r a i Z n y l . . a . . 3 . . . V . P E u a . . n . k . ? 1 » . . w . : . 1 » a 7 . I ‘ 5 n » l 1 a 1 1 ¢ 3 . . " : » ! 5 . 3 I . t . . _ . y . V . . r . A . . L 2 a . - y 5 . . 5 : . » . . . . : , . ‘ . ‘ . . , , . . , . V , . . ‘ . , . . . . . E . 5 u s h fi n w l u . r . u , . j . m . . ‘ x m o v : . a I . r x . . i , . . i . . . i . . v : : . . 1 : 5 . : } 2 ? . I v l . { 3 i 3 . ! . t . 1 3 . ‘ . 2 . } 5 . 1 2 . 3 h . u i x : . 5 t . . . i . . . . 3 . i ? . i . l ! 1 ) . t { l 3 l : I § . I 5 1 l i } t 2 1 x : a . . 1 . : ? n . | ” ” I a . n : . . . a n . % . W 4 9 . W M ; 3 % . , a r m . a » ; d u n k . r . A . h i " ’ E w , { m a m a t g ; u , 5 3 5 1 3 3 ; ? ? ? 1 1 : 7 l I R i fl é z a w n h . . . . . . ‘ C 3 1 2 9 3 0 1 3 8 8 3 2 / , / fl M f T H E S l S ‘ 5 ' ' 7 “ * l l l l l l l l ‘ l l \ l l l l l l l l l l l l \ l l l l l l l W i l l i T h i s i s t o c e r t i f y t h a t t h e d i s s e r t a t i o n e n t i t l e d H Y P O M E T H Y L A T I O N 0 F D N A M A Y U N D E R L I E T H E H E I G H T E N E D S E N S I T I V I T Y O F T H E B G C B F I M O U S E T 0 L I V E R T U M O R I G E N E S I S p r e s e n t e d b y J E N N I F E R L E E C O U N T S h a s b e e n a c c e p t e d t o w a r d s f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r P h . D . P h a r m a c o l o g y a n d T o x i c o l o g y d e g r e e i n M a j o r p r o e s s f D a t e D e c e m b e r 1 5 , 1 9 9 5 P T L O A D C V A E O l I l D R F E I A T E T N D U E R S U N r E B t O u m X o e t n o o D r r A e b o f m e T v o E e r t e d h D o u t i e u c e h d e u c e k . U E f D r o A m y o u r r e c o r d . T E D U E M S U i e A n m e m e A c t i o n / E “ O p p o m m i t y i n W e t i t i o n u m 1 L I B R A R Y M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y H Y P O M E T H Y L A T I O N O F D N A M A Y U N D E R L I E T H E H E I G H T E N E D S E N S I T I V I T Y O F T H E B B C S F 1 M O U S E T O L I V E R T U M O R I G E N E S I S V O L U M E I B y J e n n i f e r L e e C o u n t s A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l f i l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y D e p a r t m e n t o f P h a r m a c o l o g y a n d T o x i c o l o g y 1 9 9 5 A B S T R A C T H Y P O M E T H Y L A T I O N O F D N A M A Y U N D E R L I E T H E H E I G H T E N E D S E N S I T I V I T Y O F T H E B G C S F I M O U S E T O L I V E R T U M O R I G E N E S I S B y J e n n i f e r L e e C o u n t s 5 - M e t h y l c y t o s i n e ( 5 M e C ) i s a n a t u r a l l y o c c u r r i n g m e t h y l a t e d b a s e a n d i t s p r e s e n c e i n D N A p l a y s a r o l e i n r e g u l a t i n g g e n e e x p r e s s i o n . I i n v e s t i g a t e d t h e h y p o t h e s i s t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A ( a d e c r e a s e d 5 M e C c o n t e n t ) m a y u n d e r l i e t h e h e i g h t e n e d s e n s i t i v i t y o f t h e B G C S F 1 m o u s e t o l i v e r t u m o r i g e n e s i s b y f a c i l i t a t i n g a b e r r a n t o n c o g e n e e x p r e s s i o n i n v o l v e d i n t u m o r p r o m o t i o n . T o t e s t t h i s , t h r e e l i v e r t u m o r p r o m o t e r s ( a c h o l i n e - d e v o i d , m e t h i o n i n e - d e f i c i e n t ( C M D ) d i e t , p h e n o b a r b i t a l ( P B ) , a n d t h e c o - a d m i n i s t r a t i o n o f t h e C M D d i e t w i t h P B ) w e r e c o m p a r e d i n r e l a t i v e l y l i v e r t u m o r s e n s i t i v e 8 6 C 3 F 1 a n d r e l a t i v e l y l i v e r t u m o r r e s i s t a n t C S 7 B L / 6 m i c e . S p e c i f i c a l l y , I e x a m i n e d t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f D N A g l o b a l l y a n d o f s p e c i f i c o n c o g e n e s , l e v e l s o f o n c o g e n e e x p r e s s i o n , a n d l e v e l s o f h e p a t o c y t e a n d n o n - h e p a t o c y t e c e l l p r o l i f e r a t i o n . G l o b a l h y p o m e t h y l a t i o n w a s e v i d e n t i n t h e B 6 C 3 F 1 m o u s e e a r l i e r a n d t o a l a r g e r e x t e n t t h a n t h e C S 7 B L / 6 m o u s e i n r e s p o n s e t o a l l t h r e e t u m o r p r o m o t e r s . H y p o m e t h y l a t i o n o f H a - r a s a n d r a f w a s e v i d e n t i n b o t h s t r a i n s a f t e r 1 2 w e e k s o f O M B d i e t a d m i n i s t r a t i o n , b u t n o t a t e a r l i e r t i m e s . B a s a l a n d t u m o r p r o m o t e r - i n d u c e d c e l l p r o l i f e r a t i o n w a s h i g h e r i n t h e C S 7 B U 6 a s c o m p a r e d t o t h e B G C a F l . I n a d d i t i o n , t h e 8 6 0 3 F 1 e x h i b i t e d m o r e s u s t a i n e d e l e v a t e d H a - r a s a n d r a t m F i N A l e v e l s . T h e s e o b s e r v a t i o n s s u p p o r t t h e h y p o t h e s i s t h a t t h e 3 6 C 3 F 1 h a s a d e c r e a s e d a b i l i t y t o m a i n t a i n n a s c e n t m e t h y l a t i o n s t a t u s i n r e s p o n s e t o t u m o r p r o m o t i n g t r e a t m e n t s . I n a d d i t i o n , I d e m o n s t r a t e d t h a t 5 M e C w a s p r e s e n t i n t h e 5 ’ f l a n k i n g r e g i o n o f H a — r a s , a n d t h a t p o r t i o n s o f t h i s r e g i o n w e r e h y p e r m e t h y l a t e d i n l i v e r s f r o m 2 4 m o n t h o l d B G C S F 1 m i c e a s c o m p a r e d t o l i v e r s f r o m y o u n g m i c e . F i n a l l y , s p o n t a n e o u s a n d P B - i n d u c e d ( 0 . 0 5 % w / w ) 8 6 0 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s w e r e e x a m i n e d f o r g l o b a l a l t e r a t i o n s i n D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s a n d c h a n g e s i n o n c o g e n e m R N A l e v e l s . G l o b a l h y p o m e t h y l a t i o n w a s e v i d e n t m o r e f r e q u e n t l y i n c a r c i n o m a s t h a n a d e n o m a s . H a - r a s m F l N A w a s i n c r e a s e d i n s o m e s p o n t a n e o u s l i v e r t u m o r s a n d i n t h e m a j o r i t y o f P B - i n d u c e d l i v e r t u m o r s . r a f m R N A w a s u n c h a n g e d . A l t e r e d m e t h y l a t i o n a n d e x p r e s s i o n o f H a - r a s m a y p l a y a r o l e i n t h e h i g h t u m o r s u s c e p t i b i l i t y o f t h e B B C 3 F 1 m o u s e . T h e s e d a t a a r e c o n s i s t e n t w i t h t u m o r i g e n e s i s a s a s t o c h a s t i c p r o c e s s i n v o l v i n g c l o n a l e x p a n s i o n o f i n i t i a t e d c e l l s p o t e n t i a l l y b e a r i n g d i f f e r e n t p h e n o t y p e s . T h u s , t h e r e s u l t s o f t h e s e s t u d i e s s u p p o r t t h e n o t i o n s t h a t ( 1 ) h y p o m e t h y l a t i o n i s i n v o l v e d i n c a r c i n o g e n e s i s a n d ( 2 ) a d e c r e a s e d c a p a c i t y t o m a i n t a i n n a s c e n t m e t h y l a t i o n m a y , i n p a r t , u n d e r l i e t h e h i g h p r o p e n s i t y o f t h e B B C S F i m o u s e t o w a r d l i v e r t u m o r d e v e l o p m e n t . T h i s d i s s e r t a t i o n i s d e d i c a t e d t o m y g r a n d p a r e n t s , J o h n & T h e r e s a P a v l o c k a n d R o b e r t & C y n t h i a J e a n S a b e l l a . A C K N O W L E D G M E N T S I a m g r a t e f u l t o D r . J a y G o o d m a n f o r h i s g u i d a n c e t h r o u g h o u t t h i s p r o j e c t . O u r m a n y d i s c u s s i o n s h a v e f o s t e r e d m y g r o w t h s c i e n t i f i c a l l y a n d p e r s o n a l l y , f o r t h a t l w i l l a l w a y s b e a p p r e c i a t i v e . T h e a s s i s t a n c e a n d a d v i c e o f m y g u i d a n c e c o m m i t t e e , D r . E m m e t t B r a s e l t o n , D r . V e r o n i c a M a h e r , D r . J a m e s T r o s k o , a n d D r . C l i f f o r d W e l s c h , h a s a l s o b e e n i m p o r t a n t t o m e a n d i s g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e d . I n a d d i t i o n , I t h a n k t h e e a r l y w o r k b y D r . R o s e a n n V o r c e a n d D r . J e a n R a y f r o m t h i s l a b o r a t o r y ; t h e y m a d e i t p o s s i b l e f o r m y p r o j e c t t o g r o w i n d e p t h . l a m t h a n k f u l f o r t h e t e c h n i c a l a s s i s t a n c e o f f e r e d b y B e t h M o u l d s a n d J a n i c e K a z n o w s k i . Y o u m a d e i t f u n t o c o m e i n t o w o r k e a c h d a y ! F i n a n c i a l s u p p o r t i n t h e f o r m o f a c o m p e t i t i v e f e l l o w s h i p f r o m t h e S o c i e t y o f T o x i c o l o g y s p o n s o r e d b y H o f f m a n n - L a R o c h e i s g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e d . l t h a n k m y f e l l o w g r a d u a t e s t u d e n t s f o r t h e i r s u p p o r t a n d f r i e n d s h i p o v e r t h e y e a r s . L a s t , b u t c e r t a i n l y n o t l e a s t , l t h a n k m y f a m i l y ; T o m & S a n d y P a v l o c k , f o r b r i n g i n g m e i n t o t h e w o r l d , r e m i n d i n g m e t h a t I c o u l d d o a n y t h i n g , a n d e n c o u r a g i n g m e t o t r y , M i k e & A l i s o n S t a u d i n g e r , a n d D i c k & K a t h y C o u n t s f o r t h e i r s u p p o r t a n d e n c o u r a g e m e n t , a n d f i n a l l y , m y h u s b a n d , P a t r i c k C o u n t s , f o r l o v i n g m e , s u p p o r t i n g m e , a n d p r o v i d i n g m e t h e e n c o u r a g e m e n t t o “ k e e p o n p l u g g i n g ” e v e r y d a y . L I S T O F T A B L E S L I S T O F F I G U R E S L I S T O F A B B R E V I A T I O N S I N T R O D U C T I O N E p i g e n e t i c s D N A M e t h y l a t i o n D N A M e t h y l a t i o n a n d G e n e A c t i v i t y D N A M e t h y l a t i o n i n T u m o r T i s s u e a ) H y p o m e t h y l a t i o n b ) H y p e r r n e t h y l a t i o n c ) H y p o m e t h y l a t i o n i n H u m a n a n d R o d e n t T u m o r s H y p o t h e s i s a n d E x p e r i m e n t a l M o d e l T u m o r P r o m o t i o n I n v o l v i n g R e s i s t a n c e t o I n h i b i t i o n o f C e l l P r o l i f e r a t i o n : A R o l e f o r H y p o m e t h y l a t i o n o f D N A M e t h y l D e f i c i e n t D i e t s D N A D a m a g e a n d A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n D N A M e t h y l a t i o n a n d C h e m o p r e v e n t i o n D i f f e r e n c e s i n D N A M e t h y l a t i o n B e t w e e n R o d e n t s a n d H u m a n s C a p a c i t y t o M a i n t a i n a N o r m a l P a t t e r n o f M e t h y l a t i o n M e t h y l a t i o n o f t h e 5 ’ F l a n k i n g R e g i o n o f H a - r a s O B J E C T I V E S A N D S P E C I F I C A I M S O b j e c t i v e S p e c i f i c A i m s C H A P T E R 1 - P r e f a c e C H A P T E R 1 - C o m p a r a t i v e A n a l y s i s o f t h e M e t h y l a t i o n S t a t u s o f t h e 5 ' F l a n k i n g R e g i o n o f H a - r a s i n B S C S F 1 , C B H / H e a n d 0 5 7 B L / 6 M o u s e L i v e r S u m m a r y I n t r o d u c t i o n M e t h o d s S e q u e n c e A n a l y s i s A n i m a l s D N A I s o l a t i o n a n d S o u t h e r n A n a l y s i s R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n A c k n o w l e d g m e n t R e f e r e n c e s C H A P T E R 2 - P r e f a c e C H A P T E R 2 - H y p o m e t h y l a t i o n o f D N A : A N o n g e n o t o x i c M e c h a n i s m I n v o l v e d i n T u m o r P r o m o t i o n S u m m a r y v i x i i x v i i i 1 2 1 4 1 4 1 5 1 6 1 7 2 0 2 5 3 4 3 7 4 0 4 0 4 1 4 2 4 2 4 3 4 6 4 6 4 7 4 8 5 O 5 0 5 1 5 1 5 4 6 0 6 0 6 4 6 5 6 5 I n t r o d u c t i o n I n h e r i t a n c e o f P h e n o t y p e , E p i g e n e t i c s a n d D N A M e t h y l a t i o n D N A M e t h y l a t i o n a n d C a r c i n o g e n e s i s M a r k e d H y p o m e t h y l a t i o n m a y I n h i b i t T u m o r i g e n e s i s C e l l P r o l i f e r a t i o n a n d D N A M e t h y l a t i o n H y p o m e t h y l a t i o n o f D N A c a n b e V i e w e d a s a S e c o n d a r y M e c h a n i s m M o u s e L i v e r T u m o r i g e n e s i s a s a M o d e l 5 ’ F l a n k i n g R e g i o n o f H a - r a s t M o u s e v s . H u m a n D N A M e t h y l a t i o n : I m p l i c a t i o n s f o r R i s k A s s e s s m e n t A c k n o w l e d g m e n t s R e f e r e n c e s C H A P T E R 3 - P r e f a c e C H A P T E R 3 - 5 - M e t h y l c y t o s i n e i s P r e s e n t i n t h e 5 ' F l a n k i n g R e g i o n o f H a - r a s i n M o u s e L i v e r a n d I n c r e a s e s w i t h A g e i n g A b s t r a c t I n t r o d u c t i o n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s A n i m a l s D N A I s o l a t i o n P C R - B a s e d A s s e s s m e n t o f M e t h y l a t i o n S t a t u s R e s u l t s D i s c u s s i o n A c k n o w l e d g m e n t s R e f e r e n c e s C H A P T E R 4 - P r e f a c e C H A P T E R 4 - C e l l P r o l i f e r a t i o n a n d G l o b a l M e t h y l a t i o n S t a t u s C h a n g e s i n M o u s e L i v e r A f t e r P h e n o b a r b i t a l a n d / o r C h o l i n e - D e v o i d , M e t h i o n i n e - D e f i c i e n t D i e t A d m i n i s t r a t i o n A b s t r a c t I n t r o d u c t i o n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s A n i m a l s D N A I s o l a t i o n C e l l P r o l i f e r a t i o n A s s e s s m e n t G l o b a l L i v e r D N A M e t h y l a t i o n A n a l y s i s R e s u l t s C e l l P r o l i f e r a t i o n G l o b a l M e t h y l a t i o n S t a t u s D i s c u s s i o n A c k n o w l e d g m e n t s R e f e r e n c e s v i i 6 6 6 7 6 9 7 O 7 1 7 2 7 3 7 6 8 3 8 5 8 5 9 2 9 3 9 3 9 4 1 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 5 1 1 6 1 2 2 1 2 2 1 2 8 1 3 0 1 3 0 1 3 1 1 3 5 1 3 5 1 3 7 1 3 7 1 4 1 1 4 2 1 4 2 1 4 4 1 5 8 1 6 6 1 6 6 C H A P T E R 5 - P r e f a c e C H A P T E R 5 - C o m p a r i s o n o f T u m o r P r o m o t i n g T r e a t m e n t s o n D N A M e t h y l a t i o n S t a t u s a n d G e n e E x p r e s s i o n i n B S C 3 F 1 a n d C S 7 B L / 6 M o u s e L i v e r a n d i n B B C 3 F 1 M o u s e L i v e r T u m o r s A b s t r a c t I n t r o d u c t i o n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s A n i m a l s a n d T u m o r P r o m o t i n g T r e a t m e n t s A n i m a l s a n d L i v e r T u m o r s R N A a n d D N A I s o l a t i o n G l o b a l A s s e s s m e n t o f L i v e r D N A M e t h y l a t i o n S t a t u s D N A E l e c t r o p h o r e s i s a n d S o u t h e r n A n a l y s i s S A M S y n t h e t a s e R N A E l e c t r o p h o r e s i s a n d N o r t h e r n A n a l y s i s I m a g e A n a l y s i s t o Q u a n t i t a t e C h a n g e s i n m R N A L e v e l s R e s u l t s M e t h y l a t i o n S t a t u s o f H a - r a s a n d r a f C M D D i e t - I n d u c e d C h a n g e s i n m R N A L e v e l s : H a - r a s , r a f , a n d S A M S y n t h e t a s e ( T a b l e 1 ) P B - l n d u c e d C h a n g e s i n m R N A L e v e l s : H a - r a s , r a f , a n d S A M S y n t h e t a s e ( T a b l e 2 ) C M D - D i e t C o - A d m i n i s t e r e d w i t h P B - l n d u c e d C h a n g e s i n m R N A L e v e l s : H a - r a s , r a f , a n d S A M S y n t h e t a s e ( T a b l e 3 ) G l o b a l L i v e r M e t h y l a t i o n S t a t u s E x p r e s s i o n o f H a - r a s , r a f , a n d S A M S y n t h e t a s e i n 8 6 C 3 F 1 M o u s e L i v e r T u m o r s D i s c u s s i o n A c k n o w l e d g m e n t s R e f e r e n c e s D I S C U S S I O N C h a n g e s i n D N A M e t h y l a t i o n a n d C a n c e r R o l e s f o r A l t e r a t i o n s i n D N A M e t h y l a t i o n i n C a r c i n o g e n e s i s H y p o m e t h y l a t i o n H y p e r m e t h y l a t i o n M u t a t i o n C o n c l u s i o n s S U M M A R Y A N D C O N C L U S I O N S S y n o p s i s o f S i g n i f i c a n t F i n d i n g s S p e c i f i c A i m s a n d S i g n i f i c a n t F i n d i n g s O v e r a l l C o n c l u s i o n s A P P E N D I X 1 - V e r i f i c a t i o n o f P C R P r o d u c t s f r o m t h e 5 ' F l a n k i n g R e g i o n o f H a - r a s v i i i 1 7 3 1 7 5 1 7 5 1 7 6 1 7 9 1 7 9 1 8 1 1 8 1 1 8 1 1 8 2 1 8 4 1 8 4 1 8 6 1 8 6 1 8 6 1 8 7 1 9 3 1 9 5 1 9 5 2 0 1 2 0 1 2 0 9 2 1 0 2 1 6 2 1 7 2 1 8 2 1 9 2 2 1 2 2 2 2 2 4 2 2 8 2 2 8 2 2 9 2 3 3 2 3 9 A P P E N D I X 2 - M e t h y l a t i o n S t a t u s o f C C G G S i t e s i n M o u s e L i v e r : H p a l l M e t h y l a s e A P P E N D I X 3 - C e l l P r o l i f e r a t i o n : A d d i t i o n a l l n f o r r n a t i o n A P P E N D I X 4 - M e t h y l a t i o n S t a t u s o f H a - r a s i n B G C S F 1 a n d C S 7 B L / 6 M o u s e L i v e r A f t e r C M D D i e t , P B , o r C M D D i e t + P B f o r 1 , 2 , a n d 4 W e e k s A P P E N D I X 5 - V a r i a b l e P r e s e n c e o f t h e r a f 6 . 7 k b B a n d i n t h e M s p l L a n e A P P E N D I X 6 - D e s c r i p t i o n o f I m a g e A n a l y s i s - B a s e d Q u a n t i f i c a t i o n o f m R N A E x p r e s s i o n L I S T O F R E F E R E N C E S : I N T R O D U C T I O N . D I S C U S S I O N , a n d A P P E N D I C E S 2 5 3 2 6 6 2 9 3 3 0 0 3 0 5 3 1 1 L I S T O F T A B L E S C H A P T E R 3 T a b l e 1 : R e s t r i c t i o n E n z y m e s a n d R e c o g n i t i o n S i t e s U t i l i z e d i n t h e A s s e s s m e n t o f t h e M e t h y l a t i o n S t a t u s o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H e - r a s ( M c C l e l l a n d a n d N e l s o n , 1 9 9 2 ) T a b l e 2 : I n c r e a s e s i n 5 M e C C o n t e n t w i t h A g e i n t h e 5 ' F l a n k i n g R e g i o n o f H a - r a s i n B G C 3 F 1 M o u s e L i v e r C H A P T E R 5 T a b l e 1 : C M D D i e t - I n d u c e d C h a n g e s i n m R N A L e v e l s T a b l e 2 : P B — l n d u c e d C h a n g e s i n m R N A L e v e l s T a b l e 3 : C M D D i e t C o - A d m i n i s t e r e d w i t h P B - I n d u c e d C h a n g e s i n m R N A L e v e l s D I S C U S S I O N T a b l e 1 : D N A M e t h y l a t i o n M a y P l a y a V a r i e t y o f R o l e s i n C a r c i n o g e n e s i s A P P E N D I X 2 T a b l e 1 : B S C S F 1 H p a l l M e t h y l a s e R e a c t i o n s - A v e r a g e d V a l u e s T a b l e 2 : C 5 7 B L / 6 H p a l l M e t h y l a s e R e a c t i o n s - A v e r a g e d V a l u e s T a b l e 3 : 8 6 C 3 F 1 S s s l M e t h y l a s e R e a c t i o n s - A v e r a g e d V a l u e s T a b l e 4 : 0 5 7 B L / 6 S s s l M e t h y l a s e R e a c t i o n s - A v e r a g e d V a l u e s A P P E N D I X 3 T a b l e 1 : B G C S F I A n i m a l K e y T a b l e 2 : B G C 3 F 1 H e p a t o c y t e L a b e l i n g I n d e x T a b l e 3 : B G C 3 F 1 N o n - H e p a t o c y t e L a b e l i n g I n d e x X 1 0 3 1 1 5 1 9 2 1 9 4 1 9 6 2 2 5 2 5 4 2 5 5 2 5 6 2 5 7 2 6 7 2 6 8 2 6 9 T a b l e 4 : C S 7 B U 6 A n i m a l K e y T a b l e 5 : C S 7 B L / 6 H e p a t o c y t e L a b e l i n g I n d e x T a b l e 6 : C S 7 B L / 6 N o n - H e p a t o c y t e L a b e l i n g I n d e x T a b l e 7 : N o n - H e p a t o c y t e F r a c t i o n o f B 6 C 3 F 1 T o t a l N u c l e i T a b l e 8 : N o n - H e p a t o c y t e F r a c t i o n o f B G C S F 1 L a b e l e d N u c l e i T a b l e 9 : N o n - H e p a t o c y t e F r a c t i o n o f C S 7 B L / 6 T o t a l N u c l e i T a b l e 1 0 : N o n - H e p a t o c y t e F r a c t i o n o f C S 7 B L / 6 L a b e l e d N u c l e i A P P E N D I X 6 T a b l e 1 : N o r m a l i z a t i o n o f S A M S y n t h e t a s e m R N A t o 2 8 8 R N A x i 2 7 4 2 7 5 2 7 6 2 8 9 2 9 0 2 9 1 2 9 2 3 1 0 L I S T O F F I G U R E S I N T R O D U C T I O N F i g u r e 1 - T h e i n t e r p l a y b e t w e e n f a c t o r s i n f l u e n c i n g m u t a t i o n a n d m e t h y l a t i o n o f D N A , a n d h o w t h e s e c a n l e a d t o a b e r r a n t g e n e e x p r e s s i o n F i g u r e 2 - S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f m a i n t e n a n c e m e t h y l a t i o n o f D N A f o l l o w i n g D N A r e p l i c a t i o n ( m o d i f i e d f r o m H e r g e r s b e r g , 1 9 9 1 ) F i g u r e 3 - P h e n o b a r b i t a l ( P B ) p r o m o t i o n m a y i n v o l v e t h e e x p a n s i o n o f p o p u l a t i o n s o f c e l l s t h a t h a v e o v e r c o m e t h e i n h i b i t o r y e f f e c t s o f P B o n c e l l p r o l i f e r a t i o n F i g u r e 4 - P o t e n t i a l m e c h a n i s m ( s ) o f a c t i o n o f c h o l i n e - d e v o i d , m e t h i o n i n e - d e f i c i e n t ( C M D ) d i e t s i n r o d e n t l i v e r C H A P T E R 1 F i g u r e 1 - S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f m o u s e c - H a - r a s , p l u s a p o r t i o n o f t h e c o d i n g r e g i o n F i g u r e 2 - M e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e f r a g m e n t o f H a - r a s o b t a i n e d b y M b o l d i g e s t i o n F i g u r e 3 - M e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e f r a g m e n t o f H a - r a s o b t a i n e d b y S t y l d i g e s t i o n F i g u r e 4 - M e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e f r a g m e n t o f H a - r a s o b t a i n e d b y S t y l d i g e s t i o n C H A P T E R 2 F i g u r e 1 - D i s t r i b u t i o n o f c y t o s i n e ( C ) a n d g u a n i n e ( G ) b a s e s , a n d C p G d i n u c l e o t i d e s i n t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s F i g u r e 2 - A c o m p a r i s o n o f t h e b a s e s e q u e n c e o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s i n S E N C A R m o u s e a n d N M R I m o u s e D N A x i i 1 0 2 3 3 0 5 3 5 6 5 7 5 8 7 8 8 0 F i g u r e 3 - A c o m p a r i s o n o f t h e b a s e s e q u e n c e o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s i n N M R I m o u s e a n d h u m a n D N A 8 1 F i g u r e 4 - A c o m p a r i s o n o f t h e b a s e s e q u e n c e o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s i n S E N C A R m o u s e a n d h u m a n D N A 8 2 C H A P T E R 3 F i g u r e 1 - D i s t r i b u t i o n o f t h e r a t i o o f o b s e r v e d t o e x p e c t e d C p G s i t e s i n t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s 9 9 F i g u r e 2 - M e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e r e g i o n a m p l i f i e d b y t h e 5 / 8 P C R p r i m e r s e t i n y o u n g m o u s e l i v e r 1 0 6 F i g u r e 3 - M e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e r e g i o n a m p l i f i e d b y t h e 6 / 7 P C R p r i m e r s e t i n y o u n g m o u s e l i v e r 1 0 8 F i g u r e 4 - M e t h y l a t i o n s t a t u s o f C C G G s i t e s i n t h e r e g i o n a m p l i f i e d b y t h e ( A ) 6 / 7 P C R p r i m e r s e t a n d ( B ) 5 / 8 P C R p r i m e r s e t i n y o u n g m o u s e l i v e r 1 1 0 F i g u r e 5 - S u m m a r y o f c y t o s i n e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e p o r t i o n o f t h e 5 ’ f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s a m p l i f i e d b y P C R p r i m e r s e t 5 / 8 i n y o u n g m o u s e l i v e r 1 1 1 F i g u r e 6 - S u m m a r y o f c y t o s i n e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e p o r t i o n o f t h e 5 ’ f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s a m p l i f i e d b y P C R p r i m e r s e t 6 / 7 i n y o u n g m o u s e l i v e r 1 1 2 F i g u r e 7 - M e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e r e g i o n a m p l i f i e d b y t h e 5 / 8 P C R p r i m e r s e t i n t h e l i v e r o f 2 4 m o n t h o l d B 6 C 3 F 1 m i c e 1 1 3 F i g u r e 8 - M e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e X h o l s i t e i n t h e r e g i o n a m p l i f i e d b y t h e 6 / 7 P C R p r i m e r s e t i n y o u n g a n d a g e d m o u s e l i v e r 1 1 4 C H A P T E R 4 F i g u r e 1 - D i g i t i z e d i m a g e o f M a c i n t o s h c o m p u t e r - a s s i s t e d a s s e s s m e n t o f c e l l p r o l i f e r a t i o n 1 3 9 F i g u r e 2 - C o m p a r i s o n o f c o n t r o l l a b e l i n g i n d e x ( L l ) i n h e p a t o c y t e s v e r s u s n o n - h e p a t o c y t e s i n B G C 3 F 1 a n d C S 7 B L / 6 m o u s e l i v e r 1 4 3 F i g u r e 3 - H e p a t o c y t e l a b e l i n g i n d e x i n B 6 0 3 F 1 a n d C S 7 B L / 6 m a l e m i c e a f t e r C M D d i e t a d m i n i s t r a t i o n f o r 1 , 2 , o r 4 w e e k s , a n d t h e r e c o v e r y g r o u p ( 4 w e e k s d i e t f o l l o w e d b y 2 w e e k s o f c o n t r o l d i e t ) 1 4 6 x i i i F i g u r e 4 - H e p a t o c y t e l a b e l i n g i n d e x i n B 6 C 3 F 1 a n d C 5 7 B L / 6 m a l e m i c e a f t e r a p r o m o t i n g d o s e o f P B f o r 1 , 2 , o r 4 w e e k s a n d t h e r e c o v e r y g r o u p ( 4 w e e k s P B f o l l o w e d b y 2 w e e k s w i t h o u t ) 1 4 8 F i g u r e 5 - H e p a t o c y t e l a b e l i n g i n d e x i n B G C S F 1 a n d C 5 7 B L / 6 m a l e m i c e a f t e r c o - a d m i n i s t r a t i o n o f a C M D d i e t a n d 0 . 0 5 % P B f o r 1 , 2 , o r 4 w e e k s a n d t h e r e c o v e r y g r o u p ( 4 w e e k s t r e a t m e n t f o l l o w e d b y 2 w e e k s o f c o n t r o l ) 1 5 0 F i g u r e 6 - E f f e c t o f t h e a d m i n i s t r a t i o n o f a C M D d i e t o n t h e g l o b a l m e t h y l a t i o n s t a t u s o f l i v e r D N A i n B 6 C 3 F 1 a n d C S 7 B L / 6 m a l e m i c e 1 5 3 F i g u r e 7 - E f f e c t o f t h e a d m i n i s t r a t i o n o f 0 . 0 5 % P B i n t h e d r i n k i n g w a t e r o n t h e g l o b a l m e t h y l a t i o n s t a t u s o f l i v e r D N A i n B B C 3 F 1 a n d C S 7 B L / 6 m a l e m i c e 1 5 5 F i g u r e 8 - E f f e c t o f t h e c o - a d m i n i s t r a t i o n o f a C M D d i e t a n d 0 . 0 5 % P B i n t h e d r i n k i n g w a t e r o n t h e g l o b a l m e t h y l a t i o n s t a t u s o f l i v e r D N A i n B 6 C 3 F 1 a n d C 5 7 B L / 6 m a l e m i c e 1 5 7 C H A P T E R 5 F i g u r e 1 - M e t h y l a t i o n s t a t u s o f H a - r a s i n ( A ) B B C 3 F 1 a n d ( B ) C 5 7 B L / 6 m o u s e l i v e r a f t e r C M D d i e t a d m i n i s t r a t i o n f o r 1 2 w e e k s 1 8 9 F i g u r e 2 - M e t h y l a t i o n s t a t u s o f r e f i n ( A ) B G C 3 F 1 a n d ( B ) C 5 7 B L / 6 m o u s e l i v e r a f t e r C M D d i e t a d m i n i s t r a t i o n f o r 1 2 w e e k s 1 9 1 F i g u r e 3 - G l o b a l m e t h y l a t i o n s t a t u s o f s p o n t a n e o u s a d e n o m a s a n d c a r c i n o m a s f r o m B 6 C S F 1 m o u s e l i v e r 1 9 8 F i g u r e 4 - G l o b a l m e t h y l a t i o n s t a t u s o f P B - i n d u c e d a d e n o m a s a n d c a r c i n o m a s f r o m B 6 C 3 F 1 m o u s e l i v e r 2 0 0 F i g u r e 5 - m R N A e x p r e s s i o n o f H a - r a s , r a f , S A M s y n t h e t a s e , a n d 2 8 8 i n s p o n t a n e o u s a d e n o m a s a n d c a r c i n o m a s f r o m B 6 C 3 F 1 m o u s e l i v e r 2 0 2 F i g u r e 6 - m R N A e x p r e s s i o n o f H a - r a s , r a f , S A M s y n t h e t a s e , a n d 2 8 8 i n P B - i n d u c e d c a r c i n o m a s f r o m B 6 C 3 F 1 m o u s e l i v e r 2 0 3 S U M M A R Y A N D C O N C L U S I O N S F i g u r e 1 - P r o p o s e d m o d e l f o r t h e h e i g h t e n e d s e n s i t i v i t y o f t h e B S C 3 F 1 m o u s e t o I i v e r t u m o r i g e n e s i s 2 3 6 x i v A P P E N D I X 1 F i g u r e 1 - A n a l y s i s o f t h e p o r t i o n o f t h e 5 ’ f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s a m p l i f i e d b y p r i m e r s e t 5 / 8 t o d e t e r m i n e l o c a t i o n o f a r e c o g n i t i o n s i t e f o r a r e s t r i c t i o n e n z y m e t h a t c o u l d b e e m p l o y e d a s a “ d i a g n o s t i c ” e n z y m e 2 4 0 F i g u r e 2 - C o n f i r m a t i o n o f r e s t r i c t i o n o f t h e r e g i o n a m p l i f i e d b y P C R p r i m e r s 5 / 8 b y R s a l 2 4 1 F i g u r e 3 - A n a l y s i s o f t h e p o r t i o n o f t h e 5 ’ f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s a m p l i f i e d b y p r i m e r s e t 6 / 7 t o d e t e r m i n e l o c a t i o n o f a r e c o g n i t i o n s i t e f o r a r e s t r i c t i o n e n z y m e t h a t c o u l d b e e m p l o y e d a s a “ d i a g n o s t i c " e n z y m e 2 4 3 F i g u r e 4 - C o n f i r m a t i o n o f r e s t r i c t i o n o f t h e r e g i o n a m p l i f i e d b y P C R p r i m e r s 6 / 7 b y H i n c l l 2 4 4 F i g u r e 5 - D i d e o x y s e q u e n c i n g l a d d e r o f t h e p o r t i o n o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s a m p l i f i e d b y P C R p r i m e r s e t 5 / 8 2 4 9 F i g u r e 6 - C o m p a r i s o n o f s e q u e n c e o b t a i n e d f r o m p r i m e r 8 u s i n g D N A f r o m B 6 C 3 F 1 m o u s e l i v e r w i t h l i t e r a t u r e s e q u e n c e s o f t h i s r e g i o n f o r S E N C A R a n d N M R I m i c e - 2 5 0 F i g u r e 7 - L i m i t e d P C R c a r r i e d o u t f o r o p t i m i z a t i o n o f t h e n u m b e r o f r o u n d s o f a m p l i f i c a t i o n t o u s e f o r P C R p r i m e r s e t 5 / 8 2 5 1 F i g u r e 8 - L i m i t e d P C R c a r r i e d o u t f o r o p t i m i z a t i o n o f t h e n u m b e r o f r o u n d s o f a m p l i f i c a t i o n t o u s e f o r P C R p r i m e r s e t 6 / 7 2 5 2 A P P E N D I X 2 F i g u r e 1 - E f f e c t o f t h e a d m i n i s t r a t i o n o f a C M D d i e t o n t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f H p a l l s i t e s o f l i v e r D N A i n B 6 C S F 1 a n d C 5 7 B L / 6 m a l e m i c e 2 6 1 F i g u r e 2 - E f f e c t o f t h e a d m i n i s t r a t i o n o f a p r o m o t i n g d o s e o f P B i n t h e d r i n k i n g w a t e r ( 0 . 0 5 % w / w ) o n t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f H p a l l s i t e s o f l i v e r D N A i n B 6 C 3 F 1 a n d C S 7 B L / 6 m a l e m i c e 2 6 3 F i g u r e 3 - E f f e c t o f t h e c o - a d m i n i s t r a t i o n o f a C M D d i e t a n d a p r o m o t i n g d o s e o f P B i n t h e d r i n k i n g w a t e r ( 0 . 0 5 % w / w ) o n t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f H p a l l s i t e s o f l i v e r D N A i n B 6 0 3 F 1 a n d C 5 7 B L / 6 m a l e m i c e 2 6 5 X V A P P E N D I X 3 F i g u r e 1 - C h a n g e s i n “ h e p a t o c y t e ” c e l l p o p u l a t i o n s i n B G C S F 1 t o t a l n u c l e i w i t h C M D d i e t , P B , a n d C M D d i e t + P B a f t e r 1 , 2 , o r 4 w e e k s a n d t h e r e c o v e r y ( 4 w e e k s t r e a t e d d i e t f o l l o w e d b y 2 w e e k s c o n t r o l ) 2 7 1 F i g u r e 2 - C h a n g e s i n “ h e p a t o c y t e ” c e l l p o p u l a t i o n s i n B 6 0 3 F 1 l a b e l e d n u c l e i w i t h C M D d i e t , P B , a n d C M D d i e t + P B a f t e r 1 , 2 , o r 4 w e e k s a n d t h e r e c o v e r y ( 4 w e e k s t r e a t e d d i e t f o l l o w e d b y 2 w e e k s c o n t r o l ) 2 7 3 F i g u r e 3 - C h a n g e s i n “ h e p a t o c y t e ” c e l l p o p u l a t i o n s i n C 5 7 B L / 6 t o t a l n u c l e i w i t h C M D d i e t , P B , a n d C M D d i e t + P B a f t e r 1 , 2 , o r 4 w e e k s a n d t h e r e c o v e r y ( 4 w e e k s t r e a t e d d i e t f o l l o w e d b y 2 w e e k s c o n t r o l ) 2 7 8 F i g u r e 4 - C h a n g e s i n “ h e p a t o c y t e ” c e l l p o p u l a t i o n s i n C S 7 B L / 6 l a b e l e d n u c l e i w i t h C M D d i e t , P B , a n d C M D d i e t + P B a f t e r 1 , 2 , o r 4 w e e k s a n d t h e r e c o v e r y ( 4 w e e k s t r e a t e d d i e t f o l l o w e d b y 2 w e e k s c o n t r o l ) 2 8 0 F i g u r e 5 - N o n - h e p a t o c y t e l a b e l i n g i n d e x i n 8 6 C 3 F 1 a n d C S 7 B L / 6 m a l e m i c e a f t e r C M D d i e t a d m i n i s t r a t i o n f o r 1 , 2 , o r 4 w e e k s , a n d t h e r e c o v e r y g r o u p ( 4 w e e k s , C M D d i e t f o l l o w e d b y 2 w e e k s c o n t r o l ) 2 8 2 F i g u r e 6 - N o n - h e p a t o c y t e l a b e l i n g i n d e x i n B 6 C S F 1 a n d C S 7 B L / 6 m a l e m i c e a f t e r P B a d m i n i s t r a t i o n f o r 1 , 2 , o r 4 w e e k s , a n d t h e r e c o v e r y g r o u p ( 4 w e e k s t r e a t m e n t f o l l o w e d b y 2 w e e k s w i t h o u t ) 2 8 4 F i g u r e 7 - N o n - h e p a t o c y t e l a b e l i n g i n d e x i n B 6 0 3 F 1 a n d C S 7 B L / 6 m a l e m i c e a f t e r t h e c o - a d m i n i s t r a t i o n o f a C M D d i e t a n d P B f o r 1 , 2 , o r 4 w e e k s , a n d t h e r e c o v e r y g r o u p ( 4 w e e k s t r e a t m e n t d i e t f o l l o w e d b y 2 w e e k s w i t h o u t ) 2 8 6 A P P E N D I X 4 F i g u r e 1 - M e t h y l a t i o n s t a t u s o f H a - r a s i n ( A ) B 6 0 3 F 1 a n d ( B ) C S 7 B L / 6 m o u s e l i v e r a f t e r C M D d i e t , P B , a n d C M D d i e t + P B a d m i n i s t r a t i o n f o r 1 w e e k 2 9 5 F i g u r e 2 - M e t h y l a t i o n s t a t u s o f H a - r a s i n ( A ) B 6 0 3 F 1 a n d ( B ) C 5 7 B L / 6 m o u s e l i v e r a f t e r C M D d i e t , P B , a n d C M D d i e t + P B a d m i n i s t r a t i o n f o r 2 w e e k s 2 9 7 x v i F i g u r e 3 - M e t h y l a t i o n s t a t u s o f H a - r a s i n ( A ) B 6 C S F 1 a n d ( B ) C S 7 B L / 6 m o u s e l i v e r a f t e r C M D d i e t , P B , a n d C M D d i e t + P B a d m i n i s t r a t i o n f o r 4 w e e k s A P P E N D I X 5 F i g u r e 1 - V a r i a b l e p r e s e n c e o f t h e r e f 6 . 7 k b b a n d i n B 6 C 3 F 1 m o u s e l i v e r F i g u r e 2 - E f f e c t o f p r o l o n g e d d i g e s t i o n w i t h M s p l o n t h e p r e s e n c e o f t h e r a f 6 . 7 k b b a n d A P P E N D I X 6 F i g u r e 1 - I m a g e a n a l y s i s t o q u a n t i f y m R N A e x p r e s s i o n o f C S 7 B L / 6 w e e k 2 R N A F i g u r e 2 - P i x e l d e n s i t i e s f r o m N I H I m a g e o f t h e s c a n n e d a u t o r a d i o g r a p h s f o r ( A ) S A M s y n t h e t a s e a n d ( B ) 2 8 8 R N A x v i i 2 9 9 3 0 2 3 0 4 3 0 7 3 0 9 5 M e C A T P A z a C b p B r d U C M D c p m D A G D E N D M S O D N A D N A M T a s e d N T P s E G F E G F - R E R E G G T L I S T O F A B B R E V I A T I O N S 5 - m e t h y l c y t o s i n e a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e 5 - a z a c y t i d i n e b a s e p a i r b r o m o d e o x y u r i d i n e c h o l i n e - d e v o i d , m e t h i o n i n e - d e f i c i e n t c o u n t s p e r m i n u t e d i a c y l g y l c e r o l d i e t h y l n i t r o s a m i n e d i m e t h y l s u l f o x i d e d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d D N A - ( c y t o s i n e - 5 ) - m e t h y l t r a n s f e r a s e d e o x y A T P , d e o x y T T P , d e o x y C T P , d e o x y G T P e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r - r e c e p t o r e s t r o g e n r e s p o n s i v e e l e m e n t y - g l u t a m y l t r a n s p e p t i d a s e x v i i i H a - r a s H P L C I P 3 k b K i - r a s L l M 6 P - l G F 2 r M D B P M L T m R N A o b / e x p 2 1 P B P C R P K C P L C P S K P T K R N A r R N A S A H S A M S S C H a r v e y r a s h i g h p r e s s u r e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y i n o s i t o l t r i p h o s p h a t e k i l o b a s e p a i r K i r s t e n r a s l a b e l i n g i n d e x m a n n o s e - 6 - p h o s p h a t e / i n s u l i n - l i k e g r o w t h f a c t o r 2 r e c e p t o r m e t h y l a t e d D N A b i n d i n g p r o t e i n m o u s e l i v e r t u m o r s m e s s e n g e r r i b o n u c l e i c a c i d r a t i o o f o b s e r v e d t o e x p e c t e d p r o t e i n p r o d u c t o f H a - r a s p h e n o b a r b i t a l p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n p r o t e i n k i n a s e C p h o s p h o l i p a s e C p r o t e i n s e r i n e k i n a s e p r o t e i n t y r o s i n e k i n a s e r i b o n u c l e i c a c i d r i b o s o m a l r i b o n u c l e i c a c i d S - a d e n o s y l h o m o c y s t i n e S - a d e n o s y l - L - m e t h i o n i n e s t a n d a r d s o d i u m c h l o r i d e , s o d i u m c i t r a t e b u f f e r x i x S D S T B E T G F B T M A C T P A T R E V H L V L D L s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e t r i s b o r a t e E D T A b u f f e r t r i s E D T A b u f f e r t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r B t e t r a m e t h y l a m m o n i u m c h l o r i d e 1 2 - O - t e t r a d e c a n o y l p h o r b o l - 1 3 - a c e t a t e T P A r e s p o n s i v e e l e m e n t u n i t s v o n H i p p e I - L i n d a u v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s X X I N T R O D U C T I O N C a r c i n o g e n e s i s i s a m u l t i s t a g e , m u l t i s t e p p r o c e s s c o n s i s t i n g o f a t l e a s t t h r e e e x p e r i m e n t a l l y d e f i n e d s t a g e s : i n i t i a t i o n , p r o m o t i o n , a n d p r o g r e s s i o n ( P i t o t , 1 9 9 0 ; D r a g a n e t a l . , 1 9 9 3 ) . I n e x p e r i m e n t a l m o d e l s i t i s p o s s i b l e t o d e m o n s t r a t e t h a t a c h e m i c a l e x e r t s i t s c a r c i n o g e n i c e f f e c t b y a c t i n g a t a p a r t i c u l a r s t a g e . F o r e x a m p l e , m a n y c h e m i c a l s ( b u t n o t a l l ) t h a t a c t a s m u t a g e n s a r e e f f e c t i v e i n i t i a t i n g a g e n t s . T h e i n i t i a t i o n s t a g e i s d e f i n e d a s a n i r r e v e r s i b l e c h a n g e t o t h e D N A b a s e s e q u e n c e , p r o b a b l y a m u t a t i o n , d u e t o t h e i n t e r a c t i o n o f a c h e m i c a l w i t h D N A . P r o m o t i n g a g e n t s a r e c a p a b l e o f f a c i l i t a t i n g t h e c l o n a l e x p a n s i o n o f i n i t i a t e d c e l l s p o t e n t i a l l y l e a d i n g t o a t u m o r . T h i s i n v o l v e s i n c r e a s e d c e l l p r o l i f e r a t i o n ( B u t t e w v o r t h e t a l . , 1 9 9 1 ) a n d / o r d e c r e a s e d a p o p t o s i s ( S c h u l t e - H e r m a n n e t a l . , 1 9 9 0 ; B u r s c h e t a l . , 1 9 9 3 ; S c h u l t e - H e r m a n n e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h e p o t e n t i a l e x i s t s f o r t h e d e v e l o p m e n t o f s p o n t a n e o u s m u t a t i o n s ( s o m e o f w h i c h m a y c o n s t i t u t e a n i n i t i a t i n g e v e n t ) d u r i n g p e r i o d s o f c e l l p r o l i f e r a t i o n e . g . , c o m p e n s a t o r y h y p e r p l a s i a i n r e s p o n s e t o n e c r o s i s ( A m e s a n d G o l d , 1 9 9 0 ) a n d f o l l o w i n g t r e a t m e n t w i t h p r o m o t i n g a g e n t s . T h e p r o g r e s s i o n s t a g e o f c a r c i n o g e n e s i s i s c h a r a c t e r i z e d b y c h a n g e s i n p l o i d y a n d a u t o n o m o u s c l o n a l e x p a n s i o n , i . e . , t h e p r e s e n c e o f a p r o m o t e r i s n o l o n g e r r e q u i r e d ( D r a g a n e t a l . , 1 9 9 3 ) . T h e t e r m s i n i t i a t i o n a n d p r o m o t i o n r e f e r t o m o d e s o f a c t i o n ( r e f e r e n c e d i n M c C l a i n , 1 9 9 4 ) . I n i t i a t i n g a g e n t s a c t b y a g e n o t o x i c m e c h a n i s m , i . e . , e i t h e r t h e c h e m i c a l o r o n e o f i t s m e t a b o l i t e s r e a c t s d i r e c t l y w i t h D N A ( W i l l i a m s , 1 9 8 0 ) . H o w e v e r , t h e m u l t i s t a g e m o d e l w a s n o t i n t e n d e d t o c o n n o t e t h a t m u t a t i o n o n l y o c c u r s d u r i n g i n i t i a t i o n o r t h a t p r o m o t i o n o n l y i n v o l v e s 2 e n h a n c i n g c e l l p r o l i f e r a t i o n o f a n d / o r ' p r e v e n t i n g a p o p t o s i s o f i n i t i a t e d c e l l s . A l t e r a t i o n s t o t h e g e n o m e o c c u r a t a v a r i e t y o f p o i n t s i n t h e c a r c i n o g e n i c p r o c e s s ( V o g e l s t e i n e t a l . , 1 9 8 8 ; M a r x , 1 9 9 1 ) . C h e m i c a l s t h a t f o r m D N A a d d u c t s a n d h a v e t h e p o t e n t i a l t o a c t a s i n i t i a t i n g a g e n t s a r e r e f e r e d t o a s g e n o t o x i c c h e m i c a l s ( W i l l i a m s , 1 9 8 9 ; B e n i g n i a n d A n d r e o l i , 1 9 9 3 ; M a t t h e w s a t a l . , 1 9 9 3 ; S u l l i v a n e t a l , 1 9 9 3 ; C h a n g e t a l . , 1 9 9 4 ; M i l l e r , 1 9 9 4 ) . T h e r e i s a n e e d t o b e t t e r u n d e r s t a n d n o n g e n o t o x i c m e c h a n i s m s o f c a r c i n o g e n e s i s . P r o m o t i n g a g e n t s a r e n o n g e n o t o x i c , t h a t i s , n e i t h e r t h e c o m p o u n d n o r a n y o f i t s m e t a b o l i t e s i n t e r a c t s d i r e c t l y w i t h D N A ( W i l l i a m s , 1 9 8 0 ) . A l t e r a t i o n s i n D N A m e t h y l a t i o n , m o s t c o m m o n l y h y p o m e t h y l a t i o n , c a n a c t a s a n e p i g e n e t i c , n o n g e n o t o x i c m e c h a n i s m t o f a c i l i t a t e t h e a b e r r a n t e x p r e s s i o n o f o n c o g e n e s t h a t i s i n v o l v e d i n c a r c i n o g e n e s i s . A s s t a t e d a b o v e , n o n g e n o t o x i c c a r c i n o g e n s d o n o t d i r e c t l y i n t e r a c t w i t h D N A . T h e s e c o m p o u n d s m a y e x e r t t h e i r e f f e c t s i n a v a r i e t y o f w a y s ( W i l l i a m s a n d W e i s b e r g e r , 1 9 9 1 ; M c C l a i n , 1 9 9 4 ) , f o r e x a m p l e , b y c a u s i n g c y t o t o x i c i t y o r c h r o n i c t i s s u e i r r i t a t i o n , e n h a n c i n g c e l l p r o l i f e r a t i o n , i n d u c i n g h o r m o n e i m b a l a n c e s , a l t e r i n g i m m u n e f u n c t i o n , i n h i b i t i n g n o r m a l c e l l - c e l l c o m m u n i c a t i o n , o r f a c i l i t a t i n g a b e r r a n t g e n e e x p r e s s i o n , p o s s i b l y a s a c o n s e q u e n c e o f a l t e r i n g D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s ( G o o d m a n a n d C o u n t s , 1 9 9 3 ; C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 ; 1 9 9 5 3 ; 1 9 9 5 c ; 1 9 9 5 d ) D N A m e t h y l a t i o n p l a y s a r o l e i n t h e r e g u l a t i o n o f g e n e a c t i v i t y . H y p o m e t h y l a t i o n ( i . e . , d e c r e a s e d 5 - m e t h y l c y t o s i n e ( 5 M e C ) c o n t e n t ) o f a g e n e i s n e c e s s a r y , b u t n o t s u f f i c i e n t , f o r i t s e x p r e s s i o n , t h e r e f o r e a h y p o m e t h y l a t e d c e l l . T h u s , h y p o m e t h y l a t i o n a n d m u t a t i o n c a n b e v i e w e d a s c o m p l e m e n t a r y 3 g e n e c a n b e c o n s i d e r e d t o p o s s e s s a n i n c r e a s e d p o t e n t i a l f o r e x p r e s s i o n a s c o m p a r e d t o a h y p e r m e t h y l a t e d g e n e ( r e f e r e n c e d i n V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 8 9 ) . A l t e r a t i o n s i n D N A m e t h y l a t i o n c a n e n h a n c e t h e e x p r e s s i o n o f o n c o g e n e s a n d / o r i n t e r f e r e w i t h t h e e x p r e s s i o n o f t u m o r s u p p r e s s o r g e n e s . T h i s c a n o c c u r v i a h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A t h a t f a c i l i t a t e s i n c r e a s e d , a b e r r a n t e x p r e s s i o n o f d o m i n a n t - a c t i n g o n c o g e n e s a n d / o r b y h y p e r m e t h y l a t i o n o f D N A f a c i l i t a t i n g a b e r r a n t , d e c r e a s e d e x p r e s s i o n o f r e c e s s i v e - a c t i n g t u m o r s u p p r e s s o r g e n e s . H y p o m e t h y l a t i o n m a y b e a m e c h a n i s m u n d e r l y i n g t h e r o l e o f c e l l p r o l i f e r a t i o n i n c a r c i n o g e n e s i s ( G o o d m a n a n d C o u n t s , 1 9 9 3 ) , a n d h y p o m e t h y l a t i o n c o u l d p o s s i b l y r e s u l t f r o m a n e n z y m a t i c r e p l a c e m e n t o f 5 M e C w i t h c y t o s i n e t h a t i s n o t l i n k e d t o D N A r e p l i c a t i o n ( V a i r a p a n d i a n d D u k e r , 1 9 9 3 ) . A d d i t i o n a l l y , t h e i m p o r t a n c e o f t h e p r e s e n c e o f t h e D N A - ( c y t o s i n e - 5 ) - m e t h y l t r a n s f e r a s e ( D N A M T a s e ) g e n e w i l l b e d i s c u s s e d i n t h e c o n t e x t o f D N A M T a s e k n o c k o u t m i c e , a n d e m p h a s i s w i l l b e p l a c e d o n t h e r o l e t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A m a y p l a y i n t u m o r p r o m o t i o n ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 ; 1 9 9 5 0 ) . T h e p r e s e n c e o f D N A a d d u c t s ( e . g . , O s - m e t h y l g u a n i n e ) c a n i n t e r f e r e w i t h t h e a b i l i t y o f D N A M T a s e t o b i n d D N A a t a h e m i m e t h y l a t e d s i t e a n d r e s t o r e t h e n o r m a l 5 M e C c o n t e n t a f t e r D N A r e p l i c a t i o n ( W e i t z m a n e t a l . , 1 9 9 4 ) . T h u s , o n e c a n a n t i c i p a t e t h a t g e n o t o x i c c o m p o u n d s c a n a l t e r t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f D N A i n a n h e r i t a b l e e p i g e n e t i c m a n n e r , i n a d d i t i o n t o p o t e n t i a l m u t a g e n i c e f f e c t s . W i t h t h e p o s s i b l e e x c e p t i o n o f t u m o r s u p p r e s s o r g e n e s , a m u t a t e d g e n e m u s t b e e x p r e s s e d i n o r d e r t o a l t e r t h e p h e n o t y p e o f a 4 w i t h r e g a r d t o f a c i l i t a t i n g a b e r r a n t g e n e e x p r e s s i o n . A s c h e m a t i c i l l u s t r a t i n g t h e i n t e r p l a y b e t w e e n f a c t o r s i n f l u e n c i n g m u t a t i o n a n d m e t h y l a t i o n o f D N A , a n d h o w t h e s e c a n l e a d t o a b e r r a n t g e n e e x p r e s s i o n i s p r o v i d e d ( F i g u r e 1 ) . M y e x p e r i m e n t a l m o d e l i s m o u s e l i v e r t u m o r i g e n e s i s , w h e r e t h e f o c u s i s o n o n c o g e n e s t h a t a r e r e l e v a n t t o t h i s s y s t e m , n a m e l y H a - r a s a n d r e f . T h e r e l a t i v e l y l i v e r t u m o r p r o n e B 6 C 3 F 1 ( C 5 7 B L / 6 x C 3 H / H e ) m o u s e i s e m p l o y e d , a n d r e l e v a n t c o m p a r i s o n s a r e m a d e w i t h t h e r e l a t i v e l y s e n s i t i v e C 3 H / H e p a t e r n a l s t r a i n a n d t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 m a t e r n a l s t r a i n ( G o o d m a n e t a l . , 1 9 9 1 ; G o o d m a n a n d C o u n t s , 1 9 9 3 ; C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 , 1 9 9 5 0 , 1 9 9 5 d ) . T h e d e g r e e o f s e n s i t i v i t y o f t h e p a r e n t a l s t r a i n s i s h e r i t a b l e a n d i s d e t e r m i n e d l a r g e l y b y a g e n e t i c l o c u s , t h e h e p a t o c a r c i n o g e n s e n s i t i v i t y l o c u s ( H a n i g a n e t a l . , 1 9 8 8 ) . A n e l e g a n t s t u d y i n v o l v i n g C 3 H / H e N < - > C S 7 B L / 6 N c h i m e r i c m i c e d e m o n s t r a t e d t h a t t h e d i f f e r e n t s e n s i t i v i t i e s o f t h e s e s t r a i n s t o t u m o r d e v e l o p m e n t e x i s t s i n t h e t a r g e t c e l l s ( e . g . , a t u m o r s u s c e p t i b i l i t y g e n e ) a n d i s n o t m i l i e u ( e . g . , h o r m o n e ) d e p e n d e n t ( L e e e t a l . , 1 9 9 1 ) . A u n i q u e a s p e c t o f m y r e s e a r c h i s t h a t i t o f f e r s t h e p o t e n t i a l t o p r o v i d e i n s i g h t r e g a r d i n g m o l e c u l a r m e c h a n i s m s t h a t u n d e r l i e p r o m o t i o n o f c a r c i n o g e n e s i s , w h i l e a t t h e s a m e t i m e , t h e r e s u l t s c a n p r o v i d e t h e t y p e o f i n f o r m a t i o n t h a t i s r e q u i r e d t o t a k e a m o r e r a t i o n a l a p p r o a c h t o c a r c i n o g e n r i s k a s s e s s m e n t . S p e c i f i c a l l y , i t c a n p r o v i d e i n s i g h t r e g a r d i n g d o s e - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p s , t h e e x i s t e n c e o f t h r e s h o l d s a n d s p e c i e s - t o - s p e c i e s e x t r a p o l a t i o n i s s u e s ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 ; 1 9 9 5 b ; 1 9 9 5 d ) . T h e r a t i o n a l e f o r c h o o s i n g s p e c i f i c o n c o g e n e s t o s t u d y i s b a s e d u p o n t h e F i g u r e 1 - T h e i n t e r p l a y b e t w e e n f a c t o r s i n f l u e n c i n g m u t a t i o n a n d m e t h y l a t i o n o f D N A , a n d h o w t h e s e c a n l e a d t o a b e r r a n t g e n e e x p r e s s i o n . A s i m p l e o n e - t o - o n e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d e i t h e r h y p o m e t h y l a t i o n , m u t a t i o n , o r h y p e r m e t h y l a t i o n i s n o t e n v i s i o n e d . T h e p r o b a b i l i t y o f h y p o m e t h y l a t i o n o c c u r r i n g f o l l o w i n g D N A r e p l i c a t i o n i s a f f e c t e d b y a c o m p l e x i n t e r p l a y b e t w e e n t h e r a t e o f c e l l p r o l i f e r a t i o n , t h e l e v e l o f S A M , a n d t h e c a p a c i t y p l u s f i d e l i t y o f D N A M T a s e ( i n c l u d i n g t h e a c c e s s i b i l i t y o f C p G r e g i o n s t o t h e e n z y m e ) . E n z y m a t i c r e m o v a l o f 5 M e C a n d r e p l a c e m e n t w i t h C h a s a l s o b e e n d e s c r i b e d a s a m e c h a n i s m f o r h y p o m e t h y l a t i o n . I n a d d i t i o n , D N A - a d d u c t f o r m a t i o n ( e . g . , a l k y l a t i o n o f D N A ) m a y i n c r e a s e t h e p r o b a b i l i t y o f h y p o m e t h y l a t i o n . I n a n a n a l o g o u s f a s h i o n , t h e p r o b a b i l i t y o f a m u t a t i o n o c c u r r i n g i s i n f l u e n c e d b y t h e e x t e n t o f a d d u c t f o r m a t i o n , t h e p r o m u t a g e n i c p o t e n t i a l o f t h e s p e c i f i c a d d u c t ( s ) f o r m e d , a n d t h e r a t e o f c e l l p r o l i f e r a t i o n i n r e l a t i o n s h i p t o t h e c a p a c i t y p l u s f i d e l i t y o f D N A r e p a i r . 5 M e C c a n d e a m i n a t e s p o n t a n e o u s l y t o f o r m T , l e a d i n g t o C t o T t r a n s i t i o n s . T h e r e f o r e , h y p e r m e t h y l a t i o n o f D N A i s e x p e c t e d t o i n c r e a s e C G t o T A p o i n t m u t a t i o n s . A d d i t i o n a l l y , h y p e r m e t h y l a t i o n o f D N A m a y l e a d t o t h e i n a c t i v a t i o n o f t u m o r s u p p r e s s o r g e n e s . H Y P E R M E T H Y L A T I O N . / M U T A T I O N C E L L P R O L I F E R A T I O N D N A - A D D U C T D N A A B E R R A N T G E N E M E T H Y L A S E E X P R E S S I O N / ' H Y P O M E T H Y L A T I O N S - A D E N O S Y L M E T H I O N I N E / E N Z Y M A T I C / 7 h i g h i n v o l v e m e n t o f H a - r a s i n m o u s e l i v e r t u m o r s i n t h o s e s t r a i n s t h a t a r e h i g h l y s u s c e p t i b l e t o l i v e r t u m o r i g e n e s i s ( e . g . , B 6 C 3 F 1 a n d C 3 H / H e ) ( B u c h m a n n e t a l . , 1 9 9 1 ) . H o w e v e r , a p p r o x i m a t e l y o n e - t h i r d t o o n e - h a l f o f t h e l i v e r t u m o r s i n B G C 3 F 1 m i c e d o n o t a p p e a r t o i n v o l v e a n a c t i v a t e d H a - r a s a s a s s e s s e d b y m u t a t i o n ( R e y n o l d s e t a l . , 1 9 8 7 ; B u c h m a n n e t a l . , 1 9 9 1 ; M a r o n p o t e t a l . , 1 9 9 5 ) o r b y t h e a b i l i t y o f D N A f r o m t h e s e t u m o r s t o t r a n s f o r m N I H - 3 T 3 c e l l s ( R e y n o l d s e t a l . , 1 9 8 7 ) . T h u s g e n e p r o d u c t s o t h e r t h a n , o r i n a d d i t i o n t o , t h a t o f H a - r a s a r e l i k e l y t o b e i n v o l v e d i n m o u s e l i v e r t u m o r i g e n e s i s . T h e r a f g e n e i s a r e a s o n a b l e c a n d i d a t e i n t h i s r e g a r d a s i t i s a n o t h e r o n c o g e n e i n v o l v e d i n s i g n a l t r a n s d u c t i o n t o t h e n u c l e u s a n d i t a c t s d o w n - s t r e a m , o r i n d e p e n d e n t , o f ( R a p p , 1 9 9 1 ) o r a s a n e f f e c t o r o f H a - r a s ( B r t v a e t a l . , 1 9 9 5 ) . E p i g e n e t i c s A t h o r o u g h c o n s i d e r a t i o n o f i n h e r i t a n c e i n v o l v e s m a k i n g a d i s t i n c t i o n b e t w e e n t h e t r a n s m i s s i o n o f g e n e s f r o m g e n e r a t i o n t o g e n e r a t i o n o r f r o m a p a r e n t c e l l t o d a u g h t e r c e l l s ( i . e . , i n h e r i t a n c e o f D N A b a s e s e q u e n c e ) , a n d t h e m e c h a n i s m s i n v o l v e d i n t h e t r a n s m i s s i o n o f a l t e r n a t i v e s t a t e s o f g e n e a c t i v i t y f o l l o w i n g c e l l d i v i s i o n . E p i g e n e t i c s i s t h e t e r m u s e d t o d e s c r i b e t h e l a t t e r . I t m a y b e d e f i n e d a s t h e s t u d y o f m e c h a n i s m s r e s p o n s i b l e f o r t h e t e m p o r a l a n d s p a t i a l c o n t r o l o f g e n e a c t i v i t y , e . g . , c h a n g e s i n g e n e e x p r e s s i o n d u r i n g d e v e l o p m e n t , s e g r e g a t i o n o f g e n e a c t i v i t i e s s u c h t h a t d a u g h t e r s o f a n i n d i v i d u a l c e l l h a v e d i f f e r e n t p a t t e r n s o f g e n e e x p r e s s i o n , a n d m e c h a n i s m s t o p e r m i t t h e s o m a t i c i n h e r i t a n c e o f a s p e c i f i c s e t o f a c t i v e a n d q u i e s c e n t g e n e s . D N A m e t h y l a t i o n i s 8 o n e e p i g e n e t i c m e c h a n i s m b y w h i c h g e n e a c t i v i t y , i n c l u d i n g g e n o m i c i m p r i n t i n g ( B r a n d e i s e t a l . , 1 9 9 3 ; K a f r i e t a l . , , 1 9 9 3 ) , m a y b e r e g u l a t e d ( r e f e r e n c e d i n H o l l i d a y , 1 9 9 0 ; R a z i n a n d K a f r i , 1 9 9 4 ) . C h a n g e s i n t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f a g e n e p r o v i d e a m e c h a n i s m b y w h i c h i t s p o t e n t i a l f o r e x p r e s s i o n c a n b e a l t e r e d i n a n e p i g e n e t i c h e r i t a b l e m a n n e r ( H o l l i d a y , 1 9 9 0 ; J o n e s a n d B u c k l e y , 1 9 9 0 ) a n d , i n l i g h t o f t h e e n z y m a t i c s t e p s i n v o l v e d i n D N A m a i n t e n a n c e m e t h y l a t i o n , i t i s e x p e c t e d t h a t m o d i f i c a t i o n s i n D N A m e t h y l a t i o n w o u l d r e s u l t f r o m t h r e s h o l d - e x h i b i t i n g e v e n t s . D N A M e t h y l a t i o n 5 M e C i s m o s t o f t e n f o u n d i n D N A a t C p G r e s i d u e s a n d e a c h s i t e i s m o d i f i e d o n b o t h s t r a n d s ( R a z i n a n d C e d a r , 1 9 9 1 ) , i . e . , D N A m e t h y l a t i o n i s s y m m e t r i c a l . T h e r e a r e a l s o d e m o n s t r a t i o n s o f 5 M e C a t n o n - C p G s i t e s , e . g . , C p r G , i n D N A ( W o o d c o c k e t a l . , 1 9 8 7 ; C l a r k e t a l . , 1 9 9 5 ) . D u r i n g p e r i o d s o f c e l l p r o l i f e r a t i o n t h e e s t a b l i s h e d p a t t e r n o f D N A m e t h y l a t i o n i s m a i n t a i n e d b y t h e a c t i o n o f a n S - a d e n o s y l m e t h i o n i n e ( S A W - r e q u i r i n g m a i n t e n a n c e m e t h y l a s e ( H e r g e r s b e r g , 1 9 9 1 ) i . e . , D N A M T a s e ( F i g u r e 2 ) . 5 M e C i s n o t a s u b s t r a t e f o r n u c l e o s i d e m o n o p h o s p h a t e k i n a s e ( V i l p o a n d V i l p o , 1 9 9 3 ) a n d a 5 M e C d e a m i n a s e c a n m e t a b o l i z e f r e e 5 M e C t o t h y m i n e ( V a i r a p a n d i a n d D u k e r , 1 9 9 3 ) ; t h e r e f o r e , s a l v a g e o f t h i s m o d i f i e d b a s e a n d i t s d i r e c t i n c o r p o r a t i o n i n t o D N A i s p r e v e n t e d . I m m e d i a t e l y f o l l o w i n g D N A r e p l i c a t i o n t h e n e w l y s y n t h e s i z e d s t r a n d i s u n m o d i f i e d . H o w e v e r , t h e m a i n t e n a n c e m e t h y l a s e i s s p e c i f i c f o r h e m i m e t h y l a t e d s i t e s ( G r u e n b a u m e t a l . , F i g u r e 2 - S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f m a i n t e n a n c e m e t h y l a t i o n o f D N A f o l l o w i n g D N A r e p l i c a t i o n ( m o d i f i e d f r o m H e r g e r s b e r g , 1 9 9 1 ) . M a i n t e n a n c e m e t h y l a t i o n i s c a r r i e d o u t i n v i v o b y t h e D N A - ( c y t o s i n e - S ) - m e t h y l t r a n s f e r a s e ( D N A M T a s e ) . T h i s e n z y m e p r o p a g a t e s t h e p a r e n t a l p a t t e r n o f m e t h y l a t i o n i n d a u g h t e r c e l l s a f t e r D N A r e p l i c a t i o n . N o r m a l l y , w h e n D N A r e p l i c a t i o n o c c u r s , t h e n e w l y s y n t h e s i z e d s t r a n d i s u n m o d i f i e d b e c a u s e 5 M e C c a n n o t b e i n c o r p o r a t e d d i r e c t l y i n t o D N A . C o n s e q u e n t l y , t h e n e w d o u b l e - s t r a n d e d D N A c o n t a i n s h e m i m e t h y l a t e d s i t e s t h a t p r o v i d e a s i g n a l t o t h e D N A M T a s e t o r e s t o r e t h e f u l l y m e t h y l a t e d p a t t e r n . A d e c r e a s e d l e v e l o f S A M m a y l e a d t o h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A , a s w i l l a d e c r e a s e d f i d e l i t y o f t h e D N A M T a s e , i f a s e c o n d r o u n d o f D N A r e p l i c a t i o n o c c u r s u t i l i z i n g t h e u n m o d i f i e d s t r a n d a s t h e p a r e n t a l s t r a n d . T h i s e p i g e n e t i c c h a n g e i s h e r i t a b l e . I n a d d i t i o n , d e n o v o m e t h y l a t i o n a n d d e m e t h y l a t i o n w i t h o u t D N A r e p l i c a t i o n m a y o c c u r . T h i s p a r a d i g m p r o v i d e s a b a s i s f o r t h e h y p o t h e s i s t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A i s a n o n g e n o t o x i c , e p i g e n e t i c m e c h a n i s m u n d e r l y i n g c a r c i n o g e n e s i s . n o i t a l y h t e m o v o n e d 5 ' - G G C C A C G T G A C C G G - 3 ' ‘ — ’ 1 0 l n a c fl v e ( m e t h y l a t e d ) C H 3 C H 3 5 ' - G G C C A C G T G A C C G G - 3 ' 3 ' - C C G G T G C A C T G G C C - 5 ' C H 3 C H 3 D N A m a i n t e n a n c e r e p l i c a t i o n m e t h y l a t i o n C H 3 C H 3 5 ' - G G C C A C G T G A C C G G - 3 ' 3 ' - C C G G T G C A C T G G C C - 5 ' D N A r e p l i c a t i o n n o m a i n t e n a n c e m e t h y l a t i o n 3 ' - C C G G T G C A C T G G C C - 5 ' a c t i v e ( h y p o m e t h y l a t e d ) d e m e t h y l a t i o n w i t h o u t D N A r e p l i c a t i o n 1 1 1 9 8 2 ) a n d , t h e r e f o r e , i t c a n r e s t o r e t h e n o r m a l s y m m e t r i c a l p a t t e r n o f D N A m e t h y l a t i o n ( d e n o v o m e t h y l a t i o n ( S z y f , 1 9 9 1 ; H a s s e e t a l . , 1 9 9 2 ) a n d d e m e t h y l a t i o n w i t h o u t D N A r e p l i c a t i o n ( R a z i n e t a l . , 1 9 8 6 ; V a i r a p a n d i a n d D u k e r , 1 9 9 3 ) m a y a l s o o c c u r ) . A C p G s i t e w h i c h i s i n i t i a l l y u n m o d i f i e d c a n r e m a i n t h a t w a y a f t e r r e p l i c a t i o n w h i l e a m e t h y l a t e d C p G s i t e w i l l b e r e c o g n i z e d b y t h e m e t h y l g r o u p r e m a i n i n g o n t h e p a r e n t a l s t r a n d a n d b e m o d i f i e d o n t h e c o m p l e m e n t a r y s t r a n d ( R a z i n a n d C e d a r , 1 9 9 1 ) . I f m a i n t e n a n c e m e t h y l a t i o n d o e s n o t t a k e p l a c e , e . g . , d u e t o a d e c r e a s e d l e v e l o f S A M o r a r e d u c e d f i d e l i t y o f D N A M T a s e a c t i v i t y , a n d c e l l d i v i s i o n f o l l o w e d b y a s e c o n d r o u n d o f D N A r e p l i c a t i o n t a k e s p l a c e , t h e n t h a t d a u g h t e r s t r a n d w i l l g i v e r i s e t o d o u b l e - s t r a n d e d D N A w h i c h h a s l o s t a m e t h y l a t e d s i t e ; g e n e r a t i n g h y p o m e t h y l a t e d D N A . T h i s e p i g e n e t i c c h a n g e i s h e r i t a b l e ( F i g u r e 2 ) . A c D N A e n c o d i n g t h e D N A M T a s e o f m o u s e c e l l s , w h i c h a p p e a r s c a p a b l e o f f u n c t i o n i n g a s a m a i n t e n a n c e m e t h y l a s e , h a s b e e n c l o n e d ( B e s t o r e t a l . , 1 9 8 8 ) . T h e c a r b o x y l - t e r m i n a l a m i n o a c i d s e q u e n c e o f t h e i n f e r r e d p r o t e i n i s s i m i l a r t o b a c t e r i a l t y p e I I D N A c y t o s i n e m e t h y l t r a n s f e r a s e s . T h e e n z y m e w a s s h o w n t o b e e x p r e s s e d i n a v a r i e t y o f m o u s e c e l l t y p e s ( B e s t o r e t a l . , 1 9 8 8 ) . T h e 5 ' f l a n k i n g s e q u e n c e o f D N A M T a s e d o e s n o t c o n t a i n T A T A o r C A A T b o x e s ( R o u l e a u e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h u s i t s h a r e s c h a r a c t e r i s t i c s o f h o u s e k e e p i n g o r w i d e l y e x p r e s s e d g e n e s ( G a r d i n e r - G a r d e n a n d F r o m m e r , 1 9 8 7 ) . H o w e v e r , i t d o e s n o t c o n t a i n C p G i s l a n d s ( R o u l e a u e t a l . , 1 9 9 2 ) w h i c h a r e c h a r a c t e r i s t i c o f t h e s e g e n e s ( G a r d i n e r - G a r d e n a n d F r o m m e r , 1 9 8 7 ) . T h e 5 ' f l a n k i n g s e q u e n c e o f D N A M T a s e c o n t a i n s A P 1 , A P 2 a n d g l u c o c o r t i c o i d c i s e l e m e n t s ( R o u l e a u e t a l . , 1 2 1 9 9 2 ) a n d i t s a c t i v i t y c a n b e m o d u l a t e d b y t h e R a s - A P 1 s i g n a l i n g p a t h w a y ( R o u l e a u e t a l . , 1 9 9 5 ; M a c L e o d e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h e f i d e l i t y o f D N A M T a s e i s c o m p a r a b l e t o t h a t o f m a m m a l i a n D N A p o l y m e r a s e ( S m i t h e t a l . , 1 9 9 2 ) . A n e x a m p l e o f t h e k e y r o l e p l a y e d b y m a i n t e n a n c e m e t h y l a t i o n i s p r o v i d e d b y t h e r e s u l t s o f a s t u d y i n v o l v i n g t a r g e t e d m u t a t i o n o f D N A M T a s e w h i c h r e s u l t e d i n m i c e w i t h t h e g e n e “ k n o c k e d o u t ” f u n c t i o n a l l y ( L i e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h i s r e s u l t e d i n a 3 - f o l d r e d u c t i o n i n t h e l e v e l o f m e t h y l a t i o n o f g e n o m i c D N A i n e m b r y o s c a u s i n g a b n o r m a l d e v e l o p m e n t a n d e m b r y o n i c l e t h a l i t y . I n t e r e s t i n g l y , a s i m i l a r r e d u c t i o n o f m e t h y l a t i o n i n e m b r y o n i c s t e m c e l l s d i d n o t a f f e c t t h e i r v i a b i l i t y o r c a p a c i t y t o p r o l i f e r a t e ( L i e t a l . , 1 9 9 2 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e o b s e r v a t i o n s i l l u s t r a t e t h e i m p o r t a n t a n d e s s e n t i a l r o l e p l a y e d b y D N A m e t h y l a t i o n i n t h e c o n t r o l o f s p e c i a l i z e d c e l l f u n c t i o n s i n a w h o l e a n i m a l . l I n i v i D N A m e t h y l a t i o n p l a y s a r o l e i n t h e r e g u l a t i o n o f g e n e a c t i v i t y ( R a z i n a n d C e d a r , 1 9 9 1 ; R a z i n a n d K a f r i , 1 9 9 4 ) . C y t o s i n e m e t h y l a t i o n p r o d u c e s a l o c a l i z e d p a t t e r n o f s t e r i c , h y d r o p h o b i c , e n e r g e t i c , c o n f o r m a t i o n a l , a n d e l e c t r o s t a t i c a l t e r a t i o n s i n D N A , p r i m a r i l y i n t h e m a j o r g r o v e w h e r e m o s t p r o t e i n i n t e r a c t i o n s w i t h D N A o c c u r ( H a u s h e e r e t a l . , 1 9 8 9 ) ; m e t h y l a t i o n e n h a n c e s w h i l e d e m e t h y l a t i o n r e d u c e s s t a b i l i t y o f t h e D N A h e l i x ( M u r c h i e a n d L i l l y , 1 9 8 9 ; X o d o e t a l . , 1 9 9 4 ) . D i f f e r e n t i a l m e t h y l a t i o n o f D N A i s a d e t e r m i n a n t o f h i g h e r o r d e r c h r o m a t i n s t r u c t u r e ( L e w i s a n d B i r d , 1 9 9 1 ) . I n a d d i t i o n , t h e m e t h y l g r o u p p r o v i d e s a c h e m i c a l s i g n a l w h i c h i s r e c o g n i z e d b y t r a n s - a c t i n g f a c t o r s . B i n d i n g o r l a c k o f b i n d i n g o f t h e s e f a c t o r s r e g u l a t e t r a n s c r i p t i o n ( H o l l i d a y , 1 9 9 0 ) . W h i l e 1 3 i t i s g e n e r a l l y r e c o g n i z e d t h a t k e y c i s e l e m e n t s c o n t r o l l i n g g e n e e x p r e s s i o n a r e l o c a t e d i n t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n ( J o n e s , 1 9 8 6 ) , c r i t i c a l d o m a i n s i n v o l v e d i n t h e r e g u l a t i o n o f t r a n s c r i p t i o n m a y b e l o c a t e d a l l a l o n g t h e g e n e , e . g . , t o w a r d s t h e m i d d l e ( Y i s r a e l i e t a l . , 1 9 8 8 ; M u n z e l e t a l . , 1 9 9 1 ; O p d e n c a m p e t a l . , 1 9 9 2 ) a n d a t t h e 3 ' r e g i o n ( S p a n d i d o s , 1 9 8 7 ; C o h e n a n d L e v i n s o n , 1 9 8 8 ; S h a r r a r d e t a l . , 1 9 9 2 ) M e t h y l a t i o n c a n i n h i b i t t r a n s c r i p t i o n i n t h r e e p o s s i b l e w a y s , t h a t a r e n o t m u t u a l l y e x c l u s i v e : 1 ) m e t h y l a t i o n m a y a f f e c t t r a n s c r i p t i o n b y a l t e r i n g c h r o m a t i n s t r u c t u r e ( r e f e r e n c e d i n A d a m s , 1 9 9 0 ) , 2 ) 5 M e C c a n i n t e r f e r e w i t h t r a n s c r i p t i o n d i r e c t l y a s m e t h y l a t i o n i n t h e r e c o g n i t i o n s i t e m i g h t p r e v e n t t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s f r o m b i n d i n g t o t h e i r c o g n a t e s e q u e n c e s , o r 3 ) p r o t e i n s i n t h e n u c l e u s t h a t b i n d s p e c i f i c a l l y t o m e t h y l a t e d D N A , e . g . , m e t h y l a t e d D N A b i n d i n g p r o t e i n ( M D B P ) ( Z h a n g e t a l . , 1 9 9 0 ) a n d m e t h y l - C p G b i n d i n g p r o t e i n s ( M e C P - 1 a n d M e C P - 2 ) ( B o y e s a n d B i r d , 1 9 9 1 ) , m a y b l o c k a c c e s s o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s . T h e r e i s e v i d e n c e i n m a m m a l i a n c e l l s s u p p o r t i n g t h e r o l e f o r m e c h a n i s m s 2 a n d 3 n o t e d a b o v e w h i c h i n v o l v e d i r e c t o r i n d i r e c t i n h i b i t i o n o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r b i n d i n g ( r e f e r e n c e d i n M e e h a n e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h u s , D N A m e t h y l a t i o n a p p e a r s t o b e a m e c h a n i s m w h e r e b y c e l l s c a n c o n t r o l t h e e x p r e s s i o n o f g e n e s w i t h s i m i l a r p r o m o t e r r e g i o n s i n t h e p r e s e n c e o f u b i q u i t o u s t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s ( J o n e s a n d B u c k l e y , 1 9 9 0 ) . 1 4 W W W 8 ) M u t a t i o n D e c r e a s e s i n D N A m e t h y l a t i o n a r e f r e q u e n t l y o b s e r v e d i n t u m o r t i s s u e a n d a b e r r a t i o n s i n m e t h y l a t i o n m i g h t b e a k e y f a c t o r i n c a r c i n o g e n e s i s ( H o l l i d a y , 1 9 8 7 ; J o n e s a n d B u c k l e y , 1 9 9 0 ) . T h e r e i s a d i r e c t r e l a t i o n s h i p b e t w e e n D N A m e t h y l a t i o n a n d g e n e s i l e n c i n g ( H o l l i d a y a n d H o , 1 9 9 1 ) . A d d i t i o n a l e v i d e n c e i n s u p p o r t o f a r o l e f o r h y p o m e t h y l a t i o n i n c a r c i n o g e n e s i s c o m e s f r o m s t u d i e s i n v o l v i n g 5 - a z a - c y t i d i n e ( A z a C ) , a n a n a l o g o f c y t i d i n e . T h e d e o x y n u c l e o t i d e o f A z a C c a n b e i n c o r p o r a t e d i n t o D N A l e a d i n g t o h y p o m e t h y l a t i o n o f n e w l y r e p l i c a t e d D N A a s a c o n s e q u e n c e o f n o n c o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n o f D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e ( G l o v e r a n d L e y l a n d - J o n e s , 1 9 8 7 ) . A z a C c a n a l t e r g e n e e x p r e s s i o n , a n d t h u s c h a n g e d i f f e r e n t i a t i o n , i n r a t f e t u s e s a n d a c t a s a t u m o r p r o m o t e r i n r a t l i v e r ( C a r r e t a l . , 1 9 8 4 ) . T h i s o b s e r v a t i o n i s s u p p o r t e d b y a s t u d y i n d i c a t i n g t h a t e x p o s u r e o f n o n t u m o r i g e n i c f i b r o b l a s t s , e x p r e s s i n g r a s o r m y c o n c o g e n e s , t o A z a C c a n l e a d t o m a l i g n a n t t r a n s f o r m a t i o n ( R i m o l d i e t a l . , 1 9 9 1 ) . I n a d d i t i o n , b o t h s p o n t a n e o u s l y t r a n s f o r m e d r a t l i v e r e p i t h e l i a l c e l l s a n d t h o s e t r a n s f o r m e d b y A z a C a r e r e s i s t a n t t o t h e g r o w t h i n h i b i t o r y e f f e c t s o f t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - 3 ( T G F — B ) ( H u g g e t t e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h i s s i m i l a r i t y i n p h e n o t y p e b e t w e e n s p o n t a n e o u s a n d A z a C t r a n s f o r r n a n t s i s c o n s i s t e n t w i t h t h e n o t i o n t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A i s t y p i c a l l y i n v o l v e d i n t h e m u l t i s t e p p r o c e s s b y w h i c h a n o r m a l c e l l i s t r a n s f o r m e d i n t o a m a l i g n a n t c e l l . 1 5 b ) 1 1 W I n c r e a s e s i n D N A m e t h y l a t i o n , i . e . , h y p e r m e t h y l a t i o n , c a n a l s o p l a y a r o l e i n c a r c i n o g e n e s i s . T u m o r s u p p r e s s o r g e n e s m u s t b e a c t i v e t o p r e v e n t t r a n s f o r m a t i o n ; h y p e r m e t h y l a t i o n c a n t u r n o f f e x p r e s s i o n o f t h e s e g e n e s a n d l e a d t o c a n c e r . S t u d i e s i n v o l v i n g n e u r a l t u m o r s ( M a k e s e t a l . , 1 9 9 3 a ) a n d r e n a l t u m o r s ( M a k o s ‘ e t a l . , 1 9 9 3 b ) i n d i c a t e t h a t r e g i o n a l h y p e r m e t h y l a t i o n m i g h t c o n s t i t u t e a m o l e c u l a r c h a n g e w h i c h i s a s s o c i a t e d w i t h g e n e t i c i n s t a b i l i t y l e a d i n g t o a l l e l i c l o s s o f t h e c h r o m o s o m e i n q u e s t i o n a n d , t h u s , c o n t r i b u t e t o p r o g r e s s i o n a s a c o n s e q u e n c e o f t h e l o s s o f a t u m o r s u p p r e s s o r g e n e ( s ) . T h e s e o b s e r v a t i o n s a r e c o m p a t i b l e w i t h a n e a r l i e r s t u d y ( K l e i n e t a l . , 1 9 9 1 ) i n d i c a t i n g t h a t l o s s o f a s e n e s c e n c e g e n e o n t h e h u m a n X c h r o m o s o m e , o r i t s i n a c t i v a t i o n b y h y p e r m e t h y l a t i o n , i s a s s o c i a t e d w i t h t h e a c q u i s i t i o n o f i m m o r t a l i t y , a n d m i g h t r e p r e s e n t a n e a r l y e v e n t a s s o c i a t e d w i t h n i c k e l - i n d u c e d t r a n s f o r m a t i o n . T h e s e s t u d i e s a r e c o m p l e m e n t e d b y d a t a i l l u s t r a t i n g h y p e r m e t h y l a t i o n o f t h e v o n H i p p e l - L i n d a u ( V H L ) g e n e i n a s u b s e t o f c l e a r - c e l l r e n a l c a r c i n o m a s w h e r e t h i s t u m o r s u p p r e s s o r g e n e w a s i n a c t i v a t e d , t h o u g h n o t m u t a t e d ( H e r m a n e t a l . , 1 9 9 4 ) . I m p o r t a n t l y , t h e r e s e a r c h e r s w e n t f u r t h e r a n d t r e a t e d a r e n a l c e l l l i n e c o n t a i n i n g a n i n a c t i v a t e V H L g e n e w i t h A z a C a n d d e m o n s t r a t e d r e a c t i v a t i o n o f t h e g e n e ( H e r m a n e t a l . , 1 9 9 4 ) . B y t a k i n g t h i s s t e p t h e y w e r e a b l e t o d e m o n s t r a t e t h a t t h e i n a c t i v a t i o n o f t h e g e n e w a s n o t d u e t o a g r o s s a l t e r a t i o n o f t h e p r o m o t e r a s i t w a s r e v e r s i b l e u n d e r c o n d i t i o n s t h a t w o u l d b e e x p e c t e d t o l e a d t o h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A . I n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f D N A M T a s e o c c u r s d u r i n g c o l o n c a r c i n o g e n e s i s a n d t h i s m i g h t p l a y a r o l e i n t h e 1 6 h y p e r m e t h y l a t i o n a n d g e n e t i c i n s t a b i l i t y n o t e d a b o v e ( E l - D e i r y e t a l . , 1 9 9 1 ) . I n a d d i t i o n , s p o n t a n e o u s d e a m i n a t i o n o f 5 M e C t o t h y m i n e c a n r e s u l t i n C : G t o A : T t r a n s i t i o n s . T h u s , 5 M e C m i g h t a c t a s a n e n d o g e n o u s m u t a g e n a n d d e a m i n a t i o n - d r i v e n p o i n t m u t a t i o n s c o u l d p l a y a r o l e i n c a r c i n o g e n e s i s ( R i d e o u t a t a l . , 1 9 9 0 ; S h e n e t a l . , 1 9 9 4 ; Z h a n g a n d M a t h e w s , 1 9 9 4 ) . I n t h i s c o n t e x t i t s h o u l d b e n o t e d t h a t a s m a n y a s 4 3 % o f p 5 3 g e n e m u t a t i o n s m a y b e d u e t o t h e p r e s e n c e o f 5 M e C ( R i d e o u t e t a l . , 1 9 9 0 ) . 6 ) W W W W h i l e i t a p p e a r s t h a t h y p e r m e t h y l a t i o n o f l i m i t e d r e g i o n s o f t h e g e n o m e c a n , i n d e e d , p l a y a r o l e i n c a r c i n o g e n e s i s , t h e r e i s a c o n s i s t e n t f i n d i n g t h a t o v e r a l l h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A i s a g e n e r a l p h e n o m e n o n i n v o l v e d i n c a r c i n o g e n e s i s i n b o t h r o d e n t s a n d h u m a n s . T h e g e n o m i c l e v e l o f 5 M e C i s l o w e r i n c h e m i c a l - i n d u c e d r a t l i v e r t u m o r s ( L a p e y r e a n d B e c k e r , 1 9 7 9 ) , a n d i n s p o n t a n e o u s a n d c h e m i c a l - i n d u c e d m o u s e l i v e r t u m o r s ( L a p e y r e e t a l . , 1 9 8 1 ) a s c o m p a r e d t o n o r m a l l i v e r t i s s u e . I n a d d i t i o n , h y p o m e t h y l a t i o n i s a r e l a t i v e l y e a r l y e v e n t i n c a r c i n o g e n e s i s i n h u m a n s ( F e i n b e r g a n d V o g e l s t e i n , 1 9 8 3 ; G o e l z e t a l . , 1 9 8 5 ) . F u r t h e r m o r e , m o s t m e t a s t a t i c h u m a n n e o p l a s m s h a v e s i g n i f i c a n t l y l o w e r g e n o m i c 5 M e C t h a n b e n i g n n e o p l a s m s o r n o r m a l t i s s u e , a n d t h e p e r c e n t a g e o f p r i m a r y m a l i g n a n c i e s w i t h h y p o m e t h y l a t e d D N A i s i n t e r m e d i a t e b e t w e e n t h o s e o f m e t a s t a s e s a n d b e n i g n n e o p l a s m s ( G a m a - S o s a e t a l . , 1 9 8 3 ) . R e c e n t s t u d i e s e x a m i n i n g g l o b a l a l t e r a t i o n s i n m e t h y l a t i o n s t a t u s i n h u m a n s h a v e s u p p o r t e d t h e s e d a t a . F o r e x a m p l e , g l o b a l h y p o m e t h y l a t i o n i n c r e a s e s p r o g r e s s i v e l y f r o m c e r v i c a l d y s p l a s i a t o c e r v i c a l c a r c i n o m a ( K i m e t a l . , 1 9 9 4 ) . 1 7 T h i s a p p e a r s t o r e f l e c t a r o l e f o r h y p o m e t h y l a t i o n i n t u m o r p r o g r e s s i o n i n a d d i t i o n t o p r o m o t i o n . T h e i n v o l v e m e n t o f r e g i o n a l h y p e r m e t h y l a t i o n a n d a g e n e r a l h y p o m e t h y l a t i o n o f t h e g e n o m e a r e n o t i n c o m p a t i b l e . I n d e e d , h y p e r m e t h y l a t i o n l e a d i n g t o l o s s o f t u m o r s u p p r e s s o r g e n e a c t i v i t y a n d h y p o m e t h y l a t i o n f a c i l i t a t i n g a b e r r a n t i n c r e a s e s i n o n c o g e n e e x p r e s s i o n c a n b e v i e w e d a s c o m p l e m e n t a r y m e c h a n i s m s i n v o l v e d i n m u l t i s t a g e c a r c i n o g e n e s i s . A n e x a m p l e o f t h e c o m p l e x r o l e s f o r D N A m e t h y l a t i o n i s p r o v i d e d b y t h e m a n n o s e - 6 - p h o s p h a t e / i n s u l i n - I i k e g r o w t h f a c t o r I I r e c e p t o r ( M 6 P - l G F 2 r ) g e n e w h e r e m e t h y l a t i o n a c t u a l l y s e r v e s d u a l r o l e s , a s d e s c r i b e d b e l o w . H y p o t h e s i s a n d E x p e r i m e n t a l M o d e l A l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n m a y p l a y a v a r i e t y o f r o l e s i n t u m o r i g e n e s i s ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 a ) . M y e x p e r i m e n t a l i n t e r e s t s e m p h a s i z e t e s t i n g t h e h y p o t h e s i s ( G o o d m a n e t a l . , 1 9 9 1 ; G o o d m a n a n d C o u n t s , 1 9 9 3 ; C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 ; 1 9 9 5 a ; 1 9 9 5 0 ; 1 9 9 5 d ) t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A i s a n o n g e n o t o x i c , t h r e s h o l d - e x h i b i t i n g , m e c h a n i s m t h a t f a c i l i t a t e s t h e a b e r r a n t o n c o g e n e e x p r e s s i o n t h a t p l a y s a r o l e i n c a r c i n o g e n e s i s . I n p a r t i c u l a r , t h i s e p i g e n e t i c m e c h a n i s m m a y p l a y a k e y r o l e i n t u m o r p r o m o t i o n ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 ) . T h e p h e n o m e n o n o f d e n o v o m e t h y l a t i o n ( S z y f , 1 9 9 1 ; H a s s e e t a l . , 1 9 9 2 ) p r o v i d e s a p o t e n t i a l m e c h a n i s m f o r r e v e r s i n g h y p o m e t h y l a t i o n . T h u s , o u r h y p o t h e s i s r e g a r d i n g t h e r o l e o f h y p o m e t h y l a t i o n i n t u m o r p r o m o t i o n i s c o m p a t i b l e w i t h t h e n o t i o n t h a t r e v e r s i b i l i t y i s a f u n d a m e n t a l c o m p o n e n t o f t h e p r o m o t i o n s t a g e o f c a r c i n o g e n e s i s ( P i t o t , 1 9 9 0 ; D r a g a n e t a l . , 1 9 9 3 ) . 1 8 T h e B 6 0 3 F 1 m o u s e e x h i b i t s a u n i q u e l y h i g h s p o n t a n e o u s i n c i d e n c e o f l i v e r t u m o r s ( B e c k e r , 1 9 8 2 ) a n d t h e r e i s a h i g h i n v o l v e m e n t o f H a - r a s i n B 6 C 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s . T h u s , I c h o s e t o s t u d y H a - r a s b e c a u s e o f i t s h i g h i n v o l v e m e n t i n B G C 3 F 1 m o u s e I i v e r t u m o r i g e n e s i s . A c t i v a t i o n ( e . g . , m u t a t i o n ) o f H a - r a s i s s e e n i n s p o n t a n e o u s - a n d g e n o t o x i c c h e m i c a l - i n d u c e d l i v e r t u m o r s i n t h e B 6 C S F 1 ( C S 7 B L / 6 x C S H / H e ) m o u s e ( W i s e m a n a t a l . , 1 9 8 6 ; R e y n o l d s a t a l . , 1 9 8 7 ; S t o w e r s e t a l . , 1 9 8 8 ; B u c h m a n n e t a l . , 1 9 9 1 ; M a r o n p o t e t a l . , 1 9 9 5 ) , b u t n o t i n n o n - l i v e r t u m o r s o f t h e s a m e a n i m a l ( C a n d r i a n e t a l . , 1 9 9 1 ) . A d d i t i o n a l l y , t h e r e i s a l o w f r e q u e n c y o f i n v o l v e m e n t o f m u t a t e d H a - r a s i n m o u s e l i v e r t u m o r s i n d u c e d b y n o n g e n o t o x i c c o m p o u n d s ( F o x e t a l . , 1 9 9 0 ; B a u e r - H o f f m a n n e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h e r e i s a l s o a s t r i k i n g a b s e n c e o f H a - r a s a c t i v a t i o n i n d i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E M - i n d u c e d l i v e r t u m o r s o f t h e F i s h e r - 3 4 4 r a t ( S t o w e r s e t a l . , 1 9 8 8 ) a n d t h e 0 5 7 B L / 6 m o u s e ( B u c h m a n n e t a l . , 1 9 9 1 ) a n d o c c u r s w i t h a v a r i a b l e f r e q u e n c y ( 1 7 % - 8 5 % ) i n s p o n t a n e o u s l i v e r t u m o r s o f t h e C 3 H / H e m o u s e ( r e f e r e n c e d i n E n o m o t o e t a l . , 1 9 9 3 ) . T h i s l a s t f i n d i n g , t h a t H a - r a s i n v o l v e m e n t i s s e e n t o a v a r i a b l e d e g r e e i n t h e p a t e r n a l s t r a i n t h a t i s a l s o s u s c e p t i b l e t o s p o n t a n e o u s l i v e r t u m o r i g e n e s i s ( B e c k e r , 1 9 8 2 ) , i n d i c a t e s t h a t l i v e r t u m o r f o r m a t i o n i n t h e B 6 C 3 F 1 i s n o t s i m p l y t h e s u m o f w h a t i s o b s e r v e d i n t h e p a r e n t a l s t r a i n s , a s t h e s p o n t a n e o u s l i v e r t u m o r i n c i d e n c e i n t h e C S 7 B L / 6 i s v i r t u a l l y z e r o a t 1 8 m o n t h s ( B e c k e r , 1 9 8 2 ) . T h e u n u s u a l l y h i g h i n c i d e n c e o f l i v e r t u m o r i g e n e s i s i n t h e B 6 C S F 1 m o u s e t h a t c a n n o t b e e x p l a i n e d m e r e l y b y m u t a t i o n a t c o d o n 6 1 o f H a - r a s ( S c h w a r t z e t a l . , 1 9 9 1 ; M a r o n p o t e t a l . , 1 9 9 5 ) l e d t o o u r a n a l y s i s o f t h e 1 9 m e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h i s o n c o g e n e . T h e r e s u l t s o f p r e v i o u s s t u d i e s f r o m o u r l a b o r a t o r y i n d i c a t e t h a t H a - r a s i n t h e n a s c e n t l i v e r o f t h e l i v e r t u m o r p r o n e s t r a i n s ( i . e . , B 6 C 3 F 1 a n d C 3 H / H e ) p o s s e s s a n a d d i t i o n a l y D N A s e I h y p e r s e n s i t i v e s i t e a s c o m p a r e d t o t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 9 1 a ) i n d i c a t i n g a n i n c r e a s e d p o t e n t i a l f o r e x p r e s s i o n i n t h e l i v e r t u m o r s u s c e p t i b l e s t r a i n s . F u r t h e r , n o r m a l l i v e r f r o m B 6 C 3 F 1 a n d C S H / H e m i c e w a s d e m o n s t r a t e d t o l a c k a m e t h y l a t e d s i t e t h a t i s p r e s e n t i n t h e r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 s t r a i n ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 8 9 ) . H a - r a s w a s a l s o s h o w n t o b e h y p o m e t h y l a t e d i n B 6 C 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s i n d u c e d b y b o t h a g e n o t o x i c ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 8 9 ) a n d n o n - g e n o t o x i c c o m p o u n d s , a s w e l l a s i n s p o n t a n e o u s l i v e r t u m o r s ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 9 1 b ) . T h e s e s t u d i e s d e m o n s t r a t e t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o f H a - r a s i s a c o m m o n e v e n t i n m o u s e l i v e r t u m o r i g e n e s i s a n d t h a t t h i s c o u l d f a c i l i t a t e t h e a b e r r a n t o n c o g e n e e x p r e s s i o n t h a t i s s e e n ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 8 9 ; R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) . I n l i g h t o f t h e m u l t i s t e p n a t u r e o f t u m o r i g e n e s i s w e d i d n o t w a n t t o l i m i t o u r e x a m i n a t i o n o f a l t e r a t i o n s i n m e t h y l a t i o n t o H a - r a s , t h i s l e d t o t h e i n v e s t i g a t i o n o f t h e r a f o n c o g e n e a s a n o t h e r p o t e n t i a l t a r g e t g e n e ( R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e B 6 0 3 F 1 m o u s e i n h e r i t s a m a t e r n a l r a f a l l e l e c o n t a i n i n g a m e t h y l a t e d s i t e t h a t i s n o t p r e s e n t i n t h e p a t e r n a l a l l e l e . A t 7 d a y s a f t e r p a r t i a l h e p a t e c t o m y o r a f t e r a d m i n i s t r a t i o n o f a p r o m o t i n g d o s e o f p h e n o b a r b i t a l ( P B ) f o r 1 4 d a y s r a f i n B 6 C 3 F 1 m o u s e l i v e r i s h y p o m e t h y l a t e d . T h e a d d i t i o n a l m e t h y l a t e d s i t e i n t h e a l l e l e i n h e r i t e d f r o m t h e C 5 7 B L / 6 i s n o t m a i n t a i n e d . H o w e v e r , t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f r e f i n t h e l i v e r o f t h e C 5 7 B L / 6 2 0 m o u s e i s n o t a f f e c t e d b y P B t r e a t m e n t . T h i s i n d i c a t e s t h a t t h e l i v e r t u m o r p r o n e B 6 C 3 F 1 m o u s e h a s a l o w e r c a p a c i t y t o m a i n t a i n t h e n a s c e n t m e t h y l a t i o n s t a t u s o f r a f t h a n t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 s t r a i n . A d d i t i o n a l l y , r a f i s h y p o m e t h y l a t e d i n a n o n r a n d o m f a s h i o n i n b o t h P B - i n d u c e d a n d s p o n t a n e o u s B 6 C 3 F 1 l i v e r t u m o r s . T h e l e v e l o f r e f m R N A i s i n c r e a s e d i n 7 o u t o f 1 0 P B - i n d u c e d t u m o r s b u t i n o n l y 1 o u t o f 5 s p o n t a n e o u s t u m o r s , w h i l e H a - r a s m R N A i s i n c r e a s e d i n 9 o u t o f 1 0 P B - i n d u c e d t u m o r s a n d i n 4 o u t o f 5 s p o n t a n e o u s t u m o r s ( R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) . T h e r e s u l t s o f t h i s i n v e s t i g a t i o n ( R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) : a ) s u p p o r t t h e h y p o t h e s i s t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A i s a n o n g e n o t o x i c m e c h a n i s m i n v o l v e d i n t u m o r i g e n e s i s ; b ) s u p p o r t t h e n o t i o n t h a t P B p r o m o t e s l i v e r t u m o r s w h i c h d e v e l o p a l o n g a p a t h w a y d i f f e r e n t f r o m t h a t l e a d i n g t o s p o n t a n e o u s t u m o r s ; a n d 0 ) i n d i c a t e t h a t d i f f e r e n c e s i n D N A m e t h y l a t i o n b e t w e e n t h e C 5 7 B L / 6 a n d B 6 C 3 F 1 m i c e c o u l d , i n p a r t , a c c o u n t f o r t h e u n u s u a l l y h i g h t e n d e n c y o f t h e l a t t e r s t r a i n t o d e v e l o p l i v e r t u m o r s . T u m o r P r o m o t i o n I n v o l v i n g R e s i s t a n c e t o I n h i b i t i o n o f C e l l P r o l i f e r a t i o n : A R o l e f o r H y p o m e t h y l a t i o n o f D N A C h r o n i c e x p o s u r e t o P B r e s u l t s i n a d e c r e a s e i n t h e a b i l i t y o f h e p a t o c y t e s t o r e s p o n d t o m i t o g e n i c s t i m u l i ( R e i s e n b i c h l e r e t a l . , 1 9 9 4 ; J i r t l e e t a l . , 1 9 9 4 ) . I t h a s b e e n d e m o n s t r a t e d t h a t P B d o e s n o t m e r e l y p r o m o t e s p o n t a n e o u s t u m o r f o r m a t i o n i n t h e m o u s e a s P B - i n d u c e d t u m o r s h a v e u n i q u e c h a r a c t e r i s t i c s c o m p a r e d t o s p o n t a n e o u s l i v e r t u m o r s ( F o x e t a l . , 1 9 9 0 ; R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) . A 2 1 d e c r e a s e i n e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r ( E G F ) r e c e p t o r ( E c k l e t a l . , 1 9 8 8 ) c o m b i n e d w i t h a n i n c r e a s e i n t h e l e v e l o f T G F B ( J i r t l e a n d M e y e r , 1 9 9 1 ) , T G F B r e c e p t o r s ( R e i s e n b i c h l e r e t a l . , 1 9 9 4 ) a n d t h e M 6 P - I G F 2 r , i n v o l v e d i n a c t i v a t i n g T G F B ( J i r t l e a t a l . , 1 9 9 4 ) i n n o r m a l h e p a t o c y t e s a r e a l l a s s o c i a t e d w i t h c h r o n i c P B a d m i n i s t r a t i o n . T h i s w o u l d b e e x p e c t e d t o i n h i b i t h e p a t o c y t e p r o l i f e r a t i o n ( F i g u r e 3 ) . H o w e v e r , M 6 P - l G F 2 r a n d T G F B a r e d e c r e a s e d i n P B - p r o m o t e d p r e n e o p l a s t i c l e s i o n s ( J i r t l e e t a l . , 1 9 9 4 ) a n d T G F B i s d e c r e a s e d i n P B - p r o m o t e d l i v e r t u m o r s ( R e i s e n b i c h l e r e t a l . , 1 9 9 4 ) . A d d i t i o n a l l y , c h r o n i c P B a d m i n i s t r a t i o n i s c o r r e l a t e d w i t h a n i n h i b i t i o n o f t h e a b i l i t y o f 1 2 - O - t e t r a d e c a n o y l p h o r b o l - 1 3 - a c e t a t e ( T P A ) t o c a u s e t r a n s l o c a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C ( P K C ) t o t h e c e l l m e m b r a n e ( B r o c k e n b r o u g h e t a l . , 1 9 9 1 ) . F u r t h e r , P B t r e a t m e n t c a n e n h a n c e t h e c l o n a b i l i t y o f h e p a t o c y t e s ( J i r t l e a n d M i c h a l o p o u l o s , 1 9 8 6 ) a n d s t i m u l a t e t h e p r o l i f e r a t i o n o f p u t a t i v e i n i t i a t e d h e p a t o c y t e s u n d e r c o n d i t i o n s i n w h i c h n o r m a l h e p a t o c y t e s s e n e s c e a n d d i e ( K a u f m a n n e t a l . , 1 9 8 8 ) . A c t i v a t i o n o f t h e E G F r e c e p t o r r e s u l t s i n p h o s p h o r y l a t i o n a n d i n c r e a s e d k i n a s e a c t i v i t y o f r e f b y P K C - d e p e n d e n t a n d P K C - i n d e p e n d e n t p a t h w a y s ( r e f e r e n c e d i n A p p a t a l . , 1 9 9 1 ; B a c c a r i n i e t a l . , 1 9 9 1 ) . I n l i g h t o f t h i s a n d t h e d i s c u s s i o n p r e s e n t e d a b o v e , i t w a s p r o p o s e d ( R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) t h a t t h o s e h e p a t o c y t e s e x h i b i t i n g a n i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f H a - r a s a n d r e f m a y b e a b l e t o o v e r c o m e t h e g r o w t h i n h i b i t o r y a c t i o n s o f P B a n d s e r v e a s t h e p r o g e n i t o r s o f t h e P B - i n d u c e d l i v e r t u m o r s . T h e d e v e l o p m e n t o f s p o n t a n e o u s m o u s e l i v e r 2 2 F i g u r e 3 - P h e n o b a r b i t a l ( P B ) p r o m o t i o n m a y i n v o l v e t h e e x p a n s i o n o f p o p u l a t i o n s o f c e l l s t h a t h a v e o v e r c o m e t h e i n h i b i t o r y e f f e c t s o f P B o n c e l l p r o l i f e r a t i o n . S o m e p a t h w a y s o f h e p a t o c y t e s i g n a l t r a n s d u c t i o n a r e i l l u s t r a t e d . T h e e f f e c t o f P B i s i n d i c a t e d a s a ( + ) r e p r e s e n t i n g s t i m u l a t i o n o r a H r e p r e s e n t i n g i n h i b i t i o n . S h o r t t e r m a d m i n i s t r a t i o n o f P B s t i m u l a t e s c e l l p r o l i f e r a t i o n , w h i l e c h r o n i c P B i n h i b i t s c e l l p r o l i f e r a t i o n . A n * c o r r e s p o n d s t o t h e a c t i v a t e d ( p h o s p h o r y l a t e d ) f o r m o f a p r o t e i n . l S l O l ‘ l o f o n c e l l l s l r a l e d . > r a ( 1 a s c e l l s u m 2 3 T P A P K C r a f * I C E L L P R O L I F E R A T I O N I ( - ) T G F B M G P - I G F 2 r 2 4 t u m o r s w h i c h , i n c o n t r a s t t o t h o s e i n d u c e d b y P B , c o n t a i n a h i g h f r e q u e n c y o f c o d o n 6 1 m u t a t i o n s i n H a - r a s ( F o x e t a l . , 1 9 9 0 ) i n v o l v e s a n i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f H a - r a s a n d n o t r a f ( R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) . F u r t h e r m o r e , h y p o m e t h y l a t i o n m a y b e a m e c h a n i s m t h a t f a c i l i t a t e s t h e c r u c i a l a b e r r a n t o n c o g e n e e x p r e s s i o n . T h i s p r o p o s a l i s c o n s i s t e n t w i t h t h e o b s e r v a t i o n s t h a t r e s i s t a n c e t o t h e g r o w t h i n h i b i t o r y a c t i o n o f T G F - B h a s b e e n o b s e r v e d a ) f o l l o w i n g i n t r o d u c t i o n o f v - H a - r a s i n t o r a t l i v e r e p i t h e l i a l c e l l s ( H o u c k e t a l . , 1 9 8 9 ) a n d t h e d e g r e e o f r e s i s t a n c e , e x h i b i t e d b y r a t i n t e s t i n a l e p i t h e l i a l c e l l s , i s r e l a t e d d i r e c t l y t o t h e l e v e l o f e x p r e s s i o n o f a m u t a t e d H a - r a s ( F i l m u s e t a l . , 1 9 9 2 ) ; a n d b ) i n r a t l i v e r e p i t h e l i a l c e l l s t r a n s f o r m e d w i t h v - r a f ( H u g g e t t e t a l . , 1 9 9 0 ) , s p o n t a n e o u s l y , o r b y t r e a t m e n t w i t h t h e D N A h y p o m e t h y l a t i n g a g e n t A z a C ( H u g g e t t e t a l . , 1 9 9 1 ) . S e v e r a l p e r o x i s o m e p r o l i f e r a t o r s ( e . g . , n a f e n o p i n , m e t h y l - c l o f e n a p a t e , W y - 1 4 , 6 4 3 a n d c l o f i b r i c a c i d ) , w h i c h a r e n o n g e n o t o x i c c o m p o u n d s t h a t m a y p r o d u c e r o d e n t l i v e r t u m o r s f o l l o w i n g p r o l o n g e d a d m i n i s t r a t i o n , h a v e b e e n s h o w n t o i n c r e a s e t h e l e v e l o f T G F - B f o l l o w i n g t h e i r d a i l y a d m i n i s t r a t i o n f o r o n e w e e k ( R u m s b y e t a l . , 1 9 9 4 ) . T h e r e f o r e , w e h y p o t h e s i z e t h a t d e v e l o p m e n t o f r e s i s t a n c e t o g r o w t h i n h i b i t i o n i s a g e n e r a l m e c h a n i s m i n v o l v e d i n t u m o r p r o m o t i o n a s o p p o s e d t o b e i n g u n i q u e f o r P B . T G F - B i s s e c r e t e d f r o m c e l l s a s a l a t e n t c o m p l e x c o n t a i n i n g p h o s p h o m a n n o s y l r e s i d u e s w h i c h c a n u n d e r g o p r o t e o l y t i c a c t i v a t i o n f o l l o w i n g b i n d i n g t o t h e M 6 P - I G F 2 r l o c a t e d o n t h e c e l l s u r f a c e ( r e f e r e n c e d i n J i r t l e e t a l . , 1 9 9 3 ; M i l l s o f a l . , 1 9 9 5 ) . T h e r e f o r e , t h e M 6 P - l G F 2 r g e n e c a n b e v i e w e d a s a 2 5 l i k e l y t u m o r s u p p r e s s o r g e n e ( D e S o u z a e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h e r e a p p e a r t o b e d u a l r o l e s r e g a r d i n g m e t h y l a t i o n a n d t h e M 6 P - I G F 2 r g e n e a s h y p o m e t h y l a t i o n o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n i s r e q u i r e d f o r e x p r e s s i o n a n d m e t h y l a t i o n w i t h i n a n i n t r o n a p p e a r s t o b e a n i m p r i n t i n g s i g n a l r e q u i r e d f o r e x p r e s s i o n ( S t d g e r e t a l . , 1 9 9 3 ) . I n t h i s c o n t e x t , i t s h o u l d b e n o t e d t h a t f a i l u r e t o m a i n t a i n m e t h y l a t i o n o f t h e i m p r i n t e d M 6 P - l G F 2 r i n t r o n w o u l d b e e x p e c t e d t o l e a d t o i n h i b i t i o n o f t r a n s c r i p t i o n , a n d a d e c r e a s e d c a p a c i t y t o r e s p o n d t o T G F - B - i n d u c e d i n h i b i t i o n o f p r o l i f e r a t i o n . T h i s c o u l d b e o n e o f t h e s p e c i f i c m e c h a n i s m s u n d e r l y i n g t h e r o l e o f h y p o m e t h y l a t i o n i n t u m o r p r o m o t i o n . I n t h e m o u s e , o n l y t h e m a t e r n a l a l l e l e i s e x p r e s s e d ( B a r l o w e t a l . , 1 9 9 1 ) , h o w e v e r , b o t h a l l e l e s a r e u s u a l l y e x p r e s s e d i n t h e h u m a n ( X u e t a l . , 1 9 9 3 ) . T h i s c o u l d , i n p a r t , p r o v i d e a b a s i s f o r t h e o b s e r v a t i o n s t h a t , i n g e n e r a l , r o d e n t c e l l s a r e m o r e s u s c e p t i b l e t o t r a n s f o r m a t i o n t h a n h u m a n c e l l s ( r e f e r e n c e d i n R h i m , 1 9 9 3 ) i . e . , t h e r e i s a h i g h e r p r o b a b i l i t y o f l o s i n g t u m o r s u p p r e s s o r f u n c t i o n w h e n o n e i m p r i n t e d e x p r e s s e d a l l e l e i s i n v o l v e d a s c o m p a r e d t o a s i t u a t i o n w h e r e b o t h a l l e l e s a r e e x p r e s s e d . F u r t h e r m o r e , d i f f e r e n c e s i n m e t h y l a t i o n b e t w e e n t h e C S 7 B L / 6 a n d 8 6 C 3 F 1 s t r a i n s o f m i c e c o u l d , i n p a r t , e x p l a i n t h e h i g h t e n d e n c y o f t h e l a t t e r s t r a i n t o d e v e l o p l i v e r t u m o r s ( G o o d m a n e t a l . , 1 9 9 1 ; G o o d m a n a n d C o u n t s , 1 9 9 3 ; C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 0 ; R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) . M e t h y l D e f i c i e n t D l e t s A n e x p e r i m e n t a l m o d e l s y s t e m t h a t c a n b e u s e d t o i n d u c e r o d e n t l i v e r t u m o r s i s t h a t o f a m e t h y l d e f i c i e n t d i e t ( i . e . , d e f i c i e n t i n o n e o r a l l o f t h e d i e t r e s u l t m o r e f r o m i t s s t r o n g l y p r o m o t i n g e f f e c t t h a n f r o m t h e i n i t i a t i n g a c t i v i t y 2 6 f o l l o w i n g m e t h y l d o n o r s : c h o l i n e , m e t h i o n i n e , f o l i c a c i d , a n d v i t a m i n B 1 2 ) ; b o t h r a t s a n d m i c e w i l l d e v e l o p h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a s a f t e r a d m i n i s t r a t i o n o f m e t h y l d e f i c i e n t d i e t s ( N e w b e m e e t a l . , 1 9 8 2 ; M i k o l a t a l . , 1 9 8 3 ; G h o s h a l a n d F a r b e r , 1 9 8 4 ; ) . T h e d i e t s m a y b e c h o l i n e - d e v o i d , m e t h i o n i n e - d e f i c i e n t ( C M D ) , c h o l i n e d e v o i d o n l y , o r l i p o t r o p e d e f i c i e n t ( i . e . , d e f i c i e n t i n a l l f o u r m e t h y l d o n o r s ) . A s w o u l d b e e x p e c t e d , t h e l i p o t r o p e d e f i c i e n t d i e t i s m o r e s e v e r e t h a n t h e m o d e r a t e l y d e f i c i e n t , C M D d i e t . T h e k n o w l e d g e t h a t a C M D d i e t l e a d s t o l i v e r c a r c i n o g e n e s i s i n r o d e n t s , w i t h o u t t h e a d d i t i o n o f a n y k n o w n c a r c i n o g e n s , i s n o t n e w , a l t h o u g h i n i t i a l l y t h e c o n c e p t w a s t r e a t e d w i t h s o m e s k e p t i c i s m a s t h i s w a s o n e o f t h e f i r s t d e m o n s t r a t i o n s o f a d i e t a r y d e f i c i e n c y h a v i n g c a r c i n o g e n i c p r o p e r t i e s ( N e w b e m e a t a l . , 1 9 8 2 ; G h o s h a l a n d F a r b e r , 1 9 8 4 ) . A s t u d y b y S a w a d a a n d c o - w o r k e r s ( S a w a d a e t a l . , 1 9 9 0 ) s e t o u t t o d e t e r m i n e i f t h e C M D d i e t w a s a c t i n g a s a n i n i t i a t o r o r a p r o m o t e r i n t h e l i v e r . M a l e F i s c h e r 3 4 4 r a t s w e r e i n j e c t e d w i t h a n i n i t i a t i n g d o s e o f D E N o r s a l i n e , f e d C M D o r c o n t r o l d i e t , a n d s a c r i f i c e d a t a v a r i e t y o f t i m e p o i n t s b e t w e e n 8 a n d 4 1 w e e k s o f C M D d i e t a d m i n i s t r a t i o n . C M D d i e t a d m i n i s t r a t i o n t o D E N - i n i t i a t e d r a t s l e d t o a n i n c r e a s e i n t h e n u m b e r o f a l t e r e d h e p a t i c f o c i a n d p e r c e n t a g e o f l i v e r o c c u p i e d b y a l t e r e d h e p a t i c f o c i c o m p a r e d t o c o n t r o l r a t s . H o w e v e r , b e t w e e n 8 a n d 4 1 w e e k s o f f e e d i n g t h e C M D d i e t t h e n u m b e r o f f o c i r e m a i n e d r e l a t i v e l y c o n s t a n t w h i l e t h e r e w a s a m a r k e d , p r o g r e s s i v e i n c r e a s e i n t h e p e r c e n t a g e o f l i v e r o c c u p i e d b y f o c i . T h e s e r e s u l t s p r o v i d e e v i d e n c e t h a t t h e c a r c i n o g e n i c e f f e c t s o f t h e C M D 2 7 o f t h e d i e t ( S a w a d a e t a l . , 1 9 9 0 ) . C h o l i n e i s a r e q u i r e d c o m p o n e n t o f t h e m a m m a l i a n d i e t . T h e r e a r e s e v e r a l c r u c i a l r e a c t i o n t h a t r e q u i r e c h o l i n e o r o n e i f i t s m e t a b o l i t e s ( Z e i s e l e t a l . , 1 9 8 9 ) . C h o l i n e i s i m p o r t a n t f o r n e u r o t r a n s m i s s i o n , a s c h o l i n e i s t a k e n u p b y a h i g h a f f i n i t y p r o c e s s i n n e r v e c e l l s a n d t h i s l e a d s t o t h e f o r m a t i o n o f t h e n e u r o t r a n s m i t t e r a c e t y l c h o l i n e . C h o l i n e c o n t r i b u t e s t o t h e f o r m a t i o n o f t h e p h o s p h o l i p i d p h o s p h a t i d y l c h o l i n e w h i c h m a k e s u p a l a r g e p a r t o f c e l l u l a r m e m b r a n e s . F u r t h e r , p h o s p h a t i d y l c h o l i n e i s i m p o r t a n t i n t h e t r a n s p o r t o f l i p i d o u t o f h e p a t o c y t e s ( Y a o a n d V a n c e , 1 9 8 8 ) . I n a d d i t i o n , c h o l i n e i s i n v o l v e d i n t h e s u p p l y o f d i e t a r y m e t h y l g r o u p s r e q u i r e d f o r m e t h y l a t i o n o f D N A . T h i s o c c u r s v i a t h e c o - f a c t o r , S A M , w h i c h i s s y n t h e s i z e d f r o m c h o l i n e a n d m e t h i o n i n e i n a r e a c t i o n t h a t r e q u i r e s A T P . I t f o l l o w s f r o m t h i s d i s c u s s i o n o f c h o l i n e m e t a b o l i s m t h a t a d i e t l a c k i n g i n c h o l i n e a n d d e f i c i e n t i n m e t h i o n i n e m a y i n t e r f e r e w i t h m a n y b i o l o g i c a l p r o c e s s e s , a n d i s e x p e c t e d t o l e a d t o h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A . T h i s s y s t e m t h e n p r o v i d e s a n e x p e r i m e n t a l m o d e l t h a t c a n b e u t i l i z e d t o s t u d y t h e e f f e c t s o f h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A . I n a d d i t i o n , P B , a c l a s s i c r o d e n t l i v e r t u m o r p r o m o t e r a l s o l e a d s t o d e c r e a s e s i n S A M ( S h i v a p u r k a r a n d P o i r i e r , 1 9 8 2 ) . P B a d m i n i s t r a t i o n , a t d o s e s c a p a b l e o f p r o m o t i n g r o d e n t l i v e r t u m o r i g e n e s i s , c a u s e s a n i n c r e a s e i n c e l l p r o l i f e r a t i o n d u r i n g t h e f i r s t o n e t o t w o w e e k s o f a d m i n i s t r a t i o n ( W e g h o r s t a n d K l a u n i g , 1 9 8 9 ; K l a u n i g e t a l . , 1 9 8 9 ; S i g l i n e t a l . , 1 9 8 9 ) . T r e a t i n g a n i m a l s m a i n t a i n e d o n a C M D d i e t w h i l e a d m i n i s t e r i n g a p r o m o t i n g d o s e o f P B m a y l e a d t o a n i n c r e a s e i n p r o l i f e r a t i o n u n d e r c o n d i t i o n s w h e r e S A M i s d e p l e t e d a n d t h i s c o u l d f a c i l i t a t e 2 8 e v e n g r e a t e r l e v e l s o f h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A . E a r l y w o r k o n C M D d i e t t r e a t e d a n i m a l s , u s u a l l y t h e r a t , f o c u s e d o n u n d e r s t a n d i n g t h e o n s e t o f f a t t y l i v e r u p o n a d m i n i s t r a t i o n o f t h e d i e t ( B u c k l e y a n d H a r t r o l t , 1 9 5 5 ; N e w b e m e , 1 9 8 6 ) . T h e r e s u l t s o f m a n y s t u d i e s h a v e d e t e r m i n e d t h a t t h i s s i t u a t i o n i s d u e t o a n a l t e r e d t r a n s p o r t o f t r i g l y c e r i d e o u t o f t h e h e p a t o c y t e . T r i g l y c e r i d e i s n o r m a l l y t r a n s p o r t e d o u t o f t h e h e p a t o c y t e i n v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s ( V L D L ) ; t h e s e a r e m a d e u p , i n l a r g e p a r t , b y p h o s p h a t i d y l c h o l i n e . T h e r e m o v a l o f c h o l i n e f r o m t h e d i e t l e a d s t o d e c r e a s e d p h o s p h a t i d y l c h o l i n e a n d , t h e r e f o r e , d e c r e a s e d V L D L ( Y a o a n d V a n c e , 1 9 8 8 ) . T h e d e v e l o p m e n t o f t u m o r s i n t h e s e r a t s i n i t i a l l y l e d t o s p e c u l a t i o n t h a t a c o n t a m i n a t e ( a f l a t o x i n ) w a s p r e s e n t i n t h e d i e t s , a s t h i s w a s t h e f i r s t e x a m p l e o f a d e f i c i e n c y l e a d i n g t o t u m o r d e v e l o p m e n t . I t w a s l a t e r d e t e r m i n e d t h a t a c o n t a m i n a n t w a s n o t p r e s e n t , a n d t h e t u m o r s s t i l l d e v e l o p e d ( M i k o l a t a l . , 1 9 8 3 ; G h o s h a l a n d F a r b e r , 1 9 8 4 ; Y o k o y a m a e t a l . , 1 9 8 5 ) . T h e r e a r e c u r r e n t l y t h r e e h y p o t h e s e s a s t o t h e m e c h a n i s m o f a c t i o n o f m e t h y l d e f i c i e n c y , e . g . , C M D d i e t - i n d u c e d , i n l i v e r t u m o r i g e n e s i s : ( 1 ) d e p l e t i o n o f c h o l i n e a n d m e t h i o n i n e l e a d i n g t o d e c r e a s e d l e v e l s o f S A M a n d t h e r e b y t o h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A w h i c h f a c i l i t a t e s a b e r r a n t o n c o g e n e e x p r e s s i o n , ( W a i n f a n a n d P o i r i e r , 1 9 9 2 ; C h r i s t m a n e t a l . , 1 9 9 3 ) ( 2 ) d e p l e t i o n o f c h o l i n e a n d m e t h i o n i n e l e a d i n g t o d e c r e a s e d g e n e r a t i o n o f g l u t a t h i o n e ( a t r i p e p t i d e i m p o r t a n t i n p r o t e c t i o n a g a i n s t o x i d a t i v e d a m a g e ) w h i c h a l l o w s f o r i n c r e a s e d l e v e l s o f r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s , ( G h o s h a l a n d F a r b e r , 1 9 9 3 ) a n d ( 3 ) d e p l e t i o n o f c h o l i n e a n d m e t h i o n i n e l e a d i n g t o a l t e r a t i o n s i n P K C a n d a l t e r e d e x p r e s s i o n 2 9 o f g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r s o n t h e p l a s m a m e m b r a n e ( R o g e r s e t a l . , 1 9 9 3 ) ( F i g u r e 4 ) . N e x t t o h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A , t h e g e n e r a t i o n o f r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s l e a d i n g t o l i p i d p e r o x i d a t i o n i s a h y p o t h e s i s t h a t h a s r e c e i v e d a l o t o f a t t e n t i o n a s a p o t e n t i a l m e c h a n i s m o f t h e t u m o r i g e n i c i t y o f t h e C M D d i e t i n r o d e n t s ( R u s h m o r e e t a l . , 1 9 8 6 ; R u s h m o r e e t a l . , 1 9 8 7 ; G h o s h a l a n d F a r b e r , 1 9 9 3 ) . T h e f o r m a t i o n o f t h e s e s p e c i e s d o e s n o t n e g a t e t h e p o s s i b i l i t y t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A m a y b e i n f l u e n c i n g g e n e e x p r e s s i o n a n d f a c i l i t a t i n g t u m o r i g e n e s i s . I t i s i m p o r t a n t t o p o i n t o u t t h a t t h e g e n e r a t i o n o f r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s w o u l d b e e x p e c t e d t o r e s u l t i n G t o T a n d A t o C s u b s t i t u t i o n s ( C h e n g e t a l . , 1 9 9 2 ) , b u t t h e s e d o n o t a p p e a r i n r o d e n t s o n a C M D d i e t ( S m i t h e t a l . , 1 9 9 3 ) . F u r t h e r m o r e , a d m i n i s t r a t i o n o f a n t i o x i d a n t s i n t h e d i e t d o e s n o t p r o t e c t a g a i n s t t h e m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s t h a t o c c u r u p o n a d m i n i s t r a t i o n o f a C M D d i e t ( J e n k i n s e t a l . , 1 9 9 3 ; M i z u m o t o e t a l . , 1 9 9 4 ) . T h i s p r o t e c t i o n w o u l d b e e x p e c t e d i f t h e a l t e r e d m o r p h o l o g y ( i . e . , f a t t y l i v e r g e n e r a t i o n ) w a s d u e t o t h e g e n e r a t i o n o f r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s . D i e t a r y a n t i o x i d a n t s h a v e b e e n r e p o r t e d t o d e c r e a s e t h e s i z e o f G G T p o s i t i v e f o c i ( P e r e r a e t a l . , 1 9 8 5 ; M i z u m o t o e t a l . , 1 9 9 4 ; N a k a e e t a l . , 1 9 9 4 ) w i t h o u t a f f e c t i n g 8 - h y d r o x y g u a n i n e l e v e l s , i . e . , o x i d a t i v e D N A d a m a g e ( N a k a e e t a l . , 1 9 9 4 ) . A d d i t i o n a l l y , a c e t y l s a l i c y l i c a c i d h a s b e e n r e p o r t e d t o p r o t e c t a g a i n s t C M D d i e t - i n d u c e d h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s i n t h e r a t , b u t t h e f a t t y c h a n g e p e r s i s t e d ( D e n d a e t a l . , 1 9 9 4 ) . I n t h i s r e p o r t , a c e t y l s a l i c y l i c w a s d e m o n s t r a t e d t o d e c r e a s e h e p a t o c y t e c e l l p r o l i f e r a t i o n ( i n a n i m a l s t h a t r e c e i v e d e i t h e r C M D d i e t o r c o n t r o l ( c h o l i n e s u p p l e m e n t e d ) d i e t ) a s w e l l a s r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s g e n e r a t i o n ( D e n d a e t a l . , 1 9 9 4 ) . 3 0 O X Y G E N R A D I C A L S A L T E R E D D N A a n d / o r M E M B R A N E S C M D — P l i v e r H Y P O M E T H Y L A T I O \ N A B E R R A N T G E N E E X P R E S S I O N C E L L P R O L I F E R A T I O N P K C a n d / o r G R O W T H F A C T O R \ v P R O M O T I O N e / C A N C E R F i g u r e 4 - P o t e n t i a l m e c h a n i s m ( s ) O f a c t i o n o f c h o l i n e - d e v o i d , m e t h i o n i n e - d e f i c i e n t ( C M D ) d i e t s i n r o d e n t l i v e r . C M D d i e t s l e a d t o o x y g e n r a d i c a l f o r m a t i o n , h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A , s t i m u l a t i o n o f c e l l p r o l i f e r a t i o n , a n d a l t e r e d P K C . T h e s e e f f e c t s , a l o n e o r , m o r e l i k e l y , i n c o m b i n a t i o n , a r e i n v o l v e d i n t u m o r p r o m o t i o n t h a t f a c i l i t a t e s l i v e r n e o p l a s i a . 3 1 F u r t h e r m o r e , a c e t y l s a l i c y l i c a c i d h a s b e e n r e p o r t e d t o p r o t e c t a g a i n s t D E N - i n i t i a t e d , P B - p r o m o t e d r a t l i v e r t u m o r f o r m a t i o n ( D e n d a e t a l . , 1 9 8 9 ) i n d i c a t i n g a n i n h i b i t o r y e f f e c t o f a c e t y l s a l i c y l i c a c i d o n t u m o r p r o m o t i o n . A r e c e n t p a p e r h a s d e m o n s t r a t e d t h a t h y d r o g e n p e r o x i d e , a r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s , h a s m i t o g e n i c p r o p e r t i e s o n v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s ( S u n d a r e s a n e t a l . , 1 9 9 5 ) , i n d i c a t i n g t h a t n o n - g e n o t o x i c e f f e c t s o f o x y g e n r a d i c a l s l e a d t o i n c r e a s e d s i g n a l t r a n s d u c t i o n a n d c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d m a y , t h e r e f o r e , b e i n v o l v e d i n t h e m e c h a n i s m o f a c t i o n o f r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s . T a k e n t o g e t h e r t h e n , t h e C h e m o p r e v e n t a t i v e a c t i o n O f a c e t y l s a l i c y l i c a c i d m a y b e d u e t o d e c r e a s e d l i v e r r e g e n e r a t i o n , o r d e c r e a s e d s i g n a l t r a n s d u c t i o n v i a i n h i b i t i o n o f a r a c h a d o n i c a c i d m e t a b o l i s m . S e v e r a l r e v i e w s t h a t a d d r e s s t h e r o l e a n d l i k e l i h o o d o f e a c h O f t h e s e p o t e n t i a l m e c h a n i s m s l e a d i n g t o l i v e r t u m o r f o r m a t i o n i n r o d e n t s h a v e b e e n p u b l i s h e d a n d i t s e e m s l i k e l y t h a t m o r e t h a n o n e O f t h e s e m e c h a n i s m s m a y b e a c t i v e ( W a i n f a n a n d P o i r i e r , 1 9 9 2 ; R o g e r s e t a l . , 1 9 9 3 ; S h i n o z u k a e t a l . , 1 9 9 3 ; C h r i s t m a n e t a l . , 1 9 9 3 ; G h o s h a l a n d F a r b e r , 1 9 9 3 ; L o m b a r d i a n d S m i t h , 1 9 9 4 ) M y f o c u s i s u p o n h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A a s a m e c h a n i s m i n v o l v e d i n l i v e r t u m o r f o r m a t i o n u n d e r t h i s d i e t a r y d e f i c i e n c y . H o w e v e r , t h i s d o e s n o t e x c l u d e t h e p o s s i b i l i t y O f a n y o f t h e o t h e r m e c h a n i s m s p l a y i n g a r o l e . A d i s c u s s i o n O f t h e e x p e r i m e n t a l e v i d e n c e s u p p o r t i n g a n i m p o r t a n t r o l e f o r h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A i n t h i s s y s t e m i s u s e f u l ; h o w e v e r , c o m p a r i s o n s a r e c o m p l i c a t e d b e c a u s e o f t h e m a n y d i f f e r e n t t y p e s o f m e t h y l d e f i c i e n t d i e t s u t i l i z e d . T h e s e d i e t s r a n g e i n d e g r e e o f m e t h y l d e f i c i e n c y f r o m t h e r e l a t i v e l y 3 2 m o d e r a t e C M D d i e t t o t h e m o r e s e v e r e l i p o t r o p e d e f i c i e n t d i e t ( d e f i c i e n t i n a l l f o u r m e t h y l d o n o r s ) . H y p o m e t h y l a t i o n O f h e p a t i c D N A , a s s e s s e d b y a v a r i e t y o f m e t h o d s , i s s e e n i n a l l s t u d i e s i n r a t s ( L o c k e r e t a l . , 1 9 8 6 ; W i l s o n e t a l . , 1 9 8 4 ; W a i n f a n e t a l . , 1 9 8 9 ) a n d m i c e ( S h i v a p u r k a r e t a l . , 1 9 8 6 ) , t h o u g h i n t h e l a s t e x a m p l e t h e d e c r e a s e s w e r e n o t s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t . I n m o s t c a s e s , D N A m e t h y l a t i o n w a s a s s e s s e d b y H P L C a n d e x p r e s s e d a s % C p r e s e n t a s 5 M e C , h o w e v e r , i n t h e s t u d y b y W a i n f a n a n d c o - w o r k e r s h y p o m e t h y l a t i o n w a s a s s e s s e d i n d i r e c t l y b y t h e a b i l i t y o f t h e D N A t o a c c e p t r a d i o l a b e l e d m e t h y l g r o u p s a n d w a s e v i d e n t a f t e r o n l y o n e w e e k o n t h e l i p o t r o p e d e f i c i e n t d i e t ( W a i n f a n e t a l . , 1 9 8 9 ) . I n a s i m i l a r s t u d y b y W i l s o n a n d a s s o c i a t e s a C M D d i e t w a s a d m i n i s t e r e d f o r t w o m o n t h s b e f o r e h y p o m e t h y l a t e d D N A w a s e v i d e n t i n t h e r a t ( W i l s o n e t a l . , 1 9 8 4 ) . T h e s e O b s e r v a t i o n s l e d t o m o r e r e f i n e d a n a l y s e s b y e x a m i n i n g t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s O f s p e c i f i c g e n e s u s i n g m e t h y l a t i o n s e n s i t i v e r e s t r i c t i o n e n z y m e s . H y p o m e t h y l a t i o n w a s e v i d e n t i n H a - r a s ( B h a v e e t a l . , 1 9 8 8 ; Z a p i s e k e t a l . , 1 9 9 2 ; D i z i k e t a l . , 1 9 9 1 ; W a i n f a n a n d P o i r i e r , 1 9 9 2 ) , K i - r a s ( B h a v e e t a l . , 1 9 8 8 ; Z a p i s e k e t a l . , 1 9 9 2 ) , m y c ( D i z i k e t a l . , 1 9 9 1 ; W a i n f a n a n d P o i r i e r , 1 9 9 2 ) , a n d f o s ( D i z i k e t a l . , 1 9 9 1 ; Z a p i s e k e t a l . , 1 9 9 2 ) u s u a l l y b y o n e t o t h r e e w e e k s . A C M D d i e t w a s u t i l i z e d i n a f e w o f t h o s e s t u d i e s ( B h a v e e t a l . , 1 9 8 8 ; Z a p i s e k e t a L , 1 9 9 2 ) I n a d d i t i o n t o a n a l y z i n g t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f s p e c i f i c g e n e s , l e v e l s o f g e n e e x p r e s s i o n h a v e a l s o b e e n d e t e r m i n e d . B o t h t h e l i p o t r o p e d e f i c i e n t a n d t h e C M D d i e t l e a d t o i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f c - m y c ( C h a n d a r e t a l . , 1 9 8 9 ; D i z i k 3 3 e t a l . , 1 9 9 1 ; W a i n f a n a n d P o i r i e r , 1 9 9 2 ) , c - f o s a n d c - H a - r a s i n r a t s ( D i z i k e t a l . , 1 9 9 1 ; W a i n f a n a n d P o i r i e r , 1 9 9 2 ) . T h e s e i n c r e a s e s i n m R N A a r e e v i d e n t a f t e r o n l y o n e w e e k O f l i p o t r o p e - d e f i c i e n t d i e t a d m i n i s t r a t i o n ( D i z i k e t a l . , 1 9 9 1 ) . H s i e h a n d c o w o r k e r s m e a s u r e d t h e l e v e l o f e x p r e s s i o n o f H a - r a s , c - m y c a n d o t h e r g e n e s i n B 6 C 3 F 1 m i c e o n a l i p o t r o p e d e f i c i e n t d i e t . T h e y f o u n d l a r g e i n c r e a s e s i n c - m y c a n d s m a l l e r i n c r e a s e s i n H a - r a s m R N A e x p r e s s i o n a f t e r 2 w e e k s o f f e e d i n g ( H s i e h e t a l . , 1 9 8 9 ) . T h e s a m e s t u d y a l s o e v a l u a t e d t h e l e v e l o f c e l l p r o l i f e r a t i o n b y m e a s u r i n g 3 H - t h y m i d i n e i n c o r p o r a t i o n . H e r e , i n c r e a s e s w e r e e v i d e n t a f t e r f o u r d a y s o f l i p o t r o p e d e f i c i e n t d i e t a d m i n i s t r a t i o n ( H s i e h e t a L , 1 9 8 9 ) T h e s i g n i f i c a n c e o f t h i s e x p e r i m e n t a l s y s t e m i s r e a d i l y e v i d e n t w h e n o n e c o n s i d e r s t h e p o t e n t i a l u s e f u l n e s s O f d i e t a r y m e t h y l d e f i c i e n c i e s i n d i s c e r n i n g m e c h a n i s m s u n d e r l y i n g t u m o r p r o m o t i o n w h e n c a r e f u l c o m p a r i s o n s a r e c a r r i e d o u t b e t w e e n s t r a i n s o f m i c e w i t h w e l l - c h a r a c t e r i z e d d i f f e r e n c e s i n s e n s i t i v i t i e s t o w a r d s l i v e r t u m o r f o r m a t i o n . M y a p p r o a c h ( b e i n g c a r r i e d o u t i n c o l l a b o r a t i o n w i t h D r s . R . M . M c C l a i n a n d M L . H a r b i s o n , H o f f m a n n - L a R o c h e , I n c . ) e m p l o y i n g t h e r e l a t i v e l y s u s c e p t i b l e 8 6 C 3 F 1 a n d t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 , a l l o w s f o r c o m p a r i s o n s o f m e t h y l a t i o n s t a t u s , g e n e e x p r e s s i o n , a n d l e v e l s o f c e l l p r o l i f e r a t i o n u n d e r d i e t a r y c o n d i t i o n s k n o w n t o l e a d t o l i v e r c a r c i n o g e n e s i s i n t h e B B C 3 F 1 , a n d t o d i s c u s s a n y d i f f e r e n c e s i n t h e c o n t e x t o f t h e d i f f e r e n t p r o p e n s i t i e s t o w a r d l i v e r t u m o r i g e n e s i s e x h i b i t e d b y t h e s e a n i m a l s . 3 4 D N A D a m a g e a n d A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n T h e p o t e n t i a l f o r g e n o t o x i c c a r c i n o g e n s t o i n f l u e n c e D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s h a s b e e n s t u d i e d . W i l s o n a n d a s s o c i a t e s e x a m i n e d t h e l e v e l o f 5 M e C p r e s e n t i n D N A a f t e r t r e a t m e n t o f n o r m a l h u m a n b r o n c h i a l e p i t h e l i a l c e l l s w i t h a v a r i e t y o f c a r c i n o g e n s ( i n c l u d i n g b e n z o [ a ] p y r e n e , a f l a t o x i n B , , a n d 7 , 1 2 - d i m e t h y l b e n z [ a ] a n t h r a c e n e ) , a w e a k c a r c i n o g e n ( b e n z o [ a ] p y r e n e ) a n d a n o n - c a r c i n o g e n ( p h e n a n t h r e n e ) ( W i l s o n e t a l . , 1 9 8 7 a ) . A s a c o n t r o l t h e y u s e d A z a C , a c o m p o u n d k n o w n t o h y p o m e t h y l a t e D N A ( s e e e a r l i e r d i s c u s s i o n ) . T h e n o n - c a r c i n o g e n a n d t h e w e a k c a r c i n o g e n d i d n o t a l t e r t h e l e v e l o f 5 M e C w h i l e a l l o f t h e o t h e r c a r c i n o g e n s t e s t e d d e c r e a s e d l e v e l s o f 5 M e C i n D N A c o m p a r e d t o c o n t r o l s ( W i l s o n e t a l . , 1 9 8 7 a ) . I n a d d i t i o n , b e n z o [ a ] p y r e n e w a s t e s t e d a t s e v e r a l d o s e l e v e l s a n d a d o s e r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p w a s e x h i b i t e d ; t h e r e w a s a n i n v e r s e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n d o s e a n d 5 M e C c o n t e n t ( W i l s o n e t a l . , 1 9 8 7 a ) . T h e p r e s e n c e o f 0 6 - m e t h y l g u a n i n e o n t h e n e w l y s y n t h e s i z e d D N A s t r a n d a t h e m i m e t h y l a t e d C p G s i t e s m a y i n t e r f e r e w i t h t h e a b i l i t y o f t h e D N A M T a s e t o i n c o r p o r a t e t h e m e t h y l g r o u p o n t o t h e c y t o s i n e a d j a c e n t t o t h e O B - m e t h y l g u a n i n e d u r i n g D N A r e p l i c a t i o n ( T a n a n d L i , 1 9 9 0 ; H e p b u r n e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h u s , i n a p r o l i f e r a t i n g p o p u l a t i o n o f c e l l s , a l k y l a t i o n O f g u a n i n e o n t h e n e w l y s y n t h e s i z e d D N A s t r a n d , m a y r e s u l t i n h y p o m e t h y l a t i o n . T h i s h e r i t a b l e e p i g e n e t i c m o d i f i c a t i o n w o u l d r e m a i n e v e n i f t h e i n i t i a l D N A d a m a g e w a s e v e n t u a l l y r e p a i r e d . T h e s e s t u d i e s i n d i c a t e t h a t g e n o t o x i c c h e m i c a l s , c o m m o n l y t h o u g h t o f a s a c t i n g b y a m e c h a n i s m i n v o l v i n g m u t a g e n e s i s , m a y a l s o a c t t o i n f l u e n c e g e n e e x p r e s s i o n b y a l t e r i n g t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f D N A 3 5 ( F i g u r e 1 ) . G e n o t o x i c c o m p o u n d s a c t t o i n h i b i t m e t h y l a t i o n e i t h e r d i r e c t l y , b y c o v a l e n t l y b i n d i n g t o a n d i n a c t i v a t i n g t h e m e t h y l a s e ( R u c h i r a w a t e t a l . , 1 9 8 4 ; W o j c i e c h o w s k i a n d M e e h a n , 1 9 8 4 ) o r i n d i r e c t l y , b y a d d u c t f o r m a t i o n o n D N A p r e v e n t i n g a c c e s s o f t h e m e t h y l a s e t o t h e C p G s i t e ( T a n a n d L i , 1 9 9 0 ; H e p b u r n a t a l . , 1 9 9 1 ) . A d d i t i o n a l l y , t h e r e a r e r e p o r t s i n d i c a t i n g a n L a w i n D N A m e t h y l a s e a c t i v i t y u p o n r e m o v a l o f t h e c a r c i n o g e n ( B o e h m e t a l . , 1 9 8 3 ; P f o h l - L e s z k o w i c z a n d D i r h e i m e r , 1 9 8 6 ) . T h e i n c r e a s e d l e v e l s O f m e t h y l a s e a c t i v i t y a f t e r c a r c i n o g e n r e m o v a l m a y r e f l e c t i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f t h e m e t h y l t r a n s f e r a s e p r o t e i n a s i t a t t e m p t s t o c o m p e n s a t e f o r t h e c a r c i n o g e n s e f f e c t o n m e t h y l a t i o n s t a t u s . F u r t h e r m o r e , O 6 a l k y l a t i o n o f t h e g u a n i n e m o i e t y a t a C p G s i t e m a y n o t b e r e p a i r e d e f f i c i e n t l y w h e n t h e C i s m e t h y l a t e d a n d t h i s c o u l d f a c i l i t a t e m u t a g e n e s i s ( B e n t i v e g n a a n d B r e s n i c k , 1 9 9 4 ) . A s w a s n o t e d e a r l i e r , o n e h y p o t h e s i s r e g a r d i n g a m e c h a n i s m b y w h i c h a C M D d i e t r e s u l t s i n t u m o r i g e n e s i s i s t h e g e n e r a t i o n o f r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s . A t t h i s t i m e i t i s u s e f u l t o p o i n t o u t t h a t t h e g e n e r a t i o n o f r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s m a y a l s o i n d u c e h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A . E n d o g e n o u s o x i d a t i v e d a m a g e ( i . e . , f r e e r a d i c a l - i n d u c e d d a m a g e ) i s b e c o m i n g a n a r e a o f i n c r e a s i n g i n t e r e s t i n s t u d i e s a i m e d a t d i s c e r n i n g m e c h a n i s m s u n d e r l y i n g c a r c i n o g e n e s i s . T h i s i s d u e t o t h e p o t e n t i a l f o r o x i d a t i v e s t r e s s t o l e a d t o a l t e r a t i o n s i n D N A . F o r e x a m p l e , 8 - h y d r o x y g u a n i n e i s a c o m m o n p r o d u c t O f o x i d a t i v e d a m a g e . A r e c e n t s t u d y b y W e i t z m a n a n d c o - w o r k e r s e x a m i n e d t h e e f f e c t O f t h e p r e s e n c e o f 8 - h y d r o x y g u a n i n e i n D N A a t 5 ' - C C G G - 3 ' s i t e s i n p l a c e o f g u a n i n e ( W e i t z m a n 3 6 e t a l . , 1 9 9 4 ) . A s w a s d i s c u s s e d e a r l i e r , 5 M e C i s m o s t O f t e n f o u n d i n D N A a t C p G s i t e s a n d 5 M e C i s n o t d i r e c t l y i n c o r p o r a t e d i n t o D N A ; t h e p a r e n t a l s t r a n d o f D N A c o n t a i n s t h e 5 M e C w h i l e C i s i n c o r p o r a t e d i n t o t h e d a u g h t e r s t r a n d . T h i s g e n e r a t e s a h e m i m e t h y l a t e d s i t e t h a t i s r e c o g n i z e d b y a n S A M - r e q u i r i n g m a i n t e n a n c e m e t h y l a s e w h i c h a d d s t h e m e t h y l g r o u p t o t h e 5 p o s i t i o n o f c y t o s i n e o n t h e d a u g h t e r s t r a n d . I t w a s d e m o n s t r a t e d t h a t 8 - h y d r o x y g u a n i n e i n d e o x y o l i g o n u c l e o t i d e s i n h i b i t e d t h e a b i l i t y o f t h e D N A M T a s e t o m e t h y l a t e D N A ( W e i t z m a n e t a l . , 1 9 9 4 ) . T h i s p r o v i d e s a n e x a m p l e o f a s i t u a t i o n w h e r e o x i d a t i v e d a m a g e c a n g e n e r a t e h y p o m e t h y l a t e d D N A - a s i t u a t i o n t h a t c a n f a c i l i t a t e a b e r r a n t o n c o g e n e e x p r e s s i o n i n v o l v e d i n t u m o r i g e n e s i s . S e v e r a l s t u d i e s h a v e e x a m i n e d t h e i n f l u e n c e O f f r e e r a d i c a l e f f e c t s i n r a t l i v e r t u m o r s i n d u c e d b y a c h o l i n e - d e v o i d , m e t h i o n i n e - d e f i c i e n t d i e t ( R u s h m o r e e t a l . , 1 9 8 6 ; R u s h m o r e a t a l . , 1 9 8 7 ) a n d h a v e s h o w n t h a t l i p i d p e r o x i d a t i o n i s a n e a r l y e v e n t . T h e y s u g g e s t t h a t o x i d a t i v e D N A d a m a g e p l a y s a r o l e i n c a r c i n o g e n e s i s . E v i d e n c e d e m o n s t r a t i n g t h a t d i e t a r y a n t i o x i d a n t s p r o t e c t a g a i n s t b i o c h e m i c a l c h a n g e s , b u t n o t m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s s e e n i n m e t h y l d e f i c i e n c y ( J e n k i n s e t a l . , 1 9 9 3 ) i n d i c a t e s t h a t f a c t o r s i n a d d i t i o n t o o x i d a t i v e d a m a g e m a y b e p l a y i n g a r o l e i n d e t e r m i n i n g t h e e f f e c t s o f C M D d i e t s . I n l i g h t o f t h e d i s c u s s i o n p r e s e n t e d a b o v e , I w o u l d l i k e t o p o i n t o u t t h a t t o t h e e x t e n t t h a t o x i d a t i v e D N A d a m a g e p l a y s a r o l e i n C M D d i e t - i n d u c e d l i v e r c a r c i n o g e n e s i s , h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A m a y a l s o b e i n v o l v e d . 3 7 D N A M e t h y l a t i o n a n d C h e m o p r e v e n t i o n W h i l e t h e p r e c e d i n g d i s c u s s i o n h a s f o c u s e d o n t h e c o n v i n c i n g b o d y o f l i t e r a t u r e i n d i c a t i n g t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A c a n f a c i l i t a t e a b e r r a n t g e n e e x p r e s s i o n t h a t i s i n v o l v e d i n c a r c i n o g e n e s i s , i t i s a l s o i m p o r t a n t t o a d d r e S s t h e p o t e n t i a l f o r a n i n c r e a s e d c a p a c i t y f o r D N A m e t h y l a t i o n t o p r o t e c t a g a i n s t c a r c i n o g e n e s i s . E t h i o n i n e , a c h e m i c a l c a r c i n o g e n t h a t i n t e r f e r e s w i t h S A M m e t a b o l i s m , i s a k n o w n r o d e n t l i v e r c a r c i n o g e n ( F a r b e r , 1 9 6 3 ) . I n t e r e s t i n g l y , i f a n i m a l s a d m i n i s t e r e d a d i e t c o n t a i n i n g e t h i o n i n e a r e a l s o g i v e n a d i e t s u p p l e m e n t e d w i t h c h o l i n e a n d / o r m e t h i o n i n e t u m o r s d o n o t r e s u l t ( r e f e r e n c e d i n H o f f m a n , 1 9 8 4 ) . T h e p r o t e c t i o n a g a i n s t l i v e r t u m o r i g e n e s i s a f f o r d e d b y a d d i t i o n a l c h o l i n e a n d m e t h i o n i n e i n t h e d i e t h a s b e e n d e m o n s t r a t e d i n b o t h t h e m o u s e a n d r a t . B 6 C 3 F 1 m i c e w e r e f e d a n e x c e s s o f c h o l i n e , m e t h i o n i n e o r b o t h a f t e r a d m i n i s t r a t i o n o f a c a r c i n o g e n i c d o s e o f a f l a t o x i n B 1 a n d t h e t u m o r y i e l d w a s d e t e r m i n e d a t 5 0 w e e k s ( N e w b e m e e t a l . , 1 9 9 0 ) . T h e m i c e t h a t r e c e i v e d a f l a t o x i n B , a n d w e r e f e d t h e e x c e s s c h o l i n e a n d e x c e s s m e t h i o n i n e d i e t h a d a t u m o r y i e l d c o m p a r a b l e w i t h c o n t r o l a n i m a l s t h a t d i d n o t r e c e i v e c a r c i n o g e n , i . e . , a c h e m o p r o t e c t i v e e f f e c t w a s d e m o n s t r a t e d ( N e w b e m e e t a l . , 1 9 9 0 ) . T h e g r o u p s o f a n i m a l s t h a t r e c e i v e d e i t h e r e x c e s s c h o l i n e o r e x c e s s m e t h i o n i n e a l o n e e x h i b i t e d s o m e p r o t e c t i o n f r o m a f l a t o x i n B 1 i n d u c e d l i v e r t u m o r i g e n e s i s , b u t t h i s w a s i n t e r m e d i a t e b e t w e e n t h e a n i m a l s r e c e i v i n g a n e x c e s s O f b o t h m e t h y l d o n o r s a n d t h o s e r e c e i v i n g n o a d d i t i o n a l d i e t a r y m e t h y l d o n o r s . T h e a u t h o r s c o n c l u d e d t h a t t h e p r o t e c t i o n r e s u l t e d f r o m i n c r e a s e d m e t a b o l i c 3 8 i n a c t i v a t i o n o f a f l a t o x i n B 1 ; h o w e v e r , a r o l e f o r p r o t e c t i o n a g a i n s t h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A c a n n o t b e d i s c o u n t e d . F u l l e r t o n a n d c o - w o r k e r s n o t e d a n i n h i b i t i o n o f D E N - i n i t i a t e d a n d P B - p r o m o t e d l i v e r c a r c i n o m a , b u t n o t a d e n o m a , f o r m a t i o n i n C 3 H / H e m i c e f e d a d i e t s u p p l e m e n t e d w i t h b o t h C h o l i n e a n d m e t h i o n i n e ( F u l l e r t o n e t a l . , 1 9 9 0 ) . I n a d d i t i o n , i n t h e a n i m a l s o n t h e c h o l i n e a n d m e t h i o n i n e s u p p l e m e n t e d d i e t , t h e r e w a s a d e c r e a s e i n c a r c i n o m a , b u t n o t a d e n o m a , f o r m a t i o n a f t e r P B - t r e a t m e n t a l o n e , a n d t h e r e w e r e a l s o f e w e r m e t a s t a s e s t o t h e l u n g w h e n t u m o r s d i d f o r m ( F u l l e r t o n e t a l . , 1 9 9 0 ) . T h e p r o t e c t i v e e f f e c t o f a c e t y l s a l i c y l i c a c i d o n C M D d i e t - i n d u c e d - ( D e n d a e t a l . , 1 9 9 4 ) a n d D E N - i n i t i a t e d , P B p r o m o t e d - ( D e n d a e t a l . , 1 9 8 9 ) h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s i n t h e r a t s u p p o r t s c o n t i n u e d e x p l o r a t i o n c o n c e r n i n g i t s u s e i n C h e m o p r e v e n t i o n a n d s e r v e s t o i l l u s t r a t e t h e c o m p l e x , m u l t i p l e a l t e r a t i o n s i n v o l v e d i n t u m o r i g e n e s i s . A p r o t e c t i v e e f f e c t o f t h e a d m i n i s t r a t i o n o f S A M o n t h e d e v e l o p m e n t o f r a t l i v e r t u m o r s h a s b e e n d e m o n s t r a t e d ( P a s c a l e e t a l . , 1 9 9 2 ; F e o e t a l . , 1 9 9 1 ) . S A M i . m . i n j e c t i o n s c a n d e c r e a s e t h e s i z e a n d n u m b e r O f p r e n e o p l a s t i c f o c i i n r a t s t h a t h a v e b e e n i n i t i a t e d w i t h D E N . I n d e e d t h i s i s a c t u a l p r o t e c t i o n , n o t j u s t a s l o w i n g b e c a u s e t h e t u m o r s d o n o t d e v e l o p e v e n a f t e r c e s s a t i o n o f S A M ( P a s c a l e e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h e s e s t u d i e s s u p p o r t t h e h y p o t h e s i s t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A i s i n d e e d i n v o l v e d i n t u m o r i g e n e s i s a s t w o d i f f e r e n t m e t h o d s o f r e s t o r i n g m e t h y l g r o u p s t o t h e d i e t c a n p r o t e c t a g a i n s t c a r c i n o g e n - i n d u c e d l i v e r t u m o r f o r m a t i o n . I t a l s o p r o v i d e s a p o t e n t i a l s o u r c e f o r i n t e r v e n t i o n i n s o m e h u m a n p r e c a n c e r o u s c o n d i t i o n s , a s s u m i n g s i m i l a r 3 9 m e c h a n i s m s a r e o p e r a t i v e . A n o t h e r p o t e n t i a l l y u s e f u l p r e v e n t a t i v e m e a s u r e i s c a l o r i c r e s t r i c t i o n , w h i c h i n c r e a s e s t h e l i f e s p a n o f r o d e n t s s i g n i f i c a n t l y o v e r r o d e n t s f e d a d I i b i t u m . C o o n e y h y p o t h e s i z e s t h a t c a l o r i c r e s t r i c t i o n i n c r e a s e s l i f e s p a n i n p a r t b y a l l o w i n g f o r b e t t e r m a i n t e n a n c e m e t h y l a t i o n o f D N A ( C o o n e y , 1 9 9 3 ) . H e h y p o t h e s i z e s t h a t l e s s f a t i n t a k e i n t h e r e s t r i c t e d a n i m a l s w i l l m e a n l e s s p h o s p h a t i d y l c h o l i n e i s b e i n g u s e d t o m a k e V L D L ( C o o n e y , 1 9 9 3 ) t h a t i s n e c e s s a r y t o p a c k a g e f a t f o r t r a n s p o r t o u t o f t h e h e p a t o c y t e ( Y a o a n d V a n c e , 1 9 8 8 ) . I n t h i s s i t u a t i o n a g r e a t e r p r o p o r t i o n o f t h e a v a i l a b l e m e t h y l g r o u p d o n o r s m a y b e u s e d f o r D N A m e t h y l a t i o n r e a c t i o n s . T h i s h y p o t h e s i s i s s u p p o r t e d b y a s t u d y t e s t i n g t h e " p e r m a n e n c e " O f t h e e f f e c t o f c a l o r i c r e s t r i c t i o n i n a n i n v i v o t o i n v i t r o m o d e l ( H a s s e t a l . , 1 9 9 3 ) . T h e s e a u t h o r s f o u n d t h a t t h e e f f e c t s o f c a l o r i c r e s t r i c t i o n w e r e p a s s e d o n t o c e l l s t a k e n f r o m a n a n i m a l a n d g r o w n i n c u l t u r e ; t h e e f f e c t s i n c l u d e d i n c r e a s e d H a - r a s o n c o g e n e m e t h y l a t i o n , d e c r e a s e d H a - r a s e x p r e s s i o n a n d m u t a t i o n , a n d d e c r e a s e d p 5 3 t u m o r s u p p r e s s o r g e n e m u t a t i o n ( H a s s e t a l . , 1 9 9 3 ) . C l e a r l y , d i e t a r y r e s t r i c t i o n , w h i c h i s k n o w n t o i n c r e a s e l o n g e v i t y , w a s a b l e t o p r e v e n t h y p o m e t h y l a t i o n O f D N A t h a t i s i n v o l v e d i n t u m o r i g e n e s i s . T h e p r e v e n t a t i v e n a t u r e o f c a l o r i c r e s t r i c t i o n b r i n g s t o g e t h e r m a n y o f t h e c o n c e p t s d i s c u s s e d i n t h i s p a p e r a n d p r o v i d e s s u p p o r t f o r o u r h y p o t h e s i s ( G o o d m a n a n d C o u n t s , 1 9 9 3 ; C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 , 1 9 9 5 a , 1 9 9 5 c , 1 9 9 5 d ; R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) c o n c e r n i n g h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A b e i n g i n v o l v e d i n t h e p r o m o t i o n O f t u m o r i g e n e s i s . 4 0 D i f f e r e n c e s i n D N A M e t h y l a t i o n B e t w e e n R o d e n t s a n d H u m a n s I n c o m p l e t e D N A m e t h y l a t i o n m a y o c c u r d u r i n g c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d , w h e n a c c u m u l a t e d o v e r m a n y c e l l c y c l e s , t h i s m i g h t p l a y a r o l e i n a g e i n g ( C o o n e y , 1 9 9 3 ) . I n g e n e r a l , t h e o v e r a l l l e v e l o f g e n o m i c 5 M e C a p p e a r s t o b e m a i n t a i n e d m o r e e f f e c t i v e l y i n h u m a n c e l l s a s c o m p a r e d t o r o d e n t c e l l s . W h e n n o r m a l d i p l o i d f i b r o b l a s t s f r o m m i c e , h a m s t e r s , a n d h u m a n s w e r e g r o w n i n c u l t u r e t h e 5 M e C c o n t e n t o f t h e i r D N A ' s d e c r e a s e d o v e r t i m e , w i t h t h e r a t e o f l o s s b e i n g h i g h e s t i n m o u s e c e l l s a n d l o w e s t i n h u m a n c e l l s ( W i l s o n a n d J o n e s , 1 9 8 3 ) . T h i s i s c o n s i s t e n t w i t h a r e p o r t t h a t 5 M e C i n h u m a n l i v e r d o e s n o t d e c l i n e w i t h a g e ( T a w a a t a l . , 1 9 9 2 ) , a n d t h e o b s e r v a t i o n t h a t t h e r a t e o f l o s s o f 5 M e C f r o m m o u s e l i v e r D N A i s r e l a t e d i n v e r s e l y t o l i f e s p a n o f t h e s t r a i n s s t u d i e d ( W i l s o n e t a l . , 1 9 8 7 b ) . A d d i t i o n a l l y , a g e - l i n k e d r e a c t i v a t i o n ( r e - e x p r e s s i o n ) o f a g e n e o n t h e s i l e n t X - c h r o m o s o m e h a s b e e n s h o w n t o o c c u r i n m i c e ( W a r e h a m e t a l . , 1 9 8 7 ) b u t n o t i n h u m a n s ( M i g e o n e t a l . , 1 9 8 8 ) . D N A m e t h y l a t i o n p l a y s a k e y r o l e i n t h e i n a c t i v a t i o n o f o n e X - c h r o m o s o m e i n t h e f e m a l e ( H o l l i d a y , 1 9 8 7 ) , a n d t h e s i l e n t l o c u s i n t h e h u m a n c e l l s c o u l d b e e x p r e s s e d f o l l o w i n g t r e a t m e n t w i t h A z a C , a n i n h i b i t o r o f D N A m e t h y l a t i o n ( M i g e o n a t a l . , 1 9 8 8 ) . T h e r e f o r e , t h e a p p a r e n t d i s c r e p a n c y r e g a r d i n g X - c h r o m o s o m e r e a c t i v a t i o n a n d a g e i n g c a n b e e x p l a i n e d o n t h e b a s i s o f a h i g h e r c a p a c i t y t o m a i n t a i n m e t h y l a t i o n i n h u m a n c e l l s a s c o m p a r e d t o m o u s e c e l l s ( H o l l i d a y , 1 9 8 9 ) . 4 1 ’ l ' - r H a - r a s i s a w i d e l y e x p r e s s e d g e n e a n d t h e s e q u e n c e o f t h e p r o m o t e r r e g i o n o f m o u s e H a - r a s ( B r o w n e t a l . , 1 9 8 8 ; N e a d e s e t a l . , 1 9 9 1 ) i n d i c a t e s t h a t i t h a s s o m e c h a r a c t e r i s t i c s o f h o u s e k e e p i n g a n d o t h e r w i d e l y e x p r e s s e d g e n e s . S p e c i f i c a l l y , t h e p r o m o t e r r e g i o n c o n t a i n s C p G i s l a n d s a n d l a c k s a T A T A b o x ( B r o w n e t a l . , 1 9 8 8 ) . C p G i s l a n d s a r e e x p e c t e d t o b e u n m e t h y l a t e d , a s h a s b e e n d e t e r m i n e d f o r a v a r i e t y o f h o u s e k e e p i n g a n d t i s s u e s p e c i f i c g e n e s ( r e f e r e n c e d i n G a r d i n e r - G a r d e n a n d F r o m m e r , 1 9 8 7 ) . I n l i n e w i t h t h i s g e n e r a l l y e s t a b l i s h e d o b s e r v a t i o n , t h e p r o m o t e r r e g i o n o f h u m a n H a - r a s h a s b e e n r e p o r t e d t o b e u n m e t h y l a t e d ( B o r r e l l o e t a l . , 1 9 9 2 ) . N e v e r t h e l e s s , t h e h i g h i n v o l v e m e n t o f H a - r a s i n m o u s e l i v e r t u m o r i g e n e s i s a n d o u r p r e v i o u s w o r k s h o w i n g h y p o m e t h y l a t i o n o f H a - r a s a n d r a f i n m o u s e l i v e r t u m o r s ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 8 9 ; V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 9 1 b ; R a y a t a l . , 1 9 9 4 ) p r o m p t e d u s t o d e t e r m i n e i f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s i n m o u s e l i v e r w a s m e t h y l a t e d a n d , i f s o , i f d i f f e r e n c e s e x i s t e d b e t w e e n t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h i s r e g i o n i n m o u s e s t r a i n s t h a t e x h i b i t d i f f e r e n t p r o p e n s i t i e s f o r l i v e r t u m o r f o r m a t i o n . A s h a s b e e n d i s c u s s e d , k e y a s p e c t s o f t h e c o n t r o l o f g e n e e x p r e s s i o n o c c u r i n t h e p r o m o t e r r e g i o n ( c o n t a i n e d w i t h i n t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n ) o f a g e n e . T h i s i s t h e a r e a w h e r e t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s b i n d a n d f a c i l i t a t e b i n d i n g o f t h e R N A p o l y m e r a s e t o D N A . I n d e e d , t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f m o u s e H a - r a s c o n t a i n s p o t e n t i a l b i n d i n g S i t e s f o r a v a r i e t y o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s , i n c l u d i n g S P 1 , A P 1 , A P 2 a n d E R E ( r e f e r e n c e d i n C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 3 ) . T h e r e a r e a l s o s e v e r a l s i t e s s i m i l a r t o t h e r e c o g n i t i o n s e q u e n c e f o r M D B P ( s e e F i g u r e 1 i n 4 2 C h a p t e r 1 ) . S e q u e n c e c o m p a r i s o n s b e t w e e n s e g m e n t s o f h u m a n a n d m o u s e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n s o f H a - r a s a r e d e s c r i b e d i n d e t a i l i n C h a p t e r 2 . O B J E C T I V E S A N D S P E C I F I C A I M S O b j e c t i v e s T h e h y p o t h e s i s t h a t I a m t e s t i n g i s t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A m a y b e a n o n g e n o t o x i c , e p i g e n e t i c m e c h a n i s m t h a t f a c i l i t a t e s a b e r r a n t o n c o g e n e e x p r e s s i o n d u r i n g t u m o r p r o m o t i o n . A d d i t i o n a l l y , h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A m a y u n d e r l i e t h e h e i g h t e n e d s e n s i t i v i t y o f t h e B 6 0 3 F 1 m o u s e t o l i v e r t u m o r i g e n e s i s . M y p r o j e c t i n v o l v e s c o m p a r i n g t h e e f f e c t s O f d i f f e r e n t t u m o r p r o m o t i n g t r e a t m e n t s ( a c h o l i n e - d e v o i d , m e t h i o n i n e - d e f i c i e n t ( C M D ) d i e t , p h e n o b a r b i t a l ( P B ) a n d t h e c o - a d m i n i s t r a t i o n O f a C M D d i e t w i t h P B ) o n D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s , g e n e e x p r e s s i o n a n d c e l l p r o l i f e r a t i o n i n t h e r e l a t i v e l y l i v e r t u m o r s e n s i t i v e 3 6 C 3 F 1 a n d t h e r e l a t i v e l y l i v e r t u m o r r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 . T h e s p e c i f i c a i m s , a s o u t l i n e d b e l o w , w e r e t o e x a m i n e t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f p o r t i o n s o f t h e 5 ’ f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s , g l o b a l m e t h y l a t i o n s t a t u s , a n d t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s O f H a - r a s a n d r e f . I n a d d i t i o n , l e x a m i n e d e x p r e s s i o n O f H a - r a s , r a f , a n d S A M s y n t h e t a s e b y n o r t h e r n a n a l y s i s a n d c h a n g e s i n h e p a t o c y t e a n d n o n - h e p a t o c y t e c e l l p r o l i f e r a t i o n i n d u c e d b y t h e s e t u m o r p r o m o t i n g t r e a t m e n t s i n m o u s e l i v e r . F i n a l l y , s p o n t a n e o u s a n d P B - i n d u c e d ( 0 . 0 5 % w / w ) B 6 C 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s w e r e c h a r a c t e r i z e d f o r c h a n g e s i n t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e 5 ’ f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s , g l o b a l m e t h y l a t i o n s t a t u s , a n d H a - r a s , r a f , a n d S A M s y n t h e t a s e e x p r e s s i o n . T h e s e s t u d i e s a r e d e s c r i b e d i n t h e 5 c h a p t e r s t h a t 4 3 m a k e u p t h e b o d y O f t h i s d i s s e r t a t i o n ( C h a p t e r 1 h a s b e e n p u b l i s h e d i n C a n c e r L e t t e r s , C h a p t e r 2 i s i n p r e s s i n T o x i c o l o g y L e t t e r s , a n d C h a p t e r s 3 - 5 h a v e b e e n s u b m i t t e d f o r p u b l i c a t i o n ) . S p e c i f i c A i m s 1 . T o e x a m i n e t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f p o r t i o n s o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s i n m o u s e s t r a i n s w i t h d i f f e r i n g s e n s i t i v i t i e s t o s p o n t a n e o u s - a n d c h e m i c a l - i n d u c e d l i v e r t u m o r f o r m a t i o n ( i . e . , r e l a t i v e l y s e n s i t i v e B 6 C 3 F 1 a n d r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 ) . 2 . T O e x a m i n e t h e e f f e c t o f a c h o l i n e - d e v o i d , m e t h i o n i n e - d e f i c i e n t d i e t i n m o u s e s t r a i n s w i t h d i f f e r i n g s e n s i t i v i t i e s t o s p o n t a n e o u s - a n d c h e m i c a l - i n d u c e d l i v e r t u m o r f o r m a t i o n ( i . e . , r e l a t i v e l y s e n s i t i v e B 6 C 3 F 1 a n d r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 ) o n a ) h e p a t i c m e t h y l a t i o n s t a t u s i ) o f p o r t i o n s o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s , i i ) o f H a - r a s a n d r a f b y S o u t h e r n a n a l y s i s , a n d i i i ) g l o b a l l y b ) h e p a t i c g e n e e x p r e s s i o n i ) H a - r a s , i i ) r a f , a n d i i i ) S A M s y n t h e t a s e c ) h e p a t o c y t e a n d n o n - h e p a t o c y t e c e l l p r o l i f e r a t i o n . 3 . T o e x a m i n e t h e e f f e c t o f a p r o m o t i n g d o s e o f P B i n m o u s e s t r a i n s w i t h d i f f e r i n g s e n s i t i v i t i e s t o s p o n t a n e o u s - a n d c h e m i c a l - i n d u c e d l i v e r t u m o r 4 . 4 4 f o r m a t i o n ( i . e . , r e l a t i v e l y s e n s i t i v e 8 6 0 3 F 1 a n d r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 ) o n a ) h e p a t i c m e t h y l a t i o n s t a t u s i ) O f p o r t i o n s o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s , i i ) o f H a - r a s a n d r a f b y S o u t h e r n a n a l y s i s , a n d i i i ) g l o b a l l y b ) h e p a t i c g e n e e x p r e s s i o n i ) H a - r a s , i i ) r a f , a n d i i i ) S A M s y n t h e t a s e c ) h e p a t o c y t e a n d n o n - h e p a t o c y t e c e l l p r o l i f e r a t i o n . T O e x a m i n e t h e e f f e c t O f a c h o l i n e - d e v o i d , m e t h i o n i n e - d e f i c i e n t d i e t 0 0 - a d m i n i s t e r e d w i t h a p r o m o t i n g d o s e o f P B i n m o u s e s t r a i n s w i t h d i f f e r i n g s e n s i t i v i t i e s t o s p o n t a n e o u s - a n d c h e m i c a l - i n d u c e d l i v e r t u m o r f o r m a t i o n ( i . e . , r e l a t i v e l y s e n s i t i v e B G C S F 1 a n d r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 ) o n a ) h e p a t i c m e t h y l a t i o n s t a t u s i ) O f p o r t i o n s o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s , i i ) o f H a - r a s a n d r e f b y S o u t h e r n a n a l y s i s , a n d i i i ) g l o b a l l y b ) h e p a t i c g e n e e x p r e s s i o n i ) H a - r a s , i i ) r a f , a n d i i i ) S A M s y n t h e t a s e 4 5 c ) h e p a t o c y t e a n d n o n - h e p a t o c y t e c e l l p r o l i f e r a t i o n . 5 . T o e x a m i n e t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f p o r t i o n s o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n O f H a - r a s i n s p o n t a n e o u s - a n d P B - i n d u c e d B 6 C 3 F 1 m o u s e l i v e r a d e n o m a s a n d c a r c i n o m a s , a n d a g e - m a t c h e d c o n t r o l l i v e r a ) o f p o r t i o n s o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n O f H a - r a s , a n d b ) g l o b a l l y . 6 . T O e x a m i n e t h e l e v e l o f e x p r e s s i o n o f H a - r a s , r a f , a n d S A M s y n t h e t a s e i n s p o n t a n e o u s - a n d P B - i n d u c e d B 6 C 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s . C h a p t e r 1 P R E F A C E T h e f i r s t s p e c i f i c a i m o f m y d i s s e r t a t i o n w o r k w a s t o e x a m i n e t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f p o r t i o n s o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n O f H a - r a s i n m o u s e s t r a i n s w i t h d i f f e r i n g s e n s i t i v i t i e s t o l i v e r t u m o r f o r m a t i o n . M y a p p r o a c h i n i t i a l l y i n v o l v e d S o u t h e r n a n a l y s i s u s i n g d e o x y o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s t h a t w e r e c o m p l e m e n t a r y t o s e g m e n t s o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s . T h e h i g h G C c o n t e n t o f t h i s r e g i o n m a d e h y b r i d i z a t i o n s d i f f i c u l t ; n o n e t h e l e s s d i f f e r e n c e s w e r e e v i d e n t b e t w e e n m o u s e s t r a i n s t h a t w e r e h i g h l y s u s c e p t i b l e t o , o r d e m o n s t r a t e i n t e r m e d i a t e s e n s i t i v i t y t o , l i v e r t u m o r f o r m a t i o n ( i . e . , C 3 H / H e , B 6 C 3 F 1 , a n d N M R I ) a n d r e l a t i v e l y r e s i s t a n t m i c e ( i . e . , C 5 7 B L / 6 ) . A d d i t i o n a l l y , I w a s a b l e t o d e t e c t a n X h o l s i t e t h a t w a s u n m e t h y l a t e d i n t h i s r e g i o n , a t l e a s t i n t h e C 5 7 B L / 6 . T h e r e s u l t s o f t h e s e e x p e r i m e n t s w e r e p u b l i s h e d i n C a n c e r L e t t e r s ( 1 9 9 3 ) 7 5 , 1 2 9 - 1 3 6 a n d a r e p r e s e n t e d h e r e i n a s l i g h t l y m o d i f i e d f o r m f o r c o n s i s t e n c y o f t h i s d i s s e r t a t i o n . 4 6 C h a p t e r 1 C O M P A R A T I V E A N A L Y S I S O F T H E M E T H Y L A T I O N S T A T U S O F T H E 5 ' F L A N K I N G R E G I O N O F H a - r a s I N B 6 C 3 F 1 , C 3 H / H e A N D C S 7 B L I 6 M O U S E L I V E R J e n n i f e r L . C o u n t s a n d J a y I . G o o d m a n D e p a r t m e n t o f P h a r m a c o l o g y a n d T o x i c o l o g y I n s t i t u t e f o r E n v i r o n m e n t a l T o x i c o l o g y M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y , E a s t L a n s i n g , M I 4 8 8 2 4 - 1 3 1 7 U S A S U M M A R Y W e e x a m i n e d t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s i n t h e l i v e r o f t h e l i v e r t u m o r - p r o n e B 6 C 3 F 1 ( C 5 7 B L / 6 x C 3 H / H e ) a n d C 3 H / H e , p l u s t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 m o u s e s t r a i n s . S o u t h e r n a n a l y s i s r e v e a l e d t h e p r e s e n c e o f C C G G s i t e s m e t h y l a t e d a t t h e i n t e r n a l c y t o s i n e , a s w e l l a s u n m e t h y l a t e d C C G G s i t e s i n a l l t h r e e s t r a i n s . D i g e s t i o n w i t h S t y l a n d X h o l r e v e a l e d a n u n m e t h y l a t e d X h o l s i t e i n t h e C 5 7 B L / 6 . T h i s p a t t e r n i s n o t o b v i o u s i n t h e B 6 C 3 F 1 o r C S H / H e , i n d i c a t i n g s e q u e n c e v a r i a t i o n a n d / o r l e s s m e t h y l a t i o n o f H a - r a s i n t h o s e s t r a i n s o f m i c e t h a t e x h i b i t a h i g h p r o p e n s i t y t o w a r d s d e v e l o p m e n t o f l i v e r t u m o r s . k e m g r d s ; m o u s e l i v e r t u m o r , H a - r a s , m e t h y l a t i o n , D N A 5 - m e t h y l c y t o s i n e , 4 7 4 8 o n c o g e n e I N T R O D U C T I O N A n a c t i v a t e d H a - r a s g e n e i s o f t e n d e t e c t e d i n b o t h s p o n t a n e o u s a n d c h e m i c a l l y - i n d u c e d B 6 C 3 F 1 a n d C S H / H e m o u s e l i v e r t u m o r s w i t h a p o i n t m u t a t i o n i n c o d o n 6 1 f r e q u e n t l y d e t e c t e d i n t h e s e c a s e s ( B u c h m a n n e t a l . , 1 9 9 1 ; R i c h a r d s o n e t a l . , 1 9 9 2 ; W i s e m a n e t a l . , 1 9 8 6 ) . W h i l e m u t a t e d o n c o g e n e s c l e a r l y a p p e a r t o p l a y a r o l e i n c a r c i n o g e n e s i s , i n c r e a s e d e x p r e s s i o n c a n a l s o b e a n i m p o r t a n t f a c t o r ( C o h e n a n d L e v i n s o n , 1 9 8 8 ; L e e e t a l . , 1 9 9 1 ; S e y a m a e t a l . , 1 9 8 8 ) . A c h a n g e i n D N A m e t h y l a t i o n , i . e . , l e v e l o f D N A 5 - m e t h y l c y t o s i n e ( 5 M e C ) , h a s b e e n s u g g e s t e d t o b e a n e p i g e n e t i c m e c h a n i s m u n d e r l y i n g t h e a b e r r a n t e x p r e s s i o n o f o n c o g e n e s i n v o l v e d i n c a r c i n o g e n e s i s ( H o l l i d a y , 1 9 8 7 ; J o n e s a n d B u c k l e y , 1 9 9 0 ) . H y p o m e t h y l a t i o n ( i . e . , d e c r e a s e d 5 M e C ) a p p e a r s t o b e n e c e s s a r y b u t n o t s u f f i c i e n t f o r a g e n e t o b e t r a n s c r i b e d ( r e f e r e n c e d i n V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 8 7 ) . S e q u e n c e - s p e c i f i c D N A b i n d i n g p r o t e i n s p l a y a k e y r o l e i n t h e r e g u l a t i o n O f t r a n s c r i p t i o n i n m a m m a l i a n c e l l s . T h e s e p r o t e i n s a c t b y b i n d i n g t o c i s - a c t i n g D N A r e g u l a t o r y s e q u e n c e s . E a c h g e n e h a s a p a r t i c u l a r c o m b i n a t i o n o f p o s i t i v e a n d n e g a t i v e r e g u l a t o r y c i s e l e m e n t s t h a t a r e u n i q u e l y a r r a n g e d a s t o n u m b e r , t y p e , a n d s p a c i a l a r r a y ; m a n y o f t h e s e a r e l o c a t e d i n t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n . O n e g r o u p o f c i s e l e m e n t s r e g u l a t e s t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e p r o m o t e r r e g i o n . A s e c o n d g r o u p , e n h a n c e r s , c a n i n c r e a s e t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e p r o m o t e r o f a l i n k e d g e n e f r o m a d i s t a n c e ( e . g . , s e v e r a l k i l o b a s e s ) i n a n o r i e n t a t i o n - i n d e p e n d e n t f a s h i o n ( M i t c h e l l a n d 4 9 T j i a n , 1 9 8 9 ) . 5 M e C c a n a f f e c t t r a n s c r i p t i o n b y a l t e r i n g t r a n s c r i p t i o n f a c t o r b i n d i n g t o D N A ( R a z i n a n d C e d a r , 1 9 9 1 ) . F o r e x a m p l e , b i n d i n g o f t r a n s - a c t i n g p r o t e i n s a t A P 2 s i t e s i s i n h i b i t e d ( C o m b a n d G o o d m a n , 1 9 9 0 ) , w h i l e b i n d i n g a t m e t h y l a t e d D N A b i n d i n g p r o t e i n ( M D B P ) s i t e s i s e n h a n c e d ( B o y e s a n d B i r d , 1 9 9 1 ) b y m e t h y l a t i o n . E i t h e r o f t h e s e e v e n t s c a n r e d u c e t r a n s c r i p t i o n . T h u s , t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s m i g h t d i r e c t l y o r i n d i r e c t l y a f f e c t t h e e x p r e s s i o n o f a g e n e ( s ) w h i c h c o u l d f a c i l i t a t e t u m o r i g e n e s i s , i f i n a p p r o p r i a t e . W e a r e t e s t i n g t h e h y p o t h e s i s t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A m a y b e a m e c h a n i s m u n d e r l y i n g t h e a b e r r a n t e x p r e s s i o n o f p r o t O - o n c o g e n e s t h a t a p p e a r s t o b e i n v o l v e d i n c a r c i n o g e n e s i s ( G o o d m a n a n d C o u n t s , 1 9 9 3 ; G o o d m a n e t a l . , 1 9 9 1 ) . P r e v i o u s w o r k h a s s h o w n t h a t t h e H a - r a s g e n e i n t h e l i v e r o f m i c e s u s c e p t i b l e t o l i v e r c a r c i n o g e n e s i s l a c k s a m e t h y l a t e d s i t e w h i c h i s p r e s e n t i n a r e s i s t a n t s t r a i n ( C S 7 B L / 6 ) a n d t h a t h y p o m e t h y l a t i o n , a l o n g w i t h i n c r e a s e d e x p r e s s i o n , o c c u r s i n t h e s e m o u s e l i v e r t u m o r s ( M L T ) ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 8 9 ) . T h i s s t u d y f o c u s e d o n t h e " b o d y " o f t h e g e n e a n d l e d t o o u r c u r r e n t , m o r e s p e c i f i c a n a l y s i s o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s . T h e B 6 C 3 F 1 ( 0 5 7 B L / 6 x C 3 H / H e ) a n d t h e C 3 H / H e a r e s e n s i t i v e t o b o t h c h e m i c a l l y - i n d u c e d a n d s p o n t a n e o u s l i v e r t u m o r i g e n e s i s ( e . g . , 3 0 % a n d 6 0 % s p o n t a n e o u s M L T i n c i d e n c e i n m a l e s , r e s p e c t i v e l y ) , w h i l e t h e C S 7 B L / 6 i s r e l a t i v e l y r e s i s t a n t ( e . g . , t h e s p o n t a n e o u s M L T i n c i d e n c e i n m a l e s i s v i r t u a l l y z e r o ) ( B e c k e r , 1 9 8 2 ; B u c h m a n n e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h e h i g h s u s c e p t i b i l i t y o f t h e B 6 C S F 1 t o M L T a l l o w s i t t o s e r v e a s a g o o d m o d e l t o i n v e s t i g a t e m e c h a n i s m s o f c a r c i n o g e n e s i s ( G o o d m a n e t a l . , 1 9 9 1 ) . I n t h e s e e x p e r i m e n t s w e a s s e s s t h e 5 0 l e v e l O f m e t h y l a t i o n i n t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f c - H a - r a s o f t h e s e m o u s e s t r a i n s . I t i s i m p o r t a n t t o c a r r y o u t s t r a i n c o m p a r i s o n s t o s e e i f t h e p r o p e n s i t y t o w a r d s d e v e l o p m e n t o f t u m o r i g e n e s i s c o r r e l a t e s w i t h t h e n a s c e n t m e t h y l a t i o n s t a t u s a n d / o r t h e c a p a c i t y t o m a i n t a i n t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s i n t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s . M E T H O D S S e q u e n c e A n a l y s i s T h e s e q u e n c e o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f m o u s e c - H a - r a s w a s p r e s e n t e d b y B r o w n e t a l . ( B r o w n e t a l . , 1 9 8 8 ) a n d e x t e n d e d i n t h e 5 ' d i r e c t i o n b y N e a d e s e t a l . ( N e a d e s e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h e s t u d i e s , b a s e d o n d i f f e r e n t m o u s e s t r a i n s , s h o w e d 9 8 . 7 % s e q u e n c e h o m o l o g y i n t h e a r e a o f o v e r l a p ( 4 6 1 b a s e p a i r s ) . T h e s e d a t a p r o v i d e d a b a s i s f o r o u r s t u d i e s . G C G C o m p u t e r A n a l y s i s ( G e n e t i c s C o m p u t e r G r o u p , 1 9 9 1 ) w a s e m p l o y e d t o d e t e r m i n e ( 1 ) r e s t r i c t i o n e n z y m e r e c o g n i t i o n s i t e s f o r u s e i n S o u t h e r n a n a l y s i s ; ( 2 ) s i t e s f o r h y b r i d i z a t i o n w i t h o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e p r o b e s ; a n d ( 3 ) p o t e n t i a l c i s - a c t i n g s e q u e n c e s . T h e m e t h y l a t i o n s e n s i t i v e r e s t r i c t i o n e n z y m e s u s e d w e r e M s p l , H p a l l , H h a l , a n d X h o l . M s p l a n d H p a l l a r e i s o s c h i z o m e r s t h a t r e c o g n i z e t h e s i t e 5 ' - C C G G - 3 ' . B o t h c l e a v e D N A i f n e i t h e r c y t o s i n e ( C ) i s m e t h y l a t e d . M s p l c l e a v e s i f t h e i n t e r n a l C i s m e t h y l a t e d , w h i l e H p a l l , b u t n o t M s p l , c l e a v e s i f t h e e x t e r n a l C i s m e t h y l a t e d ( M a n n a n d S m i t h , 1 9 7 7 ) . H h a l r e c o g n i z e s t h e s e q u e n c e 5 ' - G C G C - 3 ' , b u t c a n n o t c l e a v e i f t h e i n t e r n a l C i s m e t h y l a t e d . X h o l c l e a v e s t h e s i t e 5 ' - C T C G A G - 3 ' i f t h e i n t e r n a l C i s n o t m e t h y l a t e d . S t y l a n d M b o l w e r e u s e d t o 5 1 c l e a v e o u t f r a g m e n t s o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n . T w o p r o b e s w e r e s y n t h e s i z e d ( M a c r o m o l e c u l a r S t r u c t u r e F a c i l i t y , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i w ) b a s e d u p o n l o c a t i o n i n t h e r e g i o n a n d o n % G C ( O l i g o I 5 ' - C C A G G G G T G C G G A G G A G T T C G A C C A - 3 ' , a n d O l i g o l l 5 ' - C A C C T G C T T C C C A C A C C C T C A G C C G - 3 ' ) . A v a r i e t y o f p u t a t i v e c i s - a c t i n g e l e m e n t s w e r e d i s c e r n e d ( F i g u r e 1 ) . A n i m a l s M a l e B 6 C 3 F 1 , m a l e C S H / H e a n d f e m a l e C 5 7 B L / 6 ( C h a r l e s R i v e r L a b o r a t o r i e s , P o r t a g e , M I ) a n d m a l e N M R I ( I F F A C r e d o , F r a n c e ) m i c e w e r e m a i n t a i n e d i n a c c o r d a n c e w i t h a p p l i c a b l e r e g u l a t i o n s r e g a r d i n g t h e u s e o f a n i m a l s i n r e s e a r c h . M i c e , h o u s e d 6 / c a g e , r e c e i v e d f o o d a n d w a t e r a d I i b i t u m i n a t e m p e r a t u r e a n d h u m i d i t y c o n t r o l l e d r o o m , w i t h a 1 2 h o u r l i g h t c y c l e . D N A I s o l a t i o n a n d S o u t h e r n A n a l y s i s L i v e r s w e r e O b t a i n e d f r o m 6 - 9 w e e k o l d m i c e a n d s n a p f r o z e n i n l i q u i d n i t r o g e n . D N A w a s i s o l a t e d a s d e s c r i b e d ( S t r a u s s , 1 9 9 0 ) , m o d i f i e d t o i n c l u d e a d i g e s t i o n w i t h 4 0 0 u g / m L R N A s e A ( S i g m a , S t . L o u i s , M O ) a n d a s e c o n d d i g e s t i o n w i t h 2 0 0 u g / m L p r o t e i n a s e K ( B o e h r i n g e r M a n n h e i m B i o c h e m i c a l s , I n d i a n a p o l i s , I N ) . F i v e u g D N A w e r e d i g e s t e d t o c o m p l e t i o n w i t h t h e a p p r o p r i a t e e n z y m e s ( 6 U / u g ) ( G i b c o B R L , G a i t h e r s b u r g , M D o r B o e h r i n g e r M a n n h e i m B i o c h e m i c a l s , I n d i a n a p o l i s , I N ) f o r 2 h o u r s a t 3 7 ° C , a d d i n g t h e e n z y m e i n t w o a l i q u o t s t o e n s u r e c o m p l e t e r e s t r i c t i o n . D N A w a s e l e c t r o p h o r e s e d o n a 2 % g e l ( 1 % a g a r o s e , 1 % N u S i e v e ( F M C B i O P r o d u c t s , R o c k l a n d , M E ) ) , d e p u r i n a t e d ( 0 . 2 5 N R O I ) f o r 1 0 m i n , d e n a t u r e d ( 0 . 4 N N a O H , 0 . 6 M N a C I ) f o r 3 0 m i n , a n d n e u t r a l i z e d ( 1 . 5 M N a C l , 0 . 5 M T r i s ) f o r 3 0 m i n , p r i o r . s s t . - " , . ' E n t r l t ) l 5 g o r a R " ] n i o p e E t t r e b g p e e m d r r g n n n e d e s n , m s a a 1 e r e a g r " F m e r l o e g f I n 1 " p N i e r r d o f e r e e d n , s v H d s e o 1 c e i e t e P x n E S h a n s ; e i n 0 T n i h l o 9 g t p 9 a , t . i d . 1 2 s f b s t s r e P e e O O s e d a n r i n e w e l A , r s - i , l A o t , r 1 n l i s E n P t T e e i d P ( w r w r [ o A f b o e ( o o d a p s e r w r E u t p t s p s e a e i h a t R t u s T r i e T n e t t s d d e r m i i d . l a n t l l o e n s u l p t o o s i l a b l t a e e e , l h c , p e s n i H h c ] t o g a i n r u t n r t n d i n t i i - e s p t n o y e t a H - c i b c b r a o n r i a r o c - e p d r l i s s h e - n i p t y t e x a a s c t g a n m r f o c M s r t o i e o i l u d e n n d f y d a o b r n v o i o n m i g i i e i b d v t i f t O a a l t o t e e e z s r t n o u n i a n n r p n o e s o d r e i f s e g e f d o t g e m o n c i s e s e e r e s e a r n o r b p 5 p t i e 2 l e i g s t R e o d n s i o r h i - s w n a X n e . k o n p ) t o o c ) a o A i t 1 i n ( t f a 9 t e l f d w 9 i o h n ) n T l t a u 1 ' a s y 1 g e q 5 n o e 9 . e h , l t 9 o s c t , . l e s i e 1 a h s r r ( h g e a m t s t i n H e [ a u . ' i e f p l o a s v 3 y s s e t u i - b P n n s e G B t e e d s d a G s o a i C s n b u s z e t M o C i t D a e e y P i a N 0 l d n - c t a ' - , n ; 0 a g n 5 ] g e e 9 7 o a n ) t s 2 8 c N i t C n e e ( 9 n n e s r r , d r e u m 1 p n o e n e s e e , r i a h d e . l r d e r n t t e a a ) i u n p e a c t m 8 e e j o h i i r r 8 v c T t i 9 o S c m i f d s p i r a 1 s n y e e h e m e h ( n n i w t b n d i o a . e l s d l p e e d l a e e s c r c i l d t e S f t a e n e i e r r i h s - e r t c a 2 u n n n e t 1 e w ' q w e i w d p S n g M e o i e U - o o e r s r ; e - s C x r u B e t 1 g r e 9 e G ) s i y e h 9 h C B e f F b ( T w O G [ T 1 5 2 1 3 1 3 I I 2 1 . 1 l 2 f ” n i 3 H l l o b n o x M : l e y t S j w s l o | b M | I l l | f l I l o L b M I | L n i H ” ! t S I O X I O I ' I X . . . I . I I . I I . I L . . I . 1 e r l o I b l I y M t I I C S G u I G O G g i F b . C C M | C G 5 5 I . . . . _ — — fl — — — - - . . u - - - - _ — - - _ — - w ‘ m . — . — . _ _ - - - — — 5 3 p a t t e r n w a s o b s e r v e d : a 1 . 0 8 k b b a n d t h a t c a n b e d i g e s t e d t o s m a l l e r 5 4 t o t r a n s f e r t o a n y l o n m e m b r a n e ( H y b o n d - N , A m e r s h a m , A r l i n g t o n H e i g h t s , I L ) f o r 2 0 - 2 4 h o u r s b y c a p i l l a r y a c t i o n . P r e h y b r i d i z a t i o n a n d h y b r i d i z a t i o n w i t h [ ” P ] A T P ( 6 0 0 0 C m e o l , N e w E n g l a n d N u c l e a r , B o s t o n , M A ) e n d - l a b e l e d p r o b e s ( 1 . 0 x 1 0 7 c p m ) w e r e c a r r i e d o u t i n t h e p r e s e n c e o f t e t r a m e t h y l a m m o n i u m c h l o r i d e ( T M A C , A l d r i c h , M i l w a u k e e , W I ) t o r e d u c e t h e i n f l u e n c e O f t h e h i g h % G C o f t h e p r o b e s ( W o o d a t a l . , 1 9 8 5 ) . T h e b u f f e r w a s t h e s a m e f o r p r e h y b r i d i z a t i o n a n d h y b r i d i z a t i o n [ 3 M T M A C , 1 m M E D T A ( p H 8 . 0 ) , 5 X D e n h a r d t ' s s o l u t i o n ( 1 0 0 X - 2 % F i c o l l 4 0 0 , 2 % p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e , 2 % b o v i n e s e r u m a l b u m i n ) , 0 . 6 % S D S a n d 0 . 1 M N a P O 4 ( p H 6 . 8 ) ] . F i f t e e n m i n u t e w a s h e s ( 3 M T M A C , 0 . 0 5 M T r i s ( p H 8 . 0 ) , 0 . 2 % S D S ) o f i n c r e a s i n g s t r i n g e n c y , b e g i n n i n g a t r o o m t e m p e r a t u r e t o a f i n a l t e m p e r a t u r e o f 6 0 ° C w e r e c a r r i e d o u t . P r i o r t o e x p o s u r e t o K o d a k X - O M A T A R o r F u j i A I F f i l m a t - 8 0 ° C w i t h i n t e n s i f y i n g s c r e e n s f o r 1 2 - 4 8 h r s , a f i n a l 5 m i n u t e w a s h i n 2 X S S C ( 0 . 3 M N a C l , 0 . 0 3 M s o d i u m c i t r a t e ) , 0 . 1 % S D S w a s e m p l o y e d t o r e m o v e r e s i d u a l T M A C . R E S U L T S A N D D I S C U S S I O N W e h a v e d e t e r m i n e d t h a t t h e r e i s s o m e d e g r e e o f m e t h y l a t i o n i n t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s i n m o u s e l i v e r , t h o u g h m a n y 5 ' - C C G G - 3 ' s i t e s a p p e a r t o b e u n m e t h y l a t e d . I n a d d i t i o n , o u r a n a l y s i s i n d i c a t e s t h a t t h e r e a r e s i m i l a r i t i e s b e t w e e n t h e s t r a i n s o f m i c e t h a t a r e c o n s i d e r e d t o b e r e l a t i v e l y s u s c e p t i b l e t o M L T ( C 3 H / H e , B 6 C 3 F 1 a n d N M R I ) w h i l e s o m e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e s e a n d t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B U 6 w a s n o t e d . I n a l l f o u r s t r a i n s a S i m i l a r M b o l 5 5 f r a g m e n t s b y b o t h M s p l a n d H p a l l , i n d i c a t i n g t h e p r e s e n c e o f 5 ' - C C G G - 3 ' s i t e s a n d a 0 . 7 k b b a n d t h a t r e s i s t e d c l e a v a g e b y H p a l l , b u t n o t M s p l , i n d i c a t i n g t h e p r e s e n c e o f a 5 ' - C " " ° C G G - 3 ' s i t e ( F i g u r e 2 ) . T h e S t y l f r a g m e n t s h o w s d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e r e s i s t a n t a n d s u s c e p t i b l e s t r a i n s . A 3 . 0 k b b a n d t h a t i s p r e s e n t w h e n d i g e s t e d w i t h S t y l a l o n e i s l o s t a n d a s m a l l e r b a n d r e s u l t s w h e n d i g e s t e d w i t h S t y l a n d X h o l ( F i g u r e 3 ) , i n d i c a t i n g t h a t t h e X h o l s i t e i s u n m e t h y l a t e d . T h e s e b a n d s a r e c l e a r l y p r e s e n t i n C S 7 B L / 6 ( 4 / 4 ) , b u t a r e n o t e v i d e n t i n B 6 0 3 F 1 ( 3 / 3 ) , C 3 H / H e ( 3 / 3 ) o r N M R I ( 5 / 5 ) . I n a n o t h e r a n a l y s i s u t i l i z i n g S t y l , a d i s t i n c t 3 . 0 k b b a n d i n C 5 7 B U 6 ( 4 / 4 ) t h a t i s r e s i s t a n t t o c l e a v a g e b y M s p l a n d H p a l l i n d i c a t e s t h e p o s s i b l e p r e s e n c e o f a s i t e ( s ) m e t h y l a t e d a t b o t h c y t o s i n e s ( 5 ' - M ° C M ° C G G - 3 ' ) ( F i g u r e 4 ) . T h e r e i s p r e c e d e n c e f o r t h i s ; m e t h y l a t i o n o f b o t h c y t o s i n e s a t 5 ' - C C G G - 3 ' s i t e s h a s b e e n i m p l i c a t e d i n d e c r e a s i n g t y p e I p r o c o l l a g e n g e n e e x p r e s s i o n ( P a r k e r e t a l . , 1 9 8 2 ) . T h e d i s t i n c t 3 . 0 k b b a n d i s n o t e v i d e n t i n t h e B 6 C 3 F 1 ( 7 / 7 ) , C 3 H / H e ( 3 / 3 ) o r N M R I ( 5 / 5 ) . I n v i e w o f t h e l a r g e n u m b e r o f r e c o g n i t i o n s i t e s f o r m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e s p r e s e n t i n t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s ( F i g u r e 1 ) , w e c a n a n t i c i p a t e t h a t o u r S o u t h e r n a n a l y s i s w o u l d r e v e a l r e l a t i v e l y f e w b a n d s i f t h e r e w e r e a h i g h d e g r e e o f m e t h y l a t i o n p r e s e n t . H o w e v e r , i f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n w a s u n i f o r m l y u n d e r m e t h y l a t e d e i t h e r m u l t i p l e b a n d s o r , m o r e l i k e l y , n o d i s t i n c t b a n d i n g p a t t e r n w o u l d b e O b s e r v e d . T h e d a t a p r e s e n t e d i n F i g u r e s 3 a n d 4 i n d i c a t e s e q u e n c e v a r i a t i o n a n d / o r a l e s s e r d e g r e e o f m e t h y l a t i o n o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s i n t h o s e s t r a i n s o f m i c e t h a t e x h i b i t a h i g h p r o p e n s i t y t o w a r d s d e v e l o p m e n t O f l i v e r t u m o r s . 5 6 8 6 C 3 F l o ‘ C 3 l l / l l e o ' 1 2 3 1 2 3 k l ! . . I s l ! ' 4 . 3 6 - 4 . 3 6 - 2 . 3 2 - 4 ; 2 . 3 2 - c ; 1 . 3 5 - 1 . 0 8 - - 1 ‘ 3 5 ” 0 . 8 7 - _ 1 . 0 3 - 0 6 0 _ . _ 0 . 8 7 - 0 . 6 0 - C 5 7 B L / 6 0 ‘ r e m . - 1 . 2 - 3 1 2 3 _ _ t i ! ~ k h 4 . 3 6 - 7 . } . , _ 4 . 3 5 — 2 o 3 2 - 1 ‘ w . I } ? 1 ‘ ‘ - 2 . 3 2 _ 1 . 3 5 - . 1 . 3 5 _ ' a . 1 . 0 8 ‘ — 1 . 0 8 “ 7 ‘ — o . s 7 - 0 . 8 7 - 3 & 5 ; 0 ' 6 0 - 7 ' — 0 . 6 0 - - F i g u r e 2 - M e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e f r a g m e n t o f H a - r a s O b t a i n e d b y M b o l d i g e s t i o n . H e p a t i c D N A w a s i s o l a t e d a n d s u b j e c t e d t o S o u t h e r n a n a l y s i s . T h e r e s u l t i n g h y b r i d i z a t i o n b a n d p a t t e r n s w e r e v i s u a l i z e d w i t h [ 3 2 P ] A T P e n d - l a b e l l e d o l i g o " I " . L a n e 1 , M b o l ; L a n e 2 , M b o l + M s p l ; L a n e 3 , M b o l + H p a l l . 5 7 3 6 C 3 F l d ' C 3 1 1 ] H e d ' 4 . 3 6 - - 2 . 0 3 - h 1 . 3 5 - 1 . 0 8 - 0 . 8 7 - 5 0 . 6 0 - I : l g u r e 3 - M e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e f r a g m e n t o f H a - r a s o b t a i n e d b y S t y l d ' Q e s t i o n . H e p a t i c D N A w a s i s o l a t e d a n d s u b j e c t e d t o S o u t h e r n a n a l y s i s . T h e E e s u l t i n g h y b r i d i z a t i o n p a t t e r n s w e r e v i s u a l i z e d w i t h [ 3 2 P ] A T P e n d - l a b e l l e d o l i g o “ " - L a n e 1 , S t y l ; L a n e 2 , S t y l + H i n f l ; L a n e 3 , S t y l + H h a l ; a n d L a n e 4 , S t y l + X h o l . H i n f l i s e m p l o y e d a s t h e d i a g n o s t i c e n z y m e f o r t h e S t y l f r a g m e n t . T h e a r r o w s h i g h l i g h t t h e p r e s e n c e o f a 3 . 0 k b b a n d t h a t i s p r e s e n t i n C S 7 B L / 6 i n L a n e 1 a n d c o n t a i n s a n u n m e t h y l a t e d X h o l s i t e , i n d i c a t e d b y i t s r e s t r i c t i o n i n a n e 4 . 5 8 8 6 C 3 F 1 6 ‘ C 3 H / H e a ‘ C 5 7 B L / 6 u ‘ M i l l e r 2 _ , 3 . 4 1 2 3 4 7 . C : G ; L b 4 . 3 6 - 2 . 0 3 - 1 . 3 5 - 1 . 0 8 - 0 . 8 7 - 0 . 6 0 - F i g u r e 4 - M e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e f r a g m e n t o f H a - r a s o b t a i n e d b y S t y l d i g e s t i o n . H e p a t i c D N A w a s i s o l a t e d a n d s u b j e c t e d t o S o u t h e r n a n a l y s i s . T h e r e s u l t i n g h y b r i d i z a t i o n p a t t e r n s w e r e v i s u a l i z e d w i t h [ 3 2 P ] A T P e n d - l a b e l l e d o l i g o " l l " . L a n e 1 , S t y l ; L a n e 2 , S t y l + H i n f l ; L a n e 3 , S t y l + M s p l ; a n d L a n e 4 , S t y l + H p a l l . P r e s e n c e o f a d i s t i n c t 3 . 0 k b b a n d i n C 5 7 B U 6 t h a t i s r e s i s t a n t t o c l e a v a g e b y e i t h e r e n z y m e a n d s u g g e s t s t h e p r e s e n c e o f a s i t e ( s ) m e t h y l a t e d a t b o t h c y t o s i n e s ( 5 ' - “ ° C M ° C G G - 3 ' ) . 5 9 T h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f t h e c - H a - r a s g e n e i s s i m i l a r t o t h a t o f a n u m b e r o f t h e s o - c a l l e d h o u s e k e e p i n g g e n e s ( B r o w n e t a l . , 1 9 8 8 ) . I n g e n e r a l , t h e i r 5 ' f l a n k i n g r e g i o n s a r e c h a r a c t e r i z e d b y t h e a b s e n c e o f a T A T A b o x , t h e p r e s e n c e o f m u l t i p l e S p 1 b i n d i n g s i t e s , a n u n d e r - m e t h y l a t e d G C - r i c h r e g i o n i n v o l v e d i n t h e r e g u l a t i o n O f t r a n s c r i p t i o n a n d t h e y a r e e x p r e s s e d a t a l o w l e v e l i n a v a r i e t y o f c e l l t y p e s ( B i r d , 1 9 8 6 ) . T h e a c t i v a t i o n o f t h e H a - r a s p r o t o o n c o g e n e t o a n o n c o g e n e a p p e a r s t o i n v o l v e m o r e t h a n m u t a t i o n . F o r e x a m p l e , a m u t a t i o n i n c o d o n 1 2 o f H a - r a s i s n o t s u f f i c i e n t f o r t r a n s f o r m a t i o n o f r a t f i b r o b l a s t s , a t l e a s t o n e a d d i t i o n a l e v e n t t h a t c a n l e a d t o i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f t h e g e n e a p p e a r s t o b e r e q u i r e d ( F i n n e y a n d B i s h o p , 1 9 9 3 ) . I n a d d i t i o n , a h i g h l e v e l o f e x p r e s s i o n o f t h e n o r m a l h u m a n H a - r a s g e n e w i l l t r a n s f o r m m a m m a l i a n c e l l s ( C h a n g e t a l . , 1 9 8 2 ) . F u r t h e r m o r e , m e t h y l a t i o n O f c i s - e l e m e n t s d e c r e a s e s H a - r a s p r o m o t e r a c t i v i t y i n v i t r o ( R a c h a l e t a l . , 1 9 8 9 ) a n d m e t h y l a t i o n i n h i b i t s t h e t r a n s f o r m i n g a c t i v i t y o f t h e h u m a n H a - r a s o n c o g e n e ( B o r r e l l o e t a l . , 1 9 8 7 ) . T h e r e a r e m u l t i p l e p o t e n t i a l c i s - a c t i n g r e g u l a t o r y e l e m e n t s i n t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s . T h e c a p a c i t y o f t h e s e t o b i n d t h e i r r e s p e c t i v e t r a n s - a c t i n g r e g u l a t o r c o u l d b e i n f l u e n c e d b y m e t h y l a t i o n , e . g . , t w o o f t h e c i s e l e m e n t s , A P 2 ( C o m b a n d G o o d m a n , 1 9 9 0 ) a n d M D B P ( B o y e s a n d B i r d , 1 9 9 1 ) , a r e i n f l u e n c e d d i r e c t l y b y t h e p r e s e n c e o f 5 M e C w i t h i n t h e s i t e , w h i l e m e t h y l a t i o n o f t h e c i s e l e m e n t S p 1 d o e s n o t a f f e c t b i n d i n g o f i t s t r a n s c r i p t i o n f a c t o r ( H a r r i n g t o n a t a l . , 1 9 8 8 ) . T h e b i n d i n g o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s t o m u l t i p l e s i t e s c a n b e r e q u i r e d f o r m a x i m a l e x p r e s s i o n ( C h e n e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h e r e f o r e , t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s m i g h t r e g u l a t e i t s 6 0 e x p r e s s i o n . T h i s i n i t i a l i n v e s t i g a t i o n p r o v i d e s a b a s i s f o r a m o r e i n d e p t h e x a m i n a t i o n o f t h e r o l e p l a y e d b y t h e n a s c e n t m e t h y l a t i o n s t a t u s o f H a - r a s , a n d t h e c a p a c i t y t o m a i n t a i n t h i s , i n f a c i l i t a t i n g t h e a b e r r a n t e x p r e s s i o n O f t h i s o n c o g e n e t h a t i s O f t e n a s s o c i a t e d w i t h l i v e r t u m o r i g e n e s i s i n s e n s i t i v e ( e . g . , C 3 H / H e a n d B G C 3 F 1 ) s t r a i n s o f m i c e . A C K N O W L E D G E M E N T T h i s r e s e a r c h w a s s u p p o r t e d b y U S P H S , N I H g r a n t N o . E 8 0 5 2 9 9 . R E F E R E N C E S B e c k e r , F . F . ( 1 9 8 2 ) M o r p h o l o g i c a l c l a s s i f i c a t i o n o f m o u s e l i v e r t u m o r s b a s e d o n b i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s . m , 4 2 , 3 9 1 8 - 3 9 2 3 . B i r d , A P . ( 1 9 8 6 ) C p G - r i c h i s l a n d s a n d t h e f u n c t i o n o f D N A m e t h y l a t i o n . N a t u r e ( L o n d o n ) , 3 2 1 , 2 0 9 - 2 1 3 . B o r r e l l o , M . G . , P i e r o t t i , M . A . , B o n g a r z o n e , l . , D o n g h i , R . , M o n d e l l i n i , P . a n d P o r t a , G D . ( 1 9 8 7 ) D N A m e t h y l a t i o n a f f e c t i n g t h e t r a n s f o r m i n g a c t i v i t y o f t h e h u m a n H a - r a s o n c o g e n e . 9 3 0 9 1 3 9 5 . . 4 7 , 7 5 - 7 9 . B o y e s , J . a n d B i r d , A . ( 1 9 9 1 ) D N A m e t h y l a t i o n i n h i b i t s t r a n s c r i p t i o n i n d i r e c t l y v i a a m e t h y l - C p G b i n d i n g p r o t e i n . C e l l , 6 4 , 1 1 2 3 - 1 1 3 4 . B r o w n , K . , B a i l l e u l , B . , R a m s d e n , M . , F e e , F . , K r u m l a u f , R . a n d B a l m a i n , A . ( 1 9 8 8 ) I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f t h e m o u s e 0 - H a r v e y - r a s g e n e . M Q I . C a r c i n o g e m 1 , 1 6 1 - 1 7 0 . B u c h m a n n , A . , B a u e r - H o f m a n n , R . , M a h r , J . , D r i n k w a t e r , N . R . , L u z , A . a n d S c h w a r z , M . ( 1 9 9 1 ) M u t a t i o n a l a c t i v a t i o n o f t h e c - H a - r a s g e n e i n l i v e r t u m o r s o f d i f f e r e n t r o d e n t s t r a i n s : C o r r e l a t i o n w i t h s u s c e p t i b i l i t y t o h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s . E L Q Q . N a t l , A g g g , $ 9 1 , U , S . A . , 8 8 , 9 1 1 - 9 1 5 . C h a n g , E . H . , F u r t h , M . E . , S c o l n i c k , E M . a n d L o w y , D R . ( 1 9 8 2 ) T u m o r i g e n i c 6 1 t r a n s f o r m a t i o n o f m a m m a l i a n c e l l s i n d u c e d b y a n o r m a l h u m a n g e n e h o m o l o g o u s t o t h e o n c o g e n e o f H a r v e y m u r i n e s a r c o m a v i r u s . N a t u r e 1 1 . 9 1 3 . 0 9 . 0 1 . 2 9 7 , 4 7 9 - 4 8 3 . ‘ C h e n , X . , A z i z k h a n , J . C . a n d L e e , D C . ( 1 9 9 2 ) T h e b i n d i n g o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r S p 1 t o m u l t i p l e s i t e s i s r e q u i r e d f o r m a x i m a l e x p r e s s i o n f r o m t h e r a t t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r o r p r o m o t e r . Q fl e e g e n e , 7 , 1 8 0 5 - 1 8 1 5 . C o h e n , J . . B a n d L e v i n s o n , A D . ( 1 9 8 8 ) A p o i n t m u t a t i o n i n t h e l a s t i n t r o n r e s p o n s i b l e f o r i n c r e a s e d e x p r e s s i o n a n d t r a n s f o r m i n g a c t i v i t y o f t h e c - - H a - r a s o n c o g e n e . W . 3 3 4 , 1 1 9 - 1 2 4 . C o m b , M . a n d G o o d m a n , H . M . ( 1 9 9 0 ) C p G m e t h y l a t i o n i n h i b i t s p r o e n k e p h a l i n g e n e e x p r e s s i o n a n d b i n d i n g o f t h e t r a n s c r i p t i o n f a c t o r A P - 2 . N y e l e j L A e i e e 8 9 $ . . . 1 8 , 3 9 7 5 - 3 9 8 2 . E l l i s , M . ( 1 9 9 0 ) I n C a r n e y , D . a n d S i k o r a , K . ( e d s ) W , J o h n W i l e y a n d S o n s , N e w Y o r k , p p . 1 0 7 - 1 1 8 . F i n n e y , R E . a n d B i s h o p , J . M . ( 1 9 9 3 ) P r e d i s p o s i t i o n t o n e o p l a s t i c t r a n s f o r m a t i o n c a u s e d b y g e n e r e p l a c e m e n t o f H - r a s 1 . S e i e n e e , 2 6 0 , 1 5 2 4 - 1 5 2 7 . G e n e t i c s C o m p u t e r G r o u p . ( 1 9 9 1 ) P r o g r a m M a n u a l f o r t h e G C G P a c k a g e , V e r s i o n 7 . 0 , M a d i s o n , W I . G o o d m a n , J . I . a n d C o u n t s , J . L . ( 1 9 9 3 ) H y p o m e t h y l a t i o n o f D N A : A p o s s i b l e n o n g e n o t o x i c m e c h a n i s m u n d e r l y i n g t h e r o l e o f c e l l p r o l i f e r a t i o n i n c a r c i n o g e n e s i s . E g y i r e n , H e a l t h P e r § . , 1 0 1 , ( S u p p l . 5 ) , 1 6 9 - 1 7 2 . G o o d m a n , J . . , I W a r d , J . M . P o p p . J . A . , K l a u n i g , J E . a n d F o x , T R ( 1 9 9 1 ) M o u s e l i v e r c a r c i n o g e n e s i s : M e c h a n i s m s a n d r e l e v a n c e . W , 1 7 , 6 5 1 - . 6 6 5 H a r r i n g t o n , M . . , A J o n e s , P A , l m a g a w a , M . a n d K a r i n , M . ( 1 9 8 8 ) C y t o s i n e m e t h y l a t i o n d o e s n o t a f f e c t b i n d i n g o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r S p 1 . W S S E L L L S A . 8 5 , 2 0 6 6 - 2 0 7 0 . H e r g e r s b e r g , M . ( 1 9 9 1 ) B i o l o g i c a l a s p e c t s o f c y t o s i n e m e t h y l a t i o n i n e u k a r y o t i c c e l l s . E x p e fl e g t i a , 4 7 , 1 1 7 1 - 1 1 8 5 . H o l l i d a y , R . ( 1 9 8 7 ) D N A m e t h y l a t i o n a n d e p i g e n e t i c d e f e c t s i n c a r c i n o g e n e s i s . m m , 1 8 1 , 2 1 5 - 2 1 7 . J o n e s , R A . a n d B u c k l e y , J D . ( 1 9 9 0 ) T h e r o l e o f D N A m e t h y l a t i o n i n c a n c e r . W e s . . . 5 4 . 1 - 2 3 . 6 2 L e e , L . W . , R a y m o n d , V . W . , T s a o , M . - S . , L e e , D . C . , E a r p , H S . a n d G r i s h a m , J . W . ( 1 9 9 1 ) C l o n a l c o s e g r e g a t i o n o f t u m o r i g e n i c i t y w i t h o v e r e x p r e s s i o n o f c - m y c a n d t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r o r g e n e s i n c h e m i c a l l y t r a n s f o r m e d r a t l i v e r e p i t h e l i a l c e l l s . Q e n g e e fi e e , 5 1 , 5 2 3 8 - 5 2 4 4 . M a n n , M B . a n d S m i t h , H 0 . ( 1 9 7 7 ) S p e c i f i c i t y o f H p a l l a n d H a e l l l D N A m e t h y l a s e s . W , 4 , 4 2 1 1 - 4 2 2 1 . M i t c h e l l , P . J . a n d T j i a n , R . ( 1 9 8 9 ) T r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n i n m a m m a l i a n c e l l s b y s e q u e n c e - s p e c i f i c D N A b i n d i n g p r o t e i n s . S e i e n c e , 2 4 5 , 3 7 1 - 3 7 8 . N e a d e s , R . , B e t z , N . A . , S h e n g , X . a n d P e l l i n g , J . C . ( 1 9 9 1 ) T r a n s i e n t e x p r e s s i o n o f t h e c l o n e d m o u s e c - H a - r a s 5 ' u p s t r e a m r e g i o n i n t r a n s f e c t e d p r i m a r y S E N C A R m o u s e k e r a t i n o c y t e s d e m o n s t r a t e s i t s p o w e r a s a p r o m o t e r e l e m e n t . m m 4 . 3 6 9 - 3 7 5 . P a r k e r , M . l . , J u d g e , K . a n d G e v e r s , W . ( 1 9 8 2 ) L o s s o f t y p e I p r o c o l l a g e n g e n e e x p r e s s i o n i n S V 4 0 - t r a n s f o r m e d h u m a n f i b r o b l a s t s i s a c c o m p a n i e d b y h y p e r m e t h y l a t i o n o f t h e s e g e n e s . N u e l e i e A e i g e R e e “ 1 0 , 5 8 7 9 - 5 8 9 1 . R a c h a l , M . J . , Y o o , H . , B e c k e r , F F . a n d L a p e y r e , J . - N . ( 1 9 8 9 ) I n v i t r o D N A c y t o s i n e m e t h y l a t i o n o f c i s - r e g u l a t o r y e l e m e n t s m o d u l a t e s c - H a - r a s p r o m o t e r a c t i v i t y i n v i v o . W , 1 7 , 5 1 3 5 - 5 1 4 7 . R a z i n , A . a n d C e d a r , H . ( 1 9 9 1 ) D N A M e t h y l a t i o n a n d g e n e e x p r e s s i o n . M i c L Q b L Q L j s - w . 5 5 4 5 1 - 4 5 8 R i c h a r d s o n , K . K . , H e l v e r i n g , L . M . , C o p p l e , D . M . , R e x r o a t , M . A . , L i n v i l l e , D . W . , E n g e l h a r d t , J . A . , T o d d , G C a n d R i c h a r d s o n , P C . ( 1 9 9 2 ) G e n e t i c a l t e r a t i o n s i n t h e 6 1 s t c o d o n o f t h e H - r a s o n c o g e n e i s o l a t e d f r o m a r c h i v a l s e c t i o n s o f h e p a t i c h y p e r p l a s i a s , a d e n o m a s a n d c a r c i n o m a s i n c o n t r o l g r o u p s o f B 6 0 3 F 1 m o u s e b i o a s s a y s t u d i e s c o n d u c t e d f r o m 1 9 7 9 t o 1 9 8 6 . m m , 1 3 , 9 3 5 - 9 4 1 . S c h a f f n e r , G . , S c h i r m , S . , M u l l e r - B a d e n , B . , W e b e r , F . a n d S c h a f f n e r , W . ( 1 9 8 8 ) R e d u n d a n c y o f i n f o r m a t i o n i n e n h a n c e r s a s a p r i n c i p l e o f m a m m a l i a n t r a n s c r i p t i o n c o n t r o l . J . M e l . B i o l , , 2 0 1 , 8 1 - 9 0 . S e y a m a , T . , G o d w i n , A . K . , D i P i e t r o , M . , W i n o k u r , T . S . , L e b o v i t z , R M . a n d L i e b e r m a n , M . W . ( 1 9 8 8 ) I n v i t r o a n d i n v i v o r e g u l a t i o n o f l i v e r e p i t h e l i a l c e l l s c a r r y i n g a m e t a l l o t h i o n e i n - r a s T 2 4 f u s i o n g e n e . W , 1 , 8 9 - 9 5 . S t r a u s s , W M ( 1 9 9 0 ) P r e p a r a t i o n o f g e n o m i c D N A f r o m m a m m a l i a n t i s s u e . I n A u s u b e l , F . M . , B r e n t , R . , K i n g s t o n , R . . , E M o o r e , D . . D , S e i d m a n , J . . G , S m i t h , J . . A a n d S t r u h l K ( ( e d S ) W J o h n W i l e y a n d 6 3 S o n s , N e w Y o r k . P p . 2 2 1 - 2 . 2 . 3 . V o r c e , R . L . a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 8 7 ) I n v e s t i g a t i o n o f p a r a m e t e r s a s s o c i a t e d w i t h a c t i v i t y o f t h e K i r s t e n - r a s , H a r v e y - r e s , a n d m y c o n c o g e n e s i n n o r m a l r a t l i v e r . W m . 9 0 . 8 6 - 9 5 . V o r c e , R . L . a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 8 9 ) A l t e r e d m e t h y l a t i o n o f r a s o n c o g e n e s i n b e n z i d i n e - i n d u c e d B 6 0 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s . W , 1 0 0 , 3 9 8 - 4 1 0 . W i s e m a n , R . W . , S t o w e r s , S . J . , M i l l e r , E . C . , A n d e r s o n , M W . a n d M i l l e r , J . A . ( 1 9 8 6 ) A c t i v a t i n g m u t a t i o n s o f t h e c - H a - r a s p r o t o o n c o g e n e i n c h e m i c a l l y i n d u c e d h e p a t o m a s o f t h e m a l e B 6 0 3 F 1 m o u s e . W M , 8 3 , 5 8 2 5 - 5 8 2 9 . W o o d , W . I . , G i t s c h i e r , J . , L a s k y , L A . a n d L a w n , R M . ( 1 9 8 5 ) B a s e c o m p o s i t i o n - i n d e p e n d e n t h y b r i d i z a t i o n i n t e t r a m e t h y l a m m o n i u m c h l o r i d e : A m e t h o d f o r o l i g o n u c l e o t i d e s c r e e n i n g o f h i g h l y c o m p l e x g e n e l i b r a r i e s . W $ 6 4 1 . 5 8 . . 8 2 , 1 5 8 5 - 1 5 8 8 . C h a p t e r 2 P R E F A C E T h e p r e c e d i n g c h a p t e r d e m o n s t r a t e d t h a t 5 M e C w a s p r e s e n t i n t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s i n m o u s e l i v e r . T h i s o b s e r v a t i o n r a n c o u n t e r t o w h a t h a d b e e n d e s c r i b e d f o r h u m a n H a - r a s , t h a t i s , t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f h u m a n H a - r a s h a s b e e n r e p o r t e d t o b e u n m e t h y l a t e d . T h u s e x a m i n a t i o n o f t h e e x t e n t o f s e q u e n c e s i m i l a r i t y b e t w e e n m o u s e a n d h u m a n H a - r a s , e s p e c i a l l y i n r e g i o n s b e l i e v e d t o p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e r e g u l a t i o n o f g e n e t r a n s c r i p t i o n b e c a m e a n e s s e t i a l a s p e c t o f t h e p r o j e c t . T h e G e n e t i c s C o m p u t e r G r o u p s o f t w a r e p a c k a g e w a s u t i l i z e d f o r t h i s p u r p o s e . I m p o r t a n t l y , N M R I a n d S E N C A R m i c e d e m o n s t r a t e a h i g h d e g r e e o f s e q u e n c e s i m i l a r i t y , w h i l e e i t h e r N M R I o r S E N C A R c o m p a r e d w i t h h u m a n H a - r a s d e m o n s t r a t e d o n l y 5 0 - 6 0 % s e q u e n c e s i m i l a r i t y . T h i s i n d i c a t e s t h a t m e t h y l a t i o n m a y p l a y a r o l e i n r e g u l a t i o n o f H a - r a s t r a n s c r i p t i o n a n d t h a t h u m a n a n d m o u s e H a - r a s a r e l i k e l y t o b e r e g u l a t e d d i f f e r e n t l y . T h i s m a n u s c r i p t i s i n p r e s s i n T o x i c o l o g y L e t t e r s ( 1 9 9 5 ) . 6 4 C h a p t e r 2 H Y P O M E T H Y L A T I O N O F D N A : A N O N G E N O T O X I C M E C H A N I S M I N V O L V E D I N T U M O R P R O M O T I O N J e n n i f e r L . C o u n t s a n d J a y I . G o o d m a n D e p a r t m e n t o f P h a r m a c o l o g y a n d T o x i c o l o g y M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y E a s t L a n s i n g , M I 4 8 8 2 4 U . S . A . S U M M A R Y T h e r e i s a n a b u n d a n t a m o u n t o f i n f o r m a t i o n o n t h e m e c h a n i s m s o f a c t i o n o f g e n o t o x i c c h e m i c a l s t h a t a c t a s c a r c i n o g e n s a n d t h e r o l e t h a t m u t a t i o n s p l a y i n c a r c i n o g e n e s i s . H o w e v e r , c a r c i n o g e n e s i s i s m o r e t h a n m u t a g e n e s i s a n d m a n y c a r c i n o g e n s a r e n o t m u t a g e n s . T h u s , t h e r e i s a n e e d t o c o n s i d e r n o n g e n o t o x i c m e c h a n i s m s t h a t m a y b e i n v o l v e d i n c a r c i n o g e n e s i s . I n t h i s p a p e r , w e r e v i e w o u r w o r k i n g h y p o t h e s i s t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A i s a n e p i g e n e t i c , n o n g e n o t o x i c m e c h a n i s m t h a t p l a y s a r o l e i n t u m o r p r o m o t i o n b y f a c i l i t a t i n g a b e r r a n t g e n e e x p r e s s i o n . T h e u t i l i t y o f e m p l o y i n g e x p e r i m e n t a l m o d e l s t h a t f o c u s o n r e l e v a n t c o m p a r i s o n s b e t w e e n s e n s i t i v e a n d r e s i s t a n t s t r a i n s o f m i c e i s e m p h a s i z e d . A d d i t i o n a l l y , a s p e c t s o f D N A m e t h y l a t i o n i n r o d e n t s a n d h u m a n s a r e c o m p a r e d a n d c o n t r a s t e d . W e d i s c u s s h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A a s a s e c o n d a r y m e c h a n i s m , t h a t i s e x p e c t e d t o b e t h r e s h o l d - e x h i b i t i n g , a n d c o n c l u d e b y d e s c r i b i n g h o w t h i s i n f o r m a t i o n m a y f a c i l i t a t e a r a t i o n a l a p p r o a c h t o w a r d s r i s k a s s e s s m e n t w h e n d e a l i n g w i t h 6 5 6 6 n o n g e n o t o x i c c o m p o u n d s t h a t a r e c a r c i n o g e n i c i n a b i o a s s a y . K E Y W O R D S : B i o a s s a y , C a r c i n o g e n e s i s , D N A M e t h y l a t i o n , E p i g e n e t i c , G e n o t o x i c , N o n g e n o t o x i c , P r o m o t i o n , R i s k A s s e s s m e n t . I N T R O D U C T I O N C a r c i n o g e n e s i s i s a m u l t i s t e p p r o c e s s t h a t c a n b e v i e w e d a s i n v o l v i n g s t a g e s o f i n i t i a t i o n , p r o m o t i o n a n d p r o g r e s s i o n ( D r a g a n e f a l . , 1 9 9 3 ) . T h e e x i s t e n c e o f t h e s e s t a g e s w a s , i n o u r v i e w , c o r r e c t l y n o t i n t e n d e d t o c o n n o t e t h a t m u t a t i o n o n l y o c c u r s d u r i n g i n i t i a t i o n , o r t h a t p r o m o t i o n o n l y i n v o l v e s s t i m u l a t i n g p r o l i f e r a t i o n o f a n d / o r i n h i b i t i n g a p o p t o s i s o f i n i t i a t e d c e l l s ( S c h u l t e - H e r r n a n n e t a l . , 1 9 9 0 ) . O p e r a t i o n a l l y , p r o m o t i o n e n t a i l s t h e c l o n a l e x p a n s i o n o f i n i t i a t e d c e l l s a n d a n i n i t i a t e d c e l l i s o n e t h a t m a y p r o l i f e r a t e i n r e s p o n s e t o p r o m o t e r t r e a t m e n t . T h e t e r m s i n i t i a t i o n a n d p r o m o t i o n s u g g e s t d i f f e r e n t m o d e s o f a c t i o n . A l t e r a t i o n s t o t h e g e n o m e , e . g . , a c h a n g e i n D N A m e t h y l a t i o n ( t h e e x t e n t a n d p a t t e r n o f c y t o s i n e r e s i d u e s p r e s e n t a s 5 - m e t h y l c y t o s i n e ( 5 M e C ) ) o r m u t a t i o n , t a k e p l a c e a t m u l t i p l e p o i n t s i n t h e c a r c i n o g e n i c p r o c e s s , f o r e x a m p l e a s i n t h e m o d e l o f c o l o n c a r c i n o g e n e s i s b a s e d o n V o g e l s t e i n ' s w o r k ( V o g e l s t e i n e t a l . , 1 9 8 8 ) . C a r c i n o g e n s t h a t i n t e r a c t w i t h a n d a l t e r D N A a r e c a t e g o r i z e d a s g e n o t o x i c ( t h e c h e m i c a l o r a m e t a b o l i t e o f i t i s D N A r e a c t i v e ) a n d t h e s e a r e m u t a g e n i c i n a p p r o p r i a t e t e s t s y s t e m s ( W e i s b u r g e r a n d W i l l i a m s , 1 9 8 1 ) . T h e r e i s a n a b u n d a n t a m o u n t o f i n f o r m a t i o n o n m e c h a n i s m s o f a c t i o n o f g e n o t o x i c c a r c i n o g e n s a n d t h e r o l e t h a t m u t a t i o n s p l a y i n c a r c i n o g e n e s i s ( S w e n b e r g , 1 9 9 5 ) . H o w e v e r , c a r c i n o g e n e s i s i s m o r e t h a n m u t a g e n e s i s a n d 6 7 m a n y c a r c i n o g e n s a r e n o t m u t a g e n s . A m i s m a t c h r e p a i r d e f i c i e n c y h a s b e e n i d e n t i f i e d i n p h e n o t y p i c a l l y n o r m a l h u m a n c e l l s . T h e p e o p l e w h o d o n a t e d t h e s e c e l l s h a d n u m e r o u s m u t a t i o n s i n a v a r i e t y o f t i s s u e s b u t v e r y f e w t u m o r s w e r e e v i d e n t ( P a r s o n s e t a l . , 1 9 9 5 ) . A d d i t i o n a l l y , a m o n g a g r o u p o f 1 3 8 c h e m i c a l s d e e m e d t o b e c a r c i n o g e n i c a s a r e s u l t o f b i o a s s a y s c o n d u c t e d b y t h e N a t i o n a l T o x i c o l o g y P r o g r a m 3 3 % a r e n o t m u t a g e n i c t o S a l m o n e l l a a n d p o s s e s s a n o n - a l e r t i n g c h e m i c a l s t r u c t u r e ( A s h b y e t a l . , 1 9 8 9 ) . T h u s , t h e r e i s a n e e d t o c o n s i d e r n o n g e n o t o x i c m e c h a n i s m s t h a t p l a y a r o l e i n c a r c i n o g e n e s i s . H y p o m e t h y l a t i o n o f D N A ( a d e c r e a s e i n t h e l e v e l o f 5 M e C ) a p p e a r s t o b e o n e o f t h e s e , a n d w e a r e t e s t i n g t h e h y p o t h e s i s t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A i s a n e p i g e n e t i c m e c h a n i s m i n v o l v e d i n t u m o r p r o m o t i o n ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 b ) I N H E R I T A N C E O F P H E N O T Y P E , E P I G E N E T I C S A N D D N A M E T H Y L A T I O N C h a n g e s i n g e n e e x p r e s s i o n r e s u l t i n g i n a n a l t e r e d p h e n o t y p e m a y b e d u e t o g e n e t i c m e c h a n i s m s i n v o l v i n g a n a l t e r e d D N A b a s e s e q u e n c e ( i . e . , m u t a t i o n ) o r t o e p i g e n e t i c m e c h a n i s m s i n v o l v i n g h e r i t a b l e c h a n g e s i n D N A m o d i f i c a t i o n . T h e p r e s e r v a t i o n o f D N A m e t h y l a t i o n p a t t e r n s a n d D N A - p r o t e i n c o m p l e x e s f o r m u l t i p l e c e l l g e n e r a t i o n s a r e e x a m p l e s o f h e r i t a b l e m o d i f i c a t i o n s t o D N A ( G r u e n e r t a n d C o z e n s , 1 9 9 1 ) . D N A m e t h y l a t i o n i s a m e c h a n i s m u n d e r l y i n g e p i g e n e t i c s , t h e t e r m d e s c r i b i n g t h e t r a n s m i s s i o n o f a l t e r n a t i v e s t a t e s o f g e n e a c t i v i t y i n s o m a t i c c e l l s ( H o l l i d a y , 1 9 8 7 ) . A d d i t i o n a l l y , 6 8 m e t h y l a t i o n m a y p l a y a r o l e i n g e n o m i c i m p r i n t i n g ; t h e p r e f e r e n t i a l e x p r e s s i o n o f e i t h e r t h e m a t e r n a l o r p a t e r n a l a l l e l e o f a g e n e ( H o l l i d a y , 1 9 8 7 ; L i e t a l . , 1 9 9 3 ; R a z i n a n d K a f r i , 1 9 9 4 ) . D N A m e t h y l a t i o n r e g u l a t e s g e n e e x p r e s s i o n ( R a z i n a n d K a f r i , 1 9 9 4 ) b y i n f l u e n c i n g c h r o m a t i n s t r u c t u r e ( K e s h e t e t a l . , 1 9 8 6 ) a n d t h e m e t h y l g r o u p i n f l u e n c e s t h e b i n d i n g o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s , e i t h e r d i r e c t l y o r i n d i r e c t l y b y f a c i l i t a t i n g t h e b i n d i n g o f p r o t e i n s t h a t b i n d t o m e t h y l a t e d D N A ( B o y e s a n d B i r d , 1 9 9 1 ) . I n h i b i t i o n o f t r a n s c r i p t i o n a n d D N A m e t h y l a t i o n a r e r e l a t e d d i r e c t l y , a n d t h i s i s n o t a n a l l - o r - n o n e p h e n o m e n o n ( C o s t e l l o e t a l . , 1 9 9 4 ) . H y p o m e t h y l a t i o n i s n e c e s s a r y b u t n o t s u f f i c i e n t f o r e x p r e s s i o n . T h u s , a h y p o m e t h y l a t e d g e n e c a n b e v i e w e d a s h a v i n g a h i g h e r p o t e n t i a n r o b a b i l i t y o f b e i n g e x p r e s s e d a s c o m p a r e d t o a h y p e r m e t h y l a t e d g e n e ( r e f e r e n c e d i n V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 8 9 ) . I n t h i s c o n t e x t i t s h o u l d b e n o t e d t h a t e v e n i n t h e c a s e o f t h e m a n n o s e - 6 - p h o s p h a t e / i n s u l i n - l i k e g r o w t h f a c t o r I I r e c e p t o r ( M 6 P - l G F 2 r ) g e n e w h e r e m e t h y l a t i o n o f a C p G s i t e i n a n i n t r o n s e e m s t o b e a n i m p r i n t i n g s i g n a l r e q u i r e d f o r e x p r e s s i o n , w h i l e h y p o m e t h y l a t i o n o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n i s r e q u i r e d f o r e x p r e s s i o n ( S t o g e r e t a l . , 1 9 9 3 ) . H y p o m e t h y l a t i o n m a y b e a n o n g e n o t o x i c m e c h a n i s m f a c i l i t a t i n g t h e a b e r r a n t g e n e e x p r e s s i o n i n v o l v e d i n c a r c i n o g e n e s i s ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 8 9 ; G o o d m a n e t a l . , 1 9 9 1 ; G o o d m a n a n d C o u n t s , 1 9 9 3 ; C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 b ) . F o r e x a m p l e , e x c e s s i v e e x p r e s s i o n o f n o r m a l H a - r a s c a n t r a n s f o r m c e l l s ( P u l c i a n i e t a l . , 1 9 8 5 ) a n d t h e t r a n s f o r m i n g a b i l i t y o f a v a r i e t y o f o n c o g e n e s i s d e p e n d e n t u p o n t h e i r i n c r e a s e d e x p r e s s i o n ( B r i s s e t t e e t a l . , 1 9 9 3 ) . T h i s i s n o t u n e x p e c t e d b e c a u s e w i t h t h e e x c e p t i o n o f 6 9 t u m o r s u p p r e s s o r g e n e s , a m u t a t e d g e n e m u s t b e e x p r e s s e d i n o r d e r t o a f f e c t p h e n o t y p e . D N A M E T H Y L A T I O N A N D C A R C I N O G E N E S I S C h a n g e s i n D N A m e t h y l a t i o n a r e a c o n s i s t e n t f i n d i n g i n c a n c e r c e l l s ( G a m a - S o s a e t a l . , 1 9 8 3 ; L a i r d a n d J a e n i s c h , 1 9 9 4 ) . A r g u a b l y , o v e r a l l h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A i s t h e m o s t c o n s i s t e n t a l t e r a t i o n o f t h e g e n o m e t h a t i s o b s e r v e d i n c a r c i n o g e n e s i s . F o r e x a m p l e , h y p o m e t h y l a t i o n h a s b e e n d e m o n s t r a t e d t o o c c u r a s a n e a r l y e v e n t i n t h e d e v e l o p m e n t o f c o l o n c a n c e r ( V o g e l s t e i n e t a l . , 1 9 8 8 ) . A d d i t i o n a l s u p p o r t f o r t h e r o l e o f h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A i n c a r c i n o g e n e s i s i s f o u n d b y c o m p a r i n g t h e l e v e l o f m e t h y l a t i o n a t v a r i o u s s t a g e s o f s e v e r a l t y p e s o f h u m a n c a n c e r s ; o v e r a l l , t h e l e v e l o f m e t h y l a t i o n d e c r e a s e s p r o g r e s s i v e l y a s o n e g o e s f r o m n o r m a l t i s s u e t o b e n i g n t u m o r s t o p r i m a r y m a l i g n a n c i e s t o s e c o n d a r y m a l i g n a n c i e s ( G a m a - S o s a e t a l . , 1 9 8 3 ) . A r e c e n t s t u d y h a s a l s o d e m o n s t r a t e d t h a t t h e d e g r e e o f h y p o m e t h y l a t i o n i n c r e a s e s w i t h t h e g r a d e o f c e r v i c a l n e o p l a s i a ( K i m e t a l . , 1 9 9 4 ) . A d d i t i o n a l l y , p l a c e m e n t o f r o d e n t s o n m e t h y l - d e f i c i e n t d i e t s r e s u l t s i n l i v e r t u m o r s a n d i s a s s o c i a t e d w i t h h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A ( C h r i s t m a n e t a l . , 1 9 9 3 ; N e w b e m e , 1 9 9 3 ) . T h e r e a r e o t h e r r o l e s f o r D N A m e t h y l a t i o n i n c a r c i n o g e n e s i s a n d t h e s e i n v o l v e t u m o r s u p p r e s s o r g e n e s a n d m u t a t i o n . R e g i o n a l h y p e r m e t h y l a t i o n m a y p l a y a r o l e i n c a r c i n o g e n e s i s b y i n h i b i t i n g t r a n s c r i p t i o n o f t u m o r s u p p r e s s o r g e n e s ( G r e g e r e t a l . , 1 9 9 4 ) a n d b y f a c i l i t a t i n g g e n e t i c i n s t a b i l i t y l e a d i n g t o l o s s 7 0 o f t u m o r s u p p r e s s o r g e n e s ( M a k o s e t a l . , 1 9 9 3 b ) . S p o n t a n e o u s d e a m i n a t i o n o f 5 M e C r e s u l t s i n t h e g e n e r a t i o n o f t h y m i n e a n d m a y l e a d t o a C - G t o T - A t r a n s i t i o n ( M a g e w u a n d J o n e s , 1 9 9 4 ) . F u r t h e r , i n t h e p r e s e n c e o f l o w l e v e l s o f S - a d e n o s y l m e t h i o n i n e , D N A m e t h y l a s e m a y b e a b l e t o c a t a l y z e t h e d e a m i n a t i o n o f c y t o s i n e t o f o r m u r a c i l , a g a i n l e a d i n g t o C - G t o T - A t r a n s i t i o n s ( S h e n e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h u s , t h e h i g h r a t e o f m u t a t i o n a t C p G d i n u c l e o t i d e s m a y b e d u e , i n p a r t , t o m e t h y l t r a n s f e r a s e - m e d i a t e d d e a m i n a t i o n ( L a i r d a n d J a e n i s c h , 1 9 9 4 ) . T h e s e a d d i t i o n a l p o s s i b i l i t i e s a r e c o m p a t i b l e w i t h o u r h y p o t h e s i s r e g a r d i n g t h e r o l e o f h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A i n t u m o r p r o m o t i o n ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 b ) a n d a r e n o t m u t u a l l y e x c l u s i v e . I n d e e d , i t i s r e a s o n a b l e t o p r e d i c t t h a t , a l o n e o r i n c o m b i n a t i o n , t h e s e a s p e c t s o f a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n m a y b e i n v o l v e d i n t h e m u l t i s t e p p r o c e s s o f c a r c i n o g e n e s i s . M A R K E D H Y P O M E T H Y L A T I O N M A Y I N H I B I T T U M O R I G E N E S I S T h e r e s u l t s o f t w o r e c e n t p u b l i c a t i o n s i n d i c a t e t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A b r o u g h t a b o u t b y a r e d u c t i o n i n D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e l e v e l s c a n i n h i b i t t u m o r i g e n e s i s . T h e s e i n v o l v e a n t i s e n s e R N A t o D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e m R N A ( M a c l e o d a n d S z y f , 1 9 9 5 ) o r h e t e r o z y g o s i t y o f t h e m e t h y l t r a n s f e r a s e g e n e i n c o m b i n a t i o n w i t h a d m i n i s t r a t i o n o f t h e m e t h y l t r a n s f e r a s e i n h i b i t o r 5 - a z a c y t i d i n e ( L a i r d e t a l . , 1 9 9 5 ) . B o t h o f t h e s e e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s a r e e x p e c t e d t o r e s u l t i n m a r k e d h y p o m e t h y l a t i o n . S i n c e D N A m e t h y l a t i o n p l a y s a c r i t i c a l r o l e i n d e v e l o p m e n t ( L i e t a l . , 1 9 9 3 ) a n d d i f f e r e n t i a t i o n ( H o l l i d a y , 1 9 8 7 ) w e b e l i e v e i t i s r e a s o n a b l e t o p r o p o s e t h a t h y p o m e t h y l a t i o n a t a n i n t e r m e d i a t e l e v e l d o e s p l a y 7 1 a c r i t i c a l r o l e i n c a r c i n o g e n e s i s w h i l e e x c e s s i v e h y p o m e t h y l a t i o n m a y n o t b e c o m p a t i b l e w i t h c e l l l i f e ; d e a d c e l l s d o n o t f o r m t u m o r s . C E L L P R O L I F E R A T I O N A N D D N A M E T H Y L A T I O N C e l l p r o l i f e r a t i o n p l a y s a k e y r o l e i n c a r c i n o g e n e s i s ( C o h e n a n d E l l w e i n , 1 9 9 1 ) . T h i s i n v o l v e s e x p a n s i o n o f c l o n e s o f i n i t i a t e d c e l l s d u r i n g p r o m o t i o n a n d p r o g r e s s i o n . A d d i t i o n a l l y , c e l l p r o l i f e r a t i o n m a y c o n t r i b u t e t o c a r c i n o g e n e s i s b y f a c i l i t a t i n g m u t a g e n e s i s ( A m e s a n d G o l d , 1 9 9 0 ) , i n c l u d i n g t h e p o i n t m u t a t i o n s r e s u l t i n g f r o m s p o n t a n e o u s d e a m i n a t i o n o f 5 M e C a n d m e t h y l t r a n s f e r a s e - m e d i a t e d d e a m i n a t i o n o f c y t o s i n e , d i s c u s s e d a b o v e . H o w e v e r , i t w o u l d b e a m i s t a k e t o f o c u s u p o n m u t a g e n e s i s s o l e l y . H y p o m e t h y l a t i o n m a y o c c u r d u r i n g p e r i o d s o f D N A r e p l i c a t i o n , a s a r e s u l t o f d e c r e a s e d m a i n t e n a n c e m e t h y l a t i o n ( G r u e n b a u m e t a l . , 1 9 8 2 ) , e i t h e r d u e t o a d e c r e a s e d c a p a c i t y / f i d e l i t y o f t h e m a i n t e n a n c e m e t h y l a s e , o r a d e c r e a s e d l e v e l o f t h e m e t h y l d o n o r , S - a d e n o s y l m e t h i o n i n e . T h e r e f o r e , a l t e r a t i o n s i n D N A m e t h y l a t i o n , i n c l u d i n g h y p o m e t h y l a t i o n ( G o o d m a n a n d C o u n t s , 1 9 9 3 ) , m a y b e o n e m e c h a n i s m u n d e r l y i n g a r o l e f o r c e l l p r o l i f e r a t i o n i n c a r c i n o g e n e s i s . A d d i t i o n a l l y , h y p o m e t h y l a t i o n m a y o c c u r b y a n e n z y m a t i c r e m o v a l o f 5 M e C a n d r e p l a c e m e n t w i t h c y t o s i n e t h a t i s n o t l i n k e d t o c e l l p r o l i f e r a t i o n ( R a z i n a n d K a f r i , 1 9 9 4 ) . 7 2 H Y P O M E T H Y L A T I O N O F D N A C A N B E V I E W E D A S A S E C O N D A R Y M E C H A N I S M A s e c o n d a r y m e c h a n i s m i n v o l v e d i n c a r c i n o g e n e s i s i s d e f i n e d a s a n i n d i r e c t m e c h a n i s m t h a t c a n b e s h o w n t o e x i s t u n d e r c o n d i t i o n s o f t h e b i o a s s a y ( e . g . , c h r o n i c a d m i n i s t r a t i o n o f m a x i m u m t o l e r a t e d d o s e s o f t h e t e s t c h e m i c a l ) a n d c a n a l t e r t h e t u m o r i n c i d e n c e i n d e p e n d e n t o f t h e t e s t c h e m i c a l p e r s e ( M c C l a i n , 1 9 9 4 ) . T h e p r a c t i c a l s i g n i f i c a n c e o f t h e d i s t i n c t i o n b e t w e e n a p r i m a r y a n d s e c o n d a r y m e c h a n i s m s i s t h a t s e c o n d a r y m e c h a n i s m s a r e e x p e c t e d t o i n v o l v e a t h r e s h o l d . B a s e d u p o n t h e c r i t e r i a o u t l i n e d f o r a s e c o n d a r y m e c h a n i s m ( S c h e u p l e i n , 1 9 9 5 ) , w e s u g g e s t t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A c a n b e d e s c r i b e d a s a s e c o n d a r y m e c h a n i s m i n v o l v e d i n c a r c i n o g e n e s i s . T h i s v i e w i s s u p p o r t e d b e c a u s e h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A i s a b i o l o g i c a l l y p l a u s i b l e , n o n g e n o t o x i c , t h r e s h o l d - e x h i b i t i n g , m e c h a n i s m t h a t i s i n v o l v e d i n t h e r e g u l a t i o n o f g e n e e x p r e s s i o n . I n a d d i t i o n , t h e l e v e l o f 5 M e C c a n b e m e a s u r e d e x p e r i m e n t a l l y i n s p e c i f i c g e n e s a n d i n a g l o b a l s e n s e i n e n t i r e t i s s u e s . H y p o m e t h y l a t i o n o f D N A h a s b e e n d e m o n s t r a t e d i n h u m a n a n d a n i m a l c a n c e r s . A p a r t i c u l a r l y e x c i t i n g a s p e c t o f o u r h y p o t h e s i s a r e t h e d a t a i n d i c a t i n g t h a t c o n d i t i o n s w h i c h f a v o r m e t h y l a t i o n c a n i n h i b i t c a r c i n o g e n e s i s , e . g . , t r e a t m e n t w i t h S - a d e n o s y l m e t h i o n i n e d e c r e a s e s t h e i n c i d e n c e , n u m b e r a n d s i z e o f p r e n e o p l a s t i c l e s i o n s a n d h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a s i n r a t s t h a t h a d b e e n s u b j e c t e d t o i n i t i a t i o n w i t h d i e t h y l n i t r o s a m i n e a n d p r o m o t i o n w i t h p h e n o b a r b i t a l ( P a s c a l e e t a l . , 1 9 9 2 ) . T a k e n t o g e t h e r e a c h o f t h e s e p o i n t s p r o v i d e s s u p p o r t f o r c o n s i d e r i n g h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A a s a s e c o n d a r y 7 3 m e c h a n i s m i n v o l v e d i n t u m o r i g e n e s i s . M O U S E L I V E R T U M O R I G E N E S I S A S A M O D E L O u r e x p e r i m e n t a l i n t e r e s t s i n v o l v e t e s t i n g t h e h y p o t h e s i s t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A i s a n o n g e n o t o x i c m e c h a n i s m t h a t f a c i l i t a t e s a b e r r a n t g e n e e x p r e s s i o n i n v o l v e d i n t u m o r p r o m o t i o n ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 b ) . 5 M e C m o s t c o m m o n l y o c c u r s a t C p G s i t e s , b u t m a y a l s o o c c u r a t C p C , C p A , o r C p T s i t e s . A d d i t i o n a l l y , 5 M e C m a y b e f o u n d i n m a m m a l i a n c e l l s a t C X G s i t e s ( C l a r k e t a l . , 1 9 9 5 ) . M e t h y l a t i o n s t a t u s o f D N A i s m a i n t a i n e d b y a m a i n t e n a n c e p r o c e s s t h a t o c c u r s a f t e r D N A r e p l i c a t i o n u s i n g t h e 5 M e C p r e s e n t o n t h e p a r e n t a l s t r a n d a s a s i g n a l ( R a z i n a n d K a f r i , 1 9 9 4 ) . H o w e v e r , m e t h y l a t i o n o f D N A i s n o t l i m i t e d t o t h e m a i n t e n a n c e m e t h y l a t i o n r e a c t i o n , a n d m a y a l s o o c c u r d e n o v o ( R a z i n a n d K a f r i , 1 9 9 4 ) . T h i s p r o c e s s p r o v i d e s a m e c h a n i s m w h e r e b y h y p o m e t h y l a t i o n m a y b e r e v e r s e d a n d r e v e r s i b i l i t y i s a h a l l m a r k f e a t u r e o f t h e p r o m o t i o n s t a g e o f c a r c i n o g e n e s i s ( D r a g a n e t a l . , 1 9 9 3 ) . S p e c i f i c a l l y , o u r r e s e a r c h ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 b ) i s f o c u s e d o n a n e x a m i n a t i o n o f m e t h y l a t i o n s t a t u s a n d g e n e e x p r e s s i o n i n s t r a i n s o f m i c e t h a t h a v e d i f f e r e n t s u s c e p t i b i l i t i e s t o b o t h s p o n t a n e o u s a n d c h e m i c a l - i n d u c e d l i v e r t u m o r i g e n e s i s ; t h e 8 6 0 3 F 1 a n d C S H / H e a r e r e l a t i v e l y s u s c e p t i b l e s t r a i n s , w h i l e t h e C S 7 B L / 6 i s r e l a t i v e l y r e s i s t a n t ( B e c k e r , 1 9 8 2 ) . I m p o r t a n t l y , t h e B B C 3 F 1 i s t h e F 1 h y b r i d o f a 0 5 7 B U 6 f e m a l e a n d a C 3 H / H e m a l e , s o c o m p a r i s o n s m a y b e m a d e b e t w e e n g e n e t i c a l l y r e l a t e d a n i m a l s . O u r i n i t i a l f o c u s o n H a - r a s w a s d u e t o t h e h i g h , t h o u g h n o t u n i v e r s a l , 7 4 i n v o l v e m e n t o f m u t a t e d H a - r a s ( a t c o d o n 6 1 ) i n g e n o t o x i c c h e m i c a l - i n d u c e d a n d s p o n t a n e o u s l i v e r t u m o r s i n t h e B 6 0 3 F 1 m o u s e ( S t o w e r s e t a l . , 1 9 8 8 ; B u c h m a n n e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h e C S H / H e , a l s o a r e l a t i v e l y s e n s i t i v e s t r a i n , h a s a v a r i a b l e i n c i d e n c e o f m u t a t i o n o f H a - r a s i n s p o n t a n e o u s l i v e r t u m o r s ( B u c h m a n n e t a l . , 1 9 9 1 ; E n o m o t o e t a l . , 1 9 9 3 ) . N o n g e n o t o x i c c h e m i c a l i n d u c e d l i v e r t u m o r s i n t h e 8 6 0 3 F 1 m o u s e ( F o x e t a l . , 1 9 9 0 ) a n d t h e C S H / H e m o u s e ( B a u e r - H o f m a n n e t a l . , 1 9 9 2 ) h a v e a l o w f r e q u e n c y o f m u t a t e d H a - r a s . H o w e v e r , a s d i s c u s s e d b e l o w , t h i s d o e s n o t p r e c l u d e h y p o m e t h y l a t i o n a n d i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f H a - r a s p l a y i n g a r o l e i n t h e d e v e l o p m e n t o f t h e s e t u m o r s . I n t e r e s t i n g l y , n o n - l i v e r t u m o r s i n t h e B 6 0 3 F 1 m o u s e h a v e a l o w i n c i d e n c e o f H a - r a s m u t a t i o n ; a s d o d i e t h y l n i t r o s a m i n e - i n d u c e d l i v e r t u m o r s i n t h e F i s c h e r - 3 4 4 r a t ( S t o w e r s e t a l . , 1 9 8 8 ) a n d t h e C S 7 B U 6 m o u s e ( B u c h m a n n e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h u s , t h e l a c k o f u n i f o r m i t y i n d e t e c t i n g m u t a t i o n o f H a - r a s i n t h e s e t u m o r s s u g g e s t s t h a t a f a c t o r ( s ) i n a d d i t i o n t o m u t a t i o n m a y i n f l u e n c e t u m o r f o r m a t i o n . I t w a s i n t h i s c o n t e x t t h a t w e a s s e s s e d m e t h y l a t i o n s t a t u s a n d g e n e e x p r e s s i o n o f H a - r a s i n n o r m a l m o u s e l i v e r a n d i n l i v e r t u m o r s . O u r s t u d i e s d e m o n s t r a t e d t h a t H a - r a s i n t h e l i v e r t u m o r p r o n e s t r a i n s ( i . e . , B 6 C 3 F 1 a n d C 3 H / H e ) l a c k s a m e t h y l a t e d s i t e t h a t i s p r e s e n t i n t h e l i v e r t u m o r r e s i s t a n t C S 7 B U 6 ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 8 9 ) . T h i s g e n e w a s a l s o s h o w n t o b e h y p o m e t h y l a t e d i n c h e m i c a l - i n d u c e d ( u s i n g g e n o t o x i c a n d n o n g e n o t o x i c c o m p o u n d s ) a n d s p o n t a n e o u s l i v e r t u m o r s i n t h e B 6 C 3 F 1 m o u s e ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 8 9 ; V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 9 1 b ) . I n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f H a - r a s w a s a l s o e v i d e n t ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 8 9 ; R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) . T o g e t h e r t h e s e 7 5 d a t a d e m o n s t r a t e t h a t h y p o m e t h y l a t i o n a n d i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f H a - r a s a r e c o m m o n e v e n t s i n l i v e r t u m o r i g e n e s i s i n t h e B 6 0 3 F 1 m o u s e . F u r t h e r m o r e , w e h a v e s u g g e s t e d ( R a y e t a l . , 1 9 9 4 ; C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 a ) t h a t t h o s e h e p a t o c y t e s e x h i b i t i n g a n i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f H a - r a s a n d r a f m a y b e a b l e t o o v e r c o m e t h e g r o w t h i n h i b i t o r y a c t i o n s o f p h e n o b a r b i t a l ( P B ) a n d s e r v e a s t h e p r o g e n i t o r s o f P B - p r o m o t e d l i v e r t u m o r s . I n d e e d , d e v e l o p m e n t o f r e s i s t a n c e t o g r o w t h i n h i b i t i o n m a y b e a g e n e r a l m e c h a n i s m i n v o l v e d i n t u m o r p r o m o t i o n a s o p p o s e d t o b e i n g u n i q u e t o P B ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 a ) . I n l i g h t o f t h e m u l t i s t e p n a t u r e o f t u m o r i g e n e s i s w e d i d n o t l i m i t o u r a n a l y s i s t o o n e g e n e i n v o l v e d i n c o n t r o l o f c e l l g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n ; w e a l s o i n v e s t i g a t e d t h e r e f o n c o g e n e a s a n o t h e r p o t e n t i a l t a r g e t . H a - r a s a n d r e f a r e b o t h i n v o l v e d i n s i g n a l t r a n s d u c t i o n w i t h r a f f u n c t i o n i n g d o w n s t r e a m o f , o r i n d e p e n d e n t l y o f , H a - r a s ( D a u m e t a l . , 1 9 9 4 ) . W e h a v e d e m o n s t r a t e d h y p o m e t h y l a t i o n o f r e f i n t h e B 6 0 3 F 1 , b u t n o t t h e C S 7 B L / 6 , a f t e r a p r o m o t i n g d o s e o f P B f o r 2 w e e k s ( R a y e t a L , 1 9 9 4 ) . A d d i t i o n a l l y , r a f i s h y p o m e t h y l a t e d i n t h e B 6 0 3 F 1 m o u s e i n s p o n t a n e o u s a n d P B - i n d u c e d l i v e r t u m o r s ( R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) . I n c r e a s e d r a f e x p r e s s i o n i s e v i d e n t i n t h e m a j o r i t y o f P B - i n d u c e d , b u t n o t s p o n t a n e o u s , l i v e r t u m o r s ( R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e d a t a s u p p o r t t h e n o t i o n t h a t P B - i n d u c e d t u m o r s d e v e l o p a l o n g a d i f f e r e n t p a t h w a y f r o m s p o n t a n e o u s t u m o r s a n d t h a t t h e C 5 7 B U 6 h a s a h i g h e r c a p a c i t y t o m a i n t a i n n o r m a l m e t h y l a t i o n s t a t u s o f D N A t h a n t h e l i v e r t u m o r p r o n e B 6 0 3 F 1 . I n t e r e s t i n g l y , a m u r i n e t r a n s g e n e h a s b e e n d e m o n s t r a t e d t o b e d i f f e r e n t i a l l y m e t h y l a t e d d e p e n d i n g u p o n t h e g e n e t i c b a c k g r o u n d o f t h e h o s t 7 6 s t r a i n . T h e r e i s a h i g h l e v e l o f m e t h y l a t i o n a n d l a c k o f e x p r e s s i o n w h e n t h e C S 7 B L / 6 m o u s e s e r v e s a s t h e h o s t , w h i l e t h e g e n e i s u n m e t h y l a t e d a n d e x p r e s s e d i n t h e D B A / 2 m o u s e ( E n g l e r e t a l . , 1 9 9 1 ) . D B A / 2 m i c e a r e a p p r o x i m a t e l y 2 0 - f o l d m o r e s u s c e p t i b l e t o h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s t h a n C S 7 B L / 6 m i c e f o l l o w i n g p e r i n a t a l t r e a t m e n t w i t h d i e t h y l n i t r o s a m i n e ( L e e e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h i s s u p p o r t s o u r v i e w ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 b ; R a y e t a l . , 1 9 9 4 ; C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 a ; 1 9 9 5 c ) t h a t h y p o m e t h y l a t i o n i s i n v o l v e d i n c a r c i n o g e n e s i s a n d t h a t a l o w c a p a c i t y t o m e t h y l a t e D N A c a n c o n t r i b u t e t o a n i n c r e a s e d s u s c e p t i b i l i t y t o c a r c i n o g e n e s i s . 5 ' F L A N K I N G R E G I O N O F H a - r a s : M O U S E v s . H U M A N W e h a v e a n a l y z e d t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f p o r t i o n s o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s i n B G C 3 F 1 a n d C S 7 B U 6 m i c e b y t w o a p p r o a c h e s , ( 1 ) S o u t h e r n a n a l y s i s u t i l i z i n g o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 3 ) a n d ( 2 ) a m o r e s e n s i t i v e a p p r o a c h u t i l i z i n g p r e - P C R d i g e s t i o n o f D N A w i t h m e t h y l a t i o n s e n s i t i v e e n z y m e s ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 a ) . O u r d a t a d e m o n s t r a t e t h e p r e s e n c e o f 5 M e C i n a p o r t i o n o f t h i s r e g i o n t h a t c o n t a i n s a l o w f r e q u e n c y o f C p G ( r e g i o n J C S / 8 i n F i g u r e 1 ) , w h i l e t h e r e g i o n w i t h a h i g h C p G f r e q u e n c y ( o b s e r v e d / e x p e c t e d > 0 ) i s u n m e t h y l a t e d ( r e g i o n J C 6 / 7 i n F i g u r e 1 ) . I m p o r t a n t l y , t h e J C G / 7 r e g i o n e x h i b i t s t h e m a i n c h a r a c t e r i s t i c o f a C p G i s l a n d , t h a t b e i n g a C p G r a t i o t h a t i s g r e a t e r t h a n t h e e x p e c t e d f r e q u e n c y i n D N A , a n d b e c a u s e o f t h i s i s e x p e c t e d t o b e u n m e t h y l a t e d ( G a r d i n e r - G a r d e n a n d F r o m m e r , 1 9 8 7 ) . T h e J C S / 8 p o r t i o n , o n t h e o t h e r h a n d , d o e s n o t s h a r e t h i s F i g u r e 1 . D i s t r i b u t i o n o f c y t o s i n e ( C ) a n d g u a n i n e ( G ) b a s e s , a n d C p G d i n u c l e o t i d e s i n t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s . T h e p e r c e n t o f C a n d G a n d t h e r a t i o o f o b s e r v e d C p G t o e x p e c t e d ( o b / e x ) i s u s e d t o i d e n t i f y t h e p r e s e n c e o f C p G i s l a n d s ( o b / e x > 0 ) , s h o w n h e r e f o r t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s . T h e d i s t r i b u t i o n w a s g e n e r a t e d w i t h t h e G C G p a c k a g e ( G e n e t i c s C o m p u t e r G r o u p , 1 9 9 4 ) o f c o m p u t e r p r o g r a m s u s i n g " W i n d o w " t o c a r r y o u t t h e a n a l y s i s a n d ' S t a t p l o t " t o g e n e r a t e t h e f i g u r e . T h e r e g i o n s a m p l i f i e d b y P C R p r i m e r s e t s J C S / 8 ( J C S : 5 ' - G C G A C C G G G G T G A G C G T G C A A - 3 ' ; J 0 8 : 5 ' - A G A G C C T C C A C C C T G C A G C C T - 3 ' ) a n d J C 6 / 7 ( J 0 6 : 5 ' - T G C C C G C A C T C A C C G C T I ' G C T - 3 ' ; J 0 7 : 5 ' - A G G C T G C A G G G T G G A G G C T C T - 3 ' ) a r e n o t e d , a l o n g w i t h t h e p o s i t i o n s o f e x o n s l a n d I I . T h e a r r o w s i n d i c a t e d t h e l o c a t i o n s o f t h e p u t a t i v e t r a n s c r i p t i o n s t a r t s i t e s . T h e s e q u e n c e i n f o r m a t i o n , 2 , 7 0 0 b a s e p a i r s , p o s i t i o n o f p u t a t i v e t r a n s c r i p t i o n s t a r t s i t e s a n d e x o n l o c a t i o n s w e r e o b t a i n e d f r o m t h e l i t e r a t u r e ( B r o w n e t a l . , 1 9 8 8 ; N e a d e s e r a l . , 1 9 9 1 ) . \ I \ l 0 2 # I I I I I I I I I I I I I I l I I I I . 1 e r u g i F ( x a / q o ) s o ( ° / . ) e O I n 1 L 1 r I * I ( W e I ‘ fi I I l 0 5 0 0 I . 0 0 0 I . 5 0 0 2 . 0 0 0 5 ' - B a s e P a i r s - 3 ' I 2 . 5 0 0 7 8 7 9 c h a r a c t e r i s t i c a n d i s n o t b e e x p e c t e d t o b e c o m p l e t e l y u n m e t h y l a t e d . A d d i t i o n a l l y , w e h a v e s h o w n t h a t t h e B 6 C 3 F 1 c o n t a i n s a n u n m e t h y l a t e d C C G G s i t e t h a t i s m e t h y l a t e d i n t h e C S 7 B L / 6 a n d w o u l d s u g g e s t t h a t t h i s s i t e m a y p l a y a r o l e i n t h e h i g h s p o n t a n e o u s l i v e r t u m o r i n c i d e n c e i n t h e B 6 C 3 F 1 m o u s e ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 a ) . O u r i n t e r e s t i n t h i s n o n g e n o t o x i c m e c h a n i s m o f t u m o r p r o m o t i o n p r o m p t e d u s t o c o m p a r e t h e s e q u e n c e s o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s b e t w e e n m i c e a n d h u m a n s u s i n g t h e G C G p a c k a g e ( G e n e t i c s C o m p u t e r G r o u p , 1 9 9 4 ) . T h e s e q u e n c e c o m p a r i s o n s a r e l i m i t e d b y t h e a v a i l a b i l i t y o f t h e d a t a i n t h e l i t e r a t u r e . C o m p a r i s o n o f t h e 5 ' r e g i o n o f H a - r a s ( t o - 3 3 0 b p f r o m t h e t r a n s c r i p t i o n s t a r t s i t e ) b e t w e e n S e n c a r ( N e a d e s e t a l . , 1 9 9 1 ) a n d N M R I ( B r o w n e t a l . , 1 9 8 8 ) m i c e r e v e a l s 9 9 % s e q u e n c e i d e n t i t y ( F i g u r e 2 ) . H o w e v e r , a c o m p a r i s o n o f t h i s r e g i o n b e t w e e n N M R I m i c e ( B r o w n e t a l . , 1 9 8 8 ) a n d h u m a n H a - r a s ( l s h i i e t a l . , 1 9 8 5 ) s h o w s o n l y ~ 5 9 % s e q u e n c e i d e n t i t y ( F i g u r e 3 ) . F u r t h e r m o r e , a c o m p a r i s o n o f t h i s r e g i o n ( t o - 5 5 0 b p f r o m t h e t r a n s c r i p t i o n s t a r t s i t e ) b e t w e e n S e n c a r m i c e ( N e a d e s e t a l . , 1 9 9 1 ) a n d h u m a n H a - r a s ( l s h i i e t a l . , 1 9 8 5 ) r e v e a l ~ 5 0 ° / o s e q u e n c e i d e n t i t y ( F i g u r e 4 ) . T h i s l a c k o f s e q u e n c e i d e n t i t y i n t h e p r o m o t e r r e g i o n s o f m o u s e a n d h u m a n H a - r a s s u g g e s t s t h a t t h e r e g u l a t i o n o f H a - r a s w o u l d n o t b e t h e s a m e i n t h e s e t w o s p e c i e s a s m a n y i m p o r t a n t c i s e l e m e n t s f o r t r a n s c r i p t i o n f a c t o r b i n d i n g a r e l o c a t e d i n t h e r e g i o n s t h a t w e c o m p a r e d ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 3 ; L e e a n d K e l l e r , 1 9 9 1 ) . F i c S t G S e s w n i r o r t E e a a E u N g S m o n a s q r E C p p s u N l . u e a c C , o e . R 1 R e p 9 c 2 C s N r , A r A n b i 1 A d 9 t 8 e e A R m m 9 d i r 8 o o . e s ) H u 4 o n ) v c o m m u . u d i s a o s n t s g a O - b p r T u u e e r e s a r h t a t t i i N e r e D h e H s a c s w - t o i e n m l d h n o u a s n n A e " r m e G p a t n ( a a s b o e t f o " a N ( t p o c r e h i 5 e p r N M ' t i e t s h s o d R p e t e I t r n g d a w n i r o d r o b a m e e m g w s e s a r s n o c s o d r t a t e m o a u ) p s t e a i r e . n d e . m s e a e 5 . l n n ' a i s i l s s n r t i q , D A i o t n N S N 1 t h e u t f e 9 A 9 s e M e d m n c e . R t 9 9 q i C e e T . I h y ) e G u % b 1 c o m a t n s e i f c o n h m h G d i t d u s e e i p l a e c e a h b s t a d N e a x r n a i M t 5 s ' e e D R y k t c t a e a n n e t n e m f I a A l s w N g t i e i n k q o r o t n b a i e u u G w e ( ( b h g o s c e e s h r c e a t c e o t e i n n H n t m e - e o H h g i p m p r i c a a o s o i - B n t r r f r r s s a a o H a d s f a f o w e s e a r C o s H f d ( - m r n q ) r p o o B u a - r a m u e r e r a t t s w t t o n i a h h a e w c s n e e r n e s l . 8 0 6 a m » C T G C A G G G T G G A G G C T C T G T A G T A G G T C C T C A A C G C A A C C C G A G C G T G C A 5 ’ l l l l l l l l l l I l l l l l l l l l l l l l l I l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l C T G C A G G G T G G A G G C T C T G T A G T A G G T C C T C A A C G C A A C C C G A G C G T G C A C C A G T T T C T C T C C G G A G A A A T C C C C C C G G G C T C G T A A G C A C G G T C T C G G S l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l C C A G T T T C T C T C C G G A G A A A T C C C G G G C T C G T A A G C A C G G T C T C G G T C T G T C T C T T C T G C A C C T A G G C A C T A G A C A T C A C T G T T G A C T G C A G G A C C C l l I l l l I l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l C T G T C T C T T C T G C A C C T A G G C A C T A G A C A T C A C T G T T G A G T G C A G G A C C C A A G T T C C G G C A C T G C C T T C C C C G C G G C T C C A G G A A G C C C C G C C C A G C T T C l l l I l l l l l l I I I l I I I l l l l l l l l l l I l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l A A G T T C C G G C A C T G C C T T C C C C G C G G C T C C A G G A A G C C C C G C C C A G C T T C G G C T T C T G A C G G A T G G G T T G C T C A G C C A A C C A C A A C A G G E C G C G G T G C G C I l l l l l l l l l I l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l G G C T T C T G A C G G A T G G G T T G C T C A G C C A A C C A C A A C A G G T C G C G G T G C G G A G G A G T T C T G A C C A A T C A C G G G C C G C C T C G A G T T G A C G G A C G G G C G T G G C I I l l l l l I l l l l l l l I l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l A G G A G T T C G A C C A A T C A C G G G C C G C C T C G A G T T G A C G G A C G G G C G T G G G G C G G A G C G G G G C G G C G A G C G C G G G C C C G G C l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l 0 0 c c c c A c c c c c s c c c c c A c c c c c c c c c c c c c 3 ' o A r r h s N u ' a 8 b c F I m t n l 1 w d m n h o 9 i o u a o i g u m s e u e c 8 r r M s G e t t ) s . l e i e e e R r I a d o . n m 3 I D p n . I a u t n I n a m A p d m N A d g o e d c o u e u b 5 ( u o s g y t m 9 p r 5 m e m o r ' p a p t e . a % a a s m e a e s . s n n h t h e h t i r I n H r t S n i s d a n s q x t e e m a i o t n h e r d h t r u a t n - l ) e e h a u n i o f a m G e n s t t c y t a h n n d C e ( t d i I i s n o G s h a i d i w t b p D h u a h N m a a e n t i e c a c t e . k n a s A a c e h H s B r , D g r e r e b q o a N t T 1 a h h 9 s u A ( w s e G e 8 e e n s e 5 a o i l n . - f a f o l . o e t I a s r c n i r e e s t R t i e a o e a M w t u n ( e N ) c b b p n e q t s h e m f s e c C r s m e e o e s o o c ' a p e t s p u 5 u r m a m u m q q t o w f n d n e s u e h a l t e r n c ) o a n e e c H e t b k r s w r a d e i a - . a d f s o G n n r 9 a r s e r H c r u r a e s O a o i u e p - d o c H v - B t g m p ( r , r i p a b o r a i r c 1 a o s e n o o 9 n t S r C e 9 w m i w d ) t a I e N t i u t h H e r r . t L a e n 4 s n p n - i T s s t s e M i i h o a R t n l 5 h I g e e ' n e 8 1 e m m » m ' C C A G T T T C T C T C C G G A G A A A T C c C C C C G G G C T C G T A A G C A C G G T C T C G G T 0 0 . . . . . . O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O G C T G T C T C T T C T G C A C C T A G G C A C T A G A C A T C A C T G T T G A G T G C A G G A C C C l l l l l l I l l l l l l I l I l l a c c ' r c c c c ' r c c c c ' r c ' r c c a c c m c c c c u c c c c c A G A c c c c c c c c c c c . A A G T T C C G G C A C T G C C T T C C C C G C G G C T C C A G G A A G C C C C G C C C A G C T T C l l l l l l l l l l I I I I I l l I I | I l l l l l l l l l l l l I . . . T a c r c c c ' r c c c c c ' r c c c c c c ' r ' r c c ' r c c c c c A A c c c c c e c c c c a c c s c G G C T T C T G A C G G A T G G G T T G C T C A G C C A A C C A C A A C A G G T C G C G G T G C G G l l l I l l l l l I I I I I l l l l l I I l l I l l I I I I I I I I c c c ' r c c ' r c a c z t c a c c c c c c c c ' r c a c c c m c c c c c c ' r c c s c c c c c c c c c c z t A G G A G T T C t G A C C A A T C A C G G G C C G C C T C G A G T T G A C G G A C G G G C G T G G G I I I I l l l l l I I I I I l l I l l l l l l l l l l l l l I I I T G G C G C G C A G . C C A A T G G T A G G C C G C G C C T G G C A G A C G G A C G G G C G C G G G G C G G A G C G G G G C G G C G A G C G C G G G C C C G G C o o o o o o o o o o o c o o o o o o o o " . ( _ 1 ) 3 . l l l l l l l l G C G G G G C G T G C G C A G G C C C G C C C G A G T C T C C G C C G C C C G T G C C C T G C G C C F I S c G H t c s w n r I o r o a e a E o a g - m m q s u S N u n p s r p u e , r p E C a c a a o e A r N ' n n s r b 4 c p e s . C R e 1 t ( d e R m u n 4 A e v A 9 d o d 9 e r N . r ) a H e o s c d . s d O a u o m t m e u - m s g p e t a o r r s r T e a b a t u h s t r h s e e w s c i e D t e i e i t o s N e n e m n o n a A G a . m h " u a p l l t n o , n a r b c e t ( o e a d p i h " f s e 1 5 t t r ' t h i o e 9 o h n u 1 i r o p d n d p 9 m e m o s u m ) g r a b t g c s a r r t s r a s a n a a e t s i e n p o n o w e e m D ) e ' l . n 5 d r d n a A e n e h m a i A N i s s . i d q n S u . t h u t n t e s d d h 5 e m e u n e q a m 0 c T h G b % h e n t u n a e h y u e C n . m o c d a G t i e H s f a e h m i - a p t s r l b i n e h e 5 ' k c N a s a a a s e r e x D c i n t a t d a f s A a e e l o h t n n ( u a q n e i t r i i t t n n a e t b ( b e h k o h o G i e e g c H s t e w e c m t . r l i E - t n e S h o e e a a g N h p , i r o a c a i o t r f s i C s 1 s f s g i r s n A l 9 o f H C 8 s s a R h a 5 e f n o i - d m r ) i q H r ) m p o u a m a o e u w e t - s w t u e n r t a h i l s n . s r e e e e a s r c e a l n ( e y t t 8 2 ( 5 3 6 ) C C T T T G C T C C A C C T C G A C C T A C G A G A A C A G G C A G C T A G G G G G T T C C G G C G l | I 5 ’ O O O O C O O O O O O O O O O O O O O O . C O . . . . . O O O O O O O O O O O O O G G A T C C Q G A A C T C T G T C T T C C T C T G T T A T T G C G T C C G C G G T G C T G A C T G T C C C C G A C A l I l l l I l l I l l l l l I l l l l c c m c c c c z t c c c c c ' m c c c c c c c c a c c ' r c c c c c c ' r c c c c c c c c c c c c c c C C A A T A C C C G G T C G G G A T G A C C T T T C C A C T C G T G G G C C T T T G G C G C T T T G I l I I I I I I I I I I I I I I I I r e c e s s c c c a c c c A c c c c c - r c ' r c c ' r c c z t c c c c c a c c c c ' r c a c ’ r c c c c r r c G T G A G G C T G C A G G G T G G A G G C T C T G T A G T A G G T C C T C A A C G C A A C C C G A G I l l l l l l l l I l l l l l l l l ' r c r c c c c c c c c - r c m c c c c h A G A c c c c c c c c c c c r c c r c c c a c x r c c c c C G T G C A C C A G T T T C T C T C C G G A G A A A T C C C C C C G G G C T C G T A A G C A C G G T l l l l l l I I I I I I I I l l c c c c c c c c c c c c m a u c c c c c r c c c r c c c c r r c c r c c a c m c c c c c a c C T C G G T C T G T C T C T T C T G C A C C T A G G C A C T A G A C A T C A C T G T T G A G T G C A l l l l l l l l l l l l l I l I I I I I c ' r c c c c ' r c c c c ' r c ' r c u c c . . . . . . . . . m e c c c m c c c c c a c m c c c c c c m c c m c r r c c c c c z x c ' r e c c r r c c c c c c c c c ' r c c a c c u c c c c c c c c c I I I I l l l l l I I l l l I I I I l l l I l l I I I l l l I l l l l l C G G C C C . . . T A C T G G C T C C G C C T C C C G C G T T G C T C C C G G A A G C C C C G C C C A G C T T C G G C T T C T G A C G G A T G G G T T G C T C A G C C A A C C A C A A C A G G T C G C G I l l l l l I l l l l I I I I I l l l I l l l I l I l I I I I I I c a c c c c o s c r c c r c a c m n c c c c c c c c r c a c c m c c c c c c m c c c c c c c C T G C G G A G G A G T T C T G A C C A A T C A C G G G C C G C C T C G A G T T G A C G G A C G G G I I I I I I l l l l l l l l l l I l l I I l l I I l l l l l I c c c c c x r c c c c c c c m . c c u r c c ' r a c c c c c c c c c ' r c c c a c a c c c A c c c c C G T G G G G C G G A G C G G G G C G G C G A G C G C G G G C C C G G C . . . . . . . . . . . . . . G 1 ) l l I l l I l I l l I l l I I I I I I C G C G G G G C G G G G C G T G C G C A G G C C C G C C C G A G T C T C C G C C G C C C G T G C C C 3 8 3 D N A M E T H Y L A T I O N : I M P L I C A T I O N S F O R R I S K A S S E S S M E N T T h e t e s t i n g o f o u r w o r k i n g h y p o t h e s i s , t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A i s a n e p i g e n e t i c , n o n g e n o t o x i c , t h r e s h o l d - e x h i b i t i n g m e c h a n i s m t h a t f a c i l i t a t e s t h e a b e r r a n t g e n e e x p r e s s i o n i n v o l v e d i n t u m o r i g e n e s i s , ( G o o d m a n a n d C o u n t s , 1 9 9 3 ; C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 b ; 1 9 9 5 a ; 1 9 9 5 c ) i s y i e l d i n g a g r e a t e r u n d e r s t a n d i n g o f m e c h a n i s m s o f t u m o r i g e n e s i s . I n a d d i t i o n , i t p r o v i d e s t h e t y p e o f m e c h a n i s t i c i n f o r m a t i o n t h a t i s r e q u i r e d t o t a k e a m o r e r a t i o n a l a p p r o a c h t o r i s k a s s e s s m e n t ( G o o d m a n , 1 9 9 4 ; M c C o n n e l l , 1 9 9 5 ) . A r e c e n t e v a l u a t i o n o f t h e u s e o f d a t a o b t a i n e d f r o m a n i m a l c a r c i n o g e n i c i t y s t u d i e s f o r h u m a n r i s k a s s e s s m e n t d e m o n s t r a t e d t h e d i f f i c u l t y e n c o u n t e r e d w h e n d e a l i n g w i t h n o n g e n o t o x i c c o m p o u n d s b e c a u s e t h e s e a p p e a r t o p r o d u c e c a n c e r i n a s p e c i e s - a n d / o r d o s e - s p e c i f i c m a n n e r ( C o h e n , 1 9 9 5 ) . T h i s r e i n f o r c e s o u r c o n t e n t i o n t h a t a g r e a t e r u n d e r s t a n d i n g o f m e c h a n i s m s / m o d e s o f a c t i o n o f n o n g e n o t o x i c a g e n t s w i l l p r o v i d e t h e t y p e o f i n f o r m a t i o n r e q u i r e d t o m a k e m o r e m e a n i n g f u l c o m p a r i s o n s b e t w e e n s p e c i e s . K n o w l e d g e a b o u t a p o t e n t i a l m e c h a n i s m u n d e r l y i n g t h e h e i g h t e n e d s e n s i t i v i t y o f t h e B B C S F I m o u s e t o l i v e r t u m o r i g e n e s i s , e . g . , a d e c r e a s e d c a p a c i t y f o r a n d / o r f i d e l i t y o f m a i n t e n a n c e m e t h y l a t i o n c o m p a r e d t o t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B U 6 , p r o v i d e s i n s i g h t a b o u t s p e c i e s - t o - s p e c i e s e x t r a p o l a t i o n . T h a t i s , b i o a s s a y d a t a f r o m a s t r a i n o f m o u s e u n i q u e l y d e f i c i e n t i n t h e a b i l i t y t o m a i n t a i n n o r m a l m e t h y l a t i o n s t a t u s ( e . g . , t h e 8 6 C 3 F 1 ) m a y n o t b e r e l e v a n t f o r h u m a n r i s k a s s e s s m e n t , w h i l e s t u d i e s o f m e t h y l a t i o n s t a t u s i n a n i m a l s b e t t e r c a p a b l e o f m a i n t a i n i n g n o r m a l m e t h y l a t i o n s t a t u s ( e . g . , t h e 8 4 C S 7 B U 6 ) m a y b e m o r e r e l e v a n t t o h u m a n s . I n s u p p o r t o f t h i s n o t i o n , w e a r e a b l e t o d e m o n s t r a t e g l o b a l l i v e r D N A h y p o m e t h y l a t i o n i n t h e B 6 0 3 F 1 m o u s e , b u t n o t t h e C S 7 B L / 6 , a f t e r 1 w e e k o f a d m i n i s t r a t i o n o f a c h o l i n e - d e v o i d , m e t h i o n i n e - d e f i c i e n t d i e t . A f t e r t w e l v e w e e k s o f f e e d i n g a c h o l i n e - d e v o i d , m e t h i o n i n e - d e f i c i e n t d i e t s u f f i c i e n t m e t h y l g r o u p s w e r e r e m o v e d t o d e m o n s t r a t e a s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t l e v e l o f g l o b a l h y p o m e t h y l a t i o n o f l i v e r D N A i n b o t h s t r a i n s ( C o u n t s e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h i s s u g g e s t s a n i m p o r t a n t q u a n t i t a t i v e , r a t h e r t h a n a q u a l i t a t i v e , d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e s e s t r a i n s o f m i c e . I n t h i s c o n t e x t , i t i s i l l u s t r a t i v e t o c o m p a r e r o d e n t s a n d h u m a n s w h e n o n e c o n s i d e r s t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n c a p a c i t y t o m a i n t a i n t h e n a s c e n t m e t h y l a t i o n s t a t u s o f D N A a n d s u s c e p t i b i l i t y t o t u m o r i g e n e s i s . I n c o n t r a s t t o r o d e n t c e l l s , n o r m a l h u m a n c e l l s i n c u l t u r e r a r e l y u n d e r g o s p o n t a n e o u s t r a n s f o r m a t i o n a n d h a v e g e n e r a l l y p r o v e n r e s i s t a n t t o t r a n s f o r m a t i o n b y c a r c i n o g e n s ( R h i m , 1 9 9 3 ) . T h i s c o r r e l a t e s w i t h t h e o b s e r v a t i o n t h a t t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f D N A i n p r i m a r y d i p l o i d c e l l s i n c u l t u r e i s m a i n t a i n e d m o r e f a i t h f u l l y i n h u m a n t h a n i n r o d e n t c e l l s ( H o l l i d a y , 1 9 8 9 ) . W e a r e s u g g e s t i n g t h a t h y p o m e t h y l a t i o n i s r e l e v a n t t o t u m o r i g e n e s i s i n b o t h r o d e n t s a n d h u m a n s , a n d t h a t h u m a n s m a y b e l e s s s u s c e p t i b l e t h a n r o d e n t s d u e , i n p a r t , t o a b e t t e r a b i l i t y t o m a i n t a i n n a s c e n t p a t t e r n s o f D N A m e t h y l a t i o n . I n t h i s r e g a r d , t h e l i v e r t u m o r r e s i s t a n t C S 7 B L / 6 m o u s e m a y b e m o r e s i m i l a r t o h u m a n s t h a n t h e s e n s i t i v e 8 6 0 3 F 1 m o u s e . W e v i e w h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A a s a s e c o n d a r y m e c h a n i s m ( S c h e u p l e i n , 1 9 9 5 ) t h a t m a y p r o v i d e i n s i g h t l e a d i n g t o a m o r e r a t i o n a l 8 5 i n t e r p r e t a t i o n o f a n i m a l s t u d i e s f o r h u m a n r i s k a s s e s s m e n t . O u r r e s e a r c h i s p r o v i d i n g p r a c t i c a l i n f o r m a t i o n c o n c e r n i n g d o s e - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p s , i n c l u d i n g t h e e x i s t e n c e o f p l a u s i b l e t h r e s h o l d s , t h a t c a n b e u s e d a s a m e c h a n i s t i c a n d t h e o r e t i c a l f r a m e w o r k w h e n c o n s i d e r i n g a s a f e t y f a c t o r , o r m u l t i p l e o f e x p o s u r e , a p p r o a c h t o r i s k a s s e s s m e n t . I n t h i s r e g a r d , w e e n v i s i o n a n e x p e r i m e n t a l a p p r o a c h t o w a r d s a n a l y s i s o f m e t h y l a t i o n s t a t u s a s a c o m p o n e n t o f t h e c a r c i n o g e n b i o a s s a y w h e r e t h e n o a d v e r s e e f f e c t l e v e l o f a n o n g e n o t o x i c c o m p o u n d m a y b e c o n s i d e r e d t h e h i g h e s t d o s e a t w h i c h t h e r e i s n o h y p o m e t h y l a t i o n i n t h e p o t e n t i a l t a r g e t o r g a n ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 b ; 1 9 9 5 5 ) A C K N O W L E D G E M E N T S O u r r e s e a r c h c o n c e r n i n g D N A m e t h y l a t i o n w a s i n i t i a t e d b y s u p p o r t f r o m t h e I n t e r n a t i o n a l L i f e S c i e n c e s I n s t i t u t e ( I L S I ) R i s k S c i e n c e I n s t i t u t e . T h i s i s c u r r e n t l y s u p p o r t e d b y I L S I , H e a l t h a n d E n v i r o n m e n t a l S c i e n c e s I n s t i t u t e , a n d N I H g r a n t E S - 0 5 2 9 9 . J L C i s t h e r e c i p i e n t o f a S o c i e t y o f T o x i c o l o g y p r e d o c t o r a l f e l l o w s h i p a w a r d . R E F E R E N C E S A m e s , B . N . a n d G o l d , L S . ( 1 9 9 0 ) C h e m i c a l c a r c i n o g e n e s i s : T o o m a n y r o d e n t c a r c i n o g e n s . E m a . N a t l . A g e d , S c i , U . S . A . , 8 7 , 7 7 7 2 - 7 7 7 6 . A s h b y , J . , T e n n a n t , R . W . , Z e i g e r , E . a n d S t a s i e w i c z , S . ( 1 9 8 9 ) C l a s s i f i c a t i o n a c c o r d i n g t o c h e m i c a l s t r u c t u r e , m u t a g e n i c i t y t o S a l m o n e l l a a n d l e v e l o f c a r c i n o g e n i c i t y o f a f u r t h e r 4 2 c h e m i c a l s t e s t e d f o r c a r c i n o g e n i c i t y b y t h e U S . N a t i o n a l T o x i c o l o g y P r o g r a m . M e t a t j i e e , 2 2 3 , 7 3 - 1 0 3 . 8 6 B a u e r - H o f m a n n , R . , B u c h m a n n , A . , M a h r , J . , K r e s s , S . a n d S c h w a r z , M . ( 1 9 9 2 ) T h e t u m o r p r o m o t e r s d i e l d r i n a n d p h e n o b a r b i t a l i n c r e a s e t h e f r e q u e n c y o f c - H a - r a s w i l d - t y p e b u t n o t c - H a - r a s m u t a t e d f o c a l l i v e r l e s i o n s i n m a l e C S H / H e m i c e . Q a m i n e g e n e e i e , 1 3 , 4 7 7 - 4 8 1 . B e c k e r , F . F . ( 1 9 8 2 ) M o r p h o l o g i c a l c l a s s i f i c a t i o n o f m o u s e l i v e r t u m o r s b a s e d o n b i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s . W . 4 2 , 3 9 1 8 - 3 9 2 3 . B o y e s , J . a n d B i r d , A . ( 1 9 9 1 ) D N A m e t h y l a t i o n i n h i b i t s t r a n s c r i p t i o n i n d i r e c t l y v i a a m e t h y l - C p G b i n d i n g p r o t e i n . C e l l , 6 4 , 1 1 2 3 - 1 1 3 4 . B r i s s e t t e , J . L . , M i s s e r o , C . , Y u s p a , S H . a n d D o t t o , P . ( 1 9 9 3 ) D i f f e r e n t l e v e l s o f v - H a - r a s p 2 1 e x p r e s s i o n i n p r i m a r y k e r a t i n o c y t e s t r a n s f o r m e d w i t h H a r v e y s a r c o m a v i r u s c o r r e l a t e w i t h b e n i g n v e r s u s m a l i g n a n t b e h a v i o r . M e l , 9 8 3 4 0 2 9 5 1 1 . . 7 . 2 1 - 2 5 . B r o w n , K . , B a i l l e u l , B . , R a m s d e n , M . , F e e , F . , K r u m l a u f , R . a n d B a l m a i n , A . ( 1 9 8 8 ) I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f t h e m o u s e 0 - H a r v e y - r a s g e n e . W , 1 , 1 6 1 - 1 7 0 . B u c h m a n n , A . , B a u e r - H o f m a n n , R . , M a h r , J . , D r i n k w a t e r , N . R . , L u z , A . a n d S c h w a r z , M . ( 1 9 9 1 ) M u t a t i o n a l a c t i v a t i o n o f t h e c - H a - r a s g e n e i n l i v e r t u m o r s o f d i f f e r e n t r o d e n t s t r a i n s : C o r r e l a t i o n w i t h s u s c e p t i b i l i t y t o h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s . M W . 8 8 . 9 1 1 - 9 1 5 - C h r i s t m a n , J . K . , C h e n , M . L . , S h e i k h n e j a d , G . , D i z i k , M . , A b i l e a h , S . a n d W a i n f a n , E . ( 1 9 9 3 ) M e t h y l d e f i c i e n c y , D N A m e t h y l a t i o n , a n d c a n c e r : S t u d i e s o n t h e r e v e r s i b i l i t y o f t h e e f f e c t s o f a l i p o t r o p e - d e f i c i e n t d i e t . W h e r e , 4 , 6 7 2 - 6 8 0 . C l a r k , S . J . , H a r r i s o n , J . a n d F r o m m e r , M . ( 1 9 9 5 ) C p r G m e t h y l a t i o n i n m a m m a l i a n c e l l s . N a t u r e G e n e t i g s , 1 0 , 2 0 - 2 7 . C o h e n , S M . ( 1 9 9 5 ) H u m a n r e l e v a n c e o f a n i m a l c a r c i n o g e n i c i t y s t u d i e s . R I . W . 2 1 , 7 5 - 8 0 . C o h e n , S M . a n d E l l w e i n , L B . ( 1 9 9 1 ) G e n e t i c e r r o r s , c e l l p r o l i f e r a t i o n , a n d c a r c i n o g e n e s i s . m m , 5 1 , 6 4 9 3 - 6 5 0 5 . C o s t e l l o , J . F . , F u t s c h e r , B . W . , T a n o , K . , G r a u n k e , D . M . a n d P i e p e r , R D . ( 1 9 9 4 ) G r a d e d m e t h y l a t i o n i n t h e p r o m o t e r a n d b o d y o f t h e O e - m e t h y l g u a n i n e D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e ( M G M T ) g e n e c o r r e l a t e s w i t h M G M T e x p r e s s i o n i n h u m a n g l i o m a c e l l s . J , B i e l , C h e m , 2 6 9 , 1 7 2 2 8 - 1 7 2 3 7 . C o u n t s , J . L . a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 3 ) C o m p a r a t i v e a n a l y s i s o f t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s i n B 6 0 3 F 1 , C B H / H e a n d C 5 7 B U 6 8 7 m o u s e l i v e r . Q a n g e L L e t t “ 7 5 , 1 2 9 - 1 3 6 . C o u n t s , J . L . a n d G o o d m a n , J . . I ( 1 9 9 4 a ) S i t e - s p e c i f i c m e t h y l a t i o n i n t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s I n t h e l i v e r o f t h e B 6 C S F 1 m o u s e . I h e l g x i e e l e g j e t , 1 4 , 1 4 6 . C o u n t s , J . L . a n d G o o d m a n , J . . I ( 1 9 9 4 b ) H y p o m e t h y l a t i o n o f D N A : A n e p i g e n e t i c m e c h a n i s m i n v o l v e d i n t u m o r p r o m o t i o n . W . 1 1 , 1 8 5 - 1 8 8 . C o u n t s , J . L . a n d G o o d m a n , J . . I ( 1 9 9 5 a ) H y p o m e t h y l a t i o n o f D N A : A n e p i g e n e t i c m e c h a n i s m t h a t c a n f a c i l i t a t e t h e a b e r r a n t o n c o g e n e e x p r e s s i o n i n v o l v e d i n l i v e r c a r c i n o g e n e s i s . I n J i r t l e , R . L . ( e d . ) L m e r fi e Q e n e r a t I e n _ a n g _ Q a L c m g g e n e s | § _ , M s i e g fl a L a n e fi e L e l a L M e c n a m e m s . A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k , p p . 2 2 7 - 2 5 5 . C o u n t s , J . L . a n d G o o d m a n , J . l . ( 1 9 9 5 b ) P r i n c i p l e s u n d e r l y i n g d o s e s e l e c t i o n f o r , a n d e x t r a p o l a t i o n f r o m , t h e c a r c i n o g e n b i o a s s a y : D o s e i n f l u e n c e s m e c h a n i s m . W i l l e m 2 1 4 1 8 - 4 2 1 C o u n t s , J . L . a n d G o o d m a n , J . . I ( 1 9 9 5 c ) H y p o m e t h y l a t i o n o f D N A . A p o s s i b l e e p i g e n e t i c m e c h a n i s m i n v o l v e d i n t u m o r p r o m o t i o n . I n M c C l a i n , R . M . , S l a g a , T - - J L e B o e u f R a n d P i t o t H ( e d S ) W I m o I i c a t i o n s J Q L B i s k A s s e s s m e m W i l e y - U S S N e w Y o r k p p 8 1 - 1 0 1 C o u n t s , J . L . , M c C l a i n , R . M . , H a r b i s o n , M . L . , S a n n i e n t o , J . I . a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 5 ) H y p o m e t h y l a t i o n o f D N A a n d t h e h e i g h t e n e d s e n s i t i v i t y o f t h e B G C 3 F 1 m o u s e t o l i v e r t u m o r i g e n e s i s . W , 1 5 , 5 6 . D a u r n , G . , E i s e n m a n n - T a p p e , I . F r i e s , H . - W . , T r o p p m a i r , J . a n d R a p p , U . . R ( 1 9 9 4 ) T h e I n s a n d o u t s o f R a f k I n a s e s W , 1 9 , 4 7 4 - 4 8 0 . D r a g a n , Y . . , P S a r g e n t , L . X u , Y . H . a n d P i t o t , H . C . ( 1 9 9 3 ) T h e i n i t i a t i o n - p r o m o t i o n - p r o g r e s s i o n m o d e l o f r a t h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s . W e t , M e d “ 2 0 2 , 1 6 - 2 4 . E n g l e r , P . , H a a s c h , D . , P i n k e r t , C . A . , D o g l i o , L . , G l y m o u r , M . , B r i n s t e r , R . a n d S t o r b , U . ( 1 9 9 1 ) A s t r a i n - s p e c i f i c m o d i f i e r o n m o u s e c h r o m o s o m e 4 c o n t r o l s t h e m e t h y l a t i o n o f i n d e p e n d e n t t r a n s g e n e l o c i . C e l l , 6 5 , 9 3 9 - 9 4 7 . E n o m o t o , T . , W e g h o r s t , C . M . , W a r d , J . M . , A n d e r s o n , L . M . , P e r a n t o n i , A D . a n d R i c e , J . M . ( 1 9 9 3 ) L o w f r e q u e n c y o f H - r a s a c t i v a t i o n i n n a t u r a l l y o c c u r r i n g h e p a t o c e l l u l a r t u m o r s o f C S H / H e N C r m i c e . Q a m i n e g e n e s j e , 1 4 , 1 9 3 9 - 1 9 4 4 . F o x , T . R . , S c h u m a n n , A . M . , W a t a n a b e , P . G . , Y a n o , B . L . , M a h e r , V . M . a n d M c C o r m i c k , J . J . ( 1 9 9 0 ) M u t a t i o n a l a n a l y s i s o f t h e H - r a s o n c o g e n e i n s p o n t a n e o u s 0 5 7 B U 6 x C 3 H / H e m o u s e l i v e r t u m o r s a n d t u m o r s i n d u c e d w i t h g e n o t o x i c a n d n o n g e n o t o x i c h e p a t o c a r c i n o g e n s . Q a n e e fi e a , 5 0 , 4 0 1 4 - 4 0 1 9 . 8 8 G a m a - S o s a , M A , S l a g e l , V . A . , T r e w y n , R . W . , O x e n h a n d l e r , R . , K u o , K . . , C G e h r k e , C . W . a n d E h r l i c h , M . ( 1 9 8 3 ) T h e 5 - - m e t h y l c y t o s i n e c o n t e n t o f D N A f r o m h u m a n t u m o r s W . 1 1 , 6 8 8 3 - 6 8 9 4 . G a r d i n e r - G a r d e n , M . a n d F r o m m e r , M . ( 1 9 8 7 ) C p G i s l a n d s i n v e r t e b r a t e g e n o m e s . L M e l fi i e L , 1 9 6 , 2 6 1 - 2 8 2 . G e n e t i c s C o m p u t e r G r o u p . ( 1 9 9 4 ) P r o g r a m M a n u a l f o r t h e G C G P a c k a g e , V e r s i o n 8 . 0 , M a d i s o n , W I . G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 4 ) A r a t i o n a l a p p r o a c h t o r i s k a s s e s s m e n t r e q u i r e s t h e u s e o f b i o l o g i c a l i n f o r m a t i o n : A n a n a l y s i s o f t h e N a t i o n a l T o x i c o l o g y P r o g r a m ( N T P ) , f i n a l r e p o r t o f t h e a d v i s o r y r e v i e w b y t h e N T P B o a r d o f S c i e n t i f i c C o u n s e l o r s . B a g u L l e i s c l fl a m l a m L 1 9 5 1 5 9 G o o d m a n , J . I . a n d C o u n t s , J . L . ( 1 9 9 3 ) H y p o m e t h y l a t i o n o f D N A : A p o s s i b l e n o n g e n o t o x i c m e c h a n i s m u n d e r l y i n g t h e r o l e o f c e l l p r o l i f e r a t i o n i n c a r c i n o g e n e s i s . W M , 1 0 1 ( S u p p l . 5 ) , 1 6 9 - 1 7 2 . G o o d m a n , J . I . , W a r d , J . M . , P o p p . J . A . , K l a u n i g , J E . a n d F o x , T R . ( 1 9 9 1 ) M o u s e l i v e r c a r c i n o g e n e s i s : M e c h a n i s m s a n d r e l e v a n c e . W , 1 7 , 6 5 1 - 6 6 5 . G r e g e r , V . , D e b u s , N . , L o h m a n n , D . , H o p p i n g , W . , P a s s a r g e , E . a n d H o r s t h e m k e , B . ( 1 9 9 4 ) F r e q u e n c y a n d p a t e r n a l o r i g i n o f h y p e r m e t h y l a t e d R B 1 a l l e l e s i n r e t i n o b l a s t o m a . fi e m a n fi e n e L , 9 4 , 4 9 1 - 4 9 6 . G r u e n b a u m , Y . , C e d a r , H . a n d R a z i n , A . ( 1 9 8 2 ) S u b s t r a t e a n d s e q u e n c e s p e c i f i c i t y o f a e u k a r y o t i c D N A m e t h y l a s e . W , 2 9 5 , 2 6 0 - 2 6 2 . G r u e n e r t , D C . a n d C o z e n s , A L . ( 1 9 9 1 ) I n h e r i t a n c e o f p h e n o t y p e i n m a m m a l i a n c e l l s : G e n e t i c v s . e p i g e n e t i c m e c h a n i s m s . A m e _ r , _ J , _ E l J y e i e L , 2 6 0 ( L u n g C e l l . M o l . P h y s i o l . 4 ) , L 3 8 6 - L 3 9 4 . H o l l i d a y , R . ( 1 9 8 7 ) T h e i n h e r i t a n c e o f e p i g e n e t i c d e f e c t s . S e i e m e , 2 3 8 , 1 6 3 - 1 7 0 . H o l l i d a y , R . ( 1 9 8 9 ) X - c h r o m o s o m e r e a c t i v a t i o n a n d a g e i n g . N a t a L e J L e n e e n ) , 3 3 7 , 3 1 1 . l s h i i , S . , M e r l i n o , G T . a n d P a s t a n , l . ( 1 9 8 5 ) P r o m o t e r r e g i o n o f t h e h u m a n H a r v e y r a s p r o t o - o n c o g e n e : S i m i l a r i t y t o t h e E G F r e c e p t o r p r o t o - o n c o g e n e p r o m o t e r . S c i e n c e , 2 3 0 , 1 3 7 8 - 1 3 8 1 . K e s h e t , l . , L i e m a n - H u r w i t z , J . a n d C e d a r , H . ( 1 9 8 6 ) D N A m e t h y l a t i o n a f f e c t s t h e 8 9 f o r m a t i o n o f a c t i v e c h r o m a t i n . C e l l , 4 4 , 5 3 5 - 5 4 3 . K i m , Y . - l . , G i u l i a n o , A . , H a t c h , K . D . , S c h n e i d e r , A . , N o u r , M . A . , D a l l a l , G . E . , S e l h u b , J . a n d M a s o n , J E . ( 1 9 9 4 ) G l o b a l D N A h y p o m e t h y l a t i o n i n c r e a s e s p r o g r e s s i v e l y i n c e r v i c a l d y s p l a s i a a n d c a r c i n o m a . C a n e e r , 7 4 , 8 9 3 - 8 9 9 . L a i r d , P . W . a n d J a e n i s c h , R . ( 1 9 9 4 ) D N A m e t h y l a t i o n a n d c a n c e r . fl y m a j L M e L G e n e t i c s . 3 . 1 4 8 7 - 1 4 9 5 . L a i r d , P . W . , J a c k s o n - G r u s b y , L . , F a z e l i , A . , D i c k i n s o n , S . L . , J u n g , W . E . , L i , E . , W e i n b e r g , R A . a n d J a e n i s c h , R . ( 1 9 9 5 ) S u p p r e s s i o n o f i n t e s t i n a l n e o p l a s i a b y D N A h y p o m e t h y l a t i o n . C e l l , 8 1 , 1 9 7 - 2 0 5 . L e e , G . H . , B e n n e t t , L . M . , C a r a b e o , R A . a n d D r i n k w a t e r , N R . ( 1 9 9 5 ) I d e n t i f i c a t i o n o f h e p a t o c a r c i n o g e n - r e s i s t a n c e g e n e s i n D B A / 2 m i c e . C e n fi j e s , 1 3 9 , 3 8 7 - 3 9 5 . L e e , W . a n d K e l l e r , E B . ( 1 9 9 1 ) R e g u l a t o r y e l e m e n t s m e d i a t i n g t r a n s c r i p t i o n o f t h e h u m a n H a - r a s g e n e . J , _ M e L _ B _ i e l , , 2 2 0 , 5 9 9 - 6 1 1 . L i , B , B e a r d , C . a n d J a e n i s c h , R . ( 1 9 9 3 ) R o l e f o r D N A m e t h y l a t i o n i n g e n o m i c i m p r i n t i n g . W e ) , 3 6 6 , 3 6 2 - 3 6 5 . M a c L e o d , A R . a n d S z y f , M . ( 1 9 9 5 ) E x p r e s s i o n o f a n t i s e n s e t o D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e m R N A i n d u c e s D N A d e m e t h y l a t i o n a n d i n h i b i t s t u m o r i g e n e s i s . J , _ B i e _ l , _ C h _ e m , , 2 7 0 , 8 0 3 7 - 8 0 4 3 . M a g e w u , A N . a n d J o n e s , R A . ( 1 9 9 4 ) U b i q u i t o u s a n d t e n a c i o u s m e t h y l a t i o n o f t h e C p G s i t e i n c o d o n 2 4 8 o f t h e p 5 3 g e n e m a y e x p l a i n i t s f r e q u e n t a p p e a r a n c e a s a m u t a t i o n a l h o t s p o t i n h u m a n c a n c e r . M e L C e I l , _ B _ i e L , 1 4 , 4 2 2 5 - 4 2 3 2 . M a k o s , M . , N e l k i n , B . D . , R e i t e r , R . E . , G n a r r a , J . R . , B r o o k s , J . , l s a a c s , W . , L i n e h a n , M . a n d B a y l i n , S B . ( 1 9 9 3 ) R e g i o n a l D N A h y p e r m e t h y l a t i o n a t D 1 7 8 5 p r e c e d e s 1 7 p s t r u c t u r a l c h a n g e s i n t h e p r o g r e s s i o n o f r e n a l t u m o r s . C a n e e r B e e , 5 3 , 2 7 1 9 - 2 7 2 2 . M c C l a i n , R M . ( 1 9 9 4 ) M e c h a n i s t i c c o n s i d e r a t i o n s i n t h e r e g u l a t i o n a n d c l a s s i f i c a t i o n o f c h e m i c a l c a r c i n o g e n s . I n K o t s o n i s , F . N . , M a c k e y , M . a n d H j e l l e , J . ( e d s . ) l \ l u 1 m j e n a l l o x j e o _ l e g y . R a v i n P r e s s , N e w Y o r k , p p . 2 7 3 - 3 0 4 . M c C o n n e l l , E . E . ( 1 9 9 5 ) H i s t o r i c a l r e v i e w o f t h e r o d e n t b i o a s s a y a n d f u t u r e d i r e c t i o n s . W m . 2 1 . 3 8 - 4 3 . N e a d e s , R . , B e t z , N . A . , S h e n g , X . a n d P e l l i n g , J . C . ( 1 9 9 1 ) T r a n s i e n t e x p r e s s i o n o f t h e c l o n e d m o u s e c - H a - r a s 5 ' u p s t r e a m r e g i o n i n t r a n s f e c t e d p r i m a r y S E N C A R m o u s e k e r a t i n o c y t e s d e m o n s t r a t e s i t s p o w e r a s a p r o m o t e r e l e m e n t . 9 o M Q I J Z Q L Q I D Q Q E D . . . 4 . 3 6 9 - 3 7 5 . N e w b e m e , P M . ( 1 9 9 3 ) T h e m e t h y l - d e f i c i e n c y m o d e l : H i s t o r y c h a r a c t e r i s t i c s a n d r e s e a r c h d i r e c t i o n s . J , _ N e l r _ B i _ e e b e m _ , , 4 , 6 1 8 - 6 2 4 . P a r s o n s , R . , L i , G . - M . , L o n g l e y , M . , M o d r i c h , P . , L i u , 8 . , B e r k , T . , H a m i l t o n , S . R . , K i n z l e r , K . W . a n d V o g e l s t e i n , B . ( 1 9 9 5 ) M i s m a t c h r e p a i r d e f i c i e n c y i n p h e n o t y p i c a l l y n o r m a l h u m a n c e l l s . S e l e e e e , 2 6 8 , 7 3 8 - 7 4 0 . P a s c a l e , R . M . , M a r r a s , V . , S i m i l e , M . M . , D a i n o , L . , P i n n a , G . , B e n n a t i , C . M . , S e d d a i u , M . A . , M a s s a r e l l i , G . a n d F e o , F . ( 1 9 9 2 ) C h e m o p r e v e n t i o n o f r a t l i v e r c a r c i n o g e n e s i s b y S - a d e n o s y l - L - m e t h i o n i n e : A l o n g - t e r m s t u d y . C a n e e L B e s u 5 2 , 4 9 7 9 - 4 9 8 6 . P u l c i a n i , S . , S a n t o s , E . , L o n g , L . K . , S o t t e n t i n o , V . a n d B a r b a i c i d , M . ( 1 9 8 5 ) r a s g e n e a m p l i f i c a t i o n a n d m a l i g n a n t t r a n s f o r m a t i o n . M e l , C e l l , B i e l , , 5 , 2 8 3 6 - 2 8 4 1 . R a y , J . S . , H a r b i s o n , M . L . , M c C l a i n , R M . a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 4 ) A l t e r a t i o n s i n t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s a n d e x p r e s s i o n o f t h e r e f o n c o g e n e i n p h e n o b a r b i t a l - i n d u c e d a n d s p o n t a n e o u s B G C 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s . W , 9 , 1 5 5 - 1 6 6 . R a z i n , A . a n d K a f r i , T . ( 1 9 9 4 ) D N A M e t h y l a t i o n f r o m e m b r y o t o a d u l t . E L e e , W M , 4 8 , 5 3 - 8 1 . R h i m , J . S . ( 1 9 9 3 ) N e o p l a s t i c t r a n s f o r m a t i o n o f h u m a n c e l l s i n v i t r o . M W ! 4 ! 3 1 3 - 3 1 5 - S c h e u p l e i n , R . J . ( 1 9 9 5 ) T h e u s e o f b i o l o g i c a l d a t a i n a d d i t i o n t o t h e c a r c i n o g e n b i o a s s a y i n q u a n t i t a t i v e r i s k a s s e s s m e n t . I n M c C l a i n , R . M . , S l a g a , T . J . , L e B o e u f , R . a n d P i t o t , l - I . ( e d s . ) n T u r P r o o t i n : m ' ' B j e l e A e s e s e m e e t . W i l e y - L i s s , N e w Y o , r k p p . 3 4 7 - 3 5 7 . S c h u l t e - H e r m a n n , R . , T i m m e r m a n n - T r o s i e n e r , l . , B a r t h e l , G . a n d B u r s c h , W . ( 1 9 9 0 ) D N A s y n t h e s i s , a p o p t o s i s , a n d p h e n o t y p i c e x p r e s s i o n a s d e t e r m i n a n t s o f g r o w t h o f a l t e r e d f o c i i n r a t l i v e r d u r i n g p h e n o b a r b i t a l p r o m o t i o n . £ 2 0 9 . 8 1 B e e “ 5 0 , 5 1 2 7 - 5 1 3 5 . S h e n , J . - C . , R i d e o u t , W M . a n d J o n e s , P A . ( 1 9 9 2 ) H i g h f r e q u e n c y m u t a g e n e s i s b y a D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e . C e l l , 7 1 , 1 0 7 3 - 1 0 8 0 . S t é g e r , R . , K u b i c k a , P . , L i u , C . - G . , K a f r i , T . , R a z i n , A . , C e d a r , H . a n d B a r l o w , D P . ( 1 9 9 3 ) M a t e r n a l - s p e c i f i c m e t h y l a t i o n o f t h e i m p r i n t e d m o u s e l g f 2 r l o c u s i d e n t i f i e s t h e e x p r e s s e d l o c u s a s c a r r y i n g t h e i m p r i n t e d s i g n a l . C e fi , 7 3 , 6 1 - 7 1 . S t o w e r s , S . J . , W i s e m a n , R . W . , W a r d , J . M . , M i l l e r , E . C . , M i l l e r , J . A . , A n d e r s o n , 9 1 M W . a n d E v a , A . ( 1 9 8 8 ) D e t e c t i o n o f a c t i v a t e d p r o t o - o n c o g e n e s i n N - n i t r o s o d i e t h y l a m i n e - i n d u c e d l i v e r t u m o r s : A c o m p a r i s o n b e t w e e n B 6 0 3 F 1 m i c e a n d F i s c h e r 3 4 4 r a t s . C a r e i e e g e e e s i e , 9 , 2 7 1 - 2 7 6 . S w e n b e r g , J . A . ( 1 9 9 5 ) B i o a s s a y d e s i g n a n d M T D s e t t i n g : O l d m e t h o d s a n d n e w a p p r o a c h e s . I i P h l . , 2 1 , 4 4 - 5 1 . V o g e l s t e i n , B . , F e a r o n , E . R . , H a m i l t o n , S . R . , K e r n , S . E . , P r e i s i n g e r , A . C . , L e p p e r t , M . , N a k a m u r a , Y . , W h i t e , R . , S m i t s , A . M . M . a n d B o s , J . L . ( 1 9 8 8 ) G e n e t i c a l t e r a t i o n s d u r i n g c o l o r e c t a I - t u m o r d e v e l o p m e n t . M , 3 1 9 , 5 2 5 - 5 3 2 . V o r c e , R . L . a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 8 9 ) A l t e r e d m e t h y l a t i o n o f r a s o n c o g e n e s i n b e n z i d i n e - i n d u c e d B 6 0 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s . I e x j e e L _ A e e l , _ P h a r m a e e L , 1 0 0 , 3 9 8 - 4 1 0 . V o r c e , R . L . a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 1 ) H y p o m e t h y l a t i o n o f r a s o n c o g e n e s i n c h e m i c a l l y i n d u c e d a n d s p o n t a n e o u s B B C 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s . M l , E n v i m fl e a l t b . 3 4 . 3 6 7 - 3 8 4 . W e i s b u r g e r , J . H . a n d W i l l i a m s , G M . ( 1 9 8 1 ) C a r c i n o g e n t e s t i n g : C u r r e n t p r o b l e m s a n d n e w a p p r o a c h e s . S e i e n e e , 2 1 4 , 4 0 1 - 4 0 7 . C h a p t e r 3 P R E F A C E C h a p t e r 3 p r e s e n t s i n f o r m a t i o n e x p a n d i n g u p o n m y i n i t i a l o b s e r v a t i o n s d e s c r i b e d i n C h a p t e r 1 b y f u r t h e r e x p l o r i n g 5 M e C i n p o r t i o n s o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s i n m o u s e l i v e r . I n a d d i t i o n , t h e s e s t u d i e s d e s c r i b e t h e h y p e r m e t h y l a t i o n t h a t o c c u r s i n t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s w i t h a g e i n g . T h e S o u t h e r n a n a l y s i s w i t h d e o x y o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e - a p p r o a c h u t i l i z e d i n C h p a t e r 1 w a s l i m i t e d b y t h e h i g h G C c o n t e n t o f t h e r e g i o n s w h i c h m a d e h y b r i d i z a t i o n v e r y c h a l l e n g i n g . T h a t d i f f i c u l t y l e d t o t h e P C R - b a s e d a p p r o a c h d e s c r i b e d h e r e . I f e l t i t w a s i m p o r t a n t , n o t o n l y t o c o n f i r m t h e p r e s e n c e o f 5 M e C i n t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s , b u t a l s o t o a t t e m p t t o r e a c h s o m e c o n c l u s i o n s c o n c e r n i n g t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f s p e c i f i c s i t e s i n t h e r e g i o n . I n a d d i t i o n t o c o n f i r m i n g t h e p r e s e n c e o f 5 M e C i n t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s , I a l s o d e m o n s t r a t e d t h a t i t w a s p r e s e n t h e t e r o g e n e o u s l y . T h a t i s , d i f f e r e n t c e l l s p o t e n t i a l l y h a d a u n i q u e m e t h y l a t i o n s t a t u s . T u m o r p r o m o t e r t r e a t m e n t - r e l a t e d d i f f e r e n c e s w e r e n o t d i s c e r n e d , h o w e v e r t h i s a p p r o a c h i s s o m e w h a t l i m i t e d w h e n m o r e t h a n o n e r e g o c n i t i o n s i t e i s p r e s e n t i n t h e s e g m e n t t o b e a m p l i f i e d a s o n e u n m e t h y l a t e d s i t e w o u l d p r e v e n t p r o d u c t f o r m a t i o n . I n t r i g u i n g d i f f e r e n c e s i n t h e m e t h y l a t i o n c o n t e n t o f t h e t w o s e g m e n t s a m p l i f i e d w e r e d i s c e r n e d . T h e n o n - C p G i s l a n d r e g i o n h a d a h i g h e r c o n t e n t o f 5 M e C a n d e x h i b i t e d m o r e i n c r e a s e s w i t h a g e i n g t h a n t h e C p G i s l a n d r e g i o n . T h i s m a n u s c r i p t h a s b e e n s u b m i t t e d f o r p u b l i c a t i o n . 9 2 C h a p t e r 3 5 - M E T H Y L C Y T O S I N E I S P R E S E N T I N T H E 5 ’ F L A N K I N G R E G I O N O F H a - r a s I N M O U S E L I V E R A N D I N C R E A S E S W I T H A G E I N G J e n n i f e r L . C o u n t s ‘ , J a n i c e M . K a z n o w s k i ‘ , R . M i c h a e l M c C l a i n z , a n d J a y I . G o o d m a n ‘ ‘ D e p a r t m e n t o f P h a r m a c o l o g y a n d T o x i c o l o g y , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y , E a s t L a n s i n g , M I ; 2 P r e c l i n i c a l D e v e l o p m e n t , H o f f m a n n L a R o c h e , l n c . , N u t l e y , N J A B S T R A C T M o d i f i c a t i o n s t o D N A - 5 M e C c o n t e n t ( i . e . , a l t e r a t i o n s i n t h e l e v e l o f 5 M e C ) c o n s t i t u t e e p i g e n e t i c e v e n t s , a n d a r e n o t m u t a g e n i c , a s b o t h 5 M e C a n d c y t o s i n e b a s e p a i r w i t h g u a n i n e . I n g e n e r a l , h y p o m e t h y l a t i o n o f a g e n e i s n e c e s s a r y , b u t n o t s u f f i c i e n t f o r e x p r e s s i o n , w h i l e m e t h y l a t e d g e n e s t y p i c a l l y a r e q u i e s c e n t . H a - r a s i s a n o n c o g e n e t h a t i s c o m m o n l y i m p l i c a t e d i n m o u s e l i v e r t u m o r i g e n e s i s , o f t e n , t h o u g h n o t a l w a y s , i n v o l v i n g m u t a t i o n . I n l i g h t o f t h e l i v e r t u m o r p o p u l a t i o n t h a t d o e s n o t i n v o l v e m u t a t i o n o f H a - r a s , w e s e t o u t t o d e t e r m i n e t h e 5 M e C c o n t e n t o f t h e 5 ’ f l a n k i n g r e g i o n o f t h i s g e n e . A P C R - b a s e d a p p r o a c h u t i l i z i n g p r e - P C R d i g e s t i o n w i t h m e t h y l a t i o n s e n s i t i v e e n z y m e s w a s e m p l o y e d t o d e t e r m i n e t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f p o r t i o n s o f H a - r a s i n n o r m a l B 6 0 3 F 1 a n d C S 7 B L / 6 m o u s e l i v e r . A d d i t i o n a l l y w e e x a m i n e d t h e p o t e n t i a l o f k n o w n r o d e n t l i v e r t u m o r p r o m o t i n g s t i m u l i t o a f f e c t t h e D N A 9 3 9 4 m e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e s e r e g i o n s . W e h a v e d e m o n s t r a t e d t h e p r e s e n c e o f 5 M e C I n a p o r t i o n o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s t h a t d o e s n o t s h a r e c h a r a c t e r i s t i c s o f a C p G i s l a n d ( a s e g m e n t o f D N A , a p p r o x i m a t e l y 5 0 0 t o 2 0 0 0 b p , c o n t a i n i n g a h i g h G C c o n t e n t a n d a g r e a t e r t h a n e x p e c t e d n u m b e r o f C p G s i t e s ) , w h i l e t h e r e g i o n t h a t d o e s s h a r e C p G i s l a n d c h a r a c t e r i s t i c s i s p r i m a r i l y u n m e t h y l a t e d . T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t m e t h y l a t i o n m a y p l a y a r o l e i n r e g u l a t i n g e x p r e s s i o n o f H a - r a s i n m o u s e l i v e r . H a - r a s i n h u m a n l i v e r h a s b e e n r e p o r t e d t o b e u n m e t h y l a t e d . A d d i t i o n a l l y , t h e r e i s a s u b s t a n t i a l s e q u e n c e d i f f e r e n c e i n a k e y r e g i o n o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s i n t h e m o u s e a s c o m p a r e d t o t h e h u m a n . T h e s e d i f f e r e n c e s i n D N A m e t h y l a t i o n a n d s e q u e n c e m a y , i n p a r t , p r o v i d e a b a s i s f o r t h e f r e q u e n t i n v o l v e m e n t o f H a - r a s i n m o u s e l i v e r t u m o r s a n d i t s v i r t u a l l a c k o f i n v o l v e m e n t i n h u m a n t u m o r s . I N T R O D U C T I O N T h e r e i s c o n s i d e r a b l e i n t e r e s t i n t h e r o l e o f a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n ( D N A 5 - m e t h y l c y t o s i n e ( 5 M e C ) c o n t e n t ) i n t u m o r i g e n e s i s a n d i n t h e r e g u l a t i o n o f g e n e e x p r e s s i o n , i n c l u d i n g i m p r i n t i n g a n d d e v e l o p m e n t ( R a z i n a n d C e d a r , 1 9 9 1 ) . A n i n v e r s e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e l e v e l o f m e t h y l a t i o n a n d g e n e e x p r e s s i o n e x i s t s g e n e r a l l y ; t h a t i s , a h y p o m e t h y l a t e d g e n e p o s s e s s e s a n i n c r e a s e d p o t e n t i a l f o r e x p r e s s i o n a s c o m p a r e d t o a h y p e r m e t h y l a t e d g e n e . I m p r i n t i n g c a n b e d e s c r i b e d a s m o n o a l l e l i c e x p r e s s i o n o f a g e n e , i . e . , e i t h e r t h e p a t e r n a l o r m a t e r n a l a l l e l e i s e x p r e s s e d ( R a z i n a n d K a f r i , 1 9 9 4 ) . T h e m a n n o s e - 6 - p h o s p h a t e / i n s u l i n - I i k e g r o w t h f a c t o r I I r e c e p t o r i s a n i m p r i n t e d g e n e w h e r e 9 5 ' m e t h y l a t i o n p l a y s d u a l r o l e s i n r e g u l a t i n g e x p r e s s i o n . A m e t h y l g r o u p a t a C p G s i t e i n a n i n t r o n o f t h e e x p r e s s e d a l l e l e m u s t b e p r e s e n t a s t h e i m p r i n t i n g s i g n a l a n d t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n m u s t b e u n m e t h y l a t e d f o r e x p r e s s i o n t o o c c u r ( S t o g e r e t a l . , 1 9 9 3 ) . T h e b i o l o g i c a l i m p o r t a n c e o f D N A m e t h y l a t i o n w a s d e t e r m i n e d b y a n e l e g a n t s t u d y e m p l o y i n g D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e ( D N A M T a s e ) k n o c k o u t s w h i c h d e m o n s t r a t e d t h a t e m b r y o s h o m o z y g o u s f o r a D N A M T a s e m u t a t i o n d i e d u r i n g g e s t a t i o n w i t h t h e i r g e n o m i c D N A h y p o m e t h y l a t e d ( L i e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h i s s t u d y e s t a b l i s h e d t h a t e x p r e s s i o n o f t h e g e n e r e s p o n s i b l e f o r t h e m a i n t e n a n c e m e t h y l a t i o n r e a c t i o n i s e s s e n t i a l f o r d e v e l o p m e n t . T y p i c a l l y , w i d e l y e x p r e s s e d g e n e s a n d h o u s e k e e p i n g g e n e s a r e u n m e t h y l a t e d a n d c o n t a i n C p G i s l a n d s , w h i c h a r e s e g m e n t s o f D N A , a p p r o x i m a t e l y 5 0 0 t o 2 0 0 0 b p w i t h a g r e a t e r t h a n 5 0 % G C c o n t e n t a n d a h i g h r a t i o o f o b s e r v e d t o e x p e c t e d C p G s i t e s ( B i r d , 1 9 8 6 ; G a r d i n e r - G a r d e n a n d F r o m m e r , 1 9 8 7 ) . I n g e n e r a l , C p G s i t e s a r e u n d e r r e p r e s e n t e d i n t h e g e n o m e ( B i r d , 1 9 8 6 ) . I n a c t i v e g e n e s a r e c o m m o n l y m e t h y l a t e d . I t i s b e l i e v e d t h e m e t h y l g r o u p a c t s a s a s i g n a l t o p r e v e n t t r a n s c r i p t i o n o f t h e g e n e b y i n h i b i t i n g t h e b i n d i n g o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s e i t h e r d i r e c t l y , b y a f f e c t i n g a d e c r e a s e d a f f i n i t y f o r t h e i r c o g n a t e c i s e l e m e n t s , o r i n d i r e c t l y , b y f a c i l i t a t i n g t h e b i n d i n g o f m e t h y l a t e d D N A b i n d i n g p r o t e i n s t h a t b l o c k t h e a c c e s s i b i l i t y o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s t o D N A ( M e e h a n e t a l . , 1 9 9 2 ) . I n t h i s m a n n e r , h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A m a y l e a d t o a b e r r a n t g e n e e x p r e s s i o n , a h y p o t h e s i s t h a t w e p u r s u e ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 ; 1 9 9 5 a ) . A l t e r n a t i v e l y , t h e m e t h y l g r o u p s m a y b e a d d e d 9 6 a f t e r s i l e n c i n g o f t h e g e n e a n d m a y b e i m p o r t a n t i n m a i n t a i n i n g t h e i n a c t i v e s t a t e ( B u s c h h a u s e n e t a l . , 1 9 8 7 ) . T h e r e s u l t s o f i n v e s t i g a t i o n s r e g a r d i n g s t a b i l i t y o f m e t h y l a t i o n s t a t u s d u r i n g a g e i n g h a v e , i n g e n e r a l , d e m o n s t r a t e d a d e c l i n e i n t h e g e n o m i c D N A 5 M e C c o n t e n t ( r e f e r e n c e d i n C o o n e y , 1 9 9 3 ) . A d d i t i o n a l l y , m a i n t e n a n c e o f m e t h y l a t i o n s t a t u s m a y d e p e n d u p o n l i f e s p a n a s l o n g e r l i v e d s p e c i e s a r e b e t t e r c a p a b l e o f m a i n t a i n i n g n a s c e n t m e t h y l a t i o n s t a t u s ( W i l s o n e t a l . , 1 9 8 7 ) . T h e r e a r e e x a m p l e s o f s p e c i f i c a r e a s o f h y p e r m e t h y l a t i o n i n t h e m y c g e n e a s s o c i a t e d w i t h a g e i n g i n m o u s e l i v e r ( O n o e t a l . , 1 9 8 6 ; O n o e t a l . , 1 9 8 9 ) . T h e r e a r e s i m i l a r i t i e s i n t h e f l a n k i n g r e g i o n s o f m o u s e , r a t , a n d h u m a n H a - r a s , n a m e l y t h e p r o m o t e r r e g i o n s a r e G C r i c h , c o n t a i n C p G i s l a n d s , a n d l a c k T A T A b o x e s ( B r o w n e t a l . , 1 9 8 8 ) . H o w e v e r , a c o m p a r i s o n o f t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s b e t w e e n t h e 5 ’ f l a n k i n g r e g i o n s o f h u m a n a n d m o u s e H a - r a s r e v e a l s d i f f e r e n c e s . H u m a n H a - r a s i s r e p o r t e d t o b e u n m e t h y l a t e d ( B a r b i e r i e t a l . , 1 9 8 7 ; B a r b i e r i e t a l . , 1 9 8 9 ; G h a z i e t a l . , 1 9 9 2 ; B o r r e l l o e t a l . , 1 9 9 2 ) , w h i l e n u m e r o u s C p G s i t e s i n m o u s e H a - r a s a r e m e t h y l a t e d ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 9 1 ; t h i s r e p o r t ) . T h e i n t r o n s e p a r a t i n g e x o n - 1 a n d e x o n 1 e x h i b i t s a h i g h d e g r e e o f s e q u e n c e s i m i l a r i t y b e t w e e n m o u s e a n d h u m a n ( B r o w n e t a l . , 1 9 8 8 ) . H o w e v e r , t h e r e g i o n l o c a t e d a t t h e t r a n s c r i p t i o n s t a r t s i t e t o a p p r o x i m a t e l y 3 0 0 b p 5 ' o f t h i s s i t e d o e s n o t s h a r e s u c h h o m o l o g y ( C h a p t e r 2 ; C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 b ) . T h e l a t t e r p o r t i o n p l a y s a k e y r o l e i n t h e r e g u l a t i o n o f t r a n s c r i p t i o n ( l s h i i e t a l . , 1 9 8 6 ; L e e a n d K e l l e r , 1 9 9 1 ; N e a d e s e t a l . , 1 9 9 1 ) . 9 7 T h e r e i s c o n s i d e r a b l e i n t e r e s t i n t h e r o l e p l a y e d b y H a - r a s i n m o u s e l i v e r t u m o r s b e c a u s e i t i s c o m m o n l y m u t a t e d i n s p o n t a n e o u s a n d g e n o t o x i c - c h e m i c a l - i n d u c e d t u m o r s i n h i g h l y s u s c e p t i b l e s t r a i n s ( B 6 C 3 F 1 a n d C S H / H e m i c e ) w h i l e n o t m u t a t e d i n t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B U 6 s t r a i n ( B u c h m a n n e t a l . , 1 9 9 1 ) . M o r e o v e r , t h e r e i s c o n s i d e r a b l e v a r i a b i l i t y i n t h e h i g h l y s u s c e p t i b l e s t r a i n s . F o r e x a m p l e , t h e f r e q u e n c y o f m u t a t i o n a t c o d o n 6 1 o f H a - r a s i n s p o n t a n e o u s C S H / H e t u m o r s h a s b e e n r e p o r t e d t o b e a s l o w a s 1 7 % t o a s h i g h a s 8 5 % i n d i f f e r e n t s t u d i e s ( r e f e r e n c e d i n E n o m o t o e t a l . , 1 9 9 3 ; M a r o n p o t e t a l . , 1 9 9 5 ) . W h i l e m u t a t i o n i s a r e l a t i v e l y c o m m o n e v e n t i n m o u s e l i v e r t u m o r s i n t h e B 6 C 3 F 1 m o u s e ( B u c h m a n n e t a l . , 1 9 9 1 ; M a r o n p o t e t a l . , 1 9 9 5 ) , w e n e e d t o b e a r i n m i n d t h a t a p p r o x i m a t e l y 5 0 % o f t h e l i v e r t u m o r s d o n o t h a v e a m u t a t e d H a - r a s ( M a r o n p o t e t a l . , 1 9 9 5 ) . I t i s p o s s i b l e t h a t t h e s e t u m o r s d e v e l o p t h r o u g h a m e c h a n i s m n o t i n v o l v i n g m u t a t e d H a - r a s . M a n y m o u s e l i v e r t u m o r s i n d u c e d b y n o n g e n o t o x i c c a r c i n o g e n s , i n c l u d i n g p h e n o b a r b i t a l ( P B ) , h a v e a d e c r e a s e d i n c i d e n c e o f m u t a t i o n a t H a - r a s c o m p a r e d t o s p o n t a n e o u s t u m o r s ( F o x e t a l . , 1 9 9 0 ) . P B a d m i n i s t r a t i o n l e a d s t o h y p o m e t h y l a t i o n ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 9 1 ) a n d i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f H a - r a s i n B G C 3 F 1 m o u s e l i v e r ( R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) . A d d i t i o n a l l y , o v e r - e x p r e s s i o n o f a n o r m a l r a s g e n e p r o d u c t m a y a l s o u n d e r l i e t u m o r d e v e l o p m e n t ( P u l c i a n i e t a l . , 1 9 8 5 ; S h a s t r y , 1 9 9 5 ) . F o r e x a m p l e , t h e m e t a s t a t i c a b i l i t y o f h u m a n b r e a s t c a n c e r s w a s d e m o n s t r a t e d t o b e d e p e n d e n t u p o n o v e r e x p r e s s i o n o f t h e n o r m a l , n o t t h e m u t a t e d , p 2 1 p r o t e i n ( S h e k h a r a n d M i l l e r , 1 9 9 4 - 9 5 ) . 9 8 I n l i g h t o f t h e f a c t t h a t H a - r a s m a y b e i n v o l v e d i n m o u s e l i v e r t u m o r i g e n e s i s t h r o u g h a m e c h a n i s m n o t i n v o l v i n g m u t a t i o n , a n d t h e k e y r o l e t h a t m e t h y l a t i o n m a y p l a y i n r e g u l a t i n g g e n e e x p r e s s i o n , w e s e t o u t t o a s s e s s t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s , a p o r t i o n o f t h e g e n e n o t e x a m i n e d i n o u r e a r l i e r s t u d y ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 9 1 ) . O u r i n i t i a l i n v e s t i g a t i o n i n v o l v e d S o u t h e r n a n a l y s i s u t i l i z i n g o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s c o m p l e m e n t a r y t o p o r t i o n s o f t h e 5 ’ f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 3 ) . T h i s a p p r o a c h p r o v i d e d a n i n d i c a t i o n t h a t 5 M e C w a s p r e s e n t i n t h e 5 ’ f l a n k i n g r e g i o n o f t h i s w i d e l y e x p r e s s e d g e n e a n d l e d t o t h e m o r e c o m p r e h e n s i v e i n v e s t i g a t i o n r e p o r t e d h e r e . O u r c u r r e n t a n a l y s i s i n v o l v e d P C R a m p l i f i c a t i o n o f t w o p o r t i o n s o f t h e 5 ’ f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s . T h e s e g m e n t s a m p l i f i e d c o n t a i n s i t e s w h e r e d i f f e r e n c e s i n m e t h y l a t i o n s t a t u s w e r e l i k e l y t o e x i s t ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 3 ) . O n e o f t h e r e g i o n s , a m p l i f i e d b y p r i m e r s e t 5 / 8 , d o e s n o t c o n t a i n a C p G i s l a n d , w h i l e t h e o t h e r , a m p l i f i e d b y p r i m e r s e t 6 / 7 , d o e s c o n t a i n a C p G i s l a n d ( F i g u r e 1 ) . A t h o r o u g h e x a m i n a t i o n o f 5 M e C i n t h i s r e g i o n w a s p e r f o r m e d a n d c o m p a r i s o n s w e r e m a d e b e t w e e n r e l a t i v e l y l i v e r t u m o r s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 a n d r e l a t i v e l y l i v e r t u m o r r e s i s t a n t C S 7 B L / 6 y o u n g m a l e m i c e . T h r e e e x p e r i m e n t a l a p p r o a c h e s w e r e e x a m i n e d f o r t h e i r a b i l i t y t o a l t e r t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s . A d d i t i o n a l l y , t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e s e r e g i o n s w a s e x a m i n e d i n 2 4 m o n t h o l d B G C 3 F 1 m o u s e l i v e r . ) n I X I A - J b J G C 1 9 9 A ' 1 0 p ' 5 4 ” ' 5 v r v v V v fi ‘ v r f v ‘ r v r 7 fl I r v v v - ' o + 1 . 5 0 0 z o o o 2 . 5 0 0 I l ’ h 0 § , 1 . § 5 ' - b a s e p a i r s - 3 ' F i g u r e 1 - D i s t r i b u t i o n o f t h e r a t i o o f o b s e r v e d t o e x p e c t e d C p G s i t e s i n t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s . T h e C p G i s l a n d - l i k e r e g i o n i n m o u s e l i v e r a s d e t e r m i n e d u s i n g “ W i n d o w ” o f t h e G C G p r o g r a m ( G e n e t i c s C o m p u t e r G r o u p , 1 9 9 4 ) b a s e d o n s e q u e n c e i n f o r m a t i o n o f 2 7 0 0 b p f r o m m o u s e H a - r a s ( B r o w n e t a l . , 1 9 8 8 ; N e a d e s e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h e r e g i o n s a m p l i f i e d b y P C R p r i m e r s e t s 5 / 8 a n d 6 / 7 a r e i d e n t i f i e d , a l o n g w i t h t h e p o s i t i o n s o f e x o n s 1 a n d 2 . T h e a r r o w i n d i c a t e s t h e l o c a t i o n o f t h e m o s t 5 ’ t r a n s c r i p t i o n s t a r t s i t e ( B r o w n e t a l . , 1 9 8 8 ) . T h i s f i g u r e i s m o d i f i e d f r o m C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 b ; r e p r i n t e d w i t h p e r m i s s i o n . 1 0 0 M A T E R I A L S 8 : M E T H O D S A n i m a l s T w e l v e w e e k o l d m a l e B 6 0 3 F 1 a n d 0 5 7 B U 6 w e r e o b t a i n e d f r o m C h a r l e s R i v e r ( P o r t a g e , M I ) a n d h o u s e d i n d i v i d u a l l y i n a t e m p e r a t u r e a n d h u m i d i t y c o n t r o l l e d r o o m o n a 1 2 h o u r l i g h t / d a r k s c h e d u l e w i t h f o o d a n d w a t e r a d I i b i t u m . A n i m a l s w e r e t r e a t e d i n a c c o r d a n c e w i t h a p p l i c a b l e g u i d e l i n e s . T h e m i c e w e r e a c c l i m a t e d t o t h e i r s u r r o u n d i n g s f o r 1 w e e k p r i o r t o b e i n g r a n d o m l y a s s i g n e d t o o n e o f f o u r g r o u p s . A l l d i e t s w e r e p u r c h a s e d f r o m T e k l a d ( M a d i s o n , W I ) . T h e f i r s t t r e a t m e n t c o n s i s t e d o f a c h o l i n e - d e v o i d , m e t h i o n i n e - d e f i c i e n t ( C M D ) d i e t ( T D # 9 2 1 0 7 , w i t h m i n e r a l m i x , A l N - 7 6 a n d v i t a m i n m i x , T D # 8 3 1 7 1 ) ( M i k o l e t a l . , 1 9 8 3 ) . T h e C M D d i e t c o n t a i n s t h e m e t h i o n i n e p r e c u r s o r , 0 . 9 % D L - h o m o c y s t i n e ( M i k o l e t a l . , 1 9 8 3 ) . T h e s e c o n d t r e a t m e n t w a s a l i v e r t u m o r p r o m o t i n g d o s e o f P B i n t h e d r i n k i n g w a t e r , 0 . 0 5 % ( w / w ) ( D i w a n e t a l . , 1 9 8 5 ) w i t h c o n t r o l d i e t ( a m i n o a c i d d e f i n e d , T D # 9 2 1 0 6 , w i t h m i n e r a l m i x , A l N - 7 6 a n d v i t a m i n m i x , T D # 4 0 0 6 0 ) . T h e t h i r d t r e a t m e n t w a s c o - a d m i n i s t r a t i o n o f t h e C M D d i e t a n d P B . T h e f o u r t h g r o u p o f a n i m a l s r e c e i v e d c o n t r o l d i e t . B o t h l o n g - t e r m P B ( B e c k e r , 1 9 8 2 ) a n d m e t h y l d e f i c i e n t d i e t s ( N e w b e m e e t a l . , 1 9 8 2 ) a r e k n o w n t o l e a d t o l i v e r t u m o r s i n B 6 C S F 1 m i c e . A d d i t i o n a l l y , t h e C M D d i e t i s a n t i c i p a t e d t o l e a d t o h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A a s c h o l i n e a n d m e t h i o n i n e a r e m e t h y l d o n o r s i n v o l v e d i n t h e s y n t h e s i s o f S - a d e n o s y l - L - m e t h i o n i n e , t h e c o f a c t o r i n v o l v e d i n d o n a t i n g m e t h y l g r o u p s ( H e r g e r s b e r g , 1 9 9 1 ) e . g . , f o r D N A m e t h y l a t i o n . A n i m a l s w e r e m a i n t a i n e d i n t h e s e g r o u p s f o r 1 , 2 a n d 4 w e e k s p r i o r t o s a c r i f i c e b y 0 0 2 a s p h y x i a t i o n . A g r o u p o f m a l e B 6 C B F 1 m i c e t h a t 1 0 1 r e c e i v e d c o n t r o l d i e t t h r o u g h o u t t h e s t u d y w a s s a c r i f i c e d a t 2 4 m o n t h s o f a g e ; t h e s e a n i m a l s w e r e d e s i g n a t e d “ a g e d ” . A t t h e t i m e o f s a c r i f i c e , l i v e r s w e r e i m m e d i a t e l y e x c i s e d , w e i g h e d , a n d s n a p f r o z e n i n l i q u i d n i t r o g e n u n t i l D N A i s o l a t i o n ; i n t h e a g e d a n i m a l s , n o r m a l l i v e r w a s s e p a r a t e d f r o m t u m o r t i s s u e . D N A I s o l a t i o n D N A w a s i s o l a t e d a s d e s c r i b e d ( S t r a u s s , 1 9 9 0 ) w i t h t h e a d d i t i o n o f a d i g e s t i o n w i t h 4 0 0 u g / m L R N A s e A ( S i g m a , S t . L o u i s , M O ) , a n d a s e c o n d d i g e s t i o n w i t h 2 0 0 u g / m L p r o t e i n a s e K ( B o e h r i n g e r M a n n h e i m B i o c h e m i c a l s , I n d i a n o p o l i s , I N ) . P C R - B a s e d A s s e s s m e n t o f M e t h y l a t i o n S t a t u s T h i s a p p r o a c h i s b a s e d u p o n t h e i n a b i l i t y o f s o m e r e s t r i c t i o n e n z y m e s t o c l e a v e D N A c o n t a i n i n g 5 M e C i n t h e i r r e c o g n i t i o n s i t e . D N A i s d i g e s t e d w i t h a m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e e n z y m e p r i o r t o P C R a m p l i f i c a t i o n ( U e d a e t a l . , 1 9 9 2 ) . I f t h e e n z y m e c a n c l e a v e t h e D N A a t a r e c o g n i t i o n s i t e l o c a t e d w i t h i n t h e r e g i o n t o b e a m p l i f i e d P C R p r o d u c t f o r m a t i o n i s p r e v e n t e d . D N A m e t h y l a t e d a t a c r i t i c a l s i t e i n t h e r e c o g n i t i o n s i t e o f t h e e n z y m e i s r e s i s t a n t t o d i g e s t i o n , s o a P C R p r o d u c t i s f o r m e d o f c o m p a r a b l e i n t e n s i t y t o t h e u n d i g e s t e d c o n t r o l . T w o r e g i o n s o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s , a p p r o x i m a t e l y 5 0 0 b p i n l e n g t h , w e r e i d e n t i f i e d a n d P C R p r i m e r s e t s w e r e d e s i g n e d t o a m p l i f y t h e m : P r i m e r s e t 5 / 8 : s e n s e 5 ' - G C G A C C G G G G T G A G C G T G C A A - S ’ a n t i s e n s e 5 ’ - A G A G C C T C C A C C C T G C A G C C T - 3 ’ 1 0 2 P r i m e r s e t 6 / 7 : s e n s e 5 ’ A G G C T G C A G G G T G G A G G C T C T - 3 ’ a n t i s e n s e 5 ’ - T G C C C G C A C T C A C C G C T T G C T - 3 ’ P r i m e r s w e r e s y n t h e s i z e d a t t h e M a c r o m o l e c u l a r S t r u c t u r e F a c i l i t y , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y . I m p o r t a n t l y t h e D N A a m p l i f i e d b y p r i m e r s e t 5 / 8 i s n o t a C p G i s l a n d , w h i l e t h a t a m p l i f i e d b y p r i m e r s e t 6 / 7 i s ( F i g u r e 1 ) . R e c o g n i t i o n s i t e s o f m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e r e s t r i c t i o n e n z y m e s w e r e d e t e r m i n e d ( M c C l e l l a n d a n d N e l s o n , 1 9 9 2 ) a n d a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 1 ; t h e i r l o c a t i o n i n t h e r e g i o n s a m p l i f i e d w e r e o b t a i n e d u s i n g t h e G e n e t i c s C o m p u t e r G r o u p s o f t w a r e p a c k a g e ( G e n e t i c s C o m p u t e r G r o u p , 1 9 9 4 ) a s d e p i c t e d i n s u m m a r y F i g u r e s 5 a n d 6 . O n e m i c r o g r a m o f D N A w a s d i g e s t e d t o c o m p l e t i o n w i t h 5 U / u g o f t h e m e t h y l a t i o n s e n s i t i v e e n z y m e w i t h t h e e n z y m e a d d e d i n t w o 2 . 5 U / u g a l i q u o t s a t a t h r e e h o u r i n t e r v a l , f o l l o w e d b y a n o v e r n i g h t i n c u b a t i o n a t t h e t e m p e r a t u r e r e c o m m e n d e d b y t h e s u p p l i e r ( G i b c o B R L , G a i t h e r s b u r g , M D ) . H o t - s t a r t P C R , a t e c h n i q u e w h e r e o n e c o m p o n e n t ( e . g . , t h e d N T P s ) i s a d d e d t o t h e m i x t u r e o n l y a f t e r t h e D N A h a s b e e n d e n a t u r e d , w a s c a r r i e d o u t o n t h e r e s t r i c t e d D N A a l o n g s i d e a n u n d i g e s t e d c o n t r o l f o r e a c h s a m p l e . E a c h P C R r e a c t i o n c o n t a i n e d 4 0 p m o l o f e a c h p r i m e r , 1 p g D N A , 1 . 2 5 U T a q p o l y m e r a s e ( 2 . 0 U f o r p r i m e r s e t 6 / 7 - a d d i t i o n a l e n z y m e w a s n e c e s s a r y b e c a u s e o f t h e i n h i b i t o r y e f f e c t o f D M S O o n t h e p o l y m e r a s e ) , a n d 5 ( I L D M S O ( p r i m e r s e t 6 / 7 o n l y - D M S O r e d u c e s t h e i n f l u e n c e o f t h e h i g h G C c o n t e n t o f t h e r e g i o n t o b e a m p l i f i e d ) t o 4 5 u L . A f t e r h e a t i n g t h e r e a c t i o n t u b e s t o 8 0 ° C , 5 u L o f a 1 : 1 : 1 : 1 m i x o f 1 0 m M d N T P ’ s w e r e a d d e d ( B o e h r i n g e r M a n n h e i m B i o c h e m i c a l s , 1 0 3 T a b l e 1 : R e s t r i c t i o n E n z y m e s a n d R e c o g n i t i o n S i t e s U t i l i z e d i n t h e A s s e s s m e n t o f t h e M e t h y l a t i o n S t a t u s o f t h e 5 ’ F l a n k i n g R e g i o n o f H a - r a s ( M c C l e l l a n d a n d N e l s o n , 1 9 9 2 ) . E n z y m e S I t e ( s ) C u t ' S i t e ( s ) N o t C u t A a l G G G C C C G G G m C C C a n d G G G C C m C A v a l C P y C G P u G " ‘ C P y C G P u G a n d C P y m C G P u G A v a l l G G ( A / T ) C C G G ( A / T ) " ‘ C C a n d G G ( A / T ) C ' “ C C f o l G C G C G m C G C E c o R l I C C ( A / T ) G G C ' “ C ( A / T ) G G H a e l l P u G C G C P y P q u C G C P y a n d P u G C G m C P y H a e l l l G G C C G G m C C H h a l G C G C G m C G C a n d G C G m C H p a l l " C C G G C m C G G K p n 2 l T C C G G A T m C C G G A a n d T C m C G G A M s p l C C G G " ‘ C C G G N a r l G G C G C C G G m C G C C S m a l C C C G G G r " C C C G G G a n d C C m C G G G S t u l A G G C C T A G G m C C T a n d A G G C m C T T h a l C G C G " ' C G C G a n d C G m C G X h o l C T C G A G C T m C G A G a n d r “ C T C G A G " ‘ C = S - m e t h y l c y t o s i n e * c l e a v e s a t ' “ C C G G , t h o u g h a t a m a r k e d l y r e d u c e d r a t e ( s e e t e x t ) 1 0 4 I n d i a n a p o l i s , I N ) . C y c l i n g c o n d i t i o n s f o r p r i m e r s e t 5 / 8 c o n s i s t e d o f a n i n i t i a l d e n a t u r a t i o n a t 9 4 ° C ( 2 m i n ) , f o l l o w e d b y 2 5 c y c l e s o f : d e n a t u r e a t 9 4 ° C ( 1 m i n ) , p r i m e r a n n e a l i n g a t 6 5 ° C ( 1 m i n ) , a n d e x t e n s i o n a t 7 2 ° C ( 2 m i n ) . A n a d d i t i o n a l 5 m i n u t e s a t 7 2 ° C a l l o w e d f o r c o m p l e t e e x t e n s i o n o f P C R p r o d u c t s a m p l i f i e d w i t h p r i m e r s e t 5 / 8 . C y c l i n g c o n d i t i o n s f o r p r i m e r s e t 6 / 7 c o n s i s t e d o f a n i n i t i a l d e n a t u r a t i o n a t 9 5 ° C ( 2 m i n ) , f o l l o w e d b y 2 4 c y c l e s o f : d e n a t u r e a t 9 6 ° C ( 3 0 s e c ) , p r i m e r a n n e a l i n g a t 6 0 ° C ( 4 5 s e c ) , a n d e x t e n s i o n a t 7 2 ° C ( 9 0 s e c ) . A n a d d i t i o n a l 7 m i n u t e s a t 7 2 ° C a l l o w e d f o r c o m p l e t e e x t e n s i o n o f P C R p r o d u c t s a m p l i f i e d w i t h p r i m e r s e t 6 / 7 . A f t e r a m p l i f i c a t i o n , t h e P C R p r o d u c t s w e r e e l e c t r o p h o r e s e d i n a 1 % a g a r o s e , 1 % N u S i e v e g e l , 1 X T B E , a n d v i s u a l i z e d b y e t h i d i u m b r o m i d e f l u o r e s c e n c e . L i m i t e d P C R c y c l i n g c o n d i t i o n s w e r e d e t e r m i n e d ( s e e A p p e n d i x 1 ) a n d e m p l o y e d t o m a x i m i z e t h e a b i l i t y t o d i s c e r n h e t e r o g e n e o u s m e t h y l a t i o n , i f i t e x i s t e d , e . g . , m e t h y l a t i o n i n s o m e , b u t n o t a l l c e l l s ( G o n z a l e z - Z u l u e t a e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h i s w a s a n i m p o r t a n t p a r a m e t e r t o i d e n t i f y , a s c a r r y i n g o u t t h e t y p i c a l 4 0 P C R c y c l e s w o u l d l e a d t o a l e v e l o f a m p l i f i e d p r o d u c t t h a t c o u l d n o t b e d i s t i n g u i s h e d f r o m t h a t o b t a i n e d i f t h e r e w e r e u n i f o r m m e t h y l a t i o n a t t h e s i t e o f i n t e r e s t i n a l l o f t h e c e l l s . H e t e r o g e n e i t y o f m e t h y l a t i o n i s e v i d e n t f r o m P C R p r o d u c t i n t e n s i t i e s l e s s t h a n t h e u n d i g e s t e d c o n t r o l , i . e . , i n s o m e o f t h e c e l l s t h e s i t e s m u s t h a v e b e e n m e t h y l a t e d , w h i l e i n o t h e r c e l l s t h e s i t e s w e r e u n m e t h y l a t e d l e a d i n g t o v a r i a b l e i n t e n s i t y l e v e l s o f t h e e t h i d i u m b r o m i d e s t a i n e d P C R p r o d u c t . O u r v i s u a l e x a m i n a t i o n o f a t l e a s t e i g h t s e p a r a t e P C R r e a c t i o n s f o r e a c h m e t h y l a t i o n s e n s i t i v e e n z y m e ( e a c h p e r f o r m e d o n D N A i s o l a t e d f r o m a d i f f e r e n t a n i m a l ) 1 0 5 a l l o w e d u s t o c l a s s i f y t h e D N A a s b e i n g ( 1 ) m e t h y l a t e d , ( 2 ) h e t e r o g e n e o u s l y m e t h y l a t e d , p r i m a r i l y m e t h y l a t e d ( g r e a t e r t h a n h a l f o f t h e i n t e n s i t y o f t h e u n d i g e s t e d c o n t r o l ) , ( 3 ) h e t e r o g e n e o u s l y m e t h y l a t e d , p r i m a r i l y u n m e t h y l a t e d ( l e s s t h a n h a l f t h e i n t e n s i t y o f t h e u n d i g e s t e d c o n t r o l ) , a n d ( 4 ) u n m e t h y l a t e d a t t h e r e c o g n i t i o n s i t e o f i n t e r e s t . R E S U L T S P C R a m p l i f i c a t i o n o f t w o d i s t i n c t r e g i o n s o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s w a s c a r r i e d o u t a n d t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e s e D N A s e g m e n t s w a s d e t e r m i n e d i n B G C S F 1 a n d 0 5 7 B L / 6 m a l e m i c e . W e d e t e r m i n e d t h e r e w a s c o n s i d e r a b l e h e t e r o g e n e i t y o f m e t h y l a t i o n i n t h e r e g i o n a m p l i f i e d b y p r i m e r s e t 5 / 8 . P r e - P C R d i g e s t s o f l i v e r D N A w i t h H a e l l l p r e v e n t e d a m p l i f i c a t i o n o f t h e r e g i o n w h i c h i s c o n s i s t e n t w i t h t h e H a e l l l s i t e s b e i n g u n m e t h y l a t e d ( F i g u r e 2 a ) . W e a l s o o b s e r v e d t h a t S t u l w a s c a p a b l e o f c l e a v i n g t h e m a j o r i t y o f t h e D N A , b u t a t r a c e o f p r o d u c t w a s f o r m e d i n d i c a t i n g t h e p r e s e n c e o f 5 M e C a t S t u l s i t e s i n D N A o f s o m e c e l l s i n t h e l i v e r ( F i g u r e 2 b ) w h i c h w a s c l a s s i f i e d a s b e i n g h e t e r o g e n e o u s l y m e t h y l a t e d , t h o u g h p r i m a r i l y u n m e t h y l a t e d . S i m i l a r r e s u l t s w e r e e v i d e n t a f t e r p r e - P C R d i g e s t i o n w i t h s e v e r a l o t h e r m e t h y l a t i o n s e n s i t i v e e n z y m e s ( s u m m a r i z e d i n F i g u r e 5 ) . I n a d d i t i o n , w e w e r e a b l e t o c l a s s i f y o t h e r s i t e s a s b e i n g h e t e r o g e n e o u s l y m e t h y l a t e d , t h o u g h p r i m a r i l y m e t h y l a t e d , f o r e x a m p l e t h e C f o l s i t e s ( F i g u r e 2 c ) . H a e l l p r e - P C R d i g e s t i o n h a d n o e f f e c t o n a m p l i f i c a t i o n o f t h e f r a g m e n t w h e n c o m p a r e d t o t h e u n d i g e s t e d c o n t r o l , i n d i c a t i n g t h e c y t o s i n e i n t h e r e c o g n i t i o n s i t e i n t h e r e g i o n 1 0 6 F i g u r e 2 - M e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e r e g i o n a m p l i f i e d b y t h e 5 / 8 P C R p r i m e r s e t i n y o u n g m o u s e l i v e r . D N A w a s i s o l a t e d f r o m B G C S F I m o u s e l i v e r a n d r e s t r i c t e d w i t h ( A ) H a e l l l , ( B ) S t u l , ( C ) C f o l , o r ( D ) H a e l l p r i o r t o P C R a m p l i f i c a t i o n ( l a n e s 1 , 3 ) o r s u b j e c t e d t o P C R a m p l i f i c a t i o n w i t h o u t p r i o r d i g e s t i o n ( l a n e s 2 , 4 ) a s d e s c r i b e d i n t h e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . L a n e M , b p l a d d e r ( 1 0 0 0 , 7 0 0 , 5 0 0 4 0 0 , 3 0 0 , 2 0 0 , 1 0 0 , a n d 5 0 b p ) ; l a n e C , n o D N A c o n t r o l . 1 0 7 e x i s t s a s 5 M e C ( F i g u r e 2 d ) . A t o t a l o f 1 2 m e t h y l a t i o n s e n s i t i v e e n z y m e s w e r e e x a m i n e d i n t h e r e g i o n a m p l i f i e d b y p r i m e r s e t 5 / 8 ; t h e r e s u l t s a r e s u m m a r i z e d i n F i g u r e 5 . I m p o r t a n t l y , t h e i n a b i l i t y o f H a e l l t o r e s t r i c t t h e D N A i s l i k e l y d u e t o t h e p r e s e n c e o f 5 M e C i n t h e r e c o g n i t i o n s i t e a n d n o t j u s t a n i n a b i l i t y t o c l e a v e i n o u r s y s t e m a s t h e H a e l l s i t e i n t h e 6 / 7 p r i m e r r e g i o n w a s d e m o n s t r a t e d t o b e u n m e t h y l a t e d ( i . e . , c o m p l e t e l y c l e a v e d ) ( F i g u r e 3 a ) . I t i s a l s o u n l i k e l y t h a t t h i s i s d u e t o s e q u e n c e v a r i a b i l i t y o f t h e r e c o g n i t i o n s i t e a s S E N C A R a n d N M R I m o u s e D N A h a v e , b a s e d u p o n s e q u e n c e i n f o r m a t i o n i n t h e l i t e r a t u r e ( B r o w n e t a l . , 1 9 8 8 ; N e a d e s e t a l . , 1 9 9 1 ) h i g h s e q u e n c e i d e n t i t y i n t h i s r e g i o n ( C h a p t e r 2 ; C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 b ) . A d d i t i o n a l l y , w e h a v e s e q u e n c e d a p o r t i o n o f t h e r e g i o n o f B 6 C 3 F 1 m o u s e l i v e r D N A a m p l i f i e d b y p r i m e r s e t 5 / 8 a n d r e v e a l e d h i g h s e q u e n c e i d e n t i t y w h e n c o m p a r e d t o S E N C A R a n d N M R I m i c e ( d a t a n o t s h o w n , s e e A p p e n d i x 1 ) . W e f o u n d t h e r e g i o n a m p l i f i e d b y p r i m e r s e t 6 / 7 t o b e u n m e t h y l a t e d o r h e t e r o g e n e o u s l y m e t h y l a t e d , t h o u g h p r i m a r i l y u n m e t h y l a t e d . H a e l l p r e - P C R d i g e s t i o n p r e v e n t e d s u b s e q u e n t a m p l i f i c a t i o n o f t h e r e g i o n , i n d i c a t i n g t h e s i t e i s u n m e t h y l a t e d ( F i g u r e 3 a ) . S m a l p r e - P C R d i g e s t i o n l e d t o p r o d u c t f o r m a t i o n o f l e s s t h a n h a l f t h e i n t e n s i t y o f t h e u n d i g e s t e d c o n t r o l , w h i c h w e c l a s s i f y a s h e t e r o g e n e o u s l y m e t h y l a t e d , t h o u g h p r i m a r i l y u n m e t h y l a t e d ( F i g u r e 3 b ) . A t o t a l o f 9 m e t h y l a t i o n s e n s i t i v e e n z y m e s w e r e e x a m i n e d i n t h e r e g i o n a m p l i f i e d b y p r i m e r s e t 6 / 7 ; t h e r e s u l t s a r e s u m m a r i z e d i n F i g u r e 6 . 1 0 8 F i g u r e 3 - M e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e r e g i o n a m p l i f i e d b y t h e 6 / 7 P C R p r i m e r s e t i n y o u n g m o u s e l i v e r . D N A w a s i s o l a t e d f r o m ( A ) B S C S F 1 a n d ( B ) C 5 7 B U 6 m o u s e l i v e r a n d r e s t r i c t e d w i t h ( A ) H a e l l o r ( B ) S m a l p r i o r t o P C R a m p l i f i c a t i o n ( l a n e s 1 , 3 ) o r s u b j e c t e d t o P C R a m p l i f i c a t i o n w i t h o u t p r i o r d i g e s t i o n ( l a n e s 2 , 4 ) a s d e s c r i b e d i n t h e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . L a n e M , b p l a d d e r a s d e s c r i b e d i n t h e l e g e n d t o F i g u r e 1 . 1 0 9 W e d e m o n s t r a t e t h a t H p a l l s i t e s i n t h e 6 / 7 r e g i o n a r e u n m e t h y l a t e d , w h i l e t h e y a r e h e t e r o g e n e o u s l y m e t h y l a t e d ( p r i m a r i l y u n m e t h y l a t e d ) i n t h e 5 / 8 r e g i o n . I m p o r t a n t l y i n b o t h s e g m e n t s t h e M s p l s i t e s w e r e d e m o n s t r a t e d t o b e h e t e r o g e n e o u s l y m e t h y l a t e d ( p r i m a r i l y u n m e t h y l a t e d ) e s t a b l i s h i n g t h e p r e s e n c e o f 5 M e C p C i n m o u s e l i v e r , b u t w e c a n n o t r u l e o u t t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e s i t e s a r e p r e s e n t a s 5 M e C p 5 M e C ( F i g u r e 4 ) . W e w e r e n o t a b l e t o d e m o n s t r a t e a n y d i f f e r e n c e s i n m e t h y l a t i o n s t a t u s i n e i t h e r r e g i o n b e t w e e n B 6 C S F 1 a n d C S 7 B L / 6 m i c e ( F i g u r e 3 , a d d i t i o n a l d a t a n o t s h o w n ) . A d d i t i o n a l l y , t h e p a t t e r n o f m e t h y l a t i o n s e e n w a s u n a f f e c t e d b y P B a d m i n i s t r a t i o n , C M D d i e t a d m i n i s t r a t i o n , o r c o - a d m i n i s t r a t i o n o f P B a n d t h e C M D d i e t f o r u p t o f o u r w e e k s ( d a t a n o t s h o w n ) . I n c r e a s e s i n 5 M e C c o n t e n t i n t h e l i v e r o f 2 4 m o n t h o l d B 6 0 3 F 1 m i c e w e r e e v i d e n t a t 1 0 o f t h e 1 2 m e t h y l a t i o n s e n s i t i v e r e s t r i c t i o n s i t e s e x a m i n e d i n t h e s e g m e n t o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s a m p l i f i e d b y P C R p r i m e r s e t 5 / 8 , e . g . , c o m p a r e F i g u r e s 7 b a n d 2 b ( S t u l ) a n d F i g u r e s 7 c a n d 2 0 ( C f o l ) . T h e i n c r e a s e i n t h i s s e g m e n t w a s p r i m a r i l y t o a c o m p l e t e l y m e t h y l a t e d p a t t e r n a n d i s s u m m a r i z e d i n T a b l e 2 . R a r e l y d i d w e o b s e r v e a c h a n g e i n 5 M e C c o n t e n t w i t h a g e i n t h e s e g m e n t o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s a m p l i f i e d b y P C R p r i m e r s e t 6 / 7 ; h o w e v e r , i n c r e a s e s w e r e e v i d e n t a t t h e H a e l l a n d X h o l s i t e s ( F i g u r e 8 ) . T h e i n c r e a s e s w e r e c o n s i d e r e d t o b e s l i g h t a s n e i t h e r o f t h e s i t e s i n c r e a s e d t o a c o m p l e t e l y m e t h y l a t e d p a t t e r n ; t h e r e s u l t s o f t h e r e a c t i o n s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 2 . 1 1 0 F i g u r e 4 - M e t h y l a t i o n s t a t u s o f C C G G s i t e s i n t h e r e g i o n a m p l i f i e d b y t h e ( A ) 6 / 7 P C R p r i m e r s e t a n d ( B ) 5 / 8 P C R p r i m e r s e t i n y o u n g m o u s e l i v e r . D N A w a s i s o l a t e d f r o m B 6 0 3 F 1 m o u s e l i v e r a n d r e s t r i c t e d w i t h ( a ) M s p l o r ( b ) H p a l l p r i o r t o P C R a m p l i f i c a t i o n ( l a n e s 1 , 3 ) o r s u b j e c t e d t o P C R a m p l i f i c a t i o n w i t h o u t p r i o r d i g e s t i o n ( l a n e s 2 , 4 ) a s d e s c r i b e d i n t h e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . L a n e M , b p l a d d e r a s d e s c r i b e d i n t h e l e g e n d t o F i g u r e 1 . O - r Q ” E c o R l l i ? — ' O = ' G = - _ — o o — — o o — - 9 ' " " " " " — - — - — A — - — - — - _ _ — - _ - — _ — _ — _ 1 1 1 5 | A v a l A v a l l | C f o l I ? G I H a e l l I I f ? H a e l l l H h a l H p a l l M s p l — o S t u l T h a l X h o l 5 0 b a s e p a i r s F i g u r e 5 - S u m m a r y o f c y t o s i n e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e p o r t i o n o f t h e 5 ’ f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s a m p l i f i e d b y P C R p r i m e r s e t 5 / 8 i n y o u n g m o u s e l i v e r . P r i m e r s e t 5 / 8 a m p l i f i e s a r e g i o n o f 5 0 3 b p , l o c a t e d i m m e d i a t e l y 5 ’ t o t h e 6 / 7 f r a g m e n t ( s e e F i g u r e 1 ) . T h e l o c a t i o n o f t h e r e c o g n i t i o n s i t e s o f m e t h y l a t i o n s e n s i t i v e r e s t r i c t i o n e n z y m e s c o n t a i n e d w i t h i n t h e r e g i o n a r e d e p i c t e d . R e c o g n i t i o n s e q u e n c e s o f t h e e n z y m e s a r e p r o v i d e d i n T a b l e 1 . A s o l i d s y m b o l c o r r e s p o n d s t o a m e t h y l a t e d c y t o s i n e , a h a t c h e d s y m b o l c o r r e s p o n d s t o h e t e r o g e n e i t y o f m e t h y l a t i o n w i t h t h e c y t o s i n e ( s ) i n t h e f r a g m e n t b e i n g p r i m a r i l y m e t h y l a t e d , a s t r i p e d s y m b o l c o r r e s p o n d s t o h e t e r o g e n e i t y o f m e t h y l a t i o n w i t h t h e c y t o s i n e ( s ) i n t h e f r a g m e n t b e i n g p r i m a r i l y u n m e t h y l a t e d , a n d a n o p e n s y m b o l c o r r e s p o n d s t o a n u n m e t h y l a t e d c y t o s i n e . 1 1 2 A p a l s ' : ? f : 3 . 1 ’ ? 1 ° $ 1 1 3 c ' 3 1 ? ? ‘ : 1 f 1 ’ ? f E fi s z ' I 1 ’ 1 ’ I . . , ; I I I X h o l I ? I 5 0 b a s e p a i r s F i g u r e 6 - S u m m a r y o f c y t o s i n e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e p o r t i o n o f t h e 5 ’ f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s a m p l i f i e d b y P C R p r i m e r s e t 6 / 7 i n y o u n g m o u s e l i v e r . P r i m e r s e t 6 / 7 a m p l i f i e s a r e g i o n o f 4 9 5 b p , e n c o m p a s s i n g t h e t r a n s c r i p t i o n s t a r t s i t e s ( B r o w n e t a l . , 1 9 8 8 ; N e a d e s e t a l . , 1 9 9 1 ) ( s e e F i g u r e 1 ) . T h e l o c a t i o n o f t h e r e c o g n i t i o n s i t e s o f m e t h y l a t i o n s e n s i t i v e r e s t r i c t i o n e n z y m e s c o n t a i n e d w i t h i n t h e r e g i o n a r e d e p i c t e d . R e c o g n i t i o n s e q u e n c e s o f t h e e n z y m e s a r e p r o v i d e d i n T a b l e 1 . A s o l i d s y m b o l c o r r e s p o n d s t o a m e t h y l a t e d c y t o s i n e , a h a t c h e d s y m b o l c o r r e s p o n d s t o h e t e r o g e n e i t y o f m e t h y l a t i o n w i t h t h e c y t o s i n e ( s ) i n t h e f r a g m e n t b e i n g p r i m a r i l y m e t h y l a t e d , a s t r i p e d s y m b o l c o r r e s p o n d s t o h e t e r o g e n e i t y o f m e t h y l a t i o n w i t h t h e c y t o s i n e ( s ) i n t h e f r a g m e n t b e i n g p r i m a r i l y u n m e t h y l a t e d , a n d a n o p e n s y m b o l c o r r e s p o n d s t o a n u n m e t h y l a t e d c y t o s i n e . F i g u r e 7 - M e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e r e g i o n a m p l i f i e d b y t h e 5 / 8 P C R p r i m e r s e t i n t h e l i v e r o f 2 4 m o n t h o l d B G C 3 F 1 m i c e . D N A w a s i s o l a t e d f r o m a g e d B 6 0 3 F 1 m o u s e l i v e r a n d r e s t r i c t e d w i t h ( A ) H a e l l l , ( B ) S t u l , ( C ) C f o l , o r ( D ) H a e l l p r i o r t o P C R a m p l i f i c a t i o n ( l a n e s 1 , 3 ) o r s u b j e c t e d t o P C R a m p l i f i c a t i o n w i t h o u t p r i o r d i g e s t i o n ( l a n e s 2 , 4 ) a s d e s c r i b e d i n t h e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . L a n e M , b p l a d d e r ( 1 0 0 0 , 7 0 0 , 5 0 0 4 0 0 , 3 0 0 , 2 0 0 , 1 0 0 , a n d 5 0 b p ) ; l a n e C , n o D N A c o n t r o l . 1 1 4 F i g u r e 8 - M e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e X h o l s i t e i n t h e r e g i o n a m p l i f i e d b y t h e 6 / 7 P C R p r i m e r s e t i n y o u n g a n d a g e d m o u s e l i v e r . D N A w a s i s o l a t e d f r o m ( A ) y o u n g o r ( B ) a g e d B B C S F 1 m o u s e l i v e r a n d r e s t r i c t e d w i t h X h o l p r i o r t o P C R a m p l i f i c a t i o n ( l a n e s 1 , 3 ) o r s u b j e c t e d t o P C R a m p l i f i c a t i o n w i t h o u t p r i o r d i g e s t i o n ( l a n e s 2 , 4 ) a s d e s c r i b e d i n t h e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . L a n e M , b p l a d d e r a s d e s c r i b e d i n t h e l e g e n d t o F i g u r e 1 . T a b l e 2 : I n c r e a s e s i n 5 M e C C o n t e n t w i t h A g e i n t h e 5 ' F l a n k i n g R e g i o n o f H a - r a s i n B 6 0 3 F 1 M o u s e L i v e r 1 1 5 5 I 8 c h a n g e 6 1 7 - c h a n g e A v a l i A p a l n c A v a l l f H a e l l I } C f o l 1 ! H h a l n c E c o R l I 1 H p a l l n c H a e l l n c M s p l n c H a e l l l n c K p n 2 l n c H h a l 1 N a r l n c H p a l l 1 S m a l n c M s p l t X h o l 1 ‘ S t u l 1 T h a l 1 X h o l 1 * c o m p l e t e l y m e t h y l a t e d h e t e r o g e n e o u s l y m e t h y l a t e d , p r i m a r i l y m e t h y l a t e d h e t e r o g e n e o u s l y m e t h y l a t e d , t h o u g h p r i m a r i l y u n m e t h y l a t e d n o c h a n g e w i t h a g e 3 - 9 0 . 4 . » D I S C ' e x m e s h y p o n 1 o c c u r m e i n l A l h o u i l l h e ' n i d d k 8 p r e e x t n s o n c o g r a s i a d m l l o l l o v f o r a G X p n o n c o l I G I a l e E x i s t l f l d e l i r - 1 1 6 D I S C U S S I O N T h e r e i s a n i n v e r s e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n m e t h y l a t i o n s t a t u s a n d g e n e e x p r e s s i o n ; t h a t i s , a m e t h y l a t e d g e n e i s t y p i c a l l y q u i e s c e n t , w h i l e a h y p o m e t h y l a t e d g e n e h a s t h e p o t e n t i a l f o r e x p r e s s i o n . T h i s r e g u l a t i o n m a y o c c u r b y a f f e c t i n g t h e b i n d i n g o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s t o t h e i r c i s e l e m e n t s a n d / o r t h e i n t e r a c t i o n w i t h m e t h y l a t e d D N A b i n d i n g p r o t e i n s ( M e e h a n e t a l . , 1 9 9 2 ) . A l t h o u g h i t i s c o m m o n t o f i n d c i s e l e m e n t s i n v o l v e d i n r e g u l a t i o n o f e x p r e s s i o n i n t h e 5 ’ f l a n k i n g r e g i o n o f g e n e s , c o n t r o l e l e m e n t s m a y a l s o e x i s t i n t h e i r m i d d l e a n d 3 ' r e g i o n s ( C o h e n a n d L e v i n s o n , 1 9 8 8 ; M i i n z e l e t a l . , 1 9 9 1 ) . 5 M e C i s p r e s e n t i n t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f m o u s e l i v e r H a - r a s , t h u s , t h e p o t e n t i a l e x i s t s f o r m e t h y l a t i o n t o p l a y a r o l e i n t h e r e g u l a t i o n o f e x p r e s s i o n o f t h i s o n c o g e n e . T h e f a c t t h a t t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s i s s i m i l a r i n B 6 0 3 F 1 a n d C S 7 B L / 6 m i c e a f t e r f o u r w e e k s o f t h e a d m i n i s t r a t i o n o f t u m o r p r o m o t i n g s t i m u l i i n d i c a t e s t o u s t h a t o n e o r m o r e o f t h e f o l l o w i n g s i t u a t i o n s m a y e x i s t : ( 1 ) p r o m o t e r t r e a t m e n t h a s n o t b e e n c a r r i e d o u t f o r a l o n g e n o u g h t i m e p e r i o d t o a f f e c t D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s a n d / o r g e n e e x p r e s s i o n , ( 2 ) t h e c h a n g e s i n m e t h y l a t i o n s t a t u s t h a t a f f e c t e x p r e s s i o n o f t h i s o n c o g e n e o c c u r i n t h e b o d y o f t h e g e n e ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 9 1 ) , ( 3 ) s t r a i n r e l a t e d d i f f e r e n c e s i n t h e p r e s e n c e a n d / o r f i d e l i t y o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s m a y e x i s t f o r t h i s o n c o g e n e , o r ( 4 ) s t r a i n r e l a t e d d i f f e r e n c e s i n t h e p r e s e n c e a n d / o r f i d e l i t y o f m e t h y l a t e d D N A b i n d i n g p r o t e i n s m a y e x i s t f o r t h i s o n c o g e n e . P r i m e r s e t 6 / 7 a m p l i f i e s a f r a g m e n t o f 4 9 5 b p a n d c o n t a i n s t h e t h r e e t r a n s c r i p t i o n s t a r t s i t e s m a p p e d b y B r o w n a n d c o - w o r k e r s ( B r o w n e t a l . , 1 9 8 8 ) . 1 1 7 T h e f r a g m e n t b e g i n s 3 3 3 b p u p s t r e a m f r o m t h e m o s t 5 ' t r a n s c r i p t i o n s t a r t s i t e a n d e x t e n d s i n t o e x o n - 1 ( B r o w n e t a l . , 1 9 8 8 ) . F u r t h e r , C p G i s l a n d s h a v e a C p G r a t i o g r e a t e r t h a n 5 0 % ( G a r d i n e r - G a r d e n a n d F r o m m e r , 1 9 8 7 ) ; t h i s r e g i o n h a s t h a t c h a r a c t e r i s t i c a s d e m o n s t r a t e d b y a C p G o b / e x > 0 ( F i g u r e 1 ) . W e w e r e a b l e t o d e t e c t a v e r y l o w l e v e l 5 M e C i n t h e C p G i s l a n d r e g i o n o f H a - r a s ( p r i m e r s e t 6 / 7 ) . I m p o r t a n t l y , t h i s i s c o m p a t i b l e w i t h t h e n o t i o n t h a t t h e s e a r e a s a r e , r e l a t i v e l y s p e a k i n g , e x p e c t e d t o b e u n m e t h y l a t e d ( B i r d , 1 9 8 6 ; G a r d i n e r - G a r d e n a n d F r o m m e r , 1 9 8 7 ) . O n l y s l i g h t i n c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n s t a t u s w e r e e v i d e n t i n t h e C p G i s l a n d r e g i o n o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s . T h i s i s a n i n d i c a t i o n t h a t t h e s e p r i m a r i l y u n m e t h y l a t e d s i t e s c a n b e i m p o r t a n t i n m a i n t a i n i n g b a s a l e x p r e s s i o n l e v e l s o f t h i s w i d e l y e x p r e s s e d g e n e ( i . e . , t h e s e s i t e s m a y b e p r o t e c t e d f r o m a b e r r a n t m e t h y l a t i o n ) a s t h e t r a n s c r i p t i o n s t a r t s i t e s a r e l o c a t e d w i t h i n t h i s s e g m e n t ( N e a d e s e t a l . , 1 9 9 1 ) . P r i m e r s e t 5 / 8 a m p l i f i e s a f r a g m e n t o f 5 0 3 b p b e g i n n i n g 8 1 5 b p u p s t r e a m f r o m t h e m o s t 5 ’ t r a n s c r i p t i o n s t a r t s i t e m a p p e d b y B r o w n a n d c o - w o r k e r s ( B r o w n e t a l . , 1 9 8 8 ) u s i n g a d d i t i o n a l s e q u e n c e d a t a p r o v i d e d b y N e a d e s e t a l . ( N e a d e s e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h i s r e g i o n c o n t a i n s s e v e r a l p u t a t i v e t r a n s c r i p t i o n f a c t o r c i s e l e m e n t s ( s e e F i g u r e 1 i n C h a p t e r 1 ) . T h e r e g i o n h a s a G C c o n t e n t l e s s t h a n 5 0 % a n d C p G o b / e x < 0 ; t h e r e f o r e , i s n o t c o n s i d e r e d a C p G i s l a n d ( F i g u r e 1 ) ( G a r d i n e r - G a r d e n a n d F r o m m e r , 1 9 8 7 ) . T h u s e v e n w i d e l y e x p r e s s e d g e n e s l i k e H a - r a s m a y c o n t a i n n o n - C p G i s l a n d r e g i o n s t h a t m i g h t r e a s o n a b l y b e e x p e c t e d t o b e m e t h y l a t e d . T h e n o n C p G i s l a n d , a m p l i f i e d b y P C R p r i m e r s e t 1 1 8 5 / 8 , w a s d e t e r m i n e d t o h a v e a h i g h e r l e v e l o f m e t h y l a t i o n t h a n t h a t o b s e r v e d i n t h e r e g i o n a m p l i f i e d b y p r i m e r s e t 6 / 7 , a l t h o u g h r a r e l y w a s a s i t e d e m o n s t r a t e d t o b e c o m p l e t e l y m e t h y l a t e d . T h e r e w e r e d r a m a t i c i n c r e a s e s i n 5 M e C c o n t e n t o f t h e n o n - C p G i s l a n d r e g i o n o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s t h a t w e e x a m i n e d w i t h t h i s P C R b a s e d a p p r o a c h . I n t e r e s t i n g l y , t h e H a e l l l s i t e s t h a t w e r e c o m p l e t e l y u n m e t h y l a t e d i n t h e y o u n g a n i m a l s r e m a i n e d s o i n t h e 2 4 m o n t h o l d m o u s e l i v e r . E v e r y o t h e r s i t e e x a m i n e d i n t h i s r e g i o n i n c r e a s e d i n 5 M e C c o n t e n t ( e x c e p t f o r t h e H a e l l s i t e w h i c h w a s c o m p l e t e l y m e t h y l a t e d i n t h e y o u n g a n i m a l s a n d w a s s t a b l y m a i n t a i n e d ) . T o t h e e x t e n t t h a t c i s e l e m e n t s c a p a b l e o f i n f l u e n c i n g e x p r e s s i o n a r e p r e s e n t i n t h i s p o r t i o n o f t h e g e n e t h e i r a b i l i t y t o a f f e c t H a - r a s m R N A l e v e l s m a y b e c o m p r o m i s e d b y t h i s i n c r e a s e i n m e t h y l a t i o n . A l t h o u g h t h e r e i s g e n e r a l l y a d e c l i n e i n 5 M e C c o n t e n t o f g e n o m i c D N A w i t h a g e ( C o o n e y , 1 9 9 3 ) , e s p e c i a l l y i n a s h o r t l i v e d s p e c i e s l i k e t h e m o u s e ( W i l s o n e t a l . , 1 9 8 7 ) , t h e r e a r e e x a m p l e s i n m o u s e l i v e r d e m o n s t r a t i n g i n c r e a s e s i n 5 M e C c o n t e n t i n c - m y c ( O n o e t a l . , 1 9 8 6 ; O n o e t a l . , 1 9 8 9 ) , c - f o s ( U e h a r a e t a l . , 1 9 8 9 ) , a n d t h e 1 8 8 a n d 2 8 8 r R N A g e n e s ( S w i s s h e l m e t a l . , 1 9 9 0 ) . T h u s , i t i s i m p o r t a n t t o e x a m i n e t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f s p e c i f i c g e n e s . T u m o r i g e n e s i s i s a m u l t i s t a g e / m u l t i s t e p p r o c e s s ( D r a g a n e f a l . , 1 9 9 3 ) w h i c h i n v o l v e s t h e c l o n a l e x p a n s i o n o f i n i t i a t e d c e l l s . A l t e r a t i o n s t o t h e g e n o m e , e . g . , m u t a t i o n o r a n e p i g e n e t i c c h a n g e s u c h a s a l t e r e d m e t h y l a t i o n ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 a ) , t h a t p r o v i d e a c e l l w i t h a g r o w t h a d v a n t a g e a s c o m p a r e d t o n o r m a l s u r r o u n d i n g c e l l s , m a y r e s u l t i n p o p u l a t i o n s o f c e l l s t h a t 1 1 9 a r e c a p a b l e o f d e v e l o p i n g i n t o f r a n k m a l i g n a n c i e s . B y i s o l a t i n g D N A f r o m w h o l e l i v e r w e c o m b i n e t h e l i k e l i h o o d o f h e t e r o g e n e i t y o f m e t h y l a t i o n a m o n g n o r m a l h e p a t o c y t e s w i t h t h e c h a n c e o f t h e p r e s e n c e o f p r e n e o p l a s t i c c e l l s ( t h a t a r e t r e a t m e n t r e l a t e d a n d / o r a r i s e s p o n t a n e o u s l y ) . F o r e x a m p l e , s p o n t a n e o u s m u t a t i o n a t c o d o n 6 1 o f H a - r a s h a s b e e n r e p o r t e d t o e x i s t i n a s u b p o p u l a t i o n o f h e p a t o c y t e s i n B S C S F I , C S H / H e , a n d C 5 7 B U 6 m i c e ( M o u l d s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 ) . A d d i t i o n a l l y , N - n i t r o s o - N - m e t h y l u r e a - i n d u c e d m a m m a r y t u m o r s a p p e a r t o a r i s e f r o m c e l l s w i t h p r e e x i s t i n g m u t a t i o n s i n c o d o n 1 2 o f H a - r a s ( C h a e t a l . , 1 9 9 4 ) . T h e s e o b s e r v a t i o n s a r e c o m p a t i b l e w i t h t h e n o t i o n t h a t s u b p o p u l a t i o n s o f c e l l s i n a t a r g e t o r g a n r e s p o n d t o t h e e f f e c t s o f t u m o r p r o m o t e r s ( M a y o l e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h u s , o n e m a y a n t i c i p a t e t h e p r e s e n c e o f s u b p o p u l a t i o n s o f c e l l s e x h i b i t i n g s o m e d i f f e r e n c e s i n m e t h y l a t i o n s t a t u s . A c c o r d i n g l y , w e w e r e n o t s u r p r i s e d t o d e t e c t e v i d e n c e o f h e t e r o g e n e i t y i n m e t h y l a t i o n o f s p e c i f i c s i t e s i n t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s . H o w e v e r , i t w a s i m p o r t a n t t o d e t e r m i n e t h i s e x p e r i m e n t a l l y . T h i s i s a n e c e s s a r y c o m p o n e n t o f t h e b o d y o f k n o w l e d g e t h a t n e e d s t o b e c o m p i l e d a n d i n t e g r a t e d i n o r d e r t o u n d e r s t a n d t h e b a s i s f o r t h e c l o n a l o r i g i n o f t u m o r s , e . g . , a l t e r a t i o n s t o t h e g e n o m e ( b o t h g e n e t i c a n d e p i g e n e t i c c h a n g e s ) t h a t m a y u n d e r l i e t h e t r a n s f o r m a t i o n o f a n o r m a l c e l l i n t o a f r a n k m a l i g n a n c y . T h e m a j o r i t y o f 5 M e C i n D N A a p p e a r s t o b e l o c a t e d a t C p G s i t e s . P r e v i o u s s t u d i e s f r o m o u r l a b o r a t o r y i n d i c a t i n g n o n - C p G m e t h y l a t i o n e m p l o y e d S o u t h e r n a n a l y s i s o f o n c o g e n e s a f t e r d i g e s t i o n w i t h m e t h y l a t i o n s e n s i t i v e e n z y m e s ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 9 1 ; R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) . M e t h y l a t i o n s e n s i t i v e 1 2 0 r e s t r i c t i o n a n a l y s i s f o r t h e a s s e s s m e n t o f m e t h y l a t i o n s t a t u s o f D N A i s l i m i t e d i n t h a t o n l y a f r a c t i o n o f t h e p o t e n t i a l l y m e t h y l a t e d s i t e s m a y b e e x a m i n e d . H o w e v e r , t h e r e s u l t s o f r e c e n t i n v e s t i g a t i o n s e m p l o y i n g a b i s u l f i t e - b a s e d D N A s e q u e n c i n g p r o c e d u r e p r o v i d e c o n v i n c i n g e v i d e n c e f o r t h e p r e s e n c e o f 5 M e C a t n o n - C p G s i t e s ( C l a r k e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h e s t u d y b y C l a r k a n d c o - w o r k e r s c o n f i r m s e a r l i e r r e p o r t s o f n o n - C p G m e t h y l a t i o n e x i s t i n g i n D N A ( W o o d c o c k e t a l . , 1 9 8 7 ; V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 9 1 ; R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) . T h e P C R - b a s e d a p p r o a c h d e s c r i b e d h e r e h a s g r e a t e r p o t e n t i a l t h a n t h e t r a d i t i o n a l S o u t h e r n a n a l y s i s a s i t p r o v i d e s t h e a b i l i t y t o d i s c e r n m e t h y l a t i o n c h a n g e s a t m o r e s p e c i f i c l o c a t i o n s w i t h i n t h e g e n o m e . H o w e v e r , t h i s a p p r o a c h i s l i m i t e d b y t h e f a c t t h a t i t i s h i g h l y s e n s i t i v e t o u n m e t h y l a t e d s i t e s . T h u s , v e r y f i n i t e a l t e r a t i o n s m a y b e m i s s e d b y t h i s m e t h o d . F o r e x a m p l e , t h e r e a r e 1 0 H p a l l s i t e s i n t h e r e g i o n a m p l i f i e d b y P C R p r i m e r s e t 6 / 7 , s o c h a n g e s i n m e t h y l a t i o n s t a t u s a t a s i t e t h a t m a y b e c r u c i a l f o r p r o t e i n b i n d i n g w i l l n o t b e e a s i l y d i s c e r n e d i n t h i s s e g m e n t . M s p l a n d H p a l l a r e m e t h y l a t i o n s e n s i t i v e i s o s c h i z o m e r s ( i . e . , t h e y r e c o g n i z e t h e s a m e s e q u e n c e i n D N A a n d d i f f e r i n t h e i r a b i l i t y t o c l e a v e b a s e d u p o n t h e p r e s e n c e o f 5 M e C i n t h e s i t e ) ( M c C l e l l a n d a n d N e l s o n , 1 9 9 2 ) . M s p l i s s e n s i t i v e t o 5 M e C a t t h e C p C s i t e o f a C C G G s i t e ( i . e . , t h e e x t e r n a l C ) ( J e n t s c h e t a l . , 1 9 8 1 ) , t h u s , i t c a n n o t c l e a v e i f t h e e x t e r n a l C i s m e t h l a t e d . H p a l l c a n n o t r e s t r i c t D N A i f t h e i n t e r n a l C o f a C C G G s i t e i s m e t h y l a t e d , b u t h a s b e e n r e p o r t e d t o r e s t r i c t D N A m e t h y l a t e d a t t h e e x t e r n a l C ( M a n n a n d S m i t h , 1 9 7 7 ) , t h o u g h a t a m a r k e d l y r e d u c e d r a t e ( K o r c h a n d H a g b l o m , 1 9 8 6 ) . W e 1 2 1 d e m o n s t r a t e t h a t t h e H p a l l s i t e s i n t h e 6 / 7 r e g i o n a r e u n m e t h y l a t e d a t t h e i n t e r n a l C o f t h e C C G G s i t e s , w h i l e t h e y a r e h e t e r o g e n e o u s l y m e t h y l a t e d ( p r i m a r i l y u n m e t h y l a t e d ) i n t h e 5 / 8 r e g i o n . I m p o r t a n t l y , i n b o t h s e g m e n t s , M s p l w a s u n a b l e t o c o m p l e t e l y r e s t r i c t t h e D N A , d e m o n s t r a t i n g m e t h y l a t i o n a t t h e e x t e r n a l C o f a C C G G s i t e ( s ) . S e v e r a l o f t h e r e s t r i c t i o n e n z y m e s i n v e s t i g a t e d a r e s e n s i t i v e t o m e t h y l a t i o n a t n o n - C p G s i t e s ( e . g . , E c o R l l - C p A o r C p T , H a e l l l - C p C , a n d S t u l - C p C o r C p T ) a n d w e r e u n a b l e t o c o m p l e t e l y r e s t r i c t t h e D N A i l l u s t r a t i n g 5 M e C p N m e t h y l a t i o n i n t h e 5 ’ f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s i n m o u s e l i v e r ( F i g u r e s 2 , 3 , 4 , 5 a n d 6 ) . I n s u m m a r y , w h i l e o u r P C R - b a s e d a p p r o a c h d i d n o t d e t e c t d i f f e r e n c e s i n m e t h y l a t i o n b e t w e e n t h e d i f f e r e n t s t r a i n s o f m i c e u s e d , w e h a v e e x p a n d e d u p o n o u r i n i t i a l r e p o r t ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 3 ) a n d f u r t h e r d e f i n e d t h e p r e s e n c e o f 5 M e C i n t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s i n m o u s e l i v e r . T h i s s i t u a t i o n d i f f e r s f r o m t h e r e s u l t s o f s t u d i e s i n d i c a t i n g t h a t t h e 5 ’ f l a n k i n g r e g i o n o f h u m a n H a - r a s i s u n m e t h y l a t e d ( B a r b i e r i e t a l . , 1 9 8 7 ; B a r b i e r i e t a l . , 1 9 8 9 ; G h a z i e t a l . , 1 9 9 2 ; B o r r e l l o e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h u s , t h e r e g u l a t i o n o f e x p r e s s i o n o f H a - r a s m a y d i f f e r b e t w e e n m o u s e a n d h u m a n . I n s u p p o r t o f t h i s n o t i o n , w e h a v e r e p o r t e d t h a t c o n s i d e r a b l e s e q u e n c e v a r i a b i l i t y e x i s t s b e t w e e n m o u s e a n d h u m a n H a - r a s i n r e g i o n s t h a t c o n t a i n s e v e r a l p u t a t i v e c i s e l e m e n t s a n d l i k e l y p l a y a r o l e i n t h e r e g u l a t i o n o f g e n e a c t i v i t y ( C h a p t e r 2 ; C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 b ) . W h i l e H a - r a s i s f r e q u e n t l y i n v o l v e d i n m o u s e l i v e r t u m o r i g e n e s i s , a s d i s c u s s e d a b o v e , t h i s g e n e i s v e r y r a r e l y r e p o r t e d t o p l a y a r o l e i n h u m a n t u m o r s a n d , t o t h e b e s t o f o u r k n o w l e d g e , i t h a s n o t b e e n r e p o r t e d t o b e i n v o l v e d i n h u m a n l i v e r t u m o r s 1 2 2 ( B o s , 1 9 8 9 ; K i a r i s a n d S p a n d i d o s , 1 9 9 5 ) . T h i s c u r i o u s s p e c i e s d i f f e r e n c e m i g h t , i n p a r t , b e a c c o u n t e d f o r b y t h e d i s s i m i l a r i t y i n m e t h y l a t i o n a n d / o r D N A s e q u e n c e i n t h e 5 ’ f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s b e t w e e n t h e s e s p e c i e s . A C K N O W L E D G M E N T S O u r r e s e a r c h c o n c e r n i n g D N A m e t h y l a t i o n w a s i n i t i a t e d b y s u p p o r t f r o m t h e I n t e r n a t i o n a l L i f e S c i e n c e s I n s t i t u t e ( I L S I ) R i s k S c i e n c e I n s t i t u t e . T h i s i s c u r r e n t l y s u p p o r t e d b y I L S I , H e a l t h a n d E n v i r o n m e n t a l S c i e n c e s I n s t i t u t e , a n d N I H g r a n t E S - 0 5 2 9 9 . J L C i s t h e r e c i p i e n t o f a S o c i e t y o f T o x i c o l o g y p r e d o c t o r a l f e l l o w s h i p a w a r d . T h e t e c h n i c a l s u p p o r t o f J o h n D o w n i n g i s g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e d . R E F E R E N C E S B a r b i e r i , R . , P i v a , R . , B u z z o n i , D . , V o l i n i a , S . a n d G a m b a r i , R . ( 1 9 8 7 ) C l u s t e r i n g o f u n d e r m e t h y l a t e d C C G G a n d G C G C s e q u e n c e s i n t h e 5 ' r e g i o n o f t h e H a - r a s - 1 o n c o g e n e o f h u m a n l e u k e m i c K 5 6 2 c e l l s . B i e e h e m . B i e e n y e . B e e , C e m m . , 1 4 5 , 9 6 - 1 0 4 . B a r b i e r i , R . , M i s c h i a t i , C . , P i v a , R . , N a s t r u z z i , C . , G i a c o m i n i , P . , N a t a l i , P G . a n d G a m b a r i , R . ( 1 9 8 9 ) D N A m e t h y l a t i o n o f t h e H a - r a s - 1 o n c o g e n e i n n e o p l a s t i c c e l l s . A e t j e a e e e l fl e e , 9 , 1 7 8 7 - 1 7 9 1 . B e c k e r , F . F . ( 1 9 8 2 ) M o r p h o l o g i c a l c l a s s i f i c a t i o n o f m o u s e l i v e r t u m o r s b a s e d o n b i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s . C a n e e r R e s , 4 2 , 3 9 1 8 - 3 9 2 3 . B i r d , A P . ( 1 9 8 6 ) C p G - r i c h i s l a n d s a n d t h e f u n c t i o n o f D N A m e t h y l a t i o n . fl a n g e ( L e e fl e ) , 3 2 1 , 2 0 9 - 2 1 3 . B o r r e l l o , M . G . , P i e r o t t i , M . A . , T a m b o r i n i , E . , B i a s s o n i , D . , R i z z e t t i , M . G . , P i l o t t i , S . a n d P o r t a , G D . ( 1 9 9 2 ) D N A m e t h y l a t i o n o f c o d i n g a n d n o n - c o d i n g r e g i o n s o f t h e h u m a n H - R A S g e n e i n n o r m a l a n d t u m o r t i s s u e s . C n e e g e e e , 7 , 2 6 9 - 2 7 5 . 1 2 3 B o s , J . L . ( 1 9 8 9 ) r a s o n c o g e n e s i n h u m a n c a n c e r : A r e v i e w . C a n e e r _ B e e , , 4 9 , 4 6 8 2 - 4 6 8 9 . B r o w n , K . , B a i l l e u l , B . , R a m s d e n , M . , F e e , F . , K r u m l a u f , R . a n d B a l m a i n , A . ( 1 9 8 8 ) I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e 5 ’ f l a n k i n g r e g i o n o f t h e m o u s e c - H a - r a s g e n e . M e L C a L e l e e g e m 1 , 1 6 1 - 1 7 0 . B u c h m a n n , A . , B a u e r - H o f m a n n , R . , M a h r , J . , D r i n k w a t e r , N . R . , L u z , A . a n d S c h w a r z , M . ( 1 9 9 1 ) M u t a t i o n a l a c t i v a t i o n o f t h e c - H a - r a s g e n e i n l i v e r t u m o r s o f d i f f e r e n t r o d e n t s t r a i n s : C o r r e l a t i o n w i t h s u s c e p t i b i l i t y t o h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s . W M . 8 8 , 9 1 1 - 9 1 5 . B u s c h h a u s e n , G . , W i t t i g , B . , G r a e s s m a n n , M . a n d G r a e s s m a n n , A . ( 1 9 8 7 ) C h r o m a t i n s t r u c t u r e i s r e q u i r e d t o b l o c k t r a n s c r i p t i o n o f t h e m e t h y l a t e d h e r p e s s i m p l e x v i r u s t h y m i d i n e k i n a s e g e n e . W M , 8 4 , 1 1 7 7 - 1 1 8 1 . C h a , R . S . , T h i l l y , W C . a n d Z a r b l , H . ( 1 9 9 4 ) N - n i t r o s o - N - m e t h y l u r e a - I n d u c e d r a t m a m m a r y t u m o r s a r i s e f r o m c e l l s w i t h p r e e x i s t i n g o n c o g e n i c H r a s I g e n e m u t a t i o n s . M W , 9 1 , 3 7 4 9 - 3 7 5 3 . C l a r k , S . J . , H a r r i s o n , J . a n d F r o m m e r , M . ( 1 9 9 5 ) C p r G m e t h y l a t i o n i n m a m m a l i a n c e l l s . N a t u r e j e n e t j e s , 1 0 , 2 0 - 2 7 . C o h e n , J E . a n d L e v i n s o n , A D . ( 1 9 8 8 ) A p o i n t m u t a t i o n i n t h e l a s t i n t r o l r e s p o n s i b l e f o r i n c r e a s e d e x p r e s s i o n a n d t r a n s f o r m i n g a c t i v i t y o f t h e c - H a - r a s o n c o g e n e . W . 3 3 4 , 1 1 9 - 1 2 4 . C o o n e y , C A . ( 1 9 9 3 ) A r e s o m a t i c c e l l s i n h e r e n t l y d e f i c i e n t i n m e t h y l a t i o n m e t a b o l i s m ? A p r o p o s e d m e c h a n i s m f o r D N A m e t h y l a t i o n l o s s , s e n e s c e n c e a n d a g i n g . C W , 5 7 , 2 6 1 - 2 7 3 . C o u n t s , J . L . a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 3 ) C o m p a r a t i v e a n a l y s i s o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s i n B G C 3 F 1 , C 3 H / H e a n d C S 7 B L / 6 m o u s e l i v e r . C a e e e u e n “ 7 5 , 1 2 9 - 1 3 6 C o u n t s , J . L . a n d G o o d m a n , J . . I ( 1 9 9 4 ) H y p o m e t h y l a t i o n o f D N A : A n e p i g e n e t i c m e c h a n i s m i n v o l v e d i n t u m o r p r o m o t i o n . M o l C a m e e e m , 1 1 , 1 8 5 - 1 8 8 . C o u n t s , J . L . a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 5 a ) A l t e r a t i o n s i n D N A m e t h y l a t i o n m a y p l a y a v a r i e t y o f r o l e s i n c a r c i n o g e n e s i s . C e l l , 8 3 , 1 3 - 1 5 . C o u n t s , J . L . a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 5 b ) H y p o m e t h y l a t i o n o f D N A : A n o n g e n o t o x i c m e c h a n i s m i n v o l v e d i n t u m o r p r o m o t i o n . I Q K I Q Q I Q Q L L Q I L . i n p r e s s . 1 2 4 D i w a n , B . A . , R i c e , J . M . , O h s h i m a , M . , W a r d , J . M . a n d D o v e , L . F . ( 1 9 8 5 ) C o m p a r a t i v e t u m o r - p r o m o t i n g a c t i v i t i e s o f p h e n o b a r b i t a l , a m o b a r b i t a l , b a r b i t a l s o d i u m , a n d b a r b i t u r i c a c i d o n l i v e r s a n d o t h e r o r g a n s o f m a l e F 3 4 4 / N C r r a t s f o l l o w i n g i n i t i a t i o n w i t h N - n i t r o s o d i e t h y l a m i n e . M m , 7 4 , 5 0 9 - 5 1 6 . D r a g a n , Y . P . , S a r g e n t , L . , X u , Y . - D . , X u , Y . - H . a n d P i t o t , H . C . ( 1 9 9 3 ) T h e i n i t i a t i o n - p r o m o t i o n - p r o g r e s s i o n m o d e l o f r a t h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s . E m e j e e , M 2 8 4 9 9 . . . 2 0 2 . 1 6 - 2 4 - E n o m o t o , T . , W e g h o r s t , C . M . , W a r d , J . M . , A n d e r s o n , L . M . , P e r a n t o n i , A C . a n d R i c e , J . M . ( 1 9 9 3 ) L o w f r e q u e n c y o f H - r a s a c t i v a t i o n i n n a t u r a l l y o c c u r r i n g h e p a t o c e l l u l a r t u m o r s o f C S H / H e N C r m i c e . C a r e i n e g e n e e i e , 9 , 1 9 3 9 - 1 9 4 4 . F o x , T . R . , S c h u m a n n , A . M . , W a t a n a b e , P . G . , Y a n o , B . L . , M a h e r , V . M . a n d M c C o r m i c k , J . J . ( 1 9 9 0 ) M u t a t i o n a l a n a l y s i s o f t h e H - r a s o n c o g e n e i n s p o n t a n e o u s C 5 7 B U 6 x C S H / H e m o u s e l i v e r t u m o r s a n d t u m o r s i n d u c e d w i t h g e n o t o x i c a n d n o n g e n o t o x i c h e p a t o c a r c i n o g e n s . C a n e e L B e a , 5 0 , 4 0 1 4 - 4 0 1 9 . G a r d i n e r - G a r d e n , M . a n d F r o m m e r , M . ( 1 9 8 7 ) C p G i s l a n d s i n v e r t e b r a t e g e n o m e s . , 1 , M e l , B i e l , , 1 9 6 , 2 6 1 - 2 8 2 . G e n e t i c s C o m p u t e r G r o u p ( 1 9 9 4 ) P r o g r a m m a n u a l f o r t h e G C G p a c k a g e , v e r s i o n 8 . 0 , M a d i s o n , W I . G h a z i , H . , G o n z a l e s , F A . a n d J o n e s , P A . ( 1 9 9 2 ) M e t h y l a t i o n o f C p G - i s l a n d - c o n t a i n i n g g e n e s i n h u m a n s p e r m , f e t a l a n d a d u l t t i s s u e s . C e e e , 1 1 4 , 2 0 3 - 2 1 0 . G o n z a l e z - Z u l u e t a , M . , B e n d e r , C . M . , Y a n g , A . S . , N g u y e n , T . , B e a r t , R . W . , V a n T o m o u t , J . M . a n d J o n e s , P A ( 1 9 9 5 ) M e t h y l a t i o n o f t h e 5 ' C p G i s l a n d o f t h e p 1 6 / C D K N 2 t u m o r s u p p r e s s o r g e n e i n n o r m a l a n d t r a n s f o r m e d h u m a n t i s s u e s c o r r e l a t e s w i t h g e n e s i l e n c i n g . C a n e e L B e s , , 5 5 , 4 5 3 1 - 4 5 3 5 . H e r g e r s b e r g , M . ( 1 9 9 1 ) B i o l o g i c a l a s p e c t s o f c y t o s i n e m e t h y l a t i o n i n e u k a r y o t i c c e l l s . E x e e fl e e t j a , 4 7 , 1 1 7 1 - 1 1 8 5 . l s h i i , S . , K a d o n a g a , J . T . , T j i a n , R . , B r a d y , J . N . , M e r l i n o , G T . a n d P a s t a n , l . ( 1 9 8 6 ) B i n d i n g o f t h e S p 1 t r a n s c r i p t i o n f a c t o r b y t h e h u m a n H a r v e y r a s I p r o t o - o n c o g e n e p r o m o t e r . S e j e e e e , 2 3 2 , 1 4 1 0 - 1 4 1 3 . J e n t s c h , S . , G i i n t h e r t , U . a n d T r a u t n e r , T A . ( 1 9 8 1 ) D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e s a f f e c t i n g t h e s e q u e n c e 5 ’ C C G G . N u e l e c h e l g l e fi e e , 9 , 2 7 5 3 - 2 7 5 9 . K i a r i s , H . a n d S p a n d i d o s , D A . ( 1 9 9 5 ) M u t a t i o n s o f r a s g e n e s i n h u m a n t u m o u r s ( r e v i e w ) . W , 7 , 4 1 3 - 4 2 1 . 1 2 5 K o r c h , C . a n d H a g b l o m , P . ( 1 9 8 6 ) I n - v i v o - m o d i f i e d g o n o c o c c a l p l a s m i d p J D 1 . A m o d e l s y s t e m f o r a n a l y s i s o f r e s t r i c t i o n e n z y m e s e n s i t i v i t y t o D N A m o d i f i c a t i o n s . W . 1 6 1 . 5 1 9 - 5 2 4 . L e e , W . a n d K e l l e r , E B . ( 1 9 9 1 ) R e g u l a t o r y e l e m e n t s m e d i a t i n g t r a n s c r i p t i o n o f t h e h u m a n H a - r a s g e n e . , l , _ M e l , _ B i e l , , 2 2 0 , 5 9 9 - 6 1 1 . L i , E . , B e s t o r , T H . a n d J a e n i s c h , R . ( 1 9 9 2 ) T a r g e t e d m u t a t i o n o f t h e D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e g e n e r e s u l t s i n e m b r y o n i c l e t h a l i t y . C e l l , 6 9 , 9 1 5 - 9 2 6 . M a n n , M B . a n d S m i t h , H Q ( 1 9 7 7 ) S p e c i f i c i t y o f H p a l l a n d H a e l l l D N A m e t h y l a s e s . W . 4 , 4 2 1 1 - 4 2 2 1 . M a r o n p o t , R . R . , F o x , T . , M a l a r k e y , D E . a n d G o l d s w o r t h y , T L . ( 1 9 9 5 ) M u t a t i o n i n t h e r a s p r o t o - o n c o g e n e : C l u e s t o e t i o l o g y a n d m o l e c u l a r p a t h o g e n e s i s o f m o u s e l i v e r t u m o r s . I e x i e e l e g y , 1 0 1 , 1 2 5 - 1 5 6 . M a y o l , X . , N e a l , G . E . , D a v i e s , R . , R o m e r o , A . a n d D o m i n g o , J . ( 1 9 9 2 ) E t h i n y l e s t r a d i o l - i n d u c e d c e l l p r o l i f e r a t i o n i n r a t l i v e r . I n v o l v e m e n t o f s p e c i f i c p o p u l a t i o n s o f h e p a t o c y t e s . C a m e g e e e e i e , 1 3 , 2 3 8 1 - 2 3 8 8 . M c C l e l l a n d , M . a n d N e l s o n , M . ( 1 9 9 2 ) E f f e c t o f s i t e - s p e c i f i c m e t h y l a t i o n o n D N A m o d i f i c a t i o n m e t h y l t r a n s f e r a s e s a n d r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e s . N y e l e i L A e i e e B e e “ ( S u p p l . ) 2 0 , 2 1 4 5 - 2 1 5 7 . M e e h a n , R . , L e w i s , J . , C r o s s , 8 . , N a n , X . , J e p p e s e n , P . a n d B i r d , A . ( 1 9 9 2 ) T r a n s c r i p t i o n a l r e p r e s s i o n b y m e t h y l a t i o n o f C p G . J _ . _ C _ e _ l l _ $ e l e _ n _ c e , ( S u p p l . ) 1 6 , 9 - 1 4 . M i k o l , Y . B . , H o o v e r , K . . , L C r e a s i a , D . a n d P o i r i e r , L A . ( 1 9 8 3 ) H e p a t o c a r c i n o g e n e s i s i n r a t s f e d m e t h y l - - d e f i c i e n t , a m i n o a c i d - d e f i n e d d i e t s . W A . 1 6 1 9 - 1 6 2 9 M o u l d s , B A . a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 4 ) S p o n t a n e o u s m u t a t i o n a t c o d o n 6 1 o f t h e H a - r a s g e n e i n t h e n a s c e n t l i v e r o f B 6 0 3 F 1 , C 3 H / H e a n d 0 5 7 B L / 6 m i c e . M i s s . 3 1 1 . 1 - 7 . M i a n e l , P . A . , P f o h l - L e s z k o w i c z , A . , R 6 h r d a n z , E . , K e i t h , G . , D i r h e i m e r , G . a n d B o c k , K . . W ( 1 9 9 1 ) S i t e - - s p e c i f i c h y p o m e t h y l a t i o n o f c - m y c p r o t o o n c o g e n e i n l i v e r n o d u l e s a n d i n h i b i t i o n o f D N A m e t h y l a t i o n b y N - - n i t r o s o m o r p h o l i n e . W . 4 2 3 6 5 - 3 7 1 N e a d e s , R . , B e t z , N . A . , S h e n g , X . a n d P e l l i n g , J . C . ( 1 9 9 1 ) T r a n s i e n t e x p r e s s i o n o f t h e c l o n e d m o u s e c - H a - r a s 5 ' u p s t r e a m r e g i o n i n t r a n s f e c t e d p r i m a r y S E N C A R m o u s e k e r a t i n o c y t e s d e m o n s t r a t e s i t s p o w e r a s a p r o m o t e r e l e m e n t . W . 4 . 3 6 9 - 3 7 5 . 1 2 6 N e w b e r n e , P . M . , d e C a m a r g o , J . L . V . a n d C l a r k , A . J . ( 1 9 8 2 ) C h o l i n e d e f i c i e n c y , p a r t i a l h e p a t e c t o m y , a n d l i v e r t u m o r s i n r a t s a n d m i c e . I e x j e e L _ P a l | 1 , , 1 0 , 9 5 - 1 0 6 . O n o , T . , T a w a , R . , S h i n y a , K , H i r o s e , S . a n d O k a d a , S . ( 1 9 8 6 ) M e t h y l a t i o n o f t h e c - m y c g e n e c h a n g e s d u r i n g a g i n g p r o c e s s o f m i c e . W C e m m , , 1 3 9 , 1 2 9 9 - 1 3 0 4 . O n o , T . , T a k a h a s h i , N . a n d O k a d a , S . ( 1 9 8 9 ) A g e - a s s o c i a t e d c h a n g e s i n D N A m e t h y l a t i o n a n d m R N A l e v e l o f t h e c - m y c g e n e i n s p l e e n a n d l i v e r o f m i c e . 1 5 0 9 1 8 1 2 3 9 5 . . . 2 1 9 . 3 9 - 5 0 - P u l c i a n i , S . , S a n t o s , E . , L o n g , L . K . , S o r r e n t i n o , V . a n d B a r b a i c i d , M . ( 1 9 8 5 ) r a s g e n e a m p l i f i c a t i o n a n d m a l i g n a n t t r a n s f o r m a t i o n . M e l , _ C e l l , _ B _ i e l , , 5 , 2 8 3 6 - 2 8 4 1 . R a y , J . S . , H a r b i s o n , M . L . , M c C l a i n , R . M . a n d G o o d m a n , J . . I ( 1 9 9 4 ) A l t e r a t i o n s i n t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s a n d e x p r e s s i o n o f t h e r a f o n c o g e n e i n p h e n o b a r b i t a l - i n d u c e d a n d s p o n t a n e o u s B 6 C S F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s . M e L C a m e e e e m , 9 , 1 5 5 - 1 6 6 . R a z i n , A . a n d C e d a r , H . ( 1 9 9 1 ) D N A m e t h y l a t i o n a n d g e n e e x p r e s s i o n . M m b i Q L B e y . 5 5 . 4 5 1 - 4 5 8 . R a z i n , A . a n d K a f r i , T . ( 1 9 9 4 ) D N A m e t h y l a t i o n f r o m e m b r y o t o a d u l t . E m W M . 4 8 , 5 3 - 8 1 . S h a s t r y , B . S . ( 1 9 9 5 ) O v e r e x p r e s s i o n o f g e n e s i n h e a l t h a n d s i c k n e s s . A b i r d ’ s e y e v i e w . C e m e , l B C C m e . P h y e l e l . 1 1 2 B , 1 - 1 3 . S h e k h a r , P . V . M . a n d M i l l e r , F . R . ( 1 9 9 4 - 9 5 ) C o r r e l a t i o n o f d i f f e r e n c e s i n m o d u l a t i o n o f r a s e x p r e s s i o n w i t h m e t a s t a t i c c o m p e t e n c e o f m o u s e m a m m a r y t u m o r s u b p o p u l a t i o n s . I n v a s i e n a n e M e t a s t a e i e , 1 4 , 2 7 - 3 7 . S t é g e r , R . , K u b i c k a , P . , L i u , C - G . , K a f r i , T . , R a z i n , A . , C e d a r , H . a n d B a r l o w , D P . ( 1 9 9 3 ) . M a t e r n a l - s p e c i f i c m e t h y l a t i o n o f t h e i m p r i n t e d m o u s e l g f 2 r l o c u s i d e n t i f i e s t h e e x p r e s s e d l o c u s a s c a r r y i n g t h e i m p r i n t i n g s i g n a l . C e l l , 7 3 , 6 1 - 7 1 . S t r a u s s , W M . ( 1 9 9 0 ) P r e p a r a t i o n o f g e n o m i c D N A f r o m m a m m a l i a n t i s s u e . I n A u s u b e l , F M , B r e n t , R , K i n g s t o n , R . E . , M o o r e , D . . , D S e i d m a n , J . . , G S m i t h , J . A . a n d S t r u h l K ( e d S ) W W W J o h n W i l e y a n d S o n s , N e w Y o r k , p p . 2 . 2 1 - . . . 2 2 3 S w i s s h e l m , K . , D i s t e c h e , C . M . , T h o r v a l d s e n , J . , N e l s o n , A . a n d S a l k , D . ( 1 9 9 0 ) A g e - r e l a t e d i n c r e a s e i n m e t h y l a t i o n o f r i b o s o m a l g e n e s a n d i n a c t i v a t i o n o f c h r o m o s o m e - s p e c i f i c r R N A g e n e c l u s t e r s i n m o u s e . M e l a t . R e e , 2 3 7 , 1 3 1 - 1 4 6 . 1 2 7 U e d a , T . , Y a m a z a k i , K . , S u z u k i , R . , F u j i m o t o , H . , S a s a k i , H . , S a k a k i , Y . a n d H i g a s h i n a k a g a w a , T . ( 1 9 9 2 ) P a r e n t a l m e t h y l a t i o n p a t t e r n s o f a t r a n s g e n i c l o c u s i n a d u l t s o m a t i c t i s s u e s a r e i m p r i n t e d d u r i n g g a m e t o g e n e s i s . C e y e l e e m e m , 1 1 6 , 8 3 1 - . 8 3 9 U e h a r a , Y . , O n o , T . , K u r i s h i t a , A . , K o k u r y u , H . a n d O k a d a , S . ( 1 9 8 9 ) A g e - d e p e n d e n t a n d t i s s u e - s p e c i f i c c h a n g e s o f D N A m e t h y l a t i o n w i t h i n a n d a r o u n d t h e c - f o s g e n e i n m i c e . C n e e g e n e , 4 , 1 0 2 3 - 1 0 2 8 . V o r c e , R . L . a n d G o o d m a n , J . . I ( 1 9 9 1 ) H y p o m e t h y l a t i o n o f r a s o n c o g e n e s i n c h e m i c a l l y i n d u c e d a n d s p o n t a n e o u s B 6 0 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s . , l , _ T _ o x l e e L E n J L a n t l e a l t b . 3 4 3 6 7 - 3 8 4 W i l s o n , V . L . , S m i t h , R . A . , M a , S . a n d C u t l e r , R C . ( 1 9 8 7 ) G e n o m i c 5 - m e t h y l d e o x y c y t i d i n e d e c r e a s e s w i t h a g e . J _ B | e _ l , _ C _ h e m l , 2 6 2 , 9 9 4 8 - 9 9 5 1 . W o o d c o c k , D . . , M C r o w t h e r , P . . J a n d D i v e r , W P ( 1 9 8 7 ) T h e m a j o r i t y o f m e t h y l a t e d d e o x y c y t i d i n e s i n h u m a n D N A a r e n o t i n t h e C p G d i n u c l e o t i d e . W 0 1 . 1 4 5 , 8 8 8 - 8 9 4 . C h a p t e r 4 P R E F A C E T h e n e x t s e r i e s o f e x p e r i m e n t s i n v o l v e d e x a m i n i n g t h e e f f e c t o f t h r e e t u m o r p r o m o t i n g t r e a t m e n t s ( a C M D d i e t , P B , a n d t h e c o - a d m i n i s t r a t i o n o f a C M D d i e t a n d P B ) o n c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d g l o b a l l i v e r D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s i n s t r a i n s o f m i c e w i t h d i f f e r i n g s e n s i t i v i t i e s t o l i v e r t u m o r f o r m a t i o n . T h e B 6 C 3 F 1 m o u s e i s u s e d a s t h e r e l a t i v e l y s u s c e p t i b l e s t r a i n a n d t h e C S 7 B L / 6 m o u s e i s u s e d a s t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t s t r a i n . S p e c i f i c a l l y , m y e x a m i n a t i o n o f c e l l p r o l i f e r a t i o n w a s u n i q u e i n t h a t a d e t e r m i n a t i o n w a s m a d e r e g a r d i n g d i f f e r e n t c e l l p o p u l a t i o n s i n t h e l i v e r : n o n - h e p a t o c y t e s , h e p a t o c y t e s , b i n u c l e a t e d h e p a t o c y t e s , a n d k a r y o m e g a l o c y t e s . T y p i c a l l y , c e l l p r o l i f e r a t i o n i s d e t e r m i n e d a s a n a m o u n t o f r a d i o a c t i v i t y p e r u g l i v e r , o r i s l i m i t e d t o a n a s s e s s m e n t o f h e p a t o c y t e s . F o r t h i s a s s e s s m e n t o f h e p a t o c y t e l a b e l i n g i n d e x , t h e l a s t t h r e e c a t e g o r i e s a r e c o m b i n e d t o o b t a i n t h e t o t a l h e p a t o c y t e p o p u l a t i o n i n t h e l i v e r . l w a s i n t e r e s t e d i n a s s e s s i n g t h e a b i l i t y o f ( 1 ) c e l l p r o l i f e r a t i o n t o b e a l t e r e d b y t h e p r o m o t i n g t r e a t m e n t s , a n d ( 2 ) D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s t o b e c h a n g e d b y t h e p r o m o t i n g t r e a t m e n t s i n r e l a t i o n s h i p t o c h a n g e s i n c e l l p r o l i f e r a t i o n . Q u i t e s u r p r i s i n g l y , I i d e n t i f i e d a h i g h e r l e v e l o f b a s a l a n d p r o m o t e r - i n d u c e d h e p a t o c y t e c e l l p r o l i f e r a t i o n i n t h e r e l a t i v e l y l i v e r t u m o r r e s i s t a n t 0 5 7 B L / 6 . A t t h e s a m e t i m e , g l o b a l h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A o c c u r r e d t o a g r e a t e r e x t e n t i n t h e r e l a t i v e l y l i v e r t u m o r s e n s i t i v e B 6 0 3 F 1 . T h i s i l l u s t r a t e s t h e l a c k o f a o n e - t o - o n e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n ( 1 ) c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d t u m o r 1 2 8 1 2 9 p r o m o t i o n a n d ( 2 ) c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A i n r e s p o n s e t o t u m o r p r o m o t i n g t r e a t m e n t s . T h u s , t h e s e d a t a s u p p o r t t h e i d e a t h a t d e m e t h y l a t i o n o f D N A n o t l i n k e d t o D N A s y n t h e s i s m a y b e i n v o l v e d i n h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A a n d i n d i c a t e a r o l e f o r t h i s p r o c e s s i n t u m o r p r o m o t i o n . F u r t h e r m o r e , t h e e x p e r i m e n t s d e s c r i b e d i n t h i s c h a p t e r a r e d i s c u s s e d i n t e r m s o f t h e i n s i g h t t h a t t h e r e s u l t s p r o v i d e r e g a r d i n g a b a s i s f o r t h e r e l a t i v e h i g h s e n s i t i v i t y o f t h e B 6 C 3 F 1 m o u s e t o l i v e r t u m o r i g e n e s i s . T h i s m a n u s c r i p t h a s b e e n s u b m i t t e d f o r p u b l i c a t i o n . C h a p t e r 4 C E L L P R O L I F E R A T I O N A N D G L O B A L M E T H Y L A T I O N S T A T U S C H A N G E S I N M O U S E L I V E R A F T E R P H E N O B A R B I T A L A N D / O R C H O L I N E - D E V O I D , M E T H I O N I N E - D E F I C I E N T D I E T A D M I N I S T R A T I O N J e n n i f e r L . C o u n t s ‘ , J u a n l . S a r m i e n t o z , M a r g a r e t L . H a r b i s o n z , J o h n C . D o w n i n g z , R . M i c h a e l M c C l a i n z , a n d J a y I . G o o d m a n ‘ ‘ D e p a r t m e n t o f P h a r m a c o l o g y a n d T o x i c o l o g y , _ M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y , E a s t L a n s i n g , M I 4 8 8 2 4 2 H o f f m a n n L a R o c h e , l n c . , N u t l e y , N J A B S T R A C T O u r l a b o r a t o r y i s t e s t i n g t h e h y p o t h e s i s t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A ( a d e c r e a s e d c o n t e n t o f 5 - m e t h y l c y t o s i n e ( 5 M e C ) c o m p a r e d t o c y t o s i n e ) f a c i l i t a t e s a b e r r a n t o n c o g e n e e x p r e s s i o n t h a t i s i n v o l v e d i n t u m o r i g e n e s i s , u s i n g a m o d e l s y s t e m o f m o u s e s t r a i n s w i t h d i f f e r i n g s u s c e p t i b i l i t i e s t o l i v e r t u m o r i g e n e s i s . T h e B 6 C 3 F 1 ( C S 7 B L / 6 X C 3 H / H e ) m o u s e s e r v e s a s t h e r e l a t i v e l y s u s c e p t i b l e s t r a i n a n d t h e C 5 7 B U 6 s e r v e s a s t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t s t r a i n . P r e v i o u s l y , w e s h o w e d h y p o m e t h y l a t i o n o f t h e r e f o n c o g e n e i n t h e B 6 C 3 F 1 m o u s e , b u t n o t t h e C S 7 B U 6 , a f t e r 2 w e e k s o f a p r o m o t i n g d o s e o f p h e n o b a r b i t a l ( P B ) . I n a d d i t i o n , h y p o m e t h y l a t i o n a n d i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f r a s a n d r e f w e r e e v i d e n t i n P B - i n d u c e d l i v e r t u m o r s i n t h e B B C 3 F 1 m o u s e . T h e s e s t u d i e s l e d t o o u r c u r r e n t e x a m i n a t i o n o f h e p a t o c y t e a n d n o n - h e p a t o c y t e p r o l i f e r a t i o n i n c o n j u n c t i o n w i t h 1 3 0 1 3 1 a n a s s e s s m e n t o f g l o b a l m e t h y l a t i o n c h a n g e s i n l i v e r D N A o f B G C 3 F 1 a n d C S 7 B L / 6 m i c e f o l l o w i n g P B t r e a t m e n t a n d / o r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f a c h o l i n e - d e v o i d , m e t h i o n i n e - d e f i c i e n t d i e t ( C M D ) , a d i e t a r y m e t h y l d e f i c i e n c y t h a t l e a d s t o l i v e r t u m o r s t h r o u g h p r o m o t i n g e f f e c t s . B r d U i n c o r p o r a t i o n i n t o D N A , u s e d t o m e a s u r e c e l l p r o l i f e r a t i o n i n d i r e c t l y , w a s v i s u a l i z e d b y i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y a n d q u a n t i f i e d b y a M a c i n t o s h - b a s e d i m a g e a n a l y s i s s y s t e m ( N I H I m a g e ) . I n c r e a s e d h e p a t o c y t e p r o l i f e r a t i o n w a s d e m o n s t r a t e d f o l l o w i n g a l l t h r e e t r e a t m e n t s . T h e i n c r e a s e w a s l a r g e r i n t h e C 5 7 B U 6 ( t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t s t r a i n ) a s c o m p a r e d t o t h e B 6 C 3 F 1 . I n c o n t r a s t , g l o b a l h y p o m e t h y l a t i o n w a s e v i d e n t t o a l a r g e r e x t e n t i n t h e B S C 3 F 1 m o u s e , a s c o m p a r e d t o t h e C S 7 B L / 6 . E v a l u a t i o n o f t h e s e d a t a s u g g e s t t h a t t h e h e i g h t e n e d s e n s i t i v i t y o f t h e B 6 C 3 F 1 m o u s e , c o m p a r e d t o t h e C S 7 B L / 6 , i s d u e , i n p a r t , t o a d e c r e a s e d c a p a c i t y f o r , o r f i d e l i t y o f , m a i n t a i n i n g n o r m a l m e t h y l a t i o n . T h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t s t r a i n i s b e t t e r a b l e t o m a i n t a i n t h e n o r m a l m e t h y l a t i o n s t a t u s o f D N A i n t h e f a c e o f a h i g h e r l e v e l o f c e l l p r o l i f e r a t i o n . I N T R O D U C T I O N 5 - M e t h y l c y t o s i n e ( 5 M e C ) i s a n a t u r a l l y o c c u r r i n g m e t h y l a t e d b a s e i n m a m m a l i a n D N A w h i c h b a s e p a i r s w i t h g u a n i n e a n d e x i s t s a t a p p r o x i m a t e l y 3 % o f c y t o s i n e r e s i d u e s . 5 M e C i s u n d e r r e p r e s e n t e d i n t h e b u l k o f t h e g e n o m e , w h i l e i t i s c o m m o n l y f o u n d i n t h e p r o m o t e r r e g i o n o f m a n y g e n e s ( B i r d , 1 9 8 6 ) . T h e l e v e l o f 5 M e C i n D N A i s , g e n e r a l l y , i n v e r s e l y a s s o c i a t e d w i t h t h e l e v e l o f g e n e e x p r e s s i o n ; t h a t i s , a h y p o m e t h y l a t e d g e n e c a n b e c o n s i d e r e d t o h a v e a 1 3 2 h i g h e r p o t e n t i a l f o r e x p r e s s i o n t h a n a h y p e r m e t h y l a t e d g e n e . D N A m e t h y l a t i o n a l s o p l a y s a r o l e i n t h e r e g u l a t i o n o f d e v e l o p m e n t a n d i m p r i n t i n g ( R a z i n a n d K a f r i , 1 9 9 4 ) . M o n o a l l e l i c e x p r e s s i o n o f a g e n e , i . e . , e i t h e r t h e m a t e r n a l a l l e l e o r t h e p a t e r n a l a l l e l e , i s r e f e r r e d t o a s i m p r i n t i n g . T h e m a n n o s e - 6 - p h o s p h a t e / i n s u l i n g r o w t h f a c t o r I I r e c e p t o r ( M 6 P - I G F 2 r ) i s o n e i m p r i n t e d g e n e w h e r e m e t h y l a t i o n h a s m o r e t h a n o n e f u n c t i o n . I n t h i s g e n e , t h e i m p r i n t i n g s i g n a l i s m e t h y l a t i o n o f a C p G s i t e i n a n i n t r o n o f t h e e x p r e s s e d a l l e l e , w h i l e . t h e 5 ’ f l a n k i n g r e g i o n m u s t b e h y p o m e t h y l a t e d f o r e x p r e s s i o n o f t h e g e n e t o o c c u r ( S t é g e r e t a l . , 1 9 9 3 ) . H i g h e r l e v e l s o f g e n e e x p r e s s i o n m a y l e a d t o p e r t u r b e d c e l l g r o w t h a n d / o r d i f f e r e n t i a t i o n . H o w e v e r , i f t h e g e n e i s a t u m o r s u p p r e s s o r g e n e , h y p e r m e t h y l a t i o n w o u l d b e a n t i c i p a t e d t o s i l e n c e i t s e x p r e s s i o n a n d t h u s , r e m o v e i t s e s s e n t i a l f u n c t i o n ( H e r m a n e t a l . , 1 9 9 5 ; G o n z a l e z - Z u l u e t a e t a l . , 1 9 9 5 ) . A l t e r a t i o n s i n m e t h y l a t i o n m a y p l a y a v a r i e t y o f r o l e s i n c a r c i n o g e n e s i s ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 a ) , a n d w e h a v e e m p h a s i z e d t e s t i n g t h e h y p o t h e s i s t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A ( a d e c r e a s e d l e v e l o f 5 M e C ) f a c i l i t a t e s t h e a b e r r a n t g e n e e x p r e s s i o n t h a t i s i n v o l v e d i n t u m o r p r o m o t i o n ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 ) . W h e n a t t e m p t i n g t o u n d e r s t a n d t r e a t m e n t r e l a t e d a l t e r a t i o n s i n m e t h y l a t i o n s t a t u s , i t i s i m p o r t a n t t o b e c o g n i z a n t o f p o s s i b l e c h a n g e s i n c e l l p r o l i f e r a t i o n a s w e l l . 5 M e C i s n o t i n c o r p o r a t e d d i r e c t l y i n t o D N A , r a t h e r t h e m e t h y l g r o u p i s a d d e d t o c y t o s i n e o f t h e n e w l y s y n t h e s i z e d s t r a n d , a t h e m i m e t h y l a t e d s i t e s , a f t e r D N A r e p l i c a t i o n t h r o u g h a n S - a d e n o s y l m e t h i o n i n e ( S A M ) - r e q u i r i n g m a i n t e n a n c e m e t h y l a s e ( H e r g e r s b e r g , 1 9 9 1 ) . T h u s , 1 3 3 h y p o m e t h y l a t i o n m a y o c c u r s e c o n d a r y t o i n c r e a s e d c e l l p r o l i f e r a t i o n i f D N A m a i n t e n a n c e m e t h y l a t i o n i s n o t c a r r i e d o u t f a i t h f u l l y ( R a z i n a n d K a f r i , 1 9 9 4 ; C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 ) . A d d i t i o n a l l y , d e n o v o m e t h y l a t i o n ( i . e . , m e t h y l a t i o n t h a t d o e s n o t r e q u i r e a h e m i m e t h y l a t e d s i t e t o s i g n a l t h e m o d i f i c a t i o n ) a n d d e m e t h y l a t i o n n o t l i n k e d t o D N A r e p l i c a t i o n h a v e b e e n d e m o n s t r a t e d a n d m a y p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n m o d i f y i n g D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s ( R a z i n a n d K a f r i , 1 9 9 4 ) . C e l l p r o l i f e r a t i o n i s i n v o l v e d w i t h m a n y a s p e c t s o f c a r c i n o g e n e s i s ( M e l n i c k e t a l . , 1 9 9 3 ) . I t i s r e q u i r e d t o fi x a p r o m u t a g e n i c l e s i o n ( C o h e n a n d E l l w e i n , 1 9 9 1 ) a n d a l s o t o e x p a n d i n i t i a t e d c e l l p o p u l a t i o n s t h r o u g h p r o m o t i o n a n d p r o g r e s s i o n t o a f r a n k m a l i g n a n c y . H e i g h t e n e d c e l l p r o l i f e r a t i o n m a y a l s o f a c i l i t a t e m u t a g e n e s i s ( A m e s a n d G o l d , 1 9 9 0 ) . T h u s , c e l l p r o l i f e r a t i o n c a n b e i n v o l v e d i n g e n e t i c a n d e p i g e n e t i c a s p e c t s o f t u m o r i g e n e s i s , b y f a c i l i t a t i n g i n c r e a s e d m u t a t i o n r a t e s a n d r e s u l t i n g i n h y p o m e t h y l a t i o n i f t h e m a i n t e n a n c e m e t h y l a t i o n r e a c t i o n i s n o t c o m p l e t e d , i . e . , a l l h e m i m e t h y l a t e d s i t e s a r e n o t c o n v e r t e d t o f u l l y m e t h y l a t e d s i t e s . C h o l i n e a n d m e t h i o n i n e a r e d i e t a r y s o u r c e s p r o v i d i n g m e t h y l g r o u p s f o r t h e s y n t h e s i s o f S A M , t h e c o - f a c t o r f o r m e t h y l a t i o n r e a c t i o n s . D i e t s d e v o i d o f c h o l i n e a n d d e f i c i e n t i n m e t h i o n i n e ( C M D d i e t s ) l e a d t o i n c r e a s e d h e p a t o c y t e c e l l p r o l i f e r a t i o n ( D e n d a e t a l . , 1 9 9 4 ; A b a n o b i e t a l . , 1 9 8 2 ) , h y p o m e t h y l a t i o n , a n d i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f o n c o g e n e s ( r e f e r e n c e d i n W a i n f a n a n d P o i r i e r , 1 9 9 2 ) . F u r t h e r , C M D d i e t s l e a d t o l i v e r t u m o r f o r m a t i o n i n r a t s ( M i k o l e t a l . , 1 9 8 3 ; G h o s h a l a n d F a r b e r , 1 9 8 4 ) a n d c h o l i n e d e f i c i e n t d i e t s a r e t u m o r i g e n i c t o B 6 C 3 F 1 m i c e ( N e w b e m e e t a l . , 1 9 8 2 ) . I t h a s b e e n d e m o n s t r a t e d t h a t t h e C M D 1 3 4 d i e t l e a d s t o l i v e r t u m o r s t h r o u g h p r o m o t i n g e f f e c t s o f t h e d i e t ( S a w a d a e t a l . , 1 9 9 0 ) . C M D d i e t a d m i n i s t r a t i o n f o r 1 2 m o n t h s d i d n o t i n c r e a s e l i v e r t u m o r f o r m a t i o n i n C 3 H / H e N m i c e ( S h i v a p u r k a r e t a l . , 1 9 8 6 ) . H o w e v e r , i t s h o u l d b e n o t e d t h a t t h i s t i m e p e r i o d w o u l d b e t o o e a r l y t o d i s c e r n a C M D d i e t - i n d u c e d i n c r e a s e i n r a t l i v e r t u m o r s ( M i k o l e t a l . , 1 9 8 3 ) . T h e o b s e r v a t i o n i s o f i n t e r e s t , h o w e v e r , a s b o t h B 6 C 3 F 1 a n d C 3 H / H e m i c e a r e c o n s i d e r e d t o b e r e l a t i v e l y s e n s i t i v e t o l i v e r t u m o r f o r m a t i o n a n d h a v e 1 0 0 % l i v e r t u m o r i n c i d e n c e a f t e r 1 2 m o n t h s o f P B a d m i n i s t r a t i o n ( B e c k e r , 1 9 8 2 ) . T h u s , a C M D d i e t m a y p r o m o t e l i v e r t u m o r f o r m a t i o n d i f f e r e n t l y t h a n P B a d m i n i s t r a t i o n . A r o l e f o r m e t h y l g r o u p d e f i c i e n c y a s a n e p i g e n e t i c m e c h a n i s m o f t u m o r i g e n e s i s h a s b e e n s u p p o r t e d b y t h e a b i l i t y o f e x c e s s c h o l i n e a n d m e t h i o n i n e t o p r o t e c t a g a i n s t a f l a t o x i n i n d u c e d l i v e r t u m o r f o r m a t i o n i n t h e B 6 C S F 1 m o u s e ( N e w b e r n e e t a l . , 1 9 9 0 ) . A d d i t i o n a l l y , d i e t s p r o v i d i n g e x o g e n o u s S A M h a v e b e e n d e m o n s t r a t e d t o p r o t e c t a g a i n s t c a r c i n o g e n - i n d u c e d r a t l i v e r t u m o r f o r m a t i o n ( P a s c a l e e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h e s e d a t a s u p p o r t t h e h y p o t h e s i s t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A i s i n v o l v e d i n t u m o r p r o m o t i o n ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 ) . P B i s a r o d e n t l i v e r t u m o r p r o m o t e r ( P e r i a n o e t a l . , 1 9 7 1 ; P i t o t , 1 9 9 0 ) w h i c h c a u s e s a t r a n s i e n t i n c r e a s e i n c e l l p r o l i f e r a t i o n d u r i n g t h e e a r l y t i m e s ( i . e . , 1 - 2 w e e k s ) f o l l o w i n g i t s a d m i n i s t r a t i o n a t a p r o m o t i n g d o s e ( L i n e t a l . , 1 9 8 9 ) . T h e r e h a v e b e e n a f e w r e p o r t s d e t a i l i n g t h e e f f e c t s o f t h e c o - a d m i n i s t r a t i o n o f a c h o l i n e - d e v o i d d i e t a n d P B i n t h e r a t ( S h i n o z u k a a n d L o m b a r d i , 1 9 8 0 ; S h i n o z u k a e t a l . , 1 9 8 2 ; A b a n o b i e t a l . , 1 9 8 2 ) . P B a d m i n i s t e r e d w i t h a c h o l i n e - d e v o i d d i e t h a d a s y n e r g i s t i c e f f e c t o n t h e n u m b e r a n d s i z e o f 1 3 5 G G T p o s i t i v e f o c i , a p u t a t i v e m a r k e r o f p r e n e o p l a s t i c c e l l s ( S h i n o z u k a a n d L o m b a r d i , 1 9 8 0 ) . A d d i t i o n a l s t u d i e s b y t h e s e i n v e s t i g a t o r s d e m o n s t r a t e d t h a t P B a d m i n i s t e r e d w i t h a c h o l i n e d e v o i d d i e t f o r 1 a n d 3 w e e k s l e d t o a n i n h i b i t i o n o f D N A s y n t h e s i s a n d h e p a t o c y t e l a b e l i n g i n d e x c o m p a r e d t o t h e c h o l i n e d e v o i d d i e t a l o n e ( A b a n o b i e t a l . , 1 9 8 2 ) . P B c o - a d m i n i s t e r e d w i t h a C M D d i e t i n t h e r a t a l s o w a s r e p o r t e d t o d e c r e a s e t h e l a b e l i n g i n d e x o f f o c i c o m p a r e d t o C M D d i e t a l o n e ( S h i n o z u k a e t a l . , 1 9 8 2 ) . W e h a v e e x a m i n e d c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d g l o b a l h e p a t i c m e t h y l a t i o n s t a t u s i n r e l a t i v e l y l i v e r t u m o r s u s c e p t i b l e B B C 3 F 1 m i c e a n d m a d e r e l e v a n t c o m p a r i s o n s w i t h r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C S 7 B L / 6 m i c e ( B e c k e r , 1 9 8 2 ) f o l l o w i n g e x p o s u r e t o t u m o r p r o m o t i n g t r e a t m e n t s , P B a n d / o r a C M D d i e t . C e l l p r o l i f e r a t i o n w a s h i g h e r i n t h e C S 7 B L / 6 w h i l e h y p o m e t h y l a t i o n o c c u r r e d t o a g r e a t e r e x t e n t i n t h e B 6 C 3 F 1 . T h e d u a l a d m i n i s t r a t i o n o f t h e C M D d i e t w i t h P B l e d t o e n h a n c e d c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d g r e a t e r g l o b a l h y p o m e t h y l a t i o n , w i t h s i m i l a r t r e n d s i n t e r m s o f s t r a i n s e n s i t i v i t i e s a s c o m p a r e d t o e i t h e r t r e a t m e n t a l o n e ( i . e . , g r e a t e r i n c r e a s e s i n c e l l p r o l i f e r a t i o n i n t h e C 5 7 B U 6 , a n d g r e a t e r l e v e l s o f h y p o m e t h y l a t i o n i n t h e B 6 C 3 F 1 ) . T h u s , t h e B S C 3 F 1 h a s a r e l a t i v e l y l o w c a p a c i t y t o m a i n t a i n t h e n a s c e n t m e t h y l a t i o n s t a t u s o f i t s h e p a t i c D N A . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S A n i m a l s M a l e B G C 3 F 1 a n d C 5 7 B U 6 w e r e o b t a i n e d f r o m C h a r l e s R i v e r ( P o r t a g e , M I ) a n d h o u s e d i n d i v i d u a l l y i n a t e m p e r a t u r e a n d h u m i d i t y c o n t r o l l e d r o o m o n a 1 3 6 1 2 h o u r l i g h t / d a r k s c h e d u l e w i t h f o o d a n d w a t e r a d I i b i t u m . A n i m a l s w e r e t r e a t e d i n a c c o r d a n c e w i t h a p p l i c a b l e g u i d e l i n e s . T h e m i c e w e r e a c c l i m a t e d t o t h e i r s u r r o u n d i n g s f o r 1 w e e k p r i o r t o b e i n g r a n d o m l y a s s i g n e d t o a t r e a t m e n t g r o u p ( 6 a n i m a l s o f e a c h s t r a i n p e r g r o u p ) . A l l d i e t s w e r e p u r c h a s e d f r o m T e k l a d ( M a d i s o n , W I ) . T h e f i r s t g r o u p o f a n i m a l s r e c e i v e d c o n t r o l d i e t ( a m i n o a c i d d e f i n e d , T D # 9 2 1 0 6 , w i t h m i n e r a l m i x , A I N - 7 6 a n d v i t a m i n m i x , T D # 4 0 0 6 0 ) . T h e s e c o n d t r e a t m e n t c o n s i s t e d o f a C M D d i e t ( T D # 9 2 1 0 7 , w i t h m i n e r a l m i x , A l N - 7 6 a n d v i t a m i n m i x , T D # 8 3 1 7 1 ) ( M i k o l e t a l . , 1 9 8 3 ) . T h e C M D d i e t c o n t a i n s t h e m e t h i o n i n e p r e c u r s o r , 0 . 9 % ( w / w ) D L - h o m o c y s t i n e ( M i k o l e t a l . , 1 9 8 3 ) . T h e t h i r d t r e a t m e n t w a s a l i v e r t u m o r p r o m o t i n g d o s e o f P B i n t h e d r i n k i n g w a t e r , 0 . 0 5 % ( w / w ) ( D i w a n e t a l . , 1 9 8 5 ) w i t h c o n t r o l d i e t . T h e f o u r t h t r e a t m e n t w a s c o - a d m i n i s t r a t i o n o f t h e C M D d i e t a n d P B . A n i m a l s w e r e m a i n t a i n e d i n t h e s e g r o u p s f o r 1 , 2 , o r 4 w e e k s . A 6 w e e k t i m e p o i n t , a r e c o v e r y g r o u p , i . e . , 4 w e e k s o f t r e a t m e n t , f o l l o w e d b y 2 w e e k s o f c o n t r o l d i e t , w a s i n c l u d e d t o e x a m i n e r e v e r s i b i l i t y . O n e w e e k p r i o r t o s a c r i f i c e b y 0 0 2 a s p h y x i a t i o n , a n i m a l s w e r e i m p l a n t e d s u b c u t a n e o u s l y w i t h a n o s m o t i c m i n i p u m p ( M o d e l 2 0 0 2 , A l z a C o r p . ) c o n t a i n i n g 2 0 m g / m L b r o m o d e o x y u r i d i n e ( B r d U ) . A d d i t i o n a l l y , g r o u p s o f m a l e B 6 0 3 F 1 a n d C S 7 B L / 6 m i c e r e c e i v e d e i t h e r c o n t r o l d i e t ( T D # 9 2 1 0 6 , A l N - 7 6 , a n d T D # 4 0 0 6 0 ) o r C M D d i e t ( T D # 9 2 1 0 7 , A l N - 7 6 , a n d T D # 8 3 1 7 1 ) f o r 1 2 w e e k s . A n i m a l s w e r e s a c r i f i c e d b y 0 0 2 a s p h y x i a t i o n , l i v e r s q u i c k l y e x c i s e d , w e i g h e d , e x a m i n e d g r o s s l y , s e c t i o n s c u t f o r h i s t o l o g y , a n d f i x e d . T h e r e m a i n d e r o f t h e l i v e r w a s s n a p f r o z e n i n l i q u i d n i t r o g e n u n t i l D N A i s o l a t i o n . T w o B 6 0 3 F 1 m i c e i n t h e C M D d i e t + P B g r o u p 1 3 7 a n d o n e C S 7 B L / 6 i n t h e c o n t r o l d i e t + P B d i e d p r i o r t o c o m p l e t i o n o f t h e s t u d y ; t h e y w e r e n o t i n c l u d e d i n a n y o f t h e a n a l y s e s . F u r t h e r , m i n i p u m p s d i s l o d g e d f r o m 2 a n i m a l s a n d t h e y w e r e n o t i n c l u d e d i n t h e a s s e s s m e n t o f c e l l p r o l i f e r a t i o n . D N A I s o l a t i o n D N A w a s i s o l a t e d e s s e n t i a l l y a s d e s c r i b e d ( S t r a u s s , 1 9 9 0 ) w i t h t h e a d d i t i o n o f a d i g e s t i o n w i t h 4 0 0 u g / m L R N A s e A ( S i g m a , S t . L o u i s , M O ) , a n d a s e c o n d d i g e s t i o n w i t h 2 0 0 u g / m L p r o t e i n a s e K ( B o e h r i n g e r M a n n h e i m B i o c h e m i c a l s , I n d i a n a p o l i s , I N ) . C e l l P r o l i f e r a t i o n A s s e s s m e n t l m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g f o r B r d U i n c o r p o r a t e d i n t o D N A w a s c a r r i e d o u t u t i l i z i n g a n t i - m o u s e B r d U a s t h e p r i m a r y a n t i b o d y a n d a n t i - m o u s e l g G a s t h e s e c o n d a r y a n t i b o d y . T h e d e t e c t i o n s y s t e m c o n s i s t e d o f a l k a l i n e p h o s p h a t a s e u t i l i z i n g F a s t R e d a s t h e c h r o m a g e n ( B i o m e d a C o r p . , F o s t e r C i t y , C A ) . S e c t i o n s w e r e l i g h t l y c o u n t e r s t a i n e d w i t h h e m a t o x y l i n p r i o r t o b e i n g m o u n t e d w i t h C r y s t a l M o u n t ( B i o m e d a C o r p . , F o s t e r C i t y , C A ) . W i t h s e c t i o n s s t a i n e d i n t h i s m a n n e r , n u c l e i c o n t a i n i n g B r d U i n c o r p o r a t e d i n t o D N A w e r e s t a i n e d r e d a n d t h e o t h e r n u c l e i w e r e s t a i n e d l i g h t b l u e ( F i g u r e 1 ) . A S o n y D X C - 9 6 0 M D R G B c a m e r a a t t a c h e d t o a N i k o n m i c r o s c o p e p r e s e n t e d t h e l i g h t m i c r o s c o p i c i m a g e s t o a S o n y v i d e o m o n i t o r ( m o d e l P V M 1 9 4 3 M D ) c o n n e c t e d t o a P o w e r M a c i n t o s h 8 1 0 0 / 8 0 A V c o m p u t e r e q u i p p e d w i t h a S c i o n L G 3 f r a m e g r a b b e r c a r d ( S c i o n , F r e d e r i c k , M D ) . A t w o - m o n i t o r s y s t e m w a s e m p l o y e d s u c h t h a t t h e l i v e i m a g e c o u l d r e a d i l y b e c o m p a r e d t o t h e F i g u r e 1 - D i g i t i z e d i m a g e o f M a c i n t o s h c o m p u t e r - a s s i s t e d a s s e s s m e n t o f c e l l p r o l i f e r a t i o n . ( A ) d i g i t i z e d c o l o r i m a g e ( B ) g r a y s c a l e i m a g e ( C ) t o t a l n u c l e i c o u n t e d i n t h e g r a y s c a l e p r e s e n t e d i n B , ( D ) l a b e l e d n u c l e i c o u n t e d i n t h e g r a y s c a l e i m a g e p r e s e n t e d i n B . 1 3 8 ' l e J n fi H 1 3 9 1 4 0 d i g i t i z e d c o m p u t e r i m a g e . T h e N I H I m a g e p r o g r a m ( v e r s i o n 1 . 5 6 ) ( p u b l i c d o m a i n s o f t w a r e w r i t t e n b y W a y n e R a s b a n d a t N I H t h a t i s a v a i l a b l e b y a n o n y m o u s F T P t o 1 2 8 . 2 3 1 . 9 8 . 3 2 ) w a s e m p l o y e d f o r i m a g e a n a l y s i s . A s s e s s m e n t o f c e l l p r o l i f e r a t i o n w a s f u r t h e r a s s i s t e d b y m a c r o s w r i t t e n b y o n e o f u s ( J . I . S . ) a n d d e s c r i b e d b e l o w . I n t h e g r a y s c a l e d i g i t i z e d i m a g e c a p t u r e d w i t h t h e r e d c o l o r c h a n n e l , t h e i n t e n s i t y o f t h e r e d s t a i n e d , B r d U c o n t a i n i n g n u c l e i w a s c o m p a r a b l e t o n o n - s t a i n e d n u c l e i s u c h t h a t a l l o f t h e n u c l e i i n t h e f i e l d w e r e d e t e c t e d a n d c o u n t e d . A f t e r e d i t i n g t h e i m a g e t o m a k e a n y c o r r e c t i o n s t h a t w e r e n e e d e d t o e n s u r e t h e c o m p u t e r r e p r e s e n t a t i o n o f t h e f i e l d w a s a c c u r a t e c o m p a r e d t o t h e m i c r o s c o p i c i m a g e , a t a b l e c o n t a i n i n g t h e a r e a , m i n i m u m a x i s a n d m a j o r a x i s f o r e a c h n u c l e u s i n t h e f i e l d w a s g e n e r a t e d . T h e s e d a t a w e r e c o p i e d i n t o t h e s p r e a d s h e e t p r o g r a m E x c e l ® . T h i s p r o c e d u r e w a s r e p e a t e d o n t h e s a m e f i e l d u s i n g t h e b l u e c o l o r c h a n n e l . I n t h e g r a y s c a l e d i g i t i z e d i m a g e c a p t u r e d w i t h t h e b l u e c o l o r c h a n n e l , t h e i n t e n s i t y o f t h e r e d - s t a i n e d n u c l e i w a s e n h a n c e d w h i l e t h e b l u e s t a i n e d n u c l e i i s r e d u c e d s u c h t h a t i t w a s e f f e c t i v e l y f i l t e r e d , f a c i l i t a t i n g t h e d i s c r i m i n a t i o n o f r e d s t a i n i n g n u c l e i ( i . e . , t h e B r d U c o n t a i n i n g n u c l e i ) b y t h e d e n s i t y s l i c e c o n t r o l . F o r e a c h l i v e r s e c t i o n , a m i n i m u m o f 1 5 f i e l d s a n d 1 3 0 0 n u c l e i w e r e c o u n t e d . O n c e a l l o f t h e f i e l d d a t a w e r e c o l l e c t e d i n t o E x c e l ® , t h e s h a p e a n d s i z e o f e a c h n u c l e u s w e r e c a l c u l a t e d . A d d i t i o n a l l y , w e d i s c r i m i n a t e d a m o n g d i f f e r e n t h e p a t o c y t e p o p u l a t i o n s w h e r e b i n u c l e a t e d h e p a t o c y t e s w e r e d e f i n e d a s t w o h e p a t o c y t e s i n c l o s e p r o x i m i t y t h a t a p p e a r e d t o b e i n t h e s a m e c e l l a n d 1 4 1 k a r y o m e g a l o c y t e s w e r e d e f i n e d a s h e p a t o c y t e s l a r g e r t h a n t h e a v e r a g e h e p a t o c y t e p l u s o n e s t a n d a r d d e v i a t i o n . N u c l e i w e r e c o n s i d e r e d t o h a v e b e e n d e r i v e d f r o m a h e p a t o c y t e i f t h e a r e a w a s < 0 . 7 5 p m 2 a n d t h e r o u n d n e s s ( r o u n d n e s s = m i n o r a x i s / m a j o r a x i s ) w a s > 0 . 7 5 ( S o a m e s e t a l . , 1 9 9 4 ) . N u c l e i w e r e d e t e r m i n e d t o h a v e b e e n d e r i v e d f r o m a b i n u c l e a t e d h e p a t o c y t e i f t h e a r e a w a s > 0 . 7 5 p m 2 a n d t h e r o u n d n e s s w a s < 0 . 7 5 . N u c l e i w e r e d e t e r m i n e d t o h a v e b e e n d e r i v e d f r o m a k a r y o m e g a l o c y t e i f t h e a r e a w a s > 0 . 7 5 p m 2 a n d t h e r o u n d n e s s w a s > 0 . 7 5 . F i n a l l y , n u c l e i w e r e d e t e r m i n e d t o h a v e b e e n d e r i v e d f r o m n o n h e p a t o c y t e s i f t h e a r e a w a s < 0 . 7 5 p m 2 a n d t h e r o u n d n e s s w a s < 0 . 7 5 . T h e f i n a l s t e p w a s t o c a l c u l a t e t h e p e r c e n t l a b e l i n g i n d e x f o r b o t h h e p a t o c y t e s a n d n o n h e p a t o c y t e s . F o r t h i s a n a l y s i s , “ h e p a t o c y t e s ” d e s i g n a t e d a u s e r d e f i n e d t e r m t h a t c o n s i s t e d o f t h e s u m o f t h e n u m b e r o f h e p a t o c y t e n u c l e i , t h e n u m b e r o f k a r y o m e g a l o c y t e n u c l e i , a n d t w i c e t h e n u m b e r o f b i n u c l e a t e d h e p a t o c y t e n u c l e i . T h e p e r c e n t l a b e l i n g i n d e x w a s c a l c u l a t e d a s t h e n u m b e r o f l a b e l e d n u c l e i o f a p a r t i c u l a r c e l l t y p e ( i . e . , “ h e p a t o c y t e s ” o r n o n - h e p a t o c y t e s ) d i v i d e d b y t h e t o t a l n u m b e r o f n u c l e i o f t h a t t y p e , m u l t i p l i e d b y 1 0 0 . G l o b a l L i v e r D N A M e t h y l a t i o n A n a l y s i s S s s l m e t h y l a s e ( C p G m e t h y l a s e ) u t i l i z e s S A M t o m e t h y l a t e t h e 5 p o s i t i o n o f C a t e v e r y C p G s i t e i n D N A t h a t i s n o t m e t h y l a t e d . I n t h i s m a n n e r , w e w e r e a b l e t o a s s e s s t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f l i v e r D N A i n d i r e c t l y a s h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A w a s a p p a r e n t a s a n i n c r e a s e i n i n c o r p o r a t i o n o f m e t h y l g r o u p s . G l o b a l l i v e r m e t h y l a t i o n a n a l y s i s w a s c a r r i e d o u t e s s e n t i a l l y a s d e s c r i b e d ( B a l a g h i a n d W a g n e r , 1 9 9 3 ) . B r i e f l y , o n e p g o f D N A w a s i n c u b a t e d w i t h 2 u C i [ 3 H - m e t h y l ] S - 1 4 2 a d e n o s y l - L - m e t h i o n i n e ( N e w E n g l a n d N u c l e a r , B o s t o n , M A , s p e c i f i c a c t i v i t y , 8 4 . 1 C i / m m o l ) , a n d 3 U S s s l m e t h y l a s e ( N e w E n g l a n d B i o l a b s , B e v e r l y , M A ) f o r 1 h o u r a t 3 0 ° C . F i f t e e n u L o f t h e m i x t u r e w e r e a p p l i e d t o a D E - 8 1 i o n e x c h a n g e f i l t e r a n d w a s h e d w i t h 0 . 5 M p h o s p h a t e b u f f e r , p H 6 . 8 , 3 t i m e s , f o l l o w e d b y o n e w a s h e a c h o f 7 0 % e t h a n o l , a n d 1 0 0 % e t h a n o l . R a d i o a c t i v i t y o n t h e d r i e d f i l t e r w a s a s s e s s e d b y l i q u i d s c i n t i l l a t i o n s p e c t r o m e t r y . A l l r e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t i n d u p l i c a t e . R a d i o l a b e l i n c o r p o r a t i o n i n t o D N A w a s p r o p o r t i o n a l t o D N A c o n c e n t r a t i o n a n d l i n e a r d u r i n g t h e p e r i o d o f m e a s u r e m e n t . R e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t a m i n i m u m o f 4 t i m e s o n e a c h D N A s a m p l e , a n d e a c h s a m p l e w a s f r o m a d i f f e r e n t a n i m a l ( 6 a n i m a l s p e r g r o u p ) . R e s u l t s w e r e c a l c u l a t e d a s c p m / u g / h r a n d e x p r e s s e d a s a p e r c e n t o f t h e a v e r a g e d c o n t r o l v a l u e s . R E S U L T S C e l l P r o l i f e r a t i o n W e h a v e d e t e r m i n e d t h a t i n n o r m a l m o u s e l i v e r , 6 5 - 7 5 % o f t h e c e l l s a r e h e p a t o c y t e s , a n d 2 5 - 3 5 % a r e n o n - h e p a t o c y t e s ( d a t a n o t s h o w n ) , w h i l e o n l y 2 - 4 % o f t h e h e p a t o c y t e s a n d 1 1 - 1 5 % o f n o n - h e p a t o c y t e s a r e u n d e r g o i n g c e l l p r o l i f e r a t i o n ( F i g u r e 2 ) . T h e v a l u e s w e o b t a i n e d f o r h e p a t o c y t e a n d n o n - h e p a t o c y t e p o p u l a t i o n s i n m o u s e l i v e r a r e s i m i l a r t o t h a t o b s e r v e d i n t h e r a t ( B u c h e r a n d M a l t , 1 9 7 1 ) . T h e l e v e l o f b a s a l h e p a t o c y t e p r o l i f e r a t i o n i s h i g h e r ( p < 0 . 0 5 ) i n t h e 0 5 7 B L / 6 ( a v e r a g e i n c o n t r o l s , 3 . 9 % ) a s c o m p a r e d t o t h e B 6 0 3 F 1 ( a v e r a g e i n c o n t r o l s , 2 . 5 % ) ( F i g u r e 2 ) . I L % e g a r e v A 1 4 3 1 5 % 1 2 % 9 % 6 % 3 % 0 % B 6 0 3 F 1 B 6 0 3 F 1 C 5 7 B U 6 0 5 7 B L / 6 h e p a t o c y t e n o n h e p . h e p a t o c y t e n o n h e p . F i g u r e 2 - C o m p a r i s o n o f c o n t r o l l a b e l i n g i n d e x ( L l ) i n h e p a t o c y t e s v e r s u s n o n - h e p a t o c y t e s i n B 6 0 3 F 1 a n d C S 7 B L / 6 m o u s e l i v e r . T h e L l o f h e p a t o c y t e s w a s a v e r a g e d f r o m a l l c o n t r o l B G C 3 F 1 a n d 0 5 7 B L / 6 a n i m a l s , s e p a r a t e l y . T h e L l o f n o n - h e p a t o c y t e s w a s a v e r a g e d f r o m a l l c o n t r o l B G C S F 1 a n d C S 7 B U 6 a n i m a l s , s e p a r a t e l y . " d e n o t e s a s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n B G C 3 F 1 a n d C S 7 B L / 6 h e p a t o c y t e L l , ( p < 0 . 0 5 ) u s i n g a t w o - t a i l e d S t u d e n t s ’ s T - t e s t . # d e n o t e s a s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n h e p a t o c y t e L I a n d n o n - h e p a t o c y t e L l , ( p < 0 . 0 5 ) u s i n g a t w o - t a i l e d S t u d e n t s ' s T - t e s t . 8 d e n o t e s a s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n B 6 0 3 F 1 a n d C 5 7 B U 6 n o n - h e p a t o c y t e L l , ( p < 0 . 0 5 ) u s i n g a t w o - t a i l e d S t u d e n t s ' s T - t e s t . 1 4 4 A d m i n i s t r a t i o n o f a C M D d i e t l e d t o a n i n c r e a s e i n h e p a t o c y t e p r o l i f e r a t i o n b e g i n n i n g a f t e r 1 w e e k , b u t d i d n o t r e a c h s t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e u n t i l t h e s e c o n d w e e k o f a d m i n i s t r a t i o n i n b o t h t h e B 6 0 3 F 1 a n d C 5 7 B U 6 ( F i g u r e 3 ) . T h e i n c r e a s e c o n t i n u e d t h r o u g h o u t t h e t r e a t m e n t p e r i o d a n d r e t u r n e d t o w a r d c o n t r o l v a l u e s i n t h e r e c o v e r y g r o u p s . N o t a b l y , t h e i n c r e a s e i n h e p a t o c y t e c e l l p r o l i f e r a t i o n w a s l a r g e r i n t h e r e l a t i v e l y l i v e r t u m o r r e s i s t a n t C S 7 B L / 6 . P B a d m i n i s t r a t i o n l e d t o a n i n c r e a s e i n c e l l p r o l i f e r a t i o n a t t h e o n e w e e k t i m e p o i n t i n b o t h s t r a i n s , w i t h t h e i n c r e a s e b e i n g l a r g e r i n t h e C 5 7 B U 6 ( F i g u r e 4 ) . A f t e r t w o w e e k s o f P B a d m i n i s t r a t i o n , t h e C 5 7 B U 6 r e t u r n e d t o w a r d c o n t r o l v a l u e s , w h i l e c e l l p r o l i f e r a t i o n i n t h e B 6 C 3 F 1 w a s s t i l l e l e v a t e d a b o v e c o n t r o l v a l u e s . B y t h e 4 w e e k t i m e p o i n t , t h e l e v e l o f c e l l p r o l i f e r a t i o n r e t u r n e d t o c o n t r o l v a l u e s i n b o t h s t r a i n s . C o - a d m i n i s t r a t i o n o f a C M D d i e t a n d P B l e d t o s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t i n c r e a s e s i n h e p a t o c y t e p r o l i f e r a t i o n i n b o t h s t r a i n s a t a l l t i m e p o i n t s ( e x c l u d i n g t h e r e c o v e r y g r o u p ) . T h e C M D d i e t a p p e a r s t o o v e r c o m e t h e i n h i b i t o r y e f f e c t s o f P B a t 4 w e e k s o f a d m i n i s t r a t i o n a s e v i d e n c e d b y t h e i n c r e a s e i n h e p a t o c y t e l a b e l i n g o v e r t h e P B g r o u p a l o n e ( F i g u r e 5 ) . G l o b a l M e t h y l a t i o n S t a t u s G l o b a l D N A h y p o m e t h y l a t i o n w a s i n d u c e d b y t h e a d m i n i s t r a t i o n o f a C M D d i e t i n B 6 C S F 1 a n d C 5 7 B U 6 m i c e , a n d t h i s o c c u r r e d t o a l a r g e r e x t e n t i n t h e r e l a t i v e l y s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m o u s e a t t h e w e e k 1 t i m e p o i n t ( F i g u r e 6 ) . I n t e r e s t i n g l y , D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s i n t h e 8 6 C 3 F 1 m o u s e l i v e r a p p r o a c h e d F i g u r e 3 - H e p a t o c y t e l a b e l i n g i n d e x i n B 6 C 3 F 1 a n d C S 7 B L / 6 m a l e m i c e a f t e r C M D d i e t a d m i n i s t r a t i o n f o r 1 , 2 , o r 4 w e e k s , a n d t h e r e c o v e r y g r o u p ( 4 w e e k s d i e t f o l l o w e d b y 2 w e e k s o f c o n t r o l d i e t ) . H e p a t o c y t e D N A s y n t h e s i s i s m e a s u r e d a s a n i n d i r e c t m e a s u r e o f c e l l p r o l i f e r a t i o n v i a i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y a n d a M a c i n t o s h - b a s e d i m a g e a n a l y s i s s y s t e m ( N I H I m a g e ) . * d e n o t e s a s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m a g e - m a t c h e d c o n t r o l s , ( p < 0 . 0 5 ) u s i n g a t w o - t a i l e d S t u d e n t ’ s T - t e s t . n = 4 - 6 , e r r o r b a r s d e n o t e s t a n d a r d e r r o r o f t h e m e a n . 1 4 5 y r e v o c e R 4 k e e W 2 k e e W F i g u r e 3 . 1 O N n % e 6 3 1 4 6 I D ' - e I I v G d 0 " G I N O 8 d 0 " l - I I O 8 d 0 “ G I N O 8 d 0 “ I J I O 8 d 0 “ C I W O B d o u m o 8 d 0 ” G I N O 8 d 0 “ I 1 1 0 W e e k 1 H s I ’ N t ( n e m d e u t t S s y d s e l s i i a s t y - l o a w n t a a n e o g y g d s a n i m s A i u g n i N t D o m d ) e 5 s 0 e . o a t 0 r b y < p p - c h ( o a s t r a o , t s e p l t n e o f a H i r c t a n e o . M c c ) i t a m d u o e h d e h t n l i c a t w a m a y s r m 6 k t - / e s e L i g e . B a w m n 7 S e a 2 h e m C y o r c o m b e t f d h n t e d s e c i a w n h f o o e o 1 r l n r F u l o e 3 m o r f f m f r C i e B B i d d B a t P r i n a n v a i d s c k n i n x e o f a e t i i e t n d s w a g n r i i 4 s e e ( f t g i o y n n p l l o l i u a e r l c o d p e i r t b l s a l g s i r l e y c t a r e f e t o v a b t s r o y o a r c e c r o s r e e t u e r a s t , 6 p o a e e n h - t e H e m 5 d d - t = n * c 4 a e n r . , i e ) . d r e n t s u g i k s g a e i n e m e t - F w a I T s e o f P B f o r 1 , 2 , o r 4 t h e s i s i s m e a s u r e d a s 1 4 7 4 k e e W . 4 e r u g i F 1 4 8 0 I D n % O B I J O A V 1 0 8 d I 1 1 9 8 d 0 “ I J I O 8 : ! I 1 1 0 8 d 0 ” P 1 0 W e e k 2 F i g u r e 5 - H e p a t o c y t e l a b e l i n g i n d e x i n B 6 C 3 F 1 a n d C S 7 B L / 6 m a l e m i c e a f t e r c o - a d m i n i s t r a t i o n o f a C M D d i e t a n d 0 . 0 5 % P B f o r 1 , 2 , o r 4 w e e k s , a n d t h e r e c o v e r y g r o u p ( 4 w e e k s t r e a t m e n t f o l l o w e d b y 2 w e e k s o f c o n t r o l ) . H e p a t o c y t e D N A s y n t h e s i s i s m e a s u r e d a s a n i n d i r e c t m e a s u r e o f c e l l p r o l i f e r a t i o n v i a i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y a n d a M a c i n t o s h - b a s e d i m a g e a n a l y s i s s y s t e m ( N I H I m a g e ) . * d e n o t e s a s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m a g e - m a t c h e d c o n t r o l s , ( p < 0 . 0 5 ) u s i n g a t w o — t a i l e d S t u d e n t ' s T - t e s t . a d e n o t e s a s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n C M D d i e t + P B a n d C M D d i e t n o P B ( F i g u r e 3 ) , ( p < 0 . 0 5 ) u s i n g a t w o — t a i l e d S t u d e n t ' s T - t e s t . b d e n o t e s a s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n C M D d i e t + P B a n d c o n t r o l d i e t + P B ( F i g u r e 4 ) , ( p < 0 . 0 5 ) u s i n g a t w o - t a i l e d S t u d e n t ’ s T - t e s t . n = 5 - 6 , e r r o r b a r s d e n o t e s t a n d a r d e r r o r o f t h e m e a n . 1 4 9 y r e v o c e R 2 k e e W . 5 e r u g i F 1 O N I 1 % 9 6 3 5 0 I n ' — J O A V 8 d G W O 8 d O U I J 8 d G I N O 8 d 0 " I 1 1 0 8 d G I N O 8 d O U I J 8 d G W O 8 d 0 “ I 1 1 9 1 5 1 c o n t r o l v a l u e s a t t h e w e e k 2 t i m e p o i n t b e f o r e r e b o u n d i n g t o a m o r e h y p o m e t h y l a t e d s t a t e a t t h e 4 w e e k t i m e p o i n t . I n C S 7 B L / 6 m i c e , t h e C M D d i e t l e d t o a l o w e r , b u t c o n s i s t e n t d e g r e e o f h y p o m e t h y l a t i o n a t a l l t r e a t m e n t t i m e p o i n t s , a s c o m p a r e d t o t h e B 6 0 3 F 1 . T h e C S 7 B L / 6 m i c e w e r e a l s o a b l e t o r e t u r n t o w a r d c o n t r o l l e v e l s o f g l o b a l m e t h y l a t i o n i n t h e r e c o v e r y g r o u p . A f t e r 1 2 w e e k s o n t h e C M D d i e t , s t r i k i n g i n c r e a s e s i n h y p o m e t h y l a t i o n w e r e e v i d e n t i n b o t h m o u s e s t r a i n s , w i t h l a r g e r i n c r e a s e s i n t h e C S 7 B L / 6 ( F i g u r e 6 ) . T h e r e f o r e , t h e C 5 7 B U 6 i s n o t c o m p l e t e l y r e s i s t a n t t o a l t e r a t i o n s i n m e t h y l a t i o n s t a t u s . P B l e d t o a d r a m a t i c a n d c o n s i s t e n t l e v e l o f h y p o m e t h y l a t i o n o n l y i n B 6 C 3 F 1 m o u s e l i v e r ( F i g u r e 7 ) . I m p o r t a n t l y , 2 w e e k s o n a c o n t r o l d i e t a f t e r 4 w e e k s o f P B w e r e a b l e t o r e s t o r e , a t l e a s t p a r t i a l l y , t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f B G C 3 F 1 l i v e r D N A ( F i g u r e 7 ) . C 5 7 B U 6 m i c e w e r e r e s i s t a n t t o t h e e f f e c t s o f P B o n g l o b a l l i v e r D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s ( F i g u r e 7 ) . C o - a d m i n i s t r a t i o n o f a C M D d i e t a n d P B l e d t o e n h a n c e d h y p o m e t h y l a t i o n i n b o t h s t r a i n s o v e r e i t h e r t r e a t m e n t a l o n e a n d a g a i n t h e a n i m a l s w e r e a b l e t o r e c o v e r ( F i g u r e 8 ) . T h e 8 6 C 3 F 1 a p p e a r s t o p a r t i a l l y r e s t o r e i t s l i v e r D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s a f t e r 2 w e e k s o f c o - a d m i n i s t r a t i o n o f C M D d i e t a n d P B , s i m i l a r t o t h e e f f e c t e v i d e n t w i t h C M D d i e t a l o n e ( c o m p a r e w e e k 2 b e t w e e n F i g u r e 6 a n d F i g u r e 8 ) . T h i s t r e n d i s n o t r e a d i l y a p p a r e n t i n t h e C S 7 B U 6 . F i g u r e 6 - E f f e c t o f t h e a d m i n i s t r a t i o n o f a C M D d i e t o n t h e g l o b a l m e t h y l a t i o n s t a t u s o f l i v e r D N A i n B 6 0 3 F 1 a n d C 5 7 B U 6 m a l e m i c e . S s s l m e t h y l a s e w a s u s e d t o a s s e s s D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s i n d i r e c t l y . T h e e n z y m e u t i l i z e s [ 3 H - C H 3 ] S A M t o d o n a t e a m e t h y l g r o u p t o t h e C o f a n y u n m e t h y l a t e d C p G s i t e s . T h u s , h y p o m e t h y l a t i o n i s a p p a r e n t a s a n i n c r e a s e i n i n c o r p o r a t i o n o f m e t h y l g r o u p s . * d e n o t e s a s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m c o n t r o l s , ( p < 0 . 0 5 ) u s i n g a t w o - t a i l e d S t u d e n t ’ s T - t e s t . n = 6 f o r e a c h m o u s e s t r a i n a t e a c h t i m e p o i n t . R e a c t i o n s w e r e r e p e a t e d a t l e a s t 8 t i m e s o n D N A f r o m e a c h a n i m a l a n d a v e r a g e d t o o b t a i n t h e v a l u e f o r t h e a n i m a l . T h e c p m / u g / h o u r v a l u e f o r e a c h o f t h e a n i m a l s i n a g r o u p ( A p p e n d i x 2 , T a b l e s 3 a n d 4 ) w e r e a v e r a g e d a n d e x p r e s s e d a s a p e r c e n t o f t h e a v e r a g e d c o n t r o l s . 1 5 2 y r e v o c e R % 0 7 I O J I U O O % F i g u r e 6 . 1 6 0 % 1 5 0 % 1 4 0 % 1 3 0 % 1 2 0 % 1 1 0 % m 9 0 % 8 0 % W e e k 1 2 1 5 3 . s l o r t n o c d e g a r e v a F i g u r e 7 - E f f e c t o f t h e a d m i n i s t r a t i o n o f 0 . 0 5 % ( w / w ) P B i n t h e d r i n k i n g w a t e r o n t h e g l o b a l m e t h y l a t i o n s t a t u s o f l i v e r D N A i n B 6 C 3 F 1 a n d 0 5 7 B L / 6 m a l e m i c e . S s s l m e t h y l a s e w a s u s e d t o a s s e s s D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s i n d i r e c t l y . T h e e n z y m e u t i l i z e s [ 3 H - C H 3 ] S A M t o d o n a t e a m e t h y l g r o u p t o t h e C o f a n y u n m e t h y l a t e d C p G s i t e s . T h u s , h y p o m e t h y l a t i o n i s a p p a r e n t a s a n i n c r e a s e i n i n c o r p o r a t i o n o f m e t h y l g r o u p s . * d e n o t e s a s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m c o n t r o l s , ( p < 0 . 0 5 ) u s i n g a t w o - t a i l e d S t u d e n t ' s T - t e s t . n = 6 f o r e a c h m o u s e s t r a i n a t e a c h t i m e p o i n t . R e a c t i o n s w e r e r e p e a t e d a t l e a s t 8 t i m e s o n D N A f r o m e a c h a n i m a l a n d a v e r a g e d t o o b t a i n t h e v a l u e f o r t h e a n i m a l . T h e c p m / p g / h o u r v a l u e f o r e a c h o f t h e a n i m a l s i n a g r o u p ( A p p e n d i x 2 , T a b l e s 3 a n d 4 ) w e r e a v e r a g e d a n d e x p r e s s e d a s a p e r c e n t o f t h e 1 5 4 % % % % % % 0 0 0 0 0 0 6 5 4 3 2 1 1 1 1 1 1 1 % 0 7 l o n u o o « y . 1 0 0 % 9 0 % 8 0 % F i g u r e 7 . W e e k 4 R e c o v e r y 1 5 5 l d e y A l h d a e h l c n b N t a t o c a a D a i e r l g l o t y s t f d s i e h a e s t e g t a h e u n a e t t s i l s r m s a a e n a a v n r u t v o s s e a o r t e y h e n t e t e a o s r t n d n u e i a f e o o a e w w s d t m u b ) g C * o 4 n h i o s e k t h a s a n n t . c d i e a d w p r e o u d e g 3 t o r r o s f a p g e a h l t y u r o l e 6 r y v s e l b h h = g a n a i t t e e d l n T m m y n , B h a . 2 f P t l t o s e s e l x ) s t m n a i w S o - d m / a n i i T w e t n ( e a p a s . r ’ t p e o t h % n c p a A i r n ( c 5 0 m o o e d a d p u c e . n e 0 o i m S o t u l t o a r n r d M m f e i d g n A e l a a S s i A 6 t / ] a a N n 3 e t i e L - r D i H o B c s d C w 7 n n l - t i o a S H D m C a 3 s n i M [ a e g n C d m a s n s i n . e i a a s z e a t s i l h l t o u 8 f o i n 1 t t ) u s e t r f t F 5 o n n 3 r a 0 o o e c a e . l h i C p m 0 t 6 p d c a a a e B p y a < t r e z s ( g t d n n i r a s e i , e o r i n n f s t e o l a e v i o A h i e e m a r d T t N t p u a D - . o r y c e l a e l n e l o r a h y c v t h e v t r t m r f o e e e i u c o l e m o r h w t r t i n o h f f d s p / e f o n e y n g c o i c s n h o u r t u e / s e i c t r m u p , t e e a p t s c f a a u a t f c f t s h f e E s s T i R d a e n n h - o o . . i i n t s e e t d T 8 n t t a t a a i c e l l s i i s o . s r y y p l f e i r a u h h G e m n g t t p g m i p i e e x i i n F m m C s a t e u - L 0 1 O ) . 8 e r u g i F % % % % % % % 0 0 0 0 0 6 4 3 1 0 0 0 8 7 1 1 1 1 1 I o n u o e % 1 5 0 % 1 2 0 % 9 0 % T i m e W e e k 4 R e c o v e r y 1 5 7 1 5 8 D I S C U S S I O N T h e r e s u l t s o f t h i s r e p o r t i n d i c a t e a d i s c o n n e c t b e t w e e n t u m o r p r o m o t i o n - i n d u c e d c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d r e p o r t e d t u m o r s e n s i t i v i t y i n m o u s e l i v e r , a s t h e r e l a t i v e l y l i v e r t u m o r r e s i s t a n t 0 5 7 B L / 6 h a d a h i g h e r l e v e l o f c e l l p r o l i f e r a t i o n i n d u c e d b y t u m o r p r o m o t e r s t i m u l i t h a n t h e r e l a t i v e l y s e n s i t i v e B 6 0 3 F 1 . I m p o r t a n t l y , g l o b a l h y p o m e t h y l a t i o n w a s e v i d e n t t o a l a r g e r e x t e n t i n t h e l i v e r t u m o r s e n s i t i v e B 6 C 3 F 1 . T h e s e r e s u l t s , t a k e n t o g e t h e r , i l l u s t r a t e t h a t t h e r e l a t i v e l y l i v e r t u m o r r e s i s t a n t C S 7 B L / 6 r e t a i n s t h e c a p a c i t y t o m a i n t a i n m e t h y l a t i o n s t a t u s o f D N A u n d e r c o n d i t i o n s o f p r o m o t e r t r e a t m e n t a n d i n c r e a s e d c e l l p r o l i f e r a t i o n . T h u s , t h e B 6 C 3 F 1 a p p e a r s t o l a c k t h e c a p a c i t y a n d / o r f i d e l i t y o f m a i n t e n a n c e m e t h y l a t i o n w h e n e x p o s e d t o k n o w n t u m o r p r o m o t i n g s t i m u l i . F u r t h e r , t h e s e d a t a d e m o n s t r a t e t h a t t h e C S 7 B L / 6 i s c a p a b l e o f e x h i b i t i n g h y p o m e t h y l a t i o n o f l i v e r D N A i n r e s p o n s e t o a C M D d i e t o r a C M D d i e t c o - a d m i n i s t e r e d w i t h P B . T h u s , i n t h i s r e s p e c t , t h e r e i s a q u a n t i t a t i v e , n o t a q u a l i t a t i v e , d i f f e r e n c e b e t w e e n B 6 C 3 F 1 a n d C S 7 B L / 6 m i c e f o l l o w i n g t r e a t m e n t w i t h t h e r o d e n t l i v e r t u m o r p r o m o t e r p h e n o b a r b i t a l . T h e r e h a v e b e e n a f e w r e p o r t s c h a r a c t e r i z i n g b a s a l l i v e r c e l l p r o l i f e r a t i o n i n r e l a t i v e l y l i v e r t u m o r s e n s i t i v e a n d r e l a t i v e l y l i v e r t u m o r r e s i s t a n t s t r a i n s o f m i c e . H a n i g a n a n d c o - w o r k e r s c o m p a r e d t h e n o r m a l l e v e l o f c e l l p r o l i f e r a t i o n b e t w e e n C S H / H e a n d C S 7 B L / 6 a n d r e p o r t e d a h i g h e r l e v e l i n t h e C S H / H e ( H a n i g a n e t a l . , 1 9 8 8 ) . F u r t h e r , L i n a n d c o - w o r k e r s r e p o r t e d t h a t t h e b a s a l l e v e l o f l i v e r c e l l p r o l i f e r a t i o n w a s g r e a t e s t i n t h e 8 6 C 3 F 1 , f o l l o w e d b y t h e C S H / H e a n d t h e C S 7 B L / 6 ( L i n e t a l . , 1 9 8 9 ) . I n b o t h o f t h e s e s t u d i e s , c e l l p r o l i f e r a t i o n 1 5 9 w a s a s s e s s e d i n d i r e c t l y b y d e t e r m i n i n g 3 H - t h y m i d i n e i n c o r p o r a t i o n i n t o l i v e r D N A / p g D N A . I n t h e p r e s e n t s t u d y w e u t i l i z e d B r d U - c o n t a i n i n g m i n i p u m p s t h a t w e r e i m p l a n t e d 1 w e e k p r i o r t o s a c r i f i c e a n d d e m o n s t r a t e d t h a t t h e C 5 7 B U 6 h a s a h i g h e r l e v e l o f b a s a l l i v e r c e l l p r o l i f e r a t i o n ( b o t h i n h e p a t o c y t e s a n d n o n - h e p a t o c y t e s ) t h a n t h e B 6 C 3 F 1 ( F i g u r e 2 ) . O n e a d v a n t a g e o f o u r m e t h o d o l o g y , i n a r e l a t i v e l y q u i e s c e n t o r g a n l i k e t h e l i v e r , i s t h e c u m u l a t i v e a s s e s s m e n t o f D N A s y n t h e s i s o v e r 7 d a y s , p r o v i d i n g a m o r e s e n s i t i v e i n d i c a t i o n o f t h e e x t e n t o f c e l l p r o l i f e r a t i o n a s c o m p a r e d t o o n e ( a t a l . , 1 9 8 9 ) o r s e v e r a l ( H a n i g a n e t a l . , 1 9 8 8 ) i n j e c t i o n s o f 3 H - t h y m i d i n e . A s e c o n d a d v a n t a g e o f o u r i m a g e a n a l y s i s - b a s e d a p p r o a c h i s t h e a b i l i t y t o d i s c e r n c h a n g e s i n p a r t i c u l a r c e l l p o p u l a t i o n s i n t h e l i v e r . I n o u r a n a l y s i s w e d i s t i n g u i s h b e t w e e n h e p a t o c y t e a n d n o n - h e p a t o c y t e c e l l p r o l i f e r a t i o n . T h e l e v e l o f c e l l p r o l i f e r a t i o n i s h i g h e r i n n o n - h e p a t o c y t e s a s c o m p a r e d t o h e p a t o c y t e s i n C S 7 B U 6 a n d B 6 C 3 F 1 m i c e ( F i g u r e 2 ) . T h i s d i s t i n c t i o n m a y b i a s r e s u l t s w h e n c e l l p r o l i f e r a t i o n d e t e r m i n a t i o n s a r e b a s e d u p o n t o t a l a m o u n t s o f a H - t h y m i d i n e / l r g D N A . T r e a t m e n t r e l a t e d e f f e c t s o n n o n - h e p a t o c y t e c e l l p r o l i f e r a t i o n w e r e n o t r e m a r k a b l e ( d a t a n o t s h o w n ) . I t s e e m s l i k e l y t o u s t h a t t h e r e m a y b e d i f f e r e n t b a s a l l e v e l s o f a p o p t o s i s i n C S 7 B L / 6 a n d B S C S F 1 m i c e , a s t h e b a s a l l e v e l o f c e l l p r o l i f e r a t i o n o f h e p a t o c y t e s a n d n o n - h e p a t o c y t e s i s g r e a t e r i n t h e C S 7 B L / 6 ( F i g u r e 2 ) . T h u s , a h i g h e r l e v e l o f c e l l d e a t h w o u l d b e r e q u i r e d i n t h e C 5 7 B U 6 t o m a i n t a i n n o r m a l l i v e r s i z e . A h e i g h t e n e d l e v e l o f a p o p t o s i s o c c u r r i n g i n t h e l i v e r o f t h e C 5 7 B U 6 c o u l d m o r e e f f i c i e n t l y r e m o v e i n i t i a t e d c e l l s ( r e f e r e n c e d i n S c h u l t e - H e r m a n n e t 1 6 0 a l . , 1 9 9 5 ) . I n t e r e s t i n g l y , P B , w h i c h l e a d s t o l i v e r t u m o r s i n 8 6 C 3 F 1 , b u t n o t C 5 7 B U 6 m i c e ( B e c k e r , 1 9 8 2 ) , d i d n o t l e a d t o g l o b a l h y p o m e t h y l a t i o n i n t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C S 7 B L / 6 . A l o n g t h e s e l i n e s , C S 7 B L / 6 a n i m a l s t h a t r e c e i v e d P B f o r 4 w e e k s f o l l o w e d b y c o n t r o l d r i n k i n g w a t e r f o r 2 w e e k s ( i . e . , t h e r e c o v e r y g r o u p ) e x h i b i t e d l e s s h e p a t o c y t e c e l l p r o l i f e r a t i o n t h a n t h e a n i m a l s t h a t r e c e i v e d c o n t r o l d i e t f o r t h e e n t i r e 6 w e e k s ( p < 0 . 0 5 ) . T h i s c o u l d b e e x p l a i n e d b y a p o p t o s i s o c c u r r i n g t o a g r e a t e r e x t e n t i n t h e 0 5 7 B L / 6 t h a n i n t h e B 6 C 3 F 1 . I t i s b e l i e v e d t h a t c e l l s c a p a b l e o f f o r m i n g t u m o r s a f t e r c h r o n i c P B t r e a t m e n t h a v e o v e r c o m e t h e g r o w t h i n h i b i t o r y e f f e c t s o f P B ( S h i n o z u k a e t a l . , 1 9 8 2 ; R e i s e n b i c h l e r e t a l . , 1 9 9 4 ; J i r t l e e t a l . , 1 9 9 4 ) . T h i s i s c o n s i s t e n t w i t h w h a t w e h a v e o b s e r v e d . I t h a s b e e n d e m o n s t r a t e d t h a t P B d o e s n o t m e r e l y p r o m o t e s p o n t a n e o u s t u m o r f o r m a t i o n i n t h e m o u s e , a s P B - i n d u c e d t u m o r s h a v e u n i q u e c h a r a c t e r i s t i c s c o m p a r e d t o s p o n t a n e o u s l i v e r t u m o r s ( F o x a t a l . , 1 9 9 0 ; R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) . A d e c r e a s e i n e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r ( E c k l e t a l . , 1 9 8 8 ) c o m b i n e d w i t h a n i n c r e a s e i n t h e l e v e l o f t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r b e t a ( T G F B ) ( J i r t l e a n d M e y e r , 1 9 9 1 ) , T G F B r e c e p t o r s ( R e i s e n b i c h l e r e t a l . , 1 9 9 4 ) a n d t h e M 6 P - I G F 2 r , i n v o l v e d i n a c t i v a t i n g T G F B ( J i r t l e e t a l . , 1 9 9 4 ) , i n n o r m a l h e p a t o c y t e s a r e a s s o c i a t e d w i t h c h r o n i c P B a d m i n i s t r a t i o n . T h i s w o u l d b e e x p e c t e d t o i n h i b i t h e p a t o c y t e p r o l i f e r a t i o n . H o w e v e r , M 6 P - I G F 2 r a n d T G F B a r e d e c r e a s e d i n P B - p r o m o t e d p r e n e o p l a s t i c l e s i o n s ( J i r t l e e t a l . , 1 9 9 4 ) a n d T G F B i s d e c r e a s e d i n P B - p r o m o t e d l i v e r t u m o r s ( R e i s e n b i c h l e r e t a l . , 1 9 9 4 ) . A d d i t i o n a l l y , h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A a t e a r l y t i m e s d u r i n g P B a d m i n i s t r a t i o n l e v e l o f h e p a t o c y t e s y n t h e s i s i n t h e r a t i s h i g h e r a f t e r 1 w e e k o f C M D d i e t t h a n 1 6 1 m a y f a c i l i t a t e r e s i s t a n c e t o P B i n h i b i t i o n o f p r o l i f e r a t i o n b y c a u s i n g i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f t h e r a f a n d H a - r a s o n c o g e n e s , w h i c h w o u l d b e e x p e c t e d t o d e c r e a s e t h e a b i l i t y o f T G F B t o i n h i b i t t h e p r o l i f e r a t i o n o f h e p a t o c y t e s ( R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) . F u r t h e r m o r e , i n l i g h t o f i t s r o l e i n a c t i v a t i n g T G F B , t h e M 6 P - I G F 2 r g e n e c a n b e v i e w e d a s a t u m o r s u p p r e s s o r g e n e ( J i r t l e e t a l . , 1 9 9 4 ; D e S o u z a e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h e M 6 P - I G F 2 r g e n e i s i m p r i n t e d i n t h e m o u s e , w i t h m e t h y l a t i o n a t a C p G s i t e i n a n i n t r o n b e i n g t h e i m p r i n t i n g s i g n a l i n t h e e x p r e s s e d m a t e r n a l a l l e l e , w h i l e b o t h a l l e l e s a r e u s u a l l y e x p r e s s e d i n t h e h u m a n . T h i s c o u l d , i n p a r t , p r o v i d e a b a s i s f o r t h e o b s e r v a t i o n s t h a t m i c e ( e s p e c i a l l y t h o s e s t r a i n s t h a t h a v e a r e l a t i v e l y l o w c a p a c i t y t o m a i n t a i n n a s c e n t m e t h y l a t i o n p a t t e r n s , e . g . , t h e B 6 0 3 F 1 ) a r e m o r e s u s c e p t i b l e t o l i v e r c a n c e r t h a n h u m a n s ( r e f e r e n c e d i n C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 c ; M i l l s e t a l . , 1 9 9 5 ) . P B a d m i n i s t e r e d w i t h a c h o l i n e d e v o i d d i e t i n h i b i t e d t h e l e v e l o f c e l l p r o l i f e r a t i o n c o m p a r e d t o C M D d i e t a l o n e a f t e r 1 a n d 3 w e e k s o f t r e a t m e n t ( A b a n o b i e r a l . , 1 9 8 2 ) . O n t h e c o n t r a r y , w e h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t t h e C M D d i e t a p p e a r s t o o v e r c o m e t h e m i t o i n h i b i t o r y e f f e c t o f P B a f t e r 1 , 2 , a n d 4 w e e k s o f a d m i n i s t r a t i o n ( F i g u r e 5 ) . T h u s , t h e c e l l s u n d e r g o i n g D N A s y n t h e s i s i n r e s p o n s e t o a C M D d i e t c o - a d m i n i s t e r e d w i t h P B m a y b e t h e p r o g e n i t o r s o f e v e n t u a l t u m o r f o r m a t i o n . A h i g h e r l e v e l o f a p o p t o s i s o f i n i t i a t e d c e l l s i n t h e r e l a t i v e l y l i v e r t u m o r r e s i s t a n t C 5 7 B U 6 m a y l e a d t o r e g e n e r a t i v e h y p e r p l a s i a a n d t h u s e x p l a i n t h e h i g h e r l e v e l o f c e l l p r o l i f e r a t i o n e x h i b i t e d b y t h e C S 7 B L / 6 . T o f u r t h e r c o m p a r e o u r d a t a t o l i t e r a t u r e v a l u e s r e p o r t e d f o r t h e r a t , t h e 1 6 2 a f t e r 3 w e e k s ( A b a n o b i e t a l . , 1 9 8 2 ) , w h i l e C S 7 B L / 6 a n d B 6 0 3 F 1 m i c e h a v e t h e h i g h e s t l e v e l o f c e l l p r o l i f e r a t i o n a f t e r 4 w e e k s o f C M D d i e t a d m i n i s t r a t i o n ( F i g u r e 3 ) . I n b o t h m o u s e s t r a i n s , c e l l p r o l i f e r a t i o n i n c r e a s e s t h r o u g h o u t t h e s t u d y i n r e s p o n s e t o C M D d i e t , r e t u r n i n g t o w a r d c o n t r o l v a l u e s i n t h e r e c o v e r y g r o u p s . T h u s , i t a p p e a r s r a t s a n d m i c e r e s p o n d d i f f e r e n t l y t o C M D d i e t i n d u c e d c e l l p r o l i f e r a t i o n . W e d e m o n s t r a t e a c o n s i s t e n t , p a r t i a l r e s t o r a t i o n o f g l o b a l m e t h y l a t i o n s t a t u s a t t h e t w o w e e k t i m e p o i n t i n 8 6 C 3 F 1 m i c e t h a t r e c e i v e d t h e C M D d i e t a n d t h e C M D d i e t c o - a d m i n i s t e r e d w i t h P 8 . T h e r e a r e r e p o r t s i l l u s t r a t i n g t h e a b i l i t y o f m a m m a l i a n s y s t e m s t o “ s c a v e n g e ” m e t h y l g r o u p s f r o m c e l l u l a r s o u r c e s u n d e r c o n d i t i o n s o f m e t h y l d e p r i v a t i o n ( U l u s e t a l . , 1 9 8 9 ; C a n t y a n d Z e i s e l , 1 9 9 4 ) . F o r e x a m p l e , p h o s p h a t i d y l c h o l i n e f r o m c e l l u l a r m e m b r a n e s m a y s e r v e t o d o n a t e c h o l i n e t o b e u t i l i z e d f o r t h e s y n t h e s i s o f S A M ( C a n t y a n d Z e i s e l , 1 9 9 4 ) , i n a s i m i l a r f a s h i o n a s h a s b e e n d e m o n s t r a t e d f o r t h e s y n t h e s i s o f a c e t y l c h o l i n e ( U l u s e t a l . , 1 9 8 9 ) . A d d i t i o n a l l y , h u m a n s o n m e t h y l d e f i c i e n t d i e t s m a i n t a i n t h e i r n i t r o g e n b a l a n c e , p r o v i d i n g e v i d e n c e f o r s c a v e n g i n g o f m e t h y l g r o u p s ( M u d d e t a l . , 1 9 8 0 ) . T h e p a r t i a l r e c o v e r y o f m e t h y l a t i o n s t a t u s i s n o t e v i d e n t i n t h e B G C S F I m i c e t h a t r e c e i v e d P B . T h i s m a y b e d u e t o t h e i n t e r a c t i o n o f P 8 w i t h p h o s p h a t i d y l c h o l i n e t h r o u g h h y d r o g e n b o n d i n g ( N o v a k a n d S w i f t , 1 9 7 6 ) , t h e r e b y p r e v e n t i n g i t s a b i l i t y t o b e s c a v e n g e d . P a r t i a l r e c o v e r y i s n o t e v i d e n t i n t h e C 5 7 B U 6 , p e r h a p s b e c a u s e t h e h y p o m e t h y l a t i o n c a u s e d b y t h e C M D d i e t o c c u r s m o r e s l o w l y t h a n i n t h e B 6 C 3 F 1 a n d t h u s t o a n e x t e n t b e l o w t h a t r e q u i r e d t o i n d u c e “ s c a v e n g i n g ” . 1 6 3 H y p o m e t h y l a t i o n o f D N A m a y t a k e p l a c e a s a c o n s e q u e n c e o f a d e c r e a s e d c a p a c i t y a n d / o r f i d e l i t y o f D N A m a i n t e n a n c e m e t h y l a s e d u r i n g p e r i o d s o f D N A r e p l i c a t i o n a s s o c i a t e d w i t h c e l l p r o l i f e r a t i o n ( r e f e r e n c e d i n C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 ) . H o w e v e r , i t d o e s n o t a p p e a r t h a t t h e h y p o m e t h y l a t i o n o b s e r v e d i n t h e c u r r e n t s t u d i e s c a n b e a c c o u n t e d f o r f u l l y o n t h e b a s i s o f d e c r e a s e d m a i n t e n a n c e m e t h y l a t i o n d u r i n g p e r i o d s o f i n c r e a s e d c e l l p r o l i f e r a t i o n . T h e r e f o r e , i t i s p o s s i b l e t h a t s o m e d e m e t h y l a t i o n i s o c c u r r i n g t h a t i s n o t l i n k e d t o D N A r e p l i c a t i o n . A d e c r e a s e i n D N A 5 M e C m a y b e b r o u g h t a b o u t b y a n e n z y m a t i c p r o c e s s i n v o l v i n g r e p l a c e m e n t o f 5 M e C w i t h C . T h i s o c c u r s d u r i n g d i f f e r e n t i a t i o n o f F r i e n d e r y t h r o l e u k e m i a c e l l s ( R a z i n e t a l . , 1 9 8 6 ) a n d e s t r a d i o l - i n d u c e d e x p r e s s i o n o f t h e a v i a n v i t e l l o g e n i n I I g e n e ( S a l u z e t a l . , 1 9 8 6 ) . T h e e n z y m a t i c r e m o v a l o f 5 M e C f r o m D N A b y a D N A - g l y c o s y l a s e h a s b e e n d e m o n s t r a t e d i n h u m a n ( V a i r a p a n d i a n d D u k e r , 1 9 9 3 ) , r o d e n t ( J o s t a n d J o s t , 1 9 9 4 ) a n d c h i c k e n ( J o s t e t a l . , 1 9 9 5 ) c e l l s . T h e k e y o b s e r v a t i o n i n t h e p r e s e n t r e p o r t i s t h a t t h e B G C 3 F 1 m o u s e i s l e s s c a p a b l e o f m a i n t a i n i n g i t s n o r m a l l e v e l o f m e t h y l a t i o n t h a n t h e C S 7 B L / 6 s t r a i n i n r e s p o n s e t o t r e a t m e n t w i t h P B o r a C M D d i e t , t w o p r o m o t e r s o f l i v e r t u m o r i g e n e s i s . I n g e n e r a l , t h e o v e r a l l l e v e l o f g e n o m i c 5 M e C a p p e a r s t o b e m a i n t a i n e d m o r e e f f e c t i v e l y i n h u m a n c e l l s a s c o m p a r e d t o r o d e n t c e l l s . W h e n n o r m a l d i p l o i d f i b r o b l a s t s f r o m m i c e , h a m s t e r s a n d h u m a n s w e r e g r o w n i n c u l t u r e t h e 5 M e C c o n t e n t o f t h e i r D N A s d e c r e a s e d o v e r t i m e , w i t h t h e r a t e o f l o s s b e i n g h i g h e s t i n m o u s e c e l l s a n d l o w e s t i n h u m a n c e l l s ( W i l s o n a n d J o n e s , 1 9 8 3 ) . A d d i t i o n a l l y , t h e r a t e o f l o s s o f 5 M e C f r o m m o u s e l i v e r D N A w a s r e l a t e d 1 6 4 i n v e r s e l y t o l i f e s p a n o f t h e s t r a i n s s t u d i e d ( W i l s o n e t a l . , 1 9 8 7 ) . T h u s , h u m a n s a r e l i k e l y t o b e m o r e r e s i s t a n t t o a l t e r a t i o n s i n m e t h y l a t i o n s t a t u s t h a n m i c e a n d t h e B 6 C 3 F 1 m o u s e , u s e d b y t h e N a t i o n a l T o x i c o l o g y P r o g r a m f o r t h e c a r c i n o g e n b i o a s s a y , i s v e r y s e n s i t i v e t o a l t e r a t i o n s i n m e t h y l a t i o n s t a t u s . A l t e r a t i o n s t o t h e g e n o m e ( e . g . , p o i n t m u t a t i o n , c h r o m o s o m e l o s s , c h a n g e s i n m e t h y l a t i o n s t a t u s ) o c c u r a t m u l t i p l e p o i n t s i n t h e c a r c i n o g e n i c p r o c e s s ( V o g e l s t e i n e t a l . , 1 9 8 8 ; M a r x , 1 9 9 1 ) . I n d e e d , a l t e r a t i o n s i n m e t h y l a t i o n m a y p l a y a v a r i e t y o f r o l e s i n c a r c i n o g e n e s i s ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 a ) . I n a d d i t i o n t o e n h a n c i n g o u r u n d e r s t a n d i n g o f t h e t r a n s f o r m a t i o n p r o c e s s , r e s e a r c h i n t h e a r e a o f D N A m e t h y l a t i o n i s p r o v i d i n g t h e t y p e o f i n f o r m a t i o n w h i c h i s r e q u i r e d i n o r d e r t o t a k e a m o r e r a t i o n a l a p p r o a c h t o w a r d s r i s k a s s e s s m e n t ( G o o d m a n , 1 9 9 4 ) . S p e c i f i c a l l y , i t i s r e l a t e d d i r e c t l y t o t h r e e p r a c t i c a l g o a l s : ( 1 ) d o s e s e t t i n g f o r t h e b i o a s s a y ; ( 2 ) a n u n d e r s t a n d i n g o f d o s e - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p s ; a n d ( 3 ) a r e a s o n e d a p p r o a c h t o w a r d s s p e c i e s - t o - s p e c i e s e x t r a p o l a t i o n i s s u e s . A n a s s e s s m e n t o f D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s s h o u l d b e c o n s i d e r e d f o r i n c l u s i o n a s a n a n c i l l a r y c o m p o n e n t ( e . g . , i n a d d i t i o n t o r o u t i n e h i s t o p a t h o l o g y , a s s e s s m e n t s o f c e l l p r o l i f e r a t i o n i n v i v o , a n d i n v i t r o t e s t s f o r t h e p o t e n t i a l t o c a u s e g e n o t o x i c i t y ) o f b o t h s u b c h r o n i c s t u d i e s a n d t h e c a r c i n o g e n b i o a s s a y ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 ; C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 d ) . T h i s c o u l d a i d i n d i s c e r n i n g t h e m e c h a n i s m o f a c t i o n ( e . g . , a p o s s i b l e n o n g e n o t o x i c , t h r e s h o l d e x h i b i t i n g m e c h a n i s m ) o f t h e c h e m i c a l b e i n g e v a l u a t e d . I n a d d i t i o n , t h i s i n f o r m a t i o n c o u l d f a c i l i t a t e a r a t i o n a l a p p r o a c h t o d o s e s e t t i n g a n d t h e s e l e c t i o n 1 6 5 o f a p p r o p r i a t e d o s e s f o r r i s k a s s e s s m e n t , e . g . , i f t o x i c i t y o c c u r s o n l y a t d o s e s a b o v e t h a t w h i c h c a u s e h y p o m e t h y l a t i o n i n t h e t a r g e t o r g a n ( s ) . T h e s e d a t a c o u l d a i d i n p r o v i d i n g t h e b a s i s f o r p l a c i n g a p r o p e r e m p h a s i s o n l o w e r d o s e s . D o s e i n f l u e n c e s m e c h a n i s m a n d , o v e r a w i d e r a n g e o f d o s e s , m e c h a n i s m c h a n g e s w i t h d o s e ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 b ) . D o s e s o f t h e t e s t c h e m i c a l t h a t c a u s e a l t e r a t i o n s i n D N A m e t h y l a t i o n s h o u l d b e v i e w e d a s h a v i n g c o m p r o m i s e d a k e y h o m e o s t a t i c m e c h a n i s m , e . g . , a t h r e s h o l d h a s b e e n e x c e e d e d . H o w e v e r , I t w o u l d n o t b e a p p r o p r i a t e t o c o n s i d e r m e a s u r e m e n t o f a l t e r a t i o n s i n D N A m e t h y l a t i o n a s a s h o r t - t e r m t e s t f o r c a r c i n o g e n s . T h e d a t a i n t h i s c u r r e n t r e p o r t , i n c o n j u n c t i o n w i t h o u r p r e v i o u s i n v e s t i g a t i o n ( R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) , l e a d u s t o p r o p o s e t h a t t h e B 6 C 3 F 1 m o u s e h a s a d e c r e a s e d c a p a c i t y a n d / o r f i d e l i t y o f m a i n t a i n i n g n a s c e n t D N A m e t h y l a t i o n a n d t h i s d e f e c t e x p l a i n s , i n p a r t , t h e r e l a t i v e h i g h s e n s i t i v i t y o f t h i s a n i m a l t o b o t h s p o n t a n e o u s a n d c h e m i c a l - i n d u c e d l i v e r t u m o r s a s c o m p a r e d t o t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C S 7 B L / 6 s t r a i n . T h i s s h o u l d b e v i e w e d w i t h i n t h e c o n t e x t t h a t : 1 ) t h e o v e r a l l l e v e l o f g e n o m i c 5 M e C a p p e a r s t o b e m a i n t a i n e d m o r e e f f e c t i v e l y i n h u m a n c e l l s a s c o m p a r e d t o r o d e n t c e l l s ( H o l l i d a y , 1 9 8 9 ; r e f e r e n c e d I n C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 0 ) ; a n d 2 ) t h e r e a r e d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e m o u s e a n d h u m a n w i t h r e g a r d t o b o t h m e t h y l a t i o n s t a t u s a n d b a s e s e q u e n c e ( s e e C h a p t e r 2 ; C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 e ) i n t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s , a n o n c o g e n e t h a t i s f r e q u e n t l y i n v o l v e d i n m o u s e l i v e r t u m o r s ( M a r o n p o t e t a l . , 1 9 9 5 ) w h i l e i t o n l y v e r y r a r e l y p l a y s a r o l e i n h u m a n c a n c e r ( B o s , 1 9 8 9 ) . T h e r e f o r e , i t a p p e a r s t o b e i n a p p r o p r i a t e t o m a k e h u m a n r i s k a s s e s s m e n t 1 6 6 d e c i s i o n s b a s e d o n l y u p o n a l i v e r t u m o r r e s p o n s e i n t h e B 6 0 3 F 1 m o u s e . I n t h o s e s i t u a t i o n s w h e r e t h e r e s u l t s o f a b i o a s s a y I n d i c a t e t h a t t h e m o u s e l i v e r i s o n e o f s e v e r a l s i t e s w h e r e a n i n c r e a s e d t u m o r i n c i d e n c e o c c u r s , t h e m o u s e l i v e r t u m o r r e s p o n s e s h o u l d b e e v a l u a t e d w i t h r e g a r d t o t h e m o d e o f a c t i o n o f t h e c h e m i c a l i n q u e s t i o n . S a f e t y a s s e s s m e n t f o r t h o s e c h e m i c a l s a c t i n g t h r o u g h a t h r e s h o l d - e x h i b i t i n g m o d e o f a c t i o n s h o u l d b e b a s e d u p o n a s a f e t y f a c t o r ( o r m u l t i p l i c i t y o f e x p o s u r e ) a p p r o a c h ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 b ) . A C K N O W L E D G M E N T S O u r r e s e a r c h c o n c e r n i n g D N A m e t h y l a t i o n w a s i n i t i a t e d b y s u p p o r t f r o m t h e I n t e r n a t i o n a l L i f e S c i e n c e s I n s t i t u t e ( I L S I ) R i s k S c i e n c e I n s t i t u t e . T h i s i s c u r r e n t l y s u p p o r t e d b y I L S I , H e a l t h a n d E n v i r o n m e n t a l S c i e n c e s I n s t i t u t e , a n d N I H g r a n t E S - 0 5 2 9 9 . J L C i s t h e r e c i p i e n t o f a S o c i e t y o f T o x i c o l o g y p r e d o c t o r a l f e l l o w s h i p a w a r d . R E F E R E N C E S A b a n o b i , S . E . , L o m b a r d i , B . a n d S h i n o z u k a , H . ( 1 9 8 2 ) S t i m u l a t i o n o f D N A s y n t h e s i s a n d c e l l p r o l i f e r a t i o n i n t h e l i v e r o f r a t s f e d a c h o l i n e - d e v o i d d i e t a n d t h e i r s u p p r e s s i o n b y p h e n o b a r b i t a l . C a m e L B e e u 4 2 , 4 1 2 - 4 1 5 . A m e s , B . N . a n d G o l d , L S . ( 1 9 9 0 ) C h e m i c a l c a r c i n o g e n e s i s : T o o m a n y r o d e n t c a r c i n o g e n s . W M , 8 7 , 7 7 7 2 - 7 7 7 6 . B a l a g h i , M . a n d W a g n e r , C . ( 1 9 9 3 ) D N A m e t h y l a t i o n ' I n f o l a t e d e f i c i e n c y : U s e o f C p G m e t h y l a s e . W , 1 9 3 , 1 1 8 4 - 1 1 9 0 . B e c k e r , P F . ( 1 9 8 2 ) M o r p h o l o g i c a l c l a s s i f i c a t i o n o f m o u s e l i v e r t u m o r s b a s e d o n b i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s . C a e e e L B e e , 4 2 , 3 9 1 8 - 3 9 2 3 . 1 6 7 B i r d , A P . ( 1 9 8 6 ) C p G - r i c h i s l a n d s a n d t h e f u n c t i o n o f D N A m e t h y l a t i o n . N a l e r e l L e n e e e l , 3 2 1 . 2 0 9 - 2 1 3 . B o s , J . L . ( 1 9 8 9 ) r a s o n c o g e n e s i n h u m a n c a n c e r : A r e v i e w . C a n e e r _ fi e s l , 4 9 , 4 6 8 2 - 4 6 8 9 . B u c h e r , N . L . R . a n d M a l t , R A . ( 1 9 7 1 ) M o r p h o l o g i c a l a n d b i o l o g i c a l a s p e c t s . I n B e g e e e m fl e r L e L L n L e L a e i n e n e y . L i t t l e , B r o w n a n d C o m p a n y , B o s t o n , p . 2 3 . C a n t y , D J . a n d Z e i s e l , S H . ( 1 9 9 4 ) L e c i t h i n a n d c h o l i n e i n h u m a n h e a l t h a n d d i s e a s e . W , 5 2 , 3 2 7 - 3 3 9 . C o h e n , S M . a n d E l l w e i n , L B . ( 1 9 9 1 ) G e n e t i c e r r o r s , c e l l p r o l i f e r a t i o n , a n d c a r c i n o g e n e s i s . C a n e e r fl e e , 5 1 , 6 4 9 3 - 6 5 0 5 . C o u n t s , J . L . a n d G o o d m a n , J . . I ( 1 9 9 4 ) H y p o m e t h y l a t i o n o f D N A . A n e p i g e n e t i c m e c h a n i s m i n v o l v e d i n t u m o r p r o m o t i o n . W . 1 1 , 1 8 5 - 1 8 8 . C o u n t s , J . L . a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 5 a ) A l t e r a t i o n s i n D N A m e t h y l a t i o n m a y p l a y a v a r i e t y o f r o l e s i n c a r c i n o g e n e s i s . C e l l , 8 3 , 1 3 - 1 5 . C o u n t s , J . L . a n d G o o d m a n , J . l . ( 1 9 9 5 b ) P r i n c i p l e s u n d e r l y i n g d o s e s e l e c t i o n f o r , a n d e x t r a p o l a t i o n f r o m , t h e c a r c i n o g e n b i o a s s a y : D o s e i n f l u e n c e s m e c h a n i s m . W 1 1 , 4 1 8 - 4 2 1 . C o u n t s , J . L . a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 5 0 ) H y p o m e t h y l a t i o n o f D N A : A n e p i g e n e t i c m e c h a n i s m t h a t c a n f a c i l i t a t e t h e a b e r r a n t o n c o g e n e e x p r e s s i o n I n v o l v e d i n l i v e r c a r c i n o g e n e s i s . I n J i r t l e , R . L . ( e d . ) ' M e l e e M a L a e e C e l l l L l a L M e e l l a e i e m e . A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k , p p . 2 2 7 - 2 5 5 . C o u n t s , J . I . . a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 5 d ) H y p o m e t h y l a t i o n o f D N A . A p o s s i b l e e p i g e n e t i c m e c h a n i s m i n v o l v e d I n t u m o r p r o m o t i o n . I n M c C l a i n , R M . S l a g a , T - - J L e B o e u f F 1 a n d P i t o t H ( « M W I m e l I c a t L Q n s l o fl i s l e s s e s s m e m W i l e y - L i s s . N e w Y o r k p p 8 1 - 1 0 1 C o u n t s , J . L . a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 5 e ) H y p o m e t h y l a t i o n o f D N A : A n o n g e n o t o x i c m e c h a n i s m i n v o l v e d i n t u m o r p r o m o t i o n . W . i n p r e s s . D e n d a , A . , T a n g , 0 . , E n d o h , T . , T s u j i u c h i , T . , H o r i g u c h i , K . , N o g u c h i , O . , M i z u m o t o , Y . , N a k a e , D . a n d K n o i s h i , Y . ( 1 9 9 4 ) P r e v e n t i o n b y a c e t y l s a l i c y l i c a c i d o f l i v e r c i r r h o s i s a n d c a r c i n o g e n e s i s a s w e l l a s g e n e r a t i o n s o f 8 - h y d r o x y d e o x y g u a n o s i n e a n d t h i o b a r b i t u r i c a c i d - r e a c t i v e s u b s t a n c e s c a u s e d b y a c h o l i n e - d e f i c i e n t , L - a m i n o a c i d - d e f i n e d d i e t i n r a t s . m m , 1 5 , 1 2 7 9 - 1 2 8 3 . 1 6 8 D e S o u z a , A . T . , H a n k i n s , G . R . , W a s h i n g t o n , M . K . , F i n e , R . L . , O r t o n , T C . a n d J i r t l e , R . L . ( 1 9 9 5 ) F r e q u e n t l o s s o f h e t e r o z y g o s i t y o f 6 q a t t h e m a n n o s e 6 - p h o s p h a t e / i n s u l i n - I i k e g r o w t h f a c t o r I I r e c e p t o r l o c u s i n h u m a n h e p a t o c e l l u l a r t u m o r s . C n e e g e n e , 1 0 , 1 7 2 5 - 1 7 2 9 . D i w a n , B . A . , R i c e , J . M . , O h s h i m a , M . , W a r d , J . M . a n d D o v e , L . F . ( 1 9 8 5 ) C o m p a r a t i v e t u m o r - p r o m o t i n g a c t i v i t i e s o f p h e n o b a r b i t a l , a m o b a r b i t a l , b a r b i t a l s o d i u m , a n d b a r b i t u r i c a c i d o n l i v e r s a n d o t h e r o r g a n s o f m a l e F 3 4 4 / N C r r a t s f o l l o w i n g i n i t i a t i o n w i t h N - n i t r o s o d i e t h y l a m i n e . M a t L C a n e e L l e e L , 7 4 , 5 0 9 - 5 1 6 . E c k l , P . M . , M e y e r , S . A . , W h i t c o m b e , W . R . a n d J i r t l e , R . L . ( 1 9 8 8 ) P h e n o b a r b i t a l r e d u c e s E G F n u m b e r a n d t h e a b i l i t y o f p h y s i o l o g i c a l c o n c e n t r a t i o n s o f c a l c i u m t o s u p p r e s s h e p a t o c y t e p r o l i f e r a t i o n . C a l e l e e e e e e s j e , 9 , 4 7 9 - 4 8 3 . F o x , T . R . , S c h u m a n n , A . M . , W a t a n a b e , P . G . , Y a n o , B . L . , M a h e r , V . M . a n d M c C o r m i c k , J . J . ( 1 9 9 0 ) M u t a t i o n a l a n a l y s i s o f t h e H - r a s o n c o g e n e i n s p o n t a n e o u s C S 7 B L / 6 x C B H / H e m o u s e l i v e r t u m o r s a n d t u m o r s i n d u c e d w i t h g e n o t o x i c a n d n o n g e n o t o x i c h e p a t o c a r c i n o g e n s . Q Q D Q Q L B Q S . 5 0 , 4 0 1 4 : 4 0 1 9 . G h o s h a l , A K a n d F a r b e r , E . ( 1 9 8 4 ) T h e i n d u c t i o n o f l i v e r c a n c e r b y d i e t a r y d e f i c i e n c y o f c h o l i n e a n d m e t h i o n i n e w i t h o u t a d d e d c a r c i n o g e n s . 9 8 m m 5 . 1 3 6 7 - 1 3 7 0 G o n z a l e z - Z u l u e t a , M . , B e n d e r , C . M . , Y a n g , A . S . , N g u y e n , T . , B e a r t , R . W . , V a n T o m o u t , J . M . a n d J o n e s , P A . ( 1 9 9 5 ) M e t h y l a t i o n o f t h e 5 ' C p G i s l a n d o f t h e p 1 6 / C D K N 2 t u m o r s u p p r e s s o r g e n e i n n o r m a l a n d t r a n s f o r m e d h u m a n t i s s u e s c o r r e l a t e s w i t h g e n e s i l e n c i n g . Q E D Q Q L B Q S . . . 5 5 , 4 5 3 1 - 4 5 3 5 . G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 4 ) A r a t i o n a l a p p r o a c h t o r i s k a s s e s s m e n t r e q u i r e s t h e u s e o f b i o l o g i c a l i n f o r m a t i o n : A n a n a l y s i s o f t h e N a t i o n a l T o x i c o l o g y P r o g r a m ( N T P ) , f i n a l r e p o r t o f t h e a d v i s o r y r e v i e w b y t h e N T P B o a r d o f S c i e n t i f i c C o u n s e l o r s . W . 1 9 5 1 5 9 H a n i g a n , M . H . , K e m p , C . J . , G i n s l e r , J . J . a n d D r i n k w a t e r , N R . ( 1 9 8 8 ) R a p i d g r o w t h o f p r e n e o p l a s t i c l e s i o n s i n h e p a t o c a r c i n o g e n - s e n s i t i v e C 3 H / H e J m a l e m i c e r e l a t i v e t o C 5 7 B U 6 J m a l e m i c e . C a r e l n e g e u e s l e , 9 , 8 8 5 - 8 9 0 . H e r g e r s b e r g , M . ( 1 9 9 1 ) B i o l o g i c a l a s p e c t s o f c y t o s i n e m e t h y l a t i o n i n e u k a r y o t i c c e l l s . E x p e r i e n j l a , 4 7 , 1 1 7 1 - 1 1 8 5 . H e r m a n , J . G . , M e r l o , A . , M a o , L . , L a p i d u s , R . G . , l s s a , J . - P . J . , D a v i d s o n , N . E . , S i d r a n s k y , D . a n d B a y l i n , S B . ( 1 9 9 5 ) I n a c t i v a t i o n o f t h e C D K N 2 / p 1 6 / M T S I g e n e i s f r e q u e n t l y a s s o c i a t e d w i t h a b e r r a n t D N A m e t h y l a t i o n i n a l l c o m m o n h u m a n c a n c e r s . C a n e e r R e e , 5 5 , 4 5 2 5 - 4 5 3 0 . 1 6 9 H o l l i d a y , R . ( 1 9 8 9 ) X - c h r o m o s o m e r e a c t i v a t i o n a n d a g e i n g . N a t u m l L e n e e n l . 3 3 7 . 3 1 1 . J i r t l e , R . L . a n d M e y e r , S A . ( 1 9 9 1 ) L i v e r t u m o r p r o m o t i o n : E f f e c t o f p h e n o b a r b i t a l o f E G F a n d p r o t e i n k i n a s e C s i g n a l t r a n s d u c t i o n a n d t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - B 1 e x p r e s s i o n . n g e e t , D i e , C e i , , 3 6 , 6 5 9 - 6 6 8 . J i r t l e , R . L . , H a n k i n s , G . R . , R e i s e n b i c h l e r , H . a n d B o y e r , I . J . ( 1 9 9 4 ) R e g u l a t i o n o f m a n n o s e 6 - p h o s p h a t e / i n s u l i n - I i k e g r o w t h f a c t o r - l l r e c e p t o r s a n d t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r b e t a d u r i n g l i v e r t u m o r p r o m o t i o n w i t h p h e n o b a r b i t a l . W e 1 5 1 4 7 3 - 1 4 7 8 J o s t , J . - P . , S i e g m a n n , M . , S u n , L . a n d L e u n g , R . ( 1 9 9 5 ) M e c h a n i s m s o f D N A d e m e t h y l a t i o n i n c h i c k e n e m b r y o s . , l , B i e l , C h e m , , 2 7 0 , 9 7 3 4 - 9 7 3 9 . J o s t , J . - P . a n d J o s t , Y . - C . ( 1 9 9 4 ) T r a n s i e n t D N A d e m e t h y l a t i o n i n d i f f e r e n t i a t i n g m o u s e m y o b l a s t s c o r r e l a t e s w i t h h i g h e r a c t i v i t y o f 5 - m e t h y l d e o x y c y t i d i n e e x c i s i o n r e p a i r . J . _ B _ l e l & l l e _ r n _ , , 2 6 9 , 1 0 0 4 0 - 1 0 0 4 3 . L i n , E . L . C . , K l a u n i g , J . E . , M a t t o x , J . K . , W e g h o r s t , C . M . , M c F a r l a n d , B . H . a n d P e r e i r a , M A . ( 1 9 8 9 ) C o m p a r i s o n o f t h e e f f e c t s o f a c u t e a n d s u b a c u t e t r e a t m e n t o f p h e n o b a r b i t a l i n d i f f e r e n t s t r a i n s o f m i c e . C a e e e L L e m , 4 8 , 4 3 - 5 1 . M a r o n p o t , R . R . , F o x , T . , M a l a r k e y , D E . a n d G o l d s w o r t h y , T L . ( 1 9 9 5 ) M u t a t i o n i n t h e r a s p r o t o - o n c o g e n e : C l u e s t o e t i o l o g y a n d m o l e c u l a r p a t h o g e n e s i s o f m o u s e l i v e r t u m o r s . T o x i e e l e g y , 1 0 1 , 1 2 5 - 1 5 6 . M a r x , J . ( 1 9 9 1 ) P o s s i b l e n e w c o l o n c a n c e r g e n e f o u n d . C e i e e e e , 2 5 1 , 1 3 1 7 . M e l n i c k , R . L . , H u f f , J . , B a r r e t t , J . C . , M a r o n p o t , R . . , R L u c i e r , G . a n d P o r t i e r , C . J . ( 1 9 9 3 ) C e l l p r o l i f e r a t i o n a n d c h e m i c a l c a r c i n o g e n e s i s : S y m p o s i u m o v e r v i e w . W . 1 0 1 ( S u p p l 5 ) 3 - 8 M i k o l , Y B . H o o v e r , K . . , L C r e a s i a , D . a n d P o i r i e r , L A . ( 1 9 8 3 ) H e p a t o c a r c i n o g e n e s i s i n r a t s f e d m e t h y l - - d e f i c i e n t , a m i n o a c i d - d e f i n e d d i e t s . C e r e m g e n e e i e . 4 . 1 6 1 9 - 1 6 2 9 M i l l s , J . . , J J i r t l e , R . . L a n d B o y e r , I . J . ( 1 9 9 5 ) M e c h a n i s m s o f l i v e r t u m o r P r o m o t i o n i n J i r t l e F i - L ( e d ) M W M e l e e e l a L a n e fi e l l e l a L M e e n a m e m g - z . A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k , p p . 1 9 9 - 2 2 6 . M u d d , S . H . , E b e r t , M . H . a n d S c r i v e r , C B . ( 1 9 8 0 ) L a b i l e m e t h y l g r o u p b a l a n c e s i n t h e h u m a n : T h e r o l e o f s a r c o s i n e . M e t a e e l l s m , 2 9 , 7 0 7 - 7 2 0 . 1 7 0 N e w b e m e , P . M . , d e C a m a r g o , J . L . V . , a n d C l a r k , A . J . ( 1 9 8 2 ) C h o l i n e d e f i c i e n c y , p a r t i a l h e p a t e c t o m y , a n d l i v e r t u m o r s i n r a t s a n d m i c e . M . 1 0 , 9 5 - 1 0 6 . N e w b e m e , P . M . , S u p h i p h a t , V . , L o c n i s k a r , M . a n d d e C a m a r g o , J . L . V . ( 1 9 9 0 ) I n h i b i t i o n o f h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s i n m i c e b y d i e t a r y m e t h y l d o n o r s m e t h i o n i n e a n d c h o l i n e . W , 1 4 , 1 7 5 - 1 8 1 . N o v a k , R F . a n d S w i f t , T . J . ( 1 9 7 6 ) N u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e s t u d i e s o f b a r b i t u r a t e - p h o s p h o l i p i d i n t e r a c t i o n s . M e l , _ E l _ 1 a _ r _ m a e e L , 1 2 , 2 6 3 - 2 7 8 . P a s c a l e , R . M . , M a r r a s , V . , S i m i l e , M . M . , D i a n o , L . , P i n n a , G . , B e n n a t i , S . , C a r t a , M . , S e d d a i u , M . A . , M a s s a r e l l i , G . a n d F e o , F . ( 1 9 9 2 ) C h e m o p r e v e n t i o n o f r a t l i v e r c a r c i n o g e n e s i s b y S - a d e n o s y I - L - m e t h i o n i n e : A l o n g t e r m s t u d y . C a n e e l : B e s t , 5 2 , 4 9 7 9 - 4 9 8 6 . P e r i a n o , C . , F r y , R . J . M . , S t a f f e l d t , E . a n d C h r i s t o p h e r , J P . ( 1 9 7 1 ) C o m p a r a t i v e e n h a n c i n g e f f e c t s o f p h e n o b a r b i t a l , a m o b a r b i t a l , d i p h e n y l h y d a n t o i n , a n d d i c h l o r o p h e n y l t r i c h l o r o e t h a n e o n 2 - a c e t y l a m i n o f l u o r e n e - i n d u c e d h e p a t i c t u m o r i g e n e s i s i n t h e r a t . C a e c e L B e a , 3 5 , 2 8 8 4 - 2 8 9 0 . P i t o t , H . C . ( 1 9 9 0 ) A l t e r e d h e p a t i c f o c i : T h e i r r o l e i n m u r i n e h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s . M W . 3 0 , 4 6 5 - 5 0 0 . R a y , J . S , H a r b i s o n , M . L . , M c C l a i n , R . M . a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 4 ) A l t e r a t i o n s i n t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s a n d e x p r e s s i o n o f t h e r e f o n c o g e n e i n p h e n o b a r b i t a l - i n d u c e d a n d s p o n t a n e o u s B G C 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s . W e n t , 9 , 1 5 5 - 1 6 6 . R a z i n , A . , S z y f , M . , K a f r i , T . , R o l l , M . , G i l o h , H . , S c a r p a , S . , C a r o t t i , D . a n d C a n t o n i , C L . ( 1 9 8 6 ) R e p l a c e m e n t o f 5 - m e t h y l c y t o s i n e b y c y t o s i n e : A p o s s i b l e m e c h a n i s m f o r t r a n s i e n t D N A d e m e t h y l a t i o n d u r i n g d i f f e r e n t i a t i o n . M a n , A e a e , _ S e l . _ _ l J _ , _ S _ , A , , 8 3 , 2 8 2 7 - 2 8 3 1 . R a z i n , A . a n d K a f r i , T . ( 1 9 9 4 ) D N A m e t h y l a t i o n f r o m e m b r y o t o a d u l t . E m N e e l e i e A e i e R e e , M e l . B i e l , , 4 8 , 5 3 - 8 1 . R e i s e n b i c h l e r , H . , C h a r i , R . S . , B o y e r , I . J . a n d J i r t l e , R . L . ( 1 9 9 4 ) T r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - 8 r e c e p t o r s t y p e I , I I a n d I I I i n p h e n o b a r b i t a l - p r o m o t e d r a t l i v e r t u m o r s . C a m l n e g e n e e l e , 1 5 , 2 7 6 3 - 2 7 6 7 . S a l u z , H . P . , J i r i c n y , J . a n d J o s t , J P . ( 1 9 8 6 ) G e n o m i c s e q u e n c i n g r e v e a l s a p o s i t i v e c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e k i n e t i c s o f s t r a n d - s p e c i f i c D N A d e m e t h y l a t i o n o f t h e o v e r l a p p i n g e s t r a d i o l / g l u c o c o r t i c o i d - r e c e p t o r b i n d i n g s i t e s a n d t h e r a t e o f a v i a n v i t e l l o g e n i n m R N A s y n t h e s i s . P E Q Q . N a t l . A e a e , S e i , L l , S , A . , 8 3 , 7 1 6 7 - 7 1 7 1 . 1 7 1 S a w a d a , N . , P o i r i e r , L . , M o r a n , S . , X u , Y . H . a n d P i t o t , H . C . ( 1 9 9 0 ) T h e e f f e c t o f c h o l i n e a n d m e t h i o n i n e d e f i c i e n c i e s o n t h e n u m b e r a n d v o l u m e p e r c e n t a g e o f a l t e r e d h e p a t i c f o c i i n t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f d i e t h y l n i t r o s a m i n e i n i t i a t i o n i n r a t l i v e r . C a r e l n e g e n e s l s , 1 1 , 2 7 3 - 2 8 1 . S c h u l t e - H e r m a n n , R . , G r a s l - - K r a q u . B . a n d B u r s c h , W . ( 1 9 9 5 ) A p o p t o s i s i n h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s . I n J i r t l e , R . L . ( e d . , ) ' L I i L e r . _ B e g e n e r a t i o n _ a n g C a r c i n o g e n e s I L M e l e c o l a L a n o C e l l o l a L M e c b a n i s m s A c a d e m i c P r o s e . N e w Y o r k , p p . 1 4 1 - 1 7 8 . S h i n o z u k a , H . a n d L o m b a r d i , B . ( 1 9 8 0 ) S y n e r g i s t i c e f f e c t o f a c h o l i n e - d e v o i d d i e t a n d p h e n o b a r b i t a l i n p r o m o t i n g t h e e m e r g e n c e o f f o c i o f y - g l u t a m y l t r a n s p e p t i d a s e - p o s i t i v e f o c i i n t h e l i v e r o f c a r c i n o g e n t r e a t e d r a t s . C a n e e r _ B e $ _ , , 4 0 , 3 8 4 6 - 3 8 4 9 . S h i n o z u k a , H . , L o m b a r d i , B . a n d A b a n o b i , S E . ( 1 9 8 2 ) A c o m p a r a t i v e s t u d y o f t h e e f f i c a c y o f f o u r b a r b i t u r a t e s a s p r o m o t e r s o f t h e d e v e l o p m e n t o f y - g l u t a m y l t r a n s p e p t i d a s e - p o s i t i v e f o c i i n t h e l i v e r o f c a r c i n o g e n t r e a t e d r a t s . C a r c i n o g e n e s i s . 3 . 1 0 1 7 - 1 0 2 0 S h i v a p u r k a r , N . , W i l s o n , M . J . , H o o v e r , K . L . , M i k o l , Y B . , C r e a s i a , D . a n d P o i r i e r , L A . ( 1 9 8 6 ) H e p a t i c D N A m e t h y l a t i o n a n d l i v e r t u m o r f o r m a t i o n i n m a l e C 3 H m i c e f e d m e t h i o n i n e - a n d c h o l i n e - d e f i c i e n t d i e t s . , l , _ N a t L _ C a n _ c e L _ l e § t , , 7 7 , 2 1 3 - 2 1 7 . S o a m e s , A . R . , L a v e n d e r , 0 . , F o s t e r , J . R . , W i l l i a m s , S M . a n d W h e e l d o n , E B . ( 1 9 9 4 ) I m a g e a n a l y s i s o f b r o m o d e o x y u r i d i n e ( B r d U ) s t a i n i n g f o r m e a s u r e m e n t o f S - p h a s e i n r a t a n d m o u s e l i v e r . W . 4 2 , 9 3 9 - 9 4 4 . S t é g e r , R . , K u b i c k a , P . , L i u , C - G . , K a f r i , T . , R a z i n , A . , C e d a r , H . a n d B a r l o w , D P . ( 1 9 9 3 ) . M a t e r n a l - s p e c i f i c m e t h y l a t i o n o f t h e i m p r i n t e d m o u s e l g f 2 r l o c u s i d e n t i f i e s t h e e x p r e s s e d l o c u s a s c a r r y i n g t h e i m p r i n t i n g s i g n a l . C e l l , 7 3 , 6 1 - 7 1 . S t r a u s s , W M . ( 1 9 9 0 ) P r e p a r a t i o n o f g e n o m i c D N A f r o m m a m m a l i a n t i s s u e . I n A u s u b e l , F . M , B r e n t , R . , K i n g s t o n , R . . , E M o o r e , D . D . S e i d m a n , J . G . S m i t h , J . . A , a n d S t r u h l K ( o d e ) C i i r r c _ t _ E r o t o c o _ s _ _ M o _ e c . u l a r _ B i o . l e g v J o h n W i i e v a n d S o n s , N e w Y o r k , p p . 2 . . 2 1 - 2 . . . 2 3 U l u s , I . H . , W u r t m a n , R . J . , M a u r o n , C . a n d B l u s z t a j n , J . K . ( 1 9 8 9 ) C h o l i n e i n c r e a s e s a c e t y l c h o l i n e r e l e a s e a n d p r o t e c t s a g a i n s t t h e s t i m u l a t i o n - i n d u c e d d e c r e a s e i n p h o s p h a t i d e l e v e l s w i t h i n m e m b r a n e s o f r a t c o r p u s s t r i a t u m . B r a i n B e e , 4 8 4 , 2 1 7 - 2 2 7 . 1 7 2 V a i r a p a n d i , M . a n d D u k e r , N J . ( 1 9 9 3 ) E n z y m i c r e m o v a l o f 5 - - m e t h y l c y t o s i n e f r o m D N A b y a h u m a n D N A - g l y c o s y l a s e . W . 2 1 , 5 3 2 3 - 5 3 2 7 . V o g e l s t e i n , B . , F e a r o n , E . R . , H a m i l t o n , S . R . , K e r n , S . E . , P r e i s i n g e r , A . C . , L e p p e r t , M . , N a k a m u r a , Y . , W h i t e , R . , S m i t s , A . M . M . a n d B o s , J . L . ( 1 9 8 8 ) G e n e t i c a l t e r a t i o n s d u r i n g c o l o r e c t a l - t u m o r d e v e l o p m e n t . N , _ E _ n e , _ t l , _ M e d _ . , 3 1 9 , 5 2 5 - 5 3 2 . W a i n f a n , E . a n d P o i r i e r , L A . ( 1 9 9 2 ) M e t h y l g r o u p s i n c a r c i n o g e n e s i s : E f f e c t s o n D N A m e t h y l a t i o n a n d g e n e e x p r e s s i o n . C a e e e L B e e ” ( S u p p l . ) 5 2 , 2 0 7 1 s - 2 0 7 7 s . W i l s o n , V . L . , a n d J o n e s , R A . ( 1 9 8 3 ) . D N A m e t h y l a t i o n d e c r e a s e s i n a g i n g b u t n o t i n i m m o r t a l c e l l s . S e i e e e e , 2 2 0 , 1 0 5 5 - 1 0 5 7 . W i l s o n , V . L . , S m i t h , R . A . , M a , S . , a n d C u t l e r , R C . ( 1 9 8 7 ) . G e n o m i c 5 - m e t h y l d e o x y c y t i d i n e d e c r e a s e s w i t h a g e . , l , _ B i _ e l , _ C l 3 e m , , 2 6 2 , 9 9 4 8 - 9 9 5 1 . " 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 l i l l i “ . . . . s . . t 3 i . 9 : . . 3 a ' \ ' . 1 1 . . A A : ; y t l f l E z . . fl . . . . « . . . . . s . . . . ” n a w . L ( 2 3 £ ( u . . ‘ . , . v u « y v i U v . m 1 : . n . h 3 f . c fi n l 9 a # . r d r H a fl s h « : n 1 . u ! . . d . 2 . u fi . t 3 h i g u ) 3 fi d , 4 l 1 - d s . d . ) . H ! g 2 : . m i $ i 1 U 3 4 : i : 3 5 ! m 4 ‘ V 5 ? : l l \ O l . t r . m i a n “ . x 1 k . n 3 : . 3 3 . “ . In?NJ?@111;m 9 m 3 ? " 0 1 Itmun: 3 8 m m 2 3 » 4 8 8 S T A T E N E R S I T Y L L I B R A R Y M i c h i g a n § t a t e U n i v e r S I W P T L O A A C V E O l I l D R F E I T N U E R S N m B u O m X o t n o o m r o w b a t o n t h d b d c . h d o u e o k . o u t f r o m y o u r r e c o r d . D A T E D U E D A T E D U E D A T E D U E M S U I . A n A f fl n n u l v o A c t i o n / E m m i O p p o r t u n i t y I n t u i t i o n m m ! H Y P O M E T H Y L A T I O N O F D N A M A Y U N D E R L I E T H E H E I G H T E N E D S E N S I T I V I T Y O F T H E B G C S F 1 M O U S E T O L I V E R T U M O R I G E N E S I S V O L U M E I I B y J e n n i f e r L e e C o u n t s A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l f i l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y D e p a r t m e n t o f P h a r m a c o l o g y a n d T o x i c o l o g y 1 9 9 5 C h a p t e r 5 P R E F A C E T h e f i n a l s e r i e s o f e x p e r i m e n t s t h a t I c a r r i e d o u t i n v o l v e d a d e t e r m i n a t i o n o f t h e e f f e c t o f r e l a t i v e l y s h o r t - t e n n p r o m o t e r a d m i n i s t r a t i o n o n t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e H a - r a s a n d r a f o n c o g e n e s , a s w e l l a s t h e l e v e l o f e x p r e s s i o n o f H a - r a s , r a f a n d S A M s y n t h e t a s e . T h e m e t h y l a t i o n s t a t u s w a s s t a b l e a f t e r 4 w e e k s o f e a c h o f t h e p r o m o t e r t r e a t m e n t s ( s e e A p p e n d i x 4 ) , b u t w a s h y p o m e t h y l a t e d a f t e r 1 2 w e e k s o f C M D d i e t a d m i n i s t r a t i o n i n b o t h B G C 3 F 1 a n d C S 7 B L / 6 . T h i s i n d i c a t e s t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o f H a - r a s i s n o t a n e a r l y e v e n t a f t e r t u m o r p r o m o t i n g t r e a t m e n t s . I h a v e b e e n u n a b l e t o m a k e a n y c o n c l u s i o n s c o n c e r n i n g t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f r a f a t a n y o f t h e e a r l y t i m e p o i n t s ( s e e A p p e n d i x 5 ) , h o w e v e r , r a f w a s h y p o m e t h y l a t e d a f t e r 1 2 w e e k s o f C M D d i e t a d m i n i s t r a t i o n i n b o t h 3 6 C 3 F 1 a n d C 5 7 B L / 6 m o u s e l i v e r . I n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f H a - r a s a n d r e f w e r e e v i d e n t a t t i m e s p r e c e d i n g t h e 1 2 w e e k C M D g r o u p , i . e . , l w a s a b l e t o d i s c e r n i n c r e a s e d e x p r e s s i o n a t t i m e s w h e n h y p o m e t h y l a t i o n o f t h e g e n e s w a s n o t r e a d i l y a p p a r e n t . H o w e v e r , t h i s d o e s n o t p r e c l u d e t h e p o s s i b i l i t y t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o c c u r r e d a t s i t e s I w a s u n a b l e t o a s s e s s w i t h m y p r o b e s . I n a d d i t i o n , m R N A e x p r e s s i o n w a s m o r e f r e q u e n t l y e l e v a t e d i n t h e B S C S F 1 a s c o m p a r e d t o t h e C S 7 B L / 6 , a n d t h e B G C S F 1 w a s m o r e l i k e l y t h a n t h e C S 7 B U 6 t o d e m o n s t r a t e e l e v a t i o n o f H a - r a s a n d r e f i n t h e s a m e l i v e r . A n o t h e r a s p e c t p r e s e n t e d i n t h i s c h a p t e r i n v o l v e s a n a s s e s s m e n t o f g l o b a l l i v e r m e t h y l a t i o n s t a t u s o f s p o n t a n e o u s a n d P B - i n d u c e d B G C a F t l i v e r 1 7 3 1 7 4 t u m o r s . H e r e t o o , t h e e x p r e s s i o n o f H a - r a s , r a f , a n d S A M s y n t h e t a s e w a s e x a m i n e d . I d i d n o t e x a m i n e t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f s p e c i f i c o n c o g e n e s i n t h e t u m o r D N A f o r t w o r e a s o n s , ( 1 ) a l i m i t e d a m o u n t o f t i s s u e w a s a v a i l a b l e a n d I w a n t e d t o b e a b l e t o i s o l a t e R N A a n d D N A f r o m t h e s a m p l e s , a s w e l l a s h a v e e n o u g h t i s s u e f o r S A M a n d S A H a s s e s s m e n t ( u n f o r t u n a t e l y , t h i s c o u l d n o t b e a c c o m p l i s h e d d u e t o t h e l a b i l e n a t u r e o f S A M e v e n a t - 8 0 ° C ) a n d ( 2 ) t h i s h a d b e e n e x a m i n e d p r e v i o u s l y i n o u r l a b o r a t o r y ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 8 9 ; V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 9 b ; F l a y e t a l . , 1 9 9 4 ) . G l o b a l a s s e s s m e n t o f t u m o r D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s d e m o n s t r a t e d s u b p o p u l a t i o n s o f t u m o r s t h a t w e r e h y p o m e t h y l a t e d a n d t h a t t h i s o c c u r r e d i n m o r e o f t h e c a r c i n o m a s t h a n t h e a d e n o m a s . I n c r e a s e d H a - r a s e x p r e s s i o n w a s a p p a r e n t i n s o m e s p o n t a n e o u s l i v e r t u m o r s a n d i n t h e m a j o r i t y o f P B - i n d u c e d l i v e r t u m o r s . r a f a n d S A M s y n t h e t a s e m R N A l e v e l s w e r e e i t h e r u n c h a n g e d o r d e c r e a s e d i n b o t h t y p e s o f t u m o r s . T h i s m a n u s c r i p t h a s b e e n s u b m i t t e d f o r p u b l i c a t i o n . C h a p t e r 5 C O M P A R I S O N O F T U M O R P R O M O T E R T R E A T M E N T S O N D N A M E T H Y L A T I O N S T A T U S A N D G E N E E X P R E S S I O N I N B G C S F 1 A N D C S 7 B L I 6 M O U S E L I V E R A N D I N 3 6 C 3 F 1 M O U S E L I V E R T U M O R S J e n n i f e r L . C o u n t s 1 , R . M . M c C l a i n z , a n d J a y I . G o o d m a n ‘ ‘ D e p a r t m e n t o f P h a r m a c o l o g y a n d T o x i c o l o g y , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y , E a s t L a n s i n g , M I ; 2 P r e c l i n i c a l D e v e l o p m e n t , H o f f m a n n L a R o c h e , N u t l e y , N J A B S T R A C T T h e e f f e c t s o f d i f f e r e n t l i v e r t u m o r p r o m o t i n g t r e a t m e n t s ( L e , a c h o l i n e - d e v o i d , m e t h i o n i n e - d e f i c i e n t ( C M D ) d i e t a n d / o r p h e n o b a r b i t a l ( P B ) ) o n H a - r a s a n d r e f m e t h y l a t i o n s t a t u s a n d e x p r e s s i o n w e r e d e t e r m i n e d i n m o u s e s t r a i n s w i t h d i f f e r e n t s u s c e p t i b i l i t i e s t o l i v e r t u m o r f o r m a t i o n , t h e r e l a t i v e l y s e n s i t i v e B S C S F 1 a n d t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C S 7 B L / 6 . T h e e x p r e s s i o n o f S A M s y n t h e t a s e m R N A , t h e e n z y m e t h a t c a t a l y z e s t h e s y n t h e s i s o f S - a d e n o s y l m e t h i o n i n e ( S A M ) , w a s a l s o d e t e r m i n e d . A d d i t i o n a l l y , B G C 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s , s p o n t a n e o u s o r P B - i n d u c e d , w e r e a s s e s s e d f o r a l t e r a t i o n s i n g l o b a l D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s a n d e x p r e s s i o n o f H a - r a s , r a f a n d S A M s y n t h e t a s e . T h e C M D d i e t l e d t o h y p o m e t h y l a t i o n o f H a - r a s a n d r e f a f t e r 1 2 w e e k s o f a d m i n i s t r a t i o n i n B 6 C 3 F 1 a n d C S 7 B L / 6 m i c e , h o w e v e r a t t h i s t i m e p o i n t r a f m R N A w a s e l e v a t e d i n 3 / 4 o f t h e B G C S F 1 s a m p l e s , b u t d e c r e a s e d i n 1 7 5 1 7 6 3 / 4 o f t h e 0 5 7 B U 6 m i c e , w h i l e H a - r a s m R N A w a s e l e v a t e d i n 6 / 6 B 6 C S F 1 m i c e , b u t o n l y 4 / 6 C S 7 B L / 6 m i c e . T h i s s u s t a i n e d i n c r e a s e d l e v e l o f H a - r a s a n d r a f m R N A i n t h e B 6 C S F 1 , b u t n o t t h e C S 7 B L / 6 , a f t e r 1 2 w e e k s o f C M D d i e t a d m i n i s t r a t i o n ( i . e . , d u r i n g a n e a r l y p h a s e o f t u m o r p r o m o t i o n ) p r o v i d e s a m e c h a n i s m t h a t m a y , i n p a r t , u n d e r l i e t h e h e i g h t e n e d s e n s i t i v i t y o f t h e B G C S F 1 m o u s e t o l i v e r t u m o r i g e n e s i s . H y p o m e t h y l a t i o n o f H a - r a s a n d r a f w a s n o t d i s c e r n e d a t e a r l i e r t i m e p o i n t s . S u b p o p u l a t i o n s o f 8 6 0 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s d i s p l a y e d g l o b a l h y p o m e t h y l a t i o n . I n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f H a - r a s w a s e v i d e n t i n s o m e s p o n t a n e o u s B 6 C S F 1 l i v e r t u m o r s a n d i n t h e m a j o r i t y o f t h e P B - i n d u c e d l i v e r t u m o r s . T h e s e e x p e r i m e n t s s u p p o r t t h e h y p o t h e s i s t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A f a c i l i t a t e s t h e a b e r r a n t o n c o g e n e e x p r e s s i o n t h a t i s i n v o l v e d i n t u m o r i g e n e s i s a n d a l s o i n d i c a t e t h a t t h e h i g h p r o p e n s i t y o f t h e B 6 C S F 1 t o e x h i b i t l i v e r t u m o r i g e n e s i s m a y b e d u e , i n p a r t , t o a h e i g h t e n e d s e n s i t i v i t y t o w a r d s d e v e l o p m e n t o f h y p o m e t h y l a t e d D N A . I N T R O D U C T I O N M e t h y l a t i o n o f D N A ( i . e . , t h e c o n t e n t o f D N A - c y t o s i n e t h a t e x i s t s a s 5 - m e t h y l c y t o s i n e ( 5 M e C ) ) p l a y s a r o l e i n t h e r e g u l a t i o n o f g e n e a c t i v i t y , i n c l u d i n g i m p r i n t i n g a n d d e v e l o p m e n t ( R a z i n a n d K a f r i , 1 9 9 4 ) . 5 - M e t h y l c y t o s i n e e x i s t s c o m m o n l y a t C p G s i t e s ( B i r d , 1 9 8 6 ) , t h o u g h n o n - C p G m e t h y l a t i o n ( e . g . , C p r G ( C l a r k e t a l . , 1 9 9 5 ) ) a l s o o c c u r s . C p G s i t e s a r e u n d e r r e p r e s e n t e d i n t h e m a j o r i t y o f t h e g e n o m e a n d a r e c o n c e n t r a t e d i n a r e a s r e f e r r e d t o a s C p G i s l a n d s ( B i r d , 1 9 8 6 ; G a r d i n e r - G a r d e n a n d F r o m m e r , 1 9 8 7 ) . M a n y w i d e l y e x p r e s s e d g e n e s 1 7 7 a n d h o u s e k e e p i n g g e n e s h a v e C p G i s l a n d s p r e s e n t i n t h e i r 5 ’ f l a n k i n g r e g i o n s ; t h e s e a r e p r i m a r i l y u n m e t h y l a t e d . T h e r e i s , i n g e n e r a l , a n i n v e r s e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n g e n e e x p r e s s i o n a n d m e t h y l a t i o n s t a t u s ( L e w i s a n d B i r d , 1 9 9 1 ) . A c h o l i n e - d e v o i d , m e t h i o n i n e - d e f i c i e n t ( C M D ) d i e t l e a d s t o r o d e n t l i v e r t u m o r s ( M i k o l e t a l . , 1 9 8 3 ; G h o s h a l a n d F a r b e r , 1 9 8 4 ; Y o k o y a m a e t a l . , 1 9 8 5 ) p r i m a r i l y t h r o u g h t u m o r p r o m o t i n g a c t i v i t y ( S a w a d a e t a l . , 1 9 9 0 ) . T h e t u m o r p r o m o t i n g a c t i v i t y o f m e t h y l d e f i c i e n t d i e t s i s f u r t h e r s u p p o r t e d b y s t u d i e s i l l u s t r a t i n g t h e r e v e r s i b i l i t y o f m a n y c h a n g e s i n m e t h y l a t i o n s t a t u s a n d g e n e e x p r e s s i o n t h a t h a d b e e n i n d u c e d i n r a t s b y a s e v e r e m e t h y l d e f i c i e n t d i e t , i . e . , d e f i c i e n t i n c h o l i n e , m e t h i o n i n e , f o l i c a c i d a n d v i t a m i n B 1 2 ( C h r i s t m a n a t a l . , 1 9 9 3 ) . R e v e r s i b i l i t y i s a h a l l m a r k f e a t u r e o f t u m o r p r o m o t i o n ( D r a g a n e t a l . , 1 9 9 3 ) . C M D d i e t s l e a d t o h y p o m e t h y l a t i o n o f h e p a t i c D N A , a s a s s e s s e d b y H P L C , a n d a d e c r e a s e i n t h e S A M / S A H r a t i o a f t e r 4 a n d 8 w e e k s o f a d m i n i s t r a t i o n t o t h e r a t ( W i l s o n e t a l . , 1 9 8 4 ) . H a - r a s a n d K i - r a s h a v e b e e n r e p o r t e d t o b e h y p o m e t h y l a t e d i n p r e n e o p l a s t i c l e s i o n s a n d l i v e r t u m o r s f r o m r a t s t h a t r e c e i v e d a C M D d i e t ( B h a v e e t a l . , 1 9 8 8 ) . A d d i t i o n a l l y , h y p o m e t h y l a t i o n o f o n c o g e n e s h a s b e e n r e p o r t e d t o o c c u r i n r a t s a f t e r o n e w e e k o n a C M D d i e t , a n d t h e l e v e l o f h y p o m e t h y l a t i o n i n c r e a s e d a s a n i m a l s w e r e m a i n t a i n e d o n t h e d i e t ( Z a p i s e k e t a l . , 1 9 9 2 ) . H y p o m e t h y l a t e d g e n e s a r e c o m m o n l y o v e r - e x p r e s s e d a s a r e s u l t o f C M D o r l i p o t r o p e d e f i c i e n t d i e t a d m i n i s t r a t i o n ( r e f e r e n c e d i n W a i n f a n a n d P o i r i e r , 1 9 9 2 ) . 1 7 8 P h e n o b a r b i t a l ( P B ) i s a r o d e n t l i v e r t u m o r p r o m o t e r ( P e r i a n o e t a l . , 1 9 7 1 ; P i t o t , 1 9 9 0 ) t h a t a l t e r s a v a r i e t y o f g r o w t h f a c t o r a n d g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r l e v e l s ( s e e F i g u r e 3 i n t h e I N T R O D U C T I O N ( p . 2 3 ) ) ( r e f e r e n c e d i n C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 b ; M i l l s o f a l . , 1 9 9 5 ) . . I n a d d i t i o n , P B l e a d s t o h y p o m e t h y l a t i o n o f H a - r a s ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 9 1 ) a n d r a f i n B 6 0 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s ( R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) . I n d e e d h y p o m e t h y l a t i o n o f r a f i s e v i d e n t a f t e r 2 w e e k s o f r e c e i v i n g a p r o m o t i n g d o s e o f P B i n t h e B 6 C 3 F 1 , b u t n o t t h e C S 7 B L / 6 ( R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) . A p r o m o t i n g d o s e o f P B h a s a l s o b e e n r e p o r t e d t o d e c r e a s e l i v e r S A M l e v e l s i n r a t s a f t e r o n e , t h r e e , a n d f i v e w e e k s a n d t h i s w a s p r e v e n t e d b y a d d i n g e x c e s s c h o l i n e i n t h e a n i m a l s ’ d i e t ( S h i v a p u r k a r a n d P o i r i e r , 1 9 8 2 ) , p r o v i d i n g s u p p o r t f o r o u r h y p o t h e s i s t h a t P B e x e r t s i t s p r o m o t i n g e f f e c t s , i n p a r t , t h r o u g h h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 ) . S A M s y n t h e t a s e c a t a l y z e s t h e s y n t h e s i s o f S A M , a c o m p o u n d t h a t i s i n v o l v e d i n p o l y a m i n e s y n t h e s i s a n d i n t h e t r a n s m e t h y l a t i o n p a t h w a y ( e . g . , d o n a t i n g m e t h y l g r o u p s t o t h e 5 p o s i t i o n o f c y t o s i n e i n D N A ) ( r e f e r e n c e d i n M a t o e t a l . , 1 9 9 4 ) . T h e m a j o r i t y o f S A M i s u t i l i z e d f o r m e t h y l a t i o n r e a c t i o n s ( r e f e r e n c e d i n M a t o e t a l . , 1 9 9 4 ) . T h e r e a r e s o m e r e p o r t s i n d i c a t i n g t h e m R N A l e v e l s r e m a i n u n c h a n g e d o r d e c l i n e s l i g h t l y a f t e r l i v e r i n j u r y a n d i n l i v e r t u m o r s ( H i r o k a w a e t a l . , 1 9 9 3 ; C h a w l a a n d J o n e s , 1 9 9 4 ; A l v a r e z e t a l . , 1 9 9 3 ) . H o w e v e r , t h e r e i s , i n g e n e r a l , a p a u c i t y o f i n f o r m a t i o n r e g a r d i n g a l t e r a t i o n s i n S A M s y n t h e t a s e m R N A l e v e l s i n l i v e r t u m o r s . T h u s , i t i s r e a s o n a b l e t o a s s e s s t h i s p a r a m e t e r i n t h e c o n t e x t o f o u r i n t e r e s t i n D N A m e t h y l a t i o n . 1 7 9 C a r c i n o g e n e s i s i s a m u l t i s t e p , m u l t i s t a g e p r o c e s s t h a t c a n b e d i v i d e d e x p e r i m e n t a l l y i n t o t h e s t a g e s o f i n i t i a t i o n , p r o m o t i o n , a n d p r o g r e s s i o n ( D r a g a n e t a l . , 1 9 9 3 ) . W h i l e m u t a g e n e s i s i s c l e a r l y i n v o l v e d i n c a r c i n o g e n e s i s , a l t e r a t i o n s i n e x p r e s s i o n o f o n c o g e n e s , e . g . , i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f r e s ( F i n n e y a n d B i s h o p , 1 9 9 3 ; M a n g u e s e t a l . , 1 9 9 4 ) a n d d e c r e a s e d e x p r e s s i o n o f t u m o r s u p p r e s s o r g e n e s , 6 . 9 . , a s a c o n s e q u e n c e o f h y p e r r n e t h y l a t i o n ( S a k a i e t a l . , 1 9 9 1 ; H e r m a n e t a l . , 1 9 9 4 ) , a l s o p l a y i m p o r t a n t r o l e s . C h a n g e s i n D N A m e t h y l a t i o n m a y u n d e r l i e a v a r i e t y o f t h e m u t a g e n i c a n d e p i g e n e t i c e v e n t s i n c a r c i n o g e n e s i s ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 a ) . I n t h i s s t u d y , w e h a v e e x t e n d e d o u r i n t e r e s t i n t h e r o l e o f D N A m e t h y l a t i o n i n c a r c i n o g e n e s i s b y e x a m i n i n g t h e e f f e c t s o f s h o r t t e r m p r o m o t e r a d m i n i s t r a t i o n , C M D d i e t a n d / o r P B , i n m o u s e s t r a i n s w i t h d i f f e r i n g s u s c e p t i b i l i t i e s t o l i v e r t u m o r f o r m a t i o n , n a m e l y t h e r e l a t i v e l y s u s c e p t i b l e B 6 0 3 F 1 a n d t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C S 7 B U 6 . S p e c i f i c a l l y , t h i s i n v o l v e d a n a s s e s s m e n t o f t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f H a - r a s a n d r a f , a n d m R N A l e v e l s o f H a - r a s , r a f , a n d S A M s y n t h e t a s e . T h e s t u d i e s i n c l u d e d a n e x a m i n a t i o n o f t h e r e v e r s i b i l i t y o f t h e c h a n g e s o b s e r v e d . A d d i t i o n a l l y , g l o b a l m e t h y l a t i o n s t a t u s a n d g e n e e x p r e s s i o n w a s e x a m i n e d i n s p o n t a n e o u s - a n d P B - i n d u c e d B 6 C S F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S A n i m a l s a n d T u m o r P r o m o t i n g T r e a t m e n t s T w e l v e w e e k o l d m a l e 8 6 C 3 F 1 a n d C S 7 B L / 6 m i c e w e r e o b t a i n e d f r o m C h a r l e s R i v e r ( P o r t a g e , M I ) a n d h o u s e d i n d i v i d u a l l y i n a t e m p e r a t u r e a n d 1 8 0 h u m i d i t y c o n t r o l l e d r o o m o n a 1 2 h o u r l i g h t / d a r k s c h e d u l e w i t h f o o d a n d w a t e r a d I i b i t u m . A n i m a l s w e r e t r e a t e d i n a c c o r d a n c e w i t h a p p l i c a b l e g u i d e l i n e s . T h e m i c e w e r e a c c l i m a t e d t o t h e i r s u r r o u n d i n g s f o r 1 w e e k p r i o r t o b e i n g r a n d o m l y a s s i g n e d t o o n e o f f o u r g r o u p s . A l l d i e t s f o r t h e t u m o r p r o m o t i o n t r e a t m e n t s w e r e p u r c h a s e d f r o m T e k l a d ( M a d i s o n , W I ) . T h e f i r s t t r e a t m e n t c o n s i s t e d o f a C M D d i e t ( T D # 9 2 1 0 7 , w i t h m i n e r a l m i x , A I N - 7 6 a n d v i t a m i n m i x , T D # 8 3 1 7 1 ) ( M i k o l e t a l . , 1 9 8 3 ) . T h e C M D d i e t c o n t a i n s t h e m e t h i o n i n e p r e c u r s o r , 0 . 9 % ( w / w ) D L - h o m o c y s t i n e ( M i k o l e t a l . , 1 9 8 3 ) . T h e s e c o n d t r e a t m e n t w a s a l i v e r t u m o r p r o m o t i n g d o s e o f P B i n t h e d r i n k i n g w a t e r , 0 . 0 5 % ( w / w ) ( D i w a n e t a l . , 1 9 8 5 ) , w i t h c o n t r o l d i e t ( a m i n o a c i d d e f i n e d , T D # 9 2 1 0 6 , w i t h m i n e r a l m i x , A I N - 7 6 a n d v i t a m i n m i x , T D # 4 0 0 6 0 ) . T h e t h i r d t r e a t m e n t w a s c o - a d m i n i s t r a t i o n o f t h e C M D d i e t a n d P B . T h e f o u r t h g r o u p o f a n i m a l s r e c e i v e d c o n t r o l d i e t . B o t h l o n g - t e r m P B ( B e c k e r , 1 9 8 2 ) a n d m e t h y l d e f i c i e n t d i e t s ( N e w b e m e e t a l . , 1 9 8 2 ) a r e k n o w n t o l e a d t o l i v e r t u m o r s i n B 6 C S F 1 m i c e . A n i m a l s w e r e m a i n t a i n e d i n t h e s e g r o u p s f o r 1 , 2 , o r 4 w e e k s . A 6 w e e k t i m e p o i n t , a r e c o v e r y g r o u p , i . e . , 4 w e e k s o f t r e a t m e n t , f o l l o w e d b y 2 w e e k s o f c o n t r o l d i e t , w a s i n c l u d e d t o e x a m i n e r e v e r s i b i l i t y . A d d i t i o n a l l y , g r o u p s o f m a l e B 6 0 3 F 1 a n d C S 7 B L / 6 m i c e r e c e i v e d e i t h e r c o n t r o l d i e t ( T D # 9 2 1 0 6 , A l N - 7 6 , a n d T D # 4 0 0 6 0 ) o r C M D d i e t ( T D # 9 2 1 0 7 , A l N - 7 6 , a n d T D # 8 3 1 7 1 ) f o r 1 2 w e e k s . A t t h e t i m e o f s a c r i f i c e b y C O 2 a s p h y x i a t i o n , l i v e r s w e r e i m m e d i a t e l y e x c i s e d , w e i g h e d , a n d s n a p f r o z e n i n l i q u i d n i t r o g e n u n t i l R N A a n d D N A i s o l a t i o n . T w o 8 6 C 3 F 1 m i c e i n t h e C M D d i e t + P B g r o u p a n d o n e C 5 7 B L / 6 i n t h e c o n t r o l d i e t + P B g r o u p d i e d p r i o r t o c o m p l e t i o n o f t h e s t u d y ; t h e y w e r e n o t i n c l u d e d f o r t h e s e a n a l y s e s . 1 8 1 A n i m a l s a n d L i v e r T u m o r s B 6 C 3 F 1 m a l e m i c e ( C h a r l e s R i v e r , P o r t a g e , M I ) h o u s e 1 / c a g e r e c e i v e d f o o d a n d w a t e r a d I i b i t u m i n a t e m p e r a t u r e a n d h u m i d i t y c o n t r o l l e d r o o m o n a 1 2 h o u r l i g h t / d a r k s c h e d u l e a n d w e r e m a i n t a i n e d i n a c c o r d a n c e w i t h a p p l i c a b l e g u i d e l i n e s . A n i m a l s r e c e i v e d s t a n d a r d r o d e n t c h o w , o r P B , 0 . 0 5 % w / w , i n t h e d i e t f o r 2 4 m o n t h s ( c o r r e s p o n d s t o a P B c l o s e o f a p p r o x i m a t e l y 7 5 m g / k g / d a y ) . A t t h e e n d o f t h e t r e a t m e n t p e r i o d , a n i m a l s w e r e s a c r i f i c e d b y C D 2 a s p h y x i a t i o n , l i v e r s w e r e r e m o v e d a n d e x a m i n e d g r o s s l y f o r t u m o r s . S p o n t a n e o u s a n d P B - i n d u c e d l i v e r t u m o r s w e r e s e p a r a t e d f r o m s u r r o u n d i n g n o r m a l t i s s u e , s e c t i o n s t a k e n f o r h e m a t o x y l i n a n d e o s i n s t a i n i n g t o d e t e r m i n e t u m o r t y p e ( i . e . , a d e n o m a o r c a r c i n o m a ) , a n d t h e r e m a i n d e r s n a p f r o z e n i n l i q u i d n i t r o g e n u n t i l R N A a n d D N A i s o l a t i o n . S a m p l e s o f s u r r o u n d i n g n o r m a l t i s s u e w e r e a l s o s n a p f r o z e n f o r s u b s e q u e n t R N A a n d D N A i s o l a t i o n . R N A a n d D N A I s o l a t i o n R N A a n d D N A w e r e i s o l a t e d f r o m 7 5 - 1 0 0 m g f r o z e n l i v e r s a m p l e s u s i n g T r i z o l r e a g e n t ( G i b c o B R L , G a i t h e r s b u r g , M D ) , f o l l o w i n g t h e s u p p l i e r ’ s i n s t r u c t i o n s . R N A w a s d i s s o l v e d i n 0 . 5 % S D S a n d f r o z e n a t - 8 0 ° C p r i o r t o n o r t h e r n a n a l y s i s . D N A w a s t a k e n t o p H 8 . 0 w i t h 0 . 1 M H E P E S f r e e a c i d w i t h E D T A a d d e d t o a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 1 m M a n d s t o r e d a t 4 ° C . G l o b a l A s s e s s m e n t o f L i v e r D N A M e t h y l a t i o n S t a t u s S s s l m e t h y l a s e ( C p G m e t h y l a s e ) u t i l i z e s S A M t o m e t h y l a t e t h e 5 p o s i t i o n o f C a t e v e r y C p G s i t e i n D N A t h a t i s n o t m e t h y l a t e d . I n t h i s m a n n e r , w e w e r e a b l e t o a s s e s s t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f l i v e r D N A i n d i r e c t l y , a s h y p o m e t h y l a t i o n 1 8 2 o f D N A w a s a p p a r e n t a s a n i n c r e a s e i n i n c o r p o r a t i o n o f m e t h y l g r o u p s . G l o b a l l i v e r m e t h y l a t i o n a n a l y s i s w a s c a r r i e d o u t e s s e n t i a l l y a s d e s c r i b e d ( B a l a g h i a n d W a g n e r , 1 9 9 3 ) . B r i e f l y , o n e p g o f D N A w a s i n c u b a t e d w i t h 2 p C i F H - m e t h y l ] S - a d e n o s y l - L - m e t h i o n i n e ( N e w E n g l a n d N u c l e a r , B o s t o n , M A , s p e c i f i c a c t i v i t y , 8 4 . 1 C i / m m o l ) , a n d 3 U S s s l m e t h y l a s e ( N e w E n g l a n d B i o l a b s , B e v e r l y , M A ) f o r 1 h o u r a t 3 0 ° C . F i f t e e n u L o f t h e m i x t u r e w e r e a p p l i e d t o a D E - 8 1 i o n e x c h a n g e f i l t e r a n d w a s h e d w i t h 0 . 5 M p h o s p h a t e b u f f e r , p H 6 . 8 , 3 t i m e s , f o l l o w e d b y o n e w a s h e a c h o f 7 0 % e t h a n o l , a n d 1 0 0 % e t h a n o l . R a d i o a c t i v i t y o n t h e d r i e d f i l t e r w a s a s s e s s e d b y l i q u i d s c i n t i l l a t i o n s p e c t r o m e t r y . A l l r e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t i n d u p l i c a t e . R a d i o l a b e l i n c o r p o r a t i o n i n t o D N A w a s p r o p o r t i o n a l t o D N A c o n c e n t r a t i o n a n d l i n e a r d u r i n g t h e p e r i o d o f m e a s u r e m e n t . R e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t a m i n i m u m o f 4 t i m e s o n e a c h D N A s a m p l e , a n d e a c h s a m p l e w a s f r o m a d i f f e r e n t a n i m a l ( 6 a n i m a l s p e r g r o u p ) . R e s u l t s w e r e c a l c u l a t e d a s c p m / u g / h r a n d e x p r e s s e d a s a p e r c e n t o f t h e a v e r a g e d c o n t r o l v a l u e s . D N A E l e c t r o p h o r e s i s a n d S o u t h e r n A n a l y s i s T e n p g o f D N A w e r e d i g e s t e d t o c o m p l e t i o n w i t h 5 U / u g M s p l o r H p a l l ( G i b c o B R L , G a i t h e r s b u r g , M D ) b y i n c u b a t i o n a t 3 7 ° C f o r a t o t a l o f 6 h o u r s , w i t h t h e e n z y m e a d d e d i n t w o a l i q u o t s a t 3 h o u r i n t e r v a l s . D N A w a s e l e c t r o p h o r e s e d o v e r n i g h t a t 5 0 V ( c u r r e n t = 3 0 - 3 5 m A ) o n a 0 . 9 % a g a r o s e g e l w i t h 1 X T B E a s t h e r u n n i n g b u f f e r . M o l e c u l a r s i z e m a r k e r s w e r e a l s o e l e c t r o p h o r e s e d o n t h e g e l t o e n a b l e a c c u r a t e d e t e r m i n a t i o n o f t h e s i z e s o f t h e b a n d s o f i n t e r e s t ( A p p l i g e n e , G a i t h e r s b u r g , M D o r B o e r h i n g e r M a n n h e i m 1 8 3 B i o c h e m i c a l s , I n d i a n a p o l i s , I N ) . P h o t o g r a p h i n g t h e e t h i d i u m b r o m i d e s t a i n e d D N A i l l u m i n a t e d b y u l t r a v i o l e t l i g h t p r o v i d e d t h i s r e c o r d . A f t e r e l e c t r o p h o r e s i s , t h e a g a r o s e g e l s w e r e w a s h e d w i t h 0 . 2 5 N H C I f o r 1 0 m i n u t e s t o p a r t i a l l y d e p u r i n a t e t h e D N A , f o l l o w e d b y d e n a t u r a t i o n i n 0 . 4 N N a O H , 0 . 6 M N a C l f o r 3 0 m i n . T h e g e l w a s t h e n n e u t r a l i z e d i n 1 . 5 M N a C l , 0 . 5 M T r i s , p H 7 . 5 f o r 3 0 m i n i m m e d i a t e l y p r i o r t o t h e t r a n s f e r . S o u t h e r n t r a n s f e r w a s c a r r i e d o u t b y c a p i l l a r y a c t i o n t h r o u g h 2 0 X S S C o v e r n i g h t o n t o a H y b o n d n y l o n m e m b r a n e ( A m e r s h a m , A r l i n g t o n H e i g h t s , I L ) . A f t e r t r a n s f e r , t h e n y l o n m e m b r a n e w a s r i n s e d i n 5 X S S C , d r i e d t h o r o u g h l y a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d t h e D N A w a s c r o s s - l i n k e d b y u l t r a v i o l e t i r r a d i a t i o n ( U V S t r a t a l i n k e r 2 4 0 0 , S t r a t a g e n e l n c . , L a J o l l a , C A ) . A v - H a - r a s o r v - r a f p r o b e ( O n c o r , G a i t h e r s b u r g , M D ) ( 2 5 n g ) w a s l a b e l e d b y t h e r a n d o m p r i m e r l a b e l i n g m e t h o d a c c o r d i n g t o t h e s u p p l i e r ’ s i n s t r u c t i o n s ( G i b c o B R L , G a i t h e r s b u r g , M D ) w i t h [ a a z P ] d C T P ( 3 0 0 0 C i / m m o l , a l a b e l e d , N e w E n g l a n d N u c l e a r , B o s t o n , M A ) t o a s p e c i f i c a c t i v i t y o f a p p r o x i m a t e l y 1 x 1 0 " c p m / p g . U n i n c o r p o r a t e d n u c l e o t i d e s w e r e r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n ( 1 , 1 0 0 x 9 ) t h r o u g h a B i o s p i n 3 0 c o l u m n ( B i o - R a d , H e r c u l e s , C A ) . H y b r i d i z a t i o n w a s p e r f o r m e d e s s e n t i a l l y a s d e s c r i b e d ( S e l d o n , 1 9 9 0 ) , u s i n g 1 x 1 0 7 c p m o f t h e ” P l a b e l e d p r o b e p e r m e m b r a n e a t 3 2 ° C f o r 2 0 - 2 2 h o u r s f o r H a - r a s o r 1 6 - 1 8 h o u r s f o r r a f . F i f t e e n m i n u t e s e r i a l w a s h e s o f i n c r e a s i n g s t r i n g e n c y w e r e c a r r i e d o u t , w i t h t h e f i n a l h i g h s t r i n g e n c y w a s h i n 0 . 1 X S S C , 1 . 0 % S D S i n a 3 7 ° C i n c u b a t o r f o r H a - r a s ( 3 0 m i n u t e s ) , o r 0 . 1 X S S C , 0 . 1 % S D S a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r r e f ( 1 5 m i n u t e s ) . M e m b r a n e s w e r e e x p o s e d 1 8 4 t o F u j i A l F f i l m w i t h t w o C r o n e x L i g h t e n i n g P l u s i n t e n s i f y i n g s c r e e n s a t - 8 0 ° C f o r 3 t o 5 d a y s f o r H a - r a s , o r 7 t o 9 d a y s f o r r a f . S A M S y n t h e t a s e A s a m p l e o f t h e m o u s e S A M s y n t h e t a s e c D N A ( p w t 3 0 ) w a s g e n e r o u s l y p r o v i d e d b y D r . J a n i c e C h o u . T h i s c D N A i s a 1 . 2 k b f r a g m e n t e n c o m p a s s i n g n u c l e o t i d e s 1 2 6 0 - 2 4 1 9 o f t h e f u l l l e n g t h c D N A ( S a k a t a e t a l . , 1 9 9 3 ) . X L 1 - B I u e - M R F ’ E . c o l i c e l l s w e r e m a d e c o m p e t e n t a n d t r a n s f o r m e d w i t h 1 0 n g p l a s m i d c o n t a i n i n g t h e S A M s y n t h e t a s e i n s e r t . S e v e r a l c o l o n i e s o b t a i n e d a f t e r o v e r n i g h t g r o w t h o n k a n a m y c i n - a n d a m p i c i l l i n - c o n t a i n i n g L B a g a r p l a t e s w e r e g r o w n o v e r n i g h t i n L B b r o t h a t 3 7 ° C a t 3 0 0 r p m . T h e p l a s m i d w a s i s o l a t e d f r o m t h e E . c o l i u s i n g t h e W i z a r d M i n i P r e p k i t ( P r o m e g a , M a d i s o n , W I ) a c c o r d i n g t o t h e i n s t r u c t i o n s f r o m t h e s u p p l i e r . T h e c D N A i n s e r t w a s r e l e a s e d f r o m t h e p l a s m i d b y d i g e s t i o n w i t h E c o r l a n d B g l l l a n d v i s u a l i z e d o n a 1 % a g a r o s e g e l s t a i n e d w i t h e t h i d i u m b r o m i d e . T h e 1 . 2 k b b a n d c o n t a i n i n g S A M s y n t h e t a s e w a s c u t f r o m t h e a g a r o s e g e l a n d p u r i f i e d u t i l i z i n g t h e G e l E x t r a c t i o n k i t a c c o r d i n g t o t h e i n s t r u c t i o n s f r o m t h e s u p p l i e r ( Q i a g e n , C h a t s w o r t h , C A ) . D N A f r o m s e v e r a l g e l p u r i f i c a t i o n s w a s p o o l e d , t h e c o n c e n t r a t i o n d e t e r m i n e d , a n d s t o r e d a t 4 ° C u n t i l 2 5 n g w e r e u s e d f o r r a n d o m p r i m e r l a b e l i n g a s d e s c r i b e d f o r H a - r a s a n d r e f . R N A E l e c t r o p h o r e s i s a n d N o r t h e r n A n a l y s i s A l l R N A s a m p l e s w e r e a s s e s s e d f o r i n t e g r i t y b y e l e c t r o p h o r e s i s w i t h e t h i d i u m b r o m i d e a n d v i s u a l i z a t i o n o f t h e 2 8 8 a n d 1 8 8 r R N A b a n d s a t t h e t i m e o f N o r t h e r n a n a l y s i s . R N A e l e c t r o p h o r e s i s w a s c a r r i e d o u t o n 1 0 p g R N A 1 8 5 s a m p l e s t h r o u g h a 0 . 6 6 M f o r m a l d e h y d e , 1 . 0 % a g a r o s e g e l a s d e s c r i b e d ( R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) . N o r t h e r n t r a n s f e r w a s c a r r i e d o u t u t i l i z i n g a d o w n w a r d a l k a l i n e p r o c e d u r e ( K o e s t i e r e t a l . , 1 9 9 3 ) a s m o d i f i e d b y t h e T u r b o b l o t t e r R a p i d D o w n w a r d T r a n s f e r S y s t e m ( S c h l e i c h e r & S c h u e l l , K e e n e , N H ) . B r i e f l y , t h e G e n e S c r e e n P l u s m e m b r a n e ( N e w E n g l a n d N u c l e a r , B o s t o n , M A ) w a s p r e p a r e d b y p r e w e t t i n g i n t r a n s f e r b u f f e r ( 3 M N a C l , 8 m M N a O H ) f o r 1 5 m i n u t e s . T h e m e m b r a n e w a s p l a c e d u p o n W h a t m a n 3 m m p a p e r a n d t h e g e l w a s p l a c e d o n t o p . S e v e r a l p i e c e s o f 3 m m p a p e r w e r e p l a c e d a t o p t h e g e l , a l s o p r e w e t i n t h e t r a n s f e r b u f f e r . F i n a l l y , a 3 m m p a p e r w i c k w a s s e t i n p l a c e a n d t r a n s f e r w a s c a r r i e d o u t f o r 1 h o u r w i t h t r a n s f e r b u f f e r p l a c e d i n t w o t r a y s a l o n g s i d e t h e s e t u p . A f t e r t r a n s f e r , t h e m e m b r a n e w a s r i n s e d i n 0 . 5 M p h o s p h a t e b u f f e r , p H 6 . 8 , d r i e d a t r o o m t e m p e r a t u r e , a n d U V c r o s s - l i n k e d a s d e s c r i b e d f o r t h e D N A m e m b r a n e . T h e n o r t h e r n b l o t s w e r e h y b r i d i z e d w i t h 1 x 1 0 7 c p m o f 3 2 F l a b e l e d r a f p e r m e m b r a n e a s d e s c r i b e d ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 8 9 ) . A f t e r a u t o r a d i o g r a p h y , t h e m e m b r a n e s w e r e s t r i p p e d o f r a d i o l a b e l b y b o i l i n g i n 0 . 3 % S D S f o r 3 0 m i n u t e s . T h e s t r i p p e d m e m b r a n e s w e r e t h e n h y b r i d i z e d w i t h 1 x 1 0 7 c p m o f 3 2 P l a b e l e d H a - r a s p e r m e m b r a n e a s d e s c r i b e d ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 8 9 ) . T h e m e m b r a n e s w e r e s t r i p p e d a g a i n a n d h y b r i d i z e d w i t h 1 x 1 0 7 c p m o f 3 2 P l a b e l e d S A M s y n t h e t a s e p e r m e m b r a n e a s d e s c r i b e d ( B r o w n , 1 9 9 4 ) . T h e n o r t h e r n b l o t s w e r e a l s o e x a m i n e d f o r 2 8 S R N A l e v e l s ( 6 . 2 5 x 1 0 ° c p m / m e m b r a n e ) a s a n i n t e r n a l c o n t r o l f o r e v e n R N A l o a d i n g ( B a r b u a n d D a u t r y , 1 9 8 9 ) . 1 8 6 I m a g e A n a l y s i s t o O u a n t l t a t e C h a n g e s i n m R N A L e v e l s A u t o r a d i o g r a p h s w e r e s c a n n e d u s i n g a H e w l e t t P a c k a r d S c a n J e t 3 c w i t h t r a n s p a r e n c y a d a p t o r , a M a c i n t o s h c o m p u t e r a n d t h e A d o b e P h o t o s h o p p r o g r a m . T h e N I H I m a g e p r o g r a m ( v e r s i o n 1 . 5 6 ) ( p u b l i c d o m a i n s o f t w a r e w r i t t e n b y W a y n e R a s b a n d a t N I H t h a t i s a v a i l a b l e b y a n o n y m o u s F T P t o 1 2 8 . 2 3 1 . 9 8 . 3 2 ) w a s e m p l o y e d f o r i m a g e a n a l y s i s u s i n g t h e G e l P l o t t i n g M a c r o s s u p p l i e d w i t h t h e p r o g r a m . T h e b a n d o n t h e a u t o r a d i o g r a p h c o r r e s p o n d i n g t o t h e m R N A o f i n t e r e s t w a s s e l e c t e d , t h e p i x e l d e n s i t y w a s d e t e r m i n e d , a n d n o r m a l i z e d t o t h e p i x e l d e n s i t y o f t h e c o r r e s p o n d i n g b a n d o n t h e 2 8 8 R N A f i l m . I n t h i s m a n n e r , c o m p a r i s o n s c a n o n l y b e m a d e b e t w e e n t r e a t e d a n d c o n t r o l s a m p l e s c o n t a i n e d o n a p a r t i c u l a r m e m b r a n e ( e a c h m e m b r a n e c o n t a i n e d R N A f r o m 1 2 a n i m a l s , 3 / g r o u p ) . C h a n g e s i n g e n e e x p r e s s i o n w e r e c o n s i d e r e d t o b e t r e a t m e n t r e l a t e d i f t h e y w e r e o u t s i d e o f t h e r a n g e o f t h e m e a n ( + / - ) 1 s t a n d a r d d e v i a t i o n o f t h e i r r e s p e c t i v e c o n t r o l v a l u e s . ( S e e A p p e n d i x 6 . ) R E S U L T S M e t h y l a t i o n S t a t u s o f H a - r a s a n d r a t T h e m e t h y l a t i o n s e n s i t i v e r e s t r i c t i o n i s o s c h i z o m e r s M s p l a n d H p a l l w e r e . u t i l i z e d t o a s s e s s p o s s i b l e c h a n g e s i n t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f H a - r a s a n d r e f i n r e s p o n s e t o t h e C M D d i e t a n d / o r P B a s t u m o r p r o m o t i n g s t i m u l i i n B 6 C 3 F 1 a n d C 5 7 B L / 6 m i c e . B o t h e n z y m e s r e c o g n i z e t h e s e q u e n c e C C G G ; H p a l l c a n n o t c l e a v e i f t h e i n t e r n a l C i s m e t h y l a t e d w h i l e m e t h y l a t i o n a t t h e e x t e r n a l C i n h i b i t s r e s t r i c t i o n b y b o t h e n z y m e s ( K o r c h a n d H a g b l o m , 1 9 8 6 ) . 1 8 7 H y p o m e t h y l a t i o n o f H a - r a s ( F i g u r e 1 ) a n d r e f ( F i g u r e 2 ) w a s o b s e r v e d i n 8 6 0 3 F 1 a n d C S 7 B L / 6 a f t e r 1 2 w e e k s o f C M D d i e t a d m i n i s t r a t i o n . H y p o m e t h y l a t i o n w a s n o t e v i d e n t a t t h e e a r l i e r t i m e p o i n t s , i . e . , u p t o 4 w e e k s i n H a - r a s w i t h a n y t r e a t m e n t ( d a t a n o t s h o w n ; s e e A p p e n d i c e s 4 a n d 5 ) . C M D D i e t - I n d u c e d C h a n g e s i n m R N A L e v e l s : H a - r a s , r a t , a n d S A M S y n t h e t a s e ( T a b l e 1 ) I n c r e a s e d H a - r a s m R N A w a s e v i d e n t a t 1 w e e k o f C M D d i e t a d m i n i s t r a t i o n i n t h e B 6 C 3 F 1 . A f t e r t h i s t i m e p o i n t , t h e r e w a s n o t a d i f f e r e n c e f r o m c o n t r o l H a - r a s e x p r e s s i o n u n t i l t h e 1 2 w e e k t i m e p o i n t w h e n a l l a n i m a l s i n t h e g r o u p d i s p l a y e d i n c r e a s e d m R N A . I n c r e a s e d H a - r a s e x p r e s s i o n w a s n o t e v i d e n t i n t h e C 5 7 B L / 6 a t w e e k 1 . H a l f o f t h e m i c e i n t h e w e e k 2 g r o u p h a d i n c r e a s e d H a - r a s e x p r e s s i o n , w h i l e t h e a n i m a l s i n t h e w e e k 4 t i m e p o i n t w e r e n o t d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l . F o u r o f t h e s i x C S 7 B L / 6 a n i m a l s i n t h e 1 2 w e e k g r o u p h a d i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f H a - r a s . A s i m i l a r t r e n d w a s o b s e r v e d f o r r a f e x p r e s s i o n , m R N A l e v e l s w e r e i n c r e a s e d i n t h e B 6 C B F 1 a t w e e k 1 , b u t n o t i n t h e C 5 7 B L / 6 u n t i l w e e k 2 . H a l f o f t h e B 6 C 3 F 1 a n i m a l s m a i n t a i n e d e l e v a t e d e x p r e s s i o n a t t h e w e e k 2 a n d w e e k 4 t i m e p o i n t s , w h i l e t h e C 5 7 B L / 6 e x h i b i t e d c o n t r o l l e v e l s o f r e f e x p r e s s i o n i n t h e 4 w e e k g r o u p . m R N A f o r r a f w a s e l e v a t e d i n 3 o f 4 B G C a F I a n i m a l s i n t h e 1 2 w e e k g r o u p , w h i l e i t w a s d e c r e a s e d i n 3 o f 4 C 5 7 B L / 6 a n i m a l s a t t h i s t i m e p o i n t . F o r b o t h H a - r a s a n d r e f , t h e l e v e l o f e x p r e s s i o n i n t h e r e c o v e r y g r o u p s w a s s i m i l a r t o t h e c o n t r o l g r o u p s . E l e v a t e d e x p r e s s i o n o f S A M s y n t h e t a s e m R N A w a s o b s e r v e d i n a l l a n i m a l s i n t h e 8 6 C 3 F 1 w e e k 1 g r o u p , b u t o n l y h a l f o f t h e w e e k 1 C 5 7 B L / 6 m i c e . I n t h e 1 8 8 F i g u r e 1 - M e t h y l a t i o n s t a t u s o f H a - r a s i n ( A ) B G C 3 F 1 a n d ( B ) C 5 7 B L / 6 m o u s e l i v e r a f t e r C M D d i e t a d m i n i s t r a t i o n f o r 1 2 w e e k s . T e n p g D N A f r o m 3 c o n t r o l a n i m a l s a n d 3 C M D d i e t a n i m a l s w e r e d i g e s t e d t o c o m p l e t i o n w i t h M s p l ( M ) o r H p a l l ( H ) a s d e s c r i b e d i n t h e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . A r r o w i n ( A ) c o r r e s p o n d s t o t h e p r e s e n c e o f a n e w b a n d i n t h e H p a l l l a n e s o f t h e C M D d i e t a d m i n i s t e r e d a n i m a l s i n d i c a t i n g l o s s o f m e t h y l a t i o n a t t h e i n t e r n a l C o f a C C G G s i t e . A r r o w i n ( B ) d e n o t e s t h e l o c a t i o n o f t h e b a n d l o s t f r o m t h e M s p l d i g e s t e d l a n e s o f t h e C M D d i e t a d m i n i s t e r e d a n i m a l s i n d i c a t i n g l o s s o f m e t h y l a t i o n a t t h e e x t e r n a l C o f a C C G G s i t e . m a l C H C o n t r o l 1 8 9 C M D d i e t 1 9 0 F i g u r e 2 - M e t h y l a t i o n s t a t u s o f r e f i n ( A ) 8 6 C 3 F 1 a n d ( B ) C S 7 B L / 6 m o u s e l i v e r a f t e r C M D d i e t a d m i n i s t r a t i o n f o r 1 2 w e e k s . T e n p g D N A f r o m 3 c o n t r o l a n i m a l s a n d 3 C M D d i e t a n i m a l s w e r e d i g e s t e d t o c o m p l e t i o n w i t h M s p l ( M ) o r H p a l l ( H ) a s d e s c r i b e d i n t h e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . A r r o w s o n t h e l e f t c o r r e s p o n d t o t h e 6 . 7 k b b a n d p r e s e n t i n t h e M s p l l a n e s o f t h e c o n t r o l a n i m a l s t h a t i s a b s e n t i n t h e C M D d i e t a d m i n i s t e r e d a n i m a l s i n d i c a t i n g l o s s o f m e t h y l a t i o n a t t h e e x t e r n a l C o f a C C G G s i t e . A r r o w o n r i g h t i n ( A ) d e m o n s t r a t e s a < 2 . 3 k b b a n d i n t h e M s p l l a n e s t h a t i n c r e a s e s i n i n t e n s i t y i n t h e C M D d i e t a d m i n i s t e r e d a n i m a l s . A r r o w o n r i g h t i n ( B ) c o r r e s p o n d s t o a 2 . 8 k b b a n d i n t h e M s p l l a n e s t h a t d e c r e a s e s i n i n t e n s i t y i n t h e C M D d i e t a d m i n i s t e r e d a n i m a l s . C o n t r o l C M D d i e t M H M H M H M H M H M H H M H M H M H M H 1 9 1 F i g u r e 2 . C o n t r o l C M D d i e t M H M T a b l e 1 : C M D D i e t - I n d u c e d C h a n g e s i n m R N A L e v e l s . 1 9 2 B 6 C 3 F 1 0 5 7 B L 1 6 H a - r a s w e e k 1 t ( 4 / 6 ) ; n c ( 2 / 6 ) n c ( 3 / 6 ) ; 0 ( 3 / 6 ) w e e k 2 n c ( 3 / 6 ) ; 0 ( 3 / 6 ) t ( 3 / 6 ) ; G ( 3 / 6 ) w e e k 4 9 ( 1 / 6 ) ; n c ( 4 / 6 ) ; 6 ( 1 / 6 ) t ( 1 / 6 ) ; n c ( 5 / 6 ) r e c o v e r y 1 ( 1 / 6 ) ; n c ( 3 / 6 ) ; 0 ( 2 / 6 ) t ( 1 / 3 ) ; n c ( 1 / 3 ) ; 5 ( 1 / 3 ) w e e k 1 2 t ( 6 / 6 ) t ( 4 / 6 ) ; n c ( 2 / 6 ) r a f w e e k 1 f ( 5 / 5 ) t ( 3 / 6 ) ; n c ( 1 / 6 ) ; 0 ( 2 / 6 ) w e e k 2 1 ( 3 / 6 ) ; n c ( 3 / 6 ) t ( 6 / 6 ) w e e k 4 f ( 3 / 6 ) ; n c ( 3 / 6 ) n c ( 5 / 6 ) ; 0 ( 1 / 6 ) r e c o v e r y n c ( 4 / 6 ) ; 0 ( 2 / 6 ) 9 ( 1 / 6 9 ; n c ( 4 / 6 ) ; I v ( 1 / 6 ) w e e k 1 2 t ( 3 / 4 ) ; n c ( 1 / 4 ) t ( 3 / 4 ) ; n c ( 1 / 4 ) S A M S T a s e w e e k 1 t ( 6 / 6 ) t ( 3 / 6 ) ; n c ( 2 / 6 ) ; 0 ( 1 / 6 ) w e e k 2 f ( 1 / 5 ) ; n c ( 4 / 5 ) t ( 3 / 6 ) ; n c ( 2 / 6 ) ; 5 ( 1 / 6 ) w e e k 4 1 ( 4 / 6 ) ; n c 0 / 6 ) ; 6 ( 1 / 6 ) t ( 3 / 6 ) ; n c ( 3 / 6 ) r e c o v e r y n c ( 2 / 6 ) ; 0 ( 4 / 6 ) t ( 2 / 6 ) ; n c ( 2 / 6 ) ; S ( 2 / 6 ) w e e k 1 2 n c ( 2 / 3 ) ; J ( 1 / 3 ) f Q / 6 fi n c ( 5 / 6 ) f D e n o t e s a n i n c r e a s e i n m R N A e x p r e s s i o n c o m p a r e d t o c o n t r o l s a f t e r n o r m a l i z a t i o n t o 2 8 8 m R N A l e v e l s 0 D e n o t e s a d e c r e a s e i n m R N A e x p r e s s i o n c o m p a r e d t o c o n t r o l s a f t e r n o r m a l i z a t i o n t o 2 8 $ m R N A l e v e l s T h e n u m b e r s i n p a r e n t h e s e s r e f e r t o t h e n u m b e r o f a n i m a l s d e m o n s t r a t i n g a c h a n g e o u t o f t h e t o t a l n u m b e r o f a n i m a l s t e s t e d . n o n o t c h a n g e d 1 9 3 B 6 0 3 F 1 , m R N A l e v e l s o f S A M s y n t h e t a s e d e c r e a s e d t o c o n t r o l l e v e l s i n t h e w e e k 2 t i m e p o i n t b e f o r e i n c r e a s i n g a g a i n i n t h e w e e k 4 a n i m a l s . T h i s r e b o u n d i n g w a s n o t e v i d e n t i n t h e C S 7 B L / 6 m i c e , w i t h i n c r e a s e s i n e x p r e s s i o n b e i n g e v i d e n t i n h a l f o f t h e a n i m a l s a t a l l t i m e p o i n t s . I n g e n e r a l , S A M s y n t h e t a s e m R N A l e v e l s w e r e s i m i l a r t o c o n t r o l s f o r b o t h s t r a i n s a t t h e w e e k 1 2 t i m e p o i n t . P B - I n d u c e d C h a n g e s i n m R N A L e v e l s : H a - r a s , r a f , S A M S y n t h e t a s e ( T a b l e 2 ) H a - r a s m R N A w a s i n c r e a s e d i n t w o - t h i r d s o f t h e B 6 0 3 F 1 a n i m a l s a t t h e 1 w e e k t i m e p o i n t a n d i n a l l a n i m a l s a t t h e w e e k 2 t i m e p o i n t . A f t e r 4 w e e k s o f P B a d m i n i s t r a t i o n , m R N A e x p r e s s i o n i n t h e B 6 C 3 F 1 w a s n o t d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l a n i m a l s . H a l f o f t h e B 6 C 3 F 1 a n i m a l s i n t h e r e c o v e r y g r o u p d e m o n s t r a t e d i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f H a - r a s . A l l o f t h e C 5 7 B L / 6 m i c e e x h i b i t e d i n c r e a s e d H a - r a s e x p r e s s i o n a f t e r 1 w e e k o f P B , w h i l e a t w e e k s 2 a n d 4 a p p r o x i m a t e l y h a l f o f t h e a n i m a l s d e m o n s t r a t e d i n c r e a s e d H a - r a s m R N A . H a - r a s m R N A w a s n o t i n c r e a s e d i n t h e C 5 7 B L / 6 a n i m a l s i n t h e r e c o v e r y g r o u p . r a f m R N A w a s i n c r e a s e d i n t h e m a j o r i t y o f b o t h B G C 3 F 1 a n d C 5 7 B L / 6 a n i m a l s i n t h e w e e k 2 t i m e p o i n t . B 6 0 3 F 1 a n i m a l s h a d a s i m i l a r l e v e l o f e x p r e s s i o n a s t h e c o n t r o l s a t t h e 4 w e e k t i m e p o i n t , w h i l e i n c r e a s e s w e r e e v i d e n t i n 5 o f 6 C 5 7 B L / 6 m i c e a t t h i s t i m e p o i n t . r a m e N A l e v e l s i n t h e r e c o v e r y g r o u p s w e r e s i m i l a r t o c o n t r o l s o r d e c r e a s e d . S A M s y n t h e t a s e m R N A w a s d e c r e a s e d c o m p a r e d t o c o n t r o l s i n b o t h B 6 C 3 F 1 a n d C S 7 B L / 6 a f t e r 1 w e e k o f P B . A p p r o x i m a t e l y h a l f o f b o t h B 6 C 3 F 1 a n d C 5 7 B L / 6 e x h i b i t e d i n c r e a s e d m R N A l e v e l s a f t e r 2 w e e k s o f P B . T a b l e 2 : P B D i e t - I n d u c e d C h a n g e s i n m R N A L e v e l s . 1 9 4 B 6 0 3 F 1 0 5 7 B L I 6 H a - r a s w e e k 1 t ( 4 / 6 ) ; n c ( 2 / 6 ) t ( 6 / 6 ) w e e k 2 1 * ( 6 / 6 ) t ( 2 / 5 ) ; n c ( 1 / 5 ) ; 0 ( 2 / 5 ) w e e k 4 n c ( 4 / 6 ) ; 5 ( 2 / 6 ) 1 ( 3 / 6 ) ; n c ( 3 / 6 ) r e c o v e r y 1 ( 3 / 6 ) ; n c ( 2 / 6 ) ; $ ( 1 / 6 ) t ( 4 / 6 ) ; n c ( 2 / 6 ) r a t w e e k 1 t ( 1 / 6 ) ; n c ( 5 / 6 ) ; 5 ( 1 / 6 ) t ( 2 / 6 ) ; n c ( 2 / 6 ) ; G ( 2 / 6 ) w e e k 2 1 * @ l 6 ) ; n o ( 2 6 ) ; J ( 1 / 6 ) t ( 3 / 5 ) ; n c ( 1 / 5 ) ; O ( 1 / 5 ) w e e k 4 n c ( 6 / 6 ) t ( 5 / 6 ) ; n c ( 1 / 6 ) r e c o v e r y 1 ( 1 / 6 ) ; n c ( 3 / 6 ) ; 6 ( 2 / 6 ) t ( 3 / 6 ) ; 0 ( 3 / 6 ) S A M S T a s e w e e k 1 0 ( 4 / 6 ) ; n c ( 2 / 6 ) c ( 1 / 6 ) ; n c ( 1 / 6 ) ; 5 ( 4 / 6 ) w e e k 2 f ( 3 / 5 ) ; 0 ( 2 / 5 ) t ( 3 / 5 ) ; n c ( 2 / 5 ) w e e k 4 n c ( 1 / 6 ) ; t ( 5 / 6 ) t ( 5 / 6 ) ; n c ( 1 / 6 ) r e c o v e r y 1 ( 2 / 6 ) ; 6 ( 4 / 6 ) t ( 1 / 5 ) ; n c ( 2 / 5 ) ; 6 ( 2 / 5 ) t D e n o t e s a n i n c r e a s e i n m R N A e x p r e s s i o n c o m p a r e d t o c o n t r o l s a f t e r n o r m a l i z a t i o n t o 2 8 $ m R N A l e v e l s 0 D e n o t e s a d e c r e a s e i n m R N A e x p r e s s i o n c o m p a r e d t o c o n t r o l s a f t e r n o r m a l i z a t i o n t o 2 8 $ m R N A l e v e l s T h e n u m b e r s i n p a r e n t h e s e s r e f e r t o t h e n u m b e r o f a n i m a l s d e m o n s t r a t i n g a c h a n g e o u t o f t h e t o t a l n u m b e r o f a n i m a l s t e s t e d . n o n o t c h a n g e d 1 9 5 F i v e o f 6 B 6 0 3 F 1 a n i m a l s h a d d e c r e a s e d S A M s y n t h e t a s e m R N A a f t e r 4 w e e k s o f P B , w h i l e 5 o f 6 C S 7 B L / 6 h a d i n c r e a s e d S A M s y n t h e t a s e m R N A . I n g e n e r a l , d e c r e a s e d S A M s y n t h e t a s e m R N A l e v e l s w e r e e v i d e n t i n t h e r e c o v e r y g r o u p s . C M D D i e t C o - A d m i n i s t e r e d w i t h P B - l n d u c e d C h a n g e s i n m R N A L e v e l s : H a - r a s , r a f , S A M S y n t h e t a s e ( T a b l e 3 ) H a - r a s m R N A w a s i n c r e a s e d i n t h e m a j o r i t y o f t h e B 6 C 3 F 1 a n i m a l s a t a l l t i m e p o i n t s . C S 7 B L / 6 a n i m a l s e x h i b i t e d i n c r e a s e d H a - r a s m R N A a f t e r 1 a n d 2 w e e k s o f t h e d u a l p r o m o t e r t r e a t m e n t , w h i l e o n l y h a l f o f t h e a n i m a l s r e s p o n d e d i n t h e 4 w e e k t i m e p o i n t . T h e B 6 C 3 F 1 a n i m a l s d i s p l a y e d v a r i a b l e r e s p o n s e s i n t e r m s o f r a m e N A , w i t h i n c r e a s e s , d e c r e a s e s a n d l e v e l s c o m p a r a b l e t o c o n t r o l a n i m a l s b e i n g e v i d e n t a t a l l t i m e p o i n t s . T h e C S 7 B U 6 e x h i b i t e d i n c r e a s e d r a f m R N A a t t h e w e e k 2 t i m e p o i n t i n a l l o f t h e a n i m a l s a n d h a l f o f t h e a n i m a l s i n t h e w e e k 4 t i m e p o i n t . A v a r i a b l e r a f m R N A l e v e l w a s e v i d e n t a t t h e o t h e r t i m e p o i n t s . S A M s y n t h e t a s e m R N A w a s v a r i a b l e i n b o t h s t r a i n s a t t h e 1 , 2 a n d 4 w e e k t i m e p o i n t s , w h i l e d e c r e a s e d S A M s y n t h e t a s e m R N A w a s e v i d e n t i n t h e r e c o v e r y g r o u p . G l o b a l L i v e r M e t h y l a t i o n S t a t u s G l o b a l h y p o m e t h y l a t i o n w a s a p p a r e n t i n 1 o f 4 s p o n t a n e o u s a d e n o m a s ( F i g u r e 3 ) a n d 1 o f 5 P B - i n d u c e d a d e n o m a s ( F i g u r e 4 ) . G l o b a l h y p o m e t h y l a t i o n w a s d e m o n s t r a t e d i n 3 o f 5 s p o n t a n e o u s c a r c i n o m a s ( F i g u r e 3 ) a n d 2 o f 3 P B - i n d u c e d c a r c i n o m a s ( F i g u r e 4 ) . 1 9 6 T a b l e 3 : C M D D i e t C o - A d m i n i s t e r e d w i t h P B - l n d u c e d C h a n g e s i n m R N A L e v e l s . B G C 3 F 1 C 5 7 B L I 6 H a - r a s w e e k 1 t ( 5 / 6 ) ; n c ( 1 / 6 ) t ( 5 / 5 ) w e e k 2 t ( 4 / 6 ) ; n c ( 2 / 6 ) t ( 6 / 6 ) w e e k 4 t ( 4 / 6 ) ; n c ( 2 / 6 ) 6 ( 3 / 6 ) ; n c ( 3 / 6 ) r e c o v e r y 1 ( 3 / 4 ) ; n c ( 1 / 4 ) t ( 1 / 3 ) ; n c ( 1 / 3 ) ; 6 ( fi g r a f w e e k 1 t ( 2 / 6 ) ; n c ( 2 / 6 ) ; 6 ( 2 / 6 ) 1 ( 1 / 3 ) ; 6 ( 2 / 3 ) w e e k 2 t ( 3 / 6 ) ; n c ( 2 / 6 ) ; 6 ( 1 / 6 ) t ( 5 / 6 ) ; n c ( 1 / 6 ) w e e k 4 t ( 1 / 6 ) ; n c ( 4 / 6 ) ; 6 ( 1 / 6 ) t ( 3 / 6 ) ; n c ( 3 / 6 ) r e c o v e r y n c ( 2 / 4 ) ; 6 ( 2 / 4 ) 1 ( 1 / 3 ) ; 6 ( 2 / 3 ) S A M S T a s e w e e k 1 t ( 2 / 6 ) ; n c ( Z 6 ) ; 6 ( 2 / 6 ) t ( 1 / 3 ) ; 6 ( 2 / 3 ) w e e k 2 t Q / S ) ; n c ( 1 / 5 ) ; 6 ( 2 / 5 ) t ( 1 / 6 ) ; n c ( 4 / 6 ) ; 6 ( 1 / 6 ) w e e k 4 f ( 1 / 4 ) ; n c ( 2 / 4 ) ; 6 ( 1 / 4 ) n c Q / G ) ; 6 ( 3 / 6 ) r e c o v e r y 6 ( 4 / 4 ) 6 ( 5 / 5 ) f D e n o t e s a n i n c r e a s e i n m R N A e x p r e s s i o n c o m p a r e d t o c o n t r o l s a f t e r n o r m a l i z a t i o n t o 2 8 $ m R N A l e v e l s 6 D e n o t e s a d e c r e a s e i n m R N A e x p r e s s i o n c o m p a r e d t o c o n t r o l s a f t e r n o r m a l i z a t i o n t o 2 8 8 m R N A l e v e l s T h e n u m b e r s i n p a r e n t h e s e s r e f e r t o t h e n u m b e r o f a n i m a l s d e m o n s t r a t i n g a c h a n g e o u t o f t h e t o t a l n u m b e r o f a n i m a l s t e s t e d . n c n o t c h a n g e d 1 9 7 F i g u r e 3 - G l o b a l m e t h y l a t i o n s t a t u s i n s p o n t a n e o u s a d e n o m a s a n d c a r c i n o m a s f r o m B G C 3 F 1 m o u s e l i v e r . S s s l m e t h y l a s e w a s u s e d t o a s s e s s D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s i n d i r e c t l y . T h e e n z y m e u t i l i z e s [ 3 H - C H 3 ] S A M t o d o n a t e a m e t h y l g r o u p t o t h e C o f a n y u n m e t h y l a t e d C p G s i t e s . T h u s , h y p o m e t h y l a t i o n i s a p p a r e n t a s a n i n c r e a s e i n i n c o r p o r a t i o n o f m e t h y l g r o u p s . O p e n b a r i s t h e a v e r a g e d v a l u e s o b t a i n e d f r o m t h e 6 a g e - m a t c h e d c o n t r o l l i v e r s a m p l e s . H a t c h e d b a r s r e p r e s e n t t h e a v e r a g e d v a l u e f o r e a c h i n d i v i d u a l a d e n o m a s a m p l e ( r e a c t i o n s w e r e r e p e a t e d 6 - 8 t i m e s a n d a v e r a g e d , e r r o r b a r s d e n o t e t h e s t a n d a r d e r r o r o f t h e m e a n ) . S o l i d b a r s r e p r e s e n t t h e a g e r a g e d v a l u e f o r e a c h i n d i v i d u a l c a r c i n o m a s a m p l e ( r e a c t i o n s w e r e r e p e a t e d 6 - 8 t i m e s a n d a v e r a g e d , e r r o r b a r s d e n o t e t h e s t a n d a r d e r r o r o f t h e m e a n ) . H y p o m e t h y l a t i o n i s e v i d e n t i n a d e n o m a 4 , c a r c i n o m a 6 , a n d c a r c i n o m a 8 . r h l g u / m p c F i g u r e 3 . 1 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 6 0 0 0 0 4 0 0 0 0 2 0 0 0 0 1 9 8 1 9 9 F i g u r e 4 - G l o b a l m e t h y l a t i o n s t a t u s i n P B - i n d u c e d a d e n o m a s a n d c a r c i n o m a s f r o m B 6 C S F 1 m o u s e l i v e r . S s s l m e t h y l a s e w a s u s e d t o a s s e s s D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s i n d i r e c t l y . T h e e n z y m e u t i l i z e s [ a H - C H 3 ] S A M t o d o n a t e a m e t h y l g r o u p t o t h e C o f a n y u n m e t h y l a t e d C p G s i t e s . T h u s , h y p o m e t h y l a t i o n i s a p p a r e n t a s a n i n c r e a s e i n i n c o r p o r a t i o n o f m e t h y l g r o u p s . O p e n b a r i s t h e a v e r a g e d v a l u e s o b t a i n e d f r o m t h e 8 a g e - m a t c h e d c o n t r o l l i v e r s a m p l e s . H a t c h e d b a r s r e p r e s e n t t h e a v e r a g e d v a l u e f o r e a c h i n d i v i d u a l a d e n o m a s a m p l e ( r e a c t i o n s w e r e r e p e a t e d 6 - 8 t i m e s a n d a v e r a g e d , e r r o r b a r s d e n o t e t h e s t a n d a r d e r r o r o f t h e m e a n ) . S o l i d b a r s r e p r e s e n t t h e a g e r a g e d v a l u e f o r e a c h i n d i v i d u a l c a r c i n o m a s a m p l e ( r e a c t i o n s w e r e r e p e a t e d 6 - 8 t i m e s a n d a v e r a g e d , e r r o r b a r s d e n o t e t h e s t a n d a r d e r r o r o f t h e m e a n ) . H y p o m e t h y l a t i o n i s e v i d e n t i n a d e n o m a 1 , c a r c i n o m a 6 , c a r c i n o m a 8 , a n d c a r c i n o m a 1 0 . F i g u r e 4 . 1 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 c p m / u g l h r 4 0 0 0 0 2 0 0 0 0 2 0 0 2 0 1 E x p r e s s i o n o f H a - r a s , r a f , a n d S A M S y n t h e t a s e i n B 6 C 3 F 1 M o u s e l e e r T u m o r s E l e v a t i o n o f H a - r a s m R N A w a s e v i d e n t i n 2 o f 4 s p o n t a n e o u s a d e n o m a s , 1 o f 3 s p o n t a n e o u s c a r c i n o m a s ( F i g u r e 5 ) , 5 o f 5 P B - i n d u c e d a d e n o m a s ( d a t a n o t s h o w n ) , a n d 4 o f 5 P B - i n d u c e d c a r c i n o m a s ( F i g u r e 6 ) . r e f m R N A w a s n o t i n c r e a s e d i n s p o n t a n e o u s o r P B - i n d u c e d B 6 C S F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s ( F i g u r e 5 a n d 6 ) . I n g e n e r a l , S A M s y n t h e t a s e m R N A w a s d e c r e a s e d o r u n c h a n g e d i n B 6 0 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s ( F i g u r e 5 a n d 6 ) . D I S C U S S I O N A d m i n i s t r a t i o n o f t h e C M D d i e t f o r u p t o 4 w e e k s d i d n o t l e a d t o h y p o m e t h y l a t i o n o f H a - r a s i n B G C 3 F 1 o r C S 7 B L / 6 m o u s e l i v e r . H o w e v e r , C M D d i e t a d m i n i s t r a t i o n f o r 1 2 w e e k s l e d t o h y p o m e t h y l a t i o n o f H a - r a s a n d r e f i n b o t h s t r a i n s . T h i s m a y a p p e a r t o i l l u s t r a t e a d i s c o n n e c t f o r h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A a s a n i m p o r t a n t f a c t o r u n d e r l y i n g d i f f e r e n t t u m o r s e n s i t i v i t i e s i n m i c e . H o w e v e r , w e d o n o t b e l i e v e t h i s i s n e c e s s a r i l y s o , a s t h e t u m o r p r o m o t i n g e f f e c t s o f t h e C M D d i e t i n C S 7 B U 6 m i c e a r e n o t k n o w n . l m p o r t a n t l y , h y p o m e t h y l a t i o n o f r e f i s e v i d e n t i n B 6 C 3 F 1 a n i m a l s a f t e r a p r o m o t i n g d o s e o f P B , b u t n o t t h e C S 7 B L / 6 ( R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) . T h i s , c o u p l e d w i t h t h e o b s e r v a t i o n ( C h a p t e r 4 ) t h a t C S 7 B L / 6 m i c e , i n c o n t r a s t t o t h e B 6 C 3 F 1 , d o n o t e x h i b i t g l o b a l h y p o m e t h y l a t i o n o v e r t h e c o u r s e o f 4 w e e k s o f t r e a t m e n t w i t h a p r o m o t i n g d o s e o f P B w h i l e b o t h s t r a i n s e x h i b i t h y p o m e t h y l a t i o n i n r e s p o n s e t o C M D d i e t a d m i n i s t r a t i o n , m a k e s i n f o r m a t i o n a b o u t t h e t u m o r r e s p o n s e o f t h e C 5 7 B L / 6 i n r e s p o n s e t o t h e C M D s u s 1 ’ a o , m " e n a t o n i c a . . . ‘ - 1 . I n . r o , a c ' p s s u s o a e m n a o t n n e o d p a s l . . A ‘ x I ' I . . , ‘ . , ‘ . ' ~ , y a m " ( ' . ‘ x ' ~ : ' - . 1 . » s n fi ‘ ‘ 1 “ ; : ) 6 3 " r x fi ' o fi r t n o c fl ' c a V r - F i g u r e 5 - m R N A e x p r e s s i o n o f H a - r a s , r a f , S A M s y n t h e t a s e , a n d 2 8 8 i n s p o n t a n e o u s a d e n o m a s a n d c a r c i n o m a s i n B 6 C S F 1 m o u s e l i v e r . N o r t h e r n b l o t w a s h y b r i d i z e d t o 1 . 0 x 1 0 7 c p m r a n d o m p r i m e r l a b e l e d p r o b e , s t r i p p e d o f p r o b e , a n d r e h y b r i d i z e d t o e a c h o f t h e o t h e r p r o b e s a s d e s c r i b e d i n t h e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . 2 8 S m R N A ( 6 . 2 5 x 1 0 ° c p m , 5 ’ e n d l a b e l e d ) w a s u s e d a s a n i n t e r n a l c o n t r o l f o r e q u a l l o a d i n g o f R N A s a m p l e s . 2 0 2 c o n t r o l P B - c a r c i n o m a s 2 0 3 S A M S T a s e 2 8 S F i g u r e 6 - m R N A e x p r e s s i o n o f H a - r a s , r a f , S A M s y n t h e t a s e , a n d 2 8 8 i n P B - c a r c i n o m a s I n B 6 C 3 F 1 m o u s e l i v e r . N o r t h e r n b l o t w a s h y b r i d i z e d t o 1 . 0 x 1 0 7 c p m r a n d o m p r i m e r l a b e l e d p r o b e , s t r i p p e d o f p r o b e , a n d r e h y b r i d i z e d t o e a c h o f t h e o t h e r p r o b e s a s d e s c r i b e d i n t h e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . 2 8 S m R N A ( 6 . 2 5 x 1 0 ° c p m , 5 ’ e n d l a b e l e d ) w a s u s e d a s a n i n t e r n a l c o n t r o l f o r e q u a l l o a d i n g o f R N A s a m p l e s . 2 0 4 d i e t n e c e s s a r y f o r a d i r e c t c o m p a r i s o n . T h e s e d a t a a r e n o t a v a i l a b l e c u r r e n t l y . F u r t h e r , t h e h y p o m e t h y l a t i o n e v i d e n t i n t h e C 5 7 B L / 6 o c c u r s o n l y i n t h e M s p l l a n e s ( i . e . , l o s s a t a n e x t e r n a l C o f a C C G G s i t e ) , w h i l e B 6 C S F 1 D N A b e c o m e s h y p o m e t h y l a t e d a t b o t h M s p l a n d H p a l l s i t e s ( F i g u r e 1 ) . T h i s i l l u s t r a t e s a h i g h e r c a p a c i t y o f t h e r e l a t i v e l y l i v e r t u m o r r e s i s t a n t C S 7 B L / 6 t o m a i n t a i n n a s c e n t m e t h y l a t i o n s t a t u s a s c o m p a r e d t o t h e r e l a t i v e l y s e n s i t i v e B 6 C 3 F 1 . F u r t h e r m o r e , t h i s o b s e r v a t i o n i s c o n s i s t e n t w i t h t h e g l o b a l m e t h y l a t i o n c h a n g e s s e e n i n r e s p o n s e t o t h e s e t u m o r p r o m o t i n g t r e a t m e n t s , i . e . , t h e B 6 C 3 F 1 i s m o r e s e n s i t i v e t o p r o m o t e r - i n d u c e d h y p o m e t h y l a t i o n t h a n t h e C S 7 B L / 6 ( s e e C h a p t e r 4 ) . T h u s , t h e r e i s a q u a n t i t a t i v e , n o t a q u a l i t a t i v e , d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e s e s t r a i n s o f m i c e w i t h r e g a r d t o c a p a c i t y t o m a i n t a i n m e t h y l a t i o n s t a t u s . N a s c e n t m e t h y l a t i o n i s m o r e s t a b l e i n t h e r e l a t i v e l y l i v e r t u m o r - r e s i s t a n t C S 7 B L / 6 a n d l e s s s t a b l e i n t h e r e l a t i v e l y s u s c e p t i b l e B 6 0 3 F 1 f o l l o w i n g e x p o s u r e t o l i v e r t u m o r p r o m o t e r s . O n e m a y a n t i c i p a t e t h a t a l t e r a t i o n s i n m e t h y l a t i o n s t a t u s a n d g e n e e x p r e s s i o n i n c r e a s e o v e r t i m e d u r i n g c o n t i n u e d a d m i n i s t r a t i o n o f t u m o r p r o m o t e r s a s t h e p o p u l a t i o n o f r e s p o n s i v e c e l l s i n c r e a s e s w i t h r e s p e c t t o t h e n o r m a l c e l l s w h i c h c o m p r i s e t h e m a j o r i t y o f c e l l s p r e s e n t i n t h e l i v e r , i . e . , m o r e c h a n g e s w o u l d b e e x p e c t e d a f t e r 1 2 w e e k s o n t h e C M D d i e t , t h a n a f t e r 4 w e e k s . T h u s , i t i s n o t s u r p r i s i n g t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o f H a - r a s a n d r a f t a k e s s o m e t i m e t o b e c o m e a p p a r e n t . E a r l i e r a n d m o r e c o n s i s t e n t i n c r e a s e s i n H a - r e s a n d r e f m R N A a r e s e e n i n t h e B 6 C 3 F 1 a s c o m p a r e d t o t h e C S 7 B L / 6 . A d d i t i o n a l l y , i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f b o t h H a - r a s a n d r e f w e r e o f t e n p r e s e n t i n 2 0 5 t h e B 6 C 3 F 1 a n i m a l s , w i t h t h e l e v e l o f o n l y o n e o r t h e o t h e r b e i n g i n c r e a s e d i n t h e C S 7 B L / 6 a n i m a l s . A f t e r 1 2 w e e k s o f C M D d i e t a d m i n i s t r a t i o n , b o t h H a - r a s a n d r e f m R N A s w e r e e l e v a t e d i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e , w h i l e o n l y H a - r a s w a s e l e v a t e d i n t h e C 5 7 B U 6 ( a n d o n l y i n 4 o u t o f 6 o f t h e a n i m a l s ) . A d d i t i o n a l l y , r a f m R N A w a s d e c r e a s e d i n t h e m a j o r i t y o f t h e C S 7 B L / 6 m i c e a t t h i s 1 2 w e e k t i m e p o i n t . T h e c y t o s o l i c r a f p r o t e i n k i n a s e a c t s a s a s i g n a l i n t e g r a t i n g s w i t c h t h a t c o m m u n i c a t e s b e t w e e n m u l t i p l e r e c e p t o r s y s t e m s o n t h e c e l l s u r f a c e a n d t h e n u c l e u s ( R a p p , 1 9 9 1 ) . T h e a c t i o n o f r e f i s d o w n s t r e a m , o r i n d e p e n d e n t , o f r e s ( R a p p , 1 9 9 1 ) a n d i t i n v o l v e s a p h y s i c a l a s s o c i a t i o n b e t w e e n t h e R a f a n d R a s p r o t e i n s ( G h o s h a n d B e l l , 1 9 9 4 ; B r t v a e t a l . , 1 9 9 5 ) , l e a d i n g t o a c t i v a t i o n o f t h e m i t o g e n - a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e s ( D a v i s , 1 9 9 3 ) t h a t p l a y a k e y r o l e i n s t i m u l a t i n g c e l l p r o l i f e r a t i o n . T h e r e f o r e , i t i s f r o m w i t h i n t h o s e p o p u l a t i o n s o f h e p a t o c y t e s e x h i b i t i n g a n i n c r e a s e i n e x p r e s s i o n o f H a - r a s , o r r a f , o r e s p e c i a l l y i n c r e a s e s i n b o t h , t h a t o n e m a y r e a s o n a b l y e x p e c t t o s e e t h e p r o l i f e r a t i v e e x p a n s i o n o f c l o n e s o f c e l l s l e a d i n g t o t u m o r s . T h e s u s t a i n e d i n c r e a s e o f e x p r e s s i o n o f r e f a n d H a - r a s i n t h e B 6 C 3 F 1 , b u t n o t i n t h e C S 7 B L / 6 , d u r i n g a n e a r l y p h a s e o f t u m o r p r o m o t i o n ( e . g . , 1 2 w e e k s o n a C M D d i e t ) p r o v i d e s a m e c h a n i s m t h a t m a y , i n p a r t , u n d e r l i e t h e h e i g h t e n e d s e n s i t i v i t y o f t h e 8 6 C 3 F 1 t o l i v e r t u m o r i g e n e s i s . T h e c o - a d m i n i s t r a t i o n o f a C M D d i e t w i t h P B l e d t o m o r e s u s t a i n e d i n c r e a s e s i n H a - r a s e x p r e s s i o n , d e m o n s t r a t i n g a n a d d i t i v e e f f e c t o f t h e p r o m o t e r s . I n g e n e r a l , t h e C M D d i e t l e d t o i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f r e f , w h i l e t h i s w a s l e s s s t r i k i n g a f t e r P B a d m i n i s t r a t i o n . T h e a d m i n i s t r a t i o n o f b o t h a d m i n i s t r a t i o n i n t h e B 6 0 3 F 1 m o u s e ( t h i s i s p r o b a b l y d u e t o s c a v e n g i n g ) . i . e . , a t 2 0 6 p r o m o t e r s l e d t o a v a r i a b l e r e s p o n s e o f r e f e x p r e s s i o n ( i . e . , i n c r e a s e d i n s o m e a n i m a l s w h i l e d e c r e a s e d i n o t h e r s ) w h i c h w a s o f t e n i n d e p e n d e n t o f t h e l e v e l o f e x p r e s s i o n o f H a - r a s . S i n c e d i f f e r e n c e s b e t w e e n H a - r a s a n d r e f e x p r e s s i o n o c c u r r e d , o u r d a t a d e m o n s t r a t e t h a t H a - r a s c a n b e i n c r e a s e d , w h i l e a t t h e s a m e t i m e , r a f i s d e c r e a s e d o r u n c h a n g e d ( a n d v i c e v e r s a ) . T h i s s u p p o r t s t h e i d e a t h a t d i f f e r e n t p a t h w a y s a r e o p e r a t i v e a n d i n v o l v e d a t d i f f e r e n t s t a g e s o f t u m o r f o r m a t i o n . O p e r a t i o n a l l y , p r o m o t i o n i n v o l v e s t h e c l o n a l e x p a n s i o n o f i n i t i a t e d c e l l s , a n d t h e s e i n i t i a t e d c e l l s m a y o c c u r s p o n t a n e o u s l y ( M o u l d s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 ) . P r o m o t i n g a g e n t s m u s t b e a d m i n i s t e r e d c o n t i n u o u s l y o v e r t i m e a n d a p p e a r t o e x e r t a v a r i e t y o f e f f e c t s . T h i s i s s u p p o r t e d b y o u r d e m o n s t r a t i o n o f g l o b a l h y p o m e t h y l a t i o n i n a s u b p o p u l a t i o n o f s p o n t a n e o u s - a n d P B - i n d u c e d a d e n o m a s a n d c a r c i n o m a s f r o m t h e B 6 C 3 F 1 m o u s e . T h e r e w e r e m o r e c a r c i n o m a s e x h i b i t i n g g l o b a l h y p o m e t h y l a t i o n t h a n a d e n o m a s . T h e v a r i a b l e l e v e l s o f g l o b a l h y p o m e t h y l a t i o n i n m o u s e l i v e r t u m o r s d e s c r i b e d h e r e a r e c o n s i s t e n t w i t h w h a t w a s o b s e r v e d i n h u m a n t u m o r s ( G a m a - S o s a e t a l . , 1 9 8 3 ) . l m p o r t a n t l y , a n d a g a i n c o n s i s t e n t w i t h o u r f i n d i n g s , t h e e x t e n t o f h y p o m e t h y l a t i o n i n c r e a s e s a s h u m a n n e o p l a s i a p r o g r e s s e s i n s e v e r i t y , i . e . , c a r c i n o m a s a r e m o r e h y p o m e t h y l a t e d t h a n a d e n o m a s ( G a m a - S o s a e t a l . , 1 9 8 3 ) . S A M s y n t h e t a s e m R N A l e v e l s p a r a l l e l t h e p a r t i a l r e c o v e r y i n g l o b a l m e t h y l a t i o n s t a t u s ( s e e C h a p t e r 4 ) s e e n a f t e r 2 w e e k s o f C M D d i e t 2 0 7 w e e k s 1 a n d 4 w h e n h i g h l e v e l s o f g l o b a l h y p o m e t h y l a t i o n a r e o c c u r r i n g , S A M s y n t h e t a s e m R N A i s e l e v a t e d i n t h e B 6 C 3 F 1 . T h i s e f f e c t i s n o t o b v i o u s i n t h e C 5 7 B U 6 . I t s e e m s p o s s i b l e t h a t S A M s y n t h e t a s e m R N A i s i n c r e a s e d a s a “ s t r e s s ” r e s p o n s e i n d u c e d b y i n c r e a s e d g l o b a l h y p o m e t h y l a t i o n , i . e . , t h e a n i m a l s m a y u p r e g u l a t e s y n t h e s i s o f S A M i n a n a t t e m p t t o r e s t o r e m e t h y l a t i o n s t a t u s . A s g l o b a l m e t h y l a t i o n r e c o v e r s s l i g h t l y i n t h e B 6 C 3 F 1 a t t h e t w o w e e k t i m e p o i n t w i t h C M D d i e t a d m i n i s t r a t i o n o r C M D d i e t c o - a d m i n i s t e r e d w i t h P B ( s e e F i g u r e s 6 a n d 8 , C h a p t e r 4 ) , S A M s y n t h e t a s e m R N A r e t u r n s t o w a r d c o n t r o l l e v e l s . T h e C 5 7 B U 6 a n i m a l s , w h i c h d i d n o t d e m o n s t r a t e t h i s s c a v e n g i n g , h a d i n c r e a s e d S A M s y n t h e t a s e i n h a l f o f t h e a n i m a l s a t t h e w e e k 2 t i m e p o i n t . P B , i n g e n e r a l , l e d t o d e c r e a s e d S A M s y n t h e t a s e m R N A i n B 6 C 3 F 1 a n d C 5 7 B U 6 a f t e r 1 w e e k o f a d m i n i s t r a t i o n . T h e d u a l p r o m o t e r t r e a t m e n t o f C M D d i e t a n d P B l e d t o v a r i a b l e r e s p o n s e s i n t h e a n i m a l s , s o m e i n c r e a s e s a n d s o m e d e c r e a s e s , s u p p o r t i n g t h e p o s s i b i l i t y t h a t d i f f e r e n t p a t h w a y s a r e o p e r a t i v e i n d i f f e r e n t a n i m a l s . P r e v i o u s s t u d i e s f r o m o u r l a b o r a t o r y d e m o n s t r a t e d i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f H a - r a s a n d r a f i n P B - i n d u c e d 8 6 C 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s ( R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) . I n t h e p r e s e n t s t u d y , u t i l i z i n g a l o w e r d o s e o f P B ( 7 5 m g / k g / d a y a s c o m p a r e d t o 1 5 0 m g / k g / d a y ( R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) ) , o n l y i n c r e a s e s i n H a - r a s m R N A w e r e d i s c e r n e d . T h i s p r o v i d e s s u p p o r t f o r P B p r o m o t i n g d i f f e r e n t s u b p o p u l a t i o n s o f i n i t i a t e d c e l l s d e p e n d i n g u p o n d o s e . L o w e r d o s e s a p p e a r t o p r o m o t e t h o s e c e l l s e x h i b i t i n g i n c r e a s e d H a - r a s e x p r e s s i o n , w h i l e h i g h e r d o s e s p r o m o t e t h o s e c e l l s e x h i b i t i n g i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f b o t h H a - r a s a n d r e f . T h e r e i s a m p l e 2 0 8 p r e c e d e n t r e g a r d i n g t h e a b i l i t y o f p r o m o t e r s t o f a c i l i t a t e t h e c l o n a l e x p a n s i o n o f s p e c i f i c s u b p o p u l a t i o n s o f c e l l s ( K r a u p p - G r a s l e t a l . , 1 9 9 0 ; M a y o l e t a l . , 1 9 9 2 ; H a n i g a n e t a l . , 1 9 9 3 ; C a t t l e y e t a l . , 1 9 9 4 ) . P B p r o m o t e s a s u b p o p u l a t i o n o f c e l l s i n m o u s e l i v e r t h a t , i n c o n t r a s t t o w h a t i s o b s e r v e d i n s p o n t a n e o u s l i v e r t u m o r s , l e a d t o t u m o r s e x h i b i t i n g a r e l a t i v e l y l o w f r e q u e n c y o f m u t a t i o n a t c o d o n 6 1 o f H a - r a s ( F o x e t a l . , 1 9 9 0 ) . H o w e v e r , c o n s i s t e n t w i t h t h e f i n d i n g s o f t h e c u r r e n t s t u d y , H a - r a s e x p r e s s i o n h a s b e e n r e p o r t e d t o b e i n c r e a s e d i n P B - p r o m o t e d m o u s e l i v e r t u m o r s ( R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) . T h i s i l l u s t r a t e s t h e i m p o r t a n c e o f c o n s i d e r i n g t h e r o l e p l a y e d b y i n c r e a s e d o n c o g e n e e x p r e s s i o n , a s w e l l a s m u t a t i o n , i n c a r c i n o g e n e s i s . A l t e r a t i o n s t o t h e g e n o m e ( e . g . , m u t a t i o n , c h r o m o s o m e l o s s , a n d c h a n g e i n m e t h y l a t i o n s t a t u s ) o c c u r a t m u l t i p l e p o i n t s i n t h e c a r c i n o g e n i c p r o c e s s , a s d e p i c t e d i n t h e V o g e l s t e i n m o d e l b a s e d o n c o l o n c a r c i n o g e n e s i s ( V o g e l s t e i n e t a l . , 1 9 8 8 ; M a r x , 1 9 9 1 ) , a n d u n d e r l i e t h e s e q u e n t i a l c l o n a l e x p a n s i o n o f c e l l s l e a d i n g t o a f r a n k m a l i g n a n c y . I n l i g h t o f t h e s t o c h a s t i c a s p e c t s o f t h e p r o c e s s , i t i s n o t s u r p r i s i n g t h a t n e o p l a s m s , e v e n t h o s e a r i s i n g i n t h e s a m e o r g a n o f t h e s a m e a n i m a l , e x h i b i t a v a r i e t y o f p h e n o t y p e s ( H e n d r i c h e t a l . , 1 9 8 7 ) . O u r p r o p o s e d r o l e f o r h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A i n t u m o r p r o m o t i o n ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 ) i s c o m p a t i b l e w i t h , a n d c o n s i s t e n t w i t h , t h e c u r r e n t v i e w o f t h e c a r c i n o g e n i c p r o c e s s . H y p o m e t h y l a t i o n i s a n o n g e n o t o x i c m e c h a n i s m a n d i t c a n b e r e v e r s e d b y d e n o v o m e t h y l a t i o n ( r e f e r e n c e d i n C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 ; C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 b ) . A p o t e n t i a l f o r r e v e r s a l i s a h a l l m a r k f o r t h e p r o m o t i o n s t a g e o f c a r c i n o g e n e s i s ( D r a g a n e t a l . , 1 9 9 3 ) . A d d i t i o n a l l y , 2 0 9 b e c a u s e a l t e r e d m e t h y l a t i o n m a y a c c o u n t f o r a v a r i e t y o f m u t a g e n i c a n d e p i g e n e t i c c h a n g e s ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 a ) , t h i s c o u l d p l a y a r o l e i n g e n e r a t i n g t h e m u l t i p l i c i t y o f p h e n o t y p e s e x h i b i t e d b y t u m o r s . T h e r e f o r e , t h e a s s o r t m e n t o f c h a n g e s i n m e t h y l a t i o n a n d g e n e e x p r e s s i o n t h a t w e o b s e r v e d i n t h e c u r r e n t s t u d y a r e w h a t o n e m a y e x p e c t i n a t a r g e t o r g a n d u r i n g t h e e a r l y p h a s e o f c a r c i n o g e n e s i s . T h e s t u d i e s r e p o r t e d h e r e s u p p o r t t h e h y p o t h e s i s t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A m a y u n d e r l i e t h e a b e r r a n t o n c o g e n e e x p r e s s i o n t h a t i s i n v o l v e d i n t u m o r i g e n e s i s ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 ; C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 a ) . I n a d d i t i o n , t h e p r o p o s a l t h a t t h e B G C 3 F 1 m o u s e h a s a d e c r e a s e d c a p a c i t y f o r a n d / o r f i d e l i t y o f m a i n t e n a n c e m e t h y l a t i o n i s s u p p o r t e d ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 ; R a y e t a l . , 1 9 9 4 ; C h a p t e r 4 ) . A b e r r a n t o n c o g e n e e x p r e s s i o n o c c u r r i n g a t c r i t i c a l t i m e s m a y l e a d t o p e r t u r b e d i n t e r c e l l u l a r s i g n a l l i n g , e . g . , a b e r r a n t a c t i v i t y o f t h e m i t o g e n a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e c a s c a d e . T h i s c o u l d l e a d t o c l o n a l e x p a n s i o n o f i n i t i a t e d c e l l s , t h r o u g h e n h a n c e d c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d / o r d e c r e a s e d a p o p t o s i s . T h e g r e a t e r a l t e r a t i o n s o f n o r m a l g e n e e x p r e s s i o n w e d i s c e r n t h a t a r e m o r e s t a b l y m a i n t a i n e d i n t h e B 6 C 3 F 1 a s c o m p a r e d t o t h e C 5 7 B U 6 , i n d i c a t e t h a t t h i s m a y , i n p a r t , u n d e r l i e t h e u n u s u a l l y h i g h s e n s i t i v i t y t o l i v e r t u m o r f o r m a t i o n e x h i b i t e d b y t h e B 6 C 3 F 1 . A C K N O W L E D G M E N T S T h e s a m p l e o f S A M s y n t h e t a s e c D N A p r o v i d e d b y D r . J a n i c e C h o u i s g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e d . O u r r e s e a r c h c o n c e r n i n g D N A m e t h y l a t i o n w a s i n i t i a t e d b y 2 1 0 s u p p o r t f r o m t h e l n t e m a t i o n a l L i f e S c i e n c e s I n s t i t u t e ( I L S I ) R i s k S c i e n c e I n s t i t u t e . T h i s i s c u r r e n t l y s u p p o r t e d b y I L S I , H e a l t h a n d E n v i r o n m e n t a l S c i e n c e s I n s t i t u t e , a n d N I H g r a n t E S - 0 5 2 9 9 . J L C i s t h e r e c i p i e n t o f a S o c i e t y o f T o x i c o l o g y p r e d o c t o r a l f e l l o w s h i p a w a r d . R E F E R E N C E S A l v a r e z , L . , C o r r a l e s , F . , M a r t i n - D u c e , A . a n d M a t o , J . M . ( 1 9 9 3 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f a f u l l - l e n g t h c D N A e n x o d i n g h u m a n l i v e r S - a d e n o s y l m e t h i o n i n e - s y n t h e t a s e : T i s s u e - s p e c i f i c g e n e e x p r e s s i o n a n d m R N A l e v e l s i n h e p a t o p a t h i e s . B i e e n e m , , L , 2 9 3 , 4 8 1 - 4 8 6 . B a l a g h i , M . a n d W a g n e r , C . ( 1 9 9 3 ) D N A m e t h y l a t i o n i n f o l a t e d e f i c i e n c y : U s e o f C P G m e t h y l a s e W 1 9 3 1 1 8 4 - 1 1 9 0 B a r b u , R . a n d D a u t r y , F . ( 1 9 8 9 ) N o r t h e r n b l o t n o r m a l i z a t i o n w i t h a 2 8 8 r R N A o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e . W M , 1 7 , 7 1 1 5 . B e c k e r , P F . ( 1 9 8 2 ) M o r p h o l o g i c a l c l a s s i f i c a t i o n o f m o u s e l i v e r t u m o r s b a s e d o n b i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s . Q Q D Q Q L B B L 4 2 , 3 9 1 8 - 3 9 2 3 . B h a v e , M . R . , W i l s o n , M . J . a n d P o i r i e r , L A . ( 1 9 8 8 ) c - H a - r a s a n d c - K i - r a s g e n e h y p o m e t h y l a t i o n i n t h e l i v e r s a n d h e p a t o m a s o f r a t s f e d m e t h y l - d e f i c i e n t , a m i n o a c i d - d e f i n e d d i e t s . W , 9 , 3 4 3 - 3 4 8 . B i r d , A P . ( 1 9 8 6 ) C p G - r i c h i s l a n d s a n d t h e f u n c t i o n o f D N A m e t h y l a t i o n . N a t u r e ( L e n d e n ) , 3 2 1 , 2 0 9 - 2 1 3 . B r o w n , T . ( 1 9 9 4 ) A n a l y s i s o f R N A b y n o r t h e r n a n d s l o t b l o t h y b r i d i z a t i o n . I n A u s u b e l , F . M . , B r e n t , R . , K i n g s t o n , R E , M o o r e , D . D . , S e i d m a n , J . G . , S m i t h , J . A . a n d S t r u h l , K . ( e d s . ) n P r l i n M r B i . J o h n W i l e y a n d S o n s , N e w Y o r k , p p . 4 . 9 . 7 - 4 . 9 . 8 . B r t v a , T . R . , D r u g a n , J . K . , G h o s h , S . , T e r r e l l , R . S . , C a m p b e l l - B u r k , 8 . , B e l l , R M . a n d D e r , C . J . ( 1 9 9 5 ) T w o d i s t i n c t R a f d o m a i n s m e d i a t e i n t e r a c t i o n w i t h R e s . J , m , 2 7 0 , 9 8 0 9 - 9 8 1 2 . C a t t l e y , R . C . , K a t o , M . P o p p , J . . , A T e e t s , V . . J a n d V o s s , K S ( 1 9 9 4 ) I n i t i a t o r - s p e c i f i c p r o m o t i o n o f h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s b y W Y - 1 4 , 6 4 3 a n d c l o f i b r a t e . C a r e l m g e n e e j e , 1 5 , 1 7 6 3 - 1 7 6 6 . 2 1 1 C h a w l a , R . . K a n d J o n e s , D . P . ( 1 9 9 4 ) A b n o r m a l m e t a b o l i s m o f S - - - a d e n o s y l - L - m e t h i o n i n e i n h y p o x i c r a t l i v e r . S i m i l a r i t i e s t o i t s a b n o r m a l m e t a b o l i s m i n a l c o h o l i c c i r r h o s i s . W u 1 1 9 9 , 4 5 - 5 1 . C h r i s t m a n , J . K . , S h e i k h n e j a d , G . , D i z i k , M . , A b i l e a h , S . a n d W a i n f a n , E . ( 1 9 9 3 ) R e v e r s i b i l i t y o f c h a n g e s i n n u c l e i c a c i d m e t h y l a t i o n a n d g e n e e x p r e s s i o n i n d u c e d i n r a t l i v e r b y s e v e r e d i e t a r y m e t h y l d e f i c i e n c y . Q a r e j n e g e n e e j e , 1 4 , 5 5 1 - 5 5 7 . C l a r k , S . J . , H a r r i s o n , J . a n d F r o m m e r , M . ( 1 9 9 5 ) C p r G m e t h y l a t i o n i n m a m m a l i a n c e l l s . W , 1 0 , 2 0 - 2 7 . C o u n t s , J . L . a n d G o o d m a n , J . . l ( 1 9 9 4 ) H y p o m e t h y l a t i o n o f D N A : A n e p i g e n e t i c m e c h a n i s m i n v o l v e d i n t u m o r p r o m o t i o n . W , 1 1 , 1 8 5 - 1 8 8 . C o u n t s , J . L . a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 5 3 ) A l t e r a t i o n s i n D N A m e t h y l a t i o n m a y p l a y a v a r i e t y o f r o l e s i n c a r c i n o g e n e s i s . C e l l , 8 3 , 1 3 - 1 5 . C o u n t s , J . L . a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 5 b ) H y p o m e t h y l a t i o n o f D N A A n e p i g e n e t i c m e c h a n i s m t h a t c a n f a c i l i t a t e t h e a b e r r a n t o n c o g e n e e x p r e s s i o n i n v o l v e d i n l i v e r c a r c i n o g e n e s i s I n J i r t l e R L ( 9 ( 1 ) m e M e l e g m e L a n d C e l l u l e L M e Q e m e m e . A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k , p p . 2 2 7 - 2 5 5 . D a v i s , R . J . ( 1 9 9 3 ) T h e m i t o g e n - a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y . m , 2 6 8 , 1 4 5 5 3 - 1 4 5 5 6 . D i w a n , B . A . , R i c e , J . M . , O h s h i m a , M . , W a r d , J . M . a n d D o v e , L P . ( 1 9 8 5 ) C o m p a r a t i v e t u m o r - p r o m o t i n g a c t i v i t i e s o f p h e n o b a r b i t a l , a m o b a r b i t a l , b a r b i t a l s o d i u m , a n d b a r b i t u r i c a c i d o n l i v e r s a n d o t h e r o r g a n s o f m a l e F 3 4 4 / N C r r a t s f o l l o w i n g i n i t i a t i o n w i t h N - n i t r o s o d i e t h y l a m i n e . J . N e l l , C e n e e r I n s t “ 7 4 , 5 0 9 - 5 1 6 . D r a g a n , Y . P . , S a r g e n t , L . , X u , Y . - D . , X u , Y . - H . a n d P i t o t , H Q ( 1 9 9 3 ) T h e i n i t i a t i o n - p r o m o t i o n - p r o g r e s s i o n m o d e l o f r a t h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s . P M W . 2 0 2 . 1 6 - 2 4 . F i n n e y , R E . a n d B i s h o p , J . M . ( 1 9 9 3 ) P r e d i s p o s i t i o n t o n e o p l a s t i c t r a n s f o r m a t i o n c a u s e d b y g e n e r e p l a c e m e n t t o H - r a s t . S e i e m e , 2 6 0 , 1 5 2 4 - 1 5 2 7 . F o x , T . R . , S c h u m a n n , A . M . , W a t a n a b e , P . G . , Y a n o , B . L . , M a h e r , V . M . a n d M c C o r m i c k , J . J . ( 1 9 9 0 ) M u t a t i o n a l a n a l y s i s o f t h e H - r a s o n c o g e n e i n s p o n t a n e o u s C S 7 B L / 6 x C 3 H / H e m o u s e l i v e r t u m o r s a n d t u m o r s i n d u c e d w i t h g e n o t o x i c a n d n o n g e n o t o x i c h e p a t o c a r c i n o g e n s . m , 5 0 , 4 0 1 4 - 4 0 1 9 . 2 1 2 G a m a - S o s a , M . . , A S l a g e l , V . . , A T r e w y n , R . . W , O x e n h a n d l e r , R . , K u o , K . C . , G e h r k e , C . W . a n d E h r l i c h , M . ( 1 9 8 3 ) T h e 5 - - m e t h y l c y t o s i n e c o n t e n t o f D N A f r o m h u m a n t u m o r s W , 1 1 , 6 8 8 3 - 6 8 9 4 . G a r d i n e r - G a r d e n , M . a n d F r o m m e r , M . ( 1 9 8 7 ) C p G i s l a n d s i n v e r t e b r a t e g e n o m e s . , L M e L fi i e L , 1 9 6 , 2 6 1 - 2 8 2 . G h o s h , S . a n d B e l l , R M . ( 1 9 9 4 ) I d e n t i f i c a t i o n o f d i s c r e t e s e g m e n t s o f h u m a n R a f - 1 k i n a s e c r i t i c a l f o r h i g h a f f i n i t y b i n d i n g t o H a - r a s . J , _ B _ j e l . _ Q b e m , , 2 6 9 , 3 0 7 8 5 - 3 0 7 8 8 . G h o s h a l , A K a n d F a r b e r , E . ( 1 9 8 4 ) T h e i n d u c t i o n o f l i v e r c a n c e r b y d i e t a r y d e f i c i e n c y o f c h o l i n e a n d m e t h i o n i n e w i t h o u t a d d e d c a r c i n o g e n s . Q a r e i n e o e n e s i s 5 . 1 3 6 7 - 1 3 7 0 . H a n i g a n , M . H . , W i n k l e r , M L . a n d D r i n k w a t e r , N R . ( 1 9 9 3 ) I n d u c t i o n o f t h r e e h i s t o c h e m i c a l l y d i s t i n c t p o p u l a t i o n s o f h e p a t i c f o c i i n C S 7 B L / 6 J m i c e . G e m i n e g e n e s i e 1 4 . 1 0 3 5 - 1 0 4 0 . H e n d r i c h , S . , C a m p b e l l , H A . a n d P i t o t , H . C . ( 1 9 8 7 ) Q u a n t i t a t i v e s t e r e o l o g i c a l e v a l u a t i o n o f f o u r h i s t o c h e m i c a l m a r k e r s o f a l t e r e d f o c i i n m u l t i s t a g e h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s i n t h e r a t . C a r e l n e g e n e e i e , 8 , 1 2 4 5 - 1 2 5 0 . H e r m a n , J . G . , L a t i f , F . , W a n g , Y . , L e r m a n , M . l . , Z b a r , 8 . , L i u , S . , S a m i d , D . , D u a n , D . . - S R . , G n a r r a , J . . , R L i n e h a m , W M a n d B a y l i n , S . B . ( 1 9 9 4 ) S i l e n c i n g o f t h e V H L t u m o r - s u p p r e s s o r g e n e b y D N A m e t h y l a t i o n i n r e n a l c a r c i n o m a . M I L A W , 9 1 , 9 7 0 0 - 9 7 0 4 . H i r o k a w a , S . , K o b a y a s h i , Y . , S u g i y a m a , T . , T e r a s h i m a , H . , W a d a , K . a n d T s u k a d a , K . ( 1 9 9 3 ) E x p r e s s i o n o f n o n - h e p a t i c - t y p e S - a d e n o s y l m e t h i o n i n e s y n t h e t a s e i s o z y m e i n r a t h e p a t o m a s i n d u c e d b y 3 ’ - m e t h y l - 4 - d i m e t h y l a m i n o a z o b e n z e n e . E E B S _ L e t L , 3 3 4 , 6 9 - 7 1 . K o e t s i e r , P . A . , S c h o r r , J . a n d D o e r f l e r , W . ( 1 9 9 3 ) A r a p i d o p t i m i z e d p r o t o c o l f o r d o w n w a r d a l k a l i n e S o u t h e r n b l o t t i n g o f D N A . B j e t e q m j g u e e , 1 5 , 2 6 0 - 2 6 1 . K o r c h , C . a n d H a g b l o m , P . ( 1 9 8 6 ) I n - v i v o - m o d i f i e d g o n o c o c c a l p l a s m i d p J D 1 . A m o d e l s y s t e m f o r a n a l y s i s o f r e s t r i c t i o n e n z y m e s e n s i t i v i t y t o D N A m o d i f i c a t i o n s . m m . 1 6 1 . 5 1 9 - 5 2 4 . K r a u p p - G r a s l , B . , H u b e r , W . , P u t z , B . , G e r b r a c h e , U . a n d S c h u l t e - H e r m a n n , R . ( 1 9 9 0 ) T u m o r p r o m o t i o n b y t h e p e r o x i s o m e p r o l i f e r a t o r n a f e n o p i n i n v o l v i n g a s p e c i f i c s u b t y p e o f a l t e r e d f o c i i n r a t l i v e r . C e n g e r R e e , 5 0 , 3 7 0 1 - 3 7 0 8 . L e w i s , J . a n d B i r d , A . ( 1 9 9 1 ) D N A m e t h y l a t i o n a n d c h r o m a t i n s t r u c t u r e . E E B S L e n “ 2 8 5 , 1 5 5 - 5 9 . 2 1 3 M a n g u e s , R . , K a h n , J . M . , S e i d m a n , I . a n d P e l l i c e r , A . ( 1 9 9 4 ) A n o v e r e x p r e s s e d N - r a s p r o t o - o n c o g e n e c o o p e r a t e s w i t h N - m e t h y l n i t r o s o u r e a i n m o u s e m a m m a r y c a r c i n o g e n e s i s . C e n s e L B e e " 5 4 , 6 3 9 5 - 6 4 0 1 . M a r x , J . ( 1 9 9 1 ) P o s s i b l e n e w c o l o n c a n c e r g e n e f o u n d . S c i e n c e , 2 5 1 , 1 3 1 7 . M e t a , J . M . , A l v a r e z , L . , C o r r a l e s , R . J . a n d P a j a r e s , M A ( 1 9 9 4 ) S - a d e n o s y l m e t h i o n i n e a n d t h e l i v e r . I n A r i a s , I . . , M B o y e r , J . . , L F a u s t o , N . , J a k o b y , W . . , B S c h a c h t e r , D A a n d S h a f r i t z , D . . A ( e d s . ) I b e _ L j 1 e _ L ; _ _ B i e l e g y _ e n _ d W m . R a v e n P r e s s , L t d . , N e w Y o r k , p p . 4 6 1 - 4 7 0 . M a y o l , X . , N e a l , G . E . , D a v i e s , R . , R o m e r o , A . a n d D o m i n g o , J . ( 1 9 9 2 ) E t h i n y l e s t r a d i o l - i n d u c e d c e l l p r o l i f e r a t i o n i n r a t l i v e r . I n v o l v e m e n t o f s p e c i f i c p o p u l a t i o n s o f h e p a t o c y t e s . C e r e j n e g e n e e j e , 1 3 , 2 3 8 1 - 2 3 8 8 . M i k o l , Y . . , B H o o v e r , K L . C r e a s i a , D . a n d P o i r i e r , L A . ( 1 9 8 3 ) H e p a t o c a r c i n o g e n e s i s i n r a t s f e d m e t h y l - d e f i c i e n t , a m i n o a c i d - d e f i n e d d i e t s . D e r e l n e g e n e e i e 4 1 6 1 9 - 1 6 2 9 M i l l s , J . . J , J i r t l e , R L . a n d B o y e r , I . J . ( 1 9 9 5 ) M e c h a n i s m s o f l i v e r t u m o r p r o m o t i o n . I n J i r t l e , R . L . ( e d . ) W W . A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k , p p . 1 9 9 - 2 2 6 . M o u l d s , B A . a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 4 ) S p o n t a n e o u s m u t a t i o n a t c o d o n 6 1 o f t h e H a - r a s g e n e i n t h e n a s c e n t l i v e r o f B 6 C 3 F 1 , 0 3 H / H e a n d C 5 7 B U 6 m i c e . M y 3 1 1 : 1 ' 7 - N e w b e m e , P . M . , d e C a m a r g o , J . L . V . a n d C l a r k , A . J . ( 1 9 8 2 ) C h o l i n e d e f i c i e n c y , p a r t i a l h e p a t e c t o m y , a n d l i v e r t u m o r s i n r a t s a n d m i c e . M , 1 0 , 9 5 - 1 0 6 . P e r i a n o , C . , F r y , R . J . M . , S t a f f e l d t , E . a n d C h r i s t o p h e r , J P . ( 1 9 7 1 ) C o m p a r a t i v e e n h a n c i n g e f f e c t s o f p h e n o b a r b i t a l , a m o b a r b i t a l , d i p h e n y l h y d a n t o i n , a n d d i c h l o r o p h e n y l t r i c h l o r o e t h a n e o n 2 - a c e t y l a m i n o f l u o r e n e - i n d u c e d h e p a t i c t u m o r i g e n e s i s i n t h e r a t . C e n e e r R e e , 3 5 , 2 8 8 4 - 2 8 9 0 . P i t o t , H . C . ( 1 9 9 0 ) A l t e r e d h e p a t i c f o c i : T h e i r r o l e i n m u r i n e h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s . W M , 3 0 , 4 6 5 - 5 0 0 . R a p p , U . R . ( 1 9 9 1 ) R o l e o f r e f - 1 s e r i n e / t h r e o n i n e p r o t e i n k i n a s e i n g r o w t h f a c t o r s i g n a l t r a n s d u c t i o n . Q n g e g e e e , 6 , 4 9 5 - 5 0 0 . R a y , J . S . , H a r b i s o n , M . L . , M c C l a i n , R M . a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 4 ) A l t e r a t i o n s i n t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s a n d e x p r e s s i o n o f t h e r e f o n c o g e n e i n p h e n o b a r b i t a l - 2 1 4 i n d u c e d a n d s p o n t a n e o u s B 6 C 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s . W , 9 , 1 5 5 - 1 6 6 . R a z i n , A . a n d K a f r i , T . ( 1 9 9 4 ) D N A m e t h y l a t i o n f r o m e m b r y o t o a d u l t . E m N e e l e i e A e i d fi e s n M e L B I e L 4 8 5 3 - 8 1 S a k a i , T . , T o g u c h i d a , J . , O h t a n i , N . , Y a n d e l l , D . W . , R a p a p o r t , J . M . a n d D r y j a , T . P . ( 1 9 9 1 ) A l l e l e - s p e c i f i c h y p e r r n e t h y l a t i o n o f t h e r e t i n o b l a s t o m a t u m o r - s u p p r e s s o r g e n e - A m z i n l i u m fi e n e h 4 8 . 8 8 0 - 8 8 8 - S a k a t a , S . F . , S h e l l y , L . L . , R u p p e r t , S . , S c h u t z , G . a n d C h o u , J . Y . ( 1 9 9 3 ) C l o n i n g a n d e x p r e s s i o n o f m u r i n e S - a d e n o s y l m e t h i o n i n e s y n t h e t a s e . , 1 . _ B _ j e L _ Q h e m , , 2 6 8 , 1 3 9 7 8 - 1 3 9 8 6 . S a w a d a , N . , P o i r i e r , L . , M o r a n , S . , X u , Y . H . a n d P i t o t , H . C . ( 1 9 9 0 ) T h e e f f e c t o f c h o l i n e a n d m e t h i o n i n e d e f i c i e n c i e s o n t h e n u m b e r a n d v o l u m e p e r c e n t a g e o f a l t e r e d h e p a t i c f o c i i n t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f d i e t h y l n i t r o s a m i n e i n i t i a t i o n i n r a t l i v e r . C e r e i n e g e n e e j e , 1 1 , 2 7 3 - 2 8 1 . S e l d o n , R . F . ( 1 9 8 7 ) A n a l y s i s o f D N A s e q u e n c e s b y b l o t t i n g a n d h y b r i d i z a t i o n . I n A u s u b e l , F . M . , B r e n t , R . , K i n s t o n , R . . , E M o o r e , D . . , D S e i d m a n , J . . G , S m i t h , J . . A a n d S t r u h l K ( e d S ) W J o h n W i l e y a n d S o n s , N e w Y o r k , p p . 2 . . . . . 2 1 - 2 2 3 S h i v a p u r k a r , N . a n d P o i r i e r , L A . ( 1 9 8 2 ) D e c r e a s e d l e v e l s o f S - a d e n o s y l m e t h i o n i n e i n t h e l i v e r s o f r a t s f e d p h e n o b a r b i t a l a n d D D T . Q a m n e e e n e e i e 3 5 8 9 - 5 9 1 V o g e l s t e i n , B . , F e a r o n , E . R . , H a m i l t o n , S . R . , K e r n , S . E . , P r e i s i n g e r , A . C . , L e p p e r t , M . , N a k a m u r a , Y . , W h i t e , R . , S m i t s , A . M . M . a n d B o s , J . L . ( 1 9 8 8 ) G e n e t i c a l t e r a t i o n s d u r i n g c o l o r e c t a l - t u m o r d e v e l o p m e n t . N . E n g , J . M e d “ 3 1 9 , 5 2 5 - 5 3 2 . V o r c e , R L . a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 8 9 ) A l t e r e d m e t h y l a t i o n o f r e s o n c o g e n e s i n b e n z i d i n e - i n d u c e d B B C 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s . n g j g e L A p p L fl e r m e e e L , 1 0 0 , 3 9 8 - 4 1 0 . V o r c e , R J . . a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 1 ) H y p o m e t h y l a t i o n o f r e s o n c o g e n e s i n c h e m i c a l l y i n d u c e d a n d s p o n t a n e o u s B 6 C 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s . l . l , l n g 9 e [ , E n l l L O L L t I e a l i h 3 4 3 6 7 - 3 8 4 W a i n f a n , E . a n d P o i r i e r , L A . ( 1 9 9 2 ) M e t h y l g r o u p s i n c a r c i n o g e n e s i s : E f f e c t s o n D N A m e t h y l a t i o n a n d g e n e e x p r e s s i o n . C e m e L B e s “ ( S u p p l . ) 5 2 , 2 0 7 1 s - 2 0 7 7 s . 2 1 5 W i l s o n , M . J . , S h o v a p u r k a r , N . a n d P o i r i e r , L A . ( 1 9 8 4 ) H y p o m e t h y l a t i o n o f h e p a t i c n u c l e a r D N A i n r a t s f e d w i t h a c a r c i n o g e n i c m e t h y l - d e f i c i e n t d i e t . E M M A . 2 1 8 , 9 8 7 - 9 9 0 . Y o k o y a m a , S . , S e l l s , M . A . , R e d d y , T . V . a n d L o m b a r d i , B . ( 1 9 8 5 ) H e p a t o c a r c i n o g e n i c a n d p r o m o t i n g a c t i o n o f a c h o l i n e - d e v o i d d i e t i n t h e r a t . C a m , 4 5 , 2 8 3 4 - 2 8 4 2 . Z a p i s e k , W . F . , C r o n i n , G . M . , L y n - C o o k , B . D . a n d P o i r i e r , L A . ( 1 9 9 2 ) T h e o n s e t o f o n c o g e n e h y p o m e t h y l a t i o n i n t h e l i v e r s o f r a t s f e d m e t h y l - d e f i c i e n t , a m i n o a c i d - d e f i n e d d i e t s . m m , 1 3 , 1 8 6 9 - 1 8 7 2 . D I S C U S S I O N T h e r e i s c o n s i d e r a b l e i n t e r e s t i n t h e r o l e t h a t D N A m e t h y l a t i o n ( 5 - m e t h y l c y t o s i n e ( 5 M e C ) c o n t e n t o f D N A ) p l a y s i n b o t h n o r m a l d e v e l o p m e n t ( R a z i n a n d K a f r i , 1 9 9 4 ) a n d c a r c i n o g e n e s i s ( L a i r d e t a l . , 1 9 9 5 ) . I n d e e d , t h e f i e l d o f D N A m e t h y l a t i o n h a s e x p l o d e d w i t h n e w i n f o r m a t i o n o v e r t h e p a s t 5 - 1 0 y e a r s . I n i t i a l l y , t h e i n f o r m a t i o n o b t a i n e d r e g a r d i n g D N A m e t h y l a t i o n a n d c a n c e r d e m o n s t r a t e d h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A g l o b a l l y b y H P L C a n a l y s i s ( G a m a - S o s a e t a l . , 1 9 8 3 ) a n d p r o g r e s s e d t o e x a m i n e a l t e r a t i o n s i n m e t h y l a t i o n s t a t u s o f a v a r i e t y o f o n c o g e n e s b e l i e v e d t o p l a y a r o l e i n h u m a n a n d / o r a n i m a l n e o p l a s i a ( G o e l z e t a l . , 1 9 8 5 ; V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 8 9 ; V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 9 1 b ; R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) . R e c e n t l y t h i s h a s g r o w n , l a r g e l y t h r o u g h t h e d e v e l o p m e n t o f n e w m o l e c u l a r t e c h n i q u e s , t o p r o v i d e i l l u s t r a t i o n s o f h y p e r m e t h y l a t i o n o f s p e c i f i c r e g i o n s o f t h e g e n o m e ( M a k o s e t a l . , 1 9 9 3 a ; M a k o s e t a l . , 1 9 9 3 b ; H e r m a n e t a l . , 1 9 9 4 ; G o n z a l e z - Z u l u e t a e t a / . , 1 9 9 5 ; H e r m a n e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h i s l e d t o s o m e t e n s i o n c o n c e r n i n g t h e r e l e v a n c e o f g l o b a l a l t e r a t i o n s i n m e t h y l a t i o n s t a t u s a n d e v e n h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A i n g e n e r a l ( e . g . , L a i r d e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h e d e m o n s t r a t i o n t h a t D N A M T a s e k n o c k o u t m i c e d i e d m i d - g e s t a t i o n , c o n c l u s i v e l y d e m o n s t r a t e d t h a t m a i n t e n a n c e m e t h y l a t i o n p r o c e s s e s w e r e e s s e n t i a l t o m a m m a l i a n d e v e l o p m e n t ( L i e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h e r e a r e s t i l l , h o w e v e r , w h a t a t f i r s t g l a n c e m a y s e e m t o b e , c o n f l i c t i n g r e p o r t s c o n c e r n i n g t h e r o l e o f D N A m e t h y l a t i o n i n c a r c i n o g e n e s i s . M y d i s s e r t a t i o n h a s e m p h a s i z e d t h e h y p o t h e s i s t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A f a c i l i t a t e s a b e r r a n t g e n e e x p r e s s i o n i n t u m o r i g e n e s i s . O t h e r s s u p p o r t t h e c o n t e n t i o n t h a t h y p e r m e t h y l a t i o n o f D N A 2 1 6 2 1 7 l e a d s t o t h e c a u s a t i v e a l t e r a t i o n i n t u m o r i g e n e s i s b y i n a c t i v a t i n g t u m o r s u p p r e s s o r g e n e s o r m a r k i n g c h r o m o s o m e r e g i o n s f o r d e l e t i o n ( H e r m a n e t a l . , 1 9 9 4 ) . S t i l l o t h e r s d o w n p l a y t h e i m p o r t a n c e o f a l t e r a t i o n s i n g e n e e x p r e s s i o n a n d f a v o r m u t a t i o n p l a y i n g t h e k e y r o l e ( L a i r d e t a l . , 1 9 9 5 ) . I b e l i e v e t h a t t h e r e i s a c t u a l l y m o r e h a r m o n y t h a n d i s c o r d h e r e a n d t h a t f o c u s i n g a t t e n t i o n s i n g l y o n o n e m e c h a n i s m m a y i m p e d e a n o v e r a l l u n d e r s t a n d i n g o f c a r c i n o g e n e s i s . T h e v i e w t h a t c a r c i n o g e n e s i s i s a m u l t i s t e p / m u l t i s t a g e p r o c e s s t h a t o c c u r s i n a w h o l e a n i m a l ( P i t o t a n d D r a g a n , 1 9 9 1 ) m u s t b e c o n s i d e r e d a l o n g w i t h t h e n o t i o n t h a t c a r c i n o g e n e s i s i s m o r e t h a n m u t a g e n e s i s . W i t h t h i s f r a m e w o r k , i t i s n o t u n e x p e c t e d t h a t D N A m e t h y l a t i o n p l a y s m u l t i p l e r o l e s i n t h e t r a n s f o r m a t i o n o f a n o r m a l c e l l i n t o a f r a n k m a l i g n a n c y . T h u s , a p p a r e n t l y d i s p a r a t e v i e w s a r e r e c o n c i l e d i n a f a s h i o n t h a t p r o v i d e s i n s i g h t r e g a r d i n g m e c h a n i s m s u n d e r l y i n g c a r c i n o g e n e s i s . C h a n g e s i n D N A M e t h y l a t i o n a n d C a n c e r B o t h g e n e r a l h y p o m e t h y l a t i o n a n d a r e a s o f r e g i o n a l h y p e r m e t h y l a t i o n c o - e x i s t i n t h e g e n o m e o f a w i d e v a r i e t y o f h u m a n a n d a n i m a l c a n c e r s ( G a m a - S o s a e t a l . , 1 9 8 3 ; H e r m a n e t a l . , 1 9 9 4 ; C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 ) . T h i s h a s m a d e a t t e m p t s t o d e f i n e a p r e c i s e r o l e f o r D N A m e t h y l a t i o n i n c a r c i n o g e n e s i s v e r y d i f f i c u l t . I n d e e d , d i f f e r e n t e f f e c t s m a y b e e v i d e n t d e p e n d i n g u p o n t h e m o d e l s y s t e m , t a r g e t t i s s u e , o r t a r g e t c e l l . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t c h a n g e s i n m e t h y l a t i o n m a y n o t p l a y a c a u s a l r o l e i n c a r c i n o g e n e s i s a n d c o u l d b e a c o n s e q u e n c e o f t h e t r a n s f o r m e d s t a t e o f t h e t u m o r c e l l w h i l e C t o T t r a n s i t i o n s 2 1 8 b r o u g h t a b o u t b y i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f t h e D N A M T a s e p l a y t h e k e y r o l e ( e . g . , L a i r d a t a l . , 1 9 9 5 ) . W h i l e D N A M T a s e - i n d u c e d m u t a t i o n s c o u l d p l a y a n i m p o r t a n t r o l e , a d d i t i o n a l f a c t o r s a p p e a r t o b e i n v o l v e d i n l i g h t o f t h e m u l t i p l e s t e p s a n d s t a g e s i n t h e c a n c e r p r o c e s s . C a n c e r s o r i g i n a t e f r o m a s i n g l e c e l l t h a t i s c h a n g e d d r a m a t i c a l l y b y a s e r i e s o f a l t e r a t i o n s t o t h e g e n o m e , e . g . , m u t a t i o n a n d c h a n g e s i n m e t h y l a t i o n t h a t a l t e r g e n e e x p r e s s i o n . C l e a r l y , m u t a g e n e s i s p l a y s a r o l e i n c a r c i n o g e n e s i s . H o w e v e r , w i t h t h e e x c e p t i o n o f t u m o r s u p p r e s s o r g e n e s , a m u t a t e d g e n e m u s t b e e x p r e s s e d i n o r d e r t o a f f e c t p h e n o t y p e . T h u s , m e c h a n i s m s u n d e r l y i n g a b e r r a n t g e n e e x p r e s s i o n m u s t b e c o n s i d e r e d . I n t e r e s t i n g l y , t w o r e c e n t p u b l i c a t i o n s i n d i c a t e t h a t e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s e x p e c t e d t o r e s u l t i n m a r k e d h y p o m e t h y l a t i o n c a n i n h i b i t t u m o r i g e n e s i s ( M a c L e o d a n d S z y f , 1 9 9 5 ; L a i r d e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h e f i r s t o f t h e s e i n v o l v e d u s e o f a n a n t i s e n s e R N A t o t h e D N A M T a s e m e s s a g e w h i c h b l o c k s t h e f u n c t i o n o f t h e D N A M T a s e , l e a d i n g t o d e m e t h y l a t i o n o f D N A , a n d t o i n h i b i t i o n o f t u m o r i g e n e s i s i n s y n g e n e i c m i c e ( M a c L e o d a n d S z y f , 1 9 9 5 ) . I n t h e s e c o n d r e p o r t , t h e i n v e s t i g a t o r s f o r c e d a r e d u c t i o n o f D N A M T a s e a c t i v i t y u s i n g M i n m i c e a n d h e t e r o z y g o s i t y o f t h e D N A M T a s e i n c o n j u n c t i o n w i t h a d m i n i s t r a t i o n o f 5 - a z a c y t i d i n e ( L a i r d e t a l . , 1 9 9 5 ) . M i n m i c e c a r r y a g e r m l i n e p o i n t m u t a t i o n i n t h e A p c t u m o r s u p p r e s s o r g e n e a n d a r e g e n e t i c a l l y p r e d i s p o s e d t o t h e d e v e l o p m e n t o f i n t e s t i n a l n e o p l a s i a a t a y o u n g a g e ( L a i r d e r a l . , 1 9 9 5 ) . D N A M T a s e r e d u c t i o n w a s a c h i e v e d b y u t i l i z i n g t h e h e t e r o z y g o t e s f r o m t h e i r e a r l i e r s t u d i e s w i t h D N A M T a s e k n o c k o u t s , y o u m a y r e c a l l t h e k n o c k o u t m i c e d i e m i d - 2 1 9 g e s t a t i o n ( L i e t a l . , 1 9 9 2 ) . C o n d i t i o n s l e a d i n g t o m a r k e d h y p o m e t h y l a t i o n i n h i b i t e d t h e i n t e s t i n a l n e o p l a s i a i n t h e M i n m i c e ( L a i r d e t a l . , 1 9 9 5 ) . S i n c e D N A m e t h y l a t i o n p l a y s a p i v o t a l r o l e i n d e v e l o p m e n t , i m p r i n t i n g , a n d d i f f e r e n t i a t i o n ( L i e t a l . , 1 9 9 2 ; L i e t a l . , 1 9 9 3 ; R a z i n a n d K a f r i , 1 9 9 4 ) i t i s r e a s o n a b l e t o p r o p o s e t h a t h y p o m e t h y l a t i o n a t a n i n t e r m e d i a t e l e v e l p l a y s a c r i t i c a l r o l e i n c a r c i n o g e n e s i s w h i l e e x c e s s i v e h y p o m e t h y l a t i o n m a y n o t b e c o m p a t i b l e w i t h t h e l i f e o f t h e a f f e c t e d c e l l s ( e . g . , d u e t o e x c e p t i o n a l d e r e g u l a t i o n o f g e n e e x p r e s s i o n ) . B y t h i s I m e a n t h e i n i t i a t e d c e l l s m a y d i e u n d e r t h e s e v e r e c o n d i t i o n s o f h y p o m e t h y l a t i o n a n d a r e n o t a v a i l a b l e t o f o r m t u m o r s . T h u s , t h e f a c t t h a t i n h i b i t i o n o f m e t h y l a t i o n m a y d e c r e a s e t u m o r f o r m a t i o n d o e s n o t p r o v e t h a t e x c e s s D N A M T a s e a c t i v i t y i s t h e s o l e m e c h a n i s m u n d e r l y i n g c a r c i n o g e n e s i s . R o l e s f o r A l t e r a t i o n s I n D N A M e t h y l a t i o n i n C a r c i n o g e n e s i s T h e w e l l e s t a b l i s h e d r o l e f o r m u t a g e n s a n d m u t a g e n e s i s i n c a r c i n o g e n e s i s m u s t b e r e c o n c i l e d w i t h t h e f a c t t h a t n o t a l l c a r c i n o g e n s a r e m u t a g e n s a n d t h e v i e w t h a t n o n m u t a g e n i c e v e n t s a r e a l s o i n v o l v e d i n t r a n s f o r m a t i o n . T h i s i s i l l u s t r a t e d b y a r e c e n t s t u d y e x a m i n i n g a m i s m a t c h r e p a i r d e f i c i e n c y t h a t h a s b e e n i d e n t i f i e d i n p h e n o t y p i c a l l y n o r m a l h u m a n c e l l s a n d t h e p e o p l e w h o d o n a t e d t h e s e c e l l s h a d n u m e r o u s m u t a t i o n s i n a v a r i e t y o f t i s s u e s b u t , c o n t r a r y t o w h a t w o u l d b e e x p e c t e d i f m u l t i p l e m u t a t i o n s w e r e s o l e l y r e s p o n s i b l e f o r c a r c i n o g e n e s i s , t h e y e x h i b i t e d v e r y f e w t u m o r s ( P a r s o n s e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h e r e a r e m e c h a n i s t i c a l l y a n d t h e o r e t i c a l l y p l a u s i b l e n o n g e n o t o x i c 2 2 0 m e c h a n i s m s t h a t s u p p o r t r o l e s f o r b o t h h y p o m e t h y l a t i o n a n d h y p e r m e t h y l a t i o n o f D N A ( i . e . , e p i g e n e t i c c h a n g e s ) i n c a r c i n o g e n e s i s ; t h e s e i n v o l v e m a i n l y a l t e r a t i o n s i n n o r m a l g e n e e x p r e s s i o n ( i n c l u d i n g t u m o r s u p p r e s s o r g e n e s ) . A l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n n o t o n l y a f f e c t s e x p r e s s i o n , b u t a l s o m a y f a c i l i t a t e m u t a t i o n a s 5 M e C c a n d e a m i n a t e s p o n t a n e o u s l y t o T . T h i s m e a n s e l e v a t e d e x p r e s s i o n o f t h e D N A M T a s e m a y l e a d t o i n c r e a s e d 5 M e C a n d t h i s c a n i n c r e a s e t h e p r o b a b i l i t y o f C t o T t r a n s i t i o n s ( L a i r d e t a l . , 1 9 9 5 ; Y a n g e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h u s , a l t e r a t i o n s i n D N A m e t h y l a t i o n a r e l i k e l y t o p l a y a v a r i e t y o f r o l e s i n c a r c i n o g e n e s i s ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 a ) . H m n e j h l l e i i e n H y p o m e t h y l a t i o n o f D N A i s a s s o c i a t e d w i t h i n c r e a s e d g e n e e x p r e s s i o n ( R a z i n a n d K a f r i , 1 9 9 4 ; F e r g u s o n e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h i s c a n p l a y a r o l e i n c a r c i n o g e n e s i s . F o r e x a m p l e , i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f m u t a t e d H a - r a s a p p e a r s t o b e i n v o l v e d i n t r a n s f o r m a t i o n ( F i n n e y a n d B i s h o p , 1 9 9 3 ) . H o w e v e r , m u t a t i o n i s n o t r e q u i r e d t o b e a d i r e c t r e s u l t o f a g e n o t o x i c c o m p o u n d a s s u b p o p u l a t i o n s o f h e p a t o c y t e s e x i s t t h a t b e a r s p o n t a n e o u s c r i t i c a l m u t a t i o n s a t c o d o n s 1 2 ( C h a e t a l . , 1 9 9 4 ) a n d 6 1 o f H a - r a s ( M o u l d s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 ) . T h e s e c e l l s m a y b e p r o m o t e d a n d e x p a n d c l o n a l l y . T h u s , i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f a n o n c o g e n e b e a r i n g a p o i n t m u t a t i o n t h a t o c c u r s s p o n t a n e o u s l y m a y b e i n d i c a t i v e o f a c a r c i n o g e n a c t i n g b y a n o n g e n o t o x i c m e c h a n i s m ( C h a e t a l . , 1 9 9 4 ) . A d d i t i o n a l l y , a d e c r e a s e d c a p a c i t y a n d / o r f i d e l i t y o f m a i n t a i n i n g t h e n o r m a l m e t h y l a t i o n s t a t u s o f D N A m a y u n d e r l i e t h e h e i g h t e n e d s e n s i t i v i t y o f s o m e m o u s e s t r a i n s t o l i v e r t u m o r i g e n e s i s w h e r e i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f o n c o g e n e s 2 2 1 a p p e a r s t o b e i n v o l v e d b y f a c i l i t a t i n g t u m o r p r o m o t i o n ( R a y e t a l . , 1 9 9 4 ; C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 ; 1 9 9 5 c ) . T h e p r i n c i p a l c h a r a c t e r i s t i c o f t h e p r o m o t i o n s t a g e o f c a r c i n o g e n e s i s t h a t d i s t i n g u i s h e s i t f r o m t h e s t a g e s o f i n i t i a t i o n a n d p r o g r e s s i o n i s i t s o p e r a t i o n a l r e v e r s i b i l i t y ( r e f e r e n c e d i n P i t o t a n d D r a g a n , 1 9 9 5 ) . T h a t i s , m a n y e n z y m e a l t e r e d f o c i o f t h e l i v e r r e g r e s s w h e n t h e p r o m o t i n g a g e n t i s w i t h d r a w n . P r o m o t i o n e n d s w h e n a l e s i o n a t t a i n s t h e c a p a c i t y f o r g r o w t h i n t h e a b s e n c e o f a p r o m o t i o n s t i m u l u s ( i . e . , a c q u i s i t i o n o f a u t o n o m o u s g r o w t h ; i t i s n o l o n g e r r e v e r s i b l e ) a n d c a n p r o g r e s s t o a f r a n k m a l i g n a n c y ( P i t o t a n d D r a g a n , 1 9 9 1 ) . T h e p r e s e n c e o f a m e c h a n i s m f o r d e n o v o m e t h y l a t i o n ( R a z i n a n d K a f r i , 1 9 9 4 ) p r o v i d e s t h e p o t e n t i a l t o r e v e r s e h y p o m e t h y l a t i o n , t h u s i t s p r o p o s e d r o l e i n t u m o r p r o m o t i o n t h a t w e a n d o t h e r s s u p p o r t i s c o n s i s t e n t w i t h t h e b i o l o g i c a l o b s e r v a t i o n t h a t r e v e r s i b i l i t y i s a h a l l m a r k o f t h i s s t a g e o f c a r c i n o g e n e s i s a n d c o m p a t i b l e w i t h t h e w h o l e a n i m a l s i t u a t i o n . I n t h i s r e g a r d , h y p o m e t h y l a t i o n m a y b e o n e o f t h e c r u c i a l f a c t o r s t h a t f a c i l i t a t e s c l o n a l e x p a n s i o n o f t h e p r o g e n i t o r c e l l s t h a t l e a d t o t u m o r s . H y p o m e t h y l a t i o n o f a p a r t i c u l a r s i t e i n t h e r e f g e n e h a s b e e n d e m o n s t r a t e d d u r i n g e a r l y s t a g e s o f P B - i n d u c e d m o u s e l i v e r t u m o r i g e n e s i s t h a t i s m a i n t a i n e d i n i t s u n m e t h y l a t e d s t a t e i n t h e P B - i n d u c e d t u m o r s ; t h u s , i t a p p e a r s c e l l s f r o m t h e p o p u l a t i o n t h a t i n i t i a l l y e x h i b i t e d h y p o m e t h y l a t i o n h a v e a d v a n c e d t o y i e l d t h e t u m o r s t h a t f o r m e d ( R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) . 1 1 1 m m H y p e r r n e t h y l a t i o n o f s p e c i f i c r e g i o n s o f D N A h a s a l s o b e e n i d e n t i f i e d i n c a n c e r c e l l s . F o r e x a m p l e , t h e V H L t u m o r s u p p r e s s o r g e n e i s h y p e r m e t h y l a t e d a l . , 1 9 9 5 ) . T h e p o t e n t i a l e x i s t s , t h e r e f o r e , f o r c y t o s i n e d e a m i n a t i n g t o u r a c i l 2 2 2 a n d i n a c t i v a t e d i n a f r a c t i o n o f r e n a l c e l l l i n e s a n d t u m o r s t h a t d o n o t h a v e m u t a t i o n s i n t h e c o d i n g r e g i o n s s e q u e n c e d ( H e r m a n e t a l . , 1 9 9 4 ) . O t h e r i n v e s t i g a t o r s h a v e d e m o n s t r a t e d a s s o c i a t i o n s i n t u m o r s b e t w e e n r e g i o n a l c h r o m o s o m a l h y p e r m e t h y l a t i o n a n d a r e a s b e l i e v e d t o c o n t a i n t u m o r s u p p r e s s o r g e n e s a t a v a r i e t y o f t a r g e t s i t e s ( M a k o s e t a l . , 1 9 9 3 a ; M a k o s e t a l . , 1 9 9 3 b ; H e r m a n e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h i s r e g i o n a l h y p e r m e t h y l a t i o n i n p o r t i o n s o f t h e g e n o m e n o r m a l l y u n m e t h y l a t e d m a y i n a c t i v a t e t u m o r s u p p r e s s o r g e n e s . T h e f u n c t i o n a l s i g n i f i c a n c e o f t h i s w o u l d b e t h e s a m e a s l o s s o f a n a l l e l e o r a n i n a c t i v a t i n g m u t a t i o n . I n s u p p o r t o f t h i s , r e g i o n a l h y p e r m e t h y l a t i o n o f t h e r e t i n o b l a s t o m a g e n e a p p e a r s t o i n h i b i t t r a n s c r i p t i o n o f t h i s t u m o r s u p p r e s s o r g e n e ( G r e g e r e t a l . , 1 9 9 4 ) . I t w i l l b e i m p o r t a n t t o d e t e r m i n e n o t o n l y w h a t t u m o r s u p p r e s s o r g e n e s l i e i n s p e c i f i c r e g i o n s a n d t h e i r n o r m a l f u n c t i o n s , b u t a l s o t o d e m o n s t r a t e a c a u s a t i v e r o l e , p e r h a p s b y r e v e r s i n g t h e i r i n a c t i v a t i o n . M 1 1 9 1 1 A n o t h e r p o t e n t i a l m e c h a n i s m u n d e r l y i n g a r o l e o f a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n a n d c a r c i n o g e n e s i s i s t h e i n t r i n s i c h y p e n n u t a b i l i t y o f 5 M e C a s c o m p a r e d t o C v i a d e a m i n a t i o n ; t h i s l e a d s t o C t o T t r a n s i t i o n s ( r e f e r e n c e d i n Y a n g e t a l . , 1 9 9 5 ) . F u r t h e r , i n t h e p r e s e n c e o f l o w l e v e l s o f S A M , D N A M T a s e m a y b e a b l e t o c a t a l y z e t h e d e a m i n a t i o n o f D N A - c y t o s i n e t o f o r m u r a c i l , l e a d i n g t o C t o T t r a n s i t i o n s ( Y a n g e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h u s , t h e h i g h r a t e o f m u t a t i o n a t C p G d i n u c l e o t i d e s m a y b e d u e , i n p a r t , t o D N A M T a s e - m e d i a t e d d e a m i n a t i o n ( L a i r d e t a l . , 1 9 9 5 ; Y a n g e t a l . , 1 9 9 5 ) a n d i n h i b i t i o n o f D N A m i s m a t c h r e p a i r ( Y a n g e t 2 2 3 l e a d i n g t o C : G t o T : A p o i n t m u t a t i o n s a n d f o r 5 M e C d e a m i n a t i n g t o t h y m i n e , a l s o l e a d i n g t o C : G t o T : A p o i n t m u t a t i o n s . A r e c e n t s t u d y c o m p a r e d t h e e f f i c i e n c i e s o f U G a n d T G m i s m a t c h e x c i s i o n a n d d e m o n s t r a t e d t h a t t h e U G m i s m a t c h ( i . e . , t h a t w o u l d r e s u l t f r o m c y t o s i n e d e a m i n a t i o n ) w a s e x c i s e d m o r e e f f i c i e n t l y ( S c h m u t t e e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h i s i n d i c a t e s t h a t h y p e r m e t h y l a t i o n ( i . e . , 5 M e C c o n t e n t ) m a y p l a y t h e p r i m a r y r o l e r e g a r d i n g m u t a t i o n a t t h e s e s i t e s r a t h e r t h a n i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f t h e D N A M T a s e f a c i l i t a t i n g d e a m i n a t i o n o f D N A - c y t o s i n e . A d d i t i o n a l l y , 5 M e C m a y i n f l u e n c e c a r c i n o g e n e s i s v i a i n h i b i t i o n o f D N A r e p a i r l e a d i n g t o t h e f i x a t i o n o f a p r o m u t a g e n i c l e s i o n ( r e f e r e n c e d i n C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 ; 1 9 9 5 0 ) . H o w e v e r , t h e h i g h p e r c e n t a g e o f m u t a t i o n s a t C p G s i t e s c a n n o t b e e x p l a i n e d s o l e l y o n t h e p r e s e n c e o f 5 M e C , a s t h e m e t h y l a t i o n p a t t e r n o f t h e p 5 3 g e n e i s t i s s u e - i n d e p e n d e n t s u g g e s t i n g t h a t t i s s u e - s p e c i f i c m e t h y l a t i o n d o e s n o t c o n t r i b u t e t o t h e d i f f e r e n t i a l m u t a t i o n p a t t e r n s a t C p G s i t e s s e e n i n t u m o r s ( T o m a l e t t i a n d P f e i f e r , 1 9 9 5 ) . T h i s o b s e r v a t i o n s u p p o r t s t h e c o n t e n t i o n t h a t t h e o v e r a l l e f f e c t o f D N A m e t h y l a t i o n a l t e r a t i o n s m a y v a r y i n d i f f e r e n t t i s s u e s a n d i n t h e g e n e s i s o f d i f f e r e n t t u m o r t y p e s . T h e c o m p l e x n a t u r e o f t h e r o l e o f m e t h y l a t i o n i n r e g u l a t i o n o f g e n e e x p r e s s i o n i s i l l u s t r a t e d b y t h e m o u s e M 6 P - l G F 2 r g e n e . I n o r d e r f o r e x p r e s s i o n t o o c c u r b o t h h y p o m e t h y l a t i o n o f t h e 5 ’ f l a n k i n g r e g i o n a n d m e t h y l a t i o n o f a s p e c i f i c C p G s i t e i n a n i n t r o n a r e r e q u i r e d . T h e l a t t e r a p p e a r s t o b e a n i m p r i n t i n g s i g n a l a n d h y p o m e t h y l a t i o n a t t h i s s i t e m a y s i l e n c e t h e g e n e e v e n i f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n r e m a i n s h y p o m e t h y l a t e d ( S t o g e r e t a l . , 1 9 9 3 ) . 2 2 4 C o n c l u s i o n s T h i s d i s c u s s i o n o f w h a t a t f i r s t g l a n c e m i g h t a p p e a r t o b e c o n f l i c t i n g r o l e s f o r D N A m e t h y l a t i o n i n c a r c i n o g e n e s i s a c t u a l l y e n h a n c e s o u r u n d e r s t a n d i n g o f t h e p r o c e s s . C a r c i n o g e n e s i s i s m o r e t h a n m u t a g e n e s i s ( T r o s k o e t a l . , 1 9 8 8 ) ! F u r t h e r , t h e t r a d i t i o n a l v i e w t h a t t h e k e y m u t a t i o n s i n c a n c e r s s t e m f r o m c a r c i n o g e n - D N A a d d u c t s i s n o t l i k e l y t o b e c o r r e c t i n t h a t d e a m i n a t i o n o f c y t o s i n e t o u r a c i l a n d 5 M e C t o t h y m i n e a r e a l s o i m p o r t a n t s o u r c e s o f c r i t i c a l p o i n t m u t a t i o n s . F u r t h e r , d e a m i n a t i o n o f 5 M e C c r e a t e s a T 6 m i s m a t c h t h a t i s n o t v e r y e f f i c i e n t l y e x c i s e d f r o m D N A ( S c h m u t t e e t a l . , 1 9 9 5 ) . I n a d d i t i o n , t h i s v i e w i s l i m i t i n g a s t h e p r e s e n c e o f a p r o m o t e r ( e n d o g e n o u s o r e x o g e n o u s ) i s r e q u i r e d t o s t i m u l a t e c l o n a l e x p a n s i o n . T h e p r o p o s a l b y P i t o t a n d D r a g a n t h a t e a c h p r o m o t e r m a y b e c a p a b l e o f s t i m u l a t i n g t h e c l o n a l e x p a n s i o n o n l y o f t h o s e c e l l s b e a r i n g a p a r t i c u l a r c o l l e c t i o n o f m u t a t i o n s d e m o n s t r a t e s j u s t h o w c o m p l i c a t e d t h e a c t u a l s i t u a t i o n d u r i n g t u m o r i g e n e s i s i s l i k e l y t o b e ( r e f e r e n c e d i n P i t o t a n d D r a g a n , 1 9 9 5 ) . M u t a t i o n , a l t e r e d g e n e e x p r e s s i o n , h y p o m e t h y l a t i o n , a n d h y p e r m e t h y l a t i o n m a y a l l p l a y r o l e s i n c a r c i n o g e n e s i s ( T a b l e 1 ) ; t h e y a r e n o t m u t u a l l y e x c l u s i v e . I d o n o t a n t i c i p a t e a s i m p l e o n e - t o - o n e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n D N A m e t h y l a t i o n a n d c a n c e r , m u t a t i o n a n d c a n c e r , o r c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d c a n c e r , n o r a r e a l l t i s s u e s a n t i c i p a t e d t o h a v e i d e n t i c a l m e c h a n i s m s o p e r a t i v e . I n s o m e s i t u a t i o n s h y p o m e t h y l a t i o n m a y b e m o s t i m p o r t a n t , i n o t h e r s h y p e r m e t h y l a t i o n , a n d i n o t h e r s m u t a t i o n . T h e e x a m i n a t i o n o f D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s p r o v i d e s t h e p o t e n t i a l t o d i s c o v e r a l t e r a t i o n s i n g e n e e x p r e s s i o n , c e l l p r o l i f e r a t i o n , m u t a t i o n , c h r o m a t i n a b e r r a t i o n s , a n d i n a c t i v a t i o n 2 2 5 T a b l e 1 : D N A M e t h y l a t i o n M a y P l a y a V a r i e t y o f R o l e s i n C a r c i n o g e n e s i s M U T A T I O N E P I G E N E T I C H Y P E R M E T H Y L A T I O N H Y P O M E T H Y L A T I O N C - > T 1 G e n e e x p r e s s i o n M a r k c h r o m o s o m e s f o r d e l e t i o n 6 I m p r i n t i n g i E X P R E S S I O N O F D N A H Y P E R M E T H Y L A T I O N M T a s e 6 T u m o r s u p p r e s s o r g e n e C _ > T e x p r e s s i o n f r o m C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 a o r d e l e t i o n o f t u m o r s u p p r e s s o r g e n e s i n o n e m u l t i f a c e t e d a p p r o a c h t h a t f i t s w i t h t h e m u l t i s t e p p r o c e s s o f c a r c i n o g e n e s i s . I n s u p p o r t o f t h i s n o t i o n i s t h e d e p i c t i o n o f h u m a n c o l o n c a r c i n o g e n e s i s w h e r e r o l e s f o r h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A , m u t a t i o n , a n d t u m o r s u p p r e s s o r g e n e i n a c t i v a t i o n a r e c o n s i d e r e d t o b e r e l e v a n t t o t h e u l t i m a t e t u m o r f o r m a t i o n ( V o g e l s t e i n e t a l . , 1 9 8 8 ; M a r x , 1 9 9 1 ) . I t i s i m p o r t a n t t h a t a m i n i m a l i s t i c a p p r o a c h i s n o t t a k e n i n d e f i n i n g t h e r o l e o f D N A m e t h y l a t i o n i n c a r c i n o g e n e s i s a s t h i s r u n s c o u n t e r t o t h e e s t a b l i s h e d v i e w o f t h e t r a n s f o r m a t i o n o f a n o r m a l c e l l i n t o a f r a n k m a l i g n a n c y a s b e i n g a m u l t i s t e p / m u l t i s t a g e p r o c e s s . I n d e e d , o n e s h o u l d a s s u m e t h a t m u l t i p l e m e c h a n i s m s u n d e r l i e c a r c i n o g e n e s i s a n d m u s t c o n s i d e r t h a t a c a r c i n o g e n m a y a c t b y m o r e t h a n o n e m e c h a n i s m . M o s t i m p o r t a n t l y , i n v e s t i g a t i o n s i n t o t h e r o l e o f D N A m e t h y l a t i o n i n c a r c i n o g e n e s i s s e r v e a s a f o c a l p o i n t f o r e n h a n c i n g o u r u n d e r s t a n d i n g o f t h e i n t e r p l a y b e t w e e n g e n e t i c a n d e p i g e n e t i c f a c t o r s u n d e r l y i n g t h i s d i s e a s e 2 2 6 p r o c e s s . T h e r e i s a n e e d t o a d d r e s s 1 ) t h e f u n c t i o n a l s i g n i f i c a n c e o f s p e c i f i c c h a n g e s i n m e t h y l a t i o n , 9 . 9 . , h o w i s t h e b i n d i n g o f t r a n s - a c t i n g f a c t o r s t o s p e c i fi c g e n e s a f f e c t e d b y m e t h y l a t i o n ; 2 ) t h e f u n c t i o n a l s i g n i f i c a n c e o f D N A M T a s e - f a c i l i t a t e d m u t a t i o n s i n s p e c i f i c g e n e s ; a n d 3 ) c h a n g e s i n m e t h y l a t i o n t h a t o c c u r i n t a r g e t t i s s u e p r i o r t o t h e a p p e a r a n c e o f f r a n k m a l i g n a n c i e s a n d a s k h o w t h e s e m a y b e r e f l e c t e d i n t h e t u m o r c e l l s . T h e o v e r a l l g o a l s h o u l d b e a n u n d e r s t a n d i n g o f c h a n g e s i n m e t h y l a t i o n a n d h o w t h e y f a c i l i t a t e m o v e m e n t o f c e l l s t h r o u g h t h e d i f f e r e n t s t a g e s o f c a r c i n o g e n e s i s . T h i s c a n b e a c c o m p l i s h e d b y k e e p i n g i n p e r s p e c t i v e t h e f a c t t h a t c a n c e r i s a d i s e a s e o f t h e w h o l e a n i m a l a n d t h u s , t h e r e i s a n e e d t o f o c u s , t h o u g h n o t e x c l u s i v e l y , o n i n v i v o s t u d i e s . A v a r i e t y o f i n v i v o m o d e l s y s t e m s a r e b e i n g e m p l o y e d p r o d u c t i v e l y i n r e s e a r c h i n g t h e r o l e o f m e t h y l a t i o n i n c a r c i n o g e n e s i s . T h e s e i n c l u d e s t u d i e s i n v o l v i n g m e t h y l d e f i c i e n t d i e t s ( r e f e r e n c e d i n C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 ; 1 9 9 5 0 ) , D N A M T a s e - m u t a n t s ( L i e t a l . , 1 9 9 2 ; L i e t a l . , 1 9 9 3 ; L a i r d e f a l . , 1 9 9 5 ) , a n d a n i m a l s t h a t e x h i b i t a g e n e t i c s u s c e p t i b i l i t y t o w a r d s t u m o r d e v e l o p m e n t ( r e f e r e n c e d i n C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 ; 1 9 9 5 0 ; L a i r d e t a l . , 1 9 9 5 ) . A k e y i s s u e c e n t e r s a r o u n d d i s c e r n i n g c h a n g e s i n m e t h y l a t i o n t h a t a r e c a u s a t i v e i n t h e c a n c e r p r o c e s s a n d d i s t i n g u i s h i n g t h e s e f r o m c h a n g e s t h a t m a y s i m p l y b e c o r r e l a t i v e . I t a p p e a r s t h a t p r o g r e s s i n t h i s a r e a w o u l d b e e n h a n c e d m a r k e d l y i f i n d i v i d u a l r e s e a r c h e r s c o u l d b r i n g t h e i r e x p e r t i s e t o b e a r o n m u l t i p l e a s p e c t s o f D N A m e t h y l a t i o n a n d c a r c i n o g e n e s i s u s i n g o r g a n s o b t a i n e d f r o m a c o m m o n p o o l o f e x p e r i m e n t a l a n i m a l s a n d i n t h i s w a y t o e x a m i n e h y p o m e t h y l a t i o n , h y p e r m e t h y l a t i o n , a n d m u t a t i o n i n t h e s a m e a n i m a l s a t d i f f e r e n t t i s s u e s i t e s . 2 2 7 A n o t h e r a s p e c t c o n c e r n i n g D N A m e t h y l a t i o n t h a t i s w o r t h y o f a d d i t i o n a l r e s e a r c h i s c h e m o p r e v e n t i o n ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 c ) . M e t h y l d e f i c i e n t d i e t s l e a d t o l i v e r t u m o r s i n r o d e n t s ( M i k o l e t a l . , 1 9 8 3 ; N e w b e m e e t a l . , 1 9 8 2 ) . A d d i t i o n a l l y , e x c e s s m e t h y l d o n o r s , i n t h e f o r m o f S A M ( P a s c a l e e t a l . , 1 9 9 2 ) o r c h o l i n e a n d m e t h i o n i n e ( N e w b e m e e t a l . , 1 9 9 0 ) p r e v e n t l i v e r t u m o r f o r m a t i o n i n r o d e n t s . T h i s , c o u p l e d w i t h t h e k n o w l e d g e t h a t a v a r i e t y o f h u m a n t u m o r s e x h i b i t h y p o m e t h y l a t e d D N A ( G o e l z e t a l . , 1 9 8 5 ; G a m a - S o s a e t a l . , 1 9 8 3 , K i m e t a l . , 1 9 9 4 ) , i n d i c a t e s t h e p o t e n t i a l f o r c h e m o p r e v e n t i o n b y e x c e s s m e t h y l d o n o r s i n h u m a n s ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 0 ) . A s e c o n d i m p o r t a n t a r e a t h a t m y d i s s e r t a t i o n m a y h a v e i m p a c t u p o n i s t h e a r e a o f r i s k a s s e s s m e n t , s p e c i f i c a l l y t h e i m p o r t a n c e o f d o s e s e t t i n g i n t h e c a r c i n o g e n b i o a s s a y , a n d t h e i n f o r m a t i o n D N A m e t h y l a t i o n m a y p r o v i d e i n e s t a b l i s h i n g t h e d o s e u s e d . R e s e a r c h o n h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A a s a n e p i g e n e t i c , t h r e s h o l d e x h i b i t i n g m e c h a n i s m u n d e r l y i n g a b e r r a n t g e n e e x p r e s s i o n i n t u m o r p r o m o t i o n c a n e n h a n c e o u r u n d e r s t a n d i n g o f c a r c i n o g e n e s i s . F u r t h e r , i t i s r e l a t e d d i r e c t l y t o t h e p r a c t i c a l g o a l s o f a p p r o p r i a t e d o s e s e l e c t i o n , u n d e r s t a n d i n g d o s e - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p s , a n d s p e c i e s - t o - s p e c i e s e x t r a p o l a t i o n i s s u e s . C u r r e n t l y , t h e c a r c i n o g e n b i o a s s a y i s c o n d u c t e d u s i n g t h e m a x i m u m t o l e r a t e d d o s e ( M T D ) o f a c o m p o u n d a n d a f r a c t i o n o f t h e M T D ( c o m m o n l y 1 / 2 M T D ) . T h i s s t r a t e g y i g n o r e s t h e f a c t t h a t e f f e c t s e x h i b i t e d a t h i g h d o s e s w o u l d n o t n e c e s s a r i l y b e e x p e c t e d t o o c c u r a t l o w e r d o s e s ( i . e . , d o s e s h u m a n s a r e m o r e l i k e l y t o b e e x p o s e d ) , e s p e c i a l l y c h e m i c a l s t h a t a c t t h r o u g h n o n - g e n o t o x i c m e c h a n i s m s ( M c C l a i n , 1 9 9 4 ) . T h e r e h a v e b e e n s e v e r a l 2 2 8 e x a m p l e s r e c e n t l y o f c o m p o u n d s t h a t h a v e b e e n l a b e l e d a s p r o b a b l e c a r c i n o g e n s w h e r e i t w a s d e m o n s t r a t e d t h a t t h e c a r c i n o g e n i c e f f e c t w a s d u e s e c o n d a r i l y t o c y t o t o x i c i t y o b s e r v e d a t t h e h i g h d o s e , f o r e x a m p l e , s a c c h a r i n a n d a - 2 u - g l o b u l i n ( C o h e n a n d E l l w e i n , 1 9 9 2 ) . R a t h e r t h a n c a r r y i n g o u t t h e b i o a s s a y u s i n g t h e M T D , w e h a v e s u g g e s t e d u s i n g a m i n i m a l l y t o x i c d o s e ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 b ) . T h i s m i n i m a l l y t o x i c d o s e w o u l d i n c o r p o r a t e i n f o r m a t i o n a b o u t t o x i c o k i n e t i c s a n d p h a r m a c o k i n e t i c s a n d b e g i n t o p r o v i d e a n u n d e r s t a n d i n g o f m e c h a n i s m o f a c t i o n . A m i n i m a l l y t o x i c d o s e m a y b e c o n s i d e r e d t o b e a d o s e t h a t d o e s n o t l e a d t o g l o b a l a l t e r a t i o n s i n D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s . T h e i n f o r m a t i o n p r o v i d e d w i t h i n m y d i s s e r t a t i o n h a s p r o v i d e d r a t h e r c o n v i n c i n g e v i d e n c e t h a t t h e B G C 3 F 1 m o u s e h a s a d e c r e a s e d c a p a c i t y f o r a n d / o r f i d e l i t y o f m a i n t a i n i n g n a s c e n t m e t h y l a t i o n s t a t u s a n d t h a t t h i s m a y b e d u e t o d e m e t h y l a t i o n o f D N A n o t l i n k e d t o D N A r e p l i c a t i o n . S U M M A R Y A N D C O N C L U S I O N S S y n o p s i s o f S i g n i f i c a n t F i n d i n g s T h e r e h a v e b e e n s e v e r a l m a j o r f i n d i n g s o f t h i s d i s s e r t a t i o n r e l a t i n g t o t h e h e i g h t e n e d s e n s i t i v i t y o f t h e 8 6 C 3 F 1 m o u s e t o l i v e r t u m o r i g e n e s i s . S p e c i f i c a l l y , I h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t h e i g h t e n e d c e l l p r o l i f e r a t i o n c a n n o t e x p l a i n t h e h i g h s p o n t a n e o u s - o r p r o m o t e r - i n d u c e d l i v e r t u m o r i n c i d e n c e o f t h e B 6 C 3 F 1 . I n a d d i t i o n , t h e a b i l i t y o f t h e r e l a t i v e l y l i v e r t u m o r r e s i s t a n t C S 7 B U 6 t o e x h i b i t g l o b a l h y p o m e t h y l a t i o n i n r e s p o n s e t o C M D d i e t a d m i n i s t r a t i o n 2 2 9 ( a l t h o u g h a t s o m e t i m e p o i n t s a t a r e d u c e d l e v e l a s c o m p a r e d t o t h e 8 6 C 3 F 1 ) i l l u s t r a t e s t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A m a y b e a g e n e r a l , n o n g e n o t o x i c e p i g e n e t i c m e c h a n i s m i n v o l v e d i n t u m o r p r o m o t i o n a s o p p o s e d t o b e i n g a u n i q u e c h a r a c t e r i s t i c o f t h e B 6 C 3 F 1 m o u s e . F u r t h e r , t h i s d e m o n s t r a t e s t h a t t h e C 5 7 B U 6 i s q u a n t i t a t i v e l y d i f f e r e n t f r o m t h e B 6 C 3 F 1 i n t h i s r e g a r d , n o t q u a l i t a t i v e l y d i f f e r e n t . I h a v e a l s o d e m o n s t r a t e d t h a t l o w - d o s e ( 0 . 0 5 % ) P B - i n d u c e d B 6 C 3 F 1 l i v e r t u m o r s e x h i b i t i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f H a - r a s , w h i l e p r e v i o u s w o r k i n o u r l a b o r a t o r y i n d i c a t e d t h a t h i g h - d o s e ( 0 . 1 0 % ) P B - i n d u c e d B 6 C 3 F 1 l i v e r t u m o r s e x h i b i t e d i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f H a - r a s a n d r e f . T h u s , m y s t u d i e s p r o v i d e s u p p o r t f o r t h e n o t i o n t h a t n o n g e n o t o x i c c o m p o u n d s m a y e x e r t d i f f e r e n t e f f e c t s a t h i g h v e r s u s l o w d o s e s . I n a d d i t i o n t o e x p a n d i n g u p o n , a n d c l a r i f y i n g , s o m e r o l e s f o r D N A m e t h y l a t i o n r e g a r d i n g t h e s e n s i t i v i t y o f t h e B 6 C 3 F 1 m o u s e t o l i v e r t u m o r i g e n e s i s , m y s t u d i e s s u p p o r t t h e c o m p l i c a t e d r o l e t h a t a l t e r a t i o n s i n D N A m e t h y l a t i o n a p p e a r t o p l a y r e g a r d i n g t u m o r i g e n e s i s a s o u t l i n e d b e l o w . I n t h e f o l l o w i n g o u t l i n e , t h e s p e c i f i c a i m s o f t h i s d i s s e r t a t i o n a r e l i s t e d . I m m e d i a t e l y f o l l o w i n g e a c h s p e c i f i c a i m ( i n d e n t e d a n d i n b o l d ) t h e k e y f i n d i n g s p e r t a i n i n g t o t h a t a i m a r e p r e s e n t e d . W e l . S p e e i t h A j m J ; T o e x a m i n e t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f p o r t i o n s o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s i n m o u s e s t r a i n s w i t h d i f f e r i n g s e n s i t i v i t i e s t o s p o n t a n e o u s - a n d c h e m i c a l - i n d u c e d l i v e r t u m o r f o r m a t i o n ( i . e . , r e l a t i v e l y s e n s i t i v e B 6 C 3 F 1 a n d r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B U 6 ) . 2 3 0 « - 5 M e C i s p r e s e n t i n t h e 5 ’ f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s . . D i f f e r e n c e s w e r e n o t o b s e r v e d i n n a s c e n t m e t h y l a t i o n s t a t u s b e t w e e n t h e B 6 C 3 F 1 a n d C S 7 B L I 6 m i c e i n t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s a s a s s e s s e d b y P C R a n a l y s i s o f t w o - 5 0 0 b p s e g m e n t s . . T h e r e i s a h i g h e r l e v e l o f 5 M e C I n t h e n o n - C p G I s l a n d r e g i o n o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s a s c o m p a r e d t o t h e C p G I s l a n d r e g i o n . I I . W W T o e x a m i n e t h e e f f e c t o f a C M D d i e t , P B , o r t h e c o - a d m i n i s t r a t i o n o f a C M D d i e t w i t h P B i n m o u s e s t r a i n s w i t h d i f f e r i n g s e n s i t i v i t i e s t o s p o n t a n e o u s - a n d c h e m i c a l - i n d u c e d l i v e r t u m o r f o r m a t i o n ( i . e . , r e l a t i v e l y s e n s i t i v e B 6 C 3 F 1 a n d r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B U 6 ) o n A . h e p a t i c m e t h y l a t i o n s t a t u s 1 . o f p o r t i o n s o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s , . N o d i s c e r n i b l e e f f e c t . 2 . o f H a - r a s a n d r e f b y S o u t h e r n a n a l y s i s , a n d . N o d i s c e r n i b l e e f f e c t u p t o 4 w e e k s o f a d m i n i s t r a t i o n . 0 H y p o m e t h y l a t i o n w a s e v i d e n t i n H a - r a s a n d r e f i n b o t h t h e B 6 C 3 F 1 a n d C 5 7 B U 6 a f t e r 1 2 w e e k s o f C M D d i e t a d m i n i s t r a t i o n . 2 3 1 3 . g l o b a l l y C M D d i e t - , P B , o r C M D d i e t « I P B - l n d u c e d g l o b a l h y p o m e t h y l a t i o n o c c u r s t o a l a r g e r e x t e n t a n d e a r l i e r i n t h e B 6 C 3 F 1 a s c o m p a r e d t o t h e C S 7 B L I 6 . A t 2 w e e k s o f C M D d i e t a d m i n i s t r a t i o n a n d C M D d i e t + P B t h e B 6 0 3 F 1 g l o b a l m e t h y l a t i o n s t a t u s p a r t i a l l y r e c o v e r s . G l o b a l h y p o m e t h y l a t i o n i s g e t e v i d e n t i n t h e C 5 7 B U 6 i n r e s p o n s e t o P B a d m i n i s t r a t i o n . B . h e p a t i c g e n e e x p r e s s i o n 1 . H a - r a s , r a f , a n d S A M s y n t h e t a s e T h e B S C 3 F 1 e x h i b i t e d m o r e c o n s i s t e n t , i n c r e a s e d m R N A l e v e l s t h a n t h e C S 7 B U 6 . T h e B 6 C 3 F 1 w a s m o r e l i k e l y t o h a v e b o t h H a - r a s a n d r e f m R N A s e l e v a t e d I n t h e s a m e a n i m a l t h a n t h e C 5 7 B U 6 . C . h e p a t o c y t e a n d n o n - h e p a t o c y t e c e l l p r o l i f e r a t i o n . H i g h e r l e v e l s o f c e l l p r o l i f e r a t i o n i n c o n t r o l h e p a t o c y t e s a n d c o n t r o l n o n - h e p a t o c y t e s i n t h e C 5 7 B U 6 a s c o m p a r e d t o t h e 8 6 C 3 F 1 . G r e a t e r i n c r e a s e s i n c e l l p r o l i f e r a t i o n d e m o n s t r a t e d b y t h e C 5 7 B U 6 a s c o m p a r e d t o t h e B 6 C 3 F 1 I n r e s p o n s e t o a l l t h r e e p r o m o t e r t r e a t m e n t s . 2 3 2 I l l . S p e e j fl e fl m i T o e x a m i n e t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f p o r t i o n s o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s i n s p o n t a n e o u s - a n d P B - i n d u c e d B 6 C B F 1 m o u s e l i v e r a d e n o m a s a n d c a r c i n o m a s , a n d a g e - m a t c h e d c o n t r o l l i v e r A . o f p o r t i o n s o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s , a n d B . g l o b a l l y . H y p e r r n e t h y l a t i o n o c c u r s i n t h e t w o s e g m e n t s o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s a n a l y z e d b y P C R a n a l y s i s I n 2 4 m o n t h o l d 8 6 0 3 F 1 m i c e a s c o m p a r e d t o y o u n g m i c e . T h e r e a r e m o r e a l t e r a t i o n s i n m e t h y l a t i o n s t a t u s e v i d e n t i n t h e n o n - C p G i s l a n d s e g m e n t a n a l y z e d ( h y p e r m e t h y l a t i o n a t 1 0 o r 1 2 r e s t r i c t i o n e n z y m e s i t e s e x a m i n e d i n t h e n o n - C p G i s l a n d r e g i o n , b u t o n l y 2 o f 9 s i t e s i n t h e C p G i s l a n d r e g i o n ) . T h e o n e r e s t r i c t i o n e n z y m e s i t e e x a m i n e d I n t h e r e g i o n a m p l i f i e d b y t h e 5 / 8 P C R p r i m e r s e t t h a t w a s c o m p l e t e l y u n m e t h y l a t e d i n t h e y o u n g a n i m a l s r e m a i n e d s o i n t h e 2 4 m o n t h o l d a n i m a l s . N o d i s c e r n i b l e d i f f e r e n c e s w e r e n o t e d b e t w e e n B 6 C 3 F 1 l i v e r t u m o r s a n d a g e - m a t c h e d c o n t r o l fi s s u e . A s u b p o p u l a t i o n o f B 6 0 3 F 1 m o u s e l i v e r a d e n o m a s a n d c a r c i n o m a s e x h i b i t e d g l o b a l h y p o m e t h y l a t i o n . 2 3 3 a G l o b a l h y p o m e t h y l a t i o n e v i d e n t i n m o r e o f t h e c a r c i n o m a s t h a n t h e a d e n o m a s . I V . S p e c i fl e A j m e ; T o e x a m i n e t h e l e v e l o f e x p r e s s i o n o f H a - r a s , r a f , a n d S A M s y n t h e t a s e , i n s p o n t a n e o u s - a n d P B - i n d u c e d ( 0 . 0 5 % w / w ) B 6 C S F 1 m o u s e l i v e r a d e n o m a s a n d c a r c i n o m a s . 0 I n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f H a - r a s w a s e v i d e n t I n 2 o f 4 s p o n t a n e o u s l i v e r a d e n o m a s a n d I n 1 o f 3 s p o n t a n e o u s l i v e r c a r c i n o m a s . . I n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f H a - r a s w a s e v i d e n t I n 5 o f 5 P B - i n d u c e d l i v e r a d e n o m a s a n d i n 4 o f 5 P B - l n d u c e d l i v e r c a r c i n o m a s . . r a f e x p r e s s i o n w a s u n c h a n g e d o r d e c r e a s e d i n s p o n t a n e o u s a n d P B - i n d u c e d l i v e r t u m o r s . . S A M s y n t h e t a s e w a s u n c h a n g e d o r d e c r e a s e d i n s p o n t a n e o u s a n d P B - i n d u c e d l i v e r t u m o r s . O v e r a l l C o n c l u s i o n s T h e h e i g h t e n e d l e v e l o f h y p o m e t h y l a t i o n e v i d e n t i n t h e r e l a t i v e l y l i v e r t u m o r s u s c e p t i b l e B 6 0 3 F 1 a f t e r t u m o r p r o m o t i n g t r e a t m e n t s , c o u p l e d w i t h t h e h e i g h t e n e d l e v e l o f c e l l p r o l i f e r a t i o n i n t h e r e l a t i v e l y l i v e r t u m o r r e s i s t a n t C S 7 B L / 6 , d e m o n s t r a t e t h a t t h e h y p o m e t h y l a t i o n e v i d e n t i n t h e B 6 C 3 F 1 i s p r o b a b l y n o t d u e t o a h e i g h t e n e d l e v e l o f b a s a l o r p r o m o t e r - i n d u c e d c e l l p r o l i f e r a t i o n . T h e s e d a t a s u p p o r t t h e h y p o t h e s i s t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A 2 3 4 m a y u n d e r l i e t h e h e i g h t e n e d s e n s i t i v i t y o f t h e B 6 C 3 F 1 m o u s e t o l i v e r t u m o r i g e n e s i s ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 4 ; 1 9 9 5 a , 1 9 9 5 0 , 1 9 9 5 d ) . T h i s m a y b e d u e t o ( s e e F i g u r e 1 ) ( 1 ) a d e c r e a s e d c a p a c i t y f o r a n d / o r f i d e l i t y o f m a i n t e n a n c e o f n a s c e n t m e t h y l a t i o n s t a t u s , ( 2 ) e n z y m a t i c d e m e t h y l a t i o n o f D N A t h a t i s n o t l i n k e d t o c e l l p r o l i f e r a t i o n , a n d / o r ( 3 ) l e s s e f f i c i e n t a p o p t o s i s o f a l t e r e d / i n i t i a t e d / d y s r e g u l a t e d c e l l s i n t h e B 6 C 3 F 1 a s c o m p a r e d t o t h e C 5 7 B U 6 . C h a n g e s i n m e t h y l a t i o n s t a t u s o c c u r w i t h a g e i n g i n t h e B 6 C 3 F 1 m o u s e . A l t e r a t i o n s i n D N A m e t h y l a t i o n w i t h a g e m a y f a c i l i t a t e a b e r r a n t o n c o g e n e a n d t u m o r s u p p r e s s o r g e n e e x p r e s s i o n a n d m a y u n d e r l i e t h e h i g h s p o n t a n e o u s l i v e r t u m o r i n c i d e n c e i n t h e B 6 C 3 F 1 . A d d i t i o n a l l y , c h a n g e s i n D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s w i t h a g e m a y b e i m p o r t a n t i n h u m a n c a n c e r s , e v e n t h o u g h h u m a n s m a i n t a i n n o r m a l m e t h y l a t i o n s t a t u s m o r e f a i t h f u l l y t h a n r o d e n t s , i f t h e a l t e r a t i o n o c c u r s e a r l y a n d e f f e c t s v i t a l g e n e e x p r e s s i o n . T h e k n o w n t u m o r i g e n i c p o t e n t i a l o f m e t h y l d e f i c i e n t d i e t s i n r o d e n t s ( M i k o l e t a l . , 1 9 8 3 ; N e w b e m e e t a l . , 1 9 8 2 ) , a s w e l l a s t h e c h e m o p r e v e n t a t i v e e f f e c t s o f e x c e s s m e t h y l d o n o r s i n r o d e n t s ( N e w b e m e e t a l . , 1 9 9 0 ; P a s c a l e e t a l . , 1 9 9 2 ) , c o u p l e d w i t h t h e k n o w l e d g e t h a t h u m a n c a n c e r s e x h i b i t h y p o m e t h y l a t e d D N A ( G a m a - S o s a e t a l . , 1 9 8 3 ; K i m e t a l . , 1 9 9 4 ) , p r o v i d e a p o t e n t i a l r o l e f o r m e t h y l d o n o r c h e m o p r e v e n t i o n i n h u m a n s ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 0 ) . S u b p o p u l a t i o n s o f B G C 3 F 1 l i v e r t u m o r s d i s p l a y i n g h y p o m e t h y l a t e d D N A a r e c o n s i s t e n t w i t h t u m o r i g e n e s i s a s a s t o c h a s t i c p r o c e s s . A s p r o p o s e d b y P i t o t a n d D r a g a n , t u m o r p r o m o t e r s m a y b e c a p a b l e o f f a c i l i t a t i n g t h e c l o n a l e x p a n s i o n o f s p e c i f i c s u b p o p u l a t i o n s o f i n i t i a t e d c e l l s ( r e f e r e n c e d i n P i t o t a n d 2 3 5 F i g u r e 1 - P r o p o s e d m o d e l f o r t h e h e i g h t e n e d s e n s i t i v i t y o f t h e B 6 C S F 1 m o u s e t o l i v e r t u m o r i g e n e s i s . P h e n o b a r b i t a l ( P B ) a n d C M D d i e t a d m i n i s t r a t i o n l e a d t o i n c r e a s e d h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A , g l o b a l l y a n d o f H a - r a s a n d r a f , a n d a b e r r a n t o n c o g e n e e x p r e s s i o n i n t h e B 6 C 3 F 1 m o u s e . T h e s e a l t e r a t i o n s o c c u r t o a l e s s e r e x t e n t i n t h e r e l a t i v e l y l i v e r t u m o r r e s i s t a n t C 5 7 B U 6 m o u s e . B o t h P B a n d t h e C M D d i e t l e a d t o i n c r e a s e d h e p a t o c y t e c e l l p r o l i f e r a t i o n i n t h e B 6 C 3 F 1 , t h o u g h l a r g e r i n c r e a s e s w e r e d e m o n s t r a t e d b y t h e C 5 7 B U 6 . I n a d d i t i o n , t h e C S 7 B L / 6 h a s a h i g h e r b a s a l l e v e l o f h e p a t o c y t e c e l l p r o l i f e r a t i o n . T h i s i n d i c a t e s t h a t t h e C 5 7 B U 6 l i k e l y h a s a h i g h e r l e v e l o f a p o p t o s i s . T h u s , i n c r e a s e d c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d p o t e n t i a l l y d e c r e a s e d , o r l e s s e f f i c i e n t , a p o p t o s i s m a y , i n p a r t , e x p l a i n t h e h e i g h t e n e d s e n s i t i v i t y o f t h e B 6 0 3 F 1 m o u s e t o l i v e r t u m o r i g e n e s i s . H y p o m e t h y l a t i o n o f D N A m a y a l s o o c c u r v i a ( 1 ) a d e c r e a s e d c a p a c i t y f o r , a n d / o r f i d e l i t y o f m a i n t e n a n c e m e t h y l a t i o n , ( 2 ) a l t e r a t i o n s i n S A M l e v e l s , a n d ( 3 ) d e m e t h y l a t i o n o f D N A n o t l i n k e d t o D N A s y n t h e s i s . 2 3 6 F i g u r e 1 . P R O P O S E D M O D E L : B 6 C 3 F 1 P B o r C M D D i e t P r o m o t i o n I C e l l P r o l i f e r a t i o n a n d / o r I A p o p t o s i s I C a p a c i t y a n d / o r f i d e l i t y o f m a i n t e n a n c e m e t h y l a t i o n a n d / o r A l t e r a t i o n s i n S A M l e v e l s a n d / o r D e m e t h y l a t i o n n o t r e q u i r i n g D N A r e p l i c a t i o n I H y p o m e t h y l a t i o n o f D N A ( g l o b a l l y a n d o f s p e c i f i c o n c o g e n e s ) I A b e r r a n t G e n e E x p r e s s i o n I S u s c e p t i b i l i t y t o L i v e r T u m o r F o r m a t i o n 2 3 7 D r a g a n , 1 9 9 5 ) . T h u s , s i n c e e a c h c e l l i n a t i s s u e p o t e n t i a l l y h a s b e e n e x p o s e d t o d i f f e r e n t i n t e m a l / e x t e m a l s t i m u l i , a n d r e s p o n d s a t d i f f e r e n t r a t e s a n d t i m e s ( i . e . , n o t a s y n c h r o n i z e d c e l l p o p u l a t i o n ) ; t h e y m a y r e s p o n d d i f f e r e n t l y t o t h e s a m e t r e a t m e n t s . A d d i t i o n a l l y , e a c h c e l l a c t s i n d e p e n d e n t l y i n i t s r e s p o n s e s , t h a t i s , h y p o m e t h y l a t i o n m a y l e a d t o i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f g e n e “ X ” i n o n e c e l l w h i l e g e n e “ Y ” i s m a d e t r a n s c r i p t i o n a l l y a c t i v e i n a n e i g h b o r i n g c e l l . A s t h e c a s c a d e o f e v e n t s i n i t i a t e d b y t h e i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f g e n e “ X ” b e g i n , t h e g e n e m a y h a v e t h e n o r m a l m e t h y l a t i o n s t a t u s r e t u r n e d a n d e x p r e s s i o n s h u t o f f ; t h i s w i l l n o t n e c e s s a r i l y s t o p t h e c a s c a d e . T h e o v e r a l l l e v e l o f h y p o m e t h y l a t i o n o b t a i n e d a n d t h e c o n s i s t e n c y o f a b e r r a n t g e n e e x p r e s s i o n m a y p r o v i d e a n e x p l a n a t i o n a s t o h o w a n d w h y t u m o r s a r e f o r m e d . T h u s , h e i g h t e n e d h y p o m e t h y l a t i o n a n d a g r e a t e r n u m b e r o f g e n e s a b e r r a n t l y e x p r e s s e d , a s s e e n i n t h e r e l a t i v e l y l i v e r t u m o r s u s c e p t i b l e B 6 0 3 F 1 , w o u l d b e a n t i c i p a t e d t o h a v e s t r o n g e r a b n o r m a l b i o l o g i c e f f e c t s t h a n m o d e r a t e h y p o m e t h y l a t i o n , i n t h e f a c e o f a h i g h l e v e l o f c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d m i n o r a l t e r a t i o n s i n g e n e e x p r e s s i o n , a s s e e n i n t h e r e l a t i v e l y l i v e r t u m o r r e s i s t a n t C S 7 B L / 6 . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e d a t a p r o v i d e s t r o n g s u p p o r t f o r t h e h y p o t h e s i s t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A m a y f a c i l i t a t e a b e r r a n t o n c o g e n e e x p r e s s i o n t h a t i s i n v o l v e d i n t u m o r i g e n e s i s . T h e s e d a t a a l s o i n d i c a t e t h a t t h e r e a s o n t h e B 6 0 3 F 1 m o u s e i s v e r y s e n s i t i v e t o s p o n t a n e o u s - a n d c h e m i c a l - i n d u c e d l i v e r t u m o r f o r m a t i o n i s d u e , i n p a r t , t o a b e r r a n t m a i n t e n a n c e o f n a s c e n t m e t h y l a t i o n s t a t u s . F u r t h e r , t h e y s u g g e s t a m o u s e b e t t e r c a p a b l e o f m a i n t a i n i n g n a s c e n t m e t h y l a t i o n s t a t u s , e . g . , t h e C 5 7 B U 6 , m a y p r o v i d e m o r e u s e f u l a n d r e l e v a n t E 2 3 8 i n f o r m a t i o n i n t h e c a r c i n o g e n b i o a s s a y r e l a t i v e t o h u m a n r i s k c h a r a c t e r i z a t i o n . A P P E N D I C E S A P P E N D I X 1 V e r i f i c a t i o n o f P C R P r o d u c t s f r o m t h e 5 ’ F l a n k i n g R e g i o n o f H a - r a s T h e D N A a m p l i f i e d b y P C R p r i m e r s e t 5 / 8 , c o m p l e m e n t a r y t o p o r t i o n s o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s , i s e x p e c t e d t o b e 5 0 3 b p . R a t h e r t h a n r e l y i n g o n s i z e a l o n e a s c o n f i r m a t i o n o f t h e p r o c e d u r e , w e a l s o e m p l o y e d d i g e s t i o n o f t h e P C R p r o d u c t w i t h a r e s t r i c t i o n e n z y m e ( i n s e n s i t i v e t o m e t h y l a t i o n ) t h a t r e s t r i c t s t h e e x p e c t e d f r a g m e n t . A s e a r c h w a s c a r r i e d o u t o n t h e G C G p r o g r a m f o r r e s t r i c t i o n e n z y m e s t h a t w o u l d b e e x p e c t e d t o c u t t h e P C R p r o d u c t o n c e . T h e r e s u l t i n g l i s t o f e n z y m e s w a s t h e n a n a l y z e d f o r p l a c e m e n t i n t h e r e g i o n e . g . , a n e n z y m e t h a t o u t v e r y c l o s e t o e i t h e r p r i m e r w o u l d h a v e m a d e d i s c e r n i n g a d i f f e r e n c e i n m i g r a t i o n o n t h e e t h i d i u m b r o m i d e s t a i n e d g e l d i f f i c u l t , a s t h e s i z e c h a n g e w o u l d h a v e b e e n v e r y s m a l l . T h e l i s t o f e n z y m e s w a s f u r t h e r n a r r o w e d b y a v a i l a b i l i t y a n d f i n a l l y b y c o s t . T h e e n z y m e c h o s e n a s t h e d i a g n o s t i c e n z y m e f o r t h e 5 / 8 p r i m e r s e t w a s R s a l ( r e c o g n i t i o n s i t e : 5 ’ - G T A C - 3 ’ ) w h i c h a f t e r r e s t r i c t i o n o f t h e P C R p r o d u c t w o u l d p r o v i d e t w o f r a g m e n t s , 1 3 5 b p a n d 3 6 8 b p ( F i g u r e 1 ) . R s a l w a s a b l e t o c o m p l e t e l y c l e a v e t h e 5 0 3 b p f r a g m e n t c o n f i r m i n g a m p l i f i c a t i o n o f t h e p o r t i o n o f i n t e r e s t o f t h e 5 ’ f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s ( F i g u r e 2 ) . T h e D N A a m p l i f i e d b y t h e P C R p r i m e r s e t 6 / 7 , c o m p l e m e n t a r y t o p o r t i o n s o f t h e i n t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s , i s e x p e c t e d t o b e 4 9 5 b p . T h e e n z y m e c h o s e n a s t h e d i a g n o s t i c e n z y m e f o r t h e 6 / 7 p r i m e r s e t w a s H i n c l l ( r e c o g n i t i o n s i t e : 5 ’ - G T ( T / C ) ( A / G ) A C - 3 ’ ) , w h i c h a f t e r r e s t r i c t i o n o f t h e P C R p r o d u c t w o u l d p r o v i d e t w o f r a g m e n t s , 2 8 6 b p a n d 2 0 9 b p ( F i g u r e 3 ) . H i n c l l w a s 2 3 9 2 4 0 G C G A C C G G G G T G A G C G T G C A A C C C C A G G C C T G C A C G A C C T G A G T A A A A G C C T G A G T T T T T C G C T G G C C C C A C T C G C A C G T T G G G G T C C G G A C G T G C T G G A C T C A T T T T C G G A C T C A A A A A C T G A G G A C G T G C T T A T T C G T T T C T T T G A A A T T T C A A A A A G T G T T G A A A A C A T G T C A T T T G G A C T C C T G C A C G A A T A A G C A A A G A A A C T T T A A A G T T T T T C A C A A C T T T T G T A C A G T A A A C R 8 a I C G T C T G A C A C A G A T G T A C C C T A C T T G C T T G A G T G G G T G G A A C A C T T C A T T T C G C C C C A A T G C A G A C T G T G T C T A C A T G G G A T G A A C G A A C T C A C C C A C C T T G T G A A G T A A A G C G G G G T T A A C C A A C T T T T C T G A C T T T C G G G G T G T T C T T C A A A T G G A C G C A G T A T G A G C T T C T G C A G T G T G G T T G A A A A G A C T G A A A G C C C C A C A A G A A G T T T A C C T G C G T C A T A C T C G A A G A C G T C A C T T G G A C C T C G A G T T T G A G A G C G G T A G G G G C G T G G T C T T C T C C A A A A C A C G A A G A G C G C G G ; _ . . L _ _ L _ — T T — — _ — _ T — — ' T A A C C T G G A G C T C A A A C T C T C G C C A T C C C C G C A C C A G A A G A G G T T T T G T G C T T C T C G C G C C T G T G A T G G C C G A C G C T G C C C C A G G A T G A G C C T T T G C T C C A C C T C G A C C T A C G A G A A C A G G — + — . . . . . . . . . + - A C A C T A C C G G C T G C G A C G G G G T C C T A C T C G G A A A C G A G G T G G A G C T G G A T G C T C T T G T C C C A G C T A G G G G G T T C C G G C G A A C T C T G T C T T C C T C T G T T A T T G C G T C C G C G G T G C T G A C T G . _ . . L — — T — T — — — T _ T G T C G A T C C C C C A A G G C C G C T T G A G A C A G A A G G A G A C A A T A A C G C A G G C G C C A C G A C T G A C T C C C C G A C A C C A A T A C C C G G T C G G G A T G A C C T T T C C A C T C G T G G G C C T T T G G C G C T T T G G — — — - + . . . . . . . . . + . . . . . . . . . + . . . . . . . . . + . . . . . . . . . + - A G G G G C T G T G G T T A T G G G C C A G C C C T A C T G G A A A G G T G A G C A C C C G G A A A C C G C G A A A C C T G A G G C T G C A G G G T G G A G G C T C T G . . . . . . . . + - - - - - - - - - + - - - - - A C T C C G A C G T C C C A C C T C C G A G A C F i g u r e 1 - A n a l y s i s o f t h e p o r t i o n o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s a m p l i f i e d b y p r i m e r s e t 5 / 8 t o d e t e r m i n e l o c a t i o n o f a r e c o g n i t i o n s i t e f o r a r e s t r i c t i o n e n z y m e t h a t c o u l d b e e m p l o y e d a s a “ d i a g n o s t i c ” e n z y m e . T h e “ m a p ” f u n c t i o n o f t h e G C G p r o g r a m ( G e n e t i c s C o m p u t e r G r o u p , 1 9 9 4 ) w a s u s e d t o d e t e r m i n e t h e l o c a t i o n o f t h e r e c o g n i t i o n s i t e s f o r a v a r i e t y o f r e s t r i c t i o n e n z y m e s , a n d b a s e d u p o n t h e s i z e o f t h e e x p e c t e d c l e a v a g e p r o d u c t s a n d a v a i l a b i l i t y o f t h e e n z y m e , R s a l ( r e c o g n i t i o n s i t e : 5 ’ - G T A C - 3 ’ ) w a s s e l e c t e d . 2 4 1 F i g u r e 2 - C o n f i r m a t i o n o f r e s t r i c t i o n o f t h e r e g i o n a m p l i f i e d b y P C R p r i m e r s 5 / 8 b y R s a l . L a n e M - m o l e c u l a r w e i g h t m a r k e r s ( 1 0 0 0 , 7 0 0 , 5 0 0 , 4 0 0 , 3 0 0 , 2 0 0 , a n d 1 0 0 b p ) . L a n e 1 - p o s t P C R r e s t r i c t i o n o f P C R p r o d u c t i n l a n e 2 w i t h R s a l . L a n e 2 - 5 0 0 b p p r o d u c t a f t e r a m p l i f i c a t i o n u s i n g p r i m e r s 5 / 8 . P C R w a s c a r r i e d o u t a s d e s c r i b e d i n t h e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s o f C h a p t e r 3 a n d t h e a m p l i f i e d p r o d u c t w a s e l e c t r o p h o r e s e d o n a 1 % a g a r o s e / 1 % N u S i e v e g e l . E t h i d i u m b r o m i d e f l u o r e s c e n c e w a s u s e d t o v i s u a l i z e t h e D N A . N a r r o w a r r o w i n d i c a t e s t h e p r e s e n c e o f t h e 5 0 0 b p b a n d . W i d e a r r o w i n d i c a t e s t h e p r e s e n c e o f t h e 3 6 8 b p R s a l - r e s t r i c t e d f r a g m e n t , t h e s m a l l e r f r a g m e n t r a n o f f t h e g e l . 2 4 2 a b l e t o c o m p l e t e l y r e s t r i c t t h e 4 9 5 b p f r a g m e n t c o n f i r m i n g a m p l i f i c a t i o n o f t h e p o r t i o n o f i n t e r e s t o f t h e 5 ’ f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s ( F i g u r e 4 ) F o r t h e r e g i o n a m p l i f i e d b y p r i m e r s e t 5 / 8 , c o n f i r m a t i o n w a s a l s o c a r r i e d o u t b y s e q u e n c i n g t h e P C R p r o d u c t . F o r t h i s , t h e P C R r e a c t i o n w a s c a r r i e d o u t u t i l i z i n g o n e b i o t i n y l a t e d P C R p r i m e r ( p r i m e r 5 ) a n d o n e n o n - b i o t i n y l a t e d p r i m e r ( p r i m e r 8 ) . T h e p r o c e d u r e w a s p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d i n C h a p t e r 3 w i t h t h e f o l l o w i n g m o d i f i c a t i o n , t h e n o n - b i o t i n y l a t e d p r i m e r w a s i n e x c e s s , s o 1 0 p M b i o t i n y l a t e d p r i m e r 5 a n d 2 0 p M p r i m e r 8 w e r e e m p l o y e d . T h e r e s u l t i n g P C R a m p l i f i c a t i o n l e d t o t h e p r o d u c t i o n o f a p r o d u c t o f a p p r o x i m a t e l y 5 0 0 b p . T h e r e f o r e , f u r t h e r p u r i f i c a t i o n o f t h e a m p l i f i e d p r o d u c t w a s n o t r e q u i r e d ( i . e . , t h e b a n d o f i n t e r e s t d i d n o t h a v e t o b e i s o l a t e d f r o m t h e a g a r o s e g e l ) . T h e h i g h G C c o n t e n t o f t h e a m p l i f i e d D N A m a d e a t t e m p t s a t s e q u e n c i n g d i f fi c u l t . T h e p r o b l e m w a s s o l v e d b y u s i n g a b i o t i n y l a t e d p r i m e r t h a t p e r m i t t e d t h e u s e o f s t r e p t a v i d i n c o n j u g a t e d m a g n e t i c p o r o u s g l a s s b e a d s ( M P G b e a d s , C p G l n c . , L i n c o l n P a r k , N J ) t o f a c i l i t a t e s e p a r a t i o n o f t h e d o u b l e s t r a n d e d P C R r e a c t i o n p r o d u c t i n t o s i n g l e s t r a n d e d s a m p l e s t h a t c o u l d b e s e q u e n c e d . M P G b e a d s w e r e p r e p a r e d a s d i r e c t e d b y t h e s u p p l i e r . B r i e f l y , t h e y w e r e m i x e d t h o r o u g h l y w i t h b i n d i n g a n d w a s h i n g b u f f e r ( 2 . 0 M N a C l , 1 m M E D T A , 1 0 m M T r i s - H C I ) ( 1 : 1 ) , m a g n e t i c a l l y s e p a r a t e d a n d t h e s u p e r n a t a n t d i s c a r d e d . T h e b e a d s w e r e r e s u s p e n d e d i n 2 v o l u m e s o f b i n d i n g a n d w a s h i n g b u f f e r . T w o v o l u m e s o f P C R p r o d u c t w e r e a d d e d t o t h e w a s h e d b e a d s a n d a l l o w e d t o s t a n d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 5 m i n u t e s , v o r t e x i n g o c c a s i o n a l l y . T h e m a g n e t w a s a p p l i e d , t h e m i x t u r e a l l o w e d t o s e p a r a t e , a n d t h e s u p e r n a t a n t d i s c a r d e d . A n m “ - I fi O H H 2 4 3 A G G C T G C A G G G T G G A G G C T C T G T A G T A G G T C C T C A A C G C A A C C C G A G C G T G C A C C A G T T T T C C G A C G T C C C A C C T C C G A G A C A T C A T C C A G G A G T T G C G T T G G G C T C G C A C G T G G T C A A A C T C T C C G G A G A A A T C C C C C C G G G C T C G T A A G C A C G G T C T C G G T C T G T C T C T T C T G C A C C T G A G A G G C C T C T T T A G G G G G G C C C G A G C A T T C G T G C C A G A G C C A G A C A G A G A A G A C G T G G A A G G C A C T A G A C A T C A C T G T T G A G T G C A G G A C C C A A G T T C C G G C A C T G C C T T C C C C G C G G C T C C G T G A T C T G T A G T G A C A A C T C A C G T C C T G G G T T C A A G G C C G T G A C G G A A G G G G C G C C G T C C A G G A A G C C C C G C C C A G C T T C G G C T T C T G A C G G A T G G G T T G C T C A G C C A A C C A C A A C A _ _ _ _ L . . L . L T ‘ — — T — — A G G T C C T T C G G G G C G G G T C G A A G C C G A A G A C T G C C T A C C C A A C G A G T C G G T T G G T G T T G T G G T C G C G G T G C G G A G G A G T T C T G A C C A A T C A C G G G C C G C C T C G A G T T G A C G G A C G G G C G T - _ _ _ = + _ _ _ . L C C A G C G C C A C G C C T C C T C A A G A C T G G T T A G T G C C C G G C G G A G C T C A A C T G C C T G C C C G C A G G G G C G G A G C G G G G C G G C G A G C G C G G G C C C G G C C A A G T C C C C G C C G T C C G C T C C C G G C G C . . _ . . . . . _ _ L _ _ A L . . . . _ . _ _ . _ _ . _ . _ . . _ _ T T C C C C G C C T C G C C C C G C C G C T C G C G C C C G G G C C G G T T C A G G G G C G G C A G G C G A G G G C C G C G C C G C A G C C C G A G C C G C A C C C G C C G C G G A C G G A G C T C A T G C G C G G G C C C A G C C G G C G C C C G - - - - - - + - - - - - - - - - + - - - - - - - - - + - - - - - - - - - + - - - - - - - - - + - - - - - - - - - + - - - G G C G T C G G G C T C G G C G T G G G C G G C G C C T G C C T C G A G T A C G C G C C C G G G T C G G C C G C G G G C T C C G C G C C C C C G C C C T G C C C C G G C C C C G G C C C C G G C C C C G G G G G G C A G T C G C G C C A G C A A - - - - - - + - - - - - - - - - + - - - - - - - - - + - - - - - - - - - + - - - - - - - - - + - - - - - - - - - + - - - A G G C G C G G G G G C G G G A C G G G G C C G G G G C C G G G G C C G G G G C C C C C C G T C A G C G C G G T C G T T G C G G T G A G T G C G G G C A . . . . . . + - - - - - - - - - C G C C A C T C A C G C C C G T F i g u r e 3 - A n a l y s i s o f t h e p o r t i o n o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s a m p l i f i e d b y p r i m e r s e t 6 / 7 t o d e t e r m i n e l o c a t i o n o f a r e c o g n i t i o n s i t e f o r a r e s t r i c t i o n e n z y m e t h a t c o u l d b e e m p l o y e d a s a “ d i a g n o s t i c ” e n z y m e . T h e “ m a p ” f u n c t i o n o f t h e G C G p r o g r a m ( G e n e t i c s C o m p u t e r G r o u p , 1 9 9 4 ) w a s u s e d t o d e t e r m i n e t h e l o c a t i o n o f t h e r e c o g n i t i o n s i t e s f o r a v a r i e t y o f r e s t r i c t i o n e n z y m e s , a n d b a s e d u p o n t h e s i z e o f t h e e x p e c t e d c l e a v a g e p r o d u c t s a n d a v a i l a b i l i t y o f t h e e n z y m e , H i n c l l ( r e c o g n i t i o n s i t e : 5 ’ G T ( T / C ) ( A / G ) A C - 3 ’ ) w a s s e l e c t e d . 2 4 4 F i g u r e 4 - C o n f i r m a t i o n o f r e s t r i c t i o n o f t h e r e g i o n a m p l i f i e d b y P C R p r i m e r s 6 / 7 b y H i n c l l . L a n e M - m o l e c u l a r w e i g h t m a r k e r s ( 1 0 0 0 , 7 0 0 , 5 0 0 , 4 0 0 , 3 0 0 . 2 0 0 , a n d 1 0 0 b p ) . L a n e 1 - a p p r o x i m a t e l y 5 0 0 b p p r o d u c t a f t e r a m p l i f i c a t i o n u s i n g p r i m e r s 6 / 7 . L a n e 2 - p o s t P C R r e s t r i c t i o n o f P C R p r o d u c t i n l a n e 1 w i t h H i n c l l . P C R w a s c a r r i e d o u t a s d e s c r i b e d i n t h e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s o f C h a p t e r 3 a n d t h e a m p l i f i e d p r o d u c t w a s e l e c t r o p h o r e s e d o n a 1 % a g a r o s e / 1 % N u S i e v e g e l . E t h i d i u m b r o m i d e f l u o r e s c e n c e w a s u s e d t o v i s u a l i z e t h e D N A . L o n g , n a r r o w a r r o w i n d i c a t e s t h e p r e s e n c e o f t h e 5 0 0 b p b a n d . W i d e a r r o w s i n d i c a t e t h e p r e s e n c e o f t h e 2 8 6 b p a n d 2 0 9 b p H i n c l l - r e s t r i c t e d f r a g m e n t s . 2 4 5 a d d i t i o n a l 2 v o l u m e s o f b i n d i n g a n d w a s h i n g b u f f e r w e r e a p p l i e d a n d t h i s w a s h i n g s t e p w a s r e p e a t e d . T h e P C R p r o d u c t w i t h t h e b e a d s w a s t h e n d e n a t u r e d b y a d d i n g 1 / 2 v o l u m e o f 0 . 1 N N a O H a n d a l l o w i n g t h i s t o i n c u b a t e a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 0 m i n u t e s . T h e s u p e r n a t a n t w a s d i s c a r d e d a n d t h e s i n g l e s t r a n d e d P C R p r o d u c t o f t h e b i o t i n y l a t e d s t r a n d w a s w a s h e d w i t h 2 . 5 v o l u m e s 0 . 1 N N a O H , f o l l o w e d b y 2 v o l u m e s b i n d i n g a n d w a s h i n g b u f f e r , a n d f i n a l l y , 2 . 5 v o l u m e s T E b u f f e r . A f t e r e a c h w a s h t h e r e a c t i o n w a s m a g n e t i c a l l y s e p a r a t e d a n d t h e s u p e r n a t a n t r e m o v e d . F o l l o w i n g t h e l a s t w a s h i n T E b u f f e r , t h e b e a d s c o n t a i n i n g t h e b i o t i n y l a t e d s t r a n d o f t h e P C R p r o d u c t w e r e r e s u s p e n d e d i n 1 / 2 v o l u m e d o u b l e d i s t i l l e d w a t e r . S e q u e n c i n g o f t h i s s i n g l e s t r a n d e d p r o d u c t w a s c a r r i e d o u t w i t h S e q u e n a s e V e r s i o n 2 . 0 ( U n i t e d S t a t e s B i o c h e m i c a l C o r p o r a t i o n , C l e v e l a n d , O H ) a c c o r d i n g t o t h e s u p p l i e r ’ s i n s t r u c t i o n s . H a l f o f t h e r e s u s p e n d e d s i n g l e s t r a n d e d P C R p r o d u c t w a s i n c u b a t e d w i t h 2 0 p M p r i m e r 8 , 2 p L 5 X s e q u e n a s e b u f f e r ( s u p p l i e d b y t h e m a n u f a c t u r e r ) a n d d o u b l e d i s t i l l e d w a t e r t o 1 0 p L a t 7 0 ° C f o r 1 5 m i n u t e s t o a n n e a l t h e p r i m e r t o t h e D N A . T h e a n n e a l e d r e a c t i o n w a s a l l o w e d t o c o m e t o r o o m t e m p e r a t u r e s l o w l y o v e r 1 5 m i n u t e s p r i o r t o t h e l a b e l i n g r e a c t i o n . O n e p L 0 . 1 M D ' l ‘ l ' ( s u p p l i e d b y t h e m a n u f a c t u r e r ) , 2 . 0 p L d i l u t e d l a b e l i n g m i x ( s u p p l i e d b y t h e m a n u f a c t u r e r ) , 1 . 0 p L d o u b l e d i s t i l l e d w a t e r a n d 2 . 0 p L [ o r - 3 5 $ ] ( s p e c i f i c a c t i v i t y = 1 3 3 4 C i / m m o l , N e w E n g l a n d N u c l e a r , B o s t o n , M A ) w e r e a d d e d t o t h e a n n e a l e d D N A r e a c t i o n , f o l l o w e d b y 2 . 0 p L o f t h e f r e s h l y d i l u t e d p o l y m e r a s e v e r s i o n 2 . 0 ( s u p p l i e d b y t h e m a n u f a c t u r e r ) . T h i s r e a c t i o n w a s a l l o w e d t o i n c u b a t e a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 5 2 4 6 m i n u t e s p r i o r t o b e i n g d i v i d e d e q u a l l y i n t o f o u r E p p e n d o r f t u b e s c o n t a i n i n g 2 . 5 p L o f e i t h e r d d G T P , d d T T P , d d C T P , o r d d A T P . T h e s e r e a c t i o n s w e r e m i x e d a n d i n c u b a t e d a t 3 7 ° C f o r 2 0 m i n u t e s b e f o r e t h e m a g n e t w a s a p p l i e d a n d t h e r e a c t i o n c o m p o n e n t s s e p a r a t e d f r o m t h e u n i n c o r p o r a t e d n u c l e o t i d e c o n t a i n e d i n t h e s u p e r n a t a n t . S t o p s o l u t i o n w a s t h e n a p p l i e d a n d 2 . 5 p L o f t h e f r e s h l y d e n a t u r e d ( h e a t r e a c t i o n t u b e s a t 9 0 ° C f o r a t l e a s t 5 m i n u t e s a n d r e m o v e i m m e d i a t e l y t o i c e ) r e a c t i o n s w e r e l o a d e d o n t o a 6 % a c r y l a m i d e , 8 . 3 M u r e a g e l a n d e l e c t r o p h o r e s e d a t 7 0 w a t t s f o r 2 h o u r s a n d 3 0 m i n u t e s . T h e d r i e d g e l w a s e x p o s e d t o H y p e r f i l m ( A m e r s h a m , A r l i n g t o n H e i g h t s , I L ) f o r 3 - 7 d a y s . A n e x a m p l e o f t h e s e q u e n c e o b t a i n e d i s p r o v i d e d ( F i g u r e 5 ) . l h a v e b e e n a b l e t o r e a d 3 1 3 b p u s i n g t h i s a p p r o a c h a n d h a v e o b t a i n e d 9 8 . 7 % s i m i l a r i t y t o t h e c o m b i n e d s e q u e n c e s B r o w n a n d c o - w o r k e r s ( B r o w n e t a l . , 1 9 8 8 ) a n d N e a d e s a n d a s s o c i a t e s ( N e a d e s e t a l . , 1 9 9 1 ) ( F i g u r e 6 ) . A d d i t i o n a l l y , a s i n d i c a t e d i n t h e t e x t o f C h a p t e r 3 , w e c a r r i e d o u t l i m i t e d c y c l e s o f a m p l i f i c a t i o n t o p r e v e n t e r r o n e o u s c o n c l u s i o n s f r o m b e i n g d r a w n c o n c e r n i n g t h e l e v e l o f m e t h y l a t i o n i n t h e r e g i o n s o f i n t e r e s t . T h i s w a s a c c o m p l i s h e d b y c a r r y i n g o u t t h e P C R r e a c t i o n a s d e s c r i b e d i n C h a p t e r 3 , r e m o v i n g a r e a c t i o n t u b e f r o m t h e t h e r m a l c y c l e r e v e r y 2 c y c l e s a n d p l a c i n g i t i n a s e c o n d t h e r m a l c y c l e r t o c a r r y o u t t h e f i n a l e x t e n s i o n t o a l l o w f o r c o m p l e t e e x t e n s i o n o f a l l P C R p r o d u c t s . T h e r e s u l t a n t r e a c t i o n p r o d u c t s w e r e v i s u a l i z e d o n a n e t h i d i u m b r o m i d e s t a i n e d 1 % a g a r o s e / 1 % N u S i e v e g e l a n d c o m p a r i s o n s w e r e m a d e c o n c e r n i n g t h e a b i l i t y t o d i s c e r n a m p l i f i e d p r o d u c t . W e d e t e r m i n e d . 2 4 7 2 5 c y c l e s w e r e o p t i m a l f o r p r i m e r s e t 5 / 8 ( F i g u r e 7 ) a n d 2 4 c y c l e s w e r e o p t i m a l f o r p r i m e r s e t 6 ” ( F i g u r e 8 ) . 2 4 8 F i g u r e 5 - D i d e o x y s e q u e n c i n g l a d d e r o f t h e p o r t i o n o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s a m p l i f i e d b y P C R p r i m e r s e t 5 / 8 . P C R a m p l i f i c a t i o n w a s c a r r i e d o u t u s i n g b i o t i n y l a t e d p r i m e r 5 a n d n o n - b i o t i n y l a t e d p r i m e r 8 i n e x c e s s . S t r e p t a v i d i n - c o a t e d m a g n e t i c p o r o u s g l a s s b e a d s a n d a s t r o n g m a g n e t w e r e u t i l i z e d t o s e p a r a t e t h e D N A s t r a n d s u n d e r d e n a t u r i n g c o n d i t i o n s . S e q u e n c i n g w a s c a r r i e d o u t o n t h e s i n g l e s t r a n d e d p r o d u c t w i t h p r i m e r 8 a s t h e s e q u e n c i n g p r i m e r a n d S e q u e n a s e v e r s i o n 2 . 0 . . . a . w . . a . u . = : . . 5 : 5 : 1 . 3 . : . . . . . . . 3 : . . . . . . w . : 2 4 9 F i g u r e 5 . . 3 4 . . . . . . F B S f c o ( ( t 9 o u N r w 0 n p i o 8 l v l h t f g 6 E a e o e o m . H r 3 k p l e G 7 a e F r a C t a % C I s - 6 e a R i 1 g A p r r s G s a n r d m h n t s m r r d - a i a p i o a e , l d n t a n u C n o g a i d c u r t o d , s k 9 i o e p h p N m t e n a p a 9 e l y a M l h o w e r c % o g e w m i o r i i v R f c s e t u e I o ( a r h r s t H c G s e s w m a a o h q e e t e n i i - s e u n h . h e n a a o t l t e . i s c l f s n c t i e t d e e t c r e r e e e l s e e q T ( t t s r e s r u e q u i t e r e r o t m s u r i h o ) m r n e l s g w p e e h B e C m s a ) n c c e e s a w e n e r u v 5 i a q d ’ a t t u s l y e f o o . o b f n c a o c a o G n s t t l b T k a h . e m r i f t , h i s p n o o s i a n i a e u g r p 8 a e r e n r e 9 s , r h r 1 p t d e e e i f r ; l i q 1 i g o 8 d g s r o n t o o u 9 n u o 9 p o e e n r s 4 m N d g n t i ) o r e e i e c n f i s r n o - d o p a r i e g p t l n o t m e r e f t l o t a f e q e e t h s r h h - r e e o r t d u a e e “ 8 l . r e t e s r l C ” o h e a p u G T ' i t g i n B e n t c p a 5 m h s r l e e t e t ) u n g i a , h . e t ( s f a t 3 l r f i D t i 9 s l 9 e l c i A t g N r o i g r o 1 e u e f t n a r ) e b o q t s u t i t n r r u a a e r h w o e t f e i f g e n e n e r o m f r c e o o r ' f o 5 o e d m e a n n r i s u e t F r l 1 d u n e k n h 1 i 2 5 0 C A A A G G C C C A C G A G T G G A A A G G T C A T C C C G A C C G G G T A T T G G T G T C G G G G l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l I l l l l l I l I l l l l l l l l l l l l . . . . . . . . g a c g a g t g g a a a g g t c a t c c c g a c c g g g t a t t g g t g t c g g g g A C A G T c a s c a c c c c c c a c c c a n r m c a c a s c m c a c a c a c m c c c 0 0 0 » . l l I l l l l I I l l l I I l I I I I l l l l l l l l l I l I I l l l l l l l l l l I l l l l l l l a c a g t c a g c a c c g c g g a c g c a a t a a c a g a g g a a g a c a g a g t t c g c c g g a a C C C C C T A G C T G C C T G T T C T C G T A G G T C G A G G T G G A G C A A A G G C T C A T C C T I I l I l I l l I l l l l I l l l l I I l l I l I I I l I I l I l I I l I l I I I l I I l l l l l . c c c c t a g c t g c c t g t t c t c g t a g g t c g a g g t g g a g c a a a g g c t c a t c c t G G G G C A G C G T C G G C C A T C A C A C C G C G C T C T T C G T G T T T T G G A G A A G A C C A I l l l I l l l I I l l I I I l l l l l l l l l I l l l = l l l l I I l ‘ I I l I l I I I I I l l l g g g g c a g c g t c g g c c a t c a c a c c g c g c t n t t c g t g t t t t g g a g a a g a c c . c c c c c c ' r A C c c c ' r c r c a n c ' r c c a c c ' r c c m c a c ' r s c a c m c c r c x m c r I l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l I l l l l l l l l l I l l l l l l l . . c c c c t a c c g c t c t c a a a c t c g a g g t c c a a c a c t g c a g a a g c t c a t a c t G C G T C C A T T T G A A G A A C A C C C C G A A A G T C A G A A A A G T T G G T A T T G G G G C G l l l l l l l l l l l l I I l I I I I I I I I I I I l I l l l l l l l l l l l l l I l l I l l l g c g t c c a t t t g a a g a a c g a c c c g a a a g t c a g a a a a g t t g g t a t t g g g g c g m r c m c ' r c ' r r c c a c c c a c ' r c a a c c n c ' r a c c c ' r a c u c ' r c ' r c ' r c a c a c I I l I I I l I l l I I I I I l I I l I l l l l O a a t g a a g t g t t C O s a c c a t h a a g c a a o O O , O O O O O O O O O O O O O O O O O O O 2 5 1 M C 2 0 c y c l e s 2 3 c y c l e s 2 5 c y c l e s 3 0 c y c l e s F i g u r e 7 - L i m i t e d P C R c a r r i e d o u t f o r o p t i m i z a t i o n o f t h e n u m b e r o f r o u n d s o f a m p l i f i c a t i o n t o u s e f o r P C R p r i m e r s e t 5 / 8 . D N A f r o m t w o a n i m a l s w a s s u b j e c t e d t o M s p l p r e - P C R d i g e s t i o n ( + ) , o r n o t s u b j e c t e d t o p r e - P C R d i g e s t i o n ( - ) , a n d t h e r e a c t i o n w a s c a r r i e d o u t u s i n g t h e c o n d i t i o n s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s o f C h a p t e r 3 e x c e p t t h a t f o u r r e a c t i o n t u b e s w e r e r e m o v e d f r o m t h e t h e r m a l c y c l e r a f t e r 2 0 , 2 3 , 2 5 , a n d 3 0 c y c l e s t o a s e c o n d t h e r m a l c y c l e r t o c a r r y o u t t h e f i n a l e x t e n s i o n . A l i q u o t s o f e a c h r e a c t i o n w e r e e l e c t r o p h o r e s e d o n a 1 % a g a r o s e / 1 % N u S i e v e g e l a n d t h e D N A v i s u a l i z e d b y e t h i d i u m b r o m i d e f l u o r e s c e n c e . T h e o p t i m a l n u m b e r o f c y c l e s ( 2 5 c y c l e s ) w a s d e t e r m i n e d t o b e t h e n u m b e r t h a t p e r m i t t e d c o n s i s t e n t v i s u a l i z a t i o n o f t h e u n d i g e s t e d p r o d u c t , b u t d i d n o t o v e r - a m p l i f y t h e p r e - P C R d i g e s t e d p r o d u c t , e . g . , a s i n 3 0 c y c l e s . 2 5 2 F i g u r e 8 - L i m i t e d P C R c a r r i e d o u t f o r o p t i m i z a t i o n o f t h e n u m b e r o f r o u n d s o f a m p l i f i c a t i o n t o u s e f o r P C R p r i m e r s e t 6 / 7 . D N A f r o m o n e a n i m a l w a s s u b j e c t e d t o M s p l p r e - P C R d i g e s t i o n ( + ) , o r n o t s u b j e c t e d t o p r e - P C R d i g e s t i o n ( - ) , a n d t h e r e a c t i o n w a s c a r r i e d o u t u s i n g t h e c o n d i t i o n s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s o f C h a p t e r 3 e x c e p t t h a t t w o r e a c t i o n t u b e s w e r e r e m o v e d f r o m t h e t h e r m a l c y c l e r a f t e r 2 2 , 2 4 , 2 6 , 2 8 , a n d 3 0 c y c l e s t o a s e c o n d t h e r m a l c y c l e r t o c a r r y o u t t h e f i n a l e x t e n s i o n . A l i q u o t s o f e a c h r e a c t i o n w e r e e l e c t r o p h o r e s e d o n a 1 % a g a r o s e / 1 % N u S i e v e g e l a n d t h e D N A v i s u a l i z e d b y e t h i d i u m b r o m i d e f l u o r e s c e n c e . T h e o p t i m a l n u m b e r o f c y c l e s ( 2 4 c y c l e s ) w a s d e t e r m i n e d t o b e t h e n u m b e r t h a t p e r m i t t e d c o n s i s t e n t v i s u a l i z a t i o n o f t h e u n d i g e s t e d p r o d u c t , b u t d i d n o t o v e r - a m p l i f y t h e p r e - P C R d i g e s t e d p r o d u c t o r a l l o w f o r a m p l i f i c a t i o n o f n o n - s p e c i f i c p r o d u c t s , e . g . , a s i n 3 0 c y c l e s . A P P E N D I X 2 M e t h y l a t i o n S t a t u s o f C C G G S i t e s i n L i v e r D N A : H p a l l M e t h y l a s e I n a d d i t i o n t o a n a n a l y s i s o f “ g l o b a l ” l i v e r D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s u s i n g S s s l m e t h y l a s e ( i . e . , C p G m e t h y l a s e ) t h a t m e t h y l a t e s D N A a t a l l u n m e t h y l a t e d C p G s i t e s , a s d e s c r i b e d i n C h a p t e r 4 , a s i m i l a r s e r i e s o f e x p e r i m e n t s w a s c a r r i e d o u t u t i l i z i n g H p a l l m e t h y l a s e ( N e w E n g l a n d B i o l a b s , B e v e r l y , M A ) . H p a l l m e t h y l a s e u t i l i z e s [ 3 H - C H 3 ] S A M t o d o n a t e a r a d i o l a b e l e d m e t h y l g r o u p t o D N A u n m e t h y l a t e d a t t h e i n t e m a l C o f a C C G G s i t e . I n t h i s r e g a r d , I h a v e b e e n a b l e t o e x a m i n e t h e “ g l o b a l ” m e t h y l a t i o n s t a t u s o f a s u b s e t o f t h e a v a i l a b l e C p G s i t e s i n D N A . T h e a v e r a g e c p m / p g / h r i n c o r p o r a t i o n f o r H p a l l m e t h y l a s e r e a c t i o n s f r o m e a c h a n i m a l i s p r o v i d e d f o r B 6 C 3 F 1 ( T a b l e 1 ) a n d C S 7 B L / 6 ( T a b l e 2 ) . W h e n u s i n g H p a l l m e t h y l a s e c o n s i d e r a b l e v a r i a b i l i t y i n i n c o r p o r a t i o n w a s n o t e d ( i . e . , a l a r g e r s p r e a d o f v a l u e s w a s o b t a i n e d f o r a g i v e n a n i m a l ) ; h o w e v e r , t h e t r e n d s o b t a i n e d w e r e s i m i l a r t o t h a t o b t a i n e d w i t h S s s l m e t h y l a s e . T w e l v e w e e k s o f C M D d i e t a d m i n i s t r a t i o n l e d t o h y p o m e t h y l a t i o n i n b o t h s t r a i n s , w h e r e t h e i n c r e a s e w a s l a r g e r i n t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C S 7 B L / 6 ; s i m i l a r t o t h e r e s u l t s o b t a i n e d w i t h S s s l m e t h y l a s e . T h e a v e r a g e c p m / p g / h r i n c o r p o r a t i o n f o r S s s l m e t h y l a s e r e a c t i o n s f r o m e a c h a n i m a l i s p r o v i d e d f o r B S C 3 F 1 ( T a b l e 3 ) a n d C S 7 B U 6 ( T a b l e 4 ) . T h e r e w a s a n a d d i t i o n a l o b s e r v a t i o n t h a t c o u l d b e m a d e c o n c e r n i n g t h e H p a l l m e t h y l a s e d a t a t h a t w a s n o t o b s e r v e d w i t h S s s l m e t h y l a s e ; e a s e p r o m o t e r t r e a t m e n t l e d t o a n i n c r e a s e i n h y p o m e t h y l a t i o n i n t h e B 6 C 3 F 1 a t 2 5 3 s e 1 5 0 0 . . . . 4 9 6 7 4 2 3 1 3 8 3 5 2 2 2 2 2 2 2 2 2 9 5 2 u 6 . . . . l a V d l a m i n e A g a 9 0 3 6 6 2 8 1 5 5 4 7 3 2 1 7 2 2 2 1 1 1 4 5 7 3 2 r 4 5 . . . . . . e l v a 5 0 2 4 2 6 9 0 1 7 6 4 2 4 6 2 5 5 0 1 m 2 A - s n o i t c a e R e s a i n A 3 l l y a h m t e M l l i n A 6 7 5 6 . . 6 . 5 4 6 a 6 p 4 4 9 5 5 7 H 1 1 F 4 1 1 1 2 2 1 3 0 6 8 5 3 7 . . 4 8 7 9 4 1 9 0 1 2 9 0 4 3 2 2 0 6 B : 1 e l b 5 1 1 9 8 6 2 2 2 1 1 1 @ d e g d o a l T B B P P o B o n B P n P D D l l r r M M t t s i d p @ A m N u D p o # c C c C n # l 4 k e e W T R E A T M E N T A n i m a l 1 A n i m a l 2 A n i m a l 4 A V E R A G E ] W e e k 1 W e e k 1 W e e k 1 W e e k 1 W e e k 2 W e e k 2 W e e k 2 W e e k 2 c t r l n o P B ‘ C M D n o P B c t r l P B C M D P B R e c o v e r y c t r l n o P B R e c o v e r y C M D n o P B R e c o v e r y c t r l P B R e c o v e r y C M D P B I i i . . . I n o a n i m a l [ 1 8 8 1 0 . 6 1 7 9 9 3 . 2 1 9 7 3 3 . 6 2 4 8 2 5 . 9 2 7 9 4 0 . 4 2 1 4 4 8 . 2 2 3 9 7 1 . 9 , 2 2 3 8 2 . 6 2 4 4 2 6 . 9 1 7 8 3 5 . 8 2 0 5 2 4 . 7 1 5 7 7 9 . 8 2 0 0 6 8 . 1 2 0 2 5 2 . 8 2 2 1 6 4 . 6 2 0 7 6 9 . 7 2 1 5 2 9 . 1 1 8 4 4 0 . 6 2 1 8 6 5 . 9 1 3 7 9 9 . 6 1 6 2 1 7 . 8 2 3 5 1 6 . 8 2 3 4 0 8 2 5 2 5 5 . 6 1 8 9 6 1 . 9 2 4 1 8 2 . 9 # 2 4 7 0 0 . 6 1 8 1 3 9 . 8 2 8 9 2 8 . 9 2 1 6 8 1 . 3 2 2 8 9 0 . 9 1 8 8 2 4 . 9 2 4 4 3 5 . 6 1 8 6 9 4 . 2 2 0 3 1 7 . 9 2 0 2 2 1 . 3 2 2 4 4 1 . 2 @ 2 0 7 7 1 . 1 2 3 0 7 0 . 1 2 3 6 2 0 2 0 8 3 9 . 2 1 8 2 5 8 . 6 2 7 5 7 7 . 9 2 1 4 9 8 . 7 @ 2 5 6 7 0 . 2 2 0 2 3 8 ( 1 7 5 9 2 . 2 1 5 5 5 9 . 9 1 6 0 0 8 . 9 2 0 9 2 5 . 2 2 2 6 9 7 . 7 2 4 9 0 5 . 7 2 1 5 8 2 . 9 1 8 3 7 0 . 8 2 0 5 9 7 . 6 1 7 6 8 9 . 7 1 6 9 8 9 . 2 2 2 4 3 4 . 9 2 2 1 5 7 . 6 2 0 0 2 2 . 7 2 6 6 9 5 . 6 2 0 1 5 2 . 3 2 0 9 7 5 . 5 , @ 1 8 7 4 3 . 7 2 3 6 7 5 4 1 4 2 0 7 . 6 i i i i t 1 6 0 1 5 . 2 l 2 1 0 9 0 . 3 2 2 0 5 8 . 9 2 2 7 0 0 . 6 2 2 1 9 7 . 3 1 9 8 0 0 . 2 2 1 8 7 9 . 0 2 1 0 3 1 . 1 2 1 2 0 9 . 9 2 0 9 7 5 . 2 1 8 1 7 1 . 1 1 6 3 4 2 . 5 - 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U n l i k e t h e r e s u l t s o b t a i n e d w i t h S s s l m e t h y l a s e t h e B 6 0 3 F 1 d i d n o t e x h i b i t h y p o m e t h y l a t i o n a t w e e k s 2 o r 4 w i t h a n y p r o m o t e r t r e a t m e n t . T h e r e c o v e r y g r o u p w a s a t c o n t r o l l e v e l s i n t h e C M D d i e t g r o u p ( F i g u r e 1 ) , b u t f o r t h e P B ( F i g u r e 2 ) a n d C M D + P B ( F i g u r e 3 ) g r o u p s t h e l e v e l o f m e t h y l a t i o n i n t h e 8 6 C 3 F 1 r e c o v e r y g r o u p s w a s s i g n i f i c a n t l y b e l o w c o n t r o l v a l u e s ( i . e . , h y p e r m e t h y l a t e d ) . T h e 0 5 7 B L / 6 d i d n o t e x h i b i t h y p o m e t h y l a t i o n a t w e e k s 1 o r 4 ; t h e r e c o v e r y g r o u p s a l s o d e m o n s t r a t e d m e t h y l a t i o n s t a t u s s i m i l a r t o t h e c o n t r o l s . I n s u m m a r y , t h e s e r e s u l t s a r e c o n s i s t e n t g e n e r a l l y w i t h t h e c o n c l u s i o n s p r e s e n t e d i n C h a p t e r 4 ; h y p o m e t h y l a t i o n o c c u r s a t a n e a r l i e r t i m e a n d t o a l a r g e r e x t e n t i n t h e B 6 C 3 F 1 a s c o m p a r e d t o t h e C 5 7 B U 6 . H o w e v e r , i t a p p e a r s t h a t a f t e r t h e h y p o m e t h y l a t i o n o c c u r s a t t h e i n t e r n a l 0 o f C C G G s i t e s , i t i s “ c o r r e c t e d ” e v e n w i t h c o n t i n u e d p r e s e n c e o f t h e p r o m o t e r . H p a l l m e t h y l a s e m a y b e b e t t e r a b l e t o p r o v i d e u s e f u l i n f o r m a t i o n a b o u t t h e i m p o r t a n c e o f a p a r t i c u l a r s i t e , t h a t i s , t h e C C G G s i t e s m a y r e p r e s e n t a s u b p o p u l a t i o n o f s i t e s t h a t a r e a t c r i t i c a l s i t e s f o r n o r m a l g e n e e x p r e s s i o n . T h e r e f o r e , h o m e o s t a t i c m e c h a n i s m s a p p e a r t o e x i s t t o m a i n t a i n t h e n a s c e n t m e t h y l a t i o n s t a t u s a n d t h i s t a k e s p l a c e v e r y s o o n a f t e r t h e a l t e r a t i o n s o c c u r . T h e u s e o f S s s l m e t h y l a s e , w h i l e p r o v i d i n g m o r e i n f o r m a t i o n b e c a u s e o f t h e f a c t t h a t i t r e c o g n i z e s m o r e s i t e s , m a y m a s k t h e d e t a i l e d a s p e c t s o f m e t h y l a t i o n s t a t u s . I b e l i e v e , c o n s i d e r i n g t h e v a r i a b i l i t y o b s e r v e d w i t h H p a l l m e t h y l a s e , t h a t S s s l m e t h y l a s e p r o v i d e s m o r e u s e f u l a n d c o n s i s t e n t i n f o r m a t i o n r e g a r d i n g g l o b a l a l t e r a t i o n s i n m e t h y l a t i o n s t a t u s . F o r s p e c i f i c c h a r a c t e r i z a t i o n o f f i n i t e a l t e r a t i o n s a P C R - 2 5 9 b a s e d a p p r o a c h , o r e x a m i n a t i o n o f t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f a p a r t i c u l a r g e n e s h o u l d b e u t i l i z e d . - t , s r d i H a o s n 3 f l a o [ n d . s o 1 i e r e e s t n t u l l o z a t o F r i a a c e 3 l t v i l p n 0 t y m e o 6 o r h u c r 8 t r u e f e e o d n h e m m r i e g / y o e z n p w c g a A r u n y e N r h s e / e n e m v D f p a o , r s e i f c e h i t v d c u e h i t T h e a l T h t f R o . T n e f o s e y a l c . t i s . t c f e t . n e l e t i n t r i i s d n i n a c i s g o m r i p i e s n l i p G e a l y a G s l a m u l e i p H t C a t h s a c t a f t C i h o s c s d t r d a i o f e s n t e e s u o a t t e s t t i a t a s a u e t r l l a s l y a a n i p y a x h v n s h e r t o e e t e t i h t s e m d t t o a m n n l n a u n e y A i e s h y N d u d a t n * o t e e D g b a m m e h o a s . f o h r s o s c t e e t s p u a v C o e d a n s e r r o a g e l o g t o a f a r e r t n l e i y r 6 e w d e d v t h t = ) e a n 2 D e i s n m M u d d e f . n n C h s a a o t t s a a e n 1 o t l f w o t - a o i s e t e T m n s a p i s l o u n r a ’ b i o o a l a t t p y r n T a r g e ( h r h t t o c d c s e n l a u p i m i y e t u n h S o i l t n m r i d m o l e g e d a r m l a p e s i f a e a n H a a h e t e . r t - A i o N s e c t w f o c n a t D l a i i n t m n a m o c i n o e e n d g a f n l s a f i o E a t s e s e m a m - u h i 1 6 ) M t t t A n 5 f e 0 U S e o 8 r . ] B r u 0 a 7 3 s t h g < p c a i p p a e 5 H F C a l C ( e 2 6 0 2 1 k e e W y r e v o 4 k e e W 2 k e e W . 1 e r % % % % u g i F 0 0 0 0 5 1 9 7 1 1 l o n u o o % 1 6 0 % 1 4 0 % 1 3 0 % 1 2 0 % 1 0 0 % 8 0 % R e c 2 6 1 F i g u r e 2 - E f f e c t o f t h e a d m i n i s t r a t i o n o f a p r o m o t i n g d o s e o f P B i n t h e d r i n k i n g w a t e r ( 0 . 0 5 % w / w ) o n t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f H p a l l s i t e s o f l i v e r D N A i n 8 6 0 3 F 1 a n d C 5 7 B U 6 m a l e m i c e . H p a l l m e t h y l a s e w a s u s e d t o a s s e s s D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s i n d i r e c t l y . T h e e n z y m e u t i l i z e s [ 3 H - C H 3 ] S A M t o d o n a t e a m e t h y l g r o u p t o t h e i n t e r n a l C o f a n y u n m e t h y l a t e d C C G G s i t e s . T h u s , h y p o m e t h y l a t i o n i s a p p a r e n t a s a n i n c r e a s e i n i n c o r p o r a t i o n o f m e t h y l g r o u p s . * d e n o t e s a s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m c o n t r o l s , ( p < 0 . 0 5 ) u s i n g a t w o - t a i l e d S t u d e n t ’ s T - t e s t . n = 6 f o r e a c h m o u s e s t r a i n a t e a c h t i m e p o i n t . R e a c t i o n s w e r e r e p e a t e d a t l e a s t 8 t i m e s o n D N A f r o m e a c h a n i m a l a n d a v e r a g e d t o o b t a i n t h e v a l u e f o r t h e a n i m a l . T h e c p m / p g / h o u r v a l u e f o r e a c h o f t h e a n i m a l s i n a g r o u p ( T a b l e s 1 a n d 2 ) w e r e a v e r a g e d a n d e x p r e s s e d a s a p e r c e n t o f t h e a v e r a g e d c o n t r o l s . 2 6 2 . 2 e r u g i F % % % % % % % % % 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 5 4 3 2 1 0 9 7 1 1 1 1 1 1 1 | o . u u o o % 8 0 % 2 6 3 F i g u r e 3 - E f f e c t o f t h e a d m i n i s t r a t i o n o f t h e c o - a d m i n i s t r a t i o n o f a C M D d i e t a n d a p r o m o t i n g d o s e o f P 8 i n t h e d r i n k i n g w a t e r ( 0 . 0 5 % w / w ) o n t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f H p a l l s i t e s o f l i v e r D N A i n B 6 C 3 F 1 a n d C 5 7 B U 6 m a l e m i c e . H p a l l m e t h y l a s e w a s u s e d t o a s s e s s D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s i n d i r e c t l y . T h e e n z y m e u t i l i z e s [ 3 H - C H 3 ] S A M t o d o n a t e a m e t h y l g r o u p t o t h e i n t e r n a l C o f a n y u n m e t h y l a t e d C C G G s i t e s . T h u s , h y p o m e t h y l a t i o n i s a p p a r e n t a s a n i n c r e a s e i n i n c o r p o r a t i o n o f m e t h y l g r o u p s . * d e n o t e s a s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m c o n t r o l s , ( p < 0 . 0 5 ) u s i n g a t w o - t a i l e d S t u d e n t ’ s T - t e s t . n = 6 f o r e a c h m o u s e s t r a i n a t e a c h t i m e p o i n t . R e a c t i o n s w e r e r e p e a t e d a t l e a s t 8 t i m e s o n D N A f r o m e a c h a n i m a l a n d a v e r a g e d t o o b t a i n t h e v a l u e f o r t h e a n i m a l . T h e c p m / u g / h o u r v a l u e f o r e a c h o f t h e a n i m a l s i n a g r o u p ( T a b l e s 1 a n d 2 ) w e r e a v e r a g e d a n d e x p r e s s e d a s a p e r c e n t o f t h e a v e r a g e d c o n t r o l s . 2 6 4 y r e v o c e R . 3 e r u g i F % % % % % % % 0 0 0 0 0 0 0 6 4 2 1 0 9 7 1 1 1 1 1 l o n u o o o / ° 1 5 0 % 1 3 0 % 8 0 % W e e k 4 2 6 5 A P P E N D I X 3 C e l l P r o l i f e r a t i o n : A d d i t i o n a l I n f o r m a t i o n T h e H o f f m a n n - L a R o c h e a n i m a l n u m b e r s a r e p r o v i d e d a s a k e y f o r t h e B G C S F 1 m i c e u s e d i n t h i s s t u d y ( T a b l e 1 ) . A d d i t i o n a l l y , t h e i n d i v i d u a l h e p a t o c y t e l a b e l i n g i n d e x ( L l ) ( T a b l e 2 ) a n d n o n - h e p a t o c y t e L l ( T a b l e 3 ) a r e p r o v i d e d . T h e s e v a l u e s p e r m i t a n e x a m i n a t i o n o f a l t e r a t i o n s i n c e l l p r o l i f e r a t i o n , m e t h y l a t i o n c h a n g e s ( T a b l e s 1 - 4 f r o m A p p e n d i x 2 ) , a n d g e n e e x p r e s s i o n i n a p a r t i c u l a r a n i m a l . T h e c h a n g e s i n h e p a t o c y t e p o p u l a t i o n s a r e i l l u s t r a t e d f o r t o t a l n u c l e i ( F i g u r e 1 ) a n d l a b e l e d n u c l e i ( F i g u r e 2 ) . T h e s e d a t a d e m o n s t r a t e a n i n c r e a s e i n t h e k a r y o m e g a l o c y t e p o p u l a t i o n w i t h P 8 a d m i n i s t r a t i o n . T h i s p r o v i d e s a n i n d i c a t i o n o f t h e n u c l e a r s w e l l i n g e x p e c t e d t o b e i n d u c e d b y P B a n d , t h e r e f o r e , s e r v e s a s a n i l l u s t r a t i o n o f t h e v a l i d i t y o f o u r i m a g e a n a l y s i s s y s t e m . S i m i l a r l y , f o r t h e C 5 7 B U 6 t h e H o f f m a n n - L a R o c h e a n i m a l n u m b e r k e y u s e d i n t h i s s t u d y i s p r o v i d e d ( T a b l e 4 ) a l o n g w i t h t h e i n d i v i d u a l h e p a t o c y t e L I ( T a b l e 5 ) a n d n o n - h e p a t o c y t e L l ( T a b l e 6 ) . T h e c h a n g e s i n t o t a l h e p a t o c y t e n u c l e i ( F i g u r e 3 ) a n d l a b e l e d h e p a t o c y t e n u c l e i ( F i g u r e 4 ) a r e p r o v i d e d . T h e C S 7 B U 6 a l s o d e m o n s t r a t e t h e c h a r a c t e r i s t i c n u c l e a r s w e l l i n g i n r e s p o n s e t o P B , a s r e f l e c t e d b y a n i n c r e a s e i n k a r y o m e g a l o c y t e s . T h e l a b e l i n g i n d i c e s o f n o n - h e p a t o c y t e s i n B S C S F 1 a n d C S 7 B L / 6 i n r e s p o n s e t o C M D d i e t a d m i n i s t r a t i o n ( F i g u r e 5 ) , P B a d m i n i s t r a t i o n ( F i g u r e 6 ) , a n d t h e c o — a d m i n i s t r a t i o n o f C M D d i e t w i t h P B ( F i g u r e 7 ) i l l u s t r a t e t h e i n f i l t r a t i o n 2 6 6 1 1 8 9 6 2 7 4 6 4 L L L L L H H H H H 6 l a m i n A ' 5 l 3 9 1 7 3 8 1 4 6 4 6 L L L L L H H H H H a m i n A 4 l y e a 4 0 4 5 9 2 K l a m i m i n A 1 4 8 6 3 6 L L L L L L H H H H H H n 3 A 1 l # a m 2 5 0 1 3 7 3 # F i 1 3 6 9 3 5 8 8 3 C 6 8 : 1 e n A 2 l a m i L L L L L L L L H H H H H H H H 1 4 7 2 5 O 7 3 5 7 3 5 B l n L L L L L L L b A H H H H H H H a T 1 l a m i n A 6 3 9 5 0 6 2 2 4 7 2 5 7 L L L L L L L H H H H H H H 1 1 2 4 k k k 2 4 c d c o e l d e g k w w w k k e l r a w - - s - w w r - c 1 m 2 T 4 1 k e i c i 2 k 4 - - - — N B B k w k w B k B d k e r n E B B P P B B P P w w - w - w a r - M P P P P B o o o o B B B o - - - - p m T n P n P P n n P n B B B B o o o u o A n E P n n P n P P D D D D D D D D p R r r r r r r # l l l l l l M M M M M M l l r r M M t t t t t t t t T c c C C c C c C c C c C c C c C # 2 6 7 4 5 2 8 8 2 7 3 8 . . . 0 0 0 3 3 2 7 3 1 3 1 9 . . . 7 9 0 9 4 3 . . 0 0 5 4 8 0 . . 2 1 3 6 5 1 2 6 6 9 6 . 8 4 6 0 . . 6 . . . 4 1 9 0 1 1 1 2 5 1 4 5 9 . . . . 3 . . 1 2 1 4 4 2 1 . 3 3 1 . . . 3 5 9 2 6 2 1 8 0 0 . . . . 6 2 7 1 2 4 9 2 5 1 1 3 7 . . . . 1 4 4 5 1 4 6 8 1 8 6 6 7 . . . . 1 1 8 3 2 B B P P o B o n B d e g d l o a l m s i i n d a p m o n P u n P D D l l r r M M t t c C C c p # # 1 1 1 1 1 4 4 4 4 k k k k k k k e e e e e e e e e e e e e e W W W W W W W 3 T a b l e 2 : B S C 3 F 1 H e p a t o c y t e L a b e l i n g I n d e x T R E A T M E N T A n i m a l 1 A n i m a l 2 A n i m a l 3 A n i m a l 4 A n i m a l 5 A n i m a l 6 A V E R A G E S E W r c t r l n o P B c m n o P B 4 . 2 7 0 . 5 5 4 . 8 7 1 . 4 7 1 . 8 7 1 . 5 5 2 . 4 3 0 . 7 0 4 C M D n o P B 6 . 5 3 7 . 3 3 1 0 . 8 8 7 . 4 7 8 . 8 4 8 . 6 8 . 2 8 0 . 6 2 7 c t r l P B 3 . 6 6 1 . 1 3 1 . 4 2 1 . 7 7 0 . 4 1 . 8 7 3 1 . 7 1 3 0 . 4 4 6 C M D P B . . . . . . I R e c o v e r y ’ c t r l n o P B 3 . 7 2 R e c o v e r y ‘ C M D n o P B R e c o v e r y c t r l P B ‘ l t i fi fi 2 6 8 6 x l e d n I g n i l a m i n A 5 e l b a a m L e t y c o i n A 4 t I a p e a m i n h A l - n o N 3 1 a I F m i 3 n C S B A l 8 4 1 1 . . 0 3 2 . 1 5 1 3 1 . . : 2 3 3 1 2 e l b a T , 3 6 . 6 1 T N E M T A E R T d e g l d a o m l i s n i a d o p n m u ' p " # “ # A n i m a l 1 I A n i m a l 2 A V E R A G E I c t r l n o P B - w k 1 C M D n o P B - w k 1 c t r l P B - w k 1 1 2 . 0 3 ) 1 3 . 2 1 5 . 8 4 1 6 . 0 6 8 . 9 2 8 . 7 6 4 . 3 4 8 . 2 3 2 4 . 6 5 2 4 . 1 1 2 7 . 1 3 1 1 . 9 2 C M D P B - w k 1 c t r l n 0 P B - w k 2 C M D n o P B - w k 2 8 . 0 9 [ 8 . 5 2 , 8 . 9 3 1 7 . 0 5 1 # # 1 4 . 4 6 1 1 . 5 7 c t r l n o P B — w k 4 C M D n o P B - w k 4 c t r l P B - w k 4 C M D P B w k 4 6 . 8 2 6 . 4 2 1 0 . 2 4 1 0 . 1 1 1 1 . 3 2 1 . 6 . 6 9 1 . 0 6 7 2 c t r l n o P B - r e c C M D n o P B - r e c c t r l P B - r e c C M D P B - r e c 4 . 2 3 7 . 3 6 3 . 2 5 8 . 0 9 3 . 8 2 1 0 . 2 2 " " " ' 6 . 6 8 1 9 . 3 1 3 . 5 8 2 6 9 F i g u r e 1 - C h a n g e s i n “ h e p a t o c y t e ” c e l l p o p u l a t i o n s i n B 6 0 3 F 1 t o t a l n u c l e i w i t h C M D d i e t , P B , a n d C M D d i e t + P B a f t e r 1 , 2 , o r 4 w e e k s a n d t h e r e c o v e r y ( 4 w e e k s t r e a t e d d i e t f o l l o w e d b y 2 w e e k s c o n t r o l ) . N u c l e i w e r e d e t e r m i n e d t o b e d e r i v e d f r o m h e p a t o c y t e s i f t h e r o u n d n e s s w a s > 0 . 7 5 a n d h a d a n a r e a < 0 . 7 5 u m z . N u c l e i w e r e d e t e r m i n e d t o b e d e r i v e d f r o m k a r y o m e g a l o c y t e s i f t h e a r e a w a s > 0 . 7 5 p m 2 a n d t h e r o u n d n e s s w a s > 0 . 7 5 . N u c l e i w e r e d e t e r m i n e d t o b e d e r i v e d f r o m b i n u c l e a t e d h e p a t o c y t e s i f t h e r o u n d n e s s w a s < 0 . 7 5 a n d t h e a r e a w a s > 0 . 7 5 u m z . T h e i n c r e a s e i n t h e k a r y o m e g a l o c y t e p o p u l a t i o n i l l u s t r a t e s t h e e x p e c t e d n u c l e a r s w e l l i n g i n r e s p o n s e t o P B . 2 7 0 % % % % 0 0 0 O 0 6 8 L l % 0 l e m u p u n t u e u u e e u c t r l n o P B w k 1 c m d n o P B w k 1 c t r l + P B w k 1 c m d + P b w k 1 c t r l n o P B w k 2 c m d n o P B w k 2 c t r I + P B w k 2 ~ c m d + P B w k 2 c t r l n o P B w k 4 c m d n o P B w k 4 c t r l + P B w k 4 c m d + P B w k 4 c t r l n o P B r e c o v c m d n o P B r e c o v c t r l + P B r e c o v c m d + P B r e c o v % 0 % 0 3 L L Z % 0 8 % 0 1 7 o n N i a 1 1 7 1 0 1 I O i n a H “ m o ; [ : 1 % 0 9 o a w o x t g x 1 1 7 1 0 1 I I % 0 9 ' l B J R D H “ E r - 1 G U I . . - d r o o p h d e - O h h u ) U J O 1 4 3 m . 0 . m 1 . 3 w L U O l 9 F i g u r e 2 - C h a n g e s i n “ h e p a t o c y t e ” c e l l p o p u l a t i o n s i n B 6 C 3 F 1 l a b e l e d n u c l e i w i t h C M D d i e t , P B , a n d C M D d i e t + P B a f t e r 1 , 2 , o r 4 w e e k s a n d t h e r e c o v e r y ( 4 w e e k s t r e a t e d d i e t f o l l o w e d b y 2 w e e k s c o n t r o l ) . N u c l e i w e r e d e t e r m i n e d t o b e d e r i v e d f r o m h e p a t o c y t e s i f t h e r o u n d n e s s w a s > 0 . 7 5 a n d h a d a n a r e a < 0 . 7 5 u m z . N u c l e i w e r e d e t e r m i n e d t o b e d e r i v e d f r o m k a r y o m e g a l o c y t e s i f t h e a r e a w a s > 0 . 7 5 p m 2 a n d t h e r o u n d n e s s w a s > 0 . 7 5 . N u c l e i w e r e d e t e r m i n e d t o b e d e r i v e d f r o m b i n u c l e a t e d h e p a t o c y t e s i f t h e r o u n d n e s s w a s < 0 . 7 5 a n d t h e a r e a w a s > 0 . 7 5 u m z . T h e i n c r e a s e i n t h e k a r y o m e g a l o c y t e p o p u l a t i o n i l l u s t r a t e s t h e e x p e c t e d n u c l e a r s w e l l i n g i n r e s p o n s e t o P 8 . 2 7 2 O l V 0 0 d 1 B 1 1 H 8 1 1 1 1 7 0 1 0 0 1 1 : I 1I e m u p u n t u e u n e e u ' 3 e J n B H * 5 % 0 0 1 c t r l n o P B w k 1 c m d n o P B w k 1 c t r l + P B w k 1 c m d + P b w k 1 c t r l n o P B w k 2 c m d n o P B w k 2 c t r l + P B w k 2 c m d + P B w k 2 c t r l n o P B w k 4 c m d n o P B w k 4 c t r l + P B w k 4 c m d + P B w k 4 c t r l n o P B r e c o v c m d n o P B r e c o v c t r l + P B r e c o v c m d + P B r e c o v S L Z § . 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N u c l e i w e r e d e t e r m i n e d t o b e d e r i v e d f r o m h e p a t o c y t e s i f t h e r o u n d n e s s w a s > 0 . 7 5 a n d h a d a n a r e a < 0 . 7 5 u r n " . N u c l e i w e r e d e t e r m i n e d t o b e d e r i v e d f r o m k a r y o m e g a l o c y t e s i f t h e a r e a w a s > 0 . 7 5 p m “ 3 a n d t h e r o u n d n e s s w a s > 0 . 7 5 . N u c l e i w e r e d e t e r m i n e d t o b e d e r i v e d f r o m b i n u c l e a t e d h e p a t o c y t e s i f t h e r o u n d n e s s w a s < 0 . 7 5 a n d t h e a r e a w a s > 0 . 7 5 u m z . T h e i n c r e a s e i n t h e k a r y o m e g a l o c y t e p o p u l a t i o n i l l u s t r a t e s t h e e x p e c t e d n u c l e a r s w e l l i n g i n r e s p o n s e t o P 8 . 2 7 7 O l V d S H 1 1 7 1 0 1 E ! e m u p u n m a m m a l ; % 0 0 l % 0 c t r l n o P B w k 1 c m d n o P B w k 1 c t r l + P B w k 1 c m d + P B w k 1 c t r l n o P B w k 2 c m d n o P B w k 2 c t r l + P B w k 2 c m d + P B w k 2 c t r l n o P B w k 4 c m d n o P B w k 4 c t r l + P B w k 4 c m d + P B w k 4 c t r l n o P B r e c o v c m d n o P B r e c o v c t r l + P B r e c o v c m d + P B r e c o v B A ? B n fi l s i — fi i fi i _ § 9 & W J Y 1 ° _ L ' 9 3 [ ' e e m fi g d F i g u r e 4 - C h a n g e s i n “ h e p a t o c y t e ” c e l l p o p u l a t i o n s i n 0 5 7 B L / 6 l a b e l e d n u c l e i w i t h C M D d i e t , P B , a n d C M D d i e t + P B a f t e r 1 , 2 , o r 4 w e e k s a n d t h e r e c o v e r y ( 4 w e e k s t r e a t e d d i e t f o l l o w e d b y 2 w e e k s c o n t r o l ) . N u c l e i w e r e d e t e r m i n e d t o b e d e r i v e d f r o m h e p a t o c y t e s i f t h e r o u n d n e s s w a s > 0 . 7 5 a n d h a d a n a r e a < 0 . 7 5 u r n " . N u c l e i w e r e d e t e r m i n e d t o b e d e r i v e d f r o m k a r y o m e g a l o c y t e s i f t h e a r e a w a s > 0 . 7 5 p m 2 a n d t h e r o u n d n e s s w a s > 0 . 7 5 . N u c l e i w e r e d e t e r m i n e d t o b e d e r i v e d f r o m b i n u c l e a t e d h e p a t o c y t e s i f t h e r o u n d n e s s w a s < 0 . 7 5 a n d t h e a r e a w a s > 0 . 7 5 p m " . T h e i n c r e a s e i n t h e k a r y o m e g a l o c y t e p o p u l a t i o n i l l u s t r a t e s t h e e x p e c t e d n u c l e a r s w e l l i n g i n r e s p o n s e t o P B . 2 7 9 9 3 W O O c A h H I V E M H O I B R N ' ' ‘ l V l l I V V l L O O O J J l . . I I D e m u , p u n t u a u n e e u ' 7 e l n fi g j c t r l n o P B w k 1 c m d n o P B w k 1 c t r l + P B w k 1 c m d + P B w k 1 c t r l n o P B w k 2 c m d n o P B w k 2 c t r l + P B w k 2 c m d + P B w k 2 c t r l n o P B w k 4 c m d n o P B w k 4 c t r l + P B w k 4 c m d + P B w k 4 c t r l n o P B r e c o v c m d n o P B r e c o v c t r l + P B r e c o v c m d + P B r e c o v 0 8 8 s s - 4 i i o r s w o s y t i l , s 2 e a a n h , a 1 t g n n r y i e o g s s f a u n A m o i ) i N 5 t D d 0 a . e r 0 t < e s s p t a i y ( b n c - i h o , m t s s d l a o a o p t r t n e t e i d h i n - c o c n a o M D d N M a e C . c d h r t ) n e l t o a a f r m t y a - n r o t e e c g c s i a i m s m k e m e e h o r l e c a w o f m e t 2 c s 6 n i / y e h L b o r n e B u f 7 f d e m S w m i d C i o l t d a l i n n o a v a f c n i t f o 1 e i i F t i n d g a 3 r i C s e 6 D f i y 8 l M l o l n a C r i c p s i t x l k s e l i d t e e n e a c i w f t s o g 4 n ( e a i l s r p e u e b u a o s t l r a o g e n e m e t d y y r t c * c e e . o r v t t . o s i a c ) d e p e e i - n t e T r g h n a e m s - a h I ’ n t t o s N a d e I H n - n N d d u a ( e 5 t r S , m e u r s e d u k s t e g e s a l i e e y i a F m s w t 2 8 1 l r t c l r t c l r t c % 5 2 F i g u r e 5 . 3 0 % m m m a » ? . 3 5 . 3 . . v " ” fl a g s 9 4 . . . " . . . w . % . % % 0 a c n 0 . 0 o . . . 2 O . . 0 I n o : 0 5 0 $ . - 1 1 2 S . x . 0 0 2 2 3 c t r l “ w a i v e w e } ; 1 F i g u r e 6 - N o n - h e p a t o c y t e l a b e l i n g i n d e x i n B 6 0 3 F 1 a n d C 5 7 B U 6 m a l e m i c e a f t e r P B a d m i n i s t r a t i o n f o r 1 , 2 , o r 4 w e e k s , a n d t h e r e c o v e r y g r o u p ( 4 w e e k s t r e a t m e n t f o l l o w e d b y 2 w e e k s w i t h o u t ) . N o n - h e p a t o c y t e D N A s y n t h e s i s i s m e a s u r e d a s a n i n d i r e c t m e a s u r e o f c e l l p r o l i f e r a t i o n v i a i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y a n d a M a c i n t o s h - b a s e d i m a g e a n a l y s i s s y s t e m ( N I H I m a g e ) . * d e n o t e s a s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m a g e - m a t c h e d c o n t r o l s , ( p < 0 . 0 5 ) u s i n g a t w o - t a i l e d S t u d e n t ’ s T - t e s t . 2 8 3 l r t c l r t c l r t c 2 k e e W . 6 e r u g i F % 5 2 % 0 3 0 % 2 0 % n % e B e J e A v 2 8 4 ' - c t r l c t r l c t r l c t r l c t r l + 2 ! + [ B + m R e c o v e r y W e e k 1 F i g u r e 7 - N o n - h e p a t o c y t e l a b e l i n g i n d e x i n B B C 3 F 1 a n d C S 7 B L / 6 m a l e m i c e a f t e r t h e c o - a d m i n i s t r a t i o n o f a C M D d i e t a n d P B f o r 1 , 2 , o r 4 w e e k s , a n d t h e r e c o v e r y g r o u p ( 4 w e e k s t r e a t m e n t f o l l o w e d b y 2 w e e k s w i t h o u t ) . N o n - h e p a t o c y t e D N A s y n t h e s i s i s m e a s u r e d a s a n i n d i r e c t m e a s u r e o f c e l l p r o l i f e r a t i o n v i a i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y a n d a M a c i n t o s h - b a s e d i m a g e a n a l y s i s s y s t e m ( N I H I m a g e ) . * d e n o t e s a s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m a g e - m a t c h e d c o n t r o l s , ( p < 0 . 0 5 ) u s i n g a t w o - t a i l e d S t u d e n t ’ s T - t e s t . 2 8 5 0 | ] b e m o a n 1 7 4 9 9 M H Z ’ l a a M l X W M % 0 8 m a 9 : ! o n H o n m o 8 : ] + + + . 3 . m e m e > 5 3 I D m a m n e e » . . . I r 9 Z 0 % Z c . % ' 4 6 1 1 1 5 1 ; ] F i g u r e 3 - C h a n g e s i n “ h e p a t o c y t e ” c e l l p o p u l a t i o n s i n C S 7 B L / 6 t o t a l n u c l e i w i t h C M D d i e t , P B , a n d C M D d i e t + P B a f t e r 1 , 2 , o r 4 w e e k s a n d t h e r e c o v e r y ( 4 w e e k s t r e a t e d d i e t f o l l o w e d b y 2 w e e k s c o n t r o l ) . N u c l e i w e r e d e t e r m i n e d t o b e d e r i v e d f r o m h e p a t o c y t e s i f t h e r o u n d n e s s w a s > O . 7 5 a n d h a d a n a r e a < 0 . 7 5 u m z . N u c l e i w e r e d e t e r m i n e d t o b e d e r i v e d f r o m k a r y o m e g a l o c y t e s i f t h e a r e a w a s > 0 . 7 5 p m 2 a n d t h e r o u n d n e s s w a s > 0 . 7 5 . N u c l e i w e r e d e t e r m i n e d t o b e d e r i v e d f r o m b i n u c l e a t e d h e p a t o c y t e s i f t h e r o u n d n e s s w a s < 0 . 7 5 a n d t h e a r e a w a s > 0 . 7 5 u r n " . T h e i n c r e a s e i n t h e k a r y o m e g a l o c y t e p o p u l a t i o n i l l u s t r a t e s t h e e x p e c t e d n u c l e a r s w e l l i n g i n r e s p o n s e t o P B . 2 7 7 e m u p u e t u e m t e a u c t r l n o P B w k 1 c m d n o P B w k 1 c t r l + P B w k 1 c m d + P B w k 1 c t r l n o P B w k 2 c m d n o P B w k 2 c t r l + P B w k 2 c m d + P B w k 2 c t r l n o P B w k 4 c m d n o P B w k 4 c t r l + P B w k 4 c m d + P B w k 4 c t r l n o P B r e c o v c m d n o P B r e c o v c t r l + P B r e c o v c m d + P B r e c o v 8 L 8 I : ! 9 . ‘ > I t - , 2 1 2 i t : 1 0 l a : S 3 9 . 1 9 % I I 1 1 ' 1 ) - < 1 ’ 1 2 o m G ) 1 I % 0 0 l ' e e m fi l g B e e e P b b b e h t » o o 4 o t t n t i t e d d i e d e e d n n e s i i n a m m i e D r m r M r e e C t e t e t e r c n i d d e d d e n e a e h r e r T , e r e B e w w . z P w i i m , e u e t l i l e c c e 5 i u u 7 l d N c . N u 0 D N . . ) 5 M l 7 > . o . B . C r z 0 s P t m a h n p > o t t o w i c 5 s w e a s a 7 e s i r k w . e e a 0 n o l s e p c s < e u w s e h n e 2 a t n e d r d e l e b a l y n r d n b a n i u o a d g n r e n a 5 w i e 7 o l h . l d l t 0 6 l a / h d o f L n e w < s B d a s t r e a 7 n a i S d a 2 e w l m C d 5 p s c u n e 7 i t s n . 5 a e 0 7 s . e n d n d e 0 r > o n t t i > c s u t s a k a o e w r s p l e a x u e e e p w h s w o s a t e p 4 e h e f ( i n t l d r l y s a e r n s e e c e u t e v o h t a ” t y o r c i f c r t s e e o u t l e t y c l r s h t e i a o e p t f t h i e a y t h p c n o s i e o d h l e d t “ t n e a a l t y a n a u g i c s p e e o s k t e a m l o o p c e y u e p g r n e w e i t n a h a 4 k b y c h m m r m o C o o o o l - r a r r , f f f g 2 4 , d d d e 1 e e e e m o r v v v u i i i r y e g r r r r t i a f e e e F a k d d d 2 7 9 e m u p u e x u e m t e e u A N O . ) A 0 ' 1 a : \ l C D C D o 0 0 0 ° 0 ° 0 o O O c o o o \ o \ o \ o \ ° o \ ° o \ ° o \ ° o \ ° o \ c t r l n o P B w k 1 c m d n o P B w k 1 c t r l + P B w k 1 c m d + P B w k 1 c t r l n o P B r e c o v c m d n o P B r e c o v O R N I E " I V L O J . I O l V d E H ' l V l O l D W O A H W W 1 0 1 I E . 0 8 3 ' 7 e m fi g d . t s e t - T s ’ t n e d u t S d e l i a t F i g u r e 5 - N o n - h e p a t o c y t e l a b e l i n g i n d e x i n B B C 3 F 1 a n d C 5 7 B U 6 m a l e m i c e a f t e r C M D d i e t a d m i n i s t r a t i o n f o r 1 , 2 , o r 4 w e e k s , a n d t h e r e c o v e r y g r o u p ( 4 w e e k s C M D d i e t f o l l o w e d b y 2 w e e k s c o n t r o l ) . N o n - h e p a t o c y t e D N A s y n t h e s i s i s m e a s u r e d a s a n i n d i r e c t m e a s u r e o f c e l l p r o l i f e r a t i o n v i a i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y a n d a M a c i n t o s h - b a s e d i m a g e a n a l y s i s s y s t e m ( N I H I m a g e ) . * d e n o t e s a s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m a g e - m a t c h e d c o n t r o l s , ( p < 0 . 0 5 ) u s i n g a t w o - 2 8 1 % 0 3 n % c a m e / i v 2 5 % 3 2 c N 3 3 I n 3 2 a 5 % 0 % F i g u r e 5 . 2 8 2 F i g u r e 6 - N o n - h e p a t o c y t e l a b e l i n g i n d e x i n 8 6 C 3 F 1 a n d C S 7 B L / 6 m a l e m i c e a f t e r P B a d m i n i s t r a t i o n f o r 1 , 2 , o r 4 w e e k s , a n d t h e r e c o v e r y g r o u p ( 4 w e e k s t r e a t m e n t f o l l o w e d b y 2 w e e k s w i t h o u t ) . N o n - h e p a t o c y t e D N A s y n t h e s i s i s m e a s u r e d a s a n i n d i r e c t m e a s u r e o f c e l l p r o l i f e r a t i o n v i a i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y a n d a M a c i n t o s h - b a s e d i m a g e a n a l y s i s s y s t e m ( N I H I m a g e ) . * d e n o t e s a s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m a g e - m a t c h e d c o n t r o l s , ( p < 0 . 0 5 ) u s i n g a t w o - t a i l e d S t u d e n t ’ s T - t e s t . 2 8 3 . 6 e r u g i F % % % 0 0 5 3 2 2 l r B t + c P 1 k e e l r o E W t c n I n % e fi u e l l v R e c o v e r y 2 8 4 F i g u r e 7 - N o n - h e p a t o c y t e l a b e l i n g i n d e x i n B B C 3 F 1 a n d 0 5 7 B L / 6 m a l e m i c e a f t e r t h e c o - a d m i n i s t r a t i o n o f a C M D d i e t a n d P B f o r 1 , 2 , o r 4 w e e k s , a n d t h e r e c o v e r y g r o u p ( 4 w e e k s t r e a t m e n t f o l l o w e d b y 2 w e e k s w i t h o u t ) . N o n - h e p a t o c y t e D N A s y n t h e s i s i s m e a s u r e d a s a n i n d i r e c t m e a s u r e o f c e l l p r o l i f e r a t i o n v i a i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y a n d a M a c i n t o s h - b a s e d i m a g e a n a l y s i s s y s t e m ( N I H I m a g e ) . * d e n o t e s a s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m a g e - m a t c h e d c o n t r o l s , ( p < 0 . 0 5 ) u s i n g a t w o - t a i l e d S t u d e n t ’ s T - t e s t . 2 8 5 v 4 9 6 M 2 ) l a a M 1 e m fi m g e d M e r o e u a l l o n 8 5 c u 1 - m e + 1 ' . m e m e > 5 3 I v m o m n o s . 5 I r 9 Z 0 % Z S % % 0 8 2 8 7 o f i m m u n e c e l l s a f t e r p r o m o t e r t r e a t m e n t ( a s e v i d e n c e d b y t h e i n c r e a s e s ) , b u t i s o t h e r w i s e u n r e m a r k a b l e . T h e i n f i l t r a t i o n o f i m m u n e c e l l s i n t o t h e l i v e r p r o v i d e d “ c h a l l e n g e s ” d u r i n g a s s e s s m e n t o f c e l l p r o l i f e r a t i o n w i t h t h i s c o m p u t e r - a s s i s t e d i m a g e a n a l y s i s s y s t e m ( i n d e e d a n y s y s t e m w o u l d h a v e d i f f i c u l t y ) . T h i s d i f f i c u l t y a r o s e b e c a u s e o f t h e c l u s t e r i n g o f t h e s e c e l l s i n t h e l i v e r ; t h e i r c l o s e p r o x i m i t y t o e a c h o t h e r m a d e a t t e m p t s a t s e p a r a t i o n f o r c o u n t i n g , a t b e s t , d i f f i c u l t . M a n y o f t h e c e l l s h a p e s c o u l d b e a l t e r e d b y a n y a t t e m p t s a t e d i t i n g t o s e p a r a t e t h e m a n d t h e n u m b e r o f c e l l s c o u l d n o t b e a c c u r a t e l y d i s c e r n e d i f t h e y w e r e p e r m i t t e d t o t o u c h ; f o r t h e s e r e a s o n s , I d i d n o t c o u n t f i e l d s t h a t h a d t h e s e “ c l u m p s ” o f c e l l s . I n a n a t t e m p t t o g a i n s o m e i n s i g h t c o n c e r n i n g n o n - h e p a t o c y t e c h a n g e s i n t h e l i v e r , l e v a l u a t e d t h e f r a c t i o n o f t h e l i v e r o c c u p i e d b y n o n - h e p a t o c y t e s . F o r t h e s e a n a l y s e s , t h e f r a c t i o n o f t h e B 6 C 3 F 1 t o t a l n u c l e i e x i s t i n g a s n o n - h e p a t o c y t e s ( T a b l e 7 ) , t h e f r a c t i o n o f t h e B 6 C 3 F 1 l a b e l e d n u c l e i e x i s t i n g a s n o n - h e p a t o c y t e s ( T a b l e 8 ) , t h e f r a c t i o n o f t h e C S 7 B L / 6 t o t a l n u c l e i e x i s t i n g a s n o n - h e p a t o c y t e s ( T a b l e 9 ) , a n d t h e f r a c t i o n o f t h e C 5 7 B U 6 l a b e l e d n u c l e i e x i s t i n g a s n o n - h e p a t o c y t e s ( T a b l e 1 0 ) w e r e d e t e r m i n e d . T h e f r a c t i o n o f t h e t o t a l n u c l e i e x i s t i n g a s n o n - h e p a t o c y t e s i n B 6 C 3 F 1 ( T a b l e 7 ) a n d i n C S 7 B L / 6 ( T a b l e 9 ) a p p e a r s t o b e r e l a t i v e l y s t a b l e . T h e f r a c t i o n o f t h e l a b e l e d n u c l e i e x i s t i n g a s n o n - h e p a t o c y t e s i n c o n t r o l a n i m a l s r a n g e d f r o m 4 9 % - 5 9 % ( B G C S F 1 a n d C 5 7 B U 6 c o m b i n e d , T a b l e s 8 a n d 1 0 ) . H o w e v e r , a f t e r 1 a n d 2 w e e k s o f C M D d i e t , P B , a n d C M D d i e t + P B a s m a l l e r f r a c t i o n o f t h e l i v e r w a s m a d e u p o f n o n - h e p a t o c y t e s ( p r o b a b l y a r e f l e c t i o n o f m y “ a v o i d i n g ” c l u s t e r s o f i m m u n e c e l l s ) . A f t e r 4 w e e k s o f t h e d i f f e r e n t p r o m o t e r t r e a t m e n t s , t h e C M D d i e t 2 8 8 v a l u e s r e m a i n e d d e c r e a s e d i n B 6 0 3 F 1 a n d C S 7 B L / 6 ( T a b l e s 8 a n d 1 0 ) , w h i l e t h e C M D d i e t + P B g r o u p w a s d e c r e a s e d ‘ o n l y i n t h e B S C 3 F 1 ( T a b l e 8 ) . T h u s , I c o n c l u d e t h a t t h e f r a c t i o n o f t h e l i v e r o c c u p i e d b y n o n - h e p a t o c y t e s d o e s n o t a l w a y s d e m o n s t r a t e t r e a t m e n t - r e l a t e d i n c r e a s e s d u e t o t h e i n a b i l i t y t o a c c u r a t e l y m e a s u r e t h e r e l a t i v e l y c o m m o n “ c l u m p s ” o f n o n - h e p a t o c y t e s t h a t o c c u r r e d i n t h e l i v e r s . S E T . Y ” C _ - O m T . 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L B P B B B P P P P P A o P P P o n + o n + o 3 T n + + n + + O l l l l r d d d d d l 3 T c c c c c c c c c c m m r r r r m m t t t t t m C i r ! 0 0 P 3 W - 1 c m d n o F E M S . . 2 c t r ! 7 * E B “ ’ 1 8 2 c m d 3 + P B w k 2 c t r l n o P 8 1 4 1 8 4 - c m d " 9 P B W K 4 _ _ _ - _ - _ 5 _ . 9 _ 1 0 _ W - 2 9 % L i 2 4 % 2 4 9 / 2 - - . 2 7 7 9 3 3 3 % 3 - 3 9 7 9 . 2 - _ 2 9 1 S E T Y C O T A P i e E l H _ r . % % % % 9 . . . . r % % % % % c 5 0 9 4 4 3 4 3 3 ‘ u N d e l e b a L 6 U B 7 5 C f o - . § 9 N § 4 2 2 O - N % D E L E B A L i e l c u N l a - 7 5 6 2 9 3 n o 5 9 t 9 9 3 2 o i T 2 1 . _ t o f c a m r F e t y u S s e c t o t a p y c o t a e p 6 3 9 7 4 § w . 4 5 7 4 e 1 2 9 9 6 6 4 2 2 6 3 3 3 5 2 5 6 6 3 H - n o H - n o N N : 0 1 f o m u e S l b - . 1 3 v a T . v 2 4 o v 1 1 4 2 2 4 v o c o k k 1 2 k 4 D w w w k k k k k k e c o r e c c e w w w w w w e r k k k B B B B w w w r r H £ B B B B B B B B P P P P 1 B B B B P P P P P P P P E P P P P o o o o o o o o n n + n + n + + B U J L n + n + n + n + l l l l l l l l d d d d d d d r r r r r r r r m m m m m m m t t t t t t t t 3 d m c c c c c c c c c c c c c c c c 2 4 6 4 9 5 2 4 5 5 3 4 [ 2 , 6 7 3 3 2 9 2 6 6 5 0 6 1 4 3 6 7 2 1 1 8 0 3 . . . 3 § % L m 6 1 % . _ 5 2 % . 4 3 % . 6 5 % 2 9 2 A P P E N D I X 4 M e t h y l a t i o n S t a t u s o f H a - r a s i n B G C 3 F 1 a n d C S 7 B L I 6 M o u s e L i v e r A f t e r C M D D l e t , P B , o r C M D + P B f o r 1 , 2 , a n d 4 W e e k s . H y p o m e t h y l a t i o n o f H a - r a s w a s n o t e v i d e n t a f t e r C M D d i e t , P B , o r t h e c o - a d m i n i s t r a t i o n o f a C M D d i e t + P B i n B G C 3 F 1 o r C S 7 B L / 6 m i c e a f t e r 1 ( F i g u r e 1 ) , 2 ( F i g u r e 2 ) , o r 4 w e e k s ( F i g u r e 3 ) o f a d m i n i s t r a t i o n . T h i s d e m o n s t r a t e s t h a t h y p o m e t h y l a t i o n o f H a - r a s i s n o t a n e a r l y e v e n t i n B 6 0 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r i g e n e s i s i n d u c e d b y t h e s e n o n g e n o t o x i c l i v e r t u m o r p r o m o t e r s . 2 9 3 2 9 4 F i g u r e 1 - M e t h y l a t i o n s t a t u s o f H a - r a s i n ( A ) B 6 0 3 F 1 a n d ( B ) C 5 7 B U 6 m o u s e l i v e r a f t e r C M D d i e t , P B , a n d C M D d i e t + P B a d m i n i s t r a t i o n f o r 1 w e e k . T e n p g D N A f r o m 2 C M D d i e t , 2 c o n t r o l , 2 P B - t r e a t e d , a n d 2 C M D d i e t + P B t r e a t e d a n i m a l s w e r e d i g e s t e d t o c o m p l e t i o n w i t h M s p l ( M ) o r H p a l l ( H ) a s d e s c r i b e d i n t h e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s a n d h y b r i d i z e d t o 3 2 P l a b e l e d - H a - r a s . T h e m e m b r a n e , a f t e r s t r i n g e n t w a s h i n g c o n d i t i o n s , w a s e x p o s e d t o F u j i A I F fi l m f o r 3 - 5 d a y s . T h e b a n d p a t t e r n f r o m t h e t r e a t e d a n i m a l s i s s i m i l a r t o t h e c o n t r o l s , d e m o n s t r a t i n g a l a c k o f h y p o m e t h y l a t i o n o f H a - r a s a f t e r 1 w e e k o f p r o m o t e r t r e a t m e n t . F i g u r e l . 3 C M D d i e t C o n t r o l P B C M D + P B M H M H M H M H M H M H M H M H 1 0 . 6 — 2 9 6 F i g u r e 2 - M e t h y l a t i o n s t a t u s o f H a - r a s i n ( A ) B 6 C 3 F 1 a n d ( B ) C S 7 B L / 6 m o u s e l i v e r a f t e r C M D d i e t , P B , a n d C M D d i e t + P B a d m i n i s t r a t i o n f o r 2 w e e k s . T e n p g D N A f r o m 2 C M D d i e t , 2 c o n t r o l , 2 P B - t r e a t e d , a n d 2 C M D d i e t + P B t r e a t e d a n i m a l s w e r e d i g e s t e d t o c o m p l e t i o n w i t h M s p l ( M ) o r H p a l l ( H ) a s d e s c r i b e d i n t h e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s a n d h y b r i d i z e d t o 3 2 F I a b e l e d - H a - r a s . T h e m e m b r a n e , a f t e r s t r i n g e n t w a s h i n g c o n d i t i o n s , w a s e x p o s e d t o F u j i A I F f i l m f o r 3 - 5 d a y s . T h e b a n d p a t t e r n f r o m t h e t r e a t e d a n i m a l s i s s i m i l a r t o t h e c o n t r o l s , d e m o n s t r a t i n g a l a c k o f h y p o m e t h y l a t i o n o f H a - r a s a f t e r 2 w e e k s o f p r o m o t e r t r e a t m e n t . H C M D d i c t C o n t r o l P B C M D + P B 1 0 M H M M H M H M H M H M 3 C M D d i e t C o n t r o l P B C M D + P B i g u r e 2 . 2 9 7 2 9 8 F i g u r e 3 - M e t h y l a t i o n s t a t u s o f H a - r a s i n ( A ) B 6 C 3 F 1 a n d ( B ) C S 7 B L / 6 m o u s e l i v e r a f t e r C M D d i e t , P B , a n d C M D d i e t + P B a d m i n i s t r a t i o n f o r 4 w e e k s . T e n u g D N A f r o m 2 C M D d i e t , 2 c o n t r o l , 2 P B - t r e a t e d , a n d 1 ( B G C 3 F 1 ) o r 2 ( C 5 7 B U 6 ) C M D d i e t + P B t r e a t e d a n i m a l s w e r e d i g e s t e d t o c o m p l e t i o n w i t h M s p l ( M ) o r H p a l l ( H ) a s d e s c r i b e d i n t h e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s a n d h y b r i d i z e d t o 3 2 P l a b e l e d - H a - r a s . T h e m e m b r a n e , a f t e r s t r i n g e n t w a s h i n g c o n d i t i o n s , w a s e x p o s e d t o F u j i A I F f i l m f o r 3 - 5 d a y s . T h e b a n d p a t t e r n f r o m t h e t r e a t e d a n i m a l s i s s i m i l a r t o t h e c o n t r o l s , d e m o n s t r a t i n g a l a c k o f h y p o m e t h y l a t i o n o f H a - r a s a f t e r 4 w e e k s o f p r o m o t e r t r e a t m e n t . 2 9 9 F i 3 . g m C M D d i e t C o n t r o l P B . . , 4 . C M D + P B M H M H M H M H M H M H M H C M D d i e t C o n t r o l P B M H M H M H M H M H M H A P P E N D I X 5 V a r i a b l e P r e s e n c e o f t h e r e f 6 . 7 k b B a n d i n t h e M s p l L a n e P r e v i o u s r e s u l t s i n o u r l a b o r a t o r y d e m o n s t r a t e d h y p o m e t h y l a t i o n o f t h e r e f 6 . 7 k b b a n d i n t h e M s p l d i g e s t e d l a n e a f t e r 2 w e e k s o f P B a d m i n i s t r a t i o n ( R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) . l h a v e b e e n u n a b l e t o o b t a i n t h e c o n s i s t e n t p r e s e n c e o f t h e 6 . 7 k b b a n d i n t h e c o n t r o l s ; t h i s h a s p r e c l u d e d a n y d e t e r m i n a t i o n o f m e t h y l a t i o n s t a t u s i n t h e v e r y y o u n g a n i m a l s ( s e e F i g u r e 1 w h e r e t h e 6 . 7 k b b a n d i s p r e s e n t i n e v e r y a n i m a l o n a m e m b r a n e ( F i g u r e 1 a ) o r a b s e n t f r o m e v e r y a n i m a l o n a m e m b r a n e ( F i g u r e 1 b ) , y e t b o t h m e m b r a n e s a r e B 6 0 3 F 1 a n i m a l s f r o m t h e w e e k 4 t i m e p o i n t ) . T h e r e w e r e s e v e r a l a t t e m p t s o n m y p a r t t o o b t a i n c o n s i s t e n c y o f t h i s b a n d : ( 1 ) o r i g i n a l l y a l l o f m y r e s t r i c t i o n e n z y m e d i g e s t i o n s p r i o r t o S o u t h e r n t r a n s f e r w e r e c a r r i e d o u t u s i n g 5 p g o f D N A / l a n e , t h e y w e r e r e p e a t e d w i t h 1 0 p g D N A / l a n e , ( 2 ) I h a d a t t e m p t e d a n e w “ r a p i d ” t r a n s f e r m e t h o d f o r S o u t h e r n a n a l y s i s ; t h i s p r o v e d t o b e u n a b l e t o b e r e - h y b r i d i z e d , s o a l l S o u t h e r n t r a n s f e r s w e r e r e p e a t e d u s i n g t h e s a m e p r o c e d u r e a s R a y e t a I . ( R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) , ( 3 ) I a t t e m p t e d t o u t i l i z e a n e w k i t ( D e c a p r i m e , A m b i o n ) t o r a n d o m p r i m e r l a b e l m y p r o b e , t h i s d i d n o t f a c i l i t a t e t h e o b s e r v a t i o n o f t h e 6 . 7 k b b a n d , a n d ( 4 ) I e l i m i n a t e d t h e 3 0 m i n u t e , 3 7 ° C s t r i n g e n t w a s h . N o n e o f t h e s e a t t e m p t s p r o v i d e d c o n s i s t e n c y o f t h e 6 . 7 k b b a n d . I n t e r e s t i n g l y , t h e a n i m a l s u s e d i n t h e R a y e t a l . s t u d y ( R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) w e r e s e v e r a l w e e k s y o u n g e r t h a n t h e a n i m a l s u s e d f o r m y s t u d i e s , 4 - 5 w e e k s o l d v e r s u s 1 2 - 1 3 w e e k s o l d . I t i s p o s s i b l e t h a t t h e r e i s s o m e “ c h u r n i n g ” o f m e t h y l a t i o n s t a t u s a s t h e a n i m a l s a g e 3 0 0 3 0 1 F i g u r e 1 - V a r i a b l e p r e s e n c e o f t h e r e f 6 . 7 k b b a n d i n B G C 3 F 1 m o u s e l i v e r . T e n p g D N A f r o m C M D d i e t , c o n t r o l , P B - t r e a t e d , a n d C M D d i e t + P B t r e a t e d B S C 3 F 1 m a l e m i c e f r o m t h e w e e k 4 t i m e p o i n t w e r e d i g e s t e d t o c o m p l e t i o n w i t h M s p l ( M ) o r H p a l l ( H ) a s d e s c r i b e d i n t h e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s t o C h a p t e r 5 a n d h y b r i d i z e d t o 3 2 P l a b e l e d - r e f . T h e a u t o r a d i o g r a p h s c o n t a i n D N A f r o m s e p a r a t e a n i m a l s . T h e m e m b r a n e s , a f t e r w a s h i n g , w a s e x p o s e d t o F u j i A I F fi l m f o r 7 - 9 d a y s a t - 8 0 ° C w i t h t w o i n t e n s i f y i n g s c r e e n s . T h e a r r o w i n d i c a t e s t h e p r e s e n c e o f t h e 6 . 7 k b b a n d i n t h e M s p l l a n e s o f a l l t h e a n i m a l s i n ( A ) a n d i t s l a c k i n a l l o f t h e a n i m a l s i n ( B ) . T h e i n a b i l i t y t o d i s c e r n t h i s b a n d c o n s i s t e n t l y i n t h e c o n t r o l a n i m a l s p r e c l u d e d a n y c o n c l u s i o n s b e i n g d r a w n c o n c e r n i n g r a f m e t h y l a t i o n s t a t u s a f t e r u p t o 4 w e e k s o f p r o m o t e r t r e a t m e n t ( i n c l u d i n g t h e r e c o v e r y g r o u p s ) . o 3 0 2 F i g u r e l . L _ _ M D n o P B 2 9 2 1 1 2 1 2 1 2 1 1 . c o n t r o l + P B M A H M M H W M H M M H H M H k i t C M D C M D n o P B c o n t r o l n o P B c o n t r o l + P B : 2 1 \ H M H 3 ' . B M H M H M H M H M H M 3 0 3 w i t h s o m e m e t h y l a t i o n a n d d e m e t h y l a t i o n o c c u r r i n g . T h e s t u d y b y R a y e t a I . i l l u s t r a t e d c o n v i n c i n g l y t h e p r e s e n c e o f t h e b a n d i n t h e c o n t r o l s a n d i t s a b s e n c e a f t e r P B a d m i n i s t r a t i o n ( R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) . T h e b a n d w a s a l s o p r e s e n t i n a g e - m a t c h e d c o n t r o l a n i m a l s a n d a b s e n t i n P B t u m o r s . l h a v e a l s o p r e s e n t e d d a t a d e m o n s t r a t i n g t h e p r e s e n c e o f t h e b a n d i n t h e w e e k 1 2 a n i m a l c o n t r o l s a n d i t s a b s e n c e a f t e r C M D d i e t a d m i n i s t r a t i o n f o r 1 2 w e e k s ( C h a p t e r 5 ) . O n e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e m e t h o d o l o g y u s e d b y R a y a n d c o - w o r k e r s ( R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) a n d m y m e t h o d w a s t h a t I a l l o w e d t h e D N A t o b e r e s t r i c t e d b y t h e r e s t r i c t i o n e n z y m e s f o r a t o t a l o f 6 h o u r s , w h i l e t h e p r e v i o u s s t u d y o n l y u t i l i z e d a t o t a l o f 2 h o u r s o f d i g e s t i o n . W h e n I c a r r i e d o u t a s i d e - b y - s i d e c o m p a r i s o n o f B G C 3 F 1 c o n t r o l l i v e r D N A w i t h 6 o r 2 h o u r s o f i n c u b a t i o n w i t h M s p l , I c a n d i s c e r n a n o t i c e a b l e d e c r e a s e i n t h e i n t e n s i t y o f t h e 6 . 7 k b b a n d i n t h e 6 h o u r d i g e s t i o n ( F i g u r e 2 ) . T h i s d e m o n s t r a t e s t h a t a t l e a s t p a r t o f t h e v a r i a b i l i t y t h a t I o b s e r v e d i s a c t u a l l y d u e t o d i g e s t i o n o f t h e b a n d . 3 0 4 6 h o u r 2 h o u r F i g u r e 2 - E f f e c t o f p r o l o n g e d d i g e s t i o n w i t h M s p l o n t h e p r e s e n c e o f t h e r e f 6 . 7 k b b a n d . T e n p g D N A f r o m 3 B 6 0 3 F 1 c o n t r o l m o u s e l i v e r s w e r e i n c u b a t e d a s d e s c r i b e d i n t h e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s i n C h a p t e r 5 ( i . e . , 6 h o u r s t o t a l d i g e s t i o n w i t h t h e e n z y m e a d d e d i n t w o a l i q u o t s a t t h r e e h o u r i n t e r v a l s ) o r i n c u b a t e d w i t h M s p l f o r a t o t a l o f 2 h o u r s ( i . e . , a s c a r r i e d o u t i n t h e R a y e t a l . , 1 9 9 4 s t u d y ) . T h e i n c r e a s e d d i g e s t i o n t i m e u t i l i z e d i n t h e p r e s e n t s t u d y m a y h a v e c o n t r i b u t e d t o t h e v a r i a b i l i t y s e e n i n t h e p r e s e n c e o f t h e r e f 6 . 7 k b b a n d a s t h e b a n d i s c l e a r l y l e s s i n t e n s e i n t h e l a n e s m a r k e d “ 6 h o u r s ” ( a r r o w i n d i c a t e s 6 . 7 k b b a n d ) . A P P E N D I X 6 D e s c r i p t i o n o f I m a g e A n a l y s i s - B a s e d Q u a n t i f i c a t i o n o f m R N A E x p r e s s i o n I m a g e a n a l y s i s w a s c a r r i e d o u t u t i l i z i n g a s y s t e m c o n s i s t i n g o f a H e w l e t t P a c k a r d S c a n J e t 3 c w i t h t r a n s p a r e n c y a d a p t e r , a M a c i n t o s h c o m p u t e r , a n d t h e s o f t w a r e A d o b e P h o t o s h o p a n d N I H I m a g e . B r i e f l y , t h e a u t o r a d i o g r a p h s w e r e s c a n n e d i n t o t h e c o m p u t e r u s i n g t h e H e w l e t t P a c k a r d s c a n n e r a n d t h e A d o b e P h o t o s h o p P r o g r a m . T h e b r i g h t n e s s a n d c o n t r a s t o f t h e s c a n n e d f i l m s w e r e o p t i m i z e d , a n d t h e f i l m w a s r o t a t e d i f n e c e s s a r y t o e n s u r e t h e b a n d s w e r e l o c a t e d h o r i z o n t a l l y a c r o s s t h e s c r e e n ( F i g u r e 1 ) . T h i s i m a g e w a s s a v e d a s a T I F F f i l e . T h e T I F F f i l e w a s o p e n e d i n N I H I m a g e a n d t h e “ G e l P l o t t i n g M a c r o s ” s u p p l i e d w i t h t h e p r o g r a m w e r e u s e d t o o b t a i n t h e p i x e l d e n s i t y o f t h e b a n d s ( F i g u r e 2 ) . T h i s w a s c a r r i e d o u t f o r t h e H a - r a s , r a f , S A M s y n t h e t a s e a n d 2 8 S R N A n o r t h e r n f i l m s . T h e p i x e l d e n s i t i e s o f t h e R N A s p e c i e s w e r e n o r m a l i z e d t o t h e p i x e l d e n s i t y o f t h e 2 8 8 R N A . M e s s a g e w a s d e e m e d t o b e c h a n g e d i f i t w a s g r e a t e r t h a n , o r l e s s t h a n , t h e a v e r a g e o f t h e r a n g e o f t h e c o n t r o l s o n t h e f i l m + / - o n e s t a n d a r d d e v i a t i o n ( T a b l e 1 ) . 3 0 5 3 0 6 F i g u r e 1 - I m a g e a n a l y s i s t o q u a n t i f y m R N A e x p r e s s i o n o f C 5 7 B U 6 w e e k 2 R N A . ( A ) A u t o r a d i o g r a p h o f S A M s y n t h e t a s e n o r t h e r n a s s c a n n e d i n t o P h o t o s h o p u s i n g a H e w l e t t P a c k a r d S c a n J e t 3 0 w i t h t r a n p a r e n c y a d a p t e r . ( B ) T I F F f i l e f r o m A o p e n e d i n N I H I m a g e . T h e “ e y e d r o p p e r " t o o l w a s u s e d t o s e l e c t t h e b a c k g r o u n d c o l o r o f t h e f i l m a n d w i t h t h e “ p a i n t b r u s h ” ( s e t a t a w i d t h o f 2 p i x e l s ) 8 l i n e w a s d r a w n b e t w e e n e a c h m R N A b a n d o n t h e f i l m . T h i s f o r c e d t h e b a n d s e p a r a t i o n a n d e n s u r e d a c c u r a c y o f t h e m e a s u r e m e n t . T h e “ b o x ” t o o l w a s u s e d t o s e l e c t t h e m R N A b a n d s a n d t h e f i r s t m a c r o w a s c a r r i e d o u t ( “ M a r k f i r s t l a n e ” ) . W h e n t h e s e c o n d m a c r o w a s c a r r i e d o u t ( “ P l o t l a n e s ” ) t h e p i x e l d e n s i t y c o u l d b e o b t a i n e d ( s e e F i g u r e 2 ) . ( C ) A u t o r a d i o g r a p h o f 2 8 8 n o r t h e r n a s s c a n n e d i n t o P h o t o s h o p u s i n g a H e w l e t t P a c k a r d S c a n J e t 3 0 w i t h t r a n p a r e n c y a d a p t e r . ( D ) T I F F f i l e f r o m C o p e n e d i n N I H I m a g e a n d t r e a t e d a s d e s c r i b e d f o r B . 3 0 7 F i g u r e 1 . 4 3 0 8 F i g u r e 2 - P i x e l d e n s i t i e s f r o m N I H I m a g e o f t h e s c a n n e d a u t o r a d i o g r a p h s f o r ( A ) S A M s y n t h e t a s e a n d ( B ) 2 8 8 R N A . T h e p i x e l d e n s i t y w a s o b t a i n e d u s i n g t h e “ P l o t l a n e s ” p o r t i o n o f t h e m a c r o . T h e a r e a u n d e r t h e c u r v e ( r e p r e s e n t a t i v e o f t h e n u m b e r o f p i x e l s a n d t h e a r e a c o v e r e d ) w a s a s c e r t a i n e d u s i n g t h e “ w a n d t o o l ” . T h e “ w a n d t o o l ” w a s s e l e c t e d a n d t h e m o u s e w a s p r e s s e d i n s i d e e a c h p e a k . T h e s e p i x e l d e n s i t i e s w e r e r e c o r d e d u s i n g t h e c o m b i n a t i o n o f t h e o p t i o n k e y a n d t h e “ t e x t ” t o o l . H e r e , t h e m o u s e w a s p r e s s e d i n e a c h p e a k i n t h e r e v e r s e o r d e r f r o m t h a t i n w h i c h t h e p i x e l d e n s i t i e s w e r e m e a s u r e d w i t h t h e “ w a n d t o o l ” . T h e s e m e a s u r e m e n t s w e r e a l s o r e c o r d e d u s i n g t h e “ S h o w r e s u l t s ” o p t i o n a n d c o p i e d i n t o E x c e l t o n o r m a l i z e t o 2 8 8 R N A ( s e e T a b l e 1 ) . u n 7 c 2 4 a 9 l . b r a t e d 0 0 ( m i c e m f m \ 3 0 0 M m m m l l m 7 8 , 0 0 3 , , 7 5 . 0 0 m a m m N m m A 5 1 4 4 . 0 0 1 3 1 “ 1 i 1 ll. . 3 0 9 7 . 1 S T 5 1 . 4 5 4 0 . 0 0 3 7 4 7 . W 3 4 9 7 . 0 0 B 3 1 0 T a b l e 1 : N o r m a l i z a t i o n o f S A M S y n t h e t a s e m R N A t o 2 8 $ R N A . 2 8 $ S T a s e S T a s e : 2 8 $ a v g + l - s t d C h a n g e d e v C M D n o P B 7 2 4 9 6 7 7 8 0 . 9 3 5 1 ! C M D n o P B 7 3 8 9 4 9 3 1 0 . 6 6 7 t C M D n o P B 7 6 3 3 6 0 6 5 0 . 7 9 5 f c t r l n o P B 8 0 2 8 2 6 7 9 0 . 3 3 4 c t r l n o P B 7 0 6 1 1 6 7 4 0 . 2 3 7 0 . 4 0 + / - 0 . 2 1 c t r l n o P B 8 1 0 0 5 1 0 3 0 . 6 3 0 c t r l + P B 7 4 3 5 3 4 9 7 0 . 4 7 0 n o c h a n g g _ c t r l 4 » P B 7 8 3 8 4 5 4 8 0 . 5 8 0 n o c h a n g e _ C M D + P B 7 0 4 6 5 1 1 0 0 . 7 2 5 t C M D + P B 7 7 8 0 3 7 4 7 0 . 4 8 2 n o c h a n g e _ C M D + P B 5 1 4 4 2 2 7 9 0 . 4 4 3 n o c h a n g e L I S T O F R E F E R E N C E S L I S T O F R E F E R E N C E S : I N T R O D U C T I O N , D I S C U S S I O N , A N D A P P E N D I C E S A d a m s , R . L . P . ( 1 9 9 0 ) D N A m e t h y l a t i o n : T h e e f f e c t o f m i n o r b a s e s o n D N A - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s . W , 2 6 5 , 3 0 9 - 3 2 0 . A m e s , B . N . a n d G o l d , L . S . ( 1 9 9 0 ) C h e m i c a l c a r c i n o g e n e s i s : T o o m a n y r o d e n t c a r c i n o g e n s . M W , 8 7 , 7 7 7 2 - 7 7 7 6 . A p p , H . , H a z a n , R . , Z i l b e r s t e i n , A . , U l l r i c h , A . , S c h l e s s i n g e r , J . a n d R a p p , U . ( 1 9 9 1 ) E p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r ( E G F ) s t i m u l a t e s a s s o c i a t i o n a n d k i n a s e a c t i v i t y o f R a f - 1 w i t h t h e E G F r e c e p t o r . W , 1 1 , 9 1 3 - 9 1 9 . B a c c a r i n i , M . , G i l l , G M . a n d S t a n l e y , E R . ( 1 9 9 1 ) E p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r s t i m u l a t e s p h o s p h o r y l a t i o n o f R A F - 1 i n d e p e n d e n t l y o f r e c e p t o r a u t o p h o s p h o r y l a t i o n a n d i n t e r n a l i z a t i o n . M m , 2 6 6 , 1 0 9 4 1 - 1 0 9 4 5 . B a r l o w , D . P . , S t o g e r , R . , H e r r r n a n n , B . G . , S a i t o , K . a n d S c h w e i f e r , N . ( 1 9 9 1 ) T h e m o u s e i n s u l i n - l i k e g r o w t h f a c t o r t y p e - 2 r e c e p t o r i s i m p r i n t e d a n d c l o s e l y l i n k e d t o t h e T m e l o c u s . W o n ) , 3 4 9 , 8 4 - 8 7 . B a u e r - H o f m a n n , R . , B u c h m a n n , A . , M a h r , J . , K r e s s , S . a n d S c h w a r z , M . ( 1 9 9 2 ) T h e t u m o r p r o m o t e r s d i e l d r i n a n d p h e n o b a r b i t a l i n c r e a s e t h e f r e q u e n c y o f c - H a - r a s w i l d - t y p e b u t n o t c - H a - r a s m u t a t e d f o c a l l i v e r l e s i o n s i n m a l e C 3 H / H e m i c e . W , 1 3 , 4 7 7 - 4 8 1 . B e c k e r , F . F . ( 1 9 8 2 ) M o r p h o l o g i c a l c l a s s i f i c a t i o n o f m o u s e l i v e r t u m o r s b a s e d o n b i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s . 9 3 0 9 1 3 6 6 , , 4 2 , 3 9 1 8 - 3 9 2 3 . B e n i g n i , R . a n d A n d r e o l i , C . ( 1 9 9 3 ) R o d e n t c a r c i n o g e n i c i t y a n d t o x i c i t y , i n v i t r o m u t a g e n i c i t y , a n d t h e i r p h y s i c a l c h e m i c a l d e t e r m i n a n t s . M u m , 2 9 7 , 2 8 1 - 2 9 2 . B e n t i v e g n a , S S . a n d B r e s n i c k , E . ( 1 9 9 4 ) I n h i b i t i o n o f h u m a n 0 “ - m e t h y l g u a n i n e - D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e b y 5 - m e t h y l c y t o s i n e . W . 5 4 , 3 2 7 - 3 2 9 . B e s t o r , T . , L a u d a n o , A . , M a t t a l i a n o , R . a n d I n g r a m , V . ( 1 9 8 8 ) C l o n i n g a n d s e q u e n c i n g o f a c D N A e n c o d i n g D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e o f m o u s e c e l l s : T h e c a r b o x y I - t e r m i n a l d o m a i n o f t h e m a m m a l i a n e n z y m e s i s r e l a t e d t o b a c t e r i a l r e s t r i c t i o n m e t h y l t r a n s f e r a s e s . M , 2 0 3 , 9 7 1 - 9 8 3 . 3 1 1 3 1 2 B h a v e , M . R . , W i l s o n , M . J . a n d P o i r i e r , L A . ( 1 9 8 8 ) c - H - r a s a n d c - K - r a s g e n e h y p o m e t h y l a t i o n i n t h e l i v e r s a n d h e p a t o m a s o f r a t s f e d m e t h y l - d e f i c i e n t , a m i n o a c i d - d e f i n e d d i e t s . W , 9 , 3 4 3 - 3 4 8 . B i r d , A P . ( 1 9 8 6 ) C p G - r i c h i s l a n d s a n d t h e f u n c t i o n o f D N A m e t h y l a t i o n . N a t u r e ( L o n d o n ) , 3 2 1 , 2 0 9 - 2 1 3 . B o e h m , T . L . J . , G r u n b e r g e r , D . a n d D r a h o v s k y , D . ( 1 9 8 3 ) A b e r r a n t d e n o v o m e t h y l a t i o n o f D N A a f t e r t r e a t m e n t o f m u r i n e c e l l s w i t h N - a c e t o x y - N - 2 - a c e t y l a m i n o f l u o r e n e . W , 4 3 , 6 0 6 6 - 6 0 7 1 . B o r r e l l o , M . G . , P i e r o t t i , M . A . , T a m b o r i n i , E . , B i a s s o n i , D . , R i z z e t t i , M . G . , P i l o t t i , S . a n d D e l l a - P o r t a , G . ( 1 9 9 2 ) D N A m e t h y l a t i o n o f c o d i n g a n d n o n - c o d i n g r e g i o n s o f t h e h u m a n H - R A S g e n e i n n o r m a l a n d t u m o r t i s s u e s . Q n m g g n g , 7 , 2 6 9 - 2 7 5 . B o y e s , J . a n d B i r d , A . ( 1 9 9 1 ) D N A m e t h y l a t i o n i n h i b i t s t r a n s c r i p t i o n i n d i r e c t l y v i a a m e t h y l - C p G b i n d i n g p r o t e i n . C e l l , 6 4 , 1 1 2 3 - 1 1 3 4 . B r a n d e i s , M . , A r i e l , M . a n d C e d a r , H . ( 1 9 9 3 ) D y n a m i c s o f D N A m e t h y l a t i o n d u r i n g d e v e l o p m e n t . B i g fi s s a y s , 1 5 , 7 0 9 - 7 1 3 . B r o c k e n b r o u g h , J . S . , M e y e r , S . A . , L i , C . a n d J i r t l e , R L . ( 1 9 9 1 ) R e v e r s i b l e a n d p h o r b o l e s t e r - s p e c i f i c d e f e c t o f p r o t e i n k i n a s e C t r a n s l o c a t i o n i n h e p a t o c y t e s i s o l a t e d f r o m p h e n o b a r b i t a l - t r e a t e d r a t s . 9 . 8 0 m . 5 1 , 1 3 0 - 1 3 6 . B r o w n , K . , B a i l l e u l , B . , R a m s d e n , M . , F e e , F . , K r u m l a u f , R a n d B a l m a i n , A . ( 1 9 8 8 ) I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e 5 ’ f l a n k i n g r e g i o n o f t h e m o u s e 0 - H a - r a s g e n e . W , 1 , 1 6 1 - 1 7 0 . B r t v a , T . R . , D r u g a n , J . K . , G h o s h , S . , T e r r e l l , R . S . , C a m p b e l l - B u r k , 8 . , B e l l , R M . a n d D e r , C . J . ( 1 9 9 5 ) T w o d i s t i n c t R a f d o m a i n s m e d i a t e i n t e r a c t i o n s w i t h R a s . , 1 , m m , 2 7 0 , 9 8 0 9 - 9 8 1 2 . B u c h m a n n , A . , B a u e r - H o f m a n n , R . , M a h r , J . , D r i n k w a t e r , N . R . , L u z , A . a n d S c h w a r z , M . ( 1 9 9 1 ) M u t a t i o n a l a c t i v a t i o n o f t h e c - H a - r a s g e n e i n l i v e r t u m o r s o f d i f f e r e n t r o d e n t s t r a i n s : C o r r e l a t i o n w i t h s u s c e p t i b i l i t y t o h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s . W 1 8 , 9 1 1 - 9 1 5 . B u c k l e y , S F . a n d H a l t r o f t , W . S . ( 1 9 5 5 ) P a t h o l o g y o f c h o l i n e d e f i c i e n c y i n t h e m o u s e ; o b s e r v a t i o n s w i t h s p e c i a l r e f e r e n c e t o l i v e r . A M . 5 9 , 1 8 5 - 1 9 7 . B u r s c h , W . , O b e r h a m m e r , F . , J i r t l e , R . L . , A s k a r i , M . , S e d i v y , R . , G r a s l - K r a u p p . B . , P u r c h i o , A F . a n d S c h u l t e - H e r r n a n n , R . ( 1 9 9 3 ) T r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - [ 3 1 a s a s i g n a l f o r i n d u c t i o n o f c e l l d e a t h b y a p o p t o s i s . B r , J . C a n c e r , 6 7 , 5 3 1 - 5 3 6 . 3 1 3 B u t t e r w o r t h , B . E . , S l a g a , T . J . , F a r l a n d , W , a n d M c C l a i n , M . ( e d s . ) ( 1 9 9 1 ) I n I : u - . 1 0 . - : 0 . = 0 = - . 0 1 ' 1 1 0 - . o r O i l ‘ l : 1 1 : 1 . W i l e y - L i s s , N e w Y o r k . C a n d r i a n , U . , Y o u , M . , G o o d r o w , T . , M a r o n p o t , R . R . , R e y n o l d s , S H . a n d A n d e r s o n , M W . ( 1 9 9 1 ) A c t i v a t i o n o f p r o t o o n c o g e n e s i n s p o n t a n e o u s l y o c c u r r i n g n o n - l i v e r t u m o r s f r o m C S 7 B L / 6 x 0 3 H F 1 m i c e . m , 5 1 , 1 1 4 8 - 1 1 5 3 . C a r r , B . . I , R e i l l y , J . . , G S m i t h , S . . , S W i n b e r g , C . a n d R i g g s , A . ( 1 9 8 4 ) T h e t u m o r i g e n i c i t y o f 5 - - a z a c y t i d i n e I n t h e m a l e F i s c h e r r a t . W . 5 , 1 5 8 3 - 1 5 9 0 . C h a , R . S . , T h i l l y , W . G . a n d Z a r b l , H . ( 1 9 9 4 ) N - n i t r o s o - N - m e t h y l u r e a - i n d u c e d r a t m a m m a r y t u m o r s a r i s e f r o m c e l l s w i t h p r e e x i s t i n g o n c o g e n i c H r a s 1 g e n e m u t a t i o n s . W , 9 1 , 3 7 4 9 - 3 7 5 3 . C h a n d a r , N . L o m b a r d i , B . a n d L o c k e r , J . ( 1 9 8 9 ) c - m y c g e n e a m p l i f i c a t i o n d u r i n g h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s b y a c h o l i n e - d e v o i d d i e t . W L L S A , 8 6 , 2 7 0 3 - 2 7 0 7 . C h a n g , L . W . , H s i a , S . M . T . , C h a n , P . - C . a n d H s i e h , L . - L . ( 1 9 9 4 ) M a c r o m o l e c u l a r a d d u c t s : B i o m a r k e r s f o r t o x i c i t y a n d c a r c i n o g e n e s i s . W M m m , 3 4 . 4 1 - 6 7 . C h e n g , K . C . , C a h i l l , D . S . , K a s a i , H . , N i s h i m u r a , S . a n d L o e b , L A . ( 1 9 9 2 ) 8 - h y d r o x y g u a n i n e , a n a b u n d a n t f o r m o f o x i d a t i v e D N A d a m a g e , c a u s e s G - > T a n d A - > C s u b s t i t u t i o n s . m m , 2 6 7 , 1 6 6 - 1 7 2 . C h r i s t m a n , J . K . , C h e n , M . L . , S h e i k h n e j a d , G . , D i z i k , M . , A b i l e a h , S . a n d W a i n f a n , E . ( 1 9 9 3 ) M e t h y l d e f i c i e n c y , D N A m e t h y l a t i o n , a n d c a n c e r : S t u d i e s o n t h e r e v e r s i b i l i t y o f t h e e f f e c t s o f a l i p o t r o p e - d e f i c i e n t d i e t . W , 4 , 6 7 2 - 6 8 0 . C l a r k , S . J . , H a r r i s o n , J . a n d F r o m m e r , M . ( 1 9 9 5 ) C p r G m e t h y l a t i o n i n m a m m a l i a n c e l l s . W , 1 0 , 2 0 - 2 7 . C o h e n , S M . a n d E l l w e i n , L B . ( 1 9 9 2 ) R i s k a s s e s s m e n t b a s e d o n h i g h - d o s e a n i m a l e x p o s u r e e x p e r i m e n t s . W 5 , 7 4 2 - 7 4 8 . C o h e n , J . B . a n d L e v i n s o n , A D . ( 1 9 8 8 ) A p o i n t m u t a t i o n i n t h e l a s t i n t r o n r e s p o n s i b l e f o r i n c r e a s e d e x p r e s s i o n a n d t r a n s f o r m i n g a c t i v i t y o f t h e c - H a - r a s o n c o g e n e . W , 3 3 4 , 1 1 9 - 1 2 4 . 3 1 4 C o o n e y , C A . ( 1 9 9 3 ) . A r e s o m a t i c c e l l s i n h e r e n t l y d e f i c i e n t i n m e t h y l a t i o n m e t a b o l i s m ? A p r o p o s e d m e c h a n i s m f o r D N A m e t h y l a t i o n l o s s , s e n e s c e n c e a n d a g i n g . W i n g , 5 7 , 2 6 1 - 2 7 3 . C o u n t s , J . L . a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 3 ) C o m p a r a t i v e a n a l y s i s o f t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e 5 ' f l a n k i n g r e g i o n o f H a - r a s i n B G C 3 F 1 , C S H / H e a n d C S 7 B L / 6 m o u s e l i v e r . Q Q D Q Q L L Q I L . 7 5 , 1 2 9 - 1 3 6 . C o u n t s , J . L . a n d G o o d m a n , J . . l ( 1 9 9 4 ) H y p o m e t h y l a t i o n o f D N A . A n e p i g e n e t i c m e c h a n i s m i n v o l v e d I n t u m o r p r o m o t i o n . W , 1 1 , 1 8 5 - 1 8 8 . C o u n t s , J . L . a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 5 a ) A l t e r a t i o n s i n D N A m e t h y l a t i o n m a y p l a y a v a r i e t y o f r o l e s i n c a r c i n o g e n e s i s . 9 3 1 1 , 8 3 , 1 3 - 1 5 . C o u n t s , J . L . a n d G o o d m a n , J . l . ( 1 9 9 5 b ) P r i n c i p l e s u n d e r l y i n g d o s e s e l e c t i o n f o r , a n d e x t r a p o l a t i o n f r o m , t h e c a r c i n o g e n b i o a s s a y : D o s e i n f l u e n c e s m e c h a n i s m . B 2 9 1 1 1 _ I 9 x i 2 2 L _ E b a L m a 2 9 1 . . 2 1 4 1 8 - 4 2 1 C o u n t s , J . L . a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 5 0 ) H y p o m e t h y l a t i o n o f D N A : A n e p i g e n e t i c m e c h a n i s m t h a t c a n f a c i l i t a t e t h e a b e r r a n t o n c o g e n e e x p r e s s i o n i n v o l v e d i n l i v e r c a r c i n o g e n e s i s . I n J i r t l e , R . L . ( e d . ) W W 5 ; M s i s g u i a n a n g fl l n u s L M s s n s n i s m s . A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k , p p . 2 2 7 - 2 5 5 . C o u n t s , J . . L a n d G o o d m a n , J . . I ( 1 9 9 5 d ) H y p o m e t h y l a t i o n o f D N A : A p o s s i b l e e p i g e n e t i c m e c h a n i s m i n v o l v e d i n t u m o r p r o m o t i o n . I n M c C l a i n , R . M . , S l a g a , T J L e B o e u f R a n d P i t o t H ( e d S I W W W i l e y - L i s s N e w Y o r k P P 8 1 1 0 1 D e n d a , A . , U r a , H . , T s u j i u c h i , T . , T s u t s u m i , M . , E i m o t o , H . , T a k a s h i m a , Y . , K i t a z a w a , S . , K i n u g a s a , T . a n d K o n i s h i , Y . ( 1 9 8 9 ) P o s s i b l e i n v o l v e m e n t o f a r a c h i d o n i c a c i d m e t a b o l i s m i n p h e n o b a r b i t a l p r o m o t i o n o f h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s . W , 1 0 , 1 9 2 9 - 1 9 3 5 . D e n d a , A . , T a n g , 0 . , E n d o h , T . , T s u j i u c h i , T . , H o r i g u c h i , K . , N o g u c h i , 0 . , M i z u m o t o , Y . , N a k a e , D . a n d K o n i s h i , Y . ( 1 9 9 4 ) P r e v e n t i o n b y a c e t y l s a l i c y l i c a c i d o f l i v e r c i r r h o s i s a n d c a r c i n o g e n e s i s a s w e l l a s g e n e r a t i o n s o f 8 - h y d r o x y d e o x y g u a n o s i n e a n d t h i o b a r b i t u r i c a c i d - r e a c t i v e s u b s t a n c e s c a u s e d b y a c h o l i n e - d e f i c i e n t , L - a m i n o a c i d - d e f i n e d d i e t i n r a t s . Q a m n s g s n s s i s , 1 5 , 1 2 7 9 - 1 2 8 3 . D e S o u z a , A . T . , H a n k i n s , G . R . , W a s h i n g t o n , M . K . , F i n e , R . L . , O r t o n , T C . a n d J i r t l e , R L . ( 1 9 9 5 ) F r e q u e n t l o s s o f h e t e r o z y g o s i t y o f G o a t t h e m a n n o s e 6 - p h o s p h a t e / i n s u l i n - l i k e g r o w t h f a c t o r I I r e c e p t o r l o c u s i n h u m a n h e p a t o c e l l u l a r t u m o r s . Q n s n g s n s , 1 0 , 1 7 2 5 - 1 7 2 9 . 3 1 5 D i z i k , M . , C h r i s t m a n , J . K . a n d W a i n f a n , E . ( 1 9 9 1 ) A l t e r a t i o n s i n e x p r e s s i o n a n d m e t h y l a t i o n o f s p e c i f i c g e n e s i n l i v e r s o f r a t s f e d a c a n c e r p r o m o t i n g m e t h y l - d e f i c i e n t d i e t . g a m i n s g s n s s i s , 1 2 , 1 3 0 7 - 1 3 1 2 . D r a g a n , Y . P . , S a r g e n t , L . , X u , Y . - D . , X u , Y . - H . a n d P i t o t , H . C . ( 1 9 9 3 ) T h e i n i t i a t i o n - p r o m o t i o n - p r o g r e s s i o n m o d e l o f r a t h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s . M W . 2 0 2 ! 1 6 - 2 4 - E c k l , P . . , M M e y e r , S . . , A W h i t c o m b e , W . . R a n d J i r t l e , R . . L ( 1 9 8 8 ) P h e n o b a r b i t a l r e d u c e s E G F n u m b e r a n d t h e a b i l i t y o f p h y s i o l o g i c a l c o n c e n t r a t i o n s o f c a l c i u m t o s u p p r e s s h e p a t o c y t e p r o l i f e r a t i o n . a n z i n s g s n s s i s , 9 , 4 7 9 - 4 8 3 . E I - D e i r y , W . S . , N e l k i n , B . D . , C e l a n o , P . , Y e n , R . - W . C . , F a l c o , J . P . , H a m i l t o n , S R , a n d B a y l i n , S B . ( 1 9 9 1 ) . H i g h e x p r e s s i o n o f t h e D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e g e n e c h a r a c t e r i z e s h u m a n n e o p l a s t i c c e l l s a n d p r o g r e s s i o n s t a g e s o f c o l o n c a n c e r . W M . 8 8 . 3 4 7 0 - 3 4 7 4 . E n o m o t o , T . , W e g h o r s t , C . M . , W a r d , J . M . , A n d e r s o n , L . M . , P e r a n t o n i , A D . a n d R i c e , J . M . ( 1 9 9 3 ) L o w f r e q u e n c y o f H - r a s a c t i v a t i o n i n n a t u r a l l y o c c u r r i n g h e p a t o c e l l u l a r t u m o r s o f C 3 H / H e N C r m i c e . Q a n g i n g g s n s s i s , 9 , 1 9 3 9 - 1 9 4 4 . F a r b e r , E . ( 1 9 6 3 ) E t h i o n i n e c a r c i n o g e n e s i s . W , 7 , 3 8 3 - 4 7 4 . F e i n b e r g , A . P , a n d V o g e l s t e i n , B . ( 1 9 8 3 ) H y p o m e t h y l a t i o n o f r e s o n c o g e n e s i n p r i m a r y h u m a n c a n c e r s . W , 1 1 1 , 4 7 - 5 4 . F e o , F . , P a s c a l e , R . , S i m i l e , M . M . , R u g g i u , M . E . , D a i n o , L . , S a t t a , G . , a n d S e d d a i u , M A . ( 1 9 9 1 ) C h e m o p r e v e n t i o n o f r a t l i v e r c a r c i n o g e n e s i s b y S - a d e n o s y l m e t h i o n i n e : R o l e o f r e m o d e l i n g a n d a p o p t o s i s . I n C o l u m b a n o , A . e t a l ( e d s ) W . P l e n u m P r e s s , N e w Y o r k , p p . 5 2 9 - 5 5 1 . F e r g u s o n , A . T . , L a p i d u s , R . G . , B a y l i n , S B . a n d D a v i d s o n , N E . ( 1 9 9 5 ) D e m e t h y l a t i o n o f t h e e s t r o g e n r e c e p t o r g e n e i n e s t r o g e n r e c e p t o r - n e g a t i v e b r e a s t c a n c e r c e l l s c a n r e a c t i v a t e e s t r o g e n r e c e p t o r g e n e e x p r e s s i o n . g a n g s ; 8 9 2 . , 5 5 , 2 2 7 9 - 2 2 8 3 F i l m u s , J . , Z h a o , J . , a n d B u i c k , R N . ( 1 9 9 2 ) O v e r e x p r e s s i o n o f H - r a s o n c o g e n e i n d u c e s r e s i s t a n c e t o t h e g r o w t h - i n h i b i t o r y a c t i o n o f t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r b e t a - 1 ( T G F - B 1 ) a n d a l t e r s t h e n u m b e r a n d t y p e o f T G F - B 1 r e c e p t o r s i n r a t i n t e s t i n a l e p i t h e l i a l c e l l c l o n e s . Q n s o g s n s , 7 , 5 2 1 - 5 2 6 . F i n n e y , R E . a n d B i s h o p , J . M . ( 1 9 9 3 ) P r e d i s p o s i t i o n t o n e o p l a s t i c t r a n s f o r m a t i o n c a u s e d b y g e n e r e p l a c e m e n t o f H - r a s 1 . S s i s n c s , 2 6 0 , 1 5 2 4 - 1 5 2 7 . F o x , T . R . , S c h u m a n n , A . M . , W a t a n a b e , P . G . , Y a n o , B . L . , M a h e r , V . M . a n d M c C o r m i c k , J . J . ( 1 9 9 0 ) M u t a t i o n a l a n a l y s i s o f t h e H - r a s o n c o g e n e i n 3 1 6 s p o n t a n e o u s C S 7 B L / 6 x C 3 H / H e m o u s e l i v e r t u m o r s a n d t u m o r s i n d u c e d w i t h g e n o t o x i c a n d n o n g e n o t o x i c h e p a t o c a r c i n o g e n s . m . 5 0 , 4 0 1 4 - 4 0 1 9 . F u l l e r t o n , F . R . , H o o v e r , K . , M i k o l , Y . B . , C r e a s i a , D A . a n d P o i r i e r , L A . ( 1 9 9 0 ) T h e i n h i b i t i o n b y m e t h i o n i n e a n d c h o l i n e o f l i v e r c a r c i n o m a f o r m a t i o n i n m a l e C 3 H m i c e d o s e d w i t h d i e t h y l n i t r o s a m i n e a n d f e d p h e n o b a r b i t a l . C a m i n s g s n e s i s , 1 1 , 1 3 0 1 - 1 3 0 5 . G a m a - S o s a , M . . , A S l a g e l , V . . , A T r e w y n , R . , W . O x e n h a n d l e r , R . , K u o , K C . G e h r k e , C . W . a n d E h r l i c h , M . ( 1 9 8 3 ) T h e 5 - - m e t h y l c y t o s i n e c o n t e n t o f D N A f r o m h u m a n t u m o r s W , 1 1 , 6 8 8 3 - 6 8 9 4 . G a r d i n e r - G a r d e n , M . a n d F r o m m e r , M . ( 1 9 8 7 ) C p G i s l a n d s i n v e r t e b r a t e g e n o m e s . I L M Q L n g L . 1 9 6 , 2 6 1 - 2 8 2 . G e n e t i c s C o m p u t e r G r o u p . ( 1 9 9 4 ) P r o g r a m m a n u a l f o r t h e G C G p a c k a g e , v e r s i o n 8 . 0 , M a d i s o n , W I . G h o s h a l , A K a n d F a r b e r , E . ( 1 9 8 4 ) T h e i n d u c t i o n o f l i v e r c a n c e r b y d i e t a r y d e f i c i e n c y o f c h o l i n e a n d m e t h i o n i n e w i t h o u t a d d e d c a r c i n o g e n s . Q a r 2 1 n 2 9 2 0 2 2 1 2 . 5 . 1 3 6 7 - 1 3 7 0 . G h o s h a l , A K , a n d F a r b e r , E . ( 1 9 9 3 ) . C h o l i n e d e f i c i e n c y , l i p o t r o p e d e f i c i e n c y a n d t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r d i s e a s e i n c l u d i n g l i v e r c a n c e r : A n e w p e r s p e c t i v e . m m . 6 8 , 2 5 5 - 2 6 0 . G l o v e r , A B . a n d L e y l a n d - J o n e s , B . ( 1 9 8 7 ) B i o c h e m i s t r y o f a z a c y t i d i n e : A r e v i e w . C a n 2 9 1 l 1 9 9 1 m 2 m _ B e p _ 9 r 1 § . 7 1 . 9 5 9 - 9 6 4 . G o e l z , S . E . , V o g e l s t e i n , 8 . , H a m i l t o n , S R , a n d F e i n b e r g , A P . ( 1 9 8 5 ) H y p o m e t h y l a t i o n o f D N A f r o m b e n i g n a n d m a l i g n a n t h u m a n c o l o n n e o p l a s m s . 5 2 1 2 2 2 9 . 2 2 8 . 1 8 7 - 1 9 0 . G o n z a l e z - Z u l u e t a , M . , B e n d e r , C . M . , Y a n g , A . S . , N g u y e n , T . , B e a r t , R . W . , V a n T o m o u t , J . M . a n d J o n e s , P A . ( 1 9 9 5 ) M e t h y l a t i o n o f t h e 5 ’ C p G i s l a n d o f t h e p 1 6 / C D K N 2 t u m o r s u p p r e s s o r g e n e i n n o r m a l a n d t r a n s f o r m e d h u m a n t i s s u e s c o r r e l a t e s w i t h g e n e s i l e n c i n g . Q a n s s n fi s s u 5 5 , 4 5 3 1 - 4 5 3 5 . G o o d m a n , J . I . a n d C o u n t s , J . L . ( 1 9 9 3 ) H y p o m e t h y l a t i o n o f D N A : A p o s s i b l e n o n g e n o t o x i c m e c h a n i s m u n d e r l y i n g t h e r o l e o f c e l l p r o l i f e r a t i o n i n c a r c i n o g e n e s i s . W , 1 0 1 ( S u p p l . 5 ) , 1 6 9 - 1 7 2 . G o o d m a n , J . I . , W a r d , J . M . , P o p p , J . A . , K l a u n i g , J . E . a n d F o x , T R . ( 1 9 9 1 ) M o u s e l i v e r c a r c i n o g e n e s i s : M e c h a n i s m s a n d r e l e v a n c e . W , 1 7 , 6 5 1 - 6 6 5 . 3 1 7 G r e g e r , V . , D e b u s , N . , L o h m a n n , D . , H o p p i n g , W . , P a s s a r g e , E . a n d H o r s t h e m k e , B . ( 1 9 9 4 ) F r e q u e n c y a n d p a t e r n a l o r i g i n o f h y p e r m e t h y l a t e d R B 1 a l l e l e s i n r e t i n o b l a s t o m a . fi n m s n fi s n s n , 9 4 , 4 9 1 - 4 9 6 . G r u e n b a u m , Y . , C e d a r , H . a n d R a z i n , A . ( 1 9 8 2 ) S u b s t r a t e a n d s e q u e n c e s p e c i f i c i t y o f a e u k a r y o t i c D N A m e t h y l a s e . W , 2 9 5 , 2 6 0 - 2 6 2 . H a n i g a n , M . H . , K e m p , C . J . , G i n s l e r , J . J . a n d D r i n k w a t e r , N R ( 1 9 8 8 ) R a p i d g r o w t h o f p r e n e o p l a s t i c l e s i o n s i n h e p a t o c a r c i n o g e n - s e n s i t i v e C S H / H e J m a l e m i c e r e l a t i v e t o C S 7 B I J 6 J m a l e m i c e . W , 9 , 8 8 5 - 8 9 0 . H a s s , B . S . , H a r t , R . W . , L u , M . H . a n d L y n - C o o k , 8 D . ( 1 9 9 3 ) E f f e c t s o f c a l o r i c r e s t r i c t i o n i n a n i m a l s o n c e l l u l a r f u n c t i o n , o n c o g e n e e x p r e s s i o n , a n d D N A m e t h y l a t i o n i n v i t r o . W , 2 9 5 , 2 8 1 - 2 8 9 . H a s s e , A . , S c h u l t z , W A a n d S i e s , H . ( 1 9 9 2 ) D e n o v o m e t h y l a t i o n o f t r a n s f e c t e d C A T g e n e p l a s m i d c o n s t r u c t s i n F 9 m o u s e e m b r y o n a l c a r c i n o m a c e l l . 3 1 9 9 1 1 1 1 9 . W 1 1 3 1 1 6 - 2 2 H a u s h e e r , F . H . , R a o , S . N . , G a m c s i k , M . P . , K o l l m a n , P . A . , C o l v i n , C . M . , S a x e , J . D . , N e l k i n , B . D . , M c L e n n a n , I . J . , B a r n e t t , G . a n d B a y l i n , S B . ( 1 9 8 9 ) C o m p u t a t i o n a l a n a l y s i s o f s t r u c t u r a l a n d e n e r g e t i c c o n s e q u e n c e s o f D N A m e t h y l a t i o n . Q a r s i n s g s n s s i s , 1 0 , 1 1 3 1 - 1 1 3 7 . H e p b u r n , P . A . , M a r g i s o n , G P . a n d T i s d a l e , M . J . ( 1 9 9 1 ) E n z y m a t i c m e t h y l a t i o n o f c y t o s i n e i n D N A i s p r e v e n t e d b y a d j a c e n t O - 6 - m e t h y l g u a n i n e r e s i d u e s . , 1 , B _ i _ o _ | _ , _ C _ n _ e _ m , , 2 6 6 , 7 9 8 5 - 7 9 8 7 . H e r g e r s b e r g , M . ( 1 9 9 1 ) B i o l o g i c a l a s p e c t s o f c y t o s i n e m e t h y l a t i o n i n e u k a r y o t i c c e l l s . 5 2 1 1 2 1 0 2 0 1 1 2 4 7 . 1 1 7 1 - 1 1 8 5 . H e r m a n , J . G . , L a t i f , F . , W e n g , Y . , L e r m a n , M . I . , Z b a r , 8 . , L i u , S . , S a m i d , D . , D u a n , D . - S . . , R G n a r r a , J R , L i n e h a n , W M a n d B a y l i n , S B ( 1 9 9 4 ) S i l e n c i n g o f t h e V H L t u m o r - s u p p r e s s o r g e n e b y D N A m e t h y l a t i o n i n r e n a l c a r c i n o m a . M I L W A . . . 9 1 , 9 7 0 0 - 9 7 0 4 . H e r m a n , J . G . , M e r l o , A . , M a o , L . , L a p i d u s , R . G . , I s s a , J . - P . J . , D a v i d s o n , N . E . , S i d r a n s k y , D . a n d B a y l i n , S B . ( 1 9 9 5 ) I n a c t i v a t i o n o f t h e C D K N 2 / p 1 6 / M T S 1 g e n e i s f r e q u e n t l y a s s o c i a t e d w i t h a b e r r a n t D N A m e t h y l a t i o n i n a l l c o m m o n h u m a n c a n c e r s . fi n g e r — R e s “ 5 5 , 4 5 2 5 - 4 5 3 0 . H o f f m a n , R M ( 1 9 8 4 ) A l t e r e d m e t h i o n i n e m e t a b o l i s m , D N A m e t h y l a t i o n a n d o n c o g e n e e x p r e s s i o n i n c a r c i n o g e n e s i s : A r e v i e w a n d s y n t h e s i s . B I Q Q J I L H L W 7 3 8 4 9 - 8 7 3 1 8 H o l l i d a y , R . ( 1 9 8 7 ) T h e i n h e r i t a n c e o f e p i g e n e t i c d e f e c t s . S s i s n s e , 2 3 8 , 1 6 3 - 1 7 0 . H o l l i d a y , R . ( 1 9 8 9 ) X - c h r o m o s o m e r e a c t i v a t i o n a n d a g e i n g . W , 3 3 7 , 3 1 1 . H o l l i d a y , R . ( 1 9 9 0 ) M e c h a n i s m s f o r t h e c o n t r o l o f g e n e a c t i v i t y d u r i n g d e v e l o p m e n t . B i Q L B B L . 6 5 , 4 3 1 - 4 7 1 . H o l l i d a y , R . a n d H o , T . ( 1 9 9 1 ) G e n e s i l e n c i n g i n m a m m a l i a n c e l l s b y u p t a k e o f 5 - m e t h y l d e o x y c y t i d i n e - 5 ' - t r i p h o s p h a t e . W M , 1 7 , 5 3 7 - 5 4 2 . H o u c k , K . A . , M i c h a l o p o u l o s , G K , a n d S t r o m , S C . ( 1 9 8 9 ) I n t r o d u c t i o n o f a H a - r a s o n c o g e n e i n t o r a t l i v e r e p i t h e l i a l c e l l s a n d p a r e n c h y m a l h e p a t o c y t e s c o n f e r s r e s i s t a n c e t o t h e g r o w t h i n h i b i t o r y e f f e c t s o f T G F - B . Q n g s g s n s , 4 , 1 9 - 2 5 . H s i e h , L . L . , W a i n f a n , E . , H o s h i n a , S . , D i z i k , M . a n d W e i n s t e i n , L B . ( 1 9 8 9 ) A l t e r e d e x p r e s s i o n o f r e t r o v i r u s - l i k e s e q u e n c e s a n d c e l l u l a r o n c o g e n e s i n m i c e f e d m e t h y l - d e f i c i e n t d i e t s . Q a n g s L B s s U 4 9 , 3 7 9 5 - 3 7 9 9 . H u g g e t t , A . C . , E l l i s , P . A . , F o r d , C . P . , H a m p t o n , L . L . , R i m o l d i , D . a n d T h o r g e i r s s o n , S S . ( 1 9 9 1 ) D e v e l o p m e n t o f r e s i s t a n c e t o t h e g r o w t h i n h i b i t o r y e f f e c t s o f t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r [ 3 , d u r i n g t h e s p o n t a n e o u s t r a n s f o r m a t i o n o f r a t l i v e r e p i t h e l i a l c e l l s . Q a n g s L B e s “ 5 1 , 5 9 2 9 - 5 9 3 6 . H u g g e t t , A . C . , H a m p t o n , L . L . , F o r d , C . P . , W i r t h , R J . , a n d T h o r g e i r s s o n , 3 . 8 . ( 1 9 9 0 ) A l t e r e d r e s p o n s i v e n e s s o f r a t l i v e r e p i t h e l i a l c e l l s t o t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r [ 3 , f o l l o w i n g t h e i r t r a n s f o r m a t i o n w i t h v - r a f . 2 2 9 2 2 3 1 9 9 . 5 0 , 7 4 6 8 - 7 4 7 5 . J e n k i n s , M . Y . , S h e i k h , N . M . , M i t c h e l l , G . V . , G r u n d e l , E . , B l a k e l y , S R . a n d C a r t e r , C . J . ( 1 9 9 3 ) D i e t a r y c a r o t e n o i d s i n f l u e n c e d b i o c h e m i c a l b u t n o t m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s i n a d u l t m a l e r a t s f e d a c h o l i n e - d e f i c i e n t d i e t . N W , 1 9 , 5 5 - 6 5 . J i r t l e , R L . a n d M e y e r , S A . ( 1 9 9 1 ) L i v e r t u m o r p r o m o t i o n : E f f e c t o f p h e n o b a r b i t a l o f E G F a n d p r o t e i n k i n a s e C s i g n a l t r a n s d u c t i o n a n d t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - B 1 e x p r e s s i o n . W , 3 6 , 6 5 9 - 6 6 8 . J i r t l e , R L . , a n d M i c h a l o p o u l o s , G . ( 1 9 8 6 ) E n h a n c e m e n t o f t h e c l o n a b i l i t y o f a d u l t p a r e n c h y m a l h e p a t o c y t e s w i t h t h e l i v e r t u m o r p r o m o t e r p h e n o b a r b i t a l . 9 9 1 9 1 0 9 9 2 2 2 2 1 2 . 7 , 1 8 1 3 - 1 8 1 7 . J i r t l e , R . L . , H a a g , J . D . , A r i a z i , E A . a n d G o u l d , M N . ( 1 9 9 3 ) I n c r e a s e d m a n n o s e 6 - p h o s p h a t e / i n s u l i n - l i k e g r o w t h f a c t o r I I r e c e p t o r a n d t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r 3 1 9 [ 3 1 l e v e l s d u r i n g m o n o t e r p e n e - i n d u c e d r e g r e s s i o n o f m a m m a r y t u m o r s . g a n g s ; 3 9 . 5 . . 5 3 , 3 8 4 9 - 3 8 5 2 . J i r t l e , R . L . , H a n k i n s , G . R . , R e i s e n b i c h l e r , H . a n d B o y e r , I . J . ( 1 9 9 4 ) R e g u l a t i o n o f m a n n o s e 6 - p h o s p h a t e / i n s u l i n - - l i k e g r o w t h f a c t o r - l l r e c e p t o r s a n d t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r b e t a d u r i n g l i v e r t u m o r p r o m o t i o n w i t h p h e n o b a r b i t a l . 2 9 2 m m . 1 5 1 4 7 3 - 1 4 7 8 J o n e s , R A . ( 1 9 8 6 ) D N A m e t h y l a t i o n a n d c a n c e r . 9 3 0 2 . 8 1 . 8 2 . 5 1 . 4 6 , 4 6 1 - 4 6 6 . J o n e s , P A . a n d B u c k l e y , J D . ( 1 9 9 0 ) T h e r o l e o f D N A m e t h y l a t i o n i n c a n c e r . W . 5 4 . 1 - 2 3 . K a f r i , T , G a o , X . , a n d R a z i n , A . ( 1 9 9 3 ) M e c h a n i s t i c a s p e c t s o f g e n o m e - w i d e d e m e t h y l a t i o n i n t h e p r e i m p l a n t a t i o n m o u s e e m b r y o . P m , N a t l , A s s n , S s i , m , 9 0 , 1 0 5 5 8 - 1 0 5 6 2 . K a u f m a n n , W . . , K R i r i e , D . . , G a n d K a u f m a n , D . . G ( 1 9 8 8 ) P h e n o b a r b i t a l - d e p e n d e n t p r o l i f e r a t i o n o f p u t a t i v e i n i t i a t e d r a t h e p a t o c y t e s . Q a m n s g s n s s i s , 9 , 7 7 9 - 7 8 2 . K i m , Y . - l . , G i u l i a n o , A . , H a t c h , K . D . , S c h n e i d e r , A . , N o u r , M . A . , D a l l a l , G . E . , S e l h u b , J . a n d M a s o n , J . B . ( 1 9 9 4 ) G l o b a l D N A h y p o m e t h y l a t i o n i n c r e a s e s p r o g r e s s i v e l y i n c e r v i c a l d y s p l a s i a a n d c a r c i n o m a . Q a n g s r , 7 4 , 8 9 3 - 8 9 9 . K l a u n i g , J . E . , S i g l i n , J . C . , S c h a f e r , L . D . , H a r t n e t t , J . A . , W e g h o r s t , C . M . , O l s o n , M . J . a n d H a m p t o n , J . A . ( 1 9 8 9 ) C o r r e l a t i o n b e t w e e n s p e c i e s a n d t i s s u e s e n s i t i v i t y t o c h e m i c a l c a r c i n o g e n e s i s i n r o d e n t s a n d t h e i n d u c t i o n o f D N A s y n t h e s i s . I n B u t t e n r v o r t h , B . E . , S l a g a , T J . , F a r l a n d , W . , M c C l a i n , M . ( e d s . ) I P I I i - J I = 0 = ' l i f = — . r 0 1 ' , - 1 . . 0 3 . - = n : . W i l e y - L i s s , I n c . , N e w Y o r k , p p . 1 8 5 - 1 9 4 . K l e i n , C . B . , C o n w a y , K . , W a n g , X . W . , B h a m r a , R . K . , L i n , X . , C o h e n , M D , A n n a b , L . , B a r r e t t , J . C . , a n d C o s t a , M . ( 1 9 9 1 ) S e n e s c e n c e o f n i c k e l - t r a n s f o r m e d c e l l s b y a n X c h r o m o s o m e : P o s s i b l e e p i g e n e t i c c o n t r o l . S s i s n s s , 2 5 1 , 7 9 6 - 7 9 9 . L a i r d , P . W . , J a c k s o n - G r u s b y , L . , F a z e l i , A . , D i c k i n s o n , S . L . , J u n g , W . E . , L i , E . , W e i n b e r g , R A . a n d J a e n i s c h , R . ( 1 9 9 5 ) S u p p r e s s i o n o f i n t e s t i n a l n e o p l a s i a b y D N A h y p o m e t h y l a t i o n . C e l l , 8 1 , 1 9 7 - 2 0 5 . L a p e y r e , J . - . , N a n d B e c k e r , F F . ( 1 9 7 9 ) 5 - - M e t h y l c y t o s i n e c o n t e n t o f n u c l e a r D N A d u r i n g c h e m i c a l h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s a n d i n c a r c i n o m a s w h i c h r e s u l t . W M 8 7 6 9 8 - 7 0 5 3 2 0 L a p e y r e , J . - N . , W a l k e r , M . S . , a n d B e c k e r , P F ( 1 9 8 1 ) D N A m e t h y l a t i o n a n d m e t h y l a s e l e v e l s i n n o r m a l a n d m a l i g n a n t m o u s e h e p a t i c t i s s u e . W 1 2 1 8 7 3 - 8 7 8 ° L e e , G . H . , N o m u r a , K . , K a n d a , H . , K u s a k a b e , M . , Y o s h i k i , A . , S a k a k u r a , T . a n d K i t a g a w a , T . ( 1 9 9 1 ) S t r a i n s p e c i f i c s e n s i t i v i t y t o d i e t h y l n i t r o s a m i n e - i n d u c e d c a r c i n o g e n e s i s i s m a i n t a i n e d i n h e p a t o c y t e s o f C S H / H e N < - > C S 7 B U 6 N c h i m e r i c m i c e . 9 3 0 2 . 9 1 . 8 9 . 5 1 . 5 1 , 3 2 5 7 - 3 2 6 0 . L e w i s , J . a n d B i r d , A . ( 1 9 9 1 ) D N A m e t h y l a t i o n a n d c h r o m a t i n s t r u c t u r e . E E B S 1 . 2 1 1 . . 2 8 5 , 1 5 5 - 5 9 . L i , E . , B e a r d , C . a n d J a e n i s c h , R . ( 1 9 9 3 ) R o l e f o r D N A m e t h y l a t i o n i n g e n o m i c i m p r i n t i n g . W , 3 6 6 , 3 6 2 - 3 6 5 . L i , E . , B e s t o r , T H . a n d J a e n i s c h , R . ( 1 9 9 2 ) T a r g e t e d m u t a t i o n o f t h e D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e g e n e r e s u l t s i n e m b r y o n i c l e t h a l i t y . Q 9 1 ] , 6 9 , 9 1 5 - 9 2 6 . L o c k e r , J . , R e d d y , T . V . a n d L o m b a r d i , B . ( 1 9 8 6 ) D N A m e t h y l a t i o n a n d h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s i n r a t s f e d a c h o l i n e - d e v o i d d i e t . Q a m j n s g s n s s i s , 7 , 1 3 0 9 - 1 3 1 2 . L o m b a r d i , B . a n d S m i t h , M L . ( 1 9 9 4 ) T u m o r i g e n e s i s , p r o t o o n c o g e n e a c t i v a t i o n , a n d o t h e r g e n e a b n o r m a l i t i e s i n m e t h y l d e f i c i e n c y . W , 5 , 2 - 9 . M a c L e o d , A R . a n d S z y f , M . ( 1 9 9 5 ) E x p r e s s i o n o f a n t i s e n s e t o D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e m R N A i n d u c e s D N A d e m e t h y l a t i o n a n d i n h i b i t s t u m o r i g e n e s i s . W . 2 7 0 , 8 0 3 7 - 8 0 4 3 . M a c L e o d , A . R . , R o u l e a u , J . a n d S z y f , M . ( 1 9 9 5 ) R e g u l a t i o n o f D N A m e t h y l a t i o n b y t h e R a s s i g n a l i n g p a t h w a y . J . M . 2 7 0 , 1 1 3 2 7 - 1 1 3 3 7 . M a k o s , M . , N e l k i n , B . D . , C h a z i n , V . R . , C a v e n e e , W . K . , B r o d e u r , G M . a n d B a y l i n , S . B . ( 1 9 9 3 a ) D N A h y p e r m e t h y l a t i o n i s a s s o c i a t e d w i t h 1 7 p a l l e l i c l o s s i n n e u r a l t u m o r s . 9 . 3 0 9 1 3 2 5 “ 5 3 , 2 7 1 5 - 2 7 1 8 . M a k o s , M . , N e l k i n , B . D . , R e i t e r , R . E . , G n a r r a , J . R . , B r o o k s , J . , l s a a c s , W . , L i n e h a n , M . a n d B a y l i n , S . B . ( 1 9 9 3 b ) R e g i o n a l h y p e r m e t h y l a t i o n a t D 1 7 8 5 p r e c e d e s 1 7 p s t r u c t u r a l c h a n g e s i n t h e p r o g r e s s i o n ' o f r e n a l t u m o r s . £ 8 0 9 . 9 1 3 9 s , , 5 3 , 2 7 1 9 - 2 7 2 2 . M a r o n p o t , R . R . , F o x , T . , M a l a r k e y , D E . a n d G o l d s w o r t h y , T L . ( 1 9 9 5 ) M u t a t i o n i n t h e r e s p r o t o - o n c o g e n e : C l u e s t o e t i o l o g y a n d m o l e c u l a r p a t h o g e n e s i s o f m o u s e l i v e r t u m o r s . M i s s i s g y , 1 0 1 , 1 2 5 - 1 5 6 . M a r x , J . ( 1 9 9 1 ) P o s s i b l e n e w c o l o n c a n c e r g e n e f o u n d . S s i s n g s , 2 5 1 , 1 3 1 7 . 3 2 1 M a t t h e w s , E . J . , S p a l d i n g , J . W . a n d T e n n a n t , R W . ( 1 9 9 3 ) T r a n s f o r m a t i o n o f B A L B / c - 3 T 3 c e l l s : v . t r a n s f o r m a t i o n r e s p o n s e s o f 1 6 8 c h e m i c a l s c o m p a r e d w i t h m u t a g e n i c i t y i n s a l m o n e l l a a n d c a r c i n o g e n i c i t y i n r o d e n t b i o a s s a y s . E n x i L q m W . ( S U p p l . 2 ) , 1 0 1 , 3 4 7 - 4 8 2 . M c C l a i n , R M . ( 1 9 9 4 ) M e c h a n i s t i c c o n s i d e r a t i o n s i n t h e r e g u l a t i o n a n d c l a s s i f i c a t i o n o f c h e m i c a l c a r c i n o g e n s . I n K o t s o n i s , F . N . M a c k e y , M . a n d H i e l l e , J . ( e d s . ) m m i s n a i l o x i s s l s g y . R a v i n P r e s s , N e w Y o r k , p p . 2 7 3 - 3 0 4 . M e e h a n , R . , L e w i s , J . , C r o s s , 8 . , N a n , X . , J e p p e s e n , P . a n d B i r d , A . ( 1 9 9 2 ) T r a n s c r i p t i o n a l r e p r e s s i o n b y m e t h y l a t i o n o f C p G . , L Q s i L S s i s n s s , ( S u p p l ) 1 6 , 9 - 1 4 . M i g e o n , B . R . , A x e l m a n , J . a n d B e g g s , A H . ( 1 9 8 8 ) E f f e c t o f a g e i n g o n r e a c t i v a t i o n o f t h e h u m a n X - I i n k e d H P R T l o c u s . W , 3 3 5 , 9 3 - 9 6 . M i k o l , Y B , H o o v e r , K L , C r e a s i a , D . a n d P o i r i e r , L A . ( 1 9 8 3 ) H e p a t o c a r c i n o g e n e s i s i n r a t s f e d m e t h y l - d e f i c i e n t , a m i n o a c i d - d e f i n e d d i e t s . 9 . 8 1 9 1 1 1 1 2 9 9 1 1 2 5 1 5 . 4 1 6 1 9 - 1 6 2 9 M i l l e r , J . A . ( 1 9 9 4 ) R e c e n t s t u d i e s o n t h e m e t a b o l i c a c t i v a t i o n o f c h e m i c a l c a r c i n o g e n s . Q a n s fl fl e s " ( S u p p l ) 5 4 , 1 8 7 9 5 - 1 8 8 1 s . M i l l s , J . J . , J i r t l e , R . . L a n d B o y e r , . I . J . ( 1 9 9 5 ) M e c h a n i s m s o f l i v e r t u m o r p r o m o t i o n . I n J i r t l e , R . L . ( e d . ) i W . A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k , p p . 1 9 9 - 2 2 6 . M i z u m o t o , Y . , N a k a e , D . , Y o s h i j i , H . , A n d o h , N . , H o r i g u c h i , K . , E n d o h , T . , K o b a y a s h i , E . , T s u j i u c h i , T . , S h i m o j i , N . , D e n d a , A . , T s u j i i , T . , N a g a o , M . , W a k a b a y a s h i , K . a n d K o n i s h i , Y . ( 1 9 9 4 ) I n h i b i t o r y e f f e c t s o f 2 - 0 - o c t a d e c y l a s c o r b i c a c i d a n d o t h e r v i t a m i n C a n d E d e r i v a t i v e s o n t h e i n d u c t i o n o f e n z y m e - a l t e r e d p u t a t i v e p r e n e o p l a s t i c l e s i o n s i n t h e l i v e r s o f r a t s f e d a c h o l i n e - d e f i c i e n t , L - a m i n o a c i d - d e f i n e d d i e t . Q a m i n g g s n s s i s , 1 5 , 2 4 1 - 2 4 6 . M o u l d s , B A . a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 4 ) S p o n t a n e o u s m u t a t i o n a t c o d o n 6 1 o f t h e H a - r a s g e n e i n t h e n a s c e n t l i v e r o f B 6 0 3 F 1 , C S H / H e a n d C S 7 B L / 6 m i c e . W i t - . 8 1 5 . ” 3 1 1 1 1 - 7 - M i a n e l , P . A . , P f o h l - L e s z k o w i c z , A . , R é h r d a n z , E . , K e i t h , G . , D i r h e i m e r , G . a n d B o c k , K . W . ( 1 9 9 1 ) S i t e - s p e c i f i c h y p o m e t h y l a t i o n o f c - m y c p r o t o o n c o g e n e i n l i v e r n o d u l e s a n d i n h i b i t i o n o f D N A m e t h y l a t i o n b y N - n i t r o s o m o r p h o l i n e . B i g s h s m , P h a n _ ’ r i , , 4 2 , 3 6 5 - 3 7 1 . M u r c h i e , A . I . H . a n d L i l l e y , D . M . J . ( 1 9 8 9 ) B a s e m e t h y l a t i o n a n d l o c a l D N A h e l i x s t a b i l i t y : E f f e c t o f t h e k i n e t i c s o f c r u c i f o r m e x t r u s i o n . M , 2 0 5 , 5 9 3 - 6 0 2 . 3 2 2 N a k a e , D . , M i z u m o t o , Y . , , Y o s h i j i , H . , A n d o h , N . , H o r i g u c h i , K . , S h i r a i w a , K . , K o b a y a s h i , E . , E n d o h , T . , S h i m o j i , N . , T a m u r a , K . , T s u j i u c h i , T . , D e n d a , A . a n d K o n i s h i , Y . ( 1 9 9 4 ) D i f f e r e n t r o l e s o f 8 - h y d r o x y g u a n i n e f o r m a t i o n a n d 2 - t h i o b a r b i t u r i c a c i d - r e a c t i n g s u b s t a n c e g e n e r a t i o n i n t h e e a r l y p h a s e o f l i v e r c a r c i n o g e n e s i s i n d u c e d b y a c h o l i n e - d e f i c i e n t , L - a m i n o a c i d - d e f i n e d d i e t i n r a t e - . 1 9 n . _ . 1 . _ Q a n 2 9 L B 2 9 . . 8 5 . 4 9 9 - 5 0 5 . N e a d e s , R . , B e t z , N . A . , S h e n g , X . a n d P e l l i n g , J G . ( 1 9 9 1 ) T r a n s i e n t e x p r e s s i o n o f t h e c l o n e d m o u s e o - H a — r a s 5 ’ u p s t r e a m r e g i o n i n t r a n s f e c t e d p r i m a r y S E N C A R m o u s e k e r a t i n o c y t e s d e m o n s t r a t e s i t s p o w e r a s a p r o m o t e r e l e m e n t . 1 1 4 9 1 1 2 9 1 2 1 1 3 9 . 9 2 0 1 . 4 . 3 6 9 - 3 7 5 . N e w b e m e , P M ( 1 9 8 6 ) L i p o t r o p i c f a c t o r s a n d o n c o g e n e s i s . l n P o i r i e r , L . . , A N e w b e m e P M a n d P e r i z e M H W ( e d S I A d x a n 2 9 2 J n j x 2 2 d m 2 M 2 L M 2 9 1 2 l n e a n d fl i s l s g y . P l e n u m P r e s s , N e w Y o r k , p p . 2 2 3 - 2 5 0 . N e w b e m e , P . M . , d e C a m a r g o , J . L . V . a n d C l a r k , A . J . ( 1 9 8 2 ) C h o l i n e d e f i c i e n c y , p a r t i a l h e p a t e c t o m y , a n d l i v e r t u m o r s i n r a t s a n d m i c e . l j n x i g n l , P a t h . , 1 0 , 9 5 - 1 0 6 . N e w b e m e , P . M . , S u p h i p h a t , V . , L o c n i s k a r , M . a n d d e C a m a r g o , J . L . V . ( 1 9 9 0 ) I n h i b i t i o n o f h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s i n m i c e b y d i e t a r y m e t h y l d o n o r s m e t h i o n i n e a n d c h o l i n e . N W , 1 4 , 1 7 5 - 1 8 1 . O p d e n c a m p , K . , R i v i e r e , M , M o l n é , M , S z p i r e r , J . a n d S z p i r e r , C . ( 1 9 9 2 ) M e t h y l a t i o n o f a n o r - f o e t o p r o t e i n g e n e i n t r a g e n i c s i t e m o d u l a t e s g e n e a c t i v i t y . N 2 2 l e i 2 A 2 ; d _ s _ B 2 9 . . 2 0 1 7 1 - 1 7 8 P a r s o n s , R . , L i , G . - M . , L o n g l e y , M . , M o d r i c h , F . , L i u , 8 . , B e r k , T . , H a m i l t o n , S . R . , K i n z l e r , K . W . a n d V o g e l s t e i n , B . ( 1 9 9 5 ) M i s m a t c h r e p a i r d e f i c i e n c y i n p h e n o t y p i c a l l y n o r m a l h u m a n c e l l s . fi g i s n g s , 2 6 8 , 7 3 8 - 7 4 0 . P a s c a l e , R . M . , M a r r a s , V . , S i m i l e , M . M . , D i a n o , L . , P i n n a , G . , B e n n a t i , S . , C a r t a , M . , S e d d a i u , M . A . , M a s s a r e l l i , G . a n d F e o , F . ( 1 9 9 2 ) C h e m o p r e v e n t i o n o f r a t l i v e r c a r c i n o g e n e s i s b y S - a d e n o s y l - L - m e t h i o n i n e : A l o n g t e r m s t u d y . Q a n s e l 8 9 . 5 1 . 5 2 . 4 9 7 9 - 4 9 8 6 . P e r e r a , M . I . R . , D e m e t r i s , A . J . , K a t y a l , S . a n d S h i n o z u k a , H . ( 1 9 8 5 ) L i p i d p e r o x i d a t i o n o f l i v e r m i c r o s o m e m e m b r a n e s i n d u c e d b y c h o l i n e - d e f i c i e n t d i e t s a n d i t s r e l a t i o n s h i p t o t h e d i e t - i n d u c e d p r o m o t i o n o f t h e i n d u c t i o n o f y - g I u t a m y l t r a n s p e p t i d a s e - p o s i t i v e f o c i . 9 . 8 9 m . . . 4 5 , 2 5 3 3 - 2 5 3 8 . 3 2 3 P f o h l - L e s z k o w i c z , A . a n d D i r h e i m e r , G . ( 1 9 8 6 ) C h a n g e s i n d e n o v o D N A ( c y t o s i n e - 5 - ) - m e t h y l t r a n s f e r a s e a c t i v i t y i n o n c o g e n i c a l l y s u s c e p t i b l e r a t t a r g e t t i s s u e s i n d u c e d b y N - m e t h y l - N - n i t r o s o u r e a . Q a n g s r j s s , 4 6 , 1 1 1 0 - 1 1 1 3 . P i t o t , H . C . ( 1 9 9 0 ) A l t e r e d h e p a t i c f o c i : T h e i r r o l e i n m u r i n e h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s . W , 3 0 , 4 6 5 - 5 0 0 . P i t o t , H . C . a n d D r a g a n , Y . P . ( 1 9 9 1 ) F a c t s a n d t h e o r i e s c o n c e r n i n g t h e m e c h a n i s m s o f c a r c i n o g e n e s i s . E A S E B J L , 5 , 2 2 8 0 - 2 2 8 6 . P i t o t , H . C . a n d D r a g a n , Y . P . ( 1 9 9 5 ) T h e i n s t a b i l i t y o f t u m o r p r o m o t i o n i n r e l a t i o n t o h u m a n c a n c e r r i s k . I n M c C l a i n , R . M . , S l a g a , T . . , J L e B o e u f , R . a n d P i t o t , H . ( e d s . ) 0 1 1 - . ” - = 1 1 T 1 1 0 ' 0 1 - 0 1 ' _ 1 1 - . 0 1 0 ' 1 - = 1 1 = 1 . W i l e y - L i s s , N e w Y o r k , p p . 2 1 - 3 8 . R a p P . U . R . ( 1 9 9 1 ) R o l e o f R a f - 1 s e r i n e / t h r e o n i n e p r o t e i n k i n a s e i n g r o w t h f a c t o r s i g n a l t r a n s d u c t i o n . Q n g s g s n s , 6 , 4 9 5 - 5 0 0 . R a y , J . S , H a r b i s o n , M . L , M c C l a i n , R . M . a n d G o o d m a n , J . . | ( 1 9 9 4 ) A l t e r a t i o n s i n t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s a n d e x p r e s s i o n o f t h e r e f o n c o g e n e i n p h e n o b a r b i t a l - i n d u c e d a n d s p o n t a n e o u s B G C 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s . W , 9 , 1 5 5 - 1 6 6 . R a z i n , A . a n d C e d a r , H . ( 1 9 9 1 ) D N A m e t h y l a t i o n a n d g e n e e x p r e s s i o n . M I 2 1 9 2 I 2 L . B 2 ¥ . 5 5 4 5 1 - 4 5 8 R a z i n , A . a n d K a f r i , T . ( 1 9 9 4 ) D N A m e t h y l a t i o n f r o m e m b r y o t o a d u l t . E m N 2 2 1 9 I 2 A 2 i d _ B 2 s . _ M 2 L _ B _ L o _ I . . 4 8 , 5 3 - 8 1 . R a z i n , A . , S z y f , M . , K a f r i , T . , R o l l , M . , G i l o h , H . , S c a r p a , S . , C a r o t t i , D . a n d C a n t o n i , G . L . ( 1 9 8 6 ) R e p l a c e m e n t o f 5 - m e t h y l c y t o s i n e b y c y t o s i n e : A p o s s i b l e m e c h a n i s m f o r t r a n s i e n t D N A d e m e t h y l a t i o n d u r i n g d i f f e r e n t i a t i o n . E L Q Q . _ N _ 8 1 L M . A . , 8 3 , 2 8 2 7 - 2 8 3 1 . R e i s e n b i c h l e r , H . , C h a r i , R . S . , B o y e r , I . J . a n d J i r t l e , R L . ( 1 9 9 4 ) T r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - i 3 r e c e p t o r s t y p e I , I I a n d I I I i n p h e n o b a r b i t a l - p r o m o t e d r a t l i v e r t u m o r s . W . 1 5 , 2 7 6 3 - 2 7 6 7 . R e y n o l d s , S . H . , S t o w e r s , S . J . , P a t t e r s o n , R . M . , M a r o n p o t , R . R . , A a r o n s o n , S . A . a n d A n d e r s o n , M W . ( 1 9 8 7 ) A c t i v a t e d o n c o g e n e s i n B G C 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s : I m p l i c a t i o n s f o r r i s k a s s e s s m e n t . S s i s n s s , 2 3 7 , 1 3 0 9 - 1 3 1 6 . R h i m , J . S . ( 1 9 9 3 ) N e o p l a s t i c t r a n s f o r m a t i o n o f h u m a n c e l l s i n v i t r o . M 0 0 2 2 9 2 1 1 2 9 1 2 . 4 . 3 1 3 - 3 3 5 . 3 2 4 R i d e o u t , W . M . , C o e t z e e , G . A . , O l u m i , A F . a n d J o n e s , P A . ( 1 9 9 0 ) 5 - M e t h y l c y t o s i n e a s a n e n d o g e n o u s m u t a g e n i n t h e h u m a n L D L r e c e p t o r a n d p 5 3 g e n e s . S s i s n g s , 2 4 9 , 1 2 8 8 - 1 2 9 0 . R i m o l d i , D . , S r i k a n t a n , V . , W i l s o n , V . L . , B a s s i n , R H . a n d S a m i d , D . ( 1 9 9 1 ) I n c r e a s e d s e n s i t i v i t y o f n o n t u m o r i g e n i c f i b r o b l a s t s e x p r e s s i n g r a s o r m y c o n c o g e n e s t o m a l i g n a n t t r a n s f o r m a t i o n i n d u c e d b y 5 - a z a - 2 ' - d e o x y c y t i d i n e . 9 2 2 2 1 8 9 9 . . 5 1 . 3 2 4 - 3 3 0 . R o g e r s , A . E . , Z e i s e l , S H . a n d G r o o p m a n , J . ( 1 9 9 3 ) D i e t a n d c a r c i n o g e n e s i s . 1 2 2 1 2 1 2 9 9 2 2 2 8 2 . 1 4 . 2 2 0 5 - 2 2 1 7 . R o u l e a u , J . , T a n i g a w a , G . a n d S z y f , M . ( 1 9 9 2 ) T h e m o u s e D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e 5 ' - r e g i o n - A u n i q u e h o u s e k e e p i n g g e n e p r o m o t e r . J , _ B _ i g L C h m , 2 6 7 , 7 3 6 8 - 7 3 7 7 . R o u l e a u , J . , M a c L e o d , A R . a n d S z y f , M . ( 1 9 9 5 ) R e g u l a t i o n o f t h e D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e b y t h e R a s - A P - 1 s i g n a l i n g p a t h w a y . L E W . 2 7 0 , 1 5 9 5 - 1 6 0 1 . R u c h i r a w a t , M . , B e c k e r , F F . a n d L a p e y r e , J . - N . ( 1 9 8 4 ) M e c h a n i s m o f r a t l i v e r D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e i n t e r a c t i o n w i t h a n t i - b e n z o [ a ] p y r e n e d i o l e p o x i d e m o d i f i e d D N A t e m p l a t e s . B i g s n s m i s t n r , 2 3 , 5 4 2 6 - 5 4 3 2 . R u m s b y , P . C . , D a v i e s , M . J . , P r i c e , R . J . a n d L a k e , B . G . ( 1 9 9 4 ) E f f e c t o f s o m e p e r o x i s o m e p r o l i f e r a t o r s o n t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - i 3 1 g e n e e x p r e s s i o n a n d i n s u l i n - l i k e g r o w t h f a c t o r l l / m a n n o s e - 6 - p h o s p h a t e r e c e p t o r g e n e e x p r e s s i o n i n r a t l i v e r . C a m j n s g s n s s i s , 1 5 , 4 1 9 - 4 2 1 . R u s h m o r e , T . H . , F a r b e r , E . , G h o s h a l , A . K . , P a r o d i , S . , P a l a , M . a n d T a n i n g h e r , M . ( 1 9 8 6 ) A c h o l i n e - d e v o i d d i e t , c a r c i n o g e n i c i n t h e r a t , i n d u c e s D N A d a m a g e a n d r e p a i r . W , 7 , 1 6 7 7 - 1 6 8 0 . R u s h m o r e , T . H . , G h a z a r i a n , D . M . , S u b r a h m a n y a n , V . , F a r b e r , E . a n d G h o s h a l , A K . ( 1 9 8 7 ) P r o b a b l e f r e e r a d i c a l e f f e c t s o n r a t l i v e r n u c l e i d u r i n g e a r l y h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s w i t h a c h o l i n e - d e v o i d l o w m e t h i o n i n e d i e t . m a s s " 4 7 , 6 7 3 1 - 6 7 4 0 . S a w a d a , N . , P o i r i e r , L . , M o r a n , S . , X u , Y . H . a n d P i t o t , H . C . ( 1 9 9 0 ) T h e e f f e c t o f c h o l i n e a n d m e t h i o n i n e d e f i c i e n c i e s o n t h e n u m b e r a n d v o l u m e p e r c e n t a g e o f a l t e r e d h e p a t i c f o c i i n t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f d i e t h y l n i t r o s a m i n e i n i t i a t i o n i n r a t l i v e r . Q a m i n s g s n s s i s , 1 1 , 2 7 3 - 2 8 1 . S c h m u t t e , C . , Y a n g , A . S . , B e a r t , R W . a n d J o n e s , R A . ( 1 9 9 5 ) B a s e e x c i s i o n r e p a i r o f U : G m i s m a t c h e s a t a m u t a t i o n a l h o t s p o t i n t h e p 5 3 g e n e i s m o r e 3 2 5 e f f i c i e n t t h a n b a s e e x c i s i o n r e p a i r o f T : G m i s m a t c h e s i n e x t r a c t s o f h u m a n c o l o n t u m o r s . Q a n s s n fi s s , 5 5 , 3 7 4 2 - 3 7 4 6 . S c h u l t e - H e r m a n n , R , G r a s l - - K r a U P p . B . a n d B u r s c h , W . ( 1 9 9 5 ) A p o p t o s i s i n h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s . I n J i r t l e , R . L . ( e d . ) W W A c a d e m i c P r e s s . N e w Y o r k , p p . 1 4 1 - 1 7 8 . S c h u l t e - H e r m a n n , R . , T i m m e r m a n n - T r o s i e n e r , l . , B a r t h e l , G . a n d B u r s c h , W . ( 1 9 9 0 ) D N A s y n t h e s i s , a p o p t o s i s , a n d p h e n o t y p i c e x p r e s s i o n a s d e t e r m i n a n t s o f g r o w t h o f a l t e r e d f o c i i n r a t l i v e r d u r i n g p h e n o b a r b i t a l p r o m o t i o n . g a n g s ] : R e s . . . 5 0 , 5 1 2 7 - 5 1 3 5 . S c h w a r t z , M , B u c h m a n n , A . , B a u e r - H o f m a n n , R . a n d M a h r , J . ( 1 9 9 1 ) M o l e c u l a r g e n e t i c a n a l y s i s o f p r e n e o p l a s t i c a n d n e o p l a s t i c l i v e r l e s i o n s i n t h e m o u s e . E 1 9 9 . _ l : l 1 2 1 9 . _ § x t 9 2 1 3 2 m . . 2 3 1 0 7 - 1 1 4 . S h a r r a r d , R . M . , R o y d s , J . A . , R o g e r s , S . a n d S h o r t h o u s e , A . J . ( 1 9 9 2 ) P a t t e r n s o f m e t h y l a t i o n o f t h e c - m y c g e n e i n h u m a n c o l o r e c t a l c a n c e r p r o g r e s s i o n . B n _ . L $ 2 9 8 2 8 1 . 6 5 , 6 6 7 - 6 7 2 . S h e n , J - C , R i d e o u t , W M a n d J o n e s , P A ( 1 9 9 4 ) T h e r a t e o f h y d r o l y t i c d e a m i n a t i o n o f 5 - m e t h y l c y t o s i n e i n d o u b l e - s t r a n d e d D N A . a n l s L L A s i d s j s s , 2 2 , 9 7 2 - 9 7 6 . S h i n o z u k a , H . , M a s u h a r a , M . , K u b o , Y . a n d K a t y a l , S . L . ( 1 9 9 3 ) G r o w t h f a c t o r a n d r e c e p t o r m o d u l a t i o n s i n r a t l i v e r b y c h o l i n e - m e t h i o n i n e d e f i c i e n c y . , 1 t h m i n , 4 , 6 1 0 - 6 1 7 . S h i v a p u r k a r , N . a n d P o i r i e r , L A . ( 1 9 8 2 ) D e c r e a s e d l e v e l s o f S - a d e n o s y l m e t h i o n i n e i n t h e l i v e r s o f r a t s f e d p h e n o b a r b i t a l a n d D D T . W e . 3 . 5 8 9 - 5 9 1 . S h i v a p u r k a r , N . , W i l s o n , M . J . , H o o v e r , K . L . , M i k o l , Y . B . , C r e a s i a , D . a n d P o i r i e r , L A . ( 1 9 8 6 ) H e p a t i c D N A m e t h y l a t i o n a n d l i v e r t u m o r f o r m a t i o n i n m a l e C 3 H m i c e f e d m e t h i o n i n e - a n d c h o l i n e - d e f i c i e n t d i e t s . W , 7 7 , 2 1 3 - 2 1 7 . S i g l i n , J . C . , W e g h o r s t , C M . a n d K l a u n i g , J . E . ( 1 9 8 9 ) R o l e o f h e p a t o c y t e p r o l i f e r a t i o n i n a l p h a - h e x a c h l o r o c y c l o h e x a n e a n d p h e n o b a r b i t a l t u m o r p r o m o t i o n i n B G C 3 F 1 m i c e . I n B u t t e r w o r t h , B E , S l a g a , T . J . , F a r l a n d , W . a n d M c C l a i n , M . . ( e d s ) 1 = i l o - : o = l ' o ' . . ' . o n - I i 0 1 . i . A s s e s s m e n t . W i l e y - L i s s , I n c . , N e w Y o r k , p p . 4 0 7 - 4 1 6 . 3 2 6 S m i t h , M . L . , Y e l e s w a r a p u , L . , S c a l a m o n g a , P . , L o c k e r , J . a n d L o m b a r d i , B , ( 1 9 9 3 ) p 5 3 m u t a t i o n s i n h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a s i n d u c e d b y a c h o l i n e - d e v o i d d i e t i n m a l e F i s c h e r 3 4 4 r a t s . Q a m i n s g e n s s i s , 1 4 , 5 0 3 - 5 1 0 . S m i t h , S . S . , K a p l a n , B . E . , S o w e r s , L C . a n d N e w m a n , E M . ( 1 9 9 2 ) M e c h a n i s m o f h u m a n m e t h y l - d i r e c t e d D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e a n d t h e f i d e l i t y o f c y t o s i n e m e t h y l a t i o n . W M , 8 9 , 4 7 4 4 - 4 7 4 8 . S p a n d i d o s , D A . a n d H o l m e s , L . ( 1 9 8 7 ) T r a n s c r i p t i o n a l e n h a n c e r a c t i v i t y i n t h e v a r i a b l e t a n d e m r e p e a t D N A s e q u e n c e d o w n s t r e a m o f t h e h u m a n H a - r a s 1 g e n e . E E B _ S _ L e _ t L , 2 1 8 , 4 1 - 4 6 . S t é g e r , R . , K u b i c k a , F . , L i u , C - G . , K a f r i , T . , R a z i n , A . , C e d a r , H . a n d B a r l o w , D P . ( 1 9 9 3 ) M a t e m a l - s p e c i f i c m e t h y l a t i o n o f t h e i m p r i n t e d m o u s e I g f 2 r l o c u s i d e n t i f i e s t h e e x p r e s s e d l o c u s a s c a r r y i n g t h e i m p r i n t i n g s i g n a l . C e l l , 7 3 , 6 1 - 7 1 . S t o w e r s , S . J . , W i s e m a n , R . W . , W a r d , J . M . , M i l l e r , E . C . , M i l l e r , J . A . , A n d e r s o n , M W . a n d E v a , A . ( 1 9 8 8 ) D e t e c t i o n o f a c t i v a t e d p r o t o - o n c o g e n e s i n N - n i t r o s o d i e t h y l a m i n e - i n d u c e d l i v e r t u m o r s : A c o m p a r i s o n b e t w e e n B 6 C 3 F 1 m i c e a n d F i s c h e r 3 4 4 r a t s . Q a r s i n s g s n s s j s , 9 , 2 7 1 - 2 7 6 . S u l l i v a n , N . , G a t e h o u s e , D . a n d T w e a t s , D . ( 1 9 9 3 ) M u t a t i o n , c a n c e r a n d t r a n s g e n i c m o d e l s : R e l e v a n c e t o t h e t o x i c o l o g y i n d u s t r y . M u t a g s n s s i s , 8 , 1 6 7 - 1 7 4 . S u n d a r e s a n , M . , Y u , Z . - X . , F e r r a n s , V . J . , l r a n i , K . a n d F i n k e l , T . ( 1 9 9 5 ) R e q u i r e m e n t f o r g e n e r a t i o n o f H 2 0 2 f o r p l a t e l e t - d e r i v e d g r o w t h f a c t o r s i g n a l t r a n s d u c t i o n . S s j s n s e , 2 7 0 , 2 9 6 - 2 9 9 . S z y f , M . ( 1 9 9 1 ) D N A m e t h y l a t i o n p a t t e r n s : A n a d d i t i o n a l l e v e l o f i n f o r m a t i o n ? W 9 1 6 9 7 6 4 - 7 6 7 T a n , N . - W . a n d L i , B . F . L . ( 1 9 9 0 ) I n t e r a c t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e s c o n t a i n i n g 6 - O - m e t h y l g u a n i n e w i t h h u m a n D N A ( c y t o s i n e - 5 ) - m e t h y l t r a n s f e r a s e . n g s h s m , 2 9 , 9 2 3 4 - 9 2 4 0 . T a w a , R . U e n o , S . , Y a m a m o t o , K . Y a m a m o t o , Y . , S a g i s a k a , K . K a t a k u r a , R . , K a y a m a , T , Y o s h i m o t o , T , S a k u r a i , H . a n d O n o , T . ( 1 9 9 2 ) M e t h y l a t e d c y t o s i n e l e v e l i n h u m a n l i v e r D N A d o e s n o t d e c l i n e i n a g i n g p r o c e s s . M m h fl s m g Q s L , 6 2 , 2 5 5 - 2 6 1 . T o m a l e t t i , S . a n d P f e i f e r , G P . ( 1 9 9 5 ) C o m p l e t e a n d t i s s u e - i n d e p e n d e n t m e t h y l a t i o n o f C p G s i t e s i n t h e p 5 3 g e n e : I m p l i c a t i o n s f o r m u t a t i o n s i n h u m a n c a n c e r s . Q n s o g s n s , 1 0 , 1 4 9 3 - 1 4 9 9 . 3 2 7 T r o s k o , J . E . ( 1 9 8 8 ) ‘ A f a i l e d p a r a d i g m : C a r c i n o g e n e s i s i s m o r e t h a n m u t a g e n e s i s ’ [ l e t t e r ] . M u t s g s n s s i s , 3 , 3 6 3 - 3 6 6 . V a i r a p a n d i , M . a n d D u k e r , N J . ( 1 9 9 3 ) E n z y m i c r e m o v a l o f 5 - m e t h y l c y t o s i n e f r o m D N A b y a h u m a n D N A - g l y c o s y l a s e . M W , 2 1 , 5 3 2 3 - 5 3 2 7 . V i l p o , J . A . a n d V i l p o , L . M . ( 1 9 9 3 ) N u c l e o s i d e m o n o p h o s p h a t e k i n a s e m a y b e t h e k e y e n z y m e p r e v e n t i n g s a l v a g e o f D N A 5 - m e t h y l c y t o s i n e . 1 1 1 1 1 1 1 9 1 2 8 9 5 . . . 2 8 6 , 2 1 7 - 2 2 0 . V o g e l s t e i n , B . , F e a r o n , E . R . , H a m i l t o n , S . R . , K e r n , S . E . , P r e i s i n g e r , A . C . , L e p p e r t , M . , N a k a m u r a , Y . , W h i t e , R . , S m i t s , A . M . M . a n d B o s , J . L . ( 1 9 8 8 ) G e n e t i c a l t e r a t i o n s d u r i n g c o l o r e c t a l - t u m o r d e v e l o p m e n t . M , 3 1 9 , 5 2 5 - 5 3 2 . V o r c e , R L . a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 8 9 ) A l t e r e d m e t h y l a t i o n o f r a s o n c o g e n e s i n b e n z i d i n e - i n d u c e d B 6 0 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s . W . 1 0 0 , 3 9 8 - 4 1 0 . V o r c e , R . L . a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 1 a ) D i f f e r e n t i a l D N a s e l h y p e r s e n s i t i v i t y o f r a s o n c o g e n e s i n B 6 C S F 1 , C S I - l / H e a n d C S 7 B L / 6 m o u s e l i v e r . J , _ I n x i g _ Q L W 1 1 1 . 3 4 , 3 8 5 - 3 9 5 . V o r c e , R L . a n d G o o d m a n , J . . l ( 1 9 9 1 b ) H y p o m e t h y l a t i o n o f r a s o n c o g e n e s i n c h e m i c a l l y i n d u c e d a n d s p o n t a n e o u s B G C S F I m o u s e l i v e r t u m o r s . J . J Q X I Q Q L E n x i x 9 9 . . l : l 9 9 l m . 3 4 . 3 6 7 - 3 8 4 W a i n f a n , E . a n d P o i r i e r , L A . ( 1 9 9 2 ) M e t h y l g r o u p s i n c a r c i n o g e n e s i s : E f f e c t s o n D N A m e t h y l a t i o n a n d g e n e e x p r e s s i o n . W e s , ( S u p p l ) 5 2 , 2 0 7 1 s - 2 0 7 7 s . W a i n f a n , E . , D i z i k , M . , S t e n d e r , M . a n d C h r i s t m a n , J . K . ( 1 9 8 9 ) R a p i d a p p e a r a n c e o f h y p o m e t h y l a t e d D N A i n l i v e r s o f r a t s f e d c a n c e r - p r o m o t i n g , m e t h y l - d e f i c i e n t d i e t s . C s n g s n fi s s " 4 9 , 4 0 9 4 - 4 0 9 7 . W a r e h a m , K . A . , L y o n , M . F . , G l e n i s t e r , R H . a n d W i l l a m s , E D . ( 1 9 8 7 ) A g e r e l a t e d r e a c t i v a t i o n o f a n X - l i n k e d g e n e . M W , 3 2 7 , 7 2 5 - 7 2 7 . W e g h o r s t , C M . a n d K l a u n i g , J . E . ( 1 9 8 9 ) P h e n o b a r b i t a l p r o m o t i o n i n d i e t h y l n i t r o s a m i n e - i n i t i a t e d i n f a n t B G C S F I m i c e : I n f l u e n c e o f g e n d e r . W . 1 0 , 6 0 9 - 6 1 2 . W e i t z m a n , S . A . , T u r k , P . W . , M i l k o w s k i , D H . a n d K o z l o w s k i , K . ( 1 9 9 4 ) F r e e r a d i c a l a d d u c t s i n d u c e a l t e r a t i o n s i n D N A c y t o s i n e m e t h y l a t i o n . P M W , 9 1 . 1 2 6 1 - 1 2 6 4 . 3 2 8 W i l l i a m s , G . M . a n d W e i s b u r g e r , J . H . ( 1 9 9 1 ) C h e m i c a l c a r c i n o g e n s . I n A m d u r , M A . D c u l l J a n d K l e a s s e n C D ( e d s ) 0 9 5 9 1 9 1 1 _ a n d _ D _ 9 9 1 1 _ s _ 1 9 x 1 2 9 1 9 9 ¥ . _ I h 9 W m . P e r g a m o n P r e s s , N e w Y o r k , p p . 1 2 7 - 2 0 0 . W i l l i a m s , G M . ( 1 9 8 0 ) C l a s s i f i c a t i o n o f g e n o t o x i c a n d e p i g e n e t i c h e p a t o c a r c i n o g e n s u s i n g l i v e r c u l t u r e a s s a y s . W , 3 4 9 , 2 7 3 - 2 8 2 . W i l l i a m s , G M . ( 1 9 8 9 ) M e t h o d s f o r e v a l u a t i n g c h e m i c a l g e n o t o x i c i t y . A n n u h fi s v , 1 2 1 1 9 1 9 1 9 2 9 1 4 9 2 9 2 9 1 . 2 9 . 1 8 9 - 2 1 1 . W i l s o n , M . J . , S h i v a p u r k a r , N . a n d P o i r i e r , L A . ( 1 9 8 4 ) H y p o m e t h y l a t i o n o f h e p a t i c n u c l e a r D N A i n r a t s f e d w i t h a c a r c i n o g e n i c m e t h y l - d e f i c i e n t d i e t . 8 9 . 9 9 9 1 9 1 . 2 1 8 , 9 8 7 - 9 9 0 . W i l s o n , V 1 . a n d J o n e s , R A . ( 1 9 8 3 ) D N A m e t h y l a t i o n d e c r e a s e s i n a g i n g b u t n o t i n i m m o r t a l c e l l s . S s i s n s s , 2 2 0 , 1 0 5 5 - 1 0 5 7 . W i l s o n , V . L . , S m i t h , R . A . , L o n g o r i a , J . , L i o t t a , M . A . , H a r p e r , C M . a n d H a r r i s , C . C . ( 1 9 8 7 a ) C h e m i c a l c a r c i n o g e n - - i n d u c e d d e c r e a s e s i n g e n o m i c 5 - m e t h y l d e o x y c y t i d i n e c o n t e n t o f n o r m a l h u m a n b r o n c h i a l e p i t h e l i a l c e l l s . E m s , W A . 8 4 3 2 9 8 - 3 3 0 1 W i l s o n , V . L . , S m i t h , R . A . , M a , S . a n d C u t l e r , R . G . ( 1 9 8 7 b ) G e n o m i c 5 - m e t h y l d e o x y c y t i d i n e d e c r e a s e s w i t h a g e . m m , 2 6 2 , 9 9 4 8 - 9 9 5 1 . W i s e m a n , R . . , W S t o w e r s , S J , M i l l e r , E . . , C A n d e r s o n , M W . a n d M i l l e r , J . . A ( 1 9 8 6 ) A c t i v a t i n g m u t a t i o n s o f t h e c - H a - r a s p r o t o o n c o g e n e i n c h e m i c a l l y i n d u c e d h e p a t o m a s o f t h e m a l e B G C S F m o u s e . M W , 8 3 , 5 8 2 5 - 5 8 2 9 . W o j c i e c h o w s k i , M P . a n d M e e h a n , T . ( 1 9 8 4 ) I n h i b i t i o n o f D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e s i n v i t r o b y b e n z o i a i p y r e n e d i o l e p o x i d e - m o d i f i e d s u b s t r a t e s . m m , 2 5 9 , 9 7 1 1 - 9 7 1 6 . W o o d c o c k , D . M . , C r o w t h e r , P . . J a n d D i v e r , W P . ( 1 9 8 7 ) T h e m a j o r i t y o f m e t h y l a t e d d e o x y c y t i d i n e s i n h u m a n D N A a r e n o t i n t h e C p G d i n u c l e o t i d e . W M . 1 4 5 , 8 8 8 - 8 9 4 . X o d o , L . E . , A l u n n i f a b b r o n i , M . a n d M a n z i n i , G . ( 1 9 9 4 ) E f f e c t o f 5 - m e t h y l c y t o s i n e o n t h e s t r u c t u r e a n d s t a b i l i t y o f D N A - f o r m a t i o n o f t r i p l e - s t r a n d e d c o n c a t e n a m e r s b y o v e r l a p p i n g o l i g o n u c l e o t i d e s . W . 1 1 , 7 0 3 - 7 2 0 . 3 2 9 X u , Y . , G o o d y e r , C . G . , D e a l , C . a n d P o l y c h r o n a k o s , C . ( 1 9 9 3 ) F u n c t i o n a l p o l y m o r p h i s m i n t h e p a r e n t a l i m p r i n t i n g o f t h e h u m a n I G F Z R g e n e . 3 1 9 2 1 3 9 1 1 1 . W . 1 9 7 . 7 4 7 - 7 5 4 . Y a o , Z . a n d V a n c e , D E . ( 1 9 8 8 ) . T h e a c t i v e s y n t h e s i s o f p h o s p h a t i d y l c h o l i n e i s r e q u i r e d f o r v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s e c r e t i o n f r o m r a t h e p a t o c y t e s . , L B L Q L C h m , 2 6 3 , 2 9 9 8 - 3 0 0 4 . Y a n g , A . S . , S h e n , J . - C . , Z i n g g , J . - M . , M i , 8 . a n d J o n e s , P . ( 1 9 9 5 ) H h a l a n d H p a l l D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e s b i n d D N A m i s m a t c h e s , m e t h y l a t e u r a c i l a n d b l o c k D N A r e p a i r . M W , 2 3 , 1 3 8 0 - 1 3 8 7 . Y i s r a e l i , J . , F r a n k , D . , R a z i n , A . a n d C e d a r , H . ( 1 9 8 8 ) E f f e c t o f i n v i t r o D N A m e t h y l a t i o n o n B - g l o b i n g e n e e x p r e s s i o n . W M , 8 5 , 4 6 3 8 - 4 6 4 2 . Y o k o y a m a , S . , S e l l s , M . A . , R e d d y , T . V . a n d L o m b a r d i , B . ( 1 9 8 5 ) H e p a t o c a r c i n o g e n i c a n d p r o m o t i n g a c t i o n o f a c h o l i n e - d e v o i d d i e t i n t h e r a t . Q a n g s n fl e s “ 4 5 , 2 8 3 4 - 2 8 4 2 . Z a p i s e k , W . F . , C r o n i n , G . M . , L y n - C o o k , 8 D . a n d P o i r i e r , L A . ( 1 9 9 2 ) T h e o n s e t o f o n c o g e n e h y p o m e t h y l a t i o n i n t h e l i v e r s o f r a t s f e d m e t h y l - d e f i c i e n t , a m i n o a c i d - d e f i n e d d i e t s . Q a m g s n s s i s , 1 3 , 1 8 6 9 - 1 8 7 2 . Z e i s e l , S . H . , Z o l a , T . , d a C o s t a , K - A . a n d P o m f r e t , E A . ( 1 9 8 9 ) E f f e c t o f c h o l i n e d e f i c i e n c y o n S - a d e n o s y l m e t h i o n i n e a n d m e t h i o n i n e c o n c e n t r a t i o n s i n r a t l i v e r . B i m n s m , 2 5 9 . 7 2 5 - 7 2 9 . Z h a n g , X - Y . , S u p a k a r , P . C . , W u , K . , E h r l i c h , K C . a n d E h r l i c h , M . ( 1 9 9 0 ) A n M D B P s i t e i n t h e f i r s t i n t r o n o f t h e h u m a n c - m y c g e n e . Q a n s e n fl s s ” 5 0 , 6 8 6 5 - 6 8 6 9 . Z h a n g , X . a n d M a t h e w s , C K . ( 1 9 9 4 ) E f f e c t o f D N A c y t o s i n e m e t h y l a t i o n u p o n d e a m i n a t i o n - i n d u c e d m u t a g e n e s i s i n a n a t u r a l t a r g e t s e q u e n c e i n d u p l e x D N A . J . M . 2 6 9 , 7 0 6 6 - 7 0 6 9 .