 0 n m 2 2 8 ( “ ) A b s o r b e r 5 h a s a r a p i d b i p h a s i c g r o w t h f o l l o w e d b y a s l o w d e c a y i n E x p e r i m e n t s 1 . 1 - “ . 1 . I n E x p e r i m e n t s 1 . 1 - 3 . 1 , A b s o r b e r 5 i s s t i l l g r o w i n g a f t e r A b s o r b e r 3 b e g i n s i t s d e c a y . I n E x p e r i m e n t s 1 . 1 a n d 2 . 1 A b s o r b e r 3 i s s t i l l d e c a y i n g a f t e r A b s o r b e r 5 h a s f i n i s h e d d e c a y i n g . T h e q u a l i t a t i v e s h a p e o f A b s o r b e r f i v e ' s c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e i s n o t c h a n g e d b y h a v i n g e x c e s s N D M A “ “ O n m o v e r N A D H i n i t i a l l y . 3 “ 0 n m ( 5 ) N D M A q u n m a n d N A D H b o t h d e c a y r a p i d l y , 3 “ 0 n m e v e n w h e n b o t h a r e i n i t i a l l y i n t w o - f o l d e x c e s s c o n c e n - t r a t i o n o f t h e t o t a l c o n c e n t r a t i o n o f a c t i v e e n z y m e s i t e s ( E x p e r i m e n t s 1 . 1 a n d 2 . 1 ) . T h u s , t h e f i r s t a n d s e c o n d t u r n o v e r s o f t h e e n z y m e s i t e s a r e b o t h r a p i d . ( 6 ) I n E x p e r i m e n t 5 . 1 ( E 1 8 . 6 N 1 5 . O s l 3 . “ ) t h e g r o w t h o f t h e N A D + — N A D H 2 6 0 n m b a n d o n f o r m i n g N A D + i s n o t c o m — p l e t e u n t i l n e a r t h e e n d o f t h e e x p e r i m e n t ( 3 5 s e c ) , l o n g a n d N A D H a f t e r t h e i n i t i a l d e c a y o f N D M A t o “ “ 0 n m 3 “ 0 n m z e r o c o n c e n t r a t i o n . I f A b s o r b e r 3 ( “ 0 3 n m ) i s e n z y m e - b o u n d N D M A , s h i f t e d f r o m “ “ 0 n m t o “ 0 3 n m , t h e N D M A m u s t b i n d o n l y t o a f o r m o f t h e e n z y m e t h a t i s i n d u c e d b y N A D H o r N A D + , s i n c e p r e - m i x i n g N D M A w i t h t h e e n z y m e d o e s n o t c h a n g e t h e c o u r s e o f t h e r e a c t i o n o v e r p r e m i x i n g N D M A w i t h N A D H ( E x p e r i m e n t s 1 . 1 a n d 2 . 1 ) . T h e i n t e r m e d i a t e s , A b s o r b e r s 3 a n d 5 , d e c a y s l o w l y i n E x p e r i m e n t 1 . 1 a n d 2 . 1 , w h e r e t w o t u r n o v e r s o f N D M A q u n m a n d N A D H 3 u O n m a r e f a s t . T h i s s u g g e s t s t h a t w h e n A b s o r b e r s 2 2 9 3 a n d 5 d e c a y e i t h e r , ( 1 ) t h e y a r e n o t e n z y m e b o u n d , ( i i ) t h e y a r e b o u n d t o a n e n z y m e s i t e o t h e r t h a n a n a c t i v e s i t e , o r ( i i i ) t h e y a r e b o u n d t o o n e a c t i v e s i t e o f e a c h d i m e r , m a k i n g t h a t s i t e i n a c t i v e , b u t l e a v i n g t h e o t h e r s i t e a c t i v e . W e a t t e m p t t o a c c o u n t f o r t h e q u a l i t a t i v e o b s e r v a t i o n s a b o v e w i t h t h e s c h e m e s h o w n i n F i g u r e “ . 5 “ . O f c o u r s e , m a n y o t h e r s c h e m e s c o u l d b e p r o p o s e d t o a c c o u n t f o r t h e s e o b s e r v a t i o n s , a n d f u r t h e r e x p e r i m e n t s a r e r e q u i r e d t o t e s t p o s s i b l e s c h e m e s a n d d i s c r i m i n a t e b e t w e e n t h e m . I n t h e s c h e m e i n F i g u r e “ . 5 “ , w e r e p r e s e n t N A D H 3 u O n m a s N 3 “ 0 ’ N D M A q u n m a s 8 “ “ 0 ’ a n d L A D H a s E o r E ' ( t w o c o n f o r - m a t i o n s ) X , Y , a n d Z a r e i n t e r m e d i a t e s . T h e s u b s c r i p t “ 0 3 , 3 2 0 i n d i c a t e s a c h r o m o p h o r e w i t h t h e s p e c t r u m o f A b s o r b e r 3 , a n d 5 5 0 , 3 2 0 r e p r e s e n t s a c h r o m o p h o r e w i t h t h e s p e c t r u m o f A b s o r b e r 5 . T h e f o r m a t i o n o f N A D 2 6 0 i s a s s u m e d t o g i v e t h e g r o w t h o f a b s o r b a n c e i n t h e 2 6 0 n m b a n d o f N A D + - N A D H . W e a s s u m e t h a t a l l e n z y m e s t a r t s a s t h e E c o n f o r m a t i o n , w i t h n o E ' c o n f o r m a t i o n i n i t i a l l y . N 3 “ O a n d 8 “ “ 0 b i n d t o E t o g i v e E N 3 “ O S “ “ 0 ’ w h i c h r a p i d l y r e a c t s t o f o r m E ' X u 0 3 , 3 2 0 . T h u s , d u r i n g i t s r a p i d g r o w t h , A b s o r b e r 3 i s e n z y m e b o u n d . X “ 0 3 , 3 2 0 r a p i d l y d i s s o c i a t e s f r o m i t s e n z y m e c o m p l e x , t h u s f r e e i n g t h e a c t i v e e n z y m e s i t e f o r a s e c o n d r a p i d t u r n o v e r o f N 3 “ O S “ “ 0 t o X “ o 3 , 3 2 0 - X u 0 3 , 3 2 0 c a n t h e n r e a c t f u r t h e r v i a e i t h e r o f t w o p r o - c e s s e s . I n t h e f i r s t p r o c e s s , X “ 0 3 3 2 0 r a p i d l y d e v e l o p s 3 2 3 0 t h e 5 5 0 , 3 2 0 c h r o m o p h o r e ( A b s o r b e r 5 ) . T h e n , i n a s l o w e r s t e p , X fi g g : § g g l o s e s t h e “ 0 3 , 3 2 0 c h r o m o p h o r e t o g i v e x 5 5 0 ’ 3 2 0 , a n d f i n a l l y , x 5 5 0 ’ 3 2 0 l o s e s i t s 5 5 0 , 3 2 0 c h r o m o - p h o r e t o p r o d u c e N A D 2 6 0 a n d p r o d u c t P . I n t h e s e c o n d p a r a l l e l p r o c e s s , X “ 0 3 , 3 2 0 c a n r e a c t t o f o r m N A D 2 6 0 a n d P b y f i r s t f o r m i n g t h e i n t e r m e d i a t e Y “ 0 3 , 3 2 0 ‘ T h u s , i n t h i s s e c o n d p r o c e s s t h e 5 5 0 , 3 2 0 c h r o m o p h o r e n e v e r d e v e l o p s . T h e s e t w o p a r a l l e l p a t h s f o r t h e f u r t h e r r e a c t i o n o f X u 0 3 , 3 2 0 a r e a n a t t e m p t t o a c c o u n t f o r t h e o b s e r v a t i o n t h a t i n E x p e r i m e n t s 1 . 1 a n d 2 . 1 A b s o r b e r 3 i s s t i l l d e c a y - i n g a f t e r A b s o r b e r 5 h a s f i n i s h e d d e c a y i n g . 0 n t h e f i r s t t u r n o v e r E i s c o n v e r t e d t o a d i f f e r e n t c o n f o r m a t i o n E ' . E ' h a s t h e s a m e c a t a l y t i c a c t i v i t y a s E , b u t E ' h a s i n a d d i t i o n t h e a b i l i t y t o s l o w l y b i n d 8 “ “ 0 w i t h o u t a n y c o e n z y m e p r e s e n t t o f o r m a d e a d e n d c o m p l e x E ' Z “ 0 3 , 3 2 0 ° T h u s , w h e n 5 “ “ 0 i s i n i t i a l l y i n e x c e s s o f N 3 “ 0 ’ t h e s l o w g r o w t h o f E ' Z “ 0 3 , 3 2 0 a c c o u n t s f o r t h e s l o w g r o w t h o f A b s o r b e r 3 d u r i n g t h e s l o w p o r t i o n o f t h e b i p h a s i c 8 “ “ 0 d e c a y . N o t e t h a t i n t h i s s c h e m e t h e a p - p e a r a n c e o f t h e “ 0 3 , 3 2 0 c h r o m o p h o r e r e q u i r e s t h e d i s a p - p e a r a n c e o f 8 “ “ 0 ’ e i t h e r t o f o r m E ' x “ 0 3 , 3 2 0 o r E ' Z u 0 3 ’ 3 2 0 . M o r e e x p e r i m e n t s w i t h g r e a t e r t h a n t w o t u r n o v e r s o f t h e e n z y m e s i t e s a r e n e e d e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r o r n o t A b s o r b e r 3 a n d 5 a r e e n z y m e b o u n d . A l s o n e e d e d a r e e x p e r i - m e n t s t o d e t e r m i n e i f N A D + , N D M A , a n d L A D H f o r m a c o m p l e x , a n d i f t h i s c o m p l e x i s A b s o r b e r 3 o r A b s o r b e r 5 . O f c o u r s e , e a c h a d d i t i o n a l e x p e r i m e n t s h o u l d b e r e s o l v e d b y p r i n c i p a l 2 3 1 c o m p o n e n t a n a l y s i s . N e w a b s o r b e r s m a y a p p e a r i n t h e a d d i - t i o n a l e x p e r i m e n t s , a n d s p e c i e s t h a t w e r e l u m p e d b y E x p e r i - m e n t s 1 . 1 - “ . 1 a s o n e a b s o r b e r m a y b e s e p a r a t e d i n t h e a d d i t i o n a l e x p e r i m e n t s . O n c e a g i v e n a b s o r b e r h a s b e e n s h o w n b y p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s t o a p p e a r i n t h e a d d i t i o n a l e x p e r i m e n t s a s w e l l a s t h e e x p e r i m e n t s r e p o r t e d h e r e , t h e c o n c e n t r a t i o n - p r o f i l e s o f t h a t a b s o r b e r i n b o t h s e t s o f e x p e r i m e n t s c a n b e c o m p a r e d t o o b t a i n n e w m e c h a n i s t i c i n f o r m a t i o n . 0 2 3 , 3 0 s t n e m i r e p x E n “ i X + V E t + s n o i t a v s w r " a o f l 0 e s s 2 b 0 3 2 0 , 3 2 3 , 3 w 0 3 , o “ 0 l 0 Z “ s 5 Y o e v i t a X ' E t s ' 7 a f E t i w l o a " l u s q o e 0 u h ) 2 u t o u u s 3 w S , o 3 l + 0 s o “ ' n i a l u X 0 E p 3 x 2 N e 3 ' * , E 3 ' t o o l 0 t o r “ S o ( 0 e X 2 3 o , u u s 3 0 “ o X u g N E m - e h 1 c . S 1 . “ 5 . “ e r u g i F f a s t 5 5 0 , 3 2 0 s l o w l 5 X - * N A D 2 6 0 + P + - + Y u 0 3 ’ 3 2 0 - + N A D 2 6 0 + P 2 3 2 C H A P T E R 5 F U L L T I M E C O U R S E A N A L Y S I S O F T H E R E V E R S I B L E M I C H A E L I S - M E N T E N M E C H A N I S M A . I n t r o d u c t i o n T h e r e v e r s i b l e , s i m p l e M i c h a e l i s - M e n t e n m e c h a n i s m i s 0 2 E + P ( I ) w h e r e E i s e n z y m e , S i s s u b s t r a t e , P i s p r o d u c t , a n d C i s t h e i n t e r m e d i a t e e n z y m e - s u b s t r a t e c o m p l e x . T h e r a t e e x — p r e s s i o n s f o r M e c h a n i s m ( I ) a r e c o u p l e d n o n l i n e a r d i f - f e r e n t i a l e q u a t i o n s t h a t h a v e s o f a r e l u d e d c l o s e d - f o r m i n t e g r a t i o n . T o c i r c u m v e n t t h i s m a t h e m a t i c a l d i f f i c u l t y , m o s t e n z y m e k i n e t i c s s t u d i e s t r e a t o n l y " i n i t i a l v e l o c i t y " d a t a , u s i n g t h e f a m i l i a r b u t a p p r o x i m a t e M i c h a e l i s — M e n t e n e q u a t i o n ( M i c h a e l i s a n d M e n t e n 1 9 1 3 ) , m e = v m a x / { 1 + ( K m / t s 1 0 ) } , ( 5 . 1 ) w h e r e [ S J O i s t h e i n i t i a l s u b s t r a t e m o l a r i t y , m e i s t h e i n i t i a l v e l o c i t y o f d i s a p p e a r a n c e o f s u b s t r a t e o r o f a p p e a r — a n c e o f p r o d u c t , a n d < . ‘ I l l m a x k 2 E E J O ’ ( 5 ' 2 ) 2 3 3 2 3 “ K m 3 ( k _ 1 + k 2 ) / k 1 , ( 5 . 3 ) w h e r e [ E J O i s t h e i n i t i a l e n z y m e m o l a r i t y . N u m e r o u s m o r e a c c u r a t e b u t s t i l l a p p r o x i m a t e s o l u t i o n s h a v e b e e n p r o p o s e d f o r M e c h a n i s m ( I ) a n d o t h e r c l o s e l y r e l a t e d m e c h a n i s m s . T h e s e i n c l u d e e x p l i c i t a l g e b r a i c ( M o r a l e s a n d G o l d m a n , 1 9 5 5 ; M i l l e r a n d A l b e r t y , 1 9 5 8 ; W o n g , 1 9 6 5 ; H o m m e s , 1 9 6 2 ; D a r v e y , P r o k l o v n i k , a n d W i l l i a m s , 1 9 6 6 ; M a g u i r e , H i j a z i , a n d L a i d l e r , 1 9 7 “ ; W a l t e r , 1 9 7 “ ; R u b i n o w a n d L e b o w i t z , 1 9 7 0 ; H e i n e k e n , T s u c h i y a a n d A r i s , 1 9 6 7 ) a s w e l l a s p u r e l y n u m e r i c a l s o l u t i o n s ( W a l t e r a n d M o r a l e s , 1 9 6 “ ; H o m m e s , 1 9 6 2 ; H e m k e r , 1 9 7 2 ; C u r t i s a n d C h a n c e , 1 9 7 2 ) . T h e n u m e r i c a l s o l u t i o n s h a v e e m p l o y e d a n a l o g c o m p u t e r s ( W a l t e r a n d M o r a l e s , 1 9 6 “ ; H o m m e s , 1 9 6 2 ) o r s p e c i a l p r o g r a m s t o i n t e g r a t e " s t i f f " d i f f e r e n t i a l e q u a t i o n s o n d i g i t a l c o m p u t e r s ( H e m k e r , 1 9 7 2 ; C u r t i s a n d C h a n c e , 1 9 7 2 ) . S o m e o f t h e a l g e b r a i c s o l u t i o n s a r e r e s t r i c t — e d t o t h e p e r i o d b e f o r e C h a s r e a c h e d i t s s t e a d y - s t a t e l e v e l ( M o r a l e s a n d G o l d m a n , 1 9 5 5 ; D a r v e y , P r o k h o v n i k , a n d W i l l i a m s , 1 9 6 6 ; M a g u i r e , H i J a z i , a n d L a i d l e r , 1 9 7 “ ) . F u l l t i m e c o u r s e a l g e b r a i c s o l u t i o n s c o v e r i n g t h e p r e - s t e a d y - s t a t e a n d s t e a d y - s t a t e p e r i o d s h a v e b e e n o b t a i n e d b y p e r t u r - b a t i o n m e t h o d s ( M i l l e r a n d A l b e r t y , 1 9 5 6 ; R u b i n o w a n d L e b o - w i t z , 1 9 7 0 ; H e i n e k e n , T s u c h i y a a n d A r i s , 1 9 6 7 ) . M i l l e r a n d A l b e r t y ( 1 9 5 8 ) u s e d a p e r t u r b a t i o n a b o u t ( k _ 2 - k l ) = 0 t o o b t a i n a s o l u t i o n t o M e c h a n i s m ( 1 ) . T h e i r s o l u t i o n i s n o t g e n e r a l , h o w e v e r , s i n c e ( k _ 2 - k 1 ) i s n o t n e c e s s a r i l y 2 3 5 s m a l l . H e i n e k e n , T s u c h i y a a n d A r i s ( 1 9 6 7 ) o b t a i n e d a s o l u t i o n t o M e c h a n i s m ( 1 ) w h e n k _ _ 2 = 0 b y e x p a n d i n g a b o u t ( [ E J O / [ S ] 0 ) = 0 i n a s i n g u l a r p e r t u r b a t i o n s c h e m e . S i n c e ( [ E l o / [ S ] 0 ) < < 1 i s a g o o d a p p r o x i m a t i o n f o r t h e s t e a d y - s t a t e i n m o s t c a s e s , t h e i r f i r s t o r d e r s o l u t i o n i s q u i t e u s e f u l . R u b i n o w a n d L e b o w i t z ( 1 9 7 0 ) o b t a i n e d o n l y t h e z e r o t h o r d e r s i n g u l a r p e r t u r b a t i o n s o l u t i o n f o r a s i m p l e , i r r e v e r s i b l e , t w o s u b s t r a t e m e c h a n i s m . N o n e o f t h e w o r k s m e n t i o n e d h a s i n c l u d e d a n e x a m i n a — t i o n o f t h e a c c u r a c y o f t h e M i c h a e l i s - M e n t e n e q u a t i o n f o r t h e i n i t i a l v e l o c i t i e s d e t e r m i n e d a n d d e f i n e d e x p e r i - m e n t a l l y . I n t h i s c h a p t e r , a f t e r a t h o r o u g h t r e a t m e n t o f t h e s t e a d y — s t a t e r a t e e x p r e s s i o n s f o r t h e r e v e r s i b l e , s i m p l e , M i c h a e l i s - M e n t e n m e c h a n i s m , w e i n t e g r a t e t h e f u l l - t i m e - c o u r s e r a t e e x p r e s s i o n s t h r o u g h f i r s t o r d e r i n t h e s i n g u l a r p e r t u r b a t i o n s c h e m e o f H e i n e k e n , T s u c h i y a a n d A r i s ( 1 9 6 7 ) . W e t h e n u s e t h e r e s u l t s : ( i ) t o e x a m i n e t h e r a n g e o f v a l i d i t y o f i n i t i a l p r o d u c t a n d s u b s t r a t e v e l o c i - t i e s p r e d i c t e d b y E q u a t i o n ( 5 . 1 ) ; ( i i ) t o i n c l u d e e x p l i c i t l y t h e d a t a o b t a i n e d a t t h e v e r y b e g i n n i n g o f t h e e x p e r i m e n t ; a n d ( i i i ) t o d i s c u s s o p t i m a l d a t a c o l l e c t i o n a n d a n a l y s i s i n f u l l - t i m e - c o u r s e e x p e r i m e n t s . T h e c h i e f p u r p o s e o f t h i s c h a p t e r i s a n a n a l y s i s o f t h e r a n g e o f v a l i d i t y o f E q u a t i o n ( 5 . 1 ) . T o t h i s e n d , w e d e r i v e a m o r e g e n e r a l r e s u l t t h a n E q u a t i o n ( 5 . 1 ) a n d e x a m i n e t h e c i r c u m s t a n c e s i n w h i c h t h e m o r e g e n e r a l r e s u l t r e d u c e s t o E q u a t i o n ( 5 . 1 ) . I n t h e u s u a l e x p e r i m e n t , u n r e a c t e d 2 3 6 s u b s t r a t e , a n d t h e c o n c e n t r a t i o n o f e i t h e r s u b s t r a t e o r p r o d u c t i s m o n i t o r e d w i t h t i m e . T h e m a s s b a l a n c e s a r e [ E 1 0 = [ E ] + [ C ] , [ 8 1 0 = [ S ] + [ P ] + [ C ] ( 5 . “ ) a n d t h e r a t e e x p r e s s i o n s f o r ( I ) a r e [ é i = - k 1 [ 8 1 ( [ E l O - [ c 1 > + k _ 1 [ C ] , ( 5 . 5 ) [ 6 ] = k 1 [ 8 1 ( [ E ] O - [ 0 ] ) + k _ 2 ( [ 3 1 0 - [ 0 1 ) ( E s l o - [ S ] - [ C 1 ) — ( k _ l + k 2 ) [ C ] , ( 5 . 6 ) [ s ] = k , [ c ] - k _ 2 ( [ E l o - [ o ] > < [ s 1 0 - [ s 1 - [ 0 1 ) , ( 5 . 7 ) w h e r e [ s ] = ( d t S J / d t ) , e g g , T h e r e a r e t w o e x p e r i m e n t a l d e f i n i t i o n s f o r b o t h t h e i n i t i a l s u b s t r a t e v e l o c i t y V ? a n d t h e i n i t i a l p r o d u c t v e l o c i t y P 1 . i t i s d e r i v e d d i f f e r e n t l y i n t h e t w o c a s e s . T h e m o r e v A l t h o u g h E q u a t i o n ( 5 . 1 ) a p p l i e s f o r b o t h d e f i n i t i o n s , c o m m o n d e f i n i t i o n , c a l l e d M e t h o d 1 i n t h e r e m a i n d e r o f t h i s c h a p t e r , c a n b e u s e d i f e n o u g h m e a s u r e m e n t s a r e a v a i l a b l e t o c o n s t r u c t e i t h e r a s u b s t r a t e o r a p r o d u c t p r o g r e s s c u r v e f o r s m a l l e x t e n t o f r e a c t i o n . T h e M e t h o d 1 i n i t i a l v e l o c i t y i s d e f i n e d a s t h e m a g n i t u d e o f t h e s l o p e o f a l i n e d r a w n t a n g e n t t o t h e p r o g r e s s c u r v e a t t i m e t , a f t e r a s m a l l e x t e n t o f r e a c t i o n , a s i n F i g u r e 5 . 1 . F i g u r e 5 . 1 . D s e t f r i a n t i e t i v o e n l o c f i o V l . t y l ’ t h e M e t h o d 1 i n i t i a l s u b - . , . _ . , - — — . — _ — - — . - - — ~ - 0 t T i m e P 2 1 y u h t o i M v e u n e e s c i t l s t o i c a a d a i c n l t c d p r s r a u o b t d s e u t , c r t b a a I E u t t e i a t r e . P m J i d I i g t h f i p s r l d o ' s a ( 5 . 9 ) a s r s y a y t f i b c e u l n t e s c t e o M s e e t d h i o t i f t o u 2 3 8 < : m S M e t h o d 1 . ' i n i t i a l s u b s t r a t e 5 I E S J I t ( 5 . 8 ) v e l o c i t y < m a n d / o r i f f e w m e a s u r e m e n t s a r e a v a i l a b l e . T h e M e t h o d 2 i n i t i a l s u b s t r a t e a n d p r o d u c t v e l o c i t i e s a r e d e f i n e d b y v § 2 = < [ s 1 0 - [ S ] t ) / t , ( 5 . 1 0 ) P v i 2 = [ F l t / t . ( 5 . 1 1 ) w h e r e [ S ] t a n d [ P ] t a r e m e a s u r e d a s h o r t t i m e t a f t e r m i x i n g , a s i n F i g u r e 5 . 2 . T h e f i r s t t w o a p p r o x i m a t i o n s i n d e r i v i n g E q u a t i o n ( 5 . 1 ) a r e t h e s a m e f o r M e t h o d s 1 a n d 2 . T h e y a r e m a d e a r b i t r a r i l y i n t h i s S e c t i o n b u t t h e y w i l l b e s h o w n b y t h e s i n g u l a r p e r t u r b a t i o n s c h e m e i n S e c t i o n B t o d e p e n d o n t h e s m a l l n e s s o f t h e r a t i o ( [ E J O / [ S ] O ) . F i r s t , m a k e a s t e a d y s t a t e a p - p r o x i m a t i o n o n t h e c o m p l e x C b y s e t t i n g [ C ] = 0 i n E q u a t i o n ( 5 . 6 ) . T h e n , o m i t a l l t e r m s c o n t a i n i n g [ C ] 2 o r [ C J E E J O f r o m E q u a t i o n s ( 5 . 6 ) a n d ( 5 . 7 ) . R e a r r a n g e m e n t o f t h e r e s u l t s t o l e a v e [ S ] a s t h e o n l y i n d e p e n d e n t v a r i a b l e y i e l d s F i g u r e 5 . 2 . D s e t f r i a n t i e t i v o e n l o o c f i t v y i . a , t h e M e t h o d 2 i n i t i a l s u b - 2 3 9 L i l l i - O T i m e 2 “ O [ é ] = - [ fi l = [ E ] O { k _ 1 k _ 2 ( [ S ] O - [ S l ) - k 1 k 2 [ s ] } / { k _ l + k 2 + k l [ S ] + k _ 2 ( [ S l o - [ S ] ) } ( 5 . 1 2 ) a n d [ C ] = [ E ] O { k _ 2 ( [ S ] O - [ S ] ) + k 1 [ S ] } / { k _ l + k 2 + k l [ S ] + k _ 2 ( [ S ] O - [ S ] } . ( 5 . 1 3 ) T h e f u r t h e r a p p r o x i m a t i o n [ S ] = [ S ] O c o n v e r t s E q u a t i o n ( 5 . 1 2 ) i n t o E q u a t i o n ( 5 . 1 ) , i n t h e f o r m S _ ° _ P _ ° _ v 1 1 - I t s 1 t | - v 1 1 - [ P l t - V m a x / { l + ( K m / [ s 1 0 ) } ( 5 . 1 u ) [ _ f . E q u a t i o n s ( 5 . 8 ) a n d ( 5 . 9 ) ] ; t h e s e a r e t h e M e t h o d 1 M i c h a e l i s - M e n t e n E q u a t i o n s . I n o r d e r t o o b t a i n t h e M e t h o d 2 M i c h a e l i s - M e n t e n E q u a - t i o n s , i n t e g r a t e E q u a t i o n ( 5 . 1 2 ) , w h e n c e ( k _ 2 - k l ) ( [ S J O - [ S l ) + ( k l k 2 + k _ 1 k _ 2 ) ( k 2 + k - l ) ( k l k - 2 E S ] 0 + k l k 2 + k - l k - 2 ) . 2 ( k 1 k 2 + k _ l k _ 2 ) ( k k + k k ) ( [ 8 1 - [ S J ) 2 n 1 - 1 2 ' 1 ’ 2 0 = - [ E ] o t . ( 5 . 1 5 ) k 1 k 2 [ 3 3 0 2 “ 1 I f w e a s s u m e ( [ S ] O - [ s ] ) < < k l k 2 [ 8 ] 0 / ( k 1 k 2 + k _ 1 k _ 2 ) , ( 5 . 1 6 ) e x p a n d t h e l o g a r i t h m i c t e r m i n a T a y l o r ' s S e r i e s , a n d r e t a i n o n l y t h e l e a d i n g t e r m , t h e n E q u a t i o n ( 5 . 1 5 ) b e c o m e s ( k I E S J O + k 2 + k _ l ) ( [ S l o - [ S ] ) / k l k 2 [ S ] O = [ E 1 0 t . ( 5 . 1 7 ) B y E q u a t i o n s ( 5 . 2 ) , ( 5 . 3 ) , ( 5 . 1 0 ) , ( 5 . 1 1 ) , ( 5 . 1 2 ) , a n d ( 5 . 1 7 ) . = V m a x / { l + ( K M / [ s 1 0 ) } ( 5 . 1 8 ) V m a x a n d K M a r e d e t e r m i n e d b y f i t t i n g E q u a t i o n ( 5 . 1 ) t o a s e t o f i n i t i a l v e l o c i t y m e a s u r e m e n t s i n w h i c h [ S J O v a r i e s o v e r t h e a p p r o x i m a t e r a n g e 0 . 2 K M i [ 8 3 0 : S K M . T h e r o l e s o f s u b s t r a t e a n d p r o d u c t c a n b e r e v e r s e d , a n d a n a d d i t i o n a l p a i r o f p a r a m e t e r s , K fi a n d V m a x c a n b e d e - t e r m i n e d f r o m a s i m i l a r s e r i e s o f e x p e r i m e n t s . T h e s e p a r a m e t e r s a r e r e l a t e d t o K M a n d V m a x b y t _ = V m a x k _ l [ E ] 0 ( k _ 1 / k 2 ) V m a x ( 5 . 2 ' ) t . . . — A l l t h e a p p r o x i m a t i o n s u s e d i n d e r i v i n g t h e M i c h a e l i s - 3 e A : e e [ [ s E k 2 l l / / / k E [ l S E [ J 1 S O 0 ] , , O , c u y 2 E a [ [ C B ] i / o [ / E [ ] $ O 1 , 0 , k _ 2 / k 1 , p T K E E s [ ( P k l _ / 1 [ + k 1 [ E ] 8 O k 1 t 0 . 2 ) / k 1 [ 8 1 0 . ( 5 . 1 9 ) 2 “ 2 M e n t e n e q u a t i o n c o n t r i b u t e t o t h e e r r o r s o f t h e p r e d i c t e d i n i t i a l v e l o c i t i e s . T h e s t e a d y - s t a t e a p p r o x i m a t i o n o n t h e c o m p l e x C c a u s e s g r e a t e r e r r o r s a t v e r y s m a l l e x t e n t s o f r e a c t i o n s i n c e t h e i n i t i a l c o n d i t i o n [ C ] t = 0 = 0 i s i n - c o n s i s t e n t w i t h E q u a t i o n ( 5 . 1 3 ) , a n d s o m e t i m e i s r e q u i r e d a f t e r m i x i n g f o r [ C ] t o a p p r o a c h t h e v a l u e g i v e n b y E q u a - t i o n ( 5 . 1 3 ) . T h e e r r o r s f r o m t h e a p p r o x i m a t i o n [ S ] ; [ s ] O u s e d i n M e t h o d 1 a n d t h e s i m i l a r a p p r o x i m a t i o n o f E q u a t i o n ( 5 . 1 6 ) f o r M e t h o d 2 i n c r e a s e w i t h e x t e n t o f r e a c t i o n . B . S i n g u l a r P e r t u r b a t i o n S o l u t i o n W e n o w i n t e g r a t e t h e d i f f e r e n t i a l r a t e e q u a t i o n s t o f i r s t o r d e r i n t h e s i n g u l a r p e r t u r b a t i o n s c h e m e o f H e i n e k e n , T s u c h i y a a n d A r i s ( 1 9 6 7 ) . T h e e q u a t i o n s a r e f i r s t m a d e d i m e n s i o n l e s s b y t h e f o l l o w i n g d e f i n i t i o n s . T h e e n z y m e a n d s u b s t r a t e m a s s b a l a n c e e q u a t i o n s a r e , r e s p e c - t i v e l y , l = e + c ( 5 . 2 0 ) 2 “ 3 1 = S + p + n o E q u a t i o n s ( 5 . 2 0 ) a n d ( 5 . 2 1 ) r e d u c e E q u a t i o n s ( 5 . 5 ) a n d ( 5 . 6 ) t o a p a i r o f d i f f e r e n t i a l e q u a t i o n s t o b e s o l v e d f o r t w o c o n c e n t r a t i o n v a r i a b l e s , 8 a n d c , ( d s / d t ) = s ( c - l ) + ( K - l ) c = F ( s , c , r , u ) u ( d C / d T ) = S ( l - Y ) ( 1 - c ) + y — ( y + K ) c + u y c ( c — l ) = G ( s , c , T , u ) w i t h i n i t i a l c o n d i t i o n s s ( 0 ) = 1 , c ( 0 ) = 0 T h e p a i r o f e q u a t i o n s i n p a n d c i s ( d p / d t ) = A c - Y p ( 1 - C ) = U ( p , c , T , u ) u ( d c / d t ) ( c - 1 ) [ 1 + ( Y - l ) p ] - K C + u 0 ( c - l ) V ( p , c , 1 , u ) w i t h i n i t i a l c o n d i t i o n s p ( 0 ) = 0 , C ( O ) = 0 ( 5 . ( 5 . ( 5 . ( 5 . ( 5 . ( 5 . 2 2 ) 2 3 ) 2 1 4 ) 2 5 ) 2 6 ) 2 7 ) 2 “ “ I f a n e x a c t s o l u t i o n w e r e o b t a i n a b l e f o r E q u a t i o n s ( 5 . 2 2 ) a n d ( 5 . 2 3 ) , p c o u l d b e c a l c u l a t e d f r o m t h e e q u a t i o n p = l — s - u c ( 5 . 2 8 ) H o w e v e r , u i s t h e p e r t u r b a t i o n p a r a m e t e r f o r o u r a p p r o x i m a t e s o l u t i o n . T o m a i n t a i n a w e l l - o r d e r e d p e r t u r b a t i o n s c h e m e f o r u # 0 , i t i s n e c e s s a r y t o o b t a i n p f r o m a s e p a r a t e s o l u - t i o n t o E q u a t i o n s ( 5 . 2 5 ) a n d ( 5 . 2 6 ) . T h e s o l u t i o n o f E q u a t i o n s ( 5 . 2 2 ) a n d ( 5 . 2 3 ) i s d e s c r i b e d h e r e . T h e s a m e p r o c e d u r e i s u s e d t o s o l v e E q u a t i o n s ( 5 . 2 5 ) a n d ( 5 . 2 6 ) , a n d t h e i r s o l u t i o n s a r e l i s t e d i n A p p e n d i x H . T h e p e r t u r b a t i o n p a r a m e t e r i n o u r s i n g u l a r p e r t u r b a - t i o n s c h e m e i s u = ( [ E ] O / [ S ] O ) , w h i c h i s u s u a l l y s m a l l c o m p a r e d t o u n i t y i n S t e a d y e s t a t e k i n e t i c s t u d i e s . I n t h e l i m i t u + 0 , E q u a t i o n s ( 5 . 2 2 ) a n d ( 5 . 2 3 ) r e d u c e t o E q u a t i o n s ( 5 . 2 9 ) a n d ( 5 . 3 0 ) , w h i c h a r e e q u i v a l e n t t o t h e s t e a d y - s t a t e e q u a t i o n s ( 5 . 1 2 ) a n d ( 5 . 1 3 ) F ( S , C , T , 0 ) ( 5 . 2 9 ) ( d s / d r ) = s ( c — l ) + ( K - 1 ) c 0 = s ( l - Y ) ( 1 - c ) + y — c ( + K ) G ( S , C , T , O ) ( 5 . 3 0 ) E q u a t i o n ( 5 . 3 0 ) i s n o t s a t i s f i e d b y t h e i n i t i a l c o n d i - t i o n s i n E q u a t i o n ( 5 . 2 “ ) s i n c e G ( s ( 0 ) , c ( 0 ) , o , 0 ) = 1 ( 5 . 3 1 ) 1 : 3 ( d c / d o ) o = 0 = 1 ( 5 . 3 3 ) 2 “ 5 A n o t h e r p a i r o f d i f f e r e n t i a l _ e q u a t i o n s i s r e q u i r e d t h a t s a t i s f i e s t h e i n i t i a l c o n d i t i o n s i n t h e l i m i t u + 0 . F r o m E q u a t i o n ( 5 . 2 3 ) , i n t h e l i m i t u + 0 a t T = 0 , w e h a v e l i m ( d c / d 1 ) T = O = l i m ( u - l ) = m ( 5 . 3 2 ) n + 0 n + 0 T h i s s u g g e s t s t h e d e f i n i t i o n o f a n e x p a n d e d t i m e s c a l e a = ( T / u ) t o g i v e a f i n i t e r a t e o f c o m p l e x p r o d u c t i o n a t T = O . T h e d i f f e r e n t i a l e q u a t i o n s i n t h e 0 t i m e s c a l e a r e c a l l e d t h e i n n e r e q u a t i o n s . T h e y c a n b e i n t e g r a t e d w i t h t h e i n i t i a l c o n d i t i o n s s ( 0 ) = 1 , c ( 0 ) = 0 i n t h e l i m i t n + 0 . I n n e r E q u a t i o n s ( d s / d o ) = u [ S ( C - 1 ) + ( K - l ) c ] = u F ( S , c , T , u ) ( 5 - 3 " ) ( d c / d o ) = s ( l - y ) ( l - c ) + y - c ( y + K ) + u y c ( c - 1 ) = G ( s , c , r , u ) ( 5 . 3 5 ) T h e T t i m e s c a l e e q u a t i o n s a r e c a l l e d t h e o u t e r e q u a - t i o n s , w h e r e t h e b a r o v e r t h e c o n c e n t r a t i o n v a r i a b l e s d e n o t e s " o u t e r " . n I 2 “ 6 O u t e r E q u a t i o n s ( d E / d ‘ l ' ) = E V E — l + ( K - l ) ? = F ( § , € , 1 ’ , u ) ( 5 . 3 6 ) [ d d s / ( i t ) = § ( l - y ) ( l - E ) + y - E ( Y + K ) + p y - C - ( E - l ) = G ( § , E , T , p ) ( 5 . 3 7 ) E q u a t i o n s ( 5 . 3 “ ) t h r o u g h ( 5 . 3 7 ) a r e n o n l i n e a r , a n d h a v e n o k n o w n c l o s e d f o r m s o l u t i o n s . H e n c e , w e t a k e u = 0 a s a z e r o t h o r d e r a p p r o x i m a t i o n t o o b t a i n s o l v a b l e l i n e a r e q u a t i o n s . A n o r d i n a r y p e r t u r b a t i o n s o l u t i o n a b o u t u = 0 i s o b t a i n e d f o r t h e i n n e r a n d o u t e r e q u a t i o n s , “ , ( 5 . 3 8 ) ( A I I " M 8 ( l / n ! ) ( 3 8 / 3 u ) o ’ c u I M m : 3 1 : n 0 a n d l i k e w i s e f o r 3 , 5 , a n d E . T h e i n i t i a l c o n d i t i o n s o f E q u a t i o n ( 5 . 2 “ ) a r e a p p l i e d t o t h e i n n e r e q u a t i o n s w i t h o u t l o s s o f g e n e r a l i t y a s 5 0 ( 0 ) = l , 5 ( 0 ) = 0 , n z _ 1 c n ( o ) = o , n 2 . o ( 5 . 3 9 ) I n i t i a l c o n d i t i o n s f o r t h e o u t e r e q u a t i o n s a r e d e r i v e d b y r e q u i r i n g t h e i n n e r a n d o u t e r s o l u t i o n s t o m a t c h i n a r e g i o n w h e r e o i s l a r g e a n d T i s c l o s e t o z e r o . T h e d e t a i l s o f t h e m a t c h i n g p r o c e d u r e a r e d e s c r i b e d i n A p p e n d i x I . m s ( m ) E n E O s n u n ( 5 . “ 0 ) m E m ) E n g o g n u n ( 5 . “ 1 ) m S ( m ) E n z o % ! | ( u § % + T § % ) n § l ( u = 0 , r = 0 ) ( 5 . “ 2 ) t h e t o t a l s o l u t i o n t o o r d e r m i n t h e p a r a m e t e r p f o r s u b - s t r a t e o v e r t h e e n t i r e t i m e c o u r s e , s ( m ) , i s d e f i n e d b y E q u a t i o n ( 5 . “ 3 ) . A s ( m ) + § ( m ) " ' s ( m ) ( 5 0 , 4 3 ) S ( m ) E q u a t i o n s ( 5 . “ 0 ) a n d ( 5 . “ 1 ) a r e t h e m ' t h o r d e r i n n e r a n d o u t e r s o l u t i o n s , r e s p e c t i v e l y . E q u a t i o n ( 5 . “ 2 ) i s t h e m ' t h o r d e r d o u b l e T a y l o r ' s S e r i e s e x p a n s i o n o f t h e o u t e r s o l u t i o n a b o u t t h e p o i n t u = 0 , t = 0 . T h e r o l e o f s ( m ) i n E q u a t i o n ( 5 . “ 3 ) i s t o s u b t r a c t 5 k m ) f r o m t h e r i g h t h a n d s i d e o n t h e i n n e r t i m e s c a l e , a n d t o s u b t r a c t s ( m ) o n t h e o u t e r t i m e s c a l e . C ( m ) ’ t h e t o t a l m ' t h o r d e r s o l u t i o n f o r t h e c o m p l e x , i s d e f i n e d s i m i l a r l y b y E q u a t i o n ( 5 . “ “ ) . 5 + - — “ . C ( m ) c ( m ) ° < m > ° ( m ) ‘ 5 u ” ) T h e z e r o t h a n d f i r s t o r d e r i n n e r a n d o u t e r e q u a t i o n s a n d t h e t o t a l f i r s t o r d e r s i n g u l a r p e r t u r b a t i o n s o l u t i o n a r e g i v e n i n A p p e n d i x H . T h e m a t c h i n g o f t h e i n n e r a n d 1 + K i c h r n t d o i i f n t ) e m t m r s q o s , e = e c u a a p a r a l r g e t n . s r e o e e r p i d Y e e n e V / P n s s 2 ( w t S e . c o w p u v i h e f s e t e r l e i t r o t e e c u h t s e i r h u b e t i p d a s i p n i t e e e f i s r f o t s c 5 e r l 1 a e e u , n h e V o s T q n t u e t i ' m i l s V i t a n , t s 2 a i o s e o V n 1 e t P ( 5 . l u o l ) “ — a 5 r e n u h t n u e h s m a e s i e m o r e f h n i a i l c i s e a r g u s l s h r s t e i o n s i a d n r t i i d e n 0 e t g . i i r r t 2 a a i , s t l a i i w l e g n v n o e 2 “ 8 o u t e r s o l u t i o n s i s d e s c r i b e d i n A p p e n d i x I . C . P r a c t i c a l R e s u l t s I n o r d e r t o e x a m i n e e f f i c i e n t l y t h e a c c u r a c y o f t h e M i c h a e l i s - M e n t e n e q u a t i o n f o r i n i t i a l v e l o c i t i e s o v e r a w i d e r a n g e o f c o n d i t i o n s , w e m u s t c h o o s e a c o m p a c t s e t o f v a r - i a b l e s t o r e p r e s e n t t h e f o u r r a t e c o n s t a n t s a n d t w o i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s . T h e d i m e n s i o n l e s s d i f f e r e n t i a l e q u a t i o n s ( 5 . 2 2 ) a n d ( 5 . 2 3 ) r e d u c e t h e s e s i x q u a n t i t i e s t o t h e f o u r i n d e p e n d e n t p a r a m e t e r s p , K , A , a n d y . W e t h e r e f o r e c h o o s e t h e d i m e n s i o n l e s s e q u a t i o n s f o r o u r a n a l y s i s . I n t h e d i m e n s i o n l e s s r e p r e s e n t a t i o n , t h e M i c h a e l i s - M e n t e n e q u a t i o n f o r i n i t i a l s u b s t r a t e a n d p r o d u c t v e l o c i - t i e s i s t h e s e " m e a s u r e d " v e l o c i t i e s t o t h o s e p r e d i c t e d b y t h e V W e d e f i n e t h e r a t i o s o f M i c h a e l i s - M e n t e n e q u a t i o n a s f o l l o w s : F o r M e t h o d 1 , 2 “ 9 R : s ( V i / m e ) = | d S ( l ) / d r | T , ( 1 + K ) A - l ( 5 . “ 6 ) " l s ( V i / m e ) = ( d P ( 1 ) / d I ) T , ( 1 + K ) A — l ( 5 . “ 7 ) F o r M e t h o d 2 , a : s ( V S / m e ) = ( l - S ( l ) ) ( l + K ) T ' - l A - l ( 5 . “ 8 ) T . H g 2 ( V S / m e ) = P ( 1 ) T ' ( 1 + K ) T ' - 1 A — l , ( 5 . “ 9 ) w h e r e 1 ' i s t h e t i m e a t w h i c h t h e i n i t i a l v e l o c i t y i s m e a s u r e d . T h e i n i t i a l v e l o c i t y p r e d i c t e d b y t h e M i c h a e l i s — M e n t e n e q u a t i o n s i s e x a c t l y c o r r e c t o n l y w h e n t h e a p p r o - p r i a t e r a t i o d e f i n e d b y E q u a t i o n ( 5 . “ 6 ) t h r o u g h ( 5 . “ 9 ) e q u a l s 1 . W e u s e t h e f o u r i n d e p e n d e n t c o m b i n a t i o n s o f u , K , A , a n d 7 d e f i n e d i n C o l u m n 1 o f T a b l e 5 . 1 t o e x a m i n e R S , R E , R 3 , a n d R S . C o l u m n 2 o f T a b l e 5 . 1 l i s t s t h e s e p a r a m e t e r s a s f u n c t i o n s o f t h e r a t e c o n s t a n t s a n d i n i t i a l c o n c e n t r a - t i o n s . I n p r a c t i c e s o m e o f t h e r a t e c o n s t a n t s m a y b e u n - k n o w n . T h e M i c h a e l i s - M e n t e n e q u a t i o n ( 5 . 1 ) g i v e s o n l y V m a x a n d K M f r o m a s i n g l e i n i t i a l v e l o c i t y s t u d y . I f t h e r e a c t i o n i s i r r e v e r s i b l e ( k _ 2 = 0 ) , n o f u r t h e r i n f o r m a t i o n i s o b t a i n a b l e f r o m s t e a d y - s t a t e i n i t i a l v e l o c i t i e s . I f t h e r e a c t i o n i s r e v e r s i b l e , w e c a n m e a s u r e t h e e q u i l i b r i u m c o n s t a n t K e q E ( [ P ] e q / [ S ] e q ) . C o l u m n 3 o f T a b l e 5 . 1 l i s t s f 1 l o - m ' s v ) . ; 1 - i o r s l - v m v y e S K + l s [ & m a n / V v ( m m m A V K K r e v e r e h - t r s u l o p f s r e t 1 e m a r ’ ) o - d r a w r o f a h E P t [ l e s l k d . s o l s e S m n e i [ K a l t / 1 ( m - m K K v n o i s n e m i D s i n c o o i l t e a v ’ r 1 t m n u e m c i e ’ . h n t o i r t l ’ m x n o a c m o f s a ‘ q d l u ) e a n q 0 i a E 1 1 t n ’ s s - i o n i e [ ) 1 1 2 ' m t n i n s t a k ) k s n ( 1 2 n t > i e e k k r M ( + 2 p - 2 1 k x s _ _ + E i 1 k 1 l 1 ( _ t e n a e h l c a i v M i k _ 2 ( k k s n s o n c o i s s i s l e e r a p h x c e i u e M q h E t . 1 1 1 t n n e o l i a t v c . i e 5 - ) A u r q i e / ) K E d l K K b ( / a [ x ( T Y e q D i m e n s i o n l e s s p a r a m e t e r s f o r a n a l y s i s o f t h e M i c h a e l i s - M e n t e n e q u a t i o n . E q u i v a l e n t e x p r e s s i o n s i n r a t e c o n s t a n t s a n d i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s . E q u i v a l e n t e x p r e s s i o n s i n ‘ K K V k a n d t h e i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s . 2 5 0 2 5 1 t h e f o u r d i m e n s i o n l e s s p a r a m e t e r s i n t e r m s o f K [ 3 3 0 . [ E 1 0 , K e q 1 - y [ ( K / A ) — l ] c a n b e c a l c u l a t e d e v e n i f k 1 i s u n k n o w n . T h e i r V M ’ m a x ’ , a n d k T h e p a r a m e t e r s p , K , a n d p h y s i c a l m e a n i n g i s e a s i l y u n d e r s t o o d . T o a l a r g e e x t e n t , 1 1 d e t e r m i n e s t h e a c c u r a c y o f t h e s t e a d y - s t a t e a p p r o x i m a t i o n , s i n c e i t i s t h e p e r t u r b i n g p a r a m e t e r i n t h e p e r t u r b a t i o n s c h e m e . K r e f l e c t s t h e d e g r e e o f s a t u r a t i o n o f t h e e n z y m e b y s u b s t r a t e w h e n t h e s t e a d y - s t a t e i s o b t a i n e d . I n m o s t i n i t i a l v e l o c i t y s t u d i e s , K i s v a r i e d f r o m 0 . 2 t o 5 . 0 . y [ ( K / X ) - 1 ] i s t h e r e c i p r o c a l o f t h e o v e r a l l e q u i l i b r i u m c o n s t a n t , K e q ' I f t h e r e a c t i o n i s i r r e v e r s i b l e , y [ ( K / A ) - 1 ] = 0 . ( A / K ) r e q u i r e s a v a l u e f o r k 1 , w h i c h c a n n o t b e d e - t e r m i n e d f r o m s t e a d y — s t a t e i n i t i a l v e l o c i t i e s i n t h e f o r - w a r d d i r e c t i o n o n l y . H o w e v e r , ( A / K ) i s a f u n c t i o n o f r a t e c o n s t a n t s o n l y a n d i s t h e r e f o r e i n d e p e n d e n t o f t h e i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s . I t l i e s i n t h e o p e n i n t e r v a l 0 < ( A / K ) < 1 . ( 5 . 5 0 ) F r o m I n e q u a l i t y ( 5 . 5 0 ) w e c a n d e r i v e a l o w e r l i m i t f o r R 1 ; k 1 > ( V m a x / K m E E J O ) ( 5 . 5 1 ) I f t h e r e a c t i o n i s a p p r e c i a b l y r e v e r s i b l e , a n i n i t i a l v e l o c i t y s t u d y i n t h e r e v e r s e d i r e c t i o n w i l l y i e l d V m a x a n d K $ . A l l o f t h e r a t e c o n s t a n t c a n b e c a l c u l a t e d f r o m 2 5 2 V K K ' i - v ' 1 " ' 1 k 1 - ( V m a x + V m a x ) [ E 3 0 K m ( 5 ' 5 2 ) k = V ' [ s ] ' 1 ( 5 5 3 ) - 1 m a x 0 ° k = v [ E ] ‘ 1 ( 5 5 “ ) 2 m a x 0 ' k = ( v + V ' ) [ E ] ' 1 K " 1 ( 5 5 5 ) - 2 m a x m a x 0 m ° ’ C o l u m n “ o f T a b l e 5 . 1 l i s t s t h e f o u r d i m e n s i o n l e s s p a r a m - V ' K e t e r s i n t e r m s o f V m a x ’ m a x ’ m . K g . ( E 1 0 . a n d ( S i g . W e b e g i n o u r a n a l y s i s w i t h a s p e c i f i c e x a m p l e t o i l - l u s t r a t e t h e u s e o f t h e a b o v e d e f i n i t i o n s . T h e i r r e v e r — s i b l e h y d r o l y s i s o f a c e t y l - L - p h e n y l a l a n i n e e t h y l e s t e r b y c h y m o t r y p s i n i s c o n s i s t e n t w i t h M e c h a n i s m I w i t h K m = u 1 0 ‘ M , a n d v m a = 1 0 " ' 5 M " 1 s e c " 1 ( H . G u t f r e u n d , 1 9 5 5 ) . C o n - x s i d e r a n i n i t i a l s u b s t r a t e v e l o c i t y d e t e r m i n e d b y M e t h o d “ 1 w i t h [ E ] O = 1 0 ‘ 6 M , a n d [ S ] O = 1 0 ' M . T h e n u = 1 0 ' 3 , K = 1 . 0 , a n d Y [ ( K / y ) — l ] = 0 . I n e q u a l i t y ( 5 1 ) r e q u i r e s t h a t k 1 > 1 0 5 M - l s e c — l . W e u s e t w o h y p o t h e t i c a l v a l u e s o f k 1 t o c a l c u l a t e ( A / K ) . F o r k 1 = 1 0 6 M ' l s e c ' l , ( A / K ) = 1 0 - 1 ; a n d f o r k 1 = 1 0 7 M - l s e c - l , ( l / K ) = 1 0 — 2 . F i g u r e 5 . 3 s h o w s t h a t f o r ( A / K ) = 1 0 ’ 2 , t h e m e a s u r e d i n i t i a l s u b s t r a t e v e l o c i t y ( R : i s d e f i n e d i n E q u a t i o n ( 5 . “ 6 ) ) s t a r t s o u t 1 9 8 t i m e s a s l a r g e a s t h e v e l o c i t y p r e d i c t e d b y t h e M i c h a e l i s - - 1 M e n t e n e q u a t i o n . F o r ( A / K ) = 1 0 , R : s t a r t s a t 1 9 . 8 . 2 5 3 1 0 3 - F I T I I . A 1 0 2 ” _ B 1 0 ‘ _ a S R ] 1 ) — I o k — m J : b { 4 1 1 1 ) 0 ) 0 1 0 " 1 0 - 3 1 0 - 2 1 0 — ) 7 F i g u r e 5 . 3 . R : v e r s u s t i m e f o r i r r e v e r s i b l e h y d r o l y s i s o f a c e t y l - L - p h e n y l a l a n i n e e t h y l e s t e r b y c h y m o t r y p s i n . ( A / K ) = 1 0 ' 2 ( A ) , 1 0 - 1 ( B ) . 2 5 “ T h e s e l a r g e e r r o r s o c c u r b e f o r e t h e c o m p l e x C h a s r e a c h e d 5 1 t o v a l u e s n e a r 1 f o r b o t h c a s e s . A s e x p l a i n e d b y H e i n e k e n , i t s s t e a d y — s t a t e l e v e l . A t T E 0 . 0 0 7 , R d r O p s r a p i d l y T s u c h i y a a n d A r i s ( 1 9 6 7 ) , t h i s s u d d e n d r o p i s c a u s e d b y t h e v a n i s h i n g o f t h e t e r m e x p [ - ( 1 + K ) T n - 1 ] i n t h e p e r t u r b a - t i o n s o l u t i o n . T h e t i m e t i n s e c o n d s i s r e l a t e d t o T b y t = k i l [ E 1 6 1 1 . F o r k 1 = 1 0 6 M ' l s e c ' l , R : r e a c h e s 1 i n 7 m s e c , w h i l e f o r k 1 = 1 0 7 M - l s e c ' l , R : r e a c h e s 1 i n 0 . 7 6 1 - l m s e c . S i n c e k 1 i s t y p i c a l l y g r e a t e r t h a n 1 0 M - s e c , a n d i n i t i a l v e l o c i t i e s a r e u s u a l l y m e a s u r e d a t t > 5 m s e c , t h e m a j o r i t y o f i n i t i a l v e l o c i t i e s r e q u i r e n o p r e - s t e a d y - s t a t e c o r r e c t i o n t o t h e M i c h a e l i s - M e n t e n e q u a t i o n . T h e p r e - s t e a d y — s t a t e p e r i o d c a n b e l e n g t h e n e d b y d e c r e a s i n g [ E ] O a n d [ 8 1 0 . W e n o w e x a m i n e t h e i n f l u e n c e o f n , K , [ ( K / A ) - 1 ] , a n d ( l / K ) o n R 5 , R E , R 3 i n f o r m a t i v e t o p l o t t h e r a t i o s v e r s u s t h e e x t e n t o f r e a c t i o n , a n d R S . F o r t h i s a n a l y s i s i t i s m o r e i n s t e a d o f t i m e . F o r p r o d u c t v e l o c i t i e s t h e e x t e n t o f r e a c t i o n i s d e f i n e d a s P ( 1 ) , a n d f o r s u b s t r a t e v e l o c i t i e s , a s 1 - S ( 1 ) . E f f e c t o f g u = ( [ E ] 0 £ L § l o l ; F i g u r e 5 . “ s h o w s t h e e f f e c t o f o n R : a t s m a l l e x t e n t s o f r e a c t i o n . I n e a c h c a s e R : d e c r e a s e s t o 1 a t ( l - S ( l ) ) < u . A M e t h o d 1 i n i t i a l s u b s t r a t e v e l o c i t y m e a s u r e d a t a n e x t e n t o f r e a c t i o n m u c h l e s s t h a n u i s c o n s i d e r a b l y g r e a t e r t h a n t h e M i c h a e l i s - M e n t e n v a l u e b e c a u s e t h e c o m p l e x C h a s n o t r e a c h e d i t s s t e a d y - s t a t e c o n c e n t r a t i o n . F i g u r e 5 . 5 s h o w s t h a t , e v e n a t e x t e n t s o f r e a c t i o n g r e a t e r t h a n u , t h e M i c h a e l i s - M e n t e n e q u a t i o n u n d e r e s t i m a t e s M e t h o d 2 i n i t i a l s u b s t r a t e _ _ l . 1 1 ) S R 1 I I T — I 1 T 0 3 L — A . B ( I D 0 L “ — , _ k L 1 t o “ _ l 1 0 — 5 J 0 1 - 3 l 0 ) " J l o " l o i 1 " — S ( I ) 0 ‘ 2 5 5 F i g u r e 5 . “ . E f f e c t o f u o n R : a t s m a l l e x t e n t s o f r e a c t i o n . u = 1 0 ’ “ ( A ) , l o ' 3 ( B ) , 1 0 - 2 ( C ) , 1 0 ‘ 1 ( D ) . F o r a l l c u r v e s , ( A / K ) = 1 0 - 3 , K = 1 . 0 , y [ ( K / A ) - 1 ] = 0 . I I F I I I / \ B ( Z [ ) _ _ . . . w l — R S 2 1 1 0 1 7 — - 0 ' - > — 2 . 1 1 0 . ‘ ° 1 0 1 - 5 1 0 1 ' 3 1 0 1 ‘ 2 1 0 1 " l 1 0 1 I “ — 5 ( I ) 2 5 6 3 F i g u r e 5 . 5 . E f f e c t o f u o n R S a t s m a l l e x t e n t s o f r e a c t i o n . u = l o ‘ “ ( A ) , 1 0 ' ( B ) , 1 0 - 2 ( C ) , 1 0 - 1 ( D ) . F o r a l l c u r v e s , ( l / K ) = 1 0 ' 3 , K = 1 . 0 , y [ ( K / l ) - l ] = 0 0 1 ( 5 . 5 8 ) 2 5 7 v e l o c i t i e s . T h e d e g r e e o f u n d e r e s t i m a t i o n i s d e s c r i b e d a p p r o x i m a t e l y b y R 3 2 ( 1 - s ( 1 ) ) ( 1 + x ) ( ( 1 - s ( 1 ) ) ( 1 + K ) - u 1 ’ 1 . ( 5 . 5 6 ) E q u a t i o n ( 5 . 5 6 ) w a s o b t a i n e d f r o m t h e f i r s t o r d e r p e r t u r b a — t i o n s o l u t i o n w i t h t h e a s s u m p t i o n s ( l — S ( l ) ) < < 1 , u < < 1 , 1 < < ( K + l ) e x p [ - ( 1 + K ) r u _ l ] ( 5 . 5 7 ) F i g u r e s 5 . 6 a n d 5 . 7 s h o w t h a t t h e i n i t i a l p r o d u c t v e l o c i t i e s b y t h e t w o m e t h o d s a r e o v e r e s t i m a t e d b y t h e M i c h a e l i s - M e n t e n e q u a t i o n a t e x t e n t s o f r e a c t i o n l e s s t h a n u . E x c e p t i n g t h e l a g s h o w n b y R S , p d o e s n o t s i g n i f i c a n t l y a f f e c t t h e a c c u r a c y o f t h e M i c h a e l i s — M e n t e n e q u a t i o n s a t e x t e n t s o f r e a c t i o n g r e a t e r t h a n u f o r u 5 1 0 . 2 . I f u i 1 0 - 2 a n d ( 1 - S ( l ) ) > u , t h e z e r o t h o r d e r o u t e r t e r m s d o m i n a t e t h e p e r t u r b a t i o n s o l u t i o n , a n d t h e f o l l o w i n g l i m i t i n g e q u a t i o n s , e q u i v a l e n t t o t h e s t e a d y - s t a t e i n t e - g r a t e d E q u a t i o n ( 5 . 1 5 ) , c a n b e u s e d . - 1 R 5 = R ; E { 7 ( l r - K ) + D + 7 ( K - 7 ) E f o } I Z K + 7 + ( 1 - Y ) ' s " O ' J " l ( 1 + K N 1 R S a E b ( 1 + K ) t ' 1 1 ‘ l ( 5 . 5 9 ) 2 5 8 [ I I I I I 0 0 % 1 1 I - 0 1 5 l i 1 I — 0 2 I 7 1 I — - 0 . 3 f — — Z : 1 ) A B . C : D O I d ; 1 l . i i — 0 5 5 4 l 1 1 1 I f 1 — c o ; . J i 4 L J 1 L i l - 4 0 - 8 — 6 - 4 - 2 0 l o g i c P M F i g u r e 5 . 6 . E f f e c t o f u o n R E a t s m a l l e x t e n t s o f r e a c t i o n . u = l o ' “ ( A ) , 1 0 ’ 3 ( B ) , 1 0 5 2 ( C ) , l o ’ 1 ( D ) . F o r a l l c u r v e s , ( A / K ) = 1 0 ' 3 , K = 1 . 0 , y [ ( K / l ) - l ] = 0 . F i g u r e 5 . 7 - E t Y ( f i D [ f o ) ( e n . K c . / t A o u o — f r 1 = 1 F ) u a o 0 l l 1 = n ' 0 “ . c ( R u 3 A r ) v , a e t s 1 , e , s 0 m ' ( a 3 l l ( / l B K ) ) x = t 1 e 0 1 n ' 0 g ’ s 3 ( C , o ) f , K e 0 r 1 = a ’ 1 g . - 0 , 2 5 9 r r ‘ 1 * 1 I c o r 2 — c l p 4 I l - c 2 r _ m n - 0 3 L — fl : 1 e 1 7 A 8 C I D g ) 1 — ' — 0 4 F 7 I 3 I - 0 5 } d I 9 ~ 0 6 1 - . 1 I 1 1 1 1 1 1 - 4 o - 8 — o - 4 - 2 0 ' 0 9 1 0 P a ) ' 2 6 0 w h e r e ( y - l ) P o K [ y ( 1 + K — l ) + l ] [ y ( K — A ) - A ] 5 0 + ) T = - 2 2 n ( 5 . 6 0 ) [ y ( 1 - K ) - l ] [ y ( l - K ) - l ] l I f ( 1 - S ( 1 ) ) ( l + K ) [ ( 1 - — s ( l ) ) ( 1 + K ) - u ] ‘ l a 1 a n d u 5 1 0 ' 2 , t h e n a ; = ( 1 — § 0 ) ( 1 + K ) r ‘ 1 ) ' 1 . ( 5 . 6 1 ) F i g u r e 5 . 8 s h o w s t h a t , f o r t h e r e l a t i v e l y h i g h v a l u e : a p p r o a c h e s 1 f o r o n l y a s m a l l p o r t i o n o f t h e r e a c t i o n . F o r H m u c h g r e a t e r t h a n 1 0 - 2 , t h e f u l l f i r s t u = 0 . 1 , R o r d e r p e r t u r b a t i o n s o l u t i o n s s h o u l d b e u s e d . E f f e c t o f K = ( K M / [ 3 3 0 1 ' F i g u r e 5 . 9 i l l u s t r a t e s t h e e f f e c t o f . K o n R : a t s m a l l e x t e n t s o f r e a c t i o n . T h e e f f e c t o n R ; i s q u a l i t a t i v e l y t h e s a m e . A s K i n c r e a s e s , R : a p p r o a c h e s 1 a t l o w e r e x t e n t s o f r e a c t i o n . F i g u r e 5 . 1 0 s h o w s t h e e f f e c t o f K o n R : a t s m a l l e x t e n t s o f r e a c t i o n . R : b e h a v e s s i m i l a r l y . W h e n K i s i n c r e a s e d f r o m 1 0 ' 2 t o 1 , R : a p p r o a c h e s 1 a t g r e a t e r e x t e n t s o f r e a c t i o n . A s K i n c r e a s e s b e y o n d 1 , t h e t r e n d r e v e r s e s a n d R E a p p r o a c h e s 1 a t l o w e r e x t e n t s o f r e a c t i o n . F i g u r e 5 . 1 1 i l l u s t r a t e s t h e e f f e c t o f K o n R : a n d R 5 a t l a r g e e x t e n t s o f r e a c t i o n f o r u ) : 1 0 - 2 , w h e r e E q u a t i o n ( 5 . 5 8 ) i s a g o o d a p p r o x i m a t i o n . A s K i n c r e a s e s , R : a n d R E d e - c r e a s e m o r e r a p i d l y w i t h e x t e n t o f r e a c t i o n . R S a n d R S b e h a v e s i m i l a r l y . T h e s o u r c e s o f t h i s t r e n d a r e t h e 2 6 1 ” I 7 W I I I I 1 . 2 — _ I . ) b _ . I O r — _ 0 . 9 _ _ _ . S R ] 0 8 — " e 0 7 » — _ 0 . 6 e - L 1 1 1 1 O 0 . 1 0 . 2 0 . 3 0 . 4 0 5 ] " 3 ( 1 ) F i g u r e 5 . 8 . R : v e r s u s e x t e n t o f r e a c t i o n f o r u = 0 . 1 , K = 1 . 0 , ( A / K ) = 1 0 ’ 3 , Y [ ( K / l ) - l ] = o . F i g u r e 5 . 9 . 2 6 2 I I I I I 1 0 5 A _ 1 0 ‘ — B — ( I 1 0 3 — — D _ _ 1 0 2 — _ 1 0 " - a , _ _ L L 1 1 1 1 1 — o — 5 - 4 - 3 - 2 l o g g U - S n E f f e c t o f K o n R : a t s m a l l e x t e n t s o f r e - a c t i o n . K = 1 0 ‘ 2 ( A ) , 1 0 ‘ 1 ( B ) , 1 . 0 ( 0 ) , 1 0 . 0 ( D ) . F o r a l l c u r v e s u = 1 0 - 3 , ( A / K ) = 1 0 ' 3 Y [ ( K / > . ) - 1 ] = 0 . ’ 2 6 3 l 1 l l _ 1 ~ 1 0 - 9 * 8 7 - 6 — 5 l 0 9 m P m F i g u r e 5 . 1 0 . E f f e c t o f K o n R ? a t s m a l l e x t e n t s o f r e a c - t i o n . K = 1 0 ‘ 2 ( A ) , 1 0 ' 1 ( B ) , l . 0 ( C ) , . 1 0 . 0 ( B ) . F o r a l l c u r v e s , u = 1 0 ’ 3 , ( l / K ) = 1 0 - 3 , Y [ ( K / A ) - 1 ] = o . = 1 0 ’ 3 . y ( ( K / ) ) - l l . o . 2 6 “ 0 . 5 - 0 . 4 1 - 1 1 0 . 0 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 P o = I _ 5 0 F i g u r e 5 . 1 1 . E f f e c t o f K o n R : a n d R 5 a t l a r g e e x t e n t s o f r e a c t i o n . K = 1 0 ‘ 2 ( A ) , 1 0 ' 1 ( B ) , 1 . 0 ( 0 ) , 1 0 . 0 ( D ) . F o r a l l c u r v e s u = 1 0 ' 3 , ( l / K ) 2 6 5 i n c r e a s i n g e r r o r s o f t h e M e t h o d 1 a p p r o x i m a t i o n [ S ] E [ S ] O a n d t h e M e t h o d 2 a p p r o x i m a t i o n l o g ( 1 + y ) E l + y a s [ $ 1 0 i s d e c r e a s e d . E f f e c t o f ( A / K ) . F i g u r e 5 . 1 2 s h o w s t h e e f f e c t o f ( I / K ) o n t h e i n i t i a l b e h a v i o r o f R 3 . T h e e f f e c t o n R 3 i s q u a l i — t a t i v e l y t h e s a m e . A s ( A / K ) d e c r e a s e s ( i . e . , a s k 1 , w h i c h i s u s u a l l y u n k n o w n , i n c r e a s e s ) , R : s t a r t s a t h i g h e r v a l u e s , b u t d r o p s t o 1 a t a n e x t e n t o f r e a c t i o n i n s e n s i - t i v e t o ( A / K ) . F i g u r e 5 . 1 3 s h o w s t h a t R 5 a p p r o a c h e s 1 P a t l o w e r e x t e n t s o f r e a c t i o n a s ( l / K ) d e c r e a s e s . R 2 b e h a v e s s i m i l a r l y . I f t h e r e a c t i o n i s i r r e v e r s i b l e , E q u a t i o n s ( 5 . 5 8 ) t h r o u g h ( 5 . 6 1 ) r e d u c e t o R 1 1 3 = a : = § ( ) ( 1 + K ) ( K + “ s ‘ 0 ) " 1 ( 5 . 6 2 ) R S = R P = " ( 1 + K ) [ - — K i n ( 1 5 ' ) 1 ‘ 3 L ( 5 6 3 ) 2 2 p 0 p o p o ° S i n c e t h e r i g h t h a n d s i d e s o f E q u a t i o n s ( 5 . 6 2 ) a n d ( 5 . 6 3 ) a r e i n d e p e n d e n t o f ( A / K ) , ( A / K ) h a s n o e f f e c t o n t h e i r - r e v e r s i b l e r e a c t i o n a f t e r t h e s t e a d y s t a t e i s o b t a i n e d i f u 1 ' 1 0 ' 2 . F o r h i g h v a l u e s o f u , h o w e v e r , ( A / K ) a f f e c t s t h e a c c u r a c y o f t h e M i c h a e l i s - M e n t e n e q u a t i o n s a t f a i r l y h i g h e x t e n t s o f r e a c t i o n , a s i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 5 . 1 “ f o r R i . I f t h e r e a c t i o n i s r e v e r s i b l e , ( l / K ) a f f e c t s e v e n t h e s t e a d y - s t a t e r e s u l t s o f E q u a t i o n s ( 5 . 5 8 ) t h r o u g h ( 5 . 6 1 ) . 2 6 6 1 0 5 1 : . . T “ " ” h — j — fi m T ' w ‘ ' - I I ' : . A 1 0 ‘ — _ B . 1 0 1 — _ s R ] _ _ _ C 1 0 % - \ _ [ D I O L - “ \ \ \ \ \ \ _ 1 r — 1 1 1 1 1 - o — 5 — 4 — 3 — 2 — 1 [ 0 9 1 ° C I ’ 5 0 ) ) F i g u r e 5 . 1 2 . E f f e c t o f ( A / K ) o n R ? a t s m a l l e x t e n t s o f r e a c t i o n . ( l / K ) = 1 0 ' u ( A ) , 1 0 ' 3 ( B ) , 1 0 " 2 ( C ) , 1 0 ' 1 ( D ) . F o r a l l c u r v e s u = 1 0 ' 3 , K . 1 . 0 , y [ ( K / l ) - 1 ] . 0 . F i g u r e 5 . 1 3 . 2 6 7 - 9 - 8 - 7 — b - 5 - 4 ' 0 9 1 0 P 0 ) E f f e c t o f ( A / K ) o n R 5 a t s m a l l e x t e n t s o f r e a c t i o n . ( A / K ) = 1 0 ' “ ( A ) , l o ' 3 ( s ) , 1 0 ’ 2 ( C ) , 1 0 - 1 ( D ) . F o r a l l c u r v e s u = 1 0 — 3 , K = 1 . 0 Y [ ( K / A ) - 1 ] = o . 0 . 1 0 0 1 2 0 1 4 1 " 5 m 0 . 1 6 0 . 1 8 0 . 2 0 2 6 8 1 . 4 — , 0 7 l 1 1 1 4 2 F i g u r e 5 . 1 “ . E f f e c t o f ( / K ) o n R ? a t l a r g e e x t e n t s o f r e a c t i o n f o r u = 0 . 2 ( A / K ) = 0 . 5 ( A ) , 0 . 1 ( B ) , 0 . 0 1 ( C ) . F o r a l l c u r v e s K = 1 . 0 , u . 0 . 2 . v [ ( K / l ) - 1 1 - 0 . 2 6 9 F i g u r e 5 . 1 5 s h o w s t h a t a s ( A / K ) i n c r e a s e s , R : a n d R I d e - c r e a s e f a s t e r w i t h i n c r e a s i n g e x t e n t o f r e a c t i o n . E f f e c t o f y [ ( K / ) . ) — 1 ] = K : : ; y [ ( K / ) . ) - l ] d o e s n o t s i g - n i f i c a n t l y a f f e c t t h e p r e - s t e a d y - s t a t e a c c u r a c y o f t h e M i c h a e l i s - M e n t e n e q u a t i o n . F i g u r e 5 . 1 6 i l l u s t r a t e s t h e e f f e c t o f y [ ( K / A ) - l ] o n R : a n d R E d u r i n g t h e s t e a d y - s t a t e p e r i o d f o r s m a l l u , w h e r e E q u a t i o n s ( 5 . 5 8 ) t h r o u g h ( 5 . 6 1 ) a p p l y . T h e e f f e c t o n a : a n d H g i s s i m i l a r . D . D i s c u s s i o n I n t h e p r e c e d i n g s e c t i o n w e h a v e e x a m i n e d t h e a c c u r a c y o f t h e M i c h a e l i s - M e n t e n e q u a t i o n f o r M e c h a n i s m ( 1 ) . T h e f o l l o w i n g r e c o m m e n d a t i o n s c a n b e f o r m u l a t e d f r o m t h e r e - s u l t s . 1 . F o r t h e u s u a l i n i t i a l v e l o c i t y s t u d y , w h e r e “ . 1 1 0 - 2 , t h e M i c h a e l i s - M e n t e n e q u a t i o n p r e d i c t s M e t h o d 1 s u b s t r a t e a n d p r o d u c t i n i t i a l v e l o c i t i e s a n d M e t h o d 2 p r o d u c t i n i t i a l v e l o c i t i e s m o s t a c c u r a t e l y a t e x t e n t s o f r e a c t i o n s l i g h t l y g r e a t e r t h a n u . A t o t h e r e x t e n t s o f P P r e a c t i o n , t h e e q u a t i o n f o r R 8 , R 1 , o r R 2 c o r r e c t t h e m e a s u r e d i n i t i a l v e l o c i t i e s s o t h a t t h e c a n b e u s e d t o M i c h a e l i s - M e n t e n e q u a t i o n c a n s t i l l b e u s e d t o i n t e r p r e t t h e r e s u l t s . F o r e x a m p l e , t h e M i c h a e l i s - M e n t e n e q u a t i o n i n i t i a l v e l o c i t y c a n b e c a l c u l a t e d f r o m a M e t h o d 1 i n i t i a l s u b s t r a t e v e l o c i t y b y t h e e q u a t i o n p I R 5 I R F i g u r e 5 . 1 5 . 2 7 0 I O ~ l I l 0 . 0 5 0 . I O . 1 5 0 . 2 0 E f f e c t o f ( A / K ) o n R : a n d R 5 a t l a r g e e x t e n t s o f r e a c t i o n w h e r e k - 2 # 0 . ( l / K ) = 0 . 2 ( A ) , 0 . 6 ( B ) , 0 . 8 ( 0 ) . F o r a l l c u r v e s u = 1 0 ' 3 , - - = - ] ' = K - 1 . 0 . y [ ( K / l ) 1 ] K e q 1 . 0 . F i g u r e 5 . 1 6 . E f f e c t o f y [ ( K / l ) - l ] = K ; 1 o n R : a n d R p 2 7 1 0 . 4 l J l 0 . 1 0 0 . 2 0 0 . 3 0 E V = I ‘ § % J . 0 . 4 0 0 . 5 0 1 a t l a r g e e x t e n t s o f r e a c t i o n . y [ ( K / A ) - 1 ] - 1 = K e q = 0 . 0 ( A ) , o . 5 0 ( B ) . 0 . 9 9 ( c ) . 1 . 9 8 ( D ) . 2 7 2 s . v m m ~ R 1 x ( m e a s u r e d i n i t i a l v e l o c i t y ) s P ' P 1 , R 1 , a n d R 2 s h o u l d b e c a l c u l a t e d f r o m E q u a t i o n s ( 5 . “ 6 ) , ( 5 . “ 7 ) , a n d ( 5 . “ 8 ) F o r e x t e n t s o f r e a c t i o n l e s s t h a n u , R u s i n g t h e f u l l f i r s t o r d e r s o l u t i o n s i n A p p e n d i x H . A t 2 , E q u a t i o n s ( 5 . 5 8 ) h i g h e x t e n t s o f r e a c t i o n w h e r e u g 1 0 - a n d ( 5 . 5 9 ) c a n b e u s e d . 2 . M e t h o d 2 i n i t i a l s u b s t r a t e v e l o c i t i e s r e q u i r e t h e f u l l f i r s t o r d e r p e r t u r b a t i o n s o l u t i o n s f o r e x t e n t s o f r e a c t i o n l e s s t h a n n . O n e c a n u s e t h e s i m p l i f i e d E q u a t i o n ( 5 . 5 7 ) f o r e x t e n t s o f r e a c t i o n s l i g h t l y g r e a t e r t h a n u . E q u a t i o n ( 5 . 6 1 ) h o l d s a t h i g h e x t e n t s o f r e a c t i o n w h e r e u 5 1 0 ‘ 2 . ' 2 b u t l e s s t h a n 3 . F o r n s i g n i f i c a n t l y l a r g e r t h a n 1 0 0 . 2 , t h e f u l l f i r s t o r d e r p e r t u r b a t i o n s o l u t i o n s i n A p p e n d i x H s h o u l d b e u s e d . S i n c e t h e f i r s t o r d e r p e r t u r b a t i o n s o l u t i o n s i n A p p e n d i x H d e p e n d o n a l l f o u r r a t e c o n s t a n t s i n t h e s i m p l e M i c h a e l i s — M e n t e n M e c h a n i s m ( I ) , e x p e r i m e n t s t h a t r e q u i r e t h e p e r t u r b a - t i o n s o l u t i o n s a r e r i c h e r w i t h i n f o r m a t i o n t h a n e x p e r i m e n t s t h a t r e q u i r e o n l y t h e M i c h a e l i s — M e n t e n e q u a t i o n . T h e f u l l f i r s t o r d e r s o l u t i o n s d o n o t l e n d t h e m s e l v e s t o g r a p h i c a l a n a l y s i s a s e a s i l y a s t h e M i c h a e l i s - M e n t e n e q u a t i o n . H o w - e v e r , n o n l i n e a r l e a s t s q u a r e s c u r v e f i t t i n g p r o g r a m s s u c h a s t h e K I N F I T p r o g r a m ( D y e a n d N i c e l y , 1 9 7 1 ) m a k e g r a p h i c a l f i t t i n g u n n e c e s s a r y . T h e e n t i r e s u b s t r a t e o r p r o d u c t p r o g r e s s c u r v e c a n b e f i t t o t h e e q u a t i o n s i n A p p e n d i x H . 2 7 3 A l l t h a t i s r e q u i r e d a r e t h e e q u a t i o n s , e n o u g h s m o o t h d a t a t o d e t e r m i n e t h e p a r a m e t e r s i n t h e e q u a t i o n s , a n d r e a s o n - a b l e i n i t i a l e s t i m a t e s o f t h e p a r a m e t e r s . H e i n e k e n , T s u c h i y a a n d A r i s ( 1 9 6 7 ) h a v e s h o w n h o w t h e s i n g u l a r p e r t u r b a t i o n f o r m a l i s m c a n b e e x t e n d e d t o m o r e c o m p l i c a t e d e n z y m e m e c h a n i s m s . B y c o m b i n i n g s i n g u l a r p e r t u r b a t i o n s o l u t i o n s w i t h n o n - l i n e a r l e a s t s q u a r e s f i t t i n g , p r e - s t e a d y - s t a t e e x p e r i m e n t s , s u c h a s t h o s e o f M a g u i r e , H i j a z i a n d L a i d l e r ( 1 9 7 “ ) o n d - c h y m o t r y p s i n c a t a l y z e d r e - a c t i o n s o f p s e u d o s u b s t r a t e s , c a n b e e x p a n d e d t o f u l l t i m e c o u r s e e x p e r i m e n t s c o v e r i n g t h e s t e a d y — s t a t e p e r i o d a s w e l l . F u r t h e r m o r e , o n e i s n o t r e s t r i c t e d t o ( [ E ] O / [ S ] O ) g 1 0 “ 2 , a s w i t h t h e M i c h a e l i s - M e n t e n e q u a t i o n . T h i s i s p a r t i c u l a r l y a d v a n t a g e o u s w h e n l a r g e r ( [ E ] O / [ S ] 0 ) r a t i o s a r e n e e d e d t o o b s e r v e d i r e c t l y e n z y m e - s u b s t r a t e a n d e n z y m e — p r o d u c t c o m p l e x e s , a s i n s o m e e x p e r i m e n t s w i t h h o r s e l i v e r a l c o h o l d e h y d r o g e n a s e ( S h o r e a n d G u t f r e u n d , 1 9 7 0 ; B e r n - h a r d , D u n n , L u i s i , a n d S h a c k , 1 9 7 0 ) . C H A P T E R 6 S U G G E S T I O N S F O R F U R T H E R W O R K T h i s c h a p t e r c o n t a i n s t w o s e c t i o n s : ( A ) s u g g e s t i o n s f o r f u r t h e r e x p e r i m e n t s o n t h e L A D H - N A D H - N D M A s y s t e m , a n d ( B ) s u g g e s t i o n s f o r t h e f u r t h e r d e v e l o p m e n t o f p r i n c i — p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s i n k i n e t i c s . T h e n u m e r i c a l o r d e r w i t h i n e a c h s e c t i o n i s a r b i t r a r y a n d d o e s n o t r e p r e s e n t p r i o r i t i e s . A . L A D H - N A D H - N D M A S y s t e m 1 . I n a n y e x p e r i m e n t w i t h L A D H , a s s a y e a c h L A D H p r e p - a r a t i o n f o r e t h a n o l ( o r a n y o t h e r r e d u c t a n t o f N A D H ) . M i x N A D + a n d t h e L A D H p r e p a r a t i o n a n d m e a s u r e t h e g r o w t h o f N A D H . T h e c o n c e n t r a t i o n o f L A D H i n t h e a s s a y s h o u l d b e ~ ( 5 - 1 5 ) u N ’ t h e c o n c e n t r a t i o n r a n g e u s e d i n t r a n s i e n t p h a s e e x p e r i m e n t s . A s s a y N D M A f o r r e d u c t a n t s o f N A D + b y m i x i n g N D M A , N A D + a n d a l o w c o n c e n t r a t i o n o f L A D H ( ~ 1 0 ’ 3 u N ) . 2 . P e r f o r m s c a n n i n g k i n e t i c s e x p e r i m e n t s w i t h l o w i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s o f L A D H ( < 1 0 " 1 u N ) a n d h i g h i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s o f N A D H a n d N D M A ( ~ 1 0 - 2 0 u M ) . D e t e r m i n e b y p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s w h e t h e r t h e s a m e i n t e r m e d i a t e s a r e o b s e r v e d u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s a s i n t h e h i g h L A D H c o n c e n t r a t i o n e x p e r i m e n t s o f C h a p t e r “ . I f t h e s a m e 2 7 “ 2 7 5 i n t e r m e d i a t e s a r e p r e s e n t a n d r e a c h a p p r o x i m a t e l y t h e s a m e a b s o r b a n c e l e v e l s i n h i g h a n d l o w e n z y m e c o n c e n t r a t i o n e x p e r i m e n t s , t h e y m a y b e i n t e r m e d i a t e s o f s u b s t r a t e s a n d p r o d u c t s w i t h o u t e n z y m e . 3 . U s e p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s t o s t u d y t h e c h a n g e s i n t h e a b s o r b a n c e s p e c t r a o f N A D H , L A D H , a n d N A D + i n m i x t u r e s o f t h e s e s p e c i e s . H o w m a n y e n z y m e - b o u n d s p e c i e s o c c u r i n t h e 3 & 0 n m - 3 2 0 n m N A D H s h i f t ? D o e s N A D H o r N 1 1 0 + p e r t u r b t h e a b s o r b a n c e s p e c t r u m o f L A D H a t 2 8 0 n m ? S i n c e t h e s p e c t r a o f N A D H , N A D + a n d L A D H a r e b r o a d a n d h i g h l y o v e r l a p p i n g i n t h e r a n g e 2 5 0 n m - 3 0 0 n m , t h e l a t t e r q u e s - t i o n c a n n o t b e c o n c l u s i v e l y a n s w e r e d b y s i m p l e d i f f e r e n c e s p e c t r a s u c h a s u s e d b y F i s h e r , A d i j a , a n d C r o s s ( 1 9 6 9 ) . I t i s i d e a l l y s u i t e d f o r a t t a c k b y p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s . “ . I n v e s t i g a t e b y r a p i d s c a n n i n g s t o p p e d f l o w e x p e r i - m e n t s w i t h p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s w h e t h e r t h e s p e c - t r u m o f L A D H i s p e r t u r b e d d u r i n g t h e r e d u c t i o n o f a c e t - a l d e h y d e b y N A D H . 5 . P e r f o r m r a p i d s c a n n i n g e x p e r i m e n t s w i t h t h e s a m e i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s o f L A D H - N A D H - N D M A f o r w h i c h D u n n a n d B e r n h a r d ( 1 9 7 1 ) p r o p o s e d t h e " h a l f - o f - t h e - s i t e s r e - a c t i v i t y m e c h a n i s m " . R e s o l v e t h e “ 0 0 n m — “ 8 0 n m r a n g e v i a p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s , a n d d e t e r m i n e w h e t h e r t h e r e s o l v e d N D M A c o n c e n t r a t i o n s a g r e e w i t h t h e " h a l f - o f - t h e - s i t e s r e a c t i v i t y m e c h a n i s m " . 6 . A d d v a r i o u s i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s o f N A D + t o t h e 2 7 6 L A D H - N A D H - N D M A r e a c t i o n s s y s t e m i n s c a n n i n g s t o p p e d f l o w e x p e r i m e n t s . H o w d o e s N A D + a f f e c t t h e a m o u n t s a n d r a t e s o f t h e i n t e r m e d i a t e s t h a t g r o w w i t h o u t N A D + ? D o n e w a b - s o r b e r s a p p e a r ? 7 . D e t e r m i n e w h e t h e r L A D H , N D M A , a n d N A D + f o r m a c o m p l e x w i t h a n a b s o r b a n c e s p e c t r u m d i s t i n g u i s h a b l e f r o m t h e f r e e s p e c i e s . I f t h e y d o , m a y t h i s i n t e r m e d i a t e b e r e l a t e d t o A b s o r b e r 3 ( X 3 2 0 , “ 0 3 ) a s s u m i n g S c h e m e 3 i n C h a p t e r “ ? 8 . P r o c e e d t o S t e p “ o f t h e s t r a t e g y o f F i g u r e 1 . 1 , b u t o n l y a f t e r p e r f o r m i n g a d d i t i o n a l s c a n n i n g e x p e r i m e n t s r e s o l v e d v i a p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s . B . P r i n c i p a l C o m p o n e n t A n a l y s i s 1 . D e r i v e c o n f i d e n c e i n t e r v a l s t a t i s t i c a l c r i t e r i a f o r d e t e r m i n i n g t h e e s s e n t i a l r a n k s o f M W a n d § W ' T o d o t h i s , t h e p r o b a b i l i t y d i s t r i b u t i o n m u s t b e d e d u c e d f o r t h e e i g e n v a l u e s a n d e i g e n v e c t o r s g i v e n a p r o b a b i l i t y d i s t r i b u t i o n o f t h e r a n d o m m e a s u r e m e n t e r r o r s . A n d e r s o n ( 1 9 6 3 ) s h o u l d p r o v i d e a s s i s t a n c e . A d d i t i o n o f c o n f i d e n c e i n t e r v a l t e s t i n g w o u l d m a k e t h e p r i n c i p a l c o m p o n e n t d e s c r i p - t i o n o f a n i d e a l e x p e r i m e n t ( 1 1 2 ; : o n e w i t h t h e a s s u m e d p r o b a b i l i t y d i s t r i b u t i o n f o r i t s e r r o r s ) m o r e c o m p l e t e . H o w e v e r , s i n c e r e a l e x p e r i m e n t s a r e n e v e r i d e a l , t h e e x a m i n a t i o n o f p l o t s o f £ ( r ) a n d A w i l l c o n t i n u e t o b e m o s t u s e f u l f o r d e t e r m i n i n g t h e e s s e n t i a l r a n k s . 2 7 7 2 . D e v i s e a w e i g h t i n g s c h e m e f o r p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s o f e x p e r i m e n t s w i t h a r b i t r a r y m e a s u r e m e n t e r r o r v a r i a n c e s 0 1 3 ( s e e c o m m e n t s a t e n d o f A p p e n d i x C ) . 3 . D e r i v e a s t a t i s t i c a l c r i t e r i o n t o h e l p d e c i d e w h e n a p r o p o s e d s t a t i c s p e c t r u m o r c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e f i t s a n e x p e r i m e n t . T h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e r i v a t i o n o f t h i s c r i t e r i o n a r e s i m i l a r t o t h o s e f o r t h e c o n f i d e n c e i n t e r v a l s t a t i s t i c a l c r i t e r i a m e n t i o n e d i n s u g g e s t i o n B . 1 a b o v e . “ . D e r i v e s o l u t i o n b a n d s f o r t h e n o r m a l i z e d s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f t h r e e o r m o r e a b - s o r b e r s a n a l o g o u s t o t h e s o l u t i o n b a n d s f o r t w o a b s o r b e r s p r e s e n t e d i n C h a p t e r 3 . W i t h t h r e e o r m o r e a b s o r b e r s , o b t a i n i n g t h e s o l u t i o n b a n d s m a y r e q u i r e n o n l i n e a r o p t i m i z a - t i o n . 5 . A p p l y p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s t o r a p i d s c a n n i n g f l u o r e s c e n c e k i n e t i c s e x p e r i m e n t s . A P P E N D I C E S A P P E N D I X A D e m o n s t r a t i o n t h a t A 3 = A F o r ' ( r m ) — a n E r r o r l e s s E x p e r i m e n t I n t h i s a p p e n d i x w e s h o w t h a t , f o r a n e r r o r l e s s e x - p e r i m e n t , £ ( “ ) d e f i n e d b y E q u a t i o n ( 2 . “ ) R = c 0 T A ( 2 u ) — ( r ) — ( r ) — ( r ) — ° i s a n e x a c t r e c o n s t r u c t i o n o f t h e e x p e r i m e n t a l a b s o r b - a n c e m a t r i x A w h e n r e q u a l s r M , t h e r a n k o f M ; i . e . , w e d e r i v e t h e e q u a t i o n T A ’ _ ( r M ) £ ( r M ) A , ( A . l ) B y s i m i l a r r e a s o n i n g , o n e c a n s h o w t h a t E q u a t i o n s ( 2 . 9 ) , ( 2 . 2 5 ) , a n d ( 2 . 2 6 ) g i v e e x a c t r e c o n s t r u c t i o n s o f t h e e x — p e r i m e n t a l a b s o r b a n c e m a t r i x f o r a n e r r o r l e s s e x p e r i m e n t w h e n r e q u a l s t h e r a n k o f § , M W , a n d § W ’ r e s p e c t i v e l y . R e c a l l t h a t i n C h a p t e r 2 , S e c t i o n B , w e i n t r o d u c e d . t h e s e c o n d m o m e n t m a t r i x o f A a s M , d e f i n e d b y E q u a t i o n ( 2 . 2 ) a s M = ( l / N ) ( 2 . 2 ) l b l b 2 7 8 2 7 9 a n d t h a t w e c o n s i d e r e d t h e e i g e n v a l u e e q u a t i o n s £ 9 1 3 : 9 3 6 3 : ( I l a 2 a ' o - a p ( A . 3 ) w h e r e 6 1 1 ’ 6 2 : . . . 3 0 p , a n d T T Q J Q J = 1 3 1 3 9 4 ‘ = 0 : i f . I i ! R H e r e w e s h a l l b e m o r e s p e c i f i c a n d c a l l M _ t h e o u t e r s e c o n d m o m e n t m a t r i x o f A . T h e i n n e r s e c o n d m o m e n t m a t r i x o f A i s c a l l e d M } , a n d i s d e f i n e d b y t h e e q u a t i o n M ' = ( l / p > A T A ( 1 1 . 1 1 ) T h e e i g e n v a l u e e q u a t i o n s f o r M ' a r e w e = 1 1 1 , 7 3 . . 1 = 1 . 2 . . . . . N ( 1 1 . 5 ) w h e r e 7 1 1 Y 2 3 . . . Z I Y N ’ a n d T e T . 2 3 % 1 , A , “ 0 1 f 3 7 ‘ k . A s b y p r o d u c t s o f d e r i v i n g E q u a t i o n ( A . 1 ) w e s h a l l o b t a i n t h e r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n t h e e i g e n v e c t o r s a n d e i g e n - v a l u e s o f M a n d M ' . D e f i n e a m a t r i x X B b y t h e e q u a t i o n 2 8 0 x ( p r ) g ( N N ) A T Y [ ( N + p ) x ( N + p ) l = A ( N X D ) Q I D X D ) - 1 a n d c o n s i d e r i t s a s s o c i a t e d e i g e n v a l u e e q u a t i o n s 2 . 9 1 = i n w , . J = 1 . 2 . . . . ( N + p ) w h e r e ” 1 > M 2 3 . Q ( N + p ) a n d T T _ 9 3 9 3 ' 2 : £ 3 9 k ‘ 0 i f 3 f k W e p a r t i t i o n e a c h e i g e n v e c t o r A d b y t h e e q u a t i o n F " ( N x 1 ) e [ ( N + p ) x 1 1 = “ a — J n l a d ( p x l ) ( A . 6 ) ( A . 7 ) ( A . 8 ) w h e r e t h e d o u b l e p r i m e s y m b o l i s u s e d a t t h i s p o i n t t o H d i s t i n g u i s h y a f r o m A d a n d $ 3 f r o m A d . I n e x p a n d e d f o r m , E q u a t i o n ( A . 7 ) b e c o m e s [ - ( N ) . I . I t 1 n ' s 9 ( N x N ) 5 3 " p E £ 3 0 0 1 ) [ 2 1 ( N x 1 ) A F P X N ) 9 ( p x p ) J 1 w ( p x 1 ) i n ( p x 1 ) . J J . 1 ( 0 3 ( A 0 9 ) 9 J = 1 ’ 2 " ° ' 9 ( N + p ) 2 8 1 U p o n m u l t i p l i c a t i o n o f t h e m a t r i c e s , E q u a t i o n ( A . 9 ) r e d u c e s t o t h e p a i r o f e q u a t i o n s “ T i " = 1 1 3 1 1 1 3 ( 1 1 . 1 0 ) j = 1 , 2 , . . . ( N + p ) " " A . l l “ 4 1 ‘ l e ( ) M u l t i p l y i n g E q u a t i o n ( A . 1 1 ) b y ( “ j / N ) ’ w e o b t a i n = n 2 ( 1 / N ) A ( 3 p _ 3 ' ¢ 1 1 3 ) 1 3 ( w 3 / N ) . ( A . 1 2 ) W h e n t h e L . H . S . o f E q u a t i o n ( A . 1 0 ) i s s u b s t i t u t e d f o r t h e q u a n t i t y ( g y m 3 ) i n E q u a t i o n ( A . 1 2 ) , w e o b t a i n [ ( l / N ) A £ 1 9 3 3 ' ' 3 ' ( w § / N ) ( A . 1 3 ) B y c o m p a r i n g E q u a t i o n ( A . 1 3 ) t o E q u a t i o n ( A . 3 ) a n d n o t i n g t h a t [ ( 1 / N ) A A t ] M , w e o b t a i n t h e f o l l o w i n g r e l a t i o n - s h i p s £ 3 = A 3 ( A . 1 “ ) 2 3 ( w J / N ) = 6 J ( A . 1 5 ) S i m i l a r s t e p s s t a r t i n g w i t h E q u a t i o n ( A . 1 0 ) g i v e t h e r e l a - t i o n s h i p s I 2 3 = i 3 J g 1 , 2 , . . . ’ N ( A . 1 6 ) $ 3 - ( l / w J ) A . £ J ( A . 2 0 ) 2 8 2 ( m i / p ) = Y 3 ( A . 1 7 ) T h u s , t h e n o n z e r o e i g e n v a l u e s o f M a n d M ' a r e r e l a t e d b y t h e e q u a t i o n ( 5 3 / Y 3 ) = ( p / N ) ( A . 1 8 ) E q u a t i o n s ( A . 1 0 ) , ( A . 1 l ) , ( A . 1 “ ) a n d ( A . 1 6 ) g i v e f o r n o n z e r o w t h e f o l l o w i n g r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n t h e e i g e n - J v e c t o r s o f M a n d M ' T 9 3 ( l / w J ) 5 . 2 3 ( A . 1 9 ) I n g e n e r a l , p a n d N a r e n o t t h e s a m e , b u t b o t h m u s t b e l a r g e r t h a n r M i f p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s i s t o b e u s e d t o d e t e r m i n e t h e m i n i m u m n u m b e r o f a b s o r b e r s i n t h e e x p e r i m e n t . I n t r o d u c e a n i n t e g e r k , w h o s e v a l u e d e p e n d s o n w h i c h o f p o r N i s l a r g e r ( = p i f p i N k ( A . 2 1 ) l = N i f p > N W i t h E q u a t i o n s ( A . 1 “ ) , ( A . 1 6 ) , a n d ( A . 2 l ) , w e c a n w r i t e E q u a t i o n s ( A . 1 0 ) a n d ( A . 1 l ) a s w h e r e A 5 - o o k ) t 1 k ( > g < $ o ( t = = d i = ) k ) = 1 = 1 i ( ( i a 8 ( _ 0 1 l i ( : 2 , k ) s , m ) 2 - . 9 r w . 9 o . . B u . , ( t s , . k ) u . . ) k , ) ) w k ) ( ( ( ( ( A 1 1 A A . 2 2 ) - . . . 2 2 2 2 5 6 ) ) 3 0 ) ) 2 8 3 T F o r t h e c a s e w h e r e k e q u a l s N , r i g h t s i d e d m u l t i p l i c a — t i o n o f E q u a t i o n ( A . 2 3 ) b y 2 3 k ) g i v e s t h e r e s u l t _ T 5 ’ 2 ( k ) 8 ( k ) 1 ( k ) ( " ' 2 7 ) F o r t h e c a s e w h e r e k e q u a l s p , r i g h t s i d e d m u l t i p l i c a t i o n o f E q u a t i o n ( A . 2 2 ) b y E I k ) ’ f o l l o w e d b y t r a n s p o s i t i o n o f t h e r e s u l t s , a l s o g i v e s E q u a t i o n ( A . 2 7 ) . S i n c e o n l y t h e f i r s t r M e i g e n v a l u e s o f M o r M ' a r e n o n z e r o , w e h a v e , u s i n g E q u a t i o n ( A . 1 5 ) w w . . . w = 0 ( A . 2 8 ) r M + l ’ I ' M + 2 ’ ’ k T h e r e f o r e , E q u a t i o n ( A . 2 7 ) c a n b e r e d u c e d t o 8 ( r M ) = d i a s ( w 1 . w 2 . . . . . w r m ) ( A . 3 0 ) . A ( r ) T ( 3 r ) i . ( $ ( r ) ( A . 3 3 ) 2 8 “ g T w h e r e F r o m E q u a t i o n ( A . 2 2 ) , w e h a v e T T Q ' ( r M ) 2 ( r M ) . — ( r M ) 5 » ( A ° 3 1 ) w h i c h s u b s t i t u t e d i n t o E q u a t i o n ( A . 2 9 ) g i v e s T T 2 ( r M ) $ ( r M ) fl ( “ - 3 2 ) , A - 1 ) l i b I I T h u s , f o r a n e r r o r l e s s e x p e r i m e n t £ ( r ) d e f i n e d b y E q u a t i o n ( 2 . “ ) e q u a l s A w h e n r e q u a l s r M . M o r e o v e r , E q u a t i o n s ( A . 2 2 ) a n d ( A . 2 3 ) c a n b e u s e d t o d e r i v e t h e f o l l o w i n g i d e n t i t i e s , w h i c h a r e u s e d i n C h a p t e r 3 , a n d h o l d f o r a n y v a l u e o f r A . I v e T ( r ) 1 ( r ) “ ' 3 ‘ ” _ T " £ ( r ) g ( r ) £ ( r ) ( A ' 3 5 ) A h " ) = — ( I ’ ) 2 ( 1 ‘ ) A ( 2 . “ ) A P P E N D I X B T h e L e a s t S q u a r e s S i g n i f i c a n c e o f £ ( r ) T h i s a p p e n d i x d e m o n s t r a t e s t h e l e a s t s q u a r e s s i g n i - f i c a n c e o f A ( r ) , t h e r p r i n c i p a l c o m p o n e n t r e c o n s t r u c t i o n o f A , d e f i n e d b y T S p e c i f i c a l l y , w e s h o w t h a t £ ( r ) i s , i n a n o r d i n a r y l e a s t I s q u a r e s s e n s e , t h e b e s t f i t o f t h e e x p e r i m e n t a l m a t r i x A t h a t c a n b e c o n s t r u c t e d b y t a k i n g a l i n e a r c o m b i n a t i o n o f t h e f i r s t r e i g e n v e c t o r s o f M . T h i s r e s u l t i s v a l i d f o r a n y v a l u e o f r , a n d d o e s n o t r e q u i r e t h a t t h e e x p e r i - m e n t a l m a t r i x A ’ b e e r r o r l e s s . T h e l e a s t s q u a r e s s i g n i — f i c a n c e o f E q u a t i o n s ( 2 . 9 ) , ( 2 . 2 5 ) , a n d ( 2 . 2 6 ) c a n b e d e m o n s t r a t e d b y t h e s a m e r e a s o n i n g u s e d h e r e t o d e m o n - s t r a t e t h e l e a s t s q u a r e s s i g n i f i c a n c e o f E q u a t i o n ( 2 . “ ) . W e c o n s t r u c t a m o d e l a b s o r b a n c e m a t r i x c a l l e d 1 ( r ) ’ w h e r e e a c h c o l u m n o f 1 ( r ) i s a l i n e a r c o m b i n a t i o n o f t h e f i r s t r e i g e n v e c t o r s o f M . T h e m a t r i x § ( r ) i s o b t a i n - e d a s t h e p a r t i c u l a r v a l u e o f Z ( r ) t h a t i s t h e b e s t o r d i n a r y l e a s t s q u a r e s f i t o f t h e e x p e r i m e n t a l m a t r i x A . W e p a r t i t i o n A , X ( r ) a n d § ( r ) i n t o c o l u m n v e c t o r s , a s 2 8 5 2 8 6 f o l l o w s _ A - = ( _ A — ’ fl 2 ’ . . . , A N ) ( B e l ) : ( r ) = ( 2 ( r ) l e z ( r ) 2 a n - a ¥ _ ( r ) N ) ( 8 . 2 ) A ( r ) = ( fl ( r ) l g fl ( r ) 2 , o o o , fl ( r ) N ) ( 8 . 3 ) T h e J ' t h v e c t o r X ( r ) i s g i v e n b y t h e l i n e a r m o d e l J 1 ( a ) , " i " 1 ( r ) § 1 ’ 3 = 1 ’ 2 1 " ” ‘ 3 ' “ ) W h e r e E 3 i s a v e c t o r o f c o e f f i c i e n t s w h o s e v a l u e s a r e a s y e t u n s p e c i f i e d . T h e o r d i n a r y l e a s t s q u a r e s l o s s f u n c — t i o n t h a t r e l a t e s t h e m o d e l s v e c t o r : ( r ) t o t h e e x p e r i - m e n t a l v e c t o r A J i s Q 3 , d e f i n e d b y J 0 3 = ( a 3 - 2 ( r ) § 3 ) T ( 5 3 - g ( r ) 5 3 ) ( 1 3 . 5 ) D e f i n e A H , ” b y t h e e q u a t i o n £ ( r ) 3 — 9 4 1 9 9 - 3 , J = l , 2 , . . . , N ( 1 3 . 6 ) w h e r e E d i s t h e p a r t i c u l a r v a l u e o f M 3 i n E q u a t i o n ( B . “ ) t h a t m i n i m i z e s Q 3 3 i . e . , g i s t h e o r d i n a r y l e a s t s q u a r e s J e s t i m a t e o f B 3 o b t a i n e d b y f i t t i n g t h e m o d e l a b s o r b a n c e s 1 ( r ) t o t h e e x p e r i m e n t a l a b s o r b a n c e s A 3 . J 2 8 7 T o m i n i m i z e Q J w i t h r e s p e c t t o M 3 , w e f i r s t o p e r a t e o n E q u a t i o n ( 8 . “ ) w i t h E B , d e f i n e d b y J a / a B 3 1 2 5 = 3 / 3 3 3 2 ( 8 . 7 ) a / a s J r W e o b t a i n V Q ] = Z E - ‘ Z - B J ( A j ' i ( r ) § - J ) J [ A j _ g ( r ) § - J J = " 2 ? ? ) ( A - j - £ ( P ) E J ) J = l , 2 , . . . N ( B . 8 ) Q J i s m i n i m i z e d w i t h r e s p e c t t o B 3 w h e n E B Q J = 9 . S e t t i n g E B Q e q u a l t o 0 a n d s u b s t i t u t i n g b f o r B , J J _ ‘ 1 1 “ J w e o b t a i n 0 = ’ " T A + ¢ ¢ T b J = 1 2 N ( B 9 ) _ - ( r ) _ J “ ( r ) — ( I ’ ) — J ’ ’ ’ ° ° ' , o M u l t i p l y i n g E q u a t i o n ( B . 9 ) b y ( g T r ) £ ( r ) ) - l a n d r e a r r a n g i n g , w e o b t a i n f o r 9 3 _ T - l T _ E J " ( 2 ( P ) $ ( I ’ ) ) 2 . ( p ) £ . 3 $ J - 1 : 2 3 ° ° ° : N ( B ° 1 0 ) B y t h e o r t h o n o r m a l i t y o f t h e e i g e n v e c t o r s o f M , w e h a v e ( g ? r ) g ( r ) ) ' 1 = I : s o t h a t E q u a t i o n ( 8 . 1 0 ) c a n b e 2 8 8 s i m p l i f i e d t o T g 3 = _ ( fl g j , J = l , 2 , . . . , N ( 1 3 . 1 1 ) S u b s t i t u t i n g 2 3 f r o m E q u a t i o n ( B . l l ) i n t o E q u a t i o n ( B . 9 ) , w e o b t a i n f o r t h e J ' t h c o l u m n o f E . ) t h e e q u a t i o n ( r A T _ A _ ( r ) J ' 5 — ( r ) £ ( r ) £ ‘ - J ’ J ‘ l , 2 , . . . , N ( 8 . 1 2 ) T h e r e f o r e , § ( r ) ’ t h e o r d i n a r y l e a s t s q u a r e s r e c o n s t r u c - t i o n o f A u s i n g t h e f i r s t r e i g e n v e c t o r s o f fl i s g i v e n b y t h e e q u a t i o n A T £ ( p ) g 2 ( r ) 2 ( r ) £ ( B . 1 ) , ( 2 . U ) A P P E N D I X C E x p e c t e d V a l u e s , V a r i a n c e s , C o v a r i a n c e s , a n d W e i g h t s f o r P r i n c i p a l C o m p o n e n t A n a l y s i s T h i s a p p e n d i x a m p l i f i e s t h e d i s c u s s i o n o f e r r o r m o d e l s a n d w e i g h t s i n S e c t i o n s D a n d E o f C h a p t e r 2 . A f t e r r e v i e w i n g t h e d e f i n i t i o n s a n d s o m e p r o p e r t i e s o f e x p e c t e d v a l u e s , v a r i a n c e s , a n d c o v a r i a n c e s o f r a n d o m v a r i a b l e s , w e d e r i v e E q u a t i o n ( 2 . 2 7 ) a n d d i s c u s s i t s s i g n i f i c a n c e . T h e f o l l o w i n g b a c k g r o u n d m a t e r i a l c o n c e r n i n g e x p e c t e d v a l u e s , v a r i a n c e s , a n d c o v a r i a n c e s , i s t a k e n f r o m C h a p t e r 2 o f B e c k a n d A r n o l d ( 1 9 7 5 ) . T h e s e c o n c e p t s a r e a l s o d i s c u s s e d i n m o s t m a t h e m a t i c a l s t a t i s t i c s t e x t b o o k s a n d t h e i r s i g n i f i c a n c e i n p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s i s d i s c u s s e d i n t h e p a p e r b y A n d e r s o n ( 1 9 6 3 ) a n d t h e m u l t i - v a r i a t e s t a t i s t i c s t e x t b o o k s o f A n d e r s o n ( 1 9 5 8 ) a n d M o r r i s o n ( 1 9 6 7 ) . T h e e x p e c t e d v a l u e o f a d i s c r e t e r a n d o m v a r i a b l e X i s d e n o t e d b y E ( X ) , a n d i s d e f i n e d a s t h e s u m o f t h e p r o d u c t s o f a l l p o s s i b l e v a l u e s o f X w i t h t h e i r i n d i v i d u a l p r o b a b i l i t i e s . I f X c a n t a k e o n o n l y n d i s c r e t e v a l u e s , ( x 1 , 1 = l , 2 , . . . , n ) , E ( X ) i s d e f i n e d b y n E ( X ) = P x = 0 . 1 i g l x i ( X 1 ) ( ) 2 8 9 2 9 0 w h e r e P ( X = x 1 ) i s t h e p r o b a b i l i t y t h a t X h a s t h e v a l u e x i . I f X i s a c o n t i n u o u s v a r i a b l e , t h e n E ( X ) i s d e f i n e d b y + 0 0 E ( X ) = 1 . x f ( x ) d x ( C . 2 ) w h e r e f ( x ) i s t h e p r o b a b i l i t y d e n s i t y f u n c t i o n o f X . T h e e x p e c t e d v a l u e o f X h a s t h e f o l l o w i n g s i g n i f i c a n c e : i f w e w e r e t o m e a s u r e i n d e p e n d e n t l y t h e v a l u e o f X a l a r g e n u m b e r o f t i m e s , w e w o u l d e x p e c t t h e a r i t h m e t i c a v e r a g e o f t h e s e i n d e p e n d e n t m e a s u r e m e n t s t o a p p r o a c h t h e v a l u e E ( X ) a s t h e n u m b e r o f m e a s u r e m e n t i n c r e a s e s . I n t h e w o r d s o f B e c k a n d A r n o l d ( 1 9 7 5 ) , E ( X ) i s a n " i d e a l i z a - t i o n o f a n a r i t h m e t i c a v e r a g e " . _ T h e O p e r a t o r E ( ) h a s t h e f o l l o w i n g t h r e e i m p o r t a n t p r o p e r t i e s : 1 . E ( ) i s a l i n e a r o p e r a t o r . H e n c e , E ( X + Y ) = E ( X ) + E ( Y ) 2 . E ( ) l e a v e s u n c h a n g e d a n y c o n s t a n t s o r n o n r a n d o m v a r i a b l e s . T h u s , i f X i s a r a n d o m v a r i a b l e , X i s a c o n s t a n t , a n d F i s a n o n r a n d o m v a r i a b l e , w e h a v e E ( K ) = K E ( K X ) = K E ( X ) E ( F ) = F E ( F X ) = F E ( X ) 2 9 1 3 . I f t w o r a n d o m v a r i a b l e s X a n d Y a r e u n c o r r e l a t e d , t h e n E ( X Y ) = [ E ( X ) ] [ E ( Y ) ] T h e v a r i a n c e o f X , d e n o t e d v a r ( X ) , i s d e f i n e d b y 2 _ 2 v a r ( X ) = E [ ( X - E ( X ) ) J - o ( C . 3 ) X w h e r e O X i s t h e s t a n d a r d d e v i a t i o n o f X . E q u a t i o n ( 0 . 3 ) c a n b e s i m p l i f i e d t o v a r ( X ) = E ( X Z ) - [ E ( X ) ] 2 ( c . u ) U n l i k e E ( ) , v a r ( ) i s n o t a l i n e a r o p e r a t o r . E q u a t i o n ( 0 . 3 ) s h o w s t h e i m p o r t a n t p r o p e r t y t h a t , i f X i s r e a l , v a r ( X ) Z O . T h e c o v a r i a n c e o f t w o r a n d o m v a r i a b l e s X a n d Y , d e n o t e d c o v ( X , Y ) , i s d e f i n e d b y C O V ( X , Y ) = E [ ( X - E ( X ) ) ( Y - E ( Y ) ) ] ( C - S ) E q u a t i o n ( 0 . 5 ) c a n b e s i m p l i f i e d t o c o v ( X , Y ) = E ( X Y ) - [ E ( X ) ] [ E ( Y ) ] ( 0 . 6 ) 2 9 2 T h u s , i f X a n d Y a r e u n c o r r e l a t e d r a n d o m v a r i a b l e s , c o v ( X , Y ) = 0 . C o m p a r i s o n o f E q u a t i o n s ( 0 . 3 ) a n d ( 0 . 6 ) r e v e a l s t h a t t h e v a r i a n c e o f X i s a c t u a l l y t h e c o v a r i a n c e o f X w i t h i t s e l f v a r ( X ) = c o v ( X , X ) T h e c o v a r i a n c e o p e r a t o r i s n o t a l i n e a r o p e r a t o r . I n C h a p t e r 2 , S e c t i o n D , w e i n t r o d u c e d t h e f o l l o w - i n g m o d e l f o r t h e m e a s u r e d a b s o r b a n c e m a t r i x A _ T $ - 3 9 + £ ( 0 . 7 ) w h e r e a l l t h e r a n d o m m e a s u r e m e n t e r r o r s a r e c o n t a i n e d i n g , a n d t h e m a t r i c e s § _ a n d g a r e r e g a r d e d a s n o n r a n d o m ( e r r o r l e s s ) . T h u s , c T ( 0 . 8 ) E ( g C T ) = [ ’ 1 ] W e a s s u m e d t h a t t h e e r r o r s i n g v a r y r a n d o m l y a b o u t z e r o ; i . e . , E ( g ) = ( 0 . 9 ) I O W e t h e r e f o r e h a v e E ( _ A _ ) = T ( 0 . 1 0 ) [ ’ 1 1 O 2 9 3 E a c h m e a s u r e m e n t e r r o r 6 1 3 w a s a s s u m e d t o b e u n c o r r e - l a t e d t o a l l o t h e r m e a s u r e m e n t e r r o r s , E ( e i j e k z ) = 0 i f 1 # k o r j # 2 ( 0 . 1 1 ) C O V ( € 1 J , € k £ ) = O I n g e n e r a l t h e v a r i a n c e o f 5 1 3 i s g i v e n b y v a r ( e i j ) = E ( e i j ) — [ E ( e 1 5 ) 3 2 = E ( e i j ) = o i j ( 0 . 1 2 ) w h e r e o i j m a y b e d i f f e r e n t f o r e v e r y d a t a p o i n t i n 5 . H o w e v e r , w e e m p h a s i z e d t h e m o r e r e s t r i c t e d v a r i a n c e m o d e l v a r ( e i j ) = a i d = x i z J ( 0 . 1 3 ) W h e r e a i d i s f a c t o r a b l e i n t o a f u n c t i o n o f t h e w a v e - l e n g t h c h a n n e l 1 a n d a f u n c t i o n o f t h e s p e c t r u m n u m b e r J . T h e m o t i v a t i o n f o r d e v e l o p i n g w e i g h t e d p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s i s t h e o b s e r v a t i o n , s h o w n b y t h e e x a m p l e i n S e c t i o n D o f C h a p t e r 2 , t h a t , i f v a r ( e i j ) d e v i a t e s s t r o n g l y f r o m a s i n g l e v a l u e f o r a l l c h a n n e l s a n d s p e c t r a , t h e r a n d o m e r r o r s i n E c a n d o m i n a t e t h e f i r s t f e w e i g e n v e c t o r s o f 5 . C o n s e q u e n t l y , w e o b t a i n a n i n - c o r r e c t e s s e n t i a l r a n k f o r M _ b y t h e u s u a l c r i t e r i o n o f 2 9 1 4 r e c o n s t r u c t i n g t h e a b s o r b a n c e s u r f a c e . T h i s p r o b l e m a r i s e s b e c a u s e p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s i s s e n s i t i v e t o h o w t h e o b s e r v a t i o n s a r e s c a l e d . O u r m o d e l f o r A h a s a n o n r a n d o m p a r t § _ Q ? a n d a r a n d o m p a r t A . T h e g o a l o f t h e w e i g h t i n g s c h e m e i s t o s c a l e t h e o b s e r v a t i o n s s o t h a t t h e p r i n c i p a l c o m p o n e n t e i g e n v e c t o r s a r e d o m i n a t e d a s m u c h a s p o s s i b l e b y t h e n o n r a n d o m p a r t o f t h e m o d e l . W e d e f i n e a w e i g h t e d a b s o r b a n c e m a t r i x A w , g i v e n b y w h 5 w = _ I ; A : _ P _ ( 0 . 1 1 4 ) w h e r e A a n d T a r e n o n s i n g u l a r a n d d i a g o n a l . N o t e t h a t A s c a l e s t h e r o w s o f A , t h a t T s c a l e s t h e c o l u m n s o f A , a n d t h a t t h e r a n k s o f A w a n d A a r e t h e s a m e , s i n c e A a n d T a r e n o n s i n g u l a r . A r e a s o n a b l e c r i t e r i o n f o r a s s i g n i n g v a l u e s f o r t h e w e i g h t i n g m a t r i c e s A _ a n d I i s t o i n s i s t t h a t , a s t h e . q u a n t i t y o f d a t a i n c r e a s e s , t h e e f f e c t o f t h e r a n d o m e r r o r s o n t h e p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s v a n i s h e s . C o n s i d e r p e r f o r m i n g n i n d e p e n d e n t r e p l i c a t e m e a s u r e - m e n t s o f t h e m a t r i x A . W e w o u l d h a v e t h e n m a t r i c e s , ( 5 1 , i = l , 2 , . . . , n ) . T h e a r i t h m e t i c a v e r a g e o f t h e s e n m a t r i c e s , A a v e = ( l / n ) 1 : 1 A 1 w o u l d a p p r o a c h t h e e r r o r - l e s s e x p e c t e d v a l u e E ( A ) = E _ g ? a s n b e c o m e s v e r y l a r g e . H o w e v e r , t h e p r i n c i p a l c o m p o n e n t r e c o n s t r u c t i o n s o f A t h a t a r e u s e d t o d e t e r m i n e t h e e s s e n t i a l r a n k m a r e n o t c o m p u t e d d i r e c t l y f r o m A , b u t i n d i r e c t l y , b y t h e e q u a t i o n A A m _ ‘ - 1 E i " - < r ) 9 - < r - > “ - — 1 T i ( 1 ~ ) E “ ’ 1 5 ) 2 9 5 w h e r e 2 ( r ) a n d E ( r ) c o n t a i n t h e e i g e n v e c t o r s o f t h e _ T w e i g h t e d s e c o n d m o m e n t m a t r i c e s M W - ( l / N ) A W A w a n d fl é = ( 1 / p ) A $ A w , r e s p e c t i v e l y . C o n s i d e r c o m p u t i n g M W a n d A W f o r e a c h o f t h e n e x p e r i m e n t s , a n d t h e n c o m p u t i n g t h e a r i t h m e t i c a v e r a g e s o f t h e r e s u l t i n g n v a l u e s o f M W a n d fl * . A s n b e c o m e s v e r y l a r g e , t h e a v e r a g e v a l u e o f M W w o u l d a p p r o a c h E ( M W ) , a n d t h e a v e r a g e v a l u e o f M W w o u l d a p p r o a c h E ( m fi ) . W e t h e r e f o r e c h o o s e t h e v a l u e s o f A a n d T s o t h a t t h e e i g e n v e c t o r s o f E ( M w ) a n d E ( M fi ) a r e n o t i n f l u e n c e d b y t h e r a n d o m m e a s u r e m e n t e r r o r s . T h e e x p e c t e d v a l u e o f M W i s g i v e n b y E ( g w ) = E [ ( l / N ) A W A $ ] ( 0 . 1 6 ) w h i c h m a y b e e x p a n d e d a n d s i m p l i f i e d b y i n s e r t i n g t h e d e f i n i t i o n o f A W a n d u s i n g t h e m a t h e m a t i c a l p r o p e r t i e s o f t h e e x p e c t e d v a l u e o p e r a t o r . S u b s t i t u t i n g E q u a t i o n ( 0 . 1 A ) f o r A w , a n d n o t i n g t h a t N i s a n i n t e g e r c o n s t a n t , w e o b t a i n 1 2 % , ) = ( l / N ) M E ; A 2 2 A T 9 ) ( ( 2 . 1 7 ) S u b s t i t u t i n g E q u a t i o n ( 0 . 8 ) f o r A i n E q u a t i o n ( 0 . 1 7 ) a n d e x p a n d i n g t h e r e s u l t , w e o b t a i n e ) . e l l b w a u , w n r O * t l l l 2 9 6 1 2 % ) = ( m u m s E . E T E Z E E T E ) + E Q : E 5 9 2 2 3 . 2 ) + “ I : . e . 3 : 2 9 . T ? ) + E ( I : . e . 2 2 2 T . 1 9 1 ( 0 . 1 8 ) W e n o w s i m p l i f y o n e b y o n e t h e f o u r t e r m s i n E q u a t i o n ( 0 . 1 8 ) . S i n c e t h e e l e m e n t s o f A , A , A a n d T a r e n o n - r a n d o m v a r i a b l e s , w e h a v e E ( L F . C T 1 1 : 2 9 2 1 “ “ L . ) = L w a f fl e ) “ : ( 0 . 1 9 ) T h e s e c o n d t e r m i n E q u a t i o n ( 0 . 1 8 ) m a y b e s i m p l i f i e d a s f o l l o w s , E ( é _ F . 2 T 2 2 2 T 9 . ) = _ L . . 1 : 2 T s a g g y . ) = . 1 . . 1 " : 9 ? 1 2 m m s > J T ( ) C . 2 0 = L . . 1 : 2 T I z E L . s ( s n T = 9 . w h e r e E ( E ) = Q w a s u s e d i n t h e l a s t s t e p . L i k e w i s e , t h e t h i r d t e r m i n E q u a t i o n ( 0 . 1 8 ) i s E ( L E T Z 9 . T L . ) = L E ( § . ) . T _ 2 9 . T i = 9 . ( 0 . 2 1 ) S i m p l i f y i n g t h e f o u r t h t e r m i n E q u a t i o n ( 0 . 1 8 ) i s e a s i e r i f w e c o n s i d e r i t s 1 , J ' t h e l e m e n t . W e h a v e A T 2 k 0 2 k p ) 1 ( c . 2 5 ) E ( d + ( l / N ) m i 2 w a ) g = ( ( L 2 l ) l k / § = N 1 L 2 k T E 0 % ) = ( 1 / p ) . . T . ( 2 1 E k A < ” ) A ) T E Z E ( A L - 2 p " > 1 3 E < A T k > ) g = $ 2 9 7 N 2 T - 2 E ( A a ' l ' . a £ 2 ) E ( k g l L i e i k a L j e j k ) ( 0 . 2 2 ) N 2 = L i L J Z T k E ( E i k e j k ) k = 1 S i n c e w e a s s u m e d t h a t t h e e r r o r s a r e u n c o r r e l a t e d , w e h a v e , u s i n g E q u a t i o n s ( 0 . 1 1 ) a n d ( 0 . 1 2 ) , E ( L 5 , 2 2 g ? 1 3 1 J = o i f i w J ( 0 . 2 3 ) 2 T _ 2 § 2 2 M L . E E ‘ . E . 2 ) , , - L 1 k = l T k o i k ( 0 . 2 1 : ) T h u s , E ( M w ) h a s b e e n s i m p l i f i e d t o t h e s u m o f t w o t e r m s T h e f i r s t t e r m a r i s e s f r o m t h e e r r o r l e s s B e e r ' s L a w c o n - t r i b u t i o n t o A , a n d t h e s e c o n d t e r m a r i s e s f r o m t h e r a n d o m m e a s u r e m e n t e r r o r s . T h e a n a l o g o u s d e r i v a t i o n f o r E ( A fi g i v e s t h e r e s u l t ( 0 . 2 6 ) P P 2 2 2 2 2 2 E q u a t i o n s ( 0 . 2 5 ) a n d ( 0 . 2 6 ) r e f e r t o t h e g e n e r a l E ( P i w ) m m ) = + + = ( ( ( U N ) l / N ) ) ( U U p p ) 1 t : t 1 2 ( ( T 5 2 1 ; 2 _ ( 2 1 2 r ( ) T L . ) : ) £ § ) 3 ) ) 2 2 £ : 2 2 ? . E ( A T ? _ M A z . ( 0 . 2 8 ) ( 0 . 2 9 ) a n d w h e r e 2 9 8 e r r o r v a r i a n c e m o d e l , w h e r e e a c h 0 2 3 i s a r b i t r a r y . W i t h t h e m o r e r e s t r i c t e d v a r i a n c e m o d e l g i v e n b y E q u a t i o n ( 0 . 1 3 ) , w e o b t a i n t h e f o l l o w i n g s i m p l i f i c a t i o n s o f t h e s u m s i n E q u a t i o n s ( 0 . 2 5 ) a n d ( 0 . 2 6 ) N N 2 2 2 2 Z T o = L x z T 2 k = 1 k i k i i k = 1 k k ( 0 . 2 7 ) T 2 § 2 L i o i = T 2 z L x k = 1 3 3 k i l k k N o t e t h a t i n E q u a t i o n s ( 0 . 2 7 ) t h e q u a n t i t i e s u n d e r t h e s u m m a t i o n d e p e n d o n l y o n t h e i n d e x k . T h e r e f o r e E q u a t i o n ( 0 . 2 5 ) a n d ( 0 . 2 6 ) c a n b e s i m p l i f i e d t o A = d i a g ( x 1 , x 2 , . . . , x p ) A = d i a g ( z l , z 2 , . . . , z N ) 2 9 9 W i t h t h e s e s i m p l i f i c a t i o n s , w e c a n e a s i l y c h o o s e t h e v a l u e s o f A a n d 2 s o t h a t t h e e i g e n v e c t o r s o f E ( A w ) a n d E ( M é ) a r e u n p e r t u r b e d b y t h e r a n d o m e r r o r s . W e w a n t t h e e i g e n v e c t o r s o f E ( A w ) a n d E ( A fi ) t o b e e i g e n v e c t o r s o f t h e e r r o r l e s s t e r m s ( l / N ) A E ( A ) T 2 E ( A T ) A a n d ( l / p ) $ ? s ( g ? ) — A 2 E ( A ? ) T , r e s p e c t i v e l y . T h u s , w e a s s i g n A a n d T b y t h e e q u a t i o n s I t " ( 0 . 3 0 ) g b l / z é f l / 2 [ * 9 w h e r e a a n d b a r e a r b i t r a r y p o s i t i v e c o n s t a n t s . ( N o t e t h a t E q u a t i o n ( 2 8 ) i n t h e p a p e r b y C o c h r a n a n d H o r n e ( 1 9 7 7 ) s h o u l d b e c o r r e c t e d t o a g r e e w i t h E q u a t i o n s ( 0 . 3 0 ) ; s p e c i f i c a l l y , E a n d 3 s h o u l d b e d e f i n e d w i t h t h e a r b i t r a r y c o n s t a n t s a a n d b t a k e n t o t h e p o s i t i v e o n e h a l f p o w e r i n s t e a d o f t h e n e g a t i v e o n e h a l f p o w e r . T h e s e c o r r e c t i o n s m a k e t h e d e f i n i t i o n s o f A a n d A c o n s i s t e n t w i t h t h e r e - m a i n d e r o f t h e p a p e r a n d w i t h t h i s t h e s i s . ) E ( A w ) a n d E ( A fi ) b e c o m e ’ E ( M w ) ( a b / N ) § 7 1 / 2 5 ( g ) § f l s ( a ? ) x f l / 2 + a t ; ( 0 . 3 1 ) ( a b / p ) g f 1 / 2 E ( A ? ) § 7 1 E ( A ) § 7 1 / 2 + a b A ’ ( 0 . 3 2 ) m m ) w h e r e t h e e r r o r t e r m s a r e r e d u c e d t o s c a l a r m u l t i p l e s o f 3 0 0 t h e i d e n t i t y m a t r i x i n b o t h c a s e s . T h e e i g e n v e c t o r s o f E ( A w ) a n d E ( M fi ) a r e t h e e i g e n v e c t o r s o f t h e e r r o r l e s s f i r s t t e r m s i n E q u a t i o n s ( 0 . 3 1 ) a n d ( 0 . 3 2 ) , r e s p e c t i v e l y . T h i s c o m p l e t e s t h e d e r i v a t i o n o f t h e w e i g h t i n g s c h e m e o f S e c t i o n E i n C h a p t e r 2 . H a v i n g s u c c e s s f u l l y a s s i g n e d t h e w e i g h t s f o r t h e r e — s t r i c t e d e r r o r v a r i a n c e m o d e l , t h e n e x t q u e s t i o n i s , g i v e n t h e u n r e s t r i c t e d e r r o r v a r i a n c e m o d e l w h e r e d i d i s a r b i t r a r i l y d i f f e r e n t ( b u t k n o w n ) f o r e a c h i a n d 3 , c a n t h e w e i g h t s b e a s s i g n e d t o a c c o m p l i s h t h e s a m e p u r p o s e f o r E ( A W ) a n d E ( A A ) ? W e n o t e t h a t t h e e r r o r t e r m s i n E q u a t i o n s ( 0 . 2 5 ) a n d ( 0 . 2 6 ) c a n b e m a d e a r b i t r a r y s c a l a r m u l t i p l e s o f i d e n t i t y m a t r i c e s b y a s s i g n i n g t h e v a l u e s o f A a n d T t o s a t i s f y t h e f o l l o w i n g s y s t e m o f e q u a t i o n s N 2 2 2 L 1 2 T k o 1 k - K , i = 1 , 2 , . p k - l ( 0 . 3 a ) ' p 2 2 2 : , 3 T J m £ 1 L m o m j K , J l , 2 , . . . N w h e r e K a n d K ' a r e a r b i t r a r y r e a l c o n s t a n t s . E q u a t i o n s ( 0 . 3 ” ) f o r m a s e t o f ( p + N ) n o n l i n e a r c o u p l e d a l g e b r a i c e q u a t i o n s w i t h ( p + N ) u n k n o w n . T h e r e f o r e , A a n d T c a n a l w a y s b e c h o s e n t o s a t i s f y t h e s e e q u a t i o n s . H o w e v e r , E q u a t i o n s ( 0 . 3 “ ) a r e n o t r e s t r i c t e d t o h a v e r e a l r o o t s . I n f a c t , i n t h e s i m p l e c a s e w h e r e p = 3 a n d N = 2 , i t c a n b e e a s i l y s h o w n t h a t T 1 a n d T 2 m u s t b e c o m p l e x . 3 0 1 T h u s , t h e d e r i v a t i o n o f a w e i g h t i n g s c h e m e f o r t h e g e n e r a l e r r o r v a r i a n c e m o d e l i s a n a r e a f o r f u t u r e i n — v e s t i g a t i o n . I f t h e f o r m A w = A m a y t r y r e l a x i n g t h e r e q u i r e m e n t t h a t A _ a n d T _ b e d i a g o n a l . A T _ i s m a i n t a i n e d , o n e H o w e v e r , t h e f o r m o f A a n d T m u s t g u a r a n t e e t h a t t h e y a r e n o n s i n g u l a r . O t h e r w i s e , A w w i l l n o t h a v e t h e s a m e r a n k a s A . A n a e s t h e t i c a l l y p l e a s i n g p r o p e r t y o f p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s t h a t s h o u l d b e m a i n t a i n e d i n a m o r e g e n e r a l w e i g h t i n g s c h e m e i s t h e u n i m p o r t a n c e o f t h e o r d e r i n w h i c h t h e r o w s a n d c o l u m n s o f A a r e a r r a n g e d . W h e n A a n d T a r e d i a g o n a l , t h e e x c h a n g e o f t w o r o w s i n A c a n b e a c c o m m o d a t e d b y e x c h a n g i n g t h e s a m e t w o r o w s i n L , M W , a n d A . T h e e x c h a n g e o f t w o c o l u m n s o f A c a n b e a c c o m m o d a t e d b y e x c h a n g i n g t h e c o r r e s p o n d i n g t w o r o w s i n 3 , H Q , a n d A . T h i s s i m p l i c i t y w o u l d b e l o s t i f A a n d A w e r e , f o r e x a m p l e , t r i d i a g o n a l m a t r i c e s o r u p p e r o r l o w e r t r i a n g u l a r m a t r i c e s . A P P E N D I X D D e r i v a t i o n o f S o l u t i o n B a n d s f o r T w o A b s o r b e r E x p e r i m e n t s I n t h i s a p p e n d i x w e d e r i v e t h e s o l u t i o n b a n d s o f t h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s i n t w o a b s o r b e r e x p e r i m e n t s . L a w t o n a n d S y l v e s t r e ( 1 9 7 1 ) p r e s e n t a d e r i v a - t i o n o f s o l u t i o n b a n d s f o r t h e s t a t i c s p e c t r a i n m u l t i - c o m p o n e n t e q u i l i b r i u m s y s t e m s . T h e i r d e r i v a t i o n i s b a s e d o n g e o m e t r i c a l a r g u m e n t s a b o u t t h e t w o d i m e n s i o n a l s p a c e 0 1 ‘ t h e e i g e n v e s t o r s Q 1 a n d 1 2 ' T h e d e r i v a t i o n p r e s e n t e d h e r e i s e q u i v a l e n t t o t h e i r s , b u t e m p h a s i z e s a m o r e a l g e - b r a i c a l a p p r o a c h . W e a l s o e x t e n d t h e r e s u l t s t o o b t a i n t h e u p p e r a n d l o w e r b o u n d s o f t h e c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s . F i r s t w e d e r i v e t h e s o l u t i o n b a n d s f o r t h e s t a t i c s p e c t r a . T h e n b y t a k i n g a d v a n t a g e o f t h e s y m m e t r y o f t h e e q u a t i o n T _ - l T - l . 9 . ' I “ . $ ( 2 ) g ( 2 ) ! ( 2 ) 2 ( 1 3 . 1 ) I ’ l l w e o b t a i n t h e s o l u t i o n b a n d s f o r t h e c o n c e n t r a t i o n p r o - f i l e s b y i n s p e c t i o n o f t h e f i r s t r e s u l t s . W e m a k e t h e f o l l o w i n g f i v e a s s u m p t i o n s t o o b t a i n t h e s o l u t i o n b a n d s f o r t h e t w o s t a t i c s p e c t r a : 3 0 2 l l : . . . ( ) T M I I l ( > o l | 3 1 ( 2 ) ) 3 5 1 ’ 5 3 2 ‘ ( f l y - ( 3 & 2 ‘ 1 3 - “ ) 3 0 3 l . T h e s t a t i c s p e c t r a a r e n o r m a l i z e d t o u n i t l e n g t h . F 5 ) 1 4 - — m ( D . 2 ) f 1 I I M ' U ' = 1 1 1 ’ 1 2 . T h e n o r m a l i z e d s t a t i c s p e c t r a i i a n d A ; f i t a s l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r s i n t h e e x p e r i m e n t . ” 3 1 7 1 3 ( 2 ) ) E i ’ £ 1 2 ‘ ( 2 1 2 ( 2 ) ) 1 1 5 ( 9 ' 3 ) . . ( 2 ’ 1 3 . T h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s c o n t a i n n o n e g a t i v e e l e m e n t s . W e h a v e t h e i n e q u a l i — t i e s H : | V I O U W [ V | O ( 1 3 . 5 ) H I I O U | o > M I ' 0 A . T h e w e i g h t e d s e c o n d m o m e n t m a t r i c e s M W a n d M W h a v e a l l n o n n e g a t i v e e l e m e n t s . T h i s i s a u t o m a t i c a l l y t r u e i f t h e a b s o r b a n c e m a t r i x A h a s a l l n o n n e g a t i v e e l e m e n t s . 5 . T h e d e t e r m i n a n t s o f g ' a n d X a r e p o s i t i v e . T h i s i s m e r e l y a c o n v e n t i o n f o r i d e n t i f y i n g w h i c h a b s o r b e r i s o n e a n d w h i c h i s t w o , s i n c e t h e s e d e t e r m i n a n t s c h a n g e s i g n w h e n a b s o r b e r s o n e a n d t w o a r e s w i t c h e d . 3 0 “ I n e x p a n d e d f o r m , E q u a t i o n s ( D . 3 ) a r e - 1 ' _ L 1 M i l u l l + ¢ 1 2 u 2 1 ) , i - l , 2 , . . . , p ( D . 6 ) v 1 1 " v _ - l 1 I _ _ f i 2 ’ L i ( ¢ 1 1 u 1 2 * ¢ i 2 u 2 2 ) ’ 1 “ ’ 9 ( D ' 7 ) I H 3 | \ ) U 7 1 2 I ' ' l e n t t o d e r i v i n g a l l t h e c o n s t r a i n t s o n “ 1 1 ’ u 2 1 , u 1 2 , D e r i v i n g t h e s o l u t i o n s b a n d s f o r f i l a n d f i s e q u i v a - a n d u é 2 t h a t a r e i m p l i e d b y A s s u m p t i o n s 1 t h r o u g h 5 a b o v e . W e s t a r t b y n o t i n g s o m e r e s t r i c t i o n s o n t h e s i g n s o f t h e e i g e n v e c t o r s o f M W a n d M W ' W h e n A s s u m p t i o n A a b o v e h o l d s , i t c a n b e s h o w n t h a t $ 1 a n d £ 1 h a v e a l l n o n n e g a - t i v e e l e m e n t s . T h e o r t h o g o n a l i t y c o n d i t i o n s i g i z = 0 a n d 1 : 1 2 = 0 t h e n r e q u i r e t h a t $ 2 a n d $ 2 e a c h h a v e a m i x - t u r e o f p o s i t i v e a n d n e g a t i v e e l e m e n t s . L e t u s a p p l y t h e s i g n c o n s t r a i n t s o n A l a n d $ 2 t o E q u a t i o n s ( D . 6 ) a n d ( D . 7 ) . A l l v a l u e s o f L 1 a n d $ 1 1 a r e n o n n e g a t i v e , a n d s o m e v a l u e s o f ¢ 1 2 m u s t b e p o s i t i v e a n d s o m e m u s t b e n e g a t i v e . T h e r e f o r e , f o r a l l v a l u e s o f f i l a n d f i 2 t o b e n o n n e g a t i v e , u i l a n d u i 2 m u s t b e p o s i - t i v e . W e h a v e ' > 0 ( D . 8 ) u i z > O ( D . 9 ) > > 1 v v 5 - 1 1 v 1 2 2 v 2 2 0 0 5 - 3 v 1 v 1 1 2 m 3 2 i i 2 n < n < o $ m 3 ¢ 3 ' I 0 1 1 1 1 4 3 . ’ ; 2 1 3 . 2 ( ( ” ( D D D ' . . ' 1 1 l 1 2 3 5 ' ) ) ) ” , “ V " ’ 1 1 2 3 i m 2 i 2 n > n > o 1 ( p m 3 0 ( $ 0 ( 1 W 1 . 3 1 J 1 2 ) 1 2 . ) 5 ' 3 0 5 A s y e t t h e s i g n s o f U 2 1 a n d u i z a r e u n s p e c i f i e d . H o w e v e r , t h e r e q u i r e m e n t t h a t a l l v a l u e s o f f i l a n d 2 & 2 b e n o n - n e g a t i v e g i v e s f o r u 2 1 a n d “ 2 2 t h e i n e q u a l i t i e s m i n ¢ m i n o . . u ' l l < L l , < u ' i - l - ( 1 3 . 1 0 ) 1 1 ¢ 1 2 > 0 ( 0 1 2 ) - 2 1 — » 1 1 ¢ i 2 < 0 ¢ 1 2 m i n ¢ m i n ¢ 1 1 - u ' - — 1 - ] = 5 1 1 ' < u ' — — ( D . l l ) 1 2 ¢ 1 2 > O ( $ 1 2 2 2 — 1 2 ¢ 1 2 < 0 ¢ 1 2 B y t h e s a m e r e a s o n i n g , a p p l i c a t i o n o f t h e s i g n c o n — s t r a i n t s f o r £ 1 a n d £ 2 p l u s t h e a s s u m p t i o n s A 1 3 . 9 , a n d Q 2 Z | Q t o E q u a t i o n s ( D . u ) g i v e s t h e i n e q u a l i t i e s W e c a n f u r t h e r r e s t r i c t t h e e l e m e n t s o f A ' b y r e c a l l i n g t h a t Q ' a n d 1 m u s t s a t i s f y t h e e q u a t i o n F r o m E q u a t o n ( D . l 6 ) h e e q u i w l 2 1 2 t v v v v e d l 1 2 2 ( I d n a a n d l t 7 y ) , w E n a h q e n e u w d r a e t i E m e o i n q u l n q a , u t 2 . i n ( D a i l o ( t t ( g ( ( g ' g g ' ) ' f ) ) ) ) i n d . e l f 2 ( D ) t e e t ( d / l / d t 2 e d l d e e = = E = = ) ' e w n g ' q U u ? b l w w z a a n 2 o w - . - w I u 2 ' t u 2 l u r l e = a é u u i e i > q > i 2 i é l t u 2 n a O o / 2 l / y a a t e l t d o i g o a e 9 ) ( D . l 6 ) n s ( ( ( ( D D D D s t t p e g o r e s t h o e . i g t i i v v e t h e h e r g i v ( ( e D D . . . . . . l 1 l 2 2 2 7 8 9 0 l 2 ) ) ) ) ) ) ( D . l 3 ) a n d l i t y ( D . T h u s , t h e R . H . S . o f I n e q u a l i t y ( D . l 3 ) a n d t h e L . H . S . o f I n e q u a l i t y ( D . l u ) c a n b e r e p l a c e d b y t h e s t r o n g e r r e s t r i c — t i o n s o f I n e q u a l i t i e s ( D . 2 l ) a n d ( D . 2 2 ) , g i v i n g m i n ¢ i l - u £ l - — — - g u é l < o ( p . 2 3 ) d 1 2 > o ¢ i 2 6 ' n 6 . i H V L 3 0 7 m i n 0 < u ' < u ' ( D . 2 U ) 2 2 — 1 2 4 5 i 2 < 0 S u b s t i t u t i n g E q u a t i o n s ( D . l 7 ) a n d ( D . 1 8 ) i n t o I n e q u a l — i t y ( D . l h ) , w e o b t a i n m m i n w m m i n w _ _ l t 1 t _ l v . A L A ( w 2 ) “ 2 2 ¢ 3 2 < 0 0 3 2 3 u 1 2 i ( w 2 ) u 2 2 w j z > 0 ( ¢ 3 2 ) ( D ' Z S ) S i n c e u i z a n d u é 2 a r e p o s i t i v e , t h e L . H . S . o f I n e q u a l i t y ( D . 2 5 ) i s a l r e a d y g u a r a n t e e d t o h o l d . T h e R . H . S . o f I n - e q u a l i t y ( D . 2 5 ) c a n b e r e a r r a n g e d t o g i v e a n e w l o w e r b o u n d f o r u ' 2 2 ' w W ( 2 . 7 % ) ” 1 ' 2 m a x G J l f ) _ < _ u 2 ' 2 ( D . 2 6 ) S u b s t i t u t i n g E q u a t i o n s ( D . l 9 ) a n d ( D . 2 0 ) i n t o I n e q u a l i t y ( D . l S ) , w e o b t a i n m m i n w m m i n ( A n n i , ( . 1 1 ) i . 3 1 1 _ < _ 4 . 1 % i s ( p . 2 7 ) “ 2 ¢ J 2 > o 1 3 2 m 2 w j 2 < o 1 3 2 S i n c e u i l i s p o s i t i v e a n d u é l i s n e g a t i v e , t h e L . H . S . o f I n e q u a l i t y ( D . 2 7 ) i s a l r e a d y g u a r a n t e e d t o h o l d . T h e R . H . S . o f I n e q u a l i t y ( D . 2 7 ) c a n b e r e a r r a n g e d t o g i v e a n e w u p p e r b o u n d f o r u é l , f ‘ ' < ( g g J u ' m i n - m 1 1 u ( D . 2 8 ) 2 1 1 3 0 8 I n s u m m a r y , A s s u m p t i o n s 2 t h r o u g h 5 r e q u i r e t h a t t h e e l e m e n t s o f A ' s a t i s f y t h e f o l l o w i n g i n e q u a l i t i e s , u i l > O ( D . 2 9 ) — m i n ¢ u ' ( E l l ) : . 1 2 3 . ( $ 2 ) m i n ( $ 1 3 ) ( 0 . 3 0 ) ¢ 1 2 > o i 2 u l l 1 3 1 u i 2 > o ( v . 3 1 ) w u ' m i n ¢ ( £ — a m m y - 1 2 . ) , . 5 2 . _ . 1 1 . ( D . 3 2 ) “ 1 3 1 u 1 2 1 1 2 < 0 ¢ 1 2 A s s u m p t i o n 1 g i v e s t h e f o l l o w i n g t w o e q u a t i o n s r e s t r i c t i n g t h e e l e m e n t s o f g ' - 1 - 1 u ' ( 1 L ¢ ) + u ' ( 1 L ¢ ) = 1 ( D - 3 3 ) 1 1 1 : 1 1 1 1 2 1 i = 1 1 1 2 - 1 _ u 1 2 ( 1 : 1 L i ¢ 1 1 u 2 2 ( 1 2 1 1 4 1 l M 1 2 ’ 1 ( D ' 3 u ) I V 7 ' D e f i n e 3 3 L a s t h e v a l u e o f E d w h e r e t h e r a t i o ( u Z J / u i j ) i s a m i n i m u m , a n d d e f i n e 2 3 H a s t h e v a l u e o f 3 3 w h e r e t h e r a t i o ( u é J / u i j ) i s a m a x i m u m . T h e n I n e q u a l i t i e s ( D . 2 9 ) t h r o u g h ( D . 3 2 ) a n d E q u a t i o n s ( D . 3 3 ) a n d ( D . 3 U ) g i v e f o r u i L , u i H , “ 2 L , a n d “ 2 H t h e e x p r e s s i o n s l i s t e d i n T a b l e 3 . 1 . T h e s e a r e t h e e x t r e m e v a l u e s f o r t h e e l e m e n t s o f g ' . I t f o l l o w s t h a t a n o r m a l i z e d s t a t i c s p e c t r u m i ' m u s t f a l l J w i t h i n t h e s e e x t r e m e v a l u e s . T h u s i 3 m u s t f a l l o n o r » H n 3 0 9 A . A ' b e t w e e n 2 3 L a n d E J H ’ d e f i n e d b y A , — _ l ' £ J H ' L . 2 ( 2 ) E J H ( D . 3 5 ) T o o b t a i n t h e s o l u t i o n b a n d s o f t h e c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s , w e m a k e t h e f o l l o w i n g f i v e a s s u m p t i o n s , w h i c h c o r r e s p o n d t o t h e a s s u m p t i o n s m a d e f o r t h e s t a t i c s p e c t r a s o l u t i o n b a n d s , b u t w i t h t h e r o l e s o f A a n d A r e v e r s e d . l . N o r m a l i z a t i o n : 2 . A b s o r b e r s i n t h e e x p e r i m e n t : ( 3 I - ' 1 v - 1 ( 1 . 1 ( 2 ) ) 1 1 ( 1 4 1 9 9 1 7 : - 1 | W > n - 1 2 ( E 1 ( 2 ) ) 2 2 3 . N o n n e g a t i v e d e f i n i t e n e s s o f c o n c e n t r a t i o n s a n d s t a t i c s p e c t r a : » > H v o w v o I [ | I | | U 3 1 0 ' 0 ) I V I O U | o > | v I O A . N o n n e g a t i v e D e f i n i t e n e s s o f t h e E l e m e n t s i n M W ! a n d A w . 5 . D e t e r m i n a n t o f A } i s p o s i t i v e . N o t i n g t h e s y m m e t r y o f E q u a t i o n ( D . l ) , w e s e e t h a t t h e s o l u t i o n b a n d s f o r t h e c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s p r e s e n t e d i n T a b l e 3 . 1 c a n b e o b t a i n e d b y r e w r i t i n g t h e s o l u t i o n b a n d e q u a t i o n s f o r t h e s t a t i c s p e c t r a w i t h g ' s u b s t i t u t e d f o r 3 A 3 , f ' J f o r 0 3 : 1 J k f o r ¢ i k ’ ¢ i k f o r k a ’ a n d T J f o r L 1 . N o t e t h a t A 1 L a n d A H d e l i n e a t e r e g i o n s o f a c c e p t a b i l i t y o f A 1 . I n g e n e r a l , A 1 L a n d A 1 H c r o s s o v e r , i . e . , 2 1 L i s n o t a l w a y s l e s s t h a n i i H . T h e s a m e s i t u a t i o n o b t a i n s f o r é i L a n d é i H ' E x a m p l e s m a y b e f o u n d i n C h a p t e r A . A P P E N D I X E C o m p u t e r T r a n s f e r a n d C a l i b r a t i o n o f S t o p p e d F l o w R a w D a t a T h i s a p p e n d i x g i v e s i n s t r u c t i o n s f o r ( l ) t r a n s f e r r i n g s t o p p e d f l o w r a w d a t a f r o m t h e P D P B I c o m p u t e r t o t h e C D 0 — 6 5 0 0 c o m p u t e r , ( 2 ) e s t i m a t i n g t h e w a v e l e n g t h o f e a c h w a v e - l e n g t h c h a n n e l i n a s c a n n i n g e x p e r i m e n t , a n d ( 3 ) c a l c u - l a t i n g a b s o r b a n c e v e r s u s t i m e a n d w a v e l e n g t h c h a n n e l f r o m t h e r a w d a t a a n d s t o r i n g t h e r e s u l t s i n a f o r m s u i t a b l e f o r K I N F I T a n d o t h e r d a t a i n t e r p r e t a t i o n p r o - g r a m s . F i g u r e E . l i s a f l o w d i a g r a m o f s t e p s ( 1 ) t h r o u g h ( 3 ) a b o v e . S t o p p e d f l o w r a w d a t a c a n b e t r a n s f e r r e d t o t h e C D C - 6 5 0 0 c o m p u t e r v i a c a r d s o r t a p e s , a n d , s i n c e t h e p r o - c e d u r e s f o r s t e p s ( 2 ) a n d ( 3 ) a r e d i f f e r e n t f o r t h e t w o m e t h o d s o f d a t a t r a n s f e r , t h e p a t h s i n F i g u r e E . l a r e l a b e l l e d " c a r d s " , " t a p e s " , o r " c a r d s a n d t a p e s " t o i n d i - c a t e t h e d a t a t r a n s f e r m e t h o d t o w h i c h t h e y a p p l y . F o r e a c h s t e p i n F i g u r e E . 1 i n w h i c h a p r o g r a m i s u s e d , t h e n a m e o f t h e p r o g r a m i s g i v e n i n p a r e n t h e s e s t o t h e l e f t o f t h e b o x d e s c r i b i n g t h e s t e p . 3 1 1 d t i d t n a a n a r b i l a C o ‘ t 2 d e r p ” a l ) c t s s t a d s ) a o n h 7 d n t . s s g E d e ) ) n ( r e u v a a n 6 s - e a a n C s a l a d ) l c t r W u s e h c t n e g . n a h D b t e . r l - b A e N o t e t s a u f b v a l o A n W o o s s r i e b e o t t 1 A f c a a n r i n a s b r i b r i p a r e l o t o t a b s l C O i r p p F A ) L A C F D N ( n o d i n t a a r e b c i n l a a b C r o e s m b i A T . 3 n o 5 . . 1 h E U . t ( u g n e l e v a W . 2 e . n n i o n E n e t t i e F D d k e s r i o D t S y p a p t o r a l e D f f s w r n o o a l r F T E P d A a e T t p C a p E Q o D t . S n l o . E ( ( S e g . v a E . e W ( n n q i e . E m t s r a q t e l E ' t u F e c m D l o a r C f y ? b s e r p e a f T s n r a o r T s d a r t a a C D d n a ? d s s s e e d e r p r p r a a a e T c t f s r n o a r s T d r a a t C a D y r b / / / / s d r a c d n A a h t e e g t m n a i e l T l u e c s v l u a a s W C r e v ’ s L e A p C a B t “ ( . n o i t a r b i l a d h e C s d e e A p e a N s t u g s n r e e d h e l d t n t v e ’ n a a a g v t l n A a a u t e w D c l e l s e t d o e t v fi n o c ) Z A T A D B A ( s e p a t c e l m a i C T ) L s A d C r D a A c ( a r e f s n a r T e h p a s T e a n p k e a e p a t a e r S E l P T a O e C d e d e e t g n t e a l e v D a e a t t w a a r D l d c v T N A n o S o i t N u n e c a k n l e c i a t ! p a t C P a r a O T T C o o . s C t v ) K T 9 Y P O C ( ) A T A D B A ( f m a r g a i D w o l F . l . E e r u g i F e n s i e N p a t a e p o a t T a k t c a a D r T y p o C s n o s n ) i s k m t a A r g . o r r D p ( ' s d r e o d t o n l e a a r C P P a C D w h P t c e f n s f o u U o S P s d r a c 3 1 2 3 1 3 E . l . D a t a T r a n s f e r F r o m t h e P D P B I t o t h e C D C — 6 5 0 0 T h e i n s t r u c t i o n s f o r u s i n g t h e C P m o d e o f t h e s t o p p e d f l o w s o f t w a r e t o p u n c h r a w d a t a o n t o c a r d s a r e g i v e n b y P a p a d a k i s ( u n p u b l i s h e d ) . T r a n s f e r r i n g d a t a b y t a p e s f r o m t h e P D P 8 I c o m p u t e r t o t h e C D C - 6 5 0 0 c o m p u t e r r e q u i r e s t w o s t e p s . R a w d a t a o n a P D P 8 I f l o p p y d i s k o r a D E C T A P E i s f i r s t t r a n s f e r r e d t o a n i n e t r a c k t a p e t h a t c a n b e r e a d o n t h e C D C - 6 5 0 0 c o m p u t e r . T h e p r o g r a m s f o r t h i s s t e p w e r e d e v e l o p e d b y D r . T o m A t k i n s o n , a n d h e s h a l l p r o v i d e w r i t t e n i n s t r u c t i o n s f o r u s i n g t h e m . F i g u r e E . 2 i s a t y p i c a l d i r e c t o r y t h a t l i s t s t h e o r d e r o f s t o p p e d f l o w d a t a f i l e s o n a n i n e t r a c k t a p e . A l t h o u g h t h e C D C - 6 5 0 0 c o m p u t e r r e a d s n i n e t r a c k t a p e s , t h e M S U _ C o m p u t e r C e n t e r d o e s n o t f u l l y s u p p o r t t h e m w i t h s o f t w a r e , a n d f u r t h e r u s e o f t h e r a w d a t a i s c h e a p e r a n d m o r e c o n v e n i e n t i f t h e c o n t e n t s o f t h e n i n e t r a c k t a p e a r e c o p i e d o n t o a s e v e n t r a c k S C O P E t a p e , a n d t h e S C O P E t a p e i s u s e d a s t h e p e r m a n e n t r e c o r d o f t h e r a w d a t a f o r t h e C D C - 6 5 0 0 c o m p u t e r . D r . D o n a l d W a r d h a s p r o v i d e d a p r o g r a m n a m e d C O P Y 9 T K t h a t c o p i e s t h e c o n t e n t s o f a n i n e t r a c k t a p e o n t o a s e v e n t r a c k S C O P E t a p e . O n e s u b m i t s t h e d a t a - f i l l e d n i n e t r a c k t a p e a n d a b l a n k , z e r o e d s e v e n t r a c k t a p e t o t h e s e r v i c e w i n d o w o f t h e C o m p u t e r C e n t e r , a n d t h e n e n t e r s t h e f o l l o w - i n g d e c k i n t o t h e C D C - 6 5 0 0 c o m p u t e r . 3 1 H H P I P V E R 2 . 9 D I R E C T O R Y T A P E ! 6 2 . . 2 B - F E B - 7 7 1 3 3 5 7 8 4 3 F I L E : I I R E C I I ? C W A O A A . R C F I L E : 2 I R E C I I 7 G W A O A B . R C F I L E : 3 I R E C I I 7 G W A O A C . R C - F I L E : 4 I R E C I I 7 G W A O A D . R C F I L E : 5 I R E C I 2 0 9 C W A O A E . R C F I L E : 6 I R E C I 2 0 9 C W A O A F R C F I L E : 7 I R E C I 2 0 9 G N A O A C R C F I L E : 8 I R E C I 2 0 9 C W A O A H . R C F I L E : 9 I R E C I 2 0 9 C W A O A I R C F I L E : I D I R E C I 2 0 9 C W A O A J . R C F I L E : I I I R E C I 2 0 9 C W A O A K . R C F I L E : 1 2 I R E C I 4 3 G W A O A L R C F I L E : I 3 I R E C I I 7 C W A O A H . R C F I L E : I 4 I R E C I I 7 C W A O A N . R C F I L E . I 3 I R E C I I ? C W A O A 0 . R C F I L E : 1 6 I R E C I I 7 C W A O A P . R C F I L E : I ? I R E C I I 7 C W A O A Q . R C F I L E . 1 8 I R E C I I ? C W A O A R . R C F I I E ' I 9 I R I C I I ? G W A O A S . R C F I L E : 2 0 I R E C I I ? G W A O A T . R C T O T A L R E C O R D S I I 7 I O . F i g u r e E . 2 . D i r e c t o r y s h o w i n g f i r s t t h i r t y d a t a f i l e s o n a n i n e t r a c k t a p e . 3 1 5 E x a m p l e 1 D e c k t h a t E x e c u t e s C O P Y 9 T K 1 . P r o b l e m N u m b e r C a r d 2 J o b C a r d - - - I D N A M E , C M H O O O O , T 2 0 0 , J C 3 0 0 0 , N T 1 , M T 1 , R G l . 3 . P a s s w o r d h . R E Q U E S T , T A P E 1 , V R N = 9 t k t a p e # , S , Z , H D , A S , R O . 5 . R E Q U E S T , T A P E 2 , V R N = 7 t k t a p e ? , R w . 6 . R E W I N D ( T A P E 1 ) 7 8 9 . R E W I N D ( T A P E 2 ) . A T T A C H ( X , C O P Y 9 T K ) . x . 1 0 . R E T U R N ( T A P E 1 ) 1 1 . R E T U R N < T A P E 2 ) 1 2 . ( 7 8 1 3 . T i t l e , N u m b e r o f f i l e s o n t h e n i n e t r a c k t a p e , F o r m a t ( A 7 0 , I l O ) 6 7 8 9 ) T h e m e a n i n g o f t h e c o n t r o l c a r d s i n E x a m p l e 1 i s d e s c r i b e d i n T h e C o m p u t e r L a b o r a t o r y U s e r ' s G u i d e , V o l . T E , ( 1 9 7 3 ) C h a p t e r s 2 t h r o u g h 7 . T h e p r o g r a m C O P Y 9 T K r e c o r d s o n t h e s e v e n t r a c k t a p e i n S C O P E f o r m a t a f a c - s i m i l e o f t h e i n f o r m a t i o n o n t h e n i n e t r a c k t a p e . T h e p r o c e d u r e f o r o b t a i n i n g a p a r t i c u l a r d a t a f i l e f r o m t h e s e v e n t r a c k S C O P E t a p e i s d e s c r i b e d i n t h e C o n t r o l D a t a S C O P E R e f e r e n c e M a n u a l ( 1 9 6 9 ) , S e c t i o n 1 0 . T h e f o l l o w i n g e x a m p l e i s a d e c k t h a t r e a d s f i l e s G W A O A C . R C a n d G W A O A T . R C f r o m a s e v e n t r a c k S C O P E t a p e a n d s t o r e s t h e i n f o r m a t i o n a s p e r m a n e n t f i l e s G W A O A C a n d G W A O A T . I n t h i s e x a m p l e t h e s e v e n t r a c k S C O P E t a p e w i t h v i s u a l r e e l n u m b e r 6 2 0 0 c o n t a i n s t w e n t y f i l e s , w h i c h a r e l i s t e d i n F i g u r e E . 1 . I t w a s c o p i e d f r o m a n i n e t r a c k t a p e h a v i n g t h i s d i r e c t o r y . T h e f i l e s a r e i d e n t i f i e d o n t h e t a p e b y t h e i r n u m b e r s . T h u s , G W A O A C . R C i s f i l e n u m b e r ‘ - l ) \ l ) A L = J l ' U \ O N ) I ( 3 1 6 3 , a n d G W A O A T . R C i s f i l e n u m b e r 2 0 . E x a m p l e 2 D e c k t h a t R e t r i e v e s F i l e s G W A O A C . R C a n d G W A O A T . R C f r o m t h e S e v e n T r a c k S C O P E T a p e 2 U 1 2 . P r o b l e m N u m b e r C a r d J o b C a r d - - - I D N A M E , C M N O O O O , T l O O , J C 2 5 0 , M T l , R G 2 . P a s s w o r d R E Q U E S T , T 7 , V R N = 6 2 0 0 , R O . R E W I N D ( T 7 ) C O P Y C F ( T 7 , X , 2 ) c o p i e s t h e f i r s t t w o f i l e s o n t o l o c a l f i l e X . C O P Y C F ( T 7 , T A P E l , l ) c o p i e s t h e t h i r d f i l e o n t o l o c a l f i l e T A P E l . C O P Y C F ( T 7 , X , 1 7 ) c o p i e s f i l e s u t h r o u g h 1 9 o n t o l o c a l f i l e X . 9 . C O P Y C F ( T 7 , T A P E 2 , 1 ) c o p i e s f i l e 2 0 o n t o l o c a l f i l e T A P E Z . l O . C A T A L O G ( T A P E l , G W A O A C , R P = 1 0 ) l l . C A T A L O G ( T A P E 2 , G W A O A T , R P = l O ) l 2 . R E T U R N ( T 7 ) 1 3 . ( 6 7 8 9 ) E . 2 . W a v e l e n g t h C a l i b r a t i o n E a c h f i l e o n t h e s e v e n t r a c k S C O P E t a p e c o n t a i n s t h e d a t a c o l l e c t i o n p a r a m e t e r s a n d t h e d i g i t i z e d o u t p u t v o l t a g e s o f t h e P h i l b r i c k l o g a r i t h m i c a m p l i f i e r f o r a l l t h e s t o r e d p o i n t s i n a s i n g l e e x p e r i m e n t . T h e p u r p o s e o f t h e c a l i - b r a t i o n p r o g r a m s i s t o c a l c u l a t e f r o m t h e s e r a w d a t a t h e a b s o l u t e B e e r ' s L a w a b s o r b a n c e s , t h e w a v e l e n g t h s , a n d t h e t i m e s f o r a l l t h e s t o r e d d a t a p o i n t s , a n d t o s u p p l y t h i s i n f o r m a t i o n i n a f o r m s u i t a b l e f o r u s e i n K I N F I T a n d o t h e r d a t a i n t e r p r e t a t i o n p r o g r a m s . T h e f i r s t c a l i b r a t i o n s t e p f o r s c a n n i n g e x p e r i m e n t s i s t o e s t i m a t e t h e w a v e l e n g t h c o r r e s p o n d i n g t o e a c h 3 1 7 w a v e l e n g t h c h a n n e l i n t h e s c a n . T h e c o m p u t e r p r o g r a m s u s e d i n t h i s s t e p a r e K I N F I T a n d W A V E . T h e c a l i b r a t i o n d a t a f o r t h i s s t e p a r e t h e ( w a v e l e n g t h c h a n n e l , w a v e l e n g t h ) o r d e r e d p a i r s f o r t h e a b s o r b a n c e p e a k s o f t h e h o l m i u m o x i d e a n d d i d y m i u m o x i d e s t a t i c s p e c t r a , c o l l e c t e d w i t h t h e s a m e m o n o c h r o m a t o r s e t t i n g s a s t h e k i n e t i c e x p e r i m e n t s . T a b l e E . l l i s t s t h e s e d a t a f o r t h e L A D H - N A D H - N D M A r e a c t i o n e x p e r i m e n t s d i s c u s s e d i n C h a p t e r A . T h e i n s t r u - m e n t a l c o n d i t i o n s f o r t h e s e s c a n n i n g e x p e r i m e n t s w e r e d r u m s e t t i n g = 1 6 1 0 . 3 , m i r r o r n u t a t i o n = 0 . 8 6 1 5 , m i r r o r r o t a t i o n s / s e c 3 7 . 5 , s a m p l e s / p o i n t = 5 , a n d s t o r e d p o i n t s / s p e c t r u m = 5 A . I n o r d e r t o i n c r e a s e t h e r e s o l u t i o n f o r t h e w a v e l e n g t h c a l i b r a t i o n , t h e h o l m i u m o x i d e a n d d i d y m i u m o x i d e s t a t i c s p e c t r a w e r e m e a s u r e d w i t h t h e s a m e d r u m s e t t i n g a n d m i r r o r n u t a t i o n a s t h e k i n e t i c e x p e r i m e n t s , b u t w i t h m i r r o r r o t a t i o n s / s e c = 7 . 5 , s a m p l e s / p o i n t = 6 , a n d s t o r e d p o i n t s / s p e c t r u m = 2 2 6 . T h e w a v e l e n g t h c h a n n e l i n t h e 5 “ p o i n t s p e c t r u m t h a t c o r r e s p o n d s t o a g i v e n w a v e — l e n g t h c h a n n e l i n t h e 2 2 6 p o i n t s p e c t r u m w a s c a l c u l a t e d f r o m t h e e q u a t i o n c h a n n e l i n 5 “ p o i n t s s p e c t r u m = ( 5 U . A / 2 2 6 . 7 ) x c h a n n e l i n 2 2 6 p o i n t s p e c t r u m . ( B . 1 ) E q u a t i o n ( B . 1 ) i s d e r i v e d f r o m t h e f a c t s t h a t t h e r e a r e § § g e a r t e e t h ) x ( 4 s a m p l e s ) ( 1 p o i n t ) = 5 A . A g p o i n t s g e a r t o o t h 5 s a m p l e s f o r w a r d s c a n f o r w a r d s c a n 3 1 8 T a b l e E . l . H o l m i u m O x i d e a n d D i d y m i u m O x i d e A b s o r b a n c e P e a k s f o r t h e L A D H — N A D H - N D M A E x p e r i m e n t s v e r s u s W a v e l e n g t h C h a n n e l m I i l i l a v s e l - ‘ l £ 3 3 8 . 1 5 2 p c e i i n r n a e l A ( n m ) V ( c m - 1 ) H o l m i u m O x i d e P e a k s 6 . 0 2 7 9 . 0 3 5 8 h 0 1 0 . 7 2 8 7 . 7 3 u 7 6 0 2 2 . 9 3 3 9 . 1 2 9 9 3 0 2 5 . 2 3 N 8 . 2 2 8 7 2 0 2 7 . 1 3 6 1 . 0 2 7 7 0 0 2 9 . 8 3 8 2 . 2 2 6 1 6 0 3 0 . 2 3 8 6 . 2 2 5 8 9 0 3 3 . 6 “ 1 9 . " 2 3 8 u 0 3 6 . 0 l l u 6 . 2 2 2 1 1 1 0 3 6 . 7 h 5 fl . 0 2 2 0 3 0 3 7 . 2 1 4 6 0 . 6 2 1 7 1 0 3 9 . 1 U 8 u . 7 2 0 6 3 0 l l 3 . 0 5 3 6 . 9 1 8 6 3 0 D i d y m i u m O x i d e P e a k s “ 1 . 0 5 1 9 . 0 1 9 9 6 0 “ 2 . 2 5 2 9 . 0 1 8 9 0 0 1 4 6 . 1 5 7 3 . 0 1 7 4 5 0 1 : 7 . 0 5 8 1 4 . 0 1 7 1 2 0 3 1 9 i n t h e s c a n n i n g k i n e t i c e x p e r i m e n t s , o f w h i c h 5 A a r e s t o r e d a n d 0 . A a r e w a s t e d , a n d ( 6 8 g e a r t e e t h ) ( 2 0 s a m p l e s 1 p o i n t ) = 2 2 6 . 7 p o i n t s ) X ( E f o r w a r d s c a n g e a r t o o t h s a m p l e s f o r w a r d s c a n i n t h e h o l m i u m o x i d e a n d d i d y m i u m o x i d e s t a t i c s p e c t r a , o f w h i c h 2 2 6 a r e s t o r e d a n d 0 . 7 a r e w a s t e d . C a l c u l a t i n g t h e w a v e l e n g t h o f e a c h w a v e l e n g t h c h a n n e l c o u l d b e v i e w e d a s t h e p r o b l e m o f i n t e r p o l a t i n g b e t w e e n t h e o b s e r v e d h o l m i u m o x i d e a n d d i d y m i u m o x i d e p e a k s . W e c o u l d f i t t h e d a t a i n T a b l e E . l w i t h a p o l y n o m i a l a n d u s e t h e p o l y n o m i a l t o c a l c u l a t e t h e w a v e l e n g t h s o f a l l t h e c h a n n e l s f o r w h i c h t h e r e a r e n o p e a k s . T h i s w o u l d n o t b e a s a t i s f a c t o r y s o l u t i o n , h o w e v e r , b e c a u s e t h e p o l y n o m i a l w o u l d h a v e t o b e e x t r a p o l a t e d b e y o n d t h e r a n g e o f t h e p e a k s . F o r e x a m p l e , i n T a b l e E . 1 t h e l a s t c h a n n e l o u t o f 5 A f o r w h i c h a c a l i b r a t i o n p e a k i s o b s e r v e d i s c h a n n e l “ 7 . A p o l y n o m i a l e s t i m a t e d b y f i t t i n g t h e d a t a i n T a b l e B . 1 w o u l d c o n t a i n n o i n f o r m a t i o n a b o u t t h e w a v e l e n g t h o f c h a n n e l s A 8 t h r o u g h 5 9 . R a t h e r t h a n u s e a n a r b i t r a r y p o l y n o m i a l t o f i t t h e w a v e l e n g t h c a l i b r a t i o n d a t a , w e s h a l l u s e a m o d e l t h a t d e s c r i b e s t h e s c a n n i n g m o n o c h r o m a t o r . T h e P e r k i n E l m e r s c a n n i n g m o n o c h r o m a t o r a n d t h e c o m p u t e r i n t e r f a c e a r e s o c o n s t r u c t e d , t h a t , i f t h e q u a r t z p r i s m ' s i n d e x o f r e f r a c - t i o n w e r e a l i n e a r f u n c t i o n o f w a v e l e n g t h , t h e r e l a t i o n - 1 ) s h i p b e t w e e n V ( c m ‘ , t h e w a v e n u m b e r o f l i g h t a t t h e e x i t 3 2 0 s l i t , a n d m , t h e w a v e l e n g t h c h a n n e l i n t h e s c a n , w o u l d b e V ( c m - 1 ) = 8 1 s i n [ 2 n ( m / n + 8 3 ) ] + 8 2 ( E . 2 ) w h e r e n i s t h e t o t a l n u m b e r o f w a v e l e n g t h c h a n n e l s i n t h e f o r w a r d a n d b a c k w a r d s c a n ( = 1 0 8 . 8 f o r t h e d a t a i n T a b l e B . 1 ) , 8 1 i s t h e h a l f w i d t h o f t h e f o r w a r d s c a n i n w a v e n u m b e r s , B 2 i s t h e c e n t e r o f t h e f o r w a r d s c a n i n w a v e n u m b e r s , a n d 8 3 i s a p h a s e a n g l e ( 2 0 . 2 5 ) . F o r t h e i d e a l c a s e o f l i n e a r d e p e n d e n c e o f i n d e x o f r e f r a c t i o n o n w a v e l e n g t h , w e w o u l d e s t i m a t e t h e t h r e e u n k n o w n p a r a m e t e r s 8 1 ’ B 2 , a n d 8 3 b y f i t t i n g E q u a t i o n ( E . 2 ) i n K I N F I T t o t h e ( m , V ) p a i r s i n T a b l e B . 1 . H o w e v e r , t h e p r i s m ' s i n d e x o f r e f r a c t i o n v a r i e s n o n l i n e a r l y w i t h w a v e l e n g t h , a n d , a b e t t e r m o d e l i s W c m ' l ) = r m ( E . 3 ) w h e r e ¢ i s t h e n u t a t i o n a n g l e o f t h e r o t a t i n g m i r r o r , g i v e n b y ¢ = a 1 s i n [ 2 n ( m / n + 0 2 ) ] ( E . u ) a n d w h e r e a 1 i s t h e h a l f w i d t h o f t h e s c a n i n n u t a t i o n a n g l e o f t h e m i r r o r , a n d a 2 i s a p h a s e a n g l e ( 2 0 . 2 5 ) . E q u a t i o n ( E . 2 ) i s t h e s p e c i a l c a s e o f E q u a t i o n s ( E . 3 ) 3 2 1 a n d ( E . A ) w h e r e V = f ( ¢ ) = 8 2 + B i g / a 1 a n d a 2 = 8 3 . F o r n o n l i n e a r d e p e n d e n c e o f i n d e x o f r e f r a c t i o n o n w a v e - l e n g t h , f ( ¢ ) i s s o m e p o l y n o m i a l i n ¢ o f d e g r e e g r e a t e r t h a n o n e . R a t h e r t h a n d e t e r m i n e ¢ a n d f ( ¢ ) , w h i c h w o u l d b e e x p e r i m e n t a l l y d i f f i c u l t , w e c a n i n c l u d e t h e n o n l i n e a r d e p e n d e n c e o f i n d e x o f r e f r a c t i o n o n w a v e l e n g t h i n t h e f o l l o w i n g w a y . W e v a r y t h e a n g l e w i t h w h i c h t h e b e a m e n t e r s t h e p r i s m , a n d h e n c e t h e w a v e l e n g t h o f l i g h t a t t h e e x i t s l i t , b y c h a n g i n g t h e d r u m s e t t i n g w i t h t h e m i r r o r n u t a t i o n a n g l e s e t t o z e r o . I n t h i s m a n n e r , w e c o n s t r u c t a t a b l e o f h o l m i u m o x i d e a n d d i d y m i u m o x i d e a b s o r b a n c e p e a k w a v e n u m b e r s v e r s u s d s ’ t h e d r u m s e t t i n g a t z e r o n u t a t i o n . T a b l e E . 2 c o n t a i n s t h i s i n f o r m a t i o n , m e a s u r e d o n J u l y 1 , 1 9 7 6 b y D r . J o s e p h C e r a s o . W e u s e t h i s i n f o r m a t i o n i n a w a v e l e n g t h c a l i b r a t i o n b y a s s u m i n g t h e m o d e l d = U s 1 s i n [ 2 n ( m / n + U 3 ) ] + U 2 ( E . 5 ) w o u l d ) = s ( d s ) ( 1 3 . 6 ) 1 ( n m ) = 1 0 7 / V ( e m ‘ 1 ) ( 1 2 . 7 ) w h e r e d B i s t h e d r u m s e t t i n g a t z e r o n u t a t i o n a n g l e , m i s t h e w a v e l e n g t h c h a n n e l n u m b e r , U l i s t h e h a l f w i d t h o f t h e s c a n i n u n i t s o f d r u m s e t t i n g a t z e r o n u t a t i o n 3 2 2 T a b l e E . 2 . W a v e n u m b e r s v e r s u s D r u m S e t t i n g s a t Z e r o M i r r o r N u t a t i o n f o r H o l m i u m O x i d e a n d D i d y m i u m O x i d e A b s o r b a n c e P e a k s . d = D r u m S e t t i n g a t Z e r o M i r r o r N u t a t i o n V ( c m - 1 ) 1 7 9 2 . 5 3 5 8 9 0 1 7 6 3 . 3 3 9 7 6 0 1 7 5 9 . 2 3 9 9 8 0 1 6 3 5 . 9 2 9 9 3 0 1 6 2 2 . 8 2 9 3 0 0 1 6 1 9 . 7 2 9 0 0 0 1 6 0 7 . 9 2 8 7 2 0 1 5 8 6 . 3 2 7 7 0 0 1 5 7 9 . 0 2 7 1 2 0 1 5 5 5 . 6 2 6 1 6 0 1 5 9 8 . 7 2 5 8 9 0 1 5 u 2 . 2 2 5 5 6 0 1 5 1 0 . 7 2 3 8 9 0 1 5 0 3 . 9 2 3 5 0 0 1 9 8 6 . 2 2 2 9 1 0 1 9 8 1 . 0 2 2 0 3 0 1 9 7 5 . 9 2 1 7 1 0 1 9 6 8 . 1 2 1 0 8 0 1 9 6 2 . 5 2 0 6 3 0 1 9 5 5 . 9 2 0 9 7 0 1 9 2 8 . 9 1 8 6 3 0 1 9 0 7 . 3 1 7 1 2 0 1 9 1 1 . 9 1 7 9 5 0 1 9 3 1 . 6 1 8 9 0 0 1 9 9 0 . 9 1 9 9 6 0 3 2 3 a n g l e , U 2 i s t h e c e n t e r o f t h e s c a n i n u n i t s o f d r u m s e t t i n g a t z e r o n u t a t i o n a n g l e , U 3 i s a p h a s e a n g l e ( 2 0 . 2 5 ) , n i s t h e t o t a l n u m b e r o f w a v e l e n g t h c h a n n e l s i n t h e f o r w a r d a n d b a c k w a r d s c a n s , a n d g ( d S ) i s a p o l y - n o m i a l i n d S . N o t e t h a t E q u a t i o n s ( E . 5 ) t h r o u g h ( E . 7 ) r e l a t e t h e w a v e l e n g t h A t o t h e c h a n n e l n u m b e r m . E q u a t i o n s ( E . 5 ) a n d ( E . 6 ) c o n t a i n p a r a m e t e r s t o b e e s t i m a t e d b y l e a s t s q u a r e s f i t t i n g t h e c a l i b r a t i o n d a t a . E q u a t i o n ( E . 7 ) i s t r u e b y t h e d e f i n i t i o n s o f A a n d F . T h e f i r s t s t e p i n u s i n g t h i s m o d e l i s t o e s t i m a t e U U 2 , a n d U b y f i t t i n g 1 ’ 3 t h e ( m , d s ) o r d e r e d p a i r s f o r t h e h o l m i u m o x i d e a n d d i d y m i - u m o x i d e s t a t i c s p e c t r a t o E q u a t i o n ( E . 5 ) w i t h K I N F I T . T h e ( m ’ d s ) o r d e r e d p a i r s f o r t h e L A D H - N A D H - N D M A e x p e r i m e n t s a r e l i s t e d i n T a b l e E . 3 , i n w h i c h e a c h d S v a l u e i s t h e o n e f r o m T a b l e E . 2 w h o s e w a v e n u m b e r c o r r e s p o n d s t o t h e h o l m i u m o x i d e o r d i d y m i u m o x i d e p e a k f r o m T a b l e E . l . G i v e n t h e d a t a i n T a b l e E . 3 , e s t i m a t e d v a r i a n c e s o f m a n d d S e q u a l t o o n e , a n d t h e r e s i d u a l f u n c t i o n R d e f i n e d b y R = d S - U l s i n [ 2 n ( m / n + U 3 ) ] + U 2 , ’ ( E . 8 ) o b s e r v e d K I N F I T e s t i m a t e d t h e v a l u e s U l = 2 0 8 . 5 : 0 . 7 , U 2 = 1 6 0 9 . 3 1 1 . 9 , a n d U 3 = 0 . 2 6 5 i 0 . 0 0 2 . T h e n e x t s t e p i s t o e s t i m a t e b y l e a s t s q u a r e s t h e p o l y n o m i a l s ( d s ) i n E q u a t i o n ( E . 6 ) . T h i s s t e p , a n d t h e f i n a l s t e p o f c a l c u l a t i n g f r o m E q u a t i o n s ( E . 5 ) t h r o u g h T a b l e E . 3 . 3 2 9 D r u m S e t t i n g s a t Z e r o M i r r o r N u t a t i o n v e r s u s W a v e l e n g t h C h a n n e l f o r t h e H o l m i u m O x i d e a n d D i d y m i u m O x i d e C a l i b r a t i o n S p e c t r a ( I n f o r m a - t i o n C o m b i n e d f r o m T a b l e s 1 a n d 2 ) . m : n w 5 9 e p l ) 8 8 9 3 8 3 ; ; 8 8 : 8 1 a n 1 d A s t = Z e D r r o m n N u s t e a t t t i i o n n g V ( c m " 1 ) H o l m i u m O x i d e P e a k s 6 . 0 1 7 9 2 . 5 3 5 8 9 0 1 0 . 7 1 7 6 3 . 3 3 9 7 6 0 2 2 . 9 1 6 3 5 . 9 2 9 9 3 0 2 5 . 2 1 6 0 7 . 9 2 8 7 2 0 2 7 . 1 1 5 8 6 . 3 2 7 7 0 0 2 9 . 8 1 5 5 5 . 6 2 6 1 6 0 3 0 . 2 1 5 9 8 . 7 2 5 8 9 0 3 3 . 6 1 5 1 0 . 7 2 3 8 9 0 3 6 . 0 1 9 8 6 . 2 2 2 9 1 0 3 6 . 7 1 9 8 1 . 0 2 2 0 3 0 3 7 . 2 1 9 7 5 . 9 2 1 7 1 0 3 9 . 1 1 9 6 2 . 5 2 0 6 3 0 9 3 . 0 1 9 2 8 . 9 1 8 6 3 0 D i d y m i u m O x i d e P e a k s 9 1 . 0 1 9 9 0 . 9 1 9 9 6 0 9 2 . 2 1 9 3 1 . 6 1 8 9 0 0 9 6 . 1 1 9 1 1 . 9 1 7 9 5 0 9 7 . 0 1 9 0 7 . 3 1 7 1 2 0 3 2 5 ( E . 7 ) a t a b l e o f w a v e l e n g t h s f o r a l l t h e w a v e l e n g t h c h a n n e l s , i s p e r f o r m e d b y t h e p r o g r a m W A V E . W A V E h a s a s u b r o u t i n e c a l l e d O R T H P O L t h a t u s e s o r d i n a r y l e a s t s q u a r e s t o f i t t h e d a t a i n T a b l e E . 2 t o t h e e q u a t i o n v = s ( d s ) = 3 0 P 0 ( d s ) + B l P l ( d s ) + . . . + 8 5 P 5 ( d s ) , ( B . 9 ) W h e r e P 0 t h r o u g h P 5 a r e o r t h o g o n a l p o l y n o m i a l s , c h o s e n s u b j e c t t o t h e r e s t r i c t i o n s t h a t g ( d s ) h a s n o i n f l e c t i o n p o i n t s o v e r t h e r a n g e o f t h e ( 1 5 v a l u e s i n T a b l e E . 2 , a n d t h a t e a c h t e r m i n E q u a t i o n ( B . 9 ) i s s t a t i s t i c a l l y s i g - n i f i c a n t a t t h e 9 5 % c o n f i d e n c e l e v e l . M o r e d e t a i l s a b o u t O R T H P O L a r e g i v e n i n A p p e n d i x F . T h e p r o g r a m W A V E t h e n u s e s E q u a t i o n s ( E . 5 ) t h r o u g h ( E . 6 ) t o c a l c u l a t e a t a b l e o f w a v e l e n g t h s f o r a l l t h e w a v e l e n g t h c h a n n e l s i n t h e e x p e r i m e n t . I t p r i n t s t h i s t a b l e a n d w r i t e s t h e i n - f o r m a t i o n o n a l o c a l f i l e c a l l e d T A P E 8 t h a t c a n b e c a t a - l o g e d a s a p e r m a n e n t f i l e t o b e u s e d i n t h e n e x t c a l i b r a - t i o n s t e p . T h e f o l l o w i n g d e c k e x e c u t e s t h e p r o g r a m W A V E . E x a m p l e 3 D e c k t h a t E x e c u t e s t h e P r o g r a m W A V E a n d S t o r e s T A P E 8 a s P e r m a n e n t F i l e W C A L I B . C o n t r o l C a r d s 1 . P r o b l e m N u m b e r C a r d 2 . J o b C a r d - - - I D N A M E , C M 9 0 0 0 0 , T 5 0 , J C 2 5 0 , R G 2 . 3 . P a s s w o r d 9 . A T T A C H ( W A V E , W A V E ) 5 . W A V E . 6 . C A T A L O G ( T A P E 8 , W C A L I B , R P = 1 0 0 ) 7 o 7 8 9 ) 3 2 6 D a t a C a r d s 8 . N P T S , N C H A N ( 2 1 5 ) N P T S N u m b e r o f ( d s , V ) o r d e r p a i r s t o b e u s e d i n e s t i m a t i n g t h e p a r a m - e t e r s i n E q u a t i o n ( E . 5 ) . N C H A N N u m b e r o f w a v e l e n g t h c h a n n e l s i n a s i n g l e f o r w a r d s c a n o f t h e e x - p e r i m e n t . 9 . ( U ( I ) , I = 1 , 2 , 3 ) ( 3 E 1 0 . 9 ) U ( I ) U 1 , U a n d U v a l u e s e s t i m a t e d b y K E N F I T f r E q u a t i o n ( E . 5 ) 1 0 . ( X ( I ) , Y ( I ) , I = 1 , N P T S ) ( 2 E 1 0 . 9 ) . X ( I ) d , d r u m s e t t i n g a t z e r o n u t a t i o n . Y ( I ) V i c m - l ) , w a v e n u m b e r o b s e r v e d f o r d S 1 1 . ( 6 7 8 9 ) T A P E 8 h a s w r i t t e n o n i t ( W L ( I ) , I = l , N C H A N ) , F o r m a t ( 5 X , E 1 0 . 9 ) , w h e r e W L ( I ) i s t h e w a v e l e n g t h i n n a n o m e t e r s o f t h e I ' t h w a v e l e n g t h c h a n n e l . G i v e n t h e d a t a i n T a b l e E . 2 , O R T H P O L c h o s e a t h i r d d e g r e e p o l y n o m i a l f o r s ( d s ) . T a b l e 9 . 3 l i s t s t h e w a v e - l e n g t h a s s i g n m e n t s o f t h e 5 9 w a v e l e n g t h c h a n n e l s i n t h e L A D H - N A D H - N D M A e x p e r i m e n t s . F i g u r e 9 . 1 i s a p l o t o f t h e w a v e l e n g t h v e r s u s w a v e l e n g t h c h a n n e l c a l i b r a t i o n . E . 3 . C a l c u l a t i o n o f A b s o r b a n c e v e r s u s T i m e a n d W a v e - l e n g t h C h a n n e l T h e p r o g r a m W A V E d e f i n e s t h e w a v e l e n g t h s c a l e o f a s c a n n i n g e x p e r i m e n t . T h e p r o g r a m A B C A L c a l c u l a t e s a b - s o r b a n c e v e r s u s t i m e a n d w a v e l e n g t h c h a n n e l f o r a s c a n n i n g 3 2 7 e x p e r i m e n t f r o m t h e w a v e l e n g t h c a l i b r a t i o n i n f o r m a t i o n , d a t a c o l l e c t i o n p a r a m e t e r s , n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r c a l i - b r a t i o n d a t a , a n d t h e d i g i t i z e d o u t p u t v o l t a g e s o f t h e P h i l b r i c k l o g a r i t h m i c a m p l i f i e r . A B C A L a l s o c a l c u l a t e s a b s o r b a n c e v e r s u s t i m e f o r a f i x e d w a v e l e n g t h e x p e r i m e n t a n d a b s o r b a n c e v e r s u s w a v e l e n g t h c h a n n e l f o r a s t a t i c s p e c t r u m . S e v e r a l a u x i l i a r y p r o g r a m s , N D F C A L , A B D A T A , a n d A B D A T A 2 , a r e u s e d t o f e e d t h e n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r d a t a , k i n e t i c r a w d a t a , a n d d a t a c o l l e c t i o n p a r a m e t e r s i n t o A B C A L . B e f o r e d e s c r i b i n g t h e i r u s e , w e s h a l l b r i e f l y d i s c u s s t h e c a l c u l a t i o n s p e r f o r m e d i n A B C A L . T i m e A B C A L a n d i t s s u b r o u t i n e T I M E R c a l c u l a t e t h e t i m e o f e a c h a b s o r b a n c e p o i n t i n a s c a n n i n g o r f i x e d w a v e l e n g t h k i n e t i c e x p e r i m e n t f r o m t h e d a t a c o l l e c t i o n p a r a m e t e r s ( S A V E P A G E ) , t h e f l o w t i m e , t h e s t o p p i n g t i m e , a n d t h e d i s t a n c e s b e t w e e n c e r t a i n f l a g s a n d t h e p l u n g e r s t o p p i n g p l a t e . F i g u r e E . 3 s c h e m a t i c a l l y s h o w s t h e l o c a t i o n o f t h e t i m i n g f l a g s f o r a s c a n n i n g k i n e t i c e x p e r i m e n t . I n t h i s e x a m p l e i t i s a s s u m e d t h a t t h e s t o p f l a g D w a s u s e d t o t r i g g e r d a t a c o l l e c t i o n . D a t a c o l l e c t i o n w o u l d a c t u a l l y b e g i n a t p o i n t G , w h e r e t h e f i r s t b e g i n n i n g o f s c a n p u l s e o c c u r s a f t e r D . T h e z e r o o f t h e t i m e s c a l e c a l c u l a t e d 3 2 8 A A ' B C _ _ _ . J I , a g E _ _ _ . _ _ 1 I J I I I ‘ 5 _ i 1 l I 1 J l I I I A c c e l e r a t i o n I l l D I c e l e r a t i O n I I l I I _ _ 1 L i ' J r I I I I l J l l L _ J D D . E F G r — v z — a # 7 3 9 6 9 9 I — — — n — — — I F i g u r e E . 3 . S t a r t F l a g s A . A ° . D . a n d C S t o p F l a g 0 P l u n g e r h i t s S t o p p i n g P l a t e E B e g i n S c a n P u l s e s G F l u i d V e l o c i t y S c h e m a t i c d i a g r a m o f t i m i n g f l a g s f o r a s c a n n i n g e x p e r i m e n t t r i g g e r e d b y t h e s t o p f l a g . T 1 a f l o w t i m e , T 2 = t i m e s h i f t , T 3 = s t o p f l a g t o p l u n g e r s t o p , T 9 = s t o p p i n g t i m e . 3 2 9 b y T I M E R i s w h e r e t h e d a t a c o l l e c t i o n b e g i n s , i ; g ; J a t p o i n t G i n t h i s e x a m p l e . A B C A L t h e n a d j u s t s t h e t i m e s c a l e t o b e g i n w h e r e t h e f l u i d f l o w h a s e n d e d , 1 1 2 ; : p o i n t F i n F i g u r e E . 3 . T h i s a d j u s t m e n t i s c a l c u l a t e d f r o m t h e f o l l o w i n g f o u r n u m b e r s : 1 . T , t h e " f l o w t i m e " , w h i c h i s t h e t i m e e l a p s e d b e t w e e n o n e o f t h e s t a r t f l a g s ( A , B , o r C ) , a n d t h e s t o p f l a g , D . T h e s t a r t f l a g u s e d s h o u l d b e t h e e a r l i e s t f l a g b y w h i c h c o n s t a n t f l o w v e l o c i t y h a s b e e n r e a c h e d , i . e . , f l a g 5 i n F i g u r e E . 9 . 2 . T 2 , t h e " t i m e s h i f t " , w h i c h i s t h e t i m e e l a p s e d b e t w e e n t h e d a t a c o l l e c t i o n t r i g g e r a n d t h e f i r s t b e g i n n i n g o f s c a n p u l s e ; i . e . , b e t w e e n p o i n t s D a n d G i n F i g u r e E . 9 . 3 - T 3 , t h e t i m e e l a p s e d b e t w e e n t h e s t o p f l a g D a n d p o i n t E , w h e r e t h e p l u n g e r h i t s t h e s t o p p i n g p l a t e . 9 . T u , t h e " s t o p p i n g t i m e " , w h i c h i s t h e t i m e e l a p s e d b e t w e e n t h e s t o p p i n g o f t h e p l u n g e r a t p o i n t E a n d t h e e n d o f f l u i d f l o w a t p o i n t F . F o r t h e e x a m p l e s h o w n i n F i g u r e E . 3 , i f T i s t h e t i m e s c a l e c a l c u l a t e d i n T I M E R t h a t s t a r t s a t p o i n t G , t h e n T ' , t h e a d j u s t e d t i m e s c a l e c a l c u l a t e d b y A B C A L t h a t s t a r t s a t p o i n t F , i s g i v e n b y ' = - . . T T + T 2 T 3 T 9 ( E . 1 0 ) W e s h a l l b r i e f l y s u m m a r i z e t h e o t h e r c a s e s . I f d a t a c o l l e c t i o n i n a s c a n n i n g e x p e r i m e n t i s t r i g g e r e d f r o m a s t a r t f l a g , s a y f l a g B , t h e n T ' = T - T + T 2 - T 3 - T u ( 3 . 1 1 ) 3 3 0 I n a f i x e d w a v e l e n g t h e x p e r i m e n t t h e d a t a c o l l e c t i o n b e g i n s a t t h e f l a g c h o s e n t o t r i g g e r d a t a c o l l e c t i o n , s i n c e t h e r e i s n o n e e d t o w a i t f o r a b e g i n n i n g o f s c a n p u l s e . T h e r e f o r e , t h e r e i s n o t i m e s h i f t , T 2 . F o r a f i x e d w a v e l e n g t h e x p e r i m e n t t r i g g e r e d b y a s t a r t f l a g , w e h a v e ' - - - - a n d f o r a f i x e d w a v e l e n g t h e x p e r i m e n t t r i g g e r e d b y t h e s t o p f l a g , w e h a v e T 1 , T 2 , T , a n d T 9 a r e o b t a i n e d a s f o l l o w s . T 3 1 ’ t h e f l o w t i m e , i s m e a s u r e d d u r i n g t h e e x p e r i m e n t a n d i s e n t e r e d i n t o t h e c a l i b r a t i o n p r o g r a m s o n a d a t a c a r d t y p e d b y t h e u s e r . T 2 , t h e t i m e s h i f t , i s o n e o f t h e A V E P A G E p a r a m e t e r s s t o r e d b y t h e P D P 8 I c o m p u t e r w i t h e a c h f i l e . T 3 , t h e t i m e b e t w e e n t h e s t o p f l a g a n d t h e p l u n g e r s t o p , i s c o m p u t e d b y A B C A L f r o m t h e e q u a t i o n T 3 = l e / y ( E . 1 9 ) w h e r e x i s t h e v e r t i c a l d i s t a n c e d i s p l a c e d b y t h e p l u n g e r b e t w e e n t h e s t o p f l a g a n d t h e p l u n g e r s t o p p i n g p l a t e , a n d y i s t h e v e r t i c a l d i s t a n c e d i s p l a c e d b y t h e p l u n g e r b e t w e e n 3 3 1 t h e s t a r t f l a g u s e d t o m e a s u r e T 1 a n d t h e s t o p f l a g . E q u a t i o n ( E . 1 9 ) a s s u m e s t h a t t h e f l u i d v e l o c i t y i s c o n s t a n t b e t w e e n p o i n t B a n d E i n F i g u r e E . 3 . T h e s t o p p i n g t i m e , T 9 ’ i s t h e t i m e t a k e n f o r t h e f l u i d v e l o c - i t y t o r e a c h z e r o a f t e r t h e p l u n g e r s t o p s m o v i n g , a n d i s u s u a l l y e s t i m a t e d t o b e 0 . 5 m s e c . A b s o r b a n c e F o r a g i v e n w a v e l e n g t h c h a n n e l , A B C A L c a l c u l a t e s t h e a b s o l u t e a b s o r b a n c e o f e a c h d a t a p o i n t f r o m a n e q u a t i o n o f t h e f o r m A = A ( V ) = B O P O ( V ) + 8 1 P 1 ( V ) + . . . + 8 5 P 5 ( V ) ( E . 1 5 ) w h e r e A i s t h e a b s o l u t e a b s o r b a n c e , V i s t h e d i g i t i z e d o u t p u t v o l t a g e o f t h e P h i l b r i c k a m p l i f i e r , 8 0 t h r o u g h 8 5 a r e p a r a m e t e r s t o b e e s t i m a t e d b y o r d i n a r y l e a s t s q u a r e s , a n d P O ( V ) t h r o u g h P 5 ( V ) a r e o r t h o g o n a l p o l y - n o m i a l s , e a c h o f d e g r e e i n V e q u a l t o i t s s u b s c r i p t . T h e t e r m s i n c l u d e d i n E q u a t i o n ( E . 1 5 ) , a n d t h e v a l u e s o f t h e i r c o e f f i c i e n t s , a r e d e t e r m i n e d i n t h e s u b r o u t i n e O R T H P O L , w h i c h f i t s t h e a b s o l u t e a b s o r b a n c e s a n d v o l t a g e s f o r t h e n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r c a l i b r a t i o n d a t a t o E q u a - t i o n ( E . 1 5 ) . A d e t a i l e d d e s c r i p t i o n o f O R T H P O L i s g i v e n i n A p p e n - d i x F . I n u s i n g A B C A L , i t i s i m p o r t a n t t o k n o w t h a t t h e t e r m s c h o s e n i n E q u a t i o n ( E . 1 5 ) m u s t p a s s t w o t e s t s : 3 3 2 ( 1 ) t h e t e r m s m u s t b e s i g n i f i c a n t a t t h e 9 5 % c o n f i d e n c e l e v e l , a n d , ( 2 ) E q u a t i o n ( E . 1 5 ) m u s t h a v e n o u n w a n t e d i n f l e c t i o n p o i n t s . T h e s e t e s t s e x c l u d e p o l y n o m i a l s t h a t f i t t h e r a n d o m e r r o r s i n t h e c a l i b r a t i o n d a t a b y c h a n g i n g d i r e c t i o n t o g o t h r o u g h e v e r y d a t a p o i n t . T h e u s e r s u p - p l i e s v a l u e s f o r t h e v a r i a b l e s M F L A G , K F L A G , L F L A G , N I N C , V M A X , a n d J F L A G , d e f i n e d i n A p p e n d i x F , t h a t c o n t r o l h o w t h e t e r m s i n E q u a t i o n ( E . 1 5 ) a r e c h o s e n . T h e P h i l b r i c k l o g a r i t h m i c a m p l i f i e r c i r c u i t h a s 1 1 o u t p u t v o l t a g e g a i n s e t t i n g s . W h e n t h e g a i n s e t t i n g s f o r t h e e x p e r i m e n t a n d t h e n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r c a l i — b r a t i o n d a t a a r e d i f f e r e n t , A B C A L a s s u m e s t h a t t h e o u t p u t v o l t a g e i s l i n e a r w i t h g a i n , a n d m a k e s t h e f o l l o w i n g a d j u s t m e n t . T h e u s e r e n t e r s o n a d a t a c a r d t h e r a t i o R g , d e f i n e d R 8 = g a i n d u r i n g e x p e r i m e n t / g a i n d u r i n g c a l i b r a t i o n I f V i s t h e v o l t a g e m e a s u r e d d u r i n g t h e e x p e r i m e n t , A B C A L c a l c u l a t e s t h e a b s o r b a n c e f r o m A = A ( V ' ) , w h e r e V ' = V / R g a n d A ( V ' ) i s g i v e n b y E q u a t i o n ( E . 1 5 ) . E . 9 I n s t r u c t i o n s f o r U s i n g A B C A L I n a d d i t i o n t o v a r i o u s c o n t r o l p a r a m e t e r s , f l a g d i s t a n c e s , e t c . , A B C A L r e q u i r e s t h e f o l l o w i n g t h r e e b l o c k s o f d a t a : 3 3 3 l . T h e d a t a c o l l e c t i o n p a r a m e t e r s a n d d i g i t i z e d P h i l b r i c k a m p l i f i e r v o l t a g e s f o r t h e e x p e r i m e n t . 2 . T h e d i g i t i z e d P h i l b r i c k a m p l i f i e r v o l t a g e s f o r t h e n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r c a l i b r a t i o n d a t a . 3 . T h e a b s o l u t e a b s o r b a n c e s o f t h e n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r s a t t h e w a v e l e n g t h s c o r r e s p o n d i n g t o t h e w a v e l e n g t h c h a n n e l s o f t h e e x p e r i m e n t . B l o c k s ( 1 ) a n d ( 2 ) a r e t h e D E C T A P E f i l e s f o r t h e e x - p e r i m e n t a n d t h e n e u t r a l d e n s i t y c a l i b r a t i o n , r e s p e c t i v e l y . T h e a b s o l u t e a b s o r b a n c e s o f t h e n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r s a r e m e a s u r e d o n t h e C a r y 1 7 s p e c t r o m e t e r . T o c a l i b r a t e o n e w a v e l e n g t h c h a n n e l i n a s c a n n i n g e x p e r i m e n t , A B C A L r e q u i r e s a t t h e a p p r o p r i a t e w a v e l e n g t h t h e a b s o l u t e a b - s o r b a n c e o f e a c h n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r u s e d i n t h e c a l i - b r a t i o n e x p e r i m e n t . F o r e x a m p l e , i n a 5 9 w a v e l e n g t h c h a n - n e l e x p e r i m e n t f o r w h i c h 8 n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r s w e r e u s e d , A B C A L n e e d s 5 9 x 8 9 3 2 a b s o l u t e a b s o r b a n c e s f r o m t h e s p e c t r a o f t h e n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r s . W e c a n e x t r a c t t h e s e a b s o r b a n c e s f r o m t h e s p e c t r a b y h a n d , o r , i f t h e w a v e l e n g t h s f a l l b e t w e e n 2 5 0 n m a n d 6 1 0 n m , w e c a n u s e t h e p r o g r a m N D F C A L , w r i t t e n b y M r . D a v i d J u n e a n d a d a p t e d b y R . C o c h r a n , t o i n t e r p o l a t e t h e a b s o r b a n c e s f r o m a 7 7 0 p o i n t l o o k u p t a b l e . T h e p r o g r a m N D F C A L r e a d s t h e w a v e l e n g t h c a l i b r a t i o n i n f o r m a t i o n f r o m T A P E 8 o f t h e p r o g r a m W A V E , a n d l i n e a r l y i n t e r p o l a t e s t h e a b s o l u t e a b s o r b a n c e s o f t h e n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r s f r o m a l o o k u p t a b l e o n a p e r m a n e n t f i l e H M W t 3 3 9 c a l l e d N F D A T 2 , w h i c h c o n t a i n s a b s o r b a n c e s f r o m t h e C a r y 1 7 s p e c t r a o f t h e n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r s a t 5 n m i n t e r - v a l s o v e r t h e r a n g e 2 5 0 n m t o 6 1 0 n m . A l t e r n a t i v e l y , t h e w a v e l e n g t h c a l i b r a t i o n i n f o r m a t i o n c a n b e r e a d f r o m c a r d s . N D F C A L p r i n t s t h e a b s o l u t e a b s o r b a n c e s o f t h e n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r s f o r e a c h w a v e l e n g t h , a n d w r i t e s t h i s i n f o r m a t i o n o n a l o c a l f i l e c a l l e d T A P E 9 , t h a t c a n b e u s e d d i r e c t l y i n t h e n e x t s t e p f o r c a l i b r a t i n g d a t a f r o m a s e v e n t r a c k S C O P E t a p e . T h e d e c k s t r u c t u r e f o r e x e c u t i n g N D F C A L f o l l o w s . E x a m p l e 9 . D e c k t h a t E x e c u t e s N D F C A L a n d S t o r e s t h e A b - s o l u t e A b s o r b a n c e s o n a P e r m a n e n t F i l e N a m e d A B S O L U T E C o n t r o l C a r d s P r o b l e m N u m b e r C a r d J o b C a r d - - - I D N A M E , C M 9 0 0 0 0 , T 5 0 , J C 3 5 0 , R G 2 . P a s s w o r d A T T A C H ( T A P E 8 , W C A L I B ) ( I f I O P T # 1 o n d a t a c a r d # 1 , T A P E 8 s h o u l d c o n t a i n t h e a r r a y ( W L ( I ) , I - 1 , N C H A N ) f r o m t h e p r o g r a m W A V E ) . A T T A C H ( T A P E 7 , N F D A T 2 ) A T T A C H ( N D F C A L , N D F C A L ) N D F C A L . C A T A L O G ( T A P E 9 , A B S O L U T E , R P = 1 0 0 ) ( 7 8 \ O C D ' Q O N U ' I 9 ) D a t a C a r d s 1 0 . I O P T ( = 1 , w a v e l e n g t h v e r s u s w a v e l e n g t h c h a n n e l i n - f o r m a t i o n t o b e r e a d f r o m c a r d s , # 1 , t o b e r e a d f r o m T A P E 8 ) ( I S ) D a t a c a r d s ( 1 1 ) a n d ( 1 2 ) a r e u s e d o n l y i f I O P T = 1 a b o v e ( 1 1 ) N W L C ( N u m b e r o f w a v e l e n g t h c h a n n e l s i n t h e e x p e r i m e n t ) 5 H N w ’ t - m I ‘ O N m O \ 3 3 5 ( 1 2 ) ( X W V L T H ( I ) , I = 1 , N W L C ) ( 5 X , E 1 0 . 9 ) X W V L T H ( I ) W a v e l e n g t h i n n a n o m e t e r s o f w a v e l e n g t h c h a n n e l I . 1 3 . N N D N u m b e r o f n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r s p e r w a v e l e n g t h c h a n n e l i n t h e c a l i b r a t i o n e x p e r i m e n t s ( I 5 ) 1 9 . ( I S E L E C ( I ) , I = 1 , N N D ) ( 1 6 1 5 ) I S E L E C ( I ) i s a c o d e f o r t h e o r d e r i n w h i c h t h e n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r s a r e s t o r e d i n t h e c a l i b r a t i o n f i l e . I S E L E C ( I ) N o m i n a l O p t i c a l D e n s i t y o f t h e I ' t h N . D . f i l t e r i n t h e C a l i b r a t i o n F i l e 0 . 0 2 0 . 1 0 0 . 2 0 0 . 3 0 0 . 6 0 0 . 7 0 0 . 8 0 1 . 0 0 1 2 3 0 s o l v e n t v s . s o l v e n t I . _ . I O ( 6 I _ I U 1 7 8 9 ) T h e l o c a l f i l e T A P E 9 c o n t a i n s t h e a b s o l u t e a b s o r b a n c e s o f t h e n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r s f o r w a v e l e n g t h c h a n n e l s 1 t h r o u g h N W L C i n t h e f o l l o w i n g f o r m : ( X N D F I L ( I S E L E C ( I ) ) , I = 1 , N N D ) ( 8 3 1 0 . 9 ) w h e r e X N D F I L ( I S E L E C ( I ) ) i s t h e a b s o l u t e a b s o r b a n c e o f n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r I S E L E C ( I ) . T h e p r o g r a m A B C A L o b t a i n s i t s i n p u t d a t a f r o m o n e o f t w o p r o g r a m s ; f r o m A B D A T A i f t h e d a t a w e r e t r a n s f e r r e d H N W ‘ - c l ' U h C I N D C O \ o H I H h o H n H u 3 3 6 b y t a p e s . T h e f o l l o w i n g - e x a m p l e g i v e s t h e d e c k s t r u c t u r e f o r e x e c u t i n g , i n s u c c e s s i o n , A B D A T A a n d A B C A L . N o t e t h a t a l l o f t h e r a w d a t a a r e e n t e r e d o n c a r d s . T w o l o c a l f i l e s , T A P E 8 a n d T A P E 9 , c o n t a i n t h e a b s o r b a n c e v e r s u s t i m e a n d w a v e l e n g t h c h a n n e l i n f o r m a t i o n i n d i f f e r e n t f o r m s . T A P E 8 i s i n t e n d e d f o r s t o r a g e a s a p e r m a n e n t f i l e o r a s a n A P L I B f i l e , a n d T A P E 9 i s i n t e n d e d t o b e p u n c h e d a s d a t a c a r d s f o r K I N F I T . T h e s e f i l e s a r e d e s c r i b e d a t t h e e n d o f t h i s s e c t i o n . E x a m p l e 5 . D e c k t h a t E x e c u t e s A B D A T A , t h e n A B C A L i S t o r e s T A P E 8 a s a P e r m a n e n t F i l e , a n d P u n c h e s T A P E 9 a s C a r d s f o r K I N F I T C o n t r o l C a r d s P r o b l e m N u m b e r C a r d J o b C a r d - - - I D N A M E , C M 5 5 0 0 0 , T 2 0 0 , J C 9 5 0 , R G 2 . P a s s w o r d A T T A C H ( A B D A T A , A B D A T A ) A B D A T A . R E W I N D ( T A P E l O ) C O P Y C F ( T A P E 1 0 , T A P E 6 ) R E W I N D ( T A P E 6 ) A T T A C H ( A B C A L , A B C A L ) C A T A L O G ( T A P E 8 , N a m e o f P . F i l e , R P = 1 0 ) R E W I N D ( T A P E 9 ) D I S P O S E , T A P E 9 , P C . < 7 8 9 ) D a t a C a r d s 1 9 . V A R T I M , V A R A B S , N W L C , S R F L A G , I T R I G ( 2 F 1 0 . 9 . 3 I S ) V A R T I M V a r i a n c e o f t i m e m e a s u r e m e n t e r r o r s i n s e c o n d s V A R A B S V a r i a n c e o f a b s o r b a n c e m e a s u r e m e n t e r r o r s o f G r o u p 1 i n a b s o r b a n c e u n i t s . N W L C N u m b e r o f w a v e l e n g t h c h a n n e l s b e i n g c a l i — b r a t e d i n t h i s r u n o f A B C A L 1 5 . 1 6 . 1 7 . 1 8 . * S R F L A G I T R I G N A M E , N U M S ( A 8 , I 6 ) N A M E N U M S 3 3 7 S p i k e R o u t i n e F l a g ( 1 = y e s , 0 - n o ) ( l e a v e b l a n k ) ( = 1 , c o l l e c t i o n t r i g g e r e d f r o m s t o p f l a g , # l , c o l l e c t i o n t r i g g e r e d f r o m a s t a r t f l a g ) N a m e o f e x p e r i m e n t d a t a f i l e o n D E C T A P E N u m b e r o f s a v e - p a g e p a r a m e t e r s f o r t h i s r u n 0 ( S A V P A G E ( K ) , x = 1 , N U M S ) ( 6 x , 1 2 1 6 ) S A V P A G E ( K ) S a v e - p a g e p a r a m e t e r s f o r t h i s k i n e t i c r u n . F L T I M E , P H I L R , T I M S K P , P N S K , S S F D I S , S F P L S D , S T P T I M ( 3 F 6 . 9 , I 6 , 3 F 6 . 9 ) F L T I M E P H I L R * T I M S K P * P N S K S S F D I S S F P L S D S T P T I M F l o w t i m e i n m s e c . ( T 1 i n F i g u r e E . 3 ) P h i l b r i c k g a i n d u r i n g e x p e r i m e n t / P h i l b r i c k g a i n d u r i n g c a l i b r a t i o n s T i m e t o s k i p t o a s s u r e g o o d d a t a ( l e a v e b l a n k ) P o i n t s t o s k i p . ( L e a v e b l a n k . ) D i s t a n c e b e t w e e n s t a r t / s t o p f l a g i n m m ( y i n E q u a t i o n 9 . 1 3 ) S t o p f l a g t o p l u n g e r s t o p i n m m ( x i n E q u a t i o n 9 . 1 3 ) S t o p p i n g t i m e i n m s e c . ( T 9 i n F i g u r e E . 3 ) . M F L A G , K F L A G , L F L A G , N I N C , V M A X , J F L A G , I P D L T ( 9 1 5 , E 1 0 . 9 , M F L A G K F L A G L F L A G N I N C V M A X J F L A G I P D L T I S S 5 X D I 5 ) ( 1 , O R T H P O L a u t o m a t i c a l l y c h o o s e s a l i n e a r f i t ; f 1 , O R T H P O L c o n s i d e r s a d d i n g t e r m s t o t h e l i n e a r f u n c t i o n u p t o 5 ' t h d e g r e e ) ( 1 , O R T H P O L r e q u i r e s 3 2 i n f l e c t i o n s w i t h i n c a l i b r a t i o n r a n g e t o r e j e c t a p o l y n o m i a l ; # 1 , O R T H P O L r e q u i r e s 1 ' 1 i n f l e c t i o n s w i t h i n c a l i b r a t i o n r a n g e t o r e j e c t a p o l y n o m i a l ) . ( l , O R T H P O L c h e c k s f o r i n f l e c t i o n s f r o m s o l v e n t v e r s u s s o l v e n t t o V M A X ; # O R T H P O L c h e c k s f o r i n f l e c t i o n s f r o m s o l v e n t v e r s u s s o l v e n t t o h i g h e s t N . D . c a l i b r a t i o n p o i n t ) . N u m b e r o f i n t e r v a l s i n t o w h i c h i n f l e c t i o n p o i n t s e a r c h r e g i o n i s d i v i d e d . I f L F L A G = 1 , O R T H P O L c h e c k s f o r i n f l e c - t i o n s i n A v e r s u s V f r o m V s o l v e n t t o V m a x ' ( 1 , N o i n f l e c t i o n t e s t i n g i s p e r f o r m e d ; f 1 , i n f l e c t i o n t e s t i n g i s p e r f o r m e d ) . ( = 1 , t h e a b s o r b a n c e v e r s u s t i m e t a b l e s a n d p a r a m e t e r s e s t i m a t e d i n O R T H P O L a r e d e l e c t e d f r o m t h e p r i n t e d o u t p u t , # l , e v e r y t h i n g i s p r i n t e d ) . 1 9 . 2 0 . 2 1 . 2 2 . 2 3 . 3 3 8 N D N A M ( A 8 ) N D N A M N a m e o f C a l i b r a t i o n f i l e o n D E C d a t a t a p e . D a t a D e c k f o r N e u t r a l D e n s i t y F i l t e r C a l i b r a t i o n ( a s i t c o m e s f r o m P D P 8 1 c a r d p u n c h ) F o r e a c h w a v e l e n g t h c h a n n e l : ( A ) C a r d w i t h n u m b e r o f w a v e l e n g t h c h a n n e l s , n u m b e r o f N . D . p o i n t s , e t c . ( t h i s c a r d i s n o t u s e d i n A B C A L , b u t a p p e a r s i n t h e P D P B I c a r d p u n c h d e c k ) . ( B ) ( V O L T ( I ) , I = 1 , # C a l i b r a t i o n p o i n t s ) ( 6 X , 1 2 I 6 ) V O L T ( I ) O u t p u t v o l t a g e o f P h i l b r i c k a m p l i f i e r a s d i g i t i z e d b y t h e i n t e r f a c e f o r e a c h c a l i b r a t i o n p o i n t . F o r e a c h w a v e l e n g t h c h a n n e l ( N D A B S ( I ) , I = l , # o f c a l i b r a t i o n p o i n t s ) ( 6 X , 8 F 6 . 3 ) N D A B S ( I ) A b s o l u t e a b s o r b a n c e s m e a s u r e d o n C a r y 1 7 f o r e a c h c a l i b r a t i o n p o i n t . F o r e a c h w a v e l e n g t h c h a n n e l , ( A ) N U M , N , I S T A R T , I E N D , I A I N F , I S O L V ( 2 1 6 , 2 1 8 , 2 I 6 ) ( B ) ( I D A T A ( I ) , I = 1 , N ) N U M W a v e l e n g t h c h a n n e l n u m b e r N N u m b e r o f T i m e p o i n t s i n t h e k i n e t i c r u n . I S T A R T S t a r t T i m e i n m s e c I E N D F i n a l t i m e i n m s e c I A I N F I n f i n i t y v o l t a g e a t w a v e l e n g t h c h a n n e l N U M . I S O L V S o l v e n t v e r s u s s o l v e n t v o l t a g e a t t h i s w a v e l e n g t h c h a n n e l . ( I f s t o r e d o n t h i s f i l e . ) I D A T A ( I ) D i g i t i z e d v o l t a g e d u r i n g e x p e r i m e n t a t w a v e l e n g t h c h a n n e l N U M i n s p e c t r u m n u m b e r I . ( 7 8 9 ) 3 3 9 D a t a C a r d s f o r A B C A L 2 9 . N N D N N D = n u m b e r o f n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r s ( 1 5 ) p e r w a v e l e n g t h c h a n n e l 2 5 . ( 6 7 8 9 ) * A B C A L w a s a d a p t e d f r o m t h e p r o g r a m A B S T I M . T h e v a r - i a b l e s S R F L A G , T I M S K P a n d P N S K a r e v e s t i g e s f r o m A B S T I M , a n d c a n b e i g n o r e d ( l e f t b l a n k ) . T h e d e c k s t r u c t u r e f o r e x e c u t i n g A B D A T A 2 a n d A B C A L , f o l l o w s . N o t e t h a t o n l y c o n t r o l p a r a m e t e r s a n d f l a g d i s t a n c e s a r e r e a d f r o m c a r d s . E x a m p l e 6 D e c k t h a t E x e c u t e s A B D A T A 2 a n d A B C A L , _ S t o r e s T A P E 8 a s a P e r m a n e n t F i l e a n d P u n c h e s T A P E 9 a s C a r d s f o r K I N F I T C o n t r o l C a r d s 1 P r o b l e m N u m b e r C a r d 2 . J o b C a r d - - - I D N A M E , C M 5 5 0 0 0 , T 2 0 0 , J C 9 5 0 , R G 2 . 3 . P a s s w o r d 9 . A T T A C H ( T A P E l l , N a m e o f E x p e r i m e n t F i l e f r o m 7 t r a c k t a p e ) 5 A T T A C H ( T A P E 1 2 , N a m e o f N . D . F i l e f r o m 7 T r a c k T a p e ) 6 A T T A C H ( T A P E 1 3 , N a m e o f F i l e C o n t a i n i n g T A P E 9 f r o m N D F C A L ) ( I n s e r t C a r d 6 o n l y i f N D F L A G # 1 i n E n t r y # 2 0 b e l o w ) 7 . A T T A C H ( A B D A T A 2 , A B D A T A 2 ) 8 . A B D A T A 2 . 9 . R E W I N D ( T A P E l O ) 1 0 . C O P Y C F ( T A P E 1 0 , T A P E 6 ) 1 1 . R E W I N D ( T A P E 6 ) 1 2 . A T T A C H ( A B C A L , A B C A L ) 1 3 . A B C A L . 1 9 . C A T A L O G ( T A P E 8 , N a m e o f P . F i l e , R P = 1 0 0 ) 1 5 . R E W I N D ( T A P E 9 ) 1 6 . D I S P O S E , T A P E 9 , P C . 1 7 . ( 7 8 9 ) 1 8 . 1 9 . 2 0 . 2 1 . 2 2 . 2 3 . ( 2 9 ) 2 5 . 2 6 . 3 9 0 D a t a C a r d s f o r A B D A T A 2 N A M E D E C T A P E N a m e o f t h e E x p e r i m e n t f i l e ; e . g . , ( A 9 ) G U L A B D . R C . N D N A M E D E C T A P E N a m e o f t h e n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r ( A 9 ) c a l i b r a t i o n f i l e ; e . g . , G U L A A G . R C . ( N O T E : A B D A T A 2 c h e c k s N A M E a n d N D N A M E a g a i n s t t h e D E C T A P E n a m e s s t o r e d a s t h e f i r s t r e c o r d s o f T A P E l l a n d T A P E 1 2 , r e s p e c t i v e l y . I f t h e y d o n o t m a t c h , p r o g r a m e x e c u t i o n s t o p s ) . I T Y P E , N N D , I W L F , N W L C , N D F L A G ( S I S ) I T Y P E ( = 1 , T A P E l l c o n t a i n s a s t a t i c s p e c t r u m , = 2 , T A P E l l c o n t a i n s a f i x e d w a v e l e n g t h e x p e r i m e n t , # 1 o r 2 , T A P E l l c o n t a i n s a s c a n n i n g k i n e t i c e x p e r i m e n t ) N N D N u m b e r o f n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r s i n t h e c a l i b r a t i o n f i l e o n T A P E 1 2 . I W L F W h e n I T Y P E = 2 , I W L F i s t h e w a v e l e n g t h c h a n n e l i n t h e n e u t r a l d e n s i t y c a l i b r a t i o n f i l e o n T A P E 1 2 w h o s e w a v e l e n g t h i s c l o s e s t t o t h e w a v e l e n g t h o f t h e e x p e r i m e n t . N W L C N u m b e r o f w a v e l e n g t h c h a n n e l s i n t h e n e u t r a l d e n s i t y c a l i b r a t i o n f i l e o n T A P E 1 2 . N D F L A G ( = 1 , N - D - f i l t e r a b s o l u t e a b s o r b a n c e s a r e o n T A P E l 3 , # 1 , N . D . f i l t e r a b s o l u t e a b — s o r b a n c e s a r e r e a d f r o m c a r d s ) V A R T I M V A R A B S , S R F L A G , I T R I G ( 2 3 1 0 . A , 2 1 5 ) F L T I M E , P H I L R , T 1 M S K P , P N S K , S S F D I S , S F P L S D , S T P T 1 M ( 3 F 6 . 9 : 1 6 , 3 F 6 . 9 ) M F L A G , K F L A G , L F L A G , N I N C , V M A X , J F L A G , I P D L T ( 9 1 5 , E 1 0 . 9 , 1 5 ; 5 X , 1 5 ) ( N D A B S ( I , J ) , J 1 , N N D ) , I = 1 , N W L C ) ( 8 E 1 0 . 9 ) E n t r y ( 2 9 ) a p p e a r s o n l y i f N D F L A G # 1 N D A B S ( I , J ) A b s o l u t e a b s o r b a n c e o f t h e J ' t h n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r a t t h e I ' t h w a v e l e n g t h c h a n n e l . ( 7 8 9 ) D a t a C a r d f o r A B C A L N N D ( I 5 ) 2 7 . ( 6 7 8 9 ) 3 9 1 A B C A L o u t p u t f i l e T A P E 8 h a s t h e f o l l o w i n g s t r u c t u r e : 1 . N A M E , I C O R ( A 9 , I 5 ) N A M E I C O R D E C T A P E n a m e o f t h e e x p e r i m e n t a l f i l e ; e . g . , G U L A B D . R C A f l a g t h a t i s s e t e q u a l t o z e r o h e r e . ( Z e r o m e a n s t h a t t h e a b s o r b a n c e s h a v e n o t b e e n i n t e r p o l a t e d a c r o s s e a c h s p e c t r u m t o c o r r e s p o n d t o a s i n g l e t i m e a n d h a v e n o t b e e n c o r r e c t e d f o r s c a t t e r e d l i g h t ) ( E n t r i e s 2 , 3 , a n d 9 a p p e a r o n c e f o r e a c h w a v e l e n g t h c h a n n e l i n a s c a n n i n g e x p e r i m e n t o r s t a t i c s p e c t r u m s t a r t i n g w i t h w a v e l e n g t h c h a n n e l 1 . ) 2 . ( N O T E : N U M , N ( 2 I 6 ) N U M W a v e l e n g t h c h a n n e l n u m b e r N N u m b e r o f A b s o r b a n c e s a t w a v e l e n g t h c h a n n e l N U M , n o t c o u n t i n g t h e a b s o r b a n c e o f t h e i n f i n i t y s p e c t r u m . E E I M E ( J ) , V A R T I M , A B S O R B ( J ) , V A ( J ) , = = l , N ) 0 2 0 ) T I M E ( J ) T i m e e l a p s e d s i n c e e n d o f f l u i d f l o w f o r t h e J ' t h s t o r e d p o i n t a t w a v e l e n g t h c h a n n e l N U M ( i n s e c o n d s ) V A R T I M V a l u e e n t e r e d o n a d a t a c a r d i n A B D A T A o r A B D A T A 2 A B S O R B ( J ) A b s o r b a n c e o f t h e J ' t h m e a s u r e m e n t a t w a v e l e n g t h c h a n n e l U M . V A ( J ) V A ( J ) = V A R A B S / ( g n - ) w h e r e g = g r o u p i n g f a c t o r , n = g r o u p n u m b e r i n w h i c h m e a s u r e - m e n t J o c c u r s . T I M I N F , V A R T I M , A I N F I N , V A R I N F ( 9 0 2 0 ) T I M I N F A I N F I N V A R I N F S e t e q u a l t o l x 1 0 6 s e c o n d s A b s o r b a n c e o f c h a n n e l N U M i n t h e f i n i t i t y s p e c t r u m . V A R I N F = V A R A B S / 2 5 6 I f T A P E 1 2 h a s a s t a t i c s p e c t r u m , e n t r y 9 c o n t a i n s m e a n i n g l e s s n u m b e r s . I f T A P E 1 2 h a s a f i x e d w a v e l e n g t h e x p e r i m e n t , e n t r i e s 2 , 3 , a n d 9 o c c u r o n c e e a c h , a n d N U M = 1 ) T A P E 9 o f A B C A L h a s t h e f o l l o w i n g s t r u c t u r e , r e p e a t e d o n c e f o r e a c h w a v e l e n g t h c h a n n e l i n a s c a n n i n g k i n e t i c e x p e r i - m e n t . 3 9 2 1 . N U M ( 1 x , ' W A V E L E N G T H C H A N N E L N U M B E R ' , 1 5 ) 2 . ( T I M E ( J ) , V A R T I M , A B S O R B ( J ) , V A ( J ) , J = 1 , N ) ( 8 E 1 0 . 9 ) 3 . T I M I N F V A R T I M , A I N F I N , V A R I N F ( 8 3 1 0 . 9 ) I n s t e a d o f p u n c h i n g K I N F I T d a t a c a r d s f r o m T A P E 9 , t h e u s e r c a n s t o r e T A P E 9 a s a p e r m a n e n t f i l e o r a s a n A P L I B t a p e f i l e . P 3 ( V ) = ( V w h e r e “ : 1 k N 1 ; ” k § ' - 8 3 a ) P 3 - O = 1 Y 1 < V > / O Z - Y J P J _ 2 , J = = Y l - O P 2 J 1 w ) , l 3 . — 2 1 . . . . , 5 , 2 , . . , 5 A P P E N D I X F S u b r o u t i n e O R T H P O L O R T H P O L i s a s u b r o u t i n e o f t h e p r o g r a m A B C A L ( A p p e n d i x E ) t h a t f i t s a b s o r b a n c e A v e r s u s v o l t a g e V w i t h t h e e q u a - t i o n A = A ( V ) = b P 0 0 + b l P l ( V ) + , . . . , + 6 5 P 5 ( V ) ( F . l ) s u b j e c t t o c e r t a i n r e s t r i c t i o n s r e g a r d i n g i n f l e c t i o n p o i n t s a n d s t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e o f t h e t e r m s . I n E q u a t i o n ( F . l ) P O . . . P 5 a r e o r t h o g o n a l p o l y n o m i a l t e r m s , e a c h w i t h d e g r e e i n V e q u a l t o i t s s u b s c r i p t , a n d b 0 . . . b 5 a r e p a r a m - e t e r s w h o s e v a l u e s a r e t o b e d e t e r m i n e d b y o r d i n a r y l e a s t s q u a r e s e s t i m a t i o n . T h e o r t h o g o n a l p o l y n o m i a l s a r e d e f i n e d b y t h e f o l l o w i n g r e c u r s i o n e q u a t i o n s ( H i m m e l b l a u , 1 9 7 0 ) . Z M " Z M I I 3 9 9 N P 2 ( v ) / 1 3 ’ 1 k k £ 1 2 P j _ 2 ( V k ) , j = 2 , 3 , . . . , 5 Y 3 = k N = n u m b e r o f c a l i b r a t i o n p o i n t s . T h e s e p o l y n o m i a l s h a v e t h e o r t h o g o n a l i t y p r o p e r t y 1 P J ( V k ) P i ( V k ) = 0 , i ¢ j f o r 1 , j = 0 , l , . . . , 5 . ( A . 2 ) k T h e u s e o f o r t h o g o n a l p o l y n o m i a l s g i v e s a s i m p l e e q u a - t i o n f o r e s t i m a t i n g e a c h b i n E q u a t i o n ( 9 . 1 ) . J N N A - 2 - N o t e t h a t S J d e p e n d s o n l y o n t h e v a l u e s o f A a n d P J f o r t h e N c a l i b r a t i o n p o i n t s . . T h i s m e a n s t h a t t h e p a r a m e t e r s a r e c o m p l e t e l y u n c o u p l e d ; c o v ( b 1 , b J ) = 0 , i f i # j , ( s e e A p p e n d i x C ) . T h e e s t i m a t e d v a r i a n c e o f e a c h b i s J N 2 v a r ( b j ) = R L S / [ ( N - M ) k é l P J ( V k ) ] w h e r e M i s t h e n u m b e r o f p o l y n o m i a l t e r m s b e i n g u s e d , a n d w h e r e R L s i s t h e l e a s t s q u a r e s l o s s f u n c t i o n d e f i n e d b y 3 9 5 T h e a d v a n t a g e o f o r t h o g o n a l p o l y n o m i a l s i s t h a t w e c a n a d d a n d d r o p t e r m s i n E q u a t i o n ( F . 1 ) w i t h o u t r e e s t i m a t i n g t h e r e m a i n i n g t e r m s . F o l l o w i n g i s a s u m m a r y o f t h e p r o - c e d u r e i n O R T H P O L f o r d e t e r m i n i n g w h a t p o l y n o m i a l t e r m s t o u s e i n E q u a t i o n ( F . 1 ) . L e t t h e p a r a m e t e r s b e w r i t t e n a s a v e c t o r b T = ( b l ’ b 2 , o o a ’ b 5 ) o O R T H P O L d e t e r m i n e s 8 o n c e . I t t h e n a s s u m e s t h a t t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n A a n d V i s a t l e a s t o f f i r s t d e g r e e i n V . T h u s 8 0 a n d 8 1 a r e a l w a y s i n c l u d e d i n t h e e q u a t i o n . I t t h e n c o n s i d e r s a d d i n g a t h i r d t e r m f r o m t h o s e t h a t r e m a i n . ( l ; § ; s f r o m 8 2 , 8 3 , 8 u , a n d 8 5 ) . I t d e t e r m i n e s w h i c h t e r m , w h e n a d d e d t o E q u a t i o n ( 9 . 1 ) , g i v e s t h e g r e a t e s t i m p r o v e m e n t o f t h e f i t . T h e b e s t n e w t e r m i s n o t a u t o - m a t i c a l l y u s e d , h o w e v e r . I t m u s t p a s s t w o t e s t s . F i r s t a n F t e s t i s p e r f o r m e d t o d e t e r m i n e i f t h e i m p r o v e m e n t o f t h e f i t i s s i g n i f i c a n t a t t h e 9 5 % c o n f i d e n c e l e v e l . T h e F s t a t i s t i c i s d e f i n e d b y t h e e q u a t i o n F E [ R L S ( q ) - R L S ( q + l ) ] / [ R L S ( q + l ) ( N - q - l ) 1 w h e r e R L S ( q ) a n d R L S ( q + l ) a r e t h e o r d e r i n g l e a s t s q u a r e s l o s s f u n c t i o n s f o r q a n d ( q + 1 ) p a r a m e t e r s , r e s p e c t i v e l y . I f a l l c a l i b r a t i o n p o i n t s h a v e u n i f o r m v a r i a n c e n o r m a l l y d i s t r i b u t e d r a n d o m m e a s u r e m e n t e r r o r s w i t h e x p e c t a t i o n 3 9 6 v a l u e 0 , t h e n F h a s t h e F ( l , N - q - l ) d i s t r i b u t i o n . T h e n e w t e r m p a s s e s f i r s t t e s t o n l y i f F . Z F ( l , N — q - l ) , i n w h i c h c a s e t h e n e w t e r m i s s i g n i f i c a n t a t t h e 9 5 % c o n f i d e n c e l e v e l . T h e s e c o n d t e s t i s a s e a r c h f o r i n f l e c t i o n p o i n t s i n A v e r s u s V o v e r t h e r a n g e o f t h e c a l i b r a t i o n d a t a . I f t h e d e g r e e o f t h e p o l y n o m i a l i s l e s s t h a n 3 t h e r e i s n o n e e d t o t e s t f o r i n f l e c t i o n s . I f t h e p o l y n o m i a l p a s s e s t h e i n f l e c t i o n t e s t ( 1 1 2 ; : n o i n f l e c t i o n s a r e f o u n d ) O R T H P O L c o n s i d e r s a d d i n g y e t a n o t h e r t e r m . T h u s , O R T H P O L r e t u r n s t o t h e p o i n t i n t h e l o o p w h e r e a n o t h e r t e r m i s a d d e d . I f t h e p o l y n o m i a l f a i l s t h e i n f l e c t i o n t e s t , O R T H P O L d r o p s t h e t e r m i t w a s c o n s i d e r i n g a n d t e s t s t h e n e x t b e s t t e r m . T h e f i n a l e q u a t i o n i s c h o s e n w h e n e i t h e r t h e l i s t o f t e r m s t o b e a d d e d h a s b e e n e x h a u s t e d o r t h e e q u a t i o n h a s o n e l e s s p a r a m e t e r t h a n t h e n u m b e r o f e x p e r i — m e n t a l p o i n t s . T e s t s 1 a n d 2 a s s u r e t h a t : l . T h e t e r m s i n t h e f i n a l e q u a t i o n a r e s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t a t t h e 9 5 % c o n f i d e n c e l e v e l ; a n d 2 . T h e r e a r e n o u n w a n t e d i n f l e c t i o n p o i n t s i n t h e f i n a l e q u a t i o n . O n p o i n t 2 a b o v e , O R T H P O L h a s f l a g s w i t h w h i c h t h e u s e r c a n d e c i d e t o r e j e c t p o l y n o m i a l s w i t h o n l y o n e i n f l e c t i o n p o i n t , m o r e t h a n o n e i n f l e c t i o n p o i n t , o r t o b y p a s s t h e i n f l e c t i o n t e s t a l t o g e t h e r . T h e f l a g s a r e : M F L A G K F L A G L F L A G N I N C V M A X J F L A G 3 9 7 ( l , O R T H P O L a u t o m a t i c a l l y c h o o s e s a l i n e a r f i t ; # 1 , O R T H P O L c o n s i d e r s a d d i n g t e r m s t o t h e l i n e a r f u n c t i o n u p t o 5 ' t h d e g r e e ) . ( 1 , O R T H P O L r e q u i r e s 3 2 i n f l e c t i o n s w i t h i n c a l i b r a t i o n r a n g e t o r e j e c t a p o l y n o m i a l ; # l , O R T H P O L r e q u i r e s 1 l i n f l e c t i o n s w i t h i n c a l i b r a t i o n r a n g e t o r e j e c t a p o l y n o m i a l ) . ( l , O R T H P O L c h e c k s f o r i n f l e c t i o n s f r o m s o l - v e n t v e r s u s s o l v e n t t o V M A X ; # l , O R T H P O L c h e c k s f o r i n f l e c t i o n s f r o m s o l v e n t v e r s u s s o l v e n t t o h i g h e s t N . D . c a l i b r a t i o n p o i n t ) . N u m b e r o f d i v i s i o n s i n t o w h i c h i n f l e c t i o n p o i n t s e a r c h i s d i v i d e d . I f L F L A G = l , O R T H P O L c h e c k s f o r i n f l e c t i o n s i n A v e r s u s V f r o m V s o l v e n t t o v m a x ' ( 1 , N o i n f l e c t i o n t e s t i n g i s p e r f o r m e d ; # l , i n f l e c t i o n t e s t i n g i s p e r f o r m e d ) . A P P E N D I X G D o c u m e n t a t i o n o f P r i n c i p a l C o m p o n e n t C o m p u t e r P r o g r a m s T h i s A p p e n d i x g i v e s i n s t r u c t i o n s f o r u s i n g t h e c o m - p u t e r p r o g r a m s w i t h w h i c h t h e p r i n c i p a l c o m p o n e n t c a l c u l a - t i o n s i n C h a p t e r 9 w e r e p e r f o r m e d . T h e s e p r o g r a m s a r e w r i t t e n i n F O R T R A N I V t o r u n o n t h e C D C 6 5 0 0 c o m p u t e r a t M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y . T h e f o l l o w i n g t e n p r o g r a m s w e r e u s e d t o p e r f o r m t h e c a l c u l a t i o n s i n C h a p t e r 9 : l . I N T E R P — C o r r e c t s a b s o r b a n c e - w a v e l e n g t h c h a n n e l - t i m e d a t a f r o m A B C A L ( A p p e n d i x E ) f o r t h e f i n i t e s c a n s p e e d o f t h e m o n o c h r o m a t o r . I N T E R P c a n a l s o u s e c u t o f f f i l t e r d a t a t o c o r r e c t a b s o r b a n c e s i n t h e u l t r a v i o l e t r a n g e f o r s c a t t e r e d v i s i b l e l i g h t . 2 . W E I G H T S - E s t i m a t e s f r o m a s c a n n i n g e x p e r i m e n t t h a t h a s n o r e a c t i o n o c c u r r i n g a n d n o s p e c t r a l a v e r a g i n g t h e s t a n d a r d d e v i a t i o n o f t h e r a n d o m a b s o r b a n c e m e a s u r e - m e n t e r r o r s a t e a c h w a v e l e n g t h c h a n n e l . 3 . R E S O L V l - S e l e c t s f r o m a n A B C A L o r I N T E R P o u t p u t f i l e t h e a b s o r b a n c e - w a v e l e n g t h c h a n n e l - t i m e d a t a t h a t i s t o b e u s e d i n a p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s , r e a d s p r i n - c i p a l c o m p o n e n t w a v e l e n g t h a n d t i m e w e i g h t s f r o m c a r d s , s e t s u p t h i s i n f o r m a t i o n f o r t h e s o l u t i o n o f t h e e i g e n v a l u e 3 9 8 3 9 9 e q u a t i o n s i n R E S O L V 2 , a n d p r o v i d e s t h r e e - d i m e n s i o n a l p l o t t i n g f i l e s o f t h e m a t r i x A a n d ( 5 , - E ) f o r t h e s e l e c t e d w a v e l e n g t h s a n d t i m e s . 9 . R E S O L V 2 - R e a d s f r o m t h e o u t p u t f i l e o f R E S O L V l t h e a b s o r b a n c e s a n d w e i g h t s f o r t h e s e l e c t e d w a v e l e n g t h s a n d t i m e s , a n d s o l v e s t h e e i g e n v a l u e e q u a t i o n f o r w e i g h t e d M a n a l y s i s o r w e i g h t e d 8 a n a l y s i s , d e p e n d i n g o n t h e v a l u e o f a f l a g . R E S O L V 2 l i s t s t h e e i g e n v a l u e s a n d t h e m e a n o f t h e n o n e s s e n t i a l e i g e n v a l u e s . T h e o u t p u t f i l e o f R E S O L V 2 c o n t a i n s t h e a b s o r b a n c e s , w e i g h t s , e i g e n v a l u e s , a n d e i g e n — v e c t o r s f o r t h e p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s . T h e o u t p u t f i l e o f R E S O L V 2 i s a n i n p u t f i l e i n p r o g r a m s t h a t u s e t h e s e e i g e n v e c t o r s a n d e i g e n v a l u e s . 5 . R E S O L V 3 - C o m p u t e s f r o m t h e i n f o r m a t i o n o n t h e o u t p u t f i l e o f R E S O L V 2 t h e f u n c t i o n Q r / ( N - r ) ( p - r ) f o r r = l , 2 , . . . , 7 . R E S O L V 3 l i s t s t h i s f u n c t i o n b y i n d i v i d u a l w a v e l e n g t h c h a n n e l s a n d f o r a l l o f t h e w a v e l e n g t h c h a n n e l s . R E S O L V 3 a l s o p r o v i d e s f i l e s f o r t h r e e - d i m e n s i o n a l p l o t t i n g o f A ( r ) ’ ( E ( r ) - E ) , o r w e i g h t e d r e s i d u a l s f o r r = l , 2 , 3 , 9 , a n d n , w h e r e n i s s e l e c t e d b y t h e u s e r . 6 . R E S O L V 9 - C o m p u t e s f r o m t h e i n f o r m a t i o n i n t h e o u t p u t f i l e o f R E S O L V 2 t h e p o i n t - b y - p o i n t v a l u e s o f A ( r ) a n d t h e w e i g h t e d r e s i d u a l s f o r s e l e c t e d w a v e l e n g t h c h a n n e l s a n d v a l u e s o f r . T h e u s e r h a s t h e o p t i o n t o o b t a i n l i n e p r i n t e r p l o t s o f A ( r ) a n d A _ v e r s u s s p e c t r u m n u m b e r a n d / o r w e i g h t e d r e s i d u a l s v e r s u s s p e c t r u m n u m b e r f o r t h e s e l e c t e d w a v e l e n g t h c h a n n e l s . 3 5 0 7 . S T A T I C - P e r f o r m s a n M o r S a n a l y s i s f i t o f a p r o p o s e d s t a t i c s p e c t r u m t o t h e e i g e n v e c t o r s a n d e i g e n - v a l u e s f r o m t h e o u t p u t f i l e o f R E S O L V 2 . 8 . G O N G - P e r f o r m s a n M a n a l y s i s f i t o f a p r o p o s e d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e t o t h e e i g e n v e c t o r s a n d e i g e n v a l u e s f r o m t h e o u t p u t f i l e o f R E S O L V 2 . 9 . L I M I T 2 - C o m p u t e s f r o m t h e i n f o r m a t i o n i n t h e o u t p u t f i l e o f R E S O L V 2 t h e s o l u t i o n b a n d s f o r t h e n o r m a l i z e d s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f a t w o - a b s o r b e r e x p e r i m e n t o r a t w o - a b s o r b e r s u b s p a c e o f a n e x p e r i m e n t . 1 0 . R E S O L V 6 — R e a d s f r o m c a r d s e i t h e r t h e c o m p l e t e ( m x m ) r o t a t i o n m a t r i x Q o r t h e c o m p l e t e ( m x m ) r o t a t i o n m a t r i x V : R E S O L V 6 t h e n c o m p u t e s V _ f r o m U , o r g f r o m V , a n d t h e s t a t i c s p e c t r a a n d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f t h e m l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r s . T h e i n s t r u c t i o n s f o r u s i n g t h e s e t x n l p r o g r a m s f o l l o w s . I N T E R P I N T E R P u s e s , i n a d d i t i o n t o d a t a c a r d s , t w o i n p u t f i l e s , c a l l e d T A P E 1 0 a n d T A P E l l . T A P E 1 0 c o n t a i n s t h e c a l i b r a t e d a b s o r b a n c e s a n d t i m e s f o r t h e s c a n n i n g e x p e r i m e n t t h a t i s t o b e c o r r e c t e d . T A P E l l c o n t a i n s t h e c a l i b r a t e d a b s o r - b a n c e s a n d t i m e s f o r a s c a n n i n g e x p e r i m e n t w i t h t h e s a m e c o n d i t i o n s a s t h e s c a n n i n g e x p e r i m e n t t h a t i s t o b e c o r - r e c t e d , b u t w i t h a c u t o f f f i l t e r t h a t a b s o r b s u l t r a v i o l e t l i g h t i n s e r t e d i n t h e s a m p l e o p t i c a l p a t h . B o t h T A P E 1 0 a n d ‘ T A P E l l c o m e f r o m t h e o u t p u t f i l e T A P E 8 o f t h e c a l i - b r a t i o n p r o g r a m A B C A L ( s e e A p p e n d i x E ) . 3 5 1 I N T E R P h a s o n e o u t p u t f i l e c a l l e d T A P E 1 2 , t h a t h a s t h e c o r r e c t e d a b s o r b a n c e - w a v e l e n g t h c h a n n e l - t i m e d a t a i n t h e f o l l o w i n g f o r m a t , w h i c h i s s i m i l a r t o t h e f o r m a t o f T A P E 8 f r o m A B C A L : 1 . N A M E , K F L A G , N A M C O R ( A 9 , 1 5 , A 9 ) N A M E - t h e D E C T A P E n a m e o f t h e e x p e r i m e n t a l f i l e t h a t h a s b e e n c o r r e c t e d . K F L A G — ( = 1 i f t h e d a t a i s c o r r e c t e d o n l y f o r f i n i t e s c a n s p e e d ; = 2 i f d a t a i s a l s o c o r r e c t e d f o r s c a t t e r e d l i g h t ) . N A M C O R - t h e D E C T A P E n a m e o f t h e e x p e r i m e n t a l f i l e t h a t c o n t a i n s t h e c u t o f f f i l t e r i n f o r m a t i o n u s e d t o c o r r e c t f o r s c a t t e r e d l i g h t . ( E n t r i e s 2 a n d 3 a p p e a r o n c e f o r e a c h w a v e l e n g t h c h a n n e l ) 2 . I , N N ( 2 1 6 ) I - w a v e l e n g t h c h a n n e l n u m b e r N N — n u m b e r o f c o n s e c u t i v e s p e c t r a ( n o t i n c l u d i n g t h e i n f i n i t y s p e c t r u m . 3 . T C O R ( J ) , A C O R ( I , J ) , J = 1 , N ( 0 2 0 , 2 0 x , 0 2 0 ) T C O R ( J ) — c o r r e c t e d t i m e o f t h e J ' t h c o n s e c u t i v e s p e c t r u m A C O R ( I , J ) - c o r r e c t e d a b s o r b a n c e a t c h a n n e l I i n t h e J ' t h s p e c t r u m . T h e f o l l o w i n g i n p u t d e c k e x e c u t e s I N T E R P : C o n t r o l C a r d s 1 . A T T A C H ( T A P E l O , E x p e r i m e n t f i l e t o b e c o r r e c t e d ) 2 . A T T A C H ( T A P E l l , E x p e r i m e n t f i l e w i t h c u t o f f f i l t e r ) 3 . A T T A C H ( I N T E R P , I N T E R P ) 9 . I N T E R P . 5 . C A T A L O G ( T A P E 1 2 , p f n a m e ) D a t a C a r d s 1 . N W L C , 1 C U T , N W L C O R ( 3 1 5 ) N W L C — n u m b e r o f w a v e l e n g t h c h a n n e l s i n t h e s c a n - i n g e x p e r i m e n t . I C U T - ( = 0 i f e x p e r i m e n t i s n o t t o b e c o r r e c t e d f o r s c a t t e r e d l i g h t ; = 1 i f e x p e r i m e n t i s t o b e c o r r e c t e d f o r s c a t t e r e d l i g h t ) N W L C O R - n u m b e r o f w a v e l e n g t h c h a n n e l s s t a r t i n g w i t h c h a n n e l 1 t h a t a r e t o b e c o r r e c t e d f o r s c a t t e r e d l i g h t i f I C U T = l . 2 . A F I L T ( I ) , 1 = 1 , N W L C O R ( 1 0 X , E 1 0 . 9 ) A F I L T ( I ) — a b s o r b a n c e o f t h e c u t o f f f i l t e r a t w a v e l e n g t h c h a n n e l I . W E I G H T S W E I G H T S r e q u i r e s a n i n p u t f i l e c a l l e d T A P E 9 , w h i c h i s t h e o u t p u t f i l e T A P E 8 f r o m A B C A L o f a s c a n n i n g e x p e r i m e n t w i t h n o r e a c t i o n o c c u r r i n g a n d w i t h n o s p e c t r a l a v e r a g i n g ( g r o u p i n g f a c t o r = 1 ) . T h e u s e r s p e c i f i e s N W L C , t h e n u m b e r o f w a v e l e n g t h c h a n n e l s i n t h e e x p e r i m e n t . T h e f o l l o w i n g i n p u t d e c k e x e c u t e s W E I G H T S : 3 5 3 C o n t r o l C a r d s 1 . A T T A C H ( T A P E 9 , T A P E 8 f r o m A B C A L ) 2 . A T T A C H ( W E I G H T S , W E I G H T S ) 3 . W E I G H T S . D a t a C a r d s 1 . N W L C ( 1 5 ) R E S O L V I I n a d d i t i o n t o d a t a c a r d s , R E S O L V l r e q u i r e s a n i n p u t f i l e c a l l e d T A P E 9 , w h i c h c o n t a i n s t h e a b s o r b a n c e — w a v e l e n g t h c h a n n e l - t i m e d a t a f o r a s c a n n i n g e x p e r i m e n t , a n d c o m e s f r o m e i t h e r T A P E 1 2 o f I N T E R P o r f r o m T A P E 8 o f A B C A L ( i f a b s o r b a n c e i s n o t c o r r e c t e d b y I N T E R P ) . R E S O L V l p r e p a r e s t h e a b s o r b a n c e d a t a f r o m s e l e c t e d w a v e l e n g t h c h a n n e l s a n d s p e c t r a f o r t h e s o l u t i o n o f t h e e i g e n v a l u e p r o b l e m i n R E S O L V 2 . T h e u s e r s p e c i f i e s o n d a t a c a r d s t h e s e l e c t e d w a v e l e n g t h c h a n n e l s a n d s p e c t r a a n d a s s i g n s v a l u e s f o r t h e w a v e l e n g t h a n d t i m e w e i g h t s . T h e i n p u t v a r i a b l e s a r e a s f o l l o w s : N W L C - n u m b e r o f w a v e l e n g t h c h a n n e l s i n t h e c o m p l e t e e x p e r i m e n t . N O P C A - n u m b e r o f p r i n c i p a l c o m p o n e n t c a l c u l a t i o n s t o b e s e t u p i n t h i s r u n o f R E S O L V l . ( A s o r i g i n a l l y p r o - g r a m m e d , N O P C A c o u l d b e g r e a t e r t h a n o n e . H o w e v e r , a s p r e s e n t l y p r o g r a m m e d , N O P C A s h o u l d a l w a y s b e a s s i g n e d t h e v a l u e 1 ) . K I N F - ( = 0 , i n p u t d a t a o n T A P E 9 i n c l u d e t h e i n f i n i t y s p e c t r u m ; = 1 , i n p u t d a t a o n T A P E 9 d o n o t i n c l u d e t h e 3 5 9 i n f i n i t y s p e c t r u m ) . ( A s p r e s e n t l y p r o g r a m m e d , T A P E 8 o f A B C A L a n d T A P E 1 2 o f I N T E R P i n c l u d e t h e i n f i n i t y s p e c t r u m , s o t h a t K I N F = 0 s h o u l d b e u s e d . ) W L ( I ) , I = 1 , N W L C - t h e w a v e l e n g t h w e i g h t f o r t h e I ' t h w a v e l e n g t h c h a n n e l ; 1 1 2 ; : W L ( I ) = L 1 , W T ( J ) , J = 1 , N - t h e t i m e w e i g h t f o r t h e J ' t h c o n s e c u t i v e s p e c t r u m ; i ; g ; , W T ( J ) = T J . N i s t h e n u m b e r o f c o n s e c u - t i v e s p e c t r a i n t h e c o m p l e t e e x p e r i m e n t , i n c l u d i n g t h e i n f i n i t y s p e c t r u m i f K I N F = 0 . N W - n u m b e r o f w a v e l e n g t h c h a n n e l s t o b e u s e d f o r t h e p r i n c i p a l c o m p o n e n t c a l c u l a t i o n . N T - n u m b e r o f s p e c t r a t o b e u s e d f o r t h e p r i n c i p a l c o m p o n e n t c a l c u l a t i o n . L A M ( I ) , I = 1 , N W - L A M ( I ) i s t h e w a v e l e n g t h c h a n n e l f r o m t h e c o m p l e t e e x p e r i m e n t t h a t b e c o m e s t h e I ' t h w a v e l e n g t h c h a n n e l u s e d i n t h e p r i n c i p a l c o m p o n e n t c a l c u l a t i o n . I f N W = N W L C a l l w a v e l e n g t h c h a n n e l s a r e s e l e c t e d f o r t h e p r i n c i p a l c o m p o n e n t c a l c u l a t i o n a n d t h e L A M ( I ) a r r a y n e e d n o t b e s p e c i f i e d b y t h e u s e r . H o w e v e r , i f N W < N W L C , t h e u s e r d e t e r m i n e s w h i c h w a v e l e n g t h c h a n - n e l s a r e s e l e c t e d b y s p e c i f y i n g t h e L A M ( I ) a r r a y . F o r e x a m p l e , i f N W L C = 5 0 , N W I S , a n d t h e w a v e l e n g t h c h a n n e l s 9 6 - 5 0 o f t h e c o m p l e t e e x p e r i m e n t a r e t o b e u s e d f o r t h e p r i n c i p a l c o m p o n e n t c a l c u l a t i o n , t h e u s e r s p e c i f i e s L A M ( 1 ) = 9 6 , L A M ( 2 ) = 9 7 , L A M ( 3 ) = 9 8 , L A M ( 9 ) = 9 9 , a n d L A M ( 5 ) = 5 0 . I n s u b s e q u e n t p r o g r a m s w a v e l e n g t h c h a n n e l 1 i n 3 5 5 t h e p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s w i l l c o r r e s p o n d t o w a v e l e n g t h c h a n n e l 9 6 i n t h e c o m p l e t e e x p e r i m e n t . I T I M E ( J ) , J = 1 , N T - I T I M E ( J ) i s t h e s p e c t r u m f r o m t h e c o m p l e t e e x p e r i m e n t t h a t b e c o m e s t h e J ' t h s p e c t r u m u s e d i n t h e p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s . 1 T 1 M E ( J ) i s t r e a t e d a n a l o g o u s l y t o L A M ( I ) . T h u s , t h e I T I M E a r r a y i s s p e c i f i e d b y t h e u s e r o n l y i f N T < N . R E S O L V l h a s t h r e e o u t p u t f i l e s c a l l e d T A P E 1 0 , T A P E l l , a n d T A P E 1 2 . T A P E 1 0 c o n t a i n s t h e d a t a f o r s o l v i n g t h e e i g e n v a l u e e q u a t i o n i n R E S O L V 2 . T h e s t r u c t u r e o f T A P E - 1 0 i s a s f o l l o w s : \ O C D N O N U I K U U N H T A P E 1 1 N A M E ( A 9 ) N A M C O R ( A 9 ) N O P C A ( 1 5 ) N W , N T ( 2 1 5 ) L A M ( I ) , I = 1 , N W ( 1 6 1 5 ) I T I M E ( J ) , J = 1 , N T ( 1 6 1 5 ) W L ( L A M ( I ) ) 1 - 1 , N w ( 6 0 2 0 ) W T ( I T I M E ( J ) ) , J = 1 , N T ( 6 0 2 0 ) A ( L A M ( 1 ) , I T I M E ( J ) ) . J = 1 , N T ( 6 0 2 0 ) ( f o r e a c h c h a n n e l , I = 1 , N W c o n t a i n s t h e e x p e r i m e n t a l d a t a A f o r s u b s e q u e n t t h r e e d i m e n s i o n a l p l o t t i n g . T A P E l l h a s , f o r e a c h w a v e l e n g t h c h a n - n e l I = 1 , N W , A ( L A M ( I ) , I T I M E ( J ) ) , J = 1 , N T ( 9 0 2 0 ) . T A P E 1 2 c o n t a i n s t h e e x p e r i m e n t a l d a t a m a t r i x ( A ’ - E ) f o r s u b s e q u e n t t h r e e d i m e n s i o n a l p l o t t i n g . T A P E 1 2 h a s f o r e a c h w a v e l e n g t h c h a n n e l I = 1 , N W . A ( L A M ( I ) , I T I M E ( J ) ) - A V E ( L A M ( I ) ) , J = 1 , N T ( 9 0 2 0 ) 3 5 6 T h e f o l l o w i n g i n p u t d e c k e x e c u t e s R E S O L V l : C o n t r o l C a r d s 1 . A T T A C H ( T A P E 9 , T A P E 8 f r o m A B C A L o r T A P E 1 2 f r o m I N T E R P ) 2 . A T T A C H ( R E S O L V 1 , R E S O L V 1 ) 3 . R E S O L V l . 9 . C A T A L O G ( T A P E 1 0 , a n a m e ) 5 . C A T A L O G ( T A P E l l , a n a m e ) 6 . C A T A L O G ( T A P E l 2 , a n a m e ) D a t a C a r d s . T w o c a r d s w i t h m e s s a g e s f o r o u t p u t ( 9 0 A 2 ) . N W L C , N O P C A , K I N F ( 8 E 1 0 . 9 ) . W L ( I ) , I = 1 , N W L C ( 8 E 1 0 . 9 ) . W T ( J ) , J = 1 , N ( 8 E 1 0 . 9 ) . N W , N T ( 2 1 5 ) . L A M ( I ) , I = 1 , N W ( 1 6 1 5 ) y 6 d o e s n o t a p p e a r i f N W = N W L C ) I T I M E ( J ) , J = 1 , N T ( 1 6 1 5 ) ( E n t r y 7 d o e s n o t a p p e a r i f N T = N ) R E S O L V 2 R E S O L V 2 r e q u i r e s a n i n p u t d a t a f i l e c a l l e d T A P E l 3 , w h i c h i s t h e o u t p u t f i l e T A P E 1 0 f r o m R E S O L V l . T h e u s e r d e t e r m i n e s w h e t h e r R E S O L V 2 p e r f o r m s a n M o r 8 a n a l y s i s b y s e t t i n g t h e v a l u e o f a f l a g v a r i a b l e c a l l e d I F L A G . I f I F L A G = 1 , a n M a n a l y s i s i s p e r f o r m e d , a n d i f I F L A G = 0 , a n S a n a l y s i s i s p e r f o r m e d . R E S O L V 2 p r o d u c e s a n o u t p u t f i l e c a l l e d T A P E 1 9 , w h i c h c o n t a i n s t h e a b s o r b a n c e d a t a , t h e w e i g h t s , a n d t h e M o r S a n a l y s i s e i g e n v e c t o r s . T A P E 1 9 i s a n i n p u t d a t a f i l e f o r e a c h p r o g r a m t h a t u s e s t h e M o r S a n a l y s i s e i g e n v e c — t o r s . T h e s t r u c t u r e o f T A P E 1 9 f o l l o w s : H C N W ‘ . I I I - l ' . O U O m N O D C O \ 3 5 7 N A M E ( A 9 ) N A M C O R ( A 9 ) N W , N T , I F L A G ( 3 1 5 ) L A M ( I ) , I = 1 , N W ( 1 6 1 5 ) I T I M E ( J ) , J = 1 , N T ( 1 6 1 5 ) W L ( I ) , I = 1 , N W ( 6 0 2 0 ) W T ( J ) , J = 1 , N T ( 6 0 2 0 ) A ( I , J ) , J = 1 , N T , I = 1 , N W ( 6 0 2 0 ) B ( I , J ) , J = 1 , N T , I = 1 , N W ( 6 0 2 0 ) ( I f I F L A G = 1 , t h e n B ( I , J ) i s t h e I , J ' t h e l e m e n t o f g ; i f I F L A G = 0 , t h e n B ( I , J ) i s t h e I , J ' t h e l e m e n t o f B . ) 1 0 . E I G ( I ) , I = 1 , N W ( 6 0 2 0 ) ( T h e B I G a r r a y c o n t a i n s t h e M o r S a n a l y s i s e i g e n v a l u e s , d e p e n d i n g o n t h e v a l u e o f I F L A G . ) 1 1 . A V E ( 1 ) , I = 1 , N W ( 6 0 2 0 ) ( A V E ( I ) = 0 . 0 i f I F L A G = 1 ; A V E ( I ) i s t h e a v e r a g e a b s o r b a n c e a t w a v e l e n g t h c h a n n e l I i f I F L A G = 0 . ) T h e f o l l o w i n g i n p u t d e c k e x e c u t e s R E S O L V 2 : C o n t r o l C a r d s 1 2 3 9 . A T T A C H ( T A P E 1 3 , T A P E 1 0 f r o m R E S O L V l ) . A T T A C H ( R E S O L V 2 , R E S O L V 2 ) . R E S O L V 2 . . C A T A L O G ( T A P E 1 9 , a n a m e ) D a t a C a r d s 1 . T w o c a r d s w i t h m e s s a g e s f o r o u t p u t ( 9 0 A 2 ) 2 . I F L A G ( 1 5 ) R E S O L V 3 R E S O L V 3 r e q u i r e s a n i n p u t f i l e c a l l e d T A P E 1 2 , w h i c h i s t h e o u t p u t f i l e T A P E 1 9 f r o m R E S O L V 2 . R E S O L V 3 h a s f i v e o u t p u t f i l e s w h i c h c o n t a i n t h e r e c o n s t r u c t e d a b s o r b a n c e d a t a i n a f o r m a t f o r t h r e e d i m e n s i o n a l p l o t t i n g . T h e s e f i l e s a r e a s f o l l o w s : 3 5 8 T A P E l — o n e e i g e n v e c t o r r e c o n s t r u c t i o n T A P E 2 — t w o e i g e n v e c t o r r e c o n s t r u c t i o n T A P E 3 - t h r e e e i g e n v e c t o r r e c o n s t r u c t i o n T A P E 9 — f o u r e i g e n v e c t o r r e c o n s t r u c t i o n T A P E S - K Q e i g e n v e c t o r r e c o n s t r u c t i o n , w h e r e K Q i s s e t b y t h e u s e r T h e t y p e o f s u r f a c e r e p r e s e n t e d i n t h e s e f i l e s i s d e t e r m i n e d b y t h e f l a g v a r i a b l e J P L O T , w h i c h i s s e t b y t h e u s e r . I f J P L O T = 0 , t h e r e c o n s t r u c t e d a b s o l u t e a b - s o r b a n c e A ( r ) i s r e p r e s e n t e d . I f J P L O T = 1 , t h e r e c o n s t r u c t - e d d i f f e r e n c e s u r f a c e E ( r ) - E ’ i s r e p r e s e n t e d , a n d i f J P L O T = 2 , t h e r e s i d u a l s u r f a c e A ( r ) - A i s r e p r e s e n t e d . E a c h o u t p u t f i l e h a s t h e f o r m a t X ( I , J ) , J = 1 , N T , I = 1 , N W ( 9 0 2 0 ) w h e r e X i s t h e a p p r o p r i a t e m a t r i x f o r t h e s u r f a c e d e s i g - n a t e d b y t h e v a l u e o f J P L O T . T h e f o l l o w i n g i n p u t d e c k e x e c u t e s R E S O L V 3 : C o n t r o l C a r d s 1 . A T T A C H ( T A P E 1 2 , T A P E 1 9 f r o m R E S O L V 2 ) 2 . A T T A C H ( R E S O L V 3 , R E S O L V 3 ) 3 . R E S O L V 3 . D a t a C a r d s 1 . T w o c a r d s w i t h m e s s a g e s f o r o u t p u t ( 9 0 A 2 ) 2 . J P L O T , K Q ( 2 1 5 ) R E S O L V 9 R E S O L V 9 r e q u i r e s t h e i n p u t f i l e T A P E l l , w h i c h i s t h e o u t p u t f i l e T A P E 1 9 o f R E S O L V 2 . B y a s s i g n i n g v a l u e s f o r 3 5 9 t h e f o l l o w i n g i n p u t v a r i a b l e s , t h e u s e r d e t e r m i n e s t h e w a v e l e n g t h c h a n n e l s a n d n u m b e r o f e i g e n v e c t o r s f o r w h i c h R E S O L V 9 c o m p u t e s t h e r e c o n s t r u c t e d a b s o r b a n c e s a n d r e - s i d u a l s . N C P - t h e n u m b e r o f w a v e l e n g t h c h a n n e l s f o r w h i c h r e c o n s t r u c t e d a b s o r b a n c e s a n d r e s i d u a l s a r e t o b e c o m p u t e d ( N C P 1 N W ) . N C A S E - t h e n u m b e r o f c a s e s t o b e s h o w n f o r e a c h o f t h e N C P w a v e l e n g t h c h a n n e l s . E a c h c a s e c o r r e S p o n d s t o a c e r t a i n n u m b e r o f e i g e n v e c t o r s , s p e c i f i e d b e l o w . J F L A G - ( = 0 , n o t w o d i m e n s i o n a l p l o t s ; = 1 , c a l c u l a t e d a n d e x p e r i m e n t a l a b s o r b a n c e v e r s u s s p e c t r u m n u m b e r p l o t t e d f o r e a c h c h a n n e l a n d e a c h c a s e ; = 2 , w e i g h t e d r e s i d u a l s v e r s u s s p e c t r u m n u m b e r p l o t t e d f o r e a c h c a s e ; = 3 , c a l c u l a t e d a n d e x p e r i m e n t a l a b s o r b a n c e s a n d w e i g h t e d r e s i d u a l s p l o t t e d f o r e a c h c a s e ) . I C P ( I ) , I = 1 , N C P - E a c h I C P ( I ) i s o n e o f t h e w a v e l e n g t h c h a n n e l n u m b e r s f o r w h i c h a b s o r b a n c e s a n d r e s i d u a l s a r e c a l c u l a t e d . T h e s e w a v e l e n g t h c h a n n e l n u m b e r s c o r - r e s p o n d t o t h e e n u m e r a t i o n o f w a v e l e n g t h c h a n n e l s f o r t h e p r i n c i p a l c o m p o n e n t c a l c u l a t i o n a n d a r e n o t n e c e s - s a r i l y t h e s a m e a s t h e w a v e l e n g t h c h a n n e l n u m b e r s f o r t h e c o m p l e t e e x p e r i m e n t ( s e e i n s t r u c t i o n s f o r R E S O L V l a b o v e ) . I Q ( I ) , 1 = 1 , N C A S E — E a c h I Q ( I ) i s a n u m b e r o f e i g e n v e c t o r s f o r w h i c h R E S O L V 9 c o m p u t e s t h e r e c o n s t r u c t e d a b s o r - b a n c e s a n d r e s i d u a l s . 3 6 0 T h e f o l l o w i n g i n p u t d e c k e x e c u t e s R E S O L V 9 : C o n t r o l C a r d s 1 . A T T A C H ( T A P E l l T A P E 1 9 f r o m R E S O L V 2 ) 2 . A T T A C H ( R E S O L V , R E S O L V 9 ) 3 . R E S O L V 9 . D a t a C a r d s 1 . T w o c a r d s w i t h m e s s a g e s f o r o u t p u t ( 9 0 A 2 ) 2 . N C P , N C A S E , J F L A G ( 3 1 5 ) 3 . 1 C P ( I ) , I = 1 , N C P ( 1 6 1 5 ) u . I Q ( I ) , 1 = 1 , N C A S E ( 1 6 1 5 ) S T A T I C S T A T I C r e q u i r e s t h e i n p u t f i l e T A P E 1 0 , w h i c h i s t h e o u t p u t f i l e T A P E 1 9 f r o m R E S O L V 2 . S T A T I C f i t s a p r o p o s e d s t a t i c s p e c t r u m t o t h e M o r S a n a l y s i s e i g e n v e c t o r s , d e - p e n d i n g o n w h i c h t y p e o f e i g e n v e c t o r s T A P E 1 0 c o n t a i n s . T h e u s e r h a s t h e o p t i o n o f r e a d i n g t h e p r o p o s e d s t a t i c s p e c t r u m f r o m a n i n p u t f i l e c a l l e d T A P E l l , w h i c h h a s t h e s a m e f o r m a t a s t h e A B C A L o u t p u t f i l e T A P E 8 f o r a m e a - s u r e d s t a t i c s p e c t r u m . A l t e r n a t i v e l y , t h e u s e r c a n e n t e r t h e p r o p o s e d s t a t i c s p e c t r u m b y c a r d s . R e c a l l t h a t i n E q u a t i o n ( 3 . 1 6 ) t h e t e r m W f 1 i s s e t e q u a l t o u n i t y i f t h e r e i s a p r o p o s e d v a l u e f o r c h a n n e l 1 a n d i s s e t e q u a l t o z e r o o t h e r w i s e . I n S T A T I C , t h e u s e r h a s t h e o p t i o n o f s e t t i n g t h e n o n z e r o w f i ' s e q u a l t o p o s i — t i v e v a l u e s o t h e r t h a n u n i t y . T h i s w o u l d c o r r e s p o n d t o a w e i g h t e d l e a s t s q u a r e s f i t o f t h e p r o p o s e d s t a t i c s p e c - t r u m . T h e i n p u t v a r i a b l e s f o r S T A T I C a r e a s f o l l o w s : 3 6 1 N W S - t h e t o t a l n u m b e r o f w a v e l e n g t h c h a n n e l s i n t h e p r o p o s e d s t a t i c s p e c t r u m . N W S U — t h e n u m b e r o f w a v e l e n g t h c h a n n e l s i n t h e p r o - p o s e d s t a t i c s p e c t r u m t h a t a r e t o b e f i t t o t h e M o r S a n a l y s i s e i g e n v e c t o r s ( N W S U < N W S ) N N — s e t e q u a l t o o n e . N Q - t h e n u m b e r o f e i g e n v e c t o r s t o b e u s e d i n f i t t i n g t h e p r o p o s e d s t a t i c s p e c t r u m ( s h o u l d b e s e t e q u a l t o t h e e s s e n t i a l r a n k m ) I W T - ( = 0 , a l l n o n z e r o W f 1 o r w s i s e t e q u a l t o u n i t y ; = 1 , v a l u e s o f n o n z e r o W f 1 o r W S i a r e s e t b y t h e u s e r ) I R E A D - ( = 0 , t h e p r o p o s e d s t a t i c s p e c t r u m i s r e a d f r o m i n p u t f i l e T A P E l l ; = 1 , t h e p r o p o s e d s t a t i c s p e c t r u m i s r e a d f r o m c a r d s ) . I S ( I ) , I R ( I ) , I = 1 , N W S U - T h e s e a r r a y s a r e s p e c i f i e d b y t h e u s e r o n l y w h e n N W S U < N W , w h e r e N W i s t h e n u m b e r o f w a v e l e n g t h c h a n n e l s u s e d i n t h e p r i n c i p a l c o m p o n e n t c a l c u l a t i o n . 1 8 ( 1 ) i s t h e n u m b e r o f t h e w a v e l e n g t h c h a n n e l i n t h e p r o p o s e d s t a t i c s p e c t r u m t h a t c o r - r e s p o n d s t o w a v e l e n g t h c h a n n e l 1 R ( I ) i n t h e e n u m e r a - t i o n o f w a v e l e n g t h c h a n n e l s f o r t h e p r i n c i p a l c o m — p o n e n t c a l c u l a t i o n . W E I G H T ( I ) , I = 1 , N W S U - T h i s a r r a y i s s p e c i f i e d b y t h e u s e r o n l y i f I W T = 1 a b o v e . W E I G H T ( I ) i s t h e n o n z e r o w e i g h t t o b e u s e d f o r t h e I ' t h w a v e l e n g t h c h a n n e l o f t h e p r o p o s e d s t a t i c s p e c t r u m i f I W T = 1 . ' I f I W T = 0 , S T A T I C s e t s e a c h e l e m e n t o f t h e W E I G H T a r r a y e q u a l 3 6 2 t o u n i t y . F J ( I ) , I = 1 , N W S - T h i s a r r a y i s s p e c i f i e d b y t h e u s e r o n l y i f I R E A D = 1 . F J ( I ) i s t h e v a l u e f o r t h e I ' t h w a v e l e n g t h c h a n n e l o f t h e p r o p o s e d s t a t i c s p e c t r u m . T h e f o l l o w i n g i n p u t d e c k e x e c u t e s S T A T I C : C o n t r o l C a r d s 1 . A T T A C H ( T A P E l O , o u t p u t f i l e T A P E 1 9 f r o m R E S O L V 2 ) 2 . A T T A C H ( T A P E l l , f i l e c o n t a i n i n g p r o p o s e d s t a t i c s p e c t r u m i f I R E A D = 0 ) 3 . A T T A C H ( S T A T I C , S T A T I C ) 9 . S T A T I C . D a t a C a r d s 1 . T w o c a r d s w i t h m e s s a g e s f o r o u t p u t ( 9 0 A 2 ) 2 . N W S , N W S U , N N , N Q , I W T , I R E A D ( 6 1 5 ) ( E n t r y 3 a p p e a r s o n l y w h e n N W S U < N W ) 3 . I S ( I ) , I R ( I ) , 1 = N W S U ( 2 1 5 ) ( E n t r y 9 a p p e a r s o n l y w h e n I W T = 1 ) 9 . W E I G H T ( I ) , I = 1 , N W S U ( 1 0 x , E l O . 9 ) ( E n t r y 5 a p p e a r s o n l y w h e n I R E A D = 1 ) 5 . F J ( I ) , I = 1 , N W S ( 8 E 1 0 . 9 ) Q Q N Q C O N C r e q u i r e s a n i n p u t d a t a f i l e c a l l e d T A P E 1 0 , w h i c h i s t h e o u t p u t f i l e T A P E 1 9 f r o m R E S O L V 2 . T A P E 1 0 s h o u l d c o n t a i n M a n a l y s i s e i g e n v e c t o r s . T h e p r o p o s e d c o n c e n t r a - t i o n p r o f i l e m a y b e r e a d f r o m a n i n p u t f i l e c a l l e d T A P E l l o r f r o m c a r d s . I f T A P E l l i s u s e d , i t s f o r m a t s h o u l d b e C O N C ( J ) , J = 1 , N T ( 5 X , E 1 0 . 9 ) w h e r e C O N C ( J ) i s t h e p r o p o s e d c o n c e n t r a t i o n i n t h e J ' t h c o n s e c u t i v e s p e c t r u m . 3 6 3 R e c a l l t h a t i n E q u a t i o n ( 3 . 1 9 ) t h e n o n z e r o W c i ' s w e r e a l l s e t e q u a l t o u n i t y . I n C O N C t h e u s e r h a s t h e o p t i o n o f s e t t i n g t h e n o n z e r o W c i ' s e q u a l t o p o s i t i v e v a l u e s o t h e r t h a n u n i t y . T h i s w o u l d c o r r e s p o n d t o w e i g h t - e d l e a s t s q u a r e s f i t t i n g o f t h e p r o p o s e d c o n c e n t r a t i o n v e c t o r . C O N C h a s a n o u t p u t f i l e c a l l e d T A P E 1 2 t h a t h a s t h e f o l l o w i n g s t r u c t u r e : C E S T ( J ) , J = 1 , N T ( 5 X , E 1 0 . 9 ) w h e r e C E S T ( J ) i s t h e e s t i m a t e d c o n c e n t r a t i o n i n t h e J ' t h c o n s e c u t i v e s p e c t r u m . T h e i n p u t v a r i a b l e s f o r C O N C a r e a s f o l l o w s : N Q - t h e n u m b e r o f e i g e n v e c t o r s u s e d t o f i t t h e p r o p o s e d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e . I W T - ( = 0 , a l l n o n z e r o W C i s e t e q u a l t o u n i t y ; = 1 , u s e r s p e c i f i e s v a l u e s f o r t h e n o n z e r o w c i ) I R E A D - ( = 0 , p r o p o s e d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e i s r e a d f r o m i n p u t f i l e T A P E l l ; = 1 , p r o p o s e d c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e i s r e a d f r o m c a r d s ) C O N C ( J ) , J = 1 , N T - t h e p r o p o s e d c o n c e n t r a t i o n i n c o n - s e c u t i v e s p e c t r u m J . W E I G H T ( J ) , J = 1 , N T - T h i s a r r a y i s s p e c i f i e d o n l y i f I W T = 1 . W E I G H T ( J ) i s t h e n o n z e r o w e i g h t u s e d f o r t h e p r o p o s e d c o n c e n t r a t i o n i n t h e J ' t h c o n s e c u t i v e s p e c — t r u m . T h e f o l l o w i n g i n p u t d e c k e x e c u t e s C O N C : 3 6 9 C o n t r o l C a r d s l . A T T A C H ( T A P E l O , o u t p u t f i l e T A P E 1 9 f r o m R E S O L V 2 ) 2 . A T T A C H ( T A P E l l , f i l e c o n t a i n i n g p r o p o s e d c o n c e n - t r a t i o n p r o f i l e i f I R E A D = 0 ) 3 . A T T A C H ( C O N C , C O N C ) 9 . C O N C . D a t a C a r d s 1 . T w o c a r d s w i t h m e s s a g e s f o r o u t p u t ( 9 0 A 2 ) 2 . N Q , 1 W T , I R E A D ( 3 1 5 ) ( E n t r y 3 a p p e a r s o n l y i f I R E A D = 1 ) 3 . C O N C ( J ) , J = 1 , N T ( 5 X , E 1 0 . 9 ) ( E n t r y 9 a p p e a r s o n l y i f I W T = 1 ) u . W E I G H T ( J ) , J = 1 , N T ( 8 E 1 0 . 9 ) L I M I T 2 L I M I T 2 r e q u i r e s a n i n p u t f i l e c a l l e d T A P E 1 0 , w h i c h i s t h e o u t p u t f i l e T A P E 1 9 f r o m R E S O L V 2 . T A P E 1 0 s h o u l d c o n - t a i n t h e M a n a l y s i s e i g e n v e c t o r s o f a n e x p e r i m e n t o r s u b - s p a c e o f a n e x p e r i m e n t f o r w h i c h t h e e s s e n t i a l r a n k m e q u a l s 2 . T h e f o l l o w i n g i n p u t d e c k e x e c u t e s L I M I T 2 . C o n t r o l C a r d s 1 . A T T A C H ( T A P E I O , o u t p u t f i l e T A P E 1 9 f r o m R E S O L V 2 ) 3 . A T T A C H ( L I M I T 2 , L I M I T 2 ) 3 . L I M I T 2 . D a t a C a r d s 1 . T w o c a r d s w i t h m e s s a g e s f o r o u t p u t ( 9 0 A 2 ) R E S O L V 6 R E S O L V 6 r e q u i r e s a n i n p u t f i l e c a l l e d T A P E 1 0 , w h i c h i s t h e o u t p u t f i l e T A P E 1 9 f r o m R E S O L V 2 . T A P E 1 0 s h o u l d 3 6 5 c o n t a i n M a n a l y s i s e i g e n v e c t o r s . T h e u s e r s u p p l i e s e i t h e r t h e c o m p l e t e ( m x m ) r o t a t i o n m a t r i x Q o r t h e c o m p l e t e ( m x m ) r o t a t i o n m a t r i x X , R E S O L V 6 t h e n e x t r a c t s f r o m t h e M a n a l y s i s e i g e n v e c t o r s t h e e s t i — m a t e d s t a t i c s p e c t r a a n d t h e c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s f o r t h e m l i n e a r l y i n d e p e n d e n t a b s o r b e r s . T h e i n p u t v a r i a b l e s f o r R E S O L V 6 a r e a s f o l l o w s : N Q - t h e e s s e n t i a l r a n k m . J O P T - ( = 0 , t h e m a t r i x H i s s p e c i f i e d b y t h e u s e r ; = 1 , t h e m a t r i x V _ i s s p e c i f i e d b y t h e u s e r ) . U ( 1 , J ) , I = 1 , N Q , J = 1 , N Q - I f J O P T = 0 , t h e u s e r s p e c i f i e s o n e c o l u m n a t a t i m e t h e r o t a t i o n m a t r i x H . V ( I , J ) , I = 1 , N Q , J = 1 , N Q - I f J O P T = l , t h e u s e r s p e c i f i e s o n e c o l u m n a t a t i m e t h e r o t a t i o n m a t r i x V . T h e f o l l o w i n g i n p u t d e c k e x e c u t e s R E S O L V 6 : C o n t r o l C a r d s 1 . A T T A C H ( T A P E l O , o u t p u t f i l e T A P E 1 9 f r o m R E S O L V 2 ) 2 . A T T A C H ( R E S O L V 6 , R E S O L V 6 ) 3 . R E S O L V 6 . D a t a C a r d s 1 . T w o c a r d s w i t h m e s s a g e s f o r o u t p u t ( 9 0 A 2 ) 2 . N Q , J P O T ( 2 1 5 ) 3 . I f J P O T = 0 , t h e n f o r e a c h c o l u m n J = 1 , N Q , U ( 1 , J ) , I = 1 , N Q ( 8 E 1 0 . 9 ) 9 . I f J P O T = 1 , t h e n f o r e a c h c o l u m n J = 1 , N Q , V ( I , J ) , I = 1 , N Q ( 8 E 1 0 . 9 ) E q u a t i o n s ( 5 . 2 2 ) a n d ( 5 - 2 3 ) + Y A P P E N D I X H S i m p l e M i c h a e l i s M e n t e n M e c h a n i s m S i n g u l a r P e r t u r b a t i o n S o l u t i o n s 1 . F i r s t O r d e r S i n g u l a r P e r t u r b a t i o n S o l u t i o n s t o Z e r o t h O r d e r I n n e r E q u a t i o n s ( d s o / d o ) 0 ( d o c / d d ) ( l - Y ) S O ’ + ( v - l ) c o s o + Y - ( Y + K ) C O ( B . 1 ) F i r s t O r d e r I n n e r E q u a t i o n s ( d s l / d o ) - 5 0 + s o c O + ( K — A ) c 0 ( d c l / d o ) = ( l - y ) s l + ( y - l ) c o s 1 + ( y — l ) c l s O - ( 1 7 + K ) c l + w o k e — l ) ( H . 2 ) Z e r o t h O r d e r O u t e r E q u a t i o n s + E ' s ' ( d S O / d T ) = - s 0 0 0 + ( K - 1 ) ' 5 ' O O = ( l - y ) § O + ( y — 1 ) E O § O + y - ( y + K ) E b ( H . 3 ) 3 6 6 + 1 + 2 K - l - 2 K A + K 2 ] } ( 1 + K ) ’ u e x p [ - ( 1 + K ) T u - 1 1 3 6 7 F i r s t O r d e r O u t e r E q u a t i o n s ( d s l / d T ) s 1 + c o s l + 0 1 3 0 + ( K - l ) c 1 ( C i a o / ( 1 ‘ 1 " ) = ( l - Y ) § 1 + ( Y ' l ) g o g l + ( Y — 1 ) E l - S — O 8 ( 1 ) a n d C ( 1 ) a r e t h e t o t a l f i r s t o r d e r s i n g u l a r p e r t u r b a t i o n s o l u t i o n s f o r t h e e n t i r e t i m e c o u r s e o f t h e r e a c t i o n , A ( l ) = 8 ( 1 ) + g - ( ] . ) - - § ( 1 ) : = S O + g 0 + U ( S l + E 1 ) — 5 ( 1 ) C ( 1 ) = 0 ( 1 ) + 3 ( 1 ) ' 8 ( 1 ) = C 0 + 8 o + ” ( C l + 6 1 ) ‘ c ( l ) ( H . 5 ) w h e r e 5 0 = 1 ( H . 6 ) c 0 = ( 1 + K ) - 1 ( 1 - { e x p E - ( 1 + K ) 1 u - 1 } ) ( H . 7 ) s 1 = - l t u “ 1 ( l + x ) ‘ 1 + ( 1 + K - A ) ( 1 + K ) - 2 { e x p [ - ( 1 + K ) T u - l ] } + ( A - l - K H H K ) " 2 ( H . 8 ) c 1 = { y E - ( 1 + K ) 3 + y ( 1 + K ) + y K ( l + K ) ] - ( 1 — v ) [ - ( i / 2 ) ( i + x > 2 1 2 u ’ 2 + ( l + K ) ( 1 + K - A ) ( K - 1 ) T u — l + [ y ( 2 K + 2 - A ) + ( l — K - 1 ) ] ( 1 + K ) ' “ e x p ( - 2 ( l + x ) r u ‘ 1 ] l1 l y 3 6 8 + [ ( l - v ) ( 1 + K ) e r u ' l + ( l - y ) K ( l + K - 2 l ) + v ( l + x ) 3 - y K ( l + K ) ] ( l + K ) ' “ ( H . 9 ) 5 0 i s t h e s o l u t i o n o f t h e t r a n s c e n d e n t a l e q u a t i o n ( l - v ) [ v ( l - K > - l 1 ‘ 1 < s O - i ) - K ( v ( l + K + 1 ) + 1 1 [ v ( A - K ) - 1 1 ' 2 2 n { ( - 1 ) ‘ 1 [ § 0 ( v ( 1 - K ) - 1 ) ( K - A ) Y ] = T ( H . 1 0 ) 6 0 , E 1 a n d 3 1 a r e e x p r e s s e d a s f u n c t i o n s o f E 0 . 6 0 = [ ( l - v ) s o + y ] [ ( l - y ) s o + v + K ] ‘ 1 ( H . 1 l ) E 1 = T l ( l + K - 1 ) [ 1 ( 1 + K ) + T 3 ] ' 1 + x 1 + x 2 + x 3 + X A + x 5 + X 6 + X 7 + X 8 ( H . 1 2 ) 6 1 = T 3 “ K ( l - y ) T § § l + y T g - y K ( T 3 - K ) T § + K ( y - 1 ) T l ( H . 1 3 ) w i t h * - 3 l Y ( K — A ) + § 0 [ v ( A - x ) - 1 1 * 3 I I t - 3 l + K + ( l - y ) § 0 l o g { ( - A ) E Y + K + ( l - Y ) § O ] ( K + 1 ) + + 3 6 9 K [ Y ( 1 + K — 1 ) + A ] y ( l + K ) + K — A y ( l + l - K ) + K - A A ( Y - l ) + Y ( 1 + K ) i o s I ( - l ) ' 1 [ ( K - l > v + ( y ( 1 - K > - 1 ) § 0 ] } i o c { ( l + x ) ’ 1 [ v + K + § 0 ( l - Y ) ] } y T l T 2 2 { T 8 + y ( K — A ) ( T ? T 3 1 T 5 ‘ 1 [ ( x - x ) v + [ v ( i - K ) - l l s 0 1 } + 1 ' 1 ) } v ( l - y ) T l T ' 3 T ' 1 { T 1 + l - 2 v ( K - 1 ) T 8 — y 2 ( K - 1 ) 2 2 3 - 1 y ( y + K ) ( T 1 + A ) T 5 1 T 3 ( T ; 1 + l ' 1 > 1 Y K ( Y - 1 ) T 1 T ' 1 { Y 2 ( K - 1 ) 2 T E Z T ’ 1 ( T ‘ 1 + A ' 1 ) } v ( K ~ l ) T 3 2 T 8 [ y [ y ( K - l ) + K ( 2 K + 1 - 2 x ) + 1 ] + 2 K 1 ] v K T l T 3 1 T 3 2 T 9 ( y + K ) 2 - y K T 1 T 3 y 2 ( l - K ) T 1 T ’ 1 T _ 1 { T ? + 1 ' 1 + ( 1 — y ) T ’ 1 T 3 - 1 — 1 - l - 1 T 6 { y ( l - K ) T 2 T u ( T l + 1 - 1 ) - ( Y + K ) T 9 2 T 1 0 } 1 0 } T 1 T 3 1 ( K ( Y + K ) T ; 1 [ ( K + l ) ‘ 1 - T 3 1 1 — K y ( K - A ) ( l - Y ) — 2 T 9 T 1 0 } - 1 - J \ T ( 1 + K ) " l + u ( A - - K - - 1 ) ( 1 + K ) ' 2 ( H . 1 u ) ) ( O 3 7 0 _ - 1 - 1 _ _ - 1 _ - 1 - 1 x 8 — K T 1 T 3 T u ( 1 y ) ( K A ) { T 3 ( 1 + K ) + T z T u T 1 0 } ( D ) I ( l ) 1 ) = ( 1 + K ) ’ l + K x ( y - 1 ) T ( 1 + K ) ' 3 ( H . 1 5 ) + u [ K ( y — 1 ) ( 1 + x - 2 x ) + Y ( 1 + x ) 3 — y K ( 1 + K ) ] ( l + K ) - u 2 . F i r s t O r d e r S i n g u l a r P e r t u r b a t i o n S o l u t i o n s t o E q u a t i o n s ( 5 . 2 5 ) a n d 1 5 . 2 6 ) F ( l ) a n d 0 ( 1 ) a r e t o t a l f i r s t o r d e r s i n g u l a r p e r t u r b a t i o n s o l u t i o n s f o r t h e e n t i r e t i m e c o u r s e o f t h e r e a c t i o n . P m = p m * i 5 ( 1 ) ‘ i s < 1 ) C ( 1 ) = c ( 1 ) + 3 ( 1 ) ' a ( 1 ) ( H ' l 6 ) w h e r e p 0 - o ( H . 1 7 ) c 0 = ( 1 + K ) ‘ 1 ( 1 - { e x p E - ( 1 + K ) r u ’ 1 ] } ( H . 1 8 ) p 1 = — A ( 1 + K ) “ 1 r u ‘ 1 + A ( 1 + K ) ’ 2 ( - 1 + { e x p [ — ( 1 + K ) r u ‘ 1 3 } ) ( E . 1 9 ) 3 7 1 c = { ( K - 1 ) E X ( y - 1 ) + K + 1 J < K + 1 ) ’ 3 r u ' 1 + A ( Y - l ) 2 - l ( l + K ) - 2 T 2 u - 2 - [ A ( l - y ) - ( 1 + K ) J < 1 + K ) ‘ “ + x x ( y — 1 ) ( 1 + x ) ‘ “ - [ A K ( l - Y ) + < K + 1 > < < K + 1 > K + 1 J > < 1 + x ) ' “ } { e x p f - ( 1 + K ) T u ' 1 ] } + [ A ( l - Y ) - < 1 + x > 1 < 1 + x > ' “ { e x p £ - 2 < 1 + K ) T u ' 1 1 } + K A ( Y - l ) ( 1 + K ) - u [ ( l + K ) T u - l - l ] + { l K ( 1 - y ) + ( K + 1 ) [ ( K + 1 ) K + 1 ] } ( 1 + K ) ' “ ( H . 2 0 ) - l - E b w h e r e 3 0 i s g i v e n b y E q u a t i o n ( H . 1 0 ) ‘ C O l _ - 1 - 1 p l - T l T 3 ( 1 + K ) + Y l + Y 2 + Y 3 + Y u + Y 5 + Y 6 + Y 7 + Y 8 ( H . 2 1 ) - = T ‘ 1 { K ( — 1 ) T ' 1 " + 1 - K ( 1 + ( - 1 ) ‘ J T ' 2 - K ( l - ) T T ' 3 } ( H 2 2 ) 0 1 3 Y 3 p i Y p o 3 Y 1 3 ' w h e r e - - 1 - 3 — Y 1 - — y ( y - 1 ) T 1 T 3 T 2 { T 2 p O - 1 2 - 2 X T 8 + A T l + A } — r i m - ' 1 ' 1 " l ’ 1 ( Y - l ) ’ 1 ' 1 ‘ ; l + l T u s z } p ( 1 ) ° ( 1 ) 3 7 2 - 1 2 - 1 — 2 - 1 - T 1 K y ( l - Y ) T 3 { - A T , 4 T 2 T 1 A T n g E Q + T ; 2 [ ( 1 + K ) 2 ( y - 1 ) 1 A [ A ( 1 — y ) + 2 T u j n g T B } 1 T - 1 T - 1 T 1 K ( T 7 — Y K ) T 3 1 { + A T u 2 1 - 1 — 1 - 2 T u T 2 - ( 1 + K ) T L l T 1 0 } - 1 - 1 - 1 - 1 ( 7 — 1 ) T 3 1 T 1 0 } K A ( 1 - y ) T 1 T l T u l { T ' 1 - ( 1 + K ) ' l 3 e 1 T 2 T u T 1 0 } - Y K ( l - Y ) T 1 T 3 l { ( 1 + K ) ( v — 1 ) ’ 1 T ' 1 T 3 l . A u ( 1 + K ) ' 2 + A r ( 1 + K ) ' l K ( 1 + K ) ’ 3 ] + T K A ( Y - l ) ( l + K ) - 3 < 1 + K ) ' 1 + u [ 2 x A ( 1 - v ) ( 1 + x ) ‘ “ + ( 1 + K ) ’ 1 ( H . 2 h ) ( H . 2 5 ) 0 ( l ) 0 v e r y l a r g e ( 1 + K ) - l + u ( 1 + K ) - u { K ( l + K ) [ A 0 ( 1 - Y ) - Y ] A P P E N D I X I M a t c h i n g o f t h e I n n e r a n d O u t e r S i n g u l a r P e r t u r b a t i o n S o l u t i o n S ‘ T h e i n i t i a l c o n d i t i o n s f o r t h e o u t e r s o l u t i o n a r e o b t a i n e d b y m a t c h i n g t h e i n n e r a n d o u t e r s o l u t i o n s . W e n o t e t h a t i n t h e l i m i t u + O , a = ( T / u ) + w , e v e n f o r T c l o s e t o z e r o . T h u s , a i s v e r y l a r g e n e a r t h e b e g i n n i n g o f t h e o u t e r s o l u t i o n . W e a s s u m e t h a t t h e i n n e r a n d o u t e r s o l u t i o n s m a t c h w h e r e o i s l a r g e e n o u g h t h a t e x p o n e n t i a l t e r m s i n E q u a t i o n s ( H . 6 ) t h r o u g h ( H . 9 ) v a n i s h , b u t t h a t T 2 O . F o r 0 v e r y l a r g e , 1 + u < 1 + x ) ‘ 1 [ - x o + ( A - l - K ) < 1 + K ) ‘ l l S ( 1 ) 0 v e r y l a r g e ( I . l ) + K ( 1 + K - 2 A ) ( 1 - y ) + y ( l + K ) 3 } ( 1 . 2 ) I n t h e T t i m e s c a l e , E q u a t i o n s 1 . 1 ) a n d ( 1 . 2 ) a r e s ( l ) = 1 — A T ( 1 + K ) ' 1 + p ( A - 1 - K ) ( 1 + K ) ’ 2 ( 1 . 3 ) 3 7 3 l a r g e _ ' l + “ ( A ’ l ' K ) ( 1 + K ) - 2 ( 1 . 5 ) 0 v e r y l a r g e 1 + ” ( A - 1 ' K ) ( 1 + K ) - 2 5 - 8 ( ( 1 l ) ) 0 _ - v 8 e ( r l y ) + u 3 7 M 0 ( 1 ) = ( 1 + K ) " 1 + K A T ( l - Y ) ( 1 + K ) — 3 + p ( l + K ) ' u [ K ( l + K - 2 A ) ( 1 - A ) + y < 1 + K > < 1 + K + x 2 ) ] ( 1 . “ ) W h e n I = 0 , E q u a t i o n s ( 1 . 3 ) a n d ( 1 . ” ) b e c o m e T = 0 ( 1 + K ) “ 1 + u ( 1 + K ) - u [ K ( l + K - 2 A ) ( l - y ) 0 ( l ) a v e r y l a r g e T = 0 + y ( l + K ) ( l + K + K 2 ) ] ‘ ( 1 . 6 ) M a t c h i n g r e q u i r e s T = 0 § 0 ( 0 ) + u § 1 ( 0 ) ( 1 . 7 ) a n d - _ _ - 1 C ( l ) ( 0 ) — - ( 1 + K ) C ( l ) 0 v e r y l a r g e T = O ( l + K ) ' u [ K ( l + K - 2 l ) ( l - y ) + y ( l + K ) ( l + K + K 2 ) ] = 8 0 ( 0 ) + u 3 1 ( 0 ) ( I . 8 ) E q u a t i o n s ( 1 . 7 ) a n d ( 1 . 8 ) a r e s a t i s f i e d w i t h o u t l o s s o f + y 3 7 5 g e n e r a l i t y b y E q u a t i o n s ( 1 . 9 ) § O ( o ) = 1 s 1 ( 0 ) = ( ; \ - 1 - 1 < ) ( 1 + K ) ' 2 c 0 ( 0 ) = ( 1 + K ) - 1 c l ( O ) = K ( l + K - 2 A ) ( 1 - Y ) ( 1 + K ) - u ( 1 + K ) ’ 3 ( 1 + K + K 2 ) ( 1 . 9 ) R E F E R E N C E S R E F E R E N C E S A n d e r s o n , T . W . , A n n . o f M a t h . S t a t . , 3 3 , 1 2 2 ( 1 9 6 3 ) . A t k i n s o n , A n t h o n y C . , a n d W i l l i a m G . H u n t e r , T e c h n o m e t r i c s , l 9 ( 2 ) , 2 7 1 ( 1 9 6 8 ) . B e c k , J a m e s V . a n d K e n n e t h J . A r n o l d , P a r a m e t e r E s t i m a t i o n i n E n g i n e e r i n g a n d S c i e n c e , P r e l i m i n a r y ’ E d i t i o n , “ M a r c h 1 9 7 5 R e v i s i o n ( M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y , E a s t L a n s i n g , M I , 1 9 7 5 ) B e l l m a n , R . , I n t r o d u c t i o n t o M a t r i x A n a l y s i s , S e c o n d E d i t i o n ( M c G r a w - H i l l B o o k C o m p a n y , N e w Y o r k , 1 9 7 0 ) . B e r n h a r d , S . A . , M . F . D u n n , P . L . L u i s i , a n d P . S h a c k , B i o c h e m i s t r y , 2 ( 1 ) , 1 8 5 ( 1 9 7 0 ) . B o x , G . E . P . , a n d H . L . L u c a s , B i o m e t r i k a , 5 g , 7 7 ( 1 9 5 9 ) . B o x , G . E . P . , a n d W . J . H i l l , T e c h n o m e t r i c s , 2 ( 1 ) , 5 7 ( 1 9 6 7 ) . B r a n d e n , C a r l - I v a r , H a n s J o v n v a l l , H a n s E k l u n d , a n d B o F u r u g r e n , " A l c o h o l D e h y d r o g e n a s e s " , T h e E n z y m e s , 3 r d E d . , V o l . 1 1 , P a u l D . B o y e r , E d . , ( A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k , 1 9 7 5 ) . B r o o k s , R o b e r t L . , J o s e p h D . S h o r e , a n d H . G u t f r e u n d , T h e J o u r n a l o f B i o l o g i c a l C h e m i s t r y , 2 U 7 ( 8 ) , 2 3 8 2 ( 1 9 7 2 ) . B u l m e r , J . T . a n d H . F . S h u r v e l l , J . P h y s . C h e m . , 7 7 , 2 5 6 ( 1 9 7 3 ) . C l e l a n d , W . W . , " S t e a d y S t a t e K i n e t i c s " , T h e E n z y m e s , 3 r d e d . , V o l . 2 , P a u l D . B o y e r , E d . , ( A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k , 1 9 7 0 ) . C o n t r o l D a t a 6 A 0 0 / 6 5 0 0 / 6 6 O O C o m p u t e r S y s t e m s S C O P E R e f e r e n c e M a n u a l ( 1 9 6 9 ) . P a l o A l t o , C a l i f o r n i a . C o o l e n , R i c h a r d B . , P h . D . T h e s i s , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y , 1 9 7 . C o o l e n , R . B . , N . P a p a d a k i s , J . A v e r y , C . G . E n k e , a n d J . L . D y e , A n a l . C h e m . , £ 1 ) l 6 u 9 ( 1 9 7 5 ) . C u k i e r , R . 1 . , C . M . F o r t u i n , K . E . S h u l e r , A . G . P e t s c k e k , a n d J . H . S c h a i b l y , J . C h e m . P h y s . , 5 2 ( 8 ) 3 8 7 3 ( 1 9 7 3 ) . 3 7 6 3 7 7 C u k i e r , R . I . , J . H . S c h a i b l y , a n d K . E . S h u l e r , J . C h e m . P h y s . , § _ 3 _ < 3 ) , 1 1 1 1 0 ( 1 9 7 5 ) . C u r t i s , A . R . a n d E . M . C h a n c e , A n a l y s i s a n d S i m u l a t i o n o f B i o c h e m i c a l S y s t e m s , V o l . 2 5 , H . C . H e m k e r a n d B . H e s s , E d s . , F . E . B . S . , 3 9 ( 1 9 7 2 ) . D a l z i e l , K . , B i o c h e m . J . , 8 9 , A D O ( 1 9 6 1 ) . D a l z i e l , K . , a n d F . M . D i c k i n s o n , B i o c h e m , J . , 1 0 0 , 3 A ( 1 9 6 6 ) . D a l z i e l , K e i t h , " K i n e t i c s a n d M e c h a n i s m o f N i c o t i n a m i d e - N u c l e o t i d e - L i n k e d D e h y d r o g e n a s e s " , T h e E n z y m e s , 3 r d E d . , V o l . 1 1 , P a u l D . B a y e r , E d . , ( A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k , 1 9 7 5 ) . D a r v e y , I . G . , S . J . P r o k h o r n i k , a n d J . F . W i l l i a m s , J . T h e o r e t . 3 1 0 1 . , 1 1 , u 5 9 ( 1 9 6 6 ) . D u n n , M . F . , a n d S i d n e y A . B e r n h a r d , B i o c h e m i s t r y , 1 9 , N o . 2 “ , A 5 6 9 ( 1 9 7 1 ) . D u n n , M i c h a e l F . , a n d J . S c o t t H u t c h i n s o n , B i o c h e m i s t r y , 1 ; , N o . 2 a , 4 8 8 2 ( 1 9 7 3 ) . D u n n , M i c h a e l F . , B i o c h e m i s t r y , 1 3 , N O . 6 , l l u 6 ( 1 9 7 A ) . D u n n , M i c h a e l F . , J e a n - F r a n c o i s B i e l l m a n n , a n d G u y B r a n l a n t , B i o c h e m i s t r y , ; 5 , N o . l “ , 3 1 7 6 ( 1 9 7 5 ) . D y e , J . L . , a n d L . H . F e l d m a n , R e v . S c i . I n s t r . , 3 7 , 1 5 A ( 1 9 6 6 ) . D y e , J . L . a n d V . N i c e l y , J . C h e m . E d . , £ 8 , A h 3 ( 1 9 7 1 ) . F i s h e r , H a r v e y F . , D i s m u s L . A d i J a , a n d D a l l a s G . C r o s s , B i o c h e m i s t r y , 8 ( 1 1 ) , A A Z A ( 1 9 6 9 ) . G e a r , C . W . , N u m e r i c a l I n i t i a l V a l u e P r o b l e m s i n _ O r d i n a r y D i f f e r e n t i a l E q u a t i o n s , ( P r e n t i c e — H a l l , I n c . , N e w J e r s e y , 1 9 7 1 ) . G u t f r e u n d , H . , D i s c . F a r a d . S o c . , 2 Q , 1 6 7 ( 1 9 5 5 ) . H a m m e s , G o r d o n G . , a n d P a u l R . S c h i m m e l , " R a p i d R e a c t i o n s a n d T r a n s i e n t S t a t e s " , T h e E n z y m e s , 3 r d E d . , V o l . 2 , P a u l D . B a y e r , E d . , ( A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k , 1 9 7 0 ) . H e i n e k e n , F . G . , H . M . T s u c h i y a , a n d R . A r i s , M a t h e m a t i c a l B i o s c i e n c e s , 1 , 9 5 ( 1 9 6 7 ) . H e m k e r , P . W . , A n a l y s i s a n d S i m u l a t i o n o f B i o c h e m i c a l S s t e m s , V o l . 2 5 , A . C . H e m k e r a n d B . H e s s , E d s . , F . E . B . S . , 5 9 ( 1 9 7 2 ) . 3 7 8 H i l l , W i l l i a m J . , W i l l i a m G . H u n t e r , a n d D e a n W . W i c h e r n , T e c h n o m e t r i c s , l _ ( l ) 1 A 5 ( 1 9 6 8 ) . H i l l , W i l l i a m J . , a n d W i l l i a m G . H u n t e r , T e c h n o m e t r i c s , 1 6 ( 3 ) , “ 2 5 ( 1 9 7 A ) . H i m m e l b l a u , D a v i d M . , P r o c e s s A n a l s i s 2 y S t a t i s t i c a l M e t h o d s , ( J o h n W i l e y a n d S o n s , ( 1 9 7 0 ) ) . H o l b r o o k , J . J . , a n d H . G u t f r e u n d , F E B S L e t t e r s , 2 2 ( 2 ) , 1 5 7 ( 1 9 7 3 ) . H o l l a w a y , M . R . a n d H . A . W h i t e , B i o c h e m . J . , 1 U 9 , 2 2 1 ( 1 9 7 5 ) . ‘ — H o m m e s , F . A . , A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . , g g , 2 8 ( 1 9 6 2 ) . H o m m e s , F . A . , A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . , 2 Q , 3 2 ( 1 9 6 2 ) . H u g u s , Z . Z . , J r . a n d A . A . E l - A w a d y , J . P h y s . C h e m . , 1 2 , 2 9 5 " ( 1 9 7 1 ) . H u n t e r , W i l l i a m G . , a n d A l b e y M . R e i n e r , T e c h n o m e t r i c s , 1 ( 3 ) , 3 0 7 ( 1 9 6 5 ) - K a n k a r e , J . J . , A n a l . C h e m . , 2 2 , 1 3 2 2 ( 1 9 7 0 ) . K a p l a n , N a t h a n 0 . , " T h e P y r i d i n e C o e n z y m e s " , T h e E n g y m e s , 2 n d E d . , V o l . 3 , P a u l D . B o y e r , H e n r y L a r d y a n d K a r l M y r b a c k , E d s . ( A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k , 1 9 6 0 ) . L a w t o n , W . H . a n d E . A . S y l v e s t r e , T e c h n o m e t r i c s , 1 2 , 6 1 7 ( 1 9 7 1 ) . L u i s i , P i e r L u i g i , a n d R o b e r t F a v i l l a , B i o c h e m i s t r y , 2 2 , N o . 1 2 , 2 3 0 3 ( 1 9 7 2 ) . M . S . U . C o m p u t e r L a b o r a t o r y , C o m p u t e r L a b o r a t o r y U s e r ' s G u i d e , V o l . 1 1 , ( 1 9 7 3 ) . M a g u i r e , R . J . , N . H . H i j a z i , a n d K . J . L a i d l e r , B i o c h e m . B i o p h y s . A c t a . , 3 A 1 , l ( 1 9 7 “ ) . M c F a r l a n d , J a m e s T . , a n d S i d n e y A . B e r n h a r d , B i o c h e m i s t r y , 1 ; , N o . 8 , 1 A 8 6 ( 1 9 7 2 ) . M i c h a e l i s , L . a n d M . L . M e n t e n , B i o c h e m . Z . , 2 2 , 3 3 3 ( 1 9 1 3 ) . M i l a n o , M . J . a n d H . L . P a r d u e , A n a l . C h e m . , 2 1 , 2 5 ( 1 9 7 5 ) . M i l l e r , J . A . , P . L e v o i r , J . C . F o n t a i n e , F . G a r n i e r , a n d J . E . D u b o i s , A n a l . C h e m . , A 7 , 2 9 ( 1 9 7 5 ) . 3 7 9 M i l l e r , W . G . a n d R . A . A l b e r t y , J . A . C . S . , 2 2 , 5 1 2 6 ( 1 9 5 8 ) . M o r a l e s , M . F . a n d D . E . G o l d m a n , J . A . C . S . , 1 1 , 6 0 6 9 ( 1 9 5 5 ) . M o r r i s o n , D o n a l d F . , M u l t i v a r i a t e S t a t i s t i c a l M e t h o d s ( M c G r a w - H i l l B o o k C o m p a n y , N e w Y o r k , 1 9 6 7 ) : P . L . B i o c h e m i c a l s , I n c . , U l t r a v i o l e t A b s o r p t i o n S p e c t r a o f 5 ' - R i b o n u c l e o t i d e s , C i r c u l a r N o . O R - 1 0 , M i l w a u k e e , W I ( 1 9 7 3 ) . P a p a d a k i s , N i c h o l a s , P h . D . T h e s i s , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y , 1 9 7 A . P a p a d a k i s , N i c h o l a s , 2 3 I n t e r a c t i v e C o m p u t e r l g g e r f a c e f o r R a p i d S c a n n i n g S t o p p e d F l o w K i n e t i c s , P a r t I I , T h e S o f t w a r e ( u n p u b l i s h e d ) . P a p a d a k i s , N . , R . B . C o o l e n , a n d J . L . D y e , A n a l . C h e m . , 2 1 , 1 6 “ “ ( 1 9 7 5 ) . P i e t r u s k o , H . , A . C l a r k , J . M . H . G r a v e s , a n d H . J . R i n g o l d , B . B . R . C . , 2 2 , 5 2 6 ( 1 9 6 6 ) . P i e t r u s k o , R e g i n a , a n d H u g o T h e o r e l l , A r c h i v e s o f B i o c h e m - i s t r y a n d B i o p h y s i c s 1 3 1 , 2 8 8 ( 1 9 6 9 ) . H i t t e r , G . L . , S . R . L o w r y , T . L . I s e n h o u r , a n d C . L . W i l k i n s , A n a l . C h e m . , fi g , 5 9 1 ( 1 9 7 6 ) . R o z e t t , R . W . a n d E . M c L . P e t e r s e n , A n a l . C h e m . , 2 1 , 1 3 0 1 ( 1 9 7 5 ) . R u b i n o w , S . I . a n d J . L . L e b o w i t z , J . A . C . S . , 2 2 , 3 8 8 8 ( 1 9 7 0 ) . S a n t i n i , R . E . , M . J . M i l a n o , a n d H . L . P a r d u e , A n a l . C h e m . , 2 ; , 9 1 5 A ( 1 9 7 3 ) . S c h a c k , P . a n d M . F . D u n n , A b s t r a c t s 8 t h M e e t i n g F e d . E u r . B i o c h e m . S o c . , # 3 0 3 ( 1 9 7 2 ) . S c h a i b l y , . J o h n H . a n d K u r t E . S h u l e r , J . C h e m . P h y s . 2 2 ( 8 ) 3 8 7 9 ( 1 9 7 3 ) . S h o r e , J o s e p h D . , B i o c h e m i s t r y , 2 ( 2 ) , 1 5 8 9 ( 1 9 6 9 ) . S h o r e , J . D . a n d H . G u t f r e u n d , B i o c h e m i s t r y , 2 ( 2 2 ) , 2 6 5 5 ( 1 9 7 0 ) . S h o r e , J . D . , H . G u t f r e u n d , R . L . B r o o k s , D . S a n t i a g o , a n d P . S a n t i a g o , B i o c h e m i s t r y , 2 2 , N o . 2 0 , ” 1 8 5 , ( 1 9 7 A ) . S h o r e , J o s e p h D . , a n d D a v i d S a n t i a g o , T h e J o u r n a l o f B i o — l o g i c a l C h e m i s t r y , 2 § 0 ( 6 ) , 2 0 0 8 ( 1 9 7 5 ) . 3 8 0 S u e l t e r , C . H . , R . B . C o o l e n , N . P a p a d a k i s , a n d J . L . D y e , A n a l y t i c a l B i o c h e m i s t r y , 2 2 , 1 5 5 ( 1 9 7 5 ) . S u n d , H . a n d H . T h e o r e l l , " A l c o h o l D e h y d r o g e n a s e s " , T h e E n z y m e s , 2 n d e d . , V o l . 7 , P a u l D . B o y e r , H e n r y L a r d y , a n d K a r l M y b é c k , E d s . ( A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k , 1 9 6 0 ) . S y l v e s t r e , E . A . , W . H . L a w t o n , a n d M . S . M a g g i o , T e c h n o — m e t r i c s , 1 2 , 3 5 3 ( 1 9 7 2 ) . T h e o r e l l , H . , fl . fl k e s o n , B . L i s z k a - K o p é c , a n d C . D e Z a l e n s k i , A r c h i v e s o f B i o c h e m i s t r y a n d B i o p h y s i c s , 1 3 9 , 2 2 1 ( 1 9 7 0 ) . V a d a s d i , K . , J . P h y s . C h e m . , 1 2 , 8 1 6 ( 1 9 7 2 ) . W a l t e r , C . a n d M . F . M o r a l e s , J . B . C . , 2 2 2 ( 2 ) , 1 2 7 7 ( 1 9 6 “ ) . W a l t e r , C . , J . T h e o r e t . 1 3 1 0 1 . , 2 2 , 1 ( 1 9 7 1 : ) . W o n g , J . T z e - F e i , J . A . C . S . , 2 1 , 1 7 8 8 ( 1 9 6 5 ) . " ‘ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 “