: 3 : ‘ - ' n 5 u ‘ 1 ‘ 3 ‘ . fl - 1 : 5 ‘ . , . . . . x é " ? . 1 : t 4 g . ' v i a A v - " , 4 I ' 5 ' : I ‘ — r ‘ : r v . a - b $ 7 1 1 ; . . 7 x F a i l i - ' l K , 3 , a ; 3 k m . . , , . . . . : f r . . ( “ . W P S ‘ . * ‘ w ’ a ‘ - I l ' ‘ r W r - fi ’ 5 ' “ w : ' _ - V # 5 3 : } . ‘ 1 : V r u ‘ é n r ’ z ’ é a é i - J ‘ " " . . 5 1 . . . . . . 1 , E ! . J n ‘ . . . . 5 , 5 ; P R O - ' 4 . 4 - . A . 1 fl u . ~ * ; r . m . ~ : ‘ J - I ~ A r . . ” v i i , * m q u ? % “ , 1 ' 3 : - , ' k m A . , r * w m y a : 9 . a n " M 5 ! . . 3 7 . 1 3 1 . . a . . i ; . - w ' u , ‘ I n m y “ , . ‘ x r 9 ’ . a * . , ; ; > < t v g i f _ ~ v 7 ‘ - 1 ” 3 5 ' “ ‘ 1 3 - , g . - 5 ' # v v m fi a n m ‘ v w ‘ 5 ' . , 3 1 ‘ fi S ‘ u J . : n . 7 % - : i w ‘ l ‘ « a : : 1 { q t - 5 m . " I . " . 5 1 . } . " ' - . h a . ' . ' : u - . 3 % “ « a ! ' $ 5 “ ? - ‘ 5 5 ’ 1 r “ ‘ 3 ' ? w ‘ 3 : ~ ‘ # 4 z ‘ m i i h i fi * m : 4 3 . . _ , . t . ' T ~ £ - . : ' e . . . . . ~ 3 3 . I . a n " ‘ 2 3 » ' r 3 ? 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E c o r d U : ] J j l — M S U I s A n m u m m i n / E m u O p p o m m l l y I n t u i t i o n H E R A R Y I m a c h i g a n m a t e i U n i v e r s i t y A N A T O M I C A L A N D F U N C T I O N A L A L T E R A T I O N S I N E N T E R I C N E U R O N S F O L L O W I N G E X T R I N S I C D E N E R V A T I O N O F G U I N E A P I G I L E U M V o l u m e I B y A n n e M a r i e R . Y u n k e r A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y D e p a r t m e n t o f P h a r m a c o l o g y a n d T o x i c o l o g y a n d N e u r o s c i e n c e P r o g r a m 1 9 9 5 A B S T R A C T A N A T O M I C A L A N D F U N C T I O N A L A L T E R A T I O N S I N E N T E R I C N E U R O N S F O L L O W I N G E X T R I N S I C D E N E R V A T I O N O F G U I N E A P I G I L E U M B y A n n e M a r i e R . Y u n k e r D i g e s t i o n i s c o n t r o l l e d b y e x t r i n s i c n e r v e s o r i g i n a t i n g o u t s i d e t h e g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t a n d b y e n t e r i c n e r v e s f o u n d w i t h i n t h e g u t . E x t r i n s i c n e r v e s i n n e r v a t e e n t e r i c n e u r o n s a n d s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s , a n d r e g u l a t e g a s t r o i n t e s t i n a l f u n c t i o n . H o w e v e r , n o r m a l d i g e s t i o n q u i c k l y r e t u r n s a f t e r d e s t r u c t i o n o f e x t r i n s i c n e r v e s , s u g g e s t i n g l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n i n d u c e s a l t e r a t i o n s i n e n t e r i c n e u r o n s . S u r g i c a l d e n e r v a t i o n o f s e g m e n t s o f g u i n e a p i g i l e u m d e s t r o y e d e x t r i n s i c n e r v e s a n d i n d u c e d c - F o s - i m m u n o r e a c t i v i t y ( i r ) i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c n e u r o n s o n e w e e k a f t e r d e n e r v a t i o n . N e w s u b s t a n c e P ( S P ) - a n d v a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p o l y p e p t i d e ( V I P ) - i r n e r v e s w e r e a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s b e g i n n i n g f o u r w e e k s a f t e r d e n e r v a t i o n . S y s t e m i c a d m i n i s t r a t i o n o f 6 - h y d r o x y - d o p a m i n e e l i m i n a t e d s y m p a t h e t i c n e r v e s a n d i n d u c e d n e w V I P - i r b u t n o t S P - i r n e r v e s , w h e r e a s c a p s a i c i n t r e a t m e n t e l i m i n a t e d e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e s a n d i n d u c e d n e w S P - i r b u t n o t V I P - i r i n n e r v a t i o n o f a r t e r i o l e s . T h e s e d a t a i n d i c a t e l o s s o f e x t r i n s i c s y m p a t h e t i c a n d s e n s o r y n e r v e s i s f o l l o w e d b y t h e a p p e a r a n c e o f V I P - a n d S P - i r p a r a v a s c u l a r n e r v e s , r e s p e c t i v e l y . I m m a t u r e a x o n s c o n t a i n n o n p h o s p h o r y l a t e d ( n p ) h e a v y m o l e c u l a r w e i g h t n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n ( N F - H ) - i r , a n d m a t u r e a x o n s c o n t a i n p h o s p h o r y l a t e d ( p ) N F - H - i r . N o r m a l l y , e n t e r i c s o m a t a c o n t a i n e d n p N F - H - i r a n d a x o n s c o n t a i n e d p N F - H - i r . H o w e v e r d e n e r v a t i o n - i n d u c e d S P - a n d V I P - i r a x o n s d i d n o t c o n t a i n p N F - H - i r , s u g g e s t i n g d e n e r v a t i o n i n d u c e s a x o n a l s p r o u t i n g . R e t r o g r a d e t r a c e r ( fl u o r o - g o l d ) w a s i n j e c t e d i n t o a r t e r i o l e s t o d e t e r m i n e i f a x o n a l s p r o u t s o r i g i n a t e d f r o m s u b m u c o s a l n e u r o n s . G r e a t e r a r t e r i o l a r i n n e r v a t i o n w o u l d i n c r e a s e t h e n u m b e r o f u p t a k e s i t e s , r e s u l t i n g i n m o r e l a b e l l e d s u b m u c o s a l n e u r o n s . D e n e r v a t i o n d i d n o t a l t e r t h e n u m b e r o f fl u o r o - g o l d c e l l s , i m p l y i n g n e w S P - i r a n d V I P - i r n e r v e s d i d n o t o r i g i n a t e f r o m s u b m u c o s a l g a n g l i a . L o s s o f e x t r i n s i c s e n s o r y i n n e r v a t i o n i n c r e a s e d n i t r i c o x i d e ( N 0 ) s y n t h a s e ( N O S ) - i r i n m y e n t e r i c n e u r o n s a n d p o t e n t i a t e d n e u r o g e n i c l o n g i t u d i n a l m u s c l e r e l a x a t i o n s . T h e s e r e l a x a t i o n s w e r e a t t e n u a t e d b y N O S a n t a g o n i s t s , s u g g e s t i n g d e n e r v a t i o n a l s o i n c r e a s e s i n h i b i t o r y i n n e r v a t i o n o f s m o o t h m u s c l e . F i n a l l y , N O m o d u l a t e s S P n e u r o t r a n s m i s s i o n a n d n o n - a d r e n e r g i c , n o n - c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n a m p l i t u d e s w e r e a t t e n u a t e d a f t e r d e n e r v a t i o n . T h e r e f o r e , t h e d a t a i n t h i s d i s s e r t a t i o n d e m o n s t r a t e e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n i n d u c e s f u n c t i o n a l a n d a n a t o m i c a l a d a p t a t i o n s t h a t a l l o w e n t e r i c n e u r o n s t o c o n t r o l g a s t r o i n t e s t i n a l f u n c t i o n i n t h e a b s e n c e o f e x t r i n s i c n e r v e s . A C K N O W L E D G E M E N T S W h e r e t h e t e l e s c o p e e n d s , t h e m i c r o s c o p e b e g i n s . W h i c h o f t h e t w o h a s t h e g r a n d e r v i e w ? V i c t o r H u g o , L e s M i s é r a b l e s 1 8 6 2 I h a v e b e e n b l e s s e d t o h a v e k n o w n a n u m b e r o f o u t s t a n d i n g p e o p l e , b u t t h r e e m e n h a v e m a d e a n i n d e l i b l e m a r k o n m y l i f e a n d t h i s d i s s e r t a t i o n . I a m h o n o r e d a n d p r i v i l e g e d t o h a v e c o m p l e t e d m y d i s s e r t a t i o n i n t h e l a b o r a t o r y o f J a m e s G a l l i g a n . J i m h a s p r o v i d e d a n i d e a l e n v i r o n m e n t f o r r e s e a r c h b y a l l o w i n g h i s g r a d u a t e s t u d e n t s f r e e d o m t o e x p l o r e t h e i r o w n i n t e r e s t s , a n d e n c o u r a g i n g e x c e l l e n c e i n t h e c l a s s r o o m a n d t h e l a b o r a t o r y . H i s e n t h u s i a s m f o r r e s e a r c h a n d h i s d e d i c a t i o n t o t e a c h i n g a r e s u r p a s s e d o n l y b y h i s w e a l t h o f k n o w l e d g e . W i t h o u t J i m ’ s i m p e t u s , I n e v e r w o u l d h a v e l e a r n e d a b o u t a n e n z y m e c a l l e d N A D P H d i a p h o r a s e , n o r w o u l d I h a v e l e a r n e d c r i t i c a l t h i n k i n g . F o r t h e p a s t e i g h t y e a r s , a l l t r i u m p h s a n d f a i l u r e s h a v e b e e n s h a r e d w i t h M i c h a e l T h o m p s o n . M i c h a e l h a s h a d f a i t h a n d s t r e n g t h w h e n I h a d n o n e , a n d h a s a l w a y s e x p r e s s e d i n t e r e s t a n d e n c o u r a g e m e n t i n t h e w o r k n e c e s s a r y t o c o m p l e t e t h i s d i s s e r t a t i o n . H e h a s t a u g h t m e a b o u t t h e r e w a r d s t h a t c o m e f r o m d e d i c a t i o n a n d p e r s e v e r a n c e i n w o r k a n d r e l a t i o n s h i p s , a n d a b o u t t h e s t r e n g t h i n i n n e r p e a c e . M i c h a e l h a s b r o u g h t l i g h t , l o v e , a n d j o y i n t o m y l i f e . F i n a l l y , I c a n n o t i m a g i n e h o w m y l i f e h a s b e e n s h a p e d b y m y f a t h e r , t h e l a t e i v W i l l i a m J a m e s Y u n k e r . I n a d d i t i o n t o t e a c h i n g m e h o w t o t i e m y s h o e l a c e s , t e l l t i m e , m u l t i p l y , a n d d r i v e , h e i n t r o d u c e d m e t o t h e e x t r a o r d i n a r y w o r l d o f b i o l o g i c a l s c i e n c e s , a n d o f t h e i m p o r t a n c e o f h a r d w o r k . H i s q u e s t f o r p e r f e c t i o n i n a l l h e d i d , a n d h i s l o v e o f f a m i l y w i l l l i v e o n i n a l l w h o k n e w h i m . W i t h o u t h i s p e r s o n a l s a c r i fi c e s a n d u n e n d i n g h a r d w o r k , m y e d u c a t i o n w o u l d n o t h a v e o c c u r r e d , a n d t h i s d i s s e r t a t i o n w o u l d n o t h a v e b e e n p o s s i b l e . I o n l y w i s h h e c o u l d h a v e s e e n w h a t h e s t a r t e d . T A B L E O F C O N T E N T S L I S T O F T A B L E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . L I S T O F F I G U R E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . L I S T O F A B B R E V I A T I O N S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I N T R O D U C T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T h e C e l l T h e o r y a n d t h e N e u r o n D o c t r i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . E a r l y A n a t o m i c a l O b s e r v a t i o n s o f t h e G a s t r o i n t e s t i n a l T r a c t . . . . . C l a s s i fi c a t i o n o f t h e E n t e r i c N e r v o u s S y s t e m . . . . . . . . . . . . . . . 2 . I N T R I N S I C I N N E R V A T I O N O F T H E G A S T R O I N T E S T I N A L T R A C T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A r r a n g e m e n t o f E n t e r i c P l e x u s e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C y t o a r c h i t e c t u r e o f E n t e r i c N e u r o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . U l t r a s t r u c t u r e o f E n t e r i c N e u r o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N e u r o c h e m i s t r y o f E n t e r i c N e u r o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C r i t e r i a f o r I d e n t i fi c a t i o n o f N e u r o t r a n s m i t t e r s i n t h e E N S . . . . . . C h e m i c a l C o d i n g o f E n t e r i c N e u r o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 . S O M E F U N C T I O N S O F I N T R I N S I C I N N E R V A T I O N . . . . . . . . . . V i s c e r o f u g a l N e u r o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I n t r i n s i c S e n s o r y N e u r o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C h o l i n e r g i c V a s o d i l a t o r y N e u r o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N o n - C h o l i n e r g i c V a s o d i l a t o r y N e u r o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . V a s o c o n s t n ' c t o r N e u r o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C h o l i n e r g i c M o t o r N e u r o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N o n - A d r e n e r g i c N o n - C h o l i n e r g i c E x c i t a t o r y M o t o r N e u r o n s . . . . . N o n - A d r e n e r g i c N o n - C h o l i n e r g i c I n h i b i t o r y M o t o r N e u r o n s . . . . . C h o l i n e r g i c I n t e r n e u r o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N o n - A d r e n e r g i c N o n - C h o l i n e r g i c I n t e m e u r o n s . . . . . . . . . . . . . . 4 . E X T R I N S I C I N N E R V A T I O N O F T H E G A S T R O I N T E S T I N A L T R A C T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ' E x t r i n s i c P a r a v a s c u l a r a n d P e r i v a s c u l a r I n n e r v a t i o n . . . . . . . . . . . A n a t o m y o f E f f e r e n t S y m p a t h e t i c I n n e r v a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . A n a t o m y o f E f f e r e n t P a r a s y m p a t h e t i c I n n e r v a t i o n . . . . . . . . . . . . A n a t o m y o f A f f e r e n t V a g a l I n n e r v a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v i x i i i X X 1 3 1 4 l 6 l 7 l 9 1 9 2 0 2 2 2 4 2 4 2 5 2 6 2 9 3 4 3 6 3 7 3 8 4 O 4 2 A n a t o m y o f I n n e r v a t i o n f r o m D o r s a l R o o t G a n g l i a . . . . . . . . . . . 4 3 5 . F U N C T I O N S O F E X T R I N S I C I N N E R V A T I O N . . . . . . . . . . . . . . . 4 4 R e g u l a t i o n o f M o t i l i t y b y S y m p a t h e t i c N e r v e s . . . . . . . . . . . . . . 4 4 R e g u l a t i o n o f B l o o d F l o w b y S y m p a t h e t i c N e r v e s . . . . . . . . . . . . 4 7 R e g u l a t i o n o f M o t i l i t y b y E f f e r e n t V a g a l N e r v e s . . . . . . . . . . . . . 4 8 R e g u l a t i o n o f B l o o d F l o w b y E f f e r e n t V a g a l N e r v e s . . . . . . . . . . 5 1 S e n s o r y R e c e p t i o n a n d E f f e c t o r F u n c t i o n s b y A f f e r e n t N e r v e s . . . 5 3 S e n s o r y R e c e p t i o n b y A f f e r e n t V a g a l N e r v e s . . . . . . . . . . . . . . . 5 6 R e g u l a t i o n o f M o t i l i t y b y A f f e r e n t V a g a l N e r v e s . . . . . . . . . . . . 5 6 R e g u l a t i o n o f B l o o d F l o w b y A f f e r e n t V a g a l N e r v e s . . . . . . . . . . 5 7 S e n s o r y R e c e p t i o n b y I n n e r v a t i o n f r o m D o r s a l R o o t G a n g l i a . . . . 5 8 R e g u l a t i o n o f M o t i l i t y b y I n n e r v a t i o n f r o m D o r s a l R o o t G a n g l i a . . 5 9 R e g u l a t i o n o f B l o o d F l o w b y I n n e r v a t i o n f r o m D o r s a l R o o t G a n g l i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 O 6 . A U T O N O M Y O F T H E E N T E R I C N E R V O U S S Y S T E M . . . . . . . . . 6 1 A n a t o m i c a l E v i d e n c e o f D e n e r v a t i o n - I n d u c e d A l t e r a t i o n s o f E n t e r i c _ N e r v e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 2 F u n c t i o n a l E v i d e n c e o f D e n e r v a t i o n - I n d u c e d A l t e r a t i o n s o f E n t e r i c N e r v e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 3 S t a t e m e n t o f P u r p o s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 4 7 . N E U R O F I L A M E N T P R O T E I N S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 7 M i c r o h e t e r o g e n i t y o f N e u r o fi l a m e n t P r o t e i n s . . . . . . . . . . . . . . . 6 8 P h o s p h o r y l a t i o n o f N e u r o fi l a m e n t P r o t e i n s . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 8 N e u r o fi l a m e n t P r o t e i n s a r e D e v e l o p m e n t a l l y - R e g u l a t e d . . . . . . . . 7 1 N e u r o fi l a m e n t s i n A u t o n o m i c N e r v e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 2 8 . F 0 8 P R O T E I N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 4 R e g u l a t i o n o f F o s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 6 F u n c t i o n s o f F o s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 7 9 . N I T R I C O X I D E S Y N T H A S E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 8 N A D P H D i a p h o r a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 8 D i s c o v e r y o f N i t r i c O x i d e S y n t h a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 0 P u t a t i v e F u n c t i o n s o f N i t r i c O x i d e S y n t h a s e . . . . . . . . . . . . . . . . 8 3 P u t a t i v e A c t i o n s o f N i t r i c O x i d e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 4 A n a t o m i c a l E v i d e n c e o f N i t r i c O x i d e S y n t h a s e i n E n t e r i c N e r v e s . 8 5 A n a t o m i c a l E v i d e n c e o f c G M P F o r m a t i o n i n t h e G I T r a c t . . . . . . 8 6 C h a r a c t e r i z a t i o n o f N O S i n E n t e r i c N e r v e s . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 7 F u n c t i o n a l E v i d e n c e o f N i t r i c O x i d e R e l e a s e b y E n t e r i c N e r v e s . . 8 8 1 0 . M E C H A N I S M S O F N E U R O N A L P L A S T I C I T Y . . . . . . . . . . . . . . . 8 9 P l a s t i c i t y i n N e u r o n a l P h e n o t y p e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 9 R e g u l a t i o n o f N e u r o n a l P h e n o t y p e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 O A x o n a l S p r o u t i n g a n d R e g e n e r a t i o n o f A d u l t N e u r o n s . . . . . . . . . 9 3 R e g u l a t i o n o f A x o n a l S p r o u t i n g a n d R e g e n e r a t i o n . . . . . . . . . . . . 9 4 1 1 . R A T I O N A L E F O R U S E O F G U I N E A P I G I L E U M . . . . . . . . . . . . 9 5 M E T H O D S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 6 v i i ‘ 2 . E X T R I N S I C D E N E R V A T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 6 3 . P R E P A R A T I O N O F I L E U M F O R I M M U N O I - H S T O C H E M I S T R Y . 9 7 4 . I M M U N O H I S T O C H E M I S T R Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 8 5 . H I S T O C H E M I S T R Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 2 6 . V E R I F I C A T I O N O F E X T R I N S I C D E N E R V A T I O N . . . . . . . . . . . 1 0 3 7 . I N J E C T I O N O F R E T R O G R A D E T R A C E R . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 4 8 . I N V I T R O R E L A X A T I O N S O F L O N G I T U D I N A L M U S C L E . . . . . 1 0 6 9 . L E N G T H - T E N S I O N R E L A T I O N S H I P S O F L O N G I T U D I N A L M U S C L E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 6 1 0 . I N V I T R O C O N T R A C T I O N S O F C I R C U L A R M U S C L E . . . . . . . 1 0 7 1 1 . N I T R I C O X I D E S Y N T H A S E A S S A Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 8 1 2 . D R U G S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 9 1 3 . S T A T I S T I C A L A N A L Y S I S O F D A T A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 0 R E S U L T S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 1 l . E X T R I N S I C D E N E R V A T I O N A L T E R S V A S C U L A R I N N E R V A T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 1 I n n e r v a t i o n o f S u b m u c o s a l A r t e r i o l e s i n N o r m a l I l e u m . . . . . . . l l l S y m p a t h e t i c N e r v e s A r e D e s t r o y e d b y E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n . . . 1 1 2 E x t r i n s i c S e n s o r y N e r v e s a r e D e s t r o y e d b y E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n 1 1 7 E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n I n c r e a s e s V a s o a c t i v e I n t e s t i n a l P o l y p e p t i d e - I m m u n o r e a c t i v i t y I n n e r v a t i o n o f S u b m u c o s a l A r t e r i o l e s . . 1 2 2 E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n R e s u l t s i n N e w S u b s t a n c e P - I m m u n o r e a c t i v e I n n e r v a t i o n o f S u b m u c o s a l A r t e r i o l e s . . . . . . . . . . . . . . 1 2 3 S p e c i fi c i t y o f P r i m a r y a n d S e c o n d a r y A n t i s e r u m . . . . . . . . . . . . 1 2 9 S p e c i fi c i t y a n d E f f e c t i v e n e s s o f C h e m i c a l D e n e r v a t i o n s . . . . . . . 1 2 9 S p e c i fi c i t y o f S u r g i c a l E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n s . . . . . . . . . . . . . . 1 3 0 2 . N E W S U B S T A N C E P - I M M U N O R E A C T I V E N E R V E S D O N O T O R I G I N A T E F R O M S U B M U C O S A L G A N G L I A . . . . . . 1 3 6 I n t r o d u c t i o n a n d E x p e r i m e n t a l R a t i o n a l e . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 6 T h e R e t r o g r a d e T r a c e r F l u o r o - g o l d L a b e l s S u b m u c o s a l N e u r o n s i n ‘ N o r m a l P r e p a r a t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 9 E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n D o e s N o t R e s u l t I n S u b s t a n c e P - I m m u n o r e a c t i v e A x o n a l S p r o u t s f r o m S u b m u c o s a l N e u r o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 3 3 . L O C A L I Z A T I O N O F P H O S P H O R Y L A T E D A N D N O N P H O S P H O R Y L A T E D H E A V Y N E U R O F I L A M E N T P R O T E I N I N E N T E R I C N E R V E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 6 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 6 S p e c i fi c i t y o f S t e r n b e r g e r M o n o c l o n a l A n t i b o d i e s . . . . . . . . . . . 1 4 6 P h o s p h o r y l a t e d N F - H - i r I s F o u n d i n S u b m u c o s a l N u c l e i a n d N e r v e F i b e r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 8 P h o s p h o r y l a t e d N F - H - i r I s F o u n d i n M y e n t e r i c N u c l e i a n d N e r v e F i b e r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 2 N o n p h o s p h o r y l a t e d N F - H - i r I s F o u n d i n S u b s t a n c e P - I m m u n o r e a c t i v e S u b m u c o s a l N e u r o n s . . . . . . . . . . . . . . 1 5 5 v i i i N o n p h o s p h o r y l a t e d N F - H - i r I s F o u n d i n M o t o r a n d S e n s o r y M y e n t e r i c N e u r o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P h o s p h o r y l a t i o n - I n d e p e n d e n t N F - H - i r I s F o u n d i n S u b m u c o s a l P e r i k a r y a a n d N e r v e F i b e r s . . . . . . . . . . . . . I . . . . . . . . P h o s p h o r y l a t i o n - I n d e p e n d e n t N F - H - i r I s F o u n d i n M y e n t e r i c P e r i k a r y a a n d N e r v e F i b e r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 . N E W V A S C U L A R I N N E R V A T I O N R E S U L T S F R O M A X O N A L S P R O U T I N G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I n t r o d u c t i o n a n d E x p e r i m e n t a l R a t i o n a l e . . . . . . . . . . . . . . . . . S u b s t a n c e P - I m m u n o r e a c t i v e V a s c u l a r N e r v e s A r e N e w A x o n s . . N e w S u b s t a n c e P - I m m u n o r e a c t i v e N e r v e s L a c k N F - H . . . . . . . . V a s o a c t i v e I n t e s t i n a l P o l y p e p t i d e - I m m u n o r e a c t i v e V a s c u l a r N e r v e s a r e N e w A x o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N e w V a s o a c t i v e I n t e s t i n a l P o l y p e p t i d e N e r v e s L a c k N F - H . . . . . N e w S u b s t a n c e P - I m m u n o r e a c t i v e V a s c u l a r N e r v e s R e s u l t f r o m L o s s o f E x t r i n s i c S e n s o r y I n n e r v a t i o n . . . . . . . . . . . . . . N e w V a s o a c t i v e I n t e s t i n a l P o l y p e p t i d e - I m m u n o r e a c t i v e V a s c u l a r N e r v e s R e s u l t F r o m L o s s o f S y m p a t h e t i c I n n e r v a t i o n 5 . E X T R I N S I C D E N E R V A T I O N I N C R E A S E S N I T R I C O X I D E S Y N T H A S E — I M M U N O R E A C T I V I T Y I N M Y E N T E R I C N E U R O N S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I n t r o d u c t i o n a n d E x p e r i m e n t a l R a t i o n a l e . . . . . . . . . . . . . . . . . E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n D o e s N o t A l t e r N A D P H D i a p h o r a s e S t a i n i n g i n t h e S u b m u c o s a l P l e x u s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n I n c r e a s e s M y e n t e r i c N A D P H D i a p h o r a s e S t a i n i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N A D P H D i a p h o r a s e S t a i n i n g i s N o t N o n - S p e c i fi c D i a p h o r a s e A c t i v i t y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I n c r e a s e d N u m b e r o f N A D P H D i a p h o r a s e P o s i t i v e N e u r o n s I s N o t ’ A s s o c i a t e d W i t h C e l l D e a t h o r M i t o s i s . . . . . . . . . . . . . I n c r e a s e d N A D P H D i a p h o r a s e S t a i n i n g R e s u l t s f r o m L o s s o f S e n s o r y I n n e r v a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N i t r i c O x i d e S y n t h a s e - I m m u n o r e a c t i v i t y a n d N A D P H D i a p h o r a s e S t a i n i n g a r e C o - L o c a l i z e d i n M y e n t e r i c N e u r o n s . . . . . . . E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n I n c r e a s e s t h e N u m b e r o f N i t r i c O x i d e ‘ S y n t h a s e - I m m u n o r e a c t i v e M y e n t e r i c N e u r o n s . . . . . . . . . I n c r e a s e d N i t r i c O x i d e S y n t h a s e R e s u l t s f r o m L o s s o f S e n s o r y I n n e r v a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . L o s s o f E x t r i n s i c I n n e r v a t i o n D o e s N o t I n c r e a s e N i t r i c O x i d e S y n t h a s e i n S u b m u c o s a l N e u r o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n D o e s N o t I n c r e a s e V a s o a c t i v e I n t e s t i n a l P o l y p e p t i d e i n M y e n t e r i c N e u r o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n D o e s N o t I n c r e a s e V a s o a c t i v e I n t e s t i n a l P o l y p e p t i d e i n S u b m u c o s a l N e u r o n s . . . . . . . . . . . . . . . 6 . N E U R O G E N I C R E L A X A T I O N S A R E P O T E N T I A T E D F O L L O W I N G E X T R I N S I C D E N E R V A T I O N . . . . . . . . . . . . . i x 1 5 8 1 6 0 1 6 6 1 6 7 1 6 8 1 7 2 1 7 3 1 7 3 1 7 8 1 7 9 1 8 2 1 8 7 1 9 7 2 0 2 2 0 5 2 1 3 2 1 5 2 2 0 I n t r o d u c t i o n a n d E x p e r i m e n t a l R a t i o n a l e . . . . . . . . . . . . . . . . . E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n D o e s N o t A l t e r P a s s i v e o r A c t i v e T e n s i l e P r o p e r t i e s o f L o n g i t u d i n a l M u s c l e . . . . . . . . . . . . . . . . E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n I n c r e a s e s N e u r o g e n i c R e l a x a t i o n s o f L o n g i t u d i n a l M u s c l e - M y e n t e r i c P l e x u s P r e p a r a t i o n s . . . . . E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n I n c r e a s e s N i t r i n e r g i c N e u r o g e n i c R e l a x a t i o n s o f L o n g i t u d i n a l M u s c l e M y e n t e r i c P l e x u s P r e p a r a t i o n s . . . D e n e r v a t i o n - I n d u c e d P o t e n t i a t i o n o f N e u r o g e n i c R e l a x a t i o n s D o e s N o t R e s u l t F r o m A l t e r a t i o n s i n L o n g i t u d i n a l M u s c l e . . . . L o s s o f P r i m a r y A f f e r e n t I n n e r v a t i o n I n c r e a s e s N i t r i n e r g i c N e u r o g e n i c R e l a x a t i o n s o f L o n g i t u d i n a l M u s c l e M y e n t e r i c P l e x u s P r e p a r a t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n D e c r e a s e s R e b o u n d C o n t r a c t i o n s o f . L o n g i t u d i n a l M u s c l e M y e n t e r i c P l e x u s P r e p a r a t i o n s . . . . . 7 . N I T R I C O X I D E R E G U L A T E S S U B S T A N C E P B U T N O T A C E T Y L C H O L I N E R E L E A S E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I n t r o d u c t i o n a n d E x p e r i m e n t a l R a t i o n a l e . . . . . . . . . . . . . . . . . T r a n s m u r a l S t i m u l a t i o n P r o d u c e s M o n o p h a s i c C o n t r a c t i o n s o f C i r c u l a r M u s c l e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N i t r i c O x i d e S y n t h a s e I n h i b i t o r s P o t e n t i a t e N e u r o g e n i c N A N C b u t n o t C h o l i n e r g i c C o n t r a c t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C P 9 6 3 4 5 - 1 A t t e n u a t e s N e u r o g e n i c N A N C C o n t r a c t i o n s F o l l o w i n g P o t e n t i a t i o n b y N i t r i c O x i d e S y n t h a s e A n t a g o n i s t s . . . . . O x y h e m o g l o b i n A t t e n u a t e s N A N C b u t n o t C h o l i n e r g i c C o n t r a c t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . c G M P I n h i b i t s N A N C C o n t r a c t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S o d i u m N i t r o p r u s s i d e I n h i b i t s N A N C C o n t r a c t i o n s . . . . . . . . . . S u p e r o x i d e D i s m u t a s e D o e s N o t A l t e r t h e A m p l i t u d e o f N A N C C o n t r a c t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . V a s o a c t i v e I n t e s t i n a l P o l y p e p t i d e D o e s N o t A l t e r t h e A m p l i t u d e o f N A N C C o n t r a c t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N i t r i c O x i d e S y n t h a s e - a n d S u b s t a n c e P - I m m u n o r e a c t i v i t y A r e L o c a l i z e d i n D i f f e r e n t N e r v e s o f t h e C i r c u l a r M u s c l e P l e x u s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 . E X T R I N S I C D E N E R V A T I O N A L T E R S N I T R I C O X I D E 2 2 1 2 2 2 2 2 8 2 3 0 2 3 0 2 3 2 2 4 5 2 4 5 2 4 6 2 5 5 2 7 5 P R O D U C T I O N A S A S S A Y E D B Y C I T R U L L I N E P R O D U C T I O N 2 8 2 I n t r o d u c t i o n a n d E x p e r i m e n t a l R a t i o n a l e . . . . . . . . . . . . . . . . . C h a r a c t e r i z a t i o n o f [ " C ] C i t r u l l i n e F o r m a t i o n i n N o r m a l L M M P H o m o g e n a t e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C a 2 + a n d C a l m o d u l i n E f f e c t s [ ” C ] C i t r u l l i n e F o r m a t i o n i n N o r m a l L M M P H o m o g e n a t e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . [ " C ] C i t r u l l i n e F o r m a t i o n i n t h e P r e s e n c e o f N O S A n t a g o n i s t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . [ ” C ] C i t r u l l i n e F o r m a t i o n i n L M M P H o m o g e n a t e s F r o m E x t r i n s i c a l l y - D e n e r v a t e d I l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . [ ” C ] C i t r u l l i n e F o r m a t i o n i n L M M P H o m o g e n a t e s F r o m 2 8 2 2 8 6 2 9 1 2 9 3 C a p s a i c i n - T r e a t e d A n i m a l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M y e n t e r i c N e u r o n s D o N o t C o n t a i n I n d u c i b l e N i t r i c O x i d e S y n t h a s e - I m m u n o r e a c t i v i t y A f t e r E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 . F O S - L I K E P R O T E I N I N C R E A S E S A F T E R E X T R I N S I C D E N E R V A T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I n t r o d u c t i o n a n d E x p e r i m e n t a l R a t i o n a l e . . . . . . . . . . . . . . . . . F o s - i r I s N o t F o u n d I n N o r m a l S u b m u c o s a l o r M y e n t e r i c P l e x u s P r e p a r a t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S u r g i c a l E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n I n c r e a s e s F o s - i r I n S u b m u c o s a l a n d M y e n t e r i c G a n g l i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . L o s s o f E x t r i n s i c S y m p a t h e t i c o r S e n s o r y N e r v e s I n c r e a s e s F o s - i r i n S u b m u c o s a l a n d M y e n t e r i c G a n g l i a . . . . . . . . . . . . . . D I S C U S S I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 . E X T R I N S I C D E N E R V A T I O N A L T E R S A R T E R I O L A R I N N E R V A T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N e w V a s c u l a r N e r v e s O r i g i n a t e F r o m M y e n t e r i c G a n g l i a . . . . . . E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n I n d u c e s A x o n a l S p r o u t i n g o f M y e n t e r i c N e r v e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S y m p a t h e t i c a n d S e n s o r y N e r v e s M e d i a t e A x o n a l S p r o u t i n g o f V I P - i r a n d S P - i r N e r v e s , R e s p e c t i v e l y . . . . . . . . . . . . . . S p e c u l a t i o n o n t h e S i g n i fi c a n c e o f I n c r e a s e d S P - a n d V I P - I r V a s c u l a r I n n e r v a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 . T H E R E I S M I C R O H E T E R O G E N I T Y I N T H E D I S T R I B U T I O N O F N F - H I N E N T E R I C N E R V E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P u t a t i v e F u n c t i o n s o f P h o s p h o r y l a t e d N F - H . . . . . . . . . . . . . . . A l l E n t e r i c N e u r o n s D o N o t C o n t a i n N F - H . . . . . . . . . . . . . . . L o c a l i z a t i o n o f P h o s p h o r y l a t i o n - I n d e p e n d e n t N F - H — i r i s S i m i l a r t o p - a n d n p N F - H - i r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S u m m a r y o f D i s t r i b u t i o n o f N F - H - i r i n E n t e r i c N e u r o n s . . . . . . 3 . E X T R I N S I C D E N E R V A T I O N A L T E R S A N A T O M Y O F M Y E N T E R I C G A N G L I A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N A D P H D i a p h o r a s e I s A R e l i a b l e M a r k e r f o r N O S . . . . . . . . . . T h e N u m b e r o f N O S - i r a n d N A D P H D i a p h o r a s e M y e n t e r i c N e u r o n s / G a n g l i a I n c r e a s e s A f t e r L o s s o f E x t r i n s i c I n n e r v a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T h e N u m b e r o f V I P - i r M y e n t e r i c N e u r o n s / G a n g l i a D o e s N o t I n c r e a s e A f t e r E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . 4 . E X T R I N S I C D E N E R V A T I O N A L T E R S L O N G I T U D I N A L M U S C L E I N N E R V A T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F u n c t i o n a l A s s a y o f N i t r i n e r g i c I n n e r v a t i o n I n d i c a t e s I n c r e a s e d N O P r o d u c t i o n P r o c e e d i n g E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n . . . . L o s s o f E x t r i n s i c S e n s o r y N e r v e s M e d i a t e s I n c r e a s e d N O S - i r a n d N e u r o g e n i c R e l a x a t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n A l t e r s R e b o u n d C o n t r a c t i o n s o f x i 2 9 5 2 9 5 2 9 3 2 9 9 3 0 0 3 0 5 3 0 8 3 1 6 3 1 8 3 2 1 3 2 1 3 2 5 3 2 6 3 2 6 3 2 7 3 3 1 3 3 2 3 3 5 L o n g i t u d i n a l M u s c l e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 6 5 . E N D O G E N O U S N O R E G U L A T E S S P B U T N O T A C h R E L E A S E 3 3 8 E n d o g e n o u s N O I n h i b i t s N A N C C o n t r a c t i o n s . . . . . . . . . . . . . 3 3 9 V I P D o e s N o t I n h i b i t N A N C C o n t r a c t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 3 E n d o g e n o u s N O D o e s N o t I n h i b i t C h o l i n e r g i c C o n t r a c t i o n s . . . . 3 4 3 R e g u l a t i o n o f R e l e a s e o f T a c h y k i n i n s a n d A C h . . . . . . . . . . . . 3 4 5 T o n i c a n d S t i m u l a t e d R e l e a s e o f N O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 7 6 . E X T R I N S I C D E N E R V A T I O N A L T E R S C I T R U L L I N E P R O D U C T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 8 [ ” C ] C i t r u l l i n e i s P r o d u c e d b y N O S i n N o r m a l H o m o g e n a t e s . . . 3 4 8 E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n A l t e r s N O S A c t i v i t y a s A s s a y e d b y [ ” C ] C i t r u l l i n e F o r m a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 1 7 . E X T R I N S I C D E N E R V A T I O N I N C R E A S E S F O S P R O T E I N . . . . . 3 5 5 S C - 5 2 R e c o g n i z e s a N u c l e a r P r o t e i n i n E n t e r i c N e u r o n s f r o m S e g m e n t s o f I l e u m I n c u b a t e d i n K r e b s s S o l u t i o n . . . . . . 3 5 5 E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n I n d u c e s c - F o s - i r i n E n t e r i c N e u r o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 6 T i m e C o u r s e o f c - F o s E x p r e s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 9 8 . P L A S T I C I T Y O F T H E E N S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 0 G r o w t h A s s o c i a t e d P r o t e i n 4 3 i s F o u n d i n E n t e r i c N e r v e s . . . . . 3 6 1 I n t e r m e d i a t e F i l a m e n t P r o t e i n s A r e F o u n d i n E n t e r i c N e r v e s . . . . 3 6 1 U b i q u i t i n i s F o u n d i n E n t e r i c N e r v e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 2 9 . S I G N I F I C A N C E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 3 B I B L I O G R A P H Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 5 x i i L I S T O F T A B L E S . A n t i s e r a u s e d t o s t u d y d e n e r v a t i o n - i n d u c e d a l t e r a t i o n s i n t h e e n t e r i c n e r v o u s s y s t e m o f g u i n e a p i g i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S u r v e y o f t h e n u m b e r o f a r t e r i o l e s w i t h n e r v e f i b e r s c o n t a i n i n g v a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p o l y p e p t i d e - i m m u n o r e a c t i v i t y i n n o r m a l , c o n t r o l , a n d d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S u r v e y o f t h e n u m b e r o f a r t e r i o l e s w i t h n e r v e fi b e r s c o n t a i n i n g s u b s t a n c e P - , b u t n o t c a l c i t o n i n g e n e r e l a t e d p e p t i d e - i m m u n o r e a c t i v i t y i n n o r m a l , c o n t r o l , a n d d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P e r c e n t a g e o f F l u o r o - g o l d - l a b e l l e d s u b m u c o s a l n e u r o n s c o n t a i n i n g s u b s t a n c e P - o r v a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p o l y p e p t i d e - i m m u n o r e a c t i v i t y i n s u b m u c o s a l g a n g l i a i n n o r m a l , c o n t r o l , a n d d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . . N u m b e r o f p e p t i d e - a n d n o n p h o s p h o r y l a t e d N F - H - i m m u n o r e a c t i v e c e l l s i n s u b m u c o s a l g a n g l i o n o f g u i n e a p i g i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N u m b e r o f p e p t i d e - a n d n o n p h o s p h o r y l a t e d N F - H - i m m u n o r e a c t i v e c e l l s i n m y e n t e r i c g a n g l i o n o f g u i n e a p i g i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S u r v e y o f t h e n u m b e r o f a r t e r i o l e s w i t h N O S - i r n e r v e s i n n o r m a l , c o n t r o l , a n d s u r g i c a l l y - d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N i t r o - L - a r g i n i n e d o e s n o t a l t e r t h e a m p l i t u d e o f c i r c u l a r m u s c l e c o n t r a c t i l e r e s p o n s e s t o s u b s t a n c e P m e t h y l e s t e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n i n l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s h o m o g e n a t e s p r e p a r e d f r o m n o r m a l i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 . E f f e c t s o f N A D P H a n d c a l c i u m o n [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n b y n i t r i c o x i d e s y n t h a s e i n l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s h o m o g e n a t e s f r o m n o r m a l i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 . A d d i t i o n o f e x o g e n o u s c a l m o d u l i n d o e s n o t a l t e r n i t r i c o x i d e s y n t h a s e a c t i v i t y o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s x i i i 1 2 8 1 4 2 1 6 1 1 6 1 2 6 8 2 8 6 2 8 9 f r o m n o r m a l i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 0 1 2 . [ ” C ] C i t r u l l i n e p r o d u c t i o n i n n o r m a l a n d c o n t r o l l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n h o m o g e n a t e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 4 1 3 . A n t i s e r u m u s e d t o l o c a l i z e c - F o s p r o t e i n i n e n t e r i c n u c l e i . . . . . . . . . . . . . 3 0 3 1 4 . T h e n u m b e r o f c - F o s - i r n u c l e i i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c g a n g l i a i n n o r m a l g u i n e a p i g i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 4 x i v L I S T O F F I G U R E S 1 . A n a t o m y o f t h e e n t e r i c n e r v o u s s y s t e m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 2 . C y t o a r c h i t e c t u r e o f e n t e r i c n e u r o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 3 . E x t r i n s i c a n d i n t r i n s i c i n n e r v a t i o n o f s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s . . . . . . . . . . . . . 3 9 4 . N i t r i c o x i d e i s p r o d u c e d f r o m L - a r g i n i n e b y t h e r a t e - l i m i t i n g e n z y m e n i t r i c o x i d e s y n t h a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1 5 . G l y o x y l i c a c i d - i n d u c e d fl u o r e s c e n c e o f n e u r o n a l s t o r e s o f n o r e p i n e p h r i n e i n s y m p a t h e t i c n e r v e fi b e r s i n s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l a n d d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 3 6 . G l y o x y l i c a c i d - i n d u c e d fl u o r e s c e n c e o f n e u r o n a l s t o r e s o f n o r e p i n e p h r i n e i n s y m p a t h e t i c n e r v e fi b e r s i n m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l a n d d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 8 7 . C o - l o c a l i z a t i o n o f s u b s t a n c e P a n d c a l c i t o n i n g e n e r e l a t e d p e p t i d e - i m m u n o r e a c t i v i t y i n e x t r i n s i c p r i m a r y a f f e r e n t n e r v e s i n s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l a n d d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . . . . . . . . 1 2 0 8 . V a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p o l y p e p t i d e - i m m u n o r e a c t i v i t y i n i n t r i n s i c n e r v e fi b e r s i n s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l a n d d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 5 9 . W e i g h t o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l , c o n t r o l , a n d d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 2 1 0 . T h i c k n e s s o f c i r c u l a r a n d l o n g i t u d i n a l m u s c l e i n t r a n s v e r s e s e c t i o n s f r o m n o r m a l , c o n t r o l , a n d d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 3 1 1 . F l u o r o - g o l d l a b e l l i n g o f n e u r o n s i n s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l a n d d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 0 1 2 . N u m b e r o f F l u o r o - g o l d l a b e l l e d n e u r o n s i n s u b m u c o s a l g a n g l i o n f r o m n o r m a l , c o n t r o l , a n d d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 4 X V 1 4 . 1 5 . 1 6 . 1 7 . 1 8 . 1 9 . 2 0 . 2 1 . 2 2 . 2 3 . 2 4 . P h o s p h o r y l a t e d h e a v y m o l e c u l a r w e i g h t n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n - i r n m u n o r e a c t i v i t y i n n u c l e i a n d n e r v e fi b e r s i n m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s i n n o r m a l i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N o n p h o s p h o r y l a t e d h e a v y m o l e c u l a r w e i g h t n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n - i m m u n o r e a c t i v i t y i n s u b m u c o s a l n e r v e c e l l b o d i e s i n n o r m a l i l e u m . . . . . N o n p h o s p h o r y l a t e d h e a v y m o l e c u l a r w e i g h t n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n - i m m u n o r e a c t i v i t y i n m y e n t e r i c n e r v e c e l l b o d i e s 1 n n o r m a l a n d d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . H e a v y m o l e c u l a r w e i g h t n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n - i m m u n o r e a c t i v i t y i n w h o l e m o u n t s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C o - l o c a l i z a t i o n o f s u b s t a n c e P - a n d p h o s p h o r y l a t e d h e a v y m o l e c u l a r w e i g h t n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n - i m m u n o r e a c t i v i t y i n n e r v e fi b e r s i n s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m c o n t r o l a n d d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N o n p h o s p h o r y l a t e d h e a v y m o l e c u l a r w e i g h t n e u r o fi l a m e n t - p r o t e i n i m m u n o r e a c t i v i t y i n s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C o - l o c a l i z a t i o n o f v a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p o l y p e p t i d e - a n d p h o s p h o r y l a t e d h e a v y m o l e c u l a r w e i g h t n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n - i m m u n o r e a c t i v i t y i n n e r v e fi b e r s i n s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . . C o - l o c a l i z a t i o n o f s u b s t a n c e P - a n d c a l c i t o n i n g e n e - r e l a t e d p e p t i d e - i m m u n o r e a c t i v i t y i n s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m i l e u m t a k e n f r o m a n i m a l s t r e a t e d w i t h c a p s a i c i n o r f r o m s u r g i c a l l y - d e n e r v a t e d s e g m e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . V a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p o l y p e p t i d e - i m m u n o r e a c t i v i t y i n s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m i l e u m t a k e n f r o m a n i m a l s t r e a t e d w i t h 6 - h y d r o x y - d o p a m i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g i n w h o l e m o u n t m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l a n d d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T h e n u m b e r o f N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n e d n e u r o n s / g a n g l i o n i n m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l , s h a m , c o n t r o l , a n d d e n e r v a t e d i l e u m . . 1 5 3 1 5 8 1 6 4 1 7 6 1 8 4 1 9 1 2 5 . N A D P H d i a p h o r a s e a n d N A D H d i a p h o r a s e s t a i n i n g i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c p l e x u s w h o l e m o u n t p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x v i 1 9 5 2 6 . 2 7 . 2 8 . 2 9 . 3 0 . 3 1 . 3 2 . 3 3 . 3 4 . T h e n u m b e r o f N A D H d i a p h o r a s e s t a i n e d n e u r o n s / g a n g l i o n i n m y e n t e r i c a n d s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l , c o n t r o l , s h a m , o r d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 8 T h e n u m b e r o f S M I 3 1 - i m m u n o r e a c t i v e n u c l e i / g a n g l i o n i n m y e n t e r i c a n d s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l , s h a m , c o n t r o l , a n d d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 0 C o - l o c a l i z a t i o n o f n i t r i c o x i d e s y n t h a s e - i m m u n o r e a c t i v i t y a n d N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g i n m y e n t e r i c g a n g l i o n f r o m n o r m a l i l e u m . . . . . . . . 2 0 3 N i t r i c o x i d e s y n t h a s e - i m m u n o r e a c t i v i t y i n m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m c o n t r o l a n d d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 6 T h e n u m b e r o f n i t r i c o x i d e s y n t h a s e - i m m u n o r e a c t i v e n e u r o n s / g a n g l i o n f r o m m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l , c o n t r o l , s h a m , a n d d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 8 N i t r i c o x i d e s y n t h a s e - i m m u n o r e a c t i v i t y i n s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l a n d d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 1 V a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p o l y p e p t i d e - i m m u n o r e a c t i v i t y i n m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l a n d e x t r i n s i c a l l y - d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . . . 2 1 6 T h e n u m b e r o f v a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p o l y p e p t i d e i m m u n o r e a c t i v e n e u r o n s / g a n g l i o n i n m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l , s h a m , a n d d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 8 H i s t a m i n e c o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p s a n d l e n g t h - t e n s i o n r e l a t i o n s h i p s f o r l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m c o n t r o l a n d d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 2 3 5 . N e u r o g e n i c N A N C r e l a x a t i o n s o f p r e c o n s t r i c t e d l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c 3 6 . 3 7 . 3 8 . 3 9 . p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l a n d d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . . . . . . . . 2 2 6 N i t r o - L - a r g i n i n e a t t e n u a t e s n e u r o g e n i c N A N C r e l a x a t i o n s o f L M M P P s f r o m c o n t r o l a n d d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 8 S o d i u m n i t r o p r u s s i d e m i m i c s n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s i n l o n g i t u d i n a l m u s c l e m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m c o n t r o l a n d d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . 2 3 1 F r e q u e n c y d e p e n d e n c e o f n e u r o g e n i c N A N C r e l a x a t i o n s o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m a n i m a l s t r e a t e d w i t h 6 - O H - D A o r c a p s a i c i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 3 C P 9 6 3 4 5 - 1 a n t a g o n i z e d s u b s t a n c e P - i n d u c e d c o n t r a c t i o n s o f n o r m a l L M M P P s 2 3 7 x v i i 4 0 . 4 1 . 4 2 . 4 3 . 4 4 . 4 5 . 4 6 . 4 7 . 4 8 . 4 9 . 5 0 . 5 1 . 5 2 . 5 3 . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e s f o r C P 9 6 3 4 5 - 1 i n h i b i t i o n o f n e r v e - e v o k e d , n o n - c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s o f n o r m a l , c o n t r o l , a n d d e n e r v a t e d L M M P P s 2 3 0 N e u r o g e n i c N A N C c o n t r a c t i o n s o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m c o n t r o l a n d d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 0 N e u r o g e n i c N A N C c o n t r a c t i o n s o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m a n i m a l s t r e a t e d w i t h 6 - O I - 1 - D A o r c a p s a i c i n . . . . . . . 2 4 2 C h a r a c t e r i z a t i o n o f N A N C c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e i n t h e p r e s e n c e o f g u a n e t h i d i n e a n d s c o p o l a m i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 7 S P M E m i m i c s N A N C c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 9 C h a r a c t e r i z a t i o n o f c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e i n t h e p r e s e n c e o f C P 9 6 3 4 5 - 1 ( 3 0 0 n M ) a n d g u a n e t h i d i n e ( 3 1 1 M ) . . . . . 2 5 1 B e t h a n e c h o l m i m i c s c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e . . . . . . . . . 2 5 3 E f f e c t s o f L N A o n N A N C a n d c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e . 2 5 6 P o t e n t i a t i o n o f N A N C c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e b y L N A i s f r e q u e n c y d e p e n d e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 7 C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p s f o r t h e e f f e c t s o f L M M A a n d L N A M E o n a m p l i t u d e s o f n e r v e - e v o k e d N A N C a n d c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 0 L N A M E p o t e n t i a t e s N A N C c o n t r a c t i o n s a n d s p o n t a n e o u s a c t i v i t y o f c i r c u l a r m u s c l e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 2 C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p s f o r e f f e c t s o f L - a n d D - e n a n t i o m e r s o f X N N A a n d X N A M E o n N A N C c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 4 C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p s f o r e f f e c t s o f L - a n d D - a r g i n i n e a n d L N A M E i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f D A r g o r L A r g ( 1 m M ) o n N A N C c o n t r a c t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 6 C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p s f o r e f f e c t s o f h e m o g l o b i n o n N A N C a n d c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e . . . . . . . . . . 2 6 7 5 4 . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e e f f e c t s o f 8 - b r o m o - c G M P a n d d i b u t r y l - 5 5 . c G M P o n N A N C c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 0 E f f e c t s o f S N P o n n e u r o g e n i c a n d a g o n i s t — i n d u c e d c o n t r a c t i o n s o f x v i i i 5 6 . 5 7 . 5 8 . 5 9 . 6 0 . 6 1 . 6 2 . 6 3 . 6 4 . 6 5 . 6 6 . c i r c u l a r m u s c l e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C o n c e n t r a t i o n r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e e f f e c t s o f S N P a n d a p a m i n o n N A N C c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p s f o r t h e e f f e c t s o f s u p e r o x i d e d i s m u t a s e o n N A N C c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e f o r t h e e f f e c t s o f v a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p o l y p e p t i d e o n N A N C c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e . . . . . . . . . . . . . . C o l o c a l i z a t i o n o f n i t r i c o x i d e s y n t h a s e - a n d s u b s t a n c e P - i m m u n o r e a c t i v i t y i n c i r c u l a r m u s c l e p l e x u s o f n o r m a l i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A n a l y s i s o f k i n e t i c s o f [ ' 4 C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n b y h o m o g e n a t e s o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . E f f e c t s o f C a 2 + , N A D P H , a n d c a l m o d u l i n o n [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n b y h o m o g e n a t e s o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . [ ” C ] C i t r u l l i n e p r o d u c t i o n b y h o m o g e n a t e s o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s i n t h e p r e s e n c e o f E G T A a n d N O S a n t a g o n i s t s . . . . . C o m p a r i s o n o f [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n b y h o m o g e n a t e s i n l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m c o n t r o l a n d d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F o s - l i k e i m m u n o r e a c t i v i t y i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c n u c l e i f r o m c o n t r o l a n d s u r g i c a l l y - d e n e r v a t e d i l e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N u m b e r o f F o s - 1 r n u c l e i i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c g a n g l i a f r o m s e g m e n t s o f i l e u m d e n e r v a t e d 1 - 2 4 w e e k s p r i o r t o e x p e r i m e n t . . . . . . . . . . . . . . N u m b e r o f F o s - i r n u c l e i i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c g a n g l i a f r o m s e g m e n t s o f i l e u m t a k e n f r o m a n i m a l s s y s t e m i c a l l y - t r e a t e d w i t h 6 - O H - D A o r c a p s a i c i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x i x 2 7 3 2 7 6 2 7 9 2 7 8 2 8 3 2 8 6 2 9 2 3 0 1 3 0 6 3 0 9 A C h A P - l A T P C G R P C a 2 + C N S C h A t C M M P P E C “ , I c , 0 D T A F D M P P D R G E D T A E G T A E N S E J P L I S T O F A B B R E V I A T I O N S a c e t y l c h o l i n e a c t i v a t o r p r o t e i n 1 a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e a u t o n o m i c n e r v o u s s y s t e m c a l c i t o n i n g e n e - r e l a t e d p e p t i d e c a l c i u m c e l s i u s c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m c h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e c i r c u l a r m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n c o n c e n t r a t i o n o f d r u g p r o d u c i n g h a l f - m a x i m a l e f f e c t c o n c e n t r a t i o n o f d r u g p r o d u c i n g h a l f - m a x i m a l i n h i b i t i o n d i c h l o r o t r i a z i n y l a m i n o fl u o r e s c e i n 1 , 1 d i m e t h y l - 4 - p h e n y l - p i p e r a z i n i u m i o d i d e d o r s a l r o o t g a n g l i a [ e t h y l e n e d i n i t r i l o ] t e t r a a c e t a t i c a c i d e t h y l e n e g l y c o l - b i s ( B - a m i n o e t h y l e t h e r ) e n t e r i c n e r v o u s s y s t e m e x c i t a t o r y j u n c t i o n p o t e n t i a l E P S P f E P S P F I T C G A B A G I G A G A P - 4 3 G C H E P E S H z 6 - O H - D A I E G i r C y 3 i N O S I J P K D a L D C D x x i e x c i t a t o r y p o s t - s y n a p t i c p o t e n t i a l f a s t e x c i t a t o r y p o s t - s y n a p t i c p o t e n t i a l fl u o r o — g o l d fl u o r e s c e i n i s o t h i o c y a n a t e g a m m a a m i n o b u t y r i c a c i d g a s t r o i n t e s t i n a l g l y o x y l i c a c i d g r a m g r o w t h - a s s o c i a t e d p r o t e i n - 4 3 g u a n y l a t e c y c l a s e [ 2 - h y d r o x y e t h y l ] p i p e r a z i n e - N ’ - [ 2 - e t h a n e s u l f o n i c a c i d ] h e r t z h o u r 6 - h y d r o x y - d o p a m i n e i m m e d i a t e e a r l y g e n e i m m u n o g l o b u l i n i m m u n o r e a c t i v i t y i n d o c a r b o c y a n i n e i n d u c i b l e n i t r i c o x i d e s y n t h a s e i n h i b i t o r y j u n c t i o n p o t e n t i a l i n i t i a l l e n g t h k i l o d a l t o n l a r g e d e n s e - c o r e d v e s i c l e s L M M P P m i n m V M E M D M M A L M M A m A C h N A D H N A D P H n A C h N F N F - H N F - L N F - M n N O S N P Y N O x x i i l e n g t h f o r d e v e l o p m e n t o f o p t i m u m t e n s i o n l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n l u m b a r m i n u t e m i l l i m o l a r m i l l i v o l t m o d i fi e d e s s e n t i a l m e d i u m N G - m o n o m e t h y l - D - a r g i n i n e N G - m o n o m e t h y l - L - a r g i n i n e m o l a r m u s c a r i n i c r e c e p t o r m u s c a r i n i c r e c e p t o r s u b t y p e n a n o m e t e r B - n i c o t i n a m i d e a d e n i n e d i n u c l e o t i d e , r e d u c e d B - n i c o t i n a m i d e a d e n i n e d i n u c l e o t i d e p h o s p h a t e , r e d u c e d n i c o t i n i c r e c e p t o r n e u r o fi l a m e n t n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n , h e a v y m o l e c u l a r w e i g h t n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n , l i g h t m o l e c u l a r w e i g h t n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n , m e d i u m m o l e c u l a r w e i g h t n e u r o n a l n i t r i c o x i d e s y n t h a s e n e u r o p e p t i d e Y n i t r i c o x i d e N O S D N A M E L N A L N A M E N A N C n p N F N E P N S P B S p N F p n p N F K + p s i s e c S B S s E P S P S S V S N P S E M S M I s c S P S P M E x x i i i n i t r i c o x i d e s y n t h a s e n i t r o G - D - a r g i n i n e m e t h y l e s t e r n i t r o G - L - a r g i n i n e n i t r o G - L - a r g i n i n e m e t h y l e s t e r n o n - a d r e n e r g i c , n o n - c h o l i n e r g i c n o n p h o s p h o r y l a t e d n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n n o r e p i n e p h r i n e p e r i p h e r a l n e r v o u s s y s t e m p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e p h o s p h o r y l a t e d n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n p h o s p h o r y l a t e d a n d n o n p h o s p h o r y l a t e d n e u r o fi l a m e n t p o t a s s i u m p o u n d s p e r s q u a r e i n c h s e c o n d s h o r t b o w e l s y n d r o m e s l o w e x c i t a t o r y p o s t - s y n a p t i c p o t e n t i a l s m a l l s y n a p t i c v e s i c l e s s o d i u m n i t r o p r u s s i d e s t a n d a r d e r r o r o f t h e m e a n S t e r n b e r g e r M o n o c l o n a l I n c o r p o r a t e d s u b c u t a n e o u s s u b s t a n c e P s u b s t a n c e P m e t h y l e s t e r N K . T R I T C T T X T R S C T H V I P x x i v t a c h y k i n i n r e c e p t o r t h o r a c i c t e t r a m e t h y l r h o d a m i n e i s o t h i o c y a n a t e ( r h o d a m i n e ) t e t r o d o t o x i n t e x a s r e d s u l f o n y l c h l o r i d e t y r o s i n e h y d r o x y l a s e u l t r a v i o l e t u n i t s v a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p o l y p e p t i d e I N T R O D U C T I O N 1 . H I S T O R I C A L O V E R V I E W T h e C e l l T h e o r y a n d t h e N e u r o n D o c t r i n e T h e e r a o f m o d e r n b i o l o g y b e g a n i n t h e 1 8 3 0 5 w h e n a n a t o m i s t s u s e d n o w - p r i m i t i v e s t a i n i n g t e c h n i q u e s t o e x a m i n e s t r u c t u r e s i n n o n v e r t e b r a t e a n d v e r t e b r a t e t i s s u e s . T h e s e s c i e n t i s t s i n c l u d e d J a c o b S c h l e i d e n a n d T h e o d o r e S c h w a n n w h o m a d e a s e r i e s o f p i o n e e r i n g o b s e r v a t i o n s t h a t l e d t o t h e d e v e l o p m e n t o f t h e C e l l T h e o r y . T h i s t r e a t i s e a d v a n c e d t h e i d e a t h a t l i v i n g t i s s u e i s n o t a n a m o r p h o u s m a s s a s p r e v i o u s l y t h o u g h t , b u t r a t h e r c o m p r i s e d o f s m a l l s t r u c t u r a l u n i t s c a l l e d " c e l l s " . T h e c e l l s w o u l d s o m e h o w c o m m u n i c a t e w i t h e a c h o t h e r i n s u c h a m a n n e r a s t o a l l o w c o o r d i n a t e d p h y s i o l o g i c a l a c t i v i t y o f t h e e n t i r e t i s s u e . A l t h o u g h t h e C e l l T h e o r y d i d n o t p r o v i d e a n y s t r u c t u r a l o r f u n c t i o n a l e v i d e n c e t h a t a c t u a l l y e x p l a i n e d t h e m e c h a n i s m s o f c o m m u n i c a t i o n b e t w e e n c e l l s , i t r e s u l t e d i n a n e x p a n d e d i n t e r e s t i n c e l l u l a r a n a t o m y , c u l m i n a t i n g i n a n e x p l o s i o n o f h i s t o l o g i c a l s t a i n i n g o f p e r i p h e r a l a n d c e n t r a l t i s s u e s . U n f o r t u n a t e l y , m a n y t i s s u e s w e r e i m p o s s i b l e t o s t u d y a s m o s t h i s t o l o g i c a l s t a i n s d i d n o t d i s c r i m i n a t e b e t w e e n h e t e r o g e n o u s p o p u l a t i o n s o f c e l l s . I n 1 8 7 3 C a m i l l o G o l g i i n t r o d u c e d a s i l v e r i m p r e g n a t i o n m e t h o d t h a t a l l o w e d t h e g r e a t n e u r o a n a t o m i s t R a m o n y C a j a l t o s t a i n n e u r o n s i n p e r i p h e r a l t i s s u e s s u c h a s t h e s m a l l i n t e s t i n e ( C a j a l , 1 8 9 5 ) , g a l l b l a d d e r , a n d p a n c r e a s ( C a j a l a n d S a l a , 1 8 9 1 ) , a s w e l l a s n e u r o n s i n t h e c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m ( C N S ) . G o l g i ’ s s i l v e r s t a i n w a s s u p e r i o r 2 t o a l l o t h e r s t a i n s a t t h a t t i m e a s i t l a b e l l e d a p p r o x i m a t e l y 1 - 7 % o f a l l n e u r o n s , t h u s a l l o w i n g o b s e r v a t i o n o f s i n g l e c e l l s . F u r t h e r m o r e , t h e e n t i r e s t r u c t u r e o f t h e n e u r o n s e q u e s t e r e d t h e s i l v e r s t a i n , a l l o w i n g t h e a n a t o m y o f t h e n e u r o n t o b e v i s u a l i z e d . R e s u l t s f r o m u s e o f t h e s i l v e r s t a i n l e d C a j a l t o p r o p o s e t h e N e u r o n D o c t r i n e , w h i c h s t a t e d t h a t n e u r o n s a r e t h e b a s i c s i g n a l i n g u n i t o f t h e n e r v o u s s y s t e m , a n d e a c h n e u r o n c o n t a i n s s e v e r a l p r o c e s s e s t h a t m a y b e i n v o l v e d i n p r o c e s s i n g a n d s u b s e q u e n t t r a n s m i t t a l o f i n f o r m a t i o n ( P r i n c i p l e o f D y n a m i c P o l a r i z a t i o n ) . C a j a l ’ s N e u r o n D o c t r i n e p r o v i d e d t h e fi r s t m o d e r n n e u r o s c i e n t i s t s a s t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l w o r k i n g m o d e l f o r t h e i r e x p l o r a t i o n s o f t h e n e r v o u s s y s t e m , a n d G o l g i ’ s s i l v e r s t a i n p r o v i d e d a t o o l t o v i s u a l i z e n e r v o u s t i s s u e s t h a t i s s t i l l i n u s e t o d a y . E a r l y A n a t o m i c a l O b s e r v a t i o n s o f t h e G a s t r o i n t e s t i n a l T r a c t P r i o r t o C a j a l ’ s u s e o f G o l g i ’ s s i l v e r s t a i n , a h a n d f u l o f a n a t o m i s t s u s e d d i f fi c u l t a n d u n r e l i a b l e s t a i n i n g t e c h n i q u e s t o e x a m i n e p e r i p h e r a l a n d c e n t r a l t i s s u e s . A l t h o u g h t h e p r e s e n c e o f p e r i p h e r a l g a n g l i a h a d b e e n k n o w n b y t h e s e c o n d c e n t u r y ( G a l e n , c a . A D . 1 2 9 - 1 9 9 ) , w r i t t e n r e c o r d s d o n o t c o n t a i n a d e s c r i p t i o n o f g a n g l i a f o u n d w i t h i n t h e g a s t r o i n t e s t i n a l ( G I ) t r a c t u n t i l t h e m i d d l e o f t h e 1 9 t h c e n t u r y . I n 1 8 4 0 , R . R e m a k d e s c r i b e d m i c r o s c o p i c g a n g l i o n i c c e l l s i n t h e w a l l s o f t h e p h a r y n x a n d s t o m a c h . T h i s o b s e r v a t i o n w a s f o l l o w e d b y r e p o r t s f r o m G e o r g e M e i s s n e r ( 1 8 5 7 ) , L e o p o l d A u e r b a c h ( 1 8 6 2 ) , a n d T h o m a s B i l l r o t h ( 1 8 5 8 ) w h i c h p r o v i d e d t h e fi r s t d e t a i l e d d e s c r i p t i o n s o f g a n g l i o n a t e d p l e x u s e s f o u n d w i t h i n t h e w a l l s o f t h e G I t r a c t . C l a s s i fi c a t i o n o f t h e E n t e r i c N e r v o u s S y s t e m I n 1 8 6 9 , t h e w o r d " e n t e r i c " fi r s t a p p e a r e d ( W e b s t e r ’ s N i n t h N e w C o l l e g i a t e D i c t i o n a r y , 1 9 8 8 ) a n d w a s d e fi n e d a s " o f o r r e l a t i n g t o t h e i n t e s t i n e s " , o r i n m o r e g e n e r a l 3 u s a g e , " r e f e r r i n g t o t h e a l i m e n t a r y t r a c t " . T o d a y , t h e e n t e r i c n e r v o u s s y s t e m ( E N S ) i s d e fi n e d a s t h e n e t w o r k o f n e u r o n s a n d s u p p o r t c e l l s f o u n d w i t h i n t h e w a l l s o f t h e G I t r a c t , p a n c r e a s , a n d g a l l b l a d d e r . T h e E N S w a s o r i g i n a l l y c l a s s i fi e d b y J o h n L a n g l e y ( 1 9 2 1 ) a s a d i v i s i o n o f t h e a u t o n o m i c n e r v o u s s y s t e m ( A N S ) , a s h e w r o t e . . w e s h o u l d e x p e c t t h e c e l l s o f A u e r b a c h ’ s a n d M e i s s n e r ’ s p l e x u s e s t o b e o n t h e c o u r s e o f t h e b u l b a r a n d s a c r a l n e r v e s , b u t a s t h e r e w a s n o c l e a r p r o o f o f t h e i r c e n t r a l c o n n e x i o n , a n d a s t h e i r o b v i o u s h i s t o l o g i c a l c h a r a c t e r s d i f f e r e d f r o m t h o s e o f a n y o t h e r p e r i p h e r a l n e r v e c e l l , I p l a c e d t h e m i n a c l a s s b y t h e m s e l v e s a s t h e e n t e r i c n e r v o u s s y s t e m . " A l t h o u g h m o s t a u t h o r s f o r t h e p a s t 6 0 y e a r s h a v e e r r o n e o u s l y f o l l o w e d C a t h e r i n e H i l l ’ s ( 1 9 2 7 ) c o n c l u s i o n t h a t m a n y g a n g l i o n i c c e l l s i n t h e E N S r e p r e s e n t p a r a s y m p a t h e t i c p o s t g a n g l i o n i c n e u r o n s , L a n g l e y c i t e d a n a t o m i c a l a n d f u n c t i o n a l e v i d e n c e t o s u p p o r t h i s c l a s s i fi c a t i o n o f t h e E N S a s d i s t i n c t f r o m p a r a s y m p a t h e t i c n e r v e s . F i r s t , h e n o t e d t h a t e n t e r i c g a n g l i a w e r e n o t o n t h e c o u r s e o f e i t h e r c r a n i a l ( i . e . , b u l b a r o r v a g a l ) o r s a c r a l n e r v e s , a n d m o s t e n t e r i c g a n g l i a d i d n o t a p p e a r t o r e c e i v e p a r a s y m p a t h e t i c p r e g a n g l i o n i c i n n e r v a t i o n . A l t h o u g h p a r a s y m p a t h e t i c p r e g a n g l i o n i c n e r v e s i n t h e v a g u s s y n a p s e o n s o m e c e l l s i n t h e s m a l l i n t e s t i n e , f e w e r t h a n 2 0 , 0 0 0 v a g a l a f f e r e n t a n d e f f e r e n t n e r v e fi b e r s p a s s t h r o u g h t h e g u i n e a p i g d i a p h r a g m ( I r w i n , 1 9 3 1 ) t o i n n e r v a t e a n e s t i m a t e d 1 0 7 n e u r o n s i n t h e E N S . T h i s e f f e r e n t t o e n t e r i c n e u r o n s r a t i o o f 1 : 5 0 0 0 w o u l d b e t h e g r e a t e s t d i v e r g e n c e r a t i o i n t h e n e r v o u s s y s t e m , a s s u m i n g a l l e n t e r i c n e u r o n s r e p r e s e n t e d p a r a s y m p a t h e t i c p o s t g a n g l i o n i c n e u r o n s . T h e p a r a s y m p a t h e t i c p r e g a n g l i o n i c n e r v e t o p o s t g a n g l i o n i c n e u r o n s d i v e r g e n c e r a t i o i s a p p r o x i m a t e l y o n e f o r m o s t a u t o n o m i c g a n g l i a ( s e e F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ) , i m p l y i n g t h a t m o s t e n t e r i c n e u r o n s a r e n o t p o s t g a n g l i o n i c c e l l s a n d d o n o t r e c e i v e p a r a s y m p a t h e t i c i n n e r v a t i o n . L a n g l e y a l s o o b s e r v e d t h a t t h e h i s t o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f e n t e r i c n e u r o n s w e r e 4 n o t s i m i l a r t o o t h e r p e r i p h e r a l n e u r o n s . T h e b e s t s t u d y o f t h e m o r p h o l o g y o f e n t e r i c n e u r o n s w a s p e r f o r m e d b y A l e x a n d e r D o g i e l ( 1 8 9 9 ) w h o u s e d m e t h y l e n e b l u e t o i l l u s t r a t e t h e r e m a r k a b l e s t r u c t u r e a n d d i v e r s i t y o f e n t e r i c n e u r o n s . A s c o m p a r e d t o t h e s i m p l e o v o i d a n d c i r c u l a r c y t o a r c h i t e c t u r e o f p a r a s y m p a t h e t i c g a n g l i o n i c c e l l s , e n t e r i c n e u r o n s p o s s e s s e d n u m e r o u s b r a n c h i n g fi l a m e n t o u s a n d l a m e l l a r d e n d r i t e s t h a t a r e m o r e s i m i l a r t o n e u r o n s i n t h e C N S t h a n t o n e u r o n s i n t h e A N S . T h e r e c e n t d e v e l o p m e n t o f i m m u n o h i s t o c h e m i c a l t e c h n i q u e s h a s a l s o s u p p o r t e d L a n g l e y ’ s i n t u i t i v e c o n c l u s i o n . E n t e r i c n e u r o n s c o n t a i n a v a r i e t y o f p e p t i d e s a n d p r o t e i n s t h a t a r e n o t f o u n d i n p a r a s y m p a t h e t i c p o s t g a n g l i o n i c c e l l s , o r a r e f o u n d c o - e x p r e s s e d i n d i f f e r e n t c o m b i n a t i o n s t h a n t h o s e p r o t e i n s f o u n d i n p a r a s y m p a t h e t i c n e u r o n s . F u r t h e r m o r e , e a c h e n t e r i c g a n g l i o n a p p e a r s t o h a v e a r a n d o m s e l e c t i o n o f c e l l m o r p h o l o g i e s a n d c e l l m a r k e r s , u n l i k e o t h e r a u t o n o m i c g a n g l i a , w h e r e m o r p h o l o g i c a l l y a n d f u n c t i o n a l l y s i m i l a r c e l l s a r e o r g a n i z e d i n t o d i s c r e t e c l u s t e r s o r g r o u p s o f c e l l s . F i n a l l y , t h e u l t r a s t r u c t u r e o f e n t e r i c g a n g l i a d i f f e r s f r o m t h a t o f o t h e r a u t o n o m i c g a n g l i a , a s e n t e r i c g a n g l i a l a c k i n t e r n a l c a p i l l a r i e s a n d c o n n e c t i v e t i s s u e f o u n d i n o t h e r a u t o n o m i c g a n g l i a ( C o o k a n d B u m s t o c k , 1 9 7 6 ) . A l t h o u g h o t h e r a u t o n o m i c g a n g l i a c o n t a i n c o l l a g e n , fi b r o b l a s t s , m a c r o p h a g e s , a n d m a s t c e l l s , e n t e r i c g a n g l i a c o n t a i n o n l y t i g h t l y p a c k e d n e u r o n s a n d g l i a t h a t a r e n o t e n c o m p a s s e d b y s a t e l l i t e c e l l s h e a t h s f o u n d i n o t h e r a u t o n o m i c g a n g l i a ( r e v i e w e d i n L l e w e l l y n - S m i t h e t a l . , 1 9 8 3 ) . T h e r e f o r e , b a s e d o n m o r p h o l o g i c a l a n d h i s t o l o g i c a l p r o p e r t i e s , e n t e r i c g a n g l i a d o n o t r e s e m b l e a u t o n o m i c g a n g l i a , b u t r a t h e r r e s e m b l e t h e o r g a n i z a t i o n a l u l t r a s t r u c t u r e o f t h e C N S . I n a d d i t i o n t o a n a t o m i c a l o b s e r v a t i o n s , L a n g l e y k n e w o f t h e w o r k o f W i l l i a m B a y l i s s a n d E r n e s t S t a r l i n g ( 1 8 9 9 ; 1 9 0 0 a ; 1 9 0 0 b ) , t h a t d e m o n s t r a t e d t h e e x i s t e n c e o f 5 p o l a r i z e d r e fl e x e s i n s m a l l a n d l a r g e i n t e s t i n e i s o l a t e d f r o m e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n . S u c h r e fl e x e s w e r e n o t o b s e r v e d i n a n y o t h e r p e r i p h e r a l t i s s u e t h a t h a d b e e n e x a m i n e d , a l l o w i n g L a n g l e y t o a r g u e t h a t c o m p l e x r e fl e x p a t h w a y s s u c h a s t h e p e r i s t a l t i c r e fl e x o c c u r r e d i n d e p e n d e n t l y o f p a r a s y m p a t h e t i c a n d s y m p a t h e t i c n e r v e s . F u r t h e r m o r e , t h e a b i l i t y t o m a i n t a i n r e fl e x a c t i v i t y w h e n i s o l a t e d f r o m C N S i n n e r v a t i o n i m p l i e s t h a t a l l n e u r a l e l e m e n t s r e s p o n s i b l e f o r t h e r e fl e x , i n c l u d i n g p r i m a r y a f f e r e n t ( s e n s o r y ) n e u r o n s , i n t e m e u r o n s , a n d m o t o r n e u r o n s m u s t r e s i d e w i t h i n t h e E N S . T h i s i n d i c a t e d t h a t u n l i k e o t h e r a u t o n o m i c g a n g l i a , e n t e r i c n e u r o n s d o n o t f u n c t i o n s i m p l y a s r e l a y s i n c e n t r i f u g a l p a t h w a y s . I n f a c t , L a n g l e y a n d o t h e r p h y s i o l o g i s t s s u c h a s W a l t e r C a n n o n ( 1 9 0 6 ) o b s e r v e d t h a t d i g e s t i o n w a s n o t c o m p r o m i s e d p r o c e e d i n g s u r g i c a l d e s t r u c t i o n o f e x t r i n s i c n e r v e s , f u r t h e r s u g g e s t i n g t h a t n e u r o n s i n t h e E N S e x h i b i t a h i g h d e g r e e o f a u t o n o m y a n d a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e p h y s i o l o g i c a l p r o c e s s e s o f d i g e s t i o n . A l t h o u g h L a n g l e y ’ s d e s c r i p t i o n o f t h e A N S m a y n o w b e c o n s i d e r e d a n o v e r s i m p l i fi c a t i o n ( F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ) , e m b r y o l o g i c a l d a t a h a v e f u r t h e r s u p p o r t e d c l a s s i fi c a t i o n o f t h e E N S a s a s e p a r a t e d i v i s i o n o f t h e A N S . T h e o n t o g e n y o f e n t e r i c n e u r o n s h a s b e e n s t u d i e d s i n c e t h e m i d - 1 9 5 0 3 ( Y n t e m a a n d H a m m o n d , 1 9 5 4 ) , r e s u l t i n g i n t h e c o n c l u s i o n t h a t s i m i l a r t o p a r a s y m p a t h e t i c n e u r o n s , e n t e r i c n e u r o n s a r e d e r i v e d f r o m n e u r o b l a s t s f r o m v a g a l a n d s a c r a l r e g i o n s o f t h e n e u r a l c r e s t ( L e D o u a r i n a n d T e i l l e t , 1 9 7 3 ; P o m e r a n z a n d G e r s h o n , 1 9 9 0 ; G e r s h o n e t a l . , 1 9 9 3 ) . U n l i k e p a r a s y m p a t h e t i c n e u r o n s , e n t e r i c n e u r o b l a s t s m i g r a t e f r o m t h e c r e s t t o t h e i m m a t u r e g u t a l o n g t h e v a g u s n e r v e ( r e v i e w e d i n G e r s h o n e t a l . , 1 9 9 3 ) a n d d i f f e r e n t i a t e i n t o e n t e r i c n e u r o n s . I n c o n t r a s t t o p a r a s y m p a t h e t i c a n d e n t e r i c n e u r o n s , t h e p r e c u r s o r c e l l s o f s y m p a t h e t i c n e r v e s o r i g i n a t e f r o m t h e t r u n k r e g i o n o f t h e n e u r a l c r e s t ( L e D o u a r i n , 1 9 8 2 ) . 6 F u r t h e r m o r e , t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f l o c a l h o r m o n e s a n d g r o w t h f a c t o r s r e s u l t s i n f u r t h e r d i f f e r e n t i a t i o n o f s y m p a t h e t i c a n d p a r a s y m p a t h e t i c n e u r o n s , w h e r e a s e n t e r i c n e u r o n s a r e t h o u g h t t o d i f f e r e n t i a t e i n t h e a b s e n c e o f e x o g e n o u s m o l e c u l e s ( C a r n a h a n e t a l . , 1 9 9 1 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e d e v e l o p m e n t s t u d i e s s u g g e s t t h a t e n t e r i c n e u r o n s m a t u r e d i f f e r e n t i a l l y t h a n d o o t h e r n e u r o n s o f t h e A N S . 2 . I N T R I N S I C I N N E R V A T I O N O F T H E G A S T R O I N T E S T I N A L T R A C T A r r a n g e m e n t o f E n t e r i c P l e x u s e s T h e E N S i s c o m p r i s e d o f t w o i n t e r c o n n e c t i n g n e t w o r k s , o r p l e x u s e s , o f n e r v e s . T h e s u b m u c o s a l p l e x u s ( M e i s s n e r ’ s p l e x u s ) i s a n e t w o r k o f s m a l l g a n g l i a a n d c o n n e c t i n g n e r v e fi b e r s f o u n d i n c o n n e c t i v e t i s s u e o f t h e s u b m u c o s a l l a y e r l o c a t e d b e t w e e n m u c o s a l a n d c i r c u l a r m u s c l e l a y e r s ( F i g u r e l a ) . S u b m u c o s a l g a n g l i a c o n t a i n a p p r o x i m a t e l y 8 c e l l s / g a n g l i o n ( Y o u n g e t a l . , 1 9 9 3 ) , a n d t h e s e n e u r o n s p r o j e c t t o m u c o s a a n d a r t e r i o l e s f o u n d w i t h i n t h e s u b m u c o s a l l a y e r o f t h e G I t r a c t t o r e g u l a t e s e c r e t i o n , a b s o r p t i o n , a n d b l o o d fl o w . I n c o n t r a s t , t h e m y e n t e r i c p l e x u s ( A u e r b a c h ’ s p l e x u s ) i s c o m p o s e d o f t h r e e p l e x u s e s l o c a t e d b e t w e e n l o n g i t u d i n a l a n d c i r c u l a r m u s c l e l a y e r s o f t h e G I t r a c t ( F i g u r e 1 b ) . T h e p r i m a r y p l e x u s c o n t a i n s i n t e r g a n g l i o n i c ( i n t e m o d a l ) n e r v e fi b e r s , a s w e l l a s m y e n t e r i c g a n g l i a . M y e n t e r i c g a n g l i a c o n t a i n a p p r o x i m a t e l y 1 0 5 c e l l s / g a n g l i o n ( Y o u n g e t a l . , 1 9 9 3 a ) . T h e s e c o n d a r y p l e x u s i s c o m p r i s e d o f n e r v e fi b e r s o r i g i n a t i n g f r o m p r i m a r y m y e n t e r i c g a n g l i a a n d n e r v e fi b e r s , a n d s e c o n d a r y p l e x u s n e r v e s i n n e r v a t e c i r c u l a r m u s c l e ( A u e r b a c h , 1 8 6 4 ; B r o o k e s e t a l . , 1 9 9 2 ) . F i n a l l y , t h e t e r t i a r y p l e x u s i s f o r m e d b y m e a n d e r i n g b u n d l e s o f n e r v e fi b e r s l o c a t e d i n s p a c e s b e t w e e n t h e p r i m a r y p l e x u s a n d p r o v i d e s f u n c t i o n a l i n n e r v a t i o n t o l o n g i t u d i n a l m u s c l e ( r e v i e w e d i n F u r n e s s F i g u r e 1 . A n a t o m y o f t h e e n t e r i c n e r v o u s s y s t e m . A . C a m e r a l u c i d a d r a w i n g o f t r a n s v e r s e s e c t i o n o f g u i n e a p i g i l e u m s t a i n e d w i t h h e m a t o x y l i n a n d e o s i n . N u c l e i o f e p i t h e l i a l , e n d o c r i n e , n e r v o u s a n d m u s c l e c e l l s a r e s h o w n . M a g n i fi c a t i o n i s 1 6 0 X . C a l i b r a t i o n b a r f o r A i s 5 p m . B . C a m e r a l u c i d a d r a w i n g o f w h o l e m o u n t p r e p a r a t i o n o f g u i n e a p i g i l e a l m y e n t e r i c p l e x u s - l o n g i t u d i n a l m u s c l e . T h e m y e n t e r i c p l e x u s a d h e r e s t o l o n g i t u d i n a l m u s c l e a n d c a n n o t b e p h y s i c a l l y s e p a r a t e d . M a g n i fi c a t i o n i s 4 0 X . C a l i b r a t i o n b a r f o r B i s 1 0 0 u m . F i g “ r e A 1' m u c o s a 9 o i r t " } 1 . 3 : : a a s - O O f ‘ O ' ‘ :- ~"~ i .-. 5 : 1 5 5 " , f a a " V . 9 a n d C o s t a , 1 9 8 7 ; L l e w e l l y n - S m i t h e t a l . , 1 9 9 3 ) . T h e m u s c l e l a y e r s o f t h e G I t r a c t r e c e i v e a d d i t i o n a l i n n e r v a t i o n o t h e r t h a n t h e n e r v e fi b e r s o r i g i n a t i n g f r o m g a n g l i o n a t e d l a y e r s . T h e c i r c u l a r m u s c l e r e c e i v e s i n n e r v a t i o n f r o m c i r c u l a r m u s c l e p l e x u s a n d d e e p m u s c u l a r p l e x u s , i n a d d i t i o n t o i n n e r v a t i o n f r o m t h e s e c o n d a r y p l e x u s o f t h e m y e n t e r i c p l e x u s . T h e c i r c u l a r m u s c l e p l e x u s i s o r i e n t a t e d p a r a l l e l t o c i r c u l a r m u s c l e fi b e r s , a n d r e c e i v e s i n n e r v a t i o n f r o m p r i m a r y a n d s e c o n d a r y p l e x u s e s o f t h e m y e n t e r i c p l e x u s . I n c o n t r a s t , t h e d e e p m u s c u l a r p l e x u s i s o r i e n t a t e d p a r a l l e l t o c i r c u l a r m u s c l e a n d s e p a r a t e s a t h i n l a y e r o f m u s c l e c e l l s f r o m c i r c u l a r m u s c l e ( G a b e l l a , 1 9 7 4 ) , t h u s s u g g e s t i n g t h a t c i r c u l a r m u s c l e i s a s y m m e t r i c a l l y i n n e r v a t e d b y t h e E N S . A l t h o u g h a l o n g i t u d i n a l m u s c l e p l e x u s i s f o u n d i n s o m e s p e c i e s i n c l u d i n g h u m a n s , a n a n a l o g o u s p l e x u s i s n o t f o u n d i n r o d e n t s . H o w e v e r , n e r v e fi b e r s o f t h e t e r t i a r y p l e x u s c a n b e l o c a l i z e d i n s m a l l t r o u g h s o n t h e s u r f a c e o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e ( L l e w e l l y n - S m i t h , 1 9 8 6 ) , i n d i c a t i n g t h a t n e r v e fi b e r s o f t h e t e r t i a r y p l e x u s f o r m n e u r o e f f e c t o r j u n c t i o n s w i t h l o n g i t u d i n a l m u s c l e . C y t o a r c h i t e c t u r e o f E n t e r i c N e u r o n s T h e m o s t e l e g a n t a n d i n t u i t i v e s t u d y o f t h e m o r p h o l o g y o f e n t e r i c n e u r o n s w a s p e r f o r m e d i n t h e l a t e 1 8 0 0 5 b y A l e x a n d e r D o g i e l . D o g i e l u s e d m e t h y l e n e b l u e t o s t a i n e n t e r i c n e u r o n s i n l a r g e a n d s m a l l i n t e s t i n e s o f r a t s , g u i n e a p i g s , r a b b i t s , c a t s , a n d h u m a n s ( D o g i e l 1 8 9 9 ) , a n d c o n c l u d e d t h a t t h e r e a r e t h r e e s e p a r a t e c l a s s e s o f n e u r o n s i n t h e m y e n t e r i c p l e x u s . D o g i e l t y p e I c e l l s w e r e d e s c r i b e d a s fl a t t e n e d c e l l s w i t h s t e l l a t e o r a n g u l a r m o r p h o l o g i e s t h a t m e a s u r e d 1 0 - 4 0 p m i n t h e l o n g a x i s , a n d 1 0 - 2 0 u m i n t h e s h o r t a x i s ( F i g u r e 2 ) . T h e s e c e l l s h a v e 2 - 2 2 b r o a d a n d fl a t d e n d r i t e s t h a t f r e q u e n t l y t e r m i n a t e i n m u l t i p l e s h o r t t u f t s . T h e a x o n s f r o m D o g i e l t y p e I c e l l s a r i s e f r o m c e l l 1 0 s o m a t a o r d e n d r i t e s , a n d a r e o c c a s i o n a l l y o b s e r v e d t o b i f u r c a t e a n d / o r c o n t a i n s p i n e s . D o g i e l w a s a b l e t o t r a c e t h e s e a x o n s f o r s h o r t d i s t a n c e s , a n d c o n c l u d e d t h a t a l t h o u g h t h e y p r o j e c t e d t o o t h e r g a n g l i a , t h e y e v e n t u a l l y a p p e a r e d t o e n t e r t h e c i r c u l a r m u s c l e . D o g i e l t y p e 1 1 c e l l s a r e 2 0 - 5 0 p m i n t h e l o n g a x i s , a n d 1 0 - 2 0 p m i n t h e s h o r t a x i s , a n d h a v e a n g u l a r , s p i n d l e , o r s t a r - s h a p e d s m o o t h c e l l s o m a t a . T y p e 1 1 c e l l s h a v e l o n g a n d fi l a m e n t o u s p r o c e s s e s t h a t o r i g i n a t e f r o m 3 — 1 0 t h i c k d e n d r i t e s , a n d s i n g l e a x o n s w h i c h a r i s e f r o m e i t h e r p r o n o u n c e d a x o n h i l l o c k - l i k e s t r u c t u r e s o r d e n d r i t e s . D o g i e l t r a c e d t h e s e a x o n s t o o t h e r g a n g l i a w i t h i n t h e p l a n e o f t h e m y e n t e r i c p l e x u s . F i n a l l y , T y p e 1 1 1 c e l l s a r e a p p r o x i m a t e l y t h e s a m e s i z e a n d p o s s e s s t h e s a m e m o r p h o l o g y a s D o g i e l t y p e I c e l l s . H o w e v e r , t y p e 1 1 1 c e l l s h a v e 2 - 1 0 d e n d r i t e s t h a t a r e l e s s b r o a d t h a n t y p e I d e n d r i t e s a n d t a p e r i n t o b r a n c h e d d e n d r i t e s t h a t f r e q u e n t l y t e r m i n a t e i n fi l a m e n t o u s d i s t a l d e n d r i t e s a s t h e y p r o j e c t a w a y f r o m t h e c e l l s o m a . S i m i l a r t o a x o n s f r o m t y p e I I c e l l s , a x o n s o f t y p e I I I a x o n s o r i g i n a t e d f r o m c e l l s o m a t a o r d e n d r i t e s a n d p r o j e c t t o i n t e r g a n g l i o n i c n e r v e fi b e r s . A s D o g i e l t y p e 1 1 1 c e l l s a r e s i m i l a r t o t y p e I c e l l s , m a n y r e s e a r c h e r s c o n f u s e d t h e s e t w o c e l l m o r p h o l o g i e s . F o r e x a m p l e , C a t h e r i n e H i l l ( 1 9 2 7 ) u s e d v i o l e t s t a i n i n g t o o b s e r v e n e u r o n s i n s u b m u c o s a l g a n g l i a , a n d c o n c l u d e d t h a t t y p e I I I c e l l s w e r e a c t u a l l y a v a r i a n t o f t y p e I c e l l s . H o w e v e r , D o g i e l c l e a r l y s t a t e d t h a t t y p e 1 1 1 c e l l s w e r e u n i q u e a n d d i f f e r e n t t h a n t y p e I c e l l s , a n d a r e f o u n d p r e d o m i n a n t l y i n t h e s u b m u c o s a l p l e x u s ( r e v i e w e d i n F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ) . A l t h o u g h D o g i e l ’ s d e s c r i p t i o n a c c o u n t s f o r t h e m a j o r i t y o f c e l l s i n t h e E N S , m a n y c e l l s c a n n o t b e c a t e g o r i z e d b y h i s c l a s s i fi c a t i o n s c h e m e . I n o n e c l a s s i fi c a t i o n s c h e m e a d v o c a t e d m o r e r e c e n t l y ( C o s t a e t a l . , 1 9 8 6 a ) 4 4 % o f a l l m y e n t e r i c n e u r o n s v i s u a l i z e d b y i m m u n o c y t o c h e m i s t r y c o u p l e d t o i n d i r e c t fl u o r e s c e n c e c o u l d n o t b e p l a c e d i n D o g i e l ’ s 1 1 F i g u r e 2 . C y t o a r c h i t e c t u r e o f e n t e r i c n e u r o n s . C a m e r a l u c i d a d r a w i n g s o f t h r e e m o r p h o l o g i e s d e s c r i b e d b y D o g i e l ( 1 8 9 9 ) . D o g i e l t y p e I a n d 1 1 c e l l s a r e f o u n d i n m y e n t e r i c g a n g l i a , w h e r e a s t y p e 1 1 1 c e l l s a r e l o c a l i z e d i n s u b m u c o s a l g a n g l i a . T y p e I n e u r o n s w e r e s t a i n e d b y N A D P H d i a p h o r a s e h i s t o c h e m i s t r y , t y p e I I n e u r o n s w e r e s t a i n e d w i t h a n t i s e r m n a g a i n s t n o n p h o s p h o r y l a t e d h e a v y n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n , a n d t y p e I I I n e u r o n s w e r e s t a i n e d w i t h a n t i s e r u m a g a i n s t c h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e . N e u r o n s a r e m a g n i fi e d b y 3 2 0 X . C a l i b r a t i o n b a r i s 9 u m . M F i g u r e 2 . D o g i e l t y p e I c e l l s D o g i e l t y p e 1 1 c e l l s D o g i e l t y p e 1 1 1 c e l l s 1 3 s c h e m e . H o w e v e r , o v e r 9 0 % o f n e u r o n s c o u l d b e c l a s s i fi e d i n D o g i e l ’ s s c h e m e w h e n m y e n t e r i c n e u r o n s w e r e r a n d o m l y fi l l e d w i t h L u c i f e r Y e l l o w , i m p l y i n g t h a t t h e d i s c r e p a n c y i n l a b e l l i n g c o u l d r e s u l t f r o m d i f f e r e n c e s i n m e t h o d o l o g y . A l t h o u g h D o g i e l ’ s c l a s s i fi c a t i o n s c h e m e a c c o u n t s f o r m a n y n e u r o n s i n t h e E N S , a t l e a s t s o m e e n t e r i c n e u r o n s d o n o t fi t a n y o f h i s c a t e g o r i z e s , s u g g e s t i n g a m o r e d e t a i l e d s c h e m e i s n e e d e d . D o g i e l s p e c u l a t e d t h a t a f u n c t i o n a l s i g n i fi c a n c e u n d e r l a i d t h e m o r p h o l o g i c a l d i f f e r e n c e s i n e n t e r i c n e u r o n s . F o r e x a m p l e , a s D o g i e l t y p e I c e l l s a p p e a r e d t o p r o j e c t t o c i r c u l a r m u s c l e , h e p o s t u l a t e d t h a t t h e y w e r e m o t o r n e u r o n s . A l t h o u g h D o g i e l w a s f r e q u e n t l y u n a b l e t o t r a c e p r o j e c t i o n s o f t y p e 1 1 c e l l s , h e c o n c l u d e d t h a t t h e y w e r e l i k e l y t o b e i n t r i n s i c s e n s o r y n e u r o n s , a s t h e s e c e l l s a p p e a r e d t o s e n d m u l t i p l e l o n g a x o n - l i k e d e n d r i t e s t o w a r d s t h e m u c o s a l s u r f a c e . F u r t h e r m o r e , a x o n s o f D o g i e l t y p e 1 1 c e l l s p r o j e c t e d t o m y e n t e r i c n e u r o n s i n o t h e r g a n g l i a , a l l o w i n g s e n s o r y i n f o r m a t i o n t o b e ‘ t r a n s m i t t e d t o o t h e r m y e n t e r i c n e u r o n s . H o w e v e r , u n t i l t h e i n v e n t i o n o f e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l t e c h n i q u e s , t h e i d e a t h a t p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n s w e r e c o r r e l a t e d t o c e l l m o r p h o l o g y r e m a i n e d u n t e s t e d a n d h i g h l y d e b a t e d ( s e e H i l l , 1 9 2 7 ; G a b e l l a , 1 9 7 6 ) . U l t r a s t r u c t u r e o f E n t e r i c N e u r o n s D o g i e l ’ s o b s e r v a t i o n s w e r e l i m i t e d b y t h e l i g h t m i c r o s c o p e s i n e x i s t e n c e a t t h e e n d o f t h e n i n e t e e n t h c e n t u r y . E l e c t r o n m i c r o s c o p y s t u d i e s h a v e y i e l d e d a d d i t i o n a l i n f o r m a t i o n o n t h e s t r u c t u r e a n d o r g a n i z a t i o n o f e n t e r i c n e u r o n s , a s e i g h t c l a s s e s o f m y e n t e r i c n e u r o n s h a v e b e e n i d e n t i fi e d b a s e d o n m i c r o a n a t o m i c a l d i f f e r e n c e s ( C o o k a n d B u m s t o c k , 1 9 7 6 ) . T w o c l a s s e s o f e n t e r i c n e u r o n s h a v e a x o - s o m a t i c s y n a p s e s a n d p e r i k a r y a t h a t a r e 8 - 1 3 u m i n d i a m e t e r . H o w e v e r , ( i ) s m a l l c e l l s n e a r t h e g a n g l i o n i c s u r f a c e c o n t a i n o c c a s i o n a l l a r g e d e n s e - c o r e d v e s i c l e s a n d a r e s u r r o u n d e d b y e n t e r i c g l i a l 1 4 c e l l s , w h e r e a s ( i i ) s m a l l c e l l s i n t h e i n t e r i o r o f t h e g a n g l i a h a v e n e i t h e r d e n s e - c o r e d v e s i c l e s o r c o n t a c t s w i t h g l i a l c e l l s . A v a r i a t i o n o f ( i i i ) s m a l l c e l l s w i t h a x o - d e n d r i t i c s y n a p s e s a n d a v e r a g e p e r i k a r y o n d i a m e t e r o f 1 4 - 1 8 p m a r e o n l y o b s e r v e d i n t h e s t o m a c h . F o u r c l a s s e s o f m e d i u m - s i z e d m y e n t e r i c n e u r o n s a r e o b s e r v e d , w i t h d i a m e t e r s o f 2 0 - 2 5 p m . E l l i p t i c a l s h a p e d n e u r o n s ( i v ) m e a s u r i n g 2 0 1 1 m i n t h e l o n g a x i s , a n d 1 0 p m i n t h e s h o r t a x i s c o n t a i n n u m e r o u s r i b o s o m e s a n d r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m , r e s u l t i n g i n a n e l e c t r o n - d e n s e a p p e a r a n c e . T h e s e c e l l s a r e f o u n d i n t h e i n t e r i o r o f t h e g a n g l i a a n d h a v e a x e - s o m a t i c s y n a p s e s . A s e c o n d p o p u l a t i o n o f m e d i u m - s i z e d n e u r o n s ( v ) a l s o h a v e a x o - s o m a t i c s y n a p s e s a n d a p p e a r e d e l e c t r o n - d e n s e , a s t h e y c o n t a i n n u m e r o u s a n d d i s t i n c t i v e m i t o c h o n d r i a . T h e fi n a l t w o c l a s s e s o f m e d i u m - s i z e d m y e n t e r i c n e u r o n s h a v e b r o a d d e n d r i t e s ( v i ) o r t h i n d e n d r i t e s ( v i i ) , a n d a r e l o c a t e d a t t h e p e r i p h e r y a n d t h e i n t e r i o r o f g a n g l i a , r e s p e c t i v e l y . F i n a l l y , t w o p o p u l a t i o n s o f n e u r o n s h a v e l a r g e p e r i k a r y a o f 3 0 - 3 5 p m , a l t h o u g h s o m e n e u r o n s i n t h i s c l a s s a r e f o u n d o u t s i d e o f m y e n t e r i c g a n g l i a . L a r g e n e u r o n s w i t h i n t h e g a n g l i a ( v i i i ) h a v e s m a l l a n d f a i n t m i t o c h o n d r i a a n d f e w s y n a p t i c c o n t a c t s . S u b m u c o s a l g a n g l i o n i c n e u r o n s d o n o t d i f f e r f r o m e a c h o t h e r i n t h e i r u l t r a s t r u c t u r a l o r g a n i z a t i o n , a s t h e y p o s s e s s b r o a d a n d t h i n d e n d r i t e s , a x o - s o m a t i c a n d a x o - d e n d r i t i c s y n a p s e s , a n d p e r i k a r y a t h a t m e a s u r e 1 2 - 3 0 p m ( W i l s o n e t a l . , 1 9 8 1 ) . N e u r o c h e m i s t r y o f E n t e r i c N e u r o n s P h a r m a c o l o g i c a l s t u d i e s i n t h e e a r l y 2 0 t h c e n t u r y b y r e s e a r c h e r s s u c h a s L a n g l e y , D i x o n , D a l e ( 1 9 1 3 a n d 1 9 1 4 ) , L o e w i ( 1 9 2 6 ) , a n d C a n n o n ( 1 9 2 1 ) c o n v i n c i n g l y i l l u s t r a t e d t h a t p a r a s y m p a t h e t i c n e r v e s r e l e a s e d a c e t y l c h o l i n e ( A C h ) a n d s y m p a t h e t i c n e r v e s r e l e a s e d n o r e p i n e p h r i n e ( N E ) . H o w e v e r , i d e n t i t y o f m a n y n e u r o t r a n s m i t t e r s i n t h e E N S r e m a i n e d u n r e s o l v e d , f o r b i o c h e m i c a l p r o t o c o l s , a n d h i s t o c h e m i c a l t e c h n i q u e s s u c h a s 1 5 i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y , w e r e n o t a v a i l a b l e p r i o r t o t h e e a r l y 1 9 8 0 5 . N o r e p i n e p h r i n e w a s t h e fi r s t n e u r o t r a n s m i t t e r t o b e i d e n t i fi e d i n p e r i p h e r a l a n d c e n t r a l t i s s u e s b y h i s t o l o g i c a l m e t h o d s . E r a n k o ( 1 9 5 2 ) d e v e l o p e d a p r o t o c o l f o r t h e a n a t o m i c a l l o c a l i z a t i o n o f c a t e c h o l a m i n e s u s i n g h o t f o r m a l d e h y d e v a p o r . T h i s t e c h n i q u e p r o v e d t o b e d i f fi c u l t a s t h e w a t e r c o n t e n t h a d t o b e c o n t r o l l e d c a r e f u l l y , u l t i m a t e l y l e a d i n g t o d e v e l o p m e n t a n d u s e o f g l y o x y l i c a c i d ( G A ) t o r e v e a l n e u r o n a l s t o r e s o f c a t e c h o l a m i n e s ( F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 7 5 ) . T h e s e h i s t o l o g i c a l t e c h n i q u e s w e r e a d v a n t a g e o u s a s p r e p a r a t i o n s o f p e r i p h e r a l t i s s u e s c o u l d b e i n c u b a t e d i n h o t f o r m a l d e h y d e v a p o r o r g l y o x y l i c a c i d , a n d t h e n e x a m i n e d u s i n g fl u o r e s c e n t m i c r o s c o p y . A s N E fl u o r e s c e d b r i g h t b l u e , i n n e r v a t i o n c o u l d b e e a s i l y v i s u a l i z e d . H o w e v e r , h i s t o l o g i c a l t e c h n i q u e s d i d n o t a l l o w l o c a l i z a t i o n o f a n y o t h e r c a t e c h o l a m i n e s , s u c h a s d o p a m i n e a n d e p i n e p h r i n e , o r a n y o t h e r n e u r o t r a n s m i t t e r s , s u c h a s A C h . B e g i n n i n g i n t h e 1 9 7 0 5 , i m m u n o l o g i c a l t e c h n i q u e s w e r e u s e d t o r a i s e a n t i b o d i e s o r a n t i s e r u m a g a i n s t p u t a t i v e e n z y m e s a n d n e u r o t r a n s m i t t e r s . T h o m a s H o k f e l t e t a l . ( 1 9 7 5 ) w e r e t h e fi r s t g r o u p t o a p p l y s u c h t e c h n i q u e s t o t h e E N S f o r t h e y d e s c r i b e d s o m a t o s t a t i n - i m m u n o r e a c t i v e ( i r ) n e u r o n s i n m y e n t e r i c g a n g l i a . T h i s o b s e r v a t i o n s u g g e s t e d t h a t p e p t i d e s m a y a l s o b e u s e d b y e n t e r i c n e u r o n s a s n e u r o t r a n s m i t t e r s o r a s m o d u l a t o r s o f n e u r o t r a n s m i s s i o n . I m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t u d i e s h a v e f o u n d e n t e r i c n e u r o n s c o n t a i n a p l e t h o r a o f p o s s i b l e n e u r o t r a n s m i t t e r s i n c l u d i n g a n g i o t e n s i n ( r e v i e w e d i n C o s t a e t a l . , 1 9 8 7 ) , b o m b e s i n ( r e v i e w e d i n C o s t a e t a l . , 1 9 9 1 ) , c a l c i t o n i n g e n e - r e l a t e d p e p t i d e ( C G R P ) ( F u r n e s s e t a l . , 1 9 8 5 ) , c h o l e c y s t o k i n i n 1 - 8 ( S c h u l t z b e r g e t a l . , 1 9 8 0 ) d y n o r p h i n 1 - 8 a n d 1 - 1 7 ( C o s t a e t a l . , 1 9 8 5 a ) , m e t - a n d l e u - e n k e p h a l i n ( F u r n e s s e t a l . , 1 9 8 3 ) , h i s t a m i n e , g a l a n i n ( r e v i e w e d i n F u r n e s s e t a 1 . , 1 9 8 8 ) , g a s t r i n - r e l e a s i n g p e p t i d e 1 - 2 7 1 6 ( C o s t a e t a l . , 1 9 8 4 ) , n e u r o p e p t i d e Y ( N P Y ) ( F u r n e s s e t a l . , 1 9 8 3 b ; F u r n e s s e t a l . , 1 9 8 5 ; K e a s t e t a l . , 1 9 8 4 b ) , n e u r o t e n s i n , p e p t i d e h i s t i d i n e i s o l e u c i n e a m i n e ( r e v i e w e d i n F u r n e s s e t a l . , 1 9 8 2 ) , p i t u i t a r y a d e n y l a t e c y c l a s e a c t i v a t i n g p e p t i d e ( S u n d l e r e t a l . , 1 9 9 2 ) , s o m a t o s t a t i n ( H o k f e l t e t a l . , 1 9 7 5 ; C o s t a e t a l . , 1 9 8 0 ; C o s t a a n d F u r n e s s , 1 9 8 4 ; K e a s t e t a l . , 1 9 8 4 a ) , s u b s t a n c e K , s u b s t a n c e P ( S P ) ( C o s t a e t a l . , 1 9 8 1 ; K e a s t e t a l . , 1 9 8 4 b ) , a n d / o r v a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p e p t i d e ( V I P ) ( F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 7 9 ; C o s t a a n d F u r n e s s , 1 9 8 3 ; r e v i e w e d i n F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 2 a ; K e a s t e t a l . , 1 9 8 4 b ) . A n t i s e r u m o r a n t i b o d i e s h a v e a l s o b e e n r a i s e d a g a i n s t e n z y m e s i n v o l v e d i n t h e s y n t h e s i s o f n e u r o t r a n s m i t t e r s . F o r e x a m p l e , e n t e r i c n e u r o n s h a v e b e e n s h o w n t o c o n t a i n c h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e ( C h A t ) - i r , t h e e n z y m e r e s p o n s i b l e f o r p r o d u c t i o n o f A C h ; n i t r i c o x i d e s y n t h a s e ( N O S ) - i r , t h e r a t e - l i m i t i n g e n z y m e f o r s y n t h e s i s o f n i t r i c o x i d e ( N O ) ; a n d / o r t y r o s i n e h y d r o x y l a s e ( T H ) , t h e r a t e - l i m i t i n g e n z y m e f o r s y n t h e s i s o f c a t e c h o l a m i n e s . S o m e e n t e r i c n e u r o n s h a v e a l s o b e e n s h o w n t o c o n t a i n s e r o t o n i n - 1 r ( C o s t a e t a l . , 1 9 8 2 ; G r i f fi t h a n d B u m s t o c k , 1 9 8 3 ; F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 2 ) , a s w e l l a s u p t a k e o f g a m m a a m i n o b u t y r i c a c i d ( G A B A ) ( K r a n t i s a n d K e r r , 1 9 8 1 ) . T h e r e f o r e , a l t h o u g h t h e f u n c t i o n s c o n t r o l l e d b y t h e E N S a p p e a r s i m p l e c o m p a r e d t o t h o s e m e d i a t e d b y t h e C N S , e a c h e n t e r i c n e u r o n m a y r e l e a s e m u l t i p l e n e u r o t r a n s m i t t e r s a n d n e u r o m o d u l a t o r s t h a t i n t u r n , m a y i n fl u e n c e a r t e r i o l e s , G I s m o o t h m u s c l e , a n d o t h e r e n t e r i c n e u r o n s . C r i t e r i a f o r I d e n t i fi c a t i o n o f N e u r o t r a n s m i t t e r s i n t h e E N S T h e E N S c o n t a i n s a w i d e v a r i e t y o f p u n i t i v e p e p t i n e r g i c a n d a m i n e r g i c n e u r o t r a n s m i t t e r s a s d e s c r i b e d i n t h e p r e c e d i n g s e c t i o n . A n u m b e r o f t h e s e m o l e c u l e s h a v e m e t t h e c r i t e r i a f o r i d e n t i fi c a t i o n a s n e u r o t r a n s m i t t e r s . A l t h o u g h s o m e a u t h o r s c l a i m a s m a n y a s s i x c r i t e r i a m u s t b e m e t f o r a m o l e c u l e t o b e a n e u r o t r a n s m i t t e r ( P a t o n , 1 9 5 8 ; 1 7 W e r m a n , 1 9 6 6 ; O r r e g o , 1 9 7 9 ) , k n o w n e x c e p t i o n s e x i s t f o r e v e r y c o n d i t i o n e x c e p t t w o : T h e m o l e c u l e m u s t b e r e l e a s e d f r o m n e u r o n s u p o n n e r v e s t i m u l a t i o n , a n d e x o g e n o u s a p p l i c a t i o n o f t h e m o l e c u l e t o e f f e c t o r t i s s u e s m u s t m i m i c t h e e f f e c t s o f n e r v e s t i m u l a t i o n . A l t h o u g h t h e s e c r i t e r i a a p p e a r s i m p l i s t i c , e v e n t o d a y , m a n y n e u r o c h e m i c a l s f o u n d i n e n t e r i c n e u r o n s c a n n o t b e c o n c l u s i v e l y i d e n t i fi e d a s " n e u r o t r a n s m i t t e r " o r a s " n e u r o m o d u l a t o r " . M a n y e x p e r i m e n t a l p a r a d i g m s m a y a l l o w s u b s t a n c e s t o r e a c h s i t e s t h a t a r e n o t a c c e s s i b l e i n p h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n s ( r e v i e w e d i n F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ) . H o w e v e r , a n u m b e r o f m o l e c u l e s h a v e b e e n p o s i t i v e l y i d e n t i fi e d a s n e u r o t r a n s m i t t e r s i n t h e E N S , i n c l u d i n g A C h , N E , N O ( o r a N O - l i k e m o l e c u l e ) , o p i a t e p e p t i d e s , s e r o t o n i n , S P , a n d V I P . C h e m i c a l C o d i n g o f E n t e r i c N e u r o n s A l t h o u g h t h e p r e c e d i n g d i s c u s s i o n o f n e u r o c h e m i s t r y o f e n t e r i c n e u r o n s s u g g e s t s t h a t t h e s e n e u r o n s a r e v e r y c o m p l e x , a s u r p r i s i n g p a t t e r n o f c h e m i c a l c o d i n g h a s e m e r g e d f r o m e a r l y i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t u d i e s b y H o k f e l t e t a l . ( S c h u l t z b e r g e t a l . ( 1 9 8 0 ) ) . T h e s e s t u d i e s u s e d i m m u n o h i s t o c h e m i c a l a n d h i s t o l o g i c a l t e c h n i q u e s t o l o c a l i z e t w o s u b s t a n c e s s i m u l t a n e o u s l y i n t h e s a m e c e l l . H o k f e l t ’ s g r o u p w e r e t h e fi r s t t o r e p o r t t h a t s o m e s u b m u c o s a l n e u r o n s i n r a t a n d g u i n e a p i g c o n t a i n e d s o m a t o s t a t i n a n d c h o l e c y s t o k i n i n , b u t o t h e r s u b m u c o s a l n e u r o n s d i d n o t c o n t a i n e i t h e r n e u r o p e p t i d e . T h i s o b s e r v a t i o n l e d J o h n F u r n e s s , M a r c e l l o C o s t a , a n d c o - w o r k e r s t o f u r t h e r i n v e s t i g a t e t h e p o s s i b i l i t y t h a t e n t e r i c n e u r o n s p o s s e s s e d a c h e m i c a l c o d e , i n w h i c h n e u r o n s c o u l d b e c l a s s i fi e d a c c o r d i n g t o t h e i r n e u r o p e p t i d e a n d a m i n e c o n t e n t . T h e r e s u l t i n g s t u d i e s p e r f o r m e d o v e r t h e n e x t t e n y e a r s i n d i c a t e d t h a t d i s t r i b u t i o n o f d i f f e r e n t p e p t i d e - c o n t a i n i n g n e u r o n s i s d i s t i n c t , a n d t h a t e a c h p e p t i d e o r a m i n e m a y s e r v e a s a m a r k e r f o r 1 8 a d i f f e r e n t f u n c t i o n a l s e t o f n e u r o n s . F o r e x a m p l e , a n a m a z i n g l y s i m p l e p a t t e r n w a s o b s e r v e d i n s u b m u c o s a l g a n g l i a o f g u i n e a p i g , a s a l l s u b m u c o s a l n e u r o n s c o u l d b e p l a c e d i n o n e o f f o u r c a t e g o r i z e s : 4 5 . 3 % o f s u b m u c o s a l n e u r o n s c o n t a i n e d d y n o r p h i n - , g a l a n i n - , a n d V I P - i m m u n o r e a c t i v i t y ( i r ) ; 2 8 . 6 % o f n e u r o n s c o n t a i n e d C h A t - , c h o l e c y s t o k i n i n - , C G R P - , N P Y - , a n d s o m a t o s t a t i n - i r ; 1 0 . 8 % o f n e u r o n s c o n t a i n e d C h A t - a n d S P - i r ; a n d 1 4 . 4 % o f c e l l s c o n t a i n e d C h A t - i r o n l y ( F u r n e s s e t a l . , 1 9 8 4 ; F u r n e s s e t a l . , 1 9 8 5 ; r e v i e w e d i n F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ; r e v i e w e d i n C o s t a e t a l . , 1 9 9 1 ) . I m m u n o h i s t o c h e m i c a l a n d f u n c t i o n a l s t u d i e s h a v e r e v e a l e d t h a t c h e m i c a l c o n t e n t o f s u b m u c o s a l n e u r o n s i s c o r r e l a t e d t o f u n c t i o n s o f n e u r o n s . F o r e x a m p l e , i n g u i n e a p i g i l e u m , d y n o r p h i n - , g a l a n i n - , a n d V I P - i r n e u r o n s a r e t h o u g h t t o m e d i a t e n o n - c h o l i n e r g i c s e c r e t o m o t o r a c t i v i t y a n d m a y m e d i a t e v a s o d i l a t i o n i n s o m e a r t e r i o l e s ( r e v i e w e d i n S u r p r e n a n t , 1 9 9 4 ; b u t s e e G a l l i g a n e t a l . , 1 9 9 0 ) . C h o l i n e r g i c s e c r e t o m o t o r a c t i v i t y i s r e g u l a t e d b y n e u r o n s c o n t a i n i n g C h A T - , c h o l e c y s t o k i n i n - , C G R P - , N P Y - , a n d s o m a t o s t a t i n - 1 r , w h e r e a s c h o l i n e r g i c v a s o d i l a t o r y n e r v e s c o n t a i n C h A t - a n d c a l r e t i n i n - i r ( B r o o k e s e t a l . , 1 9 9 2 ) . F i n a l l y , C h A t - a n d S P - i r c e l l s h a v e b e e n p r o p o s e d t o b e i n t r i n s i c s e n s o r y n e u r o n s ( r e v i e w e d i n F u r n e s s e t a l . , 1 9 8 4 ; F u r n e s s e t a l . , 1 9 8 5 ; F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ; S o n g e t a l . , 1 9 9 2 ) . S u b c l a s s e s o f m y e n t e r i c n e u r o n s m a y a l s o b e c a t e g o r i z e d b y m o r p h o l o g y , i m m u n o h i s t o c h e m i c a l c o n t e n t , t a r g e t s o f i n n e r v a t i o n , a n d p r o p o s e d f u n c t i o n s ( r e v i e w e d i n C o s t a e t a l . , 1 9 8 6 a ; F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ) . M y e n t e r i c n e u r o n s m a y p r o v i d e e x c i t a t o r y o r i n h i b i t o r y i n n e r v a t i o n t o c i r c u l a r o r l o n g i t u d i n a l m u s c l e ( m o t o r n e u r o n s ) , r e c e i v e a n d t r a n s m i t s e n s o r y i n n e r v a t i o n ( i n t r i n s i c s e n s o r y n e u r o n s ) , a n d f u n c t i o n a s i n t e m e u r o n s i n r e fl e x o r e f f e c t o r p a t h w a y s . I m m u n o h i s t o c h e m i s t r y a n d a n a t o m i c a l t r a c i n g 1 9 w i t h D i I , a c a r b o c y a n i n e d y e , h a v e i d e n t i fi e d fi v e m y e n t e r i c p r o j e c t i o n s t o c i r c u l a r m u s c l e : ( i ) l a r g e D o g i e l t y p e I c e l l s c o n t a i n d y n o r p h i n - , g a s t r i n - r e l e a s i n g p e p t i d e - , n e u r o fi l a m e n t ( N F ) p r o t e i n - , a n d V I P - i r ; ( i i ) s m a l l D o g i e l t y p e I c e l l s c o n t a i n d y n o r p h i n - , e n k e p h a l i n , N P Y - , a n d V I P - i r ; ( i i i ) s m a l l n e u r o n s c o n t a i n C h A t - i r ; ( i v ) s m a l l n e u r o n s c o n t a i n C h A t - a n d S P - i r ; a n d ( v ) s m a l l D o g i e l I c e l l s c o n t a i n C h A t - , e n k e p h a l i n , N F - , a n d S P - i r ( B r o o k e s e t a l . , 1 9 9 1 b ) . I n c o n t r a s t , s i m i l a r e x p e r i m e n t s h a v e n o t p r o v i d e d a c l e a r c l a s s i fi c a t i o n s c h e m e f o r i n n e r v a t i o n t o l o n g i t u d i n a l m u s c l e ; h o w e v e r , m o s t n e u r o n s a p p e a r t o c o n t a i n C h A t - i r , a n d 4 7 % o f t h e s e c e l l s c o n t a i n S P - i r ( B r o o k e s e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h e r e i s l i t t l e i n f o r m a t i o n r e g a r d i n g i n t r i n s i c s e n s o r y n e u r o n s , a l t h o u g h m o s t a u t h o r s a g r e e t h a t e n t e r i c s e n s o r y n e u r o n s e x i s t w i t h i n m y e n t e r i c g a n g l i a . A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , D o g i e l ( 1 8 9 9 ) h y p o t h e s i z e d t h a t fi l a m e n t o u s t y p e 1 1 c e l l s f u n c t i o n a s s e n s o r y n e r v e s . T h e m a j o r i t y o f c e l l s w i t h t h i s m o r p h o l o g y c o n t a i n c a l b i n d i n - , s o m a t o s t a t i n - , a n d S P - i r ( C o s t a e t a l . , 1 9 8 6 b ; P o m p o l o a n d F u r n e s s , 1 9 8 8 ; F u r n e s s e t a l . , 1 9 9 0 ) . T h e r e f o r e , t h e d i r e c t i m p l i c a t i o n o f t h e t h e o r y o f c h e m i c a l c o d i n g i s s i m p l y a n e x t e n s i o n o f D o g i e l ’ s w o r k ; n a m e l y , t h a t n e u r o n s w i t h s i m i l a r m o r p h o l o g i e s a n d c h e m i c a l c o n t e n t h a v e s i m i l a r p r o j e c t i o n s a n d m e d i a t e t h e s a m e p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n s . 3 . S O M E F U N C T I O N S O F I N T R I N S I C I N N E R V A T I O N V i s c e r o f u g a l N e u r o n s A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , L a n g l e y ( 1 9 2 1 ) , B a y l i s s a n d S t a r l i n g ( 1 8 9 9 , 1 9 0 0 ) , C a n n o n ( 1 9 0 6 ) , a n d A l v a r e z ( 1 9 4 8 ) w e r e a m o n g t h e fi r s t p h y s i o l o g i s t s t o o b s e r v e t h a t e n t e r i c r e fl e x e s s u c h a s p e r i s t a l s i s a n d t h e v a s o d i l a t o r r e fl e x c o u l d o c c u r i n d e p e n d e n t l y o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n . H o w e v e r , r e m o v a l o f p r e v e r t e b r a l g a n g l i a a b o l i s h e s r e fl e x e s t h a t 2 0 o c c u r o v e r l o n g l e n g t h s o f t h e d i g e s t i v e t r a c t ( K u n t z a n d V a n B u s k i r k , 1 9 4 1 ) , s u g g e s t i n g s e g m e n t s o f t h e G I t r a c t m a y b e i n t e r c o n n e c t e d b y p r o j e c t i o n s b e t w e e n t h e E N S a n d p r e v e r t e b r a l g a n g l i a . F u n c t i o n a l a n d h i s t o l o g i c a l s t u d i e s s u p p o r t t h i s h y p o t h e s i s , a s r e fl e x a c t i v i t y i s o b s e r v e d w h e n t r a n s e c t e d r e g i o n s o f t h e g u t a r e c o n n e c t e d o n l y b y m e s e n t e r y a n d p r e v e r t e b r a l ( c e l i a c ) g a n g l i a ( K u n t z a n d S a c c o m a n n o , 1 9 4 4 ) . F u r t h e r m o r e , n e r v e fi b e r s a r e f o u n d i n d e c e n t r a l i z e d c e l i a c g a n g l i a ( K u n t z , 1 9 3 8 ) , i m p l y i n g p r e v e r t e b r a l g a n g l i a r e c e i v e i n n e r v a t i o n f r o m t h e v i s c e r a . R e t r o g r a d e l a b e l l i n g o f s e g m e n t s o f t h e G I t r a c t w i t h F a s t B l u e h a s p r o v e n t h a t s o m e e n t e r i c n e u r o n s p r o j e c t t o c e l i a c , s u p e r i o r m e s e n t e r i c , o r i n f e r i o r m e s e n t e r i c g a n g l i a ( M e s s e n g e r a n d F u r n e s s 1 9 9 2 ; M e s s e n g e r a n d F u r n e s s , 1 9 9 3 ) . V i s c e r o f u g a l e n t e r i c n e u r o n s a r e f o u n d o n l y i n m y e n t e r i c g a n g l i a , w i t h i n c r e a s i n g d e n s i t y f r o m t h e s t o m a c h t o l a r g e i n t e s t i n e . I t i s i m p e r a t i v e t o n o t e t h a t v e r y f e w n e u r o n s i n t h e i l e u m p r o j e c t t o p r e v e r t e b r a l g a n g l i a , a s i n j e c t i o n o f i n f e r i o r m e s e n t e r i c g a n g l i a d o e s n o t l a b e l m y e n t e r i c n e u r o n s , a n d i n j e c t i o n o f s u p e r i o r m e s e n t e r i c g a n g l i a l a b e l s 0 . 0 2 5 % o f m y e n t e r i c n e u r o n s , w h e r e a s i n j e c t i o n o f c e l i a c g a n g l i a l a b e l s 0 . 1 % o f m y e n t e r i c n e u r o n s . I n t r i n s i c S e n s o r y N e u r o n s A p p r o x i m a t e l y 7 5 % o f i l e a l V i s c e r o f u g a l n e u r o n s h a v e c y t o a r c h i t e c t u r a l p r o p e r t i e s c o n s i s t e n t w i t h D o g i e l t y p e I I n e u r o n s , a s t h e y a p p e a r t o s e n d fi l a m e n t o u s d e n d r i t e s c i r c u m v e n t r a l l y t o w a r d s t h e m u c o s a l s u r f a c e , a n d t h e i r a x o n s p r o j e c t w i t h i n m y e n t e r i c g a n g l i a ( M e s s e n g e r a n d F u r n e s s , 1 9 9 2 ; M e s s e n g e r a n d F u r n e s s , 1 9 9 3 ) . S u c h o b s e r v a t i o n s o f b i p o l a r o r p s e d u o u n i p o l a r e n t e r i c c e l l s r e s u l t e d i n t h e h y p o t h e s i s t h a t t h e s e n e u r o n s r e p r e s e n t i n t r i n s i c s e n s o r y n e u r o n s ( D o g i e l , 1 8 9 9 ) . M u c o s a l d i s t o r t i o n a n d s t r e t c h i n g o f t h e G I t r a c t c a n p r o d u c e p o l a r i z e d r e fl e x e s s u c h a s p e r i s t a l s i s ( Y u a n e t a l . , 1 9 9 1 ) . 2 1 F u r t h e r m o r e , t h e p r e s e n c e o f s u c h r e fl e x e s i n e x t r i n s i c a l l y - d e n e r v a t e d i l e u m s u p p o r t s t h e c o n c l u s i o n t h a t s o m e e n t e r i c n e u r o n s f u n c t i o n a s s e n s o r y c e l l s ( B a y l i s s a n d S t a r l i n g , 1 8 9 9 ; B a y l i s s a n d S t a r l i n g , 1 9 0 0 ; T r e n d e l e n b u r g , 1 9 1 7 ) . A l t h o u g h m o s t r e s e a r c h e r s a g r e e t h a t e n t e r i c s e n s o r y n e u r o n s e x i s t , n o o n e h a s b e e n a b l e t o c o n c l u s i v e l y p r o v e t h e i r l o c a t i o n , c y t o a r c h i t e c t u r e , c h e m i c a l c o m p o s i t i o n , o r e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l p r o p e r t i e s . A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , s i l v e r i m p r e g n a t i o n o r m e t h y l e n e b l u e s t a i n i n g r e v e a l s p s e u d o - u n i p o l a r o r b i p o l a r n e u r o n s i n s u b m u c o s a a n d m y e n t e r i c p l e x u s e s ; t h e s e n e u r o n s a r e p r o p o s e d t o b e s e n s o r y c e l l s ( D o g i e l , 1 8 9 9 ; L a w r e n t j a w , 1 9 3 1 ) . K i r s c h g e s s n e r a n d G e r s h o n ( 1 9 8 8 a ) f o u n d 2 0 - 5 0 % o f a l l s u b m u c o s a l n e u r o n s a n d 2 % o f m y e n t e r i c n e u r o n s i n r a t s m a l l i n t e s t i n e e x p r e s s N - a c e t y l - l a c t o s a m i n e c a r b o h y d r a t e d i f f e r e n t i a t i o n a n t i g e n s . A s t h e s e a n t i g e n s a r e c o m m o n l y f o u n d i n p r i m a r y s e n s o r y n e u r o n s , t h e i r l o c a l i z a t i o n i n s u b m u c o s a l n e u r o n s m a y i n d i c a t e e n t e r i c s e n s o r y n e u r o n s . I n v i t r o f u n c t i o n a l s t u d i e s h a s s u p p o r t e d t h e c o n c l u s i o n t h a t s u b m u c o s a l g a n g l i a c o n t a i n s e n s o r y n e u r o n s , a s m u c o s a l s t i m u l a t i o n i n d u c e s i m m e d i a t e e a r l y g e n e ( I E G ) e x p r e s s i o n i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c n e u r o n s , s u g g e s t i n g s t i m u l u s - i n v o k e d n u c l e a r a c t i v i t y ( K i r s c h g e s s n e r a n d G e r s h o n , 1 9 8 8 a ; H u n t e t a l . , 1 9 8 7 ) . I n t e r e s t i n g l y , t h e g a n g l i o n i c n i c o t i n i c r e c e p t o r ( n A C h ) a n t a g o n i s t h e x a r n e t h o n i u m p r e v e n t e d i n d u c t i o n o f I E G i n m y e n t e r i c n e u r o n s , s u g g e s t i n g s e n s o r y i n f o r m a t i o n i s r e c e i v e d a n d t r a n s m i t t e d b y s u b m u c o s a l n e u r o n s . F i n a l l y , s i m i l a r t o n e u r o n s i n d o r s a l r o o t g a n g l i a ( D R G ) , a s u b s e t o f s u b m u c o s a l n e u r o n s d o n o t a p p e a r t o r e c e i v e s y n a p t i c i n p u t ( S u r p r e n a n t , 1 9 8 4 ) , f u r t h e r i m p l y i n g i n t r i n s i c s e n s o r y c e l l s a r e f o u n d i n s u b m u c o s a l g a n g l i a . H o w e v e r , i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t u d i e s h a v e f o u n d c a l c i u m b i n d i n g p r o t e i n s t y p i c a l o f s e n s o r y n e u r o n s i n b r a i n n u c l e i ( R o g e r s , 1 9 8 9 ; W i n s k y e t a l . , 1 9 8 9 ) , s e n s o r y g a n g l i a ( K u r a m o t o e t a l . , 1 9 9 0 ; R o g e r s , 1 9 8 9 ) , a n d i n D o g i e l t y p e I I 2 2 m y e n t e r i c n e u r o n s ( F u r n e s s e t a l . , 1 9 9 0 ; B r o o k e s e t a l . , 1 9 9 1 b ) . T h e s e d a t a p r o v i d e a t l e a s t p r e l i m i n a r y e v i d e n c e t h a t i n t r i n s i c n e u r o n s m a y b e l o c a t e d i n m y e n t e r i c g a n g l i a , a s w e l l a s s u b m u c o s a l g a n g l i a . C h o l i n e r g i c V a s o d i l a t o r y N e u r o n s N e r v e s t i m u l a t i o n o f e x t r i n s i c n e r v e s p r o d u c e s v a s o d i l a t i o n i n s o m e s e g m e n t s o f t h e G I t r a c t ( D a l e , 1 9 1 3 ; K e w e n t e r , 1 9 6 5 ) . H o w e v e r , t h e fi r s t e v i d e n c e f o r e n t e r i c r e g u l a t i o n o f b l o o d fl o w w a s p r o v i d e d b y B i b e r a n d c o - w o r k e r s ( 1 9 7 1 ) . S t i m u l a t i o n o f i n t r a m u r a l n e r v e s ( B i b e r e t a l . , 1 9 7 3 ) o r m u c o s a o f t h e s m a l l i n t e s t i n e ( B i b e r e t a l . , 1 9 7 3 ) i n c r e a s e d b l o o d fl o w b y 3 0 - 1 5 0 % , e v e n a f t e r e x t r i n s i c n e r v e s h a d b e e n d e s t r o y e d , i n d i c a t i n g t h a t e n t e r i c n e u r o n s m e d i a t e n e r v e - e v o k e d v a s o d i l a t i o n . A l t h o u g h v a s o d i l a t i o n w a s b l o c k e d w h e n t e t r o d o t o x i n ( T T X ) o r l o c a l a n e s t h e t i c s w e r e a p p l i e d t o t h e m u c o s a , v a s o d i l a t i o n r e m a i n e d a f t e r a p p l i c a t i o n o f a - o r B - a d r e n o r e c e p t o r a n t a g o n i s t s o r c h l o r i s o n d a r n i n e , a n A C h r e c e p t o r a n t a g o n i s t . U n f o r t u n a t e l y , t h e i d e n t i t y o f t h e v a s o d i l a t o r s u b s t a n c e a n d t h e o r i g i n o f v a s o d i l a t o r n e u r o n s w e r e n o t i d e n t i fi e d , a s i t w a s a l m o s t i m p o s s i b l e t o s t u d y r e s p o n s e s o f a r t e r i o l e s w i t h o u t s i d e w a l l d i a m e t e r o f l e s s t h a n 1 0 0 u m . A l t h o u g h p a r a s y m p a t h e t i c n e r v e s r e l e a s e A C h t o r e l a x p e r i p h e r a l a r t e r i o l e s , n e i t h e r p h a r m a c o l o g i c a l n o r a n a t o m i c a l s t u d i e s o f e n t e r i c c h o l i n e r g i c i n n e r v a t i o n c o u l d b e p e r f o r m e d o n s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s . U n t i l 1 9 9 3 , i m m u n o h i s t o c h e m i c a l d e m o n s t r a t i o n o f c h o l i n e r g i c i n n e r v a t i o n w a s a l m o s t i m p o s s i b l e , a s v i r t u a l l y a l l a n t i b o d i e s r a i s e d a g a i n s t C h A t d i d n o t r e c o g n i z e a u t o n o m i c c h o l i n e r g i c n e r v e fi b e r s . F u r t h e r m o r e , a l t h o u g h s o m e n e r v e fi b e r s c a n b e f o l l o w e d f o r l o n g d i s t a n c e s a f t e r i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ( d e s c r i b e d i n F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ) , n e r v e s a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s h a v e m u l t i p l e 2 3 c o l l a t e r a l s t h a t c r o s s - o v e r a n d r u n w i t h a r t e r i o l e s i n m u l t i p l e p l a n e s , r e s u l t i n g i n d i f fi c u l t y f o l l o w i n g a s i n g l e n e r v e fi b e r f r o m i t s o r i g i n t o i t s t a r g e t ( B o m s t e i n e t a l . , 1 9 8 7 ; G a l l i g a n e t a l . , 1 9 9 0 ) . A n a t o m i c a l t r a c i n g o f i n n e r v a t i o n t o s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s a l s o p r o v e d t o b e n e a r i m p o s s i b l e , a s r e t r o g r a d e d y e s a r e t a k e n u p b y s y m p a t h e t i c a n d p r i m a r y a f f e r e n t n e r v e s f o u n d i n c l o s e a s s o c i a t i o n w i t h b l o o d v e s s e l s , t h u s l i m i t i n g a v a i l a b i l i t y o f d y e f o r u p t a k e b y v a s o d i l a t o r n e u r o n s . F u r t h e r m o r e , m o s t a n a t o m i c a l t r a c e r s u s e d i n t h e C N S a r e o f l i m i t e d u s e i n t h e E N S , d u e t o d i s t a n c e s b e t w e e n e n p a s s a n t i n n e r v a t i o n a n d s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s o r G 1 s m o o t h m u s c l e . T h e d e v e l o p m e n t o f t h e D i a m t r a k o n - l i n e a r t e r i o l e v i d e o - m o n i t o r i n g s y s t e m ( N e i l d , 1 9 8 9 ) h a s a l l o w e d s m a l l d i a m e t e r r e s i s t a n c e v e s s e l s t o b e s t u d i e d , a n d r e s u l t i n g d a t a h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t s u b m u c o s a l n e u r o n s p r o v i d e c h o l i n e r g i c v a s o d i l a t i o n i n n o r m a l s m a l l i n t e s t i n e . E l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n o f s u b m u c o s a l g a n g l i a o r i n t e r g a n g l i o n i c n e r v e fi b e r s r e s u l t s i n f r e q u e n c y - d e p e n d e n t , T T X - s e n s i t i v e v a s o d i l a t i o n o f p r e c o n s t r i c t e d a r t e r i o l e s ( N e i l d e t a l . , 1 9 9 0 ; G a l l i g a n e t a l . , 1 9 9 0 ; A n d r i a n t s i t o h a i n a a n d S u r p r e n a n t , 1 9 9 2 ) . T h i s v a s o d i l a t i o n i s m e d i a t e d b y s u b m u c o s a l n e u r o n s , a s s u r g i c a l d e s t r u c t i o n o f u n d e r l y i n g m y e n t e r i c p l e x u s a n d e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n d o e s n o t a l t e r t h e a m p l i t u d e o r d u r a t i o n o f v a s o d i l a t i o n ; h o w e v e r , v a s o d i l a t i o n i s e l i m i n a t e d b y d e s t r u c t i o n o f i n t e r g a n g l i o n i c s u b m u c o s a l n e r v e s t r a n d s ( N e i l d e t a l . , 1 9 9 0 ) . V a s o d i l a t i o n i s p o t e n t i a t e d b y a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e i n h i b i t o r s , a n d i s t o t a l l y i n h i b i t e d b y m u s c a r i n i c A C h ( m A C h ) a n t a g o n i s t s . C o n s t r u c t i o n o f a n t a g o n i s t c o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e s r e v e a l s t h a t A C h a c t s t h r o u g h M 3 r e c e p t o r s ( N e i l d e t a l . , 1 9 9 1 ) t h o u g h t t o b e l o c a t e d o n e n d o t h e l i a l c e l l s ( A n d r i a n t s i t o h a i n a a n d S u r p r e n a n t , 1 9 9 2 ) . A c t i v a t i o n o f t h e s e r e c e p t o r s l e a d s t o r e l a x a t i o n o f a r t e r i o l e s v i a r e l e a s e o f N O ( A n d r i a n t s i t o h a i n a a n d S u r p r e n a n t , 1 9 9 2 ; 2 4 S u r p r e n a n t , 1 9 9 4 ) . I m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t u d i e s h a v e i d e n t i fi e d c h o l i n e r g i c n e u r o n s i n s u b m u c o s a l g a n g l i a . A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , C h A T - i r i s f o u n d i n a p p r o x i m a t e l y 5 4 % o f s u b m u c o s a l n e u r o n s ( F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 3 a ; F u r n e s s e t a l . , 1 9 8 4 ; r e v i e w e d i n F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ; S c h e m a n n e t a 1 . , 1 9 9 3 ) , a n d a p p r o x i m a t e l y 2 0 % o f t h e s e c e l l s c o n t a i n c a l r e t i n i n a n d h a v e p r o j e c t i o n s c o n s i s t e n t w i t h v a s o d i l a t o r y n e r v e s ( P o m p o l o a n d F u r n e s s , 1 9 8 8 ) . T h e r e f o r e , a n a t o m i c a l a n d f u n c t i o n a l d a t a p r o v e t h e p r e s e n c e o f e n t e r i c c h o l i n e r g i c v a s o d i l a t o r y n e u r o n s w i t h i n s u b m u c o s a l g a n g l i a . N o n - C h o l i n e r g i c V a s o d i l a t o r y N e u r o n s A l t h o u g h i m m u n o h i s t o c h e m i c a l t e c h n i q u e s h a v e i d e n t i fi e d n o n - c h o l i n e r g i c v a s o d i l a t o r y s u b s t a n c e s i n c l u d i n g V I P a n d C G R P i n s u b m u c o s a l n e u r o n s , a n d e a r l y e x p e r i m e n t s s u g g e s t e d t h e p r e s e n c e o f n o n - c h o l i n e r g i c v a s o d i l a t i o n ( B i b e r e t a l . , 1 9 7 1 ; B i b e r e t a l . , 1 9 7 3 ) , m u s c a r i n i c a n t a g o n i s t s i n h i b i t n e u r o g e n i c v a s o d i l a t i o n s . E x o g e n o u s a p p l i c a t i o n o f V I P o r S P , b u t n o t C G R P , d i l a t e s s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s ( G a l l i g a n e t a l . , 1 9 9 0 ) . H o w e v e r , t h e a c t i o n s o f V I P a r e m e d i a t e d b y V I P — e v o k e d d e p o l a r i z a t i o n s o f c h o l i n e r g i c v a s o m o t o r n e u r o n s ( M i h a r a e t a l . , 1 9 8 5 ; S u r p r e n a n t , 1 9 8 5 ) a s m A C h r e c e p t o r a n t a g o n i s t s s u c h a s p i r e n z e p i n e i n h i b i t r e s p o n s e s t o V I P , a n d c h o l i n e s t e r a s e i n h i b i t o r s s u c h a s e s e r i n e p o t e n t i a t e v a s o d i l a t i o n r e s p o n s e ( G a l l i g a n e t a l . , 1 9 9 0 ) . M u s c a r i n i c r e c e p t o r a n t a g o n i s t s d o n o t a l t e r d i l a t i o n i n r e s p o n s e t o S P , i n d i c a t i n g t a c h y k i n i n ( N K ) r e c e p t o r s a r e p r e s e n t o n s m o o t h m u s c l e c e l l s o f s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s . V a s o c o n s t r i c t o r N e u r o n s A t t h i s t i m e , e v i d e n c e s u g g e s t s t h a t e n t e r i c n e u r o n s d o n o t m e d i a t e v a s o c o n s t r i c t i o n o f a r t e r i o l e s , a s e l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n o f s u b m u c o s a l g a n g l i a d o e s n o t 2 5 e l i c i t v a s o c o n s t r i c t i o n o f s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s i n n o r m a l o r e x t r i n s i c a l l y - d e n e r v a t e d i l e u m ( G a l l i g a n e t a l . , 1 9 9 0 ; r e v i e w e d i n S u r p r e n a n t , 1 9 9 4 ) . C h o l i n e r g i c M o t o r N e u r o n s A n a t o m i c a l a n d f u n c t i o n a l d a t a h a v e p r o v e n t h a t A C h i s p r o d u c e d a n d r e l e a s e d b y e n t e r i c e x c i t a t o r y m o t o r n e u r o n s . A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , m a n y m y e n t e r i c n e u r o n s c o n t a i n C h A t - i r ( F u r n e s s e t a l . , 1 9 8 3 a ; F u r n e s s e t a l . , 1 9 8 4 ; r e v i e w e d i n F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ; S c h e m a n n e t a l . , 1 9 9 3 ) , a n d c h o l i n e r g i c n e u r o n s i n n e r v a t e l o n g i t u d i n a l a n d c i r c u l a r m u s c l e l a y e r s a s r e v e a l e d b y a n a t o m i c a l t r a c i n g t e c h n i q u e s ( B r o o k e s e t a l . , 1 9 9 1 b ; B r o o k e s e t a l . , 1 9 9 2 ) . A c e t y l c h o l i n e p r o d u c t i o n m a y b e a s s a y e d b y m e a s u r i n g o u t fl o w o f [ 3 H ] A C h f r o m [ 3 H ] c h o l i n e - l a b e l l e d t i s s u e s . T h e s e e x p e r i m e n t s d e m o n s t r a t e t h a t m y e n t e r i c g a n g l i a a r e t h e m a j o r s i t e o f A C h s y n t h e s i s , a s l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s ( L M M P P s ) p r o d u c e a p p r o x i m a t e l y 1 0 t i m e s t h a t o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e a l o n e ( S z e r b , 1 9 7 5 ) . F u r t h e r r n o r e , t h i s t e c h n i q u e h a s b e e n u s e d t o v e r i f y r e l e a s e o f A C h f r o m m y e n t e r i c n e r v e s ( D a l e a n d F e l d b e r g , 1 9 3 4 ) , a n d n e r v e - e v o k e d r e l e a s e o f [ 3 H ] A C h ( S z e r b 1 9 7 5 , 1 9 7 6 ) i s i n h i b i t e d b y T T X a n d b o t u l i n u s t o x i n , p r o v i n g e n t e r i c n e u r o n s r e l e a s e A C h . T h e a c t i o n s o f A C h o n c i r c u l a r a n d l o n g i t u d i n a l m u s c l e , a n d t h e c o n t r i b u t i o n o f A C h i n t h e p e r i s t a l t i c r e fl e x h a v e b e e n w e l l - c h a r a c t e r i z e d . D i s t e n s i o n o f s m a l l i n t e s t i n e e l i c i t s a n o r a l l y - d i r e c t e d e x c i t a t o r y r e fl e x t h a t c o n t r a c t s c i r c u l a r m u s c l e ( B a y l i s s a n d S t a r l i n g , 1 8 9 9 ) . E a r l y e x p e r i m e n t s d e m o n s t r a t e d t h a t T T X a n d m A C h r e c e p t o r a n t a g o n i s t s s u c h a s h y o s c i n e ( s c o p o l a m i n e ) i n h i b i t p e r i s t a l s i s ( r e v i e w e d i n K o s t e r l i t z a n d L e e s , 1 9 6 4 ) , a n d t h a t A C h r e l e a s e i s a s s o c i a t e d w i t h p e r i s t a l s i s ( I k e d a e t a l . , 1 9 5 8 ) . H o w e v e r , i t w a s i m p o s s i b l e t o d e t e r m i n e t h e l o c a t i o n o f c h o l i n e r g i c n e u r o n s i n t h e r e fl e x . 2 6 I n 1 9 9 0 T o n i n i a n d C o s t a i n v e n t e d a p a r t i t i o n e d o r g a n b a t h w h i c h a l l o w e d d r u g s t o b e a p p l i e d s p e c i fi c a l l y t o t h e s i t e o f c o n t r a c t i o n ( o r a l s e g m e n t ) , s i t e o f s t i m u l a t i o n ( a b o r a l s e g m e n t ) , o r t o i n t e r m e d i a t e s e g m e n t s o f i s o l a t e d g u i n e a p i g i l e u m . D i s t e n s i o n o f t h e a b o r a l e n d e l i c i t e d r e fl e x c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e i n t h e o r a l s e g m e n t , a n d a p p l i c a t i o n o f m A C H r e c e p t o r a n t a g o n i s t s a p p l i e d t o o r a l o r a b o r a l s e g m e n t s i n h i b i t e d 9 5 % o f r e fl e x c o n t r a c t i o n s ( T o n i n i a n d C o s t a , 1 9 9 0 ) . T h e s e d a t a s u g g e s t t h a t c h o l i n e r g i c i n t e m e u r o n s a t t h e s i t e o f d i s t e n s i o n , a n d m o t o r n e u r o n s i n t h e o r a l s e g m e n t m e d i a t e t h e e x c i t a t o r y p h a s e o f p e r i s t a l s i s . T h i s h y p o t h e s i s i s s t r e n g t h e n e d b y i n v i t r o e x p e r i m e n t s u t i l i z i n g n e r v e - m u s c l e p r e p a r a t i o n s , a s l o w - f r e q u e n c y t r a n s m u r a l s t i m u l a t i o n c o n t r a c t s L M M P P s o r c i r c u l a r m u s c l e m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s ( C M M P P s ) . M u s c a r i n i c r e c e p t o r a n t a g o n i s t s s u c h a s p i p e r a z i n e , a M I r e c e p t o r a n t a g o n i s t , i n h i b i t c o n t r a c t i l e a c t i v i t y ( T o n i n i a n d C o s t a , 1 9 9 0 ) , i n d i c a t i n g A C h a c t s a t m A C h r e c e p t o r s o n G 1 s m o o t h m u s c l e t o p r o d u c e c o n t r a c t i o n s . F u r t h e r m o r e , c o n t r a c t i o n s a r e e n h a n c e d b y a n t i - c h o l i n e s t e r a s e s ( r e v i e w e d i n K o s t e r l i t z a n d L e e s , 1 9 6 4 ) . F i n a l l y , e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l e x p e r i m e n t s d e m o n s t r a t e n e r v e s t i m u l a t i o n i n d u c e s t r a n s i e n t d e p o l a r i z a t i o n s i n s m o o t h m u s c l e c e l l s f r o m c i r c u l a r m u s c l e . T h e s e d e p o l a r i z a t i o n s , o r " e x c i t a t o r y j u n c t i o n p o t e n t i a l s " ( E J P s ) a r e s e n s i t i v e t o m A C h a n t a g o n i s t s ( B e n n e t t a n d B u m s t o c k , 1 9 6 8 ) , p r o v i d i n g a d d i t i o n a l e v i d e n c e t h a t e n t e r i c c h o l i n e r g i c n e u r o n s a c c o u n t f o r t h e m a j o r i t y o f t h e e x c i t a t o r y r e fl e x o f p e r i s t a l s i s . N o n - A d r e n e r g i c N o n - C h o l i n e r g i c E x c i t a t o r y M o t o r N e u r o n s A l t h o u g h h y o s c i n e i n c r e a s e s t h e t h r e s h o l d v a l u e n e c e s s a r y t o t r i g g e r p e r i s t a l s i s , d e c r e a s e s t h e n u m b e r o f c o m p l e t e p e r i s t a l s e s , a n d d e c r e a s e s t h e a m o u n t o f fl u i d e j e c t e d , h y o s c i n e a n d o t h e r m u s c a r i n i c a n t a g o n i s t s a r e u n a b l e t o t o t a l l y p r e v e n t p e r i s t a l t i c a c t i v i t y 2 7 ( T o n i n i e t a l . , 1 9 8 1 ) . T h e s e o b s e r v a t i o n s s u p p o r t K o s t e r l i t z a n d W a t t ’ s ( 1 9 6 3 ) e a r l i e r o b s e r v a t i o n s o f a n o n - c h o l i n e r g i c e x c i t a t o r y c o m p o n e n t o f g r a d e d r e fl e x c o n t r a c t i o n s o f t h e G I t r a c t . F i f t y y e a r s e a r l i e r , V o n E u l e r a n d G a d d t u n ( 1 9 3 1 ) i l l u s t r a t e d t h a t e x t r a c t s m a d e f r o m i n t e s t i n a l t i s s u e c o n t a i n e d a p e p t i d e t h a t c o n t r a c t e d i n t e s t i n a l s m o o t h m u s c l e ( B u r y a n d M a s h f o r d , 1 9 7 7 ) , t h u s i m p l y i n g t h a t a n e x c i t a t o r y p e p t i d e m a y a l s o b e i n v o l v e d i n m e d i a t i o n o f p e r i s t a l s i s . A n a t o m i c a l a n d f u n c t i o n a l s t u d i e s h a v e s u g g e s t e d S P i s a n e x c i t a t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r i n t h e G I t r a c t . S u b s t a n c e P - l i k e i m m u n o r e a c t i v i t y i s l o c a l i z e d i n a x o n s ( N i l s s o n e t a l . , 1 9 7 5 ; r e v i e w e d i n F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ) , a n d n e u r o n s o f s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c p l e x u s e s ( P e a r s e a n d P o l a k , 1 9 7 5 ; r e v i e w e d i n F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ) . E x t r i n s i c d e n e r v a t i o n s o f l o o p s o f i l e u m d o e s n o t a l t e r S P c o n t e n t o f L M M P P s a s m e a s u r e d u s i n g a b i o a s s a y , f u r t h e r s u g g e s t i n g t h a t m o s t S P i s p r o d u c e d b y e n t e r i c n e u r o n s ( F r a n c o e t a l . , 1 9 7 9 b ) . M e a s u r e m e n t s o f S P c o n fi r m e d t h a t m y e n t e r i c g a n g l i a , n o t l o n g i t u d i n a l m u s c l e , a r e t h e s o u r c e o f t h e m a j o r i t y o f S P w i t h i n t h e G I t r a c t ( F r a n c o e t a l . , 1 9 7 9 b ) . B i o a s s a y s ( F r a n c o e t a l . , 1 9 7 9 a , 1 9 7 9 b ) , r a d i o i m m u n o a s s a y s ( B a r o n e t a l . , 1 9 8 3 ; D o n n e r e r e t a l . , 1 9 8 4 ; H o l z e r , 1 9 8 4 ) , a n d r a d i o i m m u n o a s s a y s c o u p l e d t o g e l e x c l u s i o n c h r o m a t o g r a p h y ( H o l z e r , 1 9 8 4 ) , h a v e a l l p r o v e n t h a t t r a n s m u r a l s t i m u l a t i o n o f t h e G I t r a c t o r L M M P P s r e l e a s e s S P f r o m m y e n t e r i c n e u r o n s . F u r t h e r m o r e , S P r e l e a s e i s f r e q u e n c y - d e p e n d e n t , i n h i b i t e d b y T T X a n d r e m o v a l o f c a l c i u m ( C a 2 + ) i o n s , m i m i c k e d b y p o t a s s i u m ( K W - i n d u c e d d e p o l a r i z a t i o n , a n d r e s u l t s i n c o n t r a c t i o n o f i l e a l s m o o t h m u s c l e ( F r a n c o e t a l . , 1 9 7 9 a , 1 9 7 9 b ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t e l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n o f e n t e r i c n e r v e s r e l e a s e s S P . I n c r e a s e d i l e a l i n t r a l u m i n a l p r e s s u r e a l s o r e l e a s e s S P c o n c o m i t a n t t o i n i t i a t i o n o f p e r i s t a l s i s ( D o n n e r e r e t a l . , 1 9 8 4 ) , f u r t h e r 2 8 s u g g e s t i n g t h a t S P m e d i a t e s t h e n o n - c h o l i n e r g i c c o m p o n e n t o f p e r i s t a l s i s . S t u d i e s o f n e r v e - m u s c l e p r e p a r a t i o n s h a v e p r o v e n t h a t S P i s a n e u r o t r a n s m i t t e r i n t h e G I t r a c t . I n t h e p r e s e n c e o f a t r o p i n e o r h y o s c i n e , t r a i n s o f e l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n r e s u l t i n n e u r o g e n i c c o n t r a c t i o n s o f L M M P P s ( A m b a c h e a n d F r e e m a n , 1 9 6 8 ; C o s t a a n d F u r n e s s , 1 9 7 2 ) , a n d c o n t r a c t i o n s a r e m i m i c k e d b y a p p l i c a t i o n o f e x o g e n o u s S P ( B u r y a n d M a s h f o r d , 1 9 7 7 ; r e v i e w e d i n F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ) . N e r v e - a n d S P - e v o k e d c o n t r a c t i o n s a r e a n t a g o n i z e d b y p r i o r e x p o s u r e t o S P ( F r a n c o e t a l . , 1 9 7 9 a , 1 9 7 9 b ) , s u g g e s t i n g d e s e n s i t i z a t i o n o f S P r e c e p t o r s o c c u r . D e v e l o p m e n t o f p e p t i d e a n d n o n - p e p t i d e a n t a g o n i s t s t o S P r e c e p t o r s ( a l s o r e f e r r e d t o a s " t a c h y k i n i n r e c e p t o r s " ( N K r e c e p t o r s ) ) h a s p r o v i d e d f u r t h e r e v i d e n c e f o r S P a s a n e u r o t r a n s m i t t e r t o l o n g i t u d i n a l a n d c i r c u l a r m u s c l e . F o r e x a m p l e , D - A r g ' , D - P r o z , D - T r p 7 ' 9 - S P , L e u l 1 - s u b s t a n c e P , a n d D - P r o z , D - T r p 7 ' 9 , L e u l ' - s u b s t a n c e P a t t e n u a t e n e u r o g e n i c h y o s c i n e - i n s e n s i t i v e c o n t r a c t i o n s o f l o n g i t u d i n a l a n d c i r c u l a r m u s c l e , b u t d o n o t a l t e r h y o s c i n e - s e n s i t i v e r e s p o n s e s ( G i n t z l e r a n d H y d e , 1 9 8 3 ; C o s t a e t a l . , 1 9 8 5 b ) . S i m i l a r l y , t h e n o v e l n o n - p e p t i d e a n t a g o n i s t 2 ( C P 9 6 3 4 5 - 1 ) i n h i b i t s n o n - c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s a s w e l l a s b i n d i n g o f [ 3 H ] S P a t N K l r e c e p t o r s ( S n i d e r e t a l . , 1 9 9 1 ) . A s N K l r e c e p t o r s a r e f o u n d i n h i g h d e n s i t y o n G 1 s m o o t h m u s c l e ( r e v i e w e d i n G e r a r d e t a l . , 1 9 9 3 ) , a n d a p p l i c a t i o n o f S P p r o d u c e s E J P s i n s m o o t h m u s c l e o f t h e i n t e s t i n e ( F u j i s a w a a n d I t o , 1 9 8 2 ) , t h e s e d a t a p r o v i d e s t r o n g e v i d e n c e t h a t S P a c t s o n r e c e p t o r s o n s m o o t h m u s c l e t o p r o d u c e c o n t r a c t i o n s . N e u r o k i n i n r e c e p t o r a n t a g o n i s t s a l s o i n h i b i t h y o s c i n e - r e s i s t a n t e x c i t a t o r y r e fl e x a c t i v i t y i n t h e i n t e s t i n e , b u t d o n o t a l t e r h y o s c i n e - s e n s i t i v e c o n t r a c t i l e a c t i v i t y ( C o s t a e t a l . , 1 9 8 5 c ) , f u r t h e r s t r e n g t h e n i n g t h e c o n c l u s i o n t h a t S P i s a n i m p o r t a n t n e u r o t r a n s m i t t e r i n p e r i s t a l s i s . 2 9 N o n - A d r e n e r g i c N o n - C h o l i n e r g i c I n h i b i t o r y M o t o r N e u r o n s T r a n s m u r a l s t i m u l a t i o n r e l a x e s p r e c o n t r a c t e d L M M P P s i n t h e p r e s e n c e o f m A C h a n t a g o n i s t s ( r e v i e w e d i n F u m e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ) . T h e s e r e l a x a t i o n s a r e n o t m e d i a t e d b y s y m p a t h e t i c n e r v e s , a s t h e y a r e o b s e r v e d f o l l o w i n g d e s t r u c t i o n o f s y m p a t h e t i c n e r v e s ( F u r n e s s , 1 9 6 9 ) o r a f t e r a d d i t i o n o f d i r e c t o r i n d i r e c t - a c t i n g s y m p a t h o l y t i c d r u g s ( B u r n s t o c k e t a l . , 1 9 6 6 ; C a m p b e l l , 1 9 6 6 ) . E l e c t r o p h y s i o l o g i c a l r e c o r d i n g s o f s m o o t h m u s c l e c e l l s r e v e a l t h a t r e l a x a t i o n i s n o t d u e t o i n h i b i t i o n o f r e l e a s e o f e x c i t a t o r y e n t e r i c n e u r o t r a n s m i t t e r s , a s t r a n s m u r a l s t i m u l a t i o n r e s u l t s i n t r a n s i e n t h y p e r p o l a r i z a t i o n o f s m o o t h m u s c l e c e l l s ( B u r n s t o c k e t a l . , 1 9 6 3 ; B u r n s t o c k e t a l . , 1 9 6 6 ; B e n n e t t a n d B u r n s t o c k , 1 9 6 8 ) . H y p e r p o l a r i z a t i o n s , o r " i n h i b i t o r y j u n c t i o n p o t e n t i a l s " ( I J P s ) a r e a l s o r e c o r d e d a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n o r a d d i t i o n o f s y m p a t h o l y t i c d r u g s ( B u r n s t o c k e t a l . , 1 9 6 6 ) , p r o v i n g t h a t e n t e r i c n e u r o n s r e l e a s e a n i n h i b i t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r . T h i s c o n c l u s i o n i s s u p p o r t e d b y i n v i t r o a n d i n v i v o o b s e r v a t i o n s , a s r e l a x a t i o n o f t h e l o w e r e s o p h a g e a l s p h i n c t e r a f t e r s w a l l o w i n g , r e l a x a t i o n o f t h e s t o m a c h d u r i n g e a t i n g , a n d r e l a x a t i o n o f i n t e s t i n e a b o r a l t o a b o l u s d u r i n g p e r i s t a l s i s c a n o c c u r a f t e r l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n ( B a y l i s s a n d S t a r l i n g , 1 8 9 9 , 1 9 0 0 b ; r e v i e w e d i n F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ; r e v i e w e d i n S a n d e r s a n d W a r d , 1 9 9 2 ) . U n t i l r e c e n t l y , t h e i d e n t i t y o f e n t e r i c i n h i b i t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r s w a s n o t k n o w n . E a r l y r e s e a r c h f o c u s e d o n a d e n o s i n e 5 ’ - t 1 i p h o s p h a t e ( A T P ) o r a r e l a t e d p u r i n e c o m p o u n d ( B u r n s t o c k e t a l . , 1 9 7 0 ; B u r n s t o c k 1 9 7 2 ; B u r n s t o c k 1 9 7 5 ) , a s s t i m u l a t i o n o f m y e n t e r i c g a n g l i a r e l e a s e s A T P , a d e n o s i n e d i p h o s p h a t e , a n d a d e n o s i n e m o n o p h o s p h a t e . F u r t h e r - m o r e , a p p l i c a t i o n o f e x o g e n o u s A T P r e l a x e s n u m e r o u s p r e c o n s t r i c t e d s m o o t h m u s c l e p r e p a r a t i o n s f r o m a n u m b e r o f s p e c i e s ( B u r n s t o c k e t a l . , 1 9 7 0 ) . A l t h o u g h t h e s e d a t a 0 3 0 s u g g e s t p u r i n e s m e d i a t e n o n - a d r e n e r g i c , n o n - c h o l i n e r g i c ( N A N C ) r e l a x a t i o n s , t h r e e p i e c e s o f e v i d e n c e p r o v e t h a t a n o t h e r m o l e c u l e m u s t b e i n v o l v e d . F i r s t , m a n y n e r v e s , i n c l u d i n g e x t r i n s i c n e r v e s , r e l e a s e A T P d u r i n g n e u r o t r a n s m i s s i o n , s u g g e s t i n g m o s t n e r v e s m a y n o t s p e c i fi c a l l y r e l e a s e A T P a s a n e u r o t r a n s m i t t e r . S e c o n d l y , h i s t o l o g i c a l t e c h n i q u e s h a v e n o t l o c a l i z e d A T P s t o r e s i n e n t e r i c n e u r o n s w i t h D o g i e l t y p e I m o r p h o l o g y ( r e v i e w e d i n F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ) . H o w e v e r , t h e m o s t d a m a g i n g e v i d e n c e a g a i n s t A T P c o m e s f r o m t h e o b s e r v a t i o n t h a t a n a l o g u e s o f A T P d o n o t r e l a x a n u m b e r o f G I s m o o t h m u s c l e p r e p a r a t i o n s ( C o s t a e t a l . , 1 9 8 6 b ) , s u g g e s t i n g t h a t A T P i s n o t a n i n h i b i t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r i n a l l t i s s u e s . I n t h e 1 9 8 0 5 , v a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p o l y p e p t i d e ( V I P ) w a s h y p o t h e s i z e d t o m e d i a t e r e l a x a t i o n o f G I s m o o t h m u s c l e . U n l i k e A T P , s u i t a b l e i m m u n o h i s t o c h e m i c a l t e c h n i q u e s a l l o w e d f o r v i s u a l i z a t i o n o f V I P , a n d a n t i s e r u m r a i s e d a g a i n s t V I P r e c o g n i z e d a s u b p o p u l a t i o n o f m y e n t e r i c n e u r o n s a n d v a r i c o s e n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h c i r c u l a r a n d l o n g i t u d i n a l m u s c l e l a y e r s ( C o s t a e t a l . , 1 9 8 0 ) . T r a n s m u r a l n e r v e s t i m u l a t i o n r e l e a s e s V I P ( F a h r e n k r u g e t a l . , 1 9 7 8 ) , a n d a p p l i c a t i o n o f e x o g e n o u s V I P r e l a x e s s o m e s m o o t h m u s c l e p r e p a r a t i o n s . H o w e v e r , s o m e G I s m o o t h m u s c l e , s u c h a s i l e a l l o n g i t u d i n a l m u s c l e o f g u i n e a p i g d o e s n o t r e s p o n d t o V I P ( C o s t a e t a l . , 1 9 8 6 b ) , l e a d i n g t o t h e c o n c l u s i o n t h a t V I P i s n o t a n i n h i b i t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r f o r a l l G I s m o o t h m u s c l e . I n 1 9 9 0 , D a v i d B r e d t a n d c o - w o r k e r s d e m o n s t r a t e d t h e p r e s e n t o f n i t r i c o x i d e s y n t h a s e ( N O S ) i n a p o p u l a t i o n o f m y e n t e r i c n e u r o n s f o u n d i n s m a l l i n t e s t i n e o f r a t . A s N O S i s t h e r a t e - l i m i t i n g e n z y m e t h a t d e - i m i d a t e s L - a r g i n i n e t o e q u i r n o l a r c o n c e n t r a t i o n s o f L - c i t r u l l i n e a n d n i t r i c o x i d e ( N O ) ( P a l m e r e t a l . , 1 9 8 8 ; P a l m e r a n d M o n c a d a , 1 9 8 9 ; r e v i e w e d i n M o n c a d a e t a l . , 1 9 9 1 ; S a n d e r s a n d W a r d , 1 9 9 2 ) ( F i g u r e 4 ) , t h i s o b s e r v a t i o n 3 1 s u g g e s t e d t h a t N O i s s y n t h e s i z e d a n d r e l e a s e d f r o m m y e n t e r i c n e u r o n s . N u m e r o u s a n a t o m i c a l s t u d i e s h a v e l o c a l i z e d N O S - i r i n m y e n t e r i c n e u r o n s i n a l l s p e c i e s a n d G I s e g m e n t s e x a m i n e d t o d a t e , i n c l u d i n g g u i n e a p i g s m a l l i n t e s t i n e ( C o s t a e t a l . , 1 9 9 1 ; C o s t a e t a l . , 1 9 9 2 ; Y o u n g e t a l . , 1 9 9 2 ) a n d c o l o n ( M c C o n a l o g u e a n d F u r n e s s , 1 9 9 3 ) , a n d r a t a n t r u m , d u o d e n u m , i l e u m , c a e c u m , p r o x i m a l c o l o n a n d d i s t a l c o l o n ( B e l a i e t a l . , 1 9 9 2 ) . N i t r i c o x i d e s y n t h a s e - i r i s f o u n d i n l a r g e a n d s m a l l D o g i e l I c e l l s l o c a t e d a t t h e p e r i p h e r y o f m y e n t e r i c g a n g l i a , a n d i n s m a l l , o v a l n e u r o n s i n t h e i n t e r i o r o f m y e n t e r i c g a n g l i a , s u g g e s t i n g e n t e r i c m o t o r n e u r o n s a n d i n t e r n e u r o n s c o n t a i n N O S - i r . I m m u n o r e a c t i v i t y i s n o t f o u n d i n n o n - n e u r a l c e l l s , e x c e p t f o r r a r e m u c o s a l e n d o c r i n e c e l l s ( C o s t a e t a l . , 1 9 9 2 ) , b u t n u m e r o u s N O S - i r v a r i c o s e n e r v e fi b e r s a r e f o u n d i n m y e n t e r i c a n d s u b m u c o s a l g a n g l i a , i n t e m o d a l s t r a n d s , s e c o n d a r y a n d t e r t i a r y p l e x u s e s , a n d c i r c u l a r a n d d e e p m u s c u l a r p l e x u s e s a s s o c i a t e d w i t h c i r c u l a r m u s c l e ( C o s t a e t a l . , 1 9 9 2 ) . A l t h o u g h r e t r o g r a d e t r a c i n g e x p e r i m e n t s h a v e n o t b e e n p e r f o r m e d , e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n o f l o o p s o f i l e u m d o e s n o t e l i m i n a t e N O S - i r n e r v e s , p r o v i n g t h e y o r i g i n a t e f r o m e n t e r i c n e u r o n s ( C o s t a e t a l . , 1 9 9 2 ; M c C o n a l o g u e a n d F u m e s s , 1 9 9 3 ) . R e m o v a l o f t h e m y e n t e r i c p l e x u s ( m y e c t o m y ) e l i m i n a t e s N O S - i r n e r v e s i n s u b m u c o s a l g a n g l i a a n d c i r c u l a r m u s c l e , i n d i c a t i n g t h a t N O S - i r n e r v e s o r i g i n a t e f r o m m y e n t e r i c g a n g l i a . F u r t h e r m o r e , m y e c t o m i e s r e s u l t i n a c c u m u l a t i o n o f N O S - i r i n n e r v e s o r a l t o t h e l e s i o n , i m p l y i n g N O S - i r n e r v e s i n n e r v a t e a b o r a l n e u r o n s o r m u s c l e ( C o s t a e t a l . , 1 9 9 2 ; M c C o n a l o g u e a n d F u r n e s s , 1 9 9 3 ) . T h e s e p r o j e c t i o n s a r e c o n s i s t e n t w i t h d a t a f r o m a n a l y s i s o f p e r i s t a l s i s , a s d e s c e n d i n g r e l a x a t i o n p r o c e e d s d i s t e n s i o n o f t h e l u m e n ( B a y l i s s a n d S t a r l i n g , 1 8 9 9 ; B a y l i s s a n d S t a r l i n g , 1 9 0 0 ; C o s t a a n d F u r n e s s , 1 9 7 6 ; F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ) . E x t e n s i v e f u n c t i o n a l s t u d i e s h a v e s u p p o r t e d t h e h y p o t h e s i s t h a t N O i s s y n t h e s i z e d 3 2 a n d r e l e a s e d f r o m m y e n t e r i c n e u r o n s . N i t r i c o x i d e i s r e l e a s e d f r o m e n t e r i c n e r v e s f o l l o w i n g t r a n s m u r a l s t i m u l a t i o n ( B u l t e t a l . , 1 9 9 0 ; W i k l u n d e t a l . , 1 9 9 3 b ; S h u t t l e w o r t h e t a l . , 1 9 9 4 ) , o r a p p l i c a t i o n o f n i c o t i n i c a g o n i s t s ( S h u t t l e w o r t h e t a l . , 1 9 9 4 ) . F u r t h e r m o r e , i n t h e p r e s e n c e o f T T X , a p p l i c a t i o n o f e x o g e n o u s N O o r d r u g s t h a t l i b e r a t e N O - l i k e m o l e c u l e s r e l a x e s o p h a g e a l s p h i n c t e r ( S h i k a n o e t a l . , 1 9 8 8 ) , t a e n i a c o l i ( S h i k a n o e t a l . , 1 9 8 8 ) , d u o d e n u m l o n g i t u d i n a l m u s c l e ( T o d a e t a l . , 1 9 9 0 ) , i l e u m l o n g i t u d i n a l m u s c l e ( T o d a e t a l . , 1 9 9 0 ; O s t h a u s a n d G a l l i g a n , 1 9 9 1 ) , a n d c i r c u l a r m u s c l e ( B o e c k x s t a e n s e t a l . , 1 9 9 0 ) . T h e s e r e l a x a t i o n s m i m i c n e r v e - e v o k e d N A N C r e l a x a t i o n s p r o d u c e d b y t r a n s m u r a l n e r v e s t i m u l a t i o n o f t h e G I t r a c t ( S h u t t l e w o r t h e t a l . , 1 9 9 1 ; O s t h a u s a n d G a l l i g a n , 1 9 9 2 ; r e v i e w e d i n S a n d e r s a n d W a r d , 1 9 9 2 ) , i m p l y i n g t h a t t h e i d e n t i t y o f t h e u n k n o w n i n h i b i t o r y N A N C n e u r o t r a n s m i t t e r i s N O o r a N O - l i k e m o l e c u l e . B i o c h e m i c a l e x p e r i m e n t s h a v e s h o w n t h a t g u a n i d i n e n i t r o g e n a t o m s c a n b e s u b s t i t u t e d w i t h a m e t h y l o r n i t r i l e g r o u p , f o r m i n g N G - m o n o m e t h y l - L - a r g i n i n e ( L M M A ) ( R e s s e t a I . , 1 9 8 9 ) o r N G - n i t r o - L - a r g i n i n e ( L N A ) , r e s p e c t i v e l y . S o m e L - a r g i n i n e a n a l o g s i n c l u d i n g L N A i n h i b i t N O p r o d u c t i o n b y p e r m a n e n t l y b i n d i n g t o , a n d i n h i b i t i n g N O S ( F u r f m e e t a l . , 1 9 9 3 ) ; a l t e r n a t i v e l y , m o s t s u b s t i t u t e d L - a r g i n i n e a n a l o g s a r e c o m p e t i t i v e a n t a g o n i s t s ( F i g u r e 4 ) , t h u s i n h i b i t i n g b i n d i n g o f L - a r g i n i n e t o N O S ( P a l m e r a n d M o n c a d a , 1 9 8 9 ; M a y e r , 1 9 8 9 ; r e v i e w e d i n M o n c a d a , 1 9 9 1 ; r e v i e w e d i n S a n d e r s a n d W a r d , 1 9 9 2 ) . H o w e v e r , N O S a n t a g o n i s t s s u c h a s L M M A d o n o t a f f e c t a r g i n i n e - u t i l i z i n g e n z y m e s s u c h a s a r g i n a s e o r a r g i n i n e d e c a r b o x y l a s e , i n d i c a t i n g s p e c i fi c i t y f o r N O S ( G r a n g e r e t a l . , 1 9 9 0 ) . I n v i t r o p h a r m a c o l o g i c a l e x p e r i m e n t s h a v e f o u n d t h a t a p p l i c a t i o n o f s u b s t i t u t e d L - a r g i n i n e a n a l o g s a t t e n u a t e t r a n s m u r a l n e r v e s t i m u l a t i o n - i n d u c e d n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s o f l o w e r e s o p h a g e a l s p h i n c t e r ( T o t t r u p e t a l . , 1 9 8 6 ) , s t o m a c h 3 3 ( B o e c k x s t a e n s e t a l . , 1 9 9 0 ) , s m a l l i n t e s t i n e ( T o d a e t a l . , 1 9 9 0 ; O s t h a u s a n d G a l l i g a n , 1 9 9 1 ) , a n d c o l o n ( S h u t t l e w o r t h e t a l . , 1 9 9 1 ; H u r n p h r e y s e t a l . , 1 9 9 1 ) . H o w e v e r , t h e s e d r u g s d o n o t a l t e r m u s c l e r e s p o n s i v e n e s s t o m A C h r e c e p t o r a g o n i s t s s u c h a s b e t h a n e c h o l , i n d i c a t i n g t h a t N O S a n t a g o n i s t s d o n o t a f f e c t c o n t r a c t i l e p r o p e r t i e s o f G I s m o o t h m u s c l e . O x y h e m o g l o b i n b i n d s e x t r a c e l l u l a r N O , i n d e p e n d e n t o f N O S ; a s e x p e c t e d , h e m o g l o b i n a t t e n u a t e s N A N C n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s i n t i s s u e s t a k e n f r o m t h e e n t i r e G I t r a c t ( r e v i e w e d i n S a n d e r s a n d W a r d , 1 9 9 2 ) . F i n a l l y , r e m o v a l o f e x t r a c e l l u l a r C a ” e l i m i n a t e s e n z y m e a c t i v i t y ( B r e d t a n d S y n d e r , 1 9 9 0 b ) , a s w e l l a s m u s c l e r e l a x a t i o n ( r e v i e w e d i n F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e d a t a i n d i c a t e N O o r N O S a n t a g o n i s t s i n h i b i t n e r v e - e v o k e d r e l a x a t i o n s , i n d i c a t i n g t h a t N O i s r e l e a s e d f r o m e n t e r i c n e r v e s . A s d i s c u s s e d p r e v i o u s l y , d i s t e n s i o n o f t h e s m a l l i n t e s t i n e s t i m u l a t e s p e r i s t a l s i s , r e s u l t i n g i n r e l a x a t i o n o f a b o r a l i l e m n ( B a y l i s s a n d S t a r l i n g , 1 8 9 9 ; C o s t a a n d F u r n e s s , 1 9 7 6 ) . I n r a t p r o x i m a l c o l o n , n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s a r e n o t a f f e c t e d b y d e s e n s i t i z a t i o n t o A T P o r V I P , b u t a r e i n h i b i t e d b y L N A ( H a t a e t a l . , 1 9 9 0 ) , i n d i c a t i n g N O i s i m p o r t a n t i n p e r i s t a l s i s . F u r t h e r m o r e , N O S a n t a g o n i s t s a l t e r t h r e s h o l d v o l u m e o f i n i t i a t i o n , r a t e o f p r o p u l s i o n o f s o l i d s , a n d r e s u l t s i n d y s c o o r d i n a t i o n o f p e r i s t a l s i s , ( C o s t a e t a l . , 1 9 9 1 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e d a t a p r o v i d e p h y s i o l o g i c a l e v i d e n c e t h a t N O m e d i a t e s a t l e a s t p a r t o f t h e d e s c e n d i n g i n h i b i t o r y r e fl e x d u r i n g p e r i s t a l s i s . E l e c t r o p h y s i o l o g i c a l s t u d i e s h a v e v e r i fi e d t h a t N O , o r a s i m i l a r m o l e c u l e , a c c o u n t s f o r a t l e a s t p a r t o f t h e t r a n s i e n t h y p e r p o l a r i z a t i o n o f s m o o t h m u s c l e c e l l s a s s o c i a t e d w i t h r e l a x a t i o n o f G I s m o o t h m u s c l e . I n c a n i n e d u o d e n u m , a p p l i c a t i o n o f e x o g e n o u s N O o r t h e N O - d o n o r s o d i u m n i t r o p r u s s i d e ( S N P ) h y p e r p o l a r i z e s r e s t i n g m e m b r a n e p o t e n t i a l s i n 3 4 a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r ( S t a r k e t a l . , 1 9 9 3 ) . E x o g e n o u s N O i s u n l i k e l y t o a c t o n m y e n t e r i c n e u r o n s , a s S N P - i n d u c e d I J P s a r e n o t a t t e n u a t e d b y T T X o r l o w C a y - h i g h M g 2 + b u f f e r . F u r t h e r m o r e , L - , b u t n o t D - , a r g i n i n e a n a l o g s , a t t e n u a t e n e r v e - e v o k e d , b u t n o t S N P - i n d u c e d , I J P s . T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t N O S a n t a g o n i s t s d o n o t a c t o n s m o o t h m u s c l e c e l l s . A s p r e d i c t e d , o x y h e m o g l o b i n a n d r e m o v a l o f C a 2 + a t t e n u a t e d n e r v e - a n d S N P - e v o k e d I J P s ( S t a r k e t a l . , 1 9 9 3 ) . T h e r e f o r e , e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l s t u d i e s a g r e e w i t h i n v i t r o f u n c t i o n a l d a t a , a n d p r o v e t h a t N O , o r a N O - l i k e m o l e c u l e , i s a n i m p o r t a n t i n t r i n s i c i n h i b i t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r . H o w e v e r , a l t h o u g h t h e s e d a t a d e m o n s t r a t e t h a t N O m e d i a t e s N A N C r e l a x a t i o n s , i t s h o u l d b e n o t e d t h a t c h a r a c t e r i s t i c s o f a g o n i s t - a n d e l e c t r i c a l fi e l d s t i m u l a t i o n - i n d u c e d I J P s a r e d i s t i n c t , a s h y p e r p o l a r i z a t i o n a n d r e p o l a r i z a t i o n o f n e u r o g e n i c I J P s o c c u r i n h a l f t h e t i m e a s c o m p a r e d t o a g o n i s t - e v o k e d I J P s . F u r t h e r m o r e , a l t h o u g h o x y h e m o g l o b i n a n d L - a r g i n i n e a n a l o g s a t t e n u a t e n e u r o g e n i c N A N C U P S a n d r e l a x a t i o n s o f s m o o t h m u s c l e , t h e y d o n o t t o t a l l y i n h i b i t e i t h e r e v e n t . B i o c h e m i c a l s t u d i e s h a v e p r o v e n L - a r g i n i n e a n a l o g s i n h i b i t N O f o r m a t i o n . T h e r e f o r e , i t i s p r o b a b l e t h a t o t h e r m o l e c u l e s , i n c l u d i n g A T P a n d V I P , a r e i m p o r t a n t i n m e d i a t i o n o f N A N C n e u r o t r a n s n r i s s i o n . C h o l i n e r g i c I n t e r n e u r o n s A n a t o m i c a l t r a c i n g f r o m G I s m o o t h m u s c l e r e v e a l s t h a t m o s t m o t o r n e u r o n s t o c i r c u l a r a n d l o n g i t u d i n a l m u s c l e c o n t a i n A C h . H o w e v e r , m y e n t e r i c i n t e r n e u r o n s a l s o c o n t a i n A C h . A l t h o u g h a n a t o m i c a l s t u d i e s h a v e b e e n d i f fi c u l t d u e t o l i m i t a t i o n s w i t h a n t i s e r u m r a i s e d a g a i n s t C h A t , b o t h B r o o k e s e t a l . ( 1 9 9 2 ) a n d S c h e m a n n e t a l . ( 1 9 9 3 ) i d e n t i fi e d a p o p u l a t i o n o f s m a l l C h A t - i r n e u r o n s . T h e s e n e u r o n s w e r e n o t l a b e l l e d b y r e t r o g r a d e d y e a p p l i e d t o c i r c u l a r o r l o n g i t u d i n a l m u s c l e , f u r t h e r s u g g e s t i n g t h a t s o m e 3 5 n o n - m o t o r m y e n t e r i c n e u r o n s c o n t a i n e d C h A t - i r . S t u d i e s o f r e fl e x a c t i v i t y o f m y e n t e r i c n e u r o n s h a v e p r o v i d e d c o n v i n c i n g e v i d e n c e t h a t A C h i s u s e d i n c o m m u n i c a t i o n b e t w e e n e n t e r i c n e u r o n s . L u m e n a l d i s t e n s i o n e v o k e s a s c e n d i n g c o n t r a c t i l e a c t i v i t y a n d d e s c e n d i n g r e l a x a t i o n s ( B a y l i s s a n d S t a r l i n g , 1 8 9 9 ; B a y l i s s a n d S t a r l i n g , 1 9 0 0 a ; C o s t a a n d F u r n e s s , 1 9 7 6 ) . T h i s r e fl e x a c t i v i t y i n v o l v e s n A C h a n d m A C h r e c e p t o r s , a s h y o s c i n e ( s c o p o l a m i n e ) a n d h e x a m e t h o n i u m i n h i b i t c o n t r a c t i o n s o r a l t o t h e s i t e o f s t i m u l u s ( C o s t a a n d F u r n e s s , 1 9 7 6 ) . H o w e v e r , u n t i l i n v e n t i o n o f p a r t i t i o n e d o r g a n b a t h s , i t w a s i m p o s s i b l e t o d e t e r m i n e t h e a n a t o m i c a l l o c a t i o n a n d r e l a t i v e c o n t r i b u t i o n o f c h o l i n e r g i c i n t e m e u r o n s i n t h e p e r i s t a l t i c r e fl e x . A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , T o n i n i a n d C o s t a ( 1 9 9 0 ) f o u n d t h a t r e fl e x c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e w e r e a n t a g o n i z e d b y h e x a m e t h o n i t u n o r h y o s c i n e a p p l i e d n e a r t h e s i t e o f d i s t e n s i o n . T h e r e f o r e , t h e s e d a t a p r o v i d e i n v i t r o e v i d e n c e o f c h o l i n e r g i c i n t e m e u r o n s n e a r t h e s i t e o f i l e a l d i s t e n s i o n , a s w e l l a s c h o l i n e r g i c n e u r o t r a n s m i s s i o n b e t w e e n e n t e r i c n e u r o n s . E l e c t r o p h y s i o l o g i c a l r e c o r d i n g s f r o m m y e n t e r i c n e u r o n s c o n fi r m t h a t n A C h a n d m A C h r e c e p t o r s a r e l o c a l i z e d o n e n t e r i c n e u r o n s . F o c a l s t i m u l a t i o n o f i n t e r g a n g l i o n i c n e r v e s r e s u l t s i n a n u m b e r o f s y n a p t i c p o t e n t i a l s i n c l u d i n g t r a n s i e n t ( 2 0 m s e c ) d e p o l a r i z a t i o n s o f n e u r o n a l m e m b r a n e s c a l l e d " f a s t e x c i t a t o r y p o s t - s y n a p t i c p o t e n t i a l s " ( f E P S P s ) . M a n y t E P S P s a r e m e d i a t e d b y n A C h r e c e p t o r s , a s n A C h a n t a g o n i s t s s u c h a s t u b o c u r a r i n e a n d h e x a m e t h o n i u m b l o c k n e r v e - e v o k e d f E P S P s ( N i s h i a n d N o r t h , 1 9 7 3 a ) . E x o g e n o u s a p p l i c a t i o n o f A C h f r o m e l e c t r o d e s p l a c e d c l o s e t o c e l l s o m a t a m i m i c f E P S P s ( N i s h i a n d N o r t h , 1 9 7 3 a ; N o r t h e t a l . , 1 9 8 0 ) , a n d t h e s e r e s p o n s e s a r e a l s o a n t a g o n i z e d b y n A C h a n t a g o n i s t s ( N o r t h e t a l . , 1 9 8 0 ) . I n h i b i t i o n o f c h o l i n e s t e r a s e b y p h y s o s t i g m i n e 3 6 p r e v e n t s m e t a b o l i s m o f A C h a n d p r o l o n g s t h e a m p l i t u d e a n d d u r a t i o n o f n e r v e - e v o k e d f E P S P s ( N o r t h a n d N i s h i , 1 9 7 4 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e fi r n c t i o n a l a n d e l e c t r o - p h y s i o l o g i c a l s t u d i e s d e m o n s t r a t e e n t e r i c n e u r o n s r e l e a s e A C h t o a c t i v a t e n A C h r e c e p t o r s o n e n t e r i c n e u r o n s . M u s c a r i n i c r e c e p t o r a n t a g o n i s t s s u c h a s h y o s c i n e a l s o i n h i b i t r e fl e x c o n t r a c t i l e a c t i v i t y ( C o s t a a n d F u r n e s s , 1 9 7 6 ; T o n i n i a n d C o s t a , 1 9 9 0 ) . E l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n o f i n t e r g a n g l i o n i c n e r v e s t r a n d s i n t h e m y e n t e r i c p l e x u s p r o d u c e s d e p o l a r i z a t i o n s o f m y e n t e r i c n e u r o n s c a l l e d " s l o w e x c i t a t o r y p o s t - s y n a p t i c p o t e n t i a l s " ( s E P S P s ) . M a n y s E P S P s a r e a t t e n u a t e d o r a b o l i s h e d b y m u s c a r i n i c a n t a g o n i s t s ( N o r t h a n d T o k i m a s a , 1 9 8 2 ; N o r t h e t a l . , 1 9 8 5 ) , a n d m A C h a g o n i s t s c a n m i m i c s E P S P s i n s o m e c e l l s ( N o r t h e t a l . , 1 9 8 5 ) , p r o v i d i n g f u r t h e r e v i d e n c e f o r c h o l i n e r g i c i n t e m e u r o n s i n t h e E N S . N o n - A d r e n e r g i c N o n - C h o l i n e r g i c I n t e r n e u r o n s M a n y s y n a p t i c e v e n t s i n t h e E N S a r e i n h i b i t e d b y T T X a n d r e m o v a l o f C a 2 + ( W o o d a n d M a y e r , 1 9 7 9 ) , b u t a r e n o t a f f e c t e d b y c h o l i n e r g i c a n t a g o n i s t s s u c h a s h e x a m e t h o n i u m , a t r o p i n e , c u r a r e , o r p h y s o s t i g m i n e . T h e s e s y n a p t i c e v e n t s a r e n o t a f f e c t e d b y d i r e c t - o r i n d i r e c t - a c t i n g s y m p a t h o l y t i c d r u g s , s u g g e s t i n g e n t e r i c i n t e m e u r o n s m a y u s e n e u r o p e p t i d e s o r a m i n e s i n n e u r o t r a n s m i s s i o n ( r e v i e w e d i n F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ) . R e c e n t e x p e r i m e n t s h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t s o m e e n t e r i c n e u r o n s u s e A T P t o m e d i a t e f E P S P s , a s a p p l i c a t i o n o f A T P m i m i c s f E P S P s . F u r t h e r m o r e , s u r a r n i n , a p u r i n e r g i c r e c e p t o r a n t a g o n i s t , a t t e n u a t e s n e r v e - a n d A T P - e v o k e d d e p o l a r i z a t i o n s i n t h e p r e s e n c e o f h e x a m e t h o n i u m ( G a l l i g a n a n d B e r t r a n d , 1 9 9 4 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t A T P m a y b y a n e n t e r i c n e u r o t r a n s m i t t e r , a l t h o u g h f u r t h e r s t u d i e s a r e n e e d e d t o d e t e r m i n e t h e o r i g i n o f p u r i n e r g i c i n n e r v a t i o n . 3 7 E l e c t r o p h y s i o l o g i c a l s t u d i e s h a v e a l s o s u g g e s t e d t h a t S P a n d s e r o t o n i n a r e u s e d i n c o m m u n i c a t i o n b e t w e e n e n t e r i c n e u r o n s . A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , S P - i r i s f o u n d i n m y e n t e r i c n e u r o n s a n d i n b a s k e t - l i k e i n n e r v a t i o n o f s o m e m y e n t e r i c n e u r o n s ( N i l s s o n e t a l . , 1 9 8 0 ; r e v i e w e d i n F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ) , a n d p h y s i o l o g i c a l s t i m u l i r e l e a s e s S P a s m e a s u r e d b y r a d i o i m m u n o a s s a y ( H o l z e r , 1 9 8 4 ) a n d h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( M u r p h y e t a l . , 1 9 8 2 ) . B i n d i n g s t u d i e s ( D r a p e a u e t a l . , 1 9 9 0 ) a n d f u n c t i o n a l s t u d i e s ( F o x a n d D a n i e l , 1 9 8 6 ; K i l b i n g e r e t a l . , 1 9 8 6 ) h a v e s u g g e s t e d N K r e c e p t o r s a r e l o c a t e d o n s o m e e n t e r i c n e u r o n s . A p p l i c a t i o n o f S P f o r s h o r t p e r i o d s o f t i m e t o e n t e r i c n e u r o n s m i m i c s n e u r o g e n i c s E P S P s r e c o r d e d i n m y e n t e r i c n e u r o n s ( K a t a y a m a e t a 1 . , 1 9 7 9 ; J o h n s o n e t a l . , 1 9 8 0 ; J o h n s o n e t a l . , 1 9 8 1 ) . A l t h o u g h a n t a g o n i s t s f o r n e u r o n a l N K r e c e p t o r s h a v e n o t b e e n d e v e l o p e d , c h y m o t r y p s i n h y d r o l y z e s S P , a n d d e c r e a s e s t h e a m p l i t u d e a n d d u r a t i o n o f n e u r o g e n i c a n d a g o n i s t - i n d u c e d s E P S P s ( J o h n s o n e t a l . , 1 9 8 1 ) . T h e r e f o r e , t h e s e d a t a p r o v i d e c o m p e l l i n g e v i d e n c e t h a t S P i s u s e d a s a n e u r o t r a n s m i t t e r b y n o n - m o t o r n e u r o n s . S i m i l a r a n a t o m i c a l a n d f u n c t i o n a l e v i d e n c e a l s o s u g g e s t s t h a t s e r o t o n i n c a n m e d i a t e s o m e s E P S P s ( K a t a y a m a a n d N o r t h , 1 9 7 8 ; W o o d a n d M a y e r , 1 9 7 9 ; r e v i e w e d i n F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ) . 4 . E X T R I N S I C I N N E R V A T I O N O F T H E G A S T R O I N T E S T I N A L T R A C T E x t r i n s i c P a r a v a s c u l a r a n d P e r i v a s c u l a r I n n e r v a t i o n A s n e r v e s o f t h e E N S a r e r e f e r r e d t o a s " i n t r i n s i c " , a l l n e r v e s o r i g i n a t i n g f r o m s o u r c e s l o c a t e d o u t s i d e o f t h e w a l l o f t h e g u t a r e i d e n t i fi e d a s " e x t r i n s i c " . E x t r i n s i c s y m p a t h e t i c , p a r a s y m p a t h e t i c , a n d s e n s o r y ( p r i m a r y a f f e r e n t ) n e r v e s o r i g i n a t e f r o m s o u r c e s l o c a t e d o u t s i d e o f t h e G I t r a c t a n d e n t e r t h e G I t r a c t b y u t i l i z i n g t h e t r a c t p r o v i d e d 3 8 b y s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s ( F i g u r e 3 ) . E x t r i n s i c p a r a v a s c u l a r i n n e r v a t i o n i s o r i e n t a t e d p a r a l l e l t o a r t e r i o l e s , a n d l i e s a l o n g t h e b l o o d v e s s e l s w i t h i n a n d o u t s i d e o f t h e a d v e n t i t i a . T h i s p a r a v a s c u l a r i n n e r v a t i o n m a y t h e n r e m a i n a s s o c i a t e d w i t h t h e a r t e r i o l e s t o r e g u l a t e m i c r o - c i r c u l a t i o n , o r p r o j e c t a w a y f r o m a r t e r i o l e s t o i n n e r v a t e m u c o s a l c r y p t s , e n t e r i c g a n g l i a , a n s s m o o t h m u s c l e . P e r i v a s c u l a r e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n f o r m a c o n t i n u o u s n e t w o r k o f a n a s t o m o s i n g n e r v e fi b e r s t h a t c o m p r i s e t h e p e r i v a s c u l a r p l e x u s f o u n d i n a d v e n t i t i a a n d s u p e r fi c i a l p l a n e o f s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s . T h e s e n e r v e s r e m a i n a s s o c i a t e d w i t h t h e v a s c u l a t u r e t o r e g u l a t e m i c r o c i r c u l a t i o n . A n a t o m y o f E f f e r e n t S y m p a t h e t i c I n n e r v a t i o n T h e a x o n s o f c h o l i n e r g i c s y m p a t h e t i c p r e g a n g l i o n i c c e l l b o d i e s i n t h o r a c i c ( T ) a n d l u m b a r ( L ) i n t e r m e d i o l a t e r a l g r a y m a t t e r o f t h e s p i n a l c o r d e n t e r t h e s p l a n c h n i c n e r v e s , a n d t e r m i n a t e o n n o r a d r e n e r g i c p o s t g a n g l i o n i c p r e v e r t e b r a l c e l i a c , i n f e r i o r m e s e n t e r i c , s u p e r i o r m e s e n t e r i c , a n d p e l v i c g a n g l i a ( L a n g l e y , 1 9 2 1 ; F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 7 4 a ; r e v i e w e d b y S z u r s z e w s k i a n d K i n g , 1 9 8 9 ) . A l t h o u g h v a r i a t i o n s e x i s t a m o n g s p e c i e s , t h e s m a l l i n t e s t i n e i s m a i n l y i n n e r v a t e d b y m e s e n t e r i c g a n g l i a w h i c h r e c e i v e p r e g a n g l i o n i c a x o n s o r i g i n a t i n g f r o m T 9 t o T I O s p i n a l r o o t s ( r e v i e w e d b y R o n a n a n d G o n e l l a , 1 9 8 1 ) . T h e m a j o r i t y o f p o s t g a n g l i o n i c s y m p a t h e t i c n e u r o n s f o u n d i n c e l i a c - m e s e n t e r i c g a n g l i a p r o j e c t v i a s p l a n c h n i c n e r v e s t o t h e s t o m a c h a n d s m a l l i n t e s t i n e a s p e r i v a s c u l a r a n d p a r a v a s c u l a r n e r v e s , a s i n t e r r u p t i o n o f m e s e n t e r i c n e r v e s o r r e m o v a l o f p r e v e r t e b r a l g a n g l i a e l i m i n a t e s s y m p a t h e t i c i n n e r v a t i o n ( F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 7 1 ; F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 7 8 ) . A l t h o u g h m o s t s y m p a t h e t i c i n n e r v a t i o n t o t h e s m a l l i n t e s t i n e o r i g i n a t e s f r o m p r e v e r t e b r a l g a n g l i a , s o m e s y m p a t h e t i c i n n e r v a t i o n o r i g i n a t e s f r o m c e r v i c a l c h a i n g a n g l i a a n d p r o j e c t s w i t h i n v a g a l n e r v e s t o t h e u p p e r s m a l l i n t e s t i n e ( L u n d b e r g e t a l . , 1 9 7 8 ; 3 9 1 fl ‘ V o ’ F i g u r e 3 . E x t r i n s i c a n d i n t r i n s i c i n n e r v a t i o n o f s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s . D r a w i n g o f w h o l e m o u n t p r e p a r a t i o n o f s u b m u c o s a l p l e x u s o f g u i n e a p i g i l e u m . A r t e r i o l e s r e c e i v e p a r a v a s c u l a r a n d p e r i v a s c u l a r i n n e r v a t i o n f r o m e x t r i n s i c s y m p a t h e t i c a n d s e n s o r y n e r v e s , a s w e l l a s n e r v e s f r o m i n t r i n s i c v a s o d i l a t o r y n e u r o n s . C a l i b r a t i o n b a r i s a p p r o x i m a t e l y 2 0 u m . 4 0 M u r y o b a y a s h i e t a l . , 1 9 6 8 ; A h l m a n , 1 9 7 8 ) . E a r l y h i s t o l o g i c a l s t u d i e s u s e d h o t f o r m a l d e h y d e v a p o r s o r g l y o x y l i c a c i d ( G A ) t o i n d u c e fl u o r e s c e n c e o f n e u r o n a l s t o r e s o f c a t e c h o l a m i n e s , r e s u l t i n g i n s t a i n i n g t h a t c o u l d b e v i s u a l i z e d u s i n g fl u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y . M o r e r e c e n t l y , a n t i b o d i e s a g a i n s t T H , t h e r a t e - l i m i t i n g e n z y m e f o r t h e p r o d u c t i o n o f c a t e c h o l a m i n e s , o r d o p a m i n e B - h y d r o x y l a s e , t h e e n z y m e t h a t c a t a l y z e s f o r m a t i o n o f N E f r o m d o p a m i n e ( F u r n e s s e t a l . , 1 9 7 9 ) h a v e b e e n e x t e n s i v e l y u s e d i n a n u m b e r o f p e r i p h e r a l t i s s u e s , i n c l u d i n g t h e G I t r a c t , t o i d e n t i f y s y m p a t h e t i c n e r v e s . H i s t o l o g i c a l a n d i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t u d i e s o f t h e g u t h a v e r e v e a l e d a d e n s e n e t w o r k o f n o r a d r e n e r g i c i n n e r v a t i o n a r o u n d s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s a n d a w e l l - d e v e l o p e d p e r i - n e u r o n a l i n n e r v a t i o n i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c g a n g l i a ( F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 7 5 ) . I n t e r e s t i n g l y , s y m p a t h e t i c i n n e r v a t i o n t o s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s a l s o c o n t a i n s N P Y - i r , a l t h o u g h s y m p a t h e t i c n e r v e s t o e n t e r i c g a n g l i a d o n o t c o n t a i n d e t e c t a b l e N P Y - i r ( E k b l a d e t a l . , 1 9 8 4 ) . T h e a c c o m p a n y i n g v e i n s r e c e i v e l i t t l e s y m p a t h e t i c i n n e r v a t i o n . A l t h o u g h a s p a r s e n e t w o r k o f s y m p a t h e t i c n e r v e s i s f o u n d i n t h e m u c o s a a n d c i r c u l a r m u s c l e , l i t t l e i n n e r v a t i o n i s f o u n d w i t h t h e l o n g i t u d i n a l m u s c l e l a y e r o f t h e s m a l l i n t e s t i n e . N o r a d r e n e r g i c c e l l b o d i e s a r e n o t o b s e r v e d i n s u b m u c o s a l o r m y e n t e r i c g a n g l i a i n a l l r e g i o n s o f t h e G I t r a c t e x c e p t t h e c o l o n ( r e v i e w e d i n F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 7 4 ; F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ) . A n a t o m y o f E f f e r e n t P a r a s y m p a t h e t i c I n n e r v a t i o n C h o l i n e r g i c p a r a s y m p a t h e t i c p r e g a n g l i o n i c c e l l b o d i e s i n t h e r o s t r a l p o r t i o n o f d o r s a l m o t o r n u c l e u s a n d n u c l e u s a m b i g u u s o f t h e m e d u l l a o b l o n g a t a s y n a p s e o n c h o l i n e r g i c c e l l s i n e n t e r i c g a n g l i a a s r e v e a l e d b y r e t r o g r a d e a n d a n t e r o g r a d e t r a c i n g ( S a t o m i e t a l . , 1 9 7 8 ; Z h a n g e t a l . , 1 9 9 1 ) . H o w e v e r , t h e n u c l e a r a m b i g u u s p r o v i d e s o n l y 4 1 a m i n o r i n n e r v a t i o n b e l o w t h e e s o p h a g u s ( K a l i a a n d S u l l i v a n , 1 9 8 2 ) ; t h e r e f o r e , m o s t a n a t o m i c a l t r a c i n g h a s f o c u s e d o n t h e d o r s a l m o t o r n u c l e u s . I n t e r e s t i n g l y , f e w e r t h a n 2 0 , 0 0 0 v a g a l fi b e r s ( a f f e r e n t a n d e f f e r e n t ) p a s s t h r o u g h t h e g u i n e a p i g d i a p h r a g m ( I r w i n , 1 9 3 1 ) , s u g g e s t i n g t h a t m o s t e n t e r i c n e u r o n s a n d e f f e c t o r t i s s u e s d o n o t r e c e i v e p a r a s y m p a t h e t i c i n n e r v a t i o n . T h i s c o n c l u s i o n h a s b e e n s u p p o r t e d b y a n a t o m i c a l t r a c i n g t e c h n i q u e s , f o r i n j e c t i o n o f a n t e r o g r a d e t r a c e r i n t h e d o r s a l m o t o r n u c l e u s o f t h e v a g u s r e s u l t s i n l a b e l l e d n e r v e fi b e r s i n o n l y 3 0 % o f m y e n t e r i c g a n g l i a o f t h e s m a l l i n t e s t i n e . T h e s e r e s u l t s i m p l y t h a t v a g a l n e r v e s m a y e x e r t e f f e c t s b y i n n e r v a t i n g a s m a l l n u m b e r o f c o m m a n d n e u r o n s i n e n t e r i c g a n g l i a ( W o o d , 1 9 8 7 ; K i r c h g e s s n e r a n d G e r s h o n , 1 9 8 9 ) . V a g a l e f f e r e n t n e r v e s a r e n o t f o u n d i n a d v e n t i t i a , m u s c l e l a y e r s , s u b m u c o s a l p l e x u s , o r m u c o s a ( K i r c h g e s s n e r a n d G e r s h o n , 1 9 8 9 ; B e r t h o u d e t a l . , 1 9 9 0 ) . F i n a l l y , v e r y f e w n e r v e fi b e r s i n t h e s m a l l i n t e s t i n e d e g e n e r a t e a f t e r v a g o t o m y ( H o n j i n , 1 9 5 1 ; S t o v i c h e k a n d N i k u l i n , 1 9 7 0 ) , f u r t h e r d e m o n s t r a t i n g t h e p a u c i t y o f i n n e r v a t i o n b y p a r a s y m p a t h e t i c n e r v e s . A l t h o u g h o t h e r o r g a n s o f t h e G I t r a c t r e c e i v e p a r a s y m p a t h e t i c p r e g a n g l i o n i c i n n e r v a t i o n o r i g i n a t i n g f r o m t h e r e t r o f a c i a l n u c l e u s , n u c l e u s r e t r o a r n b i g u u s , a n d / o r l a t e r a l i n t e r m e d i a t e g r a y m a t t e r a n d O n u f ’ s n u c l e u s o f s a c r a l s p i n a l c o r d s e g m e n t s S 1 , 5 ( r e v i e w e d b y G i l l i s e t a l . , 1 9 8 9 ) , a n a t o m i c a l t r a c i n g s t u d i e s h a v e n o t r e v e a l e d s u c h p r o j e c t i o n s t o t h e s m a l l i n t e s t i n e . A l t h o u g h h i s t o l o g i c a l m a r k e r s a r e n o t s p e c i fi c f o r a c e t y l c h o l i n e , a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e h a s b e e n u s e d i n s o m e c e n t r a l t i s s u e s a s a p o t e n t i a l m a r k e r f o r c h o l i n e r g i c c e l l s . H o w e v e r , a s c h o l i n e r g i c a n d n o n - c h o l i n e r g i c p e r i p h e r a l n e r v e s a r e a s s o c i a t e d w i t h a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e , t h e s t a i n i s n o t u s e f u l i n l o c a l i z a t i o n o f c h o l i n e r g i c s o m a t a o r a x o n s ( S i l v e r , 1 9 7 4 ) . A n t i b o d i e s h a v e b e e n r e c e n t l y r a i s e d a g a i n s t c h o l i n e 4 2 a c e t y l t r a n s f e r a s e ( C h A t ) , t h e e n z y m e r e s p o n s i b l e f o r s y n t h e s i s o f A C h ( E c k e n s t e i n e t a l . , 1 9 8 1 ; K i m u r a e t a l . , 1 9 8 0 ) . U n f o r t u n a t e l y , c h o l i n e r g i c i n n e r v a t i o n t o t h e E N S h a s b e e n d i f f i c u l t t o s t u d y u s i n g i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y . A l t h o u g h n e r v e fi b e r s c o n t a i n i n g C h A t - i t h a v e b e e n o b s e r v e d t o b e a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c g a n g l i a ( F u m e s s e t a l . , 1 9 8 3 a ; S c h e m a n n e t a l . , 1 9 9 3 ) , f e w p a r a s y m p a t h e t i c n e r v e fi b e r s d e g e n e r a t e a f t e r v a g o t o m y ( S t o v i c h e k a n d N i k u l i n , 1 9 7 0 ) , i m p l y i n g t h a t t h e C h A t - i r n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h t h e g a n g l i a a r e p r e d o m i n a n t l y f r o m t h e E N S . F u r t h e r m o r e , a l t h o u g h e x t r i n s i c n e r v e s a r e t h o u g h t t o e n t e r t h e w a l l o f t h e G I t r a c t u s i n g a r t e r i o l e s a s t r a c t s , C h A t - i r i s n o t s e e n i n n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h t h e a r t e r i o l e s ( F u r n e s s e t a l . , 1 9 8 3 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e r e i s l i t t l e v a g a l i n n e r v a t i o n t o t h e s m a l l i n t e s t i n e , a n d m o s t c h o l i n e r g i c i n n e r v a t i o n i s f r o m t h e E N S . A n a t o m y o f A f f e r e n t V a g a l I n n e r v a t i o n T h e G I t r a c t r e c e i v e s e x t r i n s i c s e n s o r y i n n e r v a t i o n o r i g i n a t i n g f r o m a u t o n o m i c a n d s o m a t i c n e r v o u s s y s t e m s . P s e u d o - u n i p o l a r s e n s o r y n e u r o n s f o u n d i n n o d o s e ( i n f e r i o r v a g a l ) g a n g l i a s e n d t h e i r c e n t r a l p r o c e s s e s t o t h e n u c l e u s t r a c t u s s o l i t a r i u s o f t h e m e d u l l a , a n d t h e i r p e r i p h e r a l p r o c e s s t o t h e G I t r a c t v i a t h e v a g u s n e r v e , a s r e v e a l e d b y a n a t o m i c a l t r a c i n g . F o r e x a m p l e , a p p l i c a t i o n o f t h e r e t r o g r a d e d y e fl u o r o - g o l d t o t h e s t o m a c h o r t h e p a n c r e a s r e v e a l s s e n s o r y v a g a l n e r v e t e r m i n a l s i n n o d o s e g a n g l i a ( D o c k r a y e t a l . , 1 9 8 9 ) . U n f o r t u n a t e l y , s u c h s t u d i e s h a v e n o t b e e n p e r f o r m e d o n t h e s m a l l i n t e s t i n e . H o w e v e r , s i m i l a r r e s u l t s a r e e x p e c t e d , a s h i s t o l o g i c a l s t u d i e s h a v e r e v e a l e d t h a t 7 0 - 9 0 % o f v a g a l n e r v e fi b e r s a t t h e d i a p h r a g m i c l e v e l a r e u n m y e l i n a t e d a f f e r e n t n e r v e s a n d o n l y 1 0 - 2 0 % o f t h e s e n e r v e s s e r v e a s e f f e r e n t i n n e r v a t i o n ( I r w i n , 1 9 3 1 ; A g o s t i n i e t a l . , 1 9 5 7 , H o f f m a n a n d S c h n i t z l e i n , 1 9 6 1 ; G r u n d y a n d S c r a t c h e r d , 1 9 8 9 ) . 4 3 S y m p a t h e t i c a n d s p i n a l g a n g l i o n i c a f f e r e n t i n n e r v a t i o n c o n t a i n s s p e c i fi c n e u r o c h e n r i c a l m a r k e r s t h u s a l l o w i n g a n a t o m i c a l l o c a l i z a t i o n o f t h e s e n e r v e s . U n f o r t u n a t e l y , i m m u n o h i s t o c h e m i c a l m e t h o d s h a v e n o t r e v e a l e d a n y n e u r o p e p t i d e s t h a t a r e f o u n d e x c l u s i v e l y i n p a r a s y m p a t h e t i c a f f e r e n t n e r v e s . V a g a l a f f e r e n t n e r v e fi b e r s d o n o t c o n t a i n C h A t - i r , b u t i n s o m e r e g i o n s o f t h e g u t s u c h a s t h e s t o m a c h , v a g a l n e r v e s m a y c o n t a i n d e t e c t a b l e l e v e l s o f C G R P - , S P - , a n d / o r V I P - i r ( P e d e r s o n e t a l . , 1 9 8 1 ; R a y b o u l d e t a l . , 1 9 8 9 ) . I t s h o u l d b e n o t e d t h a t t h e s e n e u r o p e p t i d e s a r e a l s o f o u n d i n s p i n a l g a n g l i o n i c a f f e r e n t i n n e r v a t i o n . H o w e v e r , b i l a t e r a l v a g o t o m y d o e s n o t a l t e r C G R P - , S P - , o r V I P - i r i n t h e s m a l l o r l a r g e i n t e s t i n e ( G i b b i n s e t a l . , 1 9 8 5 ; G o e h l e r e t a l . , 1 9 8 8 ; S u e t a l . , 1 9 8 7 ; S t e r n i n i , 1 9 9 1 ) , s u g g e s t i n g a p a u c i t y o f v a g a l a f f e r e n t i n n e r v a t i o n t o t h e i n t e s t i n e . A n a t o m y o f I n n e r v a t i o n f r o m D o r s a l R o o t G a n g l i a S u r g i c a l d e n e r v a t i o n c o m b i n e d w i t h a n a t o m i c a l t r a c i n g t e c h n i q u e s h a v e i n d i c a t e d t h a t t h e m a j o r i t y o f e x t r i n s i c s e n s o r y i n n e r v a t i o n t o t h e G I t r a c t o r i g i n a t e s f r o m s p i n a l s e n s o r y g a n g l i a ( r e v i e w e d b y S t e r n i n i , 1 9 9 3 ) . P s e u d o - u n i p o l a r s e n s o r y n e u r o n s l o c a t e d i n d o r s a l r o o t g a n g l i a ( D R G ) s e n d t h e i r c e n t r a l u n m y e l i n a t e d p r o c e s s e s t o l a m i n a e I a n d V o f t h e d o r s a l h o r n , a n d t h e i r p e r i p h e r a l p r o c e s s e s i n t o s p l a n c h n i c n e r v e s ( G r u n d y a n d S c r a t c h e r d , 1 9 8 9 ) . I t s h o u l d b e n o t e d t h a t t h e s e p r i m a r y s e n s o r y n e r v e s g i v e o f f n u m e r o u s c o l l a t e r a l b r a n c h e s a t p r e v e r t e b r a l g a n g l i a ( L e e e t a l . , 1 9 8 5 ) , t h a t m a y m o d u l a t e t h e e l e c t r i c a l p r o p e r t i e s o f s y m p a t h e t i c p o s t g a n g l i o n i c n e u r o n s ( A l d s k o g i u s e t a l . , 1 9 8 6 ; M a t h e w s e t a l . , 1 9 8 2 ; r e v i e w e d i n E l v i n e t a l . , 1 9 9 3 ) . S p i n a l a f f e r e n t n e r v e s e n t e r t h e w a l l o f t h e g u t a s p e r i v a s c u l a r n e r v e fi b e r s a s r e v e a l e d b y i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ( P a p k a e t a l . , 1 9 8 4 ; G i b b i n s e t a l . , 1 9 8 5 ; U d d m a n e t 4 4 a l . , 1 9 8 6 ) . N e u r o n s i n t h e D R G c o n t a i n a v a r i e t y o f n e u r o p e p t i d e s , i n c l u d i n g C G R P , c h o l e c y s t o k i n i n , d y n o r p h i n , e n k a p h a l i n s , g a l a n i n , s o m a t o s t a t i n , S P , a n d V I P ( r e v i e w e d b y H D o c k r a y e t a l . , 1 9 9 1 ) . H o w e v e r , p r o j e c t i o n s t o t h e G I t r a c t c o n t a i n o n l y t w o o f t h e s e p e p t i d e s , a s S P - i r a n d C G R P - i r a r e a l w a y s f o u n d c o - l o c a l i z e d i n n e r v e fi b e r s o f t h e D R G ( G i b b i n s e t a l . , 1 9 8 5 ) . F u r t h e r m o r e , a p p l i c a t i o n o f t h e r e t r o g r a d e d y e D i I t o t h e s m a l l i n t e s t i n e r e s u l t s i n l a b e l l i n g o f S P - i r / C G R P — i r c e l l s , b u t a l m o s t n o o t h e r c e l l s i n t h e d o r s a l r o o t g a n g l i a l o c a t e d p r i m a r i l y a t T é - L , ( V i c k e r s a n d C o s t a , u n p u b l i s h e d d a t a , i n C o s t a e t a l . , 1 9 9 1 ) . A s d i s c u s s e d p r e v i o u s l y , t h e s e S P / C G R P — i r n e r v e fi b e r s f o r m a p e r i v a s c u l a r p l e x u s , a n d b r a n c h t o i n n e r v a t e s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c g a n g l i a . N e r v e fi b e r s f r o m t h e D R G a r e a l s o f o u n d i n t h e m u c o s a , b u t n o t a s s o c i a t e d w i t h c i r c u l a r o r l o n g i t u d i n a l m u s c l e l a y e r s ( G i b b i n s e t a l . , 1 9 8 5 ; C o s t a e t a l . , 1 9 8 5 ; r e v i e w e d i n S t e r n i n i , 1 9 9 1 ) . 5 . F U N C T I O N S O F E X T R I N S I C I N N E R V A T I O N A n a t o m i c a l e v i d e n c e h a s s h o w n t h a t t h e G I t r a c t r e c e i v e s s y m p a t h e t i c , p a r a s y m p a t h e t i c , a n d p r i m a r y a f f e r e n t i n n e r v a t i o n o r i g i n a t i n g f r o m s o u r c e s l o c a t e d o u t s i d e o f t h e g u t . A l t h o u g h t h e c o n n e c t i n g p a t h w a y s a r e w e l l - u n d e r s t o o d , t h e f u n c t i o n o f m a n y o f t h e s e n e r v e s r e m a i n s a c o n t r o v e r s y e v e n t o d a y . H o w e v e r , a l m o s t a l l i n v e s t i g a t o r s n o w a c c e p t t h a t s y m p a t h e t i c n e r v e s p r o v i d e i n h i b i t o r y i n n e r v a t i o n , w h e r e a s p a r a s y m p a t h e t i c n e r v e s m a y p r o v i d e e x c i t a t o r y a n d i n h i b i t o r y i n n e r v a t i o n t o t h e G I t r a c t . R e g u l a t i o n o f M o t i l i t y b y S y m p a t h e t i c N e r v e s O n e o f t h e fi r s t p h a r m a c o l o g i c a l e x p e r i m e n t s t o e x a m i n e t h e e f f e c t s o f s y m p a t h e t i c n e r v e s t i m u l a t i o n o n t h e G I t r a c t w a s p e r f o r m e d b y L a n g l e y a n d D i c k i n s o n ( 1 8 8 9 ) , a s t h e y d i s c o v e r e d t h a t a p p l i c a t i o n o f n i c o t i n e t o c e l i a c o r m e s e n t e r i c g a n g l i a p r e v e n t e d 4 5 m o t i l i t y o f t h e s t o m a c h . D i r e c t a p p l i c a t i o n o f n i c o t i n e t o s p l a n c h n i c n e r v e s d i d n o t a l t e r m o t i l i t y , t h u s i n d i c a t i n g t h a t n A C h r e c e p t o r s w e r e l o c a t e d o n p o s t g a n g l i o n i c n e u r o n s . S t i m u l a t i o n o f t h o r a c i c p r e - g a n g l i o n i c n e r v e fi b e r s t o s u p e r i o r m e s e n t e r i c g a n g l i a p r o d u c e d i d e n t i c a l r e s u l t s , a s m o t i l i t y o f t h e s m a l l i n t e s t i n e w a s i n h i b i t e d ( L u d w i g , 1 8 5 2 ; P fl fi g e r , 1 8 5 7 ; L i s t e r , 1 8 5 8 ; B a s c h , 1 8 7 3 ; B a y l i s s a n d S t a r l i n g , 1 8 9 9 ) . F u r t h e r m o r e , s t i m u l a t i o n o f m e s e n t e r i c n e r v e s t o a s e g m e n t o f i n t e s t i n e g e n e r a t e d a s u b s t a n c e t h a t r e l a x e d a n u n s t i m u l a t e d p i e c e o f i n t e s t i n e , t h u s p r o v i d i n g t h e fi r s t d e m o n s t r a t i o n o f a n i n t e s t i n a l n e u r o t r a n s m i t t e r . F i n k l e m a n ( 1 9 3 0 ) f o u n d t h a t i n h i b i t i o n o f m o t i l i t y o f i s o l a t e d r a b b i t d u o d e n u m w a s m i m i c k e d b y a p p l i c a t i o n o f e x o g e n o u s e p i n e p h r i n e , a n d b o t h a g o n i s t - a n d n e r v e - m e d i a t e d i n h i b i t i o n o f m o t i l i t y w e r e a t t e n u a t e d b y a d r e n e r g i c a n t a g o n i s t s o r d e s e n s i t i z a t i o n o f t h e m u s c l e . H o w e v e r , i t t o o k a n a d d i t i o n a l t w e n t y y e a r s f o r M a n n a n d W e s t ( 1 9 5 1 ) t o d e d u c e t h a t s y m p a t h e t i c n e r v e s r e l e a s e d p r e d o m i n a n t l y N E , a n d n o t e p i n e p h r i n e . S i m i l a r i n v i v o e x p e r i m e n t s s u g g e s t e d t h a t N E i s c a p a b l e o f i n h i b i t i o n o f c o n t r a c t i o n s m e d i a t e d b y p a r a s y m p a t h e t i c i n n e r v a t i o n , a s v a g a l s t i m u l a t i o n p r o d u c e s c o n t r a c t i o n s o f t h e i l e u m t h a t a r e g r e a t l y r e d u c e d b y s y m p a t h e t i c n e r v e s t i m u l a t i o n . T h i s i n h i b i t i o n o f c o n t r a c t i l e a c t i v i t y i s n o t d u e t o d i r e c t s y m p a t h e t i c i n h i b i t i o n o f v a g a l a c t i v i t y , a s s i m i l a r fi n d i n g s w e r e m a d e f o l l o w i n g c h r o n i c v a g o t o m i e s ( J a n s s o n a n d L i s a n d e r , 1 9 6 9 ) . H o w e v e r , t h e s i t e o f a c t i o n o f N E w a s n o t k n o w n , a l t h o u g h t h e m e c h a n i s m o f a c t i o n o f N E d i d n o t a p p e a r t o b e a t l o n g i t u d i n a l m u s c l e , a s m u s c l e r e s p o n s i v e n e s s t o A C h w a s n o t a l t e r e d b y s t i m u l a t i o n o f s y m p a t h e t i c n e r v e s ( K e r n t e r , 1 9 6 5 ) . T h i s c o n c l u s i o n w a s s u p p o r t e d b y h i s t o l o g i c a l s t u d i e s , a s s y m p a t h e t i c n e r v e s w e r e n o t o b s e r v e d i n t h e m u s c l e l a y e r s o f t h e g u t o f s m a l l m a m m a l s ( N o r b e r g , 1 9 6 4 ; G a b e l l a a n d C o s t a , 1 9 6 7 ; C o s t a a n d 4 6 G a b e l l a , 1 9 7 1 ) . T h e c o n t r o v e r s y r e g a r d i n g t h e s i t e a n d m e c h a n i s m o f a c t i o n o f s y m p a t h e t i c i n n e r v a t i o n w a s a n s w e r e d u s i n g h i s t o l o g y , i n v i t r o m e a s u r e m e n t s o f o u t fl o w o f A C h , a n d e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l t e c h n i q u e s . H i s t o l o g i c a l d e m o n s t r a t i o n o f f o r m a l d e h y d e v a p o r - i n d u c e d fl u o r e s c e n c e o f s y m p a t h e t i c n e r v e fi b e r s p r o v e d t h a t t h e t e r m i n a l a x o n s o f p o s t g a n g l i o n i c s y m p a t h e t i c n e r v e s w e r e f o u n d w i t h i n t h e G I t r a c t ( N o r b e r g , 1 9 6 4 ) . F u r t h e r m o r e , t h e p a t t e r n o f fl u o r e s c e n t n e r v e s w i t h i n m y e n t e r i c g a n g l i a s u g g e s t e d t h a t s y m p a t h e t i c i n h i b i t i o n o f m o t i l i t y o c c u r r e d a t e n t e r i c n e u r o n s , a s m o s t m y e n t e r i c n e u r o n s h a s e n p a s s a n t i n n e r v a t i o n b y n o r a d r e n e r g i c n e r v e fi b e r s ( r e v i e w e d i n L l e w e l l y n - S m i t h e t a l . , 1 9 8 3 ) . T h e s e a n a t o m i c a l d a t a s u p p o r t e d t h e h y p o t h e s i s o f K e r n t e r ( 1 9 6 5 ) , f o r h e s u g g e s t e d t h a t N E a c t e d a t e n t e r i c n e u r o n s a n d n o t o n c i r c u l a r o r l o n g i t u d i n a l m u s c l e s . F u n c t i o n a l e v i d e n c e f o r t h i s h y p o t h e s i s w a s g e n e r a t e d u s i n g e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l s t u d i e s . N e u r o t r a n s m i s s i o n b y i n h i b i t o r y m o t o r n e u r o n s n o r m a l l y r e s u l t s i n h y p e r p o l a r i z a t i o n o f m u s c l e c e l l s , a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y . H o w e v e r , s t i m u l a t i o n o f s y m p a t h e t i c n e r v e s d i d n o t p r o d u c e I J P s , t h u s p r o v i d i n g c o n c l u s i v e e v i d e n c e t h a t G I s m o o t h m u s c l e d o e s n o t r e c e i v e d i r e c t i n n e r v a t i o n f r o m s y m p a t h e t i c n e r v e s . F u r t h e r m o r e , t h i s s t u d y d e m o n s t r a t e d t h a t N E d i d n o t s t i m u l a t e m y e n t e r i c i n h i b i t o r y m o t o r n e u r o n s , a s r e l e a s e o f i n h i b i t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r s w o u l d p r o d u c e I J P s . M e a s u r e m e n t s o f A C h o u t fl o w f r o m p e r f u s e d s e g m e n t s o f i l e u m s u p p p o r t e d K e m t e r ’ s h y p o t h e s i s , a s s t i m u l a t i o n o f s y m p a t h e t i c n e r v e s r e d u c e d A C h r e l e a s e b y a p p r o x i m a t e l y 4 5 % ( V i z i a n d K n o l l , 1 9 7 1 ) . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b t a i n e d i n t i s s u e s i n w h i c h v a g a l i n n e r v a t i o n h a d b e e n d e s t r o y e d . F o r e x a m p l e , f o l l o w i n g e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n o f l o o p s o f i l e u m , a p p l i c a t i o n o f e x o g e n o u s N E s i g n i fi c a n t l y r e d u c e d i n t r i n s i c r e l e a s e o f A C h i n v i t r o ( L e e , 1 9 7 0 ; F u r n e s s a n d B u r n s t o c k , 4 7 1 9 7 5 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e d a t a d e m o n s t r a t e t h a t N E i n h i b i t s e n t e r i c e x c i t a t o r y n e u r o n s . T h e fi n a l s u p p o r t f o r s y m p a t h e t i c i n h i b i t i o n o f e n t e r i c c h o l i n e r g i c n e u r o n s i s o b t a i n e d f r o m e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l s t u d i e s . A p p l i c a t i o n o f e x o g e n o u s N E o r s t i m u l a t i o n o f m e s e n t e r i c n e r v e fi b e r s a t d i d n o t a f f e c t m e m b r a n e p r o p e r t i e s o f m y e n t e r i c n e u r o n s ( H i r s t a n d M c K i r d y , 1 9 7 4 ; N i s h i a n d N o r t h , 1 9 7 3 b ) . H o w e v e r , s t i m u l a t i o n o f s y m p a t h e t i c i n n e r v a t i o n r e s u l t e d i n p r e - s y n a p t i c i n h i b i t i o n o f c h o l i n e r g i c n e u r o t r a n s r r r i s s i o n ( H i r s t a n d M c K i r d y , 1 9 7 4 ) , t h a t w a s s h o w n t o b e m e d i a t e d b y a z - a d r e n e r g i c r e c e p t o r s ( D r e w , 1 9 7 8 ; F r i g o e t a l . , 1 9 8 4 ) . T h e r e f o r e , s y m p a t h e t i c n e r v e s i n h i b i t e x c i t a t o r y m y e n t e r i c n e u r o n s , r e s u l t i n g i n d e c r e a s e d m o t i l i t y o f G I s m o o t h m u s c l e . R e g u l a t i o n o f B l o o d F l o w b y S y m p a t h e t i c N e r v e s S y m p a t h e t i c i n n e r v a t i o n p r o v i d e s e x t r i n s i c r e g u l a t i o n o f b l o o d fl o w t h r o u g h t h e m i c r o v a s c u l a t u r e o f t h e G I t r a c t . N o r m a l l y , m e s e n t e r i c a n d s p l a n c h n i c v e s s e l s c o n t a i n a p p r o x i m a t e l y 2 5 - 3 0 % o f t h e t o t a l b l o o d v o l u m e o f t h e b o d y ( L a c r o i x , 1 9 6 0 ) , a n d i n t e s t i n a l m u c o s a h a s t h e h i g h e s t v a s c u l a r p e r f u s i o n o f a n y p e r i p h e r a l t i s s u e i n t h e b o d y . P e r f u s i o n o f t h e m u c o s a a l l o w s f o r s e c r e t o r y a n d a b s o r p t i v e p r o c e s s e s t o o c c u r . T h e s e p r o c e s s e s a r e p a r t i a l l y m e d i a t e d b y e x t r i n s i c s y m p a t h e t i c n e r v e s t h a t m e d i a t e v a s o c o n s t r i c t i o n o f r e s i s t a n c e v e s s e l s o f t h e G I t r a c t . D a l e ( 1 9 1 3 ) r e p o r t e d t h a t s t i m u l a t i o n o f s y m p a t h e t i c n e r v e s c o n s t r i c t e d a r t e r i o l e s , a n d a , a d r e n e r g i c r e c e p t o r a n t a g o n i s t s a n d i n d i r e c t s y m p a t h o l y t i c d r u g s a t t e n u a t e d o r i n h i b i t e d n e u r o g e n i c v a s o c o n s t r i c t i o n s . H o w e v e r , i n a n u m b e r o f s p e c i e s , s t i m u l a t i o n o f e x t r i n s i c n e r v e s r e s u l t s i n E J P s i n s m o o t h m u s c l e c e l l s a n d c o r r e s p o n d i n g v a s o c o n s t r i c t i o n s w h i c h a r e i n s e n s i t i v e t o a . a d r e n e r g i c r e c e p t o r a n t a g o n i s t s a n d c a t e c h o l a m i n e - d e p l e t i o n b y r e s e r p i n e ( E v a n s a n d S u r p r e n a n t , 1 9 9 2 ) . H o w e v e r , v a s o c o n s t r i c t i o n i s d e p e n d e n t o n e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n , a s 4 8 d e s t r u c t i o n o f s y m p a t h e t i c n e r v e s e l i m i n a t e s v a s o c o n s t r i c t i o n s . I n a d d i t i o n t o N E , s y m p a t h e t i c n e r v e s a l s o c o n t a i n a n d r e l e a s e A T P o r a r e l a t e d m o l e c u l e , a s a c t i v a t i o n o f P 2 " p u r i n o r e c e p t o r s c o n s t r i c t s s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s ( E v a n s a n d S u p r e n a n t , 1 9 9 2 ) . A l t h o u g h s y m p a t h e t i c p o s t g a n g l i o n i c c e l l b o d i e s w i t h i n c e l i a c g a n g l i a c o n t a i n N P Y , a p o t e n t v a s o c o n s t r i c t o r ( E d v i s s o n e t a l . , 1 9 8 4 ; r e v i e w e d i n F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ) , a p h y s i o l o g i c a l r o l e f o r N P Y i n c o n t r o l o f m e s e n t e r i c b l o o d fl o w h a s n o t b e e n f o u n d . R e g u l a t i o n o f M o t i l i t y b y E f f e r e n t V a g a l N e r v e s A l t h o u g h n e r v e s t i m u l a t i o n o f t h e s y m p a t h e t i c n e r v o u s s y s t e m p r o d u c e s c l e a r i n h i b i t i o n o f m o t i l i t y o f t h e G I t r a c t , a n d t r a n s e c t i o n o f s p l a n c h n i c n e r v e s r e s u l t s i n a m a r k e d i n c r e a s e i n i n t e s t i n a l m o t i l i t y ( B a y l i s s a n d S t a r l i n g , 1 8 9 9 ) c o n fl i c t i n g d a t a h a s r e s u l t e d f r o m i n v i v o s t u d i e s o f p a r a s y m p a t h e t i c i n n e r v a t i o n . F o r e x a m p l e , B a y l i s s a n d S t a r l i n g ( 1 8 9 9 ) a n d v a n H a r n ( 1 9 6 3 ) o b s e r v e d i n c r e a s e d i l e a l m o t o r a c t i v i t y f o l l o w i n g v a g a l s t i m u l a t i o n i n m a n y a n i m a l s . H o w e v e r , t h e s e a u t h o r s a l s o o b s e r v e d t h a t i d e n t i c a l s t i m u l a t i o n o f v a g a l n e r v e s c o u l d s t i m u l a t e a n d i n h i b i t m o t i l i t y , o r o n l y i n h i b i t i n t e s t i n a l m o t i l i t y . S u c h r e s u l t s l e d B a y l i s s a n d S t a r l i n g t o c o n c l u d e v a g a l n e r v e s c o n t a i n b o t h e x c i t a t o r y a n d i n h i b i t o r y e f f e r e n t i n n e r v a t i o n . H o w e v e r , v a g a l e x c i t a t o r y a n d i n h i b i t o r y i n n e r v a t i o n a p p e a r e d t o e x h i b i t u n i q u e s t i m u l a t i o n r e q u i r e m e n t s a n d l a t e n c y o f a c t i v a t i o n , a s e x c i t a t o r y r e s p o n s e s a l w a y s o c c u r r e d w i t h i n t w o s e c o n d s o f n e r v e s t i m u l a t i o n , w h e r e a s i n h i b i t o r y e v e n t s d e v e l o p e d t w e n t y t o t h i r t y s e c o n d s a f t e r n e r v e s t i m u l a t i o n . A n a l t e r n a t i v e e x p l a n a t i o n o f t h e o b s e r v e d m i x e d m o t o r a c t i v i t y f o l l o w i n g v a g a l s t i m u l a t i o n w a s p r o v i d e d b y K e w e n t e r ( 1 9 6 5 ) . H e n o t e d t h e d i f f e r e n c e s i n t i m e o f o n s e t o f e x c i t a t o r y a n d i n h i b i t o r y e f f e c t s , a n d h y p o t h e s i z e d t h a t i n h i b i t i o n o f m o t i l i t y f o l l o w i n g v a g a l s t i m u l a t i o n r e s u l t e d f r o m r e fl e x a c t i v a t i o n o f s y m p a t h e t i c i n n e r v a t i o n . A c t i v a t i o n o f v a g a l 4 9 n e r v e s w o u l d d e c r e a s e s y s t e m i c b l o o d p r e s s u r e , a n d a c t i v a t e b a r o r e c e p t o r r e fl e x e s , t h u s i n c r e a s i n g s y m p a t h e t i c n e r v e a c t i v i t y . I n c r e a s e d s y m p a t h e t i c o u t fl o w w o u l d t h e n i n h i b i t m o t i l i t y b y a c t i v a t i n g 0 1 2 a d r e n o r e c e p t o r s a s d i s c u s s e d p r e v i o u s l y . F u r t h e r m o r e , i n c r e a s e d s y m p a t h e t i c n e r v e o u t fl o w s t i m u l a t e s t h e m e d u l l a r y r e g i o n o f a d r e n a l g l a n d s , r e s u l t i n g i n i n c r e a s e d c o n c e n t r a t i o n s o f c i r c u l a t i n g c a t e c h o l a m i n e s . T h e r e f o r e , c i r c u l a t i n g N E w o u l d t h e n a c t t o i n h i b i t m o t i l i t y a t n o n - i n n e r v a t e d a d r e n e r g i c r e c e p t o r s o n s m o o t h m u s c l e . I n v i v o s t i m u l a t i o n o f d i s t a l p r o c e s s e s o f v a g a l i n n e r v a t i o n i n a d r e n a l e c t o m i z e d a n i m a l s f a i l e d t o p r o d u c e i n h i b i t i o n o f m o t o r a c t i v i t y ( K e w e n t e r , 1 9 6 5 ) , t h u s s u p p o r t i n g t h i s h y p o t h e s i s . F i n a l l y , i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f a t r o p i n e , a m A C h r e c e p t o r a n t a g o n i s t p r i o r o r d u r i n g v a g a l s t i m u l a t i o n i n n o r m a l a n i m a l s r e s u l t e d i n o n l y i n c r e a s e d m o t o r a c t i v i t y o f t h e i n t e s t i n e ( K e w e n t e r , 1 9 6 5 ) , f u r t h e r s u g g e s t i n g t h a t p a r a s y m p a t h e t i c e f f e r e n t i n n e r v a t i o n p r o v i d e d o n l y e x c i t a t o r y i n n e r v a t i o n t o t h e G I t r a c t . K e w e n t e r ’ s c o n c l u s i o n s g e n e r a t e d a g r e a t d e a l o f c o n t r o v e r s y o v e r t h e i d e n t i t y o f p a r a s y m p a t h e t i c n e u r o t r a n s m i t t e r s , a s w e l l a s t h e p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n s o f v a g u s n e r v e s . C l o s e r e x a m i n a t i o n o f t h e e a r l y i n v i v o w o r k r e v e a l e d t h a t u s e o f a n e s t h e t i z a t i o n , s i t e o f v a g a l n e r v e s t i m u l a t i o n , a n d s t i m u l u s p a r a m e t e r s f o r n e r v e s t i m u l a t i o n c o u l d a l l a l t e r r e s p o n s e s t o v a g a l n e r v e s t i m u l a t i o n . F o r e x a m p l e , s i n g l e - s h o c k s t i m u l a t i o n o f v a g a l n e r v e - e n d i n g s d i d n o t a l t e r i n t e s t i n a l m o t i l i t y ( r e v i e w e d i n R o n a n a n d G o n e l l a , 1 9 8 1 ) . H o w e v e r , v a g a l s t i m u l a t i o n w i t h t r a i n s o f p u l s e s i n d u c e d c o n t r a c t i o n s a n d e n h a n c e d a m p l i t u d e a n d d u r a t i o n o f p r e - e x i s t i n g c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r a n d l o n g i t u d i n a l m u s c l e ( G o n e l l a , 1 9 6 4 ; R o n a n a n d G o n e l l a , 1 9 8 1 ) . F u r t h e r m o r e , t h e s e e f f e c t s w e r e a n t a g o n i z e d b y a t r o p i n e ( F u k u d a , 1 9 6 8 ) , s u g g e s t i n g v a g a l s t i m u l a t i o n r e l e a s e d A C h . I n t e r e s t i n g l y , u n l i k e K e w e n t e r ’ s ( 1 9 6 5 ) s t u d y , o t h e r i n v e s t i g a t o r s d e m o n s t r a t e d t h a t a d d i t i o n o f a t r o p i n e 5 0 ( F u k u d a , 1 9 6 8 ) o r h i g h f r e q u e n c y v a g a l s t i m u l a t i o n ( r e v i e w e d b y R o n a n a n d G o n e l l a , 1 9 8 1 ) r e l a x e d G I s m o o t h m u s c l e . A l t h o u g h t h e r e a r e m a n y i n t e r p r e t a t i o n s o f t h e s e d a t a , v a g a l p a r a s y m p a t h e t i c p o s t g a n g l i o n i c c h o l i n e r g i c n e r v e s f o r m e x c i t a t o r y s y n a p s e s o n e n t e r i c e x c i t a t o r y n e u r o n s ( C a m p b e l l 1 9 6 6 , 1 9 7 0 ; M a r t i n s o n , 1 9 6 5 ) . H i g h f r e q u e n c y v a g a l s t i m u l a t i o n m a y r e l e a s e a d e n o s i n e ( B u r n s t o c k , 1 9 7 2 ; B u r n s t o c k , 1 9 7 5 ) , N O ( T o t t r u p e t a l . , 1 9 8 1 ) , s e r o t o n i n ( W o o d , 1 9 8 1 ) , o r V I P ( r e v i e w e d i n F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ) f r o m m y e n t e r i c n e u r o n s , r e s u l t i n g i n r e l a x a t i o n o f c i r c u l a r a n d l o n g i t u d i n a l m u s c l e . I f v a g a l e f f e r e n t s i n n e r v a t e G I t i s s u e , t h e n t r a n s e c t i o n o f v a g a l n e r v e s w o u l d b e e x p e c t e d t o d e c r e a s e a c t i v i t y o f G I s m o o t h m u s c l e . H o w e v e r , K e w e n t e r ( 1 9 6 5 ) o b s e r v e d o n l y m i n o r c h a n g e s i n i n t e s t i n a l b a s a l t o n e a n d m o t i l i t y a f t e r v a g a l s e c t i o n , s u g g e s t i n g t h a t p a r a s y m p a t h e t i c n e r v e s a r e n o r m a l l y n o t a c t i v e . A n a l t e r n a t i v e h y p o t h e s i s h a s r e s u l t e d f r o m r e c e n t d e v e l o p m e n t o f a n a t o m i c a l t r a c i n g t e c h n i q u e s . U s e o f t h e a n t e r o g r a d e t r a c e r D i I h a s i l l u s t r a t e d t h a t c h o l i n e r g i c p a r a s y m p a t h e t i c p r e - g a n g l i o n i c p a r a s y m p a t h e t i c n e r v e s f r o m d o r s a l m o t o r n u c l e i p r o v i d e p e n - n e u r o n a l i n n e r v a t i o n t o a d r e n e r g i c p o s t - g a n g l i o n i c n e u r o n s i n t h e c e l i a c a n d s u p e r i o r m e s e n t e r i c g a n g l i a ( B e r t h o u d a n d P o w l e y , 1 9 9 3 ) . A l t h o u g h t h e f u n c t i o n i s n o t k n o w n , i t h a s b e e n h y p o t h e s i z e d t h a t t h i s i n n e r v a t i o n a l l o w s v a g a l i n fl u e n c e o n G 1 m o t i l i t y w i t h o u t r e q u i r i n g a c t u a l v a g a l i n n e r v a t i o n w i t h i n t h e G I t r a c t . T h e r e f o r e , i f t h i s h y p o t h e s i s i s c o r r e c t , s e c t i o n i n g o f t h e v a g u s d u r i n g a p e r i o d o f s y m p a t h e t i c n e r v e q u i e s c e n c e w o u l d n o t a l t e r t h e b a s i c p a t t e r n o f m o t i l i t y , a s t h i s m o t o r a c t i v i t y w o u l d b e p r e d o m i n a n t l y c o n t r o l l e d b y t h e i n t r i n s i c r h y t h m o f G I s m o o t h m u s c l e a n d e n t e r i c n e u r o n s . H o w e v e r , d u r i n g s y m p a t h e t i c n e r v e a c t i v i t y , s t i m u l a t i o n o f p a r a s y m p a t h e t i c n e r v e s w o u l d i n c r e a s e a c t i v i t y o f t h e i l e u m . T h i s p o t e n t i a l e x p l a n a t i o n w o u l d a l s o e x p l a i n t h e s e e m i n g n e g a t i v e d a t a o f s u c h i n v e s t i g a t o r s a s K e w e n t e r , B a y l i s s 5 1 a n d S t a r l i n g ( 1 9 0 1 ) , a n d A l v a r e z ( 1 9 2 9 ) , i n t h a t s e c t i o n o f t h e p a r a s y m p a t h e t i c n e r v e s d i d n o t a l t e r G I m o t i l i t y o f t h e i n t e s t i n e . T h e r e f o r e , a l t h o u g h f e w p a r a s y m p a t h e t i c n e r v e s a r e f o u n d w i t h i n t h e s a m l l i n t e s t i n e , v a g a l n e r v e s m a y i n fl u e n c e a c t i v i t y o f e n t e r i c a n d p o s t g a n g l i o n i c s y m p a t h e t i c n e u r o n s . H o w e v e r , t h e p h y s i o l o g i c a l e f f e c t s o f p a r a s y m p a t h e t i c n e r v e a c t i v i t y m a y b e m e d i a t e d b y s y m p a t h e t i c t o n e t o t h e G I t r a c t . l v e s t i g a t o r s s u c h a s B a y l i s s a n d S t a r l i n g ( 1 9 0 1 ) a n d A l v a r e z ( 1 9 2 9 ) f o u n d i t d i f fi c u l t t o s t u d y v a g a l l y - m e d i a t e d m o t o r r e s p o n s e s i n p r o x i m a l a n d d i s t a l s m a l l i n t e s t i n e i n t h e p r e s e n c e o f s y m p a t h e t i c i n n e r v a t i o n . I n v i v o s t u d i e s b y K e w e n t e r ( 1 9 6 5 ) f o u n d e l e v a t e d b a s a l s y m p a t h e t i c n e r v e a c t i v i t y i n G I t i s s u e s u n r e s p o n s i v e t o v a g a l n e r v e s t i m u l a t i o n . G r e a t e r f r e q u e n c y s t i m u l a t i o n o f s y m p a t h e t i c n e r v e s w a s n e c e s s a r y t o i n h i b i t m o t i l i t y o f G I s m o o t h m s u c l e i n t i s s u e s s e n s i t i v e t o v a g a l n e r v e s t i m u l a t i o n , a s c o m p a r e d t o t i s s u e s w h i c h w e r e u n r e s p o n s i v e t o v a g a l n e r v e s t i m u l a t i o n ( K e w e n t e r , 1 9 6 5 ) . I n t r a v e n o u s i n j e c t i o n s o f g u a n e t h i d i n e a n d e r g o t a m i n e c o n fi r m e d t h e s e o b s e r v a t i o n s , a s r e g i o n s o f t h e G I t r a c t w h i c h w e r e s e n s i t i v e t o p a r a s y m p a t h e t i c n e r v e s t i m u l a t i o n w e r e n o t a f f e c t e d b y i n d i r e c t - a c t i n g s y m p a t h o l y t i c d r u g s . F i n a l l y , a p p l i c a t i o n o f e x o g e n o u s g u a n e t h i d i n e p o t e n t i a t e d v a g a l l y - m e d i a t e d m o t o r r e s p o n s e s . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e d a t a s u g g e s t t h a t s y m p a t h e t i c i n n e r v a t i o n p r o v i d e s p h y s i o l o g i c a l a n t a g o n i s m o f p a r a s y m p a t h e t i c i n n e r v a t i o n o f t h e G I t r a c t . T h e r e f o r e , v a g a l t o n e m a y n o t b e o b s e r v e d u n d e r n o r m a l c o n d i t i o n s d u e t o s t r o n g t o n i c s y m p a t h e t i c i n h i b i t i o n t o s o m e r e g i o n s o f s m a l l i n t e s t i n e . R e g u l a t i o n o f B l o o d F l o w b y E f f e r e n t V a g a l N e r v e s A l t h o u g h S i r H e n r y D a l e ( 1 9 1 3 ) d e m o n s t r a t e d t h a t a u t o n o m i c n e r v e s t o t h e G I t r a c t r e l e a s e a v a s o d i l a t o r y s u b s t a n c e , u n t i l r e c e n t l y i t w a s i m p o s s i b l e t o s t u d y i n n e r v a t i o n 5 2 o f s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s , a s c h a n g e s i n a r t e r i o l a r d i a m e t e r c o u l d n o t b e m o n i t o r e d . I n o t h e r p e r i p h e r a l t i s s u e s , s t i m u l a t i o n o f p a r a s y m p a t h e t i c n e r v e s r e l a x e d r e s i s t a n c e v e s s e l s w i t h i n t a c t e n d o t h e l i a l c e l l s ( F u r c h g o t t , 1 9 8 0 ) . I n v i t r o a n d i n v i v o a p p l i c a t i o n o f e x o g e n o u s A C h a l s o d e c r e a s e d b l o o d p r e s s u r e , i m p l y i n g A C h m e d i a t e s p a r a s y m p a t h e t i c - i n d u c e d v a s o d i l a t i o n o f a r t e r i e s ( F u r c h g o t t , 1 9 8 1 ) . H o w e v e r , v a g a l s t i m u l a t i o n n e a r t h e d i a p h r a g m d i d n o t a l t e r j e j u n a l b l o o d fl o w i n a n i m a l s w i t h i n t a c t s y m p a t h e t i c n e r v e s a n d a d r e n a l g l a n d s ( K e w e n t e r , 1 9 6 5 ) . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b s e r v e d i n t h e i l e u m , s u g g e s t i n g p a r a s y m p a t h e t i c n e r v e s d o n o t r e g u l a t e i n t e s t i n a l b l o o d fl o w ( K e w e n t e r , 1 9 6 5 ) . O t h e r i n v e s t i g a t o r s o b s e r v e d h i g h f r e q u e n c y v a g a l s t i m u l a t i o n c o n s t r i c t e d s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s , s u g g e s t i n g t h i s e x p e r i m e n t a l p r o t o c o l a l s o s t i m u l a t e d s y m p a t h e t i c n e r v e s . I n t r a v e n o u s i n j e c t i o n o f g u a n e t h i d i n e a t t e n u a t e d v a s o c o n s t r i c t i o n a n d u n c o v e r e d e x c i t a t o r y m o t o r a c t i v i t y , s u g g e s t i n g p a r a s y m p a t h e t i c v a s o d i l a t i o n w a s m a s k e d b y s y m p a t h e t i c v a s o c o n s t r i c t i o n ( r e v i e w e d i n C h o u , 1 9 8 9 ) . T h e s e r e s u l t s a r e d i f fi c u l t t o i n t e r p r e t , a s v a g a l n e r v e s c o n t a i n e f f e r e n t a n d a f f e r e n t n e r v e fi b e r s . T h e r e f o r e , s t i m u l a t i o n o f v a g a l n e r v e s m a y a n t i d r o m i c a l l y a c t i v a t e a f f e r e n t n e r v e s , r e s u l t i n g i n l o c a l r e l e a s e o f v a s o d i l a t o r y s u b s t a n c e s . A l t e r n a t i v e l y , p a r a s y m p a t h e t i c n e r v e s m a y r e l e a s e A C h a n d d i l a t e s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s . P r o c e e d i n g d e s t r u c t i o n o f s y m p a t h e t i c n e r v e s , v a g a l s t i m u l a t i o n r e l a x e s a r t e r i o l e s i n s t o m a c h ( M a r t i s o n , 1 9 6 5 ; T h i e f m e t a l . , 1 9 9 0 ) a n d c o l o n ( H u l t e ’ n e t a l . , 1 9 6 9 a , 1 9 6 9 b ) . F u r t h e r m o r e , t h e s e v a s o d i l a t i o n s a r e p a r t i a l l y a n t a g o n i z e d b y a t r o p i n e , s u g g e s t i n g v a s o d i l a t i o n i s m e d i a t e d b y n e r v e - e v o k e d A C h . U n f o r t u n a t e l y , t h e s e e x p e r i m e n t s d i d n o t d e t e r m i n e i f c h o l i n e r g i c v a s o d i l a t i o n s w e r e m e d i a t e d b y p a r a s y m p a t h e t i c o r e n t e r i c n e u r o n s . 5 3 S e n s o r y R e c e p t i o n a n d E f f e c t o r F u n c t i o n s b y A f f e r e n t N e r v e s A c c o r d i n g t o t h e c l a s s i c a l s c h e m e o f a u t o n o m i c p h a r m a c o l o g y , p a r a s y m p a t h e t i c n e r v e s m e d i a t e c h o l i n e r g i c r e s p o n s e s a n d s y m p a t h e t i c n e r v e s a r e r e s p o n s i b l e f o r a d r e n e r g i c e f f e c t s . S i m i l a r t o t h e p e r i p h e r a l n e r v o u s s y s t e m ( P N S ) , s m o o t h m u s c l e a n d e n t e r i c n e u r o n s a l s o r e c e i v e i n n e r v a t i o n f r o m e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e s o r i g i n a t i n g i n D R G . A l t h o u g h s p e c i a l i z e d s o m a t i c a n d v i s c e r a l s e n s o r y r e c e p t o r s a r e c o m m o n , e x t r i n s i c a f f e r e n t i n n e r v a t i o n t o t h e G I t r a c t d o n o t e x h i b i t s u c h m o r p h o l o g i c a l s p e c i a l i z a t i o n s , r e s u l t i n g i n d i f fi c u l t y i n l o c a l i z a t i o n o f e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e e n d i n g s . F u r t h e r m o r e , u n l i k e o t h e r p e r i p h e r a l s e n s o r y n e r v e s , e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e s t o t h e v i s c e r a d o n o t r e s p o n d t o s p e c i fi c m o d a l i t i e s . F o r e x a m p l e , e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l s t u d i e s o f c o n d u c t i o n o f i m p u l s e s i n v a g a l a f f e r e n t n e r v e s h a v e r e c o r d e d a c t i v i t y a f t e r e x p o s u r e t o m e c h a n i c a l o r c h e m i c a l s t i m u l i ( r e v i e w e d i n G r u n d y a n d S c r a t c h e r d , 1 9 8 9 ) . C u r r e n t a t t e m p t s a t c a t e g o r i z a t i o n o f m o d a l i t i e s o f t h e s e n e r v e s h a v e f a i l e d ; h o w e v e r , e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e s a r e s i r n p l i s t i c a l l y d i v i d e d i n t o c h e m o r e c e p t o r s a n d m e c h a n o r e c e p t o r s . C h e m o r e c e p t o r s a r e s e n s i t i v e t o p r o t o n s , g l u c o s e , a m i n o a c i d s , a n d o t h e r s i m p l e m o l e c u l e s , w h e r e a s m e c h a n o r e c e p t o r s m a y r e s p o n d t o d e fl e c t i o n o f m u c o s a l c r y p t s , o r m o v e m e n t s o f G I s m o o t h m u s c l e ( G n m d y a n d S c r a t c h e r d , 1 9 8 9 ) . T h e r e f o r e , s i m i l a r t o o t h e r p e r i p h e r a l t i s s u e s , t h e G I t r a c t r e c e i v e s e f f e r e n t s y m p a t h e t i c a n d p a r a s y m p a t h e t i c i n n e r v a t i o n a n d a f f e r e n t s e n s o r y i n n e r v a t i o n . H o w e v e r , a t t h i s t i m e , r e l a t i v e l y l i t t l e i n f o r m a t i o n e x i s t s a b o u t v i s c e r a l s e n s o r y n e r v e s a s c o m p a r e d t o p e r i p h e r a l s e n s o r y n e r v e s . T r a d i t i o n a l l y , s e n s o r y n e r v e s h a v e b e e n v i e w e d a s a r e c e p t i v e a n d a f f e r e n t s y s t e m w h i c h a c t i v a t e s e f f e c t o r s y s t e m s . S t u d i e s o f f o r m a t i o n o f t h e w h e e l a n d fl a r e a f t e r i n fl a m m a t i o n o r i r r i t a t i o n o f t h e s k i n ( r e v i e w e d i n H o l z e r , 1 9 8 8 ) l e d L a n g l e y a n d 5 4 A n d e r s o n ( 1 8 9 4 ) t o p r o p o s e t h a t t h e r e c e p t i v e - a f f e r e n t - e f f e r e n t p a t h w a y o f s e n s o r y n e r v e s w a s m e d i a t e d b y a r e fl e x t h a t o c c u r r e d e n t i r e l y w i t h i n a s i n g l e n e u r o n . T h e a x o n r e fl e x h y p o t h e s i z e d t h a t t h e p e r i p h e r a l p r o c e s s o f s e n s o r y n e r v e s b i f u r c a t e s , a l l o w i n g o n e b r a n c h t o s e n d a f f e r e n t i n f o r m a t i o n t o t h e C N S . N e r v e i m p u l s e s w o u l d t r a v e l a n t i d r o m i c a l l y t o t h e s e c o n d b r a n c h w h i c h i n n e r v a t e s t h e e f f e c t o r o r g a n , s u c h a s a n a r t e r i o l e . T h e r e s u l t i n g a n t i d r o m i c a c t i v a t i o n o f t h e l o c a l e f f e r e n t b r a n c h w o u l d t h e n m e d i a t e v a s o d i l a t i o n ( L e w i s a n d M a r v i n , 1 9 2 7 ) . T h i s s c h e m e h a s b e e n c h a l l e n g e d b y P e t e r H o l z e r ( 1 9 8 8 ) , a s h e o b s e r v e d t h a t a n t i d r o m i c a c t i v a t i o n o f t h e p e r i p h e r a l s t u m p o f t r a n s e c t e d d o r s a l r o o t s r e s u l t e d i n v a s o d i l a t i o n i n a r t e r i o l e s i n t h e G I t r a c t a n d p e r i p h e r a l t i s s u e s , a n d m o t o r r e s p o n s e s o f t h e i l e u m , a l t h o u g h t h e a f f e r e n t p a t h w a y h a d n o t b e e n a c t i v a t e d ( H o l z e r , 1 9 9 1 ) . H i s s t u d i e s s u g g e s t t h a t s e n s o r y n e r v e s t r a n s m i t e f f e c t o r i n f o r m a t i o n b y a m e c h a n i s m s e p a r a t e f r o m t h a t o f t h e r e c e p t i v e - a f f e r e n t - e f f e r e n t p a t h w a y o f L a n g l e y a n d A n d e r s o n . A l t h o u g h i t i s n o t k n o w n i f a s i n g l e n e u r o n c a n m e d i a t e b o t h a f f e r e n t a n d e f f e r e n t i n f o r m a t i o n , s e n s o r y n e r v e s m a y h a v e a n e f f e c t o r r o l e i n r e g u l a t i o n o f b l o o d fl o w , t r o p h i c a n d i m m u n o l o g i c a l p r o c e s s e s , a n d a c t i v i t y o f a u t o n o m i c g a n g l i a a n d v i s c e r a l s m o o t h m u s c l e ( r e v i e w e d i n H o l z e r , 1 9 8 8 ) . T h e r e f o r e , i r r e s p e c t i v e o f t h e m e c h a n i s m f o r m e d i a t i o n o f e f f e c t o r f u n c t i o n s , s e n s o r y n e r v e s c a n n o t b e s i m p l y v i e w e d a s a f f e r e n t n e r v e fi b e r s . T h e p o t e n t i a l l o c a l e f f e r e n t f u n c t i o n o f s e n s o r y i n n e r v a t i o n f r o m n o d o s e a n d D R G w o u l d h a v e b e e n a l m o s t i m p o s s i b l e t o s t u d y w i t h o u t t h e d i s c o v e r y o f c a p s a i c i n . S i n c e t h e 1 8 0 0 5 , p h y s i c i a n s h a v e k n o w n t h a t i n t a k e o f c a p s i c o l , a g e l a t i n e c a p s u l e c o n t a i n i n g o i l e x t r a c t o f t h e r e d p e p p e r C a p s i c u m a n n u m , w o u l d i m p r o v e d i g e s t i o n a n d p e r i s t a l s i s ( H o g y e s , 1 8 7 8 ) . H o t c h i l i p e p p e r s o f t h e g e n u s C a p s i c u m c o n t a i n c a p s a i c i n ( 8 - m e t h y l - N — 5 5 v a n i l l y l - 6 - n o n e a m i d e ) , a n e u r o t o x i n w h i c h d e f u n c t i o n a l i z e s a l a r g e g r o u p o f s e n s o r y n e u r o n s ( J a n c s o , 1 9 6 7 ) , t h u s m a k i n g i t a v a l u a b l e t o o l t o s t u d y s e n s o r y i n n e r v a t i o n . S u b c u t a n e o u s a d m i n i s t r a t i o n ( n M - u M ) o r p e r i n e u r o n a l a p p l i c a t i o n ( p g / k g r a n g e ) o f s m a l l c o n c e n t r a t i o n s o f c a p s a i c i n t o n e o n a t a l r o d e n t s p e r m a n e n t l y d e s t r o y s m o s t p r i m a r y a f f e r e n t s e n s o r y n e u r o n s . C a p s a i c i n a p p e a r s t o b e e s p e c i a l l y t o x i c t o s m a l l , d a r k - b o d i e d t y p e B n e u r o n s f o u n d i n s e n s o r y g a n g l i a ( S z o l c s a n y i e t a l . , 1 9 7 4 ; r e v i e w e d i n H o l z e r , 1 9 9 1 ) . T h e s e n e u r o n s h a v e b e e n s h o w n t o g i v e r i s e t o e i t h e r u n m y e l i n a t e d o r t h i n l y m y e l i n a t e d " C " n e r v e fi b e r s ( J a n s c é e t a l . , 1 9 7 7 ; S c a d d i n g , 1 9 8 0 ) t h a t c o m p r i s e a p p r o x i m a t e l y 7 0 % o f a l l v i s c e r a l a f f e r e n t i n n e r v a t i o n ( B u c k a n d B u r k s , 1 9 8 6 ) . A l t h o u g h a d u l t a n i m a l s a r e l e s s s e n s i t i v e t o c a p s a i c i n , s y s t e m i c a d m i n i s t r a t i o n o r p e r i n e u r o n a l a p p l i c a t i o n o f c a p s a i c i n t o a n y p a r t o f s e n s o r y n e r v e s p r o d u c e s a n a c u t e e x c i t a t o r y p h a s e . T h i s e v e n t i s c h a r a c t e r i z e d b y a t e t r o d o t o x i n ( T T X ) - i n s e n s i t i v e d e p o l a r i z a t i o n o f p e r i p h e r a l s e n s o r y n e r v e e n d i n g s , m a s s i v e r e l e a s e o f n e u r o p e p t i d e s a n d n e u r o m o d u l a t o r s , a n d d e p l e t i o n o f n e u r o t r a n s m i t t e r s , u l t i m a t e l y r e s u l t i n g i n d e s e n s i t i z a t i o n . H o w e v e r , c u m u l a t i v e d o s e s o f c a p s a i c i n o r s y s t e m i c a d m i n i s t r a t i o n o f m g / k g c o n c e n t r a t i o n s o f c a p s a i c i n p r o d u c e s l o n g - l a s t i n g o r p e r m a n e n t l o s s o f s e n s o r y n e r v e s i n a d u l t r o d e n t s , i n c l u d i n g g u i n e a p i g s a s a s s a y e d b y i m m u n o c y t o c h e m i s t r y o f s m a l l i n t e s t i n e a n d D R G a n d r a d i o i m m u n o a s s a y o f t h e G I t r a c t a n d D R G ( G i b b i n s e t a l . , 1 9 8 5 ; S t e r n i n i e t a l . , 1 9 8 7 ; r e v i e w e d b y H o l z e r , 1 9 8 8 ; H o l z e r , 1 9 9 1 ; B u c k a n d B u r k s , 1 9 8 6 ) . T h i s l o s s i s s p e c i fi c f o r e x t r i n s i c s e n s o r y n e u r o n s a n d e n t e r i c s e n s o r y n e r v e s a r e n o t e f f e c t e d ( G a m s e e t a l . , 1 9 8 0 ; G a s p a r o v i c e t a l . , 1 9 6 4 ; J e s s e l l e t a l . , 1 9 7 8 ; H o l z e r , 1 9 8 8 ; B u c k a n d B u r k s , 1 9 8 6 ; F u r n e s s e t a l . , 1 9 8 2 ) . 5 6 S e n s o r y R e c e p t i o n b y A f f e r e n t V a g a l N e r v e s T r a d i t i o n a l l y , s t u d i e s o f p a r a s y m p a t h e t i c i n n e r v a t i o n o f t h e G I t r a c t h a v e v i e w e d v a g u s n e r v e s a s c o n t a i n i n g e f f e r e n t n e r v e fi b e r s . H o w e v e r , a s d i s c u s s e d p r e v i o u s l y , h i s t o l o g i c a l s t u d i e s o f v a g a l n e r v e s a t t h e d i a p h r a g m i c l e v e l h a v e r e v e a l e d t h a t 8 0 - 9 0 % o f v a g a l n e r v e s a r e u n m y e l i n a t e d p r i m a r y a f f e r e n t n e r v e s ( A g o s t i n i , 1 9 5 7 ) . A l t h o u g h i d e n t i fi c a t i o n o f s t i m u l i a n d m o d a l i t i e s o f e x t r i n s i c n e r v e s h a v e b e e n d i f fi c u l t t o e l u c i d a t e , a f f e r e n t v a g a l n e r v e s i n t h e v a g u s a p p e a r t o r e s p o n d t o s t i m u l i o r i g i n a t i n g f r o m m u s c l e a n d m u c o s a . F o r e x a m p l e , t h e f r e q u e n c y o f n e r v e i m p u l s e s r e c o r d e d f r o m v a g a l n e r v e s i n c r e a s e s a f t e r d i s t e n s i o n o f t h e s t o m a c h , s u g g e s t i n g t h a t v a g a l s e n s o r y n e r v e fi b e r s e i t h e r i n n e r v a t e o r h a v e s p e c i a l i z e d r e c e p t o r s f o r m e c h a n i c a l s t i m u l i ( G r u n d y a n d S c r a t c h e r d , 1 9 8 9 ) . S i m i l a r s t u d i e s a l s o r e v e a l i n c r e a s e d f r e q u e n c y o f n e r v e i m p u l s e s r e c o r d e d f r o m v a g a l n e r v e s f o l l o w i n g e x p o s u r e o f v a g a l n e r v e s t o p r o t o n s ( h y d r o g e n ) o r e t h a n o l ( r e v i e w e d i n H o l z e r , 1 9 9 1 ) , i m p l y i n g t h a t v a g a l n e r v e s a l s o t r a n s m i t s e n s o r y i n f o r m a t i o n . H o w e v e r , i t i s n o t k n o w n i f a s i n g l e v a g a l n e r v e fi b e r c a n r e s p o n d t o b o t h m e c h a n i c a l a n d c h e m i c a l s t i m u l i . R e g u l a t i o n o f M o t i l i t y b y A f f e r e n t V a g a l N e r v e s A s d i s c u s s e d p r e v i o u s l y , s t i m u l a t i o n o f v a g a l n e r v e s p r o d u c e s e x c i t a t i o n , i n h i b i t i o n , o r e x c i t a t i o n a n d i n h i b i t i o n o f G I s m o o t h m u s c l e . T h e r e f o r e , B a r t h o a n d S z o l c s a n y i ( 1 9 7 8 ) u s e d c a p s a i c i n t o s e l e c t i v e l y s t i m u l a t e e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e s t o t h e i l e u m . A p p l i c a t i o n o f s m a l l c o n c e n t r a t i o n s o f c a p s a i c i n t o s e g m e n t s o f i s o l a t e d i l e u m r e s u l t s i n n o n - c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s o f t h e i l e u m ( T o h e t a l . , 1 9 5 5 ; B a r t h o a n d S z o l c s a n y i , 1 9 7 8 ) , a s s o c i a t e d w i t h r e l e a s e o f S P a s m e a s u r e d a t t h e v a s c u l a r b e d ( D o n n e r e r e t a l . , 1 9 8 4 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e d a t a s u g g e s t t h a t e x t r i n s i c s e n s o r y a f f e r e n t 5 7 n e r v e s r e l e a s e e x c i t a t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r s o n G 1 s m o o t h m u s c l e . E l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n o f v a g a l n e r v e s i n t h e s t o m a c h r e l e a s e C G R P , S P , a n d V I P a s a s s a y e d b y r a d i o i m m u n o a s s a y ( P e d e s o n e t a l . , 1 9 8 1 ; R a y b o u l d e t a l . , 1 9 9 1 ) . H o w e v e r , s e n s o r y v a g a l n e r v e s a r e u n l i k e l y t o b e i n v o l v e d i n c o n t r o l o f m o t i l i t y o f t h e i l e u m , a s b i l a t e r a l s u b d i a p h r a g m a l v a g o t o m y d o e s n o t p r e v e n t c a p s a i c i n - i n d u c e d n o n - c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s i n r o d e n t s ( B a r t h o a n d S z o l c s a n y i , 1 9 7 8 ) . T h e s e c o n t r a c t i o n s a r e u n l i k e l y t o r e s u l t f r o m a n a c t i o n o f c a p s a i c i n o n e n t e r i c n e u r o n s , a s c o n t r a c t i o n s a r e a b o l i s h e d b y d e s t r u c t i o n o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n t o t h e i l e u m p r i o r t o a d m i n i s t r a t i o n o f c a p s a i c i n ( B a r t h o a n d S z o l c s é n y i , 1 9 7 8 ) . F i n a l e v i d e n c e f o r a l a c k o f v a g a l a f f e r e n t r e g u l a t i o n o f m o t i l i t y c o m e s f r o m s t i m u l a t i o n o f e x t r i n s i c n e r v e s a s s o c i a t e d w i t h m e s e n t e r i c a r t e r i o l e s i n g u a n e t h i d i n e - t r e a t e d p r e p a r a t i o n s . L o w f r e q u e n c y ( 1 0 H z ) n e r v e s t i m u l a t i o n p r o d u c e s c o n t r a c t i o n s t h a t a r e a t t e n u a t e d b y n A C h a n t a g o n i s t s s u c h a s h e x a m e t h o n i u m o r m e c a m y l a r n i n e , b u t n o t b y c a p s a i c i n , i m p l y i n g s t i m u l a t i o n o f n o n - s e n s o r y e x t r i n s i c n e r v e s r e l e a s e s A C h . T h i s o b s e r v a t i o n f u r t h e r s t r e n g t h e n s t h e a r g u m e n t a g a i n s t a n e f f e r e n t r o l e o f v a g a l s e n s o r y n e r v e s i n r e g u l a t i o n o f m o t i l i t y o f t h e i l e u m ( S z o l c s a n y i a n d B a r t h o , 1 9 7 8 ) . I t s h o u l d b e n o t e d h o w e v e r t h a t v a g a l s e n s o r y n e r v e s m a y b e i n v o l v e d i n r e fl e x c o n t r o l o f G I m o t i l i t y i n t h e d u o d e n u m a n d s t o m a c h , a s p e r f u s i o n o f a n i s o t o n i c m i x t u r e o f p r o t e i n , f a t , a n d c a r b o h y d r a t e s d e c r e a s e s g a s t r i c t o n e b y a n o n - a d r e n e r g i c , n o n - m u s c a r i n i c p a t h w a y ( D e P o n t i a n d M a l a g e l a d a , 1 9 8 7 ; A z p i r o z a n d M a l a g e l a d a , 1 9 8 6 ; R a y b o u l d e t a l . , 1 9 9 1 ) . R e g u l a t i o n o f B l o o d F l o w b y A f f e r e n t V a g a l N e r v e s P r o c e e d i n g d e s t r u c t i o n o f s y m p a t h e t i c n e r v e s o r p r e j u n c t i o n a l i n h i b i t i o n o f r e l e a s e o f N E , v a g a l s t i m u l a t i o n p r o d u c e s v a s o d i l a t i o n o f s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s ( r e v i e w e d i n J o d a l 5 8 a n d L u n d g r e n , 1 9 8 9 ) . T h i s v a s o d i l a t i o n i s o n l y p a r t i a l l y a t t e n u a t e d b y a t r o p i n e , s u g g e s t i n g r e l e a s e o f a n o n - c h o l i n e r g i c v a s o d i l a t o r y s u b s t a n c e ( M a r t i s o n , 1 9 6 5 ; H u l t é n e t a l . , 1 9 6 9 a ; H u l t é n e t a l . , 1 9 6 9 b ) . A s i m i l a r n o n - c h o l i n e r g i c v a s o d i l a t i o n i s o b s e r v e d f o l l o w i n g i n v i v a o r i n v i t r a a d m i n i s t r a t i o n o f l o w c o n c e n t r a t i o n s o f c a p s a i c i n i n a n u m b e r o f s p e c i e s ( R o z s a , 1 9 8 6 ; T h i e fi n e t a l . , 1 9 9 0 ; H o t t e n s t e i n e t a l . , 1 9 9 1 ) . A s l o w d o s e s o f c a p s a i c i n s t i m u l a t e s e n s o r y n e r v e s , t h e s e d a t a s u g g e s t t h a t s t i m u l a t i o n o f v a g a l s e n s o r y n e r v e s m e d i a t e n o n - c h o l i n e r g i c v a s o d i l a t i o n . I n t e r e s t i n g l y , v a g a l s t i m u l a t i o n i n c a p s a i c i n - t r e a t e d a n i m a l s p r o d u c e d v a s o d i l a t i o n s t h a t w e r e a l m o s t c o m p l e t e l y a n t a g o n i z e d b y a t r o p i n e , i m p l y i n g t h a t v a g a l s e n s o r y n e r v e s m e d i a t e p a r t o f v a g a l n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n ( R a y b o u l d , 1 9 9 1 ; T h i e fi n e t a l . , 1 9 9 0 ) . S e n s o r y R e c e p t i o n b y I n n e r v a t i o n f r o m D o r s a l R o o t G a n g l i a T h e r e a r e s i m i l a r i t i e s b e t w e e n s e n s o r y n e r v e s f r o m n o d o s e a n d D R G . F o r e x a m p l e , l i t t l e i s k n o w n r e g a r d i n g t r a n s m i s s i o n o f s e n s o r y i n f o r m a t i o n t o D R G . E l e c t r o p h y s i o l o g i c a l s t u d i e s s u g g e s t t h a t s p l a n c h n i c n e r v e s f r o m D R G i n n e r v a t e o r c o n t a i n s p e c i a l i z e d c h e m o r e c e p t o r s o r m e c h a n o r e c e p t o r s i n m e s e n t e r i c g a n g l i a ( G r u n d y a n d S c r a t c h e r d , 1 9 8 9 ) . T h e s e n e r v e s a l s o t r a n s m i t v i s c e r a l p a i n ( r e v i e w e d i n M a y e r a n d R a y b o u l d , 1 9 9 0 ) . I n t e r e s t i n g l y , v a g a l a n d s p i n a l g a n g l i o n i c s e n s o r y n e r v e s m a y p r e f e r e n t i a l l y i n n e r v a t e a n d t r a n s m i t c h e m i c a l a n d m e c h a n i c a l i n f o r m a t i o n f r o m m y e n t e r i c g a n g l i a o r s m o o t h m u s c l e a n d m u c o s a , r e s p e c t i v e l y , s u g g e s t i n g t h e s o u r c e o f s e n s o r y i n f o r m a t i o n p r e f e r e n t i a l l y a c t i v a t e s v a g a l o r d o r s a l r o o t a f f e r e n t n e r v e fi b e r s . 5 9 R e g u l a t i o n o f M o t i l i t y b y I n n e r v a t i o n f r o m D o r s a l R o o t G a n g l i a T h e r e i s a p a u c i t y o f i n f o r m a t i o n o n t h e e f f e c t o f s t i m u l a t i o n o f D R G c e l l s o n m o t i l i t y o f t h e G I t r a c t ( G i l l i s , 1 9 8 9 ) . N e r v e s t i m u l a t i o n o f d o r s a l r o o t s a t T 9 e l e v a t e s i n t r a g a s t r i c p r e s s u r e , a l t h o u g h i t i s u n c l e a r i f e l e v a t i o n r e s u l t s f r o m a c t i v a t i o n o f e f f e r e n t s y m p a t h e t i c n e r v e s b y a f f e r e n t n e r v e s , o r b y a n t i d r o m i c a c t i v a t i o n o f s p i n a l g a n g l i o n i c n e r v e s ( S e m b a a n d M i z o n h s i , 1 9 7 8 ) . T h e m o s t i n f o r m a t i o n a b o u t r e g u l a t i o n o f m o t i l i t y b y s p i n a l g a n g l i o n i c p r i m a r y a f f e r e n t n e r v e s h a s r e s u l t e d f r o m u s e o f c a p s a i c i n o n i s o l a t e d s e g m e n t s o f i l e u m . A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , a d m i n i s t r a t i o n o f c a p s i c o l i m p r o v e s p e r i s t a l s i s i n v i v a ( H o g y e s , 1 8 7 8 ; B a r t h é a n d S z o l c s a n y i , 1 9 7 8 ) , a n d a p p l i c a t i o n o f s m a l l c o n c e n t r a t i o n s o f c a p s a i c i n t o i s o l a t e d s e g m e n t s o f i l e u m i n v i t r a c a u s e s c o n t r a c t i o n s ( S z o l c s a n y i a n d B a r t h é , 1 9 7 8 ; B a r t h o a n d S z o l c s a n y i , 1 9 7 8 ; B a r t h é e t a l . , 1 9 8 2 ) . T h e s e c o n t r a c t i o n s r e s u l t f r o m s t i m u l a t i o n o f e x t r i n s i c D R G a f f e r e n t n e r v e s , a s t h e y a r e i n h i b i t e d b y T T X a n d e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n o f t h e i l e u m , b u t b y n o t b i l a t e r a l v a g o t o m y ( B a r t h é a n d S z o l c s a n y i , 1 9 7 8 ) . C a p s a i c i n - i n d u c e d c o n t r a c t i o n s d o n o t i n v o l v e n e u r o t r a n s m i s s i o n t h r o u g h g a n g l i o n i c n i c o t i n i c r e c e p t o r s , a s h e x a m e t h o n i u m , D M P P , a n d n i c o t i n e d o n o t r e d u c e t h e e f f e c t s o f c a p s a i c i n ( B a r t h é a n d S z o l c s é n y i , 1 9 7 8 ; B a r t h é e t a l . , 1 9 8 2 ) . H o w e v e r , m u s c a r i n i c a n t a g o n i s t s s u c h a s h y o s c i n e o r a t r o p i n e a t t e n u a t e a p p r o x i m a t e l y 7 5 % o f t h e c o n t r a c t i o n s ( B a r t h o e t a l , 1 9 8 2 ) , a n d s u b s t a n c e P ( D - P r o z - D - T r p ” ) , a N K r e c e p t o r a n t a g o n i s t , a b o l i s h e s a t r o p i n e - r e s i s t e n t c a p s a i c i n - i n d u c e d c o n t r a c t i o n s . T h i s t a c h y k i n i n r e c e p t o r a n t a g o n i s t a l s o r e d u c e s t h e a m p l i t u d e o f c a p s a i c i n - i n d u c e d c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s ( B a r t h é e t a I . , 1 9 8 2 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t s e n s o r y n e r v e s f r o m D R G r e l e a s e S P w h i c h a c t s d i r e c t l y o n s m o o t h m u s c l e , a n d i n d i r e c t l y o n c h o l i n e r g i c ( H o l z e r , 1 9 8 1 ) a n d S P - c o n t a i n i n g e n t e r i c n e u r o n s ( H o l z e r , 1 9 9 4 ) . I d e n t i c a l r e s u l t s a r e 6 0 o b t a i n e d a f t e r e l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n o f e x t r i n s i c p e r i - a r t e r i a l n e r v e s ( S z o l c s a n k y i a n d B a r t h é , 1 9 7 8 ; B a r t h o e t a l . , 1 9 8 2 ) , f u r t h e r s u g g e s t i n g t h a t i n n e r v a t i o n f r o m D R G s e r v e s a n e f f e r e n t f u n c t i o n i n r e g u l a t i o n o f m o t i l i t y . A l t h o u g h f u n c t i o n a l s t u d i e s p r o v i d e c o m p e l l i n g e v i d e n c e f o r a r o l e o f c a p s a i c i n - s e n s i t i v e D R G n e u r o n s i n c o n t r o l o f m o t i l i t y , i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t u d i e s d o n o t r e v e a l p r i m a r y a f f e r e n t n e r v e s i n t h e l o n g i t u d i n a l o r c i r c u l a r m u s c l e l a y e r s o f t h e G I t r a c t . H o w e v e r , o c c a s i o n a l v a r i c o s e n e r v e fi b e r s c o n t a i n i n g S P - i r a n d C G R P - i r a r e o b s e r v e d a s s i n g l e v a r i c o s e a x o n s i n i n t e r n o d a l s t r a n d s , o r i n m y e n t e r i c g a n g l i a ( G i b b i n s e t a l . , 1 9 8 5 ) . I f n e r v e s f r o m t h e D R G r e l e a s e e x c i t a t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r s s u c h a s S P o r C G R P o n e n t e r i c n e u r o n s t h e n E P S P s s h o u l d r e s u l t . T a k a k i a n d N o k a y a m a ( 1 9 8 8 ) f o u n d t h a t a s p r e d i c t e d , m e s e n t e r i c n e r v e s t i m u l a t i o n e v o k e d s l o w E P S P s a n d i n c r e a s e d e x c i t a b i l i t y i n a p p r o x i m a t e l y 3 0 % o f m y e n t e r i c n e u r o n s e x a m i n e d . T h e s e m e m b r a n e d e p o l a r i z a t i o n s w e r e m i m i c k e d b y a p p l i c a t i o n o f S P o r C G R P ( P a l m e r e t a l . , 1 9 8 6 ) , t h u s f u r t h e r s u p p o r t i n g H o l z e r ’ s h y p o t h e s i s o f e f f e r e n t f u n c t i o n s o f s e n s o r y n e r v e s . R e g u l a t i o n o f B l o o d F l o w b y I n n e r v a t i o n f r o m D o r s a l R o o t G a n g l i a N e r v e fi b e r s f r o m D R G a r e a l s o i n v o l v e d i n r e g u l a t i o n o f s u b m u c o s a l b l o o d fl o w . A s d i s c u s s e d p r e v i o u s l y , n e r v e fi b e r s f r o m t h e d o r s a l r o o t g a n g l i a a r e c l o s e l y a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s , s u g g e s t i n g t h a t s e n s o r y n e r v e s m a y h a v e a r o l e i n r e g u l a t i o n o f b l o o d fl o w . I n t h e p r e s e n c e o f g u a n e t h i d i n e , s t i m u l a t i o n o f p r o x i m a l p r o c e s s e s o f s p l a n c h n i c n e r v e s d i l a t e s s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s ( L e m b e c k a n d H o l z e r , 1 9 7 9 ) . S y s t e m i c o r p e n - n e u r o n a l a p p l i c a t i o n o f c a p s a i c i n a t D R G p r e v e n t s t h i s v a s o d i l a t i o n , p r o v i d i n g f u r t h e r e v i d e n c e t h a t s e n s o r y n e r v e s f r o m s p i n a l g a n g l i a m e d i a t e v a s o d i l a t i o n . S u b s t a n c e P , o r a s i m i l a r m o l e c u l e , a p p e a r s t o b e n e c e s s a r y f o r e n d o t h e l i u m - d e p e n d e n t v a s o d i l a t i o n 6 1 ( G a m s e e t a l . , 1 9 8 0 ; L e m b e c k a n d H o l z e r , 1 9 7 9 ) , w h i l e C G R P m a y m e d i a t e e n d o t h e l i u m - i n d e p e n d e n t v a s o d i l a t i o n i n s o m e t i s s u e s o f t h e G I t r a c t ( r e v i e w e d i n H o l z e r , 1 9 9 1 ; S t e r n i n i , 1 9 9 1 ) . H o w e v e r , t h e m e c h a n i s m o f p e p t i d e - i n d u c e d r e l a x a t i o n m a y v a r y i n d i f f e r e n t r e s i s t a n c e v e s s e l s . 6 . A U T O N O M Y O F T H E E N T E R I C N E R V O U S S Y S T E M A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , p e r i s t a l s i s i n v i v a ( B a y l i s s a n d S t a r l i n g , 1 8 9 9 ; 1 9 0 0 a ; 1 9 0 0 b ) o r i n v i t r a ( T r e n d e l e n b e r g , 1 9 1 7 ) d o e s n o t r e q u i r e e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n , a s s t e r e o t y p i c a l o r a l c o n t r a c t i o n s a n d a b o r a l r e l a x a t i o n s a r o u n d a b o l u s o f f o o d o c c u r r e d e v e n a f t e r e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n h a d b e e n d e s t r o y e d . L a n g l e y ( 1 9 2 1 ) u s e d t h e s e fi n d i n g s t o a r g u e t h a t r e fl e x e s o c c u r r e d i n t h e a b s e n c e o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n b e c a u s e t h e c o m p l e t e r e fl e x a r c , i n c l u d i n g s e n s o r y n e u r o n s , i n t e m e u r o n s , a n d m o t o r n e u r o n s w a s f o u n d w i t h i n t h e w a l l o f t h e G I t r a c t . H o w e v e r , m a n y r e fl e x e s s u c h a s r e c e p t i v e r e l a x a t i o n o f t h e s t o m a c h a n d i n h i b i t i o n o f b i l e b y c o l o n d i s t e n s i o n r e q u i r e e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n a n d a r e i n h i b i t e d b y l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s ( S h a p i r o a n d W o o d w a r d , 1 9 5 9 ; r e v i e w e d i n F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ) . F u r t h e r m o r e , e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n h a s a p r o f o u n d e f f e c t o n G 1 f u n c t i o n , a s p r e v i o u s l y d i s c u s s e d . S y m p a t h e t i c n e r v e s d i r e c t l y i n n e r v a t e s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s a n d s o m e m y e n t e r i c n e u r o n s , r e s u l t i n g i n v a s o c o n s t r i c t i o n ( D a l e , 1 9 1 3 ; E v a n s a n d S u r p r e n a n t , 1 9 9 2 ) a n d i n h i b i t i o n o f e x c i t a t o r y e n t e r i c n e u r o n s a n d m o t i l i t y ( V i z i a n d K n o l l , 1 9 7 1 ; L e e , 1 9 7 0 ; F u r n e s s a n d B u r n s t o c k , 1 9 7 5 ; H i r s t a n d M c K i r d y , 1 9 7 4 ) , r e s p e c t i v e l y . P a r a s y m p a t h e t i c i n n e r v a t i o n d o e s n o t a p p e a r t o h a v e m a j o r a c t i o n s i n t h e s m a l l i n t e s t i n e ( K e w e n t e r , 1 9 6 5 ) . E x t r i n s i c s e n s o r y i n n e r v a t i o n f r o m D R G d i r e c t l y i n n e r v a t e s s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s ( L e m b e c k a n d H o l z e r , 1 9 7 9 ) a n d m y e n t e r i c n e u r o n s 6 2 ( H o l z e r , 1 9 8 1 ; H o l z e r , 1 9 9 4 ; G i b b i n s e t a l . , 1 9 8 5 ; T a k a k i a n d N o k a y a m a , 1 9 8 8 ) a n d m e d i a t e s r e fl e x v a s o d i l a t i o n a n d i n c r e a s e d c o n t r a c t i l e a c t i v i t y . T h e r e f o r e , t h e s e d a t a p r o v i d e c o n v i n c i n g e v i d e n c e t h a t e x t r i n s i c n e r v e s h a v e i m p o r t a n t r o l e s i n r e g u l a t i o n o f G I f u n c t i o n s . H o w e v e r , s u r g i c a l d e s t r u c t i o n o f e x t r i n s i c n e r v e s r e s u l t s i n o n l y a b r i e f p e r i o d o f d i g e s t i v e d y s f u n c t i o n , f r e q u e n t l y c a t e g o r i z e d b y d i a r r h e a ( A l v a r e z , 1 9 4 8 ) . N o r m a l d i g e s t i o n t h e n r e t u r n s , a l t h o u g h e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n h a s n o t b e e n r e - e s t a b l i s h e d w i t h i n t h e G I t r a c t . T h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n i n d u c e s a n a t o m i c a l a n d f u n c t i o n a l a d a p t a t i o n s o f e n t e r i c n e u r o n s , r e s u l t i n g i n f u n c t i o n a l a u t o n o m y o f t h e E N S . S u c h a l t e r a t i o n s m a y a l l o w e n t e r i c n e u r o n s t o f u n c t i o n i n t h e a b s e n c e o f m o d u l a t o r y e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n , o r e v e n t o c o n t r o l p r o c e s s e s p r e v i o u s l y m e d i a t e d b y e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n . A n a t o m i c a l E v i d e n c e o f D e n e r v a t i o n - I n d u c e d A l t e r a t i o n s o f E n t e r i c N e r v e s S u r g i c a l d e n e r v a t i o n p r o c e d u r e s w e r e d e v e l o p e d o r i g i n a l l y t o d e t e r m i n e t h e c o n t r i b u t i o n o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n t o G 1 f u n c t i o n s . I n t h e p a s t t w e n t y y e a r s , d e n e r v a t i o n p r o c e d u r e s h a v e b e e n u s e d t o e s t a b l i s h t h e o r i g i n o f n e r v e s w i t h i n t h e G I t r a c t ( F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 7 8 ; C o s t a 2 ! a l . , 1 9 8 1 ; F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 2 ; C o s t a a n d F u r n e s s , 1 9 8 3 ; F u r n e s s e t a l . , 1 9 8 3 b ; C o s t a e t a l . , 1 9 8 4 ; F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ; C o s t a e t a l . , 1 9 9 2 ) . H o w e v e r , G a l l i g a n e t a l . ( 1 9 8 8 ) o b s e r v e d t h a t s u r g i c a l d e n e r v a t i o n o f l o o p s o f g u i n e a p i g i l e u m o r s e v e r i n g c e l i a c g a n g l i o n i c a x o n s a l t e r s i n n e r v a t i o n o f s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s . A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , e x t r i n s i c p e r i v a s c u l a r a n d p a r a v a s c u l a r s y m p a t h e t i c a n d S P - a n d C G R P - i t s e n s o r y n e r v e s a r e a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s . O n e w e e k a f t e r s u r g i c a l d e n e r v a t i o n , t h e s e n e r v e s w e r e n o t d e t e c t e d b y i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y , a l t h o u g h f a i n t S P - i r n e r v e s w e r e f o u n d a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s . T h e s e n e r v e s w e r e d i f f e r e n t f r o m 6 3 e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e s , a s t h e y w e r e t h i n n e r t h a n e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e s , h a d f e w e r a n d s m a l l e r v a r i c o s i t i e s , d i d n o t c o n t a i n C G R P - i r , a n d w e r e i n s e n s i t i v e t o s y s t e m i c a d m i n i s t r a t i o n o f c a p s a i c i n . G a l l i g a n a n d c o - w o r k e r s a l s o d e s c r i b e d f o r m a t i o n o f a p e r i v a s c u l a r p l e x u s t h a t c o n t a i n e d V I P - i r , a l t h o u g h V I P - i r i s o n l y r a r e l y a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s i n n o r m a l i l e u m . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e d a t a s u g g e s t t h a t l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n r e s u l t e d i n n e w S P - a n d V I P - i r i n n e r v a t i o n o f s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s . A f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , n e i t h e r p o p u l a t i o n o f e x t r i n s i c n e r v e fi b e r s s u r v i v e , y e t t h e d e n e r v a t e d s m a l l i n t e s t i n e d o e s n o t b e c o m e i s c h e m i c , s u g g e s t i n g t h e E N S h a s r e s p o n d e d t o l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n t o r e g u l a t e v a s o c o n s t r i c t i o n a n d v a s o d i l a t i o n . F u n c t i o n a l E v i d e n c e o f D e n e r v a t i o n - I n d u c e d A l t e r a t i o n s o f E n t e r i c N e r v e s T h e D i a m t r a k o n l i n e v i d e o - m o n i t o r i n g s y s t e m ( N e i l d , 1 9 8 9 ) w a s u s e d t o e x a m i n e n e u r o g e n i c r e g u l a t i o n o f b l o o d fl o w i n s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s o f s u r g i c a l l y - d e n e r v a t e d p r e p a r a t i o n s . L o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n h a d p r o f o u n d e f f e c t s o n e n t e r i c v a s o m o t o r n e u r o n s , a s v a s o d i l a t i o n o f s m a l l a r t e r i o l e s ( m e a s u r i n g l e s s t h a n 4 0 u m ) w a s 1 6 0 % g r e a t e r t h a n n o r m a l p r e p a r a t i o n s , a n d v a s o d i l a t i o n o f l a r g e r a r t e r i o l e s ( m e a s u r i n g g r e a t e r t h a n 4 0 p m ) w a s 7 5 % l a r g e r t h a n n o r m a l v a s o d i l a t i o n ( G a l l i g a n e t a l . , 1 9 9 0 ) . A l t h o u g h s t i m u l a t i o n o f 6 7 % o f s u b m u c o s a l g a n g l i a i n c o n t r o l a n d n o r m a l p r e p a r a t i o n s d i l a t e d a r t e r i o l e s ( N e i l d e t a l . , 1 9 8 9 ; G a l l i g a n e t a l . , 1 9 9 0 ) , s t i m u l a t i o n o f 9 7 % o f s u b m u c o s a l g a n g l i a d i l a t e d a r t e r i o l e s i n s u r g i c a l l y - d e n e r v a t e d p r e p a r a t i o n s ( G a l l i g a n e t a l . , 1 9 9 0 ) . T h e r e r e s u l t s s u g g e s t l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n i n c r e a s e d v a s o d i l a t o r s u b s t a n c e s i n a l m o s t a l l s u b m u c o s a l g a n g l i a . I n t e r e s t i n g l y , a l t h o u g h m A C h r e c e p t o r a n t a g o n i s t s i n h i b i t e d a l l n e u r o g e n i c v a s o d i l a t i o n s i n n o r m a l p r e p a r a t i o n s , t h e s e d r u g s a t t e n u a t e d o n l y a p o r t i o n o f n e u r o g e n i c v a s o d i l a t i o n a f t e r d e n e r v a t i o n ( G a l l i g a n e t a l . , 1 9 9 0 ) . T h e 6 4 t a c h y k i n i n r e c e p t o r a n t a g o n i s t s s p a n t i d e , D - A r g ' , D - P r o z , D - T r p 7 ' 9 , L e u ” - S P , a n d D - A r g ' , D - P h e ’ , D - T r p 7 ' 9 , L e u ” - S P i n h i b i t e d t h e n o n - c h o l i n e r g i c c o m p o n e n t o f v a s o d i l a t i o n ( G a l l i g a n e t a l . , 1 9 9 0 ) . E x t r i n s i c d e n e r v a t i o n d i d n o t a l t e r a r t e r i o l a r r e s p o n s i v e n e s s t o m u s c a r i n e , s u g g e s t i n g d i f f e r e n c e s i n n e u r o g e n i c v a s o d i l a t i o n w e r e n o t d u e t o d i f f e r e n c e s i n r e c e p t o r s o n s m o o t h m u s c l e o r e n d o t h e l i u r n . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e d a t a i l l u s t r a t e t h a t n e w S P - i r n e r v e s o b s e r v e d a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n o f l o o p s o f i l e u m h a v e f u n c t i o n a l s i g n i fi c a n c e i n n e u r o g e n i c v a s o d i l a t i o n o f s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s . A s e n t e r i c S P - i r p a r a v a s c u l a r n e r v e s a n d n o n - c h o l i n e r g i c v a s o d i l a t i o n s a r e n o t o b s e r v e d i n p r e p a r a t i o n s f r o m u n o p e r a t e d a n i m a l s , e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n a p p e a r s t o i n d u c e a n a t o m i c a l a n d f u n c t i o n a l a l t e r a t i o n s i n e n t e r i c n e u r o n s . S t a t e m e n t o f P u r p o s e T h e s t u d i e s b y G a l l i g a n a n d c o - w o r k e r s s u p p o r t t h e h y p o t h e s i s t h a t l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n i n d u c e s c o m p e n s a t o r y c h a n g e s i n e n t e r i c n e u r o n s t o a l l o w c o n t i n u a t i o n o f d i g e s t i v e p r o c e s s e s . T h e fi r s t g o a l o f t h i s d i s s e r t a t i o n w a s t o d e t e r m i n e t h e s o u r c e o f n e w S P - a n d V I P - i r n e r v e s a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s b y c o m b i n i n g a n a t o m i c a l t r a c i n g w i t h t h e r e t r o g r a d e d y e fl u o r o - g o l d a n d i m m u n o h i s t o - c h e m i s t r y . G a l l i g a n a n d c o w o r k e r s ( 1 9 8 8 ) d e m o n s t r a t e d n e w S P - i r i n n e r v a t i o n w a s n o t s e n s i t i v e t o c a p s a i c i n , s u g g e s t i n g t h e s e n e r v e s o r i g i n a t e d f r o m e n t e r i c s o u r c e s . H o w e v e r , t h e s o u r c e o f t h i s i n n e r v a t i o n w a s n o t i d e n t i fi e d . T h e s e c o n d g o a l w a s t o d e t e r m i n e t h e m e c h a n i s m f o r t h e a p p e a r a n c e o f n e w S P - a n d V I P - i r n e r v e s . A n a t o m i c a l s t u d i e s h a v e s h o w n a x o n a l s p r o u t i n g , p h e n o t y p i c a l t e r a t i o n s i n e x i s t i n g n e r v e fi b e r s , a n d u p - r e g u l a t i o n o f e x i s t i n g n e u r o c h e m i c a l s c a n o c c u r f o l l o w i n g a x o t o m y o f p e r i p h e r a l n e r v e s o r d e c e n t r a l i z a t i o n o f a u t o n o m i c n e r v e s . I m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t u d i e s f o r n e u r o p e p t i d e s a n d 6 5 n e u r o fi l a m e n t s w e r e u s e d t o d i s c r i m i n a t e b e t w e e n t h e s e p o s s i b i l i t i e s . S u r g i c a l d e n e r v a t i o n o f t h e i n t e s t i n e d e s t r o y s e x t r i n s i c s y m p a t h e t i c , p a r a s y m p a t h e t i c , a n d s e n s o r y n e r v e s . T h e r e f o r e , t h e t h i r d s t u d y u s e d n e u r o t o x i n s t o s e l e c t i v e l y e l i m i n a t e s y m p a t h e t i c o r s e n s o r y n e r v e s t o d e t e r m i n e t h e i d e n t i t y o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n r e s p o n s i b l e f o r a l t e r e d i n n e r v a t i o n o f s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s . F 0 5 i s a n e a r l y i m m e d i a t e g e n e p r o t e i n e n c o d e d b y c - f a s , a n d i s a n i n d e x o f i n c r e a s e d o r i n c r e a s i n g n u c l e a r a c t i v i t y . T h e r e f o r e , l o c a l i z a t i o n o f F o s - i r w a s u s e d t o d e t e r m i n e i f s p e c i fi c s u b p o p u l a t i o n s o f e n t e r i c n e u r o n s r e s p o n d e d t o l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s . A s N A D P H d i a p h o r a s e a n d N O S - i r a r e f o u n d i n p e r i v a s c u l a r i n n e r v a t i o n i n s o m e s p e c i e s e x c l u d i n g g u i n e a p i g , t h e fi f t h g o a l o f t h i s d i s s e r t a t i o n w a s t o u s e N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g t o d e t e r m i n e i f e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n i n d u c e d s t a i n i n g i n e n t e r i c n e u r o n s . S u c h c h a n g e s w o u l d b e i n d i c a t i v e o f i n d u c t i o n o f N O S , a n d a p o s s i b l e r o l e o f n i t r i c o x i d e o r i g i n a t i n g f r o m e n t e r i c n e u r o n s . T h e r e f o r e , t h e fi r s t p o r t i o n o f t h i s d i s s e r t a t i o n w i l l f u r t h e r c h a r a c t e r i z e a l t e r a t i o n s i n i n n e r v a t i o n o f s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s a n d e l u c i d a t e t h e s o u r c e a n d u n d e r l y i n g m e c h a n i s m f o r t h e n e w i n n e r v a t i o n . A s d e s c r i b e d b e l o w , n e u r o n a l N A D P H d i a p h o r a s e a n d N O S a r e t h e s a m e e n z y m e , t h u s p r o v i d i n g a n e a s y a n d c o n v e n i e n t h i s t o l o g i c a l s t a i n f o r n i t r i n e r g i c n e r v e s . I n p r e l i m i n a r y s t u d i e s o f p o s s i b l e n i t r i n e r g i c i n n e r v a t i o n o f s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s i n g u i n e a p i g i l e u m , a s i g n i fi c a n t i n c r e a s e o f m y e n t e r i c n e u r o n s c o n t a i n i n g N A D P H d i a p h o r a s e - s t a i n i n g w a s o b s e r v e d a f t e r s u r g i c a l d e n e r v a t i o n o f l o o p s o f i l e u m . N i t r i c o x i d e m e d i a t e s n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n o f G I s m o o t h m u s c l e , a n d i s p r o d u c e d b y t h e r a t e - l i m i t i n g e n z y m e N O S . T h e r e f o r e , t h e p r e l i m i n a r y h i s t o l o g i c a l e x p e r i m e n t s i n d i c a t e d a l t e r a t i o n s i n m y e n t e r i c g a n g l i a t h a t c o u l d p o t e n t i a l l y l e a d t o a l t e r e d c o n t r o l o f m o t i l i t y . T h i s h y p o t h e s i s w a s t e s t e d u s i n g a n a t o m i c a l t e c h n i q u e s a n d f u n c t i o n a l a s s a y s . T h e s i x t h g o a l 6 6 o f t h i s d i s s e r t a t i o n w a s t o c h a r a c t e r i z e N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g f o l l o w i n g 1 0 5 5 o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n , a n d t o d e t e r m i n e t h e i d e n t i t y o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n r e s p o n s i b l e f o r t h e o b s e r v e d c h a n g e s i n s t a i n i n g . S i m i l a r s t u d i e s w e r e p e r f o r m e d u s i n g a n t i s e r u m r a i s e d a g a i n s t N O S . T h e s e v e n t h s t u d y u s e d i n v i t r a n e r v e - m u s c l e p r e p a r a t i o n s t o d e t e r m i n e i f i n c r e a s e d N A D P H d i a p h o r a s e a n d N O S - i r i n m y e n t e r i c n e r v e s r e s u l t e d i n a l t e r e d f u n c t i o n a l i n n e r v a t i o n o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e . A b i o c h e m i c a l a s s a y f o r i n d i r e c t m e a s u r e m e n t o f N O w a s a l s o u s e d t o f u r t h e r c h a r a c t e r i z e d e n e r v a t i o n - i n d u c e d a l t e r a t i o n s i n N O S . T h e s e s t u d i e s i n d i c a t e d c a l c i u m - i n d e p e n d e n t p r o d u c t i o n o f N O c o u l d o c c u r a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , a n d i m m u n o h i s t o c h e m i c a l l o c a l i z a t i o n o f a n i n d u c i b l e f o r m o f N O S w a s p e r f o r m e d . F i n a l l y , i n v i t r o l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s r e v e a l e d n e u r o g e n i c c o n t r a c t i o n s p r o c e e d i n g r e l a x a t i o n s w e r e r e d u c e d i n p r e p a r a t i o n s m a d e f r o m d e n e r v a t e d l o o p s o f i l e u m . A s p r e v i o u s w o r k h a d s u g g e s t e d N O m e d i a t e s r e l e a s e o f e x c i t a t o r y e n t e r i c n e u r o t r a n s m i t t e r s , c i r c u l a r m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s w e r e u s e d t o d e t e r m i n e i f s u c h a m e c h a n i s m c o u l d o c c u r i n g u i n e a p i g i l e u m . T a k e n t o g e t h e r , t h e s t u d i e s o n i n n e r v a t i o n o f s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s a n d l o n g i t u d i n a l m u s c l e h a v e s t r e n g t h e n e d t h e h y p o t h e s i s t h a t l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n r e s u l t s i n a l t e r a t i o n s i n e n t e r i c n e r v e s , a n d h a v e p r o v i d e d t h e fi r s t e v i d e n c e o f a l t e r a t i o n s i n i n h i b i t o r y i n n e r v a t i o n o f t h e G I t r a c t . T h e r e m a i n d e r o f t h e i n t r o d u c t o r y s e c t i o n o f t h e d i s s e r t a t i o n p r o v i d e s b a c k g r o u n d i n f o r m a t i o n o n s p e c i fi c a p p r o a c h e s u s e d t o a c h i e v e t h e g o a l s o u t l i n e d i n t h e p r e c e d i n g s e c t i o n , a s w e l l a s a r a t i o n a l e f o r t h e c h o s e n m o d e l u t i l i z e d i n t h e s t u d i e s . 6 7 7 . N E U R O F I L A M E N T P R O T E I N S T h e n e u r o n a l c y t o s k e l e t o n i s c o m p o s e d o f s t r u c t u r a l p r o t e i n s t h a t m a y b e i m p o r t a n t i n m a i n t e n a n c e o f a x o p l a s m i c s p a c e ( S h a w , 1 9 8 6 ; S h a w , 1 9 9 1 ) , o r i n r e g u l a t i o n o f c e l l m o r p h o l o g y , a x o n c a l i b e r ( H o f f m a n e t a l . , 1 9 8 4 ) , i n t r a c e l l u l a r C a 2 + ( L e f e b v r e a n d M u s h y n s k i , 1 9 8 7 , 1 9 8 8 ) o r a x o n a l t r a n s p o r t ( H o f f m a n e t a l . , 1 9 8 5 ) . T h e s e s t r u c t u r a l p r o t e i n s i n c l u d e t h e i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n s , w h i c h i n t u r n , a r e c o m p r i s e d o f p r o t e i n s i n c l u d i n g t h e n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n t r i p l e t . T h e n e u r o fi l a m e n t t r i p l e t i s t h e m a j o r i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n i n n e u r o n s , a n d i s m a d e o f h e t e r o p o l y m e r s o f t h r e e s e p a r a t e g e n e p r o d u c t s ( C s o z n e k e t a l . , 1 9 8 0 ) w i t h S D S - P A G E e s t i m a t e d m o l e c u l a r w e i g h t s o f 6 8 K D a ( l i g h t m o l e c u l a r w e i g h t n e u r o fi l a m e n t , N F - L ) , 1 5 0 K D a ( m e d i u m m o l e c u l a r w e i g h t n e u r o fi l a m e n t , N F - M ) a n d 2 0 0 k D a ( h e a v y m o l e c u l a r w e i g h t n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n , N F - H ) ( H o f f m a n a n d L a s e k , 1 9 7 5 ; L i e m e t a l . , 1 9 7 8 ) . A l t h o u g h t h e s u b u n i t s o f t h e n e u r o fi l a m e n t t r i p l e t h a v e h o m o l o g o u s p r i m a r y a n d s e c o n d a r y s t r u c t u r e s ( r e v i e w e d i n S h a w , 1 9 9 1 ) , a n t i b o d i e s c a n d i s c r i m i n a t e b e t w e e n t h e s u b u n i t s i n i m m u n o b l o t s ( S h a w a n d W e b e r , 1 9 8 1 ; L e e e t a l . , 1 9 8 2 ) a n d i n i m m u n o h i s t o l o g i c a l e x p e r i m e n t s ( T r o j a n o w s k i e t a l . , 1 9 8 6 ) . I n t e r e s t i n g l y , s u c h s t u d i e s h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t a l t h o u g h a l l n e u r o n s w e r e t h o u g h t t o c o n t a i n n e u r o fi l a m e n t s , s o m e n e u r o n s d o n o t c o n t a i n n e u r o fi l a m e n t t r i p l e t p r o t e i n s ( S h a w a n d W e b e r , 1 9 8 1 ; S h a w e t a l . , 1 9 8 1 a , 1 9 8 1 b ; S h a r p e t a l . , 1 9 8 2 ; D e b u s e t a l . , 1 9 8 2 ; T r o j a n o w s k i e t a l . , 1 9 8 5 ; V i c k e r s a n d C o s t a , 1 9 9 2 ) , o r l a c k o n e o r m o r e o f t h e s u b u n i t s ( G o l d s t e i n e t a l . , 1 9 8 3 ; L i e m e t a l . , 1 9 7 8 ; T r o j a n o w s k i e t a l . , 1 9 8 5 ) . 6 8 M i c r o h e t e r o g e n i t y o f N e u r o fi l a m e n t P r o t e i n s S t u d i e s w i t h a n t i s e r u m r a i s e d a g a i n s t N F - L , N F - M , o r N F - H r e v e a l t h a t n e u r o fi l a m e n t s u b u n i t s a r e u n e q u a l l y d i s t r i b u t e d w i t h i n i n d i v i d u a l n e u r o n s . M i c r o - h e t e r o g e n e i t y i n t h e d i s t r i b u t i o n o f n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n s w a s fi r s t d e s c r i b e d i n D R G n e u r o n s i n v i t r a . A n t i s e r a r a i s e d a g a i n s t N F - L o r N F - M r e c o g n i z e d D R G s o m a t a b u t w e r e u n a b l e t o r e c o g n i z e a x o n s ( S h a r p e t a l . , 1 9 8 2 ; D e b u s e t a 1 . , 1 9 8 2 ) . H o w e v e r , a x o n s c o n t a i n e d N F - H - i r , s u g g e s t i n g a n u n e q u a l d i s t r i b u t i o n o f N F p r o t e i n s w i t h i n i n d i v i d u a l n e u r o n s . S i m i l a r r e s u l t s a r e o b t a i n e d i n t h e b r a i n , a s N F - L - a n d N F - M - i r a r e f o u n d i n s o m a t a a n d d e n d r i t e s o f p y r a m i d a l c e l l s i n t h e c e r e b e l l u m ( D e b u s e t a l . , 1 9 8 2 ; T r o j a n o w s k i e t a l . , 1 9 8 5 ) a n d c o r t e x ( S h a w e t a l . , 1 9 8 1 ; D a h l , 1 9 8 3 ) , a l t h o u g h N F - H - i r i s l o c a l i z e d o n l y i n a x o n s . F u r t h e r m o r e , h e a v y w e i g h t N F p r o t e i n - i r i s n o t f o u n d i n c e l l b o d i e s a n d d e n d r i t e s o f h i p p o c a r n p u s , b r a i n s t e m ( S h a w e t a l . , 1 9 8 1 ) , a n d s p i n a l m o t o r n e u r o n s ( D a h l , 1 9 8 3 ) . T h i s p a t t e r n o f N F - i r i s h y p o t h e s i z e d t o h a v e f u n c t i o n a l s i g n i fi c a n c e , a s N F - L a n d N F - M a r e t h o u g h t t o r e p r e s e n t i n t e g r a l c o m p o n e n t s o f n e u r o n a l c y t o s t r u c t u r e , w h e r e a s N F - H m a y o n l y b e i n c o r p o r a t e d i n t o a x o n s t o s e r v e a y e t - d e fi n e d p h y s i o l o g i c a l r o l e ( r e v i e w e d i n T r o j a n o w s k i e t a l . , 1 9 8 5 ; 1 9 8 6 ) H o w e v e r , o t h e r i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t u d i e s d e t e c t e d N F - H - i r i n c e r e b e l l a r P u r k i n j e c e l l s o m a t a a n d d e n d r i t e s ( G o l d s t e i n e t a l . , 1 9 8 3 ) , r e s u l t i n g i n m u c h c o n t r o v e r s y o v e r t h e t r u e d i s t r i b u t i o n o f t h e c o m p o n e n t s o f N F - t r i p l e t . P h o s p h o r y l a t i o n o f N e u r o fi l a m e n t P r o t e i n s I n 1 9 8 3 , G o l d s t e i n , S t e r n b e r g e r a n d S t e r n b e r g e r a d v a n c e d t h e fi e l d o f n e u r o fi l a m e n t r e s e a r c h a n d e x p l a i n e d t h e d i s c r e p a n c y f o r c o n fl i c t i n g r e p o r t s o f d i s t r i b u t i o n o f N F - H . G o l d s t e i n a n d c o - w o r k e r s r a i s e d a n d c h a r a c t e r i z e d a s e r i e s o f m o n o c l o n a l 6 9 a n t i b o d i e s r a i s e d a g a i n s t r a t h y p o t h a l a m u s , a n d d e s c r i b e d a n u m b e r o f a n t i b o d i e s t h a t s p e c i fi c a l l y r e c o g n i z e d N F - M , N F - H , o r N F - M a n d N F - H a s s h o w n b y W e s t e r n a n a l y s i s . A l t h o u g h t h e s e r i e s o f a n t i b o d i e s s h o u l d h a v e r e c o g n i z e d s i m i l a r s t r u c t u r e s i n b r a i n s l i c e s , t h e y f o u n d t h e a n t i b o d i e s c o u l d b e c l a s s i fi e d i n t o f o u r g r o u p s b a s e d o n t h e i r p a t t e r n o f i m m u n o r e a c t i v i t y , a s N F - H a n t i b o d i e s r e c o g n i z e d ( i ) s y n a p s e s , ( i i ) n e u r o fi b e r s , ( i i i ) p e r i k a r y a a n d d e n d r i t e s , o r ( i v ) n e u r o fi b e r s a n d p e r i k a r y a ( S t e r n b e r g e r a n d S t e r n b e r g e r , 1 9 8 3 ) . A f t e r i n v e s t i g a t i n g t h e a p p a r e n t d i s c r e p a n c y i n N F - H i m m u n o r e a c t i v i t y , t h e y c o n c l u d e d t h a t m o s t h e t e r o g e n e i t y i n N F - H - i r w a s n o t p r e - t r a n s l a t i o n a l , b u t r e s u l t e d f r o m p o s t - t r a n s l a t i o n a l m o d i fi c a t i o n s o f N F e p i t o p e s . P h o s p h a t a s e t r e a t m e n t o f b r a i n s e c t i o n s o r g e l s d e s t r o y e d i m m u n o r e a c t i v i t y o f a n t i b o d i e s t h a t p r e f e r e n t i a l l y r e c o g n i z e d n e u r o fi b e r s , b u t d i d n o t a l t e r a n t i b o d i e s t h a t r e c o g n i z e d p e r i k a r y o n . C o n v e r s e l y , t r e a t m e n t w i t h t h e p r o t e o l y t i c e n z y m e t r y p s i n a b o l i s h e d i m m u n o r e a c t i v i t y o f a n t i b o d i e s t h a t p r e f e r e n t i a l l y r e c o g n i z e d p e r i k a r y o n , b u t d i d n o t a l t e r i m m u n o r e a c t i v i t y o f a n t i b o d i e s t h a t r e c o g n i z e d a x o n s ( S t e r n b e r g e r a n d S t e r n b e r g e r , 1 9 8 3 ) . A s p h o s p h a t a s e r e m o v e s p h o s p h a t e g r o u p s , t h e s e d a t a i n d i c a t e d a x o n s , b u t n o t p e r i k a r y a , c o n t a i n e d p h o s p h o r y l a t e d h e a v y m o l e c u l a r w e i g h t n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n ( p N F - H - i r ) . H o w e v e r , p e r i k a r y a i n t h e C N S c o n t a i n e d n o n - p h o s p h o r y l a t e d o r l i g h t l y - p h o s p h o r y l a t e d h e a v y m o l e c u l a r w e i g h t n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n ( n p N F - H - i r ) , a s p h o s p h a t a s e t r e a t m e n t d i d n o t a l t e r t h e e p i t o p e s o f p e r i k a r y o n - s p e c i fi c a n t i b o d i e s . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t a s i n g l e n e u r o n c a n c o n t a i n h e t e r o g e n o u s d i s t r i b u t i o n o f p h o s p h o r y l a t e d a n d n o n p h o s p h o r y l a t e d N F - H p r o t e i n s . A s d i s c u s s e d p r e v i o u s l y , s o m e c e n t r a l a n d p e r i p h e r a l n e u r o n s d o n o t a p p e a r t o c o n t a i n N F p r o t e i n s . H o w e v e r , p e r i k a r y a , d e n d r i t e s , a n d a x o n s d i f f e r i n t h e i r c o m p o s i t i o n 7 0 o f n e u r o fi l a m e n t t r i p l e t p r o t e i n s u b u n i t s , a s w e l l a s i n t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f s u b u n i t p r o t e i n s . B i o c h e m i c a l s t u d i e s h a v e s h o w n t h e p r e s e n c e o f m u l t i p l e p h o s p h o r y l a t e d s e q u e n c e s o f N F - M a n d N F - H ( G o l d s t e i n e t a l . , 1 9 8 3 ; N i x o n e t a l . , 1 9 8 9 ; S t e r n b e r g e r a n d S t e r n b e r g e r , 1 9 8 3 ) . T h e c a r b o x y l - t e r m i n a l t a i l d o m a i n o f N F - M a n d N F - H c o n t a i n a s m a n y a s 5 4 r e p e a t s o f h e x a p e p t i d e s e q u e n c e s c o n t a i n i n g K S P ( l y s i n e , s e r i n e , p r o l i n e ) m o t i f s ( J u l i e n a n d M u s h y n s k i , 1 9 8 2 ) . S e v e r a l p r o t e i n k i n a s e s i n c l u d i n g c A M P d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e , m u l t i f u n c t i o n a l C a y / c a l m o d u l i n d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e , a n d p r o t e i n k i n a s e C p h o s p h o r y l a t e s e r i n e i n K S P s e q u e n c e s i n v i v a a n d i n v i t r a ( L e t e r r i e r e t a l . , 1 9 8 1 ; T a n a k a e t a l . , 1 9 8 4 ; V a l l a n o e t a l . , 1 9 8 5 ; S i h a g e t a l . 1 9 8 8 ; r e v i e w e d i n S h a w , 1 9 9 1 ) r e s u l t i n g i n h i g h l y p h o s p h o r y l a t e d N F - M , a n d e s p e c i a l l y N F - H p r o t e i n s . F u r t h e r m o r e , m o s t a n t i b o d i e s r a i s e d a g a i n s t N F - M a n d N F - H p r i o r t o 1 9 8 3 r e c o g n i z e d p h o s p h o r y l a t e d e p i t o p e s o f N F p r o t e i n s . A s a r e s u l t , N F - M - a n d N F - H - i r w a s f o u n d o n l y i n s t r u c t u r e s w h i c h c o n t a i n e d p h o s p h o r y l a t e d e p i t o p e s , s u c h a s a x o n s . H o w e v e r , a t l e a s t s o m e s o m a t a c o n t a i n n p N F - M - a n d n p N F - H - i r , a s d e v e l o p m e n t o f a n t i b o d i e s a g a i n s t n p N F - M a n d n p N F - H r e v e a l t h e p r e s e n c e o f n p N F - M - a n d n p N F - H - i r i n c e n t r a l ( S t e r n b e r g e r a n d S t e r n b e r g e r , 1 9 8 3 ) a n d p e r i p h e r a l ( C a r d e n e t a l . , 1 9 8 5 ) p e r i k a r y a a n d d e n d r i t e s . T h e p h y s i o l o g i c a l r a m i fi c a t i o n s o f p h o s p h o r y l a t i o n o f N F - p r o t e i n s i s n o t k n o w n a t t h i s t i m e . H i g h l y - p h o s p h o r y l a t e d c a r b o x y l t e r m i n a l s o f N F - H p r o t e i n a r e s t e r i c a l l y - h i n d e r e d a n d p r o j e c t r a d i a l l y i n t o a x o p l a s m i c s p a c e . A s d i s c u s s e d p r e v i o u s l y , p h o s p h o r y l a t e d K S P s e q u e n c e s a r e m o r e a b u n d a n t i n a x o n s c o m p a r e d t o d e n d r i t e s . F u r t h e r m o r e , a x o n s a r e m o r e s t a b l e t o p r o t e a s e s ( G o l d s t e i n e t a l . , 1 9 8 8 ; S t e r n b e r g e r a n d S t e r n b e r g e r , 1 9 8 3 ) , s u g g e s t i n g p h o s p h o r y l a t i o n m a y p r o t e c t t h e c a r b o x y l t e r m i n a l s f r o m 7 1 d e g r a d a t o r y c e l l u l a r p r o c e s s e s . A l t e r n a t i v e l y , p h o s p h o r y l a t i o n o f n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n s m a y a c t u a l l y i n d u c e c h a r g e r e p u l s i o n s t h a t i n c r e a s e s p a c i n g b e t w e e n 1 0 n m i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n s , r e s u l t i n g i n fi l l i n g o f a x o p l a s m i c s p a c e ( S h a w , 1 9 8 6 ; S h a w , 1 9 9 1 ) , o r i n c o n t r o l o f a x o n c a l i b e r ( H o f f m a n e t a l . , 1 9 8 4 ; H o f f m a n e t a l . , 1 9 8 5 ) . G r e a t e r a x o p l a s n r i c s p a c e o r a x o n c a l i b e r w o u l d t h e n a l l o w f o r g r e a t e r c o n d u c t i o n v e l o c i t y ( r e v i e w e d i n H o f f m a n e t a l . , 1 9 8 4 ; H o f f m a n e t a l . , 1 9 8 5 ) . A l t h o u g h p h o s p h o r y l a t i o n o f N F - M a n d N F - H d o e s n o t e f f e c t t h e a b i l i t y o f t h e s u b u n i t s t o a s s e m b l e i n t o 1 0 n m fi l a m e n t s ( G e o r g e s e t a l . , 1 9 8 6 ) , t h e a d d i t i o n o f p N F - H m a y s t a b i l i z e b u n d l e s o f a x o n s . C o v a l e n t o r w e a k i n t e r a c t i o n s b e t w e e n p h o s p h a t e g r o u p s o n n e i g h b o r i n g a x o n s m a y i n c r e a s e a x o n a l s t a b i l i t y a n d f a s c i c u l a r s t r e n g t h b y a l l o w i n g i n t e r a c t i o n s b e t w e e n 1 0 n m fi l a m e n t s . H o w e v e r , u n t i l s i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s i s u s e d t o d e s t r o y K S P s e q u e n c e s , t h e f u n c t i o n o f p h o s p h o r y l a t i o n o f N F - H w i l l n o t b e k n o w n . N e u r o fi l a m e n t P r o t e i n s a r e D e v e l o p m e n t a l l y - R e g u l a t e d N e u r o fi l a m e n t t r i p l e t p r o t e i n s s h o w a c o m m o n d e v e l o p m e n t a l p a t t e r n i n r a t s ( N a s a l e t a l . , 1 9 8 6 ) , a m p h i b i a n s ( W e a s e l e t a l . , 1 9 8 9 ) , a n d o t h e r v e r t e b r a t e s ( r e v i e w e d i n S h a w , 1 9 9 1 ) . D u r i n g e m b r y o g e n e s i s , a b u n d a n t N F - L - i r p r o t e i n s i s f o u n d i n p e r i k a r y a , d e n d r i t e s , a n d a x o n s . T h e N F - L p r o t e i n a s s o c i a t e s w i t h w e a k l y p h o s p h o r y l a t e d N F - M ( N a s a l e t a l . , 1 9 8 6 ) i n a l l s t r u c t u r e s o f t h e c e l l . H o w e v e r , i t i s h y p o t h e s i z e d t h a t i n c o r p o r a t i o n o f w e a k l y p h o s p h o r y l a t e d N F - H m a y p r o v i d e a s i g n a l t o t h e c e l l , r e s u l t i n g i n m a t u r a t i o n o f t h e c y t o s k e l e t o n , a n d t r a n s f o r m a t i o n o f t h e d e v e l o p i n g n e u r o n i n t o a d i f f e r e n t i a t e d a d u l t n e u r o n . A l t h o u g h t h e e x a c t t e m p o r a l s e q u e n c e i s u n k n o w n , p r o t e i n k i n a s e s s u c h a s C A M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e a n d p r o t e i n k i n a s e C p h o s p h o r y l a t e s e r i n e r e s i d u e s f o u n d i n K S P s e q u e n c e s , a n d t r a n s f o r m w e a k l y p h o s p h o r y l a t e d N F - H t o a n a d u l t p a t t e r n 7 2 c o m p r i s e d o f a m a x i m u m o f f o r t y - t h r e e p h o s p h o r y l a t i o n s i t e s o n t h e c a r b o x y l t e r m i n a l ( L e e e t a l . , 1 9 9 1 ; S c h i l l i n g a n d P i l g r i m , 1 9 9 0 ) . S t u d i e s o f a x o n a l s p r o u t i n g o f s c i a t i c n e r v e s r e v e a l t h a t a x o n a l i n j u r y b y c r u s h i n g o r a x o t o m y m a y r e s u l t i n r e c a p i t u l a t i o n t o i m m a t u r e , l i g h t l y p h o s p h o r y l a t e d N F - H . F o r e x a m p l e , a f t e r s c i a t i c n e r v e l e s i o n , e n z y m e - l i n k e d i m m u n o a b s o r b a n t a s s a y s ( E L I S A s ) a n d i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t u d i e s s h o w a s i g n i fi c a n t d e c r e a s e i n t h e i m m u n o r e a c t i v i t y o f S M I 3 1 ( S c h i l l i n g a n d P i l g r i m , 1 9 9 0 ) . A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , S M I 3 1 s e l e c t i v e l y r e c o g n i z e s a p h o s p h o r y l a t e d e p i t o p e o n e x t e n s i v e l y p h o s p h o r y l a t e d N F - H , t h u s i n d i c a t i n g t h a t c r i t i c a l p h o s p h a t e s h a v e b e e n l o s t o r r e m o v e d . F u r t h e r m o r e , S M I 3 2 , a m o n o c l o n a l a n t i b o d y r a i s e d a g a i n s t a n o n p h o s p h o r y l a t e d e p i t o p e o f N F - H s i g n i fi c a n t l y i n c r e a s e s u p o n n e r v e i n j u r y . T h e i n c r e a s e i n n o n p h o s p h o r y l a t e d e p i t o p e s m a y r e s u l t f r o m l o s s o f p h o s p h o r y l a t i o n o f p r e v i o u s l y - m a t u r e a x o n s . A l t e r n a t i v e l y , i n c r e a s e d n p N F - H - i r m a y o c c u r b y a x o n a l s p r o u t i n g o r b r a n c h i n g o f n e w n e r v e s , t h u s r e v e a l i n g n e w n o n p h o s p h o r y l a t e d e p i t o p e s t h a t h a v e n o t h a d t h e o p p o r t u n i t y t o b e c o m e p h o s p h o r y l a t e d . T h i s t h e o r y o f a x o n a l s p r o u t i n g o r b r a n c h i n g i s s u p p o r t e d , a s t h e i n c r e a s e i n S M I 3 2 f o l l o w i n g i n j u r y a p p e a r s t o o c c u r a t t h e t i p s o f a x o n s w h e r e a x o n a l g r o w t h w o u l d p r o g r e s s ( P e s t r o n k e t a l . , 1 9 9 0 ) . I n t e r e s t i n g l y , t h e w e a k l y p h o s p h o r y l a t e d N F - H i s t h e p r e d o m i n a n t f o r m o f N F - H d u r i n g n o r m a l e m b r y o g e n e s i s a n d g r o w t h o f a x o n s . N e u r o fi l a m e n t s i n A u t o n o m i c N e r v e s M a n y s t u d i e s h a v e c h a r a c t e r i z e d n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n - l i k e i m m u n o r e a c t i v i t y ( N F - i r ) i n t h e C N S , b u t f e w s t u d i e s h a v e e x a m i n e d n e u r o fi l a m e n t l o c a l i z a t i o n i n t h e a u t o n o m i c n e r v o u s s y s t e m ( A N S ) . A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , t h e fi r s t s t u d i e s o f m i c r o h e t e r o g e n e i t y o f N F p r o t e i n s w e r e d o n e o n c u l t u r e s o f d o r s a l r o o t g a n g l i a . A l t h o u g h s e n s o r y g a n g l i a 7 3 a r e n o t p a r t o f t h e A N S , a s u b p o p u l a t i o n o f s m a l l D R G c e l l s c o n t a i n N F - M - i r i n s i t u ( V i t a d e l l o e t a l . , 1 9 8 7 ) . N e u r o fi l a m e n t - M - i r i s n o t o b s e r v e d i n l a r g e c e l l s . N e u r o fi l a m e n t t r i p l e t - i r i s o b s e r v e d a l s o i n p a r a s y m p a t h e t i c a n d s y m p a t h e t i c g a n g l i a . T h e b e s t c h a r a c t e r i z a t i o n o f n e u r o fi l a m e n t t r i p l e t - i r i s i n c e l i a c g a n g l i o n o f g u i n e a p i g , a s 2 0 % o f p o s t g a n g l i o n i c s y m p a t h e t i c n e u r o n s c o n t a i n N F - L - , N F - M - , a n d n p N F - H - i r ( V i c k e r s e t a l . , 1 9 9 0 ) . M o s t o f t h e N F - p o s i t i v e n e u r o n s d o n o t c o n t a i n N P Y - , b u t d o c o n t a i n s o m a t o s t a t i n - i r ( V i c k e r s e t a l . , 1 9 9 0 ) , s u g g e s t i n g n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n s m a y b e e x p r e s s e d i n s o m e c e l l s t o s e r v e a c e r t a i n p u r p o s e o r f u n c t i o n t h a t i s n o t n e e d e d i n o t h e r c e l l s . S o m e e n t e r i c n e u r o n s c o n t a i n N F - i r , a l t h o u g h t h e d i s t r i b u t i o n o f i m m u n o r e a c t i v i t y i s d e p e n d e n t o n t h e t a r g e t a n t i g e n a n d t h e a n t i b o d y u s e d . F o r e x a m p l e , p r e v i o u s r e p o r t s h a v e f o u n d t h a t 1 5 % o f m y e n t e r i c n e u r o n s , a n d n o s u b m u c o s a l n e u r o n s , c o n t a i n N F - L - , N F - M - a n d N F - H - i r i n t h e g u i n e a p i g i l e u m ( C o s t a e t a l . , 1 9 8 9 ) . N F - p r o t e i n s w e r e f o u n d i n ( i ) d y n o r p h i n - , g a s t r i n r e l e a s i n g p e p t i d e - , a n d V I P - i r i n a n a l l y - p r o j e c t i n g D o g i e l t y p e 1 c e l l s a n d ( i i ) d y n o r p h i n - , e n k e p h a l i n - , a n d S P - i r s m a l l o r a l l y - p r o j e c t i n g n e u r o n s ( C o s t a e t a l . , 1 9 8 9 ) . H o w e v e r , i n r e t r o g r a d e t r a c i n g e x p e r i m e n t s f r o m G I s m o o t h m u s c l e , B r o o k e s e t a l . ( 1 9 9 1 b ; 1 9 9 2 ) c o n c l u d e d N F - t r i p l e t p r o t e i n s c o - l o c a l i z e d w i t h V I P - b u t n o t S P - i r i n D o g i e l t y p e I n e u r o n s p r o j e c t i n g t o c i r c u l a r m u s c l e . I n t e r e s t i n g l y , t h e y d i d n o t o b s e r v e N F - i r n e u r o n s t o p r o j e c t t o t h e l o n g i t u d i n a l m u s c l e ( B r o o k e s e t a 1 . , 1 9 9 2 ) . O t h e r r e s e a r c h e r s h a v e r e p o r t e d a l a r g e r d i s t r i b u t i o n o f n e u r o fi l a m e n t s u b u n i t s i n m y e n t e r i c n e u r o n s , a s a n t i s e r u m r a i s e d a g a i n s t 5 0 , 0 0 0 m o l e c u l a r w e i g h t d e g r a d a t i o n p r o d u c t r e a c t s w i t h a l l t h r e e p e p t i d e s i n t h e N F t r i p l e t , a n d r e c o g n i z e s a p p r o x i m a t e l y 1 0 - 5 0 % o f m y e n t e r i c n e u r o n s ( B j o r k l u n d e t a l . , 1 9 8 4 ) . S i m i l a r t o o t h e r s t u d i e s , m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s r a i s e d a g a i n s t n p N F - M a n d n p N F - H r e c o g n i z e s o m e m y e n t e r i c n e u r o n s , 7 4 w h e r e a s p N F - H - i r i s o b s e r v e d i n a x o n s i n i n t e m o d a l s t r a n d s a n d t h e p r i m a r y p l e x u s ( B a k e r e t a l . , 1 9 9 0 ) . U n f o r t u n a t e l y , t h e s e s t u d i e s d i d n o t q u a n t i f y t h e n u m b e r o r d e t e r m i n e t h e i d e n t i t y o f N F - i r m y e n t e r i c n e u r o n s . F i n a l l y , a l t h o u g h C o s t a e t a l . ( 1 9 8 9 ) d i d n o t o b s e r v e N F - p r o t e i n i n s u b m u c o s a l n e u r o n s , N F - M h a s b e e n f o u n d i n S P - o r C G R P - i r s u b m u c o s a l n e u r o n s i n r a t i l e u m ( B u c h a n e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h e r e f o r e , t h e s e s t u d i e s s u g g e s t t h a t a t l e a s t s o m e e n t e r i c n e u r o n s c o n t a i n n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n s . 8 . F 0 8 P R O T E I N T h e f a s o n c o g e n e w a s d i s c o v e r e d i n a v i r a l l y - i n d u c e d m u r i n e o s t e o s a r c o m a ( F i n k e l e t a l . , 1 9 6 6 ) , a n d a c e l l u l a r h o m o l o g u e ( c - f a s ) h a s b e e n o b s e r v e d i n d e v e l o p i n g m a m m a l i a n c e l l s . T h e f a s o n c o g e n e e n c o d e s F 0 5 , a 6 2 - 6 5 k D a n u c l e a r p h o s p h o p r o t e i n t h a t h a s b e e n i m p l i c a t e d i n n o r m a l c e l l g r o w t h ( K o v a r y a n d B r a v o , 1 9 9 1 ; L a u a n d N a t h a n s , 1 9 8 5 ; L a u a n d N a t h a n s , 1 9 8 7 ) , d i f f e r e n t i a t i o n ( C u r r a n a n d M o r g a n , 1 9 8 5 ; K r u j e r e t a l . , 1 9 8 5 ; a n d M i l b r a n d t , 1 9 8 6 ) , a n d d e v e l o p m e n t ( A l c a n t a r a a n d G r e e n o u g h , 1 9 9 3 ; G u b i t s e t a l . , 1 9 8 8 ) , a s m i t o g e n s a n d d i f f e r e n t i a t i o n - s p e c i fi c a n t i g e n s i n d u c e r a p i d a n d t r a n s i e n t e x p r e s s i o n o f F 0 5 . I n s i t u h y b r i d i z a t i o n a n d i m m u n o c y t o c h e m i s t r y h a s r e v e a l e d t h a t F o s c a n b e r a p i d l y a n d t r a n s i e n t l y i n d u c e d i n p h e o c h r o m o c y t o m a 1 2 c e l l s , p o s t - m i t o t i c n e u r o n s i n t h e b r a i n a n d s p i n a l c o r d , a n d d o r s a l r o o t g a n g l i a . S t i m u l i k n o w n t o i n d u c e F o s i n s e l e c t p o p u l a t i o n s o f n e u r o n s i n c l u d e p h a r m a c o l o g i c a l a g e n t s s u c h a s p e n t y l e n e t e t r a z o l ( r e v i e w e d i n M o r g a n a n d C u r r a n , 1 9 8 8 ) , s e i z u r e s ( D r a g u n o w a n d R o b e r t s o n , 1 9 8 7 ) , l i g h t ( A r o n i n e t a l . , 1 9 9 0 ) , s o u n d ( B r o w n e t a l . , 1 9 8 8 ; E h r e t a n d F i s c h e r , 1 9 9 1 ) , i s c h e m i a ( W e s s e l e t a l . , 1 9 9 1 ) , h o r m o n e s a n d g r o w t h f a c t o r s ( M i l b r a n d t , 1 9 8 6 ; B a r t e l e t a l . , 1 9 8 9 ; K r u j e r e t a l . , 1 9 8 5 ) , t r a n s e c t i o n o r s t i m u l a t i o n o f p e r i p h e r a l 7 5 n e r v e s ( L e a h e t a l . , 1 9 9 1 ; C h i e t a l . , 1 9 9 3 a ; C h i e t a l . , 1 9 9 3 b ) , s t i m u l a t i o n o f v i s c e r a l a f f e r e n t n e r v e s ( H u n t , 1 9 8 7 ; B i r d e r e t a l . , 1 9 9 1 ) , a n d s e r u m , p h o r b o l e s t e r s , n e u r o t r a n s m i t t e r s , a n d o t h e r a g e n t s t h a t i n c r e a s e i n t r a c e l l u l a r C a 2 + a n d c A M P ( G r e e n b e r g e t a l . , 1 9 8 5 ; 1 9 8 6 ) . E l e c t r o n m i c r o s c o p i c s t u d i e s h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t a l t h o u g h n e u r o n a l e x c i t a t i o n i n d u c e s c - F o s w i t h i n n e u r o n a l n u c l e i , g l i a l , e p e n d y m a l , a n d e n d o t h e l i a l c e l l s d o n o t e x p r e s s F 0 5 p r o t e i n ( M u g n a i r r i e t a l . , 1 9 8 9 ) . A l t h o u g h t h e p h y s i o l o g i c a l r o l e o f F o s i s n o t c l e a r , e x p r e s s i o n o f F o s a p p e a r s t o b e c o r r e l a t e d w i t h i n c r e a s e d n u c l e a r a c t i v i t y , a n d F o s m a y a c t a s a m e s s e n g e r b e t w e e n s h o r t - l a s t i n g e x t r a c e l l u l a r s i g n a l s a n d l o n g - t e r m n u c l e a r e v e n t s i n n e u r o n s ( r e v i e w e d i n M o r g a n a n d C u r r a n , 1 9 8 9 ) . T h e r e f o r e , i n c r e a s e s i s F o s m a y b e i n v o l v e d i n l o n g - t e r m p r o c e s s i n g o f i n f o r m a t i o n g e n e r a t e d u p o n s h o r t - t e r m s t i m u l u s . A s m a n y t y p e s o f s t i m u l i c a n i n d u c e F o s , t h i s h a s l e a d t o t h e h y p o t h e s i s t h a t n e u r o n a l a c t i v i t y a n d F o s - i r a r e r e l a t e d . F 0 5 h a s b e e n u s e d i n p l a c e o f 2 - d e o x y g l u c o s e i n m a p p i n g o f p o l y s y n a p t i c p a t h w a y s i n t h e C N S ( S c h o p p m a n a n d S t r y k e r , 1 9 8 1 ; B u l l i t t , 1 9 9 0 ) . F o r e x a m p l e , s t i m u l a t i o n o f c e r e b r a l c o r t e x r e s u l t s i n i n c r e a s e d e l e c t r i c a l a c t i v i t y , i n c r e a s e d u p t a k e o f 2 - d e o x y g l u c o s e , a n d i n d u c t i o n o f F o s - i r i n o v e r l a p p i n g p o p u l a t i o n s o f m o t o r a n d s e n s o r y c e r e b e l l a r n e u r o n s ( M o r g a n a n d C u r r a n , 1 9 8 9 ) . F 0 5 i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y a n d i n s i t u h y b r i d i z a t i o n a r e u s e f u l a l s o a s m a r k e r s f o r p h y s i o l o g i c a l a c t i v i t y ( H u n t , 1 9 8 7 ) . F o r e x a m p l e , n o x i o u s s t i m u l i r e s u l t i n e x p r e s s i o n o f c - f o s p r o t e i n i n s p i n a l c o r d a n d t h a l a r n i c n u c l e i p r e v i o u s l y i d e n t i fi e d b y e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l a n d l e s i o n e x p e r i m e n t s t o b e i n v o l v e d i n t r a n s d u c t i o n o f n o x i o u s i n f o r m a t i o n t o h i g h e r b r a i n c e n t e r s ( B u l l i t t , 1 9 9 0 ) . T h e r e f o r e , F o s — i r h a s b e e n s h o w n t o b e a v a l i d m a r k e r f o r n e u r o n s w i t h i n c r e a s e d , o r i n c r e a s i n g , n u c l e a r a c t i v i t y . 7 6 R e g u l a t i o n o f F 0 5 T h e f a s g e n e a n d c o r r e s p o n d i n g p r o t e i n a r e c l o s e l y r e g u l a t e d i n n o r m a l n e u r o n s , a s e x p r e s s i o n o f t h e g e n e c a n h a v e p r o f o u n d e f f e c t s o n c e l l f u n c t i o n i n g . T h e n o r m a l c - f a s g e n e p r o d u c t t r a n s f o r m s fi b r o b l a s t s i n v i t r o ( V e r m a , 1 9 8 6 ) , r e s u l t i n g i n a b n o r m a l c e l l d i v i s i o n . I n t h e p r o c e s s o f s t u d y i n g u n c o n t r o l l e d m i t o s i s , c i s a n d t r a n s r e g u l a t o r y e l e m e n t s a n d p r o t e i n s h a v e b e e n d i s c o v e r e d , l e a d i n g t o a b e t t e r u n d e r s t a n d i n g o f c o n t r o l o f e x p r e s s i o n o f F 0 5 p r o t e i n . F u r t h e r m o r e , a s F 0 5 i s e x p r e s s e d i n n e u r o n s a s s o c i a t e d w i t h h i g h a m o u n t s o f p l a s t i c i t y a n d t r a n s - s y n a p t i c a c t i v i t y , t h e s e r e g u l a t o r s m a y b e c r u c i a l i n c e l l u l a r l e a r n i n g , r e g u l a t i o n o f n e u r o n a l p h e n o t y p e , a n d o t h e r p r o c e s s e s n e c e s s a r y f o r d e v e l o p m e n t a n d r e g e n e r a t i o n . T h e c e l l u l a r f a s g e n e c a n b e r e g u l a t e d b y m u l t i p l e s e c o n d m e s s e n g e r s , i n c l u d i n g C a ” , c A M P , d i a c y l g l y c e r o l , a n d p r o t e i n k i n a s e C . C a l c i u m ( t h r o u g h n i f e d i p i n e - s e n s i t i v e c h a n n e l s o r f r o m i n t r a c e l l u l a r s t o r e s ) a n d c A M P a c t i v a t e C A M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e ( p r o t e i n k i n a s e A ) . P r o t e i n k i n a s e A p h o s p h o r y l a t e s s e r i n e 1 3 3 o f C A M P r e s p o n s i v e e l e m e n t b i n d i n g p r o t e i n ( C R E B ) ( r e v i e w e d i n S h e n g a n d G r e e n b e r g , 1 9 9 0 ) . P h o s p h o r y l a t e d C R E B t h e n b i n d s t o ' t h e c A M P r e s p o n s e e l e m e n t ( C R E ) l o c a t e d a t p o s i t i o n s - 5 7 t o - 6 3 u p s t r e a m o f t h e m R N A c a p ( r e v i e w e d i n V e r m a a n d S a s s o n e - C o r s i , 1 9 8 7 ) . A l t h o u g h n o n p h o s p h o r y l a t e d C R E B r e p r e s s e s t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y o f i n t e r m e d i a t e e a r l y g e n e s ( I E G s ) ( L a m p h e t a l . , 1 9 9 0 ) , d e l e t i o n o f C R E a l s o s i g n i fi c a n t l y r e d u c e s t r a n s c r i p t i o n o f f a s , i n d i c a t i n g c A M P i n d u c e s F 0 5 p r o t e i n t h r o u g h C R E B . C a l c i u m c a n a c t a l s o v i a a n u n i d e n t i fi e d C a 2 + / c a l m o d u l i n - r e g u l a t e d k i n a s e , u l t i m a t e l y r e s u l t i n g i n t r a n s c r i p t i o n o f f a s . T h i s b i o c h e m i c a l a n a l y s i s a g r e e s w i t h i n v i t r a d a t a , a s i n fl u x o f C a 2 + t h r o u g h v o l t a g e - d e p e n d e n t L - t y p e C a 2 + c h a n n e l s l e a d s t o f o r m a t i o n o f C a 2 + - 7 7 c a l m o d u l i n c o m p l e x , a n d i n d u c t i o n o f f a s m R N A a n d F 0 5 p r o t e i n ( M o r g a n a n d C u r r a n , 1 9 8 6 ; G r e e n b e r g , 1 9 8 5 ; G r e e n b e r g , 1 9 8 6 ) . A l t h o u g h r e g u l a t i o n o f F a s o c c u r s a t t h e l e v e l o f D N A , f a s m R N A a n d F 0 5 p r o t e i n c a n a l s o b e d i r e c t l y c o n t r o l l e d . F o r e x a m p l e , s e c o n d m e s s e n g e r s c a n a c t i v a t e p r o t e i n k i n a s e s , r e s u l t i n g i n p h o s p h o r y l a t i o n o f s e r i n e a n d t h r e o n i n e r e s i d u e s o f F o s ( r e v i e w e d i n V e r m a a n d S a s s o n e - C o r s i , 1 9 8 7 ) . D e p e n d i n g o n t h e i n d u c t i o n s t i m u l u s a n d t h e s i t e o f p h o s p h o r y l a t i o n , a d d i t i o n o f p h o s p h a t e g r o u p s m a y i n c r e a s e o r d e c r e a s e t h e s t a b i l i t y o f t h e m o l e c u l e ( M o r g a n a n d C u r r a n , 1 9 8 8 ) . F i n a l l y , t r a n s l a t i o n o f f a s m R N A r e q u i r e s r e m o v a l o f a 6 7 b a s e p a i r a d e n i n e - t h y m i d i n e - r i c h r e g i o n f r o m t h e 3 ’ n o n c o d i n g s e q u e n c e . T h i s r e g i o n i s t r a n s c r i b e d i n t o d e s t a b i l i z i n g m o t i f s , t h u s p r o m o t i n g d e g r a d a t i o n o f m R N A b y 3 ’ e x o n u c l e a s e s ( r e v i e w e d b y V e r m a a n d S a s s o n e - C o r s i , 1 9 8 7 ) . T h e r e f o r e , F o s c a n b e r e g u l a t e d b y e x t r a c e l l u l a r s i g n a l s a t m u l t i p l e t a r g e t s . F u n c t i o n s o f F o s U p o n s t i m u l a t i o n b y s e c o n d m e s s e n g e r s s u c h a s C A M P , p r o t e i n k i n a s e C ( P K C ) , o r e l e v a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r C a 2 + , f a s m R N A i s t r a n s c r i b e d a n d t r a n s l o c a t e d i n t o n e u r o n a l c y t o p l a s m w i t h i n m i n u t e s . C e l l u l a r m a c h i n e r y m a n u f a c t u r e s F o s p r o t e i n , w h i c h m o v e s b a c k i n t o t h e n u c l e u s ( r e v i e w e d i n V e r m a a n d S a s s o n e - C o r s i , 1 9 8 7 ; M o r g a n a n d C u r r a n , 1 9 8 8 ) . F 0 5 p r o t e i n i n t e r a c t s w i t h J u n , t h e f a m i l y o f p r o t e i n s e n c o d e d b y j u n I E G s , v i a l e u c i n e z i p p e r s , r e s u l t i n g i n f o r m a t i o n o f a h e t e r o d i m e r i c t r a n s c r i p t i o n f a c t o r c o m p l e x ( H a l a z o n e t i s e t a l . , 1 9 8 8 ) . T h e F o s - J u n h e t e r o d i m e r b i n d s w i t h h i g h a f fi n i t y t o D N A p r o t e i n - b i n d i n g e l e m e n t s w i t h c o n s e n s u s s e q u e n c e - T G A C T C A - , a l s o k n o w n a s a c t i v a t o r p r o t e i n - 1 ( A P - 1 ) b i n d i n g s i t e s . B i n d i n g o f A P - l h a s p r o f o u n d e f f e c t s o n t r a n s c r i p t i o n , a s a c t i v a t i o n o f A P - l a l l o w s F o s t o a c t i v a t e o r r e p r e s s t r a n s c r i p t i o n , d e p e n d i n g o n t h e 7 8 i d e n t i t y o f J u n p r o t e i n i n t h e h e t e r o d i m e r i c c o m p l e x . T h e r e f o r e , a n e x t r a c e l l u l a r s i g n a l i n d u c e s F 0 5 p r o t e i n , w h i c h i n fl u e n c e s t r a n s c r i p t i o n o f l a t e r e s p o n s e g e n e s t h r o u g h a n A P - l b i n d i n g s i t e . L a t e r e s p o n s e p r o t e i n s i n c l u d e C a 2 + b i n d i n g p r o t e i n s ( M a r s i a k o w s k i a n d S h o o t e r , 1 9 8 8 ) , v e s i c l e - a s s o c i a t e d p r o t e i n s ( S t e i n e t a l . , 1 9 8 8 ) , a n d n e u r o n a l - s p e c i fi c i n t e r m e d i a t e p r o t e i n s s u c h a s p e r i p h e r i n a n d l i g h t - a n d m e d i u m - w e i g h t n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n s ( L i n d e n b a u m e t a l . , 1 9 8 8 ) . L a t e r e s p o n s e g e n e s a l s o i n c l u d e a n u m b e r o f n e u r o t r a n s m i t t e r s a n d n e u r o m o d u l a t o r s s u c h a s p r e p r o e n k a p h a l i n , p r e p r o d y n o r p h i n , n e u r o p e p t i d e Y , a n d c h o l e c y s t o k i n i n . T h e p r e s e n c e o f A P - l b i n d i n g s i t e s o n t h e s e g e n e s a l l o w s s h o r t - l i v e d s t i m u l i t o i n fl u e n c e l o n g - t e r m c h a n g e s i n s t r u c t u r a l p r o t e i n s a n d n e u r o t r a n s m i t t e r s . F i n a l l y , F o s m a y n o t d i r e c t l y r e g u l a t e s o m e l a t e r e s p o n s e g e n e s , b u t m a y a c t i v a t e s y n t h e s i s o f t r a n s c r i p t i o n - f a c t o r p r o t e i n s w h i c h , i n t u r n , r e g u l a t e s e c o n d a r y t a r g e t g e n e s ( M o r g a n a n d C u r r a n , 1 9 8 9 ) . 9 . N I T R I C O X I D E S Y N T H A S E N A D P H D i a p h o r a s e S o m e o f t h e fi r s t a t t e m p t s t o s t u d y m o r p h o l o g y o f c e n t r a l a n d p e r i p h e r a l n e u r o n s u s e d e n d o g e n o u s e n z y m e s s u c h a s c h o l i n e s t e r a s e s a n d d e h y d r o g e n a s e s t o c a t a l y z e r e a c t i o n s t o s t a i n s u b p o p u l a t i o n s o f n e u r o n s . D e h y d r o g e n a s e h i s t o c h e m i s t r y u t i l i z e s e n d o g e n o u s d e h y d r o g e n a s e s t o p r o d u c e r e d u c e d c o f a c t o r s . D i a p h o r a s e s , a f a m i l y o f e n z y m e s f o u n d i n n e u r o n s a n d n o n - n e u r o n a l t i s s u e , t r a n s f e r e l e c t r o n s f r o m t h e r e d u c e d c o - f a c t o r s t o t e t r a z o l i u m s a l t . T h e r e d u c t i o n o f t e t r a z o l i u m p r e c i p i t a t e s c o l o r e d f o r r n a z a n c r y s t a l s , a l l o w i n g v i s u a l i z a t i o n o f s t a i n e d c e l l s w i t h c o n v e n t i o n a l l i g h t m i c r o s c o p y ( F r i e d e , 1 9 6 1 ; S c h e r e r - S i n g l e r e t a l . , 1 9 8 3 ) . U l t r a s t r u c t u r a l a n a l y s i s o f d i a p h o r a s e - s t a i n e d C N S 7 9 c e l l s r e v e a l s t h a t f o r r n a z a n c r y s t a l s a s s o c i a t e w i t h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m ( W o l f e t a l . , 1 9 9 2 ) a n d o t h e r o r g a n e l l e m e m b r a n e s ( H o p e a n d V i n c e n t , 1 9 8 9 ) , a l t h o u g h t h i s r e l a t i o n s h i p i s n o t o b s e r v e d i n e n t e r i c n e u r o n s ( L l e w e l l y n - S m i t h e t a l . , 1 9 9 2 ) . I n c o n t r a s t , d e h y d r o g e n a s e s t a i n i n g i n n o n - n e u r o n a l c e l l s p r o d u c e s f o r r n a z a n s t a i n i n g t h a t i s o n l y a s s o c i a t e d w i t h m i t o c h o n d r i a ( W a l k e r , 1 9 6 3 ) . A n a t o m i c a l a n d b i o c h e m i c a l t e c h n i q u e s h a v e i d e n t i fi e d t w o d i s t i n c t d i a p h o r a s e e n z y m e s . N o n s p e c i fi c d i a p h o r a s e s , s u c h a s N A D ( P ) H : q u i n o n e o x i d o r e d u c t a s e ( D T - d i a p h o r a s e ) a r e l o c a l i z e d i n h e t e r o l o g o u s p o p u l a t i o n s o f c e l l s , i n c l u d i n g h e p a t o c y t e s , p a r a c h y m a l a n d m a m m a r y c e l l s , m u c o s a l c r y p t s ( W a l k e r , 1 9 6 3 ) , a n d s o l u b l e b r a i n f r a c t i o n s ( r e v i e w e d i n H o p e a n d V i n c e n t , 1 9 8 9 ) . N o n s p e c i fi c d i a p h o r a s e s c a n u s e N A D H o r N A D P H t o f o r m f o r r n a z a n ; h o w e v e r , n e u r o n a l N A D P H d i a p h o r a s e r e q u i r e s B - N A D P H . A l t h o u g h t h e f u n c t i o n o f n e u r o n a l N A D P H d i a p h o r a s e a c t i v i t y i s u n k n o w n , n o n - s p e c i fi c d i a p h o r a s e s c a t a l y z e 2 - e l e c t r o n r e d u c t i n s o f q u i n o n e s ( M a e t a l . , 1 9 9 2 ) . N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g w a s fi r s t d e s c r i b e d i n s u b p o p u l a t i o n s o f n e u r o n s i n n e o c o r t e x , s t r i a t u m , m i d b r a i n , a n d c e r e b e l l u m o f n o r m a l t i s s u e ( T h o m a s a n d P e a r s e , 1 9 6 1 ) . I n t e r e s t i n g l y , a l t h o u g h n e u r o p a t h o l o g i e s s u c h a s i s c h e m i a , H u n t i n g t o n ’ s d i s e a s e , A l z h e i m e r ’ s d i s e a s e s , a n d e x c i t a t o r y a m i n o a c i d - t o x i c i t y e l i m i n a t e l a r g e p o p u l a t i o n s o f n e u r o n s , N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n e d c e l l s a r e s p a r e d ( T h o m a s a n d P e a r s e , 1 9 6 4 ; F e r r a n t e e t a l . , 1 9 8 5 ; K o h e t a l . , 1 9 8 6 ) , r e s u l t i n g i n a g r e a t d e a l o f i n t e r e s t i n t h e i d e n t i t y a n d r o l e o f N A D P H d i a p h o r a s e . B i o c h e m i c a l s t u d i e s o f N A D P H d i a p h o r a s e a c t i v i t y r e v e a l e d t h a t t h e r e a c t i o n i s e n z y m a t i c a l l y - c a t a l y z e d , a s i t i s a b o l i s h e d b y p r e - t r e a t m e n t w i t h p r o t e a s e s , h e a t , a c i d - a n d a l k a l i n e d e n a t u r a t i o n ( H o p e a n d V i n c e n t , 1 9 8 9 ) . U n f o r t u n a t e l y , m o r e d e t a i l e d 8 O c h a r a c t e r i z a t i o n o f N A D P H d i a p h o r a s e w a s i m p o s s i b l e a s a s p e c i fi c a s s a y w a s n o t k n o w n . H o w e v e r , i n 1 9 9 0 B r e d t a n d S y n d e r u t i l i z e d a 2 ’ , 5 ’ - A D P - l i n k e d a g a r o s e c o l u m n t o p u r i f y N O S f r o m c r u d e c e r e b e l l a r s u p e r n a t a n t p r e p a r a t i o n s . A s A D P - l i n k e d c o l u m n s a r e u s e f u l i n p u r i fi c a t i o n o f N A D P H - r e q u i r i n g e n z y m e s , H o p e a n d c o - w o r k e r s ( 1 9 9 1 ) u s e d a s i m i l a r p r o t o c o l t o i s o l a t e N A D P H d i a p h o r a s e . T h e y f o u n d N A D P H d i a p h o r a s e c o - p u r i fi e d w i t h N O S i n a s i n g l e p e a k . F u r t h e r m o r e , b o t h N O S a n d N A D P H d i a p h o r a s e a c t i v i t y w e r e i r n m u n o p r e c i p i t a t e d f r o m c r u d e s u p e m a t a n t s w i t h N A D P H d i a p h o r a s e - s p e c i fi c a n t i s e r u m , b u t n o t w i t h n o n - i m m u n e r a b b i t s e r u m , i n d i c a t i n g t h a t n e u r o n a l N A D P H d i a p h o r a s e i s a n i s o f o r r n o f N O S . I m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t u d i e s s u p p o r t e d t h i s c o n c l u s i o n , a s N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g a n d N O S - i r w e r e c o - l o c a l i z e d i n n e u r o n s i n t h e c o r p u s s t r i a t u m , c e r e b r a l c o r t e x , r e t i n a , m y e n t e r i c p l e x u s , a n d c e l l s o f t h e a d r e n a l m e d u l l a ( D a w s o n e t a l . , 1 9 9 1 ) . F u r t h e r m o r e , a l t h o u g h h u m a n k i d n e y c e l l s d o n o t s t a i n f o r N A D P H d i a p h o r a s e , f o l l o w i n g t r a n s f e c t i o n w i t h N O S c D N A , N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g i s o b s e r v e d ( D a w s o n e t a l . , 1 9 9 1 ) , p r o v i d i n g f u r t h e r e v i d e n c e t h a t N O S a n d n e u r o n a l N A D P H d i a p h o r a s e a r e t h e s a m e e n z y m e . D i s c o v e r y o f N i t r i c O x i d e S y n t h a s e S i n c e t h e d i s c o v e r y o f A C h , s o m e r e s e a r c h e r s o b s e r v e d e x o g e n o u s A C h c o n t r a c t e d r e s i s t a n c e v e s s e l s , w h i l e o t h e r r e s e a r c h e r s r e p o r t e d c h o l i n e r g i c v a s o d i l a t i o n ( r e v i e w e d i n M o n c a d a e t a l . , 1 9 9 1 ) . F u r c h g o t t a n d Z a w a d z k i ( 1 9 8 0 ) o b s e r v e d t h a t i n t a c t e n d o t h e l i a l c e l l s w e r e n e c e s s a r y f o r r e l a x a t i o n , a s e n d o t h e l i a l c e l l s r e l e a s e d a l a b i l e a n d h u m o r a l m o l e c u l e t h a t r e l a x e d p r e c o n t r a c t e d a o r t i c s t r i p s ( r e v i e w e d i n M o n c a d a e t a l . , 1 9 9 1 ) . N u m e r o u s g r o u p s i n c o r r e c t l y i d e n t i fi e d t h e m o l e c u l e a s a r a c h i d o n i c a c i d l i p o x y g e n a s e ( S i n g e r a n d P e a c h , 1 9 8 3 ) , c y t o c h r o m e P - 4 5 0 e n z y m e s ( P i n t o e t a l . , 1 9 8 5 ) , a n d a m o l e c u l e N O s y n t h a s e t e r m i n a l 8 1 A r g i n i n e n e r v e N A D P I - I I 3 H 4 E G T A c a c i u m L - N O A R G c a l m o d u l i n é - x - L - N A M E F A D F u n 0 2 L - N M M A C i t r u l l i n e % I \ ‘ 7 \ l / G u a n y l a t e c y c l a s e s m o o t h c G M P m u s c l e F i g u r e 4 . N i t r i c o x i d e i s p r o d u c e d f r o m L - a r g i n i n e b y t h e r a t e - l i m i t i n g e n z y m e n i t r i c o x i d e s y n t h a s e . N i t r i c o x i d e s y n t h a s e i s f o u n d i n n e u r o n s a n d p r o d u c e s e q u i m o l a r c o n c e n t r a t i o n s o f N O a n d c i t r u l l i n e . T y p e I i s o f o r r n o f N O S r e q u i r e s N A D P H , 8 H , , C a ” , a n d c a l m o d u l i n , a n d c a n b e a n t a g o n i z e d b y c h e l a t i o n o f e x t r a c e l l u l a r C a ” , a n t a g o n i s m o f N O S b y s u b s t i t u t e d L - a r g i n i n e a n a l o g s , a n d b i n d i n g o f e x t r a c e l l u l a r N O b y h e m o g l o b i n . N i t r i c o x i d e i s k n o w n t o a c t i v a t e g u a n y l a t e c y c l a s e i n s m o o t h m u s c l e , r e s u l t i n g i n e l e v a t e d c o n c e n t r a t i o n s o f c G M P . D i a g r a m k i n d l y p r o v i d e d b y D r . J . J . G a l l i g a n . 8 2 w i t h a c a r b o n y l c e n t e r ( G r i f fi t h e t a 1 . , 1 9 8 4 ) . H o w e v e r , i n 1 9 8 6 F u r c h g o t t s u g g e s t e d t h a t e n d o t h e l i u m d e r i v e d r e l a x i n g f a c t o r w a s n i t r i c o x i d e ( N O , N O ' ) , a n d P a l m e r a n d c o w o r k e r s ( 1 9 8 7 ) p r o v i d e d F u r c h g o t t ’ s h y p o t h e s i s t o b e c o r r e c t . T w o y e a r s l a t e r , P a l m e r ’ s g r o u p ( 1 9 8 9 ) a n d B r e d t a n d S y n d e r ( 1 9 8 9 ) i n d e p e n d e n t l y s h o w e d t h a t N O f o r m a t i o n w a s a c c o m p a n i e d b y s t o i c h i o m e t r i c c o n v e r s i o n o f a r g i n i n e t o c i t r u l l i n e a n d N O . B r e d t a n d S y n d e r ( 1 9 9 0 b ) p u r i fi e d N O S f r o m r a t c e r e b e l l u m , a n d i d e n t i fi e d i t a s a 1 5 0 k D a m o n o m e r p r o t e i n t h a t r e q u i r e d C a 2 + , c a l m o d u l i n , a n d N A D P H . P u r i fi c a t i o n o f N O S a l l o w e d p r o d u c t i o n o f a n t i s e r u m a g a i n s t N O S , N O S - 1 r t o b e o b s e r v e d i n c e n t r a l a n d a u t o n o m i c n e u r o n s ( B r e d t e t a l . , 1 9 9 0 ) , a n d t h e s e q u e n c e o f n e u r o n a l N O S t o b e d e t e r m i n e d . T h e s e q u e n c e o f c e r e b e l l a r n e u r o n a l N O S h a s 5 8 % h o m o l o g y w i t h N A D P H - c y t o c h r o m e P - 4 5 0 r e d u c t a s e ( B r e d t e t a l . , 1 9 9 1 b ) , t h u s m a k i n g i t t h e fi r s t e x a m p l e o f a s o l u b l e c y t o c h r o m e P - 4 5 0 i n e u k a r y o t e s ( W h i t e a n d M a r l e t t a , 1 9 9 2 ) . T h e c D N A s e q u e n c e o f t y p e I i s o f o r m f o u n d i n b r a i n c o n t a i n s c o n s e n s u s b i n d i n g s i t e s f o r c a l m o d u l i n , N A D P H , 6 ( R ) t e t r a h y d r o - L - b i o p t e r i n ( B H 4 ) , fl a v i n a d e n i n e d i n u c l e o t i d e ( F A D ) , fl a v i n m o n o n u c l e o t i d e ( F M N ) , a n d h e m e , a s w e l l a s 1 2 p h o s p h o r y l a t i o n s i t e s ( B r e d t e t a l . , 1 9 9 1 a ) . F i n a l l y , a n u m b e r o f p r o t e i n k i n a s e s i n c l u d i n g C A M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e , p r o t e i n k i n a s e C , a n d C a 2 + l c a l m o d u 1 i n - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e p h o s p h o r y l a t e N O S , r e s u l t i n g i n d e c r e a s e d e n z y m e a c t i v i t y i n v i t r a ( B r e d t e t a l . , 1 9 9 1 a ) . A s n e u r o s c i e n t i s t s i d e n t i fi e d N O S i n n e u r o n a l c e l l s , c a r d i o v a s c u l a r p h a r m a c o l o g i s t s i d e n t i fi e d t y p e I I I i s o f o r m o f N O S i n e n d o t h e l i a l c e l l s ( r e v i e w e d i n M o n c a d a e t a l . , 1 9 9 1 ) . I n t e r e s t i n g l y , t h e c D N A c l o n e o f e n d o t h e l i a l N O S i s o n l y 6 0 % i d e n t i c a l w i t h r a t b r a i n N O S i s o f o r m ( L a m a s e t a l . , 1 9 9 2 ; M a r s d e n e t a l . , 1 9 9 2 ) . T y p e I a n d I I I i s o f o r m s o f N O S a r e s i m i l a r a s t h e y a r e c o n s t i t u t i v e l y e x p r e s s e d , a c t i v a t e d b y C a 2 + ( E C 5 0 3 5 0 n M ) 8 3 ( S c h m i d t e t a l . , 1 9 9 2 ) , a n d n o t d e p e n d e n t u p o n n e w p r o t e i n s y n t h e s i s . H o w e v e r , i n d u c t i o n o f t y p e I I N O S i n m a c r o p h a g e s , n e u t r o p h i l s , k u p f f e r c e l l s , h e p a t o c y t e s ( E v a n s e t a l . , 1 9 9 2 ) a n d v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e i s d e p e n d e n t o n n e w R N A a n d p r o t e i n s y n t h e s i s , a n d i s c o n t r o l l e d b y t r a n s c r i p t i o n a l f a c t o r s . A l t h o u g h t y p e I a n d I I I N O S a r e r e g u l a t e d b y i n t r a c e l l u l a r C a 2 + c o n c e n t r a t i o n s a n d p h o s p h o r y l a t i o n b y p r o t e i n k i n a s e A , i n d u c i b l e N O S ( i N O S ) c D N A d o e s n o t h a v e b i n d i n g s i t e s f o r C a 2 + o r c a l m o d u l i n ( S t u e h r e t a l . , 1 9 9 1 ; M i t c h e l l e t a l . , 1 9 9 2 ) ; h o w e v e r , c a l m o d u l i n d o e s a s s o c i a t e w i t h t h e e n z y m e a f t e r t r a n s l a t i o n . F u r t h e r m o r e , i n d u c t i o n o f t y p e I I i s o f o r m o f N O S r e s u l t s i n l o n g - l a s t i n g r e l e a s e o f N O , c o m p a r e d t o t r a n s i e n t p r o d u c t i o n o f N O b y t y p e I a n d I I I i s o f o r m s . H o w e v e r , a l l p u r i fi e d N O S s a r e fl a v o p r o t e i n s c o n t a i n i n g o n e F A D a n d o n e F N fl N I p e r s u b u n i t , i n a d d i t i o n t o o n e B H 4 ( H e v e l a n d M a r l e t t a , 1 9 9 2 ) a n d o n e f e r r o p r o t o p o r p h y r i n c o m p l e x ( W h i t e a n d M a r l e t t a , 1 9 9 2 ; K l a t t e t a l . , 1 9 9 2 ) . P u t a t i v e F u n c t i o n s o f N i t r i c O x i d e S y n t h a s e A s d i s c u s s e d p r e v i o u s l y , N O S c a t a l y z e s a S - e l e c t r o n o x i d a t i o n o f o n e o f t w o c h e m i c a l l y e q u i v a l e n t g u a n i d i n o n i t r o g e n s o f L - a r g i n i n e t o L - c i t r u l l i n e a n d N O i n t h e p r e s e n c e o f m o l e c u l a r o x y g e n a n d N A D P H . H o w e v e r , a c c u m u l a t i n g e v i d e n c e s t r o n g l y s u g g e s t s t h a t N O S h a s a n u m b e r o f p o s s i b l e p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n s . I n t h e a b s e n c e o f L - a r g i n i n e a n d B H , , t y p e I N O S o x i d i z e s N A D P H i n a c a l m o d u l i n - d e p e n d e n t u p t a k e o f m o l e c u l a r o x y g e n a n d o x i d a t i o n o f N A D P H , r e s u l t i n g i n p r o d u c t i o n o f h y d r o g e n p e r o x i d e ( H 2 0 2 ) ( M a y e r e t a l . , 1 9 9 2 ) . I n t e r e s t i n g l y , t h i s m e c h a n i s m r e s e m b l e t h e p r o d u c t i o n o f H 2 0 2 b y n e u t r o p h i l s . N O S b i n d s a n d r e d u c e s c y t o c h r o m e C t w o t o t h r e e f o l d f a s t e r t h a n o x i d a t i o n o f a r g i n i n e . T h i s m e c h a n i s m d o e s n o t i n v o l v e s u p e r o x i d e r a d i c a l f o r m a t i o n b u t i s d u e t o a d i r e c t C a 2 + l c a l m o d u l i n - d e p e n d e n t i n t e r a c t i o n b e t w e e n N O S a n d c y t o c h r o m e C 8 4 ( K l a t t e t a l . , 1 9 9 2 ) . F i n a l l y , N O S c a n a s s o c i a t e w i t h c y t o c h r o m e P 4 5 0 a n d i n d u c e - C a 2 + i n d e p e n d e n t h y d r o x y l a t i o n o f N - e t h y l m o r p h i n e , s u g g e s t i n g N O S c a n p a r t i c i p a t e i n c e l l u l a r e l e c t r o n t r a n s f e r p r o c e s s e s ( H e v e l a n d M a r l e t t a , 1 9 9 2 ) . A l t h o u g h t h e f u n c t i o n s o f s u c h r e a c t i o n s a r e n o t k n o w n , t h e y m a y b e i n v o l v e d i n g e n e r a t i o n o f p a t h o p h y s i o l o g i c a l s t a t e s ( S c h m i d t e t a l . , 1 9 9 2 ) . P u t a t i v e A c t i o n s o f N i t r i c O x i d e N i t r i c o x i d e b i n d s t o t h e h e m e m o i e t y o f s o l u b l e g u a n y l a t e c y c l a s e ( R a p o p o r t a n d M u r a d , 1 9 8 3 ) , r e s u l t i n g i n c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e a n d a c t i v a t i o n o f t h e e n z y m e ( C r a v e n a n d D e R u b e r t i s , 1 9 7 8 ) . G u a n y l a t e c y c l a s e ( G C , G T P p y r o p h o s p h a t e - l y a s e ( c y c l i z i n g ) ) c a n t h e n c o n v e r t 3 ’ , 5 ’ g u a n o s i n e t r i p h o s p h a t e t o g u a n o s i n e 3 ’ , 5 ’ - c y c l i c m o n o p h o s p h a t e ( c G M P ) ( R a p o p o r t a n d M u r a d , 1 9 8 3 ) . E l e v a t e d i n t r a c e l l u l a r c G M P l e v e l s m a y t h e n h a v e a n u m b e r o f a c t i o n s w i t h i n n e u r o n a l a n d m u s c l e c e l l s . F o r e x a m p l e , c G M P - d e p e n d e n t m e c h a n i s m s c a n m e d i a t e r e l a x a t i o n o f s m o o t h m u s c l e ( r e v i e w e d i n W a r d a n d S a n d e r s , 1 9 9 2 ) . A l t e r n a t i v e l y , c G M P c a n r e g u l a t e v a r i o u s p r o t e i n k i n a s e s s u c h a s c G M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e ( p r o t e i n G k i n a s e ) ( G e r z e r a n d H a m l e t , 1 9 8 8 ) , n u c l e o s i d e 3 ’ , 5 ’ - m o n o p h o s p h a t e p h o s p h o d i e s t e r a s e s , a n d i o n c h a n n e l s ( S c h m i d t e t a l . , 1 9 9 2 ; W a r d a n d S a n d e r s , 1 9 9 2 ) . F o r e x a m p l e , c G M P h a s b e e n s h o w n t o d i r e c t l y a c t t o o p e n c a t i o n c h a n n e l s i n p h o t o r e c e p t o r c e l l s , o r t o c l o s e N a + c h a n n e l s i n k i d n e y c e l l s ( r e v i e w e d i n G a r t h w a i t e , 1 9 9 1 ) . A s e c o n d m e c h a n i s m o f a c t i o n o f N O m a y b e v i a e n d o g e n o u s A D P - r i b o s y l t r a n s f e r a s e s f o u n d i n n e u r a l a n d n o n - n e u r o n a l t i s s u e s . N i t r i c o x i d e c a n s t i m u l a t e e n d o g e n o u s A D P - r i b o s y l a t i o n o f a p r o t e i n i n p l a t e l e t s ( B r u c e a n d L a p e t i n a , 1 9 8 9 ) , a n d N O d o n o r s s u c h a s S N P e n h a n c e A D P - r i b o s y l a t i o n o f a n e u r o n a l 3 7 k D a p r o t e i n i d e n t i fi e d a s g l y c e r a l d e h y d e - 3 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e ( Z h e n g a n d S y n d e r , 1 9 9 2 ; Z h e n g 8 5 a n d S y n d e r , 1 9 9 3 ) . E l e v a t e d c G M P m a y a l s o a c c e l e r a t e t h e r a t e o f m o n o - A D P r i b o s y l a t i o n o f p r o t e i n s s u c h a s g l y c e r a l d e h y d e — 3 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e , r e s u l t i n g i n d e c r e a s e d t a r g e t a c t i v i t y ( Z h e n g a n d S y n d e r , 1 9 9 2 ) . N i t r i c o x i d e m a y m e d i a t e p h y s i o l o g i c a l p r o c e s s e s b y a l t e r i n g v o l t a g e - g a t e d i o n c h a n n e l s . S o d i u m n i t r o p r u s s i d e a n d N O i n c r e a s e t h e o p e n p r o b a b i l i t y o f C a y - a c t i v a t e d K " c h a n n e l s i n c a n i n e c o l o n i c m u s c l e ( W a r d a n d S a n d e r s , 1 9 9 2 ) . F u r t h e r m o r e , r e l e a s e o f N O f r o m n e r v e s ( R a m a g o p a l a n d L e i g h t o n , 1 9 8 9 ) o r i n t e r s t i t i a l c e l l s ( P u b l i c o v e r e t a 1 . , 1 9 9 3 ) , o r a p p l i c a t i o n o f e x o g e n o u s N O ( P u b l i c o v e r e t a l . , 1 9 9 3 ) d e c r e a s e s i n t r a c e l l u l a r C a 2 + c o n c e n t r a t i o n s i n s m o o t h m u s c l e c e l l s , s u g g e s t i n g N O m a y a f f e c t i o n c h a n n e l s . A n a t o m i c a l E v i d e n c e o f N i t r i c O x i d e S y n t h a s e i n E n t e r i c N e r v e s A l t h o u g h n o n - s p e c i fi c d e h y d r o g e n a s e h i s t o c h e m i s t r y h a s b e e n u s e d t o d e t e r m i n e t h e t o t a l n u m b e r o f n e u r o n s i n t h e G I t r a c t ( G a b e l l a , 1 9 6 7 ) , t h e fi r s t r e p o r t o f N A D P H d i a p h o r a s e b y G e r s h o n a n d K i r c h g e s s n e r ( 1 9 8 6 ) f o u n d s t a i n i n g i n a l l s u b m u c o s a l n e u r o n s a n d o n e - t h i r d o f m y e n t e r i c n e u r o n s i n g u i n e a p i g s m a l l i n t e s t i n e . H o w e v e r , Y o u n g e t a 1 . ( 1 9 9 2 ) o b s e r v e d N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g i n a p p r o x i m a t e l y o n e - t e n t h o f m y e n t e r i c n e u r o n s a n d n o s u b m u c o s a l n e u r o n s i n g u i n e a p i g i l e u m . F u r t h e r m o r e , s i m i l a r t o t h e fi n d i n g s o f D a w s o n a n d c o - w o r k e r s ( 1 9 9 1 ) , Y o u n g e t a l . r e p o r t e d t h a t N A D P H d i a p h o r a s e a n d N O S - i r w e r e a l w a y s l o c a l i z e d i n t h e s a m e p o p u l a t i o n s o f m y e n t e r i c n e u r o n s . I n t e n s e l y N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n e d n e u r o n s a l s o c o n t a i n e d b r i g h t N O S - i r , w h e r e a s w e a k N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g w a s a s s o c i a t e d w i t h f a i n t N O S - i r , a l t h o u g h t h i s p a t t e r n h a s n o t b e e n o b s e r v e d b y a l l i n v e s t i g a t o r s ( B e l a i e t a l . , 1 9 9 2 ) . H o w e v e r , a d d i t i o n o f L - a r g i n i n e o r N G ‘ n i t r o - L - a r g i n i n e d o e s n o t a l t e r N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g , s u g g e s t i n g f o r m a t i o n o f N O a n d r e d u c t i o n o f t e t r a z o l i u m s a l t o c c u r a t d i f f e r e n t s i t e s o n t h e e n z y m e 8 6 ( Y o u n g e t a l . , 1 9 9 2 ) . U n t i l r e c e n t l y , n o o t h e r l a b o r a t o r i e s h a d a c c e s s t o N O S a n t i s e r u m , r e q u i r i n g m o s t s t u d i e s o n p u t a t i v e n i t r i n e r g i c i n n e r v a t i o n t o b e p e r f o r m e d w i t h o n l y N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g . N A D P H d i a p h o r a s e h i s t o c h e m i s t r y s t a i n i n g i s f o u n d i n p r i m a r y , s e c o n d a r y , a n d t e r t i a r y p l e x u s e s o f m y e n t e r i c p l e x u s f r o m t h e e s o p h a g u s t o p r o x i m a l p o r t i o n o f t h e c o l o n ( B e l a i e t a l . , 1 9 9 2 ; A i m i e t a l . , 1 9 9 3 ; M c C o n a l o g u e a n d F u r n e s s , 1 9 9 3 ; N i c h o l s e t a l . , 1 9 9 3 ) , i n c l u d i n g g a l l b l a d d e r ( T a l m a g e a n d M a w e , 1 9 9 3 ) a n d p a n c r e a s ( S h i m o s e g a w a e t a l . , 1 9 9 3 ) . I n t e r e s t i n g l y , s o m e s t u d i e s h a v e r e p o r t e d t h a t m o s t N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n e d c e l l s i n c o l c h i c i n e — t r e a t e d t i s s u e a l s o c o n t a i n V I P - i r ( C o s t a e t a l . , 1 9 9 2 ; A i m i e t a l . , 1 9 9 3 ; S h i m o s e g a w a e t a l . , 1 9 9 3 ; T a l m a g e a n d M a w e , 1 9 9 3 ) , s u g g e s t i n g t h e p r e s e n c e o f m u l t i p l e N A N C i n h i b i t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r s i n t h e s a m e n e u r o n s . I m m u n o h i s t o c h e m i c a l e x p e r i m e n t s w i t h a n t i s e r u m r a i s e d a g a i n s t N O S h a v e c o n fi r m e d a c l o s e c o r r e l a t i o n o f N O S - a n d V I P - i r , b u t n o t N O S - a n d S P - i r , o r N O S - i r a n d c h o l i n e s t e r a s e s t a i n i n g , i n m y e n t e r i c n e u r o n s o f c o l c h i c i n e - t r e a t e d t i s s u e ( C o s t a e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h e r e f o r e , t h e s e a n a t o m i c a l d a t a i n d i c a t e t h a t V I P a n d N O S a r e c o n t a i n e d i n a p o p u l a t i o n o f m y e n t e r i c n e u r o n s t h a t d o n o t c o n t a i n S P o r A C h . A n a t o m i c a l E v i d e n c e o f c G M P F o r m a t i o n i n t h e G I T r a c t A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , i n v i t r a p h a r m a c o l o g i c a l e x p e r i m e n t s h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t N O , o r a N O - l i k e m o l e c u l e , m e d i a t e s N A N C i n h i b i t o r y n e u r o t r a n s m i s s i o n i n t h e G I t r a c t . A n a t o m i c a l a n d f u n c t i o n a l s t u d i e s h a v e s t r o n g l y s u g g e s t e d t h a t N O c a n r e l a x G I s m o o t h m u s c l e t h r o u g h a c t i v a t i o n o f G C . A l t h o u g h a n t i b o d i e s h a v e f o u n d c G M P - l i k e - i r i n g l i a l c e l l s i n t h e b r a i n a n d p e r i p h e r y ( D e V e n t e a n d S t e i n b u s c h , 1 9 9 2 ; A o k i e t a l . , 1 9 9 3 ) , b a s a l c G M P - i r i s n o t o b s e r v e d i n e n t e r i c n e u r o n s a n d s m o o t h m u s c l e c e l l s . 8 7 H o w e v e r , e l e c t r i c a l fi e l d s t i m u l a t i o n o r a d d i t i o n o f e x o g e n o u s N O i n c r e a s e s c G M P - i r i n N A D P H d i a p h o r a s e n e g a t i v e m y e n t e r i c n e u r o n s a n d s m o o t h m u s c l e c e l l s i n s m a l l i n t e s t i n e a n d c o l o n ( S h u t t l e w o r t h e t a l . , 1 9 9 3 ; Y o u n g e t a l . , 1 9 9 3 b ) . F u r t h e r r n o r e , e x o g e n o u s N O ( D u a n d C o n k l i n e t a l . , 1 9 9 2 ) a n d e l e c t r i c a l fi e l d s t i m u l a t i o n ( T o r p h y e t a l . , 1 9 8 6 ) a l s o i n c r e a s e s c G M P l e v e l s i n l o w e r e s o p h a g e a l s m o o t h m u s c l e a s m e a s u r e d b y r a d i o i m m u n o a s s a y . S t i m u l u s - i n d u c e d c G M P - i r i s p r e v e n t e d b y N L A , a N O S a n t a g o n i s t , a n d m e t h y l e n e b l u e , a s o l u b l e G C a n t a g o n i s t ( S h u t t l e w o r t h e t a l . , 1 9 9 3 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t n e r v e s t i m u l a t i o n i n c r e a s e s N O p r o d u c t i o n a n d r e l e a s e , r e s u l t i n g i n a c t i v a t i o n o f g u a n y l a t e c y c l a s e a n d f o r m a t i o n o f c G M P . C h a r a c t e r i z a t i o n o f N O S i n E n t e r i c N e r v e s F e w s t u d i e s h a v e e x a m i n e d b i o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f N O S i n t h e G I t r a c t , a l t h o u g h K o s t k a e t a l . ( 1 9 9 3 ) s t u d i e d p r o d u c t i o n o f L - c i t r u l l i n e a n d c G M P a s m e a s u r e s o f N O S a c t i v i t y i n p u r i fi e d s y n a p t o s o m e s m a d e f r o m c a n i n e d e e p m u s c u l a r p l e x u s . S i m i l a r t o c e r e b e l l a r N O S , e n t e r i c N O S r e q u i r e s N A D P H a n d e x o g e n o u s c a l m o d u l i n f o r p r o d u c t i o n o f c i t r u l l i n e a n d c G M P . A s p r e d i c t e d , i n c r e a s e d c o n c e n t r a t i o n s o f L - , b u t n o t D - a r g i n i n e p o t e n t i a t e p r o d u c t i o n o f c i t r u l l i n e a n d c G M P , i n d i c a a t i n g s t e m - s p e c i fi c i t y o f a s u b s t r a t e - d e p e n d e n t e n z y m e . H o w e v e r , u n l i k e t h e fi n d i n g s o f B r e d t a n d S y n d e r ( 1 9 9 0 ) , a d d i t i o n o f e x o g e n o u s C a 2 + i s n o t n e c e s s a r y f o r c G M P o r c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n , i n d i c a t i n g n e c e s s a r y C a ” m u s t b e s u p p l i e d b y a n e n d o g e n o u s s o u r c e . F i n a l l y , 0 . 1 m M E G T A d o e s n o t t o t a l l y i n h i b i t c i t r u l l i n e o r c G M P p r o d u c t i o n , s u g g e s t i n g N O i s f o r m e d b y C a ” - d e p e n d e n t a n d C a y - i n d e p e n d e n t f o r m s o f N O S ( K o s t k a e t a l . , 1 9 9 3 ) . 8 8 F u n c t i o n a l E v i d e n c e o f N i t r i c O x i d e R e l e a s e b y E n t e r i c N e r v e s A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , i n v i t r a n e r v e - m u s c l e p r e p a r a t i o n s m a d e f r o m a l l s e g m e n t s o f t h e G I t r a c t d e m o n s t r a t e f r e q u e n c y - d e p e n d e n t n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s t h a t a r e a t t e n u a t e d b y s u b s t i t u t e d L - a r g i n i n e a n a l o g s ( r e v i e w e d i n W a r d a n d S a n d e r s , 1 9 9 2 ) . S i m i l a r r e s u l t s a r e o b s e r v e d a f t e r a p p l i c a t i o n o f D M P P , a n A C h r e c e p t o r a g o n i s t , i n d i c a t i n g c h o l i n e r g i c r e c e p t o r s m a y b e f o u n d o n i n h i b i t o r y m o t o r n e u r o n s . M e a s u r e m e n t s o f m e t a b o l i t e s o f N O s u p p o r t t h e c o n c l u s i o n t h a t e l e c t r i c a l a n d p h a r m a c o l o g i c a l s t i m u l a t i o n r e l e a s e s N O , a s N 0 2 ' a n d N 0 3 ' c o n c e n t r a t i o n s i n c r e a s e a f t e r e l e c t r i c a l o r p h a r m a c o l o g i c a l s t i m u l a t i o n o f p i e c e s o f i l e u m ( S h u t t l e w o r t h e t a l . , 1 9 9 4 ; W i k l u n d e t a l . , 1 9 9 3 ) . R e fl e x s t u d i e s a n d i n v i v a m o t i l i t y s t u d i e s a l s o d e m o n s t r a t e t h a t e n t e r i c n e r v e s r e l e a s e N O . R e c e p t i v e r e l a x a t i o n o f t h e s t o m a c h a l l o w s i n t a k e o f a l a r g e v o l u m e w i t h o u t a s i m i l a r m a g n i t u d e i n c r e a s e i n g a s t r i c p r e s s u r e . R e c e p t i v e r e l a x a t i o n i n r e s p o n s e t o p r e s s u r e o r D M P P i s a n t a g o n i z e d b y N O S a n t a g o n i s t s , s u g g e s t i n g t h a t N O i s i m p o r t a n t i n r e l a x a t i o n ( D e s a i e t a l . , 1 9 9 1 ) . S i m i l a r r e s u l t s a r e o b s e r v e d i n t h e i l e u m , a s N O S a n t a g o n i s t s d e c r e a s e s c o m p l i a n c e o f t h e i n t e s t i n a l w a l l a t a l l d i s t e n s i o n r a t e s , i n d i c a t i n g t h a t a c c o m m o d a t i o n o f t h e s m a l l i n t e s t i n e i s a l s o m e d i a t e d b y N O ( W a t e r m a n e t a l . , 1 9 9 4 ) . N O S a n t a g o n i s t s a l s o c h a n g e t h e t h r e s h o l d v o l u m e o f i n i t i a t i o n o f p e r i s t a l s i s , d e c r e a s e t h e r a t e o f p r o p u l s i o n o f s o l i d s i n t h e i l e u m ( C o s t a e t a l . , 1 9 9 1 ) a n d s t o m a c h ( O r i h a t a a n d S a r r n a e t a l . , 1 9 9 4 ) , a n d p r o d u c e s d y s c o o r d i n a t i o n o f p e r i s t a l s i s , t h u s p r o v i d i n g y e t f u r t h e r e v i d e n c e o f N O r e l e a s e i n v i v a . 8 9 1 0 . M E C H A N I S M S O F N E U R O N A L P L A S T I C I T Y P l a s t i c i t y i n N e u r o n a l P h e n o t y p e D u r i n g d e v e l o p m e n t , m a n y p r o g e n i t o r n e u r a l c r e s t c e l l s t r a n s i e n t l y e x p r e s s c a t e c h o l a m i n e s a l t h o u g h t h e s e s y m p a t h e t i c m a r k e r s a r e l o s t b e f o r e m a t u r a t i o n ( r e v i e w e d i n G e r s h o n e t a l . , 1 9 9 3 ) . S i m i l a r l y , e m b r y o n i c a n d n e o n a t a l g a n g l i a e x p r e s s a w i d e v a r i e t y o f n e u r o p e p t i d e s n o t f o u n d i n a d u l t g a n g l i a ( r e v i e w e d i n R a o a n d L a n d i s , 1 9 9 2 ) , w h e r e a s a g i n g g a n g l i a e x p r e s s n e u r o t r a n s m i t t e r s a n d n e u r o m o d u l a t o r s n o t f o u n d i n y o u n g e r g a n g l i a ( r e v i e w e d i n H e n d r y , 1 9 9 2 ) . A l t h o u g h n e u r o s c i e n c e t e n d s t o v i e w e x p r e s s i o n o f n e u r o t r a n s m i t t e r s a s a s t a t i c e v e n t , c e l l u l a r p r o c e s s e s s u c h a s c h a n g e s i n i o n fl u x , a n d b i n d i n g o f n e u r o t r a n s m i t t e r s , n e u r o m o d u l a t o r s , c y t o k i n e s , a n d g r o w t h f a c t o r s a c t i v a t e s e c o n d a n d t h i r d m e s s e n g e r s . T h e s e i n t r a c e l l u l a r m e s s e n g e r s a c t i v a t e r i b o n u c l e a s e s , p r o t e i n k i n a s e s , a n d r e g u l a t o r y e l e m e n t s o n D N A t o t e m p o r a l l y c o n t r o l t h e a m o u n t o f n e u r o t r a n s m i t t e r p r o d u c e d . H o w e v e r , d e c e n t r a l i z a t i o n a n d a x o t o m y s t u d i e s o f a u t o n o m i c g a n g l i a h a v e r e v e a l e d t h a t p h e n o t y p i c e x p r e s s i o n o f n e u r o t r a n s m i t t e r s i s c o n s t a n t l y c o n t r o l l e d , a n d c a n b e c h a n g e d u n d e r s o m e c i r c u m s t a n c e s . F o r e x a m p l e , a d u l t c h o l i n e r g i c n e u r o n s o f t h e i r i s n o r m a l l y d o n o t e x p r e s s t h e s y m p a t h e t i c m a r k e r s T H o r N P Y . H o w e v e r , f o l l o w i n g s y m p a t h e c t o m y , T H a n d N P Y a r e e x p r e s s e d i n p r e v i o u s l y - c h o l i n e r g i c n e u r o n s ( B j o r k l u n d e t a l . , 1 9 8 5 ) , s u g g e s t i n g a s w i t c h f r o m c h o l i n e r g i c t o n o r a d r e n e r g i c f u n c t i o n . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b t a i n e d f r o m s t u d i e s o f e c c r i n e s w e a t g l a n d s c o n c e n t r a t e d i n f o o t p a d s . P h a r m a c o l o g i c a l a n d p h y s i o l o g i c a l s t u d i e s h a v e p r o v e n t h a t n e u r o g e n i c s w e a t i n g i s m e d i a t e d b y m A C h r e c e p t o r s ( L a n d i s a n d K e e f e , 1 9 8 3 ; S t e v e n s a n d L a n d i s , 1 9 8 7 ) , a n d c a t e c h o l a m i n e s a r e a b s e n t f r o m s w e a t g l a n d i n n e r v a t i o n o f a d u l t r a t s . H o w e v e r , t r a n s p l a n t a t i o n o r c r o s s - i n n e r v a t i o n o f s w e a t g l a n d s r e s u l t s i n 9 0 e x p r e s s i o n o f s y m p a t h e t i c m a r k e r s ( r e v i e w e d i n R a o a n d L a n d i s , 1 9 9 2 ) , i l l u s t r a t i n g a s w i t c h i n n e u r o n a l p h e n o t y p e . S y m p a t h e t i c n e u r o n s c a n a l s o b e i n d u c e d t o f u n c t i o n a s c h o l i n e r g i c n e u r o n s . A l t h o u g h p u r e c u l t u r e s o f s u p e r i o r c e r v i c a l g a n g l i a ( S C G ) n e u r o n s c o n t a i n s y m p a t h e t i c m a r k e r s a n d s y n t h e s i z e c a t e c h o l a m i n e s , c o n d i t i o n e d m e d i u m i n d u c e s e x p r e s s i o n o f C h A t , e l e v a t e d p r o d u c t i o n o f A C h , d e c r e a s e d s y m p a t h e t i c m a r k e r s , a n d d e c r e a s e d s y n t h e s i s o f c a t e c h o l a m i n e s ( W a l i c k e e t a l . , 1 9 7 7 ) . R e g u l a t i o n o f N e u r o n a l P h e n o t y p e T h e r e i s a g e n e r a l p a u c i t y o f i n f o r m a t i o n c o n c e r n i n g t h e r e g u l a t i o n o f c h o l i n e r g i c a n d a d r e n e r g i c n e u r o t r a n s m i t t e r s e l e c t i o n i n d e v e l o p i n g n e u r o n s a n d e v e n l e s s i s k n o w n r e g a r d i n g r e g u l a t i o n o f N A N C n e u r o t r a n s m i t t e r s . H o w e v e r , i t i s c l e a r t h a t m u l t i p l e e x t r a c e l l u l a r s i g n a l s g o v e r n t h e t r a n s m i t t e r s t a t u s o f n e u r o n s a t a n y g i v e n t i m e . A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , n e o n a t a l S C G n e u r o n s c a n e i t h e r s e c r e t e c a t e c h o l a m i n e s a n d f o r m a d r e n e r g i c s y n a p s e s , o r r e l e a s e A C h , a n d f o r m c h o l i n e r g i c s y n a p s e s . I n 1 9 7 7 , W a l i c k e e t a l . i l l u s t r a t e d t h a t e l e v a t e d K + , v e r a t r i d i n e , o r e l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n d e p o l a r i z e d S C G n e u r o n s a n d f a v o r e d d e v e l o p m e n t o f s y m p a t h e t i c c h a r a c t e r i s t i c s . H o w e v e r , i n t h e a b s e n c e o f e l e c t r i c a l a c t i v i t y , c h o l i n e r g i c p r o p e r t i e s w e r e e x p r e s s e d . T h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t r a n s - s y n a p t i c a c t i v i t y i s a n i m p o r t a n t r e g u l a t o r o f n e u r o n a l p h e n o t y p e a n d f u n c t i o n . F u r t h e r m o r e , a c t i v a t i o n o f p r e g a n g l i o n i c n e r v e s i n d u c e s m R N A ( B l a c k e t a l . , 1 9 8 6 ) , p r o t e i n ( M e u l l e r e t a l . , 1 9 6 9 ) , a n d i n c r e a s e s a c t i v i t y o f T H ( M e u l l e r e t a 1 . , 1 9 6 9 ; Z i g m o n d e t a l . , 1 9 8 9 ) . C o n v e r s e l y , d e c e n t r a l i z a t i o n d e p r e s s e s e x p r e s s i o n o f T H ( M e u l l e r e t a l . , 1 9 6 9 ; Z i g m o n d e t a l . , 1 9 8 9 ) , i n d i c a t i n g r e g u l a t i o n o f t r a n s c r i p t i o n a n d t r a n s l a t i o n o f T H . P r e - s y n a p t i c a c t i v i t y a l s o m a y b e i m p o r t a n t i n r e g u l a t i o n o f n e u r o p e p t i d e s s u c h a s S P a n d V I P . A l t h o u g h m o s t a d u l t r a t S C G n e u r o n s d o n o t c o n t a i n S P , i n v i v a a n d i n v i t r a 9 1 d e c e n t r a l i z a t i o n o f r a t S C G , a p p l i c a t i o n o f T T X , o r a d d i t i o n o f n A C h r e c e p t o r a n t a g o n i s t s i n c r e a s e s s y n t h e s i s o f p r e p r o t a c h y k i n i n m R N A a n d S P i n a d u l t S C G n e u r o n s ( K e s s l e r a n d B l a c k , 1 9 8 2 ; K e s s l e r e t a l . , 1 9 8 1 ; K e s s l e r e t a l . , , 1 9 8 3 ; B l a c k e t a l . , 1 9 8 6 ) . A s p r e d i c t e d , v e r a t r i d i n e - i n d u c e d d e p o l a r i z a t i o n a t t e u n a t e s t h e i n t r a c e l l u l a r c o n c e n t r a t i o n o f S P , a l t h o u g h a l t e r a t i o n s i n c e l l a r c o n t e n t d o n o t r e s u l t f r o m r e l e a s e o f S P ( B l a c k e t a l . , 1 9 8 6 ) . V a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p o l y p e p t i d e e x p r e s s i o n a l s o m a y b e r e g u l a t e d b y p r e - s y n a p t i c a c t i v i t y , a s S C G n e u r o n s n o r m a l l y c o n t a i n l i t t l e V I P - i r , a n d V I P - i r i n c r e a s e s a f t e r d e c e n t r a l i z a t i o n . H o w e v e r , S u n e t a l . ( 1 9 9 2 ) o b s e r v e d d e p o l a r i z a t i o n - i n d u c e d e l e v a t i o n s i n V I P - a n d S P - i r i n S C G e x p l a n t s a n d p r i m a r y c u l t u r e s , l e a d i n g t h e a u t h o r s t o c o n c l u d e t h a t s y m p a t h e t i c n e r v e a c t i v i t y a c t u a l l y i n c r e a s e s S P a n d V I P l e v e l s . U n f o r t u n a t e l y , t h i s c o n c l u s i o n i s n o t s u p p o r t e d i n v i v a , f o r v e r y l i t t l e S P a n d V I P i s f o u n d i n S C G o f n o r m a l a n i m a l s . A x o t o m y o r c r u s h i n g o f a u t o n o m i c o r s o m a t i c n e r v e s a l t e r s m R N A a n d p r o t e i n l e v e l s f o r a n u m b e r o f p e p t i d e s . F o r e x a m p l e , u n i l a t e r a l a x o t o m y o f t h e s c i a t i c n e r v e i n d u c e s N P Y , V I P , a n d g a l a n i n m R N A i n D R G n e u r o n s , a n d r e s u l t s i n a a g r e a t e r n u m b e r o f N P Y - , V I P - , o r g a l a n i n - i r D R G n e u r o n s ( N o g u c h i e t a l . , 1 9 9 3 ) . A l t h o u g h m R N A f o r C G R P a n d s o m a t o s t a t i n i s e x p r e s s e d i n n o r m a l a n d c o n t r o l c e l l s , a x o t o m y d e c r e a s e s b o t h R N A a n d p r o t e i n l e v e l s o f C G R P a n d s o m a t o s t a i n , i n d i c a t i n g t h a t m u l t i p l e r e g u l a t o r y m e c h a n i s m s a r e i n v o l v e d i n c o n t r o l o f n e u r o p e p t i d e e x p r e s s i o n . C h a n g e s i n n e u r o p e p t i d e l e v e l s a r e a l s o o b s e r v e d p r o c e e d i n g s e c t i o n o f p o s t g a n g l i o n i c S C G a x o n s , a s m R N A a n d p r o t e i n f o r V I P , b u t n o t S P , s i g n i fi c a n t l y i n c r e a s e s a f t e r a x o t o m y ( R a o e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e t a r g e t o f i n n e r v a t i o n s e c r e t e s r e g u l a t o r y m o l e c u l e s w h i c h a r e t a k e n u p a n d r e t r o g r a d e l y t r a n s p o r t e d b y p r e s y n a p t i c n e r v e s . T h e s e r e g u l a t o r y 9 2 m o l e c u l e s w o u l d i n fl u e n c e n e u r o t r a n s m i t t e r e x p r e s s i o n ( r e v i e w e d i n H e n d r y , 1 9 9 2 ) , s i m i l a r t o t h e m e c h a n i s m s b y w h i c h n e r v e g r o w t h f a c t o r ( N G F ) r e g u l a t e s n e u r o n a l s u r v i v a l ( H e n d r y e t a l . , 1 9 7 4 ) . A l t h o u g h f e w r e g u l a t o r y m o l e c u l e s h a v e b e e n i d e n t i fi e d , c y t o k i n e s s u c h a s c i l i a r y n e u r o t r o p h i c f a c t o r ( C N T F ) a n d c h o l i n e r g i c d i f f e r e n t i a t i o n f a c t o r ( C D F ) , ( a l s o k n o w n a s l e u k e m i a i n h i b i t o r y f a c t o r , L I F ) s t i m u l a t e e x p r e s s i o n o f V I P i n S C G n e u r o n s i n v i t r a ( N a w a a n d P a t t e r s o n , 1 9 9 0 ) . I n t h i s p r o p o s e d m o d e l , a n i n h i b i t o r y m o l e c u l e w o u l d o r i g i n a t e f r o m t h e t a r g e t o f i n n e r v a t i o n a n d r e p r e s s V I P e x p r e s s i o n i n n o r m a l n e u r o n s . A x o n a l c r u s h i n g o r a x o t o m y w o u l d p r e v e n t r e t r o g r a d e t r a n s p o r t o f i n h i b i t o r y m o l e c u l e s , r e s u l t i n g i n u p — r e g u l a t i o n o f n e u r o p e p t i d e e x p r e s s i o n . F i n a l l y , S P l e v e l s m a y b e r e g u l a t e d b y N G F , a s c i l i a r y g a n g l i o n e c t o m y o r d e c e n t r a l i z a t i o n o f S C G i n c r e a s e s N G F ( r e v i e w e d i n H e n d r y , 1 9 9 2 ) , e x o g e n o u s N G F i n c r e a s e s S P c o n c e n t r a t i o n a n d T H a c t i v i t y i n t h e i r i s ( K e s s l e r e t a l . , 1 9 8 3 ; K e s s l e r , 1 9 8 5 ) a n d S C G ( r e v i e w e d i n R a o a n d L a n d i s , 1 9 9 2 ) , a n d a n t i b o d i e s a g a i n s t N G F i n h i b i t i n d u c t i o n o f S P a n d T H . T h e c e l l u l a r m e c h a n i s m s f o r s u c h r e g u l a t i o n a r e u n k n o w n a t t h i s t i m e . I n d e v e l o p m e n t , n e u r o n s a n d m y o b l a s t s m a y d e v e l o p i n d e p e n d e n t l y o f e a c h o t h e r . H o w e v e r , n e u r o n s c a n i n fl u e n c e t a r g e t t i s s u e , a n d t a r g e t t i s s u e h a s p r o f o u n d e f f e c t s o n n e u r o n a l d e v e l o p m e n t s u c h a s i n f o r m a t i o n o f c o r r e c t s y n a p s e s a n d j u n c t i o n s ( r e v i e w e d i n H e n d r y , 1 9 9 2 ) . H o w e v e r , i t i s f e a s i b l e t h a t a l t h o u g h n e u r o n s a n d m y o b l a s t s p r o d u c e g r o w t h f a c t o r s s u c h a s i n s u l i n - l i k e g r o w t h f a c t o r , fi b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r , C N T F , a n d C D F , t h e s e m o l e c u l e s a r e n o t r e t r o g r a d e l y t r a n s p o r t e d , b u t a c t e x t r a c e l l u l a r l y v i a a m e m b r a n e - b o u n d r e c e p t o r t o g e n e r a t e a s e c o n d m e s s e n g e r . T h e r e f o r e , t h e a b i l i t y o f t h e s e m o l e c u l e s d e p e n d s o n t h e p r e s e n c e o f t h e m o l e c u l e i t s e l f a n d a r e c e p t o r o n t h e n e u r o n o f i n t e r e s t . T h e s e t w o c r i t e r i a a g r e e w e l l w i t h a n t i d o t a l d a t a , a s s t u d i e s h a v e i l l u s t r a t e d t h e S y m p a t h e t i c n e r v e s , s t i m u l a t i o n o f T , r e s u l t s i n v a s o c o n s t r i c t i o n o f a r t e r i o l e s i n t h e e a r , 9 3 i m p o r t a n c e o f t h e t y p e o f n e u r o n ( I a c o v i t t i e t a l . , 1 9 8 2 ; W a l i c k e e t a l . , 1 9 7 7 ) ( t h e p r e s e n c e o f a r e c e p t o r ) , a s w e l l a s t h e i m p o r t a n c e o f t h e t a r g e t o f i n n e r v a t i o n ( r e v i e w e d i n L a n d i s , 1 9 9 0 ) ( t h e s o u r c e o f c y t o k i n e s a n d / o r g r o w t h f a c t o r s ) . A l t h o u g h a c l e a r e x a m p l e h a s n o t b e e n f o u n d , b a s i c fi b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ( b F G F ) i s f o u n d i n a d r e n a l m e d u l l a r y c h r o m a f f m g r a n u l e s ( W e s t e r r n a n n e t a l . , 1 9 9 0 ) , a n d b F G F i m p r e g n a t e d g e l f o a m s c a n p r e v e n t d e a t h o f p r e g a n g l i o n i c a d r e n a l n e u r o n s f o l l o w i n g d e s t r u c t i o n o f t h e a d r e n a l m e d u l l a ( B l o t t r r e r e t a l . , 1 9 8 9 ) . A t t h i s t i m e , i t i s u n k n o w n i f b F G F i s r e t r o g r a d e l y t r a n s p o r t e d , o r a c t s v i a a s e c o n d m e s s e n g e r , o r i f b F G F c a n r e g u l a t e n e u r o t r a n s m i t t e r s , i n a d d i t i o n t o c o n t r o l l i n g c e l l f a t e . H o w e v e r , C N T F r e g u l a t e s s u r v i v a l o f d e v e l o p i n g a n d a d u l t n e u r o n s , a n d r e g u l a t e s t r a n s c r i p t i o n o f V I P , s o m a t o s t a t i n , a n d C G R P ( S y m e s e t a l . , 1 9 9 3 ) , p r o v i d i n g p r e l i m i n a r y e v i d e n c e t h a t r e g u l a t i o n b y t a r g e t - d e r i v e d m o l e c u l e s m a y o c c u r . A x o n a l S p r o u t i n g a n d R e g e n e r a t i o n o f A d u l t N e u r o n s A n a t o m i c a l s t u d i e s h a v e p r o v i d e d t w o g e n e r a l e x p l a n a t i o n s f o r p l a s t i c i t y i n a u t o n o m i c a n d p e r i p h e r a l n e r v e s . A s d e s c r i b e d a b o v e , d e n e r v a t i o n c a n i n d u c e a l t e r a t i o n s i n n e u r o n a l p h e n o t y p e , m a n i f e s t e d a s a n u p r e g u l a t i o n o f e x i s t i n g n e u r o t r a n s m i t t e r s , o r a s w i t c h i n p h e n o t y p i c e x p r e s s i o n . T h e s e c o n d m e c h a n i s m f o r p l a s t i c i t y i n v o l v e s f o r m a t i o n o f a x o n a l s p r o u t s , c o m p l e t e r e g e n e r a t i o n o f p r e v i o u s l y - d a m a g e d n e r v e s , a n d f o r m a t i o n o f c o r r e c t s y n a p s e o r j u n c t i o n s . I t h a s b e e n w e l l d o c u m e n t e d t h a t f o l l o w i n g l e s i o n o f p e r i p h e r a l n e r v e s , o r a u t o n o m i c p r e g a n g l i o n i c o r p o s t g a n g l i o n i c n e r v e s , t h e l e s i o n e d n e r v e s f o r m r e g e n e r a t i v e a x o n a l s p r o u t s t h a t w i l l o f t e n r e i n n e r v a t e t h e d e n e r v a t e d t a r g e t ( G u t h , 1 9 5 6 ) . F o r e x a m p l e , 2 t o 4 m o n t h s a f t e r l e s i o n o f p r e g a n g l i o n i c c e r v i c a l 9 4 w h e r e a s s t i m u l a t i o n o f T 4 d i l a t e s t h e p u p i l s ( L a n g l e y 1 8 9 7 ) . T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t n o t o n l y d i d p r e g a n g l i o n i c n e r v e s r e g r o w a f t e r a x o t o m y , b u t r e f o r m e d t h e c o r r e c t n e u r o - e f f e c t o r j u n c t i o n s . F u r t h e r m o r e , t h e r e a r e n u m e r o u s e x a m p l e s o f a x o n a l s p r o u t i n g a n d r e g e n e r a t i o n o f n e r v e s e x p r e s s i n g a n e w p h e n o t y p e a s c o m p a r e d t o i n n e r v a t i o n p r i o r t o s u r g e r y . F o r e x a m p l e , a f t e r c h e m i c a l s y m p a t h e c t o m y , t h e c h o l i n e r g i c i n n e r v a t i o n t o t h e v a s d e f e r e n s i n c r e a s e s , p r e s u m a b l y t o r e p l a c e t h e n o r a d r e n e r g i c i n n e r v a t i o n ( E v a n s e t a l . , 1 9 7 9 ) . A l t e r n a t i v e l y , t h e s o u r c e o f i n n e r v a t i o n m a y n o t b e a l t e r e d , b u t l e v e l s o f n e u r o t r a n s m i t t e r s o r n e u r o m o d u l a t o r s a r e a f f e c t e d b y a x o t o m y . F o l l o w i n g u n i l a t e r a l s u p e r i o r c e r v i c a l g a n g l i o n e c t o m y i n n e o n a t a l r a t s , t h e r e m a i n i n g S C G m a i n t a i n s t h e i p s i l a t e r a l i n n e r v a t i o n , a n d a s s u m e s c o n t r o l o f t h e c o n t r a l a t e r a l i r i s , t a r s a l m u s c l e , o r b i t a l m u s c l e a n d c h o r o i d a l v a s c u l a t u r e ( r e v i e w e d i n S m i t h e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h e n e w i n n e r v a t i o n f r o m t h e c o n t r a l a t e r a l S C G i n c r e a s e s m u s c l e s i z e a n d c o n t r a c t i l e s t r e n g t h , a l t h o u g h i n n e r v a t i o n s t i l l o r i g i n a t e s f r o m S C G n e u r o n s . A n a t o m i c a l s t u d i e s r e v e a l t h a t a l t h o u g h 2 1 % o f S C G n e u r o n s c o n t a i n e d N P Y u n d e r n o r m a l o r s h a m c o n d i t i o n s , f o l l o w i n g g a n g l i o n e c t o m y , 8 5 % o f S C G n e u r o n s e x p r e s s N P Y , i n d i c a t i n g e i t h e r a n u p r e g u l a t i o n o f N P Y , o r e x p r e s s i o n o f N P Y i n m a n y n e u r o n s n o t p r e v i o u s l y s y n t h e s i z i n g N P Y . R e g u l a t i o n o f A x o n a l S p r o u t i n g a n d R e g e n e r a t i o n T h e m e c h a n i s m s f o r a x o n a l s p r o u t i n g , r e g e n e r a t i o n , a n d s y n a p s e f o r m a t i o n a r e p o o r l y u n d e r s t o o d a t t h i s t i m e . A m u l t i t u d e o f m o l e c u l e s h a v e b e e n i d e n t i fi e d i n d e v e l o p i n g a n d r e g e n e r a t i n g n e r v e s t h a t m a y b e i m p o r t a n t , a n d a d i s c u s s i o n o f e a c h i s b e y o n d t h e s c o p e o f t h i s r e v i e w . H o w e v e r , C a j a l ( 1 9 2 8 ) d e m o n s t r a t e d t h a t r e g e n e r a t i n g a x o n s p r e f e r e n t i a l l y g r o w t o w a r d s d e a f f e r e n t e d s t u m p s o f t r a n s e c t e d n e r v e , a s r e g r t h i s g r e a t l y d e c r e a s e d u p o n r e m o v a l o f t h e d i s t a l n e r v e s t u m p . T h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t 9 5 t h a t t h e d i s t a l n e r v e , m y e l i n , o r s u p p o r t c e l l s r e l e a s e s s o l u b l e c h e m o a t t r a c t a n t m o l e c u l e s t h a t i n d u c e s s p r o u t i n g a n d g u i d e s r e g r o w i n g a x o n s a l o n g t h e c o r r e c t p a t h . T h e m o l e c u l e s c u r r e n t l y t h o u g h t t o b e i n v o l v e d i n s p r o u t i n g o f p e r i p h e r a l a x o n s , i n c l u d e N G F ( H e n d r y , 1 9 9 2 ; K u c h e l e t a l . , 1 9 9 2 ; V a n d e r Z e e e t a l . , 1 9 9 2 ) , i n s u l i n ( E k s t r o m e t a l . , 1 9 9 3 ; E d b l a d h e t a l . , 1 9 9 4 ) , l a m i n i n , fi b r o n e c t i n ( W a n g e t a l . , 1 9 9 2 ) , i n s u l i n - l i k e g r o w t h f a c t o r I I ( G l a z n e r e t a l . , 1 9 9 3 ; E d b l a d h , 1 9 9 4 ) , c i l i a r y n e u r o t r o p h i c f a c t o r ( S e n d t n e r e t a l . , 1 9 9 2 ) , a m y l o i d p r e c u r s o r p r o t e i n ( A l v a r e z e t a l . , 1 9 9 2 ) , a n d m a p - a s s o c i a t e d k i n a s e s ( H e n d r y , 1 9 9 2 ) . H o w e v e r , i t s h o u l d b e n o t e d t h a t i t i s i m p r o b a b l e t h a t a s i n g l e m o l e c u l e c a n i n i t i a t e a n d m a i n t a i n a x o n a l g r o w t h , a n d s e l e c t a n d m a i n t a i n t h e c o r r e c t s y n a p s e s . l l . R A T I O N A L E F O R U S E O F G U I N E A P I G I L E U M T h e n e u r o n s o f t h e s m a l l i n t e s t i n e r e g u l a t e a n u m b e r o f p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n s , i n c l u d i n g b l o o d fl o w a n d m o t i l i t y . T h e s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s a n d l o n g i t u d i n a l m u s c l e w e r e c h o s e n a s m o d e l s f o r t h e s e s t u d i e s f o r f o u r r e a s o n s . F i r s t , b o t h n e u r o e f f e c t o r t a r g e t s r e c e i v e i n t r i n s i c a n d e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n i m p o r t a n t i n r e g u l a t i o n o f d i g e s t i v e f u n c t i o n s . S e c o n d , o t h e r i n v e s t i g a t o r s h a v e c h a r a c t e r i z e d t h e p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n s a n d a n a t o m y o f e x t r i n s i c a n d i n t r i n s i c i n n e r v a t i o n t o t h e a r t e r i o l e s a n d l o n g i t u d i n a l m u s c l e i n n o r m a l s m a l l i n t e s t i n e . A s a r e s u l t o f t h i s c h a r a c t e r i z a t i o n , s p e c i fi c a n a t o m i c a l m a r k e r s c a n b e c h o s e n t o s e l e c t i v e l y l a b e l e x t r i n s i c s y m p a t h e t i c , e x t r i n s i c p r i m a r y a f f e r e n t , i n t r i n s i c e x c i t a t o r y , o r i n t r i n s i c i n h i b i t o r y i n n e r v a t i o n . F i n a l l y , f u n c t i o n a l a s s a y s f o r i n h i b i t o r y i n n e r v a t i o n e x i s t t o a l l o w c o r r e l a t i o n o f a l t e r a t i o n s i n r e g u l a t i o n o f f u n c t i o n . M E T H O D S 1 . A N I M A L S A l b i n o m a l e g u i n e a p i g s ( 2 5 0 - 4 0 0 g ) w e r e o b t a i n e d f r o m t h e M i c h i g a n D e p a r t m e n t o f P u b l i c H e a l t h ( L a n s i n g , M I ) o r C h a r l e s R i v e r B r e e d i n g L a b o r a t o r i e s ( I n d i a n a p o l i s , I n d i a n a ) a n d m a i n t a i n e d u n d e r c o n d i t i o n s o f c o n t r o l l e d t e m p e r a t u r e a n d l i g h t i n g w i t h G u i n e a P i g c h o w f r o m H a r l a n T e k l a d o r P u r i n a a n d w a t e r p r o v i d e d a d l i b i t u m . 2 . E X T R I N S I C D E N E R V A T I O N G u i n e a p i g s w e r e a n e s t h e t i z e d w i t h 5 0 m g / k g k e t a m i n e a n d 5 m g / k g x y l a z i n e a d m i n i s t e r e d i n t r a m u s c u l a r y . A l o o p o f i l e u m w i t h a t t a c h e d m e s e n t e r i c a r c a d e w a s e x p o s e d t h r o u g h a n a b d o m i n a l i n c i s i o n , a n d e x t r i n s i c p e r i v a s c u l a r a n d p a r a v a s c u l a r n e r v e s a s s o c i a t e d w i t h t h e m e s e n t e r i c b l o o d v e s s e l s i n n e r v a t i n g t h e l o o p o f i l e u m w e r e c r u s h e d w i t h w a t c h m a k e r f o r c e p s ( F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 7 8 ) . T h e a r t e r i o l e s w e r e b a t h e d w i t h a s o l u t i o n o f 1 % l i d o c a i n e t o p r e v e n t v a s o s p a s m . T h e l o o p o f i n t e s t i n e w a s i d e n t i fi e d b y a p i e c e o f 5 - 0 s i l k s u t u r e l e f t e n c i r c l i n g t h e m o t h e r a r t e r i o l e . T h e i l e u m w a s r e t u r n e d t o t h e a b d o m i n a l c a v i t y , a n d t h e i n c i s i o n w a s c l o s e d u s i n g 4 - 0 s u r g i c a l s i l k . S h a m s u r g e r i e s w e r e i d e n t i c a l t o t h e d e n e r v a t i o n s u r g e r i e s , e x c e p t t h a t t h e n e r v e s w e r e n o t c r u s h e d . A n i m a l s w e r e g i v e n s o i n j e c t i o n s o f C o m b i o t i c “ , a n a q u e o u s s u s p e n s i o n o f p e n i c i l l i n a n d d i h y d r o s t r e p t o m y c i n ( W e b s t e r , S y r a c u s e , N Y ) , a n d p l a c e d u n d e r a n i n c a n d e s c e n t l a m p t o m a i n t a i n b o d y t e m p e r a t e u n t i l t h e a n i m a l w a s r e t u r n e d t o i t s h o m e c a g e . 9 6 9 7 A s s u r g i c a l d e n e r v a t i o n d e s t r o y e d s y m p a t h e t i c , p a r a s y m p a t h e t i c a n d s e n s o r y n e r v e s , n e u r o t o x i n s w e r e u s e d t o s e l e c t i v e l y d e s t r o y a s i n g l e p o p u l a t i o n o f n e r v e s . G u i n e a p i g s w e r e a d m i n i s t e r e d s u b c u t a n e o u s i n j e c t i o n s o f 2 5 0 m g / k g o f 6 - h y d r o x y - d o p a m i n e ( 6 - O H - D A ) ( S i g m a ) o n d a y s 1 , 3 , 5 , a n d 7 t o s e l e c t i v e l y d e s t r o y s y m p a t h e t i c i n n e r v a t i o n t o t h e G I t r a c t ( F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 7 4 a ) , a s 6 - O H - D A i s a c c u m u l a t e d b y c a t e c h o l a n r i n e r g i c n e u r o n s r e s u l t i n g i n a r e s t r i c t i v e d e g e n e r a t i v e a c t i o n o f t h e c o m p o u n d ( T r a n z e r a n d T h o e n e n , 1 9 6 7 ) . C o n t r o l a n i m a l s r e c e i v e d s u b c u t a n e o u s i n j e c t i o n s o f 0 . 1 % a s c o r b i c a c i d . S m a l l u n m y e l i n a t e d p r i m a r y a f f e r e n t n e r v e s w e r e e l i m i n a t e d b y d a i l y s u b c u t a n e o u s i n j e c t i o n s o f i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f c a p s a i c i n ( 0 . 5 m g / k g t o 5 0 m g / k g ) ( P a p k a e t a l . , 1 9 8 4 ; G a l l i g a n e t a l . , 1 9 8 8 ; H o l z e r , 1 9 9 1 ) . C o n t r o l a n i m a l s r e c e i v e d s c i n j e c t i o n s o f 8 0 % P B S , 1 0 % T w e e n 8 0 , a n d 1 0 % e t h a n o l . 3 . P R E P A R A T I O N O F I L E U M F O R I M M U N O H I S T O C H E M I S T R Y G u i n e a p i g s w e r e a n e s t h e t i z e d v i a h a l o t h a n e i n h a l a t i o n , s t u n n e d , a n d e x s a n g u i n a t e d . A s e g m e n t o f i l e u m w a s r e m o v e d 1 0 - 2 0 p r o x i m a l t o t h e i l e o c e c a l j u n c t i o n a n d p l a c e d i n o x y g e n a t e d ( 9 5 % O z , 5 % C 0 2 ) K r e b s ’ s o l u t i o n c o n t a i n i n g ( ( m M ) N a C l , 1 1 7 ; K C l , 4 . 7 ; C a C l z , 2 . 5 ; M g C l z , 1 . 2 ; N a H C O 3 , 2 5 ; N a H 2 P 0 4 , 1 . 2 ; a n d g l u c o s e , 1 1 ) . T h e s e g m e n t o f i l e u m w a s t h e n t r a n s f e r r e d i n t o a p e t r i d i s h l i n e d w i t h s i l i c o n e e l a s t o m e r ( S y l g a r d R , D o w C o r n i n g , M i d l a n d , M 1 ) , t h e m e s e n t e r i c a t t a c h m e n t w a s r e m o v e d , a n d t h e i n t e s t i n e w a s o p e n e d a l o n g t h e m e s e n t e r i c b o r d e r . T h e t i s s u e w a s g e n t l y s t r e t c h e d i n t o a r e c t a n g u l a r s h e e t , p i n n e d o n t o a p i e c e o f b a l s a w o o d , a n d fi x e d a c c o r d i n g t o o n e o f t h r e e p r o t o c o l s . M o s t p r e p a r a t i o n s w e r e fi x e d o v e r n i g h t i n Z a m b o n i ’ s s o l u t i o n ( 4 % p a r a f o r m a l d e h y d e a n d 1 5 % p i c r i c a c i d ) m a i n t a i n e d a t 4 ° C ( Z a m b o n i e t a l . , 1 9 6 7 ; 9 8 S t e f a n i n i e t a l . , 1 9 6 7 C o s t a e t a l . , 1 9 8 0 ) , c l e a r e d i n d i m e t h y l s u l f o x i d e t o r e m o v e fi x a t i v e f r o m t h e t i s s u e , a n d r e h y d r a t e d i n 0 . 0 1 M p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e ( P B S ) , p H 7 . 1 . S o m e i l e a l s h e e t s w e r e fi x e d f o r 3 h a t r o o m t e m p e r a t u r e i n 4 % p a r a f o r m a l d e h y d e , a n d w a s h e d i n P B S . F i n a l l y , s o m e p r e p a r a t i o n s w e r e fi x e d i n 2 % p a r a f o r r n a l d e h y d e c o n t a i n i n g 0 . 2 % p i c r i c a c i d f o r 4 h a t r o o m t e m p e r a t u r e , a n d w a s h e d i n P B S t o r e m o v e r e s i d u a l fi x a t i v e ( S c h e m a n n e t a 1 . , 1 9 9 3 ) . F o l l o w i n g fi x a t i o n , t i s s u e s w e r e s t o r e d a t 4 ° C i n P B S w i t h 0 . 1 % s o d i u m a z i d e a s a p r e s e r v a t i v e . A s s o m e n e u r o p e p t i d e s s u c h a s s u b s t a n c e P a r e d i f fi c u l t t o l o c a l i z e i n e n t e r i c s o m a t a , s o m e p i e c e s o f i l e u m w e r e i n c u b a t e d f o r 8 h a t r o o m t e m p e r a t u r e i n E a g l e ’ s M o d i fi e d E s s e n t i a l M e d i u m ( M E M ) c o n t a i n i n g 1 0 0 1 1 M c o l c h i c i n e t o b l o c k m i c r o t u b u l e e l o n g a t i o n , r e s u l t i n g i n e n h a n c e d n e u r o p e p t i d e l e v e l s o f s o m a t a ( F u r n e s s e t a l . , 1 9 8 3 ) . P r i o r t o a n y i m m u n o h i s t o c h e m i c a l p r o c e d u r e , t h e fi x e d t i s s u e w a s w a s h e d a t l e a s t t w i c e i n P B S . T h e m u c o s a w a s r e m o v e d b y s c r a p i n g w i t h a s c a l p e l , o r b y p e e l i n g s t r i p s a w a y f r o m t h e s u b m u c o s a l p l e x u s w i t h a p a i r o f w a t c h m a k e r f o r c e p s . T h e s u b m u c o s a l p l e x u s a n d c i r c u l a r m u s c l e w e r e s e p a r a t e d f r o m t h e L M M P u s i n g b l u n t d i s s e c t i o n ( C o s t a e t a l . , 1 9 8 0 ) , r e s u l t i n g i n a s u b m u c o s a l l a y e r o r s u b m u c o s a l l a y e r a n d a t t a c h e d c i r c u l a r m u s c l e , a n d a m y e n t e r i c p l e x u s a n d l o n g i t u d i n a l m u s c l e ( L M M P ) p r e p a r a t i o n . R e p r e s e n t a t i v e s a m p l e s o f t h e s e p a r a t e d l a m i n a e m e a s u r i n g a p p r o x i m a t e l y 0 . 5 c m 2 w e r e p l a c e d i n P B S i n i n d i v i d u a l w e l l s o f F a l c o n R 2 4 w e l l t i s s u e c u l t u r e p l a t e s ( B e c t o n D i c k i n s o n , L i n c o l n P a r k , N J ) l i n e d w i t h s i l i c o n e e l a s t o m e r . 4 . I M M U N O H I S T O C H E M I S T R Y T i s s u e s w e r e i n c u b a t e d f o r 4 8 h a t r o o m t e m p e r a t u r e i n a n t i s e r u m a n d / o r a n t i b o d i e s r a i s e d a g a i n s t v a r i o u s n e u r o p e p t i d e s , e n z y m e s , o r o t h e r c e l l u l a r p r o t e i n s . T h e 9 9 p r e p a r a t i o n s w e r e i n c u b a t e d o c c a s i o n a l l y i n a s i n g l e a n t i s e r u m ; h o w e v e r , t h e m a j o r i t y o f t i s s u e s w e r e i n c u b a t e d i n t w o a n t i b o d i e s r a i s e d i n d i f f e r e n t s p e c i e s o f a n i m a l s t o a l l o w s i m u l t a n e o u s c o - l o c a l i z a t i o n o f t w o d i f f e r e n t a n t i g e n s v i a i n d i r e c t i m m u n o fl u o r e s c e n c e ( S t e r n b e r g e r , 1 9 7 4 ; C o s t a e t a l . , 1 9 8 7 ) . T h e p r i m a r y a n t i s e r a , s o u r c e s , d i l u t i o n s , a n d r e f e r e n c e s f o r c h a r a c t e r i z a t i o n a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 1 . T h e t i s s u e s w e r e w a s h e d t h r e e t i m e s i n P B S , a n d i n c u b a t e d f o r 2 h a t r o o m t e m p e r a t u r e i n t h e a p p r o p r i a t e s e c o n d a r y a n t i s e r a c o n j u g a t e d t o a fl u o r e s c e n t m o l e c u l e . B o u n d s u b s t a n c e P a n t i s e r u m w a s l o c a l i z e d u s i n g 1 : 8 0 g o a t a n t i - r a t I g G c o n j u g a t e d t o t e t r a m e t h y l r h o d a m i n e i s o t h i o c y a n a t e ( C h e m i c o n , T e m e c u l a , C A ) , T e x a s r e d s u l f o n y l c h l o r i d e ( T R S C , T e x a s r e d ) ( J a c k s o n I m m u n o l o g i c a l s , W e s t G r o o v e , P A ) , o r fl u o r e s c e i n i s o t h i o c y a n a t e ( F I T C ) ( S i g m a , S t . L o u i s , M O ) . B o u n d a n t i s e r u m r a i s e d a g a i n s t p h o s p h o r y l a t e d h e a v y n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n ( p N F - H ; S M I 3 1 ) , o r n o n p h o s p h o r y l a t e d h e a v y n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n ( n P N F - H ; S M I 3 2 ) w e r e v i s u a l i z e d b y 1 : 2 0 0 g o a t a n t i - m o u s e I g G a n d I g M c o n j u g a t e d t o r h o d a m i n e ( C h e m i c o n ) , 1 : 1 6 0 g o a t a n t i - m o u s e I g G c o n j u g a t e d t o d i c h l o r o t r i a z i n y l a m i n o fl u o r e s c e i n ( D T A F ) ( J a c k s o n ) , o r 1 : 8 0 0 g o a t a n t i - m o u s e I g G c o n j u g a t e d t o i n d o c a r b o c y a n i n e ( C y 3 ) ( J a c k s o n ) . B o u n d a n t i s e r u m r a i s e d a g a i n s t a n e p i t o p e a c c e s s i b l e i n p h o s p h o r y l a t e d a n d n o n - p h o s p h o r y l a t e d h e a v y n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n ( S M I 3 3 ) w a s l o c a l i z e d b y 1 : 2 0 0 g o a t a n t i - m o u s e I g G a n d I g M c o n j u g a t e d t o r h o d a m i n e ( C h e m i c o n ) , o r 1 : 1 0 0 0 g o a t a n t i - m o u s e I g M c o n j u g a t e d t o C y 3 ( J a c k s o n ) . A n t i b o d i e s o r a n t i s e r u m r a i s e d a g a i n s t C G R P , c F O S , c o n s t i t u t i v e N O S , i n d u c i b l e N O S , N P Y , o r V I P w e r e v i s u a l i z e d u s i n g 1 : 8 0 g o a t a n t i - r a b b i t I g G c o n j u g a t e d t o F I T C ( S i g m a ) , D T A F ( C h e m i c o n ) , o r r h o d a m i n e ( C h e m i c o n ) , o r 1 : 8 0 0 g o a t a n t i - r a b b i t I g G c o n j u g a t e d t o C y 3 . T h e t i s s u e s w e r e r i n s e d t h r e e t i m e s i n P B S t o r e m o v e u n b o u n d s e c o n d a r y a n t i s e r u m , 1 0 0 T a b l e 1 . A n t i s e r a u s e d t o s t u d y d e n e r v a t i o n - i n d u c e d a l t e r a t i o n s i n t h e e n t e r i c n e r v o u s s y s t e m o f g u i n e a p i g i l e u m . A n t i g e n T a r g e t H o s t D i l u t i o n S o u r c e R e f e r e n c e C o d e A n t i g e n C h A t C h A t r a b b i t 1 : 2 0 0 B i o m e t r a S c h e m a n n P 3 e t a l . , 1 9 9 3 C G R P C G R P r a b b i t 1 : 8 0 0 A m e r s h a m G i b b i n s A B l 9 7 1 2 8 - 3 7 e t a l . , 1 9 8 5 c F O S c F O S s h e e p n o t C a m b r i d g e n o t O A - l 1 - 8 2 3 1 - 1 6 d e t e r m i n e d R e s e a r c h a v a i l a b l e c F O S c F O S m o u s e n o t O n c o g e n e n o t A B - l 1 2 8 - 1 5 2 d e t e r m i n e d S c i e n c e s a v a i l a b l e c F O S c F O S r a b b i t 1 : 1 0 0 0 S a n t a C r u z n o t S C - 5 2 3 - 1 6 a v a i l a b l e c N O S c e r e b e l l a r r a b b i t 1 : 1 0 0 0 B . M a y e r K l i r n a s c h - N O S e w s k i e t a l . , l 9 9 2 i N O S i n d u c i b l e r a b b i t 1 : 5 0 0 M . M a r l e t t a n o t N O S a v a i l a b l e N P Y N P Y r a b b i t 1 : 4 0 0 A m e r s h a m F u m e s s R P N 1 7 0 2 1 - 3 5 e t a l . , 1 9 8 5 n p N F - H h y p o t h a l - m o u s e 1 : 5 0 0 S t e m b e r g - S t e r n b e r g - S M I 3 2 a m u s ' e r e r e t a l . , 1 9 8 3 p n p N F - H h y p o t h a l - m o u s e 1 : 1 0 0 0 S t e r n b e r g - S t e m b e r g - S M I 3 3 a m u s e r e r e t a l . , 1 9 8 3 p N F - H h y p o t h a l - m o u s e 1 : 1 0 0 0 S t e r n b e r g - S t e m b e r g - S M I 3 1 a m u s e r e r e t a l . , 1 9 8 3 S P S P r a t 1 : 2 0 0 S e r o t e c C u e l l o e t N C L 3 4 H L 1 - 1 1 a l . , 1 9 7 9 V I P V I P r a b b i t 1 : 4 0 0 J . W a l s h F u r n e s s e t 7 9 1 3 1 - 2 8 a l . , 1 9 8 1 1 0 1 m o u n t e d o n m i c r o s c o p e s l i d e s ( C o r n i n g , C o r n i n g , N Y ) w i t h b i c a r b o n a t e - b u f f e r e d g l y c e r o l ( p H 8 . 6 ) ( C o s t a e t a l . , 1 9 8 0 ) , a n d c o v e r s l i p p e d ( C o r n i n g ) . T h e t i s s u e s w e r e v i s u a l i z e d w i t h a n i n v e r t e d N i k o n d i a p h o t m i c r o s c o p e e q u i p p e d w i t h a n e p i - fl u o r e s c e n t c o l l e c t o r l e n s a t m a g n i fi c a t i o n o f 4 0 0 x . T h e b a r r i e r c u b e G l B ( 5 8 0 n m d i c h r o i c m i r r o r , 5 4 6 n m e x c i t a t i o n fi l t e r , 5 9 0 n m b a r r i e r fi l t e r ) w a s u s e d t o v i s u a l i z e T R I T C ( fl u o r o c h r o m e e x c i t a t i o n 5 5 7 n m , fl u o r o c h r o m e e m i s s i o n 5 7 6 n m ) , T R S C ( fl u o r o c h r o m c e x c i t a t i o n 5 9 6 n m , fl u o r o c h r o m e e m i s s i o n 6 2 0 n m ) , a n d C y 3 ( fl u o r o c h r o m e e x c i t a t i o n 5 5 0 n m , fl u o r o c h r o m e e m i s s i o n 5 7 0 n m ) . B a r r i e r c u b e B - 2 E ( 5 1 0 n m d i c h r o i c m i r r o r , 4 5 0 - 4 9 0 n m e x c i t a t i o n fi l t e r , 5 3 0 n m b a r r i e r fi l t e r ) w a s u s e d t o v i s u a l i z e F I T C ( fl u o r o c h r o m e e x c i t a t i o n 4 9 2 n m , fl u o r o c h r o m e e m i s s i o n 5 2 0 n m ) a n d D T A F ( fl u o r o c h r o m e e x c i t a t i o n 4 9 2 n m , fl u o r o c h r o m e e m i s s i o n 5 2 0 n m ) . K o d a k T e c h n i c a l P a n fi l m ( R o c h e s t e r , N Y ) , r a t e d a t 1 0 0 A S A w a s u s e d f o r b l a c k a n d w h i t e p h o t o g r a p h y , a n d K o d a k E k t a c h r o m e e l i t e s l i d e fi l m r a t e d a t 4 0 0 A S A w a s u s e d f o r c o l o r p h o t o g r a p h y . P e p t i d e n e u t r a l i z a t i o n w a s u s e d t o v e r i f y t h a t p r i m a r y a n t i s e r u m r e c o g n i z e d t h e i n t e n d e d a n t i g e n . A n t i s e r u m a g a i n s t N P Y , C G R P , n e u r o fi l a m e n t s ( S I V H 3 1 , S M I 3 2 , o r S M I 3 3 ) , o r f o s w e r e i n c u b a t e d w i t h 1 0 - f o l d a c c e s s ( b y w e i g h t ) o f p o r c i n e s e q u e n c e N P Y ( S i g m a ) , r a t s e q u e n c e C G R P ( S i g m a ) , n e u r o fi l a m e n t p u r i fi e d f r o m b o v i n e s p i n a l c o r d ( S i g m a ) , o r h u m a n s e q u e n c e f o s p e p t i d e ( a m i n o a c i d r e s i d u e s 3 - 1 6 ) ( S a n t a C r u z B i o t e c h n o l o g y , S a n t a C r u z , C A ) . P r e v i o u s s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t i m m u n o r e a c t i v i t y f o r S P , V I P ( G a l l i g a n e t a l . , 1 9 8 8 ) , i N O S ( M . M a r l e t t a , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) , a n d c N O S ( K l i m a s c h e w s h i e t a l . , 1 9 9 2 ) , i s e l i m i n a t e d b y i n c u b a t i o n o f t h e a n t i b o d y w i t h t h e i n t e n d e d a n t i g e n . T o v e r i f y t h a t t h e s e c o n d a r y a n t i s e r a d i d n o t r e c o g n i z e g u i n e a p i g i m m u n o g l o b u l i n , t i s s u e s w e r e i n c u b a t e d i n d i l u t e d s e c o n d a r y a n t i s e r u m f o r 2 h a t r o o m 1 0 2 t e m p e r a t u r e . F i n a l l y , t i s s u e s w e r e i n c u b a t e d i n p r i m a r y a n t i s e r u m a n d i n c o r r e c t s e c o n d a r y a n t i s e r u m t o v e r i f y t h a t c r o s s r e a c t i o n s d i d n o t o c c u r . A s S M I 3 1 , S M I 3 2 , a n d S M I 3 3 r e c o g n i z e p h o s p h o r y l a t e d , n o n p h o s p h o r y l a t e d , a n d p h o s p h o r y l a t i o n - i n d e p e n d e n t e p i t o p e s i n i m m u n o b l o t s a n d t i s s u e s ( S t e r n b e r g e r a n d S t e r n b e r g e r , 1 9 8 3 ; W a t s o n e t a l . , 1 9 8 9 ) , c o n t r o l e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d t o v e r i f y t h e i r s p e c i fi c i t y i n g u i n e a p i g i l e u m . F i x e d s u b m u c o s a l t i s s u e s w e r e i n c u b a t e d f o r 1 8 h a t 2 2 ° C i n 4 0 0 u g / m L E . c o l i a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ( S i g m a ) i n 0 . 1 M T r i s H C l , p H 8 . 0 , w i t h 0 . 0 1 M p h e n y l m e t h y l s u l f o n y l fl u o r i d e ( P M S F ) t o d e p h o s p h o r y l a t e n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n e p i t o p e s . A l t e r n a t i v e l y , t i s s u e s w e r e i n c u b a t e d f o r 1 0 m i n a t 3 7 ° C i n 4 0 0 u g / m L t r y p s i n ( G i b c o , G r a n d I s l a n d , N Y ) ) i n 0 . 0 5 M T r i s H C l , p H 7 . 6 , 0 . 3 M N a C l a n d 0 . 0 2 M C a C l z , o r i n t r y p s i n a n d p h o s p h a t a s e t r e a t m e n t s s e q u e n t i a l l y . C o n t r o l t i s s u e s w e r e i n c u b a t e d i n t h e b u f f e r s o n l y . T i s s u e s w e r e t h e n w a s h e d w i t h P B S , a n d p r o c e s s e d a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y . A s S M I 3 1 , 3 2 , a n d 3 3 a r e s e n s i t i v e t o t h e p h o s p h o r y l a t i o n s t a t u s o f t h e n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n s , p h o s p h a t e - f r e e b u f f e r ( 0 . 0 5 m T r i s b u f f e r w i t h 1 . 5 % s o d i u m c h l o r i d e , p H 7 . 6 ) w a s a l s o t e s t e d t o d e t e r m i n e i f t h e p r e s e n c e o f p h o s p h a t e i n t h e d i l u e n t b u f f e r c o u l d a l t e r t h e p a t t e r n s o f i m m u n o r e a c t i v i t y i n t h e s u b m u c o s a l p l e x u s ( T r o j a n o w s h i e t a l . , 1 9 8 5 ; T r o j a n o w s k i e t a l . , 1 9 8 6 ) . S . H I S T O C H E M I S T R Y S o m e t i s s u e s w e r e c o u n t e r s t a i n e d w i t h b i s b e n z i m i d e t o s t a i n n u c l e a r m a t e r i a l a c c o r d i n g t o t h e p r o t o c o l o f S w a n s o n a n d S a w c h e n k o ( 1 9 8 2 ) . T i s s u e s w e r e i n c u b a t e d f o r 5 m i n a t 2 2 ° C i n 1 u g / m l o f b i s b e n z i m i d e ( H o e c h s t d y e 3 3 5 2 8 ) ( S i g m a ) i n P B S , p H 7 . 2 , 1 0 3 w a s h e d w i t h P B S , a n d m o u n t e d i n b u f f e r e d g l y c e r o l f o r fl u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y . H e m a t o x y l i n a n d e o s i n s t a i n i n g u s i n g s t a n d a r d p r o c e d u r e s w a s p e r f o r m e d o n n o r m a l , d e n e r v a t e d , a n d c o n t r o l i l e u m fi x e d i n 4 % p a r a f o r m a l d e h y d e b y t h e M i c h i g a n S t a t e H i s t o t e c h n o l o g y C e n t e r . N A D P H d i a p h o r a s e h i s t o c h e m i s t r y w a s u s e d a s a p u t a t i v e a n a t o m i c a l m a r k e r f o r c N O S ( B r e n t e t a l . , 1 9 9 1 ) . T i s s u e s w e r e i n c u b a t e d i n 0 . 2 m M n i t r o b l u e t e t r a z o l i u m ( p - n i t r o t e t r a z o l i u m b l u e , 2 , 2 ’ - D i - p - n i t r o p h e n y l - 5 ’ - 5 ’ d i p h e n y l - [ 3 - 3 ’ - d i m e t h o x y - 4 , 4 ’ - d i p h e n y l e n e j - d i t e t r a z o l i u m c h l o r i d e ] ( S i g m a ) a n d 1 m M N A D P H ( S i g m a ) i n 0 . 1 M T r i s - H C l w i t h 1 % T r i t o n X - 1 0 0 , p H 8 . 0 f o r 3 0 m i n a t 3 7 ° C ( S c h e r e r - S i n g l e r e t a l . , 1 9 8 3 ) . T h e t i s s u e s w e r e w a s h e d i n 0 . 0 1 M P B S , c o v e r s l i p p e d w i t h b u f f e r e d g l y c e r o l , a n d v i s u a l i z e d u s i n g d i f f e r e n t i a l i n t e r f e r e n c e c o n t r a s t o p t i c s a t 1 0 0 , 2 0 0 , a n d 4 0 0 x m a g n i fi c a t i o n . N A D H d i a p h o r a s e h i s t o c h e m i s t r y w a s u s e d a s a n e u r o n a l s t a i n ( G a b e l l a , 1 9 6 7 ) . T i s s u e s w e r e p r o c e s s e d a s f o r N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g , e x c e p t N A D H w a s s u b s t i t u t e d a s t h e e l e c t r o n d o n o r . 6 . V E R I F I C A T I O N O F E X T R I N S I C D E N E R V A T I O N A t t h e a p p r o p r i a t e t i m e ( o n e , f o u r , s e v e n , t e n , s i x t e e n , o r t w e n t y - f o u r w e e k s a f t e r d e n e r v a t i o n ) , t h e s m a l l i n t e s t i n e w a s r e m o v e d a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y . T h e d e n e r v a t e d l o o p w a s i d e n t i fi e d b y t h e l o o p o f s i l k s u t u r e , a n d a s m a l l p i e c e o f d e n e r v a t e d a n d c o n t r o l t i s s u e f r o m t h e s a m e a n i m a l w a s p l a c e d i n a 2 % s o l u t i o n o f g l y o x y l i c a c i d ( S i g m a ) a t r o o m t e m p e r a t u r e ( C o s t a a n d F u r n e s s , 1 9 7 4 b ) . T h e m u c o s a w a s s c r a p p e d a w a y , a n d t h e s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c p l e x u s e s w e r e t e a s e d a p a r t w i t h t w o p a i r s o f w a t c h m a k e r 1 0 4 f o r c e p s . T h e t i s s u e s w e r e s t r e t c h e d fl a t o n a g l a s s c o v e r s l i p , i n c u b a t e d f o r 5 m i n a t 1 0 0 ° C , a n d c o v e r s l i p p e d w i t h m i n e r a l o i l . G l y o x y l i c a c i d r e a c t s w i t h t r y p t a m i n e i n c a t e c h o l a m i n e s i n a n a c i d - c a t a l y z e d s t e p t o f o r m t h e w e a k l y fl u o r e s c e n t 1 , 2 , 3 , 4 - t e t r a h e d r a - B — c a r b o l i n e - l - c a r b o x y l i c a c i d v i a a S c h i f f ’ 5 b a s e . T h i s c o m p o u n d c a n u n d e r a n t i o x i d a t i v e d e c a r b o x y l a t i o n t o 3 , 4 - d i h y d r o - B - c a r b o l i n e ; a l t e r n a t i v e l y , i t c a n u n d e r g o a s e c o n d i n t r a r n o l e c u l a r a c i d - c a t a l y z e d r e a c t i o n w i t h G A t o y i e l d 2 - c a r b o x y m e t h y l - 3 , 4 - d i h y d r o - B - c a r b o l i r r i u m s a l t ( B j o r k l u n d e t a l . , 1 9 7 2 ) . T h e s e e n d - p r o d u c t s g i v e o f f b l u e fl u o r e s c e n c e ( fl u o r o c h r o m e e x c i t a t i o n 4 0 5 n m , fl u o r o c h r o m e e m i s s i o n 4 5 0 r u n ) w h e n e x p o s e d t o U V l i g h t ( c u b e V - 2 A , d i c h r o i c m i r r o r 4 3 0 n m , e x c i t a t i o n fi l t e r 4 0 0 n m , b a r r i e r fi l t e r 4 5 0 n m ) ( F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 7 4 ) . D e n e r v a t i o n a f t e r o n e a n d f o u r w e e k s w a s c o n s i d e r e d a c c e p t a b l e i f t h e r e w a s a 9 0 % r e d u c t i o n i n c a t e c h o l a m i n e fl u o r e s c e n c e i n t h e s u b m u c o s a l p l e x u s . A s e x t r i n s i c n e r v e s e v e n t u a l l y r e t u r n t o t h e d e n e r v a t e d s e g m e n t , c o n t r o l s e g m e n t s f r o m t h e s a m e a n i m a l a r e u s e d t o d e t e r m i n e i f t h e p u t a t i v e l y - d e n e r v a t e d s e g m e n t c o n t a i n e d f e w e r s y m p a t h e t i c n e r v e s . A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , s e n s o r y n e r v e s f r o m t h e d o r s a l r o o t g a n g l i a c o n t a i n S P - i r a n d C G R P - 1 r i n t h e s a m e n e r v e s . T h e r e f o r e , i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y f o r S P a n d C G R P w a s u s e d t o d e t e r m i n e i f t h e d e n e r v a t i o n p r o c e d u r e w a s s u c c e s s f u l . ‘ 7 . I N J E C T I O N O F R E T R O G R A D E T R A C E R F l u o r o - g o l d ( F g ) ( F l u o r o c h r o m e I n c . , E n g l e w o o d , C O ) w a s i n j e c t e d i n t o s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s t o i d e n t i f y t h e o r i g i n o f i n t r i n s i c n e r v e s a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s i n n o r m a l a n d d e n e r v a t e d i l e u m . T h e i l e u m w a s r e m o v e d , a n d a 2 c m l e n g t h o f i l e u m w a s p l a c e d i n a p e t r i d i s h l i n e d w i t h s i l i c o n e e l a s t o m e r . T h e i l e u m w a s o p e n e d a l o n g t h e 1 0 5 m e s e n t e r i c b o r d e r , s t r e t c h e d i n t o a r e c t a n g l e , a n d t h e m u c o s a w a s r e m o v e d w i t h fi n e f o r c e p s . A s m a l l p i e c e ( 5 c m 2 ) o f s u b m u c o s a w a s r e m o v e d u s i n g fi n e s c i s s o r s a n d a n y a d h e r i n g c i r c u l a r m u s c l e w a s r e m o v e d w i t h fi n e f o r c e p s . T h e s u b m u c o s a w a s s t r e t c h e d a n d a t t a c h e d w i t h s m a l l s t a i n l e s s s t e e l p i n s t o a s m a l l o r g a n c h a m b e r ( 2 m l v o l u m e ) l i n e d w i t h s i l i c o n e e l a s t o m e r . T h e m o u n t e d s u b m u c o s a l p r e p a r a t i o n w a s t r a n s f e r r e d t o t h e s t a g e o f a n i n v e r t e d N i k o n D i a p h o t m i c r o s c o p e , a n d a r t e r i o l e s w e r e v i s u a l i z e d b y d i f f e r e n t i a l i n t e r f e r e n c e c o n t r a s t o p t i c s a t a fi n a l m a g n i fi c a t i o n o f 4 0 0 x . T h e p r e p a r a t i o n s w e r e c o n t i n u o u s l y s u p e r f u s e d w i t h o x y g e n a t e d K r e b s ’ s o l u t i o n h e a t e d t o 3 6 ° C . G l a s s m i c r o p i p e t t e s w e r e b r o k e n b a c k , b e v e l e d t o a t i p d i a m e t e r o f 8 - 1 5 p m , a n d fi l l e d w i t h a s o l u t i o n o f 4 % fl u o r o - g o l d d i s s o l v e d i n d i s t i l l e d w a t e r . T h e m i c r o p i p e t t e w a s p o s i t i o n e d w i t h a m i c r o m a n i p u l a t o r u n d e r v i s u a l g u i d a n c e o n t h e s u r f a c e o f a n a r t e r i o l e , a n d t h e n a d v a n c e d i n t o t h e a r t e r i o l a r w a l l . P u l s e s o f n i t r o g e n ( 1 0 p s i , 0 . 3 H z , 3 0 0 m s e c d u r a t i o n , 5 m i n ) w e r e u s e d t o e j e c t fl u o r o - g o l d i n t o o n e a r t e r i o l e p e r p r e p a r a t i o n . F o l l o w i n g i n j e c t i o n o f fl u o r o - g o l d , t h e m i c r o p i p e t t e s w e r e l e f t i n p l a c e f o r a n a d d i t i o n a l 1 0 m i n u t e s t o m i n i m i z e l e a k a g e o f t r a c e r f r o m t h e i n j e c t i o n s i t e . T h e o r g a n c h a m b e r w i t h a t t a c h e d s u b m u c o s a l p r e p a r a t i o n w a s i n c u b a t e d f o r 2 4 h o u r s i n E a g l e ’ s M E M s u p p l e m e n t e d w i t h 1 0 , 0 0 0 U / m l p e n i c i l l i n a n d 1 0 u g / m l p e n i c i l l i n t o a l l o w r e t r o g r a d e t r a n s p o r t t o o c c u r . A f t e r 2 4 h , t h e t i s s u e s w e r e i n c u b a t e d i n f r e s h M E M s u p p l e m e n t e d w i t h 1 0 0 1 1 M c o l c h i c i n e f o r a n a d d i t i o n a l 2 4 h , a n d t h e n fi x e d i n Z a m b o n i ’ s s o l u t i o n a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y . S o m e t i s s u e s w e r e t h e n p r o c e s s e d f o r i m m u n o h i s t o c h e m i c a l l o c a l i z a t i o n o f S P - a n d / o r V I P - i r , a n d c o v e r s l i p p e d w i t h b u f f e r e d g l y c e r o l . F l u o r o - g o l d fl u o r e s c e n c e ( fl u o r o c h r o m e e x c i t a t i o n 3 2 3 n m , fl u o r o c h r o m e e m i s s i o n 4 0 8 n m ) w a s v i e w e d w i t h U V l i g h t ( c u b e V - 2 A ) . 1 0 6 8 . I N V I T R O R E L A X A T I O N S O F L O N G I T U D I N A L M U S C L E L o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c ( L M M P ) p l e x u s p r e p a r a t i o n s w e r e m a d e f r o m s e g m e n t s o f i l e u m u s i n g a m o d i fi c a t i o n o f t h e p r o c e d u r e d e s c r i b e d b y K o s t e r l i t z e t a l . ( 1 9 6 4 ) . T h e m e s e n t e r y w a s r e m o v e d f o r s e g m e n t s o f i l e u m , a n d L M M P p r e p a r a t i o n s w e r e m a d e b y t h r e a d i n g a 5 c m p i e c e o f i l e u m o n t o a g l a s s r o d . T h e L M M P w a s t e a s e d a w a y f r o m t h e s u b m u c o s a l a n d m u c o s a l l a y e r s u s i n g a c o t t o n s w a b . T h e r e s u l t i n g L M M P w a s d i v i d e d i n h a l f , m o u n t e d i n p l e x i g l a s s h o l d e r s e q u i p p e d w i t h p l a t i n u m f o i l e l e c t r o d e s , a n d p l a c e d i n 1 0 o r 2 0 m L b a t h s c o n t a i n i n g 1 1 1 M s c o p o l a m i n e a n d 3 1 . 1 M g u a n e t h i d i n e i n w a r m e d ( 3 6 ° C ) a n d c o n t i n u o u s l y o x y g e n a t e d ( 9 5 % O 2 a n d 5 % C 0 2 ) K r e b s ’ s o l u t i o n . T h e f r e e e n d o f e a c h s e g m e n t w a s a t t a c h e d w i t h a t h r e a d t o a n i s o m e t r i c s t r a i n g a u g e f o r c e t r a n s d u c e r ( F T 0 3 C , G r a s s I n s t r t u n e n t , Q u i n c y , M A ) a n d e a c h t i s s u e w a s s t r e t c h e d t o i t s o p t i m u m l e n g t h ( L o ) f o r d e v e l o p m e n t o f a c t i v e t e n s i o n . T h e m u s c l e w a s c o n t r a c t e d w i t h 3 1 1 M h i s t a m i n e a n d n e r v e - m e d i a t e d N A N C r e l a x a t i o n s w e r e i n d u c e d b y t r a n s m u r a l e l e c t r i c a l s t i m u l i p r o v i d e d b y a G r a s s S 4 8 s t i m u l a t o r ( 6 0 V , 0 . 5 m s e c p u l s e d u r a t i o n , 1 0 0 0 m s e c t r a i n d u r a t i o n , 0 . 2 5 t r a i n s p e r s e c o n d , v a r i a b l e s t i m u l a t i o n ( 1 , 2 , 5 , 1 0 , 2 0 , o r 5 0 H z ) ) a n d a c o n s t a n t c u r r e n t i s o l a t o r ( B u r n s t o c k e t a l . , 1 9 6 6 ) . R e s p o n s e s w e r e r e c o r d e d u s i n g a G r a s s 7 D p o l y g r a p h . D a t a w e r e e x p r e s s e d a s a p e r c e n t o f 2 0 H z r e l a x a t i o n o r c o n t r a c t i o n . 9 . L E N G T H - T E N S I O N R E L A T I O N S H I P S O F L O N G I T U D I N A L M U S C L E A s d e n e r v a t i o n - i n d u c e d a l t e r a t i o n s i n n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s c o u l d r e s u l t f r o m a l t e r a t i o n s i n m u s c l e p r o p e r t i e s , p a s s i v e a n d a c t i v e t e n s i o n w a s m e a s u r e d i n n o r m a l , e x t r i n s i c a l l y d e n e r v a t e d , a n d c o n t r o l a n i m a l s . T h e s t r i p s o f m u s c l e w e r e c l a m p e d i n 1 0 7 p l e x i g l a s s a n d m e t a l h o l d e r s , a n d m o u n t e d i n p l e x i g l a s s h o l d e r s a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y . T h e l e n g t h o f t h e m u s c l e w a s a l t e r e d t h r o u g h a m i c r o m e t e r r a t c h e t s y s t e m ( P e r c y e t a 1 . , 1 9 9 0 ) . T h e i n i t i a l l e n g t h ( L , ) w a s d e fi n e d a s t h e a b s o l u t e l e n g t h o f t h e m u s c l e w h e r e t h e r e i s n o t e n s i o n i n t h e m u s c l e . T h e t i s s u e w a s s t r e t c h e d 0 . 5 m m , a n d t h e r e s p o n s e s w a s a l l o w e d t o e q u i l i b r a t e . T h e a m p l i t u d e o f t h e t h i s r e s p o n s e a t s t e a d y s t a t e r e p r e s e n t e d p a s s i v e t e n s i o n ( P ) . A d d i t i o n t e n s i o n w a s e l i c i t e d b y a d d i t i o n o f 3 u M h i s t a m i n e . T h e p e a k a m p l i t u d e o f t h e a g o n i s t - i n d u c e d r e s p o n s e w a s m e a s u r e d , a n d w a s n a m e d a c t i v e t e n s i o n ( A ) . T h i s v a l u e w a s s u m m e d w i t h P t o p r o d u c e t o t a l t e n s i o n ( T ) . T h e t i s s u e s w e r e w a s h e d 3 t i m e s , 5 m i n u t e s e a c h , a n d t h e p r o c e d u r e w a s r e p e a t e d u n t i l A d i d n o t i n c r e a s e o v e r 3 c o n s e c u t i v e t r i a l s . D a t a w e r e n o r m a l i z e d b y d i v i d i n g t h e l e n g t h o f e a c h t i s s u e b y i t s L o , w h e r e a s t e n s i o n w a s n o r m a l i z e d b y d i v i d i n g a c t i v e o r p a s s i v e t e n s i o n b y t h e m a x i m u m a c t i v e t e n s i o n f o r e a c h t i s s u e . T h e l e n g t h o f t h e m u s c l e w a s a d j u s t e d t o t h e o p t i m a l l e n g t h f o r t h e d e v e l o p m e n t o f a c t i v e t e n s i o n ( L o ) p r i o r t o n e r v e s t i m u l a t i o n . 1 0 . I N V I T R O C O N T R A C T I O N S O F C I R C U L A R M U S C L E W h o l e i l e a l p r e p a r a t i o n s w e r e p r e p a r e d b y d i v i d i n g t h e i l e u m i n t o t r a n s v e r s e r i n g s a p p r o x i m a t e l y 0 . 5 c m w i d e . A l t e r n a t i v e l y , a 2 c m p i e c e o f i l e u m w a s o p e n e d a l o n g t h e m e s e n t e r i c a t t a c h m e n t , t h e m u c o s a w a s r e m o v e d u s i n g fi n e f o r c e p s a n d a d i s s e c t i n g m i c r o s c o p e , a n d t h e r e m a i n i n g t i s s u e w a s c u t i n t o s t r i p s p e r p e n d i c u l a r t o t h e l o n g a x i s o f t h e m e s e n t e r i c b o r d e r . A l l p r e p a r a t i o n s w e r e m o u n t e d i n t h e p l a n e o f t h e c i r c u l a r m u s c l e . T h e t i s s u e s w e r e a t t a c h e d t o p l e x i g l a s s h o l d e r s a n d i s o m e t r i c f o r c e t r a n s d u c e r s a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y f o r t h e l o n g i t u d i n a l m u s c l e . T h e t i s s u e s w e r e a l l o w e d t o e q u i l i b r a t e f o r 9 0 r r r i n u t e s , a n d t h e y w e r e s t r e t c h e d u n t i l 1 g o f r e s t i n g t e n s i o n w a s m a i n t a i n e d . 1 0 8 F r e q u e n c y - r e s p o n s e c u r v e s w e r e g e n e r a t e d u s i n g p a r a m e t e r s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d f o r s t i m u l a t i o n o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e . T r a n s m u r a l s t i m u l a t i o n p r o d u c e d a m o n o p h a s i c c o n t r a c t i o n t h a t w a s a l t e r e d b y m a n y a g o n i s t s a n d a n t a g o n i s t s . A l l c o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e s w e r e c o n s t r u c t e d u s i n g c u m u l a t i v e c o n c e n t r a t i o n s o f a g o n i s t o r a n t a g o n i s t . H o w e v e r , n o n - c u m u l a t i v e c o n c e n t r a t i o n s o f s u b s t a n c e P m e t h y l e s t e r ( S P M E ) a n d b e t h a n e c h o l w e r e u s e d , a s r a p i d d e s e n s i t i z a t i o n o c c u r r e d . 1 1 . N I T R I C O X I D E S Y N T H A S E A S S A Y N O S a c t i v i t y w a s m e a s u r e d a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f M i t c h e l l e t a l . ( 1 9 9 2 ) , b a s e d o n t h e m e t h o d o f B r e d t a n d S y n d e r ( 1 9 8 9 ) . L o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s w e r e m a d e a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y . T h e t i s s u e w a s h o m o g e n i z e d o n i c e i n b u f f e r ( p H 7 . 5 ) c o n t a i n i n g ( m M ) : T r i s - H C l , 5 0 ; E D T A , 0 . 1 ; E G T A , 0 . 1 ; 2 - m e r c a p t o e t h a n o l , 1 2 ; l e u p e p t i n , 0 . 0 0 2 ; p e p s t a t i n , 0 . 0 0 1 ; a n d p h e n y l m e t h y l s u l f o n y l fl u o r i d e , 1 . N i t r i c o x i d e s y n t h a s e a c t i v i t y w a s m e a s u r e d i n t i s s u e h o m o g e n a t e s a s t h e f o r m a t i o n o f L - [ " ’ C ] c i t r u l l i n e f r o m L - [ " ’ C ] a r g i n i n e ( B r e d t a n d S y n d e r , 1 9 9 0 ) . I n m o s t e x p e r i m e n t s , t i s s u e h o m o g e n a t e s ( 5 0 u l ) w e r e i n c u b a t e d w i t h 3 1 1 M [ ” C ] a r g i n i n e ( 3 3 1 . 2 m C i / m m o l e ) ( D u p o n t N e w E n g l a n d N u c l e a r , B o s t o n , M A ) a n d e x o g e n o u s c o f a c t o r s o r a n t a g o n i s t s i n a r e a c t i o n v o l u m e m a d e u p t o 1 0 0 [ . 1 1 w i t h H E P E S ( p H 7 . 5 ) . H o m o g e n a t e s w e r e i n c u b a t e d f o r 2 5 m i n a t 3 7 ° C , a n d t h e r e a c t i o n w a s s t o p p e d b y a d d i t i o n o f 1 m 1 o f 2 0 m M H E P E S ( p H 5 . 5 ) c o n t a i n i n g 2 m M E G T A a n d 2 m M E D T A . A f t e r m i x i n g , 1 m l s a m p l e s w e r e a p p l i e d o n t o c h r o m a t o g r a p h i c c o l u m n s ( D o w e x A G 5 0 W - X 8 r e s i n , 1 . 1 g r e s i n / c o l u m n , N a + f o r m , 2 0 0 - 4 0 0 m e s h ) ( B i o r a d , R o c k v i l l e C e n t e r , N Y ) a n d [ ” C ] c i t r u l l i n e 1 0 9 w a s e l u t e d w i t h 2 x 1 m l a l i q u o t s o f w a t e r . A f t e r a d d i t i o n o f s c i n t i l l a t i o n fl u i d , r a d i o a c t i v i t y w a s m e a s u r e d u s i n g a B e c k m a n s c i n t i l l a t i o n c o u n t e r . A l t h o u g h p r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s d e m o n s t r a t e d t h a t c o l u m n s b o u n d 9 8 : 1 : 1 % ( 3 p r e p a r a t i o n s ) o f [ ” C ] a r g i n i n e , b a c k g r o u n d c o u n t s r e s u l t i n g f r o m t r a c e [ ” C ] a r g i n i n e w e r e m e a s u r e d b y a p p l y i n g t i s s u e - f r e e h o m o g e n a t e s t o 3 c o n t r o l c o l u m n s / t r e a t m e n t . T h e b a c k g r o u n d c o u n t s w e r e a v e r a g e d , a n d s u b t r a c t e d f r o m c o u n t s o f s a m p l e s c o n t a i n i n g t i s s u e . [ ” C ] C i t r u l l i n e p r o d u c t i o n w a s e x p r e s s e d a s p m o l e / m g p r o t e i n , a n d p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s w e r e m e a s u r e d a s d e s c r i b e d b y B r a d f o r d ( 1 9 7 6 ) , u s i n g b o v i n e s e r u m a l b u m i n ( S i g m a ) f o r s t a n d a r d s , a n d p r o t e i n a s s a y d y e r e a g e n t c o n c e n t r a t e f r o m B i o r a d . F i n a l l y , f o r m a t i o n o f [ " C ] c i t r u l l i n e w a s c o n fi r m e d b y t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y ( I y e n g a r e t a l . , 1 9 8 7 ) . 1 2 . D R U G S A l l d r u g s w e r e p u r c h a s e d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o , e x c e p t C P - 9 6 , 3 4 5 - 1 ( d i h y d r o c h l o r i d e s a l t o f [ ( Z S , 3 S ) - c i s - 2 - ( d i p h e n y l m e t h y l ) - N - [ ( 2 - m e t h o x y p h e n y l ) - m e t h y l ] - 1 - a z a b i c y c l o [ 2 , 2 , 2 ] o c t a n - 3 - a m i n e ] , w h i c h w a s t h e g i f t o f P fi z e r ( G r o t o n , C N ) , a n d 8 - B r o m o - c G M P , w h i c h w a s p u r c h a s e d f r o m R e s e a r c h B i o c h e m i c a l s ( N a t i c k , M A ) . P a p a v e r i n e a n d t e t r o d o t o x i n ( T T X ) w e r e d i s s o l v e d i n d i l u t e a c e t i c a c i d , N G - n i t r o - L - a r g i n i n e ( L N A ) w a s d i s s o l v e d i n d i l u t e h y d r o c h l o r i c a c i d , a n d a l l o t h e r d r u g s w e r e d i s s o l v e d i n d e i o n i z e d w a t e r . O x y h e m o g l o b i n a n d s u p e r o x i d e d i s m u t a s e w e r e m a i n t a i n e d o n i c e a f t e r r e c o n s t i t u t i o n , a n d s o d i u m n i t r o p r u s s i d e ( S N P ) w a s m a d e f r e s h d a i l y i m m e d i a t e l y p r i o r t o u s e . 1 1 0 1 3 . S T A T I S T I C A L A N A L Y S I S O F D A T A D a t a w e r e e x p r e s s e d a s m e a n i s t a n d a r d e r r o r o f t h e m e a n . I n a n a t o m i c a l s t u d i e s , t h e r a t i o o f c e l l s / g a n g l i a b e t w e e n t w o g r o u p s w e r e c o m p a r e d u s i n g t h e n o n - p a r a m e t r i c M a n n - W h i t n e y o r W i l c o x o n r a n k - s u r n ( M a n n - W h i t r r e y - W i l c o x o n ) t e s t , w h e r e a s c o m p a r i s o n s b e t w e e n t h r e e o r m o r e u n p a i r e d g r o u p s w e r e m a d e u s i n g t h e K r u s k a l W a l l i s T e s t , f o l l o w e d b y t h e S t u d e n t N e w m a n K e u l s T e s t f o r a p o s t e r i o r i c o m p a r i s o n s . I n f u n c t i o n a l s t u d i e s , c o m p a r i s o n s b e t w e e n t w o g r o u p s w e r e m a d e u s i n g a 2 - t a i l e d s t u d e n t ’ s T t e s t a f t e r v e r i fi c a t i o n o f e q u i v a l e n t v a r i a n c e u s i n g t h e F s t a t i s t i c , w h e r e a s m u l t i p l e c o m p a r i s o n s w e r e m a d e u s i n g a n a l y s i s o f v a r i a n c e ( A N O V A ) , p r o c e e d e d b y t h e L e a s t S i g n i fi c a n t D i f f e r e n c e s t e s t ( S t e e l a n d T o r r i e , 1 9 6 0 ) . T h e e f f e c t o f e a c h d r u g w a s e x p r e s s e d a s t h e p e r c e n t i n c r e a s e o r d e c r e a s e a s c o m p a r e d t o 2 0 H z s t i m u l a t i o n , a n d t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e d r u g p r o d u c i n g h a l f - m a x i m a l ( E C S O ) o r h a l f - m a x i m a l i n h i b i t i o n ( I C S O ) w a s d e t e r m i n e d f o r e a c h t i s s u e , a n d t h e a v e r a g e v a l u e s w e r e e x p r e s s e d a s t h e g e o g r a p h i c m e a n ( F l e m i n g e t a l . , 1 9 7 2 ) . T h e 9 5 % c o n fi d e n c e l i m i t s w e r e c a l c u l a t e d u s i n g t h e S E M . o f t h e a v e r a g e E C s o a n d S t u d e n t ’ s I v a l u e f o r n - 1 d e g r e e s o f f r e e d o m ( K e n a k i n , 1 9 8 7 ) . S i m i l a r s t a t i s t i c a l t e s t s w e r e p e r f o r m e d o n d a t a g e n e r a t e d b y m e a s u r e m e n t o f c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n , e x c e p t t h e D u n c a n M u l t i p l e R a n g e T e s t w a s u t i l i z e d p r o c e e d i n g t w o - w a y A N O V A w i t h r e p l i c a t e s , a n d D u n n e t t ’ s T e s t w a s u s e d t o c o m p a r e s e v e r a l m e a n s t o a s i n g l e c o n t r o l . D i f f e r e n c e s a m o n g g r o u p s w e r e c o n s i d e r e d s i g n i fi c a n t i f t h e p r o b a b i l i t y o f t y p e I e r r o r w a s l e s s t h a n 5 % . R E S U L T S 1 . E X T R I N S I C D E N E R V A T I O N A L T E R S V A S C U L A R I N N E R V A T I O N I n n e r v a t i o n o f S u b m u c o s a l A r t e r i o l e s i n N o r m a l I l e u m F o u r p o p u l a t i o n s o f n e r v e fi b e r s w e r e a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s i n n o r m a l g u i n e a p i g i l e u m . G l y o x y l i c a c i d ( G A ) - i n d u c e d fl u o r e s c e n c e o f n e u r o n a l s t o r e s o f c a t e c h o l a m i n e s a n d i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y f o r T H ( d a t a n o t s h o w n ) a n d N P Y ( d a t a n o t s h o w n ) r e v e a l e d a d e n s e p a r a v a s c u l a r a n d p e r i v a s c u l a r p l e x u s s u r r o u n d i n g a l l s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s ( F i g u r e 5 A ) . V a r i c o s e a n d n o n - v a r i c o s e c a t e c h o l a m i n e r g i c n e r v e fi b e r s c o v e r e d t h e s u r f a c e s o f s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c g a n g l i a , a n d s o m e s y m p a t h e t i c n e r v e fi b e r s f o r m e d p e r i c e l l u l a r b a s k e t s a r o u n d s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c n e u r o n s . S u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c g a n g l i a d i d n o t c o n t a i n c a t e c h o l a m i n e r g i c n e u r o n s , a s G A - i n d u c e d fl u o r e s c e n t o r T H - i r n e u r o n s w e r e n o t o b s e r v e d . I m m u n o h i s t o c h e m i s t r y f o r S P - a n d C G R P - i r r e v e a l e d t h a t p a r a v a s c u l a r v a r i c o s e n e r v e fi b e r s a l w a y s c o n t a i n e d S P - a n d C G R P - i r i n t h e s a m e n e r v e s ( F i g u r e s 7 A a n d 7 8 ) . S u b s t a n c e P - / C G R P - i r n e r v e fi b e r s w e r e b r i g h t l y fl u o r e s c e n t w i t h l a r g e v a r i c o s i t i e s , a n d t h e s e n e r v e s h a d a l a r g e r c a l i b e r t h a n o t h e r n e r v e fi b e r s . S u b s t a n c e P - w i t h o u t C G R P - i r , a n d C G R P - w i t h o u t S P - i r w a s n e v e r o b s e r v e d i n n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s , a l t h o u g h s o m e s u b m u c o s a l n e u r o n s c o n t a i n e d S P - o r C G R P - i r . T h i n S P - i r n e r v e fi b e r s w i t h s m a l l v a r i c o s i t i e s w e r e f o u n d w i t h i n s u b m u c o s a l g a n g l i a , a l t h o u g h t h e y w e r e n o t o b s e r v e d t o a s s o c i a t e w i t h a r t e r i o l e s . 1 1 1 1 1 2 A n t i s e r u m r a i s e d a g a i n s t V I P r e c o g n i z e d o c c a s i o n a l t h i n p a r a v a s c u l a r n e r v e fi b e r s w i t h s m a l l v a r i c o s i t i e s ( F i g u r e 8 A ) . A n t i s e r u m r a i s e d a g a i n s t C h A t i d e n t i fi e d f a i n t , t h i n , n o n - v a r i c o s e n e r v e fi b e r s c l o s e l y a s s o c i a t e d w i t h a d v e n t i t i a ] s u r f a c e s o f a r t e r i o l e s . U n l i k e o t h e r v a s c u l a r n e r v e s , C h A t - i t n e r v e fi b e r s d i d n o t f o r m a p a r a v a s c u l a r o r p e r i v a s c u l a r p l e x u s , b u t a p p e a r e d t o e n t e r a n d l e a v e t h e p l a n e o f t h e t i s s u e , r e s u l t i n g i n s h o r t s e g m e n t s o f i m m u n o r e a c t i v e n e r v e fi b e r s ( d a t a n o t s h o w n ) . F i n a l l y , a n t i s e r u m a g a i n s t N O S a n d d e h y d r o g e n a s e s t a i n i n g f o r N A D P H d i a p h o r a s e a c t i v i t y d i d n o t l a b e l p e r i v a s c u l a r o r p a r a v a s c u l a r i n n e r v a t i o n i n n o r m a l i l e u m ( F i g u r e s 2 5 A a n d 3 1 A ) i n d i c a t i n g n i t r i n e r g i c n e r v e fi b e r s w e r e n o t f o u n d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s i n n o r m a l p r e p a r a t i o n s . H o w e v e r , t h i n , v a r i c o s e N O S - i r n e r v e fi b e r s f o r m e d p e r i c e l l u l a r b a s k e t s a r o u n d s o m e s u b m u c o s a l g a n g l i o n i c n e u r o n s ( F i g u r e 3 1 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s a r e i n n e r v a t e d b y n e r v e s c o n t a i n i n g S P - l C G R P - i r , N P Y - l T H - i r , o r V I P - i r . A r t e r i o l e s a l s o r e c e i v e c h o l i n e r g i c i n n e r v a t i o n a s d e m o n s t r a t e d b y t h e p r e s e n c e o f C h A t - i r n e r v e fi b e r s . H o w e v e r , n o r m a l p a r a v a s c u l a r a n d p e r i v a s c u l a r i n n e r v a t i o n d o n o t c o n t a i n S P - w i t h o u t C G R P - i r , C G R P - w i t h o u t S P - i r , o r N O S - i r . S y m p a t h e t i c N e r v e s A r e D e s t r o y e d b y E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , g l y o x y l i c a c i d r e a c t s w i t h n e u r o n a l s t o r e s o f c a t e c h o l a m i n e s , r e s u l t i n g i n b l u e fl u o r e s c e n t s y m p a t h e t i c n e r v e fi b e r s i n s u b m u c o s a l ( F i g u r e 5 A ) a n d m y e n t e r i c p l e x u s ( F i g u r e 6 A ) p r e p a r a t i o n s w h e n v i e w e d w i t h fl u o r e s c e n t o p t i c s a n d a n U V b a r r i e r fi l t e r . O n e a n d f o u r w e e k s a f t e r s u r g i c a l d e n e r v a t i o n , v e r y l i t t l e c a t e c h o l a m i n e fl u o r e s c e n c e c o u l d b e d e t e c t e d i n s u b m u c o s a l ( F i g u r e 5 B ) o r m y e n t e r i c p l e x u s ( F i g u r e 6 B ) p r e p a r a t i o n s f r o m 1 6 / 1 8 a n i m a l s a s c o m p a r e d t o s h a r n s ( 2 a n i m a l s ) o r c o n t r o l s ( 1 8 a n i m a l s ) . C o n t r o l s e g m e n t s t a k e n o r a l o r a b o r a l t o d e n e r v a t e d s e g m e n t s l y r g e a u l n h s o e i t o F n t c a e i d u . t m m B n r a m i x b o u . c o o f r s e n e p e n n p i r i a i t s t e s r s o t h i r n n p e i b e e B fi l v n n a i a i e m h p v r e r r s o r a e r n o B n e N n i c . b . fi n i C s o t r e r e . e v u h d b r e t e a fi t e n c n p , e e m w v t c y o r e i s r e d t n t n e r a i h g o n n t ; e e i a n e l n p i r o i m i r a a r y h e t s S p t n r e o e r . a n c i b D p e v fi , e n e b . r i v n o r r o n h e i ; n o p n t f i e a o l t n v s i n r e p e e r n c e o e s r t e d g n a g o a s r N s o c l i o u a s . c fl n A o d n i u r m r e . t b u c m x u e u u e n d s e l , n r f i e i g o t - d d f a e . e i c n t c n a a e v s o k i c e r c t i a s e e l v e n w y r r e x e o d 0 o n u e 1 y d fl d l n e g d a n r e e , i c l n t t s f u a a o d m i e t n r n t s i o a i k - n e v d r e e i m e h n t w c o e a r d o 6 f t 2 c c i i s n s l n s r u y o x i n i r u x t e o t t e l y a x r p l e r G a r s p a r e r e l t e . r u 5 f b p c a fi s . e s m s a r u e 1 k v u x v i 1 g r e r e i e l e e 0 F p w n p 3 1 1 3 . m 2 : 5 e 1 1 5 c o n t a i n e d a d i s t r i b u t i o n a n d d e n s i t y o f G A - fl u o r e s c e n t n e r v e fi b e r s t h a t a p p e a r e d i d e n t i c a l t o s e g m e n t s t a k e n f r o m n o r m a l a n i m a l s . F u r t h e r m o r e , I a n d 4 w e e k s a f t e r l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n , o c c a s i o n a l b r i g h t y e l l o w s e r o t o n i n - c o n t a i n i n g e n t e r o c h r o m a f fi n c e l l s w e r e i d e n t i fi e d , i n d i c a t i n g t h a t t h e a b s e n c e o f G A - i n d u c e d fl u o r e s c e n c e r e s u l t e d f r o m l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s , a n d n o t u n i n t e n t i o n a l i n h i b i t i o n o f t h e c h e m i c a l r e a c t i o n s n e c e s s a r y f o r fl u o r e s c e n c e o f c a t e c h o l a m i n e s ( s e e m e t h o d s ) . F i n a l l y , o n e w e e k a f t e r d e n e r v a t i o n , s i n g l e p a r a v a s c u l a r s y m p a t h e t i c n e r v e s w e r e a s s o c i a t e d w i t h l a r g e ( < 4 0 u m ) a r t e r i o l e s , b u t t h e s e n e r v e s w e r e v e r y s h o r t , a n d w e r e l i k e l y t o b e t h e d i s t a l p o r t i o n o f d e g e n e r a t i n g a x o n s . A p p r o x i m a t e l y 1 0 w e e k s a f t e r d e n e r v a t i o n ( 1 0 a n i m a l s ) , G A - i n d u c e d fl u o r e s c e n t n e r v e fi b e r s w e r e n o t a s s o c i a t e d w i t h m a n y s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s o r s u b m u c o s a l g a n g l i a , a n d G A - i n d u c e d fl u o r e s c e n t n e r v e fi b e r s w e r e n o t f o u n d w i t h i n i n t e r g a n g l i o n i c n e r v e s t r a n d s . H o w e v e r , s o m e s m a l l a r t e r i o l e s ( < 4 0 u m ) h a d o n e o r t w o fl u o r e s c e n t p a r a v a s c u l a r n e r v e fi b e r s c l o s e l y o p p o s e d t o v a s c u l a r w a l l s ( F i g u r e 6 C ) . F a i n t m e a n d e r i n g p a r a v a s c u l a r n e r v e fi b e r s w e r e o c c a s i o n a l l y o b s e r v e d w i t h s o m e a r t e r i o l e s . T h e n o n - m e a n d e r i n g p a r a v a s c u l a r n e r v e s f r e q u e n t l y e n d e d w i t h b r i g h t , h a l f - m o a n e d o r c r e s c e n t - s h a p e d p r o t r u s i o n s t h a t w e r e c o n s i s t e n t w i t h g r o w t h c o n e s i n t h e A N S . P e r i v a s c u l a r i n n e r v a t i o n w a s n o t a s s o c i a t e d w i t h m o s t s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s , a l t h o u g h s y m p a t h e t i c n e r v e fi b e r s w e r e o b s e r v e d t o c r o s s o v e r l a r g e a r t e r i o l e s ( > 5 0 p m ) w i t h m u l t i p l e p a i r s o f p a r a v a s c u l a r n e r v e fi b e r s . I n a d d i t i o n t o t h e i r c l o s e a s s o c i a t i o n w i t h a r t e r i o l e s , s o m e s i n g l e , t h i n , n o n - v a r i c o s e n e r v e fi b e r s p r o j e c t e d a w a y f r o m a r t e r i o l e s t o w a r d s n o n - fl u o r e s c e n t g a n g l i a . T e n w e e k s a f t e r s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , p u n c t a t e G A - i n d u c e d fl u o r e s c e n c e 1 1 6 o f c a t e c h o l a m i n e s w a s o b s e r v e d o v e r t h e s u r f a c e o f m y e n t e r i c g a n g l i a ( F i g u r e 6 C ) , a n d s y m p a t h e t i c n e r v e fi b e r s w e r e f o u n d w i t h i n i n t e r g a n g l i o n i c n e r v e s t r a n d s o f t h e p r i m a r y p l e x u s . S i m i l a r t o r e - i n n e r v a t i o n o f s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s , s o m e s y m p a t h e t i c n e r v e fi b e r s w i t h i n p r i m a r y i n t e r g a n g l i o n i c n e r v e b u n d l e s e n d e d i n b r i g h t , c r e s c e n t - s h a p e d s t r u c t u r e s , w h i c h w e r e f r e q u e n t l y a s s o c i a t e d w i t h a h e l i c a l - l i k e t w i s t i n g o f n e r v e e n d i n g s . S y m p a t h e t i c n e r v e fi b e r s w e r e n e v e r a s s o c i a t e d w i t h l o n g i t u d i n a l m u s c l e . T w e n t y - s i x w e e k s a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n ( 5 a n i m a l s ) , G A - i n d u c e d fl u o r e s c e n t n e r v e fi b e r s w e r e f o u n d w i t h e v e r y s u b m u c o s a l a r t e r i o l e ( F i g u r e 5 D ) . M u l t i p l e p a r a v a s c u l a r s y m p a t h e t i c n e r v e fi b e r s w e r e b o t h c l o s e l y - a n d l o o s e l y - a s s o c i a t e d w i t h e v e r y a r t e r i o l e , a n d s o m e n e r v e fi b e r s c o n t a i n e d b r i g h t v a r i c o s i t i e s a n d h e t e r o g e n o u s fl u o r e s c e n c e . H o w e v e r , v e r y f e w p e r i v a s c u l a r n e r v e fi b e r s w e r e o b s e r v e d w i t h s m a l l a r t e r i o l e s ( < 5 0 u m ) ( F i g u r e 5 D ) i n d i c a t i n g t h a t t h e d e n s i t y o f s y m p a t h e t i c i n n e r v a t i o n w a s n o t r e - e s t a b l i s h e d . O c c a s i o n a l G A - i n d u c e d fl u o r e s c e n t n e r v e fi b e r s w e r e n o t a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s o r g a n g l i a , b u t d i s a p p e a r e d i n a n d o u t o f t h e p l a n e o f f o c u s ( F i g u r e 5 D ) . A s t h e s e n e r v e fi b e r s w e r e n o t o b s e r v e d i n n o r m a l o r c o n t r o l p r e p a r a t i o n s , t h e y m a y r e p r e s e n t a b e r r a n t s y m p a t h e t i c p r o j e c t i o n s . F i n a l l y , b r i g h t s y m p a t h e t i c n e r v e fi b e r s w e r e l o c a t e d i n i n t e r g a n g l i o n i c n e r v e s t r a n d s , a n d p u n c t a t e s t a i n i n g w a s f o u n d i n a l l s u b m u c o s a l g a n g l i a . I n t e r e s t i n g l y , i n e v e r y p r e p a r a t i o n e x a m i n e d , o c c a s i o n a l s u b m u c o s a l g a n g l i a c o n t a i n e d b r i g h t c a t e c h o l a m i n e r g i c n e u r o n s w i t h e c c e n t r i c , n o n - fl u o r e s c e n t n u c l e i ( F i g u r e 5 D ) . A l t h o u g h t h e s i g n i fi c a n c e o f t h e s e c a t e c h o l a m i n e r g i c n e u r o n s i s n o t k n o w n , e n t e r i c n e u r o n s t r a n s i e n t l y e x p r e s s c a t e c h o l a m i n e s d u r i n g d e v e l o p m e n t f r o m s y m p a t h o a d r e n a l p r e c u r s o r c e l l s ( C a r n a h a n e t a l . , 1 9 9 1 ; b u t s e e G e r s h o n e t a l . , 1 9 9 3 ) . T h e r e f o r e , p h e n o t y p i c e x p r e s s i o n o f s y m p a t h e t i c m a r k e r s b y s o m e 1 1 7 e n t e r i c n e u r o n s a f t e r s u r g i c a l d e n e r v a t i o n m a y m i m i c p r e n a t a l n e u r o t r a n s m i t t e r e x p r e s s i o n ( r e c a p i t u l a t i o n t o o n t o g e n y ) , s u g g e s t i n g t h e p r e s e n c e o f e x t r i n s i c n e r v e s a r e c r u c i a l i n t h e r e g u l a t i o n o f e n t e r i c p h e n o t y p e . S i m i l a r t o s u b m u c o s a l p r e p a r a t i o n s , a l l m y e n t e r i c g a n g l i a c o n t a i n e d b r i g h t , p u n c t a t e G A - i n d u c e d fl u o r e s c e n c e , a l t h o u g h c a t e c h o l a m i n e r g i c n e u r o n s w e r e n o t o b s e r v e d . S y m p a t h e t i c n e r v e s w e r e f o u n d w i t h i n i n t e r g a n g l i o n i c n e r v e t r a c t s 2 6 w e e k s a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n ( F i g u r e 6 D ) . F i n a l l y , a l t h o u g h t h e n u m b e r o f s y m p a t h e t i c n e r v e fi b e r s i n c r e a s e d 2 6 w e e k s a f t e r d e n e r v a t i o n , c o n t r o l a n d n o r m a l p r e p a r a t i o n s c o n t a i n e d m o r e fl u o r e s c e n c e , s u g g e s t i n g t h e d e n s i t y o f s y m p a t h e t i c i n n e r v a t i o n t o m y e n t e r i c g a n g l i a h a d n o t b e e n r e - e s t a b l i s h e d b y 2 6 w e e k s . A l t e r n a t i v e l y , t h e a b s e n c e o f c a t e c h o l a m i n e fl u o r e s c e n c e m a y i n d i c a t e d e c r e a s e d c a t e c h o l a m i n e p r o d u c t i o n a l t h o u g h e x t r i n s i c n e r v e s h a v e r e i n n e r v a t e d i l e a l s e g m e n t s . E x t r i n s i c S e n s o r y N e r v e s a r e D e s t r o y e d b y E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , i n n e r v a t i o n o f t h e s m a l l i n t e s t i n e f r o m D R G c a n b e v i s u a l i z e d b y c o l o c a l i z a t i o n o f S P - a n d C G R P - i r . O n e a n d f o u r w e e k s a f t e r s u r g i c a l d e n e r v a t i o n , S P - / C G R P - i r n e r v e fi b e r s w e r e n o t o b s e r v e d i n s u b m u c o s a l p r e p a r a t i o n s ( F i g u r e s 7 C a n d 7 D ) , a l t h o u g h b r i g h t S P - / C G R P - i r w a s f o u n d i n t h i c k , v a r i c o s e p a r a v a s c u l a r n e r v e fi b e r s i n n o r m a l ( F i g u r e s 7 A a n d 7 B ) , c o n t r o l ( d a t a n o t s h o w n ) , a n d s h a m - d e n e r v a t e d i l e u m ( d a t a n o t s h o w n ) . M y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s d i d n o t c o n t a i n e x t r i n s i c S P - / C G R P - i r n e r v e fi b e r s o n e w e e k a f t e r l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s ( d a t a n o t s h o w n ) , a l t h o u g h S P - o r C G R P - i r m y e n t e r i c n e u r o n c e l l b o d i e s c o u l d b e o b s e r v e d . A s n o r m a l a n d c o n t r o l m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s a l s o c o n t a i n e d f e w S P - / C G R P - i r n e r v e fi b e r s ( d a t a n o t s h o w n ) , s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s w e r e u s e d t o m o n i t o r c . s t i B e o r v n e r t e . s e a n n h n . e i m y t c s i n p m o e t n t e i 0 i h n t 4 i a t v y s a l r r p a e e m n l e b y n m t fi s i r a o m e c n i t v i x n r t o n e i c e e r n p h s s e r r t p c a a e o i p t e b u s fi l m i F y h s e t D v . f a C p o r n e i m y s n . y d t r g e i a n n s v B i r i n n e e e . s i d n b a n i o t o d r n i n h o a l t p c o g e n s n n e s s a i n p i e r r h i g e n e t c c h i n r g o p i n r e e e n b c t f s n i o e e p e s e h o m r y e r T r o u o fl N g , t . s D d . . e l c A n a u . n o n d i o . n t o r m i a i t u u v e e r d a n l e i v i n c r f a e e o d d - n e c e d e i c t c a c l i n i v y s e r x s o n n i c e r y i s n t l r e e g t x e r d x o , e r u e d n fl n e o t r a t i f d f t a e l a a c a r s k v s u d m e r n k e n e e o e i e w n d - w d c i 0 m i 6 2 c 1 o s a r n i y f e r b c n i s i x t l e n t l y o a s i m r e x e t o t t n r y f a i o r a n a e l G p h s o e t t k . r 6 p d e o e e t e s w n n r u r r r u x u u u g e t t i l e e o F F p r r 1 1 8 . o E m m i F i g u r e 7 . C o - l o c a l i z a t i o n o f s u b s t a n c e P a n d c a l c i t o n i n g e n e r e l a t e d p e p t i d e - i m m u n o r e a c t i v i t y i n e x t r i n s i c p r i m a r y a f f e r e n t n e r v e s i n s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l a n d d e n e r v a t e d i l e u m . A . S P - i r i n p e r i v a s c u l a r a n d p a r a v a s c u l a r n e r v e fi b e r s i n n o r m a l i n t e s t i n e . B . C o - l o c a l i z a t i o n o f C G R P - i r w i t h S P - i r i n n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s . C . S P - i r n e r v e fi b e r a s s o c i a t e d w i t h a n a r t e r i o l e 4 w e e k a f t e r d e n e r v a t i o n . D . T h e n e r v e fi b e r i n C d o e s n o t c o n t a i n C G R P - 1 r . b v , a r t e r i o l e . B a r i n D i s a p p r o x i m a t e l y 1 0 u m . N o t e t h e fl u o r o p h o r e i n A a n d D i s T e x a s R e d , w h e r e a s F [ T C - c o n j u g a t e d s e c o n d a r y a n t i b o d i e s w e r e u s e d i n B a n d C . 1 2 0 1 2 2 r e i n n e r v a t i o n o f e n t e r i c n e u r o n s b y e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e s . S u b s t a n c e P - / C G R P - i r n e r v e fi b e r s w e r e n o t o b s e r v e d 7 w e e k s a f t e r s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n . S i n g l e , v a r i c o s e S P - / C G R P - i r n e r v e fi b e r s w e r e r a r e l y a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s 1 0 w e e k s a f t e r d e n e r v a t i o n , a l t h o u g h o c c a s i o n a l p a r a v a s c u l a r S P - / C G R P - i r n e r v e s r e a p p e a r e d 2 4 w e e k s a f t e r l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s ( F i g u r e s 2 2 C a n d 2 2 D ) . B r i g h t l y fl u o r e s c e n t S P - / C G R P - i r n e r v e fi b e r s w e r e l o o s e l y - a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l a r w a l l s , a n d f e w p e r i v a s c u l a r S P - l C G R P - i r n e r v e fi b e r s t r a n s v e r s e d t h e s u r f a c e o f a r t e r i o l e s . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e s r e i n n e r v a t e t h e i l e u m , a n d b e g i n t o r e t u r n a p p r o x i m a t e l y 1 0 w e e k s a f t e r s u r g i c a l d i s r u p t i o n o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n . H o w e v e r , s i m i l a r t o r e i n n e r v a t i o n b y s y m p a t h e t i c n e r v e s , t h e d e n s i t y o f e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e s a p p e a r s t o r e m a i n d e c r e a s e d 2 6 w e e k s a f t e r d e n e r v a t i o n , i n d i c a t i n g 2 6 w e e k s i s n o t s u f fi c i e n t t i m e f o r e x t r i n s i c n e r v e fi b e r s t o r e g r o w i n t o t h e i n t e s t i n a l w a l l . A l t e r n a t i v e l y , s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n m a y p e r m a n e n t l y r e d u c e t h e d e n s i t y o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n t o i l e a l s e g m e n t s . E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n I n c r e a s e s V a s o a c t i v e I n t e s t i n a l P o l y p e p t i d e - 1 m m u n o r e a c t i v i t y I n n e r v a t i o n o f S u b m u c o s a l A r t e r i o l e s A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , f e w s i n g l e , s h o r t , s m o o t h o r v a r i c o s e V I P - i r n e r v e fi b e r s a r e a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s i n n o r m a l i l e u m ( F i g u r e 8 A ) . A s i m i l a r p a t t e r n a n d d e n s i t y o f V I P - i r i n n e r v a t i o n a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s w a s o b s e r v e d i n c o n t r o l ( T a b l e 2 ) a n d s h a m - o p e r a t e d a n i m a l s ( d a t a n o t s h o w n ) , a s f e w p e r i v a s c u l a r n e r v e fi b e r s c o n t a i n e d V I P - 1 r , a l t h o u g h V I P - i r w a s o b s e r v e d i n s o m e s u b m u c o s a l n e u r o n s a n d i n n e r v e fi b e r s i n i n t e r g a n g l i o n i c n e r v e b u n d l e s w h i c h c r o s s e d o v e r t h e s u r f a c e o f a r t e r i o l e s . O n e w e e k a f t e r s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , m o r e v a r i c o s e a n d s m o o t h V I P - i r 1 2 3 n e r v e fi b e r s w e r e a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s a s c o m p a r e d t o c o n t r o l t i s s u e s t a k e n o r a l o r a b o r a l t o d e n e r v a t e d s e g m e n t s o f i l e u m ( T a b l e 2 ) . F u r t h e r m o r e , o c c a s i o n a l p a i r s o f p a r a v a s c u l a r V I P - i r n e r v e fi b e r s w e r e l o c a t e d o n e i t h e r s i d e o f s o m e a r t e r i o l e s ( F i g u r e 8 8 ) ; t h i s p a t t e r n w a s n e v e r o b s e r v e d i n a r t e r i o l e s f r o m c o n t r o l p r e p a r a t i o n s . F i n a l l y , a f t e r s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , s o m e V I P - i r n e r v e s c o u l d b e f o l l o w e d f o r d i s t a n c e s o v e r 1 m m , a l t h o u g h V I P - i r n e r v e fi b e r s i n c o n t r o l p r e p a r a t i o n s a p p e a r e d a n d d i s a p p e a r e d w i t h i n 3 0 0 u m . F o u r w e e k s a f t e r l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n , V I P - i r n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h m o s t a r t e r i o l e s ( F i g u r e 8 C ) , a n d a s p a r s e V I P - i r p e r i v a s c u l a r n e r v e p l e x u s f o r m e d a r o u n d m o s t a r t e r i o l e s b y 7 w e e k s a f t e r s u r g e r y ( F i g u r e 8 D ) . A l t h o u g h i m m u n o h i s t o c h e m i c a l m e t h o d s d i d n o t a l l o w q u a n t i t a t i v e m e a s u r e s o f V I P - i r , V I P - i r v a s c u l a r i n n e r v a t i o n a p p e a r e d b r i g h t e r , a n d fl u o r e s c e n c e w a s m o r e h o m o g e n o u s a s c o m p a r e d t o c o n t r o l s . P a r a v a s c u l a r a n d p e r i v a s c u l a r V I P - i r n e r v e fi b e r s w e r e f o u n d w i t h a l m o s t e v e r y a r t e r i o l e 1 0 w e e k s a f t e r d e n e r v a t i o n , a n d a V I P - i r p l e x u s w a s a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s 1 6 a n d 2 4 w e e k s a f t e r s u r g i c a l d e n e r v a t i o n . T h e s e d a t a s u p p o r t a n d e x p a n d t h e t i m e c o u r s e o f d e n e r v a t i o n - i n d u c e d a l t e r a t i o n s i n V I P - i r v a s c u l a r i n n e r v a t i o n p r e v i o u s l y r e p o r t e d ( G a l l i g a n e t a l . , 1 9 8 8 ) , a n d i n d i c a t e t h a t e n t e r i c n e r v e s e x h i b i t n e u r o n a l p l a s t i c i t y b y i n c r e a s i n g t h e d e n s i t y o f V I P - i r n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s f o l l o w i n g 1 0 5 5 o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n . E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n R e s u l t s i n N e w S u b s t a n c e P - I m m u n o r e a c t i v e I n n e r v a t i o n o f S u b m u c o s a l A r t e r i o l e s L o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n a l s o r e s u l t e d i n m a r k e d a l t e r a t i o n s i n t h e d e n s i t y a n d d i s t r i b u t i o n o f S P - i r v a s c u l a r i n n e r v a t i o n . A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , b r i g h t S P - i r i s f o u n d 1 2 4 T a b l e 2 . S u r v e y o f t h e n u m b e r o f a r t e r i o l e s w i t h n e r v e fi b e r s c o n t a i n i n g v a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p o l y p e p t i d e - i m m u n o r e a c t i v i t y i n n o r m a l , c o n t r o l , a n d d e n e r v a t e d i l e u m . A r t e r i o l a r S i z e ( u m ) W e e k s A f t e r D e n e r - v a t i o n 0 - 1 0 1 1 - 2 0 2 1 - 3 0 3 1 - 4 0 4 1 - 5 0 5 1 - 6 0 6 1 - 7 0 n o r m a l 0 / 7 1 / 1 1 3 / 1 4 2 / 1 6 0 / 5 0 / 4 0 / 3 w e e k l 0 / 7 1 / 1 2 2 / 1 7 1 / 7 1 / 1 0 1 / 7 0 / 7 c o n t r o l w e e k l 4 / 1 0 8 / 1 0 1 8 / 2 0 7 / 1 1 2 / 7 2 / 5 0 / 4 d e n e r v . w e e k 4 0 / 8 3 / 8 1 / 9 1 / 8 2 / 4 1 / 3 0 / 7 c o n t r o l w e e k 4 4 / 8 1 2 / 1 3 1 4 / 1 6 7 / 7 7 / 8 0 / 4 0 / 8 d e n e r v . w e e k 1 0 0 / 5 1 / 9 1 / 1 3 0 / 1 1 1 / 5 0 / 6 0 / 3 c o n t r o l w e e k l O 7 / 7 1 0 / 1 0 1 1 / 1 2 9 / 1 0 3 / 7 1 / 5 6 / 1 0 d e n e r v . w e e k 2 4 1 / 8 1 / 7 0 / 1 7 1 / 1 4 0 / 6 0 / 3 2 / 1 0 c o n t r o l w e e k 2 4 8 / 9 1 3 / 1 5 1 1 / 1 2 4 / 1 2 1 / 5 1 / 4 1 / 5 d e n e r v . D e s c r i p t i o n o f t h e f r a c t i o n o f s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s r e c e i v i n g V I P - i r n e r v e s / t o t a l s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s e x a m i n e d . A s i n g l e V I P - i r p a r a v a s c u l a r n e r v e w a s a s s o c i a t e d w i t h c o n t r o l s . S e e t e x t f o r d e s c r i p t i o n o f i n n e r v a t i o n o f a r t e r i o l e s . D a t a a r e t a k e n f r o m a m i n i m u m o f 3 p r e p a r a t i o n s f o r e a c h t i m e p o i n t . F i g u r e 8 . V a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p o l y p e p t i d e - i m m u n o r e a c t i v i t y i n i n t r i n s i c n e r v e fi b e r s i n s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l a n d d e n e r v a t e d i l e u m . A . V l P - i r i n s u b m u c o s a l p l e x u s f r o m n o r m a l i l e u m . B . P a r a v a s c u l a r V l P - i r n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e w i t h a n a r t e r i o l e 1 w e e k a f t e r d e n e r v a t i o n . C . P e r i v a s c u l a r a n d p a r a v a s c u l a r V l P - i r n e r v e s a s s o c i a t e w i t h a n a r t e r i o l e 7 w e e k s a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n . D . V l P - i r n e r v e s f o r m a p e r i v a s c u l a r v a s c u l a r p l e x u s 1 0 w e e k s a f t e r d e n e r v a t i o n . b v , a r t e r i o l e ; g , s u b m u c o s a l g a n g l i o n . B a r i n D i s a p p r o x i m a t e l y 4 0 p m . 1 2 5 . m 2 : » ; < 1 2 7 c o - l o c a l i z e d w i t h C G R P - i r i n e x t r i n s i c , c a p s a i c i n - s e n s i t i v e v a r i c o s e p a r a v a s c u l a r n e r v e fi b e r s ( F i g u r e s 7 A a n d 7 8 ) . A l t h o u g h S P - i r n e r v e fi b e r s t h a t s u r r o u n d e d s u b m u c o s a l g a n g l i o n i c n e u r o n s d i d n o t c o n t a i n d e t e c t a b l e C G R P - i r , S P - i r n e r v e fi b e r s w i t h o u t d e t e c t a b l e C G R P - i r w e r e n o t f o u n d t o a s s o c i a t e w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s i n n o r m a l p r e p a r a t i o n s . E x t r i n s i c S P - l C G R P - i r n e r v e fi b e r s w e r e n o t o b s e r v e d 1 a n d 4 w e e k s a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n . H o w e v e r , f o u r w e e k s a f t e r s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , f a i n t S P - i r a x o n s w e r e a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s ( F i g u r e s 7 C a n d 7 D ) . T h e s e a x o n s w e r e u n l i k e l y t o b e e x t r i n s i c p r i m a r y a f f e r e n t s , a s t h e y d i d n o t c o n t a i n C G R P - i r , h a d s m a l l v a r i c o s i t i e s , w e r e n o t s e n s i t i v e t o s y s t e m i c c a p s a i c i n a d m i n i s t r a t i o n , a n d a p p e a r e d t o h a v e a s m a l l e r c a l i b e r t h a n e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e fi b e r s . S u b s t a n c e P - i r v a s c u l a r n e r v e fi b e r s w e r e n o t f o u n d i n c o n t r o l o r s h a m - d e n e r v a t e d s u b m u c o s a l p r e p a r a t i o n s , i n d i c a t i n g t h e a p p e a r a n c e o f t h e s e a x o n s r e s u l t e d f r o m l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n a n d n o t s u r g i c a l t r a m n a . F o u r w e e k s a f t e r d e n e r v a t i o n , p a r a v a s c u l a r S P - i r n e r v e fi b e r s w e r e o n l y a s s o c i a t e d w i t h s m a l l a r t e r i o l e s ( T a b l e 3 ) , a n d S P - i r n e r v e fi b e r s n e v e r c o n t a i n e d V I P - i r ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e n u m b e r o f a r t e r i o l e s w i t h S P - f b u t n o t C G R P - i r n e r v e fi b e r s a n d t h e d e n s i t y o f n e w S P - i r n e r v e fi b e r s / a r t e r i o l e i n c r e a s e d 7 , 1 0 , a n d 1 6 w e e k s a f t e r l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n . F u r t h e r m o r e , S P - i r p a r a v a s c u l a r n e r v e fi b e r s w e r e a s s o c i a t e d w i t h g r e a t e r l e n g t h s o f a r t e r i o l e s , a n d s o m e a r t e r i o l e s h a d m u l t i p l e n o n - v a r i c o s e S P - i r n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d o n e i t h e r s i d e o f t h e v e s s e l ( s e e F i g u r e s 2 1 A a n d 2 1 8 ) 7 a n d 1 0 w e e k s a f t e r d e n e r v a t i o n . A l t h o u g h S P - i r n e r v e fi b e r s w e r e c l o s e l y a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s 4 a n d 7 w e e k s a f t e r d e n e r v a t i o n , S P - i r n e r v e fi b e r s w e r e l o c a t e d 1 5 - 3 5 p m a w a y f r o m a r t e r i o l e s 1 6 w e e k s a f t e r d e n e r v a t i o n . F i n a l l y , a l o o s e p a r a v a s c u l a r S P - i r p l e x u s s u r r o u n d e d 1 2 8 T a b l e 3 . S u r v e y o f t h e n u m b e r o f a r t e r i o l e s w i t h n e r v e fi b e r s c o n t a i n i n g s u b s t a n c e P - , b u t n o t c a l c i t o n i n g e n e - r e l a t e d p e p t i d e - i m m u n o r e a c t i v i t y i n n o r m a l , c o n t r o l , a n d d e n e r v a t e d i l e u m . A r t e r i o l a r S i z e ( u m ) W e e k s A f t e r D e n e r - v a t i o n 0 - 1 0 1 1 - 2 0 2 1 - 3 0 3 1 - 4 0 4 1 - 5 0 5 1 - 6 0 6 1 - 7 0 n o r m a l 0 / l 0 0 / 1 0 0 / 9 0 / 7 0 / 6 0 / 3 0 / 3 w e e k l 0 / 9 0 / 1 0 0 / 1 3 0 / 5 0 / 5 0 / 4 o n c o n t r o l w e e k l 5 / 8 4 / 7 8 / 1 0 6 / 8 0 / 4 0 / 5 0 / 4 d e n e r v . w e e k 4 0 / 8 0 / 9 0 / 1 1 0 / 7 0 / 4 0 / 4 0 / 7 c o n t r o l w e e k 4 5 / 9 9 / 1 2 1 5 / 1 8 9 / 1 0 1 / 5 0 / 5 0 / 8 d e n e r v . w e e k l 0 0 / 5 0 / 7 0 / l 2 0 / 6 0 / 4 0 / 6 0 / 3 c o n t r o l w e e k 1 0 6 / 8 1 3 / 1 3 1 7 / 1 7 9 / 1 1 2 / 6 1 / 4 6 / 1 0 d e n e r v . w e e k 2 4 0 / 1 0 0 / 1 1 0 / 7 0 / 8 0 / 3 0 / 2 2 / 1 0 c o n t r o l w e e k 2 4 7 / 1 0 1 0 / 1 2 9 / 1 2 7 / 1 1 0 / 5 0 / 4 1 / 5 d e n e r v . D e s c r i p t i o n o f t h e f r a c t i o n o f s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s r e c e i v i n g n e r v e s c o n t a i n i n g S P - , b u t n o t C G R P - i r n e r v e s / t o t a l s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s e x a m i n e d . S e e t e x t f o r d e s c r i p t i o n o f i n n e r v a t i o n o f a r t e r i o l e s . D a t a a r e t a k e n f r o m a m i n i m u m o f 3 p r e p a r a t i o n s f o r e a c h t i m e p o i n t . 1 2 9 a r t e r i o l e s b y 1 6 w e e k s a f t e r d e n e r v a t i o n . A l t h o u g h s o m e b r i g h t , t h i c k , v a r i c o s e n e r v e s c o n t a i n e d S P / C G R P - i r , t h i n S P - i r n e r v e s w i t h o u t C G R P - i r c o u l d b e d e t e c t e d a t t h i s l a t e t i m e p o i n t ( s e e F i g u r e s 2 1 A a n d 2 1 B ) . S p e c i fi c i t y o f P r i m a r y a n d S e c o n d a r y A n t i s e r u m A s i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y w a s u s e d t o l o c a l i z e e x t r i n s i c a n d e n t e r i c n e r v e s , i t w a s i m p e r a t i v e t o d e t e r m i n e t h e s p e c i fi c i t y o f a n t i s e r a r a i s e d a g a i n s t C h A t , C G R P , c F o s , N O S , N P Y , n p N F - H , p n p N F - H , p N F - H , S P , a n d V I P . A l l o f t h e s e c o n d a r y a n t i s e r a r e c o g n i z e d t h e i n t e n d e d I g G e p i t o p e o f p r i m a r y a n t i s e r a , a s fl u o r e s c e n c e w a s n o t o b s e r v e d i n t i s s u e s i n c u b a t e d i n s e c o n d a r y a n t i s e r u m w i t h o u t p r i m a r y a n t i s e r u m . F u r t h e r m o r e , s e c o n d a r y a n t i s e r a d i d n o t b i n d t o i n c o r r e c t p r i m a r y a n t i s e r a e x c e p t g o a t a n t i - m o u s e I g G a n d M c o n j u g a t e d t o r h o d a m i n e a n d g o a t a n t i - m o u s e I g G c o n j u g a t e d t o C y 3 . B o t h a n t i s e r a r e c o g n i z e d b o u n d a n t i s e r u m r a i s e d a g a i n s t S P a n d w e r e n o t u s e d i n c o - l o c a l i z a t i o n s t u d i e s . G o a t a n t i - r a b b i t I g G c o n j u g a t e d t o C y 3 b o u n d s o m e o f t h e m o u s e a n d r a t a n t i s e r u m . T h e r e f o r e , t h i s s e c o n d a r y a n t i s e r u m w a s n o t u s e d f o r c o - l o c a l i z a t i o n s t u d i e s . A l l o f t h e p r i m a r y a n t i s e r a w e r e a b l e t o r e c o g n i z e t h e t a r g e t p e p t i d e a s p e p t i d e n e u t r a l i z a t i o n f o r C G R P , c F o s , N P Y , n p N F - H , p n p N F - H , p N F - H , S P , a n d V I P p r e v e n t e d i m m u n o r e a c t i v i t y . S p e c i fi c i t y a n d E f f e c t i v e n e s s o f C h e m i c a l D e n e r v a t i o n s A s d e s c r i b e d i n t h e p r e c e d i n g p a g e s , s u r g i c a l d e n e r v a t i o n o f l o o p s o f g u i n e a p i g i l e u m e l i m i n a t e s a l l e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n . T h e r e f o r e 6 - O H - D A a n d c a p s a i c i n w e r e u s e d t o d e s t r o y e x t r i n s i c s y m p a t h e t i c a n d s e n s o r y n e r v e s , r e s p e c t i v e l y . G l y o x y l i c a c i d - i n d u c e d fl u o r e s c e n c e o f n e u r o n a l s t o r e s o f c a t e c h o l a m i n e s w a s u s e d t o v e r i f y e f f e c t i v e n e s s o f 6 - O H - D A t r e a t m e n t , a s t h i s h i s t o l o g i c a l t e c h n i q u e c o u l d b e p e r f o r m e d i n m i n u t e s u t i l i z i n g 1 3 0 f r e s h t i s s u e . A s s o o n a s o n e w e e k a f t e r s y s t e m i c a d m i n i s t r a t i o n o f 6 - O H - D A , a l m o s t n o c a t e c h o l a m i n e fl u o r e s c e n c e c o u l d b e d e t e c t e d i n s u b m u c o s a l o r m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s . H o w e v e r , s e g m e n t s t a k e n f r o m v e h i c l e - t r e a t e d c o n t r o l s c o n t a i n e d a d i s t r i b u t i o n o f G A - fl u o r e s c e n t n e r v e fi b e r s i d e n t i c a l t o s e g m e n t s t a k e n f r o m n o r m a l a n i m a l s . T r e a t m e n t w i t h 6 - O H - D A d i d n o t a l t e r t h e d e n s i t y o r a p p e a r a n c e o f S P - / C G R P - i r n e r v e fi b e r s , o r t h e l o c a l i z a t i o n o f S P - , C G R P - o r N P Y - i r i n e n t e r i c n e r v e c e l l b o d i e s o r a x o n s , i n d i c a t i n g t h a t 6 - O H - D A w a s a s p e c i fi c n e u r o t o x i n f o r s y m p a t h e t i c n e r v e fi b e r s . C h e m i c a l d e n e r v a t i o n b y c a p s a i c i n d i d n o t a l t e r l o c a l i z a t i o n o f S P - o r C G R P - i r i n e n t e r i c n e r v e c e l l b o d i e s o r n e r v e fi b e r s , o r t h e d e n s i t y a n d a p p e a r a n c e o f G A - i n d u c e d fl u o r e s c e n t n e r v e fi b e r s . H o w e v e r , c a p s a i c i n a d m i n i s t r a t i o n d e s t r o y e d e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e fi b e r s a s v i s u a l i z e d b y i m m u n o h i s t o c h e m i c a l d e t e c t i o n o f S P - l C G R P - i r n e r v e fi b e r s . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e d a t a a g r e e w i t h p r e v i o u s l y p u b l i s h e d d a t a i l l u s t r a t i n g t h e s p e c i fi c i t y o f 6 - O H - D A a n d c a p s a i c i n . S p e c i fi c i t y o f S u r g i c a l E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n s H e m a t o x y l i n a n d e o s i n s t a i n i n g w a s u s e d t o d e t e r m i n e i f s u r g i c a l m a n i p u l a t i o n s o f l o o p s o f i l e u m o r d i r e c t l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s d a m a g e d m u c o s a o r a l t e r e d p h y s i c a l p r o p e r t i e s o f G I s m o o t h m u s c l e . A b r u p t c e s s a t i o n o f b l o o d fl o w t o t h e g u t r e s u l t s i n r a p i d g a n g r e n e , u l t i m a t e l y p r o d u c i n g p e r i t o n i t i s ( r e v i e w e d i n G a l l a v a n e t a l . , 1 9 8 9 ) . B e c a u s e o f i t s h i g h r e s t i n g d e m a n d f o r n u t r i e n t s a n d o x y g e n , t h e m u c o s a i s e x q u i s i t e l y s e n s i t i v e t o o x y g e n d e p r i v a t i o n ( G a l l a v a n e t a l . , 1 9 8 9 ) , u n l i k e s l o w l y - r e s p o n d i n g s m o o t h m u s c l e . D u r i n g o x y g e n d e p r i v a t i o n , m u c o s a l c e l l s a r e u n a b l e t o e x c l u d e l u m e n a l c o n t e n t s s u c h a s b a c t e r i a a n d p r o t e o l y t i c e n z y m e s , r e s u l t i n g i n s l o u g h i n g a n d d i s r u p t i o n o f m u c o s a l c r y p t s , a n d u l c e r a t i o n ( G a l l a v a n e t a l . , 1 9 8 9 ) . B r e a k d o w n o f t h e m u c o s a l b a r r i e r a l l o w s 1 3 1 fl u i d s a n d b l o o d t o e n t e r t h e l u m e n , w h e r e m i c r o o r g a n i s m s p r o d u c e d i s t e n s i o n o f t h e b o w e l . T h e r e f o r e , t h e m u c o s a w a s e x a m i n e d i n c r o s s - s e c t i o n s o f i l e u m t o d e t e r m i n e i f m u c o s a d a m a g e o c c u r r e d a f t e r s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n . S u b m u c o s a l a r t e r i o l e s w e r e c r u s h e d f o r o n l y 3 s e c / c r u s h d u r i n g s u r g i c a l d e n e r v a t i o n s , a f t e r w h i c h t i m e b l o o d fl o w d i d n o t a p p e a r t o b e i n t e r r u p t e d . T h i s o b s e r v a t i o n w a s s u p p o r t e d b y m o r p h o l o g i c a l o b s e r v a t i o n s o f d e n e r v a t e d l o o p s o f i l e u m . O n e w e e k a f t e r s u r g e r y , l o o p s o f d e n e r v a t e d i l e u m w e r e p i n k a n d o x y g e n a t e d , a n d d i d n o t a p p e a r d i f f e r e n t i n s i z e o r c o l o r t h a n s e g m e n t s o f i l e u m o r a l o r a b o r a l t o t h e d e n e r v a t i o n . H e m a t o x y l i n a n d e o s i n s t a i n i n g w a s u s e d t o s t a i n d e n e r v a t e d a n d c o n t r o l t i s s u e s , t h u s a l l o w i n g c e l l u l a r s t r u c t u r e s t o b e o b s e r v e d . C o d e d s l i d e s o f s u r g i c a l l y - d e n e r v a t e d o r c o n t r o l t r a n s v e r s e s e c t i o n s w e r e u n d i s t i n g u i s h a b l e f r o m e a c h o t h e r , a s m u c o s a l c r y p t s d i d n o t a p p e a r t o b e a l t e r e d b y l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s . F i n a l l y , a b o a r d - c e r t i fi e d p a t h o l o g i s t d i d n o t o b s e r v e m u c o s a l d a m a g e m a n i f e s t e d a s s l o u g h i n g o r u l c e r a t i o n i n s u r g i c a l l y - d e n e r v a t e d o r c o n t r o l t i s s u e s . I n fi l t r a t i o n b y m a c r o p h a g e s a n d n e u t r o p h i l s a l s o w a s n o t o b s e r v e d . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n d o e s n o t i n t e r r u p t b l o o d fl o w t o d e n e r v a t e d s e g m e n t s . D u r i n g d i s e a s e a n d c h a n g e s i n d i e t , h y p e r p l a s i a a n d / o r h y p e r t r o p h y c a n o c c u r , r e s u l t i n g i n i n c r e a s e d t h i c k n e s s o f G I s m o o t h m u s c l e . H y p e r p l a s i a ( i n c r e a s e d m u s c l e c e l l n u m b e r ) a n d h y p e r t r o p h y ( i n c r e a s e d c e l l v o l u m e n o t a s s o c i a t e d w i t h m i t o s i s ) o c c u r a f t e r s t e n o s i s o r t r a n s e c t i o n o f t h e G I t r a c t ( r e v i e w e d i n G a b e l l a , 1 9 8 9 ) . T o d e t e r m i n e i f s u r g i c a l m a n i p u l a t i o n s o r l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n a l t e r e d n u c l e a r e v e n t s i n m u s c l e c e l l s r e s u l t i n g i n h y p e r p l a s i a o r h y p e r t r o p h y o f s m o o t h m u s c l e c e l l s , t h e w e t w e i g h t o f L M M P P s w a s e x a m i n e d i n c o n t r o l a n d d e n e r v a t e d p r e p a r a t i o n s . F o l l o w i n g p r e p a r a t i o n 1 3 2 ‘ 5 8 g 0 . 1 5 ' E [ : 1 c o n t r o l - d e n e r v a t e d 2 0 . 1 2 “ \ 3 0 . 0 9 - E . ' 5 0 . 0 6 ' 3 ‘ 6 0 . 0 3 - 3 . fl F l fl i ] [ L g 0 . 0 0 2 n o r m a l w e e k s a f t e r d e n e 1 r v a t i 0 n F i g u r e 9 . W e i g h t o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l , c o n t r o l , a n d d e n e r v a t e d i l e u m . L M M P P s w e r e p r e p a r a t e d a s d e s c r i b e d i n m e t h o d s , w e i g h t e d i n a k n o w n v o l u m e o f w a t e r , a n d t h e l e n g t h o f e a c h p r e p a r a t i o n w a s r e c o r d e d . D a t a a r e e x p r e s s e d a s m e a n s o f m u s c l e w e i g h t / l e n g t h o f p r e p a r a t i o n i S E M f o r 3 - 4 p r e p a r a t i o n s f r o m 3 - 4 a n i m a l s f o r e a c h t i m e . 1 3 3 F i g u r e 1 0 . T h i c k n e s s o f c i r c u l a r a n d l o n g i t u d i n a l m u s c l e i n t r a n s v e r s e s e c t i o n s f r o m n o r m a l , c o n t r o l , a n d d e n e r v a t e d i l e u m . T r a n s v e r s e s e c t i o n s o f i l e u m w e r e p r e p a r e d a s d e s c r i b e d i n m e t h o d s , s t a i n e d f o r h e m a t o x y l i n a n d e o s i n , a n d m u s c l e t h i c k n e s s e s w e r e m e a s u r e d u s i n g a n e y e - p i e c e m i c r o m e t e r a t 4 0 0 x m a g n i fi c a t i o n . A . T h i c k n e s s o f c i r c u l a r m u s c l e i n n o r m a l , c o n t r o l , a n d d e n e r v a t e d p r e p a r a t i o n s . B . T h i c k n e s s o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e . O p e n b a r s r e p r e s e n t v a l u e s f r o m c o n t r o l p r e p a r a t i o n s a n d s o l i d b a r s r e p r e s e n t v a l u e s f r o m d e n e r v a t e d p r e p a r a t i o n s . D a t a a r e e x p r e s s e d a s m e a n s o f m u s c l e t h i c k n e s s e s i S E M f o r 6 - 9 s e c t i o n s f r o m 2 - 3 a n i m a l s f o r e a c h t i m e . 1 3 4 F i g u r e 1 0 . A 1 0 0 - c i r c u l a r m u s c l e E 3 - 3 0 - w a 2 6 0 - . 2 l 2 5 4 0 - 2 g 2 0 - 3 E . 0 n o r m a l 1 4 1 0 1 6 w e e k s a f t e r d e n e r v a t i o n B A 1 0 0 — l o n g i t u d i n a l m u s c l e E 3 - 8 0 - i n t n g 6 0 - . 1 : I 2 5 4 0 - 2 ’ 2 ° ' fl 3 s I 0 n o r m a l 1 4 1 0 1 6 w e e k s a f t e r d e n e r v a t i o n 1 3 5 o f L M M P P s , L M M P P s w e r e w e i g h e d i n a k n o w n v o l u m e o f w a t e r , a n d t h e l e n g t h o f e a c h p r e p a r a t i o n w a s r e c o r d e d . T h e s e d a t a w e r e n o r m a l i z e d f o r t h e l e n g t h o f e a c h t i s s u e , a n d t h e v a l u e s c o m p a r e d f o r c o n t r o l a n d d e n e r v a t e d s e g m e n t s . A n i n c r e a s e i n t h i s r a t i o w o u l d b e e x p e c t e d i f h y p e r t r o p h y o r h y p e r p l a s i a o c c u r r e d . A s s h o w n i n F i g u r e 9 , l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e fi b e r s d i d n o t a l t e r t h e w e i g h t o f L M M P P s , s u g g e s t i n g t h a t e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n d i d n o t i n d u c e h y p e r p l a s i a o r h y p e r t r o p h y o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e c e l l s . P o t e n t i a l c h a n g e s i n c i r c u l a r a n d l o n g i t u d i n a l m u s c l e w e r e i n v e s t i g a t e d f u r t h e r b y e x a m i n i n g h e m a t o x y l i n a n d e o s i n s t a i n e d t r a n s v e r s e s e c t i o n s o f c o n t r o l a n d s u r g i c a l l y - d e n e r v a t e d i l e u m . T h e b o r d e r s t h a t s e p a r a t e l o n g i t u d i n a l a n d c i r c u l a r m u s c l e f r o m o t h e r l a m i n a e o f t h e i l e u m a r e d i s c r e t e a n d e a s i l y v i s u a l i z e d ( s e e F i g u r e 1 A ) , a n d a n e y e - p i e c e m i c r o m e t e r w a s u s e d t o m e a s u r e t h e t h i c k n e s s o f c i r c u l a r a n d l o n g i t u d i n a l m u s c l e i n n o r m a l , c o n t r o l , a n d d e n e r v a t e d i l e u m . A s s h o w n i n F i g u r e s 1 0 A a n d 1 0 B , e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n d i d n o t a l t e r t h e t h i c k n e s s o f c i r c u l a r o r l o n g i t u d i n a l m u s c l e a s c o m p a r e d t o s e c t i o n s t a k e n f r o m a n i m a l - m a t c h e d c o n t r o l s e g m e n t s . T h e s e d a t a s u p p o r t t h e c o n c l u s i o n t h a t n e i t h e r m u s c l e d i v i s i o n , n o r e x p a n s i o n o f e x i s t i n g m u s c l e c e l l s , o c c u r r e d a f t e r s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n . 1 3 6 2 . N E W S U B S T A N C E P - I M M U N O R E A C T I V E N E R V E S D O N O T O R I G I N A T E F R O M S U B M U C O S A L G A N G L I A I n t r o d u c t i o n a n d E x p e r i m e n t a l R a t i o n a l e T h e r e a r e t h r e e p o s s i b l e m e c h a n i s m s t o a c c o u n t f o r t h e p r e s e n c e o f n e w S P - a n d V I P - i r n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s a f t e r l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n . F i r s t , i n c r e a s e d S P - a n d V I P - i r n e r v e s m a y n o t r e p r e s e n t a n i n c r e a s e i n t h e t o t a l n u m b e r o f i n t r i n s i c n e r v e fi b e r s , b u t m a y r e s u l t f r o m i n c r e a s e d c o n t e n t o f S P o r V I P i n n e r v e s p r e v i o u s l y a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s . A s d i s c u s s e d p r e v i o u s l y , t h e c o n c e n t r a t i o n s o f p r o t a c h y k i n i n m R N A a n d S P i n c r e a s e s a f t e r d e c e n t r a l i z a t i o n o f S C G n e u r o n s ( K e s s l e r e t a l . , 1 9 8 1 ) . T h e s e d a t a s u g g e s t t h a t l o s s o f t r a n s - s y n a p t i c a c t i v i t y u p r e g u l a t e s t h e e x p r e s s i o n o f S P . A l t h o u g h i n c r e a s e d S P a n d V I P i s p o s s i b l e , t h i s e x p l a n a t i o n d o e s n o t a c c o u n t f o r a l l o f t h e a l t e r a t i o n s o b s e r v e d i n v a s c u l a r i n n e r v a t i o n a fi e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n . U p r e g u l a t i o n o f t h e c o n c e n t r a t i o n s o f n e u r o p e p t i d e s o c c u r s q u i c k l y a f t e r p e r t u r b a n c e o f n e r v e s ( R a o a n d L a n d i s , 1 9 9 2 ) , a n d n e u r o p e p t i d e l e v e l s d o n o t c o n t i n u e t o i n c r e a s e o v e r t i m e a f t e r d e c e n t r a l i z a t i o n ( R a o a n d L a n d i s , 1 9 9 2 ) . A s t h e n u m b e r o f V I P - a n d S P - i r n e r v e fi b e r s i n c r e a s e d o v e r t i m e , a n a l t e r n a t i v e m e c h a n i s m a p p e a r e d p l a u s i b l e . A l t e r a t i o n s i n i n n e r v a t i o n a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s m a y r e s u l t f r o m c h a n g e s i n p h e n o t y p i c e x p r e s s i o n o f e n t e r i c n e u r o n s , s u c h a s d e n o v a s y n t h e s i s o f n e u r o p e p t i d e s p r e v i o u s l y n o t e x p r e s s e d . F o l l o w i n g l o n g - t e r m s y m p a t h e c t o m y , d o p a m i n e B - h y d r o x y l a s e - i r a p p e a r s i n c h o l i n e r g i c n e r v e s o f r a t c e r e b r a l a r t e r i e s ( M i o n e e t a l . , 1 9 9 1 ) , a l t h o u g h t h i s p r o t e i n i s n o r m a l l y o n l y e x p r e s s e d b y s y m p a t h e t i c n e r v e s . T h e s e r e s u l t s i m p l y t h a t l o s s o f s y m p a t h e t i c i n n e r v a t i o n i n d u c e s t r a n s l a t i o n a n d / o r t r a n s c r i p t i o n o f d o p a m i n e - B - h y d r o x y l a s e . T h e r e f o r e , s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n m a y r e s u l t i n n e w 1 3 7 p a t t e r n s o f e x p r e s s i o n o f n e u r o p e p t i d e s n o t p r e v i o u s l y o b s e r v e d i n e x i s t i n g v a s c u l a r n e r v e s . F i n a l l y , n e w S P - a n d V I P - i r n e r v e s m a y r e s u l t f r o m a x o n a l s p r o u t i n g o f e n t e r i c n e r v e s . A x o n a l s p r o u t i n g i s i n d u c e d i n r e s p o n s e t o n e r v e i n j u r y s u c h a s t r a n s e c t i o n a n d c r u s h i n g ( s e e i n t r o d u c t i o n ) . F o r e x a m p l e , a u t o n o m i c p r e g a n g l i o n i c n e r v e fi b e r s f o r m n e w a x o n s a f t e r p a r t i a l d e n e r v a t i o n o f S C G ( M u r r a y a n d T h o m p s o n , 1 9 5 7 ) . S i m i l a r l y , s e n s o r y n e r v e fi b e r s s p r o u t a f t e r d e s t r u c t i o n o f s y m p a t h e t i c n e r v e fi b e r s i n s w e a t g l a n d o f r a t s ( Y o d l o w s k i e t a l . , 1 9 8 4 ) , a n d p e r i p h e r a l n e r v e i n j u r y t r i g g e r s c e n t r a l ( W o o l f e t a l . , 1 9 9 2 ) a n d p e r i p h e r a l ( P e s t r o n k a n d C r a c h m a n , 1 9 8 8 ) s p r o u t i n g o f m y e l i n a t e d a f f e r e n t n e r v e fi b e r s . T h e r e f o r e , a p p e a r a n c e o f n e w i n n e r v a t i o n a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s m a y r e s u l t f r o m s p r o u t i n g o f e x i s t i n g a x o n s , i n c r e a s e d c o n c e n t r a t i o n s o f p r e v i o u s l y - e x i s t i n g ( b u t n o t d e t e c t a b l e ) n e u r o t r a n s m i t t e r s , o r d e n o v a s y n t h e s i s o f n e w n e u r o p e p t i d e s i n n e r v e s p r e v i o u s l y a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s . A s d e s c r i b e d i n t h e p r e v i o u s s e c t i o n , e n t e r i c n e u r o n s r e s p o n d t o l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n b y i n c r e a s i n g t h e d e n s i t y o f S P - a n d V I P - i r n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s . T h e p r e s e n c e o f t h e s e n e r v e fi b e r s i s n o t a l t e r e d b y s y s t e m i c c a p s a i c i n a d m i n i s t r a t i o n ( G a l l i g a n e t a l . , 1 9 8 8 ) , f u r t h e r i n d i c a t i n g t h a t t h e n e r v e s o r i g i n a t e f r o m s u b m u c o s a l o r m y e n t e r i c g a n g l i a . H o w e v e r , p r e v i o u s e x p e r i m e n t s d i d n o t d e t e r m i n e t h e m e c h a n i s m b y w h i c h n e w i n n e r v a t i o n r e s u l t e d , o r t h e s o u r c e o f t h e s e n e w n e r v e s . T h e s e q u e s t i o n s w e r e a d d r e s s e d b y c o m b i n i n g i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y w i t h r e t r o g r a d e t r a c i n g o f e n t e r i c n e r v e s i n n e r v a t i n g s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s i n n o r m a l , c o n t r o l , a n d s u r g i c a l l y - d e n e r v a t e d p r e p a r a t i o n s o f s u b m u c o s a l p l e x u s . F l u o r o - g o l d ( F g ) i s a u s e f u l r e t r o g r a d e n e u r o t r a c e r i n t h e C N S , a s i t i s n o t t a k e n u p b y fi b e r s o f p a s s a g e . F u r t h e r m o r e , F g fl u o r e s c e n c e c a n b e d e t e c t e d i n f r e s h a n d fi x e d t i s s u e s u s i n g fl u o r e s c e n c e 1 3 8 m i c r o s c o p y . T h e r e f o r e , i t w a s h y p o t h e s i z e d t h a t i f F g w a s i n j e c t e d i n t o s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s , t h e n n e r v e fi b e r s i n n e r v a t i n g a r t e r i o l e s w o u l d r e t r o g r a d e l y t r a n s p o r t F g , r e s u l t i n g i n l a b e l l i n g o f e n t e r i c n e u r o n s . I f l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n s t i m u l a t e s a x o n a l s p r o u t i n g f r o m s u b m u c o s a l n e u r o n s , t h e n t h e n u m b e r o f F g - l a b e l l e d n e u r o n s / g a n g l i o n w o u l d i n c r e a s e a s c o m p a r e d t o c o n t r o l p r e p a r a t i o n s . A l t e r n a t i v e l y , i f 1 0 5 5 o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n u p r e g u l a t e s o r s t i m u l a t e s d e n o v a s y n t h e s i s o f S P a n d / o r V I P i n n e r v e fi b e r s p r e v i o u s l y a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s , t h e n t h e n u m b e r s o f F g u p t a k e s i t e s a n d F g - l a b e l l e d s u b m u c o s a l n e u r o n s / g a n g l i o n w o u l d b e s i m i l a r i n c o n t r o l a n d d e n e r v a t e d t i s s u e s . H o w e v e r , a s p r e v i o u s w o r k h a s d e m o n s t r a t e d f o u r c l a s s e s o f s u b m u c o s a l n e u r o n s ( F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ) , i n c r e a s e d F g - l a b e l l e d n e u r o n s / g a n g l i o n c o u l d r e s u l t f r o m a x o n a l s p r o u t i n g o f n o n - S P o r n o n - V I P n e u r o n s . T h e r e f o r e , c o - l o c a l i z a t i o n o f F g a n d S P - o r V I P - i r w o u l d d e t e r m i n e i f i n c r e a s e d F g - l a b e l l i n g i n s u b m u c o s a l n e u r o n s r e s u l t e d f r o m a x o n a l s p r o u t i n g o f V I P - o r S P - i r n e u r o n s . I f a x o n a l s p r o u t i n g d o e s n o t o c c u r , t h e n n e w n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s m a y r e s u l t f r o m i n c r e a s e d c o n c e n t r a t i o n s o f S P a n d V I P i n e n t e r i c n e r v e s p r e v i o u s l y a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s . A l t e r a t i o n s i n t h e n u m b e r o f F g - l a b e l l e d n e u r o n s c o n t a i n i n g S P - o r V I P - i r w o u l d i n d i c a t e i n c r e a s e d s y n t h e s i s o f n e w n e u r o t r a n s m i t t e r s i n n e r v e s p r e v i o u s l y a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s . U n f o r t u n a t e l y , t h e s e e x p e r i m e n t s w o u l d n o t d i s c r i m i n a t e b e t w e e n e l e v a t e d s y n t h e s i s o f p r e v i o u s l y e x i s t i n g n e u r o t r a n s m i t t e r s f r o m d e n o v a s y n t h e s i s a n d a l t e r e d n e u r o n a l p h e n o t y p e . F u r t h e r m o r e , t h i s e x p e r i m e n t a l d e s i g n a s s u m e s i n c r e a s e d c o n c e n t r a t i o n s o f S P o r V I P i n n e r v e fi b e r s n e a r a r t e r i o l e s w o u l d a l s o s u b s t a n t i a l l y i n c r e a s e n e u r o p e p t i d e c o n c e n t r a t i o n s i n t h e c e l l s o m a t a , a l l o w i n g d e t e c t i o n u s i n g i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y . 1 3 9 T h e R e t r o g r a d e T r a c e r F l u o r o - g o l d L a b e l s S u b m u c o s a l N e u r o n s i n N o r m a l P r e p a r a t i o n s P r o c e e d i n g s u c c e s s f u l c a n n u l a t i o n o f 3 0 - 4 5 p m r e s i s t a n c e v e s s e l s , p r e s s u r e i n j e c t i o n s o f fl u o r o - g o l d fi l l e d a r t e r i o l e s w i t h y e l l o w fl u o r e s c e n t d y e w i t h v e r y l i t t l e l e a k a g e o u t s i d e t h e a r t e r i o l e . M i c r o p i p e t t e s w e r e n o t w i t h d r a w n i m m e d i a t e l y a f t e r i n j e c t i o n , a s a g r e a t e r a m o u n t o f F g r e m a i n e d w i t h i n a r t e r i o l e s t h u s g r e a t l y r e d u c i n g t h e s p r e a d o f fl u o r e s c e n c e o v e r s i t e s o f i n j e c t i o n ( F i g u r e 1 1 A ) . T w e n t y - f o u r o r f o r t y - e i g h t h o u r s a f t e r i n j e c t i o n , o c c a s i o n a l n u c l e a t e d s a t e l l i t e c e l l s w e r e l a b e l l e d w i t h F g ( F i g u r e 1 1 B ) . T h e s e c e l l s w e r e f o u n d n e a r i n j e c t e d a r t e r i o l e s o r s u r r o u n d i n g n e a r b y g a n g l i a a n d d i d n o t h a v e a m o r p h o l o g y c o n s i s t e n t w i t h s u b m u c o s a l n e u r o n s . A l t h o u g h i m m u n o h i s t o - c h e m i c a l s t u d i e s w e r e n o t p e r f o r m e d t o i d e n t i t y t h e s e c e l l s , t h e i r m o r p h o l o g y w a s c o n s i s t e n t w i t h S c h w a n n c e l l s a n d e n t e r i c g l i a . E n t e r i c g l i a l c e l l s a r e f r e q u e n t l y a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l g a n g l i a a n d h a v e l o n g p r o c e s s e s w h i c h r a d i a t e f r o m c e n t r a l l y - l o c a t e d p e r i k a r y a t o t e r m i n a t e i n s m a l l s w e l l i n g s ( G e r s h o n a n d R o t h m a n , 1 9 9 1 ) . S c h w a n n c e l l s a r e f o u n d n e a r b l o o d v e s s e l s a n d a r e d i s t i n g u i s h e d b y c e n t r a l l y - l o c a t e d p e r i k a r y a a n d s y m m e t r i c a l fl a t o r t h i n c y t o p l a s m p r o j e c t i o n s . F l u o r o - g o l d l a b e l l i n g w a s a l s o o b s e r v e d i n s u b m u c o s a l g a n g l i a ( F i g u r e 1 1 C ) . I n n o r m a l p r e p a r a t i o n s , 0 . 1 9 i 0 . 0 2 n e u r o n s / s u b m u c o s a l g a n g l i o n ( 6 7 n e u r o n s , 3 8 6 g a n g l i a , 3 a n i m a l s , 4 p r e p a r a t i o n s ) c o n t a i n e d F g . T h e s e n e u r o n s h a d b r i g h t h o m o g e n e o u s l y - s t a i n e d c y t o p l a s m , b r o a d a n d fl a t d e n d r i t e s c o n s i s t e n t w i t h D o g i e l t y p e I I I n e u r o n s , a n d d a r k , l e s s - s t a i n e d e c c e n t r i c a l l y - p l a c e d n u c l e i ( F i g u r e 1 1 C ) . O c c a s i o n a l a x o n s c o u l d b e t r a c e d f o r s h o r t d i s t a n c e s ( < 5 0 p m ) . I t w a s l i k e l y t h a t n e u r o n a l l a b e l l i n g w i t h F g r e s u l t e d f r o m s p e c i fi c r e t r o g r a d e t r a n s p o r t b y e n t e r i c n e r v e s a n d n o t u p t a k e o f F g b y c e l l b o d i e s , a s p r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s r e v e a l e d a t l e a s t 2 4 h o u r s w a s r e q u i r e d f o r n e u r o n s t o c o n t a i n F g . F i g u r e 1 1 . F l u o r o - g o l d l a b e l l i n g o f n e u r o n s i n s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l a n d d e n e r v a t e d i l e u m . A . W h o l e m o u n t p r e p a r a t i o n s h o w i n g F g - s t a i n i n g o v e r a r t e r i o l a r s i t e o f i n j e c t i o n . B . O c c a s i o n a l s m a l l , n o n - g a n g l i o n i c c e l l s c o n t a i n e d F g . C . F g - l a b e l l e d s u b m u c o s a l g a n g l i o n i c n e u r o n i n n o r m a l i l e u m . D . F g - l a b e l l e d s u b m u c o s a l g a n g l i o n i c n e u r o n i n i l e u m d e n e r v a t e d 6 w e e k s p r i o r t o e x p e r i m e n t . b v , a r t e r i o l e ; g , s u b m u c o s a l g a n g l i o n ; a r r o w , l a b e l l e d c e l l o r n e u r o n . B a r i n D i s a p p r o x i m a t e l y 3 0 1 1 m . 1 4 0 . : 2 % ; 1 4 2 T a b l e 4 . P e r c e n t a g e o f F l u o r o - g o l d - l a b e l l e d n e u r o n s c o n t a i n i n g s u b s t a n c e P - o r v a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p o l y p e p t i d e - i r i n s u b m u c o s a l g a n g l i a i n n o r m a l , c o n t r o l , a n d d e n e r v a t e d i l e u m . T r e a t m e n t S P - i r / F g - l a b e l l e d c e l l s V I P - i r / F g - l a b e l l e d c e l l s ( W e e k s a f t e r D e n e r v a t i o n ) ( S P c e l l s , F g c e l l s ) ( V I P c e l l s , F g c e l l s ) n o r m a l 6 i - 6 % 0 i 0 % ( 1 . 1 8 ) ( 0 , 2 3 ) c o n t r o l , w e e k 6 5 i 3 % 4 i 4 % ( 2 . 2 1 ) ( 1 , 3 8 ) d e n e r v a t e d , w e e k 6 6 i 4 % 1 3 i 8 % ( 1 . 1 3 ) ( 2 . 3 3 ) c o n t r o l , w e e k 8 0 i 0 % 0 i 0 % ( 0 , 6 ) ( 0 , 2 0 ) d e n e r v a t e d , w e e k 8 7 i 7 % 8 i 8 % ( 1 , 2 3 ) ( 1 , 9 ) D a t a w e r e t e s t e d f o r s i g n i fi c a n c e ( p < 0 . 0 5 ) w i t h t h e W i l c o x o n r a n k - s u m t e s t f o r n o n p a r a m e t r i c d a t a . F u r t h e r m o r e , i n j e c t i o n s d i r e c t l y a b o v e a r t e r i o l e s f a i l e d t o l a b e l l i n g o f s u b m u c o s a l n e u r o n s , i n d i c a t i n g F g - l a b e l l e d n e u r o n s d i d n o t o c c u r b y u p t a k e o f F g l o c a t e d o u t s i d e o f a r t e r i o l e s . C o - l o c a l i z a t i o n s t u d i e s w i t h a n t i s e r u m r a i s e d a g a i n s t S P o r V I P r e v e a l e d t h a t 6 i 6 % o f F g - fi l l e d n e u r o n s c o n t a i n e d S P - i r , w h e r e a s 0 i 0 % o f F g - fi l l e d n e u r o n s c o n t a i n e d V I P - i r i n n o r m a l s u b m u c o s a l p r e p a r a t i o n s ( T a b l e 4 ) . A s 5 6 % o f s u b m u c o s a l n e u r o n s c o n t a i n e i t h e r V I P - o r S P - i r ( r e v i e w e d i n F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ; s e e i n t r o d u c t i o n ) , t h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t F g p o s i t i v e s u b m u c o s a l n e u r o n s m u s t e i t h e r c o n t a i n C h A t , o r C h A t / c h o l e c y s t o k i n i n / C G R P N P Y / a n d s o m a t o s t a t i n ( s e e i n t r o d u c t i o n ) . 1 4 3 E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n D o e s N o t R e s u l t I n S u b s t a n c e P - I m m u n o r e a c t i v e A x o n a l S p r o u t s f r o m S u b m u c o s a l N e u r o n s F o u r w e e k s a f t e r s u r g i c a l d e n e r v a t i o n , 0 . 1 8 i 0 . 0 2 s u b m u c o s a l n e u r o n s / g a n g l i o n ( 3 4 n e u r o n s , 1 9 8 g a n g l i a , 3 p r e p a r a t i o n s , 2 a n i m a l s ) w e r e l a b e l l e d w i t h F g . S i m i l a r t o c o n t r o l a n d n o r m a l p r e p a r a t i o n s , t h e s e n e u r o n s w e r e l o c a t e d a t t h e p e r i p h e r y o f g a n g l i a , c o n t a i n e d h o m o g e n e o u s l y - s t a i n e d c y t o p l a s m , a n d h a d e c c e n t r i c a l l y - p l a c e d n u c l e i . T h e i r m o r p h o l o g y w a s c o n s i s t e n t w i t h D o g i e l t y p e I I I n e u r o n s . F u r t h e r m o r e , l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n d i d n o t a l t e r t h e n u m b e r o f F g - l a b e l l e d n e u r o n s a s c o m p a r e d t o a n i m a l - m a t c h e d c o n t r o l s ( 0 . 1 9 i 0 . 0 2 s u b m u c o s a l n e u r o n s / g a n g l i o n , 3 5 n e u r o n s , 1 8 0 g a n g l i a , 3 p r e p a r a t i o n s , 2 a n i m a l s ) ( F i g u r e 1 2 ) , i n d i c a t i n g a x o n a l s p r o u t i n g o f s u b m u c o s a l n e u r o n s d i d n o t o c c u r . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b t a i n e d 6 ( F i g u r e 1 1 D ) a n d 8 w e e k s a f t e r s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , a s 0 . 2 2 i 0 . 0 4 ( 7 6 n e u r o n s , 3 4 1 g a n g l i a , 6 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) a n d 0 . 1 4 i 0 . 0 2 ( 3 4 n e u r o n s , 2 4 4 g a n g l i a , 5 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) F g - l a b e l l e d s u b m u c o s a l n e u r o n s / g a n g l i o n w e r e o b s e r v e d 6 a n d 8 w e e k s a f t e r l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s . T h e s e r e s u l t s w e r e n o t d i f f e r e n t f r o m a n i m a l - m a t c h e d c o n t r o l s 6 ( 0 . 2 i 0 . 0 6 F g n e u r o n s / g a n g l i o n , 4 1 n e u r o n s , 2 0 4 g a n g l i a , 4 p r e p a r a t i o n s , 2 a n i m a l s ) a n d 8 ( 0 . 1 9 i 0 . 0 2 F g n e u r o n s / g a n g l i o n ; 3 0 n e u r o n s , 1 6 3 g a n g l i a , 4 p r e p a r a t i o n s , 2 a n i m a l s ) w e e k s a f t e r l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n , i n d i c a t i n g a x o n a l s p r o u t i n g f r o m s u b m u c o s a l n e r v e s d i d n o t o c c u r a t l a t e r t i m e s a f t e r s u r g i c a l d e n e r v a t i o n . S o m e p r e p a r a t i o n s w e r e p r o c e s s e d f o r i m m u n o h i s t o c h e m i c a l d e t e c t i o n o f S P - a n d / o r V I P - i r . S i x a n d w e e k s a f t e r s u r g i c a l d e n e r v a t i o n , 6 i 4 % a n d 1 3 i 8 % o f F g n e u r o n s c o n t a i n e d S P - a n d V I P - i r , r e s p e c t i v e l y , a n d s i m i l a r r e s u l t s w e r e o b s e r v e d 8 w e e k s a f t e r l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n ( T a b l e 4 ) . A l t h o u g h 6 i 2 % o f F g n e u r o n s c o n t a i n e d S P i n c o n t r o l a n i m a l s , 0 i 0 % o f F g n e u r o n s c o n t a i n e d V I P - i r , i n d i c a t i n g V I P m a y 1 4 4 C . 2 ‘ 2 1 0 0 " a . a E c o n t r o l - d e n e r v a t e d i 8 0 . 7 5 - 0 5 E . 9 3 0 . 5 0 - \ 3 ' 8 o h a 0 . 2 5 . . ' 6 1 ° t o ? 0 . 0 0 3 n o r m a l 4 6 8 I L w e e k s a f t e r d e n e r v a t i o n F i g u r e 1 2 . N u m b e r o f F l u o r o - g o l d l a b e l l e d n e u r o n s i n s u b m u c o s a l g a n g l i o n f r o m n o r m a l , c o n t r o l , a n d d e n e r v a t e d i l e u m . R e t r o g r a d e t r a n s p o r t w a s a l l o w e d f o r 4 8 h o u r s i n a l l p r e p a r a t i o n s . D a t a a r e m e a n s o f F g - c e l l s / s u b m u c o s a l g a n g l i o n 2 * : S E M f o r 3 - 6 p r e p a r a t i o n s f o r e a c h t i m e e x a m i n e d . 1 4 5 i n c r e a s e i n a p o p u l a t i o n o f s u b m u c o s a l n e u r o n s f o l l o w i n g e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , a l t h o u g h e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n d o e s n o t i n d u c e a x o n a l s p r o u t i n g o f s u b m u c o s a l n e u r o n s . H o w e v e r , S P - a n d V I P - i r w e r e e x a m i n e d i n l e s s t h a n 3 0 F g - l a b e l l e d n e u r o n s f o r e a c h t i m e p o i n t , s u g g e s t i n g a d d i t i o n a l e x p e r i m e n t s a r e n e c e s s a r y t o d e t e r m i n e i f t h e r e i s a s t a t i s t i c a l l y - s i g n i fi c a n t i n c r e a s e i n V I P - i r F g - l a b e l l e d n e u r o n s a f t e r d e n e r v a t i o n . 1 4 6 3 . L O C A L I Z A T I O N O F P H O S P H O R Y L A T E D A N D N O N P H O S P H O R Y L A T E D H E A V Y N E U R O F I L A M E N T P R O T E I N I N E N T E R I C N E R V E S I n t r o d u c t i o n I n o r d e r t o u s e p h o s p h o r y l a t i o n - s e n s i t i v e a n t i b o d i e s r a i s e d a g a i n s t N F - H , i t w a s n e c e s s a r y t o c h a r a c t e r i z e t h e i r b i n d i n g i n p r e p a r a t i o n s m a d e f r o m n o r m a l g u i n e a p i g i l e u m . T h e r e f o r e , a n t i b o d i e s r a i s e d a g a i n s t p h o s p h o r y l a t e d , n o n p h o s p h o r y l a t e d , a n d p h o s p h o r y l a t i o n - i n d e p e n d e n t e p i t o p e s o f N F - H w e r e u s e d t o d e t e r m i n e i f d i s c r e t e s u b p o p u l a t i o n s o f e n t e r i c n e u r o n s c o n t a i n e d N F - H , a n d i f t h e d i s t r i b u t i o n o f p h o s p h o r y l a t e d N F - H w a s h o m o g e n e o u s i n e x t r i n s i c a n d i n t r i n s i c n e r v e s . A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , S M I 3 1 , S M I 3 2 , a n d S M I 3 3 a r e m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s r a i s e d a g a i n s t n e u r o fi l a r n e n t p r o t e i n s f r o m r a t h y p o t h a l a m u s ( S t e r n b e r g e r a n d S t e r n b e r g e r , 1 9 8 3 ) . I m m u n o l o g i c a l a n d i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t S M I 3 1 r e c o g n i z e s a n e x t e n s i v e l y p h o s p h o r y l a t e d e p i t o p e o n N F - H ( p N F - H ) , a n d t o a l e s s e r e x t e n t , o n N F - M , S M I 3 2 r e a c t s w i t h a n o n p h o s p h o r y l a t e d e p i t o p e o n N F - H ( n p N F - H ) , a n d S M I 3 3 r e c o g n i z e s a n o n p h o s p h o r y l a t e d e p i t o p e t h a t i s a c c e s s i b l e i n b o t h p h o s p h o r y l a t e d a n d n o n p h o s p h o r y l a t e d N F - H ( p n p N F - H ) ( S t e r n b e r g e r a n d S t e r n b e r g e r , 1 9 8 3 ) . A l t h o u g h t h i s s e r i e s o f a n t i b o d i e s c a n r e c o g n i z e N F - M , a p p r o x i m a t e l y 9 0 % o f t o t a l r e a c t i v i t y i s w i t h t h e 2 0 0 K d a n e u r o fi l a m e n t s u b u n i t ( P e s t r o n k e t a 1 , 1 9 9 0 ; Y e e e t a l . , 1 9 8 8 ; W a t s o n e t a l . , 1 9 8 9 ) , s u g g e s t i n g t h e n o m e n c l a t u r e o f " N F - H " i s a p p r o p r i a t e . S p e c i fi c i t y o f S t e r n b e r g e r M o n o c l o n a l A n t i b o d i e s S t a i n i n g w i t h S M I 3 1 , S M I 3 2 , a n d S M I 3 3 w a s a b o l i s h e d f o l l o w i n g p r e - i n c u b a t i o n o f e a c h a n t i s e r u m w i t h n e u r o fi l a m e n t s i s o l a t e d f r o m b o v i n e s p i n a l c o r d , i n d i c a t i n g t h a t e a c h a n t i b o d y r e c o g n i z e d n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n s ( d a t a n o t s h o w n ) . T r y p s i n 1 4 7 a n d p h o s p h a t a s e p r e t r e a t m e n t o f s u b m u c o s a l p r e p a r a t i o n s w a s u s e d t o v e r i f y t h a t e a c h a n t i b o d y w a s s p e c i fi c f o r p N F ( S M I 3 1 ) , n p N F ( S M I 3 2 ) , o r p n p N F ( S M I 3 3 ) . P r e t r e a t m e n t o f s u b m u c o s a l p r e p a r a t i o n s w i t h a l k a l i n e p h o s p h a t a s e d e p h o s p h o r y l a t e s p h o s p h o r y l a t e d N F - H - i r , a n d r e s u l t e d i n d e c r e a s e d S M I 3 1 l o c a l i z a t i o n , b u t n o t b i n d i n g o f S M I 3 2 o r S M I 3 3 , i n d i c a t i n g t h a t b i n d i n g o f S M I 3 1 r e q u i r e s t h e p r e s e n c e o f p h o s p h a t e g r o u p s o n t h e t a r g e t a n t i g e n . P r e t r e a t m e n t w i t h t r y p s i n d i d n o t a l t e r S M I 3 3 b i n d i n g , b u t a b o l i s h e d s t a i n i n g b y S M I 3 2 . A s t r y p s i n i s a s e r i n e p r o t e a s e t h a t c l e a v e s t h e c a r b o x y l t e r m i n a l e n d o f a r g i n i n e a n d l y s i n e r e s i d u e s u n l e s s s u c h s i t e s a r e p r o t e c t e d b y p o s t - t r a n s l a t i o n a l m o d i fi c a t i o n s , s u c h a s p h o s p h o r y l a t i o n ( C a r d e n e t a l . , 1 9 8 5 ; S t e r n b e r g e r a n d S t e r n b e r g e r , 1 9 8 3 ; N i x o n e t a l . , 1 9 8 2 ) , t h e s e r e s u l t s s t r o n g l y s u g g e s t t h a t S M ] 3 2 r e c o g n i z e s a n o n p h o s p h o r y l a t e d e p i t o p e . T r y p s i n d i d n o t a l t e r s t a i n i n g b y S M I 3 1 , p r e s u m a b l y d u e t o t h e p r e s e n c e o f p h o s p h o r a t e g r o u p s o n N F - H . S e q u e n t i a l t r y p s i n a n d a l k a l i n e p h o s p h a t a s e t r e a t m e n t d e s t r o y e d p N F - H - a n d n p N F - H - i r . A d d i t i o n a l s t a i n i n g w a s n o t r e v e a l e d w i t h S M I 3 2 , s u g g e s t i n g t h a t p o t e n t i a l e p i t o p e s a r e n o t m a s k e d b y p h o s p h o r y l a t i o n . F i n a l l y , t h e p a t t e r n o f s t a i n i n g f o r S W 3 3 w a s n o t a l t e r e d b y p h o s p h a t a s e o r t r y p s i n , s u g g e s t i n g S M I 3 3 r e c o g n i z e s a n o n p h o s p h o r y l a t e d e p i t o p e t h a t i s a c c e s s i b l e i n p h o s p h o r y l a t e d a n d n o n p h o s p h o r y l a t e d n e u r o fi l a m e n t s ( S t e r n b e r g e r a n d S t e r n b e r g e r , 1 9 8 3 ; W a t s o n e t a l . , 1 9 8 9 ) . T h e p a t t e r n s o f i m m u n o r e a c t i v i t y f o r p N F - H - , n p N F - H - , a n d p n p N F - H - i r i n t h e s u b m u c o s a l p l e x u s w e r e s i m i l a r i r r e s p e c t i v e o f t h e b u f f e r u s e d t o d i l u t e t h e a n t i b o d i e s . T h i s o b s e r v a t i o n s u g g e s t s t h a t b i n d i n g o f S M I 3 1 , 3 2 , o r 3 3 i s n o t a l t e r e d b y t h e p r e s e n c e o f p h o s p h a t e i n t h e d i l u e n t b u f f e r . 1 4 8 P h o s p h o r y l a t e d N F - H - i r I s F o u n d i n S u b m u c o s a l N u c l e i a n d N e r v e F i b e r s I n c u b a t i o n w i t h S M I 3 1 , S M I 3 2 , a n d S M I 3 3 g a v e d i f f e r e n t s t a i n i n g p a t t e r n s i n t h e s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c p l e x u s e s . N F - H i s t h e m o s t p h o s p h o r y l a t e d c o m p o n e n t o f t h e n e u r o fi l a m e n t t r i p l e t , a s i t c o n t a i n s a p p r o x i m a t e l y 2 2 m o l e s o f p h o s p h a t e / m o l e o f p o l y p e p t i d e ( J u l i e n a n d M u s h y n s k i , 1 9 8 2 ) . A s a r e s u l t , m o s t a n t i s e r u m r a i s e d a g a i n s t N F - H r e c o g n i z e s a p h o s p h o r y l a t e d e p i t o p e ( C a r d e n , 1 9 8 5 ) . S i m i l a r t o o t h e r s t u d i e s i n t h e C N S ( S t e r n b e r g e r a n d S t e r n b e r g e r , 1 9 8 3 ) a n d E N S ( B a k e r e t a l . , 1 9 9 0 ) , l i t t l e p N F - i r w a s o b s e r v e d i n n e u r o n a l c y t o p l a s m , a s d e n d r i t e s a n d s o m a t a o f s u b m u c o s a l n e u r o n s d i d n o t c o n t a i n N F - H - i r . H o w e v e r , s t r o n g p N F - H - i r w a s l o c a l i z e d i n n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s ( F i g u r e 1 3 A ) , i n t e r g a n g l i o n i c n e r v e s t r a n d s ( F i g u r e 1 3 B ) , a n d o c c a s i o n a l l y i n s i n g l e a x o n s t r a n s v e r s i n g t h r o u g h t h e s u b m u c o s a l p l e x u s ( F i g u r e 1 3 B ) . H o w e v e r , d i s t i n c t e l l i p t i c a l a n d r o u n d - s h a p e d b o d i e s w e r e s t a i n e d i n s u b m u c o s a l p r e p a r a t i o n s ( F i g u r e 1 3 B ) , w i t h t h e b r i g h t e s t s t a i n i n g w i t h i n s u b m u c o s a l g a n g l i a . T h e r e w e r e 7 . 1 i 0 . 5 ( 7 , 3 5 5 o r g a n e l l e s , 1 , 1 1 6 g a n g l i a , l 3 p r e p a r a t i o n s , 4 a n i m a l s ) b o d i e s / s u b m u c o s a l g a n g l i o n t h a t m e a s u r e d 1 9 i - 2 u m i n t h e l o n g a x i s a n d 9 . 0 i 0 . 3 p m i n t h e s h o r t a x i s . T h i s i m m u n o r e a c t i v i t y w a s c o - l o c a l i z e d w i t h t h e n u c l e a r s t a i n b i s b e n z i m i d e ( F i g u r e s 1 3 B a n d 1 3 C ) , s u g g e s t i n g t h a t S M I 3 1 a l s o r e c o g n i z e s a n e p i t o p e f o u n d i n g a n g l i o n i c n u c l e i . T h e p a t t e r n o f i m m u n o r e a c t i v i t y w a s n o t u n i f o r m i n t h e n u c l e i , a s 4 - 6 c i r c u l a r a r e a s o f l e s s t h a n 1 p m w e r e d e v o i d o f s t a i n i n g i n e a c h n u c l e u s . F u r t h e r m o r e , t h e r e w a s f r e q u e n t l y a d a r k r i n g d e v o i d o f a n y i m m u n o r e a c t i v i t y s u r r o u n d i n g t h e n u c l e u s , a n d t h e r e m a i n i n g c y t o p l a s m o f t h e c e l l c o n t a i n e d v e r y f a i n t fi l a m e n t o u s s t a i n i n g w h i c h a p p e a r e d c o n t i n u o u s w i t h t h e i n t e r g a n g l i o n i c s t r a n d s . T h e c o - l o c a l i z a t i o n o f S M I 3 1 a n d b i s b e n z a m i d e s u g g e s t t h a t e n t e r i c n u c l e i c o n t a i n a p r o t e i n 1 4 9 F i g u r e 1 3 . P h o s p h o r y l a t e d h e a v y m o l e c u l a r w e i g h t n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n - i m m u n o r e a c t i v i t y i n n u c l e i a n d n e r v e fi b e r s i n s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s i n n o r m a l i l e u m . A . p N F - H - i r i n n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s . B . S M I 3 l - i r i n o r g a n e l l e s f o u n d w i t h i n a s u b m u c o s a l g a n g l i o n . C . C o - l o c a l i z a t i o n w i t h H o e c h s t d y e 3 3 5 2 8 ( b i s B e n z i m i d e , b B ) w i t h i n a s u b m u c o s a l g a n g l i o n i d e n t i fi e s o r g a n e l l e s a s n u c l e i . b v , a r t e r i o l e ; a r r o w i n A i n d i c a t e s p e r i v a s c u l a r n e r v e fi b e r , a r r o w i n B i n d i c a t e s s t a i n e d S M I 3 l - i r n u c l e i . C a l i b r a t i o n b a r i n C i s 3 0 u m . F i g u r e 1 3 . r A 1 5 1 w i t h s e q u e n c e h o m o l o g y t o n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n s . T h e r e i s s o m e h o m o l o g y b e t w e e n i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n s a n d l a m i n s , a f a m i l y o f s t r u c t u r a l p r o t e i n s f o u n d w i t h i n t h e n u c l e a r e n v e l o p e ( M c K e o n , 1 9 8 6 ) . H o w e v e r , n u c l e a r s t a i n i n g h a s n o t b e e n r e p o r t e d i n o t h e r t i s s u e s u s i n g a n t i s e r u m r a i s e d a g a i n s t p N F - H , s u g g e s t i n g t h a t e n t e r i c n u c l e i c o n t a i n u n i q u e p h o s p h o r y l a t e d p r o t e i n s t h a t m a y p r o t e c t t h e n u c l e a r o r g a n e l l e s a g a i n s t m e c h a n i c a l f o r c e s t h a t d e v e l o p d u r i n g m o t i l i t y ( s e e S h a r k e y e t a l . , 1 9 9 0 ) . A l t e r n a t i v e l y , S M I 3 1 m a y r e c o g n i z e p h o s p h o r y l a t e d K S P o r o t h e r s i m i l a r s e q u e n c e s s u c h a s t h o s e f o u n d i n h i s t o n e H 1 o r s o m e o t h e r n u c l e a r p r o t e i n ( W o o d , 1 9 8 2 ) . A s e x t r i n s i c s y m p a t h e t i c , p a r a s y m p a t h e t i c , a n d s e n s o r y n e r v e fi b e r s a r e a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s , i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t u d i e s w e r e u s e d t o d e t e r m i n e t h e i d e n t i t y o f p N F - H - i r n e r v e fi b e r s i n t h e v a s c u l a r p l e x u s . P r e v i o u s w o r k d e s c r i b e d i n t h e p r e c e d i n g p a g e s h a s d e m o n s t r a t e d t h a t e a c h p o p u l a t i o n o f n e r v e s c o n t a i n s u n i q u e n e u r o p e p t i d e s , a s s y m p a t h e t i c n e r v e s c o n t a i n N P Y - i r ( F u r n e s s e t a l . , 1 9 8 5 ) , a n d e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e s c o n t a i n C G R P - a n d S P - i r ( G i b b i n s e t a l . , 1 9 8 5 ) . E n t e r i c n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s c o n t a i n V I P - i r b u t n o t N P Y - , S P - , o r C G R P - i r ( r e v i e w e d i n F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ) . P h o s p h o r y l a t e d N F - H - i r w a s f o u n d c o - l o c a l i z e d w i t h N P Y - ( d a t a n o t s h o w n ) , C G R P - ( F i g u r e s 1 5 C a n d 1 5 D ) , a n d V I P - i r ( F i g u r e s 1 5 E a n d 1 5 F ) i n n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s . T h i s p a t t e r n o f c o - l o c a l i z a t i o n s u g g e s t s t h a t p N F - H - i r i s f o u n d i n e x t r i n s i c a n d i n t r i n s i c n e r v e s a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s . T h e i d e n t i t y o f p N F - H - i r n e r v e s w e r e v e r i fi e d u s i n g s u r g i c a l a n d c h e m i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n s . S u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n o f l o o p s o f i l e u m d e s t r o y s e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n , a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d . L o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n a b o l i s h e d p N F - H - i r 1 5 2 n e r v e s a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s , b u t n o t p N F - H - i r i n i n t e r g a n g l i o n i c n e r v e s t r a n d s , o n e w e e k a f t e r s u r g i c a l d e n e r v a t i o n ( F i g u r e 1 6 A ) . P h o s p h o r y l a t e d N F - H - i r n e r v e fi b e r s w e r e n o t a l t e r e d i n t i s s u e s t a k e n f r o m u n o p e r a t e d s e g m e n t s o f i l e u m f r o m t h e s a m e a n i m a l s ( F i g u r e 1 6 B ) . P h o s p h o r y l a t e d N F - H - l N P Y - i r , p N F - I - I / C G R P - i r , o r p N F - H - N I P - i r n e r v e fi b e r s w e r e r a r e l y o b s e r v e d a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , a n d s h a m s u r g e r i e s d i d n o t a f f e c t i m m u n o r e a c t i v i t y o r l o c a l i z a t i o n o f a n y a n t i g e n ( d a t a n o t s h o w n ) . A s p r e d i c t e d , a d m i n i s t r a t i o n o f c a p s a i c i n , b u t n o t t h e v e h i c l e , e l i m i n a t e d p N F - H - l C G R P - i r n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s ( F i g u r e s 1 6 C a n d 1 6 D ) o n e w e e k a f t e r t r e a t m e n t ; c a p s a i c i n a d m i n i s t r a t i o n d i d n o t a f f e c t p N F - H - l N P Y - i r o r p N F - H - N I P - i r n e r v e s . F i n a l l y , s y s t e m i c 6 - O H - D A t r e a t m e n t d e s t r o y e d p N F - H - l N P Y - i r n e r v e s a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s ( F i g u r e s 1 6 B a n d 1 6 F ) , b u t d i d n o t a l t e r n e r v e s c o n t a i n i n g p N F - H - / C G R P - i r o r p N F - H - l V I P - i r . S y s t e m i c v e h i c l e a d m i n i s t r a t i o n d i d n o t a f f e c t p N F - H - i r o r n e u r o p e p t i d e - i r ( d a t a n o t s h o w n ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t e x t r i n s i c s y m p a t h e t i c a n d s e n s o r y n e r v e s c o n t a i n p N F - H - i r . P h o s p h o r y l a t e d N F - H - i r I s F o u n d i n M y e n t e r i c N u c l e i a n d N e r v e F i b e r s B r i g h t p N F - H - i r w a s l o c a l i z e d i n i n t e r g a n g l i o n i c n e r v e b u n d l e s o f p r i m a r y a n d s e c o n d a r y p l e x u s e s , a n d f a i n t p N F - H - i r w a s o b s e r v e d i n t h e t e r t i a r y p l e x u s ( F i g u r e 1 7 A a n d 1 7 B ) . H o w e v e r , p N F - H - i r w a s n o t o b s e r v e d i n n e r v e v a r i c o s i t i e s . S M I 3 1 - i r w a s c o - l o c a l i z e d w i t h b i s b e n z a m i d e i n c e l l o r g a n e l l e s ( d a t a n o t s h o w n ) , s u g g e s t i n g S M I 3 1 r e c o g n i z e s a n e p i t o p e f o u n d i n a l l e n t e r i c n u c l e i . B r i g h t S M I 3 1 - i r w a s l o c a l i z e d i n m y e n t e r i c g a n g l i a ( 1 0 8 i - 1 6 n u c l e i / g a n g l i o n ; 1 3 , 0 6 6 n u c l e i , 1 0 0 m y e n t e r i c g a n g l i a , 9 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) . N u c l e a r s t a i n i n g b y S M I 3 1 w a s n o t u n i f o r m , a s s m a l l c i r c u l a r o r o v o i d a r e a s w e r e d e v o i d o f i m m u n o r e a c t i v i t y , s i m i l a r t o t h e p a t t e r n o f S M I 3 1 - i r 1 5 3 F i g u r e 1 4 . P h o s p h o r y l a t e d h e a v y m o l e c u l a r w e i g h t n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n - i m m u n o r e a c t i v i t y i n n u c l e i a n d n e r v e fi b e r s i n m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s i n n o r m a l i l e u m . A . p N F - H - i r n e r v e fi b e r s o f p r i m a r y a n d s e c o n d a r y p l e x u s e s . B . F a i n t p N F - H - i r i n t e r t i a r y p l e x u s . g , m y e n t e r i c g a n g l i o n ; a r r o w i n d i c a t e s s e c o n d a r y p l e x u s ; a r r o w w i t h a s t e r i s k i n d i c a t e s t e r n i a r y p l e x u s ; s m a l l a r r o w i n d i c a t e s n u c l e i i m m u n o r e a c t i v e f o r S M I 3 1 . C a l i b r a t i o n b a r i n D i s 3 0 u m . 1 5 4 F i g u r e 1 4 . 1 5 5 i n s u b m u c o s a l g a n g l i o n i c n u c l e i . F a i n t S M I 3 1 - i r w a s a l s o o b s e r v e d i n n o n - g a n g l i o n i c n u c l e i . N e i t h e r s u r g i c a l o r c h e m i c a l d e n e r v a t i o n a f f e c t e d S M I 3 1 - i r i n n e r v e fi b e r s i n t h e m y e n t e r i c p l e x u s ( d a t a n o t s h o w n ) , f u r t h e r s u g g e s t i n g p N F - H - i r i s f o u n d i n e x t r i n s i c a n d i n t r i n s i c i n n e r v a t i o n o f t h e G I t r a c t . N o n p h o s p h o r y l a t e d N F - H - i r I s F o u n d i n S u b s t a n c e P - I m m u n o r e a c t i v e S u b m u c o s a l N e u r o n s S M I 3 2 g a v e a d i f f e r e n t p a t t e r n o f i m m u n o r e a c t i v i t y a s c o m p a r e d t o s t a i n i n g w i t h S M I 3 1 . S u b m u c o s a l i n t e r g a n g l i o n i c n e r v e s t r a n d s , n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s , a n d g a n g l i o n i c n u c l e i d i d n o t c o n t a i n d e t e c t a b l e n p N F - H - i r . H o w e v e r , 1 . 3 _ + _ 0 . 1 c e l l s / g a n g l i o n ( 3 , 3 5 8 c e l l s , 2 , 6 9 0 s u b m u c o s a l g a n g l i a , 4 3 p r e p a r a t i o n s , 4 a n i m a l s ) c o n t a i n e d n p N F - H - i r . T h e s e n e u r o n s w e r e f r e q u e n t l y l o c a t e d n e a r i n t e r g a n g l i o n i c n e r v e b u n d l e s a t t h e p e r i p h e r y o f g a n g l i a ( F i g u r e 1 5 ) . T h e n p - N F - H - i r n e u r o n s h a d e c c e n t r i c a l l y - p l a c e d d a r k n u c l e i d e v o i d o f i m m u n o r e a c t i v i t y a n d u n i f o r m l y s t a i n e d c y t o p l a s m . A l t h o u g h d e n d r i t e s w e r e n o t i m m u n o r e a c t i v e , o c c a s i o n a l l y , p r o x i m a l p r o c e s s e s o f a x o n s w e r e v i s i b l e . T h e n p - N F - H - i r c e l l s w e r e c l a s s i fi e d b y t h r e e m o r p h o l o g i e s c o n s i s t e n t w i t h D o g i e l t y p e I I I m o r p h o l o g y . A p p r o x i m a t e l y 4 6 % o f a l l n p - N F - H - i r c e l l s w e r e 3 8 i 2 p m i n t h e l o n g a x i s a n d 1 4 i 1 p m i n t h e n a r r o w a x i s . T h e s e c e l l s h a d a x o n s t h a t w e r e u s u a l l y f o u n d w i t h i n t h e g a n g l i a . A p p r o x i m a t e l y 3 8 % o f a l l S M I 3 2 - i r c e l l s w e r e p y r a m i d a l o r s q u a r e - s h a p e d a n d m e a s u r e d 2 7 i 1 p m i n t h e l o n g a x i s a n d 2 0 i 1 p m i n t h e s h o r t a x i s . T h e a x o n s f r o m t h e s e c e l l s f r e q u e n t l y w e r e a s s o c i a t e d w i t h i n t e r g a n g l i o n i c n e r v e fi b e r s . T h e s e a x o n s d i d n o t e n t e r t h e b o d y o f t h e g a n g l i a . F i n a l l y , t h e r e m a i n i n g 1 6 % o f t h e n p N F - H - i r s u b m u c o s a l n e u r o n s d i d n o t fi t i n t o e i t h e r c a t e g o r y a n d w e r e 2 3 i 3 p m i n t h e l o n g a x i s a n d 1 3 i 2 p m i n t h e s h o r t a x i s . 1 5 6 F i g u r e 1 5 . N o n p h o s p h o r y l a t e d h e a v y m o l e c u l a r w e i g h t n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n - i m m u n o r e a c t i v i t y i n s u b m u c o s a l n e r v e c e l l b o d i e s i n n o r m a l i l e u m . A . C G R P - 1 r i n a s i n g l e g a n g l i o n i c n e u r o n . B . n p N F - H - i r i s l o c a l i z e d i n a c e l l w i t h o u t C G R P - i t . C . N P Y - i r i n a s u b m u c o s a l g a n g l i o n . D . C o r r e s p o n d i n g c o - l o c a l i z a t i o n o f n p N F - H - i r . T h e a r r o w r e p r e s e n t s a n p N F - H - i r n e u r o n t h a t d o e s n o t c o n t a i n N P Y - i r . E . I n t e n s e V I P - i r i n s u b m u c o s a l g a n g l i o n ; t h e a r r o w i n d i c a t e s a V I P - i r n e u r o n . F . C o r r e s p o n d i n g c o - l o c a l i z a t i o n o f n p N F - H - i r . N o t i c e a r r o w m a r k s n p N F - H - i r n e u r o n ; t h i s n e u r o n d o e s n o t c o n t a i n V I P - i r . G . S P - i r i n g a n g l i o n i c n e u r o n s a n d a b e a d e d v a r i c o s i t y . N o t e t h a t o n e g a n g l i o n d o e s n o t c o n t a i n S P - i r n e u r o n s . H . n p N F - H - i r i s f o u n d i n t h e s a m e p o p u l a t i o n o f S P - i r c e l l s . g , s u b m u c o s a l g a n g l i o n . B a r i n H i s a p p r o x i m a t e l y 3 0 u m . F i g u r e 1 5 . 1 5 8 T h e a x o n s f r o m t h e s e c e l l s f r e q u e n t l y w e r e n o t v i s i b l e . S u b m u c o s a l t i s s u e s w e r e i n c u b a t e d w i t h S M I 3 2 a n d a n t i s e r u m r a i s e d a g a i n s t n e u r o p e p t i d e s t o d e t e r m i n e t h e s u b c l a s s ( e s ) o f n e u r o n s c o n t a i n i n g n p - N F - H - i r ( T a b l e 5 ) . N o n p h o s p h o r y l a t e d - N F - H - i r w a s n o t o b s e r v e d t o b e c o - l o c a l i z e d w i t h C G R P ( 1 1 p r e p a r a t i o n s ) ( F i g u r e s 1 5 A a n d 1 5 B ) , N P Y ( 1 0 p r e p a r a t i o n s ) ( F i g u r e 1 5 C a n d 1 5 D ) , o r V I P ( 1 6 p r e p a r a t i o n s ) ( F i g u r e 1 5 B a n d 1 5 F ) . H o w e v e r , i n c o l c h i c i n e - t r e a t e d t i s s u e s , 9 2 i 2 % o f a l l n p - N F - H - i r n e u r o n s a l s o c o n t a i n e d S P - i r ( F i g u r e s 1 5 G a n d 1 5 H ) w h i l e 9 4 i 2 % o f a l l S P - i r n e u r o n s c o n t a i n e d n p - N F - H - i r . C o n v e r s e l y , a l m o s t a l l n p N F - H - i r n e u r o n s c o n t a i n e d S P - i r . S u r g i c a l - o r c h e m i c a l - e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n d i d n o t a l t e r n p - N F - H - i r i n s u b m u c o s a l n e u r o n s ( d a t a n o t s h o w n ) . N o n p h o s p h o r y l a t e d N F - H - i r I s F o u n d i n M o t o r a n d S e n s o r y M y e n t e r i c N e u r o n s I n t e r g a n g l i o n i c n e r v e fi b e r s a n d n e r v e fi b e r s i n t h e s e c o n d a r y a n d t e r t i a r y p l e x u s e s o f t h e m y e n t e r i c p l e x u s d i d n o t c o n t a i n n p N F - H - i r . H o w e v e r , n p N F - H - i r w a s o b s e r v e d i n 3 2 i 3 . 0 m y e n t e r i c n e u r o n s / g a n g l i o n ( 1 0 , 5 2 2 c e l l s , 3 5 0 g a n g l i a , 2 6 p r e p a r a t i o n s , 6 a n i m a l s ) ( F i g u r e 1 6 ) . T h e s e c e l l s w e r e l o c a t e d a t t h e p e r i p h e r a l b o r d e r a s w e l l a s i n t h e i n t e r i o r o f t h e g a n g l i a . R a r e l y , h o m o g e n e o u s l y - s t a i n e d , l a r g e e x t r a - g a n g l i o n i c n e u r o n s c o n t a i n e d n p N F - H - i r . N o n p h o s p h o r y l a t e d N F - H - i r w a s o b s e r v e d i n d e n d r i t e s a n d a x o n s o f m a n y n e u r o n s . I n s o m e n e u r o n s , 4 - 1 5 b r o a d a n d fl a t d e n d r i t e s c o u l d b e o b s e r v e d , w i t h o c c a s i o n a l a x o n s e m e r g i n g f r o m e i t h e r a d e n d r i t e - l i k e p r o c e s s o r t h e c e l l s o m a , c o n s i s t e n t w i t h D o g i e l t y p e I m o r p h o l o g y . S o m e n p N F - H - i r n e u r o n s h a d s m o o t h s o m a t a w i t h s t a i n e d a x o n h i l l o c k s , a n d c o n t a i n e d 4 - 8 fi l a m e n t o u s d e n d r i t e s . T h e s e n e u r o n s r e p r e s e n t D o g i e l t y p e I I n e u r o n s . N o n p h o s p h o r y l a t e d N F - H - i r a x o n s e x h i b i t e d a n u m b e r o f p r o j e c t i o n s , a s t h e y a p p e a r e d t o e x i t t h e g a n g l i a w i t h o u t e n t e r i n g i n t e r n o d a l n e r v e b u n d l e s , 1 5 9 p r o j e c t e d o u t o f t h e g a n g l i a w i t h i n t h e i n t e r n o d a l n e r v e b u n d l e s , o r p r o j e c t e d w i t h i n t h e b o d y o f t h e g a n g l i a . H o w e v e r , n p N F - H - i r w a s m o s t f r e q u e n t l y o b s e r v e d o n l y i n p r o x i m a l p o r t i o n o f a x o n s o v e r d i s t a n c e s u p t o 5 0 p m . B i f u r c a t i o n s i n a x o n s w e r e o b s e r v e d r a r e l y . N o n p h o s p h o r y l a t e d - N F - H - i r m y e n t e r i c c e l l s c o u l d n o t b e c a t e g o r i z e d b y s h a p e . T h e y h a d a n a v e r a g e s i z e o f 3 4 i 1 p m i n t h e l o n g a x i s , a n d 2 0 : t 1 p m i n t h e n a r r o w a x i s , w i t h t h e l a r g e s t n p N F - H - i r c e l l m e a s u r i n g 5 5 x 2 8 u m ( l o n g a n d n a r r o w a x i s ) , a n d t h e s m a l l e s t c e l l m e a s u r i n g 2 0 x 1 0 u m ( l o n g a n d n a r r o w a x i s , r e s p e c t i v e l y ) . M y e n t e r i c n e u r o n s e x h i b i t e d d i v e r s i t y i n t h e p a t t e r n o f n p N F - H - i r i n t h e c y t o p l a s m a n d i n t h e i n t e n s i t y o f s t a i n i n g . T h e m a j o r i t y o f s m a l l n p N F - H - i r m y e n t e r i c c e l l s c o n t a i n e d fl u o r e s c e n c e t h r o u g h o u t t h e s o m a . H o w e v e r , a p p r o x i m a t e l y 2 5 % o f a l l n p N F - H - i r c e l l s c o n t a i n e d fi l a m e n t o u s n p - N F - H - i r t h r o u g h o u t t h e c y t o p l a s m , a n d w e r e f r e q u e n t l y t h e l a r g e s t n p N F - H - i r c e l l s i n t h e g a n g l i o n . T i s s u e s w e r e i n c u b a t e d w i t h S M I 3 2 a n d a n t i s e r u m a g a i n s t n e u r o p e p t i d e s t o i d e n t i f y t h e s u b c l a s s e s o f m y e n t e r i c n e u r o n s t h a t c o n t a i n n p - N F - H - i r ( T a b l e 6 ) . N o n p h o s p h o r y l a t e d N F - H - i r m y e n t e r i c n e u r o n s d i d n o t c o n t a i n C G R P - ( 1 2 p r e p a r a t i o n s ) o r N P Y - i r ( 1 2 p r e p a r a t i o n s ) . A l t h o u g h t h e m y e n t e r i c p l e x u s c o n t a i n s a d e n s e p l e x u s o f S P - i r n e r v e fi b e r s o r i g i n a t i n g f r o m m y e n t e r i c n e u r o n s , t h i s s t u d y w a s u n a b l e t o i d e n t i f y i n d i v i d u a l S P - i r m y e n t e r i c n e u r o n s , e v e n a f t e r i n c u b a t i o n i n c o l c h i c i n e c o n t a i n i n g m e d i u m a s b r i g h t S P - i r a x o n s c o v e r e d S P - i r m y e n t e r i c n e r v e c e l l b o d i e s . A l t h o u g h m a n y m y e n t e r i c n e u r o n s c o n t a i n S P - i r i n m y e n t e r i c g a n g l i a , i m m u n o h i s t o c h e m i c a l m e t h o d s c a n o n l y d e t e c t f a i n t l e v e l s o f S P . P a r t o f t h e d i f fi c u l t y i n d e t e c t i o n o f S P r e s u l t s f r o m b r i g h t e x t r i n s i c a n d i n t r i n s i c v a r i c o s e n e r v e fi b e r s t h a t p r o j e c t o v e r t h e s u r f a c e o f m y e n t e r i c g a n g l i a , m a s k i n g S P - i r i n m y e n t e r i c n e u r o n s . R a r e S P - i r n e u r o n s w e r e f o u n d t o c o n t a i n 1 6 0 n p N F - H - i r , i n d i c a t i n g t h a t s o m e S P n e u r o n s m a y c o n t a i n n p N F - H - i r ( d a t a n o t s h o w n ) , s i m i l a r t o t h e c h e m i c a l c o d i n g i n s u b m u c o s a l g a n g l i a . C o - l o c a l i z a t i o n s t u d i e s h a v e a l s o d e t e r m i n e d t h a t s o m e n p N F - H - i r n e u r o n s a l s o c o n t a i n e d e i t h e r V I P - i r ( 2 6 p r e p a r a t i o n s ) ( F i g u r e s 1 8 C a n d 1 8 D ) o r N O S - i r ( F i g u r e s 1 8 B a n d 1 8 F ) ( 1 0 p r e p a r a t i o n s ) , a l t h o u g h s o m e V I P - i r a n d N O S - i r c e l l s d i d n o t c o n t a i n d e t e c t a b l e a m o u n t s o f n p - N F - H - i r . S u r g i c a l - o r c h e m i c a l - d e n e r v a t i o n d i d n o t a l t e r n p — N F - H - i r i n m y e n t e r i c n e u r o n s ( F i g u r e s 1 8 A a n d 1 8 B ) . P h o s p h o r y l a t i o n - I n d e p e n d e n t N F - H - i r I s F o u n d i n S u b m u c o s a l P e r i k a r y a a n d N e r v e F i b e r s U n l i k e S M I 3 1 o r S M I 3 2 , S M I 3 3 r e c o g n i z e s a n o n p h o s p h o r y l a t e d e p i t o p e o n N F - H t h a t i s a c c e s s i b l e o n p h o s p h o r y l a t e d a n d n o n p h o s p h o r y l a t e d n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n . I n s u b m u c o s a l p r e p a r a t i o n s , p n p N F - H - i r w a s f o u n d i n i n t e r g a n g l i o n i c n e r v e fi b e r s , n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h t h e a r t e r i o l e s , a n d i n 2 . 1 i 0 . 1 s u b m u c o s a l n e u r o n s / g a n g l i o n ( 1 , 0 8 0 c e l l s , 5 3 8 g a n g l i a , 1 0 p r e p a r a t i o n s ) ( F i g u r e s 1 7 A a n d 1 7 B ) . T h e i m m u n o r e a c t i v i t y w a s h o m o g e n o u s i n t h e c y t o s o l , a n d w a s n o t o b s e r v e d i n t h e n u c l e u s . S M I 3 3 a p p e a r e d t o r e c o g n i z e t h e s a m e p o p u l a t i o n o f s u b m u c o s a l c e l l s i d e n t i fi e d b y S M I 3 2 , a s p N F - H - a n d p n p N F - H - i r c e l l s w e r e l o c a t e d a t t h e p e r i p h e r y o f t h e g a n g l i o n , s h a r e d s i m i l a r m o r p h o l o g i e s , a n d d i d n o t h a v e v i s i b l e d e n d r i t e s . A s S M I 3 2 a n d S M I 3 3 d i f f e r i n t h e i r h e a v y c h a i n , c o - l o c a l i z a t i o n s t u d i e s c o u l d b e p e r f o r m e d u s i n g s e c o n d a r y a n t i s e r u m r a i s e d a g a i n s t I g G t o v i s u a l i z e n p N F - H - i r o r I g M t o v i s u a l i z e p n p N F - H - i r . S u c h s t u d i e s r e v e a l e d t h a t n p N F - H - i r a n d p n p N F - H - i r w e r e c o - l o c a l i z e d i n a l m o s t a l l c e l l s e x a m i n e d ( d a t a n o t s h o w n ) . T a b l e 5 . N u m b e r o f p e p t i d e - a n d n o n p h o s p h o r y l a t e d N F - H - i r c e l l s i n s u b m u c o s a l g a n g l i o n o f g u i n e a p i g i l e u m . P e p t i d e P e p t i d e - i t n p - N F - H - i r C o - l o c a l i z a t i o n c e l l s / g a n g l i o n c e l l s / g a n g l i o n o f n e u r o p e p t i d e - ( c e l l s ; g a n g l i a ) ( c e l l s ; g a n g l i a ) a n d n p - N F - H - i r ( % n p - N F - H - i r c e l l s ) C G R P 1 . 6 : 0 . 1 l . 4 i 0 . l 0 % ( 1 , 6 3 7 ; 1 , 1 9 0 ) ( 8 5 0 ; 6 0 8 ) N O S 0 . 0 0 3 i 0 . 0 0 2 1 . 4 i 0 . 1 0 % ( 4 ; 9 5 7 ) ( 1 , 2 6 0 ; 9 0 0 ) N P Y 1 6 : 0 1 1 . 3 i 0 . 1 0 % ( 1 , 3 2 2 ; 8 7 9 ) ( 9 1 2 ; 6 7 1 ) S P 1 2 : 0 1 1 3 : 0 1 9 4 i 2 % ( 7 4 6 ; 6 6 1 ) ( 8 1 7 ; 6 6 1 ) V I P 3 . 5 i 0 . 2 1 . 3 i 0 . 1 0 % ( 4 , 3 0 8 ; 1 , 4 7 8 ) ( 1 , 5 7 4 ; 1 , 0 4 6 ) T a b l e 6 . N u m b e r o f p e p t i d e - a n d n o n p h o s p h o r y l a t e d N F - H - i r c e l l s i n m y e n t e r i c g a n g l i o n o f g u i n e a p i g i l e u m . P e p t i d e P e p t i d e - i r n p - N F - H - i r C o - l o c a l i z a t i o n c e l l s / g a n g l i o n c e l l s / g a n g l i o n o f n e u r o p e p t i d e - ( c e l l s ; g a n g l i a ) ( c e l l s ; g a n g l i a ) a n d n p - N F - H - i r ( % n p - N F - H - i r c e l l s ) C G R P 2 . 0 i 0 . 6 3 1 i 3 . 0 0 % 5 8 - ( 1 8 6 ; 1 3 5 ) ( 2 , 6 0 4 ; 8 4 ) N O S 1 0 i 1 . 7 3 0 i 3 . 0 2 9 i 5 % ( 1 , 2 5 6 ; 1 4 4 ) ( 1 , 5 7 4 ; 1 4 4 ) N P Y 1 . 1 i 0 . 3 3 5 i 3 . 4 0 % ( 2 1 6 ; 1 5 6 ) ( 1 , 7 8 4 ; 5 0 ) S P n o t c o u n t e d n o t c a l c u l a t e d V I P 3 . 0 i 0 . 3 3 1 i 1 . 8 1 0 i 3 % ( 7 4 0 ; 2 4 4 ) ( 4 , 6 5 2 ; 4 1 3 ) 1 6 2 F i g u r e 1 6 . N o n p h o s p h o r y l a t e d h e a v y m o l e c u l a r w e i g h t n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n - i m m u n o r e a c t i v i t y i n m y e n t e r i c n e r v e c e l l b o d i e s i n n o r m a l a n d d e n e r v a t e d i l e u m . A . n p N F - H - i r i s f o u n d i n m a n y n e u r o n s i n w h o l e m o u n t p r e p a r a t i o n s o f m y e n t e r i c p l e x u s f r o m n o r m a l i l e u m . B . n p N F - H - i r i s n o t a l t e r e d b y l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s o n e w e e k p r i o r t o e x p e r i m e n t . C . V I P - i r i n a s i n g l e m y e n t e r i c n e u r o n . D . N o n p h o s p h o r y l a t e d N F - H - i r i s l o c a l i z e d i n a n e u r o n w i t h V l P - i r ( a r r o w ) , a s w e l l a s n e u r o n s w i t h o u t V I P - i r . E . N O S - i r m y e n t e r i c n e u r o n s . F . N o n p h o s p h o r y l a t e d N F - H - i r i s l o c a l i z e d i n n e u r o n s w i t h N O S - i r ( a r r o w ) , a n d i n n e u r o n s t h a t d o n o t c o n t a i n N O S - i r . B a r i n G i s a p p r o x i m a t e l y 3 0 u m . s k r d u i s n - i x e l 3 r a 3 e y t p r s I a a c M d i d S n r n e t . o c a n w B e e o s y . f r m s o r e a d l s o n ; r i a e r e e b v l t r fi a r e s e a n o v l r c i r a u s e - m o n 3 3 b c d u u s m n I a M b t S u s n s e u v o r h m t e i n , w o r r e w c a l d i o e n h t o w a i i l n i c g o n . s n o r u y e . s a s g t n m a r i e p v n t c i i o n 0 t i i r 3 c t e a a r t y e v n i r r e - l o y e 3 e 3 t n m n a u n i I , m m l i m M l r a x i - n a S l t u o i . c n o r p e s t a C p t a o u v s . r i b a s p r r a e D , t y p b n fi n n e r a i m e i m - a 3 l 3 v r r n a e i fi B o l n d r M c e z . u i S i n e n l o n o a i . c l i t l A g o h g l n g a n . a s i g i m g e w u r r , e e i g r - l t a i n 3 ; i 3 n l l u c a d I r o m n u e M r e a l S o n o s m n n r . m D o i y - o r v u 3 r . 3 a e f s e n H s l x n M e u I . o a l S 7 i s p 1 t o e a y c t e r r r a u p u a a m i c g e b t i r d i u r n e F t i p s 1 6 4 . . : a s » ; 1 6 6 P h o s p h o r y l a t i o n I n d e p e n d e n t N F - H - i r I s F o u n d i n M y e n t e r i c P e r i k a r y a a n d N e r v e F i b e r s I n t h e m y e n t e r i c p l e x u s , p n p N F - H - i r w a s l o c a l i z e d i n i n t e r g a n g l i o n i c n e r v e s t r a n d s o f t h e p r i m a r y p l e x u s , a s w e l l a s i n s e c o n d a r y a n d t e r t i a r y p l e x u s e s ( F i g u r e 1 7 C ) , a n d n e r v e fi b e r s c l o s e l y a s s o c i a t e d w i t h c i r c u l a r m u s c l e . I n t e r e s t i n g l y , o t h e r i n v e s t i g a t o r s ( B r o o k e s e t a l . , 1 9 9 2 ) h a v e n o t o b s e r v e d N F - H - i r i n t h e t e r t i a r y m u s c l e p l e x u s , d e m o n s t r a t i n g v a r i a t i o n s i n l o c a l i z a t i o n o f n e u r o fi l a m e n t s p o s s i b l y d u e t o d i f f e r e n c e s i n a n t i b o d i e s . A l t h o u g h p n p N F - H - i r a p p e a r e d h o m o g e n o u s t h r o u g h o u t t h e n e r v e fi b e r s , s t r o n g p n p N F - H - i r w a s l o c a l i z e d a t t h e p e r i p h e r y o f t h e p r i m a r y p l e x u s a n d t h e n e r v e s t r a n d s o f t h e s e c o n d a r y p l e x u s . W i t h i n t h e m y e n t e r i c g a n g l i a , 3 6 i 4 n e u r o n s / g a n g l i o n ( 1 , 9 9 0 c e l l s , 1 3 0 g a n g l i a , 1 2 p r e p a r a t i o n s ) c o n t a i n e d p n p N F - H - i r . S i m i l a r t o n p N F - H - i r m y e n t e r i c c e l l s , t h e s e n e u r o n s w e r e l o c a t e d t h r o u g h o u t t h e g a n g l i o n , a n d p r o c e s s e s c o u l d b e o b s e r v e d i n s o m e c e l l s . A l t h o u g h t h e m a j o r i t y o f p n p N F - H - i r c e l l s c o n t a i n e d h o m o g e n o u s i m m u n o r e a c t i v i t y , a p p r o x i m a t e l y 2 5 % o f a l l c e l l s c o n t a i n e d fi l a m e n t o u s p n p N F - H - i r ( F i g u r e 1 7 D ) . 1 6 7 4 . N E W V A S C U L A R I N N E R V A T I O N R E S U L T S F R O M A X O N A L S P R O U T I N G I n t r o d u c t i o n a n d E x p e r i m e n t a l R a t i o n a l e A s d i s c u s s e d i n t h e i n t r o d u c t i o n , n u m e r o u s s t u d i e s h a v e r e v e a l e d t h a t t h e n e u r o fi l a m e n t t r i p l e t p r o t e i n s a r e c l o s e l y - r e g u l a t e d d u r i n g d e v e l o p m e n t , a s i n c o r p o r a t i o n o f N F - H a n d p h o s p h o r y l a t i o n o f N F - M a n d N F - H c o i n c i d e s w i t h m a t u r a t i o n o f a x o n s ( r e v i e w e d i n S h a w , 1 9 9 1 ) . F u r t h e r m o r e , d u r i n g r e g e n e r a t i o n o f p e r i p h e r a l n e r v e s , t h e p a t t e r n o f i n c o r p o r a t i o n a n d p h o s p h o r y l a t i o n o f N F - M a n d N F - H i s v e r y s i m i l a r t o t h e p a t t e r n e x p r e s s e d d u r i n g d e v e l o p m e n t ( S c h i l l i n g a n d P i l g r i m , 1 9 9 0 ) . S p e c i fi c a l l y , f e w K S P s e q u e n c e s i n N F - H a r e p h o s p h o r y l a t e d i n g r o w i n g a n d r e g e n e r a t i n g p e r i p h e r a l a x o n s ( r e v i e w e d i n S h a w , 1 9 9 1 ; S c h i l l i n g a n d P i l g r i m , 1 9 9 0 ; P e s t r o n k e t a l . , 1 9 9 0 ) . S i m i l a r r e s u l t s a r e o b s e r v e d i n d e v e l o p i n g a n d r e g e n e r a t i n g D R G n e u r o n s , a s i m m a t u r e a x o n s d o n o t c o n t a i n N F - H - i r , a l t h o u g h N F - H - i r i s f o u n d i n a d u l t a x o n s ( S h a w e t a l . , 1 9 8 1 ; r e v i e w e d i n S h a w , 1 9 9 1 ) . T h e r e f o r e , t h e s e r e s u l t s s u g g e s t i n c o r p o r a t i o n a n d p h o s p h o r y l a t i o n o f N F - H i s i n v o l v e d i n m a t u r a t i o n o f a x o n s ( s e e S h a w , 1 9 8 6 ) . I n t h e p r e v i o u s s e c t i o n , t r y p s i n a n d p h o s p h a t a s e w e r e u s e d t o d e m o n s t r a t e t h e s e l e c t i v e l y o f S M I 3 1 a n d S M I 3 2 f o r p h o s p h o r y l a t e d a n d n o n p h o s p h o r y l a t e d N F - H , r e s p e c t i v e l y . F u r t h e r r n o r e , c h a r a c t e r i z a t i o n o f S M I 3 1 a n d 3 2 r e v e a l e d m i c r o h e t e r o g e n i t y i n t h e d i s t r i b u t i o n o f p N F - H a n d n p N F - H , a s S M I 3 1 - i r w a s o n l y o b s e r v e d i n a x o n s ( a n d n u c l e i ) , w h e r e a s S M I 3 2 - i r w a s o n l y f o u n d i n n e u r o n c e l l b o d i e s . T h e s e s t u d i e s i n d i c a t e t h a t S M I 3 1 a n d S M I 3 2 m a y b e u s e d t o d e t e r m i n e i f s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n i n d u c e s a x o n a l s p r o u t i n g o f e n t e r i c S P o r V I P n e r v e fi b e r s , r e s u l t i n g i n n e w v a s c u l a r i n n e r v a t i o n . A s p r e v i o u s l y d i s c u s s e d , r e t r o g r a d e t r a c i n g s t u d i e s w i t h F g i n d i c a t e d t h a t e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n d i d n o t s t i m u l a t e a x o n a l s p r o u t i n g o f s u b m u c o s a l n e u r o n s . 1 6 8 T h e r e f o r e , i f a x o n a l s p r o u t i n g o c c u r s , t h e n t h e n e r v e fi b e r s m u s t o r i g i n a t e f r o m n e u r o n s i n m y e n t e r i c g a n g l i a . A l t h o u g h i t w a s i m p o s s i b l e t o t r a c e S P - o r V I P - i r m y e n t e r i c n e r v e s t o s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s i n t r a n s v e r s e s e c t i o n s o f i l e u m , i t w a s h y p o t h e s i z e d t h a t l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n i n d u c e s a x o n a l s p r o u t i n g o f m y e n t e r i c n e r v e s , r e s u l t i n g i n i n c r e a s e d d e n s i t y o f n e r v e s a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s . T h i s h y p o t h e s i s w a s t e s t e d u s i n g w h o l e m o u n t s u b m u c o s a l p r e p a r a t i o n s a n d i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y f o r n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n s . I f l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n i n d u c e d a x o n a l s p r o u t i n g o f m y e n t e r i c n e r v e fi b e r s c o n t a i n i n g S P o r V I P , t h e n p N F - H - i r s h o u l d n o t b e o b s e r v e d i n S P - o r V I P - i r n e r v e fi b e r s , N F - H i s n o t p h o s p h o r y l a t e d i n g r o w i n g a n d r e g e n e r a t i n g a x o n s ( s e e p r o c e e d i n g s e c t i o n ) . H o w e v e r , i f t h e S P - a n d V I P - i r n e r v e s a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s r e s u l t f r o m e i t h e r u p r e g u l a t i o n o r d e n o v a s y n t h e s i s o f S P o r V I P , t h e n t h e s e p r o - e x i s t i n g m a t u r e n e r v e fi b e r s s h o u l d c o n t a i n p N F - H - i r . T h e r e f o r e , i m m u n o h i s t o c h e m i c a l m e t h o d s f o r c o - l o c a l i z a t i o n o f S P o r V I P a n d S M I 3 1 o r S M I 3 2 w e r e u s e d t o d e t e r m i n e i f n e w S P - o r V I P - i r n e r v e fi b e r s o r i g i n a t e d f r o m m y e n t e r i c g a n g l i a . S u b s t a n c e P - I m m u n o r e a c t i v e V a s c u l a r N e r v e s A r e N e w A x o n s A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , m u l t i p l e p N F - H - i r n e r v e fi b e r s w e r e a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s i n n o r m a l i l e u m , a n d t h e m a j o r i t y o f t h e s e a x o n s w e r e d e s t r o y e d b y e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n . T h i s r e s u l t w a s n o t u n e x p e c t e d , a s e x t r i n s i c s e n s o r y a n d s y m p a t h e t i c n e r v e fi b e r s a n d i n t r i n s i c V I P - i r n e r v e fi b e r s c o n t a i n e d p N F - H . H o w e v e r , a l t h o u g h p N F - H - i r w a s o b s e r v e d i n e n t e r i c n e r v e fi b e r s i n i n t e r g a n g l i o n i c n e r v e s t r a n d s , f e w p N F - H - i r n e r v e fi b e r s w e r e a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s a f t e r s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , s u g g e s t i n g t h a t f e w i n t r i n s i c n e r v e fi b e r s a r e n o r m a l l y n o t a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s . T h i s o b s e r v a t i o n a r g u e s a g a i n s t t h e h y p o t h e s i s t h a t s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n i n c r e a s e s t h e c o n c e n t r a t i o n 1 6 9 o f S P a n d V I P i n i n t r i n s i c a x o n s p r e v i o u s l y a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s , a s i n t r i n s i c a x o n s w e r e n o t a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s . T h e r e f o r e , t h e h y p o t h e s i s o f d e n e r v a t i o n - i n d u c e d a x o n a l s p r o u t i n g w a s f u r t h e r i n v e s t i g a t e d b y e x a m i n i n g c o - l o c a l i z a t i o n o f N F - H - a n d S P - o r V I P - i r n e r v e s i n s u r g i c a l l y - d e n e r v a t e d p r e p a r a t i o n s . I n n o r m a l a n d c o n t r o l t i s s u e s , S P - ( F i g u r e s 1 8 A a n d 1 8 B ) a n d C G R P - i t ( d a t a n o t s h o w n ) n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s a l w a y s c o n t a i n e d s t r o n g p N F - H - i r . A s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d , t h e s e n e r v e fi b e r s a r e s e n s i t i v e t o c a p s a i c i n a n d r e p r e s e n t e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e s . F o u r w e e k s a f t e r s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , f a i n t , t h i n , n o n - v a r i c o s e S P - i r n e r v e fi b e r s d i d n o t c o n t a i n p N F - H - i r ( F i g u r e s 1 8 C a n d 1 8 D ) . H o w e v e r , p N F - H - i r w a s o b s e r v e d i n s u b m u c o s a l n u c l e i a n d i n t e r g a n g l i o n i c n e r v e s t r a n d s o f t h e s a m e p r e p a r a t i o n s , s u g g e s t i n g t h a t t h e l a c k o f p N F - H - i r i n n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s d i d n o t r e s u l t f r o m e x p e r i m e n t a l e r r o r , b u t a c t u a l r e p r e s e n t e d l o s s o f p N F - H - i r . T e n w e e k s a f t e r s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , S P - a n d p N F - H - i r w e r e c o - l o c a l i z e d i n s o m e p a r a v a s c u l a r n e r v e fi b e r s l o o s e l y a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s ( d a t a n o t s h o w n ) . H o w e v e r , m o s t S P - i r n e r v e fi b e r s d i d n o t c o n t a i n p N F - H - i r , a s n e r v e fi b e r s c l o s e l y a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s c o n t a i n e d S P - i r , b u t n o t p N F - H - i r . F i n a l l y , 2 4 - 2 6 w e e k s a f t e r s u r g i c a l d e n e r v a t i o n , s o m e S P - i r n e r v e s c o n t a i n e d p N F - H - i r ( d a t a n o t s h o w n ) . H o w e v e r , e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e fi b e r s c o n t a i n S P - i r . A s t h e s e n e r v e fi b e r s b e g i n t o r e t u r n 1 0 w e e k s a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , i t w a s d i f fi c u l t t o d e t e r m i n e i f S P - / p N F - H - i r n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s o r i g i n a t e d f r o m i n t r i n s i c o r e x t r i n s i c s o u r c e s . T h e r e f o r e , c o - l o c a l i z a t i o n o f p N F - H - i r ( S M I 3 1 ) a n d C G R P w e r e e x a m i n e d t o a t t e m p t t o i d e n t i f y t h e s o u r c e o f S P - i r n e r v e s . P r o c e e d i n g s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , S P - i r v a s c u l a r n e r v e fi b e r s d i d n o t F i g u r e 1 8 . C o - l o c a l i z a t i o n o f s u b s t a n c e P - a n d p h o s p h o r y l a t e d h e a v y m o l e c u l a r w e i g h t n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n - i m m u n o r e a c t i v i t y i n n e r v e fi b e r s i n s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m c o n t r o l a n d d e n e r v a t e d i l e u m . A . S P - i r p e r i v a s c u l a r n e r v e fi b e r s a r e a s s o c i a t e d w i t h a s u b m u c o s a l a r t e r i o l e i n n o r m a l i n t e s t i n e . B . p N F - H - i r i s c o - l o c a l i z e d w i t h S P i n n o r m a l v a s c u l a r i n n e r v a t i o n . S C . ' l ' e n w e e k s a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , m u l t i p l e S P - i r n e r v e s a r e a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s . D . C o - l o c a l i z a t i o n o f p N F - I l - i r 0 r e v e a l s s o m e S P - i r n e r v e s a r e p N F - H - i r . b v , a r t e r i o l e ; g , g a n g l i o n . B a r i n D i s a p p r o x i m a t e l y 5 0 p m . a : s a m e 1 7 2 n o t c o n t a i n C G R P - i r , a l t h o u g h e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e fi b e r s c o n t a i n S P - / C G R P - i r . T w e n t y - f o u r w e e k s a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , m a n y C G R P - i r n e r v e fi b e r s d i d n o t c o n t a i n p N F - H - i r ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e p a t t e r n o f l o c a l i z a t i o n o f C G R P - a n d p N F - H - i r i n d i c a t e t h a t r e g e n e r a t i n g s e n s o r y n e r v e fi b e r s d o n o t c o n t a i n p N F - H . H o w e v e r , o c c a s i o n a l n e r v e fi b e r s c o - l o c a l i z e d C G R P - a n d p N F - H - i r , s u g g e s t i n g t h a t e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e fi b e r s d o n o t c o n t a i n p N F - H - i r d u r i n g r e g e n e r a t i o n , b u t i n c o r p o r a t e a n d p h o s p h o r y l a t e N F - H a f t e r s t a b i l i z a t i o n o r m a t u r a t i o n . T h e r e f o r e , a f t e r s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , s u b m u c o s a l p r e p a r a t i o n s c o n t a i n m a t u r e ( C G R P - l e F - H - i r ) a n d r e g r o w i n g ( C G R P - / b u t n o t p N F - H - i r ) n e r v e fi b e r s , t h u s a c c o u n t i n g f o r o b s e r v e d d i f f e r e n c e s i n c o - l o c a l i z a t i o n o f C G R P a n d p N F - H . S i m i l a r l y S P - / p N F - H - i r n e r v e s m a y r e p r e s e n t m a t u r e e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e fi b e r s , s u c h a s t h o s e a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s . A l t e r n a t i v e l y , S P - / p N F - H - i r n e r v e s m a y i n d i c a t e m a t u r e i n t r i n s i c n e r v e fi b e r s i n s u b m u c o s a l g a n g l i a a n d i n t e r g a n g l i o n i c n e r v e s t r a n d s . N e w S u b s t a n c e P - I m m u n o r e a c t i v e N e r v e s L a c k N F - H C o - l o c a l i z a t i o n s t u d i e s w i t h a n t i s e r u m a g a i n s t N F - H a n d S P i n d i c a t e d t h a t m a n y S P - i r n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s d o n o t c o n t a i n p N F - H - i r a f t e r e x t r i n s i c s u r g i c a l d e n e r v a t i o n . H o w e v e r , t h e s e s t u d i e s w e r e i n c o n c l u s i v e , a s t h e y w e r e u n a b l e t o d e t e r m i n e i f t h e a b s e n c e o f p N F - H - i r r e s u l t e d f r o m d i s r u p t i o n o f a p h o s p h o r y l a t e d e p i t o p e n e c e s s a r y f o r a n t i g e n i c i t y , o r i f S P - i r n e r v e fi b e r s d i d n o t c o n t a i n h e a v y m o l e c u l a r w e i g h t n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n . T o d i s t i n g u i s h b e t w e e n t h e s e p o s s i b i l i t i e s , S M I 3 2 w a s u s e d . P r e v i o u s c h a r a c t e r i z a t i o n o f S M I 3 2 r e v e a l e d t h a t t h e a n t i b o d y r e c o g n i z e s a n o n p h o s p h o r y l a t e d e p i t o p e o n N F - H p r o t e i n . I f t h e a b s e n c e o f p N F - H - i r r e s u l t e d f r o m d e p h o s p h o r y l a t i o n a f t e r s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , t h e n S M I 3 2 s h o u l d 1 7 3 r e c o g n i z e n e r v e fi b e r s c o n t a i n i n g S P . H o w e v e r , i f t h e a b s e n c e o f p N F - H - i r r e s u l t e d f r o m l o s s o f t h e N F - H s u b u n i t , t h e n S P - i r n e r v e fi b e r s s h o u l d n o t c o n t a i n n p N F - H - i r . I n p r e p a r a t i o n s m a d e f r o m n o r m a l a n d c o n t r o l t i s s u e s , S M I 3 2 b i n d i n g w a s o b s e r v e d i n S P - i r n e r v e c e l l b o d i e s i n s u b m u c o s a l g a n g l i a , b u t n o t i n p a r a v a s c u l a r o r p e r i v a s c u l a r i n n e r v a t i o n a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s ( F i g u r e 1 5 ) . O n e a n d f o u r w e e k s a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , s o m a t a o f s o m e s u b m u c o s a l n e u r o n s c o n t a i n e d n p N F - H - i r ; f e w n p N F - H - i r n e r v e fi b e r s w e r e o b s e r v e d i n p r e p a r a t i o n s f r o m d e n e r v a t e d s e g m e n t s o f i l e u m F i g u r e s 1 9 A a n d 1 9 8 ) . H o w e v e r , o c c a s i o n a l fi b e r - l i k e s t r u c t u r e s w e r e o b s e r v e d , a n d t h e s e s t r u c t u r e s w e r e n o t a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s o r g a n g l i a ( F i g u r e 1 9 C ) . T h e s e fi b e r s c o u l d b e f o l l o w e d f o r 3 0 0 - 5 0 0 u m , a n d c o n t a i n e d o c c a s i o n a l o v a l s w e l l i n g s , c o n s i s t e n t w i t h r e t r a c t i n g o r d y i n g a x o n s . T h e r e f o r e , t h e o n l y n p N F - H - i r n e r v e fi b e r s w e r e o b s e r v e d e a r l y a f t e r d e n e r v a t i o n , a n d w e r e l i k e l y t o r e p r e s e n t d y i n g e x t r i n s i c n e r v e s . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b t a i n e d w i t h a m o n o c l o n a l a n t i b o d y r a i s e d a g a i n s t p n p N F - H - i r ( S M I 3 3 ) , a s n e r v e fi b e r s w e r e n o t o b s e r v e d a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n . H o w e v e r , t h e a b s e n c e o f n p N F - H - i r a n d p n p N F - H - i r n e r v e fi b e r s s t r o n g l y s u g g e s t s t h a t t h e a b s e n c e o f p N F - H - i r ( S M I 3 1 ) r e s u l t e d f r o m t h e a b s e n c e o f N F - H i n t h e n e u r o fi l a m e n t t r i p l e t a s s e m b l y , a n d n o t d e p h o s p h o r y l a t i o n o f K S P s e q u e n c e s . V a s o a c t i v e I n t e s t i n a l P o l y p e p t i d e - I m m u n o r e a c t i v e V a s c u l a r N e r v e s a r e N e w A x o n s C o - l o c a l i z a t i o n s t u d i e s w e r e p e r f o r m e d o n t i s s u e s f r o m e x t r i n s i c a l l y - d e n e r v a t e d s e g m e n t s o f i l e u m t o d e t e r m i n e i f d e n e r v a t i o n - i n d u c e d a l t e r a t i o n s o f V I P - i r n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s r e s u l t e d f r o m a x o n a l s p r o u t i n g o f m y e n t e r i c g a n g l i a . A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , V I P - i r a n d p N F - H - i r w e r e c o - l o c a l i z e d i n s p a r s e , t h i n n e r v e s a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s i n n o r m a l a n d c o n t r o l p r e p a r a t i o n s . H o w e v e r , f o u r 1 7 4 F i g u r e 1 9 . N o n p h o s p h o r y l a t e d h e a v y m o l e c u l a r w e i g h t n e u r o fi l a r n e n t - p r o t e i n i r n m u n o - r e a c t i v i t y i n s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m d e n e r v a t e d i l e u m . A . S P - i r i s f o u n d i n p a r a v a s c u l a r n e r v e s o n e w e e k a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n . B . n p N F - H - i r i s n o t o b s e r v e d i n v a s c u l a r i n n e r v a t i o n . C . S M I 3 2 - i r n e r v e fi b e r - l i k e s t r u c t u r e s a r e l o c a l i z e d 7 w e e k s a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n . A r r o w s i n C i n d i c a t e n e r v e fi b e r - l i k e s t r u c t u r e . g , g a n g l i o n . C a l i b r a t i o n b a r i n C i s a p p r o x i m a t e l y 4 0 u m . - s r . n r r i i e i - e — b P t P fi l o l V r V p e v e h t r t m n e i o e n w s m r a a d n e i l l z fi u d i o c l e r s a v u r a c e e v o n s a l r - t a o h p c b o s g i r e i i b e r - w o P i r l - t a d V H l e - u v F . c r N A e e p l s . o b . m m o u D y t e l . v o i y a l n e s s d h e u i t o d i a r e v i v t - e r a H r e l n - p y e F r d N s k o h m p e p o e s w r . B o f h p . s n t d o n n e e t x n i e i a . t m s a i m - r e a d p r d p e e i 0 p t e x a t r 5 p p e v e o y r p s e t l y u n l x r e e t o e d o p l i a r e m l i p l p a o n s l i x o i a r t e s k r s t p e e r e p o t c a w a n u i n s m 4 a i e b v u d h i e D s t t t i c a n n a v i i w o r d s r s e e a n t r a v a e B e b d i f fi c o , s o n n s e e o v o s l o i i r i a t r e t n a e s a z r r t i a e n r i a l p b a fi e y , c r t v o p e i b l v - r v l o e a . i C s n s t c o r . a r c e 0 e i b 2 u r - fi e o m P r e n l b u v u u V g r m s i m n . e F i i C n 1 7 6 . o m 2 % : 1 7 8 w e e k s a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , t h e d e n s i t y o f V I P - i r n e r v e fi b e r s i n c r e a s e d , a n d p N F - H - i r w a s n o t o b s e r v e d i n m o s t V I P - i r n e r v e fi b e r s ( F i g u r e s 2 0 A a n d 2 0 B ) . H o w e v e r , r a r e V I P - i r n e r v e fi b e r s c o n t a i n e d p N F - H - i r , a n d w e r e l i k e l y t o r e p r e s e n t V I P - i r n e r v e fi b e r s o b s e r v e d i n n o r m a l i l e u m . T e n w e e k s a f t e r l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e fi b e r s , m o s t V I P - i r p a r a v a s c u l a r a n d p e r i v a s c u l a r n e r v e fi b e r s d i d n o t c o n t a i n d e t e c t a b l e p N F - H - i r . S i x t e e n ( F i g u r e s 2 0 C a n d 2 0 D ) a n d t w e n t y - f o u r w e e k s a f t e r d e n e r v a t i o n , s o m e V I P - i r n e r v e fi b e r s d i d n o t c o n t a i n p N F - H - i r , s i m i l a r t o t h e r e s u l t s o b s e r v e d w i t h S P - i r v a s c u l a r n e r v e s . F i n a l l y , a l t h o u g h V I P - i r p a r a v a s c u l a r n e r v e fi b e r s i n c o n t a c t w i t h a r t e r i o l e s d i d n o t c o n t a i n p N F - H - i r , s o m e n e r v e fi b e r s t h a t w e r e f o u n d 3 0 - 5 0 p m f r o m t h e a r t e r i o l e s c o n t a i n e d p N F - H - i r a n d V I P - i r ( F i g u r e s 2 0 C a n d 2 0 D ) . T h e r e f o r e , t h e s e d a t a s u g g e s t t h a t e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n i n d u c e s a x o n a l s p r o u t i n g i n m y e n t e r i c n e u r o n s , c u l m i n a t i n g i n n e w S P - a n d V l P - i r n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s . N e w V a s o a c t i v e I n t e s t i n a l P o l y p e p t i d e N e r v e s L a c k N F - H A s p N F - H - i r w a s n o t o b s e r v e d i n m a n y V I P - i r n e r v e fi b e r s , S M ] 3 2 a n d S M I 3 3 w e r e u s e d t o d e t e r m i n e i f t h e a b s e n c e o f p N F - H - i r r e s u l t e d f r o m a n a b s e n c e o f N F - H p r o t e i n o r f r o m d e p h o s p h o r y l a t i o n o f K S P s e q u e n c e s . F o u r , t e n , a n d s i x t e e n w e e k s a f t e r s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , n p N F - H - a n d p n p N F - H - i r w e r e n o t o b s e r v e d i n n e r v e fi b e r s i n s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s ( d a t a n o t s h o w n ) , i n d i c a t i n g a s w i t h S P - i r n e r v e fi b e r s , t h e l a c k o f p N F - H - i r r e s u l t e d f r o m t h e a b s e n c e o f N F - H , a n d n o t f r o m c h a n g e s i n t h e p h o s p h o r y l a t i o n s t a t u s o f N F - H . 1 7 9 N e w S u b s t a n c e P - I m m u n o r e a c t i v e V a s c u l a r N e r v e s R e s u l t f r o m L o s s o f E x t r i n s i c S e n s o r y I n n e r v a t i o n S u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n a l t e r s i n n e r v a t i o n o f s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s a n d r e g u l a t i o n o f n e u r o g e n i c v a s o d i l a t i o n ( G a l l i g a n e t a l . , 1 9 9 0 ) , a n d a x o n a l s p r o u t i n g o f m y e n t e r i c n e u r o n s a p p e a r s t o b e o n e m e c h a n i s m b y w h i c h n e w S P - o r V I P - i r v a s c u l a r n e r v e s a p p e a r . H o w e v e r , t h e s t i m u l u s f o r i n d u c t i o n o f a l t e r a t i o n s i n i n n e r v a t i o n o f G I m i c r o v a s c u l a t u r e a r e u n k n o w n . T o b e g i n t o a d d r e s s t h i s q u e s t i o n , a n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h 6 - O H - D A o r c a p s a i c i n t o s e l e c t i v e l y e l i m i n a t e a s i n g l e p o p u l a t i o n o f e x t r i n s i c n e r v e s . S u b s t a n c e P - a n d V I P - i r n e r v e fi b e r s w e r e t h e n e x a m i n e d t o d e t e r m i n e i f 1 0 5 5 o f a s i n g l e p o p u l a t i o n o f n e r v e fi b e r s w a s s u f fi c i e n t s t i m u l u s t o a l t e r i n n e r v a t i o n a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s . F o l l o w i n g n e u r o t o x i n - a n d v e h i c l e - t r e a t m e n t , a n i m a l s w e r e a l l o w e d t o r e c o v e r l o r 4 w e e k s f o r 6 - O H - D A , o r 1 o r 9 w e e k s f o r c a p s a i c i n . O n e w e e k a f t e r 6 - O H - D A t r e a t m e n t , g l y o x y l i c a c i d - i n d u c e d fl u o r e s c e n t n e r v e s w e r e n o t o b s e r v e d , a l t h o u g h o c c a s i o n a l p a t c h e s o f c a t e c h o l a m i n e fl u o r e s c e n c e w a s o b s e r v e d . A s n e r v e fi b e r s w e r e n o t c l e a r l y v i s i b l e , t h e s e a r e a s o f c a t e c h o l a m i n e s m a y h a v e b e e n d e g e n e r a t i n g s y m p a t h e t i c n e r v e fi b e r s . I m m u n o h i s t o c h e m i s t r y f o r S P a n d C G R P r e v e a l e d S P - i r s u b m u c o s a l g a n g l i o n i c n e u r o n s a n d S P - / C G R P - i r n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s s i m i l a r t o t h o s e o b s e r v e d i n p r e p a r a t i o n s f r o m v e h i c l e - t r e a t e d a n i m a l s . S u b s t a n c e P - i r n e r v e fi b e r s w i t h o u t C G R P - i r w e r e n o t o b s e r v e d 1 o r 4 w e e k s a f t e r s y m p a t h e c t o m y ( d a t a n o t s h o w n ) , s u g g e s t i n g t h a t t h e a p p e a r a n c e o f S P - i r n e r v e fi b e r s a f t e r s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n m a y n o t h a v e r e s u l t e d f r o m l o s s o f s y m p a t h e t i c n e r v e fi b e r s . L a t e r t i m e p o i n t s i n 6 - O H - D A t r e a t e d a n i m a l s c o u l d n o t b e e x a m i n e d , a s a d m i n i s t r a t i o n o f 6 - O H - D A , b u t n o t t h e v e h i c l e , r e s u l t e d i n s k i n l e s i o n s a t t h e s i t e o f i n j e c t i o n , r e q u i r i n g a n i m a l s F i g u r e 2 1 . C o - l o c a l i z a t i o n o f s u b s t a n c e P - a n d c a l c i t o n i n g e n e - r e l a t e d p e p t i d e - i m m u n o r e a c t i v i t y i n s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m i l e u m t a k e n f r o m a n i m a l s t r e a t e d w i t h c a p s a i c i n o r f r o m s u r g i c a l l y - d e n e r v a t e d s e g m e n t s . A . S P - i r n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h a n a r t e r i o l e 9 w e e k s a f t e r c a p s a i c i n - t r e a t m e n t . B . N e r v e fi b e r s i n C d o n o t c o n t a i n C G R P - i r . a r e a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s o n e w e e k a f t e r s y s t e m i c c a p s a i c i n t r e a t m e n t . C . S P - i r n e r v e fi b e r s a r e f o u n d a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s 2 6 w e e k s a f t e r s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n . D . C G R P c o - l o c a l i z e s w i t h S P - i r i n C , s u g g e s t i n g t h a t p r i m a r y a f f e r e n t i n n e r v a t i o n h a s r e t u r n e d t o t h e d e n e r v a t e d s e g m e n t , a l t h o u g h t h e n u m b e r o f p r i m a r y a f f e r e n t n e r v e fi b e r s i s r e d u c e d c o m p a r e d t o c o n t r o l s . b v , a r t e r i o l e ; g , g a n g l i o n . B a r i n D i s a p p r o x i m a t e l y 4 0 u m . N o t e t h a t t h e fl u o r o p h o r e i n A a n d D a r e F I T C , w h e r e a s T e x a s R e d c o n j u g a t e d s e c o n d a r y a n t i b o d i e s w e r e u s e d i n B a n d C . 1 8 0 I I m o . _ m 8 2 3 ; l 0 0 1 < 1 8 2 t o b e u s e d a t e a r l y t i m e s a f t e r d e n e r v a t i o n . O n e w e e k a f t e r c a p s a i c i n t r e a t m e n t , S P - l C G R P - i r o r S P - / w i t h o u t C G R P - i r n e r v e fi b e r s w e r e n o t o b s e r v e d t o b e a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s ( d a t a n o t s h o w n ) . H o w e v e r , b y 9 w e e k s a f t e r a d m i n i s t r a t i o n o f c a p s a i c i n , f a i n t , t h i n , n o n - v a r i c o s e S P - i r n e r v e s w i t h o u t C G R P - i r w e r e a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s s i m i l a r t o S P - i r n e r v e fi b e r s o b s e r v e d a f t e r s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n ( F i g u r e s 2 1 A a n d 2 1 B ) . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t l o s s o f e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e fi b e r s , b u t n o t s y m p a t h e t i c n e r v e fi b e r s , i s r e s p o n s i b l e f o r i n i t i a t i n g c e l l u l a r e v e n t s t h a t r e s u l t i n n e w S P - i r v a s c u l a r i n n e r v a t i o n . F i n a l l y , t h e s e r e s u l t s f u r t h e r s u p p o r t t h e c o n c l u s i o n t h a t i n c r e a s e d S P - i r n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s r e s u l t s f r o m l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n , a n d n o t f r o m d i r e c t o r i n d i r e c t a l t e r a t i o n s d u e t o s u r g i c a l t r a u m a . N e w V a s o a c t i v e I n t e s t i n a l P o l y p e p t i d e - 1 m m u n o r e a c t i v e V a s c u l a r N e r v e s R e s u l t F r o m L o s s o f S y m p a t h e t i c I n n e r v a t i o n O n e w e e k a f t e r t r e a t m e n t o f a n i m a l s w i t h c a p s a i c i n , s t r o n g V I P - i r w a s o b s e r v e d i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c g a n g l i a , a s b r i g h t n e u r o n s a n d n e r v e fi b e r s w e r e e a s i l y l o c a t e d . H o w e v e r , m u l t i p l e V I P - i r n e r v e fi b e r s w e r e n o t o b s e r v e d t o a s s o c i a t e w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s ( F i g u r e 2 2 A ) . F o u r w e e k s a f t e r s y m p a t h e c t o m y , b r i g h t V I P - i r n e r v e fi b e r s w e r e a s s o c i a t e d w i t h s o m e a r t e r i o l e s , a n d m u l t i p l e V I P - i r p a r a v a s c u l a r n e r v e fi b e r s w e r e o b s e r v e d ( F i g u r e 2 2 B ) . F e w V I P - i r n e r v e fi b e r s w e r e f o u n d t o b e a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s i n v e h i c l e - t r e a t e d a n i m a l s ( F i g u r e 2 2 C ) , s u g g e s t i n g t h a t l o s s o f s y m p a t h e t i c n e r v e s d u r i n g e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n i n d u c e d a l t e r a t i o n s i n V I P - i r i n n e r v a t i o n o f s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s . O n e w e e k a f t e r c a p s a i c i n t r e a t m e n t , V I P - i r w a s o b s e r v e d i n s u b m u c o s a l n e u r o n s , 1 8 3 a n d o c c a s i o n a l t h i n , s h o r t s m o o t h o r v a r i c o s e n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s . T h e p a t t e r n a n d d i s t r i b u t i o n o f V I P - i r w a s s i m i l a r t o t h a t i n p r e p a r a t i o n s m a d e f r o m n o r m a l o r v e h i c l e - t r e a t e d a n i m a l s . F i n a l l y , n i n e w e e k s a f t e r c a p s a i c i n a d m i n i s t r a t i o n , s u b m u c o s a l n e u r o n s a n d o c c a s i o n a l p a r a v a s c u l a r n e r v e fi b e r s c o n t a i n e d V I P - i r ( d a t a n o t s h o w n ) . H o w e v e r , t h e r e w a s n e i t h e r q u a l i t a t i v e n o r q u a n t i t a t i v e e v i d e n c e t o s u g g e s t t h a t l o s s o f p r i m a r y a f f e r e n t n e r v e s i n c r e a s e d V I P - i r i n s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s . T h e s e o b s e r v a t i o n s i n d i c a t e t h a t l o s s o f s y m p a t h e t i c , b u t n o t s e n s o r y n e r v e s , i s r e s p o n s i b l e f o r i n c r e a s e d V I P - i r v a s c u l a r i n n e r v a t i o n f o l l o w i n g 1 0 5 5 o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n . 1 8 4 F i g u r e 2 2 . V a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p o l y p e p t i d e - i m m u n o r e a c t i v i t y i n s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m i l e u m t a k e n f r o m a n i m a l s t r e a t e d w i t h 6 - h y d r o x y - d o p a m i n e . A . F e w V I P - i r n e r v e s a r e a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s 1 w e e k a f t e r 6 - O H - D A t r e a t m e n t . B . M u l t i p l e V I P - i r p a r a v a s c u l a r n e r v e fi b e r s a r e a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s 4 w e e k s a f t e r 6 - O H - D A t r e a t m e n t . C . V I P - i r i n v e h i c l e - t r e a t e d c o n t r o l s a p p e a r s s i m i l a r t o V I P - i r i n n o r m a l p r e p a r a t i o n s . b v , a r t e r i o l e ; g , s u b m u c o s a l g a n g l i o n . B a r i n C i s a p p r o x i m a t e l y 3 0 u m . 1 8 5 F i g u r e 2 2 . M I C H I G A N S T A T E U N I V . L I B R Q R I E S i l l W i l l i i l l " I i i “ i i i i l i l l i l l l l i l l i i l l H I 3 1 2 9 3 0 1 4 1 1 0 5 4 2 . x . 4 “ : a a ' u a ‘ - . ‘ . A . . ‘ " - ‘ “ ; 5 ' 6 “ 5 ‘ 1 " “ x 4 " ‘ . » . J " . Y ~ £ 5 1 “ . fi fi { 1 5 “ M A fi t L I ? ! , . l ' L . “ ‘ A ' ‘ 2 “ : : 1 ” ~ ‘ : 3 V , . . , 1 ” . I » . f ‘ r . ’ 3 4 v - r . “ . A n . 1 . . . . U ~ . v . ‘ 3 5 : ! W W 11/le W O W M L c U h n I i i B g v R a e r A s n R i S Y i t y E a t e ! M i A N A T O M I C A L A N D F U N C T I O N A L A L T E R A T I O N S I N E N T E R I C N E U R O N S F O L L O W I N G E X T R I N S I C D E N E R V A T I O N O F G U I N E A P I G I L E U M V o l u m e I I B y A n n e M a r i e R . Y u n k e r A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y D e p a r t m e n t o f P h a r m a c o l o g y a n d T o x i c o l o g y a n d N e u r o s c i e n c e P r o g r a m 1 9 9 5 1 8 6 5 . E X T R I N S I C D E N E R V A T I O N I N C R E A S E S N I T R I C O X I D E S Y N T H A S E - I M M U N O R E A C T I V I T Y I N M Y E N T E R I C N E U R O N S I n t r o d u c t i o n a n d E x p e r i m e n t a l R a t i o n a l e N e u r o g e n i c r e l a x a t i o n o f a r t e r i o l e s i s m e d i a t e d a t l e a s t i n p a r t b y e n d o t h e l i u m d e r i v e d r e l a x i n g f a c t o r ( E D R F ) . A l t h o u g h s o m e c o n t r o v e r s y e x i s t s a s t o t h e c h e m i c a l i d e n t i t y o f E D R F , t h e m o l e c u l e i s c l o s e l y r e l a t e d t o N O . A s l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n r e s u l t s i n p r o f o u n d a n a t o m i c a l a n d f u n c t i o n a l c h a n g e s i n r e g u l a t i o n o f n e u r o g e n i c v a s o d i l a t i o n , i t w a s h y p o t h e s i z e d t h a t s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n w o u l d a l t e r N O S i n n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s . A s a n t i s e r u m a g a i n s t N O S w a s n o t a v a i l a b l e , N A D P H d i a p h o r a s e h i s t o c h e m i s t r y w a s u s e d a s a m e a s u r e o f N O S - i r i n s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s i n n o r m a l , c o n t r o l , a n d s u r g i c a l l y - d e n e r v a t e d p r e p a r a t i o n s . E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n D o e s N o t A l t e r N A D P H D i a p h o r a s e S t a i n i n g i n t h e S u b m u c o s a l P l e x u s F e w s t r u c t u r e s c o n t a i n e d N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g i n p r e p a r a t i o n s m a d e f r o m n o r m a l s u b m u c o s a l p l e x u s , f o r o n l y 0 . 0 0 2 t 0 . 0 0 2 n e u r o n s / s u b m u c o s a l g a n g l i o n ( 3 n e u r o n s , 1 2 5 4 s u b m u c o s a l g a n g l i a ) c o n t a i n e d f o r m a z a n p r e c i p i t a t e , a n d n e r v e fi b e r s w e r e n o t o b s e r v e d t o c o n t a i n N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g ( F i g u r e 2 3 A ) . D a r k s t a i n i n g w a s o b s e r v e d w i t h i n o c c a s i o n a l m u c o s a l c r y p t s t h a t h a d n o t b e e n d i s s e c t e d a w a y f r o m t h e s u b m u c o s a l p l e x u s , i n d i c a t i n g t h a t e p i t h e l i a l c e l l s c o n t a i n e d N A D P H d i a p h o r a s e a c t i v i t y . F i n a l l y , d a r k a n d p u n c t a t e s t a i n i n g w a s f o u n d w i t h i n a r t e r i o l e s , a s e n d o t h e l i a l c e l l s c o n t a i n e d N A D P H d i a p h o r a s e r e s p e c t i v e l y . C a p a c i t a n c e v e s s e l s w e r e n o t s t a i n e d . O n e w e e k a f t e r s u r g i c a l e l i m i n a t i o n o f e x t r i n s i c n e r v e s , N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g w a s o b s e r v e d i n e n d o t h e l i a l c e l l s a n d m u c o s a l c r y p t s , b u t n o t i n i n t e r g a n g l i o n i c 1 8 7 n e r v e s , o r i n n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e n u m b e r o f N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n e d s u b m u c o s a l n e u r o n s w a s n o t a l t e r e d , a s 0 . 0 0 2 i 0 . 0 0 1 N A D P H d i a p h o r a s e p o s i t i v e n e u r o n s / s u b m u c o s a l g a n g l i o n ( 2 n e u r o n s , 8 7 1 s u b m u c o s a l g a n g l i a ) w e r e o b s e r v e d i n c o n t r o l t i s s u e s , w h e r e a s 0 . 0 0 1 i 0 . 0 0 1 n e u r o n s / s u b m u c o s a l g a n g l i o n i n d e n e r v a t e d p r e p a r a t i o n s c o n t a i n e d N A D P H d i a p h o r a s e ( 1 n e u r o n , 9 6 3 s u b m u c o s a l g a n g l i a ) . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b t a i n e d 4 , 8 , a n d 1 6 w e e k s a f t e r l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n ( d a t a n o t s h o w n ) , i n d i c a t i n g t h a t l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s d o e s n o t i n c r e a s e N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g i n s u b m u c o s a l n e r v e s . E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n I n c r e a s e s M y e n t e r i c N A D P H D i a p h o r a s e S t a i n i n g A l t h o u g h e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n d i d n o t a l t e r N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g i n t h e s u b m u c o s a l p l e x u s , m y e n t e r i c p l e x u s - l o n g i t u d i n a l m u s c l e p r e p a r a t i o n s w e r e p r o c e s s e d s i m u l t a n e o u s l y w i t h s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s t o v e r i f y t h a t N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g o c c u r r e d . S u b p o p u l a t i o n s o f m y e n t e r i c n e u r o n s i n n o r m a l g u i n e a i l e u m a r e k n o w n t o c o n t a i n N A D P H d i a p h o r a s e ( G e r s h o n a n d K i r c h g e s s n e r , 1 9 8 6 ; Y o u n g e t a l . , 1 9 9 2 ) , t h e r e b y a l l o w i n g a p o s i t i v e c o n t r o l f o r N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g . I n n o r m a l m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s , 9 . 6 i 1 . 2 n e u r o n s / g a n g l i a ( 2 9 4 2 c e l l s , 3 1 4 g a n g l i a ) s t a i n e d f o r N A D P H d i a p h o r a s e . T h e s e c e l l s w e r e c l a s s i fi e d i n t o t w o m o r p h o l o g i e s ( F i g u r e 2 3 ) : 1 6 : t 3 % o f s t a i n e d n e u r o n s w e r e 3 5 - 4 5 p m i n t h e l o n g a x i s , w i t h l a m e l l a r d e n d r i t e s a n d a s i n g l e a x o n . T h e s e c e l l s w e r e d a r k l y s t a i n e d , f r e q u e n t l y l o c a t e d a t t h e p e r i p h e r y o f g a n g l i a , a n d w e r e c l a s s i fi e d a s D o g i e l t y p e I c e l l s . T h e r e m a i n d e r o f t h e n e u r o n s w e r e 1 0 - 2 9 p m i n t h e l o n g a x i s , l i g h t l y s t a i n e d , a n d l o c a t e d i n t h e i n t e r i o r o f g a n g l i a . T h e p r o c e s s e s o f t h e s e c e l l s w e r e f r e q u e n t l y n o t v i s i b l e , b u t s o m e l a m e l l a r d e n d r i t e s w e r e o b s e r v e d . 1 8 8 F i g u r e 2 3 . N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g i n w h o l e m o u n t m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l a n d d e n e r v a t e d i l e u m . A . M y e n t e r i c g a n g l i o n f r o m n o r m a l i l e u m p r o c e s s e d f o r N A D P H d i a p h o r a s e h i s t o c h e m i s t r y . L a r g e , d a r k l y s t a i n e d c e l l s ( a r r o w ) , a n d s m a l l , m o r e l i g h t l y s t a i n e d c e l l s a r e p r e s e n t . B . O n e w e e k a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , t h e n u m b e r o f c e l l s s t a i n e d f o r N A D P H d i a p h o r a s e i n c r e a s e d . L a r g e , d a r k l y s t a i n e d n e u r o n s ( a r r o w ) a n d s m a l l n e u r o n s a r e p r e s e n t . C a l i b r a t i o n b a r i n B i s 4 5 u m . 1 8 9 F i g u r e 2 3 . l “ ‘ 1 7 l l . i 1 9 0 T h e s e t w o c l a s s e s o f N A D P H d i a p h o r a s e - s t a i n e d n e u r o n s m a y r e p r e s e n t m o t o r n e u r o n s a n d i n t e m e u r o n s , r e s p e c t i v e l y ( Y o u n g e t a l . , 1 9 9 2 ; s e e i n t r o d u c t i o n ) . F i n a l l y , n e r v e b u n d l e s i n p r i m a r y a n d s e c o n d a r y p l e x u s e s c o n t a i n e d d a r k N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g , a n d l i t t l e s t a i n i n g w a s o b s e r v e d i n t h e t e r t i a r y p l e x u s . T i s s u e s fi x e d i n Z a m b o n i ’ s s o l u t i o n d i d n o t e x h i b i t s t a i n i n g . O n e w e e k a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n t h e n u m b e r o f N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n e d c e l l s i n m y e n t e r i c g a n g l i a w a s i n c r e a s e d a s c o m p a r e d t o a n i m a l m a t c h e d c o n t r o l s ( F i g u r e 2 3 ) . A n a v e r a g e o f 1 5 . 9 i 1 . 7 s t a i n e d n e u r o n s / m y e n t e r i c g a n g l i o n ( 3 3 5 1 n e u r o n s , 2 1 6 g a n g l i a ) w e r e i n t h e d e n e r v a t e d r e g i o n , w h e r e a s c o n t r o l s e g m e n t s f r o m t h e s a m e a n i m a l s c o n t a i n e d 6 . 0 i 1 . 0 n e u r o n s / g a n g l i o n ( 1 5 9 7 n e u r o n s , 2 9 8 g a n g l i a ) ( F i g u r e 2 4 ) . T h e p r o p o r t i o n o f l a r g e , d a r k l y - s t a i n e d n e u r o n s t o t h a t o f l i g h t l y s t a i n e d n e u r o n s w a s n o t a l t e r e d b y d e n e r v a t i o n ( 1 6 : 8 3 i 2 % ) a s c o m p a r e d t o c o n t r o l s ( 1 8 : 8 1 i 2 % ) , a l t h o u g h d e n e r v a t e d p r e p a r a t i o n s w e r e m o r e d a r k l y s t a i n e d . T h e n u m b e r o f N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n e d m y e n t e r i c n e u r o n s / g a n g l i o n f r o m s h a m - o p e r a t e d a n i m a l s ( 9 . 9 i 0 . 7 , 8 3 1 n e u r o n s , 8 7 g a n g l i a , 4 p r e p a r a t i o n s , 2 a n i m a l s ) w a s n o t d i f f e r e n t f r o m a n i m a l - m a t c h e d c o n t r o l s ( 1 0 . 0 i 0 . 5 , 1 7 7 2 n e u r o n s , 1 7 7 g a n g l i a ) ( F i g u r e 2 4 ) , i n d i c a t i n g t h a t s u r g i c a l t r a u m a a n d h a n d l i n g o f t h e i l e u m d i d n o t i n c r e a s e N A D P H d i a p h o r a s e . T h e n u m b e r o f N A D P H - d i a p h o r a s e s t a i n e d n e u r o n s / m y e n t e r i c g a n g l i o n r e m a i n e d e l e v a t e d a t 7 a n d 1 0 w e e k s a f t e r d e n e r v a t i o n ( F i g u r e 2 4 ) . A l t h o u g h n u m e r o u s e x t r i n s i c n e r v e s w e r e o b s e r v e d i n a l l g a n g l i a 2 4 w e e k s a f t e r d e n e r v a t i o n , t h e n u m b e r o f N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n e d n e u r o n s r e m a i n e d e l e v a t e d b y 5 5 i 1 % . T h i s w a s t h e s m a l l e s t i n c r e a s e i n N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n e d n e u r o n s o b s e r v e d a t a n y t i m e , p o s s i b l y a s a r e s u l t o f r e - e s t a b l i s h m e n t o f i n t e r a c t i o n s b e t w e e n e x t r i n s i c a n d i n t r i n s i c n e r v e s . 1 9 1 F i g u r e 2 4 . T h e n u m b e r o f N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n e d n e u r o n s / g a n g l i o n i n m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l , s h a m , c o n t r o l , a n d d e n e r v a t e d i l e u m . A . N u m b e r o f N A D P H d i a p h o r a s e p o s i t i v e n e u r o n s / m y e n t e r i c g a n g l i o n i n p r e p a r a t i o n s o b t a i n e d f r o m n o r m a l , s h a m , o r e x t r i n s i c a l l y - d e n e r v a t e d i l e u m . C o n t r o l s w e r e f r o m a r e a s o f i l e u m o r a l o r a b o r a l t o t h e d e n e r v a t e d l o o p . B . N u m b e r o f N A D P H d i a p h o r a s e p o s i t i v e n e u r o n s o b t a i n e d f r o m a n i m a l s t r e a t e d w i t h 6 - h y d r o x y - d o p a m i n e o r c a p s a i c i n t o d e s t r o y s y m p a t h e t i c o r p r i m a r y a f f e r e n t i n n e r v a t i o n , r e s p e c t i v e l y . C o n t r o l s w e r e f r o m a g e - m a t c h e d v e h i c l e - t r e a t e d a n i m a l s . D a t a a r e m e a n o f d i a p h o r a s e p o s i t i v e n e u r o n s / g a n g l i a i S E M f r o m a t l e a s t 3 p r e p a r a t i o n s p e r a n i m a l . n o i l g n a g / s l l e c e s a r o h p a i d n o i l g n a g / s l l e c e s a r o h p a i d F i g u r e 2 4 A 2 5 ' 2 0 ‘ 1 5 ' 1 0 ' 1 9 2 c o n t r o l - d e n e r v a t e d - J — n o r m a l s h a m 1 7 1 o 2 4 w e e k s a f t e r d e n e r v a t i o n v e h i c l e - d e n e r v a t e d 6 - O H - D A c a p s a i c i n t r e a t m e n t 1 9 3 N A D P H D i a p h o r a s e S t a i n i n g i s N o t N o n - S p e c i fi c D i a p h o r a s e A c t i v i t y D i c u m a r o l i s a n o r a l a n t i - c o a g u l a n t t h a t p r e v e n t s e l e c t r o n t r a n s f e r f r o m N A D ( P ) H t o F A D , a n d b i n d s w i t h h i g h a f fi n i t y t o n o n - s p e c i fi c , b u t n o t N A D P H - d e p e n d e n t , d i a p h o r a s e s . P r e - t r e a t m e n t o f s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s w i t h 0 . 1 m M d i c u m a r o l f o r 1 h r a t r o o m t e m p e r a t u r e d i d n o t i n h i b i t s t a i n i n g o f m y e n t e r i c n e u r o n s , b u t r e d u c e d s t a i n i n g o f m u c o s a l c r y p t s . H o w e v e r , i f B - N A D H w a s s u b s t i t u t e d f o r B - N A D P H , n o n - s p e c i fi c d i a p h o r a s e s t a i n i n g o c c u r r e d , a s 8 i 0 . 0 5 s u b m u c o s a l n e u r o n s / g a n g l i o n ( 6 3 9 9 n e u r o n s , 8 0 7 s u b m u c o s a l g a n g l i o n ) ( F i g u r e 2 5 8 ) a n d 5 9 i - 5 m y e n t e r i c n e u r o n s / g a n g l i o n ( 4 4 1 4 n e u r o n s , 8 3 m y e n t e r i c g a n g l i o n ) c o n t a i n e d N A D H d i a p h o r a s e s t a i n i n g ( F i g u r e 2 5 D ) . U n l i k e t h e r e s u l t s f r o m N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g , t h e s e n e u r o n s w e r e l i g h t l y s t a i n e d , a n d n e i t h e r a x o n s n o r d e n d r i t e s w e r e e v e r v i s i b l e . F u r t h e r m o r e , N A D H h i s t o c h e m i s t r y s t a i n e d m o s t n e u r o n s i n s u b m u c o s a l g a n g l i a , a n d a p p r o x i m a t e l y 6 0 % o f m y e n t e r i c n e u r o n s , u n l i k e N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g . N A D H h i s t o c h e m i s t r y w a s s e n s i t i v e t o d i c u m a r o l , a s n e u r o n s d i d n o t s t a i n f o r N A D H d i a p h o r a s e a f t e r t h e p r e p a r a t i o n s w e r e i n c u b a t e d i n d i c u m a r o l ( d a t a n o t s h o w n ) . F i n a l l y , N A D P H s t a i n i n g w a s n o t o b s e r v e d i f N A D P H w a s e x c l u d e d f r o m t h e r e a c t i o n m i x t u r e , a n d N A D H s t a i n i n g w a s n o t o b s e r v e d i f N A D H w a s e x c l u d e d f r o m t h e r e a c t i o n m i x t u r e . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g d o e s n o t r e s u l t f r o m n o n - s p e c i fi c d i a p h o r a s e a c t i v i t y , b u t i s c o n s i s t e n t w i t h r e p o r t s o f n e u r o n a l N A D P H d i a p h o r a s e a c t i v i t y . I n c r e a s e d N u m b e r o f N A D P H D i a p h o r a s e P o s i t i v e N e u r o n s I s N o t A s s o c i a t e d W i t h C e l l D e a t h o r M i t o s i s N A D H d i a p h o r a s e s t a i n i n g h a s b e e n u s e d p r e v i o u s l y a s a n e s t i m a t e o f t h e t o t a l n u m b e r o f n e u r o n s w i t h i n t h e G I t r a c t ( G a b e l l a , 1 9 7 6 ) . A n i n c r e a s e i n t h e n u m b e r o f 1 9 4 N A D P H d i a p h o r a s e p o s i t i v e m y e n t e r i c n e u r o n s m a y r e s u l t f r o m o n e o f t w o m e c h a n i s m s . F i r s t , l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n m a y i n c r e a s e t h e t o t a l n u m b e r o f m y e n t e r i c n e u r o n s / g a n g l i a , a n d n e w n e u r o n s c o n t a i n N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g . T h e r e f o r e , i n c r e a s e d N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g w o u l d n o t i n d i c a t e a l t e r e d p h e n o t y p i c e x p r e s s i o n o f m a t u r e n e u r o n s , b u t r a t h e r b i r t h o f n e w n e u r o n s . A l t h o u g h C N S n e u r o n s c a n n o t d i v i d e a f t e r m a t u r a t i o n , e l e c t r o n m i c r o g r a p h s r e v e a l p r o g e n i t o r - l i k e c e l l s w i t h i n m y e n t e r i c g a n g l i a ( B u r n s t o c k a n d C o o k e , 1 9 7 6 ) , t h a t h a v e b e e n p r o p o s e d t o b e p r e m i t o t i c c e l l s . A l t e r n a t i v e l y , i n c r e a s e d N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g i n m y e n t e r i c g a n g l i a m a y r e p r e s e n t i n c r e a s e d c a t a l y t i c a c t i v i t y , i n c r e a s e d p r o d u c t i o n o f e x i s t i n g e n z y m e , o r d e n o v o s y n t h e s i s o f n e u r o n s p e c i fi c d i a p h o r a s e , a l l r e s u l t i n g i n a l t e r e d p h e n o t y p i c e x p r e s s i o n o f s o m e e n t e r i c n e u r o n s . A s s h o w n i n F i g u r e 2 6 , l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s n e i t h e r i n c r e a s e d n o r d e c r e a s e d t h e n u m b e r o f N A D H d i a p h o r a s e - s t a i n e d n e u r o n s i n s u b m u c o s a l ( F i g u r e 2 6 A ) o r m y e n t e r i c ( F i g u r e 2 6 8 ) g a n g l i a . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n d o e s n o t s t i m u l a t e d i v i s i o n a n d d e v e l o p m e n t o f p r o g e n i t o r c e l l s . S e c o n d l y , t h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t p r o g r a m m e d c e l l d e a t h d o e s n o t o c c u r a f t e r e l e v a t e d N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g . F o l l o w i n g v e n t r a l r o o t a v u l s i o n , W u e t a l . ( 1 9 9 2 ; 1 9 9 3 ) o b s e r v e d i n c r e a s e d N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g p r i o r t o l o s s o f m o t o r n e u r o n s , s u g g e s t i n g t h a t e x p r e s s i o n o f N A D P H d i a p h o r a s e m a y p l a y a n u n d e fi n e d r o l e i n a p o t o s i s . F i n a l l y , t h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t u n l i k e N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g , N A D H s t a i n i n g i s n o t e f f e c t e d b y d e n e r v a t i o n , f u r t h e r s u p p o r t i n g t h e c o n c l u s i o n t h a t N A D P H d i a p h o r a s e h i s t o c h e m i s t r y d o e s n o t r e s u l t f r o m n o n - s p e c i fi c d i a p h o r a s e a c t i v i t y . A l t h o u g h N A D H d i a p h o r a s e h i s t o c h e m i s t r y h a s b e e n u s e d a s a n e s t i m a t e o f c e l l F i g u r e 2 5 . N A D P H d i a p h o r a s e a n d N A D H d i a p h o r a s e s t a i n i n g i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c p l e x u s w h o l e m o u n t p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l i l e u m . A . S u b m u c o s a l p r e p a r a t i o n s t a i n e d b y N A D P H d i a p h o r a s e h i s t o c h e m i s t r y . B . S u b m u c o s a l p r e p a r a t i o n p r o c e s s e d f o r N A D H d i a p h o r a s e h i s t o c h e m i s t r y . C . N A D P H d i a p h o r a s e h i s t o c h e m i s t r y i n a m y e n t e r i c g a n g l i o n . D . M y e n t e r i c p r e p a r a t i o n p r o c e s s e d f o r N A D H d i a p h o r a s e h i s t o c h e m i s t r y . b v , a r t e r i o l e ; g , g a n g l i o n ; a r r o w s i n d i c a t e p o s i t i v e l y - s t a i n e d n e u r o n s . B a r i n D i s a p p r o x i m a t e l y 4 0 p m . 1 9 5 . n 2 , 5 1 9 7 n u m b e r s , t h e r e c e n t d e v e l o p m e n t o f a n t i s e r u m a g a i n s t n e r v e c e l l b o d i e s ( Y o u n g e t a l . , 1 9 9 3 a ) h a s e s t i m a t e d t h a t N A D H d i a p h o r a s e - p o s i t i v e m y e n t e r i c n e u r o n s r e p r e s e n t o n l y 6 0 - 8 0 % o f m y e n t e r i c n e u r o n s . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e a b e t t e r m e t h o d o f l a b e l l i n g m y e n t e r i c n e u r o n s i s n e e d e d . P r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s w i t h m e t h y l e n e b l u e g a v e s p o r a d i c s t a i n i n g i n p r e p a r a t i o n s o f m y e n t e r i c p l e x u s a n d w a s n o t u s e d . H o w e v e r , a s S M I 3 1 a n d b i s b e n z a r n i d e c o - l o c a l i z e d i n e n t e r i c n u c l e i , S M I 3 1 w a s u s e d t o v i s u a l i z e g a n g l i o n i c n u c l e i i n c o n t r o l a n d d e n e r v a t e d p r e p a r a t i o n s . T o p r e v e n t i n c l u s i o n o f e n t e r i c g l i a i n c e l l c o u n t s , o n l y n u c l e i w i t h v i s i b l e n u c l e o l i w e r e c o u n t e d , a s g l i a l ‘ n u c l e i l a c k t h e s e s t r u c t u r e s ( G e r s h o n a n d R o t h m a n , 1 9 9 1 ) . S i m i l a r t o r e s u l t s o b t a i n e d w i t h N A D H d i a p h o r a s e s t a i n i n g , l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n d i d n o t a f f e c t t h e n u m b e r o f s u b m u c o s a l ( F i g u r e 2 7 A ) o r m y e n t e r i c ( F i g u r e 2 7 B ) n u c l e i c o u n t e d a n y t i m e a f t e r d e n e r v a t i o n . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n d o e s n o t i n d u c e m i t o s i s o f i m m a t u r e n e u r o n s , a n d d o e s n o t r e s u l t i n p r o g r a m m e d c e l l d e a t h . H o w e v e r , l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n i n d u c e s a l t e r a t i o n s i n s o m e m y e n t e r i c n e u r o n s , r e s u l t i n g i n e x p r e s s i o n o f a n e w p h e n o t y p e . I n c r e a s e d N A D P H D i a p h o r a s e S t a i n i n g R e s u l t s f r o m L o s s o f S e n s o r y I n n e r v a t i o n A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , t r e a t m e n t w i t h 6 - O H - D A d e c r e a s e d c a t e c h o l a m i n e fl u o r e s c e n c e i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c g a n g l i a ; S P / C G R P - i r w a s n o t a f f e c t e d . T r e a t m e n t w i t h 6 - O H - D A d i d n o t c h a n g e t h e n u m b e r o f N A D P H d i a p h o r a s e p o s i t i v e n e u r o n s i n m y e n t e r i c g a n g l i a ( 1 1 . 4 i 0 . 7 c e l l s / g a n g l i o n , 3 6 3 0 c e l l s , 3 2 6 g a n g l i a ) c o m p a r e d t o v e h i c l e — t r e a t e d c o n t r o l s ( 9 . 4 i 0 . 8 c e l l s / g a n g l i o n , 4 3 1 2 c e l l s , 5 6 8 g a n g l i a ) ( F i g u r e 2 4 B ) . C a p s a i c i n - t r e a t m e n t e l i m i n a t e d S P / C G R P - i r n e r v e fi b e r s , a n d r e s u l t e d i n i n c r e a s e d N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g . N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g w a s d a r k e r , a n d t h e 1 9 8 F i g u r e 2 6 . T h e n u m b e r o f N A D H d i a p h o r a s e s t a i n e d n e u r o n s / g a n g l i o n i n m y e n t e r i c a n d s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l , c o n t r o l , s h a m , o r d e n e r v a t e d i l e u m . A . N u m b e r o f N A D H d i a p h o r a s e p o s i t i v e c e l l s / g a n g l i o n i n s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s o b t a i n e d f r o m n o r m a l , s h a m , o r e x t r i n s i c a l l y - d e n e r v a t e d i l e u m . C o n t r o l s w e r e t a k e n f r o m a n a r e a o f i l e m n o r a l o r a b o r a l t o t h e d e n e r v a t e d l o o p . B . N u m b e r o f N A D H d i a p h o r a s e - p o s i t i v e c e l l s / g a n g l i o n i n m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s o b t a i n e d f r o m n o r m a l , s h a m , o r e x t r i n s i c a l l y - d e n e r v a t e d i l e u m . D a t a a r e m e a n s i S E M f r o m a t l e a s t 4 p r e p a r a t i o n s p e r a n i m a l . 1 9 9 F i g u r e 2 6 . > : 3 c o n t r o l - d e n e r v a t e d . 5 . E ! 1 0 - 3 I 3 8 - 2 * " ; 6 . - 0 Q s 4 - 8 3 . 5 2 E o g n o r m a l 1 7 1 0 2 4 w e e k s a t t e r d e n e r v a t i o n [ : 3 c o n t r o l ‘ - d e n e r v a t e d 5 . g 1 0 0 r I 2 . 2 8 ° " 3 s o - T O 0 g 4 0 - 8 2 a 2 0 E o g n o r m a l 1 7 1 0 2 4 w e e k s a f t e r d e n e r v a t i o n 2 0 0 F i g u r e 2 7 . T h e n u m b e r o f S M I 3 1 - i m m u n o r e a c t i v e n u c l e i / g a n g l i o n i n m y e n t e r i c a n d s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l , s h a m , c o n t r o l , a n d d e n e r v a t e d i l e u m . A . N u m b e r o f S M I 3 l - i r n u c l e i / g a n g l i o n i n s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s o b t a i n e d f r o m n o r m a l , s h a m , o r e x u ' i n s i c a l l y - d e n e r v a t e d i l e u m . C o n t r o l s w e r e t a k e n f r o m a n a r e a o f i l e t u n o r a l o r a b o r a l t o t h e d e n e r v a t e d l o o p . B . N u m b e r o f S M I 3 1 - i r n u c l e i / g a n g l i o n i n m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s o b t a i n e d f r o m n o r m a l , s h a m , o r e x t r i n s i c a l l y - d e n e r v a t e d i l e u m . D a t a a r e m e a n s i S E M f o r a t l e a s t 3 p r e p a r a t i o n s p e r a n i m a l . 2 0 1 F i g u r e 2 7 . E c o n t r o l - d e n e r v a t e d : . 2 ' 5 1 O - c a I z 8 J 0 3 6 ' : I I : 4 l . . 2 I 1 - 2 P o r 5 O a , n o r m a l 1 7 1 O 2 4 w e e k s a f t e r d e n e r v a t i o n [ 3 c o n t r o l - d e n e r v a t e d I : . 2 ' 5 1 2 5 - = 1 a O 1 0 0 - 2 0 7 5 7 5 - a c 5 0 - 9 . - I v - 2 5 ' 0 i o a , n o r m a l 1 7 1 0 2 4 w e e k s a f t e r d e n e r v a t i o n 2 0 2 n u m b e r o f N A D P H - d i a p h o r a s e p o s i t i v e n e u r o n s ( 2 0 . 5 i 1 . 4 c e l l s / g a n g l i o n , 5 1 5 0 n e u r o n s , 2 8 6 g a n g l i a ) i n c r e a s e d b y 9 4 i 2 % a s c o m p a r e d t o v e h i c l e - t r e a t e d c o n t r o l s ( 1 0 . 6 i 1 . 0 8 n e u r o n s / g a n g l i o n , 4 2 9 9 n e u r o n s , 4 2 3 g a n g l i a ) . N i t r i c O x i d e S y n t h a s e - I m m u n o r e a c t i v i t y a n d N A D P H D i a p h o r a s e S t a i n i n g a r e C o - L o c a l i z e d i n M y e n t e r i c N e u r o n s P o l y c l o n a l a n t i s e r u m r a i s e d a g a i n s t p o r c i n e c e r e b e l l a r N O S w a s u s e d t o v e r i f y t h a t d e n e r v a t i o n - i n d u c e d i n c r e a s e i n N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g r e p r e s e n t e d d e n e r v a t i o n - i n d u c e d a l t e r a t i o n s i n N O S i n m y e n t e r i c g a n g l i a . I n p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l i l e u m , N O S - i r w a s n o t o b s e r v e d i n i n t e r g a n g l i o n i c , p a r a v a s c u l a r , a n d p e r i v a s c u l a r n e r v e s ( F i g u r e 3 4 A ) , a n d o n l y 0 . 0 0 3 i 0 . 0 0 2 n e u r o n s / s u b m u c o s a l g a n g l i a c o n t a i n e d N O S - i r ( 4 n e u r o n s , 9 5 7 s u b m u c o s a l g a n g l i a , 1 0 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) . H o w e v e r , s i m i l a r t o r e s u l t s f r o m N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g , 8 . 7 i 0 . 6 n e u r o n s / m y e n t e r i c g a n g l i o n w e r e i m m u n o r e a c t i v e f o r N O S ( 4 0 0 2 n e u r o n s , 4 5 6 g a n g l i a , 2 6 p r e p a r a t i o n s , 7 a n i m a l s ) ( F i g u r e 3 0 ) . N i t r i c o x i d e s y n t h a s e - i r w a s l o c a t e d i n t w o p o p u l a t i o n s o f m y e n t e r i c n e u r o n s ( F i g u r e s 2 8 a n d 2 9 ) , a s 1 7 i 2 % o f n e u r o n s w e r e l a r g e ( > 3 0 u m ) , b r i g h t l y - fl u o r e s c e n t D o g i e l t y p e I n e u r o n s l o c a t e d a t t h e p e r i p h e r y o f m y e n t e r i c g a n g l i a . T h e m a j o r i t y o f N O S - i r n e u r o n s w e r e s m a l l ( < 3 0 u m ) , l e s s - b r i g h t l y s t a i n e d , a n d f o u n d w i t h i n t h e i n t e r i o r o f g a n g l i a . D e n d r i t e s a n d a x o n s o f s m a l l e r n e u r o n s w e r e n o t v i s i b l e , a n d t h e i r m o r p h o l o g y w a s d i f fi c u l t t o r e s o l v e . H o w e v e r , t h e y a p p e a r e d t o h a v e s m a l l , s m o o t h s o m a t a , a n d m a y r e p r e s e n t i n t e m e u r o n s . N e r v e b u n d l e s i n p r i m a r y a n d s e c o n d a r y p l e x u s e s o f m y e n t e r i c p l e x u s , a n d d e e p m u s c u l a r p l e x u s o f t h e c i r c u l a r m u s c l e c o n t a i n e d b r i g h t N O S - i r , a l t h o u g h l i t t l e s t a i n i n g w a s o b s e r v e d i n t h e t e r t i a r y p l e x u s . C o - l o c a l i z a t i o n s t u d i e s w i t h N A D P H d i a p h o r a s e w e r e p e r f o r m e d t o d e t e r m i n e d t h e 2 0 3 F i g u r e 2 8 . C o — l o c a l i z a t i o n o f n i t r i c o x i d e s y n t h a s e - i m m u n o r e a c t i v i t y a n d N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g i n m y e n t e r i c g a n g l i o n f r o m n o r m a l i l e u m . A . W h o l e m o u n t p r e p a r a t i o n o f m y e n t e r i c p l e x u s p r o c e s s e d f o r N O S - i r . L a r g e , d a r k l y s t a i n e d c e l l s ( a r r o w ) a n d s m a l l , m o r e l i g h t l y s t a i n e d n e u r o n s a r e p r e s e n t . B . N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g i s f o u n d i n m a n y N O S - i r n e u r o n s ( a r r o w s ) . B a r i n B i s 4 0 u m . 2 0 4 F i g u r e 2 8 . 2 0 5 p r o p o r t i o n o f n e u r o n s c o n t a i n i n g N A D P H d i a p h o r a s e a n d N O S - i r . T i s s u e s w e r e fi x e d i n p a r a f o r m a l d e h y d e , a n d p r o c e s s e d f o r N O S - i r . T h e n u m b e r o f n e u r o n s / g a n g l i o n w a s r e c o r d e d , t h e t i s s u e s w e r e w a s h e d i n P B S , a n d p r o c e s s e d f o r N A D P H d i a p h o r a s e h i s t o c h e m i s t r y . A s p r e l i m i n a r y s t u d i e s r e v e a l e d t h a t d a r k N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g c o n c e a l e d i m m u n o fl u o r e s c e n c e , p r e p a r a t i o n s w e r e i n c u b a t e d i n n i t r o b l u e t e t r a z o l i u m a n d N A D P H f o r o n l y 1 5 m i n . T h e d e c r e a s e d i n c u b a t i o n t i m e a l l o w e d m o s t N A D P H d i a p h o r a s e c e l l s t o b e v i s u a l i z e d , a s 8 . 4 i 0 . 5 6 N A D P H d i a p h o r a s e p o s i t i v e c e l l s / m y e n t e r i c g a n g l i o n ( 1 , 7 6 8 n e u r o n s , 2 1 2 m y e n t e r i c g a n g l i a , 8 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) w e r e o b s e r v e d . I n 1 3 p r e p a r a t i o n s ( 3 a n i m a l s ) , 8 0 - 1 0 0 % o f N O S - i r n e u r o n s / p r e p a r a t i o n c o n t a i n e d N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g ( F i g u r e 2 8 ) , w i t h a n a v e r a g e o f 8 8 i 2 % o f N O S - i r n e u r o n s c o n t a i n i n g N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g . I n t h e s a m e p r e p a r a t i o n s , 7 0 - 1 0 0 % o f N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n e d n e u r o n s / p r e p a r a t i o n c o n t a i n e d N O S - i r , a s 8 5 : t 4 % o f N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n e d n e u r o n s c o n t a i n e d N O S - i r . A l t h o u g h s o m e d a r k l y s t a i n e d N A D P H d i a p h o r a s e n e u r o n s c o n t a i n e d b r i g h t N O S - i r , o c c a s i o n a l b r i g h t N O S - i r n e u r o n s d i d n o t c o n t a i n d e t e c t a b l e N A D P H d i a p h o r a s e . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e r e i s a s t r o n g r e l a t i o n s h i p b e t w e e n N O S - i r a n d N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g i n e n t e r i c n e u r o n s . E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n I n c r e a s e s t h e N u m b e r o f N i t r i c O x i d e S y n t h a s e - I m m u n o r e a c t i v e M y e n t e r i c N e u r o n s O n e w e e k a f t e r s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , c o n t r o l s e g m e n t s c o n t a i n e d 8 . 7 i 0 . 5 N O S - i r n e u r o n s / m y e n t e r i c g a n g l i a ( 2 , 8 6 8 N O S - i r n e u r o n s , 3 4 2 m y e n t e r i c g a n g l i a , 1 2 p r e p a r a t i o n s , 4 a n i m a l s ) . H o w e v e r , t h e n u m b e r o f N O S - i r n e u r o n s i n d e n e r v a t e d s e g m e n t s s i g n i fi c a n t l y i n c r e a s e d , a s 1 3 i 0 . 5 N O S - i r n e u r o n s / m y e n t e r i c g a n g l i o n ( 4 , 1 8 4 2 0 6 F i g u r e 2 9 . N i t r i c o x i d e s y n t h a s e - i r n m u n o r e a c t i v i t y i n m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m c o n t r o l a n d d e n e r v a t e d i l e u m . A . N O S - i r i n m y e n t e r i c g a n g l i o n t a k e n f r o m c o n t r o l s e g m e n t . B . F o u r w e e k s a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , i n c r e a s e d n e u r o n s c o n t a i n N O S - i r . L a r g e , d a r k l y s t a i n e d n e u r o n s ( a r r o w ) a n d s m a l l , l i g h t l y s t a i n e d n e u r o n s a r e p r e s e n t . C a l i b r a t i o n b a r i n B i s a p p r o x i m a t e l y 4 0 p m . F i g u r e 2 9 . 2 0 8 F i g u r e 3 0 . T h e n u m b e r o f n i t r i c o x i d e s y n t h a s e - i m m u n o r e a c t i v e n e u r o n s / g a n g l i o n f r o m m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l , c o n t r o l , s h a m , a n d d e n e r v a t e d i l e u m . A . N u m b e r o f N O S - i r n e u r o n s / g a n g l i o n i n m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s o b t a i n e d f r o m n o r m a l , s h a m , o r e x t r i n s i c a l l y - d e n e r v a t e d i l e u m . C o n t r o l s w e r e f r o m a n a r e a o f i l e u m o r a l o r a b o r a l t o t h e d e n e r v a t e d l o o p . B . T h e n u m b e r o f N O S n e u r o n s / m y e n t e r i c g a n g l i o n o b t a i n e d f r o m a n i m a l s t r e a t e d w i t h 6 - O H - D A o r c a p s a i c i n t o d e s t r o y s y m p a t h e t i c o r p r i m a r y a f f e r e n t i n n e r v a t i o n , r e s p e c t i v e l y . C o n t r o l s w e r e f r o m a g e - m a t c h e d v e h i c l e - t r e a t e d a n i m a l s . D a t a a r e m e a n s i S E M f r o m a t l e a s t 3 p r e p a r a t i o n s p e r a n i m a l . 2 0 9 F i g u r e 3 0 . A c o n t r o l - d e n e r v a t e d : : . g 2 5 - 2 . a 2 0 ' 1 . * * . 2 2 1 5 ' 3 1 0 - h a ) O o . 2 n o r m a l s h a m 1 7 1 O 2 4 w e e k s a f t e r d e n e r v a t i o n B v e h i c l e d e n e r v a t e d r : 2 2 5 - g a 2 0 ' * 2 ' g 1 5 ' 8 1 0 - " I ” ; 5 i - t o o O z 6 - O H - D A c a p s a i c i n t r e a t m e n t 2 1 0 N O S - i r n e u r o n s , 3 2 8 m y e n t e r i c g a n g l i a , 1 2 p r e p a r a t i o n s , 4 a n i m a l s ) w e r e o b s e r v e d 3 0 ) . T h e r a t i o o f l a r g e , b r i g h t l y - fl u o r e s c e n t : s m a l l n e u r o n s w a s n o t a l t e r e d b y ( 1 8 : 8 2 i 3 % ) ( F i g u r e 2 9 ) . T h e n u m b e r o f N O S - i r m y e n t e r i c n e u r o n s / g a n g l i o n s h a m - d e n e r v a t e d s e g m e n t s o f i l e u m ( 8 . 1 i 0 . 5 N O S - i r n e u r o n s / m y e n t e r i c g a n g l i o n ) n o t d i f f e r e n t f r o m a n i m a l - m a t c h e d c o n t r o l s ( 7 . 9 i 0 . 4 N O S - i r g a n g l i o n ) , i n d i c a t i n g t h a t i n c r e a s e d N O S - i r i n m y e n t e r i c g a n g l i a w a s n o t t h e r e s u l t o f s u r g i c a l s t r e s s . F i n a l l y , s i m i l a r t o r e s u l t s o b t a i n e d u t i l i z i n g N A D P H d i a p h o r a s e h i s t o c h e m i s t r y , t h e n u m b e r o f N O S - i r n e u r o n s r e m a i n e d e l e v a t e d 4 , 7 , 1 0 , 1 6 , a n d 2 4 w e e k s a f t e r l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s ( F i g u r e 2 9 ) , f u r t h e r s u p p o r t i n g t h e h y p o t h e s i s t h a t N O S i s i n c r e a s e d b y l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s . A s N O S - i r i n n e r v e fi b e r s i n i n t e r g a n g l i o n i c n e r v e s t r a n d s a n d s e c o n d a r y n e r v e fi b e r s i s v e r y b r i g h t i n n o r m a l t i s s u e s , i t w a s i m p o s s i b l e t o u s e i m m u n o h i s t o c h e m i c a l m e t h o d s t o d e t e r m i n e i f e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n i n c r e a s e d t h e a m o u n t o f p r o t e i n i n t h e s e n e r v e s . H o w e v e r , N O S - i r w a s n o t o b s e r v e d i n t h e t e r t i a r y p l e x u s i n n o r m a l , c o n t r o l , o r d e n e r v a t e d t i s s u e s a t a n y t i m e ( F i g u r e 2 9 ) . I n c r e a s e d N i t r i c O x i d e S y n t h a s e R e s u l t s f r o m L o s s o f S e n s o r y I n n e r v a t i o n S y s t e m i c a d m i n i s t r a t i o n o f 6 - O H - D A d i d n o t a l t e r t h e n u m b e r o f N O S - i r n e u r o n s i n m y e n t e r i c g a n g l i a ( 9 . 8 i 0 . 2 N O S - i r n e u r o n s / g a n g l i o n , 2 , 9 7 6 n e u r o n s , 3 0 4 g a n g l i a , 3 a n i m a l s ) c o m p a r e d t o t i s s u e s t a k e n f r o m v e h i c l e - t r e a t e d c o n t r o l s ( 9 . 9 : t 0 . 4 N O S - i r n e u r o n s / g a n g l i o n , 4 , 6 5 6 n e u r o n s , 4 5 6 g a n g l i a , 3 a n i m a l s ) o n e w e e k a f t e r d e s t r u c t i o n o f s y m p a t h e t i c n e r v e t e r m i n a l s ( F i g u r e 3 0 ) . H o w e v e r , s y s t e m i c a d m i n i s t r a t i o n o f c a p s a i c i n s i g n i fi c a n t l y i n c r e a s e d t h e n u m b e r o f N O S - i r n e u r o n s / m y e n t e r i c g a n g l i o n a s c o m p a r e d t o v e h i c l e - t r e a t e d c o n t r o l s ( F i g u r e 3 0 ) , i n d i c a t i n g t h a t l o s s o f p r i m a r y a f f e r e n t n e r v e s i s r e s p o n s i b l e f o r i n c r e a s e d N O S o b s e r v e d i n m y e n t e r i c g a n g l i a a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n . 2 1 1 F i g u r e 3 1 . N i t r i c o x i d e s y n t h a s e - i m m u n o r e a c t i v i t y i n s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l a n d d e n e r v a t e d i l e t u n . A . L i t t l e N O S - i r i s o b s e r v e d i n s u b m u c o s a l g a n g l i a o r i n v a s c u l a r i n n e r v a t i o n . B . F o u r w e e k s a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , o c c a s i o n a l N O S - i r n e r v e s a r e a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s ( a r r o w ) . C . F o u r w e e k s a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , o c c a s i o n a l N O S - i r s u b m u c o s a l n e u r o n s a r e o b s e r v e d i n g a n g l i a ( a r r o w w i t h a s t e r i s k ) . b v , a r t e r i o l e ; g , g a n g l i o n . B a r i n C i s a p p r o x i m a t e l y 3 0 u m . F i g u r e 3 1 . 2 1 3 L o s s o f E x t r i n s i c I n n e r v a t i o n D o e s N o t I n c r e a s e N i t r i c O x i d e S y n t h a s e i n S u b m u c o s a l N e u r o n s A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , o n l y r a r e s u b m u c o s a l n e u r o n s c o n t a i n N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g o r N O S - i r i n n o r m a l t i s s u e s . H o w e v e r , N O S - i r w a s e x a m i n e d i n s u b m u c o s a l n e u r o n s t o v e r i f y t h a t l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n d i d n o t i n d u c e N O S - i r i n s u b m u c o s a l n e u r o n s . O n e w e e k a f t e r l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s , 0 . 0 2 i 0 . 0 1 s u b m u c o s a l n e u r o n s / g a n g l i o n c o n t a i n e d N O S - i r ( 3 0 n e u r o n s , 2 1 0 6 g a n g l i a , l 4 p r e p a r a t i o n s , 5 a n i m a l s ) , w h e r e a s c o n t r o l p r e p a r a t i o n s c o n t a i n e d 0 . 0 1 i 0 . 0 s u b m u c o s a l n e u r o n s / g a n g l i o n ( 6 n e u r o n s , 1 , 0 7 8 g a n g l i a , 8 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) ( F i g u r e 3 1 ) . S i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e s w e r e n o t o b s e r v e d a t a n y t i m e a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , i n d i c a t i n g t h a t l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s d i d n o t i n c r e a s e N O S i n s u b m u c o s a l n e u r o n s ( F i g u r e 3 1 C ) . H o w e v e r , a s s o o n a s f o u r w e e k s a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , o c c a s i o n a l t h i n , n o n - v a r i c o s e N O S - i r n e r v e fi b e r s w e r e c l o s e l y a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s ( F i g u r e 3 1 B ) . A l t h o u g h N O S - i r n e r v e s w e r e n o t o b s e r v e d w i t h a r t e r i o l e s m e a s u r i n g o v e r 6 0 u m , N O S - i r n e r v e s w e r e s e e n w i t h a r t e r i o l e s a s s m a l l a s 1 0 u m ( T a b l e 7 ) . S i n g l e N O S - i r n e r v e s w e r e u s u a l l y a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s ; h o w e v e r , 3 6 % o f 3 0 - 5 0 p m a r t e r i o l e s w i t h N O S - i r i n n e r v a t i o n h a d a p a i r p a r a l l e l N O S - i r n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d o n e i t h e r s i d e o f t h e a r t e r i o l e . T h e m a j o r i t y o f a r t e r i o l e s f r o m c o n t r o l a n d s h a m p r e p a r a t i o n s d i d n o t h a v e N O S - i r n e r v e fi b e r s ( F i g u r e 3 1 ) , i n d i c a t i n g t h e a p p e a r a n c e o f N O S - i r n e r v e fi b e r s r e s u l t e d f r o m l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s . S e v e n a n d t e n w e e k s a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , p a r a v a s c u l a r n e r v e s c l o s e l y - a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s , a n d s o m e m e a n d e r i n g n e r v e fi b e r s w e r e o b s e r v e d . S i m i l a r t o e a r l i e r t i m e s , N O S - i r w a s n o t o b s e r v e d i n c o n t r o l s u b m u c o s a l p r e p a r a t i o n s . F i n a l l y , r a r e N O S - i r n e r v e s w e r e a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s 2 4 w e e k s a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n . 2 1 4 T a b l e 7 . S u r v e y o f t h e n u m b e r o f a r t e r i o l e s w i t h N O S - i r n e r v e s i n n o r m a l , c o n t r o l , a n d s u r g i c a l l y - d e n e r v a t e d i l e u m . A r t e r i o l a r S i z e ( u m ) W e e k s A f t e r D e n e r - v a t i o n 0 - 1 0 1 1 — 2 0 2 1 - 3 0 3 1 - 4 0 4 1 - 5 0 5 1 - 6 0 6 1 - 7 0 n o r m a l 0 / 1 4 0 / 1 4 0 / 1 5 0 / 1 2 0 / 8 0 / 4 0 / 7 w e e k l 0 / 9 0 / 1 2 1 / 1 1 1 / 1 0 0 / 7 0 / 6 0 / 7 c o n t r o l w e e k l 0 / 1 0 0 / 1 0 0 / 1 7 0 / 1 1 1 / 8 0 / 6 0 / 4 d e n e r v . w e e k 4 0 / 9 0 / 1 6 1 / 1 7 1 / 8 0 / 7 0 / 6 0 / 7 c o n t r o l w e e k 4 1 / 7 0 / 1 0 5 / 1 7 7 / 1 1 " 7 / 1 0 * 0 / 6 0 / 8 d e n e r v . w e e k 7 0 / 8 0 / 2 0 0 / 1 8 0 / 1 4 1 / 1 3 0 / 6 0 / 3 c o n t r o l a : a : a : w e e k 7 2 / 1 0 9 / 1 9 3 / 1 3 2 / 1 3 3 / 7 0 / 5 6 / 1 0 d e n e r v . w e e k 2 4 0 / 6 0 / 1 6 1 / 2 0 1 / 1 7 0 / 1 4 0 / 5 2 / 1 0 c o n t r o l w e e k 2 4 0 / 8 6 / 1 6 9 / 1 9 * 4 / 1 2 3 / 1 2 2 / 7 1 / 5 d e n e r v . D e s c r i p t i o n o f t h e f r a c t i o n o f s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s r e c e i v i n g N O S - i r n e r v e s / t o t a l s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s e x a m i n e d . A s i n g l e N O S - i r p a r a v a s c u l a r n e r v e w a s a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s , u n l e s s m a r k e d b y * , t o d e n o t e t w o n e r v e s a s s o c i a t e d w i t h a s i n g l e a r t e r i o l e . D a t a a r e t a k e n f r o m a m i n i m u m o f 4 p r e p a r a t i o n s f o r e a c h t i m e p o i n t . 2 1 5 E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n D o e s N o t I n c r e a s e V a s o a c t i v e I n t e s t i n a l P o l y p e p t i d e i n M y e n t e r i c N e u r o n s A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t u d i e s h a v e d e m o n s t r a t e d N O S - i r , N A D P H d i a p h o r a s e , a n d V I P - i r a r e c o - l o c a l i z e d i n t h e s a m e p o p u l a t i o n o f m y e n t e r i c n e u r o n s ( s e e i n t r o d u c t i o n ) . F u r t h e r m o r e , e x p l a n t a n d d e n e r v a t i o n s t u d i e s o f a u t o n o m i c a n d d o r s a l r o o t g a n g l i a h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t d e c e n t r a l i z a t i o n o r a x o t o m y o f g a n g l i o n i c n e u r o n s i n c r e a s e s V I P l e v e l s b y 1 0 0 - 2 4 0 f o l d ( r e v i e w e d i n R a o a n d L a n d i s , 1 9 9 2 ) . T h e r e f o r e , V I P - i r w a s e x a m i n e d i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c g a n g l i a t o d e t e r m i n e i f V I P w a s a l t e r e d b y l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s . I n n o r m a l p r e p a r a t i o n s , b r i g h t V I P - i r w a s o b s e r v e d i n v a r i c o s e n e r v e fi b e r s w i t h i n g a n g l i a a n d t e r t i a r y p l e x u s e s , a n d 3 . 0 i 0 . 3 n e u r o n s / m y e n t e r i c g a n g l i o n ( 7 4 0 n e u r o n s , 2 4 4 m y e n t e r i c g a n g l i a , 1 4 p r e p a r a t i o n s , 4 a n i m a l s ) c o n t a i n e d V I P - i r ( F i g u r e 3 3 A ) . V a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p o l y p e p t i d e - i r w a s o b s e r v e d i n t h e c y t o p l a s m o f s i n g l e n e u r o n s l o c a t e d i n t h e i n t e r i o r o f t h e g a n g l i a ( F i g u r e 3 2 A ) . T h e s e n e u r o n s h a d s i n g l e a x o n s t h a t p r o j e c t e d w i t h i n t h e g a n g l i a f o r s h o r t d i s t a n c e s , a n d l a m e l l a r o r fl a t d e n d r i t e s c h a r a c t e r i s t i c o f D o g i e l I o r I I I n e u r o n s . M o s t V I P - i r n e u r o n s w e r e a s s o c i a t e d w i t h o t h e r V I P - i r n e u r o n s t h a t w e r e i n c l u s t e r s o f 2 - 6 n e u r o n s / g a n g l i a . O n e w e e k a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , t h e m y e n t e r i c p l e x u s c o n t a i n e d 3 . 0 i 0 . 5 V I P - i r n e u r o n s / g a n g l i o n ( 7 5 1 n e u r o n s , 3 7 6 g a n g l i a , 2 1 p r e p a r a t i o n s , 5 a n i m a l s ) , w h i c h w a s n o t d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l p r e p a r a t i o n s t a k e n o r a l o r a b o r a l t o t h e d e n e r v a t e d s e g m e n t s ( 2 . 2 i 0 . 3 V I P - i r n e u r o n s / g a n g l i o n ( 7 5 1 n e u r o n s , 3 7 6 g a n g l i a , 2 1 p r e p a r a t i o n s , 5 a n i m a l s ) ( F i g u r e 3 3 A ) . S i m i l a r r e s u l t s w e r e a t a l l t i m e p o i n t s e x a m i n e d ( F i g u r e 3 2 A ) . F i n a l l y , e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n d i d n o t a l t e r t h e n u m b e r o f b u n c h e s , o r t h e n u m b e r o f n e u r o n s / b u n c h ( d a t a n o t s h o w n ) . 2 1 6 F i g u r e 3 2 . V a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p o l y p e p t i d e - i m m u n o r e a c t i v i t y i n m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l a n d e x t r i n s i c a l l y - d e n e r v a t e d i l e u m . A . V I P - i r i n m y e n t e r i c g a n g l i o n t a k e n f r o m c o n t r o l s e g m e n t o f i l e u m . B . F o u r w e e k s a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , V I P - i r i s n o t a l t e r e d i n m y e n t e r i c g a n g l i a . C a l i b r a t i o n b a r i n B i s a p p r o x i m a t e l y 4 0 u m . 2 1 8 F i g u r e 3 3 . T h e n u m b e r o f v a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p o l y p e p t i d e - i m m u n o r e a c t i v e n e u r o n s / g a n g l i o n i n m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l , s h a m , a n d d e n e r v a t e d i l e u m . A . N u m b e r o f V I P - i r n e u r o n s / g a n g l i o n i n m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m d e n e r v a t e d a n d c o n t r o l l o o p s . B . T h e n u m b e r o f V I P - i r n e u r o n s / m y e n t e r i c g a n g l i a o b t a i n e d a f t e r a n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h 6 - h y d r o x y - d o p a m i n e o r c a p s a i c i n t o d e s t r o y s y m p a t h e t i c o r p r i m a r y a f f e r e n t i n n e r v a t i o n , r e s p e c t i v e l y . C o n t r o l s w e r e t a k e n f r o m a g e - m a t c h e d v e h i c l e - t r e a t e d a n i m a l s . D a t a a r e m e a n s i S E M f r o m a t l e a s t 3 p r e p a r a t i o n s p e r a n i m a l . F i g u r e 3 3 . C . 2 2 5 2 2 0 fl 3 ' 1 5 . 9 . 8 t o h I ' - 5 E > O c . 2 2 5 2 ' 2 0 fl 3 1 5 2 8 1 0 I - I I . 5 2 - > o m 2 1 9 l : c o n t r o l - d e n e r v a t e d I I I I 7 1 0 2 4 n o r m a l s h a m 1 w e e k s a f t e r d e n e r v a t i o n [ 3 v e h i c l e - d e n e r v a t e d 6 - O H - D A c a p s a i c i n t r e a t m e n t 2 2 0 E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n D o e s N o t I n c r e a s e V a s o a c t i v e I n t e s t i n a l P o l y p e p t i d e i n S u b m u c o s a l N e u r o n s S t r o n g , c y t o p l a s m i c V I P - i r w a s o b s e r v e d i n 3 . 5 i 0 . 2 s u b m u c o s a l n e u r o n s / g a n g l i a ( 4 , 3 0 8 n e u r o n s , 1 , 4 7 8 g a n g l i a , 2 5 p r e p a r a t i o n s , 8 a n i m a l s ) w i t h D o g i e l I I I m o r p h o l o g y . O n e w e e k a f t e r l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s , t h e n u m b e r o f V I P - i r n e u r o n s / g a n g l i a w a s n o t a l t e r e d , a s 4 . 0 i 0 . 6 V I P - i r c e l l s / g a n g l i a ( 3 , 2 2 2 n e u r o n s , 8 0 5 g a n g l i a , 2 8 p r e p a r a t i o n s , 5 a n i m a l s ) w e r e o b s e r v e d i n d e n e r v a t e d t i s s u e s , w h e r e a s c o n t r o l p r e p a r a t i o n s c o n t a i n e d 3 . 0 i 0 . 6 V I P - i r c e l l s / g a n g l i a ( 4 , 1 9 7 n e u r o n s , 1 , 3 9 6 g a n g l i a , 3 1 p r e p a r a t i o n s , 5 a n i m a l s ) . F u r t h e r m o r e , e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n d i d n o t a l t e r t h e n u m b e r o f V I P - i r s u b m u c o s a l n e u r o n s / g a n g l i a a t a l l t i m e p o i n t s e x a m i n e d ( d a t a n o t s h o w n ) , i n d i c a t i n g t h a t l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s d o e s n o t i n c r e a s e V I P i n s u b m u c o s a l g a n g l i a . 2 2 1 6 . N E U R O G E N I C R E L A X A T I O N S A R E P O T E N T I A T E D F O L L O W I N G E X T R I N S I C D E N E R V A T I O N I n t r o d u c t i o n a n d E x p e r i m e n t a l R a t i o n a l e A s d e s c r i b e d i n t h e i n t r o d u c t i o n , t r a n s m u r a l s t i m u l a t i o n o f p r e c o n t r a c t e d l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s ( L M M P P s ) r e s u l t s i n a n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n o f s m o o t h m u s c l e f o l l o w e d i m m e d i a t e l y b y a r e b o u n d o r o f f c o n t r a c t i o n . P r e v i o u s w o r k h a s s h o w n c o n c l u s i v e l y t h a t N O m e d i a t e s a l a r g e p r o p o r t i o n o f n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s o f G I s m o o t h m u s c l e i n a l l s p e c i e s t h u s f a r e x a m i n e d ( s e e i n t r o d u c t i o n ) . L M M P P s f r o m g u i n e a p i g i l e u m h a v e b e e n e x t e n s i v e l y u s e d t o d e m o n s t r a t e t h a t m y e n t e r i c n e u r o n s r e l e a s e N O , a n d t h a t N O h a s s i m i l a r p h a r m a c o l o g i c a l p r o p e r t i e s a s t h e n e u r o g e n i c N A N C i n h i b i t o r y n e u r o t r a n m s m i t t e r . T h e r e f o r e , r e l a x a t i o n s o f L M M P P s f r o m c o n t r o l a n d e x t r i n s i c a l l y - d e n e r v a t e d s e g m e n t s o f i l e u m w e r e e x a m i n e d i n o r d e r t o d e t e r m i n e i f i n c r e a s e d q u a n t i t y o f N O S - i r m y e n t e r i c n e u r o n s h a d a f u n c t i o n a l c o n s e q u e n c e o n G 1 m o t i l i t y . S p e c i fi c a l l y , i t w a s h y p o t h e s i z e d t h a t t h e i n c r e a s e d n u m b e r o f N O S - i r m y e n t e r i c n e u r o n s w o u l d i n c r e a s e p r o d u c t i o n a n d r e l e a s e o f N O i n d e n e r v a t e d p r e p a r a t i o n s , r e s u l t i n g i n l a r g e r n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s o f L M M P P s a s c o m p a r e d t o c o n t r o l p r e p a r a t i o n s . F u r t h e r m o r e , a s t h e p h a r m a c o l o g y o f n e u r o t r a n s m i s s i o n t o i l e a l s m o o t h m u s c l e h a s b e e n w e l l - c h a r a c t e r i z e d , f u n c t i o n a l a l t e r a t i o n s i n o t h e r n e u r o t r a n s m i t t e r s m a y b e d e t e c t e d i n t h i s m o d e l a f t e r l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s . E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n D o e s N o t A l t e r P a s s i v e o r A c t i v e T e n s i l e P r o p e r t i e s o f L o n g i t u d i n a l M u s c l e H i s t a m i n e ( 0 . 3 - 3 0 u M ) c o n t r a c t e d L M M P P s f r o m n o r m a l , c o n t r o l , a n d d e n e r v a t e d s e g m e n t s o f i l e u m . A f t e r a r a p i d c o n t r a c t i o n , a s m a l l d e s e n s i t i z a t i o n o c c u r r e d , a n d 2 2 2 s u s t a i n e d a c t i v e t e n s i o n w a s m a i n t a i n e d u n t i l h i s t a m i n e w a s r e m o v e d b y w a s h i n g . A s p r e - c o n t r a c t e d t i s s u e s w e r e n e c e s s a r y t o s t u d y n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s , t h e fi r s t s t u d y d e t e r m i n e d i f l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n a l t e r e d t h e h i s t a m i n e c o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e . F o u r ( 2 a n i m a l s , 1 2 p r e p a r a t i o n s ) a n d s e v e n w e e k s ( 2 a n i m a l s , 1 1 p r e p a r a t i o n s ) a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , t h e a m p l i t u d e o f h i s t a m i n e - e v o k e d c o n t r a c t i o n s o f L M M P P s w a s n o t d i f f e r e n t t h a n c o n t r a c t i o n a m p l i t u d e s f r o m L M M P P s m a d e f r o m c o n t r o l s e g m e n t s o r a l o r a b o r a l t o t h e d e n e r v a t e d s e g m e n t ( F i g u r e 3 4 A ) . T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s d o e s n o t a l t e r h i s t a m i n e r e c e p t o r s o r t h e c o n t r a c t i l e a p p a r a t u s o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e . G e n e r a t i o n o f a c t i v e a n d p a s s i v e t e n s i o n b y l o n g i t u d i n a l m u s c l e w a s f u r t h e r e x a m i n e d i n L M M P P s m a d e f r o m d e n e r v a t e d a n d c o n t r o l l o o p s o f i l e u m . S e v e n w e e k s a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e l e n g t h o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e a n d t h e d e v e l o p m e n t o f p a s s i v e ( F i g u r e 3 7 B ) a n d a c t i v e ( F i g u r e 3 7 C ) w e r e n o t a f f e c t e d b y l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s . E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n I n c r e a s e s N e u r o g e n i c R e l a x a t i o n s o f L o n g i t u d i n a l M u s c l e - M y e n t e r i c P l e x u s P r e p a r a t i o n s I n t h e p r e s e n c e o f h i s t a m i n e ( 3 u M ) , t r a n s m u r a l s t i m u l a t i o n ( 2 0 H z ) o f p r e - c o n t r a c t e d L M M P P s f r o m n o r m a l i l e u m r e s u l t e d i n T T X - s e n s i t i v e ( 3 0 0 n M ) n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e . T h e s e r e l a x a t i o n s w e r e a t t e n u a t e d i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r b y o x y h e m o g l o b i n a n d L - , b u t n o t D - a r g i n i n e a n a l o g s ( d a t a n o t s h o w n ) , s i m i l a r t o t h e fi n d i n g s o f O s t h a u s a n d G a l l i g a n ( 1 9 9 2 ) . T h e s e d r u g s w e r e u n l i k e l y t o d i r e c t l y a f f e c t s m o o t h m u s c l e , a s p a p e v e r i n e ( 1 0 u M ) - i n d u c e d r e l a x a t i o n s w e r e n o t a l t e r e d b y 1 0 0 u M L N A o r 1 0 u M h e m o g l o b i n ( d a t a n o t s h o w n ) . F i n a l l y , S N P 2 2 3 F i g u r e 3 4 . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e e f f e c t s o f h i s t a m i n e o n N A N C r e l a x a t i o n s o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m c o n t r o l a n d d e n e r v a t e d i l e u m , a n d l e n g t h - t e n s i o n r e l a t i o n s h i p s f o r l o n g i t u d i n a l m u s c l e f r o m c o n t r o l a n d d e n e r v a t e d i l e u m . A . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e e f f e c t s o f h i s t a m i n e o n L M M P P s f r o m c o n t r o l a n d s u r g i c a l l y - d e n e r v a t e d l o o p s o f i l e u m . C o n t r o l s w e r e t a k e n o r a l o r a b o r a l t o t h e d e n e r v a t e d s e g m e n t . B . P a s s i v e t e n s i o n r e l a t i o n s h i p s f o r c o n t r o l a n d s u r g i c a l l y - d e n e r v a t e d L M M P P s . P a s s i v e t e n s i o n w a s g e n e r a t e d b y s t r e t c h i n g t h e p r e p a r a t i o n s b y 0 . 5 m m i n c r e m e n t s a n d a l l o w i n g t h e p r e p a r a t i o n s t o r e a c h s t e a d y - s t a t e t e n s i o n a s d e s c r i b e d i n t h e t e x t . D a t a w e r e p o o l e d f r o m 6 p r e p a r a t i o n s f r o m 2 a n i m a l s , a n d w e r e n o r m a l i z e d f o r m a x i m u m a c t i v e t e n s i o n . C . A c t i v e t e n s i o n r e l a t i o n s h i p s f o r c o n t r o l a n d s u r g i c a l l y - d e n e r v a t e d i l e u m . A c t i v e t e n s i o n w a s g e n e r a t e d b y a p p l i c a t i o n o f h i s t a m i n e ( 3 p M ) , a n d t h e m a x i m u m a g o n i s t - i n d u c e d c o n t r a c t i l e e v e n t w a s m e a s u r e d a s d e s c r i b e d i n t h e t e x t . D a t a w e r e p o o l e d f r o m 6 p r e p a r a t i o n s f r o m 2 a n i m a l s a n d w e r e n o r m a l i z e d f o r m a x i m u m a c t i v e t e n s i o n . P r e p a r a t i o n s w e r e d e n e r v a t e d 4 o r 7 w e e k s p r i o r t o e x p e r i m e n t . ) o t n o i s n e t n o i s n e t e v i t c a m u m i x a m 6 9 n o i s n e t e v i t c a m u m i x a m 6 9 F i g u r e 3 4 . A 1 . 0 0 " 1 . 0 0 ' 2 2 4 L L A - A ‘ L ‘ o . o o ' 0 . 1 2 0 0 ' 1 0 0 " 1 2 0 ' 0 0 ’ 4 0 ’ 1 0 0 " 0 0 ' 4 0 ' 0 0 . 4 0 A A A A A A A I [ h i s t a m i n e ] ( I I I ) ‘ 8 1 . 0 0 1 . 2 0 J L 0 . 0 0 0 . 8 0 1 . 0 0 1 . 2 0 L I L o 2 2 5 d e c o m p o s e s t o N O a n d t h i s e x o g e n o u s N O - d o n o r m i m i c k e d n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s ( F i g u r e 3 7 ) , i n a g r e e m e n t w i t h o t h e r s t u d i e s ( O s t h a u s a n d G a l l i g a n , 1 9 9 1 ) . F o u r a n d s e v e n w e e k s a f t e r s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , t r a n s m u r a l s t i m u l a t i o n ( 2 0 H z ) o f h i s t a m i n e ( 3 u M ) - c o n t r a c t e d L M M P P s f r o m s u r g i c a l l y - d e n e r v a t e d i l e u m p r o d u c e d r e l a x a t i o n s w i t h l a r g e r a m p l i t u d e s a n d d u r a t i o n o f r e l a x a t i o n a s c o m p a r e d t o c o n t r o l p r e p a r a t i o n s f r o m t h e s a m e a n i m a l s ( F i g u r e 3 5 A ) . A l l r e l a x a t i o n s w e r e i n h i b i t e d b y T T X ( 3 0 0 n M ) , i n d i c a t i n g t h e r e l a x a t i o n s r e s u l t e d f r o m s t i m u l a t i o n o f e n t e r i c n e r v e s . F r e q u e n c y - r e s p o n s e c u r v e s f o r e x t r i n s i c a l l y - d e n e r v a t e d a n d c o n t r o l L M M P P s w e r e e x a m i n e d t o d e t e r m i n e i f t h e f r e q u e n c y o f n e r v e s t i m u l a t i o n a f f e c t e d t h e a m p l i t u d e o f r e l a x a t i o n o f L M M P P s , a n d i f t h i s r e l a t i o n s h i p w a s a l t e r e d b y l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s . A s s h o w n i n F i g u r e 3 5 B , t h e r e l a x a t i o n a m p l i t u d e o f c o n t r o l a n d d e n e r v a t e d p r e p a r a t i o n s w a s d e p e n d e n t o n t h e f r e q u e n c y o f n e r v e s t i m u l a t i o n , a s v e r y s m a l l r e l a x a t i o n s w e r e o b s e r v e d a t l o w f r e q u e n c y n e r v e s t i m u l a t i o n , a n d t h e a m p l i t u d e o f r e l a x a t i o n s i n c r e a s e d a s t h e f r e q u e n c y o f n e r v e s t i m u l a t i o n i n c r e a s e d . F u r t h e r m o r e , i n c r e a s i n g t h e f r e q u e n c y o f n e r v e s t i m u l a t i o n p o t e n t i a t e d t h e a m p l i t u d e o f n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s i n n o r m a l ( d a t a n o t s h o w n ) , c o n t r o l , a n d s u r g i c a l l y - d e n e r v a t e d p r e p a r a t i o n s ( F i g u r e 3 5 B ) . A l t h o u g h t h e a m p l i t u d e o f r e l a x a t i o n o f L M M P P s f r o m c o n t r o l a n d s u r g i c a l l y - d e n e r v a t e d s e g m e n t s o f i l e u m w a s s i m i l a r w h e n 1 , 2 , a n d 5 H z t r a i n s t i m u l i w a s u s e d , s i g n i fi c a n t l y l a r g e r r e l a x a t i o n s w e r e o b s e r v e d i n d e n e r v a t e d p r e p a r a t i o n s a t 1 0 , 2 0 , a n d 5 0 H z n e r v e s t i m u l a t i o n ( F i g u r e 3 5 ) . F o r e x a m p l e , t h e a m p l i t u d e o f n e r v e - e v o k e d r e l a x a t i o n s o f L M M P P s f r o m d e n e r v a t e d s e g m e n t s o f i l e u m w a s 1 3 % l a r g e r t h a n c o n t r o l s w h e n n e r v e s w e r e s t i m u l a t e d a t 5 H z ; h o w e v e r , t h e r e l a x a t i o n a m p l i t u d e o f L M M P P s p r e p a r e d f r o m d e n e r v a t e d s e g m e n t s o f i l e u m w a s 9 3 % l a r g e r w h e n i n t r i n s i c n e r v e s w e r e s t i m u l a t e d a t 2 2 6 F i g u r e 3 5 . N e u r o g e n i c N A N C r e l a x a t i o n s o f p r e c o n s t r i c t e d l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l a n d d e n e r v a t e d i l e u m . A . N e r v e - m e d i a t e d r e l a x a t i o n s o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m a n u n o p e r a t e d ( c o n . , c o n t r o l ) a n d s u r g i c a l l y - d e n e r v a t e d ( d e n . ) l o o p o f i l e u m . R e l a x a t i o n s w e r e i n d u c e d b y t r a i n s o f e l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n , a s d e s c r i b e d i n t h e t e x t . T h e h o r i z o n t a l a x i s i s 0 . 1 m i n , a n d t h e v e r t i c a l a x i s i s 0 . 5 g . B . E l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n o f L M M P P s p r o d u c e s a f r e q u e n c y - d e p e n d e n t i n c r e a s e i n t h e a m p l i t u d e o f r e l a x a t i o n i n c o n t r o l a n d d e n e r v a t e d t i s s u e s . D i f f e r e n c e s w e r e n o t o b s e r v e d b e t w e e n n o r m a l a n d c o n t r o l L M M P P s ( d a t a n o t s h o w n ) . I l e a l p r e p a r a t i o n s w e r e d e n e r v a t e d 4 - 7 w e e k s p r i o r t o t h e e x p e r i m e n t a n d d a t a a r e m e a n s o f a m p l i t u d e s o f n e r v e - e v o k e d r e l a x a t i o n s o f p r e - c o n t r a c t e d i l e u m f r o m 8 - 1 4 p r e p a r a t i o n s . * r e p r e s e n t s p < 0 . 0 5 a s c o m p a r e d t o a n i m a l - m a t c h e d c o n t r o l s . ) 9 ( n o i t a x a l e r F i g u r e 3 5 . 2 2 7 5 H z 1 0 H z 2 0 H z d e n . W W ” " V ‘ V ' - ° - c o n t r o l - - * - d e n e r v a t e d _ | n e r v e s t i m u l a t i o n ( H z ) 2 2 8 5 0 H z . E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n I n c r e a s e s N i t r i n e r g i c N e u r o g e n i c R e l a x a t i o n s o f L o n g i t u d i n a l M u s c l e M y e n t e r i c P l e x u s P r e p a r a t i o n s F r e q u e n c y - r e s p o n s e c u r v e s w e r e g e n e r a t e d i n t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f L N A ( 3 0 0 u M ) t o d e t e r m i n e i f t h e d e n e r v a t i o n - i n d u c e d p o t e n t i a t i o n o f n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s r e s u l t e d f r o m i n c r e a s e d p r o d u c t i o n o f N O . I n L M M P p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l a n i m a l s ( 1 7 p r e p a r a t i o n s , 4 a n i m a l s ) , L N A ( 3 0 0 u M ) s i g n i fi c a n t l y a t t e n u a t e d r e l a x a t i o n s g e n e r a t e d a t 1 0 - 5 0 H z n e r v e s t i m u l a t i o n ( d a t a n o t s h o w n ) . H o w e v e r , d i f f e r e n c e s w e r e n o t o b s e r v e d a t 1 - 5 H z , i n d i c a t i n g t h e s m a l l a m p l i t u d e r e l a x a t i o n s o b s e r v e d a t t h e s e f r e q u e n c i e s w e r e n o t m e d i a t e d b y N O . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b t a i n e d i n L M M P p r e p a r a t i o n s f r o m c o n t r o l a n d d e n e r v a t e d L M M P p r e p a r a t i o n s ( F i g u r e 3 6 ) , a s n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s p r o d u c e d b y 1 0 - 5 0 H z n e r v e s t i m u l a t i o n w e r e i n h i b i t e d b y L N A ( 3 0 0 u M ) . T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t d e n e r v a t i o n - i n d u c e d p o t e n t i a t i o n o f n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s r e s u l t e d f r o m i n c r e a s e d N O , a s r e l a x a t i o n s w e r e a t t e n u a t e d b y a k n o w n , p r e v i o u s l y - c h a r a c t e r i z e d N O S a n t a g o n i s t . F u r t h e r m o r e , L N A d i d n o t a t t e n u a t e r e l a x a t i o n s o f c o n t r o l o r d e n e r v a t e d p r e p a r a t i o n s a t f r e q u e n c i e s b e l o w 5 H z , s u g g e s t i n g t h a t l o w f r e q u e n c y r e l a x a t i o n s a r e n o t m e d i a t e d b y N O , b u t b y a n u n i d e n t i fi e d i n h i b i t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r . F i n a l l y , t h e f r e q u e n c y - d e p e n d e n c e o f L N A o f f e r s a n e x p l a n a t i o n f o r t h e l a c k o f p o t e n t i a t i o n o f l o w f r e q u e n c y r e l a x a t i o n s a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n . A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s i n c r e a s e s N O S - i r a n d N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g i n m y e n t e r i c n e u r o n s , a n d p o t e n t i a t e s n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s a t 1 0 - 5 0 H z s t i m u l a t i o n . H o w e v e r , e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n m a y n o t p o t e n t i a t e l o w f r e q u e n c y r e l a x a t i o n s , a s l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s d o e s n o t a l t e r t h e u n i d e n t i fi e d n e u r o t r a n s m i t t e r ( s ) r e l e a s e d a t 1 - 5 H z . 2 2 9 0 . 6 0 r . . A 0 . 4 8 ’ 5 ! C . ' . 2 0 3 6 ' 5 x 0 . 2 4 ' . 2 2 0 . 1 2 " 0 . 0 0 ‘ ‘ ‘ “ ” ‘ 0 . 1 1 0 0 t r e q u e n c y ( H z ) F i g u r e 3 6 . N i t r o - L - a r g i n i n e a t t e n u a t e s n e u r o g e n i c N A N C r e l a x a t i o n s o f L M M P P s f r o m c o n t r o l a n d d e n e r v a t e d i l e u m . A m p l i t u d e s o f n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s o f L M M P P s f r o m c o n t r o l ( c l o s e d c i r c l e s ) a n d d e n e r v a t e d ( c l o s e d t r i a n g l e s ) s e g m e n t s o f i l e u m a r e d e p e n d e n t o n t h e f r e q u e n c y o f n e r v e s t i m u l a t i o n . L N A ( 3 0 0 u M ) s i g n i fi c a n t l y a t t e n u a t e d n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s g e n e r a t e d a t 1 0 , 2 0 , a n d 5 0 H z s t i m u l a t i o n i n c o n t r o l ( o p e n c i r c l e s ) a n d d e n e r v a t e d ( o p e n t r i a n g l e s ) p r e p a r a t i o n s . L N A w a s a d d e d t o t i s s u e s 3 0 m i n p r i o r t o e x p e r i m e n t s . D a t a a r e m e a n s o f a m p l i t u d e o f r e l a x a t i o n s o f p r e c o n t r a c t e d t i s s u e s : 1 : S E M f o r 1 2 p r e p a r a t i o n s f r o m 2 a n i m a l s d e n e r v a t e d 4 w e e k s p r i o r t o e x p e r i m e n t . A l t h o u g h n o t i n d i c a t e d , n e r v e - e v o k e d r e l a x a t i o n s ( 1 0 - 5 0 H z ) a r e s i g n i fi c a n t l y l a r g e r i n d e n e r v a t e d p r e p a r a t i o n s , a n d L N A s i g n i fi c a n t l y a t t e n u a t e d r e l a x a t i o n s i n c o n t r o l a n d d e n e r v a t e d p r e p a r a t i o n s a t 1 0 - 5 0 H z n ' a n s m u r a l s t i m u l a t i o n ( p < 0 . 0 5 ) . 2 3 0 D e n e r v a t i o n - I n d u c e d P o t e n t i a t i o n o f N e u r o g e n i c R e l a x a t i o n s D o e s N o t R e s u l t F r o m A l t e r a t i o n s i n L o n g i t u d i n a l M u s c l e P r o c e e d i n g e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , l a r g e r n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s c o u l d r e s u l t f r o m i n c r e a s e d r e l e a s e o f i n h i b i t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r , s u c h a s N O . H o w e v e r , l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s m a y i n d u c e a l t e r a t i o n s i n l o n g i t u d i n a l m u s c l e , r e s u l t i n g i n i n c r e a s e d s e n s i t i v i t y t o i n h i b i t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r s . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e s f o r s o d i u m n i t r o p r u s s i d e ( S N P ) w e r e e x a m i n e d i n L M M P P s f r o m c o n t r o l a n d d e n e r v a t e d r e g i o n s t o d e t e r m i n e i f e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n p o t e n t i a t e d t h e r e s p o n s i v e n e s s o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e t o e x o g e n o u s N O . A s s h o w n i n F i g u r e 3 7 , e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n d i d n o t a l t e r S N P - i n d u c e d ( 1 - 3 0 u M ) r e l a x a t i o n s o f p r e c o n t r a c t e d L M M P P s , a s t h e a m p l i t u d e o f r e l a x a t i o n s w e r e n o t d i f f e r e n t i n d e n e r v a t e d o r c o n t r o l p r e p a r a t i o n s . T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t d e n e r v a t i o n - i n d u c e d p o t e n t i a t i o n o f r e l a x a t i o n s d o e s n o t r e s u l t f r o m c h a n g e s i n s e n s i t i v i t y o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e , b u t f r o m i n c r e a s e d i n h i b i t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r r e l e a s e . L o s s o f P r i m a r y A f f e r e n t I n n e r v a t i o n I n c r e a s e s N i t r i n e r g i c N e u r o g e n i c R e l a x a t i o n s o f L o n g i t u d i n a l M u s c l e M y e n t e r i c P l e x u s P r e p a r a t i o n s A s s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n d e s t r o y s e x t r i n s i c s y m p a t h e t i c a n d s e n s o r y n e r v e s , 6 - O H - D A a n d c a p s a i c i n w e r e u s e d t o e l i m i n a t e s y m p a t h e t i c a n d s e n s o r y n e r v e s r e s p e c t i v e l y . T h e a m p l i t u d e o f n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s w a s n o t a l t e r e d o n e a n d f o u r w e e k s a f t e r a d m i n i s t r a t i o n o f 6 - O H - D A , a s t h e f r e q u e n c y — r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p f r o m p r e p a r a t i o n s m a d e f r o m i l e u m o f 6 - O H - D A - t r e a t e d a n i m a l s ( 8 p r e p a r a t i o n s , 2 a n i m a l s ) w e r e n o t d i f f e r e n t f r o m f r e q u e n c y - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p s f r o m v e h i c l e - t r e a t e d a n i m a l s ( 6 p r e p a r a t i o n s , 2 a n i m a l s ) ( F i g u r e 3 8 A ) . H o w e v e r , s e v e n w e e k s a f t e r a d m i n i s t r a t i o n o f c a p s a i c i n ( l 4 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) s i g n i fi c a n t l y l a r g e r n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s w e r e o b s e r v e d a t 2 0 a n d 5 0 H z n e r v e s t i m u l a t i o n a s c o m p a r e d t o p r e p a r a t i o n s f r o m c o n t r o l - d e n e r v a t e d 1 5 0 - g . . . 2 1 2 0 ‘ 5 x s o - 2 3 c o - a ? s o - o — 1 3 1 0 s o [ s o d i u m n i t r o p r u s s i d e ] m m F i g u r e 3 7 . S o d i u m n i t r o p r u s s i d e m i m i c s n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s i n l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m c o n t r o l a n d d e n e r v a t e d i l e u m . N o n - c u m u l a t i v e c o n c e n t r a t i o n s o f S N P w e r e a p p l i e d t o p r e - c o n t r a c t e d L M M P P s , a n d t h e d a t a a r e e x p r e s s e d a s m e a n s o f % l o s s o f h i s t a m i n e - i n d u c e d t o n e i S E M . A n i m a l s w e r e d e n e r v a t e d 4 a n d 7 w e e k s p r i o r t o t h e e x p e r i m e n t . 2 3 2 v e h i c l e - t r e a t e d a n i m a l s ( 9 p r e p a r a t i o n s , 2 a n i m a l s ) ( F i g u r e 3 8 B ) . T h e s e r e l a x a t i o n s w e r e a t t e n u a t e d b y L N A i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r ( 1 - 3 0 0 u M ) ( d a t a n o l t s h o w n ) , s i m i l a r t o r e s u l t s o b t a i n e d f r o m s u r g i c a l l y - d e n e r v a t e d i l e u m . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t l o s s o f e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e s , b u t n o t s y m p a t h e t i c n e r v e s , a c c o u n t s f o r i n c r e a s e d p o t e n t i a t i o n o f n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s . E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n D e c r e a s e s R e b o u n d C o n t r a c t i o n s o f L o n g i t u d i n a l M u s c l e M y e n t e r i c P l e x u s P r e p a r a t i o n s F o l l o w i n g n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e , a m o n o p h a s i c c o n t r a c t i l e e v e n t i s o b s e r v e d i n n o r m a l t i s s u e s ( O s t h a u s a n d G a l l i g a n , 1 9 9 2 ) . T h e s e c o n t r a c t i l e e v e n t s , r e f e r r e d t o a s r e b o u n d o r o f f c o n t r a c t i o n s , a r e m e d i a t e d b y S P . I n n o r m a l t i s s u e s , S P , o r s u b s t a n c e P m e t h y l e s t e r ( S P M E ) , a N K l r e c e p t o r a g o n i s t , p r o d u c e d c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t ( 1 - 3 0 0 n M ) c o n t r a c t i o n s i n t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f T T X ( 3 0 0 n M ) ( d a t a n o t s h o w n ) . F u r t h e r m o r e , C P - 9 6 , 3 4 5 - l , a n o n - p e p t i d e N K , r e c e p t o r a n t a g o n i s t , a n t a g o n i z e d S P c o n t r a c t i o n s i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r ( F i g u r e 3 9 ) , r e s u l t i n g i n p a r a l l e l s h i f t s i n S P c o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e s ( F i g u r e 3 9 ) . S c h i l d a n a l y s i s o f t h e s e d a t a r e v e a l e d a s l o p e n o t s i g n i fi c a n t l y d i f f e r e n t f r o m 1 ( F i g u r e 3 9 B ) , a l l o w i n g e s t i m a t i o n o f t h e c o n c e n t r a t i o n o f C P - 9 6 , 3 4 5 - l n e c e s s a r y t o p r o d u c e a 2 - f o l d s h i f t i n t h e S P c o n c e n t r a t i o n r e s p o n s e c u r v e ( p A z ; p A 2 = 8 . 2 3 ) . S c h i l d a n a l y s i s a l s o a l l o w e d e s t i m a t i o n o f t h e a n t a g o n i s t d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t ( K b ; K b = 5 . 8 n M ) . T h i s c o n s t a n t i s s i m i l a r t o d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s f o r N K | r e c e p t o r s i n g u i n e a p i g i l e u m ( s e e G e r a r d e t a l . , 1 9 9 3 ) , i n d i c a t i n g C P - 9 6 , 3 4 5 - 1 i s a v a l u a b l e a n t a g o n i s t i n t h e s t u d y o f t a c h y k i n i n r e c e p t o r s . F o u r a n d s e v e n w e e k s a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , t h e a m p l i t u d e o f r e b o u n d c o n t r a c t i o n s w e r e s i g n i fi c a n t l y a t t e n u a t e d a s c o m p a r e d t o c o n t r o l p r e p a r a t i o n s ( F i g u r e s 2 3 3 F i g u r e 3 8 . F r e q u e n c y d e p e n d e n c e o f n e u r o g e n i c N A N C r e l a x a t i o n s o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m a n i m a l s t r e a t e d w i t h 6 - O H - D A o r c a p s a i c i n . A . E l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n o f L M M P P s p r o d u c e d a f r e q u e n c y - d e p e n d e n t i n c r e a s e i n t h e a m p l i t u d e o f r e l a x a t i o n s i n v e h i c l e - a n d 6 - O H - D A - t r e a t e d p r e p a r a t i o n s . B . E l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n o f L M M P P s p r o d u c e d a f r e q u e n c y - d e p e n d e n t i n c r e a s e i n t h e a m p l i t u d e o f r e l a x a t i o n s i n v e h i c l e - a n d c a p s a i c i n - t r e a t e d p r e p a r a t i o n s . * r e p r e s e n t s p < 0 . 0 5 a s c o m p a r e d t o v e h i c l e - t r e a t e d c o n t r o l s . 2 3 4 F i g u r e 3 8 . - 0 - v e h i c l e - 0 - 6 - O H - D A 0 . 7 0 - : 9 0 . 5 6 - c P . 2 0 . 4 2 l _ _ _ x 0 . 2 8 - / . e , _ , 3 ' i / i 2 0 . 1 4 - 9 ’ i / I é / L 0 . 0 0 . - * L ‘ 1 U ' 0 . 1 1 1 0 1 0 0 n e r v e s t i m u l a t i o n ( H z ) - * ' - v e h i c l e ' 1 ' “ c a p s a i c i n 0 . 7 0 - 3 0 . 5 6 - g 0 . 4 2 - 7 6 x 0 . 2 8 ' . 2 g 0 . 1 4 - 0 . 0 0 * - 0 . 1 n e r v e s t i m u l a t i o n ( H z ) 2 3 5 3 8 A a n d 3 8 B ) . F r e q u e n c y - r e s p o n s e c u r v e s w e r e g e n e r a t e d t o d e t e r m i n e i f d e n e r v a t i o n - i n d u c e d a t t e n u a t i o n o f n e r v e - e v o k e d N A N C c o n t r a c t i o n s w a s f r e q u e n c y d e p e n d e n t . A s s h o w n i n F i g u r e s 4 1 A a n d 4 1 B , i n c r e a s e d f r e q u e n c y o f n e r v e s t i m u l a t i o n p o t e n t i a t e d t h e a m p l i t u d e s o f r e b o u n d c o n t r a c t i o n s i n a l l t i s s u e s e x a m i n e d . F u r t h e r m o r e , l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n a t t e n u a t e d t h e a m p l i t u d e s o f r e b o u n d c o n t r a c t i o n a s c o m p a r e d t o r e s p o n s e s o f c o n t r o l p r e p a r a t i o n s a t a l l f r e q u e n c i e s e x a m i n e d . T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t d e n e r v a t i o n - i n d u c e d a l t e r a t i o n s i n r e b o u n d c o n t r a c t i o n s a r e n o t d e p e n d e n t o n t h e f r e q u e n c y o f n e r v e s t i m u l a t i o n . C P - 9 6 , 3 4 5 - l ( 1 - 3 0 0 n M ) i n h i b i t e d r e b o u n d c o n t r a c t i o n s i n c o n t r o l a n d d e n e r v a t e d t i s s u e i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r ( F i g u r e 4 1 A ) , i n d i c a t i n g t h a t l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s d i d n o t a l t e r t h e i d e n t i t y o f n e u r o t r a n s m i t t e r u s e d t o m e d i a t e r e b o u n d c o n t r a c t i o n s . F u r t h e r m o r e , C P - 9 6 , 3 4 5 - 1 d i d n o t a l t e r t h e b e t h a n e c h o l c o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e s o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e ( F i g u r e 4 0 B ) . T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t C P - 9 6 , 3 4 5 - 1 d o e s n o t i n h i b i t n e u r o g e n i c a c t i v i t y b y n o n - s e l e c t i v e a l t e r a t i o n s i n c o n t r a c t i b i l i t y o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e , b u t r a t h e r i n h i b i t s S P n e u r o t r a n s m i s s i o n b y a n a c t i o n a t N K 1 r e c e p t o r s o n l o n g i t u d i n a l m u s c l e . U s e o f t h e N K , r e c e p t o r a n t a g o n i s t d i d n o t d e t e r m i n e i f t h e d e n e r v a t i o n - i n d u c e d l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n d e c r e a s e d r e l e a s e o f e x c i t a t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r s , o r d e c r e a s e d c o n t r a c t i b i l i t y o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e . H o w e v e r , a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , s u r g i c a l d e n e r v a t i o n d i d n o t a l t e r t h e a m p l i t u d e o f h i s t a m i n e c o n t r a c t i o n s , i n d i c a t i n g l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s d i d n o t a f f e c t c o n t r a c t i l e p r o p e r t i e s o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e . F i n a l l y , a s i m i l a r a t t e n u a t i o n o f r e b o u n d c o n t r a c t i o n s w a s o b s e r v e d i n p r e p a r a t i o n s m a d e f r o m a n i m a l s t r e a t e d w i t h c a p s a i c i n ( F i g u r e 4 3 A ) , b u t n o t 6 - O H - D A ( F i g u r e 4 3 B ) . 2 3 6 F i g u r e 3 9 . C P - 9 6 , 3 4 5 - 1 a n t a g o n i z e d s u b s t a n c e P - i n d u c e d c o n t r a c t i o n s o f L M M P P s f r o m n o r m a l i l e u m . A . C o n c e n t r a t i o n r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p s f o r S P i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f i n d i c a t e d c o n c e n t r a t i o n s o f C P - 9 6 , 3 4 5 - 1 . D a t a a r e m e a n 1 : S E M o f a m i n i m u m o f e i g h t o b s e r v a t i o n s p e r p o i n t . B . S c h i l d a n a l y s i s o f d a t a i n A y i e l d e d a s l o p e o f 1 . 0 7 : i : 0 . 1 1 ( n o t s i g n i fi c a n t l y d i f f e r e n t f r o m 1 . 0 ) a n d a p A 2 v a l u e o f 8 . 2 3 . D a t a k i n d l y p r o v i d e d b y D r . J . J . G a l l i g a n f r o m e x p e r i m e n t s p e r f o r m e d b y C . M a r t i n . ) 9 ( n o i s n e t ) 1 - 8 0 ( g o l F i g u r e 3 9 A 2 3 7 C P - 9 6 , 3 4 5 - 1 ( n M ) - 0 - - O - — - — — Q — 0 1 0 3 0 1 0 0 1 . 4 0 - e l T T ; / T / O 0 . 7 0 - i g e / o / * L 0 . 0 0 - + - - 1 ° ” 1 0 “ 1 0 ” 1 0 * [ s u b s t a n c e P l ( M ) 1 . 5 0 - _ 2 1 . 0 0 - 0 . 5 0 - 0 . 0 0 - 8 . 5 0 - 8 . 0 0 - 7 . 5 0 - 7 . 0 0 l o g [ O P - 9 6 , 3 4 5 - 1 ] ( M ) 2 3 8 F i g u r e 4 0 . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e s f o r C P - 9 6 , 3 4 5 - 1 - m e d i a t e d i n h i b i t i o n o f n e r v e - e v o k e d , n o n - c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s o f n o r m a l , c o n t r o l , a n d d e n e r v a t e d L M M P P s . A . C P - 9 6 , 3 4 5 - l i n h i b i t s n e r v e - e v o k e d n o n - c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s o f L M M P P s i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r . B . C P - 9 6 , 3 4 5 - 1 d i d n o t a f f e c t c o n t r a c t i o n s p r o d u c e d b y b e t h a n e c h o l i n n o r m a l i l e u m . D a t a a r e e x p r e s s e d a s m e a n o f c o n t r a c t i o n a m p l i t u d e ( g ) , f r o m a m i n i m u m o f n i n e p r e p a r a t i o n s . ) a ( n o i s n e t ) 9 ( n o i s n e t 2 3 9 F i g u r e 4 0 . A - 0 - R O M ! “ - 0 - c o n t r o l “ A - d e n e r v a t e d 0 . 4 0 - 0 . 0 2 - i 0 . 2 4 - ¥ \ l 0 . 1 6 . I \ O \ c T > / ° \ g u 0 . 0 a - l \ § k T 0 . 0 0 - 8 — § ; 3 o n 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 [ O P - 9 6 , 3 4 5 - 1 l ( n M ) — o - o - 0 - 1 0 ' A - 3 0 * V — 1 0 0 c p - s s , s 4 5 - 1 ( n u ) 3 . 5 0 . 2 . 8 0 i 2 . 1 0 . 1 . 4 0 - 0 . 7 0 - 0 . 0 0 ‘ * 0 . 1 1 1 0 1 0 0 b e t h a n e c h o l ( H M ) 2 4 0 F i g u r e 4 1 . N e u r o g e n i c N A N C c o n t r a c t i o n s o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m c o n t r o l a n d d e n e r v a t e d i l e u m . A . N e r v e - m e d i a t e d c o n t r a c t i o n s o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m a n u n o p e r a t e d a n d s u r g i c a l l y - d e n e r v a t e d l o o p o f i l e u m . C o n t r a c t i o n s w e r e i n d u c e d b y t r a i n s o f e l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n , a s d e s c r i b e d i n t h e t e x t . T h e h o r i z o n t a l a x i s i s 0 . 1 m i n , a n d t h e v e r t i c a l a x i s i s 0 . 5 g . B . E l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n o f L M M P P s p r o d u c e s a f r e q u e n c y - d e p e n d e n t i n c r e a s e i n t h e a m p l i t u d e o f c o n t r a c t i o n i n c o n t r o l a n d d e n e r v a t e d t i s s u e s . D i f f e r e n c e s w e r e n o t o b s e r v e d b e t w e e n n o r m a l a n d c o n t r o l L M M P P s . I l e a l p r e p a r a t i o n s w e r e d e n e r v a t e d 4 - 7 w e e k s p r i o r t o t h e e x p e r i m e n t . * r e p r e s e n t s p < 0 . 0 5 a s c o m p a r e d t o a n i m a l - m a t c h e d c o n t r o l s . c d o e n n . . $ T 2 4 1 F i g u r e 4 1 . 1 0 H z 2 0 H z + L N A . . _ @ . d e n . W W T 5 0 H z + T T X - o — C o n t r o l - 0 - D e n e r v a t e d 1 . 5 0 - 3 1 . 2 0 r ( I ) v U ’ l c 0 . 9 0 - / 2 * 5 g 0 . 6 0 ' e » a 1 ’ / ' L 0 T T " " 0 . 3 0 - o — — _ a _ _ — 6 / C f ; i : ; / § - — - ; / * 0 . 0 0 ‘ ‘ “ “ ‘ ‘ - . - . . . 0 . 1 1 1 0 1 0 0 N e r v e S t i m u l a t i o n ( H z ) 2 4 2 F i g u r e 4 2 . N e u r o g e n i c N A N C c o n t r a c t i o n s o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m a n i m a l s t r e a t e d w i t h 6 - O H - D A o r c a p s a i c i n . A . E l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n o f L M M P P s p r o d u c e d f r e q u e n c y - d e p e n d e n t i n c r e a s e s i n a m p l i t u d e o f c o n t r a c t i o n i n v e h i c l e - a n d 6 - O H - D A - t r e a t e d p r e p a r a t i o n s . B . E l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n o f L M M P P s p r o d u c e d f r e q u e n c y - d e p e n d e n t i n c r e a s e s i n a m p l i t u d e o f c o n t r a c t i o n s i n v e h i c l e - a n d c a p s a i c i n - t r e a t e d p r e p a r a t i o n s . * r e p r e s e n t s p < 0 . 0 5 a s c o m p a r e d t o v e h i c l e - t r e a t e d c o n t r o l s . 2 4 3 F i g u r e 4 2 . ' 0 ' v e h i c l e - ' - 5 - 0 H - D A 1 . 5 0 - A 1 . 2 0 " 3 T ' _ o C 0 . 9 0 / . 2 t g 0 . 0 0 - r / ' 3 0 s o - k 3 5 ¢ g 5 7 8 / l 1 1 r 0 . 0 0 A L A A A A A A A I L A L I 0 . 1 1 1 0 1 0 0 n e r v e s t i m u l a t i o n ( H z ) ' 0 - v e h i c l e ' 2 - c a p s a i c i n 1 . 5 0 - A 1 . 2 0 ' T 8 r c 0 . 9 0 . ’ / e 2 T a - ' 0 c 0 . 6 0 . / . L o r " ' 0 . 3 0 - T T 5 / 3 O f f / J - 0 . 0 0 “ M L ' 7 0 . 1 1 1 0 1 0 0 n e r v e s t i m u l a t i o n ( H z ) 2 4 4 I n t e r e s t i n g l y , l o s s o f p r i m a r y a f f e r e n t n e r v e s a l s o m i m i c k e d d e n e r v a t i o n - i n d u c e d c h a n g e s i n n i t r i n e r g i c i n n e r v a t i o n , s u g g e s t i n g c o m m o n n e u r o t r a n s m i t t e r s m a y b e i n v o l v e d i n c o n t r o l o f e x c i t a t o r y a n d i n h i b i t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r r e l e a s e . L - n i t r o - a r g i n i n e ( 3 0 0 n M ) p o t e n t i a t e d r e b o u n d c o n t r a c t i o n s b y 2 4 0 % i n c o n t r o l p r e p a r a t i o n s , b u t i n c r e a s e d t h e a m p l i t u d e o f r e b o u n d c o n t r a c t i o n s i n d e n e r v a t e d p r e p a r a t i o n s o n l y b y 5 0 % ( F i g u r e 4 1 A ) . A s l o s s o f e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e s i n c r e a s e s N O S a n d N O , d e c r e a s e d e x c i t a t o r y N A N C n e u r o t r a n s m i s s i o n m a y r e s u l t f r o m i n h i b i t i o n b y N O . T h e r e f o r e , a s d e n e r v a t e d p r e p a r a t i o n s c o n t a i n m o r e N O S a s c o m p a r e d t o c o n t r o l s , L N A i n h i b i t s f e w e r N O S m o l e c u l e s , a n d N O c a n i n h i b i t S P r e l e a s e . H o w e v e r , c o n t r o l t i s s u e s c o n t a i n l e s s N O S , a n d L N A i n h i b i t e d a g r e a t e r p e r c e n t a g e o f t o t a l N O S , t h u s e l i m i n a t i n g n i t r i n e r g i c i n h i b i t i o n o f S P r e l e a s e . A l t e r n a t i v e l y , n e u r o t r a n s m i t t e r s f r o m s e n s o r y n e r v e s a r e v e r y i m p o r t a n t i n m e d i a t i o n o f m o t i l i t y ( s e e i n t r o d u c t i o n ) , a n d d e n e r v a t i o n m a y e l i m i n a t e e x c i t a t o r y i n p u t i n t o n o n - c h o l i n e r g i c m o t o r n e u r o n s ( s e e i n t r o d u c t i o n ) . I n c o n c l u s i o n , t h e r e s u l t s i n t h i s s e c t i o n d e m o n s t r a t e t h a t l o s s o f a s i n g l e p o p u l a t i o n o f e x t r i n s i c n e r v e s h a s p r o f o u n d e f f e c t s o n a n a t o m y a n d e x c i t a t o r y a n d i n h i b i t o r y i n n e r v a t i o n o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e . 2 4 5 7 . N I T R I C O X I D E R E G U L A T E S S U B S T A N C E P B U T N O T A C E T Y L C H O L I N E R E L E A S E I n t r o d u c t i o n a n d E x p e r i m e n t a l R a t i o n a l e A s d e s c r i b e d i n t h e p r e v i o u s s e c t i o n , t r a n s m u r a l n e r v e s t i m u l a t i o n o f L M M P s r e s u l t s i n r e l a x a t i o n o f G I s m o o t h m u s c l e , f o l l o w e d b y c o n t r a c t i l e e v e n t s r e f e r r e d t o a s " o f f " o r " r e b o u n " c o n t r a c t i o n s . A l t h o u g h N O S a n t a g o n i s t s a t t e n u a t e n e u r o g e n i c N A N C r e l a x a t i o n s , n u m e r o u s i n v e s t i g a t o r s h a v e o b s e r v e d t h a t t h e a m p l i t u d e a n d / o r d u r a t i o n o f r e b o u n d c o n t r a c t i o n s i s p o t e n t i a t e d b y N O S a n t a g o n i s t s . G u s t a f s s o n e t a l . ( 1 9 9 0 ) w e r e t h e fi r s t i n v e s t i g a t o r s t o p r o p o s e t h a t N O a c t s a t e n t e r i c p e r i k a r y a o r n e r v e v a r i c o s i t i e s t o i n h i b i t r e l e a s e o f e x c i t a t o r y n o n - c h o l i n e r g i c n e u r o t r a n s m i t t e r s . A d d i t i o n o f N O S a n t a g o n i s t s w o u l d a t t e n u a t e t h i s p r e j u n c t i o n a l i n h i b i t i o n , r e s u l t i n g i n t h e o b s e r v e d p o t e n t i a t i o n o f n e u r o g e n i c r e b o u n d c o n t r a c t i o n s . H o w e v e r , o t h e r i n v e s t i g a t o r s ( O s t h a u s a n d G a l l i g a n , 1 9 9 2 ) h a v e s u g g e s t e d t h a t p o t e n t i a t i o n o f r e b o u n d c o n t r a c t i o n s r e s u l t s f r o m p h y s i o l o g i c a l a n t a g o n i s m b y N O o n t h e a c t i o n o f e x c i t a t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r s o n G 1 s m o o t h m u s c l e . T r a n s m u r a l n e r v e s t i m u l a t i o n r e s u l t s i n r e l e a s e o f e x c i t a t o r y a n d i n h i b i t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r s t h a t a c t d i r e c t l y o n G I s m o o t h m u s c l e . H o w e v e r , a d d i t i o n o f N O S a n t a g o n i s t s w o u l d d e c r e a s e i n h i b i t o r y t o n e t o t h e m u s c l e , r e s u l t i n g i n l a r g e r e x c i t a t o r y r e s p o n s e s , a l t h o u g h r e l e a s e o f e x c i t a t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r s h a s n o t b e e n a l t e r e d . T h e c i r c u l a r m u s c l e r e c e i v e s a d e n s e n i t r i n e r g i c i n n e r v a t i o n f r o m m y e n t e r i c n e u r o n s , a s w e l l a s e x c i t o r y i n n e r v a t i o n f r o m C h A t - / S P - i r m y e n t e r i c n e u r o n s ( B r o o k e s e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h e r e f o r e , c i r c u l a r m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s ( C M M P P s ) w e r e u s e d t o d e t e r m i n e i f e n d o g e n o u s N O m o d u l a t e s S P a n d A C h r e l e a s e f r o m t h e s a m e e n t e r i c n e r v e s . C i r c u l a r m u s c l e p r e p a r a t i o n s w e r e m a d e b y a t t a c h i n g s t r i p s o f c i r c u l a r m u s c l e - 2 4 6 m y e n t e r i c p l e x u s o r r i n g s o f i l e u m p a r a l l e l t o t h e c i r c u l a r m u s c l e t o f o r c e t r a n s d u c e r s . A s t h e s e p r e p a r a t i o n s g a v e s i m i l a r r e s p o n s e s , r i n g s o f i l e u m w e r e u s e d f o r t h e m a j o r i t y o f t h e e x p e r i m e n t s . P r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s i n d i c a t e d t h a t C M M P P s d o n o t m a i n t a i n a c t i v e t e n s i o n i n r e s p o n s e t o h i s t a m i n e ( 1 - 3 0 0 1 1 M ) o r p r o s t a g l a n d i n F 2 m ( 1 - 3 0 0 r i b / D , a l l o w i n g c o n t r a c t i l e a c t i v i t y t o b e s t u d i e d i n t h e a b s e n c e o f n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s o f s m o o t h m u s c l e . F u r t h e r m o r e , a s c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e p r o p e l i n t e s t i n a l c o n t e n t s , n i t r i n e r g i c m o d u l a t i o n o f e x c i t a t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r r e l e a s e w o u l d h a v e p r o f o u n d e f f e c t s o n m o t i l i t y . T r a n s m u r a l S t i m u l a t i o n P r o d u c e s M o n o p h a s i c C o n t r a c t i o n s o f C i r c u l a r M u s c l e I n t h e p r e s e n c e o f s c o p o l a m i n e ( 1 n M ) a n d g u a n e t h i d i n e ( 3 1 1 M ) , t r a n s m u r a l s t i m u l a t i o n c a u s e d m o n o p h a s i c N A N C c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e ( 4 0 p r e p a r a t i o n s , 1 0 a n i m a l s ) ( F i g u r e 4 3 A ) . T h e a m p l i t u d e o f c o n t r a c t i o n s w a s f r e q u e n c y - d e p e n d e n t ( F i g u r e 4 3 B ) , a n d c o n t r a c t i o n s w e r e a b o l i s h e d b y t e t r o d o t o x i n ( 0 . 3 1 1 M ) ( F i g u r e s 4 3 A a n d 4 3 B ) . S p o n t a n e o u s c o n t r a c t i l e a c t i v i t y w a s o b s e r v e d i n 5 / 4 0 p r e p a r a t i o n s , a n d t h i s a c t i v i t y w a s a b o l i s h e d a s t h e f r e q u e n c y o f n e r v e s t i m u l a t i o n i n c r e a s e d . N A N C c o n t r a c t i o n s w e r e a t t e n u a t e d i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r b y C P - 9 6 , 3 4 5 ( l - 3 0 0 n M ) ( 1 6 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) ( F i g u r e 4 3 A a n d F i g u r e 4 3 C ) , a n o n - p e p t i d e n e u r o k i n i n - l ( N K l ) r e c e p t o r a n t a g o n i s t ( S y n d e r e t a l . , 1 9 9 1 ) , a n d w e r e m i m i c k e d b y S P M E ( 1 - 1 0 0 0 n M ) ( 2 2 p r e p a r a t i o n s , 4 a n i m a l s ) , a N K l a g o n i s t ( F i g u r e 4 4 A a n d F i g u r e 4 4 B ) ( H a l l a n d M o r t o n , 1 9 9 1 ) . T h e c o n c e n t r a t i o n o f C P - 9 6 , 3 4 5 t h a t p r o d u c e d h a l f - m a x i m a l i n h i b i t i o n o f 2 0 H z c o n t r a c t i o n s w a s 1 2 i 5 n M a n d t h e S P M E E C 5 0 w a s 2 9 i 8 n M . T h e c o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p f o r S P M E w a s a b o l i s h e d b y a d d i t i o n o f C P - 9 6 , 3 4 5 ( 3 0 0 n M ) ( F i g u r e 4 4 B ) , b u t w a s n o t a l t e r e d b y T T X ( 3 0 0 n M ) ( F i g u r e 4 4 B ) . 2 4 7 F i g u r e 4 3 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f N A N C c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e i n t h e p r e s e n c e o f s c o p o l a m i n e ( 1 n M ) a n d g u a n e t h i d i n e ( 3 n M ) . A . T o p P a n e l : I n c r e a s i n g f r e q u e n c y o f n e r v e s t i m u l a t i o n ( 1 - 5 0 H z , 1 s e c , 0 . 3 m s e c p u l s e d u r a t i o n ) i n c r e a s e s t h e a m p l i t u d e o f c i r c u l a r m u s c l e c o n t r a c t i o n s ; c o n t r a c t i o n s a r e i n h i b i t e d b y T T X ( 3 0 0 n M ) . B o t t o m P a n e l : T h e N K l r e c e p t o r a n t a g o n i s t C P - 9 6 , 3 4 5 i n h i b i t s 2 0 H z N A N C c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r . H o r i z o n t a l a x i s i s 2 5 s e c , a n d v e r t i c a l a x i s i s 1 g . B . F r e q u e n c y - r e s p o n s e c u r v e f o r N A N C c o n t r a c t i o n s i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f T T X ( 3 0 0 n M ) . D a t a a r e m e a n 1 : S E M o f m a x i m u m c o n t r a c t i o n a m p l i t u d e e x p r e s s e d i n g r a m s o f t e n s i o n . C . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e f o r t h e N K I r e c e p t o r a n t a g o n i s t C P - 9 6 , 3 4 5 . D a t a a r e m e a n 1 S E M o f p e r c e n t o f c o n t r o l 2 0 H z N A N C c o n t r a c t i o n s . F i g u r e 4 3 . A l I l l . 2 4 8 ( " 2 ’ 5 0 + T T X 2 0 H z S t i m u l a t i o n _ _ i . ' _ i L 1 0 0 3 0 0 C P - 9 6 , 3 4 5 ( 1 1 M ) J B 3 . 0 0 - ‘ 9 ' N A N C : 9 “ a _ - - - m a c 5 r ' r x T / i § 1 . s o ~ / I / I 3 g 1 . 2 0 - 5 0 5 0 - . - / § / 0 . 0 0 e ' / ‘ ‘ ' ‘ 0 . 1 1 1 0 1 0 0 S t i m u l a t i o n F r e q u e n c y ( H z ) 0 c 1 0 0 ' 3 T 8 8 0 ‘ 2 ‘ ; I . L \ z o 1 \ 3 ' 3 4 0 . E o \ 5 N 2 0 ' L \ - g a s 0 A A A . - . . \ . 9 A . . - o n 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 [ O P - 9 6 , 3 4 5 1 ( n M ) 2 4 9 F i g u r e 4 4 . S P M E m i m i c s N A N C c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e . A . T o p P a n e l : I n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f S P M E i n c r e a s e t h e a m p l i t u d e o f c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e ; c o n t r a c t i o n s a r e n o t i n h i b i t e d b y T T X ( 3 0 0 n M ) . B o t t o m P a n e l : T h e N K I r e c e p t o r a n t a g o n i s t C P - 9 6 , 3 4 5 i n h i b i t s S P M E - e v o k e d c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r . H o r i z o n t a l a x i s i s 2 5 s e c , a n d v e r t i c a l a x i s i s 1 g . B . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e f o r t h e N K l r e c e p t o r a g o n i s t S P M E i n t h e p r e s e n c e o f T T X ( 3 0 0 n M ) o r C P - 9 6 , 3 4 5 ( 3 0 0 n M ) . D a t a a r e m e a n 1 S E M o f m a x i m u m c o n t r a c t i o n a m p l i t u d e e x p r e s s e d i n g r a m s . G u a n e t h i d i n e ( 3 1 1 M ) a n d s c o p o l a m i n e ( 1 n M ) a r e p r e s e n t t h r o u g h o u t t h i s e x p e r i m e n t . 2 5 0 F i g u r e 4 4 . A S P M E 1 0 k J i m . A W ( “ W 1 0 0 + T T X 1 0 0 n M S P M E M h i m , m m 1 0 0 3 0 0 C P - 9 6 , 3 4 5 ( n M ) _ l B 1 . 4 0 : _ . _ S P M E A - ' o - - s p u r s a r r x l / % — i 3 1 - ‘ 2 - — . — S P M E 8 . § : e p - s s , s 4 s l . 2 0 . 8 4 ' ' 5 E 0 . 5 6 - " E O O 0 . 2 8 ' 0 . 0 0 ‘ . 0 . 3 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 [ S P M E ] ( n M ) 2 5 1 F i g u r e 4 5 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e i n t h e p r e s e n c e o f C P - 9 6 , 3 4 5 ( 3 0 0 n M ) a n d g u a n e t h i d i n e ( 3 u M ) . A . T o p P a n e l : I n c r e a s i n g f r e q u e n c y o f n e r v e s t i m u l a t i o n ( 1 - 5 0 H z , 1 s e c , 0 . 3 m s e c p u l s e d u r a t i o n ) i n c r e a s e s t h e a m p l i t u d e o f c i r c u l a r m u s c l e c o n t r a c t i o n s ; c o n t r a c t i o n s a r e i n h i b i t e d b y T T X ( 3 0 0 n M ) . B o t t o m P a n e l : T h e m A C h r e c e p t o r a n t a g o n i s t s c o p o l a m i n e i n h i b i t s 2 0 H z c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r . H o r i z o n t a l a x i s i s 2 5 s e c , a n d v e r t i c a l a x i s i s 1 g . B . F r e q u e n c y - r e s p o n s e c u r v e f o r c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f T T X ( 3 0 0 n M ) . D a t a a r e m e a n i S E M o f m a x i m t u n c o n t r a c t i o n a m p l i t u d e e x p r e s s e d i n g r a m s . C . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e f o r t h e m A C h r e c e p t o r a n t a g o n i s t s c o p o l a m i n e . D a t a a r e m e a n i S E M o f p e r c e n t o f c o n t r o l 2 0 H z c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s . ( u 2 i 0 m S t H Z ) + T T H a t z i l o n i : L _ _ 3 . l . _ _ _ _ 3 _ 0 L 0 X _ 2 5 2 F i g u r e 4 5 . A 1 F r e q u e n c y . _ _ . _ L _ _ . 5 i . s c o p o l a m i n e o ( n M ) J B 3 . 0 0 i - ‘ - c h o l i n e r g i c 3 2 . 4 0 . - I - c h o l i n e r g i c " 8 1 T T X 7 1 : A 3 1 . 8 0 - * ~ 0 8 1 . 2 0 - a c T O o 0 . 6 0 - / / ; 0 . 0 0 ‘ - A W _ ‘ O J 1 1 0 1 0 0 S t i m u l a t i o n F r e q u e n c y ( H z ) C § 1 0 0 l l T 0 6 J . T 1 5 3 ° ’ i \ l T . 2 l \ A — T 0 s o - l 1 o T N . z 4 0 N i A 3 2 ° - 1 a t ! o - - 0 . 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 [ s c o p o l a m i n e ] ( n M ) 2 5 3 F i g u r e 4 6 . B e t h a n e c h o l m i m i c s c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e . A . T o p P a n e l : I n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f b e t h a n e c h o l i n c r e a s e t h e a m p l i t u d e o f c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e ; c o n t r a c t i o n s a r e n o t i n h i b i t e d b y T T X ( 3 0 0 n M ) . B o t t o m P a n e l : T h e m A C h r e c e p t o r a n t a g o n i s t s c o p o l a m i n e i n h i b i t s b e t h a n e c h o l - e v o k e d c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r . H o r i z o n t a l a x i s i s 2 5 s e c , a n d v e r t i c a l a x i s i s 1 g . B . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e f o r t h e m A C h a g o n i s t b e t h a n e c h o l i n t h e p r e s e n c e o f T T X ( 3 0 0 n M ) o r s c o p o l a m i n e ( 1 1 1 M ) . D a t a a r e m e a n 1 S E M o f m a x i m u m c o n t r a c t i o n a m p l i t u d e e x p r e s s e d i n g r a m s . G u a n e t h i d i n e ( 3 n M ) a n d C P - 9 6 , 3 4 5 ( 3 0 0 n M ) a r e p r e s e n t t h r o u g h o u t t h i s e x p e r i m e n t . L P ? “ _ A b b e e t t h h a ( a n H n M e e ) c c h h o o l l s c o i p : ; w M M i o l a m N M + T T X 3 0 _ 0 I 1 1 0 0 0 0 n e ( n M ) 2 5 4 F i g u r e 4 6 . B 3 ' “ " - A - b e t h a n e c h o l | A " ' I - b e t h a n e c h o l 4 3 2 ' 4 0 8 : s c o p o l a m i n e l l ' g 1 . 8 0 ' i L d 7 5 . S 1 . 2 0 - fl a = l o o 0 . 6 0 - fl / ‘ A 2 A A L L A L I 0 . 0 0 : - 0 . 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 [ b e t h a n e c h o l ] ( 1 1 M ) 2 5 5 I n t h e p r e s e n c e o f g u a n e t h i d i n e ( 3 1 1 M ) a n d C P - 9 6 , 3 4 5 ( 3 0 0 n M ) , t r a n s m u r a l m s t i m u l a t i o n e v o k e d m o n o p h a s i c c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e ( 1 8 p r e p a r a t i o n s , 4 a n i m a l s ) . C o n t r a c t i o n a m p l i t u d e w a s f r e q u e n c y - d e p e n d e n t ( F i g u r e 4 5 A a n d F i g u r e 4 5 B ) , a b o l i s h e d b y t e t r o d o t o x i n ( 3 0 0 n M ) ( F i g u r e 4 5 A a n d F i g u r e 4 5 B ) , a n d a t t e n u a t e d i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r b y s c o p o l a m i n e ( 1 - 3 0 0 0 n M ) ( 2 2 p r e p a r a t i o n s , 5 a n i m a l s ) ( F i g u r e 4 5 C ) . F i n a l l y , b e t h a n e c h o l ( 0 . 3 u M - 3 0 0 u M ) m i m i c k e d t h e s e c o n t r a c t i o n s ( 1 7 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) ( F i g u r e 4 6 A a n d F i g u r e 4 6 B ) , w i t h a n E C 5 0 o f 2 0 i 3 u M . A l t h o u g h b e t h a n e c h o l p r o d u c e d c o n t r a c t i o n s i n t h e p r e s e n c e o f T T X ( 3 0 0 n M ) ( F i g u r e 4 6 A ) , a d d i t i o n o f 1 u M s c o p o l a m i n e p r i o r t o b e t h a n e c h o l i n h i b i t e d a l l a g o n i s t - i n d u c e d c o n t r a c t i l e a c t i v i t y ( F i g u r e 4 6 B ) . A s n e u r o g e n i c r e s p o n s e s r e c o r d e d i n t h e p r e s e n c e o f g u a n e t h i d i n e a n d C P - 9 6 , 3 4 5 w e r e m i m i c k e d b y b e t h a n e c h o l a n d a t t e n u a t e d b y s c o p o l a m i n e , t h e s e c o n t r a c t i o n s w e r e m e d i a t e d l a r g e l y b y A C h , a n d r e f e r r e d t o a s " c h o l i n e r g i c " . N i t r i c O x i d e S y n t h a s e I n h i b i t o r s P o t e n t i a t e N A N C b u t n o t C h o l i n e r g i c C o n t r a c t i o n s N G - n i t r o - L - a r g i n i n e ( L N A ) p o t e n t i a t e d 2 0 H z N A N C c o n t r a c t i o n s i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r , w i t h a n E C 5 0 o f 1 8 i 4 u M ( F i g u r e 4 7 ) . T o d e t e r m i n e i f p o t e n t i a t i o n o f N A N C c o n t r a c t i o n s w a s d e p e n d e n t o n f r e q u e n c y o f n e r v e s t i m u l a t i o n , f r e q u e n c y - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p s w e r e g e n e r a t e d i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f 3 0 0 u M L N A . A s s h o w n i n F i g u r e 4 8 , L N A d i d n o t s i g n i fi c a n t l y a l t e r N A N C c o n t r a c t i o n s o b t a i n e d a t 1 o r 2 H z , a l t h o u g h t h e s e p a r a m e t e r s w e r e . s u f fi c i e n t t o e l i c i t N A N C c o n t r a c t i o n s . L o w f r e q u e n c y n e r v e s t i m u l a t i o n ( 1 H z ) p r o d u c e d c o n t r a c t i o n s ( 0 . 1 9 i 0 . 0 6 g , m a x i m u m a m p l i t u d e ) i n 1 2 / 4 0 t i s s u e s , w h e r e a s N A N C c o n t r a c t i o n s ( 0 . 2 8 i 0 . 0 5 g , m a x i m u m a m p l i t u d e ) w e r e o b s e r v e d i n 2 4 / 4 0 p r e p a r a t i o n s s t i m u l a t e d a t 2 H z . H o w e v e r , 2 5 6 F i g u r e 4 7 . E f f e c t s o f L N A o n N A N C a n d c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e . A . T o p P a n e l : L N A p o t e n t i a t e s N A N C c o n t r a c t i o n s ( 2 0 H z , 1 s e c , 0 . 3 m s e c p u l s e d u r a t i o n ) o f c i r c u l a r m u s c l e i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r . B o t t o m P a n e l : L N A d o e s n o t a f f e c t c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s ( 2 0 H z , 1 s e c , 0 . 3 m s e c p u l s e d u r a t i o n ) . H o r i z o n t a l a x i s i s 2 0 s e c , a n d v e r t i c a l a x i s i s 1 g . B . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e e f f e c t s o f L N A o n N A N C a n d c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s . D a t a a r e m e a n i S E M o f p e r c e n t o f c o n t r o l 2 0 H z N A N C o r c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s r e c o r d e d i n t h e p r e s e n c e o f g u a n e t h i d i n e ( 3 1 1 M ) a n d s c o p o l a m i n e ( 1 n M ) o r C P - 9 6 , 3 4 5 ( 3 0 0 n M ) , r e s p e c t i v e l y . 2 5 7 F i g u r e 4 7 . " r 1 . , l l . 1 . l l 1 1 0 0 L N A ( 1 1 M ) . J B . 5 3 0 0 ' ' 3 2 5 0 . . _ . - N A N C 0 . . a - A - c h o l i n e r g i c ; z 2 0 0 " 3 / 4 . 5 / / / ‘ 1 5 0 - . 0 o I / J . a 1 0 0 4 3 / 1 5 0 - 3 ’ 3 8 $ " ‘ “ ‘ “ - ~ ; — — ; — — i " ” ‘ - 5 0 A . 2 . . u 1 . L . . . r “ J 0 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 [ L N A l t u M i . 4 : 0 ) g 1 ( 0 n o - i t s c a u r t n o C o i d o T 1 1 , — - — i . — . ‘ \ _ 2 5 8 _ l 0 " N A N C T o ' - 0 - N A N C a L N A * o / l P L A A L L L A A L A L l A A l I L A L L I 9 i . 5 S t i m u l a t i o n F r e q u e n c y ( H z ) F i g u r e 4 8 . P o t e n t i a t i o n o f n e u r o g e n i c N A N C c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e b y L N A i s f r e q u e n c y d e p e n d e n t . F r e q u e n c y - r e s p o n s e c u r v e s w e r e g e n e r a t e d i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f 3 0 0 u M L N A . D a t a a r e m e a n i S E M o f m a x i m u m c o n t r a c t i o n a m p l i t u d e s f r o m 1 4 p r e p a r a t i o n s i n 3 a n i m a l s . G u a n e t h i d i n e ( 3 u M ) a n d s c o p o l a m i n e ( 1 u M ) a r e p r e s e n t t h r o u g h o u t t h i s e x p e r i m e n t . A s t e r i s k s i n d i c a t e d i f f e r e n c e s f r o m c o n t r o l ( S t u d e n t ’ s t t e s t f o r p a i r e d d a t a ; p < 0 . 0 5 ) . 2 5 9 L N A p o t e n t i a t e d t h e a m p l i t u d e o f N A N C c o n t r a c t i o n s a t 5 , 1 0 , 2 0 , a n d 5 0 H z . T h e N O s y n t h a s e i n h i b i t o r s N G - m e t h y l - L - a r g i n i n e ( L M M A ) ( 1 - 3 0 0 n M ) ( 1 4 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) a n d N G - n i t r o - L - a r g i n i n e m e t h y l e s t e r ( L N A M E ) ( 1 - 3 0 0 n M ) ( 1 6 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) a l s o p o t e n t i a t e d N A N C c o n t r a c t i o n s i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r ( F i g u r e 4 9 ) . L N A M E ( 2 1 i 5 u M , E C S O ) p o t e n t i a t e d 2 0 H z r e s p o n s e s i n 1 2 / 1 6 t i s s u e s ( F i g u r e 4 9 A ) , a n d r e v e a l e d c o n t r a c t i o n s i n 2 / 4 t i s s u e s p r e v i o u s l y n o t e x h i b i t i n g c o n t r a c t i l e a c t i v i t y , w h e r e a s L M M A ( 3 8 i 1 0 1 . 1 M , E C S O ) p o t e n t i a t e d N A N C c o n t r a c t i o n s i n 1 1 / 1 4 t i s s u e s ( F i g u r e 4 9 B ) . U n l i k e L N A M E , a d d i t i o n o f L I V H V I A d i d n o t r e v e a l n e u r o g e n i c c o n t r a c t i l e a c t i v i t y i n u n r e s p o n s i v e t i s s u e s . F i n a l l y , a d d i t i o n o f N O S a n t a g o n i s t s i n c r e a s e d s p o n t a n e o u s a c t i v i t y o f p r e p a r a t i o n s . L N A i n c r e a s e d s p o n t a n e o u s m u s c l e a c t i v i t y i n 6 / 1 6 p r e p a r a t i o n s p r e v i o u s l y n o t e x h i b i t i n g fl u c t u a t i o n s i n b a s a l t o n e . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b s e r v e d w i t h L N A M E a n d L M M A , a s s p o n t a n e o u s a c t i v i t y w a s o b s e r v e d i n 5 / 1 6 a n d 6 / 1 4 p r e p a r a t i o n s r e s p e c t i v e l y ( F i g u r e 5 0 ) ; m o s t o f t h i s a c t i v i t y w a s i n h i b i t e d b y T T X ( 3 0 0 n M ) ( F i g u r e 5 0 ) . T o d e t e r m i n e i f N O S a n t a g o n i s t s a l s o p o t e n t i a t e d c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s , n e u r o g e n i c c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s w e r e r e c o r d e d i n t h e p r e s e n c e o f g u a n e t h i d i n e a n d C P - 9 6 , 3 4 5 . L M M A ( 1 - 3 0 0 n M ) ( 1 2 p r e p a r a t i o n s , 2 a n i m a l s ) ( F i g u r e 4 9 A ) , L N A M E ( 1 - 3 0 0 n M ) ( 1 4 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) ( F i g u r e 4 9 B ) , a n d L N A ( 1 - 3 0 0 n M ) ( 1 6 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) ( F i g u r e 4 7 A a n d F i g u r e 4 7 B ) d i d n o t s i g n i fi c a n t l y a l t e r t h e a m p l i t u d e o r t i m e o f d u r a t i o n o f 2 0 H z c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s . F u r t h e r m o r e , L N A d i d n o t a l t e r t h e a m p l i t u d e o f c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s g e n e r a t e d b y a n y o t h e r f r e q u e n c y o f s t i m u l a t i o n ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e s i t e o f a c t i o n o f N O S a n t a g o n i s t s w a s e l u c i d a t e d b y e x a m i n i n g r e s p o n s e s o f 2 6 0 F i g u r e 4 9 . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e e f f e c t s o f L M M A a n d L N A M E o n N A N C a n d c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e . A . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e e f f e c t s o f L M M A o n N A N C a n d c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s ( 2 0 H z n e r v e s t i m u l a t i o n ) . B . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e e f f e c t s o f L N A M E o n N A N C a n d c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s ( 2 0 H z n e r v e s t i m u l a t i o n ) . D a t a a r e m e a n i S E M o f p e r c e n t o f c o n t r o l 2 0 H z N A N C o r c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s r e c o r d e d i n t h e p r e s e n c e o f g u a n e t h i d i n e ( 3 n M ) a n d s c o p o l a m i n e ( 1 n M ) o r C P - 9 6 , 3 4 5 ( 3 0 0 n M ) , r e s p e c t i v e l y . n o i t c a r t n o C z H 0 2 6 9 n o i t c a r t n o C z H 0 2 6 9 F i g u r e 4 9 . A 3 0 0 2 5 0 ' 2 0 0 1 5 0 1 0 0 3 0 0 2 5 0 2 0 0 1 5 0 1 0 0 2 6 1 - ' - N A N C " 4 - c h o l i n e r g i c b [ L M M A ] ( 1 1 M ) - o - N A N C . - t - c h o l i n e r g i c . / 2 O J 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 [ L N A M E ] ( H M ) 2 6 2 t t 1 _ | F i g u r e 5 0 . L N A M E p o t e n t i a t e s N A N C c o n t r a c t i o n s a n d s p o n t a n e o u s a c t i v i t y o f c i r c u l a r m u s c l e . A . N e r v e s t i m u l a t i o n ( 2 0 H z ) c o n t r a c t s c i r c u l a r m u s c l e . B . L N A M E ( 3 0 0 n M ) a d d e d 1 0 m i n p r i o r t o t h e e x p e r i m e n t p o t e n t i a t e s N A N C c o n t r a c t i o n s a n d i n c r e a s e s s p o n t a n e o u s a c t i v i t y o f c i r c u l a r m u s c l e . C . T T X ( 3 0 0 n M ) a d d e d 1 0 m i n p r i o r t o t h e e x p e r i m e n t i n h i b i t s N A N C c o n t r a c t i o n s a n d s p o n t a n e o u s a c t i v i t y o f c i r c u l a r m u s c l e . A r r o w s i n d i c a t e n e u r o g e n i c c o n t r a c t i o n s . H o r i z o n t a l a x i s i s 2 5 s e c a n d v e r t i c a l a x i s i s 0 . 5 g . G u a n e t h i d i n e ( 3 n M ) a n d s c o p o l a m i n e ( 1 u M ) a r e p r e s e n t t h r o u g h o u t t h i s e x p e r i m e n t . 2 6 3 c i r c u l a r m u s c l e t o S P M E i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f 1 0 ( 8 p r e p a r a t i o n s , 2 a n i m a l s ) o r 1 0 0 u M L N A ( 8 p r e p a r a t i o n s , 2 a n i m a l s ) . S P M E c o n t r a c t i o n s w e r e n o t a l t e r e d b y 1 0 o r 1 0 0 u M L N A ( T a b l e 8 ) . T o v e r i f y t h e s t e r e o - s p e c i fi c i t y o f t h e N O S a n t a g o n i s t s , 1 - 3 0 0 u M N G - m e t h y l - D - a r g i n i n e ( D M M A ) ( 1 1 p r e p a r a t i o n s , 2 a n i m a l s ) a n d N G - n i t r o - D - a r g i n i n e m e t h y l e s t e r ( D N A M E ) ( 1 7 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) w e r e t e s t e d a g a i n s t 2 0 H z N A N C c o n t r a c t i o n s . N e i t h e r D M M A n o r D N A M E a l t e r e d N A N C c o n t r a c t i o n s , a s c o m p a r e d t o e q u a l c o n c e n t r a t i o n s o f L M M A ( F i g u r e 5 1 A ) o r L N A M E ( F i g u r e 5 1 B ) . L - A r g i n i n e ( L A r g ) ( 2 1 p r e p a r a t i o n s , 4 a n i m a l s ) a n d D - a r g i n i n e ( D A r g ) ( 2 0 p r e p a r a t i o n s , 4 a n i m a l s ) w e r e u s e d t o d e t e r m i n e s p e c i fi c i t y a n d r e v e r s i b i l i t y o f N O S a n t a g o n i s t s . N e i t h e r L A r g n o r D A r g ( 1 - 3 0 0 0 u M ) a f f e c t e d 2 0 H z N A N C c o n t r a c t i o n s ( F i g u r e 5 2 ) . F u r t h e r m o r e , n e i t h e r n u m e r o u s w a s h e s ( 1 0 , 1 0 m i n e a c h ) , n o r a d d i t i o n o f L A r g o r D A r g ( l o r 3 m M ) r e v e r s e d p o t e n t i a t i o n o f N A N C n e u r o g e n i c c o n t r a c t i o n s b y L N A ( 3 0 0 1 . 1 M ) ( d a t a n o t s h o w n ) o r L N A M E ( 3 0 0 n M ) i f a d d e d a f t e r a p p l i c a t i o n o f t h e N O S a n t a g o n i s t . H o w e v e r , i f L A r g ( 1 o r 3 m M ) w a s a d d e d t o t h e t i s s u e s p r i o r t o a p p l i c a t i o n o f N O S a n t a g o n i s t s ( l 4 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) , n e i t h e r L N A ( d a t a n o t s h o w n ) o r L N A M E ( F i g u r e 5 2 ) p o t e n t i a t e d N A N C c o n t r a c t i o n s . E q u a l c o n c e n t r a t i o n s o f D A r g d i d n o t p r e v e n t p o t e n t i a t i o n o f 2 0 H z N A N C c o n t r a c t i o n s b y L N A ( d a t a n o t s h o w n ) o r L N A M E ( F i g u r e 5 2 ) . C P - 9 6 , 3 4 5 A t t e n u a t e s N A N C C o n t r a c t i o n s F o l l o w i n g P o t e n t i a t i o n b y N i t r i c O x i d e S y n t h a s e A n t a g o n i s t s A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , 1 - 3 0 0 n M C P - 9 6 , 3 4 5 a t t e n u a t e d n e u r o g e n i c N A N C c o n t r a c t i o n s g e n e r a t e d a t 2 0 H z w i t h a n 1 C , 0 o f 1 2 i 5 n M . C P - 9 6 , 3 4 5 ( 1 - 3 0 0 n M ) a l s o 2 6 4 F i g u r e 5 1 . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e e f f e c t s o f L - a n d D - e n a n t i o m e r s o f X N N A a n d X N A M E o n N A N C c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e . A . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e e f f e c t s o f L M M A a n d D M M A o n N A N C c o n t r a c t i o n s ( 2 0 H z n e r v e s t i m u l a t i o n ) . N o t e t h e L - i s o m e r d a t a h a v e b e e n r e p l o t t e d f r o m F i g . 4 9 A . B . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e e f f e c t s o f L N A M E a n d D N A M E o n N A N C c o n t r a c t i o n s ( 2 0 H z ) . N o t e t h e L - i s o m e r d a t a h a v e b e e n r e p l o t t e d f r o m F i g . 4 9 B . D a t a a r e m e a n s i S E M o f p e r c e n t o f c o n t r o l 2 0 H z N A N C c o n t r a c t i o n s . G u a n e t h i d i n e ( 3 n M ) a n d s c o p o l a m i n e ( 1 n M ) a r e p r e s e n t t h r o u g h o u t t h i s e x p e r i m e n t . u o n o e n u o o 1 H 0 3 9 6 1 1 0 9 0 3 1 1 1 1 0 0 z l - l O Z 9 6 1 I o e i l . 0 . 1 7 0 0 3 0 5 5 0 0 5 5 . I I o o I I . g . 7 n 0 0 8 0 8 2 2 x 3 0 2 5 . z s ‘ 4 2 3 3 3 3 2 : o r . . 0 0 0 — . O i - O - i . r 4 A P 0 0 — o w — . S N v . 0 o n ! o n 0 0 . . o u r O O N o n « 0 0 » _ . . O o n ! 0 O n 0 0 — . c a r 0 0 8 e m u c o n . E 2 : 5 : 2 6 6 F i g u r e 5 2 . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e e f f e c t s o f L - a n d D - a r g i n i n e a n d L N A M E i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f D A r g o r L A r g ( 1 m M ) o n N A N C c o n t r a c t i o n s . A . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p s f o r D A r g a n d L A r g o n N A N C c o n t r a c t i o n s . B . L A r g b u t n o t D A r g p r e v e n t e d p o t e n t i a t i o n o f N A N C c o n t r a c t i o n s ( 2 0 H z s t i m u l a t i o n ) b y L N A M E w h e n a d d e d 1 0 m i n p r i o r , b u t n o t a f t e r , L N A M E . L N A M E p o t e n t i a t e d N A N C c o n t r a c t i o n s e v o k e d b y 2 0 H z s t i m u l a t i o n . D a t a a r e m e a n s i S E M o f p e r c e n t p o t e n t i a t i o n o f c o n t r o l 2 0 H z N A N C c o n t r a c t i o n s . G u a n e t h i d i n e ( 3 I I M ) a n d s c o p o l a m i n e ( 1 p M ) a r e p r e s e n t t h r o u g h o u t t h i s e x p e r i m e n t . 2 6 7 F i g u r e 5 2 . A " " D - i s o m o r - A - L - l c o m o r 5 1 0 0 r 2 0 3 s o ~ U 5 s o - 0 N . 1 4 0 g 2 0 - - - - " - - - - “ - 1 — : 3 - - — - - - 1 0 0 0 1 0 0 0 0 [ X - a r g i n i n o l ( n M ) B - . - L N A M E - + - L N A M E - - - L N A M E & D - A r g & L - A r g S g 2 7 5 ' - 1 ' A g 2 1 5 - T , , / ‘ s I ? " . . o 1 . 5 ’ 1 . i i i ! . L N n : r ; 9 5 o 3 5 P N 3 2 - 2 5 ‘ 0 . 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 [ n l t r o - x - o r g l n l n o m e t h y l e s t e r ] ( I I I ! ) 2 6 8 T a b l e 8 . N i t r o - L - a r g i n i n e d o e s n o t a l t e r t h e a m p l i t u d e o f c i r c u l a r m u s c l e c o n t r a c t i l e r e s p o n s e s t o s u b s t a n c e P m e t h y l e s t e r . S u b s t a n c e P M e t h y l E s t e r ( n M ) L N A ( n M ) 1 0 3 0 1 0 0 3 0 0 1 0 0 0 0 0 . 1 2 : 1 : 0 . 0 4 0 . 2 1 i 0 . 0 5 O . 4 5 : l : 0 . 2 3 O . 9 2 i 0 . 2 9 1 . 0 0 1 0 2 4 1 0 0 . 1 3 i 0 . 0 7 0 . 2 3 : 0 . 0 7 0 . 5 1 1 0 2 3 0 . 8 2 i 0 . 2 8 0 . 9 2 : 0 . 2 7 0 0 . 2 9 i 0 . 1 l 0 . 7 0 i 0 . 1 5 0 . 6 8 : 0 . 2 3 0 . 6 9 : 0 . 3 2 0 . 7 0 i 0 . 2 8 1 0 0 0 . 2 6 : 0 . 0 9 0 . 7 4 : 0 . 1 2 O . 6 8 : t 0 . 2 2 0 . 6 8 i 0 . 2 2 0 . 6 7 : 0 . 1 2 N o n - c u m u l a t i v e c o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e d a t a w e r e g e n e r a t e d i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f L N A a d d e d 1 0 m i n p r i o r t o S P M E . V a l u e s r e p r e s e n t m e a n 1 S E M f o r a m p l i t u d e o f a g o n i s t - i n d u c e d c o n t r a c t i o n s ( g ) o f 8 p r e p a r a t i o n s f r o m 2 a n i m a l s f o r 1 0 a n d 1 0 0 u M ' L N A . a t t e n u a t e d L N A - a n d L N A M E - i n d u c e d p o t e n t i a t i o n o f N A N C c o n t r a c t i o n s . C P - 9 6 , 3 4 5 ( 3 0 0 n M ) r e d u c e d L N A - a n d L N A M E - i n d u c e d p o t e n t i a t i o n o f N A N C c o n t r a c t i o n s b y 9 3 i 3 % a n d 9 5 : t 2 % , r e s p e c t i v e l y , w i t h a c o m b i n e d 1 C 5 0 o f 1 4 i 3 n M ( 1 9 p r e p a r a t i o n s , 5 a n i m a l s ) . O x y h e m o g l o b i n A t t e n u a t e s N A N C b u t n o t C h o l i n e r g i c C o n t r a c t i o n s H e m o g l o b i n ( 1 - 1 0 p M ) p o t e n t i a t e d N A N C c o n t r a c t i o n s i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r i n 1 1 / 1 5 p r e p a r a t i o n s ( F i g u r e 5 3 ) . T r a n s m u r a l s t i m u l a t i o n f a i l e d t o p r o d u c e c o n t r a c t i o n s i n 3 / 1 5 p r e p a r a t i o n s . H o w e v e r , m o n o p h a s i c c o n t r a c t i o n s ( 0 . 2 7 i 0 . 1 0 g , m a x i m u m a m p l i t u d e ) w e r e o b s e r v e d i n t h e s e t i s s u e s a f t e r a d d i t i o n o f 1 u M h e m o g l o b i n , a n d t h e a m p l i t u d e o f t h e c o n t r a c t i o n s i n c r e a s e d i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r u p o n a d d i t i o n o f 3 u M ( 0 . 3 9 i 0 . 1 4 g ) o r 1 0 u M ( 0 . 4 4 i 0 . 1 5 g ) h e m o g l o b i n . I n t e r e s t i n g l y , h e m o g l o b i n d i d n o t s i g n i fi c a n t l y a f f e c t c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s ( F i g u r e 5 3 ) . H e m o g l o b i n ( 1 0 n M ) d i d n o t a l t e r c o n t r a c t i o n s g e n e r a t e d b y a d d i t i o n o f 3 0 ( 0 . 4 7 i 0 . 1 3 ) g ( n o i t c a r t n o C 2 6 9 1 . 7 5 - . ' 1 . 4 0 - l l 1 . 0 5 ' I 0 . 7 0 ' 0 . 3 5 ' i i o 1 3 ‘ 1 0 [ h e m o g l o b i n ] ( I I M ) 0 . 0 0 F i g u r e S 3 . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p s f o r t h e e f f e c t s o f h e m o g l o b i n o n N A N C a n d c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e . N A N C ( o p e n b a r s ) a n d c h o l i n e r g i c ( fi l l e d b a r s ) c o n t r a c t i o n s ( 2 0 H z ) w e r e . a f f e c t e d d i f f e r e n t i a l l y b y h e m o g l o b i n . D a t a a r e m e a n s i S E M o f m a x i m u m c o n t r a c t i o n a m p l i t u d e e x p r e s s e d i n g r a m s o f t e n s i o n . N A N C a n d c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s w e r e r e c o r d e d i n t h e p r e s e n c e o f g u a n e t h i d i n e ( 3 u M ) a n d s c o p o l a m i n e ( 1 n M ) o r C P - 9 6 , 3 4 5 ( 3 0 0 n M ) , r e s p e c t i v e l y . A s t e r i s k s i n d i c a t e d i f f e r e n c e s f r o m c o n t r o l ( A n a l y s i s o f V a r i a n c e p r o c e e d e d b y T e s t f o r L e a s t S i g n i fi c a n t D i f f e r e n c e s ; p < 0 . 0 5 ) . 2 7 0 2 1 2 0 I - T . T T 3 1 0 0 T $ T T g t I T 1 1 ‘ 1 3 8 0 . . _ 1 1 1 l 0 c o - T 5 ‘ : + d i b u t r y l - c G M P 4 ° ' + 8 - b r o m o - c G M P O 1 ' N 2 0 ' J . $ 0 1 n n n A A l A l L L n n I l l A l A n A n 1 1 4 ] 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 [ c G M P ] ( I I M ) F i g u r e 5 4 . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e e f f e c t s o f 8 - b r o m o - c G M P a n d d i b u t r y l - c G M P o n N A N C c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e . C u m u l a t i v e c o n c e n t r a t i o n s o f 8 - b r o m o - c G M P o r d i b u t y r l - c G M P a r e a d d e d a t 2 0 m i n i n c r e m e n t s . D a t a a r e m e a n i S E M o f p e r c e n t o f c o n t r o l 2 0 H z c o n t r a c t i o n s . G u a n e t h i d i n e ( 3 n M ) a n d s c o p o l a m i n e ( 1 n M ) a r e p r e s e n t t h r o u g h o u t t h i s e x p e r i m e n t . 2 7 1 g ) o r 3 0 0 n M ( 0 . 8 8 i 0 . 1 6 g ) S P M E a s c o m p a r e d t o c o n t r o l r e s p o n s e s ( 0 . 5 7 i 0 . 1 1 ; 1 . 1 8 i - 0 . 2 7 g ) ( 1 0 p r e p a r a t i o n s , 2 a n i m a l s ) . F i n a l l y , h e m o g l o b i n ( 1 0 u m i n c r e a s e d s p o n t a n e o u s a c t i v i t y o f 4 / 1 1 C M M P P s ( d a t a n o t s h o w n ) . c G M P I n h i b i t s N A N C C o n t r a c t i o n s 8 - B r o m o - c G M P ( 1 0 0 - 1 0 0 0 u M ) ( 1 2 p r e p a r a t i o n s , 2 a n i m a l s ) , b u t n o t d i b u t y r l - c G M P ( 1 - 1 0 0 0 n M ) ( 1 1 p r e p a r a t i o n s , 2 a n i m a l s ) , p r o d u c e d a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t d e c r e a s e i n N A N C c o n t r a c t i o n s p r o d u c e d b y 2 0 H z t r a n s m u r a l n e r v e s t i m u l a t i o n ( F i g u r e 5 4 ) , w i t h a n E C 5 0 o f 1 8 9 i 2 4 p m . T h e i n h i b i t i o n c a u s e d b y 8 - b r o m o - c G M P d i d n o t e x h i b i t t a c h y p h y l a x i s , a n d c o n t r a c t i o n s d i d n o t r e c o v e r a f t e r r e p e a t e d w a s h i n g ( 1 0 w a s h e s , 1 0 m i n e a c h ) ( d a t a n o t s h o w n ) . P a p a v e r i n e ( 1 - 1 0 I I M ) i n h i b i t s p h o s p h o d i e s t e r a s e s , a n d p r o d u c e d a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t d e c r e a s e i n t h e a m p l i t u d e o f n e u r o g e n i c N A N C c o n t r a c t i o n s ( d a t a n o t s h o w n ) , w i t h a n I C s o v a l u e o f 1 . 5 9 i 0 . 2 3 p M ( 1 3 p r e p a r a t i o n s , 2 a n i m a l s ) . T h e s i t e o f a c t i o n o f p a p a v e r i n e w a s d e t e r m i n e d b y e x a m i n i n g C M M P P s r e s p o n s e s t o S P M E . P a p a v e r i n e ( 1 0 I I M ) i n h i b i t e d 1 0 0 j : 0 % o f c o n t r a c t i l e a c t i v i t y i n r e s p o n s e t o 1 0 0 n M S P M E ( 1 0 p r e p a r a t i o n s , 2 a n i m a l s ) . T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t p a p a v e r i n e i n h i b i t s N A N C c o n t r a c t i o n s b y a d i r e c t m e c h a n i s m o n c i r c u l a r s m o o t h m u s c l e . S o d i u m N i t r o p r u s s i d e I n h i b i t s N A N C C o n t r a c t i o n s S o d i u m n i t r o p r u s s i d e ( S N P ) i n h i b i t e d N A N C c o n t r a c t i o n s i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r ( 0 . 1 - 3 0 0 I I M ) ( F i g u r e 5 5 ) , w i t h a n E C , 0 o f 3 9 0 i 3 3 n M ( 1 6 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) . S N P a l s o i n h i b i t e d n e r v e - e v o k e d c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r ( 1 2 p r e p a r a t i o n s , 2 a n i m a l s ) , a l t h o u g h t h e E C 5 0 ( 1 0 9 8 i 2 7 2 F i g u r e 5 5 . E f f e c t s o f S N P o n n e u r o g e n i c a n d a g o n i s t - i n d u c e d c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e . A . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e e f f e c t s o f S N P o n N A N C a n d c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e . N A N C a n d c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s ( 2 0 H z n e r v e s t i m u l a t i o n ) a r e a t t e n u a t e d b y S N P i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r . D a t a a r e m e a n i S E M o f p e r c e n t o f c o n t r o l 2 0 H z N A N C o r c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s r e c o r d e d i n t h e p r e s e n c e o f g u a n e t h i d i n e ( 3 n M ) a n d s c o p o l a m i n e ( 1 n M ) o r C P - 9 6 , 3 4 5 ( 3 0 0 n M ) , r e s p e c t i v e l y . B . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p f o r b e t h a n e c h o l i n t h e a b s e n c e ( o p e n b a r s ) a n d p r e s e n c e ( c l o s e d b a r s ) o f 1 0 0 u M S N P . D a t a a r e m e a n i S E M o f m a x i m u m c o n t r a c t i o n a m p l i t u d e e x p r e s s e d i n g r a m s o f t e n s i o n . G u a n e t h i d i n e ( 3 [ A N D a n d s c o p o l a m i n e ( 1 n M ) w e r e p r e s e n t t h r o u g h o u t t h e e x p e r i m e n t . C . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p f o r S P M E i n t h e a b s e n c e ( o p e n b a r s ) a n d p r e s e n c e ( c l o s e d b a r s ) o f 1 0 0 I I M S N P . D a t a a r e m e a n i S E M o f m a x i m u m c o n t r a c t i o n a m p l i t u d e e x p r e s s e d i n g r a m s o f t e n s i o n . G u a n e t h i d i n e ( 3 p M ) a n d C P - 9 6 , 3 4 5 ( 3 0 0 n M ) w e r e p r e s e n t t h r o u g h o u t t h e e x p e r i m e n t . A s t e r i s k s i n d i c a t e d i f f e r e n c e s f r o m c o n t r o l ( S t u d e n t ’ s t t e s t f o r p a i r e d d a t a ; p < 0 . 0 5 ) . I — b — I I — \ D — I I - \ O - D n o i t c a r t n o C z H 0 2 6 9 ) a ( n o i t c a r t n o C ) g ( n o i t c a r t n o C [ S P M E ] ( n M ) 1 0 1 0 0 1 2 0 ‘ Q 6 0 ” 0 0 0 L 8 0 ’ 1 4 0 ‘ C 1 0 0 ' [ b e t h a n e c h o l ] ( n M ) 3 0 3 0 0 Q 0 0 Q B O ' L 6 0 ” $ 4 0 “ $ 2 0 ’ Q O O F [ S N P ] ( u m ) 1 0 1 0 0 1 0 0 0 N O O F . % — > — 1 / \ l - A - c h o l i n e r g i c - ° - N A N C F i g u r e U I S J I > 2 7 4 4 6 n M ) f o r i n h i b i t i o n o f c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s w a s s i g n i fi c a n t l y g r e a t e r t h a n t h a t f o r i n h i b i t i o n o f N A N C c o n t r a c t i o n s . T h e s i t e o f a c t i o n o f S N P w a s d e t e r m i n e d b y e x a m i n i n g t h e e f f e c t s o f S N P o n S P M E a n d b e t h a n e c h o l r e s p o n s e s i n t i s s u e s p r e t r e a t e d w i t h g u a n e t h i d i n e ( 3 n M ) a n d s c o p o l a m i n e ( 1 n M ) , a n d g u a n e t h i d i n e ( 3 n M ) a n d C P - 9 6 , 3 4 5 ( 3 0 0 n M ) , r e s p e c t i v e l y . I n 4 / 1 0 t i s s u e s ( 2 a n i m a l s ) , S N P ( 1 0 a n d 1 0 0 n M ) d i d n o t a l t e r t h e a m p l i t u d e o f r e s p o n s e s o f c i r c u l a r m u s c l e t o 1 0 o r 1 0 0 n M S P M E . H o w e v e r , S N P ( 1 0 0 n M ) s i g n i fi c a n t l y r e d u c e d t h e a m p l i t u d e o f S P M E r e s p o n s e s i n 6 / 1 0 t i s s u e s ( F i g u r e 5 5 ) . S o d i u m n i t r o p r u s s i d e ( 1 0 0 n M ) d i d n o t a l t e r t h e d u r a t i o n o f c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e p r o d u c e d i n r e s p o n s e t o 3 , 3 0 , o r 3 0 0 I I M b e t h a n e c h o l ( 1 1 p r e p a r a t i o n s , 2 a n i m a l s ) ( F i g u r e 5 5 ) . T h e E C 5 0 f o r i n h i b i t i o n o f N A N C c o n t r a c t i o n s b y S N P i n c r e a s e d t o 2 6 0 0 : l : 7 0 n M w h e n p r e p a r a t i o n s w e r e t r e a t e d w i t h a p a m i n ( 1 0 0 n M ) ( 1 4 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) ( F i g u r e 5 6 ) . A s s h o w n i n F i g u r e 5 6 , a d d i t i o n o f a p a m i n r e s u l t e d i n a n u p w a r d s s h i f t o f t h e S N P c o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e . I n t h e a b s e n c e o f S N P , a p a m i n ( 1 - 3 0 0 n M ) p r o d u c e d a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t i n c r e a s e i n t h e a m p l i t u d e o f n e u r o g e n i c N A N C c o n t r a c t i o n s ( 1 6 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) , w i t h a n 1 3 C 5 0 o f 6 9 i 9 n M ( F i g u r e 5 6 ) . S u p e r o x i d e D i s m u t a s e D o e s N o t A l t e r t h e A m p l i t u d e o f N A N C C o n t r a c t i o n s T h e p h y s i o l o g i c a l a c t i v i t y o f N O i s v e r y s h o r t , a s N O i s b r o k e n d o w n b y f r e e r a d i c a l s . S u p e r o x i d e d i s m u t a s e ( S O D ) c a n s c a v e n g e f r e e r a d i c a l s , t h u s p r o l o n g i n g t h e a c t i o n s o f N O ( r e v i e w e d i n M o n c a d a e t a l . , 1 9 9 1 ) . S u p e r o x i d e d i s m u t a s e ( 1 0 - 3 0 0 u n i t s / m l ) d i d n o t h a v e a n y e f f e c t o n a m p l i t u d e o r d u r a t i o n o f N A N C c o n t r a c t i o n s p r o d u c e d b y 2 0 H z t r a n s m u r a l n e r v e s t i m u l a t i o n ( 1 0 p r e p a r a t i o n s , 2 a n i m a l s ) ( F i g u r e 5 7 ) . 2 7 5 V a s o a c t i v e I n t e s t i n a l P o l y p e p t i d e D o e s N o t A l t e r t h e A m p l i t u d e o f N A N C C o n t r a c t i o n s V a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p o l y p e p t i d e ( V I P ) ( 1 - 3 0 0 n M ) d i d n o t a l t e r t h e a m p l i t u d e o f N A N C c o n t r a c t i o n s p r o d u c e d b y 2 0 H z t r a n s m u r a l s t i m u l a t i o n ( 1 6 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) ( F i g u r e 5 8 ) . H o w e v e r , V I P c a u s e d a t r a n s i e n t ( < 2 m i n ) r e l a x a t i o n o f c i r c u l a r m u s c l e i n 8 / 1 5 p r e p a r a t i o n s . A t 1 , 1 0 , a n d 1 0 0 n M , V I P r e l a x e d c i r c u l a r m u s c l e b y 0 . 1 8 i 0 . 0 7 , 0 . 1 9 i 0 . 0 5 , a n d 0 . 2 4 i 0 . 0 6 g , r e s p e c t i v e l y . T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t u n l i k e N O , V I P d o e s n o t r e g u l a t e r e l e a s e o f S P . N i t r i c O x i d e S y n t h a s e - a n d S u b s t a n c e P - I m m u n o r e a c t i v i t y A r e L o c a l i z e d i n D i f f e r e n t N e r v e s o f t h e C i r c u l a r M u s c l e P l e x u s P r e p a r a t i o n s o f s u b m u c o s a l p l e x u s w i t h a t t a c h e d c i r c u l a r m u s c l e p l e x u s w e r e i n c u b a t e d i n a n t i s e r u m r a i s e d a g a i n s t N O S a n d S P t o d e t e r m i n e t h e a n a t o m i c a l r e l a t i o n s h i p b e t w e e n N O S - a n d S P - i r n e r v e s . I n fi v e p r e p a r a t i o n s e x a m i n e d , b r i g h t S P - i r w a s l o c a l i z e d i n n e r v e fi b e r s w i t h l a r g e , s t r o n g l y - i m m u n o r e a c t i v e v a r i c o s i t i e s . T h e s e n e r v e s r a n p a r a l l e l t o t h e c i r c u l a r m u s c l e , a n d r a m i fi e d e x t e n s i v e l y ( F i g u r e 6 0 ) . I n t e n s e N O S - i r w a s a l s o v i s u a l i z e d i n t h e s e p r e p a r a t i o n s , a s m a n y n e r v e s c o n t a i n e d s t r o n g N O S - i r ( F i g u r e 5 9 ) . T h e N O S - i r n e r v e s a l s o w e r e o r i e n t a t e d p a r a l l e l t o t h e m u s c l e , a n d f e w N O S - i r v a r i c o s i t i e s w e r e o b s e r v e d . A l t h o u g h i t w a s i m p o s s i b l e t o q u a n t i f y t h e n u m b e r o f n e r v e s d u e t o e x t e n s i v e b r a n c h i n g , S P - a n d N O S - i r w e r e n e v e r o b s e r v e d i n t h e s a m e n e r v e fi b e r s ( F i g u r e 5 9 ) . 2 7 6 F i g u r e 5 6 . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e e f f e c t s o f S N P a n d a p a m i n o n N A N C c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e . A . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e e f f e c t s o f S N P o n N A N C c o n t r a c t i o n s i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f a p a m i n ( 3 0 0 n M ) . D a t a a r e m e a n a n d S E M o f p e r c e n t o f c o n t r o l 2 0 H z N A N C c o n t r a c t i o n s . B . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e f o r t h e e f f e c t o f a p a m i n o n N A N C c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e . D a t a a r e m e a n a n d S E M a n d a r e e x p r e s s e d a s p e r c e n t o f c o n t r o l 2 0 H z N A N C c o n t r a c t i o n s . G u a n e t h i d i n e ( 3 n M ) a n d s c o p o l a m i n e ( 1 u M ) a r e p r e s e n t t h r o u g h o u t t h i s e x p e r i m e n t . 2 7 7 F i g u r e 5 6 . A C 1 0 0 " I : 3 E \ r - l - S N P & a p a m i n 0 8 0 . . . I . - . — S N P 2 I T T l T a I o 6 0 - l T ' l E 0 A n - N 4 0 - " : I : 2 , \ l — S — - — ~ 3 \ 3 _ . _ — 3 ° 2 0 - l " L ‘ N * 0 H A I l L l A I 0 . 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 - [ S N P l ( u M I B c 6 0 ’ . 2 s 5 0 ' . 2 4 0 L a a . g 3 0 ‘ T 0 2 ° _ I / I N J . z 1 0 ' T o O r 4 N 0 l g - 2 0 A A A L + A A A I A [ A A A A A A I A A A A A A A A I A A L L L L A A ’ 0 . 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 [ a p a m i n ] ( n M ) ) g ( n o i t c a r t n o c 2 7 8 L 7 5 ” L 5 0 * L 2 5 L 0 0 0 J 5 0 5 0 0 2 5 0 0 0 0 1 O 3 0 1 0 0 3 0 0 [ s u p e r o x i d e d i s m u t a s e ] ( m m ) F i g u r e 5 7 . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e f o r t h e e f f e c t s o f s u p e r o x i d e d i s m u t a s e o n N A N C c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e . T r a n s m u r a l s t i m u l a t i o n ( 2 0 H z ) o f c i r c u l a r m u s c l e - l o n g i t u d i n a l m u s c l e p r e p a r a t i o n s r e s u l t e d i n N A N C c o n t r a c t i o n s , a n d a d d i t i o n o f s u p e r o x i d e d i s m u t a s e d i d n o t a l t e r a m p l i t u d e o r d u r a t i o n o f c o n t r a c t i o n s . D a t a a r e a m p l i t u d e o f c o n t r a c t i o n s m e a s u r e d i n g r a m s , a n d a r e p l o t t e d a s m e a n i S E M . A 5 2 2 o " ' 0 3 ' : 3 . 0 0 1 1 0 0 . . . . 8 2 6 0 0 0 0 0 - ~ . / l \ l l I \ o " . ” - - - “ “ “ ‘ - . . . . . . . 1 . . . . . . . . 0 . 3 1 1 0 1 . A 0 0 . . i J 0 0 . . . . A 1 . 0 0 . I . 2 7 9 [ V I P ] ( n M ) F i g u r e 5 8 . C o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e f o r t h e e f f e c t s o f v a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p o l y p e p t i d e o n N A N C c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e . D a t a a r e m e a n 1 S E M o f m a x i m u m c o n t r a c t i o n a m p l i t u d e . G u a n e t h i d i n e ( 3 n M ) a n d s c o p o l a m i n e ( 1 u M ) a r e p r e s e n t t h r o u g h o u t t h i s e x p e r i m e n t . 2 8 0 F i g u r e 5 9 . C o l o c a l i z a t i o n o f n i t r i c o x i d e s y n t h a s e - a n d s u b s t a n c e P - i m m u n o r e a c t i v i t y i n c i r c u l a r m u s c l e p l e x u s o f n o r m a l i l e u m . A . W h o l e m o u n t p r e p a r a t i o n o f c i r c u l a r m u s c l e a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l l a y e r . N O S - i r i s o b s e r v e d i n b r i g h t , v a r i c o s e n e r v e s w h i c h r a m i f y e x t e n s i v e l y . B . C o l o c a l i z a t i o n o f S P - i r . S P - i r i s a l s o o b s e r v e d i n m u l t i p l e n e r v e s , b u t t h e s e n e r v e s d o n o t c o n t a i n N O S - i r . 2 8 1 F i g u r e 5 9 . 2 8 2 8 . E X T R I N S I C D E N E R V A T I O N A L T E R S N I T R I C O X I D E P R O D U C T I O N A S A S S A Y E D B Y C I T R U L L I N E P R O D U C T I O N I n t r o d u c t i o n a n d E x p e r i m e n t a l R a t i o n a l e A s d e s c r i b e d i n t h e i n t r o d u c t i o n , N O S i s t h e r a t e - l i m i t i n g e n z y m e t h a t c a t a l y z e s a S - e l e c t r o n o x i d a t i o n o f o n e o f t w o c h e m i c a l l y e q u i v a l e n t g u a n i d i n o n i t r o g e n s o f L - a r g i n i n e t o f o r m e q u i m o l a r c o n c e n t r a t i o n s o f L - c i t r u l l i n e a n d N O i n t h e p r e s e n c e o f m o l e c u l a r o x y g e n a n d N A D P H ( P a l m e r , 1 9 8 8 ; P a l m e r , 1 9 8 9 ; r e v i e w e d i n M o n c a d a e t a l . , 1 9 9 1 ; S a n d e r s a n d W a r d , 1 9 9 2 ) . C o n c e n t r a t i o n s o f N O h a v e b e e n m e a s u r e d b y e l e c t r o n p a r a m a g n e t i c r e s o n a n c e u s i n g t r a p p i n g c o m p o u n d s s u c h a s n i t r o s o c o m p o u n d s o r r e d u c e d h e m o g l o b i n , s p e c t r o p h o t o m e t r i c d e t e c t i o n o f f o r m a t i o n o f m e t h e m o g l o b i n f r o m h e m o g l o b i n , c h e m i l u m i n e s c e n c e d e t e c t i o n o f o z o n e a n d N O i n t e r m e d i a t e s , i n d i r e c t m e a s u r e m e n t o f n i t r i t e s a n d n i t r a t e s u s i n g G r i e s s ’ r e a g e n t , a n d m o r e r e c e n t l y , u s i n g n e w a m p e r o m e t r i c m i c r o e l e c t r o d e a s s a y s . H o w e v e r , t h e m o s t c o m m o n i n d i r e c t m e a s u r e m e n t o f N O i s t h e w i d e l y - a c c e p t e d a s s a y o f f o r m a t i o n o f c i t r u l l i n e f r o m r a d i o a c t i v e a r g i n i n e ( B r e d t a n d S y n d e r , 1 9 8 9 ) . T h i s a s s a y u s e s i o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y t o s e p a r a t e [ ” C ] c i t r u l l i n e f r o m [ ” C ] a r g i n i n e , w h i c h r e m a i n s b o u n d o n t h e c a t i o n e x c h a n g e r e s i n . T h e [ ” C ] c i t r u l l i n e c o n c e n t r a t i o n o f t i s s u e s o f i n t e r e s t c a n t h e n b e m e a s u r e d b y c o u n t i n g t h e n u m b e r o f B - p a r t i c l e s t h a t d e c a y p e r g i v e n t i m e . A s c i t r u l l i n e a n d N O a r e f o r m e d i n e q u i m o l a r r a t i o s , a l t e r a t i o n s i n c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n a r e i n d i c a t i v e o f c h a n g e s i n N O c o n c e n t r a t i o n s . T h e r e f o r e , i t w a s h y p o t h e s i z e d t h a t t h e i n c r e a s e d n u m b e r o f N O S - i r n e u r o n s i n m y e n t e r i c g a n g l i a w o u l d r e s u l t i n g r e a t e r N O p r o d u c t i o n i n p r e p a r a t i o n s m a d e f r o m d e n e r v a t e d s e g m e n t s o f i l e u m a s c o m p a r e d t o c o n t r o l s e g m e n t s . [ ” C ] C i t r u l l i n e p r o d u c t i o n w a s m e a s u r e d i n n o r m a l a n d s u r g i c a l l y - d e n e r v a t e d i l e u m t o d e t e r m i n e i f l o s s 2 8 3 o f e x t r i n s i c n e r v e s a l t e r e d p r o d u c t i o n o f [ ” C ] c i t r u l l i n e a n d N O . C h a r a c t e r i z a t i o n o f [ “ C ] C i t r u l l i n e F o r m a t i o n i n N o r m a l L M M P H o m o g e n a t e s I n t h e a b s e n c e o f t i s s u e h o m o g e n a t e , c a t i o n - i o n e x c h a n g e c o l u m n s b o u n d 9 7 i 1 % ( n = 3 ) o f [ ” C ] a r g i n i n e a p p l i e d t o t h e c o l u m n w h e n d e - i o n i z e d w a t e r w a s u s e d t o w a s h t h e c o l u m n s , i n d i c a t i n g t h a t t h e m a j o r i t y o f m e a s u r e d r a d i o a c t i v i t y w a s n o t f r e e a r g i n i n e . H o w e v e r , i f t h e t o t a l v o l u m e o f e l u a n t o r h o m o g e n a t e c o n t a i n e d 4 0 % o r m o r e H E P E S b u f f e r , 6 0 i 7 % o f [ ” C ] a r g i n i n e w a s u n a b l e t o b i n d . A s H E P E S i s p o s i t i v e l y c h a r g e d , i t m a y c o m p e t e w i t h a r g i n i n e m o l e c u l e s f o r b i n d i n g , r e s u l t i n g i n d i s p l a c e m e n t o f [ “ C ] a r g i n i n e f r o m c a t i o n - e x c h a n g e c o l u m n s a n d e x t r e m e l y h i g h b a c k g r o u n d s . T h e r e f o r e , c o l u m n s w e r e e l u t e d w i t h w a t e r , a n d t i s s u e h o m o g e n i z a t i o n b u f f e r w a s u s e d t o b r i n g h o m o g e n a t e s t o v o l u m e . P r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d t o d e t e r m i n e t h e o p t i m u m a s s a y c o n d i t i o n s f o r i n c u b a t i o n o f L M M P h o m o g e n a t e s w i t h [ " C ] a r g i n i n e . I n t h e p r e s e n c e o f 3 u M [ ” C ] a r g i n i n e , 8 6 . 2 i 1 6 . 4 ( 9 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) , 6 6 . 4 i 1 2 . 7 ( 9 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) , a n d 4 9 . 6 i 1 4 . 3 ( 3 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) p m o l e s [ ' 4 C ] c i t r u l l i n e / m g p r o t e i n w a s m e a s u r e d 2 5 , 4 0 , a n d 6 0 m i n a f t e r i n c u b a t i o n o f t i s s u e h o m o g e n a t e s w i t h [ " C ] a r g i n i n e . A l l s u b s e q u e n t e x p e r i m e n t s w e r e i n c u b a t e d f o r 2 5 m i n a t 3 7 ° C . T h e e f f e c t s o f v a r y i n g t h e c o n c e n t r a t i o n o f [ ” C ] a r g i n i n e o n t h e q u a n t i t y o f [ ” C ] c i t r u l l i n e f o r m e d / m g p r o t e i n / m i n w a s d e t e r m i n e d i n n o r m a l L M M P h o m o g e n a t e s ( 9 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) . A l i n e a r r e l a t i o n s h i p w a s o b s e r v e d f o r s m a l l c o n c e n t r a t i o n s ( 1 - 1 0 n M ) o f [ ” C ] a r g i n i n e , a s i n c r e a s i n g t h e c o n c e n t r a t i o n o f [ ” C ] a r g i n i n e r e s u l t e d i n g r e a t e r p r o d u c t i o n o f [ ” C ] c i t r u l l i n e / m g p r o t e i n / m i n ( F i g u r e 6 0 ) . H o w e v e r , [ ” C ] a r g i n i n e w a s n o l o n g e r l i m i t i n g b y 2 0 I I M , a n d [ ‘ 4 C ] p r o d u c t i o n w a s n o t d e p e n d e n t o n t h e 2 8 4 F i g u r e 6 0 . A n a l y s i s o f k i n e t i c s o f [ " C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n b y h o m o g e n a t e s o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s . A . E f f e c t s o f i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f [ ” C ] a r g i n i n e o n c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n i n t h e p r e s e n c e o f 1 m M N A D P H . B . D o u b l e r e c i p r o c a l ( L i n e w e a v e r - B u r k e ) p l o t o f d a t a f r o m A . K M i s 7 . 2 u M a r g i n i n e a n d V m i s 1 8 . 6 p m o l e s / m g p r o t e i n / m i n . H o m o g e n a t e s w e r e i n c u b a t e d w i t h v a r y i n g c o n c e n t r a t i o n s o f [ ” C ] a r g i n i n e f o r 2 5 m i n a t 3 7 ° C . “ l n l m l g m l c l o m p ( n o i t c u d o r P t l C I 1 2 8 5 F i g u r e 6 0 . 1 3 . E 2 0 . - O J . - 1 6 O E l 3 g 1 2 . 2 g a ' 0 2 ° 4 O . 5 E o 1 l . 3 o 2 0 4 0 s o s o 1 0 0 [ A r a l ( H M ) 0 . 2 0 ‘ 0 . 1 5 ' 0 . 1 0 ' 0 . 0 5 ‘ / 0 . 0 0 / _ 0 . 0 5 L I I I I I - 0 . 2 0 - 0 . 1 0 0 . 0 0 0 . 1 0 0 . 2 0 0 . 3 0 0 . 4 0 1 I I A r a ] ( I I M Y ‘ 2 8 6 T a b l e 9 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n i n l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s h o m o g e n a t e s p r e p a r e d f r o m n o r m a l i l e u m . [ ” C ] A r g i n i n e H o m o g e n a t e 3 “ M 5 p M B a s a l 6 9 . 5 i 1 0 . 6 ( 9 ) 1 5 2 i 1 8 . 7 ( 8 ) + N A D P H ( 1 m M ) 2 6 7 i 4 4 . 3 ( 9 ) * 3 0 9 i 3 7 . 2 ( 8 ) * + C a l c i u m ( 2 m M ) 4 0 . 3 i 1 1 . 3 ( 9 ) 8 2 . 1 i 2 1 . 7 ( 8 ) H o m o g e n a t e s w e r e i n c u b a t e d w i t h [ ” C ] A r g i n i n e f o r 2 5 m i n . V a l u e s a r e m e a n 1 S E M f o r ( 1 1 ) r e p l i c a t e s f r o m 3 - 4 a n i m a l s , a n d a r e e x p r e s s e d a s p m o l e [ ” C ] c i t r u l l i n e / m g p r o t e i n . * , v a l u e s f o r h o m o g e n a t e s c o n t a i n i n g N A D P H a r e s i g n i fi c a n t l y d i f f e r e n t ( p < 0 . 0 5 ) f r o m b a s a l p r o d u c t i o n , a s w e l l a s f r o m p r o d u c t i o n i n t h e p r e s e n c e o f a n a d d i t i o n a l 2 m M c a l c i u m . c o n c e n t r a t i o n o f [ ” C ] a r g i n i n e . A d o u b l e - r e c i p r o c a l ( L i n e w e a v e r - B u r k e ) p l o t o f t h e s e d a t a r e v e a l e d a M i c h a e l i s c o n s t a n t ( K M ) o f 7 . 2 1 1 M , a n d a m a x i m u m i n i t i a l v e l o c i t y ( V m ) o f 1 8 . 6 p m o l e [ “ C ] c i t r u l l i n e / m g p r o t e i n / m i n ( F i g u r e 1 B ) . A s 3 u M [ ” C ] a r g i n i n e w a s o n t h e l i n e a r p o r t i o n o f t h e s u b s t r a t e - v e l o c i t y c u r v e , t h i s c o n c e n t r a t i o n w a s u s e d f o r a l l T h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y w a s u s e d t o i d e n t i f y t h e c o l u m n fl o w - t h r o u g h . T h e e l u a n t c o m p o n e n t s w e r e v i s u a l i z e d w i t h n i n h y d r i n s p r a y , a n d t h e m a j o r i t y o f t h e e l u a n t h a d a s i m i l a r m i g r a t i o n d i s t a n c e a s L - c i t r u l l i n e s t a n d a r d s , w h e r e a s t h e c o m p o n e n t s o f t i s s u e - f r e e h o m o g e n a t e s h a d a s i m i l a r m i g r a t i o n d i s t a n c e a s L - a r g i n i n e s t a n d a r d s . T h e s e d a t a a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e f o r m a t i o n o f [ ” C ] c i t r u l l i n e f r o m [ ” C ] a r g i n i n e ( B r e d t a n d S y n d e r , 1 9 8 9 ) . C a 2 + a n d C a l m o d u l i n E f f e c t s [ ” C ] C i t r u l l i n e F o r m a t i o n i n N o r m a l L M M P H o m o g e n a t e s A d d i t i o n o f 0 . 1 m M C a 2 + ( a s C a C l z ) t o n o r m a l L M M P h o m o g e n a t e s d i d n o t i n c r e a s e b a s a l [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n , a s 7 0 . 2 i 1 1 . 6 p m o l e s [ " C ] c i t r u l l i n e / m g p r o t e i n 2 8 7 F i g u r e 6 1 . E f f e c t s o f C a 2 + , N A D P H , a n d c a l m o d u l i n o n [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n b y h o m o g e n a t e s o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s . A . E f f e c t s o f 1 m M C a 2 + ( a s C a C l z ) o n [ ' 4 C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f 1 m M N A D P H . A s t e r i s k ( * ) i n d i c a t e s p < 0 . 0 5 a s c o m p a r e d t o b a s a l p r o d u c t i o n , a n d c r o s s ( + ) i n d i c a t e s p < 0 . 0 5 a s c o m p a r e d t o [ ' 4 C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n i n t h e p r e s e n c e o f 1 m M N A D P H . B . E f f e c t s o f 0 . 1 m M C a 2 + a n d 3 0 u g / u l c a l m o d u l i n ( C a M ) o n [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n i n t h e p r e s e n c e o f 1 m M N A D P H . A s t e r i s k ( * ) i n d i c a t e s p < 0 . 0 5 a s c o m p a r e d t o p r o d u c t i o n i n t h e p r e s e n c e o f N A D P H a n d C a M . H o m o g e n a t e s w e r e i n c u b a t e d w i t h 3 1 . 1 M [ ” C ] a r g i n i n e f o r 2 5 m i n a t 3 7 ° C . n i e t o r p a n I / e n i l l u r t i c e l o m p n l e t o r § p g m / 0 0 e n i l l u r N t i c e l o m p N A D P H 0 . 1 g t “ 1 - C a C a l l C a l ; + C a . 5 O O O O O O O O O N 0 0 b O O O O O O > F i g u r e 6 1 . 2 8 8 2 8 9 T a b l e 1 0 . E f f e c t s o f N A D P H a n d c a l c i u m o n [ " C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n b y n i t r i c o x i d e s y n t h a s e i n l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s h o m o g e n a t e s f r o m n o r m a l i l e u m . C a l c i u m ( m M ) N A D P H 0 m M 2 m M 0 m M 6 9 . 5 i 1 0 . 6 ( 9 ) 4 0 . 3 : t 1 3 . 0 ( 9 ) 1 m M 2 6 7 i 4 4 . 3 ( 9 ) " ' + 1 4 3 i 3 5 . 7 ( 9 ) " U r H o m o g e n a t e s w e r e i n c u b a t e d w i t h 3 1 1 M [ ” C ] a r g i n i n e f o r 2 5 m i n . V a l u e s a r e m e a n i S E M f o r ( n ) r e p l i c a t i o n s f r o m 4 a n i m a l s , a n d a r e e x p r e s s e d a s p m o l e [ ” C ] c i t r u l l i n e / 1 0 0 u g p r o t e i n . * , v a l u e s o f h o m o g e n a t e s c o n t a i n i n g N A D P H a r e s i g n i fi c a n t l y d i f f e r e n t ( p < 0 . 0 5 ) f r o m v a l u e s o f h o m o g e n a t e s w i t h o u t N A D P H . + , v a l u e s o f h o m o g e n a t e s c o n t a i n i n g C a 2 + a n d N A D P H a r e s i g n i fi c a n t l y d i f f e r e n t ( p < 0 . 0 5 ) f r o m v a l u e s o f h o m o g e n a t e s c o n t a i n i n g o n l y N A D P H . w a s p r o d u c e d b y h o m o g e n a t e s i n t h e p r e s e n c e o f C a 2 + ( 9 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) , a n d 6 9 . 5 i 1 0 . 6 p m o l e s [ ” C ] c i t r u l l i n e / m g p r o t e i n w a s p r o d u c e d i n t h e a b s e n c e o f p u t a t i v e c o f a c t o r s ( 9 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) . S i m i l a r l y , e l e v a t i o n o f C a 2 + t o 1 m M d i d n o t a l t e r b a s a l [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n ( F i g u r e 6 1 A ) . A l t h o u g h C a 2 + d i d n o t a f f e c t [ " C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n ( T a b l e 9 ) , a d d i t i o n o f 1 m M N A D P H s i g n i fi c a n t l y i n c r e a s e d [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n b y 2 8 5 % ( F i g u r e 6 1 A a n d T a b l e 9 ) , a n d w a s i n c l u d e d i n a l l s u b s e q u e n t e x p e r i m e n t s . T h e l o w c o n c e n t r a t i o n o f C a ” ( 0 . 1 m M ) d i d n o t a l t e r N A D P H - e n h a n c e d [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n ( 2 7 4 i 3 1 . 3 p m o l e s / m g p r o t e i n , 9 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) a s c o m p a r e d t o N A D P H - e n h a n c e d p r o d u c t i o n i n t h e a b s e n c e o f e x o g e n o u s C a “ ( 2 6 7 i 4 4 . 3 p m o l e s / m g p r o t e i n , 9 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) . H o w e v e r , e l e v a t i o n o f e x o g e n o u s C a 2 + t o 1 m M s i g n i fi c a n t l y d e c r e a s e d N A D P H - e n h a n c e d [ " C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n ( 8 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) ( F i g u r e 6 1 A a n d T a b l e 1 0 ) . T h e e f f e c t s o f e x o g e n o u s c a l m o d u l i n o n [ ” C ] c i t r u l l i n e f o r m a t i o n w a s e x a m i n e d , a s t h e t y p e I i s o f o r m o f N O S i s l o c a l i z e d i n e n t e r i c n e u r o n s ( B r e d t e t a l . , 1 9 9 0 ; B e l a i e t . n i m 5 2 r o f n i l u d o m l a c f o s n o 0 3 0 1 ) i n i e t o r p t a r t n e c n g o m / e n i ) 3 l l l p c g n i y r a u v r t / g i p d c ( n ] n C i ” l [ u a , H d P e o l m o l m a l p C ( D A N . M f s y o l m a t i n m v o i i t t c a A r t e n s e a c h n 1 i n , a e n 3 i n r i o g r 2 a t o 1 ] n C . C y 0 " S [ m o r f e M d s 1 e i 1 t x O c a 3 c i h l i t r i t i N w p e r ) 1 1 0 . 0 d 1 e ( t a r o f b u c n M i E e S r e i w n s a e e t m 0 a n e e r a g o a m t o a H D T a b l e 1 1 . A d d i t i o n o f e x o g e n o u s c a l m o d u l i n d o e s n o t a l t e r n i t r i c o x i d e s y n t h a s e a c t i v i t y o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m n o r m a l i l e u m . 2 5 4 i 4 9 . 6 2 6 5 i 4 8 . 7 2 4 1 i 3 8 . 0 1 8 0 : t 6 7 . 9 2 7 9 i 6 8 . 8 2 6 6 i 7 1 . 9 2 7 1 i 6 6 . 7 ( 8 ) ( 6 ) ( 6 ) ( 8 ) ( 6 ) ( 6 ) ( 6 ) 2 9 0 2 9 1 a l . , 1 9 9 2 ; C o s t a e t a l . , 1 9 9 2 ; Y o u n g e t a l . , 1 9 9 2 ) , a n d a c t i v i t y o f t h i s i s o f o r m i s d e p e n d e n t o n C a 2 + a n d c a l m o d u l i n ( B r e d t a n d S y n d e r , 1 9 9 0 ) . I n t h e p r e s e n c e o f 1 m M N A D P H , 0 . 0 1 t o 3 0 u g / u l c a l m o d u l i n d i d n o t a f f e c t [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n ( 6 - 8 p r e p a r a t i o n s / c a l m o d u l i n c o n c e n t r a t i o n ) ( F i g u r e 6 1 B a n d T a b l e 1 1 ) . I f 0 . 1 m M C a 2 + w a s i n c l u d e d w i t h 3 0 u g / 1 . 1 1 c a l m o d u l i n , t h e n [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n i n c r e a s e d a s c o m p a r e d t o N A D P H - e n h a n c e d c i t r u l l i n e f o r m a t i o n ( 7 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) ( F i g u r e 6 1 B ) . F i n a l l y , E G T A w a s u s e d t o c h e l a t e C a 2 + i n h o m o g e n a t e s a n d t o d e t e r m i n e i f e n d o g e n o u s C a 2 + w a s i m p o r t a n t i n N A D P H - e n h a n c e d [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n . A s s h o w n i n F i g u r e 6 2 , 0 . 1 a n d 1 m M E G T A a t t e n u a t e d [ ” C ] c i t r u l l i n e f o r m a t i o n b y 7 1 a n d 9 9 % , r e s p e c t i v e l y ( 9 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) , f u r t h e r d e m o n s t r a t i n g t h e i m p o r t a n c e o f C a 2 + i n [ ” C ] c i t r u l l i n e f o r m a t i o n . [ “ C ] C i t r u l l i n e F o r m a t i o n i n t h e P r e s e n c e o f N O S A n t a g o n i s t s S u b s t i t u t e d L - a r g i n i n e a n a l o g s s u c h a s N G - n i t r o - L - a r g i n i n e ( L N A ) a n d N G - n i t r o - L - a r g i n i n e m e t h y l e s t e r ( L N A M E ) i n h i b i t f o r m a t i o n o f N O ( r e v i e w e d i n M o n c a d a e t a l . , 1 9 9 1 ) a n d p r e v e n t N O - m e d i a t e d r e s p o n s e s o f a n u m b e r o f t i s s u e s , i n c l u d i n g n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n o f G I s m o o t h m u s c l e ( r e v i e w e d i n S a n d e r s a n d W a r d , 1 9 9 2 ) . I n t h e p r e s e n c e o f 1 m M N A D P H , L N A M E ( 0 . 0 1 m M ) r e d u c e d [ " C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n b y 3 8 % , a n d 0 . 1 m M L N A M E a t t e n u a t e d [ ” C ] c i t r u l l i n e f o r m a t i o n b y 9 5 % a s c o m p a r e d t o N A D P H - e n h a n c e d p r o d u c t i o n i n t h e a b s e n c e o f N O S a n t a g o n i s t s ( 9 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) ( F i g u r e 6 2 ) . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b s e r v e d w h e n L N A ( 0 . 0 1 o r 0 . 1 m M ) w a s i n c l u d e d i n h o m o g e n a t e s , a s [ " C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n d e c r e a s e d b y 4 2 a n d 9 6 % , r e s p e c t i v e l y ( F i g u r e 6 2 ) . H o w e v e r , t h e D - e n a n t i o m e r o f L N A M E d i d n o t a f f e c t [ ” C ] c i t r u l l i n e f o r m a t i o n a s 2 3 2 i 4 7 . 3 p m o l e s / m g p r o t e i n w a s f o r m e d i n t h e p r e s e n c e o f 1 m M N A D P H n i e t o r p g m / e n i l l u r t i c e l o m p 5 0 0 ' 4 0 0 “ 3 0 0 2 0 0 1 0 0 N A D P H O . 1 1 . 0 L N A M E L N A E G T A E G T A F i g u r e 6 2 . [ " C ] C i t r u l l i n e p r o d u c t i o n b y h o m o g e n a t e s o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s i n t h e p r e s e n c e o f E G T A a n d N O S a n t a g o n i s t s . E f f e c t s o f E G T A ( 0 . 1 a n d 1 m M ) , 0 . 1 m M N G - n i t r o - L - a r g i n i n e m e t h y l e s t e r ( L N A M E ) , o r 0 . 1 m M N G - n i t r o - L - a r g i n i n e ( L N A ) o n [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n i n t h e p r e s e n c e o f 1 m M N A D P H . A s t e r i s k s ( * ) i n d i c a t e p < 0 . 0 5 a s c o m p a r e d t o p r o d u c t i o n i n t h e p r e s e n c e o f N A D P H . H o m o g e n a t e s w e r e i n c u b a t e d w i t h 3 u M [ ” C ] a r g i n i n e f o r 2 5 m i n a t 3 7 ° C . 2 9 3 a n d 0 . 1 m M D N A M E ( 6 p r e p a r a t i o n s , 2 a n i m a l s ) . T h i s w a s n o t d i f f e r e n t f r o m p r o d u c t i o n i n t h e p r e s e n c e o f 1 m M N A D P H o n l y . [ " C ] C i t r u l l i n e F o r m a t i o n i n L M M P H o m o g e n a t e s F r o m E x t r i n s i c a l l y - D e n e r v a t e d I l e u m B a s a l [ ” C ] c i t r u l l i n e f o r m a t i o n w a s s i m i l a r i n e x t r i n s i c a l l y - d e n e r v a t e d , c o n t r o l , a n d n o r m a l h o m o g e n a t e s , a s 4 0 . 0 i 1 0 . 4 , 5 1 . 5 . 1 : 1 1 . 5 , a n d 4 9 . 5 i 1 0 . 6 p m o l e s / m g p r o t e i n w e r e p r o d u c e d b y e x t r i n s i c a l l y - d e n e r v a t e d ( 3 p r e p a r a t i o n s ) , c o n t r o l ( 3 p r e p a r a t i o n s ) , a n d n o r m a l ( 3 p r e p a r a t i o n s ) L M M P h o m o g e n a t e s , r e s p e c t i v e l y . N A D P H ( 1 m M ) s i g n i fi c a n t l y i n c r e a s e d [ ” C ] c i t r u l l i n e f o r m a t i o n b y 1 0 0 % a n d 1 6 0 % i n h o m o g e n a t e s p r e p a r e d f r o m e x t r i n s i c a l l y - d e n e r v a t e d ( 3 p r e p a r a t i o n s ) a n d c o n t r o l ( 3 p r e p a r a t i o n s ) i l e u m . H o w e v e r , N A D P H - e n h a n c e d [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n i n h o m o g e n a t e s f r o m e x t r i n s i c a l l y - d e n e r v a t e d i l e u m ( 9 p r e p a r a t i o n s , 4 a n i m a l s ) w a s d e c r e a s e d a s c o m p a r e d t o p r o d u c t i o n i n h o m o g e n a t e s f r o m c o n t r o l i l e u m ( 9 p r e p a r a t i o n s , 4 a n i m a l s ) ( F i g u r e 6 3 ) . [ ” C ] C i t r u l l i n e p r o d u c t i o n i n h o m o g e n a t e s o f c o n t r o l i l e u m w a s n o t s i g n i fi c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h a t o f n o r m a l h o m o g e n a t e s , a s 1 3 8 . 8 i 2 6 . 2 a n d 1 0 0 . 8 i 2 0 . 8 p m o l e s / m g p r o t e i n w e r e m e a s u r e d f r o m c o n t r o l a n d n o r m a l h o m o g e n a t e s , r e s p e c t i v e l y ( T a b l e 1 2 ) . N A D P H - e n h a n c e d [ ” C ] c i t r u l l i n e f o r m a t i o n i n e x t r i n s i c a l l y - d e n e r v a t e d L M I V I P h o m o g e n a t e s w a s s i g n i fi c a n t l y i n h i b i t e d b y L N A ( 0 . 1 m M ) ( 7 . 8 i 4 . 4 p m o l e s c i t r u l l i n e / m g p r o t e i n , 8 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) a n d L N A M E ( 0 . 1 m M ) ( 9 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) ( F i g u r e 6 3 A ) . E G T A a t c o n c e n t r a t i o n s o f 0 . 1 a n d 1 m M a t t e n u a t e d [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n i n c o n t r o l h o m o g e n a t e s b y 7 5 % ( 9 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) a n d 9 9 % ( 9 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) , r e s p e c t i v e l y . H o w e v e r , 0 . 1 a n d 1 m M E G T A o n l y 2 9 4 T a b l e 1 2 . [ ” C ] C i t r u l l i n e p r o d u c t i o n i n n o r m a l a n d c o n t r o l l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n h o m o g e n a t e s . 1 m M N A D P H S o u r c e 1 0 0 u M L - N A M E 1 m M E G T A n o r m a l 1 0 0 8 i 2 0 . 8 ( 6 ) 4 . 2 i 0 2 * ( 6 ) 0 . 2 i 0 4 * ( 6 ) c o n t r o l 1 3 8 . 8 i 2 6 . 2 ( 6 ) 4 i 2 0 * ( 6 ) 3 . 7 : t 2 3 * ( 6 ) H o m o g e n a t e s w e r e i n c u b a t e d w i t h 3 I I M [ ” C ] a r g i n i n e f o r 2 5 m i n . V a l u e s a r e m e a n s i S E M f o r ( n ) r e p l i c a t i o n s f r o m 3 a n i m a l s , a n d a r e e x p r e s s e d a s p m o l e [ ” C ] c i t r u l l i n e / m g p r o t e i n . * , v a l u e s o f h o m o g e n a t e s a r e s i g n i fi c a n t l y d i f f e r e n t ( p < 0 . 0 5 ) f r o m v a l u e s o f h o m o g e n a t e s w i t h N A D P H . S i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n n o r m a l a n d c o n t r o l g r o u p s w e r e n o t d e t e c t e d . a t t e n u a t e d [ ” C ] c i t r u l l i n e f o r m a t i o n b y 4 8 a n d 7 0 % i n h o m o g e n a t e s m a d e f r o m d e n e r v a t e d L M M P p r e p a r a t i o n s ( 9 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) ( F i g u r e 6 3 A ) . F u r t h e r m o r e , a l t h o u g h [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n i n t h e p r e s e n c e o f 1 m M E G T A w a s a s m a l l p r o p o r t i o n ( 3 0 % ) o f t o t a l N A D P H - e n h a n c e d [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n , E G T A - i n s e n s i t i v e [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n w a s o b s e r v e d i n a l l h o m o g e n a t e s m a d e f r o m d e n e r v a t e d s e g m e n t s o f i l e u m . A s [ ' 4 C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n w a s n o r m a l i z e d f o r t h e a m o u n t o f p r o t e i n i n L I V fl V I P ' h o m o g e n a t e s , [ ' 4 C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n m a y h a v e a p p e a r e d t o d e c r e a s e b e c a u s e s u r g i c a l d e n e r v a t i o n i n d u c e d m u s c l e t h i c k e n i n g , r e s u l t i n g i n a g r e a t e r c o n c e n t r a t i o n o f p r o t e i n i n d e n e r v a t e d h o m o g e n a t e s a s c o m p a r e d t o c o n t r o l s . T h i s h y p o t h e s i s w a s t e s t e d b y w e i g h i n g L M M P p r e p a r a t i o n s i n a s t a n d a r d v o l u m e o f h o m o g e n i z a t i o n b u f f e r a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y . L M M P p r e p a r a t i o n s f r o m c o n t r o l i l e u m ( 9 p r e p a r a t i o n s ) w e i g h e d 0 . 0 2 1 t 0 . 0 0 1 g / c m , a n d t h i s v a l u e w a s n o t d i f f e r e n t f r o m L M M P p r e p a r a t i o n s m a d e f r o m d e n e r v a t e d i l e u m ( 0 . 0 2 4 i 0 . 0 0 2 g / c m , 9 p r e p a r a t i o n s ) ( F i g u r e 9 ) . 2 9 5 [ “ C ] C i t r u l l i n e F o r m a t i o n i n L M M P H o m o g e n a t e s F r o m C a p s a i c i n - T r e a t e d A n i m a l s A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , s y s t e m i c a d m i n i s t r a t i o n o f c a p s a i c i n w a s u s e d t o s e l e c t i v e l y d e s t r o y t h i n , u n m y e l i n a t e d s e n s o r y a f f e r e n t n e r v e s ( P a p k a e t a l . , 1 9 8 4 ; G a l l i g a n e t a l . , 1 9 8 8 ) . C a 2 + ( 0 . 1 m M ) i n c r e a s e d [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n b y 3 0 % , a n d N A D P H ( 1 m M ) s i g n i fi c a n t l y p o t e n t i a t e d [ ” C ] c i t r u l l i n e f o r m a t i o n b y 2 4 5 % a s c o m p a r e d t o b a s a l p r o d u c t i o n i n c h e m i c a l l y - d e n e r v a t e d L M M P h o m o g e n a t e s . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b s e r v e d i n h o m o g e n a t e s m a d e f r o m i l e u m i n v e h i c l e - t r e a t e d a n i m a l s ( d a t a n o t s h o w n ) . H o w e v e r , i n t h e p r e s e n c e o f 1 m M N A D P H , [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n w a s 5 0 % l e s s i n h o m o g e n a t e s f r o m c a p s a i c i n - t r e a t e d a n i m a l s ( 7 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) t h a n i n h o m o g e n a t e s f r o m v e h i c l e - t r e a t e d a n i m a l s ( 6 p r e p a r a t i o n s , 2 a n i m a l s ) ( F i g u r e 6 3 ) . [ " C ] C i t r u l l i n e p r o d u c t i o n w a s a t t e n u a t e d b y L N A ( 0 . 1 m M ) i n h o m o g e n a t e s m a d e f r o m c a p s a i c i n - t r e a t e d a n d v e h i c l e - t r e a t e d a n i m a l s , a s c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n w a s d e c r e a s e d b y 9 6 % a n d 9 8 % a s c o m p a r e d t o N A D P H - e n h a n c e d p r o d u c t i o n b y h o m o g e n a t e s f r o m c a p s a i c i n - o r v e h i c l e - t r e a t e d a n i m a l s , r e s p e c t i v e l y . L N A M E ( 0 . 1 m M ) a l s o i n h i b i t e d 9 7 % a n d 9 8 % o f [ ” C ] c i t r u l l i n e f o r m a t i o n i n L M M P s f r o m c a p s a i c i n - a n d v e h i c l e - t r e a t e d a n i m a l s ( F i g u r e 6 3 B ) . F i n a l l y , r e m o v a l o f C a 2 + b y E G T A ( 1 m M ) a t t e n u a t e d c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n i n h o m o g e n a t e s f r o m c a p s a i c i n - a n d v e h i c l e - t r e a t e d a n i m a l s b y 9 9 % a n d 9 8 % , r e s p e c t i v e l y ( F i g u r e 6 3 B ) . M y e n t e r i c N e u r o n s D o N o t C o n t a i n I n d u c i b l e N i t r i c O x i d e S y n t h a s e - l m m u n o r e a c t i v i t y A f t e r E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n A f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , a p p r o x i m a t e l y 3 3 % o f c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n w a s i n s e n s i t i v e t o r e m o v a l o f e x t r a c e l l u l a r C a ” . T h e r e f o r e , p o l y c l o n a l a n t i s e r u m a g a i n s t i n d u c i b l e N O S ( i N O S ) i s o l a t e d f r o m m a c r o p h a g e s w a s u s e d t o d e t e r m i n e i f i N O S - i r w a s 2 9 6 l o c a l i z e d i n m y e n t e r i c g a n g l i a s e v e n w e e k s a f t e r l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s . I n d u c i b l e N O S - i r w a s n o t o b s e r v e d i n m y e n t e r i c o r s u b m u c o s a l g a n g l i a , n e r v e s t r a n d s , a r t e r i o l e s , G I s m o o t h m u s c l e , o r e x t r a g a n g l i o n i c c e l l s . P o s i t i v e i m m u n o r e a c t i v i t y w a s o b s e r v e d i n e x t r a g a n g l i o n i c m a c r o p h a g e - l i k e s t r u c t u r e s ( d a t a n o t s h o w n ) a f t e r 3 h r i n c u b a t i o n o f n o r m a l i l e u m w i t h 1 0 0 n g / m l l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( s e r o t y p e 0 1 2 8 2 3 1 2 ) , s u g g e s t i n g c o r r e c t fi x a t i v e s a n d d i l u t i o n s o f r e a g e n t s h a d b e e n u t i l i z e d . H o w e v e r , i t w a s i m p o s s i b l e t o d e t e r m i n e i f l a c k o f i m m u n o r e a c t i v i t y r e s u l t e d f r o m a b s e n c e o f t h e a n t i g e n , o r f r o m t h e a b s e n c e o f b i n d i n g o f a n t i s e r u m r a i s e d a g a i n s t m a c r o p h a g e i N O S a l t h o u g h t y p e I I i s o f o r m o f N O S w a s p r e s e n t . 2 9 7 F i g u r e 6 3 . C o m p a r i s o n o f [ ' 4 C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n b y h o m o g e n a t e s i n l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m c o n t r o l a n d d e n e r v a t e d i l e u m . A . E f f e c t s o f 0 . 1 m M L N A M E , a n d 1 m M E G T A o n c o n t r o l a n d s u r g i c a l l y - d e n e r v a t e d i l e u m . L o o p s o f i l e u m w e r e d e n e r v a t e d 7 w e e k s p r i o r t o t h e e x p e r i m e n t a n d c o n t r o l s e g m e n t s w e r e t a k e n o r a l o r a b o r a l t o t h e d e n e r v a t e d s e g m e n t . N A D P H ( 1 m M ) w a s p r e s e n t i n a l l h o m o g e n a t e s . B . E f f e c t s o f 0 . 1 m M L N A M E , a n d 1 m M E G T A o n i l e u m f r o m v e h i c l e - a n d c a p s a i c i n - t r e a t e d a n i m a l s . L o o p s o f i l e u m w e r e t a k e n 7 w e e k s a f t e r a d m i n i s t r a t i o n o f v e h i c l e o r c a p s a i c i n . N A D P H ( 1 m M ) w a s p r e s e n t i n a l l h o m o g e n a t e s . D o u b l e a s t e r i s k s ( * * ) i n d i c a t e p < 0 . 0 5 a s c o m p a r e d t o p r o d u c t i o n b y c o n t r o l h o m o g e n a t e s . S i n g l e a s t e r i s k s ( * ) i n d i c a t e p < 0 . 0 5 a s c o m p a r e d t o p r o d u c t i o n b y c o n t r o l o r d e n e r v a t e d L M M P h o m o g e n a t e s i n t h e p r e s e n c e o f 1 m M N A D P H . C r o s s ( + ) i n d i c a t e s p < 0 . 0 1 a s c o m p a r e d t o c o n t r o l h o m o g e n a t e s i n t h e p r e s e n c e o f 1 m M E G T A . H o m o g e n a t e s w e r e i n c u b a t e d w i t h 3 u M [ ” C ] a r g i n i n e f o r 2 5 m i n a t 3 7 ° C . 2 9 8 F i g u r e 6 3 . A 1 6 0 ' 5 s E 1 2 0 . 1 : ] c o n t r o l 3 ’ - d e n e r v a t e d \ E 8 0 ~ E 5 . 4 o - ' 3 a a 0 N A D P H L N A M E E G T A B 1 6 0 " . 5 s g m . 1 : v e h i c l e 2 ' ‘ - c a p s a i c i n \ E 8 0 - E % 2 4 0 ' O S . I I ” e 0 r — L - I 1 ' 1 N A D P H L N A M E E G T A 2 9 9 9 . F O S - L I K E P R O T E I N I N C R E A S E S A F T E R E X T R I N S I C D E N E R V A T I O N I n t r o d u c t i o n a n d E x p e r i m e n t a l R a t i o n a l e R e c e n t l y , e x p r e s s i o n o f t h e i n t r a n u c l e a r p h o s p h o p r o t e i n F 0 3 h a s b e e n f o u n d t o i n c r e a s e f o l l o w i n g m a n i p u l a t i o n s s u c h a s e x p o s u r e t o g r o w t h f a c t o r s ( M i l b r a n t , 1 9 8 6 ) a n d i n d u c t i o n o f s e i z u r e s ( S a g e r e t a l . , 1 9 8 8 ) ( s e e i n t r o d u c t i o n ) . F o s h a s b e e n u s e d a s a n i n d i c a t o r o f i n c r e a s e d ( o r i n c r e a s i n g ) n u c l e a r a c t i v i t y , a l t h o u g h t h e r o l e o f F o s h a s n o t b e e n e l u c i d a t e d . F o s h a s b e e n p r o p o s e d t o b e a t h i r d m e s s e n g e r b e t w e e n e x t r a c e l l u l a r s i g n a l s a n d n u c l e a r e v e n t s ( S a g e r e t a l . , 1 9 8 8 ) , a s F o s i s i n v o l v e d i n i n i t i a t i o n o f t r a n s c r i p t i o n o f c e l l - s p e c i fi c t a r g e t g e n e s u l t i m a t e l y r e s u l t i n g i n a c e l l u l a r r e s p o n s e ( L a u a n d N a t h a n s , 1 9 8 7 ; s e e i n t r o d u c t i o n ) . T h e r e f o r e , e x p r e s s i o n o f F o s m a y i n d i c a t e a l t e r a t i o n s i n n u c l e a r e v e n t s o f n e u r o n s . P r e v i o u s s t u d i e s o n e n t e r i c n e u r o n s h a v e r e v e a l e d t h a t F o s - l i k e - i r c a n n o t b e d e t e c t e d i n c o n t r o l s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c g a n g l i a . H o w e v e r , s t i m u l a t i o n o f m u c o s a i n d u c e s F o s - i r i n a p o p u l a t i o n o f s u b m u c o s a l n e u r o n s ( K i r c h g e s s n e r e t a l . , 1 9 9 2 ) , s u g g e s t i n g s o m e e n t e r i c n e u r o n s c a n e x p r e s s F o s p r o t e i n i n r e s p o n s e t o s t i m u l i . A s l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n i n d u c e s a n u m b e r o f c h a n g e s i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c g a n g l i a , s o m e s i g n a l m u s t c o m m u n i c a t e b e t w e e n t h e e x t e r i o r m i l i e u a n d t h e n u c l e u s ; c - f o s , t h e e a r l y i m m e d i a t e g e n e ( E I G ) t h a t e n c o d e s F o s p r o t e i n w o u l d b e a p l a u s i b l e c a n d i d a t e ( W e s s e l e t a l . , 1 9 9 1 ) . F u r t h e r m o r e , i n c r e a s e d p r o t e i n s y n t h e s i s w o u l d b e e x p e c t e d t o o c c u r a f t e r i n c r e a s e d n u c l e a r e v e n t s , w h i c h w o u l d i n t u r n b e c o r r e l a t e d w i t h i n c r e a s e d F o s - i r . T h e r e f o r e , i m m u n o c y t o c h e m i s t r y w a s u s e d t o l o c a l i z e F o s - i r i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c g a n g l i o n i c n u c l e i t o t e s t t h e h y p o t h e s i s t h a t l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n i n d u c e d E I G e x p r e s s i o n . F o s - i r c o u l d t h e n b e u s e d t o d e t e r m i n e i f e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n e f f e c t s 3 0 0 a l l e n t e r i c n e u r o n s , o r i f s p e c i fi c s u b p o p u l a t i o n s o f e n t e r i c n e u r o n s r e s p o n d t o l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s . F o s - i r I s N o t F o u n d I n N o r m a l S u b m u c o s a l o r M y e n t e r i c P l e x u s P r e p a r a t i o n s T h r e e a n t i s e r u m w e r e u s e d t o l o c a l i z e F o s - i r i n e n t e r i c n u c l e i ( T a b l e 1 3 ) . P o l y c l o n a l a n t i s e r u m S C - 5 2 ( S a n t a - C r u z ) , m o n o c l o n a l a n t i b o d y A B - l ( O n c o g e n e S c i e n c e s ) , a n d p o l y c l o n a l a n t i s e r u m O A - 1 1 - 8 2 3 ( C a m b r i d g e R e s e a r c h B i o c h e m i c a l s ) f a i l e d t o r e c o g n i z e e p i t o p e s i n n o r m a l s u b m u c o s a l ( 5 p r e p a r a t i o n s / a n t i b o d y ) a n d m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s ( 2 - 5 p r e p a r a t i o n s / a n t i b o d y ) fi x e d i n Z a m b o n i ’ s s o l u t i o n o r 4 % p a r a f o r m a l d e h y d e . A s p r e v i o u s w o r k h a s d e m o n s t r a t e d t h a t h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f K d e p o l a r i z e n e u r o n s a n d i n d u c e e x p r e s s i o n o f F o s - i r i n v i t r o ( M o r g a n a n d C u r r a n , 1 9 8 6 ) , s e g m e n t s o f i l e u m w e r e i n c u b a t e d i n K r e b s ’ s o l u t i o n c o n t a i n i n g 5 0 m M K + ( a s K C l ) t o d e t e r m i n e i f e n t e r i c n e u r o n s c a n e x p r e s s F o s . O A - 1 1 - 8 2 3 a n d A B - l d i d n o t r e c o g n i z e a n y e p i t o p e s o n s u b m u c o s a l o r m y e n t e r i c g a n g l i a a f t e r 1 , 2 , 3 , o r 4 h i n d e p o l a r i z i n g m e d i u m ( 3 s u b m u c o s a l a n d 3 m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s / a n t i b o d y / t i m e p o i n t ) ( T a b l e 1 4 ) . H o w e v e r , o n e h o u r a f t e r i n c u b a t i o n i n h i g h K K r e b s ’ s o l u t i o n , S C - 5 2 - i r w a s o b s e r v e d i n s u b m u c o s a l ( 3 p r e p a r a t i o n s ) a n d m y e n t e r i c ( 3 p r e p a r a t i o n s ) g a n g l i o n i c n u c l e i i n t i s s u e s fi x e d i n Z a m b o n i ’ s s o l u t i o n ( F i g u r e 6 4 ) . S C - 5 2 b i n d i n g w a s l o c a l i z e d i n o v o i d - s h a p e d o r g a n e l l e s i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s fi x e d i n Z a m b o n i ’ s s o l u t i o n b u t n o t 4 % p a r a f o r m a l d e h y d e . T h e s e o r g a n e l l e s w e r e a l s o s t a i n e d b y t h e n u c l e a r d y e b i s B e n z i m i d e ( H o e c h s t d y e 3 3 5 2 8 ) ( d a t a n o t s h o w n ) , i n d i c a t i n g t h e a n t i b o d y r e c o g n i z e d a n u c l e a r p r o t e i n . F u r t h e r m o r e , F o s - i r w a s o n l y l o c a l i z e d i n g a n g l i o n i c n u c l e i , a s n u c l e i f r o m m u s c l e c e l l s , fi b r o b l a s t s , a n d o t h e r e x t r a g a n g l i o n i c c e l l s [ r e v i e w e d i n 1 6 ] w e r e n o t fl u o r e s c e n t . S i m i l a r l y , s t r u c t u r e s s u c h a s s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s , n e r v e fi b e r s , F i g u r e 6 4 . F o s - i r i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c g a n g l i a i n w h o l e m o u n t p r e p a r a t i o n s f r o m c o n t r o l a n d s u r g i c a l l y - d e n e r v a t e d i l e u m . A . F o s - i r i s n o t o b s e r v e d i n s u b m u c o s a l g a n g l i a f r o m c o n t r o l i l e u m t a k e n o r a l o r a b o r a l t o d e n e r v a t e d s e g m e n t s . B . F o s - i r i n s u b m u c o s a l g a n g l i a f r o m l o o p s o f i l e u m d e n e r v a t e d 1 w e e k p r i o r t o e x p e r i m e n t . C . F o s - i r i s n o t o b s e r v e d i n m y e n t e r i c g a n g l i a f r o m c o n t r o l i l e u m . D . F o s - i r i n m y e n t e r i c g a n g l i a f r o m l o o p s o f i l e u m d e n e r v a t e d 1 w e e k p r i o r t o e x p e r i m e n t . g , g a n g l i o n , a r r o w s i n d i c a t e d F o s - i r n u c l e i . C a l i b r a t i o n b a r i n D i s a p p r o x i m a t e l y 4 0 u m . 3 0 1 . 4 6 2 & 3 3 0 3 T a b l e 1 3 . A n t i s e r u m u s e d t o l o c a l i z e c - F o s p r o t e i n i n e n t e r i c n u c l e i . S o u r c e S e q u e n c e o f S y n t h e t i c A n t i b o d y C o d e T a r g e t A n t i g e n P e p t i d e A n t i g e n H o s t A B - l O n c o g e n e S c i e n c e s K V E Q L S P E E E E K R R I R R m o u s e m o n o c l o n a l h u m a n c - F o s , 1 2 8 - 1 5 2 E R N K M A A A O A - 1 1 - 8 2 3 C a m b r i d g e R e s e a r c h M F S G F N A D Y E A S S S R s h e e p p o l y c l o n a l B i o c h e m i c a l s [ C y s ] h u m a n c - F o s , 1 - 1 6 8 0 5 2 S a n t a C r u z B i o t e c h n o l o g y S G F N A D Y E A S S S R C r a b b i t p o l y c l o n a l h u m a n c - F o s , 3 - 1 6 i n t e r g a n g l i o n i c n e r v e b u n d l e s , a n d m u s c l e c e l l s d i d n o t c o n t a i n F o s - i r . I n s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s , s u b m u c o s a l g a n g l i o n c o n t a i n e d a n a v e r a g e o f 8 . 2 i 0 . 6 F o s - i r n u c l e i ( 3 p r e p a r a t i o n s , 8 9 8 n u c l e i , 1 1 5 g a n g l i a ) ( T a b l e 1 4 ) , w i t h a n a v e r a g e s i z e o f 1 1 . 3 : 1 : 0 . 3 p m ( l o n g a x i s ) a n d 8 . 5 i 0 . 3 p m ( s h o r t a x i s ) . M y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s c o n t a i n e d 1 1 0 i 8 F o s - i r n u c l e i ( 3 p r e p a r a t i o n s , 1 , 3 3 7 n u c l e i , 1 3 g a n g l i a ) a n d n u c l e i h a d a n a v e r a g e s i z e o f 1 3 . 5 i 0 . 3 p m ( l o n g a x i s ) a n d 9 . 2 i 0 . 3 p m ( s h o r t a x i s ) . B i n d i n g o f S C - 5 2 w a s p r e v e n t e d b y p r e - i n c u b a t i n g t h e a n t i s e r u m w i t h l O - f o l d a c c e s s ( b y w e i g h t ) o f s y n t h e t i c c - F o s p e p t i d e p r i o r t o a p p l i c a t i o n o f a n t i s e r u m t o t i s s u e s s a m p l e s , a n d i m m u n o r e a c t i v e n u c l e i w e r e n o t o b s e r v e d i f t h e p r i m a r y a n t i s e r u m w a s n o t a p p l i e d b e f o r e s e c o n d a r y a n t i s e r u m . A l t h o u g h F o s - i r w a s o b s e r v e d i n p r e p a r a t i o n s m a d e f r o m s e g m e n t s o f i l e u m i n c u b a t e d i n K r e b s ’ s o l u t i o n c o n t a i n i n g 5 0 m M K ’ , F o s - i r n u c l e i w e r e a l s o p r e s e n t i n p r e p a r a t i o n s m a d e f r o m s e g m e n t s o f i l e u m i n c u b a t e d i n n o r m a l K r e b s ’ s o l u t i o n ( T a b l e 1 4 ) . T h e n u m b e r o f F o s - i r n u c l e i / s u b m u c o s a l g a n g l i o n ( 4 p r e p a r a t i o n s ) a n d F o s - i r n u c l e i / m y e n t e r i c g a n g l i o n ( 4 p r e p a r a t i o n s ) f r o m s e g m e n t s o f i l e u m i n c u b a t e d i n K r e b s ’ T a b l e 1 4 . T h e n u m b e r o f c - F o s - i r n u c l e i i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c g a n g l i a i n n o r m a l g u i n e a p i g i l e u m . 3 0 4 T r e a t m e n t S u b m u c o s a l G a n g l i o n M y e n t e r i c G a n g l i o n ( F o s - i r n u c l e i , g a n g l i a ) ( F o s - i r n u c l e i , g a n g l i a ) S C - 5 2 n o r m a l i l e u m 0 i 0 0 i 0 z a m b o n i fi x a t i o n ( 0 , 2 1 6 ) ( 0 , 2 7 ) n o r m a l i l e u m 0 i 0 0 i 0 4 % p a r a f o r r n a l d e h y d e ( 0 , 2 3 4 ) ( 0 , 2 0 ) c o n t r o l m e d i u m 8 . 1 5 i 0 . 5 9 1 1 0 i 8 1 h o u r ( 8 9 6 , 1 1 5 ) ( 1 3 3 7 , 1 3 ) K ’ - m e d i u m 8 . 1 4 i 0 . 4 3 1 2 6 i : 6 1 h o u r ( 7 5 0 , 9 3 ) ( 2 0 5 0 , 1 8 ) c o n t r o l m e d i u m 9 . 0 4 i 0 . 4 7 1 2 3 i 9 2 h o u r s ( 1 9 2 4 , 2 1 6 ) ( 3 2 9 0 , 2 7 ) K i - m e d i u m 7 . 5 4 i 0 . 5 6 1 2 1 i 8 2 h o u r s ( 1 1 0 1 , 1 4 8 ) ( 5 8 6 2 , 6 2 ) c o n t r o l m e d i u m 9 . 4 4 i 0 . 4 0 1 2 3 i 1 2 4 h o u r s ( 4 1 9 4 , 4 5 0 ) ( 9 1 5 3 , 7 9 ) K ’ - m e d i u m 9 . 8 4 i 0 . 6 5 1 2 4 i 8 4 h o u r s ( 2 2 7 0 , 2 3 4 ) ( 5 9 9 0 , 4 9 ) A B — l c o n t r o l m e d i u m 0 i 0 0 i 0 4 h o u r s ( 0 , 1 2 3 ) ( 0 , 3 0 ) K i - m e d i u m O i 0 0 i 0 4 h o u r s ( 0 , 9 2 ) ( 0 , 3 5 ) O A - 1 1 - 8 2 3 c o n t r o l m e d i u m 0 i 0 0 i 0 4 h o u r s ( 0 , 1 4 2 ) ( 0 , 4 5 ) K i - m e d i u m 0 i - 0 O : t 0 4 h o u r s ( 0 , 7 8 ) ( 0 , 3 7 ) N u m b e r o f F o s - i r n u c l e i / g a n g l i o n i n n o r m a l g u i n e a p i g i l e u m . D a t a a r e m e a n s o f F o s - i r n u c l e i / g a n g l i o n i S E M f o r 3 p r e p a r a t i o n s f r o m e a c h t r e a t m e n t . 3 0 5 s o l u t i o n ( 6 p r e p a r a t i o n s ) w a s n o t d i f f e r e n t f r o m t h e n u m b e r o f F o s - i r n u c l e i / g a n g l i o n i n p r e p a r a t i o n s i n c u b a t e d i n h i g h K + K r e b s ’ s o l u t i o n ( 6 p r e p a r a t i o n s ) ( T a b l e 1 4 ) . F u r t h e r m o r e , t h e n u m b e r o f F o s - i r n u c l e i / s u b m u c o s a l g a n g l i o n a n d F o s - i r n u c l e i / m y e n t e r i c g a n g l i o n w a s n o t a l t e r e d b y t h e l e n g t h o f i n c u b a t i o n ( 1 - 4 h r ) i n n o r m a l o r h i g h K + K r e b s ’ s o l u t i o n ( 4 - 6 p r e p a r a t i o n s / t i m e p o i n t ) ( T a b l e 1 4 ) . S u r g i c a l E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n I n c r e a s e s F o s - i r i n S u b m u c o s a l a n d M y e n t e r i c G a n g l i a A g r e a t e r n m n b e r o f F o s - i r n u c l e i w e r e o b s e r v e d i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c g a n g l i a o n e w e e k a f t e r l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n a s c o m p a r e d t o c o n t r o l p r e p a r a t i o n s t a k e n f r o m s e g m e n t s o r a l o r a b o r a l t o t h e d e n e r v a t e d r e g i o n i n a n i m a l - m a t c h e d c o n t r o l s ( F i g u r e 6 5 ) . F o s - i r w a s o b s e r v e d i n g a n g l i o n i c n u c l e i i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c g a n g l i a , b u t n o t i n o t h e r s t r u c t u r e s ( F i g u r e 6 4 ) . S i g n i fi c a n t l y m o r e n u c l e i c o n t a i n e d F o s - i r i n s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s f r o m e x t r i n s i c a l l y - d e n e r v a t e d i l e u m , a s 1 1 . 7 i 1 . 2 s u b m u c o s a l n u c l e i / g a n g l i o n ( 9 , 7 2 7 F o s - i r n u c l e i , 8 5 1 g a n g l i a , 8 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) w e r e o b s e r v e d i n d e n e r v a t e d p r e p a r a t i o n s , a n d c o n t r o l p r e p a r a t i o n s c o n t a i n e d 3 . 7 : t 1 . 1 F o s - i r s u b m u c o s a l n u c l e i / g a n g l i o n ( 2 , 1 0 0 F o s - i r n u c l e i , 5 5 9 g a n g l i a , 8 p r e p a r a t i o n s , 3 a n i m a l s ) ( F i g u r e 6 5 A ) . A n i n c r e a s e w a s o b s e r v e d a l s o i n m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s , a s 1 1 4 i 6 m y e n t e r i c n u c l e i / g a n g l i o n w e r e f o u n d i n e x t r i n s i c a l l y - d e n e r v a t e d p r e p a r a t i o n s ( 1 , 4 2 4 F o s - i r n u c l e i , 1 5 0 m y e n t e r i c g a n g l i a , 1 3 p r e p a r a t i o n s , 4 a n i m a l s ) , a n d c o n t r o l p r e p a r a t i o n s c o n t a i n e d 1 3 i 4 n u c l e i / g a n g l i o n ( 2 , 4 6 9 F o s - i r n u c l e i , 2 3 1 g a n g l i a , 1 0 p r e p a r a t i o n s , 4 a n i m a l s ) ( F i g u r e 6 5 B ) . H o w e v e r , t h e n u m b e r o f F o s - i r n u c l e i / g a n g l i o n d i d n o t i n c r e a s e i n s u b m u c o s a l o r m y e n t e r i c p r e p a r a t i o n s t a k e n f r o m s h a m - d e n e r v a t e d s e g m e n t s o f i l e u m a s c o m p a r e d t o c o n t r o l s t a k e n f r o m t h e s a m e a n i m a l s ( F i g u r e 6 5 ) . 3 0 6 F i g u r e 6 5 . N u m b e r o f F o s - i r n u c l e i i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c g a n g l i a f r o m s e g m e n t s o f i l e u m d e n e r v a t e d 1 - 2 4 w e e k s p r i o r t o e x p e r i m e n t . A . N u m b e r o f F o s - i r n u c l e i i n s u b m u c o s a l g a n g l i a f r o m s h a m a n d d e n e r v a t e d i l e u m . B . N u m b e r o f F o s - i r m y e n t e r i c g a n g l i a f r o m s h a m a n d d e n e r v a t e d i l e u m . D a t a a r e 8 - 1 0 t i s s u e s f r o m 3 - 4 a n i m a l s f o r e a c h t i m e p o i n t . A s t e r i s k s ( * ) i n d i c a t e p < 0 . 0 5 a s c o m p a r e d t o s e g m e n t s t a k e n o r a l o r a b o r a l t o d e n e r v a t e d s e g m e n t s . F i g u r e 6 5 . A : g 5 1 5 E O O _ 1 2 I C O 3 9 E A a : 6 E 3 : 3 . 2 l . . 0 I I . B : g 1 2 0 O G I ° 9 6 . 2 b O z 7 2 O h E 2 4 a 2 0 a ‘ 2 4 . 5 . I 3 0 I I . 3 0 7 * c o n t r o l 6 - d e n e r v a t e d I n o r m a l s h a m 1 4 7 1 0 2 4 w e e k s a f t e r d e n e r v a t i o n _ [ : 1 c o n t r o l - d e n e r v a t e d n o r m a l s h a m 1 4 7 1 0 2 4 w e e k s a t t e r d e n e r v a t i o n 3 0 8 S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b s e r v e d i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c g a n g l i a 4 , 7 , 1 0 , a n d 2 4 w e e k s a f t e r l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s ( F i g u r e 6 5 ) , a s t h e n u m b e r o f F o s - i r n u c l e i / s u b m u c o s a l g a n g l i o n a n d F o s - i r n u c l e i / m y e n t e r i c g a n g l i o n w a s s i g n i fi c a n t l y g r e a t e r i n s e g m e n t s f r o m d e n e r v a t e d t i s s u e s , a s c o m p a r e d t o p r e p a r a t i o n s f r o m c o n t r o l s e g m e n t s o f i l e u m . H o w e v e r , t h e n u m b e r o f F o s - i r n u c l e i / g a n g l i o n d e c r e a s e d o v e r t i m e . F o r e x a m p l e , 1 w e e k a f t e r d e n e r v a t i o n , s u b m u c o s a l g a n g l i o n c o n t a i n e d 1 1 . 7 i 1 . 2 5 F o s - i r n u c l e i , w h e r e a s 2 . 0 5 i 0 . 8 5 F o s - i r n u c l e i / g a n g l i o n w e r e o b s e r v e d 2 4 w e e k s a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n . L o s s o f E x t r i n s i c S y m p a t h e t i c o r S e n s o r y N e r v e s I n c r e a s e s F o s - i r i n S u b m u c o s a l a n d M y e n t e r i c G a n g l i a G u i n e a p i g s w e r e t r e a t e d w i t h c a p s a i c i n o r 6 - O H - D A t o d e s t r o y e x t r i n s i c s e n s o r y o r s y m p a t h e t i c n e r v e s , r e s p e c t i v e l y . O n e w e e k a f t e r t r e a t m e n t w i t h 6 - O H - D A , t h e n u m b e r o f F o s - i r n u c l e i i n c r e a s e d s i g n i fi c a n t l y i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c g a n g l i a a s c o m p a r e d t o p r e p a r a t i o n s f r o m v e h i c l e - t r e a t e d a n i m a l s ( F i g u r e 6 6 ) . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b t a i n e d a f t e r s y s t e m i c a d m i n i s t r a t i o n o f c a p s a i c i n , a s t h e n u m b e r o f F o s - i r n u c l e i i n c r e a s e d b y 3 5 0 % a n d 7 0 0 % i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c g a n g l i a , r e s p e c t i v e l y , a s c o m p a r e d t o t i s s u e s t a k e n f r o m v e h i c l e - t r e a t e d a n i m a l s ( F i g u r e 6 6 ) . 3 0 9 F i g u r e 6 6 . N u m b e r o f F o s - i r n u c l e i i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c g a n g l i a f r o m s e g m e n t s o f i l e u m t a k e n f r o m a n i m a l s s y s t e m i c a l l y - t r e a t e d w i t h 6 - O H - D A o r c a p s a i c i n . A . N u m b e r o f F o s - i r n u c l e i i n s u b m u c o s a l g a n g l i a f r o m a n i m a l s t r e a t e d w i t h 6 - O H - D A o r c a p s a i c i n 1 w k p r i o r t o e x p e r i m e n t . B . N u m b e r o f F o s - i r n u c l e i i n m y e n t e r i c g a n g l i a f r o m a n i m a l s t r e a t e d w i t h 6 - O H - D A o r c a p s a i c i n 1 w e e k p r i o r t o e x p e r i m e n t . D a t a a r e 3 - 6 t i s s u e s f r o m 3 a n i m a l s f o r e a c h t i m e p o i n t . A s t e r i s k s ( * ) i n d i c a t e p < 0 . 0 5 a s c o m p a r e d t o s e g m e n t s t a k e n f r o m v e h i c l e - t r e a t e d a n i m a l s , a n d c r o s s ( + ) i n d i c a t e s p < 0 . 0 5 a s c o m p a r e d t o s e g m e n t s t a k e n f r o m 6 - O H - D A - t r e a t e d a n i m a l s . 6 - O H - D A C a p s a i c i n t r e a t m e n t 3 1 0 F i g u r e 6 6 . 5 = . 1 5 r . a v e h i c l e . 5 1 2 ' - d e n e r v a t e d 8 3 9 ' o g . . 3 s e - 0 g I : 3 " . 9 . - l : 5 ° T 6 - O H - D A C a p s a i c i n t r e a t m e n t 5 1 2 0 = 6 . v e h i c l e ’ s O a 9 6 . - d e n e r v a t e d . 2 h 0 z 7 2 - g e s 4 , . E 0 2 2 4 - . 2 . I g _ I L 0 D I S C U S S I O N 1 . E X T R I N S I C D E N E R V A T I O N A L T E R S A R T E R I O L A R I N N E R V A T I O N A l t h o u g h V I P - o r S P - w i t h o u t C G R P - i r n e r v e fi b e r s a r e r a r e l y a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s i n n o r m a l i l e u m , G a l l i g a n e t a l . ( 1 9 8 8 ) f o u n d n e w S P - a n d V I P - i r n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s a s s o o n a s 4 w e e k s a f t e r e l i m i n a t i o n o f e x t r i n s i c n e r v e s t o l o o p s o f g u i n e a p i g i l e u m . S u b s t a n c e P - a n d V I P - i r w e r e n o t f o u n d t o b e c o l o c a l i z e d i n t h e s a m e n e r v e fi b e r s , i n d i c a t i n g t h a t a t l e a s t t w o p o p u l a t i o n s o f e n t e r i c n e u r o n s w e r e a l t e r e d b y l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s . T h e s e S P - a n d V I P - i r n e r v e fi b e r s w e r e u n l i k e l y t o r e s u l t f r o m a x o n a l s p r o u t i n g o r r e g r o w t h o f e x t r i n s i c n e r v e s , a s n e w S P - o r V I P - i r n e r v e s w e r e n o t s e n s i t i v e t o c a p s a i c i n o r 6 - h y d r o x y d o p a m i n e . F u r t h e r m o r e , s y m p a t h e t i c a n d p r i m a r y a f f e r e n t n e r v e fi b e r s w e r e n o t l o c a l i z e d i n t h e d e n e r v a t e d s e g m e n t o f i l e u m d u r i n g t h e a p p e a r a n c e o f n e w V I P - a n d S P - i r n e r v e fi b e r s , s u g g e s t i n g t h e a l t e r e d i n n e r v a t i o n o r i g i n a t e d f r o m e n t e r i c n e u r o n s . I n 1 9 9 0 , G a l l i g a n e t a l . d e m o n s t r a t e d f u n c t i o n a l i m p o r t a n c e o f t h e n e w S P - i r n e r v e s , a s t h e n e u r o t r a n s m i t t e r r e s p o n s i b l e f o r v a s o d i l a t i o n o f s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s w a s a l t e r e d b y s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n . A s d e s c r i b e d i n t h e i n t r o d u c t i o n , n e u r o g e n i c v a s o d i l a t i o n o f a r t e r i o l e s w a s m e d i a t e d b y A C h ; h o w e v e r , f o l l o w i n g l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s , v a s o d i l a t i o n s w e r e i n h i b i t e d b y N K r e c e p t o r a n t a g o n i s t s , i n d i c a t i n g v a s o d i l a t i o n w e r e m e d i a t e d b y S P . H o w e v e r , t h e s e a n a t o m i c a l a n d f u n c t i o n a l s t u d i e s d i d n o t d e t e r m i n e t h e m e c h a n i s m f o r a p p e a r a n c e o f n e w i n n e r v a t i o n , n o r d i d t h e y i d e n t i f y t h e 3 1 1 3 1 2 o r i g i n o f t h e s e e n t e r i c n e u r o n s . T h e r e f o r e , t h e fi r s t s p e c i fi c a i m o f t h i s d i s s e r t a t i o n w a s t o d e t e r m i n e t h e m e c h a n i s m a n d o r i g i n o f n e w S P - a n d V I P - i r v a s c u l a r n e r v e s . N e w V a s c u l a r N e r v e s O r i g i n a t e F r o m M y e n t e r i c G a n g l i a T h e s e q u e s t i o n s w e r e a n s w e r e d b y u s i n g t h e r e t r o g r a d e d y e F l u o r o - g o l d ( F g ) t o i d e n t i f y v a s o m o t o r n e u r o n s i n s u b m u c o s a l g a n g l i a . A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , F g w a s i n j e c t e d i n t o a r t e r i o l e s , r e t r o g r a d e t r a n s p o r t w a s a l l o w e d t o o c c u r , a n d F g - l a b e l l e d n e u r o n s w e r e v i s u a l i z e d a n d c o u n t e d . P r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s d e m o n s t r a t e d t h a t s u b m u c o s a l n e u r o n s o n l y c o n t a i n e d F g i f t h e d y e w a s i n j e c t e d i n t o t h e l u m e n o f a r t e r i o l e s , a n d n o t o v e r t h e s u r f a c e o f t h e a r t e r i o l e s , i n d i c a t i n g a x o n s o f p a s s a g e d i d n o t t r a n s p o r t F g . A s a r e s u l t o f t h e s e e x p e r i m e n t s , t h e p r e s e n c e o f F g l a b e l l e d s u b m u c o s a l n e u r o n s w a s i n t e r p r e t e d a s i d e n t i fi c a t i o n o f v a s o m o t o r n e u r o n s . N e w S P - o r V I P - i r n e r v e s c o u l d r e s u l t f r o m a x o n a l s p r o u t i n g o f e n t e r i c n e u r o n s a n d f o r m a t i o n o f n e w s y n a p s e s a n d n e u r o e f f e c t o r j u n c t i o n s . A l t e r n a t i v e l y , n e w n e r v e fi b e r s c o u l d r e s u l t f r o m c h a n g e s i n p h e n o t y p i c e x p r e s s i o n o f e x i s t i n g n e r v e fi b e r s . I f s u b m u c o s a l n e u r o n s p r o v i d e d t h e s o u r c e o f n e w i n n e r v a t i o n , t h e n a x o n a l s p r o u t i n g w o u l d i n c r e a s e t h e n u m b e r o f s i t e s f o r u p t a k e o f F g , r e s u l t i n g i n a g r e a t e r n u m b e r o f F g - l a b e l l e d n e u r o n s / s u b m u c o s a l g a n g l i a . H o w e v e r , i f s u b m u c o s a l n e u r o n s p r o v i d e d t h e s o u r c e o f n e w i n n e r v a t i o n , a n d a x o n a l s p r o u t i n g d i d n o t o c c u r , t h e n t h e r a t i o o f F g - l a b e l l e d n e u r o n s / s u b m u c o s a l g a n g l i a w o u l d n o t d i f f e r . T h e n e w S P - o r V I P - i r n e r v e fi b e r s w o u l d r e s u l t f r o m e i t h e r u p r e g u l a t i o n o f S P o r V I P , o r d e n o v o s y n t h e s i s o f S P o r V I P i n n e u r o n s n o r m a l l y n o t e x p r e s s i n g t h e s e p e p t i d e s . I n t h i s m o d e l , i n c r e a s e d S P o r V I P - i r w o u l d b e m a n i f e s t e d a s i n c r e a s e d c o l o c a l i z a t i o n o f S P - o r V I P - i r i n F g - l a b e l l e d n e u r o n s . A l t h o u g h F g - l a b e l l i n g w a s o b s e r v e d i n s u b m u c o s a l n e u r o n s i n w h o l e m o u n t s u b m u c o s a l 3 1 3 p r e p a r a t i o n s m a d e f r o m n o r m a l , c o n t r o l , a n d d e n e r v a t e d l o o p s o f i l e u m , i n c r e a s e d F g - l a b e l l e d n e u r o n s / s u b m u c o s a l g a n g l i a w a s n e v e r o b s e r v e d a t a n y t i m e p o i n t e x a m i n e d . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s d i d n o t i n d u c e a x o n a l s p r o u t i n g f r o m s u b m u c o s a l n e u r o n s . F u r t h e r m o r e , e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n d i d n o t i n c r e a s e S P - i r / F g - l a b e l l e d n e u r o n s , n o r V I P - i r / F g l a b e l l e d n e u r o n s w i t h i n s u b m u c o s a l g a n g l i a , i m p l y i n g t h a t l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s d i d n o t c h a n g e p h e n o t y p i c e x p r e s s i o n o f s u b m u c o s a l n e u r o n s . T h e r e f o r e , a l t h o u g h t h e s e d a t a d i d n o t i d e n t i f y t h e m e c h a n i s m b y w h i c h n e w S P - o r V I P - i r n e r v e s w e r e a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s , t h e s e F g s t u d i e s s t r o n g l y s u g g e s t t h e s o u r c e o f S P - a n d V I P - i r n e r v e s o r i g i n a t e s f r o m m y e n t e r i c n e u r o n s . U n f o r t u n a t e l y , d u e t o g r e a t t e c h n i c a l d i f fi c u l t i e s , i t w a s i m p o s s i b l e t o e x a m i n e fl u o r o - g o l d l a b e l l i n g i n p r e p a r a t i o n s w h i c h c o n t a i n e d t h e m y e n t e r i c p l e x u s , i n a d d i t i o n t o t h e s u b m u c o s a l l a y e r . I n d e s i g n i n g e x p e r i m e n t s t o i d e n t i f y t h e m e c h a n i s m f o r t h e a p p e a r a n c e o f n e w S P - o r V I P - i r n e r v e fi b e r s , i t w a s a s s u m e d t h a t a x o n a l s p r o u t s f r o m s u b m u c o s a l g a n g l i a w o u l d u p t a k e a n d r e t r o g r a d e l y t r a n s p o r t F g i n a s i m i l a r m a n n e r t o a d u l t a x o n s . H o w e v e r , i f t h i s p o s t u l a t e w a s i n c o r r e c t , t h e n i n t e r p r e t a t i o n o f F g l a b e l l i n g i n s u b m u c o s a l n e u r o n s w o u l d l e a d t o f a l s e r e j e c t i o n o f t h e h y p o t h e s i s t h a t S P - a n d V I P - i r n e r v e fi b e r s r e s u l t f r o m a x o n a l s p r o u t s o f s u b m u c o s a l n e u r o n s . R e c e n t l y , J i a n g a n d S u r p r e n a n t ( 1 9 9 2 ) h a v e s h o w n t h a t s u r g i c a l r e m o v a l o f t h e m y e n t e r i c p l e x u s p r i o r t o d e n e r v a t i o n p r e v e n t s t h e a p p e a r a n c e o f S P - i r n e r v e fi b e r s , a s w e l l a s n e u r o g e n i c , n o n - c h o l i n e r g i c v a s o d i l a t i o n o f s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s . A s t h e m y e n t e r i c p l e x u s i s c r u c i a l i n t h e r e g u l a t i o n o f t h e r a t e o f c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d c e l l g r o w t h i n t h e r a t j e j u n u m ( S e e e t a l . , 1 9 9 0 ) , r e m o v a l o f t h e m y e n t e r i c p l e x u s m a y s o m e h o w p r e v e n t d e n e r v a t i o n - i n d u c e d a l t e r a t i o n s i n t h e s u b m u c o s a l p l e x u s o f t h e i l e u m . H o w e v e r , t h e m o r e p l a u s i b l e i n t e r p r e t a t i o n o f t h e s e d a t a i n d i c a t e s 3 1 4 t h a t e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n i n d u c e s a x o n a l s p r o u t i n g o f S P - a n d V I P - i r n e r v e fi b e r s . A l t e r n a t i v e l y , m y e n t e r i c n e r v e fi b e r s m a y a s s o c i a t e w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s i n n o r m a l t i s s u e , a n d l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e fi b e r s a l t e r s t h e p h e n o t y p i c e x p r e s s i o n o f t h e s e n e r v e s , r e s u l t i n g i n u p r e g u l a t i o n o r n e w t r a n s c r i p t i o n a n d t r a n s l a t i o n o f S P . T h e r e f o r e , t h e c o n c l u s i o n s f r o m r e t r o g r a d e t r a c i n g s t u d i e s a g r e e w i t h t h e c o n c l u s i o n s o f J i a n g a n d S u r p r e n a n t ( 1 9 9 2 ) , p r o v i d i n g s t r o n g e v i d e n c e t h a t e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n i n d u c e s a l t e r a t i o n s i n m y e n t e r i c n e u r o n s , r e s u l t i n g i n n e w v a s c u l a r i n n e r v a t i o n . E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n I n d u c e s A x o n a l S p r o u t i n g o f M y e n t e r i c N e r v e s A l t h o u g h r e t r o g r a d e t r a c i n g s t u d i e s s u g g e s t e d t h a t m y e n t e r i c n e u r o n s a s t h e s o u r c e o f n e w v a s c u l a r i n n e r v a t i o n , n e i t h e r r e t r o g r a d e t r a c i n g n o r J i a n g a n d S u r p r e n a n t ( 1 9 9 2 ) i d e n t i fi e d t h e m e c h a n i s m s r e s p o n s i b l e f o r n e w S P - o r V I P - i r n e r v e fi b e r s t o b e c o m e a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s . A s d i s c u s s e d p r e v i o u s l y , d u r i n g d e v e l o p m e n t a n d r e g e n e r a t i o n , i m m a t u r e a x o n s c o n t a i n n o n p h o s p h o r y l a t e d ( n p ) n e u r o fi l a m e n t h e a v y c h a i n ( N F - H ) - i r , a n d m a t u r e a x o n s c o n t a i n p h o s p h o r y l a t e d ( p ) - N F — H - i r . T h e r e f o r e , a n t i s e r u m r a i s e d a g a i n s t n p N F - H ( S M I 3 1 ) , p N F - H - i r ( S M I 3 2 ) , a n d p n p N F - H - i r ( S M I 3 3 ) w e r e u s e d t o d i s c r i m i n a t e b e t w e e n a x o n a l s p r o u t i n g a n d a l t e r a t i o n s i n p h e n o t y p i c e x p r e s s i o n o f m y e n t e r i c n e u r o n s a s p u t a t i v e m e c h a n i s m s . E x t r i n s i c d e n e r v a t i o n m a y i n c r e a s e S P - o r V I P - i r t h r o u g h i n c r e a s e d t r a n s c r i p t i o n o r t r a n s l a t i o n o f p r e - e x i s i t i n g p e p t i d e s , o r d e n o v o s y n t h e s i s a n d e x p r e s s i o n o f S P o r V I P . I n c r e a s e d o r n e w e x p r e s s i o n o f n e u r o p e p t i d e s i n a x o n s p r e v i o u s l y a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s w o u l d t h e n r e s u l t i n d e n e r v a t i o n - i n d u c e d a p p e a r a n c e o f S P - o r V I P - i r n e r v e fi b e r s . I f i n t r i n s i c v a s c u l a r n e r v e fi b e r s c o n t a i n p N F - H - i r ( s e e r e s u l t s ) , t h e n S P - o r V I P - i r s h o u l d c o l o c a l i z e w i t h p N F - H - i r . H o w e v e r , i f S P - o r V I P - i r n e r v e s d o n o t c o n t a i n p N F - H - i r , t h e n a p p e a r a n c e o f S P - a n d V I P - i r n e r v e s 3 1 5 w o u l d b e c o n s i s t e n t w i t h a x o n a l s p r o u t i n g . F o u r w e e k s a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , a l m o s t a l l S P - a n d V I P - i r n e r v e fi b e r s d i d n o t c o n t a i n p N F - H - i r , i n d i c a t i n g t h e a p p e a r a n c e o f S P - i r a n d V I P - i r n e r v e fi b e r s r e s u l t e d f r o m a x o n a l s p r o u t i n g , o r g r o w t h , o f m y e n t e r i c n e r v e s . U n f o r t u n a t e l y , t h e s e s t u d i e s w e r e u n a b l e t o d e t e r m i n e i f a x o n a l s p r o u t i n g o c c u r r e d b y c o l l a t e r a l b r a n c h i n g o f a x o n s n o r m a l l y i n n e r v a t i n g m u c o s a a n d s u b m u c o s a l g a n g l i a , o r b y n e w n e r v e s e n t e r i n g t h e s u b m u c o s a l p l e x u s . A l t h o u g h n u m e r o u s e x t r i n s i c n e r v e fi b e r s h a d r e t u r n e d b y 2 6 w e e k s a f t e r s u r g e r y , s o m e S P - o r V I P - i r n e r v e s d i d n o t c o n t a i n p N F - H - i r , s u g g e s t i n g s o m e a x o n a l g r o w t h o c c u r r e d a t t h i s l a t e t i m e . I n t e r e s t i n g l y , o t h e r V I P - o r S P - i r n e r v e fi b e r s d i d c o n t a i n d e t e c t a b l e p N F - H - i r , p o s s i b l y i n d i c a t i n g s t a b i l i z a t i o n a n d m a t u r a t i o n o f n e w i n n e r v a t i o n ( r e v i e w e d i n S h a w , 1 9 9 1 ) . F i n a l l y , V I P - a n d S P - i r n e r v e fi b e r s w i t h o u t p N F - H - i r f r e q u e n t l y w e r e c l o s e l y a s s o c i a t e d w i t h a r t e r i o l e s , a n d a p p e a r e d t o u s e a r t e r i o l e s a s a t r a c t , w h e r e a s p N F - H - i r n e r v e s w e r e f r e q u e n t l y f u r t h e r a w a y f r o m a r t e r i o l a r w a l l s . T h e r e r e s u l t s a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e p a t t e r n o f r e i n n e r v a t i o n d e s c r i b e d b y H i l l ( 1 9 8 2 ) , s u g g e s t i n g t h e a r t e r i o l a r w a l l m a y s e c r e t e t r o p h i c m o l e c u l e s t o p r o m o t e a x o n a l g r o w t h ( s e e S t e r n i n i , 1 9 9 2 ) . N o n p h o s p h o r y l a t e d N F - H - i r w a s o n l y o b s e r v e d i n s u b m u c o s a l n e u r o n s a n d i n o c c a s i o n a l n e r v e - l i k e s t r u c t u r e s c o n s i s t e n t w i t h r e t r a c t i n g o r d y i n g d i s t a l p r o c e s s e s o f e x t r i n s i c n e r v e fi b e r s . T h e s e s t r u c t u r e s d i d n o t c o n t a i n p N F - H - i r , s u g g e s t i n g t h a t e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n r e s u l t e d i n d e p h o s p h o r y l a t i o n , o r i n t e r u p t e d i n t r a c e l l u l a r m a c h i n e r y , r e s u l t i n g i n f a i l u r e t o m a i n p o s t - t r a n s l a t i o n a l m o d i fi c a t i o n s s u c h a s p h o s p h o r y l a t i o n o f K S P s e q u e n c e s . F u r t h e r m o r e , n p N F - H - i r w a s n e v e r o b s e r v e d i n v a s c u l a r i n n e r v a t i o n , s u g g e s t i n g a x o n a l s p r o u t s f r o m m y e n t e r i c g a n g l i a , o r r e g e n e r a t i n g e x t r i n s i c n e r v e s , d o n o t 3 1 6 c o n t a i n h e a v y m o l e c u l a r w e i g h t n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n ( N F - H ) . H o w e v e r , o n c e N F - H b e c o m e s i n c o r p o r a t e d i n t o a x o n s , i t i s r a p i d l y p h o s p h o r y l a t e d , t h u s a c c o u n t i n g f o r t h e s u d d e n a p p e a r a n c e o f p N F - H - i r . T h i s c o n c l u s i o n i s c o n s i s t e n t w i t h r e p o r t s o f a p p e a r a n c e o f p N F - H - i r i n d e v e l o p m e n t a n d r e g e n e r a t i o n ( N a s a l e t a l . , 1 9 8 6 ; S h a w , 1 9 9 1 ) , a l t h o u g h N F - H - m a y r e m a i n n o n p h o s p h o r y l a t e d f o r a g r e a t e r l e n g t h o f t i m e i n s c i a t i c n e r v e m o d e l s o f r e g e n e r a t i o n ( S c h i l l i n g a n d P i l g r i m , 1 9 9 0 ; P e s t r o n k e t a l . , 1 9 9 0 ) . S y m p a t h e t i c a n d S e n s o r y N e r v e s M e d i a t e A x o n a l S p r o u t i n g o f V I P - i r a n d S P - i r N e r v e s , R e s p e c t i v e l y ' A n a t o m i c a l d a t a s u g g e s t s t h a t e v e r y s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c g a n g l i o n i c n e u r o n m a y r e c e i v e s y m p a t h e t i c i n n e r v a t i o n ( F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 7 4 a ) . T h e r e f o r e , l o s s o f s y m p a t h e t i c n e r v e s f o l l o w i n g s u r g e r y o r a d m i n i s t r a t i o n o f 6 - O H - D A m a y a f f e c t m a n y p o p u l a t i o n s o f e n t e r i c n e u r o n s . A l t h o u g h l i t t l e i n f o r m a t i o n e x i s t s o n r e g u l a t i o n o f p h e n o t y p i c e x p r e s s i o n o r a x o n a l s p r o u t i n g , o n e o f t w o g e n e r a l m e c h a n i s m s m u s t o c c u r . S y m p a t h e t i c n e r v e s m a y r e l e a s e i n h i b i t o r y s u b s t a n c e s s u c h a s c y t o k i n e s ( R a o a n d L a n d i s , 1 9 9 2 ) t h a t d o w n - r e g u l a t e o r i n h i b i t e x p r e s s i o n o f c e l l u l a r o n c o g e n e s , r e g u l a t o r y p r o t e i n s , o r t r a n s - a c t i n g f a c t o r s t h a t c o n t r o l t r a n s c r i p t i o n . R e m o v a l o f t h i s i n h i b i t i o n t h e n a l l o w s t h e s e p r o g r a m s t o b e c o m e a c t i v a t e d , r e s u l t i n g i n a x o n a l s p r o u t i n g o f V I P - i r n e r v e s . A t t h i s t i m e , f e w i n h i b i t o r y . m o l e c u l e s h a v e b e e n i d e n t i fi e d . A l t e r n a t i v e l y , d u r i n g d e g e n e r a t i o n a n d w i t h d r a w a l o f s y m p a t h e t i c n e r v e s , s t i m u l a t o r y g r o w t h f a c t o r s a n d c y t o k i n e s m a y b e r e l e a s e d t o p r o m o t e a x o n a l g r o w t h a n d i n c r e a s e d n u c l e a r a c t i v i t y . F o r e x a m p l e , d e c e n t r a l i z a t i o n o f s u p e r i o r c e r v i c a l g a n g l i o n i c ( S C G ) n e u r o n s r e l e a s e s N G F f r o m s y m p a t h e t i c n e r v e s , r e s u l t i n g i n i n c r e a s e d t a c h y k i n i n m R N A a n d p r o t e i n ( S P ) ( K e s s l e r e t a l . , 1 9 8 3 ; H e n d r y , 1 9 9 2 ) . 3 1 7 A l t h o u g h t h e s e s t u d i e s d i d n o t a t t e m p t t o i d e n t i f y t h e c e l l u l a r m e s s e n g e r s r e s p o n s i b l e f o r i n c r e a s e d S P - a n d V I P - i r n e r v e s , n e u r o t o x i n s w e r e u s e d t o s e l e c t i v e l y e l i m i n a t e s y m p a t h e t i c o r s e n s o r y n e r v e s t o d e t e r m i n e i f l o s s o f a s i n g l e p o p u l a t i o n o f n e r v e s c o u l d a l t e r v a s c u l a r i n n e r v a t i o n . A s d e s c r i b e d i n t h e i n t r o d u c t i o n , d e c e n t r a l i z a t i o n o f S C G i n c r e a s e d S P - i r . H o w e v e r , S P - l w i t h o u t C G R P - i r w e r e n o t o b s e r v e d a f t e r s y m p a t h e c t o m y . T h i s o b s e r v a t i o n s u g g e s t s t h a t r e s p o n s i v e n e s s o f a t i s s u e t o l o s s o f i n n e r v a t i o n m u s t d e p e n d o n t h e s o u r c e o f i n n e r v a t i o n , a s w e l l a s t h e t y p e o f r e c e p t o r s e x p r e s s e d o n t a r g e t n e u r o n s . R e m o v a l o f p r e g a n g l i o n i c n e r v e fi b e r s t o S C G a l s o i n c r e a s e d V I P - i r ( s e e i n t r o d u c t i o n ) . I n t e r e s t i n g l y , V I P - i r p a r a v a s c u l a r p l e x u s f o r m e d a fi e r e l i m i n a t i o n o f s y m p a t h e t i c n e r v e s , s i m i l a r t o t h e r e s u l t s o b t a i n e d a f t e r s y s t e m i c s y m p a t h e c t o m y o f a d u l t r a t s ( A b e r d e e n e t a l . , 1 9 9 2 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t s y m p a t h e t i c n e r v e s n o r m a l l y i n h i b i t e x p r e s s i o n o f V I P . T h e r e f o r e , d e s t r u c t i o n o f s y m p a t h e t i c n e r v e s a l l o w s u p r e g u l a t i o n o f V I P , a s w e l l a s a x o n a l s p r o u t i n g o f m y e n t e r i c n e r v e fi b e r s . I t w a s s u r p r i s i n g t h a t l o s s o f e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e s i n c r e a s e d S P - i r v a s c u l a r n e r v e s , a s f e w S P - / C G R P - i r n e r v e s a r e o b s e r v e d i n m y e n t e r i c g a n g l i a ( G i b b i n s e t a l . , 1 9 8 5 ; t h i s d i s s e r t a t i o n ) . S i m i l a r t h i n , f a i n t , S P - i r n e r v e s h a v e b e e n o b s e r v e d b y o t h e r i n v e s t i g a t o r s ( K . S h a r k e y , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n s ) , s u p p o r t i n g t h e c o n c l u s i o n t h a t n e w , S P - i r a p p e a r a f t e r l o s s o f e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e fi b e r s . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t l o s s o f s p e c i fi c p o p u l a t i o n s o f e x t r i n s i c n e r v e fi b e r s c a n a c c o u n t f o r a p p e a r a n c e o f S P - o r V I P - i r v a s c u l a r i n n e r v a t i o n , i m p l y i n g r e g u l a t i o n o f e n t e r i c n e u r o n s i s m o r e c o m p l e x t h a n s i m p l e i n h i b i t i o n o f 0 1 2 o r N K l r e c e p t o r s t o c o n t r o l e x c i t a b i l i t y o f n e u r o t r a n s m i t t e r r e l e a s e . 3 1 8 S p e c u l a t i o n o n t h e S i g n i fi c a n c e o f I n c r e a s e d S P - a n d V I P - I r V a s c u l a r I n n e r v a t i o n A l t h o u g h G a l l i g a n e t a l . ( 1 9 9 0 ) d e m o n s t r a t e d n e w S P - i r n e r v e fi b e r s r e g u l a t e n o n - c h o l i n e r g i c v a s o d i l a t i o n o f s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s , i t h a s b e e n i m p o s s i b l e t o a n s w e r t h e u l t i m a t e q u e s t i o n : W h y d o m y e n t e r i c n e r v e s s e n d n e w S P - a n d V I P - i r n e r v e fi b e r s t o a s s o c i a t e w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s ? A s d i s c u s s e d i n t h e i n t r o d u c t i o n o f t h i s d i s s e r t a t i o n , n e u r o g e n i c v a s o d i l a t i o n o f s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s i s m e d i a t e d b y A C h r e l e a s e f r o m s u b m u c o s a l n e u r o n s . A n a t o m i c a l t r a c i n g s t u d i e s l o c a l i z e f e w p a r a s y m p a t h e t i c n e r v e s w i t h i n t h e G I w a l l ( K i r c h g e s s n e r a n d G e r s h o n , 1 9 8 9 ) , a n d s t i m u l a t i o n o f v a g a l n e r v e s d o e s n o t a l t e r s u b m u c o s a l b l o o d fl o w ( K e w e n t e r , 1 9 6 5 ) . S t i m u l a t i o n o f s u b m u c o s a l g a n g l i a o r i n t e r g a n g l i o n i c n e r v e t r a c t s p r o d u c e s m a r k e d v a s o d i l a t i o n s ( S u r p r e n a n t e t a 1 . , 1 9 8 9 ) , i n d i c a t i n g t h a t C h A t - i r s u b m u c o s a l n e u r o n s c o n t r o l b l o o d fl o w . H o w e v e r , f o l l o w i n g s u r g i c a l d e s t r u c t i o n o f e x t r i n s i c n e r v e s , C h A t - i r n e r v e s h a v e n o t b e e n d e s t r o y e d , y e t v a s o d i l a t i o n i s m e d i a t e d n o t b y A C h , b u t b y S P . T h i s fi n d i n g r a i s e s t h r e e q u e s t i o n s : ( 1 ) W h y d o e s f u n c t i o n a l i n n e r v a t i o n c h a n g e f r o m c h o l i n e r g i c t o n o n - c h o l i n e r g i c , e v e n t h o u g h c h o l i n e r g i c i n n e r v a t i o n h a s n o t b e e n d e s t r o y e d ? ( 2 ) W h a t i s t h e m e c h a n i s m o f t h e s e a l t e r a t i o n s ? a n d ( 3 ) W h a t i s t h e r e s u l t o f l o s s o f c h o l i n e r g i c r e g u l a t i o n o f b l o o d fl o w ? A t t h i s t i m e , t h e s e q u e s t i o n s c a n n o t b e d e fi n i t i v e l y a n s w e r e d . I n t h e m o s t s i m p l i s t i c a n a l y s i s , o n e o f t w o p o s s i b i l i t i e s e x i s t . ( 1 ) T h e a l t e r a t i o n s o c c u r f o r a s p e c i fi c r e a s o n , v i a d e fi n e d m e c h a n i s m s , r e s u l t i n g i n a l t e r e d p h e n o t y p i c a n d p h a r m a c o l o g i c a l i n n e r v a t i o n o f s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s . ( 2 ) T h e a l t e r a t i o n s o c c u r b y a n o n - s p e c i fi c p a t h w a y v i a d e fi n e d m e c h a n i s m s . A l t h o u g h i t i s i m p o s s i b l e t o a n s w e r e i t h e r q u e s t i o n , i t i s p o s s i b l e t h a t c h a n g e s i n i n n e r v a t i o n o f a r t e r i o l e s c o r r e s p o n d s t o c h a n g e s i n b l o o d fl o w a s 3 1 9 a r e s u l t o f l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n . R e g e n e r a t i o n i n t h e p e r i p h e r a l n e r v o u s s y s t e m c a n b e a s s o c i a t e d w i t h i n d u c t i o n o f s c h w a n n c e l l p r o l i f e r a t i o n , i n fl u x o f m a c r o p h a g e s , d i g e s t i o n o f m y e l i n , a n d a x o n a l g r o w t h o r s p r o u t i n g ( H a l l , 1 9 8 9 ; Z o c h o d n e a n d H o , 1 9 9 2 ) . M a n y o f t h e s e p r o c e s s e s m a y o c c u r i n t h e G I t r a c t f o l l o w i n g l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n , a n d e a c h r e s p o n s e m u s t h a v e a m e t a b o l i c r e q u i r e m e n t . T h e r e f o r e , a l t e r a t i o n s i n i n n e r v a t i o n o f s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s m a y n o t o c c u r b e c a u s e C h A t - i r n e r v e fi b e r s o r m A C h r e c e p t o r s a r e d o w n - r e g u l a t e d o r d e s t r o y e d , b u t b e c a u s e d e m a n d s i n b l o o d fl o w h a v e b e e n a l t e r e d . E x t r i n s i c s y m p a t h e t i c n e r v e s c o n s t r i c t s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s v i a r e l e a s e o f A T P ( E v a n s a n d S u r p r e n a n t , 1 9 9 2 ) w h e r e a s a l l k n o w n e x t r i n s i c a n d i n t r i n s i c n e r v e s r e l e a s e v a s o d i l a t o r y a g e n t s ( L e m b e c k a n d H o l z e r , 1 9 7 9 ; r e v i e w e d b y S u r p r e n a n t , 1 9 9 4 ) . A t t h i s t i m e , i t i s n o t k n o w n h o w l o s s o f t h e o n l y k n o w n s o u r c e o f v a s o c o n s t r i c t i o n a f f e c t s s u b m u c o s a l b l o o d fl o w . A s t h e m i c r o v a s c u l a t u r e a c c o u n t s f o r 2 0 - 3 0 % o f r e s i s t a n c e b l o o d fl o w , l o s s o f s y m p a t h e t i c t o n e w o u l d b e p r e d i c t e d t o r e s u l t i n i n c r e a s e d b l o o d fl o w . I t w i l l b e o f i n t e r e s t t o d e t e r m i n e i f e n t e r i c n e u r o n s c a n m e d i a t e v a s o c o n s t r i c t i o n a f t e r l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s . T h r o u g h o u t m o s t o f t h i s d i s s e r t a t i o n , i t h a s b e e n a s s u m e d t h a t e x t r i n s i c n e r v e s m e d i a t e t h e c h a n g e s i n i n n e r v a t i o n o f s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s . H i s t o l o g i c a l s t u d i e s h a v e v e r i fi e d t h a t s u r g e r y d o e s n o t r e s u l t i n g r o s s m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s o f t h e G I t r a c t . H o w e v e r , l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e fi b e r s m a y i n d u c e a l t e r a t i o n s i n e n d o t h e l i a l c e l l s o r s m o o t h m u s c l e , r e s u l t i n g i n s t i m u l a t o r y p r o d u c t i o n o f t r o p h i c m o l e c u l e s t h a t i n d u c e a x o n a l s p r o u t i n g f r o m e n t e r i c n e u r o n s . I t i s i n t e r e s t i n g t o n o t e t h a t i n t r i n s i c S P - a n d V I P - i r n e r v e s , a s w e l l a s e x t r i n s i c n e r v e s , a s s o c i a t e w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s b e f o r e 3 2 0 i n n e r v a t i n g s u b m u c o s a l g a n g l i a , o r f o r m i n g l o o s e p a r a v a s c u l a r p l e x u s e s t h a t a r e n o t i n d i r e c t c o n t a c t w i t h a r t e r i o l e s . T h e s e r e s u l t s a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e p r e s e n c e o f a p o s i t i v e t r o p h i c m o l e c u l e . I n t e r e s t i n g l y , l o w l e v e l s o f N G F i s a s s o c i a t e d w i t h n o r m a l s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s ( S t e r n i n i , 1 9 9 3 ) , i n d i c a t i n g a r t e r i o l e s m a y h e l p t o r e c r u i t t h e i r o w n i n n e r v a t i o n . A l t h o u g h S P - i r n e r v e fi b e r s a r e i m p o r t a n t i n r e g u l a t i o n o f b l o o d fl o w a f t e r d e n e r v a t i o n , a p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n f o r V I P - i r n e r v e fi b e r s h a s n o t b e e n d i s c o v e r e d . T h e s e n e r v e s d o n o t a p p e a r t o r e g u l a t e b l o o d f l o w ( G a l l i g a n e t a l . , 1 9 9 0 ) , b u t m a y p l a y a r o l e i n c o n t r o l o f s e c r e t i o n ( r e v i e w e d i n F u m e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ) . A l t e r n a t i v e l y , V I P m a y a c t a s a t r o p h i c m o l e c u l e o n s o m e u n i d e n t i fi e d t a r g e t , u l t i m a t e l y a l l o w i n g e n t e r i c n e u r o n s t o c o n t r o l b l o o d fl o w , s e c r e t i o n , a n d a b s o r p t i o n i n t h e a b s e n c e o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n . O n l y f u r t h e r e x p e r i m e n t s w i l l d e t e r m i n e t h e s i g n i fi c a n c e o f n e w S P - a n d V I P - i r , a n d d e s c r i b e o t h e r a d a p t a t i o n s f o r r e g u l a t i o n o f b l o o d f l o w i n t h e a b s e n c e o f s y m p a t h e t i c a n d p r i m a r y a f f e r e n t n e r v e s . F i n a l l y , i t w i l l b e o f i n t e r e s t t o d e t e r m i n e i f t h e d e n s i t y o f e x t r i n s i c n e r v e fi b e r s r e t u r n s a f t e r d e n e r v a t i o n , a s w e l l a s t h e s o u r c e o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n t h a t r e - i n n e r v a t e s t h e i l e u m . 2 . T H E R E I S M I C R O H E T E R O G E N I T Y I N T H E D I S T R I B U T I O N O F N F - H I N E N T E R I C N E R V E S A l t h o u g h n u m e r o u s i n v e s t i g a t o r s h a v e d e s c r i b e d l o c a l i z a t i o n o f n e u r o fi l a m e n t t r i p l e t p r o t e i n s i n t h e C N S , t h e r e i s a g e n e r a l p a u c i t y o f i n f o r m a t i o n r e g a r d i n g N F - i r i n e n t e r i c n e r v e s . T h e r e f o r e , t h i s s t u d y u s e d a n t i s e r u m r a i s e d a g a i n s t p h o s p h o r y l a t e d , n o n p h o s p h o r y l a t e d , o r p h o s p h o r y l a t i o n - i n d e p e n d e n t e p i t 0 p e s f o u n d p r i m a r i l y o n N F - H t o s t a i n e x t r i n s i c a n d i n t r i n s i c i n n e r v a t i o n o f t h e G I t r a c t . T h e r e s u l t s f r o m t h i s s t u d y i l l u s t r a t e t h a t t h e d i s t r i b u t i o n o f N F - H - i r i s h e t e r o l o g o u s i n t h e E N S , a s b i n d i n g o f S M I 3 2 1 3 1 , S M I 3 2 , a n d S M I 3 3 r e s u l t s i n u n i q u e p a t t e r n s o f i m m u n o r e a c t i v i t y w h i c h a r e d e p e n d e n t o n p h o s p h o r y l a t i o n s t a t u s o f N F - H p r o t e i n . T h i s h e t e r o g e n e i t y r e s u l t s f r o m p o s t - t r a n s l a t i o n a l p h o s p h o r y l a t i o n o f N F - H , p r o v i d i n g a d i f f e r e n t i a l d i s t r i b u t i o n o f p N F - H - i r w i t h i n i n d i v i d u a l e n t e r i c n e u r o n s , a s w e l l a s i n p o p u l a t i o n s o f n e r v e s . F i n a l l y , a s i n o t h e r t i s s u e s , o n l y a s u b p o p u l a t i o n o f m y e n t e r i c a n d s u b m u c o s a l n e u r o n s c o n t a i n n p N F - H - i r . P u t a t i v e F u n c t i o n s o f P h o s p h o r y l a t e d N F - H P h o s p h o r y l a t e d N F - H - i r w a s o b s e r v e d i n e x t r i n s i c n e r v e s o r i g i n a t i n g f r o m s e n s o r y g a n g l i a ( i . e . , d o r s a l r o o t g a n g l i a ) , a n d p r e v e r t e b r a l g a n g l i a ( i . e . , c e l i a c g a n g l i o n ) , a n d i n d i s t a l p r o c e s s e s o f n e r v e s o r i g i n a t i n g f r o m e n t e r i c g a n g l i a . T h e s e d a t a s u g g e s t t h a t p h o s p h o r y l a t i o n o f n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n s i s n o t d e p e n d e n t s i m p l y o n l e n g t h o r c a l i b e r o f t h e a x o n , o r i g i n o r l o c a t i o n o f t h e c e l l b o d y , o r s p e c i fi c f u n c t i o n s o f t h e n e u r o n . A l t h o u g h t h e p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n s o f p h o s p h o r y l a t i o n o f n e u r o fi l a r n e n t s a r e n o t c l e a r , p h o s p h o r y l a t i o n o f N F - H m a y c o n t r i b u t e t o a x o n a l m a t u r a t i o n a n d s t a b i l i t y ( W i l l a r d a n d S i m o n , 1 9 8 1 ; s e e i n t r o d u c t i o n ) . A l t e r n a t i v e l y , p h o s p h o r y l a t i o n m a y i n c r e a s e t h e s p a c e b e t w e e n n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n s , r e s u l t i n g i n i n c r e a s e d a x o n c a l i b e r n e c e s s a r y f o r h i g h v e l o c i t y c o n d u c t i o n o f a c t i o n p o t e n t i a l s , w i t h o u t r e q u i r i n g l a r g e q u a n t i t i e s o f c y t o s k e l e t a l p r o t e i n s ( s e e S h a w , 1 9 9 1 ) . A l l E n t e r i c N e u r o n s D o N o t C o n t a i n N F - H A l t h o u g h p N F - i r w a s f o u n d p r i m a r i l y i n a x o n s a s s o c i a t e d w i t h m u s c l e a n d i n i n t e r g a n g l i o n i c b u n d l e s o f a x o n s , n p N F - H - i r w a s l o c a l i z e d i n e n t e r i c p e r i k a r y a o f n e u r o n s i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c p l e x u s e s . T h e s e r e s u l t s a r e c o n s i s t e n t w i t h p r e v i o u s s t u d i e s 3 2 2 o n c e n t r a l ( S t e r n b e r g e r a n d S t e m b e r g e r , 1 9 8 3 ; G o l d s t e i n e t a l . , 1 9 8 3 ) p e r i p h e r a l ( L e e , C a r d e n , a n d T r o j a n o w s k i , 1 9 8 6 ) a n d e n t e r i c ( B a k e r e t a l . , 1 9 9 0 ; T r o j a n o w s k i e t a l . , 1 9 8 6 ) n e u r o n s . S u c h s t u d i e s h a v e o b s e r v e d s i m i l a r m i c r o h e t e r o g e n i t y i n l o c a l i z a t i o n o f p N F - H - i r i n s i n g l e c e l l s , a s p N F - H - i r w a s o b s e r v e d i n a x o n s , b u t n o t i n p e r i k a r y a , a n d n p N F - H - i r w a s o b s e r v e d i n p e r i k a r y a , b u t n o t a x o n s . I n t h e b r a i n a n d p e r i p h e r a l g a n g l i a , n o n p h o s p h o r y l a t e d N F - i r c a n b e l o c a l i z e d t o s u b p o p u l a t i o n s o f n e u r o n s i n c e n t r a l ( C a m p b e l l a n d M o r r i s o n , 1 9 8 9 ) a n d p e r i p h e r a l g a n g l i a . S i m i l a r r e s u l t s a r e o b s e r v e d i n e n t e r i c g a n g l i a , a s o n l y s o m e s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c n e u r o n s c o n t a i n e d n p N F - H - i r . P r e v i o u s i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t u d i e s h a v e f o u n d t h a t s u b p o p u l a t i o n s o f e n t e r i c n e u r o n s s h a r e c o m m o n f u n c t i o n s , m o r p h o l o g y , a n d n e u r o p e p t i d e c o n t e n t ( F u r n e s s e t a l . , 1 9 8 8 ; C o s t a e t a l . , 1 9 8 7 ) . A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , t h e s u b m u c o s a l p l e x u s o f g u i n e a p i g i l e u m i s u n i q u e , f o r o n l y f o u r c l a s s e s o f n e u r o n s c a n b e d e s c r i b e d b a s e d o n n e u r o c h e m i c a l c o n t e n t ( a l s o k n o w n a s c h e m i c a l c o d i n g ) a n d p u t a t i v e f u n c t i o n s . D a t a i n t h i s d i s s e r t a t i o n s t r o n g l y s u g g e s t t h a t N F - H - i r i s f o u n d i n o n l y a s i n g l e s u b p o p u l a t i o n o f p N F - H - i r s u b m u c o s a l n e u r o n s , a s a l m o s t a l l n p N F - H - i r c e l l s c o - l o c a l i z e d w i t h S P , b u t n o t w i t h N P Y , C G R P , o r V I P . S u b s t a n c e P - i r s u b m u c o s a l c e l l s a r e t h o u g h t t o f u n c t i o n a s i n t r i n s i c s e n s o r y c e l l s ( r e v i e w e d i n F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ) , a n d t h e p r e s e n c e o f n p N F - H - i r m a y b e r e l a t e d t o n e u r o t r a n s m i t t e r c o n t e n t o r f u n c t i o n o f t h e n e u r o n s , s u c h a s r e c e p t i o n a n d t r a n s d u c t i o n o f m e c h a n i c a l s i g n a l s f r o m m u c o s a . I f t h i s h y p o t h e s i s i s c o r r e c t , t h e n n e u r o fi l a r n e n t s h a v e a g r e a t e r r o l e i n c e l l f u n c t i o n t h a n s i m p l y r e g u l a t i o n o f c e l l m o r p h o l o g y . A l t e r n a t i v e l y , t h e p r e s e n c e o f n p N F - H - i r m a y a l l o w n e u r o n s g r e a t e r a d a p t a b i l i t y a n d p l a s t i c i t y a s c o m p a r e d t o n e u r o n s t h a t l a c k n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n s . N o n p h o s p h o r y l a t e d N F - H - i r w a s a l s o o b s e r v e d i n a 3 2 3 p o p u l a t i o n o f n e u r o n s i n m y e n t e r i c g a n g l i a . C o - l o c a l i z a t i o n s t u d i e s o f S M I 3 2 a n d n e u r o p e p t i d e s i n d i c a t e t h a t n p N F - H - i r w a s o b s e r v e d i n s o m e n e u r o n s c o n t a i n i n g V I P - i r o r N O S - i r , b u t n e v e r N P Y - i r o r C G R P - i r . M y e n t e r i c g a n g l i a c o n t a i n a p p r o x i m a t e l y 1 0 5 n e u r o n s / g a n g l i o n ( Y o u n g e t a l . , 1 9 9 3 ) , t h u s a p p r o x i m a t e l y 3 0 % ( 3 2 p N F - H - i r n e u r o n s / g a n g l i o n / 1 0 5 t o t a l n e u r o n s / g a n g l i o n ) o f m y e n t e r i c n e u r o n s c o n t a i n n p N F - H - i r . A l t h o u g h V I P - i r o r N O S - i r w a s o b s e r v e d i n s o m e n p N F - H - i r n e u r o n s , t h e i d e n t i t y o f m a n y n p N F - H - i r n e u r o n s w a s n o t e l u c i d a t e d . H o w e v e r , a p p r o x i m a t e l y 4 4 % o f a l l m y e n t e r i c n e u r o n s c o n t a i n S P - i r a n d s o m e N F - t r i p l e t - i r n e u r o n s c o n t a i n S P - i r i n m y e n t e r i c g a n g l i a i n g u i n e a p i g i l e u m ( C o s t a e t a l . , 1 9 9 2 ) . A l t h o u g h S P - i r c e l l b o d i e s w e r e d i f fi c u l t t o r e s o l v e f r o m b r i g h t S P - i r n e r v e fi b e r s l o c a t e d o v e r m y e n t e r i c g a n g l i a , r a r e S P - i r n e u r o n s c o u l d b e o b s e r v e d t o c o n t a i n n p N F - H - i r . F u r t h e r m o r e , t h e m o r p h o l o g y o f m a n y n p N F - H - i r n e u r o n s w h i c h d i d n o t c o n t a i n V I P - o r N O S - i r w a s s i m i l a r t o t h e m o r p h o l o g y o f D o g i e l t y p e I I o r s m a l l S P - i r n e u r o n s t h a t l a c k o b s e r v a b l e d e n d r i t e s ( r e v i e w e d i n F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ) . T h e r e f o r e , i t i s p r o b a b l e t h a t s o m e n p - N F - H - i r n e u r o n s c o n t a i n S P - i r , a n d D o g i e l I ( V I P - a n d N O S - i r n e u r o n s ) , D o g i e l I I ( S P - i r m y e n t e r i c n e u r o n s ) , a n d D o g i e l I I I ( S P - i r s u b m u c o s a l n e u r o n s ) c o n t a i n n p N F - H - i r . A s d e s c r i b e d a b o v e , n p N F - H - i r i s f o u n d i n a p 0 p u l a t i o n o f n e u r o n s c o n t a i n i n g N O S o r V I P - i r . T h e s e c e l l s h a v e m o r p h o l o g i e s t h a t a r e c o n s i s t e n t w i t h D o g i e l t y p e I n e u r o n s , a n d a r e l i k e l y t o r e p r e s e n t i n t e m e u r o n s a n d m o t o r n e u r o n s ( r e v i e w e d i n F u r n e s s e t a l . , 1 9 9 3 ) . A n a t o m i c a l t r a c i n g c o m b i n e d w i t h i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t u d i e s u s i n g a n t i s e r u m a g a i n s t n p N F - M a n d - H p r o t e i n s ( V i t a d e l l o , 1 9 8 7 ; B r o o k e s e t a l . , 1 9 9 1 ) a l s o s u g g e s t t h a t t h e m a j o r i t y o f n p N F - i r c e l l s a r e m o t o r n e u r o n s a n d p r o j e c t t o t h e c i r c u l a r m u s c l e . F u r t h e r m o r e , a s t h e c i r c u l a r m u s c l e r e c e i v e s a d e n s e S P i n n e r v a t i o n f r o m 3 2 4 m y e n t e r i c n e u r o n s ( B r o o k e s e t a l . , 1 9 9 1 ) , s o m e n p N F - H - i r n e u r o n s m a y c o n t a i n S P - i r . I f n p N F - H - i r i s f o u n d i n n e u r o n s w i t h d i f f e r i n g m o r p h o l o g y a n d n e u r o t r a n s m i t t e r c o n t e n t , t h e n t h e p r e s e n c e o f n p N F - H - i r m a y b e i n d i c a t i v e o f c o m m o n e f f e c t o r t i s s u e a n d f u n c t i o n . I n a g r e e m e n t w i t h p r e v i o u s r e p o r t s ( C o s t a e t a l . , 1 9 9 2 ; B a k e r e t a l . , 1 9 9 0 ; B a k e r e t a l . , 1 9 9 3 ; B j o r k l u n d e t a l . , 1 9 8 4 ) , s o m e m y e n t e r i c n e u r o n s d o n o t c o n t a i n d e t e c t a b l e N F - H - i r , f u r t h e r s u g g e s t i n g t h a t n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n s h a v e a d d i t i o n a l f u n c t i o n s o t h e r t h a n r e g u l a t i o n o f m o r p h o l o g y . T h e p a t t e r n o f i m m u n o r e a c t i v i t y w i t h i n m y e n t e r i c c e l l s e x h i b i t e d h e t e r o g e n e i t y , a s s o m e c e l l s c o n t a i n e d v e r y fi l a m e n t o u s s t a i n i n g t h r o u g h o u t t h e c e l l s o m a a n d d e n d r i t e s . H o w e v e r , o t h e r m y e n t e r i c c e l l s c o n t a i n e d a p a t t e r n o f n p N F - H - i r t h a t w a s m o r e s i m i l a r t o t h a t o b s e r v e d i n t h e s u b m u c o s a l p l e x u s . T h i s s e c o n d p o p u l a t i o n o f m y e n t e r i c a n d s u b m u c o s a l c e l l s c o n t a i n e d m o r e u n i f o r m n p N F - H - i r , a n d d i d n o t h a v e i m m u n o r e a c t i v e d e n d r i t e s . H o w e v e r , s o m e c e l l s i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c p l e x u s e s h a d s h o r t a x o n s w i t h n p N F - H - i r , w i t h b r i g h t e s t s t a i n i n g i n a x o n h i l l o c k , a n d d e c r e a s e d i m m u n o r e a c t i v i t y o v e r t h e p r o x i m a l p r o c e s s . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e o b s e r v a t i o n s a g r e e w i t h o t h e r p u b l i s h e d r e p o r t s o f m i c r o h e t e r o g e n i t y i n t h e c e l l u l a r d i s t r i b u t i o n o f n p N F - H - i r , a s N F - H i s r e l a t i v e l y n o n p h o s p h o r y l a t e d i n p e r i k a r y a , a n d b e c o m e s p h o s p h o r y l a t e d a s i t i s t r a n s p o r t e d i n t o t h e a x o n ( S t e m b e r g e r a n d S t e r n b e r g e r , 1 9 8 3 ; N i x o n e t a l . , 1 9 8 7 ; P e s t r o n k e t a l . , 1 9 9 0 ) T h e r e a r e s e v e r a l p o s s i b l e e x p l a n a t i o n s f o r t h e l a c k o f n p N F - H - i r i n s o m e e n t e r i c n e u r o n s . I n c e n t r a l a n d p e r i p h e r a l t i s s u e s , s m a l l c e l l s f r e q u e n t l y d o n o t c o n t a i n N F t r i p l e t - i r ( S h a w e t a l . , 1 9 8 1 ; S h a r p e t a l . , 1 9 8 2 ; T r o j a n o w s k i e t a l . , 1 9 8 6 ; r e v i e w e d i n S h a w , 1 9 9 1 ) , s u g g e s t i n g s m a l l c e l l s d o n o t r e q u i r e t h e f u n c t i o n s p r o v i d e d b y 3 2 5 n e u r o fi l a m e n t t r i p l e t p r o t e i n s . A l t e r n a t i v e l y , c e l l s w i t h o u t N F - t r i p l e t - i r m a y c o n t a i n o t h e r p r o t e i n s t h a t a s s u m e f u n c t i o n s n o r m a l l y m e d i a t e d b y n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n s . F o r e x a m p l e , s o m e a u t o n o m i c n e u r o n s w i t h o u t N F - t r i p l e t — i r c o n t a i n p e r i p h e r i n , a n i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n h o m o l o g o u s t o t y p e - I I I i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n s ( V i c k e r s e t a l . , 1 9 9 0 ; P a r y s e k e t a l . , 1 9 8 8 ) , o r t h e i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t o r - i n t e r n e x i n ( V i c k e r s e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h i s s u g g e s t s n e u r o fi l a m e n t t r i p l e t p r o t e i n s a r e n o t r e q u i r e d b y a l l c e l l s . H o w e v e r , T r o j a n o w s k i e t a l . ( 1 9 8 6 ) e s t i m a t e d t h a t 9 9 % o f a l l p e r i p h e r a l n e u r o n s c o n t a i n N F - t r i p l e t - i r . T h e i r o b s e r v a t i o n s u g g e s t s t h a t l o c a l i z a t i o n o f N F - t r i p l e t p r o t e i n s m a y d e p e n d o n t h e p r o t o c o l u s e d t o p r e p a r e t h e a n t i b o d y a n d o n i d e n t i t y o f t h e a n t i g e n . A s N F - t r i p l e t p r o t e i n s m a y b e m a s k e d o r a l t e r e d b y p o s t - t r a n s l a t i o n a l m o d i fi c a t i o n s s u c h a s p h o s p h o r y l a t i o n o r p r o t e o l y t i c c l e a v a g e ( r e v i e w e d i n N i x o n e t a l . , 1 9 8 2 ) , a n a n t i b o d y r a i s e d a g a i n s t r a t N F - H m a y n o t r e c o g n i z e a m o d i fi e d e p i t o p e i n g u i n e a p i g N F - H , a l t h o u g h N F - H i s p r e s e n t i n t h e c e l l . F i n a l l y , N F - H m a y b e s y n t h e s i z e d a n d r a p i d l y t r a n s p o r t e d o u t o f t h e p e r i k a r y o n , r e s u l t i n g i n a l a c k o f n p N F - H — i r i n s o m e e n t e r i c n e u r o n s . L o c a l i z a t i o n o f P h o s p h o r y l a t i o n - I n d e p e n d e n t N F - H - i r i s S i m i l a r t o p - a n d n p N F - H — i r A l t h o u g h S M I 3 1 a n d S M I 3 2 r e c o g n i z e s p e c i fi c p h o s p h o r y l a t e d o r n o n p h o s p h o r y l a t e d e p i t o p e s , S M I 3 3 i d e n t i fi e s a n o n p h o s p h o r y l a t e d e p i t o p e t h a t i s a c c e s s i b l e i n p h o s p h o r y l a t e d a n d n o n p h o s p h o r y l a t e d N F - H . I n t h e s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c p l e x u s e s , p n p N F - H - i r w a s s i m i l a r t o p N F - H - a n d n p N F - H - i r , a s s o m e n e u r o n s a n d i n t e r g a n g l i o n i c n e r v e fi b e r s c o n t a i n e d p n p N F - H - i r . T h i s s t a i n i n g w a s s i m i l a r i n a p p e a r a n c e t o p r e v i o u s r e p o r t s u s i n g a n t i b o d i e s a g a i n s t p n p N F - H ( B a k e r e t a l . , 1 9 9 0 ) o r N F a n t i s e r u m ( B j i i r k l u n d e t a l . , 1 9 8 4 ) . H o w e v e r , u n l i k e p N F - H - i r , p n p N F - H - i r w a s n o t 3 2 6 o b s e r v e d i n s u b m u c o s a l o r m y e n t e r i c g a n g l i o n i c n u c l e i , f u r t h e r s u g g e s t i n g t h a t n u c l e a r S N fl 3 1 - i r w a s t h e r e s u l t o f u n i q u e c r o s s - r e a c t i v i t y w i t h a p h o s p h o r y l a t e d p r o t e i n f o u n d i n e n t e r i c n u c l e i . S u m m a r y o f D i s t r i b u t i o n o f N F - H - i r i n E n t e r i c N e u r o n s I n c o n c l u s i o n , S M I 3 1 , S M I 3 2 , a n d S M I 3 3 s t a i n i n g d e m o n s t r a t e a u n i q u e d i s t r i b u t i o n o f p h o s p h o r y l a t e d , n o n p h o s p h o r y l a t e d , a n d p h o s p h o r y l a t i o n - i n d e p e n d e n t n e u r o fi l a m e n t h e a v y c h a i n p r o t e i n i n e x t r i n s i c a n d i n t r i n s i c i n n e r v a t i o n o f t h e G I t r a c t . S u b c l a s s e s o f e n t e r i c n e u r o n s c o n t a i n n p N F - H - i r , s u g g e s t i n g N F - H m a y h a v e r o l e s i n c e l l p r o c e s s e s t h a t a r e n o t r e l a t e d t o c e l l s t r u c t u r e , b u t m a y b e r e l a t e d t o n e u r o t r a n s m i t t e r c o n t e n t o r c e l l f u n c t i o n s . T h e p r e s e n c e o f n p N F - H - i r m a y b e u s e d t o d i s t i n g u i s h s u b p o p u l a t i o n s o f c e l l s b a s e d o n t h e c y t o s k e l e t a l c o n t e n t o f t h e n e u r o n s . H o w e v e r , o n l y a d d i t i o n a l s t u d i e s w i l l d e t e r m i n e t h e s i g n i fi c a n c e o f t h e p r e s e n c e , o r a b s e n c e , o f n e u r o fi l a m e n t s i n n o r m a l t i s s u e . 3 . E X T R I N S I C D E N E R V A T I O N A L T E R S A N A T O M Y O F M Y E N T E R I C G A N G L I A N A D P H d i a p h o r a s e h i s t o c h e m i s t r y w a s u s e d t o d e t e r m i n e i f e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n i n d u c e d a l t e r a t i o n s i n n i t r i n e r g i c n e r v e s a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s . N A D P H d i a p h o r a s e h i s t o c h e m i s t r y p r o d u c e s i n s o l u b l e f o r m a z a n p r e c i p i t a t e f o u n d i n p a r a v a s c u l a r n e r v e s i n s u b m u c o s a l p l e x u s o f r a t s m a l l a n d l a r g e i n t e s t i n e ( N i c h o l s e t a l . , 1 9 9 3 ) , g u i n e a p i g s m a l l a n d l a r g e i n t e s t i n e ( N i c h o l s e t a l . , 1 9 9 3 ) , a n d g u i n e a p i g ( N i c h o l s e t a l . , 1 9 9 3 ) , r a t ( M c C o n a l o g u e a n d F u r n e s s , 1 9 9 2 ) , a n d d o g ( W a r d e t a l . , 1 9 9 2 ) c o l o n . S u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s o f c o l o n c o n t a i n a p o p u l a t i o n o f N A D P H d i a p h o r a s e p o s i t i v e n e u r o n s 3 2 7 w h i c h c o - l o c a l i z e N O S - i r ( W a r d e t a l . , 1 9 9 2 ) , a n d t h e s e n e u r o n s h a v e b e e n h y p o t h e s i z e d t o b e i n v o l v e d i n p a c e m a k e r a c t i v i t y a n d r e g u l a t i o n o f b l o o d fl o w ( N i c h o l s e t a l . , 1 9 9 2 ) . H o w e v e r , s t u d i e s i n t h i s d i s s e r t a t i o n d i d n o t d e m o n s t r a t e N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g i n v a s c u l a r n e r v e s o r s u b m u c o s a l g a n g l i a i n n o r m a l , c o n t r o l , o r d e n e r v a t e d g u i n e a p i g s u b m u c o s a l p l e x u s . C o s t a e t a l . ( 1 9 9 2 ) a n d Y o u n g e t a l . ( 1 9 9 2 ) a l s o f a i l e d t o d e m o n s t r a t e N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g i n s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s o f g u i n e a p i g i l e u m . T h i s d i s c r e p a n c y m a y r e s u l t f r o m d i f f e r e n c e s i n a n i m a l s p e c i e s , s e c t i o n o f G I t r a c t e x a m i n e d , a n d fi x a t i v e u s e d t o p r e p a r e s u b m u c o s a l p l e x u s p r e p a r a t i o n s . ( N i c h o l s a n d c o - w o r k e r s u s e d a m o d i fi e d Z a m b o n i ’ s s o l u t i o n o f 4 % p a r a f o r m a l d e h y d e a n d 0 . 4 % p i c r i c a c i d i n P B S , w h e r e a s a l l o t h e r s u s e d p a r a f o r r n a l d e h y d e o n l y . ) R e g a r d l e s s o f t h e c a u s e o f d i f f e r e n c e s i n s t a i n i n g o f s u b m u c o s a l p l e x u s , n i t r i n e r g i c n e r v e s w e r e n o t a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s a t a n y t i m e a f t e r d e n e r v a t i o n . H o w e v e r , m y e n t e r i c p l e x u s l o n g i t u d i n a l m u s c l e p r e p a r a t i o n s w e r e s i m u l t a n e o u s l y p r o c e s s e d t o v e r i f y t h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s m a d e c o r r e c t l y . T h e r e s u l t i n g d a t a i n d i c a t e d t h a t l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s i n c r e a s e s N A D P H d i a p h o r a s e , a n d t h e s e c o n d p o r t i o n o f t h i s d i s s e r t a t i o n w a s d e d i c a t e d t o c h a r a c t e r i z i n g a l t e r a t i o n s i n i n h i b i t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r s u s i n g l o n g i t u d i n a l a n d c i r c u l a r m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s . N A D P H D i a p h o r a s e I s A R e l i a b l e M a r k e r f o r N O S A l t h o u g h B r e d t a n d S y n d e r r a i s e d a n t i s e r u m a g a i n s t N O S , n e i t h e r a p r i v a t e n o r a c o m m e r c i a l s o u r c e o f N O S a n t i s e r u m w a s a v a i l a b l e u n t i l t h e l a s t y e a r o f t h e s e s t u d i e s , r e q u i r i n g N A D P H d i a p h o r a s e h i s t o c h e m i s t r y t o b e u s e d a s a n i n d e x o f N O S . T h e r e f o r e , a n u m b e r o f c o n t r o l s t u d i e s w e r e p e r f o r m e d t o d e t e r m i n e t h e v a l i d i t y o f t h i s a p p r o a c h . F i r s t , N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g h a d a n a b s o l u t e r e q u i r e m e n t f o r N A D P H , a s t h e 3 2 8 s t a i n i n g p a t t e r n c h a n g e d d r a s t i c a l l y w h e n a n e q u i m o l a r c o n c e n t r a t i o n o f N A D H w a s u s e d i n p l a c e o f N A D P H . S e c o n d l y , d i c u m a r o l , a n i n h i b i t o r o f n o n - s p e c i fi c d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y , i n h i b i t e d N A D H d i a p h o r a s e s t a i n i n g , a n d N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g o f m u c o s a l c r y p t s , b u t n o t n e u r o n s . T h i r d , a l t h o u g h e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n s i g n i fi c a n t l y i n c r e a s e d t h e n u m b e r o f N A D P H d i a p h o r a s e p o s i t i v e m y e n t e r i c n e u r o n s / g a n g l i o n , s u b m u c o s a l n e u r o n s w e r e n o t a l t e r e d , i m p l y i n g a s e l e c t i v e p h e n o m e n o n o c c u r r e d . F i n a l l y , a l t h o u g h t h e r e a c t i o n w a s e n z y m a t i c a l l y - c a t a l y z e d , o p t i m u m N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g o c c u r r e d i n fi x e d , n o t f r e s h , t i s s u e s , s i m i l a r t o c h o l i n e s t e r a s e h i s t o c h e m i s t r y . S i m i l a r r e s u l t s h a v e b e e n o b t a i n e d b y Y o u n g e t a 1 . ( 1 9 9 2 ) a n d H o p e a n d V i n c e n t ( 1 9 8 7 ) . F i n a l v e r i fi c a t i o n o f t h e v a l i d i t y o f N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g a s a m a r k e r f o r N O S c a m e a f t e r o b t a i n i n g N O S a n t i s e r u m . A p p r o x i m a t e l y 8 0 - 1 0 0 % o f N A D P H d i a p h o r a s e - p o s i t i v e m y e n t e r i c n e u r o n s / g a n g l i a c o n t a i n e d N O S - i r . I t i s l i k e l y t h a t s o m e n e u r o n s d o n o t c o n t a i n N O S a n d N A D P H , a s o c c a s i o n a l l y b r i g h t N O S - i r n e u r o n s w e r e o b s e r v e d w i t h o u t d e t e c t a b l e N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g . D a r k N A D P H d i a p h o r a s e - s t a i n e d n e u r o n s w e r e o b s e r v e d a l s o w i t h o u t d e t e c t a b l e c o r r e s p o n d i n g N O S - i r . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t s o m e n e u r o n s c o n t a i n N O S , b u t m a y n o t c o n t a i n N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g b e c a u s e N O S i s u n a b l e t o c a t a l y z e t h e d i a p h o r a s e r e a c t i o n i n t h a t n e u r o n . A l t e r n a t i v e l y , o c c a s i o n a l n e u r o n s m a y c o n t a i n n o n - s p e c i fi c N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g , b u t n o t N O S p r o t e i n . H o w e v e r , i t i s a l s o p r o b a b l e t h a t d a r k N A D P H d i a p h o r a s e m a s k e d f a i n t N O S - i r , a n d t h a t b r i g h t N O S - i r q u e n c h e d N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g , a c c o u n t i n g f o r l e s s t h a t 1 0 0 % c o l o c a l i z a t i o n o f N O S - i r a n d N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g . I t s h o u l d b e n o t e d t h a t t h e d a t a i n t h i s d i s s e r t a t i o n a g r e e s w i t h p r e v i o u s l y p u b l i s h e d r e p o r t s t h a t d e m o n s t r a t e d a c l o s e a s s o c i a t i o n o f N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g a n d N O S - i r ( Y o u n g e t 3 2 9 a l . , 1 9 9 2 ; B e l a i e t a l . , 1 9 9 2 ; W a r d e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h e N u m b e r o f N O S - i r a n d N A D P H D i a p h o r a s e M y e n t e r i c N e u r o n s / G a n g l i a I n c r e a s e s A f t e r L o s s o f E x t r i n s i c I n n e r v a t i o n A s s o o n a s 1 w e e k a f t e r l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e fi b e r s , t h e n u m b e r o f n e u r o n s c o n t a i n i n g N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g a n d N O S - i r w a s s i g n i fi c a n t l y e l e v a t e d a s c o m p a r e d t o c o n t r o l t i s s u e s t a k e n f r o m t h e s a m e a n i m a l s . T h i s i n c r e a s e i n n e u r o n a l n u m b e r r e s u l t e d f r o m l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e fi b e r s , a s t h e n u m b e r o f N O S - i r n e u r o n s w a s n o t a l t e r e d i n s e g m e n t s o f i l e u m t h a t w e r e e x p o s e d , b u t w h o s e n e r v e fi b e r s w e r e n o t c r u s h e d ( s h a m s u r g e r i e s ) . F u r t h e r m o r e , i t i s u n l i k e l y t h a t i n c r e a s e d N A D P H d i a p h o r a s e o r N O S - i r r e s u l t s f r o m a x o t o m y o f v i s c e r o f u g a l n e u r o n s , a s o n l y 1 . 0 2 5 % o f i l e a l m y e n t e r i c n e u r o n s p r o j e c t t o s u p e r i o r m e s e n t e r i c g a n g l i a a n d c e l i a c g a n g l i a ( M e s s e n g e r a n d F u r n e s s , 1 9 9 2 ; M e s s e n g e r a n d F u r n e s s , 1 9 9 3 ; b u t s e e F i a l l o s — E s t r a d a , 1 9 9 3 ; H i i k f e l t , 1 9 9 4 ) . F i n a l l y , c h a n g e s i n N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g a n d N O S - i r a r e u n l i k e l y t o o c c u r a s a t r e s u l t o f i s c h e m i a , a s s i m i l a r r e s u l t s w e r e o b t a i n e d a f t e r s y s t e m i c a d m i n i s t r a t i o n o f c a p s a i c i n , b u t n o t 6 - O H - D A , i n d i c a t i n g l o s s o f e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e fi b e r s m e d i a t e s t h e i n c r e a s e i n m y e n t e r i c n e u r o n s c o n t a i n i n g N O S - i r a n d N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g . N A D H h i s t o c h e m i s t r y a n d i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y f o r S W 3 1 - i r g a n g l i o n i c n u c l e i w e r e u s e d t o d e t e r m i n e i f i n c r e a s e d N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g a n d N O S - i r r e s u l t e d f r o m s t i m u l a t i o n o f p r o g e n i t o r c e l l s . F u r t h e r m o r e , f o l l o w i n g a v u l s i o n o f v e n t r a l r o o t s , N A D P H d i a p h o r a s e a n d N O S - i r i n c r e a s e s i n m o t o r n u c l e i , a f t e r w h i c h t i m e n e u r o n a l d e a t h e n s u e s ( W u e t a l . , 1 9 9 2 ; W u e t a l . , 1 9 9 3 ) , s u g g e s t i n g i n c r e a s e d N O S - i r / N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g m a y p r e c e d e p r o g r a m m e d c e l l d e a t h . U s i n g h i s t o c h e m i s t i c a l s t a i n i n g f o r N A D H h i s t o c h e m i s t r y a n d i m m u n o h i s t o c h e m i c a l l o c a l i z a t i o n o f S M I 3 1 - i r , t h e n u m b e r o f 3 3 0 m y e n t e r i c n e u r o n s / g a n g l i a c o u l d b e m o n i t o r e d a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n . A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , t h e n u m b e r o f m y e n t e r i c n e u r o n s a n d n e u r o n a l n u c l e i w e r e n o t a l t e r e d a t a n y t i m e a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , i n d i c a t i n g t h a t n e u r o n a l d e a t h d i d n o t o c c u r ; f u r t h e r m o r e , t h e s e d a t a i m p l y t h a t i n c r e a s e d N O S - i r d i d n o t r e s u l t f r o m i n c r e a s e d n e u r o n s / g a n g l i a . A l t h o u g h t h e m e c h a n i s m s f o r i n c r e a s e d N O S - i r w e r e n o t a d d r e s s e d , t w o m e c h a n i s m s c o u l d a c c o u n t f o r t h e e l e v a t e d n u m b e r o f N A D P H d i a p h o r a s e a n d N O S - i r n e u r o n s / m y e n t e r i c g a n g l i a . L o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s m a y i n d u c e N A D P H d i a p h o r a s e a c t i v i t y a n d N O S - i r i n n e u r o n s w h i c h n o r m a l l y d o n o t e x p r e s s t h e t y p e I i s o f o r m o f N O S . F o r e x a m p l e , i n c r e a s e d t r a n s c r i p t i o n o f p r e - e x i s t i n g N O S m R N A w o u l d r e s u l t i n t h e a p p e a r a n c e o f m o r e N O S - i r n e u r o n s , a s i m m u n o h i s t o c h e m i c a l m e t h o d s c o u l d d e t e c t a g r e a t e r a m o u n t o f p r o t e i n i n a g r e a t e r q u a n t i t y o f n e u r o n s . S i m i l a r l y , i n c r e a s e d t r a n s l a t i o n o f N O S w o u l d i n c r e a s e t h e i n t r a c e l l u l a r l e v e l s o f N O S , r e s u l t i n g i n s t r o n g e r i m m u n o r e a c t i v i t y a n d N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g . A l t e r n a t i v e l y , e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n m a y i n d u c e p r e v i o u s l y n o n - d e t e c t a b l e N A D P H d i a p h o r a s e a c t i v i t y a n d N O S - i r b y i n c r e a s i n g m R N A s t a b i l i t y a n d b a s a l t r a n s c r i p t i o n a n d / o r t r a n s l a t i o n . U n f o r t u n a t e l y , t h e p o l y c l o n a l N O S a n t i s e r u m w a s r a i s e d i n r a b b i t , t h u s p r e v e n t i n g m a n y c o l o c a l i z a t i o n s t u d i e s w i t h a n t i s e r u m r a i s e d a g a i n s t C h A t , N P Y , C G R P , a n d V I P . I n n o r m a l i l e u m , s o m e i n t e m e u r o n s a n d m o s t i n h i b i t o r y m o t o r n e u r o n s c o n t a i n N O S - i r ( s e e i n t r o d u c t i o n ) . H o w e v e r , o n l y f u r t h e r e x p e r i m e n t s w i l l d e t e r m i n e t h e p h e n o t y p i c c l a s s e s o f N O S - i r n e u r o n s a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n a n d i f t h e i n c r e a s e d q u a n t i t y o f N O S - i r n e u r o n s / m y e n t e r i c g a n g l i a r e s u l t s f r o m d e n o v o s y n t h e s i s o r u p r e g u l a t i o n o f p r e - e x i s t i n g N O S . 3 3 1 T h e N u m b e r o f V I P - i r M y e n t e r i c N e u r o n s / G a n g l i a D o e s N o t I n c r e a s e A f t e r E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n A s V I P - i r c o l o c a l i z e s w i t h N O S - i r ( C o s t a e t a l . , 1 9 9 2 ) a n d N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g ( A i m i e t a l . , 1 9 9 3 ; T a l m a g e a n d M a w e , 1 9 9 3 ) , V I P - i r w a s e x a m i n e d i n c o n t r o l a n d d e n e r v a t e d p r e p a r a t i o n s t o d e t e r m i n e i f t h i s i n h i b i t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r w a s a l s o a f f e c t e d . I n t e r e s t i n g l y , e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n d i d n o t a l t e r t h e n u m b e r o f V I P - i r m y e n t e r i c n e u r o n s / g a n g l i a a t a n y t i m e e x a m i n e d , i n d i c a t i n g e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n d i d n o t i n c r e a s e a l l i n h i b i t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r s b u t m a y h a v e s e l e c t i v e l y a f f e c t e d N O S . A l t h o u g h N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g a n d V I P - i r h a v e b e e n r e p o r t e d i n t h e s a m e p o p u l a t i o n o f m y e n t e r i c n e u r o n s i n g u i n e a p i g i l e u m ( C o s t a 2 ! a l . , 1 9 9 2 ) , c o l o c a l i z a t i o n s t u d i e s w i t h N A D P H d i a p h o r a s e a n d a n t i s e r u m r a i s e d a g a i n s t V I P f a i l e d t o i d e n t i f y V I P - i r a n d N A D P H d i a p h o r a s e p o s i t i v e n e u r o n s i n n o r m a l o r d e n e r v a t e d i l e u m . H o w e v e r , a n a t o m i c a l s t u d i e s r e p o r t i n g c o l o c a l i z a t i o n o f N O S - i r o r N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g a n d V I P - i r ( C o s t a e t a l . , 1 9 9 2 ; A i m i e t a l . , 1 9 9 3 ; T a l m a g e a n d M a w e , 1 9 9 3 ) , u s e d c o l c h i c i n e - p r e t r e a t e d t i s s u e s . C o l c h i c i n e i n h i b i t s m i c r o t u b u l e e l o n g a t i o n , a n d p r e v e n t s a n t e r o g r a d e a x o n a l t r a n s p o r t , r e s u l t i n g i n a c c u m u l a t i o n o f n e u r o p e p t i d e s i n c e l l s o m a t a . H o w e v e r , c o l c h i c i n e t r e a t m e n t c a n i n c r e a s e n e u r o p e p t i d e l e v e l s i n t h e b r a i n b y i n d u c i n g d e n o v a s y n t h e s i s o f m R N A f o r s o m e n e u r o p e p t i d e s , a l t h o u g h t h e m R N A w a s n o t f o u n d i n t h e s e c e l l s p r i o r t o c o l c h i c i n e t r e a t m e n t . T h i s o b s e r v a t i o n i n d i c a t e s t h a t c o l c h i c i n e c a n a l t e r t r a n s c r i p t i o n o f m R N A e n c o d i n g n e u r o p e p t i d e s ( C o r t e s e t a l . , 1 9 9 0 ; C e c c a t e l l i e t a l . , 1 9 9 1 ) . A s i m i l a r p h e n o m e n a m a y o c c u r i n t h e G I t r a c t , a s V I P - i r i s f o u n d i n 3 i 0 . 5 m y e n t e r i c c e l l s / g a n g l i o n i n f r e s h l y - fi x e d t i s s u e , i n a g r e e m e n t w i t h t h e fi r s t p u b l i s h e d r e p o r t s o f V I P - i r b y F u r n e s s a n d C o s t a ( 1 9 8 4 ) . I n t e r e s t i n g l y , t h e s e V I P - i r n e u r o n s d o n o t c o n t a i n N O S - i r , a n d a r e c l a s s i fi e d a s D o g i e l 1 1 1 c e l l s , u n l i k e t h e D o g i e l I m o r p h o l o g y o f 3 3 2 N O S - i r c e l l s . H o w e v e r , f o l l o w i n g c o l c h i c i n e t r e a t m e n t ( 8 0 n M ) i n o r g a n o t y p i c c u l t u r e m e d i u m , 1 0 - 2 0 V I P - i r c e l l s / g a n g l i o n c a n b e d e t e c t e d , a n d t h e s e D o g i e l t y p e I n e u r o n s c o n t a i n N O S - i r ( C o s t a e t a l . , 1 9 9 2 ) . I n s i t u h y b r i d i z a t i o n s t u d i e s o f V I P m R N A i n t h e E N S s u g g e s t s t h a t t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n V I P - a n d N O S - i r m a y n o t b e a s c o m m o n a s o r i g i n a l l y t h o u g h t , a s c o l c h i c i n e c a n i n d u c e d e n o v a s y n t h e s i s o f V I P m R N A ( E c k b l a d , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n s ) . F u r t h e r m o r e , f o l l o w i n g d e c e n t r a l i z a t i o n o f a u t o n o m i c g a n g l i a , o r a f t e r p l a c e m e n t i n t o c u l t u r e f o r 2 4 h r s , V I P - i r c a n i n c r e a s e b y 2 4 0 x ( R a o a n d L a n d i s , 1 9 9 2 ) p r o v i d i n g f u r t h e r e v i d e n c e o f p h e n o t y p i c p l a s t i c i t y i n t h e A N S , a s w e l l a s f u r t h e r q u e s t i o n i n g t h e c o n c l u s i o n t h a t V I P a n d N O S a r e f o u n d n o r m a l l y i n t h e s a m e p o p u l a t i o n o f m y e n t e r i c n e u r o n s i n g u i n e a p i g i l e u m . 4 . E X T R I N S I C D E N E R V A T I O N A L T E R S L O N G I T U D I N A L M U S C L E I N N E R V A T I O N F u n c t i o n a l A s s a y o f N i t r i n e r g i c I n n e r v a t i o n I n d i c a t e s I n c r e a s e d N O P r o d u c t i o n P r o c e e d i n g E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n A l t h o u g h s t r o n g N O S - i r a n d N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g h a v e b e e n f o u n d i n m y e n t e r i c n e u r o n p e r i k a r y a , N O S - i r a n d N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g h a v e b e e n f o u n d i n v a r i c o s e n e r v e fi b e r s b y s o m e s t u d i e s ( B e l a i e t a 1 . , 1 9 9 2 ; A i m i e t a l . , 1 9 9 3 ; N i c h o l s e t a l . , 1 9 9 3 ) , a l t h o u g h o t h e r s t u d i e s d i d n o t o b s e r v e N O S - i r o r N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g i n n e r v e fi b e r s ( A i m i e t a l . , 1 9 9 3 ) s u c h a s t h o s e t h a t f o r m t h e t e r t i a r y p l e x u s o n t h e l o n g i t u d i n a l m u s c l e ( C o s t a e t a l . , 1 9 9 2 ) . H o w e v e r , a s d e s c r i b e d i n t h e i n t r o d u c t i o n , n e u r o g e n i c n i t r i n e r g i c r e l a x a t i o n s h a v e b e e n i d e n t i fi e d i n a l l r e g i o n s o f t h e G I t r a c t i n a l l s p e c i e s e x a m i n e d t o d a t e , i n d i c a t i n g t h a t n e r v e s r e l e a s e N O ( s e e S h u t t l e w o r t h , 1 9 9 4 ; W i k l u n d , 1 9 9 3 ) . 3 3 3 T h e n u m b e r o f N A D P H d i a p h o r a s e a n d N O S - i r n e u r o n s i n c r e a s e d a p p r o x i m a t e l y 9 0 % a s c o m p a r e d t o c o n t r o l p r e p a r a t i o n s a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n . A s n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e a r e m e d i a t e d b y r e l e a s e o f N O i n n o r m a l i l e u m , i t w a s h y p o t h e s i z e d t h a t t h e i n c r e a s e d q u a n t i t y o f N O S - i r m y e n t e r i c n e u r o n s w o u l d r e l e a s e a g r e a t e r a m o u n t o f N O a n d p r o d u c e l a r g e r r e l a x a t i o n s a s c o m p a r e d t o c o n t r o l p r e p a r a t i o n s . T h e r e f o r e , l o n g i t u d i n a l m u s c l e - m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s w e r e u s e d a s a b i o a s s a y t o d e t e r m i n e i f N O p r o d u c t i o n w a s p o t e n t i a t e d a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n . T r a n s m u r a l s t i m u l a t i o n ( 2 0 H z ) r e l a x e d p r e c o n t r a c t e d L M M P P s f r o m n o r m a l , c o n t r o l , a n d d e n e r v a t e d i l e u m . H o w e v e r , t h e r e l a x a t i o n s w e r e s i g n i fi c a n t l y l a r g e r i n d e n e r v a t e d p r e p a r a t i o n s , a s t h e a m p l i t u d e a n d d u r a t i o n o f r e l a x a t i o n s w a s p o t e n t i a t e d a f t e r l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s . T h e a l t e r a t i o n s i n n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s d i d n o t r e s u l t f r o m d e n e r v a t i o n - i n d u c e d c h a n g e s i n t h e p r o p e r t i e s o f s m o o t h m u s c l e , a s s i m i l a r r e s p o n s e s t o h i s t a m i n e a n d S N P w e r e o b s e r v e d i n p r e p a r a t i o n s f r o m d e n e r v a t e d a n d c o n t r o l s e g m e n t s o f i l e u m . F u r t h e r m o r e , t h e m u s c l e t h i c k n e s s o f c i r c u l a r a n d l o n g i t u d i n a l m u s c l e , t h e w e t w e i g h t o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e , a n d t h e p a s s i v e a n d a c t i v e m u s c l e p r o p e r t i e s w e r e n o t a f f e c t e d b y l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s . T h e s e d a t a p r o v i d e a n a t o m i c a l a n d f u n c t i o n a l e v i d e n c e t h a t s u r g i c a l d e s t r u c t i o n o f e x t r i n s i c n e r v e s a n d m a n i p u l a t i o n s o f t h e G I t r a c t d o n o t p r o d u c e d e t e c t a b l e c h a n g e s i n m u s c l e c e l l s , s u c h a s m i t o s i s o r h y p e r p l a s i a , o r a l t e r c o n t r a c t i b l i t y o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e . S u b s t i t u t e d L - a r g i n i n e a n a l o g s s u c h a s n i t r o - L - a r g i n i n e b i n d a n d i n h i b i t c a t a l y t i c a c t i v i t y o f N O S ( s e e i n t r o d u c t i o n ) . T h e r e f o r e , N L A w a s u s e d t o d e t e r m i n e i f n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s o f p r e p a r a t i o n s f r o m d e n e r v a t e d i l e u m w e r e m e d i a t e d b y N O . L N A i n h i b i t e d r e l a x a t i o n s o f n o r m a l p r e p a r a t i o n s i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r a n d a t t e n u a t e d 3 3 4 r e l a x a t i o n s o f c o n t r o l a n d d e n e r v a t e d L M M P P s , v e r i f y i n g r e l a x a t i o n s w e r e m e d i a t e d b y N O . A s d i s c u s s e d i n t h e r e s u l t s , L N A d i d n o t a t t e n u a t e r e l a x a t i o n s g e n e r a t e d a t l o w f r e q u e n c y n e r v e s t i m u l a t i o n , s u g g e s t i n g t h a t N O i s p r e f e r e n t i a l l y r e l e a s e d d u r i n g h i g h f r e q u e n c y n e r v e s t i m u l a t i o n . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b s e r v e d i n c i r c u l a r m u s c l e p r e p a r a t i o n s , a n d t h e s e d a t a s u g g e s t d i f f e r e n t n e u r o t r a n s m i t t e r s a r e r e l e a s e d b y l o w - o r h i g h - f r e q u e n c y n e r v e s t i m u l a t i o n . A l t h o u g h l o w - f r e q u e n c y n e r v e s t i m u l a t i o n o f s y m p a t h e t i c a n d p a r a s y m p a t h e t i c n e r v e s r e l e a s e s t h e c l a s s i c a l n e u r o t r a n s m i t t e r s N E a n d A C h , h i g h f r e q u e n c y n e r v e s t i m u l a t i o n r e l e a s e s N P Y a n d V I P , r e s p e c t i v e l y , f r o m l a r g e d e n s e - c o r e d v e s i c l e s ( r e v i e w e d i n L u n d b e r g a n d H i i k f e l t , 1 9 8 6 ) . T h e r e f o r e , a n u n i d e n t i fi e d n e u r o t r a n s m i t t e r m a y b e r e l e a s e d a t l o w f r e q u e n c y n e r v e s t i m u l a t i o n , w h e r e a s N O i s r e l e a s e d a t g r e a t e r f r e q u e n c i e s o f n e r v e s t i m u l a t i o n . A l t h o u g h e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l s t u d i e s h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t h i g h - f r e q u e n c y n e r v e s t i m u l a t i o n c a n r e l e a s e d i f f e r e n t n e u r o t r a n s m i t t e r s a s c o m p a r e d t o l o w - f r e q u e n c y n e r v e s t i m u l a t i o n , c o n c e r n h a s b e e n r a i s e d t h a t t h e h i g h - f r e q u e n c y n e r v e s t i m u l a t i o n n e c e s s a r y t o e v o k e r e l e a s e o f N P Y f r o m s y m p a t h e t i c n e r v e fi b e r s , o r V I P f r o m p a r a s y m p a t h e t i c n e r v e fi b e r s , i s n o t i n t h e p h y s i o l o g i c a l r a n g e o f w h i c h m o s t n e r v e s c a n fi r e f o r l o n g p e r i o d s o f t i m e . F o r e x a m p l e , v a g a l e f f e r e n t n e r v e s fi r e b e t w e e n 6 a n d 1 0 H z ( M i o l a n a n d R o m a n , 1 9 7 8 ) , a n d t h e s e n e r v e s m u s t b e s t i m u l a t e d a t f r e q u e n c i e s g r e a t e r t h a n 2 0 H z f o r V I P r e l e a s e . H o w e v e r , e x t r a c e l l u l a r r e c o r d i n g s o f a u t o n o m i c n e r v e s h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t m a n y n e r v e s m a y s p o n t a n e o u s l y fi r e a t h i g h f r e q u e n c i e s . F o r e x a m p l e , s o m e m y e n t e r i c n e u r o n s o f t h e c a t s m a l l i n t e s t i n e d i s c h a r g e a t 3 6 H z ( W o o d , 1 9 8 9 ) , a l t h o u g h o t h e r m y e n t e r i c n e u r o n s d i s c h a r g e d a t l o w e r f r e q u e n c i e s . S i m i l a r o b s e r v a t i o n s h a v e b e e n m a d e f r o m m y e n t e r i c n e u r o n s i n g u i n e a p i g i l e u m , a s b u r s t i n g - t y p e n e u r o n s fi r e 3 3 5 o v e r 2 0 H z ( W o o d , 1 9 8 9 ) . T h e r e f o r e , t h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t n e r v e s m a y fi r e a c t i o n p o t e n t i a l s o v e r a w i d e - r a n g e o f n e r v e f r e q u e n c i e s , w h i c h m a y p r e f e r e n t i a l l y r e l e a s e s o m e n e u r o t r a n s m i t t e r s . F i n a l l y , f r e q u e n c y - r e s p o n s e c u r v e s w e r e o b t a i n e d i n c o n t r o l a n d d e n e r v a t i o n p r e p a r a t i o n s t o d e t e r m i n e i f r e l a x a t i o n s w e r e p o t e n t i a t e d a t a l l f r e q u e n c i e s . A s d e s c r i b e d i n t h e r e s u l t s , p o t e n t i a t i o n o f r e l a x a t i o n s w e r e o n l y o b s e r v e d a t 1 0 , 2 0 a n d 5 0 H z . T h e s e f r e q u e n c i e s p r o d u c e N O - m e d i a t e d r e l a x a t i o n s i n n o r m a l t i s s u e s , a s t h e r e l a x a t i o n s g e n e r a t e d a t t h e s e f r e q u e n c i e s w e r e a t t e n u a t e d b y L N A ( s e e a b o v e ) . T h e s e d a t a a r e c o n s i s t e n t w i t h i n c r e a s e d N O p r o d u c t i o n a n d r e l e a s e b y m y e n t e r i c n e r v e s a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n . F u r t h e r m o r e , a s d e s c r i b e d i n t h e p r e c e d i n g p a r a g r a p h , r e l a x a t i o n s g e n e r a t e d a t l o w f r e q u e n c y n e r v e s t i m u l a t i o n w e r e n o t s e n s i t i v e t o L N A , s u g g e s t i n g a n e u r o t r a n s m i t t e r o t h e r t h a n N O w a s r e s p o n s i b l e f o r o b s e r v e d r e l a x a t i o n s . A s t h e l o w - f r e q u e n c y r e l a x a t i o n s w e r e n o t a l t e r e d b y e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , t h i s m a y b e f u r t h e r e v i d e n c e o f p r e f e r e n t i a l i n c r e a s e o f N O S , a n d n o t s i m p l y a n e l e v a t i o n i n a l l i n h i b i t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r s . L o s s o f E x t r i n s i c S e n s o r y N e r v e s M e d i a t e s I n c r e a s e d N O S - 1 r a n d N e u r o g e n i c R e l a x a t i o n s I n c r e a s e d N O S - i r a n d l a r g e r r e l a x a t i o n s w e r e o b s e r v e d i n s u r g i c a l l y - d e n e r v a t e d a n d c a p s a i c i n - d e n e r v a t e d i l e u m , i n d i c a t i n g a l t e r a t i o n s i n N O S r e s u l t e d f r o m l o s s o f e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e s . C a p s a i c i n s e l e c t i v e l y d e s t r o y s u n m y e l i n a t e d o r l i g h t l y - m y e l i n a t e d S P - l C G R P - i r n e r v e s o r i g i n a t i n g f r o m s m a l l , d a r k - b o d i e d n e u r o n s i n D R G ( s e e i n t r o d u c t i o n ) . A l t h o u g h s y m p a t h e t i c n e r v e s a r e f o u n d o v e r t h e e n t i r e s u r f a c e o f m y e n t e r i c g a n g l i a , l o s s o f s y m p a t h e t i c n e r v e s d i d n o t a l t e r N O S - i r , r e l a x a t i o n s o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e , o r a c t i v e 3 3 6 o r p a s s i v e p r o p e r t i e s o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e . I n t e r e s t i n g l y , f e w S P - l C G R P - i r n e r v e s a r e f o u n d i n m y e n t e r i c g a n g l i a ( G i b b i n s e t a l . , 1 9 8 5 ; t h i s s t u d y ) , a l t h o u g h s t i m u l a t i o n o f p r i m a r y s e n s o r y n e r v e s e v o k e s s E P S P s i n s o m e m y e n t e r i c n e u r o n s ( T a k a k i a n d N o k a y a m a , 1 9 8 8 ) . T h e r e f o r e , c h a n g e s i n N O S - i r m a y r e s u l t f r o m d i r e c t l o s s o f t r a n s - s y n a p t i c a c t i v i t y o f e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e s . A s d e s c r i b e d i n t h e i n t r o d u c i t o n , d e n e r v a t i o n o f S C G n e u r o n s i n c r e a s e s S P - a n d V I P - i r . R e l e a s e o f n e u r o t r a n s m i t t e r s f r o m e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e s m a y r e p r e s s e x p r e s s i o n o f N O S ; a l t e r n a t i v e l y , d a m a n g e o f s e n s o r y n e r v e s m a y r e l e a s e c y t o k i n e s , t r o p h i c m o l e c u l e s , o r s o m e o t h e r u n i d e n t i fi e d m o l e c u l e , t h a t i n i t i a t e s t r a n s c r i p t i o n o r t r a n s l a t i o n o f N O S . U n f o r t u n a t e l y , l i t t l e i n f o r m a t i o n e x i s t s i n t h e l i t e r a t u r e t o d i s c r i m i n a t e b e t w e e n t h e s e p o s s i b i l i t i e s . H o w e v e r , a s d i s c u s s e d i n t h e i n t r o d u c t i o n , d e c e n t r a l i z a t i o n o f S C G i n c r e a s e s t r a n s c r i p t i o n o f T H a n d S P , r e s u l t i n g i n e l e v a t e d i m m u n o r e a c t i v i t y a n d h y d r o x y l a t i o n o f t y r o s i n e . O n l y m o l e c u l a r b i o l o g i c a l s t u d i e s w i l l b e a b l e t o d e t e r m i n e t h e p r o x i m a l c a u s e o f e l e v a t e d N O S i n m y e n t e r i c g a n g l i a , o r t h e u l t i m a t e r e s u l t o f i n c r e a s e d n e u r o g e n i c n i t r i n e r g i c r e l a x a t i o n s o f i l e u m f o l l o w i n g e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n . E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n A l t e r s R e b o u n d C o n t r a c t i o n s o f L o n g i t u d i n a l M u s c l e S u r g i c a l d e n e r v a t i o n s o f l o o p s o f i n t e s t i n e a l s o a l t e r e d r e b o u n d c o n t r a c t i o n s o f L M P S . I n n o r m a l , c o n t r o l , a n d d e n e r v a t e d i l e u m , t h e s e c o n t r a c t i o n s a r e i n h i b i t e d b y T T X a n d C P 9 6 3 4 5 - 1 , a n o n p e p t i d e N K l a n t a g o n i s t , i n d i c a t i n g t h e y a r e m e d i a t e d b y r e l e a s e o f S P . A f t e r d e n e r v a t i o n o r c a p s a i c i n t r e a t m e n t , b u t n o t 6 - O H - D A t r e a t m e n t , r e b o u n d c o n t r a c t i o n s w e r e s i g n i fi c a n t l y s m a l l e r a t a l l f r e q u e n c i e s , a n d r e b o u n d c o n t r a c t i o n s w e r e n o t s e e n i n t i s s u e s t a k e n f r o m c a p s a i c i n - t r e a t e d a n i m a l s . A s d e s c r i b e d i n t h e i n t r o d u c t i o n , p r i m a r y a f f e r e n t n e r v e s r e l e a s e S P , a n d l o c a l a p p l i c a t i o n o f c a p s a i c i n 3 3 7 c o n t r a c t s L M M P P s b y r e l e a s i n g S P ( S z o l c s a n y i a n d B a r t h o , 1 9 7 8 ; B a r t h o a n d S z o l c s a n y i , 1 9 8 2 ) . T h e r e f o r e , c o n t r a c t i o n s m a y b e s m a l l e r , o r n o n - e x i s t a n t , b e c u a s e e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e s r e l e a s e S P a n d c o n t r a c t l o n g i t u d i n a l m u s c l e . H o w e v e r , f e w e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e fi b e r s a r e f o u n d i n l o n g i t u d i n a l m u s c l e , a n d m A C h a n t a g o n i s t s a t t e n u a t e a p p r o x i m a t l e y 7 5 % o f c a p s a i c i n - i n d u c e d c o n t r a c t i o n s , i n d i c a t i n g t h a t p r i m a r y a f f e r e n t n e r v e s i n n e r v a t e e x c i t a t o r y m o t o r n e u o m s ( s e e i n t r o d u c t i o n ) . A s e c o n d , o r a l t e r n a t i v e , e x p l a i n a t i o n i s b a s e d o n w o r k b y B o e c k x s t a e n s ( B u l t e t a l . , 1 9 9 0 ; B o e c k x s t a e n s e t a l . , 1 9 9 0 ) . T h e y p r o p o s e d t h a t N O r e g u l a t e d S P r e l e a s e , a s N L A p o t e n t i a t e d r e b o u n d c o n t r a c t i o n s b u t n o t e x o g e n o u s l y a p p l i e d S P . O s t h a u s a n d G a l l i g a n ( 1 9 9 1 ) a l s o o b s e r v e d N O S a n t a g o n i s t s a t t e n u a t e d r e b o u n d c o n t r a c t i o n s o f g u i n e a p i g i l e u m , a l t h o u g h t h e y h y p o t h e s i z e d t h a t a t t e n u a t i o n o f S P - m e d i a t e d c o n t r a c t i o n s r e s u l t e d f r o m p h y s i o l o g i c a l a n t a g o n i s m o f e x c i t a t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r s a t l o n g i t u d i n a l m u s c l e . T h e r e f o r e , m o t i l i t y o f L M M P P s d e p e n d e d o n t e m p o r a l s u m m a t i o n o f e x c i t a t o r y a n d i n h i b i t o r y i n n e r v a t i o n . I n c r e a s e d n i t r i n e r g i c i n n e r v a t i o n w o u l d t h e n a n t a g o i n i z e S P r e l e a s e , r e s u l t i n g i n s m a l l e r r e b o u n d c o n t r a c t i o n s . N o r m a l L M M P P s w e r e u s e d t o d e t e r m i n e i f N O a c t u a l l y i n h i b i t s S P r e l e a s e . H o w e v e r t h e s e d a t a w e r e d i f fi c u l t t o i n t e r p r e t , a s N O S a n t a g o n i s t s a f f e c t e d r e l a x a t i o n s a n d r e b o u n d c o n t r a c t i o n s . T h e r e f o r e , C M M P P s w e r e u s e d t o t e s t t h e h y p o t h e s i s t h a t N O i n h i b i t s S P f r o m m y e n t e r i c n e u r o n s . T h e r e s u l t s g e n e r a t e d f r o m C M M P P s s u p p o r t t h i s h y p o t h e s i s , i n d i c a t i n g r e b o u n d c o n t r a c t i o n s a r e a t t e n u a t e d a f t e r d e n e r v a t i o n a s a r e s u l t o f i n c r e a s e d i n h i b i t i o n o f r e l e a s e o f S P b y e l e v a t e d N O S . 3 3 8 5 . E N D O G E N O U S N O R E G U L A T E S S P B U T N O T A C h R E L E A S E M o t i l i t y o f G I s m o o t h m u s c l e i s p a r t i a l l y c o n t r o l l e d b y m y e n t e r i c n e u r o n s t h a t r e l e a s e e x c i t a t o r y a n d i n h i b i t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r s ( r e v i e w e d b y F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ) . P o s t j u n c t i o n a l r e s p o n s e s a r e d e p e n d e n t o n t h e i d e n t i t y , q u a n t i t y , a n d t e m p o r a l r e l e a s e o f e n t e r i c n e u r o t r a n s m i t t e r s . F o r e x a m p l e , s t i m u l a t i o n o f L M M P p r e p a r a t i o n s r e l e a s e s ( a m o n g o t h e r n e u r o t r a n s m i t t e r s ) N O a n d S P , r e s u l t i n g i n a r e l a x a t i o n f o l l o w e d b y a r e b o u n d c o n t r a c t i o n ( O s t h a u s a n d G a l l i g a n , 1 9 9 2 ) . N O S a n t a g o n i s t s a t t e n u a t e n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s a n d p o t e n t i a t e r e b o u n d c o n t r a c t i o n s , s u g g e s t i n g t h a t r e l e a s e o f N O n o r m a l l y m a s k s a c t i o n o f e x c i t a t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r s . H o w e v e r , o t h e r s ( G u s t a f f s o n e t a l . , 1 9 9 0 ; H r y o r e n k o e t a l . , 1 9 9 4 ) h a v e p r o v i d e d e v i d e n c e t h a t N O m a y i n h i b i t r e l e a s e o f e x c i t a t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r s f r o m m y e n t e r i c n e r v e s . T h e r e f o r e , N O m a y a f f e c t e n t e r i c m o t o r n e u r o n s , i n a d d i t i o n t o i t s w e l l - c h a r a c t e r i z e d a c t i o n o n s m o o t h m u s c l e ( s e e i n t r o d u c t i o n ) . C i r c u l a r m u s c l e o f g u i n e a p i g i l e u m i s i n n e r v a t e d b y m y e n t e r i c n e u r o n s t h a t c o n t a i n b o t h c h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e ( C h A t ) - a n d S P - i m m u n o r e a c t i v i t y ( i r ) ( B r o o k e s e t a l . , 1 9 9 1 ) . A s C h A t c a t a l y z e s f o r m a t i o n o f A C h , t h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t c h o l i n e r g i c a n d n o n c h o l i n e r g i c i n p u t t o c i r c u l a r m u s c l e o f g u i n e a p i g i l e u m i s p r o v i d e d b y a s i n g l e p o p u l a t i o n o f n e u r o n s . E l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n o f m y e n t e r i c n e r v e s e v o k e s r e l e a s e o f A C h a n d S P , r e s u l t i n g i n a f a s t , c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n , f o l l o w e d b y a s l o w e r , n o n c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n o f c i r c u l a r m u s c l e t h a t i s i n h i b i t e d b y S P a n t a g o n i s t s ( s e e i n t r o d u c t i o n f o r r e v i e w ) . C i r c u l a r m u s c l e a l s o r e c e i v e s a d e n s e i n n e r v a t i o n o f N O S - i r m y e n t e r i c n e r v e s ( C o s t a e t a l . , 1 9 9 2 ) , a n d e l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n o f m y e n t e r i c n e r v e s e v o k e s r e l e a s e o f N O ( S h u t t l e w o r t h e t a l . , 1 9 9 4 ) , r e s u l t i n g i n r e l a x a t i o n o f p r e - c o n t r a c t e d c i r c u l a r m u s c l e . T h e r e f o r e , a s c i r c u l a r m u s c l e i s i n n e r v a t e d b y i n h i b i t o r y n i t r i n e r g i c a n d e x c i t a t o r y 3 3 9 c h o l i n e r g i c a n d n o n c h o l i n e r g i c n e r v e s , c i r c u l a r m u s c l e p r e p a r a t i o n s w e r e u s e d t o d e t e r m i n e i f N O i n h i b i t s r e l e a s e o f S P a n d A C h f r o m m y e n t e r i c n e u r o n s . E n d o g e n o u s N O I n h i b i t s N A N C C o n t r a c t i o n s P h a r m a c o l o g i c a l a n t a g o n i s t s w e r e u s e d t o b l o c k N K l o r m u s c a r i n i c ( m A C h ) r e c e p t o r s , a l l o w i n g c h o l i n e r g i c a n d n o n c h o l i n e r g i c r e s p o n s e s t o b e s t u d i e d i n d e p e n d e n t l y . I n t h e p r e s e n c e o f s c o p o l a m i n e , a m A C h r e c e p t o r a n t a g o n i s t , a n d g u a n e t h i d i n e , a n i n d i r e c t - a c t i n g s y m p a t h o l y t i c d r u g , t r a n s m u r a l s t i m u l a t i o n p r o d u c e d m o n o p h a s i c c o n t r a c t i o n s t h a t w e r e n e r v e - m e d i a t e d , a s c o n t r a c t i o n s w e r e i n h i b i t e d b y T T X . N A N C c o n t r a c t i o n s w e r e a l s o i n h i b i t e d b y t h e c o m p e t i t i v e a n t a g o n i s t C P - 9 6 , 3 4 5 a n d t h e e s t i m a t e d C P - 9 6 , 3 4 5 E C , O ( 1 2 n M ) i s c o n s i s t e n t w i t h a s p e c i fi c i n t e r a c t i o n a t N K l r e c e p t o r s ( S n i d e r e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t N A N C c o n t r a c t i o n s a r e m e d i a t e d p r e d o m i n a n t l y b y n e r v e - r e l e a s e d t a c h y k i n i n s s u c h a s S P . T h i s c o n c l u s i o n w a s s u p p o r t e d b y s t u d i e s u s i n g S P M E , a s S P M E m i m i c k e d N A N C c o n t r a c t i o n s w i t h a n e s t i m a t e d E C 5 0 o f 2 0 n M , s u g g e s t i n g S P M E i n t e r a c t e d s p e c i fi c a l l y w i t h N K l r e c e p t o r s o n c i r c u l a r m u s c l e ( H a l l a n d M o r t o n , 1 9 9 1 ) . F i n a l l y , a s C P - 9 6 , 3 4 5 i n h i b i t e d b o t h n e u r o g e n i c a n d S P M E r e s p o n s e s , t h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t n e r v e - r e l e a s e d t a c h y k i n i n s a c t i v a t e N K l r e c e p t o r s , c u l m i n a t i n g i n c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e . T h e s u b s t i t u t e d L A r g a n a l o g s L N A , L N A M E , a n d L M M A a r e s p e c i fi c i n h i b i t o r s o f N O s y n t h e s i s a n d N O - m e d i a t e d r e s p o n s e s i n a n u m b e r o f t i s s u e s ( s e e i n t r o d u c t i o n ) , i n c l u d i n g G I s m o o t h m u s c l e . T h e s e d r u g s p r o d u c e d c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t p o t e n t i a t i o n o f n e u r o g e n i c N A N C c o n t r a c t i o n s i n a m a n n e r c o n s i s t e n t w i t h i n h i b i t i o n o f N O S . F i r s t , D - e n a n t i o m e r s D N A M E a n d D M M A f a i l e d t o p o t e n t i a t e N A N C c o n t r a c t i o n s , i n d i c a t i n g p o t e n t i a t i o n b y L A r g a n a l o g s e x h i b i t e d s t e r e o - s p e c i fi c i t y . S e c o n d l y , L A r g b u t n o t D A r g 3 4 0 p r e v e n t e d p o t e n t i a t i o n b y L N A M E a n d L N A . T h e s e d a t a a g r e e w i t h p r e v i o u s s t u d i e s t h a t s u g g e s t e d L A r g a n a l o g s c o m p e t i t i v e l y i n h i b i t N O s y n t h e s i s . F u r t h e r m o r e , t h e o b s e r v a t i o n t h a t D A r g w a s i n e f f e c t i v e a t p r e v e n t i n g p o t e n t i a t i o n b y L A r g a n a l o g s f u r t h e r d e m o n s t r a t e s s t e r e o - s p e c i fi c i t y o f L A r g a n a l o g s . T h e r e f o r e , N O S a n t a g o n i s t s p o t e n t i a t e N A N C c o n t r a c t i o n s b y s p e c i fi c a n d r e v e r s i b l e i n h i b i t o r s o f N O s y n t h e s i s . T h e c o n c l u s i o n t h a t N O i n h i b i t s N A N C c o n t r a c t i o n s w a s s u p p o r t e d b y d a t a f r o m s t u d i e s u s i n g h e m o g l o b i n t o b i n d a n d i n a c t i v a t e e x t r a c e l l u l a r N O , a n d S N P t o l i b e r a t e N O i n s o l u t i o n . H e m o g l o b i n p o t e n t i a t e d N A N C c o n t r a c t i o n s i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r , s u g g e s t i n g t h a t d e c r e a s e d a v a i l a b i l i t y o f N O r e s u l t s i n l a r g e r N A N C c o n t r a c t i o n s . I f e n d o g e n o u s N O i n h i b i t s N A N C c o n t r a c t i o n s , t h e n S N P s h o u l d a t t e n u a t e N A N C c o n t r a c t i o n s . A l t h o u g h S N P d i d n o t a p p e a r t o a l t e r b a s a l t o n e o f c i r c u l a r m u s c l e , S N P a t t e n u a t e d N A N C c o n t r a c t i o n s i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r . T h e s e r e s u l t s m a y i n d i c a t e t h a t N O d o n o r s , s u c h a s S N P , i n h i b i t N A N C c o n t r a c t i o n s b y a t t e n u a t i n g t a c h y k i n i n r e l e a s e f r o m e n t e r i c n e u r o n s , w h e r e a s d e c r e a s e d N O p r o d u c t i o n b y N O S a n t a g o n i s t s , o r d e c r e a s e d N O a v a i l a b i l i t y b y h e m o g l o b i n , p o t e n t i a t e s t a c h y k i n i n r e l e a s e . S P M E m i m i c k e d N A N C c o n t r a c t i o n s , a n d r e s p o n s e s t o S P M E w e r e u s e d t o d e t e r m i n e i f N O S a n t a g o n i s t s , h e m o g l o b i n , a n d S N P a f f e c t e d c o n t r a c t i b i l i t y a n d b a s a l t o n e o f c i r c u l a r m u s c l e . C o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e i n d u c e d b y S P M E w e r e n o t a l t e r e d b y c o n c e n t r a t i o n s o f L N A , a s c o n t r a c t i o n s o f e q u a l a m p l i t u d e w e r e o b s e r v e d i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f L N A . T h e r e f o r e , N O S a n t a g o n i s t s d o n o t a l t e r c o n t r a c t i b i l i t y o f c i r c u l a r m u s c l e , b u t p o t e n t i a t e N A N C c o n t r a c t i o n s b y i n h i b i t i n g N O s y n t h e s i s . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b s e r v e d w i t h h e m o g l o b i n , a s c o n t r a c t i o n s i n d u c e d b y S P M E w e r e n o t a f f e c t e d b y 1 0 1 1 M h e m o g l o b i n . T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t h e m o g l o b i n d o e s n o t a l t e r 3 4 1 c o n t r a c t i b i l i t y o r b a s a l t o n e o f c i r c u l a r m u s c l e , b u t p o t e n t i a t e s N A N C c o n t r a c t i o n s b y b i n d i n g a n d i n a c t i v a t i n g N O . T h e r e f o r e , N O S a n t a g o n i s t s a n d h e m o g l o b i n p o t e n t i a t e N A N C c o n t r a c t i o n s b y s p e c i fi c i n h i b i t i o n o f N O s y n t h e s i s o r a v a i l a b i l i t y , r e s p e c t i v e l y . F u r t h e r m o r e , t h e s e d a t a s u g g e s t t h a t N O i n h i b i t s t a c h y k i n i n r e l e a s e f r o m e n t e r i c e x c i t a t o r y m o t o r n e u r o n s . R e m o v a l o f t h e i n h i b i t o r y n i t r i n e r g i c t o n e b y d e c r e a s i n g N O p r o d u c t i o n o r e x t r a c e l l u l a r c o n c e n t r a t i o n s h o u l d e n h a n c e t a c h y k i n i n r e l e a s e , r e s u l t i n g i n p o t e n t i a t i o n o f N A N C c o n t r a c t i o n s . I f N O i n h i b i t s t a c h y k i n i n r e l e a s e f r o m m y e n t e r i c n e u r o n s , t h e n e x o g e n o u s N O a p p l i e d a s S N P s h o u l d a t t e n u a t e N A N C c o n t r a c t i o n s . A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , S N P a t t e n u a t e d N A N C c o n t r a c t i o n s i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r . H o w e v e r , S N P s i g n i fi c a n t l y a t t e n u a t e d c o n t r a c t i o n s e l i c i t e d b y S P M E , i n d i c a t i n g t h a t S N P m a y a l t e r s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y s c o u p l e d t o N K I r e c e p t o r s , r e s u l t i n g i n i n h i b i t i o n o f c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e . A l t e r n a t i v e l y , S N P m a y r e l a x c i r c u l a r m u s c l e , r e s u l t i n g i n d e c r e a s e d a m p l i t u d e o f S P M E - e v o k e d c o n t r a c t i o n s . A p a m i n b l o c k s s m a l l c o n d u c t a n c e C a z i - a c t i v a t e d K i c h a n n e l s f o u n d o n s m o o t h m u s c l e ( D a n i e l , 1 9 8 5 ) a n d i n h i b i t s N O - m e d i a t e d r e l a x a t i o n o f G I s m o o t h m u s c l e ( r e v i e w e d i n O s t h a u s a n d G a l l i g a n , 1 9 9 2 ) . A p a m i n p o t e n t i a t e d n e u r o g e n i c N A N C c o n t r a c t i o n s i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r . H o w e v e r , a p a m i n s h i f t e d t h e S N P c o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e u p w a r d s , i n d i c a t i n g t h a t a p a m i n b l o c k e d s o m e o f t h e e f f e c t s o f S N P . T h i s a p a m i n - s e n s i t i v e c o m p o n e n t r e p r e s e n t e d t h e a c t i o n s o f S N P o n s m o o t h m u s c l e , a s a p a m i n - s e n s i t i v e i o n i c c h a n n e l s a r e n o t f o u n d o n e n t e r i c n e u r o n s ( B o m s t e i n e t a l . , 1 9 9 4 ) . A s a c o n s e q u e n c e o f t h i s d i r e c t e f f e c t o f S N P , S N P a t t e n u a t e d S P M E - i n d u c e d c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e . I n c o n t r a s t , t h e a p a m i n - i n s e n s i t i v e c o m p o n e n t 3 4 2 o f S N P - i n d u c e d a t t e n u a t i o n o f N A N C c o n t r a c t i o n s r e p r e s e n t e d t h e a c t i o n o f S N P o n e n t e r i c n e u r o n s . T h i s c o n c l u s i o n i s s u p p o r t e d b y e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l s t u d i e s , a s S N P s u p p r e s s e s n o n c h o l i n e r g i c , s l o w e x c i t a t o r y p o s t - s y n a p t i c p o t e n t i a l s ( E P S P s ) r e c o r d e d f r o m m y e n t e r i c n e u r o n s ( T a m u r a e t a l . , 1 9 9 3 ) . F i n a l l y , a l t h o u g h S N P a t t e n u a t e d b o t h n e u r o g e n i c N A N C a n d S P M E - e v o k e d c o n t r a c t i o n s , S N P i n h i b i t e d a g r e a t e r p r o p o r t i o n o f n e u r o g e n i c N A N C c o n t r a c t i o n s a s c o m p a r e d t o S P M E r e s p o n s e s . A s d i s c u s s e d p r e v i o u s l y , S N P a l t e r s t h e p r o p e r t i e s o f c i r c u l a r m u s c l e , r e s u l t i n g i n i n h i b i t i o n o f S P M E - i n d u c e d c o n t r a c t i o n s . H o w e v e r , i f S N P a t t e n u a t e d n e u r o g e n i c c o n t r a c t i o n s b y a p o s t j u n c t i o n a l m e c h a n i s m o n l y , t h e n S N P s h o u l d a t t e n u a t e n e u r o g e n i c a n d S P M E - e v o k e d c o n t r a c t i o n s e q u a l l y , a s N A N C c o n t r a c t i o n s a r e m e d i a t e d b y r e l e a s e o f t a c h y k i n i n s . A g r e a t e r p r o p o r t i o n ( a p p r o x i m a t e l y 8 0 % ) o f n e u r o g e n i c N A N C c o n t r a c t i o n s w e r e i n h i b i t e d b y S N P a s c o m p a r e d t o S P M E r e s p o n s e s ( a p p r o x i m a t e l y 4 0 % ) . T h i s o b s e r v a t i o n f u r t h e r s u g g e s t s t h a t i n a d d i t i o n t o p o s t j u n c t i o n a l i n h i b i t i o n o f c o n t r a c t i o n s , S N P a f f e c t s e x c i t a t o r y m o t o r n e u r o n s , r e s u l t i n g i n i n h i b i t i o n o f t a c h y k i n i n r e l e a s e . T h e fi n a l p i e c e o f e v i d e n c e t o s u p p o r t t h e c o n c l u s i o n o f n i t r i n e r g i c i n h i b i t i o n o f t a c h y k i n i n r e l e a s e r e s u l t e d f r o m u s e o f C P - 9 6 , 3 4 5 . T h e N K l r e c e p t o r a n t a g o n i s t a l s o a t t e n u a t e d n e u r o g e n i c N A N C c o n t r a c t i o n s a f t e r p o t e n t i a t i o n b y N O S a n t a g o n i s t s , w i t h a n e s t i m a t e d E C 5 0 ( 1 4 n M ) c o n s i s t e n t w i t h a s p e c i fi c i n t e r a c t i o n a t N K I r e c e p t o r s . F u r t h e r m o r e , C P - 9 6 , 3 4 5 i n h i b i t e d o v e r 9 0 % o f N A N C c o n t r a c t i o n s a f t e r t r e a t m e n t w i t h N O S a n t a g o n i s t s . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e e f f e c t s o f n e u r o t r a n s m i t t e r r e l e a s e d a fi e r p o t e n t i a t i o n a r e m e d i a t e d b y N K I r e c e p t o r s , c o n s i s t e n t w i t h e n h a n c e d r e l e a s e o f t a c h y k i n i n s . 3 4 3 V I P D o e s N o t I n h i b i t N A N C C o n t r a c t i o n s V I P - i r i s c l o s e l y a s s o c i a t e d w i t h N O S - i r i n m y e n t e r i c n e u r o n s , a n d V I P i s a n i n h i b i t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r i n s o m e s e g m e n t s o f t h e G I t r a c t ( s e e i n t r o d u c t i o n ) . H o w e v e r , V I P p r o d u c e d s m a l l , r a p i d l y - d e s e n s i t i z i n g r e l a x a t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e , a n d d i d n o t a f f e c t n e u r o g e n i c N A N C c o n t r a c t i o n s . T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t u n l i k e N O , V I P d o e s n o t r e g u l a t e t a c h y k i n i n r e l e a s e o r s i g n i fi c a n t l y a f f e c t c o n t r a c t i b i l i t y o f c i r c u l a r m u s c l e . E n d o g e n o u s N O D o e s N o t I n h i b i t C h o l i n e r g i c C o n t r a c t i o n s I n t h e p r e s e n c e o f g u a n e t h i d i n e a n d C P - 9 6 , 3 4 5 , t r a n s m u r a l s t i m u l a t i o n o f c i r c u l a r m u s c l e p r e p a r a t i o n s p r o d u c e d m o n o p h a s i c c o n t r a c t i o n s w h i c h w e r e b l o c k e d b y s c o p o l a m i n e a n d T T X , i n d i c a t i n g c o n t r a c t i o n s r e s u l t e d f r o m s t i m u l a t i o n o f c h o l i n e r g i c m o t o r n e u r o n s . T h i s c o n c l u s i o n w a s s u p p o r t e d b y u s e o f b e t h a n e c h o l , a m A C h r e c e p t o r a g o n i s t , a s b e t h a n e c h o l m i m i c k e d n e u r o g e n i c c o n t r a c t i o n s . F i n a l l y , s c o p o l a m i n e i n h i b i t e d b e t h a n e c h o l - i n d u c e d c o n t r a c t i o n s , i n d i c a t i n g n e r v e - r e l e a s e d A C h a c t i v a t e s m A C h r e c e p t o r s , c u l m i n a t i n g i n c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e . A l t h o u g h N O S a n t a g o n i s t s p o t e n t i a t e d N A N C c o n t r a c t i o n s , i n h i b i t i o n o f N O f o r m a t i o n b y L N A , L N A M E , a n d L M M A d i d n o t a f f e c t c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s , a s c o n t r a c t i o n s o f e q u a l a m p l i t u d e w e r e o b s e r v e d i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f N O S a n t a g o n i s t s . S i m i l a r l y , h e m o g l o b i n d i d n o t s i g n i fi c a n t l y a l t e r c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s , i n d i c a t i n g N A N C b u t n o t c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s a r e p o t e n t i a t e d b y N O S a n t a g o n i s t s . T h e s e d a t a a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e c o n c l u s i o n t h a t e n d o g e n o u s N O i n h i b i t s r e l e a s e o f t a c h y k i n i n s b u t n o t A C h f r o m e x c i t a t o r y m o t o r n e u r o n s . T h e s t u d i e s u s i n g N O S a n t a g o n i s t s a n d h e m o g l o b i n s u g g e s t t h a t u n l i k e N A N C c o n t r a c t i o n s , n e u r o g e n i c c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s a r e n o t i n h i b i t e d b y e n d o g e n o u s N O . 3 4 4 S u r p r i s i n g l y , S N P i n h i b i t e d n e u r o g e n i c c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s , a l t h o u g h t h e e s t i m a t e d E C 5 0 a n d m a x i m u m e f f e c t o f S N P w e r e d i f f e r e n t f o r n e u r o g e n i c N A N C a n d c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s . S N P i n h i b i t e d c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s w i t h a n e s t i m a t e d E C s o o f 1 0 9 8 n M , w h e r e a s a t t e n u a t i o n o f N A N C c o n t r a c t i o n s h a d a n e s t i m a t e d S N P E C , 0 o f 3 9 0 n M . T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t a l a r g e r c o n c e n t r a t i o n o f S N P i s n e c e s s a r y t o i n h i b i t t h e s a m e p r o p o r t i o n o f c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s a s c o m p a r e d t o N A N C c o n t r a c t i o n s . F u r t h e r m o r e , e q u a l c o n c e n t r a t i o n s o f S N P i n h i b i t e d a s m a l l e r p r o p o r t i o n o f c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s a s c o m p a r e d t o N A N C c o n t r a c t i o n s . T h e r e f o r e , a l t h o u g h S N P a t t e n u a t e s n e u r o g e n i c N A N C a n d c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s , c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s a r e l e s s s e n s i t i v e t o i n h i b i t i o n b y t h e N O d o n o r S N P . T h e m A C h r e c e p t o r a g o n i s t b e t h a n e c h o l m i m i c k e d n e u r o g e n i c c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s , a n d r e s p o n s e s t o b e t h a n e c h o l w e r e u s e d t o d e t e r m i n e i f S N P a f f e c t e d c o n t r a c t i b i l i t y a n d b a s a l t o n e o f c i r c u l a r m u s c l e . A l t h o u g h S N P a t t e n u a t e d S P M E - i n d u c e d c o n t r a c t i o n s , b e t h a n e c h o l - i n d u c e d c o n t r a c t i o n s w e r e n o t a l t e r e d b y S N P . T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t S N P a t t e n u a t e s c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s b y i n h i b i t i n g r e l e a s e o f A C h f r o m e x c i t a t o r y m o t o r n e u r o n s , a s b a s a l t o n e a n d s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y s c o u p l e d t o m A C h r e c e p t o r s a r e n o t a f f e c t e d b y S N P . H o w e v e r , N O S a n t a g o n i s t s a n d h e m o g l o b i n f a i l e d t o p o t e n t i a t e n e u r o g e n i c c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s , s u g g e s t i n g t h a t e n d o g e n o u s N O p r e s e n t u n d e r t h e s e e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s d o e s n o t r e g u l a t e A C h r e l e a s e . G r e a t e r c o n c e n t r a t i o n s o f N O o b t a i n e d b y l o n g d u r a t i o n o f t r a i n s o f n e r v e s t i m u l a t i o n ( H r y h o r e n k o e t a l . , 1 9 9 4 ) o r a p p l i c a t i o n o f N O d o n o r s s u c h a s S N P m a y p r o v i d e s u f fi c i e n t N O f o r r e g u l a t i o n o f S P a n d A C h r e l e a s e f r o m t h e s a m e n e r v e v a r i c o s i t i e s . A s d i s c u s s e d p r e v i o u s l y , S N P a t t e n u a t e d S P M E r e s p o n s e s , i n d i c a t i n g t h a t S N P 3 4 5 a l t e r e d s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y s c o u p l e d t o N K l r e c e p t o r s . S N P d i d n o t a f f e c t b e t h a n e c h o l r e s p o n s e s , s u g g e s t i n g t h a t s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y s c o u p l e d t o m A C h r e c e p t o r s a r e n o t s e n s i t i v e t o i n h i b i t i o n b y N O . F u r t h e r r n o r e , t h e s e r e s u l t s s t r e n g t h e n t h e c o n c l u s i o n t h a t a s p e c i fi c r e c e p t o r o r b i o c h e m i c a l p a t h w a y i s a t t e n u a t e d b y S N P . I f S N P i n h i b i t e d S P M E r e s p o n s e s b y d e c r e a s i n g b a s a l t o n e o f c i r c u l a r m u s c l e , t h e n m A C h r e s p o n s e s s h o u l d b e a f f e c t e d b y S N P . A s b e t h a n e c h o l r e s p o n s e s w e r e n o t a l t e r e d b y S N P , t h e s e d a t a i n d i c a t e S P M E c o n t r a c t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e a r e s p e c i fi c a l l y i n h i b i t e d b y S N P . F i n a l l y , L N A a n d h e m o g l o b i n d i d n o t s i g n i fi c a n t l y a l t e r S P M E - i n d u c e d c o n t r a c t i o n s , s u g g e s t i n g t h a t e n d o g e n o u s N O d o e s n o t m o d u l a t e N K l r e c e p t o r m e d i a t e d r e s p o n s e s . T h e n e r v e - e v o k e d ( l m i n t r a i n l e n g t h , 3 2 H z , 1 m s e c p u l s e d u r a t i o n ) N O c o n c e n t r a t i o n ( 3 0 0 0 p m o l / g t i s s u e / m i n ) f r o m c i r c u l a r a n d l o n g i t u d i n a l m u s c l e s ( W i k l u n d e t a l . , 1 9 9 3 ) i s m u c h l e s s t h a n t h e a m o u n t o f S N P a d d e d t o c i r c u l a r m u s c l e p r e p a r a t i o n s i n t h e p r e s e n t s t u d y , i n d i c a t i n g t h a t l a r g e c o n c e n t r a t i o n s o f N O a r e n e c e s s a r y t o a t t e n u a t e c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s . R e g u l a t i o n o f R e l e a s e o f T a c h y k i n i n s a n d A C h C i r c u l a r m u s c l e i s i n n e r v a t e d b y m y e n t e r i c n e u r o n s t h a t c o n t a i n b o t h A C h a n d S P . T h e r e s u l t s p r e s e n t e d i n t h i s p a p e r i n d i c a t e t h a t N O d i f f e r e n t i a l l y a f f e c t s r e l e a s e o f A C h a n d t a c h y k i n i n s f r o m t h e s a m e n e r v e , a s N O S a n t a g o n i s t s a n d h e m o g l o b i n p o t e n t i a t e d N A N C b u t n o t c h o l i n e r g i c n e u r o g e n i c c o n t r a c t i o n s . F u r t h e r m o r e , t h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t r e l e a s e o f t a c h y k i n i n s i s m o r e s e n s i t i v e t o i n h i b i t i o n b y N O . A l t h o u g h t h e s e s t u d i e s d i d n o t d e t e r m i n e t h e m e c h a n i s m f o r i n h i b i t i o n o f t a c h y k i n i n r e l e a s e b y N O , N O S - i r n e r v e s a r e c l o s e l y a s s o c i a t e d w i t h o t h e r n e u r o n s . O v e r 4 0 % o f m y e n t e r i c n e u r o n s c o n t a i n S P - i r a n d t h e s e n e u r o n s d o n o t c o n t a i n N O S - i r ( L l e w e l l y n - S m i t h e t a l . , 1 9 9 2 ) , i n d i c a t i n g t h a t 3 4 6 m a n y N O S - i r n e r v e s a r e l o c a t e d n e a r S P - i r n e r v e s . T h i s c l o s e p r o x i m i t y m a y a l l o w N O r e l e a s e d f r o m i n t e m e u r o n s o r i n h i b i t o r y m o t o r n e u r o n s t o d i f f u s e a c r o s s a s h o r t d i s t a n c e t o e f f e c t e x c i t a t o r y m o t o r n e u r o n s . B o t h N O a n d S N P b i n d a n d a c t i v a t e g u a n y l a t e c y c l a s e , r e s u l t i n g i n e l e v a t e d c G M P c o n c e n t r a t i o n s . A l t h o u g h c e l l p e r m e a b l e 8 - b r o m o - c G M P i n h i b i t e d N A N C c o n t r a c t i o n s i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r , e x o g e n o u s c G M P w a s u n l i k e l y t o a f f e c t e x c i t a t o r y m o t o r n e u r o n s d i r e c t l y . S P - i r m y e n t e r i c n e u r o n s i n g u i n e a p i g i l e u m d o n o t c o n t a i n c G M P - i r a f t e r t r e a t m e n t w i t h S N P ( Y o u n g e t a l . , 1 9 9 3 ) , s u g g e s t i n g a n a l t e r n a t i v e m e c h a n i s m i s r e s p o n s i b l e f o r i n h i b i t i o n o f n e u r o t r a n s m i t t e r r e l e a s e . L M M P h o m o g e n a t e s c o n t a i n d i s t i n c t v e s i c l e s w i t h A C h o r S P , c o m p a r a b l e t o s m a l l s y n a p t i c c h o l i n e r g i c v e s i c l e s ( S S V ) a n d l a r g e , d e n s e - c o r e p e p t i n e r g i c v e s i c l e s ( L D C V ) ( A g o s t o n e t a l . , 1 9 8 5 ) f o u n d i n o t h e r a u t o n o m i c n e r v e s . D i f f e r e n c e s i n n i t r i n e r g i c r e g u l a t i o n o f S P a n d A C h r e l e a s e m a y r e s u l t f r o m s p a t i a l l o c a l i z a t i o n o f n o n c h o l i n e r g i c a n d c h o l i n e r g i c v e s i c l e s , a s m o r e n u m e r o u s S S V s c l u s t e r n e a r s p e c i a l i z e d r e g i o n s o f n e r v e v a r i c o s i t i e s , a n d L D C V s a r e f o u n d f u r t h e r a w a y f r o m t h e p l a s m a l e m m a ( r e v i e w e d i n d e C a m i l l i a n d J a h n , 1 9 9 0 ) . I f N O S - i r n e r v e s a r e l o c a t e d p r e f e r e n t i a l l y n e a r v e s i c l e s c o n t a i n i n g t a c h y k i n i n s , t h e n e n d o g e n o u s N O m a y i n h i b i t r e l e a s e o f L D C V s ; c o n c e n t r a t i o n s o f e n d o g e n o u s N O m a y b e t o o l o w t o a f f e c t c h o l i n e r g i c S S V s f o u n d n e a r r e l e a s e s i t e s o f v a r i c o s i t i e s . A l t e r n a t i v e l y , d i f f e r e n t i a l r e g u l a t i o n o f r e l e a s e o f e x c i t a t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r s b y e n d o g e n o u s N O a n d d i f f e r e n t i a l s e n s i t i v i t y t o e x o g e n o u s N O m a y o c c u r a s a r e s u l t o f d i f f e r e n c e s i n d o c k i n g p r o t e i n s , s p a t i a l a s s o c i a t i o n w i t h C a 2 + c h a n n e l s , o r o t h e r u n i d e n t i fi e d r e q u i r e m e n t s f o r e x o c y t o s i s t h a t d i f f e r b e t w e e n S S V s a n d L D C V s ( M a t t e o l i e t a l . , 1 9 8 8 ) . 3 4 7 T o n i c a n d S t i m u l a t e d R e l e a s e o f N O A l t h o u g h n e r v e - e v o k e d r e l a x a t i o n s o f c i r c u l a r m u s c l e w e r e n o t o b s e r v e d i n t h i s s t u d y , s t i m u l a t i o n o f m y e n t e r i c n e r v e s r e l e a s e s N O a s m e a s u r e d b y b i o a s s a y , h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y , a n d f u n c t i o n a l a s s a y s ( s e e i n t r o d u c t i o n ) . I n t h i s s t u d y , i t w a s l i k e l y t h a t n e r v e s t i m u l a t i o n e v o k e d r e l e a s e o f N O , a s p o t e n t i a t i o n o f N A N C c o n t r a c t i o n s w a s d e p e n d e n t o n t h e f r e q u e n c y o f n e r v e s t i m u l a t i o n . C o n t r a c t i o n s g e n e r a t e d a t 1 a n d 2 H z w e r e n o t p o t e n t i a t e d b y L N A , s u g g e s t i n g l o w f r e q u e n c y n e r v e s t i m u l a t i o n i s n o t s u f fi c i e n t t o a c t i v a t e N O S . M o s t N O p r o d u c t i o n b y L M M P h o m o g e n a t e s i s C a 2 + - d e p e n d e n t ( K o s t a e t a l . , 1 9 9 3 ) , w i t h a n e s t i m a t e d E C , o o f 3 5 0 n M . F u r t h e r m o r e , N O r e l e a s e i s d e p e n d e n t o n e n t r y o f e x t r a c e l l u l a r C a ” , a s m - c o n o t o x i n G V I A p r e f e r e n t i a l l y a t t e n u a t e s N O r e l e a s e d a t l o w f r e q u e n c y n e r v e s t i m u l a t i o n ( B o e c k x s t a e n s e t a l . , 1 9 9 3 ) . T h e r e f o r e , l o w f r e q u e n c y s t i m u l a t i o n m a y n o t a l l o w e n t r y o f s u f f i c i e n t C a 2 + t o s t i m u l a t e N O p r o d u c t i o n o r r e l e a s e f r o m e n t e r i c n e r v e s . A s d i s c u s s e d p r e v i o u s l y , N O S a n t a g o n i s t s a n d h e m o g l o b i n p o t e n t i a t e d n e u r o g e n i c N A N C c o n t r a c t i o n s , i m p l y i n g t h a t N O m u s t b e s y n t h e s i z e d a n d r e l e a s e d e i t h e r p r i o r t o , o r d u r i n g , n e r v e s t i m u l a t i o n . N O m a y c o n t i n u a l l y b e r e l e a s e d t o m o d u l a t e n e u r o t r a n s m i t t e r r e l e a s e a n d c i r c u l a r m u s c l e t o n e , a s b a s a l l e v e l s o f N O m e t a b o l i t e s a r e d e t e c t e d p r i o r t o n e r v e s t i m u l a t i o n . F u r t h e r m o r e , i n t h i s s t u d y , a d d i t i o n o f N O S a n t a g o n i s t s o r h e m o g l o b i n i n c r e a s e d s p o n t a n e o u s a c t i v i t y o f c i r c u l a r m u s c l e , i n d i c a t i n g t h a t N O i s r e l e a s e d u n d e r b a s a l c o n d i t i o n s t o i n h i b i t m u s c l e t o n e . A l t e r n a t i v e l y , t o n i c r e l e a s e o f N O i n h i b i t e d r e l e a s e o f e x c i t a t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r s f r o m m y e n t e r i c n e r v e s . N O S a n t a g o n i s t s o r h e m o g l o b i n r e m o v e t h i s i n h i b i t i o n , r e s u l t i n g i n i n c r e a s e d s p o n t a n e o u s r e l e a s e o f e x c i t a t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r s , a n d i n c r e a s e d a c t i v i t y o f c i r c u l a r m u s c l e . T T X 3 4 8 i n h i b i t e d s p o n t a n e o u s a c t i v i t y o f c i r c u l a r m u s c l e a f t e r a d d i t i o n o f N O S a n t a g o n i s t s , i n d i c a t i n g t h a t e n d o g e n o u s N O i n h i b i t s r e l e a s e o f e x c i t a t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r s f r o m e n t e r i c m o t o r n e u r o n s . R e m o v a l o f i n h i b i t o r y n i t r i n e r g i c t o n e i n c r e a s e s n e u r o t r a n s m i t t e r r e l e a s e , r e s u l t i n g i n i n c r e a s e d m o t o r a c t i v i t y . T h e r e f o r e , t h e s e d a t a f u r t h e r s u p p o r t t h e g e n e r a l c o n c l u s i o n t h a t e n d o g e n o u s N O i n h i b i t s e x c i t a t o r y n o n c h o l i n e r g i c n e u r o t r a n s m i t t e r r e l e a s e f r o m e n t e r i c n e u r o n s . 6 . E X T R I N S I C D E N E R V A T I O N A L T E R S C I T R U L L I N E P R O D U C T I O N [ " C ] C i t r u l l i n e i s P r o d u c e d b y N O S i n N o r m a l H o m o g e n a t e s W h e n h o m o g e n a t e s o f L M M P f r o m n o r m a l a n i m a l s w e r e i n c u b a t e d w i t h [ ' 4 C ] a r g i n i n e , t h e m a j o r i t y o f c o l u m n fl o w - t h r o u g h m i g r a t e d o n s i l i c a t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y p l a t e s w i t h t h e c i t r u l l i n e s t a n d a r d . A s 9 8 % o f [ ” C ] a r g i n i n e r e m a i n e d b o u n d t o t h e c a t i o n - e x c h a n g e c o l u m n , t h e s e d a t a s u g g e s t t h a t [ ” C ] a r g i n i n e i s c o n v e r t e d t o [ " C ] c i t r u l l i n e , c o n s i s t e n t w i t h t h e c o n v e r s i o n o f a r g i n i n e t o c i t r u l l i n e a n d N O b y N O S ( B r e d t a n d S y n d e r , 1 9 8 9 ) . A n u m b e r o f e x p e r i m e n t s s u p p o r t e d t h e c o n c l u s i o n t h a t [ ” C ] c i t r u l l i n e f o r m a t i o n w a s c a t a l y z e d b y N O S i n L M M P h o m o g e n a t e s . [ ” C ] C i t r u l l i n e f o r m a t i o n b y L M M P h o m o g e n a t e s h a d a n u m b e r o f s i m i l a r i t i e s t o [ ” C ] c i t r u l l i n e f o r m a t i o n i n c e r e b e l l u m ( B r e d t a n d S y n d e r , 1 9 8 9 ; B r e d t a n d S y n d e r , 1 9 9 0 ) a n d c i r c u l a r m u s c l e - d e e p m y e n t e r i c p l e x u s o f c a n i n e i l e u m ( K o s t k a e t a l . , 1 9 9 3 ) . A l t h o u g h b a s a l l e v e l s o f [ ' 4 C ] c i t r u l l i n e c o u l d b e m e a s u r e d , [ " C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n i n c r e a s e d o v e r 2 - f o l d t h e a d d i t i o n o f 1 m M N A D P H . A s f o r m a t i o n o f N O r e q u i r e s o x i d a t i o n o f N A D P H ( r e v i e w e d i n M o n c a d a e t a l . , 1 9 9 1 ) , t h e N A D P H - d e p e n d e n c e o f [ ‘ 4 C ] c i t r u l l i n e f o r m a t i o n i s c o n s i s t e n t w i t h N O S a c t i v i t y ( B r e d t 3 4 9 a n d S y n d e r , 1 9 9 0 ; r e v i e w e d i n S c h m i d t e t a l . , 1 9 9 2 ; r e v i e w e d i n D a w s o n a n d S y n d e r , 1 9 9 4 ) . F u r t h e r r n o r e , [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n w a s i n h i b i t e d b y t h e w e l l - c h a r a c t e r i z e d N O S a n t a g o n i s t s L N A M E a n d L N A . H o w e v e r , t h e D - e n a n t i o m e r o f L N A M E d i d n o t a f f e c t [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n , s u g g e s t i n g L N A M E a c t e d t h r o u g h a s t e r e o s p e c i fi c m e c h a n i s m , s u c h a s b i n d i n g t o N O S . T h e k i n e t i c s f o r [ ” C ] c i t r u l l i n e f o r m a t i o n i n u n p u r i fi e d L M M P h o m o g e n a t e s a r e s i m i l a r t o t h e k i n e t i c s o f u n p u r i fi e d c e r e b e l l a r N O S ( B r e d t a n d S y n d e r , 1 9 8 9 ) . [ ” C ] C i t r u l l i n e f o r m a t i o n i n L M M P h o m o g e n a t e s w a s l i n e a r i n t h e r a n g e o f s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s o f 1 - 1 0 1 1 M , w i t h a K M o f 7 . 2 I I M a n d V m a x o f 1 8 . 6 p m o l e / m g p r o t e i n / m i n . T h e s e v a l u e s a r e v e r y s i m i l a r t o t h o s e o f c e r e b e l l a r h o m o g e n a t e s ( B r e d t a n d S y n d e r , 1 9 8 9 ) ( K M o f 6 u M a n d V m a m o f 1 5 0 p m o l e [ ” C ] c i t r u l l i n e / m g p r o t e i n / m i n ) , a l t h o u g h t h e l o w e r V m v a l u e i n t h i s s t u d y m a y i n d i c a t e a g r e a t e r c o n c e n t r a t i o n o f p r o t e i n s i n L M M P h o m o g e n a t e s t h a t a r e n o t i n v o l v e d i n t h e f o r m a t i o n o f [ ” C ] c i t r u l l i n e . T h e r e f o r e , t h e r a t i o o f N O S / t o t a l p r o t e i n m a y b e d e c r e a s e d i n L M M P p r e p a r a t i o n s a s c o m p a r e d t o c e r e b e l l a r h o m o g e n a t e s , c u l m i n a t i n g i n a l o w e r V m a x . [ ” C ] C i t r u l l i n e p r o d u c t i o n w a s d e p e n d e n t o n t h e p r e s e n c e o f e n d o g e n o u s C a 2 + . E G T A p r e f e r e n t i a l l y c h e l a t e s C a 2 + o v e r o t h e r d i v a l e n t c a t i o n s ( r e v i e w e d i n B a r t f a i e t a l . , 1 9 7 9 ) , a n d a d d i t i o n o f E G T A d e c r e a s e d [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n b y 7 1 % ( 0 . 1 m M E G T A ) a n d 9 9 % ( 1 m M E G T A ) . T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t s u f fi c i e n t e n d o g e n o u s C a 2 + i s p r e s e n t i n L M M P p r e p a r a t i o n s t o s u p p o r t [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n , s i m i l a r t o a c t i v a t i o n o f t y p e I i s o f o r m o f N O S d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( r e v i e w e d i n S c h m i d t e t a 1 . , 1 9 9 2 ; D a w s o n a n d S y n d e r , 1 9 9 4 ) . A d d i t i o n o f 0 . 1 m M e x o g e n o u s C a 2 + d i d n o t s i g n i fi c a n t l y a f f e c t b a s a l o r N A D P H - e n h a n c e d [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n . T h e s e r e s u l t s a r e i d e n t i c a l t o s t u d i e s o f 3 5 0 c i r c u l a r m u s c l e - d e e p m u s c u l a r p l e x u s ( K o s t k a e t a l . , 1 9 9 3 ) , a n d m a y i n d i c a t e t h a t e n d o g e n o u s C a 2 + r e l e a s e d d u r i n g h o m o g e n i z a t i o n o f n e u r o n s a n d s m o o t h m u s c l e c e l l s i s s u f fi c i e n t t o a c t i v a t e N O S ( C a 2 + E C 5 0 2 0 0 n M , ( B r e d t a n d S n y d e r , 1 9 9 0 ) ) . A l t h o u g h l o w c o n c e n t r a t i o n s o f C a 2 + d i d n o t a l t e r b a s a l [ " C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n , 1 m M C a 2 + a t t e n u a t e d [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n i n t h e p r e s e n c e o f 1 m M N A D P H . T h e s e d a t a s u g g e s t t h a t h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f C a 2 + i n h i b i t N O S . N i t r i c o x i d e s y n t h a s e h a s m u l t i p l e s i t e s f o r p h o s p h o r y l a t i o n b y p r o t e i n k i n a s e C , a n d C a y / c a l m o d u l i n p r o t e i n k i n a s e ( B r e d t e t a l . , 1 9 9 2 ) a n d p h o s p h o r y l a t i o n o f N O S d e c r e a s e s e n z y m e a c t i v i t y ( B r e d t e t a l . , 1 9 9 2 ; r e v i e w e d i n S c h m i d t e t a l . , 1 9 9 2 ; D a w s o n a n d S y n d e r , 1 9 9 4 ) . A s t h e p r e s e n c e o f C a 2 + ( 1 m M ) i s n e c e s s a r y f o r a c t i v i t y o f p r o t e i n k i n a s e C a n d C a 2 ’ / c a l m o d u l i n k i n a s e ( B r e d t e t a l . , 1 9 9 2 ) , 1 m M C a 2 + m a y a c t i v a t e k i n a s e s , r e s u l t i n g i n d e c r e a s e d a c t i v i t y o f N O S . A l t e r n a t i v e l y , C a 2 + m a y d i r e c t l y a f f e c t N O S a c t i v i t y , a s 1 m M C a 2 + d e c r e a s e s p u r i fi e d e n z y m e a c t i v i t y ( B r e d t e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h e r e f o r e , l a r g e c o n c e n t r a t i o n s o f C a 2 + m a y d e c r e a s e [ ” C ] c i t r u l l i n e ( a n d N O p r o d u c t i o n ) b y a c t i v a t i n g k i n a s e s i n t h e h o m o g e n a t e , a s w e l l a s d i r e c t l y a f f e c t i n g N O S . S u c h a m e c h a n i s m m a y b e i m p o r t a n t t o l i m i t t h e d u r a t i o n o f a c t i v i t y o f N O S a f t e r n e r v e s t i m u l a t i o n . [ ” C ] C i t r u l l i n e p r o d u c t i o n w a s n o t a l t e r e d b y a d d i t i o n o f 0 . 1 - 3 0 p g / u l c a l m o d u l i n . T h e s e d a t a m a y s u g g e s t t h a t t h e e n d o g e n o u s c o n c e n t r a t i o n o f c a l m o d u l i n r e l e a s e d b y h o m o g e n i z a t i o n i s s u f fi c i e n t f o r N O S a c t i v i t y . A l t e r n a t i v e l y , [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n m a y n o t r e q u i r e e x o g e n o u s c a l m o d u l i n . T h e t y p e I I i s o f o r m o f N O S i n d u c e d i n m a c r o p h a g e s , n e u t r o p h i l s , a n d k u p f f e r c e l l s ( r e v i e w e d i n M o n c a d a e t a l . , 1 9 9 1 ) i s n o t d e p e n d e n t o n C a 2 + o r c a l m o d u l i n , a s c a l m o d u l i n i s n o r m a l l y b o u n d t o t h i s f o r m o f N O S . H o w e v e r , w h e n 0 . 1 m M C a 2 + w a s i n c l u d e d w i t h 3 0 u g / u l c a l m o d u l i n , g r e a t e r c i t r u l l i n e 3 5 1 f o r m a t i o n w a s o b s e r v e d a s c o m p a r e d t o h o m o g e n a t e s c o n t a i n i n g o n l y N A D P H , i m p l y i n g t h a t [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n i n L M M P h o m o g e n a t e s r e q u i r e d c a l m o d u l i n . [ ” C ] C i t r u l l i n e p r o d u c t i o n i n n o r m a l L M M P h o m o g e n a t e s o c c u r r e d b y a p a t h w a y t h a t w a s d e p e n d e n t o n N A D P H , C a 2 + , a n d c a l m o d u l i n , a n d w a s i n h i b i t e d b y L - b u t n o t D - s u b s t i t u t e d a r g i n i n e a n a l o g s . F i n a l l y , t h e M i c h a e l i s c o n s t a n t w a s s i m i l a r t o t h a t o f c e r e b e l l a r N O S , i n d i c a t i n g [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n i n n o r m a l L M M P h o m o g e n a t e s w a s m e d i a t e d b y t y p e I i s o f o r m o f N O S . A l t h o u g h t h i s s t u d y d i d n o t d e t e r m i n e t h e s o u r c e o f N O S , t y p e I N O S - i r h a s b e e n d e s c r i b e d i n e n t e r i c n e u r o n s w i t h m o r p h o l o g y a n d c h e m i c a l c o d i n g c o n s i s t e n t w i t h m o t o r n e u r o n s ( C o s t a e t a l . , 1 9 9 2 ; Y o u n g e t a l . , 1 9 9 2 ) , a n d N O S - i r i s n o t f o u n d i n s m o o t h m u s c l e o r e n t e r i c g l i a . I n s o m e r e g i o n s o f t h e G I t r a c t , N O m a y b e r e l e a s e d f r o m s m o o t h m u s c l e i n r e s p o n s e t o V I P ( G r i d e r e t a l . , 1 9 9 2 ) ; t h i s d o e s n o t a p p e a r t o b e t r u e f o r s m a l l i n t e s t i n e ( D a n i e l e t a l . , 1 9 9 4 ) . F i n a l l y , s a x i t o x i n b i n d s t o n e u r o n a l N a + c h a n n e l s , a n d N O S a c t i v i t y a n d s a x i t o x i n b i n d i n g a r e f o u n d i n e n t e r i c s y n a p t o s o m e s b u t n o t s m o o t h m u s c l e c e l l s f r o m c a n i n e i l e u m ( K o s t k a e t a l . , 1 9 9 3 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e d a t a s u g g e s t t h a t c i t r u l l i n e a n d N O a r e p r o d u c e d b y N O S i n e n t e r i c n e r v e s . E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n A l t e r s N O S A c t i v i t y a s A s s a y e d b y [ “ C ] C i t r u l l i n e F o r m a t i o n [ ” C ] C i t r u l l i n e p r o d u c t i o n i n h o m o g e n a t e s p r e p a r e d f r o m d e n e r v a t e d l o o p s o f i l e u m w a s s i m i l a r t o p r o d u c t i o n i n n o r m a l h o m o g e n a t e s , a s c i t r u l l i n e f o r m a t i o n w a s e n h a n c e d b y e x o g e n o u s N A D P H . F u r t h e r m o r e , t h e N O S a n t a g o n i s t s L N A a n d L N A M E i n h i b i t e d [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n . H o w e v e r , e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n s i g n i fi c a n t l y a f f e c t e d c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n a s t h e q u a n t i t y o f [ ' 4 C ] c i t r u l l i n e f o r m e d i n d e n e r v a t e d L M M P h o m o g e n a t e s d e c r e a s e d b y 5 0 % . A s c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n w a s e x p r e s s e d a s a f r a c t i o n o f t h e t o t a l 3 5 2 a m o u n t o f p r o t e i n i n L M M P h o m o g e n a t e s , [ " C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n m a y h a v e a p p e a r e d t o d e c r e a s e i f s u r g i c a l d e n e r v a t i o n i n d u c e d t h i c k e n i n g o f t h e l o n g i t u d i n a l m u s c l e . M u s c l e t h i c k e n i n g c a n r e s u l t f r o m h y p e r p l a s i a ( i n c r e a s e d c e l l n u m b e r ) o r h y p e r t r o p h y ( i n c r e a s e d c e l l v o l u m e ) ( G a b e l l a , 1 9 8 4 ) , a n d c o u l d r e s u l t i n a g r e a t e r p r o t e i n c o n t e n t / h o m o g e n a t e . H o w e v e r , a t t e n u a t i o n o f [ " C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n w a s u n l i k e l y t h e r e s u l t o f i n c r e a s e d p r o t e i n c o n t e n t o f h o m o g e n a t e s , a s t h e w e t w e i g h t o f m u s c l e / c m w a s n o t a f f e c t e d b y d e n e r v a t i o n , s u g g e s t i n g s i m i l a r p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s i n c o n t r o l a n d d e n e r v a t e d L M M P p r e p a r a t i o n s . D e c r e a s e d [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n w a s o b s e r v e d a l s o i n L M M P h o m o g e n a t e s t a k e n f r o m a n i m a l s t r e a t e d s y s t e m i c a l l y w i t h c a p s a i c i n . C a p s a i c i n i s a w e l l - c h a r a c t e r i z e d n e u r o t o x i n t h a t s e l e c t i v e l y d e s t r o y s t h i n , u n m y e l i n a t e d e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e s w i t h o u t a f f e c t i n g e n t e r i c n e u r o n s ( r e v i e w e d i n H o l z e r , 1 9 9 1 ) o r s y m p a t h e t i c n e r v e s ( G a l l i g a n e t a l . , 1 9 8 8 ; Y u n k e r a n d G a l l i g a n , 1 9 9 4 a ) . T h i s o b s e r v a t i o n s u g g e s t s t h a t c h a n g e s i n [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n o b s e r v e d a f t e r s u r g i c a l d e n e r v a t i o n d i d n o t o c c u r a s a r e s u l t o f s u r g i c a l t r a u m a o r h a n d l i n g o f t h e i l e u m , b u t f r o m l o s s o f a s p e c i fi c s u b p o p u l a t i o n o f e x t r i n s i c n e r v e s . I n t e r e s t i n g l y , a s s h o w n i n t h i s d i s s e r t a t i o n , e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n i n c r e a s e s t h e n u m b e r o f m y e n t e r i c n e u r o n s c o n t a i n i n g N A D P H d i a p h o r a s e a n d N O S - i r , a n d t h e s e a n a t o m i c a l c h a n g e s a r e m i m i c k e d b y s y s t e m i c a d m i n i s t r a t i o n o f c a p s a i c i n . T h e r e f o r e , a l t h o u g h e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n i n c r e a s e s N O S - i r a n d N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g , l o s s o f e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e s d e c r e a s e s [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n b y N O S . C i t r u l l i n e a n d N O a r e p r o d u c e d i n e q u i m o l a r c o n c e n t r a t i o n s ( B r e d t a n d S y n d e r , 1 9 8 9 ; B r e d t a n d S y n d e r , 1 9 9 0 ) , a n d [ ” C ] c i t r u l l i n e f o r m a t i o n i n t h i s s t u d y w a s c o n s i s t e n t w i t h N O S a c t i v i t y . T h e d a t a p r e s e n t e d i n t h e p r e s e n t s t u d y i n d i c a t e t h a t l o s s o f e x t r i n s i c 3 5 3 s e n s o r y n e r v e s d e c r e a s e s N A D P H - e n h a n c e d p r o d u c t i o n o f N O i n L M M P h o m o g e n a t e s w i t h o u t a f f e c t i n g b a s a l N O f o r m a t i o n . H o w e v e r , i n f u n c t i o n a l s t u d i e s o f i n n e r v a t i o n o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e , t h e a m p l i t u d e a n d d u r a t i o n o f N O - m e d i a t e d n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s o f L M M P p r e p a r a t i o n s a r e p o t e n t i a t e d a f t e r l o s s o f e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e s ( Y u n k e r a n d G a l l i g a n , 1 9 9 4 b ) . T h e b i o c h e m i c a l d a t a p r e s e n t e d h e r e a r e n o t c o n s i s t e n t w i t h d e n e r v a t i o n - i n d u c e d i n c r e a s e s i n N O S - i r a n d N O - m e d i a t e d n e u r o g e n i c r e l a x a t i o n s d i s c u s s e d p r e v i o u s l y . T h e s e d a t a m a y i n d i c a t e t h a t l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n s i m u l t a n e o u s l y i n c r e a s e s N O S a n d a l t e r s r e g u l a t i o n o f N O p r o d u c t i o n i n h o m o g e n a t e s . F o r e x a m p l e , [ ” C ] c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n m a y d e c r e a s e a s a r e s u l t o f d i f f e r e n c e s i n s e n s i t i v i t y t o N A D P H . I f N A D P H i s l e s s e f f e c t i v e a t s t i m u l a t i n g N O a n d c i t r u l l i n e p r o d u c t i o n i n h o m o g e n a t e s f r o m d e n e r v a t e d i l e u m a s c o m p a r e d t o c o n t r o l s , N A D P H - e n h a n c e d [ ” C ] c i t r u l l i n e f o r m a t i o n m a y b e g r e a t e r i n c o n t r o l h o m o g e n a t e s , a l t h o u g h e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n h a s i n c r e a s e d N O S . F u r t h e r r n o r e , N O S a c t i v i t y i s r e g u l a t e d b y a n u m b e r o f f a c t o r s i n c l u d i n g C a 2 + , c a l m o d u l i n , N A D P H , c A M P d e p e n d e n t k i n a s e , p r o t e i n k i n a s e C , a n d C a y / c a l m o d u l i n k i n a s e ( B r e d t e t a l . , 1 9 9 2 ; r e v i e w e d b y D a w s o n a n d S y n d e r , 1 9 9 4 ) . E x t r i n s i c d e n e r v a t i o n m a y a f f e c t o n e o r m o r e o f t h e s e f a c t o r s , r e s u l t i n g i n a l t e r e d r e g u l a t i o n o f N O S a c t i v i t y . P a r a d o x i c a l d a t a f r o m t h e b i o c h e m i c a l a s s a y a n d f u n c t i o n a l a s s a y m a y a l s o o c c u r b y d i f f e r e n t r e g u l a t i o n o f N O S u n d e r i n v i t r a a n d i n s i t u c o n d i t i o n s . A c t i v i t y o f t y p e I N O S i s d e p e n d e n t o n C a 2 + r e l e a s e d f r o m r y a n o d i n e - s e n s i t i v e i n t r a c e l l u l a r s t o r e s ( P u b l i c o v e r e t a l . , 1 9 9 3 ) . I f e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n e l e v a t e s s e q u e s t e r e d C a ” , t h e n n e r v e s t i m u l a t i o n m a y c a u s e g r e a t e r i n c r e a s e s i n i n t r a c e l l u l a r C a 2 + , c u l m i n a t i n g i n e l e v a t e d N O p r o d u c t i o n a n d r e l e a s e , c o n s i s t e n t w i t h g r e a t e r n i t r i n e r g i c r e l a x a t i o n s . H o w e v e r , 3 5 4 h o m o g e n i z a t i o n o f t h e s e p r e p a r a t i o n s w o u l d r e l e a s e i n t r a c e l l u l a r C a 2 + s t o r e s , r e s u l t i n g i n g r e a t e r C a 2 + c o n c e n t r a t i o n s i n h o m o g e n a t e s f r o m d e n e r v a t e d t i s s u e s a s c o m p a r e d t o c o n t r o l s . A l t h o u g h l o w c o n c e n t r a t i o n s o f C a 2 + s t i m u l a t e N O S a c t i v i t y , e l e v a t e d C a 2 + i n h o m o g e n a t e s f r o m d e n e r v a t e d t i s s u e s w o u l d i n h i b i t N O S d i r e c t l y a n d s t i m u l a t e C a 2 + - d e p e n d e n t p h o s p h o r y l a t i o n o f N O S ( B r e d t e t a l . , 1 9 9 2 ) , r e s u l t i n g i n d e c r e a s e d N O S a c t i v i t y i n h o m o g e n a t e s f r o m d e n e r v a t e d t i s s u e s . A l t h o u g h 1 m M E G T A i n h i b i t e d [ ” C ] c i t r u l l i n e f o r m a t i o n i n n o r m a l a n d c o n t r o l p r e p a r a t i o n s , 3 0 % o f N O S a c t i v i t y w a s u n a f f e c t e d b y E G T A a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n . K o s t k a e t a l . ( 1 9 9 3 ) o b s e r v e d t h a t 4 0 % o f N O S a c t i v i t y w a s u n a f f e c t e d b y 0 . 1 m M E G T A i n s y n a p t o s o m e s p r e p a r e d f r o m c i r c u l a r m u s c l e a n d d e e p m u s c u l a r p l e x u s o f c a n i n e i l e u m . H o w e v e r , i t i s u n l i k e l y t h a t C a y - i n d e p e n d e n t N O S a c t i v i t y i n L M M P h o m o g e n a t e s a n d e n t e r i c s y n a p t o s o m e s i s m e d i a t e d b y t h e t y p e I I i s o f o r m o f N O S l o c a l i z e d i n m a c r o p h a g e s a n d l i v e r c e l l s ( r e v i e w e d i n M o n c a d a e t a l . , 1 9 9 1 ) . S a l t e r e t a l . ( 1 9 9 1 ) a l s o r e p o r t e d a C a 2 ’ - i n d e p e n d e n t N O S i n i l e a l h o m o g e n a t e s f r o m r a t t h a t w a s o n l y p a r t i a l l y i n h i b i t e d b y g l u c o c o r t i c o i d s , a k n o w n i n h i b i t o r o f t y p e I I N O S ( r e v i e w e d i n M o n c a d a e t a l . , 1 9 9 1 ) . F u r t h e r m o r e , t h e C a y - i n d e p e n d e n t f o r m o f N O S i s n o t i n h i b i t e d b y L - c a n a v a n i n e ( K o s t k a e t a l . , 1 9 9 3 ) , a s e l e c t i v e t y p e I I N O S a n t a g o n i s t ( M o n c a d a e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h e s e d a t a , a s w e l l a s t h a t p r e s e n t e d i n t h e p r e s e n t s t u d y m a y b e e v i d e n c e o f a n u n d e fi n e d i s o f o r m o f N O S , i n a d d i t i o n t o t y p e I N O S , i n L M M P h o m o g e n a t e s . 3 5 5 7 . E X T R I N S I C D E N E R V A T I O N I N C R E A S E S F O S P R O T E I N S C - 5 2 R e c o g n i z e s a N u c l e a r P r o t e i n i n E n t e r i c N e u r o n s f r o m S e g m e n t s o f I l e u m I n c u b a t e d i n K r e b s ’ S o l u t i o n T h r e e a n t i s e r u m w e r e t e s t e d t o d e t e r m i n e i f e n t e r i c n e u r o n s e x p r e s s F a s . F o s - i r w a s n o t c o n s t i t u t i v e l y e x p r e s s e d i n e n t e r i c n e u r o n s o f g u i n e a p i g i l e u m , a s i m m u n o r e a c t i v i t y w a s n o t o b s e r v e d i n p r e p a r a t i o n s t h a t w e r e p l a c e d i n Z a m b o n i ’ s fi x a t i v e o r 4 % p a r a f o r m a l d e h y d e i m m e d i a t e l y a f t e r d i s s e c t i o n . A s h i g h K + - e v o k e d d e p o l a r i z a t i o n c a n i n d u c e e x p r e s s i o n o f F 0 8 ( s e e i n t r o d u c t i o n ) , s e g m e n t s o f i l e u m w e r e i n c u b a t e d i n K r e b s ’ s o l u t i o n c o n t a i n i n g 5 0 m M K C l t o d e t e r m i n e i f t h e a b s e n c e o f F o s - i r r e s u l t e d f r o m t h e t r u e a b s e n c e o f F o s p r o t e i n , o r i f t h e a n t i b o d i e s r a i s e d a g a i n s t F a s w e r e u n a b l e t o b i n d t o F a s i n e n t e r i c n u c l e i . S C - 5 2 - i r w a s o b s e r v e d i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c g a n g l i a , b u t n o t i n a n y o t h e r s t r u c t u r e s , w h e r e a s A B - l o r O A - 1 1 - 8 2 3 d i d n o t r e c o g n i z e a n y a n t i g e n s . F u r t h e r m o r e , S C - 5 2 - i r w a s c o - l o c a l i z e d w i t h s t a i n i n g b y t h e n u c l e a r d y e b i s B e n z i m i d e [ 4 0 ] , i n d i c a t i n g t h a t S C - 5 2 r e c o g n i z e d a p r o t e i n f o u n d e x c l u s i v e l y i n n u c l e i o f g a n g l i o n i c c e l l s t h a t w a s c o n s i s t e n t w i t h F a s p r o t e i n . A l t h o u g h S C - 5 2 - i r r e c o g n i z e d a n u c l e a r p r o t e i n , i m m u n o r e a c t i v i t y w a s n o t o b s e r v e d w i t h a n t i b o d i e s A B - l o r O A - 1 1 - 8 2 3 . C o m p a r i s o n s b e t w e e n t h e t a r g e t a n t i g e n s i n d i c a t e d t h a t S C - 5 2 r e c o g n i z e d a 1 4 a m i n o - a c i d s e q u e n c e f o u n d a t t h e N - t e r m i n u s o f h u m a n c - F o s , w h e r e a s A B - l w a s r a i s e d a g a i n s t a h u m a n C - t e r m i n u s s e q u e n c e . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e h u m a n C - t e r m i n u s s e q u e n c e m a y n o t b e s h a r e d b y F o s i n g u i n e a p i g e n t e r i c n e u r o n s , t h u s p o t e n t i a l l y a c c o u n t i n g f o r t h e l a c k o f i m m u n o r e a c t i v i t y . H o w e v e r , t r a c i n g s t u d i e s i n t h e C N S h a v e a l s o e s t a b l i s h e d t h a t a n t i s e r u m r a i s e d a g a i n s t t h e N - t e r m i n u s o f F o s a r e m o r e s e l e c t i v e a g a i n s t F o s , a s c o m p a r e d t o p r o t e i n s r a i s e d 3 5 6 a g a i n s t t h e C - t e r m i n u s o f F a s ( s e e i n t r o d u c t i o n ) , s u g g e s t i n g F o s p r o t e i n i s s i m i l a r i n n e u r o n s f r o m t h e c e n t r a l a n d a u t o n o m i c n e r v o u s s y s t e m s . F u r t h e r m o r e , a l t h o u g h O A - l 1 - 8 2 3 w a s r a i s e d a g a i n s t r e s i d u e s 1 - 1 6 o f t h e N - t e r m i n u s o f s y n t h e t i c c - F o s a n d S C - 5 2 w a s r a i s e d a g a i n s t r e s i d u e s 3 - 1 6 , O A - 1 1 - 8 2 3 d i d n o t r e c o g n i z e e n t e r i c a n t i g e n s . T h i s d i s c r e p a n c y i n b i n d i n g s u g g e s t s t h a t r e s i d u e s 1 a n d 2 a r e c r u c i a l i n d e t e r m i n i n g b i n d i n g o f O A - 1 1 - 8 2 3 a n d t h e s e r e s i d u e s a r e n o t a v a i l a b l e i n g u i n e a p i g e n t e r i c F a s . A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , g a n g l i o n i c n u c l e i i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c g a n g l i a c o n t a i n e d F o s - i r a f t e r s e g m e n t s o f i l e u m w e r e i n c u b a t e d f o r 1 - 4 h r i n o x y g e n a t e d K r e b s ’ s o l u t i o n o r K r e b s ’ s o l u t i o n c o n t a i n i n g 5 0 m M K C l . P r e p a r a t i o n o f s e g m e n t s o f i l e u m r e s u l t s i n a x o t o m i e s o f e n t e r i c n e u r o n s p r o j e c t i n g i n a b o r a l a n d o r a l p a t h w a y s ( r e v i e w e d i n F u r n e s s a n d C o s t a , 1 9 8 7 ) , s u g g e s t i n g t r a n s e c t i o n o f e n t e r i c n e u r o n s m a y b e s u f fi c i e n t s t i m u l u s t o i n d u c e F o s . S i m i l a r r e s u l t s a r e s e e n i n o t h e r p e r i p h e r a l n e r v e s , a s t r a n s e c t i o n o f s c i a t i c n e r v e s i n c r e a s e s F o s - i r i n i p s i l a t e r a l n e u r o n s o f l u m b a r s p i n a l c o l u m n ( C h i e t a l , 1 9 9 1 ) b u t n o t n e u r o n s i n c o n t r a l a t e r a l l a m i n a e . H o w e v e r , a x o t o m i e s o f e n t e r i c n e r v e s a r e u n l i k e l y t o a c c o u n t f o r a l l o f t h e o b s e r v e d F o s - i r , a s m a n y e n t e r i c n e u r o n s p r o j e c t t o o t h e r n e u r o n s , m u c o s a , o r s m o o t h m u s c l e f o u n d w i t h i n t h e s e g m e n t a n d w o u l d n o t b e d i r e c t l y a f f e c t e d b y s e c t i o n i n g o f t h e i l e u m i n t o s e g m e n t s . A s e x t r i n s i c n e r v e s i n n e r v a t i n g s e g m e n t s o f i l e u m a r e t r a n s e c t e d d u r i n g d i s s e c t i o n , l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s m a y c a u s e e x p r e s s i o n o f F o s p r o t e i n i n e n t e r i c n e u r o n s . E x t r i n s i c D e n e r v a t i o n I n d u c e s c - F o s - i r i n E n t e r i c N e u r o n s T h e h y p o t h e s i s t h a t l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s i n c r e a s e s e x p r e s s i o n o f F o s p r o t e i n w a s t e s t e d b y e l i m i n a t i n g e x t r i n s i c n e r v e s t o l o o p s o f i l e u m i n v i v a . B y o n e w e e k a f t e r s u r g i c a l d e n e r v a t i o n , s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c g a n g l i o n i c n u c l e i c o n t a i n e d F o s - i r , 3 5 7 a l t h o u g h F o s - i r w a s n o t o b s e r v e d i n n u c l e i o f e x t r a g a n g l i o n i c c e l l s . T h e m a j o r i t y o f e n t e r i c n e u r o n a l n u c l e i e x p r e s s e d F a s , a s a p p r o x i m a t e l y 1 2 s u b m u c o s a l n e u r o n s / g a n g l i o n a n d 1 1 4 m y e n t e r i c n e u r o n s / g a n g l i o n c o n t a i n e d F o s - i r , c o n s i s t e n t w i t h p r e v i o u s r e p o r t s o f t h e t o t a l n u m b e r o f c e l l s / g a n g l i o n i n g u i n e a p i g i l e u m ( Y o u n g e t a l . , 1 9 9 3 a ) . F e w F o s - i r n u c l e i w e r e o b s e r v e d i n g a n g l i a f r o m s h a m - d e n e r v a t e d i l e u m , i n d i c a t i n g t h a t h a n d l i n g o f l o o p s o f i l e u m a n d s u r g i c a l p r o c e d u r e s d i d n o t a c c o u n t f o r t h e l a r g e i n c r e a s e i n F o s - i r o b s e r v e d a f t e r s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n . T h e s e d a t a s u g g e s t t h a t e x p r e s s i o n o f F o s - i r i n e n t e r i c n u c l e i m a y r e s u l t p a r t l y f r o m d i r e c t l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n o f i n d i v i d u a l n e u r o n s . A l t e r n a t i v e l y , a p p e a r a n c e o f F o s - i r m a y o c c u r a s l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s i n d u c e s a l t e r a t i o n s i n e n t e r i c n e u r o n s , w h i c h i n t u r n , s y n a p s e o n e n t e r i c n e u r o n s w h i c h d o n o t r e c e i v e d i r e c t e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n . L o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n c o u l d t h e n a l t e r n e u r o t r a n s m i s s i o n b y e n t e r i c n e r v e s , r e s u l t i n g i n F o s - i r i n n e u r o n s w i t h o u t d i r e c t e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n . K i r c h g e s s n e r e t a 1 . ( 1 9 9 2 ) o b s e r v e d F o s - i r w a s e x p r e s s e d i n s o m e e n t e r i c n e u r o n s a s a r e s u l t o f c h o l i n e r g i c s y n a p t i c t r a n s m i s s i o n , a s t h e n i c o t i n i c r e c e p t o r a n t a g o n i s t h e x a m e t h o n i u m p r e v e n t e d i n d u c t i o n o f F o s - i r i n r e s p o n s e t o s e n s o r y s t i m u l i . T h i s r e s u l t s u g g e s t s t h a t e n t e r i c n e u r o n s c a n i n d u c e F o s - i r i n o t h e r e n t e r i c n e u r o n s b y n o r m a l n e u r o t r a n s m i s s i o n . T h e r e f o r e , i t i s f e a s i b l e t h a t c h a n g e s i n e n t e r i c n e u r o n s p r e v i o u s l y i n n e r v a t e d b y e x t r i n s i c n e r v e s c a n i n fl u e n c e e n t e r i c n e u r o n s t h a t d o n o t r e c e i v e e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n , r e s u l t i n g i n e x p r e s s i o n o f F 0 5 . A s s u r g i c a l d e s t r u c t i o n o f e x t r i n s i c n e r v e s e l i m i n a t e d s y m p a t h e t i c a n d e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e s , w e l l - c h a r a c t e r i z e d n e u r o t o x i n s w e r e u s e d t o s e l e c t i v e l y d e s t r o y a s i n g l e p o p u l a t i o n o f e x t r i n s i c n e r v e s . S i m i l a r t o t h e r e s u l t s o f s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , s y s t e m i c c a p s a i c i n o r 6 - O H - D A t r e a t m e n t i n c r e a s e d F o s - i r i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c 3 5 8 n u c l e i , a s a g r e a t e r n u m b e r o f F o s - i r g a n g l i o n i c n u c l e i w a s o b s e r v e d i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c g a n g l i a a s c o m p a r e d t o c o n t r o l p r e p a r a t i o n s f r o m v e h i c l e - t r e a t e d i l e u m . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t l o s s o f e x t r i n s i c s e n s o r y o r s y m p a t h e t i c n e r v e s i s s u f f i c i e n t f o r i n d u c t i o n o f F a s p r o t e i n . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e r e s u l t s a l s o s u p p o r t t h e c o n c l u s i o n t h a t i n c r e a s e d F o s p r o t e i n r e s u l t s f r o m l o s s o f e x t r i n s i c n e r v e s , a n d d o e s n o t o c c u r i n r e s p o n s e t o s u r g i c a l p r o c e d u r e s u s e d t o d e s t r o y e x t r i n s i c n e r v e s . M o s t e n t e r i c n e u r o n s e x p r e s s e d F o s - i r a f t e r s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n o r a d m i n i s t r a t i o n o f c a p s a i c i n . A l t h o u g h a n e q u a l n u m b e r o f F o s - i r s u b m u c o s a l n u c l e i / g a n g l i o n w a s o b s e r v e d a f t e r 6 - O H - D A o r c a p s a i c i n a d m i n i s t r a t i o n , 6 - O H - D A w a s l e s s e f f e c t i v e a t i n d u c i n g F o s - i r i n m y e n t e r i c g a n g l i a a s c o m p a r e d t o i l e u m t a k e n f r o m c a p s a i c i n - t r e a t e d a n i m a l s . A n a v e r a g e o f 5 0 m y e n t e r i c n u c l e i / g a n g l i o n c o n t a i n e d F o s - i r a f t e r s y s t e m i c 6 - O H - D A t r e a t m e n t , w h e r e a s a n a v e r a g e o f 9 2 m y e n t e r i c n u c l e i / g a n g l i o n c o n t a i n e d F o s - i r a f t e r s y s t e m i c c a p s a i c i n a d m i n i s t r a t i o n . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t l o s s o f e x t r i n s i c s y m p a t h e t i c n e r v e s i n d u c e s F o s - i r i n m o s t s u b m u c o s a l g a n g l i o n i c n u c l e i , a n d m a n y m y e n t e r i c g a n g l i o n i c n u c l e i ; h o w e v e r , l o s s o f e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e s m a y i n d u c e F o s - i r i n a l l n u c l e i o f e n t e r i c n e u r o n s . T h e s e r e s u l t s a r e s u r p r i s i n g , a s r e l a t i v e l y f e w e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e s a r e o b s e r v e d i n s u b m u c o s a l o r m y e n t e r i c g a n g l i a ( s e e i n t r o d u c t i o n ) . H o w e v e r , s t i m u l a t i o n o f e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e s b y c a p s a i c i n h a s p r o f o u n d e f f e c t s o n d i g e s t i o n a n d p e r i s t a l s i s ( r e v i e w e d i n i n t r o d u c t i o n ) , i n d i c a t i n g s t i m u l a t i o n o f f e w e x t r i n s i c s e n s o r y n e r v e s h a s m a n y e f f e c t s o n f u n c t i o n . T h e r e f o r e , a l t h o u g h e x t r i n s i c n e r v e s d o n o t d i r e c t l y i n n e r v a t e a l l e n t e r i c n e u r o n s , l o s s o f a s i n g l e p o p u l a t i o n o f e x t r i n s i c n e r v e s m a y a l t e r n u c l e a r e v e n t s o f m a n y e n t e r i c n e u r o n s . 3 5 9 T i m e C o u r s e o f c - F o s E x p r e s s i o n I n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s , F o s - i r r e m a i n e d e l e v a t e d u p t o 2 4 w e e k s a f t e r s u r g i c a l e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n . H o w e v e r , t h e n u m b e r o f F o s - i r n u c l e i i n s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c p l e x u s p r e p a r a t i o n s d e c r e a s e d o v e r t i m e i n a t i m e c o u r s e s i m i l a r t o t h a t r e q u i r e d f o r r e t u r n o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t e x t r i n s i c n e r v e s m a y r e p r e s s e x p r e s s i o n o f F o s - i r , a n d e l i m i n a t i o n o f e x t r i n s i c n e r v e s p e r m i t s t r a n s l a t i o n o f f a s m R N A . A l t e r n a t i v e l y , d e g e n e r a t i n g e x t r i n s i c n e r v e s m a y r e l e a s e f a c t o r s t h a t i n c r e a s e e x p r e s s i o n o f F o s ( s e e i n t r o d u c t i o n ) . I r r e s p e c t i v e o f t h e m e c h a n i s m f o r i n d u c t i o n o f F o s - i r , t h e l e n g t h o f e x p r e s s i o n o f F o s - i r i n g a n g l i o n i c n u c l e i w a s s u r p r i s i n g , a s F o s e x p r e s s i o n i s r a p i d l y e x p r e s s e d i n m o s t s y s t e m s e x a m i n e d ( r e v i e w e d i n i n t r o d u c t i o n ) i n c l u d i n g t h e i n v i t r a m o d e l u s e d i n s o m e o f t h e s t u d i e s p r e s e n t e d i n t h i s p a p e r . F o r e x a m p l e , F o s - i r w a s d e t e c t e d i n s e g m e n t s o f i l e u m w i t h i n 1 h r o f i n c u b a t i n g i n o x y g e n a t e d K r e b s ’ s o l u t i o n . H o w e v e r , e x p r e s s i o n o f F o s i s a l s o t r a n s i e n t i n m a n y t i s s u e s , a l t h o u g h s o m e i m m e d i a t e e a r l y g e n e s ( I E G s ) c a n b e d e t e c t e d f o r o v e r t w e n t y w e e k s a f t e r t r a n s e c t i o n o f s c i a t i c n e r v e ( H e r d e g e n e t a l . , 1 9 9 2 ) . A s s o m e I E G S a r e e x p r e s s e d d u r i n g s c i a t i c n e r v e r e g e n e r a t i o n , a n d d e c r e a s e a f t e r s u c c e s s f u l r e g e n e r a t i o n , t h e s e d a t a m a y s u g g e s t t h a t I E G S a r e i m p o r t a n t i n i n i t i a t i n g a n d m a i n t a i n i n g r e g e n e r a t i v e p r o c e s s e s ( H e r d e g e n e t a l . , 1 9 9 2 ) . S i m i l a r l y , a s e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n h a s n o t r e t u r n e d 2 4 w e e k s a f t e r s u r g i c a l e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , s o m e e n t e r i c n e u r o n s m a y c o n t i n u e t o f o r m n e w c o n n e c t i o n s a n d e x p r e s s F o s . A t t h i s t i m e , h o w e v e r , i t i s u n k n o w n i f t h e s a m e p o p u l a t i o n o f e n t e r i c n e u r o n s e x p r e s s F o s - i r a t a l l t i m e s a f t e r l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n , o r i f s u b p o p u l a t i o n s o f e n t e r i c n e u r o n s o n l y t r a n s i e n t l y e x p r e s s F o s - i r a t c e r t a i n t i m e a f t e r d e n e r v a t i o n . 3 6 0 8 . P L A S T I C I T Y O F T H E E N S A l t h o u g h m a n y n e u r o n s o f t h e C N S a r e u n a b l e t o f o r m n e w s y n a p s e s f o l l o w i n g i n j u r y , a u t o n o m i c n e u r o n s c a n s u r v i v e a x o n a l d a m a g e . S t u d i e s b y p r e v i o u s i n v e s t i g a t o r s , a s w e l l a s t h i s d i s s e r t a t i o n , h a v e s h o w n t h a t e n t e r i c n e u r o n s h a v e a h i g h d e g r e e o f p l a s t i c i t y f o l l o w i n g t r a u m a s u c h a s s t e n o s i s , o b s t r u c t i o n , a n d l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n . S i m p l i s t i c a l l y , t h e d i g e s t i v e t r a c t i s t h e o l d e s t o r g a n i n m a m m a l s , w i t h e v o l u t i o n a d d i n g d i s c r e t e v i s c e r a , e x o s k e l e t o n , a n d l i m b s . T h e r e f o r e , s o m e o f t h e fi r s t n e u r o n s t o b e d e v e l o p e d d u r i n g e v o l u t i o n w e r e t h e a n c e s t o r s o f e n t e r i c n e u r o n s , a n d m a y b e r e l a t e d t o t r a n s i e n t l y c a t e c h o l a m i n e r g i c a d r e n o c h r o m a f fi n c e l l s . I n t h e p r e s e n c e o f t r o p h i c m o l e c u l e s , s y m p a t h e t i c , p a r a s y m p a t h e t i c , o r s e n s o r y n e u r o n s d e v e l o p f r o m t h e s e p r e c u r s o r c e l l s . H o w e v e r , i n t h e a b s e n c e o f e n v i r o n m e n t a l s i g n a l s , t r a n s i e n t l y c a t e c h o l a m i n e r g i c c e l l s d e v e l o p i n t o e n t e r i c n e u r o n s . A s a r e s u l t , e n t e r i c n e u r o n s m a y n o t u n d e r g o t h e l i n e a r m a t u r a t i o n p r o c e s s o f o t h e r n e u r o n s , a n d r e p r e s e n t t h e o l d e s t n e u r o n s i n v e r t e b r a t e s . A l t h o u g h m a t u r a t i o n a n d d e v e l o p m e n t o f n e u r o n s i s n o t w e l l - u n d e r s t o o d , s p e c i a l i z a t i o n s o f c e n t r a l a n d a u t o n o m i c n e r v e s m a y t h e n l i m i t t h e a b i l i t y o f t h e n e u r o n t o r e s p o n d t o t r a u m a t i c i n j u r y , o r t o r e g r o w a f t e r d a m a g e . H o w e v e r , e n t e r i c n e u r o n s h a v e n e v e r d i f f e r e n t i a t e d ; t h e r e f o r e , t h e y c a n e x h i b i t m o r e p l a s t i c i t y t h a n o t h e r n e u r o n s i n t h e c e n t r a l o r a u t o n o m i c n e r v o u s s y s t e m s . S u c h r a t i o n a l e m a y s o m e d a y a l l o w e n t e r i c n e u r o n s f r o m a d o n o r t o b e t r a n s p l a n t e d i n t o d a m a g e d s p i n a l c o r d o r b r a i n . I f c o r r e c t h o r m o n e s a n d g r o w t h f a c t o r s a r e a p p l i e d , e n t e r i c n e u r o n s m a y b e i n d u c e d t o f o r m n e w c o n n e c t i o n s a n d f u n c t i o n a s c e n t r a l , p a r a s y m p a t h e t i c , o r s y m p a t h e t i c n e u r o n s . H o w e v e r , s u c h s t u d i e s w o u l d r e q u i r e a b e t t e r u n d e r s t a n d i n g o f d e v e l o p m e n t o f t h e n e r v o u s s y s t e m , i n c l u d i n g a c a t e g o r i z a t i o n o f a l t e r a t i o n s o f e n t e r i c n e u r o n s f o l l o w i n g l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n . 3 6 1 G r o w t h A s s o c i a t e d P r o t e i n 4 3 i s F o u n d i n E n t e r i c N e r v e s G r o w t h a s s o c i a t e d p r o t e i n 4 3 ( G A P 4 3 ) ( P r o t e i n B 5 0 ) i s a m e m b r a n e b o u n d p h o s p h o p r o t e i n i d e n t i c a l t o a p h o s p h o p r o t e i n f o u n d i n g r o w t h c o n e m e m b r a n e s d u r i n g e m b r y o g e n e s i s ( p h o s p h o p r o t e i n 4 6 ) , i n p e r i p h e r a l n e u r o n s u n d e r g o i n g r e g e n e r a t i o n ( B e n o w i t z a n d R o u t t e n b e r g , 1 9 8 7 ) , a n d i n b r a i n r e g i o n s a s s o c i a t e d w i t h s y n a p t i c p l a s t i c i t y a n d s y n a p t o g e n e s i s ( V e r h a a g e n e t a l . , 1 9 8 9 ) . A l t h o u g h m o s t a d u l t n e r v e s d o n o t c o n t a i n G A P 4 3 , t h e E N S o f r a t s , f e r r e t s , a n d h u m a n s c o n t a i n G A P 4 3 - i r i n n e r v e fi b e r s o f t h e s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c p l e x u s e s , a s w e l l a s i n n e u r o n s o f t h e m y e n t e r i c p l e x u s ( S h a r k e y e t a l . , 1 9 9 0 ) . T h i s o b s e r v a t i o n s u g g e s t s t h a t t h e E N S m a y h a v e a g r e a t e r d e g r e e o f p l a s t i c i t y t h a n o t h e r n e r v o u s s y s t e m s . I n t e r m e d i a t e F i l a m e n t P r o t e i n s A r e F o u n d i n E n t e r i c N e r v e s A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n s b e l o n g t o a l a r g e r f a m i l y o f p r o t e i n s k n o w n a s i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s t h a t a c t a s s t r u c t u r a l p r o t e i n s a n d f o r m 1 0 n m fi l a m e n t s i n v i v a a n d i n v i t r a . A n t i s e r u m r a i s e d a g a i n s t a - i n t e r n e x i n , a n i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n , h a s r e v e a l e d t h a t t h i s 6 6 k D a p r o t e i n i s e x p r e s s e d a t i t s h i g h e s t l e v e l s i n d e v e l o p i n g n e u r o n s i n t h e C N S . I t i s h y p o t h e s i z e d t h a t a - i n t e r n e x i n p r o v i d e s a s c a f f o l d f o r n e u r o n a l i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t n e t w o r k i n e a r l y d e v e l o p m e n t . E v e n t u a l l y , o r - i n t e r n e x i n i s r e p l a c e d d u r i n g d e v e l o p m e n t b y n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n s i n m a n y n e u r o n s . H o w e v e r , s u b m u c o s a l a n d m y e n t e r i c n e u r o n s f r o m a d u l t a n i m a l s c o n t a i n a - i n t e m e x i n , s u g g e s t i n g t h e p r o t e i n h a s s o m e f u n c t i o n t h a t i s n o t r e q u i r e d i n o t h e r m a t u r e n e u r o n s . 3 6 2 U b i q u i t i n i s F o u n d i n E n t e r i c N e r v e s A p p r o x i m a t e l y 8 0 % o f m y e n t e r i c n e u r o n s c o n t a i n a c y t o s o l i c p r o t e i n t e r m e d p r o t e i n g e n e p r o d u c t ( P G P ) 9 . 5 ( B a k e r e t a l . , 1 9 9 4 ) . A l t h o u g h t h e f u n c t i o n o f P G P 9 . 5 w a s n o t k n o w n , r e c e n t s e q u e n c e h o m o l o g y c o m p a r i s o n s r e v e a l t h a t u b i q u i t i n a n d P G P 9 . 5 s h a r e s i g n i fi c a n t s e q u e n c e h o m o l o g y ( E a k e r , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n s ) . U b i q u i t i n i s a 7 6 a m i n o a c i d p o l y p e p t i d e t h o u g h t t o b e i n v o l v e d i n e s s e n t i a l c y t o p l a s m i c , n o n - l y s o s o m a l d e g r a d a t i o n o f n a t u r a l l y s h o r t - l i v e d o r d a m a g e d p r o t e i n s ( J e n t s c h e t a l . , 1 9 9 0 ) , a n d e x t r e m e l y h i g h l e v e l s a r e f o u n d i n e n t e r i c , b u t n o t c e n t r a l n e r v e s . I n t e r e s t i n g l y , t h e m o s t r e s p o n s i v e n e r v e s i n t h e p e r i p h e r y t o r e g e n e r a t i o n c o n t a i n h i g h a m o u n t s o f u b i q u i t i n . I n t h e l a t e 1 9 6 0 8 a n d 1 9 7 0 s m u l t i p l e r e s e a r c h e r s r e p o r t e d t h e p r e s e n c e o f R N A i n a x o n s o f s q u i d a n d v e r t e b r a t e s , a l t h o u g h r i b o s o m e s w e r e r a r e l y o b s e r v e d ( r e v i e w e d i n C h a k r a b o r t y a n d I n g o g k u a , 1 9 9 3 ) . U n l i k e s o m a t a , w h i c h c o n t a i n 8 5 % r i b o s o m a l R N A , 1 0 - 1 5 % t r a n s f e r R N A , a n d 0 - 5 % m e s s e n g e r R N A , t h e p r o p o r t i o n o f R N A i n a x o n s w a s 8 0 - 9 0 % t r a n s f e r R N A ( L e s e k e t a l . , 1 9 7 3 ; B l a c k a n d L e s e k , 1 9 7 7 ) . B i o c h e m i c a l s t u d i e s u s i n g E d m a n d e g r a d a t i o n r e a c t i o n s f o u n d t h a t p r o t e i n s w i t h N - t e r m i n a l a c i d i c a m i n o a c i d s e q u e n c e s u n d e r w e n t t R N A - d e p e n d e n t p o s t - t r a n s l a t i o n a l m o d i fi c a t i o n s b y a d d i t i o n o f a r g i n i n e ( r e v i e w e d i n C h a k r a b o r t y a n d I n g o g k u a , 1 9 9 3 ) . A r g i n y l a t i o n i s n e c e s s a r y f o r d e g r a d a t i o n o f p r o t e i n b y u b i q u i t i n , a s a d d i t i o n o f a r g i n i n e a l l o w s b i n d i n g o f u b i q u i t i n t o i n t e r n a l l y s i n e r e s i d u e s , w h i l e s i m u l t a n e o u s l y w e a k e n i n g t h e s t r u c t u r e o f t h e p r o t e i n t o b e d e g r a d e d ( C h a k r a b o r t y a n d I n g o g k u a , 1 9 9 3 ) . I n t e r e s t i n g l y , a l t h o u g h p e r i p h e r a l n e r v e s a r g i n y l a t e a n d u b i q u i t i n a t e c e l l u l a r p r o t e i n s w i t h i n 1 2 h a f t e r l e s i o n , n e r v e s i n t h e c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m d o n o t r e s p o n d f o r 3 - 5 d a y s ( S c h y n e - A t h w a l e t a l . , 1 9 8 8 ) . D i f f e r e n c e s i n c o n c e n t r a t i o n s o f u b i q u i t i n a n d t R N A , a n d t i m e o f a c t i v a t i o n o f t h e s e p r o t e i n s m a y t h e n 3 6 3 a c c o u n t f o r s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e s i n t h e r a t e a n d a b i l i t y t o d e g r a d e u n n e c e s s a r y p r o t e i n s , u l t i m a t e l y r e s u l t i n g i n r e g e n e r a t i o n i n p e r i p h e r a l n e r v e s , a n d a x o n a l d e a t h i n t h e C N S . T h e r e f o r e , e n t e r i c n e u r o n s m a y s e n d a x o n a l s p r o u t s , f o r m n e w c o n n e c t i o n s , a n d c h a n g e n e u r o n a l p h e n o t y p e a f t e r e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n b e c a u s e t h e y a r e m o r e p l a s t i c t h a n o t h e r c e n t r a l 0 1 ' a u t o n o m i c 1 1 6 1 ' V C S . 9 . S I G N I F I C A N C E T h e s e s t u d i e s a r e s i g n i fi c a n t i n t h r e e a r e a s . G a s t r o i n t e s t i n a l d i s e a s e s s u c h a s C r o h n ’ s d i s e a s e a n d u l c e r a t i v e c o l i t i s f r e q u e n t l y a r e t r e a t e d b y s u r g i c a l r e m o v a l o f n o r m a l a n d i n fl a m e d s e g m e n t s o f i n t e s t i n e , r e s u l t i n g i n a c o n d i t i o n r e f e r r e d t o a s s h o r t b o w e l s y n d r o m e ( S B S ) . C u r r e n t l y , i n t e s t i n a l t r a n s p l a n t a t i o n i s c o n s i d e r e d f o r t r e a t m e n t o f S B S , b u t l i t t l e i s k n o w n a b o u t e n t e r i c a d a p t a t i o n s t h a t a l l o w t h e t r a n s p l a n t e d s e g m e n t t o f u n c t i o n n o r m a l l y i n t h e a b s e n c e o f e x t r i n s i c n e r v e s . I n t e r e s t i n g l y , i n c r e a s e d N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g i s o b s e r v e d i n t r a n s v e r s e s e c t i o n s o f j e j e n u r n t r a n s p l a n t e d i n t o r e c e i p i e n t o r d o n o r a n i m a l s ( S t a d e l m a n n e t a l . , 1 9 9 4 ; H e e c k t e t a l . , 1 9 9 4 ) . A l t h o u g h m a r k e d i s c h e m i c i s a s s o c i a t e d w i t h t r a n s p l a n t a t i o n s , t h i s o b s e r v e d i n c r e a s e i n d i a p h o r a s e s t a i n i n g m a y r e s u l t f r o m s i m i l a r m e c h a n i s m s s u c h a s t h o s e s t u d i e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n . I f t h e h y p o t h e s i s i s c o r r e c t , t h e n a l t e r e d t r a n s i t a n d m o t i l i t y ( N a k a d a e t a l . , 1 9 9 4 ) r e s u l t s f r o m d e n e r v a t i o n - i n d u c e d p o t e n t i a t i o n o f n i t r i n e r g i c r e l a x a t i o n s , a n d a t t e n u a t i o n o f r e b o u n d c o n t r a c t i o n s . S e c o n d , a l t h o u g h t h e a n a t o m i c a l , n e u r o c h e m i c a l , a n d b a s i c e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f e n t e r i c n e u r o n s i n n o r m a l g u t h a v e b e e n d o c u m e n t e d , t h e r e s p o n s e s o f i n d i v i d u a l n e u r o n s t o e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n h a v e n o t b e e n e x a m i n e d . T h e s t u d y p r o v i d e d s o m e o f t h e fi r s t d a t a t o d e s c r i b e d a l t e r a t i o n s i n s u b p o p u l a t i o n s o f e n t e r i c n e u r o n s f o l l o w i n g l o s s o f e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n , a s w e l l a s B I B L I O G R A P H Y 3 6 4 p r o v i d i n g s o m e o f t h e fi r s t s t u d i e s t o a d d r e s s m e c h a n i s m s r e s p o n s i b l e f o r a l t e r a t i o n s i n e n t e r i c n e r v e s . F i n a l l y , a l t h o u g h t h o u s a n d s o f p a t i e n t s s u f f e r f r o m d i s o r d e r s o f G I m o t i l i t y , l i t t l e i s k n o w n a b o u t t h e e t i o l o g y o f s u c h d i s e a s e s a s i r r i t a b l e b o w e l s y n d r o m e . T h e s e d i s e a s e s m a y a c t u a l l y b e n e u r o l o g i c a l p r o b l e m s t h a t c a n b e a t t r i b u t e d t o d e f e c t s i n t r a n s m i s s i o n b e t w e e n t h e E N S a n d e x t r i n s i c n e r v e s , o r i n a l t e r a t i o n s i n n e u r o t r a n s m i t t e r c o n t e n t o f e n t e r i c n e u r o n s . I n H i r s c h s p r u n g ’ s d i s e a s e , d i a b e t e s , a n d c o l i t i s , a l t e r a t i o n s i n e n t e r i c n e u r o n s i n c l u d e i n t e n s e N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g i n m y e n t e r i c n e u r o n s , p o s s i b l y r e s u l t i n g f r o m d e c r e a s e d e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n ( E l i a k i m e t a l . , 1 9 9 4 ; R a t c l i f f e e t a l . , 1 9 9 4 ) . T h e r e f o r e , t h i s d i s s e r t a t i o n p r o v i d e s s o m e o f t h e fi r s t e v i d e n c e o f s p e c i fi c e n t e r i c a d a p t a t i o n s f o l l o w i n g e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n , h o p e f u l l y l e a d i n g t o a b e t t e r u n d e r s t a n d i n g o f G I n e u r o l o g y , a s w e l l a s p r o v i d i n g a u s e f u l m o d e l i n t h e s t u d y o f r e g u l a t i o n o f n e u r o n a l p h e n o t y p e . B I B L I O G R A P H Y A g o s t o n i E . J . , C h i n n o c k M . , D e B u r g h D . , a n d M u r r a y J G . ( 1 9 5 7 ) F u n c t i o n a l a n d h i s t o l o g i c a l s t u d i e s o f t h e v a g u s n e r v e a n d i t s b r a n c h e s t o t h e h e a r t , l u n g s , a n d a b d o m i n a l v i s c e r a i n t h e c a t . J . P h y s i o ] . ( L a n d ) 1 3 5 : 1 8 2 - 2 0 5 . A h l m a n B . H . , L u n d b e r g J . M . , a n d D a h l s t r i i m A . ( 1 9 7 8 ) E v i d e n c e f o r i n n e r v a t i o n o f t h e s m a l l i n t e s t i n e f r o m t h e c e r v i c a l s y m p a t h e t i c g a n g l i a . J . S u r g . R e s . 2 4 : 1 4 2 - 1 4 9 . A i m i Y . , K i m u r a H . , K i n o s h i t a T . , M i n a r n i Y . , F u j i m u r a M . , a n d V i n c e n t S R . ( 1 9 9 3 ) H i s t o c h e m i c a l l o c a l i z a t i o n o f n i t r i c o x i d e s y n t h a s e i n r a t e n t e r i c n e r v o u s s y s t e m . N e u r o s c i e n c e . 5 3 : 5 5 3 - 5 6 0 . A l d s k o g i u s H . , E l v i n L . - G . , a n d F o r s m a n C . ( 1 9 8 6 ) P r i m a r y s e n s o r y a f f e r e n t s i n t h e i n f e r i o r m e s e n t e r i c g a n g l i o n a n d r e l a t e d n e r v e s o f t h e g u i n e a p i g . A n e x p e r i m e n t a l s t u d y w i t h a n t e r o g r a d e l y t r a n s p o r t e d w h e a t g e r m a g g l u t i n i n - h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e c o n j u g a t e . J . A u t o . N e r v . S y s . 1 5 : 1 7 9 - 1 9 0 . A l v a r e z J . , M o r e n o R . D . , L l a n o s O . , I n e s t r o s a N . C . , B r a n d a n E . , C o l b y T . , a n d E s c h R S . ( 1 9 9 2 ) A x o n a l s p r o u t i n g i n d u c e d i n t h e s c i a t i c n e r v e b y t h e a m y l o i d p r e c u r s o r p r o t e i n ( A P P ) a n d o t h e r a n t i p r o t e a s e s . N e u r o s c i . L e t t . 1 4 4 : 1 3 0 - 1 3 4 . A l v a r e z W C . ( 1 9 4 8 ) A n I n t r o d u c t i o n t o G a s t r a e n t e r a l a g y . 4 t h e d i t i o n . H e i n e m a n n , L o n d o n . A l v a r e z W . C . , H o s o i K . , O v e r g a r d A . , a n d A s c a n i o H . ( 1 9 2 9 ) T h e e f f e c t s o f d e g e n e r a t i v e s e c t i o n o f t h e v a g i a n d t h e s p l a n c h n i c o n t h e d i g e s t i v e t r a c t . A m . J . P h y s i o l . 9 0 : 6 3 1 - 6 5 5 . A m b a c h e N . a n d F r e e m a n M A . ( 1 9 6 8 ) A t r o p i n e - r e s i s t a n t l o n g i t u d i n a l m u s c l e s p a s m s d u e t o e x c i t a t i o n o f n o n - c h o l i n e r g i c n e u r o n s i n A u e r b a c h ’ s p l e x u s . J . P h y s i o ] . ( L a n d ) 1 9 9 : 7 0 5 - 7 2 7 . A n d r i a n t s i t o h a i n a R . a n d S u r p r e n a n t A . ( 1 9 9 2 ) A c e t y l c h o l i n e r e l e a s e d f r o m g u i n e a - p i g s u b m u c o s a l n e u r o n e s d i l a t e s a r t e r i o l e s b y r e l e a s i n g n i t r i c o x i d e f r o m e n d o t h e l i u m . J . P h y s i o l . ( L a n d ) 4 5 3 : 4 9 3 - 5 0 2 . A o k i E . , S e m b a R . , M i k o s h i b a K . , a n d K a s h i w a r n a t a S . ( 1 9 9 1 a ) P r e d o m i n a n t l o c a l i z a t i o n i n g l i a l c e l l s o f f r e e L - a r g i n i n e . I m m u n o c y t o c h e m i c a l e v i d e n c e . B r a i n R e s . 5 4 7 : 1 9 0 - 1 9 2 . 3 6 5 3 6 6 A o k i E . , S e m b a R . , a n d K a s h i w a m a t a S . ( 1 9 9 1 b ) E v i d e n c e f o r t h e p r e s e n c e o f L - a r g i n i n e i n t h e g l i a l c o m p o n e n t s o f t h e p e r i p h e r a l n e r v o u s s y s t e m . B r a i n R e s . 5 5 9 : 1 5 9 - 1 6 2 . A o k i E . , T a k e u c h i I . K . , S h o j i R . , a n d S e m b a R . ( 1 9 9 3 ) L o c a l i z a t i o n o f n i t r i c o x i d e - r e l a t e d s u b s t a n c e s i n t h e p e r i p h e r a l n e r v o u s s y s t e m . B r a i n R e s . 6 2 0 : 1 4 2 - 1 4 5 . A r o n i n N . , S a g a r S . M . , S h a r p R R , a n d S c h w a r t z W . J . ( 1 9 9 0 ) L i g h t r e g u l a t e s e x p r e s s i o n o f a F o s - r e l a t e d p r o t e i n i n r a t s u p r a c h i a s m a t i c n u c l e i . P r a c . N a t ] . A c a d S c i . 8 7 2 5 9 5 9 - 5 9 6 2 . A u b e r b a c h L . ( 1 8 6 2 ) U e b e r e i n e n P l e x u s g a n g l i o s u s m y o g a s t r i c u s . U e b e r e i n e n P l e x u s g a n g l i o s u s m y o g a s t r i c u s . 3 9 e r J a h r - B e r i c h t u . A b h . d S c h l e s i s c h e n G e s e l l s f v a t e r l a n d C u l t : 1 0 3 - 1 0 4 . A u e r b a c h L . ( 1 8 6 4 ) F e m e r e v o r l a u fi g e M i t t e i l u n g u b e r d e n N e r v a n a p p a r a t d e s D a r m e s . A r c h . P a t h o l . A n a t . P h y s i o ] . 3 0 : 4 5 7 - 4 6 0 . A z p i r o z F . a n d M a l a g e l a d a J . R . ( 1 9 8 6 ) V a g a l l y m e d i a t e d g a s t r i c r e l a x a t i o n i n d u c e d b y i n t e s t i n a l n u t r i e n t s i n t h e d o g . A m . J . P h y s i o ] . 2 1 5 : G 7 2 7 . B a r t e l D . P . , S h e n g M . , L a u L R , a n d B r e e n b e r g M E . ( 1 9 8 9 ) G r t h f a c t o r s a n d m e m b r a n e d e p o l a r i z a t i o n a c t i v a t e d i s t i n c t p r o g r a m s o f e a r l y r e s p o n s e g e n e e x p r e s s i o n : d i s s o c i a t i o n o f f o s a n d j u n e x p r e s s i o n . G e n e s a n d D e v e l o p m e n t . 3 : 3 0 4 - 3 1 3 . B a r t h o L . , H o l z e r P . , a n d L e m b e c k F . ( 1 9 8 3 ) S y m p a t h e t i c c o n t r o l o f s u b s t a n c e P r e l e a s i n g e n t e r i c n e u r o n s i n t h e g u i n e a p i g i l e u m . N e u r o s c i . L e t t . 3 8 : 2 9 1 - 2 9 6 . B a r t h o L . , H o l z e r P . , L e m b e c k F . , a n d S z o l c s a n y i J . ( 1 9 8 2 ) E v i d e n c e t h a t t h e c o n t r a c t i l e r e s p o n s e o f t h e g u i n e a - p i g i l e u m t o c a p s a i c i n i s d u e t o r e l e a s e o f s u b s t a n c e P . J . P h y s i o ] . ( L a n d ) 3 3 2 : 1 5 7 - 1 6 7 . B a r t h o L . a n d S z o l c s a n y i J . ( 1 9 7 8 ) T h e s i t e o f a c t i o n o f c a p s a i c i n o n t h e g u i n e a - p i g i s o l a t e d i l e u m . N a u n . S c h m i e d A r c h . P h a r m a c o l . 3 0 5 : 7 5 - 8 1 . B a r o n S . A . , J a f f e B . M . , a n d G i n t z l e r A R . ( 1 9 8 3 ) R e l e a s e o f s u b s t a n c e P f r o m t h e e n t e r i c n e r v o u s s y s t e m : d i r e c t q u a n t i t a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n . J . P h a r m . a n d E x p . T h e r . 2 2 7 : 3 6 5 - 3 6 8 . B a y l i s s W . M . a n d S t a r l i n g E H . ( 1 8 9 9 ) T h e m o v e m e n t s a n d i n n e r v a t i o n o f t h e s m a l l i n t e s t i n e . J . P h y s i o ] . ( L a n d ) 2 4 : 1 0 0 - 1 4 3 . B a y l i s s W . M . a n d S t a r l i n g E . H . ( 1 9 0 0 a ) T h e m o v e m e n t s a n d t h e i n n e r v a t i o n o f t h e l a r g e i n t e s t i n e . J . P h y s i o l . ( L a n d ) 2 6 : 1 0 7 - 1 0 8 . B a y l i s s W . M . a n d S t a r l i n g E . H . ( 1 9 0 0 b ) T h e m o v e m e n t s a n d i n n e r v a t i o n o f t h e s m a l l i n t e s t i n e . J . P h y s i o ] . ( L a n d ) 2 6 : 1 2 5 - 1 3 8 . 3 6 7 B a y l i s s W . M . a n d S t a r l i n g E H . ( 1 9 0 1 ) B e l a i A . , S c h m i d t , H . H . H . W . , H o y l e C . H . V , H a s s a l l C . J . S , S a f f r e y M . J . , M o s s J . , F o r s t e r m a n n J . , M u r a d , F . , a n d B u r n s t o c k G . ( 1 9 9 2 ) C o - l o c a l i z a t i o n o f n i t r i c o x i d e s y n t h a s e a n d N A D P H - d i a p h o r a s e i n t h e m y e n t e r i c p l e x u s o f t h e r a t g u t . N e u r o s c i . L e t t . 1 4 3 : 6 0 - 6 4 . B e n n e t t M R . a n d B u r n s t o c k G . ( 1 9 6 8 ) E l e c t r o p h y s i o l o g y o f t h e i n n e r v a t i o n o f i n t e s t i n a l s m o o t h m u s c l e . I n : C o d e C . F . ( e d . ) A l i m e n t a r y C a n a l . A m e r i c a n P h y s i o l o g i c a l S o c i e t y , W a s h i n g t o n , D C ( H a n d b o o k o f P h y s i o l o g y ) , v o l . 6 , s e c t . 6 , p p . 1 7 0 9 - 1 7 3 2 . B e n o w i t z L I . a n d R o u t t e n b e r g A . ( 1 9 8 7 ) A m e m b r a n e p h o s p h o p r o t e i n a s s o c i a t e d w i t h n e u r a l d e v e l o p m e n t , a x o n a l r e g e n e r a t i o n , p h o s p h o l i p i d m e t a b o l i s m a n d s y n a p t i c p l a s t i c i t y . T r e n d s N e u r o s c i e n c e . 1 0 : 5 2 7 - 5 3 2 . B e r t h o u d H . R . , J e d r e z e j e w s k a A . , a n d P o w l e y T . L . ( 1 9 9 0 ) S i m u l t a n e o u s l a b e l l i n g o f v a g a l i n n e r v a t i o n o f t h e g u t a n d a f f e r e n t p r o j e c t i o n s f r o m t h e v i s c e r a l f o r e b r a i n w i t h d i I i n j e c t e d i n t o t h e d o r s a l v a g a l c o m p l e x i n t h e r a t . J . C o m p . N e u r a . 3 0 1 : 6 5 - 7 9 . B e r t h o u d H R . a n d P o w l e y T R . ( 1 9 9 3 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f v a g a l i n n e r v a t i o n t o t h e r a t c e l i a c , s u p r a r e n a l a n d m e s e n t e r i c g a n g l i a . J . A u t o . N e r v . S y s . 4 2 : 1 5 3 - 1 7 0 . B i b e r B . , L u n d g r e n O . , a n d S v a n v i k J . ( 1 9 7 1 ) S t u d i e s o n t h e i n t e s t i n a l v a s o d i l a t i o n o b s e r v e d a f t e r m e c h a n i c a l s t i m u l a t i o n o f t h e m u c o s a o f t h e g u t . A c t a P h y s i o ] . S c a n d 8 2 : 1 7 7 - 1 9 0 . B i b e r B . , F a r a J . , a n d L u n d g r e n O . ( 1 9 7 3 ) I n t e s t i n a l v a s o d i l a t i o n i n r e s p o n s e t o t r a n s m u r a l e l e c t r i c a l fi e l d s t i m u l a t i o n . A c t a P h y s i o l . S c a n d 8 7 : 2 7 7 - 2 8 2 . B i l l r o t h T . ( 1 8 5 8 ) E i n i g e B e o b a c h t u n g e n fi b e r d a s a u s g e d e h n t e V o r k o m m e n v o n N e r v e n a n a s t o m e s e n i m T r a c t u s i n t e s t i n a l i s . A r c h . P h y s i o l . S c a n d 5 1 5 : 1 1 - 1 6 . B i r b e r L . A . , R o p p o l o J . R . , I a d a r o l a J . J . , a n d d e G r o a t W C . ( 1 9 9 1 ) E l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n o f v i s c e r a l a f f e r e n t p a t h w a y s i n t h e p e l v i c n e r v e i n c r e a s e s c - f a s i n t h e r a t l u m b o s a c r a l s p i n a l c o r d . N e u r o s c i . L e t t . 1 2 9 : 1 9 3 - 1 9 6 . B j o r k l u n d A . , L u n d v a l l O . , a n d S v a n s s o n L A . ( 1 9 7 2 ) M e c h a n i s m s o f fl u o r o p h o r e f o r m a t i o n b y t h e h i s t o c h e m i c a l g l y o x y l i c a c i d m e t h o d f o r m o n o a m i n e s . H i s t a c h e m i e . 2 2 : 1 1 3 - 1 3 1 . B j o r k l u n d H . , D a h l D . , a n d S e i g e r A . ( 1 9 8 4 ) N e u r o fi l a m e n t a n d g l i a l fi b r i l l a r y a c i d p r o t e i n - r e l a t e d i m m u n o r e a c t i v i t y i n r o d e n t e n t e r i c n e r v o u s s y s t e m . N e u r o s c i e n c e . 1 2 : 2 7 7 - 2 8 7 . B j é i r k l u n d H . , H o k f e l t T . , G o l d s t e i n M . , T e r e n i u s L . , a n d O l s o n L . ( 1 9 8 5 ) A p p e a r a n c e o f t h e n o r a d r e n e r g i c m a r k e r s t y r o s i n e h y d r o x y l a s e a n d n e u r o p e p t i d e Y i n c h o l i n e r g i c 3 6 8 n e r v e s o f t h e i r i s f o l l o w i n g s y m p a t h e c t o m y . J . N e u r o s c i e n c e . 5 : 1 6 3 3 - 1 6 4 3 . B j o r k r o t h U . ( 1 9 8 3 ) I n h i b i t i o n o f s m o o t h m u s c l e c o n t r a c t i o n s i n d u c e d b y c a p s a i c i n a n d e l e c t r i c a l t r a n s m u r a l s t i m u l a t i o n b y a s u b s t a n c e P a n t a g o n i s t . A c t a P h y s i o ] . S c a n d S u p p l . 5 1 5 : 1 1 - 1 6 . B l a c k 1 . 8 . , A d l e r J . E . , a n d L a G a m m a E R ( 1 9 8 6 ) I m p u l s e a c t i v i t y d i f f e r e n t i a l l y r e g u l a t e s c o - l o c a l i z e d t r a n s m i t t e r s b y a l t e r i n g m e s s e n g e r R N A l e v e l s . I n : P r o g r e s s i n B r a i n R e s e a r c h , V o l . 8 6 . ( e d s . ) T . H o k f e l t , K . F u x e , a n d B . P e m o w ( E l s e v i e r P u b l i s h e r s , A m s t e r d a m ) p p . 1 2 1 - 1 2 7 . B l a c k M . a n d L a s e k R . J . ( 1 9 7 7 ) T h e p r e s e n c e o f t r a n s f e r R N A i n t h e a x o p l a s m o f t h e s q u i d g i a n t a x o n s . J . N e u r a b i a . 8 2 2 2 9 - 2 3 7 . B l o t t n e r D . , W e s t e r r n a n n R . , G r o t h e C . , B o h l e n P . , a n d U n s i c k e r K . ( 1 9 8 9 ) C i l i a r y n e u r o t r o p h i c f a c t o r s u p p o r t s t a r g e t - d e p r i v e d p r e g a n g l i o n i c s y m p a t h e t i c s p i n a l c o r d n e u r o n s . N e u r o s c i . L e t t . 1 0 5 : 3 1 6 - 3 2 0 . B o e c k x s t a n e s G . E . , P e l c k m a n s P . A . , B u l t H . , D e M a n , J . G . , H e r m a n A . G . , a n d V a n M a e r c k e Y . M . ( 1 9 9 0 ) N o n - a d r e n e r g i c n o n - c h o l i n e r g i c r e l a x a t i o n m e d i a t e d b y n i t r i c o x i d e i n t h e c a n i n e i l e o c o l o n i c j u n c t i o n . E u r . J . P h a r m a c o l . 1 9 0 : 2 3 9 - 2 4 6 . B o m s t e i n J . C . , F u r n e s s J . B . , a n d C o s t a M . ( 1 9 8 7 ) S o u r c e s o f e x c i t a t o r y s y n a p t i c i n p u t s t o n e u r o c h e m i c a l l y i d e n t i fi e d s u b m u c o u s n e u r o n s o f g u i n e a - p i g s m a l l i n t e s t i n e . J . A u t o . N e r v . S y s . 1 8 : 8 3 - 9 1 . B r a d f o r d M . M . ( 1 9 7 6 ) A r a p i d a n d s e n s i t i v e m e t h o d f o r t h e q u a n t i fi c a t i o n o f p r o t e i n u t i l i z i n g t h e p r i n c i p l e o f p r o t e i n - d y e b i n d i n g . A n a l . B i o c h e m . 7 2 : 2 4 8 - 2 5 4 . B r e d t D . S . , F e r r i s O D , a n d S y n d e r S . H . ( 1 9 9 1 3 ) N i t r i c o x i d e s y n t h a s e r e g u l a t o r y s i t e s . J . B i o l . C h e m . 2 6 7 : 1 0 9 7 6 - 1 0 9 8 1 . B r e d t D . S . , F o t u h i M . , H w a n g P . M . , a n d S n y d e r S . H . ( 1 9 9 1 b ) N i t r i c o x i d e s y n t h a s e a n d n e u r o n a l N A D P H d i a p h o r a s e a r e i d e n t i c a l i n b r a i n a n d p e r i p h e r a l t i s s u e s . P r a c . N a t ] . A c a d S c i . 8 8 : 7 7 9 7 - 7 8 0 1 . B r e d t D . S . , H w a n g P . M . , G l a t t C . E . , L o w e n s t e i n R . , R e e d R . , a n d S n y d e r S H . ( 1 9 9 1 ) C l o n e d a n d e x p r e s s e d n i t r i c o x i d e s y n t h a s e s t r u c t u r a l l y r e s e m b l e s c y t o c h r o m e P - 4 5 0 r e d u c t a s e . N a t u r e . 3 5 1 : 7 1 4 - 7 1 8 . B r e d t D . S . , H w a n g P . M . , a n d S n y d e r S H . ( 1 9 9 0 ) L o c a l i z a t i o n o f n i t r i c o x i d e s y n t h a s e i n d i c a t i n g a n e u r a l r o l e f o r n i t r i c o x i d e . N a t u r e . 3 4 7 : 7 6 8 - 7 7 0 . B r e d t D . S . a n d S y n d e r S . ( 1 9 8 9 ) N i t r i c o x i d e m e d i a t e s g l u t a m a t e - l i n k e d e n h a n c e m e n t o f c G M P l e v e l s i n t h e c e r e b e l l u m . P r a c . N a t ] . A c a d . S c i . 8 6 : 9 0 3 0 - 9 0 3 3 . 3 6 9 B r e d t D . S . a n d S y n d e r S . ( 1 9 9 0 ) I s o l a t i o n o f n i t r i c o x i d e s y n t h a s e , a c a l m o d u l i n - r e q u i r i n g e n z y m e . P r o c . N a t ] . A c a d S c i . 8 7 : 6 8 2 - 6 8 5 . B r o o k e s S . J . H . , S o n g Z . - M . , S t e e l e P . A . , a n d C o s t a M . ( 1 9 9 2 ) I d e n t i fi c a t i o n o f m o t o r n e u r o n s t o t h e l o n g i t u d i n a l m u s c l e o f t h e g u i n e a p i g i l e u m . G a s t r o e n t . 1 0 3 : 9 6 1 - 9 7 3 . B r o o k e s S . J . H . , S t e e l e P . A . , a n d C o s t a M . ( 1 9 9 1 a ) C a l r e t i n i n i m m u n o r e a c t i v i t y i n c h o l i n e r g i c m o t o r n e u r o n e s , i n t e m e u r o n e s , a n d v a s o m o t o r n e u r o n e s i n t h e g u i n e a - p i g s m a l l i n t e s t i n e . C e l l T i s s u e R e s . 2 6 3 : 4 7 1 - 4 8 1 . B r o o k e s S . J . H . , S t e e l e P . A . , a n d C o s t a M . ( 1 9 9 1 b ) I d e n t i fi c a t i o n a n d i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y o f c h o l i n e r g i c a n d n o n - c h o l i n e r g i c c i r c u l a r m u s c l e m o t o r n e u r o n s i n t h e g u i n e a - p i g s m a l l i n t e s t i n e . N e u r o s c i e n c e . 4 2 ( 3 ) : 8 6 3 - 8 7 8 . B r o w n M . C . , B e r g l u n d A . M . , K i a n g N . Y . S , a n d R y u g o D . K . ( 1 9 8 8 ) C e n t r a l t r a j e c t o r i e s o f t y p e I I s p i r a l g a n g l i o n n e u r o n s . J . C o m p . N e u r a l . 2 7 8 : 5 8 1 - 5 9 0 . B r u c e B . a n d L a p e t i n a E . G . ( 1 9 8 9 ) A c t i v a t i o n o f a c y t o s o l i c A D P - r i b o s y l t r a n s f e r a s e b y n i t r i c o x i d e - g e n e r a t i n g a g e n t s . J . B i o l . C h e m . 2 6 4 : 8 4 5 5 - 8 4 5 8 . B u c h a n A . M . J . ( 1 9 9 1 ) N e u r o fi l a m e n t M a n d c a l b i n d i n D 2 , , " a r e p r e s e n t i n m u t u a l l y e x c l u s i v e s u b p o p u l a t i o n s o f e n t e r i c n e u r o n s i n t h e r a t s u b m u c o u s p l e x u s . B r a i n R e s . 5 3 8 : 1 7 1 - 1 7 5 . B u c k S H . a n d B u r k s T . F . ( 1 9 8 6 ) T h e n e u r o p h a r m a c o l o g y o f c a p s a i c i n : R e v i e w o f s o m e r e c e n t o b s e r v a t i o n s . P h a r m a c o l . R e v . 3 8 : 1 7 9 - 2 2 6 . B u l l i t t E . ( 1 9 9 0 ) E x p r e s s i o n o f c - f o s - l i k e p r o t e i n a s a m a r k e r f o r n e u r o n a l a c t i v i t y f o l l o w i n g n o x i o u s s t i m u l a t i o n i n t h e r a t . J . C o m p . N e u r a l . 2 9 6 : 5 1 7 - 5 3 0 . B u l t H . , B o e c k x s t a e n s G . E . , P e l c k m a n s P . A . , J o r d a e n s F . H . , V a n M a e r c k e Y . M . , a n d H e r m a n A G . ( 1 9 9 0 ) N i t r i c o x i d e a s a n i n h i b i t o r y n o n a d r e n e r g i c n o n - c h o l i n e r g i c n e u r o t r a n s m i t t e r . N a t u r e . 3 4 5 : 3 4 6 - 3 4 7 . B u r n s t o c k G . ( 1 9 7 2 ) P u r i n e r g i c n e r v e s . P h a r m a c o l . R e v . , 2 4 : 5 0 9 - 5 8 1 . B u r n s t o c k G . ( 1 9 7 5 ) P u r i n e r g i c t r a n s m i s s i o n . I n : H a n d b o o k o f P s y c h a p h a r m a c o l a g y , V o l . 5 , S y n a p t i c M o d u l a t o r s , e d s . L . L I v e r s o n e t a l . ( P l e n u m P r e s s , L o n d o n ) p p . 1 3 1 - 1 9 4 . B u r n s t o c k G . , C a m p b e l l G . , a n d R a n d M . J . ( 1 9 6 6 ) T h e i n h i b i t o r y i n n e r v a t i o n o f t h e t a e n i a o f t h e g u i n e a p i g c a e c u m . J . P h y s i o ] . L a n d 1 8 2 : 5 0 4 - 5 2 6 . B u r n s t o c k G . , C a m p b e l l G . , B e n n e t t M . , a n d H o l m a n M . E . ( 1 9 6 3 ) T h e i n h i b i t o r y i n n e r v a t i o n o f t h e t a e n i a o f t h e g u i n e a - p i g c a e c u m . J . P h y s i o ] . L a n d . 1 8 2 : 5 0 4 - 5 2 6 . B u r n s t o c k G . , C a m p b e l l G . , S a t c h e l l D . , a n d S m y t h e A . ( 1 9 7 0 ) E v i d e n c e t h a t a d e n o s i n e 3 7 0 t r i p h o s p h a t e o r a r e l a t e d n u c l e o t i d e i s t h e t r a n s m i t t e r s u b s t a n c e r e l e a s e d b y n o n - a d r e n e r g i c i n h i b i t o r y n e r v e s i n t h e g u t . B u r y R . W . a n d M a s h f o r d M L . ( 1 9 7 7 ) A p h a r m a c o l o g i c a l i n v e s t i g a t i o n o f s y n t h e t i c s u b s t a n c e P o n t h e i s o l a t e d g u i n e a - p i g i l e u m . C l i n . E x p . P h a r m a c o l . P h y s i o ] . 4 : 4 5 3 - 4 6 1 . C a j a l S . R . ( l 8 9 5 ) L e s n a u v e l l e i d e é s s u r l a s t r u c t u r e d u s y s t é m e n e r v e u x c h e z l ’ h a m m e e t c h e z l e s v e r t é b r é s . R e i n w a l d , P a r i s . C a j a l S R . ( 1 9 1 1 ) H i s t a l a g i e d u s y s t é m e n e r v e x d e 1 ’ h a m m e e t d e s v e r t é b r é s . V o l I I . M a l i o n e , P a r i s . C a j a l S R . ( 1 9 2 8 ) D e g e n e r a t i o n a n d R e g e n e r a t i o n o f t h e N e r v o u s S y s t e m . O x f o r d U n i v e r s i t y P r e s s , L o n d o n , r e p r i n t e d 1 9 9 1 . C a j a l S R . a n d S a l a C . ( 1 8 9 1 ) T e r m i n a c i a n d e l a s n e r v i a s y t u b a s g l a n d u l a r e s d e ] p a n c r e a s d e l a s v e r t e b r a d a s . B a c e t a S a n i t a r i a d e B a r c e l o n a . C a m p b e l l G . ( 1 9 6 6 ) T h e i n h i b i t o r y n e r v e fi b r e s i n t h e v a g a l s u p p l y t o t h e g u i n e a p i g s t o m a c h . J . P h y s i o ] . L a n d 1 8 5 : 6 0 0 - 6 1 2 . C a m p b e l l G . ( 1 9 7 0 ) A u t o n o m i c n e r v o u s s u p p l y t o e f f e c t o r t i s s u e s . I n : B u l b r i n g E . , B r a d i n g A . , J o n e s A . , a n d T o m i t a T . ( e d . ) S m o o t h M u s c l e . A r n o l d , L o n d o n . p p . 4 5 1 - 4 9 5 . C a m p b e l l M . J . a n d M o r r i s o n J . H . ( 1 9 8 9 ) M o n o c l o n a l a n t i b o d y t o n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n ( S M I - 3 2 ) l a b e l s a s u b p o p u l a t i o n o f p y r a m i d a l n e u r o n s i n t h e h u m a n a n d m o n k e y n e o c o r t e x . J . C o m p . N e u r a l . 2 8 2 : 1 9 1 - 2 0 5 . C a n n o n W . B . ( 1 9 0 6 ) T h e m o t o r a c t i v i t i e s o f t h e s t o m a c h a n d s m a l l i n t e s t i n e a f t e r s p l a n c h n i c a n d v a g u s s e c t i o n . A m . J . P h y s i o l . 1 7 : 4 2 9 - 4 4 2 . C a n n o n W . B . a n d M u r p h y R T . ( 1 9 0 7 ) T h e m o v e m e n t s o f t h e s t o m a c h a n d i n t e s t i n e i n s o m e s u r g i c a l c o n d i t i o n s . A n n . S u r g . 4 3 : 5 1 2 - 5 3 6 . C a n n o n W . B . a n d U r i d i l J . E . ( 1 9 2 1 ) S t u d i e s o n t h e c o n d i t i o n s o f a c t i v i t y i n e n d o c r i n e g l a n d s . V I I I . S o m e e f f e c t s o n t h e d e n e r v a t e d h e a r t o f s t i m u l a t i n g t h e n e r v e s o f t h e l i v e r . A m . J . P h y s i o ] , 5 8 : 3 5 3 - 3 5 4 . C a r d e n M . J . , S c h l a e p f e r W . W . , a n d L e e V . M . - Y . ( 1 9 8 5 ) T h e s t r u c t u r e , b i o c h e m i c a l p r o p e r t i e s , a n d i m m u n o g e n i c i t y o f n e u r o fi l a m e n t p e r i p h e r a l r e g i o n s a r e d e t e r m i n e d b y p h o s p h o r y l a t i o n s t a t e . . 1 . B i o l . C h e m . 2 6 0 : 9 8 0 5 - 9 8 1 7 . C a r n a h a n J . F . , A n d e r s o n D . J . , a n d P a t t e r s o n R H . ( 1 9 9 1 ) E v i d e n c e t h a t e n t e r i c n e u r o n s m a y d e r i v e f r o m t h e s y m p a t h o a d r e n a l l i n e a g e . D e v . B i o . 1 4 8 : 5 5 2 - 5 6 1 . C h a h l L A . ( 1 9 8 2 ) E v i d e n c e t h a t t h e c o n t r a c t i l e r e s p o n s e o f t h e g u i n e a - p i g i l e u m t o 3 7 1 c a p s a i c i n i s d u e t o s u b s t a n c e P r e l e a s e . N a u n y n S c h m i e d e b e r g ’ s A r c h . P h a r m a c o l . 3 1 9 : 2 1 2 - 2 1 5 . C h a k r a b o r t y G . a n d I n g o g l i a N A . ( 1 9 8 3 ) N - T e r m i n a l a r g i n y l a t i o n a n d u n i q u i t i n - m e d i a t e d p r o t e o l y s i s i n n e r v e r e g e n e r a t i o n . B r a i n R e s . B u l l . 3 0 : 4 3 9 - 4 4 5 . C h i S . - I . , L e v i n e J . D . , a n d B a s b a u m A . I . ( 1 9 9 3 a ) P e r i p h e r a l a n d c e n t r a l c o n t r i b u t i o n s t o t h e p e r s i s t e n t e x p r e s s i o n o f s p i n a l c o r d f o s - l i k e i m m u n o r e a c t i v i t y p r o d u c e d b y s c i a t i c n e r v e t r a n s e c t i o n i n t h e r a t . B r a i n R e s . 6 1 7 : 2 2 5 - 2 3 7 . C h i S . - I . , L e v i n e J . D . , a n d B a s b a u m A . I . ( 1 9 9 3 b ) E f f e c t s o f i n j u r y d i s c h a r g e o n t h e p e r s i s t e n t e x p r e s s i o n o f s p i n a l c o r d f o s - l i k e i m m u n o r e a c t i v i t y p r o d u c e d b y s c i a t i c n e r v e t r a n s e c t i o n i n t h e r a t . B r a i n R e s . 6 1 7 : 2 2 0 - 2 2 4 . C h o u , C C . ( 1 9 8 1 ) G a s t r o i n t e s t i n a l c i r c u l a t i o n a n d m o t o r f u n c t i o n . I n : G a s t r o i n t e s t i n a l C i r c u l a t i o n a n d M o t o r F u n c t i o n . ( e d ) J D . W o o d ( A m e r i c a n P h y s i o l o g i c a l S o c i e t y , M a r y l a n d ) p p . 1 4 7 5 - 1 5 1 7 . C o o k R D . a n d B u r n s t o c k G . ( 1 9 7 6 ) T h e u l t r a s t r u c t u r e o f A u e r b a c h ’ s p l e x u s i n t h e g u i n e a p i g . N e u r o n a l e l e m e n t s . J . N e u r a c y t a ] . 5 : 1 7 1 - 1 9 4 . C o s t a M . , B r o o k e s 8 . , S t e e l e P . , a n d V i c k e r s J . ( 1 9 9 1 a ) C h e m i c a l c o d i n g o f n e u r o n s i n t h e g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t . I n : S e n s o r y N e r v e s a n d N e u r a p e p t i d e s i n G a s t r o e n t e r a l a g y , e d s . M . C o s t a e t a ] . ( P l e n u m P r e s s , N e w Y o r k ) p p . 1 7 - 2 7 . C o s t a M . a n d F u r n e s s J . B . ( 1 9 7 6 ) T h e p e r i s t a l t i c r e fl e x : A n a n a l y s i s o f n e r v e p a t h w a y s a n d t h e i r p h a r m a c o l o g y . N a u n y n - S c h m i e d e b e r g ’ s A r c h . P h a r m a c o l . 2 9 4 : 4 7 - 6 0 . C o s t a M . a n d F u r n e s s J . B . ( 1 9 7 2 ) S l o w c o n t r a c t i o n s o f t h e g u i n e a - p i g p r o x i m a l c o l o n i n r e s p o n s e t o t h e s t i m u l a t i o n o f a n u n i d e n t i fi e d t y p e o f n e r v e . B r . J . P h a r m a c o l . 4 5 : 1 5 1 P - 1 5 2 P . C o s t a M . a n d F u r n e s s J . B . ( 1 9 8 3 ) T h e o r i g i n s , p a t h w a y s a n d t e r m i n a t i o n s o f n e u r o n s w i t h V I P - l i k e i m m u n o r e a c t i v i t y i n t h e g u i n e a - p i g s m a l l i n t e s t i n e . N e u r o s c i e n c e . 1 3 , 9 1 1 - 9 2 0 . C o s t a M . a n d F u r n e s s J . B . ( 1 9 8 4 ) S o m a t o s t a t i n i s p r e s e n t i n a s u b p o p u l a t i o n o f n o r a d r e n e r g i c n e r v e fi b r e s s u p p l y i n g t h e i n t e s t i n e . N e u r o s c i e n c e . 1 3 : 9 1 1 - 9 2 0 . C o s t a M . , F u r n e s s J . B . , B r o o k e s S . J . H . , B r e d t D . S . , a n d S n y d e r S H . ( 1 9 9 1 ) P r e s e n c e a n d c h e m i c a l c o d i n g o f n e u r o n s w i t h n i t r i c o x i d e s y n t h a s e i m m u n o r e a c t i v i t y i n t h e g u i n e a p i g s m a l l i n t e s t i n e . P r a c . A u s t . P h y s i o l . P h a r m a c o l . S a c . 2 2 : 9 7 P . C o s t a M . , F u r n e s s J . B . , B u f f a R . , a n d S o l c i a E L . ( 1 9 8 0 ) I m m u n o h i s t o c h e m i c a l l o c a l i z a t i o n o f p o l y p e p t i d e s i n p e r i p h e r a l a u t o n o m i c n e r v e s u s i n g w h o l e m o u n t p r e p a r a t i o n s . H i s t a c h e m i s t r y . 6 5 , 1 5 7 - 1 6 5 . 3 7 2 C o s t a M . , F u r n e s s J . B . , a n d C u e l l o A . C . ( 1 9 8 5 a ) S e p a r a t e p o p u l a t i o n s o f o p i o i d c o n t a i n i n g n e u r o n s i n t h e g u i n e a - p i g i n t e s t i n e . N e u r a p e p t i d e s . 5 : 4 4 5 - 4 4 8 . C o s t a M . , F u r n e s s J . B . , C u e l l o A . C . , V e r h o f s t a d A . A . J . , S t e i n b u s c h H . W . M . , a n d E l d e R P . ( 1 9 8 2 ) N e u r o n s w i t h 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e - l i k e i m m u n o r e a c t i v i t y i n t h e e n t e r i c n e r v o u s s y s t e m : t h e i r v i s u a l i z a t i o n a n d r e a c t i o n s t o d r u g t r e a t m e n t . N e u r o s c i e n c e . 7 : 3 5 1 - 3 6 3 . C o s t a M . , F u r n e s s J . B . , a n d G i b b i n s I . L . ( 1 9 8 6 a ) C h e m i c a l c o d i n g o f e n t e r i c n e u r o n s . P r a g . B r a i n R e s . 6 8 : 2 1 7 - 2 3 9 . C o s t a M . , F u r n e s s J . B . , a n d G i b b i n s L L . ( 1 9 8 7 ) C h e m i c a l c o d i n g o f e n t e r i c n e u r o n s . I n : P r o g r e s s i n B r a i n R e s e a r c h . ( e d s . ) H o k f e l t T . , F u r e K . , a n d P e r n o w B . ( E l s e v i e r , A m s t e r d a m ) 6 8 , 2 1 7 - 2 3 9 . C o s t a M . , F u r n e s s J . B . , a n d H u m p h r e y s C . M . S . ( 1 9 8 6 b ) A p a m i n d i s t i n g u i s h e s t w o t y p e s o f r e l a x a t i o n m e d i a t e d b y e n t e r i c n e r v e s i n t h e g u i n e a - p i g g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t . N a u n y n - S c h m i e d e b e r g ’ s A r c h . P h a r m a c o l . 3 3 2 : 7 9 - 8 8 . C o s t a M . , F u r n e s s J . B . , L l e w e l l y n - S m i t h I . J . , a n d C u e l l o A . C . ( 1 9 8 1 ) P r o j e c t i o n s o f s u b s t a n c e P n e u r o n s w i t h i n t h e g u i n e a - p i g s m a l l i n t e s t i n e . N e u r o s c i e n c e . 6 : 4 1 1 - 4 2 4 . C o s t a M . , F u r n e s s J . B . , L l e w e l l y n - S m i t h I . J . , M u r p h y R . , B o m s t e i n , J . C . , a n d K e a s t J . R . ( 1 9 8 5 b ) F u n c t i o n a l r o l e s f o r s u b s t a n c e P - c o n t a i n i n g n e u r o n s i n t h e g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t . I n : S u b s t a n c e P . M e t a b o l i s m a n d B i o l o g i c a l A c t i o n s . e d s . C . C . J o r d a n , P . O e h m e ( T a y l o r a n d F r a n c i s , L o n d o n ) p p . 1 8 - 2 7 . C o s t a M . , F u r n e s s J . B . , P o m p o l o 8 . , B r o o k e s S . J . H . , B o m s t e i n J . C . , B r e d t , D . S . , a n d S y n d e r S H . ( 1 9 9 2 ) P r o j e c t i o n s a n d c h e m i c a l c o d i n g o f n e u r o n s w i t h i m m u n o r e a c t i v i t y f o r n i t r i c o x i d e s y n t h a s e i n t h e g u i n e a - p i g s m a l l i n t e s t i n e . N e u r o s c i . L e t t . 1 4 8 : 1 2 1 - 1 2 5 . C o s t a M . , F u r n e s s J . B . , P u l l i n C O . a n d B o m s t e i n J . ( 1 9 8 5 c ) S u b s t a n c e P n e u r o n s m e d i a t e n o n - c h o l i n e r g i c t r a n s m i s s i o n t o t h e c i r c u l a r m u s c l e o f t h e g u i n e a - p i g i n t e s t i n e . N a u n y n - S c h m i e d e b e r g ’ s A r c h . P h a r m a c o l . 3 2 8 : 4 4 6 - 4 5 2 . C o s t a M . , F u r n e s s J . B . , Y a n a i h a r a N . , Y a n a i h a r a C . , a n d M o o d y T . W . ( 1 9 8 4 ) D i s t r i b u t i o n a n d p r o j e c t i o n s o f n e u r o n s w i t h i m m u n o r e a c t i v i t y f o r b o t h g a s t r i n - r e l e a s i n g p e p t i d e a n d b o m b e s i n i n t h e g u i n e a - p i g s m a l l i n t e s t i n e . C e l l T i s s u e R e s . 2 3 5 : 2 8 5 - 2 9 3 . C o s t a M . a n d G a b e l l a G . ( 1 9 7 1 ) A d r e n e r g i c i n n e r v a t i o n o f t h e a l i m e n t a r y t r a c t . Z . Z e l l f a r s c h . 1 2 2 1 3 5 7 - 3 7 7 . C o s t a M . , V i t a d e l l o M . , a n d D a h l D . ( 1 9 8 9 ) T h e c h e m i c a l c o d i n g o f n e u r o fi l a m e n t i m m u n o r e a c t i v e e n t e r i c n e u r o n s i n t h e g u i n e a p i g s m a l l i n t e s t i n e . N e u r o s c i . L e t t . S u p p l . 3 4 : 8 7 4 . e z r u e a n e y e n a a v n m e o u h s r l n d r e n o i l z n p e fi D t e t e o m R a A e H m ( a y t k r l . e s , . c i e 1 . a a n y , n 9 n a l : 3 i S c s c t t 8 d n a ) o p v a E d a i s r e o t e I x o t o i e v i f t D m n e R d o n e . u n n b i J e r i m s n u . s n D . E e t r r t o s f i a s c . . e , J o h p x B . i . i o o C s r l e o C n t g . d o e l F u t c l l a h C W h l n e . B h i e R i i R . i d e s m o e i n m n l s i n v ( . i . c . C h g i C n D d o e e 1 a l 2 w 9 , l 1 6 v 5 s 7 3 6 8 n 3 e k : d 7 t m : i i 3 ) i : R i n 4 H e c 3 - e t 3 s M - 3 r t o 3 o 6 e o r - x . n 6 f i 8 c . a t 4 d e t h 4 e ( s 4 1 3 . r e 8 5 1 f 4 f 0 i 3 , e 1 n a o . p a e 8 9 b n 0 t r o d ) w a f e t a e h l g e a n r m u d S e t n e t e r e s e d l s u a r t e i n p c c o t m s v n r t o n o fi l i a t r a o h m v t e o s e e n r y n e s l b t r e m i p fi a l e n e s h i s e b o f h o e y m e c s y n t h p u m o e s i n p e r i k d d x f , i a s r y o a 3 7 3 D a l e H . H . ( 1 9 1 3 ) O n t h e a c t i o n o f e r g o t o x i n e w i t h s p e c i a l r e f e r e n c e t o t h e e x i s t e n c e o f s y m p a t h e t i c v a s o d i l a t o r s . J . P h y s i o l . L a n d 4 6 : 2 9 1 - 3 0 0 . D a l e H . H . ( 1 9 1 4 ) T h e a c t i o n o f c e r t a i n e s t e r s a n d e t h e r s o f c h o l i n e , a n d t h e i r r e l a t i o n t o m u s c a r i n e . J . P h a r m . a n d E x p . T h e n , 6 2 1 4 7 - 1 9 0 . D a l e H . H . a n d F e l d b e r g W . ( 1 9 3 4 ) T h e c h e m i c a l t r a n s m i t t e r o f v a g u s e f f e c t s o f t h e s t o m a c h . J . P h y s i o ] . L a n d 8 1 : 3 2 0 - 3 3 4 . D a w s o n T . M . , B r e d t D . S . , F o t u h i M . , H w a n g P . M . , a n d S y n d e r S H . ( 1 9 9 1 ) N i t r i c o x i d e s y n t h a s e a n d n e u r o n a l N A D P H d i a p h o r a s e a r e i d e n t i c a l i n b r a i n a n d p e r i p h e r a l t i s s u e s . P r a c . N a t ] . A c a d S c i . 8 8 : 7 7 9 7 - 7 8 0 1 . D e b u s E . , F l i i g g e G . , W e b e r K . , a n d O s b o r n M . ( 1 9 8 2 ) A m o n o c l o n a l a n t i b o d y s p e c i fi c f o r t h e 2 0 0 K p o l y p e p t i d e o f t h e n e u r o fi l a m e n t t r i p l e t . E M B O J . 1 , 4 1 - 4 5 . D e V e n t e J . a n d S t e i n b u s c h H . W . M . ( 1 9 9 2 ) O n t h e s t i m u l a t i o n o f s o l u b l e a n d p a r t i c u l a t e g u a n y l a t e c y c l a s e i n t h e r a t b r a i n a n d t h e i n v o l v e m e n t o f n i t r i c o x i d e a s s t u d i e d b y c G M P i m m u n o c y t o c h e m i s t r y . A c t a H i s t o c h e m . 9 2 : 1 3 - 3 8 . D e P o n t i F . , A z p i r o z F . , M a l a g e l a d a H R . ( 1 9 8 7 ) R e fl e x g a s t r i c r e l a x a t i o n i n r e s p o n s e t o d i s t e n s i o n o f t h e d u o d e n u m . A m . J . P h y s i o l . 2 5 2 : G 5 9 5 - G 6 0 4 . D o c k r a y G . J . , F o r s t e r , E R , a n d L o u i s , S M . ( 1 9 9 1 ) P e p t i d e s a n d t h e i r r e c e p t o r s o n a f f e r e n t n e u r o n s t o t h e u p p e r g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t . I n : S e n s o r y N e r v e s a n d N e u r a p e p t i d e s i n G a s t r o e n t e r a l o g y . ( e d s . ) M . C o s t a e t a ] . ( P l e n u m P r e s s , N e w Y o r k ) p p . 5 3 - 6 2 . D o c k r a y G . J . , G r e e n T . , a n d V a r r o A . ( 1 9 8 9 ) T h e a f f e r e n t p e p t i d e r g i c i n n e r v a t i o n o f t h e u p p e r g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t . I n : N e r v e s a n d t h e G a s t r o i n t e s t i n a l T r a c t . ( e d s . ) M . V . S i n g e r a n d H . G o e b e l l ( M T P P r e s s , N e t h e r l a n d s ) . D o g i e l A S . ( 1 8 9 9 ) U b e r d a n b a u d e r G a n g l i e n i n d e n G e fl e c h t e n d e s D a r m e s u n d d e r G a l l e n b l a s e d e s M e n s c h e n u n d d e r S a u g e t i e r e . A r c h . A n a t . P h y s i o ] . L e i p z i g , A n a t . A b t . 1 8 9 9 : 1 3 0 - 1 5 8 . 3 7 4 D o n n e r e r J . , B a r t h o L . , H o l e r P . , a n d L e m b e c k F . ( 1 9 8 4 ) I n t e s t i n a l p e r i s t a l s i s a s s o c i a t e d w i t h r e l e a s e o f i m m u n o r e a c t i v e s u b s t a n c e P . N e u r o s c i e n c e . 1 1 : 9 1 3 - 9 1 8 . D r a g u n o w M . a n d R o b e r t s o n H . ( 1 9 8 7 ) G e n e r a l i z e d s e i z u r e s i n d u c e c - f a s p r o t e i n ( s ) i n m a m m a l i a n n e u r o n s . N e u r o s c i . L e t t . 8 2 : 1 5 7 - 1 6 1 . D r a p e a u G . , R o u i s s i N . , N a n t e l F . , R h a l e b N . E . , T o u s i g n a n t C . , a n d R e g o l i D . ( 1 9 9 0 ) A n t a g o n i s t f o r t h e n e u r o k i n i n - 3 r e c e p t o r e v a l u a t e d i n s e l e c t i v e r e c e p t o r s y s t e m s . R e g . P e p t i d e s . 3 1 : 1 2 5 - 1 3 5 . D r e w G M . ( 1 9 7 8 ) P h a r m a c o l o g i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e p r e s y n a p t i c o r - a d r e n o c e p t o r s r e g u l a t i n g c h o l i n e r g i c a c t i v i t y i n t h e g u i n e a p i g i l e u m . B r . J . P h a r m a c o l . 6 4 : 2 9 3 - 3 0 0 . D u C . J . , M u r r a y J . B . , B a t e s N . , a n d C o n k l i n J . L . ( 1 9 9 2 ) N i t r i c o x i d e : m e d i a t o r o f N A N C h y p e r p o l a r i z a t i o n o f o p o s s u m e s o p h a g e a l s m o o t h m u s c l e . A m . J . P h y s i o l . 2 6 1 : G 1 0 1 2 - G 1 0 1 6 . B a k e r E . Y . , S a l l u s t i o J . E . , H a r r i s J . M . , a n d S h a w G . ( 1 9 9 3 ) M y e n t e r i c p l e x u s n e u r o n s h a v e d e v e l o p m e n t a l l y a c q u i r e d d i f f e r e n c e s i n t h e m e d i u m m o l e c u l a r w e i g h t s u b u n i t o f n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n . N e u r o s c i e n c e . 5 3 : 5 6 1 - 5 7 0 . E a k e r E . Y . , S h a w G . , a n d S n i n s k y C A . ( 1 9 9 0 ) N e u r o fi l a m e n t i m m u n o r e a c t i v i t y i n m y e n t e r i c n e u r o n s d i f f e r s f r o m t h a t f o u n d i n t h e c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m . G a s t r o e n t e r a l a g y . 9 9 : 1 3 6 4 - 1 3 7 1 . E c k e n s t e i n , F l . , B a r d e , Y . A . , a n d T h o e n e n , H . ( 1 9 8 1 ) P r o d u c t i o n o f s p e c i fi c a n t i b o d i e s t o c h o l i n e a c e t y l - t r a n s f e r a s e p u r i fi e d f r o m p i g b r a i n . N e u r o s c i e n c e , 6 : 9 9 3 - 1 0 0 0 . E d b l a d h M . , A . F e x - S v e n n i n g s e n , E k s t r a m P . A . R . , a n d E d s t r t i m A . ( 1 9 9 4 ) I n s u l i n a n d I G F - I I , b u t n o t I G F - 1 , s t i m u l a t e s t h e i n v i t r o r e g e n e r a t i o n o f a d u l t f r o g s c i a t i c s e n s o r y a x o n s . B r a i n R e s . 6 4 1 : 7 6 - 8 2 . E d v i n s s o n L . , E k b l a d , E . , H a k a n s o n R . , W a h l s t e d t C . ( 1 9 8 4 ) N e u r o p e p t i d e y p o t e n t i a t e s t h e e f f e c t s o f v a r i o u s v a s o c o n s t r i c t o r a g e n t s o n r a b b i t b l o o d v e s s e l s . B r . J . P h a r m a c o l . 8 6 : 5 1 9 - 5 2 5 . E k b l a d E . , H a k a n s o n R . , a n d S u n d l e r F . ( 1 9 8 4 ) V I P a n d P H I c o e x i s t w i t h a n N P Y - l i k e p e p t i d e i n i n t r a m u r a l n e u r o n s o f t h e s m a l l i n t e s t i n e . R e g . P e p . 1 0 : 4 7 - 5 5 . E k s t r a m P . A . R . , E d b l a d h M . , a n d E d s t r a m , A . ( 1 9 9 3 ) T i m e - d e p e n d e n t e f f e c t s o f ( i n s u l i n o n s c h w a n n c e l l p r o l i f e r a t i o n i n t h e i n v i t r o r e g e n e r a t i n g a d u l t f r o g s c i a t i c n e r v e . J . N e u r o s c i . R e s . 3 4 : 6 1 4 - 6 2 1 . E l v i n L . A . , L i n d h B . , a n d H o k f e l t T . ( 1 9 9 3 ) T h e c h e m i c a l n e u r o a n a t o m y o f s y m p a t h e t i c g a n g l i a . A n n . R e v . N e u r a s c i . 1 6 : 4 7 1 - 5 0 7 . 3 7 5 E r a n k o O . ( 1 9 5 2 ) O n t h e h i s t o c h e m i s t r y o f t h e a d r e n a l m e d u l l a o f t h e r a t , w i t h s p e c i a l r e f e r e n c e t o a c i d p h o s p h a t a s e . A c t a A n a t . S u p p ] . ( B a s a l ) 1 7 : 1 - 6 0 . E v a n s B . K . , H e a t h J . W . , a n d B u r n s t o c k G . ( 1 9 7 9 ) R e i n n e r v a t i o n f o l l o w i n g g u a n e t h i d i n e - i n d u c e d s y m p a t h e c t o m y o f a d u l t r a t s . J . N e u r a c y t a . 8 2 3 8 1 - 4 0 0 . E v a n s R J . a n d S u r p r e n a n t A . ( 1 9 9 2 ) V a s o c o n s t r i c t i o n o f g u i n e a - p i g s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s f o l l o w i n g s y m p a t h e t i c n e r v e s t i m u l a t i o n i s m e d i a t e d b y t h e r e l e a s e o f A T P . B r . J . P h a r m a c o l . 1 0 6 2 2 4 2 - 2 4 9 . F a h r e n k r u g J . , H a g l u n d U . , J o d a l M . , L u n d g r e n O . , O l b e L . , S c h a f f a l i t z k y d e M u c k a d e l l C B . ( 1 9 7 8 ) I n fl u e n c e o f t h e a u t o n o m i c n e r v o u s s y s t e m o n t h e r e l e a s e o f v a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p o l y p e p t i d e f r o m t h e p o r c i n e g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t . J . P h y s i o l . 2 8 0 : 4 0 5 - 4 2 2 . F e r r a n t e R . J . , K o w a l l N . W . , B e a l M . F . , R i c h a r d s o n E . P . , B i r d E D , a n d M a r t i n J . B . ( 1 9 8 5 ) S e l e c t i v e s p a r i n g o f a c l a s s o f s t r i a t a l n e u r o n s i n H u n t i n g t o n ’ s d i s e a s e . S c i e n c e . 2 3 0 : 5 6 1 - 5 6 4 . F i n k e l M . P . , B i s k i s B . O . , a n d J i n k i n s P B . ( 1 9 6 6 ) V i r u s i n d u c t i o n o f o s t e o s a r c o m a s a i n m i c e . S c i e n c e . 1 5 1 : 6 9 8 - 7 0 1 . F i n k l e m a n B . ( 1 9 3 3 ) O n t h e n a t u r e o f i n h i b i t i o n i n t h e i n t e s t i n e . J . P h y s i o l . ( L a n d ) 7 0 : 1 4 5 - 1 5 7 . F o x J . E . T . , a n d D a n i e l B E . ( 1 9 8 6 ) S u b s t a n c e P : a p o t e n t i n h i b i t o r o f t h e c a n i n e s m a l l i n t e s t i n e i n v i v o . A m . J . P h y s i o l . l 3 : G 2 l - G 2 7 . F r a n c o R . , C o s t a M . , a n d F u r n e s s J . B . ( 1 9 7 9 a ) E v i d e n c e f o r t h e r e l e a s e o f e n d o g e n o u s s u b s t a n c e P f r o m i n t e s t i n a l n e r v e s . N a u n y n - S c h m i e d e b e r g ’ s A r c h . P h a r m a c o l . 3 0 6 : 1 9 5 - 2 0 1 . F r a n c o R . , C o s t a M . , a n d F u r n e s s J . B . ( 1 9 7 9 b ) E v i d e n c e t h a t a x o n s c o n t a i n i n g s u b s t a n c e P i n t h e g u i n e a - p i g i l e u m a r e o f i n t r i n s i c o r i g i n . N a u n y n - S c h m i e d e b e r g ’ s A r c h . P h a r m a c o l . 3 0 7 : 5 7 - 6 3 . F r i e d e R . L . ( 1 9 6 1 ) A h i s t o c h e m i c a l a t l a s o f t i s s u e o x i d a t i o n i n t h e b r a i n s t e m o f t h e c a t . K a r g e r , B a s e l . F r i g o G . M . , L e c c h i n i S . , M a r c o l i M . T o n i n i M . , D ’ A r g e l o L . , C r e m a A . ( 1 9 8 4 ) C h a n g e s i n s e n s i t i v i t y t o t h e i n h i b i t o r y e f f e c t s o f a d r e n e r g i c a g o n i s t s o n i n t e s t i n a l m o t o r a c t i v i t y a f t e r c h r o n i c s y m p a t h e t i c d e n e r v a t i o n . N a u n y n - S c h e m i e d e b e r g ’ s A r c h . P h a r m a c o l . 3 2 5 : 1 4 5 - 1 5 2 . F u k u d a H . ( 1 9 6 8 ) O n t h e r e l a t i o n s h i p o f t h e i n h i b i t o r y n e u r o n e c o n c e r n e d w i t h t h e i n t e s t i n a l i n t r i n s i c r e fl e x e s w i t h v a g a l i n h i b i t i o n . J . P h y s i o ] . S a c . J p n . 3 0 : 7 0 2 - 7 0 9 . 3 7 6 F u g i s a w a K . , a n d I t o Y . ( 1 9 8 2 ) T h e e f f e c t s o f s u b s t a n c e P o n s m o o t h m u s c l e c e l l s a n d o n n e u r o - e f f e c t o r t r a n s m i s s i o n i n t h e g u i n e a - p i g i l e u m , B r i t . J . P h a r m a c o l . 7 6 : 2 7 9 - 2 9 0 . F u r c h g o t t R . F . , a n d Z a w a d z k i J . V . ( 1 9 8 0 ) T h e o b l i g a t o r y r o l e o f e n d o t h e l i a l c e l l s i n t h e r e l a x a t i o n o f a r t e r i a l s m o o t h m u s c l e b y a c e t y l c h o l i n e . N a t u r e . 2 8 8 : 3 7 3 - 3 7 6 . F u r n e s s J . B . ( 1 9 6 9 ) T h e p r e s e n c e o f i n h i b i t o r y n e r v e s i n t h e c o l o n a f t e r s y m p a t h e t i c d e n e r v a t i o n . E u r . J . P h a r m a c o l . 6 2 3 4 9 - 3 5 2 . F u r n e s s J . B . a n d B u r n s t o c k G . ( 1 9 7 5 ) R o l e s o f c i r c u l a t i n g c a t e c h o l a r r r i n e s i n t h e g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t . I n : H a n d b o o k o f P h y s i o l o g y . ( A m e r i c a n P h y s i o l o g i c a l S o c i e t y , W a s h i n g t o n , D C . ) v o l . 6 , s e c t . 7 . p p . 5 1 5 - 5 3 6 . F u r n e s s J . B . a n d C o s t a M . ( 1 9 7 1 ) M o r p h o l o g y a n d d i s t r i b u t i o n o f i n t r i n s i c a d r e n e r g i c n e u r o n e s i n t h e p r o x i m a l c o l o n o f t h e g u i n e a - p i g . Z . Z e l l f a r s c h 1 2 0 : 3 4 6 - 3 6 3 . F u r n e s s J . B . a n d C o s t a M . ( 1 9 7 4 a ) T h e a d r e n e r g i c i n n e r v a t i o n o f t h e g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t . E r g e b . P h y s i o ] . 6 9 2 1 - 5 1 . F u r n e s s J . B . a n d C o s t a M . ( 1 9 7 5 ) T h e u s e o f g l y o x y l i c a c i d f o r t h e fl u o r e s c e n c e h i s t o c h e m i c a l d e m o n s t r a t i o n o f s t o r e s o f n o r a d r e n a l i n e a n d 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e i n w h o l e m o u n t s . H i s t a c h e m . 4 1 : 3 3 3 - 3 5 2 . F u r n e s s J . B . a n d C o s t a M . ( 1 9 7 8 ) D i s t r i b u t i o n o f i n t r i n s i c n e r v e c e l l b o d i e s a n d a x o n s w h i c h t a k e u p a r o m a t i c a m i n e s a n d t h e i r p r e c u r s o r s i n t h e s m a l l i n t e s t i n e o f t h e g u i n e a p i g . C e l l T i s s u e R e s . 1 8 8 2 5 2 7 - 5 4 3 . F u r n e s s J . B . a n d C o s t a M . ( 1 9 7 9 ) P r o j e c t i o n s o f i n t e s t i n a l n e u r o n s s h o w i n g i m m u n o r e a c t i v i t y f o r v a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p o l y p e p t i d e a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e s e n e u r o n s b e i n g t h e e n t e r i c i n h i b i t o r y n e u r o n s . N e u r o s c i . L e t t . 1 5 : 1 9 9 - 2 0 4 . F u r n e s s J . B . a n d C o s t a M . ( 1 9 8 0 ) T y p e s o f n e r v e s i n t h e e n t e r i c n e r v o u s s y s t e m . N e u r o s c i e n c e 5 2 1 - 2 0 . F u r n e s s J . B . a n d C o s t a M . ( 1 9 8 2 a ) E n t e r i c i n h i b i t o r y n e r v e s a n d V I P . I n : V a s o a c t i v e I n t e s t i n a l P e p t i d e . e d . S . I . S a i d ( R a v e n P r e s s , N e w Y o r k ) p p . 3 9 1 - 4 0 6 . F u r n e s s J . B . a n d C o s t a M . ( 1 9 8 2 ) N e u r o n s w i t h 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e - l i k e i m m u n o r e a c t i v i t y i n t h e e n t e r i c s y s t e m : t h e i r p r o j e c t i o n s i n t h e g u i n e a - p i g s m a l l i n t e s t i n e . N e u r a s c i . 7 2 3 4 1 - 3 4 9 . F u r n e s s J . B . a n d C o s t a M . ( 1 9 8 7 ) T h e E n t e r i c N e r v o u s S y s t e m . B e l l a n d B a i n L t d . , G l a s g o w , 2 9 0 p p . F u r n e s s , J . B . , C o s t a , M . , a n d E c k e n s t e i n F . ( 1 9 8 3 ) N e u r o n e s l o c a l i z e d w i t h a n t i b o d i e s a g a i n s t c h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e i n t h e e n t e r i c n e r v o u s s y s t e m . N e u r o s c i . L e t t . 4 0 : 1 0 5 - 3 7 7 1 0 9 . F u r n e s s J . B . , C o s t a M . , a n d E m s o n R C . ( 1 9 8 3 ) D i s t r i b u t i o n , p a t h w a y s , a n d r e a c t i o n s t o d r u g t r e a t m e n t o f n e r v e s w i t h n e u r o p e p t i d e Y - a n d p a n c r e a t i c p o l y p e p t i d e - l i k e i m m u n o r e a c t i v i t y i n t h e g u i n e a - p i g d i g e s t i v e t r a c t . C e l l T i s s . R e s . 2 3 4 2 7 1 - 9 2 . F u r n e s s J . B . , C o s t a M . , a n d F r e e m a n C G . ( 1 9 7 9 ) A b s e n c e o f t y r o s i n e h y d r o x y l a s e a c t i v i t y a n d d o p a m i n e B - h y d r o x y l a s e i m m u n o r e a c t i v i t y i n i n t r i n s i c n e r v e s o f t h e g u i n e a - p i g i l e u m . N e u r a s c i . 4 2 3 0 5 - 3 1 0 . F u r n e s s J . B . , C o s t a M . , G i b b i n s I . L . , L l e w e l l y n - S m i t h I . J . , a n d O l i v e r J . R . ( 1 9 8 5 ) N e u r o c h e m i c a l l y s i m i l a r m y e n t e r i c a n d s u b m u c o u s n e u r o n s d i r e c t l y t r a c e d t o t h e m u c o s a o f t h e s m a l l i n t e s t i n e . C e l l T i s s . R e s . 2 4 1 : 1 5 5 - 1 6 3 . F u r n e s s J . B . , C o s t a M . , a n d K e a s t J . R . ( 1 9 8 4 ) C h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e - a n d p e p t i d e i m m u n o r e a c t i v i t y o f s u b m u c o u s n e u r o n s i n t h e s m a l l i n t e s t i n e o f t h e g u i n e a - p i g . C e l l T i s s . R e s . 2 3 7 : 3 2 9 - 3 3 6 . F u r n e s s J . B . , C o s t a M . , a n d M i l l e r R . J . ( 1 9 8 3 ) D i s t r i b u t i o n a n d p r o j e c t i o n o f n e r v e s w i t h e n k e p h a l i n - l i k e i m m u n o r e a c t i v i t y i n t h e g u i n e a p i g s m a l l i n t e s t i n e . N e u r o s c i e n c e . 8 , 6 5 3 - 6 6 4 . F u r n e s s J . B . , C o s t a M . , a n d M i l l e r R . J . ( 1 9 8 3 ) D i s t r i b u t i o n a n d p r o j e c t i o n o f n e r v e s w i t h e n k e p h a l i n - l i k e i m m u n o r e a c t i v i t y i n t h e g u i n e a p i g s m a l l i n t e s t i n e . N e u r o s c i e n c e . 8 2 6 5 3 - 6 6 4 . F u r n e s s J . B . , L l e w e l l y n - S m i t h I . J . , B o m s t e i n J . C . , a n d C o s t a M . ( 1 9 8 8 ) C h e m i c a l n e u r o a n a t o m y a n d t h e a n a l y s i s o f n e u r o n a l c i r c u i t r y i n t h e e n t e r i c n e r v o u s s y s t e m . I n A . B o r k l u n d , T . H i i k f e l t , a n d C . m e a n ( E d s ) , H a n d b o o k o f C h e m i c a l N e u r a a n a t a m y , E l s e v i e r , A m s t e r d a m , p p . 1 6 1 - 2 1 8 . F u r n e s s J . B . , T r u s s e l l D . C . , P o m p o l o S . , B o m s t e i n J . C . , a n d S m i t h T . K . ( 1 9 9 0 ) C a l b i n d i n n e u r o n s o f t h e g u i n e a - p i g s m a l l i n t e s t i n e : q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f t h e i r n u m b e r s a n d p r o j e c t i o n s . C e l l T i s s . R e s . 2 6 0 : 2 6 1 - 2 7 2 . F u r n e s s J . B . , C o s t a M . , a n d M u r p h y R . ( 1 9 8 2 ) D e t e c t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f n e u r o t r a n s m i t t e r s , p a r t i c u l a r l y p e p t i d e s , i n t h e g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t . S c a n d . J . G a s t r o e n t e r a ] . 1 7 2 6 1 - 7 0 . G a b e l l a G . ( 1 9 6 7 ) N e u r o n n u m b e r i n t h e m y e n t e r i c p l e x u s i n n e w - b o r n a n d a d u l t r a t s . S p e c i a l i a . 1 5 ( 1 ) 2 5 2 - 5 3 . G a b e l l a G . ( 1 9 7 4 ) S p e c i a l m u s c l e c e l l s a n d t h e i r i n n e r v a t i o n i n t h e m a m m a l i a n s m a l l i n t e s t i n e . C e l l T i s s u e R e s . 1 5 3 2 6 3 - 7 7 . G a b e l l a G . , a n d C o s t a M . ( 1 9 6 7 ) L e fi b r e a d r e n e r g i c h e n e l c a n a l e a l i m e n t a r e . G . A c a d 3 7 8 M e d T o r i n a . 1 3 0 2 1 9 8 - 2 1 7 . G a l l i g a n J . J . ( 1 9 9 3 ) D i f f e r e n t i a l i n h i b i t i o n o f c h o l i n e r g i c a n d n o n c h o l i n e r g i c n e u r o g e n i c c o n t r a c t i o n s b y m u o p i o d a n d a l p h a - 2 a d r e n e r g i c a g o n i s t s i n g u i n e a p i g i l e u m . J . P h a r m . a n d E x p . T h e r . 2 6 4 ( 1 ) 2 3 7 5 - 3 8 3 . G a l l i g a n J . J . a n d B e r t r a n d P P . ( 1 9 9 4 ) A T P m e d i a t e s f a s t s y n a p t i c p o t e n t i a l s o n e n t e r i c n e u r o n s . J . N e u r o s c i . ( i n p r e s s ) . G a l l i g a n J . J . , C o s t a M . , a n d F u r n e s s J . B . ( 1 9 8 8 ) C h a n g e s i n s u r v i v i n g n e r v e fi b e r s a s s o c i a t e d w i t h s u b m u c o s a l a r t e r i e s f o l l o w i n g e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n o f t h e s m a l l i n t e s t i n e . C e l l T i s s u e R e s . 2 5 3 : 6 4 7 - 6 5 6 . G a l l i g a n J . J . , J i a n g M . M . , S h e n K . Z . , a n d S u r p r e n a n t A . M . ( 1 9 9 0 ) S u b s t a n c e P m e d i a t e d n e u r o g e n i c v a s o d i l a t i o n i n e x t r i n s i c a l l y d e n e r v a t e d g u i n e a - p i g s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s . J . P h y s i o l . 4 2 0 : 2 6 7 - 2 8 0 . G e o r g e s E . , L e f e b v r e S . , a n d M u s h y n s k i W . E . ( 1 9 8 6 ) D e p h o s p h o r y l a t i o n o f n e u r o fi l a m e n t s b y e x o g e n o u s p h o s p h a t a s e s h a s n o e f f e c t o n r e a s s e m b l y o f s u b u n i t s . J . N e u r o c h e m . 4 7 : 4 7 7 - 4 8 3 . G e r a g h t y D P , a n d B u r c h e r E . ( 1 9 9 2 ) E f f e c t o f c h r o n i c c a p s a i c i n t r e a t m e n t o n t a c h y k i n i n N K l b i n d i n g s i t e s i n t h e r a t . P e p t i d e s . 1 3 : 4 0 9 - 4 1 1 . G e r a r d N . P . , B a o L . , X i a o - P i n g H . , a n d G e r a r d C . ( 1 9 9 3 ) M o l e c u l a r a s p e c t s o f t h e t a c h y k i n i n r e c e p t o r s . R e g u l a t o r y P e p t i d e s . 4 3 : 2 1 - 3 5 . G e r s h o n M D . ( 1 9 9 3 ) F r o m n e u r a l c r e s t t o b o w e l : D e v e l o p m e n t o f t h e e n t e r i c n e r v o u s s y s t e m . J . N e u r a b i a ] . 2 4 ( 2 ) : 1 9 9 - 2 1 4 . G e r s h o n M . D . , a n d K i r c h g e s s n e r A L . ( 1 9 8 6 ) D e fi n i t i o n o f s u b s e t s o f e n t e r i c n e u r o n s b y t h e h i s t o c h e m i c a l d e m o n s t r a t i o n o f t h e a c t i v i t i e s o f e n d o g e n o u s a l k a l i n e p h o s p h a t a s e a n d N A D P H - d i a p h o r a s e c o - l o c a l i z a t i o n w i t h n e u r o p e p t i d e s . S a c . N e u r a s c i . A b s t r . 1 2 2 1 0 2 1 . G e r s h o n M D . a n d R o t h m a n T . P . ( 1 9 9 1 ) E n t e r i c g l i a . G l i a . 4 2 1 9 5 - 2 0 4 . G i b b i n s I . L . , F u r n e s s J . B . , C o s t a M . , M a c l n t y r e I . , H i l l y a r d O J , a n d G i r g i s S . ( 1 9 8 5 ) C o - l o c a l i z a t i o n o f c a l c i t o n i n g e n e r e l a t e d p e p t i d e - l i k e i m m u n o r e a c t i v i t y w i t h s u b s t a n c e P i n c u t a n e o u s , v a s c u l a r a n d v i s c e r a l s e n s o r y n e u r o n s o f g u i n e a - p i g s . N e u r o s c i . L e t t . 5 7 2 1 2 8 - 1 3 0 . G i b s o n A . , M i r z a z a d e h S . , H o b b s A . J . , a n d M o o r e , P . ( 1 9 8 8 ) L - N G - m o n o m e t h y l a r g i n i n e a n d L - N G - n i t r o a r g i n i n e i n a d r e n e r g i c , n o n - c h o l i n e r g i c r e l a x a t i o n o f t h e m o u s e a n o c o c c y g e u s m u s c l e . B r . J P h a r m a c o l . 9 9 : 6 0 2 - 6 0 6 . 3 7 9 G i l l e s p i e J . S . , a n d S h e n g H . ( 1 9 8 8 ) I n fl u e n c e o f h e m o g l o b i n a n d e r y t h r o c y t e s o n t h e e f f e c t s o f E D R F , a s m o o t h m u s c l e i n h i b i t o r y f a c t o r , a n d n i t r i c o x i d e o n v a s c u l a r a n d n o n v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e . B r . J . P h a r m a c o l . 9 5 2 1 1 5 1 - 1 1 5 6 . G i l l i s R . A . , Q u e s t J . A . , P a g a n i R D , a n d N o r m a n W P . ( 1 9 8 9 ) C o n t r o l c e n t e r s i n t h e c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m f o r r e g u l a t i n g g a s t r o i n t e s t i n a l m o t i l i t y . I n : H a n d b o o k o f P h y s i o l o g y , T h e G a s t r o i n t e s t i n a l S y s t e m . ( e d ) J . D . W o o d ( A m e r i c a n P h y s i o l o g i c a l S o c i e t y , B e t h e s d a ) p p . 6 2 1 - 6 8 3 . G i n t z l e r A . R . , a n d H y d e D . ( 1 9 8 3 ) A s p e c i fi c s u b s t a n c e P a n t a g o n i s t a t t e n u a t e s n o n - c h o l i n e r g i c e l e c t r i c a l l y n o n - c h o l i n e r g i c e l e c t r i c a l l y i n d u c e d c o n t r a c t u r e s o f t h e g u i n e a - p i g s m a l l i n t e s t i n e . N e u r o s c i . L e t t . 4 0 : 7 5 - 7 9 . G l a z n e r J . W . , L u p i e n S . , M i l l e r J . A . , a n d I s h i i D . N . ( 1 9 9 3 ) I n s u l i n - l i k e g r o w t h f a c t o r 1 1 i n c r e a s e s t h e r a t e o f s c i a t i c n e r v e r e g e n e r a t i o n i n r a t s . N e u r a s c i . 5 4 : 7 9 1 - 7 9 7 . G o l d s t e i n M . E . , S t e m b e r g e r L . A . , a n d S t e m b e r g e r N H . ( 1 9 8 3 ) M i c r o h e t e r o g e n i t y ( " n e u r o t y p y " ) o f n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n s . P r a c . N a t ] . A c a d S c i . U S A . 8 0 , 3 1 0 1 - 3 1 0 5 . G o n e l l a J . ( 1 9 6 4 ) E t u d e d e l ’ a c t i v é e ’ l e c t r i q u e d e s fi b r e s m u s c u l a i r e s l o n g i t u d i n a l e s d u d u o d e n u m i n v i v o . A c t i o n d e l a s t i m u l a t i o n d e s n e r f s v a g u e s . C . R . S a c . B i o l , 1 5 8 2 2 4 0 9 - 2 4 1 3 . G r i f fi t h S . G . a n d B u r n s t o c k G . ( 1 9 8 3 ) S e r o t o n i n e r g i c n e u r o n s i n h u m a n f e t a l i n t e s t i n e : A n i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t u d y . G a s t r o e n t . 8 5 : 9 2 9 - 9 3 7 . G r i f fi t h T . M . , E d w a r d s D . H . , L e w i s J . H . , N e w b y A . C . , a n d H e n d e r s o n A H . ( 1 9 8 4 ) T h e n a t u r e o f e n d o t h e l i u m - d e r i v e d v a s c u l a r r e l a x a n t f a c t o r . N a t u r e . 3 0 8 2 6 4 5 - 6 4 7 . G r u d y D . a n d S c r a t c h e r d T . ( 1 9 8 9 ) S e n s o r y a f f e r e n t s f r o m t h e g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t . I n : H a n d b o o k o f P h y s i o l o g y , T h e G a s t r o i n t e s t i n a l S y s t e m . ( e d ) . J . D . W o o d ( A m e r i c a n P h y s i o l o g i c a l S o c i e t y , B e t h e s d a ) p p . 5 9 3 - 6 2 0 . G u s t a f s s o n L . E . , W i l u n d C . U . , a n d W i k l u n d N P . ( 1 9 9 0 ) M o d u l a t i o n o f a u t o n o m i c n e u r o e f f e c t o r t r a n s m i s s i o n b y n i t r i c o x i d e i n g u i n e a - p i g i l e u m . B i a c h e m . R e s . C o m m . 1 7 3 2 1 0 6 - 1 1 0 . G u t h L . ( 1 9 5 6 ) R e g e n e r a t i o n i n t h e m a m m a l i a n p e r i p h e r a l n e r v o u s s y s t e m . P h y s i o l . R e v . 3 6 : 4 4 1 - 4 7 8 . H a l a z o n e t i s T . D . , G e o r g o p o u l o s K . , G r e e n b e r g M . E . , a n d L e d e r P . ( 1 9 8 8 ) c - J u n d i r n e r i z e s w i t h i t s e l f a n d w i t h c - F o s , f o r m i n g c o m p l e x e s o f d i f f e r e n t D N A b i n d i n g a f fi n i t i e s . C e l l . 5 5 : 9 1 7 - 9 2 4 . H a l l J . M . a n d M o r t o n I . K . M . ( 1 9 9 1 ) S u b t y p e s a n d e x c i t a t i o n - c o n t r a c t i o n c o u p l i n g m e c h a n i s m s f o r n e u r o k i n i n r e c e p t o r s i n s m o o t h m u s c l e o f t h e g u i n e a - p i g T a e n i a c a l i . 3 8 0 N a u n y n - S c h m i e d e b e r g ’ s A r c h . P h a r m a c o l . 3 4 4 : 2 5 5 - 2 3 4 . H a l l S M . ( 1 9 8 9 ) R e g e n e r a t i o n i n t h e p e r i p h e r a l n e r v o u s s y s t e m . N e u r a p a t h a l . A p p ] . N e u r o b i a ] . 1 5 : 5 1 3 - 5 2 9 . H e n d r y L A . ( 1 9 9 2 ) R e t r o g r a d e f a c t o r s i n p e r i p h e r a l n e r v e s . P h a r m a c . T h e r . 5 6 : 2 6 5 - 2 8 5 . H e n d r y I . A . , S t fi c k e l K . , T h o e n e n H . , a n d I v e r s e n L L . ( 1 9 7 4 ) T h e r e t r o g r a d e t r a n s p o r t o f n e r v e g r o w t h f a c t o r . B r a i n R e s . 6 8 2 1 0 3 - 1 2 1 . H e v e l J . M . a n d M a r l e t t a M A . ( 1 9 9 2 ) M a c r o p h a g e n i t r i c o x i d e s y n t h a s e : R e l a t i o n s h i p b e t w e e n e n z y m e - b o u n d t e t r a - h y d r o b i o p t e r i n a n d s y n t h a s e : R e l a t i o n s h i p b e t w e e n e n z y m e - b o u n d t e t r a - h d r o b i o p t e r i n a n d s y n t h a s e a c t i v i t y . B i o c h e m i s t r y . 3 1 : 7 1 6 0 - 7 1 6 5 . H i l l C . J . ( 1 9 2 7 ) A c o n t r i b u t i o n t o o u r k n o w l e d g e o f t h e e n t e r i c p l e x u s e s . P h i l o s . T r a n s . R . S a c . L a n d o n . B 2 1 5 : 3 5 5 - 3 8 7 . H i r s t G . D . S . a n d M c K i r d y H Q ( 1 9 7 4 ) P r e s y n a p t i c i n h i b i t i o n a t m a m m a l i a n p e r i p h e r a l s y n a p s e ? N a t u r e . 2 5 0 : 4 3 0 - 4 3 1 . H a k f e l t , T . , J o h a n s s o n , 0 . , E f e n d i c , S . , L u f t , A . , a n d A r i m u r a , A . ( 1 9 7 5 ) A r e t h e r e s o m a t o s t a t i n c o n t a i n i n g n e r v e s i n t h e r a t g u t ? I m m u n o h i s t o c h e m i c a l e v i d e n c e f o r a n e w t y p e o f p e r i p h e r a l n e r v e s . E x p e r i m e n t a , 3 1 : 8 5 2 - 8 5 4 . H o f f m a n H . H . a n d S c h n i t z l e i n H . N . ( 1 9 6 1 ) T h e n I u n b e r s o f n e r v e fi b r e s i n t h e v a g u s n e r v e o f m a n . A n a t . R e c . 1 3 9 : 4 2 9 - 4 3 5 . H o f f m a n P . N . , G r i f fi n J . W . , G o l d B . G . , a n d P r i c e D . L . ( 1 9 8 5 ) S l o w i n g o f n e u r o fi l a m e n t t r a n s p o r t a n d t h e r a d i a l g r o w t h o f d e v e l o p i n g n e r v e fi b e r s . J . N e u r o s c i . 5 , 2 9 2 0 - 2 9 2 9 . H o f f m a n P . N . , G r i f fi n J . W . , a n d P r i c e D . L . ( 1 9 8 4 ) C o n t r o l o f a x o n a l c a l i b e r b y n e u r o fi l a m e n t t r a n s p o r t . J . C e l l B i o l . 9 9 , 7 0 5 - 7 1 4 . H o f f m a n R N . a n d L a s e k R . J . ( 1 9 7 5 ) T h e s l o w c o m p o n e n t o f a x o n a l t r a n s p o r t : I d e n t i fi c a t i o n o f m a j o r s t r u c t u r a l p o l y p e p t i d e s o f t h e a x o n a n d t h e i r g e n e r a l i t y a m o n g m a m m a l i a n n e u r o n s . J . C e l l B i o l . 6 6 , 3 5 1 - 3 6 6 . H ' o ' g y e s A . ( 1 8 7 8 ) B e i t r a g e z u r p h y s i o l o g i s c h e n W i r k u n g d e r B e s t a n d t e i l e d e s C a p s a i c u m a n n u m . A r c h . E x p . P a t h . P h a r m a k 9 2 1 1 3 - 1 3 0 . H o k f e l t T . , J o h a n s s o n 0 , E f e n d i c S . , L u f t A . , a n d A i m u r a A . ( 1 9 7 5 ) A r e t h e r e s o m a t o s t a t i n c o n t a i n i n g n e r v e s i n t h e r a t g u t ? I m m u n o h i s t o c h e m i c a l e v i d e n c e f o r a n e w t y p e o f p e r i p h e r a l n e r v e . E x p e r i e n t i a . 3 1 2 8 5 2 - 8 5 4 H o l z e r P . ( 1 9 8 4 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e s t i m u l u s - i n d u c e d r e l e a s e o f i m m u n o r e a c t i v e 3 8 1 s u b s t a n c e P f r o m t h e m y e n t e r i c p l e x u s o f t h e g u i n e a - p i g s m a l l i n t e s t i n e . B r a i n R e s . 2 9 7 : 1 2 7 - 1 3 6 . H o l z e r P . ( 1 9 8 8 ) L o c a l e f f e c t o r f u n c t i o n s o f c a p s a i c i n - s e n s i t i v e s e n s o r y n e r v e e n d i n g s : i n v o l v e m e n t o f t a c h y k i n i n s , c a l c i t o n i n g e n e - r e l a t e d p e p t i d e a n d o t h e r n e u r o p e p t i d e s , N e u r a s c i . 2 4 2 7 3 9 - 7 6 8 . H o l z e r P . ( 1 9 9 1 ) C a p s a i c i n a s a t o o l f o r s t u d y i n g s e n s o r y n e u r o n f u n c t i o n s . I n : S e n s o r y N e r v e s a n d N e u r a p e p t i d e s i n G a s t r o e n t e r a l a g y . e d . M . C o s t a ( P l e n u m P r e s s , N e w Y o r k ) p p . 3 - 1 5 . H o l z e r P . , E m s o n P . C . , I v e r s e n L . L . , a n d S h a r m a n D P . ( 1 9 8 1 ) R e g i o n a l d i f f e r e n c e s i n t h e r e s p o n s e t o s u b s t a n c e P o f t h e l o n g i t u d i n a l m u s c l e a n d t h e c o n c e n t r a t i o n o f s u b s t a n c e P i n t h e d i g e s t i v e t r a c t o f t h e g u i n e a - p i g . N e u r a s c i . 6 2 1 4 3 3 - 1 4 4 1 . H o n j i n R . ( 1 9 5 1 ) S t u d i e s o n t h e n e r v e e n d i n g s i n t h e s m a l l i n t e s t i n e . C y t a ] . N e u r a l . S t u d 9 2 1 - 1 8 . H o p e B . T . , M i c h a e l G . J . , K n i g g e K M . a n d V i n c e n t S R . ( 1 9 9 1 ) N e u r o n a l N A D P H d i a p h o r a s e i s a n i t r i c o x i d e s y n t h a s e . P r a c . N a t ] . A c a d S c i . U S A . 8 8 2 2 8 1 1 - 2 8 1 4 . H o p e B . T . a n d V i n c e n t S R . ( 1 9 8 9 ) H i s t o c h e m i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f n e u r o n a l N A D P H - d i a p h o r a s e . J . H i s t o c h e m . a n d C y t o c h e m . 3 7 : 6 5 3 - 6 6 1 . H u l t é n L . , J o d a l M . , a n d L u n d g r e n O . ( 1 9 6 9 a ) E x t r i n s i c n e r v o u s c o n t r o l o f c o l o n i c b l o o d fl o w . A c t a P h y s i o l . S c a n d S u p p l . 3 3 5 2 3 9 - 4 9 . H u l t é n L . J o d a l M . , a n d L u n d g r e n O . ( 1 9 6 9 b ) L o c a l a n d n e r v o u s c o n t r o l o f t h e c o n s e c u t i v e v a s c u l a r s e c t i o n s o f t h e c o l o n . A c t a P h y s i o ] . S c a n d S u p p l . 3 3 5 2 5 1 - 6 4 . H u n t S . P . , D i n i A . , a n d E v a n G . ( 1 9 8 7 ) I n d u c t i o n o f c - f a s - l i k e p r o t e i n i n s p i n a l c o r d n e u r o n s f o l l o w i n g s e n s o r y s t i m u l a t i o n . N a t u r e . 3 2 8 : 6 3 2 - 6 3 4 . I a c o v i t t i L . , J o h n s o n M . , J o h T . H . , B u n g e R P . ( 1 9 8 2 ) N e u r o s c i e n c e 7 2 2 2 2 5 - 2 2 3 9 . I k e d a M . , H a y a m a T . , C h u j y o N . , a n d H o s h i A . ( 1 9 5 8 ) A c e t y l c h o l i n e c o n t e n t i n t h e s t r e t c h e d w a l l o f i n t e s t i n e . A m e r . J . P h y s i o ] . 1 9 2 2 2 7 - 2 9 . I r w i n D A . ( 1 9 3 1 ) T h e a n a t o m y o f A u e r b a c h ’ s p l e x u s . A m . J . A n a t . 4 9 : 1 4 1 - 1 6 6 . J a n c s o N . , J a n c s o - G a b o r A . , a n d S z o l c a n y i J . ( 1 9 6 7 ) 1 D i r e c t e v i d e n c e f o r n e u r o g e n i c i n fl a m m a t i o n a n d i t s p r e v e n t i o n b y d e n e r v a t i o n a n d b y p r e t r e a t m e n t w i t h c a p s a i c i n . B r . J . P h a r m a c o l . 3 1 : 1 3 8 - 1 5 1 . J a n s s o n G . ( 1 9 6 9 ) E x t r i n s i c n e r v o u s c o n t r o l o f g a s t r i c m o t i l i t y . A n e x p e r i m e n t a l s t u d y i n t h e c a t . A c t a P h y s i o ] . S c a n d S u p p l . 3 2 6 2 1 - 4 2 . 3 8 2 J e n t s c h S . , S e u f e r t W , S o m m e r T . , a n d R e i n s H A . ( 1 9 9 0 ) U b i q u i t i n c o n j u g a t i n g e n z y m e s : N o v e l r e g u l a t o r s o f e u k a r y o t i c c e l l s . T r e n d s B i o c h e m . 1 5 : 1 9 5 - 1 9 8 . J i a n g M . M , a n d S u r p r e n a n t A . ( 1 9 9 2 ) R e - i n n e r v a t i o n o f s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s b y m y e n t e r i c n e u r o n s f o l l o w i n g e x t r i n s i c d e n e r v a t i o n . J . A u t o . N e r v . S y s . 3 7 2 1 4 5 - 1 5 4 . J o h n s o n S . M . , K a t a y a m a Y . , a n d N o r t h R . A . ( 1 9 8 0 ) S l o w s y n a p t i c p o t e n t i a l s i n n e u r o n e s o f t h e m y e n t e r i c p l e x u s . J . P h y s i o l . 3 0 1 : 5 0 5 - 5 1 6 . J o h n s o n S . M . , K a t a y a m a Y . , M o r i t a K . , a n d N o r t h R . A . ( 1 9 8 1 ) M e d i a t o r s o f s l o w s y n a p t i c p o t e n t i a l s i n t h e m y e n t e r i c p l e x u s o f g u i n e a p i g i l e u m . J . P h y s i o ] . 3 2 0 : 1 7 5 - 1 8 6 . J u l i e n J P , a n d M u s h y n s k i W . E . ( 1 9 8 2 ) M u l t i p l e p h o s p h o r y l a t i o n s i t e s i n m a m m a l i a n n e u r o fi l a r n e n t p o l y p e p t i d e s . J . B i o l . C h e m . 2 5 7 , 1 0 4 6 7 - 1 0 4 7 0 . J a n s s o n G . ( 1 9 8 0 ) C h e m i c a l n e u r o t o x i n s a s d e n e r v a t i o n t o o l s i n n e u r o b i o l o g y . A n n . R e v . N e u r a s c i . 3 2 1 6 9 - 1 8 7 . J a n s s o n G . , S a c h s C . ( 1 9 7 0 ) E f f e c t s o f 6 - h y d r o x y d o p a m i n e o n t h e u p t a k e a n d s t o r a g e o f n o r a d r e n a l i n e i n s y m p a t h e t i c a d r e n e r g i c n e u r o n s . E u r . J . P h a r m a c o l . 9 2 1 4 1 - 1 5 5 . K a l i a M . , a n d S u l l i v a n J . M . ( 1 9 8 2 ) B r a i n s t e m p r o j e c t i o n s o f s e n s o r y a n d m o t o r c o m p o n e n t s o f t h e v a g u s n e r v e i n t h e r a t . J . C o m p . N e u r a l . 2 1 1 : 2 4 8 - 2 6 4 . K a t a y a m a Y . a n d N o r t h R . A . ( 1 9 7 8 ) D o e s s u b s t a n c e P m e d i a t e s l o w s y n a p t i c e x c i t a t i o n w i t h i n t h e m y e n t e r i c p l e x u s ? N a t u r e . 2 7 4 : 3 8 7 - 3 8 8 . K a t a y a m a Y . , N o r t h R . A . , a n d W i l l i a m s J . T . ( 1 9 7 9 ) T h e a c t i o n o f s u b s t a n c e P o n n e u r o n s o f t h e m y e n t e r i c p l e x u s o f t h e g u i n e a p i g s m a l l i n t e s t i n e . P r a c . S a c . L a n d [ B ] 2 0 6 : 1 9 1 - 2 0 8 . K e a s t J . R . , F u r n e s s J . B . , a n d C o s t a M . ( 1 9 8 4 a ) S o m a t o s t a t i n i n h u m a n e n t e r i c n e r v e s : i t s d i s t r i b u t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n . C e l l T i s s u e R e s . 2 3 7 : 2 9 9 - 3 0 8 . K e a s t J . R . , F u r n e s s J . B . , a n d C o s t a M . ( 1 9 8 4 b ) T h e o r i g i n s o f p e p t i d e a n d n o r e p i n e p h r i n e n e r v e i n t h e m u c o s a o f t h e g u i n e a - p i g s m a l l i n t e s t i n e . G a s t r o e n t . 8 6 2 6 3 7 - 6 4 4 . K e s s l e r J . A . ( 1 9 8 5 ) P a r a s y m p a t h e t i c , s y m p a t h e t i c , a n d s e n s o r y i n t e r a c t i o n s i n t h e i r i s : N e r v e g r o w t h f a c t o r r e g u l a t e s c h o l i n e r g i c c i l i a r y g a n g l i o n i n n e r v a t i o n i n v i v a . J N e u r o s c i . 5 2 2 7 1 9 - 2 7 2 5 . K e s s l e r J . , A d l e r J . , B o h n M . , a n d B l a c k I . ( 1 9 8 1 ) S u b s t a n c e P i n p r i n c i p a l s y m p a t h e t i c n e u r o n s : R e g u l a t i o n b y i m p u l s e a c t i v i t y . S c i e n c e 2 1 4 2 3 3 5 - 3 3 5 . K e s s l e r J . , B e l l W . O . , a n d B l a c k L B . ( 1 9 8 3 ) I n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e s y m p a t h e t i c a n d s e n s o r y i n n e r v a t i o n o f t h e i r i s . J . N e u r o s c i . 3 2 1 3 0 1 - 1 3 0 7 . 3 8 3 K e s s l e r J . a n d B l a c k L B . ( 1 9 8 2 ) R e g u l a t i o n o f s u b s t a n c e P i n a d u l t r a t s y m p a t h e t i c g a n g l i a . B r a i n R e s . 2 3 4 : 1 8 2 - 1 8 7 . K e w e n t e r J . ( 1 9 6 5 ) T h e v a g a l c o n t r o l o f t h e j e j u n a l a n d i l e a l m o t i l i t y a n d b l o o d fl o w . A c t a P h y s i o l . S c a n d 6 5 ( 2 5 1 ) 2 l - 6 7 . K i l b i n g e r H . , S t a u b , P . , E r l h o f I . , a n d H o l z e r P . ( 1 9 8 6 ) A n t a g o n i s t d i s c r i m i n a t i o n b e t w e e n s u b t y p e s o f t a c h y k i n i n r e c e p t o r s i n t h e g u i n e a - p i g i l e u m . N a u n y n - S c h m i e d e b e r g ’ s A r c h P h a r m a c o l . 3 3 4 : 1 8 1 - 1 8 7 . K i m u r a , H . , M c G e e r , P . L . , P e n g , F . , a n d M c G e e r , E . G . ( 1 9 8 0 ) C h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e - c o n t a i n i n g n e u r o n s i n r o d e n t b r a i n d e m o n s t r a t e d b y i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y . S c i e n c e , 2 0 8 : 1 0 5 7 - 1 0 5 9 . K i r c h g e s s n e r A . L . a n d G e r s h o n M . D . ( 1 9 8 8 a ) M a r k e r s s h a r e d b e t w e e n d o r s a l r o o t a n d e n t e r i c g a n g l i a . J . C o m p . N e u r a l . 2 7 6 : 6 0 7 - 6 2 1 . K i r c h g e s s n e r A . L . a n d G e r s h o n M . D . ( 1 9 8 8 b ) P r o j e c t i o n s o f s u b m u c o s a l n e u r o n s t o t h e m y e n t e r i c p l e x u s o f t h e g u i n e a p i g i n t e s t i n e : I n v i t r o t r a c i n g o f m i c r o c i r c u i t s b y r e t r o g r a d e a n d a n t e r o g r a d e t r a n s p o r t . J . C o m p . N e u r a l . 2 7 7 : 4 8 7 - 4 9 8 . K i r c h g e s s n e r A . L . a n d G e r s h o n M D . ( 1 9 8 9 ) I d e n t i fi c a t i o n o f v a g a l e f f e r e n t fi b e r s a n d p u t a t i v e t a r g e t n e u r o n s i n t h e e n t e r i c n e r v o u s s y s t e m o f t h e r a t . J . C o m p . N e u r a . 2 8 5 2 3 8 - 5 3 . K i r c h g e s s n e r A . L . , T a m i r H . , a n d G e r s h o n M D . ( 1 9 9 2 ) I d e n t i fi c a t i o n a n d s t i m u l a t i o n b y s e r o t o n i n o f i n t r i n s i c s e n s o r y n e u r o n s o f t h e s u b m u c o s a l p l e x u s o f t h e g u i n e a p i g g u t : A c t i v i t y - i n d u c e d e x p r e s s i o n o f F o s i m m u n o r e a c t i v i t y . J . N e u r o s c i . 1 2 ( 1 ) 2 2 3 5 - 2 8 1 . K l a t t B , S c h m i d t K . , a n d M a y e r B . ( 1 9 9 2 ) B r a i n n i t r i c o x i d e s y n t h a s e i s a h e m o p r o t e i n . B i a c h e m . . 1 . 2 8 8 2 1 5 - 1 7 . K l i m a s c h e w s k i L . , K u m m e r W . , M a y e r B . , C o u r a u d J . Y . , P r e i s s l e r U . , P h i l i p p i n B . , a n d H e y m C . ( 1 9 9 2 ) N i t r i c o x i d e s y n t h a s e i n c a r d i a c n e r v e fi b e r s a n d n e u r o n s o f r a t a n d g u i n e a p i g h e a r t . C i r . R e s . 7 1 , 1 5 3 3 - 1 5 3 7 . K o h J . - Y . , P e t e r s 8 . , a n d C h o i D . W . ( 1 9 8 6 ) N e u r o n s c o n t a i n i n g N A D P H - d i a p h o r a s e a r e s e l e c t i v e l y r e s i s t a n t t o q u i n o l a t e t o x i c i t y . S c i e n c e . 2 3 4 2 7 3 - 7 6 . K o n i g s m a r k B . W . ( 1 9 6 9 ) M e t h o d s f o r t h e c o u n t i n g o f n e u r o n s . I n : C o n t e m p o r a r y R e s e a r c h M e t h o d s i n N e u r a a n a t a m y . e d s . W . J . H . N a u t a a n d S . O . E . E b b e s s o n ( S p r i n g e r - V e r l a g , G e r m a n y ) . p p . 1 - 1 3 2 . K o s t a P . , J a n g E . , W a t s o n E . D . , S t e w a r t J . L . a n d D a n e i l B E . ( 1 9 9 3 ) N i t r i c o x i d e s y n t h a s e i n t h e a u t o n o m i c n e r v o u s s y s t e m o f c a n i n e i l e u m . J . P h a r m . a n d E x p T h e r . L a L a n a r d n n d p p o h s W t i . i i s S C . W e , r ( v . D u 9 g 9 w l 0 a a ) e 1 r t k i i n a o T V b J . y , . t r g e t r r a e O n fi s r c r i R p . t , i M n o o n f a t c r t n o i r n c y A g u l a t i o n o f n e u r o t r a M M n . s P , m r a t n d e t s e p r i V o e n r s r e p h e n n e o a l t I . M e y m p e e n . . t - ( b 1 i n T r e 9 n 9 d 0 i . ) n i g n N e g p N r e o u t r a e a t l s i n c v i e s r . 3 8 4 2 6 4 ( 1 ) 2 2 3 4 - 2 3 9 . K o s t e r l i t z H . W . a n d L e s s G M . ( 1 9 6 4 ) P h a r m a c o l o g i c a l a n a l y s i s o f i n t r i n s i c i n t e s t i n a l r e fl e x e s . P h a r m a c o l . R e v . 1 6 : 3 0 1 - 3 3 9 . K o s t e r l i t z H . W . a n d W a t t A J . ( 1 9 6 3 ) R e fl e x c o n t r a c t i o n s o f t h e l o n g i t u d i n a l m u s c l e o f t h e i s o l a t e d g u i n e a - p i g i l e u m , r e s i s t a n t t o t h e i n h i b i t o r y a c t i o n s o f m o r p h i n e a n d h y o s c i n e . J P h y s i o l . 1 6 9 : 1 1 5 P - 1 1 6 P . K r a n t i s A . , K e r r D J . ( 1 9 8 1 ) A u t o r a d i o g r a p h i c l o c a l i z a t i o n o f [ 3 H ] - g a m m a a m i n o b u t y r i c a c i d i n t h e m y e n t e r i c p l e x u s o f t h e g u i n e a - p i g s m a l l i n t e s t i n e . N e u r o s c i . L e t t . 2 3 : 2 6 3 - 2 6 8 . K r u i j e r W . , S c h u b e r t D . , a n d V e r r n a I . M . ( 1 9 8 5 ) I n d u c t i o n o f t h e p r o t o - o n c o g e n e f a s b y n e r v e g r o w t h f a c t o r . P r a c . N a t ] . A c a d S c i . 8 2 : 7 3 3 0 - 7 3 3 4 . K u c h e l G . A . , H e l l e n d a l l R . , a n d B l u m M . ( 1 9 9 2 ) T r a n s y n a p t i c r e g u l a t i o n o f l o w - a f fi n i t y p 7 5 n e r v e g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r m R N A p r e c e d e s a n d a c c o m p a n i e s l e s i o n - i n d u c e d c o l l a t e r a l n e u r o n a l s p r o u t i n g . E x p . N e u r a . 1 1 8 2 7 3 - 8 4 . K u m m e r W . , G i b b i n s I . L . , S t e f e n P . , a n d K a p o o r V . ( 1 9 9 0 ) C a t e c h o l a m i n e s a n d c a t e c h o l a m i n e - s y n t h e s i z i n g e n z y m e s i n g u i n e a - p i g s e n s o r y g a n g l i a . C e l l T i s s u e R e s . 2 6 1 2 5 9 5 - 6 0 6 . K u n t z A . ( 1 9 3 8 ) T h e s t r u c t u r a l o r g a n i z a t i o n o f t h e c e l i a c g a n g l i a . J . C o m p . N e u r a l . 6 9 2 1 - 1 2 . K u n t z A . a n d S a c c o m a n n o G . ( 1 9 4 4 ) R e fl e x i n h i b i t i o n o f i n t e s t i n a l m o t i l i t y m e d i a t e d t h r o u g h d e c e n t r a l i z e d p r e v e r t e b r a l g a n g l i a . J . N e u r o p h y s i o l . 7 2 1 6 3 - 1 7 0 . K u n t z A . a n d V a n B u s k i r k C . ( 1 9 4 1 ) R e fl e x i n h i b i t i o n o f b i l e fl o w a n d i n t e s t i n a l m o t i l i t y m e d i a t e d t h r o u g h d e c e n t r a l i z e d c e l i a c p l e x u s . P r a c . S a c . E x p . B i o l . M e d 4 6 : 5 1 9 - 5 2 3 . K u r a m o t o H . , F u r n e s s J . B . , a n d G i b b i n s L L . ( 1 9 9 0 ) C a l b i n d i n i m m u n o r e a c t i v i t y i n s e n s o r y a n d a u t o n o m i c g a n g l i a i n t h e g u i n e a p i g . N e u r o s c i . L e t t . 1 1 5 2 6 8 - 7 3 . L a c r o i x E . ( 1 9 6 0 ) L a c i r c u l a t i o n s p l a n c h n i q u e . A c t a G a s t r a - e n t . B e l g . 2 3 : 5 3 4 - 5 8 1 . L a m a s S . , M a r s d e n P . A . , L i G . K . , T e m p s t P . , a n d M i c h e l T . ( 1 9 9 2 ) P r a c . N a t ] . A c a d S c i . 8 9 2 6 3 4 8 - 6 3 5 2 . m o d u l a t e d b y p h o s p h o r y l a t i o n . P r a c . N a t l . A c a d S c i . 8 7 2 4 3 2 0 - 4 3 2 4 . 3 8 5 1 3 ( 8 ) : 3 4 4 - 3 5 0 . L a n d i s S C . a n d K e e f e D . ( 1 9 8 3 ) E v i d e n c e f o r n e u r o t r a n s m i t t e r p l a s t i c i t y i n v i v a : D e v e l o p m e n t a l c h a n g e s i n t h e p r o p e r t i e s o f c h o l i n e r g i c s y m p a t h e t i c n e u r o n s . D e v . B i o l . 9 8 : 3 4 9 - 3 7 2 . L a n g l e y J . N . ( 1 8 9 7 ) O n r e g e n e r a t i o n o f p r e - g a n g l i o n i c a n d o f p o s t - g a n g l i o n i c v i s c e r a l n e r v e fi b e r s . J . P h y s i o l . 2 4 5 : 9 1 - 1 3 5 . L a n g l e y J . N . ( 1 9 2 1 ) T h e A u t o n o m i c N e r v o u s S y s t e m , P a r t I . H e f f e r , C a m b r i d g e . L a n g l e y J . N . a n d A m d e r s o n H . K . ( 1 8 9 4 ) O n r e fl e x a c t i o n f r o m s y m p a t h e t i c g a n g l i a . J . P h y s i o ] . L a n d 1 6 : 4 1 0 - 4 4 0 . L a n g l e y J . N . a n d D i c k i n s o n W . L . ( 1 8 9 9 ) O n t h e l o c a l p a r a l y s i s o f t h e p e r i p h e r a l g a n g l i a a n d o n t h e c o n n e x i o n o f d i f f e r e n t c l a s s e s o f n e r v e fi b e r s w i t h t h e m . P r a c . R . S a c . L a n d 4 6 : 4 2 3 - 4 3 1 . L a s e k R . J . , D a b r o w s k i C . , N o r d l a n d e r R . ( 1 9 7 3 ) A n a l y s i s o f a x o p l a s m i c R N A f r o m i n v e r t e b r a t e a x o n s . N a t u r e . 2 4 4 : 1 6 2 - 1 6 5 . L a u L R a n d N a t h a n s D . ( 1 9 8 7 ) E x p r e s s i o n o f a s e t o f g r o w t h - r e l a t e d i m m e d i a t e e a r l y g e n e s i n B A L B / c 3 t 3 c e l l s : C o o r d i n a t e r e g u l a t i o n w i t h c - f g o r c - _ y g . P r a c . N a t l . A c a d S c i . U S A . 8 4 : 1 1 8 2 - 1 1 8 6 . L a w r e n j e w B ] . ( 1 9 3 1 ) L z u r l e h r e v o n d e r c y t o a r c h i t e c k t o n i k d e s p e r i p h e r i s c h e n a u t o n o m e n n e r v e n s y s t e m s . I . D i e c y t o a r c h i t e c k t o n i k d e r g a n g l i e n d e s v e r d a u u n g s k a n a l s b e i m h u n d e . Z . M i k r a s k A n a t . F a r s c h . 2 3 : 5 2 7 - 5 5 1 . L e a r n i n g D B . a n d C a u n a N . ( 1 9 6 0 ) A q u a l i t a t i v e a n d q u a n t i t a t i v e s t u d y o f t h e m y e n t e r i c p l e x u s o f t h e s m a l l i n t e s t i n e o f t h e c a t . J . A n a t . 9 5 ( 2 ) : ] 6 0 - 1 6 9 . L e D o u a r i n N M . ( 1 9 8 2 ) T h e N e u r a l C r e s t . C a m b r i d g e U n i v e r s i t y P r e s s , C a m b r i d g e . L e e C Y . ( 1 9 7 0 ) A d r e n e r g i c r e c e p t o r s i n t h e i n t e s t i n e . I n : S m o o t h M u s c l e . e d s . E . B i l l b r i n g e t a ] . ( A r n o l d , L o n d o n ) . L e e H . J . , E l l i o t G . J . , H a m m o n d D . N . , L e e V . M . Y . , a n d W a i n e r B . H . ( 1 9 9 1 ) C o n s t i t u t i v e e x p r e s s i o n o f t h e m a t u r e a r r a y o f n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n s b y a C N S n e u r o n a l c e l l l i n e . B r a i n R e s . 5 5 8 2 1 9 7 - 2 0 8 . L e e V . M . - Y . , W u H . L . , a n d S c h l a e p f e r W . W . ( 1 9 8 2 ) M o n o c l o n a l a n t i b o d i e s r e c o g n i z e i n d i v i d u a l n e u r o fi l a m e n t t r i p l e t p r o t e i n s . P r a c . N a t l . A c a d S c i . U S A . 7 9 , 6 0 8 9 - 6 0 9 2 . L e e Y . , T a k a m i K . , K a w a i Y . , G i r g i s S . , H i l l y a r d C . J . , M a c l n t y r e I . , E m s o n R C , a n d T o k y a r n a M . ( 1 9 8 5 ) D i s t r i b u t i o n o f c a l c i t o n i n g e n e - r e l a t e d p e p t i d e i n t h e r a t p e r i p h e r a l 3 8 6 n e r v o u s s y s t e m w i t h s p e c i a l r e f e r e n c e t o c o e x i s t e n c e w i t h s u b s t a n c e P . N e u r a s c i . 1 5 : 1 2 2 7 - 1 2 3 7 . L e f e b v r e S . a n d M u s h y n s k i , W . E . ( 1 9 8 7 ) C a l c i u m b i n d i n g t o u n t r e a t e d a n d d e p h o s p h o r y l a t e d p o r c i n e n e u r o fi l a m e n t s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 4 5 , 1 0 0 6 - 1 0 1 1 . L e f e b v r e S . a n d M u s h y n s k i , W . E . ( 1 9 8 8 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e c a t i o n - b i n d i n g p r o p e r t i e s o f p o r c i n e n e u r o fi l a m e n t s . B i o c h e m i s t r y . 2 7 , 8 5 0 3 - 8 5 0 8 . L e m b e c k F . a n d H o l z e r P . ( 1 9 7 9 ) S u b s t a n c e P a s n e u r o g e n i c m e d i a t o r o f a n t i d r o m i c v a s o d i l a t i o n a n d n e u r o g e n i c p l a s m a e x t r a v a s a t i o n . N a u n y n - S c h m i e d e b e r g s A r c h . P h a r m a c . 3 1 0 : 1 7 5 - 1 8 3 . L e t e r r i e r J . F . , L i e m R . K . H . , S h e l a n s k i M L . ( 1 9 8 1 ) P r e f e r e n t i a l p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 1 5 0 , 0 0 0 m o l e c u l a r w e i g h t c o m p o n e n t o f n e u r o fi l a r n e n t s b y a c y c l i c - A M P - d e p e n d e n t , m i c r o t u b u l e - a s s o c i a t e d p r o t e i n k i n a s e . J . C e l l B i o l . 9 0 : 7 5 5 - 7 6 0 . L e w i s T . a n d M a r v i n H M . ( 1 9 2 7 ) O b s e r v a t i o n s r e l a t i n g t o v a s o d i l a t i o n a r i s i n g f r o m a n t i d r o m i c i m p u l s e s , t o h e r p e s z o s t e r a n d t r o p h i c e f f e c t s . H e a r t . 1 4 : 2 7 - 4 6 . L i G O a n d R a n d M . J . ( 1 9 8 9 ) E v i d e n c e f o r a r o l e o f n i t r i c o x i d e i n t h e n e u r o t r a n s m i t t e r s y s t e m m e d i a t i n g r e l a x a t i o n o f t h e r a t a n o c o c c y g e u s m u s c l e . C l i n . E x p . P h a r m a c o l . P h y s i o l . 1 6 2 9 3 3 - 9 3 8 . L i e m R . K . H . , S h u - H u i Y . , S a l o m o n G . D . , a n d S h e l a n s k i M L . ( 1 9 7 8 ) I n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s i n n e r v o u s t i s s u e s . J . C e l l B i o l . 7 9 , 6 3 7 - 6 4 5 . L i n d e n b a u m M . H . , C a r b o n e t t o S . , G r o s v e l d F . , F l a v e l l D . , a n d M u s h y n s k i W . E . ( 1 9 8 8 ) T r a n s c r i p t i o n a l a n d p o s t - t r a n s l a t i o n a l e f f e c t s o f n e r v e g r o w t h f a c t o r o n e x p r e s s i o n o f t h r e e n e u r o fi l a m e n t s u b u n i t s i n P C 1 2 c e l l s . J . B i o l . C h e m . 2 6 3 : 5 6 6 2 - 5 6 6 7 . L i s t e r J . ( 1 8 5 8 ) P r e l i m i n a r y a c c o u n t o f a n i n q u i r y i n t o t h e f u n c t i o n s o f t h e v i s c e r a l n e r v e s , w i t h s p e c i a l r e f e r e n c e t o t h e s o - c a l l e d " i n h i b i t o r y s y s t e m " . P r a c . R a y . S a c . 9 : 3 6 7 - 3 8 0 . L l e w e l l y n - S m i t h I . J . , C o s t a M . , F u r n e s s J . B . , a n d B o m s t e i n J . C . ( 1 9 9 3 ) S t r u c t u r e o f t h e t e r t i a r y c o m p o n e n t o f t h e m y e n t e r i c p l e x u s i n t h e g u i n e a - p i g s m a l l i n t e s t i n e . C e l l T i s s . R e s . 2 7 2 : 5 0 9 - 5 1 6 . L l e w e l l y n - S m i t h I . J . , F u r n e s s J . B . , a n d C o s t a M . ( 1 9 8 6 ) I n n e r v a t i o n o f t h e l o n g i t u d i n a l m u s c l e o f t h e g u i n e a - p i g i n t e s t i n e . C e l l T i s s u e R e s . 2 4 4 : 1 7 3 - 1 8 0 . L l e w e l l y n - S m i t h I . J . , F u r n e s s J . B . , W i l s o n A . J . , a n d C o s t a M . ( 1 9 8 3 ) O r g a n i z a t i o n a n d fi n e s t r u c t u r e o f e n t e r i c g a n g l i a . I n : A u t o n o m i c G a n g l i a . ( e d . ) L . G . E l f v i n . ( J o h n W i l e y a n d S o n s , L o n d o n ) p p . 1 4 5 - 1 8 2 . 3 8 7 L l e w e l l y n - S m i t h I . J . , S o n g Z . - M . , C o s t a M . , B r e d t D . S . , a n d S n y d e r S H . ( 1 9 9 2 ) U l t r a s t r u c t u r a l l o c a l i z a t i o n o f n i t r i c o x i d e s y n t h a s e i m m u n o r e a c t i v i t y i n g u i n e a p i g e n t e r i c n e u r o n s . B r a i n R e s . 5 7 7 : 3 3 7 - 3 4 2 . L l e w e l l y n - S m i t h I . J . , W i l s o n A . J . , F u r n e s s J . B . , C o s t a M . a n d R u s h R . A . ( 1 9 8 1 ) U l t r a s t r u c t u r a l i d e n t i fi c a t i o n o f n o r a d r e n e r g i c a x o n s a n d t h e i r d i s t r i b u t i o n w i t h i n t h e e n t e r i c p l e x u s e s o f t h e g u i n e a - p i g s m a l l i n t e s t i n e . J . N e u r a c y t a ] . 1 0 : 3 3 1 - 3 5 2 . L o e w i , O . a n d N a v r a t i l . E . ( 1 9 2 6 ) U b e r h u m o r a l e U b e r t r a g b a r k e i t d e r H e r z n e r v e n w i r k u n g . X . M i t t e i l u n g . U b e r d a s S c h i c k s a l d e s V a g u s s t o f f . P fl r ' t g e r s A r c h . G e s a m t e P h y s i o ] , 2 1 4 : 6 7 8 - 6 8 8 . L u d w i g C . ( 1 8 5 2 ) S y m p a t h i s c h e r N e r v . L e h r b u c h d e r P h y s i o l o g i e d e s M e n s c h e n . B d . 1 . , S . ( L e i p z i g - H e i d e l b e r g ) . L u n d b e r g J . M . , D a h l s t r o m A . , L a r s s o n 1 . , P e t t e r s s o n G . , A h l m a n H . , a n d K e w e n t e r J . ( 1 9 7 8 ) E f f e r e n t i n n e r v a t i o n o f t h e s m a l l i n t e s t i n e b y a d r e n e r g i c n e u r o n s f r o m t h e c e r v i c a l s y m p a t h e t i c a n d s t e l l a t e g a n g l i a , s t u d i e d b y r e t r o g r a d e t r a n s p o r t o f p e r o x i d a s e . A c t a P h y s i o ] . S c a n d 1 0 4 2 3 3 - 4 2 . M a Q . , C u i K . , Z i a o F . , L u A . Y . , a n d Y a n g C S . ( 1 9 9 2 ) I d e n t i fi c a t i o n o f a g l y c i n e - r i c h s e q u e n c e a s a n N A D ( P ) H - b i n d i n g s i t e a n d t y r o s i n e 1 2 9 a s a d i c u m a r o l - b i n d i n g s i t e i n r a t l i v e r N A D ( P ) q u u i n o n e o x i d o r e d u c t a s e b y s i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s . J . B i o l . C h e m . 2 6 7 ( 3 1 ) : 2 2 2 9 8 - 2 2 3 0 4 . M a n n M . a n d W e s t G B . ( 1 9 5 1 ) T h e n a t u r e o f u t e r i n e a n d i n t e s t i n a l s y m p a t h i n . B r i t . J . P h a r m a c o l . 6 : 7 9 - 8 2 . M a s j a k o w s k i P . a n d S h o o t e r E M . ( 1 9 8 8 ) N e r v e g r o w t h f a c t o r i n d u c e s t h e g e n e s o f t w o p r o t e i n s r e l a t e d t o a f a m i l y o f c a l c i u m - b i n d i n g p r o t e i n s i n P C 1 2 c e l l s . P r a c . N a t l . A c a d S c i . U S A 8 5 : 1 2 7 7 - 1 2 8 1 . M a r s d e n P . A . , S c h a p p e r t K . T . , C h e m H . S . , F l o w e r s M . , S u n d e l l C . L . , W i l c o x J . N . , L a m a s S . , a n d M i c h e l T . ( 1 9 9 2 ) M o l e c u l a r c l o n i n g a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f h u m a n e n d o t h e l i a l n i t r i c o x i d e s y n t h a s e . F E B S . 3 0 7 : 2 8 7 - 2 9 3 . M a r t i n W . , S m i t h J . A . , L e w i s M . J . , a n d H e n d e r s o n A H . ( 1 9 8 8 ) E v i d e n c e t h a t i n h i b i t o r y f a c t o r e x t r a c t e d f r o m b o v i n e r e t r a c t o r p e n i s i s n i t r i t e , w h o s e a c i d - a c t i v a t e d d e r i v a t i v e i s s t a b i l i z e d n i t r i c o x i d e . B r . J P h a r m a c o l . 9 3 : 5 7 9 - 5 8 6 . M a t t h e w s M R . a n d C u e l l o A . , C . ( 1 9 8 2 ) U l t r a s t r u c t u r e a n d d i s t r i b u t i o n o f s u b s t a n c e P - i m m u n o r e a c t i v e s e n s o r y c o l l a t e r a l s i n t h e g u i n e a p i g p r e - v e r t e b r a l s y m p a t h e t i c g a n g l i a . J . C o m p . N e u r a l . 2 5 8 2 2 8 - 5 1 . M a r t i s o n J . ( 1 9 6 5 ) T h e e f f e c t o f g r a d e d v a g a l s t i m u l a t i o n o f g a s t r i c m o t i l i t y , s e c r e t i o n , a n d b l o o d fl o w i n t h e c a t . A c t a P h y s i o ] . S c a n d 6 5 2 3 0 0 - 3 0 9 . 3 8 8 M a y e r E A . a n d R a y b o u l d H E . ( 1 9 9 0 ) R o l e o f v i s c e r a l a f f e r e n t m e c h a n i s m s i n f u n c t i o n a l b o w e l d i s o r d e r s . G a s t r o e n t . 9 9 : 1 6 8 8 - 1 7 0 4 . M c C o n a l o g u e K . a n d F u r n e s s J . B . ( 1 9 9 3 ) P r o j e c t i o n s o f n i t r i c o x i d e s y n t h e s i z i n g n e u r o n s i n t h e g u i n e a p i g c o l o n . C e l l T i s s . R e s . 2 7 1 2 5 4 5 - 5 5 3 . M c K e o n F . D . , K i r s c h n e r , M . W . , a n d C a p u t , D . ( 1 9 8 6 ) H o m o l o g i e s i n b o t h p r i m a r y a n d s e c o n d a r y s t r u c t u r e b e t w e e n n u c l e a r e n v e 1 0 p e a n d i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n s . N a t u r e . 3 1 9 , 4 6 3 - 4 6 8 . M e i s s n e r G . ( 1 8 5 7 ) U b e r d i e N e r v e n d e r D a r m w a n d . Z . R a t i o n M e d N . F . 8 2 3 6 4 - 3 6 6 . M e s s e n g e r J P . a n d F u r n e s s J . B . ( 1 9 9 2 ) D i s t r i b u t i o n o f e n t e r i c n e r v e c e l l s t h a t p r o j e c t t o t h e c o e l i a c g a n g l i o n o f t h e g u i n e a - p i g . C e l l T i s s u e R e s . 2 6 9 : 1 1 9 - 1 3 2 . M e s s e n g e r J . P . a n d F u r n e s s J . B . ( 1 9 9 3 ) D i s t r i b u t i o n o f e n t e r i c n e r v e c e l l s p r o j e c t i n g t o t h e s u p e r i o r a n d i n f e r i o r m e s e n t e r i c g a n g l i a o f t h e g u i n e a - p i g . C e l l T i s s u e R e s . 2 7 1 2 3 3 3 - 3 3 9 . M i h a r a S . , K a t a y a m a Y . , a n d N i s h i S . ( 1 9 8 5 ) S l o w p o s t s y n a p t i c p o t e n t i a l s i n n e u r o n s o f s u b m u c o u s p l e x u s o f g u i n e a p i g c a e c u m a n d t h e i r m i m i c r y b y n o r a d r e n a l i n e a n d v a r i o u s p e p t i d e s . N e u r a s c i . 1 6 : 1 0 5 6 - 1 0 6 8 . M i l b r a n d t J . ( 1 9 8 6 ) N e r v e g r o w t h f a c t o r r a p i d l y - i n d u c e s c - f a s m R N A i n P C 1 2 r a t p h e o c h r o m o c y t o m a c e l l s . P r a c . N a t ] . A c a d S c i . 8 3 : 4 7 8 9 - 4 7 9 3 . M i t c h e l l J . A . , K o h l h a a s K . L . , M a t s u m o t o T . , P o l l o c k J . S . , F o r s t e r m a n n U . , W a r n e r T . D . , S c h m i d t H . H . W . a n d M u r a d F . ( 1 9 9 2 ) I n d u c t i o n o f N A D P H - D e p e n d e n t d i a p h o r a s e a n d n i t r i c o x i d e s y n t h a s e a c t i v i t y i n a o r t i c s m o o t h m u s c l e a n d c u l t u r e d m a c r o p h a g e s . M a l e . P h a r m . 4 1 : 1 ] 5 3 - 1 1 6 8 . M i o n e M . C . , S a n c e s a r i o G . , D ’ A n g e l o V . , a n d B e m a r d i G . ( 1 9 9 1 ) I n c r e a s e o f d o p a m i n e B - h y d r o x y l a s e i m m u n o r e a c t i v i t y i n n o n - n o r a d r e n e r g i c n e r v e s o f r a t c e r e b r a l a r t e r i e s f o l l o w i n g l o n g - t e r m s y m p a t h e c t o m y . N e u r a s c i . L e t t e r s . 1 2 3 2 1 6 7 - 1 7 1 . M o n c a d a S . , P a l m e r R . M . J . , a n d H i g g s E A . ( 1 9 9 1 ) N i t r i c o x i d e : P h y s i o l o g y , p a t h o p h y s i o l o g y , a n d p h a r m a c o l o g y . P h a r m . R e v . 4 3 2 1 0 9 - 1 4 2 . M o r g a n M . a n d C u r r a n T . ( 1 9 8 6 ) R o l e o f i o n fl u x i n t h e c o n t r o l o f c - f a s e x p r e s s i o n . N a t u r e . 3 3 2 : 5 5 2 - 5 5 5 . M o r g a n J . I . a n d C u r r a n T . ( 1 9 8 8 ) C a l c i r u n a s a m o d u l a t o r o f t h e i m m e d i a t e - e a r l y g e n e c a s c a d e i n n e u r o n s . C e l l C a l c i u m . 9 : 3 0 3 - 3 1 1 . M o r g a n J . I . a n d C u r r a n T . ( 1 9 8 9 ) S t i m u l u s - t r a n s c r i p t i o n c o u p l i n g i n n e u r o n s : R o l e o f 3 8 9 c e l l u l a r i r n m e d i a t e - e a r l y g e n e s . T r e n d s i n N e u r a s c i . 1 2 2 4 5 9 - 4 6 2 . M u e l l e r R . A . , T h o e n e n H . , a n d A x e l r o d J . ( 1 9 6 9 ) I n c r e a s e i n t y r o s i n e h y d r o x y l a s e a c t i v i t y a f t e r r e s e r p i n e t r e a t m e n t . J . P h a r m . E x p . T h e r . 1 6 9 2 7 4 - 7 9 . M u r p h y R . , F u r n e s s J . B . , B e a r d s l e y A . M . , a n d C o s t a M . ( 1 9 8 2 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f s u b s t a n c e P - l i k e i m m u n o r e a c t i v i t y i n p e r i p h e r a l s e n s o r y n e r v e s a n d e n t e r i c n e r v e s b y h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y a n d r a d i o i m m u n o a s s a y . R e g u l a t o r y P e p t i d e s . 4 : 2 0 3 - 2 1 2 . M u r r a y J . a n d T h o m p s o n J . ( 1 9 5 7 ) T h e o c c u r r e n c e a n d f u n c t i o n o f c o l l a t e r a l s p r o u t i n g i n t h e s y m p a t h e t i c n e r v o u s s y s t e m o f t h e c a t . J . P h y s i o ] . 1 3 5 2 1 3 3 - 1 6 2 . M u r y o b a y a s h i T . , M o r i J . , F u j i w a r a M . , S h i m a m o t o K . ( 1 9 6 8 ) F l u o r e s c e n c e h i s t o c h e m i c a l d e m o n s t r a t i o n o f a d r e n e r g i c n e r v e fi b e r s i n t h e v a g u s n e r v e o f c a t s a n d d o g s . J p n . J . P h a r m a c o l . 1 8 : 2 8 5 - 2 9 3 . N a k a g a w a S . , M i z u m a M . , I c h i k i 1 1 . , a n d S a h e k i T . ( 1 9 9 1 ) I m m u n o c y t o c h e m i c a l d e m o n s t r a t i o n o f a r g i n i n o s u c c i n a t e s y n t h e t a s e i n t h e n e u r o n a l s t r u c t u r e s o f t h e i n t e s t i n a l t r a c t a n d p a n c r e a s o f t h e J a p a n e s e m o n k e y . A c t a H i s t o c h e m . C y t o c h e m . 2 4 : 2 0 9 - 2 1 3 . N a w a H . a n d P a t t e r s o n P . ( 1 9 9 0 ) S e p a r a t i o n a n d p a r t i a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f n e u r o p e p t i d e - i n d u c i n g f a c t o r s i n h e a r t c e l l c o n d i t i o n e d m e d i u m . N e u r o n . 4 2 2 6 9 - 2 7 7 . N e i l d T O . ( 1 9 8 9 ) M e a s u r e m e n t o f a r t e r i o l e d i a m e t e r c h a n g e s b y a n a l y s i s o f t e l e v i s i o n i m a g e s . B l o o d V e s s e l s . 2 6 : 4 8 - 5 2 . N e i l d T . O . , S h e n K . Z . , a n d S u r p r e n a n t A . ( 1 9 9 0 ) V a s o d i l a t i o n o f a r t e r i o l e s b y a c e t y l c h o l i n e r e l e a s e d f r o m s i n g l e n e u r o n s i n t h e g u i n e a - p i g s u b m u c o s a l p l e x u s . J . P h y s i o l . 4 2 0 : 2 4 7 - 2 6 5 . N i c h o l s K . , S t a i n e s W . , a n d K r a n t i s A . ( 1 9 9 2 ) H i s t o c h e m i c a l l o c a l i z a t i o n o f n i t r i c o x i d e s y n t h e s i z i n g n e u r o n s a n d v a s c u l a r s i t e s i n t h e g u i n e a p i g i n t e s t i n e . N e u r a s c i . 5 3 2 5 5 3 - 5 6 0 . N i c h o l s K . , S t a i n e s W . , a n d K r a n t i s A . ( 1 9 9 3 ) N i t r i c o x i d e s y n t h a s e d i s t r i b u t i o n i n t h e r a t i n t e s t i n e : A h i s t o c h e m i c a l a n a l y s i s . G a s t r o e n t . 1 0 5 2 1 6 5 1 - 1 6 6 1 . N i l s s o n G . , L a r s s o n L . I . , H a k a n s o n R . , B r o d i n E . , P e m o w B . , a n d S u n d l e r F . ( 1 9 8 0 ) L o c a l i z a t i o n o f S P - l i k e i m m u n o r e a c t i v i t y i n m o u s e g u t . H i s t a c h e m . 4 3 : 9 7 - 9 9 . N i s h i S . a n d N o r t h R . A . ( 1 9 7 3 a ) I n t r a c e l l u l a r r e c o r d i n g f r o m t h e m y e n t e r i c p l e x u s o f t h e g u i n e a - p i g i l e u m . J . P h y s i o l . 2 3 1 : 4 7 1 - 4 9 1 . M i s h i S . a n d N o r t h R . A . ( 1 9 7 3 b ) P r e s y n a p t i c a c t i o n o f n o r a d r e n a l i n e i n t h e m y e n t e r i c p l e x u s . J . P h y s i o l . 2 3 1 : 2 9 P - 3 0 P . 3 9 0 N i x o n R . A . , B r o w n B . A . , a n d M o r o t t a C A . ( 1 9 8 2 ) P o s t t r a n s l a t i o n a l m o d i fi c a t i o n o f a n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n d u r i n g a x o p l a s m i c t r a n s p o r t : I m p l i c a t i o n s f o r r e g i o n a l s p e c i a l i z a t i o n o f C N S a x o n s . J . C e l l B i o l . 9 4 , 1 5 0 - 1 5 8 . N i x o n R . A . , L e w i s S . E . , D a h l D . , M a r o t t a C . A . , a n d D r a g e r U . C . ( 1 9 8 9 ) E a r l y p o s t t r a n s l a t i o n a l m o d i fi c a t i o n s o f t h e t h r e e n e u r o fi l a m e n t s u b u n i t s i n m o u s e r e t i n a l g a n g l i o n c e l l s : N e u r o n a l s i t e s a n d t i m e c o u r s e i n r e l a t i o n t o s u b u n i t p o l y m e r i z a t i o n a n d a x o n a l t r a n s p o r t . M a ] . B r a i n R e s . 5 2 9 3 - 1 0 8 . N i x o n R . A . , L e w i s S E , a n d M a r o t t a C A . ( 1 9 8 7 ) P o s t t r a n s l a t i o n a l m o d i fi c a t i o n o f n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n s b y p h o s p h a t e d u r i n g a x o p l a s m i c t r a n s p o r t i n r e t i n a l g a n g l i o n c e l l n e u r o n s . J . N e u r o s c i . 7 : 1 1 4 5 - 1 1 5 8 . N o g u c h i K . , D e L e o n M . , N a h i n R . L . , S e n b a E . , a n d R u d a M A . ( 1 9 9 3 ) Q u a n t i fi c a t i o n o f a x o t o m y - i n d u c e d a l t e r a t i o n o f n e u r o p e p t i d e m R N A s i n d o r s a l r o o t g a n g l i o n n e u r o n s w i t h s p e c i a l r e f e r e n c e t o n e u r o p e p t i d e Y m R N A a n d t h e e f f e c t s o f n e o n a t a l c a p s a i c i n t r e a t m e n t . J . N e u r o s c i . R e s . 3 5 : 5 4 - 6 6 . N o r b e r g , K . - A . ( 1 9 6 4 ) A d r e n e r g i c i n n e r v a t i o n o f t h e i n t e s t i n a l w a l l s t u d i e d b y fl u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y . I n t . J . N e u r a p h a r m a c a l . 3 2 3 7 9 - 3 8 2 . N o r t h R . A . , H e n d e r s o n G . , K a t a y a m a Y . , a n d J o h n s o n S M . ( 1 9 8 0 ) P r e s y n a p t i c i n h i b i t i o n o f a c e t y l c h o l i n e r e l e a s e b y 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e i n t h e e n t e r i c n e r v o u s s y s t e m . N e u r o s c i e n c e . 5 : 5 8 1 - 5 8 6 . N o r t h R . A . a n d N i s h i S . 9 1 9 7 4 ) P r o p e r t i e s o f t h e g a n g l i o n c e l l s o f t h e m y e n t e r i c p l e x u s o f t h e g u i n e a p i g i l e u m d e t e r m i n e d b y i n t r a c e l l u l a r r e c o r d i n g . I n : D a n i e l E . E . ( e d . ) P r o c . 4 t h I n t . S y m p . o n G a s t r o i n t e s t i n a l M o t i l i t y . M i t c h e l l P r e s s , V a n c o u v e r , p p . 6 6 7 - 6 7 6 . N o r t h R . A . a n d T o k i m a s a T . ( 1 9 8 2 ) M u s c a r i n i c s y n a p t i c p o t e n t i a l s i n g u i n e a - p i g m y e n t e r i c p l e x u s n e u r o n e s . J . P h y s i o ] . 3 3 3 : 1 5 1 - 1 5 6 . N o r t h R . A . , S l a c k B E , a n d S u r p r e n a n t A . ( 1 9 8 5 ) M u s c a r i n i c M I a n d M 2 r e c e p t o r s m e d i a t e d e p o l a r i z a t i o n a n d p r e s y n a p t i c i n h i b i t i o n i n g u i n e a - p i g e n t e r i c n e r v o u s s y s t e m . J . P h y s i o l . 3 6 8 : 4 3 5 - 4 5 2 . O r r e g o F . ( 1 9 7 9 ) C r i t e r i a f o r t h e i d e n t i fi c a t i o n o f c e n t r a l n e u r o t r a n s m i t t e r s a n d t h e i r a p p l i c a t i o n t o s t u d i e s w i t h s o m e n e r v e t i s s u e p r e p a r a t i o n s i n v i t r o . N e u r a s c i . 4 2 1 0 3 7 - 1 0 5 7 . O s t h a u s L . E . , a n d G a l l i g a n J . J . ( 1 9 9 1 ) A n t a g o n i s t s o f n i t r i c o x i d e s y n t h e s i s i n h i b i t n e r v e - m e d i a t e d r e l a x a t i o n s o f l o n g i t u d i n a l m u s c l e i n g u i n e a p i g i l e u m . J . P h a r m . a n d E x p T h e r . 2 6 0 ( 1 ) : ] 4 0 - 1 4 5 . P a l m e r J . M . , S c h e m a n n M . , T a m u r a K . , a n d W o o d J . D . ( 1 9 8 6 ) C a l c i t o n i n g e n e - r e l a t e d p e p t i d e e x c i t e s m y e n t e r i c n e u r o n s . E u r o p e a n J . P h a r m . 1 3 2 : 1 6 3 - 1 7 0 . 3 9 ] P a l m e r R . M . J . , A s h t o n D . S . , a n d M o n c a d a S . ( 1 9 8 8 ) V a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s s y n t h e s i z e n i t r i c o x i d e f r o m L - a r g i n i n e . N a t u r e . 3 3 3 : 6 6 4 - 6 6 6 . P a l m e r R . M . J . , F e r r i g e A . G . , a n d M o n c a d a S . ( 1 9 8 7 ) N i t r i c o x i d e r e l e a s e a c c o u n t s f o r t h e b i o l o g i c a l a c t i v i t y o f e n d o t h e l i u m - d e r i v e d r e l a x i n g f a c t o r . N a t u r e . 3 2 7 : 5 2 4 - 5 2 6 . P a l m e r R . M . J . a n d M o n c a d a S . ( 1 9 8 9 ) A n o v e l c i t r u l l i n e - f o r m i n g e n z y m e i m p l i c a t e d i n t h e f o r m a t i o n o f n i t r i c o x i d e b y v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 1 5 8 : 3 4 8 - 3 5 2 . P a p k a R . E . , F u r n e s s J . B . , D e l l a N . G . , M o r p h y R . , a n d C o s t a M . ( 1 9 8 4 ) T i m e c o u r s e o f e f f e c t o f c a p s a i c i n o n u l t r a s t r u c t u r e a n d h i s t o c h e m i s t r y o f s u b s t a n c e P i m m u n o r e a c t i v e n e r v e s a s s o c i a t e d w i t h t h e c a r d i o v a s c u l a r s y s t e m o f t h e g u i n e a - p i g . N e u r a s c i . 1 2 2 1 2 7 7 . P a r y s e k L . M . , C h i s o l d R . L . , L e t C . A . , a n d G o l d m a n R D . ( 1 9 8 8 ) A t y p e I I I i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t g e n e i s e x p r e s s e d i n m a t u r e n e u r o n s . N e u r o n 1 2 3 9 5 - 4 0 1 . P a t o n W . D . M . ( 1 9 5 5 ) T h e r e s p o n s e o f t h e g u i n e a - p i g i l e u m t o e l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n b y c o a x i a l e l e c t r o d e s . J . P h y s i o ] . 1 2 7 : 4 0 - 4 1 P . P a t o n W . D . M . ( 1 9 5 8 ) C e n t r a l a n d s y n a p t i c t r a n s m i s s i o n i n t h e n e r v o u s s y s t e m . A n n . R e v . P h y s i o ] . 2 0 : 4 3 1 - 4 7 0 . P e a r s e A . G . E . a n d P o l a k J . M . ( 1 9 7 5 ) I m m u n o c y t o c h e m i c a l l o c a l i z a t i o n o f s u b s t a n c e P i n m a m m a l i a n i n t e s t i n e . H i s t a c h e m . 4 1 : 3 7 3 - 3 7 5 . P e d e r s o n R . , O ’ D o r i s i o T . , H o w e T . , M a c l n t o s h B . , M u e i l e r H . , B r o w n J . , a n d C a t a l a n d S . ( 1 9 8 1 ) V a g a l r e l e a s e o f I R - V I P a n d I R - g a s t r i n f r o m t h e i s o l a t e d p e r f u s e d r a t s t o m a c h . M a l e . C e l l . E n d o c r i n o l . 2 3 : 2 2 5 . P e r c y W . H . , B u r t o n M . B . , F a l l i c k F . , a n d B u r a k o f f R . ( 1 9 9 0 ) A c o m p a r i s o n o f h u m a n a n d r a b b i t d i s t a l c o l o n i c m u s c l e r e s p o n s e s t o i n fl a m m a t o r y m e d i a t o r s . G a s t r o e n t . 9 9 : 1 3 2 4 - 1 3 3 2 . P e s t r o n k A . , W a t s o n D R , a n d Y u a n C M . ( 1 9 9 0 ) N e u r o fi l a m e n t p h o s p h o r y l a t i o n i n p e r i p h e r a l n e r v e : C h a n g e s w i t h a x o n a l l e n g t h a n d g r o w t h s t a t e . J . N e u r o c h e m . 5 4 ( 3 ) : 9 7 7 - 9 8 2 . P fl i i g e r E . ( 1 8 5 7 ) U b e r d a s H e m m u n g s - n e r v e n s y s t e m fi i r d i e p e r i s t a l t i s c h e n B e w e g u n g e n d e r G d e a r m e . ( B e r l i n , H i r s c h w a l d ) . P i n t o A . , A b r a h a m N . G . , a n d M u l l a n e K M . ( 1 9 8 6 ) C y t o c h r o m e P - 4 5 0 - d e p e n d e n t m o n o o x y g e n a s e a c t i v i t y a n d e n d o t h e l i a l - d e p e n d e n t r e l a x a t i o n s i n d u c e d b y a r a c h i d o n i c a c i d . J . P h a r m . E x p . T h e r . 2 3 6 2 4 4 5 - 4 5 1 . P o m p e r a n z H . D , a n d G e r s h o n M D . ( 1 9 9 0 ) C o l o n i z a t i o n o f t h e a v i a n h i n d g u t b y c e l l s 3 9 2 d e r i v e d f r o m t h e s a c r a l n e u r a l c r e s t . D e v ] . B i o l . 1 3 7 2 3 7 8 - 3 9 4 . P o m p o l o S . a n d F u r n e s s J . B . ( 1 9 8 8 ) U l t r a s t r u c t u r e a n d s y n a p t i c r e l a t i o n s h i p s o f c a l b i n d i n - r e a c t i v e , D o g i e l t y p e I I n e u r o n s , i n m y e n t e r i c g a n g l i a o f g u i n e a - p i g s m a l l i n t e s t i n e . . 1 . N e u r a c y t a ] . 1 7 : 7 7 1 - 7 8 2 . P u b l i c o v e r N . G . , H a m m o n d B . M . , a n d S a n d e r s K M . ( 1 9 9 3 ) A m p l i fi c a t i o n o f n i t r i c o x i d e s i g n a l i n g b y i n t e r s t i t i a l c e l l s i s o l a t e d f r o m c a n i n e c o l o n . P r a c . N a t ] . A c a d S c i . 9 0 2 2 0 8 7 - 2 0 9 1 . R a m a g o p a l M . V . a n d L e i g h t o n J G . ( 1 9 8 9 ) E f f e c t s o f N G - m o n o - m e t h y l - L - a r g i n i n e o n fi e l d s t i m u l a t i o n - i n d u c e d d e c r e a s e s i n c y t o s o l i c C a 2 + l e v e l s a n d r e l a x a t i o n i n t h e r a t a n o c c y g e u s m u s c l e . E u r . J . P h a r m a c o l . 1 7 4 2 2 9 7 - 2 9 9 . R a o M S . a n d L a n d i s S C . ( 1 9 9 2 ) C e l l i n t e r a c t i o n s t h a t d e t e r m i n e s y m p a t h e t i c n e u r o n t r a n s m i t t e r p h e n o t y p e a n d t h e n e u r o k i n e s t h a t m e d i a t e t h e m . J . N e u r a b i a ] . 2 4 : 2 1 5 - 2 3 2 . R a o M . S . , S u n Y . , V a i d y a n a t h a n U . , L a n d i s S C , a n d Z i g m o n d R E . ( 1 9 9 2 ) R e g u l a t i o n o f s u b s t a n c e P i s s i m i l a r t o t h a t o f v a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p e p t i d e a f t e r a x o t o m y o r e x p l a n t a t i o n o f t h e r a t s u p e r i o r c e r v i c a l g a n g l i o n . . I . N e u r a b i a ] . 2 4 : 5 7 1 - 5 8 0 . R a p o p o r t R M . a n d M u r a d F . ( 1 9 8 3 ) A g o n i s t i n d u c e d e n d o t h e l i u m - d e p e n d e n t r e l a x a t i o n i n r a t t h o r a c i c a o r t a m a y b e m e d i a t e d t h r o u g h c y c l i c G M P . C i r c . R e s . 5 2 : 3 5 2 - 3 5 7 . R e m a k R . ( 1 8 4 0 ) N e u e ' B e i t r a g e z u r K e n n t n i s v o n o r g a n i s c h e n N e r v e n s y s t e m . M e d Z V e r . H e i l k P r e u s s 9 2 7 - 8 . R o g e r s J . H . ( 1 9 8 9 ) T w o c a l c i u m - b i n d i n g p r o t e i n s m a r k m a n y c h i c k s e n s o r y n e u r o n s . N e u r a s c i . 3 1 : 6 9 7 - 7 0 9 . R e s s D . D . , P a l m e r R . M . J . , H o d s o n H . F . , a n d M o n c a d a A S . ( 1 9 8 9 ) A s p e c i fi c i n h i b i t o r o f n i t r i c o x i d e f o r m a t i o n f r o m L - a r g i n i n e a t t e n u a t e s e n d o t h e l i u m - d e p e n d e n t r e l a x a t i o n . B r i t i s h J . P h a r m a c o l . 9 6 : 4 1 8 - 4 2 4 . R o n a n C . , a n d G o n e l l a J . ( 1 9 8 1 ) E x t r i n s i c C o n t r o l o f D i g e s t i v e T r a c t M o t i l i t y . I n P h y s i o l o g y o f t h e G a s t r o i n t e s t i n a l T r a c t , e d . L . R . J o h n s o n ( R a v e n P r e s s , N e w Y o r k ) p p . 2 8 9 - 3 3 3 . R o z s a Z . , S h a r k e y K . A . , J a n c s o G . , a n d V a r r o V . ( 1 9 8 6 ) E v i d e n c e f o r a r o l e o f c a p s a i c i n - s e n s i t i v e m u c o s a ] a f f e r e n t n e r v e s i n t h e r e g u l a t i o n o f m e s e n t e r i c b l o o d fl o w i n t h e d o g . G a s t r o e n t . 9 0 : 9 0 6 - 9 1 0 . S a n d e r s K . M . , a n d W a r d S M . ( 1 9 9 2 ) N i t r i c o x i d e a s a m e d i a t o r o f n o n a d r e n e r g i c n o n c h o l i n e r g i c n e u r o t r a n s m i s s i o n . J . A m . P h y s i o ] . 2 6 2 2 G 3 7 9 - G 3 9 2 . S a t o m i H . , Y a m a t o t o T . , I s e , H . , a n d T a k a t a m a H . ( 1 9 7 8 ) P a t h w a y o f e n t e r o g a t r i c r e fl e x . 3 9 3 P r a c . S o c . E x p . B i o l . M e d . 1 0 1 2 4 0 7 - 4 0 9 . S c h e m a n n M . , S a n n H . , S c h a a f , C . , a n d M a d e r , M . ( 1 9 9 3 ) I d e n t i fi c a t i o n o f c h o l i n e r g i c n e u r o n s i n e n t e r i c n e r v o u s s y s t e m b y a n t i b o d i e s a g a i n s t c h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e . A m . J . P h y s i o ] . 2 8 2 G 1 0 0 5 - G 1 0 0 9 . S c h e r e r - S i n g l e r U . , V i n c e n t S . R . , K i m u r a H . , a n d M c G e e r E . G . ( 1 9 8 3 ) D e m o n s t r a t i o n o f a u n i q u e p o p u l a t i o n o f n e u r o n s w i t h N A D P H d i a p h o r a s e h i s t o c h e m i s t r y . J . N e u r o s c i . M e t h o d s . 9 2 2 2 8 - 2 3 4 . S c h i l l i n g K . a n d P i l g r i m C . ( 1 9 9 0 ) E x p r e s s i o n o f n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n s i n d e v e l o p i n g n e u r o n s . A c t a H i s t a c h e m i c a S u p p l - B a n d X X X V I I I . 5 : 7 7 - 8 0 . S c h m i d t H . H . H . W . , P o l l o c k J . S . , N a k a n e M . , F t i r s t e r m a n n U . , a n d M u r a d F . ( 1 9 9 2 ) C a z i / c a l m o d u l i n - r e g u l a t e d n i t r i c o x i d e s y n t h a s e s . C e l l C a l c i u m . 1 3 : 4 2 7 - 4 3 4 . S c h m u e d L C , a n d F a l l o w J . H . ( 1 9 8 6 ) F l u o r o - g o l d : A n e w fl u o r e s c e n t r e t r o g r a d e a x o n a l t r a c e r w i t h n u m e r o u s u n i q u e p r o p e r t i e s . B r a i n R e s . 3 7 7 2 1 4 7 - 1 5 4 . S c h u l t z b e r g M . , H o k f e l t T . , N i l s s o n G . , T e r e n i u s L . , R e h f e l d J . F l . , B r o w n M . , E l d e R . , G o l d s t e i n M . , a n d S a i d S . ( 1 9 8 0 ) D i s t r i b u t i o n o f p e p t i d e - a n d c a t e c h o l a m i n e - c o n t a i n i n g n e u r o n s i n t h e g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t o f r a t a n d g u i n e a - p i g : i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t u d i e s w i t h a n t i s e r a t o s u b s t a n c e P , v a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p o l y p e p t i d e , e n k e p h a l i n s , s o m a t o s t a t i n , g a s t r i n / c h o l e c y s t o k i n i n , n e u r o t e n s i n , a n d d o p a m i n e B - h y d r o x y l a s e . N e u r a s c i . 5 2 6 8 9 - 7 4 4 . S e e N . A . , E p s t e i n M . L . , D a h l J . L . , a n d B a s s P . ( 1 9 9 0 ) T h e m y e n t e r i c p l e x u s r e g u l a t e s c e l l g r t h i n r a t j e j u n u m . J . A u t o . N e r v . S y s . 3 1 : 2 1 9 - 2 3 0 . S e n d t n e r M . , S t o c k l i K . A . , a n d T h o e n e n H . ( 1 9 9 2 ) S y n t h e s i s a n d l o c a l i z a t i o n o f c i l i a r y n e u r o t r o p h i c f a c t o r i n t h e s c i a t i c n e r v e o f t h e a d u l t r a t a f t e r l e s i o n d u r i n g r e g e n e r a t i o n . J . C e l l B i o l . 1 1 8 : 1 3 9 - 1 4 8 . S e m b a T . a n d M i z o n i s h i T . ( 1 9 7 8 ) A t r o p i n e - r e s i s t a n t e x c i t a t i o n o f m o t i l i t y o f t h e d o g s t o m a c h a n d c o l o n i n d u c e d b y s t i m u l a t i o n o f t h e e x t t i n s i c n e r v e s a n d t h e i r c e n t e r s . J p n . J . P h y s i o ] . 2 8 : 2 3 9 - 2 4 8 . S h a p i r o H . a n d W o o d w a r d E R . ( 1 9 5 9 ) P a t h w a y o f e n t e r o g a t r i c r e fl e x . P r a c . S o c . E x p . B i o l . 1 0 1 , 4 0 7 - 4 0 9 . S h a r k e y K . A . , C o g g i n s P . J . , T e t z l a f f W . , Z w i e r s H . , B i s b y M . A . , a n d D a v i s o n 1 . 8 . ( 1 9 9 0 ) D i s t r i b u t i o n o f g r o w t h - a s s o c i a t e d p r o t e i n , B - S O ( G A P - 4 3 ) i n t h e m a m m a l i a n e n t e r i c n e r v o u s s y s t e m . N e u r o s c i e n c e . 3 8 ( 1 ) : l 3 - 2 0 . S h a r p G . A . , S h a w G . , a n d W e b e r K . ( 1 9 8 2 ) I m m u n o e l e c t r o n - m i c r o s c o p i c a l l o c a l i z a t i o n s t u d y o f t h e n e u r o fi l a m e n t t r i p l e t p r o t e i n s a l o n g n e u r o fi l a r n e n t s o f c u l t u r e d d o r s a l r o o t g a n g l i o n c e l l s . E x p . C e l l R e s . 1 3 7 , 4 0 3 - 4 1 3 . 3 9 4 S h a w G . ( 1 9 8 6 ) N e u r o fi l a m e n t : A b u n d a n t b u t m y s t e r i o u s s t r u c t u r e s . B i a a s s a y s 4 : 1 6 1 - 1 6 6 . S h a w G . ( 1 9 9 1 ) N e u r o fi l a m e n t p r o t e i n s . I n : B u r g o y n e , R . D . ( e d . ) T h e N e u r o n a l C y t o s k e l e t o n . W i l e y - L i s s , N e w Y o r k , 1 8 5 - 2 1 4 . S h a w G . M . , O s b o r n M . , a n d W e b e r K . ( 1 9 8 1 ) A n i m m u n o fl u o r e s c e n c e m i c r o s c o p i c a l s t u d y o f t h e n e u r o fi l a m e n t t r i p l e t p r o t e i n s v i m e n t i n , a n d g l i a l fi b r i l l a r y a c i d i c p r o t e i n w i t h i n t h e a d u l t r a t b r a i n . E u r . J . C e l l B i o l . 2 6 , 6 8 - 8 2 . S h a w G . M . , O s b o r n M . , a n d W e b e r K . ( 1 9 8 1 ) A r r a n g e m e n t o f n e u r o fi l a m e n t s , m i c r o t u b u l e s , a n d m i c r o fi l a m e n t - a s s o c i a t e d p r o t e i n s i n c u l t u r e d d o r s a l r o o t g a n g l i o n n e u r o n s . E u r . J . C e l l B i o l . 2 4 , 2 0 - 2 7 . S h a w G . M . , a n d W e b e r K . ( 1 9 8 1 ) T h e d i s t r i b u t i o n o f n e u r o fi l a m e n t t r i p l e t p r o t e i n s w i t h i n i n d i v i d u a l n e u r o n e s . E x p . C e l l R e s . 1 3 6 , 1 1 9 - 1 2 5 . S h e n g M . a n d G r e e n b e r g M . E . 9 1 9 9 0 ) T h e r e g u l a t i o n a n d f u n c t i o n o f c - f a s a n d o t h e r i r n m e d i a t e - e a r l y g e n e s i n t h e n e r v o u s s y s t e m . N e u r o n . 4 : 4 7 7 - 4 8 5 . S h i m o s e g a w a T . , A b e T . , S a t o h A . , A b e R . , K i k u c h i Y . , K o i z u m i M . , a n d T o y o t a T . ( 1 9 9 3 ) N A D P H - d i a p h o r a s e a c t i v i t y i n n e u r o n s o f t h e m a m m a l i a n p a n c r e a s : C o e x p r e s s i o n w i t h v a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p o l y p e p t i d e . G a s t r o e n t . 1 0 5 : 9 9 9 - 1 0 0 8 . S h u t t l e w o r t h C . W . , Z u e C . , W a r d S . M . , D e V e n t e J . , a n d S a n d e r s K M . ( 1 9 9 3 ) I m m u n o h i s t o c h e m i c a l l o c a l i z a t i o n o f 3 ’ , 5 ’ - c y c l i c c u a n o s i n e m o n o p h o s p h a t e i n t h e c a n i n e p r o x i m a l c o l o n : R e s p o n s e s t o n i t r i c o x i d e a n d e l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n o f e n t e r i c i n h i b i t o r y n e u r o n s . N e u r a s c i . 5 6 : 5 1 3 - 5 2 2 . S h y n e - A t h w a l S . , R i c c i o R . V . , C h a k r a b o r t y G . , I n g o g l i a N A . ( 1 9 8 6 ) P r o t e i n m o d i fi c a t i o n s b y a m i n o a c i d a d d i t i o n i s i n c r e a s e d i n c r u s h e d s c i a t i c b u t n o t o p t i c n e r v e s . S c i n e c e . 2 3 1 1 6 0 3 - 6 0 5 . S i h a g R . L . , J e n g A . Y . , a n d N i x o n R . A . ( 1 9 8 8 ) P h o s p h o r y l a t i o n o f n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n s b y p r o t e i n k i n a s e C . F E B S L e t t . 2 3 3 : 1 8 1 - 1 8 5 . S i l v e r , A . ( 1 9 7 4 ) T h e B i o l o g y o f C h a l i n e s t e r a s e s . N o r t h - H o l l a n d , A m s t e r d a m . S h i k a n o K . , L o n g C . J . , O h l s t e i n B . H . , a n d B e r k o t i w z B A . ( 1 9 8 8 ) C o m p a r a t i v e p h a r m a c o l o g y o f e n d o t h e l i u m - d e r i v e d r e l a x i n g f a c t o r a n d n i t r i c o x i d e . J . P h a r m . a n d E x p . T h e r . 2 4 7 : 8 7 3 - 8 8 1 . S i n g e r H A . a n d P e a c h M . J . ( 1 9 8 3 ) E n d o t h e l i u m - d e p e n d e n t r e l a x a t i o n o f r a b b i t a o r t a . 1 . R e l a x a t i o n s t i m u l a t e d b y a r a c h i d o n i c a c i d . J . P h a r m . E x p . T h e r . 2 2 6 : 7 9 0 - 7 9 5 . S m i t h P . G . , H o f f m a n T . L . , a n d R e d d y H . ( 1 9 9 1 ) S p r o u t i n g o f a b e r r a n t n e u r o p e p t i d e Y - 3 9 5 i m m u n o r e a c t i v e s y m p a t h e t i c n e r v e s i n t o n e o n a t a l l y d e n e r v a t e d s m o o t h m u s c l e . R e g . P e p t i d e s . 3 5 : 1 0 3 - 1 1 3 . S n i d e r R . M . , C o n s t a n t i n e J . W . , L o w e J . A . I I I . , L o n g o K . P . , L e b e l W . S . , W o o d y H . A . , D r o z d a S . E . , D e s a i M . C . , V i n i c k P . J . , S p e n c e r R . W . , a n d H e s s H . J . ( 1 9 9 1 ) A p o t e n t n o n p e p t i d e a n t a g o n i s t o f t h e s u b s t a n c e P ( N K l ) r e c e p t o r . S c i e n c e . 2 5 1 : 4 3 5 - 4 3 7 . S o n g Z . - M . , B r o o k e s S . J . H . , S t e e l e P . A . , a n d C o s t a M . ( 1 9 9 2 ) P r o j e c t i o n s a n d p a t h w a y s o f s u b m u c o u s n e u r o n s t o t h e m u c o s a o f t h e g u i n e a - p i g s m a l l i n t e s t i n e . C e l l T i s s u e R e s . 2 6 9 2 8 7 - 9 8 . S t a r k M . E . , B a u e r A . J . , a n d S z u r s z e w s k i J . H . ( 1 9 9 3 ) E f f e c t o f n i t r i c o x i d e o n c i r c u l a r m u s c l e o f t h e c a n i n e s m a l l i n t e s t i n e . J . P h y s i o ] . S t e f a n i n i M . , D e M a r t i n o C . , a n d Z a m b o n i L . ( 1 9 6 7 ) F i x a t i o n o f e j a c u l a t e d s p e r m a t o z o a f o r e l e c t r o n m i c r o s c o p y . N a t u r e . 2 1 6 : 1 7 4 - 1 7 4 . S t e i n R . , M o r i N . , M a t t h e w s K . , L o L C , a n d A n d e r s o n D J . ( 1 9 8 8 ) T h e N G F - i n d i c u b i l e S C G 1 0 m R N A e n c o d e s a n o v e l m e m b r a n e - b o u n d p r o t e i n p r e s e n t i n g r o w t h c o n e s a n d a b u n d a n t i n d e v e l o p m e n t n e u r o n s . N e u r o n . 1 : 4 6 3 - 4 7 6 . S t e m b e r g e r L A . ( 1 9 7 4 ) I m m u n o c y t o c h e m i s t r y . ( P r e n t i c e H a l l , E n g l e w o o d C l i f f s , N e w J e r s e y ) . S t e m b e r g e r L . A . , a n d S t e m b e r g e r N H . ( 1 9 8 3 ) M o n o c l o n a l a n t i b o d i e s d i s t i n g u i s h p h o s p h o r y l a t e d a n d n o n p h o s p h o r y l a t e d f o r m s o f n e u r o fi l a m e n t s i n s i t u . P r a c . N a t l . A c a d S c i . U S A . 8 0 : 6 1 2 6 - 6 1 3 0 . S t e r n i n i C . ( 1 9 8 7 ) D i s t r i b u t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f c a l c i t o n i n g e n e - r e l a t e d p e p t i d e i m m u n o r e a c t i v i t y i n t h e d i g e s t i v e s y s t e m o f n o r m a l a n d c a p s a i c i n - t r e a t e d r a t s . G a s t r o e n t . 9 3 : 8 5 2 - 8 6 2 . S t e r n i n i C . ( 1 9 9 1 ) T a c h y k i n i n a n d c a l c i t o n i n g e n e - r e l a t e d p e p t i d e i m m u n o r e a c t i v i t i e s a n d R N A s i n t h e m a m m a l i n a e n t e r i c n e r v o u s s y s t e m a n d s e n s o r y g a n g l i a . I n S e n s o r y N e r v e s a n d N e u r a p e p t i d e s i n G a s t r o e n t e r a l a g y , ( e d ) . M . C o s t a e t a ] . ( P l e n u m P r e s s , N Y ) p p . 3 9 - 5 1 . S t e v e n s L . M . a n d L a n d i s S C . ( 1 9 9 0 ) T a r g e t i n fl u e n c e s o n t r a n s m i t t e r c h o i c e b y s y m p a t h e t i c n e u r o n s d e v e l o p i n g i n t h e a n t e r i o r c h a m b e r o f t h e e y e . D e v . B i o l . 1 3 7 2 1 0 9 - 1 2 4 . S t o v i c h e k G . V . a n d N i k u l i n V . M . ( 1 9 7 0 ) R e a c t i v i t y o f n e u r o n s i n a n i n t e s t i n a l g r a f t . N e u r a s c i . T r a n s ] . 1 1 : 1 0 7 - 1 1 3 . S u n Y . , R a o M . S . , L a n d i s 8 . 0 , a n d Z i g m o n d R E . ( 1 9 9 2 ) D e p o l a r i z a t i o n i n c r e a s e s v a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p e p t i d e - a n d s u b s t a n c e P - l i k e i m m u n o r e a c t i v i t i e s i n c u l t u r e d n e o n a t a l 3 9 6 a n d a d u l t s y m p a t h e t i c n e u r o n s . J . N e u r o s c i . 1 2 : 3 7 1 7 - 3 7 2 8 . S u r p r e n a n t A . ( 1 9 8 4 ) T w o t y p e s o f n e u r o n e s l a c k i n g s y n a p t i c i n p u t i n t h e s u b m u c o u s p l e x u s o f g u i n e a - p i g s m a l l i n t e s t i n e . J . P h y s i o ] . 3 5 1 2 3 6 3 - 3 7 8 . S u r p r e n a n t A . ( 1 9 8 5 ) T r a n s m i t t e r m e c h a n i s m s i n t h e e n t e r i c n e r v o u s s y s t e m . I n T r e n d s i n A u t o n o m i c P h a r m a c o l o g y . v o l . 3 . , e d . K a l s n e r , 8 . , p p . 7 1 - 9 8 . U r b a n a n d S c h w a r z e n b e r g , B a l t i o m o r e , M D , U S A . S w a n s o n L . W , a n d S a w c h e n k o P E . ( 1 9 8 2 ) S o m e fl u o r e s c e n t c o u n t e r s t a i n s f o r n e u r o a n a t o m i c a l s t u d i e s . J . H i s t o c h e m . a n d C y t o c h e m . 3 0 ( 2 ) , 1 2 1 - 1 2 8 . S y m e s J . , R a o e M . S , L e w i s S . E . , L a n d i s S . C . , H y m a n S E , a n d F i n k S . ( 1 9 9 3 ) C i l i a r y n e u r o t r o p h i c f a c t o r c o o r d i n a t e l y a c t i v a t e s t r a n s c r i p t i o n o f n e u r o p e p t i d e g e n e s i n a n e u r o b l a s t o m a c e l l l i n e . P r a c . N a t ] . A c a d S c i . 9 0 : 5 7 2 - 5 7 6 . S z e r b J . C . ( 1 9 7 5 ) E n d o g e n o u s a c e t y l c h o l i n e r e l e a s e a n d l a b e l l e d a c e t y l c h o l i n e f o r m a t i o n f o r m 3 H c h o l i n e i n t h e m y e n t e r i c p l e x u s o f t h e g u i n e a p i g i l e u m . C a n J . P h y s i o l . P h a r m . 5 3 : 5 6 6 - 5 7 4 . S z e r b J . C . ( 1 9 7 6 ) S t o r a g e a n d r e l e a s e o f l a b e l l e d a c e t y l c h o l i n e i n t h e m y e n t e r i c p l e x u s o f t h e g u i n e a - p i g i l e u m . C a n . J . P h y s i o ] . P h a r m a c a ] . 5 4 2 1 2 - 2 2 . S z o l c s a n y i J . a n d B a r t h o L . ( 1 9 7 8 ) N e w t y p e o f n e r v e - m e d i a t e d c h o l i n e r g i c c o n t r a c t i o n s o f t h e g u i n e a - p i g s m a l l i n t e s t i n e a n d i t s s e l e c t i v e b l o c k a d e b y c a p s a i c i n . N a u n y n - S c h m e i e d e b e r g ’ s A r c h . P h a r m a c o l . 3 0 5 2 8 3 - 9 0 . S z u r s z e w s k i J . H . , a n d K i n g B R ( 1 9 8 9 ) P h y s i o l o g y i f p r e v e r t e b r a l g a n g l i a i n m a m m a l s w i t h s p e c i a l r e f e r e n c e t o i n t e r i o r m e s e n t e r i c g a n g l i o n . I n : H a n d b o o k o f P h y s i o l o g y , T h e G a s t r o i n t e s t i n a l S y s t e m . ( e d . ) J . D . W o o d ( A m e r i c a n P h y s i o l o g i c a l S o c i e t y , B e t h e s d a ) p p . 5 1 9 - 5 9 2 . T a k a k i M . a n d N a k a y a m a S . ( 1 9 8 8 ) E f f e c t s o f m e s e n t e r i c n e r v e s t i m u l a t i o n o n t h e e l e c t r i c a l a c t i v i t y o f m y e n t e r i c n e u r o n s i n t h e g u i n e a p i g i l e u m . B r a i n R e s . 4 4 2 2 3 5 1 - 3 5 3 . T a l m a g e E . K . a n d M a w e G M . ( 1 9 9 3 ) N A D P H - d i a p h o r a s e a n d V I P a r e c o - l o c a l i z e d i n n e u r o n s o f g a l l b l a d d e r g a n g l i a . J . A u t o . N e r v . S y s t . 4 3 : 8 3 - 9 0 . T a n a k a E . , M i y a m o t o E . , T a s h i r o T . , K o m i y a Y . , K u r o k a w a M . ( 1 9 8 4 ) C a l c i u m - c a l d o d u l i n - d e p e n d e n t a n d c y c l i c A M P - d e p e n d e n t p h o s p h o r y l a t i o n o f n e u r o fi l a m e n t s a n d g l i a l fi b r i l l a r y a c i d i c p r o t e i n . B i o m e d R e s . 5 2 2 3 9 - 2 4 4 . T h i e fi n G . , R a y b o u l d H . E . , L e u n g F . W . , T a c h é Y . , a n d G u t h R H . ( 1 9 9 0 ) C a p s a i c i n - s e n s i t i v e a f f e r e n t fi b e r s c o n t r i b u t e t o g a s t r i c m u c o s a l b l o o d fl o w r e s p o n s e t o e l e c t r i c a l v a g a l s t i m u l a t i o n . A m . J . P h y s i o ] . 2 5 9 2 G 1 0 3 7 - G 1 0 4 3 . 3 9 7 T h o m a s E . a n d P e a r s e A . G . E . ( 1 9 6 1 ) T h e fi n e l o c a l i z a t i o n o f d e h y d r o g e n a s e s i n t h e n e r v o u s s y s t e m . H i s t a c h e m i e . 2 2 2 6 6 - 2 7 2 . T h o m a s E . a n d P e a r s e A . G . E . ( 1 9 6 4 ) T h e s o l i t a r y a c t i v e c e l l s h i s t o c h e n r i c a l d e m o n s t r a t i o n o f d a r n a g e - r e s i t a n t n e r v e c e l l s w i t h a T P N - d i a p h o r a s e r e a c t i o n . A c t a N e u r a p a t h a l . 3 2 3 2 6 - 3 3 7 . T o d a N . , B a b a H . , a n d O k a m u r a T . ( 1 9 9 0 ) R o l e o f n i t r i c o x i d e i n n o n - a d r e n e r g i c , n o n - c h o l i n e r g i c n e r v e - m e d i a t e d r e l a x a t i o n i n d o g d u o d e n a l l o n g i t u d i n a l m u s c l e s t r i p s . J a p a n e s e J o u r n a l o f P h a r m a c o l o g y . 5 3 2 2 8 1 - 2 8 4 . T o h C . C . , L e e s T S , a n d K i a n g A K . ( 1 9 5 5 ) T h e p h a r m a c o l o g i c a l a c t i o n s o f c a p s a i c i n a n d a n a l o g u e s . B r . J . P h a r m a c o l . 1 0 : 1 7 5 - 1 8 2 . T o n i n i M . a n d C o s t a M . ( 1 9 9 0 ) A p h a r a c o l o g i c a l a n a l y s i s o f t h e n e u r o n a l c i r c u i t r y i n v o l v e d i n d i s t e n s i o n - e v o k e d e n t e r i c e x c i t a t o r y r e fl e x . N e u r a s c i . 3 2 7 8 7 - 7 9 5 . T o n i n i M . , F r i g o G . , L e c c h i n i S . , D ’ A n g e l o L . , a n d C r e m a A . 9 1 9 8 1 ) H y o s c i n e - r e s i s t a n t p e r i s t a l s i s i n g u i n e a - p i g i l e u m . E u r o p e a n J . P h a r m . 7 1 2 3 7 5 - 3 8 1 . T o r p h y T . J . , F i n e C . F . , B u r m a n M . , B a r n e t t e M S , a n d O r m s b e e H S . ( 1 9 8 6 ) L o w e r e s o p h a g e a l s p i n c t e r r e l a x a t i o n i s a s s o c i a t e d w i t h i n c r e a s e d c y c l i c n u c l e o t i d e c o t e n t . A m . J . P h y s i o ] . G 7 8 6 - G 7 9 3 . T o t t r u p A . , K u n d s e n M . A . , a n d G r e g e r s e n H . ( 1 9 8 6 ) T h e r o l e o f t h e L - A r g i n i n e - n i t r i c o x i d e p a t h w a y i n r e l a x a t i o n o f t h e o p o s s u m l o w e r e s o p h a g e a l s p h i n c t e r . B r . J . P h a r m . 1 0 4 2 1 1 3 - 1 1 6 . T r a n z e r J P . a n d T h o e n e n H . ( 1 9 6 7 ) U l t r a m o r p h o l o g i s c h e V e r a n d e r t m g e n d e r s y m p a t i s c h e n N e r v e n e n d i g u n g e n d e r K a t z e n a c h V o r b e h a n d l i n g m i t 5 - a n d 6 - H y d r o x y - D o p a m i n . N a u n y n - S c h m i e d e b e r g s A r c h . E x p . P a t h o l . P h a r m a k a ] . 2 5 7 2 3 5 3 . T r e n d e l e n b u r g P . ( 1 9 7 1 ) p h y s i o l o g i s c h e u n d p h a r m a k o l o g i s c h e V e r s u c h e fi b e r d i e D i t n n d a r m P e r i s t a l t i c k . N a u y n - S c h m i e d e g e r s A r c h . E x p . P a t h o l . P h a r m a k a ] . 8 1 2 5 5 - 1 2 9 . T r o j a n o w s k i J . Q . , O b r o c k a M . A . , a n d L e e V . M - Y . ( 1 9 8 5 ) D i s t r i b u t i o n o f n e u r o fi l a m e n t s u b u n i t s i n n e u r o n s a n d n e u r o n a l p r o c e s s e s : I m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t u d i e s o f b o v i n e c e r e b e l l u m w i t h s u b u n i t - s p e c i fi c m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s T r o j a n o w s k i J . Q . , W a l k e n s t e i n N . , a n d L e e V . M . - Y . ( 1 9 8 6 ) E x p r e s s i o n o f n e u r o fi l a m e n t s u b u n i t s i n n e u r o n s o f t h e c e n t r a l a n d p e r i p h e r a l n e r v o u s s y s t e m : A n i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t u d y w i t h m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s . J . N e u r o s c i . 6 , 6 5 0 - 6 6 0 . U d d m a n R . , E d v i n s s o n L . , K e b l a d E . , H a k a n s o n R . , a n d S u n d l e r F . ( 1 9 8 6 ) C a l c i t o n i n g e n e - r e l a t e d p e p t i d e ( C G R P ) : p e r i v a s c u l a r d i s t r i b u t i o n a n d v a s o d i l a t o r y e f f e c t s . R e g . P e p t i d e s . 1 5 2 1 . 3 9 8 V a l l a n o M . I . , B u c k h o l z T . M . , a n d D e L o r e n z o R . J . ( 1 9 8 5 ) P h o s p h o r y l a t i o n o f n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n s b y e n d o g e n o u s c a l c i u m / c a l m o d u l i n d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 3 0 2 9 5 7 - 9 6 3 . v a n D e r Z e e C . E . E . M . , F a w c e t t J . , a n d D i a m o n d J . ( 1 9 9 2 ) A n t i b o d y t o N G F i n h i b i t s c o l l a t e r a l s p r o u t i n g o f s e p t o h i p p o c a m p a l fi b e r s f o l l o w i n g e n t o r h i n a l c o r t e x l e s i o n i n a d u l t r a t s . J . C o m p . N e u r a l . 3 2 6 2 9 1 - 1 0 0 . v a n H a r m G . L . ( 1 9 6 3 ) R e s p o n s e s o f m u s c l e s o f e a t s m a l l i n t e s t i n e t o a u t o n o m i c n e r v e s t i m u l a t i o n . A m . J . P h y s i o l . 2 0 4 : 3 5 2 - 3 5 8 . V e r h a a g e n J . , O e s t r e i c h e r A . B . , G i s p e n W . H . , a n d M a r g o l i s F . L . ( 1 9 8 9 ) T h e e x p r e s s i o n o f t h e g r o w t h a s s o c i a t e d p r o t e i n B - 5 0 / G A P - 4 3 i n t h e o l f a c t o r y s y s t e m o f n e o n a t a l a n d a d u l t r a t s . J . N e u r o s c i . 9 2 6 8 3 - 6 9 1 . V e r m a I . M . a n d S a s s o n e - C o r s c i B L . ( 1 9 8 7 ) P r o t o - o n c o g e n e f o s : C o m p l e x b u t v e r s a t i l e r e g u l a t o i n . C e l l . 5 1 : 5 1 3 - 5 1 4 . V i c k e r s J . C . , C h i u F . C . , a n d C o s t a M . ( 1 9 9 2 ) S e l e c t i v e d i s t r i b u t i o n o f t h e 6 6 - k D a n e u r o n a l i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n i n t h e s e n s o r y a n d a u t o n o m i c n e r v o u s s y s t e m o f t h e g u i n e a - p i g . B r a i n R e s . 5 8 5 , 2 0 5 - 2 1 1 . V i c k e r s J . C . , C o s t a M . , V i t a d e l l o M . , D a h l D . , a n d M a r o t t a C A . ( 1 9 9 0 ) N e u r o fi l a m e n t p r o t e i n - t r i p l e t i m m u n o r e a c t i v i t y i n d i s t i n c t s u b p o p u l a t i o n s o f p e p t i d e - c o n t a i n i n g n e u r o n s i n t h e g u i n e a - p i g c o e l i a c g a n g l i o n . N e u r o s c i . 3 4 , 7 4 3 - 7 5 9 . V i t a d e l l o M . , T r i b a n C . , F a b r i s M . , D o n a M . , G o r i o A . , a n d S c h i a f fi n o S . , ( 1 9 8 7 ) A d e v e l o p m e n t a l l y r e g u l a t e d i s o f o r m o f 1 5 0 , 0 0 0 m o l e c u l a r w e i g h t n e u r o fi l a m e n t p r o t e i n s p e c i fi c a l l y e x p r e s s e d i n a u t o n o m i c a n d s m a l l s e n s o r y n e u r o n s . N e u r o s c i . 2 3 , 9 3 1 - 9 4 1 V i z i E . S . , K n o l l J . ( 1 9 7 1 ) T h e e f f e c t s o f s y m p a t h e t i c n e r v e s t i m u l a t i o n a n d g u a n e t h i d i n e o n p a r a s y m p a t h e t i c n e u r o e f f e c t o r t r a n s m i s s i o n ; t h e i n h i b i t i o n o f a c e t y l c h o l i n e r e l e a s e . J . P h a r m . P h a r m a c o l . 2 3 : 9 1 8 - 9 2 5 . V o n B a s c h S . ( 1 8 7 3 ) D i e h e m m u n d d e r d a r m b e w e g u n g d u r c h d e n n e r v u s s p l a n c h n i c u s . S i t z . A k a d W i s s . W i e n , , A b t h 1 1 1 . 6 8 2 7 - 2 8 . V o n E u l e r U S . a n d G a d d u m J . H . ( 1 9 3 1 ) A n u n i d e n t i fi e d d e p r e s s o r s u b s t a n c e i n c e r t a i n t i s s u e e x t r a c t s . J . P h y s i o ] . 2 0 5 : 5 4 9 - 5 6 2 . W a l i c k e P . A . , C a m p e n o t R B , a n d P a t t e r s o n P H . ( 1 9 7 7 ) D e t e r m i n a t i o n o f t r a n s m i t t e r f u n c t i o n b y n e u r o n a l a c t i v i t y . P r a c . N a t l . A c a d S c i . U S A . 7 4 : 5 7 6 7 - 5 7 7 1 . W a l k e r D . G . ( 1 9 6 3 ) A s u r v e y o f d e h y d r o g e n a s e s i n v a r i o u s e p i t h e l i a l c e l l s i n t h e r a t . J o u r n a l C e l l B i o l o g y . 1 7 2 2 5 5 - 2 7 7 . 3 9 9 W a n g G . Y . , H i r a i K . I . , S h i m a d a H . , T a j i S . , a n d Z h o n g 8 . 2 . ( 1 9 9 2 ) B e h a v i o r o f a x o n s , s c h w a n n c e l l s a n d p e r i n e u i a l c e l l s i n n e r v e r e g n e r a t i o n w i t h i n t r a n s p l a n t e d n e r v e g r a f t s : e f f e c t s o f a n t i - l a m i n i n a n d a n t i - fi b r o n e c t i n a n t i s e r a . B r a i n R e s . 5 8 3 : 2 1 6 - 2 2 6 . W a r d S . M . , Z u e C . , S h u t t l e w o r t h C . W . , B r e d t D . S . , S n y d e r S H , a n d S a n d e r s K M . ( 1 9 9 2 ) N A D P H d i a p h o r a s e a n d n i t r i c o x i d e s y n t h a s e c o l o c a l i z a t i o n i n e n t e r i c n e u r o n s o f c a n i n e p r o x i m a l c o l o n . A m . J . P h y s i o l . 2 6 3 2 G 2 7 7 - G 2 8 4 . W a t s o n D . F . , G r i f fi n J . W . , F i t t r o K . P . , a n d H o f f m a n P . N . ( 1 9 8 9 ) P h o s p h o r y l a t i o n - d e p e n d e n t i m m u n o r e a c t i v i t y o f n e u r o fi l a m e n t s i n c r e a s e s d u r i n g a x o n a l m a t u r a t i o n a n d B - B i - i m i n o d i p r o p i o n i t r i l e i n t o x i c a t i o n . J . N e u r o c h e m . 5 3 : 1 8 1 8 - 1 8 2 9 . W e r m a n R . ( 1 9 6 6 ) A r e v i e w - c r i t e r a f o r i d e n t i fi c a t i o n o f a c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m t r a n s m i t t e r . C o m p . B i o c h e m . P h y s i o l . 1 8 2 7 4 5 - 7 6 6 , W e s t e r r n a n n R . , J o h a n n s e n M . , U n s i c k e r K . , a n d G r o t h e C . ( 1 9 9 0 ) B a s c i f fi b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ( b F G F ) i m m u n o r e a c t i v i t y i s p r e s e n t i n c h r o m a f fi n g r a n u l e s . J . N e u r o c h e m . 5 5 : 2 8 5 - 2 9 2 . W h i t e K . A . a n d M a r l e t t a M . A . ( 1 9 9 2 ) N i t r i c o x i d e s y n t h a e i s a c y t o c h r o m e P 4 5 0 - t y p e h e m o p r o t e i n . B i o c h e m i s t r y . 3 1 : 6 6 2 7 - 6 6 3 1 . W i k l u n d C . U . , O l g a r t C . , W i k l u n d N P , a n d G u s t a f s s o n L E . ( 1 9 9 3 ) M o d u l a t i o n o f c h o l i n e r g i c a n d s u b s t a n c e P - l i k e n e u r o t r a n s m i s s i o n b y n i t r i c o x i d e i n t h e g u i n e a p i g i l e u m . B r . J . P h a r m a c o l . 1 1 0 2 8 3 3 - 8 3 9 . W i l l a r d M . a n d S i m o n C . ( 1 9 8 1 ) A n t i b o d y d e c o r a t i o n o f n e u r o fi l a r n e n t s . J . C e l l B i o l . 8 9 : 1 9 8 - 2 0 5 . W i n s k y L , N a k a t a H . , M a r t i n B . M . , a n d J a c o b o w i t z D . M . ( 1 9 8 9 ) I s o l a t i o n , p a r t i a l a m i n o a c i d s e q u e n c e , a n d i m m u n o h i s t o c h e m i c a l l o c a l i z a t i o n o f a b r a i n - s p e c i fi c c a l c i u m - b i n d i n g p r o t e i n . P r a c . N a t ] . A c a d . S c i . U S A . 8 6 : 1 0 1 3 9 - 1 0 1 4 3 . W o l f G . , W u r d i g S . , a n d S c h fi n z e l J . ( 1 9 9 2 ) N i t r i c o x i d e s y n t h a s e i n r a t b r a i n i s p r e d o i n a n t l y l o c a t e d a t n e u r o n a l e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m : a n e l e c t r o n m i c r o s c o p i c d e m o n s t r a t i o n o f N A D P H - d i a p h o r a s e a c t i v i t y . W o o d J D . ( 1 9 8 7 ) P h y s i o l o g y o f t h e e n t e r i c n e r v o u s s y s t e m . I n L . R . J o h n s o n , J . C h r i s t e n s e n , J . D . J a c k s o n , E . D . J a c o b s o n , a n d J . H . W a l s c h ( E d s . ) P h y s i o l o g y o f t h e G a s t r o i n t s t i n a ] T r a c t , V a ] . 1 , R a v e n P r e s s , N e w Y o r k , p p . 6 7 - 1 0 9 . W o o d J D . a n d M a y e r C . J . ( 1 9 7 9 ) I n t r a c e l l u l a r s t u d y o f t o n i c - t y p e e n t e r i c n e u r o n s i n g u i n e a - p i g s m a l l i n t e s t i n e . J . N e u r o p h y s i o l . 4 3 : 5 6 9 - 5 8 1 . W o o l f C . J . , S h o r t l a n d P . , a n d C o g g e s h a l l R E . ( 1 9 9 2 ) P e r i p h e r a l n e r v e i n j u r y t r i g g e r s c e n t r a l s p r o u t i n g o f m y e l i n a t e d a f f e r e n t s . N a t u r e . 3 5 5 2 7 5 - 7 7 . 4 0 0 W i k l u n d C . U . , O l g a r t C . , W i k l u n d N P , a n d G u s t a f s s o n L . E . ( 1 9 9 3 a ) M o d u l a t i o n o f c h o l i n e r g i c a n d s u b s t a n c e P - l i k e n e u r o t r a n s m i s s i o n b y n i t r i c o x i d e i n t h e g u i n e a p i g i l e u m . B r . J . P h a r m a c o l . 1 1 0 2 8 3 3 - 8 3 9 . W i k l u n d N . P . , L e o n e A . M . , G u s t a f s s o n L . E . , a n d M o n c a d a S . ( 1 9 9 3 b ) R e l e a s e o f n i t r i c o x i d e e v o k e d b y n e r v e s t i m u l a t i o n i n g u i n e a - p i g i n t e s t i n e . N e u r a s c i . 5 3 : 6 0 7 - 6 1 1 . Y e e W . C . , P e s t r o n k A . , A l d e r s o n K . , a n d Y u a n C M . ( 1 9 8 9 ) R e g i o n a l h e t e r o g e n e i t y i n t h e d i s t a l m o t o r a x o n : T h r e e z o n e s w i t h d i s t i n c t i v e i n t r i n s i c c o m p o n e n t s . J . N e u r a c y t a ] . 1 7 : 6 4 9 - 6 5 6 . Y n t e m a C L . a n d H a m m o n d W . S . ( 1 9 5 4 ) T h e o r i g i n o r i n t r i n s i c g a n g l i a o f t r u n k v i s c e r a f r o m v a g a l n e u r a l c r e s t i n t h e c h i c k e m b r y o . J . C o m p . N e u r a l . 1 0 1 : 5 1 5 - 5 4 1 . Y o d l o w s k i M . L . , F r e d i e u J . R . , a n d L a n d i s S C . ( 1 9 8 4 ) N e o n a t a l 6 - h y d r o x y d o p a m i n e t r e a t m e n t e l i m i n a t e s c h o l i n e r g i c s y m p a t h e t i c i n n e r v a t i o n a n d i n d u c e s s e n s o r y s p r o u t i n g i n r a t s w e a t g l a n d s . J . N e u r o s c i . 6 2 1 5 3 5 - 1 5 4 8 . Y o u n g H . M . , F u r n e s s J . B . , S e w e l l P . , B u r c h e r B F , a n d K a n d i a h C . J . ( 1 9 9 3 ) T o t a l n u m b e r s o f n e u r o n s i n m y e n t e r i c g a n g l i a o f t h e g u i n e a - p i g s m a l l i n t e s t i n e . C e l l a n d T i s s . R e s . 2 7 ( 3 ) : 5 4 5 - 5 5 3 . Y o u n g H . M . , F u r n e s s J . B . , S h u t t l e w o r t h C . W . R . , B r e d t D . S . , a n d S n y d e r S H . ( 1 9 9 2 ) C o - l o c a l i z a t i o n o f n i t r i c o x i d e s y n t h a s e i m m u n o r e a c t i v i t y a n d N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g i n n e u r o n s o f t h e g u i n e a - p i g i n t e s t i n e . H i s t o c h e m . 9 7 : 3 7 5 - 3 7 8 . Y o u n g H . M . , M c C o n a l o g u e K . , F u r n e s s J . B . , a n d D e V e n t e J . ( 1 9 9 3 ) N i t r i c o x i d e t a r g e t s i n t h e g u i n e a p i g i n t e s t i n e i d e n t i fi e d b y i n d u c t i o n o f c y c l i c G M P i m m u n o r e a c t i v i t y . N e u r a s c i . 5 5 ( 2 ) : 5 8 3 - 5 9 6 . Y u a n S . Y . , F u r n e s s J . B . , B o r n s t e i n J . C . , a n d S M i t h T . K . ( 1 9 9 1 ) M u c o s a l d i s t o r t i o n b y c o m p r e s s i o n e l i c i t s p o l a r i z e d r e fl e x e s a n d e n h a n c e s r e s p o n s e s o f t h e c i r c u l a r m u s c l e t o d i s t e n s i o n i n t h e s m a l l i n t e s t i n e . J . A u t o . N e r v . S y s t e m . 3 5 : 2 1 9 - 2 2 6 . Y u n k e r A . M . a n d G a l l i g a n J . J . ( 1 9 9 2 ) E x t r i n s i c d e n e r v a t i o n i n d u c e s c h a n g e s i n n e u r o p e p t i d e a n d p h o s p h o r y l a t e d h e a v y n e u r o fi l a m e n t i m m u n o r e a c t i v i t y i n s u b m u c o s a l p l e x u s o f g u i n e a p i g i l e u m . S a c . N e u r a s c i . A b s t r . l 8 ( 1 ) : 4 2 8 . Y u n k e r A . M . a n d G a l l i g a n J . J . ( 1 9 9 4 ) E x t r i n s i c d e n e r v a t i o n i n c r e a s e s N A D P H d i a p h o r a s e s t a i n i n g i n m y e n t e r i c n e r v e s o f g u i n e a p i g i l e u m . N e u r o s c i . L e t t . 1 6 7 2 5 1 - 5 4 . Z a m b o n i L . a n d D e M a r t i n o C . ( 1 9 6 7 ) B u f f e r e d p i c r i c a c i d - f o r m a l d e h y d e : A n e w , r a p i d fi x a t i v e f o r e l e c t r o n m i c r o s c o p y . J . C e l l B i o l . 3 5 : 3 0 7 . Z h a n g J . a n d S y n d e r S H . ( 1 9 9 2 ) P r a c . N a t l . A c a d S c i . 8 9 2 9 3 8 2 . 4 0 ] Z h a n g J . a n d S y n d e r S H . ( 1 9 9 3 ) P u r i fi c a t i o n o f a n i t r i c o x i d e - s t i m u l a t e d A D P - R i b o s y l a t e d p r o t e i n u s i n g b i o t i n y l a t e d B - n i c o t i n a m i d e a d e n i n e d i n u c l e o t i d e . B i o c h e m i s t r y . 3 2 : 2 2 2 8 - 2 2 3 3 . Z h a n g Z . , P a g e ] R . , S i m p s o n P . , a n d R e n e h a n W . ( 1 9 9 1 ) T h e t a r g e t s p e c i fi c i t y o f t h e e x t r i n s i c i n n e r v a t i o n o f t h e r a t s m a l l i n t e s t i n e . J . A u t o . N e r v . S y s . 3 2 : 5 3 - 6 2 . Z i g m o n d R . , H y a t t - S a c h s H . , B a l d w i n 0 , Q u 2 . , S u n Y . , M c K e o n T . , S c h r e i b e r R . , a n d V a i d y a n a t h a n U . ( 1 9 9 2 ) P h e n o t y p i c p l a s t i c i t y i n a d u l t s y m p a t h e t i c n e u r o n s : C h a n g e s i n n e u r o p e p t i d e e x p r e s s i o n i n o r g a n c u l t u r e . P r a c . N a t l . A c a d S c i . 8 9 2 1 5 0 7 - 1 5 1 1 . Z o c h o d n e D . W . a n d H o L T . ( 1 9 9 2 ) H y p e r e m i a o f i n j u r e d p e r i p h e r a l n e r v e : S e n s i t i v i t y t o C G R P a n t a g o n i s m . B r a i n R e s . 5 9 8 2 5 9 - 6 6 . “ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1' ll R I E S 1