v : . I . . . r . . 3 1 1 t € ¢ . . . i f . \ - 5 5 5 7 I . - . fl I c u w u n u - . . . x . I . . 9 . . . . . . . 1 . . :: x . ‘ l a . u “ S fl , ? 1 n ? i x : “ a . w . . . 2 : » Y m 9 . g r S , . ‘ fi I « e s 1 ; : . : 2 ? I r 1 3 . 1 1 5 . . . s . I t : ( t o t ! ! ! I } . 3 3 . 1 : ! I } . t ‘ A n n i . ‘ . ‘ , . n u n . ‘ . 2 . " 3 P a . i o " ; I ! 3 % : 5 3 5 % . m > I V mu/H/I/I/II/H/H/l 3 1 2 9 3 1/!W I 0 1 4 2 1 III/IllW W I I / W 6 7 4 5 T h i s i s t o c e r t i f y t h a t t h e d i s s e r t a t i o n e n t i t l e d T h e r o l e o f p 1 a t e 1 e t s i n i i p o p o i y s a c c h a r i d e - i n d u c e d 1 i v e r i n j u r y p r e s e n t e d b y J u l i a M e r y 1 P e a r s o n h a s b e e n a c c e p t e d t o w a r d s f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r D o c t o r a t e d e g r e e “ , P h a r m a c o ' l o g y , T o x i c o l o g y a n d E n v i r o n m e n t a ] T o x i c o i o g y 7 2 M , 4 . 7 2 m M a j o r p r o f e s s o r / D a t e 9 / 2 . 9 7 / 9 4 M S U i : a n A f fi r m a t i v e A c t i o n / E q u a l O p p o r t u n i t y I n s t i t u t i o n 0 - 1 2 7 7 1 B e t u O r X n t o P T L o A A D C V A E O I I t D R F E I T N U E R S T E D U N r E a u m o . e e o n D o o o r r A e M m T v r E M a i a t h d D s t U d E m o t h y o u r m o D A T E D d o U . E M S U I s A n A f fl n n a t l v o A c t i o n / E q u a l O p p o r t u n i t y s I n W t a i t t u n n o n a - m L I B R A R Y M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y T H E R O L E O F P L A T E L E T S I N L I P O P O L Y S A C C H A R I D E - I N D U C E D L I V E R I N J U R Y V o l u m e I b y J u l i a M e r y l P e a r s o n A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l f i l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y D e p a r t m e n t o f P h a r m a c o l o g y a n d T o x i c o l o g y 1 9 9 6 A B S T R A C T T H E R O L E O F P L A T E L E T S I N L I P O P O L Y S A C C H A R I D E - I N D U C E D L I V E R I N J U R Y B v J u l i a M e r y l P e a r s o n E x p o s u r e t o l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( L P S ) f r o m g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a l e a d s t o a n a r r a y o f p a t h o p h y s i o l o g i c a l t e r a t i o n s , i n c l u d i n g m u l t i p l e o r g a n f a i l u r e a n d l i v e r i n j u r y . T h e d e v e l o p m e n t o f h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s e n t a i l s c o n t r i b u t i o n s f r o m b o t h c e l l u l a r a n d s o l u b l e i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s , i n c l u d i n g n e u t r o p h i l s , K u p f f e r c e l l s , T N F - a a n d c o m p o n e n t s o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m . M u c h r e m a i n s u n k n o w n a b o u t t h e r o l e o f p l a t e l e t s a n d t h e i r i n t e r a c t i o n s w i t h t h e s e m e d i a t o r s i n t h e p a t h o g e n e s i s o f l i v e r i n j u r y i n v i v a . T i m e c o u r s e s t u d i e s r e v e a l e d t h a t n e u t r o p h i l s a n d p l a t e l e t s a c c u m u l a t e i n t h e l i v e r w i t h i n 1 h o u r a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n . T h e s e e v e n t s p r e c e d e d t h e a p p e a r a n c e o f T N F - a i n p l a s m a , t h r o m b o c y t o p e n i a , a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d t h e o n s e t o f h e p a t o c e l l u a r d a m a g e . P r i o r d e p l e t i o n o f p l a t e l e t s w i t h a n a n t i s e r u m a t t e n u a t e d L P S - i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y a n d s u g g e s t e d t h a t p l a t e l e t s c o n t r i b u t e t o t h e a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m . T o a d d r e s s t h e m e c h a n i s m b y w h i c h p l a t e l e t s a c c u m u l a t e w i t h i n t h e l i v e r , s t u d i e s w e r e c o n d u c t e d i n n e u t r o p h i l - d e p l e t e d o r K u p f f e r c e l l - i n a c t i v a t e d a n i m a l s . R e s u l t s f r o m t h e s e s t u d i e s s u g g e s t e d t h a t K u p f f e r c e l l s , b u t n o t n e u t r o p h i l s , c o n t r i b u t e t o t h e h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n a n d t h r o m b o c y t o p e n i a o b s e r v e d a f t e r L P S e x p o s u r e . T h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , a n d t h r o m b i n i n p a r t i c u l a r , c a n s t i m u l a t e p l a t e l e t s . P r e t r e a t m e n t w i t h h e p a r i n , o r t h e t h r o m b i n i n h i b i t o r , h i r u d i n , a f f o r d e d p r o t e c t i o n f r o m l i v e r i n j u r y b u t d i d n o t a l t e r h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n a n d t h r o m b o c y t o p e n i a i n L P S - t r e a t e d a n i m a l s . F u r t h e r m o r e , t h r o m b i n i s a d i s t a l m e d i a t o r o f l i v e r i n j u r y , s i n c e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f h e p a r i n o r h i r u d i n 2 . 5 h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S a f f o r d e d p r o t e c t i o n f r o m h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y . L i p i d m e d i a t o r s , i n c l u d i n g p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r ( P A F ) , l e u k o t r i e n e s a n d c y c l o o x y g e n a s e p r o d u c t s a r e r e l e a s e d f r o m p l a t e l e t s a n d c o u l d c o n t r i b u t e t o t h e a c t i v a t i o n o f o t h e r i n f l a m m a t o r y c e l l s a n d t h e d e v e l o p m e n t o f h e p a t o c e l l u l a r d a m a g e . T o a d d r e s s t h e s e p o s s i b i l i t i e s , s t u d i e s w e r e c o n d u c t e d w i t h i n h i b i t o r s o f 5 - l i p o x y g e n a s e , c y c l o o x y g e n a s e a n d t h r o m b o x a n e s y n t h a s e a n d a P A F r e c e p t o r a n t a g o n i s t . R e s u l t s s u g g e s t e d t h a t P A F , I i p o x y g e n a s e p r o d u c t s a n d t h r o m b o x a n e a r e n o t c r i t i c a l m e d i a t o r s i n t h i s m o d e l , b u t s u g g e s t e d s o m e c y c l o o x y g e n a s e p r o d u c t s p a r t i a l l y c o n t r i b u t e t o l i v e r i n j u r y . I n c o n c l u s i o n , r e s u l t s o f t h e s e s t u d i e s p r o v i d e n o v e l i n s i g h t i n t o t h e m e c h a n i s m s o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . T h e f i n d i n g s s u g g e s t p l a t e l e t i n t e r a c t w i t h o t h e r i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s i n t h e p a t h o g e n e s i s o f h e p a t o c e l l u l a r d a m a g e . I n l o v i n g m e m o r y o f m y g r a n d f a t h e r B u d B o e d e k e r a n d f o r M o m , D a d a n d H a z e l M a r i e A C K N O W L E D G E M E N T S F i r s t a n d f o r e m o s t , I w o u l d l i k e t o t h a n k m y f r i e n d , m e n t o r a n d a d v i s o r D r . R o b e r t R o t h f o r a l l o f h i s s u p p o r t a n d e n c o u r a g e m e n t . I a m e s p e c i a l l y g r a t e f u l T H A T h e s p e n t s o m u c h t i m e h e l p i n g m e b e c o m e l e s s g r a m m a t i c a l l y c h a l l e n g e d . l w o u l d a l s o l i k e t o t h a n k t h e o t h e r m e m b e r s o f m y t h e s i s c o m m i t t e e D r s . L a r r y F i s c h e r , G r e g F i n k , K e n S c h w a r t z a n d T o m B e l l f o r a l l o f t h e i r a s s i s t a n c e a n d e n c o u r a g e m e n t . I a m e x t r e m e l y g r a t e f u l t o D r . J i m H e w e t t f o r s h o w i n g m e h o w t o h a n d l e l a b o r a t o r y a n i m a l s a n d f o r s p a r k i n g m y i n t e r e s t i n t h i s p r o j e c t . A n u m b e r o f u n i q u e i n d i v i d u a l s p r o v i d e d w o n d e r f u l t e c h n i c a l a s s i s t a n c e a n d d a i l y e n t e r t a i n m e n t . S p e c i a l t h a n k s t o m y g r a d u a t e s t u d e n t m e n t o r , D r . M a r c B a i l i e . I n a d d i t i o n , t h a n k s t o a l l t h e o t h e r p a s t a n d p r e s e n t R o t h o n i a n s D r s . C i n d y H o o r n , A l b e r t E r i c S c h u l t z e , P a t L a p p i n , P a t t i T i t h o f , F r e d o M o u l i n , R o s i e S n e e d , A l a n B r o w n a n d D w a y n e H i l l a n d t h e o t h e r n o n - v e t e r i n a r i a n s J i m W a g n e r , J o h n B u c h w e i t z a n d D r . P a t t i G a n e y . I n a d d i t i o n , I a m g r a t e f u l f o r t h e t e c h n i c a l a s s i s t a n c e p r o v i d e d b y K e r r i R o s s . T h i s w o r k c o u l d h a v e n e v e r b e e n c o m p l e t e d w i t h o u t t h e l o n g h o u r s o f d e d i c a t i o n a n d h a r d w o r k p u t i n b y T h e r e s e S c h m i d t a n d R a n d y W e s t r i c k . I f i t w a s n ’ t f o r t h e s e t w o I w o u l d b e k n e e d e e p i n i n d i u m a n d w o u l d h a v e n e v e r p u b l i s h e d a p a p e r . I a m i n d e b t e d t o D i a n e H u m m e l , N e l d a C a r p e n t e r a n d M i c k i e V a n d e r l i p f o r l i m i t i n g m y i n t e r a c t i o n w i t h t h e A d m i n i s t r a t i v e O f f i c e s a t M S U . S p e c i a l t h a n k s t o t h e l a d i e s o f t h e h i s t o l o g y l a b , L e a n n L u m b e r t a n d C a t h y C a m p b e l l , f o r t h e i r a s s i s t a n c e w i t h i m m u n o c y t o c h e m i s t r y . I a m a l s o t h a n k f u l t o R a l p h C o m m o n s f o r h i s h e l p w i t h t h e p h o t o g r a p h y o f h i s t o l o g y s e c t i o n s . I a m v e r y g r a t e f u l t o D r . E r i c S c h u l t z e f o r h i s p a i n s t a k i n g h o u r s o n t h e m i c r o s c o p e a n d h i s m e t i c u l o u s h i s t o p a t h o l o g i c a n d m o r p h o m e t r i c a n a l y s e s t h a t a r e p r e s e n t e d t h o u g h o u t t h i s t h e s i s . I w o u l d e s p e c i a l l y l i k e t o e x p r e s s m y g r a t i t u d e t o J o h n D a v i s a n d D r s . K e n S c h w a r t z a n d M i c h a e l S c o t t f o r t h e i r a s s i s t a n c e w i t h t h e p l a t e l e t a n d c o a g u l a t i o n s t u d i e s . I n a d d i t i o n , s p e c i a l t h a n k s t o D r . G r e g F i n k f o r h i s e x p e r t i s e w i t h s t a t i s t i c s , h e m o d y n a m i c s a n d c i g a r s . S p e c i a l t h a n k s t o M i k e f o r y e a r s o f c o m p a n i o n s h i p a n d t e a c h i n g m e p e r s e v e r a n c e , p e r s p e c t i v e a n d p r i o r i t i e s . F i n a l l y , m y u n e n d i n g l o v e t o M o m , D a d a n d L a u r a f o r y e a r s o f s u p p o r t , l o v e a n d m o t i v a t i o n . v i T A B L E O F C O N T E N T S L I S T O F T A B L E S x i i L I S T O F F I G U R E S x i i i L I S T O F A B B R E V I A T I O N S x v i i C H A P T E R 1 G E N E R A L I N T R O D U C T I O N 1 l . L P S : s t r u c t u r e , e x p o s u r e , c l e a r a n c e a n d e f f e c t s 3 A . L P S s t r u c t u r e 3 B . R o u t e s o f e x p o s u r e 4 C . C l e a r a n c e o f L P S 5 D . P a t h o p h y s i o l o g i c e f f e c t s o f L P S 6 1 . C i r c u l a t o r y s h o c k 7 2 . D i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n 8 3 . M u l t i p l e o r g a n i n j u r y 9 E . C e l l u l a r e f f e c t s o f L P S 1 0 1 . C e l l u l a r a n d s o l u b l e b i n d i n g p r o t e i n s 1 0 2 . C y t o t o x i c i t y o f L P S 1 1 3 . S t i m u l a t i o n o f i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s 1 2 l l . L P S - m e d i a t e d h e p a t o t o x i c i t y 1 4 A . L i v e r s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n 1 4 B . H e p a t i c a l t e r a t i o n s a f t e r L P S e x p o s u r e 1 5 1 . M o r p h o l o g i c c h a n g e s 1 5 2 . F u n c fl o n a l c h a n g e s 1 7 v i i ? " ” 9 ’ 5 9 0 . P ‘ M . ’ 5 ” ! ? ” 5 ’ 9 C . R o l e s o f c e l l u l a r a n d s o l u b l e m e d i a t o r s N e u t r o p h i l s K u p f f e r c e l l s C y t o k i n e s C o a g u l a t i o n s y s t e m L i p i d m e d i a t o r s L i p o x y g e n a s e p a t h w a y s C y c l o o x y g e n a s e p a t h w a y P l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r 6 . P l a t e l e t s P l a t e l e t s A . 9 ’ m P l a t e l e t s t r u c t u r e P l a t e l e t a c t i v a t i o n P l a t e l e t d e g r a n u l a t i o n P l a t e l e t r e l e a s e p r o d u c t s i n t i s s u e i n j u r y I n t e r a c t i o n s b e t w e e n p l a t e l e t s a n d m e d i a t o r s P l a t e l e t - c o a g u l a t i o n s y s t e m i n t e r a c t i o n s P l a t e l e t - n e u t r o p h i l i n t e r a c t i o n s P l a t e l e t - K u p f f e r c e l l i n t e r a c t i o n s C o n c l u s i o n R e s e a r c h g o a l s C H A P T E R 2 R O L E O F P L A T E L E T S I N L I V E R I N J U R Y A . B . A b s t r a c t I n t r o d u c t i o n M a t e r i a l s a n d m e t h o d s a t e r i a l s A n i m a l s A n t i - r a t p l a t e l e t s e r u m T i m e c o u r s e s t u d i e s N e u t r o p h i l i m m u n o c y t o c h e m i s t r y P l a t e l e t s e q u e s t r a t i o n s t u d i e s v i i i 1 9 1 9 2 3 2 5 2 7 2 9 3 2 3 3 3 5 3 7 3 9 3 9 4 3 4 6 4 9 5 1 5 1 5 2 5 5 5 8 5 8 6 1 6 2 6 3 6 4 6 4 6 5 6 5 6 5 6 7 6 8 " ! ’ 9 “ . ” 5 ’ 9 7 . P l a t e l e t d e p l e t i o n s t u d i e s 8 . M o r p h o m e t r i c a n a l y s i s 9 . T N F - a a c t i v i t y 1 0 . D a t a a n a l y s i s C H A P T E R 3 a ? R e s u l t s 1 . T i m e c o u r s e o f a l t e r a t i o n s i n b l o o d a n d l i v e r V e r i f i c a t i o n o f p l a t e l e t d e p l e t i o n E f f e c t o f p l a t e l e t d e p l e t i o n o n l i v e r i n j u r y E f f e c t o f p l a t e l e t d e p l e t i o n o n c o a g u l a t i o n E f f e c t o f p l a t e l e t d e p l e t i o n o n T N F — a E f f e c t o f p l a t e l e t d e p l e t i o n o n t o t a l W B C s D i s c u s s i o n I N T E R A C T I O N S B E T W E E N P L A T E L E T S , N E U T R O P H I L S A N D K U P F F E R C E L L S D U R I N G L P S E X P O S U R E A b s t r a c t I n t r o d u c t i o n M a t e r i a l s a n d m e t h o d s 1 . M a t e r i a l s 2 . A n i m a l s 3 . P l a t e l e t d i s t r i b u t i o n i n t i s s u e s 4 . P r e p a r a t i o n o f a n t i - n e u t r o p h i l l g 5 . N e u t r o p h i l d e p l e t i o n s t u d i e s 6 . G a d o l i n i u m c h l o r i d e s t u d i e s 7 . D a t a a n a l y s i s R e s u h s 1 . N e u t r o p h i l d e p l e t i o n s t u d i e s 2 . G a d o l i n i u m c h l o r i d e s t u d i e s D i s c u s s i o n C H A P T E R 4 T H E R O L E O F T H R O M B I N I N L P S - M E D I A T E D A . L I V E R I N J U R Y A b s t r a c t 7 0 7 0 7 1 7 1 7 3 7 3 7 4 7 5 7 6 7 7 7 7 9 7 1 0 4 1 0 5 1 0 6 1 0 8 1 0 8 1 0 8 1 0 8 1 0 8 1 0 8 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 3 4 1 4 1 1 4 2 ? " I ’ P P ' P ’ P H P P P ‘ . P ’ P P ‘ P C H A P T E R 5 d I n t r o d u c t i o n M a t e r i a l s a n d m e t h o d s M a t e r i a l s A n i m a l s Q u a n t i f i c a t i o n o f h e p a t i c p l a t e l e t s H e p a r i n p r e t r e a t m e n t s t u d i e s H i r u d i n p r e t r e a t m e n t s t u d i e s Q u a n t i f i c a t i o n o f h e p a t i c n e u t r o p h i l s H e p a r i n p o s t t r e a t m e n t s t u d i e s H i r u d i n p o s t t r e a t m e n t s t u d i e s H i s t o p a t h o l o g i c e v a l u a t i o n D a t a a n a l y s i s R e s u k s 1 . H e p a r i n p r e t r e a t m e n t s t u d i e s 2 . H i r u d i n p r e t r e a t m e n t s t u d i e s 3 . H e p a r i n a n d h i r u d i n p o s t t r e a t m e n t s t u d i e s D i s c u s s i o n T H E R O L E S O F P A F A N D L E U K O T R I E N E S I N L P S - I N D U C E D L I V E R I N J U R Y A b s t r a c t I n t r o d u c t i o n M a t e r i a l s a n d m e t h o d s M a t e r i a l s A n i m a l s V e r i f i c a t i o n o f d r u g e f f i c a c y E x p e r i m e n t a l p r o t o c o l s D a t a a n a l y s i s R e s u n s D i s c u s s i o n 1 4 3 1 4 5 1 4 5 1 4 5 1 4 5 1 4 5 1 4 6 1 4 7 1 4 7 1 4 8 1 4 8 1 4 9 1 4 9 1 4 9 1 5 1 1 5 2 1 8 6 1 9 4 1 9 5 1 9 6 1 9 8 1 9 8 1 9 9 1 9 9 1 9 9 2 0 0 2 0 1 2 1 3 r p ? ” 5 ’ 9 8 C H A P T E R 6 T H E R O L E S O F C Y C L O O X Y G E N A S E P R O D U C T S I N L P S - I N D U C E D H E P A T O T O X I C I T Y A . A b s t r a c t B . I n t r o d u c t i o n C . M a t e r i a l s a n d m e t h o d s M a t e r i a l s A n i m a l s Q u a n t i f i c a t i o n o f t i s s u e p l a t e l e t d e p o s i t i o n T i m e c o u r s e o f T x B 2 p r o d u c t i o n A s p i r i n s t u d y D a z m e g r e l s t u d y D a t a a n a l y s i s D . R e s u l t s 1 . T i m e c o u r s e o f T x 8 2 p r o d u c t i o n 2 . A s p i r i n s t u d y 3 . D a z m e g r e l s t u d y E . D i s c u s s i o n C H A P T E R 7 S U M M A R Y A N D C O N C L U S I O N S L I S T O F R E F E R E N C E S x i 2 1 8 2 1 9 2 2 0 2 2 2 2 2 2 2 2 3 2 2 3 2 2 3 2 2 3 2 2 4 2 2 5 2 2 5 2 2 5 2 2 6 2 2 7 2 5 1 2 5 6 2 7 5 1 . 1 2 . 1 3 . 1 3 . 2 4 . 1 4 . 2 4 . 3 4 . 4 6 . 1 7 . 1 L I S T O F T A B L E S P r o d u c t s r e l e a s e d f r o m a c t i v a t e d p l a t e l e t s M o r p h o m e t r i c a n a l y s i s o f l i v e r s f r o m L P S - t r e a t e d r a t s E f f e c t s o f n e u t r o p h i l d e p l e t i o n a n d L P S o n p l a t e l e t d i s t r i b u t i o n i n b l o o d , s p l e e n , k i d n e y s a n d l u n g s E f f e c t s o f G d C l 3 a n d L P S o n p l a t e l e t d i s t r i b u t i o n i n t h e s p l e e n , k i d n e y s a n d l u n g s P r o t e c t i o n f r o m L P S - i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y b y a d m i n i s t r a t i o n o f h e p a r i n E f f e c t s o f h e p a r i n a n d L P S o n p l a t e l e t d i s t r i b u t i o n i n b l o o d , s p l e e n , k i d n e y s a n d l u n g s P r o t e c t i o n f r o m L P S - i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y b y a d m i n i s t r a t i o n o f h i r u d i n E f f e c t s o f L P S a n d h i r u d i n o n p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n i n s p l e e n , k i d n e y s a n d l u n g s E f f e c t s o f a s p i r i n a n d L P S o n p l a t e l e t d i s t r i b u t i o n i n t h e b l o o d , s p l e e n , k i d n e y s a n d l u n g s L P S — i n d u c e d l i v e r i n j u r y a n d a l t e r a t i o n s b y c o - t r e a t m e n t w i t h v a r i o u s a g e n t s x i i £ 6 9 2 4 8 9 0 1 2 2 1 2 7 1 5 8 1 6 3 1 7 2 1 7 9 2 4 0 2 6 4 L I S T O F F I G U R E S fl o u r s . B a a : 1 . 1 A r a c h i d o n i c a c i d m e t a b o l i c p a t h w a y s 3 1 1 . 2 P l a t e l e t s t r u c t u r e 4 2 2 . 1 T e m p o r a l e f f e c t s o f L P S a d m i n i s t r a t i o n o n b l o o d a n d l i v e r m a r k e r s 7 9 2 . 2 E f f e c t s o f L P S a d m i n i s t r a t i o n o n c i r c u l a t i n g w h i t e b l o o d c e l l s 8 1 2 . 3 E f f e c t s o f L P S o n b l o o d a n d o r g a n p l a t e l e t d i s t r i b u t i o n 8 3 2 . 4 E f f e c t s o f p l a t e l e t d e p l e t i o n a n d L P S o n b l o o d p l a t e l e t n u m b e r s 8 5 2 . 5 E f f e c t s o f p l a t e l e t d e p l e t i o n o n l i v e r i n j u r y 8 7 2 . 6 P h o t o m i c r o g r a p h s o f s e c t i o n s o f l i v e r f r o m r a t s t r e a t e d w i t h C S / L P S a n d A P S / L P S 8 9 2 . 7 E f f e c t s o f p l a t e l e t d e p l e t i o n o n t h e L P S - i n d u c e d c h a n g e i n p l a s m a f i b r i n o g e n 9 2 2 . 8 E f f e c t s o f p l a t e l e t d e p l e t i o n o n L P S - i n d u c e d e l e v a t i o n i n p l a s m a T N F - a a c t i v i t y 9 4 2 . 9 E f f e c t o f p l a t e l e t d e p l e t i o n o n L P S - i n d u c e d a l t e r a t i o n s i n w h i t e b l o o d c e l l n u m b e r s 9 6 3 . 1 E f f e c t s o f n e u t r o p h i l d e p l e t i o n a n d L P S o n b l o o d n e u t r o p h i l s 1 1 5 3 . 2 E f f e c t s o f n e u t r o p h i l d e p l e t i o n a n d L P S o n p l a s m a A L T a c t i v i t y 1 1 7 x i i i 3 . 3 3 . 4 3 . 5 3 . 6 3 . 7 3 . 8 3 . 9 4 . 1 4 . 2 4 . 3 4 . 4 4 . 5 4 . 6 4 . 7 L I S T O F F I G U R E S ( c o n t i n u e d ) E f f e c t s o f n e u t r o p h i l d e p l e t i o n a n d L P S o n h e p a t i c p l a t e l e t s e q u e s t r a t i o n E f f e c t s o f n e u t r o p h i l d e p l e t i o n a n d L P S o n b l o o d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n E f f e c t s o f G d C l 3 a n d L P S o n p l a s m a A L T a c t i v i t y E f f e c t s o f G d C l 3 a n d L P S o n h e p a t i c p l a t e l e t s e q u e s t r a t i o n E f f e c t s o f G d C l 3 a n d L P S o n b l o o d r a d i o a c t i v i t y E f f e c t s o f G d C l 3 a n d L P S o n b l o o d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n E f f e c t s o f G d C l 3 a n d L P S o n p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n E f f e c t s o f L P S a n d h e p a r i n o n p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n E f f e c t s o f L P S a n d h e p a r i n o n l i v e r i n j u r y ( p l a s m a A L T a c t i v i t y ) E f f e c t s o f L P S a n d h e p a r i n o n b l o o d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n E f f e c t s o f L P S a n d h e p a r i n o n h e p a t i c p l a t e l e t s e q u e s t r a t i o n E f f e c t s o f L P S a n d h i r u d i n o n p l a s m a a c t i v a t e d p a r t i a l t h r o m b o p l a s t i n t i m e E f f e c t s o f L P S a n d h i r u d i n o n p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n E f f e c t s o f L P S a n d h i r u d i n o n p l a s m a a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e a c t i v i t y x i v 1 1 8 1 2 1 1 2 4 1 2 6 1 2 9 1 3 1 1 3 3 1 5 5 1 5 7 1 6 0 1 6 2 1 6 5 1 6 7 1 6 9 L I S T O F F I G U R E S ( c o n t i n u e d ) 4 . 8 P h o t o m i c r o g r a p h s o f s e c t i o n s o f l i v e r f r o m r a t s t r e a t e d w i t h L P S a n d s a l i n e o r w i t h L P S a n d h i r u d i n 1 7 1 4 . 9 E f f e c t s o f L P S a n d h i r u d i n o n h e p a t i c n e u t r o p h i l a c c u m u l a t i o n 1 7 4 4 . 1 0 E f f e c t s o f L P S a n d h i r u d i n o n b l o o d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n 1 7 6 4 . 1 1 E f f e c t s o f L P S a n d h i r u d i n o n r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s i n b l o o d 1 7 8 4 . 1 2 E f f e c t s o f L P S a n d h i r u d i n o n h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n 1 8 1 4 . 1 3 E f f e c t s o f h e p a r i n a d m i n i s t e r e d b e f o r e a n d a f t e r L P S o n l i v e r i n j u r y 1 8 3 4 . 1 4 E f f e c t s o f h i r u d i n a d m i n i s t e r e d a f t e r L P S o n l i v e r i n j u r y 1 8 5 5 . 1 E f f e c t s o f L P S a n d W E B 2 0 8 6 o n l i v e r i n j u r y 2 0 4 5 . 2 E f f e c t s o f L P S a n d W E B 2 0 8 6 / Z i l e u t o n o n p l a s m a A L T a c t i v i t y 2 0 6 5 . 3 E f f e c t s o f L P S a n d W E B 2 0 8 6 / Z i l e u t o n o n l i v e r i n j u r y 2 0 8 5 . 4 E f f e c t s o f L P S a n d W E B 2 0 8 6 / Z i l e u t o n o n b l o o d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n 2 1 0 5 . 5 E f f e c t s o f L P S a n d W E B 2 0 8 6 / Z i l e u t o n o n p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n 2 1 2 6 . 1 P l a s m a T x B 2 c o n c e n t r a t i o n d u r i n g L P S e x p o s u r e 2 2 9 6 . 2 E f f e c t s o f L P S a n d a s p i r i n o n p l a s m a T s z c o n c e n t r a t i o n 2 3 1 6 . 3 E f f e c t s o f L P S a n d a s p i r i n o n p l a s m a A L T a c t i v i t y 2 3 3 X V 6 . 4 6 . 5 6 . 6 6 . 7 6 . 8 6 . 9 6 . 1 0 7 . 1 7 . 2 L I S T O F F I G U R E S ( c o n t i n u e d ) E f f e c t s o f L P S a n d a s p i r i n o n p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n E f f e c t s o f L P S a n d a s p i r i n o n b l o o d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n E f f e c t s o f L P S a n d a s p i r i n o n h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n E f f e c t s o f L P S a n d d a z m e g r e l o n p l a s m a T s z c o n c e n t r a t i o n E f f e c t s o f L P S a n d d a z m e g r e l o n p l a s m a A L T a c t i v i t y E f f e c t s o f L P S a n d d a z m e g r e l o n b l o o d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n E f f e c t s o f L P S a n d d a z m e g r e l o n p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n E f f e c t s o f L P S a n d d a z m e g r e l o n h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n M e c h a n i s m s o f n e u t r o p h i l a n d p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n i n l i v e r M e c h a n i s m s a n d c o n s e q u e n c e s o f i n f l a m m a t o r y c e l l a c fl v a fl o n 2 3 5 2 3 7 2 3 9 2 4 2 2 4 4 2 4 6 2 4 8 2 5 0 2 7 0 2 7 4 A A A D P A L T A N Q V A A P T T A P S A T P I S - T G C C a C S E I A D I C d i H E T E d l D T S E . c o l i E G F f m l p 9 G d C l 3 G p G S H G S S G H E P 5 - H E T E 1 2 - H E T E 5 - H P E T E 1 2 - H P E T E 1 5 - H P E T E 5 - H T H D L H M W I C A M - 1 I Q l L - 1 l L - 6 I n i n i v h r L I S T O F A B B R E V I A T I O N S a r a c h i d o n i c a c i d a d e n o s i n e d i p h o s p h a t e a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e a n a l y s i s o f v a r i a n c e a c t i v a t e d p a r t i a l t h r o m b o p l a s t i n t i m e a n t i p l a t e l e t s e r u m a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e b e t a - t h r o m b o g l o b u l i n C e l s i u s c a l c i u m c o n t r o l s e r u m e n z y m e i m m u n o a s s a y d i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n 5 , 1 2 - h y d r o x y e i c o s a t e t r a e n o i c a c i d d e c i l i t e r d e n s e t u b u l a r s y s t e m E s c h e r i c h i a c o l i e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r N - f o r m y l - m e t h i o n y l - l e u c y l - p h e n y l a l a n i n e g r a m g a d o l i n i u m c h l o r i d e g l y c 0 p r o t e i n g l u t a t h i o n e o x i d i z e d g l u t a t h i o n e h e p a n n 5 - h y d r o x y e i c o s a t e t r a e n o i c a c i d 1 2 - h y d r o x y e i c o s a t e t r a e n o i c a c i d 5 - h y d r o p e r o x y e i c o s a t e t r a e n o i c a c i d 1 2 - h y d r o p e r o x y e i c o s a t e t r a e n o i c a c i d 1 5 - h y d r o p e r o x y e i c o s a t e t r a e n o i c a c i d s e r o t o n i n h i g h d e n s i t y I i p o p r o t e i n h i g h m o l e c u l a r w e i g h t i n t r a c e l l u l a r a d h e s i o n m o l e c u l e - 1 i m m u n o g l o b u l i n i n t e r l e u k i n - 1 i n t e r l e u k i n - 6 i n d i u m i n t r a p e r i t o n e a l i n t r a v e n o u s h o u r k D a L A P F 4 L B P L P S L T s L T A 4 L T B 4 L T C 4 L T D 4 L T E , M C m i n m g m l M Q F p C i # 9 p m N A P Z n 9 0 , o c P A F P B P P D G F P F 4 9 9 P 6 5 2 P G F M P G F h P G G 2 P G H 2 P e n P G J 2 P L A 2 p o P P P L I S T O F A B B R E V I A T I O N S ( c o n t i n u e d ) k i l o d a l t o n k i l o g r a m l i t e r l o w - a f f i n i t y p l a t e l e t f a c t o r 4 l i p o p o l y s a c c h a r i d e b i n d i n g p r o t e i n l i p o p o l y s a c c h a r i d e l e u k o t r i e n e s l e u k o t r i e n e A 4 l e u k o t r i e n e B 4 l e u k o t r i e n e C 4 l e u k o t r i e n e D 4 l e u k o t r i e n e E 4 m e t h y l c e l l u l o s e m i n u t e s m i l l i g r a m m a g n e s i u m m i l l i l i t e r m u l t i p l e o r g a n f a i l u r e m i c r o c u r i e m i c r o g r a m m i c r o l i t e r m i c r o m e t e r n e u t r o p h i l a c t i v a t i n g p e p t i d e 2 n a n o g r a m s u p e r o x i d e a n i o n o p e n c a n a l i c u l a r s y s t e m p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r p l a t e l e t b a s i c p r o t e i n p l a t e l e t d e r i v e d g r o w t h f a c t o r p l a t e l e t f a c t o r 4 p i c o g r a m p r o s t a g l a n d i n E 2 p r o s t a g l a n d i n F 1 0 p r o s t a g l a n d i n F 2 , p r o s t a g l a n d i n G 2 p r o s t a g l a n d i n H 2 p r o s t a g l a n d i n l 2 p r o s t a g l a n d i n J 2 p h o s p h o l i p a s e A 2 p e r a s p l a t e l e t p o o r p l a s m a x v i i i P R P S A L s c S E M T G F — B T N F - a T x A , T s z 8 . e n t e r i t i d i s U V E H v W F W B C s L I S T O F A B B R E V I A T I O N S ( c o n t i n u e d ) p l a t e l e t r i c h p l a s m a s a l i n e s u b c u t a n e o u s s t a n d a r d e r r o r o f t h e m e a n t i s s u e g r o w t h f a c t o r - b e t a t u m o r n e c r o s i s f a c t o r - a l p h a t h r o m b o x a n e A 2 t h r o m b o x a n e B 2 S a l m o n e l l a e n t e r i t i d i s u n i t v e h i c l e v o n W i l l e b r a n d f a c t o r w h i t e b l o o d c e l l s x i x C h a p t e r 1 G e n e r a l I n t r o d u c t i o n I n t h e l a t e 1 8 7 0 ’ s , R o b e r t K o c h e s t a b l i s h e d t h e l i n k b e t w e e n i n f e c t i o u s d i s e a s e a n d m i c r o b e s . D e c a d e s l a t e r , K o c h ’ s s t u d e n t , R i c h a r d P f e i f f e r d i s c o v e r e d t h a t l y s a t e s f r o m h e a t - i n a c t i v a t e d V i b r i o c h l o r a e b a c t e r i a i n d u c e d d e a t h i n e x p e r i m e n t a l a n i m a l s . P f e i f f e r h y p o t h e s i z e d t h a t t h i s t o x i c c o m p o n e n t w a s f o u n d w i t h i n t h e b a c t e r i a a n d t h e r e f o r e c a l l e d i t e n d o t o x i n ( M o r r i s o n e t a l . , 1 9 7 9 ) . Y e a r s l a t e r , t h e s t r u c t u r e o f e n d o t o x i n w a s c h a r a c t e r i z e d a n d f o u n d t o b e a l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( L P S ) l o c a t e d w i t h i n t h e c e l l w a l l o f g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a . A c e n t u r y l a t e r , m u c h r e m a i n s u n k n o w n a b o u t t h e s p e c i f i c m e c h a n i s m s b y w h i c h e n d o g e n o u s i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s c o n t r i b u t e t o t h e p a t h o g e n e s i s o f t i s s u e i n j u r y d u r i n g L P S e x p o s u r e i n v i v a . T h e p u r p o s e o f t h i s i n t r o d u c t i o n i s t o d i s c u s s L P S a n d t h e h o s t - d e r i v e d r e s p o n s e s t o L P S t h a t c o n t r i b u t e t o t i s s u e i n j u r y . S e c t i o n I w i l l i n t r o d u c e L P S a n d w i l l p r o v i d e d e s c r i p t i o n s o f i t s s t r u c t u r e , r o u t e s o f e x p o s u r e , c l e a r a n c e a n d s o m e o f i t s p a t h o p h y s i o l o g i c e f f e c t s . I n S e c t i o n I I , t h e e f f e c t s o f L P S o n t h e l i v e r w i l l b e d e s c r i b e d i n d e t a i l . I n p a r t i c u l a r , t h i s c h a p t e r w i l l f o c u s o n s o m e o f t h e c e l l u l a r a n d s o l u b l e m e d i a t o r s t h a t a r e c r i t i c a l i n t h e p a t h o g e n e s i s o f h e p a t i c i n j u r y . S e c t i o n I I I w i l l f o c u s o n p l a t e l e t s , w i t h e m p h a s i s o n t h e i r f u n c t i o n , p o t e n t i a l r o l e s i n t h e d e v e l o p m e n t o f t i s s u e i n j u r y a n d t h e i r i n t e r a c t i o n s w i t h o t h e r i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s . 3 l . L P S : S T R U C T U R E . E X P O S U R E , C L E A R A N C E A N D E F F E C T S l . A . L P S S t r u c t u r e L P S i s a n e n d o t o x i n i s o l a t e d f r o m t h e c e l l w a l l s o f g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a . I t c o n s i s t s o f a l i p i d r e g i o n , c a l l e d l i p i d A , c o v a l e n t l y b o u n d t o a p o l y s a c c h a r i d e r e g i o n . T h e p o l y s a c c h a r i d e r e g i o n , w h i c h e x t e n d s o u t w a r d f r o m t h e b a c t e r i a , i s c o m p o s e d o f t w o r e g i o n s : t h e c o r e p o l y s a c c h a r i d e a n d t h e 0 - a n t i g e n p o l y s a c c h a r i d e ( M o r r i s o n e t a l . , 1 9 7 9 l . T h e c o r e p o l y s a c c h a r i d e r e g i o n i s s i m i l a r a m o n g d i f f e r e n t s t r a i n s o f b a c t e r i a a n d c o n t a i n s s e v e r a l s u g a r m o i e t i e s w i t h a u n i q u e d e o x y s u g a r , 2 - k e t o - 3 - d e o x y o c t o n i c a c i d . T h e Q - a n t i g e n p o l y s a c c h a r i d e i s u n i q u e f o r e a c h t y p e o f b a c t e r i a a n d L P S . C o n s i s t i n g o f s e v e r a l r e p e a t i n g o l i g o s a c c h a r i d e u n i t s , t h e n u m b e r o f t h e s e u n i t s v a r i e s . T h e l i p i d A r e g i o n i s a m p h i p a t h i c a n d e m b e d d e d w i t h i n t h e c e l l w a l l l i p i d b i l a y e r . I t c o n s i s t s o f a t w o g l u c a s a m i n e r e s i d u e s j o i n e d b y a ( 3 1 - 6 l i n k a g e t o f o r m a b a c k b o n e . A m i d e a n d e s t e r b a n d s l i - n k l o n g - c h a i n f a t t y a c i d s t o t h i s b a c k b o n e , a l o n g w i t h c h a r g e d p y r o p h o s p h a t e g r o u p s t h a t c o n t i b u t e t o i t s a m p h i p a t h i c n a t u r e . T h e l i p i d A r e g i o n i s r e m a r k a b l y s i m i l a r a m o n g g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a . T h i s c o n s e r v e d r e g i o n o f t h e L P S m o l e c u l e a p p e a r s t o m e d i a t e m a n y o f t h e p a t h o p h y s i o l o g i c e f f e c t s o f L P S , s i n c e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f l i p i d A c a n m i m i c t h e e f f e c t s o f L P S ( N o w o t n y , 1 9 8 7 ) . I n a d d i t i o n , m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s t o t h i s r e g i o n i n h i b i t t h e b i o l o g i c a l a c t i v i t i e s o f L P S ( R i e t s c h e l e t a l . , 1 9 7 7 ) . l . B . R o u t e s o f L P S e x p o s u r e T h e m o s t o b v i o u s m o d e o f L P S e x p o s u r e i s f r o m i n f e c t i o n w i t h g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a . S i n c e L P S i s e m b e d d e d w i t h i n t h e c e l l w a l l s o f t h e b a c t e r i a , i t i s n o t n o r m a l l y r e l e a s e d . H o w e v e r , i t c a n b e r e l e a s e d d u r i n g c e l l d i v i s i o n a n d d e a t h . I n a d d i t i o n , t r e a t m e n t o f b a c t e r i a l i n f e c t i o n s w i t h a n t i b i o t i c s c a n l i b e r a t e L P S ( S h e n e p e t a l . , 1 9 8 8 ; S h e n e p e t a l . , 1 9 8 4 ) . T h u s , a n t i m i c r o b i a l t h e r a p y c a n e n h a n c e e x p o s u r e t o L P S a n d m a y c o n t r i b u t e t o t h e s t e a d i l y w o r s e n i n g c o u r s e o f d i s e a s e i n s o m e p a t i e n t s . T h e g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t c o n t a i n s i n d i g e n o u s g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a l f l o r a a n d l a r g e q u a n t i t i e s o f L P S . T h e i n t e s t i n a l w a l l i n h i b i t s t h e r e l e a s e i n t o b l o o d o f b a c t e r i a a n d m o s t o f t h e L P S f r o m t h e g u t . H o w e v e r , l o w l e v e l s o f L P S c a n b e d e t e c t e d i n p o r t a l b l o o d , b u t n o t i n t h e s y s t e m i c b l o o d , u n d e r n o r m a l p h y s i o l o g i c c o n d i t i o n s i n h u m a n s ( J a c o b e t a l . , 1 9 7 7 ) . S i n c e t h i s p o r t a l L P S e x p o s u r e i s n o t a s s o c i a t e d w i t h d i s e a s e a n d i s n o t d e t e c t e d i n t h e s y s t e m i c c i r c u l a t i o n , i t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t n o r m a l l i v e r f u n c t i o n s i n c l u d e t h e r e m o v a l o f L P S f r o m t h e p o r t a l b l o o d . C e r t a i n p a t h o p h y s i o l g i c a l c o n d i t i o n s s u c h a s p o r t a l v e i n o c c l u s i o n e n h a n c e t h e a b s o r p t i o n o f L P S f r o m t h e g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t ( G a n s e t a l . , 1 9 7 4 ) . I n a d d i t i o n , i n t e s t i n a l i s c h e m i a ( C a t y e t a l . , 1 9 9 0 ) . d i e t a r y c i r r h o s i s ( B r o i t m a n e t a l . , 1 9 6 4 ) a n d c h e m i c a l l y i n d u c e d l i v e r i n j u r y ( N o l a n , 1 9 7 5 ; N o l a n e t a l . , 1 9 8 9 ) c a n p r o m o t e L P S a b s o r p t i o n f r o m t h e g u t . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e f i n d i n g s s u g g e s t t h a t u n d e r n o r m a l c o n d i t i o n s , s o m e L P S i s r e l e a s e d f r o m t h e 5 g u t i n t o t h e p o r t a l c i r c u l a t i o n a n d t h a t t h e l i v e r r e m o v e s m o s t o f i t . H e p a t i c d i s e a s e s m a y c o n t r i b u t e t o e l e v a t e d L P S i n t h e s y s t e m i c c i r c u l a t i o n b y i m p a i r i n g h e p a t i c c l e a r a n c e o f L P S . l . C . C l e a r a n c e o f L P S S t u d i e s w i t h r a d i o l a b e l e d L P S s u g g e s t t h a t L P S i s c l e a r e d f r o m t h e c i r c u l a t i o n p r i m a r i l y b y t h e l i v e r , a l t h o u g h r a d i o l a b e l e d L P S i s a l s o d e t e c t e d i n l u n g s , s p l e e n , k i d n e y s a n d a d r e n a l g l a n d s . T h e k i n e t i c s o f L P S r e m o v a l i s b i p h a s i c a n d d o s e - d e p e n d e n t . T h e i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f l o w d o s e s o f L P S l u g / k g ) r e s u l t s i n a r a p i d c l e a r a n c e o f L P S w i t h i n 3 0 m i n u t e s f o l l o w e d b y a s l o w e r c l e a r a n c e p h a s e o f t h e r e m a i n i n g L P S o v e r a p e r i o d o f h o u r s ( M a t h i s o n e t a l . , 1 9 7 9 ) . T h e a d m i n i s t r a t i o n o f l a r g e r d o s e s o f L P S ( m g / k g ) p r o l o n g s t h e s l o w e r p h a s e o f L P S c l e a r a n c e o v e r 4 8 h o u r s ( F r e u d e n b e r g e t a l . , 1 9 8 5 ) . T h e r a d i o l a b e l e d L P S i s l o c a l i z e d w i t h i n t i s s u e m a c r o p h a g e s a n d i s f o u n d p r e d o m i n a n t l y w i t h i n t h e h e p a t i c K u p f f e r c e l l s ( M a t h i s o n e t a l . , 1 9 7 9 ; F r e u d e n b e r g e t a l . , 1 9 8 5 ) . R u m i n a n t s h a v e p h a g o c y t i c p u l m o n a r y i n t r a v a s c u l a r m a c r o p h a g e s a n d a r e v e r y s u s c e p t i b l e t o l u n g i n j u r y a f t e r L P S e x p o s u r e . F o l l o w i n g i n t r a p a r t a l a d m i n i s t r a t i o n , m o s t o f t h e L P S i s c l e a r e d b y t h e l i v e r . H o w e v e r , t h e i n t r a j u g u l a r a d m i n i s t r a t i o n r e s u l t s i n t h e c l e a r a n c e o f L P S b y t h e p u l m o n a r y i n t r a v a s c u l a r m a c r o p h a g e s . T h u s , i n r u m i n a n t s , t h e r o u t e o f L P S a d m i n i s t r a t i o n 6 d e f i n e s t h e o r g a n r e s p o n s i b l e f o r L P S r e m o v a l f r o m t h e c i r c u l a t i o n . T h i s f i n d i n g m a y e x p l a i n w h y r u m i n a n t s a r e p a r t i c u l a r l y s u s c e p t i b l e t o p u l m o n a r y i n j u r y f o l l o w i n g L P S e x p o s u r e ( D e C a m p e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h e c l e a r a n c e o f L P S i s i n f l u e n c e d b y p l a s m a b i n d i n g p r o t e i n s . L P S b i n d s t o h i g h d e n s i t y l i p o p r o t e i n s ( H D l e a n d t h e l i p o p o l y s a c c h a r i d e b i n d i n g p r o t e i n ( L B P ) . T h e b i n d i n g o f L P S t o H D L s p r o l o n g s t h e h a l f - l i f e o f L P S a n d a l s o i n h i b i t s i t s b i o l o g i c a c t i v i t y ( U l e v i t c h e t a l . , 1 9 8 1 ) . T h e b i n d i n g o f t h e l i p i d A r e g i o n o f L P S t o L B P c a n a l s o i n f l u e n c e i t s c l e a r a n c e f r o m p l a s m a ( T o b i a s e t a l . , 1 9 8 8 l . T h i s L P S - L B P c o m p l e x w i l l b e d i s c u s s e d i n s e c t i o n I . E . 1 . I . D . P a t h o p h y s i o l o g i c e f f e c t s o f L P S S y s t e m i c g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a l i n f e c t i o n s ( s e p s i s o r s e p t i c e m i a ) o f t e n r e s u l t i n c i r c u l a t o r y s h o c k , d i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n ( D I C ) , m u l t i p l e o r g a n f a i l u r e ( M Q F ) a n d d e a t h . I n d e e d , s e p s i s a n d M Q F a r e m a j o r c a u s e s o f d e a t h i n h o s p i t a l i z e d p a t i e n t s . S e v e r a l s t u d i e s r e p o r t m o r t a l i t y r a t e s o f 5 0 — 7 4 % i n s e p t i c p a t i e n t s w i t h M Q F ( F r y e t a l . , 1 9 8 0 ; C a r r i c o e t a l . , 1 9 8 6 ) . L P S i s p r o p o s e d t o b e a m a j o r c o n t r i b u t i n g f a c t o r t o t h e h i g h m o r t a l i t y r a t e s a s s o c i a t e d w i t h s e p s i s , s i n c e a n t i b o d i e s w h i c h n e u t r a l i z e L P S a f f o r d p r o t e c t i o n f r o m l e t h a l i t y i n b o t h a n i m a l s a n d p a t i e n t s ( D u n n e t a l . , 1 9 8 4 ; B a u m g a r t n e r , 1 9 9 2 ; Z i e g l e r e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h e m e c h a n i s m s b y w h i c h L P S e x p o s u r e r e s u l t s i n t i s s u e i n j u r y a r e 7 c o m p l e x a n d v a r y a m o n g t i s s u e s . H o w e v e r , t h e i n v o l v e m e n t o f h o s t - d e r i v e d , c e l l u l a r a n d s o l u b l e m e d i a t o r s i n t h e p a t h o g e n e s i s o f L P S - m e d i a t e d t i s s u e i n j u r y i s a u n i v e r s a l f i n d i n g . F o r t h e s a k e o f b r e v i t y , t h e r o l e s o f i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s i n t h e d e v e l o p m e n t o f p a t h o p h y s i o l g i c a l t e r a t i o n s i n e x t r a h e p a t i c t i s s u e s w i l l n o t b e d e s c r i b e d i n d e t a i l . S e c t i o n I I w i l l f o c u s o n t h e r o l e o f t h e s e i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s i n t h e p a t h o g e n e s i s o f h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y . I . D . 1 . C i r c u l a t o r y s h o c k L P S e x p o s u r e r e s u l t s i n h y p o t e n s i o n a n d d e c r e a s e d c a r d i a c o u t p u t a n d t i s s u e p e r f u s i o n . W i t h i n m i n u t e s a f t e r t h e i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f L P S , m e a n a r t e r i a l p r e s s u r e d e c r e a s e s . T h i s i s a s s o c i a t e d w i t h a s i m i l a r d e c r e a s e i n c a r d i a c o u t p u t . L a t e r , a s l i g h t r e b o u n d i n b o t h m e a n a r t e r i a l p r e s s u r e a n d c a r d i a c o u t p u t i s o f t e n o b s e r v e d ( M o o r e e t a l . , 1 9 9 1 ; C a s a I s - S t e n z e l , 1 9 8 7 ) . T a c h y c a r d i a , a r e f l e x r e s p o n s e t o d e c r e a s e d m e a n a r t e r i a l p r e s s u r e , i s o b s e r v e d a s w e l l ( Q i e t a l . , 1 9 9 0 ) . T h e h y p o t e n s i o n a n d d e c r e a s e d c a r d i a c o u t p u t c o n t r i b u t e t o a l t e r a t i o n s i n t i s s u e p e r f u s i o n ( M a z e s e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h e e x p o s u r e t o L P S a l s o r e s u l t s i n i n c r e a s e d v a s c u l a r p e r m e a b i l i t y , p a r t i c u l a r l y i n t h e l u n g s ( O l s o n e t a l . , 1 9 9 0 ; C h a n g , 1 9 9 2 l . T h e n a t u r e a n d m a g n i t u d e o f t h e s e c a r d i o v a s c u l a r r e s p o n s e s a r e d e p e n d e n t u p o n s p e c i e s , d o s e s a n d s o u r c e s o f L P S a n d r o u t e s o f e x p o s u r e . 8 I . D . 2 . D i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n L P S c a n d i r e c t l y a c t i v a t e b o t h t h e i n t r i n s i c a n d e x t r i n s i c p a t h w a y s o f c o a g u l a t i o n i n v i t r o , t h r o u g h a c t i v a t i o n o f f a c t o r X I I a n d r e l e a s e a n d / o r e x p r e s s i o n o f t i s s u e f a c t o r , r e s p e c t i v e l y ( M o r r i s o n e t a l . , 1 9 7 4 ; S t e r n e t a l . , 1 9 8 5 ; S i m c h o w i t z , 1 9 8 5 ) . L P S a d m i n i s t r a t i o n i n v i v a r e s u l t s i n d i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n ( D I C ) . T h i s i s c h a r a c t e r i z e d b y d e c r e a s e s i n p l a s m a f i b r i n o g e n a n d b l o o d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s , p r o l o n g a t i o n o f b o t h p r o t h r a m b i n a n d a c t i v a t e d p a r t i a l t h r o m b o p l a s t i n t i m e s a n d e l e v a t i o n s i n f i b r i n d e g r a d a t i o n p r o d u c t s . T h e s e c h a n g e s a r e a c c o m p a n i e d b y t h e d e p o s i t i o n o f f i b r i n w i t h i n t h e m i c r o c i r c u l a t i o n o f s e v e r a l t i s s u e s ( I t o e t a l . , 1 9 9 0 ; K r a m e r e t a l . , 1 9 7 7 ) . L P S - i n d u c e d D I C c a n b e i n h i b i t e d b y t h e a d m i n i s t r a t i o n o f a n t i c o a g u l a n t s o r i n h i b i t i o n o r r e m o v a l o f p l a t e l e t s ( I t o e t a l . , 1 9 9 0 ; K r a m e r e t a l . , 1 9 7 7 ; M a r g a r e t t e n e t a l . , 1 9 6 7 ) . D I C i s a c r i t i c a l e v e n t i n t h e l e t h a l i t y a f t e r L P S e x p o s u r e , a n d t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m c o n t r i b u t e s t o t h e p a t h o g e n e s i s o f t i s s u e i n j u r y ( E m e r s o n e t a l . , 1 9 8 7 ; H a u p t m a n e t a l . , 1 9 8 8 ) . I n a d d i t i o n , D I C i s a n e a r l y m a n i f e s t a t i o n o f s e p s i s a n d i s o f t e n u s e d a s a n i n d i c a t o r o f i n f e c t i o n w i t h g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a ( B o n e , 1 9 9 2 ) . A n a s s o c i a t i o n b e t w e e n D I C a n d l e t h a l i t y i s s u p p o r t e d b y s t u d i e s i n w h i c h a n t i c o a g u l a n t s a n d f i b r i n o l y t i c a g e n t s a f f o r d p r o t e c t i o n f r o m d e a t h a f t e r L P S e x p o s u r e ( S m i t h e t a l . , 1 9 8 8 ; E m e r s o n e t a l . , 1 9 8 7 l . T h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S i n d u c e s f i b r i n t h r o m b i f o r m a t i o n i n n u m e r o u s t i s s u e s , i n c l u d i n g t h e l u n g s , l i v e r , s p l e e n a n d k i d n e y ( K o t h e t a l . , 1 9 8 0 ; K r a m e r e t a l . , 1 9 7 7 ) . T h e d e p o s i t i o n o f t h r o m b i w i t h i n t i s s u e s m a y c o n t r i b u t e t o o r g a n i n j u r y b y d i s r u p t i n g l o c a l b l o o d f l o w . I . D . 3 . M u l t i p l e o r g a n i n j u r y L P S e x p o s u r e r e s u l t s i n i n j u r y t o s e v e r a l o r g a n s , i n c l u d i n g t h e l u n g s , g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t , k i d n e y s a n d l i v e r . P u l m o n a r y a l t e r a t i o n s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n a r e b i p h a s i c . E a r l y i n e n d o t o x e m i a , m e a n p u l m o n a r y a r t e r i a l p r e s s u r e a n d p u l m o n a r y v a s c u l a r r e s i s t a n c e i n c r e a s e d r a m a t i c a l l y . T h e s e p a r a m e t e r s r e t u r n t o w a r d c o n t r o l l e v e l s , f o l l o w e d b y a s e c o n d g r a d u a l i n c r e a s e i n p u l m o n a r y a r t e r i a l p r e s s u r e . T h i s s e c o n d p h a s e i s a c c o m p a n i e d b y i n c r e a s e d p u l m o n a r y m i c r o v a s c u l a r h y d r o s t a t i c p r e s s u r e a n d i n c r e a s e d a l v e o l a r - c a p i l l a r y p e r m e a b i l i t y ( O l s o n e t a l . , 1 9 8 5 ; O l s o n e t a l . , 1 9 9 0 ) . L P S e x p o s u r e a n d s u b s e q u e n t D I C c u l m i n a t e s i n r e n a l t u b u l a r n e c r o s i s ( D u e t a l . , 1 9 9 4 ) . T h i s i s a s s o c i a t e d w i t h r e n a l d y s f u n c t i o n , a s m a r k e d b y e l e v a t e d b l o o d u r e a n i t r o g e n a n d s e r u m c r e a t i n i n e . T h e h y p o t e n s i v e e f f e c t s o f L P S a r e b e l i e v e d t o c o n t r i b u t e t o m a r k e d d e c r e a s e s i n r e n a l b l o o d f l o w a n d g l o m e r u l a r f i l t r a t i o n r a t e ( C o c h r a n e , 1 9 7 8 ) . G a s t r o i n t e s t i n a l a l t e r a t i o n s i n c l u d e i n c r e a s e d m i c r o v a s c u l a r p e r m e a b i l i t y , e d e m a a n d g a s t r i c b l e e d i n g ( M a s u d a e t a l . , 1 9 8 9 ) . L P S - m e d i a t e d h y p o t e n s i o n a n d s u b s e q u e n t a l t e r a t i o n s i n m u c o s a l b l o o d f l o w a r e b e l i e v e d t o c o n t r i b u t e t o s l o u g h i n g o f i n t e s t i n a l m u c o s a l c e l l s a n d d e c r e a s e d m u c u s p r o d u c t i o n . T h e r e i s i n c r e a s i n g e v i d e n c e t h a t e n d o t o x e m i a , d u e t o i t s e f f e c t s o n g a s t r o i n t e s t i n a l p e r m e a b i l i t y , c a n p r o m o t e t h e a d d i t i o n a l a b s o r p t i o n o f b a c t e r i a a n d L P S f r o m t h e g u t , t h e r e b y e n h a n c i n g e n d o t o x e m i a a n d b a c t e r e m i a ( C a r r i c o e t a l . , 1 9 8 6 ) . 1 0 l . E . C e l l u l a r e f f e c t s o f L P S I . E . 1 . C e l l u l a r a n d s o l u b l e L P S b i n d i n g p r o t e i n s L P S c a n b i n d t o e n d o g e n o u s s e r u m p r o t e i n s s u c h a s H D L . T h i s b i n d i n g d e c r e a s e s t h e b i o l o g i c a c t i v i t y o f L P S ( U l e v i t c h e t a l . , 1 9 8 1 ) . L P S a l s o b i n d s t o t h e l i p o p o l y s a c c h a r i d e b i n d i n g p r o t e i n ( L B P ) , w h i c h d r a m a t i c a l l y e n h a n c e s t h e p r o i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e t o L P S . S m a l l q u a n t i t i e s o f L B P a r e p r e s e n t i n s e r u m u n d e r n o r m a l c o n d i t i o n s . E x p o s u r e t o L P S i n d u c e s t h e e x p r e s s i o n o f a c u t e p h a s e p r o t e i n s , w h i c h i n c l u d e s L B P . T h e p r e s e n c e o f L B P e n h a n c e s m a c r o p h a g e a n d n e u t r o p h i l r e s p o n s e s t o L P S 1 0 0 - 1 0 0 0 f o l d ( M a t h i s o n e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h e e n h a n c e d r e s p o n s i v e n e s s o f l e u k o c y t e s t o t h e L P S - L B P c o m p l e x i s b e l i e v e d t o b e a c o n s e q u e n c e o f b i n d i n g o f t h i s c o m p l e x t o t h e C D 1 4 r e c e p t o r , s i n c e t h i s e f f e c t i s i n h i b i t e d w i t h a n t i - C D 1 4 r e c e p t o r m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s ( Y a n g e t a l . , 1 9 9 4 ) . T h e C D 1 4 r e c e p t o r i s f o u n d o n " 1 0 n o c y t e s , m a c r o p h a g e s a n d n e u t r o p h i l s a n d i t s a c t i v a t i o n c o n t r i b u t e s t o t h e e > < p r e s s i o n o f C D 1 1 b / C D 1 8 i n t e g r i n ( M a c - 1 ) , t i s s u e f a c t o r , T N F - a , i n t e r l e u k i n - 1 a n d i n t e r l e u k i n - 6 ( H e u m a n n e t a l . , 1 9 9 2 ; Y a n g e t a l . , 1 9 9 4 ) . L P S c a n a l s o b i n d t o o t h e r r e c e p t o r s i n a L B P - i n d e p e n d e n t m a n n e r . A 7 3 k D a p r o t e i n , o r i g i n a l l y d e s c r i b e d o n m o u s e m a c r o p h a g e s a n d T a n d 8 W m p h o c y t e s , b i n d s s p e c i f i c a l l y t o t h e l i p i d A m o i e t y ( H a l l i n g e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h i s P r o t e i n f u n c t i o n s a s a r e c e p t o r s i n c e a c t i v a t i o n o f t h i s r e c e p t o r w i t h a m O n o c l o n a l a n t i b o d y s t i m u l a t e s t h e t u m o r i c i d a l a c t i v i t y o f m a c r o p h a g e s ( C h e n 9 ? a l . , 1 9 9 0 ) . T h i s r e c e p t o r h a s a l s o b e e n i d e n t i f i e d o n h u m a n p e r i p h e r a l b l o o d 1 1 m o n o c y t e s , l y m p h o c y t e s , n e u t r o p h i l s a n d p l a t e l e t s ( H a l l i n g e t a l . , 1 9 9 2 ) . A d d i t i o n a l b i n d i n g s i t e s o f 2 0 , 3 1 , 3 8 a n d 5 0 k D a h a v e b e e n i d e n t i f i e d o n h u m a n b l o o d c e l l s , b u t t h e i r r o l e i n L P S - i n d u c e d r e s p o n s e s i s n o t k n o w n ( H a l l i n g e t a l . , 1 9 9 2 ) . I n a d d i t i o n t o t h e 7 3 k D a b i n d i n g p r o t e i n , p r o t e i n s o f 9 6 k D a o n t h e m a c r o p h a g e R A W 2 6 3 c e l l l i n e ( G o l e n b o c k e t a l . , 1 9 9 0 ) , 6 5 a n d 5 5 k D a o n J 7 7 4 c e l l s ( H a r a — K u g e e t a l . , 1 9 9 0 ) , 4 7 k D a o n h e p a t o c y t e s ( P a r e n t , 1 9 8 9 ) a n d 1 8 k D a o n m o u s e 7 0 2 / 3 p r e - B c e l l l i n e ( K i r k l a n d e t a l . , 1 9 9 0 ) h a v e b e e n i d e n t i f i e d . A l t h o u g h n u m e r o u s L P S - b i n d i n g p r o t e i n s h a v e b e e n i d e n t i f i e d , s e v e r a l a p p e a r t o b e u n i q u e f o r s p e c i f i c c e l l p o p u l a t i o n s . T h e i r p r e c i s e r o l e s i n t h e v a r i o u s c e l l u l a r r e s p o n s e s t o L P S r e m a i n t o b e e s t a b l i s h e d . L P S e x p o s u r e u p r e g u l a t e s t h e e x p r e s s i o n o f C D 1 1 b / C D 1 8 b y t h e i n t e r a c t i o n o f L P S w i t h C D 1 4 . C D 1 1 b / C D I B i s p r e s e n t o n l e u k o c y t e s a n d i s i n v o l v e d i n a d h e r e n c e t o e n d o t h e l i u m a n d d i a p e d e s i s i n t o t i s s u e s . T h e i n t e r a c t i o n o f L P S w i t h t h i s r e c e p t o r i s b e l i e v e d t o p r o m o t e t h e p h a g o c y t o s i s o f g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a b y m a c r o p h a g e s a n d n e u t r o p h i l s ( L y n a m e t a l . , 1 9 9 4 ) . I . E . 2 . C y t o t o x i c i t y o f L P S L P S i s c y t o t o x i c t o c u l t u r e d m a c r a p h a g e s ( G l a d e e t a l . , 1 9 7 7 ) a n d e n d o t h e l i a l c e l l s ( H a r l a n e t a l . , 1 9 8 3 b ) . E n d o t h e l i a l t o x i c i t y i n v i t r a i s c h a r a c t e r i z e d b y d e t a c h m e n t , l e a k a g e o f c y t o p l a s m i c e n z y m e s a n d b y a l t e r a t i o n s i n p r o t e i n , D N A a n d R N A s y n t h e s i s ( M e y r i c k , 1 9 8 6 ) . T h e c y t o t o x i c i t y i s a s s o c i a t e d w i t h o x y g e n r a d i c a l s b o t h i n v i t r a a n d i n v i v a . L P S - i n d u c e d i n j u r y t o c u l t u r e d e n d o t h e l i a l c e l l s i s i n h i b i t e d w i t h o x y g e n r a d i c a l 1 2 s c a v e n g e r s ( B r i g h a m e t a l . , 1 9 8 7 ) . A n t i o x i d a n t s a l s o p r o t e c t t h e s i n u s o i d a l e n d o t h e l i u m f r o m i n j u r y a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n t o r a t s ( D e a c i u c e t a l . , 1 9 9 3 a ; D e a c i u c e t a l . , 1 9 9 3 b ; L i u e t a l . , 1 9 9 4 ) . I . E . 3 . S t i m u l a t i o n o f i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r r e l e a s e C e l l c u l t u r e s t u d i e s h a v e h e l p e d e l u c i d a t e s o m e o f t h e i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s r e l e a s e d f r o m c e l l s e x p o s e d t o L P S . T h e s e p o t e n t b i o a c t i v e c o m p o u n d s h a v e a l s o b e e n d e t e c t e d i n v i v a a n d a r e a s s o c i a t e d w i t h t h e p a t h o g e n e s i s o f L P S - i n d u c e d a l t e r a t i o n s . M a c r o p h a g e s , n e u t r o p h i l s a n d e n d o t h e l i a l c e l l s a r e m a j o r s o u r c e s o f i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s . F o r e x a m p l e , e x p o s u r e t o L P S s t i m u l a t e s m a c r o p h a g e e x p r e s s i o n o f t i s s u e f a c t o r ( Y a n g e t a l . , 1 9 9 4 ) . T N F - a ( Y a n g e t a l . , 1 9 9 4 ) , i n t e r l e u k i n - 1 ( D o i d e e t a l . , 1 9 8 7 ) , a r a c h i d o n i c a c i d m e t a b o l i t e s ( D e c k e r e t a l . , 1 9 8 9 ) , n i t r i c o x i d e ( M a r l e t t a e t a / . , 1 9 8 8 ) , l y s o s o m a l e n z y m e s ( D e c k e r , 1 9 9 0 ) , o x y g e n r a d i c a l s ( J a e s c h k e e t a l . , 1 9 9 2 b ) a n d p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r ( D e c k e r , 1 9 9 0 ) . T h e s e i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s c a n p r o m o t e t h e d e v e l o p m e n t o f p a t h o p h y s i o l g i c a l t e r a t i o n s i n d e p e n d e n t l y a n d a l s o i n a s y n e r g i s t i c f a s h i o n w i t h o t h e r i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s a n d w i t h L P S . M a n y o f t h e s e w i l l b e d i s c u s s e d a s t h e y r e l a t e t o t h e d e v e l o p m e n t o f h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y d u r i n g L P S e x p o s u r e i n S e c t i o n I I . L P S c a n s t i m u l a t e i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r r e l e a s e b y s e v e r a l m e c h a n i s m s . F o r i n s t a n c e , L P S - i n d u c e d a c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e A 2 r e s u l t s i n t h e c l e a v a g e 1 3 o f m e m b r a n e p h o s p h o l i p i d s i n t o l y s o p h o s p h o l i p i d s a n d a r a c h i d o n i c a c i d ( M o h r i e t a l . , 1 9 9 0 ) . T h i s l e a d s t o t h e f o r m a t i o n o f p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r , a n d t o l e u k o t r i e n e s a n d p r o s t a g l a n d i n s b y t h e I i p o x y g e n a s e a n d c y c l o o x y g e n a s e p a t h w a y s , r e s p e c t i v e l y . L P S c a n a l s o s t i m u l a t e i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r r e l e a s e b y t h e i n d u c t i o n o f g e n e e x p r e s s i o n . F o r e x a m p l e , L P S e x p o s u r e r e s u l t s i n i n c r e a s e d T N F - a m R N A e x p r e s s i o n ( M o h r i e t a l . , 1 9 9 0 ) . G e n e e x p r e s s i o n i s i n v o l v e d i n t h e e x p r e s s i o n o f a d h e s i o n m o l e c u l e s a s w e l l ( C o l u c c i e t a l . , 1 9 8 3 ) . I n a d d i t i o n , i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r r e l e a s e c a n b e i n f l u e n c e d b y o t h e r m e d i a t o r s , w h i c h c a n e i t h e r i n h i b i t o r p r o m o t e t h e r e l e a s e o f b i o a c t i v e c o m p o u n d s . F o r e x a m p l e , p r o s t a g l a n d i n E , i n h i b i t s T N F - a r e l e a s e f r o m m a c r o p h a g e s ( S t r e i t e r e t a l . , 1 9 8 8 ) . I n c o n t r a s t , P A F e n h a n c e s L P S - i n d u c e d s u p e r o x i d e p r o d u c t i o n ( G a r d n e r e t a l . , 1 9 9 5 ) a n d e x p r e s s i o n o f t i s s u e f a c t o r ( O s t e r u d , 1 9 9 2 ) . I n s u m m a r y , L P S c a n s t i m u l a t e t h e r e l e a s e o f i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s , w h i c h c a n d i r e c t l y c o n t r i b u t e t o L P S - m e d i a t e d t i s s u e i n j u r y a n d a l s o p r o m o t e o r i n h i b i t t h e p r o d u c t i o n o f o t h e r i n f l a m m a t o r y s u b s t a n c e s . T h u s , t h e p o s s i b l e m e c h a n i s m s b y w h i c h t h e s e m e d i a t o r s c o n t r i b u t e t o t h e p a t h o p h y s i o l o g i c a l t e r a t i o n s o b s e r v e d d u r i n g L P S e x p o s u r e i n v i v a a r e m u l t i f a r i o u s . T h e f o c u s o f t h i s d i s s e r t a t i o n i s o n t h e m e c h a n i s m s b y w h i c h L P S e x p o s u r e c u l m i n a t e s i n h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y . S e c t i o n I I w i l l i n c l u d e c o m p r e h e n s i v e d i s c u s s i o n o f t h e d i r e c t e f f e c t s o f L P S o n t h e l i v e r . I n a d d i t i o n , a s d i s c u s s e d i n t h i s c h a p t e r , h o s t - d e r i v e d c e l l u l a r a n d s o l u b l e m e d i a t o r s a p p e a r t o b e c r i t i c a l i n t h e b i o l o g i c a l r e s p o n s e s t o L P S . A m a i n f o c u s o f t h e f o l l o w i n g 1 4 s e c t i o n w i l l b e t h e p o s s i b l e r o l e s o f s o m e o f t h e s e m e d i a t o r s i n t h e d e v e l o p m e n t o f h e p a t o t o x i c i t y . I I . L P S - M E D I A T E D H E P A T O T O X I C I T Y I I . A . L i v e r s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n T h e l i v e r c o m p r i s e s s e v e r a l c e l l t y p e s . T h e h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l s a r e r e s p o n s i b l e f o r m o s t h e p a t i c f u n c t i o n s a n d c o n s i s t i t u t e a p p r o x i m a t e l y 8 0 % o f t h e c e l l s w i t h i n t h e l i v e r ( L a u t t e t a / . , 1 9 8 7 ) . T h e r e m a i n i n g h e p a t i c c e l l s c o n s i s t o f s i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l s , K u p f f e r c e l l s ( r e s i d e n t l i v e r m a c r o p h a g e s ) , I t o c e l l s ( f a t s t o r i n g c e l l s ) a n d b i l e d u c t e p i t h e l i a l c e l l s . T h e l i v e r r e c e i v e s a d u a l b l o o d s u p p l y t h a t r e p r e s e n t s a b o u t 2 5 % o f c a r d i a c o u t p u t . T h e h e p a t i c a r t e r y o n l y s u p p l i e s o n e - t h i r d o f t h e t o t a l h e p a t i c b l o o d f l o w i n h u m a n s b u t f u r n i s h e s n e a r l y 7 5 % o f t h e o x y g e n s u p p l y ( L a u t t e t a l . , 1 9 8 7 ) . T h e p o r t a l v e i n p r o v i d e s a m a j o r i t y o f b l o o d s u p p l y t o t h e l i v e r . T h e p o r t a l v e i n c o n t a i n s b l o o d t h a t h a s p a s s e d t h r o u g h t h e m e s e n t e r i c s y s t e m a n d i s t h e r e f o r e r i c h i n n u t r i e n t s b u t r e l a t i v e l y p o o r i n o x y g e n . T h e b a s i c s t r u c t u r a l u n i t o f t h e l i v e r i s t h e l o b u l e . T h e c e n t r a l v e i n l i e s i n t h e c e n t e r o f t h e I o b u l e f r o m w h i c h c o r d s o f p a r e n c h y m a l c e l l s r a d i a t e o u t w a r d t o t h e p o r t a l t r i a d s , w h i c h c o n t a i n b r a n c h e s f r o m t h e p o r t a l v e i n , 1 5 h e p a t i c a r t e r y , l y m p h n o d e s a n d b i l e d u c t s . T h e p a r e n c h y m a l c e l l s s u r r o u n d i n g t h e c e n t r a l v e i n a n d p o r t a l t r i a d a r e t e r m e d c e n t r i l o b u l a r a n d p e r i p o r t a l c e l l s , r e s p e c t i v e l y . T h e c e l l s i n b e t w e e n a r e r e f e r r e d t o a s m i d z o n a l c e l l s . B l o o d e n t e r s t h e l i v e r l o b u l e a t t h e p o r t a l t r i a d s a n d f l o w s t h r o u g h s i n u s o i d s t o t h e c e n t r i l o b u l a r r e g i o n s , w h e r e b l o o d e n t e r s t h e c e n t r a l v e i n a n d e v e n t u a l l y l e a v e s t h e l i v e r v i a t h e h e p a t i c v e i n . F e n e s t r a t e d e n d o t h e l i a l c e l l s l i n e t h e s e s i n u s o i d s a l l o w i n g f o r c o n t a c t b e t w e e n t h e p l a s m a a n d h e p a t o c y t e s . K u p f f e r c e l l s a r e f o u n d s c a t t e r e d t h r o u g h o u t t h e l i v e r s i n u s o i d s . T h e i r m a i n f u n c t i o n i s t o r e m o v e p a r t i c u l a t e d e b r i s , s e n e s c e n t b l o o d c e l l s a n d f o r e i g n s u b s t a n c e s s u c h a s b a c t e r i a a n d L P S . B i l e p r o d u c e d b y t h e p a r e n c h y m a l c e l l s i s t r a n s p o r t e d t o t h e p o r t a l t r i a d i n b i l e c a n a l i c u l i . M a i n f u n c t i o n s o f t h e l i v e r i n c l u d e s y n t h e s i s o f p l a s m a p r o t e i n s , r e g u l a t i o n o f c a r b o h y d r a t e m e t a b o l i s m , s t o r a g e o f g l y c o g e n a n d v i t a m i n s , m e t a b o l i s m o f l i p i d s , d e g r a d a t i o n o f h o r m o n e s , f o r m a t i o n o f b i l e c o n s t i t u e n t s a n d m e t a b o l i s m a n d e x c r e t i o n o f x e n o b i o t i c a g e n t s . I I . B . H e p a t i c a l t e r a t i o n s a f t e r L P S e x p o s u r e I I . B . 1 . M o r p h o l o g i c c h a n g e s K u p f f e r c e l l s a r e t h e f i r s t h e p a t i c c e l l s t o b e a l t e r e d a f t e r L P S e x p o s u r e . T h e s e a l t e r a t i o n s i n c l u d e s w e l l i n g a n d a n i n c r e a s e i n b o t h n u m b e r a n d s i z e o f p h a g o c y t i c v a c u o l e s f o l l o w e d b y t h e l o s s o f p r i m a r y l y s o s o m e s . P l a t e l e t s , w i t h 1 6 s e c r e t o r y g r a n u l e s i n t a c t , a r e f r e q u e n t l y o b s e r v e d w i t h i n p h a g o c y t i c v a c u o l e s o f K u p f f e r c e l l s ( L e v y e t a l . , 1 9 6 8 3 ; L e v y e t a l . , 1 9 6 8 b ) . T h e s e c h a n g e s o c c u r w i t h i n 1 5 m i n u t e s a f t e r s y s t e m i c L P S e x p o s u r e . T h i r t y m i n u t e s a f t e r e x p o s u r e , s i g n i f i c a n t n u m b e r s o f n e u t r o p h i l s a c c u m u l a t e w i t h i n t h e s i n u s o i d s , a n d a n u m b e r o f n e u t r o p h i l s a r e l o c a t e d w i t h i n K u p f f e r c e l l p h a g o s o m e s . S u b s e q u e n t t o a l t e r a t i o n s i n K u p f f e r c e l l s , s w e l l i n g o f e n d o t h e l i a l c e l l p r o c e s s e s o c c u r s a l o n g w i t h t h e a p p e a r a n c e o f f i b r i n c l u m p s a n d p l a t e l e t t h r o m b i w i t h i n t h e s i n u s o i d s ( L e v y e t a l . , 1 9 6 8 a ; L e v y e t a l . , 1 9 6 8 b ; D u r h a m e t a l . , 1 9 9 0 ) . H e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l s d o n o t a p p e a r t o b e a l t e r e d u n t i l 2 - 4 h o u r s a f t e r L P S e x p o s u r e . P a r e n c h y m a l c e l l c h a n g e s i n c l u d e c y t o p l a s m i c i n v a g i n a t i o n o f n u c l e i , m i t o c h o n d r i a l a n d m i c r o v i l l i s w e l l i n g , v a c u o l a t i o n a n d t h e p r e s e n c e o f s p h e r i c a l e o s i n o p h i l i c c y t O p l a s m i c d r o p l e t s ( L e v y e t a l . , 1 9 6 8 a ; L e v y e t a l . , 1 9 6 8 b ; D u r h a m e t a l . , 1 9 9 0 ) . F o u r h o u r s a f t e r L P S e x p o s u r e , t h e r e i s e v i d e n c e o f p a r e n c h y m a l d e g e n e r a t i o n a n d n e c r o s i s . H e p a t o c e l l u l a r l e s i o n s a r e c h a r a c t e r i z e d b y m u l t i f o c a l , i r r e g u l a r l y s h a p e d a r e a s o f m i d z o n a l h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 2 ) . N e c r o t i c c e l l s a r e h y p e r e o s i n o p h i l i c w i t h s m a l l , p y k n o t i c n u c l e i o r p a l e w i t h i n d i s t i n c t o r a b s e n t n u c l e i a n d i n d i s t i n c t c y t o p l a s m i c b o r d e r s . T h e s e l e s i o n s c o n t a i n d e g e n e r a t e n e u t r o p h i l s a n d s m a l l a m o u n t s o f h e m o r r h a g e ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 2 ) . B e t w e e n f o u r a n d s i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , l i v e r - s p e c i f i c e n z y m e s s u c h a s a s p a r t a t e a m i n o t r a n s f e r a s e a n d a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e a r e e l e v a t e d i n p l a s m a , i n d i c a t i n g a l o s s i n h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l i n t e g r i t y . 1 7 I I . B . 2 . F u n c t i o n a l c h a n g e s L P S e x p o s u r e d e c r e a s e s g l u c o n e a g e n e s i s a n d s t i m u l a t e s g l y c o g e n o l y s i s . T h e s e c h a n g e s c o n t r i b u t e t o a m a r k e d r e d u c t i o n i n p a r e n c h y m a l c e l l g l y c o g e n c o n t e n t w i t h i n 3 0 m i n u t e s a f t e r s y s t e m i c L P S e x p o s u r e ( L e v y e t a l . , 1 9 6 8 a ; L a w a t a l . , 1 9 6 8 b ; F i l k i n s e t a l . , 1 9 7 7 ; F i l k i n s e t a l . , 1 9 7 4 ) . R e s u l t s f r o m s t u d i e s i n v i t r a s u g g e s t t h a t L P S e x p o s u r e a l t e r s h e p a t i c l i p i d m e t a b o l i s m . T h e a d d i t i o n o f L P S t o i s o l a t e d p a r e n c h y m a l c e l l s i n c r e a s e s c e l l u l a r l i p i d c o n t e n t ( V i c t o r o v e t a l . , 1 9 8 9 ) . T h i s i s a s s o c i a t e d w i t h e n h a n c e d s e c r e t i o n o f l i p i d s i n t o t h e c u l t u r e m e d i u m . T h e s e c h a n g e s a r e b e l i e v e d t o r e s u l t f r o m i n c r e a s e d l i p i d s y n t h e s i s , s i n c e h e p a t o c y t e s i n c o r p o r a t e r a d i o l a b e l e d a c e t a t e i n t o n e u t r a l l i p i d s . T h e s e a l t e r a t i o n s m a y c o n t r i b u t e t o t h e a c c u m u l a t i o n o f l i p i d s w i t h i n t h e l i v e r a n d m a y e x p l a i n f a t t y c h a n g e s o b s e r v e d i n l i v e r s 2 4 h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( L e v y e t a l . , 1 9 6 8 a ; L e v y e t a l . , 1 9 6 8 b ) . C h o l e s t a s i s i s d e f i n e d a s a d e c r e a s e i n b i l e f l o w . T h i s i s c h a r a c t e r i z e d b y e l e v a t e d p l a s m a b i l i r u b i n a n d d e c r e a s e d c l e a r a n c e o f s u l f o b r o m o p h t h a l e i n a n d i n d o c y a n i n e g r e e n . I n i s o l a t e d l i v e r s p e r f u s e d w i t h b u f f e r , t h e a d d i t i o n o f L P S t o t h e b u f f e r r e s u l t s i n c h o l e s t a s i s ( U t i l i e t a l . , 1 9 7 6 ; U t i l i e t a l . , 1 9 7 7 ) . T h i s a p p e a r s t o b e m e d i a t e d d i r e c t l y b y L P S s i n c e b l o o d e l e m e n t s a r e n o t p r e s e n t i n t h e b u f f e r . I n a d d i t i o n , c h o l e s t a s i s d e v e l o p s w i t h o u t s i g n i f i c a n t r e l e a s e o f p a r e n c h y m a l c e l l e n z y m e s i n t o t h e p e r f u s a t e , s u g g e s t i n g t h a t c h a n g e s i n b i l e f l o w o c c u r i n t h e a b s e n c e o f h e p a t o c e l l u l a r d a m a g e ( U t i l i e t a l . , 1 9 7 7 ) . H e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l s p r o d u c e b i l e a n d e x p o r t i t i n t o t h e b i l e 1 8 c a n a l i c u l i , w h e r e i t i s c o l l e c t e d i n t o b i l e d u c t s i n t h e p o r t a l t r i a d a n d t r a n s p o r t e d t o t h e g a l l b l a d d e r f o r s t o r a g e . B i l e i s p r o d u c e d b y t w o m e c h a n i s m s , o n e b i l e s a l t - d e p e n d e n t a n d t h e o t h e r b i l e s a l t - i n d e p e n d e n t ( E r l i n g e r e t a l . , 1 9 7 4 ) . T h e b i l e s a l t - d e p e n d e n t f r a c t i o n i s f o r m e d b y t h e s e c r e t i o n o f b i l e i n t o t h e c a n a l i c u l i b y t h e f o r m a t i o n o f a n o s m o t i c g r a d i e n t . I n t h e b i l e s a l t - i n d e p e n d e n t f r a c t i o n , b i l e i s a c t i v e l y t r a n s p o r t e d i n t o t h e c a n a l i c u l i b y a N a + l K + A T P a s e l o c a t e d o n t h e p a r e n c h y m a l c e l l m e m b r a n e ( E r l i n g e r e t a l . , 1 9 7 4 ) . S o m e e v i d e n c e s u g g e s t s t h a t L P S c a n i n h i b i t t h i s N a ” / K * A T P a s e i n i s o l a t e d m e m b r a n e s ( U t i l i e t a l . , 1 9 7 6 ) . I n a d d i t i o n , a l t h o u g h b i l e f l o w i s r e d u c e d a f t e r L P S e x p o s u r e , t h i s i s n o t a s s o c i a t e d w i t h d e c r e a s e d s e c r e t i o n o f b i l e s a l t s ( U t i l i e t a l . , 1 9 7 6 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e s t u d i e s s u g g e s t t h a t L P S c a n d i r e c t l y a l t e r t h e f o r m a t i o n o f t h e s a l t - i n d e p e n d e n t f r a c t i o n o f b i l e . A s m e n t i o n e d i n S e c t i o n I , K u p f f e r c e l l s a r e t h e p r i m a r y c e l l s r e s p o n s i b l e f o r t h e r e m o v a l o f L P S f r o m t h e c i r c u l a t i o n a f t e r t h e i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f L P S t o r o d e n t s . I n a d d i t i o n , e n d o t h e l i a l c e l l s c a n r e m o v e L P S b y a p r o c e s s o f m i c r o p i n o c y t o s i s . S o m e L P S i s a l s o a s s o c i a t e d w i t h h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l s . T h i s a s s o c i a t i o n m a y b e r e s p o n s i b l e f o r s o m e o f t h e a l t e r a t i o n s i n h e p a t o c e l l u l a r f u n c t i o n . H o w e v e r , e x p o s u r e t o L P S d o e s n o t a p p e a r t o r e s u l t i n h e p a t o c e l l u l a r t o x i c i t y , a l t h o u g h i t i s p o s s i b l e t h a t L P S e x p o s u r e m a y p r e d i s p o s e t h e h e p a t o c y t e s t o i n j u r y f r o m i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s . T h e r e m a i n i n g s e c t i o n s i n t h i s c h a p t e r w i l l f o c u s o n s o m e o f t h e c e l l u l a r a n d s o l u b l e m e d i a t o r s t h a t m a y c o n t r i b u t e t o t h e p a t h o g e n e s i s o f h e p a t o c e l l u l a r d a m a g e a f t e r L P S e x p o s u r e . 1 9 I I . C . R o l e s o f c e l l u l a r a n d s o l u b l e m e d i a t o r s i n L P S - m e d i a t e d h e p t o t o x i c i t y T h e f o l l o w i n g s u b s e c t i o n s w i l l f o c u s o n t h e m e c h a n i s m s b y w h i c h i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s c o n t i b u t e t o t h e p a t h o g e n e s i s o f h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y , a s d e t e r m i n e d b y b o t h i n v i t r o a n d i n v i v o s t u d i e s . P a r t i c u l a r a t t e n t i o n w i l l b e c e n t e r e d o n t h e r o l e s o f n e u t r o p h i l s , K u p f f e r c e l l s , c y t o k i n e s , c o a g u l a t i o n f a c t o r s , l i p i d m e d i a t o r s a n d p l a t e l e t s . A s w i l l b e d i s c u s s e d i n t h i s s e c t i o n , t h e r o l e o f s o m e o f t h e s e e n d o g e n o u s m e d i a t o r s i n t h e d e v e l o p m e n t o f L P S - m e d i a t e d h e p a t o t o x i c i t y i s o f t e n m o d e l - d e p e n d e n t . A l t h o u g h t h e c e l l u l a r m e d i a t o r s i n v o l v e d i n L P S - i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y a r e c o n s i s t e n t a m o n g m o d e l s , t h e r e a r e c o n s i d e r a b l e d i f f e r e n c e s r e g a r d i n g t h e c r i t i c a l n a t u r e o f s o l u b l e m e d i a t o r s a m o n g a n i m a l m o d e l s i n t h e r e s p o n s e t o L P S i n v i v a . S o m e o f t h e v a r i a b l e f a c t o r s i n c l u d e s p e c i e s d i f f e r e n c e s , r o u t e a n d d u r a t i o n o f L P S e x p o s u r e , a n d d i f f e r e n c e s i n d o s e s a n d b a c t e r i a l s o u r c e s o f L P S . T h e f o l l o w i n g d i s c u s s i o n o n t h e r o l e s o f i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s i n L P S - i n d u c e d h e p a t o c e l l u l a r d a m a g e w i l l h i g h l i g h t s o m e o f t h e s e d i f f e r e n c e s . I I . C . 1 . N e u t r o p h i l s T h e a c c u m u l a t i o n o f n e u t r o p h i l s w i t h i n t h e s i n u s o i d s i s o n e o f t h e e a r l i e s t a l t e r a t i o n s o b s e r v e d i n l i v e r s o f a n i m a l s e x p o s e d t o L P S ( L e v y e t a l . , 1 9 6 B a ; L e v y e t a l . , 1 9 6 8 b ) . T h e m o s t c o m p e l l i n g e v i d e n c e f o r a r o l e f o r n e u t r o p h i l s i n 2 0 L P S - m e d i a t e d h e p a t o t o x i c i t y c o m e s f r o m s t u d i e s i n w h i c h p r i o r d e p l e t i o n o f n e u t r o p h i l s w i t h a n t i b o d i e s p r e v e n t s t h e m a n i f e s t a t i o n o f h e p a t o t o x i c i t y a f t e r L P S e x p o s u r e ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 2 ; J a e s c h k e e t a l . , 1 9 9 1 b ) . T h e s e f i n d i n g s a r e s u p p o r t e d b y s t u d i e s u s i n g c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s . L a r g e d o s e s o f v i n b l a s t i n e i n h i b i t w h i t e b l o o d c e l l f o r m a t i o n i n b o n e m a r r o w a n d r e s u l t i n a p r o u n o u n c e d I e u k o p e n i a . T h i s l e u k o p e n i a i s a s s o c i a t e d w i t h p r o t e c t i o n f r o m t h e h e p a t o t o x i c e f f e c t s o f L P S e x p o s u r e i n r a t s ( Y o s h i k a w a e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h e m e c h a n i s m b y w h i c h n e u t r o p h i l s a c c u m u l a t e w i t h i n t h e l i v e r r e m a i n s u n c l e a r . H o w e v e r , L P S i s d i r e c t l y t o x i c t o c u l t u r e d e n d o t h e l i a l c e l l s ( H a r l a n e t a l . , 1 9 8 3 b ; H a r l a n e t a l . , 1 9 8 3 a ) a n d e v i d e n c e f r o m L P S - t r e a t e d r a t s i n d i c a t e s a n e a r l y a n d p r o n o u n c e d d e c r e a s e i n s i n u s o i d a l c e l l s t h a t r e s e m b l e e n d o t h e l i u m a n d a l o s s i n e n d o t h e l i a l c e l l f u n c t i o n s ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 2 ; D e a c i u c e t a l . , 1 9 9 3 a ; D e a c i u c e t a l . , 1 9 9 3 c ) . I n j u r y t o t h e e n d o t h e l i u m a n d s u b s e q u e n t e x p o s u r e o f t h e s u b e n d o t h e l i u m m i g h t p r o m o t e t h e a d h e r e n c e a n d a c c u m u l a t i o n o f n e u t r o p h i l s w i t h i n t h e s i n u s o i d s . L P S e x p o s u r e c a n u p r e g u l a t e t h e e x p r e s s i o n o f a d h e s i o n m o l e c u l e s o n a v a r i e t y o f c e l l s , i n c l u d i n g e n d o t h e l i a l c e l l s ( s t o r n , 1 9 9 0 ) . T h e s e a d h e s i o n m o l e c u l e s p r o m o t e l e u k o c y t e a d h e r e n c e t o s u c h c e l l s . A l t h o u g h o n e s u c h a d h e s i o n m o l e c u l e , l C A M - l , i s u p r e g u l a t e d a f t e r L P S e x p o s u r e ( E s s a n i e t a l . , 1 9 9 5 ) , a n t i b o d i e s t o t h i s m o l e c u l e d o n o t i n h i b i t h e p a t i c n e u t r o p h i l i n f i l t r a t i o n a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n ( E s s a n i e t a l . , 1 9 9 5 ) . A n o t h e r i m p o r t a n t a d h e s i o n m o l e c u l e i s P - s e l e c t i n ( G M P - 1 4 0 ) . T h i s l e c t i n c o n t a i n i n g m o l e c u l e i s p a c k a g e d w i t h i n t h e a - g r a n u l e s o f p l a t e l e t s a n d W e i b e l - P a l a d e b o d i e s i n 2 1 e n d o t h e l i a l c e l l s . S t i m u l a t i o n o f t h e s e c e l l s r e s u l t s i n t h e r a p i d e x p r e s s i o n o f t h i s m o l e c u l e o n t h e c e l l s u r f a c e . L P S e x p o s u r e r e s u l t s i n t h e e x p r e s s i o n o f P - s e l e c t i n o n e n d o t h e l i a l c e l l s ( C o u g h l a n e t a l . , 1 9 9 4 ) . P - s e l e c t i n i s s u g g e s t e d t o m e d i a t e h e p a t i c n e u t r o p h i l a c c u m u l a t i o n i n r a t s e x p o s e d t o L P S , s i n c e a n a n t i b o d y t o P - s e l e c t i n c o m p l e t e l y b l o c k s s i n u s o i d a l n e u t r o p h i l i a ( C o u g h l a n e t a l . , 1 9 9 4 ) . E x p o s u r e t o L P S s t i m u l a t e s t h e r e l e a s e o f c y t o k i n e s , s u c h a s I L - 1 , T N F - a a n d P A F . E a c h o f t h e s e m e d i a t o r s c o u l d c o n t r i b u t e t o t h e a d h e r e n c e o f n e u t r o p h i l s i n t h e l i v e r s i n c e t h e y a l l u p r e g u l a t e a d h e s i o n m o l e c u l e e x p r e s s i o n o n e n d o t h e l i u m ( s e e b e l o w ) . I t i s p o s s i b l e t h a t s e v e r a l i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s a n d a d h e s i o n m o l e c u l e s c o n t r i b u t e t o h e p a t i c s i n u s o i d a l n e u t r o p h i l i a . A l t h o u g h n e u t r o p h i l s a c c u m u l a t e w i t h i n t h e l i v e r r a p i d l y a f t e r L P S e x p o s u r e , a n u n r e s o l v e d q u e s t i o n i s h o w a n d w h e n t h e s e c e l l s b e c o m e a c t i v a t e d . N u m e r o u s i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s a n d a d h e s i o n m o l e c l e s c a n p r i m e o r d i r e c t l y s t i m u l a t e n e u t r o p h i l a c t i v a t i o n . F o r e x a m p l e , a n a n t i b o d y t o ( C A M - 1 d o e s n o t i n h i b i t t h e h e p a t i c a c c u m u l a t i o n o f n e u t r o p h i l s y e t a f f o r d s p r o t e c t i o n f r o m l i v e r i n j u r y ( E s s a n i e t a l . , 1 9 9 5 ) , s u g g e s t i n g t h a t l C A M - l i s i n v o l v e d i n t h e a c t i v a t i o n o f n e u t r o p h i l s . P A F i s c h e m o t a c t i c f o r n e u t r o p h i l s a n d c a n s t i m u l a t e t h e p r o d u c t i o n o f s u p e r o x i d e a n i o n ( W o r t h e n e t a l . , 1 9 8 3 ; M o n t r u c c h i o e t a l . , 1 9 9 3 ; T a k a h a s h i e t a l . , 1 9 9 1 ) . O t h e r m e d i a t o r s , s u c h a s T N F - a , p r i m e n e u t r o p h i l s f o r a c t i v a t i o n a n d e n h a n c e s u p e r o x i d e g e n e r a t i o n a n d d e g r a n u l a t i o n i n r e s p o n s e t o o t h e r s t i m u l i ( K l e b a n o f f e t a l . , 1 9 8 6 ) . S e v e r a l m e d i a t o r s , a n d t h e i r e f f e c t s o n n e u t r o p h i l s , w i l l b e d i s c u s s e d i n t h e f o l l o w i n g s u b s e c t i o n s . T h e m e c h a n i s m s b y w h i c h n e u t r o p h i l s m e d i a t e h e p a t o c e l l u l a r d a m a g e i n 2 2 v i v a r e m a i n u n c l e a r . S t i m u l a t e d n e u t r o p h i l s c a n r e l e a s e n u m e r o u s i n f l a m m a t o r y s u b s t a n c e s t h a t c o u l d a l t e r p a r e n c h y m a l c e l l i n t e g r i t y . T h e s e i n c l u d e r e a c t i v e o x y g e n m e t a b o l i t e s , s u c h a s s u p e r o x i d e , h y d r o g e n p e r o x i d e a n d h y d r o x y l r a d i c a l . T h e s e r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s c a n i n i t i a t e l i p i d p e r o x i d a t i o n a n d r e s u l t i n m e m b r a n e d a m a g e . L i p i d p e r o x i d a t i o n p r o d u c t s h a v e b e e n d e t e c t e d i n l i v e r s 8 - 1 6 h o u r s a f t e r L P S e x p o s u r e ( O g a w a e t a l . , 1 9 8 2 ; S u g i n o e t a l . , 1 9 8 7 ) , h o w e v e r t h e m a g n i t u d e o f l i p i d p e r o x i d a t i o n i n t h e l i v e r i s s i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a n t h a t o b s e r v e d d u r i n g i s c h e m i a / r e p e r f u s i o n i n j u r y ( J a e s c h k e e t a l . , 1 9 9 2 d ; J a e s c h k e e t a l . , 1 9 9 1 a ; L i u e t a l . , 1 9 9 5 ) . C o n c u r r e n t w i t h t h e i n c r e a s e i n l i p i d p e r o x i d a t i o n p r o d u c t s i s a d e c r e a s e i n h e p a t o c e l l u l a r A T P c o n t e n t ( S u g i n o e t a l . , 1 9 8 9 ) , s u g g e s t i n g l i p i d p e r o x i d a t i o n r e s u l t s i n m i t o c h o n d r i a l d y s f u n c t i o n . T h e a d m i n i s t r a t i o n o f a n t i o x i d a n t s s u c h a s c a t a l a s e , s u p e r o x i d e d i s m u t a s e a n d a - t o c o p h e r o l a t t e n u a t e l e t h a l i t y a n d h e p a t o t o x i c i t y i n L P S - t r e a t e d m i c e ( N e i h o r s t e r e t a l . , 1 9 9 2 ; S u g i n o e t a l . , 1 9 8 7 ) . H o w e v e r , o x y g e n r a d i c a l s a r e n o t c r i t i c a l i n a l l m o d e l s o f e n d o t o x e m i a s i n c e o x y g e n r a d i c a l s c a v e n g e r s d o n o t i n h i b i t t h e c a r d i o v a s c u l a r e f f e c t s o f L P S i n d o g s ( N o v o t n y e t a l . , 1 9 8 8 ) . T h u s , t h e r o l e o f o x y g e n r a d i c a l s i n L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y r e m a i n s u n c l e a r . A c t i v a t i o n o f n e u t r o p h i l s a l s o r e s u l t s i n d e g r a n u l a t i o n a n d r e l e a s e o f I y s o s o m a l c o n s t i t u e n t s i n t o t h e e x t r a c e l l u l a r m i l e u . T h e s e I y s o s o m e s c o n t a i n p r o t e a s e s , l a c t o f e r r i n a n d m y e l o p e r o x i d a s e , a n e n z y m e t h a t c a n g e n e r a t e t h e p o t e n t o x i d e n t , h y p o c h l o r o u s a c i d . S t u d i e s w i t h p r o t e a s e i n h i b i t o r s s u g g e s t t h a t t h e n e u t r o p h i l p r o t e a s e , e l a s t a s e , p r o m o t e s r e n a l d y s f u n c t i o n i n i s o l a t e d p e r f u s e d k i d n e y s ( L i n a s e t a l . , 1 9 9 1 ) . I n a d d i t i o n , f - m e t - I e u - p h e ( f m l p ) 2 3 s t i m u l a t e d n e u t r o p h i l s m e d i a t e h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y i n v i t r a b y r e l e a s i n g c a t h e p s i n G a n d e l a s t a s e ( H o e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h e r o l e o f p r o t e a s e s w i l l b e d i s c u s s e d i n g r e a t e r d e t a i l i n S e c t i o n I I I . F u r t h e r s t u d y i s n e e d e d t o e v a l u a t e t h e r o l e s o f t h e s e n e u t r o p h i l - d e r i v e d p r o t e a s e s i n L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . U p o n a c t i v a t i o n , n e u t r o p h i l s a l s o r e l e a s e p o t e n t i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s s u c h a s t h e c y s t e i n y l l e u k o t r i e n e s a n d P A F ( s e e b e l o w ) , w h i c h c o u l d c o n t r i b u t e t o c y t o t o x i c i t y . I I . C . 2 . K u p f f e r c e l l s K u p f f e r c e l l s , t h e r e s i d e n t m a c r o p h a g e s o f t h e l i v e r , a r e p a r t o f t h e i n n a t e i m m u n e r e s p o n s e a n d t h e i r p h a g o c y t i c a c t i v i t y i s c r i t i c a l i n t h e r e m o v a l o f i n v a d i n g m i c r o b i a l p a t h o g e n s . A s d i s c u s s e d i n S e c t i o n I , t h e y r a p i d l y r e m o v e L P S f r o m t h e c i r c u l a t i o n a n d t h e r e b y p r e v e n t g u t - d e r i v e d L P S f r o m r e a c h i n g t h e s y s t e m i c c i r c u l a t i o n . A l t h o u g h t h i s p h a g o c y t i c a c t i v i t y o f K u p f f e r c e l l s p r e v e n t s s y s t e m i c e n d o t o x e m i a , s e v e r a l s t u d i e s s u g g e s t t h e s e c e l l s p r o m o t e t h e p a t h o g e n e s i s o f L P S - i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y . F o r e x a m p l e , g a d o l i n i u m c h l o r i d e ( G d C l a ) f o r m s i n s o l u b l e c a r b o n a t e a n d p h o s p h a t e p r e c i p i t a t e s i n b l o o d w h i c h a r e p h a g o c y t o s e d b y K u p f f e r c e l l s a n d r e s u l t s i n t h e i r i n a c t i v a t i o n ( D e a n e t a l . , 1 9 8 8 ; H a r d o n k e t a l . , 1 9 9 2 ) . P r e t r e a t m e n t o f r a t s w i t h G d C l 3 a t t e n u a t e s t h e h e p a t o t o x i c i t y o b s e r v e d a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n . W h y K u p f f e r c e l l i n h i b i t i o n w i t h G d C l 3 l e a d s t o p r o t e c t i o n f r o m l i v e r i n j u r y r e m a i n s u n c l e a r . H o w e v e r , G d C l a a d m i n i s t r a t i o n d o e s n o t r e d u c e t h e e l e v a t i o n i n p l a s m a T N F - a a c t i v i t y ( s e e b e l o w ) o r h e p a t i c n e u t r o p h i l a c c u m u l a t i o n , s u g g e s t i n g t h a t t h e p r e s e n c e 2 4 o f n e u t r o p h i l s a n d T N F - a i s i n s u f f i c i e n t t o p r o d u c e l i v e r i n j u r y i n t h e a b s e n c e o f f u n c t i o n a l K u p f f e r c e l l s . F u r t h e r e v i d e n c e f o r a r o l e f o r K u p f f e r c e l l s i n L P S - m e d i a t e d h e p a t o t o x i c i t y c o m e s f r o m s t u d i e s w i t h C 3 H / H e J m i c e . T h e s e m i c e a r e e x c e p t i o n a l l y r e s i s t e n t t o t h e l e t h a l e f f e c t s o f L P S . T h i s r e s i s t a n c e m a y b e m e d i a t e d b y a l t e r a t i o n s i n m a c r o p h a g e f u n c t i o n s . I n c o n t r a s t t o o t h e r s t r a i n s o f m i c e a n d a n i m a l s p e c i e s , t h e m a c r o p h a g e s i s o l a t e d f r o m C 3 H / H e J a r e l e s s r e s p o n s i v e t o L P S e x p o s u r e a n d d o n o t r e l e a s e m a n y i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s ( W a h l e t a l . , 1 9 7 9 ; T r a c e y e t a l . , 1 9 8 6 ) . M a c r o p h a g e - d e r i v e d m e d i a t o r s h a v e b e e n i m p l i c a t e d i n t h e p a t h o g e n e s i s o f h e p a t o t o x i c i t y i n o t h e r m o d e l s ( s e e b e l o w ) . T h u s , a l t e r a t i o n s i n m a c r o p h a g e f u n c t i o n m a y e x p l a i n t h e r e d u c e d r e s p o n s i v e n e s s t o L P S i n t h e s e r e s i s t e n t m i c e . T h i s f i n d i n g p r o v i d e s e v i d e n c e t h a t m a c r o p h a g e s c o n t r i b u t e t o L P S - m e d i a t e d l i v e r i n j u r y u n d e r n o r m a l c i r c u m s t a n c e s . K u p f f e r c e l l s f r o m C 3 H / H e J m i c e a l s o h a v e r e d u c e d p h a g o c y t i c a c t i v i t y c o m p a r e d t o L P S - s e n s i t i v e m i c e ( M c C u s k e y e t a l . , 1 9 8 4 a ; M c C u s k e y e t a l . , 1 9 8 4 b ) . T h e d e c r e a s e d p h a g o c y t i c a c t i v i t y m a y b e p a r t l y r e l a t e d t o d e f i c i e n c i e s i n I y s o s o m a l e n z y m e s . A c t i v a t e d K u p f f e r c e l l s c a n r e l e a s e n u m e r o u s i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s t h a t c o u l d c o n t r i b u t e t o h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y . K u p f f e r c e l l a c t i v a t i o n r e s u l t s i n t h e r e l e a s e o f l i p o x y g e n s e p r o d u c t s a n d o x y g e n r a d i c a l s , w h i c h c a n d i r e c t l y i n j u r e e n d o t h e l i a l c e l l s ( D e a c i u c e t a l . , 1 9 9 3 a ; D e a c i u c e t a l . , 1 9 9 3 a ; L i u e t a l . , 1 9 9 4 ) . T h e r e l e a s e o f r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s b y K u p f f e r c e l l s m a y a l s o c o n t r i b u t e t o o x i d a t i v e s t r e s s i n h e p a t o c y t e s ( J a e s c h k e , 1 9 9 2 a ; L i u e t a l . , 1 9 9 4 ; 2 5 l i m u r o e t a l . , 1 9 9 4 ) , a s m e a s u r e d b y a d e c r e a s e i n t o t a l h e p a t o c e l l u l a r g l u t a t h i o n e c o n t e n t ( G S H + G 5 8 6 ) a n d a n i n c r e a s e i n o x i d i z e d g l u t a t h i o n e ( G S S G I . G l u t a t h i o n e i s a n e n d o g e n o u s f r e e r a d i c a l s c a v e n g e r t h a t i s i m p o r t a n t i n p r o t e c t i n g t h e c e l l f r o m i n j u r i o u s o x y g e n r a d i c a l s . A n o x i d a t i v e s t r e s s c o u l d p r e d i s p o s e l i v e r c e l l s t o t h e a c t i o n s o f L P S o r o t h e r e n d o g e n o u s c h e m i c a l m e d i a t o r s ( A d a m s o n e t a l . , 1 9 9 2 ; L i u e t a l . , 1 9 9 4 ) . I I . C . 3 . C y t o k i n e s L P S e x p o s u r e s t i m u l a t e s t h e e x p r e s s i o n o f v a r i o u s c y t o k i n e s s u c h a s T N F - a a n d i n t e r l e u k i n s - 1 a n d - 6 . A t r a n s i e n t i n c r e a s e i n c i r c u l a t i n g T N F - a c o n c e n t r a t i o n o c c u r s b e t w e e n 1 a n d 2 h o u r s a f t e r L P S e x p o s u r e ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 3 ) . T N F - a a p p e a r s t o c o n t r i b u t e t o d e v e l o p m e n t o f s e v e r a l L P S - m e d i a t e d p a t h o p h y s i o l o g i c a l t e r a t i o n s i n c e n e u t r a l i z a t i o n o f T N F - a w i t h a n t i b o d i e s a f f o r d s p r o t e c t i o n a g a i n s t h y p o t e n s i o n ( T o b i a s e t a l . , 1 9 8 8 ) , l u n g i n j u r y ( C a t y e t a l . , 1 9 9 0 ; R e m i c k e t a l . , 1 9 9 0 ) a n d l e t h a l i t y ( B e u t l e r e t a l . , 1 9 8 5 ) . I n a d d i t i o n , t h e a d m i n i s t r a t i o n o f r e c o m b i n a n t T N F - a c a n m i m i c s o m e o f t h e p a t h o p h y s i o l o g i c e f f e c t s o f L P S e x p o s u r e ( R e m i c k e t a l . , 1 9 8 7 ) . T N F - a i s c r i t i c a l f o r t h e p a t h o g e n e s i s o f h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y s i n c e i n h i b i t i o n o f i t s r e l e a s e w i t h p e n t o x i f y l l i n e o r n e u t r a l i z a t i o n o f i t w i t h a n t i b o d i e s a t t e n u a t e s L P S - m e d i a t e d l i v e r n e c r o s i s ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 3 ) . T h e m e c h a n i s m b y w h i c h T N F - a c o n t r i b u t e s t o l i v e r i n j u r y a r e n o t k n o w n . T N F - a p r o m o t e s s y n t h e s i s o f a c u t e p h a s e p r o t e i n s i n t h e l i v e r ( A n d u s e t a l . , 1 9 9 1 ) w h i c h a r e i m p o r t a n t i n t h e r e g u l a t i o n o f i n f l a m m a t o r y p r o c e s s e s . T N F - a a l s o s t i m u l a t e s 2 6 t h e e x p r e s s i o n o f a d h e s i o n m o l e c u l e s o n b o t h t h e e n d o t h e l i u m a n d n e u t r o p h i l s i n v i t r a ( B e v i l a c q u a e t a l . , 1 9 8 5 ; V a d a s e t a l . , 1 9 9 0 ; S a l y e r e t a l . , 1 9 9 0 ) . S u c h e v e n t s c o u l d p r o m o t e t h e a c c u m u l a t i o n o f n e u t r o p h i l s w i t h i n t h e l i v e r s i n u s o i d s . H o w e v e r , n e u t r a l i z a t i o n o f T N F - a w i t h a n t i b o d i e s d o e s n o t p r e v e n t t h e h e p a t i c n e u t r o p h i l s e q u e s t r a t i o n o b s e r v e d a f t e r L P S e x p o s u r e ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 3 ) . T N F - a c a n p r i m e n e u t r o p h i l s f o r t h e r e l e a s e o f I y s o s o m a l p r o t e a s e s a n d r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s i n v i t r o ( K l e b a n o f f e t a l . , 1 9 8 6 ) . T h i s s u g g e s t s t h a t T N F - a m i g h t c o n t r i b u t e t o l i v e r i n j u r y b y a m e c h a n i s m i n v o l v i n g a c t i v a t i o n o f n e u t r o p h i l s . H o w e v e r , r e s u l t s f r o m s t u d i e s w i t h G d C l 3 s u g g e s t t h a t t h e e f f e c t s o f T N F - a d o n o t a p p e a r t o b e m e d i a t e d t h r o u g h n e u t r o p h i l s s i n c e K u p f f e r c e l l i n h i b i t i o n p r e v e n t s t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r i n j u r y d e s p i t e t h e p r e s e n c e o f e l e v a t e d T N F - a c o n c e n t r a t i o n s i n t h e s y s t e m i c c i r c u l a t i o n a n d p r o n o u n c e d s i n u s o i d a l n e u t r o p h i l i a . I t i s n o t k n o w n i f t h e h e p a t i c c o n c e n t r a t i o n s o f T N F - a a r e s i m i l a r t o t h o s e d e t e c t e d i n t h e b l o o d . l n t e r l e u k i n s - 1 a n d - 6 a r e a l s o m a r k e d l y e l e v a t e d w i t h i n 2 - 6 h o u r s a f t e r L P S e x p o s u r e . T h e e l e v a t i o n s i n I L - 1 o c c u r p r i o r t o e l e v a t i o n s i n l L - 6 ( C h e n s u e e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h e s e i n t e r l e u k i n s a r e c r i t i c a l f o r t h e l e t h a l i t y o b s e r v e d a f t e r L P S e x p o s u r e s i n c e l L - 6 n e u t r a l i z i n g a n t i s e r u m a n d I L - 1 r e c e p t o r a n t a g o n i s t s a f f o r d p r o t e c t i o n ( O h l s s o n e t a l . , 1 9 9 0 ; S t a r n e s e t a l . , 1 9 9 0 ) . T h e a c t i v i t i e s o f I L - 1 a r e s i m i l a r t o t h o s e p r o d u c e d b y T N F - a . A l t h o u g h t h e s e c y t o k i n e s h a v e b e e n i m p l i c a t e d i n t h e d e v e l o p m e n t o f r e n a l m i c r o c i r c u l a t o r y i n j u r y i n r e s p o n s e t o L P S ( M o v a t , 1 9 8 7 ) , t h e i r r o l e s i n L P S - i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y a r e u n k n o w n . 2 7 I I . C . 3 . C o a g u l a t i o n s y s t e m N u m e r o u s s t u d i e s h a v e f o c u s e d o n L P S - i n d u c e d a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d D I C i n t h e p a t h o g e n e s i s o f t i s s u e i n j u r y . W i t h i n 2 - 3 h o u r s a f t e r t h e i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f L P S t o r a t s , p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n s d e c r e a s e , s u g g e s t i n g t h a t t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i s a c t i v a t e d . T h i s e v e n t p r e c e d e s t h e o n s e t o f l i v e r i n j u r y ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 5 ) . R e s u l t s o f s e v e r a l s t u d i e s s u g g e s t t h a t a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i s n e c e s s a r y f o r t h e p a t h o g e n e s i s o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . F o r i n s t a n c e , t h e i n f u s i o n o f t h r o m b i n i n t o t h e p o r t a l v e i n o f r a t s p r o d u c e s l i v e r i n j u r y t h a t i s m o r p h o l o g i c a l l y s i m i l a r t o t h a t i n d u c e d b y L P S ( S h i b a y a m a , 1 9 8 7 ) . I n a d d i t i o n , p r e t r e a t m e n t o f a n i m a l s w i t h a n t i c o a g u l a n t s s u c h a s w a r f a r i n o r h e p a r i n p r e v e n t s a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a s w e l l a s l i v e r i n j u r y i n L P S - t r e a t e d r a t s ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 5 ; M a r g a r e t t e n e t a l . , 1 9 6 7 ) . B o t h o f t h e s e a g e n t s i n t e r f e r e b y d i f f e r e n t m e c h a n i s m s w i t h t h r o m b i n , t h e r e b y i n h i b i t i n g t h e f o r m a t i o n o f i n s o l u b l e f i b r i n c l o t s . C o n s e q u e n t l y , i t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e f o r m a t i o n o f o c c l u s i v e f i b r i n t h r o m b i a n d c o n s e q u e n t i s c h m i a u n d e r l i e t i s s u e i n j u r y ( S h i b a y a m a , 1 9 8 7 ; M a r g a r e t t e n e t a l . , 1 9 6 7 ) , y e t t h e r e i s l i t t l e d i r e c t s u p p o r t f o r t h i s h y p o t h e s i s , a n d t h e m e c h a n i s m b y w h i c h t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m c o n t r i b u t e s t o l i v e r i n j u r y r e m a i n s u n c l e a r . I n d e e d , p r e t r e a t m e n t o f r a t s w i t h a n c r o d , w h i c h a n t i c o a g u l a t e s b y d e p l e t i n g p l a s m a f i b r i n o g e n b u t d o e s n o t i n t e r f e r e w i t h t h r o m b i n , f a i l s t o p r o t e c t r a t s a g a i n s t L P S - i n d u c e d h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 5 ) , s u g g e s t i n g t h a t i n s o l u b l e f i b r i n c l o t f o r m a t i o n d o e s n o t e x p l a i n t h e c r i t i c a l r o l e o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i n l i v e r i n j u r y . 2 8 T a k e n t o g e t h e r , t h e s e f i n d i n g s r a i s e t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h r o m b i n i s i n v o l v e d i n t h e p a t h o g e n e s i s o f l i v e r i n j u r y b y a m e c h a n i s m t h a t i s i n d e p e n d e n t o f i t s a b i l i t y t o f o r m o c c l u s i v e f i b r i n t h r o m b i . I n a d d i t i o n t o i t s r o l e i n t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , t h r o m b i n a f f e c t s m a n y c e l l s t h r o u g h r e c e p t o r - m e d i a t e d a c t i o n s a n d h a s p r o i n f l a m m a t o r y e f f e c t s t h a t c o u l d c o n t r i b u t e t o t i s s u e i n j u r y . F o r e x a m p l e , t h r o m b i n c a n i n f l u e n c e e n d o t h e l i a l c e l l s , r e s u l t i n g i n e x p r e s s i o n o f a d h e s i o n m o l e c u l e s a n d t h e r e l e a s e o f c y t o k i n e s ( B i z i o s e t a l . , 1 9 8 6 ; D e M i c h e l e e t a l . , 1 9 9 2 ) . S u c h e v e n t s c o u l d c o n t r i b u t e t o t h e a c c u m u l a t i o n o f n e u t r o p h i l s a n d o t h e r i n f l a m m a t o r y c e l l s w i t h i n t i s s u e s . T h r o m b i n i s a l s o a n a c t i v a t o r o f p l a t e l e t s a n d a c h e m o a t t r a c t a n t a n d a c t i v a t o r o f n e u t r o p h i l s ( D r a k e e t a l . , 1 9 9 2 ; B i z i o s e t a l . , 1 9 8 6 ) . I t s t i m u l a t e s t h r o m b o x a n e A , r e l e a s e f r o m p l a t e l e t s ( F e i n s t e i n e t a l . , 1 9 7 7 ) , a n d s e v e r a l s t u d i e s s u g g e s t t h a t t h i s a r a c h i d o n i c a c i d m e t a b o l i t e i s i m p o r t a n t i n t h e p a t h o g e n e s i s o f l i v e r i n j u r y i n s a m e a n i m a l m o d e l s ( s e e b e l o w ) . T h r o m b i n s t i m u l a t e s t h e p r o d u c t i o n o f c y t o k i n e s a n d a r a c h i d o n i c a c i d m e t a b o l i t e s f r o m m a c r o p h a g e s i n v i t r a ( B a r - S h a v i t e t a l . , 1 9 8 3 a ; B a r - S h a v i t e t a l . , 1 9 8 3 b ; J o n e s e t a l . , 1 9 9 0 ; P o d j a r n y e t a l . , 1 9 8 9 ) . A c c o r d i n g l y , t h r o m b i n m i g h t c o n t r i b u t e t o t h e p a t h o g e n e s i s o f l i v e r i n j u r y b y s t i m u l a t i n g t h e r e l e a s e o f i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s f r o m K u p f f e r c e l l s . I t i s p o s s i b l e t h a t t h r o m b i n c o n t r i b u t e s t o p a r e n c h y m a l c e l l n e c r o s i s b y a d i r e c t e f f e c t o n t h e s e c e l l s . H i g h a n d l o w a f f i n i t y b i n d i n g s i t e s f o r t h r o m b i n o n h e p a t o c y t e s h a v e b e e n r e p o r t e d , a l t h o u g h t h e f u n c t i o n s o f t h e s e ” r e c e p t o r s " i s n o t k n o w n ( W e y e r e t a l . , 1 9 8 8 ) . T h r o m b i n s t i m u l a t e s g l y c o g e n o l y s i s i n 2 9 i s o l a t e d , p e r f u s e d l i v e r s b y a c y c l o o x y g e n a s e - d e p e n d e n t m e c h a n i s m ( Y a m a n a k a e t a l . , 1 9 9 2 ) . H o w e v e r , t h e m e c h a n i s m b y w h i c h t h r o m b i n c o n t r i b u t e s t o h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y r e m a i n s t o b e d e t e r m i n e d . I I . C . 4 . L i p i d m e d i a t o r s A r a c h i d o n i c a c i d ( A A ) i s a 2 0 - c a r b o n , p o l y u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d ( 5 , 8 , 1 1 , 1 4 — e i c o s a t e t r a e n o i c a c i d ) t h a t i s d e r i v e d d i r e c t l y f r o m d i e t a r y s o u r c e s o r b y b i o s y n t h e s i s f r o m t h e e s s e n t i a l f a t t y a c i d , l i n o l e i c a c i d . A A i s i n c o r p o r a t e d i n t o c e l l m e m b r a n e s w h e r e i t i s e s t e r i f i e d t o p h o s p h o l i p i d s , p a r t i c u l a r l y i n t h e c a r b o n 2 p o s i t i o n o f p h o p h a t i d y l c h o l i n e a n d p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l . L P S e x p o s u r e a c t i v a t e s p h o s p h o l i p a s e A , , w h i c h c l e a v e s t h e s e p h o s p h o l i p i d s i n t o f r e e A A a n d l y s o p h o s p h o l i p i d s . T h e f r e e A A i s t h e n f u r t h e r m e t a b o l i z e d b y l i p o x y g e n a s e s a n d c y c l o o x y g e n a s e , r e s u l t i n g i n t h e p r o d u c t i o n o f l e u k o t r i e n e s , p r o s t a g l a n d i n s a n d o t h e r l i p i d m e d i a t o r s ( s e e F i g u r e 1 . 1 ) . T h e l y s o p h o s p h o l i p i d r e l e a s e d f r o m p h o s p h a t i d y l c h o l i n e c a n b e a c e t y l a t e d t o f o r m P A F ( 1 - 0 - a | k y l - 2 ( R ) - a c e t y l - g l y c e r o - 3 - c h o l i n e ) . T h e c r i t i c a l n a t u r e o f l i p i d m e d i a t o r s i n t h e p a t h o g e n e s i s o f l i v e r i n j u r y a f t e r L P S e x p o s u r e i s s u p p o r t e d b y s t u d i e s i n r a t s m a i n t a i n e d o n a d i e t d e f i c i e n t i n e s s e n t i a l f a t t y a c i d s . T h e s e a n i m a l s a r e d e v o i d o f A A a n d r e s i s t a n t t o t h e h e p a t o t o x i c e f f e c t s o f S a l m o n e l l a e n t e r i t i d i s L P S ( C o o k e t a l . , 1 9 8 2 ; C o o k e t a l . , 1 9 8 0 ) . I n a d d i t i o n , d e x a m e t h a s o n e , w h i c h i n h i b i t s t h e a c t i o n s o f p h o s p h o l i p a s e A , , a f f o r d s p r o t e c t i o n f r o m L P S h e p a t o t o x i c i t y i n g a l a c t o s a m i n e - p r e t r e a t e d m i c e ( T i e g s e t a l . , 1 9 8 8 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e f i n d i n g s s u p p o r t t h e 3 0 F i g u r e 1 . 1 . A r a c h i d o n i c a c i d m e t a b o l i c p a t h w a y s . A r a c h i d o n i c a c i d i s l i b e r a t e d f r o m m e m b r a n e l i p i d s a f t e r c l e a v a g e b y p h o p h o l i p a s e A , . T h e f r e e a r a c h i d o n a t e i s t h e n f u r t h e r m e t a b o l i z e d b y t h e c y c l o o x y g e n a s e a n d I i p o x y g e n a s e p a t h w a y s . S o m e o f t h e k e y l i p i d m e d i a t o r s a r e s h o w n , a l o n g w i t h t h e i r m a i n b i o l o g i c e f f e c t s . n o i t a r e / o t a c r a o n o / t c g / a r l r t s s n a r d . t , s / x a i t c 2 g n A g o x a c o n e i ! l l a s / t n e t o p a m e d e p o p . A a v i m l A o h o a h c p C 2 l a s i v e o c i h s h A p a F t H G p i A n o P c o > a r e ‘ 4 P a t s u g y . a e . n x g o v n o 2 a / o G 2 r l I G g l a / c y c P G g i P a d a s a v ! l p y ( s y l é — s d i p i l g e d I C a C n I a l ’ r I b O d m 2 I h e s s A C m L a r l P a l e c i i n o x x ’ a a / / n o o o i m m l e e c / r l c i r l h h s c c r r s n o c E 4 o T 8 s n o c o h c n a E T a r L v b H - 5 e s a 9 n e E g T é y 4 E 4 x D P A 0 o H T p W * * L L L i - I S 4 L * E v a s c u l a r p a r m a a b fl r ‘ l y ¢ 4 P G E P G D P G F 2 . 2 a v a s o a c I v a 3 1 3 2 c o n t e n t i o n t h a t A A m e t a b o l i t e s c o n t r i b u t e t o t h e p a t h o g e n e s i s o f h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y . T h e n e x t s e c t i o n s w i l l f o c u s o n t h e c r i t i c a l r o l e s o f A A m e t a b o l i t e s a n d P A F i n l i v e r i n j u r y r e s u l t i n g f r o m L P S e x p o s u r e . W . F r e e A A c a n b e c o n v e r t e d i n t o h y d r o p e r o x y d e r i v a t i v e s b y l i p o x y g e n a s e s . 5 — l i p o x y g e n a s e , a b u n d a n t i n n e u t r o p h i l s a n d m a c r o p h a g e s , c o n v e r t s A A i n t o 5 - H P E T E . I n n e u t r o p h i l s , 5 - H P E T E c a n t h e n u n d e r g o f u r t h e r m e t a b o l i s m b y d i f f e r e n t r o u t e s : g l u t a t h i o n e p e r o x i d a s e c o n v e r t s 5 - H P E T E t o 5 - H E T E , a p o t e n t n e u t r o p h i l c h e m o a t t r a c t a n t ; 5 - I i p o x y g e n a s e , u s i n g 1 5 - H P E T E a s a s u b s t r a t e , c a n i n t r o d u c e a n o t h e r h y d r o x y l g r o u p t o p r o d u c e l i p o x i n s ; a n d 5 - I i p o x y g e n a s e c a n c o n v e r t ' 5 - H P E T E t o l e u k o t r i e n e A 4 ( D e c k e r , 1 9 9 0 ) . L T A 4 i s u n s t a b l e a n d i s e i t h e r e n z y m i c a l l y c o n v e r t e d t o L T B 4 , a p o t e n t c h e m o t a c t i c a g e n t , o r c o n j u g a t e d t o g l u t a t h i o n e t o f o r m L T C 4 , L T D 4 a n d L T E 4 , w h i c h c a u s e v a s o c o n s t r i c t i o n , b r o n c h o s p a s m a n d i n c r e a s e d v a s c u l a r p e r m e a b i l i t y ( C o t r a n e t a l . , 1 9 8 9 ; B a l l e t a l . , 1 9 8 6 ) . P l a t e l e t s , w h i c h c o n t a i n 1 2 - l i p o x y g e n a s e , c a n c o n v e r t A A i n t o 1 2 - H P E T E , w h i c h i s f u r t h e r m e t a b o l i z e d t o 1 2 - H E T E ( C o t r a n e t a l . , 1 9 8 9 ; B a l l e t a l . , 1 9 8 6 ) . 1 2 - H P E T E c a n s t i m u l a t e 5 - l i p o x y g e n a s e i n l e u k o c y t e s , r e s u l t i n g i n t h e f o r m a t i o n o f 5 - H E T E , L T B 4 a n d d i H E T E ( 5 , 1 2 H E T E ) ( M a c l o u f e t a l . , 1 9 8 2 ) . L T s a r e c r i t i c a l f o r s e v e r a l L P S - m e d i a t e d a l t e r a t i o n s . L T C 4 a n d L T D 4 a r e p r e s e n t i n t h e b i l e o f L P S - t r e a t e d r a t s ( H a g m a n n e t a l . , 1 9 8 5 ) , a n d t h e i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f L P S r e s u l t s i n L T f o r m a t i o n i n v i v a t h r o u g h a m e c h a n i s m t h a t d e p e n d s u p o n c o m p l e m e n t ( J a e s c h k e e t a l . , 1 9 9 2 c ) . L T s a r e 3 3 c r i t i c a l f o r L P S - i n d u c e d l e u k o p e n i a ( C o o k e t a l . , 1 9 8 5 ) . I n a d d i t i o n , t h e y c o n t r i b u t e t o l i v e r i n j u r y i n a n e x p e r i m e n t a l m o d e l o f e n d o t o x e m i a i n w h i c h m i c e a r e s e n s i t i z e d w i t h g a l a c t o s a m i n e ( T i e g s e t a l . , 1 9 8 8 ) . S o m e e v i d e n c e s u g g e s t s t h a t l i v e r i n j u r y r e s u l t i n g f r o m t h e i n t r a p e r i t o n e a l a d m i n i s t r a t i o n o f L P S i s n o t m e d i a t e d b y 5 - l i p o x y g e n a s e p r o d u c t s a l o n e , b u t r a t h e r b y t h e c o m b i n a t i o n o f U s a n d P A F ( Y o s h i k a w a e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h e s e f i n d i n g s s u g g e s t t h a t t h e r o l e o f U s i n L P S - i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y i s d e p e n d e n t u p o n t h e e x p e r i m e n t a l m o d e l u s e d . W . C y c l o o x y g e n a s e c a n r a p i d l y t r a n s f o r m A A i n t o t h e p r o s t a g l a n d i n e n d o p e r o x i d e , P G G , , w h i c h i s e n z y m i c a l l y c o n v e r t e d t o P G H , . P G H , i s t h e n m e t a b o l i z e d t o s e v e r a l o t h e r p r o d u c t s w h i c h h a v e v a r i o u s a n d s o m e t i m e s o p p o s i n g b i o l o g i c e f f e c t s . T h r o m b o x a n e s y n t h a s e c o n v e r t s P G H , i n t o T x A , . T h r o m b o x a n e , a p o t e n t v a s o c o n s t r i c t o r a n d p l a t e l e t a g g r e g a t o r , i s r e l e a s e d f r o m K u p f f e r c e l l s a n d p l a t e l e t s , a s w e l l a s o t h e r c e l l s ( K a w a d a e t a l . , 1 9 9 2 ; M o s c a t e t a l . , 1 9 8 7 ) . P G I 2 a n d P G E , a r e p o t e n t i n h i b i t o r s o f p l a t e l e t a g g r e g a t i o n a n d a r e v a s o d i l a t o r s . P G F , , i s v a s o c o n s t r i c t i v e a n d P G D , , t h e m a j o r p r o s t a n o i d r e l e a s e d f r o m K u p f f e r c e l l s , i s a v a s o c o n s t r i c t o r o r v a s o d i l a t o r , d e p e n d i n g u p o n t h e t i s s u e ( Q u i r o g a e t a l . , 1 9 9 3 ; B a l l e t a l . , 1 9 8 6 ; C o t r a n e t a l . , 1 9 8 9 ) . N u m e r o u s s t u d i e s h a v e i m p l i c a t e d c y c l o o x y g e n a s e p r o d u c t s i n t h e p a t h o g e n e s i s o f L P S - i n d u c e d l e t h a l i t y i n s e v e r a l a n i m a l m o d e l s . I n r a t s , L P S a d m i n i s t r a t i o n s t i m u l a t e s t h e p r o d u c t i o n o f P G I , a n d T x A , . a s m e a s u r e d b y t h e 3 4 s t a b l e m e t a b o l i t e s 6 - k e t o - P G F , , , a n d T x B , i n p l a s m a , r e s p e c t i v e l y ( C o o k e t a l . , 1 9 8 0 ; O l a n o f f e t a l . , 1 9 8 5 ; W i s e e t a l . , 1 9 8 0 ; H a l u s h k a e t a l . , 1 9 8 1 ; I s h i g u r o e t a l . , 1 9 9 4 ) . I n h i b i t i o n o f t h e f o r m a t i o n o f c y c l o o x y g e n a s e m e t a b o l i t e s w i t h a s p i r i n o r i b u p r o f e n a t t e n u a t e s t h e l e t h a l e f f e c t s o f L P S ( C o o k e t a l . , 1 9 8 2 ; W i s e e t a l . , 1 9 8 0 ; H a l u s h k a e t a l . , 1 9 8 1 ; I s h i g u r o e t a l . , 1 9 9 4 ) . I n a d d i t i o n , p r e t r e a t m e n t w i t h a s p i r i n a t t e n u a t e s l i v e r i n j u r y a f t e r t h e i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f L P S i n r a t s ( I s h i g u r o e t a l . , 1 9 9 4 ) . H o w e v e r , t h e i m p o r t a n c e o f c y c l o o x y g e n a s e m e t a b o l i t e s i n t h e p a t h o g e n e s i s o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y i s m o d e l - d e p e n d e n t , s i n c e a s p i r i n a n d i b u p r o f e n d o n o t a f f o r d p r o t e c t i o n f r o m t h e h e p a t o t o x i c e f f e c t s o f L P S i n m i c e t h a t h a v e b e e n s e n s i t i z e d w i t h g a l a c t o s a m i n e ( T i e g s e t a l . , 1 9 8 8 ; W e n d e l e t a l . , 1 9 8 6 ) . W i t h t h e d e v e l o p m e n t o f n e w e r p h a r m a c o l o g i c i n t e r v e n t i o n s , c o n s i d e r a b l e a t t e n t i o n h a s f o c u s e d o n t h e r o l e o f T x A , i n e n d o t o x e m i a a n d , i n p a r t i c u l a r , i t s r o l e i n L P S - i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y . S t u d i e s w i t h t h r o m b o x a n e s y n t h a s e i n h i b i t o r s a n d t h r o m b o x a n e r e c e p t o r a n t a g o n i s t s h a v e s u p p o r t e d a r o l e f o r T x A , i n t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r i n j u r y i n r a t s t r e a t e d w i t h i n t r a v e n o u s S a l m o n e l l a e n t e r i t i d i s L P S ( C o o k e t a l . , 1 9 8 2 ; W i s e e t a l . , 1 9 8 0 ) a n d i n m i c e t r e a t e d w i t h L P S o n e w e e k a f t e r p r i m i n g w i t h C . p a r v u m ( N a g a i e t a l . , 1 9 8 9 ) . H o w e v e r , T x A , m a y n o t b e c r i t i c a l f o r t h e d e v e l o p m e n t o f L P S - i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y i n a l l m o d e l s , s i n c e t h r o m b o x a n e s y n t h a s e i n h i b i t i o n d o e s n o t a f f o r d p r o t e c t i o n i n a r a t m o d e l o f s e p s i s i n w h i c h a f e c a l s u s p e n s i o n i s i n s t i l l e d i n t o t h e p e r i t o n e a l c a v i t y ( C o o k e t a l . , 1 9 8 2 ; B u t l e r e t a l . , 1 9 8 3 ) o r i n a m o d e l o f E . c a l i L P S i n f u s i o n i n t h e r a t ( F u r m a n e t a l . , 1 9 8 4 ) . T h u s , t h e r o l e a n d 3 5 i m p o r t a n c e o f T x A , a s a d e t e r m i n a n t o f l i v e r i n j u r y d u r i n g e n d o t o x e m i a m a y v a r y w i t h b i o l o g i c a l a n d / o r e x p e r i m e n t a l d i f f e r e n c e s a m o n g a n i m a l m o d e l s . T h e i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f E . c a l i L P S t o r a t s r e s u l t s i n a p r o n o u n c e d t h r o m b o c y t o p e n i a a n d a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , a s m a r k e d b y a d e c r e a s e i n p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 5 ; M a r g a r e t t e n e t a l . , 1 9 6 7 ) . T x A , i s a p o t e n t a g g r e g a t o r o f p l a t e l e t s . I n m o d e l s i n w h i c h t h r o m b o x a n e s y n t h a s e i n h i b i t o r s o r r e c e p t o r a n t a g o n i s t s a f f o r d p r o t e c t i o n f r o m l e t h a l i t y a n d l i v e r i n j u r y , r e s u l t s s u g g e s t t h a t T x A , c o n t r i b u t e s t o a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d t h r o m b o c y t o p e n i a ( O l a n o f f e t a l . , 1 9 8 5 ; T a n e y a m a e t a l . , 1 9 8 9 ; C o o k e t a l . , 1 9 8 2 ; W i s e e t a l . , 1 9 8 0 ) . T h u s , i n t h e s e m o d e l s , T x A , m a y c o n t r i b u t e t o h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y b y a m e c h a n i s m i n v o l v i n g i t s i n t e r a c t i o n s w i t h p l a t e l e t s a n d / o r t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m . _ F _ ’ _ _ F . S u b s e q u e n t t o t h e a c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e A , , I y s o p h o s p h o l i p i d s c a n b e c o n v e r t e d t o P A F b y a c e t y l C o A a c e t y l t r a n s f e r a s e ( B r a t t o n e t a l . , 1 9 8 9 ) . P A F i s c r i t i c a l f o r t h e d e v e l o p m e n t o f n u m e r o u s L P S - m e d i a t e d a l t e r a t i o n s , i n c l u d i n g h y p o t e n s i o n ( C a s a l s - S t e n z e l e t a l . , 1 9 8 8 ) , l u n g i n j u r y ( O l s o n e t a l . , 1 9 9 0 ; Y u e e t a l . , 1 9 9 1 ) a n d d e a t h ( C a s a I s - S t e n z e l e t a l . , 1 9 8 8 ; S a l a r i e t a l . , 1 9 9 0 ; R a b i n o v i c l e t a l . , 1 9 9 0 ) . P A F i s p r o d u c e d b y l e u k o c y t e s , p l a t e l e t s a n d e n d o t h e l i a l c e l l s a n d h a s p r o i n f l a m m a t o r y p r o p e r t i e s . F o r e x a m p l e , i t c a n m e d i a t e n e u t r o p h i l c h e m o t a x i s a n d a c t i v a t i o n ( W o r t h e n e t a l . , 1 9 8 3 ; M o n t r u c c h i o e t a l . , 1 9 9 3 ; T a k a h a s h i e t a l . , 1 9 9 1 ) , i n c r e a s e v a s c u l a r p e r m e a b i l i t y a n d a l t e r v a s c u l a r t o n e ( H o s f o r d e t a l . , 1 9 9 3 ; B u x t o n e t a l . , 1 9 8 6 ) . 3 6 P A F a l s o s t i m u l a t e s t h e p r o d u c t i o n o f o t h e r s o l u b l e m e d i a t o r s s u c h a s e i c o s a n o i d s , c y t o k i n e s a n d s u p e r o x i d e a n i o n ( H o s f o r d e t a l . , 1 9 9 3 ; S n y d e r , 1 9 9 0 ; T a k a h a s h i e t a l . , 1 9 9 1 ) . P A F c a n i n f l u e n c e t h e l i v e r , s i n c e t h e i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f P A F i n c r e a s e s h e p a t i c v a s c u l a r r e s i s t a n c e , g l u c o s e p r o d u c t i o n , o x y g e n u p t a k e a n d f r e e r a d i c a l g e n e r a t i o n ( L a p o i n t e e t a l . , 1 9 8 9 ; Z h o u e t a l . , 1 9 9 2 ) . I t c a n a f f e c t n o n - p a r e n c h y m a l c e l l s o f t h e l i v e r b y s t i m u l a t i n g s u p e r o x i d e p r o d u c t i o n f r o m b o t h K u p f f e r c e l l s a n d t h e e n d o t h e l i u m ( G a r d n e r e t a l . , 1 9 9 5 ) . S i n c e P A F a l t e r s h e p a t i c f u n c t i o n s a n d c a n b e p r o d u c e d b y a n d s t i m u l a t e i n f l a m m a t o r y c e l l s t h a t a r e r e q u i r e d f o r t h e g e n e s i s o f l i v e r i n j u r y , i t i s p o s s i b l e t h a t P A F m a y b e a c r i t i c a l m e d i a t o r o f h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y d u r i n g L P S e x p o s u r e . A r e c e n t s t u d y i n d i c a t e s t h a t a n t a g o n i s m o f P A F r e c e p t o r s a l o n e i s i n s u f f i c i e n t t o p r e v e n t l i v e r i n j u r y i n t h e r a t a f t e r t h e i n t r a p e r i t o n e a l a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( Y o s h i k a w a e t a l . , 1 9 9 2 ) . S i m i l a r l y , a d m i n i s t r a t i o n o f a 5 - I i p o x y g e n a s e i n h i b i t o r a f f o r d s n o p r o t e c t i o n . H o w e v e r , o n e s t u d y s u g g e s t s t h a t t h e c o m b i n a t i o n o f a P A F r e c e p t o r a n t a g o n i s t a n d a 5 - l i p o x y g e n a s e i n h i b i t o r p r e v e n t s h e p a t i c i n j u r y a n d l e t h a l i t y ( Y o s h i k a w a e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h i s s t u d y s u p p o r t s t h e h y p o t h e s i s t h a t P A F i n c o m b i n a t i o n w i t h U s i s c r i t i c a l f o r t h e d e v e l o p m e n t o f h e p a t i c i n j u r y a n d s u g g e s t s t h a t P A F a n d U s h a v e r e d u n d a n t a c t i o n s i n t h i s m o d e l . T h i s f i n d i n g c o n t r a s t s r e s u l t s o b s e r v e d i n m i c e s e n s i t i z e d w i t h g a l a c t o s a m i n e . I n t h e g a l a c t o s a m i n e / L P S m o d e l , i n h i b i t i o n o f L T b i o s y n t h e s i s p r e v e n t s l i v e r i n j u r y , w h e r e a s P A F a n t a g o n i s m d o e s n o t . T h e C o n t r a s t s b e t w e e n t h e s e s t u d i e s m a y r e s u l t f r o m s p e c i e s d i f f e r e n c e s o r f r o m 3 7 o t h e r b i o l o g i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s a m o n g a n i m a l m o d e l s . A s m e n t i o n e d , t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m c o n t r i b u t e s t o t h e p a t h o g e n e s i s o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . S o m e s t u d i e s s u g g e s t t h a t P A F m a y b e i n v o l v e d i n t h e L P S - i n d u c e d a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d t h r o m b o c y t o p e n i a . P A F r e c e p t o r a n t a g o n i s m a t t e n u a t e s D I C i n d u c e d b y t h e i n f u s i o n o f L P S t o r a t s ( l m a n i s h i e t a l . , 1 9 9 1 ; I m u r a e t a l . , 1 9 8 6 ) . H o w e v e r , b l o c k a d e o f P A F ’ s a c t i o n s d o e s n o t i n h i b i t D I C i n s e p t i c r a b b i t s ( D u e t a l . , 1 9 9 4 ) o r t h r o m b o c y t o p e n i a i n r a t s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f l a r g e d o s e s o f L P S ( R a b i n o v i c l e t a l . , 1 9 9 0 ) . T h u s , s i m i l a r t o t h e f i n d i n g s w i t h l i v e r i n j u r y , t h e r o l e o f P A F i n L P S - i n d u c e d D I C i s m o d e l - d e p e n d e n t . I I . C . 5 . P l a t e l e t s S e v e r a l s t u d i e s s u g g e s t a r o l e f o r p l a t e l e t s i n t h e p a t h o g e n e s i s o f s o m e L P S - i n d u c e d r e s p o n s e s . W i t h i n 2 h o u r s a f t e r t h e i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f L P S i n t h e r a t , b l o o d p l a t e l e t n u m b e r s d e c r e a s e b y 7 5 % . T h i s t h r o m b o c y t o p e n i a o c c u r s p r i o r t o t h e o n s e t o f l i v e r i n j u r y ( O l a n o f f e t a l . , 1 9 8 5 ) . I n a d d i t i o n , e l e c t r o n m i c r o g r a p h s f r o m l i v e r s o f L P S - t r e a t e d m i c e s h o w p l a t e l e t s w i t h i n l i v e r s i n u s o i d s a n d w i t h i n K u p f f e r c e l l s ( L e v y e t a l . , 1 9 6 8 a ; L e v y e t a l . , 1 9 6 8 b ) . L P S e x p o s u r e r e s u l t s i n a r e d i s t r i b u t i o n o f p l a t e l e t s f r o m t h e b l o o d i n t o h e p a t i c a n d p u l m o n a r y t i s s u e s . B a s e d o n m e a s u r e m e n t s o f t i s s u e p l a t e l e t 3 8 " ‘ i n d i u m - I a b e l e d p l a t e l e t s , L P S e x p o s u r e c a u s e s a d i s t r i b u t i o n i n d o g s w i t h r a p i d , t r a n s i e n t a c c u m u l a t i o n o f p l a t e l e t s w i t h i n t h e l u n g s t h a t i s m a x i m a l 1 0 m i n u t e s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n . O n e h o u r a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S , m o s t o f t h e a c c u m u l a t e d p l a t e l e t s l e a v e t h e l u n g s a n d a r e d e p o s i t e d w i t h i n t h e l i v e r ( G u t m a n n e t a l . , 1 9 8 7 ; S o s t m a n e t a l . , 1 9 8 3 l . I n m i c e , t h e i n j e c t i o n o f L P S s t i m u l a t e s a d o s e - d e p e n d e n t i n c r e a s e i n h e p a t i c s e r o t o n i n ( 5 - H T ) , a c o n s t i t u e n t o f p l a t e l e t d e n s e g r a n u l e s . T h i s i n c r e a s e d h e p a t i c 5 - H T i s t e m p o r a l l y a s s o c i a t e d w i t h a f a l l i n b l o o d p l a t e l e t n u m b e r s a n d i n b l o o d 5 - H T . T h e r e f o r e , t h e e l e v a t e d h e p a t i c 5 - H T i s s u g g e s t e d t o r e f l e c t t h e a c c u m u l a t i o n o f p l a t e l e t s w i t h i n t h e l i v e r ( E n d o e t a l . , 1 9 9 3 ; E n d o , 1 9 8 4 ) . T h u s , d i f f e r e n t t e c h n i q u e s u s e d i n s e v e r a l a n i m a l m o d e l s s u g g e s t t h a t L P S a d m i n i s t r a t i o n r e s u l t s i n h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n . P l a t e l e t s a p p e a r t o c o n t r i b u t e t o s e v e r a l L P S - m e d i a t e d a l t e r a t i o n s . F o r i n s t a n c e , p l a t e l e t d e p l e t i o n w i t h a n t i b o d i e s a f f o r d s p r o t e c t i o n f r o m D I C i n r a b b i t s c h a l l e n g e d w i t h t w o i n t r a v e n o u s i n j e c t i o n s o f L P S ( g e n e r a l i z e d S c h w a r t z m a n r e a c t i o n ) ( K r a m e r e t a l . , 1 9 7 7 ) . D r u g s t h a t i n h i b i t p l a t e l e t f u n c t i o n a l s o p r e v e n t D I C i n r a t s i n f u s e d w i t h E . c o l i L P S o v e r a 4 h o u r p e r i o d ( I t o e t a l . , 1 9 9 0 ) . I n g a l a c t o s a m i n e s e n s i t i z e d m i c e , p r i o r r e m o v a l o f p l a t e l e t s w i t h a n a n t i b o d y p r o t e c t s a n i m a l s f r o m t h e l e t h a l e f f e c t s o f L P S ( P i g u e t e t a l . , 1 9 9 3 ) . A l t h o u g h t h e s e s t u d i e s s u g g e s t t h a t p l a t e l e t s a r e c r i t i c a l f o r t h e p a t h o g e n e s i s o f L P S - i n d u c e d D I C a n d l e t h a l i t y a n d s h o w t h a t p l a t e l e t s r a p i d l y a c c u m u l a t e w i t h i n t h e l i v e r a f t e r L P S e x p o s u r e , t h e r o l e o f p l a t e l e t s i n l i v e r i n j u r y h a s n o t b e e n e v a l u a t e d . A r e c e n t s t u d y s u g g e s t s a r e l a t i o n s h i p b e t w e e n 3 9 t h e d e g r e e o f L P S - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a a n d h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y ( S h i b a y a m a e t a l . , 1 9 9 5 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e o b s e r v a t i o n s s u p p o r t t h e p o s s i b i l i t y t h a t p l a t e l e t s m a y p l a y a r o l e i n t h e p a t h o g e n e s i s o f L P S - m e d i a t e d h e p a t o t o x i c i t y . S e c t i o n I I I w i l l t h e r e f o r e f o c u s o n p l a t e l e t s a n d h o w p l a t e l e t s m i g h t c o n t r i b u t e t o t h e p a t h o g e n e s i s o f h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y . I n p a r t i c u l a r , t h i s s e c t i o n w i l l f o c u s o n p l a t e l e t f u n c t i o n s a n d p r o d u c t s a n d t h e i r p o t e n t i a l i n t e r a c t i o n s w i t h t h e i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s o f l i v e r i n j u r y d i s c u s s e d a b o v e . I I I . P L A T E L E T S I I I . A . P l a t e l e t S t r u c t u r e P l a t e l e t s a r e t h e s m a l l e s t ( 2 p m ) y e t o n e o f t h e m o s t n u m e r o u s b l o o d e l e m e n t s . T h e s e s m a l l , a n u c l e a t e d i s c o i d c e l l s a r e d e r i v e d f r o m m e g a k a r y o c y t e s i n t h e b o n e m a r r o w a n d h a v e a c i r c u l a t i n g h a l f - l i f e o f a p p r o x i m a t e l y 2 . 5 d a y s i n r a t s ( W h i t e e t a l . , 1 9 8 8 ) . I n h u m a n s , n e a r l y o n e - t h i r d o f p l a t e l e t s a r e s t o r e d i n t h e s p l e e n a s a n i n t e r c h a n g e a b l e p o o l t h a t c a n b e r a p i d l y r e l e a s e d i n t o t h e c i r c u l a t i o n ( M a c k i e e t a l . , 1 9 8 8 ) . T o s i m p l i f y t h e c o m p l i c a t e d s t r u c t u r e s o f t h e p l a t e l e t a n d r e l a t e t h e m t o f u n c t i o n a l a c t i v i t i e s , t h e p l a t e l e t c a n b e d i v i d e d i n t o f o u r m a i n r e g i o n s : t h e 4 0 p e r i p h e r a l z o n e , t h e s o l - g e l z o n e , t h e o r g a n e l l e z o n e a n d t h e m e m b r a n e s y s t e m s ( M a c k i e e t a l . , 1 9 8 8 ; W h i t e e t a l . , 1 9 9 4 ) . T h e p e r i p h e r a l z o n e i s c o m p o s e d o f t h e m e m b r a n e s a n d a s s o c i a t e d s t r u c t u r e s w h i c h c o n s t i t u t e t h e s u r f a c e o f t h e p l a t e l e t a n d t h e w a l l s o f p l a t e l e t - s p e c i f i c c h a n n e l s t e r m e d t h e o p e n c a n a l i c u l a r s y s t e m ( O C S ) . T h e s e m e m b r a n e s a r e r i c h i n g l y c o p r o t e i n s a n d c o n t a i n r e c e p t o r s f o r p r o s t a n o i d s , c o a g u l a t i o n f a c t o r s , i m m u n o g l o b u l i n s a n d c o m p l e m e n t . T h e p e r i p h e r a l z o n e i n c l u d e s t h e s u b m e m b r a n e r e g i o n t h a t c o n t a i n s f i l a m e n t s w h i c h a r e c l o s e l y l i n k e d t o m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s a n d w h i c h a r e i m p o r t a n t f o r t h e t r a n s l a t i o n o f c h e m i c a l s i g n a l s r e c e i v e d o n t h e p l a t e l e t e x t e r i o r . T h e s o l - g e l z o n e i s t h e m a t r i x o f t h e p l a t e l e t c y t o p l a s m . I t c o n t a i n s f i b r o u s s y s t e m s o f m i c r o f i l a m e n t s a n d m i c r o t u b u l e s . T h i s r e g i o n s u p p o r t s t h e p l a t e l e t d i s c o i d s h a p e a n d p r o v i d e s t h e c o n t r a c t i l e s y s t e m i n v o l v e d i n s h a p e c h a n g e , p s e u d o p o d f o r m a t i o n a n d s e c r e t i o n . T h e o r g a n e l l e z o n e c o n s i s t s o f m i t o c h o n d r i a , l y s o s o m e s . p e r o x i s o m e s , d e n s e b o d i e s a n d g r a n u l e s . T h e s e o r g a n e l l e s a r e c r i t i c a l f o r m e t a b o l i c p r o c e s s e s a n d t h e s t o r a g e o f e n z y m e s , a d e n i n e n u c l e o t i d e s , s e r o t o n i n a n d c a l c i u m w h i c h a r e d e s t i n e d f o r r e l e a s e u p o n p l a t e l e t a c t i v a t i o n . T h e m e m b r a n e s y s t e m c o n t a i n s t w o d i s t i n c t s t r u c t u r e s : t h e O C S a n d t h e d e n s e t u b u l a r s y s t e m ( D T S ) . T h e O C S , a l t h o u g h i n t i m a t e l y a s s o c i a t e d w i t h t h e p e r i p h e r a l z o n e , i s d e s c r i b e d h e r e i n t h i s s e c t i o n s i n c e i t i s a u n i q u e p l a t e l e t s t r u c t u r e . I t f o r m s a n e t w o r k o f c a n a l i c u l i t h r o u g h t h e p l a t e l e t t h a t i s c o n n e c t e d t o t h e e x t e r i o r s u r f a c e . T h i s n e t w o r k g r e a t l y i n c r e a s e s t h e s u r f a c e a r e a o f t h e p l a t e l e t a n d p r o v i d e s a n e g r e s s r o u t e f o r p r o d u c t s o f t h e r e l e a s e r e a c t i o n . T h e O C S r e m a i n s i n t a c t d u r i n g p l a t e l e t 4 1 F i g u r e 1 . 2 P l a t e l e t s t r u c t u r e . T h i s d i a g r a m s u m m a r i z e s s o m e o f t h e u l t r a s t r u c t u r a l f e a t u r e s o f a n o n - a c t i v a t e d p l a t e l e t . C o m p o n e n t s o f t h e p e r i p h e r a l z o n e i n c l u d e t h e c e l l m e m b r a n e a n d t h e s u r f a c e c o n n e c t e d O C S . T h e s o l - g e l z o n e c o n t a i n s m i c r o f i l a m e n t s a n d m i c r o t u b u l e s . E m b e d d e d w i t h i n t h e s o l - g e l z o n e a r e m i t o c h o n d r i a , g r a n u l e s , d e n s e b o d i e s a n d I y s o s o m e s t h a t c o n s t i t u t e t h e o r g a n e l l e z o n e . S p e c i a l i z e d m e m b r a n e s y s t e m s i n c l u d e t h e O C S a n d D T S . S E L U B U T O R C I H A I R D N O H C O T I I S T D E L U N A R O a S C O E L U N A R O E S N E D / 4 2 4 3 a g g r e g a t i o n a n d s h a p e c h a n g e . w h i c h s u g g e s t s t h a t s h a p e c h a n g e i s n o t a c o n s e q u e n c e o f t h e O C S o p e n i n g a n d f u s i n g w i t h t h e p l a t e l e t m e m b r a n e . D T S c h a n n e l s a r e d e r i v e d f r o m s m o o t h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m , a r e l o c a t e d i n c l o s e a s s o c i a t i o n w i t h t h e O C S a n d p r o v i d e a s t o r a g e s i t e f o r c a l c i u m . I n a d d i t i o n , t h e D T S i s t h e s i t e f o r t h e s y n t h e s i s o f e i c o s a n o i d s , a s i t c o n t a i n s e n z y m e s f r o m t h e c y c l o o x y g e n a s e a n d I i p o x y g e n a s e p a t h w a y s ( M a c k i e e t a l . , 1 9 8 8 ; W h i t e e t a l . , 1 9 9 4 ; N i e w i a r o w s k i e t a l . , 1 9 9 4 ; G o r d o n , 1 9 8 1 ) . I I I . B . P l a t e l e t A c t i v a t i o n N u m e r o u s p a r t i c u l a t e a n d s o l u b l e s u b s t a n c e s c a n s t i m u l a t e p l a t e l e t a c t i v a t i o n . T h e s e i n c l u d e A D P , n o r e p i n e p h r i n e , t h r o m b i n , a r a c h i d o n i c a c i d , c o l l a g e n , T x A , , P G G , , s e r o t o n i n , v a s o p r e s s i n , c a l c i u m i o n o p h o r e s , i m m u n e c o m p l e x e s a n d P A F ( M a c k i e e t a l . , 1 9 8 8 ; W h i t e , 1 9 9 4 ; N i e w i a r o w s k i e t a l . , 1 9 9 4 ) . H o w e v e r , w i t h r e g a r d t o t h i s t h e s i s , i t i s i m p o r t a n t t o n o t e t h a t a l t h o u g h r a t p l a t e l e t s c a n p r o d u c e P A F , t h e y d o n o t r e s p o n d t o P A F ( K l e e e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h i s b i o l o g i c a l d i f f e r e n c e m a y e x p l a i n s o m e o f t h e c o n t r a s t i n g f i n d i n g s u s i n g P A F r e c e p t o r a n t a g o n i s t s a m o n g a n i m a l m o d e l s o f e n d o t o x e m i a . U p o n a c t i v a t i o n w i t h t h e s e s t i m u l i , p l a t e l e t s u n d e r g o a c o m p l e x s e r i e s o f e v e n t s d e s c r i b e d a s a d h e r e n c e , s h a p e c h a n g e , s e c r e t i o n a n d a g g r e g a t i o n . W h e n t h e v a s c u l a r e n d o t h e l i u m i s i n j u r e d , t h e s u b e n d o t h e l i a l m a t r i x c o n t a i n i n g c o l l a g e n i s e x p o s e d a n d p l a t e l e t s r a p i d l y a d h e r e t o t h i s m a t r i x , c h a n g e s h a p e 4 4 a n d s p r e a d a c r o s s t h e s i t e o f d a m a g e . T h e p l a t e l e t s t h e n s e c r e t e t h e i r g r a n u l a r c o n s t i t u e n t s t h a t m o d i f y v a s c u l a r t o n e a n d p r o m o t e f u r t h e r p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n . T h e r e s u l t i s a a g g r e g a t e o f p l a t e l e t s . S t i m u l a t e d p l a t e l e t s a l s o e x p r e s s a p r o c o a g u l a n t s u r f a c e w h i c h p r o m o t e s t h e a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d s u b s e q u e n t f i b r i n f o r m a t i o n . T h e f i b r i n a d d s m e c h a n i c a l s u p p o r t t o t h e p l a t e l e t t h r o m b u s b y f o r m i n g l i n k s b e t w e e n p l a t e l e t s u r f a c e g l y c o p r o t e i n s ( S t o r m o r k e n , 1 9 6 9 ; B e n n e t t , 1 9 9 2 ; M a c k i e e t a l . , 1 9 8 8 ) . P l a t e l e t a d h e r e n c e t o t h e s u b e n d o t h e l i u m i n v o l v e s c o m p l e x i n t e r a c t i o n s b e t w e e n p l a s m a p r o t e i n s a n d g l y c o p r o t e i n s o n t h e p l a t e l e t s u r f a c e . S o m e o f t h e c r i t i c a l p l a s m a p r o t e i n s i n c l u d e v o n W i l l e b r a n d f a c t o r ( v W F ) , f i b r o n e c t i n , f i b r i n o g e n a n d t h r o m b o s p o n d i n . R e s t i n g p l a t e l e t s d o n o t i n t e r a c t w i t h f i b r i n o g e n s i n c e t h e g l y c o p r o t e i n l I b / l l l a ( o r 0 . . . , 8 3 ) i s i n a n i n a c t i v e c o n f o r m a t i o n a n d h a s l o w a f f i n i t y f o r f i b r i n o g e n ( C a l v e t e , 1 9 9 4 ) . H o w e v e r , u p o n p l a t e l e t a c t i v a t i o n , t h e l l b / l l l a c o m p l e x u n d e r g o e s m e a s u r a b l e c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s a n d b e c o m e s a h i g h - a f f i n i t y r e c e p t o r f o r s o l u b l e f i b r i n o g e n a n d o t h e r p l a s m a a d h e s i v e p r o t e i n s , i n c l u d i n g f i b r o n e c t i n , v i t r o n e c t i n a n d v W F ( C a l v e t e , 1 9 9 4 ) . T h i s c o m p l e x i s i m p o r t a n t f o r c r o s s l i n k i n g p l a t e l e t s t o e a c h o t h e r a n d a l s o f o r t h e a d h e r e n c e o f p l a t e l e t s t o s u b e n d o t h e l i u m . A n o t h e r i m p o r t a n t m e d i a t o r o f p l a t e l e t a d h e r e n c e t o e x p o s e d s u b e n d o t h e l i u m i s v W F . T h i s p r o t e i n i s s y n t h e s i z e d i n e n d o t h e l i a l c e l l s a n d s e c r e t e d i n a c o n t r o l l e d f a s h i o n . T h e v a s c u l a r e n d o t h e l i u m r e l e a s e s s o m e v W F d i r e c t l y i n t o t h e p l a s m a , b u t a m a j o r i t y o f v W F i s r e l e a s e d i n t o t h e s u b e n d o t h e l i u m w h e r e i t b i n d s t o t h e m a t r i x t o p r o v i d e a s u r f a c e f o r p l a t e l e t 4 5 a t t a c h m e n t s h o u l d t h e e n d o t h e l i u m b e d a m a g e d ( P e a r s o n , 1 9 9 1 ; W a r e e t a l . , 1 9 9 3 ) . v W F c a n b i n d t o g l y c o p r o t e i n l l b / l l l a , b u t i t p r i m a r i l y b i n d s t o p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n l b ( K a i n o h e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h e i m p o r t a n c e o f v W F b i n d i n g t o g l y c o p r o t e i n l b i n h e m o s t a s i s a n d t h r o m b o s i s i s e m p h a s i z e d b y t h e B e r n a r d S o u l i e r s y n d r o m e , i n w h i c h t h e a b s e n c e o f t h i s g l y c o p r o t e i n f r o m p l a t e l e t s r e s u l t s i n b l e e d i n g d i s o r d e r s ( C h a r o e t a l . , 1 9 9 4 ; B e n n e t t , 1 9 9 2 ) . O t h e r i m p o r t a n t m e d i a t o r s o f a d h e s i o n i n c l u d e t h e s e l e c t i n s . T h e s e l e c t i n s m e d i a t e c e l l - c e l l i n t e r a c t i o n s . E - a n d L - s e l e c t i n s m e d i a t e t h e a d h e s i o n o f n e u t r o p h i l s a n d l y m p h o c y t e s , r e s p e c t i v e l y , t o t h e e n d o t h e l i u m . P s e l e c t i n , o r G M P - 1 4 0 ( P A D G E M ) , i s f o u n d w i t h i n t h e W e i b e l - P a l a d e b o d i e s o f e n d o t h e l i a l c e l l s a n d w i t h i n a - g r a n u l e s o f p l a t e l e t s . U p o n a c t i v a t i o n o f t h e s e c e l l s , t h e p r e e x i s t i n g P - s e l e c t i n i s r a p i d l y m o b i l i z e d t o t h e c e l l s u r f a c e a n d m e d i a t e s t h e a d h e s i o n o f n e u t r o p h i l s t o e n d o t h e l i u m a n d o f l e u k o c y t e s t o p l a t e l e t s ( S a n d e r s e t a l . , 1 9 9 2 ; 3 7 ) . P - s e l e c t i n a p p e a r s t o m e d i a t e p l a t e l e t a g g r e g a t i o n a s w e l l , s i n c e i t h a s b e e n l o c a l i z e d b e t w e e n a d j a c e n t p l a t e l e t s u n d e r g o i n g a g g r e g a t i o n a n d s i n c e a m o n o c l o n a l a n t i b o d y t o i t i n h i b i t s a g g r e g a t i o n ( P a r m e n t i e r e t a l . , 1 9 9 1 ) . A f t e r a d h e s i o n t o t h e s u b e n d o t h e l i u m , p l a t e l e t s c h a n g e s h a p e f r o m n o r m a l d i s c o i d t o a n i r r e g u l a r l y s h a p e d e l o n g a t e d c e l l w i t h c y t o p l a s m i c p r o j e c t i o n s . T h e p r e s e n c e o f p s e u d o p o d s o n p l a t e l e t s c a n b e u s e d a s a m a r k e r o f p l a t e l e t a c t i v a t i o n . T h e s h a p e c h a n g e a l l o w s p l a t e l e t s t o s p r e a d a c r o s s t h e e x p o s e d s u b e n d o t h e l i u m . 4 6 I I I . C . P l a t e l e t d e g r a n u l a t i o n A c t i v a t i o n o f p l a t e l e t s r e s u l t s i n t h e r e l e a s e o f p l a t e l e t g r a n u l a r c o n s t i t u e n t s . T h e s e g r a n u l e c o m p o n e n t s a r e i m p o r t a n t a s t h e y m o d i f y v a s c u l a r t o n e , r e c r u i t m o r e p l a t e l e t s t o t h e s i t e o f i n j u r y a n d e n h a n c e a g g r e g a t e f o r m a t i o n . T h e p l a t e l e t r e l e a s e r e a c t i o n i n v o l v e s t h e f u s i o n o f p l a t e l e t g r a n u l e s a n d d e n s e b o d i e s t o t h e O C S i n a c a l c i u m - d e p e n d e n t p r o c e s s a n d t h e r e l e a s e o f c o n s t i t u e n t s i n t o t h e O C S f o l l o w e d b y s e c r e t i o n i n t o t h e e x t r a c e l l u l a r e n v i r o n m e n t ( M a c k i e e t a l . , 1 9 8 8 ; B e n n e t t , 1 9 9 2 ) . T a b l e 1 s u m m a r i z e s s o m e o f t h e m e d i a t o r s r e l e a s e d f r o m p l a t e l e t s . T h e a - g r a n u l e s c o n t a i n p l a t e l e t - s p e c i f i c p r o t e i n s s u c h a s p l a t e l e t f a c t o r 4 ( P F 4 ) a n d I S - t h r o m b o g l o b u l i n ( B T G ) , a s w e l l a s c o a g u l a t i o n f a c t o r s , g r o w t h f a c t o r s a n d g l y c o p r o t e i n s . P l a t e l e t b a s i c p r o t e i n ( P B P ) i s a p r e c u r s o r o f l o w a f f i n i t y p l a t e l e t f a c t o r 4 ( L A P F 4 ) , P F 4 a n d ( S T G . P B P a n d L A P F 4 a r e f o u n d w i t h i n m e g a k a r y o c y t e s a n d p l a t e l e t s , b u t o n l y P F 4 a n d B T G a r e f o u n d i n p l a t e l e t r e l e a s a t e s . P F 4 b i n d s h e p a r i n a n d c a n n e u t r a l i z e i t s a c t i v i t y . P F 4 c a n a l s o b i n d t o h e p a t o c y t e s , a n d t h e h e p a t o c y t e i s i n v o l v e d i n i t s d e g r a d a t i o n ( R u c i n s k i e t a l . , 1 9 8 6 ) . O t h e r a c t i v i t i e s o f P F 4 i n c l u d e s t i m u l a t i o n o f h i s t a m i n e r e l e a s e , p o t e n t i a t i o n o f p l a t e l e t a g g r e g a t i o n a n d o f d i g e s t i o n o f e l a s t i n b y e l a s t a s e ( B r i n d l e y e t a l . , 1 9 8 3 ; C a p i t a n i o e t a l . , 1 9 8 5 ) . B T G h a s s o m e h e p a r i n - b i n d i n g a c t i v i t y ( H o l t e t a l . , 1 9 8 8 ) . I n t e r e s t i n g l y , t h e m o s t c h a r a c t e r i z e d b i o l o g i c a c t i v i t y o f I S T G o c c u r s w h e n t h i s p r o t e i n i s c l e a v e d . T h e C - t e r m i n a l f r a g m e n t i s k n o w n a s B T G - F o r n e u t r o p h i l a c t i v a t i n g p e p t i d e 2 ( N A P , ) . T h i s f r a g m e n t i s 4 7 c h e m o t a c t i c f o r n e u t r o p h i l s a n d s t i m u l a t e s n e u t r o p h i l d e g r a n u l a t i o n ( W a l z e t a l . , 1 9 8 9 ) . T h e d e n s e g r a n u l e s o f p l a t e l e t s c o n t a i n l a r g e a m o u n t s o f a d e n o s i n e a n d g u a n o s i n e d i - a n d t r i p h o s p h a t e s , C a , M g a n d s e r o t o n i n . S e r o t o n i n i s v a s o a c t i v e a n d m a y b e i m p o r t a n t i n l i m i t i n g b l o o d l o s s a t t h e s i t e o f i n j u r y . S e r o t o n i n a n d A D P a l s o p r o m o t e f u r t h e r l o c a l p l a t e l e t r e c r u i t m e n t , a s t h e y s t i m u l a t e p l a t e l e t a g g r e g a t i o n . P l a t e l e t s c a n p h a g o c y t o s e s e v e r a l k i n d s o f p a r t i c l e s s u c h a s c o l l a g e n , f i b r i n a n d i m m u n e c o m p l e x e s ( G o r d o n e t a l . , 1 9 7 6 ) a n d h a v e l y s o s o m e s w h i c h c o n t a i n a c i d h y d r o l a s e s t h a t a r e u s e d t o d e g r a d e t h e p h a g o c y t o s e d m a t e r i a l . U p o n e x p o s u r e t o s t r o n g p l a t e l e t s t i m u l a t o r s , t h e s e I y s o s o m a l c o n s t i t u e n t s a r e r e l e a s e d . T h e s e c r e t i o n o f t h e s e e n z y m e s c o u l d h a v e p a t h o p h y s i o l o g i c c o n s e q u e n c e s . F o r e x a m p l e , c o l l a g e n a s e i s p r o p o s e d t o f u n c t i o n a s a f e e d b a c k m e c h a n i s m t h a t l i m i t s f u r t h e r t h r o m b u s f o r m a t i o n ( C h e s n e y e t a l . , 1 9 7 4 ) . E l a s t a s e i s b e l i e v e d t o b e c r i t i c a l i n t h e d e v e l o p m e n t o f a t h e r o s c l e r o s i s , s i n c e t h i s d i s e a s e f e a t u r e s d e g r a d a t i o n o f a r t e r i a l e l a s t i c t i s s u e ( N i e w i a r o w s k i e t a l . , 1 9 9 4 ) . 4 8 T a b l e 1 . 1 P r o d u c t s R e l e a s e d f r o m A c t i v a t e d P l a t e l e t s C o n s t i t u e n t s F u n c t i o n R e f e r e n c e a - G r a n u l e s a l b u m i n p l a s m a p r o t e i n ( H o l m s e n , 1 9 9 4 ) 0 2 m a c r o g l o b u l i n p l a s m a p r o t e i n ( N a c h m a n e t a / . 1 9 7 6 ) f i b r i n o g e n c o a g u l a t i o n ( H o l m s e n , 1 9 9 4 ) f a c t o r V c o a g u l a t i o n ( H o l m s e n , 1 9 9 4 ) v W F c o a g u l a t i o n , a d h e s i o n ( N i e w i a r o w s k i , 1 9 8 5 ) H M W k i n i n o g e n c o a g u l a t i o n ( S c h m a i e r e t a l . 1 9 8 3 ) P F 4 a n t i h e p a r i n ( W a l z e t a l . 1 9 8 9 ) p l a s m i n o g e n f i b r i n o l y s i s ( N i e w i a r o w s k i , 1 9 8 5 ) a , a n t i p l a s m i n B — T G l i k e p r o t e i n s t h r o m b o s p o n d i n f i b r o n e c t i n a 1 a n t i t r y p s i n C 1 i n h i b i t o r P D G F E G F T G F - B D e n s e G r a n u l e s a d e n o s i n e , A D P , A T P 5 - H T c a l c i u m m a g n e s i u m L y s o s o m e s B - g l u c u r o n i d a s e B - g a l a c t o s i d a s e N - a c e t y l g l u c o s a m i n i d a s e a r y l s u l f a t a s e e l a s t a s e c o fl a g e n a s e c a t h e p s i n s A , B a n d D L i p i d M e d i a t o r s T x A , P A F 1 2 - H P E T E , 1 2 - H E T E d i H E T E i n h i b i t s f i b r i n o l y s i s n e u t r o p h i l a c t i v a t i o n a d h e s i o n a d h e s i o n p r o t e a s e i n h i b i t o r c o m p l e m e n t i n h i b i t o r g r o w t h f a c t o r g r o w t h f a c t o r g r o w t h f a c t o r a g g r e g a t i o n v a s o c o n s t r i c t i o n s i g n a l l i n g s i g n a l l i n g h y d r o l a s e h y d r o l a s e h y d r o l a s e h y d r o l a s e p r o t e a s e p r o t e a s e p r o t e a s e a g g r e g a t i o n i n f l a m m a t i o n n e u t r o p h i l s t i m u l a t i o n l e u k o c y t e c h e m o t a x i s ( N a c h m a n e t a l . 1 9 7 6 ) ( W a l z e t a l . 1 9 8 9 ) ( N i e w i a r o w s k i , 1 9 8 5 ) ( N i e w i a r o w s k i , 1 9 8 5 ) ( N a c h m a n e t a l . 1 9 7 6 ) ( S c h m a i e r e t a l . 1 9 8 3 ) ( H o l m s e n , 1 9 9 4 ) ( H o l m s e n , 1 9 9 4 ) ( H o l m s e n , 1 9 9 4 ) ( H o l m s e n , 1 9 9 4 ) ( H o l m s e n , 1 9 9 4 ) ( H o l m s e n , 1 9 9 4 ) ( H o l m s e n , 1 9 9 4 ) ( H o l m s e n e t a l . 1 9 7 0 ) ( H o l m s e n e t a l . 1 9 7 0 ) ( H o l m s e n e t a l . 1 9 7 0 ) ( H o l m s e n e t a l . 1 9 7 0 ) ( J a m e s e t a l . 1 9 8 5 ) ( C h e s n e y , 1 9 7 4 ) ( H o l m s e n e t a l . 1 9 7 0 ) ( N i e w i a r o w s k i . 1 9 9 4 ) ( B r a t t o n e t a l . 1 9 8 9 ) ( M a c l o u f e t a l . 1 9 8 2 ) ( R o o m m a t e / . 1 9 9 3 ) 4 9 I I I . D . P l a t e l e t r e l e a s e p r o d u c t s i n t i s s u e i n j u r y T h e m a i n h y p o t h e s i s u n d e r l y i n g t h e e x p e r i m e n t s d e s c r i b e d i n t h i s t h e s i s i s t h a t p l a t e l e t s c o n t r i b u t e t o t h e p a t h o g e n e s i s o f L P S - i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y . P l a t e l e t s m i g h t d i r e c t l y p r o m o t e l i v e r i n j u r y b y s e v e r a l m e c h a n i s m s . F o r e x a m p l e , p l a t e l e t s c o u l d c o n t r i b u t e t o h e p a t o c e l l u l a r d a m a g e t h r o u g h t h e f o r m a t i o n o f o c c l u s i v e p l a t e l e t t h r o m b i . I n d e e d , a s d i s c u s s e d a b o v e , p l a t e l e t t h r o m b i h a v e b e e n o b s e r v e d w i t h i n t h e s i n u s o i d s o f L P S - t r e a t e d r a t s ( L e v y e t a l . , 1 9 6 8 a ; L e v y e t a l . , 1 9 6 8 b ) . I t i s t h e r e f o r e p o s s i b l e t h a t p l a t e l e t s p r o m o t e t i s s u e i n j u r y b y a m e c h a n i s m i n v o l v i n g t h e f o r m a t i o n o f o c c l u s i v e t h r o m b i a n d a r e s u l t a n t d e c r e a s e i n p e r f u s i o n . T h i s m e c h a n i s m i s b e l i e v e d t o m e d i a t e t h e r e n a l i n j u r y o b s e r v e d a f t e r t h e i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f L P S i n r a b b i t s ( S c h w a r t z m a n r e a c t i o n ) , s i n c e p l a t e l e t d e p l e t i o n a f f o r d s p r o t e c t i o n f r o m t h e d e v e l o p m e n t o f g l o m e r u l a r m i c r o c l o t s a n d r e n a l i n j u r y ( K r a m e r e t a l . , 1 9 7 7 ) . H o w e v e r , a s i m i l a r m e c h a n i s m i s n o t l i k e l y t o o c c u r i n t h e l i v e r , s i n c e h e p a t i c i s c h e m i a i s c h a r a c t e r i z e d b y c e n t r i l o b u l a r i n j u r y ( J a e s c h k e e t a l . , 1 9 9 0 ; K e h r e r e t a l . , 1 9 9 0 ; J a e s c h k e , 1 9 9 2 3 ) , w h e r e a s L P S e x p o s u r e r e s u l t s p r i m a r i l y i n m i d z o n a l h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h u s , t h e l o c a t i o n o f p a r e n c h y m a l c e l l d a m a g e s u g g e s t s t h a t L P S e x p o s u r e a n d i s c h e m i a l e a d t o l i v e r i n j u r y b y d i f f e r e n t m e c h a n i s m s . P l a t e l e t s c o u l d c o n t r i b u t e t o l i v e r i n j u r y b y r e l e a s i n g p l a t e l e t c o n s t i t u e n t s . O f t h e m e d i a t o r s d i s c u s s e d i n T a b l e 1 , t h o s e m o s t l i k e l y t o c o n t r i b u t e d i r e c t l y t o c e l l d a m a g e s e e m t o b e t h e l i p i d m e d i a t o r s a n d p r o t e a s e s . T h e r o l e s o f 5 0 T x A , , P A F a n d l e u k o t r i e n e s i n l i v e r i n j u r y w e r e d i s c u s s e d a b o v e . T h e p r o t e a s e s , s u c h a s e l a s t a s e a n d t h e c a t h e p s i n s , c o u l d i n j u r e c e l l s b y p r o t e o l y t i c a c t i o n o n c e l l m e m b r a n e s . T h e r o l e s o f p l a t e l e t p r o t e a s e s i n t i s s u e i n j u r y i s n o t w e l l c h a r a c t e r i z e d , h o w e v e r n e u t r o p h i l - d e r i v e d p r o t e a s e s s u c h a s e l a s t a s e a n d c a t h e p s i n G a r e c r i t i c a l m e d i a t o r s o f c y t o t o x i c i t y i n v i t r o . F o r e x a m p l e , n e u t r o p h i l s s t i m u l a t e d w i t h f - m e t - l e u - p h e ( f m l p ) a r e c y t o t o x i c t o c u l t u r e d e n d o t h e l i a l c e l l s . T h i s c y t o t o x i c i t y i s m i m i c k e d w i t h t h e a d d i t i o n o f p u r i f i e d e l a s t a s e a n d i n h i b i t e d w i t h s p e c i f i c e l a s t a s e i n h i b i t o r s ( S m e d l e y e t a l . , 1 9 8 6 ) . I n a d d i t i o n , s i m i l a r s t u d i e s h a v e s u g g e s t e d t h a t a c t i v a t e d n e u t r o p h i l s m e d i a t e h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l k i l l i n g b y r e l e a s i n g c a t h e p s i n G a n d e l a s t a s e ( H 0 a t _ a l . , 1 9 9 5 ) . I t r e m a i n s u n k n o w n w h e t h e r p l a t e l e t - d e r i v e d e l a s t a s e , a l t h o u g h b i o c h e m i c a l l y d i f f e r e n t f r o m t h a t r e l e a s e d b y a c t i v a t e d n e u t r o p h i l s ( J a m e s e t a l . , 1 9 8 5 ) , c o u l d h a v e s i m i l a r c y t o t o x i c e f f e c t s . A s s t u d i e s i n v i t r o s u g g e s t , n e u t r o p h i l - d e r i v e d e l a s t a s e m a y c o n t r i b u t e t o t h e p a t h o g e n e s i s o f t i s s u e i n j u r y i n v i v a . F o r i n s t a n c e , t h e i n f u s i o n o f n e u t r o p h i l - d e r i v e d e l a s t a s e a n d c a t h e p s i n G i n t o t h e r e n a l a r t e r y c a u s e s g l o m e r u l a r b a s e m e n t m e m b r a n e i n j u r y a n d p r o t e i n u r i a ( J o h n s o n e t a l . , 1 9 8 8 ) . I n p l a s m a , d e p e n d i n g u p o n t h e c o n c e n t r a t i o n s , n e u t r o p h i l - d e r i v e d e l a s t a s e i s u n b o u n d o r c o m p l e x e d w i t h t h e p l a s m a p r o t e i n , a , - a n t i t r y p s i n . T h e s e e l a s t a s e - a n t i t r y p s i n c o m p l e x e s a r e e l e v a t e d i n s e p t i c p a t i e n t s , a n d t h e p l a s m a c o n c e n t r a t i o n o f e l a s t a s e c o r r e l a t e s w i t h t h e s e v e r i t y o f i n f e c t i o n ( F r i t z e t a l . , 1 9 8 6 ) . T h u s , i t h a s b e e n h y p o t h e s i z e d t h a t e x t e n s i v e r e l e a s e o f e l a s t a s e f r o m s t i m u l a t e d n e u t r o p h i l s c a n o v e r c o m e t h e e n d o g e n o u s a n t i p r o t e a s e a c t i v i t y 5 1 o f a 1 - a n t i t r y p s i n a n d c o n t r i b u t e t o i n j u r y b y n o n - s p e c i f i c p r o t e o l y s i s o f s t r u c t u r a l e l e m e n t s . H o w e v e r , s i m i l a r t o t h e f i n d i n g s i n v i t r o , t h e r o l e o f p l a t e l e t - d e r i v e d p r o t e a s e s i n t i s s u e i n j u r y i n v i v a i s n o t f u l l y u n d e r s t o o d . I I I . E . I n t e r a c t i o n s b e t w e e n p l a t e l e t s a n d i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s T h e r e m a i n i n g p l a t e l e t c o n s t i t u e n t s r e l e a s e d u p o n a c t i v a t i o n a r e u n l i k e l y t o m e d i a t e h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y d i r e c t l y , b u t t h e y c o u l d c o n t r i b u t e t o p a r e n c h y m a l c e l l d a m a g e b y i n t e r a c t i n g w i t h o t h e r , c r i t i c a l i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s . T h e f o l l o w i n g s u b s e c t i o n s w i l l a d d r e s s s o m e p o t e n t i a l i n t e r a c t i o n s o f p l a t e l e t s w i t h t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , n e u t r o p h i l s a n d K u p f f e r c e l l s . P l a t s l s t - s g s g u l a t i g n s y s t e m i n t e r a c t i o n s . A s m e n t i o n e d p r e v i o u s l y , t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i s c r i t i c a l f o r t h e p a t h o g e n e s i s o f l i v e r i n j u r y d u r i n g L P S e x p o s u r e ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 5 ; M a r g a r e t t e n e t a l . , 1 9 6 7 ) . P l a t e l e t s m a y i n f l u e n c e t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i n s e v e r a l w a y s . A s s h o w n i n T a b l e 1 , t h e a - g r a n u l e s o f p l a t e l e t s c o n t a i n c o a g u l a t i o n p r o t e i n s i n c l u d i n g v W F a n d v W F a n t i g e n , f i b r i n o g e n a n d h i g h m o l e c u l a r w e i g h t k i n i n o g e n . T h e s u r f a c e o f p l a t e l e t s c a n b i n d c o a g u l a t i o n f a c t o r s a n d c a n a c t i v a t e c o m p o n e n t s o f t h e i n t r i n s i c p a t h w a y , s u c h a s p r o t h r a m b i n a n d f a c t o r s X , X I a n d X l l . P l a t e l e t s c a n a l s o p r o t e c t f a c t o r s X l a a n d X a f r o m p r o t e o l y t i c i n a c t i v a t i o n ( W a l s h , 1 9 8 1 a ; W a l s h e t a l . , 1 9 8 1 b ; W a l s h e t a l . , 1 9 9 3 ) , t h e r e b y p r o m o t i n g c l o t f o r m a t i o n . 5 2 T h u s , p l a t e l e t s c o u l d c o n t r i b u t e t o h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y b y p r o m o t i n g a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m . W . N e u t r o p h i l s h a v e b e e n l o c a l i z e d w i t h i n p l a t e l e t t h r o m b i i n v i v a ( W e s t e r e t a l . , 1 9 7 9 ) a n d n e u t r o p h i l s i n t e r a c t w i t h p l a t e l e t a g g r e g a t e s f o l l o w i n g d e s q u a m a t i o n o f a r t e r i e s ( R a t l i f f e t a l . 1 9 7 9 ) . I n a d d i t i o n , n e u t r o p h i l s i n f l u e n c e p l a t e l e t d e p o s i t i o n i n t i s s u e s i n r e s p o n s e t o i n t r a d e r m a l i n j e c t i o n o f L P S , s i n c e p r i o r n e u t r o p h i l d e p l e t i o n i n h i b i t s t h i s i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e ( l s s e k u t z e t a l . , 1 9 8 3 ) . S i m i l a r l y , a c t i v a t e d p l a t e l e t s c a n i n f l u e n c e n e u t r o p h i l a c c u m u l a t i o n i n t i s s u e s b y e x p r e s s i n g P - s e l e c t i n . T h e a d h e s i o n o f n e u t r o p h i l s t o a c o n f l u e n t m o n o l a y e r o f p l a t e l e t s i n a f l o w c h a m b e r i s c o m p l e t e l y i n h i b i t e d w i t h a P - s e l e c t i n a n t i b o d y ( Y e o e t a l . , 1 9 9 4 ) . I n a d d i t i o n , t h e n e u t r o p h i l s b o u n d t o p l a t e l e t s e x p r e s s i n g P - s e l e c t i n a p p e a r t o b e a c t i v a t e d , s i n c e C d 1 1 b a n d C D 1 8 s u r f a c e e x p r e s s i o n i s u p r e g u l a t e d o n a d h e r e n t , b u t n o t o n n o n a d h e r e n t n e u t r o p h i l s ( Y e o e t a l . , 1 9 9 4 ) . S i m i l a r f i n d i n g s a r e r e p o r t e d i n v i v a . A P - s e l e c t i n a n t i b o d y i n h i b i t s l e u k o c y t e a d h e r e n c e t o p l a t e l e t s t h a t h a v e a c c u m u l a t e d o n g r a f t s i m p l a n t e d w i t h a n a r t e r i o v e n o u s s h u n t i n m i c e ( P a l a b r i c a e t a l . , 1 9 9 2 ) . N e u t r o p h i l s a r e c r i t i c a l f o r L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 2 ; J a e s c h k e e t a l . , 1 9 9 1 b ) , a n d s e v e r a l p l a t e l e t c o n s t i t u e n t s c a n i n f l u e n c e n e u t r o p h i l f u n c t i o n s . A s m e n t i o n e d p r e v i o u s l y , P A F , w h i c h i s p r o d u c e d f r o m n u m e r o u s i n f l a m m a t o r y c e l l s i n c l u d i n g p l a t e l e t s , i s c h e m o t a c t i c f o r a n d 5 3 s t i m u l a t e s d e g r a n u l a t i o n o f n e u t r o p h i l s ( H o s f o r d e t a l . , 1 9 9 3 ) . T h e B - t h r o m b o g l o b u l i n f a m i l y o f p r o t e i n s r e l e a s e d f r o m a - g r a n u l e s , i n c l u d i n g P B P , l o w a f f i n i t y P F 4 a n d N A P - 2 , a r e c h e m o t a c t i c f o r n e u t r o p h i l s a n d s t i m u l a t e n e u t r o p h i l i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m f l u x e s a n d d e g r a n u l a t i o n ( W a l z e t a l . , 1 9 8 9 ; H o l t e t a l . , 1 9 8 6 ; H o l t e t a l . , 1 9 8 8 ) . I n a d d i t i o n , P F 4 e n h a n c e s t h e a c t i v i t y o f e l a s t a s e p u r i f i e d f r o m h u m a n n e u t r o p h i l s ( L o n k y e t a l . , 1 9 8 1 ; L o n k y e t a l . , 1 9 7 8 ) . S u c h a m e c h a n i s m m i g h t c o n t r i b u t e t o t h e p a t h o g e n e s i s o f t h e a d u l t r e s p i r a t o r y d i s t r e s s s y n d r o m e ( A R D S ) , s i n c e p l a t e l e t s a r e s e q u e s t e r e d i n t h e p u l m o n a r y t i s s u e o f p a t i e n t s w i t h A R D S i n a s s o c i a t i o n w i t h e l e v a t e d c o n c e n t r a t i o n s o f P F 4 a n d B - T G i n b r o n c h o a l v e o l a r l a v a g e f l u i d ( I d e l l e t a l . , 1 9 8 9 ) . I t h a s b e e n h y p o t h e s i z e d t h a t I S T G - l i k e p r o t e i n s c o n t r i b u t e t o A R D S b y p r o m o t i n g p u l m o n a r y n e u t r o p h i l i n f i l t r a t i o n a n d a c t i v a t i o n a n d i n c r e a s i n g n e u t r o p h i l - d e r i v e d e l a s t a s e a c t i v i t y ( I d e l l e t a l . , 1 9 8 9 ) . S t u d i e s c o n d u c t e d i n v i t r a s u g g e s t t h a t p l a t e l e t s i n f l u e n c e n e u t r o p h i l a c t i v a t i o n . F o r i n s t a n c e , h u m a n p l a t e l e t s r e l e a s e a s o l u b l e f a c t o r t h a t i n c r e a s e s f m l p - i n d u c e d 0 , ‘ p r o d u c t i o n i n n e u t r o p h i l s ( W r i g h t e t a l . , 1 9 8 8 ; N a u m e t a l . , 1 9 9 1 ) . S i m i l a r c o - i n c u b a t i o n s t u d i e s i n s h e e p s u g g e s t i n t e r a c t i o n s b e t w e e n n e u t r o p h i l s a n d p l a t e l e t s i n r e s p o n s e t o t h r o m b i n . T h e a d d i t i o n o f t h r o m b i n t o n e u t r o p h i l s o r p l a t e l e t s a l o n e d o e s n o t i n c r e a s e 0 , ‘ p r o d u c t i o n ; h o w e v e r , w h e n p l a t e l e t s a n d n e u t r o p h i l s a r e c o - i n c u b a t e d , t h e a d d i t i o n o f t h r o m b i n r e s u l t s i n a 5 - f o l d i n c r e a s e i n s t i m u l a t e d 0 , ‘ p r o d u c t i o n ( M o o n e t a l . , 1 9 9 0 ) . T h i s e n h a n c e d r e s p o n s e i s d e p e n d e n t u p o n t h r o m b i n c o n c e n t r a t i o n a n d t h e p l a t e l e t m e u t r o p h i l r a t i o a n d i s s u g g e s t e d t o b e m e d i a t e d b y d i r e c t c o n t a c t 5 4 b e t w e e n p l a t e l e t s a n d n e u t r o p h i l s . N o t o n l y c a n p l a t e l e t s i n f l u e n c e n e u t r o p h i l s b u t n e u t r o p h i l s c a n i n f l u e n c e p l a t e l e t s t o o . P u r i f i e d , n e u t r o p h i l - d e r i v e d c a t h e p s i n G s t i m u l a t e s p l a t e l e t a g g r e g a t i o n a n d t h e r e l e a s e o f s e r o t o n i n a n d T x A , ( E v a n g e l i s t a e t a l . , 1 9 9 2 ; S e l a k e t a l . , 1 9 8 8 ) . S i m i l a r f i n d i n g s a r e r e p o r t e d i n a m o d i f i e d r o s e t t i n g a s s a y i n w h i c h f m l p — s t i m u l a t e d n e u t r o p h i l s i n d u c e s e r o t o n i n r e l e a s e f r o m p l a t e l e t s . T h i s e f f e c t i s l i k e l y m e d i a t e d b y c a t h e p s i n G , s i n c e a - 1 a n t i p r o t e a s e i n h i b i t s t h i s e f f e c t ( E v a n g e l i s t a e t a l . , 1 9 9 3 ) . T h e m e c h a n i s m b y w h i c h c a t h e p s i n G s t i m u l a t e s p l a t e l e t s i s n o t c l e a r l y u n d e r s t o o d , h o w e v e r , c a t h e p s i n G i s r e p o r t e d t o a l t e r t h e e x p r e s s i o n o f p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n s . F o r i n s t a n c e , t h i s p r o t e a s e d e c r e a s e s t h e e x p r e s s i o n o f g l y c o p r o t e i n l b a n d v W F b i n d i n g b y a m e c h a n i s m i n v o l v i n g p r o t e o l y s i s a n d a l s o a c y t o s k e l e t o n - m e d i a t e d r e d i s t r i b u t i o n o f t h e g l y c o p r o t e i n ( L a R o s a e t a l . , 1 9 9 4 ) . I n c o n t r a s t , c a t h e p s i n G s t i m u l a t e s t h e e x p r e s s i o n o f g l y c o p r o t e i n l l b / I l l a o n t h e s u r f a c e o f p l a t e l e t s ( M o l i n a e t a l . , 1 9 9 3 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e s t u d i e s s u g g e s t t h a t a c t i v a t e d n e u t r o p h i l s a n d s u b s e q u e n t r e l e a s e o f c a t h e p s i n G m i g h t r e d u c e p l a t e l e t b i n d i n g t o t h e e n d o t h e l i u m w h i l e i n c r e a s i n g t h e i r a b i l i t y t o a g g r e g a t e . S i n c e T N F - a i s a c r i t i c a l m e d i a t o r o f L P S - i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y , i t i s i n t e r e s t i n g t o n o t e t h a t p r i m i n g o f n e u t r o p h i l s w i t h T N F - a e n h a n c e s c a t h e p s i n G r e l e a s e i n r e s p o n s e t o f m l p a n d a l s o e n h a n c e s p l a t e l e t a c t i v a t i o n a n d s e r o t o n i n r e l e a s e ( R e n e s t o e t a l . , 1 9 9 1 ) . S u c h a n i n t e r a c t i o n c o u l d e x p l a i n t h e c r i t i c a l n a t u r e o f b o t h n e u t r o p h i l s a n d T N F - a i n t h e p a t h o g e n e s i s o f h e p a t o t o x i c i t y . 5 5 A n o t h e r n e u t r o p h i l d e r i v e d p r o t e a s e , e l a s t a s e , h a s t h e o p p o s i t e e f f e c t o n p l a t e l e t s ; i t i n h i b i t s t h r o m b i n - i n d u c e d p l a t e l e t a g g r e g a t i o n ( B r o w e r e t a l . , 1 9 8 5 ) . l m m u n o c y t o c h e m i s t r y s u g g e s t s t h a t e l a s t a s e e x p o s u r e r e d u c e s t h e n u m b e r o f h i g h a f f i n i t y t h r o m b i n b i n d i n g s i t e s o n t h e p l a t e l e t s u r f a c e a n d , s i m i l a r t o c a t h e p s i n G , r e s u l t s i n t h e p r o t e o l y t i c c l e a v a g e o f l b ( B r o w e r e t a l . , 1 9 8 5 ) . T h u s , d i f f e r e n t n e u t r o p h i l - d e r i v e d p r o t e a s e s h a v e s o m e o p p o s i n g e f f e c t s o n p l a t e l e t s . A n o t h e r i n t e r a c t i o n b e t w e e n n e u t r o p h i l s a n d p l a t e l e t s i s t r a n s c e l l u l a r m e t a b o l i s m o f a r a c h i d o n i c a c i d a n d i t s m e t a b o l i t e s i n v i t r a . P l a t e l e t - d e r i v e d a r a c h i d o n a t e c a n s e r v e a s a p r e c u r s o r f o r L T B 4 a n d 5 - H E T E p r o d u c t i o n i n n e u t r o p h i l s ( M a r c u s e t a l . , 1 9 8 2 ) . I n a d d i t i o n , p l a t e l e t - d e r i v e d 1 2 - H E T E i s m e t a b o l i z e d t o d i H E T E , a p r e c u r s o r o f L T B , , b y n e u t r o p h i l s ( M a r c u s e t a l . , 1 9 8 2 ) . O n t h e o t h e r h a n d , n e u t r o p h i l - d e r i v e d 5 - H E T E a n d L T A 4 a r e c o n v e r t e d t o d i H E T E a n d L T C 4 , r e s p e c t i v e l y , b y p l a t e l e t s ( M a c l o u f e t a l . , 1 9 9 0 ; M a c l o u f e t a l . , 1 9 8 2 ) . T h e r o l e a n d s i g n i f i c a n c e o f t h i s t r a n s c e l l u l a r m e t a b o l i s m i n v i v o i s n o t u n d e r s t o o d . P l a t e l e t - K u p f f s r s e l l i n t e r a c t i g n s . A s m e n t i o n e d , e l e c t r o n m i c r o g r a p h s o f m u r i n e l i v e r s a f t e r L P S e x p o s u r e r e v e a l t h a t p l a t e l e t s a r e p r e s e n t w i t h i n t h e l i v e r s i n u s o i d s a n d a l s o w i t h i n K u p f f e r c e l l s ( L e v y e t a l . , 1 9 6 8 b ; E n d o e t a l . , 1 9 9 3 ) . K u p f f e r c e l l s c o u l d c o n t r i b u t e t o p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n b y s e v e r a l m e c h a n i s m s . T h e h e p a t i c r e t i c u l o e n d o t h e l i a l s y s t e m , c o n s i s t i n g o f K u p f f e r c e l l s a n d e n d o t h e l i a l c e l l s , c a n c l e a r s e n e s c e n t p l a t e l e t s a s w e l l a s p l a t e l e t - i m m u n e 5 6 c o m p l e x e s , a s o b s e r v e d d u r i n g i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a p u r p u r a ( d u P H e y n s e t a l . , 1 9 8 6 ) . T h e c l e a r a n c e o f p l a t e l e t s b y K u p f f e r c e l l s m a y b e m e d i a t e d i n p a r t b y t h e C l q r e c e p t o r l o c a t e d o n K u p f f e r c e l l s . T h i s r e c e p t o r c o m p l e x c o n t r i b u t e s t o t h e c l e a r a n c e o f f i b r o n e c t i n c o a t e d c e l l s , p r o t e i n s a n d p a r t i c l e s . B o t h s t i m u l a t e d K u p f f e r c e l l s a n d p l a t e l e t s r e l e a s e f i b r o n e c t i n ( T o t h e t a l . , 1 9 9 2 ; N i e w i a r o w s k i e t a l . , 1 9 9 4 ) . I n a d d i t i o n , L P S e x p o s u r e i n c r e a s e s s e r u m f i b r o n e c t i n c o n c e n t r a t i o n ( R i c h a r d s e t a l . , 1 9 8 5 ) . M o r e o v e r , t h e e n h a n c e d K u p f f e r c e l l p h a g o c y t i c a c t i v i t y o b s e r v e d a f t e r c h a l l e n g e w i t h a s m a l l d o s e o f L P S c o r r e l a t e s w i t h e l e v a t e d p l a s m a f i b r o n e c t i n c o n c e n t r a t i o n ( R i c h a r d s e t a l . , 1 9 8 5 ) . A c c o r d i n g l y , b o t h p l a t e l e t s a n d K u p f f e r c e l l s , t h r o u g h t h e r e l e a s e o f f i b r o n e c t i n , c o u l d s t i m u l a t e K u p f f e r c e l l p h a g o c y t o s i s . K u p f f e r c e l l s f r o m n o r m a l r a t l i v e r s p r o d u c e T x A , , P G E , a n d p r i m a r i l y P G D , . W h e n e x p o s e d t o L P S , t h e s e c e l l s p r o d u c e p r i m a r i l y P G E , ( K a w a d a e t a l . , 1 9 9 2 ) . I n a d d i t i o n , t h e s t i m u l a t i o n o f K u p f f e r c e l l s w i t h c a l c i u m i o n o p h o r e , p h o r b o l e s t e r o r o p s o n i z e d z y m o s a n s t i m u l a t e s b o t h P G D , a n d T x A , p r o d u c t i o n ( D i e t e r e t a l . , 1 9 8 9 ) . S i n c e t h e s e p r o s t a n o i d s h a v e v a r i o u s e f f e c t s o n p l a t e l e t a g g r e g a t i o n , i t i s p o s s i b l e t h a t t h e i r b a l a n c e m o d i f i e s p l a t e l e t r e a c t i v i t y . A c t i v a t e d K u p f f e r c e l l s c a n d i r e c t l y i n j u r e t h e s i n u s o i d a l e n d o t h e l i u m t h r o u g h t h e r e l e a s e o f I i p o x y g e n a s e m e t a b o l i t e s a n d o x y g e n r a d i c a l s ( D e a c i u c e t a l . , 1 9 9 3 a ; D e a c i u c e t a l . , 1 9 9 4 ; D e a c i u c e t a l . , 1 9 9 3 c ; L i u e t a l . , 1 9 9 5 ; L i u e t a l . , 1 9 9 4 ) . a n d e n d o t h e l i a l c e l l i n j u r y p r o m o t e s p l a t e l e t a d h e r e n c e a n d a c t i v a t i o n . M o r e o v e r , o x y g e n r a d i c a l - m e d i a t e d i n j u r y t o t h e e n d o t h e l i u m , t h r o u g h c h a n g e s i n t h e p r o d u c t i o n o f p l a t e l e t i n h i b i t o r s s u c h a s p r o s t a c y c l i n a n d n i t r i c o x i d e , m a y 5 7 a l t e r t h e a c t i v i t y o f p l a t e l e t s ( S a l v e m i n i e t a l . , 1 9 9 3 ) . I n a d d i t i o n , o x y g e n r a d i c a l s c a n d i r e c t l y i n f l u e n c e p l a t e l e t s , i n a s m u c h a s l a r g e c o n c e n t r a t i o n s o f h y d r o g e n p e r o x i d e s t i m u l a t e p l a t e l e t a g g r e g a t i o n ( S a l v e m i n i e t a l . , 1 9 9 3 ) . T h e s e p o t e n t i a l i n t e r a c t i o n s b e t w e e n K u p f f e r c e l l s a n d p l a t e l e t s h a v e n o t b e e n w e l l c h a r a c t e r i z e d d u r i n g L P S e x p o s u r e i n v i v a . i v 0 8 ” M 5 8 I V . C O N C L U S I O N T h i s i n t r o d u c t o r y c h a p t e r h a s f o c u s e d o n t h e r o l e s o f i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s , i n c l u d i n g n e u t r o p h i l s , K u p f f e r c e l l s , t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d l i p i d d e r i v a t i v e s , i n t h e p a t h o g e n e s i s o f L P S - m e d i a t e d h e p a t o t o x i c i t y . I n a d d i t i o n , e m p h a s i s h a s b e e n p l a c e d o n p l a t e l e t s a n d t h e i r p o s s i b l e c o n t r i b u t i o n s t o t h e d e v e l o p m e n t o f t i s s u e i n j u r y . T h e m a i n f o c u s o f t h i s d i s s e r t a t i o n i s t o e x a m i n e t h e r o l e o f p l a t e l e t s i n L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y , f o c u s i n g o n t h e p o t e n t i a l i n t e r a c t i o n s b e t w e e n p l a t e l e t s a n d o t h e r c e l l u l a r a n d s o l u b l e m e d i a t o r s o f i n f l a m m a t i o n . T h e g l o b a l h y p o t h e s i s i s t h a t p l a t e l e t s c o n t r i b u t e t o L P S - i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y b y m e c h a n i s m s i n v o l v i n g t h e i r i n t e r a c t i o n s w i t h o t h e r c e l l u l a r a n d s o l u b l e i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s . V . R E S E A R C H G O A L S 1 . A m a i n g o a l o f t h i s r e s e a r c h w a s t o d e t e r m i n e i f p l a t e l e t s a c c u m u l a t e i n t h e l i v e r a f t e r e x p o s u r e t o L P S . I n a d d i t i o n , t i m e c o u r s e s t u d i e s w e r e c o n d u c t e d t o d e s c r i b e t h e t e m p o r a l r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n a n d t h r o m b o c y t o p e n i a r e l a t i v e t o h e p a t i c n e u t r o p h i l a c c u m u l a t i o n , a c t i v a t i o n o f t h e 5 9 c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d o n s e t o f h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y . P l a t e l e t d e p l e t i o n e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d t o a s c e r t a i n w h e t h e r p l a t e l e t s a r e c r i t i c a l f o r t h e p a t h o g e n e s i s o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . T h e s e s t u d i e s a l s o e v a l u a t e d t h e e f f e c t o f p l a t e l e t d e p l e t i o n o n h e p a t i c n e u t r o p h i l a c c u m u l a t i o n , p r o d u c t i o n o f p l a s m a T N F - a a c t i v i t y a n d a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m . 2 . S i n c e b o t h n e u t r o p h i l s a n d K u p f f e r c e l l s c o n t r i b u t e t o L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y a n d b o t h o f t h e s e c e l l s c a n i n t e r a c t w i t h p l a t e l e t s , t h e r o l e s o f K u p f f e r c e l l s a n d n e u t r o p h i l s i n t h e h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n a n d t h r o m b o c y t o p e n i a a f t e r e x p o s u r e t o L P S w e r e e v a l u a t e d . 3 . E x p o s u r e t o L P S a c t i v a t e s t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , a n d t h i s a c t i v a t i o n i s c r i t i c a l f o r t h e d e v e l o p m e n t o f h e p a t o c e l l u l a r d a m a g e . T h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , m o s t n o t a b l y t h r o m b i n , c a n s t i m u l a t e p l a t e l e t a g g r e g a t i o n . S t u d i e s w e r e c o n d u c t e d w i t h h e p a r i n a n d t h e t h r o m b i n i n h i b i t o r , h i r u d i n , t o e v a l u a t e t h e r o l e o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i n t h e h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n a n d t h r o m b o c y t o p e n i a d u r i n g e x p o s u r e t o L P S . I n a d d i t i o n , t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t s a s a d i s t a l m e d i a t o r ( i . e . a c t s s h o r t l y b e f o r e t h e o n s e t o f l i v e r i n j u r y ) , e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d i n w h i c h h e p a r i n a n d h i r u d i n w e r e a d m i n i s t e r e d a t v a r i o u s t i m e s a f t e r L P S e x p o s u r e a n d t h e i r e f f e c t s o n t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r i n j u r y w e r e e v a l u a t e d . 4 . N u m e r o u s i n f l a m m a t o r y c e l l s , i n c l u d i n g p l a t e l e t s , n e u t r o p h i l s a n d K u p f f e r 6 0 c e l l s , c a n r e l e a s e a n d b e s t i m u l a t e d b y P A F a n d l e u k o t r i e n e s . T o a d d r e s s t h e r o l e s o f t h e s e l i p i d m e d i a t o r s i n t h e t h r o m b o c y t o p e n i a , a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d l i v e r i n j u r y m e d i a t e d b y L P S , s t u d i e s w e r e c o n d u c t e d w i t h a P A F r e c e p t o r a n t a g o n i s t a n d a 5 - l i p o x y g e n a s e i n h i b i t o r . 5 . C y c l o o x y g e n a s e m e t a b o l i t e s , i n p a r t i c u l a r t h r o m b o x a n e , a r e p r o d u c e d f r o m p l a t e l e t s a n d o t h e r i n f l a m m a t o r y c e l l s a n d a r e c r i t i c a l f o r t h e d e v e l o p m e n t o f n u m e r o u s L P S - m e d i a t e d p a t h o p h y s i o l o g i c e f f e c t s . A s t u d y w a s c o n d u c t e d t o d e t e r m i n e t h e t e m p o r a l r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e p r o d u c t i o n o f t h r o m b o x a n e r e l a t i v e t o o t h e r L P S - m e d i a t e d a l t e r a t i o n s . T o a d d r e s s t h e r o l e o f c y c l o o x y g e n a s e m e t a b o l i t e s a n d t h r o m b o x a n e i n t h e p a t h o g e n e s i s o f L P S - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a , a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n a n d l i v e r i n j u r y , e x p e r i m e n t s w i t h a s p i r i n a n d t h e t h r o m b o x a n e s y n t h a s e i n h i b i t o r , d a z m e g r e l w e r e p e r f o r m e d . C H A P T E R 2 R O L E O F P L A T E L E T S I N L P S - I N D U C E D L I V E R I N J U R Y 6 1 6 2 2 . A . A b s t r a c t A f t e r L P S i n j e c t i o n i n t o r a t s , p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n a n d n u m b e r s o f b l o o d p l a t e l e t s a n d l e u k o c y t e s d e c r e a s e . R e s u l t s o f o u r s t u d i e s , u s i n g i m m u n o c y t o c h e m i s t r y f o r t h e d e t e c t i o n o f n e u t r o p h i l s a n d 1 1 1 i n d i u m - l a b e l i n g t o i d e n t i f y p l a t e l e t s , i n d i c a t e t h a t b o t h n e u t r o p h i l s a n d p l a t e l e t s a c c u m u l a t e w i t h i n t h e l i v e r e a r l y a f t e r a d m i n i s t r a t i o n o f L P S t o r a t s . T h e a c c u m u l a t i o n o f p l a t e l e t s i n t h e l i v e r p r i o r t o t h e o n s e t o f i n j u r y s u g g e s t e d t h a t p l a t e l e t s c o n t r i b u t e t o t h e m a n i f e s t a t i o n o f L P S - i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y . T o t e s t t h i s h y p o t h e s i s , t h e n u m b e r o f c i r c u l a t i n g b l o o d p l a t e l e t s w a s d e c r e a s e d b y t h e a d m i n i s t r a t i o n o f a n a n t i - r a t p l a t e l e t s e r u m ( A P S ) p r i o r t o L P S a d m i n i s t r a t i o n . T h e c o n s e q u e n t t h r o m b o c y t o p e n i a b y A P S a d m i n i s t r a t i o n w a s a s s o c i a t e d w i t h a n a t t e n u a t i o n o f b o t h L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y a n d t h e a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m . H o w e v e r , t h e A P S t r e a t m e n t d i d n o t p r e v e n t t h e h e p a t i c n e u t r o p h i l a c c u m u l a t i o n . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t p l a t e l e t s c o n t r i b u t e t o t h e p a t h o g e n e s i s o f l i v e r i n j u r y a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , p e r h a p s t h r o u g h t h e i r i n t e g r a l r o l e i n c o a g u l a t i o n a n d / o r i n t e r a c t i o n w i t h n e u t r o p h i l s , b u t t h e y d o n o t a p p e a r t o c o n t r i b u t e t o h e p a t i c n e u t r o p h i l a c c u m u l a t i o n . 6 3 2 . 8 . I n t r o d u c t i o n S e v e r a l s t u d i e s s u g g e s t a r o l e f o r p l a t e l e t s i n t h e p a t h o g e n e s i s o f s o m e L P S - i n d u c e d r e s p o n s e s . P l a t e l e t s e q u e s t r a t i o n i n b o t h t h e l u n g a n d l i v e r h a s b e e n r e p o r t e d i n e x p e r i m e n t a l m o d e l s o f e n d o t o x i n s h o c k ( C h r i s t e n s o n e t a l . , 1 9 8 7 ; S o s t m a n e t a l . , 1 9 8 3 ) . I n a d d i t i o n , a n t i b o d y - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a p r o t e c t s r a b b i t s ( K r a m e r e t a l . , 1 9 7 7 ) a n d r a t s ( I t o e t a l . , 1 9 9 0 ) f r o m e n d o t o x i n - i n d u c e d d i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n ( D I C ) . F u r t h e r m o r e , d r u g s t h a t p r e v e n t s y n t h e s i s o r a c t i o n o f t h r o m b o x a n e A , , w h i c h i s p r o d u c e d b y a c t i v a t e d p l a t e l e t s , p r o v i d e p r o t e c t i o n i n a n i m a l m o d e l s o f L P S - i n d u c e d D I C a n d l i v e r i n j u r y ( I t o e t a l . , 1 9 9 0 ; W i s e e t a l . , 1 9 8 0 ) . A r e c e n t s t u d y r e v e a l e d a c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e s e v e r i t y o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y a n d t h r o m b o c y t o p e n i a I S h i b a y a m a e t a l . , 1 9 9 5 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t a r e l a t i o n s h i p b e t w e e n p l a t e l e t s a n d l i v e r i n j u r y . H o w e v e r , s t u d i e s t o t e s t t h e h y p o t h e s i s t h a t p l a t e l e t s a c t u a l l y c o n t r i b u t e t o t h e p a t h o g e n e s i s o f l i v e r i n j u r y h a v e n o t b e e n r e p o r t e d . 1 T o e l u c i d a t e t h e r o l e o f p l a t e l e t s i n L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y , t h e t e m p o r a l r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n t h e o n s e t o f l i v e r i n j u r y a n d c h a n g e s i n p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n , p l a s m a T N F - a a c t i v i t y , a n d t h e n u m b e r s o f p l a t e l e t s a n d n e u t r o p h i l s i n b l o o d a n d l i v e r w e r e e v a l u a t e d i n t h e s a m e g r o u p o f r a t s a f t e r i n t r a v e n o u s i n j e c t i o n o f E . c o l i L P S . T o t e s t t h e h y p o t h e s i s t h a t p l a t e l e t s c o n t r i b u t e t o t h e m a n i f e s t a t i o n o f L P S - i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y , t h e i n f l u e n c e o f t h r o m b o c y t o p e n i a o n l i v e r i n j u r y w a s e x a m i n e d . F i n a l l y , t o i n v e s t i g a t e p o t e n t i a l 6 4 i n t e r a c t i o n s b e t w e e n p l a t e l e t s a n d o t h e r m e d i a t o r s i n v i v a , t h e e f f e c t s o f p l a t e l e t d e p l e t i o n o n L P S - i n d u c e d c h a n g e s i n f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n a n d T N F - 0 a c t i v i t y i n p l a s m a a n d n e u t r o p h i l a c c u m u l a t i o n i n l i v e r w e r e e v a l u a t e d . 2 . C . M a t e r i a l s a n d m e t h o d s 2 . C . 1 . M a t e r i a l s L i p o p o l y s a c c h a r i d e ( E s c h e r i c h i a c a l i , s e r o t y p e 1 2 8 : 8 1 2 ) , K i t 6 0 5 - D f o r m e a s u r e m e n t o f b i l i r u b i n c o n c e n t r a t i o n a n d K i t 5 9 f o r d e t e r m i n a t i o n o f a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e a c t i v i t y ( A L T ) w e r e p u r c h a s e d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o m p a n y ( S t . L o u i s , M O ) . D i l u t i o n a n d l y s i s o f e r y t h r o c y t e s f o r p l a t e l e t e n u m e r a t i o n w e r e p e r f o r m e d i n p l a t e l e t U n o p e t t e s " ( B a x t e r S c i e n t i f i c P r o d u c t s , M c G a w P a r k , I L ) . F i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n w a s m e a s u r e d i n a B B L ‘ ” F i b r o m e t e r ( B e c t o n , D i c k i n s o n a n d C o m p a n y , H u n t V a l l e y , M D ) u s i n g D a t a - P I P f i b r i n o g e n d e t e r m i n a t i o n k i t ( B a x t e r S c i e n t i f i c P r o d u c t s , M c G a w P a r k , I L ) . A l l i m m u n o c y t o c h e m i c a l r e a g e n t s , e x c e p t r a b b i t a n t i - r a t n e u t r o p h i l i m m u n o g l o b u l i n , w e r e p u r c h a s e d f r o m V e c t o r L a b o r a t o r i e s ( B u r l i n g a m e , C A ) . 1 1 1 l n d i u m - o x i n e w a s p u r c h a s e d f r o m M e d i - P h y s i c s D i v i s i o n o f A m e r s h a m ( A r l i n g t o n H e i g h t s , I L ) . P r o s t a g l a n d i n E 1 w a s p u r c h a s e d f r o m C a l b i o c h e m ( S a n D i e g o , C A ) . 6 5 2 . C . 2 . A n i m a l s T o b e c o n s i s t e n t w i t h p r e v i o u s s t u d i e s w i t h t h i s m o d e l , f e m a l e , S p r a g u e - D a w l e y r a t s ( C r I : C D B R ( S D ) V A F / p l u s , C h a r l e s R i v e r , P o r t a g e , M I ) w e i g h i n g 2 0 0 - 2 5 0 9 w e r e u s e d i n a l l s t u d i e s . T h e a n i m a l s w e r e m a i n t a i n e d o n a 1 2 h r l i g h t / d a r k c y c l e u n d e r c o n t r o l l e d t e m p e r a t u r e ( 1 8 - 2 1 ° C ) a n d h u m i d i t y ( 5 5 : I : 5 % ) . F o o d ( R a t c h o w , T e k l a d , M a d i s o n , W I ) a n d w a t e r w e r e a l l o w e d a d l i b i t u m . A l l p r o c e d u r e s o n a n i m a l s w e r e c a r r i e d o u t a c c o r d i n g t o t h e g u i d e l i n e s o f t h e A m e r i c a n A s s o c i a t i o n o f L a b o r a t o r y A n i m a l S c i e n c e s a n d t h e U n i v e r s i t y L a b o r a t o r y A n i m a l R e s e a r c h f a c i l i t i e s o f M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y . 2 . C . 3 . A n t i - r a t p l a t e l e t s e r u m P o l y c l o n a l , a n t i - r a t p l a t e l e t s e r u m w a s c o l l e c t e d f r o m a N u b i a n g o a t a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( W h i t e e t a l . , 1 9 8 9 ) . C o m p l e m e n t w a s i n a c t i v a t e d b y i n c u b a t i o n o f s e r u m a t 5 6 ° C f o r 4 5 m i n u t e s . A n t i - p l a t e l e t s e r u m ( A P S ) w a s a d s o r b e d w i t h w a s h e d r a t r e d b l o o d c e l l s . C o n t r o l s e r u m ( C S ) w a s s i m i l a r l y p r e p a r e d f r o m a g o a t t h a t h a d n o t b e e n i m m u n i z e d . B o t h A P S a n d C S w e r e s t o r e d i n 2 m l a l i q u o t s a t - 2 0 ° C u n t i l u s e . 2 . C . 4 . T i m e c o u r s e s t u d i e s I n i t i a l s t u d i e s w e r e p e r f o r m e d t o a s s e s s t h e t e m p o r a l e f f e c t s o f l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( L P S ) a d m i n i s t r a t i o n o n b l o o d c o n s t i t u e n t s a n d t h e l i v e r . R a t s w e r e t r e a t e d e i t h e r w i t h L P S ( 4 m g / k g ) o r w i t h i t s s a l i n e ( S A L ) v e h i c l e i n a v o l u m e o f 4 m l / k g a s a s i n g l e i n j e c t i o n i n t h e t a i l v e i n . T h i s d o s e o f L P S 6 6 r e s u l t s i n r e p r o d u c i b l e l i v e r i n j u r y w i t h i n 6 h o u r s w i t h o u t s i g n i f i c a n t m o r t a l i t y . A t v a r i o u s t i m e s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , r a t s w e r e a n e s t h e t i z e d w i t h s o d i u m p e n t o b a r b i t a l ( 5 0 m g / k g , i p ) a n d a m i d l i n e l a p a r o t o m y w a s p e r f o r m e d . B l o o d w a s d r a w n i n t o s o d i u m c i t r a t e ( 0 . 3 8 % f i n a l c o n c e n t r a t i o n ) f r o m t h e d e s c e n d i n g a o r t a , a n d l i v e r s e c t i o n s w e r e f i x e d i n H i s t o c h o i c e ‘ ” f i x a t i v e f o r h i s t o l o g i c e v a l u a t i o n a n d i m m u n o c y t o c h e m i s t r y . T h i s t r e a t m e n t r e g i m e n r e s u l t e d i n n o m o r t a l i t y w i t h i n 6 h r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n . P l a t e l e t s w e r e c o u n t e d i n a h e m o c y t o m e t e r a f t e r e r y t h r o c y t e l y s i s a n d d i l u t i o n i n p l a t e l e t U n o p e t t e s . T o t a l l e u k o c y t e ( W B C ) c o u n t s w e r e p e r f o r m e d u s i n g a C o u l t e r c o u n t e r ( C o u l t e r E l e c t r o n i c s L i m i t e d , L u t o n , E n g l a n d ) . D i f f e r e n t i a l c o u n t s w e r e p e r f o r m e d o n b l o o d s m e a r s s t a i n e d w i t h b u f f e r e d , m o d i f i e d d i f f e r e n t i a l W r i g h t - G i e m s a s t a i n t o o b t a i n t h e f r a c t i o n o f n e u t r o p h i l s a n d l y m p h o c y t e s i n e a c h b l o o d s a m p l e . T h e t o t a l n u m b e r o f W B C s w a s m u l t i p l i e d b y t h i s f r a c t i o n t o o b t a i n a b s o l u t e n u m b e r s o f n e u t r o p h i l s a n d l y m p h o c y t e s . P l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n w a s d e t e r m i n e d f r o m t h e t h r o m b i n c l o t t i n g t i m e s o f d i l u t e d p l a s m a s a m p l e s m e a s u r e d i n a f i b r o m e t e r . P l a s m a a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e a c t i v i t y ( A L T ) w a s u s e d a s a m a r k e r o f h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l i n j u r y a n d w a s d e t e r m i n e d s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y u s i n g S i g m a K i t 5 9 . T o t a l p l a s m a b i l i r u b i n w a s u s e d a s a m a r k e r o f c h o l e s t a t i c l i v e r i n j u r y a n d w a s d e t e r m i n e d s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y u s i n g S i g m a K i t 6 0 5 - D . P l a s m a t u m o r n e c r o s i s f a c t o r a l p h a ( T N F - a ) w a s m e a s u r e d b y t h e l y s i s o f t h e f i b r o s a r c o m a c e l l l i n e , W E H I 1 6 4 , c l o n e 1 3 a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( H e w e t t e t 6 7 a l . , 1 9 9 3 ) . H u m a n r e c o m b i n a n t T N F - a w a s u s e d t o e s t a b l i s h a s t a n d a r d c u r v e ( R a n d D S y s t e m s , M i n n e a p o l i s , M N ) . 2 . C . 5 . N e u t r o p h i l i m m u n o c y t o c h e m i s t r y T o q u a n t i f y h e p a t i c n e u t r o p h i l n u m b e r s , a n i m m u n o c y t o c h e m i c a l s t a i n f o r n e u t r o p h i l s w a s e m p l o y e d . L i v e r s e c t i o n s w e r e c o l l e c t e d , p r e s e r v e d i n H i s t o c h o i c e ‘ ” f i x a t i v e , e m b e d d e d i n p a r a f f i n a n d s e c t i o n e d a t 5 m i c r o n s . P a r a f f i n w a s r e m o v e d f r o m t i s s u e s e c t i o n s w i t h x y l e n e p r i o r t o i m m u n o c y t o c h e m i c a l s t a i n i n g . T h e i m m u n o c y t o c h e m i c a l p r o c e d u r e w a s p e r f o r m e d o n a n a u t o m a t e d i m m u n o s t a i n e r ( L e i c a H i s t o s t a i n e r l g , M o d e l V 2 . 0 1 , A u s t r a l i a n B i o m e d i c a l C o r p o r a t i o n L t d . , M o u n t W a v e r l y , A u s t r a l i a ) u s i n g V e c t a s t a i n A B C l m m u n o h i s t o c h e m i c a l K i t ( V e c t o r , B u r l i n g a m e , C A ) . A l l i n c u b a t i o n s w e r e p e r f o r m e d a t r o o m t e m p e r a t u r e . A f t e r e a c h i n c u b a t i o n , s l i d e s w e r e r i n s e d t w i c e w i t h T r i s - p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e s o l u t i o n ( 0 . 7 5 % T r i z m a - H C I , 0 . 9 % N a C l , p H 7 . 6 ) . T o e l i m i n a t e n o n s p e c i f i c b i n d i n g , t i s s u e s e c t i o n s w e r e i n c u b a t e d w i t h n o r m a l g o a t s e r u m ( 3 0 m i n u t e s ) , a v i d i n b l o c k i n g r e a g e n t ( 1 5 m i n u t e s ) a n d b i o t i n b l o c k i n g r e a g e n t ( 1 5 m i n u t e s ) a s d e s c r i b e d i n t h e V e c t a s t a i n A B C l m m u n o c y t o c h e m i c a l k i t . S e c t i o n s w e r e t h e n i n c u b a t e d w i t h r a b b i t a n t i - r a t n e u t r o p h i l p o l y c l o n a l i m m u n o g l o b u l i n f o r 1 h o u r . T h i s i m m u n o g l o b u l i n w a s i s o l a t e d f r o m t h e s e r u m o f r a b b i t s i m m u n i z e d w i t h r a t n e u t r o p h i l s a s d e s c r i b e d b y H e w e t t a n d R o t h ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 2 ) . T o m a x i m i z e n e u t r o p h i l s t a i n i n g , a n a v i d i n / b i o t i n l a b e l i n g p r o c e d u r e w a s u s e d . T i s s u e s e c t i o n s w e r e i n c u b a t e d w i t h b i o t i n y l a t e d g o a t a n t i - r a b b i t l g G ( 2 0 6 8 m i n u t e s ) . I n c u b a t i o n w i t h a n a v i d i n - c o n j u g a t e d a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ( 3 0 m i n u t e s ) a n d V e c t o r R e d s u b s t r a t e ( 8 m i n u t e s ) r e s u l t e d i n r e d - s t a i n i n g o f n e u t r o p h i l s w i t h i n t h e l i v e r s e c t i o n s . T i s s u e s w e r e t h e n c o u n t e r s t a i n e d w i t h L e r n e r 2 H e m a t o x y l i n f o r 2 m i n u t e s . T h e n u m b e r s o f s i n u s o i d a l h e p a t i c n e u t r o p h i l s w e r e d e t e r m i n e d w i t h m i c r o s c o p y b y e n u m e r a t i n g n e u t r o p h i l s i n 2 0 f i e l d s s p a c e d e q u a l l y t h r o u g h o u t t h e l e n g t h o f e a c h t i s s u e s e c t i o n a n d w a s e x p r e s s e d a s a v e r a g e c e l l s / m m 2 o f l i v e r . 2 . C . 6 . P l a t e l e t S e q u e s t r a t i o n S t u d i e s T o a s s e s s h e p a t i c p l a t e l e t s e q u e s t r a t i o n , p l a t e l e t s w e r e r a d i o l a b e l e d w i t h m i n d i u m - o x i n e . B r i e f l y , b l o o d w a s c o l l e c t e d b y c a r d i a c p u n c t u r e f r o m d o n o r , f e m a l e , S p r a g u e - D a w l e y r a t s i n 3 . 8 % s o d i u m c i t r a t e ( 9 : 1 , b l o o d z s o d i u m c i t r a t e ) . P l a t e l e t r i c h p l a s m a ( P R P ) w a s i s o l a t e d b y s p i n n i n g w h o l e b l o o d f o r 1 5 m i n a t 2 5 0 9 i n a c e n t r i f u g e . T h e P R P w a s s p u n a t 8 0 0 9 f o r 2 0 m i n t o i s o l a t e p l a t e l e t s f r o m p l a t e l e t p o o r p l a s m a ( P P P ) . T h e p l a t e l e t p e l l e t w a s w a s h e d a n d r e s u s p e n d e d i n 2 m l T y r o d e ’ s b u f f e r ( p H 6 . 5 ) c o n t a i n i n g 1 3 7 m M N a C I , 2 . 6 m M K C I , 1 1 . 9 m M N a H C O , , 0 . 3 2 m M N a H , P O , , 2 m M M g C l , , 5 . 6 m M D - g l u c o s e , 2 5 , 0 0 0 U / L s o d i u m h e p a r i n a n d 3 0 0 n g / m l p r o s t a g l a n d i n E 1 . P l a t e l e t s w e r e l a b e l l e d w i t h 2 0 0 p C i 1 1 1 l n - o x i n e f o r 1 0 m i n a t 3 7 ° C . A f t e r l a b e l e d p l a t e l e t s w e r e p e l l e t e d a t 4 0 0 9 f o r 2 0 m i n , t h e s u p e r n a t a n t w a s r e m o v e d a n d p l a t e l e t s w e r e w a s h e d a n d r e s u s p e n d e d i n 2 m l T y r o d e ' s b u f f e r . T h i s c e n t r i f u g a t i o n a n d w a s h w e r e r e p e a t e d . F i n a l l y , p l a t e l e t s w e r e r e s u s p e n d e d i n 2 m l P P P . F r o m t h i s s u s p e n s i o n , t h e y w e r e e n u m e r a t e d i n a h e m a c y t o m e t e r a s d e s c r i b e d a b o v e . 6 9 T h e f i n a l v o l u m e o f t h e i n j e c t e d 1 1 1 l n - o x i n e l a b e l e d p l a t e l e t s o l u t i o n w a s a d j u s t e d w i t h P P P s u c h t h a t e a c h r a t r e c e i v e d 0 . 3 m l s o l u t i o n c o n t a i n i n g 3 - 5 x 1 0 ° r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s . A n a l i q u o t o f t h i s i n j e c t i o n s o l u t i o n w a s r e m o v e d f o r d e t e r m i n a t i o n o f i n j e c t e d r a d i o a c t i v i t y . T h i s p r o c e d u r e h a s b e e n u t i l i z e d e x t e n s i v e l y a n d h a s b e e n s h o w n n o t t o i n j u r e p l a t e l e t s , a s a s s e s s e d b y t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y a n d p l a t e l e t a g g r e g o m e t r y ( W h i t e e t a l . , 1 9 8 9 ) . I n t h e h e p a t i c p l a t e l e t s e q u e s t r a t i o n s t u d i e s , e a c h r a t r e c e i v e d a s i n g l e b o l u s i n j e c t i o n i n t o t h e t a i l v e i n o f 0 . 3 m l m I n - o x i n e - l a b e l e d p l a t e l e t s s u s p e n d e d i n p l a s m a . T w o h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s , a n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r S A L v e h i c l e . A t v a r i o u s t i m e s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S o r S A L v e h i c l e , a n i m a l s w e r e a n e s t h e t i z e d a s d e s c r i b e d a b o v e . A b l o o d s a m p l e w a s c o l l e c t e d a n d t h e l i v e r , s p l e e n , l u n g s a n d l e f t k i d n e y w e r e e x c i s e d . E a c h o r g a n w a s w e i g h e d a n d t h e r a d i o a c t i v i t y o f a f r a c t i o n o f t h e o r g a n ( l i v e r ) o r t h e e n t i r e o r g a n ( k i d n e y , s p l e e n , a n d l u n g s ) w a s m e a s u r e d i n a g a m m a c o u n t e r ( T M A n a l y t i c G a m m a T r a c 1 1 9 3 , T M A n a l y t i c , E l k G r o v e V i l l a g e , I L ) . T o t a l o r g a n r a d i o a c t i v i t y w a s c a l c u l a t e d . N o c o r r e c t i o n f o r b l o o d c o n t e n t w a s m a d e w h e n c a l c u l a t i n g o r g a n r a d i o a c t i v i t y . B l o o d ( 1 m l ) a n d p l a t e l e t p o o r p l a s m a ( 0 . 2 m l ) s a m p l e s w e r e e v a l u a t e d f o r r a d i o a c t i v i t y . D a t a a r e e x p r e s s e d a s p e r c e n t o f t o t a l i n j e c t e d r a d i o a c t i v i t y i n i n d i v i d u a l o r g a n s o r p e r m l b l o o d o r p l a s m a . 7 0 2 . C . 7 . P l a t e l e t d e p l e t i o n s t u d i e s T o a s s e s s t h e r o l e o f p l a t e l e t s i n L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y , a n t i - r a t p l a t e l e t s e r u m ( A P S , 0 . 5 m l / r a t , i p ) o r c o n t r o l s e r u m ( C S ) w a s a d m i n i s t e r e d t o r a t s 1 2 h r s p r i o r t o t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S . T h i s t r e a t m e n t r e g i m e n r e d u c e d b l o o d p l a t e l e t n u m b e r s t o 1 0 - 2 0 % o f n o r m a l t h r o u g h o u t t h e d u r a t i o n o f t h e s t u d y ( d a t a n o t s h o w n , ( W h i t e e t a l . , 1 9 8 9 ) ) . S i x h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i v , b o l u s ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e , a n i m a l s w e r e a n e s t h e t i z e d a s d e s c r i b e d a b o v e , a n d c i t r a t e d b l o o d a n d l i v e r s e c t i o n s w e r e c o l l e c t e d . B l o o d l e u k o c y t e s a n d p l a t e l e t s , A L T a c t i v i t y a n d b i l i r u b i n c o n c e n t r a t i o n i n p l a s m a a n d p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n w e r e d e t e r m i n e d a s d e s c r i b e d a b o v e . 2 . C . 8 . M o r p h o m e t r i c a n a l y s i s . I n t h e p l a t e l e t d e p l e t i o n s t u d i e s , s a m p l e s o f l i v e r w e r e f i x e d i n 1 0 % n e u t r a l b u f f e r e d f o r m a l i n a n d p r o c e s s e d f o r h i s t o p a t h o l o g i c e v a l u a t i o n . P a r a f f i n - e m b e d d e d s e c t i o n s w e r e c u t a t 6 p m a n d s t a i n e d w i t h h e m a t o x y l i n a n d e o s i n . S l i d e s w e r e c o d e d , r a n d o m i z e d , a n d e v a l u a t e d b y a p a t h o l o g i s t . T h e s e v e r i t y o f e a c h l e s i o n w a s g r a d e d a s f o l l o w s : n o l e s i o n ( 0 ) , m i l d n e c r o s i s ( 1 ) , m o d e r a t e n e c r o s i s ( 2 ) , m a r k e d n e c r o s i s w i t h m i l d h e m o r r h a g e ( 3 ) , s e v e r e n e c r o s i s w i t h m o d e r a t e h e m o r r h a g e ( 4 ) a n d s e v e r e n e c r o s i s w i t h m a r k e d h e m o r r h a g e ( 5 ) . M o r p h o m e t r i c a s s e s s m e n t w a s p e r f o r m e d o n c o d e d l i v e r s e c t i o n s u s i n g a J a n d e l V i d e o A n a l y s i s S y s t e m ( J a n d e l S c i e n t i f i c , C o r t e M a d e r a , C A ) a t t a c h e d t o a N i k o n M i c r o p h o t - F X m i c r o s c o p e ( N i k o n I n s t r u m e n t G r o u p , O a k P a r k , I L ) . 7 1 T h e a r e a o f h e p a t i c t i s s u e e x a m i n e d , t h e a r e a o f i n d i v i d u a l l e s i o n s , t h e n u m b e r o f s e g m e n t e d n e u t r o p h i l s p e r l e s i o n a n d t h e n u m b e r o f n e u t r o p h i l s p e r a r e a o f t i s s u e w e r e d e t e r m i n e d . T h e a r e a o f l i v e r w i t h l e s i o n s w a s c a l c u l a t e d a n d e x p r e s s e d a s p e r c e n t a g e o f l i v e r a f f e c t e d , a n d t h e n u m b e r o f l e s i o n s / a r e a o f l i v e r w a s d e t e r m i n e d . T h e i n j u r y i n d e x w a s d e f i n e d a s t h e p r o d u c t o f t h e m e a n l e s i o n a r e a ( c m ’ ) a n d t h e m e a n l e s i o n s e v e r i t y s c o r e . T h e n u m b e r o f n e u t r o p h i l s p e r l e s i o n w a s d e t e r m i n e d b y d i r e c t m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n o f t i s s u e a n d w a s e x p r e s s e d a s c e l l s / l e s i o n . T h e n u m b e r o f n e u t r o p h i l s / a r e a o f l e s i o n w a s c a l c u l a t e d . T h e n u m b e r o f n e u t r o p h i l s / a r e a o f l i v e r w a s d e t e r m i n e d b y e n u m e r a t i n g n e u t r o p h i l s i n 2 0 f i e l d s s p a c e d e q u a l l y t h r o u g h o u t t h e l e n g t h o f e a c h t i s s u e s e c t i o n a n d w a s e x p r e s s e d a s c e l l s / m m 2 o f l i v e r . 2 . C . 9 . T N F - a a c t i v i t y . T o d e t e r m i n e t h e e f f e c t o f p l a t e l e t d e p l e t i o n o n p l a s m a T N F - a a c t i v i t y , a n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h A P S o r C S 1 2 h r p r i o r t o b o l u s a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r i t s S A L v e h i c l e ( a s d e s c r i b e d a b o v e ) . O n e a n d a h a l f h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S , a n i m a l s w e r e a n e s t h e t i z e d , a n d p l a s m a s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d a n d f r o z e n a t - 2 0 ° C f o r l a t e r m e a s u r e m e n t o f p l a s m a T N F - a a c t i v i t y a s d e s c r i b e d a b o v e . 2 . C . 1 0 . D a t a a n a l y s i s A o n e - w a y , c o m p l e t e l y r a n d o m a n a l y s i s o f v a r i a n c e ( A N O V A ) w a s u s e d t o a n a l y z e t i m e - d e p e n d e n t a l t e r a t i o n s i n p l a s m a A L T a n d T N F - a a c t i v i t i e s a n d 7 2 f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n , b l o o d p l a t e l e t n u m b e r s , h e p a t i c n e u t r o p h i l n u m b e r s a n d h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n . D a t a w i t h n o n h o m o g e n e o u s v a r i a n c e s w e r e s q u a r e r o o t - o r l o g - t r a n s f o r m e d p r i o r t o a n a l y s i s . C o m p a r i s o n s a m o n g g r o u p s w e r e p e r f o r m e d u s i n g T u k e y ’ s o m e g a t e s t ( S t e e l e t a l . , 1 9 8 0 ) . A K r u s k a l - W a l l i s o n e - w a y A N O V A o n r a n k s w a s u s e d t o a n a l y z e p l a s m a b i l i r u b i n c o n c e n t r a t i o n s a n d w h i t e c e l l n u m b e r s , a s v a r i a n c e s w e r e n o n h o m o g e n e o u s . I n t h e p l a t e l e t d e p l e t i o n s t u d i e s , a 2 X 2 m u l t i f a c t o r i a l , c o m p l e t e l y r a n d o m A N O V A w a s u s e d t o a n a l y z e p l a s m a A L T a c t i v i t y , p l a s m a f i b r i n o g e n a n d T N F - a c o n c e n t r a t i o n s , a n d b l o o d p l a t e l e t , t o t a l W B C a n d n e u t r o p h i l n u m b e r s . D a t a w i t h n o n h o m o g e n e o u s v a r i a n c e s w e r e s q u a r e r o o t - o r l o g - t r a n s f o r m e d p r i o r t o a n a l y s i s . C o m p a r i s o n s b e t w e e n p a i r s o f t r e a t m e n t g r o u p s w e r e p e r f o r m e d w i t h T u k e y ’ s o m e g a t e s t f o r p l a s m a A L T a n d T N F a c t i v i t y , f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n a n d b l o o d c e l l n u m b e r s . C o m p a r i s o n s o f p l a s m a b i l i r u b i n c o n c e n t r a t i o n s w e r e p e r f o r m e d w i t h t h e K r u s k a l - W a l l i s r a n k s u m s t e s t , a s t h e v a r i a n c e s w e r e n o t h o m o g e n e o u s ( S t e e l e t a l . , 1 9 8 0 ) . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : I : S E M . M o r p h o m e t r i c d a t a w e r e a n a l y z e d u s i n g t h e K r u s k a l - W a l l i s n o n p a r a m e t r i c t e s t . C o m p a r i s o n s b e t w e e n p a i r s o f t r e a t m e n t g r o u p s w e r e p e r f o r m e d u s i n g t h e r a n k s u m t e s t ( S t e e l e t a l . , 1 9 8 0 ) . T h e c r i t e r i o n f o r s i g n i f i c a n c e w a s p s 0 . 0 5 f o r a l l s t u d i e s . 7 3 2 . D . R e s u l t s 2 . D . 1 . T i m e c o u r s e o f L P S - i n d u c e d a l t e r a t i o n s i n b l o o d a n d l i v e r . D e c r e a s e s i n p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n a n d b l o o d p l a t e l e t n u m b e r s i n v i v a c a n r e f l e c t a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d p l a t e l e t a c t i v a t i o n , r e s p e c t i v e l y . F i g u r e 2 . 1 s h o w s t h e d e v e l o p m e n t o f e f f e c t s o f L P S a d m i n i s t r a t i o n o n p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n a n d b l o o d p l a t e l e t n u m b e r s r e l a t i v e t o e v e n t s o c c u r r i n g i n l i v e r s o f t h e s a m e a n i m a l s . A p r o n o u n c e d d e c r e a s e i n b o t h c i r c u l a t i n g f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n a n d b l o o d p l a t e l e t n u m b e r s b e g a n b e t w e e n 2 a n d 4 h r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n . P l a s m a T N F - o a c t i v i t y i n c r e a s e d w i t h i n 1 h r a n d p e a k e d a b o u t 1 . 5 h r s a f t e r L P S i n j e c t i o n ( F i g u r e 2 . 1 ) . T h i s t i m e c o u r s e i s c o n s i s t e n t w i t h p r e v i o u s r e p o r t s o n p l a s m a T N F - a l e v e l s a f t e r L P S e x p o s u r e ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 3 ) . T h e s e c h a n g e s o c c u r r e d p r i o r t o t h e o n s e t o f l i v e r i n j u r y , a s e s t i m a t e d b y e l e v a t i o n s i n p l a s m a A L T a c t i v i t y . T h i s m a r k e r o f l i v e r i n j u r y w a s m a r g i n a l l y e l e v a t e d a t 4 h o u r s a n d m o r e m a r k e d l y e l e v a t e d b y 6 h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n . T h e i n c r e a s e d p l a s m a A L T a c t i v i t y w a s a s s o c i a t e d w i t h h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l n e c r o s i s a s r e v e a l e d b y h i s t o p a t h o l o g i c e v a l u a t i o n ( s e e b e l o w ) . F i g u r e 2 . 1 a l s o s h o w s t h e p r o n o u n c e d h e p a t i c n e u t r o p h i l a c c u m u l a t i o n t h a t b e g a n w i t h i n 1 5 m i n a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n a n d c o n t i n u e d u n t i l 3 h o u r s . T h e n u m b e r s o f n e u t r o p h i l s w i t h i n t h e l i v e r s i n u s o i d s w e r e n o t d i f f e r e n t a t 3 7 4 a n d 6 h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n . B l o o d n e u t r o p h i l s a n d l y m p h o c y t e s d e c r e a s e d r a p i d l y a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n ( F i g u r e 2 . 2 ) . A n i m a l s r e m a i n e d I y m p h o p e n i c t h r o u g h o u t t h e 6 h r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n . B y c o n t r a s t , b l o o d n e u t r o p h i l n u m b e r s b e g a n t o i n c r e a s e b y 2 h r s a n d r e t u r n e d t o c o n t r o l l e v e l s w i t h i n 6 h r a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n . T h e i n c r e a s e i n b l o o d n e u t r o p h i l s w a s c h a r a c t e r i z e d b y i n c r e a s e s i n i m m a t u r e , b a n d n e u t r o p h i l s a s w e l l a s m a t u r e , s e g m e n t e d n e u t r o p h i l s ( a r e g e n e r a t i v e l e f t s h i f t , F i g u r e 2 . 2 ) . T o a s s e s s h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n , 1 1 1 I n - o x i n e - l a b e l e d p l a t e l e t s w e r e u s e d t o t r a c e p l a t e l e t s i n v i v a a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n . R a d i o a c t i v i t y a c c u m u l a t e d i n t h e l i v e r w i t h i n 1 h r a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n ( F i g u r e 2 . 1 ) . H e p a t i c r a d i o a c t i v i t y c o n t i n u a l l y r o s e t h r o u g h o u t t h e 6 h r a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n . L P S a d m i n i s t r a t i o n d i d n o t s i g n i f i c a n t l y a l t e r 1 1 1 I n a c c u m u l a t i o n i n t h e s p l e e n , k i d n e y s o r l u n g s ( F i g u r e 2 . 3 ) a s c o m p a r e d t o S A L - t r e a t e d r a t s . H o w e v e r , s i m i l a r t o s t u d i e s w i t h b l o o d p l a t e l e t n u m b e r s ( F i g u r e 2 . 1 ) , " ‘ I n - o x i n e - l a b e l e d p l a t e l e t s i n b l o o d d e c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y 6 h r a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n ( F i g u r e 2 . 3 ) . L e s s t h a n 1 % o f i n j e c t e d r a d i o a c t i v i t y w a s d e t e c t e d i n p l a s m a a n d l e s s t h a n 0 . 0 0 1 % o f t o t a l i n j e c t e d r a d i o a c t i v i t y w a s d e t e c t e d i n t h e b i l e f r o m e i t h e r S A L o r L P S t r e a t e d a n i m a l s ( d a t a n o t s h o w n ) . 2 . D . 2 . V e r i f i c a t i o n o f p l a t e l e t d e p l e t i o n S i n c e b l o o d p l a t e l e t n u m b e r s d e c r e a s e d p r i o r t o t h e o n s e t o f l i v e r i n j u r y i n t h i s m o d e l a n d s i n c e m l n - o x i n e - l a b e l e d p l a t e l e t s a c c u m u l a t e d i n t h e l i v e r 7 5 a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n ( F i g u r e 2 . 1 ) , p l a t e l e t d e p l e t i o n s t u d i e s w e r e c o n d u c t e d t o t e s t t h e h y p o t h e s i s t h a t p l a t e l e t s m a y b e i m p o r t a n t i n t h e m a n i f e s t a t i o n o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . T h e a d m i n i s t r a t i o n o f a n a n t i - r a t p l a t e l e t s e r u m ( A P S ) 1 2 h r p r i o r t o t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S r e d u c e d b l o o d p l a t e l e t n u m b e r s t o l e s s t h a n 2 0 % o f c o n t r o l ( F i g u r e 2 . 4 ) . C o n s i s t e n t w i t h t h e r e s u l t s i n F i g u r e 2 . 1 , b l o o d p l a t e l e t n u m b e r s w e r e s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d 6 h r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S t o C S p r e t r e a t e d r a t s . 2 . D . 3 . T h e e f f e c t o f p l a t e l e t d e p l e t i o n o n l i v e r i n j u r y P l a t e l e t d e p l e t i o n w a s a s s o c i a t e d w i t h a m a r k e d a t t e n u a t i o n o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y , a s m e a s u r e d b y e l e v a t i o n s i n p l a s m a A L T a c t i v i t y a n d b i l i r u b i n c o n c e n t r a t i o n ( F i g u r e 2 . 5 ) a n d b y m o r p h o m e t r i c a n a l y s i s o f l i v e r s e c t i o n s ( F i g u r e 2 . 6 , T a b l e 2 . 1 ) . L i v e r s f r o m S A L - t r e a t e d c o n t r o l s p r e t r e a t e d w i t h C S o r A P S h a d n o e v i d e n c e o f i n f l a m m a t i o n ( F i g u r e 2 . 6 ) . T h e n u m b e r o f n e u t r o p h i l s p e r a r e a o f l i v e r i n S A L - t r e a t e d r a t s w a s q u i t e s m a l l a n d w a s u n a f f e c t e d b y A P S t r e a t m e n t ( 1 : t : 0 / m m 2 f o r A P S p r e t r e a t e d r a t s a n d 2 : t 1 / m m 2 f o r C S p r e t r e a t e d r a t s ) . S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , l i v e r s f r o m C S p r e t r e a t e d r a t s h a d m u l t i f o c a l , a c u t e , m o d e r a t e t o m a r k e d h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s ( n e u t r o p h i l i c h e p a t i t i s ) ( F i g u r e 2 . 6 ) . T h e h e p a t i c s i n u s o i d s c o n t a i n e d m a n y n e u t r o p h i l s ( T a b l e 2 . 1 ) , f e w p l u m p K u p f f e r c e l l s a n d s m a l l a m o u n t s o f a n e o s i n o p h i l i c , p r o t e i n a c e o u s p r e c i p i t a t e . T h e r e w e r e m u l t i f o c a l , i r r e g u l a r l y s h a p e d a r e a s o f m i d z o n a l h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s . T h e s e l e s i o n s w e r e 7 6 c h a r a c t e r i z e d b y h y p e r e o s i n o p h i l i c p a r e n c h y m a l c e l l s w i t h s m a l l , p y k n o t i c n u c l e i o r p a l e p a r e n c h y m a l c e l l s w i t h i n d i s t i n c t o r a b s e n t n u c l e i a n d i n d i s t i n c t c y t o p l a s m i c b o r d e r s . T h e n e c r o t i c f o c i c o n t a i n e d a m o d e r a t e n u m b e r o f d e g e n e r a t e n e u t r o p h i l s , a n d s o m e h a d s m a l l a m o u n t s o f h e m o r r h a g e . T h e n u m b e r o f n e u t r o p h i l s i n l e s i o n s w a s g r e a t e r t h a n t h a t i n u n a f f e c t e d t i s s u e ( T a b l e 2 . 1 ) . T h e r e w e r e a l s o f e w s i n g l e n e c r o t i c c e l l s s c a t t e r e d w i t h i n t h e l i v e r s e c t i o n s . S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , l i v e r s f r o m r a t s t h a t w e r e p l a t e l e t d e p l e t e d w i t h A P S h a d l e s i o n s t h a t w e r e s i m i l a r i n c h a r a c t e r b u t m u c h f e w e r a n d s m a l l e r c o m p a r e d t o l i v e r s f r o m r a t s p r e t r e a t e d w i t h C S ( F i g u r e 2 . 6 , T a b l e 2 . 1 ) . H o w e v e r , t h e r e w a s n o d i f f e r e n c e i n t h e s e v e r i t y o f l e s i o n s o r t h e n u m b e r o f n e u t r o p h i l s o b s e r v e d i n e a c h l e s i o n , p e r a r e a o f t h e l e s i o n , o r p e r u n i t o f a r e a l i v e r b e t w e e n L P S - t r e a t e d r a t s p r e t r e a t e d w i t h A P S a n d t h o s e t r e a t e d w i t h C S . 2 . D . 4 . E f f e c t o f p l a t e l e t d e p l e t i o n o n t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m P r e t r e a t m e n t w i t h A P S h a d n o e f f e c t o n p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n i n S A L - t r e a t e d a n i m a l s , h o w e v e r p l a t e l e t d e p l e t i o n p r e v e n t e d t h e L P S - i n d u c e d d e c r e a s e i n p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n ( F i g u r e 2 . 7 ) . 7 7 2 . D . 5 . E f f e c t o f p l a t e l e t d e p l e t i o n o n p l a s m a T N F a c t i v i t y I n a n i m a l s p r e t r e a t e d w i t h e i t h e r C S o r A P S , p l a s m a T N F - a a c t i v i t y w a s b e l o w t h e l e v e l o f d e t e c t i o n ( l e s s t h a n 1 n g / m l ) 1 . 5 h r a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f S A L v e h i c l e ( F i g u r e 2 . 8 ) . P l a s m a T N F - a a c t i v i t y w a s e l e v a t e d 1 . 5 h r a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S i n C S p r e t r e a t e d r a t s . I n p l a t e l e t d e p l e t e d r a t s , t h i s e l e v a t i o n i n p l a s m a T N F - o w a s e v e n m o r e p r o n o u n c e d . 2 . D . 6 . E f f e c t o f p l a t e l e t d e p l e t i o n o n t o t a l W B C c o u n t s S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , a n i m a l s p r e t r e a t e d w i t h e i t h e r C S o r A P S h a d s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d t o t a l W B C c o u n t s , w h i c h w a s d u e t o a r e d u c t i o n i n t h e n u m b e r s o f l y m p h o c y t e s ( F i g u r e 2 . 9 ) . B l o o d n e u t r o p h i l n u m b e r s w e r e n o t s i g n i f i c a n t l y a l t e r e d 6 h r a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n . T h i s f i n d i n g i s c o n s i s t e n t w i t h t i m e c o u r s e s t u d i e s ( F i g u r e 2 . 2 ) , w h i c h s h o w e d t h a t b l o o d n e u t r o p h i l n u m b e r s r e t u r n t o n o r m a l b y 6 h r a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n . 7 8 F i g u r e 2 . 1 . T e m p o r a l e f f e c t s o f L P S a d m i n i s t r a t i o n o n b l o o d ( t o p ) a n d l i v e r ( b o t t o m ) m a r k e r s . L P S ( 4 m g / k g ) o r S A L v e h i c l e w a s a d m i n i s t e r e d i v a t 0 h r . S i n c e v a l u e s f r o m S A L v e h i c l e - t r e a t e d a n i m a l s d i d n o t c h a n g e s i g n i f i c a n t l y w i t h t i m e , t h e s e w e r e c o m b i n e d a n d e x p r e s s e d a s a t i m e - z e r o c o n t r o l . S a m p l e s w e r e c o l l e c t e d a n d e v a l u a t e d a s d e s c r i b e d i n " M e t h o d s . " R e s u l t s a r e n o r m a l i z e d t o 1 . 0 , w h e r e a v a l u e o f 1 . 0 ( : t w e i g h t e d s t a n d a r d e r r o r o f d i f f e r e n c e s ) c o r r e s p o n d e d t o t h e f o l l o w i n g : 1 6 0 : I : 9 . 8 m g / d l f o r p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n ; 8 6 1 , 0 0 0 : 1 : 7 1 , 0 0 0 c e l l s / p l b l o o d f o r p l a t e l e t s ; 9 5 . 6 : 1 : 1 3 . 0 n g / m l f o r p l a s m a T N F c o n c e n t r a t i o n ; 3 8 8 : I : 3 0 c e l l s / m m ’ f o r n e u t r o p h i l s p e r a r e a l i v e r ; 5 6 . 8 : t 3 . 7 p e r c e n t o f i n j e c t e d r a d i o a c t i v i t y f o r h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n a n d 1 2 5 3 : 1 : 1 0 6 . 2 U / L f o r p l a s m a A L T . N = 6 - 1 4 f o r e a c h g r o u p . F i l l e d c i r c l e d e n o t e s s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m v e h i c l e c o n t r o l ( L a . 0 h r ) . 7 9 ’ m ‘ o Q 3 1 4 ) . ' \ - - - - B l o o d p l a t e l e t s g o = ~ \ ‘ P l a s m a f i b r i n o g e n \ 8 7 ' " a - - - - P l a s m a T N F . 0 8 I ‘ \ 0 ‘ r \ \ . E I B ' ‘ ~ ° ~ E 6 ‘ 0 ’ ‘ \ 3 O “ . \ . ~ 5 4 - r , ‘ . o 7 ‘ - . _ 2 l l “ \ . a , I \ f . 2 - I ’ ‘ \ O \ E C ’ 0 O 0 " " " " " " " O U > . \ , " ’ o ' I ' l I ' T I r 1 . 9 o 1 2 3 5 6 ( D A 1 N e u t r o p h i l s i n l i v e r 3 _ - - - - P l a t e l e t s i n l i v e r . , I , 3 " 6 > ' o . I ) . E ‘ 5 . E L o 5 . U ) L o x L . o E L . g l 3 6 T i m e a f t e r L P S I n j e c t i o n ( h o u r s ) F i g u r e 2 . 1 8 0 F i g u r e 2 . 2 . E f f e c t s o f L P S a d m i n i s t r a t i o n o n c i r c u l a t i n g w h i t e b l o o d c e l l s . L P S ( 4 m g / k g ) o r i t s S A L v e h i c l e w a s a d m i n i s t e r e d i v a t 0 h r . C e l l s i n b l o o d w e r e e n u m e r a t e d a s d e s c r i b e d i n " M e t h o d s . ” S i n c e v a l u e s f o r S A L v e h i c l e - t r e a t e d r a t s d i d n o t c h a n g e s i g n i f i c a n t l y w i t h t i m e , t h e s e w e r e c o m b i n e d a n d e x p r e s s e d a s v e h i c l e c o n t r o l ( i . e . 0 h r ) . ( A ) T o t a l w h i t e b l o o d c e l l n u m b e r s ( W B C s ) , n e u t r o p h i l s a n d l y m p h o c y t e s . 3 , t o t a l W B C s a r e s i g n i f c a n t l y d i f f e r e n t f r o m S A L v e h i c l e ( i . e . , 0 h r ) b , l y m p h o c y t e s a r e s i g n i f c a n t l y d i f f e r e n t f r o m S A L v e h i c l e ( i . e . , 0 h r ) c , n e u t r o p h i l s a r e s i g n i f c a n t l y d i f f e r e n t f r o m S A L v e h i c l e ( i . e . , 0 h r ) ( 8 ) T o t a l b l o o d n e u t r o p h i l s , s e g m e n t e d n e u t r o p h i l s a n d b a n d e d n e u t r o p h i l s . a , s e g m e n t e d n e u t r o p h i l s a r e s i g n i f c a n t l y d i f f e r e n t f r o m S A L v e h i c l e ( i . e . , 0 h r ) b , b a n d n e u t r o p h i l s a r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m S A L v e h i c l e ( i . e . , 0 h r ) 0 , t o t a l n e u t r o p h i l s a r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m S A L v e h i c l e ( i . e . , 0 h r ) R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : I : S E M , N = 6 - 1 4 . ) l p / s l l e c ( s l l e C d o o l B e t i h W ) l p / s l l e c ( s l i h p o r t u e N A n o o n 1 1 2 0 0 0 - ' ’ 4 o o o , 8 1 0 T o t a l W B C : Q N e u t r o p h i l s D L y m p h o c y t e s 5 0 0 0 - 4 0 0 0 3 0 0 0 2 0 0 0 A 1 T i m e a f t e r L P S l n j e c t l o n ( h o u r s ) 0 T o t a l N e u t r o p h i l s Q S e g m e n t e d N e u t r o p h i l s V B a n d N e u t r o p h i l s d U I I T I 1 2 3 4 5 6 T i m e a f t e r L P S i n j e c t i o n ( h o u r s ) F I G U R E 2 . 2 8 2 F i g u r e 2 . 3 . T h e e f f e c t o f L P S o n b l o o d a n d o r g a n p l a t e l e t d i s t r i b u t i o n . P l a t e l e t a c c u m u l a t i o n w a s m e a s u r e d a s c h a n g e s i n t i s s u e r a d i o a c t i v i t y a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f 1 1 1 i n d i u m - o x i n e - l a b e l e d p l a t e l e t s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s t h e p e r c e n t o f t o t a l i n j e c t e d r a d i o a c t i v i t y p r e s e n t i n 1 m l b l o o d ( A ) , s p l e e n ( B ) , k i d n e y s ( C ) , a n d l u n g s ( D ) . a s d e s c r i b e d i n " M e t h o d s . " R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n i S E M , N = 6 - 8 . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m S A L v e h i c l e ( i . e . , 0 h r ) . n e e l p s n I m p c d e t c e j n I f o t n e c r e P d o o l b l m r e p m p c d e t c e j n I f o t n e c r e P s y e n d i k n i m p c d e t c e j n I f o t n e c r e P T i m e a f t e r L P S i n j e c t i o n ( h o u r s ) T i m e a f t e r L P S i n j e c t i o n ( h o u r s ) 8 3 P e r c e n t o f i n j e c t e d c p m i n l u n g F I G U R E 2 . 3 1 6 - 1 4 - 1 0 1 h T i m e a f t e r L P S i n j e c t i o n ( h o u r s ) T i m e a f t e r L P S i n j e c t i o n ( h o u r s ) 8 4 F i g u r e 2 . 4 . E f f e c t s o f p l a t e l e t d e p l e t i o n a n d L P S o n b l o o d p l a t e l e t n u m b e r s . R a t s w e r e p r e t r e a t e d w i t h e i t h e r c o n t r o l s e r u m ( C S ) o r a n t i - p l a t e l e t s e r u m ( A P S ) 1 2 h o u r s b e f o r e t h e i v a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g ) o r S A L v e h i c l e . 6 h r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S o r S A L , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r p l a t e l e t e n u m e r a t i o n a s d e s c r i b e d i n ” M e t h o d s " . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 8 . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e C S g r o u p . b , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e S A L g r o u p . 2 . 1 } . . . 8 n o : 3 2 3 2 ; 3 2 m i : fi a 2 § . 8 5 L P S S A L F I G U R E 2 . 4 8 6 F i g u r e 2 . 5 . T h e e f f e c t o f p l a t e l e t d e p l e t i o n o n L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . A n i m a l s w e r e p r e t r e a t e d e i t h e r w i t h c o n t r o l s e r u m ( C S ) o r a n t i - p l a t e l e t s e r u m ( A P S ) 1 2 h o u r s b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r s a l i n e v e h i c l e . 6 h r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S o r S A L , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f p l a s m a a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e ( A L T ) a c t i v i t y ( A ) a n d t o t a l p l a s m a b i l i r u b i n ( B ) , a s d e s c r i b e d i n " M e t h o d s " . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : t S E M , N = 8 . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e S A L g r o u p . b , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e C S g r o u p . ) L / U ( y t i v i t c A T L A a m s a L P m N o 5 n . i ) l d / g m ( n i b u r i - o ‘ l i B a m s a : 0 u l P l a t o T : r @ ; t W F I G U R E 2 . 5 S A L L P S a . L C S A P S S A L L P S 1 5 0 0 1 1 0 0 0 - s a o - 8 7 8 8 F i g u r e 2 . 6 . P h o t o m i c r o g r a p h s o f s e c t i o n s o f l i v e r f r o m r a t s t r e a t e d w i t h C S / L P S ( t o p ) a n d A P S / L P S ( b o t t o m ) . T o p : L i v e r s f r o m C S / L P S t r e a t e d r a t s h a d l e s i o n s w e r e c h a r a c t e r i z e d b y m u l t i f o c a l , l a r g e , i r r e g u l a r l y s h a p e d f o c i o f m i d z o n a l h e p a t o t c e l l u l a r n e c r o s i s ( a r e a b e t w e e n a r r o w s ) w i t h s i n u s o i d a l n e u t r o p h i l i a . B o t t o m : I n t h e l i v e r s f r o m a n i m a l s t r e a t e d w i t h A P S / L P S , t h e f o c i o f m i d z o n a l h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s ( a r e a b e t w e e n a r r o w s ) w e r e f e w e r a n d m u c h s m a l l e r . S i n u s o i d a l n e u t r o p h i l i a w a s n o t c h a n g e d b y p r e t r e a t m e n t w i t h A P S . H e m a t o x y l i n a n d e o s i n s t a i n s . 1 0 0 x m a g n i f i c a t i o n , b a r = 2 0 0 u m . ( e 9 0 T A B L E 2 . 1 H O R P E O M E T R I C A N A L Y S I S O E L I V E R B P R O M R A T E T R E A T E D W I T H L P B ‘ T R E A T M E N T C B + L P B A P B + L P S % L i v e r A f f e c t e d 6 . 7 i 2 . 9 0 . 2 i 0 . 1 ' L e s i o n s / A r e a L i v e r 6 7 i 2 3 1 1 t 4 ' ( l e s i o n s / c m z ) M e a n L e s i o n A r e a 0 . 0 6 3 i 0 . 0 1 3 0 . 0 2 3 t 0 . 0 0 5 ‘ ( m m ? ) L e s i o n S e v e r i t y 1 . 8 0 i 0 . 1 7 2 . 0 3 t 0 . 2 2 I n j u r y I n d e x c 0 . 1 3 5 t 0 . 0 4 3 0 . 0 3 8 i 0 . 0 0 9 ‘ N e u t r o p h i l s / L e s i o n 1 7 i 3 1 7 i 3 N e u t r o p h i l s / L e s i o n A r e a 5 2 8 i 1 6 3 9 8 0 i 1 8 7 ( c e l l s / m m z ) N e u t r o p h i l s / A r e a L i v e r 1 2 4 i 1 4 1 0 9 i 9 ( c e l l s / m m z ) A A n i m a l s w e r e p r e t r e a t e d e i t h e r w i t h c o n t r o l s e r u m ( C S ) o r a n t i - p l a t e l e t a n t i s e r u m ( A P S ) 1 2 h o u r s b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S . 6 h r a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i . v . ) o r s a l i n e v e h i c l e , l i v e r s e c t i o n s w e r e c o l l e c t e d f o r m o r p h o m e t r i c a n a l y s i s , a s d e s c r i b e d i n " M e t h o d s . " R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n s : S E M , N = 8 - 1 0 . R e s u l t s s h o w n i n t h i s t a b l e c o n s i s t o n l y o f L P S t r e a t e d a n i m a l s . N o n e o f t h e a n i m a l s t r e a t e d w i t h s a l i n e v e h i c l e h a d l i v e r l e s i o n s , a n d a l l t a b u l a r i z e d v a l u e s w e r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e i r r e s p e c t i v e c o n t r o l . B D e t e r m i n e d a s l e s i o n e d a r e a / t o t a l a r e a e x a m i n e d f o r e a c h r a t m u l t i p l i e d b y 1 0 0 . “ D e t e r m i n e d a s t h e p r o d u c t o f t h e s e v e r i t y s c o r e ( 0 - 5 ) a n d l e s i o n a r e a f o r e a c h r a t . ' S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m C S g r o u p . 9 1 F i g u r e 2 . 7 . T h e e f f e c t o f p l a t e l e t d e p l e t i o n o n t h e L P S - i n d u c e d c h a n g e i n p l a s m a f i b r i n o g e n . A n i m a l s w e r e p r e t r e a t e d w i t h e i t h e r c o n t r o l s e r u m ( C S ) o r a n t i - p l a t e l e t a n t i s e r u m ( A P S ) 1 2 h o u r s b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r S A L v e h i c l e . 6 h r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S o r S A L v e h i c l e , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f p l a s m a f i b r i n o g e n a s d e s c r i b e d i n ” M e t h o d s ” . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : t S E M , N = 8 . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e S A L g r o u p . b , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e C S g r o u p . d d d d d d d d d l § \ \ \ \ . 0 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ > § 9 3 F i g u r e 2 . 8 . T h e e f f e c t o f p l a t e l e t d e p l e t i o n o n L P S - i n d u c e d e l e v a t i o n i n p l a s m a T N F - a a c t i v i t y . A n i m a l s w e r e p r e t r e a t e d w i t h e i t h e r c o n t r o l s e r u m ( C S ) o r a n t i - p l a t e l e t a n t i s e r u m ( A P S ) 1 2 h o u r s b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r S A L v e h i c l e . 1 . 5 h r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S o r S A L , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f p l a s m a T N F - a a c t i v i t y , a s d e s c r i b e d i n ” M e t h o d s ” . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : t S E M , N = 3 - 8 . N D . ( n o t d e t e c t a b l e ) . v a l u e s l e s s t h a n 1 n g / m l . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e S A L g r o u p . b , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e C S g r o u p . 9 5 F i g u r e 2 . 9 . T h e e f f e c t o f p l a t e l e t d e p l e t i o n o n L P S - i n d u c e d a l t e r a t i o n s i n w h i t e b l o o d c e l l n u m b e r s . A n i m a l s w e r e p r e t r e a t e d w i t h e i t h e r c o n t r o l s e r u m ( C S ) o r a n t i - p l a t e l e t a n t i s e r u m ( A P S ) 1 2 h o u r s b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r S A L v e h i c l e . 6 h r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S o r S A L , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f t o t a l w h i t e c e l l s ( T O T A L W B C ) , n e u t r o p h i l s a n d l y m p h o c y t e s a s d e s c r i b e d i n ” M e t h o d s " . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 8 . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e S A L g r o u p . 1 2 ° ° ° 7 I m N L E Y U M T P R H O O P C H Y I T L E S S ) l p / s l l e c ( s l l e C d o o l B o l fi i l - — - } r ) o U 9 6 [ : 3 T O T A L w a c m 0 O O 1 o 4 0 0 0 " L . A P S C S A P S S A L L P S F I G U R E 2 . 9 9 7 2 . E . D i s c u s s i o n E v i d e n c e f r o m t h i s s t u d y s u g g e s t s t h a t p l a t e l e t s a r e i n v o l v e d i n t h e m a n i f e s t a t i o n o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . W e f o u n d t h a t t h e n u m b e r s o f b l o o d p l a t e l e t s d e c r e a s e d p r i o r t o t h e o n s e t o f l i v e r i n j u r y , c o n f i r m i n g o b s e r v a t i o n s o f o t h e r s ( S h i b a y a m a e t a l . , 1 9 9 5 ) . S e c o n d l y , r a d i o l a b e l e d - p l a t e l e t s a c c u m u l a t e d i n t h e l i v e r p r i o r t o t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r i n j u r y ( F i g u r e 2 . 1 ) . F i n a l l y , p l a t e l e t d e p l e t i o n a t t e n u a t e d L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . a s m e a s u r e d b y p l a s m a A L T a c t i v i t y , b i l i r u b i n c o n c e n t r a t i o n a n d m o r p h o m e t r i c a n a l y s i s o f l i v e r s e c t i o n s , w h i c h r e v e a l e d a p r o n o u n c e d r e d u c t i o n i n t h e s i z e a n d n u m b e r o f l e s i o n s i n l i v e r s o f L P S - t r e a t e d a n i m a l s ( F i g u r e 2 . 6 , T a b l e 2 . 1 ) . A d m i n i s t r a t i o n o f p o l y c l o n a l o r m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a g a i n s t p l a t e l e t s h a s b e e n u s e d t o e x p l o r e t h e r o l e o f t h e s e c e l l s i n s e v e r a l o t h e r L P S - i n d u c e d p a t h o p h y s i o l o g i c a l t e r a t i o n s ( I t o e t a l . , 1 9 9 0 ; K r a m e r e t a l . , 1 9 7 7 ; P i g u e t e t a l . , 1 9 9 3 ) s u p p o r t i n g t h e u s e f u l n e s s o f t h i s m e t h o d i n v i v o . W e u s e d a p o l y c l o n a l , a n t i - r a t p l a t e l e t a n t i s e r u m ( A P S ) t o i n d u c e t h r o m b o c y t o p e n i a p r i o r t o L P S a d m i n i s t r a t i o n . T h e A P S w a s s e l e c t i v e f o r p l a t e l e t s , s i n c e t h e n u m b e r s o f n o o t h e r c i r c u l a t i n g b l o o d c e l l s w e r e a l t e r e d ( F i g u r e 2 . 9 ) . I n a d d i t i o n , t h e A P S a l o n e h a d n o a p p a r e n t a f f e c t o n t h e l i v e r a s a s s e s s e d b y m o r p h o m e t r i c a n a l y s i s a n d A L T a c t i v i t y a n d b i l i r u b i n c o n c e n t r a t i o n i n p l a s m a . T h e u s e o f a p o l y c l o n a l a n t i s e r u m t o d e p l e t e p l a t e l e t s r a i s e s t h e p o s s i b i l i t y t h a t d e v e l o p m e n t o f a n t i b o d y - a n t i g e n c o m p l e x e s a n d c o n s e q u e n t c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n m a y h a v e c o n t r i b u t e d t o t h e h e p a t o p r o t e c t i v e e f f e c t s o f t h e A P S . 9 8 P r e v i o u s s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t t h e a d m i n i s t r a t i o n o f a n a n t i b o d y t o d e p l e t e p l a t e l e t s r e s u l t s i n c l e a r a n c e o f t h e p l a t e l e t s b y t h e K u p f f e r a n d e n d o t h e l i a l c e l l s o f t h e l i v e r . T h e p o s s i b i l i t y e x i s t s t h a t K u p f f e r c e l l f u n c t i o n m a y b e a l t e r e d b y t h e s e p h a g o c y t o s e d p l a t e l e t s . I n a s m u c h a s K u p f f e r c e l l s h a v e b e e n s h o w n t o m e d i a t e L P S - i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y ( l i m u r o e t a l . , 1 9 9 4 ) , a l t e r a t i o n o f K u p f f e r c e l l f u n c t i o n w i t h p l a t e l e t - a n t i b o d y c o m p l e x e s m i g h t c o n t r i b u t e t o t h e h e p a t o p r o t e c t i v e e f f e c t s o f t h e A P S . H o w e v e r , t h e u s e o f a p o l y c l o n a l a n t i - l y m p h o c y t e s e r u m t o r e d u c e b l o o d l y m p h o c y t e n u m b e r s w a s n o t p r o t e c t i v e i n t h i s m o d e l ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 2 ) . w h i c h s u p p o r t s t h e c o n t e n t i o n t h a t t h e A P S a f f o r d e d p r o t e c t i o n b y d e p l e t i n g p l a t e l e t s r a t h e r t h a n b y t h e g e n e r a t i o n o f i m m u n e c o m p l e x e s . I n a d d i t i o n , i t a p p e a r s t h a t s u c h i m m u n e c o m p l e x e s m a y h a v e a c t u a l l y S t i m u l a t e d r a t h e r t h a n i n h i b i t e d K u p f f e r c e l l s s i n c e p l a s m a T N F - a a c t i v i t y i s e n h a n c e d i n p l a t e l e t d e p l e t e d a n i m a l s g i v e n L P S ( F i g u r e 2 . 8 ) . T h i s f i n d i n g i s s i m i l a r t o p r e v i o u s r e s u l t s i n w h i c h a n a n t i b o d y a g a i n s t n e u t r o p h i l s r e s u l t e d i n e l e v a t e d p l a s m a T N F - a a c t i v i t y a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n c o m p a r e d t o a n i m a l s t r e a t e d w i t h L P S a n d c o n t r o l s e r u m ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 2 ; H e w e t t e t a l . , 1 9 9 3 ) . T N F - a h a s b e e n i m p l i c a t e d a s a r e q u i r e m e n t f o r l i v e r i n j u r y i n t h i s m o d e l ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 3 ) . T h e f i n d i n g t h a t d e p l e t i o n o f n e u t r o p h i l s a n d p l a t e l e t s r e s u l t e d i n e n h a n c e d p l a s m a T N F - a c o n c e n t r a t i o n i n L P S - t r e a t e d r a t s y e t p r e v e n t e d h e p a t i c i n j u r y s u g g e s t s t h a t t h e c r i t i c a l a c t i o n o f T N F - a i n l i v e r i n j u r y d e p e n d s u p o n t h e p r e s e n c e o f n e u t r o p h i l s a n d p l a t e l e t s . S u p p o r t f o r t h e h y p o t h e s i s t h a t p l a t e l e t s c o n t r i b u t e t o L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y w a s p r o v i d e d b y s t u d i e s i n w h i c h 1 1 1 l n - o x i n e - l a b e l e d p l a t e l e t s w e r e u s e d 9 9 t o a s s e s s h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n . P l a t e l e t s a c c u m u l a t e d i n t h e l i v e r p r i o r t o t h e o n s e t o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . R a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s h a v e b e e n w i d e l y u s e d t o m e a s u r e p l a t e l e t d e p o s i t i o n i n t i s s u e s . T h e r a d i o l a b e l i n g p r o c e d u r e d o e s n o t a l t e r p l a t e l e t f u n c t i o n ( S o s t m a n e t a l . , 1 9 8 3 ; W h i t e e t a l . , 1 9 8 9 ) . T h e t i m e c o u r s e o f h e p a t i c p l a t e l e t d e p o s i t i o n i n t h i s s t u d y w a s s i m i l a r t o t h a t r e p o r t e d b y o t h e r s u s i n g s e r o t o n i n ( 5 - H T ) a s a m a r k e r o f h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n ( E n d o e t a l . , 1 9 9 3 ) . W e c o n s i d e r e d t h e p o s s i b l i t y t h a t t h e i n c r e a s e i n h e p a t i c r a d i o a c t i v i t y w a s d u e t o f r e e 1 1 1 I n d i u m t h a t d i s s o c i a t e d f r o m p l a t e l e t s a n d w a s c l e a r e d i n t o t h e b i l e . T h i s i s u n l i k e l y , s i n c e b i l e f r o m e i t h e r S A L - o r L P S - t r e a t e d r a t s c o n t a i n e d v e r y l i t t l e r a d i o a c t i v i t y ( d a t a n o t s h o w n ) . I n a d d i t i o n , p l a s m a s a m p l e s h a d l i t t l e r a d i o a c t i v i t y , w h e r e a s b l o o d s a m p l e s c o n t a i n e d c o n s i d e r a b l e r a d i o a c t i v i t y , s u g g e s t i n g t h a t t h e 1 1 1 l n r e m a i n s a s s o c i a t e d w i t h t h e p l a t e l e t s . S e l e c t i v e c l e a r a n c e o f t h e r a d i o l a b e l e d , b u t n o t u n l a b e l e d p l a t e l e t s b y t h e l i v e r m i g h t h a v e c o n t r i b u t e d t o t h e i n c r e a s e d h e p a t i c r a d i o a c t i v i t y i n L P S - t r e a t e d r a t s . H o w e v e r , p r e l i m i n a r y s t u d i e s i n d i c a t e d t h a t r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s i n c o n t r o l r a t s w e r e c l e a r e d e q u a l l y f r o m b o t h t h e s p l e e n a n d l i v e r , a n d t h e k i n e t i c s o f t h i s c l e a r a n c e c o r r e s p o n d e d t o t h e c i r c u l a t i n g h a l f - l i f e o f r a t p l a t e l e t s ( d a t a n o t s h o w n , ( W h i t e e t a l . , 1 9 8 9 ) ) . M o r e o v e r , L P S a d m i n i s t r a t i o n r e s u l t e d i n a n i n c r e a s e o n l y i n h e p a t i c r a d i o a c t i v i t y , w i t h o u t a n y s i g n i f i c a n t a l t e r a t i o n s i n s p l e n i c r a d i o a c t i v i t y . T h e i n c r e a s e i n h e p a t i c 1 1 1 l n w a s n o t a r e s u l t o f p o o l i n g o f b l o o d i n l i v e r t i s s u e s i n c e l i v e r w e i g h t s w e r e n o t s i g n i f i c a n t l y e l e v a t e d a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n a s c o m p a r e d t o S A L - t r e a t e d a n i m a l s ( d a t a n o t s h o w n ) . T h u s , L P S a d m i n i s t r a t i o n 1 0 0 a p p e a r s t o c a u s e s e l e c t i v e a c c u m u l a t i o n o f p l a t e l e t s i n l i v e r . T h i s f i n d i n g i s c o n s i s t e n t w i t h a n d m a y e x p l a i n t h e c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e s e v e r i t y o f L P S - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a a n d l i v e r i n j u r y ( S h i b a y a m a e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h e s t i m u l u s f o r t h i s p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n a n d t h e b a s i s f o r t h e l i v e r s e l e c t i v i t y r e m a i n u n c l e a r . T h e h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n a n d t h r o m b o c y t o p e n i a s u g g e s t t h a t p l a t e l e t s a r e a c t i v a t e d d u r i n g L P S e x p o s u r e . T h e m e c h a n i s m s o f p l a t e l e t a c t i v a t i o n i n t h i s m o d e l a r e u n k n o w n , a l t h o u g h i n o t h e r s p e c i e s L P S m a y a c t i v a t e p l a t e l e t s b y d i r e c t o r i n d i r e c t m e c h a n i s m s . E v i d e n c e f r o m t h i s s t u d y s u g g e s t s t h a t p l a t e l e t s a r e n o t d i r e c t l y a c t i v a t e d b y L P S i n v i v a s i n c e b l o o d p l a t e l e t s d i d n o t d e c r e a s e u n t i l n e a r l y 3 h r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n a n d t h e h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n w a s n o t s i g n i f i c a n t u n t i l 1 h r a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n a n d c o n t i n u e d t h r o u g h a t l e a s t 5 h o u r s t h e r e a f t e r ( F i g u r e 2 . 1 ) . A c c o r d i n g l y , a v a i l a b l e e v i d e n c e s u g g e s t s t h a t a c c u m u l a t i o n a n d a c t i v a t i o n o f p l a t e l e t s w i t h i n t h e l i v e r s o f L P S - t r e a t e d r a t s o c c u r b y i n d i r e c t m e c h a n i s m s . F o r e x a m p l e , i n j u r y t o e n d o t h e l i a l c e l l s ( H a r l a n e t a l . , 1 9 8 3 b ; H e w e t t e t a l . , 1 9 9 2 ) a n d c o n s e q u e n t e x p o s u r e o f t h e s u b e n d o t h e l i u m m i g h t a c t i v a t e t h e c o a g u l a t i o n c a s c a d e a n d p r o m p t p l a t e l e t a d h e r e n c e a n d a g g r e g a t i o n . T h e f i n d i n g s t h a t e i t h e r n e u t r o p h i l d e p l e t i o n ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 2 ) o r p l a t e l e t d e p l e t i o n p r o v i d e s p r o t e c t i o n f r o m L P S - i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y i n d i c a t e s t h a t n e i t h e r p l a t e l e t s n o r n e u t r o p h i l s a r e s u f f i c i e n t t o p r o d u c e i n j u r y b y t h e m s e l v e s . I t m a y b e t h a t e i t h e r c o o p e r a t i o n b e t w e e n t h e s e t w o c e l l t y p e s o r t h e s e q u e n t i a l a c t i v a t i o n o f t h e m i s r e q u i r e d f o r t h e e x p r e s s i o n o f l i v e r i n j u r y . 1 0 1 I n t h i s s t u d y , b o t h p l a t e l e t s a n d n e u t r o p h i l s w e r e p r e s e n t i n t h e l i v e r p r i o r t o t h e o n s e t o f l i v e r i n j u r y . I n t e r e s t i n g l y , p l a t e l e t d e p l e t i o n a t t e n u a t e d l i v e r i n j u r y b u t d i d n o t a l t e r t h e n u m b e r s o f n e u t r o p h i l s w i t h i n t h e s i n u s o i d s . T h u s , a l t h o u g h L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y i s n e u t r o p h i l d e p e n d e n t , t h e p r e s e n c e o f n e u t r o p h i l s w i t h i n t h e l i v e r i s n o t s u f f i c i e n t t o p r o d u c e l i v e r i n j u r y i n t h e a b s e n c e o f p l a t e l e t s , s u g g e s t i n g t h a t p l a t e l e t s i n t e r a c t w i t h n e u t r o p h i l s i n t h e p a t h o g e n e s i s . I n t h i s m o d e l , n e u t r o p h i l s a r e p r e s e n t t h r o u g h o u t t h e e n t i r e l i v e r , n o t s o l e l y w i t h i n n e c r o t i c f o c i . I t w o u l d b e o f i n t e r e s t t o k n o w w h e t h e r p l a t e l e t s a r e a s s o c i a t e d g e n e r a l l y w i t h n e u t r o p h i l s i n t h e l i v e r s o f L P S - t r e a t e d r a t s o r w h e t h e r t h e y t e n d t o a s s o c i a t e p r e f e r e n t i a l l y w i t h n e u t r o p h i l s i n a r e a s u n d e r g o i n g h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s . I t i s p o s s i b l e t h a t p l a t e l e t s a r e a c t i v a t e d i n d i r e c t l y i n t h i s m o d e l b y a n e f f e c t o f L P S o n n e u t r o p h i l s . L P S a s w e l l a s s o l u b l e m e d i a t o r s r e l e a s e d f r o m c e l l s d u r i n g L P S e x p o s u r e c a n s t i m u l a t e n e u t r o p h i l s t o r e l e a s e p r o t e a s e s s u c h a s c a t h e p s i n G . T h i s p r o t e i n c a u s e s p l a t e l e t a g g r e g a t i o n , c a l c i u m m o b i l i z a t i o n a n d t h e r e l e a s e o f t h r o m b o x a n e A 2 a n d s e r o t o n i n i n v i t r a ( d e l M a s c h i o e t a l . , 1 9 9 0 ; F e r r e r - L o p e z e t a l . , 1 9 9 0 ; S e l a k e t a l . , 1 9 8 8 ) . F u r t h e r m o r e , p r i m i n g o f n e u t r o p h i l s w i t h T N F - a i n c r e a s e s n e u t r o p h i l - i n d u c e d p l a t e l e t a g g r e g a t i o n b y i n c r e a s i n g t h e a m o u n t o f c a t h e p s i n G r e l e a s e d f r o m n e u t r o p h i l s ( R e n e s t o e t a l . , 1 9 9 1 ) . A l t h o u g h t h e s e s t u d i e s h a v e b e e n c o n d u c t e d i n v i t r o , i t i s p o s s i b l e t h a t s i m i l a r e v e n t s o c c u r i n v i v a . N o t o n l y d o n e u t r o p h i l s a n d p l a t e l e t s a c c u m u l a t e i n t h e l i v e r s o f L P S - t r e a t e d r a t s , b u t s i g n i f i c a n t a m o u n t s o f T N F - a a r e p r e s e n t i n t h e p l a s m a p r i o r t o t h e o n s e t o f l i v e r i n j u r y ( F i g u r e 2 . 1 ) . 1 0 2 A c c o r d i n g l y , t h e r e l e a s e o f c a t h e p s i n G m a y b e a m e c h a n i s m b y w h i c h p l a t e l e t s , n e u t r o p h i l s a n d T N F - a i n t e r a c t i n t h e g e n e s i s o f l i v e r i n j u r y a f t e r L P S e x p o s u r e . P l a t e l e t s p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h r o m b o s i s a n d h e m o s t a s i s , a n d L P S m a y i n f l u e n c e p l a t e l e t s b y a c t i v a t i n g t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m . L P S a c t i v a t e s b o t h t h e i n t r i n s i c a n d e x t r i n s i c p a t h w a y s o f c o a g u l a t i o n i n v i t r a . P l a t e l e t s c a n a l s o a c t i v a t e t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , a n d i t i s p o s s i b l e t h a t s u c h a n i n t e r a c t i o n i s i n v o l v e d i n t h e h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y t h a t o c c u r s d u r i n g L P S e x p o s u r e . I n t h i s s t u d y , t h r o m b o c y t o p e n i a a n d h y p o f i b r i n o g e n e m i a o c c u r r e d b e t w e e n 2 - 3 h o u r s a f t e r L P S i n j e c t i o n ( F i g u r e 2 . 1 ) , s u g g e s t i n g a c o n s u m p t i v e c o a g u l o p a t h y . R e s u l t s o f a p r e v i o u s s t u d y s u g g e s t a r o l e f o r t h r o m b i n i n t h e g e n e s i s o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y a n d t h a t i t s c r i t i c a l a c t i o n i s i n d e p e n d e n t o f i t s a b i l i t y t o f o r m i n s o l u b l e f i b r i n c l o t s ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h r o m b i n c a n a c t i v a t e p l a t e l e t s a n d m a y p r o v i d e t h e l i n k b e t w e e n p l a t e l e t s a n d c o a g u l a t i o n i n t h i s m o d e l . I n t h i s s t u d y , p l a t e l e t d e p l e t i o n p r e v e n t e d L P S - i n d u c e d a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a s w e l l a s l i v e r i n j u r y . T h i s s u g g e s t s t h a t p l a t e l e t s c o n t r i b u t e t o l i v e r i n j u r y t h r o u g h a m e c h a n i s m t h a t i n v o l v e s a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d r e s u l t a n t f o r m a t i o n o f t h r o m b i n . A c t i v a t e d p l a t e l e t s c a n r e l e a s e m a n y i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s , i n c l u d i n g s e r o t o n i n , p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r ( P A F ) a n d t h r o m b o x a n e A 2 . A s m e n t i o n e d p r e v i o u s l y , l i v e r s e r o t o n i n i n c r e a s e s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n ( E n d o e t a l . , 1 9 9 3 ) . P A F p r o m o t e s n e u t r o p h i l c h e m o t a x i s , a g g r e g a t i o n , g r a n u l e s e c r e t i o n , s u p e r o x i d e p r o d u c t i o n a n d t h e r e l e a s e o f a r a c h i d o n i c a c i d m e t a b o l i t e s 1 0 3 ( M o n t r u c c h i o e t a l . , 1 9 9 3 ; H o s f o r d e t a l . , 1 9 9 3 ) . T r e a t m e n t o f r a t s w i t h a P A F r e c e p t o r a n t a g o n i s t a f f o r d s p r o t e c t i o n f r o m L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y ( I m u r a e t a l . , 1 9 8 6 ) . T h r o m b o x a n e A 2 m a y c o n t r i b u t e t o t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r i n j u r y , s i n c e p l a s m a t h r o m b o x a n e i s e l e v a t e d a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n a n d d r u g s w h i c h i n h i b i t t h e s y n t h e s i s o r a c t i o n o f t h r o m b o x a n e A , p r o t e c t r a t s f r o m L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y ( W i s e e t a l . , 1 9 8 0 ) . T h u s , p l a t e l e t s m a y c o n t r i b u t e t o L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y b y r e l e a s i n g o n e o r m o r e o f t h e s e c h e m i c a l m e d i a t o r s . I n s u m m a r y , p l a t e l e t s a n d n e u t r o p h i l s a c c u m u l a t e w i t h i n t h e l i v e r p r i o r t o t h e o n s e t o f l i v e r i n j u r y . P l a t e l e t s a p p a r e n t l y c o n t r i b u t e t o L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y , i n a s m u c h a s p l a t e l e t d e p l e t i o n a t t e n u a t e s h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s . N e u t r o p h i l s a n d T N F - a a r e c r i t i c a l m e d i a t o r s o f l i v e r p a t h o g e n e s i s d u r i n g L P S ' e x p o s u r e , h o w e v e r , p l a t e l e t s m e d i a t e n e i t h e r t h e i n c r e a s e i n p l a s m a T N F - a c o n c e n t r a t i o n n o r t h e h e p a t i c a c c u m u l a t i o n o f n e u t r o p h i l s . I t i s p o s s i b l e t h a t p l a t e l e t s c o n t r i b u t e t o n e u t r o p h i l a c t i v a t i o n . T h e y p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m s i n c e p l a t e l e t d e p l e t i o n p r e v e n t s L P S - i n d u c e d h y p o f i b r i n o g e n e m i a . A c o m p l e t e u n d e r s t a n d i n g o f t h e c r i t i c a l r o l e o f p l a t e l e t s i n L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y i s l i k e l y t o r e q u i r e e l u c i d a t i o n o f t h e i r i n t e r a c t i o n s w i t h o t h e r c e l l u l a r a n d s o l u b l e i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s . C H A P T E R 3 I N T E R D E P E N D E N C E A M O N G N E U T R O P H I L S . K U P F F E R C E L L S A N D P L A T E L E T S D U R I N G L P S E X P O S U R E 1 0 4 1 0 5 3 . A . A b s t r a c t E x p o s u r e t o l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( L P S ) f r o m g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a l e a d s t o a n a r r a y o f p a t h o p h y s i o l o g i c c h a n g e s , i n c l u d i n g d i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n , m u l t i p l e o r g a n f a i l u r e a n d l i v e r i n j u r y . T h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r i n j u r y e n t a i l s c o n t r i b u t i o n s f r o m b o t h c e l l u l a r a n d s o l u b l e m e d i a t o r s , i n c l u d i n g n e u t r o p h i l s , p l a t e l e t s , K u p f f e r c e l l s a n d c o m p o n e n t s o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m . M u c h r e m a i n s u n k n o w n a b o u t t h e i n t e r a c t i o n s a m o n g t h e s e m e d i a t o r s i n t h e p a t h o g e n e s i s o f l i v e r i n j u r y i n v i v a . A c c o r d i n g l y , s t u d i e s w e r e c o n d u c t e d i n n e u t r o p h i l - d e p l e t e d a n i m a l s t o e v a l u a t e t h e r o l e o f n e u t r o p h i l s i n L P S - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a a n d h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n . A s s h o w n p r e v i o u s l y , n e u t r o p h i l d e p l e t i o n w i t h a n a n t i - n e u t r o p h i l i m m u n o g l o b u l i n a t t e n u a t e d l i v e r i n j u r y , a s m a r k e d b y e l e v a t i o n s i n p l a s m a a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e a c t i v i t y . I n a d d i t i o n , n e u t r o p h i l d e p l e t i o n t h e d e c r e a s e i n b l o o d p l a t e l e t n u m b e r s b u t d i d n o t i n h i b i t t h e h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n o b s e r v e d d u r i n g L P S e x p o s u r e . T o e v a l u a t e t h e r o l e o f K u p f f e r c e l l s i n t h e s e L P S - m e d i a t e d e v e n t s , s t u d i e s w e r e c o n d u c t e d w i t h g a d o l i n i u m c h l o r i d e , a n a g e n t t h a t i n h i b i t s K u p f f e r c e l l f u n c t i o n a n d p r e v e n t s L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . F e m a l e , S p r a g u e - D a w l e y r a t s w e r e p r e t r e a t e d w i t h G d C l 3 - 6 H 2 0 ( 1 0 m g / k g , i v ) o r s a l i n e v e h i c l e 2 4 h r s p r i o r t o t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r s a l i n e v e h i c l e . T h e y w e r e t h e n t r e a t e d w i t h 1 1 1 i n d i u m - l a b e l e d p l a t e l e t s 2 h r s b e f o r e L P S a d m i n i s t r a t i o n t o q u a n t i f y p l a t e l e t d e p o s i t i o n i n v a r i o u s t i s s u e s . A s s h o w n p r e v i o u s l y , p r e t r e a t m e n t w i t h G d C l 3 a t t e n u a t e d l i v e r i n j u r y . P r e t r e a t m e n t w i t h G d C l 3 a t t e n u a t e d 1 0 6 t h r o m b o c y t o p e n i a a n d h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n o b s e r v e d a f t e r L P S e x p o s u r e , b u t i t d i d n o t a l t e r t h e a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , a s m a r k e d b y a d e c r e a s e i n p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t K u p f f e r c e l s b u t n o t n e u t r o p h i l s c o n t r i b u t e t o t h e a c c u m u l a t i o n o f p l a t e l e t s i n t h e l i v e r a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n a n d r a i s e t h e p o s s i b i l i t y t h a t p r o t e c t i o n a g a i n s t L P S - i n d u c e d h e p a t i c i n j u r y b y K u p f f e r c e l l i n a c t i v a t i o n m a y b e d u e t o d e c r e a s e d d e p o s i t i o n o f p l a t e l e t s w i t h i n t h e l i v e r . R e s u l t s f r o m t h e s e s t u d i e s a l s o s u g g e s t t h a t t h e p r e s e n c e o f p l a t e l e t s w i t h i n t h e l i v e r i s i n s u f f i c i e n t t o r e s u l t i n l i v e r i n j u r y a n d s u g g e s t t h a t a n i n t e r d e p e n d e n c e b e t w e e n n e u t r o p h i l s a n d p l a t e l e t s m a y b e r e q u i r e d f o r t h e m a n i f e s t a t i o n o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y i n t h e r a t . 3 . B . l n t r o d u c t i o n N e u t r o p h i l s a n d p l a t e l e t s a c c u m u l a t e i n t h e l i v e r w i t h i n 1 h o u r a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n . N e u t r o p h i l s c a n s t i m u l a t e p l a t e l e t a g g r e g a t i o n b y a m e c h a n i s m i n v o l v i n g t h e r e l e a s e o f c a t h e p s i n G . T h i s I y s o s o m a l p r o t e a s e s t i m u l a t e s p l a t e l e t a g g r e g a t i o n a n d t h e s u b s e q u e n t r e l e a s e o f s e r o t o n i n a n d T x A , ( E v a n g e l i s t a e t a l . , 1 9 9 2 ) . C a t h e p s i n G a l s o s t i m u l a t e s t h e e x p r e s s i o n o f p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n l l b / l l l a , a n a c t i o n t h a t w o u l d p r o m o t e p l a t e l e t a g g r e g a t i o n ( L a R o s a e t a l . , 1 9 9 4 ) . T h e r e b y , n e u t r o p h i l s m i g h t m e d i a t e L P S - i n d u c e d h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n a n d t h r o m b o c y t o p e n i a . 1 0 7 K u p f f e r c e l l s , t h e r e s i d e n t m a c r o p h a g e s o f t h e l i v e r , r a p i d l y r e m o v e L P S f r o m t h e c i r c u l a t i o n a n d r e l e a s e n u m e r o u s i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s i n r e s p o n s e t o L P S e x p o s u r e . G a d o l i n i u m c h l o r i d e ( G d C l a l , a n a g e n t t h a t i n h i b i t s K u p f f e r c e l l p h a g o c y t o s i s , p r o t e c t s r a t s f r o m L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y ( l i m u r o e t a l . , 1 9 9 4 ; B r o w n e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h e s p e c i f i c r o l e o f K u p f f e r c e l l s i n t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r p a t h o g e n e s i s i s u n c l e a r , b u t i t i s p o s s i b l e t h a t K u p f f e r c e l l s i n t e r a c t w i t h o t h e r c r i t i c a l i n f l a m m a t o r y c e l l s s u c h a s p l a t e l e t s d u r i n g t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r i n j u r y . E l e c t r o n m i c r o g r a p h s o f m u r i n e l i v e r s a f t e r L P S e x p o s u r e h a v e r e v e a l e d p l a t e l e t s i n t h e l i v e r s i n u s o i d s a n d t h e s p a c e s o f D i s s e a n d w i t h i n K u p f f e r c e l l s ( E n d o e t a l . , 1 9 9 3 ) , b u t t h e m e c h a n i s m s b y w h i c h p l a t e l e t s a c c u m u l a t e i n t h e l i v e r a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n h a v e n o t b e e n e l u c i d a t e d . L P S - s t i m u l a t e d K u p f f e r c e l l s r e l e a s e n u m e r o u s i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s s u c h a s t h r o m b o x a n e A , , w h i c h i s a p o t e n t a c t i v a t o r o f p l a t e l e t s t h a t m i g h t c o n t r i b u t e t o t h e d e p o s i t i o n o f t h e s e c e l l s ( D e c k e r , 1 9 9 0 ; C o o k e t a l . , 1 9 8 1 ; R o d r i g u e z d e T u r c o e t a l . , 1 9 9 0 ) . M o r e o v e r , t h e r e t i c u l o e n d o t h e l i a l s y s t e m o f t h e l i v e r a n d s p l e e n m i g h t c o n t r i b u t e t o t h e r e m o v a l o f p l a t e l e t s f r o m t h e b l o o d a s i t d o e s i n o t h e r p a t h o p h y s i o l o g i c c o n d i t i o n s s u c h a s i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a p u r p u r a ( d u P H e y n s e t a l . , 1 9 8 6 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e f i n d i n g s r a i s e t h e p o s s i b i l i t y t h a t s t i m u l a t e d K u p f f e r c e l l s c o n t r i b u t e t o t h e d e c r e a s e i n b l o o d p l a t e l e t s a n d t h e a c c u m u l a t i o n o f p l a t e l e t s w i t h i n t h e l i v e r a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n . T o e v a l u a t e p o t e n t i a l i n t e r a c t i o n s o f n e u t r o p h i l s a n d K u p f f e r c e l l s w i t h p l a t e l e t s o r t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , s e p a r a t e s t u d i e s w e r e c o n d u c t e d u s i n g 1 0 8 e i t h e r n e u t r o p h i l - d e p l e t e d o r K u p f f e r c e l l - i n a c t i v a t e d a n i m a l s . S t u d i e s w e r e c o n d u c t e d t o e v a l u a t e t h e e f f e c t s o f n e u t r o p h i l d e p l e t i o n o r K u p f f e r c e l l i n h i b i t i o n o n t h r o m b o c y t o p e n i a , a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d s e q u e s t r a t i o n o f p l a t e l e t s i n l i v e r a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n t o r a t s . 3 . C . M a t e r i a l s a n d m e t h o d s 3 . C . 1 . S e e C h a p t e r 2 , s e c t i o n C 1 . 3 . C . 2 . A n i m a l s S e e C h a p t e r 2 , s e c t i o n C 2 3 . C . 3 . P l a t e l e t d i s t r i b u t i o n i n t i s s u e s S e e C h a p t e r 2 , s e c t i o n C . 6 . 3 . C . 4 . P r e p a r a t i o n o f a n t i - n e u t r o p h i l i m m u n o g l o b u l i n R a b b i t s w e r e i m m u n i z e d a g a i n s t r a t n e u t r o p h i l s b y i n j e c t i n g n e u t r o p h i l s s u s p e n d e d i n F r e u n d ' s c o m p l e t e a d j u v e n t i n t o t h e f o o t p a d s , a s d e s c r i b e d 1 0 9 p r e v i o u s l y ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h i s w a s f o l l o w e d b y i n t r a m u s c u l a r b o o s t e r i n j e c t i o n s o f n e u t r o p h i l s . O n e w e e k a f t e r t h e s e c o n d n e u t r o p h i l b o o s t e r i n j e c t i o n , b l o o d w a s d r a w n f r o m t h e c e n t r a l e a r a r t e r y a n d a l l o w e d t o c l o t . T h e t o t a l i m m u n o g l o b u l i n ( l g ) f r a c t i o n o f s e r u m f r o m r a b b i t s w a s i s o l a t e d b y a m m o n i u m s u l f a t e p r e c i p i t a t i o n ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 2 ) a n d s t o r e d a t - 2 0 ° C p r i o r t o u s e . T o t a l l g f r o m u n t r e a t e d r a b b i t s w a s i s o l a t e d i n a s i m i l a r m a n n e r a n d u s e d a s a c o n t r o l ( c o n t r o l l g ) . 3 . C . 5 . N e u t r o p h i l d e p l e t i o n s t u d i e s R a t s w e r e t r e a t e d w i t h a n t i — P M N l g o r c o n t r o l l g ( 1 m l , i v ) 1 8 a n d 6 h o u r s b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S . T h i s p r o c e d u r e h a s b e e n u s e d p r e v i o u s l y a n d t h e a d m i n i s t r a t i o n o f a n t i - P M N l g r e d u c e s b l o o d n e u t r o p h i l s n u m b e r s t o < 5 % o f t h o s e f r o m r a t s t r e a t e d w i t h c o n t r o l l g ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h e n u m b e r s o f r e d b l o o d c e l l s , o t h e r l e u k o c y t e s a n d p l a t e l e t s a r e n o t s i g n i f i c a n t l y a l t e r e d b y t h e a d m i n i s t r a t i o n o f t h e a n t i - P M N l g . T w o h o u r s b e f o r e L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r s a l i n e v e h i c l e a d m i n i s t r a t i o n , a n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h 1 1 1 l n - l a b e l e d p l a t e l e t s , a s d e s c r i b e d a b o v e . S i x h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S , a n i m a l s w e r e a n e s t h e t i z e d w i t h s o d i u m p e n t o b a r b i t a l ( 5 0 m g / k g , i p ) a n d a m i d l i n e l a p a r o t o m y w a s p e r f o r m e d . B l o o d w a s d r a w n f r o m t h e d e s c e n d i n g a o r t a i n t o s o d i u m c i t r a t e ( 0 . 3 8 % f i n a l c o n c e n t r a t i o n ) . T h e l i v e r , s p l e e n , k i d n e y s a n d l u n g s w e r e e x c i s e d f o r d e t e r m i n a t i o n o f r a d i o a c t i v i t y ( s e e a b o v e ) . B l o o d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n w a s d e t e r m i n e d i n a h e m o c y t o m e t e r a f t e r e r y t h r o c y t e l y s i s a n d d i l u t i o n i n p l a t e l e t U n o p e t t e s . T o t a l w h i t e b l o o d c e l l c o u n t s w e r e p e r f o r m e d i n 1 1 0 a C o u l t e r C o u n t e r M o d e l 2 M . D i f f e r e n t i a l c o u n t s w e r e p e r f o r m e d o n b l o o d s m e a r s s t a i n e d w i t h b u f f e r e d , d i f f e r e n t i a l W r i g h t - G i e m s a s t a i n t o o b t a i n t h e f r a c t i o n o f n e u t r o p h i l s a n d l y m p h o c y t e s i n e a c h b l o o d s a m p l e . T h e t o t a l n u m b e r o f w h i t e b l o o d c e l l s w a s m u l t i p l i e d b y t h i s f r a c t i o n t o o b t a i n n u m b e r s o f n e u t r o p h i l s ( c e l l s / p l b l o o d ) . P l a s m a s a m p l e s w e r e a s s a y e d f o r A L T a c t i v i t y . 3 . C . 6 . G a d o l i n i u m c h l o r i d e s t u d i e s R a t s w e r e p r e t r e a t e d w i t h G d C l 3 - 6 H 2 0 ( 1 0 m g / k g , i v ) o r s a l i n e v e h i c l e ( 2 m l / k g ) v i a t h e t a i l v e i n 2 4 h r s b e f o r e L P S a d m i n i s t r a t i o n . T h i s t r e a t m e n t r e g i m e n i n h i b i t s K u p f f e r c e l l p h a g o c y t o s i s a s m e a s u r e d b y c l e a r a n c e o f c o l l o i d a l c a r b o n f r o m b l o o d ( l i m u r o e t a l . , 1 9 9 4 ; B r o w n e t a l . , 1 9 9 5 ) . T w o h o u r s b e f o r e L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r s a l i n e v e h i c l e a d m i n i s t r a t i o n , a n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h m l n - l a b e l e d p l a t e l e t s , a s d e s c r i b e d a b o v e . S i x h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S , a n i m a l s w e r e a n e s t h e t i z e d w i t h s o d i u m p e n t o b a r b i t a l ( 5 0 m g / k g , i p ) a n d a m i d l i n e l a p a r o t o m y w a s p e r f o r m e d . B l o o d w a s d r a w n f r o m t h e d e s c e n d i n g a o r t a i n t o s o d i u m c i t r a t e ( 0 . 3 8 % f i n a l c o n c e n t r a t i o n ) . T h e l i v e r , s p l e e n , k i d n e y s a n d l u n g s w e r e e x c i s e d f o r d e t e r m i n a t i o n o f r a d i o a c t i v i t y ( s e e a b o v e ) . B l o o d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s w e r e d e t e r m i n e d i n a h e m o c y t o m e t e r a f t e r e r y t h r o c y t e l y s i s a n d d i l u t i o n i n p l a t e l e t U n o p e t t e s . P l a s m a s a m p l e s w e r e a s s a y e d f o r p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n i n a B B L F i b r o m e t e r ( B e c t o n , D i c k i n s o n a n d C o m p a n y , H u n t V a l l e y , M D ) a n d f o r A L T a c t i v i t y . 1 1 1 3 . C . 7 . D a t a a n a l y s i s A 2 X 2 m u l t i f a c t o r i a l , c o m p l e t e l y r a n d o m a n a l y s i s o f v a r i a n c e ( A N O V A ) w a s u s e d t o e v a l u a t e a l l d a t a . D a t a w i t h n o n h o m o g e n e o u s v a r i a n c e s w e r e s q u a r e r o o t - o r l o g - t r a n s f o r m e d p r i o r t o a n a l y s i s . C o m p a r i s o n s b e t w e e n g r o u p s w e r e p e r f o r m e d w i t h T u k e y ' s o m e g a t e s t ( S t e e l a n d T o r r i e , 1 9 8 0 ) . T h e c r i t e r i o n f o r s i g n i f i c a n c e f o r a l l s t u d i e s w a s p s 0 . 0 5 . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : s t a n d a r d e r r o r o f t h e m e a n ( S E M ) . F o r a l l r e s u l t s p r e s e n t e d , N r e p r e s e n t s t h e n u m b e r o f i n d i v i d u a l a n i m a l s u s e d i n t h e s t u d y . 3 . D . R e s u l t s 3 . D . 1 . N e u t r o p h i l d e p l e t i o n s t u d i e s T o a d d r e s s t h e c o n t r i b u t i o n o f n e u t r o p h i l s t o h e p a t o t o x i c i t y , t h r o m b o c y t o p e n i a a n d h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n c a u s e d b y L P S e x p o s u r e , b l o o d n e u t r o p h i l c o n c e n t r a t i o n w a s r e d u c e d b y t h e a d m i n i s t r a t i o n o f a n t i - n e u t r o p h i l l g . T h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S r e s u l t e d i n a s i g n i f i c a n t d e c r e a s e i n b l o o d n e u t r o p h i l s ( F i g u r e 3 . 1 ) . A s s h o w n p r e v i o u s l y ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 2 ) , a n t i - n e u t r o p h i l l g m a r k e d l y r e d u c e d t h e n u m b e r s o f n e u t r o p h i l s i n b l o o d . C o n s i s t e n t w i t h p r e v i o u s r e s u l t s ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 2 ; J a e s c h k e e t a l . , 1 9 9 1 b ) , t h e r e d u c t i o n i n b l o o d n e u t r o p h i l n u m b e r s w a s a s s o c i a t e d w i t h a n a t t e n u a t i o n o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y , a s m a r k e d b y e l e v a t e d A L T a c t i v i t y ( F i g u r e 3 . 2 ) . 1 1 2 m o d e l , w e e v a l u a t e d t h e e f f e c t o f n e u t r o p h i l d e p l e t i o n o n L P S - i n d u c e d h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n a n d t h r o m b o c y t o p e n i a . T h e a d m i n i s t r a t i o n o f a n t i - n e u t r o p h i l l g i n c r e a s e d t h e a c c u m u l a t i o n o f r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s w i t h i n t h e l i v e r i n s a l i n e - t r e a t e d a n i m a l s ( F i g u r e 3 . 3 ) . T h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S i n c r e a s e d h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n , a n d t h i s e f f e c t w a s e n h a n c e d i n n e u t r o p h i l - d e p l e t e d a n i m a l s ( F i g u r e 3 . 3 ) . T h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S p r o d u c e d a s i g n i f i c a n t r e d u c t i o n i n b l o o d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n ( F i g u r e 3 . 4 ) , a f i n d i n g c o n s i s t e n t w i t h p r e v i o u s s t u d i e s s h o w i n g t h a t L P S a d m i n i s t r a t i o n r e s u l t s i n t h r o m b o c y t o p e n i a ( P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 5 ) . N e u t r o p h i l - d e p l e t i o n w i t h a n t i - P M N l g r e s u l t e d i n a s l i g h t l y l e s s p r o n o u n c e d d e c r e a s e i n t o t a l b l o o d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n ( F i g u r e 3 . 4 ) . C o n s i s t e n t w i t h p r e v i o u s s t u d i e s , L P S e x p o s u r e d i d n o t a l t e r t h e d i s t r i b u t i o n o f p l a t e l e t s i n t h e l u n g s , k i d n e y s o r s p l e e n . S i m i l a r t o r e s u l t s w i t h b l o o d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n , i t d i d n o t r e d u c e b l o o d r a d i o a c t i v i t y ( T a b l e 3 . 1 ) . N e u t r o p h i l d e p l e t i o n d i d n o t a l t e r r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s s i n b l o o d a n d o t h e r o r g a n s . 3 . D . 2 . G d C l 3 S t u d i e s S i x h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S , l i v e r i n j u r y w a s e v a l u a t e d . P l a s m a A L T a c t i v i t y w a s e l e v a t e d a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( F i g u r e 3 . 5 ) , a n d t h i s w a s c o n s i s t e n t w i t h h i s t o l o g i c f i n d i n g s ( d a t a n o t s h o w n ) . A s r e p o r t e d p r e v i o u s l y ( l i m u r o e t a l . , 1 9 9 4 ; B r o w n e t a l . , 1 9 9 5 ) , p r e t r e a t m e n t w i t h G d C l 3 s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d t h i s L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . T h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S r e s u l t e d i n a s i g n i f i c a n t a c c u m u l a t i o n o f 1 1 1 I n - 1 1 3 r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s w i t h i n t h e l i v e r , a s m e a s u r e d b y i n c r e a s e d h e p a t i c r a d i o a c t i v i t y ( F i g u r e 3 . 6 ) . P r e t r e a t m e n t w i t h G d C l 3 a t t e n u a t e d t h i s L P S - i n d u c e d h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n b y 4 6 % . C o n s i s t e n t w i t h p r e v i o u s s t u d i e s ( P e a r s o n e t a l . 1 9 9 5 ) . L P S a d m i n i s t r a t i o n d i d n o t a l t e r t h e d i s t r i b u t i o n o f r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s i n t h e l u n g s , s p l e e n a n d k i d n e y s ( T a b l e 3 . 1 ) . H o w e v e r , t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S t o a n i m a l s p r e t r e a t e d w i t h G d C l ; . I r e s u l t e d i n a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s i n t h e l u n g s o f r a t s t r e a t e d w i t h L P S . L P S e x p o s u r e p r o d u c e d a s i g n i f i c a n t r e d u c t i o n i n b o t h r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s i n b l o o d ( F i g u r e 3 . 7 ) a n d b l o o d t o t a l p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n ( F i g u r e 3 . 8 ) , a f i n d i n g c o n s i s t e n t w i t h p r e v i o u s s t u d i e s s h o w i n g t h a t L P S a d m i n i s t r a t i o n r e s u l t s i n t h r o m b o c y t o p e n i a ( P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 5 ) . P r e t r e a t m e n t w i t h G d C l 3 r e s u l t e d i n a l e s s p r o n o u n c e d d e c r e a s e i n r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s i n b l o o d a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n ( F i g u r e 3 . 7 ) , b u t i t d i d n o t s i g n i f i c a n t l y a l t e r b l o o d t o t a l p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n a f t e r L P S e x p o s u r e ( F i g u r e 3 . 8 ) . L P S a d m i n i s t r a t i o n r e s u l t e d i n a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , a s d e m o n s t r a t e d b y a d e c r e a s e i n p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n ( F i g u r e 3 . 9 ) . T h i s d e c r e a s e w a s n o t a f f e c t e d b y p r e t r e a t m e n t w i t h G d C l a . 1 1 4 F i g u r e 3 . 1 . h f f f n i - n r i l n n ' l . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h c o n t r o l l g o r a n t i - n e u t r o p h i l l g 1 8 a n d 6 h o u r s b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S . S i x h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r i t s s a l i n e ( S A L ) v e h i c l e , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r t h e e n u m e r a t i o n o f t o t a l w h i t e b l o o d c e l l c o u n t s a n d d i f f e r e n t i a l c o u n t s a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 4 - 7 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f L P S b , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f a n t i - n e u t r o p h i l I 9 ) l p / s l l e c ( s l i h p o r t u e N d o o l B 1 1 5 j I C o n t r o l l g 9 0 0 0 - - A n t i - P M N l g 5 0 0 0 - 3 0 0 0 - I 0 O 0 S A L L P S F i g u r e 3 . 1 1 1 6 F i g u r e 3 . 2 . T h - f f ‘ . - , r u h i l o - o l - i . i o ' o n o : n : A : ' \ . . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h a n t i - n e u t r o p h i l l g o r c o n t r o l l g ( 1 m l , i v ) 1 8 a n d 6 h o u r s b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r i t s S A L v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f p l a s m a A L T a c t i v i t y a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 4 - 7 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f L P S b , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f a n t i - n e u t r o p h i l I 9 3 ’ E ' : E 3 ‘ 3 3 5 0 < 3 ' ' < 5 Em 2 “ ' 1 C A o n n t t r i o — l P g l N M l g ( - 1 2 0 0 - 1 1 0 0 0 - O 0 4 0 0 0 0 - _ 2 0 0 - 0 r F : S i A g _ _ _ - L u r e 3 . 2 L P S 1 1 7 1 1 8 F i g u r e 3 . 3 . T h e e f f e e t e e f n e e t r e e h i l d e p l e t i e g e n d L E S e n h e e a t i e p l a t e l e t 5 1 0 1 1 1 5 1 1 3 1 1 0 0 - A l l a n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h m l n - l a b e l e d p l a t e l e t s ( i v ) 2 h r s b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h a n t i - n e u t r o p h i l l g o r c o n t r o l l g ( 1 m l , i v ) 1 8 a n d 6 h o u r s b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r i t s S A L v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , l i v e r s e c t i o n s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f r a d i o a c t i v i t y i n a g a m m a c o u n t e r a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 4 — 7 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f L P S b , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f a n t i - n e u t r o p h i l l 0 r e v i l n i m p c d e t c e j n i t n e c r e P 1 1 9 g o . 1 C o n t r o l l g 8 0 ‘ o , b 6 0 - o 5 0 - 4 0 - 2 0 ~ 1 0 - S A L L P S F i g u r e 3 . 3 1 2 0 F i g u r e 3 . 4 . T h e e f f e e t e e f n e g t r e e h i l d e p l e t i e n a n d L E S e n b l e e d p l a t e l e t W i p e . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h a n t i - n e u t r o p h i l l g o r c o n t r o l l g ( 1 m l , i v ) 1 8 a n d 6 h o u r s b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r i t s S A L v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r e n u m e r a t i o n o f b l o o d p l a t e l e t s a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 4 - 7 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f L P S b , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f a n t i - n e u t r o p h i l l 9 ‘ 2 ‘ [ 3 C o n t r o l l g ) l p / s l l e c 6 0 1 x ( s r e b m u N t e l e t a l P d o o l B 1 2 1 - A n t i - P M N l g 1 0 - S A L L P S F I G U R E 3 . 4 1 2 2 T A B L E 3 . 1 E f f e c t s o f N e u t r o p h i l D e p l e t i o n a n d L P S o n P l a t e l e t D i s t r i b u t i o n i n B l o o d , S p l e e n . K i d n e y s a n d L u n g s B L O O D ' 4 . 9 : l : 0 . 2 4 . 2 : l : 0 . 3 1 . 0 : t 0 . 1 * 1 . 3 : t 0 . 1 * S P L E E N 1 8 . 5 : t 1 . 4 2 2 . 9 : l : 1 . 9 1 2 . 8 : t 2 . 7 1 5 . 9 : 2 2 K I D N E Y 1 . 7 3 : 0 . 2 1 . 7 : l : 0 . 2 2 . 4 3 : 0 . 3 2 . 3 3 : 0 . 2 L U N G S 3 . 2 : t 0 . 2 3 . 5 3 : 0 . 4 3 . 0 : l : _ 0 . 5 2 . 3 3 : 0 . 4 A l l a n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h 1 1 1 l n - l a b e l e d p l a t e l e t s ( i v ) 2 h r s b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h a n t i - n e u t r o p h i l l g ( P M N ) o r c o n t r o l l g ( C o n ) 1 8 a n d 6 h o u r s b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r i t s S A L v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , b l o o d a n d o r g a n s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f r a d i o a c t i v i t y i n a g a m m a c o u n t e r a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s p e r c e n t o f i n j e c t e d r a d i o a c t i v i t y i n 1 m l b l o o d o r e n t i r e o r g a n ( m e a n : 1 : S E M ) , N = 4 - 7 p e r g r o u p . * s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e S A L g r o u p 1 2 3 F i g u r e 3 . 5 . T f f f P n l ' v i . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h G d C l 3 ( 1 0 m g / k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e ( S A L ) 2 4 h r s b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r i t s S A L v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f p l a s m a A L T a c t i v i t y a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 6 - 1 0 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f L P S b , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f G d C l 3 ) L / s t i n U ( y t i v i t c A T L A a m s a l P 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0 6 0 0 4 0 0 2 0 0 l L 1 2 4 S A L l l 1 S A L L P S F I G U R E 3 . 5 1 2 5 F i g u r e 3 . 6 . T - - - . ' . u O I O I I H - o z z : : o : - - ' n . A l l a n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h m l n - l a b e l e d p l a t e l e t s ( i v ) 2 h r s b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h G d C l 3 ( 1 0 m g l k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e ( S A L ) 2 4 h r s b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g l k g , i v ) o r i t s S A L v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , l i v e r s e c t i o n s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f r a d i o a c t i v i t y i n a g a m m a c o u n t e r a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 6 - 1 0 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f L P S b , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f G d C l 3 . 4 O . u 5 3 . 5 3 0 E — c o “ 0 3 2 0 — 0 0 . 2 : E 1 O o q | o c o d 1 2 6 L P S S A L F i g u r e 3 . 6 1 2 7 T A B L E 3 . 2 E f f e c t s o f G d C l 3 a n d L P S o n P l a t e l e t D i s t r i b u t i o n i n t h e S p l e e n , K i d n e y s a n d L u n g s ‘ " 8 0 8 1 - 8 M + 8 L G a o l + 8 A I - _ — S P L E E N ; 1 3 6 8 0 . 7 1 1 5 8 1 . 5 1 1 . 5 : l : 0 . 8 1 4 . 6 8 0 8 , K I D N E Y S E 2 . 4 . 8 2 . 0 2 1 8 1 . 6 4 . 5 8 1 . 1 4 . 4 8 1 . 1 L U N G S 5 2 5 8 0 . 2 2 7 8 0 . 2 2 0 8 0 . 2 3 . 5 1 : 0 . 1 “ R a t s w e r e p r e t r e a t e d w i t h G d C l 3 ( 1 0 m g l k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e ( S A L ) 2 4 h r s b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r i t s S A L v e h i c l e . T h e y w e r e g i v e n 1 1 1 l n - l a b e l e d p l a t e l e t s 2 h r s b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S o r i t s S A L v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S , b l o o d a n d o r g a n s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f r a d i o a c t i v i t y a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s p e r c e n t o f i n j e c t e d r a d i o a c t i v i t y i n e n t i r e o r g a n ( m e a n : 1 : S E M ) , N = 6 - 1 O p e r g r o u p . “ s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f L P S b S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f G d C l 3 J 1 2 8 F i g u r e 3 . 7 . T h f f f P n l n l ' ’ ' . A n i m a l s w e r e p r e t r e a t e d w i t h G d C l 3 ( 1 0 m g / k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e ( S A L ) 2 4 h r s b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g l k g , i v ) o r i t s S A L v e h i c l e . T o m e a s u r e r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t d i s t r i b u t i o n i n b l o o d a n d o r g a n s , r a t s w e r e t r e a t e d w i t h 1 1 1 l n - l a b e l e d p l a t e l e t s ( i v ) 2 h r s b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S . S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f r a d i o a c t i v i t y i n a g a m m a c o u n t e r a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : l : S E M , N = 6 - 1 0 p e r g r o u p . a , S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f L P S 0 , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f G d C l 3 5 o - o o E 4 _ — E L o o E g o 3 q “ 2 3 — 3 0 2 5 E u g e n . 4 | q 0 1 2 9 [ : 1 S A L - 0 c h s L P S S A L F i g u r e 3 . 7 1 3 0 F i g u r e 3 . 8 . T h f f f P n l i . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h G d C l 3 ( 1 0 m g l k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e ( S A L ) 2 4 h r s b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g l k g , i v ) o r i t s S A L v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r e n u m e r a t i o n o f b l o o d p l a t e l e t s a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 6 - 1 0 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f L P S 1 3 1 : 3 S A L I G d C l , d - L P S S A L F i g u r e 3 . 8 1 3 2 F i g u r e 3 . 9 . T h e e f f e e t e Q f L P S a n d £ 5 1 9 1 3 e n p l e e m e f i b t i n g g e n e g n g e n t r a t i e g . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h G d C l 3 ( 1 0 m g l k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e ( S A L ) 2 4 h r s b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g l k g , i v ) o r i t s S A L v e h i c l e . . S i x h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S , b l o o d w a s c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 8 S E M , N = 6 - 1 O p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f L P S A _ o \ m E v c o m o c t 1 n fi . o E m o E 1 3 3 1 5 0 - _ O O 2 2 5 0 7 . I D ) 1 . . _ 0 O 0 O L P S S A L F i g u r e 3 . 9 1 3 4 3 . E . D i s c u s s i o n I n t h i s S t u d y , r a t s e x p o s e d t o L P S d e v e l o p e d h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y , a s m e a s u r e d b y e l e v a t i o n s i n p l a s m a A L T a c t i v i t y a n d h i s t o l o g i c e v i d e n c e o f n e c r o s i s . T h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S a l s o r e s u l t e d i n a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d t h r o m b o c y t o p e n i a . T h e l o s s o f p l a t e l e t s i n t h e b l o o d w a s r e f l e c t e d i n a s i g n i f i c a n t a n d s e l e c t i v e a c c u m u l a t i o n o f p l a t e l e t s w i t h i n t h e l i v e r . T h e d i s t r i b u t i o n o f r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s i n t h e l u n g s , k i d n e y s a n d s p l e e n w a s n o t a l t e r e d b y e x p o s u r e t o L P S . T h e s e r e s u l t s c o n f i r m t h e e f f e c t s o f L P S e x p o s u r e r e p o r t e d p r e v i o u s l y ( P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 5 ) . B o t h n e u t r o p h i l s a n d p l a t e l e t s a c c u m u l a t e i n t h e l i v e r s o f L P S - t r e a t e d a n i m a l s ( H e w e t t e t a l . 1 9 9 2 ; L e v y e r a l . 1 9 6 8 b ; E n d o e r a l . 1 9 9 2 ) . T o u n c o v e r i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e s e i n f l a m m a t o r y c e l l s i n L P S - m e d i a t e d a l t e r a t i o n s i n v i v a , a n i m a l s w e r e r e n d e r e d n e u t r o p e n i c b y t h e a d m i n i s t r a t i o n o f a n a n t i - n e u t r o p h i l l g . A S s h o w n p r e v i o u s l y ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 2 ; J a e s c h k e e t a l . , 1 9 9 1 b ) , n e u t r o p h i l - d e p l e t e d a n i m a l s w e r e l e s s s e n s i t i v e t o t h e h e p a t o t o x i c e f f e c t s o f L P S . H o w e v e r , d e s p i t e t h e c a p a c i t y o f a c t i v a t e d n e u t r o p h i l s t o a d h e r e t o a n d s t i m u l a t e p l a t e l e t s a n d c a u s e t h e m t o e x p r e s s g l y c o p r o t e i n l l b / l l l a i n v i t r a ( E v a n g e l i s t a e r a l . , 1 9 9 2 ; L a R o s a e t a l . , 1 9 9 4 ) , n e u t r o p h i l s a p p a r e n t l y d o n o t c o n t r i b u t e t o L P S - i n d u c e d h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n , s i n c e h e p a t i c r a d i o a c t i v i t y r e m a i n e d e l e v a t e d i n n e u t r o p e n i c a n i m a l s . I n t h i s s t u d y , t h e r o l e o f K u p f f e r c e l l s i n L P S - m e d i a t e d p a t h o p h y s i o l o g y w a s e v a l u a t e d b y t h e p r e t r e a t m e n t w i t h G d C l a . G d C l 3 f o r m s i n s o l u b l e 1 3 5 c a r b o n a t e a n d p h o s p h a t e p r e c i p i t a t e s i n b l o o d w h i c h a r e p h a g o c y t o s e d b y K u p f f e r c e l l s , r e s u l t i n g i n t h e i r i n a c t i v a t i o n ( D e a n e t a l . , 1 9 8 8 ; H a r d o n k e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h e G d C l 3 t r e a t m e n t r e g i m e n w e u s e d i n h i b i t s K u p f f e r c e l l p h a g o c y t o s i s o f c a r b o n p a r t i c l e s i n v i v a , a s m e a s u r e d b y c a r b o n c l e a r a n c e a n d h i s t o l o g i c a n d m o r p h o l o g i c a n a l y s i s ( H a r d o n k e t a l . , 1 9 9 2 ; G a n e y e t a l . , 1 9 9 3 ) . C o n s i s t e n t w i t h o t h e r s t u d i e s ( l i m u r o e t a l . , 1 9 9 4 ; B r o w n e t a l . , 1 9 9 5 ) , p r e t r e a t m e n t w i t h G d C l 3 a t t e n u a t e d t h e h e p a t o t o x i c i t y o b s e r v e d a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n . T h e m e c h a n i s m s b y w h i c h K u p f f e r c e l l i n h i b i t i o n w i t h G d C l 3 l e a d s t o p r o t e c t i o n f r o m l i v e r i n j u r y r e m a i n s u n c l e a r . I n a p r e v i o u s s t u d y , G d C l 3 a d m i n i s t r a t i o n d i d n o t r e d u c e h e p a t i c n e u t r o p h i l a c c u m u l a t i o n o b s e r v e d a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n ( l i m u r o e t a l . , 1 9 9 4 ; B r o w n e t a l . , 1 9 9 5 ) , s u g g e s t i n g t h a t K u p f f e r c e l l s a r e n o t n e e d e d f o r t h e a c c u m u l a t i o n o f n e u t r o p h i l s i n t h e l i v e r . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t e d t h a t K u p f f e r c e l l s c o n t r i b u t e t o s o m e o t h e r c r i t i c a l e v e n t r e q u i r e d f o r t h e e x p r e s s i o n o f h e p a t i c i n j u r y a f t e r L P S e x p o s u r e . T h e i n h i b i t i o n o r d e p l e t i o n o f K u p f f e r c e l l s a n d p l a t e l e t s , r e s p e c t i v e l y , p r o t e c t s c o m p l e t e l y a g a i n s t t h e h e p a t o t o x i c e f f e c t s o f L P S , s u g g e s t i n g t h a t t h e s e c e l l s m i g h t b e l i n k e d i n t h e p a t h o g e n e s i s . T o u n c o v e r a n i n t e r a c t i o n b e t w e e n K u p f f e r c e l l s a n d p l a t e l e t s d u r i n g L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y , w e e v a l u a t e d t h e e f f e c t o f p r e t r e a t m e n t w i t h G d C l 3 o n h e p a t i c a c c u m u l a t i o n o f 1 1 1 l n - l a b e l e d p l a t e l e t s . P r e t r e a t m e n t w i t h G d C l 3 r e d u c e d h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n d u r i n g L P S e x p o s u r e ( F i g u r e 3 . 6 ) , s u g g e s t i n g t h a t K u p f f e r c e l l s c o n t r i b u t e i n p a r t t o t h e h e p a t i c p l a t e l e t s e q u e s t r a t i o n . T h e e x a c t m e c h a n i s m b y w h i c h K u p f f e r c e l l s m e d i a t e h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n i s n o t f u l l y 1 3 6 u n d e r s t o o d . T h e a c c u m u l a t i o n o f r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s w i t h i n t h e l i v e r i s n o t l i k e l y d u e t o t h e r e m o v a l o f p l a t e l e t s i n j u r e d b y t h e r a d i o l a b e l i n g p r o c e d u r e , s i n c e n u m e r o u s S t u d i e s h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t t h i s t e c h n i q u e d o e s n o t a l t e r p l a t e l e t f u n c t i o n ( W h i t e e t a l . , 1 9 8 8 ; C h r i s t e n s o n e t a l . , 1 9 8 7 ; S o s t m a n e t a l . , 1 9 8 3 ) . T h e f i n d i n g t h a t K u p f f e r c e l l s c o n t r i b u t e t o h e p a t i c p l a t e l e t s e q u e s t r a t i o n i S c o n s i s t e n t w i t h e l e c t r o n m i c r o g r a p h i c S t u d i e s w h i c h h a v e S h o w n t h a t L P S e x p o s u r e r e s u l t s i n t h e p r e s e n c e o f p l a t e l e t s b o t h w i t h i n K u p f f e r c e l l s a n d w i t h i n t h e s i n u s o i d s a n d t h e s p a c e s o f D i s s e ( E n d o e r a l . , 1 9 9 3 ) . U s i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y , w e h a v e c o n f i r m e d i n t h i s m o d e l t h e p r e s e n c e o f p l a t e l e t s i n b o t h t h e K u p f f e r c e l l s a n d s i n u s o i d s 6 h r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n ( u n p u b l i s h e d r e s u l t s ) . K u p f f e r c e l l s c o u l d c o n t r i b u t e t o h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n b y s e v e r a l m e c h a n i s m s . T h e h e p a t i c r e t i c u l o e n d o t h e l i a l s y s t e m , c o n s i s t i n g o f K u p f f e r c e l l s a n d e n d o t h e l i a l c e l l s , c a n c l e a r s e n e s c e n t p l a t e l e t s a s w e l l a s p l a t e l e t - i m m u n e c o m p l e x e s , a s o b s e r v e d d u r i n g i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a p u r p u r a ( d u P H e y n s e t a l . , 1 9 8 6 ) . T h e c l e a r a n c e o f p l a t e l e t s b y K u p f f e r c e l l s m a y b e m e d i a t e d b y t h e C 1 q r e c e p t o r l o c a t e d o n K u p f f e r c e l l s ( T o t h e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h i s r e c e p t o r c o m p l e x c o n t r i b u t e s t o t h e c l e a r a n c e o f n u m e r o u s c e l l s , c o a g u l a t i o n f a c t o r s , b a c t e r i a a n d c e l l u l a r d e b r i s a f t e r o p s o n i z a t i o n o f t h e p a r t i c u l a t e m a t t e r w i t h f i b r o n e c t i n , a n a b u n d a n t s e r u m c o n s t i t u e n t . S t i m u l a t e d K u p f f e r c e l l s r e l e a s e f i b r o n e c t i n , a n d L P S a d m i n i s t r a t i o n i n c r e a s e s s e r u m f i b r o n e c t i n c o n c e n t r a t i o n ( T o t h e t a l . , 1 9 9 2 ; R i c h a r d s e t a l . , 1 9 8 5 ) . M o r e o v e r , e n h a n c e d K u p f f e r c e l l p h a g o c y t i c a c t i v i t y o b s e r v e d a f t e r c h a l l e n g e w i t h a s m a l l d o s e o f L P S c o r r e l a t e s 1 3 7 w i t h e l e v a t e d p l a s m a f i b r o n e c t i n c o n c e n t r a t i o n ( R i c h a r d s e t a l . , 1 9 8 5 ) . A c c o r d i n g l y , t h e K u p f f e r c e l l s m a y c o n t r i b u t e t o h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n b y a m e c h a n i s m i n v o l v i n g L P S + m e d i a t e d c h a n g e s i n f i b r o n e c t i n c o n c e n t r a t i o n . T h e a d m i n i s t r a t i o n o f t h e a n t i - n e u t r o p h i l l g c o u l d s t i m u l a t e K u p f f e r c e l l s b y t h e f o r m a t i o n o f a n t i b o d y - a n t i g e n c o m p l e x e s . E n h a n c e d K u p f f e r c e l l a c t i v i t y c o u l d s t i m u l a t e p h a g o c y t o s i s o f p l a t e l e t s . S u c h a m e c h a n i s m w o u l d e x p l a i n t h e f i n d i n g t h a t a n t i - n e u t r o p h i l l g a d m i n i s t r a t i o n i n c r e a s e d h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n , e v e n i n t h e a b s e n c e o f L P S . K u p f f e r c e l l s c o u l d a l s o c o n t r i b u t e t o h e p a t i c p l a t e l e t s e q u e s t r a t i o n b y r e l e a s i n g s o l u b l e m e d i a t o r s t h a t a c t i v a t e p l a t e l e t s . F o r e x a m p l e , i n v i t r o , L P S - s t i m u l a t e d K u p f f e r c e l l s r e l e a s e t h r o m b o x a n e A , , a p o t e n t p l a t e l e t a c t i v a t o r ( R o d r i g u e z d e T u r c o e t a l . , 1 9 9 0 ; I s h i g u r o e t a l . , 1 9 9 4 ) . P l a s m a c o n c e n t r a t i o n o f t h r o m b o x a n e 8 , , t h e s t a b l e m e t a b o l i t e o f t h r o m b o x a n e A 2 , i s e l e v a t e d a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n i n v i v a ( W i s e e t a l . , 1 9 8 0 ) . H o w e v e r , t h e c e l l u l a r s o u r c e o f t h i s t h r o m b o x a n e a n d t h e r o l e o f t h r o m b o x a n e i n L P S - i n d u c e d h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n a r e n o t k n o w n . K u p f f e r c e l l s a n d n e u t r o p h i l s r e l e a s e o x y g e n r a d i c a l s i n r e s p o n s e t o L P S e x p o s u r e ( L i u e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h i s r e s p i r a t o r y b u r s t c o u l d d i r e c t l y i n f l u e n c e p l a t e l e t s , i n a s m u c h a s l a r g e c o n c e n t r a t i o n s o f h y d r o g e n p e r o x i d e s t i m u l a t e p l a t e l e t a g g r e g a t i o n ( S a l v e m i n i e t a l . , 1 9 9 3 ) . A l t e r n a t i v e l y , a c t i v a t e d K u p f f e r c e l l s , t h r o u g h t h e r e l e a s e o f I i p o x y g e n a s e m e t a b o l i t e s a n d o x y g e n r a d i c a l s , c a n d i r e c t l y i n j u r e t h e s i n o s o i d a l e n d o t h e l i u m ( D e a c i u c e r a l . , 1 9 9 3 a ; D e a c i u c e t a l . , 1 9 9 4 ; A r a i e r a l . , 1 9 9 3 ; L i u e t a l . , 1 9 9 4 ) . a n e v e n t t h a t p r o m o t e s p l a t e l e t a g g r e g a t i o n . M o r e o v e r , o x y g e n r a d i c a l - m e d i a t e d i n j u r y t o t h e 1 3 8 e n d o t h e l i u m , t h r o u g h c h a n g e s i n t h e p r o d u c t i o n o f p l a t e l e t i n h i b i t o r s s u c h a s p r o s t a c y c l i n a n d n i t r i c o x i d e , m a y a l t e r t h e a c t i v i t y o f p l a t e l e t s ( S a l v e m i n i e t a l . , 1 9 9 3 ) . S i n c e t r e a t m e n t w i t h G d C l 3 i n h i b i t s s u p e r o x i d e p r o d u c t i o n f r o m K u p f f e r c e l l s ( l i m u r o e t a l . , 1 9 9 4 ) , i t i s p o s s i b l e t h a t t h e s e r e s i d e n t m a c r o p h a g e s c o n t r i b u t e t o h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n b y a m e c h a n i s m i n v o l v i n g o x y g e n r a d i c a l - m e d i a t e d e n d o t h e l i a l c e l l i n j u r y . T h e s e p o t e n t i a l i n t e r a c t i o n s b e t w e e n K u p f f e r c e l l s , t h e e n d o t h e l i u m a n d p l a t e l e t s h a v e n o t b e e n w e l l c h a r a c t e r i z e d d u r i n g L P S e x p o s u r e i n v i v a . A S S h o w n p r e v i o u s l y ( P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 5 ) , t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S r e s u l t e d i n a p r o n o u n c e d t h r o m b o c y t o p e n i a . D e c r e a s e s i n t o t a l p l a t e l e t s ( F i g u r e 3 . 8 ) a s w e l l a s r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s i n b l o o d ( F i g u r e 3 . 7 ) f o l l o w e d L P S i n j e c t i o n . P r e t r e a t m e n t w i t h G d C l a a t t e n u a t e d t h e d e c r e a s e i n b l o o d r a d i o a c t i v i t y ; h o w e v e r , i t d i d n o t s i g n i f i c a n t l y a l t e r t o t a l b l o o d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n . T h e s e c o n t r a s t i n g r e s u l t s m a y b e e x p l a i n e d b y p l a t e l e t d y n a m i c s i n v i v a . T h e c o n c e n t r a t i o n o f e n d o g e n o u s p l a t e l e t s i s d e t e r m i n e d b y r a t e s o f b o t h r e m o v a l a n d r e p l e n i s h m e n t . A c c o r d i n g l y , t o t a l b l o o d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n i s i n f l u e n c e d b y b o t h o f t h e s e f a c t o r s , w h e r e a s t h e n u m b e r o f i n j e c t e d , r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s i s i n f l u e n c e d o n l y b y p r o c e s s e s o f r e m o v a l . T h e r e m o v a l o f p l a t e l e t s f r o m t h e c i r c u l a t i o n s t i m u l a t e s a r a p i d r e p l e n i s h m e n t o f t h e m f r o m s p l e n i c m e g a k a r y o c y t e s ( d u P H e y n s e t a l . , 1 9 8 5 ) . A c c o r d i n g l y ; w h e n L P S e x p o s u r e r e s u l t s i n t h r o m b o c y t o p e n i a , i t i s l i k e l y t h a t t h e m e g a k a r y o c y t i c p o o l r e s p o n d s b y r e l e a s i n g p l a t e l e t s i n t o t h e b l o o d . T h i s w o u l d t e n d t o i n c r e a s e t o t a l p l a t e l e t 1 3 9 c o n c e n t r a t i o n i n b l o o d b u t w o u l d o b v i o u s l y n o t c o n t r i b u t e t o t h e n u m b e r s o f r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s . T h e a t t e n u a t i o n b y G d C l 3 o f t h e L P S - i n d u c e d d e c r e a s e i n " ‘ l n - l a b e l e d p l a t e l e t s ( F i g u r e 3 . 7 ) i n d i c a t e s t h a t G d C l 3 p r e t r e a t m e n t r e d u c e d t h e r e m o v a l o f p l a t e l e t s f r o m t h e c i r c u l a t i o n . T h i s w o u l d b e e x p e c t e d a l s o t o r e d u c e t h e S t i m u l u s f o r p l a t e l e t r e l e a s e f r o m s t o r a g e p o o l s . A c c o r d i n g l y , t h e c o n s e q u e n t r e d u c t i o n i n t h e c o m p e n s a t o r y r e l e a s e o f p l a t e l e t s f r o m m e g a k a r y o c y t e s i n t o b l o o d m a y h a v e r e s u l t e d i n n o n e t e f f e c t o f G d C l 3 p r e t r e a t m e n t o n L P S - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a ( F i g u r e 3 . 8 ) d e s p i t e i t s e f f e c t i n d e c r e a s i n g p l a t e l e t r e m o v a l f r o m b l o o d ( F i g u r e 3 . 7 ) . T h u s , p l a t e l e t s n e w l y r e l e a s e d f r o m e n d o g e n o u s s t o r a g e p o o l s l i k e l y r e p r e s e n t a g r e a t e r p e r c e n t a g e o f t o t a l b l o o d p l a t e l e t s i n r a t s t r e a t e d w i t h o n l y L P S c o m p a r e d t o t h o s e t h a t a l s o r e c e i v e d G d C l a . E x p o s u r e t o L P S r e s u l t e d i n a r e d i s t r i b u t i o n o f p l a t e l e t s , s i n c e b l o o d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n d e c r e a s e d a n d p l a t e l e t s a c c u m u l a t e d i n t h e l i v e r . B y c o n t r a s t , L P S a d m i n i s t r a t i o n d i d n o t a l t e r t h e d i s t r i b u t i o n o f r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s i n t h e s p l e e n , k i d n e y s o r l u n g s . I n c o n t r a s t t o p l a t e l e t s , n e u t r o p h i l s a c c u m u l a t e i n l a r g e n u m b e r s i n a l v e o l a r w a l l s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n ( F r e v e r t e r a l . , 1 9 9 2 ; B r o w n e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h i s d i f f e r e n c e s u g g e s t s t h a t t i s s u e n e u t r o p h i l a c c u m u l a t i o n d o e s n o t n e c e s s a r i l y p r o m o t e a c c u m u l a t i o n o f p l a t e l e t s , a c o n c l u s i o n c o n s i s t e n t w i t h t h e r e s u l t s i n l i v e r ( s e e a b o v e ) . G d C l 3 t r e a t m e n t r e s u l t s i n a m o d e s t i n c r e a s e i n p u l m o n a r y p l a t e l e t s i n a n i m a l s g i v e n L P S . T h i s s u g g e s t s t h a t r e d u c e d K u p f f e r c e l l a c t i v i t y r e s u l t s i n a n i n c r e a s e i n p u l m o n a r y p l a t e l e t s . T h i s m a k e s s e n s e , i f , a s t h e r e s u l t s i n l i v e r s u g g e s t , K u p f f e r c e l l s a r e 1 4 0 r e s p o n s i b l e f o r p h a g o c y t o s i n g a p o p u l a t i o n o f c i r c u l a t i n g p l a t e l e t s a l t e r e d d u r i n g L P S e x p o s u r e . I n h i b i t i o n o f K u p f f e r c e l l p h a g o c y t o s i s o f s u c h p l a t e l e t s w o u l d a l l o w a c c e s s o f t h e m t o o t h e r t i s s u e s , w h e r e t h e a l t e r e d p l a t e l e t s m i g h t t e n d t o a c c u m u l a t e . S i n c e t h e p u l m o n a r y v a s c u l a t u r e r e p r e s e n t s t h e f i r s t c a p i l l a r y b e d d o w n s t r e a m f r o m t h e l i v e r , i t i s r e a s o n a b l e t h a t t h e l u n g s w o u l d b e a s i t e o f a c c u m u l a t i o n i n t h i s c i r c u m s t a n c e . I n s u m m a r y , n e u t r o p h i l d e p l e t i o n w a s a s s o c i a t e d w i t h a n a t t e n u a t i o n o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y a n d t h r o m b o c y t o p e n i a , b u t h a d n o e f f e c t o n h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t n e u t r o p h i l s c o n t r i b u t e t o l i v e r i n j u r y b y a m e c h a n i s m t h a t i s i n d e p e n d e n t o f h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n . G d C l 3 g i v e n a t a d o s e t h a t i n h i b i t s K u p f f e r c e l l p h a g o c y t o s i s p r o t e c t e d r a t s a g a i n s t l i v e r i n j u r y a n d a t t e n u a t e d b o t h t h e r e m o v a l o f r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s f r o m t h e b l o o d a n d t h e i r a c c u m u l a t i o n i n t h e l i v e r . B y c o n t r a s t , K u p f f e r c e l l i n h i b i t i o n d i d n o t a f f e c t t h e L P S - i n d u c e d a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t K u p f f e r c e l l s c o n t r i b u t e t o t h e h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n d u r i n g L P S e x p o s u r e b y a m e c h a n s i m t h a t i s i n d e p e n d e n t o f t h e t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m . 1 \ > 4 9 . . 7 3 1 h . 3 v : 5 n ‘ < 3 5 5 “ i . ; 1 . i 1 . 3 ! “ fi . I : i 1 . 2 i . . 3 . . . . . . . . { A 1 : . I . $ 0 : 2 . 3 3 1 9 : : . . . . . . ~ 5 E . r Q m . A p r m i l f a l : z . a . u . t . 5 . 1 x . . . . 5 “ " . a 1 . 3 . : . . . t . . h . . : A 3 l 5 ' . “ a . . . 5 ( " ‘ Q 3 ( . . I . f . . . 3 . . . i s " : I . . \ . h ! l 1 1 . . € . ¢ . . u . . fi . € . 5 f I \ l . c : ‘ i t l n . . V P 4 3 9 . . ? . . . i . . . . f . 1 . ! . . . 3 w 1 m f ' { . . i » “ n . . . u . . p : . . . . 1 3 ‘ . : 5 z 3 . ‘ 1 , a 3 5 v 5 . \ ‘ 3 1 . 1 8 . : A 3 . I . ) } 1 : v i 1 . . , 6 1 5 m : P L A C E l l R E T U R N B O X t o r o m a n t h i s c h e c k o u t f r o m y o u r n o o r d . T O A V O I D F I N E S M u m o n o r M o r e d u o d u o . D A T E D U E D A T E D U E D A T E D U E 1 | I I M S U l s A n A f fl n n a fl v o M u m / E m i l O p p o m m l t y l m t l t u i o n W m 1 T H E R O L E O F P L A T E L E T S I N L l P O P O L Y S A C C H A R I D E - I N D U C E D L I V E R I N J U R Y V o l u m e I I b y J u l i a M e r y l P e a r s o n A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l f i l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y D e p a r t m e n t o f P h a r m a c o l o g y a n d T o x i c o l o g y 1 9 9 6 C H A P T E R 4 T H E R O L E O F T H R O M B I N I N L P S - M E D I A T E D L I V E R I N J U R Y 1 4 1 1 4 2 4 . A . A b s t r a c t T h e i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( L P S ) f r o m g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a t o r a t s r e s u l t s i n h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l i n j u r y w i t h i n 6 h r s . T h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d p l a t e l e t s a r e c r i t i c a l t o t h e p a t h o g e n e s i s s i n c e p r e t r e a t m e n t w i t h t h e a n t i c o a g u l a n t s , w a r f a r i n o r h e p a r i n , o r p l a t e l e t d e p l e t i o n a t t e n u a t e d L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . P r i o r d e p l e t i o n o f f i b r i n o g e n w i t h a n c r o d d i d n o t p r e v e n t l i v e r i n j u r y , s u g g e s t i n g t h a t t h r o m b i n m a y b e a k e y m e d i a t o r o f l i v e r i n j u r y i n t h i s m o d e l . H o w e v e r , a n y i n t e r a c t i o n b e t w e e n p l a t e l e t s a n d t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a s i t r e l a t e s t o l i v e r i n j u r y i n v i v o i s n o t f u l l y u n d e r s t o o d . A c c o r d i n g l y , w e t e s t e d t h e e f f e c t o f p r e t r e a t i n g a n i m a l s w i t h t h e a n t i c o a g u l a n t , h e p a r i n , a n d t h e t h r o m b i n i n h i b i t o r , h i r u d i n , o n L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y , t h r o m b o c y t o p e n i a a n d h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n . P r e t r e a t m e n t w i t h h e p a r i n o r h i r u d i n e f f e c t i v e l y i n h i b i t e d c o a g u l a t i o n , a s e v i d e n c e d b y p r o l o n g e d a c t i v a t e d p a r t i a l t h r o m b o p l a s t i n t i m e ( A P T T ) a n d b y m a i n t e n a n c e o f p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n i n L P S - t r e a t e d r a t s . T r e a t m e n t w i t h h e p a r i n o r h i r u d i n p r e v e n t e d L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y , a s s e s s e d b y p l a s m a a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e a c t i v i t y a n d h i s t o l o g i c e v i d e n c e o f h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s . P r e t r e a t m e n t w i t h e i t h e r h e p a r i n o r h i r u d i n d i d n o t a l t e r L P S - i n d u c e d h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n . F u r t h e r m o r e , p r e t r e a t m e n t w i t h h i r u d i n , b u t n o t h e p a r i n , p a r t i a l l y a t t e n u a t e d t h e d e c r e a s e i n b l o o d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n t h a t a c c o m p a n i e d L P S a d m i n i s t r a t i o n . T h e s e f i n d i n g s s u g g e s t e d t h a t t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , i n p a r t i c u l a r t h r o m b i n , i s i n v o l v e d i n L P S — i n d u c e d l i v e r i n j u r y b y a m e c h a n i s m w h i c h i s i n d e p e n d e n t o f 1 4 3 h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n . T o e l u c i d a t e f u r t h e r t h e r o l e o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i n t h e m e c h a n i s m o f l i v e r i n j u r y i n t h i s m o d e l , w e a d m i n i s t e r e d h e p a r i n o r h i r u d i n a t v a r i o u s t i m e s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n . W h e n h e p a r i n o r h i r u d i n w a s a d m i n i s t e r e d 2 . 5 h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S , a t i m e w h e n p l a t e l e t s h a v e a c c u m u l a t e d w i t h i n t h e l i v e r , h e p a t i c i n j u r y w a s p r e v e n t e d . T h e s e f i n d i n g s s u g g e s t t h a t t h r o m b i n i s a c r i t i c a l a n d d i s t a l m e d i a t o r o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . 4 . B . I n t r o d u c t i o n E v i d e n c e f o r a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m d u r i n g L P S e x p o s u r e i n c l u d e s a p r o n o u n c e d d e c r e a s e i n p l a s m a f i b r i n o g e n ( P r a g e r e t a l . , 1 9 7 9 ) , a n i n c r e a s e i n t h e p r o t h r o m b i n a n d p a r t i a l t h r o m b o p l a s t i n t i m e s ( Y o s h i k a w a e t a l . , 1 9 8 1 ) a n d e l e v a t i o n s o f p l a s m a f i b r i n d e g r a d a t i o n p r o d u c t s ( G o m e z e t a l . , 1 9 8 9 ) . T h e s e a l t e r a t i o n s i n t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m b e g i n 2 - 3 h r s a f t e r t h e i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f L P S a n d o c c u r p r i o r t o t h e o n s e t o f l i v e r i n j u r y ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 5 ; P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a p p e a r s t o c o n t r i b u t e t o L P S - i n d u c e d h e p a t o c e l l u l a r d a m a g e , s i n c e p r e t r e a t m e n t w i t h a n t i c o a g u l a n t s s u c h a s w a r f a r i n o r h e p a r i n a t d o s e s l a r g e e n o u g h t o r e d u c e t h r o m b i n a c t i v i t y a t t e n u a t e s l i v e r i n j u r y ( M a r g a r e t t e n e t a l . , 1 9 6 7 ; H e w e t t e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h e a c t u a l m e c h a n i s m b y w h i c h t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m c o n t r i b u t e s 1 4 4 t o h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l i n j u r y r e m a i n s u n c l e a r , b u t e v i d e n c e s u g g e s t s t h a t t h e l i v e r i n j u r y i s i n d e p e n d e n t o f f i b r i n o g e n a n d f o r m a t i o n o f i n s o l u b l e f i b r i n c l o t s ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 5 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e f i n d i n g s i m p l i c a t e t h r o m b i n a s a p o s s i b l e m e d i a t o r o f L P S - i n d u c e d h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y . L P S e x p o s u r e a l s o r e s u l t s i n a d e c r e a s e i n b l o o d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n w i t h i n 2 - 3 h r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n t o r a t s ( P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 5 ) . S t u d i e s w i t h 1 1 1 i n d i u m - l a b e l e d p l a t e l e t s s h o w t h a t p l a t e l e t s b e g i n t o a c c u m u l a t e i n t h e l i v e r w i t h i n 1 h r a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n a n d p r i o r t o t h e o n s e t o f l i v e r i n j u r y ( P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 5 ) . F u r t h e r m o r e , p l a t e l e t s a p p e a r t o c o n t r i b u t e t o l i v e r i n j u r y s i n c e d e p l e t i o n o f p l a t e l e t s p r i o r t o L P S a d m i n i s t r a t i o n p r e v e n t s h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y ( P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h e m e c h a n i s m b y w h i c h p l a t e l e t s c o n t r i b u t e t o l i v e r i n j u r y i s n o t k n o w n , h o w e v e r p l a t e l e t d e p l e t i o n s t u d i e s s u g g e s t t h a t p l a t e l e t s a r e c r i t i c a l f o r t h e L P S - i n d u c e d a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n c a s c a d e ( P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h e s e f i n d i n g s s u p p o r t t h e h y p o t h e s i s t h a t p l a t e l e t s i n t e r a c t w i t h t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i n t h e d e v e l o p m e n t o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y i n v i v a . T o o u r k n o w l e d g e , t h e r e a r e n o r e p o r t s d e s c r i b i n g h o w p l a t e l e t s a n d t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i n t e r a c t t o c o n t r i b u t e t o l i v e r i n j u r y i n v i v a . T o i n c r e a s e u n d e r s t a n d i n g o f i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e s e i n f l a m m a t o r y c o m p o n e n t s d u r i n g t h e g e n e s i s o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y i n v i v a , r a t s w e r e p r e t r e a t e d w i t h h e p a r i n o r t h e h i g h l y s e l e c t i v e t h r o m b i n i n h i b i t o r , h i r u d i n , t o d e t e r m i n e t h e r o l e o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d t h r o m b i n i n L P S - i n d u c e d h e p a t i c p l a t e l e t s e q u e s t r a t i o n . I n a d d i t i o n , i n a n a t t e m p t t o u n d e r s t a n d w h e n t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m 1 4 5 c o n t r i b u t e s t o h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y , h e p a r i n o r h i r u d i n w a s a d m i n i s t e r e d a t v a r i o u s t i m e s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S . 4 . C . M a t e r i a l s a n d m e t h o d s 4 . C . 1 . M a t e r i a l s S e e C h a p t e r 2 , s e c t i o n C . 1 . R e a g e n t s f o r m e a s u r e m e n t o f a c t i v a t e d p a r t i a l t h r o m b o p l a s t i n t i m e s ( A P T T s ) w e r e p u r c h a s e d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o m p a n y ( S t . L o u i s , M O ) . A P T T s w e r e m e a s u r e d i n a B B L F i b r o m e t e r ( B e c t o n , D i c k i n s o n a n d C o m p a n y , H u n t V a l l e y , M D ) . R e c o m b i n a n t h i r u d i n ( H E W - 0 2 3 ) w a s a g e n e r o u s g i f t f r o m B e h r i n g ( B e h r i n g w e r k e A k t i e n g e s e l l s c h a f t , M a r b u r g , G e r m a n y ) . 4 . C . 2 . A n i m a l s S e e C h a p t e r 2 , S e c t i o n 0 . 2 4 . C . 3 . Q u a n t i f i c a t i o n o f h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n S e e C h a p t e r 2 , S e c t i o n C 2 . 4 . D . 4 . H e p a r i n p r e t r e a t m e n t s t u d i e s R a t s w e r e g i v e n r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s 2 h r s b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( t i m e 0 h r ) a s d e s c r i b e d a b o v e . O n e h o u r p r i o r t o t h e a d m i n i s t r a t i o n o f 1 4 6 L P S , a n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h h e p a r i n ( 2 0 0 0 U / k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e , a n i m a l s w e r e a n e s t h e t i z e d w i t h s o d i u m p e n t o b a r b i t a l ( 5 0 m g / k g , i p ) a n d a m i d l i n e l a p a r o t o m y w a s p e r f o r m e d . B l o o d w a s d r a w n i n t o s o d i u m c i t r a t e ( 0 . 3 8 % f i n a l c o n c e n t r a t i o n ) f r o m t h e d e s c e n d i n g a o r t a a n d o r g a n s w e r e c o l l e c t e d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f r a d i o a c t i v i t y ( s e e a b o v e ) . L i v e r s e c t i o n s w e r e f i x e d i n 1 0 % n e u t r a l b u f f e r e d f o r m a l i n a n d p r o c e s s e d f o r h i s t o l o g i c e v a l u a t i o n . B l o o d p l a t e l e t s w e r e d e t e r m i n e d i n a h e m a c y t o m e t e r a f t e r r e d c e l l l y s i s a n d d i l u t i o n i n p l a t e l e t U n o p e t t e s . P l a s m a s a m p l e s w e r e a s s a y e d f o r p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n a n d A P T T i n a B B L F i b r o m e t e r ( B e c t o n , D i c k i n s o n a n d C o m p a n y , H u n t V a l l e y , M D ) a n d f o r A L T a c t i v i t y . 4 . C . 5 . H i r u d i n p r e t r e a t m e n t s t u d i e s T o a s s e s s t h e r o l e o f t h r o m b i n i n L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y , a n i m a l s w e r e p r e t r e a t e d w i t h r e c o m b i n a n t h i r u d i n . P r e l i m i n a r y s t u d i e s w e r e c o n d u c t e d t o d e t e r m i n e a d o s e a n d r o u t e o f a d m i n i s t r a t i o n o f h i r u d i n t h a t w o u l d e f f e c t i v e l y i n h i b i t t h r o m b i n a s m e a s u r e d b y e l e v a t i o n s i n a c t i v a t e d p a r t i a l t h r o m b o p l a s t i n t i m e s ( A P T T s ) . A l l a n i m a l s w e r e g i v e n r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s t o e v a l u a t e h e p a t i c p l a t e l e t s e q u e s t r a t i o n . T w o h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s , a n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h L P S ( 5 m g / k g , i v ) o r s a l i n e v e h i c l e ( C O N T R O L ) . T h e y w e r e t h e n t r e a t e d w i t h r e c o m b i n a n t h i r u d i n ( 3 6 , 0 0 0 u n i t s / k g , s o ) o r i t s s a l i n e ( S A L ) v e h i c l e 0 . 5 , 2 . 5 a n d 4 . 5 h r a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S . S i x h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S , a n i m a l s w e r e 1 4 7 a n e s t h e t i z e d w i t h s o d i u m p e n t o b a r b i t a l ( 5 0 m g / k g , i p ) a n d a m i d l i n e l a p a r o t o m y w a s p e r f o r m e d . B l o o d w a s d r a w n i n t o s o d i u m c i t r a t e ( 0 . 3 8 % f i n a l c o n c e n t r a t i o n ) f r o m t h e d e s c e n d i n g a o r t a , a n d o r g a n s w e r e c o l l e c t e d f o r d e t e r m i n a t i o n o f r a d i o a c t i v i t y ( s e e a b o v e ) . L i v e r s e c t i o n s w e r e f i x e d i n 1 0 % n e u t r a l b u f f e r e d f o r m a l i n a n d p r o c e s s e d f o r h i s t o l o g i c e v a l u a t i o n . B l o o d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s w e r e d e t e r m i n e d i n a h e m o c y t o m e t e r a f t e r e r y t h r o c y t e l y s i s a n d d i l u t i o n i n p l a t e l e t U n o p e t t e s . P l a s m a s a m p l e s w e r e a s s a y e d f o r A P T T , f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 5 ; M a r g a r e t t e n e t a l . , 1 9 6 7 ) a n d A L T a c t i v i t y . 4 . C . 6 . Q u a n t i f i c a t i o n o f h e p a t i c n e u t r o p h i l a c c u m u l a t i o n S e e C h a p t e r 2 , s e c t i o n 3 . 4 . C . 7 . H e p a r i n p o s t t r e a t m e n t s t u d i e s . T o e l u c i d a t e w h e n t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m c o n t r i b u t e s t o t h e p a t h o g e n e s i s o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y , a n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e . A n i m a l s w e r e a l s o g i v e n h e p a r i n ( 2 0 0 0 U / k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e e i t h e r 1 h r b e f o r e o r 1 . 5 o r 2 . 5 h r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n . S i x h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S , a n i m a l s w e r e a n e s t h e t i z e d a s d e s c r i b e d a b o v e , a n d b l o o d a n d l i v e r s e c t i o n s w e r e c o l l e c t e d f o r t h e e v a l u a t i o n o f l i v e r i n j u r y , a s m e a s u r e d b y p l a s m a A L T a c t i v i t y a n d h i s t o l o g i c e v a l u a t i o n . 1 4 8 4 . C . 8 . H i r u d i n p o s t t r e a t m e n t s t u d i e s P r e l i m i n a r y s t u d i e s w e r e c o n d u c t e d t o d e t e r m i n e a d o s e a n d r o u t e o f a d m i n i s t r a t i o n o f h i r u d i n t h a t w o u l d e f f e c t i v e l y i n h i b i t t h r o m b i n a s m e a s u r e d b y e l e v a t i o n s i n a c t i v a t e d p a r t i a l t h r o m b o p l a s t i n t i m e s ( A P T T , d a t a n o t s h o w n ) . T h e s e r e s u l t s s h o w e d t h a t a s u b c u t a n e o u s a d m i n i s t r a t i o n o f r e c o m b i n a n t h i r u d i n ( H E W - 0 2 3 ; 3 6 , 0 0 0 U / k g ) p r o d u c e d a t h r e e - f o l d e l e v a t i o n i n p l a s m a A P T T t h a t l a s t e d f o r 2 h r s . T o t e s t t h e h y p o t h e s i s t h a t t h r o m b i n i s a d i s t a l m e d i a t o r o f l i v e r i n j u r y , a n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e . A n i m a l s w e r e s u b s e q u e n t l y g i v e n r — h i r u d i n ( 3 6 , 0 0 0 U / k g , s o ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e 2 . 5 a n d 4 . 5 h r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n . S i x h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S , a n i m a l s w e r e a n e s t h e t i z e d a s d e s c r i b e d a b o v e , a n d b l o o d a n d l i v e r s e c t i o n s w e r e c o l l e c t e d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f l i v e r i n j u r y , a s m e a s u r e d b y p l a s m a A L T a c t i v i t y a n d h i s t o l o g i c e v a l u a t i o n . 4 . C . 1 0 . H i s t o p a t h o l o g i c e v a l u a t i o n S e c t i o n s o f l i v e r w e r e f i x e d i n 1 0 % n e u t r a l b u f f e r e d f o r m a l i n a n d p r o c e s s e d f o r h i s t o p a t h o l o g i c e v a l u a t i o n . P a r a f f i n - e m b e d d e d s e c t i o n s w e r e c u t a t 6 p m a n d s t a i n e d w i t h h e m a t o x y l i n a n d e o s i n . S l i d e s w e r e c o d e d , r a n d o m i z e d a n d e v a l u a t e d b y a p a t h o l o g i s t . T h e s e v e r i t y o f e a c h l e s i o n w a s g r a d e d a s f o l l o w s : 0 = n o e v i d e n c e o f i n f l a m m a t i o n o r n e c r o s i s ; 1 = s i n u s o i d a l n e u t r o p h i l i a o n l y ; 2 = s i n u s o i d a l n e u t r o p h i l i a w i t h m u l t i f o c a l , s i n g l e c e l l n e c r o s i s ; 3 = m u l t i f o c a l , a c u t e , m i l d h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s w i t h s i n u s o i d a l n e u t r o p h i l i a ; 4 = m u l t i f o c a l , a c u t e , m o d e r a t e h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s w i t h 1 4 9 s i n u s o i d a l n e u t r o p h i l i a ; 5 = m u l t i f o c a l , a c u t e , m a r k e d h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s w i t h s i n u s o i d a l n e u t r o p h i l i a . 4 . C . 1 1 . D a t a a n a l y s i s A 2 X 2 m u l t i f a c t o r i a l , c o m p l e t e l y r a n d o m a n a l y s i s o f v a r i a n c e ( A N O V A ) w a s u s e d t o e v a l u a t e h e p a r i n a n d h i r u d i n p r e t r e a t m e n t s t u d i e s . D a t a w i t h n o n h o m o g e n e o u s v a r i a n c e s w e r e s q u a r e r o o t - o r l o g - t r a n s f o r m e d p r i o r t o a n a l y s i s . C o m p a r i s o n s a m o n g g r o u p s w e r e p e r f o r m e d w i t h t h e L S D t e s t f o r A P T T v a l u e s . C o m p a r i s o n s a m o n g g r o u p s w e r e p e r f o r m e d w i t h T u k e y ’ s o m e g a t e s t f o r a l l o t h e r d a t a ( S t e e l a n d T o r r i e , 1 9 8 0 ) . I n t h e h e p a r i n a n d h i r u d i n p o s t t r e a t m e n t s t u d i e s , c o m p a r i s o n s b e t w e e n g r o u p s w e r e p e r f o r m e d w i t h t h e S t u d e n t ’ s t t e s t ( S t e e l a n d T o r r i e , 1 9 8 0 ) . T h e c r i t e r i o n f o r s i g n i f i c a n c e f o r a l l s t u d i e s w a s p 5 0 . 0 5 . D a t a a r e e x p r e s s e d a s m e a n : l : S E M . 4 . D . R e s u l t s 4 . D . 1 . H e p a r i n p r e t r e a t m e n t s t u d i e s T o t e s t t h e h y p o t h e s i s t h a t t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m c o n t r i b u t e s t o L P S - i n d u c e d h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n a n d l i v e r i n j u r y , a n i m a l s w e r e p r e t r e a t e d w i t h t h e a n t i c o a g u l a n t , h e p a r i n , p r i o r t o L P S a d m i n i s t r a t i o n . F i g u r e 4 . 1 s h o w s t h e e f f e c t s o f L P S a n d h e p a r i n o n a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , a s m e a s u r e d b y c h a n g e s i n p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n . A s r e p o r t e d 1 5 0 p r e v i o u s l y ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 5 ; P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 5 ) , t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S r e s u l t e d i n a m a r k e d d e c r e a s e i n p l a s m a f i b r i n o g e n . P r e t r e a t m e n t w i t h h e p a r i n p r e v e n t e d t h e L P S - i n d u c e d d e c r e a s e i n p l a s m a f i b r i n o g e n , a f i n d i n g t h a t v e r i f i e d t h e a n t i c o a g u l a n t e f f e c t o f h e p a r i n t r e a t m e n t . C o n s i s t e n t w i t h p r e v i o u s f i n d i n g s ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 5 ) , p r e t r e a t m e n t w i t h h e p a r i n a t t e n u a t e d L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y , a s d e t e c t e d b y e l e v a t i o n s i n p l a s m a a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e a c t i v i t y ( F i g u r e 4 . 2 ) a n d m o r p h o l o g i c e v a l u a t i o n o f l i v e r s e c t i o n s ( T a b l e 4 . 1 ) . L i v e r s f r o m L P S - t r e a t e d r a t s h a d m i l d t o m a r k e d h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s w i t h a m a r k e d s i n u s o i d a l n e u t r o p h i l i a . P r e t r e a t m e n t w i t h h e p a r i n a t t e n u a t e d t h e L P S - i n d u c e d h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s b u t d i d n o t p r e v e n t t h e L P S - i n d u c e d s i n u s o i d a l n e u t r o p h i l i a ( T a b l e 4 . 1 ) . T o e v a l u a t e w h e t h e r a n a c t i v a t e d c o a g u l a t i o n s y s t e m c o n t r i b u t e s t o t h e p a t h o g e n e s i s o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y b y a l t e r i n g p l a t e l e t k i n e t i c s , w e d e t e r m i n e d t h e e f f e c t o f p r e t r e a t m e n t w i t h h e p a r i n o n L P S - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a a n d h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n . T h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S r e s u l t e d i n a p r o n o u n c e d d e c r e a s e i n b l o o d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n ( F i g u r e 4 . 3 ) . T h i s w a s n o t a l t e r e d b y t r e a t m e n t w i t h h e p a r i n . L P S a d m i n i s t r a t i o n c a u s e d a s i g n i f i c a n t a c c u m u l a t i o n o f p l a t e l e t s w i t h i n t h e l i v e r a s m e a s u r e d b y e l e v a t i o n i n r a d i o a c t i v i t y i n t h e l i v e r ( F i g u r e 4 . 4 ) . A d m i n i s t r a t i o n o f h e p a r i n d i d n o t s i g n i f i c a n t l y a l t e r t h e h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n . N e i t h e r L P S n o r h e p a r i n a d m i n i s t r a t i o n a f f e c t e d t h e d i s t r i b u t i o n o f r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s i n t h e s p l e e n , k i d n e y s o r l u n g s ( T a b l e 4 . 2 ) . I n c o n t r a s t , L P S p r o d u c e d a s i g n i f i c a n t d e c r e a s e i n r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s i n b l o o d r a d i o a c t i v i t y , c o n s i s t e n t w i t h t h e d e c r e a s e i n 1 5 1 b l o o d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s . H e p a r i n t r e a t m e n t d i d n o t s i g n i f i c a n t l y a l t e r t h i s d e c r e a s e i n b l o o d r a d i o a c t i v i t y ( T a b l e 4 . 2 ) . 4 . D . 2 . H i r u d i n p r e t r e a t m e n t s t u d i e s T o e v a l u a t e t h e r o l e o f t h r o m b i n i n L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y , w e u s e d t h e s p e c i f i c t h r o m b i n i n h i b i t o r , h i r u d i n . F i g u r e 4 . 5 c o n f i r m s t h e e f f e c t i v e n e s s o f h i r u d i n i n i n h i b i t i n g t h r o m b i n , a s i n d i c a t e d b y i n c r e a s e s i n A P T T . T r e a t m e n t w i t h h i r u d i n s i g n i f i c a n t l y p r o l o n g e d A P T T a s c o m p a r e d t o a n i m a l s a d m i n i s t e r e d s a l i n e v e h i c l e . T r e a t m e n t w i t h L P S a l s o t e n d e d t o p r o l o n g A P T T , a l t h o u g h t h i s w a s n o t s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t . T r e a t m e n t w i t h L P S r e s u l t e d i n a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , a s m a r k e d b y d e c r e a s e d p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n s ( F i g u r e 4 . 6 ) . T h e a d m i n i s t r a t i o n o f h i r u d i n p r e v e n t e d t h i s d e c r e a s e , c o n f i r m i n g t h a t t h e h i r u d i n d o s i n g r e g i m e n e f f e c t i v e l y i n h i b i t e d t h e a c t i o n s o f t h r o m b i n . F i g u r e 4 . 7 s h o w s t h e e f f e c t o f h i r u d i n o n t h e L P S - i n d u c e d l o s s o f h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l i n t e g r i t y , a s e s t i m a t e d b y i n c r e a s e d p l a s m a A L T a c t i v i t y . T h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S p r o d u c e d h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y w i t h i n 6 h r s , a n d t r e a t m e n t w i t h h i r u d i n p r e v e n t e d l i v e r d a m a g e . T h i s f i n d i n g i s c o n s i s t e n t w i t h h i s t o l o g i c a n a l y s i s o f l i v e r s e c t i o n s ( F i g u r e 4 . 8 , T a b l e 4 . 3 ) . L i v e r s f r o m L P S - t r e a t e d a n i m a l s h a d m i l d t o m a r k e d h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s w i t h s i n u s o i d a l n e u t r o p h i l i a . T r e a t m e n t w i t h h i r u d i n a t t e n u a t e d L P S - i n d u c e d h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s b u t d i d n o t p r e v e n t i n f i l t r a t i o n o f n e u t r o p h i l s w i t h i n t h e l i v e r s i n u s o i d s ( F i g u r e 4 . 9 ; T a b l e 4 . 3 ) . 1 5 2 T o e v a l u a t e t h e m e c h a n i s m b y w h i c h t h r o m b i n c o n t r i b u t e s t o L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y , w e e v a l u a t e d t h e e f f e c t o f h i r u d i n o n L P S - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a a n d h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n , a s m e a s u r e d b y b l o o d p l a t e l e t e n u m e r a t i o n a n d r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s e q u e s t r a t i o n i n t h e l i v e r , r e s p e c t i v e l y . T h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S p r o d u c e d a p r o n o u n c e d d e c r e a s e i n b l o o d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n ( F i g u r e 4 . 1 0 ) . T h i s L P S - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a w a s m o r e m o d e s t i n a n i m a l s t r e a t e d w i t h h i r u d i n . S i m i l a r t o t h e f i n d i n g s w i t h t o t a l b l o o d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s , L P S p r o d u c e d a s i g n i f i c a n t d e c r e a s e i n r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s i n t h e b l o o d , a n d t r e a t m e n t w i t h h i r u d i n s l i g h t l y a t t e n u a t e d t h i s d e c r e a s e i n b l o o d r a d i o a c t i v i t y ( F i g u r e 4 . 1 1 ) . A s r e p o r t e d p r e v i o u s l y , L P S a d m i n i s t r a t i o n c a u s e d h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n a s m e a s u r e d b y t h e e l e v a t i o n i n h e p a t i c 1 1 1 I n ( F i g u r e 4 . 1 2 ) . A d m i n i s t r a t i o n o f h i r u d i n d i d n o t s i g n i f i c a n t l y a l t e r t h e h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n . T h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S , w i t h o r w i t h o u t h i r u d i n , d i d n o t a l t e r t h e d i s t r i b u t i o n o f r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s i n t h e s p l e e n , k i d n e y s o r l u n g s ( T a b l e 4 . 4 ) . 4 . D . 3 . H e p a r i n a n d h i r u d i n p o s t t r e a t m e n t s t u d i e s R e s u l t s f r o m t h e s e s t u d i e s s u g g e s t e d t h a t a n a c t i v a t e d c o a g u l a t i o n s y s t e m c o n t r i b u t e s t o t h e p a t h o g e n e s i s o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y b u t d o e s n o t m e d i a t e t h e L P S - i n d u c e d h e p a t i c n e u t r o p h i l a n d p l a t e l e t s e q u e s t r a t i o n . T h i s r a i s e d t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m p l a y s a r o l e i n l i v e r i n j u r y a f t e r t h e s e i n f l a m m a t o r y c e l l s h a v e a l r e a d y a c c u m u l a t e d w i t h i n t h e l i v e r . T o t e s t t h i s 1 5 3 h y p o t h e s i s , h e p a r i n o r i t s s a l i n e v e h i c l e w a s a d m i n i s t e r e d e i t h e r 1 h r p r i o r t o o r 1 . 5 o r 2 . 5 h r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S , a n d l i v e r i n j u r y w a s e v a l u a t e d a t 6 h r . P r e t r e a t m e n t w i t h h e p a r i n a t t e n u a t e d L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y , a s m e a s u r e d b y p l a s m a A L T a c t i v i t y ( F i g u r e 4 . 1 3 ) . T h e a d m i n i s t r a t i o n o f h e p a r i n 1 . 5 o r 2 . 5 h r s a f t e r L P S s i m i l a r l y r e d u c e d l i v e r i n j u r y . T h e a d m i n i s t r a t i o n o f h e p a r i n 3 . 5 h r s a f t e r L P S d i d n o t s i g n i f i c a n t l y a l t e r l i v e r i n j u r y o b s e r v e d a t 6 h r s ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e s e f i n d i n g s s u g g e s t e d t h a t a n a c t i v a t e d c o a g u l a t i o n s y s t e m i s a d i s t a l m e d i a t o r o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . T o u n d e r s t a n d f u r t h e r t h e m e c h a n i s m b y w h i c h t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m c o n t r i b u t e s t o h e p a t o c e l l u l a r d a m a g e , w e u s e d t h e s p e c i f i c t h r o m b i n i n h i b i t o r , h i r u d i n , t o e v a l u a t e w h e t h e r t h r o m b i n c o n t r i b u t e s t o t i s s u e i n j u r y . H i r u d i n w a s a d m i n i s t e r e d 2 . 5 a n d 4 . 5 h r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S , a n d l i v e r i n j u r y w a s a s s e s s e d b y p l a s m a A L T a c t i v i t y a t 6 h r . S i m i l a r t o t h e f i n d i n g s w i t h h e p a r i n , t h e a d m i n i s t r a t i o n o f h i r u d i n b e g i n n i n g 2 . 5 h r s a f t e r L P S r e d u c e d l i v e r i n j u r y ( F i g u r e 4 . 1 4 ) . 1 5 4 F i g u r e 4 . 1 . 1 : : f f : o f ' : n o , u . ' n 0 1 . : n : ' - i . . . . . : 1 : , ' . . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h h e p a r i n ( H E P , 2 0 0 0 U / k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e ( S A L ) 1 h r p r i o r t o t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r i t s S A L v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 6 - 1 2 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m S A L / S A L g r o u p b , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m S A L / L P S g r o u p ( l p / b w ) u a b o u p q g j o w s o l d L P S L F i g u r e 4 . 1 1 5 6 F i g u r e 4 . 2 . T h e e fi e e t e e ! L P S a n d h e p a r i n e n l i v e r i n j u m ( e l e e m e A L I e e t i g i m ) . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h h e p a r i n ( H E P , 2 0 0 0 U / k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e ( S A L ) 1 h r p r i o r t o t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r i t s S A L v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f l i v e r i n j u r y a s m e a s u r e d b y p l a s m a A L T a c t i v i t y . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 ; S E M , N = 6 - 1 2 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m S A L / S A L g r o u p b , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m S A L / L P S g r o u p v . _ \ c A ? 3 3 0 > . _ . . _ > o . 0 O 7 _ a m o r _ v u 7 O n p O 5 $ 9 O O 0 0 . _ 1 0 0 0 - E : S A L 1 2 0 0 - ‘ H E P S A L F i g u r e 4 . 2 L P S 1 5 7 H S e H a p S l i n e a a r l i i n n e p a r / i / e S n a l i n e e S / a L l P i S / L P n S 1 1 0 0 0 0 - - - - 7 5 1 7 - - 8 2 5 - . - . 1 4 - - - 7 1 - - - 7 1 1 5 8 T A B L E 4 . 1 P r o t e c t i o n f r o m L P S - I n d u c e d H e p a t o t o x i c i t y b y A d m i n i s t r a t i o n o f H e p a r i n P e r c e n t o f A n i m a l s w i t h H i s t o p a t h o l o g i c S c o r e T r e a t m e n t 0 1 2 3 4 5 H e p a r i n ( 2 0 0 0 U / k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e w a s a d m i n i s t e r e d t o r a t s 1 h r p r i o r t o t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S , l i v e r s e c t i o n s w e r e c o l l e c t e d a n d f i x e d i n 1 0 % n e u t r a l b u f f e r e d f o r m a l i n a n d p r e p a r e d f o r a n a l y s i s b y l i g h t m i c r o s c o p y . T h e s e v e r i t y o f h e p a t i c i n j u r y w a s g r a d e d o n a s c a l e o f 0 - 5 r e f l e c t i n g t h e f r e q u e n c y a n d s i z e o f t h e l e s i o n s . 0 = n o e v i d e n c e o f i n f l a m m a t i o n ; 1 = s i n u s o i d a l n e u t r o p h i l i a o n l y ; 2 = s i n u s o i d a l n e u t r o p h i l i a w i t h m u l t i f o c a l s i n g l e c e l l n e c r o s i s ; 3 = m u l t i f o c a l , a c u t e , m i l d h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s w i t h s i n u s o i d a l n e u t r o p h i l i a ; 4 = m u l t i f o c a l , a c u t e , m o d e r a t e h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s w i t h s i n u s o i d a l n e u t r o p h i l i a ; 5 = m u l t i f o c a l , a c u t e m a r k e d h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s w i t h s i n u s o i d a l n e u t r o p h i l i a . V a l u e s i n d i c a t e t h e p e r c e n t o f a n i m a l s p r e s e n t i n g e a c h s c o r e . 1 5 9 F i g u r e 4 3 - M u m m m m m m m m m fl n m m m A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h h e p a r i n ( H E P , 2 0 0 0 U / k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e ( S A L ) 1 h r p r i o r t o t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r i t s S A L v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r e n u m e r a t i o n o f b l o o d p l a t e l e t s a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 6 - 1 2 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e S A L g r o u p 9 \ 3 I n \ . . . i 2 . 8 a ? O g . . . \ \ \ \ \ \ \ X \ v O a . \ $ \ 2 8 . \ \ O . \ 0 . . . . 5 n o o . O 9 . _ m \ \ \ \ \ \ \ \ H E P S S A L F i g u r e 4 . 3 1 6 1 F i g u r e 4 . 4 . T - : 1 - - f _ _ ’ . - n o h - o . r i . w . i o l . - : - . _ - r . i . T o m e a s u r e h e p a t i c p l a t e l e t s e q u e s t r a t i o n , a l i a n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h 1 1 1 I n - o x i n e r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s ( i v ) 2 h r s p r i o r t o t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h h e p a r i n ( H E P , 2 0 0 0 U / k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e ( S A L ) 1 h r p r i o r t o t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r i t s S A L v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , l i v e r s e c t i o n s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f r a d i o a c t i v i t y i n a g a m m a c o u n t e r a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 6 - 1 2 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e S A L g r o u p r e v i l n i m p c d e t c e j n i f o % e W F i g u r e 4 . 4 S A L L P S 0 O O 1 0 - O 1 6 2 E f f e c t s o f H e p a r i n a n d L P S o n P l a t e l e t D i s t r i b u t i o n 1 6 3 T A B L E 4 . 2 i n B l o o d , S p l e e n , K i d n e y s a n d L u n g s B L O O D ' 3 . 2 : 1 : 0 . 2 4 . 0 : l : 0 . 6 0 . 3 : 1 : 0 . 4 1 1 1 . 8 1 0 . 4 " : S P L E E N I 1 0 . 6 : l : 2 . 8 1 4 . 0 : l : 1 . 0 1 2 . 2 : I : 1 . 3 1 4 . 4 : 0 6 I K I D N E Y S l 1 . 6 : l : 0 . 2 1 . 7 : l : 0 . 3 2 . 6 i 0 . 3 1 . 7 : l : 0 . 6 I W ’ _ _ . I - 2 . 1 1 0 : 1 6 2 . 5 1 0 . 3 2 . 8 f 0 . 4 3 . 9 : 1 : 0 . 4 A l l a n i m a l s w e r e g i v e n 1 1 1 l n - o x i n e r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s 2 h r s p r i o r t o t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S o r i t s s a l i n e v e h i c l e . R a t s w e r e t r e a t e d w i t h h e p a r i n ( H E P , 2 0 0 0 U / k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e ( S A L ) 1 h r p r i o r t o t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r i t s S A L v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S , b l o o d a n d o r g a n s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f r a d i o a c t i v i t y a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s p e r c e n t o f i n j e c t e d r a d i o a c t i v i t y i n 1 m l b l o o d o r e n t i r e o r g a n ( m e a n : 1 : S E M ) , N = 8 - 1 4 p e r g r o u p . “ s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e S A L g r o u p i n t h e a b s e n c e o f L P S 1 6 4 F i g u r e 4 . 5 . = - - . ' . 1 - ' o , 0 1 - . ' . : o o . n ' . o n e - 1 . . i M L L P S ( 5 m g / k g ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e w a s a d m i n i s t e r e d i n t h e t a i l v e i n . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h h i r u d i n ( 3 6 , 0 0 0 U / k g , s o ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e 0 . 5 , 2 . 5 a n d 4 . 5 h r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S . S i x h r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f p l a s m a A P T T a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 6 - 1 3 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e C O N T R O L g r o u p b , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m S A L / L P S g r o u p M I § \ \ \ \ \ \ \ . A m \ \ i \ . \ t o o o o o v . _ . . _ . n _ < \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ « \ \ \ \ \ \ § \ S A L I N E S : H I R U D I N 1 5 0 1 2 5 - 1 0 0 7 5 5 0 - 2 5 O L P S C O N T R O L F i g u r e 4 . 5 1 6 6 F i g u r e 4 . 6 . 1 : z z . P . . i r i u . . 1 . f o " 1 0 9 : 1 . n r i n . L P S ( 5 m g / k g ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e w a s a d m i n i s t e r e d i n t h e t a i l v e i n . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h h i r u d i n ( 3 6 , 0 0 0 U / k g , s c ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e 0 . 5 , 2 . 5 a n d 4 . 5 h r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S . S i x h r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 6 - 1 3 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e C O N T R O L g r o u p b , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m S A L / L P S g r o u p i N \ \ § \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ o \ \ T \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ K F i g u r e 4 . 6 C O N T R O L L P S S I H l R U D I N I S A L I N E 1 6 8 F i g u r e 4 . 7 . f f f n h i r i n n l l n i n ( A L I ) a e t j v j t y . L P S ( 5 m g / k g ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e w a s a d m i n i s t e r e d i n t h e t a i l v e i n . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h h i r u d i n ( 3 6 , 0 0 0 U / k g , s o ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e 0 . 5 , 2 . 5 a n d 4 . 5 h r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S . S i x h r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f p l a s m a A L T a c t i v i t y a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 6 - 1 3 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e C O N T R O L g r o u p b , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e S A L / L P S g r o u p 1 6 9 1 0 0 0 1 . . , S A L I N E a m . \ \ \ \ V H I R U D I N I . . 8 0 0 - 8 1 8 1 ' 3 \ h i c i e a _ _ ” ’ 5 . 4 ? 6 0 0 - > A L T 1 ; : 0 S E M , ° 5 < 4 0 0 - O E m 2 o . 2 0 0 - S 0 C O N T R O L L P S F i g u r e 4 . 7 1 7 0 F i g u r e 4 . 8 . ’ c o u t h - o f ‘ ‘ n o ' . f u n - H z . A l e l e g e ( 1 9 9 ) g r w i t h L E S e g g h i r g d i n ( b e n e m ) . T o p : L P S - i n d u c e d l e s i o n s a r e c h a r a c t e r i z e d b y m u l t i f o c a l , l a r g e , i r r e g u l a r l y s h a p e d f o c i o f m i d z o n a l h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s w i t h s i n u s o i d a l n e u t r o p h i l i a . B o t t o m : T r e a t m e n t w i t h L P S a n d h i r u d i n r e s u l t e d i n s m a l l e r f o c i o f m i d z o n a l h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s b u t n e u t r o p h i l s w e r e s t i l l p r e s e n t w i t h i n t h e l i v e r s i n u s o i d s . " ' 1 " , . 1 . . , f ; ‘ 3 8 - ” : “ 2 3 _ 4 k { 1 7 1 s o ' ~ ’ r “ : _ P . 1 s - - r - W ‘ r . M V - - « r . g k . . _ : . ' . . _ . ’ ‘ » y n n a a W ' u r n , w r . - , . n 3 ' J W & & % § fi { fi t _ w , r 4 1 3 , 9 w w - « 1 . 1 ! ” W i - t ; 1 7 2 T A B L E 4 . 3 P r o t e c t i o n f r o m L P S - I n d u c e d H e p a t o t o x i c l t y b y A d m i n i s t r a t i o n o f H i r u d i n P e r c e n t o f A n i m a l s w i t h H i s t o p a t h o l o g i c S c o r e T r e a t m e n t 0 1 2 3 4 5 C o n t r o l / S A L 1 0 0 - - - - - C o n t r o l / H i r u d i n 1 0 0 - - ' - - - L P S / S A L - 8 8 4 2 2 5 1 7 L P S / H i r u d i n - 3 3 3 3 ’ 3 3 - - R a t s w e r e t r e a t e d w i t h L P S ( 5 m g / k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e ( C O N T R O L ) . H i r u d i n ( 3 6 , 0 0 0 U / k g , s o ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e ( S A L ) w a s a d m i n i s t e r e d 0 . 5 , 2 . 5 a n d 4 . 5 h r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S . S i x h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S , l i v e r s e c t i o n s w e r e c o l l e c t e d a n d f i x e d i n 1 0 % n e u t r a l b u f f e r e d f o r m a l i n a n d p r e p a r e d f o r a n a l y s i s b y l i g h t m i c r o s c o p y . T h e s e v e r i t y o f h e p a t i c i n j u r y w a s g r a d e d o n a s c a l e o f 0 - 5 r e f l e c t i n g t h e f r e q u e n c y a n d s i z e o f t h e l e s i o n s . 0 = n o e v i d e n c e o f i n f l a m m a t i o n o r n e c r o s i s ; 1 = s i n u s o i d a l n e u t r 0 p h i l i a o n l y ; 2 = s i n u s o i d a l n e u t r o p h i l i a w i t h m u l t i f o c a l , s i n g l e c e l l n e c r o s i s ; 3 = m u l t i f o c a l , a c u t e , m i l d h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s w i t h s i n u s o i d a l n e u t r o p h i l i a ; 4 = m u l t i f o c a l , a c u t e , m o d e r a t e h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s w i t h s i n u s o i d a l n e u t r o p h i l i a ; 5 = m u l t i f o c a l , a c u t e , m a r k e d h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s w i t h s i n u s o i d a l n e u t r o p h i l i a . V a l u e s i n d i c a t e t h e p e r c e n t a g e o f a n i m a l s p r e s e n t i n g e a c h s c o r e . N = 6 - 1 2 p e r g r o u p . 1 7 3 F i g u r e 4 . 9 . T f P n h i r i n n h L P S ( 5 m g / k g ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e w a s a d m i n i s t e r e d i n t h e t a i l v e i n . S u b s e q u e n t l y , a n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h h i r u d i n ( 3 6 , 0 0 0 U / k g , s o ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e 0 . 5 , 2 . 5 a n d 4 . 5 h r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S . S i x h r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , l i v e r s e c t i o n s w e r e c o l l e c t e d a n d p r e p a r e d f o r i m m u n o c y t o c h e m i s t r y f o r n e u t r o p h i l s a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . N e u t r o p h i l s w e r e c o u n t e d i n 2 0 5 0 0 x f i e l d s a n d a v e r a g e d f o r e a c h a n i m a l . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M . N = 6 - 1 3 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e C O N T R O L g r o u p . S : H I R U D I N s o 5 O : x o o m h z fi o z a 2 5 i § \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ m \ z \ \ \ \ \ \ \ S A L I N E 7 5 . L P S C O N T R O L F i g u r e 4 . 9 1 7 5 F i g u r e 4 . 1 0 . 1 - : ; o f P . n o h i r o i o n o o o o o : : z o . ; . . . , L P S ( 5 m g / k g ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e w a s a d m i n i s t e r e d i n t h e t a i l v e i n . S u b s e q u e n t l y , a n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h h i r u d i n ( 3 6 , 0 0 0 U / k g , s o ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e 0 . 5 , 2 . 5 a n d 4 . 5 h r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S . S i x h r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r e n u m e r a t i o n o f b l o o d p l a t e l e t n u m b e r s a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 6 - 1 3 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e C O N T R O L g r o u p b , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m S A L / L P S g r o u p é 1 o _ A . _ 1 \ m _ _ 0 e 8 q n o s 0 6 . $ . 6 1 . 3 6 0 4 _ : . 3 2 m 0 2 _ V \ \ \ \ \ ; \ \ \ \ \ \ S A L I N E \ . H l R U D l N q 2 L P S C O N T R O L F i g u r e 4 . 1 0 1 7 7 F i g u r e 4 . 1 1 . T h f f f P n h i r i n n n m 1 1 9 1 1 0 1 1 - T w o h o u r s p r i o r t o t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 5 m g / k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e , 1 1 1 l n - r a d i o l a b e l d p l a t e l e t s w e r e a d m i n i s t e r e d t o r a t s . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h h i r u d i n ( 3 6 , 0 0 0 U / k g , s o ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e 0 . 5 , 2 . 5 a n d 4 . 5 h r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S . S i x h r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f b l o o d r a d i o a c t i v i t y a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : t S E M , N = 6 - 1 3 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e C O N T R O L g r o u p b , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m S A L / L P S g r o u p ' ' \ H I R U D I N r e v i l n i m p c d e t u l 1 c l N e j n i f o 1 . l % _ F i g u r e 4 . 1 1 C O N T R O L L P S . p O O O O O l 5 0 1 . — S A L I N E 1 7 8 1 7 9 T A B L E 4 . 4 E f f e c t s o f L P S a n d H i r u d i n o n P l a t e l e t A c c u m u l a t i o n i n S p l e e n , K i d n e y s a n d L u n g s T R E A T M E N T L S P L E E N K I D N E Y S L U N G S C O N T R O L / S A L 1 4 . 6 i 0 . 5 1 . 2 : l : 0 . 1 3 . 0 1 0 . 2 C O N T R O L / H I R 1 3 . 8 i 0 . 5 1 . 6 i 0 . 3 2 . 6 t 0 . 1 L P S / S A I L 1 1 . 3 i 1 . 3 1 . 4 1 0 . 2 2 . 4 i 0 . 3 L P S / H I R 1 4 . 6 i 0 . 7 1 . 9 i 0 . 2 3 . 5 i 0 . 3 E a c h a n i m a l r e c e i v e d " ‘ i n d i u m - r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s t o d e t e r m i n e t h e d i s t r i b u t i o n o f p l a t e l e t s . T w o h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s , L P S ( 5 m g / k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e ( C O N T R O L ) w a s a d m i n i s t e r e d . H i r u d i n ( H I R , 3 6 , 0 0 0 m m , 9 0 ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e ( S A L ) w a s a d m i n i s t e r e d 0 . 5 , 2 . 5 a n d 4 . 5 h r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S . S i x h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S , o r g a n s w e r e c o l l e c t e d a n d r a d i o a c t i v i t y w a s m e a s u r e d a s a m a r k e r o f p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n . D a t a a r e e x p r e s s e d a s p e r c e n t o f i n j e c t e d r a d i o a c t i v i t y i n e a c h o r g a n 1 S E M . N = 6 - 1 2 . 1 8 0 F i g u r e 4 . 1 2 . 1 ‘ : = o f ' . n o , ' r o 0 1 1 : 0 : o : : : : u : o n R a t s w e r e g i v e n 1 1 1 l n - r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s i . v . a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . L P S ( 5 m g / k g ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e w a s a d m i n i s t e r e d i n t h e t a i l v e i n . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h h i r u d i n ( 3 6 , 0 0 0 U / k g , s c i o r i t s s a l i n e v e h i c l e 0 . 5 , 2 . 5 a n d 4 . 5 h r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S . S i x h r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , l i v e r s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f h e p a t i c r a d i o a c t i v i t y . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 6 - 1 3 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e C O N T R O L g r o u p r e v i l n i m p c d e t c e j n i f o x 1 ° C O N T R O L W L 3 5 0 - . p O U 0 N O O 1 8 1 [ : 1 S A L I N E ‘ . \ \ \ \ \ ‘ H I R U D I N § F i g u r e 4 . 1 2 1 8 2 F i g u r e 4 . 1 3 . I ] h e e fl e e t e a f h e p a r i n a d m i n i s t e r e d n e f a r e a g e a f t e r L E S a n l i v e r L O I U D L A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h h e p a r i n ( H E P , 2 0 0 0 U / k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e ( S A L ) 1 h r p r i o r t o ( - 1 h r ) o r 1 . 5 , 2 . 5 o r 3 . 5 h r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r i t s S A L v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S , b l o o d w a s c o l l e c t e d f o r a s s e s s m e n t o f l i v e r i n j u r y a s m e a s u r e d b y p l a s m a A L T a c t i v i t y a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 8 - 1 4 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e S A L / L P S g r o u p ) L / U ( y t i v i t c a T L A a m s a l P 1 0 0 0 8 0 0 0 1 O O 4 0 0 2 0 0 1 8 3 - L P S + S A L [ : | L P S + H E P A R I N , a a . a - 1 h r + 1 . 5 h r + 2 . 5 h r T i m e o f h e p a r i n t r e a t m e n t F i g u r e 4 . 1 3 1 8 4 F i g u r e 4 . 1 4 . T h e e f f e e t e a f h i r a a i n a a m j n i e t e r e g a f t e r L E S e a ( j g e ; i a i g g . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e . H i r u d i n ( 3 6 , 0 0 0 U / k g , s c i o r i t s s a l i n e v e h i c l e w a s a d m i n i s t e r e d 2 . 5 a n d 4 . 5 h r s a f t e r L P S . S i x h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S , b l o o d w a s c o l l e c t e d f o r a s s e s s m e n t o f l i v e r i n j u r y a s m e a s u r e d b y p l a s m a A L T a c t i v i t y . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 6 - 9 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e S A L / L P S g r o u p ) L / U ( y t i v i t c a T L A a m s a l P O ) O O 4 0 0 2 0 0 1 8 5 [ : l S A L I N E : - - - H I R U D I N L “ . . . b n . . . l S A L L P S F i g u r e 4 . 1 4 1 8 6 4 . E . D i s c u s s i o n T h e p a t h o g e n e s i s o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y e n t a i l s a c t i o n s o f s e v e r a l c e l l u l a r a n d s o l u b l e i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s , i n c l u d i n g b u t n o t l i m i t e d t o n e u t r o p h i l s , K u p f f e r c e l l s , T N F - a , p l a t e l e t s a n d t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 2 ; l i m u r o e t a l . , 1 9 9 4 ; H e w e t t e t a l . , 1 9 9 3 ; P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 5 ; H e w e t t e t a l . , 1 9 9 5 ) . U n d e r s t a n d i n g t h e m e c h a n i s m b y w h i c h e x p o s u r e t o L P S c u l m i n a t e s i n h e p a t i c i n j u r y n e c e s s i t a t e s k n o w i n g w h e n a n d h o w t h e s e i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s i n t e r a c t . I n t h i s m o d e l , n e u t r o p h i l s a n d p l a t e l e t s b e g i n t o a c c u m u l a t e i n t h e l i v e r w i t h i n 1 h r a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , a n d p e a k c o n c e n t r a t i o n s o f c y t o k i n e s s u c h a s T N F - a o c c u r 9 0 m i n u t e s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n ( P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h e s e e v e n t s p r e c e d e t h e o n s e t o f l i v e r i n j u r y , w h i c h i s n o t d e t e c t a b l e a s i n c r e a s e d p l a s m a A L T a c t i v i t y u n t i l n e a r l y 4 h r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n ( P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 5 ) . R e s u l t s f r o m t h i s a n d o t h e r s t u d i e s i n d i c a t e t h a t t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i s c r i t i c a l t o t h e d e v e l o p m e n t o f L P S - i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 5 ; M a r g a r e t t e n e t a l . , 1 9 6 7 ) . O u r r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m d o e s n o t m e d i a t e L P S - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a o r t h e p l a t e l e t a n d n e u t r o p h i l a c c u m u l a t i o n o b s e r v e d i n l i v e r s o f r a t s e x p o s e d t o L P S . I n a d d i t i o n , t h e p r o t e c t i o n f r o m i n j u r y b y h e p a r i n o r h i r u d i n a d m i n i s t e r e d a f t e r L P S a t t i m e s w h e n n e u t r o p h i l s a n d p l a t e l e t s h a v e a c c u m u l a t e d w i t h i n t h e l i v e r s u g g e s t s t h a t t h r o m b i n i s a " d i s t a l " m e d i a t o r o f l i v e r i n j u r y ; t h a t i s , i t s a c t i o n o c c u r s a f t e r t h e a c c u m u l a t i o n o f i n f l a m m a t o r y c e l l s i n t h e l i v e r a n d a f t e r e x p o s u r e t o c y t o k i n e s 1 8 7 l i k e T N F - a ( P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 5 ; H e w e t t e t a l . , 1 9 9 3 ) . T h e s e f i n d i n g s r a i s e a q u e s t i o n a s t o h o w t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m c o n t r i b u t e s t o t h e d e v e l o p m e n t o f h e p a t o t o x i c i t y . i t h a s b e e n h y p o t h e s i z e d t h a t t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m c o n t r i b u t e s t o t i s s u e i n j u r y t h r o u g h t h e f o r m a t i o n o f o c c l u s i v e f i b r i n t h r o m b i t h a t r e s u l t s i n d e c r e a s e d t i s s u e p e r f u s i o n a n d i s c h e m i a . H o w e v e r , t r e a t m e n t o f r a t s w i t h a n c r o d , a s n a k e v e n o m e n z y m e t h a t a n t i c o a g u l a t e s b l o o d b y d e p l e t i n g p l a s m a o f f i b r i n o g e n , f a i l e d t o p r e v e n t l i v e r l e s i o n s a f t e r L P S e x p o s u r e . T h i s r e s u l t s u g g e s t s t h a t t h e r o l e o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i n t h e d e v e l o p m e n t o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y i s i n d e p e n d e n t o f f i b r i n o g e n a n d o f t h e f o r m a t i o n o f i n s o l u b l e f i b r i n t h r o m b i ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h e l o c a t i o n o f t h e l e s i o n f u r t h e r a r g u e s a g a i n s t i s c h e m i a a s t h e b a s i s f o r i n j u r y , i n a s m u c h a s s t u d i e s o f h e p a t i c i s c h e m i a / r e p e r f u s i o n i n t h e r a t h a v e s h o w n t h a t r e s u l t i n g d a m a g e i s c h a r a c t e r i z e d b y c e n t r i l o b u l a r t i s s u e i n j u r y , w h e r e a s L P S e x p o s u r e r e s u l t s p r i m a r i l y i n m i d z o n a l h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s ( J a e s c h k e e t a l . , 1 9 9 0 ; K e h r e r e t a l . , i 9 9 0 ) . F u r t h e r m o r e , i n t h i s m o d e l t h e l i v e r i n j u r y b e g i n s w i t h i n 4 h r s a f t e r L P S e x p o s u r e , a n d r e s u l t s w i t h h e p a r i n a n d h i r u d i n s u g g e s t t h a t t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m b e c o m e s i m p o r t a n t b e t w e e n 2 . 5 a n d 3 . 5 h r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , i . e . j u s t p r i o r t o t h e o n s e t o f o v e r t l i v e r i n j u r y ( P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h u s , t h e r e i s a r e l a t i v e l y s h o r t p e r i o d o f t i m e b e t w e e n a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d t h e o n s e t o f l i v e r i n j u r y , a f i n d i n g t h a t d o e s n o t s u p p o r t a n i s c h e m i a - b a s e d m e c h a n i s m , w h i c h r e q u i r e s a l o n g e r d u r a t i o n o f r e d u c e d b l o o d f l o w t o c a u s e i n j u r y t o t h e l i v e r ( J a e s c h k e e t a l . , 1 9 9 0 ; J a e s c h k e e t a l . , 1 9 9 1 a ; H u g h e s e t a l . , 1 9 9 2 ) . 1 8 8 T h e e x a c t r o l e o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i n t h i s m o d e l o f h e p a t o t o x i c i t y r e m a i n s u n c l e a r . A n t i c o a g u l a n t s s u c h a s w a r f a r i n o r h e p a r i n t h a t i n t e r f e r e w i t h t h e a c t i o n s o f t h r o m b i n a r e h e p a t o p r o t e c t i v e , b u t a n c r o d , a n a n t i c o a g u l a n t w h i c h d o e s n o t i n h i b i t t h r o m b i n o r p r e v e n t i t s f o r m a t i o n , f a i l e d t o p r e v e n t l i v e r i n j u r y ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h e s e f i n d i n g s p o i n t t o t h r o m b i n a s a m e d i a t o r o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . T h r o m b i n , a s e r i n e p r o t e a s e , h a s l o n g b e e n k n o w n f o r i t s r o l e i n t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , a n d a c t i v a t i o n o f e i t h e r t h e i n t r i n s i c o r e x t r i n s i c p a t h w a y s o f c o a g u l a t i o n b y L P S c u l m i n a t e s i n t h e f o r m a t i o n o f t h r o m b i n f r o m p r o t h r o m b i n . T o e v a l u a t e f u r t h e r t h e r o l e o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d t h r o m b i n i n p a r t i c u l a r , w e u t i l i z e d t h e a n t i c o a g u l a n t , h e p a r i n , a n d t h e s e l e c t i v e t h r o m b i n i n h i b i t o r , h i r u d i n . H i r u d i n , a p e p t i d e i n i t i a l l y i s o l a t e d f r o m t h e s a l i v a o f l e e c h e s ( H i r u d a m e d i c i n e / i s ) , i s a n e x t r e m e l y p o t e n t a n d s e l e c t i v e i n h i b i t o r o f t h r o m b i n . I t f o r m s a h i g h l y s t a b l e c o m p l e x w i t h t h r o m b i n a n d b l o c k s i t s c a t a l y t i c s i t e ( F e n t o n e t a l . , 1 9 9 1 ; M a r k w a r d t , 1 9 8 9 ; T a l b o t , 1 9 8 9 ; F e n t o n , 1 9 8 9 ) . T h e a n t i c o a g u l a n t , h e p a r i n , c a n a l s o i n h i b i t t h r o m b i n b u t l a c k s t h e s p e c i f i c i t y o f h i r u d i n . H e p a r i n i n c r e a s e s t h e a f f i n i t y o f a n t i t h r o m b i n l l l ( A T l l l ) f o r t h r o m b i n , b u t A T l l l a l s o h a s a f f i n i t y f o r o t h e r c o a g u l a t i o n f a c t o r s , n a m e l y F a c t o r s l X a , X a , X l a a n d X l i a a n d o t h e r p r o t e o l o y t i c e n z y m e s s u c h a s k a l l i k r e i n , t r y p s i n a n d p l a s m i n ( O l s o n e t a l . , 1 9 9 4 ) . H e p a r i n ' s e f f e c t o n b l o o d c e l l s i s c o m p l e x . I n r e g a r d t o p l a t e l e t s , h e p a r i n c a n a f f e c t p l a t e l e t a g g r e g a t i o n a n d c a n c a u s e t h r o m b o c y t o p e n i a i n h u m a n b e i n g s . i n a d d i t i o n , a c t i v a t e d p l a t e l e t s c a n r e l e a s e p l a t e l e t f a c t o r 4 , a p r o t e i n t h a t c a n n e u t r a l i z e h e p a r i n . H e p a r i n i n h i b i t s c e r t a i n n e u t r o p h i l f u n c t i o n s 1 8 9 i n v i t r a , i n c l u d i n g d e g r a n u l a t i o n a n d n e u t r o p h i l - i n d u c e d p l a t e l e t a g g r e g a t i o n v i a i n h i b i t i o n o f c a t h e p s i n G , a p r o t e a s e r e l e a s e d f r o m a c t i v a t e d n e u t r o p h i l s t h a t e f f e c t s h e p a t o c e l l u l a r k i l l i n g i n v i t r a ( F e r r e r - L o p e z e t a l . , 1 9 9 2 ; W e b b e t a l . , 1 9 9 3 ; H o e t a l . , 1 9 9 5 ) . M o r e v e r , t h e a d m i n i s t r a t i o n o f h e p a r i n c a n i n f l u e n c e i n f l a m m a t o r y e v e n t s b y i n c r e a s i n g e x t r a c e l l u l a r s u p e r o x i d e d i s m u t a s e ( B e c k e r e t a l . , 1 9 9 4 ) , a c t i v a t i n g t h e c o m p l e m e n t s y s t e m , b i n d i n g t o e n d o t h e l i u m ( O l s o n e t a l . , 1 9 9 4 ) a n d i n h i b i t i n g s o l u b l e p h o s p h o l i p a s e A 2 ( D u a e t a l . , 1 9 9 4 ) . S i n c e h e p a r i n c a n h a v e s i g n i f i c a n t i n t e r a c t i o n s w i t h b o t h n e u t r o p h i l s a n d p l a t e l e t s , c e l l s w h i c h a r e c r i t i c a l t o L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 2 ; P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 5 ) . w e c h o s e t o e v a l u a t e t h e r o l e o f t h r o m b i n i n t h i s m o d e l b y u s i n g t h e m o r e s e l e c t i v e t h r o m b i n i n h i b i t o r , h i r u d i n . R e s u l t s f r o m t h i s s t u d y i n d i c a t e t h a t t h r o m b i n i s n e e d e d f o r t h e m a n i f e s t a t i o n o f L P S - i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y , s i n c e t r e a t m e n t w i t h h i r u d i n s i g n i f i c a n t l y a t t e n u a t e d l i v e r i n j u r y a s m e a s u r e d b y p l a s m a A L T a c t i v i t y a n d h i s t o l o g i c e v i d e n c e o f n e c r o s i s . I n t h e s e s t u d i e s , h i r u d i n t r e a t m e n t a t t e n u a t e d L P S - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a , a s m e a s u r e d b y b o t h p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n a n d m i n - - r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s i n b l o o d . T h i s s u g g e s t s t h a t t h r o m b i n m a y c o n t r i b u t e , s o m e w h a t , t o t h e t h r o m b o c y t o p e n i a o b s e r v e d a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n b y a m e c h a n i s m l i k e l y d u e t o t h e d i r e c t p l a t e l e t a g g r e g a t i n g e f f e c t o f t h r o m b i n . A l t h o u g h a s i m i l a r t r e n d w a s o b s e r v e d i n s t u d i e s c o n d u c t e d w i t h h e p a r i n , i t w a s n o t s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t . T h e d i s c r e p a n c i e s b e t w e e n t h e s e f i n d i n g s m a y r e s u l t f r o m h e p a r i n ’ s i n h i b i t o r y e f f e c t o n p l a t e l e t f u n c t i o n a n d f u r t h e r s u p p o r t s t h e h i r u d i n ’ s s p e c i f i c i t y a n d v a l u e i n i n v i v a s t u d i e s . 1 9 0 T h r o m b i n i s n e c e s s a r y f o r f i b r i n c l o t f o r m a t i o n , b u t t h e a c t i o n s o f t h r o m b i n a r e n o t l i m i t e d t o t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m . T h r o m b i n c a n i n f l u e n c e m a n y c e l l s i n c l u d i n g e n d o t h e l i u m , n e u t r o p h i l s a n d p l a t e l e t s t h r o u g h r e c e p t o r - m e d i a t e d a c t i o n s . F o r e x a m p l e , t h r o m b i n c a n i n f l u e n c e c e l l a d h e r e n c e b y s t i m u l a t i n g t h e e x p r e s s i o n o f a d h e s i o n m o l e c u l e s a n d t h e r e l e a s e o f c y t o k i n e s ( G a r c i a e t a l . , 1 9 8 6 ; D e M i c h e l e e t a l . , 1 9 9 2 ) . S u c h a n e v e n t c o u l d c o n t r i b u t e t o t h e i n f l a m m a t o r y c e l l a c c u m u l a t i o n i n t h e l i v e r s a f t e r L P S e x p o s u r e . F u r t h e r m o r e , t h r o m b i n i s a n a c t i v a t o r o f p l a t e l e t s a n d a c h e m o a t t r a c t a n t a n d a c t i v a t o r o f n e u t r o p h i l s ( M a r i n e t a l . , 1 9 9 0 ; B i z i o s e t a l . , 1 9 8 6 ; C o h e n e t a l . , 1 9 9 1 ) . I n t h i s m o d e l , t h r o m b i n d o e s n o t a p p e a r t o p r o m o t e t h e a c c u m u l a t i o n o f n e u t r o p h i l s o r p l a t e l e t s i n t h e l i v e r s i n c e a c c u m u l a t i o n w a s u n a f f e c t e d b y h e p a r i n a d m i n i s t r a t i o n . O t h e r s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t h e p a r i n d o e s n o t a l t e r n e u t r o p h i l s t i c k i n g t o m e s e n t e r i c v e n u l e s i n r e s p o n s e t o L P S a s m e a s u r e d b y i n t r a v i t a l f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y a n d l u m i n o l - d e p e n d e n t c h e m i l u m i n e s c e n c e t e c h n i q u e s ( S u z u k i e t a l . , 1 9 8 8 ) . A l s o , t h e a d m i n i s t r a t i o n o f h e p a r i n o r h i r u d i n a t t e n u a t e d l i v e r i n j u r y i n t h i s m o d e l a f t e r t h e s e i n f l a m m a t o r y c e l l s h a d a c c u m u l a t e d w i t h i n t h e l i v e r . I t i s p o s s i b l e t h a t t h r o m b i n m a y a c t i v a t e t h e s e c e l l s a f t e r t h e i r h e p a t i c a c c u m u l a t i o n . A m e c h a n i s m b y w h i c h t h r o m b i n s t i m u l a t e s t h e i n f l a m m a t o r y c e l l s a l r e a d y p r e s e n t w i t h i n t h e s i n u s o i d s w o u l d b e c o n s i s t e n t w i t h t h e f i n d i n g s t h a t L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y i s d e p e n d e n t u p o n n e u t r o p h i l s a n d p l a t e l e t s a s w e l l a s t h r o m b i n . O f p o t e n t i a l i n t e r e s t i n t h i s r e g a r d i s t h e r e c e n t o b s e r v a t i o n t h a t t h r o m b i n - a c t i v a t e d p l a t e l e t s c a n i n c r e a s e t h e r e l e a s e o f c y t o t o x i c f a c t o r s f r o m n e u t r o p h i l s i n v i t r a ( G o m e z e t a l . , 1 9 8 9 ) . 1 9 1 W h e t h e r t h r o m b i n a c t s v i a s u c h a m e c h a n i s m i n v i v a r e m a i n s t o b e d e t e r m i n e d . K u p f f e r c e l l s , t h e r e s i d e n t m a c r o p h a g e s o f t h e l i v e r , p l a y a c r i t i c a l r o l e i n L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y ( 2 4 ; S h i b a y a m a e t a l . , 1 9 9 1 ) . L i t t l e i s k n o w n a b o u t t h e e f f e c t o f t h r o m b i n o n t h e s e c e l l s , h o w e v e r t h r o m b i n a l t e r s t h e p r o d u c t i o n o f c y t o k i n e s a n d a r a c h i d o n i c a c i d m e t a b o l i t e s i n o t h e r t y p e s o f m a c r o p h a g e s i n v i t r a ( B a r - S h a v i t e t a l . , 1 9 8 3 a ; B a r - S h a v i t e t a l . , 1 9 8 3 b ; J o n e s e t a l . , 1 9 9 0 ; P o d j a r n y e t a l . , 1 9 8 9 ) . A c c o r d i n g l y , t h r o m b i n m i g h t c o n t r i b u t e t o t h e p a t h o g e n e s i s o f l i v e r i n j u r y b y s t i m u l a t i n g t h e r e l e a s e o f i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s f r o m K u p f f e r c e l l s . T h r o m b i n c a n a c t i v a t e e n d o t h e l i u m t o r e l e a s e c o a g u l a t i o n f a c t o r s a n d c y t o k i n e s a n d t o e x p r e s s a d h e s i o n m o l e c u l e s ( B i z i o s e t a l . , 1 9 8 6 ; D e M i c h e l e e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h e s e e v e n t s c o u l d c o n t r i b u t e t o t h e a c t i v a t i o n o f i n f l a m m a t o r y c e l l s . T h u s , t h r o m b i n ’ s c r i t i c a l r o l e i n L P S - i n d u c e d h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y m a y d e r i v e f r o m o n e o r m o r e o f i t s e f f e c t s o n c e l l s i n t h e h e p a t i c s i n u s o i d . I t i s p o s s i b l e t h a t t h r o m b i n m a y c o n t r i b u t e t o p a r e n c h y m a l c e l l n e c r o s i s b y a d i r e c t e f f e c t o n t h e s e c e l l s . H i g h a n d l o w a f f i n i t y b i n d i n g s i t e s f o r t h r o m b i n o n h e p a t o c y t e s h a v e b e e n r e p o r t e d , a l t h o u g h t h e f u n c t i o n o f t h e s e " r e c e p t o r s ” i s n o t k n o w n ( W e y e r e t a l . , 1 9 8 8 ) . T h r o m b i n s t i m u l a t e s g l y c o g e n o l y s i s i n i s o l a t e d , p e r f u s e d l i v e r s b y a c y c l o o x y g e n a s e - d e p e n d e n t m e c h a n i s m ( Y a m a n a k a e t a l . , 1 9 9 2 ) . H o w e v e r , t h e d i r e c t e f f e c t s o f t h r o m b i n o n l i v e r p a r e n c h y m a l c e l l s a n d t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h r o m b i n m a y d i r e c t l y c o n t r i b u t e t o h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y r e m a i n t o b e d e t e r m i n e d . T h e f i n d i n g t h a t h e p a r i n o r h i r u d i n p r o v i d e s p r o t e c t i o n w h e n g i v e n a f t e r 1 9 2 t h e a c c u m u l a t i o n o f n e u t r o p h i l s a n d p l a t e l e t s w i t h i n t h e l i v e r p r o v i d e s i n s i g h t i n t o t h e m e c h a n i s m ( s ) b y w h i c h L P S e x p o s u r e c u l m i n a t e s i n l i v e r i n j u r y . F o r e x a m p l e , t h i s f i n d i n g s u g g e s t s t h a t t h e m e r e p r e s e n c e o f n e u t r o p h i l s a n d p l a t e l e t s w i t h i n t h e l i v e r i s n o t s u f f i c i e n t t o p r o m o t e h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y . T h u s , i t r a i s e s t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h r o m b i n m a y a c t d i r e c t l y o n t h e s e i n f l a m m a t o r y c e l l s t o s t i m u l a t e t h e r e l e a s e o f m e d i a t o r s t h a t c a u s e s t i s s u e i n j u r y . i t i s a l s o p o s s i b l e t h a t n e u t r o p h i l s a n d p l a t e l e t s a l t e r h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l s i n a w a y t h a t m a k e s t h e m s u s c e p t i b l e t o i n j u r y b y a n a c t i v a t e d c o a g u l a t i o n s y s t e m . T h a t t h r o m b i n i s a d i s t a l l i n k i n t h e c h a i n o f e v e n t s t h a t p r o d u c e l i v e r i n j u r y m a y p r o v e u s e f u l i n t h e c l i n i c a l s e t t i n g . I n e x p e r i m e n t a l S t u d i e s , d r u g s t h a t i n t e r f e r e w i t h c e l l u l a r a n d s o l u b l e m e d i a t o r s h a v e u s u a l l y b e e n a d m i n i s t e r e d t o a n i m a l s p r i o r t o t h e a d m i n i s t r a t i o n o f e n d o t o x i n . i n t h i s s t u d y , w e h a v e f o u n d a n a g e n t t h a t a f f o r d s p r o t e c t i o n w h e n a d m i n i s t e r e d a f t e r L P S e x p o s u r e a n d i n c l o s e t e m p o r a l a p p o s i t i o n t o t h e o n s e t o f l i v e r i n j u r y . I n e n d o t o x e m i c p a t i e n t s , f o r w h o m p r o p h y l a c t i c t r e a t m e n t i s n o t p r a c t i c a l , t h i s q u a l i t y h a s c o n s i d e r a b l e i m p o r t a n c e . I n s u m m a r y , r e s u l t s f r o m t h i s s t u d y i n c r e a s e c u r r e n t u n d e r s t a n d i n g o f t h e m e c h a n i s m ( s ) b y w h i c h L P S e x p o s u r e c u l m i n a t e s i n h e p a t o c e l l u l a r d a m a g e . R e s u l t s f r o m s t u d i e s i n a n i m a l s w e r e p r e t r e a t e d w i t h h e p a r i n o r h i r u d i n s u g g e s t t h a t t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , a l t h o u g h c r i t i c a l f o r t h e g e n e s i s o f l i v e r d a m a g e , i s n o t n e e d e d f o r t h e r e c r u i t m e n t o f p l a t e l e t s a n d n e u t r o p h i l s i n t o t h e l i v e r . F u r t h e r m o r e , t h e n o v e l f i n d i n g t h a t t h r o m b i n i s a c r i t i c a l y e t d i s t a l m e d i a t o r o f l i v e r i n j u r y r a i s e s a n i n t e r e s t i n g q u e s t i o n a s t o h o w t h r o m b i n m e d i a t e s 1 9 3 h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y d u r i n g i n f l a m m a t i o n . C H A P T E R 5 T H E R O L E S O F P A F A N D L E U K O T R I E N E S I N L P S - I N D U C E D L I V E R I N J U R Y 1 9 4 1 9 5 5 . A . A b s t r a c t T h e i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( L P S ) t o r a t s r e s u l t s i n l i v e r l e s i o n s c h a r a c t e r i z e d b y t h e i n f i l t r a t i o n o f b o t h p l a t e l e t s a n d n e u t r o p h i l s i n t o t h e l i v e r a n d b y m i d z o n a l h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s . T h e l i v e r i n j u r y i s d e p e n d e n t o n n e u t r o p h i l s , p l a t e l e t s a n d t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , a s r e m o v a l o r i n h i b i t i o n o f a n y o f t h e s e c o m p o n e n t s i n h i b i t s t h e d e v e l o p m e n t o f h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s . P l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r ( P A F ) a n d t h e c y s t e i n y l l e u k o t r i e n e s ( U S ) a r e p o t e n t i n f l a m m a t o r y l i p i d s t h a t a r e c r i t i c a l f o r t h e d e v e l o p m e n t o f s o m e L P S - m e d i a t e d a l t e r a t i o n s . T o t e s t t h e h y p o t h e s i s t h a t P A F , a l o n e o r i n c o m b i n a t i o n w i t h U s , c o n t r i b u t e s t o t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r i n j u r y d u r i n g L P S e x p o s u r e , w e c o n d u c t e d s t u d i e s w i t h t h e P A F r e c e p t o r a n t a g o n i s t , W E B 2 0 8 6 , a n d t h e 5 - I i p o x y g e n a s e i n h i b i t o r , Z i l e u t o n . F e m a l e , S p r a g u e - D a w l e y r a t s w e r e p r e t r e a t e d w i t h W E B 2 0 8 6 ( 1 0 m g / k g , i p ) a l o n e o r w i t h Z i l e u t o n ( 4 0 m g / k g , p o ) 1 h o u r b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e . T r e a t m e n t w i t h W E B 2 0 8 6 , a l o n e o r i n c o m b i n a t i o n w i t h Z i l e u t o n , d i d n o t i n h i b i t L P S - m e d i a t e d h e p a t i c n e u t r o p h i l i n f i l t r a t i o n o r l i v e r i n j u r y , a s a s s e s s e d b y h i s t o l o g i c e v a l u a t i o n a n d i n c r e a s e s i n p l a s m a a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e a c t i v i t y . P r e t r e a t m e n t w i t h t h e s e a g e n t s a l s o h a d n o e f f e c t o n t h e a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m o r o n t h e t h r o m b o c y t o p e n i a i n d u c e d b y L P S . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t P A F , a l o n e o r i n c o m b i n a t i o n w i t h 5 - l i p o x y g e n a s e p r o d u c t s , i s n o t a c r i t i c a l m e d i a t o r o f L P S - i n d u c e d h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y i n t h i s m o d e l . 1 9 6 5 . B . I n t r o d u c t i o n P l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r ( P A F , 1 - 0 - a l k y l - 2 ( R i - a c e t y I - g l y c e r o - S - p h o s p h o c h o l i n e ) i s a l i p i d m e d i a t o r t h a t i s c r i t i c a l f o r t h e d e v e l o p m e n t o f n u m e r o u s L P S - m e d i a t e d a l t e r a t i o n s , i n c l u d i n g h y p o t e n s i o n ( C a s a l s — S t e n z e l e t a l . , 1 9 8 8 ) , l u n g i n j u r y ( O l s o n e t a l . , 1 9 9 0 ; Y u e e t a l . , 1 9 8 1 ) a n d d e a t h ( C a s a l s - S t e n z e l e t a l . , i 9 8 8 ; S a l a r i e t a l . , 1 9 9 0 ; R a b i n o v i c i e t a l . , 1 9 9 0 ) . P A F i s p r o d u c e d b y l e u k o c y t e s , p l a t e l e t s a n d e n d o t h e l i a l c e l l s a n d h a s p r o i n f l a m m a t o r y p r o p e r t i e s . F o r e x a m p l e , i t c a n m e d i a t e n e u t r o p h i l c h e m o t a x i s a n d a c t i v a t i o n ( W o r t h e n e t a i . , 1 9 8 3 ; M o n t r u c c h i o e t a l . , 1 9 9 3 ; T a k a h a s h i e t a l . , 1 9 9 1 ) , i n c r e a s e v a s c u l a r p e r m e a b i l i t y a n d a l t e r v a s c u l a r t o n e ( H o s f o r d e t a l . , 1 9 9 3 ; B u x t o n e t a l . , 1 9 8 6 ) . P A F a l s o s t i m u l a t e s t h e p r o d u c t i o n o f o t h e r s o l u b l e m e d i a t o r s s u c h a s e i c o s a n o i d s , c y t o k i n e s a n d s u p e r o x i d e a n i o n ( H o s f o r d e t a l . , 1 9 9 3 ; S n y d e r , 1 9 9 0 ; T a k a h a s h i e t a l . , 1 9 9 1 ) . A r e c e n t s t u d y i n d i c a t e d t h a t a n t a g o n i s m o f P A F r e c e p t o r s a l o n e i s i n s u f f i c i e n t t o p r e v e n t l i v e r i n j u r y i n t h e r a t a f t e r t h e i n t r a p e r i t o n e a l a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( Y o s h i k a w a e t a l . , 1 9 9 2 ) . S i m i l a r l y , a d m i n i s t r a t i o n o f a 5 - l i p o x y g e n a s e i n h i b i t o r a f f o r d e d n o p r o t e c t i o n . H o w e v e r , t h e c o m b i n a t i o n o f a P A F r e c e p t o r a n t a g o n i s t a n d a 5 - l i p o x y g e n a s e i n h i b i t o r p r e v e n t e d h e p a t i c i n j u r y a n d l e t h a l i t y ( Y o s h i k a w a e t a / . , 1 9 9 2 ) . T h i s s t u d y s u p p o r t e d t h e h y p o t h e s i s t h a t P A F i n c o m b i n a t i o n w i t h U s i s c r i t i c a l f o r t h e d e v e l o p m e n t o f h e p a t i c i n j u r y a n d s u g g e s t e d t h a t P A F a n d U s m a y h a v e r e d u n d a n t a c t i o n s i n t h i s m o d e l . L i k e P A F , t h e U s c a n m e d i a t e i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e s , e d e m a a n d 1 9 7 c h a n g e s i n v a s c u l a r t o n e . W i t h r e g a r d t o o t h e r a l t e r a t i o n s f o l l o w i n g L P S e x p o s u r e , t h e U s a r e i n v o l v e d i n t h e d e v e l o p m e n t o f l e u k o p e n i a ( C o o k e t a l . , 1 9 8 5 ) . I n a d d i t i o n , L T C , a n d L T D 4 h a v e b e e n d e t e c t e d i n t h e b i l e o f L P S - t r e a t e d r a t s ( H a g m a n n e t a l . , 1 9 8 5 ) , a n d t h e i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f L P S r e s u l t s i n L T f o r m a t i o n i n v i v a t h r o u g h a m e c h a n i s m t h a t d e p e n d s u p o n c o m p l e m e n t ( J a e s c h k e e t a l . , 1 9 9 2 c ) . T h e U S a r e c r i t i c a l f o r L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y i n a n o t h e r e x p e r i m e n t a l m o d e l o f e n d o t o x e m i a , n a m e l y i n m i c e s e n s i t i z e d w i t h g a l a c t o s a m i n e ( T i e g s e t a l . , 1 9 8 8 ) . H o w e v e r , i n t h e r a t t h e l i v e r i n j u r y o b s e r v e d a f t e r t h e i n t r a p e r i t o n e a l a d m i n i s t r a t i o n o f L P S l i v e r i n j u r y i s n o t m e d i a t e d b y 5 - l i p o x y g e n a s e p r o d u c t s , a l o n e , b u t r a t h e r b y t h e c o m b i n a t i o n o f U s a n d P A F ( Y o s h i k a w a e t a l . , 1 9 9 2 ) . S i n c e s t u d i e s e v a l u a t i n g t h e r o l e o f t h e c y s t e i n y l L T S a p p e a r t o b e m o d e l - d e p e n d e n t , w e t h o u g h t i t i m p o r t a n t t o e v a l u a t e t h e r o l e o f t h e L T S i n a m o d e l o f l i v e r i n j u r y r e s u l t i n g f r o m t h e i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f L P S i n t h e r a t . T h e p a t h o g e n e s i s o f h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y t h a t f o l l o w s t h e i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f L P S i n t h e r a t h a s b e e n w e l l c h a r a c t e r i z e d a n d i s d e p e n d e n t u p o n n e u t r o p h i l s , p l a t e l e t s , K u p f f e r c e l l s a n d t u m o r n e c r o s i s f a c t o r - a l p h a a n d r e q u i r e s a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 2 ; P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 5 ; 2 4 ; l i m u r o e t a l . , 1 9 9 4 ; H e w e t t e t a l . , 1 9 9 3 ; H e w e t t e t a l . , 1 9 9 5 ) . A l t h o u g h s e v e r a l s t u d i e s h a v e i m p l i c a t e d P A F a n d L T s i n t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r i n j u r y i n o t h e r m o d e l s , t h e r o l e s o f P A F a n d L T S a p p e a r s t o b e d e p e n d e n t u p o n s p e c i e s a n d r o u t e o f a d m i n i s t r a t i o n o f L P S . T h e r e f o r e , s t u d i e s w e r e c o n d u c t e d t o e v a l u a t e t h e r o l e s o f t h e s e m e d i a t o r s i n t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r 1 9 8 i n j u r y i n t h e r a t a f t e r t h e i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f L P S . T o e v a l u a t e t h e r o l e s o f P A F a n d L T S , r a t s w e r e p r e t r e a t e d w i t h e i t h e r t h e P A F r e c e p t o r a n t a g o n i s t , W E B 2 0 8 6 , a l o n e o r i n c o m b i n a t i o n w i t h t h e 5 - I i p o x y g e n a s e i n h i b i t o r , Z i l e u t o n . W e e v a l u a t e d t h e e f f e c t s o f t h e c o a d m i n i s t r a t i o n o f W E B 2 0 8 6 a n d Z i l e u t o n o n L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y , t h r o m b o c y t o p e n i a a n d a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m . 5 . C . M a t e r i a l s a n d m e t h o d s 5 . C . 1 . M a t e r i a l s L i p o p o l y s a c c h a r i d e ( E s c h e r i c h i a c a / i , s e r o t y p e 0 1 2 8 : 8 1 2 ) a n d K i t 5 9 f o r d e t e r m i n a t i o n o f p l a s m a a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e a c t i v i t y ( A L T ) w e r e p u r c h a s e d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o m p a n y ( S t . L o u i s , M O ) . D i l u t i o n o f b l o o d a n d l y s i s o f e r y t h r o c y t e s f o r p l a t e l e t e n u m e r a t i o n w e r e p e r f o r m e d i n p l a t e l e t U n o p e t t e s ( B a x t e r S c i e n t i f i c P r o d u c t s , M c G a w P a r k , I L ) . P l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n w a s m e a s u r e d i n a B B L F i b r o m e t e r ( B e c t o n , D i c k i n s o n a n d C o m p a n y , H u n t V a l l e y , M D ) u s i n g D a t a - F i f i b r i n o g e n d e t e r m i n a t i o n k i t ( B a x t e r S c i e n t i f i c P r o d u c t s , M c G a w P a r k , I L ) . P A F w a s p u r c h a s e d f r o m C a l b i o c h e m ( S a n D i e g o , C A ) . W E B 2 0 8 6 w a s a g e n e r o u s g i f t f r o m B o e h r i n g e r l n g e l h e i m C o r p o r a t i o n ( R i d g e f i e l d , C T ) . Z i l e u t o n w a s a g e n e r o u s g i f t f r o m A b b o t t L a b o r a t o r i e s ( A b b o t t P a r k , I L ) . 1 9 9 5 . C . 2 . A n i m a l s S e e C h a p t e r 2 , s e c t i o n C . 2 . 5 . C . 3 . V e r i f i c a t i o n o f d r u g e f f i c a c y P r e l i m i n a r y s t u d i e s w e r e c o n d u c t e d t o e s t a b l i s h a n e f f e c t i v e d o s i n g r e g i m e n f o r t h e P A F r e c e p t o r a n t a g o n i s t , W E B 2 0 8 6 , a n d t h e 5 - I i p o x y g e n a s e i n h i b i t o r , Z i l e u t o n . T h e a d m i n i s t r a t i o n o f W E B 2 0 8 6 ( 1 0 m g / k g , i p ) i n h i b i t e d P A F - i n d u c e d h y p o t e n s i o n b y 8 6 % . P A F r e c e p t o r a n t a g o n i s m o c c u r r e d b y 3 0 m i n u t e s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f W E B 2 0 8 6 a n d w a s m a i n t a i n e d u p t o 8 h o u r s t h e r e a f t e r . T h e s e r e s u l t s h a v e b e e n p u b l i s h e d i n d e t a i l e l s e w h e r e ( B a i l e e r a l . , 1 9 9 5 b ) . T h e e f f i c a c y o f 5 - l i p o x y g e n a s e i n h i b i t i o n w i t h Z i l e u t o n w a s v e r i f i e d b y e v a l u a t i n g t h e e x v i v a p r o d u c t i o n o f L T B 4 a f t e r s t i m u l a t i o n o f w h o l e b l o o d w i t h t h e c a l c i u m i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 . S i x h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f Z i l e u t o n ( 4 0 m g / k g , p o ) , L T B 4 p r o d u c t i o n i n w h o l e b l o o d w a s i n h i b i t e d b y 8 5 % ( B a i l i e e t a l . 1 9 9 5 a ) . 5 . C . 4 . E x p e r i m e n t a l p r o t o c o l s T o a d d r e s s t h e r o l e o f P A F i n l i v e r i n j u r y , a n i m a l s w e r e p r e t r e a t e d w i t h W E B 2 0 8 6 ( 1 0 m g / k g , i p ) o r s a l i n e v e h i c l e 1 h o u r b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r s a l i n e v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S , a n i m a l s w e r e a n e s t h e t i z e d w i t h s o d i u m p e n t o b a r b i t a l ( 5 0 m g / k g , i p ) a n d a m i d l i n e l a p a r o t o m y w a s p e r f o r m e d . B l o o d w a s c o l l e c t e d i n t o s o d i u m c i t r a t e ( 0 . 3 8 % f i n a l c o n c e n t r a t i o n ) f r o m t h e d e s c e n d i n g a o r t a , a n d l i v e r s e c t i o n s w e r e 2 0 0 f i x e d i n 1 0 % n e u t r a l b u f f e r e d f o r m a l i n f o r h i s t o l o g i c e v a l u a t i o n . P l a s m a w a s a s s a y e d f o r A L T a c t i v i t y , a m a r k e r o f h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y . T o a d d r e s s t h e p o s s i b l e r e d u n d a n c y i n t h e r o l e s o f P A F a n d L T S i n l i v e r i n j u r y , a c o m b i n a t i o n o f W E B 2 0 8 6 a n d Z i l e u t o n w a s e m p l o y e d . R a t s w e r e t r e a t e d w i t h e i t h e r W E B 2 0 8 6 ( 1 0 m g / k g , i p ) o r s a l i n e v e h i c l e a n d w i t h e i t h e r Z i l e u t o n ( 4 0 m g / k g , p o ) o r 0 . 2 % m e t h y l c e l l u l o s e v e h i c l e 1 h o u r b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i v ) . S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , a n i m a l s w e r e a n e s t h e t i z e d a s d e s c r i b e d a b o v e a n d b l o o d a n d l i v e r s e c t i o n s w e r e c o l l e c t e d . B l o o d p l a t e l e t s w e r e e n u m e r a t e d i n a h e m a c y t o m e t e r a f t e r e r y t h r o c y t e l y s i s a n d d i l u t i o n i n p l a t e l e t U n o p e t t e s . P l a s m a A L T a c t i v i t y w a s u s e d a s a m a r k e r o f h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l i n j u r y a n d w a s d e t e r m i n e d s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y u s i n g S i g m a K i t 5 9 ( B e r g m e y e r e t a l . , 1 9 7 8 ) . P l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n w a s d e t e r m i n e d f r o m t h e t h r o m b i n c l o t t i n g t i m e s o f d i l u t e d p l a s m a i n a f i b r o m e t e r ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 5 ) . 5 . C . 5 . S t a t i s t i c a l a n a l y s i s D a t a w e r e a n a l y z e d w i t h a c o m p l e t e l y r a n d o m , t w o - w a y a n a l y s i s o f v a r i a n c e ( A N O V A ) . H o m o g e n e i t y o f v a r i a n c e w a s t e s t e d w i t h t h e F - m a x t e s t p r i o r t o a n a l y s i s ( S t e e l a n d T o r r i e , 1 9 8 0 ) . N o n h o m o g e n e o u s d a t a w e r e l o g - t r a n s f o r m e d p r i o r t o a n a l y s i s . C o m p a r i s o n s b e t w e e n t r e a t m e n t m e a n s w e r e p e r f o r m e d u s i n g T u k e y ' s o m e g a t e s t . T h e c r i t e r i o n f o r s i g n i f i c a n c e w a s p s 0 . 0 5 . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n 3 : S E M . 2 0 1 5 . D . R e s u l t s T h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S t o r a t s r e s u l t e d i n h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s w i t h i n 6 h r s . T h i s l i v e r i n j u r y w a s a s s e s s e d b y e l e v a t i o n s i n p l a s m a a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e ( A L T ) a c t i v i t y , a n i n d i c a t i o n o f a l o s s i n p a r e n c h y m a l c e l l i n t e g r i t y . P r e t r e a t m e n t w i t h t h e P A F r e c e p t o r a n t a g o n i s t , W E B 2 0 8 6 , d i d n o t p r e v e n t L P S - i n d u c e d h e p a t o c e l l u l a r d a m a g e ( F i g u r e 5 . 1 ) . T o a d d r e s s t h e p o s s i b i l i t y t h a t 5 - l i p o x y g e n a s e m e t a b o l i t e s a n d P A F m a y h a v e c r i t i c a l b u t r e d u n d a n t a c t i o n s , a n i m a l s w e r e c o t r e a t e d w i t h W E B 2 0 8 6 a n d Z i l e u t o n . A s b e f o r e , t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S p r o d u c e d a s i g n i f i c a n t e l e v a t i o n i n p l a s m a A L T a c t i v i t y , i n d i c a t i v e o f l i v e r i n j u r y ( F i g u r e 5 . 2 ) . C o t r e a t m e n t w i t h W E B 2 0 8 6 a n d Z i l e u t o n d i d n o t p r e v e n t t h i s l i v e r i n j u r y . T h e f i n d i n g s w i t h A L T a c t i v i t y w e r e c o n s i s t e n t w i t h r e s u l t s o f h i s t o l o g i c e v a l u a t i o n o f l i v e r s e c t i o n s . L P S a d m i n i s t r a t i o n r e s u l t e d i n a p r o n o u n c e d i n f i l t r a t i o n o f n e u t r o p h i l s i n t o t h e l i v e r t i s s u e a n d m u l t i f o c a l , i r r e g u l a r l y s h a p e d a r e a s o f m i d z o n a l h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s ( F i g u r e 5 . 3 ) . T h e s e l e s i o n s w e r e c h a r a c t e r i z e d b y h y p e r e o s i n o p h i l i c p a r e n c h y m a l c e l l s w i t h s m a l l p y k n o t i c n u c l e i a n d i n d i s t i n c t c y t o p l a s m i c b o r d e r s . N e i t h e r L P S - i n d u c e d s i n u s o i d a l n e u t r o p h i l i a n o r h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s w e r e a l t e r e d b y p r e t r e a t m e n t w i t h W E B 2 0 8 6 a n d Z i l e u t o n . A s r e p o r t e d p r e v i o u s l y ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 5 ; P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 5 ) , t h e i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f L P S r e s u l t e d i n a d e c r e a s e i n b l o o d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n ( F i g u r e 5 . 4 ) a n d p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n ( F i g u r e 5 . 5 ) , a m a r k e r o f a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m . P r e t r e a t m e n t w i t h W E B 2 0 8 6 2 0 2 a n d Z i l e u t o n d i d n o t s i g n i f i c a n t l y a l t e r L P S - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a ( F i g u r e 5 . 4 ) o r t h e d e c r e a s e i n p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n ( F i g u r e 5 . 5 ) . 2 0 3 F i g u r e 5 . 1 . T f f f L P n W i i A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h W E B 2 0 8 6 ( 1 0 m g / k g , i p ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e 1 h r b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f p l a s m a A L T a c t i v i t y a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 5 - 8 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f L P S v r _ \ m : : C A ? 8 O O — 3 1 0 p 9 O O > . 5 P 7 . O O > o d v — 7 O O — o c E O F I G U R E 5 . 1 S A L L P S 2 0 0 - 0 0 0 - [ : 1 S A L I N E - W E B 2 0 8 6 2 0 4 2 0 5 F i g u r e 5 . 2 . T h e e f f e e t a p f L P S a r i a W E B 2 9 8 § Z Z i l e p t p n a n p l a s m a A L I 6 1 3 1 1 1 1 ! - A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h W E B 2 0 8 6 ( 1 0 m g / k g , i p ) p l u s Z i l e u t o n ( 4 0 m g / k g , p o ) o r t h e i r r e s p e c t i v e v e h i c l e s ( s a l i n e a n d m e t h y l c e l l u l o s e ( M C ) , r e s p e c t i v e l y ) 1 h r b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f p l a s m a A L T a c t i v i t y a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n 3 : S E M , N = 5 - 8 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f L P S ) L / s t i n U ( y t i v i t c A T L A a m s a l P 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0 6 0 0 4 0 0 2 0 0 2 G 3 S A U N E / M C - W E B 2 0 8 6 / Z I L E U T O N S A L L P S F i g u r e 5 . 2 2 0 7 F i g u r e 5 . 3 . T f P n W B ' l ' ° ' . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h W E B 2 0 8 6 ( 1 0 m g / k g , i p ) p l u s Z i l e u t o n ( 4 0 m g / k g , p o ) o r t h e i r r e s p e c t i v e v e h i c l e s ( s a l i n e a n d m e t h y l c e l l u l o s e ( M C ) , r e s p e c t i v e l y ) 1 h r b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , l i v e r s e c t i o n s w e r e c o l l e c t e d , f i x e d a n d p r o c e s s e d f o r h i s t o l o g i c e v a l u a t i o n . L P S a d m i n i s t r a t i o n r e s u l t e d i n a m a r k e d s i n u s o i d a l n e u t r o p h i l i a a n d m i d z o n a l h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s . P r e t r e a t m e n t w i t h W E B 2 0 8 6 a n d Z i l e u t o n d i d n o t a l t e r e i t h e r t h e n e u t r o p h i l i a o r t h e h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s o b s e r v e d a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n . . A n i m l s : 9 , p o l l ' e l y ) I I I S i x h o u r s m e d i a n u s o i d é j E B 2 0 8 6 m m 5 2 0 9 F i g u r e 5 . 4 . T h e 2 1 1 6 9 1 5 e f L P S a n d W E B 2 9 8 6 [ Z i l e m e n e n 0 1 2 9 ! ! Q I Q I E I Q I e p p e e m m j p p . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h W E B 2 0 8 6 ( 1 0 m g / k g , i p ) p l u s Z i l e u t o n ( 4 0 m g / k g , p o ) o r t h e i r r e s p e c t i v e v e h i c l e s ( s a l i n e a n d m e t h y l c e l l u l o s e ( M C ) , r e s p e c t i v e l y ) 1 h r b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r e n u m e r a t i o n o f b l o o d p l a t e l e t s a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : I : S E M , N = 5 - 8 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f L P S ) l u / I ‘ p 7 . o l l o c ° ‘ 7 N J 0 1 x ( " I I o n o i t 0 l a . m r t n e c l ° : . a n o C t - ° r l e . - l e t a l P . N ° l d o o l 0 . o B S A L L P S 2 1 0 I S A L I N E / M C - W E B 2 0 8 6 / Z I L E U T O N 2 1 1 F i g u r 8 5 . 5 . T h - f f - o f L P . n o W : 1 : . ’ . o 1 o o . 1 1 : ' o ' 1 o o - 1 W A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h W E B 2 0 8 6 ( 1 0 m g / k g , i p ) p l u s Z i l e u t o n ( 4 0 m g / k g , p o ) o r t h e i r r e s p e c t i v e v e h i c l e s ( s a l i n e a n d m e t h y l c e l l u l o s e ( M C ) , r e s p e c t i v e l y ) 1 h r b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g / k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S , b l o o d w a s c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 5 - 8 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f L P S ) l d / g m ( n e g o n i r b i F a m s a l P 2 0 0 1 7 5 1 5 0 1 2 5 1 0 0 7 5 5 0 2 5 2 N 2 , S A L I N E / M C - W E B 2 0 8 6 / Z I L E U T O N S A L L P S 2 1 3 5 . E . D i s c u s s i o n R e s u l t s f r o m t h i s s t u d y s u g g e s t t h a t P A F , a l o n e o r i n c o m b i n a t i o n w i t h L T S , i s n o t r e q u i r e d f o r t h e t h r o m b o c y t o p e n i a , a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m o r l i v e r i n j u r y t h a t f o l l o w s t h e i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f E . c a l i L P S t o r a t s . I n p r e l i m i n a r y s t u d i e s , t h e e f f e c t i v e n e s s o f t h e t r e a t m e n t r e g i m e n s f o r W E B 2 0 8 6 a n d Z i l e u t o n w e r e v e r i f i e d ( B a i l i e e t a l . , 1 9 9 5 a ; B a i l i e e t a l . , 1 9 9 5 b ) . T h e r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t t h e s e d r u g s e f f e c t i v e l y a n t a g o n i z e d t h e a c t i o n s o f P A F a n d L T b i o s y n t h e s i s i n v i v a . S i m i l a r d o s e s o f W E B 2 0 8 6 ( 1 - 1 0 m g / k g ) h a v e b e e n u s e d i n a n o t h e r r a t m o d e l i n w h i c h i t p r o t e c t e d a g a i n s t t h e l e t h a l e f f e c t s o f i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f 1 5 m g / k g E . c a / i L P S ( C a s a l s - S t e n z e l e r a l . , 1 9 8 8 ) , s u p p o r t i n g t h e c o n t e n t i o n t h a t t h e l a c k o f e f f e c t o f W E B 2 0 8 6 o n L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y w a s n o t d u e t o i n s u f f i c i e n t a n t a g o n i s m o f P A F . O u r f i n d i n g t h a t b l o c k a d e o f P A F a n d U s d i d n o t p r e v e n t l i v e r i n j u r y i n t h i s m o d e l i s i n c o n t r a s t t o r e s u l t s u s i n g o t h e r m o d e l s o f e n d o t o x e m i a . F o r e x a m p l e , p r e t r e a t m e n t w i t h t h e P A F r e c e p t o r a n t a g o n i s t , C V 3 9 8 8 , i n c o m b i n a t i o n w i t h t h e 5 - l i p o x y g e n a s e i n h i b i t o r , O N O - 1 0 7 8 , p r e v e n t e d l i v e r i n j u r y i n t h e r a t a f t e r L P S e x p o s u r e ( Y o s h i k a w a e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h e c o n t r a s t i n g r e s u l t s m a y d e r i v e f r o m a d i f f e r e n c e i n e x p e r i m e n t a l m o d e l s . I n t h e s t u d y o f Y o s h i k a w a e t a l . ( Y o s h i k a w a e t a l . , 1 9 9 2 ) . a n i m a l s w e r e e x p o s e d t o a l a r g e r d o s e o f L P S ( 7 m g / k g ) b y i n t r a p e r i t o n e a l r a t h e r t h a n i n t r a v e n o u s i n j e c t i o n a n d l i v e r i n j u r y w a s a s s e s s e d 3 h o u r s , r a t h e r t h a n 6 h o u r s l a t e r . I n a d d i t i o n , t h e l i v e r i n j u r y t h e y o b s e r v e d w a s n o t a s p r o n o u n c e d a s t h a t o b s e r v e d i n t h i s s t u d y . 2 1 4 T h e c o n t r a s t i n g n a t u r e o f t h e r e s u l t s m a y b e a c o n s e q u e n c e o f d i f f e r e n c e s i n t h e r o u t e o f a d m i n i s t r a t i o n o f L P S a n d / o r t h e d e g r e e o f h e p a t o c e l l u l a r d a m a g e b e t w e e n t h e t w o s t u d i e s . I n a d d i t i o n , t h e d i f f e r e n c e s i n r o u t e s o f a d m i n i s t r a t i o n o f L P S a r e a s s o c i a t e d w i t h t e m p o r a l d i f f e r e n c e s i n t h e d e v e l o p m e n t o f i n j u r y , s i n c e t h e o n s e t o f l i v e r d a m a g e a f t e r t h e i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f 4 m g / k g L P S d o e s n o t b e g i n u n t i l 4 h o u r s a f t e r e x p o s u r e ( P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h u s , i n t h e s t u d y t h a t r e v e a l e d a r o l e f o r P A F a n d L T S i n l i v e r i n j u r y a f t e r t h e i n t r a p e r i t o n e a l a d m i n i s t r a t i o n o f L P S , h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y w a s e v a l u a t e d a t a t i m e b e f o r e i t a p p e a r s i n r e s p o n s e t o i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n . T h i s t e m p o r a l d i f f e r e n c e s u g g e s t s t h a t l i v e r i n j u r y i n t h e t w o m o d e l s a r i s e s b y d i f f e r e n t m e c h a n i s m s , a n d s u c h a d i f f e r e n c e m a y u n d e r l i e t h e d i v e r g e n t f i n d i n g s r e g a r d i n g t h e r o l e s P A P a n d L T S . A n o t h e r m o d e l o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y e n t a i l s m i c e t h a t a r e s e n s i t i z e d w i t h g a l a c t o s a m i n e , a p r o t e i n s y n t h e s i s i n h i b i t o r . I n t h e g a l a c t o s a m i n e / L P S m o d e l , i n h i b i t i o n o f L T b i o s y n t h e s i s p r e v e n t e d l i v e r i n j u r y , w h e r e a s P A F a n t a g o n i s m w i t h W E B 2 0 8 6 d i d n o t ( T i e g s e t a l . , 1 9 8 8 ) . T h e c o n t r a s t b e t w e e n t h i s f i n d i n g a n d o u r s m a y r e s u l t f r o m s p e c i e s d i f f e r e n c e s . I n a d d i t i o n , t h e a d m i n i s t r a t i o n o f g a l a c t o s a m i n e m a y i n c r e a s e t h e s e n s i t i v i t y o f h e p a t o c y t e s t o d a m a g e i n d u c e d b y L T S a n d m a y a l s o i n v o k e d i f f e r e n t i n f l a m m a t o r y p r o c e s s e s . i n a n y c a s e , t h e s e d i f f e r e n c e s i n r e s u l t s l i k e l y a r i s e f r o m b i o l o g i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s a m o n g a n i m a l m o d e l s . I f s o , t h e s e f i n d i n g s e m p h a s i z e t h a t a s p e c i f i c i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r t h a t i s c r i t i c a l i n o n e m o d e l o f e n d o t o x e m i a m a y b e i n c o n s e q u e n t i a l i n a n o t h e r . 2 1 5 T h e a d m i n i s t r a t i o n o f P A F r e s u l t s i n n e u t r 0 p h i l a c c u m u l a t i o n i n l u n g s o f r a b b i t s ( W o r t h e n e t a l . , 1 9 8 3 ) a n d r a t s ( C h a n g , 1 9 9 4 ) . I n a d d i t i o n , P A F r e c e p t o r a n t a g o n i s m a f f o r d s p r o t e c t i o n a g a i n s t p u l m o n a r y l e u k o c y t e a c c u m u l a t i o n o b s e r v e d a f t e r t h e i n t r a t h o r a c i c a d m i n i s t r a t i o n o f E . c a l i L P S i n g u i n e a p i g s ( B o z z a e t a l . , 1 9 9 4 ) . H o w e v e r , i n r a t s t r e a t e d w i t h S . e n t e r i t i d i s L P S , P A F b l o c k a d e d o e s n o t p r e v e n t p u l m o n a r y n e u t r o p h i l s e q u e s t r a t i o n ( C h a n g , 1 9 9 4 ) . T h u s , t h e r o l e o f P A F i n L P S - m e d i a t e d n e u t r o p h i l a c c u m u l a t i o n i n t h e l u n g s i s m o d e l - d e p e n d e n t . C o m p a r e d t o t h e l u n g s , l i t t l e i s k n o w n a b o u t p o s s i b l e c o n t r i b u t i o n s o f P A F a n d L T S i n t h e s e q u e s t r a t i o n o f n e u t r o p h i l s w i t h i n t h e l i v e r a f t e r L P S e x p o s u r e . R e s u l t s f r o m t h i s s t u d y s u g g e s t t h a t P A F a n d L T S a r e n o t r e q u i r e d f o r s i n u s o i d a l n e u t r o p h i l i a d u r i n g L P S e x p o s u r e i n r a t s , s i n c e h i s t o p a t h o l o g i c a n a l y s i s r e v e a l e d l a r g e r n u m b e r s o f n e u t r o p h i l s i n l i v e r s f r o m L P S - t r e a t e d a n i m a l s i r r e s p e c t i v e o f p r e t r e a t m e n t w i t h W E B 2 0 8 6 a n d Z i l e u t o n ( F i g u r e 5 . 3 ) . I n t h i s m o d e l , n e u t r o p h i l s a p p e a r t o a c c u m u l a t e i n t h e l i v e r b y a d i f f e r e n t m e c h a n i s m , s u c h a s t h e e x p r e s s i o n o f P s e l e c t i n o n s i n u s o i d a l e n d o t h e l i u m ( C o u g h l a n e t a l . , 1 9 9 4 ) . N e u t r o p e n i a i s o f t e n u s e d a s a n i n d i c a t o r o f n e u t r o p h i l a c c u m u l a t i o n i n t i s s u e s . T h e r o l e o f P A F i n n e u t r o p e n i a i s c o n t r o v e r s i a l , i n a s m u c h a s s o m e f i n d i n g s h a v e s u p p o r t e d a r o l e f o r P A F i n L P S - i n d u c e d n e u t r o p e n i a ( C o u g h l a n e t a l . , 1 9 9 4 ) w h e r e a s o t h e r s s u g g e s t e d t h a t P A F i s n o t i n v o l v e d ( O k a m o t o e t a l . , 1 9 8 6 ; R a b i n o v i c i e t a l . , 1 9 9 0 ) . S i m i l a r l y , t h e r o l e o f L T s i n L P S - i n d u c e d n e u t r o p e n i a i s u n c l e a r s i n c e i n h i b i t i o n o f 5 - l i p o x y g e n a s e a t t e n u a t e d n e u t r o p e n i a i n t h e r a t a f t e r t h e i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f 1 5 m g / k g 5 ‘ . e n t e r i t i d i s L P S 2 1 6 ( C o o k e t a l . , 1 9 8 5 ) , b u t d i d n o t a l t e r n e u t r o p e n i a i n s h e e p a f t e r a 2 0 m i n u t e i n f u s i o n o f E . c a l i L P S ( K u r a t o m i e t a l . , 1 9 9 3 ) . O u r r e s u l t s i n d i c a t e t h a t , i n t h e r a t g i v e n L P S i n t r a v e n o u s l y a t a r e l a t i v e l y s m a l l d o s e , n e i t h e r L T s n o r P A F a r e r e s p o n s i b l e f o r n e u t r o p e n i a . T h u s , a s f o r l i v e r i n j u r y , t h e r o l e s o f P A F a n d U s i n L P S - i n d u c e d n e u t r o p e n i a a r e h i g h l y m o d e l - d e p e n d e n t . T h e h e p a t o c e l l u l a r d a m a g e a f t e r L P S e x p o s u r e i n t h e m o d e l w e u s e d i s d e p e n d e n t o n b o t h p l a t e l e t s a n d a n a c t i v a t e d c o a g u l a t i o n s y s t e m ( P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 5 ; H e w e t t e t a l . , 1 9 9 5 ) . P r i o r t o t h e o n s e t o f l i v e r i n j u r y , b l o o d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n d e c r e a s e s a n d p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n i s r e d u c e d , m a r k i n g a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m ( P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 5 ) . P r e t r e a t m e n t w i t h W E B 2 0 8 6 a n d Z i l e u t o n d i d n o t a l t e r L P S - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a o r t h e d e c r e a s e i n p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n . T h i s s u g g e s t s t h a t P A F a n d U s a r e n o t c r i t i c a l m e d i a t o r s o f e i t h e r o f t h e s e p h e n o m e n a i n t h i s m o d e l . R e s u l t s o f s t u d i e s e v a l u a t i n g t h e r o l e s P A F a n d L T S i n L P S - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a a n d a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m h a v e b e e n i n c o n s i s t e n t . I n a r a t m o d e l i n w h i c h L P S w a s i n f u s e d o v e r a 4 h o u r p e r i o d , P A F w a s c r i t i c a l f o r t h e d e v e l o p m e n t o f t h r o m b o c y t o p e n i a a n d a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m ( l m a n i s h i e t a l . , 1 9 9 1 ; l m u r a e t a l . , 1 9 8 6 ) . H o w e v e r , P A F r e c e p t o r a n t a g o n i s m d i d n o t p r e v e n t t h e t h r o m b o c y t o p e n i a o b s e r v e d a f t e r i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f a l a r g e r d o s e ( 1 4 . 4 m g / k g ) o f L P S ( R a b i n o v i c i e t a l . , 1 9 9 0 ) . S i m i l a r l y , c o n t r a s t i n g r e s u l t s h a v e b e e n r e p o r t e d i n m o d e l s o f e n d o t o x e m i a i n r a b b i t s ( D u e t a l . , 1 9 9 4 ; O k a m o t o e t a l . , 1 9 8 6 ) . A s f o r l i v e r i n j u r y , d i f f e r e n c e s i n s p e c i e s , L P S s o u r c e o r d o s e , r o u t e o f 2 1 7 a d m i n i s t r a t i o n o r t h e t i m e o f e v a l u a t i o n m a y u n d e r l i e t h e d i s p a r i t i e s i n r e s u l t s . I n c o n c l u s i o n , o u r r e s u l t s s u g g e s t t h a t P A F a n d t h e c y s t e i n y l L T s a r e n o t c r i t i c a l m e d i a t o r s o f t h e t h r o m b o c y t o p e n i a , a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , h e p a t i c n e u t r o p h i l a c c u m u l a t i o n o r h e p a t o t o x i c i t y t h a t o c c u r s i n t h i s m o d e l e m p l o y i n g i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f L P S t o r a t s . I n l i g h t o f o t h e r p u b l i s h e d s t u d i e s o f t h e r o l e s o f P A F a n d L T s , i t a p p e a r s t h a t t h e s e l i p i d m e d i a t o r s c o n t r i b u t e t o p a t h o p h y s i o l o g i c a l t e r a t i o n s i n s o m e , b u t n o t a l l a n i m a l m o d e l s o f e n d o t o x e m i a . T h i s e m p h a s i z e s t h a t t h e r o l e a n d i m p o r t a n c e o f a s p e c i f i c i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r i n t h e p a t h o g e n e s i s o f t i s s u e i n j u r y m a y v a r y w i t h s p e c i e s , n a t u r e o f L P S e x p o s u r e o r o t h e r f a c t o r s t h a t d i f f e r f r o m o n e a n i m a l m o d e l t o a n o t h e r . C H A P T E R 6 T H E R O L E O F C Y C L O O X Y G E N A S E P R O D U C T S I N L P S - I N D U C E D H E P A T O T O X I C I T Y 2 1 8 2 1 9 6 . A . A b s t r a c t T h e i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( L P S ) t o r a t s r e s u l t s i n a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , t h r o m o b o c y t o p e n i a a n d l i v e r d a m a g e . H e p a t i c l e s i o n s a r e c h a r a c t e r i z e d b y t h e i n f i l t r a t i o n o f b o t h p l a t e l e t s a n d n e u t r o p h i l s a n d b y m i d z o n a l p a r e n c h y m a l c e l l n e c r o s i s . T h e g e n e s i s o f l i v e r i n j u r y i s d e p e n d e n t o n n u m e r o u s s o l u b l e a n d c e l l u l a r i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s , i n c l u d i n g p l a t e l e t s , n e u t r o p h i l s , K u p f f e r c e l l s a n d c o m p o n e n t s o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m . C y c l o o x y g e n a s e p r o d u c t s , i n c l u d i n g t h r o m b o x a n e , a r e c r i t i c a l t o t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r d a m a g e i n o t h e r m o d e l s o f e n d o t o x e m i a . A f t e r i n t r a v e n o u s L P S a d m i n i s t r a t i o n ( 4 m g / k g ) , p l a s m a t h r o m b o x a n e 8 2 c o n c e n t r a t i o n s s t e a d i l y i n c r e a s e d o v e r a 6 h r p e r i o d , i n d i c a t i n g t h a t L P S e x p o s u r e i n c r e a s e s b i o s y n t h e s i s o f c y c l o o x y g e n a s e p r o d u c t s . T o t e s t t h e h y p o t h e s i s t h a t c y c l o o x y g e n a s e m e t a b o l i t e s c o n t r i b u t e t o t h e d e v e l o p m e n t o f h e p a t o c e l l u l a r d a m a g e , a n i m a l s w e r e p r e t r e a t e d w i t h a s p i r i n ( 4 5 0 m g / k g , p o ) . P r e t r e a t m e n t w i t h a s p i r i n r e d u c e d b u t d i d n o t p r e v e n t l i v e r i n j u r y , a s m a r k e d b y a 5 0 % r e d u c t i o n i n t h e L P S - i n d u c e d e l e v a t i o n i n p l a s m a a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e a c t i v i t y a n d b y h i s t o l o g i c e v a l u a t i o n . P r e t r e a t m e n t w i t h a s p i r i n h a d n o e f f e c t o n L P S - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a , a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m o r h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t e d t h a t c y c l o o x y g e n a s e p r o d u c t s c o n t r i b u t e t o t h e g e n e s i s o f h e p a t o t o x i c i t y . T o e v a l u a t e w h e t h e r t h r o m b o x a n e A 2 i s i n v o l v e d i n l i v e r i n j u r y , a n i m a l s w e r e p r e t r e a t e d w i t h a t h r o m b o x a n e s y n t h a s e i n h i b i t o r , d a z m e g r e l ( 5 0 2 2 0 m g / k g , p o ) . P r e t r e a t m e n t w i t h d a z m e g r e l p r e v e n t e d t h e L P S - i n d u c e d e l e v a t i o n i n p l a s m a t h r o m b o x a n e c o n c e n t r a t i o n . H o w e v e r , i t d i d n o t a l t e r L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y , a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , t h r o m b o c y t o p e n i a o r h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e f i n d i n g s s u g g e s t t h a t c y c l o o x y g e n a s e p r o d u c t s , b u t n o t t h r o m b o x a n e , c o n t r i b u t e t o t h e d e v e l o p m e n t o f h e p a t o t o x i c i t y i n r a t s t r e a t e d i n t r a v e n o u s l y w i t h L P S . 6 . B . I n t r o d u c t i o n N u m e r o u s s t u d i e s h a v e i m p l i c a t e d c y c l o o x y g e n a s e p r o d u c t s i n t h e p a t h o g e n e s i s o f L P S - i n d u c e d l e t h a l i t y i n s e v e r a l a n i m a l m o d e l s . I n r a t s , L P S a d m i n i s t r a t i o n s t i m u l a t e s t h e p r o d u c t i o n o f P G I , a n d T x A z , a s m e a s u r e d b y t h e s t a b l e m e t a b o l i t e s 6 - k e t o - P G F , , a n d T s z , r e s p e c t i v e l y ( C o o k e t a l . , 1 9 8 0 ; O l a n o f f e t a l . , 1 9 8 5 ; W i s e e t a l . , 1 9 8 0 ; H a l u s h k a e t a l . , 1 9 8 1 ; l s h i g u r o e t a l . , 1 9 9 4 ) . I n h i b i t i o n o f t h e f o r m a t i o n o f c y c l o o x y g e n a s e m e t a b o l i t e s w i t h a s p i r i n a n d i b u p r o f e n a t t e n u a t e s t h e l e t h a l e f f e c t s o f L P S ( C o o k e t a l . , 1 9 8 2 ; W i s e e t a l . , 1 9 8 0 ; H a l u s h k a e t a l . , 1 9 8 1 ; l s h i g u r o e t a l . , 1 9 9 4 ) . I n a d d i t i o n , p r e t r e a t m e n t w i t h a s p i r i n a t t e n u a t e s l i v e r i n j u r y a f t e r t h e i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f L P S i n r a t s ( l s h i g u r o e t a l . , 1 9 9 4 ) . H o w e v e r , t h e r o l e o f c y c l o o x y g e n a s e m e t a b o l i t e s i n t h e p a t h o g e n e s i s o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y i s m o d e l - d e p e n d e n t , s i n c e a s p i r i n a n d i b u p r o f e n d o n o t a f f o r d p r o t e c t i o n f r o m t h e h e p a t o t o x i c e f f e c t s o f L P S i n m i c e t h a t h a v e b e e n s e n s i t i z e d w i t h g a l a c t o s a m i n e 2 2 1 ( T i e g s e t a l . , 1 9 8 8 ; W e n d e l e r a l . , 1 9 8 6 ) . W i t h t h e d e v e l o p m e n t o f n e w e r p h a r m a c o l o g i c i n t e r v e n t i o n s , c o n s i d e r a b l e a t t e n t i o n h a s f o c u s e d o n t h e r o l e o f T x A 2 i n e n d o t o x e m i a , a n d i n p a r t i c u l a r , i t s r o l e i n L P S - i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y . S t u d i e s w i t h t h r o m b o x a n e s y n t h a s e i n h i b i t o r s a n d t h r o m b o x a n e r e c e p t o r a n t a g o n i s t s h a v e s u p p o r t e d a r o l e f o r T x A , i n t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r i n j u r y i n r a t s t r e a t e d w i t h i n t r a v e n o u s S a l m o n e l l a e n t e r i t i d i s L P S ( C o o k e t a l . , 1 9 8 2 ; W i s e e t a l . , 1 9 8 0 ) a n d i n m i c e t r e a t e d w i t h L P S o n e w e e k a f t e r p r i m i n g w i t h C . p a r v u m ( N a g a i e t a l . , 1 9 8 9 ) . H o w e v e r , T x A z m a y n o t b e c r i t i c a l f o r t h e d e v e l o p m e n t o f L P S - i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y i n a l l m o d e l s , s i n c e t h r o m b o x a n e s y n t h a s e i n h i b i t i o n d o e s n o t a f f o r d p r o t e c t i o n i n a r a t m o d e l o f s e p s i s i n w h i c h a f e c a l s u s p e n s i o n i s i n s t i l l e d i n t o t h e p e r i t o n e a l c a v i t y ( C o o k e t a l . , 1 9 8 2 ; B u t l e r e t a l . , 1 9 8 3 ) o r i n a m o d e l o f E . c a l i L P S i n f u s i o n i n t h e r a t ( F u r m a n e t a l . , 1 9 8 4 ) . T h u s , t h e r o l e a n d i m p o r t a n c e o f T x A 2 a s a d e t e r m i n a n t o f l i v e r i n j u r y d u r i n g e n d o t o x e m i a m a y v a r y w i t h b i o l o g i c a l a n d / o r e x p e r i m e n t a l d i f f e r e n c e s a m o n g a n i m a l s m o d e l s . O n e m o d e l o f e n d o t o x e m i a i n v o l v e s a s i n g l e i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f E . c a l i L P S t o r a t s . T o d e t e r m i n e t h e t i m e c o u r s e o f T x A Z p r o d u c t i o n i n t h i s m o d e l , p l a s m a T s z c o n c e n t r a t i o n w a s m e a s u r e d a t v a r i o u s t i m e s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n . T o e v a l u a t e t h e r o l e o f c y c l o o x y g e n a s e m e t a b o l i t e s , e s p e c i a l l y t h r o m b o x a n e , t h e e f f e c t o f p r e t r e a t m e n t e i t h e r w i t h a s p i r i n o r w i t h t h e t h r o m b o x a n e s y n t h a s e i n h i b i t o r , d a z m e g r e l , o n L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y w a s d e t e r m i n e d . F i n a l l y , t o g a i n i n s i g h t i n t h e p o s s i b l e m e c h a n i s m s b y w h i c h p r o s t a n o i d s c o n t r i b u t e t o h e p a o t o t o x i c i t y i n v i v a , w e e v a l u a t e d t h e e f f e c t s o f 2 2 2 a s p i r i n a n d d a z m e g r e l o n a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , t h r o m b o c y t o p e n i a a n d h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n d u r i n g L P S e x p o s u r e . 6 . C . M a t e r i a l s a n d m e t h o d s 6 . C . 1 . M a t e r i a l s L i p o p o l y s a c c h a r i d e ( E s c h e r i c h i a c a l i , s e r o t y p e 0 1 2 8 : B 1 2 ) , h e p a r i n ( T y p e I I , d i s o d i u m s a l t ) , a s p i r i n , i n d o m e t h a c i n a n d K i t 5 9 f o r d e t e r m i n a t i o n o f a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e ( A L T ) a c t i v i t y w e r e p u r c h a s e d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o m p a n y ( S t . L o u i s , M O ) . D e t e r m i n a t i o n o f p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n s w a s p e r f o r m e d w i t h D a t a - F l f i b r i n o g e n r e a g e n t s ( B a x t e r S c i e n t i f i c P r o d u c t s ) . B l o o d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s w e r e d e t e r m i n e d i n a B a k e r S y s t e m 2 0 0 0 B l o o d C e l l A n a l y z e r . " ‘ I n d i u m - o x i n e w a s p u r c h a s e d f r o m M e d i - P h y s i c s d i v i s i o n o f A m e r s h a m L i f e S c i e n c e ( A r l i n g t o n H e i g h t s , I L ) . P r o s t a g l a n d i n E 1 w a s p u r c h a s e d f r o m C a l b i o c h e m ( S a n D i e g o , C A ) . E n z y m e i m m u n o a s s a y ( E I A ) k i t s f o r m e a s u r e m e n t o f T x B , w e r e p u r c h a s e d f r o m C a y m a n C h e m i c a l ( A n n A r b o r , M I ) . 0 1 8 c o l u m n s f o r t h e e x t r a c t i o n o f l i p i d s w e r e p u r c h a s e d f r o m W a t e r s C h r o m a t o g r a p h y ( M i l l i p o r e , M i l f o r d , M A ) . D a z m e g r e l w a s a g e n e r o u s g i f t f r o m P f i z e r P h a m a c e u t i c a l s ( E n g l a n d ) . 6 . C . 2 . A n i m a l s S e e C h a p t e r 2 , s e c t i o n 0 . 2 . 2 2 3 6 . C . 3 . Q u a n t i f i c a t i o n o f t i s s u e p l a t e l e t d i s t r i b u t i o n S e e C h a p t e r 2 , s e c t i o n C . 6 . 6 . C . 4 . T i m e c o u r s e o f T x B 2 p r o d u c t i o n R a t s w e r e t r e a t e d w i t h L P S ( 4 m g l k g , i v ) o r s a l i n e v e h i c l e . T w o , f o u r a n d 6 h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S , a n i m a l s w e r e a n e s t h e t i z e d w i t h s o d i u m p e n t o b a r b i t a l ( 5 0 m g l k g , i p ) a n d a m i d l i n e l a p a r o t o m y w a s p e r f o r m e d . B l o o d w a s d r a w n f r o m t h e d e s c e n d i n g a o r t a i n t o a s y r i n g e c o n t a i n i n g s o d i u m c i t r a t e ( 0 . 3 8 % f i n a l c o n c e n t r a t i o n ) a n d i n d o m e t h a c i n ( 0 . 1 m M f i n a l c o n c e n t r a t i o n ) . P l a s m a ( 0 . 5 m l ) w a s s t o r e d a t - 2 0 ° C u n t i l i t w a s a s s a y e d f o r T s z i m m u n o r e a c t i v e s u b s t a n c e . P r o s t a n o i d s w e r e e x t r a c t e d f r o m p l a s m a w i t h S e p - P a k C - 1 8 c a r t r i d g e s . M e a s u r e m e n t o f T s z w a s p e r f o r m e d b y t h e U n i v e r s i t y o f M i c h i g a n L i g a n d C o r e l a b o r a t o r y u s i n g a T s z E I A k i t ( C a y m a n C h e m i c a l C o m p a n y , A n n A r b o r , M I ) . 6 . C . 5 . A s p i r i n s t u d y A s p i r i n ( 2 0 0 m g l m l ) w a s d i s s o l v e d i n s t e r i l e w a t e r ( p H 1 2 ) c o n t a i n i n g 0 . 9 5 M s o d i u m c a r b o n a t e . O n c e a s p i r i n w a s i n s o l u t i o n , t h e p H w a s a d j u s t e d t o 8 . 0 w i t h 1 M H C I . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h " ‘ l n - l a b e l e d p l a t e l e t s 2 h o u r s b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S . A s p i r i n ( 4 5 0 m g / k g ) o r v e h i c l e ( w a t e r , p H 8 . 0 ) w a s a d m i n i s t e r e d b y g a v a g e 1 h o u r b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g l k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e . T h i s t r e a t m e n t r e g i m e n h a s b e e n s h o w n t o 2 2 4 i n h i b i t p l a t e l e t a g g r e g a t i o n e x v i v a w i t h i n 1 h o u r a f t e r a s p i r i n a d m i n i s t r a t i o n ( B a i l i e e t a l . , 1 9 9 5 ) . S i x h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S , a n i m a l s w e r e a n e s t h e t i z e d w i t h s o d i u m p e n t o b a r b i t a l ( 5 0 m g l k g , i p ) a n d a m i d l i n e l a p a r o t o m y w a s p e r f o r m e d . B l o o d w a s d r a w n f r o m t h e d e s c e n d i n g a o r t a i n t o s o d i u m c i t r a t e ( 0 . 3 8 % f i n a l c o n c e n t r a t i o n ) a n d i n d o m e t h a c i n ( 0 . 1 m M f i n a l c o n c e n t r a t i o n ) . T h e l i v e r , l u n g s , s p l e e n a n d k i d n e y s w e r e e x c i s e d f o r d e t e r m i n a t i o n o f r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t d i s t r i b u t i o n . L i v e r s e c t i o n s w e r e f i x e d i n 1 0 % n e u t r a l b u f f e r e d f o r m a l i n a n d p r o c e s s e d f o r h i s t o l o g i c e v a l u a t i o n . B l o o d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s w e r e d e t e r m i n e d , a n d p l a s m a s a m p l e s w e r e a s s a y e d f o r p l a s m a T x B 2 a n d f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n a n d f o r A L T a c t i v i t y . 6 . C . 6 . D a z m e g r e l s t u d y D a z m e g r e l ( 2 5 m g l m l ) w a s d i s s o l v e d i n s t e r i l e w a t e r ( p H 1 2 ) . O n c e i n s o l u t i o n , t h e p H w a s a d j u s t e d t o 8 . 5 w i t h 1 M H C l . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h 1 1 1 l n - I a b e l e d p l a t e l e t s 2 h o u r s b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S . D a z m e g r e l ( 5 0 m g l k g ) o r i t s v e h i c l e ( w a t e r , p H 8 . 5 ) w a s a d m i n i s t e r e d b y g a v a g e 1 h o u r b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g l k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S , a n i m a l s w e r e a n e s t h e t i z e d w i t h s o d i u m p e n t o b a r b i t a l ( 5 0 m g l k g , i p ) a n d a m i d l i n e l a p a r o t o m y w a s p e r f o r m e d . B l o o d w a s d r a w n f r o m t h e d e s c e n d i n g a o r t a i n t o s o d i u m c i t r a t e ( 0 . 3 8 % f i n a l c o n c e n t r a t i o n ) a n d i n d o m e t h a c i n ( 0 . 1 m M f i n a l c o n c e n t r a t i o n ) . T h e l i v e r , l u n g s , s p l e e n a n d k i d n e y s w e r e e x c i s e d f o r d e t e r m i n a t i o n o f r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t d i s t r i b u t i o n . L i v e r s e c t i o n s w e r e f i x e d i n 1 0 % n e u t r a l b u f f e r e d f o r m a l i n a n d p r o c e s s e d f o r 2 2 5 h i s t o l o g i c e v a l u a t i o n . B l o o d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s w e r e d e t e r m i n e d a n d p l a s m a s a m p l e s w e r e a s s a y e d f o r p l a s m a T s z a n d f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n a n d f o r A L T a c t i v i t y . 6 . C . 7 . D a t a a n a l y s i s A o n e - w a y a n a l y s i s o f v a r i a n c e ( A N O V A ) o n r a n k s w a s u s e d t o e v a l u a t e r e s u l t s o f t h e t i m e c o u r s e o f p l a s m a T x B , p r o d u c t i o n . C o m p a r i s o n s b e t w e e n t r e a t m e n t a n d c o n t r o l w e r e p e r f o r m e d w i t h D u n n ' s m e t h o d ( S t e e l a n d T o r r i e , 1 9 8 0 ) . F o r a s p i r i n a n d d a z m e g r e l s t u d i e s , a l l d a t a w e r e a n a l y z e d w i t h a 2 X 2 m u l t i f a c t o r i a l , c o m p l e t e l y r a n d o m A N O V A . D a t a w i t h n o n h o m o g e n e o u s v a r i a n c e s w e r e s q u a r e r o o t - o r l o g - t r a n s f o r m e d p r i o r t o a n a l y s i s . C o m p a r i s o n s b e t w e e n g r o u p s w e r e p e r f o r m e d w i t h T u k e y ' s o m e g a t e s t ( S t e e l a n d T o r r i e , 1 9 8 0 ) . T h e c r i t e r i o n f o r s i g n i f i c a n c e f o r a l l s t u d i e s w a s p 5 0 . 0 5 . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : s t a n d a r d e r r o r o f t h e m e a n ( S E M ) . F o r a l l r e s u l t s p r e s e n t e d , N r e p r e s e n t s t h e n u m b e r o f i n d i v i d u a l a n i m a l s u s e d i n t h e s t u d y . 6 . D . R e s u l t s 6 . D . 1 . T i m e c o u r s e o f T s z p r o d u c t i o n L P S a d m i n i s t r a t i o n r e s u l t e d i n a n e l e v a t i o n i n p l a s m a T s z c o n c e n t r a t i o n . P l a s m a T s z w a s e l e v a t e d 2 h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n a n d r e m a i n e d e l e v a t e d t h e r e a f t e r ( F i g u r e 6 . 1 ) . 2 2 6 6 . D . 2 . A s p i r i n s t u d y P r e t r e a t m e n t w i t h a s p i r i n p r e v e n t e d t h e L P S - i n d u c e d e l e v a t i o n i n p l a s m a T s z c o n c e n t r a t i o n m e a s u r e d 6 h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S , c o n f i r m i n g i n h i b i t i o n o f c y c l o o x y g e n a s e a c t i v i t y ( F i g u r e 6 . 2 ) . P l a s m a a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e ( A L T ) o c c u r s i n h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l s a n d i t s r e l e a s e i n t o t h e p l a s m a i s c o m m o n l y u s e d a s a n i n d i c a t o r o f h e p a t o c e l l u l a r d a m a g e . A s s h o w n i n p r e v i o u s s t u d i e s , L P S a d m i n i s t r a t i o n r e s u l t e d i n l i v e r i n j u r y , a s m a r k e d b y e l e v a t i o n s i n p l a s m a A L T a c t i v i t y ( F i g u r e 6 . 3 ) . P r e t r e a t m e n t w i t h a s p i r i n r e d u c e d t h e i n c r e a s e i n A L T a e t i v i t y b y 5 0 % , s u g g e s t i n g a r e d u c t i o n i n l i v e r i n j u r y . T h i s f i n d i n g w a s c o n s i s t e n t w i t h h i s t o l g i c e v a l u a t i o n o f l i v e r s e c t i o n s ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S r e s u l t e d i n a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , a s m a r k e d b y a d e c r e a s e i n p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n ( F i g u r e 6 . 4 ) . A s p i r i n h a d n o e f f e c t o n L P S - i n d u c e d a c t i v a t i o n o f c o a g u l a t i o n . C o n s i s t e n t w i t h p r e v i o u s s t u d i e s , L P S a l s o r e s u l t e d i n t h r o m b o c y t o p e n i a ( F i g u r e 6 . 5 ) a n d a p r o n o u n c e d a c c u m u l a t i o n o f r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s i n t h e l i v e r ( F i g u r e 6 . 6 ) . P r e t r e a t m e n t w i t h a s p i r i n a l t e r e d n e i t h e r t h e t h r o m b o c y t o p e n i a n o r t h e h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n . T a b l e 6 . 1 s h o w s t h e d i s t r i b u t i o n o f r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s i n b l o o d , s p l e e n , k i d n e y s a n d l u n g s f o r e a c h t r e a t m e n t g r o u p . L P S e x p o s u r e r e s u l t e d i n a s i g n i f i c a n t d e c r e a s e i n r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s i n b l o o d , a n d t h i s d e c r e a s e w a s n o t a l t e r e d b y p r e t r e a t m e n t w i t h a s p i r i n . L P S e x p o s u r e d e c r e a s e d s p l e n i c r a d i o a c t i v i t y , a n d t h i s w a s i n h i b i t e d w i t h a s p i r i n . T h e d i s t r i b u t i o n o f r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s i n t h e l u n g s a n d k i d n e y s w a s n o t a l t e r e d b y t h e 2 2 7 a d m i n i s t r a t i o n o f L P S i r r e s p e c t i v e o f a s p i r i n t r e a t m e n t . 6 . D . 3 . D a z m e g r e l s t u d y A s w i t h a s p i r i n , p r e t r e a t m e n t w i t h d a z m e g r e l i n h i b i t e d t h e L P S - i n d u c e d e l e v a t i o n i n p l a s m a T s z c o n c e n t r a t i o n ( F i g u r e 6 . 7 ) , v e r i f y i n g t h e i n h i b i t i o n o f t h r o m b o x a n e s y n t h a s e a c t i v i t y . H o w e v e r , p r e t r e a t m e n t w i t h d a z m e g r e l d i d n o t i n h i b i t t h e h e p a t o t o x i c i t y o b s e r v e d a f t e r L P S e x p o s u r e , a s m e a s u r e d b y p l a s m a A L T a c t i v i t y ( F i g u r e 6 . 8 ) . T h i s f i n d i n g w a s c o n s i s t e n t w i t h h i s t o l o g i c e v a l u a t i o n o f l i v e r s e c t i o n s ( d a t a n o t s h o w n ) . S i m i l a r t o t h e f i n d i n g s w i t h a s p i r i n , d a z m e g r e l h a d n o e f f e c t o n L P S - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a ( F i g u r e 6 . 9 ) , a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m ( F i g u r e 6 . 1 0 ) o r h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n ( F i g u r e 6 . 1 1 ) . T h e d i s t r i b u t i o n o f r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s i n b l o o d a n d o t h e r t i s s u e s i n t h e d a z m e g r e l s t u d y w a s s i m i l a r t o t h a t r e p o r t e d f o r a s p i r i n ( d a t a n o t s h o w n ) . 2 2 8 F i g u r e 6 . 1 . l m T 2 e p n e e n t r a t i p n p a r i n g L P S e x p p e u r e . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h L P S ( 4 m g l k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e . T w o , f o u r a n d s i x h o u r s l a t e r , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f p l a s m a T x B 2 c o n c e n t r a t i o n a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . S i n c e t h e v a l u e s f r o m s a l i n e - t r e a t e d r a t s d i d n o t c h a n g e w i t h t i m e , t h e s e v a l u e s w e r e g r o u p e d a n d r e p r e s e n t e d a s c o n t r o l ( i . e . , 0 h r ) . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 3 — 5 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l ( i . e . , 0 h r ) ) l m / g p ( 2 8 e n a x o b m o r h T a m s a l P I O I 1 T i m e a f t e r 2 I P L l 3 S a d m i n i s 4 I t r a t i l 5 o n l 6 ( h r s ) 2 2 9 8 0 0 7 O 6 0 0 - a O / 4 0 0 - 2 0 0 - , i H G U R E 6 4 2 3 0 F i g u r e 6 2 . W o m a n . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h a s p i r i n ( 4 5 0 m g l k g , p o ) o r i t s v e h i c l e 1 h r b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g l k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f p l a s m a T x B 2 c o n c e n t r a t i o n a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 6 - 1 1 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f L P S b , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f a s p i r i n ) l m / g p ( e n a x o b m o r h T a m s a l P M m : < m I _ O _ i m a I m m o o . ' 5 3 2 2 m o o o G o o . B o o . m o o - 0 I I m > : z m C u m 3 0 c m m 9 N 2 3 2 F i g u r e 6 . 3 . T h e e f f e e t a p f L P S a n a a s p i r i n a n p l a s m a A L I a e t j y i t y . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h a s p i r i n ( 4 5 0 m g l k g , p o ) o r i t s v e h i c l e 1 h r b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g l k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f p l a s m a A L T a c t i v i t y a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : l : S E M , N = 6 — 1 1 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f L P S b , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f a s p i r i n - A S P I R I N ) L / U ( y t i v i t c A T L A a m s a l P 1 6 0 0 - 4 0 0 1 2 0 0 - 8 0 0 - 2 3 3 V E H I C L E I — L “ S A L I N E F i g u r e 6 . 3 a , b L P S 2 3 4 F i g u r e 6 . 4 . T h f f f n i r i n n l f i r i A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h a s p i r i n ( 4 5 0 m g / k g , p o ) o r i t s v e h i c l e 1 h r b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g l k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 6 - 1 1 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f L P S ) l d / g m ( n e g o n i r b i F a m s a l P e m m r m e m d m d fi i p h a 3 8 9 3 I N ) C ) C ) — l ( 1 1 C D C D C D C D 1 0 0 - 1 2 3 5 V E H I C L E - A S P I R I N ( 1 i i S A L I N E L P S F I G U R E 6 . 4 2 3 6 F i g u r e 6 . 5 . T h e e f f e p t a p f L P S a n d a s p i r i n a n a l g a e p l a t e l e t e p p e e n t t a t j p p . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h a S p i r i n ( 4 5 0 m g l k g , p o ) o r i t s v e h i c l e 1 h r b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g l k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 6 - 1 1 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f L P S A _ : 0 \ o _ _ o o a ? 8 5 6 . 2 8 0 4 8 . 3 3 2 2 . ” . o o o O _ m 2 3 7 V E H I C L E - A S P I R I N L P S S A L I N E F I G U R E 6 . 5 2 3 8 F i g u r e 6 . 6 . T h e e f f e e t e Q f L P S a r i a a e p i r i n e n h e p a t i e p l a t e l e t a e e u m u l a t i e g . A l l a n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h 1 1 1 I n - l a b e l e d p l a t e l e t s ( i v ) 2 h r s b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h a s p i r i n ( 4 5 0 m g l k g , p o ) o r i t s v e h i c l e 1 h r b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g l k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , l i v e r s e c t i o n s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f r a d i o a c t i v i t y i n a g a m m a c o u n t e r a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 6 - 1 1 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f L P S S A L I N E L P S 2 3 9 0 3 O V E H I C L E a L A S P I R I N o 5 0 - _ a . 2 . E 4 0 E O . o 3 0 - ' O B . 3 2 0 - E I ~ 1 5 1 0 ~ 0 2 0 F i g u r e 6 . 6 2 4 0 T A B L E 6 . 1 E f f e c t s o f A s p i r i n a n d L P S o n P l a t e l e t D i s t r i b u t i o n I n t h e B l o o d , S p l e e n , K i d n e y s a n d L u n g s T R E A T M E N T G R O U P S T I S S U E S A L I N E L P S + . . S A L I N E + V E H + A S P I R I N L P S + V E H A S P I R I N B L O O D 4 . 6 i 0 . 6 3 . 7 : 1 : 0 . 4 0 . 7 : I : 0 . 2 ‘ 1 . 2 : 0 . 5 ' S P L E E N 1 5 3 1 0 . 6 1 4 . 0 : l : 0 . 9 9 . 5 1 0 . 8 ' 1 4 . 6 1 2 5 K I D N E Y S 1 5 1 0 . 5 1 . 6 3 : 0 . 4 2 . 2 3 : 0 . 8 2 . 4 3 : 0 . 5 L U N G S 3 3 1 0 . 8 2 . 7 1 0 3 2 . 2 3 : 0 . 2 2 . 5 3 : 0 . 2 R a t s w e r e g i v e n m l n - l a b e l e d p l a t e l e t s 2 h r s b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S . R a t s w e r e p r e t r e a t e d w i t h e i t h e r a s p i r i n ( 4 5 0 m g l k g , p o ) o r i t s v e h i c l e ( V E H ) 1 h r b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g l k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S , b l o o d a n d o r g a n s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f r a d i o a c t i v i t y a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s p e r c e n t o f i n j e c t e d r a d i o a c t i v i t y i n t h e e n t i r e o r g a n ( m e a n 3 : S E M ) , N = 6 - 1 1 p e r g r o u p . ' s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f L P S b s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f a s p i r i n 2 4 1 F i g u r e 6 . 7 . T h e e f f e e t s p f L P S a n a a a z m e g t e l e n p l a s m a I x fl z m e e p t t a t i p p . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h d a z m e g r e l ( 5 0 m g l k g , p o ) o r i t s v e h i c l e 1 h r b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g l k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f p l a s m a T x B 2 c o n c e n t r a t i o n a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 6 - 1 1 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f L P S b , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f d a z m e g r e l ) l m / g p ( e n a x o b m o r h T a m s a l P 1 5 0 0 - — l N O 0 9 0 0 - 6 0 0 - 3 0 0 - 2 4 2 V E H I C L E . D A Z M E G R E L T : h S A L I N E F I G U R E 6 . 7 a , b j L P S 2 4 3 F i g u r e 6 . 8 . T h e e f f e e t s p f L P S a n d d a z m e g r e l p p p l a s m a A L ! a e t i v l t y . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h d a z m e g r e l ( 5 0 m g l k g , p o ) o r i t s v e h i c l e 1 h r b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g l k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f p l a s m a A L T a c t i v i t y a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 6 - 1 1 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f L P S 1 0 0 0 i < " 3 3 E 4 ‘ 5 < 5 < U E U 2 D ) . I - - 8 0 0 6 0 0 4 0 0 2 0 0 - 0 V D E A H Z I C M L E E G R E L a i i i I N E S A L L P S F i g u r e 6 . 8 2 4 4 2 4 5 F i g u r e 6 . 9 . T h e e f f e e t s p f L P S a n a p a z m e g r e l a n p i p e d p l a t e l e t e p p e e n t r a t i p n . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h d a z m e g r e l ( 5 0 m g l k g , p o ) o r i t s v e h i c l e 1 h r b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g l k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 6 - 1 1 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f L P S A _ 1 O \ o _ _ o o o n : 8 x v 6 . 2 8 0 4 8 . 2 8 . 2 3 3 o o o 0 _ m 2 4 6 V E H I C L E - D A Z M E G R E L L P S S A L I N E F I G U R E 6 . 9 2 4 7 F i g u r e 6 . 1 0 . T h f f f P n z m r l n l ° r ' n n n r i n . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h d a z m e g r e l ( 5 0 m g l k g , p o ) o r i t s v e h i c l e 1 h r b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g l k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 6 — 1 1 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f L P S ) l d / g m ( n e g o n i r b i F a m s a l P O N N O 0 1 O O — I 0 1 0 1 0 0 - 0 1 2 4 8 V E H I C L E _ D A Z M E G R E L S A L I N E L P S F i g u r e 6 . 1 0 2 4 9 F i g u r e 6 . 1 1 . T h f f f P n m W . A l l a n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h “ ‘ l n - l a b e l e d p l a t e l e t s ( i v ) 2 h r s b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h d a z m e g r e l ( 5 0 m g l k g , p o ) o r i t s v e h i c l e 1 h r b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 4 m g l k g , i v ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e . S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , l i v e r s e c t i o n s w e r e c o l l e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f r a d i o a c t i v i t y i n a g a m m a c o u n t e r a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n : 1 : S E M , N = 6 - 1 1 p e r g r o u p . a , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f L P S 2 5 0 5 0 . V E H I C L E 3 ' D A Z M E G R E L a a . 2 5 o . . E E 4 0 1 o . o ' 0 3 0 - . 8 o . 9 . . E 2 0 : o 1 0 - m a s 0 S A L I N E L P S F i g u r e 6 . 1 1 2 5 1 6 . E . D i s c u s s i o n T h e i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f L P S t o r a t s s t i m u l a t e s T x A 2 p r o d u c t i o n , a s m e a s u r e d b y i n c r e a s e d p l a s m a T x B 2 c o n c e n t r a t i o n . C o n c e n t r a t i o n s o f T x B 2 a r e e l e v a t e d 2 h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S a n d t e n d t o i n c r e a s e t h e r e a f t e r . R e s u l t s f r o m t h i s s t u d y s u g g e s t t h a t c y c l o o x y g e n a s e p r o d u c t s , b u t n o t t h r o m b o x a n e , c o n t r i b u t e t o t h e p a t h o g e n e s i s o f L P S - i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y . I n a d d i t i o n , c y c l o o x y g e n a s e p r o d u c t s a p p a r e n t l y d o n o t c o n t r i b u t e t o t h e a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , t h r o m b o c y t o p e n i a o r h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n o b s e r v e d a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n . T x A 2 , a p o t e n t v a s o c o n s t r i c t o r a n d a c t i v a t o r o f p l a t e l e t s , i s r e l e a s e d f r o m n u m e r o u s c e l l s , i n c l u d i n g a c t i v a t e d p l a t e l e t s a n d L P S - t r e a t e d K u p f f e r c e l l s ( K a w a d a e t a l . , 1 9 9 2 ; M o s c a t e t a l . , 1 9 8 7 ; l s h i g u r o e t a l . , 1 9 9 4 ) . O n c e a c t i v a t e d , p l a t e l e t s r e l e a s e c o a g u l a t i o n f a c t o r s , e x p r e s s a p r o c o a g u l a n t s u r f a c e t h a t s t i m u l a t e s t h e i n t r i n s i c p a t h w a y o f c o a g u l a t i o n a n d p r o t e c t c o a g u l a t i o n f a c t o r s f r o m p r o t e o l y t i c d e g r a d a t i o n ( W a l s h , 1 9 8 1 a ; W a l s h e t a l . , 1 9 8 1 b ) . S i n c e L P S - i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y i s d e p e n d e n t u p o n K u p f f e r c e l l s , p l a t e l e t s a n d t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m ( l i m u r o e t a l . , 1 9 9 4 ; P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 5 ; H e w e t t e t a l . , 1 9 9 5 ; M a r g a r e t t e n e t a l . , 1 9 6 7 ) a n d T x A 2 c o u l d m e d i a t e i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e m , t h i s p r o m p t e d a n e v a l u a t i o n o f t h e r o l e o f T x A 2 i n L P S - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a , h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n a n d a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m . H o w e v e r , r e s u l t s w i t h a s p i r i n a n d d a z m e g r e l s u g g e s t t h a t t h r o m b o x a n e d o e s n o t c o n t r i b u t e t o t h e s e e v e n t s . T h i s f i n d i n g c o n t r a s t s r e s u l t s 2 5 2 f r o m a n o t h e r m o d e l o f e n d o t o x e m i a i n w h i c h t h r o m b o x a n e s y n t h a s e i n h i b i t o r s a t t e n u a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a ( O l a n o f f e t a l . , 1 9 8 5 ) a n d t h e e l e v a t i o n i n f i b r i n d e g r a d a t i o n p r o d u c t s ( W i s e e t a l . , 1 9 8 0 ) i n r a t s t r e a t e d i n t r a v e n o u s l y w i t h 2 0 m g / k g S a l m o n e l l a e n t e r i t i d i s L P S . T h e c o n t r a s t i n g n a t u r e o f t h e r e s u l t s m a y b e a c o n s e q u e n c e o f d i f f e r e n c e s i n t h e b a c t e r i a l s o u r c e a n d d o s e o f L P S . I n t h e s e s t u d i e s , p r e t r e a t m e n t w i t h a s p i r i n a t t e n u a t e d L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y b u t t h e t h r o m b o x a n e s y n t h a s e i n h i b i t o r , d a z m e g r e l , h a d n o e f f e c t . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e f i n d i n g s s u g g e s t t h a t p r o s t a n o i d s o t h e r t h a n t h r o m b o x a n e m i g h t b e c r i t i c a l t o t h e d e v e l o p m e n t o f h e p a t o t o x i c i t y . P G D Z i s t h e m a i n p r o s t a n o i d p r o d u c e d b y u n s t i m u l a t e d K u p f f e r c e l l s , a n d i t s p r o d u c t i o n i s i n c r e a s e d u p o n K u p f f e r c e l l a c t i v a t i o n ( U j i h a r a e t a l . , 1 9 8 8 ; G r e w e e t a l . , 1 9 9 2 ; D i e t e r e t a l . , 1 9 8 9 ) . I n c e r t a i n t u m o r c e l l l i n e s , P G D 2 a n d i t s s e r u m m e t a b o l i t e , d e l t a ” - P G J Z , a r e c y t o t o x i c ( l k a i e r a l . , 1 9 9 5 ; U j i h a r a e t a l . , 1 9 8 8 ) . T h i s c y t o t o x i c i t y i s c h a r a c t e r i z e d b y c h a n g e s i n c e l l m e m b r a n e i n t e g r i t y a n d d a m a g e t o a c t i n a n d k e r a t i n f i l a m e n t s ( l k a i e t a l . , 1 9 9 5 ) . I t i s n o t k n o w n w h e t h e r P G D 2 h a s s i m i l a r c y t o t o x i c e f f e c t s o n h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l s . H o w e v e r , P G D , s p e c i f i c a l l y b i n d s t o h e p a t o c y t e s ( K u i p e r e t a l . , 1 9 8 8 ; C a s t e l e i j n e t a l . , 1 9 8 8 a ; C a s t e l e i j n e t a l . , 1 9 8 8 b ; K u i p e r e t a l . , 1 9 8 9 ) a n d c a n a l t e r h e p a t o c e l l u l a r f u n c t i o n . I n t h e i s o l a t e d p e r f u s e d l i v e r , P G D 2 i n c r e a s e s c a l c i u m e f f l u x , g l y c o g e n o l y s i s a n d p o r t a l p r e s s u r e ( A l t i n e t a l . , 1 9 8 8 ) . T h e r e l a t i o n s h i p o f t h e s e a l t e r a t i o n s t o h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s i s u n k n o w n , b u t , t h e p o s s i b i l i t y t h a t P G D 2 , b y a l t e r i n g i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m , m i g h t i n c r e a s e t h e s u s c e p t i b i l i t y o f h e p a t o c y t e s t o i n j u r y f r o m o t h e r i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s i s i n t r i g u i n g . 2 5 3 T h e s e s t u d i e s s u g g e s t t h a t t h r o m b o x a n e i s n o t c r i t i c a l t o t h e p a t h o g e n e s i s o f l i v e r i n j u r y d u r i n g L P S e x p o s u r e a n d a r e i n c o n t r a s t t o f i n d i n g s i n a n o t h e r m o d e l o f e n d o t o x e m i a i n w h i c h r a t s w e r e t r e a t e d w i t h a l a r g e r d o s e o f L P S . T h e b o l u s , i n t r a v e n o u s i n j e c t i o n o f 2 0 m g / k g 8 . e n t e r i t i d i s L P S r e s u l t s i n a p e a k o f p l a s m a T x B , c o n c e n t r a t i o n w i t h i n 3 0 m i n u t e s t h a t d e c r e a s e s t h e r e a f t e r ( C o o k e t a l . , 1 9 8 0 ) . S i g n i f i c a n t h e p a t o c e l l u l a r d a m a g e o c c u r s w i t h i n 4 h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S . I n t h i s m o d e l o f e n d o t o x e m i a , p r e t r e a t m e n t w i t h c y c l o o x y g e n a s e i n h i b i t o r s , t h r o m b o x a n e s y n t h a s e i n h i b i t o r s o r t h r o m b o x a n e r e c e p t o r a n t a g o n i s t s a f f o r d s p r o t e c t i o n f r o m l e t h a l i t y , l i v e r i n j u r y , t h r o m b o c y t o p e n i a a n d a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m ( O l a n o f f e t a l . , 1 9 8 5 ; W i s e e t a l . , 1 9 8 0 ; C o o k e t a l . , 1 9 8 2 ; W i s e e t a l . , 1 9 8 0 ; C o o k e t a l . , 1 9 8 0 ) . T h i s m o d e l u s i n g 8 . e n t e r i t i d i s L P S i s d i f f e r e n t f r o m t h e o n e w e u s e d i n w h i c h t h e i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f a s m a l l e r d o s e o f E . c a l i L P S t o r a t s r e s u l t e d i n a m o r e g r a d u a l i n c r e a s e i n p l a s m a T s z o v e r a 6 h o u r p e r i o d . I n a d d i t i o n , i n t h e m o d e l w e h a v e e m p l o y e d , t h e o n s e t o f l i v e r i n j u r y d o e s n o t o c c u r u n t i l n e a r l y 4 h o u r s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S a n d i s n o t p r o n o u n c e d u n t i l a b o u t 6 h o u r s a f t e r L P S e x p o s u r e ( P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h u s , t h e t i m e c o u r s e o f t h r o m b o x a n e p r o d u c t i o n a n d t h e o n s e t o f h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y a p p e a r t o d i f f e r s i g n i f i c a n t l y i n t h e s e t w o m o d e l s . T h e d i s s i m i l a r i t i e s m a y b e a c o n s e q u e n c e o f b o t h t h e b a c t e r i a l s o u r c e a n d d o s e o f L P S . T h e s e c o n t r a s t i n g f i n d i n g s u n d e r s c o r e t h a t d i f f e r e n t i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s m a y h a v e p r o m i n a n c e i n v a r i o u s m o d e l s o f e n d o t o x e m i a . 2 5 4 B a s e d o n t h e t i m e c o u r s e o f p l a s m a T x B , p r o d u c t i o n , r e s u l t s i n t h e m o d e l e m p l o y i n g b o l u s , i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f a m o d e s t d o s e o f E . c a l i L P S a p p e a r t o r e s e m b l e m o r e c l o s e l y m o d e l s i n w h i c h e n d o t o x e m i a i s i n d u c e d b y t h e i n t r a p e r i t o n e a l a d m i n i s t r a t i o n o f a f e c a l s u s p e n s i o n ( C o o k e t a l . , 1 9 8 2 ; B u t l e r e t a l . , 1 9 8 3 ) o r t h e i n f u s i o n o f E . c a l i L P S o v e r a 4 h o u r p e r i o d ( F u r m a n e t a l . , 1 9 8 4 ) . I n t h e s e m o d e l s , t h e e l e v a t i o n o f p l a s m a T x B 2 i s s u s t a i n e d o v e r a 4 - 8 h o u r p e r i o d a f t e r t h e i n i t i a t i o n o f e n d o t o x e m i a . I n a d d i t i o n , t h r o m b o x a n e s y n t h a s e i n h i b i t o r s d o n o t p r e v e n t l e t h a l i t y o r l i v e r i n j u r y ( C o o k e t a l . , 1 9 8 2 ; B u t l e r e t a l . , 1 9 8 3 ; F u r m a n e t a l . , 1 9 8 4 ) . T h u s , i n m o d e l s i n w h i c h t h e e l e v a t i o n o f p l a s m a T x B 2 i s s u s t a i n e d f o r s e v e r a l h o u r s , t h r o m b o x a n e d o e s n o t a p p e a r t o b e c r i t i c a l t o t h e d e v e l o p m e n t o f l e t h a l o r h e p a t o t o x i c e f f e c t s . B y c o n t r a s t , i n m o d e l s o f e n d o t o x e m i a i n w h i c h t h e e l e v a t i o n i n p l a s m a T x B 2 i s m o r e p r o n o u n c e d a n d t r a n s i e n t , t h r o m b o x a n e i s c r i t i c a l f o r t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r i n j u r y ( W i s e e t a l . , 1 9 8 0 ; C o o k e t a l . , 1 9 8 2 ) . T o g e t h e r , t h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e r o l e o f i m p o r t a n c e o f t h r o m b o x a n e i n v a r i o u s m o d e l s o f e n d o t o x e m i a m a y b e d e f i n e d b y t h e d u r a t i o n a n d m a g n i t u d e o f T x B 2 p r o d u c t i o n . I n s u m m a r y , r e s u l t s f r o m t h i s s t u d y s u g g e s t t h a t t h r o m b o x a n e i s n o t a c r i t i c a l m e d i a t o r o f l i v e r i n j u r y , t h r o m b o c y t o p e n i a , h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n a n d a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m d u r i n g L P S e x p o s u r e . T h e s e f i n d i n g s a l s o s u g g e s t t h a t p r o s t a n o i d s o t h e r t h a n t h r o m b o x a n e p a r t i a l l y c o n t r i b u t e t o l i v e r i n j u r y i n t h i s m o d e l . I n l i g h t o f o t h e r p u b l i s h e d r e s u l t s o n t h e r o l e o f t h r o m b o x a n e , t h e s e f i n d i n g s e m p h a s i z e d i f f e r e n c e s a m o n g a n i m a l m o d e l s o f e n d o t o x e m i a . F u r t h e r m o r e , t h e s e f i n d i n g s s u g g e s t t h a t t h e n a t u r e o f 2 5 5 t h r o m b o x a n e g e n e r a t i o n i n r e s p o n s e t o L P S m a y v a r y a m o n g m o d e l s a n d t h i s m a y d e f i n e i t s c r i t i c a l r o l e i n t h e p a t h o g e n e s i s o f t i s s u e i n j u r y . m m m m Z O _ w D A U Z O U 0 2 < > m < 5 = 2 3 m 5 « 3 . 5 4 1 0 2 5 7 T h e o v e r a l l a i m o f t h i s d i s s e r t a t i o n w a s t o e x a m i n e t h e m e c h a n i s m s b y w h i c h e x p o s u r e t o L P S c u l m i n a t e s i n l i v e r i n j u r y . I n p a r t i c u l a r , t h e r o l e s o f h o s t - d e r i v e d , c e l l u l a r a n d s o l u b l e m e d i a t o r s i n t h e p a t h o g e n e s i s w e r e e v a l u a t e d . M a j o r e m p h a s i s w a s p l a c e d o n t h e r o l e o f p l a t e l e t s i n h e p a t o t o x i c i t y . S t u d i e s w e r e c o n d u c t e d t o e v a l u a t e h o w p l a t e l e t s m i g h t c o n t r i b u t e t o t i s s u e i n j u r y a n d a l s o h o w p l a t e l e t s i n t e r a c t w i t h o t h e r i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s . R e s u l t s f r o m s t u d i e s p r e s e n t e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n s u g g e s t t h a t s e v e r a l i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s , i n c l u d i n g p l a t e l e t s , n e u t r o p h i l s , K u p f f e r c e l l s , t h r o m b i n a n d c y c l o o x y g e n a s e p r o d u c t s , c o n t r i b u t e t o t h e m a n i f e s t a t i o n o f h e p a t o c e l l u l a r d a m a g e . I n a d d i t i o n , r e s u l t s f r o m t h e s e s t u d i e s s u g g e s t t h a t t h e f u l l p a t h o g e n e s i s o f l i v e r i n j u r y d e p e n d s u p o n c o m p l e x i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e s e i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s . 7 . A . T e m p o r a l r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n a l t e r a t i o n s i n t h e b l o o d a n d l i v e r d u r i n g L P S e x p o s u r e T h e a d m i n i s t r a t i o n o f a s i n g l e , b o l u s i n j e c t i o n o f L P S r e s u l t e d i n t h e a c c u m u l a t i o n o f b o t h p l a t e l e t s a n d n e u t r o p h i l s w i t h i n 1 h o u r , f o l l o w e d b y c o n t i n u e d i n c r e a s e s o v e r t h e n e x t s e v e r a l h o u r s . C o n c u r r e n t w i t h t h e h e p a t i c n e u t r o p h i l i n f i l t r a t i o n w a s a p r o n o u n c e d d e c r e a s e i n b l o o d n e u t r o p h i l s , f o l l o w e d b y a r e l e a s e o f i m m a t u r e , b a n d n e u t r o p h i l s i n t o t h e b l o o d . T h e h e p a t i c i n f i l t r a t i o n o f i n f l a m m a t o r y c e l l s p r e c e d e d t h e i n c r e a s e i n p l a s m a T N F - a 2 5 8 c o n c e n t r a t i o n t h a t w a s m a x i m a l 1 . 5 h o u r s a f t e r L P S e x p o s u r e . P l a s m a T x B 2 a l s o i n c r e a s e d c o n t i n u o u s l y a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S t h r o u g h o u t t h e 6 h o u r d u r a t i o n o f t h e s e s t u d i e s . A c o n s u m p t i v e c o a g u l o p a t h y b e g a n b e t w e e n 2 - 3 h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n . T h i s w a s c h a r a c t e r i z e d b y d e c r e a s e d p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n a n d b l o o d p l a t e l e t n u m b e r s . A l l o f t h e s e e v e n t s p r e c e d e d t h e o n s e t o f h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y , a s m a r k e d b y e l e v a t i o n s i n t h e p l a s m a o f t h e l i v e r s p e c i f i c e n z y m e , A L T . L i v e r d a m a g e p r o g r e s s e d r a p i d l y b e t w e e n 4 a n d 6 h o u r s a f t e r L P S e x p o s u r e . S i x h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , l i v e r i n j u r y w a s c h a r a c t e r i z e d b y p r i m a r i l y , m i d z o n a l h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s w i t h a p r o n o u n c e d s i n u s o i d a l n e u t r o p h i l i a . 7 . B . T h e r o l e o f p l a t e l e t s i n L P S - i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y R e s u l t s f r o m s t u d i e s p r e s e n t e d i n C h a p t e r 2 d e m o n s t r a t e d t h a t a n i m a l s b e c a m e t h r o m b o c y t o p e n i c p r i o r t o t h e o n s e t o f l i v e r i n j u r y . I n a d d i t i o n , s t u d i e s w i t h 1 1 1 l n - l a b e l e d p l a t e l e t s , s u g g e s t e d t h a t p l a t e l e t s a c c u m u l a t e i n t h e l i v e r s h o r t l y a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S . P r i o r d e p l e t i o n o f p l a t e l e t s w i t h a p o l y c l o n a l a n t i s e r u m a f f o r d e d p r o t e c t i o n f r o m l i v e r i n j u r y . T h e s e r e s u l t s s u p p o r t t h e m a i n h y p o t h e s i s o f t h i s t h e s i s t h a t p l a t e l e t s c o n t r i b u t e t o L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . T a k i n g a l l o f t h e v a l u e s f r o m L P S - t r e a t e d a n i m a l s e v a l u a t e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n , t h e r e a p p e a r s t o b e a w e a k n e g a t i v e c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e 2 5 9 n u m b e r s o f p l a t e l e t s i n t h e b l o o d a n d p l a s m a A L T a c t i v i t y . T h i s c o r r e l a t i o n s u g g e s t s t h a t t h e d e g r e e o f t h r o m b o c y t o p e n i a i s a s s o c i a t e d w i t h t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r i n j u r y . H o w e v e r , t h e r e w a s n o c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e n u m b e r s o f r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s i n t h e l i v e r a n d t h e d e g r e e o f l i v e r i n j u r y . T h u s , b l o o d p l a t e l e t n u m b e r s a p p e a r t o m o r e c l o s e l y r e l a t e t o l i v e r i n j u r y t h a n h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n . I t i s p o s s i b l e t h a t o n l y a f e w p l a t e l e t s n e e d t o a c c u m u l a t e i n t h e l i v e r t o c o n t r i b u t e t o t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r i n j u r y . T h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n b l o o d p l a t e l e t s a n d l i v e r i n j u r y m a y b e r e l a t e d t o t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , a s t h e r e i s a v e r y s t r o n g n e g a t i v e c o r r e l a t i o n b e t w e e n a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d l i v e r i n j u r y . I n g e n e r a l , t h e s e c o r r e l a t i o n s a p p e a r t o s u p p o r t t h e c o n t e n t i o n t h a t p l a t e l e t s c o n t r i b u t e t o t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r i n j u r y . S i n c e p l a t e l e t s a c c u m u l a t e d i n t h e l i v e r p r i o r t o t h e o n s e t o f l i v e r i n j u r y a n d t h e y w e r e c r i t i c a l f o r t h e d e v e l o p m e n t o f t h i s l i v e r i n j u r y , t h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n i s a c r i t i c a l e v e n t i n t h e p a t h o g e n e s i s . T h u s , s t u d i e s w e r e c o n d u c t e d t o a d d r e s s t h e p o s s i b l e m e c h a n i s m s b y w h i c h p l a t e l e t s a c c u m u l a t e i n t h e l i v e r a f t e r L P S e x p o s u r e . i n p a r t i c u l a r , s t u d i e s w e r e c o n d u c t e d t o e v a l u a t e t h e c o n t r i b u t i o n s o f o t h e r i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s , s u c h a s n e u t r o p h i l s , K u p f f e r c e l l s , t h r o m b i n a n d T x A z , i n t h e m a n i f e s t a t i o n o f h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n . R e s u l t s f r o m t h e s e s t u d i e s s u g g e s t t h a t L P S e x p o s u r e s t i m u l a t e s t h e a c c u m u l a t i o n o f p l a t e l e t s i n t h e l i v e r b y m e c h a n i s m s t h a t a r e i n d e p e n d e n t o f n e u t r o p h i l s , t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , t h r o m b i n a n d T x A z . H o w e v e r , s t u d i e s 2 6 0 w i t h G d C l 3 s u g g e s t t h a t K u p f f e r c e l l s p a r t i a l l y c o n t r i b u t e t o t h e a c c u m u l a t i o n o f p l a t e l e t s . S i n c e K u p f f e r c e l l i n a c t i v a t i o n d i d n o t a b o l i s h t h e p l a t e l e t i n f i l t r a t i o n , t h e s e s t u d i e s s u g g e s t t h a t a n o t h e r m e c h a n i s m c o n t r i b u t e s t o t h e i r a c c u m u l a t i o n . S i n c e p l a t e l e t s a r e c r i t i c a l i n t h e p a t h o g e n e s i s o f l i v e r i n j u r y , t h i s r e s u l t r a i s e d t h e q u e s t i o n o f h o w p l a t e l e t s m e d i a t e t h i s i n j u r y . R e s u l t s f r o m p l a t e l e t d e p l e t i o n s t u d i e s s u g g e s t t h a t p l a t e l e t s a r e n e c e s s a r y f o r t h e a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a f t e r L P S . S i n c e s t u d i e s w i t h h e p a r i n a n d h i r u d i n s u g g e s t t h a t a n a c t i v a t e d c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d s u b s e q u e n t t h r o m b i n f o r m a t i o n i s r e q u i r e d f o r t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r i n j u r y , t h e s e f i n d i n g s , t a k e n t o g e t h e r , i m p l y t h a t p l a t e l e t s m i g h t c o n t r i b u t e i n h e p a t o t o x i c i t y s i m p l y b y p r o m o t i n g t h e a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m . P l a t e l e t s c o u l d a l s o p r o m o t e l i v e r i n j u r y b y r e l e a s i n g s o l u b l e i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s s u c h a s c y c l o o x y g e n a s e a n d l i p o x y g e n a s e p r o d u c t s a n d P A F . H o w e v e r , s t u d i e s w i t h a P A F r e c e p t o r a n t a g o n i s t , a n d S - l i p o x y g e n a s e a n d t h r o m b o x a n e s y n t h a s e i n h i b i t o r s , s u g g e s t t h a t t h e s e m e d i a t o r s a r e n o t c r i t i c a l f o r t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r i n j u r y a f t e r L P S e x p o s u r e . T h e r e f o r e , i t i s n o t l i k e l y t h a t p l a t e l e t s c o n t r i b u t e t o t i s s u e i n j u r y b y m e c h a n i s m s i n v o l v i n g t h e s e m e d i a t o r s . 2 6 1 7 . C . T h e r o l e s o f o t h e r i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s i n L P S - i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y 7 . C . 1 . T h e c o a g u l a t i o n s y s t e m B o t h p l a t e l e t s a n d t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i n t e r a c t d u r i n g t h r o m b o s i s . T o e l u c i d a t e s o m e o f t h e s e i n t e r a c t i o n s i n v i v o , s t u d i e s w e r e c o n d u c t e d w i t h a n t i b o d i e s t o p l a t e l e t s a n d a n t i c o a g u l a n t s . R e s u l t s f r o m p l a t e l e t d e p l e t i o n s t u d i e s s u g g e s t t h a t p l a t e l e t s c o n t r i b u t e t o t h e a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a f t e r L P S e x p o s u r e . C o n v e r s e l y , s t u d i e s i n a n i m a l s p r e t r e a t e d w i t h h e p a r i n o r h i r u d i n , s u g g e s t t h a t t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m d o e s n o t c o n t r i b u t e t o L P S - i n d u c e d h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n o r t h r o m b o c y t o p e n i a . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e s t u d i e s s u g g e s t t h a t d u r i n g L P S e x p o s u r e , p l a t e l e t s m e d i a t e t h e a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m w h e r e a s t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m d o e s n o t i n f l u e n c e p l a t e l e t s . T h e r e s u l t s o f t h e s e s t u d i e s s u g g e s t e d t h a t t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m d o e s n o t i n h i b i t L P S - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a a n d h e p a t i c p l a t e l e t a n d n e u t r o p h i l a c c u m u l a t i o n , y e t c o n t r i b u t e s t o t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r i n j u r y . T h e s e f i n d i n g s , t a k e n t o g e t h e r w i t h t h e t i m e c o u r s e o f t h e d e c r e a s e i n p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n , i n f e r r e d t h a t t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i s n o t a c t i v a t e d u n t i l s e v e r a l h o u r s a f t e r L P S e x p o s u r e . T o t e s t t h i s h y p o t h e s i s , h e p a r i n o r t h e s e l e c t i v e t h r o m b i n i n h i b i t o r , h i r u d i n , w a s a d m i n i s t e r e d a t v a r i o u s t i m e s a f t e r t h e i n j e c t i o n o f L P S . T h e s e a n t i c o a g u l a n t s c a n b e a d m i n i s t e r e d 2 . 5 h o u r s a f t e r L P S e x p o s u r e a n d s t i l l i n h i b i t t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r i n j u r y . T h u s , t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i s a d i s t a l m e d i a t o r o f l i v e r i n j u r y , i n t h a t i t i s n o t a c t i v a t e d u n t i l s e v e r a l 2 6 2 h o u r s a f t e r L P S e x p o s u r e a n d a p p e a r s t o a c t s h o r t l y b e f o r e t h e o n s e t o f h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y . T h i s f i n d i n g p r o v i d e s n o v e l i n s i g h t i n t h e m e c h a n i s m s b y w h i c h L P S e x p o s u r e r e s u l t s i n l i v e r i n j u r y . F i r s t , i t s u g g e s t s t h a t t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , i n p a r t i c u l a r , t h r o m b i n , a p p e a r s t o b e c r i t i c a l s h o r t l y b e t h e a p p e a r a n c e o f h e p a t o c e l l u l a r d a m a g e . M o r e i n t e r e s t i n g , t h i s r e s u l t s u g g e s t s t h a t a l l t h e p r i o r e v e n t s i n d u c e d b y L P S e x p o s u r e , s u c h a s h e p a t i c p l a t e l e t a n d n e u t r o p h i l i n f i l t r a t i o n a n d c y t o k i n e r e l e a s e , a r e n o t s u f f i c i e n t t o p r o d u c e l i v e r i n j u r y . T h u s , l i v e r i n j u r y i n v o l v e s i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d o t h e r i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s . T h i s r a i s e s t h e p o s s i b i l i t y t h a t K u p f f e r c e l l s , n e u t r o p h i l s a n d p l a t e l e t s e x p o s e d t o L P S a n d s u b s e q u e n t m e d i a t o r r e l e a s e m a y i n c r e a s e t h e s u s c e p t i b i l i t y o f h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l s t o d a m a g e b y t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m . i t i s a l s o p o s s i b l e t h a t t h r o m b i n m a y a c t o n t h e s e o t h e r i n f l a m m a t o r y c e l l s a n d s t i m u l a t e t h e i r r e l e a s e o f a m e d i a t o r t h a t l e a d s t o h e p a t o c e l l u l a r d a m a g e . 7 . C . 2 . L i p i d m e d i a t o r s R e s u l t s w i t h W E B 2 0 8 6 a n d Z i l e u t o n s u g g e s t t h a t P A F , a l o n e o r i n c o m b i n a t i o n w i t h 5 - l i p o x y g e n a s e p r o d u c t s , i s n o t a c r i t i c a l m e d i a t o r o f L P S - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a , a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d l i v e r i n j u r y . I n a d d i t i o n , r e s u l t s f r o m s t u d i e s w i t h D a z m e g r e l s u g g e s t t h a t T x A , i s n o t a c r i t i c a l m e d i a t o r o f t h e s e a l t e r a t i o n s a s w e l l . S i n c e t h e s e m e d i a t o r s h a v e b e e n 2 6 3 s h o w n t o c o n t r i b u t e t o l i v e r i n j u r y i n o t h e r m o d e l s o f e n d o t o x e m i a , t h e s e r e s u l t s e m p h a s i z e d i f f e r e n c e s b e t w e e n e x p e r i m e n t a l m o d e l s . S o m e o f t h e s e d i f f e r e n c e s m a y b e a t t r i b u t e d t o d i f f e r e n c e s a m o n g b a c t e r i a l s o u r c e s a n d d o s e s o f L P S , r o u t e o f a d m i n i s t r a t i o n a n d a n i m a l s p e c i e s . I t i s i n t e r e s t i n g t o n o t e t h a t , a m o n g a n i m a l m o d e l s , t h e r e i s n o d i f f e r e n c e s b e t w e e n v t h e c r i t i c a l c e l l s i n v o l v e d i n l i v e r i n j u r y ( i . e . n e u t r o p h i l s a n d K u p f f e r c e l l s a r e c r i t i c a l i n e v e r y m o d e l ) . H o w e v e r , t h e r o l e o f s o l u b l e m e d i a t o r s a p p e a r s t o d i f f e r g r e a t l y a m o n g m o d e l s . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e r o l e s c y t o k i n e s a n d s o l u b l e m e d i a t o r s i n t i s s u e i n j u r y c a n v a r y a n d m a y b e a c o n s e q u e n c e o f s p e c i e s v a r i a b i l i t y a n d t h e n a t u r e o f t h e e n d o t o x i n i n s u l t . P r e t r e a t m e n t w i t h a s p i r i n a t t e n u a t e d l i v e r i n j u r y , b u t d i d n o t a l t e r h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n , t h r o m b o c y t o p e n i a o r a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m . T h u s , c y c l o o x y g e n a s e p r o d u c t s o t h e r t h a n t h r o m b o x a n e , p e r h a p s P 6 0 2 , c o n t r i b u t e p a r t i a l l y t o t h e d e v e l o p m e n t o f h e p a t o c e l l u l a r d a m a g e . H o w e v e r , t h e e x a c t c y c l o o x y g e n a s e m e t a b o l i t e s i n v o l v e d i n l i v e r i n j u r y a r e n o t k n o w n . T a b l e 7 . 1 s u m m a r i z e s m a n y o f t h e e f f e c t s o f L P S a n d v a r i o u s a g e n t s o n l i v e r i n j u r y t h a t h a v e b e e n p r e s e n t e d o r d i s c u s s e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n . I t i s b y n o m e a n s c o m p r e h e n s i v e b u t p r o v i d e s a s u m m a r y o f s o m e c r i t i c a l r e s u l t s a s w e l l a s s o m e i n t e r a c t i o n s b e t w e e n i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s . 2 6 4 T a b l e 7 . 1 E n d o t o x i n - i n d u c e d l i v e r i n j u r y a n d a l t e r a t i o n s b y c o t r e a t m e n t w i t h v a r i o u s a g e n t s . T h i s t a b l e s u m m a r i z e s t h e e f f e c t s o f v a r i o u s a g e n t s o n l i v e r i n j u r y a s w e l l a s o t h e r p a r a m e t e r s k n o w n t o b e i n v o l v e d i n L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . I n c l u d e d a r e a l l t h e a g e n t s p r e s e n t e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n a s w e l l a s a g e n t s a p p l i e d t o t h e i n t r a v e n o u s L P S m o d e l i n t h e r a t . K e y : P = p r o t e c t i o n ; W = w o r s e ; N = n o p r o t e c t i o n ; N A = n o t a p p l i c a b l e ; U = u n k n o w n ; P P = p a r t i a l p r o t e c t i o n . A N a F N T s C E s t n l i P d o o l b s N n M i P r e v i l s d o N n A A M N N o i P l b o t s i H - n i i l b i u B r n a - d d o o b b n + o s F m o o s s i i n e F i N N o s t c A l l t C i h h g A M T r T b b p K b n n ’ P P h L l l l i i f l l t N t F n 6 n l M - h e N X i d 8 o n n e e P o l p r o T T 0 t - r m i i 3 n e a - 9 l s - r r u P 2 i 1 u r r g o i c o 1 t f i c e o t r c a i e n e d p p m N t y h t r n l a r B a s c e s z n c p n o a i l a E a Z p a w W h a a d C o - R x ; A L T / A S T + + + P l t s i n l i v e r 1 1 1 w h i t e c e l l s P P l T X B Z P P 2 6 6 7 . D . I n t e r a c t i o n s b e t w e e n i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s i n t h e p a t h o g e n e s i s o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y S t u d i e s c o n d u c t e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n s u g g e s t t h a t i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s i n t e r a c t i n t h e m a n i f e s t a t i o n o f l i v e r i n j u r y d u r i n g L P S e x p o s u r e . R e s u l t s f r o m t h e s e s t u d i e s a n d o t h e r s s h o w t h a t p r i o r r e m o v a l o r i n h i b i t i o n o f n e u t r o p h i l s , p l a t e l e t s , K u p f f e r c e l l s , T N F - a o r t h r o m b i n i n h i b i t s , a l m o s t c o m p l e t e l y , t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r i n j u r y . T h u s , e a c h o f t h e s e m e d i a t o r s c o n t r i b u t e s t o l i v e r i n j u r y i n s o m e w a y . H o w e v e r , l i v e r i n j u r y i n v o l v e s i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e s e m e d i a t o r s . F o r i n s t a n c e , p l a t e l e t d e p l e t i o n a t t e n u a t e s l i v e r i n j u r y a n d a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , b u t d o e s n o t i n h i b i t h e p a t i c n e u t r o p h i l a c c u m u l a t i o n o r t h e p r o d u c t i o n o f T N F - a . T h u s , t h e p r e s e n c e o f n e u t r o p h i l s a n d T N F - a i s n o t s u f f i c i e n t t o p r o d u c e l i v e r i n j u r y . T h i s s u g g e s t s t h a t l i v e r i n j u r y a r i s e s f r o m t h e i n t e r a c t i o n o f p l a t e l e t s a n d t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m w i t h n e u t r o p h i l s a n d T N F - a . T h e s e t h e m e i s s u p p o r t e d b y n e a r l y a l l t h e s t u d i e s i n t h i s d i s s e r t a t i o n . F o r e x a m p l e , p r e t r e a t m e n t w i t h h e p a r i n o r h i r u d i n , a t t e n u a t e s l i v e r i n j u r y b u t d o e s n o t a l t e r h e p a t i c n e u t r o p h i l a n d p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n , f u r t h e r s u p p o r t i n g t h e h y p o t h e s i s t h a t l i v e r i n j u r y i s a r e s u l t o f i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e s e m e d i a t o r s . S i m i l a r f i n d i n g s w e r e f o u n d w i t h K u p f f e r c e l l s . L i v e r i n j u r y a n d h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n i s r e d u c e d i n a n i m a l s t r e a t e d w i t h G d C l a , d e s p i t e h e p a t i c n e u t r o p h i l i n f i l t r a t i o n , a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d e l e v a t e d T N F - a c o n c e n t r a t i o n s . T h u s , n e u t r o p h i l s , a n a c t i v a t e d c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d 2 6 7 T N F - a a r e n o t s u f f i c i e n t t o r e s u l t i n l i v e r i n j u r y . T h i s s u g g e s t s t h a t K u p f f e r c e l l s a r e c r i t i c a l f o r t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r i n j u r y b y m e c h a n i s m s i n v o l v i n g i n t e r a c t i o n s w i t h t h e s e o t h e r m e d i a t o r s . F u t u r e s t u d i e s u s i n g i n v i t r o m e t h o d s s u c h a s c o c u l t u r e s a n d i s o l a t e d p e r f u s e d l i v e r s c o u l d h e l p e l u c i d a t e s o m e o f t h e s e i n t e r a c t i o n s . F i g u r e 7 . 1 s u m m a r i z e s m a n y o f t h e f i n d i n g s p r e s e n t e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n . E x p o s u r e t o L P S l i k e l y a l t e r s t h e f u n c t i o n s o f K u p f f e r c e l l s a n d s t i m u l a t e s t h e a c c u m u l a t i o n o f b o t h p l a t e l e t s a n d n e u t r o p h i l s i n t h e l i v e r . T h e m e c h a n i s m b y w h i c h L P S s t i m u l a t e s t h e i n f i l t r a t i o n o f i n f l a m m a t o r y c e l l s i s p o s s i b l y d u e t o a d i r e c t e f f e c t o n t h e e n d o t h e l i u m a n d t h e s u b s e q u e n t u p r e g u l a t i o n o f a d h e s i o n m o l e c u l e s a n d / o r o v e r t e n d o t h e l i a l c e l l d a m a g e . T h e K u p f f e r c e l l s a r e i n v o l v e d i n t h e a c c u m u l a t i o n o f p l a t e l e t s i n t h e l i v e r , b y a m e c h a n i s m t h a t i s i n d e p e n d e n t o f t h r o m b o x a n e . T h e s e i n f l a m m a t o r y c e l l s a r e p o s s i b l y i n v o l v e d i n t h e p a t h o g e n e s i s o f l i v e r i n j u r y v i a t h e r e l e a s e o f s o l u b l e m e d i a t o r s . H o w e v e r , t h r o m b o x a n e , P A F a n d U s d o n o t a p p e a r t o b e c r i t i c a l m e d i a t o r s o f l i v e r i n j u r y . P l a t e l e t s a r e c r i t i c a l f o r t h e a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d s u b s e q u e n t t h r o m b i n f o r m a t i o n . S i n c e t h r o m b i n i s a d i s t a l m e d i a t o r o f l i v e r i n j u r y a n d c a n i n f l u e n c e a l l o f t h e s e c e l l s p r e s e n t w i t h i n t h e l i v e r , t h e m e c h a n i s m b y w h i c h t h r o m b i n p r o m o t e s h e p a t o c e l l u l a r d a m a g e i s n o t c l e a r . F o r i n s t a n c e , t h r o m b i n c o u l d d i r e c t l y e f f e c t s u s c e p t i b l e h e p a t o c y t e s . I n a d d i t i o n , t h r o m b i n c a n s t i m u l a t e t h e r e l e a s e o f p o t e n t i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s f r o m K u p f f e r c e l l s , n e u t r o p h i l s , p l a t e l e t s a n d t h e e n d o t h e l i u m . I t i s p o s s i b l e t h a t t h r o m b i n c o n t r i b u t e s t o h e p a t o c e l l u l a r d a m a g e ll 2 6 8 b y e v o k i n g t h e r e l e a s e o f c y t o t o x i c m e d i a t o r s f r o m t h e s e i n f l a m m a t o r y c e l l s . 2 6 9 F i g u r e 7 . 1 T h e m e c h a n i s m s b y w h i c h i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s i n t e r a c t i n t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r i n j u r y . L P S a c t s o n s e v e r a l c e l l s , i n c l u d i n g t h e e n d o t h e l i u m ( E C ) a n d K u p f f e r c e l l s ( K C ) . L P S e x p o s u r e a l s o s t i m u l a t e s t h e p r o d u c t i o n o f T N F - a , a l t h o u g h i t s c e l l u l a r s o u r c e a n d b i o l o g i c e f f e c t s a r e n o t k n o w n i n v i v a . K u p f f e r c e l l s c o n t r i b u t e t o L P S - i n d u c e d h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n . P l a t e l e t s a r e c r i t i c a l f o r t h e a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d s u b s e q u e n t t h r o m b i n f o r m a t i o n . T h e p r e c i s e m e c h a n i s m s b y w h i c h t h r o m b i n c o n t r i b u t e s t o l i v e r i n j u r y a r e n o t k n o w n , h o w e v e r t h r o m b i n c a n i n f l u e n c e o t h e r h e p a t i c c e l l s ( d a s h e d l i n e s ) s u c h a s p l a t e l e t s , K u p f f e r c e l l s , n e u t r o p h i l s , e n d o t h e l i u m a n d p a r e n c h y m a l c e l l s . l l / / / / s N s N I T W u 1 C S E u - E m c L S T L P S T L P . N l s H e E I S P D r u - o A P u fi Y o o R E V I L N I N O I T A L U N U u R C C A T E L E T 1 A . L 7 E R P D U N G A I F L I H P O H T U E N F O S M S I N A H C E M U ’ , 1 s ‘ 1 J N ' e u s a L / l l s m O G A H P 1 - : N I P S T L P ! 7 N L I l P l z A S T L l x T P s t l u n ! N I P T u g v V I F J ‘ N , F N P L T S \ 2 7 0 2 7 1 7 . E . H y p o t h e t i c a l m e c h a n i s m o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y F i g u r e 7 . 2 h i g h l i g h t s s o m e o f t h e p o t e n t i a l m e c h a n i s m s b y w h i c h L P S e x p o s u r e r e s u l t s i n l i v e r i n j u r y . N u m e r o u s i n v i v a a n d i n v i t r o s t u d i e s h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t t h e e x p o s u r e t o L P S a l t e r s K u p f f e r c e l l a n d e n d o t h e l i a l c e l l f u n c t i o n . S i n c e t h e s e c e l l s c a n b i n d L P S a n d a r e a l r e a d y p r e s e n t w i t h i n t h e l i v e r , i t i s l i k e l y t h a t L P S f i r s t i n t e r a c t s w i t h t h e s e c e l l s . S u c h a n i n t e r a c t i o n c o u l d p r o m o t e t h e e x p r e s s i o n o f a d h e s i o n m o l e c u l e s o r t h e r e l e a s e o f i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s w h i c h c o n t r i b u t e t o t h e a c c u m u l a t i o n o f b a t h p l a t e l e t s a n d n e u t r o p h i l s w i t h i n t h e l i v e r . K u p f f e r c e l l s p a r t i a l l y c o n t r i b u t e t o t h e a c c u m u l a t i o n o f p l a t e l e t s , b u t n o t n e u t r o p h i l s , b y a n u n k n o w n m e c h a n i s m . P l a s m a T N F - a a c t i v i t y i s e l e v a t e d s h o r t l y a f t e r t h e o n s e t o f h e p a t i c p l a t e l e t a n d n e u t r o p h i l a c c u m u l a t i o n . T h e c e l l u l a r s o u r c e o f t h i s T N F - a i s n o t k n o w n , b u t e v i d e n c e f r o m G d C l 3 t r e a t e d a n i m a l s s u g g e s t i t i s n o t s o l e l y p r o d u c e d b y K u p f f e r c e l l s . T N F - a i s c r i t i c a l f o r t h e p a t h o g e n e s i s o f l i v e r i n j u r y , a l t h o u g h i t s c e l l u l a r t a r g e t s i n v i v a a r e n o t c l e a r l y d e f i n e d . E v i d e n c e f r o m n e u t r o p h i l d e p l e t i o n s t u d i e s s u g g e s t t h a t T N F - a m a y s t i m u l a t e n e u t r o p h i l s a n d i t i s t h e n e u t r o p h i l - d e r i v e d m e d i a t o r s t h a t c o n t r i b u t e t o h e p a t o c e l l u l a r d a m a g e . P l a t e l e t s a r e c r i t i c a l f o r t h e a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d s u b s e q u e n t t h r o m b i n , a ” d i s t a l " e v e n t s i n c e p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n s a r e n o t d e c r e a s e d u n t i l n e a r l y 2 - 3 h o u r s a f t e r L P S e x p o s u r e . T h r o m b i n i s c r i t i c a l m e d i a t o r o f l i v e r i n j u r y t h a t a c t s s h o r t l y b e f o r e t h e o n s e t o f h e p a t o c e l l u l a r d a m a g e . T h e m e c h a n i s m s b y w h i c h t h r o m b i n c o n t r i b u t e s t o l i v e r i n j u r y a r e n o t k n o w n . H o w e v e r , i n v i t r o s t u d i e s s u g g e s t t h a t t h r o m b i n c a n i n t e r a c t w i t h a l l 2 7 2 t h e c e l l s p r e s e n t i n L P S - t r e a t e d l i v e r s , i n c l u d i n g p l a t e l e t s , e n d o t h e l i u m , n e u t r o p h i l s , K u p f f e r c e l l s a n d h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l s . T h u s , f u t u r e s t u d i e s i n i s o l a t e d o r g a n a n d c e l l s y s t e m s c o u l d h e l p e l u c i d a t e t h e m e c h a n i s m s b y w h i c h t h r o m b i n f o r m a t i o n c u l m i n a t e s i n p a r e n c h y m a l c e l l i n j u r y . 2 7 3 F i g u r e 7 . 2 P r o p o s e d m e c h a n i s m o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . ( 1 ) L P S d i r e c t l y a l t e r s K u p f f e r c e l l s a n d t h e e n d o t h e l i u m . T h e s t i m u l a t i o n o f a d h e s i o n m o l e c u l e s o r o v e r t e n d o t h e l i a l c e l l i n j u r y c o n t r i b u t e s t o t h e a c c u m u l a t i o n o f i n f l a m m a t o r y c e l l s w i t h i n t h e l i v e r . ( 2 ) I n a d d i t i o n , K u p f f e r c e l l s c o n t r i b u t e t o t h e h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n . ( 3 ) L P S e x p o s u r e a l s o r e s u l t s i n t h e r e l e a s e o f T N F - a i n t o p l a s m a a f t e r p l a t e l e t s a n d n e u t r o p h i l s h a v e a l r e a d y b e g u n t o a c c u m u l a t e w i t h i n t h e l i v e r t i s s u e s . T h e s o u r c e s a n d t a r g e t s o f T N F a r e n o t c l e a r l y d e f i n e d . ( 4 ) P l a t e l e t s c o n t r i b u t e t o L P S - i n d u c e d a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d s u b s e q u e n t t h r o m b i n f o r m a t i o n . ( 5 ) T h r o m b i n a p p e a r s t o b e a c r i t i c a l y e t d i s t a l m e d i a t o r o f l i v e r i n j u r y . T h e c e l l u l a r t a r g e t s o f t h r o m b i n ( d a s h e d l i n e s ) a n d t h e m e c h a n i s m b y w h i c h i t s f o r m a t i o n c o n t r i b u t e s t o p a r e n c h y m a l c e l l i n j u r y r e m a i n u n c l e a r . N O I T A V I a N I S P E H T A C . . . T . C . A L L E C Y R O T A . _ . _ . . . _ — — D A R v x o Y R U M N - J M A L / F N I F — — — O — / 2 . 7 E R U G S I E F C N E U N I B M O O 9 A Q M E O R C ) S G H N ~ T O > C D N A S M S I N A H C E M — . , C E I C H S E S A E T O R P " S " E - N c t . I e K O T Y C F N T \ L P S F I e d u f 2 r ” F ( m C ’ 2 7 4 L I S T O F R E F E R E N C E S 2 7 5 L I S T O F R E F E R E N C E S A d a m s o n , G M . a n d B i l l i n g s , R E . ( 1 9 9 2 ) . T u m o r n e c r o s i s f a c t o r i n d u c e d o x i d a t i v e s t r e s s i n i s o l a t e d m o u s e h e p a t o c y t e s . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 2 9 4 ( 1 ) . 2 2 3 - 2 2 9 . A l t i n , J . G . a n d B y g r a v e , F L . ( 1 9 8 8 ) . P r o s t a g l a n d i n F 2 , a n d t h e t h r o m b o x a n e A 2 a n a l o g u e O N O - 1 1 1 1 3 s t i m u l a t e C a 2 + f l u x e s a n d o t h e r p h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e s i n r a t l i v e r . B i o c h e m J . 2 4 9 , 6 7 7 - 6 8 5 . A n d u s , T . , B a u e r , J . , a n d G e r o k , W . ( 1 9 9 1 ) . E f f e c t s o f c y t o k i n e s o n t h e l i v e r . H e p a t a / a g y 1 3 ( 2 ) , 3 6 4 - 3 7 5 . A r a i , M . , M o c h i d a , S . , O h n o , A . , O g a t a , l . , a n d F u j i w a r a , K . ( 1 9 9 3 ) . S i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l d a m a g e b y a c t i v a t e d m a c r o p h a g e s i n r a t l i v e r n e c r o s i s . G a s t r a e n t e r a l a g y 1 0 4 , 1 4 6 6 - 1 4 7 1 . B a i l i e , M . B . , D a h m , L . J . , P e t e r s - G o l d e n , M . , H a r r i s , R . R . , C a r t e r , G . C . , a n d R o t h , R . A . ( 1 9 9 5 a ) . L e u k o t r i e n e s a n d a l p h a - n a p h t h y l i s o t h i o c y a n a t e i n d u c e d l i v e r i n j u r y . T o x i c o l o g y 1 0 0 , 1 3 9 - 1 4 9 . B a i l i e , M . B . , P e a r s o n , J . M . , F i n k , 6 . 0 . a n d R o t h , R . A . P l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r r e c e p t o r b l o c k a d e a l o n e o r i n c o m b i n a t i o n w i t h l e u k o t r i e n e s y n t h e s i s d o e s n o t a m e l i o r a t e a - n a p h t h y l i s o t h i o c y a n a t e - i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y . [ i n P r e s s ] T o x i c o l o g y L e t t e r s 1 9 9 5 b . B a l l , H . A . , C o o k , J . A . , W i s e , W . C . , a n d H a l u s h k a , P . V . ( 1 9 8 6 ) . R o l e o f t h r o m b o x a n e , p r o s t a g l a n d i n s a n d l e u k o t r i e n e s i n e n d o t o x i c a n d s e p t i c s h o c k . I n t . C a r e M e d . 1 2 . 1 1 6 - 1 2 6 . B a r - S h a v i t , R . , K a h n , A . , F e n t o n , J . W . , I L , a n d W i l n e r , G . D . ( 1 9 8 3 a ) . R e c e p t o r - m e d i a t e d c h e m o t a c t i c r e s p o n s e o f a m a c r o p h a g e c e l l l i n e ( J 7 7 4 ) t o t h r o m b i n . L a b . I n v e s t . 4 9 , 7 0 2 - 7 0 7 . B a r - S h a v i t , R . , K a h n , A . , F e n t o n , J . W . , I L , a n d W i l n e r , G . D . ( 1 9 8 3 b ) . C h e m o t a c t i c r e s p o n s e o f m a n o c y t e s t o t h r o m b i n . J . C e l l . B i o l . 9 6 , 2 8 2 - 2 8 5 . B a u m g a r t n e r , J . ( 1 9 9 2 ) . A n t i - e n d o t o x i n t h e r a p y a n d t h e m a n a g e m e n t o f 2 7 6 s e p s i s . J . A n t i m i c r o b . C h e m o t h e r . 2 9 , 3 6 0 - 3 6 3 . B e c k e r , M . , M e n g e r , M . D . , a n d L e h r , H . ( 1 9 9 4 ) . H e p a r i n - r e l e a s e d s u p e r o x i d e d i s m u t a s e i n h i b i t s p o s t i s c h e m i c l e u k o c y t e a d h e s i o n t o v e n u l a r e n d o t h e l i u m . A m . J . P h y s i o l . 2 6 7 . H 9 2 5 - H 9 3 0 . B e n n e t t , J . S . ( 1 9 9 2 ) . M e c h a n i s m s o f p l a t e l e t a d h e s i o n a n d a g g r e g a t i o n : a n u p d a t e . H o s p i t a l P r a c t i c e 2 7 , 1 2 4 - 1 4 0 . B e r g m e y e r , H . U . , S c h e i b e , P . , a n d W a h l e f e l d , A . W . ( 1 9 7 8 ) . O p t i m i z a t i o n o f m e t h o d s f o r a s p a r t a t e a m i n o t r a n s f e r a s e a n d a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e . C l i n . C h e m . 2 4 , 5 8 B e u t l e r , B . , M i l s a r k , I . W . , a n d C e r a m i , A . C . ( 1 9 8 5 ) . P a s s i v e i m m u n i z a t i o n a g a i n s t c a h e c t i n l t u m o r n e r o s i s f a c t o r p r o t e c t s m i c e f r o m l e t h a l e f f e c t s o f e n d o t o x i n . S c i e n c e 2 2 9 , 8 6 9 - 8 7 1 . B e v i l a c q u a , M . P . , P o b e r , J . S . , W h e e l e r , M . E . , C o t r a n , R . S . , a n d G i m b r o n e , M . A . , J r . ( 1 9 8 5 ) . I n t e r l e u k i n 1 a c t s o n c u l t u r e d h u m a n v a s c u l a r e n d o t h e l i u m t o i n c r e a s e t h e a d h e s i a n o f p o l y m o r p h o n u c l e a r l e u k o c y t e s , m o n o c y t e s , a n d r e l a t e d l e u k o c y t e c e l l l i n e s . J . C l i n . I n v e s t . 7 6 , 2 0 0 3 - 2 0 1 1 . B i z i o s , R . , L a i , L . , F e n t o n , J . W . , I I , a n d M a l i k , A . B . ( 1 9 8 6 ) . T h r o m b i n - i n d u c e d c h e m o t a x i s a n d a g g r e g a t i o n o f n e u t r o p h i l s . J . C e l l . P h y s i o l . 1 2 8 , 4 8 5 - 4 9 0 . B o n e , R . C . ( 1 9 9 2 ) . M o d u l a t o r s o f c o a g u l a t i o n . A c r i t i c a l a p p r a i s a l o f t h e i r r o l e i n s e p s i s . A r c h . I n t e r n . M e d . 1 5 2 , 1 3 8 1 - 1 3 8 9 . B o z z a , P . T . , C a s t r o - F a r i a - N e t o , l - l . C . , S i l v a , A . R . , L a r a n g e i r a , A . P . , S i l v a , P . M . R . , M a r t i n s , M . A . , a n d C o r d e i r o , R . S . B . ( 1 9 9 4 ) . L i p o p o l y s a c c h a r i d e - i n d u c e d p l e u r a l n e u t r o p h i l a c c u m u l a t i o n d e p e n d s o n m a r r o w n e u t r o p h i l s a n d p l a t e l e t - a c t i v a t i n g f a c t o r . E u r . J . P h a r m a c a l . 2 7 0 , 1 4 3 - 1 4 9 . B r a t t o n , D . a n d H e n s o n , P M . ( 1 9 8 9 ) . C e l l u l a r o r i g i n s o f P A F . P . J . B a a r n e s , C . P . P a g e a n d P M . H e n s o n , ( E d s . ) , P l a t e l e t - a c t i v a t i n g F a c t o r a n d H u m a n D i s e a s e , B l a c k w e l l . O x f o r d , L o n d o n p p . 2 3 - 5 7 . B r i g h a m , K . L . , M e y r i c k , 8 . , B e r r y , L . C . , J r . , a n d R e p i n e , J . E . ( 1 9 8 7 ) . A n t i o x i d a n t s p r o t e c t c u l t u r e d b o v i n e l u n g e n d o t h e l i a l c e l l s f r o m i n j u r y b y e n d o t o x i n . J . A p p l . P h y s i o l . 6 3 . 8 4 0 - 8 5 0 . B r i n d l e y , L . L . , S w e e t , J . M . . a n d G o e t z l , E . J . ( 1 9 8 3 ) . S t i m u l a t i o n o f h i s t a m i n e r e l e a s e f r o m h u m a n b a s o p h i l s b y h u m a n p l a t e l e t f a c t o r 4 . J . C l i n . I n v e s t . 7 2 , 1 2 1 8 - 1 2 2 3 . 2 7 7 B r o i t m a n , S . A . , G o t t l i e b , L . S . , a n d Z a m c h e k , N . ( 1 9 6 4 ) . I n f l u e n c e o f n e o m y c i n a n d i n g e s t e d e n d o t o x i n i n t h e p a t h o g e n e s i s o f c h o l i n e d e f i c i e n c y c i r r h o s i s i n t h e a d u l t r a t . J . E x p . M e d . 1 1 9 , 6 3 3 - 6 4 1 . B r o w e r , M . S . , L e v i n , R . l . , a n d G a r r y , K . ( 1 9 8 5 ) . H u m a n n e u t r o p h i l e l a s t a s e m o d u l a t e s p l a t e l e t f u n c t i o n b y l i m i t e d p r o t e o l y s i s o f m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s . J . C l i n . I n v e s t . 7 5 , 6 5 7 - 6 6 6 . B r o w n , A . P . , N g , H . , J e a n , P . A . , G a n e y , P . E . , a n d R o t h , R . A . K u p f f e r c e l l i n a c t i v a t i o n p r o t e c t s a g a i n s t l i p o p o l y s a c c h a r i d e - i n d u c e d h e p a t i c i n j u r y d e s p i t e n e u t r o p h i l a c c u m u l a t i o n a n d t u m o r n e c r o s i s f a c t o r - a ( T N F - a ) r e l e a s e . [ A b s t r a c t ] T a x i c a l a g i s t 1 3 7 ( 7 2 7 ) , 1 9 9 5 . B u t l e r , R . R . , J r . , W i s e , W . C . , H a l u s h k a , P . V . , a n d C o o k , J . A . ( 1 9 8 3 ) . G e n t a m y c i n a n d i n d o m e t h a c i n i n t h e t r e a t m e n t o f s e p t i c s h o c k : e f f e c t s o n p r o s t a c y c l i n a n d t h r o m b o x a n e A 2 p r o d u c t i o n . J . P h a r m . E x p . T h e r . 2 2 5 , 9 4 - 1 0 1 . B u x t o n , ( 3 . 8 . , F i s h e r , R . A . , H a n a h a n , D . J . , a n d O l s o n , M S . ( 1 9 8 6 ) . P l a t e l e t - a c t i v a t i n g f a c t o r - m e d i a t e d v a s o c o n s t r i c t i o n a n d g l y c o g e n o l y s i s i n t h e p e r f u s e d r a t l i v e r . J . B i o l . C h e m . 2 6 1 ( 2 ) , 6 4 4 - 6 4 9 . C a l v e t e , J . J . ( 1 9 9 4 ) . C l u e s f o r u n d e r s t a n d i n g t h e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f a p r o t o t y p i c h u m a n i n t e g r i n : t h e p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n l l b / l l l a c o m p l e x . T h r a m b . H a e m a s t a s . 7 2 ( 1 ) , 1 - 1 5 . C a p i t a n i o , A . M . , N i e w i a r o w s k i , S . , R u c i n s k i , 8 . , T u s z y n s k i , C . P . , C i e r n i e w s k i , C . S . , H e r s h o c k , D . , a n d K o r n e c k i , E . ( 1 9 8 5 ) . I n t e r a c t i o n o f p l a t e l e t f a c t o r 4 w i t h h u m a n p l a t e l e t s . B i a c h i m . B i o p h y s . A c t a 8 3 9 , 1 6 1 - 1 7 3 . C a r r i c o , C . J . , M e a k i n s , J . L . , M a r s h a l l , J . C . , F r y , 0 . , a n d M a i e r , R . V . ( 1 9 8 6 ) . M u l t i p l e - o r g a n - f a i l u r e s y n d r o m e . A r c h . S u r g . 1 2 1 , 1 9 6 - 1 9 7 . C a s a l s - S t e n z e l , J . ( 1 9 8 7 ) . P r o t e c t i v e e f f e c t o f W E B 2 0 8 6 , a n o v e l a n t a g o n i s t o f p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r , i n e n d o t o x i n s h o c k . E u r . J . P h a r m a c a / . 1 3 5 , 1 1 7 - 1 2 2 . C a s a l s - S t e n z e l , J . a n d H e u e r , H . ( 1 9 8 8 ) . P h a r m a c o l o g y o f P A F a n t a g o n i s t s . P r a g . B i o c h e m . P h a r m a c o l . 2 2 , 5 8 - 6 5 . C a s t e l e i j n , E . , K u i p e r , J . , v a n R o o i j , H . C . J . , K a m p s , J . A . A . M . , K o s t e r , J . F . , a n d v a n B e r k e l , T . J . C . ( 1 9 8 8 a ) . H o r m o n a l c o n t r o l o f g l y c o g e n o l y s i s i n p a r e n c h y m a l l i v e r c e l l s b y K u p f f e r a n d e n d o t h e l i a l l i v e r c e l l s . J . B i o l . C h e m . 2 6 3 , 2 6 9 9 - 2 7 0 3 . C a s t e l e i j n , E . , K u i p e r , J . , v a n R o o i j , H . C . J . , K o s t e r , J . F . , a n d v a n B e r k e l , T . J . C . 2 7 8 ( 1 9 8 8 b ) . C o n d i t i o n e d m e d i a o f K u p f f e r a n d e n d o t h e l i a l l i v e r c e l l s i n f l u e n c e p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n i n p a r e n c h y m a l l i v e r c e l l s . B i a c h e m . J . 2 5 2 , 6 0 1 - 6 0 5 . C a t y , M . G . , G u i c e , K . S . , O l d h a m , K . T . , R e m i c k , D . G . , a n d K u n k e l , S . L . ( 1 9 9 0 ) . E v i d e n c e f o r t u m o r n e c r o s i s f a c t o r - i n d u c e d p u l m o n a r y m i c r o v a s c u l a r i n j u r y a f t e r i n t e s t i n a l i s c h e m i a - r e p e r f u s i o n i n j u r y . A n n . S u r g . 2 1 2 , 6 9 4 - 7 0 0 . C h a n g , S . ( 1 9 9 2 ) . E n d o t o x i n - i n d u c e d l u n g v a s c u l a r i n j u r y : r o l e o f p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r , t u m o r n e c r o s i s f a c t o r a n d n e u t r o p h i l s . C l i n . R e s . 4 0 , 5 2 8 - 5 3 6 . C h a n g , S . ( 1 9 9 4 ) . E n d o t o x i n - i n d u c e d p u l m o n a r y l e u k o s t a s i s i n t h e r a t : r o l e o f p l a t e l e t - a c t i v a t i n g f a c t o r a n d t u m o r n e c r o s i s f a c t o r . J . L a b . C l i n . M e d . 1 2 3 , 6 5 - 7 2 . C h a r o , I . F . , K i e f f e r , N . a n d P h i l l i p s , D . R . ( 1 9 9 4 ) . P l a t e l e t m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s . R . W . C o l m a n , J . H i r s h , V . J . M a r d e r a n d E . W . S a l z m a n , ( E d s . ) , H e m a s t a s i s a n d t h r o m b o s i s : b a s i c p r i n c i p l e s a n d c l i n i c a l p r a c t i c e , 3 . J . B . L i p p i n c o t t C o m p a n y . P h i l a d e l p h i a p p . 4 8 9 - 5 0 7 . C h e n , T . , B r i g h t , S . W . , P a c e , J . L . , R u s s e l l , S . W . , a n d M o r r i s o n , D . C . ( 1 9 9 0 ) . I n d u c t i o n o f m a c r o p h a g e - m e d i a t e d t u m o r c y t o t o x i c i t y b y a h a m s t e r m o n o c l o n a l a n t i b o d y w i t h s p e c i f i c i t y f o r l i p o p o l y s a c c h a r i d e r e c e p t o r . J . I m m u n o l . 1 4 5 ( 1 ) , 8 - 1 2 . C h e n s u e , S . W . , T e r e b u h , P . D . , R e m i c k , D . G . , S c a l e s , W . E . , a n d K u n k e l , S . L . ( 1 9 9 1 ) . I n v i v o b i o l o g i c a n d i m m u n o h i s t o c h e m i c a l a n a l y s i s o f i n t e r l e u k i n - 1 a l p h a , b e t a a n d t u m o r n e c r o s i s f a c t o r d u r i n g e x p e r i m e n t a l e n d o t o x e m i a . K i n e t i c s , K u p f f e r c e l l e x p r e s s i o n , a n d g l u c o c o r i t c o i d e f f e c t s . A m . J . P a t h o l . 1 3 8 , 3 9 5 - 4 0 2 . C h e s n e y , C . M . , H a r p e r , E . , a n d C o l m a n , R . W . ( 1 9 7 4 ) . H u m a n p l a t e l e t c o l l a g e n a s e . J . C l i n . I n v e s t . 5 3 . 1 6 4 7 - 1 6 5 4 . C h r i s t e n s o n , J . T . , S i g u r d s s o n , G . H . , M o u s a w i , M . , a n d O w u n w a n n e , A . ( 1 9 8 7 ) . U s e o f i n d i u m - 1 1 1 o x i n e t o s t u d y t h e e f f e c t s o f t e r b u t a l i n e o n p u l m o n a r y a n d h e p a t i c p l a t e l e t s e q u e s t r a t i o n i n e n d o t o x i n s h o c k . J . P h y s i o l . I m a g i n g 2 . 1 8 6 - 1 9 1 . C o c h r a n e , C . G . ( 1 9 7 8 ) . M e d i a t i n g s y s t e m s i n i n f l a m m a t o r y d i s e a s e . J . I n v e s t . D e r m a t o l . 7 1 , 4 0 - 4 8 . C o h e n , W . M . , W u , H . , L e a t h e r s t o n e , G . L . , J e n z a n o , J . W . , a n d L u n d b l a d , R . L . ( 1 9 9 1 ) . L i n k a g e b e t w e e n b l o o d c o a g u l a t i o n a n d i n f l a m m a t i o n : s t i m u l a t i o n o f n e u t r o p h i l t i s s u e k a l l i k r e i n b y t h r o m b i n . B i a c h e m . B i a p h y s . R e s . C o m m . 1 7 6 , 3 1 5 - 3 2 0 . 2 7 9 C o l u c c i , M . , B a l c o n i , G . , L o r e n z e t , R . , P e i t r a , A . , L o c a t i , D . , D o n a t i , M . B . , a n d S e m e r a r o , N . ( 1 9 8 3 ) . C u l t u r e d h u m a n e n d o t h e l i a l c e l l s g e n e r a t e t i s s u e f a c t o r i n r e s p o n s e t o e n d o t o x i n . J . C l i n . I n v e s t . 7 1 , 1 8 9 3 - 1 8 9 6 . C o o k , J . A . , W i s e , W . C . , a n d H a l u s h k a , P . V . ( 1 9 8 0 ) . E l e v a t e d t h r o m b o x a n e l e v e l s i n t h e r a t d u r i n g e n d o t o x i c s h o c k . J . C l i n . I n v e s t . 6 5 , 2 2 7 - 2 3 0 . C o o k , J . A . , W i s e , W . C . , a n d H a l u s h k a , P . V . ( 1 9 8 1 ) . T h r o m b o x a n e A , a n d p r o s t a c y c l i n p r o d u c t i o n b y l i p o p o l y s a c c h a r i d e - s t i m u l a t e d p e r i t o n e a l m a c r o p h a g e s . J o u r n a l o f t h e R e t i c u l a e n d a t h e l i a l S o c i e t y 3 0 ( 5 ) , 4 4 5 - 4 5 0 . C o o k , J . A . , W i s e , W . C . , B u t l e r , R . R . , R e i n e s , H . D . , R a m b o , W . , a n d H a l u s h k a , P . V . ( 1 9 8 2 ) . T h e p o t e n t i a l r o l e o f t h r o m b o x a n e a n d p r o s t a c y c l i n i n e n d o t o x i c a n d s e p t i c s h o c k . A m . J . E m e r g e n c y M e d . 2 , 2 8 - 3 7 . C o o k , J . A . , W i s e , W . C . , a n d H a l u s h k a , P . V . ( 1 9 8 5 ) . P r o t e c t i v e e f f e c t o f a s e l e c t i v e l e u k o t r i e n e a n t a g o n i s t i n e n d o t o x e m i a i n t h e r a t . J . P h a r m . E x p . 7 7 7 e r . 2 3 5 ( 2 ) . 4 7 0 - 4 7 4 . C o t r a n , R . S . , K u m a r , V . a n d R o b b i n s , S . L . ( 1 9 8 9 ) . I n f l a m m a t i o n a n d r e p a i r . R . S . C o t r a n , V . K u m a r a n d S . L . R o b b i n s , ( E d s . ) , R o b b i n s P a t h o l o g i c B a s i s o f D i s e a s e , 4 . W . B . S a u n d e r s C o m p a n y . P h i l a d e l p h i a p p . 3 9 - 8 6 . C o u g h l a n , A . F . , H a u , H . , D u n l a p , L . C . , B e r n d t , M . C . , a n d H a n c o c k , W . W . ( 1 9 9 4 ) . P - s e l e c t i n a n d p l a t e l e t - a c t i v a t i n g f a c t o r m e d i a t e i n i t i a l e n d o t o x i n - i n d u c e d n e u t r o p e n i a . J . E x p . M e d . 1 7 9 , 3 2 9 - 3 3 4 . D e a c i u c , l . V . , B a g b y , G . J . , L a n g , C . H . , S k r e p n i k , N . , a n d S p i t z e r , J . J . ( 1 9 9 3 a ) . G r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e i m p a i r s h y a l u r o n a n c l e a r a n c e i n v i v o a n d i t s u p t a k e b y t h e i s o l a t e d , p e r f u s e d l i v e r . H e p a t a l a g y 1 8 , 1 7 3 - 1 7 8 . D e a c i u c , l . V . , B a g b y , G . J . , L a n g , C . H . , a n d S p i t z e r , J . J . ( 1 9 9 3 b ) . H y a l u r o n i c a c i d u p t a k e b y t h e i s o l a t e d , p e r f u s e d r a t l i v e r : a n i n d e x o f h e p a t i c s i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l f u n c t i o n . H e p a t a l a g y 1 7 , 2 6 6 - 2 7 2 . D e a c i u c , l . V . , B a g b y , G . J . , a n d S p i t z e r , J . J . ( 1 9 9 3 c ) . A s s o c i a t i o n o f g a l a c t o s a m i n e - i n d u c e d h e p a t i t i s i n t h e r a t w i t h h y p e r h y a l u r o n a n a e m i a a n d d e c r e a s e d h y a l u r o n a n u p t a k e b y t h e i s o l a t e d , p e r f u s e d l i v e r . B i a c h e m . P h a r m a c a l . 4 6 ( 4 ) . 6 7 1 - 6 7 5 . D e a c i u c , l . V . , B a g b y , G . J . , N e i s m a n , M . R . , S k r e p n i k , N . , a n d S p i t z e r , J . J . I 1 9 9 4 ) . M o d u l a t i o n o f h e p a t i c s i n u s i o d a l e n d o t h e l i a l c e l l f u n c t i o n b y K u p f f e r c e l l s : a n e x a m p l e o f i n t e r c e l l u l a r c o m m u n i c a t i o n i n t h e l i v e r . H e p a t a l a g y 1 9 , 4 6 4 - 4 7 0 . 2 8 0 D e a n , P . B . , N e i m i , P . , K i v i s a a r i , L . , a n d K a r m a n o , M . ( 1 9 8 8 ) . C o m p a r a t i v e p h a r m a c o k i n e t i c s o f g a d o l i n i u m D T P A a n d g a d o l i n i u m c h l o r i d e . I n v e s t . R a d i a l . 2 3 , $ 2 5 8 - $ 2 6 0 . D e C a m p , M . M . , W a r n e r , A . E . , M a l i n a , R . M . , a n d B r a i n , J D . ( 1 9 9 2 ) . H e p a t i c v e r s u s p u l m o n a r y u p t a k e o f p a r t i c l e s i n j e c t e d i n t o t h e p o r t a l c i r c u l a t i o n i n s h e e p . A m . R e v . R e s p i r . D i s . 1 4 6 , 2 2 4 - 2 3 1 . D e c k e r , K . ( 1 9 9 0 ) . B i o l o g i c a l l y a c t i v e p r o d u c t s o f s t i m u l a t e d l i v e r m a c r o p h a g e s ( K u p f f e r c e l l s ) . E u r . J . B i a c h e m . 1 9 2 , 2 4 5 - 2 6 1 . D e c k e r , T . , L o h m a n n - M a t t h e s , M . , K a r c k , U . , P e t e r s , T . , a n d D e c k e r , K . ( 1 9 8 9 ) . C o m p a r a t i v e s t u d y o f c y t o t o x i c i t y , t u m o r n e c r o s i s f a c t o r , a n d p r o s t a g l a n d i n r e l e a s e a f t e r s t i m u l a t i o n o f r a t k u p f f e r c e l l s , a n d m u r i n e i n f l a m m a t o r y l i v e r m a c r o p h a g e s . J . L e u k . B i o l . 4 5 , 1 3 9 - 1 4 6 . d e l M a s c h i o , A . , E v a n g e l i s t a , V . , R a j t a r , G . , C h e n , Z . M . , C e r l e t t i , C . , a n d D e G a e t a n o , G . ( 1 9 9 0 ) . P l a t e l e t a c t i v a t i o n b y p o l y m o r p h o n u c l e a r l e u k o c y t e s e x p o s e d t o c h e m o t a c t i c a g e n t s . A m . J . P h y s i o l . 2 5 8 ( 2 7 ) , H 8 7 0 - H 8 7 9 . D e M i c h e l e , M . A . A . a n d M i n n e a r , F . L . ( 1 9 9 2 ) . M o d u l a t i o n o f v a s c u l a r e n d o t h e l i a l p e r m e a b i l i t y b y t h r o m b i n . S e m i n a r s i n T h r o m b o s i s a n d H e m a s t a s i s 1 8 ( 3 ) . 2 8 7 - 2 9 5 . D i e t e r , P . , P e t e r s , T . , S c h u l z e - S p e c k i n g , A . , a n d D e c k e r , K . ( 1 9 8 9 ) . I n d e p e n d e n t r e g u l a t i o n o f t h r o m b o x a n e a n d p r o s t a g l a n d i n s y n t h e s i s i n l i v e r m a c r o p h a g e s . B i a c h e m . P h a r m a c o l . 3 8 . 1 5 7 7 - 1 5 8 1 . D o i d e , S . a n d S t e i n m a n , R M . ( 1 9 8 7 ) . I n d u c t i o n o f m u r i n e i n t e r l e u k i n 1 : s t i m u l i a n d r e s p o n s i v e p r i m a r y c e l l s . P r a c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 4 , 3 8 0 2 - 3 8 0 6 . D r a k e , W . T . a n d l s s e k u t z , A . C . ( 1 9 9 2 ) . A r o l e f o r a - t h r o m b i n i n p o l y m o r p h o n u c l e a r l e u k o c y t e r e c r u i t m e n t d u r i n g i n f l a m m a t i o n . S e m i n a r s i n T h r o m b o s i s a n d H e m a s t a s i s 1 8 , 3 3 3 - 3 4 0 . d u P H e y n s , A . , B a d e n h o r s t , P . N . , L a t t e r , M . G . , P i e t e r s , H . , a n d W e s s e l s , P . ( 1 9 8 5 ) . K i n e t i c s a n d m o b i l i z a t i o n f r o m t h e s p l e e n o f l n d i u m - 1 1 1 - l a b e l e d p l a t e l e t s d u r i n g p l a t e l e t a p h e r e s i s . T r a n s f u s i o n 2 5 , 2 1 5 - 2 1 8 . d u P H e y n s , A . , B a d e n h o r s t , P . N . , L a t t e r , M . G . , P i e t e r s , H . , W e s s e l s , P . , a n d K o t z e , H . F . ( 1 9 8 6 ) . P l a t e l e t t u r n o v e r a n d k i n e t i c s i n i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a : r e s u l t s w i t h a u t o l o g o u s 1 1 1 I n - l a b e l e d p l a t e l e t s a n d h o m o l o g o u s 5 1 C r - l a b e l e d p l a t e l e t s d i f f e r . B l o o d 1 , 8 6 9 2 . D u e , R . a n d C h o , W . ( 1 9 9 4 ) . I n h i b i t i o n o f h u m a n s e c r e t o r y c l a s s I I 2 8 1 p h o s p h o l i p a s e A , b y h e p a r i n . E u r . J . B i a c h e m . 2 2 1 , 4 8 1 - 4 9 0 . D u n n , D . L . , M a c h , P . A . , C a n d i e , R . M . , a n d C e r r a , P B ( 1 9 8 4 ) . A n i t c o r e e n d o t o x i n F l a b ' ) , e q u i n e i m m u n o g l o b u l i n f r a g m e n t s p r o t e c t a g a i n s t l e t h a l e f f e c t s o f g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a l s e p s i s . S u r g e r y 9 6 , 4 4 0 - 4 4 6 . D u r h a m , S . K . , B r o u w e r , A . , B a r e l d s , R . J . , H o r a n , M . A . , a n d K n o o k , D . L . ( 1 9 9 0 ) . C o m p a r a t i v e e n d o t o x i n - i n d u c e d h e p a t i c i n j u r y i n y o u n g a n d a g e d r a t s . J . P a t h o l . 1 6 2 , 3 4 1 - 3 4 9 . E m e r s o n , T . E . , J r . , F o u r n e l , M . A . , L e a c h , W . J . , a n d R e d e n s , T . B . ( 1 9 8 7 ) . P r o t e c t i o n a g a i n s t d i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n a n d d e a t h b y a n t i t h r o m b i n I I I i n t h e E s c h e r i c h i a c a l i e n d o t o x e m i c r a t . C i r c u l a t o r y S h a c k 2 1 , 1 - 1 3 . E n d o , Y . ( 1 9 8 4 ) . I n d u c t i o n o f h y p o g l y c a e m i a a n d a c c u m u l a t i o n o f 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e i n t h e l i v e r a f t e r t h e i n j e c t i o n o f m i t o g e n i c s u b s t a n c e s i n t o m i c e . B r . J . P h a r m a c . 8 1 , 6 4 5 - 6 5 0 . E n d o , Y . a n d N a k a m u r a , M . ( 1 9 9 2 ) . T h e e f f e c t o f l i p o p o l y s a c c h a r i d e , i n t e r l e u k i n - 1 a n d t u m o u r n e c r o s i s f a c t o r o n t h e h e p a t i c a c c u m u l a t i o n o f 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e a n d p l a t e l e t s i n t h e m o u s e . B r . J . P h a r m a c . 1 0 5 , 6 1 3 - 6 1 9 . E n d o , Y . a n d N a k a m u r a , M . ( 1 9 9 3 ) . A c t i v e t r a n s l a c a t i o n o f p l a t e l e t s i n t o s i n u s o i d a l a n d D i s s e s p a c e s i n t h e l i v e r i n r e s p o n s e t o l i p o p o l y s a c c h a r i d e s , i n t e r l e u k i n - 1 a n d t u m o r n e c r o s i s f a c t o r . G e n . P h a r m a c . 2 4 ( 5 ) , 1 0 3 9 - 1 0 5 3 . E r l i n g e r , S . a n d D h u m e a u x , D . ( 1 9 7 4 ) . M e c h a n i s m s a n d c o n t r o l o f s e c r e t i o n o f b i l e w a t e r a n d e l e c t r o l y t e s . G a s t r a e n t e r a l a g y 6 6 , 2 8 1 - 3 0 4 . E s s a n i , N . A . , F i s h e r , M . A . , F a r h o o d , A . , M a n n i n g , A . M . , S m i t h , C . W . , a n d J a e s c h k e , H . ( 1 9 9 5 ) . C y t o k i n e - i n d u c e d u p r e g u l a t i o n o f h e p a t i c i n t e r c e l l u l a r a d h e s i o n m o l e c u l e - 1 m R N A e x p r e s s i o n a n d i t s r o l e i n t h e p a t h o p h y s i o l o g y o f m u r i n e e n d o t o x i n s h o c k a n d a c u t e l i v e r f a i l u r e . H e p a t a l . 2 1 , 1 6 3 2 - 1 6 3 9 . E v a n g e l i s t a , V . , P i c c a r d o n i , P . , M a u g e r i , M . , D e G a e t a n o , G . , a n d C e r l e t t i , C . ( 1 9 9 2 ) . I n h i b i t i o n b y h e p a r i n o f p l a t e l e t a c t i v a t i o n i n d u c e d b y n e u t r o p h i l - d e r i v e d c a t h e p s i n G . E u r . J . P h a r m a c a l . 2 1 6 , 4 0 1 - 4 0 5 . E v a n g e l i s t a , V . , P i c c a r d o n i , P . , W h i t e , J . G . , D e G a e t a n o , ( 5 . , a n d C e r l e t t i , C . ( 1 9 9 3 ) . C a t h e p s i n G - d e p e n d e n t p l a t e l e t s t i m u l a t i o n b y a c t i v a t e d p o l y m o r p h o n u c l e a r l e u k o c y t e s a n d i t s i n h i b i t o n b y a n t i p r o t e i n a s e s : R o l e o f P - s e l e c t i n - m e d i a t e d c e l l - c e l l a d h e s i o n . B l o o d 8 1 ( 1 1 ) , 2 9 4 7 - 2 9 5 7 . 2 8 2 F e i n s t e i n , M . B . , B e c k e r , E . L . , a n d F r a s e r , C . ( 1 9 7 7 ) . T h r o m b i n , c o l l a g e n a n d A 2 3 1 8 7 s t i m u l a t e d e n d o g e n o u s p l a t e l e t a r a c h i d a n a t e m e t a b o l i s m : d i f f e r e n t i a l i n h i b i t i o n b y P G E , , l o c a l a n e s t h e t i c s a n d a s e r i n e - p r o t e a s e i n h i b i t o r . P r a s t a g l a n d i n s 1 4 , 1 0 7 5 - 1 0 9 3 . F e n t o n , J . W . , I I , ( 1 9 8 9 ) . T h r o m b i n i n t e r a c t i o n s w i t h h i r u d i n . S e m i n a r s i n T h r o m b o s i s a n d H e m a s t a s i s 1 5 , 2 6 5 - 2 8 7 . F e n t o n , J . W . , l l . , V i l l a n u e v a , G . B . , O f o s u , P . A . , a n d M a r g a n o r e , J . M . ( 1 9 9 1 ) . T h r o m b i n i n h i b i t i o n b y h i r u d i n : h o w h i r u d i n i n h i b i t s t h r o m b i n . H a e m a s t a s i s 2 1 ( s u p p l . 1 ) . 2 7 - 3 1 . F e r r e r - L o p e z , P . , R e n e s t o , P . , S c h a t t n e r , M . , B a s s o t , S . , L a u r e n t , P . , a n d C h i g n a r d , M . ( 1 9 9 0 ) . A c t i v a t i o n o f h u m a n p l a t e l e t s b y C 5 a - s t i m u l a t e d n e u t r o p h i l s : a r o l e f o r c a t h e p s i n G . A m . J . P h y s i o l . 2 5 8 ( 2 7 ) , C 1 1 0 0 - C 1 1 0 7 . F e r r e r - L o p e z , P . , R e n e s t o , P . , P r e v o s t , M . , G o u n o n , P . , a n d C h i g n a r d , M . ( 1 9 9 2 ) . H e p a r i n i n h i b i t s n e u t r o p h i l - i n d u c e d p l a t e l e t a c t i v a t i o n v i a c a t h e p s i n G . J . L a b . C / i n . M e d . 1 1 9 . 2 3 1 - 2 3 9 . F i l k i n s , J . P . a n d C o r n e l l , R . P . ( 1 9 7 4 ) . D e p r e s s i o n o f h e p a t i c g l u c o n e o g e n e s i s a n d t h e h y p o g l y c e m i a o f e n d o t o x i n s h o c k . A m . J . P h y s i o ] . 2 2 7 , 7 7 8 - 7 8 1 . F i l k i n s , J . P . a n d C o r n e l l , R . P . ( 1 9 7 7 ) . I n v i v a v s i n v i t r o e f f e c t s o f e n d o t o x i n o n g l y c o g e n o l y s i s , g l u c o n e o g e n e s i s , a n d g l u c o s e u t i l i z a t i o n . P r a c . S o c . E x p . B i o l . M e d . 1 5 5 . 2 1 6 - 2 1 8 . F r e u d e n b e r g , N . , F r e u d e n b e r g , M . A . , B a n d a r a , K . , a n d G a l a n o s , C . ( 1 9 8 5 ) . D i s t r i b u t i o n a n d l o c a l i z a t i o n o f e n d o t o x i n i n t h e r e t i c u l o - e n d o t h e l i a l s y s t e m ( R E S ) a n d i n t h e m a i n v e s s e l s o f t h e r a t d u r i n g s h o c k . P a t h o l . R e s . P r a c t . 1 7 9 , 5 1 7 - 5 2 7 . F r i t z , H . , J o c h u m , M . , G e i g e r , R . , D u s w a l d , K . H . , D i t t m e r , H . , K o r t m a n n , H . , N e u m a n n , S . , a n d L a n g , H . ( 1 9 8 6 ) . G r a n u l o c y t e p r o t e i n a s e s a s m e d i a t o r s o f u n s p e c i f i c p r o t e o l y s i s i n i n f l a m m a t i o n : a r e v i e w . F a l i a H i s t a c h e m i c a E t C y t a b i a l a g i a 2 4 , 9 9 - 1 1 6 . F r y , D . E . , P e a r l s t e i n , L . , F u l t o n , R . L . , a n d P o l k , H . C . , J r . ( 1 9 8 0 ) . M u l t i p l e s y s t e m o r g a n f a i l u r e . T h e r o l e o f u n c o n t r o l l e d i n f e c t i o n . A r c h . S u r g . 1 1 5 , 1 3 6 - 1 4 0 . F u r m a n , B . L . , M c K e c h n i e , K . , a n d P a r r a t t , J R . ( 1 9 8 4 ) . F a i l u r e o f d r u g s t h a t s e l e c t i v e l y i n h i b i t t h r o m b o x a n e s y n t h e s i s t o m o d i f y e n d o t o x i n s h o c k i n c o n s c i o u s r a t s . B r . J . P h a r m a c . 8 2 , 2 8 9 - 2 9 4 . 2 8 3 G a n e y , P . E . , B a i l i e , M . B . , a n d R o t h , R . A . ( 1 9 9 3 ) M o d u l a t i o n o f K u p f f e r c e l l f u n c t i o n w i t h g a d o l i n i u m c h l o r i d e d o e s n o t a l t e r m e t h y l e n e d i a n i l i n e o r a l l y l a l c o h o l h e p a t o t o x i c i t y . ( A b s t r a c t ) T a x i c a l a g i s t 1 3 . 4 2 9 G a n s , H . a n d M a t s u m o t a , K . ( 1 9 7 4 ) . T h e e s c a p e o f e n d o t o x i n f r o m t h e i n t e s t i n e . S u r g . G y n e c o l . O b s t e t . 1 3 9 , 3 9 5 - 4 0 2 . G a r c i a , J . G . N . , S i f l i n g e r - B i r n b o i m , A . , B i z i o s , R . , D e l V e c c h i o , P . J . , F e n t o n , J . W . , I l . , a n d M a l i k , A B . ( 1 9 8 6 ) . T h r o m b i n - i n d u c e d i n c r e a s e i n a l b u m i n p e r m e a b i l i t y a c r o s s t h e e n d o t h e l i u m . J . C e l l . P h y s i o l . 1 2 8 , 9 6 - 1 0 4 . G a r d n e r , C . R . , L a s k i n , J . D . , a n d L a s k i n , D . L . ( 1 9 9 5 ) . D i s t i n c t b i o c h e m i c a l r e s p o n s e s o f h e p a t i c m a c r o p h a g e s a n d e n d o t h e l i a l c e l l s t o p l a t e l e t - a c t i v a t i n g f a c t o r d u r i n g e n d o t o x e m i a . J . L e u k . B i o l . 5 7 , 2 6 9 - 2 7 4 . G l a d e , L . M . , J a c q u e s , A . , M e r g e n h a g e n , S E , a n d R o s e n s t r i e c h , D . L . ( 1 9 7 7 ) . R e s i s t a n c e o f m a c r o p h a g e s f r o m C S H / H e J m i c e t o t h e i n v i t r o c y t o t o x i c e f f e c t s o f e n d o t o x i n . J . I m m u n o l . 1 1 9 , 1 6 2 - 1 6 6 . G o l e n b o c k , D . T . , H a m p t o n , R . Y . , R a e t z , C . R . H . , a n d W r i g h t , S D . ( 1 9 9 0 ) . H u m a n p h a g o c y t e s h a v e m u l t i p l e l i p i d A - b i n d i n g s i t e s . I n f e c t . I m m u n . 5 8 ( 1 2 ) , 4 0 6 9 - 4 0 7 5 . G o m e z , C . , P a r a m o , J . A . , C o l u c c i , M . , a n d R o c h a , E . ( 1 9 8 9 ) . E f f e c t o f h e p a r i n a n d / o r a n t i t h r o m b i n I I I o n t h e g e n e r a t i o n o f e n d o t o x i n - i n d u c e d p l a s m i n o g e n a c t i v a t o r i n h i b i t o r . T h r a m b . H a e m a s t a s . 6 2 , 6 9 4 - 6 9 8 . G o r d o n , J . L . a n d M i l n e r , A . J . ( 1 9 7 6 ) . B l o o d p l a t e l e t s a s m u l t i f u n c t i o n a l c e l l s . J . L . G o r d o n , ( E d . ) , P l a t e l e t s i n b i o l o g y a n d p a t h o l o g y , 1 . N o r t h H o l l a n d P u b l i s h i n g C o m p a n y . A m s t e r d a m p p . 3 - 2 2 . G o r d o n , J . L . ( 1 9 8 1 ) . P l a t e l e t s i n p e r s p e c t i v e . J . T . D i n g l e a n d J . L . G o r d o n , ( E d s . ) , P l a t e l e t s i n b i o l o g y a n d p a t h o l o g y 2 , E l s e v i e r . A m s t e r d a m p p . 1 - 1 7 . G r e w e , M . , D u y s t e r , J . , D i e t e r , P . , H e n n i n g e r , H . , S c h u l z e - S p e c k i n g , A . , a n d D e c k e r , K . ( 1 9 9 2 ) . P r o s t a g l a n d i n D Z a n d E 2 s y n t h e s e s i n r a t K u p f f e r c e l l s a r e a n t a g o n i s t i c a l l y r e g u l a t e d b y l i p o p o l y s a c c h a r i d e a n d p h o r b o l e s t e r . B i o l . C h e m . 3 7 3 , 6 5 5 - 6 6 4 . G u t m a n n , P . D . , M u r t h y , V . S . , W o j c i e c h o w s k i , M . T . , W u r m , R . M . , a n d E d z a r d s , R . A . ( 1 9 8 7 ) . T r a n s i e n t p u l m o n a r y p l a t e l e t s e q u e s t r a t i o n d u r i n g e n d o t o x e m i a i n d o g s . C i r c u l a t o r y S h a c k 2 1 , 1 8 5 - 1 9 5 . H a g m a n n , W . , D e n z l i n g e r , C . , a n d K e p p l e r , D . ( 1 9 8 5 ) . P r o d u c t i o n o f p e p t i d e l e u k o t r i e n e s i n e n d o t o x i n s h o c k . F E B S L e t t e r s 1 8 0 ( 2 ) , 3 0 9 - 3 1 3 . 2 8 4 H a i l i n g , J . L . , H a m i l l , D . R . , L e i , M . , a n d M o r r i s o n , D . C . ( 1 9 9 2 ) . I d e n t i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f l i p o p o l y s a c c h a r i d e - b i n d i n g p r o t e i n s o n h u m a n p e r i p h e r a l b l o o d c e l l p o p u l a t i o n s . I n f e c t . I m m u n . 6 0 . 8 4 5 - 8 5 2 . H a l u s h k a , P . V . , W i s e , W . C . , a n d C o o k , J . A . ( 1 9 8 1 ) . P r o t e c t i v e e f f e c t s o f a s p i r i n i n e n d o t o x i c s h o c k . J . P h a r m . E x p . 7 7 1 e r . 2 1 8 , 4 6 4 - 4 6 9 . H a r a - K u g e , S . , A m a m n o , F . , N i s h i j i m a , M . , a n d A k a m a t s u , Y . ( 1 9 9 0 ) . I s o l a t i o n o f l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( L P S ) - r e s i s t a n t m u t a n t , w i t h d e f e c t i v e L P S b i n d i n g , o f c u l t u r e d m a c r o p h a g e - l i k e c e l l s . J . B i o l . C h e m . 2 6 5 , 6 6 0 6 - 6 6 1 0 . H a r d o n k , M . J . , D i j k h u i s , F . W . J . , H u l s t a e r t , C . E . , a n d K o u d s t a a l , J . ( 1 9 9 2 ) . H e t e r o g e n e i t y o f r a t l i v e r a n d s p l e e n m a c r o p h a g e s i n g a d o l i n i u m c h o l o r i d e - i n d u c e d e l i m i n a t i o n a n d r e p o p u l a t i o n . J . L e u k . B i o l . 5 2 , 2 9 6 - 3 0 2 . H a r l a n , J . M . , H a r k e r , L . A . , R e i d y , M . A . , G a j d u s e k , C . M . , S c h w a r t z , S M , a n d S t r i k e r , G . E . ( 1 9 8 3 a ) . L i p o p o l y s a c c h a r i d e - m e d i a t e d e n d o t h e l i a l c e l l i n j u r y i n v i t r o . L a b . I n v e s t . 4 8 , 2 6 9 - 2 7 4 . H a r l a n , J . M . , H a r k e r , L . A . , S t r i k e r , G E , a n d W e a v e r , L . J . ( 1 9 8 3 b ) . E f f e c t s o f l i p o p o l y s a c c h a r i d e o n h u m a n e n d o t h e l i a l c e l l s i n c u l t u r e . T h r o m b . R e s . 2 9 , 1 5 - 2 6 . H a u p t m a n , J . G . , H a s s o u n a , H . l . , B e l l , T . G . , P e n n e r , J . A . , a n d E m e r s o n , T . E . ( 1 9 8 8 ) . E f f i c a c y o f a n t i t h r o m b i n I I I i n e n d o t o x i n - i n d u c e d d i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n . C i r c u l a t o r y S h a c k 2 5 , 1 1 1 - 1 2 2 . H e u m a n n , D . , G a l l a y , P . , B a r r a s , C . , Z a e c h , P . , U l e v i t c h , R . J . , T o b i a s , P . S . , G l a u s e r , M . , a n d B a u m g a r t n e r , J D . ( 1 9 9 2 ) . C o n t r o l o f l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( L P S ) b i n d i n g a n d L P S - i n d u c e d t u m o r n e c r o s i s f a c t o r s e c r e t i o n i n h u m a n p e r i p h e r a l b l o o d m o n o c y t e s . J . I m m u n o l . 1 4 8 , 3 5 0 5 - 3 5 1 2 . H e w e t t , J . A . , S c h u l t z e , A . E . , V a n C i s e , S . , a n d R o t h , R . A . ( 1 9 9 2 ) . N e u t r o p h i l d e p l e t i o n p r o t e c t s a g a i n s t l i v e r i n j u r y f r o m b a c t e r i a l e n d o t o x i n . L a b . I n v e s t . 6 6 ( 3 ) . 3 4 7 - 3 6 1 . H e w e t t , J . A . , J e a n , P . A . , K u n k e l , S . L . , a n d R o t h , R . A . ( 1 9 9 3 ) . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n t u m o r n e c r o s i s f a c t o r - 0 a n d n e u t r o p h i l s i n e n d o t o x i n - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . A m . J . P h y s i o l . 2 6 5 ( 2 8 ) , G 1 0 1 1 - G 1 0 1 5 . H e w e t t , J . A . a n d R o t h , R . A . ( 1 9 9 5 ) . T h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , b u t n o t c i r c u l a t i n g f i b r i n o g e n , c o n t r i b u t e s t o l i v e r i n j u r y i n r a t s e x p o s e d t o l i p o p o l y s a c c h a r i d e f r o m g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a . J . P h a r m a c o l . E x p . T h e r . 2 7 2 , 5 3 - 6 2 . 2 8 5 H o , J . S . , B u c h w e i t z , J . P . , R o t h , R . A . , a n d G a n e y , P . E . ( 1 9 9 5 ) . I d e n t i f i c a t i o n o f f a c t o r s f r o m r a t n e u t r o p h i l s i n v o l v e d i n c y t o t o x i c i t y t o i s o l a t e d h e p a t o c y t e s . J . L e u k . B i o l . ( I n p r e s s ) . H o l m s e n , H . a n d D a y , H . J . ( 1 9 7 0 ) . T h e s e l e c t i v i t y o f t h e t h r o m b i n - i n d u c e d p l a t e l e t r e l e a s e r e a c t i o n : s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n o f r e l e a s e d a n d r e t a i n e d c o n s t i t u e n t s . J . L a b . C l i n . M e d . 7 5 , 8 4 0 - 8 5 5 . H o l m s e n , H . ( 1 9 9 4 ) . P l a t e l e t s e c r e t i o n a n d e n e r g y m e t a b o l i s m . R . W . C o l m a n , J . H i r s h , V . J . M a r d e r a n d E . W . S a l z m a n , ( E d s . ) , H e m a s t a s i s a n d t h r o m b o s i s : b a s i c p r i n c i p l e s a n d c l i n i c a l p r a c t i c e , 3 . J 8 L i p p i n c o t t C o m p a n y . P h i l a d e l p h i a p p . 5 2 4 - 5 4 5 . H o l t , J . C . , H a r r i s , M . E . , H o l t , A . M . , L a n g e , E . , H e n s c h e n , A . , a n d N i e w i a r o w s k i , S . ( 1 9 8 6 ) . C h a r a c t e r i z a t i o n o f h u m a n p l a t e l e t b a s i c p r o t e i n , a p r e c u r s o r f o r m o f l o w - a f f i n i t y p l a t e l e t f a c t o r 4 a n d B - t h r o m b o g l o b u l i n . B i o c h e m i s t r y 2 5 , 1 9 8 8 - 1 9 9 6 . H o l t , J . C . , R a b e l l i n o , E . M . , G e w i r t z , A . M . , G u n k e l , L . M . , a n d R u c i n s k i , B . ( 1 9 8 8 ) . O c c u r r e n c e o f p l a t e l e t b a s i c p r o t e i n , a p r e c u r s o r o f l o w a f f i n i t y p l a t e l e t f a c t o r 4 a n d B - t h r o m b o g l o b u l i n , i n h u m a n p l a t e l e t s a n d m e g a k a r y o c y t e s . E x p . H e m a t o l . 1 6 , 3 0 2 - 3 0 6 . H o s f o r d , D . , K o l t a i , M . a n d B r a q u e t , P . ( 1 9 9 3 ) . P l a t e l e t - a c t i v a t i n g f a c t o r i n s h o c k , s e p s i s a n d o r g a n f a i l u r e . G . S c h l a g a n d H . R e d l , ( E d s . ) , P a t h a p h y s i a l a g y o f S h o c k , S e p s i s a n d O r g a n F a i l u r e , S p r i n g e r V e r l a g . B e r l i n p p . 5 0 2 - 5 1 2 . H u g h e s , H . , F a r h o o d , A . , a n d J a e s c h k e , H . ( 1 9 9 2 ) . R o l e o f l e u k o t r i e n e B 4 i n t h e p a t h o g e n e s i s o f h e p a t i c i s c h e m i a - r e p e r f u s i o n i n j u r y i n t h e r a t . P r a s t a g l a n d i n s L e u k o t r i e n e s & E s s e n t i a l F a t t y A c i d 4 5 , 1 1 3 - 1 1 9 . l d e l l , S . , M a u n d e r , R . , F e i n , A . M . , S w i t a l s k a , H . l . , T u s z y n s k i , G . P . , M c L a r t y , J . , a n d N i e w i a r o w s k i , S . ( 1 9 8 9 ) . P l a t e l e t - s p e c i f i c a — g r a n u l e p r o t e i n s a n d t h r o m b o s p o n d i n i n b r a n c h o a l v e o l a r l a v a g e i n t h e a d u l t r e s p i r a t o r y d i s t r e s s s y n d r o m e . C h e s t 9 6 , 1 1 2 5 - 1 1 3 2 . l i m u r o , Y . , Y a m a m o t o , M . , K o h n o , H . , l t a k u r a , J . , F u j i i , H . , a n d M a t s u m o t o , Y . ( 1 9 9 4 ) . B l o c k a d e o f l i v e r m a c r o p h a g e s b y g a d o l i n i u m c h l o r i d e r e d u c e s l e t h a l i t y i n e n d o t o x e m i c r a t s - a n a l y s i s o f m e c h a n i s m s o f l e t h a l i t y i n e n d o t o x e m i a . J . L e u k . B i o ] . 5 5 , 7 2 3 - 7 2 8 . l k a i , K . , Y a m a m o t o , M . , M a t s u y o s h i , N . , a n d F u k u s h i m a , M . ( 1 9 9 5 ) . E f f e c t o f a c y t o t o x i c p r o s t a g l a n d i n , J ‘ z - p r o s t a g l a n d i n J , o n e - c a d h e r i n e x p r e s s i o n i n t r a n s f o r m e d e p i d e r m a l c e l l s i n c u l t u r e . P r a s t a g l a n d i n s L e u k o t r i e n e s & E s s e n t i a l F a t t y A c i d 5 2 , 3 0 3 - 3 0 7 . 2 8 6 I m a n i s h i , N . , K o m u r o , Y . , a n d M o r o o k a , S . ( 1 9 9 1 ) . E f f e c t o f a s e l e c t i v e P A F a n t a g o n i s t S M - 1 0 6 6 1 ( I + I - ) - c i s - 3 , 5 - d i m e t h y l - Z - ( 3 - p y r i d y l ) t h i a z o l i d i n - 4 - o n e H C l ) o n e x p e r i m e n t a l d i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n ( D I C ) . L i p i d s 2 6 , 1 3 9 1 - 1 3 9 5 . l m u r a , Y . , T e r a s h i t a , 2 . , a n d N i s h i k a w a , K . ( 1 9 8 6 ) . P o s s i b l e r o l e o f p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r ( P A F ) i n d i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n ( D I C ) , e v i d e n c e d b y u s e o f a P A F a n t a g o n i s t , C V - 3 9 8 8 . L i f e S c i e n c e s 3 9 . 1 1 1 - 1 1 7 . l s h i g u r o , S . , A r i i , S . , M o n d e n , K . , A d a c h i , Y . , F u n a k i , N . , H i g a s h i t s u j i , H . , F u j i t a , S . , F u r u t a n i , M . , M i s e , M . , K i t a o , T . , N a k a m u r a , T . , U s h i k u b i , F . , N a k a m u r a , K . , N a r u m i y a , S . , E n o m o t o , K . e t a ] . ( 1 9 9 4 ) . I d e n t i f i c a t i o n o f t h e t h r o m b o x a n e A 2 r e c e p t o r i n h e p a t i c s i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l s a n d i t s r o l e i n e n d o t o x i n - i n d u c e d l i v e r i n j u r y i n r a t s . H e p a t a l . 2 0 , , 1 2 8 1 - 1 2 8 6 . l s s e k u t z , A . C . , R i p l e y , M . , a n d J a c k s o n , J . R . ( 1 9 8 3 ) . R o l e o f n e u t r o p h i l s i n t h e d e p o s i t i o n o f p l a t e l e t s d u r i n g a c u t e i n f l a m m a t i o n . L a b . I n v e s t . 4 9 . 6 , 7 1 6 - 7 2 4 . I t o , T . , A s a i , F . , O s h i m a , T . , a n d K o b a y a s h i , S . ( 1 9 9 0 ) . R o l e o f a c t i v a t e d p l a t e l e t s i n e n d o t o x i n - i n d u c e d D l C i n r a t s . T h r o m b . R e s . 5 9 , 7 3 5 - 7 4 7 . J a c o b , A . l . , G o l d b e r g , P . K . , B l o o m , N . , D e g e n s h e i n , G . A . , a n d K o z i n n , P . J . ( 1 9 7 7 ) . E n d o t o x i n a n d b a c t e r i a i n p o r t a l b l o o d . G a s t r a e n t e r a l a g y 7 2 , 1 2 6 8 - 1 2 7 0 . J a e s c h k e , H . , F a r h o o d , A . , a n d S m i t h , C . W . ( 1 9 9 0 ) . N e u t r o p h i l s c o n t r i b u t e t o i s c h e m i a / r e p e r f u s i o n i n j u r y i n r a t l i v e r i n v i v a . F A S E B J . 4 , 3 3 5 5 - 3 3 5 9 . J a e s c h k e , H . a n d F a r h o o d , A . ( 1 9 9 1 a ) . N e u t r o p h i l a n d K u p f f e r c e l l - i n d u c e d o x i d a n t s t r e s s a n d i s c h e m i a - r e p e r f u s i o n i n j u r y i n r a t l i v e r . A m . J . P h y s i o l . 2 6 0 , 6 3 5 5 - 6 3 6 2 . J a e s c h k e , H . , F a r h o o d , A . , a n d S m i t h , C . W . ( 1 9 9 1 b ) . N e u t r o p h i l - i n d u c e d l i v e r c e l l i n j u r y i n e n d o t o x i n s h o c k i s a C D 1 1 b / C D 1 8 - d e p e n d e n t m e c h a n i s m . A m . J . P h y s i o l . 2 1 . 6 1 0 5 1 - 6 1 0 5 6 . J a e s c h k e , H . ( 1 9 9 2 a ) . E n h a n c e d s i n u s o i d a l g l u t a t h i o n e e f f l u x d u r i n g e n d o t o x i n - i n d u c e d o x i d a n t s t r e s s i n v i v o . A m . J . P h y s i o l . 2 6 3 ( 2 6 ) , G 6 0 - G 6 8 . J a e s c h k e , H . , B a u t i s t a , A . P . , S p o l a r i c s , 2 . , a n d S p i t z e r , J . J . ( 1 9 9 2 b ) . S u p e r o x i d e g e n e r a t i o n b y n e u t r o p h i l s a n d K u p f f e r c e l l s d u r i n g i n v i v a r e p e r f u s i o n a f t e r h e p a t i c i s c h e m i a i n r a t s . J . L e u k . B i o l . 5 2 , 3 7 7 - 3 8 2 . J a e s c h k e , H . , R a f t e r y , M . J . , J u s t e s e n , U . , a n d G a s k e l l , S . J . ( 1 9 9 2 c ) . S e r u m c o m p l e m e n t m e d i a t e s e n d o t o x i n - i n d u c e d c y s t e i n y l l e u k o t r i e n e f o r m a t i o n i n r a t s 2 8 7 i n v i v o . A m . J . P h y s i o l . 2 6 3 . 6 9 4 7 - 6 9 5 2 . J a e s c h k e , H . , S c h i n i , V B , a n d F a r h o o d , A . ( 1 9 9 2 d ) . R o l e o f n i t r i c o x i d e i n t h e o x i d a n t s t r e s s d u r i n g i s c h e m i a / r e p e r f u s i o n i n j u r y o f t h e l i v e r . L i f e S c i e n c e s 5 0 , 1 7 9 7 - 1 8 0 4 . J a m e s , H . L . , W a c h t f o g e l , Y . T . , J a m e s , P . L . , Z i m m e r m a n , J . M . , C o l m a n , R . W . , a n d C o h e n , A . B . ( 1 9 8 5 ) . A u n i q u e e l a s t a s e i n h u m a n b l o o d p l a t e l e t s . J . C l i n . I n v e s t . 7 6 . 2 3 3 0 - 2 3 3 7 . J o h n s o n , R . J . , A l p e r s , C . E . , P r i t z i , P . , S c h u l z e , M . , B a k e r , P . , P r u c h n o , C . , a n d C o u s e r , W . 6 . ( 1 9 8 8 ) . P l a t e l e t s m e d i a t e n e u t r o p h i l - d e p e n d e n t i m m u n e c o m p l e x n e p h r i t i s i n t h e r a t . J . C l i n . I n v e s t . 8 2 , 1 2 2 5 - 1 2 3 5 . J o n e s , A . a n d G e c z y , C . L . ( 1 9 9 0 ) . T h r o m b i n a n d f a c t o r X a e n h a n c e t h e p r o d u c t i o n o f i n t e r l e u k i n - 1 . I m m u n o l o g y 7 1 , 2 3 6 - 2 4 1 . K a i n a h , M . , l k e d a , Y . , N i s h i a , S . , a n d N a k a d a t e , T . ( 1 9 9 2 ) . G l y c 0 p r o t e i n l a l l l a - m e d i a t e d a c t i v a t i o n - d e p e n d e n t p l a t e l e t a d h e s i o n t o c o l l a g e n . T h r a m b . R e s . 6 5 . 1 6 5 - 1 7 6 . K a w a d a , N . , M i z o g u c h i , Y . , K o b a y a s h i , K . , M a n n a , T . , M o r i s a w a , S . , U e d a , N . , O m o t o , Y . , T a k a h a s h i , Y . , a n d Y a m a m o t o , S . ( 1 9 9 2 ) . P o s s i b l e i n d u c t i o n o f f a t t y a c i d c y c l o - o x y g e n a s e i n l i p o p o l y s a c c h a r i d e - s t i m u l a t e d K u p f f e r c e l l s . G a s t r a e n t e r a l a g y 1 0 3 . 1 0 2 6 - 1 0 3 3 . K e h r e r , J . P . , J o n e s , D . P . , L e m a s t e r s , J . J . , F a r b e r , J . L . , a n d J a e s c h k e , H . ( 1 9 9 0 ) . C o n t e m p o r a r y i s s u e s i n t o x i c o l o g y . M e c h a n i s m s o f h y p o x i c c e l l i n j u r y . T a x i c a l . A p p l . P h a r m a c o l . 1 0 6 , 1 6 5 - 1 7 8 . K i r k l a n d , T . N . , V i r c a , G . D . , K u u s - R e i c h e r , T . , M u l t e r , F . l ( . , K i m , S . Y . , U l e v i t c h , R . J . , a n d T o b i a s , P S ( 1 9 9 0 ) . I d e n t i f i c a t i o n o f l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( L P S I - b i n d i n g p r o t e i n s i n 7 0 2 / 3 c e l l s b y p h o t o a f f i n i t y c r o s s - l i n k i n g . J . B i o l . C h e m . 2 5 6 . 9 5 2 0 - 9 5 2 5 . K l e b a n o f f , S . J . , V a d a s , M . A . , l - I a r l a n , J . M . , S p a r k s , L . H . , G a m b l e , J . R . , A g o s t i , J . M . , a n d W a l t e r s d o r p h , A M . ( 1 9 8 6 ) . S t i m u l a t i o n o f n e u t r o p h i l s b y t u m o r n e c r o s i s f a c t o r . J . I m m u n o l . 1 3 6 ( 1 1 ) , 4 2 2 0 - 4 2 2 5 . K l e e , A . , S c h m i d - S c h o n b e i n , G . W . , a n d S e i f f g e , D . ( 1 9 9 1 ) . E f f e c t s o f p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r o n r a t p l a t e l e t s i n v i v a . E u r . J . P h a r m a c a I . 2 0 9 , 2 2 3 - 2 3 0 . K a t h , W . , N o w a k , G . , a n d M a r k w a r d t , F . ( 1 9 8 0 ) . M o n i t o r i n g o f m i c r o t h r o m b o s i s i n e x p e r i m e n t a l a n i m a l s b y c o n t i n u o u s r e c o r d i n g o f 1 2 5 l - f i b r i n d e p o s i t s a n d 5 1 C r - l a b e l l e d p l a t e l e t s i n t h e l u n g s . A c t a B i o l . M e d . G e r m . 3 9 , 2 8 8 1 5 7 - 1 6 2 . K r a m e r , W . a n d M u l l e r - B e r g h a u s , G . ( 1 9 7 7 ) . E f f e c t o f p l a t e l e t a n t i s e r u m o n t h e a c t i v a t i o n o f i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n b y e n d o t o x i n . T h r o m b . R e s . 1 0 , 4 7 - 7 0 . K u i p e r , J . , Z i j l s t r a , F . J . , K a m p s , J . A . A . M . , a n d v a n B e r k e l , T . J . C . ( 1 9 8 8 ) . I d e n t i f i c a t i o n o f p r o s t a g l a n d i n D , a s t h e m a j o r e i c o s a n o i d f r o m l i v e r e n d o t h e l i a l a n d K u p f f e r c e l l s . B i a c h i m . B i o p h y s . A c t a 9 5 9 . 1 4 3 - 1 5 2 . K u i p e r , J . , Z i j l s t r a , F . J . , K a m p s , J . A . A . M . , a n d v a n B e r k e l , T . J . C . ( 1 9 8 9 ) . C e l l u l a r c o m m u n i c a t o n i n s i d e t h e l i v e r . B i a c h e m . J . 2 6 2 , 1 9 5 - 2 0 1 . K u r a t o m i , Y . , L e f f e r t s , P . L . , C h r i s t m a n , B . W . , P a r k e r , R . E . , S m i t h , W . G . , M u e l l e r , R . A . , a n d S n a p p e r , J . R . ( 1 9 9 3 ) . E f f e c t o f a 5 - l i p o x y g e n a s e i n h i b i t o r o n e n d o t o x i n - i n d u c e d p u l m o n a r y d y s f u n c t i o n i n a w a k e s h e e p . J . A p p l . P h y s i o l . 7 4 ( 2 ) . 5 9 6 - 6 0 5 . L a p o i n t e , D . S . a n d O l s o n , M S . ( 1 9 8 9 ) . P l a t e l e t - a c t i v a t i n g f a c t o r - s t i m u l a t e d h e p a t i c g l y c o g e n o l y s i s i s n o t m e d i a t e d t h r o u g h c y c l o o x y g e n a s e - d e r i v e d m e t a b o l i t e s o f a r a c h i d o n i c a c i d . J . B i o l . C h e m . 2 6 4 , 1 2 1 3 0 - 1 2 1 3 3 . L a R o s a , C . A . , R o h r e r , M . J . , B e n o i t , S . E . , B a r n a r d , M . R . , a n d M i c h e l s o n , A D . ( 1 9 9 4 ) . N e u t r o p h i l c a t h e p s i n G m o d u l a t e s t h e p l a t e l e t s u r f a c e e x p r e s s i o n o f t h e g l y c o p r o t e i n ( 6 P ) l b - I X c o m p l e x b y p r o t e o l y s i s o f t h e v o n W i l l e b r a n d f a c t o r b i n d i n g s i t e o n G P l b a a n d b y a c y t o s k e l e t a l - m e d i a t e d r e d i s t r i b u t i o n o f t h e r e m a i n d e r o f t h e c o m p l e x . B l o o d 8 4 ( 1 ) , 1 5 8 - 1 6 8 . L a u t t , W . W . a n d G r e e n w a y , C V . ( 1 9 8 7 ) . C o n c e p t u a l r e v i e w o f t h e h e p a t i c v a s c u l a r b e d . H e p a t a l a g y 7 ( 5 ) . 9 5 2 - 9 6 3 . L e v y , E . , P a t h , F . C . , a n d R u e b n e r , B . H . ( 1 9 6 8 a ) . H e p a t i c c h a n g e s p r o d u c e d b y a s i n g l e d o s e o f e n d o t o x i n i n t h e m o u s e . L i g h t m i c r o s c o p y a n d h i s t o c h e m i s t r y . A m . J . P a t h o l . 5 1 ( 2 ) . 2 6 9 - 2 8 5 . L e v y , E . , P a t h , F . C . , S l u s s e r , R . J . , a n d R u e b n e r , B . H . ( 1 9 6 8 b ) . H e p a t i c c h a n g e s p r o d u c e d b y a s i n g l e d o s e o f e n d o t o x i n i n t h e m o u s e . E l e c t r o n m i c r o s c o p y . A m . J . P a t h o l . 5 2 , 4 7 7 - 5 0 2 . L i n a s , S . L . , W h i t t e n b u r g , D . , a n d R e p i n e , J . E . ( 1 9 9 1 ) . R o l e o f n e u t r o p h i l d e r i v e d o x i d a n t s a n d e l a s t a s e i n l i p o p o l y s a c c h a r i d e - m e d i a t e d r e n a l i n j u r y . K i d n e y I n t . 3 9 . 6 1 8 - 6 2 3 . L i u , P . , V o n d e r f e c h t , S . L . , M c G u i r e , G . M . , F i s h e r , M . A . , F a r h o o d , A . , a n d J a e s c h k e , H . ( 1 9 9 4 ) . T h e 2 1 - a m i n o s t e r o i d t i r i l a z a d m e s y l a t e p r o t e c t s a g a i n s t e n d o t o x i n s h o c k a n d a c u t e l i v e r f a i l u r e i n r a t s . J . P h a r m . E x p . T h e r . 2 7 1 , 2 8 9 4 3 8 - 4 4 5 . L i u , P . , M c G u i r e , G . M . , F i s h e r , M . A . , F a r h o o d , A . , S m i t h , C . W . , a n d J a e s c h k e , H . ( 1 9 9 5 ) . A c t i v a t i o n o f K u p f f e r c e l l s a n d n e u t r o p h i l s f o r r e a c t i v e o x y g e n f o r m a t i o n i s r e s p o n s i b l e f o r e n d o t o x i n - e n h a n c e d l i v e r i n j u r y a f t e r h e p a t i c i s c h e m i a . S h o c k 3 , 5 6 - 6 2 . L o n k y , S . A . , M a r s h , J . , a n d W o h l , H . ( 1 9 7 8 ) . S t i m u l a t i o n o f h u m a n g r a n u l o c y t e e l a s t a s e b y p l a t e l e t f a c t o r 4 a n d h e p a r i n . B i a c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 8 5 ( 3 ) . 1 1 1 3 - 1 1 1 8 . L o n k y , S A . a n d W o h l , H . ( 1 9 8 1 ) . S t i m u l a t i o n o f h u m a n l e u k o c y t e e l a s t a s e b y p l a t e l e t f a c t o r 4 . P h y s i o l o g i c , m o r p h o l o g i c a n d b i o c h e m i c a l e f f e c t s o n h a m s t e r l u n g s i n v i t r o . J . C l i n . I n v e s t . 6 7 , 8 1 7 - 8 2 6 . L y n a m , E . B . , S i m o n , S . l . , R o c h o n , Y . P . , a n d S k l a r , L A . ( 1 9 9 4 ) . L i p o p o l y s a c c h a r i d e e n h a n c e d C D 1 1 b / C D 1 8 f u n c t i o n b u t i n h i b i t s n e u t r o p h i l a g g r e g a t i o n . B l o o d 8 3 ( 1 1 ) , 3 3 0 3 - 3 3 1 1 . M a c k i e , l . J . a n d N e a l , C . R . ( 1 9 8 8 ) . T h e p l a t e l e t . R . M . P i t t i l o a n d S . J . M a c h i n , ( E d s . ) , P l a t e l e t - v e s s e l w a l l i n t e r a c t i o n s , S p r i n g e r - V e r l a g . L o n d o n p p . 1 - 3 2 . M a c l o u f , J . , F r u t e a u d e L a c l o s , 8 . , a n d B o r g e a t , P . ( 1 9 8 2 ) . S t i m u l a t i o n o f l e u k o t r i e n e b i o s y n t h e s i s i n h u m a n b l o o d l e u k o c y t e s b y p l a t e l e t - d e r i v e d 1 2 - h y d r o p e r o x y - i c o s a t e t r a e n o i c a c i d . P r a c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 7 9 , 6 0 4 2 - 6 0 4 6 . M a c l o u f , J . , M u r p h y , R . C . , a n d H e n s o n , P M . ( 1 9 9 0 ) . T r a n s c e l l u l a r b i o s y n t h e s i s o f s u l f i d o p e p t i d e l e u k o t r i e n e s d u r i n g r e c e p t o r - m e d i a t e d s t i m u l a t i o n o f h u m a n n e u t r o p h i l / p l a t e l e t m i x t u r e s . B l a a d 7 6 ( 9 ) . 1 8 3 8 - 1 8 4 4 . M a r c u s , A . J . , B r o e k m a n , M . J . , S a f i e r , L . B . , U l l m a n , H . L . , a n d I s l a m , I . ( 1 9 8 2 ) . F o r m a t i o n o f l e u k o t r i e n e s a n d o t h e r h y d r o x y a c i d s d u r i n g p l a t e l e t - n e u t r o p h i l i n t e r a c t i o n s i n v i t r o . B i a c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 0 9 ( 1 ) , 1 3 0 - 1 3 7 . M a r g a r e t t e n , W . , M c K a y , D . G . , a n d P h i l l i p s , L L . ( 1 9 6 7 ) . T h e e f f e c t o f h e p a r i n o n e n d o t o x i n s h o c k i n t h e r a t . A m . J . P a t h o l . 5 1 , 6 1 - 6 8 . M a r k w a r d t , F . ( 1 9 8 9 ) . D e v e l o p m e n t o f h i r u d i n a s a n a n t i t h r o m b o t i c a g e n t . S e m i n a r s i n T h r o m b o s i s a n d H e m a s t a s i s 1 5 ( 3 ) . 2 6 9 - 2 8 2 . M a r l e t t a , M . A . , Y o o n , P . S . , l y e n g a r , R . , L e a f , C . D . , a n d W i s h n o k , J . S . ( 1 9 8 8 ) . M a c r o p h a g e o x i d a t i o n o f L - a r g i n i n e t o n i t r i t e a n d n i t r a t e : n i t r i c o x i d e i s a n i n t e r m e d i a t e . B i o c h e m i s t r y 2 7 , 8 7 0 6 - 8 7 1 1 . 2 9 0 M a s u d a , H . , K a w a m u r a , K . , T o h d a , K . , S h o z a w a , T . , S a g e s h i m a , M . , a n d K a m i y a , A . ( 1 9 8 9 ) . I n c r e a s e i n e n d o t h e l i a l c e l l d e n s i t y b e f o r e a r t e r y e n l a r g e m e n t i n f l o w - l o a d e d c a n i n e c a r o t i c a r t e r y . A t h e r . 9 , 8 1 2 - 8 2 3 . M a t h i s o n , J . C . a n d U l e v i t c h , R . J . ( 1 9 7 9 ) . T h e c l e a r a n c e , t i s s u e d i s t r i b u t i o n , a n d c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n o f i n t r a v e n o u s l y i n j e c t e d l i p o p o l y s a c c h a r i d e i n r a b b i t s . J . I m m u n o l . 1 2 3 , 2 1 3 3 - 2 1 4 3 . M a t h i s o n , J . C . , T o b i a s , P . S . , W o l f s o n , E . , a n d U l e v i t c h , R . J . ( 1 9 9 2 ) . P l a s m a l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( L P S ) - b i n d i n g p r o t e i n . A k e y c o m p o n e n t i n m a c r o p h a g e r e c o g n i t i o n o f g r a m - n e g a t i v e L P S . J . I m m u n o l . 1 4 9 , 2 0 0 - 2 0 6 . M c C u s k e y , R . S . , M c C u s k e y , P . A . , U r b a s c h e k , R . , a n d U r b a s c h e k , B . ( 1 9 8 4 a ) . S p e c i e s d i f f e r e n c e s i n k u p f f e r c e l l s a n d e n d o t o x i n s e n s i t i v i t y . I n f e c t . I m m u n . 4 5 , 2 7 8 - 2 8 0 . M c C u s k e y , R . S . , U r b a s c h e k , R . , M c C u s k e y , P . A . , S a c c o , N . , S t a u b e r , W . T . , P i n k s t a f f , C . A . , a n d U r b a s c h e k , B . ( 1 9 8 4 b ) . D e f i c i e n t k u p f f e r c e l l p h a g o c y t o s i s a n d l y s o s o m a l e n z y m e s i n t h e e n d o t o x i n - l o w - r e s p o n s i v e C 3 H / H e J m o u s e . J . L e u k . B i o l . 3 6 . 5 9 1 - 6 0 0 . M e y r i c k , 8 . 0 . ( 1 9 8 6 ) . E n d o t o x i n - m e d i a t e d p u l m o n a r y e n d o t h e l i a l c e l l i n j u r y . F e d e r a t i o n P r o c e e d i n g s 4 5 ( 1 ) , 1 9 - 2 4 . M o h r i , M . , S p r i g g s , D . R . , a n d K u f e , D . ( 1 9 9 0 ) . E f f e c t s o f l i p o p o l y s a c c h a r i d e o n p h o s p h o l i p a s e A , a c t i v i t y a n d t u m o r n e c r o s i s f a c t o r e x p r e s s i o n i n H L - 6 0 c e l l s . J . I m m u n o l . 1 4 4 , 2 6 7 8 - 2 6 8 2 . M o l i n a , M . , D i L a l l o , M . , M a r t e l l i , N . , D e G a e t a n o , 6 . , a n d C e r l e t t i , C . ( 1 9 9 3 ) . E f f e c t s o f l e u k o c y t e - d e r i v e d c a t h e p s i n G o n p l a t e l e t m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n l b - I X a n d l l b - l l l a c o m p l e x e s : a c o m p a r i s o n w i t h t h r o m b i n . B l o o d 8 2 ( 8 ) . 2 4 4 2 - 2 4 5 1 . M o n t r u c c h i o , 6 . , A l l o a t t i , 6 . , M a r i a n o , F . , C o m i n o , A . , C a c a c e , 6 . , P o l l o n i , R . , D e F i l i p p i , P . G . , E m a n u e l l i , 6 . , a n d C a m u s s i , 6 . ( 1 9 9 3 ) . R o l e o f p l a t e l e t - a c t i v a t i n g f a c t o r i n p o l y m o r p h o n u c l e a r n e u t r o p h i l r e c r u i t m e n t i n r e p e r f u s e d i s c h e m i c r a b b i t h e a r t . A m . J . P a t h o l . 1 4 2 ( 2 ) , 4 7 1 - 4 8 0 . M o o n , D . G . , v a n D e r Z e e , H . , W e s t o n , L . K . , G u d e w i c z , P . W . , F e n t o n , J . W . , I I , a n d K a p l a n , J . E . ( 1 9 9 0 ) . P l a t e l e t m o d u l a t i o n o f n e u t r o p h i l s u p e r o x i d e a n i o n p r o d u c t i o n . T h r a m b . H a e m a s t a s . 6 3 . 9 1 - 9 6 . M o o r e , J . M . , E a r n e s t , M . A . , D i S i m o n e , A . G . , A b u m r a d , N . N . , a n d F l e t c h e r , J . R . ( 1 9 9 1 ) . A P A F r e c e p t o r a n t a g o n i s t , B N 5 2 0 2 1 , a t t e n u a t e s t h r o m b o x a n e r e l e a s e a n d i m p r o v e s s u r v i v a l i n l e t h a l c a n i n e e n d o t o x e m i a . C i r c u l a t o r y S h a c k 3 5 , 2 9 1 5 3 - 5 9 . M o r i n , A . , M a r c h a n d - A r v i e r , M . , D o u t r e m e p u i c h , F . , a n d V i g n e r o n , C . ( 1 9 9 0 ) . C o a g u l a t i o n i m p a c t o n c h e m o t a c t i c a c t i v i t y g e n e r a t i o n f o r p o l y m o r p h o n u c l e a r l e u k o c y t e s . T h r o m b . R e s . 5 9 . 9 7 9 - 9 8 4 . M o r r i s o n , D . C . a n d C o c h r a n e , C . 6 . ( 1 9 7 4 ) . D i r e c t e v i d e n c e f o r h a g e m a n f a c t o r ( f a c t o r X I I ) a c t i v a t i o n b y b a c t e r i a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e s ( e n d o t o x i n s ) . J . E x p . M e d . 1 4 0 . 7 9 7 - 8 1 1 . M o r r i s o n , D . C . a n d U l e v i t c h , R . J . ( 1 9 7 9 ) . T h e e f f e c t s o f b a c t e r i a l e n d o t o x i n s o n h o s t m e d i a t i o n s y s t e m s . A m . J . P a t h o l . 3 3 , 5 2 7 - 6 1 7 . M o s c a t , J . , I g l e s i a s , S . , M o r e n o , F . , H e r r e r a , C . , a n d G a r c i a - B a r r e n o , P . ( 1 9 8 7 ) . E f f e c t s o f E s c h e r i c h i a c a l i l i p o p o l y s a c c h a r i d e o n t h e p h o s p h o i n o s i t i d e m e t a b o l i s m a n d s e r o t o n i n s e c r e t i o n i n t h r o m b i n - a c t i v a t e d p l a t e l e t s . C i r c u l a t o r y S h a c k 2 3 , 8 5 - 9 2 . M o v a t , H 1 . ( 1 9 8 7 ) . T u m o r n e c r o s i s f a c t o r a n d i n t e r l e u k i n - 1 : r o l e i n a c u t e i n f l a m m a t i o n a n d m i c r o v a s c u l a r i n j u r y . J . L a b . C I i n . M e d . 1 1 0 ( 6 ) , 6 6 8 - 6 8 1 . M a z e s , T . , Z i j l s t r a , F . J . , H e i l i g e r s , J . P . C . , T a k , C . J . A . M . , B e n - E f r a i m , S . , B o n t a , L L , a n d S a x e n a , P . R . ( 1 9 9 1 ) . S e q u e n t i a l r e l e a s e o f t u m o u r n e c r o s i s f a c t o r , p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r a n d e i c o s a n o i d s d u r i n g e n d o t o x i n s h o c k i n a n a e s t h e t i z e d p i g s ; p r o t e c t i v e e f f e c t s o f i n d o m e t h a c i n . B r . J . P h a r m a c . 1 0 4 , 6 9 1 - 6 9 9 . N a c h m a n , R . L . a n d H a r p e l , P . C . ( 1 9 7 6 ) . P l a t e l e t a , - m a c r o g l o b u l i n a n d a , - a n t i t r y p s i n . J . B i o l . C h e m . 2 5 1 , 4 5 1 4 - 4 5 2 1 . N a g a i , H . , A o k i , M . , S h i m a z a w a , T . , Y a k u o , l . , K o d a , A . , a n d K a s a h a r a , M . ( 1 9 8 9 ) . E f f e c t o f O K Y - 0 4 6 a n d O N O - 3 7 0 8 o n l i v e r i n j u r y i n m i c e . J a p a n . J . P h a r m a c o l . 5 1 , 1 9 1 - 1 9 7 . N a u m , C . C . , K a p l a n , 8 . 5 . , a n d B a s f o r d , R . E . ( 1 9 9 1 ) . P l a t e l e t s a n d A T P p r i m e n e u t r o p h i l s f o r e n h a n c e d O , - g e n e r a t i o n a t l o w c o n c e n t r a t i o n s b u t i n h i b i t 0 , - g e n e r a t i o n a t h i g h c o n c e n t r a t i o n . J . L e u k . B i o l . 4 9 , 8 3 - 8 9 . N e i h o r s t e r , M . , l n o u e , M . , a n d W e n d e l , A . ( 1 9 9 2 ) . A l i n k b e t w e e n e x t r a c e l l u l a r r e a c t i v e o x y g e n a n d e n d o t o x i n - i n d u c e d r e l e a s e o f t u m o r n e c r o s i s f a c t o r a l p h a i n v i v a . B i a c h e m . P h a r m a c o l . 4 3 . 1 1 5 1 - 1 1 5 4 . N i e w i a r o w s k i , S . a n d H o l t , J . C . ( 1 9 8 5 ) . P l a t e l e t a - g r a n u l e p r o t e i n s : b i o c h e m i c a l a n d p a t h o l o g i c a l a s p e c t s . 6 . L . L o n g e n e c k e r , ( E d . ) , T h e p l a t e l e t s : p h y s i o l o g y a n d p h a r m a c o l o g ) ’ . A c a d e m i c P r e s s . O r l a n d o p p . 4 9 - 8 3 . 2 9 2 N i e w i a r o w s k i , S . , H o l t , J . C . a n d C o o k , J . J . ( 1 9 9 4 ) . B i o c h e m i s t r y a n d p h y s i o l o g y a n d s e c r e t e d p l a t e l e t p r o t e i n s . R . W . C o l m a n , J . H i r s h , V . J . M a r d e r a n d E . W . S a l z m a n , ( E d s . ) , H e m a s t a s i s a n d t h r o m b o s i s : b a s i c p r i n c i p l e s a n d c l i n i c a l p r a c t i c e , 3 . J 8 L i p p i n c o t t C o m p a n y . P h i l a d e l p h i a p p . 5 4 6 - 5 5 6 . N o l a n , J . P . ( 1 9 7 5 ) . T h e r o l e o f e n d o t o x i n i n l i v e r i n j u r y . G a s t r a e n t e r a l a g y 6 9 , 1 3 4 6 - 1 3 5 6 . N o l a n , J . P . a n d C a m a r a , D . S . ( 1 9 8 9 ) . I n t e s t i n a l e n d o t o x i n s a s c o - f a c t o r s i n l i v e r i n j u r y . I m m u n o l o g i c a l I n v e s t i g a t i o n s 1 8 . 3 2 5 - 3 3 7 . N o v o t n y , M . J . , L a u g h l i n , M . H . , a n d A d a m s , H R ( 1 9 8 8 ) . E v i d e n c e f o r l a c k o f i m p o r t a n c e o f o x y g e n f r e e r a d i c a l s i n E s c h e r i c h i a c a l i e n d o t o x e m i a i n d o g s . A m . J . P h y s i o l . 2 5 4 ( 2 3 ) . H 9 5 4 — H 9 6 2 . N o w o t n y , A . ( 1 9 8 7 ) . R e v i e w o f t h e m o l e c u l a r r e q u i r e m e n t s o f e n d o t o x i c a c t i o n s . R e v . I n f e c t . D i s . 9 ( s u p p l . 5 ) , $ 5 0 3 - $ 5 1 1 . O g a w a , R . , M o r i t a , T . , K u n i m o t o , F . , a n d F u g i t a , T . ( 1 9 8 2 ) . C h a n g e s i n h e p a t i c l i p o p e r o x i d e c o n c e n t r a t i o n i n e n d o t o x e m i c r a t s . C i r c u l a t o r y S h o c k 9 , 3 6 9 O h l s s o n , K . , B j o r k , P . , B e r g e n f e l d t , M . , H a g e m a n , R . , a n d T h o m p s o n , R . C . ( 1 9 9 0 ) . I n t e r l e u k i n - 1 r e c e p t o r a n t a g o n i s t r e d u c e s m o r t a l i t y f r o m e n d o t o x i n s h o c k . N a t u r e 3 4 8 , 5 5 0 - 5 5 2 . O k a m o t o , M . , Y o s h i d a , K . , N i s h i k a w a , M . , K o h s a k a , M . , a n d A o k i , H . ( 1 9 8 6 ) . P l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r ( P A F ) i n v o l v e m e n t i n e n d o t o x i n - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n r a b b i t s : s t u d i e s w i t h F R - 9 0 0 4 5 2 , a s p e c i f i c i n h i b i t o r o f P A F . T h r o m b . R e s . 4 2 , 6 6 1 - 6 7 1 . O l a n o f f , L . S . , C o o k , J . A . , E l l e r , T . , K n a p p . D . R . , a n d H a l u s h k a , P . V . ( 1 9 8 5 ) . P r o t e c t i v e e f f e c t s o f t r a n s - 1 3 - A P T , a t h r o m b o x a n e r e c e p t o r a n t a g o n i s t , i n e n d o t o x e m i a . J . C a r d i a . P h a r m a c a l . 7 , 1 1 4 - 1 2 0 . O l s o n , N . C . , B r o w n , T . T . , J r . , a n d A n d e r s o n , D . L . ( 1 9 8 5 ) . D e x a m e t h a s o n e a n d i n d o m e t h a c i n m o d i f y e n d o t o x i n - i n d u c e d r e s p i r a t o r y f a i l u r e i n p i g s . J . A p p l . P h y s i o l . 5 8 ( 1 ) . 2 7 4 - 2 8 4 . O l s o n , N . C . , J o y c e , P . B . , a n d F l e i s h e r , L . N . ( 1 9 9 0 ) . R o l e o f p l a t e l e t - a c t i v a t i n g f a c t o r a n d e i c o s a n o i d s d u r i n g e n d o t o x i n - i n d u c e d l u n g i n j u r y i n p i g s . A m . J . P h y s i o l . 2 5 8 . H 1 6 7 4 - H 1 6 8 6 . O l s o n , S . T . a n d B j o r k , l . ( 1 9 9 4 ) . R e g u l a t i o n o f t h r o m b i n a c t i v i t y b y a n t i t h r o m b i n a n d h e p a r i n . S e m i n a r s i n T h r o m b o s i s a n d H e m a s t a s i s 2 0 , 3 7 3 - 4 0 9 . 2 9 3 O s b o r n , L . ( 1 9 9 0 ) . L e u k o c y t e a d h e s i o n t o e n d o t h e l i u m i n i n f l a m m a t i o n . C e l l 6 2 , 3 - 6 . O s t e r u d , B . ( 1 9 9 2 ) . P l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r e n h a n c e m e n t o f l i p o p o l y s a c c h a r i d e - i n d u c e d t i s s u e f a c t o r a c t i v i t y i n m a n o c y t e s : r e q u i r e m e n t o f p l a t e l e t s a n d g r a n u l o c y t e s . J . L e u k . B i o l . 5 1 , 4 6 2 - 4 6 5 . O u , M . C . , K a m b a y a s h i , J . , K a w a s a k i , T . , U e m u r a , Y . , S h i n a z a k i , K . , S h i b a , E . , S a k o n , M . , Y u k a w a , M . , a n d M o r i , T . ( 1 9 9 4 ) . P o t e n t i a l e t i o l o g i c r o l e o f P A F i n t w o m a j o r s e p t i c c o m p l i c a t i o n s ; d i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n a n d m u l t i p l e o r g a n f a i l u r e . T h r o m b . R e s . 7 3 ( 3 / 4 ) , 2 2 7 - 2 3 8 . P a l a b r i c a , T . , L o b b , R . , F u r i e , B . C . , A r o n o v i t z , M . , B e n j a m i n , C . , H s u , Y . , S a j e r , S . A . , a n d F u r i e , B . ( 1 9 9 2 ) . L e u k o c y t e a c c u m u l a t i o n p r o m o t i n g f i b r i n d e p o s i t i o n i s m e d i a t e d i n v i v a b y P - s e l e c t i n o n a d h e r e n t p l a t e l e t s . N a t u r e 3 5 9 , 8 4 8 - 8 5 1 . P a r e n t , J . B . ( 1 9 8 9 ) . C o r e s p e c i f i c r e c e p t o r f o r l i p o p o l y s a c c h a r i d e o n h e p a t o c y t e s . C i r c u l a t o r y S h a c k 2 7 , 3 4 1 - 3 4 2 . P a r m e n t i e r , S . , M c G r e g o r , L . , C a t i m e l , B . , L e u n g , L L , a n d M c G r e g o r , J . L . ( 1 9 9 1 ) . I n h i b i t i o n o f p l a t e l e t f u n c t i o n s b y a m o n o c l o n a l a n t i b o d y ( L Y P 2 0 ) d i r e c t e d a g a i n s t a g r a n u l e m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n ( G M P - 1 4 O I P A D G E M ) . B l o o d 7 7 . 1 7 3 4 - 1 7 3 9 . P e a r s o n , J D . ( 1 9 9 1 ) . E n d o t h e l i a l c e l l b i o l o g y . R a d i o l o g y 1 7 9 , 9 - 1 4 . P e a r s o n , J . M . , S c h u l t z e , A . E . , J e a n , P . A . , a n d R o t h , R . A . ( 1 9 9 5 ) . P l a t e l e t p a r t i c i p a t i o n i n l i v e r i n j u r y f r o m g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e i n t h e r a t . S h o c k 4 , 1 7 8 - 1 8 6 . P i g u e t , P . F . , V e s i n , C . , R y s e r , J . E . , S e n a l d i , 6 . , G r a u , G . E . , a n d T a c c h i n i - C o t t i e r , F . ( 1 9 9 3 ) . A n e f f e c t o r r o l e f o r p l a t e l e t s i n s y s t e m i c a n d l o c a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e - i n d u c e d t o x i c i t y i n m i c e , m e d i a t e d b y a C D 1 1 a - a n d C D S 4 — d e p e n d e n t i n t e r a c t i o n w i t h e n d o t h e l i u m . I n f e c t . I m m u n . 6 1 ( 1 0 ) , 4 1 8 2 - 4 1 8 7 . P o d j a r n y , E . , R a t h a u s , M . , P o m e r a n z , A . , S h a p i r a , J . , a n d B e r n h e i m , J . ( 1 9 8 9 ) . T h r o m b i n i n h i b i t s t h e s y n t h e s i s o f p r o s t a n o i d s b y i s o l a t e d g l o m e r u l i a n d p e r i t o n e a l m a c r o p h a g e s i n r a t s . N e p h r a n 5 3 , 5 0 - 5 3 . P r a g e r , R . L . , D u n n , E . L . , K i r s h , M M , a n d P e n n e r , J . A . ( 1 9 7 9 ) . E n d o t o x i n - i n d u c e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n ( D I C ) a n d i t s t h e r a p y . A d v . S h a c k R e s . 2 , 2 7 7 - 2 8 7 . O i , M . a n d J o n e s , 8 8 ( 1 9 9 0 ) . C o n t r i b u t i o n o f p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r t o 2 9 4 h e m o d y n a m i c a n d s y m p a t h e t i c r e s p o n s e s t o b a c t e r i a l e n d o t o x i n i n c o n s c i o u s r a t s . C i r c u l a t o r y S h a c k 3 2 , 1 5 3 - 1 6 3 . O u i r o g a , J . a n d P r i e t o , J . ( 1 9 9 3 ) . L i v e r c y t o p r o t e c t i o n b y p r o s t a g l a n d i n s . P h a r m a c . T h e r . 5 8 , 6 7 - 9 3 . R a b i n o v i c i , R . , Y u e , T . , F a r h a t , M . , S m i t h , E . F . , I l l , E s s e r , K . M . , S l i v j a k , M . , a n d F e u e r s t e i n , G . ( 1 9 9 0 ) . P l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r ( P A F ) a n d t u m o r n e c r o s i s f a c t o r - a ( T N F a ) i n t e r a c t i o n s i n e n d o t o x e m i c s h o c k : s t u d i e s w i t h B N 5 0 7 3 9 , a n o v e l P A F a n t a g o n i s t . J . P h a r m a c o l . E x p . T h e r . 2 5 4 , 9 7 6 - 9 8 1 . R a t l i f f , N . B . , G e r r a r d , J . M . , a n d W h i t e , J . G . ( 1 9 7 9 ) . P l a t e l e t - l e u k o c y t e i n t e r a c t i o n f o l l o w i n g a r t e r i a l e n d o t h e l i a l - i n j u r y . A m . J . P a t h o l . 9 6 ( 2 ) , 5 6 7 - 5 7 6 . R e m i c k , D . G . , K u n k e l , R . G . , L a r r i c k , J . W . , a n d K u n k e l , S . L . ( 1 9 8 7 ) . A c u t e i n v i v a e f f e c t s o f h u m a n r e c o m b i n a n t t u m o r n e c r o s i s f a c t o r . L a b . I n v e s t . 5 6 ( 6 ) , 5 8 3 - 5 9 0 . R e m i c k , D . G . , S t r i e t e r , R . M . , E s k a n d a r i , M . K . , N g u y e n , D . T . , G e n o r d , M . A . , R a i f o r d , C . L . , a n d K u n k e l , S . L . ( 1 9 9 0 ) . R o l e o f t u m o r n e c r o s i s f a c t o r - a i n I i p o p o l y s a c c h r i d e - i n d u c e d p a t h o l o g i c a l t e r a t i o n s . A m . J . P a t h o l . 1 3 6 ( 1 ) , 4 9 - 6 0 . R e n e s t o , P . a n d C h i g n a r d , M . ( 1 9 9 1 ) . T u m o r n e c r o s i s f a c t o r - a e n h a n c e s p l a t e l e t a c t i v a t i o n v i a c a t h e p s i n 6 r e l e a s e d f r o m n e u t r o p h i l s . J . I m m u n o l . 1 4 6 ( 7 ) , 2 3 0 5 - 2 3 0 9 . R i c h a r d s , R S . a n d S a b a , T M . ( 1 9 8 5 ) . E f f e c t o f e n d o t o x i n o n f i b r o n e c t i n a n d K u p f f e r c e l l a c t i v i t y . H e p a t a l a g y 5 , 3 2 - 3 7 . R i e t s c h e l , E T . a n d G a l a n o s , C . ( 1 9 7 7 ) . L i p i d A a n t i s e r u m - m e d i a t e d p r o t e c t i o n a g a i n s t l i p o p o l y s a c c h a r i d e - a n d l i p i d A - i n d u c e d f e v e r a n d s k i n n e c r o s i s . I n f e c t . I m m u n . 1 5 . 3 4 - 4 9 . R o d r i g u e z d e T u r c o , E B . a n d S p i t z e r , J . A . ( 1 9 9 0 ) . E i c o s a n o i d p r o d u c t i o n i n n o n p a r e n c h y m a l l i v e r c e l l s i s o l a t e d f r o m r a t s i n f u s e d w i t h E . c o l i e n d o t o x i n . J . L e u k . B i o ] . 4 8 , 4 8 8 - 4 9 4 . R u c i n s k i , 8 . , K n i g h t , L . C . , a n d N i e w i a r o w s k i , S . ( 1 9 8 6 ) . C l e a r a n c e o f h u m a n p l a t e l e t f a c t o r 4 b y l i v e r a n d k i d n e y : i t s a l t e r a t i o n b y h e p a r i n . A m . J . P h y s i o l . 2 5 1 . H 8 0 0 - H 8 0 7 . S a l a r i , H . , D e m o s , M . , a n d W a n g , A . ( 1 9 9 0 ) . C o m p a r a t i v e h e m o d y n a m i c s a n d c a r d i o v a s c u l a r e f f e c t s o f e n d o t o x i n a n d p l a t e l e t - a c t i v a t i n g f a c t o r i n r a t . C i r c u l a t o r y S h a c k 3 2 , 1 8 9 - 2 0 7 . 2 9 5 S a l v e m i n i , D . a n d B a t t i n g , R . ( 1 9 9 3 ) . M o d u l a t i o n o f p l a t e l e t f u n c t i o n b y f r e e r a d i c a l s a n d f r e e - r a d i c a l s c a v e n g e r s . T I P S 1 4 , 3 6 - 4 2 . S a l y e r , J . L . , B o h n s a c k , J . F . , K n a p e , W . A . , S h i g e o k a , A . O . , A s h w o o d , E R , a n d H i l l , H R ( 1 9 9 0 ) . M e c h a n i s m s o f t u m o r n e c r o s i s f a c t o r - a l p h a a l t e r a t i o n o f P M N a d h e s i o n a n d m i g r a t i o n . A m . J . P a t h o l . 1 3 6 . 8 3 1 - 8 4 1 . S a n d e r s , W . E . , W i l s o n , R . W . , B a l l a n t y n e , C . M . , a n d B e a u d e t , A . L . ( 1 9 9 2 ) . M o l e c u l a r c l o n i n g a n d a n a l y s i s o f i n v i v o e x p r e s s i o n o f m u r i n e p - s e l e c t i n . B l o o d 8 0 ( 3 ) . 7 9 5 - 8 0 0 . S c h m a i e r , A . H . , Z u c k e r b e r g , A . , S i l v e r m a n , C . , K u c h i b h o t l a , J . , T u s z y n s k i , G . P . , a n d C o l m a n , R . W . ( 1 9 8 3 ) . H i g h - m o l e c u l a r w e i g h t k i n i n o g e n . A s e c r e t e d p l a t e l e t p r o t e i n . J . C l i n . I n v e s t . 7 1 , 1 4 7 7 - 1 4 8 9 . S e l a k , M . A . , C h i g n a r d , M . , a n d S m i t h , J . B . ( 1 9 8 8 ) . C a t h e p s i n G i s a s t r o n g p l a t e l e t a g o n i s t r e l e a s e d b y n e u t r o p h i l s . B i a c h e m . J . 2 5 1 , 2 9 3 - 2 9 9 . S h e n e p , J . L . a n d M o g a n , K . A . ( 1 9 8 4 ) . K i n e t i c s o f e n d o t o x i n r e l e a s e d u r i n g a n t i b i o t i c t h e r a p y f o r e x p e r i m e n t a l g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a l s e p s i s . J . I n f e c t . D i s . 1 5 0 , 3 8 0 - 3 8 8 . S h e n e p , J . L . , F l y n n , P . M . , B a r r e t t , F . F . , S t i d h a m , G . L . , a n d W e s t e n k i r c h n e r , D P . ( 1 9 8 8 ) . S e r i a l q u a n t i t a t i o n o f e n d o t o x e m i a a n d b a c t e r e m i a d u r i n g t h e r a p y f o r g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a l s e p s i s . J . I n f e c t . D i s . 1 5 7 , 5 6 5 - 5 6 8 . S h i b a y a m a , Y . ( 1 9 8 7 ) . S i n u s o i d a l c i r c u l a t o r y d i s t u r b a n c e b y m i c r o t h r o m b o s i s a s a c a u s e o f e n d o t o x i n - i n d u c e d h e p a t i c i n j u r y . J . P a t h o l . 1 5 1 , 3 1 5 - 3 2 1 . S h i b a y a m a , Y . , H a s h i m o t o , K . , a n d N a k a t a , K . ( 1 9 9 1 ) . R e l a t i o n o f t h e r e t i c u l o e n d o t h e l i a l f u n c t i o n t o e n d o t o x i n h e p a t o t o x i c i t y . E x p . P a t h o l . 4 3 , 1 7 3 - 1 7 9 . S h i b a y a m a , Y . , A s a k a , S . , U r a n o , T . , A r a k i , M . , a n d O d a , K . ( 1 9 9 5 ) . R o l e o f n e u t r o p h i l s a n d p l a t e l e t s i n t h e p a t h o g e n e s i s o f f o c a l h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s i n e n d o t o x e m i a . E x p . T o x i c . P a t h o l . 4 7 , 3 5 - 3 9 . S i m c h o w i t z , L . ( 1 9 8 5 ) . I n t r a c e l l u l a r p H m o d u l a t e s t h e g e n e r a t i o n o f s u p e r o x i d e r a d i c a l s b y h u m a n n e u t r o p h i l s . J . C l i n . I n v e s t . 7 6 , 1 0 7 9 - 1 0 8 9 . S m e d l e y , L . A . , T a n n e s e n , M . G . , S a n d h a n s , R . A . , H a s l e t t , C . , G u t h r i e , L . A . , J o h n s t o n , R . B . , H e n s o n , P . M . , a n d W o r t h e n , 6 . 8 . ( 1 9 8 6 ) . N e u t r o p h i l - m e d i a t e d i n j u r y t o e n d o t h e l i a l c e l l s . E n h a n c e m e n t b y e n d o t o x i n a n d e s s e n t i a l r o l e o f n e u t r o p h i l e l a s t a s e . J . C l i n . I n v e s t . 7 7 , 1 2 3 3 - 1 2 4 3 . 2 9 6 S m i t h , E . F . l . , K i n t e r , L . B . , J u g u s , M . , a n d Z e i d , R . ( 1 9 8 8 ) . E f f e c t o f t h e t h r o m b o l y t i c a g e n t , s t r e p t o k i n a s e , o n t h e r e s p o n s e s t o e n d o t o x e m i a i n c o n s c i o u s r a t s . C i r c u l a t o r y S h a c k 2 5 , 8 5 - 9 4 . S n y d e r , F . ( 1 9 9 0 ) . P l a t e l e t - a c t i v a t i n g f a c t o r a n d r e l a t e d a c e t y l a t e d l i p i d s a s p o t e n t b i o l o g i c a l l y a c t i v e c e l l u l a r m e d i a t o r s . A m . J . P h y s i o l . 2 5 9 , c 6 9 7 - c 7 0 8 . S o s t m a n , H . D . , Z o g h b i , S . S . , S m i t h , G . J . W . , C a r b o , P . , N e u m a n n , R . D . , G o t t s c h a l k , A . , a n d G r e e n s p a n , R . H . ( 1 9 8 3 ) . P l a t e l e t k i n e t i c s a n d b i o d i s t r i b u t i o n i n c a n i n e e n d o t o x e m i a . I n v e s t . R a d i a l . 1 8 . 4 2 5 - 4 3 5 . S t a r n e s , H . F . , P e a r c e , M . K . , T e w a r i , A . , Y i m , J . H . , Z o u , J . , a n d A b r a m s , J . S . ( 1 9 9 0 ) . A n t i - l L - 6 m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s p r o t e c t a g a i n s t l e t h a l E s c h e r i c h i a c a l i i n f e c t i o n a n d l e t h a l t u m o r n e c r o s i s f a c t o r - a l p h a c h a l l e n g e i n m i c e . J . I m m u n o l . 1 4 5 . 4 1 8 5 - 4 1 9 1 . S t e e l a n d T o r r i e . P r i n c i p l e s a n d P r o c e d u r e s i n S t a t i s t i c s . A B i o m e t r i c a l A p p r o a c h . 2 n d e d . N e w Y o r k : M c G r a w - H i l l ; 1 9 8 0 . S t e m , D . , N a w r o t h , P . , H a n d l e y , D . , a n d K i s i e l , W . ( 1 9 8 5 ) . A n e n d o t h e l i a l c e l l - d e p e n d a n t p a t h w a y o f c o a g u l a t i o n . P r a c . N a t l . A c a d . S c i . 8 2 . 2 5 2 3 - 2 5 2 7 . S t o r m o r k e n , H . ( 1 9 6 9 ) . T h e p l a t e l e t r e l e a s e r e a c t i o n . I t s g e n e r a l a s p e c t s a n d r e l a t i o n t o p h a g o c y t o s i s / p i n o c y t o s i s . S c a n d . J . C l i n . L a b . I n v e s t . s u p p l . 1 0 7 , 1 1 5 - 1 2 0 . S t r e i t e r , R . M . , R e m i c k , D . G . , W a r d , P . A . , S p e n g l e r , R N , a n d L y n c h , J . P . , I l l . ( 1 9 8 8 ) . C e l l u l a r a n d m o l e c u l a r r e g u l a t i o n o f t u m o r n e c r o s i s f a c t o r - a l p h a p r o d u c t i o n b y p e n t o x i f y l l i n e . B i a c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 5 5 , 1 2 3 0 - 1 2 3 6 . S u g i n o , K . , D o h i , K . , Y a m a d a . K . , a n d K a w a s a k i , T . ( 1 9 8 7 ) . T h e r o l e o f l i p i d p e r o x i d a t i o n i n e n d o t o x i n - i n d u c e d h e p a t i c d a m a g e a n d t h e p r o t e c t i v e e f f e c t o f a n t i o x i d a n t s . S u r g e r y 1 0 1 , 7 4 6 - 7 5 2 . S u g i n o , K . , K i y o h i k o , D . , Y a m a d a , K . , a n d K a w a s a k i , T . ( 1 9 8 9 ) . C h a n g e s i n t h e l e v e l s o f e n d o g e n o u s a n t i o x i d a n t s i n t h e l i v e r o f m i c e w i t h e x p e r i m e n t a l e n d o t o x e m i a a n d t h e p r o t e c t i v e e f f e c t s o f t h e a n t i o x i d a n t s . S u r g e r y 1 0 5 , 2 0 0 - 2 0 6 . S u z u k i , M . , S u e m a t s u , M . , M i u r a , S . , O s h i o , C . , O d a , M . , a n d T s u c h i y a , M . ( 1 9 8 8 ) . M i c r o c i r c u l a t o r y d i s t u r b a n c e s i n e n d o t o x i n - i n d u c e d d i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n . A d v . E x p . M e d . B i o l . 2 4 2 , 1 3 5 - 1 4 1 . T a k a h a s h i , S . , Y o s h i k a w a , T . , N a i t o , Y . , T a n i g a w a , I T . , Y o s h i d a , N . , a n d K o n d o , M . ( 1 9 9 1 ) . R o l e o f p l a t e l e t - a c t i v a t i n g f a c t o r ( P A F ) i n s u p e r o x i d e p r o d u c t i o n b y 2 9 7 h u m a n p o l y m o r p h o n u c l e a r l e u k o c y t e s . L i p i d s 2 6 , 1 2 2 7 - 1 2 3 0 . T a l b o t , M . ( 1 9 8 9 ) . B i o l o g y o f r e c o m b i n a n t h i r u d i n ( C G P 3 9 3 9 3 ) : a n e w p r o s p e c t i n t h e t r e a t m e n t o f t h r o m b o s i s . S e m i n a r s i n T h r o m b o s i s a n d H e m a s t a s i s 1 5 ( 3 ) , 2 9 3 - 3 0 1 . T a n e y a m a , C . , S a s a o , J . , S e n n a , S . , K i m u r a , M . , K i y o n o , S . , G o t o , H . , a n d A r a k a w a , K . ( 1 9 8 9 ) . P r o t e c t i v e e f f e c t s o f O N O 3 7 0 8 , a n n e w t h r o m b o x a n e A , r e c e p t o r a n t a g o n i s t , d u r i n g e x p e r i m e n t a l e n d o t o x i n s h o c k . C i r c u l a t o r y S h a c k 2 8 , 6 9 - 7 7 . T h o m p s o n , D . C . , T h o m p s o n , J . A . , S u g u m a r a n , M . , a n d M o l d e u s , P . ( 1 9 9 3 ) . B i o l o g i c a l a n d t o x i c o l o g i c a l c o n s e q u e n c e s o f q u i n o n e m e t h i d e f o r m a t i o n . C h e m . B i o l . I n t e r a c t i o n s 8 6 . 1 2 9 - 1 6 2 . T i e g s , G . a n d W e n d e l , A . ( 1 9 8 8 ) . L e u k o t r i e n e - m e d i a t e d l i v e r i n j u r y . B i a c h e m . P h a r m a c a l . 3 7 ( 1 3 ) , 2 5 6 9 - 2 5 7 3 . T o b i a s , P . S . , M a t h i s o n , J . C . , a n d U l e v i t c h , R . J . ( 1 9 8 8 ) . A f a m i l y o f l i p o p o l y s a c c h a r i d e b i n d i n g p r o t e i n s i n v o l v e d i n r e s p o n s e s t o g r a m - n e g a t i v e s e p s i s . J . B i o l . C h e m . 2 6 3 , 1 3 4 7 9 - 1 3 4 8 1 . T o t h , C . A . a n d T h o m a s , P . ( 1 9 9 2 ) . L i v e r e n d o c y t o s i s a n d k u p f f e r c e l l s . H e p a t a l 1 6 , 2 5 5 - 2 6 6 . T r a c e y , K . J . , B e u t l e r , B . , L o w r y , S . F . , M e r r y w e a t h e r , J . , W o l p e , S . , M i l s a r k , l . W . , H a r i r i , R . J . , F a h e y , T . J . , Z e n t e l l a , A . , A l b e r t , J . D . , S h i r e s , G . T . , a n d C e r a m i , A . ( 1 9 8 6 ) . S h o c k a n d t i s s u e i n j u r y i n d u c e d b y r e c o m b i n a n t h u m a n c a c h e c t i n . S c i e n c e 2 3 4 , 4 7 0 - 4 7 4 . U j i h a r a , M . , U r a d e , Y . , E g u c h i , N . , H a y a s h i , H . , l k a i , K . , a n d H a y a i s h i , O . ( 1 9 8 8 ) . P r o s t a g l a n d i n D , f o r m a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t i s s y n t h e t a s e s i n v a r i o u s t i s s u e s o f a d u l t r a t s . A r c h . B i a c h e m . B i o p h y s . 2 6 0 , 5 2 1 - 5 3 1 . U l e v i t c h , R . J . , J o h n s t o n , A . R . , a n d W e i n s t e i n , 0 . 8 . ( 1 9 8 1 ) . N e w f u n c t i o n f o r h i g h d e n s i t y l i p o p r o t e i n ( H D L ) : I l . I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a b a c t e r i a l I i p o p o l y s a c c h a r i d e - H D L c o m p l e x f o r m e d i n r a b b i t p l a s m a . J . C l i n . I n v e s t . 6 7 , 8 2 7 U t i l i , R . , A b e r n a t h y , C . D . , a n d Z i m m e r m a n , H . J . ( 1 9 7 6 ) . C h o l e s t a t i c e f f e c t s o f E s c h e r i c h i a c o l i e n d o t o x i n o n t h e i s o l a t e d p e r f u s e d r a t l i v e r . G a s t r a e n t e r a l a g y 7 0 ( 2 ) . 2 4 8 - 2 5 3 . U t i l i , R . , A b e r n a t h y , c o , a n d Z i m m e r m a n , H . J . ( 1 9 7 7 ) . S t u d i e s o n t h e a r r e a r s o f E . c a l i e n d o t o x i n o n c a n i l i c u l a r b i l e f o r m a t i o n i n t h e i s o l a t e d p e r f u s e d r a t 2 9 8 l i v e r . J . L a b . C l i n . M e d . 8 9 , 4 7 1 - 4 8 2 . V a d a s , M A . a n d G a m b l e , J . R . ( 1 9 9 0 ) . R e g u l a t i o n o f t h e a d h e s i o n o f n e u t r o p h i l s t o e n d o t h e l i u m . B i a c h e m . P h a r m a c a l . 4 0 ( 8 ) , 1 6 8 3 - 1 6 8 7 . V i c t o r o v , A . V . , G l a d k a y a , E . M . , N o v i k o v , D . K . , K o s y k h , V . A . , a n d Y u r k i v , V . A . ( 1 9 8 9 ) . L i p o p o l y s a c c h a r i d e t o x i n c a n d i r e c t l y s t i m u l a t e t h e i n t r a c e l l u l a r a c c u m u l a t i o n o f l i p i d s a n d t h e i r s e c r e t i o n i n t o m e d i u m i n t h e p r i m a r y c u l t u r e o f r a b b i t h e p a t o c y t e s . F E B S L e t t e r s 2 5 6 . 1 5 5 - 1 5 8 . W a h l , L . M . , R o s e n s t r e i c h , D . L . , G l a d e , L . M . , S a n d b e r g , A . L . , a n d M e r g e n h a g e n , S . E . ( 1 9 7 9 ) . D e f e c t i v e p r o s t a g l a n d i n s y n t h e s i s b y C 3 H l H e J m o u s e m a c r o p h a g e s s t i m u l a t e d w i t h e n d o t o x i n p r e p a r a t i o n s . I n f e c t . I m m u n . 2 3 , 8 - 1 3 . W a l s h , P . N . ( 1 9 8 1 a ) . P l a t e l e t s a n d c o a g u l a t i o n p r o t e i n s . F e d e r a t i o n P r o c e e d i n g s 4 0 . 2 0 8 6 - 2 0 9 1 . W a l s h , P . N . a n d G r i f f i n , J . H . ( 1 9 8 1 b ) . P l a t e l e t - c o a g u l a n t p r o t e i n i n t e r a c t i o n s i n c o n t a c t a c t i v a t i o n . A n n . N . Y . A c a d . S c i . 3 7 0 , 2 4 1 - 2 5 2 . W a l s h , P . N . , B a g l i a , P . A . , a n d J a m e s o n , B A . ( 1 9 9 3 ) . F a c t o r X ) a n d p l a t e l e t s : a c t i v a t i o n a n d r e g u l a t i o n . T h r a m b . H a e m a s t a s . 7 0 , 7 5 - 7 9 . W a l z , A . , D e w a l d , 8 . , v o n T s c h a r n e r , 8 . , a n d B a g g i o l i n i , M . ( 1 9 8 9 ) . E f f e c t s o f t h e n e u t r o p h i l - a c t i v a t i n g p e p t i d e N A P - 2 , p l a t e l e t b a s i c p r o t e i n , c o n n e c t i v e t i s s u e - a c t i v a t i n g p e p t i d e I l l , a n d p l a t e l e t f a c t o r 4 o n h u m a n n e u t r o p h i l s . J . E x p . M e d . 1 7 0 , 1 7 4 5 - 1 7 5 0 . W a r e , J . A . a n d H e i s t a d , D D . ( 1 9 9 3 ) . P l a t e l e t - e n d o t h e l i u m i n t e r a c t i o n s . N . E n g l . J . M e d . 3 2 8 , 6 2 8 - 6 3 5 . W e b b , L . M . C . , E h r e n g r u b e r , M . U . , C l a r k - L e w i s , l . , B a g g i o l i n i , M . , a n d R a t , A . ( 1 9 9 3 ) . B i n d i n g t o h e p a r a n s u l f a t e o r h e p a r i n e n h a n c e s n e u t r o p h i l r e s p o n s e s t o i n t e r l e u k i n 8 . P r a c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 9 0 , 7 1 5 8 - 7 1 6 2 . W e n d e l , A . a n d T i e g s , 6 . ( 1 9 8 6 ) . A n o v e l b i o l o g i c a l l y a c t i v e s e l e n o - o r g a n i c c o m p o u n d - V I . P r o t e c t i o n b y e b s e l e n ( P 2 5 1 ) a g a i n s t g a l a c t o s a m i n e / e n d o t o x i n - i n d u c e d h e p a t i t i s i n m i c e . B i a c h e m . P h a r m a c a l . 3 5 ( 1 3 ) , 2 1 1 5 - 2 1 1 8 . W e s t e r , J . , S i x m a , J . J . , G e u z e , J . J . , a n d H e i j n e n , H . F . G . ( 1 9 7 9 ) . M o r p h o l o g y o f t h e h e m o s t a t i c p l u g i n h u m a n s k i n w o u n d s . T r a n s f o r m a t i o n o f t h e p l u g . L a b . I n v e s t . 4 1 ( 2 ) , 1 8 2 - 1 9 2 . W e y e r , 8 . , P e t e r s o n , T . E . , a n d S o n n e , O . ( 1 9 8 8 ) . C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e 2 9 9 b i n d i n g o f b o v i n e t h r o m b i n t o i s o l a t e d r a t h e p a t o c y t e s . T h r a m b . H a e m a s t a s . 6 0 . 4 1 9 - 4 2 7 . W h i t e , J . G . ( 1 9 9 4 ) . A n a t o m y a n d s t r u c t u r a l o r g a n i z a t i o n o f t h e p l a t e l e t . R . W . C o l m a n , J . H i r s h , V . J . M a r d e r a n d E . W . S a l z m a n , ( E d s . ) , H e m a s t a s i s a n d t h r o m b o s i s : b a s i c p r i n c i p l e s a n d c l i n i c a l p r a c t i c e , 3 . J . B . L i p p i n c o t t C o m p a n y . P h i l a d e l p h i a p p . 3 9 7 - 4 1 3 . W h i t e , S M . a n d R o t h , R . A . ( 1 9 8 8 ) . P u l m o n a r y p l a t e l e t s e q u e s t r a t i o n i s i n c r e a s e d f o l l o w i n g m o n o c r o t a l i n e p y r r o l e t r e a t m e n t o f r a t s . T a x i c a l . A p p l . P h a r m a c o l . 9 6 , 4 6 5 - 4 7 5 . W h i t e , S . M . , W a g n e r , J . G . , a n d R o t h , R . A . ( 1 9 8 9 ) . E f f e c t s o f a l t e r e d p l a t e l e t n u m b e r o n p u l m o n a r y h y p e r t e n s i o n a n d p l a t e l e t s e q u e s t r a t i o n i n m o n o c r o t a l i n e p y r r o l e - t r e a t e d r a t s . T a x i c a l . A p p l . P h a r m a c o l . 9 9 , 3 0 2 - 3 1 3 . W i s e , W . , C o o k , J . , H a l u s h k a , P . , a n d K n a p p . D . ( 1 9 8 0 ) . P r o t e c t i v e e f f e c t s o f t h r o m b o x a n e s y n t h e t a s e i n h i b i t o r s i n r a t s i n e n d o t o x i c s h o c k . C i r c . R e s . 4 6 , 8 5 4 - 8 5 9 . W i s e , W . C . , C o o k , J . A . , E l l e r , T . , a n d H a l u s h k a , P . V . ( 1 9 8 0 ) . I b u p r o f e n i m p r o v e s s u r v i v a l f r o m e n d o t o x i c s h o c k i n t h e r a t . J . P h a r m a c o l . E x p . T h e r . 2 1 5 . 1 6 0 - 1 6 4 . W o r t h e n , 6 . 8 . , G a i n s , A . J . , M i t c h e l , B . C . , L a r s e n , G . L . , R e e v e s , J . R . , a n d H e n s o n , P M . ( 1 9 8 3 ) . P l a t e l e t - a c t i v a t i n g f a c t o r c a u s e s n e u t r o p h i l a c c u m u l a t i o n a n d e d e m a i n r a b b i t l u n g s . C h e s t 5 . 1 3 - 1 5 . W r i g h t , 6 . 6 . , R e a d , P . W . , a n d M a n d e l ) , 6 . L . ( 1 9 8 8 ) . L i p o p o l y s a c c h a r i d e r e l e a s e s a p r i m i n g s u b s t a n c e f r o m p l a t e l e t s t h a t a u g m e n t s t h e o x i d a t i v e r e s p o n s e o f p o l y m o r p h o n u c l e a r n e u t r o p h i l s t o c h e m o t a c t i c p e p t i d e . J . I n f e c t . D i s . 1 5 7 . 6 9 0 - 6 9 6 . Y a m a n a k a , H . , N u k i n a , 8 . , H a n d l e r , J . A . , C u r r i n , R . T . , L e m a s t e r s , J . J . , a n d T h u r m a n , R 6 . ( 1 9 9 2 ) . T r a n s i e n t a c t i v a t i o n o f h e p a t i c g l y c o g e n o l y s i s b y t h r o m b i n i n p e r f u s e d l i v e r s . E u r . J . B i a c h e m . 2 0 8 , 7 5 3 - 7 5 9 . Y a n g , 2 . , K h e m l a n i , L . S . , D e a n , D . F . , C a r t e r , C . D . , S l a u s o n , D . O . , a n d B o c h s l e r , P . N . ( 1 9 9 4 ) . S e r u m c o m p o n e n t s e n h a n c e b a c t e r i a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e - i n d u c e d t i s s u e f a c t o r e x p r e s s i o n a n d t u m o r n e c r o s i s f a c t o r - a s e c r e t i o n b y b o v i n e a l v e o l a r m a c r o p h a g e s i n v i t r o . J . L e u k . B i o l . 5 5 . 4 8 3 - 4 8 8 . Y e o , E . L . , S h e p p a r d , J . ) . , a n d F e u e r s t e i n , L A . ( 1 9 9 4 ) . R o l e o f P - s e l e c t i n a n d l e u k o c y t e a c t i v a t i o n i n p o l y m o r p h o n u c l e a r c e l l a d h e s i o n t o s u r f a c e a d h e r e n t a c t i v a t e d p l a t e l e t s u n d e r p h y s i o l o g i c s h e a r c o n d i t i o n s ( a n i n j u r y v e s s e l w a l l 3 0 0 m o d e l ) . B I a a d 8 3 ( 9 ) . 2 4 9 8 - 2 5 0 7 . Y o s h i k a w a , D . a n d G o t o , F . ( 1 9 9 2 ) . E f f e c t o f p l a t e l e t - a c t i v a t i n g f a c t o r a n t a g o n i s t a n d l e u k o t r i e n e a n t a g o n i s t o n e n d o t o x i n s h o c k i n t h e r a t : r o l e o f t h e l e u k o c y t e . C i r c u l a t o r y S h a c k 3 8 . 2 9 - 3 3 . Y o s h i k a w a , T . , F u r u k a w a , Y . , M u r a k a m i , M . , T a k e m u r a , S . , a n d K o n d o , M . ( 1 9 8 1 ) . E x p e r i m e n t a l m o d e l o f d i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n i n d u c e d b y s u s t a i n e d i n f u s i o n o f e n d o t o x i n . R e s . E x p . M e d . 1 7 9 , 2 2 3 - 2 2 8 . Y u e , T . , R a b i n o v i c i , R . a n d F e u e r s t e i n , 6 . ( 1 9 9 1 ) . P l a t e l e t - A c t i v a t i n g F a c t o r ( P A F l - A p u t a t i v e m e d i a t o r i n i n f l a m m a t o r y t i s s u e i n j u r y . P . Y . W o n g a n d C . N . S e r h a n , ( E d s . ) , C e l l - C e l l I n t e r a c t i o n s i n t h e R e l e a s e o f I n f a m m a t a r y M e d i a t o r s , P l e n u m P r e s s . N e w Y o r k p p . 2 2 3 - 2 3 3 . Z h o u , W . , C h a o , W . , L e v i n e , B . A . , a n d O l s o n , M S . ( 1 9 9 2 ) . R o l e o f p l a t e l e t - a c t i v a t i n g f a c t o r i n h e p a t i c r e s p o n s e s a f t e r b i l e d u c t l i g a t i o n i n r a t s . A m . J . P h y s i o l . 2 6 3 , 6 5 8 7 - 6 5 9 2 . Z i e g l e r , E . J . , F i s h e r , C . J . , S p r u n g , C . L . , S t r a u b e , R . C . , S a d o f f , J . C . , F a u l d e , G . E . , W o r t e l , C . H . , F i n k , M . P . , D e l l i n g e r , P . , T e n g , N . N . H . , A l l e n , I . E . , B e r g e r , H . J . , K n a t t e r u d , G . L . , L o B u g l i o , A . F . , a n d S m i t h , C . R . ( 1 9 9 1 ) . T r e a t m e n t o f g r a m - n e g a t i v e b a c t e r e m i a a n d s e p t i c s h o c k w i t h H A - 1 A h u m a n m o n o c l o n a l a n t i b o d y a g a i n s t e n d o t o x i n . N . E n g ] . J . M e d . 3 2 4 , 4 2 9 - 4 3 6 . M I C H I G A N S T R T I l l E U N I V . L I B R R R I E S l l l l I l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l 4 2 1 6 7 5 2 3 0 1 l l l l l l l l l 2 9 3 1