J ‘ I I I . . | _ _ I g ‘ P I ‘ 4 1 - I t ! _ _ - — _ . I ; \\\iii i i \\\\\‘\‘\\\\\\\\\\\\\\\\‘ M a S a m ; M l c L U I h n i i B g v R a e A n r s R i S Y t t a y t e I T Y L | | B R A R | E S \ \ \ \ \ \ \ \ M I H C T h i s i s t o c e r t i f y t h a t t h e d i s s e r t a t i o n e n t i t l e d I M M U N E - M E D I A T E D T H R O M B O C Y T O P E N I A I N D O G S : A S S A Y D E V E L O P M E N T , A R O L E F O R C O M P L E M E N T , A N D A S S E S S M E N T I N A T O X I C O L O G I C S T U D Y p r e s e n t e d b y M i c h a e ] A . S c o t t h a s b e e n a c c e p t e d t o w a r d s f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r . P a t h o l o g y / E n v i r o n m e n t a i P h ' D ’ d e g r e e ‘ " T o x i c o i o g y M a j o r p r o f e s s o r D a t e 1 0 - 2 7 - 9 5 M S U i s a n A f fi r m a t i v e A c t i o n / E q u a l O p p o r t u n i t y I n s t i t u t i o n 0 - 1 2 7 7 1 P L A C E N R E T U R N B O X t o r o m o v o t h i s o h o d t o u t f r o m y o u r r o c o r d . T O A V O I D F I N E S r o t u r n o n o r b d o r o d o t . d u o . D A T E D U E D A T E D U E D A T E D U E M S U t o A n N fl n n o t l v o A c t i o n / E m i l O p p o r t u n i t y I n s t i t u t i o n W o t I M M U N E - M E D I A T E D T H R O M B O C Y T O P E N I A I N D O G S : A S S A Y D E V E L O P M E N T , A R O L E F O R C O M P L E M E N T , A N D A S S E S S M E N T I N A T O X I C O L O G I C S T U D Y V o l u m e I B y M i c h a e l A . S c o t t A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y A D e p a r t m e n t o f P a t h o l o g y 1 9 9 5 o m b o p e n o o t i e m r y a i f o h a s e s T o n l r e W o c e e s a r T i ) o c c s y t . d c h a d i n n t h e t e r t i o c w t i d a i s h c n p a m h e c t d r e d 7 S e e e c l c o b T o r c n e i o a t o v e 3 P r e a e n r e ° A a r a I u u g d r i u p e n p e a a e i x a y e t l n n g o a f s i o l o G s e r e t s , o a n o e e l b i r u n r g t s e n fi C I r n r g s s p n f o s r i n s o s t o g c d f d e o S l s h o e d d u a i r u r v A a e f u I y u A i n d o d s f P o n h o d e n r m I e n g p s e o i c l M t d ( t w i a u r c g b s a o m g i a l p S r o i a , o n p - l o , a y p p b n s g m i l d n A o a e r a n l i o s e e s n ) e d d n a e d d , y s c r n e s p y r i f i a e m p e p s p t t t w e c a p p l d e u n c s r d l c u c t a t a h i o m c l n p c l e e n r d m a h o n e i t i t c t c v s a i i s t i d e i e d n n e r p M u h e g m b a c n A l o y u l e c e i l f s b f l p e fl l i fi s e d h h e n a , t r t l a c l 7 t u , e e t n i l e fi 3 g e t w P ° a p t n y r y n a o e a i s a d . - h a C u c n y e i S i - t e m n . n r t b i t A n t i i s s n o t p - g b s a o a r t n u s e d 1 p v o b f e f o t n a 2 I h e c e i x c i d e T h n a r o d S e u I a a d s i g d e t c i l e x o d i s i a o l c s d b s d a s b n z d - s t e u p d a a n l o e - e l e l o m d e g l s a t i o e e s c a a o e t e t t g w o a o n P s r e n S o a i - o i i l i e g c t m n s d m h n i i e m b d p e c B n c r s e A u I s e n u , o n t i o h f e i t o n s n a d t n i o o n a t o i l e o v o e o s b i s s n g i r m t y f u o d t f a r m o d c e a s n h c i y t m b l e i t s e l e s i f t n t r e m u u a o m i a d e s y e o p a w n i s t i b h c i o d n i o e d e l o w n i s n e g n i c e M a g o e l g o r a e n t n a n o ( a a r s t l , e t p b r P n i t p ( y i b e u a d B w i r h w r e u n r y a I i I a s u g m t e e e p T a . m I n e n l i o e ) l u o M b r i b r s i e M h . s t fi o a c i n I n l s d ) g e o e T t d u e e ( o t 1 g i t a o c t a v P 2 v l r e G t f a c s a n l v m i t m h s n h o b i h e t p u b I t g t w e r ( g S 3 w F u S c e i h I 3 v e l t e l o a r a s i : l i g y n t r i e d o h i a b p R % l s n e o ‘ n a s i c n S I e S 2 r i a s d o o A I y d o u I i w c - s m 0 b i n p i % d n l o s m u d d o c g i ) e d a t a u l e d u r s g i i d I a b r r h s n r a . e a s n i u d o s t e o l g n s b i g n o c e u e a i s f d t t y d - . y d c g M . A B S T R A C T I M M U N E - M E D I A T E D T H R O M B O C Y T O P E N I A I N D O G S : A S S A Y D E V E L O P M E N T , A R O L E F O R C O M P L E M E N T , A N D A S S E S S M E N T I N A T O X I C O L O G I C S T U D Y B y M i c h a e l A . S c o t t s c r e e n i n g o r r e c h a l l e n g e s t u d i e s , s o h u m o r a l i m m u n i t y d i d n o t a p p e a r t o b e r e s p o n s i b l e f o r t h e c y t o p e n i a s . I n h u m a n p a t i e n t s , d r u g - i n d u c e d I M T m a y o c c u r w h e n i m m u n e c o m p l e x e s b i n d t o p l a t e l e t F c ' y r e c e p t o r s . W e t e s t e d c a n i n e p l a t e l e t s f o r a r e s p o n s e t o h e a t - a g g r e g a t e d I g G ( H A I g G ) a n a l o g o u s t o t h e F e y r e c e p t o r - m e d i a t e d a g g r e g a t i o n o f h u m a n p l a t e l e t s , a n d f o u n d t h a t t h e y l a c k e d a f u n c t i o n a l F c ' y r e c e p t o r a n a l o g u e . I n s t e a d , c a n i n e p l a t e l e t s w e r e a g g l u t i n a t e d b y t h e c o m p l e m e n t - m e d i a t e d ( C 3 ) i n t e r p l a t e l e t b r i d g i n g o f H A I g G . T h i s p r o g r e s s e d t o a g g r e g a t i o n a n d r e l e a s e u n d e r c e r t a i n c o n d i t i o n s , s u g g e s t i n g t h e p o s s i b i l i t y o f a r e c e p t o r - l i n k e d s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y . T h e i m p o r t a n c e o f P S A l g a n d c o m p l e m e n t i n t h e p a t h o g e n e s i s o f c a n i n e t h r o m b o c y t o p e n i c c o n d i t i o n s a s s o c i a t e d w i t h t o x i c a n t s , i n f e c t i o n s , n e o p l a s m s , a n d a u t o i m m u n i t y c a n n o w b e i n v e s t i g a t e d . C o p y r i g h t b y M I C H A E L A L A N S C O T T 1 9 9 5 T o m y p a r e n t s , D r . a n d M r s . E a r l e S . S c o t t , w h o i n s t i l l e d i n m e t h e d e s i r e t o l e a r n a n d t h e w i l l t o q u e s t i o n A C K N O W L E D G M E N T S I e x t e n d m y s i n c e r e g r a t i t u d e t o t h e m e m b e r s o f m y g r a d u a t e c o m m i t t e e , D r s . T h o m a s B e l l , R o b e r t B u l l , K e n n e t h S c h w a r t z , a n d S t u a r t S l e i g h t ( a c a d e m i c a d v i s o r ) . T h e i r s u p p o r t , e n c o u r a g e m e n t , a n d g u i d a n c e w e r e u n w a v e r i n g . I a m p a r t i c u l a r l y i n d e b t e d t o m y p r i n c i p a l r e s e a r c h a d v i s o r , D r . S c h w a r t z , f o r h i s g e n e r o u s c o m m i t m e n t o f t i m e , e n e r g y , a n d r e s o u r c e s t o t h e s u c c e s s f u l c o m p l e t i o n o f m y p r o g r a m . H i s e a s y a c c e s s i b i l i t y , h i s s t e a d f a s t g o o d h u m o r , a n d h i s e t e r n a l o p t i m i s m p r o v i d e d a p a r t i c u l a r l y p o s i t i v e w o r k i n g e n v i r o n m e n t . I h o p e t o r e fl e c t h i s i n fl u e n c e i n t h e f u t u r e . J o h n M i c h a e l D a v i s ! W i t h o u t J . D . , t r u l y n o n e o f t h i s w o r k w o u l d h a v e b e e n p o s s i b l e . I D . s h o w e d m e t h e a r t o f s c i e n c e a n d t a u g h t m e t h e s k i l l s a n d t e c h n i q u e s t o p r a c t i c e i t . I w i l l b e f o r e v e r g r a t e f u l . I a m a l s o v e r y t h a n k f u l f o r t h e s e n s e o f c o m m u n i t y g e n e r a t e d b y t h e c l o s e r e l a t i o n s h i p s a m o n g t h e l a b o r a t o r i e s o f D r . B u l l , D r . J o h n G e r l a c h , a n d D r . S c h w a r t z . T h e f r e q u e n t e x c h a n g e s o f r e s o u r c e s , i n f o r m a t i o n , a n d c o m r a d e r i e w e r e i n v a l u a b l e . D r . G e r l a c h ’ s k i n d a n d r e p e a t e d a s s i s t a n c e w i t h c o m p u t e r g r a p h i c s w a s e s p e c i a l l y a p p r e c i a t e d . S i m i l a r l y , t h e fi n e c o n t r i b u t i o n s o f D i a n n e S c h w a r t z t o t h e c r e a t i o n o f fi g u r e s a n d t a b l e s w e r e e n o r m o u s l y h e l p f u l . O f t h e m a n y o t h e r p e o p l e w h o p r o v i d e d v a l u a b l e t e c h n i c a l o r m o r a l s u p p o r t , I w o u l d l i k e t o g i v e s p e c i a l r e c o g n i t i o n t o R a l p h C o m m o n a n d C a r o l A y a l a f o r t h e i r fi n e v i e l e c t r o n m i c r o s c o p y a n d p h o t o g r a p h y , D a v i d K o r c a l f o r h i s t e c h n i c a l e x p e r t i s e i n t h e c l i n i c a l p a t h o l o g y l a b o r a t o r y , D r . A n n e H a l e f o r h e r g e n e r o u s a i d e a s a c l i n i c a l l i a i s o n , B r i a n R i c h m o n d f o r t h e m a n y h o u r s s p e n t h e l p i n g t o d e v e 1 0 p a n d p e r f o r m t h e e r y t h r o c y t e a n t i b o d y a s s a y , a n d D e b H o w e f o r h e r f r e q u e n t a n d h e l p f u l s e c r e t a r i a l a s s i s t a n c e . F o r e f fi c i e n t l y a n d p a i n l e s s l y p a c k a g i n g t h e w o r k i n t o i t s f i n a l a n d p r o p e r f o r m , I t h a n k V i c k i H o e l z e r — M a d d o x . A n d l a s t l y , I e x t e n d a n i n c r e d i b l y s p e c i a l a n d w h o l e - h e a r t e d t h a n k - y o u t o m y w i f e C a t h e r i n e f o r h e r a s s i s t a n c e , h e r u n y i e l d i n g s u p p o r t a n d p a t i e n c e , a n d f o r h e r n e v e r e n d i n g l o v e . v i i T A B L E O F C O N T E N T S L I S T O F T A B L E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x v L I S T O F F I G U R E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x v i i i K E Y T O A B B R E V I A T I O N S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x x i i i R E V I E W O F T H E L I T E R A T U R E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 I . I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 I I . T h r o m b o c y t o p e n i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 A . P s e u d o t h r o m b o c y t o p e n i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 B . C a u s e s o f T h r o m b o c y t o p e n i a i n D o g s . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1 . i n c i d e n c e a n d g e n e r a l d i s e a s e a s s o c i a t i o n s . . . . . . . . . . . . 8 2 . p a t h o p h y s i o l o g i c m e c h a n i s m s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 a . d e c r e a s e d p r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 ( 1 ) c h e m i c a l t o x i c a n t s ( d r u g s ) w i t h p r e d i c t a b l e e f f e c t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 ( a ) c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 ( b ) e s t r o g e n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 i ) e n d o g e n o u s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 i i ) e x o g e n o u s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 ( c ) d r u g s w i t h i d i o s y n c r a t i c e f f e c t s . . . . . . . . . . l 6 ( 2 ) i r r a d i a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 ( 3 ) m y e l o p h t h i s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 ( 4 ) i m m u n e - m e d i a t e d s u p p r e s s i o n . . . . . . . . . . . . . . l 9 ( 5 ) h e r e d i t a r y d i s o r d e r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 ( a ) c y c l i c h e m a t o p o i e s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 ( b ) h e r e d i t a r y t h r o m b a s t h e n i c t h r o m b o p a t h i a . . . . 2 1 ( 6 ) i n f e c t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 ( 7 ) i d i o p a t h i c . . . . . _ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 ( 8 ) o t h e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 b . a b n o r m a l d i s t r i b u t i o n ( s e q u e s t r a t i o n ) . . . . . . . . . . . . . 2 3 c . s e v e r e b l o o d l o s s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 d . p a t h o l o g i c a l l y d e c r e a s e d p l a t e l e t s u r v i v a l . . . . . . . . . . . 2 8 ( l ) n o n i m m u n o l o g i c a l l y d e c r e a s e d p l a t e l e t s u r v i v a l . . . . 2 8 ( a ) d r u g s a n d f o r e i g n m a t e r i a l s . . . . . . . . . . . . . 2 8 i ) h e p a r i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 i i ) p r o t a m i n e s u l f a t e . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 v i i i ( 2 ) i i i ) h u m a n I V I g G . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 i v ) G M - C S F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 v ) m o n o c r o t a l i n e p y r r o l e . . . . . . . . . . . . . 3 0 v i ) M D L 1 9 , 6 6 9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 O v i i ) f o r e i g n s u r f a c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 v i i i ) c a t i o n i z e d a l b u m i n . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 i x ) o t h e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 ( b ) d i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n . . . . . . 3 2 ( c ) i n f e c t i o n s / s e p s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 i ) g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a . . . . . . . . . . . . . 3 3 i i ) l e p t o s p i r o s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 i i i ) n e m a t o d e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 i v ) R o c k y M o u n t a i n s p o t t e d f e v e r . . . . . . . . 3 6 v ) i n f e c t i o u s c a n i n e h e p a t i t i s . . . . . . . . . . . 3 8 v i ) h e r p e s v i r u s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 v i i ) s e p t i c p e r i t o n i t i s . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 ( d ) n e o p l a s i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 0 ( e ) e n v e n o m a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 0 ( t ) e x t r a c o r p o r e a l c i r c u l a t i o n . . . . . . . . . . . . . . 4 0 ( g ) z i n c - i n d u c e d h e m o l y t i c a n e m i a . . . . . . . . . . . 4 1 ( h ) h y p o p h o s p h a t e m i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1 ( i ) t h r o m b o t i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a / h e m o l y t i c u r e m i c s y n d r o m e . . . . . . . . . . . . 4 1 ( i ) v a s c u l i t i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2 ( k ) o t h e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 3 i m m u n o l o g i c a l l y d e c r e a s e d p l a t e l e t s u r v i v a l . . . . . . 4 3 ( a ) a n a p h y l a x i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 3 ( b ) s e c o n d a r y I M T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 4 i ) d r u g - i n d u c e d . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 5 a ) g o l d s a l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 6 b ) s u l f o n a m i d e s . . . . . . . . . . . . . . . 4 8 c ) c e p h a l o s p o r i n s . . . . . . . . . . . . . . 5 0 d ) d i e t h y l s t i l b e s t r o l . . . . . . . . . . . . . 5 2 e ) l e v a m i s o l e . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 3 0 o t h e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 4 i i ) s y s t e m i c i m m u n e - m e d i a t e d d i s e a s e . . . . . 5 4 a ) s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s . . . . . 5 5 b ) E v a n s ’ s y n d r o m e . . . . . . . . . . . . . 5 5 c ) o t h e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 6 i i i ) n e o p l a s i a . . . . . . . . . . . . . ' . . . . . . . . 5 7 i v ) i n f e c t i o u s d i s e a s e s . . . . . . . . . . . . . . . 5 8 v ) a l l o i m m u n e n e o n a t a l . . . . . . . . . . . . . . 6 4 v i ) p o s t t r a n s f u s i o n p u r p u r a . . . . . . . . . . . . 6 5 v i i ) h y p o t h y r o i d i s m . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 6 v i i i ) o t h e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 6 ( c ) p r i m a r y I M T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 7 i x i ) h u m a n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 7 a ) a c u t e I M T . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 7 b ) c h r o n i c I M T . . . . . . . . . . . . . . . . 6 9 i i ) c a n i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 5 a ) i n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . 7 5 b ) h i s t o r y o f c a n i n e I M T . . . . . . . . . . 7 7 c ) s i g n a l m e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 7 d ) p a t i e n t h i s t o r y a t p r e s e n t a t i o n . . . . . 7 8 e ) p h y s i c a l fi n d i n g s . . . . . . . . . . . . . 7 9 f ) l a b o r a t o r y fi n d i n g s . . . . . . . . . . . . 8 0 g ) t h e r a p y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 4 h ) o u t c o m e . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 6 e . c o n d i t i o n s f o r w h i c h t h e m e c h a n i s m o f t h r o m b o c y t o p e n i a i s l a r g e l y m u l t i f a c t o r i a l o r n o t c l e a r l y e s t a b l i s h e d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 7 ( l ) i n f e c t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 7 ( a ) r i c k e t t s i a l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 8 i ) c a n i n e m o n o c y t i c e h r l i c h i o s i s . . . . . . . . 8 8 i i ) c a n i n e g r a n u l o c y t i c e h r l i c h i o s i s . . . . . . . 9 1 i i i ) i n f e c t i o u s c a n i n e c y c l i c t h r o m b o c y t o p e n i a . . . . . . . . . . . . . . . . 9 2 i v ) h e m o b a r t o n e l l o s i s . . . . . . . . . . . . . . . 9 4 ( b ) p r o t o z o a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 4 i ) b a b e s i o s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 4 i i ) l e i s h m a n i a s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 5 ( c ) f u n g a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 6 ( d ) o t h e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 7 ( 2 ) n e o p l a s i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 7 C . D i a g n o s t i c C o n s i d e r a t i o n s f o r T h r o m b o c y t o p e n i a . . . . . . . . . . 1 0 1 1 . h i s t o r y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 1 2 . p h y s i c a l e x a m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 1 3 . c o m p l e t e b l o o d c o u n t ( C B C ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 2 4 . c h e m i s t r y p r o fi l e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 3 5 . b o n e m a r r o w . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 3 6 . c o a g u l a t i o n p r o fi l e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 5 7 . s u r v e y r a d i o g r a p h s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 5 8 . b l o o d c u l t u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 5 9 . s e r o l o g y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 5 1 0 . i m m u n o l o g i c s c r e e n i n g t e s t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 6 1 1 . t e s t s f o r P A I g a n d P B I g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 6 I I I . D e t e c t i o n a n d S i g n i fi c a n c e o f P A I g a n d P B I g . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 0 A . S i g n i fi c a n c e o f P A I g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 0 B . A s s a y s f o r H u m a n P A I g a n d P B I g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 5 1 . t y p e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 5 2 . t e c h n i q u e c o n s i d e r a t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 1 a . l o w t i t e r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 2 X b . a l l o a n t i b o d i e s v s . a u t o a n t i b o d i e s . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 2 c . s e r u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 3 d . a n t i c o a g u l a n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 4 e . fi x a t i o n o f p l a t e l e t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 7 f . f r e e z i n g o f p l a t e l e t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 8 g . p o s i t i v e c o n v e r s i o n o f s t o r e d s a m p l e s . . . . . . . . . . . . 1 2 9 h . c y t o s o l i c r e a c t i v i t y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 0 i . a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 2 j . c o n t r o l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 3 k . e r y t h r o c y t e a n d l e u k o c y t e c o n t a m i n a t i o n . . . . . . . . . . 1 3 3 1 . t o t a l v s . s u r f a c e i m m u n o g l o b u l i n . . . . . . . . . . . . . . 1 3 4 m . s a m p l e h a n d l i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 7 C . V e t e r i n a r y A s s a y s f o r P A I g a n d P B I g . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 8 1 . P F 3 r e l e a s e a s s a y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 9 2 . m e g a k a r y o c y t e i m m u n o fl u o r e s c e n c e . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 1 3 . E L I S A s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 4 a . w i t h p o l y c l o n a l a n t i - [ c a n i n e I g G ] . . . . . . . . . . . . . . 1 4 4 b . w i t h s t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n A . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 7 ( 1 ) s t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n A . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 7 ( 2 ) a s s a y s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 8 4 . p l a t e l e t i m m u n o r a d i o m e t r i c a s s a y s . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 4 5 . p l a t e l e t i m m u n o f l u o r e s c e n c e a s s a y s . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 5 6 . p l a t e l e t f r a g m e n t a t i o n i n d e x . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 2 7 . o t h e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 3 D . S u m m a r y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 5 R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 7 C H A P T E R 1 S T A P H Y L O C O C C A L P R O T E I N A B I N D I N G T O C A N I N E I g G A N D I g M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 1 A b s t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 1 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 2 M e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 3 A f fi n i t y c o l u m n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 3 I m m u n o g l o b u l i n p u r i fi c a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 4 S p A a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 5 S D S — P A G E a n d d e n s i t o m e t r y . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 6 S o l i d p h a s e a s s a y s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 6 R e s u l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 8 S D S - P A G E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 8 Q u a n t i t a t i v e S p A c h r o m a t o g r a p h y . . . . . . . . . . . . . . 2 1 8 D e n s i t o m e t r y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 1 I R M A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 3 D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 5 R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 0 x i C H A P T E R 2 A N I M M U N O R A D I O M E T R I C A S S A Y F O R T H E D E T E C T I O N O F C A N I N E P L A T E L E T - A S S O C I A T E D I M M U N O G L O B U L I N S . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 2 A b s t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 2 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 3 M e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 5 D o g s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 5 B l o o d c o l l e c t i o n a n d p l a t e l e t i s o l a t i o n . . . . . . . . . . . . 2 3 6 R a d i o l a b e l i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 6 P o s i t i v e c o n t r o l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 7 F i x a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 7 A s s a y c o n d i t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 8 S a m p l e S t o r a g e a n d A s s a y T e m p e r a t u r e . . . . . . . . 2 3 8 S p A B i n d i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 9 T e s t P l a t e l e t N u m b e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 9 S t a n d a r d A s s a y M e t h o d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 9 E v a l u a t i o n o f a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s . . . . . . . . . . . . . . 2 4 1 C o n c e n t r a t i o n D e p e n d e n c y . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 1 D o s e - r e s p o n s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 1 C o e f fi c i e n t o f v a r i a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 2 R e f e r e n c e r a n g e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 2 C l i n i c a l e v a l u a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 2 R e s u l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 3 P o s i t i v e C o n t r o l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 3 F i x a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 5 A s s a y c o n d i t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 1 S a m p l e S t o r a g e a n d A s s a y T e m p e r a t u r e s . . . . . . . . 2 5 1 I n d i r e c t A s s a y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 1 D i r e c t A s s a y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 5 S p A B i n d i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 0 T e s t P l a t e l e t N u m b e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 2 O t h e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 4 E v a l u a t i o n o f a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s . . . . . . . . . . . . . . 2 6 4 C o n c e n t r a t i o n D e p e n d e n c y . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 4 D o s e - r e s p o n s e C u r v e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 7 C o e f fi c i e n t s o f v a r i a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 0 R e f e r e n c e r a n g e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 0 C l i n i c a l e v a l u a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 1 D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 8 R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 3 x i i L E W . C H A P T E R 3 C A N I N E A G G R E G A T E D I g G I N D U C E S C O M P L E M E N T - M E D I A T E D , N O T F C - M E D I A T E D , C L U M P I N G O F C A N I N E P L A T E L E T S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 7 A b s t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 7 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 8 M e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 0 M a t e r i a l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 0 D o g s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 1 B l o o d c o l l e c t i o n a n d p l a t e l e t i s o l a t i o n . . . . . . . . . . . . 2 9 1 I g G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 2 F e a n d F a b p u r i fi c a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 2 H e a t a g g r e g a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 3 A g g r e g o m e t r y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 3 L a c t a t e d e h y d r o g e n a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 4 P a r t i c l e c o u n t i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 4 R e s u l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 4 D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 8 R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 3 C H A P T E R 4 A G G R E G A T E D I g G I N D U C E S A G G L U T I N A T I O N O F C A N I N E P L A T E L E T S B Y I M M U N E A D H E R E N C E . . . . 3 2 6 A b s t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 6 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 7 M e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 8 M a t e r i a l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 8 D o g s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 9 B l o o d c o l l e c t i o n a n d p l a t e l e t i s o l a t i o n . . . . . . . . . . . . 3 2 9 I g G a n d i m m u n o g l o b u l i n f r a c t i o n s . . . . . . . . . . . . . . 3 3 0 H e a t a g g r e g a t i o n o f I g G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 0 A g g r e g o m e t r y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 1 A T P s e c r e t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 1 P l a t e l e t fi x a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 2 T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( T E M ) . . . . . . . . . . 3 3 3 C 3 a s s a y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 3 R e s u l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 4 D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 4 R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 0 C H A P T E R 5 E V A L U A T I O N O F H U M O R A L I M M U N E M E C H A N I S M S I N T H E P A T H O G E N E S I S O F C Y T O P E N I A S I N D O G S A D M I N I S T E R E D D R U G X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 3 A b s t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 3 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 4 M e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 7 B l o o d c o l l e c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 7 x i i i ‘ v - " Q ‘ - R a d i o l a b e l i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 7 I m m u n o g l o b u l i n p u r i fi c a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 8 E r y t h r o c y t e s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n . . . . . . 3 6 8 P l a t e l e t s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n . . . . . . . . . 3 7 0 S o l i d p h a s e r a d i o m e t r i c C l q a s s a y f o r i m m u n e c o m p l e x e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 1 P h a s e I s t u d i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 2 P h a s e H s t u d i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 3 R e s u l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 3 P h a s e I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 3 E S A I g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 3 P S A I g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 8 I C s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 2 P h a s e I I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 6 E S A I g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 6 P S A I g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 0 I C s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 4 D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 8 R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 0 1 S U M M A R Y A N D C O N C L U S I O N S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 0 2 R E F E R E N C E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 0 7 x i v T a b l e 1 . 1 T a b l e 1 . 2 T a b l e 1 . 3 T a b l e 1 . 4 T a b l e 2 . 1 T a b l e 2 . 2 T a b l e 2 . 3 T a b l e 2 . 4 T a b l e 2 . 5 T a b l e 2 . 6 L I S T O F T A B L E S I m m u n o g l o b u l i n r e c o v e r y i n fl o w t h r o u g h ( F T ) a n d e l u a t e ( E ) f r a c t i o n s f r o m S p A a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y . S o l i d p h a s e b i n d i n g o f i o d i n a t e d a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s t o S p A c o l u m n F T a n d E f r a c t i o n s o f i m m u n o g l o b u l i n p u r i fi e d b y a n t i - [ I g G ( w h o l e m o l e c u l e ) ] a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y . S o l i d p h a s e b i n d i n g o f i o d i n a t e d a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s t o S p A c o l u m n F T a n d E f r a c t i o n s o f I g G p u r i fi e d b y a n t i - [ I g G ( 7 ) ] a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y . S o l i d p h a s e b i n d i n g o f i o d i n a t e d a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s t o S p A c o l u m n F T a n d E f r a c t i o n s o f I g M p u r i fi e d b y a n t i - [ I g M ( , u ) ] a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y . E f f e c t s o f p l a s m a s t o r a g e t e m p e r a t u r e a n d p l a s m a i n c u b a t i o n t e m p e r a t u r e o n S p A - d e t e c t a b l e p l a t e l e t - b i n d a b l e i m m u n o g l o b - u l i n f o r t h r e e d o g s . D e t e r m i n a t i o n o f t h e c l a s s o f p l a t e l e t - b i n d a b l e i m m u n o g l o b u - l i n r e s p o n s i b l e f o r n o n s p e c i fi c b i n d i n g . E f f e c t s o f s t o r a g e t i m e a n d t e m p e r a t u r e o n d e t e c t a b l e p l a t e l e t s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n f o r n o r m a l d o g s . I n t e r a s s a y a n d i n t r a - a s s a y c o e f fi c i e n t s o f v a r i a t i o n ( % ) f o r S p A a n d a n t i - 7 d e t e c t o r s . P l a t e l e t s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n ( P S A I g ) r e s u l t s f o r d o g s d i a g n o s e d w i t h i m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e - n i a . P l a t e l e t s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n ( P S A I g ) r e s u l t s f o r t h r o m b o c y t o p e n i c d o g s n o t g i v e n a d i a g n o s i s o f i m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a . X V 2 2 0 2 2 3 2 2 4 2 2 4 2 5 2 2 5 5 2 5 7 2 7 0 2 7 3 2 7 4 T a b l e 3 . 1 T a b l e 4 . 1 T a b l e 5 . 1 T a b l e 5 . 2 a T a b l e 5 . 2 b T a b l e 5 . 2 e T a b l e 5 . 3 T a b l e 5 . 4 a T a b l e 5 . 4 b T a b l e 5 . 5 T a b l e 5 . 6 a T a b l e 5 . 6 b T a b l e 5 . 6 c T a b l e 5 . 7 L a c t a t e d e h y d r o g e n a s e r e l e a s e f r o m p l a t e l e t s d u r i n g a g g r e g o — m e t r y . D e t e c t i o n o f C 3 o n H A I g G i n c u b a t e d w i t h u n h e a t e d p l a s m a a n d w i t h h e a t - i n a c t i v a t e d p l a s m a . I n i t i a l a s s a y f o r p l a t e l e t - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n i n t h r o m b o c y t o p e n i c a n d c o n t r o l d o g s . P h a s e I c o r r e l a t i o n c o e f fi c i e n t s ( r ) a n d S I O p e s ( m ) o f t h e S p A s t a n d a r d c u r v e s , p l u s a n d m i n u s D X , f o r t h e e r y t h r o c y t e s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n ( E S A I g ) a s s a y . P h a s e I p o s i t i v e c o n t r o l r e s u l t s f o r a n t i y i n t h e a s s a y f o r E S A I g G , p l u s a n d m i n u s D X ( % b o u n d ) . P h a s e I p o s i t i v e c o n t r o l r e s u l t s f o r a n t i - p i n t h e a s s a y f o r E S A I g M , p l u s a n d m i n u s D X ( % b o u n d ) . P h a s e I r e s u l t s f o r e r y t h r o c y t e s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o - g l o b u l i n i n t r e a t e d a n d c o n t r o l d o g s , p l u s ( + ) a n d m i n u s ( - ) D X ( % b o u n d ) . P h a s e I c o r r e l a t i o n c o e f fi c i e n t s ( r ) a n d s l o p e s ( m ) o f t h e S p A s t a n d a r d c u r v e s , p l u s a n d m i n u s D X , f o r t h e p l a t e l e t s u r f a c e - a s s o e i a t e d i m m u n o g l o b u l i n ( P S A I g ) a s s a y . P h a s e I p o s i t i v e c o n t r o l r e s u l t s f o r a n t i - y i n t h e a s s a y f o r P S A I g G , p l u s a n d m i n u s D X ( % b o u n d ) . P h a s e I r e s u l t s f o r p l a t e l e t s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u - l i n i n t r e a t e d a n d c o n t r o l d o g s , p l u s ( + ) a n d m i n u s ( - ) D X ( % b o u n d ) . P h a s e I c o r r e l a t i o n c o e f fi c i e n t s ( r ) a n d s l o p e s ( m ) o f t h e S p A s t a n d a r d c u r v e s f o r t h e C l q a s s a y . P h a s e 1 p o s i t i v e c o n t r o l r e s u l t s ( % b o u n d ) f o r C l q - b i n d a b l e I g G u s i n g h e a t - a g g r e g a t e d I g G . P h a s e I p o s i t i v e c o n t r o l r e s u l t s ( % b o u n d ) f o r C l q - b i n d a b l e I g M u s i n g h e a t a g g r e g a t e d I g M . P h a s e I r e s u l t s f o r C l q - b i n d a b l e i m m u n e c o m p l e x e s i n t r e a t e d a n d c o n t r o l d o g s ( % b o u n d ) . x v i 3 1 4 3 4 0 3 6 6 3 7 5 3 7 5 3 7 5 3 7 6 3 7 9 3 7 9 3 8 0 3 8 3 3 8 3 3 8 3 F i g u r e 2 . 1 F i g u r e 2 . 2 F i g u r e 2 . 3 F i g u r e 2 . 4 F i g u r e 2 . 5 L I S T O F F I G U R E S A u t o r a d i o g r a p h o f 1 2 5 I - l a b e 1 e d p l a t e l e t s u r f a c e p r o t e i n s i m m u n o p r e c i p i t a t e d b y t h e a s s a y p o s i t i v e c o n t r o l p l a s m a ( A ) . P r o t e i n s w e r e s e p a r a t e d b y S D S - P A G E u n d e r r e d u c i n g a n d , n o n r e d u c i n g c o n d i t i o n s o n a 5 - 1 2 % g r a d i e n t g e l . N e g a t i v e c o n t r o l s w e r e n o r m a l c a n i n e p l a s m a ( B ) a n d P B S ( C ) . L a b e l e d p l a t e l e t l y s a t e s ( D ) h a d t h r e e p r e d o m i n a n t b a n d s ( n o n r e d u c e d ) c o r r e s p o n d i n g i n d e s c e n d i n g o r d e r o f m o l e c u l a r m a s s t o g l y c o p r o t e i n s I , I I , a n d H I . D e c r e a s i n g r e a c t i v i t y o f w a s h e d c a n i n e p l a t e l e t s w i t h r e f r i g e r a t o r s t o r a g e f o r 4 d a y s . R e a c t i v i t y w a s t e s t e d w i t h a h u m a n a n t i - P P “ l a n t i b o d y ( a ) a n d t h e p o s i t i v e c o n t r o l c a n i n e a u t o a n t i b o d y ( b ) . D a t a w e r e g e n e r a t e d i n d u p l i c a t e . R e a c t i v i t y o f fi x e d p l a t e l e t s t o a ) t h e p o s i t i v e c o n t r o l c a n i n e p l a s m a , b ) h u m a n a n t i - P l A l p l a s m a , a n d c ) r a b b i t a n t i - [ c a n i n e p l a t e l e t ] s e r u m w a s c o m p a r e d t o w e e k - o l d u n fi x e d p l a t e l e t s ( d a s h e d l i n e s ) . R e a c t i v i t y w a s a s s e s s e d o v e r 8 4 ( a , b ) o r 2 8 ( e ) d a y s . E r r o r s ( i S . D . ) a r e s h o w n f o r t h e u n fi x e d p l a t e l e t s a n d f o r t h e l o w e s t c u r v e i n t h e fi x e d p l a t e l e t g r o u p s . C o m p a r i s o n o f s a m p l e s t o r a g e c o n d i t i o n s o n S p A - d e t e c t a b l e P S A I g f o r t h r e e n o r m a l d o g s ( a , b , c ) . S a m p l e s w e r e t e s t e d f r e s h ( F ) a n d t h e n d a i l y w i t h s t o r a g e a s r e f r i g e r a t e d w h o l e b l o o d ( R W B ) , r o o m t e m p e r a t u r e w h o l e b l o o d ( R T W B ) , r e f r i g e r a t e d p l a s m a ( R P ) , r o o m t e m p e r a t u r e p l a s m a ( R T P ) , a n d p l a s m a f r o z e n a t - 6 5 ° C . I n e a c h g r o u p , c o n s e c u t i v e b a r s r e p r e s e n t c o n s e c u t i v e d a y s . T h e d a y 5 b a r s f o r R P a n d R T P a r e d i v i d e d , t h e l o w e r p o r t i o n r e p r e s e n t i n g P S A I g a f t e r s a m p l e fi l t r a t i o n ( 0 . 2 2 p m fi l t e r ) . I n c r e a s e d P S A I g ( % b o u n d - _ l - S D . ) w i t h r o o m t e m p e r a t u r e ( R T ) s t o r a g e o f w h o l e b l o o d f r o m t e n n o r m a l d o g s . P l a t e l e t s w e r e h a r v e s t e d a n d a s s a y e d f r e s h , a t 2 4 h r w i t h o u t w a r m i n g t o 3 7 ° C , a n d a t 2 4 h r a f t e r w a r m i n g t h e b l o o d t o 3 7 ° C f o r 3 0 m i n u t e s . x v i i i 2 4 4 2 4 7 2 5 0 2 5 4 2 5 9 ‘ - 7 1 . 1 ; v . 1 . . . v 1 1 . 1 . : . . l K . t t , v i . . . . . I I . 1 ’ 7 7 1 . 1 . . r : ' 0 h a . 1 F i g u r e 2 . 6 F i g u r e 2 . 7 F i g u r e 2 . 8 F i g u r e 2 . 9 F i g u r e 3 . 1 F i g u r e 3 . 2 F i g u r e 3 . 3 T i m e t o s a t u r a t i o n f o r t h e b i n d i n g o f S p A t o P S A I g . E r r o r b a r s ( i S . D . ) a r e s m a l l e r t h a n d a t a s y m b o l s w h e r e n o t s h o w n . D i r e c t r e l a t i o n s h i p b e t w e e n p l a t e l e t n u m b e r a n d S p A - d e t e c t a b l e P S A I g . P l a t e l e t s w e r e f r o m a d o g w i t h c l i n i c a l I M T a n d a n o r m a l d o g . E r r o r b a r s ( j ; S . D . ) a r e s m a l l e r t h a n d a t a s y m b o l s w h e r e n o t s h o w n . C o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n c y o f t h e b i n d i n g o f p o l y c l o n a l a n t i — 7 ( a n t i — I g G ) t o P S A I g a s c o m p a r e d t o t h e c o n s t a n t b i n d i n g o f S p A . E r r o r b a r s ( i S . D . ) a r e s m a l l e r t h a n d a t a s y m b o l s w h e r e n o t s h o w n . L i n e a r b i n d i n g o f S p A t o i n c r e a s i n g P S A I g c o n t r a s t e d w i t h n o n l i n e a r b i n d i n g o f a n t i - G ( a ) a n d a n t i - y ( a n t i - I g G ) ( b ) . I n ( a ) , e r r o r b a r s ( 1 S D . ) a r e s m a l l e r t h a n d a t a s y m b o l s w h e r e n o t s h o w n . D a t a i n ( b ) w e r e b a s e d o n d u p l i c a t e d e t e r m i n a - t i o n s . A g g r e g o m e t r y c u r v e s u s i n g : a ) h u m a n G F P w i t h h u m a n ( H ) a n d c a n i n e ( C ) H A I g G p l u s ( + ) a n d m i n u s ( - ) m o n o c l o n a l a n t i b o d y I V . 3 , b ) c a n i n e G F P w i t h h u m a n a n d c a n i n e H A I g G , a n d c ) c a n i n e P R P w i t h c a n i n e H A I g G . U n h e a t e d m o n o m e r i c I g G ( 1 ) i s c o m p a r e d t o i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f H A I g G ( 3 2 u g / m l ( 2 ) , 6 4 u g / m l ( 3 ) , 1 2 8 u g / m l ( 4 ) ) a n d t o 1 2 8 p g / m l H A I g G f o r m e d a t 5 9 ° C ( 5 ) . I n ( d ) , t h e m a x i m u m l i g h t t r a n s m i t t a n c e w i t h H A I g G ( 6 ) i n P R P i s c o m p a r e d t o t h a t o f r e v e r s i b l e ( 7 ) a n d i r r e v e r s i b l e ( 8 ) A D P a g g r e g a t i o n s . P h o t o g r a p h s o f a g g r e g o m e t r y c u v e t t e s c o n t a i n i n g a ) u n s t i m u - l a t e d p l a t e l e t s , b ) n u m e r o u s s m a l l c l u m p s o f p l a t e l e t s c o r r e - s p o n d i n g t o t h e m a x i m a l r e s p o n s e t o 0 . 4 m g / m l H A I g G , a n d c ) f e w e r l a r g e c l u m p s o f p l a t e l e t s c o r r e s p o n d i n g t o f u l l - s c a l e a g g r e g a t i o n a f t e r s t i m u l a t i o n w i t h 2 . 5 u g / m l c o l l a g e n . A g g r e g o m e t r y c u r v e s f o r c a n i n e G F P ( 3 0 0 p l ) i n c u b a t e d w i t h H A I g G i n t h e p r e s e n c e o f 1 0 0 p l c i t r a t e d p l a s m a ( 2 , 3 ) o r T y r o d e ’ s b u f f e r ( 1 ) . T r a c i n g s i n d i s t i n g u i s h a b l e f r o m c u r v e 2 w e r e g e n e r a t e d w i t h h e p a r i n i z e d p l a s m a a n d s e r u m p l u s h i r u d i n . F o r c u r v e 3 , H A I g G a n d p l a s m a w e r e i n c u b a t - e d f o r 1 0 m i n b e f o r e a d d i t i o n t o G F P . x i x 2 6 1 2 6 3 2 6 6 2 6 9 2 9 7 2 9 8 3 0 0 ‘ . T S . ‘ I . . 3 8 1 ! 1 . - I . I . 1 r . . . ' £ . : 0 1 v 1 ; . i t s : c ( 4 1 . . . . > 0 " . l . ( i n : F i g u r e 3 . 4 F i g u r e 3 . 5 F i g u r e 3 . 6 F i g u r e 3 . 7 F i g u r e 3 . 8 E f f e c t s o f h e a t i n g s e r u m ( 5 6 ° C , 5 m i n ) o r p l a s m a ( 5 0 ° C , 2 0 m i n ) o n t h e i r s u p p o r t o f H A I g G - i n d u c e d c l u m p i n g o f G F P . H A I g G ( a ) o r p l a t e l e t a g o n i s t s ( b ) w e r e a d d e d t o 3 0 0 p l G F P a n d 1 0 0 p l h e a t e d s e r u m p l u s h i r u d i n ( 1 , 4 - 7 ) , h e a t e d p l a s m a ( 2 ) , o r u n h e a t e d s e m m ( 3 ) . P l a t e l e t a g o n i s t s w e r e P A F ( 4 ) , c o l l a g e n ( 5 ) , A D P ( 6 ) , a n d P M A ( 7 ) . A g g r e g o m e t r y c u r v e s g e n e r a t e d w i t h 0 . 7 m g / m l z y m o s a n ( 2 , 4 ) o r 2 5 p g / m l L P S ( 1 , 3 ) i n 3 0 0 p l G F P w i t h 1 0 0 p l s e r u m p l u s h i r u d i n . S e r u m w a s e i t h e r u n h e a t e d ( 3 , 4 ) o r h e a t e d ( 1 , 2 ) a t 5 6 ° C f o r 5 m i n . E f f e c t s o f c o m p l e m e n t d e p l e t i o n b y z y m o s a n ( a ) a n d c o b r a v e n o m f a c t o r ( b ) o n a g g r e g o m e t r y w i t h H A I g G a n d c o n t r o l a g o n i s t s a d d e d t o 3 0 0 p l G F P p l u s 1 0 0 p 1 c o m p l e m e n t - d e - p l e t e d ( 1 , 3 , 4 , 5 , 7 , 8 ) o r c o n t r o l p l a s m a w i t h c o m p l e m e n t a c t i v i t y ( 2 , 6 ) . E f f e c t s o f H A I g G i n c o m p l e m e n t - d e p l e t e d p l a s m a ( 1 , 5 ) w e r e c o m p a r e d t o i t s e f f e c t s o n c o n t r o l p l a s m a ( 2 , 6 ) . C o n t r o l a g o n i s t s w e r e c o l l a g e n ( 3 ) , A D P ( 4 ) , P A F ( 7 ) , a n d c a l c i u m i o n o p h o r e ( 8 ) . E f f e c t s o f c o b r a v e n o m f a c t o r ( C V F ) o n a g g r e g a t i o n s i n d u c e d b y A D P ( a ) a n d c o l l a g e n ( b ) u s i n g 3 0 0 p 1 G F P a n d 1 0 0 p l C V F - t r e a t e d p l a s m a , c o n t r o l p l a s m a , o r T y r o d e ’ s b u f f e r . I n ( a ) , A D P ( 2 0 p M fi n a l ) w a s a d d e d t o G F P p l u s C V F - t r e a t e d p l a s m a ( 1 ) , t o G F P p l u s c o n t r o l p l a s m a ( 3 ) , o r t o G F P s i m u l t a n e o u s l y w i t h C V F - t r e a t e d p l a s m a ( 2 ) . I n ( b ) , c o l l a g e n ( 5 p g / m l fi n a l ) w a s a d d e d t o G F P p l u s p l a s m a i n c u b a t e d w i t h C V F f o r 7 5 m i n a t 3 7 ° C ( 4 ) , t o G F P p l u s C V F - t r e a t e d T y r o d e ’ s b u f f e r ( 7 ) , t o G F P p l u s T y r o d e ’ s b u f f e r ( 8 ) , t o G F P p l u s u n t r e a t e d p l a s m a ( 9 ) , t o G F P s i m u l t a n e o u s l y w i t h C V F - t r e a t e d p l a s m a ( 5 ) , a n d t o G F P w i t h u n h e a t e d p l a s m a i m m e d i a t e l y a f t e r t h e a d d i t i o n o f C V F , t h u s a v o i d i n g p r e i n c u b a t i o n o f C V F w i t h p l a s m a ( 6 ) . A g g r e g a t i o n c u r v e s f o r H A I g G a d d e d t o 3 0 0 p l G F P p l u s 1 0 0 p l C 3 — d e fi c i e n t ( 1 ) o r n o r m a l c o n t r o l ( 2 ) p l a s m a . R e s u l t s w i t h a s e c o n d p a i r o f C 3 - d e fi c i e n t a n d n o r m a l d o g s w e r e t h e s a m e . 3 0 3 3 0 5 3 0 8 3 1 1 3 1 3 F i g u r e 3 . 9 F i g u r e 4 . 1 F i g u r e 4 . 2 F i g u r e 4 . 3 F i g u r e 4 . 4 F i g u r e 4 . 5 F i g u r e 4 . 6 T e c h n i c o n H - l a n a l y s i s o f c e l l s i n c i t r a t e d w h o l e b l o o d f r o m 1 o f 2 t e s t d o g s b e f o r e ( a ) a n d 1 5 m i n a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 2 5 m g / m l H A I g G ( b ) o r m a t c h i n g v o l u m e s o f P B S ( c ) . T h e a p p a r e n t p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s o f e a c h s a m p l e f o r d o g 1 ( D 1 ) a n d d o g 2 ( D 2 ) a r e r e c o r d e d n e x t t o t h e c o r r e s p o n d - i n g r e p r e s e n t a t i v e c y t o g r a m . A n e l l i p s e s u r r o u n d s t h e r e g i o n w h e r e p l a t e l e t c l u m p s a r e r e c o r d e d . N = n e u t r o p h i l s , E = e o s i n o p h i l s , M = m o n o c y t e s , L = l y m p h o c y t e s . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h s o f c a n i n e p l a t e l e t s a f t e r a g g r e g o m e t r y w i t h H A I g G f o r m e d a t 5 6 ° C ( a ) a n d 5 9 ° C ( b , c , d ) . H A I g G ( d i n s e r t a n d a r r o w s ) w a s a s s o c i a t e d w i t h t h e s u r f a c e s o f c l u m p e d p l a t e l e t s ( a , b , c ) , b u t n o t w i t h u n c l u m p e d p l a t e l e t s i n c u b a t e d w i t h H A I g G i n t h e p r e s e n c e o f h e a t - i n a c t i v a t e d p l a s m a ( ( 1 ) . a ) X 1 4 , 0 0 0 , b ) X 1 6 , 8 5 0 , c ) X 2 2 , 0 0 0 , d ) X 1 3 , 6 5 0 A g g r e g o m e t r y c u r v e s f o r G F P i n c u b a t e d w i t h w a s h e d H A I g G ( a ; b 1 , 3 , 4 ) o r H A F a b s ( 2 ) p r e v i o u s l y i n c u b a t e d i n p l a s m a ( a ; b 2 - 4 ) o r h e a t - i n a c t i v a t e d p l a s m a ( 1 ) . " A c t i v a t e d " H A I g G g e n e r a t e d d o s e - r e s p o n s e c u r v e s ( a ) a n d o c c a s i o n a l f u l l - s c a l e a g g r e g a t i o n ( b 4 ) i n h i b i t a b l e w i t h 5 m M E G T A ( b 3 ) . E f f e c t o f g o a t a n t i - [ c a n i n e C 3 ] a n t i b o d i e s o n H A I g G - i n d u c e d c l u m p i n g o f G F P . H A I g G w a s fi r s t i n c u b a t e d w i t h p l a s m a t o f o r m C 3 - H A I g G a n d t h e n w i t h 1 ) g o a t a n t i - [ c a n i n e C 3 ] t o b l o c k H A I g G - a s s o c i a t e d C 3 , o r 2 ) c o n t r o l g o a t I g G . T h e s a m e r e s u l t s w e r e o b t a i n e d w i t h G F P f r o m a s e c o n d d o g . E f f e c t s o f R G D S ( l o w e r c u r v e s ) a n d n o n s e n s e p e p t i d e s ( u p p e r c u r v e s ) o n a g g r e g o m e t r y u s i n g P R P w i t h a ) 0 . 2 5 m g / m l H A I g G , b ) 1 0 p M A D P , a n d c ) 5 p g / m l c o l l a g e n . R e s p o n s i v e n e s s o f H A I g G - c l u m p e d p l a t e l e t s t o 1 ) 1 0 p M A D P , 2 ) 2 . 5 p g / m l c o l l a g e n , a n d 3 ) 5 p M A T P . T h e e f f e c t o f A T P o n u n c l u m p e d p l a t e l e t s i s s h o w n f o r c o m p a r i s o n ( 4 ) . A r r o w s i n d i c a t e a d d i t i o n o f p l a t e l e t a g o n i s t s . E f f e c t s o f a ) 1 p M P g E l , b ) 1 0 0 p M s p h i n g o s i n e , a n d c ) 5 p g / m l a n t i m y c i n A p l u s 1 0 m M 2 - d e o x y - D — g l u c o s e o n H A I g G - i n d u c e d p l a t e l e t c l u m p i n g . I n ( c ) , t h e i n h i b i t i o n o f A D P , c o l l a g e n , P A F , c a l c i u m i o n o p h o r e , a n d P M A a r e r e p r e s e n t e d b y a s i n g l e t r a c i n g . I = i n h i b i t o r , N I = n o i n h i b i t o r 3 1 7 3 3 6 3 3 9 3 4 1 3 4 4 3 4 6 3 4 9 r’ 9 I t . . . “ « u - I $ . 1 l 7 . . . > 1 . . . . 1 1 1 3 1 ' . o p l l . . I v . 1 1 . . l ‘ . l F i g u r e 4 . 7 F i g u r e 4 . 8 F i g u r e 5 . 1 F i g u r e 5 . 2 F i g u r e 5 . 3 F i g u r e 5 . 4 F i g u r e 5 . 5 F i g u r e 5 . 6 E f f e c t s o f H A I g G o n P R P c o m p a r e d t o p l a t e l e t s fi x e d w i t h 4 % p a r a f o r m a l d e h y d e ( P ) , 0 . 0 1 % g l u t a r a l d e h y d e ( G ) , o r 0 . 0 0 1 % G . F i x e d p l a t e l e t s w e r e r e s u s p e n d e d i n f r e s h p l a s m a . H A I g G w a s a d d e d s i m u l t a n e o u s l y t o t h e t e s t c u v e t t e a n d t o p l a s m a i n t h e b l a n k c u v e t t e t o c a n c e l o u t a b s o r b a n c e c h a n g e s d u e t o t h e i n t e r a c t i o n o f H A I g G w i t h p l a s m a . H A I g G - i n d u c e d a g g r e g a t i o n o c c u r r i n g w i t h l ) G F P p l u s c i t r a t e d p l a s m a f r o m o n e p a r t i c u l a r d o g , 2 ) G F P p l u s s e r u m ( w i t h h i r u d i n ) , 3 ) t h e a d d i t i o n o f " a c t i v a t e d " H A I g G ( p r e - i n c u b a t e d i n p l a s m a ) t o G F P , a n d 4 ) P R P f r o m h i r u d i n - a n t i c o a g u l a t e d b l o o d . A d d i t i o n o f P g E 1 l i m i t e d t h e s e r e s p o n s e s t o a g g l u t i n a t i o n ( 5 ) . T h e s e t r a c i n g s w e r e r e c o r d e d o n d i f f e r e n t d a y s . P h a s e I m e a n S p A s t a n d a r d c u r v e s , p l u s a n d m i n u s D X , f o r t h e e r y t h r o c y t e s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n a s s a y . P h a s e I m e a n S p A s t a n d a r d c u r v e s , p l u s a n d m i n u s D X , f o r t h e p l a t e l e t s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n a s s a y . P h a s e I s t a n d a r d c u r v e f o r t h e C l q a s s a y f o r i m m u n e c o m p l e x e s . P h a s e I I S p A s t a n d a r d c u r v e s , p l u s a n d m i n u s D X , f o r t h e e r y t h r o c y t e s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n a s s a y . P h a s e H m e a n S p A s t a n d a r d c u r v e s , p l u s a n d m i n u s D X , f o r t h e p l a t e l e t s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n a s s a y . P h a s e I I S p A s t a n d a r d c u r v e f o r t h e C l q a s s a y f o r i m m u n e c o m p l e x e s . x x i i 3 5 1 3 5 3 3 7 7 3 8 1 3 8 5 3 8 9 3 9 3 3 9 7 A C D A T P B S A C B C C I C C V F C V s D - M I F A D M I F T D E A l . 1 D X E L I S A s E S A I g F C - P I F A F T G F P K E Y T O A B B R E V I A T I O N S a c i d c i t r a t e d e x t r o s e a d e n o s i n e d i p h o s p h a t e a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a b o v i n e s e r u m a l b u m i n c o m p l e t e b l o o d c o u n t c i r c u l a t i n g i m m u n e c o m p l e x e s c o b r a v e n o m f a c t o r c o e f fi c i e n t s o f v a r i a t i o n d i r e c t m e g a k a r y o c y t e i m m u n o fl u o r e s c e n c e a s s a y d i r e c t m e g a k a r y o c y t e i m m u n o fl u o r e s c e n c e t e s t i n g d o g e r y t h r o c y t e a n t i g e n 1 . 1 d r u g X e l u a t e e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y s e r y t h r o c y t e s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n fl o w c y t o m e t r i c p l a t e l e t i m m u n o fl u o r e s c e n c e a s s a y fl o w t h r o u g h g e l - fi l t e r e d p l a t e l e t s x x i i i ' fi n H A I g G H A I g M H I T I C I M T I V I g G K 9 H A I g G L P S M - P I F A M A I P A P A P P A I g P B I g P B S P C h e a t - a g g r e g a t e d I g G C a n i n e h e a t - a g g r e g a t e d I g M h e p a r i n - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a i m m u n e a d h e r e n c e i m m u n e c o m p l e x i m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a i m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a i m m u n o r a d i o m e t r i c a s s a y i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a h u m a n g a m m a g l o b u l i n c a n i n e H A I g G l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e l i p o p o l y s a c c h a r i d e m i c r o s c 0 p i c p l a t e l e t i m m u n o fl u o r e s c e n c e a s s a y M o n o c l o n a l A n t i b o d y — s p e c i fi c I m m o b i l i z a t i o n o f P l a t e l e t A n t i g e n s m o n o n u c l e a r p h a g o c y t e s y s t e m m e a n p l a t e l e t v o l u m e s n i t r o b l u e t e t r a z o l i u m p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r p l a t e l e t a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n p l a t e l e t - b i n d a b l e i m m u n o g l o b u l i n p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e p o s i t i v e c o n t r o l x x i v P F 3 p l a t e l e t f a c t o r - 3 P F A p a r a f o r m a l d e h y d e P g E l p r o s t a g l a n d i n E 1 P M A p h o r b o l 1 2 - m y r i s t a t e 1 3 a c e t a t e P R P p l a t e l e t - r i c h p l a s m a R T r o o m t e m p e r a t u r e S D S - P A G E s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s S p A . s t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n A X X V R E V I E W O F T H E L I T E R A T U R E T h e f o l l o w i n g d e fi n i t i o n s a r e p r o v i d e d t o c l a r i f y h o w s e v e r a l t e r m s r e l a t i n g t o i m m u n o l o g i c a l t h r o m b o c y t o p e n i a s w i l l b e u s e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n . T h e u s e o f t h e s e t e r m s h a s b e e n v a r i a b l e a n d s o m e t i m e s i m p r e c i s e . p l a t e l e t a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n ( P A I g ) = a n y i m m u n o g l o b u l i n d e t e c t e d i n o r o n p l a t e l e t s i n c l u d i n g i n t e r n a l a n d s u r f a c e i m m u n o g l o b u l i n , s p e c i fi c a l l y o r n o n s p e c i fi c a l l y b o u n d i n a n y w a y ; c o n t e x t i s r e q u i r e d t o d e t e r m i n e i f P A I g r e f e r s o n l y t o s u r f a c e i m m u n o g l o b u l i n , a s i s o f t e n t h e c a s e , o r t o t o t a l i m m u n o g l o b u l i n i n c l u d i n g i n t e r n a l a n d s u r f a c e f r a c t i o n s p l a t e l e t - b i n d a b l e i m m u n o g l o b a n ( P B I g ) = a n y i m m u n o g l o b u l i n i n s e r u m , p l a s m a , o r f r a c t i o n s t h e r e o f t h a t r e m a i n s b o u n d t o p l a t e l e t s a f t e r s u i t a b l e i n c u b a t i o n s a n d w a s h e s a n t i p l a t e l e t a n t i b o d i e s = i r n m u n o g l o b u l i n s ( P A I g a n d P B I g ) w i t h s p e c i fi c i t i e s f o r p l a t e l e t e p i t o p e s ; t h e t e r m u s u a l l y a p p l i e s t o a n t i b o d i e s r e a c t i v e w i t h s u r f a c e e p i t o p e s , b u t a n t i b o d i e s t o i n t e r n a l e p i t o p e s a r e a l s o a n t i p l a t e l e t a n t i b o d i e s 2 a n t i p l a t e l e t a u t o a n t i b o d i e s = a n t i p l a t e l e t a n t i b o d i e s w i t h r e a c t i v i t y t o p l a t e l e t s f r o m t h e s a m e i n d i v i d u a l t h a t i s p r o d u c i n g t h e a n t i b o d i e s a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a ( A T P ) = t h r o m b o c y t o p e n i a c a u s e d b y a n t i p l a t e l e t a u t o a n t i b o d i e s ; A T P i s a l s o u s e d f o r a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i a = t h r o m b o c y t o p e n i a f r o m u n k n o w n c a u s e s i m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a ( I M T ) = t h r o m b o c y t o p e n i a r e s u l t i n g f r o m i m m u n o l o g i c a l f a c t o r s , u s u a l l y a n t i b o d y - m e d i a t e d d e s t r u c t i o n p r i m a r y I M T = I M T u n a s s o c i a t e d w i t h a n u n d e r l y i n g c o n d i t i o n ; w h i l e k n o w n t o b e i m m u n e - m e d i a t e d , c a s e s o f p r i m a r y I M T a r e a l s o i d i o p a t h i c i n t h a t t h e i r i n c i t i n g c a u s e s a r e u n k n o w n s e c o n d a r y I M T = I M T a s s o c i a t e d w i t h u n d e r l y i n g d i s e a s e s s u c h a s n e o p l a s i a , s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s , h y p e r t h y r o i d i s m , o r d r u g e x p o s u r e ; t h e s e m a y o r m a y n o t b e a u t o i m m u n e i m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a ( I M T P ) = I M T w i t h m u c o c u t a n e o u s h e m o r r h a g e ; m a n y p a t i e n t s h a v e I M T w i t h o u t p u r p u r a i d i o p m y " 4 3 . “ ! — . ‘ d o d l “ ‘ x . : w " i t . § 3 i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a ( I T P ) = a d i s e a s e w h e r e m u c o c u t a n e o u s h e m o r r h a g e i s a s s o c i a t e d w i t h t h r o m b o c y t o p e n i a f r o m u n k n o w n c a u s e s ; t h i s t e r m i s a l s o u s e d b y s o m e t o m e a n I M T P b e c a u s e t h e o r i g i n a l t e r m i n o l o g y p e r s i s t e d a f t e r t h e i m m u n o l o g i c a l n a t u r e o f m a n y c a s e s o f " I T P " w a s d e m o n s t r a t e d ; " I T P " i s a l s o t h e a b b r e v i a t i o n o f t e n u s e d f o r " i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a " w h i c h i s e q u i v a l e n t t o I M T P I . I n t r o d u c t i o n P l a t e l e t s , t h e s m a l l e s t f o r m e d e l e m e n t s o f b l o o d , a r e a n u c l e a t e c y t o p l a s m i c f r a g m e n t s o f t h e l a r g e s t h e m a t o p o i e t i c c e l l s , t h e m e g a k a r y o c y t e s . M e g a k a r y o c y t e s r e s i d i n g p r i m a r i l y i n t h e b o n e m a r r o w b u t a l s o i n s u c h s i t e s a s t h e s p l e e n a n d l u n g , 1 s h e d t h e i r d i s c o i d p l a t e l e t s i n t o t h e b l o o d s t r e a m . I n n o r m a l d o g s , p l a t e l e t s c i r c u l a t e a t a c o n c e n t r a t i o n o f a b o u t 2 0 0 , 0 0 0 - 5 0 0 , 0 0 0 / p l . 2 M e g a k a r y o c y t e s a l s o c i r c u l a t e i n c a n i n e b l o o d a t v e r y l o w c o n c e n t r a t i o n s , p e r h a p s i n t r a n s i t f r o m m a r r o w t o l u n g s , 3 b u t t h e s i g n i fi c a n c e o f t h i s i s u n k n o w n . T h e m a i n t e n a n c e o f n o r m a l c i r c u l a t i n g p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s r e q u i r e s e f f e c t i v e m e g a k a r y o e y m p o i e s i s a n d t h r o m b o p o i e s i s . T h e s e c o m p l e x p r o c e s s e s a r e u n d e r c y t o k i n e c o n t r o l s u c h t h a t d e c r e a s e s i n c i r c u l a t i n g p l a t e l e t m a s s n o r m a l l y r e s u l t i n i n c r e a s e d p l a t e l e t p r o d u c t i o n . 4 T h r o m b o p o i e t i n i s t h e n a m e g i v e n t o t h e c y t o k i n e p r i m a r i l y c o n t r o l l i n g t h e s e p r o c e s s e s . T h r o m b o p o i e t i n w a s r e c e n t l y p u r i fi e d a n d c l o n e d , a n d i t s r e c e p t o r , c - M p l , h a s b e e n i d e n t i fi e d a s t h e p r o d u c t o f t h e c - m p l p r o t o - o n c o g e n e w h i c h i s a m e m b e r o f t h e c y t o k i n e r e c e p t o r s u p e r f a m i l y . “ * 6 C a n i n e t h r o m b o p o i e s i s a p p e a r s t o b e g o v e r n e d S i m i l a r l y , a s s e r a f r o m d o g s m a d e a p l a s t i c b y i r r a d i a t i o n c o n t a i n a h u m o r a l 2 ‘ \ ( ’ o I . E f f ) ’ 3 1 . . > _ » v i i . ’ r u n 4 7 H . ) , £ 1 . , 1 r 3 ; “ . I t ! ” 1 . 1 : . n . ( . 1 r b b l o 4 f a c t o r , p r e s u m a b l y t h r o m b o p o i e t i n , t h a t b i n d s t o c - M p l a n d t r a n s m i t s a m i t o g e n i c s i g n a l t o m e g a k a r y o c y t e s . 7 ' 8 W h i l e t h i s s i g n a l i s p i v o t a l t o t h r o m b o p o i e s i s , o t h e r c y t o k i n e s s u c h a s i n t e r l e u k i n 6 h a v e b e e n s h o w n t o i n fl u e n c e t h e p r o d u c t i o n a n d f u n c t i o n o f c a n i n e p l a t e l e t s . 9 C i r c u l a t i n g p l a t e l e t s p a r t i c i p a t e i n n u m e r o u s p h y s i o l o g i c a n d p a t h o l o g i c p r o c e s s e s i n c l u d i n g m a i n t e n a n c e o f v a s c u l a r i n t e g r i t y , c o a g u l a t i o n , fi b r i n o l y s i s , i n fl a m m a t i o n , t h r o m b o s i s , t u m o r m e t a s t a s i s , n e o v a s c u l a r i z a t i o n , a n d r e p a i r . T h e s e m e t a b o l i c a c t i v i t i e s i n v o l v e t h e p a r t i c i p a t i o n o f p l a t e l e t m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s a n d p h o s p h o l i p i d s , s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y s , i n t e r n a l s t o r a g e g r a n u l e s a n d t h e i r s e c r e t o r y p a t h w a y s , m e t a b o l i c p a t h w a y s f o r t h e d e n o v o g e n e r a t i o n a n d r e l e a s e o f c y t o p l a s m i c p r o d u c t s , m u s c u l a r a n d m i c r o t u b u l a r c o m p o n e n t s , o t h e r c e l l s , a n d n u m e r o u s p l a s m a f a c t o r s . 1 ° D e s p i t e t h e i r a n u c l e a t e s t a t u s , m a m m a l i a n p l a t e l e t s a r e c l e a r l y v e r y a c t i v e , c o m p l e x , a n d i m p o r t a n t e l e m e n t s o f b l o o d . O f p r i m a r y r e l e v a n c e t o t h i s r e v i e w , p l a t e l e t s a r e e s s e n t i a l f o r n o r m a l h e m o s t a s i s . W i t h d a m a g e t o v a s c u l a r e n d o t h e l i u m , n o r m a l p l a t e l e t s q u i c k l y a d h e r e t o e x p o s e d s u b e n d o t h e l i u m w h e r e t h e y s p r e a d , a g g r e g a t e , a n d f o r m a p r i m a r y h e m o s t a t i c p l a t e l e t p l u g . S u b e n d o t h e l i a l c o l l a g e n i s i m p o r t a n t a s a n i n i t i a l p l a t e l e t a g o n i s t i n t h i s p r o c e s s . P l a t e l e t a c t i v a t i o n l e a d s t o t h e s e c r e t i o n o f A D P f r o m d e n s e g r a n u l e s a n d t o t h e g e n e r a t i o n a n d r e l e a s e o f t h r o m b o x a n c A 2 , b o t h o f w h i c h r e s u l t i n t h e r e c r u i t m e n t a n d a c t i v a t i o n o f m o r e p l a t e l e t s t o s t r e n g t h e n t h e p l u g . C o n c o m i t a n t a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m l e a d s t o t h e g e n e r a t i o n o f a n o t h e r p o t e n t p l a t e l e t a g o n i s t , t h r o m b i n , w h i c h c l e a v e s fi b r i n o g e n t o f o r m a s t a b i l i z i n g fi b r i n n e t w o r k w i t h i n a n d a r o u n d t h e p l a t e l e t p l u g p a t c h i n g t h e v a s c u l a r d e f e c t . l o 5 S e v e r e l y i m p a i r e d p r i m a r y h e m o s t a s i s r e s u l t s i n r e d u c e d v a s c u l a r i n t e g r i t y a n d h e m o r r h a g e c h a r a c t e r i z e d m o s t f r e q u e n t l y b y m u c o c u t a n e o u s p e t e c h i a e a n d e c c h y m o s e s , e p i s t a x i s , m e l e n a , h e m a t o c h e z i a , h e m a t u r i a , s c l e r a l h e m o r r h a g e , h y p h e m a , a n d r e t i n a l h e m o r r h a g e . T h i s p a t t e r n o f h e m o r r h a g e o c c u r s i n d o g s w i t h c o n g e n i t a l a n d a c q u i r e d p l a t e l e t f u n c t i o n a l d e f e c t s , a n d i n d o g s w i t h m a r k e d r e d u c t i o n s i n t h e c i r c u l a t i n g p l a t e l e t m a s s . T h r o m b o c y t o p e n i a , d e fi n e d b y a p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n b e l o w t h e n o r m a l r a n g e , i s g e n e r a l l y c o n s i d e r e d t h e m o s t f r e q u e n t c a u s e o f n o n t r a u m a t i e h e m o r r h a g e i n d o g s . H . T h r o m b o c y t o p e n i a A . P s e u d o t h r o m b o c y t o p e n i a T r u e t h r o m b o c y t o p e n i a m u s t a l w a y s b e d i f f e r e n t i a t e d f r o m p s e u d o t h r o m b o — c y t o p e n i a , a l a b o r a t o r y a r t i f a c t o c c u r r i n g w h e n a s u b s t a n t i a l p r o p o r t i o n o f t h e p l a t e l e t s i n a s a m p l e a r e n o t r e c o g n i z e d a s s u c h . W i t h h u m a n s a m p l e s , p s e u d o t h r o m b o c y t o p e n i a m a y o c c u r w h e n p l a t e l e t s a r e c l u m p e d d u e t o : ” 1 ) a n t i c o a g u l a n t - d e p e n d e n t I g G , I g A , o r I g M a n t i b o d i e s r e a c t i v e t o G P I I b / I I I a i n t h e p r e s e n c e o f E D T A o r s o m e t i m e s o t h e r a n t i c o a g u l a n t s “ 1 3 2 ) c o l d a g g l u t i n i n s ; 3 ) p l a t e l e t r o s e t t i n g a r o u n d n e u t r o p h i l s o r m o n o c y t e s ( p l a t e l e t s a t e l l i t i s m ) , w h i c h i s g e n e r a l l y d u e t o E D T A - d e p e n d e n t i n t e r a c t i o n s a t r o o m t e m p e r a t u r e , p o s s i b l y i n v o l v i n g I g G 1 4 o r t h r o m b o s p o n d i n ; 1 5 4 ) p l a t e l e t a c t i v a t i o n d u r i n g o r a f t e r v e n i p u n c t u r e ; o r 5 ) t o a s i g n i fi c a n t n u m b e r o f t h e p l a t e l e t s i n a s a m p l e b e i n g l a r g e r t h a n t h e h i g h t h r e s h o l d s e t t i n g f o r p l a t e l e t s o n a u t o m a t e d c o u n t e r s . T h e l a t t e r t w o a r e c o m m o n c o n c e r n s f o r t h e a c c u r a t e e n u m e r a t i o n o f c a n i n e p l a t e l e t s . A s a b r e e d , n o r m a l c a v a l i e r K i n g C h a r l e s s p a n i e l s h a v e t h e s a m e c i r c u l a t i n g c o n c e n t r a t i o n o f p l a t e l e t s a s o t h e r c a n i n e b r e e d s , b u t a u t o m a t e d c o u n t e r s u n d e r e s t i m a t e 6 t h e i r p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s a n d o f t e n i n d i c a t e t h r o m b o c y t o p e n i a . “ “ 7 T h i s p s e u d o t h r o m - b o c y t o p e n i a i s d u e t o a b i m o d a l d i s t r i b u t i o n o f p l a t e l e t s i z e w i t h o n e p l a t e l e t p o p u l a t i o n s i m i l a r i n s i z e t o p l a t e l e t s o f o t h e r b r e e d s , a n d a s e c o n d l a r g e r p o p u l a t i o n t h a t i s a p p a r e n t l y g a t e d o u t o f t h e p l a t e l e t s i z e r a n g e b y a t l e a s t s o m e a u t o m a t e d c e l l c o u n t e r s . T h e c a u s e o f t h i s b r e e d d i f f e r e n c e i s u n k n o w n . G r e y h o u n d s g e n e r a l l y a p p e a r t o h a v e l o w e r c i r c u l a t i n g p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s t h a n o t h e r b r e e d s . “ " 1 9 T h e m e a n ( : 1 : S D . ) p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n o f 3 6 c l i n i c a l l y n o r m a l g r e y h o u n d s w a s 1 5 4 , 0 0 0 i 4 3 , 0 0 0 , w h i l e t h a t o f n o n - g r e y h o u n d s w a s 2 3 8 , 0 0 0 1 2 2 , 0 0 0 ( p < 0 . 0 0 1 ) . 1 9 I t h a s b e e n s u g g e s t e d , b u t n o t p r o v e n , t h a t b i p o t e n t i a l m a r r o w s t e m c e l l s r e s p o n s i v e t o e r y t h r o p o i e t i n a n d t h r o m b o p o i e t i n g e n e r a t e e r y t h r o c y t e s i n g r e y h o u n d s a t t h e e x p e n s e o f p l a t e l e t s 1 9 T h i s w o u l d b e c o n s i s t e n t w i t h t h e e l e v a t e d h e m a t o c r i t s i n t h e s e d o g s a s w e l l a s t h e l o w p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s . P l a t e l e t s e q u e s t r a t i o n a n d l o w - g r a d e i m m u n e - m e d i a t e d o r i n f e c t i o u s d e s t r u c t i o n h a v e a l s o b e e n s u g g e s t e d c a u s e s o f a p p a r e n t t h r o m b o c y t o p e n i a i n g r e y h o u n d s . “ 1 9 I f n o p a t h o l o g i c o r c l i n i c a l s i g n i fi c a n c e c a n b e l i n k e d t o t h i s b r e e d d i f f e r e n c e , a g r e y h o u n d - s p e c i fi c r e f e r e n c e r a n g e f o r p l a t e l e t C o n c e n t r a t i o n w i l l b e r e q u i r e d t o p r e v e n t t h e m i s d i a g n o s i s o f t h r o m b o c y t o p e n i a i n t h i s b r e e d . A n t i c o a g u l a n t - i n d u c e d p s e u d o t h r o m b o c y t o p e n i a h a s a l s o r e c e n t l y b e e n r e p o r t e d i n d o g s . ” 2 1 I n a c a r e f u l l y s t u d i e d c a s e , E D T A - a n t i c o a g u l a t e d b l o o d f r o m a h e a l t h y , u “ t r e a t e d d o g h a d a n a p p a r e n t p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n o f 5 0 , 0 0 0 / p 1 a s a s s e s s e d b y a T e ( I l l n i c o n H - 1 h e m a t o l o g y a n a l y z e r . 2 0 T h e p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s o f s e v e r a l p r e v i o u s S a l I l p l e s r a n g e d f r o m 2 4 8 , 0 0 0 t o 3 1 6 , 0 0 0 / p l . P l a t e l e t c l u m p s w e r e a l s o n o t e d b y d i r e c t e x fi r n i n a t i o n o f b l o o d s m e a r s m a d e a t t h e t i m e o f a p p a r e n t t h r o m b o c y t o p e n i a . P l a t e l e t 7 c l u m p i n g w a s n o t a p p a r e n t w h e n c i t r i c a c i d o r h e p a r i n w e r e u s e d a s a n t i c o a g u l a n t s , a n d t h e p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s w i t h t h e s e t w o a n t i c o a g u l a n t s w e r e 1 0 5 , 0 0 0 a n d 1 9 1 , 0 0 0 / p l , r e s p e c t i v e l y . R e c e n t s t u d i e s o f t h e p h e n o m e n o n w i t h h u m a n b l o o d i n d i c a t e t h a t f o r a n y g i v e n s a m p l e , s e v e r a l a n t i c o a g u l a n t s m a y i n d u c e p s e u d o t h r o m b o c y t o p e n i a , b u t E D T A c o n s i s t e n t l y h a s t h e g r e a t e s t e f f e c t . ‘ 3 I n t e r e s t i n g l y , i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f E D T A a p p e a r t o i n c r e a s e t h e e f f e c t i n i t i a l l y b u t e v e n t u a l l y i n h i b i t a n d i n f a c t p r e v e n t p l a t e l e t c l u m p i n g i n s u s c e p t i b l e s a m p l e s . 1 3 W h i l e t h i s fi n d i n g l e d t o t h e s u g g e s t i o n t h a t c a l c i u m c h e l a t i o n m a y n o t b e s o l e l y r e s p o n s i b l e f o r i n d u c i n g a n t i b o d y i n t e r a c t i o n s w i t h G P I I b / I I I a , i t i s a l s o p o s s i b l e t h a t c a l c i u m c h e l a t i o n i s c r i t i c a l b u t t h a t h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f E D T A i n h i b i t n e c e s s a r y m e t a b o l i c p l a t e l e t p r o c e s s e s . T h e e x p r e s s i o n o f a c t i v a t i o n a n t i g e n s o n c l u m p e d p l a t e l e t s i n d i c a t e s t h a t p l a t e l e t a c t i v a t i o n a n d m e t a b o l i c p r o c e s s e s a r e i n v o l v e d . ‘ 3 D i f f e r e n t i a t i o n o f t r u e t h r o m b o c y t o p e n i a f r o m p s e u d o t h r o m b o c y t o p e n i a i s b e s t d o n e b y t h e d i r e c t e v a l u a t i o n o f a b l o o d s m e a r ; 1 3 t h e p r e s e n c e o f m a n y l a r g e p l a t e l e t s s h o u l d s u g g e s t t h e n e e d f o r a m a n u a l m e t h o d o f p l a t e l e t e n u m e r a t i o n , a n d t h e p r e s e n c e o f p l a t e l e t c l u m p s i n d i c a t e s t h e n e e d f o r a n o t h e r s a m p l e . T h e m e t h o d o f p l a t e l e t e n u m e r a t i o n s i g n i fi c a n t l y a f f e c t s t h e d e g r e e o f p s e u d o t h r o m b o c y t o p e n i a w i t h a n y g i v e n s a m p l e , a n d a u t o m a t e d c o u n t e r s c a n n o t b e r e l i e d u p o n t o i n d i c a t e t h e p r e s e n c e o f p l a t e l e t c l u m p s . ‘ 3 ! 1 : I r . J ; 1 “ , 4 1 u i F m ' L l . 1 1 . P L . . . ) J ) . . . L i e . a ) £ 5 2 p 3 . . 1 ( f r . 1 “ . v a o r 8 B . C a u s e s o f T h r o m b o c y t o p e n i a i n D o g s W h i l e t h e f o c u s o f t h i s d i s s e r t a t i o n i s o n c a n i n e I M T , a l l k n o w n c a u s e s o f t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s w i l l b e d i s c u s s e d b e c a u s e : 1 ) t h e d i a g n o s i s o f I M T i s l a r g e l y o n e o f e x c l u s i o n , n e c e s s i t a t i n g a fi r m k n o w l e d g e o f p o t e n t i a l c a u s e s , a n d 2 ) i m m u n e - ‘ m e d i a t e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n m a y c o n t r i b u t e t o t h r o m b o c y t o p e n i a i n m a n y d i s e a s e s . W h a t i s k n o w n a b o u t t h e m e c h a n i s m o f t h r o m b o c y t o p e n i a i n t h e s e d i s e a s e s w i l l b e d i s c u s s e d i n a n a t t e m p t t o d o c u m e n t a n y p o t e n t i a l i m m u n e - m e d i a t e d c o n t r i b u t i o n s , a n d t o d i f f e r e n t i a t e c l e a r l y n o n i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a s f r o m i m m u n e o r p o t e n t i a l l y i m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a s . G e n e r a l r e v i e w s o f t h r o m b o c y t o p e n i a a n d s p e c i fi c r e v i e w s o f I M T a n d d r u g - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s h a v e o f t e n i n t e r m i x e d a s i g n i fi c a n t a m o u n t o f k n o w l e d g e a b o u t t h e h u m a n c o n d i t i o n s w i t h a r e l a t i v e l y s m a l l a m o u n t o f d o c u m e n t e d k n o w l e d g e a b o u t t h e c a n i n e c o n d i t i o n s ? ” 2 4 W h i l e s i m i l a r c a u s e s a r e l i k e l y o p e r a n t i n a n a l o g o u s h u m a n a n d c a n i n e c o n d i t i o n s , t h e y a r e n o t n e c e s s a r i l y i d e n t i c a l . I n t h i s r e v i e w , a n a t t e m p t h a s b e e n m a d e t o f o c u s p r i n c i p a l l y o n c a n i n e t h r o m b o c y t o p e n i a , o m i t t i n g s e v e r a l d i s e a s e s a s s o c i a t e d w i t h t h r o m b o c y t o p e n i a i n p e o p l e t h a t h a v e n o t b e e n i d e n t i fi e d i n d o g s . H u m a n c o n d i t i o n s a r e d i s c u s s e d w h e r e t h e y m a y b e u s e f u l m o d e l s t o b e t t e r u n d e r s t a n d c a n i n e d i s e a s e s , p r i m a r i l y t h o s e w i t h a n i m m u n e - m e d i a t e d p a t h o g e n e - s i s . D i s c u s s i o n s p e r t a i n i n g t o t h e h u m a n m o d e l w i l l b e c l e a r l y i d e n t i fi e d a s s u c h . 1 . i n c i d e n c e a n d g e n e r a l d i s e a s e a s s o c i a t i o n s T h e i n c i d e n c e o f t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s i s p r o b a b l y b e s t e s t i m a t e d b y a r e t r o s p e c t i v e s u r v e y o f d o g s e x a m i n e d a t t h e C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e , N o r t h A . . . t u r d “ . I f . f t . . 1 ! _ < ¢ A 3 : . T c { 1 . ’ 0 1 : L . . . V , w . : 1 . 1 c l . { 3 } : a 3 “ . 9 C a r o l i n a S t a t e U n i v e r s i t y f r o m 1 9 8 3 t o 1 9 8 9 . 2 5 O f t h e 1 8 , 9 1 0 d o g s f o r w h i c h a c o m p l e t e b l o o d c o u n t w a s o b t a i n e d , 9 8 7 , o r a b o u t 5 % , w e r e t h r o m b o c y t o p e n i c ( < 2 0 0 , 0 0 0 / p l ) , t h o u g h 4 8 % o f t h e s e h a d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s o v e r 1 5 0 , 0 0 0 / p l . T h i s i n c i d e n c e i s b i a s e d f o r a r e f e r r a l i n s t i t u t i o n a s w e l l a s f o r t h e g e o g r a p h i c r e g i o n w h i c h , c o m p a r e d t o m a n y o t h e r p a r t s o f t h e c o u n t r y , h a s a h i g h e r p r e v a l e n c e o f i n f e c t i o u s d i s e a s e s a s s o c i a t e d w i t h t h r o m b o c y t o p e n i a . T h e 9 8 7 t h r o m b o c y t o p e n i c d o g s w e r e c a t e g o r i z e d b y g e n e r a l d i s e a s e t y p e s u c h t h a t t h r o m b o c y t o p e n i a w a s a t t r i b u t e d t o t h e f o l l o w i n g : I M T i n 5 % , c y t o p a t h o l o g i c a l l y o r h i s t o p a t h o l o g i c a l l y c o n fi r m e d n e o p l a s i a i n 1 3 % , i n fl a m m a t i o n o r i n f e c t i o n i n 2 3 % , a n d m i s c e l l a n e o u s c a u s e s i n 5 9 % . 2 5 M i s c e l l a n e o u s c o n d i t i o n s i n c l u d e d t r a u m a ( 7 0 ) , a c u t e h e m o r r h a g e ( 2 9 ) , d r u g t h e r a p y i n c l u d i n g c a n c e r c h e m o t h e r a p y ( 7 0 ) , c o a g u l o p a t h i e s s u c h a s D I C o f u n k n o w n o r i g i n ( 8 ) , p l a t e l e t c l u m p i n g ( 7 0 ) , r e n a l a n d l i v e r d i s e a s e ( 2 9 ) , s e q u e s t r a t i o n ( 3 ) , a n d b o n e m a r r o w d i s e a s e s u c h a s h y p e r e s t r o g e n i s m ( 6 ) . A l s o p l a c e d i n t h e m i s c e l l a n e o u s c a t e g o r y w e r e 3 0 4 ( 3 1 % ) d o g s f o r w h i c h t h e c a u s e o f t h r o m b o c y t o - p e n i a w a s u n k n o w n . I n c l u s i o n o f t h r o m b o c y t o p e n i a d u e t o p l a t e l e t c l u m p i n g m a y h a v e s l i g h t l y o v e r e s t i m a t e d t h e i n c i d e n c e o f t r u e t h r o m b o c y t o p e n i a , a s p s e u d o t h r o m b o - c y t o p e n i a m a y h a v e a c c o u n t e d f o r m a n y o f t h e s e 7 0 c a s e s . ” O v e r a l l , I M T w a s d i a g n o s e d i n 0 . 2 6 % o f a l l a d m i s s i o n s i n c l u d i n g d o g s w i t h d i a g n o s e s o f p r i m a r y I M T ( 2 7 , 0 . 1 4 % o f a l l a d m i s s i o n s ) , s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s ( S L E ) ( 1 3 ) , E v a n s s y n d r o m e ( 6 ) , p e m p h i g u s ( 1 ) , a n d r h e u m a t o i d a r t h r i t i s ( 1 ) . T h e d i a g n o s i s o f I M T w a s m a d e c l i n i c a l l y o n t h e b a s i s o f a p o s i t i v e a n t i n u c l e a r a n t i b o d y t e s t , a p o s i t i v e L E c e l l p r e p a r a t i o n , t h r o m b o c y t o p e n i a w i t h m e g a k a r y o c y t i c h y p e r p l a s i a , o r r e s p o n s e t o i m m u n o s u p p r e s s i v e d r u g t h e r a p y o r s p l e n e c t o m y . o J 3 : - v 1 ) « t i n y : I i n “ . . . . E v e r y . . 3 1 . J 0 i f ) . c l ) ! _ : J . . 3 » 1 . r . . v E 1 0 I n a n o t h e r s t u d y o f 6 0 t h r o m b o c y t o p e n i c d o g s , t h e g e n e r a l d i a g n o s e s w e r e c a t e g o r i z e d a s i m m u n e - m e d i a t e d i n 3 3 ( 5 5 % ) , n e o p l a s i a - a s s o c i a t e d i n 1 1 ( 1 8 % ) , i n f e c t i o u s o r i n fl a m m a t o r y i n 8 ( 1 3 % ) , a n d m i s c e l l a n e o u s ( i n c l u d i n g D I C a n d u n k n o w n c a u s e s ) i n 8 ( 1 3 % ) . 2 6 T h e p o p u l a t i o n i n c l u d e d o n l y t h o s e t h r o m b o c y t o p e n i c d o g s f o r w h i c h p l a t e l e t v o l u m e a n a l y s e s a n d b o n e m a r r o w e v a l u a t i o n w e r e d o n e w i t h i n 4 8 h r o f e a c h o t h e r . S i n c e p l a t e l e t v o l u m e s a n d f r a g m e n t a t i o n i n d i c e s w e r e c o n s i d e r e d u s e f u l i n m a k i n g a d i a g n o s i s o f I M T , t h e p o p u l a t i o n w a s l i k e l y b i a s e d t o w a r d t h i s d i a g n o s i s . T h i s m a y e x p l a i n t h e l a r g e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e 2 s t u d i e s w i t h r e s p e c t t o t h e p e r c e n t a g e o f t h r o m b o c y t o p e n i a s a t t r i b u t a b l e t o i m m u n e - m e d i a t e d m e c h a n i s m s . C l e a r l y , t h r o m b o c y t o p e n i a i s f r e q u e n t l y a s s o c i a t e d w i t h n e o p l a s i a a n d i n f e c t i o n o r i n fl a m m a t i o n , e a c h o f w h i c h c a n b e o c c u l t . T h i s e m p h a s i z e s t h e i m p o r t a n c e o f t h o r o u g h e v a l u a t i o n s i n a n a t t e m p t t o e x c l u d e s u c h c a u s e s b e f o r e a d i a g n o s i s o f p r i m a r y I M T i s r e a c h e d . C o n fi r m i n g a n t i b o d y - m e d i a t e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n w i t h r e l i a b l e t e s t s f o r P A I g m a y b e u s e f u l f o r g u i d i n g t r e a t m e n t i n I M T a s w e l l a s i n t h e t h r o m b o c y t o p e n i c c o n d i t i o n s a s s o c i a t e d w i t h n e o p l a s i a , i n f e c t i o n s , a n d i n fl a m m a t i o n . 2 . p a t h o p h y s i o l o g i c m e c h a n i s m s W h i l e n u m e r o u s s p e c i fi c d i s e a s e s t a t e s a r e a s s o c i a t e d w i t h t h r o m b o c y t o p e n i a , o n l y a f e w g e n e r a l p a t h o p h y s i o l o g i c m e c h a n i s m s a r e u l t i m a t e l y r e s p o n s i b l e f o r t h e c o n d i t i o n . T h e t o t a l b o d y p l a t e l e t m a s s a t a n y g i v e n t i m e i s d e p e n d e n t u p o n a b a l a n c e b e t w e e n t h e r a t e o f p l a t e l e t p r o d u c t i o n a n d t h e r a t e o f p l a t e l e t d e s t r u c t i o n o r c o n s u m p t i o n . T h e p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n o f p e r i p h e r a l b l o o d i s s i m i l a r l y a f f e c t e d b y t h e s e f a c t o r s , a n d a d d i t i o n a l l y b y t h e d e g r e e o f p l a t e l e t s e q u e s t r a t i o n o u t s i d e t h e p e r i p h e r a l v a s c u l a r s y s t e m . 1 1 W h e n t h e b a l a n c e t i p s t o w a r d p r o d u c t i o n , t h e r e s u l t i s a n i n c r e a s e d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n , c a l l e d t h r o m b o c y t o s i s ; w h e n t h e b a l a n c e t i p s t o w a r d c o n s u m p t i o n , d e s t r u c t i o n , o r s e q u e s t r a t i o n , t h r o m b o c y t 0 p e n i a m a y e n s u e . I n t e n s i fi e d p l a t e l e t p r o d u c t i o n m a y p a r t i a l l y o r c o m p l e t e l y c o m p e n s a t e c o n s u m p t i v e a n d d e s t r u c t i v e s t a t e s , t h u s m a i n t a i n i n g r e l a t i v e l y n o r m a l p e r i p h e r a l p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s . M a n y t h r o m b o c y t o p e n i c s t a t e s a r e l i k e l y c a u s e d b y t h e c u m u l a t i v e e f f e c t s o f m u l t i p l e p a t h o p h y s i o l o g i c m e c h a n i s m s , b u t o t h e r s a p p e a r t o h a v e a p r e d o m i n a n t c a u s e . W h e r e v e r p o s s i b l e , t h e f o l l o w i n g c a u s e s o f c a n i n e t h r o m b o c y t o p e n i a w i l l b e g r o u p e d b y t h e p r e d o m i n a t i n g p a t h o p h y s i o l o g i c m e c h a n i s m t h o u g h t t o p r o d u c e t h e t h r o m b o c y t o p e n i a . T h e p a t h o p h y s i o l o g y o f t h r o m b o c y t o p e n i a s a s s o c i a t e d w i t h n e o p l a s i a a n d i n f e c t i o u s d i s e a s e s a r e o f t e n m u l t i f a c t o r i a l , c o m p l e x , o r o n l y t e n u o u s l y d e fi n e d . C o n s e q u e n t l y , s o m e o f t h e i r d i s c u s s i o n w i l l b e s e p a r a t e f r o m s p e c i fi c m e c h a n i s t i c c a t e g o r i e s . a . d e c r e a s e d p r o d u c t i o n A d e q u a t e p l a t e l e t p r o d u c t i o n i s d e p e n d e n t u p o n t h e m a i n t e n a n c e o f a h e a l t h y m e g a k a r y o c y t e p o p u l a t i o n . C o n d i t i o n s w h i c h r e d u c e t h e n u m b e r o f v i a b l e m e g a k a r y - o c y t e s o r h e m a t o p o i e t i c c e l l s i n g e n e r a l m a y l e a d t o t h r o m b o c y t o p e n i a , b i c y t o p e n i a , o r p a n c y t o p e n i a . I n m o s t c a s e s o f b o n e m a r r o w i n j u r y , m u l t i p l e c e l l l i n e s a r e a f f e c t e d . 2 7 T h r o m b o p o i e s i s m a y a l s o b e d e c r e a s e d w h e n a d e q u a t e n u m b e r s o f m e g a k a r y o c y t e s a r e p r e s e n t i f t h e y a r e f u n c t i o n a l l y i m p a i r e d , t h o u g h t h i s i s d i f fi c u l t t o e v a l u a t e . 1 2 ( 1 ) c h e m i c a l t o x i c a n t s ( d r u g s ) w i t h p r e d i c t a b l e e f f e c t s P r e d i c t a b l e a n d d o s e - d e p e n d e n t t h r o m b o c y t 0 p e n i a s h a v e b e e n w e l l - d o c u m e n t e d f o r s e v e r a l c o m m o n m y e l o s u p p r e s s i v e d r u g s i n d o g s . O t h e r c h e m i c a l s h a v e b e e n i m p l i c a t e d b y c l i n i c a l r e p o r t s , b u t a fi r m c a u s e - a n d - e f f e c t r e l a t i o n s h i p h a s n o t b e e n e s t a b l i s h e d . ( a ) c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s T h e b o n e m a r r o w s u p p r e s s i o n o c c u r r i n g w i t h m a n y a n t i n e o p l a s t i c c h e m o t h e r a p e u - t i c a g e n t s i s a w e l l - r e c o g n i z e d t o x i c i t y t h a t i s n o t r e s t r i c t e d t o a n y p a r t i c u l a r c l a s s o f d r u g . 2 8 ‘ 3 ° M y e l o s u p p r e s s i o n , w h i c h m a y i n c l u d e t h r o m b o c y t o p e n i a , c a n o c c u r w i t h t h e u s e o f : 1 ) a l k y l a t i n g a g e n t s ( b u s u l f a n , c h l o r a m b u c i l , c y c l o p h o s p h a m i d e , m e l p h a l a n , 3 1 d a c a r b a z i n e ) ; 2 ) m i t o t i c i n h i b i t o r s ( v i n b l a s t i n e ) ; 3 ) a n t i r n e t a b o l i t e s ( p y r i m i d i n e a n a l o g u e s i n c l u d i n g c y t o s i n e a r a b i n o s i d c , 5 - fl u o r o u r a c i l , a n d 5 - a z a - 2 ’ - d e o x y c y t i d i n e , 3 2 p u r i n e a n a l o g u e s i n c l u d i n g 6 - m e r c a p t o p u r i n e a n d a z a t h i o p r i n e , 3 3 a n d t h e f o l i c a c i d a n t a g o n i s t m e t h o t r e x a t e ) ; 4 ) a n t i b i o t i c s ( d o x o r u b i c i n , m i t o m y c i n , m i t h r a m y c i n ) , a n d 5 ) o t h e r a g e n t s s u c h a s c i s p l a t i n , h y d r o x y u r e a , a n d c a r m u s t i n e . T h e s o m e t i m e s s e v e r e t h r o m b o c y t o p e n i a c a u s e d b y d o x o r u b i c i n i n d o g s 3 4 h a s b e e n a s s o c i a t e d w i t h d e c r e a s e d p l a t e l e t s u r v i v a l . 3 5 I t i s n o t k n o w n i f t h e d e c r e a s e d p l a t e l e t s u r v i v a l i s j u s t t h e r e s u l t o f a m o r e r a p i d t u r n o v e r o f p l a t e l e t s d u e t o t h e l o w p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s , o r i f d o x o r u b i c i n h a s m o r e d i r e c t e f f e c t s o n t h e p l a t e l e t s w h i c h c o n t r i b u t e t o t h e i r e a r l y r e m o v a l . 3 5 M y e l o s u p p r e s s i o n a n d t h r o m b o c y t o p e n i a w e r e p r o f o u n d a n d i n t o l e r a b l e w h e n d o x o r u b i c i n w a s e n c a p s u l a t e d i n g l u t a r a l d e h y d e — t r e a t e d e r y t h r o c y t e s b e f o r e a d m i n i s t r a t i o n , p e r h a p s b e c a u s e fi x a t i o n a l t e r e d t h e d r u g ’ s e f f e c t . ” W i t h t h e 1 3 r e l a t e d d r u g m i t o x a n t r o n e , t h r o m b o c y t o p e n i a d o e s n o t a p p e a r t o b e a c l i n i c a l p r o b l e m a t d o s a g e s u p t o 6 . 5 m g / m 2 . 3 7 ' 3 8 C i s p l a t i n , a s a s i n g l e a g e n t , i n d u c e d s e v e r e t h r o m b o c y - t o p e n i a w i t h o r w i t h o u t g r a n u l o c y t o p e n i a i n 1 0 % o f 4 1 d o g s t r e a t e d f o r a v a r i e t y o f m a l i g n a n c i e s . ” A z a t h i o p r i n e h a s a l s o b e e n a s s o c i a t e d w i t h p a n c y t o p e n i a i n d o g s . 4 0 ( b ) e s t r o g e n s E s t r o g e n s , f r o m e i t h e r e n d o g e n o u s o r e x o g e n o u s s o u r c e s , c a n h a v e p r o f o u n d e f f e c t s o n h e m a t o p o i e s i s i n s u c h s e n s i t i v e s p e c i e s a s f e r r e t s , 4 M 3 m i c e , “ a n d d o g s . 4 5 I n d o g s , t h e e f f e c t s o f n a t u r a l o r s y n t h e t i c e s t r o g e n s h a v e b e e n w e l l - s t u d i e d . H e m a t o - l o g i c a l l y , a m a r k e d i n i t i a l l e u k o c y t o s i s i s f o l l o w e d b y l e u k o p e n i a , p r o g r e s s i v e a n e m i a , a n d a p e r s i s t e n t t h r o m b o c y t o p e n i a . “ 5 ' 4 6 T h e s e fi n d i n g s a r e a s s o c i a t e d w i t h i n i t i a l l y s t i m u l a t e d b u t l a t e r d e p r e s s e d g r a n u l o p o i e s i s , d e p r e s s e d e r y t h r o p o i e s i s , a n d d e p r e s s e d t h r o m b o p o i e s i s a c c o m p a n i e d b y a h y p o p l a s t i c b o n e m a r r o w . “ 4 8 T h e s e v e r i t y o f t h e h e m a t o l o g i c c h a n g e s a r e d o s e - d e p e n d e n t a n d v a r y w i t h t h e i n d i v i d u a l a f f e c t e d ; a s p e c t r u m o f c o n d i t i o n s , f r o m a p l a s t i c p a n c y t o p e n i a t o t r a n s i e n t t h r o m b o c y t o p e n i a , m a y b e s e e n . W h i l e g r e a t i n d i v i d u a l v a r i a t i o n i n t h e t o x i c i t y o f e s t r o g e n s h a s b e e n f r e q u e n t l y n o t e d , o t h e r s h a v e c o n s i s t e n t l y i n d u c e d e x p e r i m e n t a l t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s . “ 4 9 A s i n g l e i n t r a m u s c u l a r i n j e c t i o n o f e s t r a d i o l v a l e r a t e ( 1 m g / k g ) i n t o 8 h e a l t h y d o g s l e d t o m e a n p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s t h a t w e r e s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t l y r e d u c e d b y d a y 7 , 9 . 1 % o f i n i t i a l v a l u e ( 3 5 1 , 0 0 0 / p l ) o n d a y 1 1 , a n d a t a n a d i r o f 1 2 , 0 0 0 / p l o n d a y 1 4 . 4 8 R e c o v e r y b e g a n o n d a y 1 7 a n d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s w e r e 1 2 5 , 0 0 0 / p 1 i n t h e 3 d o g s e v a l u a t e d o n d a y 2 3 . N o d o g s b l e d s p o n t a n e o u s l y , a n d m e a n p l a t e l e t v o l u m e s d i d n o t 1 4 c h a n g e . M e g a k a r y o c y t e n u m b e r s i n t h e b o n e m a r r o w w e r e m a r k e d l y r e d u c e d , a n d 1 1 1 I n — k i n e t i c s w e r e i n d i c a t i v e o f s u p p r e s s e d t h r o m b o p o i e s i s . T h e m a i n t e n a n c e o f m i n i m u m p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s a f t e r a l l r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s h a d d i s a p p e a r e d i n d i c a t e d p e r s i s t e n c e o f a b a s a l r a t e o f t h r o m b o p o i e s i s . P r e d i c t a b l e t h r o m b o c y t o p e n i a o f s i m i l a r s e v e r i t y a n d t i m e - c o u r s e w a s a l s o i n d u c e d i n 4 d o g s b y a s i n g l e i n t r a m u s c u l a r i n j e c t i o n o f e s t r a d i o l c y p i o n a t e a t a d o s e o f 1 m g / k g . “ 9 T h e s y n t h e t i c e t h y n y l e s t r a d i o l h a s a l s o i n d u c e d a d o s e d e p e n d e n t t h r o m b o c y t o p e - n i a . 5 0 A t a d o s e o f 1 m g / k g p e r 0 8 o n c e d a i l y , t h r o m b o c y t o p e n i a d e v e l o p e d w i t h a n a d i r o f 7 1 , 0 0 0 / p l d u r i n g w e e k 4 , w i t h p a r t i a l r e c o v e r y b e f o r e a s e c o n d l o w o f 8 5 , 0 0 0 / p l o n w e e k 1 0 . A t a d o s e o f 5 m g / k g , t h e m e a n p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n f e l l t o 3 , 0 0 0 / p l b y w e e k 3 a n d w a s p e r s i s t e n t l y l o w , r e s u l t i n g i n s e v e r e h e m o r r h a g e a n d d e a t h . S t u d i e s i n m i c e h a v e s h o w n t h a t e s t r o g e n s d o n o t d i r e c t l y i n h i b i t m y e l o p o i e s i s ; r a t h e r , t h e y s t i m u l a t e t h e m u r i n e t h y m u s t o p r o d u c e a n i n h i b i t o r o f g r a n u l o c y t e - m a c r o p h a g e p r o g e n i t o r c e l l r e p l i c a t i o n . 5 1 C a n i n e t h y m i c s t r o m a l c e l l s s t u d i e d i n v i t r o h a v e a l s o b e e n s h o w n t o p r o d u c e a n i n h i b i t o r o f m y e l o p o i e s i s , m o r e i n h i b i t o r y t h a n t h e m u r i n e a n a l o g u e , 5 2 w h i l e e s t r o g e n h a s n o s i g n i fi c a n t d i r e c t e f f e c t o n c a n i n e m a r r o w p r o g e n i t o r s . ‘ “ 5 - 5 2 T h i s a n d t h e p r e s e n c e o f e s t r o g e n r e c e p t o r s o n n o n l y m p h o i d t h y m i c c e l l s s u g g e s t s t h a t t h e t h y m u s m a y m e d i a t e e s t r o g e n - i n d u c e d m y e l o s u p p r e s s i o n i n v i v o . 5 2 I n v i v o s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t s o m e d o g s i n j e c t e d w i t h e s t r o g e n h a d a s e r u m f a c t o r i n h i b i t o r y t o G M - C F U f o r m a t i o n . 5 3 I t i s n o t y e t k n o w n i f t h i s f a c t o r i s t h e s a m e a s t h a t p r o d u c e d b y t h y m i c s t r o m a l c e l l s i n c u l t u r e , b u t i t m a y p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e d e v e l o p m e n t o f t h e c y t o p e n i a s p r o d u c e d i n s o m e a n i m a l s e x p o s e d t o e s t r o g e n . 5 3 F 3 1 1 5 V a r i a t i o n s i n t h e a m o u n t p r o d u c e d m a y e x p l a i n t h e v a r i a t i o n s a m o n g d o g s i n s u s c e p t i b i l i - t y t o e s t r o g e n m y e l o t o x i c o s i s f ‘ 2 C l i n i c a l l y , e s t r o g e n - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a d e v e l o p s f r o m e n d o g e n o u s a n d e x o g e n o u s e s t r o g e n S O l l l ‘ C C S . i ) e n d o g e n o u s T h r o m b o c y t o p e n i a w i t h b o n e m a r r o w h y p o p l a s i a o c c u r s s e c o n d a r y t o t h e h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f e n d o g e n o u s e s t r o g e n s p r o d u c e d b y s o m e t e s t i c u l a r s e r t o l i c e l l n e o p l a s m s “ 5 5 a n d b y s o m e o v a r i a n g r a n u l o s a c e l l n e o p l a s m s . 5 6 M y e l o s u p p r e s s i o n w i t h t h r o m b o c y t o p e n i a d u e t o h y p e r e s t r o g e n i s m h a s a l s o o c c u r r e d w i t h t e s t i c u l a r i n t e r s t i t i a l c e l l t u m o r s ? 7 fi ) e x o g e n o u s T h r o m b o c y t o p e n i a h a s a l s o o c c u r r e d a s a r e s u l t o f t h e u s e o f s y n t h e t i c e s t r o g e n s t o t e r m i n a t e p r e g n a n c i e s 5 8 o r a s t h e r a p i e s f o r s u c h c o n d i t i o n s a s e s t r o g e n - r e s p o n s i v e u r i n a r y i n c o n t i n e n c e , p r o s t a t i c h y p e r p l a s i a , a n d p e r i a n a l h e p a t o i d a d e n o m a s . 5 9 M a r r o w s u p p r e s s i o n i s n o t u n i q u e t o a n y p a r t i c u l a r s y n t h e t i c e s t r o g e n i c c o m p o u n d , t h o u g h t h e r e a p p e a r t o b e d i f f e r e n c e s i n t o x i c i t y . W h i l e m a n y b e l i e v e t h a t t h e c h a n c e f o r s u c c e s s i n t r e a t i n g d o g s w i t h e s t r o g e n - i n d u c e d m y e l o s u p p r e s s i o n a r e t o o l o w t o b e j u s t i fi e d , t h e r a p y h a s b e e n s u c c e s s f u l w h e n r e p e a t e d p l a t e l e t t r a n s f u s i o n s w e r e u s e d . “ 7 H o w e v e r , c o n s i d e r a b l e e f f o r t a n d e x p e n s e m a y b e r e q u i r e d t o p r o v i d e t h e n e c e s s a r y l o n g - t e r m s u p p o r t . S u r g i c a l e x t i r p a t i o n o f l 6 e s t r o g e n - p r o d u c i n g n e o p l a s m s i s c e r t a i n l y n e c e s s a r y w h e n e n d o g e n o u s s o u r c e s a r e p r e s e n t . ( c ) d r u g s w i t h i d i o s y n c r a t i c e f f e c t s P h e n y l b u t a z o n e a n d m e c l o f e n a m i c a c i d a r e n o n s t e r o i d a l a n t i - i n fl a m m a t o r y d r u g s w h i c h h a v e b e e n a s s o c i a t e d w i t h i d i o s y n c r a t i c m y e l o s u p p r e s s i o n a n d h y p o p l a s t i c b o n e m a r r o w s i n d o g s . “ " 7 ' ° ° ' ° ‘ B i c y t o p e n i a s a n d p a n c y t o p e n i a h a v e b e e n r e p o r t e d , b u t t h e p a t h o p h y s i o l o g y o f t h e s u p p r e s s i o n h a s n o t b e e n s t u d i e d i n d o g s . S c a t t e r e d c l i n i c a l c a s e r e p o r t s h a v e i m p l i c a t e d o t h e r d r u g s a s c a u s e s o f t h r o m b o c y t o p e n i a d u e t o m y e l o s u p p r e s s i o n . T h e s e i n c l u d e t h i a c e t a r c e m i d e w h i c h w a s a s s o c i a t e d w i t h p a n c y t o p e n i a , 6 2 t r i m e t h o p r i m - s u l f a m e t h o x a z o l e a s s o c i a t e d w i t h t h r o m b o c y t o p e n i a a n d a n e m i a , " 3 a n d t r i m e t h o p r i m - s u l f a d i a z i n e w i t h f e n b e n d a z o l e w h i c h w a s a s s o c i a t e d w i t h a p l a s t i c a n e m i a . ‘ 7 ' ° ‘ I n t h e c a s e o f t r i m e t h o p r i m - s u l f a d i a z i n e , i t a p p e a r s t h a t m y e l o s u p p r e s s i o n c a n o c c u r w h e n a d m i n i s t e r e d t o d o g s o n p o o r d i e t s w i t h p o o r f o l a t e s t a t u s . “ I n s u c h d o g s , p o t e n t i a t e d s u l f o n a m i d e s f u r t h e r d e c r e a s e f o l a t e c o n c e n t r a t i o n s b y i n h i b i t i n g s e q u e n t i a l s t e p s i n f o l a t e m e t a b o l i s m . T h i s c a n l e a d t o s u p p r e s s e d D N A s y n t h e s i s a n d r e d u c e d h e m a t o p o i e s i s . H o w e v e r , f o l a t e d e fi c i e n c i e s a r e r a r e i n d o g s , s o m o r e s t u d i e s a r e n e e d e d t o u n d e r s t a n d t h e s i g n i fi c a n c e o f t h i s p o t e n t i a l . I t i s i m p o r t a n t t o r e c o g n i z e t h e p o t e n t i a l m y e l o s u p p r e s s i v e e f f e c t s o f t h e p o t e n t i a t e d s u l f o n a m i d e s b e c a u s e t h e s e a n t i m i c r o b i a l s h a v e a l s o b e e n i m p l i c a t e d i n c a u s i n g i m m u n e - m e d i a t e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n i n d o g s ( s e e b e l o w ) . T h e t w o c o n d i t i o n s r e q u i r e d i f f e r e n t i a t i o n . 1 7 ( 2 ) i r r a d i a t i o n I o n i z i n g r a d i a t i o n f r o m s o u r c e s i n c l u d i n g x - r a y s , 6 0 C o , 1 9 8 A u , 2 2 ° R a , 2 3 9 P u , 9 0 S r , 2 1 0 P o , a n d 5 0 Y h a s l o n g b e e n u s e d t o i n d u c e g e n e r a l i z e d b o n e m a r r o w a p l a s i a i n d o g s f o r t h e s t u d y o f t h e e f f e c t s o f i r r a d i a t i o n a n d a s m o d e l s f o r t r e a t m e n t o f r a d i a t i o n - i n d u c e d d i s e a s e . 6 6 I r r a d i a t i o n , b e i t x - i r r a d i a t i o n , ‘ 5 7 ' 6 8 y - i r r a d i a t i o n ( " ’ o C o ) , 6 5 m o r i n t e r n a l B - i r r a d i a t i o n f r o m e x p o s u r e t o a n d a b s o r p t i o n o f “ ° " S r 7 2 ' 7 3 o r 3 2 P 7 4 m a y c a u s e t h r o m b o c y t o p e - n i a o r p a n c y t o p e n i a w i t h t e r m i n a l a p l a s t i c a n e m i a o r m y e l o p r o l i f e r a t i v e d i s e a s e . B e c a u s e 9 0 S r a n d 3 ‘ Z P t r a n s l o c a t e q u i c k l y t o t h e s k e l e t o n a f t e r e x p o s u r e , m y e l o s u p p r e s s i o n b y t h e s e B - e m i t t e r s i s s i m i l a r t o t h a t o f a c u t e e x t e r n a l r a d i a t i o n . T h i s m y e l o s u p p r e s s i o n h a s b e e n u s e d t o a d v a n t a g e i n t h e t h e r a p y ! o f s u c h c o n d i t i o n s i n d o g s a s p o l y c y t h e m i a v c r a ( p r i m a r y e r y t h r o c y t o s i s ) a n d e s s e n t i a l t h r o m b o c y t o s i s . 7 4 R e c e n t l y , m a r r o w - a b l a t i v e t o t a l b o d y i r r a d i a t i o n ( ° ° C o ) h a s b e e n u s e d i n d o g s p r i o r t o a u t o l o g o u s b o n e m a r r o w t r ' a n s p l a n t a t i o n . 7 5 ' 7 6 T h e s e d o g s r e q u i r e d a s l o n g a s 8 w e e k s f o r t h e i r p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s t o e x c e e d 2 0 , 0 0 0 / p l , a n d p l a t e l e t t r a n s f u s i o n s w e r e n e c e s s a r y f o r u p t o 7 w e e k s t o p r e v e n t s i g n i fi c a n t h e m o r r h a g e . ( 3 ) m y e l o p h t h i s i s M a r r o w r e p l a c e m e n t b y p r i m a r y o r m e t a s t a t i c n e o p l a s t i c p r o l i f e r a t i o n s c a n c a u s e m y e l o p h t h i s i c t h r o m b o c y t o p e n i a o r m u l t i p l e c y t o p e n i a s i n d o g s w h e n s u b s t a n t i a l m a r r o w i n fi l t r a t i o n i s p r e s e n t . I t m a y n o t b e p o s s i b l e , h o w e v e r , t o d e fi n i t i v e l y i n c r i m i n a t e p h y s i c a l m a r r o w r e p l a c e m e n t a s t h e p r i n c i p a l c a u s e o f s u p p r e s s e d h e m a t o p o i e s i s i n a n y g i v e n c a s e . M y e l o p h t h i s i c s u p p r e s s i o n h a s b e e n r e p o r t e d t o o c c u r i n d o g s w i t h a c u t e m y e l o g e n o u s a n d l y m p h o c y t i c l e u k e m i a s , 7 7 c h r o n i c l y m p h o c y t i c l e u k e m i a , ” 7 9 1 8 7 8 " “ m u l t i p l e m y e l o m a , 8 2 s o m e l y m p h o c y t o s i s o f l a r g e g r a n u l a r l y m p h o c y t e s , 8 0 l y m p h o m a , c a s e s o f m e g a k a r y o b l a s t i c l e u k e m i a 8 3 a n d o t h e r m y e l o p r o l i f e r a t i v e d i s o r d e r s i n v o l v i n g m e g a k a r y o c y t e s . 8 4 T h e s p e c t r u m o f m a r r o w i n v o l v e m e n t b y c a n i n e l y m p h o p r o l i f e r a t i v e m a l i g n a n c i e s , f r o m f o c a l t o p a c k e d p a t t e r n s , h a s b e e n d e s c r i b e d . 8 5 T h e p r e c i s e m e c h a n i s m s o f m y e l o p h t h i s i c - i n d u c e d m y e l o s u p p r e s s i o n a r e n o t k n o w n , b u t c o m p e t i t i o n f o r n u t r i e n t s , o c c l u s i o n o f b l o o d s u p p l y , l y s i s o f m a r r o w c e l l s , a n d s e c r e t i o n o f i n h i b i t o r s h a v e b e e n c o n s i d e r e d p o t e n t i a l c o n t r i b u t i n g f a c t o r s . M y e l o fi b r o s i s i s a l s o a c a u s e o f m a r r o w r e p l a c e m e n t a n d t h u s m a y p o t e n t i a l l y c a u s e o r c o n t r i b u t e t o t h r o m b o c y t o p e n i a . I n d o g s , m y e l o fi b r o s i s h a s b e e n a s s o c i a t e d w i t h n e o p l a s i a , h e m o l y t i c a n e m i a s , i r r a d i a t i o n , a n d m y e l o n e c r o s i s , t h o u g h t h e c a u s e i s u n k n o w n i n m a n y c a s e s . ” 8 7 T h r o m b o c y t O p e n i a h a s s p e c i fi c a l l y b e e n a s s o c i a t e d w i t h m y e l o fi b r o s i s i n d o g s w i t h n e o p l a s i a ” ; 8 8 D I C , 8 9 m y e l o n e c r o s i s , 8 8 p y m v a t e k i n a s e d e fi c i e n c y , “ " " 9 1 a n d e x p e r i m e n t a l i r r a d i a t i o n . “ 9 2 M y e l o n e c r o s i s w i t h o u t a p p a r e n t m y e l o fi b r o s i s h a s a l s o b e e n a s s o c i a t e d w i t h t h r o m b o c y t o p e n i a . 3 9 " ” 3 C a u s e s o f m y e l o - n e c r o s i s h a v e r e c e n t l y b e e n r e v i e w e d f o r d o g s a n d i n c l u d e i n f e c t i o n s , n e o p l a s i a , a n d d r u g s . 8 7 T h r o m b o p o i e s i s m a y n o t b e a s s e n s i t i v e t o m y e l o fi b r o s i s a s i s e r y t h r o p o i e s i s . I n o n e s e r i e s o f 1 4 d o g s w i t h m y e l o fi b r o s i s , 1 3 h a d n o n r e g e n e r a t i v e a n e m i a s ( m e a n H c t = 1 8 % ) b u t o n l y 3 w e r e t h r o m b o c y t o p e n i c , a n d n o t m a r k e d l y s o . “ 5 I n f a c t , 5 n o n t h r o m b o - c y t o p e n i c d o g s a c t u a l l y h a d a n i n c r e a s e d n u m b e r o f m e g a k a r y o c y t e s , c o n s i s t e n t w i t h t h e h y p o t h e s i s t h a t m e g a k a r y o c y t e - d e r i v e d g r o w t h f a c t o r s h a v e a p a t h o p h y s i o l o g i c r o l e i n a t l e a s t s o m e c a s e s o f m y e l o fi b r o s i s . T h e r e l a t i v e e f f e c t s o f m y e l o fi b r o s i s o n d i f f e r e n t m a r r o w c e l l l i n e s m a y d e p e n d o n t h e u n d e r l y i n g c a u s e . 1 9 ( 4 ) i m m u n e - m e d i a t e d s u p p r e s s i o n T h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h m a r k e d m a r r o w h y p o p l a s i a o r a p l a s i a h a s b e e n r e p o r t e d i n a d o g w i t h a p o s i t i v e r e s u l t f o r p o s s i b l e a n t i p l a t e l e t a n t i b o d i e s u s i n g a p l a t e l e t f a c t o r - 3 ( P F 3 ) a s s a y . 9 4 I M T w a s s t r o n g l y s u s p e c t e d , b u t r e s p o n s e t o t h e r a p y c o u l d n o t d i f f e r e n t i a t e t h e e f f e c t s o f o x y t e t r a c y c l i n e f r o m t h o s e o f c o r t i c o s t e r o i d s . O t h e r w e a k n e s s e s o f t h e c a s e s t u d y i n c l u d e d f a i l u r e t o e x a m i n e a c o r e b i o p s y o f t h e m a r r o w a n d u s e o f s e r u m f o r t h e P F 3 a s s a y ( d i s c u s s e d b e l o w ) . H o w e v e r , t h e c a s e s u g g e s t s t h a t a m e g a k a r y o c y t i c I M T m a y o c c u r i n d o g s , s i m i l a r t o t h e b e t t e r s t u d i e d c a n i n e c a s e s o f a n t i b o d y - m e d i a t e d p u r e e r y t h r o c y t e a p l a s i a . 9 5 A c q u i r e d a m e g a k a r y o c y t i c t h r o m b o c y t o p e n i a i n p e o p l e i s a r a r e d i s o r d e r c h a r a c t e r i z e d b y t h e a b s e n c e o r e x t r e m e p a u c i t y o f m e g a k a r y o c y t e s . I t p r o b a b l y h a s m u l t i p l e c a u s e s , b u t t h e g e n e r a l l a c k o f r e c o g n i z a b l e m e g a k a r y o c y t e s o r o f m a r r o w c e l l s r e a c t i v e w i t h a n t i - [ p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n ] a n t i b o d i e s s u g g e s t s a d e f e c t i n m e g a k a r y o c y t e d e v e l o p m e n t a t a s t a g e p r e c e d i n g t h e a c q u i s i t i o n o f p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n s . 9 6 I n s o m e c a s e s , i t h a s b e e n c a u s e d b y a n t i b o d i e s r e a c t i v e t o p l a t e l e t s a n d m e g a k a r y o c y t e s 9 ‘ 5 " " 7 o r t o c y t o k i n e s 9 8 t h a t n o r m a l l y p a r t i c i p a t e i n m e g a k a r y o c y t o p o i e s i s . W h i l e s u c h c a s e s a r e a c t u a l l y a t y p e o f I M T , t h e i r p a t h o g e n e s i s i n v o l v e s a n o b v i o u s p r o d u c t i o n f a i l u r e a n d s o t h e y a r e a d d r e s s e d h e r e . I n o n e c a r e f u l l y s t u d i e d h u m a n p a t i e n t w i t h a m e g a k a r y o c y t i c I M T a n d e l e v a t e d P A I g , I g G i s o l a t e d f r o m t h e p a t i e n t ’ s p l a s m a a f t e r s h e r e l a p s e d w i t h t h e d i s e a s e m a r k e d l y i n h i b i t e d t h e f o r m a t i o n o f m e g a k a r y o c y t e C F U , e s p e c i a l l y i n t h e p r e s e n c e o f c o m p l e - m e n t . 9 7 T h i s i n h i b i t i o n c o u l d b e r e m o v e d b y i n c u b a t i n g t h e I g G w i t h a u t o l o g o u s o r a l l o g e n e i c p l a t e l e t s . I g G i s o l a t e d f r o m a s a m p l e o b t a i n e d w h e n t h e p a t i e n t w a s i n 2 0 ’ r e m i s s i o n d i d n o t i n h i b i t m e g a k a r y o c y t o p o i e s i s . T h e s e fi n d i n g s i n d i c a t e d t h e p r e s e n c e o f a n t i b o d i e s t h a t b o u n d t o p l a t e l e t s a n d a l s o i n h i b i t e d n o r m a l m e g a k a r y o c y t o p o i e s i s . I n a n o t h e r p a t i e n t , G M - C S F a c t i v i t y w a s s u p p r e s s e d b y a n t i - [ G M - C S F ] a n t i b o d i e s s u c h t h a t t h e p a t i e n t h a d a m e g a k a r y o c y t i c t h r o m b o c y t o p e n i a i n t h e a b s e n c e o f e l e v a t e d P A I g . 9 8 W h i l e t h e s e r e p o r t s a r e r a r e , a n t i b o d i e s m a y m o r e c o m m o n l y r e a c t w i t h m e g a k a r y o c y t e s i n s u c h a w a y a s t o a l t e r t h e i r d e v e l o p m e n t a n d t h r o m b o p o i e t i c a c t i v i t y b u t n o t t h e i r n u m b e r ” 1 0 1 ( s e e b e l o w ) . C e l l - m e d i a t e d i m m u n i t y h a s a l s o b e e n i m p l i c a t e d i n t h e p a t h o g e n e s i s o f h u m a n a c q u i r e d a m e g a k a r y o c y t i c t h r o m b o c y t 0 p e n i a , w i t h s u p p r e s s i o n o f m e g a k a r y o c y t o p o i e s i s b e i n g t h o u g h t t o r e s u l t f r o m T l y m p h o c y t e s i n o n e c a s e a n d c e l l s o f t h e m o n o c y t e / m a c r o - p h a g e l i n e i n a n o t h e r . ‘ 0 2 T h e c o n t r i b u t i o n o f c e l l - m e d i a t e d i m m u n i t y t o c a n i n e a m e g a k a r y o c y t i c t h r o m b o c y t o p e n i c c o n d i t i o n s r e m a i n s t o b e s h o w n . I n c r e a s e d P A I g G h a s a l s o b e e n d e t e c t e d i n h u m a n p a t i e n t s w i t h a p l a s t i c p a n c y t o p e n i a , r e p o r t e d l y u n r e l a t e d t o t r a n s f u s i o n h i s t o r y . 1 0 3 " “ T h i s s u g g e s t s t h a t a p l a s t i c p a n c y t o p e n i a m a y h a v e a n a u t o i m m u n e o r i m m u n e - m e d i a t e d c o m p o n e n t i n s o m e p e o p l e , a n d t h a t p l a t e l e t d e s t r u c t i o n a n d d e c r e a s e d p l a t e l e t p r o d u c t i o n m a y o c c u r s i m u l t a n e o u s l y . S i n c e s o m e c a s e s o f p u r e e r y t h r o c y t e a p l a s i a i n d o g s a p p e a r t o h a v e a n i m m u n e - m e d i a t e d p a t h o g e n e s i s , ” 1 0 5 i t w o u l d s e e m r e a s o n a b l e t o h y p o t h e s i z e t h a t s o m e c a s e s o f a p l a s t i c p a n c y t o p e n i a i n d o g s m a y a l s o b e i m m u n e - m e d i a t e d . 2 1 ( 5 ) h e r e d i t a r y d i s o r d e r s ( a ) c y c l i c h e m a t o p o i e s i s C y c l i c h e m a t o p o i e s i s o f g r e y c o l l i e s i s a r a r e a u t o s o m a l r e c e s s i v e c o n d i t i o n c h a r a c t e r i z e d b y r e g u l a r c y c l i c fl u c t u a t i o n s i n l e u k o c y t e , r e t i c u l o c y t e , a n d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s w i t h a p e r i o d i c i t y o f a b o u t 1 1 - 1 4 d a y s . “ 1 0 7 P e r i o d i c d e c r e a s e s i n c e l l p r o d u c t i o n a r e d u e t o a s t e m c e l l d i s o r d e r t h a t i s c o r r e c t a b l e b y b o n e m a r r o w t r a n s p l a n t a t i o n . ‘ 0 8 C y c l i c d e p r e s s i o n s i n p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s m a y b e g r e a t e n o u g h t o i n d u c e t h r o m b o c y t o p e n i a i n a f f e c t e d d o g s . ( b ) h e r e d i t a r y t h r o m b a s t h e n i c t h r o m b o p a t h i a A v a r i a b l e b u t m o d e r a t e t h r o m b o c y t O p e n i a w a s r e p o r t e d i n o t t e r h o u n d s w i t h h e r e d i t a r y t h r o m b a s t h e n i c t h r o m b o p a t h i a , b u t t h e c a u s e o f t h e t h r o m b o c y t 0 p e n i a i s u n k n o w n . ‘ ° 9 ' “ ° T h e p r e s e n c e o f a l a r g e p o p u l a t i o n o f b i z a r r e g i a n t p l a t e l e t s a n d t h e d e fi c i e n c y i n s u r f a c e g l y c o p r o t e i n s i n a f f e c t e d d o g s s u g g e s t s t h a t t h e t h r o m b o c y t O p e n i a m a y b e t h e r e s u l t o f p r o d u c t i o n a b n o r m a l i t i e s . ( 6 ) i n f e c t i o n s D e c r e a s e d p l a t e l e t p r o d u c t i o n m a y c o n t r i b u t e t o t h e t h r o m b o c y t o p e n i a o f i n f e c t i o n s w h e n m e g a k a r y o c y t e s a r e d a m a g e d b y d i r e c t i n f e c t i o n , i m m u n e - m e d i a t e d m e c h a n i s m s , o r p r e s u m a b l y b y t h e l o c a l e f f e c t s o f m a r k e d i n t r a m e d u l l a r y i n fl a m m a t i o n . F o r e x a m p l e , c a n i n e d i s t e m p e r v i r u s c a n i n f e c t m e g a k a r y o c y t e s a n d m a y c o n t r i b u t e t o t h r o m b o c y t o p e n i a i n d i s t e m p e r . 1 1 1 C h r o n i c c a n i n e m o n o c y t i c e h r l i c h i o s i s i s a s s o c i a t e d w i t h b o n e m a r r o w h y p o p l a s i a a n d c y t o p e n i a s o f u n k n o w n c a u s e . “ 1 1 3 A n d i n f e c t i o n s 2 2 w i t h s u c h o r g a n i s m s a s L e i s h m a m ' a s p p . c a n b e a s s o c i a t e d w i t h g r a n u l o m a t o u s m a r r o w i n fi l t r a t e s o f o r g a n i s m - l a d e n m a c r o p h a g e s t h a t m a y a f f e c t h e m a t o p o i e s i s . “ T h e t h r o m b o c y t o p e n i a o f t h e s e d i s e a s e s i s m u l t i f a c t o r i a l a n d w i l l b e d i s c u s s e d i n m o r e d e t a i l b e l o w . C a n i n e p a r v o v i r u s i n f e c t s r a p i d l y d i v i d i n g c e l l s l e a d i n g m o s t n o t a b l y t o a c u t e e n t e r i t i s a n d o f t e n p a n l e u k o p e n i a . 1 1 5 P a r v o v i r a l i n f e c t i o n s h a v e r e p o r t e d l y b e e n a s s o c i a t e d w i t h s u p p r e s s i o n t h r o m b o c y t o p e n i a . 1 1 6 H o w e v e r , v i r a l a n t i g e n h a s m i n i m a l l y a n d i n c o n s i s t e n t l y b e e n f o u n d i n t h e b o n e m a r r o w o f e x p e r i m e n t a l l y i n f e c t e d d o g s , a n d , w h e n p r e s e n t , i t w a s n o t a p p a r e n t i n r e c o g n i z a b l e c e l l s o f t h e m e g a k a r y o c y t i c s e r i e s . “ 1 1 7 M o r e o v e r , t h e n e u t r o p e n i a a p p e a r s t o b e s e c o n d a r y t o s e v e r e e n t e r i t i s r a t h e r t h a n t o m a r r o w s u p p r e s s i o n . “ 5 O t h e r s t u d i e s h a v e f a i l e d t o i d e n t i f y s i g n i fi c a n t l y s u p p r e s s e d e r y t h r o p o i e s i s . 1 1 8 O v e r a l l , t h e r e i s n o c o m p e l l i n g e v i d e n c e t o i n d i c a t e t h a t s u p p r e s s e d h e m a t o p o i e s i s c a u s e s t h r o m b o c y t o p e n i a i n c a n i n e p a r v o v i r a l i n f e c t i o n s . W h e n t h r o m b o c y t o p e n i a o c c u r s , i t i s m o r e l i k e l y r e l a t e d t o s e p t i c e m i a / e n d o t o x e m i a a s s o c i a t e d w i t h s e v e r e e n t e r i t i s . 1 1 5 ( 7 ) i d i o p a t h i c B o n e m a r r o w a p l a s i a o r h y p o p l a s i a c a n o c c u r w i t h o u t a n o b v i o u s c a u s e , a s c a n m e g a k a r y o c y t i c a p l a s i a o r h y p o p l a s i a . S u c h c a s e s o f p l a t e l e t p r o d u c t i o n f a i l u r e m u s t b e c l a s s i fi e d a s i d i o p a t h i c , t h o u g h t h e y m a y i n f a c t b e t h e r e s u l t o f u n i d e n t i fi e d m y e l o s u p - p r e s s i v e t o x i c a n t s , i n f e c t i o n s , o r i m m u n o l o g i c d i s o r d e r s . 2 3 ( 8 ) o t h e r D e f e c t i v e p l a t e l e t p r o d u c t i o n a n d t h r o m b o c y t o p e n i a r e p o r t e d l y o c c u r w i t h u r e m i a , 1 1 9 b u t t h e p r e c i s e p a t h o g e n e s i s a n d f r e q u e n c y i n d o g s a r e n o t c l e a r . b . a b n o r m a l d i s t r i b u t i o n ( s e q u e s t r a t i o n ) C o n d i t i o n s f a l l i n g i n t o t h i s c a t e g o r y o c c u r w h e n t h e t o t a l b o d y p l a t e l e t m a s s i s n o r m a l , b u t t h e c i r c u l a t i n g p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n i s r e d u c e d b e c a u s e o f r e v e r s i b l e p l a t e l e t r e d i s t r i b u t i o n o u t o f t h e c i r c u l a t i o n . R e d i s t r i b u t i o n i n t o o r g a n s h a s b e e n c o m m o n l y r e f e r r e d t o a s s e q u e s t r a t i o n . H o w e v e r , t h e t e r m " s e q u e s t r a t i o n " h a s a l s o c o m m o n l y b e e n u s e d i n t h e c o n t e x t o f i r r e v e r s i b l e o r g a n t r a p p i n g d u e t o p l a t e l e t d e s t r u c t i o n b y t h e m o n o n u c l e a r p h a g o c y t e s y s t e m . 1 2 " I n t h i s d i s s e r t a t i o n , i r r e v e r s i b l e o r g a n t r a p p i n g f a l l s u n d e r t h e c a t e g o r y o f d e c r e a s e d p l a t e l e t s u r v i v a l . S e q u e s t r a t i o n i s u s e d t o d e s c r i b e r e v e r s i b l e p l a t e l e t r e d i s t r i b u t i o n o u t o f t h e c i r c u l a t i n g p o o l . I n c r e a s e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n m a y o c c u r t o s o m e d e g r e e a s a s e c o n d a r y p h e n o m e n o n . A p p r o x i m a t e l y o n e t h i r d o f h u m a n p l a t e l e t s u s u a l l y r e s i d e i n t h e s p l e e n . 1 2 1 R e p o r t s i n d o g s h a v e b e e n s i m i l a r } 1 2 2 a s a b o u t a t h i r d o f 1 1 1 I n — l a b e l e d p l a t e l e t s q u i c k l y d i s t r i b u t e t o t h e s p l e e n o n i n f u s i o n i n t o n o r m a l d o g s . 1 2 2 H o w e v e r , t h e r e m a y b e s o m e h a n d l i n g d a m a g e o f i n f u s e d p l a t e l e t s t h a t l e a d s t o s e l e c t i v e t r a p p i n g a n d d e s t r u c t i o n b y t h e s p l e n i c m o n o n u c l e a r p h a g o c y t e s y s t e m ( M P S ) , s o t h i s v a l u e c o u l d b e h i g h . E p i n e p h r i n e i n j e c t i o n s i n n o r m a l d o g s c a u s e d a r a p i d t r a n s i e n t i n c r e a s e i n p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s t h a t a m o u n t e d t o 3 3 % o f t h e p e a k c o n c e n t r a t i o n s . 1 2 3 W h e n e p i n e p h r i n e w a s g i v e n t o a s p l e n e c t o m i z e d d o g , t h e m e a n i n c r e m e n t i n p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n w a s 1 7 % o f t h e p e a k c o n c e n t r a t i o n . I f t h e d a t a f o r t h e s i n g l e a s p l e n i c d o g a r e l a r g e l y i r r i t a b l - 1 e l i t i s t p p m . 5 5 0 3 3 : : d i p r o p e l i t e r a t i ; 1 ‘ u l ‘ 3 ‘ ” ’ E r i fl r n b 5 9 : 3 1 : ( m i n i ; f l i e d : W i t h : O n e l f ‘ i i t m d l g g r 3 3 6 5 3 1 6 3 m i f ‘ l ‘ i ‘ S I r u m 2 4 a p p l i c a b l e t o o t h e r d o g s , t h e n t h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t d o g s h a v e a r a p i d l y m o b i l i z a b l e p l a t e l e t p o o l s p l i t n e a r l y e q u a l l y b e t w e e n t h e s p l e e n a n d e l s e w h e r e . H u m a n p a t i e n t s w i t h e n l a r g e d s p l e e n s f r o m s u c h d i s e a s e s a s l y m p h o m a , p o l y c y t h e m i a v e r a , a n d i n f e c t i o u s m o n o n u c l e o s i s w e r e S h o w n t o h a v e t h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h n o r m a l t o t a l p l a t e l e t m a s s e s . 1 2 1 S p l e n i c p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s w e r e d i s p r o p o r t i o n a t e l y h i g h c o m p a r e d t o t h e a m o u n t o f s p l e n i c b l o o d , a n d t h e s p l e e n s o f h y p e r s p l e n i c p a t i e n t s c o n t a i n e d a h i g h e r p e r c e n t a g e o f t h e t o t a l p l a t e l e t m a s s t h a n d i d s p l e e n s o f n o r m a l p a t i e n t s . E p i n e p h r i n e i n f u s i o n s c a u s e d i n c r e a s e d p l a t e l e t c o n c e n t r a — t i o n s i n n o r m a l a n d s p l e n o m e g a l i c s u b j e c t s b u t n o t i n a s p l e n i c p a t i e n t s . 1 2 1 T o g e t h e r , t h e d a t a s u p p o r t a n i n c r e a s e d p o o l i n g o f e x c h a n g e a b l e p l a t e l e t s i n e n l a r g e d s p l e e n s . S p l e n i c p l a t e l e t d e s t r u c t i o n w a s c o n s i d e r e d a s m a l l b u t a d d i t i v e c o n t r i b u t o r t o t h e t h r o m b o c y t o p e - n i a . S i m i l a r e f f e c t s o f s p l e n o m e g a l y h a v e b e e n p r e s u m e d t o o c c u r i n d o g s , b e i n g a s s o c i a t e d w i t h m i l d t o m o d e r a t e t h r o m b o c y t o p e n i a s o f l i t t l e c l i n i c a l s i g n i fi c a n c e . 2 7 G e n e r a l l y , w h e n e v e r u n e x p l a i n e d t h r o m b o c y t o p e n i a a c c o m p a n i e s s p l e n o m e g a l y i n d o g s , s p l e n i c s e q u e s t r a t i o n i s c o n s i d e r e d a l i k e l y c o n t r i b u t o r t o t h e t h r o m b o c y t o p e n i a . T h r o m b o c y t o p e n i a w a s a t t r i b u t e d t o s e q u e s t r a t i o n i n 3 o f 9 8 7 t h r o m b o c y t o p e n i c d o g s i n o n e r e v i e w , b u t t h e d e t a i l s w e r e n o t p r o v i d e d . ” S p l e n i c p o o l i n g r e p o r t e d l y c a n o c c u r i n d o g s w i t h s p l e n i c o r h e p a t i c n e 0 p l a s i a , s p l e n i c t o r s i o n , h e m o l y t i c c r i s i s , b a r b i t u r a t e a n e s t h e s i a , a n d h e p a t o m e g a l y . ” 1 2 4 H o w e v e r , s p l e n i c t r a p p i n g i n t h e s e c a s e s i s u n p r o v e n , a n d i f p r e s e n t , i t c o u l d r e l a t e t o e i t h e r r e v e r s i b l e ( r e d i s t r i b u t i o n ) o r i r r e v e r s i b l e ( d e s t r u c t i o n ) m e c h a n i s m s . fi g 5 w e . a g e fi e ” fi g 1 . 3 . - L r n 2 5 S p l e n i c p l a t e l e t s e q u e s t r a t i o n w i t h h e p a t o m e g a l y a n d l i v e r f a i l u r e i s r e p o r t e d l y s e c o n d a r y t o s h u n t i n g o f h e p a t i c b l o o d t o t h e s p l e n i c c i r c u l a t i o n d u e t o p o r t a l h y p e r t e n - s i o n . ” H o w e v e r , i f t h r o m b o c y t o p e n i a o c c u r s t h r o u g h t h i s m e c h a n i s m i n l i v e r f a i l u r e , i t w o u l d a p p e a r t o b e u n c o m m o n a n d c l i n i c a l l y l e s s i m p o r t a n t t h a n p l a t e l e t d y s f u n c t i o n . I n a p l a t e l e t s t u d y o f 2 0 d o g s w i t h c o n fi r m e d h e p a t i c d i s e a s e , 6 d o g s h a d m u c o c u t a n e o u s b l e e d i n g a s s o c i a t e d w i t h d e c r e a s e d p l a t e l e t f u n c t i o n b u t n o d o g w a s t h r o m b o c y t o p e n i c . 1 2 6 M i l d t o m o d e r a t e t h r o m b o c y t o p e n i a a n d s e v e r e n o n r e g e n e r a t i v e a n e m i a w e r e a t t r i b u t e d t o s p l e n o m e g a l y i n a d o g w i t h a h y p o c e l l u l a r b o n e m a r r o w a n d s p l e n i c h e m a t o p o i e s i s . 1 2 7 T h e d o g w a s t r e a t e d w i t h t e t r a c y c l i n e a n d c o r t i c o s t e r o i d s f o r s u s p e c t e d e h r l i c h i o s i s o r i m m u n e - m e d i a t e d d i s e a s e . B e c a u s e i t d i d n o t r e s p o n d f a v o r a b l y t o t h e r a p y , i t s s p l e e n w a s r e m o v e d a n d f o u n d t o w e i g h 1 5 % o f i t s t o t a l b o d y w e i g h t . B y 8 d a y s p o s t - s p l e n e c t o m y , t h e d o g ’ s h e m a t o c r i t h a d d o u b l e d a n d t h e p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n w a s o v e r 1 x 1 0 ° / p l . F i f t y d a y s a f t e r s p l e n e c t o m y t h e b o n e m a r r o w w a s h y p e r c e l l u l a r w i t h o u t a b n o r m a l i t i e s . N o c a u s e f o r t h e c y t o p e n i a s o t h e r t h a n s p l e n o m e g a l y w e r e i d e n t i fi e d , a n d s p l e n e c t o m y r e s o l v e d t h e c y t o p e n i a s . D o g s w i t h m a s s i v e s p l e n o m e g a l y d u e t o l y m p h o m a a r e o f t e n t h r o m b o c y t o p e n i c , a n d s p l e n e c t o m y m a y r e s o l v e t h e t h r o m b o c y t o p e n i a . 1 2 8 W h i l e t h i s s u g g e s t s t h a t s e q u e s t r a t i o n m a y h a v e a m e c h a n i s t i c r o l e i n t h e t h r o m b o c y t o p e n i a , o t h e r f a c t o r s s u c h a s i m m u n e d y s f u n c t i o n o r t h e t u m o r b u r d e n m a y b e i n v o l v e d . E x p e r i m e n t a l l y , t h e m a r k e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n d u c e d b y i n t r a v e n o u s e n d o t o x i n i n d o g s i s a s s o c i a t e d w i t h t r a n s i e n t p u l m o n a r y p l a t e l e t s e q u e s t r a t i o n w i t h p r o g r e s s i v e t r a n s l o c a t i o n o f t h e p u h n o n a r y p l a t e l e t s t o p r e d o m i n a n t l y t h e l i v e r w h e r e t h e y a r e a . . . 7 6 1 3 0 ; ? 2 6 d e s t r o y e d . ‘ 2 9 S e v e r e h y p o t h e r m i a , d e fi n e d b y r e c t a l t e m p e r a t u r e s o f 2 0 ° C , m a y i n d u c e s i g n i fi c a n t p l a t e l e t s e q u e s t r a t i o n i n t h e l u n g s , l i v e r , a n d s p l e e n o f d o g s . 1 3 0 E x p e r i m e n t a l i n f u s i o n o f a c o m b i n a t i o n o f f a c t o r X a a n d p h o s p h a t i d y l e h o — l i n e / p h o s p h a t i d y l s e r i n e v e s i c l e s i n t o d o g s w a s u s e d t o m i m i c t h e t h r o m b i n g e n e r a t i o n t h a t o c c u r s i n D I C . I t l e d t o s e l e c t i v e l o s s o f h i g h m o l e c u l a r w e i g h t m u l t i m e r s o f v o n W i l l e b r a n d ’ s f a c t o r ( v W F ) , a n d a r a p i d , r e v e r s i b l e t h r o m b o c y t o p e n i a t h a t w a s m a r k e d a n d a s s o c i a t e d w i t h c i r c u l a t i n g p l a t e l e t a g g r e g a t e s . 1 3 1 T h e s p e c i fi c c a u s e o f t h e t h r o m b o c y t o p e n i a i s u n k n o w n b u t a p p e a r e d t o b e d u e t o t r a n s i e n t s e q u e s t r a t i o n , p o s s i b l y o f p l a t e l e t a g g r e g a t e s i n t h e m i c r o c i r c u l a t i o n o r o f p l a t e l e t s a n d v W F a t e n d o t h e l i a l c e l l s u r f a c e s . S e v e r a l r e l a t i v e l y o l d s t u d i e s o f t h e a c u t e i n v i v o e f f e c t s o f h e p a r i n o n c a n i n e p l a t e l e t s h a v e b e e n r e p o r t e d . P l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s i n 3 d o g s g i v e n 2 0 0 U / k g w e r e t r a n s i e n t l y d e c r e a s e d a t 5 - 1 0 m i n u t e s , a t 5 - 9 0 m i n u t e s , a n d a t 5 - 7 5 m i n u t e s a f t e r h e p a r i n i n j e c t i o n } 4 0 Q u i c k " 4 1 h a d s i m i l a r r e s u l t s i n 4 d o g s , u s i n g 5 d i f f e r e n t h e p a r i n s . W h e n a t l e a s t 5 5 U h e p a r i n w e r e i n j e c t e d , t h e r e w a s a l w a y s a t r a n s i e n t , s e v e r e t h r o m b o c y t o p e n i a t h a t w a s u s u a l l y m a x i m a l a t 5 m i n u t e s a n d g o n e b y 3 0 m i n u t e s . H e f u r t h e r n o t e d t h a t a t 1 m i n u t e a f t e r i n j e c t i o n , a l l p l a t e l e t s w e r e i n c l u m p s ; a t m i n u t e 2 , s i n g l e p l a t e l e t s w e r e a p p e a r i n g b u t c l u m p s w e r e p r e s e n t ; a n d b y 5 m i n u t e s , a g g l u t i n a t i o n w a s g o n e . T h e a u t h o r s f e l t t h a t t h e r e t u m o f p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s t o n o r m a l w a s d u e t o p l a t e l e t r e l e a s e f r o m c l u m p s , i n t e r e s t i n g l y , w h i l e s t i l l i n t h e p r e s e n c e o f a m a r k e d h e p a r i n e m i a . F i d l a r 5 4 2 h a d s i m i l a r r e s u l t s , w i t h p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s d r o p p i n g t r a n s i e n t l y , s o m e t i m e s t o 1 0 % o f p r e h e p a r i n v a l u e s , w i t h i n t r a v e n o u s h e p a r i n i n f u s i o n s . T h e d e g r e e o f t h r o m b o c y t o p e n i a v a r i e d a m o n g d o g s , a n d w a s a s s o c i a t e d w i t h c l u m p i n g i n a l l d o g s f r o m I , 3 ' " . a i r - v . r C U S M U . P a " 0 ? i t s : 1 3 1 m ; 2 7 f r o m 2 . 5 m i n u t e s t o m o r e t h a n 1 h o u r a f t e r i n j e c t i o n . C o n t i n u o u s i n f u s i o n s m a i n t a i n e d d e p r e s s e d c o u n t s , t h o u g h n o t a s l o w a s t h e i n i t i a l d r 0 p . L e u k o c y t e c o n c e n t r a t i o n s t e n d e d t o d r o p s i m i l a r l y t o p l a t e l e t s . R o w s e l l 1 3 2 m o r e r e c e n t l y r e p o r t e d t h a t 5 0 , 9 0 , a n d 2 2 0 U / k g h e p a r i n s u b c u t a n e - o u s l y e v e r y 8 h o u r s h a d n o e f f e c t o n p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s i n d o g s , t h o u g h a t r a n s i e n t t h r o m b o c y t o p e n i a i n t h e fi r s t h o u r w o u l d n o t h a v e b e e n d e t e c t e d b y t h e p r o t o c o l . P l a t e l e t s u r v i v a l s i n t h e h e p a r i n i z e d d o g s w e r e a s s e s s e d b y d i i s o p r o p y l fl u o r o p h o s p h a t e - 3 2 P . W h i l e 2 2 0 U / k g h e p a r i n d e c r e a s e d p l a t e l e t s u r v i v a l w i t h o u t a f f e c t i n g p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s , 5 0 a n d 9 0 U / k g h e p a r i n a c t u a l l y p r o l o n g e d p l a t e l e t s u r v i v a l . T h e fi n d i n g s s u g g e s t t h a t t h e r e m a y b e a n a c u t e p l a t e l e t r e d i s t r i b u t i o n a f t e r h e p a r i n i n j e c t i o n t h a t i s a s s o c i a t e d w i t h p l a t e l e t c l u m p i n g b u t n o t n e c e s s a r i l y s h o r t e n e d p l a t e l e t s u r v i v a l . A t h i g h d o s e s o f h e p a r i n , p l a t e l e t s u r v i v a l m a y b e s h o r t e n e d , i n d i c a t i n g a c o n s u m p t i v e o r d e s t r u c t i v e m e c h a n i s m . L a s t l y , s e q u e s t r a t i o n h a s b e e n c o n s i d e r e d a p o s s i b l e c o n t r i b u t o r t o t h e t h r o m b o c y - t o p e n i a o f s o m e i n f e c t i o u s d i s e a s e s t o b e d i s c u s s e d i n l a t e r s e c t i o n s . c . s e v e r e b l o o d l o s s E x p e r i m e n t a l l y i n d u c e d s e v e r e a c u t e b l o o d l o s s h a s c a u s e d m o d e r a t e t h r o m b o c y t o - p e n i a i n d o g s w h e n a c c o m p a n i e d b y v o l u m e r e p l a c e m e n t . “ 1 3 4 T h r o m b o c y t o p e n i a w a s a s s o c i a t e d w i t h r e g e n e r a t i v e t h r o m b o p o i e t i c r e s p o n s e s c h a r a c t e r i z e d b y i n c r e a s e s i n m e a n p l a t e l e t v o l u m e a n d p l a t e l e t d e n s i t y . M i l d e r t h r o m b o c y t o p e n i a h a s d e v e l o p e d 6 t o 1 0 h o u r s a f t e r s e v e r e a c u t e h e m o r r h a g e w i t h o u t v o l u m e r e p l a c e m e n t . ‘ 3 5 2 8 C l i n i c a l l y , t h r o m b o c y t o p e n i a h a s b e e n a t t r i b u t e d t o b l o o d l o s s i n d o g s . 2 5 I n g e n e r a l , h o w e v e r , c l i n i c a l h e m o r r h a g e a l o n e i s u n l i k e l y t o c a u s e c l i n i c a l l y s i g n i fi c a n t 1 1 9 , 1 3 6 , 1 3 7 t h r o m b o c y t o p e n i a . d . p a t h o l o g i c a l l y d e c r e a s e d p l a t e l e t s u r v i v a l T h e a v e r a g e l i f e s p a n o f c a n i n e p l a t e l e t s i n t h e p e r i p h e r a l b l o o d i s a p p r o x i m a t e l y 5 - 7 d a y s w h e t h e r m e a s u r e d w i t h r a d i o a c t i v e 2 o r n e w e r b i o t i n y l a t i o n t e c h n i q u e s . 1 3 8 W h e n t h i s l i f e s p a n i s s h o r t e n e d b y a n a c c e l e r a t e d r e m o v a l o f p l a t e l e t s f r o m t h e c i r c u l a t i o n , t h r o m b o c y t o p e n i a w i l l o c c u r i f t h e r e i s n o c o m p e n s a t o r y i n c r e a s e i n t h r o m b o p o i e s i s . A c c e l e r a t e d r e m o v a l m a y b e d u e t o a n i n c r e a s e d u t i l i z a t i o n o f p l a t e l e t s , o f t e n c a l l e d c o n s u m p t i o n , a n d / o r t o a d e s t r u c t i o n o f p l a t e l e t s b y i m m u n o l o g i c o r n o n i r n m u n o l o g i c m e a n s . P l a t e l e t s u r v i v a l s t u d i e s c a n b e u s e d t o c o n fi r m a c c e l e r a t e d p l a t e l e t r e m o v a l , b u t t h e y h a v e n o t b e e n a p p l i e d c l i n i c a l l y t o d o g s . ( 1 ) n o n i m m u n o l o g i c a l l y d e c r e a s e d p l a t e l e t s u r v i v a l ( a ) d r u g s a n d f o r e i g n m a t e r i a l s N o n i m m u n o l o g i c , c o n s u m p t i v e , d r u g - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a s h a v e b e e n r e p r o d u c i b l y c a u s e d b y s e v e r a l p h a r m a c o l o g i c a g e n t s u s e d c l i n i c a l l y o r e x p e r i m e n t a l l y i n p e O p l e a n d i n d o g s . O t h e r d r u g s h a v e b e e n n o t e d t o c a u s e s u c h t h r o m b o c y t o p e n i a s d u r i n g t o x i c i t y t r i a l s i n d r u g d e v e l o p m e n t s t u d i e s . I t i s l i k e l y t h a t s o m e o f t h e s e g o u n r e p o r t e d a n d p u b l i s h e d r e p o r t s u n d e r e s t i m a t e t h e n u m b e r o f p h a r m a c o l o g i c c o m p o u n d s f o u n d t o i n d u c e t h r o m b o c y t o p e n i a . T h e f o l l o w i n g s e r v e a s e x a m p l e s . 2 9 i ) h e p a r i n A s d i s c u s s e d p r e v i o u s l y , p l a t e l e t s u r v i v a l m a y b e d e c r e a s e d i n d o g s g i v e n 2 2 0 U / k g h e p a r i n s u b c u t a n e o u s l y e v e r y 8 h o u r s . ‘ 3 2 H o w e v e r , t h r o m b o c y t o p e n i a d i d n o t o c c u r , s o t h e c l i n i c a l s i g n i fi c a n c e o f t h i s fi n d i n g i s q u e s t i o n a b l e . T h e r e h a v e b e e n n o r e p o r t s o f c l i n i c a l l y s i g n i fi c a n t h e p a r i n - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s . i i ) p r o t a m i n e s u l f a t e P r o t a m i n e s u l f a t e i s u s e d t o r e v e r s e t h e e f f e c t s o f h e p a r i n . I n h e p a r i n i z e d o r n o n h e p a r i n i z e d d o g s , i t c a n i n d u c e a r e l a t i v e l y s e v e r e t h r o m b o c y t o p e n i a ” ‘ 9 ‘ ” l w i t h p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n i n t h e l u n g s . ” 2 T h o u g h p r o t a m i n e - h e p a r i n c o m p l e x e s a c t i v a t e c o m p l e m e n t , c o m p l e m e n t a p p e a r s t o h a v e n o r o l e i n t h e t h r o m b o c y t o p e n i a i n d u c e d b y p r o t a m i n e i n d o g s . “ 3 T h e t h r o m b o c y t o p e n i a m a y r e l a t e t o t h e d i r e c t a n d i m m e d i a t e p r o a g g r e g a t o r y e f f e c t o f p r o t a m i n e o n w a s h e d h u m a n p l a t e l e t s . 1 4 4 i i i ) h u m a n I V I g G H u m a n g a m m a g l o b u l i n ( I V I g G ) p r e p a r a t i o n s h a v e r e c e n t l y b e e n e v a l u a t e d f o r u s e i n t r e a t i n g i m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a a n d h e m o l y t i c a n e m i a i n d o g s . A s i n g l e i n f u s i o n o f 1 m g / k g I V I g G t o d o g s i n d u c e d a n u n e x p l a i n e d m i l d t h r o m b o c y t o p e n i a ( 1 4 8 , 0 0 0 / p l ) w i t h a n a d i r o n d a y s 7 a n d 8 . 1 “ 5 T h i s e f f e c t w o u l d b e a n t a g o n i s t i c t o t h e d e s i r e d e f f e c t i f i t a l s o o c c u r s i n d o g s w i t h I M T . T h e r e f o r e , w h i l e a p r o v e n t h e r a p y f o r p e o p l e w i t h I M T , f u r t h e r s t u d i e s a r e i n d i c a t e d b e f o r e h u m a n I V I g G c a n b e r e c o m m e n d e d f o r u s e i n d o g s . . . $ 3 8 8 $ 8 3 . “ . q u A . . . ” 5 3 . 3 . 2 2 3 0 i v ) G M - C S F C a n i n e 1 4 6 a n d h u m a n r G M — C S F 1 4 7 w e r e s h o w n t o c a u s e a r e p r o d u c i b l e , d o s e - d e p e n d e n t , m i l d t o m a r k e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n n o r m a l d o g s . T h r o m b o c y t o p e n i a w a s a s s o c i a t e d w i t h n o r m a l o r i n c r e a s e d n u m b e r s o f m a r r o w m e g a k a r y o c y t e s , l a r g e c i r c u l a t i n g p l a t e l e t s , a n d d e c r e a s e d p l a t e l e t s u r v i v a l s . W h i l e p r o d u c t i o n m a y h a v e b e e n a f f e c t e d t o s o m e d e g r e e , t h e fi n d i n g s w e r e m o r e c o n s i s t e n t w i t h a c o n s u m p t i v e t h r o m b o c y t o p e n i a . v ) m o n o c r o t a l i n e p y r r o l e T h e p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d m o n o c r o t a l i n e i s t o x i c t o e n d o t h e l i a l c e l l s a n d c a u s e s a c u t e a n d p e r s i s t e n t t h r o m b o c y t o p e n i a i n e x p e r i m e n t a l l y e x p o s e d d o g s . ” ' 8 T h e t h r o m b o c y t o p e n i a i s a s s o c i a t e d w i t h p l a t e l e t d e p o s i t i o n i n t h e l u n g s , a n d w h i l e i t h a s b e e n t e r m e d s e q u e s t r a t i o n , i t i s l i k e l y n o t a p a s s i v e p r o c e s s . v i ) M D L 1 9 , 6 6 9 T h r o m b o c y t o p e n i a , a p p a r e n t l y a s s o c i a t e d w i t h d e c r e a s e d p l a t e l e t s u r v i v a l , o c c u r r e d i n d o g s r e c e i v i n g t h e a n t i d e p r e s s a n t c o m p o u n d M D L 1 9 , 6 6 0 . ” 9 T h r o m b o c y t o - p e n i a r e a c h e d m a x i m a l s e v e r i t y ( 1 0 , 0 0 0 - 4 0 , 0 0 0 ) b y 1 w e e k , a n d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s r e t u r n e d t o a t l e a s t b a s e l i n e v a l u e s b y 4 - 7 d a y s a f t e r c e s s a t i o n o f d o s i n g . 1 5 0 M e g a k a r y o - c y t i c h y p e r p l a s i a , i n c r e a s e d n u m b e r s o f l a r g e p l a t e l e t s w i t h a b u n d a n t r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m , a n d i m p r o v e m e n t i n p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s w h i l e d o g s w e r e s t i l l r e c e i v i n g t h e c o m p o u n d s u g g e s t e d a r e s p o n s i v e p r o d u c t i v e c a p a c i t y o f t h e b o n e m a r r o w . P l a t e l e t v a c u o l a t i o n w a s f e l t t o b e s u g g e s t i v e o f p o s s i b l e d i r e c t d a m a g e t o t h e p l a t e l e t s . T h e r e 3 1 w a s n o e v i d e n c e o f D I C o r s p l e n o m e g a l y . 1 5 0 T h e p r e c i s e m e c h a n i s m o f t h i s d r u g - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a w a s n o t d e t e r m i n e d , b u t i m m u n e m e c h a n i s m s a n d d i r e c t d r u g e f f e c t s w e r e c o n s i d e r e d . H o w e v e r , d i r e c t p r o a g g r e g a t o r y e f f e c t s w e r e n o t d e t e c t e d , a n d p r e d n i s o n e d i d n o t p r o t e c t f r o m t h e t h r o m b o c y t o p e n i a . P A I g w a s n o t m e a s u r e d . T h e s e s t u d i e s d e m o n s t r a t e t h e d i f fi c u l t i e s e n c o u n t e r e d i n u n d e r s t a n d i n g t h e p r e c i s e m e c h a n i s m o f d r u g - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a , e v e n i n a n e x p e r i m e n t a l s e t t i n g . v i i ) f o r e i g n s u r f a c e s D o g s h a v e c o m m o n l y b e e n u s e d t o t e s t t h e b i o c o m p a t i b i l i t y o f b i o m a t e r i a l s s u c h a s p l a s t i c s u s e d f o r v a r i o u s s o r t s o f c a t h e t e r s . P o l y v i n y l - c o a t e d p o l y e t h y l e n e t u b i n g i s a n e x a m p l e o f s u c h a m a t e r i a l w h i c h i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n t e s t d o g s . ‘ 5 ‘ v i i i ) c a t i o n i z e d a l b u m i n E x p e r i m e n t a l u s e o f c a t i o n i z e d a l b u m i n h a s i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s . ‘ 5 2 T h i s m a y . i n p a r t , b e d u e t o d i r e c t e f f e c t s s i n c e c a t i o n i z e d a l b u m i n c a u s e d p l a t e l e t a g g r e g a t i o n i n v i t r o . i x ) o t h e r I n p e o p l e , b l e o m y c i n , d e s m o p r e s s i n , m i t o m y c i n , r i s t o c e t i n , a n d h e m a t i n m a y a l s o c a u s e n o n i m m u n e d e s t r u c t i o n o f p l a t e l e t s . 1 1 T h e s e a n d o t h e r d r u g s m a y d o t h e s a m e i n d o g s . 3 2 ( b ) d i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n C o n s u m p t i v e c o a g u l a t i v e p r o c e s s e s s u c h a s d i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n ( D I C ) a r e , b y d e fi n i t i o n , a s s o c i a t e d w i t h t h e c o n s u m p t i o n o f p l a t e l e t s , fi b r i n o g e n , a n d c o a g u l a t i o n f a c t o r s . I n d o g s , s u c h e x c e s s i v e a c t i v i t y o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m h a s b e e n r e p o r t e d i n a s s o c i a t i o n w i t h n u m e r o u s c o n d i t i o n s i n c l u d i n g s e p s i s , n e c r o s i s , n e o p l a s i a , o v e r h e a t i n g , s e v e r e t r a t u n a , p a n c r e a t i t i s , s n a k e e n v e n o m a t i o n , h e p a t i c d i s e a s e , g a s t r i c d i l a t i o n a n d v o l v u l u s , c o n g e s t i v e h e a r t f a i l u r e , a n d h e a r t w o r m d i s e a s e . ‘ 5 3 " 5 9 I n D I C , e v i d e n c e o f s y s t e m i c t h r o m b o e m b o l i s m a n d o r g a n f a i l u r e m a y b e p r e s e n t . P l a t e l e t a n d fi b r i n o g e n c o n s u m p t i o n m a y b e e v i d e n c e d b y d e c r e a s e d c i r c u l a t i n g c o n c e n t r a t i o n s , t h o u g h s u r v i v a l s t u d i e s m a y b e n e c e s s a r y t o d o c u m e n t i n c r e a s e d c o n s u m p t i o n w h e n p r o d u c t i o n p a r t i a l l y c o m p e n s a t e s o r e v e n e x c e e d s i n c r e a s e s i n c o n s u m p t i o n . W h e n c o n s u m p t i o n o f c o a g u l a t i o n f a c t o r s o c c u r s a t a r a t e g r e a t e r t h a n c o m p e n s a t o r y p r o d u c t i o n , a n d p l a s m a c o n c e n t r a t i o n s o f p l a t e l e t s a n d c o a g u l a t i o n f a c t o r s a r e d r a m a t i c a l l y r e d u c e d , h e m o r r h a g e m a y e n s u e . C l i n i c a l a n d l a b o r a t o r y e v i d e n c e f o r D I C i n d i c a t e a n o n i m m u n o l o g i c c o n s u m p t i v e c o n t r i b u t i o n t o t h r o m b o c y t o p e n i a , b u t o t h e r m e c h a n i s m s r e s p o n s i b l e f o r t h r o m b o c y t o p e - n i a i n d o g s w i t h D I C d e p e n d o n t h e u n d e r l y i n g d i s e a s e . A n i m m u n o l o g i c c o m p o n e n t m a y b e p r e s e n t . P l a t e l e t s f r o m a d o g w i t h D I C o f u n k n o w n e t i o l o g y w e r e p o s i t i v e f o r P A I g i n o n e r e p o r t . 1 6 0 D o g s w i t h D I C o f u n r e p o r t e d c a u s e h a v e h a d p o s i t i v e r e s u l t s f o r p o s s i b l e a n t i p l a t e l e t a n t i b o d i e s u s i n g t h e P F 3 t e s t o r t h e d i r e c t m e g a k a r y o c y t e i m m u n o fl u o r e s c e n e e a s s a y . 1 6 1 T h e r e l a t i o n s h i p o f s u c h fi n d i n g s t o D I C i t s e l f v e r s u s t h e u n d e r l y i n g c o n d i t i o n r e q u i r e s f u r t h e r s t u d i e s . 3 3 E x p e r i m e n t a l l y , c o n s u m p t i v e c o a g u l a t i o n w i t h m i l d t o m o d e r a t e t h r o m b o c y t o p e n i a h a s o c c u r r e d i n d o g s a u t o t r a n s f u s e d a f t e r m a s s i v e i n t r a p e r i t o n e a l h e m o r r h a g e . “ 5 2 C o m p a r e d t o c o n t r o l d o g s t r a n s f u s e d w i t h b a n k e d b l o o d , a u t o t r a n s f u s e d d o g s h a d p r o l o n g e d P T a n d P T T S , e l e v a t e d F D P S , a n d d e c r e a s e d c o n c e n t r a t i o n s o f f a c t o r s I I , V , V I I I , fi b r i n o g e n , a n d p l a t e l e t s . V e r y l o w p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s i n t h e b l o o d p r o c e s s e d f o r a u t o t r a n s f u s i o n p r o b a b l y c o n t r i b u t e d t o t h e g r e a t e r t h r o m b o c y t o p e n i a a s c o m p a r e d t o t h a t o c c u r r i n g w i t h b a n k e d b l o o d t r a n s f u s i o n , b u t t h e r e a s o n s f o r t h e c o n s u m p t i v e c o a g u l o p a t h y a r e n o t c l e a r . ( e ) i n f e c t i o n s / s e p s i s W h i l e t h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h i n f e c t i o n m a y r e s u l t f r o m a n y c o m b i n a t i o n o f p a t h o p h y s i o l o g i c m e c h a n i s m s , d e c r e a s e d p l a t e l e t s u r v i v a l i s l i k e l y t o c o n t r i b u t e i n m a n y c a s e s . T h r o m b o c y t o p e n i a m a y o c c u r s p o r a d i c a l l y w i t h m a n y i n f e c t i o n s , e s p e c i a l l y i n t e r m i n a l p a t i e n t s w i t h w i d e s p r e a d s e p s i s . I n s u c h p a t i e n t s , t h r o m b o c y t o p e n i a m a y r e l a t e a s m u c h t o t h e p a t i e n t ’ s s t a t u s a s t o t h e d i s e a s e . T h e r e a r e s o m e i n f e c t i o u s a g e n t s , h o w e v e r , t h a t r e g u l a r l y i n d u c e t h r o m b o c y t o p e n i a b y d e c r e a s i n g p l a t e l e t s u r v i v a l . i ) g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a E n d o t o x e m i a f r o m g r a r n — n e g a t i v e b a c t e r i a l i n f e c t i o n s i s f r e q u e n t l y a s s o c i a t e d w i t h t b - l ' o m b o c y t o p e n i a . 1 6 3 E x p e r i m e n t a l i n f u s i o n s o f e n d o t o x i n t o d o g s r e s u l t s i n m a r k e d t i l l ‘ c z p m b o c y t o p e n i a ” ' ‘ 6 ' ” 5 6 w h i c h m a y b e t h e r e s u l t o f n u m e r o u s f a c t o r s i n c l u d i n g t h e g e n e r a t i o n o f p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r , 1 6 7 d i r e c t e f f e c t s o n t h e p l a t e l e t s , a n d t h e i n i t i a t i o n m ‘ 6 “ ? a i t } ’ 1 ‘ i i i 1 ’ , 3 4 o f D I C . P l a t e l e t d e p l e t i o n t o u n d e r 5 % o f c o n t r o l d o g s b y e s t r o g e n a d m i n i s t r a t i o n d i d n o t a l t e r t h e h e m o d y n a m i c r e s p o n s e s , m o r t a l i t y , o r g r o s s n e c r O p s y fi n d i n g s i n d u c e d b y e n d o t o x i n i n j e c t i o n . 4 9 T h r o m b o c y t o p e n i a , t h e r e f o r e , a p p e a r s t o b e s e c o n d a r y a n d n o t a p r i m a r y c a u s e o f t h e s a l i e n t c l i n i c a l f e a t u r e s o f c a n i n e e n d o t o x i c s h o c k . D i r e c t e f f e c t s o f e n d o t o x i n o n c a n i n e p l a t e l e t s h a v e b e e n e v a l u a t e d b y i n v i t r o a g g r e g o m e t r y . T h e s t u d i e s t o d a t e i n d i c a t e t h a t e n d o t o x i n b i n d s t o c a n i n e p l a t e l e t s , 1 6 8 a p p a r e n t l y n o n s p e c i fi c a l l y , a n d c a u s e s t h e m t o p a s s i v e l y a g g l u t i n a t e 1 6 8 w i t h o u t g r a n u l e r e l e a s e ‘ w ' 1 7 0 o r t h r o m b o x a n c p r o d u c t i o n . ‘ 7 ‘ T h i s d i r e c t e f f e c t a p p e a r s t o b e d e p e n d e n t u p o n t h e c o m p l e m e n t s y s t e m , “ ’ 9 w h i c h i s a l s o n e c e s s a r y f o r e n d o t o x i n - i n d u c e d a g g r e g a t i o n a n d r e l e a s e o f r a b b i t p l a t e l e t s . ” 2 " ” T h e c o n t r i b u t i o n o f t h e s e i n t e r a c t i o n s t o i n v i v o p l a t e l e t c l e a r a n c e i s u n k n o w n . E n d o t o x i n c a n a l s o s t i m u l a t e p r o c o a g u l a n t a c t i v i t y o n m o n o c y t e s l e a d i n g t o t h e s u r f a c e g e n e r a t i o n o f t h r o m b i n w h i c h m a y a c c e l e r a t e p l a t e l e t c l e a r a n c e . 1 7 ‘ T h i s m e c h a n i s m m a y c o n t r i b u t e t o t h r o m b o c y t o p e n i a i n m a n y i n f e c t i o n s a c c o m p a n i e d b y h i s t i o c y t i e / g r a n u l o m a t o u s p r o l i f e r a t i o n s . i i ) l e p t o s p i r o s i s T h r o m b o c y t o p e n i a i s a t y p i c a l fi n d i n g i n d o g s w i t h l e p t o s p i r o s i s . 1 7 5 E x p e r i m e n t a l i n f e c t i o n s o f d o g s w i t h L e p t o s p i r a i n t e r r o g a n s s e r o v a r s h a v e p r o d u c e d v a r i a b l e t h r o m b o c y t o p e n i a s a n d a s s o c i a t e d h e m o r r h a g e i n c o n c e r t w i t h i n c r e a s e d F D P S . ” " " 1 7 7 T h e f i n d i n g s h a v e s u g g e s t e d t h a t l o w g r a d e D I C m a y c a u s e o r c o n t r i b u t e t o t h e t h r o m b o c y t o - P e n i a , p o s s i b l y s e c o n d a r y t o e n d o t h e l i a l c e l l d a m a g e . L e p r o s p i r a l t o x i n s m a y b e r e s p o n s i b l e f o r t h e e n d o t h e l i a l c e l l d a m a g e a s w e l l a s a c t i n g d i r e c t l y o n p l a t e l e t s , p l a s m a i . ‘ . . t J . A . 3 5 p r o t e i n s , o r o t h e r t i s s u e s . L e p t o s p i r a l e x t r a c t s h a v e b e e n s h o w n t o c l u m p p l a t e l e t s i n v i t r o i n a m a n n e r s i m i l a r t o E . c o l i e n d o t o x i n , b u t h o w m u c h t h i s m a y c o n t r i b u t e t o t h e o b s e r v e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n i n f e c t e d d o g s i s n o t k n o w n . 1 7 8 i i i ) n e m a t o d e s P a r a s i t i s m b y t h e l u n g w o r m A n g i o s t r o n g y l u s v a s o m m h a s b e e n a s s o c i a t e d w i t h m i l d t o m o d e r a t e t h r o m b o c y t o p e n i a t h a t o c c u r r e d i n c o n j u n c t i o n w i t h l a b o r a t o r y e v i d e n c e o f a c o n s u m p t i v e c o a g u l o p a t h y . 1 7 9 H o w e v e r , a n i m m u n e - m e d i a t e d m e c h a n i s m i n v o l v i n g i n l l ' n u l t l e c o m p l e x e s a n d a c c e l e r a t e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n w a s e n t e r t a i n e d a s a r e a s o n a b l e c a u s e o r c o n t r i b u t o r t o t h e t h r o m b o c y t o p e n i a . N o d a t a w e r e g e n e r a t e d t o s u p p o r t o r r e f u t e t h i s h y p o t h e s i s . C a n i n e h e a r t w o r m d i s e a s e , c a u s e d b y t h e fi l a r i a l n e m a t o d e D i r o fi l a r i a i m m i t i s , h a s f r e q u e n t l y b e e n a s s o c i a t e d w i t h t h r o m b o c y t o p e n i a n m m T h e p u l m o n a r y a r t e r i t i s r e s I > < 3 n s i b l e f o r t h e c l i n i c a l s i g n s o f h e a r t w o r m d i s e a s e i s u n d o u b t e d l y a l s o d i r e c t l y r e s p o n s i b l e f o r p a r t o f t h e t h r o m b o c y t o p e n i a . 1 8 1 D a m a g e d e n d o t h e l i u m a n d d y i n g h e a r t w o r m s a r e a s s o c i a t e d w i t h p l a t e l e t c o n s u m p t i o n a n d f o r m a t i o n o f t h r o m b o e m b o l i , a n d p l a t e l e t h y p e r a g g r e g a b i l i t y h a s b e e n d o c u m e n t e d . 1 8 " D i r e c t p l a t e l e t i n t e r a c t i o n s w i t h P a r a s i t e s a n d t h e i r p r o d u c t s m a y a l s o b e i m p o r t a n t c o n t r i b u t o r s t o t h r o m b o c y t o p e n i a . T h r o m b o c y m p e n i a m a y b e w o r s e n e d b y a c c o m p a n y i n g h e m o l y s i s o r D I C . D I C h a s b e e n e s t a b l i s h e d a s a c a u s e o r c o n t r i b u t o r t o t h r o m b o c y t O p e n i a i n s o m e d o g s w i t h h e a r t w o r m d i s e a s e , i n c l u d i n g d o g s w i t h a n d w i t h o u t t h e v e n a c a v a s y n - 1 5 8 d r o m e . H o w e v e r , w h e r e l o w - g r a d e D I C h a s b e e n s u g g e s t e d t o c o n t r i b u t e t o t h r o m b o c y t o p e n i a i n s o m e d o g s w i t h h e a r t w o r m i n f e c t i o n s , t h e c o n s u m p t i o n o f fi b r i n o g e n m K — 3 6 a n d c o a g u l a t i o n f a c t o r s h a s n o t b e e n p r o v e n , 1 8 1 s o t h e t h r o m b o c y t o p e n i a m a y h a v e o t h e r o r i g i n s a s w e l l . T h r o m b o c y t o p e n i a s o m e t i m e s o c c u r s o r w o r s e n s w i t h a d u l t i c i d e t r e a t m e n t , p r e s u m a b l y d u e i n p a r t t o a c t i v a t i o n a n d c o n s u m p t i o n i n t h r o m b o e m b o l i a s s o c i a t e d w i t h d y i n g h e a r t w o r m s . O n e d o g w i t h h e a r t w o r m d i s e a s e a n d c l i n i c a l I M T h a s b e e n r e p o r t e d t o h a v e i n c r e a s e d P A I g , ‘ 6 O t h o u g h t h e t w o m a y h a v e b e e n u n r e l a t e d . P A I g fi n d i n g s f o r a l a r g e n u m b e r o f h e a r t w o r m - i n f e c t e d d o g s h a v e n o t b e e n r e p o r t e d , b u t i n f e c t e d d o g s h a v e b e e n s h o w n t o h a v e i n c r e a s e d c o n c e n t r a t i o n s o f c i r c u l a t i n g i m m u n e c o m p l e x e s 1 8 2 w h i c h m i g h t C o n t r i b u t e t o t h r o m b o c y t o p e n i a . D i r e c t C o o m b s ’ t e s t i n g o f h e a r t w o r m i n f e c t e d d o g s h a s f a i l e d t o i n d i c a t e a m a j o r i m m u n o l o g i c c o n t r i b u t i o n t o t h e a n e m i a o f h e a r t w o r m d i s e a s e , 1 8 3 i v ) R o c k y M o u n t a i n s p o t t e d f e v e r T h r o m b o c y t o p e n i a i s t h e m o s t c o n s i s t e n t h e m a t o l o g i c fi n d i n g i n R o c k y M o u n t a i n S 1 3 O t t e d f e v e r ( R M S F ) c a u s e d b y R i c k e t t s i a r i c k e t t s i i . 1 8 4 T h e o r g a n i s m i s d i s t r i b u t e d b y t i l e v e c t o r t i c k s t h e A m e r i c a n d o g t i c k ( D e r m a c e n t o r v a r i a b i l i s ) a n d t h e w o o d t i c k ( D e r m a c e n t o r a n d e r s o m ) w h i c h a r e f o u n d i n t h e e a s t e r n a n d w e s t e r n U n i t e d S t a t e s , 1 ‘ e S p e c t i v e l y . W h i l e t h r o m b o c y t o p e n i a i s u s u a l l y m i l d , i t m a y b e s e v e r e , e s p e c i a l l y i f D I C o c c u r s a s a t e r m i n a l e v e n t ‘ s “ H e m o r r h a g e m a y o c c u r i n i n f e c t e d d o g s , e v e n w i t h o u t m a r k e d r e d u c t i o n s i n p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s . I n a p r o s p e c t i v e s t u d y o f 2 8 d o g s w i t h c o n fi r m e d n a t u r a l l y - a c q u i r e d R M S F , ‘ 8 5 l 8 % h a d p e t e c h i a l o r e c c h y m o t i c h e m o r r h a g e s , a n d s o m e o f t h e s e d o g s h a d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s g r e a t e r t h a n 5 0 , 0 0 0 / p l . 3 7 O t h e r c o m m o n c l i n i c a l fi n d i n g s i n c l u d e a n o r e x i a , l e t h a r g y , f e v e r , l y m p h a d e n o m e g a l y , a n d c u t a n e o u s e d e m a a n d n e c r o s i s . ‘ 8 5 - “ 3 6 T h r o m b o c y t o p e n i a h a s c o n s i s t e n t l y o c c u r r e d i n e x p e r i m e n t a l R M S F i n f e c - t i o n s , “ ‘ ° ' ” ‘ 8 ' 5 3 8 t h o u g h c l i n i c a l h e m o r r h a g e h a s n o t . 5 3 8 W h e n t h r o m b o c y t o p e n i a w a s a s s o c i a t e d w i t h p e t e c h i a l a n d e c c h y m o t i c h e m o r r h a g e s , t h e r e w a s m i c r o s c o p i c e v i d e n c e o f n e c r o t i z i n g v a s c u l i t i s i n v o l v i n g c a p i l l a r i e s , v e i n s , a n d s m a l l a r t e r i e s . 1 8 6 V a s c u l a r l e s i o n s w e r e t h o u g h t t o b e o f t w o f o r m s . D o g s d y i n g a c u t e l y h a d e n d o t h e l i a l d a m a g e S U g g e s t i v e o f d i r e c t e f f e c t s o f t h e o r g a n i s m . L a t e r l e s i o n s w e r e s i m i l a r t o i m m u n e - m e d i a t e d v a s c u l i t i d e s , s u g g e s t i n g t h e p o s s i b i l i t y o f a n i m m u n e - c o m p l e x p a t h o g e n e s i s . I n h l l m a n R M S F p a t i e n t s , v a s c u l i t i s l e a d s t o i n c r e a s e d v a s c u l a r p e r m e a b i l i t y , m i c r o - t h r < > l ' n b u s f o r m a t i o n , a n d h e m o r r h a g e s u c h a s f o c a l r e t i n a l h e m o r r h a g e s . ‘ 8 7 I n c r e a s e d r e t i t l a ] v a s c u l a r p e r m e a b i l i t y h a s a l s o b e e n d o c u m e n t e d i n e x p e r i m e n t a l l y i n f e c t e d d o g s . ‘ 8 8 T h i s g e n e r a l i z e d v a s c u l a r e n d o t h e l i a l d a m a g e i s p r e s u m a b l y t h e c a u s e o f t h r o m b o c y t o p e - I l i a i n R M S F , “ 1 8 9 b u t w h e t h e r i t r e s u l t s f r o m a d i r e c t e f f e c t o f t h e o r g a n i s m , i m m u n e - Q 0 t r i p l e x d i s e a s e , o r s o m e o t h e r m e c h a n i s m i s u n k n o w n . ‘ 8 8 T h e f a c t t h a t t h e o r g a n i s m r e p l i c a t e s i n e n d o t h e l i a l c e l l s o f s m a l l b l o o d v e s s e l s a I l c l c a p i l l a r i e s i s s u g g e s t i v e t h a t d i r e c t d a m a g e c o n t r i b u t e s t o t h e v a s c u l i t i s . 1 8 7 H u m a n P l a t e l e t s h a v e b e e n s h o w n t o a d h e r e m u c h m o r e t o R . r i c k e t t s i a - i n f e c t e d c u l t u r e d h u m a n e n d o t h e l i a l c e l l s t h a n t o u n i n f e c t e d c o n t r o l s , e v e n w h e n c e l l d a m a g e w a s m i n i m a l l y d e t e c t a b l e b y t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y . T h u s , e n d o t h e l i a l c e l l i n f e c t i o n i n v i v o m a y a l t e r t h e c e l l s i n s u c h a w a y a s t o a t t r a c t a n d c o n s u m e p l a t e l e t s l e a d i n g t o t h r o m b o c y t o p e n i a . W i t h e n d o t h e l i a l c e l l d a m a g e , p l a t e l e t s m a y a l s o b e c o n s u m e d a s t h e y p a t c h v a s c u l a r d e f e c t s b y b i n d i n g t o s u b e n d o t h e l i a l c o l l a g e n . 3 8 P l a t e l e t s f r o m d o g s w i t h e x p e r i m e n t a l R M S F t e n d e d ' t o r e s p o n d m o r e t o A D P t h a n d i d t h o s e o f u n i n f e c t e d c o n t r o l s ; t h e a g g r e g a t i o n s 1 0 p e s , m a x i m u m a m p l i t u d e s , a n d t h e p e r c e n t a g e o f d o g s w i t h i r r e v e r s i b l e a g g r e g a t i o n w e r e g r e a t e r i n t h e R M S F g r o u p . T h i s m a y h a v e b e e n r e l a t e d t o t h e i r i n c r e a s e d m e a n p l a t e l e t v o l u m e s . 1 9 0 H y p e r a g g r e g a b i l i t y a n d i n c r e a s e d m e a n s i z e a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e p r o p o s e d p e r i p h e r a l c o n s u m p t i v e p r o c e s s . H o w e v e r , D I C d o e s n o t s e e m t o b e o p e r a t i v e i n t y p i c a l n a t u r a l o r e x p e r i m e n t a l i n f e c t i o n s . ‘ 3 5 " 8 ° " 8 8 T h e r e i s n o e v i d e n c e t o d a t e t o i n c r i m i n a t e a r o l e f o r e n d o t o x i n . W h i l e i m m u n e c o m p l e x e s m a y p l a y a r o l e i n t h e p a t h o g e n e s i s o f R M S F v a s c u l i t i s , i m m u n e c o m p l e x v a s c u l i t i s w a s c o n s i d e r e d a n u n l i k e l y c a u s e o f i n c r e a s e d r e t i n a l v a s c u l a r P e r i n e a b i l i t y i n e x p e r i m e n t a l l y i n f e c t e d d o g s . 1 8 8 T h i s w a s b e c a u s e a h u m o r a l r e s p o n s e w a s n o t d e t e c t e d u n t i l p o s t - i n o c u l a t i o n d a y 8 , b u t p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s b e g a n t o d e e r e a s e o n d a y 4 a n d r e t i n a l v a s c u l a r p e r m e a b i l i t y i n c r e a s e d o n d a y 6 . A l s o , v a s c u l a r r e I > a i r o c c u r r e d a s t i t e r s c o n t i n u e d t o r i s e . O t h e r s h a v e i n v e s t i g a t e d t h e p l a s m a f r o m d O g s w i t h n a t u r a l l y - a c q u i r e d R M S F f o r P B I g 1 8 5 u s i n g t h e i n d i r e c t E L I S A o f C a m p b e l l . 1 9 1 A l l 6 s a m p l e s t e s t e d w e r e n e g a t i v e . W h i l e t h e s e fi n d i n g s o f f e r n o e v i d e n c e f o r a n i n ' l m u n o l o g i c c o n t r i b u t i o n t o t h e v a s c u l i t i s a n d t h r o m b o c y t o p e n i a , t h e y d o n o t e x c l u d e t h e D O S S i b i l i t y . v ) i n f e c t i o u s c a n i n e h e p a t i t i s D o g s w i t h e x p e r i m e n t a l l y - i n d u c e d i n f e c t i o u s c a n i n e h e p a t i t i s ( c a n i n e a d e n o v i r u s - 1 ) d e v e l o p e d m u c o s a l a n d c u t a n e o u s p e t e c h i a e i n a s s o c i a t i o n w i t h p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s l e s s t h a n 5 0 , 0 0 0 / p 1 . 1 9 2 T h r o m b o c y t 0 p e n i a w a s a c c o m p a n i e d b y d e c r e a s e d p l a t e l e t r e t e n t i o n o n g l a s s b e a d s , p r o l o n g e d P T a n d P T T , d e p r e s s e d c o a g u l a t i o n f a c t o r V I H c o n c e n t r a t i o n s , 3 9 i n c r e a s e d F D P S , a n d i n c r e a s e d n u m b e r s o f c i r c u l a t i n g m e g a p l a t e l e t s . W h i l e b o n e m a r r o w s o f s u r v i v i n g d o g s w e r e h y p e r p l a s t i c , t h o s e o f f a t a l l y i n f e c t e d d o g s w e r e h y p o p l a s t i c w i t h m e g a k a r y o c y t i c h y p o p l a s i a . E r y t h r o c y t e f r a g m e n t a t i o n , d e c r e a s e d p l a t e l e t s u r v i v a l s , d e c r e a s e d a g g r e g a t o r y r e s p o n s i v e n e s s t o A D P w i t h l e s s s e c o n d a r y a g g r e g a t i o n , a n d u l t r a s t r u c t u r a l e v i d e n c e o f v a c u o l a t i o n a n d d i l a t i o n o f t h e o p e n s u r f a c e c a n a l i c u l a r s y s t e m w e r e a l s o n o t e d . 1 9 3 T o g e t h e r , t h e fi n d i n g s s u g g e s t t h e d e v e l o p m e n t o f D I C , m o s t l i k e l y s e c o n d a r y t o w i d e s p r e a d e n d o t h e l i a l c e l l d a m a g e b y t h e v i r u s . D i r e c t e f f e c t s o f t h e v i r u s o n t h e p l a t e l e t s a n d m e g a k a r y o c y t e s c o u l d n o t b e e x c l u d e d a s C o n t r i b u t o r y t o t h e t h r o m b o c y t o p e n i a . v i ) h e r p e s v i r u s P u p p i e s i n f e c t e d w i t h c a n i n e h e r p e s v i r u s m a y h a v e m a r k e d t h r o m b o c y t o p e n i a a s s ( D e c i a t e d w i t h d i f f u s e n e c r o t i z i n g v a s c u l i t i s a n d w i d e s p r e a d p e t e c h i a l h e m o r r h a g e s . “ T h r o m b o c y t o p e n i a i s p r e s u m a b l y s e c o n d a r y t o t h e v a s c u l i t i s w h i c h m a y a l s o l e a d t o D I C . v i i ) s e p t i c p e r i t o n i t i s E x p e r i m e n t a l l y , m a r k e d t h r o m b o c y t o p e n i a o c c u r r e d s e c o n d a r y t o s e p t i c p e r i t o n i t i s i n d o g s g i v e n i n t r a p e r i t o n e a l p r o c e s s e d h u m a n f e c e s . ‘ 9 5 L a c k o f c o m p l e m e n t c o n s u m p - t i o n s u g g e s t e d t h a t t h e t h r o m b o c y t o p e n i a w a s n o t m e d i a t e d b y c o m p l e m e n t . D e c r e m e n t s i n p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n w e r e a s s o c i a t e d w i t h i n c r e m e n t s i n fi b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n , b u t fi b r i n o g e n k i n e t i c s , c o a g u l a t i o n t i m e s , a n d fi b r i n / fi b r i n o g e n d e g r a d a t i o n p r o d u c t s w e r e n o t a s s e s s e d t o d e t e r m i n e i f i n c r e a s e d c o n s u m p t i o n o f c o a g u l a t i o n f a c t o r s w a s p r e s e n t . T h e r o l e o f e n d o t o x i n s w a s n o t i n v e s t i g a t e d . d i s c u s s e d b e l o w . _ . . _ « J E T - " v . . . J — J " . - ' 4 0 O t h e r i n f e c t i o n s a s s o c i a t e d w i t h t h r o m b o c y t o p e n i a t h a t m a y b e p a r t i a l l y a t t r i b u t a b l e t o d e c r e a s e d p l a t e l e t s u r v i v a l w i l l b e d i s c u s s e d b e l o w . ( ( 1 ) n e o p l a s i a T h e t h r o m b o c y t o p e n i a o f n e o p l a s i a m a y b e a t t r i b u t a b l e t o m a n y m e c h a n i s m s i n c l u d i n g s e v e r a l a s s o c i a t e d w i t h p a t h o l o g i c a l l y d e c r e a s e d p l a t e l e t s u r v i v a l . B e c a u s e o f t h e m u l t i f a c t o r i a l n a t u r e o f t h e t h r o m b o c y t o p e n i a a n d t h e d i f fi c u l t y i n d e fi n i n g t h e p r i n c i p a l c a u s e i n a n y p a r t i c u l a r c a s e , n e o p l a s i a - a s s o c i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a w i l l b e ( e ) e n v e n o m a t i o n T h e v e n o m o f s o m e s n a k e s c o n t a i n s p l a t e l e t - a c t i v a t i n g f a c t o r s t h a t c a n p r o d u c e a l ' I l é l r k e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n t h e a b s e n c e o f D I C , w h i l e o t h e r s i n d u c e t h r o m b o c y t o p e n i a a s S O c i a t e d w i t h D I C . 1 5 6 ( f ) e x t r a c o r p o r e a l c i r c u l a t i o n E x t r a c o r p o r e a l c i r c u l a t i o n o f h u m a n b l o o d d u r i n g o p e n h e a r t s u r g e r y c a u s e s a P l a t e l e t f u n c t i o n d e f e c t a n d t h r o m b o c y t o p e n i a w i t h t h e f o r m a t i o n o f p l a t e l e t m i c r o - p a r t i c l e s , p o s s i b l y d u e t o a c t i v a t i o n b y f o r e i g n s u r f a c e s a n d t u r b u l e n t fl o w . C a n i n e p l a t e l e t s a r e s i m i l a r l y a f f e c t e d . 1 9 ° 4 1 ( g ) z i n c - i n d u c e d h e m o l y t i c a n e m i a T h r o m b o c y t O p e n i a h a s b e e n r e p o r t e d i n a s s o c i a t i o n w i t h s o m e c a s e s o f z i n c - i n d u c e d h e m o l y t i c a n e m i a i n d o g s , ‘ 9 7 ' 1 9 8 a n d i n s o m e c a s e s i t w a s a p p a r e n t l y a m a n i f e s t a t i o n o f D I C . 1 9 7 " ” H o w e v e r , t h e r e l e a s e o f A D P f r o m l y s e d e r y t h r o c y t e s m a y b e c o n t r i b u t o r y t o p l a t e l e t c o n s u m p t i o n i n t h i s a n d o t h e r f o r m s o f h e m o l y t i c a n e m i a . I n h u m a n i n f a n t s w i t h e r y t h r o b l a s t o s i s f e t a l i s , a m o d e r a t e t h r o m b o c y t o p e n i a m a y o c c u r . T h e p l a t e l e t s d o n o t s h a r e t h e a n t i g e n i c t a r g e t t h a t i s r e s p o n s i b l e f o r t h e i m m u n e - m e d i a t e d e r y t h r o c y t e d e s t r u c t i o n ; r a t h e r , i t a p p e a r s t h a t p l a t e l e t s a r e d e s t r o y e d a s a r e s u l t 0 f b r e a k d o w n p r o d u c t s o f e r y t h r o c y t e s . ’ 1 ( h ) h y p o p h o s p h a t e m i a H y p o p h o s p h a t e m i a p r o d u c e d b y h y p e r a l i r n e n t a t i o n i n d o g s h a s c a u s e d t h r o m b o c y - t o D e n i a a s s o c i a t e d w i t h s h o r t e n e d p l a t e l e t s u r v i v a l a n d d e c r e a s e d c l o t r e t r a c t i o n . 2 0 0 A f f e c t e d d o g s h a d m e g a p l a t e l e t s , m e g a k a r y o c y t i c h y p e r p l a s i a , a n d h e m o r r h a g e . P l a t e l e t A T P c o n c e n t r a t i o n s w e r e d e c r e a s e d , p e r h a p s d u e t o t h e i n h i b i t i o n o f a n a e r o b i c g l y c o l y s i s i n d u c e d b y h y p o p h o s p h a t e m i a , s i n c e p h o s p h a t e s u p p l e m e n t a t i o n p r e v e n t e d t h e s e c h a n g e s . T h e c o n t r i b u t i o n o f c o n c u r r e n t h y p o p h o s p h a t e m i a - i n d u c e d e r y t h r o c y t e h e m o l y s i s t o t h e t h r o m b o c y t o p e n i a w a s n e i t h e r d i s c u s s e d n o r e v a l u a t e d . ( i ) t h r o m b o t i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a / h e m o - l y t i c u r e m i c s y n d r o m e T h r o m b o t i c t h r o m b o c y t 0 p e n i c p u r p u r a ( T T P ) i s a c l i n i c a l s y n d r o m e c h a r a c t e r i z e d b y h e m o l y t i c a n e m i a w i t h e r y t h r o c y t e f r a g m e n t a t i o n , t h r o m b o c y t o p e n i a , n e u r o l o g i c 4 2 a b n o r m a l i t i e s , a n d u s u a l l y f e v e r a n d r e n a l d y s f u n c t i o n . 1 1 T h e s y n d r o m e h a s b e e n a s s o c i a t e d w i t h a u t o i m m u n e d i s e a s e s a n d i n f e c t i o n s , b u t t h e p a t h o g e n e s i s o f t h e s y n d r o m e i s l a r g e l y u n c l e a r a n d l i k e l y m u l t i f a c t o r i a l . I t i s p o s s i b l e , h o w e v e r , t h a t a l t e r e d v a s c u l a r e n d o t h e l i u m m a y b e t h e u n i f y i n g d i s o r d e r i n T T P . H e m o l y t i c u r e m i c s y n d r o m e ( H U S ) i s a r e l a t e d s y n d r o m e c h a r a c t e r i z e d b y a c u t e r e n a l f a i l u r e , f e v e r , h e m o l y t i c a n e m i a w i t h e r y t h r o c y t e f r a g m e n t a t i o n , a n d t h r o m b o c y t o p e n i a . H U S i s m o r e c o m m o n i n c h i l d r e n t h a n i n a d u l t s , a n d i t d i f f e r s f r o m T T P i n t h a t r e n a l f a i l u r e p r e d o m i n a t e s a n d n e u r o l o g i c a b n o r m a l i t i e s a r e u s u a l l y a b s e n t . T h e s y n d r o m e h a s b e e n a s s o c i a t e d w i t h i n f e c t i o n s , c e r t a i n d r u g s , a n d a n t i b o d i e s r e a c t i v e w i t h e n d o t h e l i a l c e l l s . A s w i t h T T P , i t s e e m s l i k e l y t h a t t h e v a s c u l a r e n d o t h e l i u m , e s p e c i a l l y o f t h e r e n a l v a s c u l a t u r e , i s a l t e r e d a n d d y s f u n c t i o n a l . A s y n d r o m e s i m i l a r t o H U S h a s b e e n r e p o r t e d i n 4 d o g s , e a c h l e s s t h a n 2 y e a r s o l d . 2 0 1 T h e s e d o g s h a d a c u t e o n s e t o f v o m i t i n g a n d l e t h a r g y , a n d t h e y d e v e l o p e d s e v e r e t h r o m b o c y t o p e n i a w i t h r e n a l f a i l u r e . O t h e r fi n d i n g s i n c l u d e d a m o d e r a t e n u m b e r o f s c h i z o c y t e s , i n c r e a s e d F D P S , s o m e t i m e s m i l d h e m o l y s i s , fi b r i n t h r o m b i i n a r t e r i o l e s a n d c a p i l l a r i e s ( i n c l u d i n g t h o s e o f t h e k i d n e y s ) , a n d i n 2 d o g s , w i d e s p r e a d p e t e c h i a e a n d g e n e r a l i z e d s e i z u r e s l a t e i n t h e c o u r s e o f t h e d i s e a s e . M o r e c a s e s a n d m o r e w o r k o n t h i s s y n d r o m e w i l l b e n e c e s s a r y t o d e fi n e i t a n d c o m p a r e i t w i t h t h e h u m a n s y n d r o m e s . ( j ) v a s c u l i t i s D i s e a s e s a s s o c i a t e d w i t h t h r o m b o c y t o p e n i a a n d v a s c u l i t i s i n c l u d e R M S F , c a n i n e h e r p e s v i r u s i n f e c t i o n , a n d H U S a n d h a v e b e e n d i s c u s s e d . 4 3 ( k ) o t h e r T h e h u m a n m o d e l w o u l d s u g g e s t t h a t s e v e r a l o t h e r n o n i m m u n o l o g i c a l , c o n s u m p t i v e t h r o m b o c y t o p e n i a s a r e l i k e l y t o o c c u r i n d o g s , b u t t h e y h a v e n o t b e e n s p e c i fi c a l l y r e p o r t e d . F o r e x a m p l e , h u m a n b u r n p a t i e n t s m a y h a v e t h r o m b o c y t 0 p e n i a w h e t h e r o r n o t t h e y b e c o m e s e p t i c , a n d i t a p p e a r s f r o m s t u d i e s i n r a t s t h a t t h e r m a l i n j u r y m a y c a u s e l o c a l i z a t i o n o f p l a t e l e t s i n d a m a g e d t i s s u e s . l l M i l d t h r o m b o c y t o p e n i a o c c u r s i n a b o u t 2 0 % o f h u m a n p a t i e n t s w i t h a o r t i c v a l v u l a r s t e n o s i s , p r e s u m a b l y d u e t o t u r b u l e n t b l o o d fl o w o r i n t e r a c t i o n s w i t h t h e d e f o r m e d v a l v e . l l F a t e m b o l i s m i s a l s o c o m m o n l y a s s o c i a t e d w i t h t h r o m b o c y t o p e n i a i n p e o p l e . 1 1 T h r o m b o c y t o p e n i a m a y o c c u r i n t h e s e a n d s i m i l a r c o n d i t i o n s i n d o g s , b u t t o d a t e , c o n fi r m e d a s s o c i a t i o n s h a v e n o t b e e n r e p o r t e d . ( 2 ) i m m u n o l o g i c a l l y d e c r e a s e d p l a t e l e t s u r v i v a l ( a ) a n a p h y l a x i s S e v e r e t h r o m b o c y t o p e n i a h a s o c c u r r e d i n a s s o c i a t i o n w i t h a n a p h y l a x i s i n p e o p l e a n d l a b o r a t o r y a n i m a l s . ‘ 1 T o t h e e x t e n t t h a t t h i s i s a h y p e r s e n s i t i v i t y r e a c t i o n , t h e m e c h a n i s m o f t h e t h r o m b o c y t o p e n i a i s i m m u n e - m e d i a t e d . H o w e v e r i t i s n o t a t y p e H h y p e r s e n s i t i v i t y a s i s t y p i c a l o f I M T . T h e t h r o m b o c y t o p e n i a m a y r e l a t e t o i m m u n e c o m p l e x i n t e r a c t i o n s w i t h p l a t e l e t s , D I C , o r o t h e r f a c t o r s . S i m i l a r l y , m i l d t o m o d e r a t e d e c r e a s e s i n p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s h a v e b e e n a s s o c i a t e d w i t h e x p o s u r e t o a l l e r g e n s i n s e n s i t i z e d p e o p l e . T h i s m a y b e d u e t o t h e i n t e r a c t i o n o f I g E w i t h p l a t e l e t s , a p o p u l a t i o n o f w h i c h a p p e a r s t o b e a r F c r e c e p t o r s f o r I g E . 2 0 2 4 4 T h r o m b o c y t o p e n i a h a s b e e n a c o n s e q u e n c e o f H y m e n o p t e r a s t i n g s i n s o m e d o g s , b u t t h e p r e c i s e m e c h a n i s m i s u n k n o w n . 2 0 3 N o n i m m u n o l o g i c e f f e c t s o f t h e v e n o m a n d a l l e r g i c r e s p o n s e s h a v e b e e n s u g g e s t e d c a u s e s , w i t h D I C l i k e l y o c c u r r i n g i n a t l e a s t s o m e C 3 8 6 8 . ( b ) s e c o n d a r y I M T I M T m a y s p o r a d i c a l l y o c c u r i n d e p e n d e n t l y b u t c o n c u r r e n t l y w i t h o t h e r d i s e a s e s . H o w e v e r , w h e n i t o c c u r s i n a s s o c i a t i o n w i t h o t h e r c o n d i t i o n s a t a f r e q u e n c y g r e a t e r t h a n w o u l d b e e x p e c t e d b y j u s t c o i n c i d e n c e , I M T h a s b e e n c o n s i d e r e d a s e c o n d a r y p r o c e s s i n d u c e d b y t h e u n d e r l y i n g d i s e a s e . 2 0 4 T h e p r e s e n c e o f e l e v a t e d P A I g i n d i c a t e s a p r o b a b l e i m m u n o l o g i c c o m p o n e n t t o t h e t h r o m b o c y t o p e n i a a n d s u g g e s t s t h a t t h e t h r o m b o c y t o p e n i a i s d u e t o p r e m a t u r e c l e a r a n c e o f i m m u n o g l o b u l i n - c o a t e d p l a t e l e t s f r o m t h e c i r c u l a t i o n . I n h u m a n m e d i c i n e , s e c o n d a r y I M T h a s b e e n a s s o c i a t e d w i t h m a n y c o n d i t i o n s , a n d i n s o m e c a s e s , I M T p r e c e d e s o t h e r s i g n s o f t h e u n d e r l y i n g d i s e a s e . A l i s t o f h u m a n c o n d i t i o n s a s s o c i a t e d w i t h s e c o n d a r y I M T m a y b e a u s e f u l g u i d e t o a n t i c i p a t e c a n i n e d i s e a s e s t h a t m a y l e a d t o I M T . N u m e r o u s d r u g s c a n i n d u c e s e c o n d a r y I M T i n p e o p l e , a n d s p e c i fi c a n t i b o d y b i n d i n g t o p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n s h a s b e e n d o c u m e n t e d i n m a n y c a s e s ? ” 2 0 6 I M T a l s o f r e q u e n t l y o c c u r s s i m u l t a n e o u s l y w i t h o t h e r a u t o i m m u n e d i s e a s e s i n c l u d i n g i m m u n e - m e d i a t e d h e m o l y t i c a n e m i a , i m m u n e — m e d i a t e d g r a n u l o c y t o p e n i a , a n d s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s . 2 0 4 ' 2 0 7 ' 2 0 8 N e o p l a s m s c o m m o n l y a s s o c i a t e d w i t h I M T i n c l u d e H o d g k i n ’ s d i s e a s e a n d n o n - H o d g k i n ’ s l y m p h o m a , a c u t e a n d c h r o n i c l y m p h o c y t i c l e u k e m i a , a n d a v a r i e t y o f s o l i d t u m o r s . 2 ° 7 ' 2 ° 9 ' 2 1 0 I m m u n e - m e d i a t e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n m a y c o n t r i b u t e t o 4 5 t h e c o n s u m p t i v e / d e s t r u c t i v e t h r o m b o c y t o p e n i a f r e q u e n t l y s e e n i n h u m a n s e p t i c e m i c p a t i e n t s w i t h o u t l a b o r a t o r y e v i d e n c e o f D I C . 2 “ ' 2 1 3 O t h e r h u m a n d i s e a s e s w i t h w e l l e s t a b l i s h e d t i e s t o I M T a r e t h y r o t o x i c o s i s a n d i n f e c t i o u s m o n o n u c l e o s i s . 2 0 4 L e s s c l e a r a s s o c i a t i o n s w i t h I M T h a v e b e e n r e p o r t e d f o r s e l e r o d e r r n a , H a s h i m o t o ’ s t h y r o i d i t i s , G a u c h e r ’ s d i s e a s e , C r o h n ’ s d i s e a s e , s a r c o i d o s i s , r h e u m a t o i d a r t h r i t i s , m y a s t h e n i a g r a v i s , u l c e r a t i v e c o l i t i s , t u b e r c u l o s i s , b r u c e l l o s i s , a n d h i s t o p l a s m o s i s . “ S o m e o f t h e s e o r s i m i l a r r e l a t i o n s h i p s m a y o c c u r i n d o g s , b u t b e c a u s e a d e q u a t e t e s t i n g f o r I M T i s r a r e , o u r k n o w l e d g e i n t h i s a r e a i s l i m i t e d . W i t h o u t w i d e s p r e a d u s e o f d i r e c t a s s a y s f o r P A I g i n d o g s , i t i s d i f fi c u l t t o m a k e s t r o n g s t a t e m e n t s a b o u t w h i c h c a n i n e d i s e a s e s c a n c a u s e s e c o n d a r y I M T . S u c h a s s o c i a t i o n s a r e s p o t t y a n d h a v e u s u a l l y b e e n m a d e t h r o u g h i n s e n s i t i v e o r n o n s p e c i fi c i n d i r e c t a s s a y s f o r P B I g , d i r e c t m e g a k a r y o - c y t e i m m u n o fl u o r e s c e n c e a s s a y s , o r b y a n a l o g y t o t h e h u m a n m o d e l . O n l y a f e w c a s e s o f a f e w d i s e a s e s h a v e b e e n s u b s t a n t i a t e d w i t h d i r e c t a s s a y s f o r P A I g . i ) d r u g - i n d u c e d F r o m a n a n t i b o d y d e t e c t i o n p e r s p e c t i v e , t w o c l a s s e s o f d r u g - i n d u c e d p l a t e l e t - r e a c t i v e a n t i b o d i e s n e e d t o b e c o n s i d e r e d : 1 ) d r u g d e p e n d e n t a n t i b o d i e s w h i c h r e q u i r e t h e p r e s e n c e o f t h e d r u g o r i t s m e t a b o l i t e i n t h e a s s a y m i x t u r e s f o r t h e i r d e t e c t i o n ( e . g . q u i n i d i n e ) , a n d 2 ) d r u g - i n d u c e d b u t d r u g - i n d e p e n d e n t a n t i b o d i e s w h i c h b e h a v e l i k e a u t o a n t i b o d i e s i n t h a t t h e d r u g ’ s p r e s e n c e i s n o t r e q u i r e d f o r b i n d i n g ( e . g . g o l d ) . 2 1 4 D r u g — d e p e n d e n t a n d d r u g - i n d e p e n d e n t a n t i b o d i e s m a y b e p r e s e n t c o n c u r r e n t l y a f t e r e x p o s u r e t o s o m e d r u g s . “ 4 6 I n p e o p l e , n u m e r o u s d r u g s h a v e b e e n a s s o c i a t e d w i t h t h e p r o d u c t i o n o f d r u g - d e p e n d e n t a n t i b o d i e s t h a t b i n d t o p l a t e l e t s a n d a p p e a r t o b e i n s t r u m e n t a l i n p r o d u c i n g t h r o m b o c y t o p e n i a . D r u g - i n d u c e d I M T h a s b e e n m o s t c l e a r l y e s t a b l i s h e d f o r a l l y l i s o - p r o p y l a c e t y l u r e a ( S e d o r r n i d ) , q u i n i n e , q u i n i d i n e , s u l f o n a m i d e s , h e p a r i n , c i m e t i d i n e , o r g a n i c a r s e n i c a l s , m e t h y l d o p a , a n d g o l d s a l t s . 2 0 4 E v i d e n c e t h a t t h r o m b o c y t o p e n i a i s i m m u n e - m e d i a t e d a n d d r u g - i n d u c e d i n t h e s e p a t i e n t s i n c l u d e s : 1 ) t h e d e v e l o p m e n t o f t h r o m b o c y t o p e n i a a n d P A I g a f t e r d r u g e x p o s u r e , w i t h a d e l a y c o n s i s t e n t w i t h a n i m m u n e r e s p o n s e ; 2 ) w i t h s o m e d r u g s , d e m o n s t r a t i o n o f i n v i t r o d r u g - d e p e n d e n c y o f t h e b i n d i n g o f s e r u m o r p l a s m a a n t i b o d i e s t o p l a t e l e t s ; 3 ) r e s o l u t i o n o f t h r o m b o c y t o p e n i a a n d P A I g l e v e l s a f t e r d r u g w i t h d r a w a l ; a n d 4 ) r e l a p s e a f t e r r e - e x p o s u r e t o t h e d r u g . E i t h e r t h e p a r e n t d r u g o r a m e t a b o l i t e m a y b e t h e o f f e n d i n g a g e n t . 2 1 6 I n d o g s , d r u g - i n d u c e d I M T h a s b e e n s u s p e c t e d i n a s s o c i a t i o n w i t h s e v e r a l d r u g s . H o w e v e r , g o o d e v i d e n c e h a s o f t e n b e e n l a c k i n g d u e t o i n a d e q u a t e a s s a y s f o r P A I g . D r u g s t h a t h a v e b e e n i n c r i r n i n a t e d i n c l u d e a u r a n o fi n ( a n o r g a n i c g o l d c o m p o u n d ) a n d g o l d s o d i u m t h i o m a l a t e , h i g h - d o s e c e f o n i c i d a n d c e f a z e d o n e ( s e c o n d g e n e r a t i o n c e p h a l o s p o r i n s ) , t r i m e t h o p r i m - s u l f a d i a z i n e , l e v a m i s o l e , a n d p o s s i b l y d i e t h y l s t i l b e s t r o l a n d d a p s o n e . a ) g o l d s a l t s I n t h e c a s e o f g o l d s a l t s , 3 o f 1 4 a n d 2 o f 1 4 d o g s r e s p e c t i v e l y r e c e i v i n g h i g h d o s e s o f o r a l a u r a n o f m o r i n j e c t a b l e g o l d s o d i u m t h i o m a l a t e d e v e l o p e d t h r o m b o c y t o p e n i a a f t e r 4 5 t o 7 2 m o n t h s o f d o s i n g i n l o n g - t e r m d r u g t o x i c i t y t r i a l s . 2 1 7 T h e p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n n a d i r s r a n g e d f r o m 4 , 0 0 0 t o 1 2 4 , 0 0 0 / p 1 , a n d t h r o m b o c y t o p e n i a w a s 4 7 a s s o c i a t e d w i t h l a r g e c i r c u l a t i n g p l a t e l e t s a n d m e g a k a r y o c y t i c h y p e r p l a s i a . T w o o f t h e 5 d o g s a l s o h a d h e m o l y t i c a n e m i a w i t h s p h e r o c y t o s i s , a n d o n e o f t h e s e d o g s w a s C o o m b s ’ - p o s i t i v e f o r I g G . W i t h c e s s a t i o n o f d o s i n g , t h r o m b o c y t o p e n i a s p o n t a n e o u s l y a n d c o m p l e t e l y r e s o l v e d i n 2 o f t h e d o g s w i t h i n 1 w e e k , a n d b y d a y 1 2 i n a t h i r d . T h e o t h e r t w o d o g s r e q u i r e d p r e d n i s o l o n e t h e r a p y t o w h i c h t h e y i n i t i a l l y r e s p o n d e d q u i c k l y , t h o u g h o n e o f t h e t w o d o g s s u f f e r e d s e v e r a l r e l a p s e s a s a t t e m p t s w e r e m a d e t o r e d u c e t h e d o s e o f p r e d n i s o l o n e w h i c h w a s fi n a l l y d i s c o n t i n u e d a f t e r 3 4 w e e k s . C o m p a r e d t o h e a l t h y , n o n t h r o m b o c y t o p e n i c c o n t r o l s , a l l 4 o f t h e 5 g o l d - t r e a t e d d o g s t e s t e d f o r P A I g w i t h a S p A - b a s e d r a d i o i r n m u n o a s s a y w e r e p o s i t i v e a t l e a s t o n c e w h i l e t h r o m b o c y t o p e n i c . I n t h e d o g w i t h r e c u r r e n t r e l a p s e s , t h e a m o u n t o f P A I g c o r r e l a t e d i n v e r s e l y w i t h t h e p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n ( r = 0 . 8 2 ) . W h i l e t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n n e g a t i v e a n d p o s i t i v e w a s s m a l l , t h e r a d i o i r n m u n o a s s a y r e s u l t s p r o v i d e d e v i d e n c e t h a t t h e t h r o m b o c y t o p e n i a s w e r e i m m u n e - m e d i a t e d . I t i s n o t k n o w n w h y t h e d i s o r d e r o c c u r r e d i n o n l y t h e h i g h - d o s e g r o u p . V a r i a b l e a n d s o m e t i m e s p r o l o n g e d p e r s i s t e n c e o f g o l d - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a a n d P A I g h a s a l s o b e e n r e p o r t e d i n p e 0 p l e w h e r e t h e r e i s e v i d e n c e t h a t g o l d s a l t s c a n i n d u c e t h e p r o d u c t i o n o f a u t o a n t i b o d i e s r e a c t i v e w i t h p l a t e l e t s i n t h e a b s e n c e o f g o l d . 2 1 8 A s i n t h e d o g s , p e o p l e r e c e i v i n g g o l d s a l t s m a y n o t b e c o m e t h r o m b o c y t o p e n i c f o r m a n y m o n t h s . T h i s g o l d - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a m a y a c t u a l l y b e a n a u t o i m m u n e p h e n o m e n o n a s o p p o s e d t o m o s t w e l l - s t u d i e d , d r u g - i n d u c e d I M T s i n p e o p l e w h i c h d o n o t p e r s i s t a f t e r d r u g w i t h d r a w a l . I n a s i n g l e c a s e r e p o r t , a d o g w i t h b u l l o u s p e m p h i g o i d d e v e l o p e d m a r k e d t h r o m b o c y t o p e n i a w i t h a c c o m p a n y i n g h e m o r r h a g e d u r i n g t h e r a p y w i t h a u r o t h i o g l u c o s e . 2 1 9 4 8 R e c o v e r y w a s s p o n t a n e o u s a f t e r c e s s a t i o n o f a u r o t h i o g l u c o s e t h e r a p y . W h e n t h e d e r m a t o s i s r e c u r r e d , a u r o t h i o g l u c o s e w a s u s e d a t 1 / 4 t h e d o s i n g f r e q u e n c y , a n d t h r o m b o c y t o p e n i a d i d n o t d e v e l o p . T e s t i n g f o r I M T w a s n o t d o n e . b ) s u l f o n a m i d e s I M T h a s f r e q u e n t l y b e e n a s s o c i a t e d w i t h s u l f o n a m i d e a n t i m i c r o b i a l s i n 2 0 5 ‘ ” a n d e v i d e n c e i s m o u n t i n g f o r a s i m i l a r t o x i c i t y i n d o g s . P o s i t i v e P A I g w a s p e o p l e , r e p o r t e d i n a d o g t h a t d e v e l o p e d t h r o m b o c y t o p e n i a s e c o n d a r y t o t r e a t m e n t w i t h t h e p o t e n t i a t e d s u l f o n a m i d e t r i m e t h o p r i m / s u l f a d i a z i n e . 1 6 0 T h i s d o g a l s o h a d a n i n c r e a s e i n s e r u m P B I g t h a t a p p a r e n t l y b o u n d w i t h o u t t h e a d d i t i o n o f d r u g t o t h e a s s a y . I t w a s n o t c l e a r f r o m t h e r e p o r t i f d r u g t h e r a p y w a s c a u s a t i v e o r s i m p l y c o i n c i d e n t a l i n t h i s c a s e . A m o r e t h o r o u g h l y e x a m i n e d e a s e o f t h r o m b o c y t o p e n i a i n a d o g t r e a t e d w i t h t r i m e t h o p r i m / s u l f a d i a z i n e h a s a l s o b e e n r e p o r t e d . 2 2 0 T h e a s s e s s m e n t o f t h e p a t h o g e n e s i s o f t h r o m b o c y t o p e n i a i n t h i s c a s e w a s i n d i r e c t a n d b a s e d o n d e t e c t i o n o f a n u n d e fi n e d h u m o r a l f a c t o r ( c o n s i d e r e d t o b e m o s t l i k e l y a n a n t i p l a t e l e t a n t i b o d y ) c a p a b l e o f l y s i n g a n d f r a g m e n t i n g p l a t e l e t s . T h e 7 — m o n t h - o l d d o g d e v e l o p e d e p i s t a x i s a f t e r a b o u t 1 w e e k o f t r i m e t h o p r i m / s u l f a d i a z i n e t h e r a p y f o r v a g i n i t i s . T h e d o g w a s s e v e r e l y t h r o m b o c y t o p e - n i c w i t h m e g a k a r y o c y t i c a n d g r a n u l o c y t i c h y p e r p l a s i a a n d a m e a n p l a t e l e t s i z e o f a b o u t 3 t i m e s n o r m a l . C o a g u l a t i o n t i m e s w e r e n o r m a l a n d r i c k e t t s i a l t i t e r s w e r e n e g a t i v e . T h e p l a t e l e t f r a g m e n t a t i o n i n d e x , a m e a s u r e o f t h e p e r c e n t a g e o f p l a t e l e t s l e s s t h a n 2 . 1 9 p m 3 i n v o l u m e , w a s a b o u t 5 t i m e s n o r m a l . A n t i b i o t i c t h e r a p y w a s d i s c o n t i n u e d a n d t h e p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n r o s e f r o m 1 5 , 0 0 0 t o 8 0 , 0 0 0 / p l o v e r t h e n e x t 2 d a y s . 4 9 S i x d a y s l a t e r , w i t h n o t h e r a p y , t h e p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n h a d c l i m b e d t o 1 8 2 , 5 0 0 / p l , t h e m e a n p l a t e l e t v o l u m e h a d d r o p p e d t o 1 0 . 6 2 p m 3 , a n d t h e f r a g m e n t a t i o n i n d e x h a d d r o p p e d t o a b o u t 2 t i m e s t h e m e a n o f n o r m a l . A t d a y 2 4 , t h e p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n w a s n o r m a l , t h e m e a n p l a t e l e t v o l u m e w a s m i l d l y e l e v a t e d , a n d t h e f r a g m e n t a t i o n i n d e x w a s e s s e n t i a l l y u n c h a n g e d . A l l 3 p a r a m e t e r s w e r e n o r m a l a t 7 m o n t h s . I n f u r t h e r t e s t s , a c u t e p a t i e n t p l a s m a ( p r e s u m a b l y c i t r a t e d ) i n d u c e d s i g n i fi c a n t l y m o r e f r a g m e n t a t i o n o f n o r m a l p l a t e l e t s w h e n i n c u b a t e d w i t h t h e m f o r 1 h r a t 3 7 ° C t h a n d i d n o r m a l c i t r a t e d p l a s m a o r c i t r a t e d p l a s m a f r o m a n o r m a l d o g t r e a t e d w i t h t r i m e t h o p r i m / s u l f a d i a z i n e . T h e a c u t e p l a s m a t h e r e f o r e c o n t a i n e d a t h r o m b o l y t i c f a c t o r t h a t t h e c o n t r o l s d i d n o t , a n d t h i s w a s c o n s i d e r e d t o b e , m o s t l i k e l y , a n a n t i b o d y . P r o o f t h a t t h e t h r o m b o l y t i c f a c t o r w a s a n a n t i b o d y w a s l a c k i n g i n t h i s c a s e , b u t s u c h a h y p o t h e s i s i s c o n s i s t e n t w i t h t h e fi n d i n g s . B e s i d e s a n a n t i p l a t e l e t a n t i b o d y , h o w e v e r , o t h e r p o s s i b i l i t i e s f o r t h e n a t u r e o f t h e h u m o r a l t h r o m b o l y t i c f a c t o r i n c l u d e i m m u n e c o m p l e x e s , e n d o t o x i n , o r o t h e r a c t i v a t o r s o f c o m p l e m e n t . A r e p o r t o f t e n c i t e d i n d i s c u s s i o n s o f d r u g - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s r e l a t e s t o a s y s t e m i c a l l e r g i c r e s p o n s e t o t r i m e t h o p r i m / s u l f a d i a z i n e i n 6 D o b e r m a n P i n s c h e r s . 2 2 1 H o w e v e r , o n l y 1 o f t h e 3 d o g s t e s t e d w a s t h r o m b o c y t o p e n i c , a n d n o d e t a i l s s p e c i fi c t o t h e t h r o m b o c y t o p e n i a w e r e r e p o r t e d . T h e d r u g r e a c t i o n a p p e a r e d t o i n v o l v e a n i m m u n e - m e d i a t e d v a s c u l i t i s w i t h c o m p l e m e n t c o n s u m p t i o n a n d m a y h a v e b e e n a t y p e H I h y p e r s e n s i t i v i t y r e a c t i o n . O n e d o g w a s r e c h a l l e n g e d a n d r e d e v e l o p e d t h e c o n d i t i o n w i t h s u l f a d i a z i n e b u t n o t t r i r n e t h o p r i m ; t h i s d o g d i d n o t h a v e t h r o m b o c y t o p e n i a . T h i s t h r o m b o c y t o p e n i a p r o b a b l y r e l a t e d m o r e t o a t y p e I I I t h a n a t y p e H h y p e r s e n s i t i v i t y r e a c t i o n . 5 0 I n a n o t h e r c a s e r e p o r t , a s i n g l e d o g t r e a t e d w i t h t h e s u l f o n e d a p s o n c f o r 5 d a y s d e v e l o p e d a r e g e n e r a t i v e a n e m i a , h y p o p r o t e i n e m i a , a n d a m a r k e d t h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h p e t e c h i a l a n d e c c h y m o t i c h e m o r r h a g e s ? 2 2 N o m e g a k a r y o c y t e s w e r e d e t e c t e d i n a n o t h e r w i s e c e l l u l a r b o n e m a r r o w , a n d t h e d o g ’ s p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n w a s u n r e s p o n s i v e t o s e v e r a l t r a n s f u s i o n s w i t h p l a t e l e t - r i c h p l a s m a o v e r t h e n e x t f e w d a y s . T h e d o g d i e d , a n d a t n e c r o p s y t h e r e w a s e v i d e n c e o f p a n c r e a t i t i s a n d D I C . A P F 3 a s s a y w a s l a t e r d o n e i n t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f d a p s o n e a n d w a s n e g a t i v e . T h e p a t h o g e n e s i s o f t h e t h r o m b o c y t o p e n i a i s u n c l e a r i n t h i s c a s e , b u t c o u l d h a v e b e e n d u e t o a d a p s o n c - i n d u c e d i m m u n e r e s p o n s e d i r e c t e d a g a i n s t m e g a k a r y o c y t e s o r m e g a k a r y o c y t e s a n d p l a t e l e t s . R e f e r e n c e h a s a l s o b e e n m a d e t o a d o g t h a t d e v e l o p e d m a r k e d t h r o m b o c y t o p e n i a a n d e p i s t a x i s i n a p p a r e n t r e l a t i o n t o s u l f o n a m i d e a n t i b i o t i c t h e r a p y . I n t h i s c a s e , t h e c o n d i t i o n r e s o l v e d w i t h o u t t h e r a p y ? A n o t h e r d o g c l i n i c a l l y d i a g n o s e d w i t h I M T h a d b e e n t r e a t e d w i t h s u l f o n a m i d e s / p e n i c i l l i n w i t h i n 2 w e e k s o f t h e d i a g n o s i s . 4 0 c ) c e p h a l o s p o r i n s I n t o x i c i t y t r i a l s w i t h t h e s e c o n d g e n e r a t i o n c e p h a l o s p o r i n s c e f o n i c i d a n d c e f a z e d o n e , d o g s d e v e l o p e d d o s e - d e p e n d e n t a n e m i a , n e u t r o p e n i a , a n d t h r o m b o c y t o p e - n i a ? 2 3 ' 2 2 5 A s fi r s t d e s c r i b e d , i t w a s c o n s i d e r e d l i k e l y t h a t t h e h e m a t o l o g i c c h a n g e s w e r e t h e r e s u l t o f m u l t i p l e m e c h a n i s m s i n c l u d i n g p e r i p h e r a l d e s t r u c t i o n a n d b o n e , m a r r o w d a m a g e . A n i m m u n e - m e d i a t e d c o m p o n e n t w a s s u g g e s t e d b y t h e d e l a y e d o n s e t o f c y t o p e n i a s , a s h o r t e n e d p e r i o d o f i n d u c t i o n o n r e c h a l l e n g e , e v i d e n c e o f i n c r e a s e d h e m o p h a g o c y t o s i s , e r y t h r o c y t e s p h e r o c y t o s i s , a n d p o s i t i v e d i r e c t a n t i g l o b u l i n t e s t s . 5 1 S t u d i e s w e r e d o n e t o a s s e s s f o r 1 2 5 I - S p A - d e t e c t a b l e a n t i b o d i e s a s s o c i a t e d w i t h p l a t e l e t s ( d i r e c t a s s a y ) , e r y t h r o c y t e s ( d i r e c t a s s a y ) , a n d g r a n u l o c y t e s ( i n d i r e c t a s s a y ) i n d o g s d e v e l o p i n g c y t o p e n i a s a f t e r t r e a t m e n t w i t h h i g h - d o s e c e p h a z e d o n e . O f t h e 1 4 t r e a t e d d o g s , 7 b e c a m e a n e m i c , 7 b e c a m e n e u t r o p e n i c , a n d 1 1 b e c a m e t h r o m b o c y t o p e n i c . O f t h e a f f e c t e d d o g s e x a m i n e d , 6 / 7 w i t h a n e m i a , 9 / 9 w i t h t h r o m b o c y t o p e n i a , a n d 7 / 7 w i t h n e u t r o p e n i a h a d p o s i t i v e r e s u l t s w i t h t h e r e s p e c t i v e a s s a y s c o m p a r e d t o c o n t r o l s . T h e a s s a y f o r P A I g w a s v e r y s i m i l a r t o t h a t d e s c r i b e d i n t h e s t u d i e s o f g o l d - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s ? 1 7 C o n c e r n s a b o u t t h i s a s s a y , a n d t h e r e f o r e t h e v a l i d i t y o f t h e r e s u l t s , a r e m o r e t h o r o u g h l y a d d r e s s e d i n t h e s e c t i o n o n v e t e r i n a r y a s s a y s f o r P A I g a n d P B I g . I t i s i m p o r t a n t t o n o t e t h e a b s e n c e o f a p o s i t i v e c o n t r o l a n d t h e w e a k n e s s o f t h e p o s i t i v i t y o f t e s t s a m p l e s . W h i l e t h e h i g h e s t p o s i t i v e r e s u l t w a s e l e v a t e d 3 t i m e s t h e c u t - o f f v a l u e o f 2 s t a n d a r d d e v i a t i o n s a b o v e t h e m e a n o f a t l e a s t 4 c o n t r o l s r u n i n t h e s a m e a s s a y , t h e n e x t 2 m o s t e l e v a t e d r e s u l t s w e r e j u s t 1 . 7 a n d 1 . 4 t i m e s t h e c u t - o f f v a l u e s . T w o o f t h e p o s i t i v e s a m p l e s w e r e l e s s t h a n 2 % a b o v e t h e c u t — o f f v a l u e s . F u r t h e r m o r e , t h e r a n g e o f c u t - o f f v a l u e s f o r d i f f e r e n t r u n s o f t h e a s s a y w a s 1 . 1 3 t o 1 . 6 4 , a n d 5 o f t h e p o s i t i v e r e s u l t s f e l l w i t h i n t h i s r a n g e ( t h o u g h t h e v a l u e s w e r e h i g h e r t h a n t h e c o n t r o l c u t - o f f s f o r t h e d a y ) . W h i l e t h e s a m p l e s r e p o r t e d a s p o s i t i v e m a y w e l l h a v e b e e n , c o n fi d e n c e i s l o w f o r t h o s e v a l u e s f a l l i n g w i t h i n o r c l o s e t o t h e r a n g e o f i n t e r a s s a y v a r i a t i o n . S i m i l a r c o m m e n t s c a n b e m a d e a b o u t t h e w e a k p o s i t i v i t y o f r e s u l t s f o r t h e e r y t h r o c y t e a s s a y w h e r e p o s i t i v e r e s u l t s r a n g e d f r o m 1 . 2 - 2 . 4 t i m e s t h e m e a n o f 3 c o n t r o l s . A s f o r t h e i n d i r e c t a s s a y f o r g r a n u l o c y t e - b i n d a b l e i m m u n o g l o b u l i n s , t h e p o s i t i v e r e s u l t s w e r e h i g h e r , r a n g i n g f r o m 1 . 6 - 6 . 6 t i m e s t h e m e a n o f 4 c o n t r o l s . I t i s 5 2 i m p o r t a n t t o m e n t i o n t h a t s e r u m s a m p l e s w e r e h e a t e d t o 5 6 ° C f o r 6 0 m i n u t e s p r i o r t o a s s a y i n g . S u c h h e a t i n g w i l l p r o d u c e a g g r e g a t e d i r n m u n o g l o b u l i n s w h i c h m a y b i n d t o l e u k o c y t e s v i a F c r e c e p t o r s . W h i l e s a m p l e s f r o m n o r m a l c o n t r o l s w e r e a l s o h e a t e d , t h e e f f e c t s o f h e a t i n g m a y o r m a y n o t b e s i m i l a r a m o n g s a m p l e s . W h i l e i m m u n e - m e d i a t e d m e c h a n i s m s m a y h a v e c o n t r i b u t e d t o t h e t h r o m b o c y t o p e - n i a i n t h e s e d o g s , t h e a s s a y s d o n o t p r o v i d e c o m p e l l i n g e v i d e n c e t h a t I M T w a s o f p r i m a r y i m p o r t a n c e . E v i d e n c e a g a i n s t d r u g - i n d u c e d I M T w a s t h e r e c o v e r y o f p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s d u r i n g o n g o i n g d r u g a d m i n i s t r a t i o n i n 5 / 1 1 d o g s . 2 2 6 P e r h a p s t h e e v i d e n c e o f m y e l o t o x i c i t y w a s o f g r e a t e r s i g n i fi c a n c e . T h i s i n c l u d e d p e r s i s t e n t d e fi c i t s o f C F U — E a n d C F U - M p r o g e n i t o r c e l l s , 2 2 6 a s w e l l a s r e v e r s i b l e u l t r a s t r u c t u r a l d a m a g e t o m a r r o w c e l l s i n c l u d i n g m i t o c h o n d r i a l d a m a g e i n m e g a k a r y o c y t e s ? 2 7 H i g h d o s e s o f c e f r n e t a z o l e h a v e a l s o b e e n s h o w n t o i n d u c e m i l d t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s , r e v e r s i b l e a f t e r c e s s a t i o n o f d o s i n g ? 2 8 T h e m e c h a n i s m o f t h e t h r o m b o c y t o p e n i a w a s n o t r e p o r t e d a n d a p p a r e n t l y n o t p u r s u e d . d ) d i e t h y l s t i l b e s t r o l D i e t h y l s t i l b e s t r o l ( D E S ) , a n o n s t e r o i d a l s y n t h e t i c w i t h e s t r o g e n i c a c t i v i t y , w a s i m p l i c a t e d i n t h e e t i o l o g y o f I M T i n a d o g t r e a t e d w i t h i t f o r 3 - 4 y e a r s ? 2 9 T h r o m b o c y t o - p e n i a w a s a s s o c i a t e d w i t h p e t e c h i a l a n d e c c h y m o t i c h e m o r r h a g e s , a n a c t i v e b o n e m a r r o w , a n d a P F 3 a s s a y r e s u l t t h a t w a s " p r o b a b l y p o s i t i v e " i n t h e p r e s e n c e o f D E S b u t n e g a t i v e i n i t s a b s e n c e . T h e s e r e s u l t s w e r e c o n s i d e r e d d i a g n o s t i c i n l i g h t o f t h e f a c t t h a t c o r t i c o s t e r o i d t r e a t m e n t h a d b e e n i n i t i a t e d b e f o r e t h e s a m p l e w a s c o l l e c t e d . H o w e v e r , i n t h e s i n g l e c o n t r o l s a m p l e , D E S a l o n e c a u s e d a s i g n i fi c a n t s h o r t e n i n g o f t h e c l o t t i n g 5 3 t i m e ( t h e e n d p o i n t o f t h e a s s a y ) , f r o m 9 8 . 5 t o 7 1 . 0 s e c o n d s , s o t h e a d d i t i o n a l 8 s e c o n d s o f s h o r t e n i n g i n t h e t e s t s a m p l e i s o f q u e s t i o n a b l e s i g n i fi c a n c e . D E S w a s d i s c o n t i n u e d a n d t h e d o g r e s p o n d e d t o c o r t i c o s t e r o i d t r e a t m e n t b u t l a t e r r e l a p s e d u p o n s t e r o i d d i s c o n t i n u a t i o n . A s e c o n d P F 3 a s s a y a t t h a t t i m e r e p o r t e d l y " c o n fi r m e d t h e p r e v i o u s r e s u l t s i m p l i c a t i n g d i e t h y l s t i l b e s t r o l " . W h e n t h e d o g r e l a p s e d a t h i r d t i m e , i t w a s s p l e n e c t o m i z e d a n d t h e n r e m a i n e d a s y m p t o m a t i c f o r a t l e a s t 2 4 m o n t h s . T h e fi n d i n g s o f a n a c t i v e b o n e m a r r o w a n d t h e f a v o r a b l e r e s p o n s e t o c o r t i c o - s t e r o i d s w e r e g o o d e v i d e n c e t h a t e s t r o g e n i c m y e l o s u p p r e s s i o n w a s n o t t h e p r o b l e m . H o w e v e r , a d e fi n i t e c a u s e - a n d - e f f e c t r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e d r u g a n d t h e t h r o m b o c y t o - p e n i a w a s n o t e s t a b l i s h e d . T h e f a c t t h a t t h i s d o g r e l a p s e d t w i c e i n t h e a b s e n c e o f c o n t i n u e d D E S a d m i n i s t r a t i o n i s n o t s u p p o r t i v e o f a t y p i c a l d r u g - d e p e n d e n t I M T i n w h i c h c a s e s t h e r e i s r a p i d r e c o v e r y w i t h d r u g w i t h d r a w a l a n d r e c u r r e n c e o f t h r o m b o c y t o p e n i a o n l y w i t h d r u g r e c h a l l e n g e ? “ O n l y i f D E S h a d i n d u c e d a t r u e a u t o i m m u n e r e s p o n s e w h i c h p e r s i s t e d a f t e r d r u g r e m o v a l , o r i f D E S h a d r e m a i n e d i n t h e d o g ’ s s y s t e m f o r a p r o l o n g e d p e r i o d o f t i m e a f t e r i t w a s d i s c o n t i n u e d , c o u l d a d r u g - i n d u c e d I M T b e c o n s i d e r e d . A s f o r t h e a s s a y r e s u l t s , t h e i n i t i a l P F 3 r e s u l t s w e r e b o r d e r l i n e , a n d t h e s e c o n d s e t o f d a t a w a s n o t p r e s e n t e d . O v e r a l l , t h e c o n c l u s i o n t h a t t h i s d o g h a d a d r u g - d e p e n d e n t I M T i s n o t p a r t i c u l a r l y c o m p e l l i n g . e ) l e v a m i s o l e A h e a r t w o r m i n f e c t e d d o g t r e a t e d w i t h l e v a m i s o l e f o r a b o u t 4 w e e k s d e v e l o p e d t h r o m b o c y t o p e n i a a n d p e t e c h i a l h e m o r r h a g e s i n a s s o c i a t i o n w i t h m e g a k a r y o c y t i c h y p e r p l a s i a i n t h e b o n e m a r r o w . 2 3 0 T h e d r u g w a s d i s c o n t i n u e d a n d t h e c o n d i t i o n r e s o l v e d 5 4 w i t h o u t t h e r a p y . B a s e d o n t h e s e fi n d i n g s , t h e a u t h o r s f e l t t h a t i m m u n e m e c h a n i s m s p r o b a b l y c o n t r i b u t e d t o t h e t h r o m b o c y t o p e n i a , a n d t h a t t h e l a c k o f l a r g e c i r c u l a t i n g p l a t e l e t s a n d a n i m m a t u r i t y o f t h e m e g a k a r y o c y t e s s u g g e s t e d i m p a i r e d t h r o m b o p o i e s i s a s w e l l . I t w a s a l s o m e n t i o n e d t h a t 2 o t h e r d o g s w e r e k n o w n t o h a v e b e c o m e t h r o m b o c y t o - p e n i c w h i l e o n l e v a m i s o l e t h e r a p y , b u t i n n o c a s e w a s s p e c i fi c e v i d e n c e p r e s e n t e d t o i m p l i c a t e a n i m m u n e p a t h o g e n e s i s . 0 o t h e r T h e f o l l o w i n g d r u g s h a v e b e e n s a i d t o c a u s e i m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s , b u t r e p o r t s t o a d e q u a t e l y s u b s t a n t i a t e t h e s e c l a i m s a r e l a c k i n g : p h e n y l b u t a z o n e , S t y r i d c a r a c i d e , a m p h e t a m i n e s , a n d d i l a n t i n . 1 3 6 i i ) s y s t e m i c i m m u n e - m e d i a t e d d i s e a s e T h e r e i s n o t a c l e a r d i v i s i o n b e t w e e n p r i m a r y I M T a n d s e c o n d a r y I M T a s s o c i a t e d w i t h s y s t e m i c i m m u n e - m e d i a t e d c o n d i t i o n s , s i n c e m a n y h u m a n p a t i e n t s w i t h I M T a l s o h a v e h i g h t i t e r s o f a n t i n u c l e a r a n t i b o d i e s b u t d o n o t d e v e l o p S L E ? " 8 ? 3 " 2 3 2 T h e t h r o m b o c y t o p e n i a s a s s o c i a t e d w i t h h u m a n S L E a n d I M T a r e f e l t t o s h a r e a c o m m o n p a t h o g e n e s i s ; d e c r e a s e d p l a t e l e t s u r v i v a l i s s e c o n d a r y t o i n c r e a s e d P A I g c a u s e d b y a u t o a n t i b o d i e s o r i m m u n e c o m p l e x e s . G e n e r a l l y , t h e s y s t e m i c i m m u n e - m e d i a t e d d i s e a s e s w i t h w h i c h I M T m a y b e a s s o c i a t e d a r e c h a r a c t e r i z e d b y g e n e r a l B - c e l l a c t i v a t i o n w i t h t h e p r o d u c t i o n o f a u t o a n t i b o d i e s d i r e c t e d t o w a r d m u l t i p l e t a r g e t s . I m m u n e c o m p l e x e s a r e o f t e n a b u n d a n t l e a d i n g t o w i d e s p r e a d o r g a n i n j u r y b y t y p e I H h y p e r s e n s i t i v i t y ? ” 5 5 P r i m a r y I M T a n d S L E m a y r e p r e s e n t d i f f e r e n t c l i n i c a l p r e s e n t a t i o n s o n a s p e c t r u m o f t h e s e a u t o i m m u n e d i s o r d e r s . T h e s a m e m a y b e t r u e i n d o g s ? ” 2 3 5 a ) s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s T h e o c c u r r e n c e o f t h r o m b o c y t o p e n i a i n a s s o c i a t i o n w i t h c a n i n e S L E w a s fi r s t r e p o r t e d i n 1 9 6 5 , 2 3 6 a n d i t i s n o w a n e x p e c t e d p o t e n t i a l f m d i n g ? 3 3 T h e r o l e o f P A I g i n S L E h a s b e e n p r e s u m e d ? ” b u t r e c e n t p o s i t i v i t y f o r P A I g i n 2 d o g s w i t h S L E i s d i r e c t e v i d e n c e t h a t P A I g m e d i a t e s t h e t h r o m b o c y t o p e n i a i n c a n i n e S L E . 1 6 0 P o s i t i v e r e s u l t s w i t h d i r e c t m e g a k a r y o c y t e i m m u n o fl u o r e s c e n c e o r w i t h i n d i r e c t a s s a y s h a v e b e e n r e p o r t e d i n m a n y d o g s w i t h S L E . “ 3 0 ' “ 3 1 ' 1 9 1 ' 2 3 7 ' 2 4 1 T h r o m b o c y t o p e n i a h a s a c c o m p a n i e d j u v e n i l e - o n s e t p o l y a r t h r i t i s s y n d r o m e i n A k i t a s , a n i m m u n e — m e d i a t e d s y n d r o m e w h i c h c a n b e v e r y s i m i l a r t o S L E ? 4 2 b ) E v a n s ’ s y n d r o m e E v a n s ’ s y n d r o m e , a s fi r s t d e s c r i b e d , w a s t h e c o - o c c u r r e n c e o f t h r o m b o c y t o p e n i a 2 4 3 T h e t e r m n o w d e fi n e s t h e o r n e u t r o p e n i a w i t h i m m u n e - m e d i a t e d h e m o l y t i c a n e m i a . c o - o c c u r r e n c e o f I M T a n d i m m u n e - m e d i a t e d h e m o l y t i c a n e m i a . I n h i s o r i g i n a l 1 9 4 9 d e s c r i p t i o n o f t h e s y n d r o m e , 2 4 3 E v a n s s h o w e d g r e a t f o r e s i g h t w h e n h e w r o t e : " I f t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a i s d u e t o t h e f o r m a t i o n o f a n a n t i b o d y - l i k e s u b s t a n c e s i m i l a r t o t h a t f o u n d i n a c q u i r e d h e m o l y t i c a n e m i a b o t h d e fi c i e n t f o r m a t i o n a n d e x c e s s i v e d e s t r u c t i o n m a y b e i m p o r t a n t i n p r o d u c i n g t h e e x t r e m e d e g r e e s o f d e s t r u c t i o n s o m e t i m e s o b s e r v e d . S e n s i t i z e d p l a t e l e t s m a y b e s u s c e p t i b l e t o a g g l u t i n a t i o n , a n d p h a g o c y t o s i s a n d t h e p r e s e n c e o f a n a n t i — p l a t e l e t a n t i b o d y i n t h e c i r c u l a t i o n m a y d a m a g e t h e c y t o p l a s m o f 5 6 t h e m e g a k a r y o c y t e s o a s t o i n h i b i t t h e f o r m a t i o n o f p l a t e l e t s . " H e a l s o s u s p e c t e d t h a t i f s u c h w e r e t h e c a s e , m u l t i p l e a n t i b o d i e s r a t h e r t h a n o n e w i t h a b r o a d s p e c t r u m o f r e a c t i v i t y w o u l d a c c o u n t f o r t h e m u l t i p l e c y t 0 p e n i a s , b e c a u s e t h e r e w a s n o c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e s e v e r i t y o f h e m o l y s i s a n d t h e d e g r e e o f t h r o m b o c y t o p e n i a . I n d e e d , t h e a n t i b o d i e s r e s p o n s i b l e f o r t h e c o n c u r r e n t c y t o p e n i a s i n a t l e a s t s o m e h u m a n p a t i e n t s h a v e s i n c e b e e n s h o w n t o b e d i s t i n c t , s i n c e t h o s e e l u t e d f r o m o n e c e l l t y p e d o n o t r e a c t w i t h t h e o t h e r c e l l t y p e ? “ T h e c a n i n e s i t u a t i o n a w a i t s f u r t h e r s t u d i e s . T h e o c c u r r e n c e o f t h r o m b o c y t o p e n i a i n a s s o c i a t i o n w i t h c a n i n e i m m u n e - m e d i a t e d h e m o l y t i c a n e m i a w a s fi r s t r e p o r t e d i n 1 9 6 5 . 2 4 5 T h e c a n i n e s y n d r o m e w a s f e l t t o m i m i c E v a n s ’ s y n d r o m e i n p e o p l e , b u t s t u d i e s o f P A I g i n d o g s w i t h E v a n s ’ s y n d r o m e h a v e n o t b e e n r e p o r t e d . A n i m m u n e - m e d i a t e d p a t h o g e n e s i s h a s b e e n s u p p o r t e d , h o w e v e r , b y p o s i t i v i t y o f i n d i r e c t a s s a y s f o r P B I g - o r b y d i r e c t m e g a k a r y o c y t e i m m u n o fl u o r e s c e n c e a s s a y s i n s o m e t e s t e d d o g s . “ " l e " ’ - 3 " " 2 " " 2 “ ° ' 2 4 7 P o s i t i v e i n d i r e c t r e s u l t s f o r P B I g h a v e a l s o b e e n r e p o r t e d i n a d o g w i t h s t e r o i d r e s p o n s i v e i d i o p a t h i c n e u t r o p e n i a a n d t h r o m b o c y t o p e n i a , a n d i n a d o g w i t h t h r o m b o c y t o - p e n i a a n d r e d c e l l a p l a s i a ? “ 1 c ) o t h e r I M T h a s o c c a s i o n a l l y b e e n c l i n i c a l l y d i a g n o s e d o r s u s p e c t e d i n d o g s w i t h 2 5 . 2 3 7 r h e u m a t o i d a r t h r i t i s o r p e m p h i g u s . 5 7 i i i ) n e o p l a s i a T h r o m b o c y t o p e n i a i s c o m m o n i n d o g s w i t h n e o p l a s i a , a n d i t m a y o c c u r f o r n u m e r o u s r e a s o n s , b o t h i m m u n o l o g i c a n d n o n i r n m u n o l o g i c ( s e e b e l o w ) . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t i m m u n e - m e d i a t e d m e c h a n i s m s m a y b e a n u n d e r - r e c o g n i z e d c o n t r i b u t o r t o t h r o m b o c y t o p e n i a s a s s o c i a t e d w i t h h u m a n n e o p l a s m s ? l o I n a r e v i e w o f 2 , 0 5 9 d o g s w i t h n e o p l a s i a , 1 0 % w e r e t h r o m b o c y t o p e n i c b u t I M T w a s d i a g n o s e d i n n o n e o f t h e m ? " 8 H o w e v e r , a p p r o p r i a t e t e s t s w e r e n o t a v a i l a b l e . I n o t h e r r e p o r t s , i m m u n e - m e d i a t e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n h a s b e e n r e p e a t e d l y i n c r i r n i n a t e d i n d o g s w i t h a v a r i e t y o f n e o p l a s t i c p r o c e s s e s . F o r e m o s t o n t h e l i s t o f a s s o c i a t e d n e o p l a s m s i s p r o b a b l y l y m p h o m a . A r e t r o s p e c t i v e r e v i e w o f t h e V e t e r i n a r y R e c o r d D a t a P r o g r a m , a d a t a r e p o s i t o r y f o r v e t e r i n a r y p a t i e n t s v i s i t i n g t e a c h i n g h o s p i t a l s a c r o s s N o r t h A m e r i c a , s h o w e d a s i g n i fi c a n t a s s o c i a t i o n b e t w e e n d i a g n o s e s o f l y m p h o s a r c o m a a n d d i a g n o s e s o f I M T ? “ 9 T h a t i s , d o g s w i t h I M T m o r e c o m m o n l y h a d l y m p h o m a t h a n d i d d o g s w i t h o u t I M T . W h i c h o c c u r r e d fi r s t a n d w h a t t h e m e c h a n i s t i c n a t u r e o f t h e r e l a t i o n s h i p i s w a s n o t a s s e s s e d . I t s h o u l d b e n o t e d t h a t t h e d a t a s p a n n e d 2 7 y e a r s , a n d t h e d i a g n o s t i c c r i t e r i a w e r e n o t s t a n d a r d i z e d i n a n y w a y . M o r e o v e r , t h e d i a g n o s i s o f I M T i n m o s t c a s e s w a s l i k e l y b a s e d o n j u s t c l i n i c a l c r i t e r i a . P o s i t i v e i n d i r e c t a s s a y s f o r P B I g a n d d i r e c t m e g a k a r y o c y t e i r n m u n o fl u o r e s c e n t a s s a y s h a v e b e e n u s e d t o s u p p o r t t h e d i a g n o s i s o f l y m p h o m a - a s s o c i a t e d I M T i n s e v e r a l r e p o r t s . ‘ ° " 2 “ ' 2 5 ° ? 5 ‘ S i m i l a r a s s a y s h a v e a l s o i n c r i r n i n a t e d h e m a n g i o s a r c o m a ? “ 1 l y m p h a n g i o m a , ” 2 m u l t i p l e m y e l o m a , a n d m y e l o g e n o u s l e u k e m i a . 1 6 ‘ O n e d o g h a s b e e n r e p o r t e d w i t h e l e v a t e d P A I g a n d m y e l o d y s p l a s i a . 1 6 0 5 8 T h e p o s s i b i l i t y t h a t i m m u n e m e c h a n i s m s p l a y a r o l e i n t h e t h r o m b o c y t o p e n i a o f s o m e c a n i n e n o n h e m a t o p o i e t i c n e 0 p l a s m s w a s s p e c i fi c a l l y a s s e s s e d i n 7 t h r o m b o c y t o p e n i c d o g s w i t h c a n c e r a n d p o s i t i v e d i r e c t m e g a k a r y o e y t e i m m u n o fl u o r e s c e n c e a s s a y ( D - M I F A ) r e s u l t s ? 5 3 C a n c e r s i n c l u d e d b e n i g n m i x e d m a m m a r y n e o p l a s m s , m a s t c e l l n e o p l a s i a , h e m a n g i o s a r c o m a w i t h m e t a s t a s e s , n a s a l a d e n o c a r c i n o m a , a n d a fi b r o s a r c o m a . A s w i l l b e d i s c u s s e d b e l o w , t h e r e l i a b i l i t y o f D - M I F A r e s u l t s i s u n c e r t a i n , s o t h e i m m u n o l o g i c a l n a t u r e o f t h e t h r o m b o c y t o p e n i a s i n t h i s s t u d y i s a l s o u n c e r t a i n . D - M I F A r e s u l t s w e r e s l i g h t l y p o s i t i v e i n 2 o f t h e n o n t h r o m b o c y t o p e n i c c o n t r o l s w i t h n e o p l a s i a , s u g g e s t i n g t h a t t h e s e d o g s h a d c o m p e n s a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a s o r t h a t p o s i t i v e r e s u l t s w e r e s o m e w h a t n o n s p e c i fi c . E a c h d o g h a d i n c r e a s e d m a r r o w m e g a k a r y o c y t e s , b u t o n l y 1 o f 6 t e s t e d h a d a p o s i t i v e P F 3 a s s a y r e s u l t . P l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s i n c r e a s e d i n 4 o f 4 d o g s w h o s e c a n c e r s w e r e t r e a t e d w i t h o u t i m m u n o s u p p r e s s i v e t h e r a p y , s u g g e s t i n g t h a t t h e t h r o m b o c y - t o p e n i a w a s r e l a t e d t o t h e c a n c e r . T h e p o s i t i v e D - M I F A i n t h r o m b o c y t o p e n i c b u t n o t n o n t h r o m b o c y t o p e n i c c a n c e r p a t i e n t s , a n d t h e c o n v e r s i o n t o n e g a t i v e a f t e r t r e a t m e n t a n d n o r m a l i z a t i o n o f p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s i m p l i c a t e d a n i m m u n e p a t h o g e n e s i s . U n f o r t u - n a t e l y , t h e r e w e r e n o c o n t r o l d o g s w i t h r e g e n e r a t i v e b u t n o n i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a . I t w a s f e l t t h a t i m m u n e c o m p l e x e s m a y h a v e c o n t r i b u t e d t o t h e I M T b e c a u s e t h e y w e r e a t h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s i n d o g s w i t h n e o p l a s i a t h a n i n t h e s a m e d o g s d u r i n g r e m i s s i o n . D I C w a s e x c l u d e d b y l a b o r a t o r y fi n d i n g s , a n d o n l y 1 d o g h a d s p l e n o m e g a l y . i v ) i n f e c t i o u s d i s e a s e s T h e p o t e n t i a l i m m u n e - m e d i a t e d c o n t r i b u t i o n t o t h e t h r o m b o c y t o p e n i a o f i n f e c t i o u s d i s e a s e s w i l l b e d i s c u s s e d i n t h i s s e c t i o n w i t h p r i m a r y r e f e r e n c e t o h u m a n d i s e a s e s . W i t ” ' 5 l A A h A ‘ y " 1 L i m e . f i r m i n . 5 9 W h i l e s i m i l a r c o n t r i b u t i o n s a r e l i k e l y a n d s h o u l d b e s o u g h t f o r c a n i n e d i s e a s e s , t h e r e a r e c u r r e n t l y l i t t l e s u p p o r t i v e d a t a . T h e h u m a n s i t u a t i o n m a y s e r v e a s a u s e f u l g u i d i n g m o d e l f o r c a n i n e s t u d i e s . M a n y b a c t e r i a l , v i r a l , f u n g a l , a n d p r o t o z o a l d i s e a s e s h a v e b e e n a s s o c i a t e d w i t h I M T i n p e o p l e . “ ' 2 “ I n g e n e r a l , i n f e c t i o n - a s s o c i a t e d I M T m a y b e r e l a t e d t o c r o s s - r e a c t i v e a n t i b o d i e s , t o b a c t e r i a l l y - i n d u c e d p r o d u c t i o n o f a u t o a n t i b o d i e s , t o t h e e x p o s u r e o f p l a t e l e t c r y p t a n t i g e n s b y t h e p r e s e n c e o f t h e o r g a n i s m s , t o t h e b i n d i n g o f a n t i b o d i e s t o i n f e c t i o u s a g e n t s ( o r t h e i r p a r t s ) a t t a c h e d t o t h e p l a t e l e t s , o r t o t h e i n d u c t i o n o f p l a t e l e t - a s s o c i a t e d i m m u n e c o m p l e x e s . ” 2 1 1 S o m e t h r o m b o c y t o p e n i c h u m a n p a t i e n t s w i t h b a c t e r i a l s e p s i s h a v e h a d e l e v a t e d P A I g w h i c h h a s b e e n c o n s i d e r e d i n d i c a t i v e o f a n i m m u n e - m e d i a t e d c o m p o n e n t t o t h e t h r o m b o c y t o p e n i a . 2 ‘ 3 ' 2 5 4 K e l t o n u s e d a d i r e c t c o m p l e m e n t l y s i s i n h i b i t i o n t e s t a n d s h o w e d t h a t P A I g G w a s i n c r e a s e d i n 1 6 o f 2 1 e p i s o d e s o f t h r o m b o c y t o p e n i c g r a m — p o s i t i v e o r g r a m - n e g a t i v e s e p t i c e m i a b u t i n o n l y 1 o f 3 1 e p i s o d e s o f n o n t h r o m b o c y t o p e n i c 3 O t h e r s h a v e s h o w n t h a t s e r u m f r o m n e o n a t e s w i t h b a c t e r i a l o r v i r a l s e p t i c e m i a . 2 1 i n f e c t i o n s f r e q u e n t l y c o n t a i n e d P B I g , t h o u g h t h e a s s a y u s e d w a s n o t q u a n t i t a t i v e ? ” L e l i e 2 5 ° m e a s u r e d P A I g w i t h a p l a t e l e t i m m u n o fl u o r e s c e n c e a s s a y i n s e p t i c e m i c h u m a n p a t i e n t s a n d s u g g e s t e d t h a t t h e P A I g r e p r e s e n t e d s p e c i fi c a u t o a n t i b o d i e s . I n c r e a s e d P A I g G w a s p r e s e n t i n 8 / 1 3 ( 6 2 % ) p a t i e n t s w i t h t h r o m b o c y t o p e n i c s e p t i c e m i a a n d a l s o i n 1 1 / 1 7 ( 6 5 % ) n o n t h r o m b o c y t o p e n i c , s e p t i c e m i c p a t i e n t s . A f t e r s u c c e s s f u l t h e r a p y , 6 - 2 9 d a y s a f t e r a c u t e t e s t i n g , 1 0 / 1 4 ( 7 1 % ) p a t i e n t s s t i l l h a d e l e v a t e d P A I g G . E t h e r e l u a t e s o f P A I g o r p o s i t i v e s e r a w e r e n o t r e a c t i v e w i t h G l a n z m a n n t y p e I p l a t e l e t s , i n d i c a t i n g s p e c i fi c i t y o f t h e P A I g G f o r G P H b / I I I a . H o w e v e r , t h e e l u a t e I g G d i d n o t r e a c t 6 0 w e l l o r a t a l l w i t h p l a t e l e t s p r e p a r e d i n c i t r a t e i n s t e a d o f E D T A . T h e s e fi n d i n g s a r e c o n s i s t e n t w i t h a n t i b o d y r e a c t i v i t y t o c r y p t a n t i g e n s i n d u c e d i n v i v o b y b a c t e r i a a n d i n v i t r o b y E D T A . O f r e l e v a n c e t o P A I g G i n s e p s i s a r e t h e r e p o r t s o f d i r e c t b a c t e r i a l b i n d i n g t o p l a t e l e t s . S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s b i n d s t o w a s h e d h u m a n p l a t e l e t s i n a r a p i d , s a t u r a b l e , a n d r e v e r s i b l e m a n n e r i n d e p e n d e n t o f p r o t e i n A a n d p l a s m a c o f a c t o r s ? 5 7 M o r e o v e r , t h e b i n d i n g c a n b e b l o c k e d b y i n c u b a t i o n w i t h a m o n o c l o n a l a n t i b o d y t o F c y R H i n d i c a t i n g a r o l e f o r t h e p l a t e l e t F e r e c e p t o r . S i m i l a r d i r e c t b i n d i n g t o h u m a n p l a t e l e t s a n d e v i d e n c e f o r a s p e c i fi c r e c e p t o r - l i g a n d i n t e r a c t i o n o f v i r i d a n s g r o u p s t r e p t o c o c c i h a s b e e n s h o w n ? 5 8 I n t h i s c a s e , h o w e v e r , b i n d i n g w a s n o t F c - m e d i a t e d . T h e s e fi n d i n g s a r e r e l e v a n t t o t h e d i s c u s s i o n o f e l e v a t e d P A I g i n s e p s i s b e c a u s e i f b a c t e r i a a r e b o u n d t o p l a t e l e t s , a n t i b o d i e s b o u n d t o t h e b a c t e r i a c o u l d a l s o b e a s s o c i a t e d w i t h t h e p l a t e l e t s l e a d i n g t o e l e v a t e d P A I g . T h i s m e c h a n i s m i s a l s o r e l e v a n t t o t h e I M T t h a t c o m p l i c a t e s s o m e h u m a n m a l a r i a ] i n f e c t i o n s , i n w h i c h c a s e s p e c i fi c I g G b i n d i n g t o p l a t e l e t - b o u n d m a l a r i a l a n t i g e n h a s b e e n S h o w n t o b e F a b - m e d i a t e d . ” 9 T h e p r e s e n c e o f p l a t e l e t - b o u n d o r g a n i s m s i s a l s o l i k e l y t o c o n t r i b u t e t o p l a t e l e t r e m o v a l t h r o u g h s u c h m e c h a n i s m s a s p l a t e l e t a c t i v a t i o n , f a c i l i t a t e d p h a g o c y t o s i s , a n d c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n . T h e r e l a t i v e c o n t r i b u t i o n o f i m m u n o l o g i c a n d n o n i r n m u n o l o g i c p l a t e l e t d e s t r u c t i o n i n s e p s i s r e m a i n s t o b e d e t e r m i n e d . A s f o r v i r u s e s , s p e c i fi c a n t i p l a t e l e t a n t i b o d i e s i d e n t i fi e d i n s o m e t h r o m b o c y t o p e n i c p a t i e n t s w i t h c o n c o m i t a n t v i r a l i n f e c t i o n s a r e e v i d e n c e f o r a v i r a l l y - i n d u c e d a u t o i m m u n e c o m p o n e n t t o t h e t h r o m b o c y t o p e n i a ? 6 0 S p e c i fi c a u t o a n t i b o d i e s , u s u a l l y d i r e c t e d a g a i n s t G P H b / H I a h a v e b e e n r e p o r t e d i n a s s o c i a t i o n w i t h s u c h v i r a l d i s e a s e s a s m e a s l e s , a c q u i r e d 6 1 r u b e l l a , H I V i n f e c t i o n s , 2 6 1 v a r i c e l l a , a n d i n f e c t i o u s m o n o n u c l e o s i s . 2 6 0 T h e f a c t o r s i n v o l v e d i n t h e i n c o n s i s t e n t p r o d u c t i o n o f t h e s e a n t i b o d i e s r e m a i n t o b e d e t e r m i n e d . T h e t h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h H I V i n f e c t i o n a p p e a r s t o h a v e a m u l t i f a c t o r i a l a n d s t a g e - d e p e n d e n t p a t h o g e n e s i s . P l a t e l e t s u r v i v a l s t u d i e s i n d i c a t e t h a t d e c r e a s e d p l a t e l e t s u r v i v a l i s o f p r i m a r y i m p o r t a n c e r e l a t i v e l y s o o n a f t e r i n f e c t i o n , b u t b o n e m a r r o w s u p p r e s s i o n i s g e n e r a l l y m o r e p r o m i n e n t a t l a t e r s t a g e s i n p a t i e n t s w i t h A I D S - r e l a t e d c o m p l e x o r f r a n k A I D S ? ° 2 E l e v a t e d P A I g i s t h o u g h t t o b e r e s p o n s i b l e f o r 2 6 ‘ c r o s s - r e a c t i v e a n t i - v i r a l p l a t e l e t d e s t r u c t i o n , a n d r o l e s f o r s p e c i fi c a u t o a n t i b o d i e s , a n t i b o d i e s , 2 ° 3 ' 2 6 4 i m m u n e c o m p l e x e s , 2 6 5 a n d c o m p l e m e n t 2 6 5 h a v e a l l b e e n d e s c r i b e d . M e g a k a r y o c y t e i n f e c t i o n m a y b e r e s p o n s i b l e f o r d e c r e a s e d p r o d u c t i o n ” ; 2 6 7 U n t i l P A I g i s e v a l u a t e d i n a c o n s i d e r a b l e n u m b e r o f d o g s w i t h i n f e c t i o u s d i s e a s e s , t h e r o l e o f i m m u n e - m e d i a t e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n i n s u c h d o g s w i l l g o u n c h a r a c t e r i z e d . A d i r e c t t e s t f o r P A I g w a s p o s i t i v e i n 1 d o g e a c h w i t h c o n c u r r e n t E h r l i c h i a c a n i s / B a b e s i a c a n i s i n f e c t i o n a n d d i r o fi l a r i a s i s . ‘ 6 0 O t h e r w i s e , I M T h a s b e e n a s s o c i a t e d w i t h i n f e c t i o n s b y i n d i r e c t e v i d e n c e f o r p l a t e l e t - r e a c t i v e a n t i b o d i e s o r b y t e s t r e s u l t s s u g g e s t i n g c o n c u r r e n t i m m u n o l o g i c d i s o r d e r s r e l a t e d t o o t h e r c e l l s . F o r e x a m p l e , p o s i t i v e C o o m b s ’ t e s t s 2 6 8 a n d a n t i n u c l e a r a n t i b o d i e s 2 6 8 r e p o r t e d i n d o g s w i t h b a c t e r i a l e n d o c a r d i t i s s u g g e s t t h e p o t e n t i a l f o r I M T i n c a n i n e b a c t e r e m i a s . D i s e a s e s f o r w h i c h i m m u n e - m e d i a t e d c o n t r i b u t i o n s h a v e b e e n r e p e a t e d l y c o n s i d e r e d i n c l u d e c a n i n e m o n o c y t i c e h r l i c h i o s i s , R M S F , h i s t o p l a s m o s i s , l e i s h m a n i a s i s , a n d d i s t e m p e r . O n l y i n t h e c a s e o f c a n i n e d i s t e m p e r a r e t h e r e c u r r e n t l y e n o u g h d a t a t o s u p p o r t a m a j o r i m m u n o l o g i c c o m p o n e n t t o t h e t h r o m b o c y t o p e n i a . 6 2 C a n i n e d i s t e m p e r v i r u s ( C D V ) , a m o r i b i l l i v i r u s ( f a m i l y P a r a m y x o v i r i d a e ) a n t i g e n i c a l l y r e l a t e d t o h u m a n m e a s l e s v i r u s , h a s b e e n a s s o c i a t e d w i t h m a r k e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n e x p e r i m e n t a l l y i n f e c t e d p u p p i e s , 1 1 1 t h o u g h t h r o m b o c y t o p e n i a h a s n o t b e e n c o n s i s t e n t l y r e c o g n i z e d i n o l d e r o r s p o n t a n e o u s l y i n f e c t e d d o g s ? 6 9 T h r o m b o c y t o p e - n i a a l s o d e v e l o p s i n d o g s v a c c i n a t e d w i t h m o d i fi e d l i v e v i r u s ( M L V ) d i s t e m p e r v a c c i n e s ? ” 2 7 2 I n t h e e x p e r i m e n t a l l y i n d u c e d i n f e c t i o n s , i n o c u l a t e d p u p p i e s w e r e t h r o m b o c y t o p e - n i c b y p o s t i n o c u l a t i o n d a y ( P I D ) 5 . 1 1 1 O n P I D 7 , p l a t e l e t - a s s o c i a t e d C D V w a s d e t e c t e d b y d i r e c t i m m u n o fl u o r e s c e n c e o n a c e t o n e - fi x e d , a i r - d r i e d c y t o c e n t r i f u g e p r e p a r a t i o n s . I g G b u t n o t I g M o r C 3 w a s f o u n d o n t h e s a m e p l a t e l e t s a s C D V a n t i g e n f r o m d a y 7 o n , a n d t h e a m o u n t o f P A I g G a n d p l a t e l e t - a s s o c i a t e d C D V a n t i g e n i n c r e a s e d a s v i r e m i a p r o g r e s s e d . S u r p r i s i n g l y , t i t e r s o f C D V - s p e c i fi c I g G w e r e n e v e r d e t e c t e d . A n i n d i r e c t p r o t e i n A - c o l l o i d a l g o l d t e c h n i q u e w a s u s e d t o s h o w t h a t f r o m P I D 7 o n , d e n s e a g g r e g a t e s l a b e l i n g s p e c i fi c a l l y f o r C D V w e r e p r e s e n t o n t h e s u r f a c e a n d i n t h e o p e n c a n a l i c u l a r s y s t e m o f p l a t e l e t s , t h o u g h w h o l e v i r i o n s w e r e n o t i d e n t i fi e d . P h a g o e y t o s i s o f p l a t e l e t s b y K u p f f e r ’ s c e l l s w a s p r o m i n e n t f r o m P I D 5 o n w a r d . T h e s e fi n d i n g s s u g g e s t t h a t a c o m p l e m e n t - i n d e p e n d e n t , i m m u n e c o m p l e x - i n d u c e d d e s t r u c t i o n o f p l a t e l e t s m a y c a u s e o r c o n t r i b u t e t o t h e t h r o m b o c y t o p e n i a o f e x p e r i m e n t a l d i s t e m p e r v i r u s . H o w e v e r , t h e n a t u r e o f t h e p r o p o s e d c o m p l e x e s a n d t h e i r o r i e n t a t i o n w i t h r e s p e c t t o t h e p l a t e l e t s u r f a c e a r e n o t k n o w n . F e r e c e p t o r b i n d i n g w a s s u g g e s t e d , b u t t h e r e i s n o e v i d e n c e t h a t d o g s h a v e a p l a t e l e t F e r e c e p t o r . A n t i b o d y b i n d i n g t o p l a t e l e t - b o u n d C D V a n t i g e n c o u l d a l s o a c c o u n t f o r t h e fi n d i n g s . 6 3 I n t h e s a m e s t u d i e s , C D V a n t i g e n w a s a s s o c i a t e d w i t h m e g a k a r y o c y t e s f r o m P I D 4 o n , b u t i t w a s m o s t a b u n d a n t a f t e r P I D 8 . 1 1 1 T h e d e n s i t y o f m e g a k a r y o c y t e s i n t h e m a r r o w o f i n f e c t e d d o g s w a s c o n s t a n t . T h e a b s e n c e o f a r e s p o n s i v e m e g a k a r y o c y t i c h y p e r p l a s i a s u g g e s t s t h a t i m p a i r e d m e g a k a r y o c y t o p o i e s i s a n d t h r o m b o p o i e s i s m a y a l s o h a v e c o n t r i b u t e d t o t h e t h r o m b o c y t o p e n i a s . T h e t h r o m b o c y t o p e n i a s r e p o r t e d i n d o g s a f t e r v a c c i n a t i o n w i t h M L V d i s t e m p e r v a c c i n e s h a v e b e e n t r a n s i e n t a n d o f v a r i a b l e d e g r e e ? ” 2 7 2 P u p p i e s v a c c i n a t e d a t 4 a n d a g a i n a t 7 w e e k s h a d d e c r e a s e d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s t h a t w e r e l o w e s t 1 w e e k a f t e r v a c c i n a t i o n ? 7 2 T h e a v e r a g e r e d u c t i o n i n p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s a f t e r p r i m a r y a n d s e c o n d a r y i m m u n i z a t i o n s w e r e 3 3 a n d 3 0 % r e s p e c t i v e l y . H o w e v e r , n o a g e - m a t c h e d n o n v a c c i n a t e d c o n t r o l s w e r e c o n c u r r e n t l y e v a l u a t e d . O t h e r s 2 7 3 h a v e f o u n d t h a t d o g s b o o s t e r e d w i t h a M L V d i s t e m p e r - h e p a t i t i s v i r u s v a c c i n e t e n d e d t o h a v e m i l d t o m o d e r a t e d e c r e a s e s i n p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n a b o u t 1 w e e k l a t e r , t h o u g h n o n e b e c a m e t h r o m b o c y t o - p e n i c . N o a d v e r s e e f f e c t s o n A D P - i n d u c e d p l a t e l e t ( P R P ) a g g r e g a t i o n w e r e d e t e c t e d i n t h e s e v a c c i n a t e d d o g s . I n a n o t h e r s t u d y , m a t u r e d o g s v a c c i n a t e d w i t h a M L V v a c c i n e f o r d i s t e m p e r , h e p a t i t i s , a n d p a r a i n fl u e n z a h a d s i g n i fi c a n t l y r e d u c e d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s 2 d a y s a f t e r v a c c i n a t i o n , a v e r a g i n g a 4 8 % d e c r e a s e f r o m b a s e l i n e v a l u e s ? 7 1 P l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s a p p e a r e d t o b e n o r m a l b y 9 6 h o u r s a f t e r v a c c i n a t i o n . S i g n i fi c a n t p l a t e l e t d e c r e m e n t s d i d n o t o c c u r i n 3 o f t h e 9 d o g s , b u t t h r o m b o c y t o p e n i a w a s m a r k e d i n 1 d o g ( 1 5 , 0 0 0 / p l ) . L e v a m i s o l e g i v e n t o a n o t h e r g r o u p o f n i n e d o g s a t t h e t i m e o f v a c c i n a t i o n p r e v e n t e d t h e d e c r e a s e i n p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s . T h i s p r o t e c t i o n m a y r e l a t e t o l e v a m i s o l e ’ s i m r n u n o m o d u l a t o r y a c t i v i t y . D i s t e m p e r i n f e c t i o n s a r e k n o w n t o i n d u c e m a r k e d “ i n ' 7 " 6 4 i m m e d i a t e a n d l o n g - t e r m e f f e c t s o n t h e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f l y m p h o i d t i s s u e , S p a r i n g n e i t h e r B n o r T l y m p h o c y t e s , b u t t h e c o n t r i b u t i o n o f t h e s e c h a n g e s t o t h e t h r o m b o c y t o p e - n i a i s u n k n o w n ? " L e v a m i s o l e m a y m o d u l a t e t h e s e e f f e c t s . R e p o r t e d l y , d e e r , f o x , b e a r , a n d r a c c o o n s v a c c i n a t e d w i t h M L V m e a s l e s o r c a n i n e d i s t e m p e r v a c c i n e s a l s o h a v e a c o n s i s t e n t d r o p o f a b o u t 1 0 0 , 0 0 0 p l a t e l e t s / p l 3 - 5 d a y s a f t e r v a c c i n a t i o n a n d l a s t i n g f o r a s l o n g a s a w e e k . 2 2 W h i l e e x p e r i m e n t a l d i s t e m p e r v a c c i n a t i o n s h a v e g e n e r a l l y n o t i n d u c e d m a r k e d t h r o m b o c y t o p e n i a , c l i n i c a l p u r p u r a h a s r e p o r t e d l y f o l l o w e d 1 - 2 1 d a y s a f t e r r o u t i n e c l i n i c a l v a c c i n a t i o n s w i t h M L V v a c c i n e s , i n c l u d i n g t h o s e f o r c a n i n e p a r v o v i r u s ” : 2 7 5 D e t a i l e d r e p o r t s o r f u r t h e r s t u d i e s o f t h e s e c l i n i c a l o b s e r v a t i o n s h a v e n o t b e e n p u b l i s h e d . A f e v e r a n d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n i m m e d i a t e l y f o l l o w i n g v a c c i n a t i o n w e r e c o n s i d e r e d s u f fi c i e n t t o s h o w t h a t t h e " r e a c t i o n s c l e a r l y w e r e v a c c i n e r e l a t e d " . 2 2 S u p p o r t f o r c l i n i c a l p u r p u r a f o l l o w i n g v a c c i n a t i o n c o m e s f r o m t h e h u m a n m o d e l . A c u t e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a w a s t h e m o s t f r e q u e n t c o m p l i c a t i o n r e q u i r i n g h o s p i t a l i z a t i o n o f F i n n i s h p e 0 p l e v a c c i n a t e d w i t h a l i v e - v i r u s m e a s l e s , m u m p s , a n d r u b e l l a v a c c i n e ? 7 6 O f t h e 1 . 5 m i l l i o n p e o p l e v a c c i n a t e d o v e r 1 2 y e a r s , t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a w a s r e p o r t e d i n a b o u t 5 0 o f t h e m , u s u a l l y 2 - 3 w e e k s a f t e r v a c c i n a t i o n . P A I g w a s i n c r e a s e d i n m a n y o f t h e s e p a t i e n t s , a n d c i r c u l a t i n g a n t i b o d i e s w i t h s p e c i fi c i t y t o G P H b / I H a w e r e p r e s e n t i n s o m e ? 7 7 v ) a l l o i m m u n e n e o n a t a l A l l o i m m u n e n e o n a t a l t h r o m b o c y t o p e n i a o c c u r s i n h u m a n i n f a n t s w h e n t h e m o t h e r h a s b e c o m e i m m u n i z e d b y f e t a l p l a t e l e t s p o s s e s s i n g p a t e m a l l y - d e r i v e d a n t i g e n i c 6 5 d e t e r m i n a n t s r e c o g n i z e d a s f o r e i g n b y t h e m o t h e r . I n p e o p l e , t r a n s p l a c e n t a l l y a c q u i r e d m a t e r n a l i m m u n o g l o b u l i n s c a u s e p l a t e l e t d e s t r u c t i o n i n u t e r o . N e o n a t a l a l l o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a h a s a l s o b e e n d e s c r i b e d i n p i g s , i n w h i c h c a s e t h e s e n s i t i z e d d a m p a s s e s t h e p l a t e l e t - r e a c t i v e a n t i b o d i e s t o t h e n e w b o r n p i g t h r o u g h h e r c o l o s t r u m ? 7 8 W h i l e n o t d e s c r i b e d i n d o g s , t h i s f o r m o f I M T m a y c e r t a i n l y o c c u r . v i ) p o s t t r a n s f u s i o n p u r p u r a P o s t t r a n s f u s i o n p u r p u r a ( P T P ) i s a d i s t i n c t e n t i t y i n h u m a n p a t i e n t s o c c u r r i n g a b o u t 1 w e e k a f t e r a t r a n s f u s i o n ? 0 4 I t i s a s s o c i a t e d w i t h s e v e r e t h r o m b o c y t o p e n i a a n d h i g h t i t e r s o f p l a t e l e t - r e a c t i v e a l l o a n t i b o d i e s w h i c h m e d i a t e d e s t r u c t i o n o f t r a n s f u s e d a s w e l l a s a u t o l o g o u s p l a t e l e t s d e s p i t e t h e f a c t t h a t a u t o l o g o u s p l a t e l e t s , a f t e r r e c o v e r y , l a c k t h e r e a c t i v e e p i t o p e f o r t h e a l l o a n t i b o d y i n q u e s t i o n . T h i s d e s t r u c t i o n o f a u t o l o g o u s p l a t e l e t s , a p p a r e n t l y b y a n a l l o a n t i b o d y , i s i n c o m p l e t e l y u n d e r s t o o d . P o s t t r a n s f u s i o n p u r p u r a m a y a l s o o c c u r p a s s i v e l y i f a l l o a n t i b o d i e s a r e i n a d v e r t e n t - l y t r a n s f u s e d . I n t h i s c a s e , t h r o m b o c y t o p e n i a o c c u r s w i t h i n a f e w h o u r s . 1 1 D e s t r u c t i o n o f a u t o l o g o u s p l a t e l e t s h a s b e e n r e p o r t e d f o r 2 d o g s g i v e n m u l t i p l e t r a n s f u s i o n s o f a l l o g e n i c p l a t e l e t s . 2 7 9 W h i l e t h r o m b o c y t o p e n i a d i d n o t o c c u r w i t h t h e fi r s t 2 5 a n d 3 4 t r a n s f u s i o n s , t h e n e x t t r a n s f u s i o n f o r e a c h d o g c a u s e d d r a m a t i c t h r o m b o c y t o p e - n i a , i n e i t h e r 3 d a y s o r 2 h o u r s . P l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s r o s e o v e r t h e f o l l o w i n g f e w d a y s , f a s t e r i n o n e d o g t h a n i n t h e o t h e r , a n d s u b s e q u e n t t r a n s f u s i o n s w e r e a s s o c i a t e d w i t h r e p e a t e d , b u t m i l d e r , d e p r e s s i o n s i n p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s . T h e a u t h o r s c o n s i d e r e d a n i m m u n e c o m p l e x m e c h a n i s m t h e m o s t l i k e l y . 6 : e 6 6 W h i l e d e t a i l s w e r e n o t p r o v i d e d , e l e v a t e d P A I g h a s b e e n r e p o r t e d i n a s i n g l e d o g t h a t d e v e l o p e d t h r o m b o c y t o p e n i a 1 4 d a y s a f t e r a b l o o d t r a n s f u s i o n . 1 6 ° T h i s d o g m a y h a v e h a d p o s t t r a n s f u s i o n p u r p u r a . U n r e l a t e d i s t h e m a r k e d b u t t r a n s i e n t p o s t — t r a n s f u s i o n t h r o m b o c y t o p e n i a t h a t h a s b e e n r e p o r t e d t o o c c u r i n c a n i n e r e c i p i e n t s o f D E A l - i n c o m p a t i b l c e r y t h r o c y t e s o r p l a s m a c o n t a i n i n g a n t i - D E A l a l l o a n t i b o d i e s ? 8 0 T h e t h r o m b o c y t o p e n i a o c c u r r e d a n d r e s o l v e d w i t h i n a f e w h o u r s o f t r a n s f u s i o n , a n d w a s a s s o c i a t e d w i t h p o o r c l o t r e t r a c t i o n . T h e r a p i d r e c o v e r y a n d t r a n s i e n t n a t u r e o f t h e t h r o m b o c y t o p e n i a s u g g e s t s t h a t s e q u e s t r a t i o n o c c u r r e d , a n d i t w a s h y p o t h e s i z e d t o b e d u e t o i m m u n e a d h e r e n c e t o t h e a n t i b o d y - c o a t e d e r y t h r o c y t e s ? 8 1 v i i ) h y p o t h y r o i d i s m P r e l i m i n a r y s t u d i e s h a v e s u g g e s t e d t h a t a s a g r o u p , h y p o t h y r o i d d o g s h a v e h i g h e r p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s a n d l o w e r m e a n p l a t e l e t v o l u m e s t h a n d o e u t h y r o i d c o n t r o l s ? 8 2 O n t h e b a s i s o f t h e s e a l t e r e d i n d i c e s a n d s u s p i c i o n s t h a t h y p o t h y r o i d i s m m a y p r e d i s p o s e t o I M T i n d o g s , i t w a s s u g g e s t e d t h a t d o g s o f k n o w n t h y r o i d s t a t u s b e a s s e s s e d f o r P A I g a n d p l a t e l e t s u r v i v a l t o d e t e r m i n e i f h y p o t h y r o i d i s m i s a c c o m p a n i e d b y a c c e l e r a t e d i m m u n e - m e d i a t e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n ? 8 2 v i i i ) o t h e r I M T h a s b e e n d i a g n o s e d i n 6 c a n i n e r e c i p i e n t s o f D L A - i n c o m p a t i b l e f e t a l l i v e r h e m a t o p o i e t i c c e l l t r a n s p l a n t s ? 8 3 T h e s e d o g s d e v e l o p e d t h r o m b o c y t o p e n i a a f t e r r e c o v e r i n g f r o m p o s t i r r a d i a t i o n n a d i r s o f p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n , a n d t h e i r b o n e m a r r o w s 6 7 w e r e h y p e r c e l l u l a r w i t h m e g a k a r y o c y t i c h y p e r p l a s i a . A l l 6 w e r e p o s i t i v e f o r m e g a k a r y o - c y t e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n b y a d i r e c t m e g a k a r y o c y t e i m m u n o fl u o r e s c e n c e t e s t , a n d 5 o f t h e 6 h a d p o s i t i v e P F 3 r e s u l t s . T h e c a u s e o f p o s t — t r a n s p l a n t a t i o n i n d u c e d I M T i n t h e s e d o g s w a s u n d e t e r m i n e d . ( c ) p r i m a r y I M T A g r e a t d e a l o f p r o g r e s s h a s b e e n m a d e o v e r t h e l a s t 3 0 y e a r s t o w a r d u n d e r s t a n d - i n g p r i m a r y I M T i n p e o p l e , b u t m a n y q u e s t i o n s r e m a i n . E f f o r t s t o c h a r a c t e r i z e a n d u n d e r s t a n d c a n i n e I M T a r e c o m p a r a t i v e l y o n l y p r e l i m i n a r y . I n t h i s s e c t i o n , t h e h u m a n c o n d i t i o n w i l l b e r e v i e w e d fi r s t t o p r o v i d e a s o l i d b a s i s f o r c o m p a r i s o n w i t h t h e c a n i n e a n a l o g u e w h i c h w i l l b e r e v i e w e d s e c o n d . i ) h u m a n a ) a c u t e I M T A c u t e I M T m a y b e b e t t e r c l a s s i fi e d a s a s e c o n d a r y f o r m o f I M T ? “ b e c a u s e i t u s u a l l y o c c u r s i n t h e w i n t e r a n d s p r i n g 1 - 2 1 d a y s f o l l o w i n g v i r a l i n f e c t i o n s ? " 4 H o w e v e r , t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n i n f e c t i o n a n d t h r o m b o c y t o p e n i a i s u n c l e a r a n d o f t e n i n a p p a r - e n t ? 0 4 I t w i l l t h e r e f o r e b e c o n s i d e r e d a p r i m a r y f o r m o f I M T f o r t h i s d i s c u s s i o n . A c u t e I M T i s a g e n d e r - n e u t r a l d i s o r d e r o c c u r r i n g i n p e o p l e o f a l l a g e s , b u t u s u a l l y i n c h i l d r e n f r o m 1 t o 1 0 y e a r s o l d . 2 8 5 C l i n i c a l l y , t h e r e i s t y p i c a l l y a s u d d e n o n s e t o f p e t e c h i a e a n d m u c o c u t a n e o u s h e m o r r h a g e s . M i l d s p l e n o m e g a l y a n d l y m p h a d e n o - m e g a l y a r e o f t e n f o u n d , b u t t h e y a r e t h o u g h t t o r e l a t e t o r e c e n t i n f e c t i o n s . T h r o m b o c y t o - O p e n i a i s o f t e n m a r k e d ( < 1 0 , 0 0 0 / p l ) a n d a c c o m p a n i e d b y a n o r m a l t o i n c r e a s e d n u m b e r 6 8 o f m e g a k a r y o c y t e s i n t h e b o n e m a r r o w . P A I g m a y b e e l e v a t e d 2 0 4 b u t c i r c u l a t i n g t i t e r s o f G P I I b / I H a a n d G P I b / I X - b i n d a b l e I g G a r e o f t e n u n d e t e c t a b l e o r o n l y m i l d l y e l e v a t e d ? “ A p r e d o m i n a n c e o f c i r c u l a t i n g I g M h a s b e e n r e p o r t e d t o b i n d t o G P I b , G P H b , G P H I a , a n d s e v e r a l u n d e fi n e d p r o t e i n s ? 8 7 A c u t e I M T u s u a l l y r e s o l v e s s p o n t a n e o u s l y w i t h i n 1 - 2 m o n t h s , t h o u g h a b o u t 1 0 % o f c h i l d r e n w i t h p r e s u m e d a c u t e I M T d e v e l o p c h r o n i c I M T ? 8 4 T h e b e s t m o d e o f t h e r a p y f o r a c u t e I M T i s s o m e w h a t c o n t r o v e r s i a l s i n c e m o s t p a t i e n t s r e c o v e r r e g a r d l e s s o f t h e t h e r a p e u t i c p r o t o c o l , a n d s o m e r e c o v e r e v e n i f u n t r e a t e d ? " " ' 2 “ " ? 8 8 T r e a t m e n t o p t i o n s i n c l u d e g a m m a g l o b u l i n , g l u c o c o r t i c o i d s , a n t i - D g l o b u l i n , a n d s p l e n e c t o m y i n s e l e c t e d c a s e s . O n a n i n d i v i d u a l b a s i s , i t i s n o t a l w a y s p o s s i b l e t o d i f f e r e n t i a t e a c u t e I M T f r o m c h r o n i c I M T . P e o p l e w i t h a n i n i t i a l d i a g n o s i s o f a c u t e I M T a r e c o n s i d e r e d t o h a v e c h r o n i c I M T i f t h e y d o n o t r e c o v e r w i t h i n 6 m o n t h s ? “ S e v e r a l p a t h o g e n i c m e c h a n i s m s h a v e b e e n p r o p o s e d t o e x p l a i n a c u t e I M T , i n c l u d i n g r o l e s f o r i m m u n e c o m p l e x e s , c r o s s - r e a c t i v e a n t i b o d i e s , a n t i - i d i o t y p e a n t i b o d i e s , a l t e r e d p l a t e l e t s u r f a c e s , i n a p p r o p r i a t e i m m u n e r e s p o n s e s , a n d i m m u n e s t i m u l a t i o n b y 2 8 ‘ T h e m e c h a n i s m o f s u p e r a n t i g e n s h a s r e c e n t l y b e e n r e v i e w e d ? 8 9 T h e s u p e r a n t i g e n s . o c c u r r e n c e o f a c u t e I M T i n t h e c o n v a l e s c e n t s t a g e o f v i r a l i n f e c t i o n s w o u l d s e e m t o a r g u e a g a i n s t v i r a l / a n t i v i r a l i m m u n e c o m p l e x e s w h i c h w o u l d p r e s u m a b l y h a v e b e e n p r e s e n t m u c h e a r l i e r . A n t i - i d i o t y p i c a n t i b o d i e s f o r m e d i n r e s p o n s e t o a n t i v i r a l a n t i b o d i e s m a y m i m i c p l a t e l e t a n t i g e n s a n d i n d u c e m o r e a n t i b o d y p r o d u c t i o n ; t h i s p h e n o m e n o n o c c u r s i n a m u r i n e m o d e l o f S L E ? 9 0 6 9 b ) c h r o n i c I M T C h r o n i c I M T a p p e a r s t o b e a n a u t o i m m u n e d i s e a s e a n a l o g o u s t o a u t o i m m u n e h e m o l y t i c a n e m i a ? 0 8 I t i s p r i m a r i l y a d i s e a s e o f a d u l t s , w i t h w o m e n b e i n g a f f e c t e d 3 t o 4 t i m e s a s f r e q u e n t l y a s m e n ? ° “ ? 3 5 H L A t y p e m a y i n fl u e n c e s u s c e p t i b i l i t y t o c h r o n i c I M T ? “ A s o p p o s e d t o t h e a c u t e c o n d i t i o n , c h r o n i c I M T u s u a l l y h a s a n i n s i d i o u s o n s e t a n d d o e s n o t r e s o l v e s p o n t a n e o u s l y . P l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s u s u a l l y r a n g e f r o m 5 , 0 0 0 t o 1 0 0 , 0 0 0 / p l , a n d a c c o m p a n y i n g c l i n i c a l s i g n s , i f p r e s e n t , i n c l u d e p e t e c h i a e a n d h e m o r r h a g e s a s s o c i a t e d w i t h t h e s k i n a n d m u c o u s m e m b r a n e s . A s w i t h a c u t e I M T , m e g a k a r y o c y t e s a r e t y p i c a l l y i n n o r m a l t o i n c r e a s e d n u m b e r s i n t h e b o n e m a r r o w . S p l e n o m e g a l y i s m i l d w h e n i t o c c u r s , a n d i t o c c u r s o n l y o c c a s i o n a l l y ; i t s p r e s e n c e s h o u l d s u g g e s t a n a l t e r n a t i v e d i a g n o s i s ? “ - 2 8 4 V a r i o u s c o m b i n a t i o n s o f i n c r e a s e d P A I g G ( a l l s u b c l a s s e s ) , I g M , I g A , a n d c o m p l e m e n t a r e u s u a l l y d e m o n s t r a b l e , w i t h I g G p r e d o m i n a t i n g . 2 0 4 ' 2 9 1 ' 2 9 6 S p e c i fi c p l a t e l e t - a s s o c i a t e d o r p l a t e l e t - b i n d a b l e a u t o a n t i b o d i e s r e a c t i v e w i t h t h e m a j o r p l a t e l e t g l y c o p r o - t e i n s a r e c u r r e n t l y d e t e c t a b l e i n a b o u t 8 0 % o f p a t i e n t s ? ” 2 9 9 T h e d e t e c t i o n o f s e r u m t i t e r s o f a n t i p l a t e l e t a n t i b o d y i s l e s s c o n s i s t e n t a n d q u i t e v a r i a b l e a m o n g s t u d i e s a n d a s s a y s . R e c e n t l y , a t l e a s t o n e p l a t e l e t - r e a c t i v e i m m u n o g l o b u l i n w a s d e t e c t e d i n 8 5 % o f s e r a t e s t e d f r o m h u m a n p a t i e n t s w i t h c h r o n i c I M T . 2 9 9 T h e h i g h p e r c e n t a g e d e t e c t e d w a s a t t r i b u t e d t o d e t e c t i n g I g A a n d I g M c l a s s e s i n a d d i t i o n t o I g G , a n d t o u s i n g a n e x p a n d e d p a n e l o f m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s c o m p a r e d t o m o s t s t u d i e s . T h e t a r g e t e p i t o p e s o f a u t o a n t i b o d i e s i n c h r o n i c I M T a r e g e n e r a l l y p u b l i c a n t i g e n s s h a r e d b y n o r m a l p l a t e l e t s f r o m m o s t p e o p l e ? ” 2 9 6 T a r g e t s h a v e b e e n i d e n t i fi e d b y s e v e r a l a p p r o a c h e s i n c l u d i n g i r n m u n o b l o t t i n g , i m m u n O p r e c i p i t a t i o n , r e a c t i v i t y w i t h 7 O p l a t e l e t s c o n g e n i t a l l y d e fi c i e n t i n p a r t i c u l a r s u r f a c e g l y c 0 p r o t e i n s , a n d b y t e c h n i q u e s b a s e d u p o n t h e i m m o b i l i z a t i o n o f p o t e n t i a l s u r f a c e t a r g e t s b y u s e o f m u r i n e m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s . T h e e p i t o p e s m o s t f r e q u e n t l y i d e n t i fi e d a r e o n g l y c o p r o t e i n s H b , I H a , t h e H b / I H a c o m p l e x , I b / V / I X , I V , a n d I a / H a , 2 3 5 ' 2 9 ° 3 m b u t o t h e r t a r g e t s p o s s i b l y i n c l u d i n g g l y c o s p h i n g o l i p i d s 3 0 3 a n d p h o s p h o l i p i d s 3 0 4 h a v e b e e n r e p o r t e d . I n a r e c e n t s t u d y , G P S I V a n d I a / I i a w e r e n e v e r r e a c t i v e t o s e r u m a n t i b o d i e s w i t h o u t r e a c t i v i t y o f e i t h e r G P I I b / H I a o r G P I b / I X ? 9 9 S o m e p a t i e n t s h a v e c l i n i c a l h e m o r r h a g i c s i g n s b u t p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s s u f fi c i e n t l y h i g h t h a t n o r m a l h e m o s t a s i s w o u l d b e e x p e c t e d . S e v e r a l p l a t e l e t m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s i n c l u d i n g G P I H a , G P H a , P - s e l e c t i n , a n d p o s s i b l y G P I b a r e p r e s e n t o n e n d o t h e l i a l c e l l s , s o i t i s p o s s i b l e t h a t a n t i b o d i e s r e a c t w i t h b o t h t a r g e t s i n s o m e I M T p a t i e n t s ? ” 3 0 8 T h i s c o u l d c o m p r o m i s e v a s c u l a r i n t e g r i t y a n d a l l o w h e m o r r h a g e a t a p p a r e n t l y p r o t e c t i v e p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s . I n o t h e r s p a t i e n t s w i t h I M T , a n t i b o d i e s a r e d i r e c t e d a g a i n s t i m p o r t a n t f u n c t i o n a l p l a t e l e t e p i t o p e s o n G P I b , G P H b / I H a , a n d G P H I a ? “ ' 3 ° 9 ‘ 3 “ I n o n e p a t i e n t , c l i n i c a l t h r o m b a s t h e n i a o c c u r r e d i n t h e a b s e n c e o f t h r o m b o c y t o p e n i a d u e t o s p e c i fi c p l a t e l e t a u t o a n t i b o d i e s d i r e c t e d a g a i n s t G P H b / I I I a . 3 1 2 I n a s t u d y o f a n o t h e r 4 9 I M T p a t i e n t s w i t h n o r m a l p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s a f t e r t r e a t m e n t , 3 ( 6 % ) h a d c o n t i n u e d b l e e d i n g t e n d e n c i e s a n d 1 8 ( 3 7 % ) h a d i n v i t r o p l a t e l e t a g g r e g a t i o n d e f e c t s , p e r h a p s r e l a t e d t o f u n c t i o n a l i m p a i r m e n t o f p l a t e l e t s b y c i r c u l a t i n g a n t i b o d i e s 3 1 0 U s u a l l y , h o w e v e r , p l a t e l e t s i n p a t i e n t s w i t h c h r o n i c I M T t e n d t o b e y o u n g a n d l a r g e w i t h a n i n c r e a s e d a v e r a g e f u n c t i o n a l c a p a c i t y t h a t i s a s s o c i a t e d w i t h s h o r t e r b l e e d i n g t i m e s t h a n t h o s e o f p a t i e n t s w i t h s i m i l a r p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s f r o m d e c r e a s e d J t ' 3 ~ . w . _ v , J " ( j 7 1 p l a t e l e t p r o d u c t i o n . 3 ‘ 3 ' 3 ” A l s o , a n i n c r e a s e i n c i r c u l a t i n g p l a t e l e t m i c r o p a r t i c l e s ( P M P S ) h a s b e e n r e p o r t e d i n I M T p a t i e n t s , a s w e l l a s i n p a t i e n t s w i t h o t h e r p l a t e l e t d e s t r u c t i v e s t a t e s , a n d t h e s e P M P s a p p e a r t o p r o v i d e s i g n i fi c a n t h e m o s t a t i c a c t i v i t y . 3 1 5 A n t i b o d y - c o a t e d p l a t e l e t s a r e g e n e r a l l y t h o u g h t t o b e r e m o v e d f r o m c i r c u l a t i o n b y m o n o n u c l e a r p h a g o c y t i c c e l l s i n t h e s p l e e n a n d l i v e r , 2 9 3 ' 3 1 6 t h o u g h t h e b o n e m a r r o w m a y p l a y a s i g n i fi c a n t r o l e a s w e l l . 3 1 7 I n c r e a s e d P A I g G a p p a r e n t l y l e a d s t o a n i n c r e a s e d h e p a t i c r o l e o f p l a t e l e t d e s t r u c t i o n . 3 1 8 K i n e t i c s t u d i e s h a v e u s u a l l y i n d i c a t e d s h o r t e n e d p l a t e l e t s u r v i v a l s c o n s i s t e n t w i t h a c c e l e r a t e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n . l o o H o w e v e r , k i n e t i c s t u d i e s m u s t b e i n t e r p r e t e d c a r e f u l l y b e c a u s e i n t h r o m b o c y t o p e n i c c o n d i t i o n s f r o m a n y c a u s e , a g r e a t e r p e r c e n t a g e o f t h e t o t a l p l a t e l e t m a s s w i l l b e c o n s u m e d b y n o r m a l p h y s i o l o g i c m a i n t e n a n c e o f v a s c u l a r i n t e g r i t y . T h u s p l a t e l e t s u r v i v a l s m a y b e d e c r e a s e d d e s p i t e p r i m a r y p r o d u c t i o n p r o b l e m s ? ” 3 1 9 T h i s i s s i m i l a r i n d o g s a s e v i d e n c e d b y s h o r t e n e d s u r v i v a l o f t r a n s f u s e d p l a t e l e t s i n d o g s m a d e t h r o m b o c y t o p e n i c b y l e t h a l i r r a d i a t i o n a s c o m p a r e d t o n o r m a l r e c i p i e n t s . 6 7 P l a t e l e t p r o d u c t i o n m a y b e d e c r e a s e d i n s o m e p a t i e n t s w i t h I M T , ‘ ° ° ° 3 2 0 p o s s i b l y b e c a u s e m e g a k a r y o c y t e s a r e f u n c t i o n a l l y d a m a g e d b y a n t i b o d i e s . B e c a u s e m o s t p a t i e n t s h a v e a n o r m a l o r i n c r e a s e d n u m b e r o f m e g a k a r y o c y t e s i n d i c a t i v e o f a d e q u a t e o r i n c r e a s e d m e g a k a r y o c y t o p o i e s i s , t h r o m b o p o i e s i s h a s g e n e r a l l y b e e n c o n s i d e r e d t o b e a c c e l e r a t e d . H o w e v e r , a n i n c r e a s e d n u m b e r o f m a r r o w m e g a k a r y o c y t e s m a y n o t r e fl e c t i n c r e a s e d p l a t e l e t p r o d u c t i o n i f m e g a k a r y o c y t e f u n c t i o n i s i m p a i r e d . 3 2 0 M e g a k a r y o c y - t o p o i c s i s m u s t b e d i f f e r e n t i a t e d f r o m t h r o m b o p o i e s i s . E x t e n s i v e a n t i b o d y c r o s s - r e a c t i v i t y b e t w e e n h u m a n p l a t e l e t s a n d m e g a k a r y o c y t e s i s w e l l r e c o g n i z e d a n d i n c l u d e s r e a c t i v i t y t o G P I b , G P I I b , a n d G P I H a ? 9 ~ 3 2 " 3 2 8 H o w e v e r , 7 2 t h e t e c h n i q u e s e m p l o y e d m a y n o t h a v e d i f f e r e n t i a t e d e x o s o l i c b i n d i n g f r o m c y t o s o l i c b i n d i n g , a n d m a y n o t h a v e c o n t r o l l e d f o r t h e p o t e n t i a l b i n d i n g o f d e t e c t i n g a n t i b o d i e s t o m e g a k a r y o c y t e s b y m e g a k a r y o c y t e F c r e c e p t o r s . I m m u n e c o m p l e x e s h a v e b e e n s h o w n t o b i n d t o h u m a n m e g a k a r y o c y t e s i d e n t i fi e d b y c o n c u r r e n t s t a i n i n g f o r G P H b a n d H I a , s u g g e s t i n g t h e p o s s i b i l i t y t h a t m e g a k a r y o c y t e s m a y s h a r e t h e F c ' y R H o f p l a t e l e t s . 3 2 4 R e c e n t l y , h u m a n m e g a k a r y o c y t e s w e r e s h o w n t o s y n t h e s i z e a n d e x p r e s s F c y R H r e c e p t o r s , a n d s i m i l a r l y t o p l a t e l e t s , t h e s e r e c e p t o r s a p p e a r e d t o b e m u c h l e s s a b u n d a n t t h a n G P I I b / H I a . 3 2 9 I t h a s b e e n h y p o t h e s i z e d t h a t t h e s e r e c e p t o r s m a y b e i m p o r t a n t i n t h e u p t a k e o f i m m u n e c o m p l e x e s , i n c l u d i n g , p e r h a p s , s u c h v i r u s e s a s H I V . I n a n y c a s e , t h e i r p r e s e n c e m u s t b e c o n s i d e r e d w h e n i n t e r p r e t i n g m e g a k a r y o c y t e i r n m u n o s t a i n i n g . W h i l e c r o s s - r e a c t i v i t y b e t w e e n p l a t e l e t s a n d m e g a k a r y o c y t e s e x i s t s , t h e c o n t r i b u t i o n o f m e g a k a r y o c y t e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n t o t h r o m b o c y t o p e n i a i n I M T h a s n o t b e e n d e t e r m i n e d . R a t s m a d e t h r o m b o c y t o p e n i c w i t h r a b b i t a n t i - [ r a t p l a t e l e t ] s e r u m a p p e a r e d t o h a v e s e v e r e l y i m p a i r e d m e g a k a r y o c y t e m a t u r a t i o n , w h e r e a s r a t s m a d e t h r o m b o c y t o p e n i c b y r e p e a t e d p l a t e l e t p h e r e s i s h a d a c c e l e r a t e d m a t u r a t i o n , t h o u g h t h e i r p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s w e r e 5 0 % h i g h e r . 3 3 0 M e g a k a r y o c y t e m a t u r a t i o n a n d h e a l t h w e r e a s s e s s e d b y m o r p h o l o g i c a l a p p e a r a n c e , p r o p o r t i o n s o f m a t u r a t i o n s t a g e s , r a t e o f t r a n s i t o f t r i t i a t e d t h y m i d i n e t h r o u g h e a c h m a t u r a t i o n s t a g e , a n d b y m e g a k a r y o c y t e n u m b e r . D o g s i n j e c t e d w i t h r a b b i t a n t i - [ c a n i n e p l a t e l e t ] a n t i s e r u m d e v e l o p e d m a r k e d t h r o m b o c y t o - ‘ T h e s e c h a n g e s p e n i a a s s o c i a t e d w i t h c h a n g e s i n t h e m e g a k a r y o c y t e p o p u l a t i o n s . ” i n c l u d e d a s h i f t t o w a r d i m m a t u r i t y b u t w i t h n o a p p a r e n t d e c r e a s e i n n u m b e r s , a n d m o r p h o l o g i c a b n o r m a l i t i e s i n c l u d i n g c y t o p l a s m i c f o a m i n e s s , v a c u o l a t i o n , k a r y o r r h e x i s , n u c l e a r s w e l l i n g , a n d k a r y o l y s i s . O c c a s i o n a l d a m a g e d m e g a k a r y o c y t e s w e r e s u r r o u n d e d 7 3 b y m o n o n u c l e a r c e l l s . T o g e t h e r , t h e fi n d i n g s s u g g e s t t h e p o t e n t i a l f o r i m p a i r e d t h r o m b O p o i e s i s d e s p i t e s t i m u l a t e d m e g a k a r y o c y t o p o i e s i s . A s f o r n a t u r a l d i s e a s e , m e g a k a r y o c y t e fl u o r e s c e n c e w a s p r e s e n t i n s a m p l e s f r o m h u m a n p a t i e n t s w i t h c h r o n i c I M T b u t n o t n o r m a l c o n t r o l s w h e n a i r - d r i e d m a r r o w s m e a r s w e r e e v a l u a t e d w i t h a n e q u i n e a n t i - [ h u m a n I g G ] s e r u m . 3 3 2 U n f o r t u n a t e l y , t h e p r e s e n c e o f fl u o r e s c e n c e f r o m s i m i l a r l y t r e a t e d n o r m a l p l a t e l e t s , a n d t h e i n a b i l i t y t o r e p r o d u c e t h e r e s u l t s w i t h a r a b b i t a n t i - [ h u m a n I g G ] s e r u m c o n f u s e d t h e i n t e r p r e t a t i o n o f t h e s e fi n d i n g s . O t h e r s 3 3 3 f o u n d t h a t t h e m e g a k a r y o c y t e s f r o m 1 0 / 1 6 p a t i e n t s w i t h c h r o n i c I M T , b u t f r o m 0 / 2 8 t h r o m b o c y t o p e n i c o r h e a l t h y c o n t r o l s r e a c t e d p o s i t i v e l y t o a fl u o r e s c e i n - c o n j u g a t e d a n t i - [ h u m a n I g A ] s e r u m . R e a c t i o n s w e r e o n l y c o n s i d e r e d p o s i t i v e i f fl u o r e s c e n c e c o u l d b e b l o c k e d b y c o i n c u b a t i o n o f t h e s m e a r s w i t h fl u o r e s c e n t a n d n o n fl u o r e s c e n t d e t e c t o r . T h e m e g a k a r y o c y t e - r e a c t i v i t y o f p l a t e l e t - r e a c t i v e i m m u n o g l o b u l i n h a s a l s o b e e n a s s e s s e d i n t w o h u m a n p a t i e n t s w i t h I M T ; r a d i o l a b e l e d I g G o b t a i n e d f r o m t h e i r c u l t u r e d s p l e n i c l y m p h o c y t e s b o u n d t o n o r m a l d o n o r m e g a k a r y o c y t e s a t l e a s t fi v e t i m e s a s m u c h a s I g G f r a c t i o n s o f c o n t r o l s , a n d b i n d i n g w a s p r e v e n t e d b y p r i o r i n c u b a t i o n o f t h e s a m p l e s w i t h n o r m a l p l a t e l e t s ? “ M o r e o v e r , m a n y m e g a k a r y o c y t e s f r o m p e 0 p l e w i t h I M T h a v e u l t r a s t r u c t u r a l e v i d e n c e o f d a m a g e , p r i m a r i l y i n t h e f o r m o f d i l a t e d d e m a r c a t i o n m e m b r a n e s y s t e m s w h i c h i s s e e n a s v a c u o l a t i o n b y l i g h t m i c r o s c o p y . 3 2 1 T h e p r e s e n c e o f n o r m a l t o i n c r e a s e d n u m b e r s o f m e g a k a r y o c y t e s i n m o s t b o n e m a r r o w s a m p l e s o f I M T p a t i e n t s i n d i c a t e s t h a t i f a n t i p l a t e l e t a n t i b o d i e s c o m m o n l y r e a c t w i t h m e g a k a r y o c y t e s , t h e y r e a c t w i t h o n l y a s u b s e t o f t h e m a n d / o r t h e y d o n o t c a u s e c o m p l e t e c e l l d e s t r u c t i o n a s t h e y d o f o r p l a t e l e t s . L e v e n e 3 3 5 u s e d a p a n e l o f m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s t o s h o w t h a t m e g a k a r y o c y t e s c h a n g e t h e i r p h e n o t y p e ( a n t i g e n e x p r e s s i o n ) a s 7 4 t h e y m a t u r e . T h e c r o s s — r e a c t i v i t y i s n o t c o m p l e t e b e t w e e n i m m a t u r e a n d m a t u r e m e g a k a r y o c y t e s o r b e t w e e n m e g a k a r y o c y t e s a n d p l a t e l e t s , s o m e a n t i g e n s b e i n g l o s t w i t h i n c r e a s i n g m a t u r i t y ? ” T h i s m a y e x p l a i n w h y s o m e p l a t e l e t - r e a c t i v e a n t i b o d i e s r e a c t w i t h o n l y a s u b s e t o f m e g a l t a r y o c y t e s ? 9 ' 3 2 6 F r e e z e - f r a c t u r e a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p i c s t u d i e s o f m e g a k a r y o c y t e s a n d p l a t e l e t s a l s o s u g g e s t t h a t t h e p l a t e l e t m e m b r a n e i s s t r u c t u r a l l y d i f f e r e n t f r o m t h a t o f m e g a k a r y o c y t e s ? 3 6 M o s t p l a t e l e t s , a n d t h e r e f o r e t h e i r m e m b r a n e s , a p p e a r t o o r i g i n a t e f r o m t h e i n t e r i o r a n d n o t f r o m t h e e x t e r n a l s u r f a c e o f m e g a k a r y - o c y t e s ? ” W h e n m e g a k a r y o c y t e s b e g i n a c t i v e t h r o m b o p o i e s i s , t h e i n t e r n a l p o r t i o n s a r e e x p o s e d a n d t h e i r a n t i g e n i c p r o p e r t i e s a r e l i k e l y c h a n g e d . F u r t h e r e v i d e n c e o f m a t u r a t i o n - d e p e n d e n t r e a c t i v i t y w a s d e s c r i b e d b y S t a h l . 3 2 1 A r a b b i t a n t i s e r u m t o m u r i n e p l a t e l e t s r e a c t e d w i t h t h e m a t u r e m e g a k a r y o c y t e s r e l e a s i n g p l a t e l e t s b u t n o t w i t h t h e s m o o t h m e g a k a r y o c y t e s l a c k i n g e v i d e n c e o f t h r o m b o p o i e s i s . A n d i n p e o p l e w i t h I M T , 5 0 - 7 5 % o f t h e m e g a k a r y o c y t e s w e r e c o n s i d e r e d d a m a g e d , b u t o n l y t h o s e w h o s e d e m a r c a t i o n m e m b r a n e s y s t e m s h a d o p e n e d t o t h e e x t e r i o r t o e l a b o r a t e p l a t e l e t s ? 2 1 R e a c t i v i t y w i t h t h e s e l a t e - s t a g e m e g a k a r y o c y t e s m a y e x p l a i n w h y m a r r o w s o f I M T p a t i e n t s o f t e n c o n t a i n m a n y m e g a k a r y o c y t e s b u t l i t t l e a c t i v e p l a t e l e t s h e d d i n g . S u c h m e g a k a r y o c y t e r e a c t i v i t y m a y a l s o e x p l a i n t h e i m p a i r e d p l a t e l e t p r o d u c t i o n , d e s p i t e i n c r e a s e d m e g a k a r y o c y t e c e l l c y c l e a c t i v i t y , s u g g e s t e d b y a u t o l o g o u s p l a t e l e t s u r v i v a l s t u d i e s i n p e o p l e w i t h c h r o n i c I M T . 1 0 " A b e t t e r u n d e r s t a n d i n g o f t h e c o n t r i b u t i o n m e g a k a r y o c y t e - r e a c t i v e a n t i b o d i e s m a k e t o t h r o m b o c y t o p e n i a i n p e o p l e w i t h I M T a w a i t s f u r t h e r s t u d i e s . H o w e v e r , i t i s i m p o r t a n t t o e m p h a s i z e t h a t t h e p r e s e n c e o f a n o r m a l o r i n c r e a s e d n u m b e r o f m e g a k a r y o c y t e s p r o v i d e s n o i n f o r m a t i o n a s t o w h e t h e r e a c h c e l l i s a c t u a l l y r e l e a s i n g a n o r m a l , i n c r e a s e d , o r d e c r e a s e d n u m b e r o f p l a t e l e t s . 7 5 S u c c e s s f u l t r e a t m e n t o f c h r o n i c I M T h a s b e e n a c h i e v e d w i t h g l u c o c o r t i c o i d s , s p l e n e c t o m y , i n t r a v e n o u s g a m m a g l o b u l i n , a n t i - D i m m u n o g l o b u l i n , a z a t h i o p r i n e , c y c l o p h o s p h a m i d e , v i n c r i s t i n e , c y c l o s p o r i n e , c o l c h i c i n e , a s c o r b a t e , d a n a z o l , a n d c o m b i n a t i o n s o f t h e s e ? ” 2 8 8 P a t i e n t s w i t h p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s a b o v e 3 0 , 0 0 0 / p l m a y n o t r e q u i r e m o r e t h a n c a r e f u l m o n i t o r i n g ? ” 3 1 0 P l a t e l e t t r a n s f u s i o n s s h o u l d b e u s e d o n l y i n l i f e - t h r e a t e n i n g s i t u a t i o n s w h e r e t r a n s i e n t i n c r e a s e s i n p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s m a y p r e v e n t s e r i o u s s e q u e l a e . R o u t i n e t r a n s f u s i o n s a r e n o t j u s t i fi e d b e c a u s e t h e u b i q u i t y o f t a r g e t a n t i g e n s m a k e s r a p i d d e s t r u c t i o n o f t r a n s f u s e d p l a t e l e t s a p r e d i c t a b l e o u t c o m e . D e s p i t e a l l t h e r a p i e s , o v e r o n e t h i r d o f 1 , 7 6 1 r e p o r t e d a f f e c t e d a d u l t s f r o m 1 9 2 8 t o 1 9 8 9 d i d n o t h a v e a c o n t i n u o u s a n d c o m p l e t e r e m i s s i o n ? ” T h e s e a r c h f o r b e t t e r t h e r a p e u t i c a l t e r n a t i v e s f o r c h r o n i c r e f r a c t o r y I M T c o n t i n u e s . A n o t h e r f o r m o f c h r o n i c I M T w h i c h m a y g o u n r e c o g n i z e d i s t h e c o m p e n s a t e d f o r m w h e n P A I g i s p r e s e n t i n t h e a b s e n c e o f t h r o m b o c y t o p e n i a . I n c r e a s e d t h r o m b o p o i e - s i s m a i n t a i n s t h e p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n i n t h e n o r m a l r a n g e d e s p i t e t h e p r e s e n c e o f P A I g a n d i n c r e a s e d i m m u n e - m e d i a t e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n . T h a t t h e P A I g i s p a t h o g e n i c i s s u p p o r t e d b y t h e d e v e l o p m e n t o f t h r o m b o c y t o p e n i a i n n e o n a t e s b o r n t o m o t h e r s w i t h t h i s " h i d d e n " d i s e a s e ? 3 7 M o r e o v e r , c i r c u l a t i n g a n t i b o d i e s i n t h e m o t h e r s a n d t h e i r o f f s p r i n g r e a c t w i t h i d e n t i c a l g l y c o p r o t e i n s . i i ) c a n i n e a ) i n t r o d u c t i o n A s w i t h p e o p l e , d o g s m a y h a v e t h r o m b o c y t o p e n i a w i t h n o d e t e c t a b l e a b n o r m a l i - t i e s b e s i d e s t h o s e r e l a t e d t o l o w p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s . A r e c e n t d i r e c t a s s a y f o r c a n i n e 7 6 P A I g h a s s h o w n t h a t s o m e o f t h e s e d o g s h a v e I M T , a s e v i d e n c e d b y e l e v a t i o n s i n P A I g . ‘ ° ° A c i d e l u a t e s o f p l a t e l e t s f r o m s o m e o f t h e s e d o g s c o n t a i n i m m u n o g l o b u l i n s t h a t r e b i n d t o a l l o g e n e i c p l a t e l e t s ? ” R a d i o i r n m u n o p r e c i p i t a t i o n s u s i n g a n t i b o d i e s i n t h e a c i d e l u a t e s h a v e s h o w n t h a t s o m e o f t h e s e a n t i b o d i e s h a v e s p e c i fi c i t y f o r G P H b / I H a . 3 3 9 T h e s e d o g s p r e s u m a b l y h a v e I M T w h i c h i s i n d u c e d b y t h e p r e s e n c e o f s u r f a c e P A I g . T h e u n d e r l y i n g r e a s o n f o r e l e v a t e d P A I g i n t h e s e d o g s i s u n k n o w n , m a k i n g t h e c o n d i t i o n i d i o p a t h i c b u t i m m u n e — m e d i a t e d a n d a u t o i m m u n e i f t h e a n t i b o d y b i n d i n g i s F a b - m e d i a t e d . H i s t o r i c a l l y , m a n y d o g s w i t h s t e r o i d - r e s p o n s i v e t h r o m b o c y t o p e n i a s h a v e b e e n d i a g n o s e d a s h a v i n g I M T o r e v e n a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a . I n r e a l i t y , d i a g n o s e s h a v e b e e n u n c e r t a i n , b e i n g b a s e d o n c l i n i c a l fi n d i n g s o r i n d i r e c t a n t i b o d y a s s a y s . C u r r e n t i n d i r e c t a s s a y s f o r c a n i n e P B I g g e n e r a l l y h a v e l i m i t e d s e n s i t i v i t y a n d s p e c i fi c i t y a n d d o n o t c o n s t i t u t e d e fi n i t i v e d i a g n o s t i c t e s t s f o r I M T ( s e e b e l o w ) . C l i n i c a l d i a g n o s e s a r e a l s o i n d i r e c t a n d r e q u i r e t h e s y s t e m a t i c e l i m i n a t i o n o f o t h e r k n o w n c a u s e s o f t h r o m b o c y t o p e n i a , s o m e t h i n g w h i c h h a s n o t a l w a y s b e e n t h o r o u g h l y d o n e . R e s p o n s e t o t h e r a p y i s d i a g n o s t i c a l l y w e a k b e c a u s e t h r o m b o c y t o p e n i a s m a y b e d u e t o u n r e c o g n i z e d f a c t o r s t h a t a r e s t e r o i d - r e s p o n s i v e , a n t i b i o t i c - r e s p o n s i v e , o r t r a n s i e n t a n d r e s o l v i n g d e s p i t e t h e r a p y . C o n s e q u e n t l y , r e p o r t s o f I M T i n d o g s m a y i n c l u d e c a s e s o f n o n i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a . A l s o , s e c o n d a r y a n d p r i m a r y I M T h a v e n o t a l w a y s b e e n c l e a r l y d i f f e r e n t i a t e d o r d i s c u s s e d s e p a r a t e l y . T h e r e f o r e , t h e f o l l o w i n g r e v i e w o f c a n i n e I M T b a s e d o n r e p o r t s i n t h e l i t e r a t u r e i s b e s t c o n s i d e r e d a r e v i e w o f p r i m a r y a n d s e c o n d a r y I M T a n d p r o b a b l y s o m e n o n i m m u n e c o n d i t i o n s a s w e l l . I t s e r v e s a s a r e c o r d o f t h e c u r r e n t u n d e r s t a n d i n g o f t h e c o m p o s i t e p i c t u r e o f w h a t h a s b e e n b e l i e v e d t o b e I M T i n d o g s . 7 7 b ) h i s t o r y o f c a n i n e I M T E a r l y c a s e r e p o r t s d e s c r i b i n g i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s w e r e l i k e l y r e p o r t s o f I M T , b u t n o s u p p o r t i v e t e s t i n g w a s a v a i l a b l e ? ” 3 4 2 T h e o c c u r r e n c e o f t h r o m b o c y t o p e n i a i n a s s o c i a t i o n w i t h c a n i n e s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s 2 3 6 a n d w i t h c a n i n e i m m u n e - m e d i a t e d h e m o l y t i c a n e m i a 2 4 5 w a s fi r s t r e p o r t e d i n 1 9 6 5 , a n d t h e l a t t e r s i t u a t i o n w a s f e l t t o m i m i c E v a n s ’ s y n d r o m e . T h e fi r s t r e p o r t o f s t u d i e s o n a s e r i e s o f d o g s w i t h I M T w a s p u b l i s h e d b y W i l k i n s e t a l . i n 1 9 7 3 . 2 ” U s i n g t h e P F 3 r e l e a s e a s s a y w i t h g l o b u l i n f r a c t i o n s o f c a n i n e p a t i e n t s , t h i s w a s t h e fi r s t l a b o r a t o r y e v i d e n c e t h a t i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s m a y b e i m m u n e - m e d i a t e d . W o r k o n i m p r o v e d a s s a y s f o r d i a g n o s i n g c a n i n e I M T h a s c o n t i n u e d , a n d a d i r e c t c l i n i c a l a s s a y f o r c a n i n e P A I g h a s b e e n d e s c r i b e d . 1 6 " A c c u r a t e d i f f e r e n t i a t i o n o f i m m u n e f r o m n o n i m m u n e c a n i n e t h r o m b o c y t o p e n i c c o n d i t i o n s a w a i t s m o r e r o u t i n e u s e o f t h i s a n d o t h e r d i r e c t a s s a y s f o r P A I g . c ) s i g n a l m e n t I t i s p r o b a b l y s a f e t o s a y t h a t d o g s o f a n y b r e e d , a g e , o r g e n d e r m a y s u f f e r f r o m p r i m a r y o r s e c o n d a r y I M T , s o t h e s i g n a l m e n t o f a n y p a r t i c u l a r p a t i e n t i s n o t u s e f u l d i a g n o s t i c a l l y . W h i l e s o m e i n v e s t i g a t o r s h a v e f o u n d n o b r e e d p r e d i s p o s i t i o n ? “ 2 3 9 o t h e r s h a v e r e p o r t e d t h a t t h e f o l l o w i n g b r e e d s a r e l i k e l y t o s u f f e r f r o m I M T : t o y p o o d l e s , m i n i a t u r e p o o d l e s , s t a n d a r d p o o d l e s , o l d E n g l i s h S h e e p d o g s , c o c k e r s p a n i e l s , a n d G e r m a n s h e p h e r d s . ” ' ” " ° " 3 ‘ 3 U s i n g a d i r e c t E L I S A f o r P A I g , L e w i s r e c e n t l y f o u n d t h a t w h i l e 8 ( 2 4 % ) o f t h e d o g s w i t h I M T w e r e c o c k e r s p a n i e l s , n o n e o f t h e 2 1 d o g s i n t h e n o n - I M T t h r o m b o c y t o p e n i c g r o u p w a s a c o c k e r s p a n i e l . “ ’ 0 W h i l e b a s e d o n s u b m i s s i o n s o f s a m p l e s 7 8 f o r C o o m b s ’ a n d P F 3 t e s t i n g r a t h e r t h a n o n r e s u l t s o f t h e s e a s s a y s , t h e f o l l o w i n g a d d i t i o n a l b r e e d s h a v e b e e n r e p o r t e d t o b e p r e d i s p o s e d t o i m m u n e - m e d i a t e d b l o o d d i s e a s e s i n g e n e r a l : I r i s h s e t t e r s , m i n i a t u r e a n d s t a n d a r d d a c h s h u n d s , S h e t l a n d S h e e p d o g s , S c o t t i s h t e r r i e r s , a n d v i z s l a s . 2 2 F a m i l i a l p r e d i s p o s i t i o n s f o r I M T a n d / o r I M H A h a v e b e e n r e p o r t e d i n t h e f o l l o w i n g b r e e d s : v i z s l a , A m e r i c a n c o c k e r s p a n i e l , l o n g - h a i r e d d a c h s h u n d , S c o t t i s h t e r r i e r , a n d o l d E n g l i s h S h e e p d o g s . 2 2 T h e a g e o f d o g s w i t h I M T h a s b e e n r e p o r t e d t o r a n g e f r o m 7 m o n t h s t o 1 4 y e a r s , w i t h 6 - 7 y e a r s a c o n s i s t e n t l y r e p o r t e d m e a n . ” ' ” " ° " ” 9 ' 3 ‘ 3 ' “ " L e w i s 1 6 0 s i m i l a r l y f o u n d a n a g e r a n g e f r o m 1 t o 1 5 y e a r s ( m e a n 6 . 4 ) ? 6 0 T h e l a c k o f a n a g e p r e d i l e c t i o n c o m p a r e d t o t o t a l h o s p i t a l a d m i s s i o n s h a s b e e n r e p o r t e d . 3 4 3 W h i l e a g e n d e r b i a s h a s n o t b e e n a p p a r e n t i n s o m e r e p o r t s ? " ' 3 " " t h e o v e r a l l n u m b e r o f f e m a l e s r e p o r t e d w i t h I M T i s a b o u t t w i c e t h e n u m b e r o f m a l e s . ” ' ” " “ " “ ” 3 3 ‘ 9 ” ? “ 7 ' 3 4 3 ' 3 " 4 L e w i s s i m i l a r l y f o u n d t h a t 6 2 % o f t h e d o g s w i t h I M T w e r e f e m a l e w h i l e t h e n o n - I M T t h r o m b o c y t o p e n i c g r o u p w a s m o s t l y ( 6 7 % ) m a l e . A s i m i l a r i n c r e a s e d i n c i d e n c e i n f e m a l e s a l s o o c c u r s w i t h c h r o n i c b u t n o t a c u t e I M T i n h u m a n p a t i e n t s ? “ A f e m a l e g e n d e r b i a s i s n o t a p p a r e n t f o r d o g s w i t h E v a n s ’ s y n d r o m e ? “ 2 4 7 d ) p a t i e n t h i s t o r y a t p r e s e n t a t i o n D o g s w i t h I M T h a v e h a d c l i n i c a l s i g n s n o t i c e d 1 d a y t o 6 m o n t h s p r i o r t o a d m i s s i o n ? 4 3 W h e n n o t e d , m o s t p r e a d m i s s i o n s i g n s o c c u r r e d w i t h i n 3 d a y s o f 9 p r e s e n t a t i o n ? ” T h e m o s t c o m m o n r e s e n t i n c o m l a i n t s f o r d o g s w i t h r i m a r y o r P g P P s e c o n d a r y I M T a r e r e p o r t e d l y a n o r e x i a , e p i s t a x i s , g a s t r o i n t e s t i n a l h e m o r r h a g e , b r u i s e s , 7 9 l e t h a r g y , w e a k n e s s , o r a l b l e e d i n g , v a g i n a l b l e e d i n g , o c u l a r b l e e d i n g , s t i f f n e s s , a n d h e m a t u r i a ? “ 3 4 3 B l e e d i n g m a y b e n o t e d a f t e r m i l d t r a u m a s u c h a s g r o o m i n g ? ” e ) p h y s i c a l fi n d i n g s T h e p h y s i c a l fi n d i n g s a n d c l i n i c a l s i g n s a s s o c i a t e d w i t h I M T i n c l u d e t h o s e d u e t o t h r o m b o c y t o p e n i a p l u s t h o s e r e f e r a b l e t o a n y u n d e r l y i n g o r c o n c u r r e n t d i s e a s e p r o c e s s . T h e h e m o r r h a g i c s i g n s r e l a t e d t o t h r o m b o c y t o p e n i a p r e d o m i n a t e a n d i n c l u d e : c u t a n e o u s e c c h y m o s e s a n d p e t e c h i a e , e s p e c i a l l y o n t h e v e n t r a l a b d o m e n a n d i n n e r l i m b s ; m u c o s a l p e t e c h i a e a f f e c t i n g o r a l , o c u l a r , n a s a l , a n d g e n i t a l m u c o s a l m e m b r a n e s ; o c u l a r h e m o r r h a g e i n c l u d i n g h y p h e m a a n d r e t i n a l h e m o r r h a g e ; m e l e n a , h e m a t o c h e z i a , a n d h e m a t e m e s i s ; e p i s t a x i s ; a n d h e m a m r i a . 2 " ° ° ‘ ° " ” 9 ' “ ° ' “ 3 H e m o r r h a g e m a y i n v o l v e a n y s y s t e m i n c l u d i n g c e r e b r a l b l e e d i n g w i t h s u d d e n d e a t h ? 4 6 P a l l o r m a y a c c o m p a n y s u b s t a n t i a l h e m o r r h a g e o r o c c u r i n a s s o c i a t i o n w i t h c o n c u r r e n t i m m u n e - m e d i a t e d h e m o l y t i c a n e m i a . " 0 F e v e r m l ' m ' 3 4 3 h a s b e e n r e p o r t e d i n u p t o 2 / 3 o f d o g s w i t h p r i m a r y o r s e c o n d a r y I M T , 2 3 9 b u t i n l e s s t h a n 1 0 % o f d o g s t h o u g h t t o h a v e p r i m a r y I M T . 3 4 3 O t h e r c o m m o n l y r e p o r t e d p h y s i c a l fi n d i n g s i n c l u d e l e t h a r g y / w e a k n e s s , c o l l a p s e , a n d d y s p n e a i n d o g s w i t h p r i m a r y I M T , 3 4 3 a n d s y s t o l i c h e a r t m u r m u r s , s p l e n o m e g a l y , p a l e m u c o u s m e m b r a n e s , s h o c k , a b d o m i n a l p a i n , l y m p h a d e n o p a t h y , 4 0 i n f e c t i o n , m a s s e s , a n d n e u r o l o g i c s i g n s a s s o c i a t e d w i t h h e m o r r h a g e 2 3 9 i n d o g s w i t h e i t h e r p r i m a r y o r s e c o n d a r y I M T . S o m e o f t h e s e fi n d i n g s m a y h a v e b e e n c o i n c i d e n t a l , w h i l e o t h e r s w e r e l i k e l y r e l a t e d t o t h e u n d e r l y i n g d i s e a s e w i t h w h i c h I M T w a s a s s o c i a t e d . I n s o m e s t u d i e s , s p l e n o m e g a l y i n d o g s h a s b e e n u s e d a s i t h a s i n h u m a n p a t i e n t s “ t o e x c l u d e t h e 8 0 d i a g n o s i s o f p r i m a r y I M T ? ” C o n s e q u e n t l y , t h e i n c i d e n c e o f s p l e n o m e g a l y i n p r i m a r y c a n i n e I M T i s i m p o s s i b l e t o e v a l u a t e f r o m r e p o r t e d s t u d i e s . f ) l a b o r a t o r y fi n d i n g s T h e p r i m a r y l a b o r a t o r y a b n o r m a l i t y i n I M T i s o b v i o u s l y t h r o m b o c y t o p e n i a . T h r o m b o c y t o p e n i a i s g e n e r a l l y s e v e r e i n r e p o r t e d c a s e s o f I M T , t h o u g h o n e s h o u l d c o n s i d e r t h e p o s s i b i l i t y t h a t m i l d a n d m o d e r a t e t h r o m b o c y t o p e n i a m a y o c c u r b u t g o u n r e c o g n i z e d d u e t o a l a c k o f c l i n i c a l s i g n s . M o r e o v e r , w h e n m i l d a n d m o d e r a t e t h r o m b o c y t o p e n i a s a r e e n c o u n t e r e d , t h e y m a y b e a t t r i b u t e d t o o t h e r c a u s e s b e c a u s e t h e y d o n o t fi t t h e e x p e c t e d p a t t e r n o f I M T . I n a n y c a s e , r e p o r t e d d o g s h a v e u s u a l l y h a d f e w e r t h a n 5 0 , 0 0 0 p l a t e l e t s / p 1 , ” ' 4 ° ' “ 7 a n d f r e q u e n t l y f e w e r t h a n 1 0 , 0 0 0 / p 1 . 3 4 3 A s a g r o u p , t h e s e p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s h a v e b e e n f o u n d t o b e s i g n i fi c a n t l y l o w e r t h a n t h o s e o f d o g s w i t h t h r o m b o c y t o p e n i a s t h o u g h t t o b e o f n o n i m m u n e o r i g i n ” 3 4 7 I n c o n t r a s t , L e w i s 1 6 0 f o u n d t h a t t h e p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s o f d o g s w i t h I M T r a n g e d f r o m 4 , 0 0 0 t o 5 5 5 , 0 0 0 / p l ( m e a n 9 1 , 0 0 0 / p l ) w h i c h w a s r e p o r t e d l y n o t d i f f e r e n t f r o m d o g s i n t h e n o n - I M T g r o u p . H o w e v e r , 6 o f t h e 3 4 d o g s w i t h I M T h a d r e s p o n d e d t o g l u c o c o r t i c o i d t h e r a p y a t t h e t i m e o f e v a l u a t i o n . M i c r o t l r r o m b o c y t e s a n d m e g a t h r o m b o c y t e s m a y b e p r e s e n t o n b l o o d s m e a r s ? 2 5 D e c r e a s e d m e a n p l a t e l e t v o l u m e s ( M P V S ) ” " ' “ 7 ° 3 4 8 a n d i n c r e a s e d M P V S ” h a v e r e s p e c t i v e l y b e e n a s s o c i a t e d w i t h i m m u n e - m e d i a t e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n a n d m e g a k a r y o c y t o p o i e s i s i n d o g s . D e c r e a s e d M P V s w e r e f o u n d t o b e s p e c i fi c f o r I M T i n o n e s t u d y , 3 4 7 t h o u g h s e v e r a l c o n c e r n s a b o u t t h i s s t u d y w i l l b e d i s c u s s e d b e l o w . I n s u m m a r y , d e c r e a s e d , 8 1 n o r m a l , o r i n c r e a s e d M P V s a n d s m a l l , n o r m a l o r l a r g e p l a t e l e t s m a y b e p r e s e n t i n d o g s w i t h M T . C l i n i c a l h e m o r r h a g e i n d o g s w i t h I M T h a s b e e n r e p o r t e d t o b e a c o n s i s t e n t fi n d i n g w i t h p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s l e s s t h a n 5 0 , 0 0 0 / p l , 2 3 9 t h o u g h m o s t r e p o r t s a s s o c i a t e b l e e d i n g w i t h c o n c e n t r a t i o n s l e s s t h a n 3 0 , 0 0 0 / p l . 3 4 3 I n t h e l a t t e r s t u d y o f p r i m a r y I M T , 8 0 % o f t h e 5 4 d o g s h a d f e w e r t h a n 1 0 , 0 0 0 p l a t e l e t s / p l d u r i n g b l e e d i n g e p i s o d e s . V a r y i n g b l e e d i n g t e n d e n c i e s a m o n g d o g s w i t h s i m i l a r p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s h a s b e e n n o t e d “ 9 a n d m a y r e l a t e t o v a r i a t i o n s i n v a s c u l a r s t a b i l i t y , t r a u m a , t h e r a p i d i t y . w i t h w h i c h t h r o m b o c y t o p e n i a d e v e l o p s , ” 0 o r o t h e r u n k n o w n f a c t o r s . A s d i s c u s s e d p r e v i o u s l y , t h e a n t i g e n i c s p e c i fi c i t i e s o f P A I g a n d t h e a g e a n d m e t a b o l i c a c t i v i t y o f t h e c i r c u l a t i n g p l a t e l e t s m a y a l s o a f f e c t t h e o c c u r r e n c e o f c l i n i c a l h e m o r r h a g e . D o g s w i t h I M T m a y h a v e a n e u t r o p h i l i a w i t h , o r m o r e o f t e n w i t h o u t , a l e f t s h i f t , a s w e l l a s a m o n o c y t o s i s ? ' ” " ’ 0 H o w e v e r , t h i s i s i n c o n s i s t e n t a n d l e u k o p e n i a a n d d 2 . 2 5 T 2 . 2 5 . 4 0 . 3 4 3 ' 9 n e u t r o p e n i a h a v e a l s o b e e n r e p o r t e A n e m i a c o m m o n l y a c c o m p a n i e s I M o c c u r r i n g i n r o u g h l y h a l f o f a l l r e p o r t e d c a s e s . A n e m i a w a s d o c u m e n t e d i n 8 3 % o f 4 5 d o g s t h o u g h t t o h a v e p r i m a r y I M T , a n d i t w a s u s u a l l y r e g e n e r a t i v e a n d a s s o c i a t e d w i t h h e m o r r h a g e , e s p e c i a l l y m e l e n a ? ” D e c r e a s e d t o t a l p r o t e i n 2 a n d l a b o r a t o r y e v i d e n c e o f i r o n d e fi c i e n c y 3 4 3 m a y b e p r e s e n t i n s o m e d o g s . A n e m i a m a y a l s o o c c u r b e c a u s e o f c o n c u r r e n t i m m u n e - m e d i a t e d h e m o l y t i c a n e r r r i a , b u t i t m o s t c o m m o n l y a p p e a r s t o b e s e c o n d a r y t o b l o o d l o s s w h i c h i s p r e s u m a b l y r e l a t e d t o d e c r e a s e d p l a t e l e t c o n c e n t r a - [ I O H S . 4 0 ' 1 6 1 ' 2 3 9 ’ 2 4 7 ' 3 5 1 B o n e m a r r o w a s p i r a t i o n s h a v e n o t b e e n a s s o c i a t e d w i t h e x c e s s i v e o r u n c o n t r o l l a - b l e h e m o r r h a g e i n d o g s w i t h I M T . 3 4 3 M e g a k a r y o c y t e s a r e u s u a l l y i n n o r m a l o r i n c r e a s e d 8 2 n u m b e r s , b u t t h e y m a y b e r e d u c e d i n n u m b e r o r e v e n a b s e n t ? ‘ “ 5 ' “ 3 ' ” 2 T h e l a t t e r s i t u a t i o n s m a y b e s i m i l a r t o t h e n o n r e g e n e r a t i v e f o r m o f c a n i n e i m m u n e - m e d i a t e d h e m o l y t i c a n e m i a i n w h i c h t h e r e a p p e a r s t o b e a m a t u r a t i o n a r r e s t . ” 3 T h e p r o g n o s i s a p p e a r s p o o r e r f o r d o g s w i t h m a r k e d m e g a k a r y o c y t i c h y p o p l a s i a ? ” 3 5 2 A n i n c r e a s e i n i m m a t u r e m e g a k a r y o c y t e s i s c o m m o n , t h e r a t i o o f m a t u r e t o i m m a t u r e m e g a k a r y o c y t e s c h a n g i n g f r o m a n o r m a l o f 2 3 5 - 5 . 2 5 : 1 t o 0 . 1 7 - 0 . 8 5 : 1 . 2 4 6 3 4 3 ” 2 M o r p h o l o g i c c h a n g e s r e p o r t e d i n m e g a k a r y o c y t e s f r o m d o g s w i t h I M T i n c l u d e c y t o p l a s m i c v a c u o l a t i o n a n d f o a m i n e s s , b a s o p h i l i a , a n d d e c r e a s e d g r a n u l a r i t y . “ ° ' ” 2 B o n e m a r r o w e v a l u a t i o n i n d o g s w i t h i s o l a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a h a s b e e n c o n s i d e r e d o f l i m i t e d h e l p b y s o m e b e c a u s e m e g a k a r y o c y t e n u m b e r s a r e n o t c o n s i s t e n t l y e l e v a t e d i n c a n i n e I M T . 2 2 R e c e n t l y , t h e p o t e n t i a l f o r s e r u m a n d I g G f r o m d o g s w i t h I M T t o i n h i b i t p l a t e l e t f u n c t i o n w a s a s s e s s e d u s i n g p l a t e l e t a g g r e g o m e t r y . ” 4 T h i s i n d i r e c t a p p r o a c h w a s c h o s e n b e c a u s e p a t i e n t s w e r e g e n e r a l l y t o o t h r o m b o c y t o p e n i c f o r d i r e c t a g g r e g a t i o n s t u d i e s . I f p o s s i b l e , d i r e c t s t u d i e s w o u l d m o r e c l e a r l y i n d i c a t e t h e i n fl u e n c e o f P A I g o n p l a t e l e t f u n c t i o n . I n d i r e c t s t u d i e s m a y s h o w e f f e c t s d u e t o a l l o a n t i b o d i e s o r s a m p l e h a n d l i n g a r t i f a c t s . I n t h i s s t u d y , s o m e o f t h e s e r u m a n d p u r i fi e d I g G s a m p l e s m i l d l y i n h i b i t e d t h e e x t e n t a n d r a t e o f p l a t e l e t a g g r e g a t i o n , b u t n o c o r r e l a t i o n c o u l d b e m a d e b e t w e e n t h e a p p a r e n t p l a t e l e t d y s f u n c t i o n a n d t h e s e v e r i t y o f c l i n i c a l b l e e d i n g . M o r e o v e r , t h e r e s u l t s a r e q u e s t i o n a b l e f o r s e v e r a l r e a s o n s : 1 ) a c o l l a g e n c o n c e n t r a t i o n t h a t s h o u l d i n d u c e p l a t e l e t a g g r e g a t i o n d i d n o t d o s o w i t h o u t a d d i t i o n o f e p i n e p h r i n e , i n d i c a t i n g a p r o b l e m w i t h t h e s y s t e m ( p e r h a p s t h e A C D a n t i c o a g u l a n t o r t h e s o u r c e o f c o l l a g e n ) ; 2 ) c o n t r o l p l a s m a w a s a p p a r e n t l y u s e d i n p l a c e o f s e r u m , s o t h e p o t e n t i a l e f f e c t s o f s e r u m f a c t o r s w e r e n o t c o n t r o l l e d f o r ; 3 ) s e r a w e r e a p p a r e n t l y n o t t r e a t e d t o r e m o v e r e s i d u a l t h r o m b i n ; 8 3 4 ) t h e n u m b e r o f n o r m a l c o n t r o l s d i d n o t a p p e a r a d e q u a t e t o p r o v i d e a n a d e q u a t e r e f e r e n c e r a n g e , s o t h e m i l d d e p r e s s i o n i n a g g r e g a t i o n m a y n o t h a v e b e e n s i g n i fi c a n t ; 5 ) s e r u m a n d i t s c o r r e s p o n d i n g I g G d i d n o t h a v e t h e s a m e e f f e c t i n 3 0 % o f t h e p o s s i b l e c o m p a r i s o n s ; a n d 6 ) m a n y s a m p l e s w e r e t e s t e d j u s t o n c e . W h i l e s o m e a n t i p l a t e l e t a n t i b o d i e s i n c a n i n e I M T m a y b i n d t o f u n c t i o n a l p l a t e l e t e p i t o p e s a n d c o n t r i b u t e t o h e m o r r h a g e , t h e y m a y a l s o b i n d t o e n d o t h e l i a l c e l l s a n d d e c r e a s e v a s c u l a r i n t e g r i t y . S h a r e d a n t i g e n i c i t y b e t w e e n c a n i n e e n d o t h e l i a l c e l l s a n d p l a t e l e t s l i k e l y e x i s t s . D o g s i m m u n i z e d w i t h a l l o g e n e i c a o r t i c e n d o t h e l i a l c e l l s h a d g r e a t l y r e d u c e d a l l o g e n e i c p l a t e l e t s u r v i v a l s b u t n o r m a l a u t o l o g o u s p l a t e l e t s u r v i v a l s c o m p a r e d t o c o n t r o l d o g s . ” S S i m i l a r l y , d o g s s e n s i t i z e d t o a l l o g e n e i c p l a t e l e t s h a d a c c e l e r a t e d v a s c u l a r r e j e c t i o n o f r e n a l t r a n s p l a n t s , p o s s i b l y r e l a t e d t o s h a r e d a n t i g e n i c i t y b e t w e e n p l a t e l e t s a n d ‘ e n d o t h e l i a l c e l l s ? ” D o g s w i t h i d i o p a t h i c a m e g a k a r y o c y t i c t h r o m b o c y t o p e n i a h a v e b e e n r e p o r t e d a n d m a y h a v e h a d i m m u n e - m e d i a t e d d i s e a s e . “ 3 4 1 C a n i n e p l a t e l e t s a n d m e g a k a r y o c y t e s h a v e b e e n s h o w n t o s h a r e r e a c t i v e s i t e s i n c l u d i n g e p i t o p e s o n G P H I a , ” 1 ' ” 7 t h o u g h t h e t e c h n i q u e s e m p l o y e d m a y h a v e a l l o w e d d e t e c t i o n o f c y t o s o l i c e p i t o p e s . D o g s i n j e c t e d w i t h r a b b i t a n t i - [ c a n i n e p l a t e l e t ] a n t i s e r u m d e v e l o p e d m a r k e d t h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h m e g a k a r y o c y t e i m m a t u r i t y a n d m o r p h o l o g i c a b n o r m a l i t i e s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ? ” S i m i l a r m o r p h o l o g i c c h a n g e s i n c l u d i n g c y t o p l a s m i c f o a m i n e s s , v a c u o l a t i o n , r e d u c e d c y t o p l a s m i c g r a n u l a r i t y , a n d k a r y o l y s i s h a v e b e e n d e s c r i b e d i n d o g s w i t h n a t u r a l l y o c c u r r i n g I M T ? " 6 T o g e t h e r , t h e fi n d i n g s s u g g e s t t h a t i m p a i r e d t h r o m b o p o i e s i s m a y o c c u r d e s p i t e s t i m u l a t e d m e g a k a r y o c y t o p o i e s i s i n a t l e a s t s o m e d o g s w i t h I M T . 8 4 g ) t h e r a p y I n t r e a t i n g d o g s w i t h I M T , a s p i r i n a n d o t h e r a n t i p l a t e l e t d r u g s s h o u l d b e a v o i d e d , a n y m e d i c a t i o n s c o n s i d e r e d c a p a b l e o f i n d u c i n g t h r o m b o c y t o p e n i a s h o u l d b e d i s c o n t i n - u e d , a n d t r a u m a s h o u l d b e m i n i m i z e d . ” U n d e r l y i n g p r o b l e m s s h o u l d b e t r e a t e d a p p r o p r i a t e l y , b u t o t h e r w i s e t h e r a p y i s a i m e d a t e l e v a t i n g p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s s u f fi c i e n t l y t o p r o t e c t a g a i n s t c l i n i c a l h e m o r r h a g e . W h i l e p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s i n t h e n o r m a l r a n g e a r e o p t i m a l , a c o n c e n t r a t i o n o f 5 0 - 1 0 0 , 0 0 0 / p l i s p r o b a b l y a d e q u a t e i n t h e a b s e n c e o f p l a t e l e t d y s f u n c t i o n . ” ' ” ” 3 4 7 ' ” l E f f o r t s t o r e a c h v a l u e s i n t h e n o r m a l r a n g e c a n b e f r u s t r a t i n g f o r b o t h t h e c l i e n t a n d t h e v e t e r i n a r i a n , a n d s i d e e f f e c t s o f t h e r a p y c a n b e a d e t r i m e n t t o t h e p a t i e n t . O c c a s i o n a l d o g s m a y e v e n d o w e l l c l i n i c a l l y d e s p i t e l o w p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s a n d n o m e d i c a l m a n a g e m e n t ? “ 7 W h i l e i m m u n o s u p p r e s s i v e d o s e s o f c o r t i c o s t e r o i d s a r e a r o u t i n e p a r t o f t h e r a p y f o r I M T , a d d i t i o n a l t r e a t m e n t s r e fl e c t c l i n i c a l b i a s a n d a r e n o t b a s e d o n r a n d o m i z e d , c o n t r o l l e d , c l i n i c a l t r i a l s . M a n y a p p r o a c h e s h a v e b e e n t a k e n , a n d t h e c o m m o n i m m u n o s u p p r e s s i v e o p t i o n s f o r i m m u n e - m e d i a t e d d i s e a s e s o f d o g s h a v e r e c e n t l y b e e n r e v i e w e d w i t h r e s p e c t t o t h e p a t h o p h y s i o l o g y o f t h e d i s o r d e r s . ” 8 V a r i o u s c o m b i n a t i o n s o f a z a t h i o p r i n e , c y c l o p h o s p h a m i d e , a n d v i n c r i s t i n e h a v e b e e n u s e d w i t h i n c o n s i s t e n t s u c c e s s . 2 7 . 4 0 . 3 4 3 D a n a z o l h a s r e p o r t e d l y b e e n s u c c e s s f u l i n t r e a t i n g s e l e c t e d d o g s w i t h r e f r a c t o r y I M T ? “ ' ” 9 C y c l o s p o r i n e m a y a l s o b e e f f e c t i v e i n s o m e d o g s w i t h c h r o n i c , r e f r a c t o r y I M T . ” 0 M o s t r e c e n t l y , h u m a n g a m m a g l o b u l i n ( I V I g G ) h a s b e e n r e p o r t e d t o b e e f f e c t i v e i n t r e a t i n g d o g s w i t h I M T . 1 4 5 T h e c l i n i c a l u t i l i t y o f t h i s t h e r a p y a w a i t s f u r t h e r s t u d i e s . 8 5 T h e u s e o f V i n c r i s t i n e h a s b e e n q u e s t i o n e d d u e t o r e p o r t s t h a t i t m a y a f f e c t p l a t e l e t f u n c t i o n . V i n c r i s t i n e r e p o r t e d l y c a u s e s i m p a i r e d e x v i v o a g g r e g a t i o n r e s p o n s e s w i t h p l a t e l e t s o f t r e a t e d h u m a n p a t i e n t s , 3 6 1 b u t i t d i d n o t s i g n i fi c a n t l y i m p a i r f u n c t i o n w h e n g i v e n a t r e c o m m e n d e d d o s e s t o n o r m a l c l o g s . 3 “ " 2 ' 3 6 3 I t h a s b e e n u s e d s u c c e s s f u l l y t o t r e a t d o g s w i t h c l i n i c a l I M T ? “ s o m e t i m e s g i v e n i n t h e f o r m o f V i n c r i s t i n e - l o a d e d p l a t e - l e t s . ” 8 ‘ ” " ” 5 S i n c e t h e r a p e u t i c c o n c e n t r a t i o n s d o n o t a p p e a r t o c a u s e p l a t e l e t d y s f u n c t i o n i n d o g s , c o n c e r n o v e r i n d u c t i o n o f s u c h d y s f u n c t i o n i s n o t j u s t i fi e d ? 6 3 H o w e v e r , s t u d i e s i n d o g s w i t h I M T a r e n e e d e d t o t e s t v i n e r i s t i n e ’ s t h e r a p e u t i c e f fi c a c y a n d t o e v a l u a t e t h e s e v e r i t y o f i t s s i d e e f f e c t s . T h e v a l u e o f s p l e n e c t o m y f o r c a n i n e I M T h a s f r e q u e n t l y b e e n d i s c u s s e d , b u t n o l a r g e - s c a l e i n v e s t i g a t i o n o f i t s c l i n i c a l u t i l i t y h a s b e e n u n d e r t a k e n . P o s t - s p l e n e c t o m y i n f e c t i o n w i t h H e m o b a r t o n e l l a c a n i s i s a r e c o g n i z e d c o m p l i c a t i o n , t h o u g h t h e i n c i d e n c e a p p e a r s t o b e l o w . ” " ” ' 3 6 6 S p l e n e c t o m y o f d o g s t h a t h a v e b e e n s e n s i t i z e d t o a l l o g e n e i c p l a t e l e t s h a s i n c o n s i s t e n t l y d e c r e a s e d t h e r e m o v a l o f t r a n s f u s e d a l l o g e n e i c p l a t e l e t s a s m e a s u r e d b y p l a t e l e t s u r v i v a l s t u d i e s ? ” S i m i l a r l y , i n I M T , s p l e n e c t o m y h a s s o m e t i m e s b e e n a s s o c i a t e d w i t h c l i n i c a l i r n p r o v e m e n 4 7 ' 3 “ ” 7 3 “ a n d s o m e t i m e s h a s a p p e a r e d t o b e u n h e l p f u l . ” " “ " 3 " 3 ' ” 1 I t r e m a i n s t o b e s e e n i f r e s p o n s e t o s p l e n e c t o m y c a n b e p r e d i c t e d . T r a n s f u s i o n h a s b e e n s u g g e s t e d f o r p r e s u r g i c a l b o o s t i n g o f t h e p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n w h e n d o g s w i t h I M T r e q u i r e s u r g e r y . ” I t h a s a l s o b e e n u s e d t o c o n t r o l s e v e r e h e m o r r h a g e ? ” H o w e v e r , i t i s n o t g e n e r a l l y i n d i c a t e d b e c a u s e t r a n s f u s e d p l a t e l e t s w i l l b e r a p i d l y d e s t r o y e d b y c i r c u l a t i n g a n t i p l a t e l e t a n t i b o d i e s j u s t a s a l l o g e n e i c p l a t e l e t s a r e r a p i d l y c l e a r e d b y a l l o a n t i b o d i e s i n r e f r a c t o r y d o g s ? 6 9 n x » . 8 6 h ) o u t c o m e O v e r a l l , a s m a n y a s h a l f t h e d o g s w i t h p r i m a r y o r s e c o n d a r y I M T m a y e x p e r i e n c e a s i n g l e b o u t o f t h r o m b o c y t o p e n i a f o l l o w e d b y r e c o v e r y . ” ? ” ' 3 “ ° ” ° R e c o v e r y m a y o c c u r w i t h i n a w e e k , ” 0 t h o u g h o t h e r s h a v e f o u n d t h a t 2 - 3 5 d a y s ( m e a n o f 8 ) w e r e n e c e s s a r y f o r p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s t o e x c e e d 1 0 0 , 0 0 0 / p l . “ o O t h e r d o g s r e s p o n d i n i t i a l l y b u t r e l a p s e , s o m e t i m e s r e q u i r i n g c o n t i n u e d t h e r a p y . " 0 ' 2 3 ‘ 3 ' 3 ‘ 4 ' 3 5 0 ' 3 7 o R e l a p s e s h a v e r e p o r t e d l y b e e n p r e c i p i t a t e d b y t h e s e v e r e c o l d o f w i n t e r o r t h e h e a t o f s u m m e r . ” L i v e v i r u s v a c c i n a t i o n , i n f e c t i o n , e s t r u s , a n d p r e g n a n c y h a v e a l s o b e e n i n c r i m i n a t e d , a n d o v a r i o h y s t e r e c t o m y h a s b e e n r e c o m m e n d e d . ” " ” H o w e v e r , t h e s e o b s e r v a t i o n s h a v e n o t b e e n s u b s t a n t i a t e d . A p p r o x i m a t e l y 2 0 % o f t h e d o g s d i e w i t h o u t r e s p o n d i n g t o t h e r a p y , o f t e n b e c a u s e o f h e m o r r h a g e . " 0 ' 2 3 9 ' 3 5 O O f 5 4 d o g s d i a g n o s e d a s h a v i n g p r i m a r y I M T b a s e d o n t h r o m b o c y t o p e n i a , n o r m a l P T a n d P T T d u r i n g b l e e d i n g e p i s o d e s , n o p a l p a b l e s p l e n o m e g a l y , a n d n o o t h e r d i a g n o s i s , t h e o u t c o m e s w e r e a s f o l l o w s : 1 4 / 5 4 d i e d n a t u r a l l y o r f r o m e u t h a n a s i a d u r i n g t h e fi r s t b o u t o f t h r o m b o c y t o p e n i a ; 1 7 / 5 4 h a d a c u t e I M T a n d r e c o v e r e d a f t e r 1 b o u t ; 8 / 5 4 h a d a c u t e , r e c u r r e n t I M T ; a n d 1 5 / 5 4 h a d c h r o n i c I M T w i t h r e c u r r e n t e p i s o d e s f o r u p t o 8 y e a r s ? " 3 W h i c h o f t h e s e o u t c o m e s a p a r t i c u l a r d o g w i l l h a v e i s c u r r e n t l y u n p r e d i c t - a b l e ? " 3 ° ” 4 T h e m a j o r c a u s e o f d e a t h i n d o g s w i t h c h r o n i c I M T h a s b e e n c o n s i d e r e d t o b e d i s c o n t i n u a t i o n o f t r e a t m e n t d u e t o t h e c u m u l a t i v e e x p e n s e o f m o n i t o r i n g a n d t r e a t i n g d o g s w i t h a n a p p a r e n t l y i n c u r a b l e c o n d i t i o n ? ” I t a p p e a r s t h e n , t h a t d o g s s u f f e r f r o m a c u t e a n d c h r o n i c f o r m s o f p r i m a r y I M T a n a l o g o u s t o t h e h u m a n s i t u a t i o n . A t t e m p t s t o c l e a r l y e s t a b l i s h a n y p o t e n t i a l d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e s e g r o u p s h a v e n o t b e e n r e p o r t e d . T h e a c u t e f o r m h a s b e e n r e p o r t e d t o o c c u r 8 7 g e n e r a l l y i n y o u n g e r a n i m a l s 1 - 2 m o n t h s a f t e r a v i r a l i n f e c t i o n o r v a c c i n a t i o n , ” b u t t h e e v i d e n c e t o s u p p o r t t h i s i s w e a k o r l a c k i n g . P r o g n o s i s h a s b e e n c o n s i d e r e d g o o d , ” b u t i f c a t e g o r i z a t i o n a s a c u t e h a s b e e n b a s e d o n r e s p o n s e t o t h e r a p y , p r o g n o s i s i s b y d e fi n i t i o n g o o d . I n t h e c h r o n i c f o r m , o n s e t i s r e p o r t e d l y i n s i d i o u s a n d r e c o v e r y i s n o t s p o n t a n e o u s d u e t o t h e c o n t i n u e d p r o d u c t i o n o f P A I g . ” A g a i n , t h e o u t c o m e d e fi n e s t h e c a t e g o r y , b u t t h e o u t c o m e c a n n o t y e t b e p r e d i c t e d b y t h e p r e s e n t a t i o n . F u r t h e r s t u d i e s u s i n g a d i r e c t a s s a y f o r P A I g a r e r e q u i r e d t o b e t t e r d e fi n e t y p e s a n d p o t e n t i a l l y s u b t y p e s o f c a n i n e I M T . e . c o n d i t i o n s f o r w h i c h t h e m e c h a n i s m o f t h r o m b o c y t o p e n i a i s l a r g e l y m u l t i f a c t o r i a l o r n o t c l e a r l y e s t a b l i s h e d ( 1 ) i n f e c t i o n s S o m e i n f e c t i o u s d i s e a s e s c o m m o n l y a s s o c i a t e d w i t h t h r o m b o c y t o p e n i a h a v e b e e n d i s c u s s e d i n p r e v i o u s s e c t i o n s c o r r e s p o n d i n g t o t h e a p p a r e n t p r i m a r y m e c h a n i s m b y w h i c h t h r o m b o c y t o p e n i a a p p e a r s t o o c c u r . F o r s e v e r a l c a n i n e i n f e c t i o u s d i s e a s e s , h o w e v e r , t h e p a t h o g e n e s i s o f t h r o m b o c y t o p e n i a i s e i t h e r t o o c o m p l e x o r t o o p o o r l y u n d e r s t o o d t o c a t e g o r i z e . T h e s e d i s e a s e s a r e d i s c u s s e d b e l o w . T o r e i t e r a t e p r e v i o u s c o m m e n t s , t h r o m b o c y t o p e n i a i s c o m m o n l y a s s o c i a t e d w i t h c a n i n e i n f e c t i o n s , i n c l u d i n g t h o s e c a u s e d b y v i r u s e s , b a c t e r i a ( e s p e c i a l l y t h e r i c k e t t s i a l s ) , p r o t o z o a , f u n g i , a n d n e m a t o d e s . ” " ‘ ° W h i l e t h r o m b o c y t o p e n i a m a y b e s p o r a d i c a l l y a s s o c i a t e d w i t h s e c o n d a r y D I C i n m a n y c r i t i c a l l y i l l d o g s w i t h m a n y d i f f e r e n t i n f e c t i o n s , t h r o m b o c y t o p e n i a i s p a r t o f t h e e x p e c t e d c l i n i c a l p i c t u r e w i t h s o m e i n f e c t i o n s . T h e p a t h o g e n e s e s o f t h e s e i n f e c t i o u s t h r o m b o c y t o p e n i a s m a y b e c o m p l i c a t e d , i n v o l v i n g 8 8 v a r i o u s c o m b i n a t i o n s o f s u p p r e s s e d p l a t e l e t p r o d u c t i o n , a l t e r e d p l a t e l e t d i s t r i b u t i o n , i n c r e a s e d c o n s u m p t i o n , o r i m m u n e - m e d i a t e d a n d n o n i m m u n e d e s t r u c t i o n . ( a ) r i c k e t t s i a l s A s a g r o u p , r i c k e t t s i a l d i s e a s e s a r e a c o m m o n i n f e c t i o u s c a u s e o f t h r o m b o c y t o p e - n i a i n e n d e m i c a r e a s . W i t h w i d e s p r e a d t r a v e l b e i n g c o m m o n p l a c e , t h e s e d i s e a s e s m u s t a l s o b e c o n s i d e r e d i n r e g i o n s l e s s p o p u l a t e d b y t h e i r v e c t o r t i c k s . i ) c a n i n e m o n o c y t i c e h r l i c h i o s i s C a n i n e m o n o c y t i c e h r l i c h i o s i s ( t r o p i c a l c a n i n e p a n c y t o p e n i a 3 7 1 i s c a u s e d b y t h e o b l i g a t e i n t r a c e l l u l a r r i c k e t t s i a l E h r l i c h i a c a n i s w h i c h i s t r a n s m i t t e d b y i t s v e c t o r , t h e b r o w n d o g t i c k ( R h i p i c e p h a l u s s a n g u i n e u s ) . T h e d i s e a s e h a s t h r e e p h a s e s : ‘ “ a n a c u t e p h a s e 1 - 3 w e e k s a f t e r i n f e c t i o n w h i c h l a s t s 2 4 w e e k s a n d i s a s s o c i a t e d w i t h m y e l o i d a n d m e g a k a r y o c y t i c h y p e r p l a s i a ; ‘ ” ' ” " " 3 7 3 a s u b c l i n i c a l p h a s e o c c u r r i n g 6 - 9 w e e k s p o s t i n o c u - l a t i o n ; a n d a c h r o n i c p h a s e a s s o c i a t e d w i t h u n e x p l a i n e d b o n e m a r r o w h y p o p l a s i a ? ” 1 1 3 A n i n a d e q u a t e c e l l - m e d i a t e d i m m u n e r e s p o n s e h a s b e e n s u g g e s t e d t o a l l o w p r o g r e s s i o n t o t h e c h r o n i c p h a s e ? " T h r o m b o c y t o p e n i a , t h e m o s t c o n s i s t e n t h e m a t o l o g i c a b n o r m a l i t y , o c c u r s i n e a c h p h a s e , a n d p a n c y t o p e n i a , o c c u r r i n g i n f e w e r t h a n 2 5 % o f r e p o r t e d d o g s , c h a r a c t e r i z e s t h e c h r o n i c p h a s e . 1 “ H o w e v e r , i n o n e r e v i e w , m o s t i n f e c t e d d o g s ( 2 4 1 / 3 2 7 ) w e r e n o t t h r o m b o c y t o p e n i c ? 7 5 G r a n u l a r l y m p h o c y t o s i s , 3 7 6 h y p e r g l o b u l i n e m i a , a n d n e u t r o p e n i a a r e a l s o c o m m o n i n s u b c l i n i c a l a n d c h r o n i c p h a s e s ? ” T h r o m b o c y t o p e n i c h e m o r r h a g e m a y o c c u r , b u t i t u s u a l l y d o e s n o t o c c u r i n t h e a c u t e p h a s e , e v e n w i t h s i g n i fi c a n t t h r o m b o c y t o p e n i a . 1 “ ? ” H e m o r r h a g e s u c h a s e p i s t a x i s 8 9 m a y a l s o o c c u r w i t h n o r m a l o r m i l d l y d e c r e a s e d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s , p r e s u m a b l y b e c a u s e o f p l a t e l e t d y s f u n c t i o n . ” ' ” 3 ' 3 8 0 P l a t e l e t d y s f u n c t i o n i n t h o s e d o g s w i t h a m a r k e d g a m m o p a t h y l i k e l y r e l a t e s t o h y p e r v i s c o s i t y s y n d r o m e . ” ' ” 8 ' 3 7 9 P l a t e l e t d y s f u n c t i o n h a s b e e n n o t e d i n e x p e r i m e n t a l l y i n f e c t e d d o g s w h o s e p l a t e l e t s h a d m a r k e d l y d e c r e a s e d a d h e s i v e n e s s t o g l a s s b e a d s . ” 1 S e r a f r o m o t h e r e x p e r i m e n t a l l y - i n f e c t e d d o g s c a u s e d l e s s P F 3 r e l e a s e i n a P F 3 a s s a y t h a n d i d c o n t r o l s e r a ? 8 2 S o m e t h i n g i n t h e s e r u m s e e m e d t o i n h i b i t r a t h e r t h a n t o s t i m u l a t e p l a t e l e t s . I n o t h e r s t u d i e s , d o g s i n f e c t e d w i t h E . c a n i s d e v e l o p e d a n u n c h a r a c t e r i z e d s e r u m f a c t o r t h a t i n h i b i t e d p l a t e l e t m i g r a t i o n a n d , c o m p a r e d t o p r e i n f e c t i o n s e r a , c a u s e d p l a t e l e t s t o b e m o r e r o u n d e d w i t h r e d u c e d p s e u d o p o d f o r m a t i o n ? ” T h e s e r u m f a c t o r h a d n o d i r e c t r e l a t i o n s h i p t o d e t e c t a b l e a n t i b o d y t i t e r s t o t h e o r g a n i s m , a n d i t s i n h i b i t o r y a c t i v i t y c o u l d b e r e m o v e d b y p r i o r i n c u b a t i o n w i t h p l a t e l e t s . T h e p l a t e l e t m i g r a t i o n i n h i b i t i o n a p p e a r e d a s t h r o m b o c y t o p e n i a d e v e l o p e d , a n d r e m a i n e d d u r i n g t h e c h r o n i c p h a s e o f t h e d i s e a s e . T h e n a t u r e o f t h i s f a c t o r h a s n o t b e e n d e t e r m i n e d . T h e a c u t e - p h a s e t h r o m b o c y t o p e n i a h a s b e e n c o n s i d e r e d t o b e d u e t o a c o m b i n a t i o n o f c o n s u m p t i o n , s e q u e s t r a t i o n , a n d a n t i b o d y - m e d i a t e d d e s t r u c t i o n ? “ w h i l e d e c r e a s e d p r o d u c t i o n i s t h o u g h t t o b e t h e c r i t i c a l f a c t o r i n c h r o n i c e h r l i c h i o s i s . 1 1 6 T h i s i n t e r p r e t a - t i o n h a s c o m e l a r g e l y f r o m k i n e t i c s t u d i e s i n e x p e r i m e n t a l l y i n f e c t e d d o g s u s i n g 3 2 P - l a b e l e d a u t o l o g o u s p l a t e l e t s ? “ 7 S S e - s e l e n o m e t h i o n i n e a n d 5 1 c h r o m i u m - l a b e l e d a u t o l o g o u s p l a t e l e t s ? ” o r ” c h r o m i u m - l a b e l e d h o m o l o g o u s p l a t e l e t s ? ” I n c r e a s e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n a p p e a r s t o o c c u r w i t h i n a f e w d a y s a f t e r e x p e r i m e n t a l i n f e c t i o n , s u g g e s t i n g t h a t t h e t h r o m b o c y t o p e n i a o f a c u t e e h r l i c h i o s i s i s n o t e n t i r e l y a n t i b o d y - m e d i a t e d . T h e p r e s e n c e o f E . c a n i s o r g a n i s m s i n e n d o t h e l i a l c e l l s o f e x p e r i m e n t a l l y i n f e c t e d d o g s ’ 8 6 s u g g e s t s t h a t 9 O e n d o t h e l i a l d a m a g e m a y c o n t r i b u t e t o c o n s u m p t i v e t h r o m b o c y t o p e n i a . C o n c u r r e n t w i t h a c c e l e r a t e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n i n a c u t e e h r l i c h i o s i s , m e g a k a r y o c y t e p r o d u c t i o n a n d p l a t e l e t r e l e a s e a p p e a r t o o c c u r a t a n a c c e l e r a t e d b u t i n a d e q u a t e r a t e t o c o m p e n s a t e f o r d e s t r u c t i o n . I n t h e c h r o n i c p h a s e , p l a t e l e t s u r v i v a l s a r e m o d e r a t e l y d e c r e a s e d , b u t n o t e n o u g h t o s u g g e s t t h a t d e s t r u c t i v e p r o c e s s e s a r e t h e p r i n c i p a l c a u s e o f t h r o m b o c y t o p e n i a . I m m u n e - m e d i a t e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n h a s b e e n p r o p o s e d t o c o n t r i b u t e t o t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s w i t h c a n i n e m o n o c y t i c e h r l i c h i o s i s . W h i l e n e g a t i v e P F 3 r e s u l t s h a v e b e e n r e p o r t e d ? ” p o s i t i v e P F 3 t e s t s a n d i n c r e a s e d a n t i n u c l e a r a n t i b o d i e s h a v e a l s o b e e n r e p o r t e d i n a s s o c i a t i o n w i t h c h r o n i c , n a t u r a l l y - o c c u r r i n g e h r l i c h i o s i s . 3 8 0 A d o g w i t h c l i n i c a l I M T a n d c o n c u r r e n t e h r l i c h i o s i s a n d b a b e s i o s i s w a s p o s i t i v e f o r P A I g a n d P B I g , 1 6 0 a n d 3 o t h e r d o g s w i t h d i a g n o s e s o f I M T b y P F 3 o r m e g a k a r y o c y t e i m m u n o fl u o - r e s c e n c e t e s t s h a d e h r l i c h i o s i s . I 6 1 P o s i t i v e C o o m b s ’ t e s t s h a v e b e e n r e p o r t e d f o r a f e w i n f e c t e d d o g s ? ” ? 7 3 ' ” 3 ' 3 8 7 s o m e b e i n g p o s i t i v e f o r I g G , I g M , a n d / o r C 3 ? 7 2 T h e s i g n i fi c a n c e o f t h i s i s u n k n o w n , b u t i t m a y r e l a t e t o h y p e r g l o b u l i n e m i a o r i m m u n e c o m p l e x d i s e a s e ? ” A n i m m u n e c o m p l e x m e c h a n i s m i s i n t r i g u i n g i n l i g h t o f t h e f a c t t h a t p r o t e i n u r i a a n d r e n a l l e s i o n s s u g g e s t i v e o f i m m u n e - m e d i a t e d r e n a l d a m a g e h a v e b e e n r e p o r t e d t o o c c u r i n d o g s m a d e t h r o m b o c y t o p e n i c b y e x p e r i m e n t a l l y - i n d u c e d a c u t e i n f e c t i o n s ? ” I n a n o t h e r s t u d y o f e x p e r i m e n t a l l y i n f e c t e d d o g s , c o m p l e m e n t w a s c o n s u m e d i n v i v o i n i n f e c t e d d o g s , a n d t h e d r o p i n c o m p l e m e n t a c t i v i t y f o l l o w e d a f e w d a y s b e h i n d t h e f a l l i n p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s ? ” A s t h i s s u g g e s t e d a p o s s i b l e r o l e f o r c o m p l e m e n t i n c a u s i n g t h e t h r o m b o c y t o p e n i a , d o g s w e r e t r e a t e d w i t h c o b r a v e n o m f a c t o r ( C V F ) t o r e d u c e m e a n h e m o l y t i c c o m p l e m e n t a c t i v i t y b e f o r e i n f e c t i o n . T h r o m b o c y t o p e n i a w a s 9 1 m o d e r a t e d i n t h e C V F - t r e a t e d d o g s , b u t s i n c e a m a r k e d i n c r e a s e i n p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n o c c u r r e d i n t h e o n l y C V F c o n t r o l d o g , t h e m o d e r a t e d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s m a y h a v e b e e n a d i r e c t e f f e c t o f C V F . T h e s e s t u d i e s n e i t h e r d e m o n s t r a t e n o r p r e c l u d e a r o l e f o r c o m p l e m e n t i n t h e t h r o m b o c y t o p e n i a o f c a n i n e m o n o c y t i c e h r l i c h i o s i s . S p l e n i c s e q u e s t r a t i o n m a y c o n t r i b u t e t o t h r o m b o c y t o p e n i a i n s o m e d o g s , a s s p l e n o m e g a l y h a s b e e n p r e s e n t i n n a t u r a l 3 7 5 3 8 9 a n d i n d u c e d i n f e c t i o n s ? ” H o w e v e r , o n l y 2 0 / 3 4 5 ( 6 % ) d o g s w i t h e h r l i c h i o s i s t h a t w e r e e v a l u a t e d f o r s p l e n o m e g a l y h a d i t ? 7 5 I n s u m m a r y , t h e p a t h o g e n e s i s o f t h r o m b o c y t o p e n i a i n c a n i n e m o n o c y t i c e h r l i c h i o s i s i s n o t y e t c l e a r . B e c a u s e o f t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h r o m b o c y t o p e n i a i s a t l e a s t p a r t i a l l y i m m u n e — m e d i a t e d , s h o r t - t e r m g l u c o c o r t i c o i d t h e r a p y h a s b e e n s u g g e s t e d w h e n l i f e - t h r e a t e n i n g t h r o m b o c y t o p e n i a i s p r e s e n t ? ” S o m e c l i n i c i a n s h a v e r o u t i n e l y t r e a t e d d o g s w i t h t e t r a c y c l i n e a n d g l u c o c o r t i c o i d s w h i l e a w a i t i n g s e r o l o g i c t e s t r e s u l t s , b e c a u s e I M T a n d c a n i n e e h r l i c h i o s i s c a n a p p e a r v e r y s i m i l a r . H o w e v e r , d o g s w i t h e h r l i c h i o s i s u s u a l l y h a v e a f e v e r a n d o t h e r c o n s t i t u t i o n a l s i g n s ? 7 5 w h i l e d o g s w i t h p r i m a r y I M T d o I l O I . i i ) c a n i n e g r a n u l o c y t i c e h r l i c h i o s i s T h r o m b o c y t o p e n i a a p p e a r s t o b e t h e m o s t c o m m o n h e m a t o l o g i c a b n o r m a l i t y i n c a n i n e g r a n u l o c y t i c e h r l i c h i o s i s c a u s e d b y E h r l i c h i i e w i n g i i ” 0 i n s o u t h e r n s t a t e s ” 1 a n d a p p a r e n t l y a d i f f e r e n t s p e c i e s i n t h e u p p e r m i d w e s t . ” 2 C l i n i c a l l y , g r a n u l o c y t i c e h r l i c h i o s i s i s a s s o c i a t e d w i t h a c u t e p o l y a r t h r i t i s t h a t i s r e s p o n s i v e t o t e t r a c y c l i n e . ” 3 ' 3 “ E h r l i c h i a l m o r u l a e a r e p r e s e n t i n n e u t r o p h i l s a n d e o s i n o p h i l s , p o s s i b l y m o n o c y t e s , b u t n o t l y m p h o c y t e s , b a s o p h i l s , o r p l a t e l e t s ? 9 1 I n f e c t e d g r a n u l o c y t e s m a y a l s o b e d e t e c t e d 9 2 i n s y n o v i a l fl u i d s a m p l e s ? “ P l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s i n 3 7 n a t u r a l l y i n f e c t e d d o g s a v e r a g e d 1 1 1 , 4 1 7 w i t h a r a n g e o f 3 4 , 0 0 0 — 1 9 6 , 0 0 0 / p l , a n d c l i n i c a l h e m o r r h a g e w a s n o t a s s o c i a t e d w i t h t h e d i s e a s e . ” 1 ' 3 “ I n s t u d i e s o f e x p e r i m e n t a l l y - i n d u c e d c a n i n e g r a n u l o c y t i c e h r l i c h i o s i s , i n o c u l a t e d d o g s h a v e d e v e l o p e d m i l d t o m a r k e d ( 6 , 0 0 0 / p 1 3 ” ) t h r o m b o c y t o p e n i a c o n c u r r e n t l y w i t h n e u t r o p e n i a , l y m p h o c y t o s i s , p y r e x i a , m o r u l a e i n n e u t r o p h i l s a n d e o s i n o p h i l s , a n d p o s i t i v e E . c a n i s t i t e r s ( a b o u t d a y 1 8 - 2 4 ) . ” ° C l i n i c a l p o l y a r t h r i t i s h a s n o t g e n e r a l l y d e v e l o p e d , o n l y 1 d o g h a v i n g h a d m i l d l y s w o l l e n c a r p i . ” 5 I t i s t h e r e f o r e n o t y e t c l e a r i f t h e o r g a n i s m c a u s e s t h e c l i n i c a l p o l y a r t h r i t i s w i t h w h i c h i t h a s b e e n a s s o c i a t e d . S t u d i e s o f t h e p a t h o g e n e s i s o f t h r o m b o c y t o p e n i a h a v e n o t b e e n r e p o r t e d . i i i ) i n f e c t i o u s c a n i n e c y c l i c t h r o m b o c y t o p e n i a I n c a n i n e c y c l i c t h r o m b o c y t o p e n i a c a u s e d b y E h r l i c h i a p l a t y s , o r g a n i s m s i n f e c t p l a t e l e t s a n d r e s i d e a s m o r u l a e w i t h i n m e m b r a n e - l i n e d v a c u o l e s ? 9 7 T h e m e c h a n i s m b y w h i c h p l a t e l e t s b e c o m e i n f e c t e d i s n o t k n o w n , b u t m e g a k a r y o c y t e i n f e c t i o n s h a v e n o t b e e n f o u n d ? ” * ” 8 T h r o m b o c y t o p e n i a d e v e l o p s r a p i d l y w i t h t h e a p p e a r a n c e o f t h e o r g a n i s m s , a n d r e s o l v e s w i t h i n 3 - 4 d a y s a f t e r t h e i r d i s a p p e a r a n c e . I t c o n t i n u e s t o o c c u r e v e r y 1 t o 2 w e e k s i n e x p e r i m e n t a l i n f e c t i o n s , b u t t h e fi r s t p a r a s i t e m i a i s a s s o c i a t e d w i t h s i g n i fi c a n t l y m o r e i n f e c t e d p l a t e l e t s t h a n a r e s u b s e q u e n t o n e s . T h i s h a s l e d t o t h e s u s p i c i o n t h a t d i r e c t e f f e c t s o f t h e o r g a n i s m m a y b e r e s p o n s i b l e f o r t h e i n i t i a l t h r o m b o c y t o p e n i a , a n d i m m u n e - m e d i a t e d m e c h a n i s m s m a y m o d u l a t e t h r o m b o c y t o p e n i a i n l a t e r p h a s e s . 9 3 I n e x p e r i m e n t a l l y - i n d u c e d d i s e a s e , b o n e m a r r o w c e l l u l a r i t y w a s i n c r e a s e d ” 9 a n d t h e d e n s i t y o f m e g a k a r y o c y t e s w a s a b o u t t w i c e t h a t o f u n i n f e c t e d c o n t r o l s ? 9 8 s u g g e s t i n g t h a t d e c r e a s e d p l a t e l e t s u r v i v a l a n d n o t d e c r e a s e d p r o d u c t i o n c a u s e s t h e t h r o m b o c y t o p e - n i a . P l a t e l e t a g g r e g a t i o n w a s a s s e s s e d b y o p t i c a l a g g r e g o m e t r y o f P R P f r o m i n f e c t e d a n d c o n t r o l d o g s . W i t h a c u t e i n f e c t i o n , 5 o u t b r e d d o g s b u t n o t 5 B e a g l e s h a d s i g n i fi c a n t l y r e d u c e d m e a n m a x i m a l a g g r e g a t i o n r e s p o n s e s t o v e r y l o w ( 0 . 1 M m ) c o n c e n t r a t i o n s o f A D P . I t w a s s u g g e s t e d t h a t i n v i v o p l a t e l e t s t i m u l a t i o n m a y m a k e t h e m r e f r a c t o r y t o e x v i v o a g g r e g a t i o n , t h e i m p l i c a t i o n b e i n g t h a t t h e o r g a n i s m m a y i n d u c e a h y p e r a g g r e g a b l e s t a t e i n v i v o l e a d i n g t o a c c e l e r a t e d p l a t e l e t c o n s u m p t i o n . W h i l e v a s c u l i t i s a p p e a r s t o c o n t r i b u t e t o t h r o m b o c y t o p e n i a i n o t h e r r i c k e t t s i a l i n f e c t i o n s , v a s c u l a r l e s i o n s h a v e n o t b e e n d e t e c t e d i n e x p e r i m e n t a l i n f e c t i o n s w i t h E h r l i c h i a p l a t y s ? 9 9 I m m u n e - m e d i a t e d d e s t r u c t i o n h a s b e e n c o n s i d e r e d b u t i s n o t s u p p o r t e d b y t h e c y c l i c n a t u r e o f t h e t h r o m b o c y t o p e n i a i n t h e f a c e o f r i s i n g t i t e r s , o r b y t h e p r e s e n c e o f t h r o m b o c y t o p e n i a i n s o m e d o g s w i t h n o d e t e c t a b l e s e r u m t i t e r s t o E . p l a t y s ? ” H o w e v e r , t h e i n d i r e c t i m m u n o fl u o r e s c e n c e a s s a y f o r t i t e r s " 0 0 d e t e c t s o n l y I g G . T h e t h r o m b o c y t o p e n i a c o u l d s t i l l b e m e d i a t e d b y a n t i b o d i e s r e a c t i v e t o c o m b i n e d p l a t e l e t / o r g a n i s m e p i t o p e s o r p l a t e l e t e p i t o p e s i n d u c e d b y t h e i n f e c t i o n . T h e r o l e o f i r m n u n e c o m p l e x e s h a s s i m i l a r l y n o t b e e n i n v e s t i g a t e d . I n t h e o r i g i n a l d e s c r i p t i o n o f t h i s d i s e a s e , c l i n i c a l i l l n e s s d i d n o t a c c o m p a n y i n f e c t i o n ? ” S i n c e t h e n , a f e b r i l e d o g w i t h u v e i t i s a n d t h r o m b o c y t o p e n i a w a s f o u n d t o b e i n f e c t e d w i t h E . p l a t y s , t h o u g h t h e c l i n i c a l s i g n s m a y n o t h a v e b e e n c a u s e d b y t h e o r g a n i s m . 4 0 1 I n a M i c h i g a n c a s e , 4 0 2 c l i n i c a l h e m o r r h a g e o c c u r r e d i n a d o g w i t h c y c l i c t h r o m b o c y t o p e n i a t h a t r e s p o n d e d t o t e t r a c y c l i n e . M o r u l a e w e r e n o t d e t e c t e d , b u t t h e d o g 9 4 h a d a s u p p o r t i v e ( n o t s t r o n g ) t i t e r f o r E . p l a t y s . H o w e v e r , o t h e r e h r l i c h i a l t i t e r s w e r e n o t r e p o r t e d . I n G r e e c e , 1 5 d o g s n a t u r a l l y i n f e c t e d w i t h a G r e e k s t r a i n o f E . p l a t y s h a d s i g n s i n c l u d i n g a n o r e x i a , d e p r e s s i o n , w e i g h t l o s s , i n t e r m i t t e n t e p i s t a x i s , p a l e m u c o u s m e m b r a n e s , a n d f e v e r . 4 0 3 F o u r t e e n o f t h e d o g s w e r e t h r o m b o c y t o p e n i c , a n d e a c h r e s p o n d e d w e l l t o t e t r a c y c l i n e t h e r a p y . W h i l e c o n c o m i t a n t i n f e c t i o n s m a y h a v e e x i s t e d , e x p e r i m e n t a l i n o c u l a t i o n s o f n o r m a l d o g s w i t h b l o o d f r o m o n e o f t h e d o g s w i t h n o e v i d e n c e o f a c o m b i n e d i n f e c t i o n a l s o p r o d u c e d s e v e r e t h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h f e v e r , d e p r e s s i o n , a n o r e x i a , a n d p e t e c h i a l a n d e c c h y m o t i c h e m o r r h a g e s . I t a p p e a r s t h e n , t h a t s o m e s t r a i n s o f E . p l a t y s m a y i n d u c e c l i n i c a l d i s e a s e . H o w e v e r , i f c l i n i c a l s i g n s a c c o m p a n y E . p l a t y s i n f e c t i o n s , o t h e r d i s e a s e p r o c e s s e s s h o u l d b e t h o r o u g h l y s o u g h t . i v ) h e m o b a r t o n e l l o s i s C a n i n e h e m o b a r t o n e l l o s i s i s c a u s e d b y t h e e p i c e l l u l a r r i c k e t t s i a l H e m o b a r t o n e l l a c a n i s . W h i l e t h r o m b o c y t o p e n i a i s n o t c h a r a c t e r i s t i c o f t h e d i s e a s e ? i t w a s a s s o c i a t e d w i t h c a n i n e h e m o b a r t o n e l l o s i s i n o n e s p l e n e c t o m i z e d d o g ? 6 6 T h e t h r o m b o c y t o p e n i a i n t h i s d o g r e s o l v e d a s t h e o r g a n i s m s d i s a p p e a r e d f r o m t h e p e r i p h e r a l b l o o d , t h o u g h t h i s m a y h a v e b e e n c o i n c i d e n t a l a n d n o t c a u s a t i v e . ( b ) p r o t o z o a i ) b a b e s i o s i s T h r o m b o c y t o p e n i a m a y o c c u r i n c a n i n e b a b e s i o s i s c a u s e d b y t i c k - b o m e o r t r a n s f u s e d B a b e s i a c a n i s o r B a b e s i a g i b s o n i . " “ " ’ ° 5 T h r o m b o c y t o p e n i a m a y b e m o d e r a t e 9 5 t o s e v e r e , a n d s o m e t i m e s c o m p l i c a t e d o r c a u s e d b y D I C . 4 0 6 T h e s p l e n o h e p a t o m e g a l y o f b a b e s i a l i n f e c t i o n s m a y c a u s e p l a t e l e t s e q u e s t r a t i o n a n d c o n t r i b u t e t o t h e t h r o m b o c y t o p e - n i a . ” “ " " ° ° " ‘ O 7 I m m u n e - m e d i a t e d m e c h a n i s m s m a y a l s o c o n t r i b u t e s i n c e 3 1 o f 3 7 i n f e c t e d d o g s i n o n e s t u d y w e r e C o o m b s ’ p o s i t i v e , " 0 8 t h o u g h n o n e o f t h e e l e v e n i n a n o t h e r r e p o r t w e r e . “ 0 7 T h e r a p i d r e t u r n o f n o r m a l p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s a f t e r t h e r a p y a r g u e s a g a i n s t a d e fi c i e n c y o f m e g a k a r y o c y t e s ? ” t h o u g h t h r o m b o p o i e s i s m a y b e i n h i b i t e d . H e m o l y s i s m a y a l s o b e c o n t r i b u t o r y . T h e p r i n c i p a l c a u s e o f t h r o m b o c y t o p e n i a i n c a n i n e b a b e s i o s i s r e m a i n s t o b e d i s c o v e r e d . i i ) l e i s h m a n i a s i s C l i n i c a l c a n i n e l e i s h m a n i a s i s “ 1 5 9 c a u s e d b y d i p h a s i c p r o t o z o a o f t h e g e n u s L e i s h m a n i a i s a s s o c i a t e d g e o g r a p h i c a l l y w i t h i t s p r i m a r y s a n d fl y v e c t o r s o f t h e g e n u s P h l e b o t o m u s i n t h e O l d W o r l d a n d t h e g e n u s L u t z o m y i a i n t h e N e w W o r l d . “ 0 9 I n 8 0 u n t r e a t e d d o g s w i t h n a t u r a l i n f e c t i o n s o f l e i s h m a n i a s i s , t h e p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s o f 5 0 w e r e m e a s u r e d a n d 2 5 d o g s w e r e t h r o m b o c y t o p e n i c . 1 5 9 S o m e o f t h e d o g s w e r e m a r k e d l y t h r o m b o c y t o p e n i c . T h r o m b o c y t o p e n i a a l s o o c c u r s i n e x p e r i m e n t a l i n f e c t i o n s , “ 1 0 a n d i t m a y b e c a u s e d b y d e c r e a s e d p r o d u c t i o n , s p l e n i c s e q u e s t r a t i o n , a n d i m m u n o d e s t r u c t i o n . H o w e v e r , t h e o p e r a t i v e p a t h o p h y s i o l o g i c m e c h a n i s m s h a v e n o t b e e n c o n c l u s i v e l y i d e n t i fi e d . A s c i r c u l a t i n g i m m u n e c o m p l e x e s ( C I C ) h a v e b e e n r e l a t e d t o t h e t h r o m b o c y t o p e - 4 1 1 n i a s e e n i n p e o p l e w i t h l e i s h m a n i a s i s , t h e y m a y p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e t h r o m b o c y t o p e n i a o f d o g s , e i t h e r d i r e c t l y o r s e c o n d a r y t o i m m u n e - c o m p l e x v a s c u l i t i s . ” 9 I n n a t u r a l c a n i n e i n f e c t i o n s , C I C w e r e d e t e c t e d b y n e p h e l o m e t r y i n 2 7 o f 2 7 s a m p l e s ? ” 9 6 O f 7 4 p a t i e n t s t e s t e d , 8 4 % h a d p o s i t i v e C o o m b s ’ t e s t s , t h o u g h t h e y w e r e u s u a l l y w e a k . T h e p r e s e n t a t i o n o f d o g s w i t h v i s c e r a l l e i s h m a n i a s i s i s r e p o r t e d l y s o m e t i m e s v e r y d i f fi c u l t t o d i f f e r e n t i a t e f r o m S L E , e s p e c i a l l y s i n c e L E c e l l ( 3 / 2 3 ) a n d A N A t e s t s ( 1 4 / 4 5 ) m a y b e p o s i t i v e i n i n f e c t e d d o g s ? ” W h i l e t h e s e fi n d i n g s i n d i c a t e t h e p o t e n t i a l f o r I M T , s u c h a c a u s e r e m a i n s t o b e e s t a b l i s h e d . A s f o r s e q u e s t r a t i o n , i t m a y c o n t r i b u t e i n s o m e c a s e s , s i n c e s p l e n o m e g a l y o c c u r s i n a b o u t 1 / 3 o f t h e c a s e s . 1 ” D e c r e a s e d p r o d u c t i o n m a y a l s o o c c u r w h e n m a r r o w s a r e p a c k e d w i t h l e i s h m a n i a — l a d e n m a c r o p h a g e s . ( c ) f u n g a l M o d e r a t e t o m a r k e d t h r o m b o c y t o p e n i a c o m m o n l y a c c o m p a n i e s c a n i n e h i s t o p l a s - m o s i s c a u s e d b y H i s t o p l a s m a c a p s u l a t u m . “ 6 ' 4 ” : 4 1 3 I n s o m e c a s e s i t h a s b e e n a s s o c i a t e d w i t h g a s t r o i n t e s t i n a l h e m o r r h a g e , a n d i n c r e a s e s i n c i r c u l a t i n g m e g a t h r o m b o c y t e s h a v e 4 1 2 b e e n i n t e r p r e t e d a s a n i n d i c a t i o n o f e f f e c t i v e t h r o m b o p o i e s i s . T h e p a t h o g e n e s i s o f t h i s t h r o m b o c y t o p e n i a i s u n k n o w n . I n p e o p l e , t h r o m b o c y t o p e n i a a l s o f r e q u e n t l y o c c u r s w i t h a c u t e h i s t o p l a s m o s i s , a n d i t h a s b e e n a s s o c i a t e d w i t h i n c r e a s e d P A I g G i n a p a t i e n t w i t h p r i m a r y p u l m o n a r y “ “ 1 5 W h e n H i s t o p l a s m a c a p s u l a t u m o r g a n i s m s w e r e i n c u b a t e d w i t h h i s t o p l a s m o s i s . h u m a n p l a t e l e t - r i c h p l a s m a , a g g r e g a t i o n a n d r e l e a s e o c c u r r e d ? “ T h e p l a t e l e t r e l e a s e r e a c t i o n r e q u i r e d t h e p r e s e n c e o f t h e y e a s t a n d I g G , w h i l e a g g r e g a t i o n h a d a n a d d i t i o n a l r e q u i r e m e n t f o r fi b r i n o g e n . U n l i k e t h e i n t e r a c t i o n o f p l a t e l e t s w i t h t h e y e a s t c e l l w a l l e x t r a c t z y m o s a n , c o m p l e m e n t w a s n o t r e q u i r e d . W h e t h e r I g G i n t e r a c t s w i t h t h e y e a s t i n a s p e c i fi c o r n o n s p e c i fi c m a n n e r i s u n k n o w n , b u t i t w a s s u g g e s t e d t h a t I g G a n d t h e y e a s t m a y f o r m a n i m m u n e c o m p l e x t h a t i n t e r a c t w i t h t h e p l a t e l e t t h r o u g h F e y r e c e p t o r s . 9 7 A s s a y s f o r P A I g h a v e n o t b e e n r e p o r t e d i n d o g s w i t h h i s t o p l a s m o s i s . F u r t h e r - m o r e , c a n i n e p l a t e l e t s h a v e n o t y e t b e e n e v a l u a t e d f o r t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f a n F e r e c e p t o r . S u c h s t u d i e s a r e i n d i c a t e d t o u n d e r s t a n d t h e t h r o m b o c y t o p e n i a o f c a n i n e h i s t o p l a s m o s i s . O t h e r f u n g a l d i s e a s e s s u c h a s d i s s e m i n a t e d c a n d i d i a s i s c a u s e d b y C a n d i d a a l b i c a n s o r C a n d i d a p a r a p s i l o s i s h a v e a l s o b e e n a s s o c i a t e d w i t h t h r o m b o c y t o p e - n i a i n d o g s . 1 1 6 ( d ) o t h e r A n i n c o m p l e t e l y c h a r a c t e r i z e d m a n g a n e s e - d e p e n d e n t r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e p r o d u c i n g i n f e c t i o u s a g e n t h a s r e c e n t l y b e e n s u s p e c t e d a s a n a g e n t c a u s i n g t h r o m b o c y t o - p e n i a i n a d o g . " 1 6 P o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n f a i l e d t o d e t e c t E h r l i c h i a c a n i s D N A i n s a m p l e s a n d c u l t u r e s f r o m t h e a f f e c t e d d o g , a n d a n i n o c u l a t e d c o n t r o l d o g d e v e l o p e d t h r o m b o c y t o p e n i a b u t d i d n o t s e r o c o n v e r t t o E . c a n i s . ( 2 ) n e o p l a s i a T h e p a t h o g e n e s i s o f t h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h n e o p l a s i a m a y r e l a t e t o a n y c o m b i n a t i o n o f t h e f o l l o w i n g : d e c r e a s e d p r o d u c t i o n f r o m m y e l o p h t h i s i s , m y e l o d y s p l a s i a , t u m o r s e c r e t i o n o f e s t r o g e n , o r c h e m o t h e r a p y ; i n c r e a s e d c o n s u m p t i o n b y D I C , m i c r o a n g i o p a t h i e s , o r h e m o r r h a g e ; i n c r e a s e d d e s t r u c t i o n b y i m m u n e m e c h a n i s m s o r s e c o n d a r y t o c o n c u r r e n t i n f e c t i o n s f r o m i r n m u n o s u p p r e s s i o n ; o r b y s e q u e s t r a t i o n i n s p l e e n s e n l a r g e d b y t u m o r i n fi l t r a t i o n o r i n o t h e r l a r g e v a s c u l a r o r g a n s o r n e o - p l a s m s . ” - 2 “ 8 ' 4 1 7 S o m e o f t h e s e m e c h a n i s m s h a v e b e e n d i s c u s s e d i n t h e p r e c e d i n g s e c t i o n s . T h e f r e q u e n t a s s o c i a t i o n o f t h r o m b o c y t o p e n i a w i t h n e o p l a s i a h a s r e c e n t l y b e e n 9 8 e m p h a s i z e d b y a r e t r o s p e c t i v e s t u d y w h i c h d o c u m e n t e d t h r o m b o c y t o p e n i a ( < 2 0 0 , 0 0 0 / p l ) i n 1 0 % o f 2 , 0 5 9 d o g s w i t h n e o p l a s i a , a n d i n 1 2 % o f d o g s w i t h m a l i g n a n t n e o p l a s m s . 2 4 8 M o r e o v e r , 1 3 % o f 9 8 7 t h r o m b o c y t O p e n i c d o g s i n a p r e v i o u s r e v i e w h a d n e o p l a s i a ? 5 I n t h e a f o r e m e n t i o n e d r e v i e w o f 2 , 0 5 9 d o g s w i t h n e o p l a s i a , d o g s w i t h h e m a n g i o - s a r c o m a s ( 4 7 % ) , l y m p h o i d n e o p l a s i a ( 3 7 % ) , h e m i c n e o p l a s i a ( 2 4 % ) , a n d c a r c i n o m a s w e r e a t s i g n i fi c a n t r i s k o f d e v e l o p i n g t h r o m b o c y t o p e n i a a s c o m p a r e d t o d o g s w i t h o t h e r n e o p l a s m s ? " 8 T h r o m b o c y t o p e n i a w a s m o s t m a r k e d w i t h b r a i n t u m o r s , h e m a n g i o s a r c o - m a s , m e l a n o m a s ( d u e t o c y t o t o x i c t h e r a p y ) , l y m p h o m a s , a n d p u l m o n a r y c a r c i n o m a s . D o g s w i t h i n f e c t i o n s p l u s n e o p l a s i a h a d m o r e s e v e r e t h r o m b o c y t o p e n i a t h a n d o g s w i t h n e 0 p l a s i a a l o n e , b u t f e w e r t h a n 2 5 % o f t h e d o g s h a d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s l e s s t h a n 1 0 0 , 0 0 0 / p l . G o l d e n R e t r i e v e r s w i t h n e 0 p l a s i a w e r e a t a n i n c r e a s e d r i s k o f d e v e l o p i n g t h r o m b o c y t o p e n i a c o m p a r e d t o o t h e r b r e e d s ? 4 8 I n a n o t h e r r e v i e w o f d o g s w i t h u n t r e a t e d c a n c e r , 3 6 % o f 1 0 0 d o g s w i t h u n t r e a t e d c a n c e r a n d n o e v i d e n c e o f h e m o r r h a g e w e r e t h r o m b o c y t O p e n i e . “ 1 8 I n t h i s s t u d y , t h r o m b o c y t o p e n i a w a s c o m m o n l y a s s o c i a t e d w i t h l y m p h o m a , m u l t i p l e m y e l o m a , a n d l e u k e m i a s , i n c l u d i n g a l l 7 d o g s w i t h m y e l o g e n o u s l e u k e m i a o r m u l t i p l e m y e l o m a . T w e l v e o f 5 9 ( 2 0 % ) d o g s w i t h s o l i d t u m o r s w e r e a l s o t h r o m b o c y t o p e n i c . I n a n o t h e r s t u d y , l y m p h o m a w a s a s s o c i a t e d w i t h p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s l e s s t h a n 2 0 0 , 0 0 0 / p l i n 3 1 o f 6 9 ( 4 9 % ) a f f e c t e d d o g s , a n d t h e c y t o p e n i a s w e r e c o n s i d e r e d t o r e l a t e t o m y e l o p h t h i - s i s . 8 1 M y e l o p h t h i s i s h a s a l s o b e e n t h e p r e s u m e d b u t u n p r o v e n p r i n c i p a l c a u s e o f t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s w i t h m u l t i p l e m y e l o m a , a c u t e l e u k e m i a , a n d c h r o n i c l y m p h o c y t i c l e u k e m i a . I n a r e v i e w o f d o g s w i t h m u l t i p l e m y e l o m a , 1 7 % o f 6 0 d o g s h a d 9 9 p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s l e s s t h a n 1 0 0 , 0 0 0 / p l w i t h 3 3 % l e s s t h a n 2 0 0 , 0 0 0 / p 1 . ” O f 1 9 d o g s w i t h a c u t e l e u k e m i a , t h r o m b o c y t o p e n i a o c c u r r e d i n 1 8 , s o m e t i m e s a l o n e ( 1 0 % ) , s o m e t i m e s w i t h a n e m i a ( 3 7 % ) , a n d s o m e t i m e s w i t h p a n c y t o p e n i a ( 4 8 % ) . 7 7 O n l y i n c a s e s o f a c u t e l y m p h o c y t i c l e u k e m i a w a s t h r o m b o c y t o p e n i a u n a c c o m p a n i e d b y o t h e r c y t o p e n i a s . I n a s t u d y o f 2 2 d o g s w i t h c h r o n i c l y m p h o c y t i c l e u k e m i a , 1 0 ( 4 5 % ) w e r e m i l d l y t o m o d e r a t e l y t h r o m b o c y t o p e n i c ( 1 1 0 , 0 0 0 - 1 9 3 , 0 0 0 / p l ) . 7 9 T h e r e l a t i v e c o n t r i b u t i o n t o t h r o m b o c y t o p e n i a o f s u c h f a c t o r s a s i m m u n o l o g i c m e c h a n i s m s , m y e l o p h t h i s i s , a n d t h e s p l e n o m e g a l y o r h e p a t o m e g a l y t h a t w a s f r e q u e n t l y p r e s e n t i n t h e s e d o g s i s n o t k n o w n , t h o u g h m y e l o p h t h i s i s i s p r e s u m e d t o p l a y a n i m p o r t a n t r o l e . D o g s w i t h a v a r i e t y o f m u l t i c e n t r i c o r m e t a s t a t i c n e o p l a s m s o f t e n h a v e d e c r e a s e d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s a s s o c i a t e d w i t h s h o r t e n e d p l a t e l e t s u r v i v a l s a n d a n i n c r e a s e d r a t e o f p l a t e l e t d e s t r u c t i o n ? ” M a n y n o n t h r o m b o c y t O p e n i c d o g s w i t h m a l i g n a n c i e s m a y a l s o h a v e d e c r e a s e d p l a t e l e t s u r v i v a l s , e s p e c i a l l y t h o s e d o g s w i t h m e t a s t a t i c c a r c i n o m a s o r 8 T h e i m p r o v e m e n t o f p l a t e l e t s u r v i v a l s i n t h r o m b o c y t o p e n i c d o g s w i t h l y m p h o m a s ? m a l i g n a n c i e s b y t r e a t m e n t w i t h a c o m b i n a t i o n o f p h o s p h o d i e s t e r a s e a n d a c y c l o o x y g e n a s e i n h i b i t o r i s c o n s i s t e n t w i t h t h e h y p o t h e s i s t h a t i n c r e a s e d p l a t e l e t c o n s u m p t i o n i s i m p o r t a n t i n t h e t h r o m b o c y t o p e n i a o f m a n y n e o p l a s t i c c o n d i t i o n s ? ” F i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n s a n d s u r v i v a l s m a y b e i n c r e a s e d , d e c r e a s e d , o r n o r m a l i n d o g s w i t h n e o p l a s i a , w h e t h e r o r n o t p l a t e l e t s u r v i v a l s a r e d e c r e a s e d . 7 8 ~ ” 8 ' 4 ” D e c r e a s e d fi b r i n o g e n s u r v i v a l i s c o n s i s t e n t w i t h a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n c a s c a d e a s o c c u r s i n D I C . H o w e v e r , m o s t e v a l u a t e d d o g s w i t h n e o p l a s i a a n d d e c r e a s e d p l a t e l e t s u r v i v a l s h a v e h a d e l e v a t e d fi b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n s a n d fi b r i n o g e n s u r v i v a l s t h a t w e r e n o t 1 0 0 d e c r e a s e d . ” " ” T h i s s u g g e s t s p l a t e l e t c o n s u m p t i v e / d e s t r u c t i v e m e c h a n i s m s o t h e r t h a n D I C i n t h e t h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h m a n y n e o p l a s m s i n d o g s . I n o n e S t u d y , h o w e v e r , d e c r e a s e d fi b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n s a n d i n c r e a s e d A P T T w e r e p r e s e n t i n a b o u t 5 0 % o f t h r o m b o c y t o p e n i c d o g s w i t h n e o p l a s i a ? " 8 D I C w a s d i a g n o s e d i n 3 3 % o f t h e s e d o g s , a n d i n 9 0 % o f t h e d o g s w i t h h e m a n g i o s a r c o m a ? 4 8 B e c a u s e D I C i s c o m m o n l y a s s o c i a t e d w i t h h e m a n g i o s a r c o m a , d o g s w i t h s u s p e c t e d h e m a n g i o s a r c o m a w e r e m o r e l i k e l y t h a n o t h e r d o g s w i t h c a n c e r t o u n d e r g o c o a g u l a t i o n s c r e e n i n g t e s t s . T h e r e s u l t s w e r e t h e r e f o r e l i k e l y b i a s e d t o w a r d d o g s w i t h h e m a n g i o s a r - c o m a . . T h r o m b o c y t o p e n i a o c c u r s i n m a n y d o g s w i t h h e m a n g i o s a r c o m a s , m a n y b u t n o t a l l o f w h i c h h a v e l a b o r a t o r y e v i d e n c e o f D I C . 1 5 3 S o m e d o g s w i t h a p p a r e n t l y j u s t c u t a n e o u s h e m a n g i o s a r c o m a s a l s o h a v e t h r o m b o c y t o p e n i a w i t h e v i d e n c e o f D I C , a s i t u a t i o n s i m i l a r i n m a n y r e s p e c t s t o h u m a n p a t i e n t s w i t h K a s s a b a c h - M e r r i t t s y n d r o m e ? ” C o n t r i b u t o r y f a c t o r s o t h e r t h a n D I C a r e n o t d e fi n e d , b u t m a y i n v o l v e s e q u e s t r a t i o n i n t h e v a s c u l a r n e o p l a s m s o r i n t e r a c t i o n s w i t h t h e p r o l i f e r a t i n g n e o p l a s t i c e n d o t h e l i a l c e l l s . D I C m a y a l s o b e a r e g u l a r c o n t r i b u t o r t o t h e t h r o m b o c y t o p e n i a o f c a n i n e s y s t e m i c m a s t o c y t o s i s . I n a s t u d y o f 1 6 a f f e c t e d d o g s , 3 o f 5 t e s t e d w e r e t h r o m b o c y t o p e n i c , a n d t h e t h r o m b o c y t o p e n i a w a s s o m e t i m e s s e v e r e a n d a s s o c i a t e d w i t h e r y t h r o c y t e f r a g m e n t a - t i o n a n d p r o l o n g e d P T , P T T , o r i n c r e a s e d F D P s ? 2 1 M a l i g n a n t h i s t i o c y t o s i s h a s b e e n a s s o c i a t e d w i t h t h r o m b o c y t o p e n i a o f u n p r o v e n p a t h o g e n e s i s ? ” p o s s i b l y r e l a t e d t o t h e p h a g o c y t i c a c t i v i t y o f t h e a t y p i c a l h i s t i o c y t e s . 1 0 1 C . D i a g n o s t i c C o n s i d e r a t i o n s f o r T h r o m b o c y t o p e n i a O n c e t h e p o t e n t i a l c a u s e s o f t h r o m b o c y t o p e n i a a r e k n o w n , d e t e r m i n i n g t h e o r i g i n o f t h r o m b o c y t o p e n i a i n a f f e c t e d d o g s b e g i n s w i t h a t h o r o u g h h i s t o r y . 1 . h i s t o r y A h i s t o r y s h o u l d i n c l u d e k n o w l e d g e o f d r u g e x p o s u r e , r e c e n t v a c c i n a t i o n s , r e c e n t t r i p s , r e c e n t c o n t a c t w i t h o t h e r d o g s , p r e v i o u s t r a n s f u s i o n s , a n d p r e v i o u s a n d c u r r e n t m e d i c a l c o n d i t i o n s . T h e a g e o f o n s e t o f t h e b l e e d i n g c o n d i t i o n i s i m p o r t a n t , a s i s t h e f r e q u e n c y , t y p e , a n d a n y a s s o c i a t i o n w i t h p h y s i c a l t r a u m a . O w n e r o b s e r v a t i o n s o f a n y b l e e d i n g i n c l u d i n g h e m a t u r i a , m e l e n a , e p i s t a x i s , o r p e t e c h i a e s h o u l d b e e l i c i t e d . P e t e c h i a e m a y b e m i s t a k e n f o r a " r a s h " a n d m a y d e v e l o p a f t e r s u c h m i n i m a l t r a u m a a s g r o o m i n g ? " 5 A h i s t o r y o f t i c k e x p o s u r e m a y s u g g e s t a n i n c r e a s e d l i k e l i h o o d o f a t i c k - b o r n e i n f e c t i o u s d i s e a s e s u c h a s R M S F , b a b e s i o s i s , o r e h r l i c h i o s i s . 2 . p h y s i c a l e x a m A s f o r a n y p a t i e n t , a t h o r o u g h p h y s i c a l e x a m i s m a n d a t o r y . P e t e c h i a e a n d e c c h y m o s e s a r e t h e h a l l m a r k o f t h r o m b o c y t o p e n i c h e m o r r h a g e , a n d t h e y m a y b e o b v i o u s o r s u b t l e . T h r o m b o c y t o p e n i a m a y a l s o b e m a n i f e s t e d b y e p i s t a x i s , m e l e n a , h e m o r r h a g i c d i a r r h e a , r e t i n a l h e m o r r h a g e , h e m a t u r i a , p r o l o n g e d e s t r a l b l e e d i n g , o r b l e e d i n g a f t e r w h e l p i n g , s u r g e r y , o r v e n i p u n c t u r e . T h e s e f o r m s o f h e m o r r h a g e s h o u l d b e c a r e f u l l y s o u g h t , i n c l u d i n g a n o p h t h a l m i c e x a m , a n d d i f f e r e n t i a t e d f r o m t h e h e m a t o m a s , h e m a r t h r o s e s , a n d b l e e d i n g i n t o o t h e r b o d y c a v i t i e s t y p i c a l o f c o a g u l a t i o n p r o t e i n d e f e c t s . 1 0 2 E p i s t a x i s , h e m a t u r i a , g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t b l e e d i n g , a n d r e p r o d u c t i v e t r a c t b l e e d i n g m a y o c c u r w i t h e i t h e r t y p e o f d i s o r d e r . A p h y s i c a l e x a m i n a t i o n s h o u l d s y s t e m a t i c a l l y a s s e s s a l l o r g a n s y s t e m s , b u t a t t e n t i o n t o t h e f o l l o w i n g m a y b e e s p e c i a l l y u s e f u l i n d e t e r m i n i n g t h e c a u s e o f k n o w n o r s u s p e c t e d t h r o m b o c y t 0 p e n i a : a t t i t u d e , c o n d i t i o n , f e v e r , p a l l o r , l y m p h a d e n o m e g a l y , s p l e n o m e g a l y , t e s t i c u l a r m a s s e s , o t h e r m a s s e s , j o i n t d i s e a s e , d e r r n a t o p a t h i e s , a n d t h e p r e s e n c e o f t i c k s . B e s i d e s b l e e d i n g a n d p e r h a p s l e t h a r g y a n d p a l l o r , d o g s w i t h p r i m a r y I M T m a y h a v e n o o t h e r a b n o r m a l p h y s i c a l fi n d i n g s . I n f e c t i o n s m a y b e s u g g e s t e d b y a d e p r e s s e d a t t i t u d e , f e v e r , l y m p h a d e n o m e g a l y , t i c k s , j o i n t d i s e a s e , o r p e r i p h e r a l c u t a n e o u s n e c r o s i s . N e o p l a s i a m a y b e s u g g e s t e d b y t h e p r e s e n c e o f l y m p h a d e n o m e g a l y , s p l e n o m e g a l y , o t h e r m a s s e s , o r c a c h e x i a . S y s t e m i c i m m u n e - m e d i a t e d d i s e a s e m a y b e s u g g e s t e d b y p o l y a r t h r i t i s o r c e r t a i n f o r m s o f d e r m a t i t i s . T h e p r e s e n c e o f s p l e n o m e g a l y s u g g e s t s t h a t t h r o m b o c y t o p e n i a i s a s e c o n d a r y p r o c e s s . ” T h e s e a n d o t h e r fi n d i n g s e a c h s h o u l d l e a d t o a n a p p r o p r i a t e d i a g n o s t i c p l a n . 3 . c o m p l e t e b l o o d c o u n t ( C B C ) A C B C i s t y p i c a l l y d o n e i n t h e p r o c e s s o f c o n fi r m i n g t h r o m b o c y t o p e n i a s u s p e c t e d f r o m c l i n i c a l l y d e t e c t e d m u c o s a l h e m o r r h a g e . U n s u s p e c t e d t h r o m b o c y t o p e n i a m a y b e d i s c o v e r e d w h e n 3 C B C i s d o n e f o r o t h e r r e a s o n s . F r e s h b l o o d s m e a r s s h o u l d b e e v a l u a t e d , e s p e c i a l l y i n t h e a b s e n c e o f c l i n i c a l h e m o r r h a g e , t o c o n fi r m a u t o m a t e d r e s u l t s a n d e x c l u d e t h e p o s s i b i l i t y o f p s e u d o t h r o m b o c y t o p e n i a . C a r e f u l v e n i p u n c t u r e w i l l h e l p t o p r e v e n t p l a t e l e t a c t i v a t i o n a n d a r t i f a c t u a l l y l o w p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s . 1 0 3 W h i l e m a n y r e l a t e d o r u n r e l a t e d a b n o r m a l i t i e s m a y b e p r e s e n t , t h e f o l l o w i n g fi n d i n g s a r e e s p e c i a l l y s i g n i fi c a n t i n e s t a b l i s h i n g t h e c a u s e o f t h r o m b o c y t o p e n i a : b i c y t o p e n i a , p a n c y t o p e n i a , l e u k e m i a , a n i n fl a m m a t o r y l e u k o g r a m , g r a n u l a r l y m p h o c y t o - s i s , i n t r a c e l l u l a r o r g a n i s m s s u c h a s f u n g i , e h r l i c h i a e , a n d o t h e r b a c t e r i a , d i s t e m p e r i n c l u s i o n s , e x t r a c e l l u l a r p a r a s i t e s s u c h a s t h e m i c r o fi l a r i a o f D i r o fi l a r i a i m m i t i s , a n d e r y t h r o c y t e f o r m s s u c h a s s p h e r o c y t e s , f r a g m e n t s , a n d d a c r y o c y t e s s u g g e s t i v e o f i m m u n e - m e d i a t e d h e m o l y t i c a n e m i a , D I C , a n d m y e l o fi b r o s i s , r e s p e c t i v e l y . I f t h r o m b o c y t o p e n i a d o e s n o t a c c o m p a n y h e m o r r h a g e t y p i c a l o f t h r o m b o c y t o p e n i a , t e s t i n g s h o u l d b e d i r e c t e d t o w a r d t h e a s s e s s m e n t o f p l a t e l e t f u n c t i o n a n d v a s c u l a r i n t e g r i t y . 4 . c h e m i s t r y p r o fi l e A r o u t i n e c h e m i s t r y p r o fi l e m a y p r o v i d e e v i d e n c e f o r u n d e r l y i n g c o n d i t i o n s i n c l u d i n g r e n a l d i s e a s e , h e p a t i c d i s e a s e , a n d p a n c r e a t i t i s . H y p e r g a m m a g l o b u l i n e m i a m a y b e s e e n w i t h s o m e l y m p h o p r o l i f e r a t i v e d i s o r d e r s a n d c h r o n i c i n f e c t i o n s . S e r u m p r o t e i n e l e c t r o p h o r e s i s c a n p r o v i d e m o r e s p e c i fi c i n f o r m a t i o n r e g a r d i n g p r o t e i n a b n o r m a l i t i e s , b u t i t i s i m p o r t a n t t o r e c o g n i z e t h a t m o n o c l o n a l g a m m o p a t h i e s m a y o c c u r w i t h i n f e c t i o u s c o n d i t i o n s s u c h a s c a n i n e m o n o c y t i c e h r l i c h i o s i s i n a d d i t i o n t o n e o p l a s t i c c o n d i t i o n s . H y p e r c a l c e m i a m a y i n d i c a t e t h e n e e d t o s e a r c h f o r o t h e r w i s e o c c u l t n e o p l a s i a s u c h a s l y m p h o m a . 5 . b o n e m a r r o w E x a m i n a t i o n o f b o n e m a r r o w a s p i r a t e s a n d c o r e b i o p s i e s c a n b e d i a g n o s t i c . C o r e b i o p s i e s a l l o w t h e b e s t a s s e s s m e n t o f m a r r o w c e l l u l a r i t y a n d m e g a k a r y o c y t e d e n s i t y , 1 0 4 w h i l e a s p i r a t e s a l l o w c a r e f u l e x a m i n a t i o n o f c y t o m o r p h o l o g y . N e c r o s i s i s b e s t a p p r e c i a t e d h i s t O p a t h o l o g i c a l l y . M a r r o w e v a l u a t i o n i s i n d i c a t e d w h e n m u l t i p l e c y t o p e n i a s a r e p r e s e n t o r w h e n t h e r e i s a s u s p i c i o n o f l e u k e m i a , m u l t i p l e m y e l o m a , o r s o m e o t h e r m y e l o p r o l i f e r a t i v e d i s o r d e r . O t h e r d i s o r d e r s a s s o c i a t e d w i t h p r o d u c t i o n f a i l u r e m a y a l s o b e i d e n t i fi e d , i n c l u d i n g m y e l o fi b r o s i s , m e t a s t a t i c c a n c e r , a n d g r a n u l o m a t o u s i n f e c t i o n s . I f h y p o p l a s i a o r a p l a s i a i s s u s p e c t e d , a c o r e b i o p s y s h o u l d a l w a y s b e c o l l e c t e d . M e g a k a r y o c y t e s s h o u l d b e e v a l u a t e d f o r n u m b e r a n d m o r p h o l o g y . T h e n u m b e r o f m e g a k a r y o c y t e s i n t h e b o n e m a r r o w h a s c o m m o n l y b e e n i n t e r p r e t e d a s a n a s s e s s m e n t o f t h r o m b o p o i e s i s , t h e p r e s e n c e o f m a n y m e g a k a r y o c y t e s s u g g e s t i n g t h a t t h r o m b o c y t o p e - n i a i s d u e t o d e c r e a s e d p l a t e l e t s u r v i v a l . H o w e v e r , t h e n u m b e r o f m e g a k a r y o c y t e s i s a b e t t e r i n d i c a t o r o f m e g a k a r y o c y t o p o i e s i s , a n d d e c r e a s e d t h r o m b o p o i e s i s m a y s t i l l b e p o s s i b l e w i t h a n a p p a r e n t a d e q u a t e n u m b e r o f m e g a k a r y o c y t e s . M e g a k a r y o c y t i c h y p o p l a s i a o r a p l a s i a s u g g e s t t h e r e m a y b e a r e l a t i v e l y d e l a y e d r e s p o n s e t o s u c c e s s f u l t h e r a p y . M e g a k a r y o c y t i c h y p e r p l a s i a w i t h i n c r e a s e d i m m a t u r e f o r m s a n d f e w m a t u r e c e l l s a c t i v e l y s h e d d i n g p l a t e l e t s s u g g e s t s r e s p o n s i v e m e g a k a r y o c y t o p o i e s i s , t h o u g h t h r o m b o p o i e s i s m a y b e i m p a i r e d . M o r p h o l o g i c c h a n g e s m a y b e i n d i c a t i v e o f c e l l d a m a g e a n d i m p a i r e d t h r o m b o p o i e s i s . M e g a k a r y o c y t i c h y p e r p l a s i a i n c l u d i n g m a n y m a t u r e c e l l s s u g g e s t s r e s p o n s i v e t h r o m b o p o i e s i s d u e t o p a t h o l o g i c a l l y d e c r e a s e d p l a t e l e t s u r v i v a l . T h r o m b o c y t o p e n i a s h o u l d n o t b e c o n s i d e r e d a c o n t r a i n d i c a t i o n f o r b o n e m a r r o w s a m p l i n g . “ 9 1 0 5 6 . c o a g u l a t i o n p r o fi l e C o a g u l a t i o n p r o fi l e s a r e v e r y i m p o r t a n t i n d e t e c t i n g c o n s u m p t i v e t h r o m b o - c y t o p e n i a s a s s o c i a t e d w i t h D I C . 1 5 7 S e v e r a l p e r m u t a t i o n s o f t h e p r o fi l e r e s u l t s , i n c l u d i n g s i g n i fi c a n t e l e v a t i o n s o f p r o t h r o m b i n t i m e s a n d / o r p a r t i a l t h r o m b o p l a s t i n t i m e s i n c o n j u n c t i o n w i t h d e c r e a s i n g p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s o r t h r o m b o c y t o p e n i a a n d d e c r e a s i n g fi b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n s o r h y p o fi b r i n o g e n e m i a , a r e i n d i c a t i o n s o f a n o n g o i n g c o n s u m p t i v e c o a g u l o p a t h y . M e a s u r e m e n t o f c i r c u l a t i n g c o n c e n t r a t i o n s o f a n t i t h r o m b i n I H , fi b r i n / fi b r i n o g e n d e g r a d a t i o n p r o d u c t s , p l a s m i n o g e n , a n d f a c t o r V c a n a l s o b e u s e f u l , a s c a n i n s p e c t i o n o f b l o o d fi h n s f o r e r y t h r o c y t e f r a g m e n t a t i o n . T h e a b s e n c e o f a b n o r m a l i t i e s o t h e r t h a n d e c r e a s e d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s s u g g e s t s t h e a b s e n c e o f s u c h c o n d i t i o n s . 7 . s u r v e y r a d i o g r a p h s S u r v e y r a d i o g r a p h s a n d u l t r a s o n o g r a p h y a c t a s e x t e n s i o n s o f t h e p h y s i c a l e x a m i n a t i o n . O c c u l t n e o p l a s i a m a y b e d e t e c t e d b y s u c h p r o c e d u r e s . 8 . b l o o d c u l t u r e s W h e n p h y s i c a l a n d l a b o r a t o r y fi n d i n g s a r e s u g g e s t i v e o f p o s s i b l e s e p t i c e m i a , b l o o d c u l t u r e s m a y b e u s e d i n a n a t t e m p t t o c o n fi r m t h e s u s p i c i o n . 9 . s e r o l o g y S e r o l o g y m a y b e u s e d t o d e t e c t e x p o s u r e t o o t h e r i n f e c t i o u s a g e n t s , m o s t n o t a b l y t h e r i c k e t t s i a l s . T h e i n d i r e c t fl u o r e s c e n t a n t i b o d y a s s a y i s s e n s i t i v e a n d s p e c i fi c f o r 1 0 6 E h r l i c h i a c a n i s . A p o s i t i v e t i t e r i s i n d i c a t i v e o f i n f e c t i o n s i n c e m o s t d o g s b e c o m e s e r o n e g a t i v e w i t h i n 6 - 9 m o n t h s a f t e r s u c c e s s f u l t h e r a p y ? “ T h e s e r o l o g i c d i a g n o s i s o f E h r l i c h i a p l a t y s i n f e c t i o n s i s b a s e d o n a s p e c i fi c i n d i r e c t i m m u n o fl u o r e s c e n c e a s s a y f o r E . p l a t y s a n t i b o d i e s i n s e r u m s a m p l e s . D i a g n o s i s o f R M S F r e q u i r e s d i r e c t i m m u n o fl u o - r e s c e n t t e s t i n g f o r R i c k e t t s i a r i c k e t t s i i a n t i g e n i n t i s s u e b i o p s y o r n e c r o p s y s p e c i m e n s , s e r o l o g i c t e s t i n g , o r r i c k e t t s i a l c u l t u r e . T h e i n d i r e c t fl u o r e s c e n t a n t i b o d y t e s t i s d i a g n o s t i c w h e n c o n v a l e s c e n t s a m p l e s h a v e a t l e a s t f o u r t i m e s t h e a n t i b o d y t i t e r s o f a c u t e s a m p l e s ? ” T h e d i a g n o s i s o f g r a n u l o c y t i c e h r l i c h i o s i s c u r r e n t l y r e q u i r e s t h e d e t e c t i o n o f m o r u l a e i n g r a n u l o c y t e s a n d s e r o p o s i t i v i t y t o t h e c r o s s - r e a c t i n g E . c a n i s ? “ I f o t h e r s e r o l o g y o r v i r o l o g y i s a p p r o p r i a t e , i t w i l l b e i n d i c a t e d b y o t h e r s p e c i fi c fi n d i n g s . 1 0 . i m m u n o l o g i c s c r e e n i n g t e s t s I f s y s t e m i c i m m u n e - m e d i a t e d d i s e a s e i s s u s p e c t e d , t e s t s f o r a n t i n u c l e a r a n t i b o d i e s , r h e u m a t o i d f a c t o r , L E c e l l s , a n d e r y t h r o c y t e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n m a y b e i n d i c a t e d . 1 1 . t e s t s f o r P A I g a n d P B I g L a s t l y , w h e r e a v a i l a b l e , a s s a y s c a n b e u s e d t o d e t e c t p l a t e l e t - a s s o c i a t e d o r s p e c i fi c m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n s . R o u t i n e a s s a y s d o n o t d e t e c t a n t i p l a t e l e t a n t i b o d y ; r a t h e r , t h e y d e t e c t a n y i m m u n o g l o b u l i n t h a t i s a s s o c i a t e d w i t h a p a t i e n t ’ s p l a t e l e t s o r t h a t i s i n t h e s e r u m / p l a s m a o f a p a t i e n t a n d w i l l a s s o c i a t e w i t h n o r m a l t e s t p l a t e l e t s . A p o s i t i v e r e s u l t i s n o t i n a n d o f i t s e l f d i a g n o s t i c o f a n a u t o i m m u n e I g G t r i m e r s , a n d l a r g e r a g g r e g a t e s o f I g G . 4 2 6 1 0 7 c o n d i t i o n , b e c a u s e t h e a s s a y s g e n e r a l l y d o n o t d e t e r m i n e t h e o r i e n t a t i o n o r s p e c i fi c i t y o f t h e d e t e c t e d i m m u n o g l o b u l i n . I m m u n o g l o b u l i n s m a y b e a s s o c i a t e d w i t h t h e p l a t e l e t s u r f a c e i n s e v e r a l d i f f e r e n t w a y s . F a b - m e d i a t e d b i n d i n g r e f e r s t o t h e s p e c i fi c b i n d i n g o f a n a n t i b o d y b y i t s a n t i g e n - r e c o g n i z i n g e n d t o i t s r e a c t i v e e p i t o p e . T h i s o c c u r s i n t h e c a s e o f p l a t e l e t r e a c t i v e a u t o a n t i b o d i e s a n d a l l o a n t i b o d i e s . S o m e o f t h e d r u g - i n d u c e d a n t i b o d i e s , s u c h a s t h o s e i n d u c e d b y q u i n i n e a n d q u i n i d i n e , h a v e a l s o b e e n s h o w n t o b i n d s p e c i fi c a l l y b y t h e i r F a b e n d s t o s p e c i fi c p l a t e l e t e p i t o p e s ? ” " ’ 2 5 F a b - m e d i a t e d b i n d i n g c a n a l s o o c c u r t o a n a n t i g e n i c d e t e r m i n a n t a d s o r b e d o n t o t h e p l a t e l e t s u r f a c e , a s h a s b e e n s h o w n t o o c c u r i n h u m a n m a l a r i a l i n f e c t i o n s ? ” S u c h a n t i b o d i e s a r e P A I g s b u t n o t a n t i p l a t e l e t a n t i b o d i e s . T h e f r e q u e n c y w i t h w h i c h t h e s e P A l g s a r e p r e s e n t i n i n f e c t i o u s a n d n o n i n f e c t i o u s d i s e a s e s i s u n k n o w n . I n e a c h c a s e , t h e F c e n d s o f t h e i m m u n o g l o b u l i n s a r e d i r e c t e d m o r e o r l e s s o u t w a r d s u c h t h a t t h e y a r e a v a i l a b l e t o F c r e c e p t o r s o n p h a g o c y t i c c e l l s . I n t h i s w a y , F a b - m e d i a t e d b i n d i n g m a y r e s u l t i n F c - m e d i a t e d p h a g o c y t o s i s . T h e s u r f a c e o f h u m a n p l a t e l e t s h a v e F c r e c e p t o r s f o r I g G ? ” F c r e c e p t o r s o c c u r a s o n e o f s e v e r a l d i f f e r e n t p h e n o t y p e s , “ ” “ ’ 2 9 e a c h o f w h i c h c a n b i n d t h e F e e n d o f I g G m o l e c u l e s . T h e b i n d i n g s p e c i fi c i t y f o r d i f f e r e n t I g G s u b t y p e s v a r i e s w i t h t h e p h e n o t y p e , b u t e a c h p l a t e l e t h a s a b o u t 1 , 0 0 0 t o 2 , 0 0 0 F c y R I I ? ” 4 3 1 T h i s n u m b e r s t a y s r e l a t i v e l y s t a b l e i n h e a l t h , b u t m a y i n c r e a s e w i t h d i s e a s e o r p l a t e l e t a c t i v a t i o n . " ” ' 5 ” I m m u n o - g l o b u l i n s c a n b i n d t o t h e F c y R H b y t h e i r P C p o r t i o n s , t h u s b e c o m i n g P A I g . T h i s i m m u n o l o g i c a l l y n o n s p e c i fi c b i n d i n g c a n o c c u r w i t h i m m u n e c o m p l e x e s , I g G d i m e r s , 1 0 8 T h e b e s t d e s c r i b e d F c — m e d i a t e d b i n d i n g o f i m m u n o g l o b u l i n s t o p l a t e l e t F c y R H o c c u r s i n i m m u n o l o g i c h e p a r i n - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a . I n t h i s d r u g - i n d u c e d d i s o r d e r , a n t i b o d i e s b i n d t o p l a t e l e t f a c t o r 4 a n d h e p a r i n t o f o r m c o m p l e x e s w h i c h b i n d t o p l a t e l e t F c y R H b y t h e F e e n d s o f t h e i m m u n o g l o b u l i n m o l e c u l e s ? ” T h e F e e n d s o f o t h e r I g G m o l e c u l e s b o u n d t o t h e c o m p l e x a r e p r e s u m a b l y e x p o s e d s u c h t h a t t h e F c r e c e p t o r s o f p h a g o c y t i c c e l l s c a n m e d i a t e p l a t e l e t d e s t r u c t i o n . M o r e o v e r , i n t r a p l a t e l e t a n d i n t e r p l a t e l e t b r i d g i n g b y t h e s e c o m p l e x e s c a n c a u s e p l a t e l e t a c t i v a t i o n w h i c h c a n p r e s u m a b l y c o n t r i b u t e t o i n c r e a s e d p l a t e l e t c o n s u m p t i o n a n d t h r o m b o c y t O p e n i a ‘ “ S i m i l a r l y , t h e F c - m e d i a t e d b i n d i n g o f a g g r e g a t e d I g G t o p l a t e l e t s i n v i t r o c a u s e s p l a t e l e t a g g r e g a t i o n ? ” D a t a s u g g e s t t h a t c i r c u l a t i n g i m m u n e c o m p l e x e s ( C I C s ) c a n a c c e l e r a t e p l a t e l e t d e s t r u c t i o n , p e r h a p s b y a n F c - m e d i a t e d m e c h a n i s m . C o n c e n t r a t i o n s o f C I C i n h u m a n l e u k e m i a p a t i e n t s h a v e b e e n s h o w n t o c o r r e l a t e d i r e c t l y w i t h t h e r e m o v a l r a t e o f t r a n s f u s e d p l a t e l e t s a n d i n d i r e c t l y w i t h t h e i n c r e m e n t i n p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n a f t e r t r a n s f u s i o n ? ” " ’ 3 6 P l a t e l e t t r a n s f u s i o n s d e c r e a s e d t h e c o n c e n t r a t i o n s o f C I C ( R a j i c e l l ) ? ” T h i s i s i n d i r e c t e v i d e n c e t o s u g g e s t t h a t i m m u n e c o m p l e x e s m a y b i n d t o p l a t e l e t s , p e r h a p s b y c o m p l e m e n t o r F c r e c e p t o r s , a n d a c c e l e r a t e t h e i r c l e a r a n c e . T h e s i g n i fi c a n c e o f t h e s e fi n d i n g s f o r d o g s r e m a i n s t o b e s h o w n . I t i s a l s o n o t y e t c l e a r t o w h a t e x t e n t s u c h i m m u n o g l o b u l i n s m a y b e d e t e c t e d b y a s s a y s f o r P A I g . C a n i n e p l a t e l e t s h a v e n o t b e e n a s s e s s e d f o r t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f F c r e c e p t o r s f o r I g G ? 1 T h e r e f o r e , i t i s n o t k n o w n i f F c - m e d i a t e d b i n d i n g o f a n t i b o d i e s a n d i m m u n e c o m p l e x e s c a n o c c u r a n d c a u s e t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s . I t i s k n o w n , h o w e v e r , t h a t n o t a l l s p e c i e s h a v e p l a t e l e t F c ' y r e c e p t o r s . T h e r a b b i t , f o r i n s t a n c e , d o e s n o t . ” 7 U n l e s s i m m u n e c o m p l e x e s c a n b i n d t o t h e p l a t e l e t o t h e r t h a n b y F c r e c e p t o r s , 3 1 0 9 l a c k o f F c r e c e p t o r s w o u l d i m p l y t h a t t h r o m b o c y t o p e n i a s h o u l d n o t o c c u r i n d o g s d u e t o c i r c u l a t i n g i m m u n e c o m p l e x e s f r o m n e 0 p l a s i a , i n f e c t i o u s d i s e a s e s , d r u g s s u c h a s h e p a r i n , s y s t e m i c a u t o i m m u n e d i s e a s e s , o r f r o m t h e f o r m a t i o n o f a n t i g e n - a n t i b o d y c o m p l e x e s a f t e r v a c c i n a t i o n s . S i m i l a r l y , a g g r e g a t e d I g G w o u l d n o t b e e x p e c t e d t o a g g r e g a t e c a n i n e p l a t e l e t s i n v i t r o . I t i s p o s s i b l e , h o w e v e r , t h a t i m m u n e c o m p l e x e s c a n b i n d t o a n d a c t i v a t e c a n i n e p l a t e l e t s o t h e r t h a n b y F c r e c e p t o r s . S p e c i fi c a l l y , t h e y m a y b i n d v i a a c o m p l e m e n t p r o t e i n b r i d g e i n a m a n n e r k n o w n a s i m m u n e a d h e r e n c e . " ” ~ ‘ ” S e v e r a l r e c e p t o r s f o r c o m p l e m e n t p r o t e i n s h a v e b e e n i d e n t i fi e d o n h u m a n p l a t e l e t s , b u t t h e i r s i g n i fi c a n c e i s n o t f u l l y a p p r e c i a t e d . ” N o n - p r i m a t e m a m m a l s h a v e b e e n c o n s i d e r e d t o h a v e p l a t e l e t s c a p a b l e o f i m m u n e a d h e r e n c e ? ” “ “ " ” b u t r e l a t i v e l y l i t t l e i s k n o w n a b o u t t h e i m m u n e a d h e r e n c e p o t e n t i a l o f c a n i n e p l a t e l e t s . C o m p l e m e n t r e c e p t o r s h a v e n o t b e e n s p e c i fi c a l l y i d e n t i fi e d o n c a n i n e p l a t e l e t s . T h e l a s t w a y t h a t i m m u n o g l o b u l i n s c a n b e a s s o c i a t e d w i t h t h e p l a t e l e t s u r f a c e fi t s n e i t h e r o f t h e a b o v e c a t e g o r i e s . A g g r e g a t e s o f I g G h a v e b e e n s h o w n t o b i n d t o p l a t e l e t G P H b / H l a i n a n o n F a b a n d a n o n F c - m e d i a t e d m a n n e r , t h e n a t u r e o f w h i c h w a s n o t d e t e r m i n e d ? “ I t i s p o s s i b l e t h a t s o m e i m m u n o g l o b u l i n s c o n t a i n t h e R G D s e q u e n c e t h a t a l l o w s t h e m t o b i n d t o t h i s i n t e g r i n ? ” F u r t h e r s t u d i e s a r e n e c e s s a r y b e f o r e t h e i m p o r t a n c e a n d f r e q u e n c y o f s u c h b i n d i n g a r e d e t e r m i n e d . W h e t h e r o r n o t o t h e r i m m u n o l o g i c a l l y n o n s p e c i fi c m e c h a n i s m s o f b i n d i n g e x i s t a l s o r e m a i n s t o b e s e e n . T h e p r e s e n c e o f P A I g , w h a t e v e r i t s o r i e n t a t i o n , i s e v i d e n c e t h a t t h e r e i s a n i m m u n e c o m p o n e n t t o t h e t h r o m b o c y t o p e n i a , a n d i n t h e a b s e n c e o f o t h e r d e t e c t a b l e a b n o r m a l i t i e s r e q u i r i n g t h e r a p y , p o s i t i v e r e s u l t s c a n s u p p o r t a c l i n i c i a n ’ s d e c i s i o n t o 1 1 0 i n s t i t u t e i m m u n o s u p p r e s s i v e t h e r a p y . E v e n a f t e r t h r e e d e c a d e s o f a s s a y d e v e l O p m e n t i n h u m a n m e d i c i n e , t h e d i a g n o s i s o f p r i m a r y I M T i s p r i m a r i l y o n e o f e x c l u s i o n . A s s a y r e s u l t s m a y s u p p o r t c l i n i c a l s u s p i c i o n s , b u t d i a g n o s t i c a n d t h e r a p e u t i c p l a n s m a y b e a f f e c t e d l i t t l e b y t h e r e s u l t s ? ” A s s a y s a r e v e r y i m p o r t a n t , h o w e v e r , i n d i a g n o s i n g d r u g - i n d u c e d I M T , p o s t t r a n s f u s i o n p u r p u r a , n e o n a t a l a l l o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a , a n d r e f r a c t o r i n e s s t o p l a t e l e t t r a n s f u s i o n s i n w h i c h c a s e p o t e n t i a l d o n o r s c a n a l s o b e s c r e e n e d f o r p l a t e l e t c o m p a t i b i l i t y ? “ T h e y a r e a l s o a n i m p o r t a n t r e s e a r c h t o o l t o b e t t e r u n d e r s t a n d t h e c o n t r i b u t i o n s o f i m m u n e - m e d i a t e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n t o t h r o m b o c y t o p e n i c p a t i e n t s . I H . D e t e c t i o n a n d S i g n i fi c a n c e o f P A I g a n d P B I g A . S i g n i fi c a n c e o f P A I g T h e s t u d i e s H a r r i n g t o n r e p o r t e d i n 1 9 5 1 e s t a b l i s h e d t h a t t h e p l a s m a o r w h o l e b l o o d o f s o m e h u m a n p a t i e n t s w i t h i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i a c o u l d i n d u c e a c u t e t h r o m b o c y t o p e n i a , s o m e t i m e s a c c o m p a n i e d b y p u r p u r a , w h e n i n f u s e d i n t o n o r m a l r e c i p i e n t s o r p a t i e n t s w i t h i n o p e r a b l e c a n c e r ? “ 6 C o n t r o l i n f u s i o n s d i d n o t i n d u c e t h r o m b o c y t o p e n i a . T h e t h r o m b o c y t o p e n i c f a c t o r w a s f o u n d i n t h e g l o b u l i n f r a c t i o n o f t h e o n e p l a s m a s a m p l e f r a c t i o n a t e d . S h u l r n a n “ 7 l a t e r r e p e a t e d t h e s e s t u d i e s a n d a l s o i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a b y i n f u s i n g a c u t e p l a s m a f r o m a n a f f e c t e d p a t i e n t i n t o t h e s a m e p a t i e n t i n r e m i s s i o n , t h u s d e m o n s t r a t i n g a u t o r e a c t i v i t y . M o r e o v e r , h e s h o w e d t h a t t h e t h r o m b o c y t o p e n i c p l a s m a a c t i v i t y r e s i d e d i n 7 S i m m u n o g l o b u l i n f r a c t i o n s , i t a f f e c t e d a u t o l o g o u s a n d h o m o l o g o u s p l a t e l e t s , i t h a d a t l e a s t s o m e s p e c i e s s p e c i fi c i t y , a n d i t p r o d u c e d e f f e c t s i n v i v o t h a t w e r e s i m i l a r t o t h o s e p r o d u c e d b y k n o w n a n t i p l a t e l e t 1 1 1 a n t i b o d i e s ? 4 7 T h e s e fi n d i n g s s t r o n g l y i n c r i m i n a t e d i m m u n o g l o b u l i n a s h a v i n g a k e y r o l e i n t h e p a t h o g e n e s i s o f h u m a n i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t 0 p e n i a . W h i l e i t w a s n o t k n o w n i f t h e a n t i b o d y w a s d i r e c t e d t o w a r d a u t o l o g o u s p l a t e l e t a n t i g e n s , a n t i g e n s a d s o r b e d o n t o p l a t e l e t s , o r a n t i b o d y c o m p l e x e d w i t h a n t i g e n t h a t b e c a m e n o n s p e c i fi c a l l y a d s o r b e d t o p l a t e l e t s , t h e s e a r c h f o r w a y s t o d e t e c t P A I g a n d P B I g b e g a n . S i n c e t h e n , e v i d e n c e h a s m o u n t e d t o i n d i c a t e t h a t I M T u s u a l l y r e s u l t s f r o m t h e u n e x p l a i n e d p r o d u c t i o n o f p l a t e l e t - r e a c t i v e a u t o a n t i b o d i e s t h a t m e d i a t e p l a t e l e t d e s t r u c t i o n b y t h e m o n o n u c l e a r p h a g o c y t e s y s t e m ( M P 8 ) . S i m i l a r t o t h e p l a s m a t r a n s f u s i o n e x p e r i m e n t s o f H a r r i n g t o n 4 4 6 a n d S h u l m a n 4 4 7 a r e t h e n a t u r a l t r a n s f e r s t u d i e s o f M o t h e r N a t u r e i n w h i c h f e t u s e s o f m o t h e r s w i t h t h r o m b o c y t o p e n i a a n d i n c r e a s e d P A I g G a l s o d e v e l o p t h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h i n c r e a s e d P A I g G ? “ ’ “ 8 T h i s i s c o n s i s t e n t w i t h p l a c e n t a l t r a n s f e r o f t h e p a t h o g e n i c i m m u n o g l o b u l i n s . A c c i d e n t a l t r a n s f e r e x p e r i m e n t s h a v e a l s o b e e n i n s t r u c t i v e . A l i v e r t r a n s p l a n t a t i o n r e c i p i e n t d e v e l o p e d t h r o m b o c y t o p e n i a a n d e l e v a t e d P A I g a f t e r r e c e i v i n g t h e l i v e r o f a d o n o r w i t h t h r o m b o c y t o p e n i a a n d e l e v a t e d P A I g . T h i s i s f u r t h e r s u p p o r t o f a t r a n s m i t t a b l e , i m m u n e - m e d i a t e d p a t h o g e n e s i s . 4 4 9 A n o t h e r p a t i e n t d e v e l o p e d t h r o m b o c y t o - p e n i a a s s o c i a t e d w i t h e l e v a t e d P A I g M a f t e r a n a l l o g e n e i c b o n e m a r r o w g r a f t f r o m a d o n o r w h o w a s l a t e r s h o w n t o h a v e e l e v a t e d P A I g M w i t h t h e s a m e s p e c t r u m o f r e a c t i v i t y ? ” ” ‘ T h e fi n d i n g s s u g g e s t t h a t a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a c a n b e t r a n s f e r r e d b y c e l l s c a p a b l e o f p r o l i f e r a t i n g i n a b o n e m a r r o w g r a f t . T h e r e i s o t h e r e v i d e n c e l i n k i n g P A I g t o c e l l s o f t h e i m m u n e s y s t e m . N o r m a l h u m a n l y m p h o c y t e s h a v e t h e c a p a c i t y t o p r o d u c e a n t i b o d i e s r e a c t i v e w i t h n o r m a l p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n s , D N A , a n d p h o s p h o l i p i d s , ‘ ” ° 4 ” b u t t h e s t i m u l u s f o r t h e i r p r o d u c t i o n o r 1 1 2 o v e r p r o d u c t i o n i s n o t k n o w n . A s c o m p a r e d t o T - h e l p e r l y m p h o c y t e s f r o m h e a l t h y p e o p l e , t h o s e o f p a t i e n t s w i t h p r i m a r y I M T p r o l i f e r a t e m o r e a n d s e c r e t e s i g n i fi c a n t l y m o r e I L - 2 w h e n s t i m u l a t e d b y n o r m a l p l a t e l e t s ? “ T h i s m a y b e e v i d e n c e o f a n i r n m u n o r e g u l a t o r y a b n o r m a l i t y t h a t e n h a n c e s a u t o a n t i b o d y p r o d u c t i o n . C o m p a r e d t o c o n t r o l s , a n i n c r e a s e d p e r c e n t a g e o f B l y m p h o c y t e s e x p r e s s i n g t h e p a n - T c e l l m a r k e r C D 5 h a s b e e n f o u n d i n t h e b l o o d a n d s p l e e n s o f p a t i e n t s w i t h d i a g n o s e s o f I M T . ” 5 T h e s e c e l l s w e r e c a p a b l e o f p r o d u c i n g p l a t e l e t - r e a c t i v e a n t i b o d i e s i n v i t r o , s u g g e s t i n g t h a t t h e y h a d a n i n v i v o r o l e i n t h e p a t h o g e n e s i s o f I M T . I n o t h e r s t u d i e s , m o n o c y t e s a n d l y m p h o c y t e s i s o l a t e d f r o m p a t i e n t s w i t h d i a g n o s e s o f I M T a d h e r e d m u c h m o r e t o G P I I b / I H a t h a n d i d c e l l s f r o m c o n t r o l s ? 5 6 T h e a d h e r e n c e t o G P I I b / I H a w a s s h o w n t o b e F ( a b ’ ) 2 - m e d i a t e d , a n d t h e a n t i b o d i e s w e r e fi x e d t o t h e m o n o n u c l e a r c e l l s i n a n F c - d e p e n d e n t m a n n e r . T h e s e fi n d i n g s s u p p o r t t h e c o n c e p t t h a t a n t i b o d y - a r m e d l e u k o c y t e s p a r t i c i p a t e i n t h e p a t h o g e n e s i s o f I M T . W h i l e s o m e P B I g S f r o m p e o p l e w i t h d i a g n o s e s o f I M T h a v e b e e n s h o w n t o b i n d s p e c i fi c a l l y b y t h e i r F a b p o r t i o n s t o p l a t e l e t s a n d i s o l a t e d p l a t e l e t m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s , m o r e s t u d i e s a r e n e e d e d t o d o c u m e n t t h e p r e s u m p t i o n t h a t t h i s i s i n d e e d t h e r u l e ? “ C l i n i c a l s t u d i e s h a v e p r o v i d e d f u r t h e r e v i d e n c e t h a t P A I g i s p a t h o g e n i c a n d r e l a t e d t o a c t i v e d i s e a s e i n h u m a n I M T p a t i e n t s . W h e n P A I g w a s a s s e s s e d i n p a t i e n t s w i t h a c t i v e d i s e a s e a n d i n n o n t r e a t e d p a t i e n t s i n r e m i s s i o n , 3 9 / 5 3 ( 7 4 % ) p a t i e n t s w i t h a c t i v e d i s e a s e h a d d i r e c t l y d e t e c t a b l e P A I g , w h i l e o n l y 2 / 2 6 ( 8 % ) i n r e m i s s i o n d i d . 2 9 7 F u r t h e r m o r e , o f 8 p a t i e n t s w i t h a c t i v e d i s e a s e w h o s e p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s r e s p o n d e d t o p r e d n i s o n e t h e r a p y , P A I g d e c r e a s e d s i g n i fi c a n t l y i n 2 a n d b e c a m e u n d e t e c t a b l e i n 6 . W h e n 2 o f t h e r e s p o n d i n g p a t i e n t s r e l a p s e d , P A I g r e a p p e a r e d . D e t e c t a b l e P A I g 1 1 3 r e m a i n e d u n c h a n g e d , h o w e v e r , i n 4 p a t i e n t s w h o s e p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s d i d n o t r e s p o n d t o p r e d n i s o n e . W h i l e t h e s e d a t a s u g g e s t a c a u s a t i v e r o l e f o r P A I g i n t h e d e v e l o p m e n t o f t h r o m b o c y t o p e n i a , t h e y d o n o t p r o v e i t . P A I g c o u l d s i m p l y b e a s e c o n d a r y r e fl e c t i o n o f t h r o m b o c y t o p e n i a , r i s i n g a s p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s f a l l a n d f a l l i n g a s p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s r i s e . H o w e v e r , t h e c o m p o s i t e fi n d i n g s d o n o t s u p p o r t t h i s h y p o t h e s i s . T o i n v e s t i g a t e i f i n c r e a s e d P A I g G c o u l d b e t h e r e s u l t o f t h r o m b o c y t o p e n i a , r a t h e r t h a n i t s c a u s e , s u r f a c e P A I g G w a s m e a s u r e d o n w a s h e d p l a t e l e t s f r o m r a b b i t s m a d e m o d e r a t e l y t h r o m b o c y t o p e n i c i n t h r e e w a y s : 1 ) I M T w a s i n d u c e d b y t h e i n j e c t i o n o f g u i n e a p i g a n t i - [ r a b b i t p l a t e l e t ] s e r u m ; 2 ) n o n i m m u n e n o n r e g e n e r a t i v e t h r o m b o c y t o p e n i a w a s i n d u c e d b y i r r a d i a t i o n ; a n d 3 ) n o n i m m u n e c o n s u m p t i v e t h r o m b o c y t o p e n i a w a s i n d u c e d b y i n j e c t i o n o f A D P ? 5 7 P A I g G w a s i n c r e a s e d a b o v e c o n t r o l s i n a l l o f t h e r a b b i t s w i t h I M T b u t i n n o n e o f t h e r a b b i t s w i t h n o n i m m u n e c o n s u m p t i v e o r n o n r e g e n e r a t i v e t h r o m b o c y t o p e n i a . T h i s e v i d e n c e s u g g e s t s t h a t P A I g G d o e s n o t i n c r e a s e j u s t a s a r e s u l t o f t h r o m b o c y t o p e n i a . R a t h e r , i t s p r e s e n c e i s e v i d e n c e o f a n i m m u n e - m e d i a t e d p r o c e s s . U n f o r t u n a t e l y , t h i s s t u d y d i d n o t e x c l u d e t h e p o s s i b i l i t y t h a t e l e v a t i o n s i n P A I g G c o u l d o c c u r i n r e s p o n s e t o m o r e m a r k e d t h r o m b o c y t o p e n i a s o f n o n i m m u n e p a t h o g e n e s i s . T h e d e t e c t i o n o f p l a t e l e t - r e a c t i v e i m m u n o g l o b u l i n s i n t h e p l a s m a o r s e r u m o f a p p a r e n t l y n o r m a l p e o p l e h a s a l s o b r o u g h t d o u b t t o t h e s i g n i fi c a n c e o f P B I g s ? ” P l a t e l e t s u r v i v a l s t u d i e s d o n e i n s o m e p a t i e n t s w i t h e l e v a t e d P A I g h a v e b e e n n o r m a l ? ” i n d i c a t i n g t h a t t h e e l e v a t e d P A I g w a s n o t a s s o c i a t e d w i t h a n i n c r e a s e d r a t e o f d e s t r u c t i o n a n d s u g g e s t i n g t h a t P A I g m a y n o t b e o f p a t h o g e n i c s i g n i fi c a n c e . H o w e v e r , e l e v a t e d P A I g w i l l l e a d t o d e c r e a s e d p l a t e l e t s u r v i v a l o n l y i f t h e M P 8 i s f u n c t i o n i n g a d e q u a t e l y a n d 1 1 4 r e m o v i n g t h e a n t i b o d y - c o a t e d p l a t e l e t s . K e l t o n 4 5 8 s h o w e d t h a t 5 p a t i e n t s w i t h e l e v a t e d P A I g b u t n o r m a l o r n e a r - n o r m a l p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s h a d n o r m a l p l a t e l e t s u r v i v a l s b u t i m p a i r e d M P S a c t i v i t y a s a s s e s s e d b y m e a s u r i n g t h e c l e a r a n c e o f a u t o l o g o u s c h r o m i u m — l a b e l e d e r y t h r o c y t e s s e n s i t i z e d w i t h a l l o a n t i b o d y . I n c o n t r a s t , t h r o m b o c y t o p e n i c p a t i e n t s w i t h e l e v a t e d P A I g h a d n o r m a l M P S a c t i v i t y a n d s h o r t e n e d p l a t e l e t s u r v i v a l s . T h e s e s t u d i e s i n d i c a t e t h a t e l e v a t e d P A I g i n a n o n t h r o m b o c y t o p e n i c p a t i e n t S h o u l d n o t b e c o n s i d e r e d a n o n s p e c i fi c fi n d i n g ; t h r o m b o c y t o p e n i a m a y b e p r e v e n t e d b y l o w M P S a c t i v i t y o r c o m p e n s a t e d p l a t e l e t p r o d u c t i o n . T h e i m p o r t a n c e o f t h e M P S w a s a l s o s u g g e s t e d b y s t u d i e s t h a t s h o w e d t h e h i g h e s t M - C S F c o n c e n t r a t i o n s i n p a t i e n t s w i t h s e v e r e a n d s t e r o i d - r e f r a c t o r y I M T ? ” M - C S F p r o m o t e s p r o l i f e r a t i o n , d i f f e r e n t i a t i o n , a n d m a t u r a t i o n o f m o n o c y t e s , a s w e l l a s e n h a n c e s a n t i b o d y — d e p e n d e n t c e l l u l a r c y t o t o x i c i t y a n d t h e e x p r e s s i o n o f l o w a f fi n i t y I g G r e c e p t o r s . H i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f M - C S F m a y l e a d t o e n h a n c e d m a c r o p h a g e a c t i v i t y a n d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n a n d b e c a u s a l l y r e l a t e d t o t h e p o o r r e s p o n s e t o t r e a t m e n t o f I M T p a t i e n t s w i t h h i g h M - C S F c o n c e n t r a t i o n s . I n v i t r o s t u d i e s w i t h h u m a n " 6 0 a n d c a n i n e p l a t e l e t s h a v e a l s o s u g g e s t e d a r o l e f o r n e u t r o p h i l s i n t h e r e m o v a l o f a n t i b o d y — c o a t e d p l a t e l e t s f r o m c i r c u l a t i o n ? " 1 C a n i n e p l a t e l e t s u n d e r g o p h a g o c y t o s i s b y a u t o l o g o u s n e u t r o p h i l s w h e n c o - i n c u b a t e d i n v i t r o w i t h r a b b i t a n t i - [ c a n i n e p l a t e l e t ] s e r u m , a n d t h e p h a g o c y t i c a c t i v i t y i s d e t e c t a b l e b y e l e c t r o n m i c r o s c o p y o r b y m e a s u r i n g n e u t r o p h i l r e d u c t i o n o f n i t r o b l u e t e t r a z o l i u m ( N B T ) . S e r a f r o m d o g s w i t h s u s p e c t e d I M T a n d p o s i t i v e P F 3 a s s a y r e s u l t s a l s o s u p p o r t e d i n c r e a s e d N B T r e d u c t i o n , w h i l e n o r m a l s e r a a n d s e r a f r o m P F 3 n e g a t i v e d o g s s u s p e c t e d o f h a v i n g 1 1 5 I M T d i d n o t . T h e i n v i v o s i g n i fi c a n c e o f t h e s e fi n d i n g s w i t h r e s p e c t t o I M T r e m a i n s t o b e d e t e r m i n e d . ' I n s u m m a r y , t h e b u l k o f t h e e v i d e n c e s u g g e s t s t h a t P A I g d o e s m e d i a t e p l a t e l e t d e s t r u c t i o n i n I M T . R e l i a b l e m e a s u r e m e n t o f P A I g s h o u l d t h e r e f o r e b e o f d i a g n o s t i c s i g n i fi c a n c e . H o w e v e r , i n c r e a s e d P A I g m a y n o t c a u s e t h r o m b o c y t o p e n i a i f d e s t r u c t i v e m e c h a n i s m s a r e i m p a i r e d , b e c a u s e t h e n e t c i r c u l a t i n g p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n d e p e n d s o n t h e b a l a n c e b e t w e e n p l a t e l e t p r o d u c t i o n a n d p l a t e l e t r e m o v a l . A l l f a c t o r s i n t h i s e q u a t i o n m u s t b e c o n s i d e r e d t o u n d e r s t a n d t h e p a t h o g e n e s i s o f I M T a n d i t s r e s p o n s e t o t h e r a p y . I t i s a l s o p o s s i b l e t h a t t h e c e l l u l a r a r m o f t h e i m m u n e s y s t e m c a n p l a y a v a r i a b l e b u t i m p o r t a n t r o l e i n I M T ? ” " “ c o n c e i v a b l y b e i n g s o l e l y r e s p o n s i b l e f o r m e d i a t i n g s o m e i m m u n o l o g i c a l t h r o m b o c y t o p e n i a s . I n s u c h c a s e s , P A I g w o u l d n o t b e e l e v a t e d . B . A s s a y s f o r H u m a n P A I g a n d P B I g 1 . t y p e s T h e r e a r e t w o g e n e r a l c l a s s e s o f a s s a y s f o r i n v e s t i g a t i n g a n t i b o d y - m e d i a t e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n : 1 ) d i r e c t a s s a y s w h i c h a t t e m p t t o d e t e c t p a t i e n t i m m u n o g l o b u l i n a l r e a d y b o u n d t o p a t i e n t p l a t e l e t s ( P A I g ) , a n d 2 ) i n d i r e c t a s s a y s w h i c h a s s e s s p a t i e n t s e r u m o r p l a s m a f o r e v i d e n c e o f P B I g , t h e a s s u m p t i o n b e i n g t h a t i f p o s i t i v e , t h e p a t i e n t ’ s o w n p l a t e l e t s w e r e p r e s u m a b l y a f f e c t e d i n v i v o . N u m e r o u s a s s a y s h a v e b e e n d e v e l o p e d o v e r t h e l a s t t h r e e d e c a d e s ? “ ’ " ’ ” a n d t h e y h a v e g e n e r a l l y i m p r o v e d w i t h a d v a n c e s i n k n o w l e d g e a n d t e c h n o l o g y . H o w e v e r , e v e n w i t h t o d a y ’ s m o s t w i d e s p r e a d a s s a y s , t h e i n t e r p r e t a t i o n o f r e s u l t s c a n b e p r o b l e m a t i c . 1 1 6 T h e e a r l y a s s a y s w e r e i n d i r e c t f u n c t i o n a l a s s a y s . T e s t a n d c o n t r o l p l a s m a , s e r a , o r v a r i o u s l y p u r i fi e d i m m u n o g l o b u l i n f r a c t i o n s w e r e t e s t e d f o r t h e i r c a p a c i t i e s t o e l i c i t a c t i v a t i o n o f n o r m a l p l a t e l e t s ? ” A c t i v a t i o n w a s a s s e s s e d b y p l a t e l e t a g g r e g o m e t r y , d e t e c t i o n o f r e l e a s e d p l a t e l e t p r o d u c t s s u c h a s s e r o t o n i n , A T P , a n d ” c h r o m i u m , o r b y a s h o r t e n i n g o f t h e c o a g u l a t i o n t i m e i n t h e P F 3 a s s a y . T h e s e f u n c t i o n a l a s s a y s w e r e i n s e n s i t i v e a n d n o n s p e c i fi c , a n d t h e y a r e g e n e r a l l y c o n s i d e r e d o b s o l e t e ? “ T h e a b i l i t y o f s o m e a n t i b o d i e s t o fi x c o m p l e m e n t l e d t o t h e d e v e l o p m e n t o f a n i n d i r e c t q u a n t i t a t i v e p l a t e l e t c o m p l e m e n t fi x a t i o n t e s t ? “ " " 6 6 T h i s a s s a y i s l i m i t e d t o c o m p l e m e n t - fi x i n g a n t i b o d i e s a n d i s c o n s e q u e n t l y i n s e n s i t i v e ? “ A n i m p o r t a n t a d v a n c e c a m e w i t h t h e d e v e l o p m e n t o f a c o m p l e m e n t l y s i s i n h i b i t i o n a s s a y . " 6 7 I n t h i s a s s a y , t h e a m o u n t o f i m m u n o g l o b u l i n s b o u n d b y p l a t e l e t s i s q u a n t i fi e d b y t h e c o n s u m p t i o n o f a fi x e d a m o u n t o f h e m o l y t i c a l l y a c t i v e a n t i h u m a n I g G w h i c h i s d e t e c t e d b y t h e d e g r e e o f i n h i b i t i o n o f c o m p l e m e n t - m e d i a t e d l y s i s o f s h e e p e r y t h r o c y t e s a d d e d s u b s e q u e n t l y . T h i s m e t h o d a l l o w e d f o r d i r e c t a n d i n d i r e c t d e t e r m i n a t i o n s a n d q u a n t i t a t i o n w i t h o u t d e p e n d i n g o n t h e c o m p l e m e n t - fi x i n g a c t i v i t y o f t h e P A I g o r P B I g ? “ 5 W h i l e t h e a s s a y w a s w i d e l y u s e d , q u a n t i t a t i o n w a s i n a c c u r a t e d u e t o t h e i n a d v e r t e n t r e l e a s e o f i n t e r n a l I g G ? ” T h e a s s a y h a s m o s t l y b e e n r e p l a c e d b y m o r e d i r e c t t e s t i n g t e c h n i q u e s ? ” M o d e r n a s s a y s a r e g e n e r a l l y b a s e d o n i m m u n o g l o b u l i n d e t e c t i o n t h r o u g h t h e u s e o f l a b e l e d a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s ? ” T h e s e a s s a y s c a n i n d i r e c t l y t e s t f o r P B I g b y i n c u b a t i n g n o r m a l a l l o g e n e i c p l a t e l e t s w i t h s e r u m , p l a s m a , i m m u n o g l o b u l i n f r a c t i o n s o f s e r u m o r p l a s m a , o r p l a t e l e t e l u a t e s . T h e y c a n a l s o b e d i r e c t a s s a y s w h e r e p a t i e n t p l a t e l e t s a r e w a s h e d a n d a s s e s s e d d i r e c t l y f o r b o u n d i m m u n o g l o b u l i n . S i m i l a r l y , p l a t e l e t - a s s o c i a t e d c o m p l e m e n t c o m p o n e n t s m a y b e d e t e c t e d w i t h l a b e l e d a n t i - c o m p l e m e n t 1 1 7 r e a g e n t s . O f s i g n i fi c a n c e f o r d i r e c t a s s a y s i s t h e fi n d i n g t h a t s m a l l p l a t e l e t f r a g m e n t s i n d u c e d b y r e p e t i t i v e f r e e z i n g a n d t h a w i n g o f p l a t e l e t s a r e l o s t d u r i n g r o u t i n e w a s h i n g s t e p s f o r p l a t e l e t a n t i b o d y a s s a y s ? 6 8 T h e r e f o r e , i f t h e f r a g m e n t s a n d m i c r o v e s i c l e s p r e s e n t i n p a t i e n t s w i t h I M T ” ? 4 7 0 a r e s i m i l a r , t h e y w i l l n o t c o n t r i b u t e t o t h e a s s e s s m e n t o f P A I g . T h e a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s c o m m o n l y u s e d a r e p o l y c l o n a l a n t i g l o b u l i n s , m o n o c l o n a l a n t i g l o b u l i n s , F ( a b ’ ) 2 a n t i g l o b u l i n f r a g m e n t s , ‘ 7 " " ” l e c t i r r s , a n d b a c t e r i a l F c r e c e p t o r s s u c h a s S p A ? ” " 7 " T h e t y p e o f l a b e l i n g o f t h e r e a g e n t s i s d i c t a t e d b y t h e g e n e r a l t y p e o f a s s a y t o b e u s e d : 1 ) r a d i o a c t i v e a s s a y s e m p l o y r a d i o l a b e l i n g , u s u a l l y w i t h 1 2 5 i o d i n e ; 2 ) i m m u n o fl u o r e s c e n c e a s s a y s e m p l o y fl u o r e s c e n c e l a b e l i n g , u s u a l l y w i t h fl u o r e s c e i n i s o t h i o c y a n a t e ; a n d 3 ) e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y s ( E L I S A s ) e m p l o y e n z y m e c o n j u g a t i o n , u s u a l l y w i t h p e r o x i d a s e o r a l k a l i n e p h o s p h a t a s e . A f t e r i n c u b a t i o n , t h e s e p a r a t i o n o f b o u n d f r o m u n b o u n d r e a g e n t s i s d o n e w i t h w a s h i n g o r w i t h c e n t r i f u g a t i o n t h r o u g h P e r c o l l , o i l , o r s u c r o s e ? ” I n m o s t a s s a y s , t h e r e a c t i v i t y o f t h e a n t i g l o b u l i n r e a g e n t i s m e a s u r e d d i r e c t l y , w h i l e i n c o m p e t i t i v e a s s a y s , c o n s u m p t i o n o f t h e a n t i g l o b u l i n r e a g e n t i s m e a s u r e d b y d e c r e m e n t s i n i t s fl u i d p h a s e c o n c e n t r a t i o n a f t e r i t b i n d s t o P A I g . Q u a n t i t a t i o n o f t h e n u m b e r o f m o l e c u l e s o f i m m u n o g l o b u l i n p e r p l a t e l e t h a s b e e n p o s s i b l e w i t h e a c h g e n e r a l m e t h o d ? “ " ’ ” b u t n o n e h a s g a i n e d u n i v e r s a l a c c e p t a n c e a s t h e b e s t . E a c h r e a g e n t , l a b e l , a n d t e c h n i q u e h a s i t s o w n s t r e n g t h s a n d w e a k n e s s e s . R a d i o a c t i v e a s s a y s o f f e r a h i g h d e g r e e o f r e p r o d u c i b i l i t y a n d t h e p o t e n t i a l f o r p r e c i s e q u a n t i t a t i o n . ” 2 ° " ” ' 4 7 6 T h e i r o n l y r e a l d i s a d v a n t a g e i s s i m p l y t h a t t h e y r e q u i r e u s e a n d d i s p o s a l o f r a d i o a c t i v e m a t e r i a l s . E L I S A t e c h n i q u e s a r e r a d i o a c t i v e - f r e e a n d e a s i l y a p p l i e d t o c l i n i c a l l a b o r a t o r i e s . W h i l e s o m e i n v e s t i g a t o r s h a v e c o n s i d e r e d t h e m a s 1 1 8 s e n s i t i v e a n d q u a n t i fi a b l e a s r a d i o a c t i v e a n t i g l o b u l i n t e s t s ? ” o t h e r s h a v e f o u n d t h e m l e s s r e p r o d u c i b l e a n d r e l i a b l e ? ” I m m u n o fl u o r e s c e n c e a s s a y s h a v e b e e n w i d e l y u s e d s i n c e v o n d e m B o r n e f o u n d t h a t p l a t e l e t s fi x e d i n 1 % p a r a f o r m a l d e h y d e f o r 2 - 5 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e l a c k e d t h e n o n s p e c i fi c fl u o r e s c e n c e o f u n fi x e d p l a t e l e t s w h i c h h a d h a m p e r e d p r e v i o u s a t t e m p t s a t fl u o r e s c e n c e a s s a y s ? 7 7 T h e m a j o r d i s a d v a n t a g e s o f t h e s e a s s a y s i n c l u d e t h e s u b j e c t i v e a s s e s s m e n t o f fl u o r e s c e n c e a n d t h e n e e d f o r i m m e d i a t e e v a l u a t i o n i n t h e d a r k ? ” H o w e v e r , t h e s e d i s a d v a n t a g e s h a v e b e e n m i n i m i z e d w i t h t h e m o r e r e c e n t a d a p t a t i o n o f i m m u n o fl u o r e s c e n c e a s s a y s t o fl o w c y t o m e t r i c t e c h n o l o g y . F l o w c y t o m e t r y , w h e r e a v a i l a b l e , c a n r e d u c e t h e s u b j e c t i v i t y i n h e r e n t i n m o s t i r n m u n o fl u o r e s c e n c e a s s a y s , a n d i t i s m o r e s e n s i t i v e t h a n m i c r o s c o p i c a s s a y s ? 7 8 S m a l l e r b l o o d v o l u m e s a r e r e q u i r e d , a n d o t h e r c e l l t y p e s c a n b e s i m u l t a n e o u s l y e v a l u a t e d i n c a s e s o f m u l t i p l e c y t o p e n i a s ? 7 8 A t t e m p t s t o m a k e fl o w m e t h o d s q u a n t i t a t i v e h a v e b e e n r e p o r t e d , b u t t h e e s t i m a t e o f t h e n u m b e r o f I g G m o l e c u l e s p e r n o r m a l p l a t e l e t w a s h i g h e r t h a n t h e fi g u r e s u n d e r g e n e r a l a c c e p t a n c e a t t h i s t i m e ? ” T h e m o s t r e c e n t l y d e v e l o p e d a s s a y s a r e b a s e d o n r e a c t i v i t y t o w a r d s p e c i fi c p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n s r a t h e r t h a n o n g e n e r a l r e a c t i v i t y t o w a r d w h o l e p l a t e l e t s . T h e s e a s s a y s h e l p r e d u c e n o n s p e c i fi c b i n d i n g w h i l e i d e n t i f y i n g s p e c i fi c t a r g e t g l y c o p r o t e i n s o r e v e n t h e s p e c i fi c r e a c t i v e p o r t i o n s o f t a r g e t g l y c 0 p r o t e i n s . I n a n t i g e n c a p t u r e a s s a y s , m u r i n e m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a r e u s e d t o c a p t u r e t h e i r r e a c t i v e p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n s . I n o n e m e t h o d , t h e m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a r e fi x e d t o s u c h s u r f a c e s a s p o l y s t y r e n e b e a d s o r m i c r o t i t r a t i o n p l a t e w e l l s 3 0 1 b e f o r e i n c u b a t i o n w i t h s o l u b i l i z e d p l a t e l e t s . A f t e r a t t a c h m e n t o f t h e s p e c i fi c a n t i g e n s , t e s t s e r u m o r p l a s m a i s i n c u b a t e d , a n d b o u n d a n t i b o d i e s a r e d e t e c t e d w i t h a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s a f t e r w a s h i n g ? “ 1 1 9 I n a n i m p r o v e d m e t h o d , p l a t e l e t s a r e i n c u b a t e d w i t h t e s t s e r u m o r p l a s m a b e f o r e s o l u b i l i z a t i o n , t h u s l i m i t i n g t h e r e a c t i v i t y t o e x o s o l i c s i t e s , p r e s e r v i n g e p i t o p e s t h a t m a y b e l o s t b y s o l u b i l i z a t i o n , a n d r e d u c i n g n o n s p e c i fi c b i n d i n g t o t h e s o l i d p h a s e ? “ " ~ 4 8 1 I n t h e d i r e c t f o r m o f t h e a s s a y , t e s t p l a t e l e t s a r e s i m p l y s o l u b i l i z e d a f t e r w a s h i n g . A n t i g e n - a n t i b o d y c o m p l e x e s c a n t h e n b e c a p t u r e d b y a n t i — [ h u m a n I g G ] a n t i b o d i e s fi x e d t o w e l l s o r b e a d s ( i m m u n o b e a d a s s a y ) , a n d t h e b o u n d a n t i g e n s c a n b e d e t e c t e d b y s p e c i fi c m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s t o a p a n e l o f p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n s . 4 8 0 A l t e r n a t i v e l y , t h e c o m p l e x e s c a n b e c a p t u r e d b y t h e m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s t o p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n s , a n d t h e b o u n d i m m u n o g l o b u l i n c a n b e d e t e c t e d b y a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s . I n a n o t h e r m o d i fi c a t i o n , 4 8 1 p l a t e l e t s a r e e x p o s e d t o t h e t e s t s e r u m a n d s p e c i fi c m o n o c l o n a l a n t i - g l y c o p r o t e i n a n t i b o d i e s s i m u l t a n e o u s l y , a n d t h e p l a t e l e t s a r e t h e n w a s h e d a n d s o l u b i l i z e d . T h e t r i r n o l e c u l a r c o m p l e x e s o f g l y c o p r o t e i n w i t h b o u n d a n t i - g l y c o p r o - t e i n a n t i b o d i e s a n d b o u n d h u m a n i m m u n o g l o b u l i n ( i f p o s i t i v e ) a r e c a p t u r e d b y a n t i - [ m u r i n e I g ] a n t i b o d i e s a n d t h e h u m a n i m m u n o g l o b u l i n i s d e t e c t e d b y a n E L I S A . I n t h e d i r e c t f o r m o f t h i s a s s a y , w a s h e d t e s t p l a t e l e t s a r e i n c u b a t e d w i t h s p e c i fi c a n t i — g l y c o p r o t e i n m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s , a n d t h e a s s a y p r o c e e d s a s f o r t h e i n d i r e c t f o r m . T h i s a s s a y i s c o m m o n l y r e f e r r e d t o a s a M A I P A ( M o n o c l o n a l A n t i b o d y - s p e c i fi c I m m o b i l i z a t i o n o f P l a t e l e t A n t i g e n s ) . R e c e n t l y , a n i n d i r e c t a s s a y u s i n g i s o l a t e d o r c a p t u r e d p r o t e i n s m o r e s e n s i t i v e l y d e t e c t e d r e a c t i v e a n t i b o d i e s t h a n d i d a n i n d i r e c t fl o w c y t o m e t r i c i m m u n o fl u o r e s c e n c e t e c h n i q u e . 2 9 9 S i m i l a r t o t h e s e a n t i g e n c a p t u r e a s s a y s a r e m e t h o d s w h i c h m a k e u s e o f p u r i fi e d p l a t e l e t p r o t e i n s a n d s y n t h e t i c p e p t i d e s c o r r e s p o n d i n g t o p o r t i o n s o f s e q u e n c e d p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n s . 2 9 9 S e r u m , p l a s m a , o r p l a t e l e t e l u a t e s c a n b e a s s e s s e d f o r a n t i b o d i e s 1 2 0 r e a c t i v e t o t h e s p e c i fi c p r o t e i n s , a n d a d s o r p t i o n s t u d i e s c a n b e d o n e w i t h t h e p e p t i d e s t o f u r t h e r d e fi n e t h e l o c a t i o n s o f t h e r e a c t i v e e p i t o p e s . A s s a y s w i t h c a p t u r e d a n t i g e n s a n d p u r i fi e d p r o t e i n s i d e n t i f y t a r g e t g l y c o p r o t e i n s m u c h m o r e r a p i d l y t h a n d o t h e t r a d i t i o n a l t e c h n i q u e s , n a m e l y c r o s s e d i m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s , 4 8 2 i m m u n o b l o t t i n g a n d i r n m u n o - p r e c i p i t a t i o n . M o r e o v e r , i m m u n o b l o t t i n g h a s f r e q u e n t l y b e e n u n s u c c e s s f u l , p r o b a b l y d u e t o S D S d e n a t u r a t i o n o f s o m e o f t h e t a r g e t e p i t o p e s ? ” 4 8 3 T h e p r e s e n c e o f h a n d s a f t e r b l o t t i n g w i t h c o n t r o l s e r a h a s a l s o c a u s e d p r o b l e m s i n i n t e r p r e t a t i o n . A l a r g e p e r c e n t a g e o f n o r m a l h u m a n s e r a c o n t a i n I g G , I g A , a n d I g M i m m u n o g l o b u l i n s r e a c t i v e t o v i n c u l i n a n d t a l i n , p r o t e i n s p r e s e n t w i t h i n p l a t e l e t s a s w e l l a s m a n y o t h e r c e l l s . 4 8 4 T h e 9 0 k D b a n d o f I I I a c o u l d b e e a s i l y c o n f u s e d w i t h t h e 9 5 k D f r a g m e n t o f v i n c u l i n , a n d t h e 1 1 0 k D b a n d o f r e d u c e d I I I a c o u l d b e c o n f u s e d w i t h 1 2 0 k D b a n d f o r i n t a c t v i n c u l i n . A g a i n , t h i s s h o w s t h e i m p o r t a n c e o f u s i n g p r o c e d u r e s t h a t a s s e s s s u r f a c e r a t h e r t h a n i n t e r n a l b i n d i n g e p i t o p e s . A s f o r i r n m u n o p r e c i p i t a t i o n s , r a d i o a c t i v e m e t h o d s h a v e p r o v e n u t i l i t y f o r i d e n t i f y i n g t h e s u r f a c e e p i t o p e s r e a c t i v e w i t h s o m e , b u t n o t a l l , a n t i b o d i e s i n I M T . 3 ° " 3 ° 2 ' 4 8 3 R e l a t i v e l y q u i c k a n d e a s y n o n r a d i o a c t i v e m e t h o d s h a v e a l s o b e e n r e p o r t e d ? 8 5 R a d i o l a b e l i n g w i t h l a c t o p e r o x i d a s e , w h i c h i n c o r p o r a t e s t h e l a b e l p r i m a r i l y i n t o t y r o s i n e r e s i d u e s , w o r k s b e s t f o r G P I I b a n d G P I I I a . A m o r e u n i f o r m l a b e l i n g o f s u r f a c e s i a l o g l y c o p r o t e i n s c a n b e o b t a i n e d w i t h b i o t i n b y u s i n g a p e r i o d a t e m e t h o d , a n d t h e b i o t i n c a n b e d e t e c t e d b y a v i d i n - p e r o x i d a s e u s i n g l u m i n o l a s t h e s u b s t r a t e ? 8 5 W i t h t h i s m e t h o d , i m m u n o b l o t t i n g a n d i r n m u n o p r e c i p i t a t i o n s t u d i e s o f G P I b a n d G P I I b / I I I a w e r e d o n e s u c c e s s f u l l y , a n d r e p o r t e d l y w i t h t h e s a m e s e n s i t i v i t y a s w i t h u s e o f r a d i o i s o t o p i c m e t h o d s . 1 2 1 L a s t l y , t a r g e t g l y c o p r o t e i n s h a v e b e e n i d e n t i fi e d b y c o m p e t i t i v e p l a t e l e t s u s p e n s i o n i m m u n o fl u o r e s c e n c e a s s a y s b a s e d o n t h e a b i l i t y o f t h e a n t i b o d y b e i n g d e t e c t e d t o b l o c k p l a t e l e t b i n d i n g o f a n t i b o d i e s w i t h k n o w n s p e c i fi c i t y . 4 8 6 T o b e s u c c e s s f u l , t h i s m e t h o d r e q u i r e s a l a r g e p a n e l o f d e fi n e d m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s . O f a l l t h e a f o r e m e n t i o n e d o p t i o n s f o r i d e n t i f y i n g t h e s p e c i fi c t a r g e t o f p l a t e l e t - r e a c t i v e a n t i b o d i e s , t h e b e s t m e t h o d p r o b a b l y v a r i e s w i t h t h e t a r g e t ? 8 7 W h i l e m o s t o f t h e a s s a y s d e v e l o p e d f o r P A I g o r P B I g fi t i n t o o n e o f t h e p r e c e d i n g t y p e s , o t h e r a s s a y s h a v e i n c l u d e d a n i n d i r e c t s l i d e i m m u n o p e r o x i d a s e t e c h n i q u e , 4 8 8 a r a d i a l i m m u n o p r e c i p i t a t i o n a s s a y , 4 8 9 a n e l e c t r o i m m u n o a s s a y , 4 9 0 a n d a d i r e c t l a t e x p a r t i c l e a s s a y f o r w h i c h b e a d s c o a t e d w i t h a n t i - [ I g G ( F c ) ] a r e i n c u b a t e d w i t h t e s t p l a t e l e t s , t h e c o m b i n a t i o n o f w h i c h , u p o n c e n t r i f u g a t i o n , f o r m s r e c o g n i z a b l y d i f f e r e n t p e l l e t s w h e n P A I g i s p r e s e n t ? 9 1 T h e s e a s s a y s d o n o t h a v e w i d e s p r e a d u s e . 2 . t e c h n i q u e c o n s i d e r a t i o n s W h e n e v a l u a t i n g r e s u l t s o f I M T s t u d i e s , i t i s i m p o r t a n t t o c o n s i d e r t h e a s s a y t e c h n i q u e e m p l o y e d a n d i t s p o t e n t i a l f o r p r o d u c i n g m i s l e a d i n g r e s u l t s . M i s l e a d i n g r e s u l t s a r e m o r e l i k e l y t o o c c u r w i t h i n d i r e c t a s s a y s , w h e r e " I n m a n y s t u d i e s o f s e r u m a n d p l a s m a , n o s p e c i a l p r e c a u t i o n s w e r e t a k e n t o d i s c r i m i n a t e a m o n g a u t o r e a c t i v e a n t i b o d i e s , a l l o a n t i b o d i e s , c i r c u l a t i n g i m m u n e c o m p l e x e s , a n d a g g r e g a t e s o f n o r m a l I g G p r e s e n t i n s t o r e d s e r a " . 2 ° 4 H o w e v e r , d i r e c t a s s a y p r o t o c o l s m u s t a l s o b e c a r e f u l l y e v a l u a t e d . I m p o r t a n t a s p e c t s o f a s s a y p r o t o c o l s t h a t m u s t b e c o n s i d e r e d w h e n i n t e r p r e t i n g r e s u l t s a r e a d d r e s s e d i n t h e f o l l o w i n g s e c t i o n . T h e s e p o i n t s s h o u l d s i m i l a r l y b e c o n s i d e r e d i n a s s a y d e v e l o p m e n t . 1 2 2 a . l o w t i t e r s S a m p l e s f r o m p a t i e n t s w i t h c h r o n i c I M T h a v e m o r e c o m m o n l y b e e n p o s i t i v e w i t h d i r e c t a s s a y s f o r P A I g t h a n w i t h i n d i r e c t a s s a y s f o r P B I g ? 8 0 T h e d e c r e a s e d s e n s i t i v i t y o f i n d i r e c t a s s a y s h a s o f t e n b e e n c o n s i d e r e d t o b e d u e t o t i t e r s o f P B I g t h a t a r e l o w b e c a u s e a n t i b o d i e s h a v e b e e n r e m o v e d f r o m t h e c i r c u l a t i o n b y b i n d i n g t o p l a t e l e t s . T h i s m a y b e t r u e , b u t i t i s u n p r o v e n . I t i s a l s o p o s s i b l e t h a t t h e c o n d i t i o n s o f a s s a y s s o m e h o w h a m p e r d e t e c t i o n b y i n d i r e c t m e t h o d s . T h e f r e q u e n c y o f p o s i t i v i t y w a s r e c e n t l y h i g h e r b y t e s t i n g f o r m u l t i p l e c l a s s e s o f a n t i b o d y w i t h a n e x t e n d e d p a n e l o f p l a t e l e t p r o t e i n s . 2 9 9 H o w e v e r , l o w a f fi n i t y a n t i b o d i e s m a y s t i l l g o u n d e t e c t e d w i t h d i r e c t o r i n d i r e c t a s s a y s ? 9 2 b . a l l o a n t i b o d i e s v s . a u t o a n t i b o d i e s T h e r e v e r s e p r o b l e m a l s o a r i s e s , i n t h a t i n d i r e c t a s s a y s m a y b e p o s i t i v e f o r p l a t e l e t - b i n d a b l e a l l o a n t i b o d i e s w h e n d i r e c t a s s a y s a r e n e g a t i v e . S u c h a l l o a n t i b o d i e s w i l l n o t b e p r e s e n t o n t h e p a t i e n t ’ s o w n p l a t e l e t s a n d a r e n o t p a t h o g e n i c , b u t t h e y m a y r e a c t w i t h t h e a l l o g e n e i c t e s t p l a t e l e t s f r o m n o r m a l d o n o r s . P l a t e l e t - r e a c t i v e a l l o a n t i b o d i e s a r i s e f r o m p r e v i o u s t r a n s f u s i o n s o r p r e g n a n c i e s , a n d t h e y c a n a l s o b e r e l a t e d t o b l o o d t y p e a n d b e d i r e c t e d t o w a r d e r y t h r o c y t e A B H a n t i g e n s o n p l a t e l e t s ? ” " ’ 9 4 S i n c e e x p o s u r e t o t h e A B H a n t i g e n s c a n o c c u r w i t h o u t t r a n s f u s i o n , 4 9 5 a l l o a n t i b o d i e s r e a c t i v e w i t h p l a t e l e t A B H m a y o c c u r n a t u r a l l y . F o r t h i s r e a s o n , h u m a n i n d i r e c t a s s a y s r o u t i n e l y u s e p l a t e l e t s f r o m b l o o d g r o u p O d o n o r s . T h e s e p l a t e l e t s l a c k t h e A a n d B a n t i g e n s a n d w i l l b e u n r e a c t i v e t o b l o o d g r o u p - r e l a t e d a l l o a n t i b o d i e s . A l l o a n t i b o d i e s t o H L A c l a s s I a n t i g e n s m a y s t i l l b e d e t e c t e d , h o w e v e r , a n d t h e s e a r e a g a i n n o t i n d i c a t i v e o f p a t i e n t P A I g . R a t h e r , t h e y a r e i n d i c a t i v e o f p r e v i o u s i m m u n i z a t i o n w i t h a d i f f e r e n t H L A a l l o t y p e , m o s t 1 2 3 l i k e l y f r o m t r a n s f u s i o n . I n s t u d i e s o f c a n i n e p l a t e l e t r e f r a c t o r i n e s s , 5 d o g s t h a t h a d n e v e r b e e n p r e g n a n t w e r e r e f r a c t o r y t o t h e i r fi r s t d o n o r b u t n o t t o a l l d o n o r s , s u g g e s t i n g t h e p r e s e n c e o f p r e e x i s t i n g s p e c i fi c a l l o a n t i b o d i e s n o t r e l a t e d t o t r a n s f u s i o n . 3 6 9 T h e r e f o r e , n a t u r a l l y o c c u r r i n g p l a t e l e t a l l o a n t i b o d i e s m u s t b e c o n s i d e r e d p o t e n t i a l c o n f o u n d i n g f a c t o r s i n t h e i n t e r p r e t a t i o n o f i n d i r e c t a s s a y s f o r c a n i n e P B I g . c . s e r u m S e r u m , a s o p p o s e d t o p l a s m a , h a s f r e q u e n t l y b e e n u s e d a s t h e s a m p l e f o r i n d i r e c t a s s a y s . S e r u m c o n t a i n s r e s i d u a l t h r o m b i n g e n e r a t e d d u r i n g c l o t t i n g , a n d t h r o m b i n c a n a c t i v a t e p l a t e l e t s a l l o w i n g t h e m t o e x p r e s s n e w r e a c t i v e s i t e s . A s a r a t h e r p r o m i s c u o u s e n z y m e , i t a l s o h a s t h e c a p a c i t y t o e n z y m a t i c a l l y a l t e r s u r f a c e a n t i g e n s o n t e s t p l a t e l e t s , p e r h a p s r e d u c i n g o r i n d u c i n g r e a c t i v i t y . T o a v o i d r e s i d u a l t h r o m b i n , s e r u m s a m p l e s h a v e s o m e t i m e s b e e n h e a t e d t o 5 6 ° f o r 3 0 - 6 0 m i n u t e s t o i n a c t i v a t e t h e t h r o m b i n i n a d d i t i o n t o c o m p l e m e n t . W h i l e h e a t i n g m a y i n a c t i v a t e t h r o m b i n i f d o n e l o n g e n o u g h , i t a l s o i n d u c e s f o r m a t i o n o f i m m u n o g l o b u l i n a g g r e g a t e s . O n e m u s t b e c o n c e r n e d w i t h t h e p o s s i b i l i t y t h a t s u c h a g g r e g a t e s m a y b i n d t o p l a t e l e t F c ' y R I I a n d i n d u c e p o s i t i v e r e s u l t s . W h i l e F c - m e d i a t e d b i n d i n g m a y b e o f l o w a f f m i t y , t h e a b s e n c e o f s u c h b i n d i n g s h o u l d i d e a l l y b e d e m o n s t r a t e d f o r a n y a s s a y w h e r e s a m p l e s a r e h e a t e d . W h e n a s s a y s u s e fi x e d p l a t e l e t s a s t h e t e s t p l a t e l e t s , t h r o m b i n i n d u c e d a c t i v a t i o n i s n o t a p r o b l e m . T h r o m b i n m a y s t i l l b e a b l e t o e n z y m a t i c a l l y a l t e r t h e p l a t e l e t s u r f a c e , h o w e v e r . 1 2 4 d . a n t i c o a g u l a n t T h e c a l c i u m - d e p e n d e n t h e t e r o d i r n e r G P H b / I l l a i s a c o m m o n t a r g e t o f a n t i b o d i e s i n h u m a n I M T ? ” I t u n d e r g o e s i r r e v e r s i b l e d i s s o c i a t i o n a n d c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s w h e n e x p o s e d t o E D T A i n a n a l k a l i n e m e d i u m f o r 1 5 m i n u t e s a t 3 7 ° C , b u t n o t a t r o o m t e m p e r a t u r e ? 9 6 T h e d i s s o c i a t i o n o f G P H b / I l l a r e s u l t s i n u l t r a s t r u c t u r a l p l a t e l e t c h a n g e s c h a r a c t e r i z e d b y a c o l l a p s e o f t h e s u r f a c e - c o n n e c t e d o p e n c a n a l i c u l a r s y s t e m ? ” " ” W h e n t h i s o c c u r s , r e a c t i v i t y w i t h G P I I b / I I I a c o m p l e x — d e p e n d e n t a n t i b o d i e s a n d fi b r i n o g e n i s m a r k e d l y r e d u c e d ? ” 4 9 8 a n d s o m e a u t o e p i t o p e s o n G P H b / I l l a a r e l o s t u p o n c h e l a t i o n s u c h t h a t a u t o a n t i b o d i e s w i l l b i n d w e a k l y o r n o t a t a l l . ” 8 ? ” T h e s e a r e p r e s u m a b l y t 0 p o g r a p h i c ( c o n fi g u r a t i o n — d e p e n d e n t ) e p i t o p e s . I n d i r e c t a s s a y s t h a t u s e E D T A f o r a n t i c o a g u l a t i o n o f d o n o r a s s a y p l a t e l e t s o r d u r i n g w a s h i n g o r i n c u b a t i o n s t e p s - h a v e f a i l e d t o d e t e c t s o m e c o m p l e x - d e p e n d e n t a n t i b o d i e s , w h e r e a s u s e o f c i t r a t e h a s p r e s e r v e d t h e r e a c t i v i t y ? ” P r e s u m a b l y , e n o u g h c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e o c c u r s a t r o o m t e m p e r a t u r e t o a l t e r e p i t o p e s , e v e n i f c o m p l e t e d i s s o c i a t i o n d o e s n o t o c c u r . I f p l a t e l e t s a r e e x p o s e d t o E D T A i n a n i n d i r e c t a s s a y s y s t e m , t h e r e a c t i v i t y o f c o m p l e x — d e p e n d e n t a n t i b o d i e s s h o u l d b e t e s t e d . U s e o f E D T A - a n t i c o a g u l a t e d p l a s m a a s t h e t e s t s a m p l e s h o u l d n o t b e a p r o b l e m i f t h e fi n a l c o n c e n t r a - t i o n o f E D T A t o w h i c h t h e d o n o r a s s a y p l a t e l e t s a r e e x p o s e d i s l o w . C o m p l e x - d e p e n d e n t m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s p r e i n c u b a t e d w i t h h u m a n p l a t e l e t s p r o t e c t G P H b / I l l a f r o m E D T A - i n d u c e d d i s s o c i a t i o n ? ” T h e r e f o r e , d i r e c t t e s t s f o r P A I g w i t h E D T A - a n t i c o a g u l a t e d b l o o d w o u l d p r o b a b l y b e a b l e t o d e t e c t a n t i b o d i e s b o u n d t o c o m p l e x - d e p e n d e n t e p i t o p e s o n G P H b / I l l a . I t i s n o t y e t k n o w n w h e t h e r E D T A h a s s i m i l a r e f f e c t s o n c a n i n e p l a t e l e t s , 1 2 5 b u t t h e p o s s i b i l i t y m u s t b e c o n s i d e r e d . S i n c e s i m i l a r t r e a t m e n t o f r a t p l a t e l e t s d o e s n o t d i s s o c i a t e G P I I b / I I I a , E D T A m a y n o t p o s e t h i s p r o b l e m i n d o g s . 5 0 0 W h i l e t h e p r e c e e d i n g d i s c u s s i o n h a s r e l a t e d t o t h e p o t e n t i a l f o r E D T A t o l e a d t o f a l s e n e g a t i v e a s s a y r e s u l t s , i t c a n a l s o c a u s e f a l s e p o s i t i v e r e s u l t s . E D T A - i n d u c e d i m m u n o g l o b u l i n b i n d i n g t o p l a t e l e t s i s w e l l k n o w n i n t h e c o n t e x t o f p s e u d o t h r o m b o — c y t o p e n i a , 1 3 b u t i t m a y b e i m p o r t a n t f o r p l a t e l e t a n t i b o d y a s s a y s a s w e l l . W h e n c a n i n e 2 1 p l a t e l e t s a r e t e s t e d i m m e d i a t e l y o r a t 2 4 h r , P A I g G r e s u l t s a r e h i g h e r w i t h p l a t e l e t s h a r v e s t e d f r o m b l o o d a n t i c o a g u l a t e d w i t h E D T A t h a n t h e y a r e w i t h c i t r a t e d s a m p l e s . I n a h u m a n s t u d y , s o l i d b u t n o t l i q u i d K Z E D T A c a u s e d a n i n c r e a s e i n P A I g G a s s o c i a t e d w i t h I g G - r i c h p a r t i c u l a t e m a t e r i a l l a r g e r t h a n 3 3 fl a n d t h e r e f o r e t o o l a r g e t o b e p l a t e l e t - d e r i v e d ? 6 7 T h e s e p a r t i c u l a t e s c o u l d b e s e p a r a t e d f r o m p l a t e l e t s b y a P e r c o l l d e n s i t y g r a d i e n t s u c h t h a t P A I g G w a s n o t a f f e c t e d . H o w e v e r , u s e o f s o l i d K Z E D T A i n a s s a y s w h e r e p l a t e l e t s a r e h a r v e s t e d b y d i f f e r e n t i a l c e n t r i f u g a t i o n s h o u l d b e a v o i d e d . E D T A - r e l a t e d i n c r e a s e s i n b a c k g r o u n d b i n d i n g w i l l d e c r e a s e a s s a y s e n s i t i v i t y a n d , i f i n c o n s i s t e n t i n d e g r e e , l e a d t o f a l s e p o s i t i v e r e s u l t s . F o r e x a m p l e , v o n d e m B o r n e 5 0 1 r e p o r t e d t h a t 1 0 o f 9 1 e t h e r e l u a t e s f r o m E D T A - h a r v e s t e d , P A I g - p o s i t i v e p l a t e l e t s w e r e E D T A - d e p e n d e n t . T h a t i s , t h e y c o n t a i n e d i m m u n o g l o b u l i n s t h a t b o u n d t o n o r m a l p l a t e l e t s f r o m E D T A - a n t i c o a g u l a t e d b l o o d b u t n o t t o p l a t e l e t s f r o m c i t r a t e d b l o o d . T h e r e f o r e , o v e r 1 0 % o f t h e p o s i t i v e r e s u l t s f o r P A I g w e r e f a l s e p o s i t i v e s d u e t o E D T A - i n d u c e d i m m u n o g l o b u l i n b i n d i n g . I t i s s i g n i fi c a n t t h a t o n l y o n e o f t h e s e 1 0 p a t i e n t s h a d a d i a g n o s i s o f I M T , a n d t h a t p a t i e n t w a s i n r e m i s s i o n . S i m i l a r l y , E D T A - d e p e n d e n t b i n d i n g o f s e r u m i m m u n o g l o b u l i n s o c c u r r e d i n 2 3 o f 9 8 s a m p l e s f r o m p a t i e n t s w h o s e E D T A - h a r v e s t e d p l a t e l e t s w e r e p o s i t i v e i n a d i r e c t p l a t e l e t i m m u n o fl u o r e s c e n c e t e s t ? ” 1 2 6 T h e f r e q u e n c y o f f a l s e p o s i t i v e r e s u l t s r e l a t e d t o E D T A w i t h o t h e r a s s a y s y s t e m s i s n o t k n o w n , b u t t h e p o t e n t i a l f o r a s i g n i fi c a n t p r o b l e m i s l i k e l y . A s c o m p a r e d t o c i t r a t e , s o m e ‘ ” ' 5 ° 2 b u t n o t o t h e r s “ 5 0 4 h a v e f o u n d t h a t u s e o f E D T A f o r a n t i c o a g u l a t i o n o f c a n i n e b l o o d h a s b e e n a s s o c i a t e d w i t h h i g h e r m e a n p l a t e l e t v o l u m e s u s i n g i m p e d a n c e m e t h o d s , a n d m u c h m o r e p l a t e l e t s u r f a c e i r r e g u l a r i t y a n d p s e u d o p o d f o r m a t i o n ? ” I t i s p o s s i b l e t h a t t h e fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f E D T A a n d a n t i c o a g u l a n t o s m o l a l i t y h a v e v a r i e d a m o n g s t u d i e s a n d t h a t a d v e r s e e f f e c t s o c c u r o n l y u n d e r s p e c i fi c c o n d i t i o n s ? “ H o w e v e r , t h i s r e p o r t e d e f f e c t o f E D T A o n p l a t e l e t m o r p h o l o g y m a y b e r e l a t e d t o t h e i n c r e a s e d P A I g v a l u e s s e e n o n n o r m a l c a n i n e p l a t e l e t s e x p o s e d t o E D T A a s c o m p a r e d t o c i t r a t e . 2 1 U s i n g a n E L I S A , 2 1 r e p o r t e d t h a t a c i d c i t r a t e d e x t r o s e ( A C D ) i s p r e f e r a b l e t o c i t r a t e a n d E D T A a s a n a n t i c o a g u l a n t f o r d e t e c t i n g P A I g i n d o g s . T o r e a c h t h i s c o n c l u s i o n , b l o o d w a s c o l l e c t e d f r o m 3 n o r m a l d o g s i n t o A C D , c i t r a t e , a n d E D T A a n d p l a c e d o n i c e . P l a t e l e t s h a r v e s t e d i m m e d i a t e l y , a t 2 4 h r , a n d a t 4 8 h r w e r e a s s a y e d f o r P A I g w i t h t h e d e s c r i b e d a s s a y . I n c r e a s i n g s t o r a g e t i m e b e f o r e p l a t e l e t i s o l a t i o n w a s a s s o c i a t e d w i t h s i g n i fi c a n t i n c r e a s e s i n P A I g . T r e n d s i n t h e d a t a s u g g e s t e d t h a t t h e g r e a t e s t i n c r e a s e s o c c u r r e d w i t h E D T A — a n t i c o a g u l a t e d b l o o d , a n d t h e l e a s t e f f e c t w a s s e e n w i t h b l o o d c o l l e c t e d i n t o A C D . S e v e r a l s p e c u l a t i v e c a u s e s o f t h e r e p o r t e d s t o r a g e a n d a n t i c o a g u l a n t e f f e c t s w e r e s u g g e s t e d . T h e s e i n c l u d e d p o s s i b l e r o l e s f o r l o w e r e d b l o o d c a l c i u m , i n v i t r o f o r m a t i o n o f i m m u n o g l o b u l i n a g g r e g a t e s w h i c h m i g h t b i n d n o n s p e c i fi c a l l y t o a p l a t e l e t F c r e c e p t o r , a n t i c o a g u l a n t - i n d u c e d n e o a n t i g e n s , o r o t h e r m e m b r a n e a l t e r a t i o n s i n d u c e d b y a n t i c o a g u l a n t s o v e r t i m e t h a t a l l o w n o n i r n m u n o l o g i c 1 2 7 b i n d i n g o f i m m u n o g l o b u l i n t o t h e p l a t e l e t s u r f a c e . T h e p r e s e n c e o f s u r f a c e p e r t u r b a t i o n s i n d u c e d i n c a n i n e p l a t e l e t s b y E D T A m a y h a v e a r o l e . 5 0 2 T h e d a t a d o s u p p o r t t h e c o n t e n t i o n t h a t A C D i s p r e f e r r e d o v e r c i t r a t e a n d E D T A i n t h e s y s t e m u s e d , b u t i t i s n o t k n o w n i f t h e s a m e w o u l d b e t r u e w i t h o t h e r a s s a y s , o t h e r t e c h n i q u e s o f p l a t e l e t i s o l a t i o n , o t h e r s t o r a g e c o n d i t i o n s , a n d o t h e r i m m u n o g l o b u l i n d e t e c t o r s . F o r e x a m p l e , s i n c e c a n i n e p l a t e l e t s u n d e r g o s h a p e c h a n g e a t 4 ° C , e s p e c i a l l y i n E D T A , 5 0 2 t h e s t o r a g e t e m p e r a t u r e m i g h t h a v e c o n t r i b u t e d t o t h e e f f e c t ; p e r h a p s r o o m t e m p e r a t u r e s t o r a g e w o u l d b e s u p e r i o r . I t s h o u l d a l s o b e e m p h a s i z e d t h a t t h e d i f f e r e n c e s b e t w e e n A C D a n d c i t r a t e w e r e m i n i m a l , n o t s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t , a n d b a s e d o n o n l y 3 d o g s . W h i l e t h e t r e n d s a r e c l e a r w i t h t h e t e c h n i q u e s e m p l o y e d , t h e g e n e r a l s t a t e m e n t t h a t " t h e p r e f e r r e d a n t i c o a g u l a n t f o r p l a t e l e t - b o u n d a n t i b o d y m e a s u r e m e n t i s a c i d c i t r a t e d e x t r o s e " m a y b e a n o v e r s t a t e m e n t a t t h i s t i m e . c . fi x a t i o n o f p l a t e l e t s I n m a n y i n d i r e c t a s s a y s , n o r m a l d o n o r a s s a y p l a t e l e t s a r e fi x e d w i t h p a r a - f o r m a l d e h y d e ( P F A ) . T h i s i s d o n e i n fl u o r e s c e n t a s s a y s t o r e d u c e n o n s p e c i fi c p l a t e l e t a u t o fl u o r e s c e n c e ? 7 7 H o w e v e r , s u c h fi x a t i o n i s a p p a r e n t l y n o t i n n o c u o u s . v o n d e m B o r n e 5 0 1 r e p o r t e d t h e p r e s e n c e o f P F A - d e p e n d e n t a n t i b o d i e s i n 1 2 o f 9 8 s e r a f r o m p a t i e n t s w i t h p o s i t i v e d i r e c t p l a t e l e t s u s p e n s i o n i m m u n o fl u o r e s c e n c e t e s t r e s u l t s . T h a t i s , t h e i r s e r u m i m m u n o g l o b u l i n s b o u n d t o P F A - fi x e d b u t n o t u n fi x e d p l a t e l e t s . N o P F A - d e p e n d e n t a n t i b o d y b i n d i n g w a s d e t e c t e d i n p l a t e l e t e l u a t e s . U s i n g t h e s a m e a s s a y , P F A - d e p e n d e n t P B I g w e r e a l s o d e t e c t e d i n t h e s e r a o f 2 2 / 1 0 3 p a t i e n t s w i t h c h r o n i c r e n a l f a i l u r e ? ” I t w a s s u g g e s t e d t h a t t h e a l d e h y d e s u s e d i n t h e d i a l y s i s e q u i p m e n t c o u l d h a v e 1 2 8 s e n s i t i z e d t h e s e p a t i e n t s t o P F A - d e p e n d e n t a n t i b o d i e s , t h o u g h h e a l t h y c o n t r o l s w e r e n o t t e s t e d t o c o n fi r m t h e a s s o c i a t i o n w i t h c h r o n i c r e n a l f a i l u r e a n d d i a l y s i s . I t i s c l e a r , h o w e v e r , t h a t P F A fi x a t i o n o f t e s t p l a t e l e t s i n i n d i r e c t a s s a y s m a y i n d u c e a s i g n i fi c a n t n u m b e r o f f a l s e p o s i t i v e r e s u l t s . T h e u s e o f fi x a t i o n h a s b e e n q u e s t i o n e d e v e n f o r fl o w c y t o m e t r i c fl u o r e s c e n c e a s s a y s , b e c a u s e fi x a t i o n r e p o r t e d l y a l t e r s t h e l i g h t s c a t t e r i n g p r o p e r t i e s o f p l a t e l e t s i n d i c a t i v e o f s o m e s t r u c t u r a l a l t e r a t i o n s ? ” P l a t e l e t fi x a t i o n i n 0 . 5 a n d 1 % f o r m a l d e h y d e h a s b e e n s h o w n t o i n d u c e t h e e x p r e s s i o n o f P s e l e c t i n ( C D 6 2 ) a n d G P 5 3 ( C D 6 3 , a l y s o s o m a l g r a n u l e p r o t e i n ) o n n o r m a l p l a t e l e t s , 5 0 6 s o o t h e r s u r f a c e a l t e r a t i o n s a r e p o s s i b l e . T h i s c o u l d c o n c e i v a b l y i n c l u d e a l t e r a t i o n s l e a d i n g t o f a l s e n e g a t i v e r e s u l t s . H o w e v e r , l a c k o f fi x a t i o n i n fl u o r e s c e n c e a s s a y s m a y d e c r e a s e t h e s i g n a l - t o - n o i s e r a t i o a n d r e d u c e s e n s i t i v i t y . F i x a t i o n o f p a t i e n t ’ s t e s t p l a t e l e t s i s a l s o s o m e t i m e s d o n e i n d i r e c t a s s a y s . T h e r e f o r e , t h e p o t e n t i a l e x i s t s f o r fi x a t i o n - i n d u c e d f a l s e n e g a t i v e a n d f a l s e p o s i t i v e r e s u l t s f o r P A I g . f . f r e e z i n g p l a t e l e t s P a t i e n t t e s t p l a t e l e t s h a v e b e e n f r o z e n s o t h a t s a m p l e s c o u l d b e a s s a y e d l a t e r i n b a t c h e s , a n d d o n o r a s s a y p l a t e l e t s h a v e b e e n f r o z e n f o r c o n v e n i e n c e . P o t e n t i a l a d v e r s e e f f e c t s o f s u c h f r e e z i n g h a v e b e e n e v a l u a t e d f o r h u m a n p l a t e l e t s i n a p l a t e l e t i m m u n o fl u o - r e s c e n c e a s s a y . 5 0 7 W h i l e t h e r e w a s s o m e l o s s i n p l a t e l e t y i e l d , t h e p l a t e l e t a n t i g e n i c i t y w a s a p p a r e n t l y m i n i m a l l y a f f e c t e d i n a n i n d i r e c t i m m u n o fl u o r e s c e n c e a s s a y , a n d f r e e z i n g 1 2 9 o n l y m i l d l y d e c r e a s e d t h e P A I g d e t e c t a b l e o n p a t i e n t p l a t e l e t s i n a d i r e c t i m m u n o fl u o r e s — c e n c e a s s a y . 1 9 1 , 2 4 0 , 5 0 8 I n a n P l a t e l e t f r e e z i n g h a s a l s o b e e n u s e d f o r c a n i n e a s s a y s y s t e m s . i n d i r e c t E L I S A , t h e b i n d i n g o f n o r m a l s e r a t o p r e v i o u s l y f r o z e n n o r m a l a s s a y p l a t e l e t s o v e r 1 3 w e e k s w a s q u i t e c o n s i s t e n t , b u t t h e b i n d i n g o f p o s i t i v e s e r u m s a m p l e s o v e r t i m e ‘ 9 ‘ I n a n i n d i r e c t fl o w c y t o m e t r i c p l a t e l e t w a s n o t d o n e t o c o n fi r m c o n t i n u e d r e a c t i v i t y i r n m u n o fl u o r e s c e n c e a s s a y , t h e u s e o f f r o z e n v e r s u s f r e s h p l a t e l e t s w a s e v a l u a t e d b y u s i n g s e r u m f r o m 3 h e a l t h y d o g s a n d f r o m 3 d o g s w i t h s u s p e c t e d I M T 2 4 0 T h e r e w a s r e p o r t e d l y n o s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e f r e s h a n d f r o z e n p l a t e l e t d a t a , t h o u g h t h e d a t a w e r e n o t s h o w n . T h e p o s s i b i l i t y t h a t f r e e z i n g a l t e r s t h e r e a c t i v i t y t o s o m e b u t n o t o t h e r a n t i b o d i e s m u s t b e c o n s i d e r e d . S t u d i e s o f p l a t e l e t s u r v i v a l i n d o g s u s i n g f r o z e n p l a t e l e t c o n c e n t r a t e s s h o w e d a m a r k e d d e c r e a s e i n s u r v i v a l w i t h p l a t e l e t s f r o z e n 1 y e a r a s c o m p a r e d t o f r e s h p l a t e l e t s 6 7 I t i s p o s s i b l e t h a t f r e e z e - t h a w s t e p s a l t e r p l a t e l e t a n t i g e n i c i t y a s w e l l a s p l a t e l e t s u r v i v a l . g . p o s i t i v e c o n v e r s i o n o f s t o r e d s a m p l e s I n d i r e c t t e s t s a r e o f t e n b a t c h e d s o t h a t m a n y s a m p l e s c a n b e r u n a t o n e t i m e , t h u s n e c e s s i t a t i n g t h e f r e e z i n g o f s e r u m o r p l a s m a s a m p l e s u n t i l t e s t d a y . T h e r e i s e v i d e n c e t o s u g g e s t t h a t I g G i n s t o r e d s e r a ( - 2 0 ° C f o r 3 m o n t h s ) f r o m p a t i e n t s w i t h I M T m a y d e v e l o p d i s u l fi d e - b o n d e d a g g r e g a t e s t h a t b i n d t o G P I I b / I I I a i n a n o n - F ( a b ’ ) 2 , n o n - F c m a n n e r ? 4 4 I n t h i s s t u d y , s e r u m s a m p l e s c o n v e r t e d f r o m n e g a t i v e t o p o s i t i v e w i t h t i m e , t h o u g h o n l y f o r p a t i e n t s w i t h d i a g n o s e s o f p r i m a r y I M T . T h e s e fi n d i n g s q u e s t i o n t h e m e a n i n g o f s o m e p o s i t i v e r e s u l t s w i t h i n d i r e c t a s s a y s , a n d s u g g e s t t h a t s a m p l e s f o r 1 3 0 i n d i r e c t a s s a y s s h o u l d n o t b e f r o z e n f o r p r o l o n g e d p e r i o d s a t ~ 2 0 ° C . M o r e w o r k i s r e q u i r e d k n o w t h e i m p a c t o f t h i s r e p o r t , b u t i t i n d i c a t e s t h e n e e d t o f u r t h e r e x p l o r e a n d d e fi n e t h e b i n d i n g o r i e n t a t i o n o f P A I g i n I M T . h . c y t o s o l i c r e a c t i v i t y A n o t h e r p r o b l e m w i t h i n d i r e c t a s s a y s r e l a t e s p r i m a r i l y t o t h e n e w e r a s s a y s t h a t u s e c a p t u r e d o r p u r i fi e d p l a t e l e t p r o t e i n s r a t h e r t h a n w h o l e p l a t e l e t s . S o m e s e r u m a n t i b o d i e s h a v e b e e n s h o w n t o r e a c t t o i n t e r n a l c y t o s o l i c p o r t i o n s o f p l a t e l e t s t h a t a r e n o t n o r m a l l y e x p o s e d o n t h e s u r f a c e o f i n t a c t p l a t e l e t s . 2 ” ' 5 ” ' 5 1 0 T h e s e c y t o s o l i c s i t e s a r e e x p o s e d w h e n s u r f a c e p r o t e i n s a r e e x t r a c t e d f r o m t h e p l a t e l e t m e m b r a n e . I n o n e s t u d y ? ” a n t i b o d i e s r e a c t i v e w i t h c y t o s o l i c e p i t o p e s o f a t l e a s t o n e g l y c o p r o t e i n w e r e p r e s e n t i n 6 6 % o f 4 7 s e r a f r o m p a t i e n t s w i t h c h r o n i c I M T , t h o u g h t h e y w e r e n e v e r p r e s e n t w i t h o u t a c c o m p a n y i n g a n t i b o d i e s r e a c t i v e t o e x o s o l i c e p i t o p e s . T h e s p e c i fi c i t y o f t h e s e r u m a n t i b o d i e s w i t h e x o s o l i c r e a c t i v i t y a p p e a r e d t o b e r e p r e s e n t a t i v e o f t h e P A I g i n t h e s e c a s e s . P a t i e n t s w h o h a d r e c o v e r e d f r o m o t h e r p l a t e l e t - d e s t r u c t i v e s t a t e s s u c h a s P T P a n d d r u g p u r p u r a o f t e n ( 3 8 % o f 1 6 t e s t e d ) h a d s e r u m a n t i b o d i e s w i t h c y t o s o l i c b u t n o t e x o s o l i c r e a c t i v i t y . A n t i b o d i e s r e a c t i v e t o c y t o s o l i c e p i t o p e s a r e t h e r e f o r e t h o u g h t t o b e p r o d u c e d i n p l a t e l e t d e s t r u c t i v e s t a t e s w h e n c y t o s o l i c m a t e r i a l i s m a d e a v a i l a b l e f o r p r e s e n t a t i o n t o t h e i m m u n e s y s t e m . S u c h a n t i b o d i e s a r e c u r r e n t l y s u s p e c t e d o f b e i n g n o n p a t h o g e n i c . T h e r e f o r e , w h i l e i n d i r e c t a s s a y s b a s e d o n c a p t u r e d a n t i g e n s o r p u r i fi e d p r o t e i n s r e d u c e n o n s p e c i fi c i m m u n o g l o b u l i n b i n d i n g t o t h e p l a t e l e t s u r f a c e a n d d e fi n e t h e t a r g e t o f P B I g , p o s i t i v e r e a c t i o n s a r e o n l y i n t e r p r e t a b l e a f t e r e x o s o l i c r e a c t i v i t y h a s b e e n c o n fi r m e d . 1 3 1 U s e o f a s s a y s b a s e d o n r e a c t i v i t y t o w h o l e p l a t e l e t s s h o u l d b e l e s s a f f e c t e d b y c y t o s o l i c r e a c t i v i t y , t h o u g h p a r t i a l r e a c t i v i t y t o i n t a c t p l a t e l e t s m a y o c c u r s e c o n d a r y t o c h a n g e s i n d u c e d b y c e n t r i f u g a t i o n a n d w a s h i n g ? ” G e l fi l t r a t i o n m a y b e a p r e f e r a b l e m e t h o d o f o b t a i n i n g w a s h e d p l a t e l e t s f o r i n d i r e c t a s s a y s b e c a u s e c y t o s o l i c r e a c t i v i t y w a s n o t d e t e c t a b l e i n s u c h s y s t e m s ? ” H o w e v e r , m o r e w o r k i s r e q u i r e d t o c o n fi r m t h a t c y t o s o l i c - r e a c t i v e a n t i b o d i e s a r e n o n p a t h o g e n i c , a s i t i s c o n c e i v a b l e t h a t i n v i v o b i n d i n g c o u l d o c c u r w i t h p l a t e l e t s u r f a c e p e r t u r b a t i o n s . A l s o , s i n c e a n t i b o d i e s h a v e b e e n s h o w n t o e n t e r T l y m p h o c y t e s v i a F c r e c e p t o r s a n d a f f e c t t h e i r f u n c t i o n , 5 1 1 p e r h a p s p l a t e l e t s c a n i n t e r n a l i z e a n t i b o d i e s b y a n F c - m e d i a t e d p r o c e s s t h a t r e s u l t s i n a l t e r e d p l a t e l e t f u n c t i o n . A n o t h e r p o t e n t i a l a d v a n t a g e t o u s i n g w h o l e p l a t e l e t s i n i n d i r e c t a s s a y s i s t h a t m a n y g l y c o p r o t e i n s , l i p i d s , a n d c a r b o h y d r a t e s a r e n o t i n c l u d e d i n a s s a y s b a s e d o n c a p t u r e d o r p u r i fi e d a n t i g e n s , b u t a l l p o t e n t i a l s u r f a c e t a r g e t s a r e t e s t e d w i t h w h o l e p l a t e l e t s . H o w e v e r , t h e r e i s a g r e a t e r p o t e n t i a l f o r n o n s p e c i fi c i m m u n o g l o b u l i n b i n d i n g i n c l u d i n g t h a t d u e t o i m m u n e c o m p l e x e s a n d i m m u n o g l o b u l i n a g g r e g a t e s b i n d i n g t o p l a t e l e t F c ' y r e c e p t o r s . S i n c e e s s e n t i a l l y a l l o f t h e c r o s s - l i n k e d I g G d i m e r s b o u n d t o p l a t e l e t F c y R I I c a n b e r e m o v e d w i t h a s i n g l e w a s h o f P B S , i m m u n e c o m p l e x e s m a y n o t b e d e t e c t e d b y a s s a y s e m p l o y i n g s e v e r a l w a s h s t e p s ? 3 1 H o w e v e r , t h e b e h a v i o r o f l a r g e r i m m u n e c o m p l e x e s t h a t m a y b e p r e s e n t i n d i s e a s e s t a t e s i s u n k n o w n . T h e c o n t r i b u t i o n o f s u c h F c ' y R I I b i n d i n g t o P B I g G r e m a i n s t o b e c l e a r l y e s t a b l i s h e d , b u t i t a p p e a r s t o b e m i n i m a l i n s e r a f r o m h u m a n I M T p a t i e n t s . 5 1 2 1 3 2 i . a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s M a n y h u m a n p l a t e l e t i m m u n o g l o b u l i n a s s a y s h a v e a c t u a l l y b e e n a s s a y s f o r I g G b e c a u s e t h e a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s h a v e b e e n I g G - s p e c i fi c . P a t h o g e n i c I g A a n d I g M a n t i b o d i e s h a v e t h e r e f o r e b e e n u n d e r d e t e c t e d ? ” W h e n S p A h a s b e e n u s e d t o d e t e c t p l a t e l e t a n t i b o d y , I g G 3 a n t i b o d i e s h a v e b e e n m i s s e d u n l e s s S p A i n c u b a t i o n s w e r e p r e c e d e d b y i n c u b a t i o n s w i t h a p o l y c l o n a l r a b b i t a n t i - I g G a n t i b o d y ? ” 1 4 I n t h e s e w a y s , t h e c h o i c e o f d e t e c t o r h a s a n o b v i o u s e f f e c t o n t h e s e n s i t i v i t y o f t h e a s s a y . I n a r e c e n t s t u d y o f 4 7 s e r a f r o m p a t i e n t s w i t h c h r o n i c I M T , i r n m u n o b e a d t e c h n i q u e s w e r e u s e d t o i d e n t i f y I g G , I g A , a n d I g M r e a c t i v i t y t o p u r i fi e d G p s I i b / I I I a a n d l b / I X , a n d t o c a p t u r e d g l y c o p r o t e i n s I V , a n d I a l I i a ? ” S p e c i fi c G P - r e a c t i v e a n t i b o d i e s t o e x o s o l i c e p i t o p e s w e r e d e t e c t e d i n 3 8 ( 8 0 % ) o f t h e s e r a , a n d w e r e I g G i n 7 1 % , I g A i n 5 8 % , a n d I g M i n 1 8 % o f t h e p o s i t i v e s a m p l e s . L e s s s u c c e s s f u l r a t e s f o r d e t e c t i o n o f s e r u m P B I g i n o t h e r s t u d i e s m a y r e l a t e t o t h e a t t e m p t e d d e t e c t i o n o f f e w e r i m m u n o g l o b u l i n c l a s s e s . T h e u s e o f p o l y c l o n a l a s o p p o s e d t o m o n o c l o n a l d e t e c t o r s m a y a l s o h a v e a n e f f e c t o n a s s a y s e n s i t i v i t y . T h e r e i s e v i d e n c e t h a t t h e h i n g e r e g i o n o f I g G a l l o w s e n o u g h fl e x i b i l i t y f o r a n a n t i b o d y m o l e c u l e t o b i n d t o a s i n g l e p l a t e l e t b y b o t h i t s F a b a n d F c e n d s s i m u l t a n e o u s l y . 5 1 5 A n t i b o d i e s b o u n d i n t h i s w a y m a y g o u n d e t e c t e d b y m o n o c l o n a l d e t e c t o r s t h a t b i n d t o t h e F c r e g i o n a n d r e q u i r e i t t o b e e x p o s e d . S i n c e t h e r e a r e a n e s t i m a t e d 1 0 0 0 - 2 0 0 0 F c y R I I p e r h u m a n p l a t e l e t , “ 3 ° " ‘ 3 1 t h i s n u m b e r o f P A I g c o u l d c o n c e i v a b l y b e m a s k e d u n l e s s d e t e c t o r s w i t h n o n — F e s p e c i fi c i t y a r e u s e d . T h e r e f o r e , t h e s e n s i t i v i t y o f m o n o c l o n a l F c - r e a c t i v e d e t e c t o r s m a y b e l o w e r t h a n o p t i m a l . 1 3 3 j . c o n t r o l s W h i l e p r o p e r p o s i t i v e a n d n e g a t i v e c o n t r o l s a r e i m p e r a t i v e i f a s s a y r e s u l t s a r e t o b e c o m p l e t e l y r e l i a b l e , t h e i r u s e i s n o t a l w a y s c l e a r l y o u t l i n e d . G e n e r a l l y , h o w e v e r , n o r m a l p l a t e l e t s i n c u b a t e d w i t h b u f f e r s e r v e s a s a n e g a t i v e c o n t r o l . P l a s m a / s e r u m s a m p l e s c o n t a i n i n g P B I g f u n c t i o n a s t h e p o s i t i v e c o n t r o l s . T h e c o n t r o l s e r a m u s t b e f r o m t h e s a m e s p e c i e s a s t h e t e s t s a m p l e s . A c o n t r o l t h a t i s n o t t y p i c a l l y i n c l u d e d b u t m a y b e i m p o r t a n t f o r i n d i r e c t a s s a y s i s a c o n t r o l a n t i g l o b u l i n r e a g e n t t h a t d o e s n o t b i n d s p e c i fi c a l l y t o t h e i m m u n o g l o b u l i n o f t h e s p e c i e s i n q u e s t i o n . U s i n g a fl o w c y t o m e t r i c t e c h n i q u e , C h r i s t o p o u l o s ‘ ” r e c e n t l y f o u n d t h a t p l a t e l e t s f r o m p e 0 p l e w i t h I M T , a s c o m p a r e d t o t h o s e f r o m n o r m a l p e o p l e , b o u n d m o r e n o n s p e c i fi c g o a t I g G a s w e l l a s s p e c i fi c g o a t a n t i - h u m a n I g G ( 7 ) . T h i s s u g g e s t s a n i n c r e a s e d " s t i c k i n e s s " o f I M T p l a t e l e t s t h a t m a y n o t n e c e s s a r i l y r e fl e c t t h e p r e s e n c e o f a s m u c h P A I g a s m i g h t b e t h o u g h t . F u r t h e r i n v e s t i g a t i o n s w i l l b e n e e d e d t o c l a r i f y t h i s p o t e n t i a l p r o b l e m . L a s t l y , s t a n d a r d i z a t i o n s u c h t h a t c o m p a r i s o n s c a n b e m a d e f r o m l o t t o l o t o f a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s i s o f t e n n o t d i s c u s s e d , b u t i s v e r y i m p o r t a n t , e s p e c i a l l y f o r q u a n t i t a t i v e a s s a y s . I f l o t - t o - l o t c o m p a r i s o n s a r e t o b e m a d e , t h e r e l a t i v e a c t i v i t y o f e a c h n e w b a t c h o f r e a g e n t m u s t b e t e s t e d a g a i n s t s o m e s t a n d a r d , g e n e r a l l y t h e p o s i t i v e c o n t r o l a n t i b o d y , u n l e s s n e w r e f e r e n c e r a n g e s a r e e s t a b l i s h e d w i t h e a c h n e w b a t c h . k . e r y t h r o c y t e a n d l e u k o c y t e c o n t a m i n a t i o n F a l s e p o s i t i v e r e a c t i o n s f o r p l a t e l e t a n t i b o d i e s c o u l d b e i n d u c e d b y t h e p r e s e n c e o f o t h e r c e l l t y p e s i n t h e i n c u b a t i o n m i x t u r e s . F o r d i r e c t a s s a y s , l y m p h o c y t e s b e a r i n g i m m u n o g l o b u l i n s c o u l d t h e o r e t i c a l l y b e p r o b l e m a t i c , t h o u g h 2 0 % l y m p h o c y t e 1 3 4 c o n t a m i n a t i o n o f t e s t p l a t e l e t s d i d n o t s i g n i fi c a n t l y a f f e c t P A I g r e s u l t s i n a s t u d y u s i n g a S p A - b a s e d r a d i o i m m u n o a s s a y ? 1 3 G r a n u l o c y t e s o r e r y t h r o c y t e s c o u l d a l s o b e t h e s o u r c e o f d e t e c t e d i m m u n o g l o b u l i n i n t h e e v e n t o f c o n c u r r e n t i m m u n e - m e d i a t e d n e u t r o p e n i a o r i m m u n e - m e d i a t e d h e m o l y t i c a n e m i a . C o n t a m i n a t i n g e r y t h r o c y t e s h a v e b e e n l y s e d b y a m m o n i u m o x a l a t e , b u t w h e t h e r o r n o t a l l e r y t h r o c y t e m e m b r a n e s g e t r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n i s n o t c l e a r . . F o r i n d i r e c t a s s a y s , l e u k o c y t e c o n t a m i n a t i o n o f t h e p l a t e l e t s i s t h e p r i m a r y c o n c e r n b e c a u s e l e u k o c y t e s h a v e n u m e r o u s h i g h a f f m i t y F c r e c e p t o r s t h a t c a n p o t e n t i a l l y b i n d s e r u m o r p l a s m a i m m u n o g l o b u l i n . T h i s c o u l d r a i s e t h e b a c k g r o u n d o r c u t o f f l e v e l f o r a l l s a m p l e s t e s t e d w i t h t h e l e u k o c y t e - c o n t a m i n a t e d b a t c h o f p l a t e l e t s a s c o m p a r e d t o t e s t s w i t h u n c o n t a m i n a t e d p l a t e l e t s . 1 . t o t a l v s . s u r f a c e i m m u n o g l o b u l i n M u c h o f t h e d i f fi c u l t y r e l a t e d t o t h e i n t e r p r e t a t i o n o f p l a t e l e t a n t i b o d y a s s a y r e - s u l t s h a s s t e m m e d f r o m t h e f a c t t h a t o v e r 9 9 % o f t h e t o t a l I g G a s s o c i a t e d w i t h h u m a n p l a t e l e t s i s i n t e r n a l a n d l o c a t e d i n ( 3 1 - g r a n u l e s ? ” 5 1 7 O n l y a s m a l l p e r c e n t a g e i s s u r f a c e b o u n d . M e g a k a r y o c y t e s a n d p l a t e l e t s i n c o r p o r a t e t h i s i n t e r n a l I g G b y fl u i d - p h a s e e n d o - c y t o s i s s u c h t h a t p l a t e l e t I g G c o n c e n t r a t i o n s a n d i s o t y p e d i s t r i b u t i o n s c o r r e l a t e d i r e c t l y w i t h t h o s e o f t h e p l a s m a . T h i s i s t r u e i n h e a l t h y p e 0 p l e a s w e l l a s i n p a t i e n t s w i t h a b n o r m a l p l a s m a I g G c o n c e n t r a t i o n s . I g A , I g M , a n d a l b u m i n a r e a l s o i n c o r p o r a t e d b y fl u i d p h a s e e n d o c y t o s i s a n d a r e p r e s e n t i n p l a t e l e t s a t c o n c e n t r a t i o n s p r o p o r t i o n a l t o p l a s - m a c o n c e n t r a t i o n s . 5 1 7 I n c o n t r a s t , t h e u p t a k e o f fi b r i n o g e n i s m e d i a t e d b y G P I I b / I I I a a n d l e a d s t o h i g h e r p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s o f fi b r i n o g e n t h a n w o u l d b e e x p e c t e d b y 1 3 5 fl u i d - p h a s e e n d o c y t o s i s . 5 1 8 S i n c e e n d o c y t o s i s c o n t i n u e s t h r o u g h o u t t h e c i r c u l a t o r y l i f e o f h u m a n p l a t e l e t s , i n t e r n a l I g G c o n c e n t r a t i o n s i n c r e a s e a s p l a t e l e t s a g e . I n c r e a s e d t o t a l P A I g G i s a l s o p r e s e n t i n l a r g e p l a t e l e t s t h a t c o n t a i n m o r e a - g r a n u l e s . S i n c e t h e m e g a t h r o m b o c y t e s a n d " s t r e s s " p l a t e l e t s 5 1 9 r e l e a s e d d u r i n g p e r i o d s o f i n t e n s e t h r o m b o p o i e s i s a r e l a r g e , o n e w o u l d e x p e c t t o t a l p l a t e l e t I g G c o n c e n t r a t i o n s , r e p o r t e d o n a p e r p l a t e l e t b a s i s , t o b e e l e v a t e d i n a n y a c u t e r e g e n e r a t i v e t h r o m b o c y t o p e - n i a , w h e t h e r i m m u n e o r n o n i m m u n e . T h i s i s i n d e e d t h e c a s e i n p e o p l e . S i m i l a r l y , b o t h t o t a l P A I g G a n d s u r f a c e P A I g G h a v e b e e n s h o w n t o b e l o w e r i n p a t i e n t s w i t h t h r o m b o c y t o p e n i a d u e t o m a r r o w f a i l u r e a n d m i n i m a l t h r o m b o p o i e t i c c a p a c i t y . T h u s t o t a l P A I g i s n o t a g o o d m a r k e r f o r i m m u n e d e s t r u c t i o n ; r a t h e r , i t a p p e a r s t o b e m o r e o f a g e n e r a l m a r k e r o f t h r o m b o p o i e s i s , m u c h a s r e t i c u l o c y t e s a r e a m a r k e r o f a c t i v e e r y t h r o p o i e s i s . 5 1 6 S u r f a c e — b o u n d P A I g G , h o w e v e r , a s O p p o s e d t o t o t a l P A I g G , h a s b e e n m i n i m a l l y e l e v a t e d i n n o n i m m u n e c o n d i t i o n s a s s o c i a t e d w i t h p e r i p h e r a l p l a t e l e t d e s t r u c t i o n , w h i l e m a r k e d l y e l e v a t e d i n p e o p l e w i t h c l i n i c a l I M T . ” ‘ ? 7 6 ' 5 ‘ 6 D i r e c t fl o w c y t o m e t r i c p l a t e l e t i r n m u n o fl u o r e s c e n c e e v a l u a t i o n s o f s u r f a c e P A I g G o n p l a t e l e t s o f t h r o m b o c y t o p e n i c p a t i e n t s h a s s h o w n t h a t p l a t e l e t p o p u l a t i o n s o f a l l e v a l u a t e d s i z e s c o n t r i b u t e d t h e s a m e p e r c e n t a g e o f t o t a l fl u o r e s c e n c e a s d i d t h e s a m e s i z e p o p u l a t i o n s o f p l a t e l e t s w i t h n o r m a l P A I g G . 5 2 0 T h e r e f o r e , e l e v a t e d s u r f a c e P A I g G i n t h r o m b o c y t o p e n i c p a t i e n t s i s n o t s i m p l y a n a r t i f a c t r e l a t e d t o a n i n c r e a s e d p e r c e n t a g e o f m i c r o t h r o m b o c y t e s o r m e g a t h r o m - b o c y t e s . I t a p p e a r s , t h e n , t h a t s u r f a c e P A I g G i s g e n e r a l l y r e fl e c t i v e o f a n t i p l a t e l e t a n t i b o d y , b u t m i n i m a l e l e v a t i o n s m a y o c c u r i n o t h e r d i s o r d e r s u s u a l l y c o n s i d e r e d t o l a c k a n i m m u n e p a t h o g e n e s i s . E l e v a t i o n s o f s u r f a c e P A I g G i n t h e s e c a s e s m a y r e fl e c t a n 1 3 6 u n s u s p e c t e d i m m u n e c o m p o n e n t , a n u n s u s p e c t e d t e c h n i c a l p r o b l e m , o r n o n p a t h o g e n i c i n c r e a s e s d u e t o c h a n g e s i n t h e p l a t e l e t s u r f a c e i n d u c e d b y t h e u n d e r l y i n g d i s e a s e s t a t e . T h e i m p o r t a n c e o f t h i s d i s c u s s i o n w i t h r e s p e c t t o a s s a y s f o r P A I g i s t h a t p l a t e l e t s u r f a c e i m m u n o g l o b u l i n a n d n o t t o t a l p l a t e l e t i m m u n o g l o b u l i n m u s t b e a s s e s s e d f o r m e a n i n g f u l r e s u l t s . A s s a y s w i t h s t e p s t h a t p u r p o s e l y ( s o n i c a t i o n , f r e e z e - t h a w , d e t e r g e n t t r e a t m e n t ) o r u n i n t e n t i o n a l l y 5 2 1 c a u s e p l a t e l e t l y s i s o r s e c r e t i o n m a y a l l o w d e t e c t i o n o f i n t e r n a l i m m u n o g l o b u l i n i f t h e fl u i d p h a s e c o n t a i n i n g t h e i n t e r n a l p l a t e l e t p r o d u c t s i s n o t s e p a r a t e d f r o m t h e p l a t e l e t s b e f o r e t h e fi n a l a s s e s s m e n t o f P A I g . 5 2 2 T h e s a m e c o n c l u s i o n s l i k e l y h o l d f o r d o g s . C a n i n e p l a t e l e t s a l s o c o n t a i n i n t e r n a l I g G w h i c h t h e y a c c u m u l a t e i n t h e c i r c u l a t i o n a s t h e y a g e , 5 2 3 a n d l a r g e p l a t e l e t s a r e ” 4 ° 5 2 “ S t u d i e s o f c a n i n e c y c l i c p r o d u c e d i n d o g s w i t h s t r o n g t h r o m b o p o i e t i c s t i m u l i . h e m a t o p o i e s i s h a v e s h o w n t h a t t h e c y c l i c i n c r e a s e s i n p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n a r e d i r e c t l y a s s o c i a t e d w i t h c y c l i c i n c r e a s e s i n m e a n p l a t e l e t d i a m e t e r a n d p l a s m a t h r o m b o p o i e t i n a c t i v i t y . 1 0 6 D o g s g i v e n I L - 6 h a d a s m a n y a s 2 0 % o f t h e i r p l a t e l e t s a s l a r g e a s e r y t h r o c y t e s , a n d p l a t e l e t s w e r e m o r e s e n s i t i v e t o p l a t e l e t a g o n i s t s ; h o w e v e r , i t i s n o t c l e a r i f t h e l a r g e p l a t e l e t s w e r e m o r e f u n c t i o n a l b e c a u s e o f t h e i r s i z e a l o n e o r b e c a u s e o f a n o t h e r e f f e c t o f I L - 6 . 9 T o g e t h e r t h e s e fi n d i n g s s u g g e s t t h a t i n d o g s , a s i n p e 0 p l e , t o t a l P A I g G m e a s u r e d o n a p e r p l a t e l e t b a s i s m a y a l s o i n c r e a s e i n r e s p o n s e t o a n y s t r o n g t h r o m b o p o i e t i c s t i m u l u s i n c o n c e r t w i t h a n i n c r e a s e d n u m b e r o f l a r g e p l a t e l e t s , a n d c i r c u l a t o r y e n d o c y t o s i s m a y a c c e n t u a t e t h e i n c r e a s e o v e r t i m e . M e a s u r e m e n t s o f t o t a l P A I g i n d o g s s h o u l d t h e r e f o r e b e i n t e r p r e t e d c a u t i o u s l y , a n d a s s a y d e v e l o p m e n t s h o u l d f o c u s o n d e t e c t i o n o f s u r f a c e P A I g . 1 3 7 T h e e f f e c t o f y o u n g p l a t e l e t s o n P A I g G h a s b e e n m i n i m a l l y e v a l u a t e d i n 4 d o g s , b u t t h e d e t a i l s o f t h e a s s a y f o r c a n i n e P A I g w e r e n o t r e p o r t e d ? ” I t i s t h e r e f o r e n o t c l e a r i f t h e a s s a y m e a s u r e d s u r f a c e P A I g o r t o t a l P A I g . T h e a s s a y w a s p r o b a b l y e i t h e r a 1 2 5 ’ 1 - l a b e l e d a n t i g l o b u l i n t e c h n i q u e o r a c o m p l e m e n t l y s i s i n h i b i t i o n a s s a y . D o g s w e r e p l a t e l e t p h e r e s e d , a n d t h e i r P A I g G c o n c e n t r a t i o n s w e r e m e a s u r e d a s p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s r o s e t o n o r m a l . T h e r e w a s n o c o n s i s t e n t e f f e c t o f y o u n g p l a t e l e t s o n i n c r e a s i n g P A I g G , s u g g e s t i n g t h a t y o u n g p l a t e l e t s d i d n o t a f f e c t r e s u l t s w i t h t h a t a s s a y . H o w e v e r , t h e p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s d r o p p e d m a x i m a l l y t o j u s t u n d e r 1 0 0 , 0 0 0 / [ 1 . 1 , a n d t h e r e w e r e n o d a t a t o i n d i c a t e t h a t p h e r e s i s i n d u c e d a n i n c r e a s e i n M P V . m . s a m p l e h a n d l i n g P r o p e r s a m p l e h a n d l i n g i s t y p i c a l l y n o t d i s c u s s e d i n r e p o r t s o f p l a t e l e t a n t i b o d y a s s a y s , b u t t h e r e a r e m a n y a s p e c t s o f s a m p l e m a n a g e m e n t t h a t m a y h a v e a n e f f e c t o n t h e o u t c o m e o f r e s u l t s . A s p e c t s t o c o n s i d e r i n c l u d e s a m p l e a g e , s a m p l e s t o r a g e t e m p e r a t u r e , a s s a y t e m p e r a t u r e , a n d g e n e r a l h a n d l i n g t r a u m a . V a r i a t i o n s i n t h e s e f a c t o r s h a s n o t g e n e r a l l y b e e n e v a l u a t e d i n a c r i t i c a l m a n n e r , s o t h e i m p o r t a n c e o f u n i f o r m s a m p l e h a n d l i n g i s n o t k n o w n . C l e a r l y , u n i f o r m h a n d l i n g o f c o n t r o l a n d t e s t s a m p l e s s h o u l d b e t h e r u l e t o a v o i d a n y p o t e n t i a l e f f e c t s o f i n c o n s i s t e n t h a n d l i n g . I t i s c o n c e i v a b l e t h a t e q u i v a l e n t h a n d l i n g o f n o r m a l c o n t r o l s a m p l e s a n d p a t i e n t s a m p l e s d o e s n o t a l w a y s o c c u r d u e t o t h e r e a d y a v a i l a b i l i t y o f n o r m a l c o n t r o l s u b j e c t s b u t t h e s p o r a d i c a n d s o m e t i m e s u n t i m e l y a p p e a r a n c e o f p a t i e n t s . T h e n e e d f o r s a m p l e h a n d l i n g c o n s i s t e n c i e s i n d o g s h a s b e e n n o t e d . 2 1 1 3 8 C . V e t e r i n a r y A s s a y s f o r P A I g a n d P B I g A s s a y d e v e l o p m e n t f o r c a n i n e I M T i s i n i t s i n f a n c y c o m p a r e d t o a s s a y d e v e l o p m e n t f o r h u m a n I M T . B e t t e r v e t e r i n a r y a s s a y s h a v e b e e n d e v e l o p e d i n r e c e n t y e a r s , b u t t h e y h a v e n o t y e t b e e n w i d e l y t e s t e d a n d f e w r e s u l t s h a v e b e e n p u b l i s h e d . E s t i m a t e s o f a s s a y s e n s i t i v i t i e s a n d s p e c i fi c i t i e s h a v e b e e n r e g u l a r l y r e p o r t e d , b u t t h e y m u s t b e i n t e r p r e t e d c a u t i o u s l y . S u c h v a l u e s a r e b a s e d o n t h e a b i l i t y t o d i f f e r e n t i a t e i m m u n e - m e d i a t e d f r o m n o n i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c c o n d i t i o n s . T h i s d i f f e r e n t i a t i o n c a n n o t c u r r e n t l y b e d o n e b e c a u s e t h e r e i s n o d e fi n i t i v e d i a g n o s t i c t e s t ( " g o l d s t a n d a r d " ) t o c o n fi r m t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f i m m u n e - m e d i a t e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n . T h e c o n t r i b u t i o n o f i m m u n e - m e d i a t e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n t o t h e t h r o m b o c y t o p e n i a o f m a n y d i s e a s e s i s t h e r e f o r e u n k n o w n . I n l i e u o f s u c h a d e fi n i t i v e t e s t , t h e d i a g n o s e s o f t h r o m b o c y t o p e n i c c o n d i t i o n s h a v e g e n e r a l l y b e e n m a d e c l i n i c a l l y a n d a r e s u b j e c t t o e r r o r . A s s t a t e d b y C h r i s t o p o u l o s , " I t i s l o g i c a l t o a r g u e t h a t t h e s e n s i t i v i t y a n d s p e c i fi c i t y o f a n y n e w m e t h o d f o r P S I g G [ p l a t e l e t s u r f a c e I g G ] d e t e c t i o n s h o u l d r e f e r t o i t s a b i l i t y t o r e p r o d u c i b i l i t y d e t e c t k n o w n a m o u n t s o f I g G o n t h e p l a t e l e t s u r f a c e r a t h e r t h a n t h e c o m p a t i b i l i t y o f i t s r e s u l t s w i t h t h e s u b j e c t i v e c l i n i c a l d i a g n o s i s o f I T P w h i c h , a f t e r a l l , i s a h e t e r o g e n e o u s e n t i t y a n d a d i a g n o s i s o f e x c l u s i o n . " 4 7 9 T h o u g h s o m e r e p o r t s i m p l y o t h e r w i s e , c u r r e n t v e t e r i n a r y a s s a y s f o r P A I g s h o u l d n o t b e e x p e c t e d t o d i f f e r e n t i a t e p r i m a r y a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a f r o m o t h e r i m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i c d i s o r d e r s . R a t h e r , i f t h e h u m a n t h r o m b o c y t o p e n i c c o n d i t i o n s c a n s e r v e a s a g u i d e , a m o r e r e a s o n a b l e g o a l o f t h e s e a s s a y s w o u l d b e t o d i f f e r e n t i a t e p r i m a r y a n d s e c o n d a r y i m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i c c o n d i t i o n s f r o m t h r o m b o c y t O p e n i c c o n d i t i o n s d u e t o n o n i m m u n e m e c h a n i s m s . 1 3 9 1 . P F 3 r e l e a s e a s s a y O n e o f t h e e a r l i e s t a p p r o a c h e s t o d i a g n o s i n g I M T i n d o g s w a s t h r o u g h u s e o f t h e i n d i r e c t p l a t e l e t f a c t o r - 3 r e l e a s e ( P F 3 ) a s s a y ? 3 9 T h e s a m p l e s u s e d f o r t h e c a n i n e P F 3 a s s a y s h a v e b e e n e i t h e r d i a l y z e d g l o b u l i n f r a c t i o n s o b t a i n e d b y a m m o n i u m s u l f a t e p r e c i p i t a t i o n 2 3 9 o r s e r u m h e a t e d f o r 3 0 m i n u t e s a t 5 6 ° C w i t h ? “ o r w i t h o u t 5 2 5 s u b s e q u e n t b a r i u m s u l f a t e a d s o r p t i o n t o r e m o v e r e s i d u a l t h r o m b i n . L i k e t h e h u m a n a s s a y a f t e r w h i c h i t w a s m o d e l e d , 5 2 6 t h e t h e o r y b e h i n d t h e c a n i n e P F 3 a s s a y i s t h a t a n t i p l a t e l e t a n t i b o d i e s i n a t e s t p a t i e n t ’ s p l a s m a o r s e r u m w i l l b i n d t o n o r m a l a s s a y p l a t e l e t s a n d i n j u r e t h e m s o t h e y e x p r e s s o r r e l e a s e m o r e p h o s p h o l i p i d ( c a l l e d P F 3 ) w h i c h t h e n a c c e l e r a t e s c o a g u l a t i o n . C o a g u l a t i o n t i m e i s a c t u a l l y t h e t e s t p a r a m e t e r m e a s u r e d , a p o s i t i v e s a m p l e b e i n g a s s o c i a t e d w i t h a s i g n i fi c a n t l y s h o r t e n e d c o a g u l a t i o n t i m e c o m p a r e d t o n o r m a l c o n t r o l s a m p l e s . C l e a r l y , t h i s i s a v e r y i n d i r e c t t e s t w h i c h d o e s n o t s p e c i fi c a l l y d e t e c t a n t i b o d i e s a t a l l . R a t h e r , i t n o n s p e c i fi c a l l y d e t e c t s a n y s e r u m o r p l a s m a f a c t o r s c a p a b l e o f a c c e l e r a t i n g c o a g u l a t i o n b y a n y m e a n s . B e s i d e s a u t o a n t i b o d i e s , p o s i t i v e r e s u l t s m a y b e d u e t o a l l o a n t i b o d i e s o r c i r c u l a t i n g i m m u n e c o m p l e x e s . A g g r e g a t e d i m m u n o g l o b u l i n s f o r m e d t h r o u g h s a m p l e m a n i p u l a t i o n s m a y a l s o c a u s e p o s i t i v e r e s u l t s , e s p e c i a l l y w i t h s e r u m a n d f r a c t i o n a t e d s a m p l e s . W h e n h e a t e d a n d u n h e a t e d n o r m a l s e r u m s a m p l e s w e r e t e s t e d i n a n i n d i r e c t E L I S A f o r t i t e r s o f c a n i n e P B I g , s i g n i fi c a n t l y m o r e P B I g w a s c o n s i s t e n t l y d e t e c t e d i n t h e h e a t e d s a m p l e s , l i k e l y b e c a u s e o f a g g r e g a t e d I g G ? 3 7 S u c h a g g r e g a t e s g e n e r a t e d i n v i t r o b y h e a t i n g , 2 3 7 c o n c e n t r a t i n g , 4 4 5 o r f r o z e n s t o r a g e z m ' m ' m m a y e l a b o r a t e P F 3 f r o m a s s a y p l a t e l e t s c a u s i n g a c c e l e r a t e d c o a g u l a t i o n a n d f a l s e p o s i t i v e r e s u l t s ? ” 5 2 7 L i p e m i c a n d h e m o l y z e d s a m p l e s h a v e a l s o b e e n a s s o c i a t e d w i t h f a l s e 1 4 0 p o s i t i v e r e s u l t s ? ” N e g a t i v e r e s u l t s m a y o c c u r w h e n e v e r a n t i b o d y b i n d i n g d o e s n o t s u f fi c i e n t l y a l t e r t h e p l a t e l e t s u r f a c e t o e x p o s e P F 3 , o r w h e n t i t e r s a r e u n d e t e c t a b l y l o w . I n o n e s y s t e m , t h e r e p o r t e d r a n g e a n d m e a n o f c o a g u l a t i o n t i m e s f o r 5 0 c o n t r o l s e r a t e s t e d a t d i f f e r e n t t i m e s a n d w i t h d i f f e r e n t P R P b a t c h e s w e r e 5 0 - 8 5 . 5 a n d 6 6 . 1 j ; 8 . 7 s e c o n d s , r e s p e c t i v e l y ? ” T w o s a m p l e s h a d t i m e s o f 9 9 . 3 a n d 1 0 8 . 6 s e c o n d s a n d w e r e n o t i n c l u d e d . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e v a r i a b i l i t y a m o n g n o r m a l t e s t s a m p l e s a n d d o n o r p l a t e l e t s i s c o n s i d e r a b l e . B e c a u s e o f t h i s v a r i a b i l i t y w h i c h r e l a t e s i n p a r t t o d o n o r p l a t e l e t r e a c t i v i t y , t e s t s a m p l e s a r e g e n e r a l l y t e s t e d i n t a n d e m w i t h c o n t r o l s ? ” H o w e v e r , m a n y c o n t r o l s m a y b e r e q u i r e d t o p r o v i d e a r e a s o n a b l e i d e a o f n o r m a l v a r i a t i o n w i t h e a c h r u n o f t h e a s s a y . P F 3 r e s u l t s f r o m n o r m a l d o g s h a v e g e n e r a l l y b e e n e i t h e r s u p e r fi c i a l l y a d d r e s s e d o r o m i t t e d f r o m p u b l i s h e d r e p o r t s , s o i t i s d i f fi c u l t t o t e l l h o w w e l l c o n t r o l l e d t h e a s s a y h a s b e e n i n d i f f e r e n t h a n d s . ‘ ” ~ ” 9 ' 2 “ 6 ' 3 4 3 R e m o v a l o f P F 3 p o s i t i v i t y b y p r i o r i n c u b a t i o n o f s a m p l e s w i t h a m o n o s p e c i fi c r a b b i t a n t i - [ c a n i n e I g G ] a n t i b o d y h a s i n c r i m i n a t e d I g G a s t h e f a c t o r r e s p o n s i b l e f o r P F 3 p o s i t i v i t y i n s o m e d o g s w i t h c l i n i c a l I M T ? ” W i t h n o r m a l c o n t r o l s a m p l e s , t h e a n t i - [ c a n i n e I g G ] a n t i b o d y s h o r t e n e d c o a g u l a t i o n t i m e s , p o s s i b l y d u e t o t h e f o r m a t i o n o f i m m u n e c o m p l e x e s , i n s t e a d o f p r o l o n g i n g t h e m a s o c c u r r e d i n 6 o f 8 s a m p l e s f r o m d o g s w i t h p o s i t i v e P F 3 r e s u l t s . W h i l e s u c h s t u d i e s s u g g e s t i m m u n o g l o b u l i n m e d i a t i o n o f t h e P F 3 p o s i t i v i t y , t h e y d o n o t d i f f e r e n t i a t e a u t o a n t i b o d y f r o m a l l o a n t i b o d y , a g g r e g a t e d I g G , o r i m m u n e c o m p l e x e s . I n a s t u d y o f d o g s w i t h s u s p e c t e d I M T , p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s w e r e l e s s t h a n 2 0 , 0 0 0 / u l i n 6 o f 9 ( 6 7 % ) p o s i t i v e s a m p l e s b u t i n o n l y 7 o f 2 2 ( 3 4 % ) n e g a t i v e s a m p l e s ? ” I f t h e n e g a t i v e d o g s i n t h i s s t u d y t r u l y h a d I M T , t h e d a t a i n d i c a t e a g r e a t e r 1 4 1 s e n s i t i v i t y o f t h e a s s a y i n t h e p r e s e n c e o f m a r k e d a s c o m p a r e d t o m i l d t o m o d e r a t e t h r o m b o c y t o p e n i a . C u m u l a t i v e l y , 7 2 o f 1 6 8 r e p o r t e d d o g s ( 4 3 % ) w i t h t h i s d i a g n o s i s h a d p o s i t i v e P F 3 r e s u l t s . “ 5 ‘ " “ " ~ 2 3 9 ' 2 “ 6 ' 2 “ 7 ' 3 4 3 T h i s m e d i o c r e s e n s i t i v i t y f o r s u b s t a n t i a t i n g a c l i n i c a l d i a g n o s i s o f I M T , a n d t h e g r e a t p o t e n t i a l f o r n o n s p e c i fi c p o s i t i v e r e s u l t s m a k e t h e P F 3 a s s a y o n e t h a t c a n n o t b e r e c o m m e n d e d . 2 . m e g a k a r y o c y t e i m m u n o fl u o r e s c e n c e A n o t h e r e a r l y v e t e r i n a r y a s s a y w a s t h e d i r e c t m e g a k a r y o c y t e i m m u n o fl u o r e s c e n c e a s s a y ( D - M I F A ) w h i c h h a s b e e n c o n s i d e r e d a t e s t f o r a n t i p l a t e l e t a n t i b o d i e s ? ” T h e M I F A , i n c o n t r a s t t o t h e P F 3 a s s a y w h i c h a s s e s s e s p l a t e l e t a c t i v a t i o n a n d c o a g u l a t i o n , i s a c t u a l l y a n a n t i b o d y d e t e c t i o n t e c h n i q u e . I n t h i s a s s a y , fl u o r e s c e i n - c o n j u g a t e d a n t i b o d i e s t o c a n i n e i m m u n o g l o b u l i n s a r e i n c u b a t e d w i t h fi x e d b o n e m a r r o w s m e a r s f r o m t h r o m b o c y t o p e n i c o r c o n t r o l p a t i e n t s . A f t e r w a s h i n g , m e g a k a r y o c y t e s a r e m i c r o s c o p i c a l - l y i n s p e c t e d f o r fl u o r e s c e n c e . P o s i t i v e m e g a k a r y o c y t e fl u o r e s c e n c e i s c o n s i d e r e d i n d i c a t i v e o f m e g a k a r y o c y t e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n w h i c h h a s i n t u r n b e e n c o n s i d e r e d d i a g n o s t i c o f a n t i b o d y — m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a . I n d o g s , J o s h i a n d J a i n 3 3 1 s h o w e d t h a t i n j e c t e d r a b b i t a n t i - [ c a n i n e p l a t e l e t ] I g G c o u l d b e d e t e c t e d o n m e g a k a r y o c y t e s b y a D - M I F A . T h i s s i m u l t a n e o u s l y d e m o n s t r a t e d t h a t a D - M I F A c o u l d d e t e c t m e g a k a r y o c y t e - b o u n d I g G a n d t h a t c a n i n e p l a t e l e t s a n d m e g a k a r y o c y t e s s h a r e a t l e a s t s o m e a n t i g e n i c s i t e s . A s d i s c u s s e d a b o v e , a n t i b o d i e s r e a c t i v e w i t h h u m a n p l a t e l e t s h a v e b e e n s h o w n t o h a v e v a r i a b l e r e a c t i v i t y w i t h h u m a n m e g a k a r y o c y t e s ; s o m e r e a c t w i t h e s s e n t i a l l y a l l m e g a k a r y o c y t e s w h i l e o t h e r a n t i b o d i e s a r e u n r e a c t i v e w i t h m o s t m e g a k a r y o c y t e s . ” S o m e a n t i b o d i e s a p p a r e n t l y r e c o g n i z e 1 4 2 m e g a k a r y o c y t e e p i t o p e s o n l y a f t e r t h e m e g a k a r y o c y t e s h a v e r e a c h e d a n a d v a n c e d s t a g e o f m a t u r a t i o n . B e c a u s e c a n i n e p l a t e l e t s a n d m e g a k a r y o c y t e s m a y a l s o n o t b e a n t i g e n i c a l - l y i d e n t i c a l , D - M I F A p o s i t i v i t y m a y n o t a l w a y s m a t c h P A I g p o s i t i v i t y . T h e f i r s t p r o b l e m t h a t m a y b e e n c o u n t e r e d w i t h D - M I F A s i s i n a d e q u a t e s a m p l e s . S o m e m a r r o w s a m p l e s a r e d e v o i d o f i n t a c t m e g a k a r y o c y t e s o r h a v e t o o f e w t o c o n fi d e n t l y e v a l u a t e . ” " 2 4 ” ” ? ? ? W i t h a d e q u a t e s a m p l e s , h i g h b a c k g r o u n d fl u o r e s c e n c e h a s i n t e r f e r e d w i t h t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f p o s i t i v e f r o m n e g a t i v e ? “ 5 2 8 t h o u g h a fi r s t w a s h o f m a r r o w a s p i r a t e s b e f o r e i n c u b a t i n g w i t h a n t i s e r u m h e l p e d d e c r e a s e t h i s b a c k g r o u n d fl u o r e s c e n c e ? ” E v e n w h e n s a m p l e s a r e a d e q u a t e a n d fl u o r e s c e n c e i s d e t e c t e d a b o v e b a c k g r o u n d l e v e l s , t h e n a t u r e o f t h e fl u o r e s c e n c e m a y b e i n q u e s t i o n . W h e n d r i e d m a r r o w s m e a r s a r e u s e d i n s t e a d o f c e l l s u s p e n s i o n s , a s h a s b e e n t h e r u l e f o r v e t e r i n a r y a s s a y s , d a m a g e d c e l l s m a y a l l o w d e t e c t i o n o f i n t r a c e l l u l a r i m m u n o g l o b u l i n s w h e n i n f a c t n o r e l e v a n t s u r f a c e - b o u n d i m m u n o g l o b u l i n i s p r e s e n t . ” M e g a k a r y o c y t e s i n c o r p o r a t e i m m u n o - g l o b u l i n s i n t o t h e i r a g r a n u l e s b y e n d o c y t o s i s a s d i s c u s s e d a b o v e f o r p l a t e l e t s ? 1 7 T h e fl u o r e s c e n c e o f a n t i b o d y - c o a t e d h u m a n m e g a k a r y o c y t e s o n s u c h a i r - d r i e d s m e a r s , a s o p p o s e d t o c e l l s i n s u s p e n s i o n , r o u t i n e l y h a s a p a t c h y c y t o p l a s m i c p a t t e r n w h i l e r i m p a t t e r n s c h a r a c t e r i s t i c o f s u r f a c e r e a c t i v i t y c a n n o t b e a p p r e c i a t e d . ” M e g a k a r y o c y t e fl u o r e s c e n c e m a y t h e r e f o r e b e m i s l e a d i n g o n a i r - d r i e d s m e a r s . U s e o f c e l l s u s p e n s i o n s w o u l d e l i m i n a t e t h e c o m p l i c a t i o n o f d e t e c t i n g i n t e r n a l I g G e x p o s e d b y s m e a r i n g t r a u m a . P r o p e r a s s a y c o n t r o l s a r e a n o t h e r c o n c e r n . I t i s n o t c l e a r f r o m s o m e r e p o r t s i f a s i n g l e n e g a t i v e c o n t r o l b o n e m a r r o w s a m p l e i s u s e d r e p e a t e d l y o r i f s a m p l e s f r o m d i f f e r e n t n o r m a l d o g s a r e u s e d . 2 4 6 I t w o u l d b e i m p o r t a n t t o u s e m a n y n o r m a l d o g s t o g e t 1 4 3 a n a p p r e c i a t i o n o f t h e v a r i a b i l i t y i n n o r m a l b a c k g r o u n d fl u o r e s c e n c e . I n s o m e c a s e s , p l a t e l e t s p r e s e n t o n s t a i n e d p r e p a r a t i o n s h a v e s e r v e d a s p o s i t i v e c o n t r o l s . T h i s i s i n e s s e n c e u s i n g t h e t e s t a s i t s o w n c o n t r o l . I t w o u l d b e m o r e a p p r o p r i a t e t o i n c l u d e i n e a c h r u n o f t h e a s s a y a p o s i t i v e c o n t r o l m a d e b y p r e i n c u b a t i n g a n o r m a l b o n e m a r r o w p r e p a r a t i o n w i t h a n a n t i b o d y r e c o g n i z i n g a m e g a k a r y o c y t e s u r f a c e e p i t o p e . T h i s a n d a p p r o p r i a t e n e g a t i v e c o n t r o l s w o u l d c o n fi r m t h e e x p e c t e d s p e c i fi c a n d n o n s p e c i fi c r e a c t i v i t y o f t h e fl u o r e s c e i n - l a b e l e d s e c o n d a r y a n t i b o d y w i t h e a c h r u n o f t h e a s s a y . A n o t h e r p o s s i b l e p r o b l e m w i t h D - M I F A s d e p e n d s o n w h e t h e r o r n o t m e g a k a r y - o c y t e s h a v e s u r f a c e F c r e c e p t o r s . A t t h i s t i m e i t i s n o t k n o w n i f m e g a k a r y o c y t e s o r c a n i n e p l a t e l e t s h a v e F c r e c e p t o r s . 2 1 I f p r e s e n t , t h e y c o u l d b i n d n o n s p e c i fi c i m m u n o g l o b — u l i n i n c l u d i n g a n y a n t i b o d i e s u s e d a s a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s . 3 2 4 T h e c u m u l a t i v e s e n s i t i v i t y o f D - M I F A s f o r s u b s t a n t i a t i n g c l i n i c a l d i a g n o s e s o f I M T i n 4 4 r e p o r t e d d o g s i s a b o u t 5 0 % . “ 5 1 ' 2 ‘ ” 2 4 6 W h i l e t h i s s e n s i t i v i t y i s s i m i l a r t o t h a t o f t h e P F 3 a s s a y , r e s u l t s o f t h e 2 a s s a y s o n t h e s a m e d o g s d o n o t c o r r e l a t e p e r f e c t l y . I n o n e s t u d y , 6 o f 9 D - M I F A - p o s i t i v e d o g s w e r e P F 3 — n e g a t i v e , s u g g e s t i n g i n c r e a s e d s e n s i t i v i t y o f t h e d i r e c t a s s a y . ” " 5 ” S i m i l a r l y , i n a n o t h e r s t u d y o f d o g s w i t h s o l i d t u m o r s , n e g a t i v e P F 3 r e s u l t s w e r e p r e s e n t i n 6 o f 7 d o g s w i t h p o s i t i v e D - M I F A r e s u l t s . ” 3 I n b o t h s t u d i e s , P F 3 p o s i t i v i t y w a s m o r e l i k e l y w i t h s e v e r e t h r o m b o c y t o p e n i a . A D - M I F A h a s a l s o b e e n c o m p a r e d t o a n i n d i r e c t p l a t e l e t i m m u n o fl u o r e s c e n c e a s s a y f o r P B I g , a n d n e i t h e r a s s a y w a s c o n s i s t e n t l y m o r e s e n s i t i v e ? “ 1 T w o o f 5 d o g s w i t h p o s i t i v e D - M I F A fl u o r e s c e n c e h a d n e g a t i v e r e s u l t s i n t h e i n d i r e c t fl u o r e s c e n c e a s s a y , a n d 5 o f t h e 7 d o g s w i t h n e g a t i v e D - M I F A r e s u l t s w e r e p o s i t i v e i n t h e i n d i r e c t a s s a y ? “ 1 P o s i t i v e D - M I F A r e s u l t s w i t h n e g a t i v e r e s u l t s i n i n d i r e c t a s s a y s s u g g e s t t h a t D - M I F A 1 4 4 r e s u l t s a r e m o r e s e n s i t i v e , t h a t t h e y a r e a s s o c i a t e d w i t h f a l s e p o s i t i v e r e s u l t s , o r b o t h . N e g a t i v e D — M I F A r e s u l t s w i t h p o s i t i v e r e s u l t s f o r c i r c u l a t i n g P B I g s u g g e s t t h a t m e g a k a r y o c y t e s m a y n o t a l w a y s b e i n v o l v e d a n t i g e n i c a l l y i n I M T , t h a t t h e i n d i r e c t a s s a y s p r o d u c e f a l s e p o s i t i v e r e s u l t s , o r b o t h . W i t h o u t a s t a n d a r d f o r d i a g n o s i n g I M T , s e p a r a t i n g t r u e p o s i t i v e s a n d t r u e n e g a t i v e s f r o m f a l s e p o s i t i v e s a n d f a l s e n e g a t i v e s i s i m p o s s i b l e . C a n i n e s e r u m f r o m 1 d o g h a s a l s o b e e n a s s e s s e d f o r m e g a k a r y o c t e - b i n d a b l e i m m u n o g l o b u l i n i n a n i n d i r e c t M I F A , t h o u g h t h e m e t h o d s w e r e n o t d e s c r i b e d a n d t h e r e s u l t w a s n e g a t i v e . 1 4 7 ( M u r t a u g h & J a c o b s , 1 9 8 5 ) T h e m a j o r p r o b l e m s a s s o c i a t e d w i t h i n d i r e c t M I F A s r e l a t e t o a d e q u a t e c o n t r o l s , a n d i n t e r p r e t a t i o n o f t h e r e s u l t s i s w e a k e n e d b y t h e s a m e f a c t o r s t h a t a f f e c t a l l i n d i r e c t a s s a y s a s o u t l i n e d p r e v i o u s l y . 3 . E L I S A s S e v e r a l e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y s ( E L I S A s ) h a v e b e e n d e v e l o p e d t o d e t e c t e i t h e r P A I g o n p a t i e n t s ’ p l a t e l e t s o r P B I g i n p a t i e n t s ’ p l a s m a s a m p l e s . I n t h e o r y , E L I S A s a r e a t t r a c t i v e b e c a u s e o f t h e i r r e l a t i v e s i m p l i c i t y a n d n o n r e l i a n c e o n e x p e n s i v e i n s t r u m e n t s a n d r a d i o a c t i v i t y . I n p r a c t i c e h o w e v e r , t h e y h a v e b e e n a s s o c i a t e d w i t h s u c h p r o b l e m s a s a r e l a t i v e l y l a r g e a m o u n t o f n o n s p e c i fi c b a c k g r o u n d b i n d i n g ? ” 2 3 7 a . w i t h p o l y c l o n a l a n t i - [ c a n i n e I g G ] T h e fi r s t p u b l i s h e d E L I S A f o r u s e i n d i a g n o s i n g I M T i n d o g s w a s a n i n d i r e c t a s s a y f o r P B I g . 1 9 1 A h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e - c o n j u g a t e d , p o l y c l o n a l a n t i - [ c a n i n e I g G ] a d s o r b e d a g a i n s t p o o l e d p l a t e l e t s f r o m 4 h e a l t h y d o g s w a s u s e d t o d e t e c t p l a t e l e t - b o u n d 1 4 5 I g G a f t e r i n c u b a t i o n o f t e s t a n d c o n t r o l s e r a w i t h n o r m a l d o n o r p l a t e l e t s . T h e a s s a y a p p e a r e d t o b e a n i m p r o v e m e n t o v e r t h e P F 3 a s s a y s i n c e 1 5 o f 1 7 d o g s ( 8 8 % ) w i t h c l i n i c a l d i a g n o s e s o f I M T h a d p o s i t i v e E L I S A r e s u l t s w h i l e o n l y 5 3 % o f t h e s a m e d o g s h a d p o s i t i v e P F 3 r e s u l t s . W h i l e a n a p p a r e n t i m p r o v e m e n t o v e r t h e P F 3 a s s a y , t h i s E L I S A s t i l l s u f f e r e d s u c h p r o b l e m s i n h e r e n t i n i n d i r e c t a s s a y s a s p o t e n t i a l p o s i t i v i t y d u e t o n o n s p e c i fi c i m m u n e c o m p l e x e s , i m m u n o g l o b u l i n a g g r e g a t e s , a n d a l l o a n t i b o d i e s . A d d i t i o n a l c o n c e r n s w i t h t h e a s s a y r e l a t e t o s a m p l e m a n a g e m e n t , n o n s p e c i fi c b a c k g r o u n d b i n d i n g , p l a t e l e t s t o r a g e c o n d i t i o n s , a n d t h e p o s i t i v e c o n t r o l . T e s t s e r a w e r e h e a t e d t o 5 6 ° C f o r 3 0 m i n u t e s t o i n a c t i v a t e t h r o m b i n g e n e r a t e d d u r i n g c l o t t i n g , a n d t h e y w e r e t h e n f r o z e n u n t i l u s e , t h u s c r e a t i n g t h e p o t e n t i a l f o r i n v i t r o i m m u n o g l o b u l i n a g g r e g a t e f o r m a t i o n . N o n s p e c i fi c a g g r e g a t e s c o u l d h a v e i n c r e a s e d t h e a m o u n t o f P B I g , 2 3 7 t h u s d e c r e a s i n g t h e s i g n a l - t o - n o i s e r a t i o w h i c h w a s l o w c o m p a r e d t o t h e c a p a b i l i t i e s o f o t h e r a s s a y s . T h e m e a n a n d h i g h a b s o r b a n c e o f p o s i t i v e s a m p l e s w e r e o n l y 2 . 2 a n d 4 . 5 t i m e s t h e m e a n o f n o r m a l s a m p l e s , r e s p e c t i v e l y . N o n s p e c i fi c a d h e r e n c e o f i m m u n o g l o b u l i n s t o t h e p o l y s t y r e n e w e l l s u s e d i n t h e a s s a y m a y a l s o h a v e c o n t r i b u t e d t o t h e h i g h b a c k g r o u n d v a l u e s . T h e n o r m a l d o n o r p l a t e l e t s f o r t h e a s s a y w e r e c o l l e c t e d i n E D T A a n d s t o r e d a f t e r w a s h i n g a t 4 o r - 7 0 ° C b e f o r e u s e . R e s u l t s f r o m t e s t i n g n o r m a l s e r a o n t h e f r o z e n p l a t e l e t s o v e r 1 3 w e e k s w e r e q u i t e c o n s i s t e n t , b u t t h e r e w e r e n o d a t a t o i n d i c a t e t h a t t h e r e f r i g e r a t e d ( 4 ° C ) p l a t e l e t s b e h a v e d s i m i l a r l y . A l s o , t h e b i n d i n g o f p o s i t i v e s a m p l e s o v e r t i m e w i t h t h e t w o b a t c h e s o f p l a t e l e t s w a s n o t d o n e t o c o n fi r m c o n t i n u e d r e a c t i v i t y . T h e p o t e n t i a l p r o b l e m s w i t h E D T A h a v e b e e n d i s c u s s e d a b o v e . 1 4 6 A s f o r c o n t r o l s , a p o s i t i v e c o n t r o l s e r u m a n d n e g a t i v e c o n t r o l s e r a f r o m a t l e a s t 5 h e a l t h y c o n t r o l d o g s w e r e i n c l u d e d w i t h e a c h r u n o f t h e a s s a y . H o w e v e r , t h e p o s i t i v e c o n t r o l s e r u m w a s a r a b b i t a n t i - [ c a n i n e p l a t e l e t ] s e r u m t h a t h a d t o b e d e t e c t e d w i t h a n a n t i - [ r a b b i t I g G ] a n t i b o d y i n s t e a d o f t h e a c t u a l a s s a y a n t i - [ c a n i n e I g G ] a n t i b o d y . T h e a c t i v i t y o f t h e a s s a y ’ s s e c o n d a r y a n t i b o d y w a s t h e r e f o r e n o t e v a l u a t e d b y t h i s s o - c a l l e d p o s i t i v e c o n t r o l s e r u m . L a s t a r e c o n c e r n s r e l a t i n g t o t h e l o n g t e r m u s e o f t h i s a s s a y . E a c h b a t c h o f p l a t e l e t s h a d a d i f f e r e n t a m o u n t o f b a c k g r o u n d a b s o r b a n c e . T h e u p p e r l i m i t s f o r a n e g a t i v e r e s u l t w i t h t w o b a t c h e s w e r e 0 . 3 8 5 a n d 0 . 4 6 3 a b s o r b a n c e u n i t s . C o m p a r i s o n s o f r e s u l t s a m o n g b a t c h e s w o u l d t h e r e f o r e r e q u i r e a d j u s t i n g t h e d a t a r e l a t i v e t o a s t a n d a r d c u r v e g e n e r a t e d f r o m a p o s i t i v e s a m p l e , b u t t h e r e w a s n o d i s c u s s i o n o f s u c h a n o r m a l i z i n g p o s i t i v e c o n t r o l . V a r i a t i o n c o u l d a l s o o c c u r f r o m l o t t o l o t o f t h e s e c o n d a r y a n t i b o d y , a g a i n n e c e s s i t a t i n g a m e t h o d o f a s s a y n o r m a l i z a t i o n o r u s e o f a s i n g l e l o t . A n d a g a i n , t r u s t i n c o m p a r i s o n s f r o m o n e r u n t o a n o t h e r w o u l d r e q u i r e d a t a v e r i f y i n g t h a t l o n g t e r m s t o r a g e o f t h e a s s a y p l a t e l e t s h a d n o e f f e c t o n p o s i t i v e s a m p l e s . T h e r e f o r e , w h i l e t h e s e n s i t i v i t y o f t h e E L I S A t e c h n i q u e a p p e a r s t o b e g r e a t e r t h a n t h a t o f t h e P F 3 a s s a y , s e v e r a l q u e s t i o n s r e m a i n t o b e a n s w e r e d b e f o r e i t c a n b e a c c e p t e d a s a v a l i d a n d u s e f u l a s s a y . A d i r e c t E L I S A f o r P A I g w a s r e c e n t l y d e s c r i b e d i n w h i c h 1 % T r i t o n X - 1 0 0 - s o l u b i l i z e d , w a s h e d p l a t e l e t s s e r v e d a s t h e t e s t s a m p l e s ? " 8 T e s t s a m p l e s w e r e a d d e d t o w e l l s c o a t e d w i t h a n t i - [ c a n i n e I g G ] , a n d a f t e r i n c u b a t i o n a n d w a s h i n g s t e p s , h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e - c o n j u g a t e d , p o l y c l o n a l a n t i - [ c a n i n e I g G ] w a s a d d e d f o r d e t e c t i o n o f t h e b o u n d I g G . S a m p l e s w e r e e v a l u a t e d f r o m 5 0 n o r m a l d o g s , 1 3 d o g s w i t h s u s p e c t e d I M T , 1 2 1 4 7 d o g s w i t h i n fl a m m a t o r y / i n f e c t i o u s c o n d i t i o n s , 4 d o g s w i t h s y s t e m i c i m m u n e - m e d i a t e d d i s e a s e , 1 4 d o g s w i t h c a n c e r , a n d 1 1 d o g s w i t h m i s c e l l a n e o u s c o n d i t i o n s . T h e P A I g w a s r e p o r t e d l y s i g n i fi c a n t l y e l e v a t e d i n t h e I M T d o g s c o m p a r e d t o t h e o t h e r g r o u p s ( p = 0 . 0 0 1 5 ) , b u t t h e r a n g e s a n d a m o u n t o f o v e r l a p a m o n g g r o u p s w e r e n o t r e p o r t e d i n t h e a b s t r a c t . T w o a s p e c t s o f t h i s a b s t r a c t a r e s u r p r i s i n g : 1 ) t h a t e n o u g h p l a t e l e t s w e r e r e p o r t e d l y h a r v e s t e d f r o m t h r o m b o c y t o p e n i c d o g s b y c e n t r i f u g a t i o n o f j u s t 5 m l o f b l o o d , a n d 2 ) t h a t t h e u s e o f s o l u b i l i z e d p l a t e l e t s a s t e s t s a m p l e s , w h i c h r e s u l t s i n a s s a y i n g w h o l e p l a t e l e t I g G ( i n t e r n a l a n d s u r f a c e - b o u n d ) i n s t e a d o f j u s t s u r f a c e - b o u n d I g G , p r o d u c e d a s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e f r o m a l l o t h e r t e s t g r o u p s . A s d i s c u s s e d a b o v e , t o t a l p l a t e l e t I g G i s n o t a r e l i a b l e i n d i c a t o r o f s u r f a c e - b o u n d i m m u n o g l o b u l i n a n d I M T ? ” 5 1 7 I n l i g h t o f t h e l i k e l i h o o d t h a t w h o l e p l a t e l e t I g G w o u l d b e e l e v a t e d i n a s i g n i fi c a n t n u m b e r o f d o g s w i t h o u t i m m u n e - m e d i a t e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n , m o r e t h o r o u g h e v a l u a t i o n o f t h e d a t a i s n e c e s s a r y t o d e t e r m i n e h o w m u c h o v e r l a p o c c u r r e d a m o n g g r o u p s a n d t h e r e f o r e h o w u s e f u l t h e a s s a y r e a l l y i s o n a n i n d i v i d u a l b a s i s . b . w i t h s t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n A ( 1 ) s t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n A S t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n A ( S p A ) i s a 4 2 k D b a c t e r i a l t y p e I F c r e c e p t o r s e c r e t e d f r o m , o r f o u n d o n t h e s u r f a c e o f , m o s t s t r a i n s o f S t a p h y l o c o c c u s a u r e u 3 5 “ ' 5 2 9 ' 5 3 ° A s a n F c r e c e p t o r , S p A b i n d s w i t h h i g h a f fi n i t y ’ 3 1 t o c o n s t a n t r e g i o n d e t e r m i n a n t s ( C H 2 a n d C H 3 ) 5 3 2 o n t h e F c p o r t i o n o f h e a v y c h a i n s o f I g G f r o m m a n y s p e c i e s i n c l u d i n g 1 4 8 d o g s ? ” ” ” " 5 3 ° T h i s p r o p e r t y h a s m a d e S p A a u s e f u l d e t e c t o r o f a n t i g e n / a n t i b o d y i n t e r a c t i o n s i n a w i d e v a r i e t y o f i m m u n o a s s a y s . T h e m a j o r l i m i t a t i o n s o f S p A r e l a t e t o e i t h e r t o o b r o a d o r t o o n a r r o w a s p e c t r u m o f r e a c t i v i t y f o r t h e p a r t i c u l a r a p p l i c a t i o n o f i n t e r e s t . I t s b r e a d t h o f r e a c t i v i t y i s t o o g r e a t w h e n i m m u n o g l o b u l i n c l a s s - s p e c i fi c i n t e r a c t i o n s a r e d e s i r e d , b e c a u s e S p A r e a c t s w i t h s o m e n o n - I g G i m m u n o g l o b u l i n s f r o m s e v e r a l s p e c i e s . ” 6 I t s r e a c t i v i t y i s t o o n a r r o w , h o w e v e r , t o d e t e c t o r p u r i f y a l l I g G s u b c l a s s e s i n s o m e s p e c i e s ; f o r e x a m p l e , S p A d o e s n o t b i n d w e l l t o h u m a n I g G 3 a n d m u r i n e I g G l ? ” T h e b i n d i n g s p e c t r u m o f S p A t o o t h e r m a m m a l i a n i m m u n o g l o b u l i n s h a s b e e n r e v i e w e d ? ” a n d t h e r e a r e c o n t r a d i c t o r y fi n d i n g s w i t h r e s p e c t t o d o g s . S o m e i n v e s t i g a t o r s h a v e r e p o r t e d t h a t S p A b i n d s t o 8 7 % o f c a n i n e I g E , a t l e a s t 9 0 % o f c a n i n e I g M a n d I g A , a n d e s s e n t i a l l y a l l o f c a n i n e I g G ? ” ' 5 3 ‘ S u c h a s p e c t r u m o f r e a c t i v i t y w o u l d m a k e S p A a v e r y u s e f u l r e a g e n t f o r c a n i n e i m m u n o a s s a y s b e c a u s e i t w o u l d a l l o w d e t e c t i o n o f m o s t p a t h o g e n i c i m m u n o g l o b u l i n s w i t h a s i n g l e d e t e c t o r . H o w e v e r , o t h e r s 5 3 5 h a v e r e p o r t e d t h a t S p A b i n d s t o o n l y 6 7 a n d 3 6 % o f c a n i n e I g G a n d I g M , r e s p e c t i v e l y , a n d w i t h n o s u b c l a s s s p e c i fi c i t y ; i f t r u e , t h i s w o u l d b e e x p e c t e d t o l e a d t o a s i g n i fi c a n t n u m b e r o f f a l s e n e g a t i v e fi n d i n g s i n S p A — b a s e d i m m u n o a s s a y s . ( 2 ) a s s a y s U s i n g m o d i fi c a t i o n s o f t h e C a m p b e l l E L I S A , 1 9 1 M c V e y 2 3 7 i n v e s t i g a t e d t h e u s e o f a S p A - b a s e d i n d i r e c t a s s a y f o r P B I g i n t e s t s e r a . O n e o f t h e m a j o r g o a l s o f t h e w o r k w a s t o a s s e s s t h e u t i l i t y o f a n E L I S A b a s e d o n t h e u s e o f e x t r a c t e d p l a t e l e t a n t i g e n s i n p l a c e o f w h o l e p l a t e l e t s . T o t h i s e n d , s e r a w e r e t e s t e d i n 2 a s s a y s , o n e u s i n g w h o l e 1 4 9 p l a t e l e t s a n d o n e u s i n g p l a t e l e t a n t i g e n e x t r a c t s a s a n t i g e n s o u r c e s . P l a t e l e t a n t i g e n s w e r e e x t r a c t e d b y fi r s t i n c u b a t i n g S p A - S e p h a r o s e w i t h o n e s e r u m s a m p l e t h a t h a d b e e n s h o w n b y t h e w h o l e p l a t e l e t E L I S A t o h a v e a h i g h t i t e r o f P B I g . A f t e r w a s h i n g , t h e b e a d s w e r e i n c u b a t e d w i t h a p l a t e l e t l y s a t e , p r e s u m a b l y f r o m t h e s a m e p o o l o f p l a t e l e t s u s e d i n t h e w h o l e p l a t e l e t a s s a y s u c h t h a t c o m p a r i s o n s i n r e a c t i v i t y w i t h t h e w h o l e p l a t e l e t E L I S A w o u l d b e m e a n i n g f u l . A f t e r w a s h i n g , t h e b o u n d p l a t e l e t a n t i g e n s a n d i m m u n o g l o b u l i n w e r e e l u t e d f r o m t h e S p A - S e p h a r o s e , c o n c e n t r a t e d b y p e r e v a p o r a t i o n , a n d a d s o r b e d w i t h f r e s h S p A - S e p h a r o s e b e a d s t o r e d u c e t h e a m o u n t o f r e s i d u a l i m m u n o g l o b u l i n . F o r t h e E L I S A , l o n g o f t h i s e x t r a c t e d p l a t e l e t a n t i g e n w e r e a d d e d t o e a c h m i c r o t i t r a t i o n w e l l . T h e a s s a y s w e r e e v a l u a t e d i n 1 0 t h r o m b o c y t o p e n i c d o g s , 5 n o r m a l d o g s , a n d 7 d o g s w i t h o t h e r d o c u m e n t e d i m m u n e - m e d i a t e d d i s e a s e s . T h e s e l e c t i o n c r i t e r i a f o r t h e 1 0 t h r o m b o c y t o p e n i c d o g s , t h e i r s p e c i fi c c l i n i c a l d i a g n o s e s , a n d t h e b a s i s f o r t h o s e d i a g n o s e s w e r e n o t r e p o r t e d , b u t t h e y p r e s u m a b l y w e r e a l l s u s p e c t e d o f h a v i n g I M T . E a c h h a d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s l e s s t h a n 5 0 , 0 0 0 / p l , a n d 5 w e r e p o s i t i v e a n d 5 w e r e n e g a t i v e i n t h e P F 3 a s s a y . C o n c l u s i o n s w e r e l i m i t e d b y t h e l o w s a m p l e n u m b e r s , b u t t h e E L I S A s w e r e p o s i t i v e i n a l l 1 0 t h r o m b o c y t o p e n i c d o g s ( 1 0 0 % ) a n d t h u s t h e y a p p e a r e d t o b e m o r e s e n s i t i v e t h a n t h e P F 3 a s s a y . N o r m a l d o g s w e r e n e g a t i v e i n e v e r y a s s a y , b u t d o g s w i t h n o n i m m u n e t h r o m b o c y t O p e n i a s w e r e n o t e v a l u a t e d . D a t a f r o m t h e t w o E L I S A a s s a y s w e r e i n t e r p r e t e d a s i n d i c a t i n g t h a t t h e r e w a s g e n e r a l l y g r e a t e r r e a c t i v i t y w i t h w h o l e p l a t e l e t s t h a n w i t h e x t r a c t e d a n t i g e n s , b e c a u s e t h e A 4 0 5 v a l u e s a t 1 : 1 0 0 d i l u t i o n s w e r e m u c h l o w e r w i t h t h e l a t t e r . H o w e v e r , e v e n t h e s e r u m u s e d t o e x t r a c t t h e a n t i g e n s i n t h e fi r s t p l a c e r e a c t e d m o r e i n t h e w h o l e p l a t e l e t E L I S A t h a n i n t h e e x t r a c t e d a n t i g e n E L I S A , s o i t i s l i k e l y t h a t t h e r e w a s s i m p l y n o t a n 1 5 0 e q u i v a l e n t a m o u n t o f p r o t e i n a v a i l a b l e i n t h e t w o a s s a y s . T h e r e d i d n o t , i n f a c t , a p p e a r t o b e a n y e f f o r t t o e q u a l i z e t h e a m o u n t o f a n t i g e n i n t h e 2 s y s t e m s . A s s a y s b a s e d o n d e fi n e d , p u r i fi e d a n t i g e n s c a n b e v e r y u s e f u l , b u t t h e a n t i g e n s u s e d i n t h i s a s s a y w e r e n e i t h e r d e fi n e d n o r p u r e . B y u s i n g w h o l e p l a t e l e t l y s a t e s i n s t e a d o f j u s t p l a t e l e t m e m b r a n e c o m p o n e n t s , t h e e x t r a c t e d a n t i g e n s l i k e l y i n c l u d e d c y t o s o l i c d o m a i n s o f q u e s t i o n a b l e p a t h o l o g i c i m p o r t a n c e . S e c o n d , t h e u s e o f o n l y o n e p o s i t i v e s e r u m s a m p l e t o c a p t u r e p o t e n t i a l l y i m p o r t a n t a n t i g e n s i s l i k e l y t o l e a v e m a n y u n c a p t u r e d , s i n c e o n e s a m p l e w o u l d n o t b e e x p e c t e d t o r e a c t w i t h a l l t h e i m p o r t a n t p l a t e l e t a n t i g e n s . I t i s , i n f a c t , s u r p r i s i n g t h a t w i t h t h e u s e o f t h i s a p p r o a c h , e v e r y s a m p l e p o s i t i v e w i t h t h e w h o l e p l a t e l e t E L I S A w a s p o s i t i v e w i t h t h e . e x t r a c t e d a n t i g e n E L I S A . T h i s s u g g e s t s c o m m o n r e a c t i v e a n t i g e n s f o r a l l 1 0 s e r a , m u l t i p l e r e a c t i v i t y o f t h e e x t r a c t i o n s e r u m , v e r y n o n s p e c i fi c e x t r a c t i o n o f p l a t e l e t a n t i g e n s , o r o t h e r u n c h a r a c t e r i z e d p r o b l e m s w i t h t h e t e c h n i q u e . I n t e r e s t i n g l y , w h i l e a l l p o s i t i v e s a m p l e s g e n e r a l l y r e a c t e d l e s s i n t h e a n t i g e n c a p t u r e a s s a y t h a n i n t h e w h o l e p l a t e l e t a s s a y , t h e d i f f e r e n t i a l i n r e s u l t s b e t w e e n t h e s e a s s a y s w a s m u c h g r e a t e r f o r n o n t h r o m b o c y t o p e n i c d o g s w i t h d i a g n o s e s o f S L E , r h e u m a t o i d a r t h r i t i s , a n d i m m u n e - m e d i a t e d h e m o l y t i c a n e m i a t h a n f o r d o g s w i t h I M T . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e p l a t e l e t b i n d i n g s i t e s i n v o l v e d i n t h e s e c o n d i t i o n s , w h e t h e r s p e c i fi c o r n o n s p e c i fi c , w e r e n o t i s o l a t e d b y t h e e x t r a c t i o n t e c h n i q u e , a n d i t s u p p o r t s t h e a u t h o r s ’ c o n c l u s i o n t h a t u s e o f e x t r a c t e d a n t i g e n s m a y e n h a n c e t h e s p e c i fi c i t y o f i m m u n o a s s a y s f o r c a n i n e P B I g . A n o t h e r i n t e r e s t i n g a n d i m p o r t a n t fi n d i n g w a s t h a t n o r m a l s e r a h e a t e d t o 6 0 ° C f o r 3 0 m i n u t e s p r i o r t o a s s a y i n g h a d s i g n i fi c a n t l y g r e a t e r r e a c t i v i t y t h a n u n h e a t e d s e r a . 1 5 1 T h i s s u g g e s t s t h a t n o n s p e c i fi c i m m u n o g l o b u l i n a g g r e g a t e s m a y b e d e t e c t a b l e a s P B I g i n s u c h a s y s t e m . T h e u s e o f h e a t e d s e r u m i n s i m i l a r a s s a y s o r i n P F 3 a s s a y s , a s h a s o f t e n b e e n r o u t i n e , s h o u l d t h e r e f o r e b e q u e s t i o n e d . A s d e s c r i b e d , t h e r e a r e s e v e r a l o t h e r p o t e n t i a l p r o b l e m s w i t h t h i s a s s a y . W h i l e t h e r o u t i n e a s s a y s a m p l e s w e r e a p p a r e n t l y n o t h e a t e d , t h e h a n d l i n g o f t h e s e r u m s a m p l e s w a s n o t c h a r a c t e r i z e d , a n d n o m e n t i o n w a s m a d e o f t h r o m b i n i n a c t i v a t i o n b y h e a t i n g , h e p a r i n , o r h i r u d i n . T h e r e f o r e , r e s u l t s m a y h a v e b e e n a f f e c t e d b y e n z y m a t i c d e g r a d a t i o n d u e t o r e s i d u a l t h r o m b i n . I f t h e s a m p l e s w e r e k e p t i n f r o z e n s t o r a g e b e f o r e u s e , a s i s p r o b a b l e , f r e e z e - t h a w a r t i f a c t w a s a l s o p o s s i b l e . A t h i r d p o t e n t i a l p r o b l e m r e l a t i n g t o t h e s e r u m s a m p l e s w a s t h a t t h e y w e r e i n c u b a t e d w i t h p l a t e l e t s o r p l a t e l e t a n t i g e n s a t r o o m t e m p e r a t u r e . S u c h a n i n c u b a t i o n t e m p e r a t u r e a l l o w s f o r t h e p o s s i b l e b i n d i n g a n d d e t e c t i o n o f n o n p a t h o l o g i c c o l d - r e a c t i v e i m m u n o g l o b u l i n s w h i c h w o u l d p r o d u c e f a l s e p o s i t i v e r e s u l t s . T h e l a s t c o n c e r n r e l a t e s t o t h e n o r m a l p l a t e l e t s u s e d a s a n t i g e n i c s o u r c e s f o r t h e a s s a y s . T h e s e p l a t e l e t s w e r e h a r v e s t e d f r o m b l o o d a n t i c o a g u l a t e d w i t h E D T A , t h u s r a i s i n g t h e p o t e n t i a l f o r f a l s e p o s i t i v e r e s u l t s d u e t o E D T A - i n d u c e d n e o a n t i g e n s a n d f a l s e n e g a t i v e r e s u l t s d u e t o p o t e n t i a l d i s s o c i a t i o n o f t h e c a l c i u m - d e p e n d e n t G P I I b / I I I a c o m p l e x . T h e s a m e i n v e s t i g a t o r h a s r e p o r t e d q u a n t i t a t i v e r e s u l t s o f a n E L I S A f o r P A I g i n a s i n g l e c a s e r e p o r t ? 3 8 T h e a s s a y w a s n o t d e s c r i b e d , b u t t h e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e q u a n t i t a t i o n w a s n o t r e a l i s t i c . F o r t h i s d o g , P A I g G w a s r e p o r t e d l y p r e s e n t a t 2 5 , 0 0 0 f g / p l a t e l e t , w i t h a r e f e r e n c e r a n g e p r o v i d e d o f 5 , 0 0 0 t o 1 5 , 0 0 0 f g / p l a t e l e t . A v a l u e o f 2 5 , 0 0 0 f g / p l a t e l e t c o r r e s p o n d s t o a b o u t 1 X 1 0 8 m o l e c u l e s p e r p l a t e l e t . I n p e o p l e , n o r m a l t o t a l P A I g G , i n t e r n a l a n d s u r f a c e - a s s o c i a t e d , a m o u n t s t o o n l y 5 f g o r a b o u t 1 5 2 2 0 , 0 0 0 m o l e c u l e s / p l a t e l e t , a n d s u r f a c e P A I g G , w h i c h i s t h e I g G t h a t s h o u l d b e m e a s u r e d , i s l e s s t h a n 1 % o f t h e t o t a l ? " 5 W h i l e t h e r e c o u l d b e s p e c i e s d i f f e r e n c e s i n t h e a m o u n t o f I g G p e r p l a t e l e t , t h e s e n u m b e r s a r e c l e a r l y u n r e a s o n a b l y h i g h . R e c e n t l y , a n E L I S A w a s d e v e l o p e d f o r d i r e c t l y d e t e c t i n g c a n i n e P A I g b y m e a n s o f b i o t i n y l a t e d S p A a n d a l k a l i n e p h o s p h a t a s e - c o n j u g a t e d a v i d i n ? " 1 6 0 T h i s i s t h e fi r s t d i r e c t a s s a y t o b e u s e d o n a l a r g e n u m b e r o f d o g s w i t h c l i n i c a l I M T . I n t h i s a s s a y , p l a t e l e t s w e r e h a r v e s t e d b y d i f f e r e n t i a l c e n t r i f u g a t i o n f r o m A C D - a n t i c o a g u l a t e d b l o o d s u b m i t t e d o n i c e . C o n t a m i n a t i n g e r y t h r o c y t e s w e r e r e m o v e d b y l y s i s w i t h 1 % a m m o n i u m o x a l a t e , a n d t h e n m o n o l a y e r s o f 5 X 1 0 ° w a s h e d p l a t e l e t s w e r e m a d e i n w e l l s o f m i c r o t i t r a t i o n p l a t e s a n d fi x e d w i t h 1 % p a r a f o r m a l d e h y d e . T h i s w a s f o l l o w e d b y s e q u e n t i a l a l t e r n a t i n g i n c u b a t i o n s a n d w a s h e s w i t h b i o t i n y l a t e d S p A a n d t h e n a v i d i n - c o n j u g a t e d a l k a l i n e p h o s p h a t a s e . A b s o r b a n c e s w e r e d e t e r m i n e d a t 4 0 5 n m a f t e r t h e a d d i t i o n o f s u b s t r a t e a n d t e r m i n a t i o n o f t h e r e a c t i o n . A n i n d i r e c t a s s a y w a s a l s o r e p o r t e d . I t u s e d t h a w e d f r o z e n s e r u m d i l u t e d 1 : 5 w i t h P B S . T h e s e r u m w a s i n c u b a t e d w i t h m o n o l a y e r s o f h o m o l o g o u s p l a t e l e t s f r o m 3 c l i n i c a l l y n o r m a l d o g s f o r 1 h r a t 3 7 ° C . T h e m o n o l a y e r s w e r e t h e n w a s h e d 6 t i m e s a n d a s s e s s e d a s f o r t h e d i r e c t a s s a y . U s e o f t h e s e a s s a y s l e d t o t h e f o l l o w i n g o b s e r v a t i o n s : 1 ) n e i t h e r t h e a m o u n t o f P A I g n o r P B I g c o r r e l a t e d w i t h p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s o r M P V s , a n d 2 ) t h e r e w a s n o s i g n i fi c a n t c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e a m o u n t s o f P A I g a n d P B I g . T h e i n t r a - a s s a y a n d i n t e r a s s a y c o e f fi c i e n t s o f v a r i a t i o n ( C V s ) f o r t h e d i r e c t a s s a y w e r e c a l c u l a t e d f r o m 8 m e a s u r e m e n t s a n d w e r e 1 0 a n d 1 3 % r e s p e c t i v e l y . F o u r m e a s u r e m e n t s w e r e u s e d f o r t h e i n d i r e c t a s s a y a n d t h e C V s w e r e 7 a n d 1 0 % r e s p e c t i v e - l y . P o s i t i v e r e s u l t s w e r e t h o s e t h a t w e r e g r e a t e r t h a n 2 s t a n d a r d d e v i a t i o n s a b o v e t h e 1 5 3 m e a n o f 2 0 c l i n i c a l l y n o r m a l d o g s . T h e d i r e c t a s s a y r e p o r t e d l y h a d a s e n s i t i v i t y o f 9 4 % a n d a s p e c i fi c i t y o f 6 2 % f o r c l i n i c a l l y d i a g n o s e d p r i m a r y I M T 2 1 T h e 2 d o g s w i t h d i a g n o s e s o f I M T b u t n e g a t i v e t e s t s h a d b o t h b e e n t r e a t e d w i t h g l u c o c o r t i c o i d s a n d h a d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s w i t h i n t h e r e f e r e n c e r a n g e . T h e a u t h o r s a c t u a l l y s t a t e t h a t t h e s e fi g u r e s r e p r e s e n t t h e s e n s i t i v i t y a n d s p e c i fi c i t y f o r i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a w h i c h t h e y d e fi n e a s a n a u t o i m m u n e d i s e a s e . D a t a a r e l a c k i n g , h o w e v e r , t o v e r i f y t h a t a l l t h e a n t i b o d i e s d e t e c t e d w e r e t r u l y a u t o a n t i b o d i e s a s o p p o s e d t o o t h e r f o r m s o f P A I g . T h e m o d e r a t e s p e c i fi c i t y i n d i c a t e s a h i g h n u m b e r o f f a l s e p o s i t i v e r e a c t i o n s , a n i m m u n o l o g i c a l c o m p o n e n t t o t h r o m b o c y t o p e n i c c o n d i t i o n s o t h e r t h a n p u r e p r i m a r y I M T , o r b o t h . T h e i n d i r e c t a s s a y h a d a s e n s i t i v i t y o f 3 4 % a n d a s p e c i fi c i t y o f 8 0 % . T h e a u t h o r s a y s t h a t t h i s i s l o w e r t h a n o t h e r r e p o r t s f o r i n d i r e c t a s s a y s t h a t u s e d p o l y c l o n a l a n t i - [ c a n i n e I g G ] r e a g e n t s , a n d t h a t t h e l o w e r s e n s i t i v i t y m a y h a v e b e e n d u e t o t h e f a c t t h a t S p A i s r e p o r t e d l y 5 3 7 l e s s s e n s i t i v e t h a n a n t i - I g G r e a g e n t s . A s d i s c u s s e d b e l o w , h o w e v e r , t h e c o n c l u s i o n s i n t h e r e f e r e n c e d s t u d y m a y n o t b e u n i v e r s a l l y a p p l i c a b l e . A s t h e fi r s t d i r e c t E L I S A t o b e u s e d f o r c a n i n e s a m p l e s , t h i s a s s a y i s a g r e a t i m p r o v e m e n t o v e r p r e v i o u s E L I S A s . T h e p o s i t i v e c o n t r o l f o r t h e a s s a y , a n a l l o a n t i b o d y - c o n t a i n i n g s e r u m f r o m a m u l t i p l y t r a n s f u s e d d o g , i s a b e t t e r c o n t r o l t h a n t h o s e i n p r i o r r e p o r t s . H o w e v e r , b e c a u s e i t i s s e r u m a n d n o t p l a s m a , t h e p o s i t i v e c o n t r o l i s i n c u b a t e d w i t h 2 0 U / m l h e p a r i n b e f o r e u s e t o i n a c t i v a t e t h r o m b i n . 2 1 S i n c e t h e t e s t s a m p l e s a r e n o n h e p a r i n i z e d p l a s m a a n d t h e r e f o r e n o t i d e n t i c a l t o t h e c o n t r o l , t h e c o n t r o l i s a d e q u a t e b u t n o t i d e a l . 1 5 4 S e v e r a l o t h e r a s p e c t s o f t h e a s s a y a r e w o r t h y o f a t t e n t i o n . F i r s t , 5 0 m l o f b l o o d w e r e r e q u i r e d f o r t h e d i r e c t a s s a y w h e n t h e d o g s ’ p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s w e r e l e s s t h a n 1 0 , 0 0 0 / p l . T h i s m a y n o t b e t o l e r a b l e i n s o m e d o g s . C o n c e r n s o v e r t h e u s e o f 1 % a m m o n i u m o x a l a t e t o l y s e c o n t a m i n a t i n g e r y t h r o c y t e s , a n d t h e fi x a t i o n o f p l a t e l e t s i n 1 % p a r a f o r m a l d e h y d e w e r e a d d r e s s e d p r e v i o u s l y . I n r e f e r e n c e t o S p A , t h e a u t h o r s d i d n o t s t a t e h o w c o m p a r i s o n s w e r e m a d e b e t w e e n l o t s o r , a l t e r n a t i v e l y , i f a s i n g l e l o t w a s u s e d f o r a l l t h e r e p o r t e d w o r k . T h e r a n g e o f S p A c o n c e n t r a t i o n s i n t h e S i g m a p r o d u c t u s e d c a n b e s i g n i fi c a n t , s o e a c h n e w l o t m u s t b e s t a n d a r d i z e d s u c h t h a t l o t - t o - l o t c o m p a r i s o n s c a n b e m a d e . D e s p i t e t h e s e c o n c e r n s , t h i s d i r e c t a s s a y f o r P A I g a p p e a r s t o b e v e r y p r o m i s i n g f o r s u p p o r t i n g a d i a g n o s i s o f I M T i n d o g s . W i t h t h e h i g h s e n s i t i v i t y , a n e g a t i v e r e s u l t i s s t r o n g e v i d e n c e a g a i n s t I M T . 4 . p l a t e l e t i m m u n o r a d i o m e t r i c a s s a y s T h o u g h r e s u l t s o f a n u n d e s c r i b e d t e c h n i q u e f o r c a n i n e P A I g w e r e b r i e fl y r e p o r t e d i n 1 9 8 2 ? ” t h e fi r s t d e s c r i p t i o n o f a d i r e c t a s s a y f o r d e t e c t i n g c a n i n e P A I g w a s i n r e f e r e n c e t o t h r o m b o c y t o p e n i a i n d u c e d b y g o l d c o m p o u n d s . 2 1 7 T h i s a s s a y w a s a s o l i d p h a s e i m m u n o r a d i o m e t r i c a s s a y u s i n g 1 ” I - S p A . F o r t h i s a s s a y , a f t e r w a s h e d p l a t e l e t s w e r e a d d e d t o w e l l s o f m i c r o t i t r a t i o n p l a t e s , r a b b i t a n t i - [ c a n i n e I g G ] w a s a d d e d a n d i n c u b a t e d f o r 1 h r a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e w e l l s w e r e t h e n r i n s e d 3 t i m e s a n d 1 ” I - S p A w a s a d d e d a n d i n c u b a t e d f o r a n o t h e r h o u r a t r o o m t e m p e r a t u r e . A f t e r 3 r i n s e s , w e l l s w e r e c u t f r o m t h e p l a t e a n d r a d i o a c t i v i t y w a s a s s e s s e d i n a g a m m a c o u n t e r . R e s u l t s w e r e c o m p a r e d t o n o r m a l c o n t r o l d o g s b u t t h e r e w a s n o p o s i t i v e c o n t r o l . T h e p l a t e l e t w a s h 1 5 5 b u f f e r c o n t a i n e d 1 % a m m o n i u m o x a l a t e , a n d a s f o r o t h e r a s s a y s d i s c u s s e d a b o v e , d a t a t o i n d i c a t e t h a t s u c h t r e a t m e n t h a s n o e f f e c t o n d e t e c t a b l e P A I g w e r e n o t r e p o r t e d . F o u r d o g s w i t h s u s p e c t e d g o l d - i n d u c e d I N I T w e r e t e s t e d 1 6 t i m e s , a n d e a c h h a d a t l e a s t o n e p o s i t i v e r e s u l t . I n o n e d o g , p o s i t i v e r e s u l t s c o r r e l a t e d w e l l w i t h n a d i r s i n p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s w h i c h o s c i l l a t e d d i r e c t l y w i t h i n c r e a s e s a n d d e c r e a s e s i n p r e d n i s o l o n e t h e r a p y ; t h e r e w a s a d i r e c t c o r r e l a t i o n ( r = 0 . 8 2 ) b e t w e e n P A I g a n d p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n . H o w e v e r , t h e s t r o n g e s t p o s i t i v e s a m p l e h a d o n l y 1 . 8 t i m e s t h e m e a n d e t e c t a b l e i m m u n o g l o b u l i n o f t h e c o n t r o l p l a t e l e t s . T h i s i s a p o o r d i f f e r e n t i a l b e t w e e n p o s i t i v e a n d n e g a t i v e r e s u l t s i n c o m p a r i s o n t o s t a n d a r d h u m a n a s s a y s ? ” D e s p i t e t h e r e l a t i v e l y w e a k s i g n a l - t o - n o i s e r a t i o , t h i s a s s a y w a s a p p a r e n t l y s u c c e s s f u l a t d i r e c t l y d e t e c t i n g P A I g . T h e s a m e a s s a y w a s u s e d t o d i a g n o s e I M T i n a s i n g l e d o g w h o s e P A I g w a s o v e r 6 t i m e s t h a t o f c o n t r o l s ? ” T h i s d o g h a d b e e n p a r t o f a c o n t r o l g r o u p i n a l o n g - t e r m d r u g s t u d y w i t h n o c l i n i c a l o r l a b o r a t o r y a b n o r m a l i t i e s u n t i l t h r o m b o c y t o p e n i a w a s d i s c o v e r e d o n d a y 2 , 3 8 1 ( 6 . 5 y r ) . T h e p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n w a s 9 6 , 0 0 0 / p . l a n d i t f e l l t o 6 , 0 0 0 / u l o v e r t h e n e x t f e w w e e k s . T h e d o g h a d m a r k e d m e g a k a r y o c y t i c h y p e r p l a s i a . T h i s c a s e i s i n t e r e s t i n g b e c a u s e t h e d o g w a s c a r e f u l l y m o n i t o r e d p r i o r t o d e v e l o p i n g I M T , a n d t h e r e w e r e n o k n o w n p r e c i p i t a t i n g e v e n t s . 5 . p l a t e l e t i m m u n o fl u o r e s c e n c e a s s a y s T h e B l o o m i m m u n o r a d i o m e t r i c a s s a y 2 1 7 w a s c r i t i c i z e d b y T h i e m e t a l ? 3 7 f o r i t s l o w s e n s i t i v i t y , t h e n e e d f o r f r e s h p l a t e l e t s , a n d t h e l a r g e v o l u m e o f b l o o d r e q u i r e d f o r h a r v e s t i n g s u f fi c i e n t n u m b e r s o f p l a t e l e t s . W h i l e s o m e o f t h e s e a p p a r e n t p r o b l e m s c o u l d 1 5 6 b e o v e r c o m e , t h e a u t h o r s c h o s e i n s t e a d t o e x a m i n e i n d i r e c t a s s a y s a n d c o m p a r e a n i n d i r e c t s o l i d p h a s e i m m u n o r a d i o m e t r i c a s s a y t o a n i n d i r e c t fl o w c y t o m e t r i c i m m u n o fl u o — r e s c e n c e t e c h n i q u e . S e r a f r o m 4 n o r m a l d o g s a n d 5 d o g s w i t h c l i n i c a l d i a g n o s e s o f I M T w e r e i n c u b a t e d w i t h n o r m a l p o o l e d c a n i n e p l a t e l e t s . A f t e r w a s h i n g , t h e p l a t e l e t s w e r e i n c u b a t e d w i t h F I T C - S p A , F I T C - I g G , o r 1 ” I - S p A . T h e p l a t e l e t s i n c u b a t e d w i t h F I T C c o n j u g a t e s w e r e a n a l y z e d f o r fl u o r e s c e n c e b y fl o w c y t o m e t r y w h i l e a g a m m a c o u n t e r w a s u s e d t o d e t e c t r a d i o a c t i v i t y o n t h e p l a t e l e t s i n c u b a t e d w i t h 1 ” I — S p A . S e r a f r o m 4 o f 5 d o g s w e r e p o s i t i v e ( i . e . r e s u l t s w e r e g r e a t e r t h a n 2 S D a b o v e t h e m e a n o f t h e c o n t r o l s ) w i t h F I T C - I g G , w h i l e o n l y 2 o f 5 w e r e p o s i t i v e w i t h F I T C - S p A . T h e r e w a s a l s o r e p o r t e d l y g r e a t e r s e p a r a t i o n b e t w e e n n e g a t i v e a n d p o s i t i v e p l a t e l e t p o p u l a t i o n s w i t h F I T C - I g G , s u g g e s t i n g t h e s u p e r i o r i t y o f t h i s d e t e c t o r u n d e r t h e a s s a y c o n d i t i o n s u s e d . N o n e o f t h e p a t i e n t s e r a w e r e p o s i t i v e b y t h e i m m u n o r a d i o m e t r i c t e c h n i q u e , s u g g e s t i n g i t w a s i n f e r i o r t o t h e fl o w c y t o m e t r i c t e c h n i q u e s w h i c h t h e a u t h o r s c o n c l u d e d w e r e p r o m i s i n g . B e c a u s e o f t h e n u m e r o u s v a r i a b l e s i n p l a t e l e t a n t i b o d y a s s a y s , e x t r a p o l a t i o n o f t h e s e c o n c l u s i o n s t o o t h e r a s s a y s y s t e m s i s u n w a r r a n t e d . M o r e o v e r , s t u d i e s s u c h a s t h i s a r e d i f fi c u l t t o i n t e r p r e t m e a n i n g f u l l y f o r t w o m a j o r r e a s o n s : 1 ) f e w s a m p l e s w e r e a n a l y z e d , s o t h e p o w e r o f t h e fi n d i n g s i s l o w , a n d 2 ) i t i s n o t k n o w n i f t h e s e r u m s a m p l e s t r u l y c o n t a i n e d P B I g , o r i f t h e n e g a t i v e s w i t h t h e i m m u n o r a d i o m e t r i c a s s a y w e r e r e a l a n d t h e p o s i t i v e s w i t h t h e fl u o r e s c e n c e a s s a y s w e r e f a l s e d u e t o n o n s p e c i fi c i n t e r a c t i o n s . E a c h t y p e o f a s s a y a p p e a r e d t o h a v e p o t e n t i a l s i n c e t h e y e a c h l i n e a r l y d e t e c t e d i n c r e a s i n g a m o u n t s o f P B I g i n s e r i a l d i l u t i o n s o f r a b b i t s e r u m c o n t a i n i n g a n t i - [ c a n i n e p l a t e l e t ] a n t i b o d i e s . P o o l e d n o r m a l r a b b i t s e r u m w a s u s e d a s a n e g a t i v e c o n t r o l , b u t d a t a w e r e n o t s h o w n t o a l l o w c o m p a r i s o n s w i t h p o s i t i v e r e s u l t s . 1 5 7 A n i n d i r e c t m i c r o s c o p i c p l a t e l e t i m m u n o fl u o r e s c e n c e a s s a y ( M - P I F A ) ” ‘ a n d a n i n d i r e c t fl o w c y t o m e t r i c p l a t e l e t i r n m u n o fl u o r e s c e n c e a s s a y ( E C - P I F A ) ” O w e r e r e c e n t l y d e v e l o p e d f o r c l i n i c a l u s e . T h e m i c r o s c o p i c P I F A w a s r e p o r t e d l y c h o s e n f o r d e v e l o p - m e n t b e c a u s e p l a t e l e t s a r e d i f fi c u l t t o h a r v e s t i n a d e q u a t e n u m b e r s f o r d i r e c t a s s a y s , b e c a u s e s a m p l e s f o r d i r e c t a s s a y s s h o u l d b e a s s e s s e d w i t h i n 2 4 h o u r s ” a n d " b e c a u s e s t u d i e s i n h u m a n s h a v e s h o w n t h a t t h e a m o u n t o f s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n c o r r e l a t e s w e l l w i t h t h e p r e s e n c e o f i m m u n e - m e d i a t e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n " . 2 “ H o w e v e r , t h e c i t e d h u m a n s t u d i e s ? 1 6 h a v e a s s e s s e d P A I g i n d i r e c t a s s a y s a n d d o n o t a p p l y t o P B I g d e t e c t e d b y i n d i r e c t a s s a y s . T h e g e n e r a l p r o t o c o l f o r t h e M - P I F A i s a s f o l l o w s . 2 4 1 S e r u m s a m p l e s ( 2 , 1 1 ) f r o m t e s t a n d c o n t r o l d o g s w e r e i n c u b a t e d f o r 3 0 m i n u t e s a t 3 7 ° C w i t h 8 m i l l i o n w a s h e d n o r m a l c a n i n e p l a t e l e t s fi x e d i n 1 % p a r a f o r m a l d e h y d e . A f t e r w a s h i n g , t h e p l a t e l e t s w e r e i n c u b a t e d w i t h a F I T C - g o a t a n t i - [ c a n i n e I g G ] f o r 3 0 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e , w a s h e d , a n d r e s u s p e n d e d i n a g l y c e r o l - P B S s o l u t i O n . S m a l l a l i q u o t s o f t h e s e s u s p e n s i o n s w e r e p l a c e d o n g l a s s s l i d e s , e a c h o f w h i c h i n c l u d e d n e g a t i v e c o n t r o l s a m p l e s o f d o n o r p l a t e l e t s i n c u b a t e d w i t h b u f f e r , d o n o r p l a t e l e t s i n c u b a t e d w i t h n o r m a l d o g s e r u m , a n d d o n o r p l a t e l e t s i n c u b a t e d w i t h d o n o r s e r u m . E a c h s l i d e a l s o h a d a p o s i t i v e c o n t r o l s a m p l e o f d o n o r p l a t e l e t s i n c u b a t e d w i t h s e r u m f r o m a d o g w i t h c l i n i c a l I M T a n d a h i g h t i t e r o f P B I g . F l u o r e s c e n c e w a s i n t e r p r e t e d b y a s i n g l e t e c h n i c i a n a n d g r a d e d q u a l i t a t i v e l y f r o m 0 t o 4 + . P o t e n t i a l p r o b l e m s w i t h t h e a s s a y p r o t o c o l i n c l u d e t h e f o l l o w i n g : 1 ) t e s t s a m p l e s w e r e s e r u m i n s t e a d o f p l a s m a , 2 ) s a m p l e s w e r e s t o r e d a t - 7 0 ° C u n t i l a n a l y s i s , 3 ) r e s i d u a l t h r o m b i n w a s a p p a r e n t l y n o t i n a c t i v a t e d , 4 ) i t w a s n o t c l e a r i f t h e 1 0 n o r m a l d o g s e r a 1 5 8 w e r e a l s o f r o z e n b e f o r e t e s t i n g o r i f t h e y w e r e r u n f r e s h b e c a u s e t h e y w e r e r e a d i l y a v a i l a b l e , 5 ) t h e n o r m a l d o n o r p l a t e l e t s w e r e c o l l e c t e d i n E D T A f r o m o n e h e a l t h y d o g , 6 ) d o n o r p l a t e l e t s w e r e fi x e d i n 1 % p a r a f o r m a l d e h y d e , a n d 7 ) n o c o m m e n t w a s m a d e a s t o w h e t h e r o r n o t a l l t h e s e c o n d a r y a n t i b o d y u s e d w a s f r o m 1 l o t o r i f s o m e k i n d o f a d j u s t m e n t s h a d t o b e m a d e t o c o m p a r e r e s u l t s b e t w e e n l o t s . I f a s i n g l e l o t w a s u s e d , t h e r e w a s s t i l l n o m e n t i o n o f t h e c o n s i s t e n c y o f t h e p o s i t i v e c o n t r o l ’ s g r a d e d r e s u l t , s o i t i s n o t c l e a r i f t h e q u a l i t a t i v e r e s u l t s c o u l d b e c o m p a r e d f r o m o n e a s s a y t o t h e n e x t . T h e M - P I F A w a s e v a l u a t e d i n 1 0 n o r m a l d o g s , i n 7 6 t h r o m b o c y t o p e n i c d o g s o f w h i c h 2 0 w e r e s u s p e c t e d o f h a v i n g p r i m a r y I M T , a n d i n 1 8 n o n t h r o m b o c y t o p e n i c d o g s w i t h v a r i o u s d i s e a s e s . D o g s w e r e c o n s i d e r e d t o h a v e p r i m a r y I M T w h e n : p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s w e r e l e s s t h a n 7 5 , 0 0 0 / p . l , m e g a k a r y o c y t e d e n s i t y a p p e a r e d n o r m a l t o i n c r e a s e d o n m a r r o w a s p i r a t e s o r c o r e b i o p s i e s , a n d o t h e r k n o w n c a u s e s o f t h r o m b o c y t o - p e n i a i n c l u d i n g r i c k e t t s i a l d i s e a s e s , D I C , n e o p l a s i a , S L E , a n d d r u g - i n d u c e d t h r o m b o c y t o — p e n i a w e r e e x c l u d e d . S i n c e p r i m a r y I M T m a y o c c u r w i t h p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s g r e a t e r t h a n 7 5 , 0 0 0 / u l a n d w i t h a d e c r e a s e d d e n s i t y o f m e g a k a r y o c y t e s i n t h e b o n e m a r r o w , t h e r e p o r t e d s e n s i t i v i t y o f t h e a s s a y r e l a t e d t o o n l y a s u b s e t o f p o t e n t i a l I M T p r e s e n t a t i o n s . M - P I F A r e s u l t s w e r e n e g a t i v e i n a l l 1 0 n o r m a l d o g s , p o s i t i v e i n 1 4 o f t h e 2 0 d o g s w i t h s u s p e c t e d p r i m a r y I M T ( 7 0 % ) , p o s i t i v e i n 1 5 o f t h e o t h e r 5 6 t h r o m b o c y t 0 p e n i c d o g s ( 3 7 % ) , a n d p o s i t i v e i n 5 o f t h e 1 8 n o n t h r o m b o c y t o p e n i c d i s e a s e d d o g s ( 2 8 % ) . T h i s i n — d i c a t e s a m o d e r a t e s e n s i t i v i t y a n d a p o o r s p e c i fi c i t y f o r t h e d i a g n o s i s o f c l i n i c a l p r i m a r y I M T . H o w e v e r , t h e 1 5 t h r o m b o c y t o p e n i c d o g s w i t h o u t s u s p e c t e d I M T b u t w i t h p o s i t i v e r e s u l t s w e r e d i a g n o s e d w i t h : l y m p h o p r o l i f e r a t i v e d i s e a s e ( 6 ) , h e m a n g i o s a r c o m a ( 3 ) , E v a n s ’ s y n d r o m e ( 3 ) , s t e r o i d r e s p o n s i v e i d i o p a t h i c n e u t r o p e n i a a n d t h r o m b o c y t o p e n i a 1 5 9 ( 1 ) , p u r e r e d c e l l a p l a s i a ( 1 ) , a n d S L E ( 1 ) . I n c r e a s e d P B I g i s a p o t e n t i a l fi n d i n g i n e a c h o f t h e s e c o n d i t i o n s , s o t h e r e s u l t s m a y b e r e a s o n a b l y s p e c i fi c f o r p r i m a r y a n d s e c o n d a r y I M T b u t p o o r f o r p r i m a r y I M T a s d e fi n e d . O f t h e 5 p o s i t i v e n o n t h r o m b o c y t o p e n i c d o g s , 2 h a d n e o p l a s i a , 1 h a d I M H A , 1 h a d t r a u m a f r o m b e i n g h i t b y a c a r , a n d 1 h a d r e c o v e r e d f r o m s u r g e r y f o r a p o r t o s y s t e m i c s h u n t . T h e p o t e n t i a l f o r p o s i t i v e r e s u l t s r e l a t i n g t o n e o p l a s i a a n d I M H A a r e c l e a r , t h o u g h p o s i t i v e r e s u l t s c o u l d a l s o h a v e b e e n d u e t o a l l o a n t i b o d i e s . T h e d o g w i t h t h e s h u n t w a s t r a n s f u s e d a t s o m e u n s p e c i fi e d t i m e b e f o r e s a m p l e p r o c u r e m e n t a n d t h e p o s s i b i l i t y o f t r a n s f u s i o n - i n d u c e d a l l o i r n m u n i z a t i o n w a s d i s c u s s e d . H o w e v e r , t h e p o t e n t i a l f o r p r e g n a n c y - r e l a t e d a l l o i r n m u n i z a t i o n w a s n o t m e n t i o n e d f o r a n y o f t h e d o g s . F o r t h e 3 4 p o s i t i v e d o g s c o m b i n e d , t h e r e w a s a n i n v e r s e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n i n t e n s i t y o f i m m u n o fl u o r e s c e n c e a n d t h e m e a n p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n o f d o g s a t e a c h fl u o r e s c e n c e i n t e n s i t y l e v e l ( r = - 0 . 9 a s c a l c u l a t e d f r o m t h e p u b l i s h e d g r a p h ) . T h i s s u g g e s t s t h a t h i g h e r P B I g t i t e r s o c c u r i n t h o s e I M T d o g s w i t h m o r e s e v e r e t h r o m b o c y - t o p e n i a s . T h i s i s a l s o c o n s i s t e n t w i t h m o r e f r e q u e n t P F 3 p o s i t i v i t y i n s a m p l e s f r o m d o g s w i t h m o r e s e v e r e t h r o m b o c y t o p e n i a . ” 3 ' 5 ” I t f u r t h e r s u g g e s t s t h a t t h e r e s u l t s a r e , a t l e a s t o n t h e a v e r a g e , n o t r e l a t e d t o a l l o a n t i b o d i e s , s i n c e n o s u c h c o r r e l a t i o n w o u l d b e e x p e c t e d b e t w e e n p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n a n d a l l o a n t i b o d y c o n c e n t r a t i o n . H o w e v e r , i t i s s t i l l p o s s i b l e t h a t t h e P B I g i s n o t a l l a n t i p l a t e l e t a n t i b o d y ; s o m e m a y b e i m m u n e c o m p l e x e s o r n o n s p e c i fi c a g g r e g a t e s . T h e i n d i r e c t M - P I F A r e s u l t s w e r e c o m p a r e d t o D — M I F A r e s u l t s i n 1 2 d o g s . T h e o v e r a l l s e n s i t i v i t y o f t h e M - P I F A f o r s u b s t a n t i a t i n g a d i a g n o s i s o f p r i m a r y I M T ( a b o u t 7 0 % ) w a s b e t t e r t h a n t h a t o f t h e D - M I F A ( 4 1 % ) , b u t t w o d o g s h a d p o s i t i v e M I F A a n d 1 6 0 n e g a t i v e M - P I F A r e s u l t s . I t w a s s u g g e s t e d t h a t t i t e r s m a y h a v e b e e n l o w i n t h e s e 2 d o g s , m a k i n g t h e M - P I F A r e s u l t s n e g a t i v e , o r t h e M I F A r e s u l t s m a y h a v e b e e n f a l s e p o s i t i v e s . S e v e r a l p o s s i b i l i t i e s t o e x p l a i n t h e f a c t t h a t 5 M - P I F A - p o s i t i v e d o g s w e r e D - M I F A - n e g a t i v e w e r e s u g g e s t e d : 1 ) h i g h b a c k g r o u n d fl u o r e s c e n c e ( l o w s i g n a l - t o - n o i s e r a t i o ) i m p a i r e d s e n s i t i v i t y o f t h e D — M I F A , 2 ) t o o f e w m e g a k a r y o c y t e s w e r e p r e s e n t i n s o m e D - M I F A s a m p l e s , a n d 3 ) p l a t e l e t s a n d m e g a k a r y o c y t e s m a y n o t h a v e i d e n t i c a l s u r f a c e d e t e r m i n a n t s , s o s o m e a n t i b o d i e s w e r e r e a c t i v e w i t h o n l y p l a t e l e t s . N o t d i s c u s s e d w a s t h e p o s s i b i l i t y t h a t s o m e M - P I F A p o s i t i v e s w e r e t h e r e s u l t o f n o n s p e c i fi c b i n d i n g o r a l l o a n t i b o d i e s . T h e M - P I F A w a s c o m p a r e d t o a n i n d i r e c t F C - P I F A d e v e l o p e d b y t h e s a m e i n v e s t i g a t o r s ? ” T h e F C - P I F A w a s d e v e l o p e d a n d e v a l u a t e d b e c a u s e o f s e v e r a l p o t e n t i a l a d v a n t a g e s i n c l u d i n g : 1 ) q u a n t i fi c a t i o n o f a n t i b o d y b o u n d t o i n d i v i d u a l c e l l s ; 2 ) d e t e c t i o n o f l o w a m o u n t s o f fl u o r e s c e n c e ; a n d 3 ) s m a l l s a m p l e s i z e r e q u i r e m e n t s . A s f o r t h e M - P I F A , t e s t s a m p l e s w e r e s e r a s t o r e d a t - 7 0 ° C u n t i l t e s t i n g f o r r e a c t i v i t y w i t h n o r m a l a s s a y p l a t e l e t s h a r v e s t e d f r o m a s i n g l e d o g i n t h e p r e s e n c e o f E D T A . A s s a y p l a t e l e t s w e r e f r o z e n w i t h 5 % D M S O u n t i l u s e , a t w h i c h t i m e t h e p l a t e l e t s w e r e r a p i d l y t h a w e d a t 3 7 ° C , w a s h e d o n c e , a n d b r o u g h t t o t h e a p p r o p r i a t e c o n c e n t r a t i o n . N o d a t a w e r e s h o w n , b u t t h e u s e o f f r o z e n v e r s u s f r e s h p l a t e l e t s w a s e v a l u a t e d i n t h e F C - P I F A u s i n g s e r u m f r o m 3 h e a l t h y d o g s a n d 3 d o g s w i t h s u s p e c t e d I M T . T h e r e w a s r e p o r t e d l y n o s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e f r e s h a n d f r o z e n p l a t e l e t s . T h e p o t e n t i a l d i f f e r e n c e s i n r e a c t i v i t y b e t w e e n t h e fi x e d a n d f r o z e n p l a t e l e t s w e r e n o t a s s e s s e d . S i m i l a r t o t h e M - P I F A , 2 p ! o f t e s t s e r u m w e r e i n c u b a t e d i n a b u f f e r c o n t a i n i n g 3 M m E D T A w i t h 8 m i l l i o n p l a t e l e t s f o r 6 0 m i n u t e s a t 3 7 ° C . A f t e r i n c u b a t i o n , t h e 1 6 1 p l a t e l e t s w e r e w a s h e d 3 t i m e s a n d t h e n i n c u b a t e d w i t h F I T C - g o a t a n t i - [ c a n i n e I g G ] f o r 3 0 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h i s i n c u b a t i o n w a s a l s o f o l l o w e d b y 3 w a s h e s a n d t h e s a m p l e s w e r e a n a l y z e d w i t h a fl o w c y t o m e t e r . S e r u m s a m p l e s f r o m 1 0 n o r m a l d o g s w e r e u s e d a s n e g a t i v e c o n t r o l s t o e s t a b l i s h a r e f e r e n c e r a n g e w i t h e a c h a s s a y , a n d s a m p l e s w e r e c o n s i d e r e d p o s i t i v e i f t h e m e a n fl u o r e s c e n c e r a n g e w a s g r e a t e r t h a n 2 S D a b o v e t h e m e a n f o r t h e c l i n i c a l l y n o r m a l d o g s . I t i s n o t c l e a r w h y a n e w r e f e r e n c e r a n g e h a d t o b e d e t e r m i n e d w i t h e a c h a s s a y , s i n c e t h e i n t e r a s s a y C V w a s r e p o r t e d a s o n l y 6 . 1 4 f o r t h e h e a l t h y c o n t r o l s . S e r u m f r o m a d o g w i t h c l i n i c a l I M T a n d p o s i t i v e M - P I F A a n d F C - P I F A r e s u l t s w a s u s e d a s a p o s i t i v e c o n t r o l . P o t e n t i a l p r o b l e m s w i t h t h e F C - P I F A a r e s i m i l a r t o t h o s e m e n t i o n e d a b o v e f o r t h e M - P I F A . P o t e n t i a l l y s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e 2 a s s a y s , c o m p l i c a t i n g c o m p a r i s o n s , i n c l u d e : 1 ) u s e o f fi x e d p l a t e l e t s i n t h e M - P I F A b u t f r o z e n p l a t e l e t s e x p o s e d t o D M S O i n t h e F C - P I F A ; 2 ) a 3 0 m i n u t e p r i m a r y i n c u b a t i o n f o r t h e M - P I F A a n d a 6 0 m i n u t e p r i m a r y i n c u b a t i o n f o r t h e F C - P I F A ; a n d 3 ) 1 % b o v i n e s e r u m a l b u m i n ( B S A ) F C - P I F A b u f f e r b u t 0 . 2 % B S A i n t h e M - P I F A b u f f e r . S e r a f r o m 1 0 h e a l t h y d o g s a n d 2 7 d o g s w i t h c l i n i c a l d i a g n o s e s o f p r i m a r y o r s e c o n d a r y I M T w e r e t e s t e d i n e a c h a s s a y , a n d a l l h e a l t h y c o n t r o l d o g s w e r e n e g a t i v e i n e a c h a s s a y . O f t h e 2 7 t e s t d o g s , t h e F C - P I F A w a s p o s i t i v e i n 1 8 ( 6 7 % ) a n d t h e M - P I F A w a s p o s i t i v e i n 1 5 ( 5 5 . 5 % ) . W h i l e t h e F C - P I F A a p p e a r e d t o b e m o r e s e n s i t i v e t h a n t h e M - P I F A i n t h i s r e p o r t , i t w a s n o t s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t l y s o . E i g h t d o g s w e r e n e g a t i v e i n b o t h a s s a y s , 1 d o g w a s n e g a t i v e i n t h e F C - P I F A b u t p o s i t i v e i n t h e M - P I F A , a n d 4 d o g s w e r e p o s i t i v e w i t h t h e F C - P I F A b u t n e g a t i v e m i c r o s c o p i c a l l y . A l l 4 o f t h e s e h a d S L E , b u t t h e r e w a s 1 S L E d o g p o s i t i v e w i t h e a c h a s s a y a n d 1 n e g a t i v e w i t h e a c h a s s a y . 1 6 2 T h e r e w a s a s t r o n g d i r e c t l i n e a r c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e M - P I F A s c o r e s a n d t h e m e a n F C - P I F A fl u o r e s c e n c e s c o r e s ( r 2 = 0 . 8 7 3 ) . H o w e v e r , t h e r e w a s a g r e a t d e a l o f v a r i a t i o n i n F C - P I F A s c o r e s w i t h e a c h m i c r o s c o p i c s c o r e . I n c o n c l u s i o n , t h e F C - P I F A w a s f e l t t o b e " a p r a c t i c a l , o b j e c t i v e , a n d q u a n t i t a t i v e m e t h o d f o r d e t e c t i n g c i r c u l a t i n g p l a t e l e t a n t i b o d y o f t h e I g G c l a s s i n d o g s s u s p e c t e d o f h a v i n g I M T " ? " 0 W h i l e i t c a n c e r t a i n l y d e t e c t P B I g i n m a n y d o g s w i t h s u s p e c t e d I M T , i t m u s t b e r e m e m b e r e d t h a t i t c a n n o t d i f f e r e n t i a t e s p e c i fi c a u t o a n t i b o d i e s f r o m a l l o a n t i b o d i e s , a n d i t s h o u l d n o t b e c o n s i d e r e d a q u a n t i t a t i v e a s s a y . 6 . p l a t e l e t f r a g m e n t a t i o n i n d e x E v a l u a t i o n o f b l o o d f o r c i r c u l a t i n g p l a t e l e t m i c r o p a r t i c l e s h a s b e e n s u g g e s t e d a s a p o t e n t i a l l y u s e f u l d i a g n o s t i c a p p r o a c h t o s u p p o r t i n g a d i a g n o s i s o f I M T i n d o g s . 3 4 8 T h i s c a n r e p o r t e d l y b e d o n e b y d e t e r m i n i n g t h e f r a g m e n t a t i o n i n d e x o f a s a m p l e , w h e r e f r a g m e n t a t i o n i n d e x i s d e fi n e d a s t h e p e r c e n t a g e o f p l a t e l e t s l e s s t h a n a b o u t 2 F 1 i n v o l u m e ? ” 3 4 8 T h e r e i s a s i n g l e c a s e r e p o r t ( d i s c u s s e d a b o v e ) w h e r e s u c h a n a s s e s s m e n t w a s u s e d t o s u p p o r t a d i a g n o s i s o f d r u g - i n d u c e d I M T ? 2 0 A c i r c u l a t i n g p l a t e l e t l y t i c f a c t o r w a s d e t e c t e d a n d c o n s i d e r e d i n d i c a t i v e o f i m m u n e - m e d i a t e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n 2 2 0 T h e a u t h o r s c o n c l u d e d t h a t t h e i r t h r o m b o l y t i c a s s a y m i g h t b e u s e f u l w h e n P A I g c a n n o t b e d i r e c t l y d e t e c t e d d u e t o t h e i n a b i l i t y t o c o l l e c t a s u f fi c i e n t n u m b e r o f p l a t e l e t s t o a s s a y . W h i l e a n i n c r e a s e d f r a g m e n t a t i o n i n d e x m a y o c c u r i n d o g s w i t h I M T , d a t a a r e l a c k i n g t o i n d i c a t e w h a t p e r c e n t a g e o f t h e s e d o g s m a y b e s o a f f e c t e d a n d w h a t t h e s p e c i fi c i t y o f t h i s fi n d i n g i s f o r I M T . P l a t e l e t m i c r o p a r t i c l e s m a y b e g e n e r a t e d i n o t h e r 1 6 3 p l a t e l e t c o n s u m p t i v e o r d e s t r u c t i v e s t a t e s u n r e l a t e d t o i m m u n o l o g i c a l m e c h a n i s m s . F u r t h e r s t u d i e s a r e r e q u i r e d b e f o r e t h e c l i n i c a l u t i l i t y o f t h i s i n d i r e c t d i a g n o s t i c a p p r o a c h i s c l e a r . S i m i l a r l y , M P V h a s b e e n s u g g e s t e d a s a u s e f u l d i a g n o s t i c p a r a m e t e r i n t h r o m b o c y t O p e n i c d o g s . 3 4 7 M i c r o t h r o m b o c y t o s i s , d e fi n e d a s a l o w M P V , w a s r e t r o s p e c t i v e l y f o u n d t o b e a s p e c i fi c i n d i c a t o r o f c l i n i c a l l y d i a g n o s e d I M T . I t w a s p r e s e n t i n 1 7 o f 3 1 ( 5 5 % ) d o g s w i t h I M T b u t i n o n l y 1 o f 3 7 ( 3 % ) t h r o m b o c y t o p e n i c d o g s w i t h e i t h e r a d i f f e r e n t d i a g n o s i s o r n o d i a g n o s i s ? 4 7 S a m p l e s f o r t h i s s t u d y w e r e r o u t i n e E D T A - a n t i c o a g u l a t e d w h o l e b l o o d s u b m i s s i o n s f o r C B C s , a n d t h e r e w e r e n o c o n t r o l s o n t h e t i m e p a s s i n g b e t w e e n s a m p l e c o l l e c t i o n a n d s a m p l e e v a l u a t i o n . T h e r e w a s a l s o n o c o n t r o l g r o u p o f d o g s w i t h k n o w n n o n i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a o f t h e s a m e s e v e r i t y a s t h e t h r o m b o c y t o p e n i a s i n t h e I M T g r o u p . S u c h a c o n t r o l i s n e c e s s a r y t o d e t e r m i n e i f l o w M P V s r e l a t e t o u n d e r l y i n g p a t h o g e n e s i s o r s i m p l y t o m a r k e d t h r o m b o c y t o p e n i a o f a n y c a u s e . I t i s c o n c e i v a b l e t h a t t h e i n s t r u m e n t a t i o n h a s a b i a s t o w a r d l o w M P V s w h e n f e w p l a t e l e t s a n d m o r e b a c k g r o u n d p a r t i c l e s a r e a s s e s s e d . W h i l e t h e e v a l u a t i o n o f M P V m a y b e a u s e f u l d i a g n o s t i c c o n s i d e r a t i o n , m o r e c a r e f u l l y c o n t r o l l e d s t u d i e s o f t h i s i n d i r e c t a p p r o a c h a r e n e e d e d b e f o r e fi r m i n t e r p r e t a t i o n s o f t h e r e s u l t s c a n b e m a d e . 7 . o t h e r I n e v a l u a t i n g t h e p o t e n t i a l i m m u n o l o g i c a l c o n t r i b u t i o n t o t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s t r e a t e d w i t h g o l d c o m p o u n d s , a n e l e c t r o n m i c r o s c o p i c m e t h o d u s i n g a S p A - c o l l o i d a l g o l d c o n j u g a t e w a s d e v e l o p e d . ” 7 W a s h e d o r u n w a s h e d p l a t e l e t - r i c h b u f f y c o a t s a m p l e s 1 6 4 w e r e i n c u b a t e d w i t h a S p A - c o l l o i d a l g o l d c o n j u g a t e f o r 1 5 m i n a t 3 7 ° C . A f t e r w a s h i n g , t h e c e l l s w e r e s u s p e n d e d i n 1 % g l u t a r a l d e h y d e a n d p r o c e s s e d f o r e l e c t r o n m i c r o s c o p y . B o t h o f t h e t w o d o g s t e s t e d i n t h i s w a y w e r e p o s i t i v e f o r m e m b r a n e - b o u n d i m m u n o g l o b u - l i n w h e n t h e c e l l s w e r e u n w a s h e d , b u t b o t h w e r e n e g a t i v e w i t h w a s h i n g . A s t h e a u t h o r s s u g g e s t e d , f u r t h e r s t u d i e s w e r e n e e d e d t o d e t e r m i n e i f i m m u n o g l o b u l i n w a s r e m o v e d d u r i n g w a s h i n g s t e p s , p e r h a p s d u e t o l o w a f fi n i t y b i n d i n g o f p r i m a r y a n t i b o d i e s , o r i f t h e d e t e c t e d i m m u n o g l o b u l i n i n u n w a s h e d s a m p l e s w a s j u s t n o n s p e c i fi c a l l y a d s o r b e d t o t h e p l a t e l e t s u r f a c e . U n t i l s u c h w o r k , t h e r e s u l t s o f t h i s a s s a y a r e q u e s t i o n a b l e . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e q u a n t i t a t i v e N B T r e d u c t i o n t e s t m a y b e a c o n v e n i e n t i n d i r e c t a s s a y f o r d e t e c t i n g " a n t i p l a t e l e t a n t i b o d y " i n d o g s e r a ? 6 1 I n s u c h a n a s s a y , s e r a w o u l d b e i n c u b a t e d w i t h p l a t e l e t s a n d t h e n t h e p l a t e l e t s w o u l d b e i n c u b a t e d w i t h n e u t r o p h i l s t o t e s t f o r t h e p r e s e n c e o f p l a t e l e t o p s o n i z a t i o n a n d c o n s e q u e n t p h a g o c y t o s i s w i t h N B T r e d u c t i o n . T h i s w o u l d b e a v e r y i n d i r e c t m e t h o d a n d s h o u l d n o t b e c o n s i d e r e d a u s e f u l c l i n i c a l a s s a y f o r t h e d i r e c t a s s e s s m e n t o f P A I g . I m m u n o b l o t t i n g a n d i m m u n o p r e c i p i t a t i o n o f c a n i n e s a m p l e s h a v e b e e n d o n e t o i d e n t i f y t h e s p e c i fi c i t y o f P A I g o r P B I g . ” 7 ' 3 ” L e w i s 3 3 9 e l u t e d P A I g f r o m p l a t e l e t s o f d o g s w i t h I M T a n d u s e d r a d i o i m m u n o p r e c i p i t a t i o n t o s h o w t h a t G P I I b a n d / o r I I I a w e r e t h e t a r g e t s i n 4 o f 1 7 d o g s t e s t e d . W h i l e i t i s l i k e l y t h a t t h e P A I g b o u n d s p e c i fi c a l l y t o t h e g l y c o p r o t e i n s i n a F a b - m e d i a t e d m a n n e r , i t h a s n o t b e e n p r o v e n . T h e r e f o r e i t i s l i k e l y , b u t n o t p r o v e n , t h a t G P I I b / I I I a h a s t a r g e t e p i t o p e s f o r a n t i p l a t e l e t a u t o a n t i b o d i e s i n s o m e d o g s w i t h I M T . D . 1 6 5 S u m m a r y T h e r e h a v e b e e n m a n y r e c e n t a d v a n c e s i n t h e d e v e l o p m e n t o f a s s a y s f o r d e t e c t i n g a n t i b o d i e s r e s p o n s i b l e f o r p l a t e l e t d e s t r u c t i o n i n d o g s w i t h I M T . M o s t o f t h e s e a s s a y s d e t e c t P B I g a n d t h e r e f o r e t h e i r r e s u l t s n e e d t o b e i n t e r p r e t e d w i t h c a u t i o n . T h e m o s t p r o m i s i n g o f t h e r e c e n t a s s a y s i s t h e d i r e c t E L I S A o f L e w i s w h i c h d e t e c t s P A I g ? " 1 6 0 L i k e a n y d i r e c t a s s a y , i t s m a j o r l i m i t a t i o n i n t h e c l i n i c a l a r e n a i s t h e p a u c i t y o f c e l l s i n m a n y d o g s w i t h I M T . H o w e v e r , t h i s a s s a y h a s t h e p o t e n t i a l t o p r o v i d e a g r e a t d e a l o f u s e f u l i n f o r m a t i o n a b o u t t h e p a t h o g e n e s i s o f t h r o m b o c y t o p e n i a i n m a n y c a n i n e c o n d i t i o n s . I d e a l l y , s e v e r a l w e l l c h a r a c t e r i z e d a s s a y s f o r c a n i n e P A I g s h o u l d u n d e r g o w i d e s p r e a d c l i n i c a l u s e s u c h t h a t e a c h m a y s u p p o r t o r r e f u t e t h e fi n d i n g s o f t h e o t h e r s . A s t h e d e v e l o p m e n t a n d u s e o f v e t e r i n a r y a s s a y s f o r P A I g a n d P B I g c o n t i n u e , s e v e r a l m a j o r g o a l s d e s e r v e a t t e n t i o n : 1 ) 2 ) 3 ) 4 ) 5 ) t o d i f f e r e n t i a t e a m o n g a u t o a n t i b o d i e s , a l l o a n t i b o d i e s , F c - b i n d i n g , a n d i m m u n e a d h e r e n c e , t o d i f f e r e n t i a t e d i f f e r e n t s u b t y p e s o f c a n i n e I M T , i f t h e y e x i s t , t o b e a b l e t o i d e n t i f y d r u g - i n d u c e d I M T , t o d e t e r m i n e t h e c l i n i c a l u t i l i t y o f a s s a y s , t h e r e b y s u p p o r t i n g o r r e f u t i n g t h e b e l i e f t h a t , c o m p a r e d t o t h e P F 3 a s s a y , b e t t e r d i r e c t a s s a y s " w o u l d b e i m p r a c t i c a l f o r r o u t i n e u s e b e c a u s e t h e a s s u m p t i o n o f a n i m m u n e b a s i s c a n s a f e l y b e m a d e f o r t h e m a j o r i t y o f c l i n i c a l c a s e s o f r e c u r r e n t , s e v e r e t h r o m b o c y t o p e n i a " , 2 ? t o d e t e r m i n e t h e r o l e o f a n t i b o d i e s i n v a r i o u s t h r o m b o c y t o p e n i c s t a t e s i n c l u d i n g t h o s e o f n e o p l a s i a a n d i n f e c t i o u s d i s e a s e s , 6 ) 7 ) 8 ) 1 6 6 t o d e t e r m i n e i f c o m p l e m e n t - m e d i a t e d i m m u n e a d h e r e n c e i s o p e r a t i v e i n v a r i o u s c a n i n e t h r o m b o c y t o p e n i c s t a t e s , t o a p p l y a s s a y s t o v e t e r i n a r y t r a n s f u s i o n m e d i c i n e i f p l a t e l e t r e f r a c t o r i n e s s b e c o m e s a p r o b l e m , a n d t o u s e a s r e s e a r c h t o o l s t o i n v e s t i g a t e a s p e c t s o f p a t h o g e n e s i s a n d t h e r a p y f o r c a n i n e I M T , t h e r e s u l t s o f w h i c h m a y a l s o b e a p p l i c a b l e t o t h e h u m a n d i s e a s e . 1 6 7 R e f e r e n c e s 1 0 . l l . 1 2 . K a u f m a n R M , A i r o R , P o l l a c k S , C r o s b y W H , D o b e r n e c k R : O r i g i n o f p u l m o n a r y m e g a k a r y o c y t e s . B l o o d 2 5 : 7 6 7 , 1 9 6 5 J a i n N C : S c h a l m ’ s V e t e r i n a r y H e m a t o l o g y ( 4 t h e d ) . P h i l a d e l p h i a , L e a & F e b i g e r , 1 9 8 6 R o s z e l J , P r i e r J E , L 0 p r o w s k a I : T h e o c c u r r e n c e o f m e g a k a r y o c y t e s i n t h e p e r i p h e r a l b l o o d o f d o g s . J A V M A 1 4 7 : 1 3 3 , 1 9 6 5 K u t e r D J , R o s e n b e r g R D : A p p e a r a n c e o f a m e g a k a r y o c y t e g r o w t h - p r o m o t i n g a c t i v i t y , m e g a p o i e t i n , d u r i n g a c u t e t h r o m b o c y t o p e n i a i n t h e r a b b i t . B l o o d 8 4 : 1 4 6 4 , 1 9 9 4 G u r n e y A L , C a r v e r - M o o r e K , d e S a u v a g e F J , M o o r e M W : T h r o m b o c y t o p e n i a i n c - m p l - d e fi c i e n t m i c e . S c i e n c e 2 6 5 : 1 4 4 5 , 1 9 9 4 G u r n e y A L , K u a n g W J , X i e M H , M a l l o y B E , E a t o n D L , d e S a u v a g e F J : G e n o m i c s t r u c t u r e , c h r o m o s o m a l l o c a l i z a t i o n , a n d c o n s e r v e d a l t e r n a t i v e s p l i c e f o r m s o f t h r o m b o p o i e t i n . B l o o d 8 5 : 9 8 1 , 1 9 9 5 W e n d l i n g F , M a r a s k o v s k y E , D e b i l i N , F l o r i n d o C , T e e p e M , T i t e u x M , M e t h i a N , B r e t o n - G o r i u s J , C o s m a n D , V a i n c h e n k e r W : c - M p l l i g a n d i s a h u m o r a l r e g u l a t o r o f m e g a k a r y o c y t o p o i e s i s . N a t u r e 3 6 9 : 5 7 1 , 1 9 9 4 M a z u r E M , S o u t h K : H u m a n m e g a k a r y o c y t e c o l o n y - s t i m u l a t i n g f a c t o r i n s e r a f r o m a p l a s t i c d o g s : P a r t i a l p u r i fi c a t i o n , c h a r a c t e r i z a t i o n , a n d d e t e r m i n a t i o n o f h e m a t o p o i e t i c c e l l l i n e a g e s p e c i fi c i t y . E x p H e m a t o l 1 3 : 1 1 6 4 , 1 9 8 5 B u r s t e i n S A : E f f e c t s o f i n t e r l e u k i n 6 o n m e g a k a r y o c y t e s a n d o n c a n i n e p l a t e l e t f u n c t i o n . S t e m C e l l s 1 2 : 3 8 6 , 1 9 9 4 C o h n a n R W , M a r d e r V J , S a l z m a n E W , H i r s h J : P l a s m a c o a g u l a t i o n f a c t o r s , i n C o l m a n R W , H i r s h J , M a r d e r V J , S a l z m a n E W ( e d s ) : H e m o s t a s i s a n d T h r o m b o — s i s ; B a s i c P r i n c i p l e s a n d C l i n i c a l P r a c t i c e ( 3 r d e d ) . P h i l a d e l p h i a , L i p p i n c o t t , 1 9 9 4 , p 3 W i l l i a m s W J , B u e t l e r E , E r s l e v A J , L i c h t m a n M A , e d s : H e m a t o l o g y ( 4 t h e d ) . N e w Y o r k , M c G r a w - H i l l , 1 9 9 0 C a s o n a t o A , B e r t o m o r o A , P o n t a r a E , D a n n h a u s e r D , L a z z a r o A R , G i r o l a m i A : E D T A d e p e n d e n t p s e u d o t h r o m b o c y t o p e n i a c a u s e d b y a n t i b o d i e s a g a i n s t t h e c y t o a d h e s i v e r e c e p t o r o f p l a t e l e t g p I I B - I I I A . J C l i n P a t h o l 4 7 : 6 2 5 , 1 9 9 4 1 3 . 1 4 . 1 5 . 1 6 . 1 7 . 1 8 . 1 9 . 2 0 . 2 1 . 2 2 . 2 3 . 2 4 . 2 5 . 1 6 8 S c h r e z e n m e i e r H , M i i l l e r H , G u n s i l i u s E , H e i m p e l H , S e i f r i e d E : A n t i c o a g u l a n t - i n d u c e d p s e u d o t h r o m b o c y t o p e n i a a n d p s e u d o l e u c o c y t o s i s . T h r o m b H a e m o s t a s 7 3 : 5 0 6 , 1 9 9 5 B i z z a r o N : P l a t e l e t s a t e l l i t o s i s t o p o l y m o r p h o n u c l e a r s : C y t o c h e m i c a l , i m m u n o l o g - i c a l , a n d u l t r a s t r u c t u r a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f e i g h t c a s e s . A m J H e m a t o l 3 6 : 2 3 5 . 1 9 9 1 C h r i s t o p o u l o s C , M a t t o c k C : P l a t e l e t s a t e l l i t i s m a n d a g r a n u l e p r o t e i n s . J C l i n P a t h 4 4 : 7 8 8 , 1 9 9 1 B r o w n S J , S i m p s o n K W , B a k e r S J , S p a g n o l e t t i M A , E l w o o d C M : M a c r o t h r o m - b o c y t o s i s i n c a v a l i e r K i n g C h a r l e s s p a n i e l s . P r o c 1 2 t h A n n V e t M e d F o r u m , A m e r i c a n C o l l e g e o f V e t e r i n a r y I n t e r n a l M e d i c i n e . 1 9 9 4 , p 1 7 1 ( a b s t r ) B r o w n S J , S i m p s o n K W , B a k e r S , S p a g n o l e t t i M A , E l w o o d C M : M a c r o t h r o m b o - c y t o s i s i n c a v a l i e r K i n g C h a r l e s s p a n i e l s . V e t R e c o r d 1 3 5 : 2 8 1 , 1 9 9 4 E d d l e s t o n e S , T a b o a d a J : H e m a t o l o g i c c h a r a c t e r i s t i c s o f g r e y h o u n d s . J A V M A 2 0 5 : 1 5 1 3 , 1 9 9 4 ( l e t t e r ) S u l l i v a n P S , E v a n s H L , M c D o n a l d T P : P l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n a n d h e m o g l o b i n f u n c t i o n i n g r e y h o u n d s . J A V M A 2 0 5 : 8 3 8 , 1 9 9 4 T v e d t e n H W , e d : M u l t i - s p e c i e s h e m a t o l o g y a t l a s : T e c h n i c o n H — l E s y s t e m . T a r r y t o w n , N e w Y o r k , M i l e s I n c . , 1 9 9 3 , p 1 3 4 L e w i s D C , M e y e r s K M : E f f e c t o f a n t i c o a g u l a n t a n d b l o o d s t o r a g e t i m e o n p l a t e l e t - b o u n d a n t i b o d y c o n c e n t r a t i o n s i n c l i n i c a l l y n o r m a l d o g s . A m J V e t R e s 5 5 : 6 0 2 , 1 9 9 4 D o d d s W J : I m m u n e - m e d i a t e d d i s e a s e s o f t h e b l o o d . A d v V e t S c i C o m p M e d 2 7 : 1 6 3 , 1 9 8 3 H a n d a g a m a P , F e l d m a n B F : I m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n t h e d o g . C a n i n e P r a c t 1 2 : 2 5 , 1 9 8 5 H a n d a g a m a P J , F e l d m a n B F : D r u g - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a . V e t R e s C o m m u n 1 0 : 1 , 1 9 8 6 G r i n d e m C B , B r e i t s c h w e r d t E B , C o r b e t t W T , J a n s H E : E p i d e m i o l o g i c s u r v e y o f t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s : A r e p o r t o n 9 8 7 c a s e s . V e t C l i n P a t h 2 0 : 3 8 , 1 9 9 1 2 6 . 2 7 . 2 8 . 2 9 . 3 0 . 3 1 . 3 2 . 3 3 . 3 4 . 3 5 . 3 6 . 3 7 . 1 6 9 S u l l i v a n P S , M a n n i n g K L , M c D o n a l d T P : A s s o c i a t i o n o f m e a n p l a t e l e t v o l u m e a n d b o n e m a r r o w m e g a k a r y o c y t o p o i e s i s i n t h r o m b o c y t o p e n i c d o g s : 6 0 c a s e s ( 1 9 8 4 . 1 9 9 3 ) . J A V M A 2 0 6 : 3 3 2 , 1 9 9 5 F e l d m a n B F , T h o m a s o n K J , J a i n N C : Q u a n t i t a t i v e p l a t e l e t d i s o r d e r s . V e t C l i n N o r t h A m S m a l l A n i m P r a c t 1 8 : 3 5 , 1 9 8 8 H e l f a n d S C : P l a t e l e t s a n d n e o p l a s i a . V e t C l i n N o r t h A m S m a l l A n i m P r a c t 1 8 : 1 3 1 , 1 9 8 8 R o s e n t h a l R C : C h e m o t h e r a p y , i n W i t h r o w S J , M a c E w e n E G ( e d s ) : C l i n i c a l V e t e r i n a r y O n c o l o g y . P h i l a d e l p h i a , L i p p i n c o t t , 1 9 8 9 , p 6 3 T h e i l e n G H , M a d e w e l l B R , C a r t e r S K : C h e m o t h e r a p y , i n T h e i l e n G H , M a d e w e l l B R ( e d s ) : V e t e r i n a r y C a n c e r M e d i c i n e . P h i l a d e l p h i a , L e a & F e b i g e r , 1 9 8 7 , p 1 5 7 P a g e R L , M a c y D W , T h r a l l D E , D e w h i r s t M W , A l l e n S L , H e i d n e r G L , S i m D A , M c G e e M L , G i l l e t t e E L : U n e x p e c t e d t o x i c i t y a s s o c i a t e d w i t h u s e o f b o d y s u r f a c e a r e a f o r d o s i n g m e l p h a l a n i n t h e d o g . C a n c e r R e s 4 8 : 2 8 8 , 1 9 8 8 M o m p a r l e r R L , G o n z a l e s F A , M o m p a r l e r L F , M a A : P r e c l i n i c a l e v a l u a t i o n o f h e m a t o p o i e t i c t o x i c i t y o f a n t i l e u k e m i c a g e n t , 5 - A Z A - 2 ’ - d e o x y c y t i d i n e . T o x i c o l o - g y 5 7 : 3 2 9 , 1 9 8 9 H o u s t o n D M , T a y l o r J A : A c u t e p a n c r e a t i t i s a n d b o n e m a r r o w s u p p r e s s i o n i n a d o g g i v e n a z a t h i o p r i n e . C a n V e t J 3 2 : 4 9 6 , 1 9 9 1 H e n r y C J , B r e w e r W G , S t u t l e r S A : E a r l y - o n s e t l e u k 0 p e n i a a n d s e v e r e t h r o m b o - c y t o p e n i a f o l l o w i n g d o x o r u b i c i n c h e m o t h e r a p y f o r t o n s i l l a r s q u a m o u s c e l l c a r c i n o m a i n a d o g . C o r n e l l V e t 8 3 : 1 6 3 , 1 9 9 3 R a u l s D O , M o r e n o A J , G r e g o r y G , P e n n e y L L , P a r k e r G : I n d i u m - 1 1 1 o x i n e p l a t e l e t s u r v i v a l i n d o g s : E f f e c t o f d o x o r u b i c i n a n d d a c r o n g r a f t s . J N u c l M e d 2 6 : 1 3 3 1 , 1 9 8 5 M a t h e m e C M , S a t t e r fi e l d W C , G a s p a r i n i A , T o n e t t i M , A s t r o f f A B , S c h m i d t R D , R o w e L D , D e L o a c h J R : C l i n i c a l e f fi c a c y a n d t o x i c i t y o f d o x o r u b i c i n e n c a p s u l a t e d i n g l u t a r a l d e h y d e - t r e a t e d e r y t h r o c y t e s a d m i n i s t e r e d t o d o g s w i t h l y m p h o s a r c o m a . A m J V e t R e s 5 5 2 8 4 7 , 1 9 9 4 O g i l i v i e G K , M o o r e A S , C h e n C , C i e k o t P A , A t w a t e r S W , B e r g m a n P J , W a l t e r s L M : T o x i c o s e s a s s o c i a t e d w i t h t h e a d m i n i s t r a t i o n o f r n i t o x a n t r o n e t o d o g s w i t h m a l i g n a n t t u m o r s : A d o s e e s c a l a t i o n s t u d y . J A V M A 2 0 5 : 5 7 0 , 1 9 9 4 3 8 . 3 9 . 4 0 . 4 1 . 4 2 . 4 3 . 4 5 . 4 6 . 4 7 . 4 8 . 4 9 . 5 0 . 1 7 0 O g i l v i e G K , O b r a d o v i c h J E , E l m s l i e R E , V a i l D M , M o o r e A S , C u r t i s C R , S t r a w R C , D i c k i n s o n K , C o o p e r M F , W i t h r o w S J : T o x i c o s e s a s s o c i a t e d w i t h a d m i n i s t r a t i o n o f m i t o x a n t r o n e t o d o g s w i t h m a l i g n a n t t u m o r s . J A V M A 1 9 8 : 1 6 1 3 , 1 9 9 1 K n a p p D W , R i c h a r d s o n R C , B o n n e y P L , H a h n K : C i s p l a t i n t h e r a p y i n 4 1 d o g s w i t h m a l i g n a n t t u m o r s . J V e t I n t M e d 2 : 4 1 , 1 9 8 8 J a c k s o n M L , K r u t h S A : I m m u n e - m e d i a t e d h e m o l y t i c a n e m i a a n d t h r o m b o c y t o p e - n i a i n t h e d o g : A r e t r o s p e c t i v e s t u d y o f 5 5 c a s e s d i a g n o s e d f r o m 1 9 6 9 t h r o u g h 1 9 8 3 a t t h e W e s t e r n C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e . C a n V e t J 2 6 : 2 4 5 , 1 9 8 5 H a r t J E : E n d o c r i n e f a c t o r s i n h a e m a t o l o g i c a l c h a n g e s s e e n i n d o g s a n d f e r r e t s g i v e n o e s t r o g e n s . M e d H y p o t h e s e s 1 6 : 1 5 9 , 1 9 8 5 B e r n a r d S L , L e a t h e r s C W , B r o b s t D F , G o r h a m J R : E s t r o g e n - i n d u c e d b o n e m a r r o w d e p r e s s i o n i n f e r r e t s . A m J V e t R e s 4 4 2 6 5 7 , 1 9 8 3 K o c i b a G J , C a p u t o C A : A p l a s t i c a n e m i a a s s o c i a t e d w i t h e s t r u s i n p e t f e r r e t s . J A V M A 1 7 8 : 1 2 9 3 , 1 9 8 1 G a u n t S D , P i e r c e K R : M y e l o p o i e s i s a n d m a r r o w a d h e r e n t c e l l s i n e s t r a d i o l - t r e a t e d m i c e . V e t P a t h o l 2 2 : 4 0 3 , 1 9 8 5 T y s l o w i t z R , D i n g e m a n s e B : E f f e c t o f l a r g e d o s e s o f e s t r o g e n s o n t h e b l o o d p i c t u r e o f d o g s . E n d o c r i n o l o g y 2 9 : 8 1 7 , 1 9 4 1 G a u n t S D , P i e r c e K R : E f f e c t s o f e s t r a d i o l o n h e m a t o p o i e t i c a n d m a r r o w a d h e r e n t c e l l s o f d o g s . A m J V e t R e s 4 7 : 9 0 6 , 1 9 8 6 W e i s s D J , K l a u s n e r J S : D r u g - a s s o c i a t e d a p l a s t i c a n e m i a i n d o g s : E i g h t c a s e s ( 1 9 8 4 - 1 9 8 8 ) . J A V M A 1 9 6 : 4 7 2 , 1 9 9 0 A r a n d a E , P i z a r r o M , P e r e i r a J , M e z z a n o D : A c c u m u l a t i o n o f 5 - h y d r o x y t r y p t a - m i n e b y a g i n g p l a t e l e t s : S t u d i e s i n a m o d e l o f s u p p r e s s e d t h r o m b o p o i e s i s i n d o g s . T h r o m b H a e m o s t 7 1 : 4 8 8 , 1 9 9 4 F r o m A H L , F o n g J S C , C h i u T , G o o d R A : R o l e o f p l a t e l e t s i n t h e p a t h o g e n e s i s o f c a n i n e e n d o t o x i n s h o c k . I n f e c t I r n m u n 1 3 : 1 5 9 1 , 1 9 7 6 C a p e l - E d w a r d s K , H a l l D E , S a n s o m A G : H e m a t o l o g i c a l c h a n g e s o b s e r v e d i n f e m a l e b e a g l e d o g s g i v e n e t h y n y l e s t r a d i o l . T o x i c o l A p p l P h a r m a c o l 2 0 : 3 1 9 , 1 9 7 1 5 1 . 5 2 . 5 3 . 5 4 . 5 5 . 5 6 . 5 7 . 5 8 . 5 9 . 6 0 . 6 1 . 6 2 . 6 3 . 6 5 . 1 7 1 L u s t e r M I , B o o r m a n G A , K o r a c h K S , D i e t e r M P , H o n g L : M e c h a n i s m s o f e s t r o g e n - i n d u c e d m y e l o t o x i c i t y : E v i d e n c e o f t h y m i c r e g u l a t i o n . I n t J I m m u n o - p h a r m a c o l 6 : 2 8 7 , 1 9 8 4 F a r r i s G M , B e n j a m i n S A : I n h i b i t i o n o f m y e l o p o i e s i s b y c o n d i t i o n e d m e d i u m f r o m c u l t u r e d c a n i n e t h y m i c c e l l s e x p o s e d t o e s t r o g e n . A m J V e t R e s 5 4 : 1 3 6 6 , 1 9 9 3 F a r r i s G M , B e n j a m i n S A : I n h i b i t i o n o f m y e l o p o i e s i s b y s e r u m f r o m d o g s e x p o s e d t o e s t r o g e n . A m J V e t R e s 5 4 2 1 3 7 4 , 1 9 9 3 E d w a r d s D F : B o n e m a r r o w h y p o p l a s i a i n a f e m i n i z e d d o g w i t h a S e r t o l i c e l l t u m o r . J A V M A 1 7 8 : 4 9 4 , 1 9 8 1 S h e r d i n g R G , W i l s o n G P , K o c i b a G J : B o n e m a r r o w h y p o p l a s i a i n e i g h t d o g s w i t h S e r t o l i c e l l t u m o r . J A V M A 1 7 8 2 4 9 7 , 1 9 8 1 M c C a n d l i s h I A P , M u n r o C D , B r e e z e R G , N a s h A S : H o r m o n e p r o d u c i n g o v a r i a n t u m o u r s i n t h e d o g . V e t R e c o r d 1 0 5 2 9 , 1 9 7 9 S u e s s R P , B a r r S C , S a c r e E ] , F r e n c h T W : B o n e m a r r o w h y p o p l a s i a i n a f e m i n i z e d d o g w i t h a n i n t e r s t i t i a l c e l l t u m o r . J A V M A 2 0 0 : 1 3 4 6 , 1 9 9 2 B o w e n R A , O l s o n P N , B e h r e n d t M D , W h e e l e r S L , H u s t e d P W , N e t t T M : E f fi c a c y a n d t o x i c i t y o f e s t r o g e n s c o m m o n l y u s e d t o t e r m i n a t e c a n i n e p r e g n a n c y . J A V M A 1 8 6 2 7 8 3 , 1 9 8 5 H a l l E J : U s e o f l i t h i u m f o r t r e a t m e n t o f e s t r o g e n - i n d u c e d b o n e m a r r o w h y p o p l a s i a i n a d o g . J A V M A 2 0 0 : 8 1 4 , 1 9 9 2 W a t s o n A D J , W i l s o n J T , T u r n e r D M , C u l v e n o r J A : P h e n y l b u t a z o n e - i n d u c e d b l o o d d y s c r a s i a s s u s p e c t e d i n t h r e e d o g s . V e t R e c o r d 1 0 7 2 2 3 9 , 1 9 8 0 S c h a l r n O W : P h e n y l b u t a z o n e t o x i c i t y i n t w o d o g s . C a n i n e P r a c t 6 2 4 7 , 1 9 7 9 W a t s o n A D J : B o n e m a r r o w f a i l u r e i n a d o g . J S m a l l A n i m P r a c t 2 0 2 6 8 1 , 1 9 7 9 M c E w a n N A : P r e s u m p t i v e t r i m e t h o p r i m - s u l p h a m e t h o x a z o l e a s s o c i a t e d t h r o m b o - c y t o p e n i a a n d a n a e m i a i n a d o g . J S m a l l A n i m P r a c t 3 3 : 2 7 , 1 9 9 2 W e i s s D J , A d a m s L G : A p l a s t i c a n e m i a a s s o c i a t e d w i t h t r i m e t h o p r i m - s u l f a d i a z i n e a n d f e n b e n d a z o l e a d m i n i s t r a t i o n i n a d o g . J A V M A 1 9 1 : 1 1 1 9 , 1 9 8 7 L o r d i n g P M , B e l l a m y J E C : T r i r n e t h o p r i r n a n d s u l f a d i a z i n e : A d v e r s e e f f e c t s o f l o n g - t e r m a d m i n i s t r a t i o n i n d o g s . J A m A n i m H o s p A s s o c 1 4 : 4 1 0 , 1 9 7 8 6 6 . 6 7 . 6 8 . 6 9 . 7 0 . 7 1 . 7 2 . 7 3 . 7 4 . 7 5 . 7 6 . 1 7 2 M a u p i n B : B l o o d P l a t e l e t s i n M a n a n d A n i m a l s i n T w o V o l u m e s . ( v o l 1 ) B r a u n s c h w e i g , P e r g a m o n P r e s s , 1 9 6 9 , p 4 9 3 V a l e r i C R , F e i n g o l d H , M e l a r a g n o A J , V e c c h i o n e J J : C r y o p r e s e r v a t i o n o f d o g p l a t e l e t s w i t h d i r n e t h y l s u l f o x i d e : T h e r a p e u t i c e f f e c t i v e n e s s o f c r y o p r e s e r v e d p l a t e l e t s i n t h e t r e a t m e n t o f t h r o m b o c y t o p e n i c d o g s , a n d t h e e f f e c t o f p l a t e l e t s t o r a g e a t - 8 0 ° C . C r y o b i o l o g y 2 3 : 3 8 7 , 1 9 8 6 P e r r n a n V , C r o n k i t e E P , B o n d V P , S o r e n s e n D K : T h e r e g e n e r a t i v e a b i l i t y o f h e m o p o i e t i c t i s s u e f o l l o w i n g l e t h a l X - i r r a d i a t i o n i n d o g s . B l o o d 1 9 : 7 2 4 , 1 9 6 2 S e e d T , C a r n e s B , T o l l e D , F r i t z T : B l o o d r e s p o n s e s u n d e r c h r o n i c l o w d a i l y d o s e g a m m a i r r a d i a t i o n : I I . D i f f e r e n t i a l p r e c l i n i c a l r e s p o n s e s o f i r r a d i a t e d f e m a l e d o g s i n p r o g r e s s i o n t o e i t h e r a p l a s t i c a n e m i a o r m y e l o p r o l i f e r a t i v e d i s e a s e . l e u k e m i a R e s 1 7 : 4 1 1 , 1 9 9 3 B u r s t e i n S A , D o w n s T , F r i e s e P , L y n a m S , A n d e r s o n S , H e n t h o r n J , E p s t e i n R B , S a v a g e K 2 T h r o m b o c y t o p o i e s i s i n n o r m a l a n d s u b l e t h a l l y i r r a d i a t e d d o g s : R e s p o n s e t o h u m a n i n t e r l e u k i n - 6 . B l o o d 8 0 2 4 2 0 , 1 9 9 2 M a c V i t t i e T J , M o n r o y R L , P a t c h e n M L , S o u z a L M : T h e r a p e u t i c u s e o f r e c o m b i n a n t h u m a n G - C S F ( r h G - C S F ) i n a c a n i n e m o d e l o f s u b l e t h a l a n d l e t h a l w h o l e - b o d y i r r a d i a t i o n . I n t J R a d i a t B i o l 5 7 2 7 2 3 , 1 9 9 0 G i l l e t t N A , M u g g e n b u r g B A , B o e c k e r B B , H a h n F F , S e i l e r F A , R e b a r A H , J o n e s R K , M c C l e l l a n R O : S i n g l e i n h a l a t i o n e x p o s u r e t o ” S r C 1 2 i n t h e b e a g l e d o g : H e m a t o l o g i c a l e f f e c t s . R a d i a t R e s 1 1 0 : 2 6 7 , 1 9 8 7 D u n g w o r t h D L , G o l d m a n M , S w i t z e r J W , M c K e l v i e D H : D e v e l o p m e n t o f a m y e l o p r o l i f e r a t i v e d i s o r d e r i n B e a g l e s c o n t i n u o u s l y e x p o s e d t o 9 O S r . B l o o d 3 4 : 6 1 0 , 1 9 6 9 S m i t h M , T u r r e l J M : R a d i o p h o s p h o r u s ( 3 2 P ) t r e a t m e n t o f b o n e m a r r r o w d i s o r d e r s i n d o g s : 1 1 c a s e s ( 1 9 7 0 - 1 9 8 7 ) . J A V M A 1 9 4 2 9 8 , 1 9 8 9 A b r a m s — O g g A C G , K r u t h S A , C a r t e r R F , V a l l i V E , K a m e l - R e i d S , D u b é I D : P r e p a r a t i o n a n d t r a n s f u s i o n o f c a n i n e p l a t e l e t c o n c e n t r a t e s . A m J V e t R e s 5 4 : 6 3 5 , 1 9 9 3 A b r a m s - O g g A C G , K r u t h S A , C a r t e r R F , D i c k J E , V a l l i V E O , K a m e l - R e i d S , D u b é I D : C l i n i c a l a n d p a t h o l o g i c a l fi n d i n g s i n d o g s f o l l o w i n g s u p r a l e t h a l t o t a l b o d y i r r a d i a t i o n w i t h a n d w i t h o u t i n f u s i o n o f a u t o l o g o u s l o n g - t e r m m a r r o w c u l t u r e c e l l s . C a n J V e t R e s 5 7 : 7 9 , 1 9 9 2 7 7 . 7 8 . 7 9 . 8 0 . 8 1 . 8 2 . 8 3 . 8 5 . 8 6 . 8 7 . 8 8 . 8 9 . 9 1 . 1 7 3 C o u t o C G : C l i n i c o p a t h o l o g i c a s p e c t s o f a c u t e l e u k e m i a s i n t h e d o g . J A V M A 1 8 6 2 6 8 1 , 1 9 8 5 O ’ D o n n e l l M R , S l i c h t e r S J , W e i d e n P L , S t o r b R 2 P l a t e l e t a n d fi b r i n o g e n k i n e t i c s i n c a n i n e t u m o r s . C a n c e r R e s 4 1 : 1 3 7 9 , 1 9 8 1 L e i f e r t C E , M a t u s R E : C h r o n i c l y m p h o c y t i c l e u k e m i a i n t h e d o g : 2 2 c a s e s ( 1 9 7 4 - 1 9 8 4 ) . J A V M A 1 8 9 2 2 1 4 , 1 9 8 6 W e l h n a n M L , C o u t o C G , S t a r k e y R J , R o j k o J L : L y m p h o c y t o s i s o f l a r g e g r a n u l a r l y m p h o c y t e s i n t h r e e d o g s . V e t P a t h o l 2 6 : 1 5 8 , 1 9 8 9 M a d e w e l l B R : H e m a t o l o g i c a l a n d b o n e m a r r o w c y t o l o g i c a l a b n o r m a l i t i e s i n 7 5 d o g s w i t h m a l i g n a n t l y m p h o m a . J A m A n i m H o s p A s s o c 2 2 2 2 3 5 , 1 9 8 6 M a t u s R E , L e i f e r C E , M a c E w e n G , H u r v i t z A I : P r o g n o s t i c f a c t o r s f o r m u l t i p l e m y e l o m a i n t h e d o g . J A V M A 1 8 8 2 1 2 8 8 , 1 9 8 6 S h u l l R M , D e N o v o R C , M c C r a c k e n M D : M e g a k a r y o b l a s t i c l e u k e m i a i n a d o g . V e t P a t h o l 2 3 2 5 3 3 , 1 9 8 6 C a n fi e l d P J , W a t s o n A D J , B e g g A P , D i l l - M a c k y E : M y e l o p r o l i f e r a t i v e d i s o r d e r i n f o u r d o g s i n v o l v i n g d e r a n g e m e n t s o f e r y t h r o p o i e s i s , m y e l o p o i e s i s a n d m e g a k a r y o p o i e s i s . J S m a l l A n i m P r a c t 2 7 2 7 , 1 9 8 6 R a s k i n R E , K r e h b i e l J D : H i s t o p a t h o l o g y o f c a n i n e b o n e m a r r o w i n m a l i g n a n t l y m p h o p r o l i f e r a t i v e d i s o r d e r s . V e t P a t h o l 2 5 : 8 3 , 1 9 8 8 H o f f B , L u m s d e n J H , V a l l i V E O , K r u t h S A : M y e l o fi b r o s i s : R e v i e w o f c l i n i c a l a n d p a t h o l o g i c a l f e a t u r e s i n f o u r t e e n d o g s . C a n V e t J 3 2 2 3 5 7 , 1 9 9 1 . R e a g a n W J 2 A r e v i e w o f m y e l o fi b r o s i s i n d o g s . T o x i c o l P a t h o l 2 1 2 1 6 4 , 1 9 9 3 W e i s s D J , A r m s t r o n g P J : S e c o n d a r y m y e l o fi b r o s i s i n t h r e e d o g s . J A V M A 1 8 7 : 4 2 3 , 1 9 8 5 W e i s s D J , A r m s t r o n g P J , R e i m a n n K : B o n e m a r r o w n e c r o s i s i n t h e d o g . J A V M A 1 8 7 : 5 4 , 1 9 8 5 P r a s s e K W , C r o u s e r D , B e n d e r E , W a l k e r M , S c h a l l W D : P y r u v a t e k i n a s e d e fi c i e n c y a n e m i a w i t h t e r m i n a l m y e l o fi b r o s i s a n d o s t e o s c l e r o s i s i n a b e a g l e . J A V M A 1 6 6 2 1 1 7 0 , 1 9 7 5 S e a r c y G P , T a s k e r J B , M i l l e r D R : A n i m a l m o d e l o f h u m a n d i s e a s e : p y r u v a t e k i n a s e d e fi c i e n c y . A m J P a t h o l 9 4 2 6 8 9 , 1 9 7 9 9 2 . 9 3 . 9 4 . 9 5 . 9 6 . 9 7 . 9 8 . 9 9 . 1 0 0 . 1 0 1 . 1 0 2 . 1 0 3 . 1 7 4 S e e d T M , C h u b b G T , T o l l e D V , F r i t z T E , P o o l e C M , D o y l e D E , L o m b a r d L S , K a s p a r L V : T h e u l t r a s t r u c t u r e o f r a d i a t i o n - i n d u c e d e n d o s t e a l m y e l o fi b r o s i s i n t h e d o g . S c a n n i n g E l e c t r o n M i c r o s c 1 : 3 7 7 , 1 9 8 2 H o e n i g M : S i x d o g s w i t h f e a t u r e s c o m p a t i b l e w i t h m y e l o n e c r o s i s a n d m y e l o fi b r o - s i s . J A m A n i m H o s p A s s o c 2 5 2 3 3 5 , 1 9 8 9 M u r t a u g h R J , J a c o b s R M : S u s p e c t e d i m m u n e - m e d i a t e d m e g a k a r y o c y t i c h y p o p l a s i a o r a p l a s i a i n a d o g . J A V M A 1 8 6 : 1 3 1 3 , 1 9 8 5 W e i s s D J : A n t i b o d y - m e d i a t e d s u p p r e s s i o n o f e r y t h r o p o i e s i s i n d o g s w i t h r e d b l o o d c e l l a p l a s i a . A m J V e t R e s 4 7 2 2 6 4 6 , 1 9 8 6 H o f f m a n R , B r u n o E , E l w e l l J , M a z u r E , G e r w i t z A M , D e k k e r P , D e n e s A E : A c q u i r e d a m e g a k a r y o c y t i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a : A s y n d r o m e o f d i v e r s e e t i o l o g i e s . B l o o d 6 0 2 1 1 7 3 , 1 9 8 2 H o f f m a n R , Z a k n o e n S , Y a n g H H , B r u n o E , L o B u g l i o A F , A r r o w s m i t h J B , P r c h a l J T 2 A n a n t i b o d y c y t o t o x i c t o m e g a k a r y o c y t e p r o g e n i t o r c e l l s i n a p a t i e n t w i t h i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . N E n g l J M e d 3 1 2 : 1 1 7 0 , 1 9 8 5 H o f f m a n R , B r i d d e l l R A , v a n B e s i e n K , S r o u r E F , G u s c a r T , H u d s o n N W , G a n s e r A : A c q u i r e d c y c l i c a m e g a k a r y o c y t i c t h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h a n i m m u n o g l o b u l i n b l o c k i n g t h e a c t i o n o f g r a n u l o c y t e - m a c r o p h a g e c o l o n y - s t i m u l a t i n g f a c t o r . N E n g l J M e d 3 2 1 2 9 7 , 1 9 8 9 H y d e P , Z u c k e r - F r a n k l i n D : A n t i g e n i c d i f f e r e n c e s b e t w e e n h u m a n p l a t e l e t s a n d m e g a k a r y o c y t e s . A m J P a t h o l 1 2 7 2 3 4 9 , 1 9 8 7 B a l l e m P J , S e g a l G M , S t r a t t o n J R , G e m s h e i r n e r T , A d a m s o n J W , S l i c h t e r S J : M e c h a n i s m s o f t h r o m b o c y t o p e n i a i n c h r o n i c a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a : E v i d e n c e o f b o t h i m p a i r e d p l a t e l e t p r o d u c t i o n a n d i n c r e a s e d p l a t e l e t c l e a r a n c e . J C l i n I n v e s t 8 0 : 3 3 , 1 9 8 7 B e a r d s l e y D S : P l a t e l e t a u t o a n t i g e n s , i n K u n i c k i T J , G e o r g e J N ( e d s ) : P l a t e l e t I r n m u n o b i o l o g y : M o l e c u l a r a n d C l i n i c a l A s p e c t s . P h i l a d e l p h i a , L i p p i n c o t t , 1 9 8 9 , p 1 2 1 G e r w i t z A M , K e e f e r S a c c h e t t i M , B i e n R , B a r r y W E : C e l l - m e d i a t e d s u p p r e s s i o n o f m e g a k a r y o c y t o p o i e s i s i n a c q u i r e d a m e g a k a r y o c y t i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B l o o d 6 8 : 6 1 9 , 1 9 8 6 K o b a y a s h i H , K i t a n o K , I s h i d a F , S a i t o H , M i y a b a y a s h i H , Y o n e z a w a T , I n a d a H , S u z u k i A , F u r u t a S : A p l a s t i c a n e m i a a n d i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a 1 0 4 . 1 0 5 . 1 0 6 . 1 0 7 . 1 0 8 . 1 0 9 . 1 1 0 . 1 1 1 . 1 1 2 . 1 1 3 . 1 1 4 . 1 1 5 . 1 1 6 . 1 7 5 w i t h a n t i b o d y t o p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n I I b / I I I a f o l l o w i n g r e s e c t i o n o f m a l i g n a n t t h y m o m a . A c t a H a e m a t o l 9 0 : 4 2 , 1 9 9 3 K a w a g u c h i R , H a r u n a S , H i k i j i K , H i g a s h i Y , T s u k a s a Y : E l e v a t i o n o f p l a t e l e t - a s s o c i a t e d I g G i n a p l a s t i c a n e m i a . J C l i n L a b A n a l y s i s 6 : 1 3 0 , 1 9 9 2 W e i s s D J , S t o c k h a m S L , W i l l a r d M D , S c h i r r n e r R G : T r a n s i e n t e r y t h r o i d h y p o p l a s i a i n t h e d o g : R e p o r t o f fi v e c a s e s . J A m A n i m H o s p A s s o c 1 8 : 3 5 3 , 1 9 8 2 M c D o n a l d T P , C l i f t R , J o n e s J B : C a n i n e c y c l i c h e m a t o p o i e s i s : P l a t e l e t s i z e a n d t h r o m b o p o i e t i n l e v e l i n r e l a t i o n t o p l a t e l e t c o u n t . P r o c S o c E x p B i o l M e d 1 5 3 : 4 2 4 , 1 9 7 6 H a m m o n d W P , D a l e D C : L i t h i u m t h e r a p y o f c a n i n e c y c l i c h e m a t o p o i e s i s . B l o o d 5 5 2 2 6 , 1 9 8 0 Q u e s e n b e r r y P J : C y c l i c h e m a t o p o i e s i s : D i s o r d e r s o f p r i m i t i v e h e m a t o p o i e t i c s t e m c e l l s . E x p H e m a t o l 1 1 2 6 8 7 , 1 9 8 3 R a y m o n d S L , D o d d s W J : P l a t e l e t m e m b r a n e g l y c 0 p r o t e i n s i n n o r m a l d o g s a n d d o g s w i t h h e m o s t a t i c d e f e c t s . , J L a b C l i n M e d 9 3 : 6 0 7 , 1 9 7 9 D o d d s W J : F a m i l i a l c a n i n e t h r o m b o c y t o p a t h y . T h r o m b D i a t h H a e m o r r h ( s u p p ) 2 6 2 2 4 1 , 1 9 6 7 A x t h e l r n M K , K r a k o w k a S : C a n i n e d i s t e m p e r v i r u s - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a . A m J V e t R e s 4 8 : 1 2 6 9 , 1 9 8 7 R e a r d o n M J , P i e r c e K R : A c u t e e x p e r i m e n t a l c a n i n e e h r l i c h i o s i s : I . S e q u e n t i a l r e a c t i o n o f t h e h e m i c a n d l y m p h o r e t i c u l a r s y s t e m s . V e t P a t h o l 1 8 : 4 8 , 1 9 8 1 H u x s o l l D L , H i l d e b r a n d t P K , N i r n s R M , W a l k e r J S : T r 0 p i c a l c a n i n e p a n c y t o p e - n i a . J A V M A 1 5 7 2 1 6 2 7 , 1 9 7 0 S w e n s o n C L , S i l v e r m a n J , S t r o m b e r g P C , J o h n s o n S E , W i l k i e D A , E a t o n K A , K o c i b a G J 2 V i s c e r a l l e i s h m a n i a s i s i n a n E n g l i s h F o x h o u n d f r o m a n O h i o r e s e a r c h c o l o n y . J A V M A 1 9 3 : 1 0 8 9 , 1 9 8 8 M a c a r t n e y L , M c C a n d l i s h I A P , T h o m p s o n H , C o m w e l l H J C : C a n i n e p a r v o v i r u s e n t e r i t i s 1 2 C l i n i c a l , h a e m a t o l o g i c a l a n d p a t h o l o g i c a l f e a t u r e s o f e x p e r i m e n t a l i n f e c t i o n . V e t R e c o r d 1 1 5 2 2 0 1 , 1 9 8 4 B r e i t s c h w e r d t E B : I n f e c t i o u s t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s . C o m p e n d C o n t i n E d u c S m a l l A n i m P r a c t 1 0 : 1 1 7 7 , 1 9 8 8 1 1 7 . 1 1 8 . 1 1 9 . 1 2 0 . 1 2 1 . 1 2 2 . 1 2 3 . 1 2 4 . 1 2 5 . 1 2 6 . 1 2 7 . 1 2 8 . 1 2 9 . 1 7 6 M a c a r t n e y L , M c C a n d l i s h I A P , T h o m p s o n H , C o m w e l l H J C : C a n i n e p a r v o v i r u s e n t e r i t i s 2 : P a t h o g e n e s i s . V e t R e c o r d 1 1 5 2 4 5 3 , 1 9 8 4 B r o c k K V , J o n e s J B , S h u l l R M , P o t g i e t e r L N D : E f f e c t o f c a n i n e p a r v o v i r u s o n e r y t h r o i d p r o g e n i t o r s i n p h e n y l h y d r a z i n e - i n d u c e d r e g e n e r a t i v e h e m o l y t i c a n e m i a i n d o g s . A m J V e t R e s 5 0 2 9 6 5 , 1 9 8 9 F e l d m a n B F : D i s o r d e r s o f p l a t e l e t s , i n K i r k R W ( e d ) : C u r r e n t V e t e r i n a r y T h e r a p y X . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 8 9 , p 4 5 7 M u e l l e r - E c k h a r d t C , M u e l l e r - E c k h a r d t G , K a y s e r W , V o s s R M , W e g n e r J , K i i e n z l e n E : P l a t e l e t a s s o c i a t e d I g G , p l a t e l e t s u r v i v a l , a n d p l a t e l e t s e q u e s t r a t i o n i n t h r o m b o c y t o p e n i a . B r J H a e m a t o l 5 2 : 4 9 , 1 9 8 2 A s t e r R H : P o o l i n g o f p l a t e l e t s i n t h e s p l e e n : R o l e i n t h e p a t h o g e n e s i s o f " h y p e r s p l e n i c " t h r o m b o c y t o p e n i a . J C l i n I n v e s t 4 5 2 6 4 5 , 1 9 6 6 L o t t e r M G , B a d e n h o r s t P N , H e y n s A P , V a n R e e n e n O R , P i e t e r s H , M i n n a a r P C : K i n e t i c s , d i s t r i b u t i o n , a n d s i t e s o f d e s t r u c t i o n o f c a n i n e b l o o d p l a t e l e t s w i t h I n - 1 1 1 O x i n e . J N u c l M e d 2 1 : 3 6 , 1 9 8 0 F r e e d m a n M , A l t s z u l e r N , K a r p a t k i n S : P r e s e n c e o f a n o n s p l e n i c p l a t e l e t p o o l . B l o o d 5 0 : 4 1 9 , 1 9 7 7 M e y e r s K M : P a t h o b i o l o g y o f a n i m a l p l a t e l e t s . A d v V e t S c i C o m p M e d 3 0 2 1 3 1 , 1 9 8 5 C e n t e r S A : P a t h o p h y s i o l o g y , l a b o r a t o r y d i a g n o s i s , a n d d i s e a s e s o f t h e l i v e r , i n E t t i n g e r S J , F e l d m a n E C ( e d s ) : T e x t b o o k o f V e t e r i n a r y I n t e r n a l M e d i c i n e : D i s e a s e s o f t h e D o g a n d C a t ( 4 t h e d , v o l 2 ) . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 9 4 , p 1 2 6 1 W i l l i s S E , J a c k s o n M L , M e r i c S M , R o u s s e a u x C G : W h o l e b l o o d p l a t e l e t a g g r e g a t i o n i n d o g s w i t h l i v e r d i s e a s e . A m J V e t R e s 5 0 2 1 8 9 3 , 1 9 8 9 K u e h n N F , G a u n t S D : H y p o c e l l u l a r m a r r o w a n d e x t r a m e d u l l a r y h e m a t o p o i e s i s i n a d o g : H e m a t o l o g i c r e c o v e r y a f t e r s p l e n e c t o m y . J A V M A 1 8 8 2 1 3 1 3 , 1 9 8 6 B r o o k s M B , M a t u s R E , L e i f e r C E , P a t n a i k A K : U s e o f s p l e n e c t o m y i n t h e m a n a g e m e n t o f l y m p h o m a i n d o g s : 1 6 c a s e s ( 1 9 7 6 - 1 9 8 5 ) . J A V M A 1 9 1 : 1 0 0 8 , 1 9 8 7 G u t r n a n n F D , M u r t h y V S , W o j c i e c h o w s k i M T , W u r m R M , E d z a r d s R A : T r a n s i e n t p u l m o n a r y p l a t e l e t s e q u e s t r a t i o n d u r i n g e n d o t o x e m i a i n d o g s . C i r c S h o c k 2 1 2 1 8 5 , 1 9 8 7 1 3 0 . 1 3 1 . 1 3 2 . 1 3 3 . 1 3 4 . 1 3 5 . 1 3 6 . 1 3 7 . 1 3 8 . 1 3 9 . 1 4 0 . 1 4 1 . 1 4 2 . 1 7 7 V i l l a l o b o s T J , A d e l s o n E , R i l e y P A J r , C r o s b y W H , G l a u c k e H : A c a u s e o f t h e t h r o m b o c y t o p e n i a a n d l e u k o p e n i a t h a t o c c u r i n d o g s d u r i n g d e e p h y p o t h e r m i a . J C l i n I n v e s t 3 7 2 1 , 1 9 5 8 T o h C H , H o o g e n d o o r n H , G i l e s A R : T h e g e n e r a t i o n o f t h r o m b i n i n v i v o i n d u c e s t h e s e l e c t i v e l o s s o f h i g h m o l e c u l a r w e i g h t m u l t i m e r s o f v o n W i l l e b r a n d f a c t o r a n d t h e r e v e r s i b l e s e q u e s t r a t i o n o f p l a t e l e t s . B r J H a e m a t o l 8 5 2 7 5 1 , 1 9 9 3 R o w s e l l H C , G l y n n M F , M u s t a r d J F , M u r p h y E A : E f f e c t o f h e p a r i n o n p l a t e l e t e c o n o m y i n d o g s . A m J P h y s i o l 2 1 3 2 9 1 5 , 1 9 6 7 I n g r a m M , C o o p e r s m i t h A : R e t i c u l a t e d p l a t e l e t s f o l l o w i n g a c u t e b l o o d l o s s . B r J H a e m a t o l 1 7 : 2 2 5 , 1 9 6 9 M i n t e r F M , I n g r a m M : P l a t e l e t v o l u m e : d e n s i t y r e l a t i o n s h i p s i n n o r m a l a n d a c u t e l y b l e d d o g s . B r J H a e m a t o l 2 0 2 5 5 , 1 9 7 1 L j u n g q v i s t U : P l a t e l e t r e s p o n s e t o a c u t e h a e m o r r h a g e . A c t a C h i r S c a n d 1 3 7 : 7 , 1 9 7 1 J o h n e s s e e J S , H u r v i t z A I : T h r o m b o c y t o p e n i a , i n K i r k R W ( e d ) : C u r r e n t V e t e r i n a r y T h e r a p y V I I I . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 8 3 , p 3 8 9 W e i s e r M G : E r y t h r o c y t e r e s p o n s e s a n d d i s o r d e r s , i n E t t i n g e r S J , F e l d m a n E C ( e d s ) : T e x t b o o k o f V e t e r i n a r y I n t e r n a l M e d i c i n e : D i s e a s e s o f t h e D o g a n d C a t ( 4 t h e d , v o l 2 ) . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 9 4 , p 1 8 6 4 H e i l m a n n E , F r e i s e P , A n d e r s o n 8 , G e o r g e J N , H a n s o n S R , B u r s t e i n S A , D a l e G L 2 B i o t i n y l a t e d p l a t e l e t s : A n e w a p p r o a c h t o t h e m e a s u r e m e n t o f p l a t e l e t l i f e s p a n . B r J H a e m a t o l 8 5 2 7 2 9 , 1 9 9 3 K r e s o w i k T F , W a k e fi e l d T W , F e s s l e r 1 1 R D , S t a n l e y J C : A n t i c o a g u l a n t e f f e c t s o f p r o t a m i n e s u l f a t e i n a c a n i n e m o d e l . J S u r g R e s 4 5 2 8 , 1 9 8 8 L i n d b l a d B , B o r g s t r o m A , W a k e fi e l d T W , W h i t e h o u s e W M J , S t a n l e y J C : P r o t a m i n e r e v e r s a l o f a n t i c o a g u l a t i o n a c h i e v e d w i t h a l o w m o l e c u l a r w e i g h t h e p a r i n . T h e e f f e c t s o n e i c o s a n o i d s , c l o t t i n g a n d c o m p l e m e n t f a c t o r s . T h r o m b R e s 4 8 : 3 1 , 1 9 8 7 Y a n g V C , T e n g C C , K i m J - S 2 A fi l t e r d e v i c e f o r t h e p r e v e n t i o n o f b o t h h e p a r i n - a n d p r o t a m i n e - i n d u c e d c o m p l i c a t i o n s a s s o c i a t e d w i t h e x t r a c o r p o r e a l t h e r a p y . B i o m e d I n s t r u m T e c h n o l 2 4 : 4 3 3 , 1 9 9 0 W a k e fi e l d T W , B o u f f o r d J A , S p a u l d i n g S A , P e t r y N A , G r o s s M D , L i n d b l a d B , S t a n l e y J C : S e q u e s t r a t i o n o f p l a t e l e t s i n t h e p u l m o n a r y c i r c u l a t i o n a s a 1 4 3 . 1 4 4 . 1 4 5 . 1 4 6 . 1 4 7 . 1 4 8 . 1 4 9 . 1 5 0 . 1 5 1 . 1 5 2 . 1 5 3 . 1 7 8 ‘ c o n s e q u e n c e o f p r o t a m i n e r e v e r s a l o f t h e a n t i c o a g u l a n t e f f e c t s o f h e p a r i n . J V a s c S u r g 1 : 1 8 7 , 1 9 8 7 W a k e fi e l d T W , T i l l G O , L i n d b l a d B , S a e n z N , S t a n l e y J C : C o m p l e m e n t d e p l e t i o n a n d p e r s i s t e n t h e m o d y n a m i c - h e m a t o l o g i c r e s p o n s e s i n p r o t a m i n e - h e p a r i n r e a c t i o n s . J S u r g R e s 4 5 2 3 2 0 , 1 9 8 8 E i k a C : O n t h e m e c h a n i s m o f p l a t e l e t a g g r e g a t i o n i n d u c e d b y h e p a r i n , p r o t a m i n e a n d p o l y b r e n e . S c a n d J H a e m a t o l 9 : 2 4 8 , 1 9 7 2 R e a g a n W J , S c o t t - M o n c r i e f f J C , S n y d e r P W , K e l l y K , G l i c k m a n L T : A c t i o n o f h u m a n i n t r a v e n o u s g a m m a g l o b u l i n o n t h e c a n i n e h e m a t O p o i e t i c s y s t e m . B l o o d 8 4 ( s u p p ) : 6 6 2 a , 1 9 9 4 ( a b s t r ) N a s h R A , S c h u e n i n g F , A p p e l b a u m F , H a m m o n d W P , B o o n e T , M o r r i s C F , S l i c h t e r S J , S t o r b R : M o l e c u l a r c l o n i n g a n d i n v i v o e v a l u a t i o n o f c a n i n e g r a n u l o c y t e — m a c r o p h a g e c o l o n y - s t i m u l a t i n g f a c t o r . B l o o d 7 8 2 9 3 0 , 1 9 9 1 S c h u e n i n g F G , S t o r b R , G o e h l e S , N a s h R , G r a h a m T C , A p p e l b a u m F R , H a c k m a n R , S a n d m a i e r B M , U r d a l D L : S t i m u l a t i o n o f c a n i n e h e m a t o p o i e s i s b y r e c o m b i n a n t h u m a n g r a n u l o c y t e - m a c r o p h a g e c o l o n y — s t i m u l a t i n g f a c t o r . E x p H e m a t o l 1 7 : 8 8 9 , 1 9 8 9 C z e r G T , M a r s h J , K o n o p k a R , M o s e r K M : L o w - d o s e P G I Z p r e v e n t s m o n o - c r o t a l i n e - i n d u c e d t h r o m b o x a n c p r o d u c t i o n a n d l u n g i n j u r y . J A p p l P h y s i o l 6 0 2 4 6 4 , 1 9 8 6 Y a r r i n g t o n J T , W a l l a c e C D , L o u d y D E , G i b s o n J P 2 T h r e e - m o n t h e f f e c t s o f M D L 1 9 , 6 6 0 o n t h e c a n i n e p l a t e l e t a n d e r y t h r o c y t e . F u n d a m A p p l T o x i c o l 1 8 2 2 4 7 , 1 9 9 2 Y a r r i n g t o n J T , L o u d y D E , S p r i n k l e - C a v a l l o J , B r o e r s m a R , G i b s o n J P : S h o r t - t e r m s t u d i e s o f M D L 1 9 , 6 6 0 - i n d u c e d c a n i n e t h r o m b o c y t o p e n i a . T o x i c o l P a t h o l 1 8 : 6 5 1 , 1 9 9 0 I p W F , S e f t o n M V : P l a t e l e t c o n s u m p t i o n b y p o l y v i n y l a l c o h o l c o a t e d t u b i n g i n c a n i n e s . J B i o m e d M a t e r R e s 2 5 2 8 7 5 , 1 9 9 1 L a m b e r t P P , D o r i a u x M , S e n n e s a e l J , V a n h o l d e r R , L a r n m e n s - V e r s l i j p e M : P a t h o g e n i c i t y o f c a t i o n i z e d a l b u m i n i n t h e d o g : r e n a l a n d e x t r a r e n a l e f f e c t s . C l i n S c i 6 7 : 1 9 , 1 9 8 4 H a m m e r A S , C o u t o C G , S w a r d s o n C , G e t z y D : H e m o s t a t i c a b n o r m a l i t i e s i n d o g s w i t h h e m a n g i o s a r c o m a . J V e t I n t M e d 5 : 1 1 , 1 9 9 1 1 5 4 . 1 5 5 . 1 5 6 . 1 5 7 . 1 5 8 . 1 5 9 . 1 6 0 . 1 6 1 . 1 6 2 . 1 6 3 . 1 6 4 . 1 6 5 . 1 6 6 . 1 7 9 S c h a e f f e r R C J r , B r i s t o n C , C h i l t o n S - M , C a r l s o n R W : H y p o t e n s i v e a n d h e m o s t a t i c p r o p e r t i e s o f r a t t l e s n a k e ( C r o t a l u s v i r i d i s h e l l e r i ) v e n o m a n d v e n o m f r a c t i o n s i n d o g s . J P h a r m a c o l E x p T h e r 2 3 0 1 3 9 3 , 1 9 8 4 S l a p p e n d e l R J : D i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n . V e t C l i n N o r t h A m S m a l l A n i m P r a c t 1 8 : 1 6 9 , 1 9 8 8 S c h a e f f e r R C J , B r i s t o n C , C h i l t o n S - M , C a r l s o n R W : D i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n f o l l o w i n g E c h i s c a r i n a t u s v e n o m i n d o g s : E f f e c t s o f a s y n t h e t i c t h r o m b i n i n h i b i t o r . J L a b C l i n M e d 1 0 7 2 4 8 8 , 1 9 8 6 F e l d m a n B F , M a d e w e l l B R , O ’ N e i l l S : D i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n : A n t i t h r o r n b i n , p l a s m i n o g e n , a n d c o a g u l a t i o n a b n o r m a l i t i e s i n 4 1 d o g s . J A V M A 1 7 9 2 1 5 1 , 1 9 8 1 K o c i b a G J , H a t h a w a y J E : D i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n a s s o c i a t e d w i t h h e a r t w o r m d i s e a s e i n t h e d o g . J A m A n i m H o s p A s s o c 1 0 : 3 7 3 , 1 9 7 4 S l a p p e n d e l R J : C a n i n e l e i s h m a n i a s i s : A r e v i e w b a s e d o n 9 5 c a s e s i n t h e N e t h e r l a n d s . V e t Q u a r t e r l y 1 0 : 1 , 1 9 8 8 L e w i s D C , M e y e r s K M , C a l l a n M B , B i i c h e l e r J , G i g e r U : D e t e c t i o n o f p l a t e l e t - b o u n d a n d s e r u m p l a t e l e t - b i n d a b l e a n t i b o d i e s f o r d i a g n o s i s o f i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a i n d o g s . J A V M A 2 0 6 2 4 7 , 1 9 9 5 J a i n N C , S w i t z e r J W : A u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s a n d c a t s . V e t C l i n N o r t h A m S m a l l A n i m P r a c t 1 1 : 4 2 1 , 1 9 8 1 S i l v a R , M o o r e B B , B a r - o r D , G a l l o w a y W B , W r i g h t E D : T h e r i s k 2 b e n e fi t o f a u t o t r a n s f u s i o n - c o m p a r i s o n t o b a n k e d b l o o d i n a c a n i n e m o d e l . J T r a u m a 2 4 2 5 5 7 , 1 9 8 4 H a r d i e E M : E n d o t o x e m i a , i n G r e e n e C E ( e d ) : I n f e c t i o u s D i s e a s e s o f t h e D o g a n d C a t . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 9 0 , p 4 9 4 F l e t c h e r J R , R a m w e l l P W : T h e e f f e c t s o f p r o s t a c y c l i n ( P 0 1 2 ) o n e n d o t o x i n s h o c k a n d e n d o t o x i n - i n d u c e d p l a t e l e t a g g r e g a t i o n i n d o g s . C i r c S h o c k 7 : 2 9 9 , 1 9 8 0 P e n n i n g t o n D G , H y m a n A L , J a q u e s W E : P u l m o n a r y v a s c u l a r r e s p o n s e t o e n d o t o x i n i n i n t a c t d o g s . S u r g e r y 7 3 2 2 4 6 , 1 9 7 3 G a r n e r R , C h a t e r B V , B r o w n D L : T h e r o l e o f c o m p l e m e n t i n e n d o t o x i n s h o c k a n d d i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n : E x p e r i m e n t a l o b s e r v a t i o n s i n t h e d o g . B r J H a e m a t o l 2 8 2 3 9 3 , 1 9 7 4 1 6 7 . 1 6 8 . 1 6 9 . 1 7 0 . 1 7 1 . 1 7 2 . 1 7 3 . 1 7 4 . 1 7 5 . 1 7 6 . 1 7 7 . 1 7 8 . 1 8 0 T s u c h i y a R , K y o t a n i K , T o z u k a K , N i s h i z o n o K , A s h i d a Y , Y a m a d a Y , K o b a y a s h i K : A r o l e o f p l a t e l e t a c t i v a t i o n f a c t o r ( P A F ) i n e n d o t o x i n ( L P S ) - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g . V e t P a t h o l 3 1 2 5 8 2 , 1 9 9 4 ( a b s t r ) M e y e r s K M , B o e h m e M , I n b a r 0 : B i n d i n g o f 1 2 5 1 - l a b e l e d e n d o t o x i n t o b o v i n e , c a n i n e , a n d e q u i n e p l a t e l e t s a n d e n d o t o x i n - i n d u c e d a g g l u t i n a t i o n o f c a n i n e p l a t e l e t s . A m J V e t R e s 4 3 2 1 7 2 1 , 1 9 8 2 M u r p h y T L , T a y l o r F B , W e l s m a n I M , G i l l i a m J M , T a y l o r F B J r : C o m p l e m e n t — d e p e n d e n t a c t i v a t i o n o f c a n i n e p l a t e l e t s b y e n d o t o x i n a n d c o l l a g e n : I n v i t r o s t u d i e s . C l i n I m m u n o l I m m u n o p a t h o l 1 6 : 5 7 , 1 9 8 0 R o s e n b e r g J C , L e k a s N , L y s z K , M o r r e l l R : E f f e c t o f a n t i t h y m o c y t e g l o b u l i n a n d o t h e r i m m u n e r e a c t a n t s o n h u m a n p l a t e l e t s . S u r g e r y 7 7 2 5 2 0 , 1 9 7 5 H a r r i s R H , S c h m e l i n g J W , F l e t c h e r J R , R a m w e l l P W : E n d o t o x i n i n t e r a c t i o n w i t h c a n i n e p l a t e l e t s f a i l s t o s t i m u l a t e t h r o m b o x a n c p r o d u c t i o n . P r o c S o c E x p B i o l M e d 1 6 9 2 3 9 7 , 1 9 8 2 F o n g J S C , W h i t e J G , G o o d R A : I n h i b i t i o n o f e n d o t o x i c l i p o p o l y s a c c h a r i d e - m e d i a t e d p l a t e l e t a g g r e g a t i o n b y c o b r a v e n o m a n t i c o m p l e m e n t a r y f a c t o r . B l o o d 4 4 : 3 9 9 , 1 9 7 4 M a c I n t y r e D E , A l l e n A P , T h o r n e K J I , G l a u e r t A M , G o r d o n J L : E n d o t o x i n — i n d u c e d p l a t e l e t a g g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n : I . M o r p h o l o g i c a l c h a n g e s a n d p h a r m a c o l o g i c a l e f f e c t s . J C e l l S c i 2 8 2 2 1 1 , 1 9 7 7 S c h w a r t z B S , M o n r o e M C : H u m a n p l a t e l e t a g g r e g a t i o n i s i n i t i a t e d b y p e r i p h e r a l b l o o d m o n o n u c l e a r c e l l s e x p o s e d t o b a c t e r i a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e i n v i t r o . J C l i n I n v e s t 7 8 2 1 1 3 6 , 1 9 8 6 G r e e n e C E , S h o t t s E B : L e p t o s p i r o s i s , i n G r e e n e C E ( e d ) : I n f e c t i o u s D i s e a s e s o f t h e D o g a n d C a t . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 9 0 , p 4 9 8 K e e n a n K P , A l e x a n d e r A D , M o n t g o m e r y C A : P a t h o g e n e s i s o f e x p e r i m e n t a l L e p t o s p i r a i n t e r r o g a n s , s e r o v a r b a t a v i a e , i n f e c t i o n i n t h e d o g : M i c r o b i o l o g i c a l , c l i n i c a l , h e m a t o l o g i c , a n d b i o c h e m i c a l s t u d i e s . A m J V e t R e s 3 9 : 4 4 9 , 1 9 7 8 N a v a r r o C E K , K o c i b a G J 2 H e m o s t a t i c c h a n g e s i n d o g s w i t h e x p e r i m e n t a l L e p t o s p i r a i n t e r r o g a n s s e r o v a r i c t e r o h a e m o r r h a g i a e i n f e c t i o n . A m J V e t R e s 4 3 2 9 0 4 , 1 9 8 2 G o u r l e y I M G , L o w G : I n v i t r o a g g r e g a t i o n o f c a n i n e b l o o d p l a t e l e t s a n d l i q u e f a c t i o n o f b l o o d c l o t s b y l e p t o s p i r e s . A m J V e t R e s 2 3 : 1 2 5 2 , 1 9 6 2 1 7 9 . 1 8 0 . 1 8 1 . 1 8 2 . 1 8 3 . 1 8 4 . 1 8 5 . 1 8 6 . 1 8 7 . 1 8 8 . 1 8 9 . 1 9 0 . 1 8 1 S c h e l l i n g C G , G r e e n e C E , P r e s t w o o d A K , T s a n g V C W : C o a g u l a t i o n a b n o r m a l i - t i e s a s s o c i a t e d w i t h a c u t e A n g i o s t r o n g y l u s v a s o r u m i n f e c t i o n i n d o g s . A m J V e t R e s 4 7 : 2 6 6 9 , 1 9 8 6 B o u d r e a u x M K , D i l l o n A R , S p a n o J S : E n h a n c e d p l a t e l e t r e a c t i v i t y i n h e a r t w o r m - i n f e c t e d d o g s . A m J V e t R e s 5 0 : 1 5 4 4 , 1 9 8 9 C a l v e r t C A : S e l e c t e d c o m p l i c a t i o n s a n d s e q u e l a e o f c a n i n e h e a r t w o r m d i s e a s e . S e m V e t M e d S u r g ( S m a l l A n i m a l ) 2 : 5 6 , 1 9 8 7 C l e m m o n s R M , Y a m a g u c h i R A , F l e m i n g J F , M c D o n a l d T L , G r i e v e R B , I k e d a M , S c h a u b R G : T h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n a d u l t h e a r t w o r m s a n d p l a t e l e t s . P r o c e e d i n g s o f t h e H e a r t w o r m S y m p o s i u m ’ 8 3 . E d w a r d s v i l l e , V e t M e d P u b , 1 9 8 3 , p 2 0 ( a b s t r ) W e r n e r L L , H a l l i w e l l R E W , J a c k s o n R F , N e e d h a m T C , L i m p a c h M : A n i n v e s t i g a t i o n o f t h e r o l e o f i m m u n o l o g i c f a c t o r s i n a n e m i a a s s o c i a t e d w i t h c a n i n e h e a r t w o r m d i s e a s e . V e t I r n m u n o I r n m u n o p a t h 7 : 2 8 5 , 1 9 8 4 B r e i t s c h w e r d t E B : T h e R i c k e t t s i o s e s , i n E t t i n g e r S J , F e l d m a n E C ( e d s ) : T e x t b o o k o f V e t e r i n a r y I n t e r n a l M e d i c i n e : D i s e a s e s o f t h e D o g a n d C a t ( 4 t h e d , v o l 1 ) . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 9 4 , p 3 7 6 G r e e n e C E , B u r g d o r f e r W , C a v a g n o l o R , P h i l i p R N , P e a c o c k M G : R o c k y M o u n t a i n s p o t t e d f e v e r i n d o g s a n d i t s d i f f e r e n t i a t i o n f r o m c a n i n e e h r l i c h i o s i s . J A V M A 1 8 6 2 4 6 5 , 1 9 8 5 K e e n a n K P , B u h l e s W C , H u x s o l l D L , W i l l i a m s R G , H i l d e b r a n d t P K : S t u d i e s o n t h e p a t h o g e n e s i s o f R i c k e t t s i a r i c k e t t s i i i n t h e d o g : C l i n i c a l a n d C l i n i c o p a t h o l o g i c c h a n g e s o f e x p e r i m e n t a l i n f e c t i o n . A m J V e t R e s 3 8 : 8 5 1 , 1 9 7 7 S i l v e r m a n D J : A d h e r e n c e o f p l a t e l e t s t o h u m a n e n d o t h e l i a l c e l l s i n f e c t e d b y R i c k e t t s i a r i c k e t t s i i . J I n f e c t D i s 1 5 3 2 6 9 4 , 1 9 8 6 D a v i d s o n M G , B r e i t s c h w e r d t E B , W a l k e r D H , L e v y M G , C a r l s o n C S , H a r d i e E M , G r i n d e m C A , N a s i s s e M P : V a s c u l a r p e r m e a b i l i t y a n d c o a g u l a t i o n d u r i n g R i c k e t t s i a r i c k e t t s i i i n f e c t i o n i n d o g s . A m J V e t R e s 5 1 2 1 6 5 , 1 9 9 0 W a l k e r D H , M a t t e m W D : R i c k e t t s i a l v a s c u l i t i s . A m H e a r t J 1 0 0 : 8 9 6 , 1 9 8 0 G r i n d e m C B , C o r b e t t W T , L e v y M G , D a v i d s o n M G , B r e i t s c h w e r d t E B : P l a t e l e t a g g r e g a t i o n i n d o g s e x p e r i m e n t a l l y i n f e c t e d w i t h R i c k e t t s i a r i c k e t t s i i . V e t C l i n P a t h 1 9 2 2 5 , 1 9 9 0 1 9 1 . 1 9 2 . 1 9 3 . 1 9 4 . 1 9 5 . 1 9 6 . 1 9 7 . 1 9 8 . 1 9 9 . 2 0 0 . 2 0 1 . 2 0 2 . 2 0 3 . 1 8 2 C a m p b e l l K L , G e o r g e J W , G r e e n e C E : A p p l i c a t i o n o f t h e e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y f o r t h e d e t e c t i o n o f p l a t e l e t a n t i b o d i e s i n d o g s . A m J V e t R e s 4 5 2 2 5 6 1 , 1 9 8 4 W i g t o n D H , K o c i b a G J , H o o v e r E A : I n f e c t i o u s c a n i n e h e p a t i t i s : A n i m a l m o d e l f o r v i r a l - i n d u c e d d i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n . B l o o d 4 7 : 2 8 7 , 1 9 7 6 W i g t o n D H : P l a t e l e t t u r n o v e r , f u n c t i o n a n d u l t r a s t r u c t u r e i n i n f e c t i o u s c a n i n e h e p a t i t i s . V e t C l i n P a t h 7 2 1 6 , 1 9 7 8 C a r m i c h a e l L E , G r e e n e C E : C a n i n e h e r p e s v i r u s i n f e c t i o n , i n G r e e n e C E ( e d ) : I n f e c t i o u s D i s e a s e s o f t h e D o g a n d C a t . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 9 0 , p 2 5 2 S u g e r m a n I - I J , A u s t i n G L , Q u r e s h i G D , H y l e m o n P , R u d d y S , G r e e n fi e l d L J : T h r o m b o c y t o p e n i a i n p r o g r e s s i v e l e t h a l c a n i n e p e r i t o n i t i s . S u r g G y n e c o l O b s t e t 1 5 4 2 1 9 3 , 1 9 8 2 A p i t z - C a s t r o R , L e d e z m a E , E s c a l a n t e J , J o r q u e r a A , P i n a t e F M , M o r e n o - R e a J , C a r r i l l o G , L e a l O , J a i n M K : R e v e r s i b l e p r e v e n t i o n o f p l a t e l e t a c t i v a t i o n b y ( E , Z ) - 4 , 5 , 9 — t r i t h i a d o d e c a - l , 6 , 1 l - t r i e n e 9 - o x i d e ( a j o e n e ) i n d o g s u n d e r e x t r a - c o r p o r e a l c i r c u l a t i o n . A r z n e i m i t t e l f o r s c h u n g 3 8 : 9 0 1 , 1 9 8 8 B r e i t s c h w e r d t E B , A r m s t r o n g . J A , R o b i n e t t e C L , D i l l m a n R C , K a r l M L , L o w r y E C 2 T h r e e c a s e s o f a c u t e z i n c t o x i c o s i s i n d o g s . V e t H u m T o x i c o l 2 8 2 1 0 9 , 1 9 8 6 L a t i m e r K S , J a i n A V , I n g l e s b y H B , C l a r k s o n W D , J o h n s o n G B : Z i n c - i n d u c e d h e m o l y t i c a n e m i a c a u s e d b y i n g e s t i o n o f p e n n i e s b y a p u p . J A V M A 1 9 5 2 7 7 , 1 9 8 9 M e u r s K M , B r e i t s c h w e r d t E B , B a t y C J , Y o u n g M A : P o s t s u r g i c a l m o r t a l i t y s e c o n d a r y t o z i n c t o x i c i t y i n d o g s . V e t H u m T o x i c o l 3 3 : 5 7 9 , 1 9 9 1 Y a w a t a Y , H e b b e l R P , S i l v i s S , H o w e R , J a c o b H : B l o o d c e l l a b n o r m a l i t i e s c o m p l i c a t i n g t h e h y p o p h o s p h a t e m i a o f h y p e r a l i m e n t a t i o n : E r y t h r o c y t e a n d p l a t e l e t A T P d e fi c i e n c y a s s o c i a t e d w i t h h e m o l y t i c a n e m i a a n d b l e e d i n g i n h y p e r a l i r n e n t e d d o g s . J L a b C l i n M e d 8 4 2 6 4 3 , 1 9 7 4 H o l l o w a y S A , S e n i o r D F : H e m o l y t i c - u r e m i c s y n d r o m e i n d o g s . P r o c 9 t h A n n V e t M e d F o r u m , A m e r i c a n C o l l e g e o f V e t e r i n a r y I n t e r n a l M e d i c i n e , 1 9 9 1 , p 5 9 7 ( a b s t r ) C i n e s D B , v a n d e r K e y l H , L e v i n s o n A I : I n v i t r o b i n d i n g o f a n I g E p r o t e i n t o h u m a n p l a t e l e t s . J I m m u n o l 1 3 6 2 3 4 3 3 , 1 9 8 6 C o w e l l A K , C o w e l l R L , T y l e r R D , N i e v e s M A : S e v e r e s y s t e m i c r e a c t i o n s t o H y m e n o p t e r a s t i n g s i n t h r e e d o g s . J A V M A 1 9 8 2 1 0 1 4 , 1 9 9 1 2 0 4 . 2 0 5 . 2 0 6 . 2 0 7 . 2 0 8 . 2 0 9 . 2 1 0 . 2 1 1 . 2 1 2 . 2 1 3 . 2 1 4 . 2 1 5 . 1 8 3 A s t e r R H : T h e i m m u n o l o g i c t h r o m b o c y t o p e n i a s , i n K u n i c k i T J , G e o r g e J N ( e d s ) : P l a t e l e t I r n m u n o b i o l o g y : M o l e c u l a r a n d C l i n i c a l A s p e c t s . P h i l a d e l p h i a , L i p p i n c o t t , 1 9 8 9 , p 3 8 7 C u r t i s B R , M c F a r l a n d J G , W u G , V i s e n t i n G P , A s t e r R H : A n t i b o d i e s i n s u l f o n a m i d e - i n d u c e d i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a r e c o g n i z e c a l c i u m - d e p e n d e n t e p i t o p e s o n t h e g l y c o p r o t e i n I I b / I I I a c o m p l e x . B l o o d 8 4 2 1 7 6 , 1 9 9 4 B e m d t M C , C h o n g B H , A n d r e w s R K : B i o c h e m i s t r y o f d r u g - d e p e n d e n t p l a t e l e t a u t o a n t i g e n s , i n K u n i c k i T J , G e o r g e J N ( e d s ) : P l a t e l e t I r n m u n o b i o l o g y : M o l e c u l a r a n d C l i n i c a l A s p e c t s . P h i l a d e l p h i a , L i p p i n c o t t , 1 9 8 9 , p 1 3 2 H e l m e r h o r s t F M , v a n L e e u w e n E F , P e g e l s J G , v a n d e r P l a s - v a n D a l e n C , E n g e l f r i e t C P , v o n d e m B o r n e A E G K : P r i m a r y a n d s e c o n d a r y a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a : A s e r o l o g i c a l a n d c l i n i c a l a n a l y s i s . S c a n d J H a e m a t o l 2 8 2 3 1 9 , 1 9 8 2 M i e s c h e r P A , T u c c i A , B e r i s P , F a v r e H : A u t o i m m u n e h e m o l y t i c a n e m i a a n d / o r t h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h l u p u s p a r a m e t e r s . S e m i n H e m a t o l 2 9 : 1 3 , 1 9 9 2 S c h w a r t z K A , S l i c h t e r S J , H a r k e r L A : I m m u n e - m e d i a t e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n a n d t h r o m b o c y t 0 p e n i a i n p a t i e n t s w i t h s o l i d t u m o u r s . B r J H a e m a t o l 5 1 : 1 7 , 1 9 8 2 B y F S , G o o d n i g h t S H : B l e e d i n g d i s o r d e r s i n c a n c e r . S e m i n O n c o l 1 7 2 1 8 7 , 1 9 9 0 W i l s o n J ] , N e a m e P B , K e l t o n J G : I n f e c t i o n - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a . S e m T h r o m b H e m o s t 8 : 2 1 7 , 1 9 8 2 N e a m e P B , K e l t o n J G , W a l k e r I R , S t e w a r t 1 0 , N o s s e l H L , H i r s h J 2 T h r o m b o c y - t o p e n i a i n s e p t i c e m i a : T h e r o l e o f d i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n . B l o o d 5 6 : 8 8 , 1 9 8 0 K e l t o n J G , N e a m e P B , G a u l d i e J , H i r s h J 2 E l e v a t e d p l a t e l e t - a s s o c i a t e d I g G i n t h e t h r o m b o c y t o p e n i a o f s e p t i c e m i a . N E n g l J M e d 3 0 0 2 7 6 0 , 1 9 7 9 M u e l l e r - E c k h a r d t C , K i e f e l V : L a b o r a t o r y m e t h o d s f o r t h e d e t e c t i o n o f p l a t e l e t a n t i b o d i e s a n d i d e n t i fi c a t i o n o f a n t i g e n s , i n K u n i c k i T J , G e o r g e J N ( e d s ) : P l a t e l e t I m m u n o b i o l o g y : M o l e c u l a r a n d C l i n i c a l A s p e c t s . P h i l a d e l p h i a , L i p p i n c o t t , 1 9 8 9 , p 4 3 6 L e r n e r W , C a r u s o R , F a i g D , K a r p a t k i n S : D r u g - d e p e n d e n t a n d n o n - d r u g - d e p e n d e n t a n t i p l a t e l e t a n t i b o d y i n d r u g - i n d u c e d i m m u n o l o g i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B l o o d 6 6 : 3 0 6 , 1 9 8 5 2 1 6 . 2 1 7 . 2 1 8 . 2 1 9 . 2 2 0 . 2 2 1 . 2 2 2 . 2 2 3 . 2 2 4 . 2 2 5 . 2 2 6 . 2 2 7 . 1 8 4 K i e f e l V , S a n t o s o S , S c h m i d t S , S a l a m a A , M u e l l e r - E c k h a r d t C : M e t a b o l i t e - s p e c i fi c ( I g G ) a n d d r u g - s p e c i fi c a n t i b o d i e s ( I g G , I g M ) i n t w o c a s e s o f t r i m e t h - o p r i m - s u l f a m e t h o x a z o l e - i n d u c e d i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a . T r a n s f u s i o n 2 7 2 2 6 2 , 1 9 8 7 B l o o m J C , B l a c k r n e r S A , B u g e l s k i P J , S o w i n s k i J M , S a u n d e r s L Z : G o l d - i n d u c e d i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a i n t h e d o g . V e t P a t h o l 2 2 2 4 9 2 , 1 9 8 5 v o n d e m B o r n e A E G K , P e g e l s J G , v a n d e r S t a d t R J , v a n d e r P l a s - v a n D a l e n C M , H e l m e r h o r s t F M : T h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h g o l d t h e r a p y : a d r u g - i n d u c e d a u t o i m m u n e d i s e a s e ? B r J H a e m a t o l 6 3 2 5 0 9 , 1 9 8 6 F a d o k V A , S a u n d e r s B , J a n n e y E H : T h r o m b o c y t o p e n i a a n d h e m o r r h a g e a s s o c i a t e d w i t h g o l d s a l t t h e r a p y f o r b u l l o u s p e m p h i g o i d i n a d o g . J A V M A 1 8 1 2 2 6 1 , 1 9 8 2 S u l l i v a n P S , A r r i n g t o n K , W e s t R , M c D o n a l d T P : T h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h a d m i n i s t r a t i o n o f t r i m e t h o p r i m / s u l f a d i a z i n e i n a d o g . J A V M A 2 0 1 : 1 7 4 1 , 1 9 9 2 _ G i g e r U , W e r n e r L L , M i l l i c h a m p N J , G o r m a n N T : S u l f a d i a z i n e - i n d u c e d a l l e r g y i n s i x d o b e r m a n p i n s c h e r s . J A V M A 1 8 6 2 4 7 9 , 1 9 8 5 L e e s G E , M c K e e v e r P J , R u t h G R : F a t a l t h r o m b o c y t o p e n i c h e m o r r h a g i c d i a t h e s i s a s s o c i a t e d w i t h d a p s o n c a d m i n i s t r a t i o n t o a d o g . J A V M A 1 7 5 2 4 9 , 1 9 7 9 B l o o m J C , L e w i s H B , S e l l e r s T S , D e l d a r A : T h e h e m a t o l o g i c e f f e c t s o f c e f o n i c i d a n d c e f a z e d o n e i n t h e d o g : A p o t e n t i a l m o d e l o f c e p h a l o s p o r i n h e m a t o t o x i c i t y i n m a n . T o x i c o l A p p l P h a r m a c o l 9 0 : 1 3 5 , 1 9 8 7 B l o o m J C , L e w i s H B , S e l l e r s T S , D e l d a r A , M o r g a n D G : T h e h e m a t o p a t h o l o g y o f c e f o n i c i d - a n d c e f a z e d o n e — i n d u c e d b l o o d d y s c r a s i a s i n t h e d o g . T o x i c o l A p p l P h a r m a c o l 9 0 2 1 4 3 , 1 9 8 7 B l o o m J C , T h i e m P A , S e l l e r s T S , D e l d a r A , L e w i s H B : C e p h a l o s p o r i n - i n d u c e d i m m u n e c y t o p e n i a i n t h e d o g : D e m o n s t r a t i o n o f e r y t h r o c y t e - , n e u t r o p h i l - , a n d p l a t e l e t - a s s o c i a t e d I g G f o l l o w i n g t r e a t m e n t w i t h c e f a z e d o n e . A m J H e m a t o l 2 8 2 7 1 , 1 9 8 8 D e l d a r A , L e w i s H , B l o o m J , W e i s s L : C e p h a l o s p o r i n - i n d u c e d a l t e r a t i o n s i n e r y t h r o i d ( C F U - E ) a n d g r a n u l o c y t e - m a c r o p h a g e ( C F U - G M ) c o l o n y - f o r m i n g c a p a c i t y i n c a n i n e b o n e m a r r o w . F u n d a m A p p l T o x i c o l 1 1 2 4 5 0 , 1 9 8 8 D e l d a r A , L e w i s H , B l o o m J , W e i s s L : C e h p a l o s p o r i n - i n d u c e d c h a n g e s i n t h e u l t r a s t r u c t u r e o f c a n i n e b o n e m a r r o w . V e t P a t h o l 2 5 2 2 1 1 , 1 9 8 8 2 2 8 . 2 2 9 . 2 3 0 . 2 3 1 . 2 3 2 . 2 3 3 . 2 3 4 . 2 3 5 . 2 3 6 . 2 3 7 . 2 3 8 . 2 3 9 . 2 4 0 . 1 8 5 M o e J B , P i p e r R C , T a n a s e H , S o t a n i K , M a n a b e J 2 P r e c l i n i c a l s a f e t y s t u d i e s o f c e f r n e t a z o l e . J A n t i m i c r o b C h e m o t h e r 2 3 2 1 2 5 , 1 9 8 9 D a v i s W M : H a p t e n — i n d u c e d , i m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n a d o g . J A V M A 1 8 4 2 9 7 6 , 1 9 8 4 A t w e l l R B , T h o r n t o n J R , O d l u m J 2 S u s p e c t e d d r u g - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h l e v a m i s o l e t h e r a p y i n a d o g . A u s t V e t J 5 7 : 9 1 , 1 9 8 1 P a n z e r S , P e n n e r E , G r a n i n g e r W , S c h u l z E , S m o l e n J S : A n t i n u c l e a r a n t i b o d i e s i n p a t i e n t s w i t h c h r o n i c i d i o p a t h i c a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a f o l l o w e d 2 - 3 0 y e a r s . A m J H e m a t o l 3 2 2 1 0 0 , 1 9 8 9 K u r a t a Y , M i y a g a w a S , K o s u g i S : H i g h - t i t e r a n t i n u c l e a r a n t i b o d i e s , a n t i - S S A / R o a n t i b o d i e s a n d a n t i - n u c l e a r R N P a n t i b o d i e s i n p a t i e n t s w i t h i d i o p a t h i c t h r o m b o c y - t o p e n i c p u r p u r a . T h r o m b H a e m o s t 7 1 2 1 8 4 , 1 9 9 4 G o r m a n N T , W e r n e r L L : I m m u n e - m e d i a t e d d i s e a s e s o f t h e d o g a n d c a t . I . B a s i c c o n c e p t s a n d t h e s y s t e m i c i m m u n e - m e d i a t e d d i s e a s e s . B r V e t J 1 4 2 2 3 9 5 , 1 9 8 6 H o l l o w a y S A , M e y e r D J , M a n n e l l a C : P r e d n i s o l o n e a n d d a n a z o l f o r t r e a t m e n t o f i m m u n e - m e d i a t e d a n e m i a , t h r o m b o c y t o p e n i a , a n d i n e f f e c t i v e e r y t h r o i d r e g e n e r a t i o n i n a d o g . J A V M A 1 9 7 2 1 0 4 5 , 1 9 9 0 W e r n e r L L , B l o o m b e r g M S , C a l d e r w o o d M a y s M B , A c k e r m a n N : P r o g r e s s i v e p o l y s y s t e m i c i m m u n e - m e d i a t e d d i s e a s e i n a d o g . V e t I m m u n o I m m u n o p a t h 8 : 1 8 3 , 1 9 8 5 L e w i s R M , S c h w a r t z R , H e n r y W B J : C a n i n e s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s . B l o o d 2 5 2 1 4 3 , 1 9 6 5 M c V e y D S , S h u m a n W S : D e t e c t i o n o f a n t i p l a t e l e t i m m u n o g l o b u l i n i n t h r o m b o c y - t o p e n i c d o g s . V e t I m m u n o I m m u n o p a t h 2 2 2 1 0 1 , 1 9 8 9 M c V e y D S , R u d d R , T o s h a c h K , M o o r e W E , K e e t o n K S : S y s t e m i c a u t o i m m u n e d i s e a s e a n d c o n c u r r e n t n e m a t o d e i n f e c t i o n i n a d o g . J A V M A 1 9 5 2 9 5 7 , 1 9 8 9 W i l k i n s R J , H u r v i t z A I , D o d d s - L a f f m W J : I m m u n o l o g i c a l l y m e d i a t e d t h r o m b o c y - t o p e n i a i n t h e d o g . J A V M A 1 6 3 2 2 7 7 , 1 9 7 3 K r i s t e n s e n A T , W e i s s D J , K l a u s n e r J S , L a b e r J , C h r i s t i e D J : C o m p a r i s o n o f m i c r o s o p i c a n d fl o w c y t o m e t r i c d e t e c t i o n o f p l a t e l e t a n t i b o d y i n d o g s s u s p e c t e d o f h a v i n g i m m u n e — m e d i a t e d t h o m b o c y t o p e n i a . A m J V e t R e s 5 5 2 1 1 1 1 , 1 9 9 4 2 4 1 . 2 4 2 . 2 4 3 . 2 4 4 . 2 4 5 . 2 4 6 . 2 4 7 . 2 4 8 . 2 4 9 . 2 5 0 . 2 5 1 . 2 5 2 . 2 5 3 . 1 8 6 K r i s t e n s e n A T , W e i s s D J , K l a u s n e r J S , L a b e r J , C h r i s t i e D J 2 D e t e c t i o n o f a n t i p l a t e l e t a n t i b o d y w i t h a p l a t e l e t i r n m u n o fl u o r e s c e n c e a s s a y . J V e t I n t M e d 8 2 3 6 , 1 9 9 4 D o u g h e r t y S A , C e n t e r S A , S h a w E E , E r b H A : J u v e n i l e - o n s e t p o l y a r t h r i t i s s y n d r o m e i n A k i t a s . J A V M A 1 9 8 2 8 4 9 , 1 9 9 1 E v a n s R S , D u a n e R T : A c q u i r e d h e m o l y t i c a n e m i a : I . T h e r e l a t i o n o f e r y t h r o c y t e a n t i b o d y p r o d u c t i o n t o a c t i v i t y o f t h e d i s e a s e . I I . T h e s i g n i fi c a n c e o f t h r o m b o c y - t o p e n i a a n d l e u k o p e n i a . B l o o d 4 2 1 1 9 6 , 1 9 4 9 P e g e l s J G , H e l m e r h o r s t F M , v a n L e e u w e n E F , v a n d e P l a s - v a n D a l e n C , E n g e l f r i e t C P , v o n d e m B o r n e A E G K : T h e E v a n s s y n d r o m e : c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e r e s p o n s i b l e a u t o a n t i b o d i e s . B r J H a e m a t o l 5 1 : 4 4 5 , 1 9 8 2 L e w i s R M , S c h w a r t z R S , G i l m o r e C E : A u t o i m m u n e d i s e a s e s i n d o m e s t i c a n i m a l s . A n n N Y A c a d S c i 1 2 4 2 1 7 8 , 1 9 6 5 J o s h i B C , J a i n N C : D e t e c t i o n o f a n t i p l a t e l e t a n t i b o d y i n s e r u m a n d o n m e g a k a r y - o c y t e s o f d o g s w i t h a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a . A m J V e t R e s 3 7 2 6 8 1 , 1 9 7 6 F e l d m a n B F , H a n d a g a m a P , L u b b e r i n k A A M E : S p l e n e c t o m y a s a d j u n c t i v e t h e r a p y f o r i m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a a n d h e m o l y t i c a n e m i a i n t h e d o g . J A V M A 1 8 7 2 6 1 7 , 1 9 8 5 G r i n d e m C B , B r e i t s c h w e r d t E B , C o r b e t t W T , P a g e R L , J a n s H E : T h r o m b o c y t o - p e n i a a s s o c i a t e d w i t h n e o p l a s i a i n d o g s . J V e t I n t M e d 8 2 4 0 0 , 1 9 9 4 K e l l e r E T : I m m u n e - m e d i a t e d d i s e a s e a s a r i s k f a c t o r f o r c a n i n e l y m p h o m a . C a n c e r 7 0 2 2 3 3 4 , 1 9 9 2 K r i s t e n s e n A , K l a u s n e r J S : I m m u n o l o g i c d i s o r d e r s i n p a t i e n t s w i t h n e o p l a s i a . P r o c 1 0 t h A n n V e t M e d F o r u m , A m e r i c a n C o l l e g e o f V e t e r i n a r y I n t e r n a l M e d i c i n e , 1 9 9 2 , p 6 3 0 ( a b s t r ) H e l f a n d S C : N e o p l a s i a a n d i m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t O p e n i a . V e t C l i n N o r t h A m S m a l l A n i m P r a c t 1 8 : 2 6 7 , 1 9 8 8 W o o d s J P , J o h n s t o n e I B , B i e n z l e D , B a l s o n G , G a r t l e y C J 2 C o n c u r r e n t l y m p h a n g i o m a , i m m u n e ~ m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a , a n d v o n W i l l e b r a n d ’ s d i s e a s e i n a d o g . J A m A n i m H o s p A s s o c 3 1 : 7 0 , 1 9 9 5 H e l f a n d S C , C o u t o C G , M a d e w e l l B R : I m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h s o l i d t u m o r s i n d o g s . J A m A n i m H o s p A s s o c 2 1 2 7 8 7 , 1 9 8 5 2 5 4 . 2 5 5 . 2 5 6 . 2 5 7 . 2 5 8 . 2 5 9 . 2 6 0 . 2 6 1 . 2 6 2 . 2 6 3 . 2 6 4 . 2 6 5 . 1 8 7 S z a l M , B l u m b e r g N 2 C l i n i c a l c o r r e l a t e s i n p a t i e n t s w i t h e l e v a t e d p l a t e l e t - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n s . A n n C l i n L a b S c i 1 8 : 2 4 , 1 9 8 8 T a t e D Y , C a r l t o n G T , J o h n s o n D , S o r e n s o n R L , N e s b i t M , W h i t e J , T h o m p s o n T , K r i v i t W : I m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a i n s e v e r e n e o n a t a l i n f e c t i o n s . J P e d i a t r i c s 9 8 2 4 4 9 , 1 9 8 1 v a n d e r L e l i e J , v a n d e r P l a s - V a n D a l e n C M , v o n d e m B o r n e A E G K : P l a t e l e t a u t o a n t i b o d i e s i n s e p t i c a e m i a . B r J H a e m a t o l 5 8 2 7 5 5 , 1 0 8 4 Y e a m a n M R , S u l l a m P M , D a z i n P F , N o r m a n D C , B a y e r A S : C h a r a c t e r i z a t i o n o f S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s - p l a t e l e t b i n d i n g b y q u a n t i t a t i v e fl o w c y t o m e t r i c a n a l y s i s . J I n f e c t D i s 1 6 6 : 6 5 , 1 9 9 2 S u l l a m P M , P a y a n D G , D a z i n P F , V a l o n e F H : B i n d i n g o f v i r i d a n s g r o u p s t r e p t o c o c c i t o h u m a n p l a t e l e t s : a q u a n t i t i v e a n a l y s i s . I n f e c t I m m u n 5 8 2 3 8 0 2 , 1 9 9 0 K e l t o n J G , K e y s t o n e J , M o o r e J , D e n o m m e G , T o z m a n E , G l y n n M , N e a m e P B , G a u l d i e J , J e n s e n J 2 I m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a o f m a l a r i a . J C l i n I n v e s t 7 1 2 8 3 2 , 1 9 8 3 K a p l a n C , M o r i n e t F , C a r t r o n J 2 V i r u s - i n d u c e d a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a a n d n e u t r o p e n i a . S e m H e m a t o l 2 9 : 3 4 , 1 9 9 2 B e t t a i e b A , O k s e n h e n d l e r E , F r o m o n t P , D u e d a r i N , B i e r l i n g P : I r n m u n o c h e m i c a l a n a l y s i s o f p l a t e l e t a u t o a n t i b o d i e s i n H I V - r e l a t e d t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a : a s t u d y o f 6 8 p a t i e n t s . B r J H a e m a t o l 7 3 2 2 4 1 , 1 9 8 9 N a j e a n Y , R a i n J - D : T h e m e c h a n i s m o f t h r o m b o c y t o p e n i a i n p a t i e n t s w i t h H I V i n f e c t i o n . J L a b C l i n M e d 1 2 3 2 4 1 5 , 1 9 9 4 B e t t a i e b A , F r o m o n t P , L o u a c h e F , O k s e n h e n d l e r E , V a i n c h e n k e r W , D u e d a r i N , B i e r l i n g P 2 P r e s e n c e o f c r o s s - r e a c t i v e a n t i b o d y b e t w e e n h u m a n i m m u n o d e fi - c i e n c y v i r u s ( H I V ) a n d p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n s i n H I V - r e l a t e d i m m u n e t h r o m b o c y - t o p e n i c p u r p u r a . B l o o d 8 0 2 1 6 2 , 1 9 9 2 H o h m a n n A , B o o t h K , P e t e r s V , G o r d o n D , C o m a c c h i o R : C o m m o n e p i t o p e o n H I V p 2 4 a n d h u m a n p l a t e l e t s . L a n c e t 3 4 2 2 1 2 7 4 , 1 9 9 3 H y m e s K , N a r d e M , L e a f A , K a r p a t k i n S : R o l e o f L e q u i n t e g r i n s a n d c o m p l e m e n t i n p l a t e l e t - m o n o c y t e r o s e t t e f o r m a t i o n i n d u c e d b y i m m u n e c o m p l e x e s o f h u m a n i m m u n o d e fi c i e n c y v i r u s - t y p e l - i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a p a t i e n t s . B l o o d 8 1 : 2 3 7 5 , 1 9 9 3 2 6 6 . 2 6 7 . 2 6 8 . 2 6 9 . 2 7 0 . 2 7 1 . 2 7 2 . 2 7 3 . 2 7 4 . 2 7 5 . 2 7 6 . 2 7 7 . 2 7 8 . 1 8 8 L o u a c h e F , B e t t a i e b A , H e n r i A , O k s e n h e n d l e r E , F a r c e t J - P , B i e r l i n g P , S e l i g m a n n M , V a i n c h e n k e r W : I n f e c t i o n o f m e g a k a r y o c y t e s b y h u m a n i m m u n o - d e fi c i e n c y v i r u s i n s e r o p o s i t i v e p a t i e n t s w i t h i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B l o o d 7 8 2 1 6 9 7 , 1 9 9 1 B a l l e m P J , B e l z b e r g A , D e v i n e D V , L y s t e r D , S p r u s t o n B , C h a m b e r s H , D o u b r o f f P , M i k u l a s h K : K i n e t i c s t u d i e s o f t h e m e c h a n i s m o f t h r o m b o c y t o p e n i a i n p a t i e n t s w i t h h u m a n i m m u n o d e fi c i e n c y v i r u s i n f e c t i o n . N E n g l J M e d 3 2 7 2 1 7 7 9 , 1 9 9 2 C a l v e r t C 2 V a l v u l a r b a c t e r i a l e n d o c a r d i t i s i n t h e d o g . J A V M A 1 8 0 2 1 0 8 0 , 1 9 8 2 G r e e n e C E , A p p e l M J : C a n i n e D i s t e m p e r , i n G r e e n e C E ( e d ) : I n f e c t i o u s D i s e a s e s o f t h e D o g a n d C a t . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 9 0 , p 2 2 6 M c A n u l t y J F , R u d d R G 2 T h r o m b o c y t O p e n i a a s s o c i a t e d w i t h v a c c i n a t i o n o f a d o g w i t h a m o d i fi e d - l i v e p a r a m y x o v i r u s v a c c i n e . J A V M A 1 8 6 2 1 2 1 7 , 1 9 8 5 P i n e a u S , B e l b e c k L W , M o o r e 8 2 L e v a m i s o l e r e d u c e s t h e t h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h m y x o v i r u s v a c c i n a t i o n . C a n V e t J 2 1 : 8 2 , 1 9 8 0 S t r a w B : D e c r e a s e i n p l a t e l e t c o u n t a f t e r v a c c i n a t i o n w i t h d i s t e m p e r - h e p a t i t i s ( D H ) v a c c i n e . V e t M e d 7 3 2 7 2 5 , 1 9 7 8 J o n e s B E V : P l a t e l e t a g g r e g a t i o n i n d o g s a f t e r l i v e - v i r u s v a c c i n a t i o n . A c t a V e t S c a n d 2 5 2 5 0 4 , 1 9 8 4 K r a k o w k a S , H i g g i n s R J , K o e s t n e r A : C a n i n e d i s t e m p e r v i r u s : R e v i e w o f s t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l m o d u l a t i o n s i n l y m p h o i d t i s s u e s . A m J V e t R e s 4 1 2 2 8 4 , 1 9 8 0 D o d d s W J 2 I m m u n e - m e d i a t e d b l o o d d i s e a s e s . P u r e B r e d D o g s / A m e r i c a n K e n n e l G a z e t t e A p r i 1 2 7 4 , 1 9 8 7 P e l t o l a H , H e i n o n e n O P , V a l l e M , P a u n i o M , V i r t a n e n M , K a r a n k o V , C a n t e l l K : T h e e l i m i n a t i o n o f i n d i g e n o u s m e a s l e s , m u m p s , a n d r u b e l l a f r o m F i n l a n d b y a 1 2 - y e a r , t w o - d o s e v a c c i n a t i o n p r o g r a m . N E n g l J M e d 3 3 1 2 1 3 9 7 , 1 9 9 4 N i e m i n e n U , P e l t o l a H , S y r a l a M T , M a k i p e r n a a A , K e k o m a k i R : A c u t e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a f o l l o w i n g m e a s l e s , m u m p s a n d r u b e l l a v a c c i n a t i o n . A r e p o r t o n 2 3 p a t i e n t s . A c t a P a e d i a t r 8 2 2 2 6 7 , 1 9 9 3 L i n k l a t e r K A : T h e e x p e r i m e n t a l r e p r o d u c t i o n o f t h r o m b o c y t O p e n i c p u r p u r a i n p i g l e t s . R e s V e t S c i 1 8 2 1 2 7 , 1 9 7 5 2 7 9 . 2 8 0 . 2 8 1 . 2 8 2 . 2 8 3 . 2 8 4 . 2 8 5 . 2 8 6 . 2 8 7 . 2 8 8 . 2 8 9 . 2 9 0 . 2 9 1 . 1 8 9 B a l d i n i M : A c u t e " I T P " i n i s o i m m u n i z e d d o g s . A n n N Y A c a d S c i 1 2 4 2 5 4 3 , 1 9 6 4 S w i s h e r S N , Y o u n g L E 2 T h e b l o o d g r o u p i n g s y s t e m s o f d o g s . P h y s i o l R e v 4 1 2 4 9 5 , 1 9 6 1 S w i s h e r S N : N o n s p e c i fi c a d h e r e n c e o f p l a t e l e t s a n d l e u k o c y t e s t o a n t i b o d y - s e n s i t i z e d r e d c e l l s : A m e c h a n i s m p r o d u c i n g t h r o m b o c y t O p e n i a a n d l e u k o p e n i a d u r i n g i n c o m p a t i b l e t r a n s f u s i o n s . J C l i n I n v e s t 3 5 2 7 3 8 , 1 9 5 6 S u l l i v a n P , G o m p f R , S c h m e i t z e l L , C l i f t R , C o t t r e l l M , M c D o n a l d T P : A l t e r e d p l a t e l e t i n d i c e s i n d o g s w i t h h y p o t h y r o i d i s m a n d c a t s w i t h h y p e r t h y r o i d i s m . A m J V e t R e s 5 4 2 2 0 0 4 , 1 9 9 3 C a i n G R , C h a m p l i n R , J a i n N : I m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s a f t e r f e t a l l i v e r h e m a t o p o i e t i c c e l l t r a n s p l a n t a t i o n . E x p H e m a t o l 1 7 2 2 8 7 , 1 9 8 9 W a t e r s A H : A u t o i m m u n e t h r o m b o c y t O p e n i a : C l i n i c a l a s p e c t s . S e m i n H e m a t o l 2 9 2 1 8 , 1 9 9 2 G e o r g e J N , E l — H a r a k e M A , R a s k o b G E : C h r o n i c i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . N E n g l J M e d 3 3 1 2 1 2 0 7 , 1 9 9 4 B e r c h t o l d P , M c M i l l a n R , T a n i P , S o m m e r v i l l e - N e i l s e n S , B l a n c h e t t e V S : A u t o a n t i b o d i e s a g a i n s t p l a t e l e t m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s i n c h i l d r e n w i t h a c u t e a n d c h r o n i c i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B l o o d 7 4 2 1 6 0 0 , 1 9 8 9 W i n i a r s k i J : I g G a n d I g M a n t i b o d i e s t o p l a t e l e t m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n a n t i g e n s i n a c u t e c h i l d h o o d i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B r J H a e m a t o l 7 3 2 8 8 , 1 9 8 9 ‘ C o l l i n s P W , N e w l a n d A C : T r e a t m e n t m o d a l i t i e s o f a u t o i m m u n e b l o o d d i s o r d e r s . S e m i n H e m a t o l 2 9 : 6 4 , 1 9 9 2 S c h l i e v e r t P M : R o l e o f s u p e r a n t i g e n s i n h u m a n d i s e a s e . J I n f e c t D i s e a s e s 1 6 7 2 9 9 7 , 1 9 9 3 B a l i n t J P J r , J o n e s F R : D e t e c t i o n o f e l e v a t e d a n t i - i d i o t y p i c a n t i b o d y l e v e l s i n i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p a t i e n t s e x p r e s s i n g a n t i p l a t e l e t a n t i b o d y . B l o o d 8 4 2 6 6 4 , 1 9 9 4 v o n d e m B o r n e A E G K , H e l m e r h o r s t F M , v a n L e e u w e n E F , P e g e l s H G , v o n R i e s z E , E n g e l f r i e t C P : A u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a : D e t e c t i o n o f p l a t e l e t a u t o a n t i b o d i e s w i t h t h e s u s p e n s i o n i m m u n o fl u o r e s c e n c e t e s t . B r J H a e m a t o l 4 5 2 3 1 9 , 1 9 8 0 2 9 2 . 2 9 3 . 2 9 4 . 2 9 5 . 2 9 6 . 2 9 7 . 2 9 8 . 2 9 9 . 3 0 0 . 3 0 1 . 3 0 2 . 3 0 3 . 1 9 0 C i n e s D B , S c h r e i b e r A D : I m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a : U s e o f a C o o m b s a n t i g l o b u l i n t e s t t o d e t e c t I g G a n d C 3 o n p l a t e l e t s . N E n g l J M e d 3 0 0 2 1 0 6 , 1 9 7 9 P a n z e r S , N i e s s n e r H , L e c h n e r K , D u d c z a k R , J a g e r U , M a y r W R : P l a t e l e t - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n s I g G , I g M , I g A a n d c o m p l e m e n t C 3 c i n c h r o n i c i d i o p a t h i c a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a : R e l a t i o n t o t h e s e q u e s t r a t i o n p a t t e r n o f “ ‘ I n d i u m l a b e l l e d p l a t e l e t s . S c a n d J H a e m a t o l 3 7 2 9 7 , 1 9 8 6 H e g d e U M , B a l l S , Z u i a b l e A , R o t e r B L T : P l a t e l e t a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n s ( P A I g G a n d P A I g M ) i n a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a . B r J H a e m a t o l 5 9 2 2 2 1 , 1 9 8 5 N e ] J D , S t e v e n s K , M o u t o n A , P r e t o r i u s F : P l a t e l e t — b o u n d I g M i n a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a . B l o o d 6 1 2 1 1 9 , 1 9 8 3 v a n L e e u w e n E F , v a n d e r V e n J T h M , E n g e l f r i e t C P , v o n d e m B o r n e A E G K : S p e c i fi c i t y o f a u t o a n t i b o d i e s i n a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t O p e n i a . B l o o d 5 9 : 2 3 , 1 9 8 2 B e r c h t o l d P , W e n g e r M : A u t o a n t i b o d i e s a g a i n s t p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n s i n a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a : T h e i r c l i n i c a l s i g n i fi c a n c e a n d r e s p o n s e t o t r e a t m e n t . B l o o d 8 1 2 1 2 4 6 , 1 9 9 3 F u j i s a w a K , T a n i P , M c M i l l a n R 2 P l a t e l e t - a s s o c i a t e d a n t i b o d y t o g l y c o p r o t e i n I I b / I I I a f r o m c h r o n i c i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a p a t i e n t s o f t e n b i n d s t o d i v a l e n t c a t i o n - d e p e n d e n t a n t i g e n s . B l o o d 8 1 2 1 2 8 4 , 1 9 9 3 H e R , R e i d D M , J o n e s ' C E , S h u l m a n N R 2 S p e c t r u m o f I g c l a s s e s , s p e c i fi c i t i e s , a n d t i t e r s o f s e r u m a n t i g l y c o p r o t e i n s i n c h r o n i c i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B l o o d 8 3 2 1 0 2 4 , 1 9 9 4 K i e f e l V , S a n t o s o S , M u e l l e r - E c k h a r d t C 2 S e r o l o g i c a l , B i o c h e m i c a l , a n d m o l e c u l a r a s p e c t s o f p l a t e l e t a u t o a n t i g e n s . S e m i n H e m a t o l 2 9 2 2 6 , 1 9 9 2 W o o d s V L J , O h E H , M a s o n D , M c M i l l a n R : A u t o a n t i b o d i e s a g a i n s t t h e p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n I I b / I I I a c o m p l e x i n p a t i e n t s w i t h c h r o n i c I T P . B l o o d 6 3 2 3 6 8 , 1 9 8 4 W o o d s V L J , K u r a t a Y , M o n t g o m e r y R R , T a n i P , M a s o n D , O h E H , M c M i l l a n R : A u t o a n t i b o d i e s a g a i n s t p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n I b i n p a t i e n t s w i t h c h r o n i c i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B l o o d 6 4 2 1 5 6 , 1 9 8 4 K o e m e r T A W , W e i n f e l d H M , B u l l a r d L S B , W i l l i a m s L C ] 2 A n t i b o d i e s a g a i n s t p l a t e l e t g l y c o s p h i n g o l i p i d s : D e t e c t i o n i n s e r u m b y q u a n t i t a t i v e H P T L C — A u t o r a d i - o g r a p h y a n d a s s o c i a t i o n w i t h a u t o i m m u n e a n d a l l o i m m u n e p r o c e s s e s . B l o o d 7 4 2 2 7 4 , 1 9 8 9 3 0 4 . 3 0 5 . 3 0 6 . 3 0 7 . 3 0 8 . 3 0 9 . 3 1 0 . 3 1 1 . 3 1 2 . 3 1 3 . 3 1 4 . 1 9 1 H a r r i s E N , G h a r a v i A E , H e g d e U , D e r u e G , M o r g a n S H , E n g l e r t H , C h a n J K H , A s h e r s o n R A , H u g h e s G R V : A n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d i e s i n a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B r J H a e m a t o l 5 9 2 2 3 1 , 1 9 8 5 S p r a n d i o J D , S h a p i r o S S , T h i a g a r a j a n P , M c C o r d S 2 C u l t u r e d h u m a n u m b i l i c a l v e i n e n d o t h e l i a l c e l l s c o n t a i n a m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n i m m u n o l o g i c a l l y r e l a t e d t o p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n I b . B l o o d 7 1 2 2 3 4 , 1 9 8 8 A s c h A S , A d e l m a n B , F u j i r n o t o M , N a c h m a n R L : I d e n t i fi c a t i o n a n d i s o l a t i o n o f a p l a t e l e t G P I b - l i k e p r o t e i n i n h u m a n u m b i l i c a l v e i n e n d o t h e l i a l c e l l s a n d b o v i n e a o r t i c s m o o t h m u s c l e c e l l s . J C l i n I n v e s t 8 1 2 1 6 0 0 , 1 9 8 8 F i t z g e r a l d L A , S t e i n e r B , R a l l S C J , L o S , P h i l l i p s D R : P r o t e i n s e q u e n c e o f e n d o t h e l i a l g l y c o p r o t e i n I I I a d e r i v e d f r o m a c D N A c l o n e . J B i o l C h e m 2 6 2 2 3 9 3 6 , 1 9 8 7 S u g i y a m a T , P i d a r d D , W a u t i e r M - P , W a u t i e r J - L 2 C o m p a r a t i v e i m m u n o c h e m i c a l a n a l y s i s o f m e m b r a n e p r o t e i n s f r o m h u m a n p l a t e l e t s a n d e n d o t h e l i a l c e l l s . N o u v R e v F r H e m a t o l 3 2 2 1 9 9 , 1 9 9 0 S p a n g e n b e r g P , K i r c h m a i e r C M , S c h i r r n e r A , M e y e r M , B r e d d i n H K : F u n c t i o n a l s t u d i e s o n p l a t e l e t s o f a p a t i e n t w i t h a n a c q u i r e d d i s o r d e r o f p l a t e l e t f u n c t i o n a s s o c i a t e d w i t h a u t o a n t i b o d i e s a g a i n s t m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n I I B / I I I A c o m p l e x . T h r o m b R e s 6 9 2 4 3 5 , 1 9 9 3 C o r t e l a z z o S , V i e r o P , C a s a r o t t o C , D ’ E m i l i o A , D i n i E , B a r b u t T 2 B l e e d i n g o n p a t i e n t s w i t h a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a a n d n o r m a l p l a t e l e t c o u n t . S c a n d J H a e m a t o l 3 2 2 4 0 3 , 1 9 8 4 S t r i c k e r R B , W o n g D , S a k s S R , C o r a s h L , S h u m a n M A : A c q u i r e d B e r n a r d - S o u l i e r s y n d r o m e : E v i d e n c e f o r t h e r o l e o f a 2 1 0 , 0 0 0 — m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n i n t h e i n t e r a c t i o n o f p l a t e l e t s w i t h v o n W i l l e b r a n d f a c t o r . J C l i n I n v e s t 7 6 2 1 2 7 4 , 1 9 8 5 N i e s s n e r H , C l e m e t s o n K J , P a n z e r S , M u e l l e r - E c k h a r d t C , S a n t o s o S , B e t t e l h e i m P : A c q u i r e d t h r o m b a s t h e n i a d u e t o G P I I b / I I I a - s p e c i fi c p l a t e l e t a u t o a n t i b o d i e s . B l o o d 6 8 2 5 7 1 , 1 9 8 6 B u s s e l J B : A u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . H e m a t o l O n c o l C l i n N o r t h A m 4 : 1 7 9 , 1 9 9 0 H a r k e r L A , S l i c h t e r S J 2 T h e b l e e d i n g t i m e a s a s c r e e n i n g t e s t f o r e v a l u a t i o n o f p l a t e l e t f u n c t i o n . N E n g l J M e d 2 8 7 2 1 5 5 , 1 9 7 2 3 1 5 . 3 1 6 . 3 1 7 . 3 1 8 . 3 1 9 . 3 2 0 . 3 2 1 . 3 2 2 . 3 2 3 . 3 2 4 . 3 2 5 . 3 2 6 . 1 9 2 J y W , H o r s t r n a n L L , A r c e M , A h n Y S : C l i n i c a l s i g n i fi c a n c e o f p l a t e l e t m i c r o p a r t i c l e s i n a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a s . J L a b C l i n M e d 1 1 9 2 3 3 4 , 1 9 9 2 L u k S C , M u s c l o w E , S i m o n G T : P l a t e l e t p h a g o c y t o s i s i n t h e s p l e e n o f p a t i e n t s w i t h i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a ( I T P ) . H i s t o p a t h o l o g y 4 : 1 2 7 , 1 9 8 0 H i l l - Z o b e l R L , S c h e f f e l U , M c I n t y r e P A , T s a n M 2 l l l I n — o x i n e - l a b e l e d r a b b i t p l a t e l e t s : I n v i v o d i s t r i b u t i o n a n d s i t e s o f d e s t r u c t i o n . B l o o d 6 1 2 1 4 9 , 1 9 8 3 K e r n o f f L M , B l a k e K C H , S h a c k l e t o n D 2 I n fl u e n c e o f t h e a m o u n t o f p l a t e l e t - b o u n d I g G o n p l a t e l e t s u r v i v a l a n d s i t e o f s e q u e s t r a t i o n i n a u t o i m m u n e t h r o m b o - c y t o p e n i a . B l o o d 5 5 2 7 3 0 , 1 9 8 0 H a n s o n S R , S l i c h t e r S J : P l a t e l e t k i n e t i c s i n p a t i e n t s w i t h b o n e m a r r o w h y p o p l a - s i a : E v i d e n c e f o r a fi x e d p l a t e l e t r e q u i r e m e n t . B l o o d 6 6 2 1 1 0 5 , 1 9 8 5 T o m e r A , H a n s o n S R , H a r k e r L A : A u t o l o g o u s p l a t e l e t k i n e t i c s i n p a t i e n t s w i t h s e v e r e t h r o m b o c y t o p e n i a : D i s c r i m i n a t i o n b e t w e e n d i s o r d e r s o f p r o d u c t i o n a n d d e s t r u c t i o n . J L a b C l i n M e d 1 1 8 2 5 4 6 , 1 9 9 1 S t a h l C P , Z u c k e r - F r a n k l i n D , M c D o n a l d T P : I n c o m p l e t e a n t i g e n i c c r o s s - r e a c t i v i t y b e t w e e n p l a t e l e t s a n d m e g a k a r y o c y t e s : R e l e v a n c e t o I T P . B l o o d 6 7 2 4 2 1 , 1 9 8 6 T h i a g a r a j a n P , P e r u s s i a B , D e M a r c o L , W e l l s K , T r i n c h i e r i G 2 M e m b r a n e p r o t e i n s o n h u m a n m e g a k a r y o c y t e s a n d p l a t e l e t s i d e n t i fi e d b y m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s . A m J H e m a t o l 1 4 2 2 5 5 , 1 9 8 3 M a z u r E M , H o f f m a n R , C h a s i s J , M a r c h e s i S , B r u n o E 2 I r n m u n o fl u o r e s c e n t i d e n t i fi c a t i o n o f h u m a n m e g a k a r y o c y t e c o l o n i e s u s i n g a n a n t i p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n a n t i s e r u m . B l o o d 5 7 2 2 7 7 , 1 9 8 1 R a b e l l i n o E M , L e v e n e R B , L e u n g L L K , N a c h m a n R L : H u m a n m e g a k a r y o c y t e s : 1 1 . E x p r e s s i o n o f p l a t e l e t p r o t e i n s i n e a r l y m a r r o w m e g a k a r y o c y t e s . J E x p M e d 1 5 4 2 8 8 , 1 9 8 1 H o u r d i l l e P , B e n a b d a l l a h S , B e l l o c F , N u r d e n A T : D i s t r i b u t i o n o f g l y c o p r o t e i n I I b - I I I a c o m p l e x e s i n t h e s u r f a c e m e m b r a n e s o f h u m a n p l a t e l e t s a n d m e g a k a r y - o c y t e s . B r J H a e m a t o l 5 9 2 1 7 1 , 1 9 8 5 V a i n c h e n k e r W , D e s c h a m p s J F , B a s t i n J M , G u i c h a r d J , T i t e u x M , B r e t o n - G o r i u s J , M c M i c h a e l A J : T w o m o n o c l o n a l a n t i p l a t e l e t a n t i b o d i e s a s m a r k e r s o f h u m a n m e g a k a r y o c y t e m a t u r a t i o n : I r n m u n o fl u o r e s c e n t s t a i n i n g a n d p l a t e l e t p e r o x i d a s e d e t e c t i o n i n m e g a k a r y o c y t e c o l o n i e s a n d i n v i v o c e l l s f r o m n o r m a l a n d l e u k e m i c p a t i e n t s . B l o o d 5 9 2 5 1 4 , 1 9 8 2 3 2 7 . 3 2 8 . 3 2 9 . 3 3 0 . 3 3 1 . 3 3 2 . 3 3 3 . 3 3 4 . 3 3 5 . 3 3 6 . 3 3 7 . 3 3 8 . 1 9 3 V a i n c h e n k e r W , C h a p m a n J , D e s c h a m p s J F , V i n c i G , B o u g u e t J , T i t e u x M , B r e t o n - G o r i u s J 2 N o r m a l h u m a n s e r u m c o n t a i n s a f a c t o r ( s ) c a p a b l e o f i n h i b i t i n g m e g a k a r y o c y t e c o l o n y f o r m a t i o n . E x p H e m a t o l 1 0 2 6 5 0 , 1 9 8 2 V a z q u e z J J , L e w i s J H : I r n m u n o c y t o c h e m i c a l s t u d i e s o n p l a t e l e t s . T h e d e m o n s t r a - t i o n o f a c o m m o n a n t i g e n i n h u m a n p l a t e l e t s a n d m e g a k a r y o c y t e s . B l o o d 1 6 2 9 6 8 , 1 9 6 0 G e r w i r t z A M , B o g h o s i a n - S e l l L , C a t a n i L , R a t a j c z a k M Z , S h e n Y M , S c h r e i b e r A D : E x p r e s s i o n o f F c y R H a n d C D 4 r e c e p t o r s b y n o r m a l h u m a n m e g a k a r y o c y t e s . E x p H e m a t o l 2 0 2 5 1 2 , 1 9 9 2 R o l o v i c Z , B a l d i n i M , D a m e s h e k W 2 M e g a k a r y o c y t o p o i e s i s i n e x p e r i m e n t a l l y i n d u c e d i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a . B l o o d 3 5 2 1 7 3 , 1 9 7 0 J o s h i B C , J a i n N C : E x p e r i m e n t a l i m m u n o l o g i c t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s : A s t u d y o f t h r o m b o c y t o p e n i a a n d m e g a k a r y o c y t o p o i e s i s . R e s V e t S c i 2 2 : 1 1 , 1 9 7 7 M c K e n n a J L , P i s c i o t t a A V : F l u o r e s c e n c e o f m e g a k a r y o c y t e s i n i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a ( I T P ) s t a i n e d w i t h fl u o r e s c e n t a n t i g l o b u l i n s e r u m . B l o o d 1 9 2 6 6 4 , 1 9 6 2 P i z z i F , C a r r a r a P M , A l d e g h i A , E r i d a n i S : I m m u n o fl u o r e s c e n c e o f m e g a k a r y o - c y t e s i n t h e t h r o m b o c y t O p e n i c p u r p u r a s . B l o o d 2 7 2 5 2 1 , 1 9 6 6 M c M i l l a n R , L u i k e n G A , L e v y R , Y e l e n o s k y R , L o n g m i r e R L : A n t i b o d y a g a i n s t m e g a k a r y o c y t e s i n i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . J A m M e d A s s o c 2 3 9 2 2 4 6 0 , 1 9 7 8 L e v e n e R B , D a n i e l L a m a z i e r e J - M , B r o x m e y e r H E , L u L , R a b e l l i n o E M : H u m a n m e g a k a r y o c y t e s : V . C h a n g e s i n t h e p h e n o t y p i c p r o fi l e o f d i f f e r e n t i a t i n g m e g a k a r y o c y t e s . J E x p M e d 1 6 1 : 4 5 7 , 1 9 8 5 Z u c k e r — F r a n k l i n D , P e t u r s s o n S 2 T h r o m b o c y t o p o i e s i s - — a n a l y s i s b y m e m b r a n e t r a c e r a n d f r e e z e - f r a c t u r e s t u d i e s o n f r e s h h u m a n a n d c u l t u r e d m o u s e m e g a k a r y o - c y t e s . J C e l l B i o l 9 9 2 3 9 0 , 1 9 8 4 T c h e r n i a G , M o r e l — K o p p M C , Y v a r t J , K a p l a n C : N e o n a t a l t h r o m b o c y t o p e n i a a n d h i d d e n m a t e r n a l a u t o i m m u n i t y . B r J H a e m a t o l 8 4 2 4 5 7 , 1 9 9 3 L e w i s D C , M e y e r s K M , M e n a r d M , P e r r y m a n L E 2 A n t i b o d i e s b o u n d t o t h e s u r f a c e o f p l a t e l e t s f r o m d o g s w i t h i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a a r e a n t i p l a t e l e t a u t o a n t i b o d i e s . J V e t I n t M e d 6 2 1 2 3 , 1 9 9 2 ( a b s t r ) 3 3 9 . 3 4 0 . 3 4 1 . 3 4 2 . 3 4 3 . 3 4 4 . 3 4 5 . 3 4 6 . 3 4 7 . 3 4 8 . 3 4 9 . 3 5 0 . 3 5 1 . 3 5 2 . 1 9 4 L e w i s D C , M e y e r s K M : A n t i p l a t e l e t a n t i b o d i e s i n d o g s w i t h i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a b i n d t o g l y c o p r o t e i n I I b / I I I a . P r o c 1 2 t h A n n V e t M e d F o r u m , A m e r i c a n C o l l e g e o f V e t e r i n a r y I n t e r n a l M e d i c i n e , 1 9 9 4 , p 1 7 1 ( a b s t r ) G o w i n g G M : I d i o p a t h i c t h r o m b o c y t O p e n i c p u r p u r a i n t h e d o g . J A V M A 1 4 5 2 9 8 7 , 1 9 6 4 B r o d e y R S 2 C l i n i c o - p a t h o l o g i c c o n f e r e n c e . J A V M A 1 4 4 2 6 2 8 , 1 9 6 4 M a g r a n e H J , M a g r a n e W G , R o s s J R : I d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a i n a d o g - A c a s e r e p o r t . J A V M A 1 3 5 2 5 2 0 , 1 9 5 9 W i l l i a m s D A , M a g g i o - P r i c e L : C a n i n e i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i a : C l i n i c a l o b s e r v a t i o n s a n d l o n g - t e r m f o l l o w - u p i n 5 4 c a s e s . J A V M A 1 8 5 2 6 6 0 , 1 9 8 4 J a n s H E , A r m s t r o n g J , P r i c e G S : T h e r a p y o f i m m u n e m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e - n i a . J V e t I n t M e d 4 2 4 , 1 9 9 0 C l a r k H C , C h i l d r e s s R D , C o l e m a n N C : I d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a : A r e v i e w a n d c a s e r e p o r t . V e t M e d M a r c h z 4 2 7 , 1 9 8 0 H a l l i w e l l R E W : A u t o i m m u n e d i s e a s e s i n d o m e s t i c a n i m a l s . J A V M A 1 8 1 2 1 0 8 8 , 1 9 8 2 N o r t h e r n J J , T v e d t e n H W : D i a g n o s i s o f m i c r o t h r o m b o c y t o s i s a n d i m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s w i t h t h r o m b o c y t o p e n i a : 6 8 c a s e s ( 1 9 8 7 - 1 9 8 9 ) . J A V M A 2 0 0 2 3 6 8 , 1 9 9 2 S u l l i v a n P S : I m m u n e m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a : R e c e n t a d v a n c e s i n d i a g n o s i s a n d t r e a t m e n t . P r o c 1 2 t h A n n V e t M e d F o r u m , A m e r i c a n C o l l e g e o f V e t e r i n a r y I n t e r n a l M e d i c i n e , 1 9 9 4 , p 1 4 9 T h o m p s o n J P : I m m u n o l o g i c d i s e a s e s , i n E t t i n g e r 8 ] ( e d ) : T e x t b o o k o f V e t e r i n a r y I n t e r n a l M e d i c i n e ( 2 n d e d , v o l 2 ) . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 8 9 , p 2 2 9 7 T h o m p s o n J P : I m m u n o l o g i c d i s e a s e s , i n E t t i n g e r S J , F e l d m a n E C ( e d s ) : T e x t b o o k o f V e t e r i n a r y I n t e r n a l M e d i c i n e : D i s e a s e s o f t h e D o g a n d C a t ( 4 t h e d , v o l 2 ) . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 9 4 , p 2 0 0 2 H e l f a n d S C , J a i n N C , P a u l M : V i n c r i s t i n e - l o a d e d p l a t e l e t t h e r a p y f o r i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i a i n a d o g . J A V M A 1 8 5 2 2 2 4 , 1 9 8 4 H o f f B , L u m s d e n J H , V a l l i V E O : A n a p p r a i s a l o f b o n e m a r r o w b i o p s y i n a s s e s s m e n t o f s i c k d o g s . C a n J C o m p M e d 4 9 2 3 4 , 1 9 8 5 3 5 3 . 3 5 4 . 3 5 5 . 3 5 6 . 3 5 7 . 3 5 8 . 3 5 9 . 3 6 0 . 3 6 1 . 3 6 2 . 3 6 3 . 3 6 4 . 3 6 5 . 1 9 5 J o n a s L D , T h r a l l M A , W e i s e r M G : N o n r e g e n e r a t i v e f o r m o f i m m u n e - m e d i a t e d h e m o l y t i c a n e m i a i n d o g s . J A m A n i m H o s p A s s o c 2 3 2 2 0 1 , 1 9 8 7 K r i s t e n s e n A T , W e i s s D J , K l a u s n e r J S : P l a t e l e t d y s f u n c t i o n a s s o c i a t e d w i t h i m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s . J V e t I n t M e d 8 2 3 2 3 , 1 9 9 4 M o r r i s o n F S , B a l d i n i M G : A n t i g e n i c r e l a t i o n s h i p b e t w e e n b l o o d p l a t e l e t s a n d v a s c u l a r e n d o t h e l i u m . B l o o d 3 3 : 4 6 , 1 9 6 9 H a g e r E B , B u r n s R O , C a r t e r R D , M e r r i l l J P : L e s i o n s p r o d u c e d i n h o m o g r a f t e d c a n i n e k i d n e y s b y p r i o r i m m u n i z a t i o n w i t h d o n o r p l a t e l e t s . F e d P r o c 2 1 2 3 7 , 1 9 6 2 D a r b e s J , C o l b a t z k y F , M i n k u s G , H e r m a n n s W 2 D e m o n s t r a t i o n o f f e l i n e a n d c a n i n e p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n s b y i m m u n o - a n d l e c t i n h i s t o c h e m i s t r y . H i s t o c h e m 1 0 0 2 8 3 , 1 9 9 3 M i l l e r E : I m m u n o s u p p r e s s i v e t h e r a p y i n t h e t r e a t m e n t o f i m m u n e - m e d i a t e d d i s e a s e . J V e t I n t M e d 6 : 2 0 6 , 1 9 9 2 B l o o m J C , M e u n i e r L D , T h i e m P A , S e l l e r s T S : U s e o f d a n a z o l f o r t r e a t m e n t o f c o r t i c o s t e r o i d - r e s i s t a n t i m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n a d o g . J A V M A 1 9 4 2 7 6 , 1 9 8 9 C o o k A K , B e r t o y E H , G r e g o r y C R , S t e w a r t A F 2 E f f e c t o f o r a l c y c l o s p o r i n e ( C S ) i n d o g s w i t h r e f r a c t o r y i m m u n e - m e d i a t e d a n e m i a ( I M A ) o r t h r o m b o c y t o p e n i a ( I T P ) . P r o c 1 2 t h A n n V e t M e d F o r u m , A m e r i c a n C o l l e g e o f V e t e r i n a r y I n t e r n a l M e d i c i n e , 1 9 9 4 , p 1 0 0 1 S t e i n h e r z P G , M i l l e r D R , H i l g a r t n e r M W , S c h m a l z e r E A : P l a t e l e t d y s f u n c t i o n i n V i n c r i s t i n e t r e a t e d p a t i e n t s . B r J H a e m a t o l 3 2 2 4 3 9 , 1 9 7 6 M a c k i n A J , A l l e n D G , J o h n s t o n e I B : E f f e c t s o f V i n c r i s t i n e s u l f a t e o n n o r m a l c a n i n e p l a t e l e t n u m b e r a n d f u n c t i o n . P r o c 1 0 t h A n n V e t M e d F o r u m , A m e r i c a n C o l l e g e o f V e t e r i n a r y I n t e r n a l M e d i c i n e , 1 9 9 2 , p 8 2 4 M a c k i n A J , A l l e n D G , J o h n s t o n e I B : E f f e c t s o f V i n c r i s t i n e a n d p r e d n i s o n e o n p l a t e l e t n u m b e r s a n d f u n c t i o n i n c l i n i c a l l y n o r m a l d o g s . A m J V e t R e s 5 6 2 1 0 0 , 1 9 9 5 G r e e n e C E , S c o g g i n J , T h o m a s J E , B a r s a n t i J A : V i n c r i s t i n e i n t h e t r e a t m e n t o f t h r o m b o c y t o p e n i a i n fi v e d o g s . J A V M A 1 8 0 2 1 4 0 , 1 9 8 2 G o l d e n D L , L a n g s t o n V C : U s e s o f V i n c r i s t i n e a n d v i n b l a s t i n e i n d o g s a n d c a t s . J A V M A 1 9 3 2 1 1 1 4 , 1 9 8 8 3 6 6 . 3 6 7 . 3 6 8 . 3 6 9 . 3 7 0 . 3 7 1 . 3 7 2 . 3 7 3 . 3 7 4 . 3 7 5 . 3 7 6 . 3 7 7 . 3 7 8 . 1 9 6 B r o d e y R S , S c h a l r n O W : H e m o b a r t o n e l l o s i s a n d t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a i n a d o g . J A V M A 1 4 3 2 1 2 3 1 , 1 9 6 3 H e l f a n d S C : S p l e n e c t o m y : A n o l d i s s u e o f c u r r e n t c o n t r o v e r s y . J A V M A 1 8 8 2 4 6 1 , 1 9 8 6 F e l d m a n B F , H a n d a g a m a P : S p l e n e c t o m y : A n o l d i s s u e o f c u r r e n t c o n t r o v e r s y . J A V M A 1 8 8 2 4 6 2 , 1 9 8 6 S l i c h t e r S J , O ’ D o n n e l l M R , W e i d e n P , S t o r b R , S c h r o e d e r M - L : C a n i n e p l a t e l e t a l l o i r n m u n i z a t i o n : t h e r o l e o f d o n o r s e l e c t i o n . B r J H a e m a t o l 6 3 2 7 1 3 , 1 9 8 6 F e l d m a n B F , T h o m a s o n K J , J a i n N C : I m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n a d o g . V e t C l i n N o r t h A m S m a l l A n i m P r a c t 1 8 2 2 5 8 , 1 9 8 8 S e a m e r J , S n a p e T 2 E h r l i c h i a c a n i s a n d t r o p i c a l c a n i n e p a n c y t o p a e n i a . R e s V e t S c i 1 3 2 3 0 7 , 1 9 7 2 W a d d l e J R , L i t t r n a n M P : A r e t r o s p e c t i v e s t u d y o f 2 7 c a s e s o f n a t u r a l l y o c c u r r i n g c a n i n e e h r l i c h i o s i s . J A m A n i m H o s p A s s o c 2 4 2 6 1 5 , 1 9 8 7 K u e h n N F , G a u n t S D : C l i n i c a l a n d h e m a t o l o g i c fi n d i n g s i n c a n i n e e h r l i c h i o s i s . J A V M A 1 8 6 2 3 5 5 , 1 9 8 5 N y i n d o M , H u x s o l l D L , R i s t i c M , K a k o m a I , B r o w n J L , C a r s o n C A , S t e p h e n s o n E H 2 C e l l - m e d i a t e d a n d h u m o r a l i m m u n e r e s p o n s e s o f G e r m a n S h e p h e r d D o g s a n d B e a g l e s t o e x p e r i m e n t a l i n f e c t i o n w i t h E h r l i c h i a c a n i s . A m J V e t R e s 4 1 2 2 5 0 , 1 9 8 0 T r o y G C , F o r r e s t e r S D : C a n i n e e h r l i c h i o s i s : E h r l i c h i a c a n i s , E . e q u i , a n d E . r i s t i c i i i n f e c t i o n s , i n G r e e n e C E ( e d ) : I n f e c t i o u s D i s e a s e s o f t h e D o g a n d C a t . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 9 0 , p 4 0 4 W e i s e r M G , T h r a l l M A , F u l t o n R , B e c k E R , W i s e L A , V a n S t e e n h o u s e J L : G r a n u l a r l y m p h o c y t o s i s a n d h y p e r p r o t e i n e m i a i n ' d o g s w i t h c h r o n i c e h r l i c h i o s i s . J A m A n i m H o s p A s s o c 2 7 2 8 4 , 1 9 9 1 C o d n e r E C , F a r r i s - S m i t h L L : C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e s u b c l i n i c a l p h a s e o f e h r l i c h i o s i s i n d o g s . J A V M A 1 8 9 2 4 7 , 1 9 8 6 B r e i t s c h w e r d t E B , W o o d y B J , Z e r b e C A , D e B u y s s c h e r E V , B a r t a O : M o n o c l o n a l g a m m o p a t h y a s s o c i a t e d w i t h n a t u r a l l y o c c u r r i n g c a n i n e e h r l i c h i o s i s . J V e t I n t M e d 1 2 2 , 1 9 8 7 3 7 9 . 3 8 0 . 3 8 1 . 3 8 2 . 3 8 3 . 3 8 4 . 3 8 5 . 3 8 6 . 3 8 7 . 3 8 8 . 3 8 9 . 3 9 0 . 3 9 1 . 1 9 7 H o s k i n s J D , B a r t a O , R o t h s c h m i t t J 2 S e r u m h y p e r v i s c o s i t y s y n d r o m e a s s o c i a t e d w i t h E h r l i c h i a c a n i s i n f e c t i o n i n a d o g . J A V M A 1 8 3 2 1 0 1 1 , 1 9 8 3 C o d n e r E C , R o b e r t s R E , A i n s w o r t h A G : A t y p i c a l fi n d i n g s i n 1 6 c a s e s o f c a n i n e e h r l i c h i o s i s . J A V M A 1 8 6 2 1 6 6 , 1 9 8 5 L o v e r i n g S L , P i e r c e K R , A d a m s L G : S e r u m c o m p l e m e n t a n d b l o o d p l a t e l e t a d h e s i v e n e s s i n a c u t e c a n i n e e h r l i c h i o s i s . A m J V e t R e s 4 1 2 1 2 6 6 , 1 9 8 0 P i e r c e K R , M a r r s G E , H i g h t o w e r D : A c u t e c a n i n e e h r l i c h i o s i s : P l a t e l e t s u r v i v a l a n d f a c t o r 3 a s s a y . A m J V e t R e s 3 8 2 1 8 2 1 , 1 9 7 7 K a k o m a I , C a r s o n C A , R i s t i c M , S t e p h e n s o n E M , H i l d e b r a n d t P K , H u x s o l l D L : P l a t e l e t m i g r a t i o n i n h i b i t i o n a s a n i n d i c a t o r o f i m m u n o l o g i c a l l y m e d i a t e d t a r g e t c e l l i n j u r y i n c a n i n e e h r l i c h i o s i s . I n f e c t I m m u n 2 0 2 2 4 2 , 1 9 7 8 S m i t h R D , H o o k s J E , H u x s o l l D L , R i s t i c M 2 C a n i n e e h r l i c h i o s i s ( T r o p i c a l C a n i n e P a n c y t o p e n i a ) : S u r v i v a l o f p h o s p h o r u s - 3 2 - l a b e l e d b l o o d p l a t e l e t s i n n o r m a l a n d i n f e c t e d d o g s . A m J V e t R e s 3 5 2 2 6 9 , 1 9 7 4 S m i t h R D , R i s t i c M , H u x s o l l D L , B a y l o r R A : P l a t e l e t k i n e t i c s i n c a n i n e e h r l i c h i o s i s : E v i d e n c e f o r i n c r e a s e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n a s t h e c a u s e o f t h r o m b o c y t o p e n i a . I n f e c t I m m u n 1 1 2 1 2 1 6 , 1 9 7 5 H i l d e b r a n d t P K , C o n r o y J D , M c K e e A E , N y i n d o M B A , H u x s o l l D L : U l t r a s t r u c - t u r e o f E h r l i c h i a c a n i s . I n f e c t I m m u n 7 : 2 6 5 , 1 9 7 3 T r o y G C , V u l g a m o t t J C , T u m w a l d G H : C a n i n e e h r l i c h i o s i s : A r e t r o s p e c t i v e s t u d y o f 3 0 n a t u r a l l y o c c u r r i n g c a s e s . J A m A n i m H o s p A s s o c 1 6 2 1 8 1 , 1 9 8 0 C o d n e r E C , M a s l i n W R : I n v e s t i g a t i o n o f r e n a l p r o t e i n l o s s i n d o g s w i t h a c u t e e x p e r i m e n t a l l y i n d u c e d E h r l i c h i a c a n i s i n f e c t i o n . A m J V e t R e s 5 3 2 2 9 4 , 1 9 9 2 M a t t h e w m a n L A , K e l l y P J , B o b a d e P A , T a g w i r a M , M a s o n P R , M a j o k A , B r o u q u i P , R a o u l t D : I n f e c t i o n s w i t h B a b e s i a c a n i s a n d E h r l i c h i a c a n i s i n d o g s i n Z i m b a b w e . V e t R e c o r d 1 3 3 2 3 4 4 , 1 9 9 3 E w i n g S A , R o b e r s o n W R , B u c k n e r R G , H a y a t C S : A n e w s t r a i n o f E h r l i c h i a c a n i s . J A V M A 1 5 9 2 1 7 7 1 , 1 9 7 1 S t o c k h a m S L , S c h m i d t D A , C u r t i s K S , S c h a u f B G , T y l e r J W , S i m p s o n S T : E v a l u a t i o n o f g r a n u l o c y t i c e h r l i c h i o s i s i n d o g s o f M i s s o u r i , i n c l u d i n g s e r o l o g i c s t a t u s t o E h r l i c h i a c a n i s , E h r l i c h i a e q u i , a n d B o r r e l i a b u r g d o r f e r i . A m J V e t R e s 5 3 2 6 3 , 1 9 9 2 3 9 2 . 3 9 3 . 3 9 4 . 3 9 5 . 3 9 6 . 3 9 7 . 3 9 8 . 3 9 9 . 4 0 0 . 4 0 1 . 4 0 2 . 4 0 3 . 4 0 4 . 4 0 5 . 1 9 8 G r e i g B , A r m s t r o n g J , D u m l e r S 2 G r a n u l o c y t i c e h r l i c h i o s i s i n M i n n e s o t a a n d W i s c o n s i n d o g s - a p o t e n t i a l z o o n o t i c d i s e a s e . V e t P a t h o l 3 1 2 5 7 5 , 1 9 9 4 C o w e l l R L , T y l e r R D , C l i n k e n b e a r d K D , M e i n k o t h J H : E h r l i c h i o s i s a n d p o l y a r t h r i t i s i n t h r e e d o g s . J A V M A 1 9 2 2 1 0 9 3 , 1 9 8 8 B e l l a h J R , S h u l l R M , S e l c e r V S : E h r l i c h i a c a n i s - r e l a t e d p o l y a r t h r i t i s i n a d o g . J A V M A 1 8 9 2 9 2 2 , 1 9 8 6 A n z i a n i O S , E w i n g S A , B a r k e r R W : E x p e r i m e n t a l t r a n s m i s s i o n o f a g r a n u l o c y t i c f o r m o f t h e t r i b e E h r l i c h i e a e b y D e r m a c e n t o r v a r i a b i l i s a n d A m b l y o m m a a m e r i c a n u m t o d o g s . A m J V e t R e s 5 1 2 9 2 9 , 1 9 9 0 S t o c k h a m S L , T y l e r J W , S c h m i d t D A , C u r t i s K S 2 E x p e r i m e n t a l t r a n s m i s s i o n o f g r a n u l o c y t i c e h r l i c h i a l o r g a n i s m s i n d o g s . V e t C l i n P a t h 1 9 : 9 9 , 1 9 9 0 H a r v e y J W , S i m p s o n C F , G a s k i n J M : C y c l i c t h r o m b o c y t o p e n i a i n d u c e d b y a R i c k e t t s i a - l i k e a g e n t i n d o g s . J I n f e c t D i s 1 3 7 2 1 8 2 , 1 9 7 8 G a u n t S D , B a k e r D C , B a b i n S S 2 P l a t e l e t a g g r e g a t i o n s t u d i e s i n d o g s w i t h a c u t e E h r l i c h i a p l a t y s i n f e c t i o n . A m J V e t R e s 5 1 2 2 9 0 , 1 9 9 0 B a k e r D C , S i m p s o n M , G a u n t S D , C o r s t v e t R E : A c u t e E h r l i c h i a p l a t y s i n f e c t i o n i n t h e d o g . V e t P a t h o l 2 4 2 4 4 9 , 1 9 8 7 F r e n c h T W , H a r v e y J W 2 S e r o l o g i c d i a g n o s i s o f i n f e c t i o u s c y c l i c t h r o m b o c y t o p e - n i a i n d o g s u s i n g a n i n d i r e c t fl u o r e s c e n t a n t i b o d y t e s t . A m J V e t R e s 4 4 2 2 4 0 7 , 1 9 8 3 G l a z e M B , G a u n t S D : U v e i t i s a s s o c i a t e d w i t h E h r l i c h i a p l a t y s i n f e c t i o n i n a d o g . J A V M A 1 8 8 2 9 1 6 , 1 9 8 6 W i l s o n J F : E h r l i c h i a p l a t y s i n a M i c h i g a n d o g . J A m A n i m H o s p A s s o c 2 8 2 3 8 1 , 1 9 9 2 K o n t o s V I , P a p a d o p o u l o s 0 , F r e n c h T W : N a t u r a l a n d e x p e r i m e n t a l c a n i n e i n f e c t i o n s w i t h a G r e e k s t r a i n o f E h r l i c h i a p l a t y s . V e t C l i n P a t h 2 0 2 1 0 1 , 1 9 9 1 B r e i t s c h w e r d t E B : B a b e s i o s i s , i n G r e e n e C E ( e d ) : C l i n i c a l M i c r o b i o l o g y a n d I n f e c t i o u s D i s e a s e s o f t h e D o g a n d C a t . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 8 4 , p 7 9 6 B r e i t s c h w e r d t E B , M a l o n e J B , M a c W i l l i a m s P , L e v y M G , Q u a l l s C W , P r u d i c h M J : B a b e s i o s i s i n t h e G r e y h o u n d . J A V M A 1 8 2 2 9 7 8 , 1 9 8 3 4 0 6 . 4 0 7 . 4 0 8 . 4 0 9 . 4 1 0 . 4 1 1 . 4 1 2 . 4 1 3 . 4 1 4 . 4 1 5 . 4 1 6 . 4 1 7 . 4 1 8 . 1 9 9 M o o r e D J , W i l l i a m s M C : D i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n : A c o m p l i c a t i o n o f B a b e s i a c a n i s i n f e c t i o n i n t h e d o g . J S A f r V e t A s s o c 5 0 2 2 6 5 , 1 9 7 9 C o n r a d P , T h o m f o r d J , Y a m a n e I , W h i t i n g J , B o s m a L , U n o T , H o l s h u h H J , S h e l l y S 2 H e m o l y t i c a n e m i a c a u s e d b y B a b e s i a g i b s o n i i n f e c t i o n i n d o g s . J A V M A 1 9 9 2 6 0 1 , 1 9 9 1 F a r w e l l G E , L e G r a n d E K , C o b b C C 2 C l i n i c a l o b s e r v a t i o n s o n B a b e s i a g i b s o n i a n d B a b e s i a c a n i s i n f e c t i o n s i n d o g s . J A V M A 1 8 0 2 5 0 7 , 1 9 8 2 S l a p p e n d e l R J , G r e e n e C E : L e i s h m a n i a s i s , i n G r e e n e C E ( e d ) : I n f e c t i o u s D i s e a s e s o f t h e D o g a n d C a t . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 9 0 , p 7 6 9 K e e n a n C M , H e n d r i c k s L D , L i g h t n e r L , W e b s t e r I - I K , J o h n s o n A J 2 V i s c e r a l l e i s h m a n i a s i s i n t h e G e r m a n S h e p h e r d d o g : 1 . I n f e c t i o n , c l i n i c a l d i s e a s e , a n d c l i n i c a l p a t h o l o g y . V e t P a t h o l 2 1 2 7 4 , 1 9 8 4 M i e s c h e r P A , B e l e h u A 2 L e i s h m a n i a s i s : H e m a t o l o g i c a s p e c t s . S e m i n H e m a t o l 1 9 : 9 3 , 1 9 8 2 C l i n k e n b e a r d K D , T y l e r R D , C o w e l l R L : T h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h d i s s e m i n a t e d h i s t o p l a s m o s i s i n d o g s . C o m p e n d C o n t i n E d u c S m a l l A n i m P r a c t 1 1 2 3 0 1 , 1 9 8 9 C l i n k e n b e a r d K D , C o w e l l R L , T y l e r R D : D i s s e m i n a t e d h i s t o p l a s m o s i s i n d o g s : 1 2 c a s e s ( 1 9 8 1 - 1 9 8 6 ) . J A V M A 1 9 3 2 1 4 4 3 , 1 9 8 8 D e s P r e z R M , S t e c k l e y S , S t r o u d R M , H a w i g e r J 2 I n t e r a c t i o n o f H i s t o p l a s m a c a p s u l a t u m w i t h h u m a n p l a t e l e t s . J I n f e c t D i s 1 4 2 2 3 2 , 1 9 8 0 K u c e r a J C , D a v i s R B : T h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h h i s t o p l a s m o s i s a n d a n e l e v a t e d p l a t e l e t a s s o c i a t e d I g G . A m J C l i n P a t h o l 7 9 2 6 4 4 , 1 9 8 3 B r e i t s c h w e r d t E B , E n g l i s h R V , H e g a r t y B C , L e v y M G , T o m p k i n s W : P r e l i m i - n a r y c h a r a c t e r i z a t i o n o f a n o v e l i n f e c t i o u s c a u s e o f t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s . P r o c 1 0 t h A n n V e t M e d F o r u m , A m e r i c a n C o l l e g e o f V e t e r i n a r y I n t e r n a l M e d i c i n e , 1 9 9 2 , p 8 0 7 O ’ K e e f e D A , C o u t o C G : C o a g u l a t i o n a b n o r m a l i t i e s a s s o c i a t e d w i t h n e o p l a s i a . V e t C l i n N o r t h A m S m a l l A n i m P r a c t 1 8 2 1 5 7 , 1 9 8 8 M a d e w e l l B R , F e l d m a n B F , O ’ N e i l l S : C o a g u l a t i o n a b n o r m a l i t i e s i n d o g s w i t h n e o p l a s t i c d i s e a s e . T h r o m b H a e m o s t 4 4 2 3 5 , 1 9 8 0 4 1 9 . 4 2 0 . 4 2 1 . 4 2 2 . 4 2 3 . 4 2 4 . 4 2 5 . 4 2 6 . 4 2 7 . 4 2 8 . 4 2 9 . 4 3 0 . 2 0 0 S l i c h t e r S J , W e i d e n P L , O ’ D o n n e l l M R , S t o r b R 2 I n t e r r u p t i o n o f t u m o r - a s s o c i a t e d p l a t e l e t c o n s u m p t i o n w i t h p l a t e l e t e n z y m e i n h i b i t o r s . B l o o d 5 9 2 1 2 5 2 , 1 9 8 2 H a r g i s A M , F e l d m a n B F 2 E v a l u a t i o n o f h e m o s t a t i c d e f e c t s s e c o n d a r y t o v a s c u l a r t u m o r s i n d o g s : 1 1 c a s e s ( 1 9 8 3 - 1 9 8 8 ) . J A V M A 1 9 8 2 8 9 1 , 1 9 9 1 O ’ K e e f e D A , C o u t o C G , B u r k e - S c h w a r t z C , J a c o b s R M : S y s t e m i c m a s t o c y t o s i s i n 1 6 d o g s . J V e t I n t M e d 1 2 7 5 , 1 9 8 7 W e l l m a n M L , D a v e n p o r t D J , M o r t o n D , J a c o b s R M : M a l i g n a n t h i s t i o c y t o s i s i n f o u r d o g s . J A V M A 1 8 7 2 9 1 9 , 1 9 8 5 B r e i t s c h w e r d t E B , L e v y M G , D a v i d s o n M G , W a l k e r D H , B u r g d o r f e r W , C u r t i s B C , B a b i n e a u C A 2 K i n e t i c s o f I g M r e s p o n s e s t o e x p e r i m e n t a l a n d n a t u r a l l y a c q u i r e d R i c k e t t s i a r i c k e t t s i i i n f e c t i o n i n d o g s . A m J V e t R e s 5 1 2 1 3 1 2 , 1 9 9 0 V i s e n t i n G P , N e w m a n P J , A s t e r R H : C h a r a c t e r i s t i c s o f q u i n i n e - a n d q u i n i d i n e - i n d u c e d a n t i b o d i e s s p e c i fi c f o r p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n s I I b a n d m a . B l o o d 1 2 2 2 6 6 8 , 1 9 9 1 C h o n g B H , D u X , B e m d t M C , H o r n 8 , C h e s t e r m a n C N : C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e b i n d i n g d o m a i n s o n p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n s I b - I X a n d I I b / I I I a c o m p l e x e s f o r t h e q u i n i n e / q u i n i d i n e — d e p e n d e n t a n t i b o d i e s . B l o o d 1 0 2 2 1 9 0 , 1 9 9 1 R o s e n f e l d 8 1 , A n d e r s o n C L : F c r e c e p t o r s o f h u m a n p l a t e l e t s , i n K u n i c k i T J , G e o r g e J N ( e d s ) : P l a t e l e t I r n m u n o b i o l o g y : M o l e c u l a r a n d C l i n i c a l A s p e c t s . P h i l a d e l p h i a , L i p p i n c o t t , 1 9 8 9 , p 3 3 7 W a r m e r d a m P A M , V a n d e W i n k e l J G J , G o s s e l i n E J , C a p e l P J A : M o l e c u l a r b a s i s f o r a p o l y m o r p h i s m o f h u m a n F e y r e c e p t o r 1 1 ( C D 3 2 ) . J E x p M e d 1 7 2 2 1 9 , 1 9 9 0 P a r r e n P W H I , W a r m e r d a m P A M , B o e i j e L C M , A r t s J , W e s t e r d a a l N A C , V l u g A , C a p e l P J A , A a r d e n L A , V a n d e W i n k e l J G J 2 O n t h e i n t e r a c t i o n o f I g G s u b c l a s s e s w i t h t h e l o w a f fi n i t y F c y R I I a ( C D 3 2 ) o n h u m a n m o n o c y t e s , n e u t r o p h i l s , a n d p l a t e l e t s : A n a l y s i s o f a f u n c t i o n a l p o l y m o r p h i s m t o h u m a n I g G 2 . J C l i n I n v e s t 9 0 2 1 5 3 7 , 1 9 9 2 B r o o k s D G , Q i u W Q , L u s t e r A D , R a v e t c h J V 2 S t r u c t u r e a n d e x p r e s s i o n o f h u m a n I g G F c R I I ( C D 3 2 ) 2 F u n c t i o n a l h e t e r o g e n e i t y i s e n c o d e d b y t h e a l t e r n a t i v e l y s p l i c e d p r o d u c t s o f m u l t i p l e g e n e s . J E x p M e d 1 7 0 2 1 3 6 9 , 1 9 8 9 K e l t o n J G , S m i t h J W , S a n t o s A V , M u r p h y W G , H o r s e w o o d P : P l a t e l e t I g G F c r e c e p t o r . A m J H e m a t o l 2 5 2 2 9 9 , 1 9 8 7 4 3 1 . 4 3 2 . 4 3 3 . 4 3 4 . 4 3 5 . 4 3 6 . 4 3 7 . 4 3 8 . 4 3 9 . 4 4 0 . 4 4 1 . 4 4 2 . 4 4 3 . 2 0 1 K a r a s S P , R o s s e W F , K u r l a n d e r R J 2 C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e I g G - F c r e c e p t o r o n h u m a n p l a t e l e t s . B l o o d 6 0 2 1 2 7 7 , 1 9 8 2 M c h e K R , S h a t t i l S J , C i n e s D B : P l a t e l e t a c t i v a t i o n i n d u c e s i n c r e a s e d F e y r e c e p t o r e x p r e s s i o n . J I m m u n o l 1 4 4 2 3 9 2 0 , 1 9 9 0 K e l t o n J G , S m i t h J W , W a r k e n t i n T E , H a y w a r d C P M , D e n o m m e G A , H o r s e w o o d P 2 I m m u n o g l o b u l i n G f r o m p a t i e n t s w i t h h e p a r i n - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a b i n d s t o a c o m p l e x o f h e p a r i n a n d p l a t e l e t f a c t o r 4 . B l o o d 1 1 2 3 2 3 2 , 1 9 9 4 A n d e r s o n G P , A n d e r s o n C L : S i g n a l t r a n s d u c t i o n b y t h e p l a t e l e t F c r e c e p t o r . B l o o d 7 6 2 1 1 6 5 , 1 9 9 0 S a f a i - K u t t i S , Z a r o u l i s C G , D a y N K , G o o d R A , K u t t i J 2 P l a t e l e t t r a n s f u s i o n t h e r a p y a n d c i r c u l a t i n g i m m u n e c o m p l e x e s . V o x S a n g 3 9 : 2 2 , 1 9 8 0 K u t t i J , Z a r o u l i s C G , S a f a i - K u t t i S , D i n s m o r e R E , D a y N D , G o o d R A : E v i d e n c e t h a t c i r c u l a t i n g i m m u n e c o m p l e x e s r e m o v e t r a n s f u s e d p l a t e l e t s f r o m t h e c i r c u l a t i o n . A m J H e m a t o l 1 1 2 2 5 5 , 1 9 8 1 S i u h a R K , S a n t o s A V , S m i t h J W , H o r s e w o o d P , A n d r e w M , K e l t o n J G : R a b b i t p l a t e l e t s d o n o t e x p r e s s F c r e c e p t o r s f o r I g G . P l a t e l e t s 3 2 3 5 , 1 9 9 2 N e l s o n R A J : T h e i m m u n e - a d h e r e n c e p h e n o m e n o n : A n i m m u n o l o g i c a l l y s p e c i fi c r e a c t i o n b e t w e e n m i c r o o r g a n i s m s a n d e r y t h r o c y t e s l e a d i n g t o e n h a n c e d p h a g o c y t o s i s . S c i e n c e 1 1 8 2 7 3 3 , 1 9 5 3 N e l s o n D S : I m m u n e A d h e r e n c e , i n D i x o n F J J , H u m p h r e y J H ( e d s ) : A d v a n c e s I n I m m u n o l o g y ( v o l 3 ) . N e w Y o r k , A c a d e m i c P r e s s , 1 9 6 3 , p 1 3 1 S i m s P J 2 I n t e r a c t i o n o f h u m a n p l a t e l e t s w i t h t h e c o m p l e m e n t s y s t e m , i n K u n i c k i T J , G e o r g e J N ( e d s ) : P l a t e l e t I r n m u n o b i o l o g y : M o l e c u l a r a n d C l i n i c a l A s p e c t s . P h i l a d e l p h i a , L i p p i n c o t t , 1 9 8 9 , p 3 5 4 H e b e r t L A : T h e C l e a r a n c e o f i m m u n e c o m p l e x e s f r o m t h e c i r c u l a t i o n o f m a n a n d o t h e r p r i m a t e s . A m J K i d n e y D i s 1 7 2 3 5 2 , 1 9 9 1 M a n t h e i U , N i c k e l l s M W , B a r n e s S H , B a l l a r d L L , C u i W - Y , A t k i n s o n J P : I d e n t i fi c a t i o n o f a C 3 b / i C 3 b i n d i n g p r o t e i n o f r a b b i t p l a t e l e t s a n d l e u k o c y t e s : A C R l - l i k e c a n d i d a t e f o r t h e i m m u n e a d h e r e n c e r e c e p t o r . J I m m u n o l 1 4 0 2 1 2 2 8 , 1 9 8 8 W a l p o r t M J , L a c h m a n n P J 2 E r y t h r o c y t e c o m p l e m e n t r e c e p t o r t y p e 1 , i m m u n e c o m p l e x e s , a n d t h e r h e u m a t i c d i s e a s e s . A r t h r i t i s R h e u m 3 1 2 1 5 3 , 1 9 8 8 4 4 5 . 4 4 6 . 4 4 7 . 4 4 8 . 4 4 9 . 4 5 0 . 4 5 1 . 4 5 2 . 4 5 3 . 4 5 4 . 4 5 5 . 2 0 2 K a r p a t k i n S , X i a J , T h o r b e c k e G J 2 S e r u m p l a t e l e t - r e a c t i v e I g G o f a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a p a t i e n t s i s n o t F ( a b ’ ) 2 m e d i a t e d a n d a f u n c t i o n o f s t o r a g e . B l o o d 8 0 2 3 1 6 4 , 1 9 9 2 G e o r g e J N : T h e o r i g i n a n d s i g n i fi c a n c e o f p l a t e l e t I g G , i n K u n i c k i T J , G e o r g e J N ( e d s ) : P l a t e l e t I r n m u n o b i o l o g y : M o l e c u l a r a n d C l i n i c a l A s p e c t s . P h i l a d e l p h i a , L i p p i n c o t t , 1 9 8 9 , p 3 0 5 H a r r i n g t o n W J , M i n n i c h V , H o l l i n g s w o r t h J W , M o o r e C V 2 D e m o n s t r a t i o n o f a t h r o m b o c y t o p e n i c f a c t o r i n t h e b l o o d o f p a t i e n t s w i t h t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . J L a b C l i n M e d 3 8 2 1 , 1 9 5 1 S h u l m a n N R , M a r d e r V J , W e i n r a c h R S : S i m i l a r i t i e s b e t w e e n k n o w n a n t i p l a t e l e t a n t i b o d i e s a n d t h e f a c t o r r e s p o n s i b l e f o r t h r o m b o c y t O p e n i a i n i d i o p a t h i c p u r p u r a . P h y s i o l o g i c , s e r o l o g i c a n d i s o t o p i c s t u d i e s . A n n N Y A c a d S c i 1 2 4 2 4 9 9 , 1 9 6 5 K a r p a t k i n S 2 A u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . S e m i n H e m a t o l 2 2 2 2 6 0 , 1 9 8 5 F r i e n d P J , M c C a r t h y L J , F i l o R S , L e a p m a n S B , P e s c o v i t z M D , L u m e n g L , P o u n d D , A r n o l d K , H o f f m a n R , M c F a r l a n d J G , A s t e r R H : T r a n s m i s s i o n o f i d i o p a t h i c ( a u t o i m m u n e ) t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a b y l i v e r t r a n s p l a n t a t i o n . N E n g l J M e d 3 2 3 2 8 0 7 , 1 9 9 0 M i n c h i n t o n R M , K e n d r a J , W a t e r s A H , B a r r e t t A J 2 A u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e - n i a a c q u i r e d f r o m a n a l l o g e n e i c b o n e - m a r r o w g r a f t . L a n c e t i i 2 6 2 7 , 1 9 8 2 W a t e r s A H , M e t c a l f e P , M i n c h i n t o n R M , B a r r e t t A J , J a m e s D C O : A u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a a c q u i r e d f r o m a l l o g e n e i c b o n e - m a r r o w g r a f t : C o m p e n s a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n b o n e m a r r o w d o n o r a n d r e c i p i e n t . L a n c e t i i : 1 4 3 0 , 1 9 8 3 D e n o m m e G A , S m i t h J W , K e l t o n J G , B e l l D A : A h u m a n m o n o c l o n a l a u t o a n t i - b o d y t o p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n I I b d e r i v e d f r o m n o r m a l h u m a n l y m p h o c y t e s . B l o o d 7 9 2 4 4 7 , 1 9 9 2 D e n o m m e G A , K e l t o n J G , B e l l D A : T h e p r o d u c t i o n o f h u m a n m o n o c l o n a l a n t i p l a t e l e t a u t o - a n t i b o d i e s d e r i v e d f r o m h u m a n l y m p h o c y t e s o f n o r m a l o r i g i n : R e a c t i v i t y t o D N A , a n i o n i c p h o s p h o l i p i d s a n d p l a t e l e t p r o t e i n s . B r J H a e m a t o l 8 1 2 9 9 , 1 9 9 2 S e m p l e J W , F r e e d m a n J : I n c r e a s e d a n t i p l a t e l e t T h e l p e r l y m p h o c y t e r e a c t i v i t y i n p a t i e n t s w i t h a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a . B l o o d 7 8 2 2 6 1 9 , 1 9 9 1 M i z u t a n i H , F u r u b a y a s h e T , K a s h i w a g i H , H o n d a 8 , T a k e H , K u r a t a Y , Y o n e z a w a T , T a r u i S : B c e l l s e x p r e s s i n g C D 5 a n t i g e n a r e m a r k e d l y i n c r e a s e d i n 4 5 6 . 4 5 7 . 4 5 8 . 4 5 9 . 4 6 0 . 4 6 1 . 4 6 2 . 4 6 3 . 4 6 4 . 4 6 5 . 4 6 6 . 2 0 3 p e r i p h e r a l b l o o d a n d s p l e e n l y m p h o c y t e s f r o m p a t i e n t s w i t h i m m u n e t h r o m b o c y t o - p e n i c p u r p u r a . B r J H a e m a t o l 7 8 2 4 7 4 , 1 9 9 1 H y m e s K B , S c h u c k M P , K a r p a t k i n S : R e g u l a t i o n o f a u t o i m m u n e a n t i — p l a t e l e t a n t i b o d y - m e d i a t e d a d h e s i o n o f m o n o c y t e s t o p l a t e l e t G P I I b / G P I I I a : E f f e c t o f a r m e d m o n o c y t e s a n d t h e M a c - 1 r e c e p t o r . B l o o d 7 5 2 1 8 1 3 , 1 9 9 0 A m o t t J , H o r s e w o o d P , K e l t o n J G : M e a s u r e m e n t o f p l a t e l e t - a s s o c i a t e d I g G i n a n i m a l m o d e l s o f i m m u n e a n d n o n i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a . B l o o d 6 9 2 1 2 9 4 , 1 9 8 7 K e l t o n J G , C a r t e r C J , R o d g e r C , B e b e n e k G , G a u l d i e J , S h e r i d a n D , K a s s a m Y B , K e a n W F , B u c h a n a n W W , R o o n e y P J , B i a n c h i F , D e n b u r g J : T h e r e l a t i o n s h i p a m o n g p l a t e l e t - a s s o c i a t e d I g G , p l a t e l e t l i f e s p a n , a n d r e t i c u l o e n d o t h e l i - a l c e l l f u n c t i o n . B l o o d 6 3 2 1 4 3 4 , 1 9 8 4 Z e i g l e r Z R , R o s e n f e l d C S , N e m u n a i t i s J J , B e s a E C , S h a d d u c k R K : I n c r e a s e d m a c r O p h a g e c o l o n y - s t i m u l a t i n g f a c t o r l e v e l s i n i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B l o o d 8 1 2 1 2 5 1 , 1 9 9 3 H a n d i n R I , S t o s s e l T P : P h a g o c y t o s i s o f a n t i b o d y — c o a t e d p l a t e l e t s b y h u m a n g r a n u l o c y t e s . N E n g l J M e d 2 9 0 2 9 8 9 , 1 9 7 4 S h e b a n i O I , J a i n N C : M e c h a n i s m s o f p l a t e l e t d e s t r u c t i o n i n i m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a : i n v i t r o s t u d i e s w i t h c a n i n e p l a t e l e t s e x p o s e d t o h e t e r o l o g o u s a n d i s o l o g o u s a n t i p l a t e l e t a n t i b o d i e s . R e s V e t S c i 4 7 2 2 8 8 , 1 9 8 9 C l a n c y R : C e l l u l a r i m m u n i t y t o a u t o l o g o u s p l a t e l e t s a n d s e r u m - b l o c k i n g f a c t o r s i n i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . L a n c e t i 2 6 , 1 9 7 2 W y b r a n J , F u d e n b e r g H H : C e l l u l a r i m m u n i t y t o p l a t e l e t s i n i d i o p a t h i c t h r o m b o - c y t o p e n i c p u r p u r a . B l o o d 4 0 2 8 5 6 , 1 9 7 2 M u e l l e r - E c k h a r d t C : I d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a ( I T P ) : C l i n i c a l a n d i m m u n o l o g i c c o n s i d e r a t i o n s . S e m T h r o m b H e m o s t 3 : 1 2 5 , 1 9 7 7 S c h w a r t z K A : P l a t e l e t a n t i b o d y : R e v i e w o f d e t e c t i o n m e t h o d s . A m J H e m a t o l 2 9 2 1 0 6 , 1 9 8 8 S h u l m a n N R , M a r d e r V J , H i l l e r M C , C o l l i e r E M : P l a t e l e t a n d l e u k o c y t e i s o - a n t i g e n s a n d t h e i r a n t i b o d i e s : S e r o l o g i c , p h y s i o l o g i c a n d c l i n i c a l s t u d i e s , i n M o o r e C V , B r o w n E B ( e d s ) : P r o g r e s s i n H e m a t o l o g y . N e w Y o r k , G r u n e & S r a t t o n , 1 9 6 4 , p 2 2 2 4 6 7 . 4 6 8 . 4 6 9 . 4 7 0 . 4 7 1 . 4 7 2 . 4 7 3 . 4 7 4 . 4 7 5 . 4 7 6 . 4 7 7 . 4 7 8 . 2 0 4 D i x o n R , R o s s e W , E b b e r t L : Q u a n t i t a t i v e d e t e r m i n a t i o n o f a n t i b o d y i n i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . N E n g l J M e d 2 9 2 2 2 3 0 , 1 9 7 5 K e l t o n J G , S h e r i d a n D , N e a m e P B , S i m o n G T : P l a t e l e t f r a g m e n t s d o n o t c o n t r i b u t e t o e l e v a t e d l e v e l s o f p l a t e l e t a s s o c i a t e d I g G . B r J H a e m a t o l 6 1 2 7 0 7 , 1 9 8 5 Z u c k e r - F r a n k l i n D , K a r p a t k i n S : R e d - c e l l a n d p l a t e l e t f r a g m e n t a t i o n i n i d i 0 p a t h i c a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . N E n g l J M e d 2 9 7 2 5 1 7 , 1 9 7 7 K h a n E , Z u c k e r - F r a n k l i n D , K a r p a t k i n S : M i c r o t h r o m b o c y t o s i s a n d p l a t e l e t f r a g m e n t a t i o n a s s o c i a t e d w i t h i d i o p a t h i c / a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B r J H a e m a t o l 3 1 2 4 4 9 , 1 9 7 5 L y n c h D M , L y n c h J M , H o w e S E : A q u a n t i t a t i v e E L I S A p r o c e d u r e f o r t h e m e a s u r e m e n t o f m e m b r a n e - b o u n d p l a t e l e t - a s s o c i a t e d I g G ( P A I g G ) . A m J C l i n P a t h o l 8 3 2 3 3 1 , 1 9 8 5 H o w e S E , L y n c h D M , L y n c h J M : A n e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y f o r t h e q u a n t i fi c a t i o n o f s e r u m p l a t e l e t - b i n d a b l e I g G . T r a n s f u s i o n 2 4 2 3 4 8 , 1 9 8 4 C o n n e l l a n J M , Q u i n n M , W i l e y J S : T h e u s e o f 1 ” I l a b e l l e d s t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n A i n t h e d i a g n o s i s o f a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a a n d o t h e r i m m u n e m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a s . P a t h o l 1 8 2 1 1 1 , 1 9 8 6 S h a w G M , A x e l s o n J , M a g l o t t J G , L o B u g l i o A F 2 Q u a n t i fi c a t i o n o f p l a t e l e t - b o u n d I g G b y l ” I - s t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n A i n i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a a n d o t h e r t h r o m b o c y t o p e n i c d i s o r d e r s . B l o o d 6 3 2 1 5 4 , 1 9 8 4 S c h w a r t z K A , G a u g e r J A , D a v i s J M : P r e c i s e q u a n t i t a t i o n o f P A I g G : A n e w r a d i o m e t r i c m i c r o t e c h n i q u e . A m J H e m a t o l 3 3 2 1 6 7 , 1 9 9 0 C o u r t W S , B o z e m a n J M , S o o n g S , S a l e h M N , S h a w D R , L o B u g l i o A F : P l a t e l e t s u r f a c e - b o u n d I g G i n p a t i e n t s w i t h i m m u n e a n d n o n i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a . B l o o d 6 9 2 2 7 8 , 1 9 8 7 v o n d e m B o r n e A E G K , V e r h e u g t F W A , O o s t e r h o f F , v o n R i e s z E , B r u t e l d e l a R i v i é r e A , E n g e l f r i e t C P : A s i m p l e i m m u n o fl u o r e s c e n c e t e s t f o r t h e d e t e c t i o n o f p l a t e l e t a n t i b o d i e s . B r J H a e m a t o l 3 9 2 1 9 5 , 1 9 7 8 S i n t n i c o l a a s K , d e V r i e s W , v a n d e r L i n d e n R , G r a t a m a J W , B o l h u i s R L H : S i m u l t a n e o u s fl o w c y t o m e t r i c d e t e c t i o n o f a n t i b o d i e s a g a i n s t p l a t e l e t s , g r a n u l o - c y t e s a n d l y m p h o c y t e s . J I m m u n o l M e t h o d s 1 4 2 2 2 1 5 , 1 9 9 1 4 7 9 . 4 8 0 . 4 8 1 . 4 8 2 . 4 8 3 . 4 8 4 . 4 8 5 . 4 8 6 . 4 8 7 . 4 8 8 . 4 8 9 . 2 0 5 C h r i s t o p o u l o s C G , K e l s e y H C , M a c h i n S J 2 A fl o w - c y t o m e t r i c a p p r o a c h t o q u a n t i t a t i v e e s t i m a t i o n o f p l a t e l e t s u r f a c e i m m u n o g l o b u l i n G . V o x S a n g 6 4 2 1 0 6 , 1 9 9 3 M c M i l l a n R , T a n i P , M i l l a r d F , B e r c h t o l d P , R e n s h a w L , W o o d s V L J : P l a t e l e t - a s s o c i a t e d a n d p l a s m a a n t i - g l y c o p r o t e i n a u t o a n t i b o d i e s i n c h r o n i c I T P . B l o o d 7 0 2 1 0 4 0 , 1 9 8 7 K i e f e l V , S a n t o s o S , W e i s h e i t M , M i i e l l e r - E c k h a r d t C 2 M o n o c l o n a l a n t i b o d y - s p e c i fi c i m m o b i l i z a t i o n o f p l a t e l e t a n t i g e n s ( M A I P A ) : A n e w t o o l f o r t h e i d e n t i fi c a t i o n o f p l a t e l e t - r e a c t i v e a n t i b o d i e s . B l o o d 7 0 2 1 7 2 2 , 1 9 8 7 S z a t k o w s k i N S , K u n i c k i T J , A s t e r R H : I d e n t i fi c a t i o n o f g l y c o p r o t e i n I b a s a t a r g e t f o r a u t o a n t i b o d y i n i d i o p a t h i c ( a u t o i m m u n e ) t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B l o o d 6 7 2 3 1 0 , 1 9 8 6 D e v i n e D , R o s s e W F : I d e n t i fi c a t i o n o f p l a t e l e t p r o t e i n s t h a t b i n d a l l o a n t i b o d i e s a n d a u t o a n t i b o d i e s . B l o o d 2 1 2 4 0 , 1 9 8 4 R e i d D M , J o n e s C E , L u o C , S h u l m a n N R : I m m u n o g l o b u l i n s f r o m n o r m a l s e r a b i n d p l a t e l e t v i n c u l i n a n d t a l i n a n d t h e i r p r o t e o l y t i c f r a g m e n t s . B l o o d 8 1 2 7 4 5 , 1 9 9 3 F a b r i s F , C o r d i a n o I , M a z z u c c a t o M , P r a d e l l a P , R a n d i M L , G i r o l a m i A : L a b e l i n g o f p l a t e l e t s u r f a c e g l y c 0 p r o t e i n s w i t h b i o t i n d e r i v a t i v e s . T h r o m b R e s 6 6 2 4 0 9 , 1 9 9 2 V a r o n D , K a r p a t k i n S : A m o n o c l o n a l a n t i - p l a t e l e t a n t i b o d y w i t h d e c r e a s e d r e a c t i v i t y f o r a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p l a t e l e t s . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 8 0 2 6 9 9 2 , 1 9 8 3 K o k a w a T , N o m u r a S , Y a n a b u M , Y a s i r n a g u K 2 D e t e c t i o n o f p l a t e l e t a n t i g e n f o r a n t i p l a t e l e t a n t i b o d i e s i n i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a b y fl o w c y t o m e t r y , a n t i g e n - c a p t u r e E L I S A , a n d i m m u n o b l o t t i n g : a c o m p a r a t i v e s t u d y . E u r J H a e m a t o l 5 0 2 7 4 , 1 9 9 3 T a t e D Y , S o r e n s o n R L , G e r r a r d J M , W h i t e J G , K r i v i t W 2 A n i m m u n o e n z y m e h i s t o c h e m i c a l t e c h n i q u e f o r t h e d e t e c t i o n o f p l a t e l e t a n t i b o d i e s f r o m t h e s e r u m o f p a t i e n t s w i t h i d i o p a t h i c ( a u t o i m m u n e ) t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a ( I T P ) . B r J H a e m a t o l 3 7 2 2 6 5 , 1 9 7 7 M o r s e B S , G i u l i a n i D , N u s s b a u m M 2 Q u a n t i t a t i o n o f p l a t e l e t - a s s o c i a t e d I g G b y r a d i a l i m m u n o d i f f u s i o n . B l o o d 5 7 2 8 0 9 , 1 9 8 1 4 9 0 . 4 9 1 . 4 9 2 . 4 9 3 . 4 9 4 . 4 9 5 . 4 9 6 . 4 9 7 . 4 9 8 . 4 9 9 . 5 0 0 . 2 0 6 K u n i c k i T J , K o e n i g M B , K r i s t o p e i t S M , A s t e r R H : D i r e c t q u a n t i t a t i o n o f p l a t e l e t - a s s o c i a t e d I g G b y e l e c t r o i m m u n o a s s a y . B l o o d 6 0 : 5 4 , 1 9 8 2 R a m o s R R , C u r t i s B R , C h a p l i n H : A l a t e x p a r t i c l e a s s a y f o r p l a t e l e t - a s s o c i a t e d I g G . T r a n s f u s i o n 3 2 2 2 3 5 , 1 9 9 2 S h u l m a n N R , L e i s s i n g e r C A , H o t c h k i s s A J , K a u t z C A : T h e n o n s p e c i fi c n a t u r e o f p l a t e l e t - a s s o c i a t e d I g G . T r a n s A s s o c A m P h y s i c i a n s 9 5 2 2 1 3 , 1 9 8 2 O g a s a w a r a K , U e k i J , T a k e n a k a M , F u r i h a t a K : S t u d y o n t h e e x p r e s s i o n o f A B H a n t i g e n s o n p l a t e l e t s . B l o o d 8 2 2 9 9 3 , 1 9 9 3 D u n s t a n R A , S i m p s o n M B , K n o w l e s R W , R o s s e W : T h e o r i g i n o f A B H a n t i g e n s o n h u m a n p l a t e l e t s . B l o o d 6 5 2 6 1 5 , 1 9 8 5 M o l l i s o n P L , E n g e l f r i e t C P , C o n t r e r a s M 2 A B O , L e w i s , I i a n d P G r o u p s , i n B l o o d T r a n s f u s i o n i n C l i n i c a l M e d i c i n e ( 9 t h e d ) . O x f o r d , B l a c k w e l l S c i e n t i fi c , 1 9 9 3 , p 1 4 8 P i d a r d D , D i d r y D , K u n i c k i T J , N u r d e n A T : T e m p e r a t u r e — d e p e n d e n t e f f e c t s o f E D T A o n t h e m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n I I b — I I I a c o m p l e x a n d p l a t e l e t a g g r e g a b i l i t y . B l o o d 6 7 2 6 0 4 , 1 9 8 6 H a n a u D , G a c h e t C , S c h r n i t t D A , O h l m a n n P , B r i s s o n C , F a b r e M , C a z e n a v e J - P : U l t r a s t r u c t u r a l s i m i l a r i t i e s b e t w e e n e p i d e r m a l L a n g e r h a n s c e l l B i r b e c k g r a n u l e s a n d t h e s u r f a c e - c o n n e c t e d c a n a l i c u l a r s y s t e m o f E D T A - t r e a t e d h u m a n b l o o d p l a t e l e t s . J I n v e s t D e r m a t o l 9 7 2 7 5 6 , 1 9 9 1 G a c h e t C , H a n a u D , S p e h n e r D , B r i s s o n C , G a r a u d J — C , S c h r n i t t D A , O h l m a n n P , C a z e n a v e J - P : ( 2 1 1 , 5 3 i n t e g r i n d i s s o c i a t i o n i n d u c e d b y E D T A r e s u l t s i n m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s o f t h e p l a t e l e t s u r f a c e - c o n n e c t e d c a n a l i c u l a r s y s t e m w i t h d i f f e r e n t i a l l o c a t i o n o f t h e t w o s e p a r a t e s u b u n i t s . J C e l l B i o l 1 2 0 2 1 0 2 1 , 1 9 9 3 K u i j p e r s W A M , O u w e h a n d W H , P e e l e n W , M i c h i e l s J J , E n g e l f r i e t C P , v o n d e m B o r n e A E G K : T h r o m b o c y t o p e n i a d u e t o p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n I I b / I I I a - r e a c t i v e a u t o a n t i b o d i e s n o n - r e a c t i v e w i t h p l a t e l e t s f r o m E D T A b l o o d . V o x S a n g 6 3 2 1 1 9 , 1 9 9 2 G a c h e t C , S t i e r l é A , O h l m a n n P , L a n z a F , H a n a u D , C a z e n a v e J - P : N o r m a l A D P - i n d u c e d a g g r e g a t i o n a n d a b s e n c e o f d i s s o c i a t i o n o f t h e m e m b r a n e G P I I b - I I I a c o m p l e x o f i n t a c t r a t p l a t e l e t s p r e t r e a t e d w i t h E D T A . T h r o m b H a e m o s t 6 6 2 2 4 6 , 1 9 9 1 - 5 0 1 . 5 0 2 . 5 0 3 . 5 0 4 . 5 0 5 . 5 0 6 . 5 0 7 . 5 0 8 . 5 0 9 . 5 1 0 . 5 1 1 . 2 0 7 v o n d e m B o r n e A E G K , V o s J J E , v a n d e r L e l i e J , B o s s e r s B , v a n D a l e n C M : C l i n i c a l s i g n i fi c a n c e o f p o s i t i v e p l a t e l e t i m m u n o fl u o r e s c e n c e t e s t i n t h r o m b o c y t o - p e n i a . B r J H a e m a t o l 6 4 2 7 6 7 , 1 9 8 6 H a n d a g a m a P , F e l d m a n B , K o n o C , F a r v e r T 2 M e a n p l a t e l e t v o l u m e a r t i f a c t s : T h e e f f e c t o f a n t i c o a g u l a n t s a n d t e m p e r a t u r e o n c a n i n e p l a t e l e t s . V e t C l i n P a t h 1 5 : 1 3 , 1 9 8 6 M e z z a n o D , A r a n d a E , F o r a d o r i A : C o m p a r a t i v e s t u d y o f s i z e , t o t a l p r o t e i n , fi b r i n o g e n a n d 5 - H T c o n t e n t o f h u m a n a n d c a n i n e p l a t e l e t d e n s i t y s u b p o p u l a t i o n s . T h r o m b H a e m o s t 5 6 2 2 8 8 , 1 9 8 6 N a k e f f A , I n g r a m M : P l a t e l e t c o u n t : v o l u m e r e l a t i o n s h i p s i n f o u r m a m m a l i a n s p e c i e s . J A p p l P h y s i 0 1 2 8 2 5 3 0 , 1 9 7 0 M a g e e J M : A s t u d y o f t h e e f f e c t s o f t r e a t i n g p l a t e l e t s w i t h p a r a f o r m a l d e h y d e f o r u s e i n t h e p l a t e l e t s u s p e n s i o n i m m u n o fl u o r e s c e n c e t e s t . B r J H a e m a t o l 6 1 2 5 1 3 , 1 9 8 5 C a h i l l M R , M a c e y M G , N e w l a n d A C : F i x a t i o n w i t h f o r m a l d e h y d e i n d u c e s e x p r e s s i o n o f a c t i v a t i o n d e p e n d e n t p l a t e l e t m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s , P s e l e c t i n ( C D 6 2 ) a n d G P 5 3 ( C D 6 3 ) . B r J H a e m a t o l 8 4 2 5 2 7 , 1 9 9 3 H e l m e r h o r s t F M , t e n B e r g e M L , v a n d e r P l a s - v a n D a l e n C M , E n g e l f r i e t C P , v o n d e m B o r n e A E G K : P l a t e l e t f r e e z i n g f o r s e r o l o g i c a l p u r p o s e s w i t h a n d w i t h o u t a c r y o p r e s e r v a t i v e . V o x S a n g 4 6 2 3 1 8 , 1 9 8 4 C a r o t h e r s M , C o u t o C G , W a r d H , W e l l m a n M , C r i s p M S , J a c o b s R M : A m i c r o - E L I S A p r o c e d u r e f o r p l a t e l e t - a s s o c i a t e d I g G . P r o c 1 3 t h a n n V e t C a n c e r S o c m e e t i n g , 1 9 9 3 , p 1 4 9 F u j i s a w a K , T a n i P , O ’ T o o l e T E , G i n s b e r g M H , M c M i l l a n . R 2 D i f f e r e n t s p e c i fi c i t i e s o f p l a t e l e t - a s s o c i a t e d a n d p l a s m a a u t o a n t i b o d i e s t o p l a t e l e t G P I I b - L I I a i n p a t i e n t s w i t h c h r o n i c i m m u n e t h r o m b o c y t O p e n i c p u r p u r a . B l o o d 7 9 2 1 4 4 1 , 1 9 9 2 F u j i s a w a K , O ’ T o o l e T E , T a n i P , L o f t u s J C , P l o w E F , G i n s b e r g M H , M c M i l l a n R 2 A u t o a n t i b o d i e s t o t h e p r e s u m p t i v e c y t o p l a s m i c d o m a i n o f p l a t e l e t g l y c 0 p r o t e i n I I I a i n p a t i e n t s w i t h c h r o n i c i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B l o o d 7 7 2 2 2 0 7 , 1 9 9 1 A l a r c o n - S e g o v i a D , R u i z - A r g u e l l e s A , F i s h b e i n E : A n t i b o d y p e n e t r a t i o n i n t o l i v i n g c e l l s . I . I n t r a n u c l e a r i m m u n o g l o b u l i n i n p e r i p h e r a l b l o o d m o n o n u c l e a r c e l l s i n m i x e d c o n n e c t i v e t i s s u e d i s e a s e a n d s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s . C l i n E x p I m m u n o l 3 5 2 3 6 4 , 1 9 7 9 5 1 2 . 5 1 3 . 5 1 4 . 5 1 5 . 5 1 6 . 5 1 7 . 5 1 8 . 5 1 9 . 5 2 0 . 5 2 1 . 5 2 2 . 5 2 3 . 2 0 8 P f u e l l e r S L , F i r k i n B G , M c G r a t h K M , L o g a n D : A n a l y s i s o f i m m u n o g l o b u l i n s t h a t b i n d t o p l a t e l e t s f r o m s e r u m o f p a t i e n t s w i t h i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a : M o l e c u l a r w e i g h t d i s t r i b u t i o n . T h r o m b R e s 4 7 2 3 0 5 , 1 9 8 7 H y m e s K , S h u l m a n S , K a r p a t k i n S : A s o l i d - p h a s e r a d i o i r n m u n o a s s a y f o r b o u n d a n t i - p l a t e l e t a n t i b o d y : S t u d i e s o n 4 5 p a t i e n t s w i t h a u t o i m m u n e p l a t e l e t d i s o r d e r s . J L a b C l i n M e d 9 4 2 6 3 9 , 1 9 7 9 G o d i n g J W 2 U s e o f s t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n A a s a n i m m u n o l o g i c a l r e a g e n t . J I n u n u n o l M e t h o d s 2 0 2 2 4 1 , 1 9 7 8 H o r s e w o o d P , H a y w a r d C P , W a r k e n t i n T E , K e l t o n J G : I n v e s t i g a t i o n o f t h e m e c h a n i s m s o f m o n o c l o n a l a n t i b o d y - i n d u c e d p l a t e l e t a c t i v a t i o n . B l o o d 7 8 2 1 0 1 9 , 1 9 9 1 G e o r g e J N 2 P l a t e l e t i m m u n o g l o b u l i n G : I t s s i g n i fi c a n c e f o r t h e e v a l u a t i o n o f t h r o m b o c y t o p e n i a a n d f o r u n d e r s t a n d i n g t h e o r i g i n o f a - g r a n u l e p r o t e i n s . B l o o d 7 6 2 8 5 9 , 1 9 9 0 G e o r g e J N , S a u c e r m a n S : P l a t e l e t I g G , I g A , I g M , a n d a l b u m i n : C o r r e l a t i o n o f p l a t e l e t a n d p l a s m a c o n c e n t r a t i o n s i n n o r m a l s u b j e c t s a n d i n p a t i e n t s w i t h I T P o r d y s p r o t e i n e m i a . B l o o d 7 2 2 3 6 2 , 1 9 8 8 H a n d a g a m a P , S c a r b o r o u g h R M , S h u m a n M A , B a i n t o n D F : E n d o c y t o s i s o f fi b r i n o g e n i n t o m e g a k a r y o c y t e a n d p l a t e l e t a - g r a n u l e s i s m e d i a t e d b y ( r u b / 3 3 ( g l y c o p r o t e i n I I b - I I I a ) . B l o o d 8 2 2 1 3 5 , 1 9 9 3 H a t t o r i A , S o g a N , M i t o M , K o i k e T , S h i b a t a A : S t r e s s p l a t e l e t s i n n o r m a l i n d i v i d u a l s a n d p a t i e n t s w i t h i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B l o o d C e l l s 1 8 2 2 8 1 , 1 9 9 2 H o l r n e S , H e a t o n A , K u n c h u b a A , H a r t m a n P 2 I n c r e a s e d l e v e l s o f p l a t e l e t a s s o c i a t e d I g G i n p a t i e n t s w i t h t h r o m b o c y t o p e n i a a r e n o t c o n fi n e d t o a n y p a r t i c u l a r s i z e c l a s s o f p l a t e l e t s . B r i t J H a e m a t 6 8 2 4 3 1 , 1 9 8 8 H e d g e U M , P o w e l l D K , B o w e s A , G o r d o n - S m i t h E C : E n z y m e l i n k e d i m m u n o a s - s a y f o r t h e d e t e c t i o n o f p l a t e l e t a s s o c i a t e d I g G . B r i t J H a e m a t 4 8 : 3 9 , 1 9 8 1 L e i s s i n g e r C A , S t u c k e y W J 2 U n b o u n d i m m u n o g l o b u l i n s a r e a m a j o r s o u r c e o f e r r o r i n t h e q u a n t i t a t i o n o f p l a t e l e t s u r f a c e - b o u n d i r n u n o g l o b u l i n l e v e l s . T r a n s f u s i o n 3 2 2 1 5 7 , 1 9 9 2 H e i l m a n n E , H y n e s L A , F r i e s e P , G e o r g e J N , B u r s t e i n S A , D a l e G L 2 D o g p l a t e l e t s a c c u m u l a t e i n t r a c e l l u l a r fi b r i n o g e n a s t h e y a g e . J C e l l P h y s i o l 1 6 1 2 2 3 , 1 9 9 4 5 2 4 . 5 2 5 . 5 2 6 . 5 2 7 . 5 2 8 . 5 2 9 . 5 3 0 . 5 3 1 . 5 3 2 . 5 3 3 . 5 3 4 . 5 3 5 . 5 3 6 . 2 0 9 M e z z a n o D , d e l P i n o G E , M o n t e s i n o s M , G a r c i a M E , A r a n d a E , F o r a d o r i A : P l a t e l e t 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e i n c r e a s e s w i t h p l a t e l e t a g e i n d o g s . T h r o m b H a e m o s t 6 6 2 2 5 4 , 1 9 9 1 J a i n N C , K o n o M S : T h e p l a t e l e t f a c t o r - 3 t e s t f o r d e t e c t i o n o f c a n i n e a n t i p l a t e l e t a n t i b o d y . V e t C l i n P a t h 9 : 1 0 , 1 9 8 0 K a r p a t k i n M , S i s k i n d G W , K a r p a t k i n S : T h e p l a t e l e t f a c t o r 3 i m m u n o i n j u r y t e c h n i q u e r e - e v a l u a t e d . D e v e l o p m e n t o f a r a p i d t e s t f o r a n t i p l a t e l e t a n t i b o d y . D e t e c t i o n i n v a r i o u s c l i n i c a l d i s o r d e r s , i n c l u d i n g i m m u n o l o g i c d r u g - i n d u c e d a n d n e o n a t a l t h r o m b o c y t o p e n i a s . J L a b C l i n M e d 8 9 2 4 0 0 , 1 9 7 7 D o d d s W J 2 A n i m a l m o d e l o f h u m a n d i s e a s e . A m J P a t h o l 8 6 2 4 8 9 , 1 9 7 7 S l a p p e n d e l R J : I n t e r p r e t a t i o n o f t e s t s f o r i m m u n e - m e d i a t e d b l o o d d i s e a s e s , i n K i r k R W ( e d ) : C u r r e n t V e t e r i n a r y T h e r a p y I X . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 8 6 , p 4 9 8 B o y l e M D P , R e i s K J : B a c t e r i a l F c r e c e p t o r s . B i o / t e c h n o l o g y 5 2 6 9 7 , 1 9 8 7 B j o r k I , P e t e r s s o n B - A , S j o q u i s t J 2 S o m e p h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f p r o t e i n A f r o m S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s . E u r J B i o c h e m 2 9 2 5 7 9 , 1 9 7 2 K r o n v a l l G , Q u i e P G , W i l l i a m s R C J 2 Q u a n t i t a t i o n o f s t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n A : D e t e r m i n a t i o n o f e q u i l i b r i u m c o n s t a n t a n d n u m b e r o f p r o t e i n A r e s i d u e s o n b a c t e r i a . J I m m u n o l 1 0 4 2 2 7 3 , 1 9 7 0 D e i s e n h o f e r J 2 C r y s t a l l o g r a p h i c r e fi n e m e n t a n d a t o m i c m o d e l s o f a h u m a n F c f r a g m e n t a n d i t s c o m p l e x w i t h f r a g m e n t B o f p r o t e i n A f r o m S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s a t 2 . 9 - a n d 2 . 8 - A r e s o l u t i o n . B i o c h e m 2 0 2 2 3 6 1 , 1 9 8 1 W a r r G W , H a r t I R : B i n d i n g o f c a n i n e I g M a n d I g G t o p r o t e i n A o f S t a p h y l o c o c - c u s a u r e u s : A s i m p l e m e t h o d f o r t h e i s o l a t i o n o f c a n i n e i m m u n o g l o b u l i n s f r o m s e r u m a n d t h e l y m p h o c y t e s u r f a c e . A m J V e t R e s 4 0 2 9 2 2 , 1 9 7 9 P e n g Z , S i r n o n s F E R , B e c k e r A B : D i f f e r e n t i a l b i n d i n g p r o p e r t i e s o f p r o t e i n A a n d p r o t e i n G f o r d o g i m m u n o g l o b u l i n s . J I m m u n o l M e t h o d s 1 4 5 2 2 5 5 , 1 9 9 1 G o u d s w a a r d J , V a n D e r D o n k J A , N o o r d z i j A , V a n D a m R H , V a e r m a n J - P : P r o t e i n A r e a c t i v i t y o f v a r i o u s m a m m a l i a n i m m u n o g l o b u l i n s . S c a n d J I m m u n o l 8 2 2 1 , 1 9 7 8 L i n d m a r k R , T h o r é n — T o l l i n g K , S j 6 q u i s t J : B i n d i n g o f i m m u n o g l o b u l i n s t o p r o t e i n A a n d i m m u n o g l o b u l i n l e v e l s i n m a m m a l i a n s e r a . J I m m u n o l M e t h o d s 6 2 2 1 , 1 9 8 3 5 3 7 . 5 3 8 . 5 3 9 . 5 4 0 . 5 4 1 . 5 4 2 . 2 1 0 T h i e m P A , M o r o f f S , M c G r a t h J P , B l o o m J C 2 P r e l i m i n a r y fi n d i n g s o n t h e c o m p a r i s o n o f fl o w c y t o m e t r i c a n d s o l i d - p h a s e r a d i o i m m u n o a s s a y t e c h n i q u e s f o r t h e d e t e c t i o n o f s e r u m a n t i p l a t e l e t a n t i b o d i e s i n d o g s . V e t C l i n P a t h 2 0 2 1 8 , 1 9 9 1 B r e i t s c h w e r d t E B , W a l k e r D H , L e v y M G , B u r g d o r f e r W , C o r b e t t W T , H u r l b e r t S A , S t e b b i n s M E , C u r t i s B C , A l l e n D A : C l i n i c a l , h e m a t o l o g i c , a n d h u m o r a l i m m u n e r e s p o n s e i n f e m a l e d o g s i n o c u l a t e d w i t h R i c k e t t s i a r i c k e t t s i i a n d R i c k e t t s i a m o n t a n a . A m J V e t R e s 4 9 : 7 0 , 1 9 8 8 C h o n g B H , P i l g r i m R L , C o o l e y M A , C h e s t e r m a n C N : I n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f p l a t e l e t I g G F c r e c e p t o r s i n i m m u n e h e p a r i n - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a . B l o o d 8 1 2 9 8 8 , 1 9 9 3 C o p l e y A L , R o b b T P : S t u d i e s o f p l a t e l e t s I I . T h e e f f e c t o f h e p a r i n i n v i v o o n t h e p l a t e l e t c o u n t i n m i c e a n d d o g s . N E n g l J M e d 1 2 2 5 6 3 , 1 9 4 8 Q u i c k A J , S h a n b e r g e J N , S t e f a n i n i M 2 T h e e f f e c t o f h e p a r i n o n p l a t e l e t s i n v i v o . J L a b C l i n M e d 3 3 2 1 4 2 4 , 1 9 4 8 F i d l a r E , J a q u e s L B : T h e e f f e c t o f c o m m e r c i a l h e p a r i n o n t h e p l a t e l e t c o u n t . J L a b C l i n M e d 3 3 2 1 4 1 0 , 1 9 4 8 M I C H I G A N s m T E U N I V . L I B R R R I E S i l l W “ ” 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 W W I l H l l l ‘ l l l m l H l H l l 3 1 2 9 3 0 1 4 2 1 7 3 3 9 . a : o n 3 . 1 . 3 . 5 . A : I . . . I . . . ( . L l E v . l . : . 1 ’ . 4 3 . 1 . . 1 4 . . . . . x ? 3 1 . J I : 2 : 1 : n a : 2 . 1 . . , . . . x : : l . l . u . . h ‘ .. l fl l . 1 é . . . . u m d i . . l . . . u . . . ‘ . ; . . . } r L n v . . i . . L 1 4 { ' W d w fi t 1‘; . . . ‘ t 5 l 1 i t 3 h - o t t u r « . 5 ; . . ” . . 3 3 . . . x & l : 4 . . 3 I l , 9 , " f ! : 5 3 z ’ ” m m : m 3 H u I m A G u N m 2 1 S m 9 T m 3 T A m E m 0 N u U ; 1 W u 4 R E i 2 m S 1 T m Y r L m 7 l m 3 i m B fi ’ 4 ‘ A z 7 ‘ v \ " f - _ 4 4 k ~ — — ~ — - _ _ _ r T H E S I S u v , . , a ) L I B R A R Y M l c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y P T L o A D C V A E O A I I T N D R F E I E T N D U E R S U N r E B e t u O r X n o t n o m r o a b a t D A T t o n n E h d D o u t i s u c o h d e u c o k . U E m D m A y o T u E r r o c o r d D U . E _ _ u s u I s A n N fl m n t t v o A c t t o N E q u l l o p p o m n n y u W m a w o n n n a - w 1 N M U E - T A S S A Y D E W L O P M ] D O C T O R O F P H I L O S O P H Y I M M U N E - M E D I A T E D T H R O M B O C Y T O P E N I A I N D O G S : A S S A Y D E V E L O P M E N T , A R O L E F O R C O M P L E M E N T , A N D A S S E S S M E N T I N A T O X I C O L O G I C S T U D Y V o l u m e I I B y M i c h a e l A . S c o t t A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D e p a r t m e n t o f P a t h o l o g y 1 9 9 5 S T I P H I I O C O C . m : S u p t } m m } . : s c e n e s . m a l t _;::;;a:1-3n p r o c e d u r : “ n r g l o b m u n g u r e p 2 1 : 5 a s 3 3 - I ~ t a 3 2 5 * . - - a a D n a ; ‘ m ‘ i i n s u t x o e m o f 1 9 C c a n i mA ' 9 . . . “ at . n g . . . a n t i b o d i e s . . ‘ 3 5 C h r o m a . -o s r a ‘ “ w W - a d n t t U O \ m ' \ r f h e d 1 9 ‘ 3 - “ . y ) M “ l l C H A P T E R 1 S T A P H Y L O C O C C A L P R O T E I N A B I N D I N G T O C A N I N E I g G A N D I g M A b s t r a c t ‘ S t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n A ( S p A ) b i n d s w i t h h i g h a f fi n i t y t o i m m u n o g l o b u l i n s f r o m m a n y s p e c i e s , m a k i n g i t a u s e f u l r e a g e n t f o r i r n m u n o a s s a y s a n d i m m u n o g l o b u l i n p u r i fi c a t i o n p r o c e d u r e s . H o w e v e r , i t s u s e i s l i m i t e d b y p o o r r e a c t i v i t y w i t h s o m e i m m u n o g l o b u l i n s u b c l a s s e s , i n c l u d i n g h u m a n I g G 3 a n d m u r i n e I g G l . T o c l a r i f y c o n fl i c t i n g r e p o r t s o f S p A ’ s r e a c t i v i t y w i t h c a n i n e i m m u n o g l o b u l i n s , w e e v a l u a t e d t h e b i n d i n g o f c a n i n e I g G a n d I g M t o C o w a n I s t r a i n S p A . I g G a n d I g M w e r e p u r i fi e d f r o m p o o l e d n o r m a l c a n i n e p l a s m a b y a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y w i t h p o l y c l o n a l a n t i - I g G a n d a n t i - I g M a n t i b o d i e s . T h e p u r i fi e d I g G a n d I g M w e r e a s s e s s e d f o r S p A r e a c t i v i t y b y a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y u s i n g a S p A - a g a r o s e c o l u m n . T h e r e l a t i v e p r o p o r t i o n s o f t o t a l c h r o m a t o g r a p h e d I g G o r I g M i n t h e fl o w - t h r o u g h ( S p A - n o n b i n d a b l e ) a n d e l u a t e ( S p A - b i n d a b l e ) f r a c t i o n s w e r e d e t e r m i n e d b y a b s o r b a n c e a t 2 8 0 n m o r b y d e n s i t o m e t r y o f p r o t e i n b a n d s o n S D S - P A G E g e l s . T h e I g G a n d I g M i n e a c h i m m u n o g l o b u l i n f r a c t i o n w e r e a l s o n o n s p e c i fi c a l l y a d s o r b e d t o m i c r o t i t r a t i o n p l a t e s a n d t e s t e d f o r r e a c t i v i t y w i t h 1 2 5 I - S p A u s i n g a s o l i d p h a s e i m m u n o r a d i o m e t r i c a s s a y ( I R M A ) . A p p r o x i m a t e l y 2 0 % o f c a n i n e I g G a n d 3 3 % o f c a n i n e I g M d i d n o t b i n d t o t h e S p A a f fi n i t y c o l u m n a n d w e r e 2 1 1 : 5.5; u c i n 5.5..» 1;“ e w i t h m m ' ‘ 1 the 5 5' _ m .. m b . u l lIlS f r o m 5 .Nufgyi'illllil'l c l a s s ~ 5 p « w . [(5 d e t e c t 0 r p m 5:55 ‘1 J i m ~ ‘ 55:15 t o h u m a n I m t b i n d i n g s p e c $731 of M E G W n . l u m d u c t i o n S a p h t o c o c c a l p r I t : 3 : f o u n d o n t h c ‘ 5 5 2 : 5 b n d i n g ‘ t o C H 2 2 : 5 h a m a d e i t a u s e r : L 1 5 5 5 1 h a b e e n a m u m o f S p A r c l a l c 3 i p a m c u l u a p p i l t a t n ” s “ . 1 1 5 M i d , S p A h a Q b e v x 2 1 2 a l s o u n r e a c t i v e w i t h 1 2 5 I - S p A u s i n g t h e I R M A . I n c o m p l e t e r e a c t i v i t y o f S p A w i t h c a n i n e I g G a n d I g M l i m i t s t h e u s e f u l n e s s o f S p A i n c a n i n e i m m u n o l o g i c p r o c e d u r e s . I n t r o d u c t i o n S t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n A ( S p A ) i s a 4 2 k D b a c t e r i a l t y p e I F c r e c e p t o r s e c r e t e d f r o m , o r f o u n d o n t h e s u r f a c e o f , m o s t s t r a i n s o f S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s . " 3 I t s h i g h a f fi n i t y b i n d i n g 4 t o C H 2 a n d C H 3 d e t e r m i n a n t s " o n t h e F c p o r t i o n o f I g G f r o m m a n y s p e - c i e s " 6 h a s m a d e i t a u s e f u l i m m u n o g l o b u l i n d e t e c t o r i n a w i d e v a r i e t y o f i m m u n o a s s a y s . L i k e w i s e , i t h a s b e e n u s e f u l i n i m m u n o g l o b u l i n p u r i fi c a t i o n p r o c e d u r e s . T h e m a j o r l i m i t a t i o n s o f S p A r e l a t e t o e i t h e r t o o b r o a d o r t o o n a r r o w a s p e c t r u m o f r e a c t i v i t y f o r t h e p a r t i c u l a r a p p l i c a t i o n o f i n t e r e s t . B e c a u s e S p A r e a c t s w i t h s o m e n o n - I g G i m m u n o g l o b u l i n s f r o m s e v e r a l s p e c i e s , 6 i t s b r e a d t h o f r e a c t i v i t y i s t o o g r e a t w h e n i m m u n o g l o b u l i n c l a s s — s p e c i fi c i n t e r a c t i o n s a r e d e s i r e d . I t s r e a c t i v i t y i s t o o n a r r o w , h o w e v e r , t o d e t e c t o r p u r i f y a l l I g G s u b c l a s s e s i n s o m e s p e c i e s ; f o r e x a m p l e , S p A d o e s n o t b i n d w e l l t o h u m a n I g G 3 a n d m u r i n e I g G l . 2 T h e b i n d i n g s p e c t r u m o f S p A t o c a n i n e i m m u n o g l o b u l i n s h a s n o t b e e n c l e a r l y e s t a b l i s h e d . S p A h a s b e e n r e p o r t e d t o b i n d f r o m 6 7 7 t o e s s e n t i a l l y 1 0 0 % “ ' 9 o f c a n i n e I g G , a n d f r o m 3 6 7 t o 9 0 % “ 9 o f c a n i n e I g M . R e p o r t s 1 0 t h a t S p A h a s n o r e a c t i v i t y w i t h c a n i n e I g M , a n d t h a t S p A - S e p h a r o s e c a n b e u s e d t o o b t a i n p u r e c a n i n e I g G , c o n fl i c t w i t h m o s t fi n d i n g s . W h i l e u s i n g S p A - S e p h a r o s e t o p u r i f y c a n i n e I g G , i t a p p e a r e d t h a t a s i g n i fi c a n t a m o u n t o f t h e I g G w o u l d n o t b i n d t o S p A . T h e s e r e s u l t s w e r e c o n t r a r y t o t h e m o s t r e c e n t r e p o r t s o f t h e S p A - b i n d a b i l i t y o f c a n i n e I g G . 8 ' 9 C o n s e q u e n t l y , t o c l a r i f y t h e s e C a m e 1 5 1 6 a 5 5 5 1 ? . : m t m g i n r i a p n m u y m 5 5 a i s l ; 5 5 : 5 3 : 5 3 i n t h e o 2 “ . .. no.1. > n g a f r a c n n m i l : s z z z c t n g o b s e n a z z o . 5 w 4 - . ” « d i s ' . . ; : r _ : . : n . n . \ a w e } : M e t h o d s . _ . , fi f t h } : . . » . ' . m i n e d b k a } l i a r ) . . . 5 ' : a . 1 I L L Q I ‘ A s h e ; L “ B e d [ 0 C V a ‘ a u a t : . . Q A . ‘ K M y . “ ~ . 8 “ : I . \ A “ . - [ m B 5 4 . “ I n 7 7 : 3 5 . ‘ o m p a m 5 7 . 5 5 ” I m a m ‘ . ‘ ( g . 2 1 3 c o n fl i c t i n g o b s e r v a t i o n s , w e i n v e s t i g a t e d t h e b i n d i n g o f c a n i n e I g G a n d I g M t o c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e S p A ( C o w a n I s t r a i n ) u s i n g a f fi n i t y c o l u m n a n d s o l i d s t a t e s y s t e m s . M e t h o d s C a n i n e I g G a n d I g M w e r e p u r i fi e d f r o m p o o l e d c i t r a t e d p l a s m a b y a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y w i t h p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s . T h e S p A - r e a c t i v i t y o f e a c h p u r i fi e d i m m u n o g l o b u l i n w a s a s s e s s e d b y S p A a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y . T h e r e l a t i v e a m o u n t s o f p r o t e i n i n t h e c o l u m n fl o w t h r o u g h s ( n o n S p A - b i n d i n g ) a n d e l u a t e s ( S p A - b i n d i n g ) w e r e d e t e r m i n e d b y a b s o r b a n c e a t 2 8 0 n m o r b y d e n s i t o m e t r y o f p r o t e i n b a n d s o n s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( S D S - P A G E ) g e l s . S D S - P A G E w a s a l s o u s e d t o e v a l u a t e i m m u n o g l o b u l i n p u r i t y . A d d i t i o n a l l y , t h e b i n d i n g o f fl o w t h r o u g h a n d e l u a t e f r a c t i o n s t o S p A w a s a s s e s s e d w i t h a s o l i d p h a s e a s s a y s i m i l a r t o i m m u n o - r a d i o m e t r i c a s s a y s f o r c e l l - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n . A fl i n i t y c o l u m n s T h r e e i m m u n o g l o b u l i n a f fi n i t y c o l u m n s w e r e p r e p a r e d w i t h t h e A f fi - G e l R H z H y d r a z i d e G e l s y s t e m ( B i o - R a d L a b o r a t o r i e s , R i c h m o n d , C A ) , o n e e a c h w i t h : l ) a p o l y c l o n a l r a b b i t a n t i - [ c a n i n e I g G ( w h o l e m o l e c u l e ) ] a n t i b o d y ( r a b b i t a n t i - G ) ( S i g m a C h e m i c a l C o m p a n y , S t . L o u i s , M O ) ; 2 ) a n a f fi n i t y p u r i fi e d p o l y c l o n a l g o a t a n t i - [ c a n i n e I g G ( ' y ) ] a n t i b o d y ( g o a t a n t i - 7 ) ( K i r k e g a a r d a n d P e r r y L a b o r a t o r i e s , I n c . , G a i t h e r s b u r g , M D ) ; a n d 3 ) a n a f fi n i t y p u r i fi e d p o l y c l o n a l g o a t a n t i - [ c a n i n e I g M ( u ) ] a n t i b o d y ( g o a t a n t i - “ ) ( K i r k e g a a r d a n d P e r r y L a b o r a t o r i e s , I n c . , G a i t h e r s b u r g , M D ) . S p e c i fi c a l l y , 2 o r 3 5 : 1 3 5 : 3 1 : s o l u t i o n i 2 0 8 i i i 15:13.; c o n c e n t r a t i o n 0'5 2 ; ; i s h i to r at 4 ~55; : 5 m 9 c r a m r e W i t h C 1 t i n . T h e 8 1 1 1 ” ? “ 5 ‘ Iggazion b u f f e r C o r i n g c f ‘ f i c i c n c } W i t * 1 W E " t x z t o g l o h u h n b o u n d p T h e S p A a f t ‘ i n x u 1 5 : 1 2 : 2 5 l i n k e d t o c r m k i n I g G w a s 3 0 2 5 S t a t e n [ W P H 8 . 0 1 z ; o f a f i m h i s o l a t e d . a t 3 : 3 : b u f f e r 5 5 0 m M . 5 ‘ h i . ’ i e r “ o \ c r r g h : “ r i h i i n t h e d a r k a t r ‘ 1 1 } ? ! j O b u ” ( ” " 9 “ n fi fi t a P i a : . m a , “ a S P Q O k 2 1 4 m g o f a f fi n i t y i s o l a t e d , a n t i g e n - s p e c i fi c i m m u n o g l o b u l i n w e r e r e s u s p e n d e d i n 1 o r 2 m l c o u p l i n g b u f f e r ( 5 0 m M a c e t a t e , 1 5 0 m M N a C l , p H 5 . 5 ) a n d d i a l y z e d a g a i n s t 6 l i t e r s o f c o u p l i n g b u f f e r o v e r n i g h t a t 4 ° C . T h e i m m u n o g l o b u l i n w a s t h e n o x i d i z e d b y i n c u b a t i o n f o r 1 h r i n t h e d a r k a t r o o m t e m p e r a t u r e w i t h a 1 / 1 0 v o l u m e o f f r e s h s t o c k s o d i u m p e r i o d a t e s o l u t i o n ( 2 0 . 8 m g / m l ) . T h i s r e a c t i o n w a s s t o p p e d w i t h t h e a d d i t i o n o f g l y c e r o l t o a fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f 2 0 m M , a n d t h e p e r i o d a t e w a s r e m o v e d b y o v e r n i g h t d i a l y s i s i n c o u p l i n g b u f f e r a t 4 ° C . T h e o x i d i z e d i m m u n o g l o b u l i n w a s i n c u b a t e d o v e r n i g h t a t r o o m t e m p e r a t u r e w i t h 1 m l A f fi - G e l R t h a t h a d b e e n t h o r o u g h l y w a s h e d i n c o u p l i n g b u f f e r . T h e s l u r r y w a s t h e n t r a n s f e r r e d t o a c o l u m n a t 4 ° C a n d e q u i l i b r a t e d w i t h a p p l i c a t i o n b u f f e r ( p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e w i t h 0 . 0 2 5 % N a N 3 ( P B S ) , p H 7 . 2 ) . C o u p l i n g e f fi c i e n c y r a n g e d f r o m 7 1 t o 7 7 % f o r t h e t h r e e c o l u m n s , w i t h 0 . 9 t o 1 . 8 m g i m m u n o g l o b u l i n b o u n d p e r c o l u m n . T h e S p A a f fi n i t y c o l u m n w a s a 1 . 5 m l c o l u m n o f C o w a n I s t r a i n p r o t e i n A c o v a l e n t l y l i n k e d t o c r o s s - l i n k e d 4 % b e a d e d a g a r o s e ( S i g m a ) . I t s b i n d i n g c a p a c i t y f o r h u m a n I g G w a s 2 0 - 2 5 m g / m l . I t w a s e q u i l i b r a t e d i n P B S , p H 7 . 2 f o r t h e a n t i - G c o l u m n e x p e r i m e n t a n d p H 8 . 0 f o r t h e a n t i - 7 a n d a n t i - u c o l u m n e x p e r i m e n t s . I m m u n o g l o b u l i n p u r i fi c a t i o n P l a s m a w a s p o o l e d f r o m c i t r a t e d b l o o d s a m p l e s o f e i t h e r 4 o r 1 0 ( a n t i - G c o l u m n ) c l i n i c a l l y h e a l t h y d o g s , h a l f o f e a c h s e x , a n d e a c h o f a d i f f e r e n t b r e e d . A l i q u o t s o f t h e p o o l e d p l a s m a w e r e i n c u b a t e d i n t h e c o l u m n s f o r 1 5 m i n b e f o r e a l l o w i n g a l l n o n b o u n d m a t e r i a l t o fl o w t h r o u g h . B o u n d i m m u n o g l o b u l i n w a s e l u t e d w i t h P B S , p H 3 . 0 , a n d t h e p H o f e a c h e l u a t e w a s i m m e d i a t e l y a d j u s t e d t o 7 . 2 w i t h 0 . 1 M N a O H . M u l t i p l e e l u a t e s - - W i n s 4 ' . i n 5 5 . 5 5 : 5 . 6 3 a n C d a n - t r i i p ’ s 1 . 1 . 3 1 n ‘ . : n n c h r o m r t ' i z ’ n i n S “ h 8 o ' w 0 ‘ : e x ' p ” A t n “ , m “ . Z i o n 4 . . A ( a c r e 1 0 P - . L ( a n d l e s s t h a n ? . i o r 1 h r a t - . 1 3 1 1 5515 c o l l e c t e d . fi s h : o n i f ? C i u a t e p -.....:.azely a d i u s z e d * I a n d 3 1 1 1 1 1 1 5 3 : 3 5 i s m u l t i p l e c i t i e s o r . m u s t b y t e n - n t h ; I t : F o r t h e a n t i - G e ‘ i i 7 : 2 3 ; : : 1 0 : C a n d 1 t h . i : f P B S . p H " 1 . 1 0 a c t 3 c c ; ' 5 M ~ « a . . ‘ ~ . L l _ ? ' 4 5 . 1 3 1 0 s . . . 5 ‘ 1 K ‘ 9 1 " “ U “ “ " o u c h - x i . t S i 3 3 9 » . “ r 5 , k t . “ ‘ " ' p “ l " 1 0 m € ’ e r ‘ ' 3 1 . ? “ « a s . 2 1 5 f r o m m u l t i p l e c y c l e s o n e a c h c o l u m n w e r e p o o l e d a n d t h e i m m u n o g l o b u l i n s w e r e c o n c e n t r a t e d b y c e n t r i f u g a t i o n i n C e n t r i p r e p - I O c o n c e n t r a t o r s ( A m i c o n I n c . , B e v e r l y , M A ) . F o r t h e a n t i - G e l u a t e , t h e c o n c e n t r a t e d I g G w a s d i a l y z e d i n 6 l i t e r s o f w a t e r o v e r n i g h t a t 1 0 ° C a n d t h e n l y o p h i l y z e d . T h e l y o p h i l y z e d p r o t e i n w a s r e s u s p e n d e d i n 3 0 0 p l o f P B S , p H 7 . 2 , t o a c o n c e n t r a t i o n o f 9 . 3 2 m g / m l . T h e a n t i - 7 I g G a n d t h e I g M w e r e c o n c e n t r a t e d i n C e n t r i p r e p - I O a n d C e n t r i c o n - l O O c o n c e n t r a t o r s ( A m i c o n I n c . , B e v e r l y , M A ) t o 5 . 6 3 a n d 1 . 3 1 m g / m l , r e s p e c t i v e l y . S p A a fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y I n s e p a r a t e e x p e r i m e n t s , c a r e f u l l y m e a s u r e d v o l u m e s o f e a c h i m m u n o g l o b u l i n p r e p a r a t i o n w e r e l o a d e d o n t o t h e S p A - a g a r o s e a f fi n i t y c o l u m n a t l e s s t h a n 1 / 3 t h e b e d v o l u m e a n d l e s s t h a n 1 / 1 0 t h e c o l u m n ’ s b i n d i n g c a p a c i t y f o r h u m a n I g G . A f t e r i n c u b a t i o n f o r 1 h r a t 4 ° C , a p p l i c a t i o n b u f f e r w a s a l l o w e d t o fl o w a n d t h e e n t i r e fl o w t h r o u g h w a s c o l l e c t e d . T h e b o u n d i m m u n o g l o b u l i n w a s t h e n e l u t e d w i t h P B S , p H 3 . 0 , a n d t h e e n t i r e e l u a t e p e a k w a s c o l l e c t e d i n a s i n g l e f r a c t i o n . T h e p H o f t h e e l u a t e w a s i m m e d i a t e l y a d j u s t e d t o 7 . 2 w i t h N a O H . T h e a b s o r b a n c e ( 2 8 0 n m ) o f e a c h u n c o n c e n - t r a t e d fl o w t h r o u g h , e l u a t e , a n d p r e - S p A f r a c t i o n w a s t h e n m e a s u r e d i n d u p l i c a t e w i t h a s p e c t r o p h o t o m e t e r ( P e r k i n E l m e r ) t o e s t i m a t e t h e p r o t e i n r e c o v e r y . T h e e l u a t e s f r o m t h e a n t i - 7 a n d a n t i - u c o l u m n s w e r e n e a r l y p u r e , s o t h e a b s o r b a n c e s a t 2 8 0 n m p r o v i d e d a r e l i a b l e m e a s u r e o f t h e r e l a t i v e a m o u n t s o f p r o t e i n i n t h e 3 s a m p l e s f r o m t h e s e 2 c o l u m n s . ! ! i t n : p d 5 5 8 u c F I g G a D e ‘ r . e i x e i h t t h e S f s I g G i e d i n l i n e a r r r a n g e d r : 5 r l t a o e o n r o m f e l n 5 o r e a d “ D 5 S : m 5 5 5 . 2 e 3 e E 5 e 2 " 3 e 1 5 3 u n d e - P A G 7 . o f E L u o e a n 5 5 3 . b a t n h e d s : : a n o u n t i 3 : 5 2 : 3 1 3 : ' 5 e 5 t 5 c u o i n e t e p t r h h e c o u l d e n s i t o m 9 5 ; " , P f i o e a i - S p d A a n d c a ‘ l l h h e m e u l a t u o i p e t o f m e i t n ; . t i l e s 0 f fi g u ‘ . . 1 . a 4 . . 1 " 9 \5 ! 5 5 5 t h e “ ‘ 5 5 b 5 a 5 . d m fi i n d s t t o M u g h art“ anticloh . - uli ' r 'ea L a m " 2 . 5 . 5 ; p a 2 1 6 S D S - P A G E a n d d e n s i t o m e t r y P r e - S p A a n d p o s t - S p A i m m u n o g l o b u l i n s f r a c t i o n s w e r e a s s e s s e d f o r p u r i t y b y S D S — P A G E u n d e r r e d u c i n g a n d n o n r e d u c i n g c o n d i t i o n s u s i n g t h e d i s c o n t i n u o u s b u f f e r s y s t e m o f L a e m m l i . “ F o r t h e e x p e r i m e n t u s i n g t h e a n t i - G e l u a t e , t h e r e w a s s i g n i fi c a n t c o n t a m i n a t i o n o f t h e I g G b y I g M . C o n s e q u e n t l y , a b s o r b a n c e r e a d i n g s c o u l d n o t b e u s e d t o a s s e s s t h e r e l a t i v e a m o u n t s o f S p A - b i n d a b l e a n d S p A - n o n b i n d a b l e I g G . I n s t e a d , p r o t e i n b a n d s o n t h e S D S - P A G E g e l s w e r e a s s e s s e d d e n s i t o m e t r i c a l l y t o d e t e r m i n e t h e r e l a t i v e a m o u n t s o f I g G i n e a c h f r a c t i o n . T o t h i s e n d , fl o w t h r o u g h a n d e l u a t e f r a c t i o n s w e r e e l e c t r o p h o r e s e d i n t r i p l i c a t e l a n e s s u c h t h a t t h e C o o m a s s i e b l u e - s t a i n e d b a n d s h a d d e n s i t i e s i n t h e l i n e a r r a n g e o f t h e d e n s i t o m e t e r a t 5 9 5 n m . B y c u t t i n g t h e g e l s , t h e b a n d s w e r e r e a r r a n g e d s o t h a t t h e y c o u l d b e s c a n n e d i n t a n d e m a n d t h e d e n s i t o m e t e r ’ s c o m p u t e r c o u l d c a l c u l a t e t h e r e l a t i v e d e n s i t i e s o f e a c h b a n d . B y k n o w i n g t h e t o t a l v o l u m e s o f fl o w - t h r o u g h a n d e l u a t e , a n d t h e r e l a t i v e a m o u n t s o f I g G i n e a c h a s a s s e s s e d b y d e n s i t o m e t r y , t h e p e r c e n t a g e o f I g G i n e a c h f r a c t i o n c o u l d b e c a l c u l a t e d . T h e l i n e a r r a n g e o f t h e d e n s i t o m e t r y r e a d i n g s w a s d e t e r m i n e d b y d e n s i t o m e t r i c a l l y e v a l u a t i n g g e l s c o n t a i n i n g b a n d s o f h u m a n I g G i n i n c r e a s i n g a m o u n t s f r o m 2 t o 3 0 p g . S o l i d p h a s e a s s a y s A s o l i d p h a s e i m m u n o r a d i o m e t r i c a s s a y ( I R M A ) w a s u s e d t o a s s e s s t h e b i n d i n g o f t h e fl o w t h r o u g h a n d e l u a t e f r a c t i o n s o f t h e S p A a f fi n i t y c o l u m n t o t h e f o l l o w i n g 1 2 5 1 - l a b e l e d a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s : 1 ) S p A ( S i g m a ) ; 2 ) a p o l y c l o n a l g o a t a n t i - [ c a n i n e I g G ( 7 ) ] ( 1 2 5 I - a n t i - y ) ( K i r k e g a a r d a n d P e r r y L a b o r a t o r i e s , I n c . , G a i t h e r s b u r g , M D ) ; 3 ) a p o l y - c l o n a l g o a t a n t i - [ c a n i n e I g G l ] ( ” S I - a n t i — I g G l ) ( B e t h y l L a b o r a t o r i e s , I n c . , M o n t g o m e r y , . g 5 e : d e p o s i t e d i n t h e z e b a z i o n 5 1 t h u m i x g h n g i a ti . 1 0 h o t . N i t . 2 : 2 5 . 5 5 f r o m } 1 F 1 E 5 i : 5 2 s t e c : fi 2 5 5 t h o 5 1 q u a c a d l y u n d g e s l h a n d r i } d 1 o r b o b e - e 5 d r : a h . 3 3 5 t h a t e e 5 " f l ‘ g h t a t 4 T . A i r : 3:51 ...5 D I O J L J H E ~ " b u f f e r 1 5. 5 : w e l l s w e r e 5 5 2 1 5 I ' Ti‘i'i’; d ? a .5, b u t t e r ) . n A f t e 2 5 . 5 . 5 5 ; 4 5 a p o l y c l o n a l a i d - m l g o a t a n t i d e a n ; f i x - l a b e l e d - h 5 ‘ m o d i fi e a e a c h l o t o - 3 o . 6 a d i p h e n . . . . t . o t p r o t e i n 5 1 m 5 : " m . , m y \ 6 “ “ : 1 2 ‘ , 5 2 1 7 T e x a s ) ; 4 ) a p o l y c l o n a l g o a t a n t i - [ c a n i n e I n g ] ( ‘ fi l - a n t i - I n g ) ( B e t h y l ) ; a n d 5 ) a p o l y c l o n a l g o a t a n t i - [ c a n i n e I g M ( p ) ] ( ” S I - a n t i - p ) ( K i r k e g a a r d a n d P e r r y ) . P r o t e i n s w e r e r a d i o l a b e l e d b y m o d i fi c a t i o n s o f t h e m e t h o d o f F r a k e r a n d S p e c k . 1 2 B r i e fl y , 1 , 3 , 4 , 6 - t e t r a c h l o r o - 3 a , 6 a - d i p h e n y l g l y c o u r i l ( S i g m a ) w a s d i s s o l v e d i n d i m e t h y l c h l o r i d e a n d 0 . 6 p g w e r e d e p o s i t e d i n t h e b a s e o f a g l a s s t e s t t u b e b y e v a p o r a t i o n . T o t h i s w e r e a d d e d 2 5 p g o f p r o t e i n ( 1 m g / m l ) a n d 0 . 3 p C i i o d i n e - 1 2 5 ( N a I ) . A f t e r 1 0 - 1 5 m i n u t e s o f i n c u b a t i o n w i t h m i x i n g , t h e r a d i o l a b e l e d p r o t e i n w a s s e p a r a t e d f r o m t h e f r e e i o d i d e b y fi l t r a t i o n t h r o u g h a 1 0 m l S e p h a d e x G 2 5 fi l t r a t i o n c o l u m n ( P h a r m a c i a B i o t e c h , P i s c a t a w a y , N J ) . F l o w t h r o u g h a n d e l u a t e p r o t e i n s w e r e d i l u t e d i n P B S , p H 7 . 2 , t o 1 0 p g / m l , a n d t h e n i n s e r i a l q u a r t e r l y - d i l u t i o n s t o 2 . 5 a n d 0 . 6 2 5 p g / m l . T h e d i l u t e d p r o t e i n s w e r e t h e n n o n s p e c i fi c a l l y a d s o r b e d o n t o w e l l s o f a m i c r o t i t r a t i o n p l a t e ( I m m u l o n - 2 R e m o v a w e l l p l a t e s , D y n a t e c h L a b o r a t o r i e s , I n c . , C h a n t i l l y , V i r g i n i a ) i n t r i p l i c a t e 5 0 p l v o l u m e s o v e r n i g h t a t 4 ° C . A f t e r a d s o r p t i o n , w e l l s w e r e w a s h e d w i t h b l o c k i n g b u f f e r ( P B S c o n t a i n i n g 3 % b o v i n e s e r u m a l b u m i n a n d 0 . 5 % T w e e n , p H 7 . 2 ) a n d t h e n i n c u b a t e d w i t h 3 0 0 p l b l o c k i n g b u f f e r f o r 1 h r a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e b l o c k i n g b u f f e r w a s r e m o v e d a n d t h e w e l l s w e r e w a s h e d 3 t i m e s w i t h 3 0 0 p 1 r i n s e s o f w a s h i n g b u f f e r ( T w e e n - f r e e b l o c k i n g b u f f e r ) . A f t e r w a s h i n g , 5 0 p l P B S c o n t a i n i n g 1 0 p g o f e a c h a n t i g l o b u l i n r e a g e n t w e r e a d d e d t o e a c h s e t o f e l u a t e a n d fl o w t h r o u g h w e l l s , i n c l u d i n g b l a n k s . T h e a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s w e r e i n c u b a t e d i n t h e w e l l s f o r 1 h r a f t e r w h i c h t h e fl u i d w a s r e m o v e d a n d t h e w e l l s w e r e w a s h e d fi v e t i m e s w i t h w a s h i n g b u f f e r . E a c h w e l l w a s r e m o v e d a n d t r a n s f e r r e d t o a g a m m a c o u n t e r ( M o d e l 1 1 9 0 , T m A n a l y t i c , B e n s e n v i l l e , I L ) i . 5 : 5 s z g n t t : m 5 1 I g G m T h e ::5.:ed b y c a n t I g h l h a ' 5 5 5 t h v e I g M r 5 y 1 f a t h S S p A c o l u D c S - P u l a r A m G a n m E s s g fi 5 . . . : . » m o 5 ' l e M T i n t i n g e m . S p A c h r o n z . h x ‘ a n d ‘ I i s a t t a i n e d ‘ra‘ly pure I g G e m - n l ; 3 “ 0 i 4 : 5 5 . . l t h e m m m f t : d a m n i n g t h e p e r . E h o u n d t . R o u l t s 5 . 5 . 5 . 4 5 : B 5 S U E - P A G E . ' s 2 1 8 f o r d e t e r m i n i n g t h e p e r c e n t a g e o f a d d e d r a d i o a c t i v i t y t h a t r e m a i n e d b o u n d t o e a c h w e l l ( % b o u n d ) . R e s u l t s S D S - P A G E B y S D S - P A G E , t h e p r o d u c t o f t h e a n t i - G c o l u m n h a d p r e d o m i n a n t I g G b a n d s w i t h s i g n i fi c a n t I g M b a n d s a s w e l l . T h e p r o d u c t o f t h e a n t i - 7 c o l u m n w a s a l m o s t e n t i r e l y I g G , w i t h v e r y f a i n t I g M b a n d s . S i m i l a r l y , t h e p r o d u c t o f t h e a n t i - p c o l u m n w a s p r e d o m i n a n t l y I g M w i t h v e r y f a i n t I g G b a n d s . T h e S p A c o l u m n fl o w t h r o u g h ( F T ) a n d e l u a t e ( E ) o f t h e a n t i - G I g G w e r e a s s e s s e d b y S D S - P A G E u s i n g a 5 % g e l t o s e e i f t h e r e w a s a n y d e t e c t a b l e d i f f e r e n c e i n a p p a r e n t m o l e c u l a r m a s s e s . T h e r e w a s n o t . Q u a n t i t a t i v e S p A c h r o m a t o g r a p h y A s a n a l y z e d b y S D S - P A G E , t h e p r o d u c t s o f t h e a n t i - 7 a n d a n t i - p c o l u m n s w e r e n e a r l y p u r e I g G a n d I g M , r e s p e c t i v e l y . F o r t h e f o l l o w i n g c a l c u l a t i o n s o f b i n d i n g p e r c e n t a g e s , t h e i m m u n o g l o b u l i n s w e r e c o n s i d e r e d p u r e . T h e S p A - b i n d a b l e i m m u n o - g l o b u l i n i n e a c h c a s e w a s t h e r e f o r e d e fi n e d b y : - C E V E A E V E % S p A - b m d a b l e = x 1 0 0 = x 1 0 0 C T V T 1 V 1 w h e r e C E a n d C T a r e t h e c o n c e n t r a t i o n s o f t h e e l u a t e s a n d p r e - S p A t o t a l i m m u n o g l o b u l i n , I ‘ C S p e c t i v e l y , A E a n d A T a r e t h e i r r e s p e c t i v e a b s o r b a n c e s , a n d V E a n d V T a r e t h e i r ldl a t it reported a s 5‘ t h e c o l u m n « T a h l e l, l 5 1:;1'aiitiori5 u s e d 5Tdi‘T5 Recovery for the at item added to the S M 3 . 3 : ? « . 3 . I ~ are strn;lar. - a n d i y m a .5... a rough m e a s u i --~‘<.10l1 of S p A h i n d a h tailbands. The anti—G iht‘a.at. pH would not a .ipenrnent u as itpi otein 55a: dete i t ? "« p a r e d u T'ilfi 9 ' 3 3 I : ‘ ( 0 D H ~. 2 2 : 6 3 . 1 ) ? v o l u m e s . S i r . i n fi d b } t h e p r o t e i n ' s i : . . i n I m p l i c i t 1 ? m i g h t : u n m u n o g I o t F r o m h i s c o u s i n ' f i n i t e S p A - a g a r o s e ( T ‘ 5 5 : 0 2 ‘ t h e l g h I f : S p A - a g a r o s e i 1 3 5 ' . . . i r e t é i } d u e t o t h e S m a l l . 2 1 9 r e s p e c t i v e v o l u m e s . S i n c e f o r e a c h p r o t e i n , c o n c e n t r a t i o n i s e q u a l t o t h e a b s o r b a n c e d i v i d e d b y t h e p r o t e i n ’ s e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t , t h e e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t s c a n c e l o u t o f t h e e q u a t i o n . I m p l i c i t i n t h e e q u a t i o n i s t h e a s s u m p t i o n t h a t S p A - b i n d a b l e a n d S p A - n o n b i n d a b l e i m m u n o g l o b u l i n s h a v e t h e s a m e a b s o r b a n c e s a t 2 8 0 n m . F r o m t h i s e q u a t i o n , 8 2 % o f t h e I g G p u r i fi e d b y a n t i - 7 c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y b o u n d t o S p A - a g a r o s e ( T a b l e 1 . 1 ) . C o n v e r s e l y , 1 8 % o f t h e s a m e I g G d i d n o t b i n d t o S p A - a g a r o s e . O f t h e I g M p u r i fi e d b y a n t i - p c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y , a b o u t 2 / 3 b o u n d t o t h e S p A - a g a r o s e ( T a b l e 1 . 1 ) . I g M r e c o v e r y w a s 9 3 . 6 % r a t h e r t h a n 1 0 0 % a s f o r I g G , p r o b a b l y d u e t o t h e s m a l l e r a m o u n t s o f I g M u s e d . B e c a u s e o f t h i s , t h e S p A - b i n d a b l e I g M c a n b e r e p o r t e d a s 6 9 % o f t h e r e c o v e r e d I g M o r a s 6 5 . 1 % o f t h e t o t a l I g M a d d e d t o t h e c o l u m n ( T a b l e 1 . 1 ) . A b o u t 3 0 % o f t h e I g M d i d n o t b i n d t o S p A - a g a r o s e u n d e r t h e c o n d i t i o n s u s e d ( T a b l e 1 . 1 ) . R e c o v e r y f o r t h e a n t i - G p r o d u c t c o n t a i n i n g I g G a n d I g M w a s r o u g h l y 9 5 % o f t h e p r o t e i n a d d e d t o t h e S p A c o l u m n ( T a b l e 1 . 1 ) . S i n c e t h e e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t s o f I g G a n d I g M a r e s i m i l a r , a n d m o s t o f t h i s m i x w a s I g G , u s e o f t h e s a m e e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t p r o v i d e d a r o u g h m e a s u r e o f t h e r e l a t i v e a m o u n t s i n e a c h f r a c t i o n . M o r e a c c u r a t e e s t i m a t i o n o f S p A b i n d a b i l i t y , h o w e v e r , r e q u i r e d d e n s i t o m e t r i c a s s e s s m e n t o f t h e S D S - P A G E b a n d s . T h e a n t i - G c o l u m n w a s i n i t i a l l y e q u i l i b r a t e d t o p H 7 . 2 . T o c o n fi r m t h a t a h i g h e r p H w o u l d n o t a l l o w m o r e i m m u n o g l o b u l i n t o b i n d t h e S p A - a g a r o s e , t h e F T f r o m t h i s e x p e r i m e n t w a s r e c h r o m a t o g r a p h e d t h r o u g h a S p A c o l u m n e q u i l i b r a t e d a t p H 8 . 0 . N o p r o t e i n w a s d e t e c t e d i n t h e e l u a t e , s o S p A b i n d a b i l i t y w a s n o t i m p r o v e d a t p H 8 . 0 a s c o m p a r e d t o p H 7 . 2 . A l s o , f a i l u r e o f a n y o f t h e F T i m m u n o g l o b u l i n t o b i n d t o a 3 . 5 : m a n : . S m a 3 i U p 3 E n i g e s ? g s e ? n ? : % H ” 0 3 9 . . AL . g 3 a 3 i : . 2 . “ . , - 9 = . 2 a . . 5 8 m 7 . 3...... £ 3 S E r ] z h : 5 “ . 3 : J. , . L ) » 3 p t 3 : 4 3 . . . 5 2 . . “ ' . ' l 3 ’ - . _ . f « a H . . . . . . . H g . 5 2 “ . 3 . . . . . s a w 5 5 . . u . a r ; . . - m i § g . t _ . 7 5 5 “ 7 m 1 f v o a r l t u e h s e i m n i p x a t r u e r n e t h o e f s e I s g a G r a e n a d p p I r g o M x i m a t i o n s b a s e d o n u s i n g a n e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t o f 1 . 4 2 2 0 t h e S p A - a g a r o s e a s e c o n d t i m e c o n fi r m e d t h a t t h e c o l u m n c a p a c i t y h a d n o t b e e n e x c e e d e d . T a b l e 1 . 1 . I m m u n o g l o b u l i n r e c o v e r y i n fl o w t h r o u g h ( F T ) a n d e l u a t e ( E ) f r a c t i o n s f r o m S p A a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y . a n t i - G a n t i - 7 a n t i - p p o o l e d p l a s m a f r o m n 1 0 4 4 d o g s i m m u n o g l o b u l i n I g G + I g M I g G I g M c o n c e n t r a t i o n ( m g / m l ) ( 9 . 2 1 ) 1 5 . 6 3 1 . 3 1 v o l u m e l o a d e d o n t o S p A 2 5 0 4 4 4 4 8 3 c o l u m n ( p l ) p r o t e i n l o a d e d ( m g ) ( 2 . 3 0 ) 2 . 5 0 0 . 6 3 F T v o l u m e ( m l ) 9 . 8 3 1 3 . 8 0 1 1 . 4 0 F T A 2 8 0 ( 0 . 1 0 2 ) 0 . 0 4 6 0 . 0 1 9 F T p r o t e i n ( m g ) ( 0 . 7 2 ) 0 . 4 5 0 . 1 8 E v o l u m e ( m l ) 8 . 7 0 1 6 . 0 0 1 4 . 0 0 E A 2 8 0 ( 0 . 2 3 8 ) 0 . 1 7 9 0 . 0 3 5 E p r o t e i n ( m g ) ( 1 . 4 8 ) 2 . 0 5 0 . 4 1 7 0 p r o t e i n r e c o v e r y ( 9 5 . 6 ) 1 0 0 . 0 9 3 . 6 7 0 S p A - b o u n d N A 2 8 2 . 0 6 9 3 / 6 5 1 ‘ 7 0 n o t S p A - b o u n d N A 1 8 . 0 3 1 3 / 2 8 6 1 1 3 m a p p l i c a b l e b e c a u s e I g G a n d I g M a r e m i x e d b u t d o n o t h a v e t h e s a m e p e r c e n t a g e S p A b m d a b i l i t y 3 . . b a s e d o n r e c o v e r e d p r o t e i n / b a s e d o n t o t a l p r o t e i n F A C E l a n e s . B e c a u s e t h e a t l fl n fl g l l h e a : 1 0 : b e c a u s e t h e n u h a r m e d I g G a n ; . . . E f r a c t i o m w a s i t E z s u o d d l u i e d : : i i a e p h e r e s e d a t t u t fi n u m m F T m f i fi e d e u r u n a n o 2 2 1 D e n s i t o m e t r y B e c a u s e t h e a n t i - G a n t i b o d y w a s n o t h e a v y c h a i n s p e c i fi c , t h e E c o n t a i n e d b o t h I g G a n d I g M . T h e c o n t r i b u t i o n o f a n y I g A t h a t m i g h t h a v e b e e n p r e s e n t w a s c o n s i d e r e d m i n o r b e c a u s e t h e n o r m a l c i r c u l a t i n g c o n c e n t r a t i o n o f c a n i n e I g A i s o n l y a b o u t 5 % o f t h e c o m b i n e d I g G a n d I g M c o n c e n t r a t i o n s . ‘ 3 P r e l i m i n a r y S D S - P A G E a n a l y s i s o f t h e F T a n d E f r a c t i o n s w a s u s e d t o d e t e r m i n e h o w m u c h o f e a c h t o e l e c t r o p h o r e s e s u c h t h a t t h e b a n d s w o u l d h a v e d e n s i t i e s w i t h i n t h e l i n e a r r a n g e o f t h e d e n s i t o m e t e r . T h e F T w a s e l e c t r o p h o r e s e d a t t w i c e t h e v o l u m e o f t h e E . D e n s i t o m e t r i c a l l y , 3 1 . 8 % o f t h e r e c o v e r e d I g G w a s i n t h e F T b a n d ( 6 8 . 2 % w a s i n t h e E b a n d ) . T h i s i s b a s e d o n t h e m e a n v a l u e o f t h r e e d e t e r m i n a t i o n s , ( 3 1 . 6 , 3 1 . 5 , a n d 3 2 . 3 % ) , o n e a c h o f 3 d i s t i n c t s e t s o f S D S - P A G E l a n e s . S ‘ r i c e [ b f 5 1 h e r a j - o s t i f l e . - 5 o ' f t h e t o t o l u r n e s o E T : 5 c o m p a r e d t o i . “ H ‘ s ; “ ~ ‘ ‘ i r c 2 2 2 S i n c e t h e S D S - P A G E b a n d f o r F T I g G w a s g e n e r a t e d w i t h t w i c e t h e v o l u m e o f P T a s c o m p a r e d t o E , t h e r a t i o o f t h e I g G c o n c e n t r a t i o n o f t h e F T t o t h a t o f t h e E w a s : c o n c e n t r a t i o n o f F T I g G = ( 0 . 5 ) ( 3 l . 8 % ) c o n c e n t r a t i o n o f E I g G 6 8 . 2 % = 0 . 2 3 3 . T h e r a t i o o f t h e t o t a l I g G i n t h e F T t o t h a t i n t h e E c o u l d t h e r e f o r e b e c a l c u l a t e d f r o m t h e t o t a l v o l u m e s o f P T a n d E c o l l e c t e d : I g G " = 0 . 2 3 3 x ( 9 . 8 3 m l / 8 . 7 0 m l ) = 0 . 2 6 3 , I g G E s o I g G " = 0 . 2 6 3 x I g G E . S i n c e ’ I g G ” + I g G E = I g G , ( t o t a l I g G ) , ( 0 . 2 6 3 x I g G E ) + I g G E = I g G T . T h e r e f o r e , I g G , E x 1 . 2 6 3 = I g G T , I G g E = — — 1 — — = 0 . 7 9 2 I g G , 1 . 2 6 3 a n d t h e E I g G w a s 7 9 . 2 % o f t h e t o t a l I g G . T h e r e f o r e 2 0 . 8 % o f t h e I g G p u r i fi e d o n t h e a n t i - G a f fi n i t y c o l u m n a n d r e c o v e r e d f r o m t h e S p A c o l u m n w a s S p A - n o n b i n d a b l e . T h i s a g r e e s w i t h t h e 1 8 % fi g u r e d e t e r m i n e d s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y f o r t h e a n t i - 7 I g G . . 3 3 3 : E . b e v e l e r . w a s t T h e :«f'igisral a . . } : a n d : 1 { a I N i S i p - A A [ - w a s a c n a o m n s u m m b I ‘ . g ! . ; r p 2 1 3 3 1 1 6 1 3 1 0 ~=‘-'1-1\.x4 ' 6 2 “ ) k a ~ 5 ' ; £ 1 3 5 } : 1 1 “ ~ S l ‘ i - n o n b i n d 5 a . 3 1 l e 1 : b l c I g ( ; ‘ fi M ' E d fi a a n f M E p r ‘ f r a c t l . n l l } C h l l j f A E I R K L X “ a s U s : . t 5 : 5 t h e s a m e a s * S ; . l - a : : § 1 : a i a i r l e I g G a n d : f z z : : c l m . w e r e n w : : - 2 2 3 I R M A A n I R M A w a s u s e d t o c o n fi r m t h a t t h e a c t i v i t y o f S p A i n t h e c h r o m a t o g r a p h y s t u d i e s w a s t h e s a m e a s t h e a c t i v i t y o f r a d i o l a b e l e d S p A i n a s o l i d p h a s e s y s t e m . T h e S p A - n o n b i n d a b l e I g G a n d I g M f r o m t h e c h r o m a t o g r a p h i c s t u d i e s , i . e . t h e F T f r a c t i o n s o f e a c h c o l u m n , w e r e n o t d e t e c t e d b y 1 2 5 1 - S p A i n t h e I R M A ( T a b l e s 1 . 2 - 1 . 4 ) . E a c h c o l u m n B , h o w e v e r , w a s d e t e c t e d e q u a l l y w e l l b y 1 2 5 I - S p A a n d e i t h e r 1 2 S I - a n t i - y f o r I g G o r 1 2 5 I - a n t i - p t f o r I g M . N o t e t h e p r e s e n c e o f s o m e I g M i n t h e a n t i - G c o l u m n p r o d u c t ( T a b l e 1 . 2 ) . T h e I R M A w a s a l s o u s e d t o d e t e r m i n e i f p o l y c l o n a l a n t i - [ c a n i n e I g G 1 ] a n d p o l y c l o n a l a n t i - [ c a n i n e I g G Z ] a n t i b o d i e s w o u l d h a v e d i f f e r e n t r e a c t i v i t i e s w i t h t h e S p A - b i n d a b l e a n d S p A - n o n b i n d a b l e I g G . T h e s e a n t i b o d i e s r e a c t t o t w o e l e c t r o p h o r e t i c a l l y d i s t i n c t c a n i n e I g G s u b p o p u l a t i o n s , b u t t h e r e l a t i o n s h i p o f t h e s e s u b p o p u l a t i o n s t o o t h e r p u b l i s h e d c l a s s i fi c a t i o n s i s n o t c l e a r . I n a n y c a s e , e a c h a n t i b o d y d e t e c t e d S p A - b i n d a b l e a n d S p A - n o n b i n d a b l e I g G ( T a b l e 1 . 3 ) . T a b l e 1 . 2 . S o l i d p h a s e b i n d i n g o f i o d i n a t e d a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s t o S p A c o l u m n F T a n d E f r a c t i o n s o f i m m u n o g l o b u l i n p u r i fi e d b y a n t i - [ I g G ( w h o l e m o l e c u l e ) ] a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y . % b o u n d ( m e a n i S . D . ) c o n c e n t r a t i o n ‘ Z s l - S p A 1 2 S I - a n t i - ’ y ‘ 2 5 I - a n t i - p f o r a d s o r p t i o n ( p g / m l ) F T E F T E F T E 0 . 0 0 . 2 i 0 . 0 0 . 2 i 0 . 0 1 . 0 i 0 . 2 1 . 0 i 0 . 0 1 . 0 i 0 . 0 1 . 0 i 0 . 0 0 . 6 2 5 0 . 2 i 0 . 0 6 . 8 i 0 . 2 2 0 . 6 i 0 . 3 2 6 . 3 i 0 . 8 2 . 4 i 0 . 0 4 . 2 i 0 . 2 2 . 5 0 . 8 i 0 . 0 4 5 . 0 i 3 . 2 3 3 . 8 i 1 . 0 3 6 . 7 i 0 . 2 6 . 7 : t 0 . 5 1 0 . 5 i 0 . 2 1 0 . 0 2 . 8 : 1 ; 0 . 2 6 8 . 7 1 ! : 0 . 3 3 8 . 2 i 0 . 3 3 9 . 6 : 1 ; 1 . 2 1 0 . 2 i 0 . 3 1 3 . 7 i 0 . 4 S o l i d a n d E p h a s e f r a c t l 1 1 2 . 4 . \ . \ . W “ w k - 5 . 4 : “ \ ' T‘.'. I " 7 2 2 1 . 3 . S o l i d M N a n d E f r a c l i - { m i " ‘ . 1 : 0 ‘ - fl ' - ‘ - | fi \ ‘ . 0 . - « 3 . 2 0 . 5 " ] 2 3 ' # 3 - M i f . 2 . 5 0 2 2 4 T a b l e 1 . 3 . S o l i d p h a s e b i n d i n g o f i o d i n a t e d a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s t o S p A c o l u m n F T a n d E f r a c t i o n s o f I g G p u r i fi e d b y a n t i - [ I g G ( 7 ) ] a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y . % b o u n d ( m e a n i S . D . ) c o n c e n t r a t i o n 1 2 5 I — S p A 1 2 S l - a n t i a y 1 2 5 I - a n t i — G l 1 2 5 I - a n t i - G z f o r a d s o r p t i o n . ( H z / m l ) F T E F T E F T E F T E 0 . 0 0 . 1 0 . 1 1 . 2 1 . 2 0 . 4 0 . 4 0 . 2 0 . 2 : 1 ; 0 . 0 i 0 . 0 i - 0 . 1 - _ + _ - 0 . 1 i 0 . 0 i 0 . 0 i 0 . 0 : 1 ; 0 . 0 0 . 6 2 5 0 . 1 3 . 1 1 1 . 7 1 0 . 3 3 . 4 2 . 0 1 2 . 7 1 4 . 2 i 0 . 1 i 0 . 2 i 0 . 1 i 0 . 8 : l ; 0 . 1 ; + - _ 0 . 0 i 0 . 4 : 1 : 0 . 1 2 . 5 0 . 2 1 0 . 9 2 4 . 3 2 2 . 7 9 . 9 5 . 9 2 6 . 3 3 4 . 0 i 0 . 2 j ; 0 . 1 - + _ - 0 . 5 i 1 . 2 - + _ - 0 . 2 i 0 . 1 i 1 . 2 i 0 . 7 1 0 . 0 0 . 4 4 7 . 4 3 7 . 4 3 4 . 8 2 5 . 1 1 8 . 5 4 3 . 4 5 4 . 7 j ; 0 . 4 i 2 . 4 - _ l _ - 1 . 0 i 1 . 6 i - 0 . 4 - _ l - 0 . 3 i - 1 . 6 i 1 . 7 T a b l e 1 . 4 . S o l i d p h a s e b i n d i n g o f i o d i n a t e d a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s t o S p A c o l u m n F T a n d E f r a c t i o n s o f I g M p u r i fi e d b y a n t i - [ I g M ( p ) ] a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y . % b o u n d ( m e a n 1 » S D . ) c o n c e n t r a t i o n f o r ” S I - S p A ‘ Z S I - a n t i - u a b s o r p t i o n ( p g / m l ) F T E F T E 0 . 0 0 . 1 1 0 . 1 0 . 1 ; t 0 . 1 1 . 0 i 0 . 0 1 . 0 i 0 . 0 0 . 6 2 5 0 . 1 i 0 . 0 1 . 2 i 0 . 1 9 . 3 i 0 . 3 9 . 0 : 1 ; 0 . 2 2 . 5 0 . 2 : 1 ; 0 . 0 5 . 7 i 0 . 1 1 8 . 1 i - 0 . 2 1 7 . 4 i 0 . 3 1 0 . 0 0 . 9 i 0 . 1 4 1 . 2 i 0 . 7 2 4 . 0 i 0 . 5 2 3 . 8 i 0 . 9 a n n b t ‘ d } t I g G :21; steal]: { a l l . Lian-501‘ S p A - b l n d a ' n l w } . The results o f . - a n n e w a s $3 :1 plasma p o o l e d fr n1,. . 1 ....~;nd1\‘1dual d o n s l i t u s n ' o n S p A m a } n o t b e 1 1 a s h a s b e e n s u . a r e : b o u n d o n l y a b o . ‘ 3 1 } : n z i r . s p e c i fi c 1 - , . 3 3 . 2 . : c l n o m a l o g r a p h } 5 1 1 1 : ; r e s u l t s 1 . 3 3 5 2 1 1 3 1 1 1 a m o u n t o f 5 3 : » c o l u r m C o n n i m b l e I g G w e r e . 3 ; « o n S D S - P A G E g t l I m . L . ‘ K « d . a n d g e n d e r s s u e s 2 2 5 D i s c u s s i o n S p A m a y n o t b e a s u s e f u l f o r t h e d e t e c t i o n a n d p u r i fi c a t i o n o f c a n i n e i m m u n o - g l o b u l i n s a s h a s b e e n s u g g e s t e d . “ * 9 P r o t e i n A f r o m t h e C o w a n I s t r a i n o f S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s b o u n d o n l y a b o u t 8 0 % o f t h e c a n i n e I g G a n d 6 7 % o f t h e c a n i n e I g M p u r i fi e d b y h e a v y c h a i n s p e c i fi c ( 7 a n d [ 1 ) p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s . T h i s w a s t r u e u n d e r c o n d i t i o n s o f c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y a s w e l l a s i n a s o l i d p h a s e i m m u n o r a d i o m e t r i c a s s a y . S i m i l a r r e s u l t s f o r I g G w e r e g e n e r a t e d b y t w o a p p r o a c h e s . I n t h e fi r s t a p p r o a c h , a s i g n i fi c a n t a m o u n t o f I g M w a s c o — p u r i fi e d w i t h I g G o n a n a n t i - I g G ( w h o l e m o l e c u l e ) a f fi n i t y c o l u m n . C o n s e q u e n t l y , t h e r e l a t i v e a m o u n t s o f S p A - b i n d a b l e a n d S p A - n o n b i n d a b l e I g G w e r e d e t e r m i n e d b y d e n s i t o m e t r i c e v a l u a t i o n o f C o o m a s s i e b l u e - s t a i n e d b a n d s o n S D S - P A G E g e l s . I n t h e s e c o n d I g G e x p e r i m e n t s , I g G w a s p u r i fi e d w i t h a 7 - c h a i n s p e c i fi c a n t i b o d y . I g M c o ~ p u r i fi c a t i o n w a s n e g l i g i b l e . I n t h i s s t u d y , r e l a t i v e a m o u n t s o f S p A - b i n d a b l e a n d S p A - n o n b i n d a b l e I g G c o u l d b e m e a s u r e d s p e c t r o p h o t o m e t - r i c a l l y . T h e r e s u l t s o f t h e s e a p p r o a c h e s w e r e r e m a r k a b l y s i m i l a r , fi n d i n g t h a t 2 0 . 8 a n d 1 8 % o f c a n i n e I g G w a s S p A - n o n b i n d a b l e i n t h e fi r s t a n d s e c o n d m e t h o d s , r e s p e c t i v e l y . U s e o f p l a s m a p o o l e d f r o m 1 0 ( f u s t a p p r o a c h ) a n d 4 ( s e c o n d a p p r o a c h ) d o g s o f d i f f e r e n t b r e e d s a n d g e n d e r s s u g g e s t s t h a t t h e s e fi g u r e s a r e g e n e r a l l y a p p l i c a b l e , t h o u g h v a r i a t i o n a m o n g i n d i v i d u a l d o g s w a s n o t a s s e s s e d . T h e s e fi n d i n g s c o n t r a s t w i t h r e p o r t s o f l e s s S p A r e a c t i v i t y , 7 a s w e l l a s w i t h t w o r e p o r t s t h a t S p A b i n d s t o a t l e a s t 9 8 a n d 9 0 % o f n o r m a l c a n i n e I g G a n d I g M , r e S p e c t i v e l y . 8 ' 9 I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e g r e a t e r b i n d i n g s e e n b y W a r r a n d H a r t 9 m a y h a v e b e e n d u e t o a p p l i c a t i o n o f s e r u m t o S p A - S e p h a r o s e a t a h i g h e r p H ( p H 8 . 0 ) t h a n w a s u s e d p r e v i o u s l y . “ H o w e v e r , w e s a w n o d i f f e r e n c e i n r e c o v e r y w h e n I g G w a s e n a b l e I g G w a s pr: 3 ) i0.9 a m o u n t w a s u‘ 5 ; ” : E ....1ore u n a c c o u n t e d Plan-d. f r a c t i o n s i 1 r e n n i n of [he irn M o s t r e c e n t l y mutations before ' . 1 2 8 d w i t h r a w : . 5 : : f S p A f r o n 1 d i f f e r 1 5 : 1 3 . 1 5 d a t e d i n a n 5 5 . 3 R e a l i s e i t i s 1 1 1 6 : 3 5 ? “ O t h e r e x p l a n a n o : 1 : e a r l y s t u d i e s b } ( 3 : 1 c h r o m a t o g r a p h y . : . - n r e e i p i t a r e w . . : . t u i t c i f f u s i o n i m a y w i n : W a n a n d 1 1 : 1 2 : 1 1 : a f t e r S p A a ? “ 5 1 1 u s e d a c o m p e r i r i x i ' i n e a u a r i o r n . A g a i n ” E d i t 1 ‘ . t e e n 1 0 3 1 d u r i n g . " m . ' 1 . ' 2 2 6 a p p l i e d a t p H 7 . 2 a s c o m p a r e d t o p H 8 . 0 . D i f f e r e n t r e s u l t s m a y a l s o h a v e b e e n d u e t o u s e o f S p A f r o m d i f f e r e n t s t r a i n s o f S . a u r e u s , t h o u g h t h e s t r a i n s o f o r i g i n w e r e n o t s p e c i fi c a l l y s t a t e d i n a n y o n e o f t h e s e r e p o r t s . W e e v a l u a t e d S p A f r o m t h e C o w a n I s t r a i n b e c a u s e i t i s t h e m o s t f r e q u e n t n a t u r a l s o u r c e o f S p A f o r i m m u n o l o g i c p r o c e - d u r e s . 1 ' 2 O t h e r e x p l a n a t i o n s f o r d i s p a r a t e r e s u l t s m a y r e l a t e t o t h e i n v e s t i g a t o r s ’ t e c h n i q u e s . I n t h e e a r l y s t u d i e s b y G o u d s w a a r d , 7 i n c o m p l e t e p r o t e i n r e c o v e r i e s ( 3 8 . 5 t o 1 0 2 % ) a f t e r S p A c h r o m a t o g r a p h y , r e l a t i v e l y c r u d e s t a r t i n g i m m u n o g l o b u l i n m a t e r i a l ( a m m o n i u m s u l f a t e p r e c i p i t a t e s ) , a n d l i m i t e d s e n s i t i v i t y o f i m m u n o g l o b u l i n q u a n t i t i o n ( r a d i a l i m m u n o d i f f u s i o n ) m a y h a v e c o n t r i b u t e d s i g n i fi c a n t e r r o r t o t h e a s s e s s m e n t o f S p A r e a c t i v i t y . W a r r a n d H a r t 9 a l s o m e a s u r e d i m m u n o g l o b u l i n c o n c e n t r a t i o n s i n s a m p l e s b e f o r e a n d a f t e r S p A a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y , b u t t h e y c h r o m a t o g r a p h e d w h o l e s e r u m , a n d u s e d a c o m p e t i t i v e r a d i o i r n m u n o p r e c i p i t a t i o n a s s a y t o m e a s u r e i m m u n o g l o b u l i n c o n c e n t r a t i o n s . A g a i n , p r o t e i n r e c o v e r y w a s a p r o b l e m . L e s s t h a n 1 % o f t h e i n i t i a l d e t e c t a b l e I g G w a s p r e s e n t i n t h e c o l u m n F T a f t e r 3 p a s s a g e s ; b u t o n l y 6 0 % o f t h e s t a r t i n g a m o u n t w a s d e t e c t e d i n t h e e l u t e d f r a c t i o n . A l m o s t 4 0 % o f t h e I g G w a s t h e r e f o r e u n a c c o u n t e d f o r . S i m i l a r l y , o n l y 3 3 % o f t h e i n i t i a l I g M w a s d e t e c t a b l e i n t h e F T a n d E f r a c t i o n s t o g e t h e r . T h e a p p a r e n t l o s s o f i m m u n o g l o b u l i n m a y r e l a t e t o i n s e n s i t i v i t y o f t h e i m m u n o g l o b u l i n a s s a y . A l t e r n a t i v e l y , e l u t e d p r o t e i n m a y a c t u a l l y h a v e b e e n l o s t d u r i n g d i a l y s i s a n d c o n c e n t r a t i o n s t e p s . M o s t r e c e n t l y , a n i n d i r e c t E L I S A w a s u s e d t o m e a s u r e i m m u n o g l o b u l i n c o n c e n t r a t i o n s b e f o r e a n d a f t e r s e r u m w a s e x p o s e d t o S p A . 8 T h e s e r u m w a s f r o m d o g s i m m u n i z e d w i t h r a g w e e d e x t r a c t , a n d t h e E L I S A d e t e c t e d o n l y t h o s e i m m u n o g l o b u l i n s i t s m a d w i t h r a g w ' c z . : e r w a s l D C O l l S l S ' u r I n c o n t r a s t : f ' e s e x t t a l l t p u r . e p r n t e p r o t e £ 1 3 3 6 d e p r e c r s e 'il . 1 1 1 1 : E l a n d I o n e s a n d a b s o r b a n c e 1:12} particular .7; e a t chain S U I ‘ W I ‘ s p e c 711115 a t e c l a s s - w i d e r e a e t t It '15 n o t k n o w n if ” ( Of 1 8 6 a s is t r u A ' ’ ‘ 1 ' 3 1 1 3 a 1 1 3 C 1 1 0 “ 0 3 ” “ 1 3 E i O b i l i l l B r a n e 1 3 ! 3 : 5 r e p o r t e d l } u 2 2 7 t h a t r e a c t e d w i t h r a g w e e d e x t r a c t c o a t e d o n t o m i c r o t i t r a t i o n p l a t e s . I t i s t h e r e f o r e l i k e l y t h a t o n l y a f r a c t i o n o f e a c h i m m u n o g l o b u l i n c l a s s w a s d e t e c t a b l e . T h e r e c o v e r y o f i m m u n o g l o b u l i n s r a n g e d f r o m a l o w o f 3 8 % f o r I g E t o 1 0 0 % f o r I g G a n d I g A ; 6 9 % o f t h e I g M w a s r e p o r t e d l y r e c o v e r e d . T h e m a j o r c o n c e r n s a b o u t t h i s s t u d y a r e t h a t p r o t e i n r e c o v e r y w a s i n c o n s i s t e n t a n d / o r i n c o m p l e t e , a n d o n l y s o m e i m m u n o g l o b u l i n s w e r e d e t e c t a b l e . I n c o n t r a s t , p r o t e i n r e c o v e r y w a s c o n s i s t e n t l y g o o d i n o u r s t u d i e s . T h e e v a l u a t i o n o f e s s e n t i a l l y p u r e p r o t e i n s o r p r o t e i n b a n d s , a s O p p o s e d t o s e r u m o r s e r u m f r a c t i o n s , a l l o w e d m o r e p r e c i s e a n d a c c u r a t e q u a n t i t a t i o n , a n d t h e r e l a t i v e a m o u n t s o f i m m u n o - g l o b u l i n s i n t h e F T a n d E f r a c t i o n s c o u l d b e c a l c u l a t e d s i m p l y w i t h p r o p o r t i o n s b a s e d o n v o l u m e s a n d a b s o r b a n c e s . M o r e o v e r , t h e i m m u n o g l o b u l i n s e v a l u a t e d w e r e n o t r e s t r i c t e d t o a n y p a r t i c u l a r s u b p o p u l a t i o n s ; r a t h e r , t h e y w e r e a l l t h o s e i m m u n o g l o b u l i n s r e a c t i v e w i t h h e a v y c h a i n s p e c i fi c p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s . S u c h a n t i b o d i e s a r e g e n e r a l l y p r e s u m e d t o h a v e c l a s s - w i d e r e a c t i v i t y . I t i s n o t k n o w n i f S p A - n o n b i n d a b l e I g G i n d o g s r e p r e s e n t s a d i s t i n c t i m m u n o l o g i c s u b c l a s s o f I g G a s i s t r u e o f h u m a n a n d m u r i n e I g G , o r i f e a c h s u b c l a s s o f c a n i n e I g G c o n t a i n s S p A - b i n d a b l e a n d S p A - n o n b i n d a b l e i m m u n o g l o b u l i n s . W e t e s t e d t h e F T a n d E I g G t o s e e i f t h e s e f r a c t i o n s c o r r e l a t e d w i t h I g G 1 a n d I n g s u b c l a s s e s a s d e fi n e d i m m u n o e l e c t r o p h o r e t i c a l l y b y t h e a n t i b o d y s u p p l i e r ( B e t h y l L a b o r a t o r i e s , M o n t g o m e r y , T X ) . T h e y d i d n o t . G o u r d s w a a r d a l s o c o u l d n o t s h o w I g G s u b c l a s s s p e c i fi c i t y o f S p A u s i n g 3 d i f f e r e n t a n t i b o d i e s t o c a n i n e I g G s u b c l a s s e s i m m u n o e l e c t r o p h o r e t i c a l l y c l a s s i fi e d a s I g G , , b , I c h , a n d I n g . 7 T h i s c o n t r a s t s w i t h h u m a n a n d m u r i n e I g G , i n w h i c h c a s e s S P A b i n d s p o o r l y t o h u m a n I g G 3 a n d t o m u r i n e I g G , . 2 H o w e v e r , t h e c a n i n e s t u d i e s d o u d 5 u . h : o s h e r e n t r e s T i h a e c u t i o r n m e t i : : n i t 1 t e n t l h a a c t e r a e d t h o n t a i n i n 2 . 1 2 3 5 1 : I g G w i l l I: '.. '11 false n e g a t i t ' e r: £ 1 3 1 1 f o r t h e a . 3 & 5 [ 1 l e b e d e t e c t ; t s p a e n A l t h o u g h S p A - b ; :...s with 1 t h 1181141” :..-1.1.316 platelet epitt‘ ...-.ael}' Occurs with: 751:1 hanan P A I Q G b1 3 1 5 ‘ 1‘1 M t t . p r o d u c e d 3 1 1 , 2 0 : ' Id a g a i n r e l a t e Th. behefits o f 5 a t a s i d e t h e p o s s i h t . 1 . 6 , . l g G h . I g G . o r s i m u l a t i o n . I 5 m i n a ) 2 2 8 n o t e x c l u d e t h e p o s s i b i l i t y t h a t S p A - n o n b i n d a b l e I g G i s a p a r t i c u l a r I g G s u b c l a s s , b e i t I g G , , I g G ” , I g G Z b , o r I g G 2 c a s c u r r e n t l y c l a s s i fi e d , 1 5 o r s o m e o t h e r u n c h a r a c t e r i z e d s u b p o p u l a t i o n . T h e c u r r e n t r e s u l t s i m p a c t s e v e r a l c o m m o n u s e s o f S p A : 1 ) c a n i n e i m m u n o g l o b u - l i n p u r i fi c a t i o n m e t h o d s e m p l o y i n g S p A c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y m a y o m i t s i g n i fi c a n t a n d u n c h a r a c t e r i z e d s u b p o p u l a t i o n s o f I g G a n d I g M , 2 ) t h e c o m p l e t e r e m o v a l o f I g G f r o m I g G - c o n t a i n i n g s a m p l e s m a y n o t b e p o s s i b l e w i t h S p A c h r o m a t o g r a p h y , 3 ) S p A - n o n b i n d a b l e I g G w i l l n o t i r n m u n o p r e c i p i t a t e w i t h S p A d e s p i t e i t s r e a c t i v i t y w i t h t h e d e s i r e d a n t i g e n , a n d 4 ) t h e u s e o f S p A a s a n a n t i g l o b u l i n r e a g e n t f o r c a n i n e I g G m a y r e s u l t i n f a l s e n e g a t i v e r e s u l t s w i t h a v a r i e t y o f i m m u n o a s s a y s . W e h a v e e x p e r i e n c e w i t h a n I R M A f o r t h e d e t e c t i o n o f c a n i n e p l a t e l e t — a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n ( P A I g ) . 1 6 O n l y o n c e h a s t h e r e b e e n p o s i t i v i t y w i t h 1 2 5 I - a n t i - I g G ( ~ y ) b u t n o t 1 2 " ’ I - S p A . A l t h o u g h S p A - b a s e d a s s a y s f o r h u m a n P A I g w i l l n o t d e t e c t P A I g G 3 , h u m a n p a t i e n t s w i t h I M T u s u a l l y h a v e m u l t i p l e c l a s s e s o f a n t i p l a t e l e t a n t i b o d i e s w i t h r e a c t i v i t y t o m u l t i p l e p l a t e l e t e p i t o p e s . l 7 I g G 3 i s f r e q u e n t l y c o n t r i b u t o r y t o t h e d e t e c t a b l e P A I g G , b u t i t r a r e l y o c c u r s w i t h o u t o t h e r I g G s u b c l a s s e s . ” " 9 T h e r e f o r e , S p A c a n u s u a l l y r e l i a b l y d e t e c t h u m a n P A I g G , b u t i t c a n n o t a c c u r a t e l y q u a n t i f y i t . I n d o g s , i f S p A - b i n d a b l e I g G i s a l s o u s u a l l y p r o d u c e d c o n c u r r e n t l y w i t h S p A - n o n b i n d a b l e I g G , t h e m a j o r l i m i t a t i o n o f S p A w o u l d a g a i n r e l a t e t o q u a n t i t a t i o n . T h e b e n e fi t s o f S p A m a y o u t w e i g h i t s l i m i t a t i o n f o r u s e i n i m m u n o a s s a y s . S p A i s r e l a t i v e l y i n e x p e n s i v e , s t a b l e , a n d e a s i l y r a d i o l a b e l e d . I t h a s a h i g h b i n d i n g a f fi n i t y W i t h a c o n s t a n t b i n d i n g r a t i o t h a t a l l o w s q u a n t i t a t i o n o f S p A - b i n d a b l e i m m u n o g l o b u - 1 i n s . ‘ - 2 ° M o r e o v e r , i t w i l l b i n d o t h e r i m m u n o g l o b u l i n c l a s s e s i n d o g s s u c h t h a t i t m a y W P A l g i n c a s e . H u n t : a a c ' e r t s t i c s p r o b : 2 5 . 1 1 5 a r e a c c e p t a b l 1 5 . 5 . 3 . 5 L i l l l g S p A t C i ~ f ‘ . - “ . 5 . . r d 2 . 5 % o f c a n 2 2 9 d e t e c t P A I g i n c a s e s w h e r e a s p e c i fi c a n t i - I g G d e t e c t i n g a n t i b o d y w o u l d n o t . T h e s e c h a r a c t e r i s t i c s p r o b a b l y m a k e S p A a s u i t a b l e r e a g e n t i n i m m u n o a s s a y s w h e n q u a l i t a t i v e r e s u l t s a r e a c c e p t a b l e . H o w e v e r , q u a n t i t a t i o n o f c a n i n e i m m u n o g l o b u l i n s i n c l i n i c a l a s s a y s u s i n g S p A ( C o w a n I ) w i l l b e l i m i t e d b y t h e S p A m o n r e a c t i v i t y o f 2 0 % o f c a n i n e I g G a n d 3 3 % o f c a n i n e I g M . D I a e fi u i g r s e n h m u e e s n t a o t f e a 2 r n . J ' d 9 - R e f e r e n c e s a n : M D P . n ‘ G o d - 1 : 1 9 1 “ ? I l r r n t u n o K i e t h : B i b - t i t I . P e t e r s A f r o m S t a p h } K r o n t ' a l l 0 . Q . t e n n i r a t i o n b a t t e n a . J l m : 1 . 1 1 1 1 1 k a R ‘ p r o t e i n A a n d 6 3 : 1 . 1 9 8 3 G o u d s w a a r d J P r o t e i n A t e a . 3 3 1 . 1 9 7 8 P i ‘ n g 2 * S i m o M d P f t l t e t n G W a n G V L H a S e r u m a n d [ h e 1 3 7 1 2 1 1 1 1 0 1 0 3 ‘ . 3 1 1 1 m m C h I O H N - f e m . . . L t : F r a k i ‘ r P ] 5 0 1 1 1 . 1 1 B i O p h , S p , - e C 1 1 1 0 ” 3 ' s R e s C 2 3 0 R e f e r e n c e s 1 . B o y l e M D P , R e i s K J : B a c t e r i a l F c r e c e p t o r s . B i o / t e c h n o l o g y 5 : 6 9 7 , 1 9 8 7 2 . G o d i n g J W : U s e o f s t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n A a s a n i m m u n o l o g i c a l r e a g e n t . J I m m u n o M e t h o d s 2 0 2 2 4 1 , 1 9 7 8 3 . B j o r k I , P e t e r s s o n B - A , S j o q u i s t J : S o m e p h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f p r o t e i n A f r o m S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s . E u r J B i o c h e m 2 9 : 5 7 9 , 1 9 7 2 4 . K r o n v a l l G , Q u i e P G , W i l l i a m s R C J : Q u a n t i t a t i o n o f s t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n A : D e t e r m i n a t i o n o f e q u i l i b r i u m c o n s t a n t a n d n u m b e r o f p r o t e i n A r e s i d u e s o n b a c t e r i a . J I m m u n o l 1 0 4 2 2 7 3 , 1 9 7 0 5 . D e i s e n h o f e r J : C r y s t a l l o g r a p h i c r e fi n e m e n t a n d a t o m i c m o d e l s o f a h u m a n F c f r a g m e n t a n d i t s c o m p l e x w i t h f r a g m e n t B o f p r o t e i n A f r o m S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s a t 2 . 9 — a n d 2 . 8 - A r e s o l u t i o n . B i o c h e m 2 0 : 2 3 6 1 , 1 9 8 1 6 . L i n d m a r k R , T h o r é n - T o l l i n g K , S j o q u i s t J : B i n d i n g o f i m m u n o g l o b u l i n s t o p r o t e i n A a n d i m m u n o g l o b u l i n l e v e l s i n m a m m a l i a n s e r a . J I m m u n o l M e t h o d s 6 2 : 1 , 1 9 8 3 7 . G o u d s w a a r d J , V a n D e r D o n k J A , N o o r d z i j A , V a n D a m R H , V a e r m a n J - P : P r o t e i n A r e a c t i v i t y o f v a r i o u s m a m m a l i a n i m m u n o g l o b u l i n s . S c a n d J I m m u n o l 8 : 2 1 , 1 9 7 8 8 . P e n g Z , S i m o n s F E R , B e c k e r A B : D i f f e r e n t i a l b i n d i n g p r o p e r t i e s o f p r o t e i n A a n d p r o t e i n G f o r d o g i m m u n o g l o b u l i n s . J I m m u n o l M e t h o d s 1 4 5 : 2 5 5 , 1 9 9 1 9 . W a r r G W , H a r t I R : B i n d i n g o f c a n i n e I g M a n d I g G t o p r o t e i n A o f S t a p h y l o c o c - c u s a u r e u s : A s i m p l e m e t h o d f o r t h e i s o l a t i o n o f c a n i n e i m m u n o g l o b u l i n s f r o m s e r u m a n d t h e l y m p h o c y t e s u r f a c e . A m J V e t R e s 4 0 : 9 2 2 , 1 9 7 9 1 0 . Y a m a m o t o S , O m u r a M , H i r a t a H : I s o l a t i o n o f p o r c i n e , c a n i n e a n d f e l i n e I g G b y a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y u s i n g p r o t e i n A . V e t I m m u n o I r n m u n o p a t h 9 : 1 9 5 , 1 9 8 5 1 1 . L a e m m l i U K : C l e a v a g e o f s t r u c t u r a l p r o t e i n s d u r i n g t h e a s s e m b l y o f t h e h e a d o f b a c t e r i o p h a g e T 4 . N a t u r e 2 2 7 2 6 8 0 , 1 9 7 0 1 2 . F r a k e r P J , S p e c k J C J : P r o t e i n a n d c e l l m e m b r a n e i o d i n a t i o n s w i t h a s p a r i n g l y s o l u b l e c h l o r o a m i d e , 1 , 3 , 4 , 6 - t e t r a c h l o r o - 3 a , 6 a - d i p h e n y l g l y c o l u r i l . B i o c h e m B i o p h y s R e s C o m m u n 8 0 : 8 4 9 , 1 9 7 8 H a p y R e n u o i R . t p u i r d r n e s d z t a e m . E B E o n e r s R e . i d D . o l f o B \ s d n : n r g 2 ; . : ’ ) 7 . 0 3 5 f 5 a . 5 : . C . , . n ) 1 L . R L G I n i s s e c o m r a y g G \ o S L b L 1 V e F y , t . a b A . o M p a C l r m y c ; 5 . 1 . 1 : : 1 9 5 6 D i r o n E 1 . K u n A c a d e m i c P r e s s H a l l i w e l l R E W f u n c t i o n . i n V e t S c o t t M A . D a y p l a t e ‘ e t - a s s o e i a : 1 3 . 1 4 . 1 5 . 1 6 . 1 7 . 1 8 . 1 9 . 2 0 . 2 3 1 J a i n N C : S c h a l m ’ s V e t e r i n a r y H e m a t o l o g y ( 4 t h e d ) . P h i l a d e l p h i a , L e a & F e b i g e r , 1 9 8 6 D i x o n F J , K u n k e l H G , e d s : A d v a n c e s i n I m m u n o l o g y ( v o l 3 2 ) . N e w Y o r k , A c a d e m i c P r e s s , 1 9 8 2 H a l l i w e l l R E W , G o r m a n N T : T h e i m m u n o g l o b u l i n s : s t r u c t u r e , g e n e t i c s , a n d f u n c t i o n , i n V e t e r i n a r y C l i n i c a l I m m u n o l o g y . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 8 9 , p 1 9 S c o t t M A , D a v i s M , S c h w a r t z K A : A n e w i m m u n o r a d i o m e t r i c a s s a y f o r c a n i n e p l a t e l e t - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n . B l o o d 8 4 ( s u p p 1 ) : 1 8 7 a , 1 9 9 4 ( a b s t r ) H e R , R e i d D M , J o n e s C E , S h u h n a n N R : S p e c t r u m o f I g c l a s s e s , s p e c i fi c i t i e s , a n d t i t e r s o f s e r u m a n t i g l y c o p r o t e i n s i n c h r o n i c i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B l o o d 8 3 : 1 0 2 4 , 1 9 9 4 v o n d e m B o r n e A E G K , H e l r n e r h o r s t F M , v a n L e e u w e n E F , P e g e l s H G , v o n R i e s z E , E n g e l f r i e t C P : A u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a : D e t e c t i o n o f p l a t e l e t a u t o a n t i b o d i e s w i t h t h e s u s p e n s i o n i r n m u n o fl o u r e s c e n c e t e s t . B r J H a e m a t o l 4 5 : 3 1 9 , 1 9 8 0 R o s s e W F , A d a m s J P , Y o u n t W I : S u b c l a s s e s o f I g G a n t i b o d i e s i n i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a ( I T P ) . B r J H a e m a t o l 4 6 : 1 0 9 , 1 9 8 0 G r a y L S , M a s o u r e d i s S P : I n t e r a c t i o n o f 1 2 5 I - p r o t e i n A w i t h e r y t h r o c y t e — b o u n d I g G . J L a b C l i n M e d 9 9 : 3 9 9 , 1 9 8 2 I 1 It 0 9 1 0 0 0 1 m m P r e s p l a t e l e t - b i n d a h l e i r a t u h t d t e s . a n d r e n t » ; 17::- canine t ‘ T - y m p l a t e l e t s atgea'ed platelets d e . atuty to 3 different Magglabultns w e r e :.....ocwcal protein A w ‘ he class of platel' 341:1 1P5. .- I re ~ P l a s m a f r o m 1 31111311 3 : 3 3 : 5 5 . r .- ' nettetpitated +5.1:.. The exposure ~ " § . » S \ ““'5 Increase in P S " ‘ 3 -' .' i n t a c t . 1 5 a n a i d e t o i m p : 1 1 D i n d o g s . w e d e i t - 3 1 1 ‘ : f o r c a n i n e p l a t e ; \ . C H A P T E R 2 A N I M I V I U N O R A D I O M E T R I C A S S A Y F O R T H E D E T E C T I O N O F C A N I N E P L A T E L E T - A S S O C I A T E D I M N I U N O G L O B U L I N S A b s t r a c t A s a n a i d e t o i m p r o v i n g o u r u n d e r s t a n d i n g o f i m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a ( I M T ) i n d o g s , w e d e v e l o p e d a n d c h a r a c t e r i z e d a s e n s i t i v e i m m u n o r a d i o m e t r i c a s s a y ( I R M A ) f o r c a n i n e p l a t e l e t s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n ( P S A I g ) . T h i s a s s a y a l s o d e t e c t s p l a t e l e t - b i n d a b l e i m m u n o g l o b u l i n ( P B I g ) i n t h e f o r m o f a u t o a n t i b o d i e s , a l l o a n t i b o d i e s , a n d x e n o g e n e i c a n t i b o d i e s . P B I g w a s d e t e c t e d b y i n c u b a t i n g p l a s m a w i t h n o r m a l c a n i n e p l a t e l e t s fi x e d i n 0 . 0 1 % g l u t a r a l d e h y d e . W h i l e t h e r e a c t i v i t y o f u n fi x e d r e f r i g e r a t e d p l a t e l e t s d e c r e a s e d d r a m a t i c a l l y o v e r d a y s , t h e s e fi x e d p l a t e l e t s m a i n t a i n e d r e a c t i v i t y t o 3 d i f f e r e n t p l a s m a a n t i b o d i e s f o r m o n t h s t o y e a r s . T h e p l a t e l e t r e a c t i v e i m m u n o g l o b u l i n s w e r e r e p r o d u c i b l y d e t e c t e d i n a d o s e - r e s p o n s e f a s h i o n w i t h 1 2 5 I - l a b e l e d s t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n A ( S p A ) . A n t i b o d i e s t o c a n i n e I g G ( 7 ) a n d I g M ( p ) w e r e u s e d t o d e fi n e t h e c l a s s o f p l a t e l e t - r e a c t i v e a n t i b o d i e s a n d t o d e t e c t S p A - n o n b i n d a b l e i m m u n o - g l o b u l i n s . P l a s m a f r o m a d o g w i t h c l i n i c a l l y d i a g n o s e d I M T a n d a h i g h t i t e r o f P B I g t h a t i m m u n o p r e c i p i t a t e d G P I b w a s u s e d a s a p o s i t i v e c o n t r o l f o r S p A a n d t h e a n t i - I g G ( y ) d e t e c t o r . T h e e x p o s u r e o f b l o o d s a m p l e s t o 4 ° C o r r o o m t e m p e r a t u r e ( R T ) l e d t o a p r o g r e s s i v e i n c r e a s e i n P S A I g w h i c h c o u l d c o n v e r t n e g a t i v e s a m p l e s t o a p p a r e n t p o s i t i v e s 2 3 2 l l t a x e y t o p e n i a . htttduttion I m m u n e - m e d i a t e . like”: e . 1 3 platelet 5 d e s t r ; 41511371. C o n t i n u a : a : . e 1. : u s e f u l f o r i d e n t i ? lh'ombocytoper; t y e z ' E n n a r y , t e a c h t r 3 3 7 1 5 ' “311130.000 p l a t . ‘11le 0 1 t h e t “ “ 3 1 1 1 a s : in ation a b o u r r 5;". . 3 h o u r s . T h e s t a r : 3 . 3 1 ; i n c r e a s e s i n P 1 1 3 1 1 ; a n d P B l g . m o s t l 3 ' 1 p l a s m a i n c u b a t i o n s t a t e s i n P S A l g . u s u . # 1 : : l 9 t l u o m b o c y t o p e t . . . . 5 s i g n i f i c a n t . a n . : 7 t h l e r o l e i n t h e p a t ? “ fl e d t o b e u s e f u l I i n : " A “ a , Q 2 3 3 w i t h i n h o u r s . T h e s t o r a g e o f i s o l a t e d p l a s m a a t 4 ° C o r R T a l s o l e d t o p r o g r e s s i v e a n d d r a m a t i c i n c r e a s e s i n P B I g , m o s t l y I g M . F a l s e p o s i t i v e r e s u l t s d u e t o t h i s n o n s p e c i fi c P S A I g a n d P B I g , m o s t l y I g M , w e r e a v o i d e d b y u s i n g f r e s h 3 7 ° C b l o o d s a m p l e s a n d 3 7 ° C p l a s m a i n c u b a t i o n t e m p e r a t u r e s . C l i n i c a l l y , t h e a s s a y d e t e c t e d m o d e r a t e t o m a r k e d i n c r e a s e s i n P S A I g , u s u a l l y I g G , f o r 9 6 % o f 2 4 d o g s g i v e n a d i a g n o s i s o f I M T . O f t h e o t h e r 1 9 t h r o m b o c y t o p e n i c d o g s t e s t e d , 5 h a d i n c r e a s e s i n P S A I g t h a t w e r e c o n s i d e r e d c l i n i c a l l y s i g n i fi c a n t , a n d i t i s l i k e l y t h a t i m m u n e - m e d i a t e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n p l a y e d a p r i n c i p a l r o l e i n t h e p a t h o g e n e s i s o f t h r o m b o c y t o p e n i a f o r 4 o f t h e s e d o g s . T h i s a s s a y a p p e a r e d t o b e u s e f u l f o r d i f f e r e n t i a t i n g d o g s w i t h I M T f r o m d o g s w i t h n o n i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a . I n t r o d u c t i o n I m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a ( I M T ) a p p e a r s t o r e s u l t p r i m a r i l y f r o m a c c e l e r a t e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n d u e t o i n c r e a s e d p l a t e l e t s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u - l i n ( P S A I g ’ ) . C o n f u ' m i n g t h e p r e s e n c e o f i n c r e a s e d P S A I g w i t h r e l i a b l e d i r e c t a s s a y s m a y b e u s e f u l f o r i d e n t i f y i n g d o g s w i t h I M T . T h r o m b o c y t o p e n i a o c c u r r e d i n a b o u t 5 % o f 1 8 , 9 1 0 d o g s r e t r o s p e c t i v e l y e v a l u a t e d a t o n e v e t e r i n a r y t e a c h i n g h o s p i t a l , w i t h a b o u t h a l f t h e t h r o m b o c y t 0 p e n i c d o g s h a v i n g f e w e r t h a n 1 5 0 , 0 0 0 p l a t e l e t s / p l . l T h e c a u s e o f t h r o m b o c y t o p e n i a w a s u n d e t e r m i n e d i n a b o u t a t h i r d o f t h e c a s e s , b u t t h r o m b o c y t o p e n i a w a s f r e q u e n t l y a s s o c i a t e d w i t h n e o p l a s i a , i n fl a m m a t i o n , a n d i n f e c t i o n . T h r o m b o c y t 0 p e n i a w a s c o n s i d e r e d i m m u n e - m e d i a t e d i n a b o u t 5 % o f t h e c a s e s , t h o u g h s p e c i fi c t e s t i n g f o r p l a t e l e t - r e a c t i v e ‘ P S A I g i s a n y i m m u n o g l o b u l i n b o u n d s p e c i fi c a l l y o r n o n s p e c i fi c a l l y t o t h e p l a t e l e t s u r f a c e a s : 1 1 1 5 " " a n d 1' o n . a ‘ V ' I i n h a l e : a l l o a n t i ' t w d t . e 2 1 a p p l e s . H i g h b a c k g r o u n . first n e g a l t a r y o e y t e t: 1111111 include diffic‘.I . o 5 ‘ 1 0 0 \ ' l ” ' ” ! t h e e x p o s u W With n o n s u s p e n C a n i n e I M T Relatively little 1 “id In t o x r e o l o o m " 1 \ . I . 0 i : n 4 3 p E : l 3 i ; . a n " . ‘ m fl 1 1 J T U O I ( O m o g i o b u i i n w a s n o t 1 1 5 : 2 : a t i o n o f i r n m u n t r o l e s f o r P S A I ; m a i n l y a s s o c i a t e d w ; I n d i r e c t a s s a y s a t u o g l o b u l i n ( P B l g ' e x c i t e d : a n d u n a f f e . h i ‘ t e t e r . t h e s e i n d i r e t ' 1 ’ 3 3 : > ” M 5 4 1 1 1 m e g a k a m . « I . . ‘ e fi h C - S l n g s ” u . ' . 1 . 2 3 4 i m m u n o g l o b u l i n w a s n o t d o n e . D i r e c t a s s a y s f o r P S A I g m a y i m p r o v e t h e l a r g e l y c l i n i c a l d i f f e r e n t i a t i o n o f i m m u n e - m e d i a t e d f r o m n o n i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a s . T h e y m a y a l s o i d e n t i f y r o l e s f o r P S A I g i n t h e p a t h o g e n e s e s o f s u c h c a n i n e t h r o m b o c y t o p e n i a s a s t h o s e c o m m o n l y a s s o c i a t e d w i t h n e o p l a s t i c a n d i n f e c t i o u s d i s e a s e s . I n d i r e c t a s s a y s h a v e b e e n d e v e l o p e d f o r d e t e c t i n g c a n i n e p l a t e l e t - b i n d a b l e i m m u n o g l o b u l i n ( P B I g b ) i n p a t i e n t p l a s m a o r s e r u m s a m p l e s . ” T h e s e s a m p l e s a r e c o n v e n i e n t a n d u n a f f e c t e d b y t h e p a u c i t y o f c e l l s i n m a n y t h r o m b o c y t o p e n i c d o g s . H o w e v e r , t h e s e i n d i r e c t a s s a y s h a v e n o t h a d g r e a t s e n s i t i v i t y f o r c l i n i c a l l y d i a g n o s e d c a n i n e I M T , 2 - “ “ 5 a n d h i g h n o n s p e c i fi c b a c k g r o u n d b i n d i n g h a s b e e n a p r o b l e m . 2 F u r t h e r m o r e , t h e s e a s s a y s f o r P B I g d o n o t d i f f e r e n t i a t e a m o n g a n t i p l a t e l e t a u t o a n t i b o d i e s , a n t i p l a t e l e t a l l o a n t i b o d i e s , i m m u n e c o m p l e x e s , a n d a g g r e g a t e s o f n o r m a l I g G p r e s e n t i n s t o r e d s a m p l e s . H i g h b a c k g r o u n d s i g n a l s a n d m e d i o c r e s e n s i t i v i t y h a v e a l s o l i m i t e d t h e u t i l i t y o f d i r e c t m e g a k a r y o c y t e i m m u n o fl u o r e s c e n c e t e s t i n g ( D M I F T ) . 5 ° 7 ' 9 O t h e r p r o b l e m s w i t h D M I F T i n c l u d e d i f fi c u l t i e s i n c o l l e c t i n g s u f fi c i e n t n u m b e r s o f m e g a k a r y o c y t e s f o r t e s t i n g , 5 ' 7 ' 8 ' 1 ° t h e e x p o s u r e o f n o n p a t h o l o g i c c y t o s o l i c i m m u n o g l o b u l i n d u e t o s m e a r i n g t r a u m a w i t h n o n s u s p e n s i o n t e c h n i q u e s , 1 1 a n d i n c o m p l e t e l y s h a r e d a n t i g e n i c i t y b e t w e e n p l a t e l e t s a n d m e g a k a r y o c y t e s . “ T h e r e c e n t u s e o f p l a t e l e t v o l u m e a n d f r a g m e n t a t i o n f o r d i a g n o s i n g c a n i n e I M T i s a n i n d i r e c t m e t h o d w i t h u n p r o v e n s p e c i fi c i t y f o r I M T . ” M R e l a t i v e l y l i t t l e d i r e c t t e s t i n g f o r c a n i n e P S A I g h a s b e e n a t t e m p t e d c l i n i c a l l y , a n d w h e n u s e d i n t o x i c o l o g i c s e t t i n g s f o r d e t e c t i n g d r u g - i n d u c e d a n t i b o d i e s , s i g n a l - t o - n o i s e b P B I g i s a n y i m m u n o g l o b u l i n i n p l a s m a o r s e r u m s a m p l e s t h a t w i l l b i n d s p e c i fi c a l l y o r n o n s p e c i fi c a l l y t o p l a t e l e t s 0 o ' ( [ h e a p p a r e n t p : 7 . 1 : h a v e b e e n r e l a t i y z | i s : c l i n i c a l l y a n d f o e l i t r e n e t . P S A l g e l u : p r e p a r e d G P l l b a n d t a p e s f o r a n t i p l a t e l e ' W e h a t e d e t e ‘ . 1 1 . 1 1 1 f o r d e t e c t i n g : . t z p a i u n n u n o g l o b t . P a i t l a b e l e d a n t i b o d i e s 3 3 1 2 . 3 : t h e c l a s s o f : : 3 1 3 ? ” : S t o r a g e a n d a s : h i s a n d F B I c c u r : “ 3 1 ‘ 0 1 c a m n e i " Q 0 . E c o : . ‘ L i t 4 1 ' ? ' C d O g g W C r e 2 3 5 r a t i o s h a v e b e e n r e l a t i v e l y l o w . ” 1 6 R e c e n t l y , h o w e v e r , a d i r e c t E L I S A f o r P S A I g w a s u s e d c l i n i c a l l y a n d f o u n d t o d e t e c t P S A I g i n m o s t d o g s s u s p e c t e d o f h a v i n g I M T . 4 M o r e o v e r , P S A I g e l u t e d f r o m t h e p l a t e l e t s o f s o m e d o g s w i t h I M T r a d i o i m m u n o - p r e c i p i t a t e d G P I I b a n d / o r I I I a , s u g g e s t i n g t h a t a s f o r h u m a n I M T , G P I I b / I l l a h a s t a r g e t e p i t o p e s f o r a n t i p l a t e l e t a u t o a n t i b o d i e s i n s o m e d o g s w i t h I M T . 1 7 W e h a v e d e v e l o p e d a n d c h a r a c t e r i z e d a s e n s i t i v e i m m u n o r a d i o m e t r i c a s s a y ( I R M A ) f o r d e t e c t i n g P S A I g o n c a n i n e p l a t e l e t s a n d P B I g i n c a n i n e p l a s m a . T h e p r i n c i p a l i m m u n o g l o b u l i n d e t e c t o r w a s r a d i o l a b e l e d s t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n A ( S p A ) . R a d i o l a b e l e d a n t i b o d i e s t o c a n i n e I g G a n d I g M w e r e u s e d i n c o n j u n c t i o n w i t h S p A t o d e t e r m i n e t h e c l a s s o f i m m u n o g l o b u l i n a n d t o d e t e c t S p A - n o n b i n d a b l e i m m u n o g l o b u l i n s . S a m p l e s t o r a g e a n d a s s a y t e m p e r a t u r e s p r o f o u n d l y i n fl u e n c e d t h e r e s u l t s , w i t h i n c r e a s e d P S A I g a n d P B I g o c c u r r i n g u n d e r s o m e s a m p l e h a n d l i n g c o n d i t i o n s . W e s u g g e s t t h a t f o r a n y a s s a y o f c a n i n e P S A I g o r P B I g , s t r i c t s a m p l e m a n a g e m e n t m a y b e r e q u i r e d t o p r e v e n t t h e a p p a r e n t p o s i t i v i t y o f n o r m a l s a m p l e s . M e t h o d s D o g s B l o o d d o n o r d o g s w e r e m a i n t a i n e d b y t h e U n i v e r s i t y L a b o r a t o r y A n i m a l R e s o u r c e s f a c i l i t y w h i c h f o l l o w s U S D A a n d N I H g u i d e l i n e s f o r a n i m a l u s e a n d c a r e . A p p r o v a l f o r u s e w a s o b t a i n e d f r o m t h e A l l U n i v e r s i t y C o m m i t t e e o n A n i m a l U s e a n d C a r e . T h e d o g s w e r e t h o r o u g h l y p r e c o n d i t i o n e d b e f o r e u s e . 2 . 1 3 1 2 : p l a t e l e t y i e l d 1 . : ‘ L ‘ J U ‘ 1 3 t 1 h / " 1 i n g T h e f 2 3 3 - d o t E n o t l l o w i n s a e r a n d S a p t l y c l o n a l r a b b i t a n t i - « 1 4 1 1 1 1 1 5 I g G l ' fl ] 1 a m a z e d a n d P e t r : .-.:L111010:3Ct.0Q-dll‘1‘.; netbated w i t h ‘ 5 3:3:t .114. - A f t e r 1 0 1 5 552131351 1t o m f r e e ioc‘ ' a “ F t ; I n «7113113 B i o t e e h . at BSA phosphate 1 50(11U111 32106 :a t 3:181111111 use H \ r. U n r n u n o L 3 , ‘ ; : , 1 1 : o , ’ £ e r n ' o n a n d t . “ F o r n o r m a l d o ; n e e d l e i n t o p l a s t i c s y s e n s a t i o n o f 1 0 . 5 1 7 ‘ 2 : 3 1 1 : 2 4 m i n a t 1 3 1 ‘ 0 2 3 6 B l o o d c o l l e c t i o n a n d p l a t e l e t i s o l a t i o n F o r n o r m a l d o g s , b l o o d w a s d r a w n b y j u g u l a r v e n i p u n c t u r e t h r o u g h 1 8 g a u g e n e e d l e s i n t o p l a s t i c s y r i n g e s c o n t a i n i n g 1 / 1 0 v o l u m e c i t r a t e t o g i v e a fi n a l c i t r a t e c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 . 5 m M ( 0 . 3 2 % ) . P l a t e l e t s w e r e h a r v e s t e d b y d i f f e r e n t i a l c e n t r i f u g a — t i o n f o r 2 - 4 m i n a t 1 3 0 0 x g . C e n t r i f u g a t i o n w a s o f t e n r e p e a t e d o n c e o r t w i c e t o m a x i m i z e p l a t e l e t y i e l d s . R a d i o l a b e l i n g T h e f o l l o w i n g a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s w e r e r a d i o l a b e l e d b y m o d i fi c a t i o n s o f t h e m e t h o d o f F r a k e r a n d S p e c k : 1 8 s t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n A ( S p A ) ( S i g m a , S t . L o u i s , M O ) , a p o l y c l o n a l r a b b i t a n t i - [ c a n i n e I g G ( w h o l e m o l e c u l e ) ] ( a n t i - G ) ( S i g m a ) , a p o l y c l o n a l g o a t a n t i - [ c a n i n e I g G ( y ) ] ( a n t i - y ) , a n d a p o l y c l o n a l g o a t a n t i — [ c a n i n e I g M ( u ) ] ( a n t i - a ) ( K i r k e g a a r d a n d P e r r y L a b o r a t o r i e s , I n c . , G a i t h e r s b u r g , M D ) . B r i e fl y , 1 , 3 , 4 , 6 - t e t r a c h l o r o - 3 o z , 6 a - d i p h e n y l g l y c o u r i l ( S i g m a ) d e p o s i t e d o n t h e b a s e o f a g l a s s t e s t t u b e w a s i n c u b a t e d w i t h 2 5 p g o f p r o t e i n ( 1 m g / m l ) a n d 0 . 3 - 0 . 5 m C i 1 2 5 i o d i n e ( N a I , N E N D u p o n t ) . A f t e r 1 0 - 1 5 m i n u t e s o f i n c u b a t i o n w i t h m i x i n g , r a d i o l a b e l e d p r o t e i n w a s s e p a r a t e d f r o m f r e e i o d i d e b y fi l t r a t i o n t h r o u g h a 1 0 m l S e p h a d e x G 2 5 fi l t r a t i o n c o l u m n ( P h a r m a c i a B i o t e c h , I n c . , P i s c a t a w a y , N J ) . T h e l a b e l e d p r o t e i n w a s p o o l e d , d i l u t e d w i t h P B S / B S A ( p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e ( P B S ) w i t h 3 % b o v i n e s e r u m a l b u m i n ( B S A ) a n d 0 . 0 2 5 % s o d i u m a z i d e , p H 7 . 1 ) t o s t o c k c o n c e n t r a t i o n s o f 1 . 2 t a g / m l , a n d f r o z e n i n a l i q u o t s u n t i l u s e . H e a v y c h a i n s p e c i fi c i t y o f t h e a n t i - y a n d a n t i - u a n t i b o d i e s w a s c o n fi r m e d b y i m m u n o b l o t t i n g , a n d t h e s a m e l o t o f e a c h a n t i b o d y w a s u s e d i n a l l s t u d i e s . :5.1:: W 0 ! 1 1 1 6 3 5 3 3 ? 0 0 8 7 : 3 1 1 0 0 : 1 4 1 0 C 1 l 1 . i n t K e e r y a e d d i c b a y t r a d i o i r i o o f t h n n e n S : 3 1 ] : p l P B w e r e . 2 0 3 1 0 1 1 1 1 1 6 . A f t e r a r e w l h w t a t s h e d i n P B S h P C p l a s m t 3 : t s s p e a d e d i n ly s i s b u 9 1 1 5 1 . 1 5 5 8 5 . 2 1 "of n o n r e d _ _ 1 1 7 5 1 1 1 1 6 ” : 3 a n d 1 1 1 3 4 1 : 1 1 l e u a w a s i n c u b a t e | u c i n g s a m p i b t e h f o e r S e U h e e r . : p .....aptoethanolt c o r u n i o n s b u f f e r s\ W ltilt each 281 a n 1:25m o a u t o t a d i o o r “ ”short '45-’73 3 tfttation f 2 3 7 P o s i t i v e c o n t r o l T h e a s s a y p o s i t i v e c o n t r o l ( P C ) w a s c i t r a t e d p l a s m a o b t a i n e d b y p l a s m a p h e r e s i s f r o m a d o g w i t h c l i n i c a l l y d i a g n o s e d I M T . T h e s p e c i fi c i t y o f t h e P C a n t i b o d y w a s a s s e s s e d b y r a d i o i n u n u n o p r e c i p i t a t i o n u s i n g n o r m a l c a n i n e p l a t e l e t s s u r f a c e - l a b e l e d b y a m o d i fi c a t i o n o f t h e l a c t o p e r o x i d a s e t e c h n i q u e o f P h i l i p s . 1 9 T o 1 X 1 0 9 w a s h e d p l a t e l e t s i n 8 0 0 p l P B S w e r e a d d e d 2 0 0 p l ( 1 m g / m l ) l a c t o p e r o x i d a s e ( S i g m a ) i n P B S a n d 0 . 7 5 m C i 1 2 5 i o d i n e . A f t e r t h e s l o w a d d i t i o n o f 5 0 [ 1 . 1 o f 3 m M H 2 0 2 , t h e r a d i o l a b e l e d p l a t e l e t s w e r e w a s h e d i n P B S a n d r e s u s p e n d e d i n P B S / B S A . P l a t e l e t a l i q u o t s w e r e i n c u b a t e d f o r 1 h r w i t h P C p l a s m a , n o r m a l a u t o l o g o u s p l a s m a , o r P B S , a n d t h e n w a s h e d a n d r e s u s p e n d e d i n l y s i s b u f f e r ( 1 5 0 m M N a C l , 1 0 m M T r i s , w i t h 1 % T r i t o n X - 1 0 0 , 1 m M P M S F , a n d 2 4 u M l e u p e p t i n ) . A f t e r l y s i s , a 5 0 % s l u r r y o f 4 % b e a d e d a g a r o s e / S p A i n P B S / B S A w a s i n c u b a t e d w i t h e a c h s a m p l e f o r 1 h r . T h e S p A - a g a r o s e w a s t h e n w a s h e d , a n d n o n r e d u c i n g s a m p l e b u f f e r ( 3 7 0 M m T r i s ( p H 6 . 8 ) a n d 0 . 1 % S D S ) w a s a d d e d t o e a c h s a m p l e b e f o r e h e a t i n g t h e m f o r 1 0 m i n i n a b o i l i n g w a t e r b a t h . T h e a g a r o s e w a s p e l l e t e d a n d t h e s u p e m a t a n t s w e r e a s s e s s e d u n d e r n o n r e d u c i n g a n d r e d u c i n g ( w i t h 4 % B - m e r c a p t o e t h a n o l ) c o n d i t i o n s b y S D S — P A G E o n a 5 - 1 2 % l i n e a r g r a d i e n t g e l w i t h t h e d i s c o n t i n u o u s b u f f e r s y s t e m o f L a e m m l i . 2 0 M o l e c u l a r w e i g h t s t a n d a r d s w e r e e l e c t r o p h o - r e s e d w i t h e a c h g e l a n d v i s u a l i z e d w i t h C o o m a s s i e B l u e . A f t e r s t a i n i n g , t h e g e l s w e r e d r i e d f o r a u t o r a d i o g r a p h y . F i x a t i o n F o r fi x a t i o n o f p l a t e l e t s i n g l u t a r a l d e h y d e ( g r a d e 1 , S i g m a ) , f r e s h p l a t e l e t s w e r e w a s h e d 3 t i m e s i n 3 7 ° C P B S , p H 6 . 5 , w i t h 1 [ 1 M p r o s t a g l a n d i n E , ( P g E l ) . W a s h e d s t i n t D o s e - r . - ? : p a r e d t o t h o p e s s e i g t e e ; n . 4.15.7 c o n d i t i o n s Staple S t o r a g e a n d A ~ A f t e r a s u p p l y a t e s t e r e c o n d u c t e d tiigerated s a m p l e s a r ‘55 llama w e r e b a r r e " “ C’- " M a 4 3 . 7 9 o r a t ° C inett‘r 0 n 3 h e a t i n g a t w e r e t h e n i n c u ‘ a t £ 1 . 0 1 ” : g l u t a r a l d e ' r . i s s p e b d i t g l i t e p l a t e l ; l T h e r e a c t i v i t y o r 7 2 7 3 : 7 1 3 5 : l l t h e a s s a ; l a h t t m a r t p l a s m a t i 1 : : n o b o d y a l s o t e a . 1 ‘ : S a m t . . . p i s w e r e s t o r . i l l “ . 5 e l a l l r e . 2 3 8 p l a t e l e t s w e r e t h e n i n c u b a t e d a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 0 , 0 0 0 p l a t e l e t s / p l f o r 3 0 m i n i n P B S w i t h 0 . 0 1 % g l u t a r a l d e h y d e . G l u t a r a l d e h y d e w a s r e m o v e d b y w a s h i n g w i t h P B S b e f o r e r e s u s p e n d i n g t h e p l a t e l e t s i n P B S / B S A . T h e r e a c t i v i t y o f r e f r i g e r a t e d fi x e d p l a t e l e t s w a s e v a l u a t e d o v e r t i m e f o r 3 p o s i t i v e a n t i b o d i e s : 1 ) t h e a s s a y P C a n t i b o d y , 2 ) a r a b b i t a n t i - [ c a n i n e w h o l e p l a t e l e t ] p l a s m a , a n d 4 ) a h u m a n p l a s m a w i t h s p e c i fi c r e a c t i v i t y t o t h e P 1 A 1 e p i t O p e o f G P I I I a ( a n t i - P l “ ) . 2 1 T h i s a n t i b o d y a l s o r e a c t e d w i t h c a n i n e G P I I I a a s i d e n t i fi e d b y i m m u n o b l o t t i n g ( d a t a n o t s h o w n ) . D o s e - r e s p o n s e c u r v e s w e r e g e n e r a t e d w i t h fi x e d p l a t e l e t s f o r e a c h a n t i b o d y a n d c o m p a r e d t o t h o s e g e n e r a t e d w i t h 1 w e e k - o l d , r e f r i g e r a t e d , u n fi x e d p l a t e l e t s . A s s a y c o n d i t i o n s S a m p l e S t o r a g e a n d A s s a y T e m p e r a t u r e A f t e r a s u p p l y o f p l a t e l e t s w i t h r e p r o d u c i b l e r e a c t i v i t y w a s e s t a b l i s h e d , s e v e r a l s t u d i e s w e r e c o n d u c t e d t o i n v e s t i g a t e t h e h i g h n o n s p e c i fi c b a c k g r o u n d b i n d i n g s e e n w i t h r e f r i g e r a t e d s a m p l e s a n d r o o m t e m p e r a t u r e a s s a y c o n d i t i o n s . F o r t h e s e s t u d i e s , p l a t e l e t s a n d p l a s m a w e r e h a r v e s t e d f r o m c i t r a t e d b l o o d c o l l e c t e d f r o m n o r m a l b l o o d d o n o r d o g s . T h e s a m p l e s w e r e s t o r e d e i t h e r b e f o r e o r a f t e r c e l l s e p a r a t i o n a t r o o m t e m p e r a t u r e ( R T , 2 0 ~ 2 2 ° C ) , 4 ° C , o r a t 3 7 ° C . T o a c h i e v e a 3 7 ° C a s s a y t e m p e r a t u r e , i n c u b a t i o n s w e r e d o n e i n a 3 7 ° C i n c u b a t o r , w a s h b u f f e r w a s m a i n t a i n e d a t 3 7 ° C , a n d t h e p l a t e w a s W a r m e d o n a h e a t i n g p l a t e d u r i n g m a n i p u l a t i o n s . C e n t r i f u g a t i o n w a s d o n e a t r o o m t e m p e r a t u r e . 5 5 m p l a t e l e t - a s s t » . ll ‘ fi i . .5:. Platelet X u m b e r lbis e x p e r i m e ' 3 : . e r o . L0 d e t e n m n e ' t h e T SpA. P l a t e l e t s ‘ S t a i n i n g T h e l e n g t h o f i : . . — m e t i n p o l y p r o l t f t n b i t t a d S p A a t f r e t i t s 5 : 1 3 . t i m e s m o s t t i m e s . N o r m a l 1 i n 2 3 3 7 e r l a r g e b u t n ~ . . t h a t h a d b e e n : f l i n g c a p a c i t y o f S ; ” fi l e d b y W a s h i n g 2 3 9 S p A B i n d i n g T h e l e n g t h o f i n c u b a t i o n r e q u i r e d t o s a t u r a t e t h e b i n d i n g o f S p A t o P S A I g w a s d e t e r m i n e d i n p o l y p r o p y l e n e m i c r o f u g e t u b e s w h i c h a l l o w e d r a p i d w a s h i n g a n d r e m o v a l o f u n b o u n d S p A a t f r e q u e n t i n t e r v a l s . T h e n u m b e r o f p l a t e l e t s a n d v o l u m e s o f r e a g e n t s w e r e e a c h 3 t i m e s t h o s e o f t h e s t a n d a r d p l a t e a s s a y m e t h o d , a n d w a s h e s w e r e 5 t i m e s t h e v o l u m e s . N o r m a l fi x e d p l a t e l e t s w e r e fi r s t i n c u b a t e d w i t h P C p l a s m a t o p r o v i d e a r e l a t i v e l y l a r g e b u t n o t s a t u r a t i n g a m o u n t o f P S A I g . O n e s e t o f 3 t u b e s c o n t a i n e d p l a t e l e t s t h a t h a d b e e n i n c u b a t e d f o r 1 2 0 m i n w i t h t w i c e t h e P C p l a s m a t o v e r i f y t h a t t h e b i n d i n g c a p a c i t y o f S p A w a s n o t s a t u r a t e d . A t e a c h t i m e p o i n t , u n b o u n d S p A w a s r e m o v e d b y w a s h i n g a n d t h e t i p s o f t r i p l i c a t e m i c r o f u g e t u b e s w e r e r e m o v e d f o r a s s e s s i n g p l a t e l e t - a s s o c i a t e d r a d i o a c t i v i t y i n a g a m m a c o u n t e r ( T m A n a l y t i c , B e n s e n v i l l e , I L ) . T e s t P l a t e l e t N u m b e r T h i s e x p e r i m e n t w a s d o n e t o o p t i m i z e t h e n u m b e r o f p l a t e l e t s t o a s s a y f o r P S A I g , a n d t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t o f i n c r e a s i n g n u m b e r s o f p l a t e l e t s o n t h e d e t e c t i o n o f P S A I g b y S p A . P l a t e l e t s f r o m a d o g w i t h c l i n i c a l I M T a n d a p o s i t i v e t e s t f o r P S A I g w e r e a d d e d t o w e l l s a t i n c r e a s i n g n u m b e r s f r o m 2 . 5 X 1 0 6 t o 1 2 . 5 X 1 0 6 p l a t e l e t s p e r w e l l . T h e s t a n d a r d a s s a y m e t h o d s w e r e t h e n u s e d . S t a n d a r d A s s a y M e t h o d P l a t e l e t s w e r e h a r v e s t e d f r o m f r e s h c i t r a t e d b l o o d a t 3 7 ° C b y s e r i a l c e n t r i f u g a t i o n 2 t o 3 t i m e s a t 1 3 0 0 x g . P l a t e l e t - r i c h p l a s m a ( P R P ) w a s r e m o v e d a n d p o o l e d a f t e r e a c h “ T i m e n t l r a s a . Ideally tested for s a n i t a t i o n . l n 5 0 ” y g f i g a t i o n p r o c e d u 3 2 9 . 1 a l l fi n a l t h e l m 3 H 5 1 ; C o n t a m i n a i f s r e n z i a l e e n t r i f u g a t i f i f e . a n d t h e p l a t e l e t F i r e m i l l i o n t e s t s : p l a t e a n d p e l l e t e d t i e r t a t r e m o v e d a r 7 . 5 ; b u f f e r c o n t a i n i n g t a s t e s i n a s s a y b u f f e r 5 5 : 5 : e d f o r p l a t e l e t - a s i t d r a d i o a c t i v i t y i t . f i t t e d p l a t e l e t s a l l o a s s e s s e d i n t r i p l i . F o r t h e i n d i r e . I ' m } C a t t i n e p l a t e l e t P C f o r 3 0 m i n m , M a n d t h e a s s a j . ' 1 3 t h 2 4 0 c e n t r i f u g a t i o n . I n s o m e c a s e s , t h e r e m a i n i n g b l o o d w a s r e s u s p e n d e d i n P B S a n d t h e c e n t r i f u g a t i o n p r o c e d u r e w a s r e p e a t e d t o o b t a i n a b e t t e r y i e l d . P g E 1 w a s a d d e d t o t h e P R P ( 1 p M fi n a l ) b e f o r e w a s h i n g t h e p l a t e l e t s 3 t i m e s w i t h 3 7 ° C a s s a y b u f f e r ( P B S / B S A , p H 7 . 1 ) . C o n t a m i n a t i n g e r y t h r o c y t e s , i f p r e s e n t , w e r e l a r g e l y r e m o v e d b y r a p i d d i f f e r e n t i a l c e n t r i f u g a t i o n i n a m i c r o f u g e . W a s h e d p l a t e l e t s w e r e r e s u s p e n d e d i n a s s a y b u f f e r , a n d t h e p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s w e r e d e t e r m i n e d w i t h a N e u b a u e r h e m o c y t o m e t e r . F i v e m i l l i o n t e s t p l a t e l e t s w e r e a d d e d t o e a c h t e s t w e l l o f a U - b o t t o m m i c r o t i t r a - t i o n p l a t e a n d p e l l e t e d a t 8 5 0 x g f o r 8 m i n u t e s i n a B e c k r n a n 1 6 B fl o o r c e n t r i f u g e . T h e b u f f e r w a s r e m o v e d a n d t h e p l a t e l e t s w e r e r e s u s p e n d e d a n d i n c u b a t e d f o r 1 h r a t R T i n a s s a y b u f f e r c o n t a i n i n g 1 0 n g o f 1 2 5 ’ I — l a b e l e d a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s . A f t e r 3 r e s u s p e n d i n g w a s h e s i n a s s a y b u f f e r , a l i q u o t s o f t h e t e s t p l a t e l e t s w e r e r e m o v e d f r o m e a c h w e l l a n d a s s e s s e d f o r p l a t e l e t - a s s o c i a t e d r a d i o a c t i v i t y . R e s u l t s w e r e r e p o r t e d a s p e r c e n t a g e s o f t h e a d d e d r a d i o a c t i v i t y t h a t r e m a i n e d w i t h t h e p l a t e l e t s ( % b o u n d ) . W h e n t h e n u m b e r o f h a r v e s t e d p l a t e l e t s a l l o w e d i t , e a c h o f 3 a n t i g l o b u l i n d e t e c t o r s w a s u s e d , a n d e a c h s a m p l e w a s a s s e s s e d i n t r i p l i c a t e . F o r t h e i n d i r e c t a s s a y , 5 p l o f t e s t p l a s m a w a s i n c u b a t e d f o r 1 h r a t 3 7 ° C w i t h n o r m a l c a n i n e p l a t e l e t s fi x e d i n 0 . 0 1 % g l u t a r a l d e h y d e . T h e p l a s m a w a s p r e w a r m e d t o 3 7 ° C f o r 3 0 m i n b e f o r e u s e . A f t e r 3 r e s u s p e n d i n g w a s h e s , t h e d e t e c t i n g r e a g e n t s w e r e a d d e d a n d t h e a s s a y p r o c e e d e d a s f o r t h e d i r e c t a s s a y . P C p l a s m a w a s t e s t e d c o n c u r r e n t l y a s a p o s i t i v e c o n t r o l f o r S p A a n d a n t i - 7 . T h e a n t i — p a n t i b o d y w a s P e r i o d i c a l l y t e s t e d f o r i t s a b i l i t y t o d e t e c t c a n i n e h e a t - a g g r e g a t e d I g M b o u n d t o h u m a n C 1 q ( S i g m a ) n o n s p e c i fi c a l l y c o a t e d o n t o w e l l s o f m i c r o t i t r a t i o n p l a t e s . I t w a s a l s o t e s t e d “ 1 a n a s s a y f o r e r y t h r o c y t e s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n , w h e r e t h e p o s i t i v e c o n t r o l 5.5 satin: 5 5 3 m m c o n a t t i c 1.1) W W W “ E d m o n - o f d fi l l g l l ’ b i ‘ { n a r r a t i o n D e p e n d t ‘ T h e e f f e c t o f i n :5;.ant a m o u n t s o f P 5 i t : platelets a n d d fi l t ‘ t i l - 1 0 u g m l u s i n g s t . S i m i l a r s t u d i e s l e n s i a t t ' e l l m i c r o u t r ; littlailic a d s o r p t i o n E l i j a h b u f f e r . 7:55: l P B S B S A p w H i 9 t h ilt. B l e e k i n g b u f f e r W a n g e o n c e n t r . :r. tathed 5 t i m e s ‘- l l z z h g a n S t a t e L ' n i t ‘ e r s 3 1 R ? “ 5 1 0 1 1 5 : C u r v e s 2 4 1 w a s c a n i n e s e r u m c o n t a i n i n g I g M a n d I g G r e a c t i v e w i t h D E A 1 . 1 ( d o g e r y t h r o c y t e a n t i g e n 1 . 1 ) e r y t h r o c y t e s . T h i s r e a g e n t w a s k i n d l y p r o v i d e d b y D r . R o b e r t B u l l , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y . E v a l u a t i o n o f a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s C o n c e n t r a t i o n D e p e n d e n c y T h e e f f e c t o f i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s o n d e t e c t i o n o f c o n s t a n t a m o u n t s o f P S A I g w a s e v a l u a t e d . P C i m m u n o g l o b u l i n w a s b o u n d t o n o r m a l fi x e d p l a t e l e t s a n d d e t e c t e d b y t h e a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s o v e r a c o n c e n t r a t i o n r a n g e o f 0 . 1 - 1 . 0 p g / m l u s i n g s t a n d a r d a s s a y c o n d i t i o n s . S i m i l a r s t u d i e s w e r e d o n e w i t h I g G n o n s p e c i fi c a l l y a d s o r b e d t o I r n m u l o n H R e m o v a w e l l m i c r o t i t r a t i o n p l a t e w e l l s ( D y n a t e c h L a b o r a t o r i e s , I n c . , C h a n t i l l y , V A ) . N o n s p e c i fi c a d s o r p t i o n w a s d o n e o v e r n i g h t a t 4 ° C w i t h 5 0 p l o f 1 0 p g / m l I g G i n 5 0 m M C a r b o n a t e b u f f e r , p H 9 . 6 . A f t e r a d s o r p t i o n , t h e w e l l s w e r e w a s h e d 3 t i m e s w i t h b l o c k i n g b u f f e r ( P B S / B S A w i t h 0 . 5 % T w e e n ) a n d t h e n i n c u b a t e d w i t h 2 0 0 p l b l o c k i n g b u f f e r f o r 1 h r . B l o c k i n g b u f f e r w a s r e m o v e d a n d 5 0 p l o f e a c h a n t i g l o b u l i n r e a g e n t w e r e a d d e d a t i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s f r o m 0 . 1 t o 1 . 2 p g / m l . A f t e r a 4 h r i n c u b a t i o n , t h e w e l l s W e r e w a s h e d 5 t i m e s w i t h P B S / B S A b e f o r e r e m o v a l a n d t r a n s f e r t o a g a m m a c o u n t e r . D O s e - r e s p o n s e C u r v e s T h e d e t e c t i o n o f i n c r e a s i n g a m o u n t s o f P S A I g b y t h e a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s w a s a s S e s s e d u n d e r s t a n d a r d a s s a y c o n d i t i o n s . S p A a n d t h e p o l y c l o n a l a n t i - I g G a n t i b o d i e s W e r e d i r e c t l y c o m p a r e d u s i n g n o r m a l fi x e d p l a t e l e t s i n c u b a t e d w i t h i n c r e a s i n g a m o u n t s . 3 : t t t e d t o c o a t d e e r :.. r e c a l l s : t h e r e w a s r A r e f e r e n c e r a t r a t s . h a l f o f e a c h 51: 5-~‘~'C until u s e .‘l‘atretitly with w - P C « a t e : f u r y » ' for ant: c d e ‘ r k L “ . 5 3 ; l ‘1‘ . 9 1 0 1 1 1 7 1 1 0 " In m y C a S e s s . t ‘ l . » . . i P C p a t i n a . a n d b } t 7 : 1 p o s i t i t i t y f o r P S A l r . ' . . E 1 . . O n p i a l C S & S 1 e L i f t e d o f l ' a n a j g o r T h e i n t e t a s s a } 3 : 1 0 5 r e p e a t e d u s e h 3 ‘ “ ? t t e e n c e r a n g e ’ 2 5 » ‘ 5 4 : ) ; : b . P S ' 1 1 5 1 5 5 7 2 1 3 a s s 5 ‘ 5 . . . t - ' “ - ‘ ~ * C t i r e . - I g . w e » . \ ‘ J - l l . a ‘ . 2 4 2 o f P C p l a s m a , a n d b y u s i n g i n c r e a s i n g n u m b e r s o f p l a t e l e t s f r o m a d o g w i t h c l i n i c a l I M T a n d p o s i t i v i t y f o r P S A I g . S i m i l a r s t u d i e s w e r e d o n e w i t h I g G n o n s p e c i fi c a l l y c o a t e d o n t o I m m u l o n p l a t e s a s d e s c r i b e d a b o v e , e x c e p t t h a t d i l u t i o n s o f t h e 1 0 p g / m l I g G s o l u t i o n w e r e u s e d t o c o a t d e c r e a s i n g a m o u n t s o f I g G o n t o t h e w e l l s . C o e f fi c i e n t o f v a r i a t i o n T h e i n t e r a s s a y a n d i n t r a - a s s a y c o e f fi c i e n t s o f v a r i a t i o n ( C V s ) f o r t h e a s s a y w e r e b a s e d o n r e p e a t e d u s e o f t h e P C p l a s m a . N o C V c o u l d b e c a l c u l a t e d f o r t h e u s e o f a n t i - p , b e c a u s e t h e r e w a s n o p o s i t i v e c o n t r o l f o r t h e a n t i - p a n t i b o d y i n t h i s a s s a y . R e f e r e n c e r a n g e A r e f e r e n c e r a n g e w a s e s t a b l i s h e d i n 2 0 c l i n i c a l l y h e a l t h y d o g s o f a v a r i e t y o f b r e e d s , h a l f o f e a c h g e n d e r . T h e s t a n d a r d a s s a y m e t h o d w a s u s e d w i t h b l o o d m a i n t a i n e d a t 3 7 ° C u n t i l u s e w i t h i n 3 h r o f c o l l e c t i o n . T h e r e f e r e n c e r a n g e w a s e s t a b l i s h e d c o n c u r r e n t l y w i t h P C s t a n d a r d c u r v e s s o t h a t t h e c u t - o f f v a l u e u s i n g S p A c o u l d b e a d j u s t e d f o r a n y d e c r e a s e d r e a c t i v i t y o f t h e d e t e c t i n g a n t i b o d i e s t h a t m i g h t o c c u r w i t h s t o r a g e . C l i n i c a l e v a l u a t i o n P S A I g w a s a s s a y e d i n 4 3 d o g s e v a l u a t e d f o r t h r o m b o c y t o p e n i a . S p A a l o n e w a s u S e d i n e a r l y c a s e s , S p A a n d a n t i - 7 l a t e r , a n d fi n a l l y a n t i - p w a s a d d e d t o t h e a s s a y P r o c e d u r e . D i a g n o s e s o f I M T w e r e b a s e d o n e x c l u s i o n o f o t h e r k n o w n c a u s e s o f t 1 l l ‘ o m b o c y t o p e n i a a n d o n r e s p o n s e t o t h e r a p y . I n a d d i t i o n t o r o u t i n e s e r u m c h e m i s t r i e s i c o n p h e l e t o e f b e l n t e l l s w e r e : d t o o f h t S e t r o e t o d a e o o p 2 d t f y 0 c r e o r n r 5 5 ; n 2 ? t c 3 e r s 2 a r : 5 1 1 1 5 r e 3 s p o r t e d o n l y f o r u 5713-53 W e r e s u r f a c e F i l ..§.e..ll. 1 ‘ l ‘ triadiolabel It t h e r e t w i t h ‘1 R t s u l t s 1 . 7 . 7 . 5 5 : C o n t r o l T h e p o s i t i y e c . : i t t e r o f P B l g G . l 3 1 3 1 7 . " d a t a n o t s h o w r w i t h d i d n o t r e a c t 5 . _ ‘ “ , 3 ~ ‘ ‘ ‘ “ m e n : _ ‘ - ~ 2 4 3 a n d c o m p l e t e b l o o d c o u n t s , c o a g u l a t i o n p r o fi l e s w e r e u s u a l l y r u n . T i t e r s f o r E h r l i c h i a c a n i s w e r e o f t e n d e t e r m i n e d , a n d t e s t s f o r a n t i n u c l e a r a n t i b o d i e s a n d l u p u s e r y t h e m a t o s u s ( L E ) c e l l s w e r e o f t e n d o n e . B o n e m a r r o w b i o p s i e s w e r e t y p i c a l l y d o n e o n l y w h e n r e s p o n s e t o t h e r a p y w a s s l o w , o r w h e n t h e r e w e r e m u l t i p l e c y t o p e n i a s . T e s t s a m p l e s c o n s i s t e d o f 5 t o 2 0 m l c i t r a t e d b l o o d ( 0 . 3 2 % ) d r a w n b y s y r i n g e o r v a c u u m t u b e . D a t a a r e r e p o r t e d o n l y f o r u n r e f r i g e r a t e d s a m p l e s p r o c e s s e d w i t h i n 3 h r a n d w a r m e d t o 3 7 ° C . R e s u l t s P o s i t i v e C o n t r o l T h e p o s i t i v e c o n t r o l p l a s m a w a s f r o m a c o c k e r s p a n i e l w i t h c l i n i c a l I M T a n d a h i g h t i t e r o f P B I g G . T h e b i n d i n g o f t h i s a n t i b o d y t o p l a t e l e t s r e a c h e d s a t u r a t i o n w i t h i n 3 0 m i n ( d a t a n o t s h o w n ) , a n d i t w a s d e t e c t a b l e w i t h S p A a n d a n t i - 7 b u t n o t a n t i - p . T h e a n t i b o d y d i d n o t r e a c t w i t h e r y t h r o c y t e s i n d i r e c t b i n d i n g o r a d s o r p t i o n s t u d i e s . W h e n p l a t e l e t s w e r e s u r f a c e - l a b e l e d w i t h 1 2 5 i o d i n e , t h e a n t i b o d y i m m u n o p r e c i p i t a t e d G P I b ( F i g u r e 2 . 1 ) . I t t h e r e f o r e r e a c t e d w i t h G P I b o r w i t h p a r t o f t h e G P I b c o m p l e x t h a t d o e s n o t r a d i o l a b e l w i t h 1 2 5 i o d i n e a n d t h a t d o e s n o t d i s s o c i a t e f r o m i t w i t h T r i t o n X - 1 0 0 t r e a t m e n t . 2 2 ' 2 3 2 0 5 - l l 6 - 9 7 ~ 6 6 ~ 2 4 4 R e d u c e d N o n r e d u c e d F i g u r e 2 . 1 . A u t o r a d i o g r a p h o f 1 2 5 I - l a b e l e d p l a t e l e t s u r f a c e p r o r e i n s i m m u n o p r e c i p i t a t e d b y t h e a s s a y p o s i t i v e c o n t r o l p l a s m a ( A ) . P r o t e i n s w e r e s e p a r a t e d b y S D S - P A G E u n d e r r e i d u c i n g a n d n o n r e d u c i n g c o n d i t i o n s o n a 5 - 1 2 % g r a d i e n t g e l . N e g a t i v e c o n t r o l s w e r e n O l ‘ m a l c a n i n e p l a s m a ( B ) a n d P B S ( C ) . L a b e l e d p l a t e l e t l y s a t e s ( D ) h a d t h r e e p r e d o m i n a n t b a n d s ( n o n r e d u c e d ) c o r r e s p o n d i n g i n d e s c e n d i n g o r d e r o f m o l e c u l a r m a s s ‘ 0 g l y c o p r o t e i n s I , I I , a n d I I I . m a 8 9 3 3 % 5 , “ h a s £ 3 3 8 3 3 h e . . . “ 3 % . . 9 2 . . “ 5 . 3 2 8 % . i n . “ a n ” . . . . 5 5 5 8 $ 3 8 3 . ? a : 2 4 5 F i x a t i o n W h e n n o r m a l p l a t e l e t s w e r e w a s h e d a n d s t o r e d a t 4 ° C i n a s s a y b u f f e r , t h e d e t e c t a b l e P S A I g d e c r e a s e d d a i l y . M i c r o s c o p i c a l l y , t h e p l a t e l e t s a p p e a r e d t o f r a g m e n t d u r i n g s t o r a g e . W h e n u s e d a s n o r m a l t e s t p l a t e l e t s f o r d e t e c t i n g P B I g i n p l a s m a , s t o r e d p l a t e l e t s a l s o y i e l d e d d a i l y d e c r e a s e s i n d e t e c t a b l e P B I g w i t h p o s i t i v e p l a s m a s a m p l e s ( F i g u r e 2 . 2 a , b ) . T h i s l a c k o f r e p r o d u c i b i l i t y w i t h s t o r e d p l a t e l e t s i n i t i a l l y h a m p e r e d e f f o r t s t o o p t i m i z e t h e a s s a y c o n d i t i o n s a n d s t a n d a r d i z e t h e r e s u l t s . O O . 2 4 6 § 2 a a c o \ 0 o . 2 C C F i g u r e 2 . 2 . D e c r e a s i n g r e a c t i v i t y o f w a s h e d c a n i n e p l a t e l e t s w i t h r e f r i g e r a t o r s t o r a g e f o r 4 d a y s . R e a c t i v i t y w a s t e s t e d w i t h a h u m a n a n t i - P l A l a n t i b o d y ( a ) a n d t h e p o s i t i v e c o n t r o l c a n i n e a u t o a n t i b o d y ( b ) . D a t a w e r e g e n e r a t e d i n d u p l i c a t e . b " C 3 0 ‘ 0 E 5 n q 2 0 0 . U ) \ 0 o . 1 0 2 4 7 8 + d a y O + d a y 1 5 + d a y 4 ' o C 3 3 < 4 T a . a ) o \ ° 2 + — 0 ‘ i ‘ ‘ 0 . 0 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 1 . 0 p l a s m a v o l u m e ( p l ) 4 0 + d a y 0 + d a y 1 t : c 3 8 < 2 0 h — o . a ) ° \ ° 1 0 _ / o l l 1 l 3 l 0 . 0 0 5 1 . 0 1 . 5 2 . 0 2 . 5 3 . 0 3 . 5 p l a s m a v o l u m e ( p l ) F i g u r e 2 . 2 ~ F o r t h e e m 5 3 ‘ . . . p a t i e n t 55' 5 m g r : . u b a t c h e s 7 o f ‘ I t “t i ‘ n . . . 5 - m M » r - s t d a t a r I n a n e f f o r t t c i r a t d u i n i n g £ 0 1 1 5 1 1 : . e x t - r a t i o n s o f g l t i 2 1 ’ . g l u t a r a l d e h y t : fi i d f fl l fi i d t i l fl l é c ; I n t h e 8 4 d : i n l e t s . t h e r e a c h 2 4 8 I n a n e f f o r t t o o v e r c o m e t h i s p r o b l e m , p l a t e l e t fi x a t i o n w a s e v a l u a t e d a s a m e a n s o f m a i n t a i n i n g c o n s i s t e n t p l a t e l e t r e a c t i v i t y . P i l o t s t u d i e s w i t h s e v e r a l fi x a t i o n t i m e s a n d c o n c e n t r a t i o n s o f g l u t a r a l d e h y d e a n d p a r a f o r m a l d e h y d e s u g g e s t e d t h a t 3 0 m i n fi x a t i o n i n 0 . 0 1 % g l u t a r a l d e h y d e m i g h t s u c c e s s f u l l y m a i n t a i n p l a t e l e t r e a c t i v i t y . U s e o f 1 a n d 2 % p a r a f o r m a l d e h y d e c a u s e d p l a t e l e t c l u m p i n g w h i c h w a s n o t e d m i c r o s c o p i c a l l y . I n t h e 8 4 d a y t e m p o r a l s t u d y w i t h fi x e d ( 0 . 0 1 % g l u t a r a l d e h y d e ) a n d u n fi x e d p l a t e l e t s , t h e r e a c t i v i t y o f u n fi x e d p l a t e l e t s d e c r e a s e d r a p i d l y o v e r t h e fi r s t w e e k o f s t o r a g e . F o r t h e e n t i r e 2 8 o r 8 4 d a y s t e s t e d , fi x e d p l a t e l e t s m a i n t a i n e d r e a c t i v i t y t o P B I g i n p l a s m a f r o m a d o g w i t h I M T , f r o m a r a b b i t i m m u n i z e d w i t h c a n i n e p l a t e l e t s , a n d f r o m a h u m a n p a t i e n t w i t h p o s t t r a n s f u s i o n p u r p u r a a n d a n t i - P l A l a n t i b o d i e s ( F i g u r e 2 . 3 ) . S i n g l e b a t c h e s o f fi x e d p l a t e l e t s g a v e r e p r o d u c i b l e r e s u l t s w i t h t h e P C a n t i b o d y f o r a t l e a s t 2 y e a r s ( d a t a n o t s h o w n ) . d n u o b A p S 6 9 ! I ( O r ( 2 4 9 a g . i ‘ E . 5 ? ? . b E . F i g u r e 2 . 3 . R e a c t i v i t y o f fi x e d p l a t e l e t s t o a ) t h e p o s i t i v e c o n t r o l c a n i n e p l a s m a , b ) 5 ; h u m a n a n t i - P l A l p l a s m a , a n d c ) r a b b i t a n t i - [ c a n i n e p l a t e l e t ] s e r u m w a s c o m p a r e d t o w e e k - g . o l d u n fi x e d p l a t e l e t s ( d a s h e d l i n e s ) . R e a c t i v i t y w a s a s s e s s e d o v e r 8 4 ( a , b ) o r 2 8 ( c ) d a y s . 9 : E r r o r s ( i S . D . ) a r e s h o w n f o r t h e u n fi x e d p l a t e l e t s a n d f o r t h e l o w e s t c u r v e i n t h e fi x e d ° p l a t e l e t g r o u p s . c d n u o b A p S % I 5 d n u o b A 8 p S % 2 5 0 8 ‘ 6 1 ( A ) O N 0 | 8 + d a y 0 * d a y ? “ D ' d a y 2 1 * d a y 5 6 * d a y 8 4 9 " u n f i x e d . 5 O I 0 1 d 0 ! l J 1 L 0 0 O 0 . 6 0 . 9 p l a s m a v o l u m e ( p l ) 1 . 2 1 . 5 2 0 . 5 0 ‘ ' O ' d a y o * d a y 7 * d a y 2 1 ' 0 7 d a y 5 6 + d a y 8 4 * u n f i x e d % S p A b o u n d ' 2 0 . 1 U I 0 . 8 1 . 2 p l a s m a v o l u m e ( p l ) 1 . 6 2 . 0 + d a y 0 * d a y 7 ' 0 ' d a y 2 1 ' ° ' d a y 2 8 * u n f i x e d 5 b — _ _ — — X ’ . — X - . . r - " ’ o r # 1 l . I l J l I 0 . 0 2 . 5 5 . 0 7 . 5 1 0 . 0 1 2 . 5 1 5 . 0 1 7 . 5 2 0 . 0 2 2 . 5 p l a s m a v o l u m e ( n l ) F i g u r e 2 . 3 e n a c t w i t h p l a s m a a n y t o r s i o n / t s S t a p l e S t o r a g e a n d T h e d u r a t i o n a ‘ f c c t e d t h e r e s u l t s a z r s p e c i t i c b i n d i n g 2 5 1 A s s a y c o n d i t i o n s S a m p l e S t o r a g e a n d A s s a y T e m p e r a t u r e s T h e d u r a t i o n a n d t e m p e r a t u r e o f s a m p l e s t o r a g e , a n d t h e a s s a y t e m p e r a t u r e g r e a t l y a f f e c t e d t h e r e s u l t s f o r t h e d i r e c t a n d i n d i r e c t a s s a y s . W i t h e a c h a s s a y , i n c r e a s e d n o n s p e c i fi c b i n d i n g o f i m m u n o g l o b u l i n o c c u r r e d w h e n e v e r p l a t e l e t s h a d p r o l o n g e d c o n t a c t w i t h p l a s m a a t 4 ° C o r R T . I n i r e c t A s s a y N o r m a l p l a s m a s t o r e d i n t h e r e f r i g e r a t o r o r a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 2 d a y s h a d c o n s i d e r a b l y m o r e P B I g t h a n p a i r e d f r e s h - f r o z e n s a m p l e s w h e n a s s a y e d a t r o o m t e m p e r a t u r e ( T a b l e 2 . 1 ) . T h i s n o n s p e c i fi c b i n d i n g w a s m a r k e d l y r e d u c e d b y w a r m i n g t h e p l a s m a t o 3 7 ° C a n d m a i n t a i n i n g . a 3 7 ° C a s s a y t e m p e r a t u r e u n t i l a f t e r t h e u n b o u n d p l a s m a w a s r e m o v e d f r o m t h e a s s a y p l a t e l e t s b y w a s h i n g ( T a b l e 2 . 1 ) . T h e n o n s p e c i fi c b i n d i n g i n f r e s h - f r o z e n p l a s m a s a m p l e s w a s a l s o r e d u c e d b y t h i s p r o c e d u r e . T a b l e 3 . 1 . E f f : o n f " 3 3 : 3 3 5 1 3 1 2 2 8 3 ' 2 1 . 9 1 1 1 1 6 2 5 2 T a b l e 2 . 1 . E f f e c t s o f p l a s m a s t o r a g e t e m p e r a t u r e a n d p l a s m a i n c u b a t i o n t e m p e r a t u r e o n S p A — d e t e c t a b l e p l a t e l e t - b i n d a b l e i m m u n o g l o b u l i n f o r t h r e e d o g s . % S p A b o u n d - _ l - S . D . * p l a s m a D o g 1 D o g 2 D o g 3 s t o r a g e t e m p e r a t u r e R T l 3 7 ° C 2 R T 3 7 ° C R T 3 7 ° C 4 ° C 1 6 . 5 2 . 9 1 6 . 2 2 . 2 1 8 . 1 3 . 9 i 2 . 0 : t 0 . 6 i - 0 . 2 i 0 . 1 i 0 . 6 : l : 0 . 7 R T 1 4 . 4 3 . 4 9 . 2 2 . 8 1 9 . 4 6 . 1 i - 1 . 2 : 1 ; 0 . 1 i 0 . 3 i 0 . 1 i 1 . 7 : 1 ; 0 . 4 - 6 5 ° C 5 . 1 1 . 5 1 . 8 1 . 1 7 . 6 2 . 2 i 0 . 1 i 0 . 1 i 0 . 2 i 0 . 3 i 0 . 4 i 0 . 5 * m e a n s o f t r i p l i c a t e s 1 R T = a s s a y d o n e c o m p l e t e l y a t R T 2 3 7 ° C = a s s a y d o n e a t 3 7 ° C u n t i l a f t e r p l a s m a w a s r e m o v e d f r o m a s s a y p l a t e l e t s b y w a s h i n g T o f u r t h e r i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t s o f s a m p l e s t o r a g e t e m p e r a t u r e o n P B I g r e s u l t s g e n e r a t e d w i t h a 3 7 ° C p r i m a r y i n c u b a t i o n t e m p e r a t u r e , t h e P B I g i n w h o l e b l o o d a n d p l a s m a s a m p l e s s t o r e d a t R T , 4 ° C , a n d - 6 5 ° C w e r e c o m p a r e d o v e r t i m e f o r 3 d o g s ( F i g u r e 2 . 4 ) . N o r m a l p l a s m a s a m p l e s s t o r e d e i t h e r a t 4 ° C o r a t R T u s u a l l y h a d p r o g r e s s i v e i n c r e a s e s i n P B I g s o m e t i m e s b e g i n n i n g w i t h i n 2 4 h r . T h e s e i n c r e a s e s w e r e l e s s m a r k e d t h a n a t l o w e r a s s a y t e m p e r a t u r e s . T h e i n c r e a s e d P B I g c o u l d b e r e m o v e d b y p l a s m a fi l t r a t i o n t h r o u g h a 0 . 2 2 p m fi l t e r . W h e n s a m p l e s w e r e s t o r e d a t 4 ° C o r R T a s w h o l e b l o o d i n s t e a d o f p l a s m a , P B I g r e s u l t s w e r e r e l a t i v e l y l o w a n d s t a b l e , s i m i l a r t o p l a s m a s t o r e d a t - 6 5 ° C . d n u o b A p S 5 ‘ d n u o b A p S % d n u o b A p S 6 ’ 2 5 3 F i g u r e 2 . 4 . C o m p a r i s o n o f s a m p l e s t o r a g e c o n d i t i o n s o n S p A - d e t e c t a b l e P S A I g f o r t h r e e n o r m a l d o g s ( a , b , c ) . S a m p l e s w e r e t e s t e d f r e s h ( F ) a n d t h e n d a i l y w i t h s t o r a g e a s r e f r i g e r a t e d w h o l e b l o o d ( R W B ) , r o o m t e m p e r a t u r e w h o l e b l o o d ( R T W B ) , r e f r i g e r a t e d p l a s m a ( R P ) , r o o m t e m p e r a t u r e p l a s m a ( R T P ) , a n d p l a s m a f r o z e n a t - 6 5 ° C . I n e a c h g r o u p , c o n s e c u t i v e b a r s r e p r e s e n t c o n s e c u t i v e d a y s . T h e d a y 5 b a r s f o r R P a n d R T P a r e d i v i d e d , t h e l o w e r p o r t i o n r e p r e s e n t i n g P S A I g a f t e r s a m p l e fi l t r a t i o n ( 0 . 2 2 p m fi l t e r ) . m m v d s l l p u n o q N S 9 ‘ p u n o q N S 9 5 n I - A I A V o I f k l . 2 5 4 1 8 1 5 - - 6 5 P a s ? R T P I . J l N O F i g u r e 2 . 4 T o d e t e r r r 1 3 7 $ 3 1 4 T . L h : a n t - u d e t e c t o r s 5 a k g o u n d f o r { 1 2 5 5 T o d e t e r m i n e t h e c l a s s o f i m m u n o g l o b u l i n d e p o s i t e d o n fi x e d p l a t e l e t s b y p l a s m a s t o r e d a t 4 ° C , t h e P B I g i n t h e p l a s m a o f t h r e e d o g s w a s a s s e s s e d w i t h S p A , a n t i - 7 , a n d a n t i - u d e t e c t o r s ( T a b l e 2 . 2 ) . T h e S p A - b i n d a b l e P B I g , a v e r a g i n g 1 1 . 4 t i m e s t h e b a c k g r o u n d f o r fi x e d p l a t e l e t s a l o n e , w a s d u e p r i n c i p a l l y t o I g M w h i c h w a s d e t e c t e d a t a n a v e r a g e o f 5 . 6 t i m e s t h e b a c k g r o u n d a m o u n t . M i n i m a l P B I g G w a s p r e s e n t i n t h e s e n o r m a l s a m p l e s , b e i n g d e t e c t e d a t a n a v e r a g e o f o n l y 1 . 4 t i m e s b a c k g r o u n d . T a b l e 2 . 2 . D e t e r m i n a t i o n o f t h e c l a s s o f p l a t e l e t - b i n d a b l e i m m u n o g l o b u l i n r e s p o n s i b l e f o r n o n s p e c i fi c b i n d i n g . % b o u n d i S . D . * S p A a n t i - 7 a n t i - p B u f f e r 0 . 5 : I : 0 . 0 0 . 8 i 0 . 0 1 . 2 : t 0 . 2 P l a s m a l * * 5 . 0 i 0 . 3 1 . 5 : 1 ; 0 . 2 7 . 2 d : 0 . 4 P l a s m a 2 6 . 3 : t 0 . 3 1 . 0 : 1 : 0 . 2 5 . 7 i 0 . 2 P l a s m a 3 5 . 8 : 1 ; 0 . 1 0 . 8 i 0 . 3 7 . 2 : } ; 0 . 3 * m e a n s o f t r i p l i c a t e s * * p l a s m a s a m p l e s f r o m 3 n o r m a l d o g s h a d b e e n s t o r e d 2 4 h r a t 4 ° C a n d 5 # 1 e a c h w e r e a s s a y e d w i t h a 3 7 ° C p r i m a r y i n c u b a t i o n t e m p e r a t u r e D i r e c t A s s a y W i t h p l a t e l e t s f r o m n o r m a l d o g s , P S A I g c o n s i s t e n t l y i n c r e a s e d w i t h b l o o d s t o r a g e t i m e , b u t m u c h m o r e w i t h b l o o d s t o r e d a t 4 ° C o r R T t h a n a t 3 7 ° C ( T a b l e 2 . 3 ) . T h e i n c r e a s e s i n P S A I g b e g a n w i t h i n h o u r s o f b l o o d c o l l e c t i o n , t h o u g h t o v a r i a b l e d e g r e e s a m o n g d o g s , a n d t h e y w e r e p r o g r e s s i v e . B l o o d r e f r i g e r a t i o n g e n e r a l l y c a u s e d t h e g r e a t e s t i n c r e a s e s . A f t e r 6 . 5 h r o f r e f r i g e r a t i o n , t h e S p A - b i n d a b l e P S A I g f o r d o g 2 h a d i n c r e a s e d t o 1 5 t i m e s t h a t o f f r e s h p l a t e l e t s . B y 2 7 h r , t h e S p A - b i n d a b l e P S A I g o f f fi g e r a t c o m p e i t d e u l b p e d r a t e i i 1 y o f a n n a : a c c b u t t h e P i g i n c r e a s e d 1 3 7 2 C f o r m o r e t i . . ' 3 ' . “ M o d s . 3 1 1 9 3 7 . 1 0 “ p r C 3 3 3 . 3 1 5 5 b fi a u s e F 2 5 6 r e f r i g e r a t e d p l a t e l e t s f r o m d o g 1 w a s 6 0 t i m e s t h e f r e s h v a l u e . T h e s e i n c r e a s e s w e r e a c c o m p a n i e d b y i n c r e a s e s i n I g G a n d I g M a s d e t e c t e d b y t h e a n t i - y a n d a n t i — p . a n t i b o d i e s , b u t t h e n a t u r e o f t h e s e r e a g e n t s d i d n o t a l l o w q u a n t i t a t i o n ( s e e b e l o w ) . F o r b o t h d o g s , P S A I g i n c r e a s e d l i t t l e i n 1 3 h r s a m p l e s s t o r e d a t 3 7 ° C . H o w e v e r , s t o r a g e o f b l o o d a t 3 7 ° C f o r m o r e t h a n a f e w h o u r s m a r k e d l y d e c r e a s e d p l a t e l e t y i e l d s a n d a l t e r e d c e l l c e n t r i f u g a t i o n p r o p e r t i e s . S i m i l a r l y , p l a t e l e t y i e l d s w e r e d e c r e a s e d f o r r e f r i g e r a t e d s a m p l e s b e c a u s e p l a t e l e t s s e p a r a t e d m o r e w i t h t h e b u f f y c o a t s . n I m m ' 1 ) [ ‘ ( . . 7 ‘ " l l i f l y ' m d n m u n h . ' 7 ‘ ( ' " . . ' R ' ( " 7 - n 4 ‘ t l 3 l l l l l l ‘ l v l l l l ‘ l l l u t u - c n n a l l ‘ O Q I I J I D . l E , n a h l ' t ' t l l ' I l r ' ( e " 8 4 ) r h ( ' u m l c g m n l S ( l c ‘ t l ' t ' t u l v l t u p l a n - h r ! s u n “ . . . a s u s e - « I c u u c d i l l l I I I l l l I I ) } _ [ I l ) l ‘ | l l l l l l u v r l n n l n u l t h v p fi . R I " C ° 2 . 0 A 1 — 7 . 2 — 3 ) h s e r N . 4 ) h s e f 1 2 r 2 3 p 0 0 0 - C 1 ( ( 0 f 0 1 1 1 i ° 3 t 6 6 . 1 0 — — n 4 0 . a 4 . 0 . . 1 1 1 1 2 7 5 . 1 1 . 3 1 1 4 2 3 0 0 0 0 0 T 1 1 1 1 1 R 1 8 8 3 4 . . . . . 2 5 3 7 4 2 0 1 3 . 0 1 C 0 . . ° 1 A A 1 0 0 1 7 1 . . 1 — — 3 . . N N 1 1 * ) . D h s e ) h s . e r S f 0 1 3 r 1 7 . ( 0 0 0 f ( — C 1 0 i ° 1 1 0 1 t 4 . 1 0 5 4 1 — — d a . . 8 0 n . 0 n 1 0 0 5 1 u 1 6 o b % 0 . . 1 0 T 0 1 1 R 1 0 9 7 . . 0 1 1 0 1 1 . 0 0 A p S C ° 7 3 ) r h ( e 1 1 1 . 0 0 0 1 1 1 0 9 6 . . 0 4 1 = e . r u A t . a N r e , m 0 0 i 0 . . 5 0 5 0 0 s p e . . e m r t 3 3 7 . . . . 7 t e u 0 0 6 6 1 1 a 2 2 t e g a r o t S 1 2 g g o o c i l t a e r p g e i a p r r m t o e t t f s o m e o s l n p o a m r e a m s = D D T * * R T a b l e 2 . 3 . E f f e c t s o f s t o r a g e t i m e a n d t e m p e r a t u r e o n d e t e c t a b l e p l a t e l e t s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n f o r n o r m a l d o g s . O R T ' 4 ° C 0 . 3 1 0 . 0 ( f r e s h ) 0 . 2 1 0 1 N . A . 1 . 4 1 0 2 0 5 1 0 . 1 1 8 1 1 1 . 4 — 0 . 7 1 0 3 ( f r e s h ) 2 . 3 1 0 6 1 0 9 1 0 . 9 N . A . 6 . 3 1 0 2 — 1 . 1 1 0 2 1 3 . 0 1 0 4 — — 0 . 6 1 0 0 1 . 7 1 0 1 1 . 6 1 0 1 N . A . 1 . 7 1 0 1 n o t a t t e m p t e d , — = i n s u f fi c i e n t p l a t e l e t s T h e n e g a t i v e c o n t r o l b l a n k s g a v e s i m i l a r r e s u l t s f o r e a c h a s s a y , r a n g i n g f r o m 0 . 3 t o 0 . 4 % f o r S p A , 0 . 9 t o 1 . 1 % f o r a n t i - y , a n d f r o m 1 . 1 t o 1 . 4 % f o r a n t i - p . 2 5 7 I t e m 1 1 2 3 8 1 0 n o . 1 : ’ C E 1 V E 1 5 1 7 - 5 1 4 2 0 1 9 . 2 3 ( F 3 1 . 3 1 % t h a n d i d 1 1 : 2 3 1 n g 3 1 6 b l t B e c a u s e P S A I g r e s u l t s 1 0 1 : 1 3 4 h r . F o r 1 2 1 1 1 0 1 1 4 h r 3 3 1 E t ' f m fi g . R e f : 2 5 8 B e c a u s e s o m e c l i n i c a l s a m p l e s w e r e d i f fi c u l t t o o b t a i n f r e s h , w e d e t e r m i n e d t h e P S A I g r e s u l t s f o r n o r m a l d o g s u s i n g s a m p l e s t h a t w e r e m a i n t a i n e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 2 4 h r . F o r 1 0 d o g s , t h e s e v a l u e s w e r e c o m p a r e d t o P S A I g r e s u l t s f o r f r e s h s a m p l e s a n d f o r 2 4 h r s a m p l e s m a i n t a i n e d a t R T b u t h e a t e d t o 3 7 ° C f o r 3 0 m i n p r i o r t o p l a t e l e t h a r v e s t i n g . R e f r i g e r a t i o n a n d 3 7 ° C s t o r a g e w e r e n o t e v a l u a t e d i n t h i s s t u d y b e c a u s e o f m a r k e d d e c r e a s e s i n p l a t e l e t y i e l d s o c c u r r i n g w i t h t h e s e s t o r a g e c o n d i t i o n s . F o r s a m p l e s f r o m t h e s e 1 0 n o r m a l d o g s , t h e m e a n S p A - b i n d a b l e P S A I g f o r u n h e a t e d 2 4 h r s a m p l e s ( 7 . 0 % ) w a s 1 7 . 5 t i m e s t h e m e a n f o r f r e s h s a m p l e s ( 0 . 4 % ) , a n d t h e v a l u e s r a n g e d f r o m 1 . 4 t o 1 9 . 2 % ( F i g u r e 2 . 5 ) . I g M a p p e a r e d t o c o n t r i b u t e m o r e ( 4 . 2 x f r e s h ) t o t h e i n c r e a s e t h a n d i d I g G ( 2 . 8 x f r e s h ) , t h o u g h a g a i n , t h e s e r e s u l t s w e r e n o t q u a n t i t a t i v e . B y h e a t i n g t h e b l o o d f o r 3 0 m i n b e f o r e p l a t e l e t s w e r e c o l l e c t e d , t h e m e a n S p A - b i n d a b l e P S A I g w a s d e c r e a s e d b y m o r e t h a n h a l f , b u t i t w a s s t i l l 7 . 5 t i m e s t h a t o f f r e s h p l a t e l e t s . d n u o b % 1 5 - ” i t ? " 7 5 I + “ - ~ L . ‘ “ 1 1 1 3 1 n ? “ 3 1 1 1 1 0 1 3 w a 1 0 m « : 5 » , m g d n u o b % 2 5 9 1 5 1 : 1 F r e s h D 2 4 1 “ . R T h a r v e s t " " . 2 4 h r . 3 7 ° C h a r v e s t 1 O — S p A a n t i - I g G a n t i - u F i g u r e 2 . 5 . I n c r e a s e d P S A I g ( % b o u n d 1 S D . ) w i t h r o o m t e m p e r a t u r e ( R T ) s t o r a g e o f w h o l e b l o o d f r o m t e n n o r m a l d o g s . P l a t e l e t s w e r e h a r v e s t e d a n d a s s a y e d f r e s h , a t 2 4 h r w i t h o u t w a r m i n g t o 3 7 ° C , a n d a t 2 4 h r a f t e r w a r m i n g t h e b l o o d t o 3 7 ° C f o r 3 0 m i n u t e s . S p A B i n d i n g T h e b i n d t h e s t e w a r d a s s a 2 6 0 m i n i n c u b S n i l a r s t u d i e s v s a n d e d o n l y f t n a g - e n s . P l a s n ; 3 ' 3 m a x i m a l l x 2 6 0 S p A B i n d i n g T h e b i n d i n g o f S p A t o a r e l a t i v e l y l a r g e b u t n o t s a t u r a t i n g a m o u n t o f P S A I g u n d e r t h e s t a n d a r d a s s a y c o n d i t i o n s a p p e a r e d t o b e c o m p l e t e b y 3 0 m i n ( F i g u r e 2 . 6 ) . H o w e v e r , a 6 0 m i n i n c u b a t i o n p e r i o d w a s c h o s e n t o h e l p a s s u r e c o m p l e t e d e t e c t i o n o f P S A I g . S i m i l a r s t u d i e s w e r e n o t d o n e w i t h t h e p o l y c l o n a l a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s b e c a u s e t h e y w e r e i n t e n d e d o n l y f o r q u a l i t a t i v e u s e . O n e h o u r i n c u b a t i o n s w e r e u s e d f o r a l l a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s . P l a s m a i n c u b a t i o n s w e r e a l s o d o n e f o r o n e h o u r b e c a u s e p o s i t i v e a n t i b o d i e s w e r e m a x i m a l l y b o u n d b y 3 0 m i n ( d a t a n o t s h o w n ) . d n u o b A p S % N a r e “ a l l fi r $ 1 1 5 2 6 A ( A ) . T i m l \ o » I c o n l o o d n u T 5 o o b A p o l S c o 6 9 o l t o 2 6 1 — L O l 0 1 1 i l l - 0 1 5 3 0 4 5 6 0 7 5 9 0 1 0 5 1 2 0 S p A i n c u b a t i o n t i m e ( m i n ) F i g u r e 2 . 6 . T i m e t o s a t u r a t i o n f o r t h e b i n d i n g o f S p A t o P S A I g . E r r o r b a r s ( 1 S D . ) a r e s m a l l e r t h a n d a t a s y m b o l s w h e r e n o t s h o w n . : h a r v e s t i n g n : 1 : b e r o u t i n e r 2 6 2 T e s t P l a t e l e t N u m b e r T h e r e w a s a d i r e c t l i n e a r r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e n u m b e r o f P S A I g - p o s i t i v e p l a t e l e t s a s s a y e d a n d t h e P S A I g d e t e c t e d b y S p A ( F i g u r e 2 . 7 ) . B e c a u s e o f t h e d i f fi c u l t y i n h a r v e s t i n g m a n y p l a t e l e t s f r o m s e v e r e l y t h r o m b o c y t o p e n i c d o g s , 5 X 1 0 6 w a s c h o s e n a s t h e r o u t i n e n u m b e r o f p l a t e l e t s t o t e s t . 1 1 1 ' C E : 5 < a ( . 0 c \ : P 1 ; i t ' [ e l e d n u o b A p S % 2 6 3 1 4 * I M T 1 2 1 + N o r m a l 1 0 - l l o l l 0 2 . 5 5 7 . 5 1 0 1 2 . 5 1 5 p l a t e l e t n u m b e r ( m i l l i o n s ) F i g u r e 2 . 7 . D i r e c t r e l a t i o n s h i p b e t w e e n p l a t e l e t n u m b e r a n d S p A - d e t e c t a b l e P S A I g . P l a t e l e t s w e r e f r o m a d o g w i t h c l i n i c a l I M T a n d a n o r m a l d o g . E r r o r b a r s ( 1 S D . ) a r e s m a l l e r t h a n d a t a s y m b o l s w h e r e n o t s h o w n . C ‘ m i i ‘ m r a t i o n I T h e e f f : 0 1 - 5 1 [ h e C O D C E anti { G a t e d O n e ! S o n s ; e m 3 5 3 3 } ? v e e r a z t i o n s V 2 6 1 5 p r i o r [ 0 1 : 1 5 t h e 1 3 1 3 5 1 W h e n m e t e d * 3 } s 1 n e t c n t n p l e t e l s u i c i d e 3 c o n T o a s s c e i i e c t e d f r o m R e s u l t s f o r P S p B I E - P C - s p i k 3 3 1 1 1 2 1 1 1 1 8 3 1 1 0 1 : “ 1 3 1 4 1 1 0 1 S h o w 1 1 1 2 1 1 1 3 1 0 , ; o f c 2 6 4 O t h e r N o n s p e c i fi c b a c k g r o u n d b i n d i n g o f t h e a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s w a s v e r y l o w i n t h e d i r e c t a s s a y . I t w a s h i g h e r i n t h e i n d i r e c t a s s a y , p a r t l y d u e t o p l a s m a a n d d e t e c t o r i n t e r a c t i o n s w i t h t h e w e l l w a l l s . B y r e s u s p e n d i n g p l a t e l e t s a n d r e m o v i n g t h e m f r o m t h e w e l l s p r i o r t o a s s e s s i n g t h e m f o r p l a t e l e t - a s s o c i a t e d r a d i o a c t i v i t y , n o n s p e c i fi c i n t e r a c t i o n s w i t h t h e p l a s t i c w e r e n o t m e a s u r e d . W h e n e r y t h r o c y t e s v i s i b l y c o n t a m i n a t e d p l a t e l e t s a m p l e s , t h e y c o u l d u s u a l l y b e r e m o v e d b y s h o r t , r a p i d d i f f e r e n t i a l c e n t r i f u g a t i o n i n a m i c r o c e n t r i f u g e . W h e n t h e y w e r e n o t c o m p l e t e l y r e m o v e d , t h e y w e r e w a s h e d a n d t e s t e d c o n c u r r e n t l y w i t h p l a t e l e t s t o e x c l u d e a c o n t r i b u t i o n o f t h e e r y t h r o c y t e s t o t h e fi n a l P S A I g r e s u l t s . T o a s s e s s t h e e f f e c t o f l i p e m i a o n r e s u l t s f o r P B I g a n d P S A I g , b l o o d w a s c o l l e c t e d f r o m a n o r m a l d o g i m m e d i a t e l y b e f o r e a n d 9 0 m i n a f t e r t h e d o g w a s f e d c r e a m . R e s u l t s f o r P S A I g a n d P B I g w e r e c o m p a r e d b e t w e e n p r e - a n d p o s t - c r e a m s a m p l e s . F o r P B I g , P C - s p i k e d a n d u n s p i k e d l i p e m i c p l a s m a w e r e t e s t e d u s i n g a m o u n t s o f P C p l a s m a a t t h e t h r e s h o l d o f t h e a s s a y ’ s s e n s i t i v i t y . L i p e m i a d i d n o t a f f e c t t h e r e s u l t s i n t h i s d o g ( d a t a n o t s h o w n ) . E v a l u a t i o n o f a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s C o n c e n t r a t i o n D e p e n d e n c y T h e e f f e c t o f i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s o n d e t e c t i o n o f a c o n s t a n t a m o u n t o f P S A I g w a s e v a l u a t e d f o r S p A a n d t h e a n t i - y a n t i b o d y ( F i g u r e 2 . 8 ) . O v e r t h e c o n c e n t r a t i o n r a n g e t e s t e d , 0 . 1 - 1 . 0 p g / m l , t h e a m o u n t o f S p A t h a t b o u n d t o a n t i b o d y - c o a t e d p l a t e l e t s w a s c o n s t a n t . T h e r e f o r e , t h e p l a t e l e t I g G - t o - S p A b i n d i n g r a t i o a m 3 5 ? H . 9 1 1 ? “ 8 1 . 8 5 2 9 . 5 8 2 % e r m 3 m y . 2 6 5 w a s n o t i n fl u e n c e d b y t h e S p A c o n c e n t r a t i o n . T h e a n t i - 7 d e t e c t o r , h o w e v e r , b o u n d i n c r e a s i n g l y t o t h e P S A I g i n p r o p o r t i o n t o i t s c o n c e n t r a t i o n t h r o u g h m o s t o f t h e c o n c e n t r a t i o n r a n g e t e s t e d . T h e b i n d i n g o f a d i f f e r e n t p o l y c l o n a l a n t i b o d y , a n t i - G , t o I g G - c o a t e d w e l l s a l s o i n c r e a s e d w i t h i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s ( 0 . 1 - 1 . 2 p g / m l ) o f a n t i - G ( d a t a n o t s h o w n ) . ) s d n a s u o h t I 8 ( m p c t e n 2 6 6 O ) O ‘ F S p A + a n t i - I g G _ 0 1 O . 5 O 1 2 0 r - 1 0 - I — — — r 4 + H A I 0 A A l l 0 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 1 d e t e c t o r c o n c e n t r a t i o n ( p g / m l ) F i g u r e 2 . 8 . C o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n c y o f t h e b i n d i n g o f p o l y c l o n a l a n t i — 7 ( a n t i - I g G ) t o P S A I g a s c o m p a r e d t o t h e c o n s t a n t b i n d i n g o f S p A . E r r o r b a r s ( 1 S D . ) a r e s m a l l e r t h a n d a t a s y m b o l s w h e r e n o t s h o w n . B e m a i l “ 353.33- 10 F 1.5:: “ 3 5 jars-tell P e m a i l e d m a r l } L151 3:137.) h1g3 '12. our assai wider r a n g : inrzlgGl all shown... H a n d1 3 1 1 1 0 1 1 1 2 6 7 B e c a u s e t h e c o n c e n t r a t i o n o f S p A d i d n o t a f f e c t i t s b i n d i n g , s m a l l c h a n g e s i n t h e i n c u b a t i o n v o l u m e o f S p A w i t h p l a t e l e t s d i d n o t a f f e c t t h e r e s u l t s . E v e n w h e n S p A w a s a d d e d t o P S A I g - p o s i t i v e p l a t e l e t s i n v o l u m e s r a n g i n g f r o m t h e u s u a l 5 0 p l u p t o 1 5 0 p l , t h e r e w a s l i t t l e t o n o d i f f e r e n c e i n t h e r e s u l t s f o r P S A I g ( d a t a n o t s h o w n ) . D o s e - r e s p o n s e C u r v e s B e c a u s e S p A h a d a c o n s t a n t b i n d i n g r a t i o t o I g G , t h e r e w a s a d i r e c t r e l a t i o n s h i p b e t w e e n P S A I g a n d ' ~ ' % S p A b o u n d " ( F i g u r e s 2 . 3 a n d 2 . 7 ) . T h i s 1 : 1 r e l a t i o n s h i p c o n t r a s t e d w i t h t h a t o f a n t i - G ( F i g u r e 2 . 9 a ) a n d a n t i - 7 ( F i g u r e 2 % ) w h i c h d i d n o t l i n e a r l y d e t e c t l i n e a r i n c r e a s e s i n P S A I g . T h e y o n l y b e g a n t o a p p r o a c h l i n e a r d e t e c t i o n a t v e r y h i g h r a t i o s o f d e t e c t o r t o I g G , w h e n t h e i r b i n d i n g t o I g G a p p r o a c h e d s a t u r a t i o n . I n o u r a s s a y s w i t h I g G n o n s p e c i fi c a l l y a d s o r b e d t o m i c r o t i t e r p l a t e w e l l s w h e r e a m u c h w i d e r r a n g e o f d e t e c t o r z l g G r a t i o s w a s p o s s i b l e , a n d r a t i o s o f a t l e a s t 5 0 0 : 1 ( d e t e c - t o r z l g G ) a p p e a r e d t o b e n e c e s s a r y f o r l i n e a r d e t e c t i o n b y t h e a n t i - G a n t i b o d y ( d a t a n o t s h o w n ) . H o w e v e r , t h e s e p o l y c l o n a l a n t i b o d y d e t e c t o r s p r o d u c e d a g r e a t e r s i g n a l w i t h s m a l l a m o u n t s o f I g G t h a n d i d S p A . 2 6 8 F i g u r e 2 . 9 . L i n e a r b i n d i n g o f S p A t o i n c r e a s i n g P S A I g c o n t r a s t e d w i t h n o n l i n e a r b i n d i n g o f a n t i - G ( a ) a n d a n t i - 7 ( a n t i - I g G ) ( b ) . I n ( a ) . e r r o r b a r s ( 1 S D . ) a r e s m a l l e r t h a n d a t a s y m b o l s w h e r e n o t s h o w n . D a t a i n ( b ) w e r e b a s e d o n d u p l i c a t e d e t e r m i n a t i o n s . 0 o l ( O' d n u o b % 2 6 9 " ' S p A + a n t i - G 4 ° r % b o u n d 8 l N O l 1 0 — 0 L ‘ ' 1 0 5 1 0 1 5 2 0 P S A I g - p o s i t i v e p l a t e l e t s ( m i l l i o n s ) 5 0 . 0 " ' S p A + a n t i - I g G 4 0 . 0 — N . 0 o l 1 0 . 0 - 0 0 ' ' l 1 0 . 0 0 0 . 2 5 0 . 5 0 0 . 7 5 1 . 0 0 P C p l a s m a ( p l ) F i g u r e 2 . 9 : : : ~ n : a i r i i n g P T a b l e 2 . ; “ _ o [ L s - r m . 4 5 « v 3 3 5 c c n s t d e C V s w e r e c . i t : S p A . C i g h e s t c o n ; S c o n c u r r e n ' l a n d - 7 . ) . W r r . 1 5 1 5 “ a s 1 h i m ; “ Z e d f r o i 2 7 0 C o e f fi c i e n t s o f v a r i a t i o n T h e a s s a y C V s i n c r e a s e d w i t h r a d i o a c t i v e d e c a y o f a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s b e c a u s e o f c o u n t i n g e r r o r a t l o w c p m . T h e r e f o r e , t h e c o u n t i n g t i m e w a s e x t e n d e d w h e n d e c a y w a s c o n s i d e r a b l e . T h e C V s f o r S p A a n d a n t i - 7 a r e s h o w n i n T a b l e 2 . 4 . T h e i n t e r a s s a y C V s w e r e c a l c u l a t e d f o r 8 i n d e p e n d e n t a s s a y s o v e r a 2 - m o n t h p e r i o d u s i n g P C p l a s m a . F o r S p A , C V s w e r e c a l c u l a t e d a t e a c h p o i n t o f a s t a n d a r d c u r v e . F o r a n t i - 7 , o n l y t h e h i g h e s t c o n c e n t r a t i o n o f P C p l a s m a w a s u s e d . T h e i n t r a - a s s a y C V s w e r e d e t e r m i n e d f o r 8 c o n c u r r e n t r e p e t i t i o n s o f t h e P C s t a n d a r d c u r v e ( S p A ) o r h i g h e s t c o n c e n t r a t i o n o f P C ( a n t i - 7 ) . W h i l e t h e C V f o r a n t i - u c o u l d n o t b e d e t e r m i n e d f o r t h e P S A I g a s s a y b e c a u s e t h e r e w a s n o p o s i t i v e I g M c o n t r o l , t r i p l i c a t e d e t e r m i n a t i o n s w i t h p l a s m a s a m p l e s c o n t a i n i n g P B I g M w e r e o f s i m i l a r r e p r o d u c i b i l i t y t o t h e r e s u l t s w i t h t h e a n t i - 7 a n t i b o d y . T a b l e 2 . 4 . I n t e r a s s a y a n d i n t r a - a s s a y c o e f fi c i e n t s o f v a r i a t i o n ( % ) f o r S p A a n d a n t i - y d e t e c t o r s . S p A a n t i - 7 h i g h l o w m e a n i n t e r a s s a y 8 . 6 4 . 2 6 . 6 5 . 0 i n t r a - a s s a y 4 . 1 1 . 6 2 . 4 4 . 1 R e f e r e n c e r a n g e P S A I g r e f e r e n c e r a n g e s f o r 2 0 n o r m a l d o g s w e r e g e n e r a t e d u s i n g p l a t e l e t s h a r v e s t e d f r o m b l o o d l e s s t h a n 3 h r o l d a n d m a i n t a i n e d a t 3 7 ° C . T h e s e r e s u l t s w e r e ( m e a n 1 S . D . ) : f o r S p A , 0 . 5 1 0 . 2 ; f o r a n t i - 7 , 0 . 7 1 0 . 2 ; a n d f o r a n t i - p , 1 . 7 1 0 . 6 % . T h e c u t o f f f o r a p o s i t i v e r e s u l t w a s s e l e c t e d a s t h e m e a n p l u s 3 s t a n d a r d 3 5 3 1 3 1 1 0 1 1 5 a ,P.‘ r???‘ l . A . : 1 u p ['0 3 b " I P 1 . . 6 ‘ . 1 % ; A L . a : e " fl . u ::s:ed f o r P “111511311 a n d i a g n O S l S r e c e i v e d 0 1 c o : 1 - » ; {14.111110 d2 O f t l 2 7 1 d e v i a t i o n s . F o r f r e s h s a m p l e s , t h e s e c u t o f f s w e r e 1 . 1 , 1 . 3 , a n d 3 . 5 f o r S p A , a n t i - y , a n d a n t i - u , r e s p e c t i v e l y . I n c o n t r a s t t o t h e s e n o r m a l s a m p l e s , t h e r e w a s s o m e t i m e s a d e l a y o f u p t o a b o u t 3 0 m i n b e f o r e c l i n i c a l b l o o d s a m p l e s w e r e p l a c e d a t 3 7 ° C . C l i n i c a l e v a l u a t i o n T h e d e t e c t a b l e P S A I g o f p o s i t i v e s a m p l e s f r o m d o g s w i t h c l i n i c a l I M T d e c r e a s e d d r a m a t i c a l l y w i t h i n a d a y w h e n w a s h e d t e s t p l a t e l e t s w e r e s t o r e d e i t h e r a t R T o r a t 4 ° C i n a s s a y b u f f e r . S a m p l e s f o r P S A I g w e r e t h e r e f o r e a s s a y e d w i t h i n 3 h r o f s a m p l e p r e p a r a t i o n . T h e c l i n i c a l r e s u l t s a r e t a b u l a t e d i n T a b l e s 2 . 5 a n d 2 . 6 . M a n y d o g s w e r e n o t t e s t e d f o r P S A I g u n t i l t h e r a p y h a d b e g u n , s o t h e p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s a t p r e s e n t a t i o n ( i n i t i a l ) a n d o n t h e a s s a y d a t e ( a s s a y ) o f t e n d i f f e r e d . E x c e p t w h e r e n o t e d , d o g s w i t h a d i a g n o s i s o f I M T w e r e t r e a t e d w i t h p r e d n i s o n e , u s u a l l y a t l m g / l b B I D , a n d m a n y d o g s r e c e i v e d c o n c u r r e n t a n t i b i o t i c s . I n s p o r a d i c c a s e s , v i n c r i s t i n e , c y c l o s p o r i n e , c y c l o p h o s - p h a m i d e , d a n a z o l , a n d a z a t h i o p r i n e w e r e a d d i t i o n a l l y u s e d . O f t h e 2 4 d o g s w i t h c l i n i c a l d i a g n o s e s o f I M T , 2 3 ( 9 6 % ) h a d p o s i t i v e r e s u l t s f o r i n c r e a s e d P S A I g ( T a b l e 2 . 5 ) . T h e s i n g l e d o g t h a t w a s n e g a t i v e ( # 2 4 ) w a s d i s c h a r g e d w i t h i n a d a y a n d l o s t t o f o l l o w - u p b e f o r e r e s p o n s e t o t h e r a p y c o u l d b e e v a l u a t e d ; i t s d i a g n o s i s w a s t h e r e f o r e u n c e r t a i n . O f t h e 1 9 d o g s g i v e n a d i a g n o s i s o t h e r t h a n I M T ( T a b l e 2 . 6 ) , 9 ( 4 7 % ) h a d p o s i t i v e r e s u l t s b a s e d s t r i c t l y o n t h e n o r m a l r e f e r e n c e r a n g e . H o w e v e r , 4 o f t h e 9 p o s i t i v e v a l u e s w e r e c o n s i d e r e d c l i n i c a l l y i n s i g n i fi c a n t ( 1 . 4 , 1 . 5 , 1 . 6 , a n d 1 . 9 % f o r d o g s # 9 , 1 3 , 1 2 , a n d 1 4 , r e s p e c t i v e l y ) a n d l i k e l y t h e r e s u l t o f s l i g h t d e l a y s i n s a m p l e h a n d l i n g . T w o o f t h e r e m a i n i n g 5 d o g s h a d d i a g n o s e s o f i d i o p a t h i c U S $ 5 3 9 @ 5 3 3 2 H E “ . n o , “ w o n “ m e A L h 3 2 L . w a r n ; H o a x / . 2 3 . . 1 5 . 4 . 5 5 ? » 3 5 2 . 4 8 . ” w e . . . “ 5 g m H w e a : g 2 7 2 t h r o m b o c y t o p e n i a a n d n e u t r o p e n i a w h i c h m a y h a v e b e e n i m m u n e — m e d i a t e d . I n o n e o f t h e s e d o g s ( # 1 8 ) , t h e p l a t e l e t a n d n e u t r o p h i l c o n c e n t r a t i o n s i n c r e a s e d d r a m a t i c a l l y w i t h i n 5 d a y s a f t e r p r e d n i s o n e t h e r a p y w a s e v e n t u a l l y i n s t i t u t e d . T h e o t h e r d o g ( # 1 7 ) w a s q u i c k l y d i s c h a r g e d a n d l o s t t o f o l l o w - u p . T h e s e v e n t h d o g ( # 1 9 ) w a s d i a g n o s e d w i t h c h r o n i c r e n a l f a i l u r e . I t s p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s p e r s i s t e d i n t h e 4 5 , 0 0 0 - 7 0 , 0 0 0 / [ 1 . 1 r a n g e u n t i l p r e d n i s o n e t h e r a p y w a s i n s t i t u t e d , a f t e r w h i c h t h e y w e r e 1 1 9 , 0 0 0 / p . l o n d a y 6 a n d 3 1 8 , 0 0 0 / 1 1 1 o n d a y 3 3 . T h i s d o g a l s o m a y h a v e h a d I M T . T h e e i g h t h o f t h e s e 9 d o g s ( # 1 6 ) h a d z i n c - i n d u c e d h e m o l y t i c a n e m i a a n d d e v e l o p e d t h r o m b o c y t o p e n i a t r a n s i e n t l y f o r 1 d a y f o l l o w i n g a t r a n s f u s i o n o f w h o l e b l o o d . T h e d o g w a s p o s i t i v e f o r P S A I g w h i l e t h r o m b o c y t o p e n i c ( 2 7 , 0 0 0 / p 1 ) , b u t w a s n e g a t i v e t h e n e x t d a y w h e n t h e p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n h a d i n c r e a s e d t o 1 0 1 , 0 0 0 / u 1 . T h i s r e a c t i o n i s s i m i l a r t o t h e t r a n s i e n t t r a n s f u s i o n - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a o c c u r r i n g i n d o g s w i t h a n t i b o d i e s t o i n c o m p a t i b l e e r y t h r o c y t e s , 2 “ ' 2 5 a n d i t m a y i n v o l v e i m m u n e a d h e r e n c e a n d t r a n s i e n t i n c r e a s e s i n P S A I g . T h e l a s t o f t h e s e 9 d o g s h a d p y o m e t r a a n d p o s s i b l e s e p t i c e m i a ( # 1 5 ) , a n d a p p e a r e d t o h a v e m i l d b u t r e a l i n c r e a s e s i n P S A I g G a n d P S A I g M . t 1 1 1 ' P t 5 ‘ A ; R : C c C c “ C c . ‘ ' 8 B O . - l l . ' 4 ‘ 1 7 ‘ C o 3 1 1 C o D e . C o T a b l e 2 . 5 . P l a t e l e t s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n ( P S A I g ) 2 7 3 d i a g n o s e d w i t h i m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a . r e s u l t s f o r d o g s P l a t e l e t C o n c e n — P S A I g R e s u l t s t r a t i o n ( a l l ) ( % b o u n d ) B r e e d I n i t i a l A s s a y S p A a n t i - y a n t i - p P l a t e l e t R e s p o n s e s ' 1 . * B e l g i a n S h e e p d o g 7 , 0 0 0 7 , 0 0 0 5 8 . 2 2 4 . 6 1 0 . 5 4 7 , 8 0 0 o n d a y 3 4 7 , 8 0 0 3 3 . 0 1 1 . 2 6 . 6 1 0 4 , 0 0 0 o n w k 3 2 2 0 , 0 0 0 2 . 0 — — 2 2 0 , 0 0 0 o n d a y 4 7 2 . B r i t t a n y S p a n i e l 5 , 0 0 0 5 , 0 0 0 4 1 . 4 1 3 . 8 5 . 1 2 6 4 , 0 0 0 o n d a y 9 3 . * C o c k e r S p a n i e l 9 , 0 0 0 9 , 0 0 0 4 7 . 0 — — 1 0 9 , 0 0 0 o n d a y 3 1 0 9 , 0 0 0 6 . 1 1 1 . 6 2 . 7 2 2 6 , 0 0 0 o n d a y 5 4 . L a b r a d o r R e t r i e v e r 4 , 0 0 0 4 , 0 0 0 2 5 . 0 — — 1 9 8 , 0 0 0 o n d a y 8 ( r e l a p s e ) 1 4 , 0 0 0 7 9 , 0 0 0 4 . 7 8 . 3 2 . 4 2 1 0 , 0 0 0 o n d a y 4 5 . * C o c k e r S p a n i e l 3 7 , 0 0 0 6 5 , 0 0 0 3 4 . 7 2 2 . 0 5 . 5 1 2 6 , 0 0 0 o n d a y 5 6 . D a l m a t i a n 3 , 0 0 0 5 7 , 0 0 0 2 0 . 0 1 0 . 8 3 . 3 1 3 1 , 0 0 0 o n d a y 5 7 . * P o o d l e — m i x 2 3 , 0 0 0 2 6 3 , 0 0 0 2 2 . 1 2 2 . 6 1 . 9 2 6 3 , 0 0 0 o n d a y 7 8 . A u s t r a l i a n S h e p h e r d 1 8 , 0 0 0 n e x t d a y 2 3 . 2 2 6 . 6 2 . 0 1 6 2 , 0 0 0 o n d a y 5 9 . C h e s a p e a k e B a y 5 , 0 0 0 6 6 , 0 0 0 8 . 0 1 9 . 8 6 . 0 1 2 7 , 0 0 0 o n d a y 4 R e t r i e v e r 1 0 . C o c k e r - m i x 8 , 0 0 0 8 , 0 0 0 2 7 . 9 1 9 . 4 4 . 1 5 , 0 0 0 o n d a y 6 l l . C o c k e r S p a n i e l 7 , 0 0 0 7 , 0 0 0 1 . 9 — — 3 9 , 0 0 0 o n d a y 4 3 9 , 0 0 0 — 8 . 6 2 . 5 s e n t h o m e 1 2 . C o c k e r S p a n i e l 1 0 , 0 0 0 1 0 , 0 0 0 9 . 3 9 . 7 — 4 0 , 0 0 0 o n d a y 9 1 3 . C o c k e r S p a n i e l 7 , 0 0 0 1 0 7 , 0 0 0 1 1 . 0 1 8 . 4 — 1 0 7 , 0 0 0 o n d a y 4 l 4 . “ B o r z o i 5 , 0 0 0 5 , 0 0 0 2 1 . 8 2 . 2 — 1 6 0 , 0 0 0 o n d a y 4 1 5 . L a b r a d o r R e t r i e v e r 8 , 0 0 0 8 , 0 0 0 1 0 . 8 — — 2 3 1 , 0 0 0 o n d a y 4 l 6 . C o c k e r S p a n i e l 2 , 0 0 0 6 , 0 0 0 6 0 . 0 — — 2 4 , 0 0 0 o n d a y 3 s e n t h o m e l 7 . * M i x 2 2 , 0 0 0 2 2 , 0 0 0 1 0 . 6 — — 7 6 , 0 0 0 o n d a y 3 1 8 . C o c k e r S p a n i e l 1 5 , 0 0 0 9 , 0 0 0 2 5 . 0 — — 2 0 6 , 0 0 0 o n d a y 5 1 9 . " D a n d i e D i n m o n t 3 , 0 0 0 3 , 0 0 0 8 . 9 — — 4 , 0 0 0 o n d a y 4 e l e c t e d e u t h a n a s i a 2 0 . C o c k e r S p a n i e l 5 , 0 0 0 n e x t d a y 1 4 . 0 — — 4 8 , 0 0 0 o n d a y 3 2 8 5 , 0 0 0 0 . 4 — - — 2 8 5 , 0 0 0 o n d a y 1 0 2 1 . M i x 3 3 , 0 0 0 8 7 , 0 0 0 2 9 . 6 — — 8 7 , 0 0 0 o n d a y 4 2 2 . G e r m a n S h e p h e r d 3 9 , 0 0 0 n e x t d a y 2 1 . 2 — — 1 0 9 , 0 0 0 o n d a y 4 2 3 . M i x 5 3 , 0 0 0 n e x t d a y 2 4 . 0 — — 1 3 1 , 0 0 0 o n d a y 3 2 4 . * C o c k e r S p a n i e l 7 , 0 0 0 7 , 0 0 0 0 . 2 — — s e n t h o m e * t h r o m b o c y t o p e n i a w a s a n i n c i d e n t a l f i n d i n g w i t h n o c l i n i c a l s i g n s ; * * p o s s i b l e s y s t e m i c l u p u s e r y t h e - m a t o s u s ; * f o l l o w - u p p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s a s a v a i l a b l e ; d a y s f r o m i n i t i a l e v a l u a t i o n ; p o s i t i v e v a l u e s a r e t h o s e g r e a t e r t h a n 1 . 1 % f o r S p A , 1 . 3 % f o r a n t i - 7 , a n d 3 . 5 % f o r a n t i - p l " l l n - n r n n ‘ ( " . d n a I I I ’ l ' n h l c 2 . 6 . I ’ l u l c l c ' ! s u r l ) : c c - u . ~ x m u ‘ i n l c d i n n n u n n y l t v h u l i n ( I ’ S A l g ) r e s u l t s I n " t h n n n h u c y u v p c n i c d e ” . 1 9 . n u t g i v e n a d i a g n o s i s u l ' i u n u u n c - r n c d i n l c d t h r u t n h u c y n t p c n i n . y p a r e h t o n 6 , 3 3 5 y y y a a a d d s c i t y o i b i t n r e g r ; u k a s w o t 1 d t a a a n d a o o n n t i i o n e s 0 0 s 0 w d a a 0 0 0 n n o n a a n h h 0 , , p 0 0 0 o 0 0 , t t , s 6 0 k 0 u 1 8 5 n e u 3 1 e 4 7 2 u r e e m o c t u O 3 . 0 4 . 0 A 8 7 p . . S 0 0 1 . 1 - 0 0 0 a 0 a 0 0 0 d 5 r , , , , t 9 0 9 t x 8 n ) e 0 3 2 e 6 l 1 1 1 n 0 0 0 0 y c p n l o ( C n t o i e l t 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 l e t a l P a 0 0 0 0 0 i t , , , , , i 8 3 5 9 0 n I 4 3 2 3 2 1 1 1 s i y p a r e h t o m e y r a n o m l u s p . a i n o n g a i D s i e s h c h t i w a i n e m o r f x a r o h p t o p o t i o h c i t y y c l r h n c o b m o r h t d e t a i d e m o m e u e n a l l a u e p p b r r e e z z u r u a e a n n v h h e c c i d n d r u e o h h p r S S r e e t h e n e e e S D l n u u a i r r R h l t t t n s u a e a a B d m i i a i m t . t i i a i o i i e x x r l n n l t o c 6 . 2 e l b a T M M P D G M M G S . 1 . . . . . . . . 2 4 3 5 6 7 9 8 P l a t e l e t s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n ( P S A I g ) r e s u l t s f o r t h r o m b o c y t o p e n i c d o g s n o t g i v e n a d i a g n o s i s o f i m m u n e - B r e e d A s s a y a n t i - 7 a n t i - p D I C , n a s a l b l e e d i n g ; s u s p e c t n e o - p l a s i a s e i z u r e s , t h r o m b o c y t o p e n i a l a m e n e s s , p y r e x i a , p o s s i b l e c y c l i c t h r o m b o c y t o p e n i a C N S d i s e a s e w i t h s e i z u r e s , s p l e n o - m e g a l y b a c t e r i a l e n d o c a r d i t i s s p l e n i c h e m a n g i o s a r c o m a 8 0 , 0 0 0 1 8 7 , 0 0 0 3 4 , 0 0 0 6 8 , 5 0 0 3 8 , 5 0 0 3 6 , 0 0 0 3 5 , 0 0 0 1 8 7 , 0 0 0 0 . 8 0 . 6 0 . 8 0 . 9 0 . 5 1 . 4 0 . 9 2 . 2 0 . 9 1 . 6 1 . 2 u n k n o w n n o i n c r e a s e n o r e s p o n s e t o p r e d n i s o n e 2 7 4 m m c c ) n 1 1 1 n ’ 1 ' ( ( 1 1 l 0 c 1 l 1 c t u l ’ I ) . t n r ( C ( 6 . 2 c l h n ‘ l ' - - - t o i e d i b n i d o e m r p 1 d r n o a f e 0 n 0 i 0 l , c 6 y 1 c 1 y x t n a h t i w 9 6 y y a a d d n n o o - 0 0 o 0 0 0 d 0 0 0 0 , e C , t I , ' 1 i 2 p I O 7 4 s 2 S 9 1 1 7 8 . . 0 2 * 4 . 3 5 9 2 7 2 . . . . . 1 1 3 5 0 y a d t x e n 0 0 0 , 2 1 1 0 0 0 0 0 0 , , 3 8 8 9 0 0 0 , 1 0 1 c i t y c o l u n s i a s r o g n g a i D y l b i s s o p , n w o n k n u - p e e h d r e i S n r h l d e a r s d e T i l h g i H t n a n o o C t u h r s ) . t n g o n c - d E ( t e t e a h e f d g s x e c r o l o e h o a B O d W S W B D 6 . 2 e l b 0 3 4 1 1 1 . . . a T 1 1 . 1 2 . 1 5 . 1 6 . P l a t e l e t C o n c e n t r a - t i o n ( l u l ) I n i t i a l A s s a y S p A a n t i - y a n t i - u O u t c o m e M i x W e l s h C o r g i T e r r i e r m u l t i p l e m y e l o m a 2 y r a f t e r I M T p a n c y t o p e n i a w i t h m a r r o w n e o p l a s i a l e u k e m i a i d i o p a t h i c p a n c y t o p e n i a i d i o p a t h i c p a n c y t o p e n i a p y o m e t r a , s e p t i c e m i a z i n c - i n d u c e d h e m o l y t i c a n e m i a 1 1 , 0 0 0 1 1 , 0 0 0 5 8 , 0 0 0 5 8 , 0 0 0 1 2 , 0 0 0 2 d a y s l a t e r 1 0 2 , 0 0 0 1 0 3 , 0 0 0 1 7 8 , 0 0 0 2 7 , 0 0 0 2 . 8 * 1 . 6 3 . 0 5 . 5 1 8 . 3 0 . 6 3 . 0 3 . 5 6 . 9 6 . 1 p a n c y t o p e n i a p e r s i s t e d d i e d o n d a y 7 l C S s u r g e r y a n d n o f o l l o w - u p t r a n s i e n t t h r o m b o c y t o p e n i a f o r 1 d a y a f t e r t r a n s f u s i o n 2 7 5 w ' r t n c c n n ' ( t c l c m I ’ I ) . t I " 1 . 1 ( 6 . 2 c l h u ' l ' 1 1 ( H I ( / / 1 1 1 r o f e % n o ; n o 3 . s i n s c 0 1 i 0 t 0 d ) o e d i , , A r e p b 8 p d S i 1 n 3 t n e r e o a n r t p o d o f s s f n a a o e i r n f % 5 6 1 2 o 1 y y s d e . r 1 a y a l a p d a d n s d a r n n e l h t o o i n t f n h o a w 0 p 0 r e 0 0 o 0 3 o t 0 0 0 r 3 n t , , 0 u a e k 1 9 e , y r n g n 0 a 4 1 u ( 6 d 1 1 2 7 . . e 1 r 1 4 — e s o h t 3 . 0 . 4 — 2 3 1 6 4 . a s e u l a v e v i t i s o . p 1 4 . 2 2 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 , , , , s g o d r e h ) 0 2 6 o 1 t 9 4 l u l 2 r o ( f n o 0 0 0 i 0 0 0 t 0 0 0 , , , 7 9 7 2 1 2 4 , , a a i i n n e e p p o o t t y y c c o o b b e r u l i m m a o o r r h h t a a t f l a n ; % 6 . 1 1 0 . 3 s a w s g o d l a m r o n 0 1 r i i o c c n n i i e e h h e r t t p p c a a o o i p p r r n f . D o o S t t o i i u u r d d e e h i i n n c 1 n a e m u r e i A - i t r r e T p n S a n s a e ; r o f i l l p % e m a 5 i r l t l s x i a . s 3 o u d C l A M d ) . t n o c ( 6 . 2 e l b 7 8 9 1 1 1 . . . a T o n - a r h - , y - 4 i 2 t n * a P l a t e l e t C o n c e n t r a - B r e e d D i a g n o s i s I n i t i a l A s s a y S p A a n t i - 7 a n t i - p . O u t c o m e 2 7 6 r J ( 0 1 t h : 3 u ' e r e t e s t e d 6 . 1 1 3 1 1 1 1 1 8 1 6 3 : p r e d n m ‘ m t i n p o s i t i v e w i t h o r p e r h a p s l g . s n o t - g p o s i t i u p r e d o m i n a n t l } 1 . 3 . a n d 2 0 1 . i r r e s p o n s e t o 0 1 t h e . S p a n i e l s . T h e 9 0 1 3 1 6 m a l e s 9 “ 3 3 1 1 0 1 6 7 “ E x p a n d “ . 0 : E l l a . 2 7 7 O f t h e 2 3 p o s i t i v e d o g s w i t h d i a g n o s e s o f I M T , 9 w e r e t e s t e d w i t h S p A a l o n e a n d 3 w e r e t e s t e d w i t h S p A a n d a n t i - y . O f t h e 1 1 d o g s t e s t e d w i t h S p A , a n t i - 7 , a n d a n t i - u , 6 h a d i n c r e a s e s i n I g G a n d ' n o t I g M , w h i l e 5 h a d i n c r e a s e d I g G a n d I g M , w i t h I g G p r e d o m i n a t i n g . O n e d o g w i t h p o s s i b l e s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s ( # 1 4 ) h a d a s t r o n g p o s i t i v e w i t h S p A a n d a w e a k p o s i t i v e w i t h a n t i - y , s u g g e s t i n g t h a t t h e P S A I g w a s I g M o r p e r h a p s I g A . O n e d o g ( # 1 1 ) w i t h a w e a k p o s i t i v e r e s u l t u s i n g S p A h a d a m o d e r a t e l y s t r o n g p o s i t i v e r e s u l t t h e n e x t d a y w i t h a n t i - 7 , s u g g e s t i n g t h a t t h e P S A I g m a y h a v e b e e n p r e d o m i n a n t l y S p A - n o n b i n d a b l e I g G . F o r t h e f e w d o g s t e s t e d s e r i a l l y ( T a b l e 2 . 5 , d o g s 1 , 3 , a n d 2 0 ) , i n i t i a l h i g h v a l u e s f o r P S A I g d e c r e a s e d a s p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s i n c r e a s e d i n r e s p o n s e t o i m m u n o s u p p r e s s i v e t h e r a p y . O f t h e 2 3 d o g s w i t h d i a g n o s e s o f I M T a n d p o s i t i v e r e s u l t s , 9 ( 3 9 % ) w e r e C o c k e r S p a n i e l s . T h e f e m a l e z m a l e r a t i o o f t h e s e 2 3 d o g s w a s 1 3 : 1 0 , a n d 1 1 o f t h e f e m a l e s a n d 9 o f t h e m a l e s w e r e n e u t e r e d . A g e s a t p r e s e n t a t i o n r a n g e d f r o m 1 . 5 t o 1 1 . 2 5 y r w i t h a m e a n o f 6 . 7 5 y r . F o r 5 o f t h e 2 3 d o g s ( 2 2 % ) , t h r o m b o c y t o p e n i a w a s d e t e c t e d u n e x p e c t e d l y o n r o u t i n e b l o o d e x a m s f o r p r o c e d u r e s i n c l u d i n g d e n t i s t r y , c e r v i c a l r a d i o - g r a p h s , a n d a u r a l s u r g e r y . T h e s e d o g s h a d n o h e m o r r h a g e o r o t h e r c l i n i c a l s i g n s o f d i s e a s e . M o s t d o g s w i t h I M T , h o w e v e r , h a d t h e t y p i c a l r a n g e o f h e m o r r h a g i c s i g n s i n c l u d i n g m u c o s a l a n d c u t a n e o u s p e t e c h i a e a n d e c c h y m o s e s , g a s t r o i n t e s t i n a l h e m o r r h a g e , o c u l a r h e m o r r h a g e , e p i s t a x i s , a n d p r o l o n g e d b l e e d i n g f r o m v e n i p u n c t u r e s i t e s . I M T w a s d i a g n o s e d t h r o u g h o u t t h e y e a r w i t h n o o b v i o u s s e a s o n a l i t y , t h o u g h t e s t i n g w a s n o t d o n e s u c h t h a t a s e a s o n a l p a t t e r n c o u l d b e d e fi n i t i v e l y e v a l u a t e d . “ m y b i n d i n g W i f e ‘ ' I m p r Z i C l l - C ; D i s c u s s i o n A S 5 1 3 s p e n t — 1 c m O f f r s a b i l i t y 1 0 r e m a n t h e c o m p a ‘ h i e h . a f t e r a l e s p e c i a l l y a p p h o m h t x y t o p e é e t e l o p e d a n d r e p r o d u c i b l e a r L i n e a r c 0 1 i n h i g h b i n c i l l i h o d i e s [ 0 c ; - I D C I E i S n g C O H C 0 1 1 r A - 1 . n r r e l a m y e q u : 2 7 8 D i s c u s s i o n A s s t a t e d b y C h r i s t o p o u l o s , 2 6 " I t i s l o g i c a l t o a r g u e t h a t t h e s e n s i t i v i t y a n d s p e c i fi c i t y o f a n y n e w m e t h o d f o r P S I g G [ p l a t e l e t s u r f a c e I g G ] d e t e c t i o n s h o u l d r e f e r t o i t s a b i l i t y t o r e p r o d u c i b i l i t y d e t e c t k n o w n a m o u n t s o f I g G o n t h e p l a t e l e t s u r f a c e r a t h e r t h a n t h e c o m p a t i b i l i t y o f i t s r e s u l t s w i t h t h e s u b j e c t i v e c l i n i c a l d i a g n o s i s o f I T P [ I M T ] w h i c h , a f t e r a l l , i s a h e t e r o g e n e o u s e n t i t y a n d a d i a g n o s i s o f e x c l u s i o n . " T h i s i s p e r h a p s e s p e c i a l l y a p p l i c a b l e t o c a n i n e s t u d i e s , b e c a u s e t h e c o n t r i b u t i o n o f P S A I g t o t h e t h r o m b o c y t o p e n i a o f m a n y c a n i n e d i s e a s e s i s u n k n o w n . I n t h e s e s t u d i e s , w e h a v e d e v e l o p e d a n d c h a r a c t e r i z e d a s e n s i t i v e I R M A w h i c h c a n d e t e c t d e fi n e d a n t i b o d i e s i n a r e p r o d u c i b l e a n d l i n e a r f a s h i o n . L i n e a r d o s e - r e s p o n s e c u r v e s f o r P S A I g a n d P B I g w e r e p o s s i b l e w i t h S p A b e c a u s e o f i t s h i g h b i n d i n g a f fi n i t y a n d c o n s t a n t b i n d i n g r a t i o . ” 2 8 I n c o n t r a s t , t w o p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s t o c a n i n e I g G b o u n d i n c r e a s i n g l y t o I g G a s t h e i r c o n c e n t r a t i o n s i n c r e a s e d . I n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s p r e s u m a b l y s h i f t e d t h e b i n d i n g e q u i l i b r i u m s u c h t h a t l o w e r a f fi n i t y b i n d i n g s i t e s o n I g G p r o g r e s s i v e l y b e c a m e o c c u p i e d . T h e h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f d e t e c t o r s r e q u i r e d f o r c o n s t a n t d e t e c t o r - t o - I g G b i n d i n g r a t i o s a n d l i n e a r b i n d i n g c u r v e s w e r e i m p r a c t i c a l f o r r o u t i n e u s e i n t h e I R M A . A s u s e d , t h e s e d e t e c t o r s c o u l d n o t p r o d u c e a s i g n a l p r o p o r t i o n a l t o t h e a m o u n t o f P S A I g p r e s e n t , a n d t h e y w e r e n o t u s e f u l f o r r e l a t i v e q u a n t i t a t i o n o f P S A I g a m o n g s a m p l e s . T h e p o l y c l o n a l d e t e c t o r s w e r e u s e f u l , h o w e v e r , f o r d e f i n i n g t h e c l a s s o f i m m u n o g l o b u l i n p r e s e n t a n d f o r d e t e c t i n g a n y P S A I g o r P B I g t h a t w a s S p A - n o n r e a c t i v e . U n d e r t h e c o n d i t i o n s o f t h i s I R M A , S p A d i d n o t b i n d t o a b o u t 2 0 % o f c a n i n e I g G o r 3 3 % o f c a n i n e I g M . 2 9 T h e c o n c u r r e n t u s e o f S p A , a n t i - y , a n d a n t i - u t h e r e f o r e a l l o w e d t i m s o l i c e P l l ' O p lOv, b a c k g m m C . t l d l i o n “ i t d e t e c t i o n o f 2 a d d i t i o n t o r e m a l i t e r t o 1 1 - p e o p l e « a n t i - P n e p o l y c l o n a l g e n e r a t e d ‘ 0 } t t o t h e s a m e d c S p A a t d e t e c t i : 1 m i n c l i n i c a l . T h i s I R 3 3 d C w i l l “ ? a s s ; 0 1 ; . " S u r f a c e i n t h e i n d i r C C l 3 5 5 E i d l m g P T O C C C T ’ d fl l O a c U V i R ' W ; t o r t h e 9 5 1 m m P o m l l ‘ e C o m m M a e a n t i p l a t : fl y ! " ‘ A i t ? ' . . t p H C l p e S . 5 k 6 0 m m “ 4 1 2 7 9 d e t e c t i o n o f a l l P S A I g G a n d P S A I g M , a n d p r o v i d e d i m m u n o g l o b u l i n c l a s s i fi c a t i o n i n a d d i t i o n t o r e l a t i v e q u a n t i t a t i o n . S p A w a s v e r y s e n s i t i v e , d e t e c t i n g P B I g l i n e a r l y w i t h n a n o l i t e r t o m i c r o l i t e r v o l u m e s o f p l a s m a f r o m i m m u n i z e d r a b b i t s a n d f r o m d o g s o r p e o p l e ( a n t i - P l “ ) w i t h c l i n i c a l I M T . W h e n s m a l l v o l u m e s o f P C p l a s m a w e r e a s s a y e d , t h e p o l y c l o n a l d e t e c t o r s h a d g r e a t e r s e n s i t i v i t y t h a n S p A b e c a u s e o f t h e a m p l i fi e d s i g n a l s g e n e r a t e d b y t h e i r m u l t i v a l e n t b i n d i n g . H o w e v e r , n o n s p e c i fi c P S A I g w o u l d b e a m p l i fi e d t o t h e s a m e d e g r e e a s s p e c i fi c P S A I g , s o t h e p o l y c l o n a l d e t e c t o r s m a y b e n o b e t t e r t h a n S p A a t d e t e c t i n g p a t h o l o g i c P S A I g a n d d i f f e r e n t i a t i n g i t f r o m n o n s p e c i fi c i m m u n o g l o b u - l i n i n c l i n i c a l s a m p l e s . T h i s I R M A a v o i d e d m a n y o f t h e p r o b l e m s a s s o c i a t e d w i t h s o m e p r e v i o u s h u m a n a n d c a n i n e a s s a y s f o r p l a t e l e t - r e a c t i v e a n t i b o d i e s . I m p o r t a n t l y , t h e d i r e c t a s s a y d e t e c t e d o n l y s u r f a c e i m m u n o g l o b u l i n , n o t i n t e r n a l i z e d i m m u n o g l o b u l i n . 3 M 2 S i m i l a r l y , b e c a u s e t h e i n d i r e c t a s s a y u s e d w h o l e p l a t e l e t s , n o n p a t h o l o g i c p l a s m a a n t i b o d i e s r e a c t i v e w i t h c y t o s o l i c e p i t o p e s w e r e n o t d e t e c t a b l e . ” 3 5 N o n s p e c i fi c b i n d i n g w a s m i n i m i z e d b y s a m p l e h a n d l i n g p r o c e d u r e s , a s s a y t e m p e r a t u r e , a n d t h e m e a s u r e m e n t o f o n l y p l a t e l e t - a s s o c i a t e d r a d i o a c t i v i t y w i t h o u t t h e r a d i o a c t i v i t y n o n s p e c i fi c a l l y a s s o c i a t e d w i t h t h e p l a s t i c . T h i s l o w b a c k g r o u n d b i n d i n g c o m b i n e d w i t h t h e c h o s e n a m o u n t s o f p l a t e l e t s a n d S p A a l l o w e d f o r t h e g e n e r a t i o n o f s t r o n g s i g n a l - t o — n o i s e r a t i o s . I n c o n t r a s t t o s o m e a s s a y s , t h e p o s i t i v e c o n t r o l f o r t h i s I R M A w a s a p e r f e c t m a t c h f o r t h e t a r g e t a n a l y t e o f t h e a s s a y : c a n i n e a n t i p l a t e l e t a n t i b o d y i n a c i t r a t e d s a m p l e . E D T A w a s n o t u s e d b e c a u s e o f i t s a s s o c i a t i o n w i t h g r e a t e r n o n s p e c i fi c P S A I g , ” 3 7 a n d i t s p o t e n t i a l t o g e n e r a t e r e a c t i v e n e o e p i t o p e s . 3 8 ' 4 0 F u r t h e r m o r e , E D T A m a y d i s s o c i a t e c a n i n e a u b fi 3 a s i t d o e s t h e h u m a n c o m p l e x , 4 1 t h u s r e m o v i n g i m p o r t a n t c o m p l e x - d e p e n d e n t a n t i g e n s . “ 4 3 W p l e b a n d l i r A S L 3 ] c o r r e c t e d f o r e v e r t i m e . I F i r e d p l a t e l e t o r c o u n t i n g u m y n e t m a i n a n t i b o d i e s u h a l s o . c a u s e f a T h e r e f o r e . f r e P B l g : l e t e c t i o r T h e p r l e e - s t a b l e P S A P S A I g S O m c t t r i m m a t u r e s . 1 b e f o r e S t o r a g e , P l u m e } b l a s s o h a d S i g n i fi c a n t 3 3 6 f a l s e P 0 5 2 8 0 A s t a n d a r d c u r v e w a s i n c o r p o r a t e d i n t o t h e a s s a y s o t h a t t h e r e s u l t s c o u l d b e c o r r e c t e d f o r a n y c h a n g e i n S p A r e a c t i v i t y , t h u s a l l o w i n g f o r m e a n i n g f u l c o m p a r i s o n s o v e r t i m e . T h i s w a s a c c o m p l i s h e d b y u s i n g p l a t e l e t s fi x e d i n 0 . 0 1 % g l u t a r a l d e h y d e . F i x e d p l a t e l e t s h a d c o n s i s t e n t a n d l o n g - t e r m r e a c t i v i t y , a n d t h e y d i d n o t r e q u i r e t h a w i n g o r c o u n t i n g w i t h e a c h u s e ; t h e y s i m p l y r e q u i r e d r e s u s p e n s i o n . H o w e v e r , fi x e d p l a t e l e t s m a y n o t m a i n t a i n r e a c t i v i t y t o a l l a n t i b o d i e s , e s p e c i a l l y t h o s e s u c h a s s o m e d r u g - i n d u c e d a n t i b o d i e s w h i c h m a y r e q u i r e m e m b r a n e p e r t u r b a t i o n f o r b i n d i n g . “ F i x e d p l a t e l e t s m a y a l s o c a u s e f a l s e p o s i t i v e r e s u l t s f o r P B I g d u e t o a l d e h y d e - i n d u c e d n e o a n t i g e n s . ” 4 5 T h e r e f o r e , f r e s h p l a t e l e t s o r i s o l a t e d e x o s o l i c m e m b r a n e p r o t e i n s m a y b e p r e f e r a b l e f o r P B I g d e t e c t i o n . T h e p r i n c i p a l p r o b l e m w e e n c o u n t e r e d w i t h t h i s I R M A r e l a t e d t o i n c r e a s e s i n d e t e c t a b l e P S A I g a n d P B I g , m o s t l y I g M , i n s a m p l e s s t o r e d a t r o o m t e m p e r a t u r e o r 4 ° C . P S A I g s o m e t i m e s i n c r e a s e d m a r k e d l y w i t h i n h o u r s o f w h o l e b l o o d s t o r a g e a t t h e s e t e m p e r a t u r e s , w h i l e P B I g v a l u e s i n c r e a s e d d r a m a t i c a l l y o n l y w h e n p l a s m a w a s i s o l a t e d b e f o r e s t o r a g e . P r e s u m a b l y , P B I g f o r m e d i n w h o l e b l o o d b u t w a s r e m o v e d f r o m t h e p l a s m a b y a s s o c i a t i n g w i t h p l a t e l e t s a n d c o n t r i b u t i n g t o P S A I g . W h e n c l i n i c a l s a m p l e s h a d s i g n i fi c a n t i n c r e a s e s i n P S A I g M i n a d d i t i o n t o P S A I g G , i t s i g n a l e d t h e p o s s i b i l i t y o f s a m p l e h a n d l i n g p r o b l e m s . I n d e e d , t h i s o c c u r r e d w i t h o l d s a m p l e s o r s a m p l e s t h a t h a d b e e n m i s t a k e n l y r e f r i g e r a t e d . F r e s h s a m p l e s o p t i m i z e d p l a t e l e t y i e l d s a n d p r e v e n t e d t h e s e f a l s e p o s i t i v e r e s u l t s . T h e s e s t u d i e s e x t e n d t h e fi n d i n g s o f L e w i s 3 6 w h o u s e d a S p A - b a s e d E L I S A a n d s h o w e d t h a t c a n i n e P S A I g i n c r e a s e d w i t h s a m p l e s t o r a g e t i m e . W h i l e t h e a n t i c o a g u l a n t c o n t r i b u t e d t o t h i s e f f e c t , 3 6 t h e s t o r a g e o f s a m p l e s o n i c e m a y h a v e b e e n o f p r i m a r y b 3 0 d S l O r e d r i m - f l } h a n d l E v e n W 1 3 1 c a { T r x t t a e s h - f r o z e n d i n m u p o s i t i v e s . r e a . t e r e m o C v l e d i n i s i n g l e n e g a t i b s ‘ c x d i a g n o s e s . e u l e z n i n i m m h a d F l t a - m a m a n d p a t i e n t s “ ? Q I ( M a u r i e - m e d i a I n c r e a g ; ntzplatelet a n t ,. “11 b o u d i ' n d ditchmisfits. P l a t e l e t d C S l r m j u c l l b n h a . G d o 2 8 1 i m p o r t a n c e . I n o u r s t u d i e s , t i m e - r e l a t e d i n c r e a s e s i n P S A I g w e r e m i n i m a l f o r c i t r a t e d b l o o d s t o r e d a t 3 7 ° C f o r 2 4 h r . ‘ T h e s e t e m p e r a t u r e a n d s t o r a g e s t u d i e s e m p h a s i z e t h e n e e d f o r u n i f o r m 3 6 a n d t i m e l y h a n d l i n g o f c o n t r o l a n d t e s t s a m p l e s w h e n a s s a y i n g f o r c a n i n e P S A I g o r P B I g . E v e n w i t h c a r e f u l m a n a g e m e n t , h o w e v e r , f a l s e p o s i t i v e r e s u l t s f o r P B I g m a y o c c u r w i t h f r e s h - f r o z e n s a m p l e s . U n p r e d i c t a b l y a n d u n c o m m o n l y , f r e s h — f r o z e n p l a s m a s a m p l e s s t o r e d i n m u l t i p l e a l i q u o t s a t - 6 5 ° C f r o m c e r t a i n n o r m a l d o g s c o n v e r t e d t o s t r o n g p o s i t i v e s , r e a c t i n g w i t h a l l t e s t p l a t e l e t s i n c l u d i n g a u t o l o g o u s o n e s . T h i s r e a c t i v i t y c o u l d b e r e m o v e d b y fi l t r a t i o n t h r o u g h 0 . 2 2 p m fi l t e r s , b u t i t w a s n o t f u r t h e r c h a r a c t e r i z e d . C l i n i c a l l y , P S A I g w a s i n c r e a s e d i n 9 6 % o f 2 4 d o g s w i t h d i a g n o s e s o f I M T , t h e s i n g l e n e g a t i v e d o g n o t h a v i n g a w e l l - s u p p o r t e d d i a g n o s i s . O f 1 9 d o g s w i t h o t h e r d i a g n o s e s , c l e a r l y p o s i t i v e r e s u l t s f o r F S A I g o c c u r r e d i n 4 d o g s t h a t m a y r e a s o n a b l y h a v e h a d a n i m m u n e — m e d i a t e d c o m p o n e n t t o t h e i r t h r o m b o c y t o p e n i a s , a n d i n o n e d o g w i t h a p y o m e t r a a n d p r o b a b l e s e p t i c e m i a . P S A I g m a y b e i n c r e a s e d i n h u m a n s e p t i c e m i c p a t i e n t s . 4 6 4 8 G i v e n t h e u n c e r t a i n t i e s o f t h e p a t h o g e n e s i s o f t h r o m b o c y t o p e n i a i n t h e s e 5 d o g s , i t i s p o s s i b l e t h a t s i g n i fi c a n t i n c r e a s e s i n P S A I g o c c u r r e d o n l y i n d o g s w i t h a n i m m u n e - m e d i a t e d c o m p o n e n t t o t h e i r t h r o m b o c y t o p e n i a . I n c r e a s e s i n P S A I g a r e n o t s p e c i fi c f o r a n y o n e d i s e a s e . P S A I g m a y b e a n t i p l a t e l e t a n t i b o d y , a n t i b o d y b o u n d s p e c i fi c a l l y t o a d s o r b e d a n t i g e n s , o r i m m u n o g l o b u — l i n b o u n d d i r e c t l y o r i n d i r e c t l y t o t h e p l a t e l e t v i a i m m u n o l o g i c a l l y n o n s p e c i fi c m e c h a n i s m s . H o w e v e r , i n c r e a s e d P S A I g s u g g e s t s a n i m m u n e - m e d i a t e d a c c e l e r a t i o n o f p l a t e l e t d e s t r u c t i o n t h a t m a y b e a s s o c i a t e d w i t h t h r o m b o c y t o p e n i a w h e n p l a t e l e t p r o d u c t i o n h a s n o t i n c r e a s e d e n o u g h t o c o m p e n s a t e f o r d e s t r u c t i o n . T h e d e t e c t i o n o f i n c r e a s c r m l i n i c a a u p p o n o r a m l r s b . : j : e C d o P t S i n u t i l i t t u o m e g c l - p p r y t o r t c i o i o S d c P C A a n A W n r i b u t i o n g n o s i n g a r t i n u e d e I g C V o l i y ' e e p g l a - t “ e O l e R h o m i n m a g e m S a m p 2 8 2 i n c r e a s e d P S A I g m a y t h e r e f o r e b e h e l p f u l i n d i r e c t i n g i m m u n o s u p p r e s s i v e t h e r a p y . C o n t i n u e d u s e a n d c r i t i c a l e v a l u a t i o n o f t h i s a n d o t h e r a s s a y s w i l l d e fi n e t h e i r c l i n i c a l u t i l i t y f o r a v a r i e t y o f u s e s . T h e a s s e s s m e n t o f P S A I g m a y b e h e l p f u l f o r : 1 ) s u p p o r t i n g c l i n i c a l d i a g n o s e s w h i c h h a v e r e l i e d l a r g e l y o n a p p a r e n t p o s i t i v e r e s p o n s e s t o i m m u n o s u p p r e s s i v e t h e r a p y a n d o n t h e p r e s u m e d e l i m i n a t i o n o f o t h e r c a u s e s o f t h r o m b o c y t o p e n i a ; 2 ) c o n fi r m i n g d i a g n o s e s o f d r u g - i n d u c e d I M T ; 3 ) d e t e r m i n i n g t h e c o n t r i b u t i o n o f P S A I g t o t h e t h r o m b o c y t o p e n i a o f o t h e r c a n i n e d i s e a s e s ; a n d 4 ) d i a g n o s i n g a n d m a n a g i n g p l a t e l e t i n c o m p a t i b i l i t y p r o b l e m s t h a t m a y a r i s e w i t h t h e c o n t i n u e d e v o l u t i o n o f c a n i n e t r a n s f u s i o n m e d i c i n e . A s t h i s a n d o t h e r a s s a y s f o r c a n i n e P S A I g e v o l v e , s o t o o w i l l o u r u n d e r s t a n d i n g o f t h e i n t e r a c t i o n o f i m m u n o g l o b u l i n s w i t h c a n i n e p l a t e l e t s a n d t h e c o n t r i b u t i o n s o f i m m u n e — m e d i a t e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n t o t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s . T h e s t u d i e s r e p o r t e d h e r e e m p h a s i z e t h e i m p o r t a n c e o f s t r i n g e n t s a m p l e m a n a g e m e n t d u r i n g t h e c o u r s e o f f u t u r e i n v e s t i g a t i o n s . R e f e r e n c e s J G r i n d t h r o r r C a m p i r n m u R e s 4 M t V e t o p e n i I e u ' i s b o u n d t h r o m l K r i s t e l a n t i p l a 8 : 3 6 . K r i s t e r m i c r o s 0 f h a w J o s h i E 0 C 3 ' t e s I a i n M N o r t h 1 K i r k R 4 9 8 J a n ] ‘ \ ‘ a n l l b O ; I H . V d e { ” l e g a l ; S u n k E w i t h a 1 9 9 2 2 8 3 R e f e r e n c e s 1 0 . 1 1 . 1 2 . G r i n d e m C B , B r e i t s c h w e r d t E B , C o r b e t t W T , J a n s H E : E p i d e m i o l o g i c s u r v e y o f t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s : A r e p o r t o n 9 8 7 c a s e s . V e t C l i n P a t h o l 2 0 : 3 8 , 1 9 9 1 C a m p b e l l K L , G e o r g e J W , G r e e n e C E : A p p l i c a t i o n o f t h e e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y f o r t h e d e t e c t i o n o f p l a t e l e t a n t i b o d i e s i n d o g s . A m J V e t R e s 4 5 : 2 5 6 1 , 1 9 8 4 M c V e y D S , S h u m a n W S : D e t e c t i o n o f a n t i p l a t e l e t i m m u n o g l o b u l i n i n t h r o m b o c y - t o p e n i c d o g s . V e t I m m u n o I m m u n o p a t h 2 2 : 1 0 1 , 1 9 8 9 L e w i s D C , M e y e r s K M , C a l l a n M B , B fi c h e l e r J , G i g e r U : D e t e c t i o n o f p l a t e l e t - b o u n d a n d s e r u m p l a t e l e t - b i n d a b l e a n t i b o d i e s f o r d i a g n o s i s o f i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a i n d o g s . J A V M A 2 0 6 : 4 7 , 1 9 9 5 K r i s t e n s e n A T , W e i s s D J , K l a u s n e r J S , L a b e r J , C h r i s t i e D J : D e t e c t i o n o f a n t i p l a t e l e t a n t i b o d y w i t h a p l a t e l e t i m m u n o fl o u r e s c e n c e a s s a y . J V e t I n t M e d 8 : 3 6 , 1 9 9 4 K r i s t e n s e n A T , W e i s s D J , K l a u s n e r J S , L a b e r J , C h r i s t i e D J : C o m p a r i s o n o f m i c r o s o p i c a n d fl o w c y t o m e t r i c d e t e c t i o n o f p l a t e l e t a n t i b o d y i n d o g s s u s p e c t e d o f h a v i n g i m m u n e - m e d i a t e d t h o m b o c y t o p e n i a . A m J V e t R e s 5 5 : 1 1 1 1 , 1 9 9 4 J o s h i B C , J a i n N C : D e t e c t i o n o f a n t i p l a t e l e t a n t i b o d y i n s e r u m a n d o n m e g a k a r y - o c y t e s o f d o g s w i t h a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a . A m J V e t R e s 3 7 : 6 8 1 , 1 9 7 6 J a i n N C , S w i t z e r J W : A u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s a n d c a t s . V e t C l i n N o r t h A m 1 1 : 4 2 ] , 1 9 8 1 S l a p p e n d e l R J : I n t e r p r e t a t i o n o f t e s t s f o r i m m u n e - m e d i a t e d b l o o d d i s e a s e s , i n K i r k R W ( e d ) : C u r r e n t V e t e r i n a r y T h e r a p y I X . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 8 6 , p 4 9 8 J a i n N C , K o n o M S : T h e p l a t e l e t f a c t o r - 3 t e s t f o r d e t e c t i o n o f c a n i n e a n t i p l a t e l e t a n t i b o d y . V e t C l i n P a t h o l 9 : 1 0 , 1 9 8 0 H y d e P , Z u c k e r - F r a n k l i n D : A n t i g e n i c d i f f e r e n c e s b e t w e e n h u m a n p l a t e l e t s a n d m e g a k a r y o c y t e s . A m J P a t h o l 1 2 7 : 3 4 9 , 1 9 8 7 S u l l i v a n P S , A r r i n g t o n K , W e s t R , M c D o n a l d T P : T h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h a d m i n i s t r a t i o n o f t r i m e t h o p r i m / s u l f a d i a z i n e i n a d o g . J A V M A 2 0 1 : 1 7 4 1 , 1 9 9 2 ‘ 1 h . ‘ : J I S u l h \ £ a n d t r : I n t e r n ; N o r t h : m e d i I J A V M B l o o m i m m u r . B l o o m i r n m u n p l a t e l e t 2 3 : 7 1 . I m ' i s t h r o m b F o r u m F r a k e r s o l u b l e B i O p h i - g P h i l i p s p r o s e “ ; d i m e n s i [ 4 8 m m b a C t e n ' c R m T D u i t 6 9 : 1 5 : . 1 3 . 1 4 . 1 5 . 1 6 . 1 7 . 1 8 . 1 9 . 2 0 . 2 1 . 2 2 . 2 3 . 2 4 . 2 8 4 S u l l i v a n P S : I m m u n e m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a : R e c e n t a d v a n c e s i n d i a g n o s i s a n d t r e a t m e n t . P r o c 1 2 t h A n n V e t M e d F o r u m , A m e r i c a n C o l l e g e o f V e t e r i n a r y I n t e r n a l M e d i c i n e , 1 9 9 4 , p 1 4 9 N o r t h e r n J J , T v e d t e n H W : D i a g n o s i s o f m i c r o t h r o m b o c y t o s i s a n d i m m u n e — m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s w i t h t h r o m b o c y t o p e n i a : 6 8 c a s e s ( 1 9 8 7 - 1 9 8 9 ) . J A V M A 2 0 0 : 3 6 8 , 1 9 9 2 B l o o m J C , B l a c k r n e r S A , B u g e l s k i P J , S o w i n s k i J M , S a u n d e r s L Z : G o l d - i n d u c e d i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a i n t h e d o g . V e t P a t h o l 2 2 : 4 9 2 . 1 9 8 5 B l o o m J C , T h i e m P A , S e l l e r s T S , D e l d a r A , L e w i s H B : C e p h a l o s p o r i n - i n d u c e d i m m u n e c y t o p e n i a i n t h e d o g : D e m o n s t r a t i o n o f e r y t h r o c y t e — , n e u t r o p h i l - , a n d p l a t e l e t - a s s o c i a t e d I g G f o l l o w i n g t r e a t m e n t w i t h c e f a z e d o n e . A m J H e m a t o l 2 8 : 7 1 , 1 9 8 8 L e w i s D C , M e y e r s K M : A n t i p l a t e l e t a n t i b o d i e s i n d o g s w i t h i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a b i n d t o g l y c o p r o t e i n I I b / I I I a . P r o c 1 2 t h A n n V e t M e d F o r u m , A m e r i c a n C o l l e g e o f V e t e r i n a r y I n t e r n a l M e d i c i n e , 1 9 9 4 , p 1 7 1 ( a b s t r ) ‘ F r a k e r P J , S p e c k J C J : P r o t e i n a n d c e l l m e m b r a n e i o d i n a t i o n s w i t h a s p a r i n g l y s o l u b l e c h l o r o a m i d e , 1 , 3 , 4 , 6 - t e t r a c h l o r o - 3 a , 6 a — d i p h e n y l g l y c o l u r i l . B i o c h e m B i o p h y s R e s C o m m u n 8 0 : 8 4 9 , 1 9 7 8 P h i l i p s D R , A g i n P P : P l a t e l e t p l a s m a m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s : E v i d e n c e f o r t h e p r e s e n c e o f n o n e q u i v a l e n t d i s u l fi d e b o n d s u s i n g n o n r e d u c e d - r e d u c e d t w o - d i m e n s i o n a l g e l e l e c t r o p h o r e s i s . J B i o l C h e m 2 5 2 : 2 1 2 1 , 1 9 7 7 L a e m m l i U K : C l e a v a g e o f s t r u c t u r a l p r o t e i n s d u r i n g t h e a s s e m b l y o f t h e h e a d o f b a c t e r i o p h a g e T 4 . N a t u r e 2 2 7 : 6 8 0 , 1 9 7 0 R y u T , D a v i s J M , S c h w a r t z K A : D o s e - d e p e n d e n t p l a t e l e t s t i m u l a t i o n a n d i n h i b i t i o n i n d u c e d b y a n t i - P l “ I g G . J L a b C l i n M e d 1 1 6 : 9 1 , 1 9 9 0 D u X , B e u t l e r L , R u a n C , C a s t a l d i P A , B e r n d t M C : G l y c o p r o t e i n I b a n d g l y c o p r o t e i n I X a r e f u l l y c o m p l e x e d i n t h e i n t a c t p l a t e l e t m e m b r a n e . B l o o d 6 9 : 1 5 2 4 , 1 9 8 7 P i d a r d D : T h e a p p l i c a t i o n o f c r o s s e d - i m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s a n d r e l a t e d i m m u n o a s s a y s t o t h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f g l y c o p r o t e i n s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n , i n K u n i c k i T J , G e o r g e J N ( e d s ) : P l a t e l e t I m m u n o b i o l o g y : M o l e c u l a r a n d C l i n i c a l A s p e c t s . P h i l a d e l p h i a , L i p i n c o t t , 1 9 8 7 , p 1 9 3 S w i s h e r S N , Y o u n g L E : T h e b l o o d g r o u p i n g s y s t e m s o f d o g s . P h y s i o l R e v 4 1 2 4 9 5 , 1 9 6 1 ’ o — ) — l ' ) ) . ’ J 1 ( J I n ‘ 6 o ' w . S w i s h : s e r u i t i d u r i n g C h r i S t c q u a n t i i I 9 9 3 B o y l e G r a } 1 I g G . 1 2 5 . 2 6 . 2 7 . 2 8 . 2 9 . 3 0 . 3 1 . 3 2 . 3 3 . 3 4 . 3 5 . 3 6 . 2 8 5 S w i s h e r S N : N o n s p e c i fi c a d h e r e n c e o f p l a t e l e t s a n d l e u k o c y t e s t o a n t i b o d y - s e n s i t i z e d r e d c e l l s : A m e c h a n i s m p r o d u c i n g t h r o m b o c y t o p e n i a a n d l e u k o p e n i a d u r i n g i n c o m p a t i b l e t r a n s f u s i o n s . J C l i n I n v e s t 3 5 : 7 3 8 , 1 9 5 6 C h r i s t o p o u l o s C G , K e l s e y H C , M a c h i n S J : A fl o w - c y t o m e t r i c a p p r o a c h t o q u a n t i t a t i v e e s t i m a t i o n o f p l a t e l e t s u r f a c e i m m u n o g l o b u l i n G . V o x S a n g 6 4 : 1 0 6 , 1 9 9 3 B o y l e M D P , R e i s K J : B a c t e r i a l F c r e c e p t o r s . B i o / t e c h n o l o g y 5 : 6 9 7 , 1 9 8 7 G r a y L S , M a s o u r e d i s S P : I n t e r a c t i o n o f 1 2 5 I - p r o t e i n A w i t h e r y t h r o c y t e - b o u n d I g G . J L a b C l i n M e d 9 9 : 3 9 9 , 1 9 8 2 s e e c h a p t e r 1 : S t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n A b i n d i n g t o c a n i n e I g G a n d I g M . G e o r g e J N : T h e o r i g i n a n d s i g n i fi c a n c e o f p l a t e l e t I g G , i n K u n i c k i T J , G e o r g e J N ( e d s ) : P l a t e l e t I m m u n o b i o l o g y : M o l e c u l a r a n d C l i n i c a l A s p e c t s . P h i l a d e l p h i a , L i p p i n c o t t , 1 9 8 9 , p 3 0 5 G e o r g e J N : P l a t e l e t i m m u n o g l o b u l i n G : I t s s i g n i fi c a n c e f o r t h e e v a l u a t i o n o f t h r o m b o c y t o p e n i a a n d f o r u n d e r s t a n d i n g t h e o r i g i n o f a - g r a n u l e p r o t e i n s . B l o o d 7 6 : 8 5 9 . 1 9 9 0 G e o r g e J N , S a u c e r m a n S : P l a t e l e t I g G , I g A , I g M , a n d a l b u m i n : C o r r e l a t i o n o f p l a t e l e t a n d p l a s m a c o n c e n t r a t i o n s i n n o r m a l s u b j e c t s a n d i n p a t i e n t s w i t h I T P o r d y s p r o t e i n e m i a . B l o o d 7 2 : 3 6 2 , 1 9 8 8 F u j i s a w a K , T a n i P , O ’ T o o l e T E , G i n s b e r g M H , M c M i l l a n . R : D i f f e r e n t s p e c i fi c i t i e s o f p l a t e l e t - a s s o c i a t e d a n d p l a s m a a u t o a n t i b o d i e s t o p l a t e l e t G P I I b - I l l a i n p a t i e n t s w i t h c h r o n i c i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B l o o d 7 9 : 1 4 4 1 , 1 9 9 2 F u j i s a w a K , O ’ T o o l e T E , T a n i P , L o f t u s J C , P l o w B F , G i n s b e r g M H , M c M i l l a n R : A u t o a n t i b o d i e s t o t h e p r e s u m p t i v e c y t o p l a s m i c d o m a i n o f p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n I I I a i n p a t i e n t s w i t h c h r o n i c i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B l o o d 7 7 : 2 2 0 7 , 1 9 9 1 H e R , R e i d D M , J o n e s C E , S h u h n a n N R : S p e c t r u m o f I g c l a s s e s , s p e c i fi c i t i e s , a n d t i t e r s o f s e r u m a n t i g l y c o p r o t e i n s i n c h r o n i c i d i 0 p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B l o o d 8 3 : 1 0 2 4 , 1 9 9 4 L e w i s D C , M e y e r s K M : E f f e c t o f a n t i c o a g u l a n t a n d b l o o d s t o r a g e t i m e o n p l a t e l e t - b o u n d a n t i b o d y c o n c e n t r a t i o n s i n c l i n i c a l l y n o r m a l d o g s . A m J V e t R e s 5 5 : 6 0 2 , 1 9 9 4 i l . , 4 s 1 . 5 . i i V O I l c C l i n i < D C n i a T ' v e d t T a m " P i d a r t E D T . A B l o o d F U j i s a K b . 1 1 1 ( m a l e : K u l j p c B o r n e a u t o a n 1 9 9 2 B e r n d t 3 1 1 1 0 3 1 1 a n d C 1 M a g e e “ S e i n 1 9 8 5 S z a l } a s s o c i K E I I O I t h l ’ O m " a n d . a u t O a t 3 7 . 3 8 . 3 9 . 4 0 . 4 1 . 4 2 . 4 3 . 4 5 . 4 6 . 4 7 . 4 8 . 2 8 6 D i x o n R , R o s s e W , E b b e r t L : Q u a n t i t a t i v e d e t e r m i n a t i o n o f a n t i b o d y i n i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . N E n g l J M e d 2 9 2 : 2 3 0 , 1 9 7 5 S c h r e z e n m e i e r H , M u l l e r H , G u n s i l i u s E , H e i m p e l H , S e i f r i e d E : A n t i c o a g u l a n t - i n d u c e d p s e u d o t h r o m b o c y t o p e n i a a n d p s e u d o l e u c o c y t o s i s . T h r o m b H a e m o s t 7 3 : 5 0 6 , 1 9 9 5 v o n d e m B o r n e A E G K , V o s J J E , v a n d e r L e l i e J , B o s s e r s B , v a n D a l e n C M : C l i n i c a l s i g n i fi c a n c e o f p o s i t i v e p l a t e l e t i m m u n o fl u o r e s c e n c e t e s t i n t h r o m b o c y t o - p e n i a . B r J H a e m a t o l 6 4 : 7 6 7 , 1 9 8 6 T v e d t e n H W , e d : M u l t i - s p e c i e s h e m a t o l o g y a t l a s : T e c h n i c o n H - l E s y s t e m . T a r r y t o w n , N e w Y o r k , M i l e s I n c . , 1 9 9 3 , p 1 3 4 P i d a r d D , D i d r y D , K u n i c k i T J , N u r d e n A T : T e m p e r a t u r e - d e p e n d e n t e f f e c t s o f E D T A o n t h e m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n I I b - I I I a c o m p l e x a n d p l a t e l e t a g g r e g a b i l i t y . B l o o d 6 7 : 6 0 4 , 1 9 8 6 F u j i s a w a K , T a n i P , M c M i l l a n R : P l a t e l e t - a s s o c i a t e d a n t i b o d y t o g l y c o p r o t e i n H b / I I I a f r o m c h r o n i c i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a p a t i e n t s o f t e n b i n d s t o d i v a l e n t c a t i o n — d e p e n d e n t a n t i g e n s . B l o o d 8 1 : 1 2 8 4 , 1 9 9 3 K u i j p e r s W A M , O u w e h a n d W H , P e e l e n W , M i c h i e l s J J , E n g e l f r i e t C P , v o n d e m B o r n e A E G K : T h r o m b o c y t o p e n i a d u e t o p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n I I b / I I I a - r e a c t i v e a u t o a n t i b o d i e s n o n - r e a c t i v e w i t h p l a t e l e t s f r o m E D T A b l o o d . V o x S a n g 6 3 : 1 1 9 , 1 9 9 2 - B e r n d t M C , C h o n g B H , A n d r e w s R K : B i o c h e m i s t r y o f d r u g - d e p e n d e n t p l a t e l e t a u t o a n t i g e n s , i n K u n i c k i T J , G e o r g e J N ( e d s ) : P l a t e l e t I m m u n o b i o l o g y : M o l e c u l a r a n d C l i n i c a l A s p e c t s . P h i l a d e l p h i a , L i p p i n c o t t , 1 9 8 9 , p 1 3 2 M a g e e J M : A s t u d y o f t h e e f f e c t s o f t r e a t i n g p l a t e l e t s w i t h p a r a f o r m a l d e h y d e f o r u s e i n t h e p l a t e l e t s u s p e n s i o n i m m u n o fl u o r e s c e n c e t e s t . B r J H a e m a t o l 6 1 : 5 1 3 , 1 9 8 5 S z a l M , B l u m b e r g N : C l i n i c a l c o r r e l a t e s i n p a t i e n t s w i t h e l e v a t e d p l a t e l e t - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n s . A n n C l i n L a b S c i 1 8 : 2 4 , 1 9 8 8 K e l t o n J G , N e a m e P B , G a u l d i e J , H i r s h J : E l e v a t e d p l a t e l e t - a s s o c i a t e d I g G i n t h e t h r o m b o c y t o p e n i a o f s e p t i c e m i a . N E n g l J M e d 3 0 0 : 7 6 0 , 1 9 7 9 v a n d e r L e l i e J , v a n d e r P l a s - V a n D a l e n C M , v o n d e m B o r n e A E G K : P l a t e l e t a u t o a n t i b o d i e s i n s e p t i c a e m i a . B r J H a e m a t o l 5 8 2 7 5 5 , 1 0 8 4 c o r n p l e r n e n b t C A _ \ I ‘ A b s t r a c t T h e ‘ C D S E i c a n m i s m a n t i n h a v e n o t b e e t i t s n o r k n o v t o e g i m p a r e t l C a n i n e a n d h ‘ . { G F P l t h a t v c a m G F p . i n d u c e d C 1 6 1 3 ) F ; f r a g m i ‘ m s a n d G F P $ 1 1 5 f o r 5 m i n p r i H A I g G ‘ i n d U C C H A P T E R 3 C A N I N E A G G R E G A T E D I g G I N D U C E S C O N I P L E M E N T - M E D I A T E D , N O T F c - M E D I A T E D , C L U M P I N G O F C A N I N E P L A T E L E T S A b s t r a c t T h e b i n d i n g o f i m m u n e c o m p l e x e s o r I g G a g g r e g a t e s t o h u m a n p l a t e l e t F c y R I I ( C D 3 2 ) c a n s t i m u l a t e s i g n a l t r a n s d u c t i o n a n d p l a t e l e t a c t i v a t i o n . T h i s a p p e a r s t o b e i m p o r t a n t i n h u m a n p a t i e n t s w i t h h e p a r i n - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a . C a n i n e p l a t e l e t s h a v e n o t b e e n c h a r a c t e r i z e d w i t h r e s p e c t t o t h e i r r e s p o n s e s t o i m m u n o l o g i c s t i m u l i , a n d i t i s n o t k n o w n i f c a n i n e p l a t e l e t s e x p r e s s F c ' y r e c e p t o r s . W e u s e d p l a t e l e t a g g r e g o m e t r y t o c o m p a r e t h e r e s p o n s e s o f h u m a n a n d c a n i n e p l a t e l e t s t o h e a t - a g g r e g a t e d I g G ( H A I g G ) . C a n i n e a n d h u m a n H A I g G c a u s e d F c - m e d i a t e d a g g r e g a t i o n o f h u m a n g e l - fi l t e r e d p l a t e l e t s ( G F P ) t h a t w a s b l o c k e d b y t h e a n t i - F c y R I I m o n o c l o n a l a n t i b o d y I V . 3 . I n c o n t r a s t , c a n i n e G F P w e r e u n r e s p o n s i v e t o H A I g G . I n p l a t e l e t - r i c h p l a s m a , h o w e v e r , H A I g G i n d u c e d d e l a y e d a n d s u b m a x i m a l c l u m p i n g o f c a n i n e p l a t e l e t s t h a t w a s n o t b l o c k e d b y P C f r a g m e n t s o f c a n i n e I g G . T h i s p l a t e l e t c l u m p i n g a l s o o c c u r r e d i n c i t r a t e d w h o l e b l o o d a n d G F P s u s p e n d e d i n p l a s m a o r s e r u m p l u s h i r u d i n . H e a t i n g p l a s m a o r s e r u m a t 5 6 ° C f o r 5 m i n p r e v e n t e d c l u m p i n g , a s d i d 5 m M E D T A o r 5 m M E G T A . S t u d i e s w i t h c o m p l e m e n t - d e p l e t e d p l a s m a a n d c a n i n e p l a s m a n a t u r a l l y d e fi c i e n t i n C 3 s h o w e d t h a t t h e H A I g G - i n d u c e d c l u m p i n g o f c a n i n e p l a t e l e t s r e q u i r e d c o m p l e m e n t , a n d s p e c i fi c a l l y C 3 . 2 8 7 : i r e u i a t i n g l I r k n o w n . I m m u r m e d i a t e d b i n d v o l e s e x p r e s - a c t u a t o r s C b e a n i I n P < l n t r o d u c t i o I m m i b e l i e v e d t o b p a t i e n t s . i m r r r e a l l y s p e e i fi m n u n o l o g i c m m m m o 2 8 8 S i m i l a r c l u m p i n g o c c u r r e d w i t h z y m o s a n a n d b a c t e r i a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e , o t h e r k n o w n a c t i v a t o r s o f c o m p l e m e n t . T h i s c o m p l e m e n t - m e d i a t e d c l u m p i n g o f c a n i n e p l a t e l e t s m a y b e a n i m p o r t a n t c o n t r i b u t o r t o t h r o m b o c y t o p e n i a i n c a n i n e d i s e a s e s a s s o c i a t e d w i t h c i r c u l a t i n g i m m u n e c o m p l e x e s o r o t h e r c o m p l e m e n t a c t i v a t o r s . I n t r o d u c t i o n I m m u n e - m e d i a t e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n w i t h s u b s e q u e n t t h r o m b o c y t O p e n i a i s b e l i e v e d t o b e m e d i a t e d b y i n c r e a s e d p h a g o c y t o s i s o f a n t i b o d y - c o a t e d p l a t e l e t s . I n h u m a n p a t i e n t s , i m m u n o g l o b u l i n s c a n b e a s s o c i a t e d w i t h t h e p l a t e l e t s u r f a c e t h r o u g h i m m u n o l o g - i c a l l y s p e c i fi c , F ( a b ’ ) 2 , o r i m m u n o l o g i c a l l y n o n s p e c i fi c i n t e r a c t i o n s . I n d o g s , o n l y i m m u n o l o g i c a l l y s p e c i fi c b i n d i n g h a s b e e n d o c u m e n t e d . 1 ' 2 T h e p o t e n t i a l f o r n o n s p e c i fi c i n t e r a c t i o n s o f i m m u n o g l o b u l i n s w i t h c a n i n e p l a t e l e t s , a n d t h e m e c h a n i s m s i n v o l v e d , a r e u n k n o w n . I m m u n o l o g i c a l l y n o n s p e c i fi c b i n d i n g o f i m m u n o g l o b u l i n s t o p l a t e l e t s i n c l u d e s F c — m e d i a t e d b i n d i n g i n s p e c i e s w i t h p l a t e l e t F c r e c e p t o r s . H u m a n p l a t e l e t s a n d m e g a k a r y - o c y t e s e x p r e s s F c r e c e p t o r s f o r I g G , F c y R I I ( C D 3 2 ) , w h i c h a r e g l y c 0 p r o t e i n s b e l o n g i n g t o t h e i m m u n o g l o b u l i n g e n e s u p e r f a m i l y . “ 5 P l a t e l e t s o f p i g s , s h e e p , g o a t s , c a t t l e , a n d n o n h u m a n p r i m a t e s a l s o r e p o r t e d l y e x p r e s s F c r e c e p t o r s , w h i l e p l a t e l e t s o f r a b b i t s , d o g s , m i c e , a n d h o r s e s r e p o r t e d l y d o n o t } : 7 H o w e v e r , d a t a t o s u p p o r t t h e s e r e p o r t s a r e g e n e r a l l y u n a v a i l a b l e e x c e p t i n t h e c a s e o f r a b b i t s w h i c h h a v e b e e n c l e a r l y s h o w n t o l a c k F c ' y R I I a n a l o g u e s . 8 D a t a t o c o n fi r m t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f F c y r e c e p t o r s o n c a n i n e p l a t e l e t s a r e l a c k i n g . 9 T h e F l o w a f f i n i t y a o c c u r r m g i r n h i n d w e l l a n d m e d i a t e d p l a t F c - , R H . t h e I F : - _ . R l l e o n s i W i t h m o n o m c m e d i a t e d p l a m e d i a t e d a c z j T h e i i f o r h u m a n I ) . g l o b u l i n s i n t : F e f e e e p 1 0 r 5 _ a n d P l a t e l e t P l a t e l e t m i c r g F C ' b O u n d C I I i n d u c e d d l S E a f o r F c ‘ m e d i p i a l é l e u e X p r W e h 1 f u n - t r i m “ r e p l a t e l e t ; O 2 8 9 T h e F c r e c e p t o r s o n h u m a n p l a t e l e t s b i n d t h e F c p o r t i o n o f m o n o m e r i c I g G w i t h l o w a f fi n i t y a n d t h a t o f c o m p l e x e d I g G w i t h h i g h e r a f fi n i t y 9 " " T h e a f fi n i t y f o r n a t u r a l l y o c c u r r i n g i m m u n e c o m p l e x e s ( I C s ) i s u n k n o w n , b u t h e a t o r c h e m i c a l l y a g g r e g a t e d I g G b i n d w e l l a n d h a v e b e e n u s e d w i d e l y i n v i t r o a s s u b s t i t u t e s f o r t r u e I C s t o i n v e s t i g a t e F c - m e d i a t e d p l a t e l e t i n t e r a c t i o n s . D e s p i t e s o m e f u n c t i o n a l p o l y m o r p h i s m o f h u m a n p l a t e l e t F c y R I I , t h e F c - m e d i a t e d b i n d i n g o f a g g r e g a t e d I g G , I C s , o r a g g r e g a t e d F c f r a g m e n t s t o F c y R I I c o n s i s t e n t l y c a u s e s p l a t e l e t a g g r e g a t i o n a n d g r a n u l e r e l e a s e w h i c h a r e b l o c k a b l e w i t h m o n o m e r i c I g G , F c f r a g m e n t s , a n d m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s t o F c y R I I ? ‘ 1 1 T h i s F c - m e d i a t e d p l a t e l e t a c t i v a t i o n a p p e a r s t o r e s u l t f r o m s i g n a l t r a n s d u c t i o n v i a G p r o t e i n - m e d i a t e d a c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e C . ‘ 2 T h e i n v i v o c o n s e q u e n c e s o f F c - m e d i a t e d I C b i n d i n g a r e p e r h a p s b e s t d e s c r i b e d f o r h u m a n p a t i e n t s w i t h h e p a r i n - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a ( H I T ) . I n H I T , i m m u n o - g l o b u l i n s i n t e r a c t w i t h h e p a r i n a n d p l a t e l e t f a c t o r 4 t o f o r m I C s w h i c h b i n d t o p l a t e l e t F c r e c e p t o r s . ‘ 3 T h e c o n s e q u e n c e s o f F e b i n d i n g i n c l u d e a c c e l e r a t e d p l a t e l e t p h a g o c y t o s i s a n d p l a t e l e t a c t i v a t i o n l e a d i n g t o a c c e l e r a t e d p l a t e l e t c o n s u m p t i o n , t h e g e n e r a t i o n o f p l a t e l e t m i c r o p a r t i c l e s , 1 ‘ a n d t h e d e v e l o p m e n t i n s o m e p a t i e n t s o f p l a t e l e t - r i c h t h r o m b i . F c - b o u n d c i r c u l a t i n g I C s f r o m i n f e c t i o u s , n e o p l a s t i c , a u t o i m m u n e , a n d o t h e r d r u g - i n d u c e d d i s e a s e s m a y s i m i l a r l y c o n t r i b u t e t o t h r o m b o c y t o p e n i a . H o w e v e r , t h e p o t e n t i a l f o r F c - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a s i n d o g s i s d e p e n d e n t u p o n w h e t h e r o r n o t c a n i n e p l a t e l e t s e x p r e s s F c r e c e p t o r s . W e h a v e u s e d H A I g G a n d p l a t e l e t a g g r e g o m e t r y t o a s s e s s c a n i n e p l a t e l e t s f o r a f u n c t i o n a l r e s p o n s e t o H A I g G a n a l o g o u s t o t h e F c y R H — m e d i a t e d r e s p o n s e o f h u m a n p l a t e l e t s . O u r i n v e s t i g a t i o n s s h o w t h a t c a n i n e p l a t e l e t s a r e r e s p o n s i v e t o n o n s p e c i fi c i m m u n o l o g i c s t i : t e m ’ e e n H A I g G n o n o f h u m a n 1 : M e t h o d s . l i i z t e r i a l s C o h a g e r c a l c i u m l O I I O p h E s c h e r i c h i a c c P u r c h a s e d f r o m M “ ' 3 5 P u r c l R e c o m i R i b “ R o t h . 1 o f 3 0 0 L ' T I n l a h e a t i n g a , 5 6 0 . 2 9 0 i m m u n o l o g i c s t i m u l a t i o n i n t h e f o r m o f H A I g G . H o w e v e r , t h e m e c h a n i s m o f i n t e r a c t i o n b e t w e e n H A I g G a n d c a n i n e p l a t e l e t s i s m a r k e d l y d i f f e r e n t f r o m t h e F c - m e d i a t e d s t i m u l a - t i o n o f h u m a n p l a t e l e t s b y H A I g G . M e t h o d s M a t e r i a l s C o l l a g e n , a d e n o s i n e d i p h o s p h a t e ( A D P ) , p h o r b o l 1 2 - m y r i s t a t e 1 3 a c e t a t e ( P M A ) , c a l c i u m i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 , p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r ( P A F ) , l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( f r o m E s c h e r i c h i a c o l i , s e r o t y p e 0 1 2 8 : B 1 2 ) , p r o s t a g l a n d i n E 1 ( P g E l ) , a n d p a p a i n w e r e p u r c h a s e d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o m p a n y ( S t . L o u i s , M O ) . T h e m o n o c l o n a l a n t i b o d y I V . 3 w a s p u r c h a s e d f r o m M e d a r e x , I n c . ( W e s t L e b a n o n , N H ) . R e c o m b i n a n t h i r u d i n ( B e h r i n g ; M a r b u r g , G e r m a n y ) w a s a g e n e r o u s g i f t o f D r . R o b e r t R o t h . S t o c k h i r u d i n a t 4 0 U / [ 1 . 1 w a s a d d e d t o s e r u m t o g i v e a fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f 3 0 0 U / m l a f t e r G F P w e r e a d d e d . W h e n e v e r s e r u m w a s u s e d w i t h l e s s t h a n 6 0 m i n h e a t i n g a t 5 6 ° C , h i r u d i n w a s a d d e d t o i n h i b i t t h e e f f e c t s o f t h r o m b i n . C 3 - d e fi c i e n t a n d c o n t r o l c a n i n e p l a s m a w e r e g e n e r o u s l y p r o v i d e d b y D r . J e r r y A . W i n k l e s t e i n a t T h e J o h n s H o p k i n s U n i v e r s i t y S c h o o l o f M e d i c i n e ‘ s “ 1 7 F u n c t i o n a l C 3 - l i k e a c t i v i t y e x i s t s i n a f f e c t e d d o g s a t l e s s t h a n 3 - 1 0 % t h a t o f c o n t r o l d o g s , ” 1 7 a n d a n t i g e n i c a l l y d e t e c t a b l e C 3 c o n c e n t r a t i o n s a r e e v e n m o r e d e fi c i e n t ” : 1 6 Z y m o s a n w a s p r e p a r e d b y b o i l i n g 1 g r a m z y m o s a n A ( S i g m a ) p e r 2 0 0 m l w a t e r f o r 3 0 m i n , d e c a n t i n g , a n d b r i n g i n g t o 6 m g / m l i n p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e ( P B S ) . C o b r a v e n o m f a c t o r ( C V F ) f r o m N a j a n a j a ( C a l b i o c h e m - N o v a b i o c h e m C o r p o r a t i o n , L a J o l l a , C A ) c o n t a i n e d 1 . 2 5 U / p l . F o r c o m p l e m e n t d e p l e t i o n , C V F w a s i n c u b a t e d i n a c t u a t o r s . A C a r e . P r e c W O f b l O O d p l a s m a ( ' 7 - 5 L i W h e n z y m o s a i z y m o s a n . t w i n p l a s m a w a s k c ‘ c o m p a r e d d i r T h e b R e s o u r c e s f a . A l ‘ l ‘ r o x ‘ a l f o r 2 9 1 p l a s m a ( 7 . 5 U / m l ) f o r 1 h r a t 3 7 ° C a n d t h e n a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r a n o t h e r h o u r . W h e n z y m o s a n w a s u s e d f o r c o m p l e m e n t d e p l e t i o n , p l a s m a w a s i n c u b a t e d w i t h 6 m g / m l z y m o s a n , t w i c e , f o r 3 0 m i n u t e s e a c h t i m e a t 3 7 ° C . A f t e r p e l l e t i n g t h e z y m o s a n , t h e p l a s m a w a s k e p t a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r a t l e a s t a n h o u r u n t i l b e i n g u s e d . R e s u l t s w e r e c o m p a r e d d i r e c t l y t o p l a s m a p r o c e s s e d c o n c u r r e n t l y a n d i d e n t i c a l l y e x c e p t w i t h o u t a c t i v a t o r s . A l l o t h e r c h e m i c a l s w e r e r e a g e n t g r a d e . D o g s T h e b l o o d d o n o r d o g s w e r e m a i n t a i n e d b y t h e U n i v e r s i t y L a b o r a t o r y A n i m a l R e s o u r c e s f a c i l i t y w h i c h f o l l o w s U S D A a n d N I H g u i d e l i n e s f o r a n i m a l u s e a n d c a r e . A p p r o v a l f o r u s e w a s o b t a i n e d f r o m t h e A l l U n i v e r s i t y C o m m i t t e e o n A n i m a l U s e a n d C a r e . P r e c o n d i t i o n i n g a f t e r p u r c h a s e i n c l u d e d p h y s i c a l e x a m i n a t i o n , d e w o r m i n g , h e a r t w o r m t e s t i n g a n d s u b s e q u e n t p r o p h y l a x i s , r o u t i n e v a c c i n a t i o n s , d i p p i n g f o r e c t o p a r a s i t e s , a n d o b s e r v a t i o n f o r a m i n i m u m o f 3 0 d a y s b e f o r e u s e . B l o o d c o l l e c t i o n a n d p l a t e l e t i s o l a t i o n B l o o d w a s d r a w n b y j u g u l a r v e n i p u n c t u r e t h r o u g h 1 8 g a u g e n e e d l e s i n t o p l a s t i c s y r i n g e s c o n t a i n i n g 1 / 1 0 v o l u m e c i t r a t e t o g i v e a fi n a l c i t r a t e c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 . 5 m M ( 0 . 3 2 % ) . T r a u m a t i c a t t e m p t s w e r e g e n e r a l l y a b o r t e d a n d d i s c a r d e d . P l a t e l e t - r i c h p l a s m a ( P R P ) w a s h a r v e s t e d f r o m w h o l e c i t r a t e d b l o o d b y d i f f e r e n t i a l c e n t r i f u g a t i o n w i t h i n 1 5 m i n o f b l o o d c o l l e c t i o n . P R P w a s p o o l e d f r o m e a c h o f 2 o r 3 c o l l e c t i o n s a f t e r s e r i a l c e n t r i f u g a t i o n s f o r 2 - 4 m i n a t 1 3 0 0 x g . G e l - fi l t e r e d p l a t e l e t s ( G F P ) w e r e o b t a i n e d b y fi l t e r i n g 5 m l o f P R P t h r o u g h a 5 0 m l b e d v o l u m e o f S e p h a r o s e C L - 2 B ( P h a r m a c i a B N i a o t e c h . C l . 5 - n I 6 . c m Blue to 1.15112 w e r e c o l l e c t : I g G H u m ; H e a l t h . C a n A - a g a r o s e ( S S e p h a c n ' l - 3 C f r a c t i o n s i n f r a c t i o n s W e } T h e fi n a l p r c e l e c t r o p h o r e s 2 9 2 B i o t e c h , I n c . , P i s c a t a w a y , N J ) e q u i l i b r a t e d w i t h c a l c i u m - f r e e T y r o d e ’ s b u f f e r ( 1 4 0 m M N a C l , 5 . 6 m M g l u c o s e , 6 m M N a H C O 3 , 2 . 7 m M K C l , 3 . 6 m M N a H z P O 4 , a n d 0 . 3 5 % ( w / v ) b o v i n e s e r u m a l b u m i n ( B S A ) , p H 7 . 2 ) . T h e fi r s t 5 m l o f p l a t e l e t - r i c h e f fl u e n t w e r e c o l l e c t e d a n d r e c a l c i fi e d t o 1 m M c a l c i u m w i t h 5 p l o f l M C a C l z . I g G H u m a n I g G ( C o h n f r a c t i o n H ) w a s a g i f t f r o m t h e M i c h i g a n D e p a r t m e n t o f P u b l i c H e a l t h . C a n i n e I g G w a s p u r i fi e d f r o m n o r m a l c i t r a t e d p l a s m a b y s t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n A - a g a r o s e ( S i g m a ) a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y f o l l o w e d b y e x c l u s i o n c h r o m a t o g r a p h y w i t h S e p h a c r y l - 3 0 0 H R ( P h a r m a c i a ) t o r e m o v e c o n t a m i n a t i n g i m m u n o g l o b u l i n s . O n l y f r a c t i o n s i n t h e p e a k c o r r e s p o n d i n g t o m o n o m e r i c I g G w e r e p o o l e d . T h e p o o l e d f r a c t i o n s w e r e d i a l y z e d a g a i n s t w a t e r , l y o p h y l i z e d , a n d r e s u s p e n d e d i n P B S , p H 7 . 2 . T h e fi n a l p r o d u c t w a s a s s e s s e d f o r p u r i t y b y s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( S D S - P A G E ) u n d e r r e d u c i n g a n d n o n r e d u c i n g c o n d i t i o n s u s i n g C o o m a s s i e B l u e t o v i s u a l i z e t h e b a n d s . O n l y b a n d s f o r I g G w e r e p r e s e n t . I g G w a s a l t e r n a t i v e l y p u r i fi e d b y a m m o n i u m s u l f a t e p r e c i p i t a t i o n f o l l o w e d b y d i e t h y l a m i n o e t h y l S e p h a d e x i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y ( P h a r m a c i a ) a n d fi n a l l y S e p h a r o s e G - 2 0 0 ( P h a r m a c i a ) e x l u s i o n c h r o m a t o g r a p h y t o r e m o v e c o n t a m i n a t i n g I g M a n d a l b u m i n . T h e p u r i fi c a t i o n m e t h o d d i d n o t a l t e r t h e o u t c o m e o f t h e s t u d i e s . F e a n d F a b p u r i fi c a t i o n F e a n d F a b f r a g m e n t s w e r e p r e p a r e d b y p a p a i n d i g e s t i o n o f c a n i n e I g G i n d i g e s t i o n b u f f e r ( 0 . 1 M p h o s p h a t e , 1 0 m M c y s t e i n e , a n d 2 m M E D T A , p H 7 . 0 ) . T h e W h i c h e a c h h A ? 2 r 9 8 0 1 O 7 p 2 8 ! ) - t i c ; g a t 9 0 I g G w a s p u r i f S p A - b i n d a b l e . l i r i n c u b a t i o n w a s e x c h a n g e c o n c e n t r a t o r s l ' n d i g e s t e d l g t h ‘ n i n ' c h r o r i S p A - n o n b i n c S l i m C l o g s I e S i E d C G c g 1 1 $ " c l u ‘ é n t l t 5 8 3 3 1 0 1 3 2 9 3 I g G w a s p u r i fi e d b y t h e s t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n A ( S p A ) m e t h o d a n d w a s t h e r e f o r e a l l S p A - b i n d a b l e . P a p a i n w a s a d d e d a t a r a t i o o f 1 m g p a p a i n t o 1 0 0 m g I g G . A f t e r a 4 h r i n c u b a t i o n a t 3 7 ° C , t h e i n c u b a t i o n m i x t u r e w a s p l a c e d o n i c e . T h e d i g e s t i o n b u f f e r w a s e x c h a n g e d f o r P B S , p H 7 . 2 , b y r e p e a t e d d i l u t i o n a l c e n t r i f u g a t i o n s i n C e n t r i p r e p - l O c o n c e n t r a t o r s ( A m i c o n , B e v e r l y , M A ) , a n d t h e n b y d i a l y s i s i n P B S o v e r n i g h t a t 4 ° C . U n d i g e s t e d I g G w a s r e m o v e d b y S e p h a c r y l 3 0 0 e x c l u s i o n c h r o m a t o g r a p h y , a n d S p A a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y w a s u s e d t o s e p a r a t e t h e P C S ( S p A - b i n d a b l e ) f r o m t h e F a b s ( S p A - n o n b i n d a b l e ) . S D S - P A G E c o n fi r m e d r e m o v a l o f w h o l e I g G f r o m t h e F C S a n d F a b s w h i c h e a c h h a d a p p a r e n t m o l e c u l a r m a s s e s o f a b o u t 5 0 k D . H e a t a g g r e g a t i o n I g G w a s a g g r e g a t e d b y h e a t i n g 5 0 t o 1 0 0 p l a l i q u o t s o f 5 t o 8 4 m g / m l s o l u t i o n s f o r 3 0 t o 6 0 m i n a t 5 6 ° C i n a w a t e r b a t h . F o r s o m e s t u d i e s , s a m p l e s w e r e h e a t e d a t 6 5 ° C f o r 5 - 1 0 m i n t o p r o d u c e l a r g e r , v i s i b l e , a n d e a s i l y p e l l e t e d a g g r e g a t e s . A g g r e g o m e t r y O p t i c a l a g g r e g o m e t r y w a s d o n e i n a C h r o n o - l o g l u m i a g g r e g o m e t e r a t 3 7 ° C w i t h s t i r r i n g a t 9 0 0 r p m . B e c a u s e t h e e f f e c t o f H A I g G w a s s i m i l a r a t a l l p l a t e l e t c o n c e n t r a — t i o n s t e s t e d , p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s o f P R P a n d G F P w e r e n o t a d j u s t e d t o a c o n s t a n t . C o n s e q u e n t l y , c o m p a r i s o n s o f t r a c i n g s w e r e m a d e o n l y w i t h i n s i n g l e a g g r e g o m e t r y s e s s i o n s . W i t h s r i r r i n s P a r t i c l e C O M a F C e d o r o n t r m a h O e f t m H m A l o é ’ l z I E G O r b r a c e ( 3 6 A l d e l u d r o g e w e r e p e l l e l S i g r n a i i n a p e r c e t a g w e r e a l s o c a g o n i s t s ; [ h i t e a c h l i l n e 2 9 4 L a c t a t e d e h y d r o g e n a s e A D P , c a l c i u m i o n o p h o r e , a n d H A I g G w e r e a d d e d t o P R P t o a s s e s s l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e ( L D H ) r e l e a s e f r o m s t i m u l a t e d p l a t e l e t s . A f t e r 1 5 o r 6 0 m i n , p l a t e l e t s w e r e p e l l e t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a n d 1 0 0 # 1 o f s u p e r n a t a n t w e r e t e s t e d b y k i n e t i c a s s a y ( S i g m a ) i n a P e r k i n E l m e r s p e c t r o p h o t o m e t e r a t 3 4 0 n m . L D H r e l e a s e w a s r e p o r t e d a s a p e r c e n t a g e o f t h e L D H r e l e a s e d f r o m p l a t e l e t s l y s e d b y T r i t o n X - 1 0 0 . T e s t r e s u l t s w e r e a l s o c o m p a r e d t o c o n t r o l s u s i n g P R P t r e a t e d s i m i l a r l y b u t w i t h o u t t h e a d d i t i o n o f a g o n i s t s ; t h i s a s s e s s e d b a c k g r o u n d p l a s m a L D H a n d a n y L D H r e l e a s e d f r o m p l a t e l e t s w i t h s t i r r i n g o v e r t i m e . D a t a a r e m e a n s o f d u p l i c a t e d e t e r m i n a t i o n s . P a r t i c l e c o u n t i n g F o r a n a l y s i s o f p l a t e l e t c l u m p i n g i n 3 7 ° C w h o l e b l o o d , H A I g G - t r e a t e d a n d P B S — t r e a t e d c o n t r o l s a m p l e s f r o m e a c h o f 2 d o g s w e r e a n a l y s e d i n p a i r s o n a T e c h n i c o n H - l h e m a t o l o g y a n a l y z e r ( M i l e s , I n c . , T a r r y t o w n , P A ) . D a t a w e r e c o l l e c t e d b e f o r e a d d i t i o n o f H A I g G o r P B S , a n d a t 1 5 a n d 6 0 m i n a f t e r t h e i r a d d i t i o n . B l o o d s m e a r s w e r e m a d e a t e a c h t i m e a n d e v a l u a t e d t o c o n fi r m p l a t e l e t c l u m p i n g . R e s u l t s H u m a n H A I g G c a u s e d f u l l - s c a l e a g g r e g a t i o n o f h u m a n G F P ( F i g u r e 3 . 1 3 ) . A g g r e g a t i o n w a s c o n s i s t e n t l y b l o c k e d w i t h p l a s m a o r b y p r e i n c u b a t i n g t h e p l a t e l e t s w i t h I V . 3 , a m o n o c l o n a l a n t i b o d y t o t h e h u m a n p l a t e l e t F c y R I I ( F i g u r e 3 . 1 3 ) . S i m i l a r l y , c a n i n e H A I g G ( K 9 H A I g G ) w a s c a p a b l e o f f u l l y a g g r e g a t i n g h u m a n G F P ( F i g u r e 3 . 1 a ) , 3 2 5 1 1 1 5 3 t h n o f u n c t h U E A d d i c o m m a . [ h e a n d m b m a x that is 215509: n o t i n d u c e P m 5 6 3 C . P R P m o r e : 1 a m o u n t o f H lag t i m e . ir. m a t t r n a l l i g i tnal. c o r r e s i n d u c e d b y c l u m p i n g a l t o p p o s e d Fg !t g o n i s t s t o a s t 2 2 9 5 a n e f f e c t t h a t w a s a g a i n b l o c k a b l e b y I V . 3 . I n c o n t r a s t , h u m a n a n d c a n i n e H A I g G h a d n o f u n c t i o n a l e f f e c t o n c a n i n e G F P i n t h e a b s e n c e o f p l a s m a ( F i g u r e 3 . 1 b ) . A d d i t i o n o f h u m a n H A I g G t o h u m a n P R P c a u s e d n o d e t e c t a b l e a g g r e g a t i o n . I n c o n t r a s t , t h e a d d i t i o n o f h u m a n o r c a n i n e H A I g G t o c a n i n e c i t r a t e d P R P c a u s e d a d e l a y e d a n d s u b m a x i m a l c l u m p i n g o f p l a t e l e t s w i t h o u t a n i n i t i a l d e c r e a s e i n l i g h t t r a n s m i t t a n c e t h a t i s a s s o c i a t e d w i t h s h a p e c h a n g e ( F i g u r e 3 . 1 c ) . U n h e a t e d m o n o m e r i c c a n i n e I g G d i d n o t i n d u c e p l a t e l e t c l u m p i n g ( F i g u r e 3 . 1 c ) . K 9 H A I g G p r o d u c e d a t t e m p e r a t u r e s g r e a t e r t h a n 5 6 ° C , s u c h t h a t I g G a g g r e g a t e s w e r e p r e c i p i t a b l e a n d v i s i b l e , i n d u c e d c l u m p i n g i n P R P m o r e r a p i d l y a n d t o a g r e a t e r ( b u t s t i l l s u b m a x i m a l ) e x t e n t t h a n d i d t h e s a m e a m o u n t o f H A I g G p r o d u c e d a t 5 6 ° C . I n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f H A I g G s h o r t e n e d t h e l a g t i m e , i n c r e a s e d t h e r a t e o f a g g r e g a t i o n ( s l o p e ) , a n d i n c r e a s e d t h e a m p l i t u d e o f m a x i m a l l i g h t t r a n s m i t t a n c e ( F i g u r e 3 . 1 c ) . H o w e v e r , a g g r e g a t i o n s r e m a i n e d s u b m a x - i m a l , c o r r e s p o n d i n g a p p r o x i m a t e l y t o t h e a m p l i t u d e o f p r i m a r y r e v e r s i b l e a g g r e g a t i o n i n d u c e d b y t h r e s h o l d c o n c e n t r a t i o n s o f A D P ( F i g u r e 3 . 1 d ) . M a c r o s c 0 p i c a l l y , t h e c l u m p i n g a l s o a p p e a r e d i n c o m p l e t e i n t h a t t h e r e w e r e m a n y fi n e p l a t e l e t a g g r e g a t e s a s o p p o s e d t o t h e f e w e r , l a r g e r a g g r e g a t e s s e e n a f t e r m a x i m a l a g g r e g a t i o n b y s u c h p l a t e l e t a g o n i s t s a s A D P , c o l l a g e n , a n d P A P ( F i g u r e 3 . 2 ) . 2 9 6 F i g u r e 3 . 1 . A g g r e g o m e t r y c u r v e s u s i n g : a ) h u m a n G F P w i t h h u m a n ( H ) a n d c a n i n e ( C ) H A I g G p l u s ( + ) a n d m i n u s ( - ) m o n o c l o n a l a n t i b o d y I V . 3 , b ) c a n i n e G F P w i t h h u m a n a n d c a n i n e H A I g G , a n d c ) c a n i n e P R P w i t h c a n i n e H A I g G . U n h e a t e d m o n o m e r i c I g G ( 1 ) i s c o m p a r e d t o i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f H A I g G ( 3 2 , u g / m l ( 2 ) , 6 4 j i g / m l ( 3 ) , 1 2 8 j i g / m l ( 4 ) ) a n d t o 1 2 8 j i g / m l H A I g G f o r m e d a t 5 9 ° C ( 5 ) . I n ( ( 1 ) , t h e m a x i m u m l i g h t t r a n s m i t t a n c e w i t h H A I g G ( 6 ) i n P R P i s c o m p a r e d t o t h a t o f r e v e r s i b l e ( 7 ) a n d i r r e v e r s i b l e ( 8 ) A D P a g g r e g a t i o n s . o 0 C 9 2 E U ) C m t O ‘ 1 ‘ o ' L . . J l . . . r G ) O C E e U ) C c s 8 t O Q ~ F Q : h ‘ g e c n a t t i m s n a r t % 0 0 1 e c n a t t i m s n a r t % 0 0 1 % e c n a t t i m s n a r t % 0 0 1 F i g u r e 3 . 1 4 I I C - H - m H + “ W C + ' l — — - I 1 m i n 2 9 7 b 1 fl % F i g u r e 3 . 2 . P h o t o g r a p h s o f a g g r e g o m e t r y c u v e t t e s c o n t a i n i n g a ) u n s t i m u l a t e d p l a t e l e t s . b ) n u m e r o u s s m a l l c l u m p s o f p l a t e l e t s c o r r e s p o n d i n g t o t h e m a x i m a l r e s p o n s e t o 0 . 4 m g / m l H A I g G . a n d c ) f e w e r l a r g e c l u m p s o f p l a t e l e t s c o r r e s p o n d i n g t o f u l l — s c a l e a g g r e g a t i o n a f t e r s t i m u l a t i o n w i t h 2 . 5 r i g / m l c o l l a g e n . € 7 1 2 l T I l a t i C p S i n c e t h e S h o l l l l l - b I O C k l I l ‘ . W 1 5 e t a l u a t e d l e q c m o l a r t o L l l l t l g G i n d u c e t T h e f i n c a n i n e 3 0 0 i l l p l a s m a . h e p a r i t c i n h i b i t t h e i “ a s h e a t e d t o h r s d i n - i n h i b i i t ‘ d E D T A 0 W h i l e c a l c i u n S e r u m “ E Y E . e l i t t t ' l t t a t e d l l H * 1 t h w i t l 2 9 9 S i n c e t h e m o n o c l o n a l a n t i b o d y I V . 3 d i d n o t b i n d t o c a n i n e p l a t e l e t s ( d a t a n o t s h o w n ) , b l o c k i n g e x p e r i m e n t s w i t h i t w e r e n o t i n d i c a t e d . I n s t e a d , p o t e n t i a l F c - m e d i a t i o n w a s e v a l u a t e d b y p r e i n c u b a t i o n o f P R P w i t h c o n c e n t r a t i o n s o f K 9 c h a n d K 9 H A c h e q u i m o l a r t o t h o s e o f t h e a d d e d K 9 H A I g G . C a n i n e F C S a n d H A c h d i d n o t i n h i b i t H A I g G - i n d u c e d p l a t e l e t c l u m p i n g . T h e fi n d i n g s d e s c r i b e d f o r P R P a l s o o c c u r r e d w h e n K 9 H A I g G w a s a d d e d t o c a n i n e 3 0 0 p l G F P i n t h e p r e s e n c e b u t n o t i n t h e a b s e n c e o f 1 0 0 p l c a n i n e c i t r a t e d p l a s m a , h e p a r i n i z e d p l a s m a , o r h i r u d i n - s e r u m ( F i g u r e 3 . 3 ) . H i r u d i n w a s a d d e d t o s e r u m t o i n h i b i t t h e a g g r e g a t o r y e f f e c t s o f r e s i d u a l t h r o m b i n ; w e f o u n d t h a t e v e n w h e n s e r u m w a s h e a t e d f o r 4 5 m i n a t 5 6 ° C , 1 0 0 p l o f s e r u m a d d e d t o 3 0 0 p l G F P c a u s e d d e l a y e d h i r u d i n - i n h i b i t a b l e , a n d t h e r e f o r e t h r o m b i n — m e d i a t e d , a g g r e g a t i o n . T h e a d d i t i o n o f 5 m M E D T A o r 5 m M E G T A p r e v e n t e d H A I g G - i n d u c e d p l a t e l e t c l u m p i n g i n t h i s s y s t e m , w h i l e c a l c i u m r e p l e n i s h m e n t ( 5 m M ) a g a i n s u p p o r t e d i t . W h e n H A I g G a n d p l a s m a o r s e r u m w e r e p r e i n c u b a t e d b e f o r e a d d i t i o n t o G F P , t h e l a g t i m e t o p l a t e l e t c l u m p i n g w a s e l i m i n a t e d ( F i g u r e 3 . 3 ) . T h i s i n d i c a t e d t h a t t h e l a g t i m e w a s r e l a t e d t o a n i n t e r a c t i o n o f H A I g G w i t h p l a s m a r a t h e r t h a n w i t h p l a t e l e t s , a n d s u g g e s t e d t h e p o s s i b i l i t y o f a n e n z y m a t i c p r o c e s s i n v o l v i n g p l a s m a p r o t e i n s . e c n a t t i m s n a r t % 0 0 1 3 0 0 1 m i n F i g u r e 3 . 3 . A g g r e g o m e t r y c u r v e s f o r c a n i n e G F P ( 3 0 0 p l ) i n c u b a t e d w i t h H A I g G i n t h e p r e s e n c e o f 1 0 0 p 1 c i t r a t e d p l a s m a ( 2 , 3 ) o r T y r o d e ’ s b u f f e r ( 1 ) . T r a c i n g s i n d i s t i n g u i s h - a b l e f r o m c u r v e 2 w e r e g e n e r a t e d w i t h h e p a r i n i z e d p l a s m a a n d s e r u m p l u s h i r u d i n . F o r c u r v e 3 , H A I g G a n d p l a s m a w e r e i n c u b a t e d f o r 1 0 m i n b e f o r e a d d i t i o n t o G F P . H e a t l a b i l t h e a d d e d s e r u m l l e a t e d s e r u m 1 : o l l a g e n . P A P . i n h i b i t e d b y h e l I l E C l l l ‘ a l t Z ‘ t h e a 3 0 1 H e a t l a b i l i t y o f t h e c o f a c t o r ( s ) w a s s h o w n b y t h e p r e v e n t i o n o f c l u m p i n g w h e n t h e a d d e d s e r u m o r p l a s m a w a s fi r s t h e a t e d f o r 5 o r 3 0 m i n a t 5 6 ° C ( F i g u r e 3 . 4 a ) . H e a t e d s e r u m t r e a t e d w i t h h i r u d i n d i d n o t i n h i b i t a g g r e g a t i o n s i n d u c e d b y A D P , c o l l a g e n , P A F , o r P M A ( F i g u r e 3 . 4 b ) . C l u m p i n g w a s a l s o m a r k e d l y b u t n o t c o m p l e t e l y i n h i b i t e d b y h e a t i n g p l a s m a f o r 2 0 m i n a t 5 0 ° C ( F i g u r e 3 . 4 a ) , a p r o c e s s k n o w n t o i n a c t i v a t e t h e a l t e r n a t i v e c o m p l e m e n t p a t h w a y . ‘ 8 3 0 2 F i g u r e 3 . 4 . E f f e c t s o f h e a t i n g s e r u m ( 5 6 ° C , 5 m i n ) o r p l a s m a ( 5 0 ° C , 2 0 m i n ) o n t h e i r s u p p o r t o f H A I g G - i n d u c e d c l u m p i n g o f G F P . H A I g G ( a ) o r p l a t e l e t a g o n i s t s ( b ) w e r e a d d e d t o 3 0 0 p l G F P a n d 1 0 0 p l h e a t e d s e r u m p l u s h i r u d i n ( 1 , 4 - 7 ) , h e a t e d p l a s m a ( 2 ) , o r u n h e a t e d s e r u m ( 3 ) . P l a t e l e t a g o n i s t s w e r e P A F ( 4 ) , c o l l a g e n ( 5 ) , A D P ( 6 ) , a n d P M A ( 7 ) . ] a 3 F i g u r e 3 . 4 1 0 0 % t r a n s m i t t a n c e L l K K # I 1 0 0 % t r a n s m i t t a n c e 3 0 3 t — . — ' 1 m i n E v i d e m e d i a t e d w e c o m p l e m e n t : s a m e c h a r a c n a n d z j m o s a n m m a t 5 6 ° ! 3 0 4 E v i d e n c e t h a t H A I g G - i n d u c e d c l u m p i n g w a s c o m p l e m e n t - m e d i a t e d a n d n o t F c - m e d i a t e d w a s t h a t z y m o s a n a n d b a c t e r i a l l i p 0 p o l y s a c c h a r i d e ( L P S ) , o t h e r k n o w n 1 9 : 2 0 p r o d u c e d p l a s m a / s e r u m - d e p e n d e n t p l a t e l e t c l u m p i n g w i t h t h e c o m p l e m e n t a c t i v a t o r s , s a m e c h a r a c t e r i s t i c d e l a y a n d s u b m a x i m a l a g g r e g a t i o n ( F i g u r e 3 . 5 ) . T h e e f f e c t s o f L P S a n d z y m o s a n w e r e a l s o p r e v e n t e d b y u s e o f p l a s m a o r s e r u m ( w i t h h i r u d i n ) h e a t e d f o r 5 m i n a t 5 6 ° C ( F i g u r e 3 . 5 ) . 3 0 5 l - o 4 . z y m o s a n O C . ‘ E E U ) : 3 3 . L P S g 0 2 l l ) — 2 . z y m o s a n ! l A - — — — 1 . L P S l — _ ‘ l 1 m i n F i g u r e 3 . 5 . A g g r e g o m e t r y c u r v e s g e n e r a t e d w i t h 0 . 7 m g / m l z y m o s a n ( 2 , 4 ) o r 2 5 p g / m l L P S ( 1 , 3 ) i n 3 0 0 p l G F P w i t h 1 0 0 p l s e r u m p l u s h i r u d i n . S e r u m w a s e i t h e r u n h e a t e d ( 3 , 4 ) o r h e a t e d ( 1 , 2 ) a t 5 6 ° C f o r 5 m i n . 3 0 6 T o s p e c i fi c a l l y i n v e s t i g a t e t h e p a r t i c i p a t i o n o f c o m p l e m e n t i n t h e s u p p o r t o f H A I g G - i n d u c e d p l a t e l e t c l u m p i n g , p l a s m a w a s p r e t r e a t e d w i t h z y m o s a n t o a c t i v a t e c o m p l e m e n t a n d e f f e c t i v e l y d e p l e t e i t f r o m t h e p l a s m a . T h e z y m o s a n w a s t h e n p e l l e t e d b y c e n t r i f u g a t i o n b e f o r e t h e t r e a t e d p l a s m a w a s a d d e d t o G F P . A s c o m p a r e d t o c o n t r o l p l a s m a , t h e c a p a c i t y o f z y m o s a n — t r e a t e d p l a s m a t o s u p p o r t p l a t e l e t c l u m p i n g b y H A I g G w a s m a r k e d l y r e d u c e d o r a b s e n t ( F i g u r e 3 . 6 a ) . C o l l a g e n a n d A D P a g g r e g a t i o n s w e r e u n a f f e c t e d . C V F w a s a l s o u s e d t o d e p l e t e p l a s m a o f c o m p l e m e n t , a n d t h e e f f e c t s w e r e s i m i l a r ; p l a s m a d e p l e t e d o f c o m p l e m e n t b y C V F d i d n o t s u p p o r t H A I g G - i n d u c e d c l u m p i n g ( F i g u r e 3 . 6 b ) . I n c o n t r a s t , C V F c a u s e d m i l d o r n o i n h i b i t i o n o f a g g r e g a t i o n s i n d u c e d b y c a l c i u m i o n o p h o r e a n d P A P ( F i g u r e 3 . 6 b ) . H o w e v e r , C V F ’ s e f f e c t s w e r e n o t s p e c i fi c a s i t a l s o i n h i b i t e d a g g r e g a t i o n i n d u c e d i n d e p e n d e n t l y b y c o l l a g e n a n d A D P ( F i g u r e 3 . 7 ) . 3 0 7 F i g u r e 3 . 6 . E f f e c t s o f c o m p l e m e n t d e p l e t i o n b y z y m o s a n ( a ) a n d c o b r a v e n o m f a c t o r ( b ) o n a g g r e g o m e t r y w i t h H A I g G a n d c o n t r o l a g o n i s t s a d d e d t o 3 0 0 p l G F P p l u s 1 0 0 p l c o m p l e m e n t - d e p l e t e d ( 1 , 3 , 4 , 5 , 7 , 8 ) o r c o n t r o l p l a s m a w i t h c o m p l e m e n t a c t i v i t y ( 2 , 6 ) . E f f e c t s o f H A I g G i n c o m p l e m e n t - d e p l e t e d p l a s m a ( 1 , 5 ) w e r e c o m p a r e d t o i t s e f f e c t s o n c o n t r o l p l a s m a ( 2 , 6 ) . C o n t r o l a g o n i s t s w e r e c o l l a g e n ( 3 ) , A D P ( 4 ) , P A F ( 7 ) , a n d c a l c i u m i o n o p h o r e ( 8 ) . e c n a t t i m s n a r t % 0 0 1 e c n a t t i m s n a r t % 0 0 1 F i g u r e 3 . 6 1 m i n 3 0 8 I — _ — 1 1 m i n 3 0 9 T h e e f f e c t s o f C V F o n A D P a g g r e g a t i o n w e r e e v a l u a t e d b y a l t e r i n g t h e o r d e r o f a d d i t i o n o f C V F a n d A D P t o p l a t e l e t s . W h e n p l a t e l e t s w e r e e x p o s e d t o C V F - t r e a t e d p l a s m a b e f o r e t h e a d d i t i o n o f A D P , i n h i b i t i o n w a s g r e a t e r t h a n w h e n p l a t e l e t s w e r e e x p o s e d t o C V F - t r e a t e d p l a s m a a n d A D P s i m u l t a n e o u s l y b y a d d i n g G F P t o a m i x t u r e o f C V F - t r e a t e d p l a s m a a n d A D P ( F i g u r e 3 . 7 a ) . T h i s s u g g e s t e d a n e f f e c t o f C V F o r C V F - t r e a t e d p l a s m a o n t h e p l a t e l e t s . A p l a s m a r e q u i r e m e n t f o r t h e i n h i b i t i o n o f c o l l a g e n - i n d u c e d a g g r e g a t i o n w a s s h o w n b y s u b s t i t u t i n g T y r o d e ’ s b u f f e r f o r p l a s m a ; C V F d i d n o t i n h i b i t c o l l a g e n - i n d u c e d a g g r e g a t i o n i n t h e a b s e n c e o f p l a s m a , b u t i t d e l a y e d a g g r e g a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f p l a s m a , e v e n w i t h o u t a p r e i n c u b a t i o n p e r i o d ( F i g u r e 3 . 7 b , c u r v e 6 ) . I n h i b i t i o n w a s c o m p l e t e w h e n p l a s m a w a s i n c u b a t e d w i t h C V F f o r 7 5 m i n a t 3 7 ° C ( F i g u r e 3 . 7 b , c u r v e s 4 a n d 5 ) . 3 1 0 F i g u r e 3 . 7 . E f f e c t s o f c o b r a v e n o m f a c t o r ( C V F ) o n a g g r e g a t i o n s i n d u c e d b y A D P ( a ) a n d c o l l a g e n ( b ) u s i n g 3 0 0 p l G F P a n d 1 0 0 p l C V F - t r e a t e d p l a s m a , c o n t r o l p l a s m a , o r T y r o d e ’ s b u f f e r . I n ( a ) , A D P ( 2 0 p M fi n a l ) w a s a d d e d t o G F P p l u s C V F - t r e a t e d p l a s m a ( 1 ) , t o G F P p l u s c o n t r o l p l a s m a ( 3 ) , o r t o G F P s i m u l t a n e o u s l y w i t h C V F - t r e a t e d p l a s m a ( 2 ) . I n ( b ) , c o l l a g e n ( 5 p g / m l fi n a l ) w a s a d d e d t o G F P p l u s p l a s m a i n c u b a t e d w i t h C V F f o r 7 5 m i n a t 3 7 ° C ( 4 ) , t o G F P p l u s C V F - t r e a t e d T y r o d e ’ s b u f f e r ( 7 ) , t o G F P p l u s T y r o d e ’ s b u f f e r ( 8 ) , t o G F P p l u s u n t r e a t e d p l a s m a ( 9 ) , t o G F P s i m u l t a n e o u s l y w i t h C V F - t r e a t e d p l a s m a ( 5 ) , a n d t o G F P w i t h u n h e a t e d p l a s m a i m m e d i a t e l y a f t e r t h e a d d i t i o n o f C V F , t h u s a v o i d i n g p r e i n c u b a t i o n o f C V F w i t h p l a s m a ( 6 ) . e c n a t t i m s n a r t % 0 0 1 e c n a t t i m s n a r t % 0 0 1 F i g u r e 3 . 7 " — ' . 1 m i n 4 1 3 1 1 3 1 2 F u r t h e r e v i d e n c e o f a c o m p l e m e n t r e q u i r e m e n t c a m e f r o m u s e o f c a n i n e C 3 - d e fi c i e n t p l a s m a . C a n i n e p l a s m a d e fi c i e n t i n C 3 d i d n o t s u p p o r t c l u m p i n g b y K 9 H A I g G , b u t c o n t r o l p l a s m a h a n d l e d u n d e r i d e n t i c a l c o n d i t i o n s d i d ( F i g u r e 3 . 8 ) . e c n a t t i m s n a r t % 0 0 1 3 1 3 F i g m e 3 . 8 . A g g r e g a t i o n c u r v e s f o r H A I g G a d d e d t o 3 0 0 p l G F P p l u s 1 0 0 p l C 3 - d e f fi c i e n t ( 1 ) o r n o r m a l c o n t r o l ( 2 ) p l a s m a . R e s u l t s w i t h a s e c o n d p a i r o f C 3 — d e fi c i e n t a n d n o r m a l d o g s w e r e t h e s a m e . 3 1 4 T h e a d d i t i o n o f 1 0 0 p g o f K 9 H A F a b s t o P R P i n d u c e d d e l a y e d a n d r e l a t i v e l y l o w a m p l i t u d e p l a t e l e t c l u m p i n g , p e r h a p s l i m i t e d b y t h e s i z e a n d n u m b e r o f a g g r e g a t e s t h a t c o u l d f o r m b y h e a t i n g a r e l a t i v e l y d i l u t e s o l u t i o n ( 4 m g / m l ) . H A F a b s a l s o a c c e l e r a t e d a n d m i l d l y a m p l i fi e d t h e p l a t e l e t r e s p o n s e t o H A I g G . K 9 H A c h , h o w e v e r , p r o d u c e d v e r y d e l a y e d a n d v e r y m i l d p l a t e l e t c l u m p i n g . B e c a u s e c o m p l e m e n t p l a y e d a p i v o t a l r o l e i n H A I g G - i n d u c e d p l a t e l e t c l u m p i n g , p l a t e l e t l y s i s w a s a s s e s s e d b y m e a s u r i n g L D H c o n c e n t r a t i o n s i n p l a t e l e t s u s p e n s i o n s . B y 1 5 m i n , c a l c i u m i o n o p h o r e i n d u c e d t h e r e l e a s e o f d e t e c t a b l e L D H ( T a b l e 3 . 1 ) , w h i l e A D P a n d H A I g G d i d n o t . L D H w a s n o t e l e v a t e d a b o v e n e g a t i v e c o n t r o l s i n t h e s u p e r n a t a n t s o f c l u m p e d p l a t e l e t s e v e n 6 0 m i n a f t e r t h e a d d i t i o n o f H A I g G . T a b l e 3 . 1 . l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e r e l e a s e d f r o m p l a t e l e t s d u r i n g a g g r e g o m e t r y . T r e a t m e n t R e l e a s e ‘ n o a g o n i s t 0 . 3 A D P ( 2 0 m M ) 0 . 4 c a l c i u m i o n o p h o r e ( 4 0 m M ) 2 . 6 H A I g G ( 0 . 2 2 m g / m l ) 0 . 3 n o a g o n i s t ( 6 0 m i n ) 0 . 7 H A I g G ( 6 0 m i n ) 0 . 7 1 V a l u e s a r e t h e % o f L D H r e l e a s e c o m p a r e d t o t h e s u p e r n a t a n t o f p l a t e l e t s l y s e d w i t h T r i t o n X - 1 0 0 . T h e e f f e c t s o f H A I g G w e r e a l s o e v a l u a t e d i n c i t r a t e d w h o l e c a n i n e b l o o d , a s o m e w h a t m o r e p h y s i o l o g i c s y s t e m t h a n t h e P R P a n d G F P s y s t e m s . F i f t e e n m i n u t e s 3 1 5 a f t e r H A I g G o r P B S w e r e a d d e d t o c i t r a t e d b l o o d , p l a t e l e t c l u m p s w e r e d e t e c t e d b y a n a u t o m a t e d b l o o d a n a l y z e r ( T e c h n i c o n H — l ) , a n d a p p a r e n t p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s w e r e 1 7 3 , 0 0 0 / p l a n d 2 3 9 , 0 0 0 / p l i n t h e c o n t r o l s a m p l e s f r o m t w o d o g s , b u t o n l y 1 5 , 0 0 0 / p l a n d 1 7 , 0 0 0 / p 1 i n t h e H A I g G - t r e a t e d s a m p l e s ( F i g u r e 3 . 9 ) . B y 1 h r , t h e a p p a r e n t p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n h a d i n c r e a s e d t o 1 0 2 , 0 0 0 / p l a n d 5 9 , 0 0 0 / p l . P l a t e l e t c l u m p i n g w a s m a r k e d o n b l o o d s m e a r s f r o m H A I g G - t r e a t e d s a m p l e s b u t n o t o n c o n t r o l s m e a r s . 3 1 6 F i g u r e 3 . 9 . T e c h n i c o n H - l a n a l y s i s o f c e l l s i n c i t r a t e d w h o l e b l o o d f r o m 1 o f 2 t e s t d o g s b e f o r e ( a ) a n d 1 5 m i n a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 2 5 m g / m l H A I g G ( b ) o r m a t c h i n g v o l u m e s o f P B S ( c ) . T h e a p p a r e n t p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s o f e a c h s a m p l e f o r d o g 1 ( D 1 ) a n d d o g 2 ( D 2 ) a r e r e c o r d e d n e x t t o t h e c o r r e s p o n d i n g r e p r e s e n t a t i v e c y t o g r a m . A n e l l i p s e s u r r o u n d s t h e r e g i o n w h e r e p l a t e l e t c l u m p s a r e r e c o r d e d . N = n e u t r o p h i l s , E = e o s i n o p h i l s , M = m o n o c y t e s , L = l y m p h o c y t e s . J _ _ _ _ _ _ _ _ _ . . . . , , , , , , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J . . . . . . , . - A p c p o a n r c e e n t n t r p a l t a i t o e n l e t s 3 1 7 ( 1 1 1 ' ) D 1 : 2 6 4 , 0 0 0 D Z : 1 9 6 , 0 0 0 o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o . . . - . . - . . 0 3 ' ' ' ~ - ' ; ' f ? . fl . : f r a m - h a ? . I , . . , ° c ’ 0 - o o a o ' a 0 D 1 : 1 7 , 0 0 0 D Z : 1 5 , 0 0 0 D 1 : 2 3 9 , 0 0 0 D Z : 1 7 3 , 0 0 0 F i g u r e 3 . 9 3 1 8 D i s c u s s i o n T h e s e s t u d i e s s h o w t h a t c a n i n e p l a t e l e t s l a c k f u n c t i o n a l F e y r e c e p t o r s a n a l o g o u s t o t h e h u m a n F c ' y R I I w h i c h m e d i a t e a g g r e g a t i o n i n d u c e d b y H A I g G . T h i s s p e c i e s d i f f e r e n c e w a s e s t a b l i s h e d b y t h e f a i l u r e o f c a n i n e G F P t o a g g r e g a t e i n r e s p o n s e t o c a n i n e o r h u m a n H A I g G i n t h e a b s e n c e o f p l a s m a . I n c o n t r a s t , h u m a n G F P d i d a g g r e g a t e i n r e s p o n s e t o c a n i n e a n d h u m a n H A I g G , a n d t h i s a g g r e g a t i o n w a s p r e v e n t e d b y p l a s m a a n d b y t h e F c - r e a c t i v e m o n o c l o n a l a n t i b o d y I V . 3 . T h i s s p e c i e s d i f f e r e n c e i s i m p o r t a n t f o r u n d e r s t a n d i n g t h e i n v i t r o a n d i n v i v o r e s p o n s e s o f c a n i n e p l a t e l e t s t o i m m u n o l o g i c s t i m u l i . A l t h o u g h H A I g G d i d n o t i n d u c e F c - m e d i a t e d a g g r e g a t i o n o f c a n i n e G F P i n C a - T y r o d e ’ s b u f f e r , c a n i n e G F P d i d c l u m p w h e n e x p o s e d t o H A I g G i n t h e p r e s e n c e o f p l a s m a o r s e r u m . H A I g G a l s o i n d u c e d m a r k e d c l u m p i n g o f p l a t e l e t s i n c i t r a t e d w h o l e b l o o d , s u g g e s t i n g t h a t t h e r e s u l t s m a y b e a p p l i c a b l e t o w h o l e b l o o d a n d i n v i v o c o n d i t i o n s . B e c a u s e t h i s p l a s m a / s e r u m — d e p e n d e n t c l u m p i n g w a s n o t i n h i b i t a b l e b y p r e i n c u b a t i o n w i t h a g g r e g a t e d o r u n a g g r e g a t e d F c f r a g m e n t s o f c a n i n e I g G , i t d i d n o t a p p e a r t o b e F c - m e d i a t e d . I n s t e a d , t h i s H A I g G - i n d u c e d c l u m p i n g w a s m e d i a t e d b y t h e c a n i n e c o m p l e m e n t s y s t e m . A c o m p l e m e n t r e q u i r e m e n t f o r H A I g G - i n d u c e d c l u m p i n g o f c a n i n e p l a t e l e t s w a s e v i d e n c e d b y : 1 ) c a n i n e p l a s m a n a t u r a l l y d e fi c i e n t i n C 3 d i d n o t s u p p o r t H A I g G - i n d u c e d p l a t e l e t c l u m p i n g , 2 ) p l a s m a d e p l e t e d o f c o m p l e m e n t b y p r e i n c u b a t i o n w i t h C V F o r z y m o s a n d i d n o t s u p p o r t H A I g G - i n d u c e d p l a t e l e t c l u m p i n g , 3 ) k n o w n c o m p l e m e n t a c t i v a t o r s , L P S a n d z y m o s a n , i n d u c e d s i m i l a r c l u m p i n g , 4 ) c l u m p i n g w a s p r e v e n t e d b y h e a t i n g p l a s m a o r s e r u m a t 5 6 ° C f o r 5 m i n , a n d 5 ) c l u m p i n g r e q u i r e d d i v a l e n t c a t i o n s . 3 1 9 T h i s c o m p l e m e n t d e p e n d e n c y e x p l a i n s t h e p l a s m a o r s e r u m r e q u i r e m e n t a n d t h e d e l a y t h a t a l w a y s o c c u r r e d b e f o r e c l u m p i n g . A s e x p e c t e d , t h e d e l a y w a s e l i m i n a t e d b y p r e i n c u b a t i n g H A I g G w i t h p l a s m a t o a c t i v a t e c o m p l e m e n t b e f o r e t h e p l a s m a w a s a d d e d t o G F P . H A I g G m a y a c t i v a t e e i t h e r t h e c l a s s i c a l o r t h e a l t e r n a t i v e c o m p l e m e n t p a t h w a y s , b u t t h e d a t a s u g g e s t t h a t t h e a l t e r n a t i v e c o m p l e m e n t p a t h w a y w a s o f p r i m a r y i m p o r t a n c e i n H A I g G - i n d u c e d p l a t e l e t c l u m p i n g . H A I g G - i n d u c e d p l a t e l e t c l u m p i n g w a s m a r k e d l y i n h i b i t e d b y h e a t i n g p l a s m a a t 5 0 ° C f o r 2 0 m i n , a t r e a t m e n t t h a t r e m o v e s a l t e r n a t i v e c o m p l e m e n t p a t h w a y a c t i v i t y f r o m c a n i n e s e r u m w h i l e p r e s e r v i n g c l a s s i c a l p a t h w a y a c t i v i t y . ’ 8 W e c o n fi r m e d t h a t t h i s h e a t t r e a t m e n t i n a c t i v a t e d t h e c a n i n e a l t e r n a t i v e p a t h w a y b y s h o w i n g t h a t i t p r e v e n t e d t h e l y s i s o f r a b b i t e r y t h r o c y t e s b y c a n i n e s e r u m ( d a t a n o t s h o w n ) . W e a l s o c o n f i r m e d t h a t t h e l y s i s o f r a b b i t e r y t h r o c y t e s b y c a n i n e s e r u m w a s m e d i a t e d b y t h e a l t e r n a t i v e p a t h w a y b y s h o w i n g t h a t i t w a s p r e v e n t e d b y 5 m M E D T A b u t n o t b y 5 m M E G T A ( d a t a n o t s h o w n ) . 2 1 T h e r e f o r e , t h e m a r k e d b u t i n c o m p l e t e i n h i b i t i o n o f p l a t e l e t c l u m p i n g a f t e r p l a s m a w a s h e a t e d a t 5 0 ° C f o r 2 0 m i n s u g g e s t s t h a t t h e a l t e r n a t i v e c o m p l e m e n t p a t h w a y w a s o f p r i n c i p a l i m p o r t a n c e b u t t h a t t h e c l a s s i c a l p a t h w a y a l s o c o n t r i b u t e d t o p l a t e l e t c l u m p i n g . C o n s i s t e n t w i t h a p r i m a r y r o l e f o r t h e a l t e r n a t i v e p a t h w a y w e r e t h e fi n d i n g s t h a t K 9 H A F a b s w e r e g o o d i n d u c e r s o f p l a t e l e t c l u m p i n g w h i l e K 9 H A c h w e r e a t b e s t o n l y w e a k l y a c t i v e . F c - m e d i a t e d c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n o c c u r s b y t h e c l a s s i c a l p a t h w a y i n h u m a n s y s t e m s , w h i l e a c t i v a t i o n o f t h e a l t e r n a t i v e p a t h w a y b y h u m a n I g G i s F a b - m e d i a t e d . “ 2 3 I f t h e s a m e i s t r u e f o r c a n i n e I g G , t h e p o o r r e s p o n s e t o F e f r a g m e n t s s u g g e s t s t h a t a c t i v a t i o n o f t h e c l a s s i c a l p a t h w a y m a y b e i n e f fi c i e n t a t i n d u c i n g p l a t e l e t 3 2 0 c l u m p i n g w i t h o u t t h e a m p l i fi c a t i o n p r o v i d e d b y a n i n t a c t a l t e r n a t i v e p a t h w a y . H o w e v e r , i t i s a l s o p o s s i b l e t h a t F a b f r a g m e n t s h a v e a r e q u i r e d r o l e i n p l a t e l e t c l u m p i n g i n a d d i t i o n t o a c t i v a t i n g c o m p l e m e n t . B e c a u s e C 3 i s p i v o t a l f o r b o t h t h e a l t e r n a t i v e a n d c l a s s i c a l c o m p l e m e n t p a t h w a y s , l a c k o f p l a t e l e t c l u m p i n g i n t h e p r e s e n c e o f C 3 - d e fi c i e n t p l a s m a d i d n o t d i f f e r e n t i a t e t h e a c t i v i t y o f o n e p a t h w a y f r o m t h a t o f t h e o t h e r . H o w e v e r , i t c l e a r l y e s t a b l i s h e d t h a t C 3 w a s r e q u i r e d f o r t h e e f f e c t . T h e l o s s o f a c t i v i t y a f t e r p l a s m a w a s d e p l e t e d o f a l t e r n a t i v e a n d c o m m o n p a t h w a y f a c t o r s b y t r e a t m e n t w i t h t h e a l t e r n a t i v e p a t h w a y a c t i v a t o r C V F s u g g e s t s t h a t t h e c l a s s i c a l p a t h w a y c o m p o n e n t s C 1 , C 4 , a n d C 2 w e r e n o t s u f fi c i e n t t o i n d u c e p l a t e l e t c l u m p i n g . ” 2 5 I t i s p o s s i b l e , h o w e v e r , t h a t C V F t r e a t m e n t i n h i b i t e d H A I g G — i n d u c e d p l a t e l e t c l u m p i n g b e c a u s e o f e f f e c t s o t h e r t h a n c o m p l e m e n t d e p l e t i o n . N o n s p e c i fi c i n h i b i t o r y a c t i v i t y o f C V F o n c a n i n e p l a t e l e t a g g r e g o m e t r y h a s b e e n n o t e d p r e v i o u s l y . 2 6 T h e i n h i b i t i o n o f c o l l a g e n - i n d u c e d a g g r e g a t i o n i n d o g s w a s t h o u g h t t o r e l a t e t o a c o m p l e m e n t r e q u i r e m e n t . H o w e v e r , c o l l a g e n a g g r e g a t e d c a n i n e G F P i n t h e a b s e n c e o f p l a s m a . I n s t e a d , t h e d a t a s u g g e s t t h a t C V F c o n v e r t a s e s f o r m e d i n t h e p r e s e n c e o f p l a s m a m a y h a v e p r o m i s c u o u s e n z y m a t i c a c t i v i t y t h a t a f f e c t s A D P a n d c o l l a g e n r e c e p t o r s o r a c t i v a t i o n p a t h w a y s . A n y i n h i b i t o r y e f f e c t s o f C V F o n c a n i n e p l a t e l e t a g g r e g a t i o n s h o u l d b e i n t e r p r e t e d c a u t i o u s l y . B e c a u s e c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n w a s r e s p o n s i b l e f o r H A I g G - i n d u c e d p l a t e l e t C l u m m n g , w e a s s e s s e d w h e t h e r o r n o t L D H l e a k a g e o c c u r r e d a s a r e s u l t o f p l a t e l e t l y s i s f r o m s u r f a c e a s s e m b l y o f c o m p l e m e n t p r o t e i n s . T h e l a c k o f d e t e c t a b l e L D H l e a k a g e f o r 1 1 p t o a n h o u r a f t e r H A I g G w a s a d d e d t o P R P i n d i c a t e s t h a t s i g n i fi c a n t l y s i s d i d n o t o c c u r i n t h i s s y s t e m . T h i s d i f f e r s f r o m t h e r e s p o n s e o f r a b b i t p l a t e l e t s t o I C s w h i c h i n c l u d e s 3 2 1 a g g r e g a t i o n , g r a n u l e r e l e a s e , a n d l y s i s . 2 7 T h e s u b m a x i m a l a g g r e g o m e t r y t r a c i n g s a n d l a c k o f d e t e c t a b l e p l a t e l e t l y s i s w i t h c a n i n e p l a t e l e t s i n d i c a t e s p e c i e s d i f f e r e n c e s w i t h r e s p e c t t o c o m p l e m e n t - m e d i a t e d p l a t e l e t e f f e c t s . T h e f u l l i n v i v o a n d i n v i t r o s i g n i fi c a n c e o f c o m p l e m e n t - m e d i a t e d p l a t e l e t c l u m p i n g i n d o g s r e m a i n s t o b e e l u c i d a t e d . I n v i t r o , t h e fi n d i n g s m a y h e l p e x p l a i n t h e m i l d t o m o d e r a t e r i s e s i n a g g r e g a t i o n t r a c i n g b a s e l i n e s s o m e t i m e s o c c u r r i n g d u r i n g a g g r e g o m e t r y w i t h c a n i n e P R P . W e f o u n d t h a t t h e a d d i t i o n o f c i t r a t e d p l a s m a t o G F P s o m e t i m e s i n d u c e d p l a t e l e t c l u m p i n g w i t h t h e s a m e f e a t u r e s a s t h a t i n d u c e d b y H A I g G . T h i s w a s u s u a l l y m i l d a n d m o s t n o t a b l e w i t h t r a u m a t i c v e n i p u n c t u r e s . H e a t i n g t h e p l a s m a t o i n a c t i v a t e c o m p l e m e n t p r e v e n t e d t h e e f f e c t . T h e a d d i t i o n o f s e r u m ( w i t h h i r u d i n ) , e s p e c i a l l y h e m o l y z e d s e r u m , c a u s e d a m o r e p r o n o u n c e d p l a t e l e t c l u m p i n g . T h i s e f f e c t w a s a l s o p r e v e n t e d b y h e a t i n g t h e s e r u m f o r 5 m i n a t 5 6 ° C , a s w e l l a s b y c o m p l e m e n t d e p l e t i o n w i t h z y m o s a n . T h e g r e a t e r a n d m o r e c o n s i s t e n t e f f e c t s e e n w i t h s e r u m i s e x p e c t e d i n l i g h t o f t h e f a c t t h a t c o m p l e m e n t c a n b e a c t i v a t e d b y p l a s m i n , t h r o m b i n , k a l l i k r e i n , a n d H a g e m a n f a c t o r . 2 8 W e s u g g e s t t h a t c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n i n C i t r a t e d s a m p l e s i s r e s p o n s i b l e f o r t h e m i l d p l a t e l e t c l u m p i n g s o m e t i m e s o c c u r r i n g i n u n t r e a t e d c a n i n e P R P s a m p l e s . T h e d e g r e e o f t h i s e f f e c t m a y v a r y w i t h t h e d o g , t h e C i t r a t e c o n c e n t r a t i o n u s e d a n d t h e r e f o r e a l s o t h e d o g ’ s h e m a t o c r i t , g e n e r a l s a m p l e h a n d l i n g , a n d p e r h a p s m o s t i m p o r t a n t l y , t h e q u a l i t y o f t h e v e n i p u n c t u r e . T h e i n v i v o s i g n i fi c a n c e o f c o m p l e m e n t - m e d i a t e d , H A I g G — i n d u c e d c l u m p i n g o f C a n i n e p l a t e l e t s i s c u r r e n t l y u n k n o w n . H o w e v e r , t h e f a c t t h a t p l a t e l e t c l u m p i n g o c c u r r e d i n W h o l e b l o o d s u g g e s t s t h a t H A I g G , I C s , a n d o t h e r c o m p l e m e n t a c t i v a t o r s m a y a f f e c t P l a t e l e t f u n c t i o n o r k i n e t i c s i n v i v o . F u r t h e r s t u d i e s a r e r e q u i r e d t o d e t e r m i n e i f 3 2 2 c o m p l e m e n t - i n d u c e d p l a t e l e t c l u m p i n g c o n t r i b u t e s s i g n i fi c a n t l y t o s h o r t e n e d p l a t e l e t s u r v i v a l a n d t h r o m b o c y t o p e n i a i n n e o p l a s t i c , i n f e c t i o u s , a u t o i m m u n e , o r d r u g - i n d u c e d c a n i n e d i s e a s e s . W h e r e a s f u n c t i o n a l F e y r e c e p t o r s a r e i m p o r t a n t i n t h e p a t h o g e n e s i s o f s u c h h u m a n d i s e a s e s a s h e p a r i n - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a , c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n m a y b e m o r e i m p o r t a n t i n t h e p a t h o p h y s i o l o g y o f c a n i n e d i s e a s e s a s s o c i a t e d w i t h t h r o m b o c y - t o p e n i a . I n s u m m a r y , w e h a v e s h o w n t h a t : l ) c a n i n e p l a t e l e t s l a c k f u n c t i o n a l F c r e c e p t o r s a n a l o g o u s t o t h o s e o n h u m a n p l a t e l e t s , a n d 2 ) H A I g G - i n d u c e d s u b m a x i m a l c l u m p i n g o f c a n i n e p l a t e l e t s r e q u i r e s c o m p l e m e n t , a n d s p e c i fi c a l l y C 3 . H o w e v e r , t h e s e s t u d i e s d i d n o t d i s s e c t t h e m e c h a n i s m b y w h i c h H A I g G a n d c o m p l e m e n t c l u m p c a n i n e p l a t e l e t s . T h e m e c h a n i s m o f t h i s e f f e c t i s a d d r e s s e d i n a n a c c o m p a n y i n g m a n u s c r i p t . 3 2 3 R e f e r e n c e s 1 0 . l l . 1 2 . M c V e y D S , S h u m a n W S : D e t e c t i o n o f a n t i p l a t e l e t i m m u n o g l o b u l i n i n t h r o m b o c y — t o p e n i c d o g s . V e t I m m u n o I m m u n o p a t h 2 2 : 1 0 1 , 1 9 8 9 L e w i s D C , M e y e r s K M : A n t i p l a t e l e t a n t i b o d i e s i n d o g s w i t h i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a b i n d t o g l y c o p r o t e i n I I b / I I I a . P r o c 1 2 t h A n n V e t M e d F o r u m , A m e r i c a n C o l l e g e o f V e t e r i n a r y I n t e r n a l M e d i c i n e , 1 9 9 4 , p 1 7 1 ( a b s t r ) R o s e n f e l d S I , A n d e r s o n C L : F c r e c e p t o r s o f h u m a n p l a t e l e t s , i n K u n i c k i T J , G e o r g e J N ( e d s ) : P l a t e l e t I m m u n o b i o l o g y : M o l e c u l a r a n d C l i n i c a l A s p e c t s . P h i l a d e l p h i a , L i p p i n c o t t , 1 9 8 9 , p 3 3 7 K e l t o n J G , S m i t h J W , S a n t o s A V , M u r p h y W G , H o r s e w o o d P : P l a t e l e t I g G F c r e c e p t o r . A m J H e m a t o l 2 5 : 2 9 9 , 1 9 8 7 C a s s e l D L , K e l l e r M A , S u r r e y 8 , S c h w a r t z E , S c h r e i b e r A D , R a p p a p o r t E F , M c K e n z i e S E : D i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o n o f F c y R I I A , F c ' y R I I B , a n d F c ' y R I I C i n h e m a t o p o i e t i c c e l l s : A n a l y s i s o f t r a n s c r i p t s . M o l e c I r n m u n o l 3 0 : 4 5 1 , 1 9 9 3 K i n g M , M c D e r m o t t P , S c h r e i b e r A D : C h a r a c t e r i z a t i o n o f F C ' y r e c e p t o r o n h u m a n p l a t e l e t s . C e l l I r n m u n o l 1 2 8 : 4 6 2 , 1 9 9 0 N e l s o n D S : I m m u n e A d h e r e n c e , i n D i x o n F J J , H u m p h r e y J H ( e d s ) : A d v a n c e s I n I m m u n o l o g y ( v o l 3 ) . N e w Y o r k , A c a d e m i c P r e s s , 1 9 6 3 , p 1 3 1 S i u h a R K , S a n t o s A V , S m i t h J W , H o r s e w o o d P , A n d r e w M , K e l t o n J G : R a b b i t p l a t e l e t s d o n o t e x p r e s s F c r e c e p t o r s f o r I g G . P l a t e l e t s 3 : 3 5 , 1 9 9 2 L e w i s D C , M e y e r s K M : E f f e c t o f a n t i c o a g u l a n t a n d b l o o d s t o r a g e t i m e o n p l a t e l e t - b o u n d a n t i b o d y c o n c e n t r a t i o n s i n c l i n i c a l l y n o r m a l d o g s . A m J V e t R e s 5 5 : 6 0 2 , 1 9 9 4 K a r a s S P , R o s s e W F , K u r l a n d e r R J : C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e I g G - F e r e c e p t o r o n h u m a n p l a t e l e t s . B l o o d 6 0 : 1 2 7 7 , 1 9 8 2 P f u e l l e r S L , L u s c h e r E F : T h e e f f e c t s o f i m m u n e c o m p l e x e s o n b l o o d p l a t e l e t s a n d t h e i r r e l a t i o n s h i p t o c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n . I m m u n o c h e m i s t r y 9 : 1 1 5 1 , 1 9 7 2 A n d e r s o n G P , A n d e r s o n C L : S i g n a l t r a n s d u c t i o n b y t h e p l a t e l e t F c r e c e p t o r . B l o o d 7 6 : 1 1 6 5 , 1 9 9 0 1 3 . 1 4 . 1 5 . 1 6 . 1 7 . 1 8 . 1 9 . 2 0 . 2 1 . 2 2 . 2 3 . 3 2 4 K e l t o n J G , S m i t h J W , W a r k e n t i n T E , H a y w a r d C P M , D e n o m m e G A , H o r s e w o o d P : I m m u n o g l o b u l i n G f r o m p a t i e n t s w i t h h e p a r i n - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a b i n d s t o a c o m p l e x o f h e p a r i n a n d p l a t e l e t f a c t o r 4 . B l o o d 1 1 : 3 2 3 2 , 1 9 9 4 W a r k e n t i n T E , H a y w a r d C P M , B o s h k o v L K , S a n t o s A V , S h e p p a r d J I , B o d e A P , K e l t o n J G : S e r a f r o m p a t i e n t s w i t h h e p a r i n - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a g e n e r a t e p l a t e l e t - d e r i v e d m i c r o p a r t i c l e s w i t h p r o c o a g u l a n t a c t i v i t y : A n e x p l a n a t i o n f o r t h e t h r o m b o t i c c o m p l i c a t i o n s o f h e p a r i n - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a . B l o o d 1 1 : 3 6 9 1 , 1 9 9 4 W i n k e l s t e i n J A , J o h n s o n J P , S w i f t A J , F e r r y F , Y o l k e n R , C o r k L C : G e n e t i c a l l y d e t e r m i n e d d e fi c i e n c y o f t h e t h i r d c o m p o n e n t o f c o m p l e m e n t i n t h e d o g : I n v i t r o s t u d i e s o n t h e c o m p l e m e n t s y s t e m a n d c o m p l e m e n t - m e d i a t e d s e r u m a c t i v i t i e s . J I m m u n o l 1 2 9 : 2 5 9 8 , 1 9 8 2 W i n k e l s t e i n J A , C o r k L C , G r i f fi n D E , A d a m s R J , P r i c e D L : G e n e t i c a l l y d e t e r m i n e d d e fi c i e n c y o f t h e t h i r d c o m p o n e n t o f c o m p l e m e n t i n t h e d o g . S c i e n c e 2 1 2 : 1 1 6 9 , 1 9 8 1 G i l l i n o v A M , R e d m o n d J M , W i n k e l s t e i n J A , Z e h r K J , H e r s k o w i t z A , B a u m g a r t - n e r W A , C a m e r o n D E : C o m p l e m e n t a n d n e u t r o p h i l a c t i v a t i o n d u r i n g c a r d i o p u l - m a n a r y b y p a s s : A s t u d y i n t h e c o m p l e m e n t - d e fi c i e n t d o g . A n n T h o r a c S u r g 5 7 : 3 4 5 , 1 9 9 4 G o r m a n N T : A c t i v a t i o n o f t h e a l t e r n a t i v e c o m p l e m e n t p a t h w a y b y l y m p h o b l a s t s i s o l a t e d f r o m c a n i n e t h y m i c l y m p h o m a s . V e t I m m u n o I m m u n o p a t h 7 : 2 1 3 , 1 9 8 4 K a z a t c h k i n e M D , F e a r o n D T , A u s t e n K F : H u m a n a l t e r n a t i v e c o m p l e m e n t p a t h w a y : M e m b r a n e - a s s o c i a t e d s i a l i c a c i d r e g u l a t e s t h e c o m p e t i t i o n b e t w e e n B a n d 6 1 H f o r c e l l - b o u n d C 3 b . J I m m u n o l 1 2 2 : 7 5 , 1 9 7 9 P i l l e m e r L , B l u m L , l L e p o w I H , R o s s O A , T o d d E W , W a r d l a w A C : T h e p r o p e r d i n s y s t e m a n d i m m u n i t y : 1 . D e m o n s t r a t i o n a n d i s o l a t i o n o f a n e w s e r u m p r o t e i n , p r o p e r d i n , a n d i t s r o l e i n i m m u n e p h e n o m e n a . S c i e n c e 1 2 0 : 2 7 9 , 1 9 5 4 v a n D i j k H , H e e z i u s E , v a n K o o t e n P J S , R a d e m a k e r P M , v a n D a m R , W i l l e r s J M N : A s t u d y o f t h e s e n s i t i v i t y o f e r y t h r o c y t e s t o l y s i s b y h e t e r o l o g o u s s e r a v i a t h e a l t e r n a t i v e c o m p l e m e n t p a t h w a y . V e t I m m u n o I m m u n o p a t h 4 : 4 6 9 , 1 9 8 3 B u r t o n D R : T h e s t r u c t u r e o f i m m u n o g l o b u l i n s a n d t h e i r i n t e r a c t i o n w i t h c o m p l e m e n t , i n S i m R B ( e d ) : A c t i v a t o r s a n d I n h i b i t o r s o f C o m p l e m e n t . D o r d r e c h t , K l u w e r A c a d e m i c P u b l i s h e r s , 1 9 9 3 , p 6 9 B r o w n E J , J o i n e r K A , F r a n k M M : C o m p l e m e n t , i n P a u l W E ( e d ) : F u n d a m e n t a l I m m u n o l o g y . N e w Y o r k , R a v e n P r e s s , 1 9 8 4 , p 6 4 6 2 4 . 2 5 . 2 6 . 2 7 . 2 8 . 3 2 5 J o i n e r K A , H a w i g e r A , G e l f a n d I A : T h e e f f e c t o f c o b r a v e n o m f a c t o r o n a l t e r n a t i v e p a t h w a y h e m o l y t i c a c t i v i t y i n m i c e . I r n m u n o l C o m m u n 9 : 2 7 7 , 1 9 8 0 v o n Z a b r e n I : E f f e c t s o f v e n o m s o f d i f f e r e n t a n i m a l s p e c i e s o n t h e c o m p l e m e n t s y s t e m , i n S i m R B ( e d ) : A c t i v a t o r s a n d I n h i b i t o r s o f C o m p l e m e n t . D o r d r e c h t , K l u w e r A c a d e m i c P u b l i s h e r s , 1 9 9 3 , p 1 2 7 F o n g J S C , W h i t e J G , G o o d R A : I n h i b i t i o n o f e n d o t o x i c l i p o p o l y s a c c h a r i d e — m e d i a t e d p l a t e l e t a g g r e g a t i o n b y c o b r a v e n o m a n t i c o m p l e m e n t a r y f a c t o r . B l o o d 4 4 : 3 9 9 , 1 9 7 4 H e n s o n P M : M e c h a n i s m s o f r e l e a s e o f c o n s t i t u e n t s f r o m r a b b i t p l a t e l e t s b y a n t i g e n - a n t i b o d y c o m p l e x e s a n d c o m p l e m e n t : I . L y t i c a n d n o n l y t i c r e a c t i o n s . 1 0 5 : 4 7 6 , 1 9 7 0 S i m s P J : I n t e r a c t i o n o f h u m a n p l a t e l e t s w i t h t h e c o m p l e m e n t s y s t e m , i n K u n i c k i T J , G e o r g e J N ( e d s ) : P l a t e l e t I m m u n o b i o l o g y : M o l e c u l a r a n d C l i n i c a l A s p e c t s . P h i l a d e l p h i a , L i p p i n c o t t , 1 9 8 9 , p 3 5 4 C H A P T E R 4 A G G R E G A T E D I g G I N D U C E S A G G L U T I N A T I O N O F C A N I N E P L A T E L E T S B Y I M I V I U N E A D H E R E N C E A b s t r a c t I n p r e v i o u s s t u d i e s , w e s h o w e d t h a t h e a t - a g g r e g a t e d I g G ( H A I g G ) c a u s e d c a n i n e p l a t e l e t s t o c l u m p i n t h e p r e s e n c e o f p l a s m a c o n t a i n i n g a c t i v e c o m p l e m e n t a n d C 3 . I n t h e s t u d i e s r e p o r t e d h e r e , w e c h a r a c t e r i z e t h e m e c h a n i s m o f H A I g G - i n d u c e d c l u m p i n g o f c a n i n e p l a t e l e t s . P l a t e l e t m e t a b o l i s m w a s n o t r e q u i r e d , a s e v i d e n c e d b y : l ) t h e H A I g G — i n d u c e d a g g l u t i n a t i o n o f g l u t a r a l d e h y d e - fi x e d p l a t e l e t s s u s p e n d e d i n p l a s m a , a n d 2 ) t h e f a i l u r e o f p r o s t a g l a n d i n E 1 , s p h i n g o s i n e , o r a c o m b i n a t i o n o f a n t i m y c i n A a n d 2 - d e o x y - D - g l u c o s e t o p r e v e n t c l u m p i n g . R G D S p e p t i d e s w e r e a l s o n o t i n h i b i t o r y , i n d i c a t i n g t h a t fi b r i n o g e n b i n d i n g t o t h e p l a t e l e t i n t e g r i n a H b B 3 w a s n o t r e q u i r e d . B y t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y , c l u m p e d p l a t e l e t s a p p e a r e d u n a c t i v a t e d , a n d t h e y h a d s u r f a c e - a s s o c i a t e d H A I g G t h a t s o m e t i m e s a p p e a r e d t o f o r m i n t e r p l a t e l e t b r i d g e s . H A I g G w a s n o t p l a t e l e t - a s s o c i a t e d w h e n c o m p l e m e n t w a s h e a t - i n a c t i v a t e d . W h e n i n s o l u b l e H A I g G w a s i n c u b a t e d w i t h p l a s m a a n d t h e n w a s h e d , a n i n c r e a s e d a m o u n t o f H A I g G - a s s o c i a t e d C 3 w a s d e t e c t a b l e u s i n g a 1 2 5 I - a n t i - C 3 a n t i b o d y . T h e s e w a s h e d C 3 - H A I g G a g g r e g a t e s c a u s e d p l a t e l e t c l u m p i n g i n t h e a b s e n c e o f p l a s m a . C 3 - H A I g G d i d n o t i n d u c e C I l i m p i n g a f t e r i n c u b a t i o n w i t h a n a n t i - C 3 a n t i b o d y , i n d i c a t i n g t h a t C 3 m e d i a t e d t h e 3 2 6 3 2 7 p l a t e l e t - H A I g G i n t e r a c t i o n n e c e s s a r y f o r a g g l u t i n a t i o n . T h e r e f o r e , H A I g G c a u s e d p a s s i v e a g g l u t i n a t i o n o f c a n i n e p l a t e l e t s b y i m m u n e a d h e r e n c e ( I A ) . U n d e r c e r t a i n c o n d i t i o n s , a g g l u t i n a t i o n p r o g r e s s e d t o a g g r e g a t i o n w i t h A T P s e c r e t i o n . T h i s s u g g e s t s t h a t I A c a n s t i m u l a t e s i g n a l t r a n s d u c t i o n i n c a n i n e p l a t e l e t s . T h e a g g l u t i n a t i o n a n d a g g r e g a t i o n o f c a n i n e p l a t e l e t s r e s u l t i n g f r o m i m m u n e a d h e r e n c e m a y b e i m p o r t a n t i n t h e p a t h o g e n e s i s o f c a n i n e t h r o m b o c y t o p e n i c c o n d i t i o n s a s s o c i a t e d w i t h c i r c u l a t i n g i m m u n e c o m p l e x e s o r o t h e r c o m p l e m e n t a c t i v a t o r s . I n t r o d u c t i o n H e a t - a g g r e g a t e d I g G ( H A I g G ) c a u s e s p l a t e l e t c l u m p i n g w h e n i t i s a d d e d t o c a n i n e p l a t e l e t s i n t h e p r e s e n c e o f a c t i v e c a n i n e c o m p l e m e n t . ‘ T h e p h e n o m e n o n s p e c i fi c a l l y r e q u i r e s C 3 , s u g g e s t i n g t h e h y p o t h e s i s t h a t H A I g G - i n d u c e d p l a t e l e t c l u m p i n g m a y b e a c o n s e q u e n c e o f i m m u n e a d h e r e n c e . T h e s t u d i e s r e p o r t e d h e r e w e r e u n d e r t a k e n t o e v a l u a t e t h i s h y p o t h e s i s b y d e t e r m i n i n g t h e r o l e s o f p l a t e l e t m e t a b o l i s m a n d c o m p l e m e n t i n t h e m e c h a n i s m o f H A I g G - i n d u c e d c l u m p i n g o f c a n i n e p l a t e l e t s . I m m u n e a d h e r e n c e i s t h e c o m p l e m e n t - m e d i a t e d a t t a c h m e n t o f a n t i g e n - a n t i b o d y - c o m p l e m e n t c o m p l e x e s t o e r y t h r o c y t e s o r p l a t e l e t s 2 e x p r e s s i n g c o m p l e m e n t r e c e p t o r s . T h e c o m p l e m e n t - m e d i a t e d b i n d i n g o f i m m u n o g l o b u l i n s t o t h e h i g h a f fi n i t y C 3 b r e c e p t o r ( C R 1 , C D 3 5 ) o n h u m a n a n d m o n k e y e r y t h r o c y t e s i s a w e l l d e s c r i b e d e x a m p l e o f i m m u n e a d h e r e n c e . 3 T h e C R 1 - m e d i a t e d a d h e r e n c e o f i m m u n e c o m p l e x e s ( I C s ) t o e r y t h r o c y t e s i n t h e s e s p e c i e s i s a n i m p o r t a n t m e c h a n i s m o f I C p r o c e s s i n g . C R 1 r e c e p t o r s a r e a b s e n t f r o m h u m a n p l a t e l e t s } : 4 T h o u g h s e v e r a l o t h e r r e c e p t o r s f o r c o m p l e m e n t p r o t e i n s h a v e b e e n i d e n t i fi e d } : 4 t h e i r s i g n i fi c a n c e i s l a r g e l y u n k n o w n . 3 2 8 T h e r e i s a g e n e r a l l y h e l d b e l i e f t h a t t h e p r i m a r y e f f e c t o r c e l l o f i m m u n e a d h e r e n c e a n d i m m u n e c o m p l e x ( I C ) p r o c e s s i n g h a s s h i f t e d w i t h e v o l u t i o n f r o m t h e p l a t e l e t s o f s u b p r i m a t e s t o t h e e r y t h r o c y t e s o f p r i m a t e s ? “ H o w e v e r , a p l a t e l e t c o m p l e m e n t r e c e p t o r a n a l o g o u s t o t h e C R 1 r e c e p t o r o n h u m a n e r y t h r o c y t e s h a s b e e n i d e n t i fi e d o n l y o n r a b b i t p l a t e l e t s ? I n v i v o a n d i n v i t r o s t u d i e s i n d i c a t e t h a t p l a t e l e t s a r e t h e p r i n c i p a l e f f e c t o r c e l l s o f i m m u n e a d h e r e n c e a n d i m m u n e c o m p l e x p r o c e s s i n g i n r a b b i t s ] : 8 t h o u g h t h e r e i s e v i d e n c e t o s u g g e s t t h a t r a b b i t e r y t h r o c y t e s c a n a l s o p a r t i c i p a t e a n d t h a t t h e y d o h a v e C R 1 - l i k e c o f a c t o r a c t i v i t y . 9 T o d a t e , n e i t h e r t h e p r e s e n c e n o r t h e a b s e n c e o f s p e c i fi c c o m p l e m e n t r e c e p t o r s o n c a n i n e p l a t e l e t s h a s b e e n c o n fi r m e d . H o w e v e r , t h e i m m u n e a d h e r e n c e p o t e n t i a l o f c a n i n e p l a t e l e t s h a s b e e n s u g g e s t e d b y fi n d i n g t h a t t h e a d d i t i o n o f b a c t e r i a t o c a n i n e b l o o d r e s u l t e d i n a g g r e g a t e s o f p l a t e l e t s , l e u k o c y t e s , a n d b a c t e r i a . 2 B a c t e r i a a n d o t h e r s o l u b l e a n d i n s o l u b l e a n t i g e n s a l s o a d h e r e d t o w a s h e d c a n i n e p l a t e l e t s i n t h e p r e s e n c e o f a h e a t - l a b i l e s e r u m f a c t o r . 2 I n t h i s r e p o r t , w e e x p l o r e t h e m e c h a n i s m o f H A I g G - i n d u c e d p l a t e l e t c l u m p i n g i n d o g s a n d s h o w t h a t i t i s d u e t o i m m u n e a d h e r e n c e . W e f u r t h e r s h o w t h a t w h i l e p l a t e l e t c l u m p i n g a n d i m m u n e a d h e r e n c e a r e p a s s i v e p r o c e s s e s t h a t d o n o t r e q u i r e p l a t e l e t m e t a b o l i s m , p l a t e l e t a c t i v a t i o n d o e s o c c u r u n d e r c e r t a i n c i r c u m s t a n c e s . M e t h o d s M a t e r i a l s C o l l a g e n , a d e n o s i n e d i p h o s p h a t e ( A D P ) , c a l c i u m i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 , t h r o m b i n , p r o s t a g l a n d i n E 1 ( P g E l ) , 2 - d e o x y - D - g l u c o s e , a n t i m y c i n A , s p h i n g o s i n e , p a p a i n , R G D S 3 2 9 p e p t i d e , t h e c o n t r o l R K D V Y p e p t i d e , g u i n e a p i g c o m p l e m e n t , a n d c o n t r o l c a p r i n e I g G w e r e p u r c h a s e d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o m p a n y ( S t . L o u i s , M O ) . G o a t a n t i - [ c a n i n e C 3 ] w a s f r o m B e t h y l L a b o r a t o r i e s , I n c . ( M o n t g o m e r y , T X ) . H B 4 3 , a m u r i n e m o n o c l o n a l a n t i b o d y t o h u m a n I g G ( F c ) , w a s p u r c h a s e d f r o m t h e A m e r i c a n T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n ( R o c k v i l l e , M D ) . C h r o n o - l u m e l u c i f e r a s e l u c i f e r i n r e a g e n t ( L L R ) , t h e A T P s t a n d a r d , a n d a r a c h i d o n i c a c i d w e r e f r o m C h r o n o — l o g ( H a v e r t o n , P A ) . R a b b i t c o m p l e m e n t s e r u m w a s f r o m P e l - F r e e z e C l i n i c a l S y s t e m s ( B r o w n D e e r , W I ) . A l l c h e m i c a l s n o t s p e c i fi c a l l y n o t e d w e r e r e a g e n t g r a d e . R e c o m b i n a n t h i r u d i n ( B e h r i n g ; M a r b u r g , G e r m a n y ) w a s a g e n e r o u s g i f t o f D r . R o b e r t R o t h , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y . S t o c k h i r u d i n a t 4 0 U / p l w a s a d d e d t o s e r u m t o g i v e a fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f 3 0 0 U / m l a f t e r G F P w e r e a d d e d . F o r w h o l e b l o o d a n t i c o a g u l a t i o n , 5 0 0 U / m l o f h i r u d i n w e r e u s e d . T h i s p r e v e n t e d b l o o d c o a g u l a t i o n f o r a t l e a s t 2 4 h r a t r o o m t e m p e r a t u r e . D o g s T h e b l o o d d o n o r d o g s w e r e m a i n t a i n e d b y t h e U n i v e r s i t y L a b o r a t o r y A n i m a l R e s o u r c e s f a c i l i t y w h i c h f o l l o w s U S D A a n d N I H g u i d e l i n e s f o r a n i m a l u s e a n d c a r e . A p p r o v a l f o r u s e w a s o b t a i n e d f r o m t h e A l l U n i v e r s i t y C o m m i t t e e o n A n i m a l U s e a n d C a r e . T h e d o g s w e r e p r e c o n d i t i o n e d a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d . B l o o d c o l l e c t i o n a n d p l a t e l e t i s o l a t i o n B l o o d w a s d r a w n b y j u g u l a r v e n i p u c t u r e a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ‘ t o g i v e fi n a l W h o l e b l o o d c i t r a t e c o n c e n t r a t i o n s o f 1 0 . 5 m M ( 0 . 3 2 % ) . P l a t e l e t r i c h p l a s m a ( P R P ) w a s 3 3 0 h a r v e s t e d b y d i f f e r e n t i a l c e n t r i f u g a t i o n a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d . ‘ S e p h a r o s e C L — 2 B ( P h a r m a c i a B i o t e c h , I n c . , P i s c a t a w a y , N J ) e q u i l i b r a t e d w i t h c a l c i u m f r e e T y r o d e ’ s b u f f e r ( 1 4 0 m M N a C l , 5 . 6 m M g l u c o s e , 6 m M N a H C O 3 , 2 . 7 m M K C l , 3 . 6 m M N a H z P O 4 , a n d 0 . 3 5 % ( w / v ) b o v i n e s e r u m a l b u m i n ( B S A ) , p H 7 . 2 ) w a s u s e d t o o b t a i n g e l - fi l t e r e d p l a t e l e t s ( G F P ) . G F P w e r e r e c a l c i fi e d t o 1 m M c a l c i u m w i t h 5 p l o f 1 M C a C l z . T h e g e l fi l t r a t i o n p r o c e d u r e h a s b e e n r e p o r t e d . ‘ H u m a n p l a s m a a n d c e l l s w e r e o b t a i n e d f r o m n o r m a l l a b o r a t o r y v o l u n t e e r s u s i n g t h e s a m e a n t i c o a g u l a t i o n a s f o r t h e d o g s . I g G a n d i m m u n o g l o b u l i n f r a c t i o n s H u m a n I g G ( C o h n f r a c t i o n H ) w a s a g i f t f r o m t h e M i c h i g a n D e p a r t m e n t o f P u b l i c H e a l t h . C a n i n e I g G w a s p u r i fi e d f r o m n o r m a l c i t r a t e d p l a s m a a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d . ‘ I g G w a s j u d g e d p u r e b y s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( S D S - P A G E ) . F e a n d F a b f r a g m e n t s w e r e p r e p a r e d b y p a p a i n d i g e s t i o n o f c a n i n e I g G a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d . ‘ S D S - P A G E c o n fi r m e d r e m o v a l o f w h o l e I g G f r o m t h e P C S a n d F a b s w h i c h e a c h h a d a p p a r e n t m o l e c u l a r m a s s e s o f a b o u t 5 0 k D . H e a t a g g r e g a t i o n o f I g G I g G w a s a g g r e g a t e d b y h e a t i n g 5 0 t o 1 0 0 p l a l i q u o t s o f 5 t o 8 4 m g / m l s o l u t i o n s f o r 3 0 t o 6 0 m i n a t 5 6 ° C i n a w a t e r b a t h . F o r s o m e s t u d i e s , s a m p l e s w e r e h e a t e d a t 6 5 ° C f o r 1 0 m i n t o p r o d u c e l a r g e r , v i s i b l e , a n d e a s i l y p e l l e t e d a g g r e g a t e s . 3 3 1 A g g r e g o m e t r y O p t i c a l a g g r e g o m e t r y w a s d o n e i n a C h r o n o - l o g l u m i a g g r e g o m e t e r a t 3 7 ° C w i t h s t i r r i n g a t 9 0 0 r p m . B e c a u s e t h e e f f e c t o f H A I g G w a s s i m i l a r a t a l l p l a t e l e t c o n c e n t r a - t i o n s t e s t e d , p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n s o f P R P a n d G F P w e r e n o t a d j u s t e d t o a c o n s t a n t . C o n s e q u e n t l y , c o m p a r i s o n s o f t r a c i n g s w e r e m a d e o n l y w i t h i n s i n g l e b a t c h e s o f p l a t e l e t s a n d n o t b e t w e e n t h e m . F o r b l o c k i n g e x p e r i m e n t s w i t h R G D S a n d t h e c o n t r o l R K D V Y p e p t i d e s , t h e p e p t i d e s ( 0 . 2 m M fi n a l ) w e r e i n c u b a t e d w i t h p l a t e l e t s f o r 2 0 m i n a t 3 7 ° C b e f o r e t h e a d d i t i o n o f a g o n i s t s . V o l u m e s w e r e k e p t c o n s t a n t . F o r s o m e e x p e r i m e n t s , p r e c i p i t a t e d , p e l l e t a b l e H A I g G w a s i n c u b a t e d w i t h p l a s m a f o r 1 5 m i n ( 0 . 7 5 m g / m l ) t o f o r m c o m p l e m e n t - fi x e d a g g r e g a t e s ( C 3 - H A I g G ) . C 3 - H A I g G w a s t h e n p e l l e t e d , w a s h e d o n c e i n c a l c i u m — T y r o d e ’ s b u f f e r ( T y r o d e ’ s b u f f e r w i t h 1 m M C a C l z ) , r e s u s p e n d e d i n C a - T y r o d e ’ s b u f f e r , a n d u s e d f o r a g g r e g o m e t r y a t a fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 7 5 m g / m l . F o r b l o c k i n g e x p e r i m e n t s w i t h t h e a n t i - C 3 a n t i b o d y a n d c o n t r o l g o a t I g G , w a s h e d a c t i v a t e d a g g r e g a t e s w e r e p e l l e t e d , i n c u b a t e d f o r 3 0 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r e w i t h 5 0 p g o f c o n t r o l o r t e s t a n t i b o d y i n 6 0 p l v o l u m e s , w a s h e d o n c e i n 1 m l o f C a - T y r o d e ’ s , r e s u s p e n d e d i n 5 0 p l C a - T y r o d e ’ s b u f f e r , a n d a d d e d t o G F P a t a fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 7 5 m g / m l . A T P s e c r e t i o n T o r e d u c e t h e p r o a g g r e g a t o r y e f f e c t o f t h e L L R w h i c h c o n t a i n s a h i g h c o n c e n t r a t i o n o f m a g n e s i u m , h a l f t h e r e c o m m e n d e d a m o u n t w a s a d d e d t o e a c h c u v e t t e . 3 3 2 W h e n t h e r e c o m m e n d e d 4 0 p l o f L L R w e r e a d d e d t o 4 0 0 p l p l a t e l e t s u s p e n s i o n s b e f o r e t h e a d d i t i o n o f 1 0 m M A D P , 1 . 5 p M A T P w a s r e l e a s e d ; u s e o f o n l y 2 0 p l L L R l e d t o t h e r e l e a s e o f o n l y 0 . 1 p M A T P . I n a n o t h e r e x p e r i m e n t , t h e s a m e A D P s t i m u l a t i o n l e d t o 0 . 5 p M A T P r e l e a s e w i t h 2 0 p l r e a g e n t , 0 . 8 p M w i t h 4 0 p l L L R , a n d 0 . 8 p M w i t h 2 0 p l r e a g e n t p l u s m a g n e s i u m c h l o r i d e t o r e a c h a m a g n e s i u m c o n c e n t r a t i o n e q u i v a l e n t t o t h a t i n 4 0 p l L L R . T h e m a g n e s i u m i n t h e L L R t h e r e f o r e i n c r e a s e d t h e m e a s u r e d A T P r e l e a s e . W h e n 2 0 o r 4 0 p l o r r e a g e n t w e r e a d d e d i n a v o l u m e - c o n t r o l l e d m a n n e r t o p l a s m a w i t h o u t p l a t e l e t s , t h e a d d i t i o n o f A D P r e s u l t e d i n t h e s a m e a m o u n t o f A T P d e t e c t i o n ( 0 . 1 p M ) . D o u b l i n g t h e A D P d o u b l e d t h e d e t e c t e d A T P . T h i s c o n s t a n t i n c r e a s e i n m e a s u r e d A T P w a s a p p a r e n t l y d u e t o a s m a l l a m o u n t o f A T P i n t h e A D P , a n d i t w a s n o t i n c l u d e d i n t h e m e a s u r e m e n t o f r e l e a s e f o r A D P a g g r e g a t i o n s . T h e p l a s m a s t u d i e s s h o w e d t h a t t h e i n c r e a s e i n A T P r e l e a s e d e t e c t e d w i t h p l a t e l e t s w a s c l e a r l y d u e t o a n e f f e c t o f L L R o n t h e p l a t e l e t s , n o t m e r e l y t o t h e i n c r e a s e d L L R c o n c e n t r a t i o n . P l a t e l e t fi x a t i o n F o r fi x a t i o n o f p l a t e l e t s i n g l u t a r a l d e h y d e ( g r a d e 1 , S i g m a ) , f r e s h p l a t e l e t s w e r e w a s h e d 3 t i m e s i n 3 7 ° C p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e ( P B S ) , p H 6 . 5 , w i t h 1 p M P g E l . W a s h e d p l a t e l e t s w e r e t h e n i n c u b a t e d a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 0 , 0 0 0 p l a t e l e t s / p l f o r 3 0 m i n i n P B S w i t h e i t h e r 0 . 0 1 % o r 0 . 0 0 1 % g l u t a r a l d e h y d e . G l u t a r a l d e h y d e w a s r e m o v e d b y w a s h i n g w i t h P B S b e f o r e r e s u s p e n d i n g t h e p l a t e l e t s i n P B S p l u s 3 % B S A . F o r fi x a t i o n i n p a r a f o r m a l d e h y d e , p l a t e l e t s w e r e s i m i l a r l y w a s h e d a n d t h e n fi x e d i n p a r a f o r m a l d e h y d e ( 4 % fi n a l ) f o r 4 8 h r a t 4 ° C . F i x e d p l a t e l e t s w e r e w a s h e d t w i c e i n 3 3 3 P B S a n d r e s u s p e n d e d i n P B S w i t h 3 % B S A . F o r a g g r e g o m e t r y , fi x e d p l a t e l e t s w e r e p e l l e t e d a n d r e s u s p e n d e d i n f r e s h p l a s m a . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( T E M ) A g g r e g a t i o n s w e r e d o n e w i t h P R P o r G F P i n a t o t a l v o l u m e o f 5 0 0 p 1 . E q u a l v o l u m e s o f p h o s p h a t e b u f f e r e d 0 . 1 % g l u t a r a l d e h y d e w e r e a d d e d a t t h e a p p r o p r i a t e t i m e s f o r fi x a t i o n , i n c u b a t e d i n t h e a g g r e g o m e t e r f o r 1 m i n , a n d t h e n t h e c o n t e n t s w e r e t r a n s f e r r e d s o t h a t t h e p l a t e l e t s c o u l d b e p e l l e t e d i n a m i c r o c e n t r i f u g e a t 1 2 , 8 0 0 x g f o r 2 0 s e c . T h e s u p e r n a t a n t s w e r e r e m o v e d b y a s p i r a t i o n , a n d 1 m l o f p h o s p h a t e b u f f e r e d 3 % g l u t a r a l d e h y d e w a s l a y e r e d g e n t l y o v e r e a c h p e l l e t a n d a l l o w e d t o s i t o v e r n i g h t . T h e s a m p l e s w e r e t h e n p o s t - fi x e d i n 1 % o s m i u m t e t r o x i d e , r i n s e d , a n d s t a i n e d e n b l o c w i t h 2 % u r a n y l a c e t a t e . A f t e r d e h y d r a t i o n t h r o u g h a s e r i e s o f g r a d e d e t h a n o l s f o l l o w e d b y p r o p y l e n e o x i d e , t h e s a m p l e s w e r e i n fi l t r a t e d a n d e m b e d d e d w i t h P o l y b e d - A r a l d i t e e p o x y r e s i n w h i c h w a s a l l o w e d t o p o l y m e r i z e a t a b o u t 7 4 ° C f o r 2 d a y s . T h i n s e c t i o n s ( 7 0 - 9 0 n m ) w e r e s t a i n e d w i t h s a t u r a t e d a q u e o u s u r a n y l a c e t a t e f o r 1 h r a n d l e a d c i t r a t e f o r 2 - 3 m i n . S e c t i o n s w e r e e x a m i n e d a t 6 0 k V w i t h a P h i l i p s 3 0 1 e l e c t r o n m i c r o s c o p e . C 3 a s s a y C a n i n e I g G ( 3 0 m g / m l ) w a s a g g r e g a t e d b y h e a t i n g 1 5 m i n a t 6 5 ° C t o f o r m l a r g e a g g r e g a t e s . H A I g G w a s a d d e d t o f r e s h o r h e a t - i n a c t i v a t e d p l a s m a a t 0 . 7 5 m g / m l a n d i n c u b a t e d f o r 1 5 m i n a t 3 7 ° C . A g g r e g a t e s w e r e t h e n w a s h e d a n d r e s u s p e n d e d i n C a - T y r o d e ’ s , a n d 7 5 a n d 2 2 5 p g o f t e s t a n d c o n t r o l ( i n c u b a t e d w i t h h e a t - i n a c t i v a t e d p l a s m a ) H A I g G w e r e p e l l e t e d i n t u b e s f o r t r i p l i c a t e i n c u b a t i o n s w i t h ‘ 2 5 1 - l a b e l e d g o a t a n t i - [ c a n i n e 3 3 4 C 3 ] o r 1 2 S ’ I - l a b e l e d c o n t r o l a n t i b o d y . T h e c o n t r o l a n t i b o d y w a s H B 4 3 ; i t s p u r p o s e w a s t o i n d i c a t e t h e d e g r e e o f n o n s p e c i fi c t r a p p i n g o f r a d i o l a b e l e d i m m u n o g l o b u l i n i n t h e I g G a g g r e g a t e s . R e s u l t s B y T E M , p l a t e l e t c l u m p i n g w a s e v i d e n c e d b y o n l y a f e w s m a l l , l o o s e p l a t e l e t c l u m p s . P l a t e l e t s w e r e u n e v e n l y d i s t r i b u t e d o n t h i c k s e c t i o n s , b u t m o s t o f t h e c l u m p s d i d n o t r e m a i n c o h e s i v e t h r o u g h c e n t r i f u g a t i o n a n d p r o c e s s i n g . A p p a r e n t l y , t h e H A I g G - i n d u c e d p l a t e l e t c l u m p s h a d r e l a t i v e l y w e a k i n t e r p l a t e l e t b r i d g e s . T h e p l a t e l e t s c l u m p e d b y H A I g G a p p e a r e d q u i e s c e n t w i t h o u t s h a p e c h a n g e , g r a n u l e c e n t r a l i z a t i o n , o r n o t i c e a b l e l o s s o f g r a n u l e s ( F i g u r e 4 . 1 a ) . W h e n c o m p l e m e n t w a s a c t i v e a n d H A I g G i n d u c e d p l a t e l e t c l u m p i n g , p l a t e l e t s w e r e c o a t e d w i t h a g g r e g a t e s o f H A I g G ( F i g u r e 4 . 1 b ) . T h e s e a g g r e g a t e s o f I g G s o m e t i m e s a p p e a r e d t o b r i d g e p l a t e l e t s t o g e t h e r , a n d t h e y r e m a i n e d a t t a c h e d t o p l a t e l e t s a f t e r s e v e r a l w a s h e s ( F i g u r e 4 . 1 c ) . W h e n c o m p l e m e n t w a s i n a c t i v a t e d b y h e a t i n g t o p r e v e n t p l a t e l e t c l u m p i n g , t h e H A I g G a g g r e g a t e s w e r e p r e s e n t a m o n g p l a t e l e t s i n s t e a d o f o n t h e m ( F i g u r e 4 . 1 d ) . 3 3 5 F i g u r e 4 . 1 . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h s o f c a n i n e p l a t e l e t s a f t e r a g g r e g o m e t r y w i t h H A I g G f o r m e d a t 5 6 ° C ( a ) a n d 5 9 ° C ( b , c , d ) . H A I g G ( d i n s e r t a n d a r r o w s ) w a s a s s o c i a t e d w i t h t h e s u r f a c e s o f c l u m p e d p l a t e l e t s ( a , b , c ) , b u t n o t w i t h u n c l u m p e d p l a t e l e t s i n c u b a t e d w i t h H A I g G i n t h e p r e s e n c e o f h e a t - i n a c t i v a t e d p l a s m a ( ( 1 ) . a ) X 1 4 , 0 0 0 , b ) X 1 6 , 8 5 0 , c ) X 2 2 , 0 0 0 , d ) X 1 3 , 6 5 0 F i g u r e 4 . 1 T n i t o i t h e C 8 1 1 ! 3 3 7 T h e s e fi n d i n g s s u g g e s t e d t h a t c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n a l t e r e d H A I g G s u c h t h a t i t b o u n d t o p l a t e l e t s a n d f o r m e d i n t e r p l a t e l e t b r i d g e s w h i c h m e d i a t e d p l a t e l e t c l u m p i n g . T h i s h y p o t h e s i s w a s i n v e s t i g a t e d b y i n c u b a t i n g i n s o l u b l e , p e l l e t a b l e H A I g G w i t h p l a s m a t o f o r m " a c t i v a t e d " H A I g G t h a t c o u l d b e a d d e d t o G F P i n t h e a b s e n c e o f p l a s m a . W h e n t h e i n s o l u b l e a g g r e g a t e s o f " a c t i v a t e d " H A I g G w e r e w a s h e d 3 t i m e s b y p e l l e t i n g c e n t r i f u g a t i o n s a n d a d d e d t o G F P , i m m e d i a t e i n c r e a s e s i n l i g h t t r a n s m i t t a n c e w e r e n o t e d a n d t h e p l a t e l e t s a g a i n c l u m p e d ( F i g u r e 4 . 2 ) . T h e d e l a y b e f o r e c l u m p i n g t h a t a l w a y s o c c u r r e d w h e n H A I g G w a s a d d e d t o p l a s m a i n t h e p r e s e n c e o f p l a t e l e t s w a s e l i m i n a t e d . C l u m p i n g w a s d o s e — d e p e n d e n t a n d s o m e t i m e s s u b m a x i m a l , b u t o t h e r t i m e s f u l l - s c a l e a g g r e g a t i o n w a s i n d u c e d ( F i g u r e 4 . 2 b ) . T h e p r e s e n c e o f 5 m M E G T A o r 5 m M E D T A p r e v e n t e d f u l l a g g r e g a t i o n i n d u c e d b y t h e s e " a c t i v a t e d " a g g r e g a t e s b u t s u b m a x i m a l c l u m p i n g s t i l l o c c u r r e d ( F i g u r e 4 . 2 b ) . W h e n H A I g G w a s i n c u b a t e d w i t h h e a t - i n a c t i v a t e d p l a s m a ( 5 m i n 5 6 ° C ) , t h e w a s h e d H A I g G d i d n o t i n d u c e p l a t e l e t c l u m p i n g ( F i g u r e 4 . 2 b ) . W h e n H A F a b s w e r e i n c u b a t e d w i t h p l a s m a a n d t h e n w a s h e d , t h e y i n d u c e d i m m e d i a t e c l u m p i n g o f G F P i n t h e a b s e n c e o f p l a s m a ( F i g u r e 4 . 2 b ) . T h e r e f o r e , a c o m p l e m e n t p r o t e i n o r a p r o d u c t o f c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n e i t h e r b e c a m e a s s o c i a t e d w i t h t h e H A I g G ( F a b ) o r a l t e r e d i t i n s u c h a w a y a s t o i n d u c e p l a t e l e t c l u m p i n g . 3 3 8 F i g u r e 4 . 2 . A g g r e g o m e t r y c u r v e s f o r G F P i n c u b a t e d w i t h w a s h e d H A I g G ( a ; b l , 3 , 4 ) o r H A F a b s ( 2 ) p r e v i o u s l y i n c u b a t e d i n p l a s m a ( a ; b 2 - 4 ) o r h e a t - i n a c t i v a t e d p l a s m a ( 1 ) . " A c t i v a t e d " H A I g G g e n e r a t e d d o s e - r e s p o n s e c u r v e s ( a ) a n d o c c a s i o n a l f u l l - s c a l e a g g r e g a t i o n ( b 4 ) i n h i b i t a b l e w i t h 5 m M E G T A ( b 3 ) . e c n a t t i m s n a r t % 0 0 1 e c n a t t i m s n a r t % 0 0 1 3 3 9 1 . 6 m g / m l 0 . 8 m g / m l 0 . 4 m g / m l 0 . 2 m g / m l F i g u r e 4 . 2 3 4 0 T o i n v e s t i g a t e w h e t h e r o r n o t C 3 w a s a s s o c i a t e d w i t h t h e " a c t i v a t e d " a g g r e g a t e s o f I g G , t h e y w e r e p r o b e d w i t h a ‘ fi l - l a b e l e d p o l y c l o n a l a n t i - [ c a n i n e C 3 ] a n t i b o d y . C o m p a r e d t o H A I g G i n c u b a t e d w i t h h e a t - i n a c t i v a t e d p l a s m a , t h e r e w a s a s i g n i fi c a n t b u t r e l a t i v e l y w e a k s i g n a l f r o m t h e " a c t i v a t e d " a g g r e g a t e s u s i n g t h e a n t i - C 3 a n t i b o d y ( T a b l e 4 . 1 ) . N o n s p e c i fi c a l l y b o u n d o r t r a p p e d 1 2 5 I - l a b e l e d c o n t r o l a n t i b o d y , H B 4 3 , w a s n o t i n c r e a s e d w i t h t h e " a c t i v a t e " a g g r e g a t e s . T h e r e f o r e , C 3 a p p e a r e d t o b e fi x e d t o t h e H A I g G t h a t h a d b e e n i n c u b a t e d w i t h p l a s m a . T a b l e 4 . 1 . D e t e c t i o n o f C 3 o n H A I g G i n c u b a t e d w i t h u n h e a t e d p l a s m a a n d w i t h h e a t - i n a c t i v a t e d p l a s m a . % b o u n d i S . D . h e a t e d p l a s m a H A I g G u n h e a t e d p l a s m a H A I g G a n t i - C 3 9 . 1 i 1 . 2 1 4 . 6 i 1 . 6 H B 4 3 2 . 5 : 1 : 0 . 2 1 . 6 : l : 0 . 1 T o d e t e r m i n e i f t h i s fi x e d C 3 w a s i n s t r u m e n t a l i n c l u m p i n g t h e p l a t e l e t s t o g e t h e r , C 3 - H A I g G w a s i n c u b a t e d w i t h g o a t a n t i - [ c a n i n e C 3 ] o r c o n t r o l g o a t I g G p r i o r t o a g g r e g o m e t r y . P l a t e l e t c l u m p i n g s t i l l o c c u r r e d w i t h t h e c o n t r o l s a m p l e , b u t n o c l u m p i n g o c c u r r e d w h e n C 3 p r o t e i n s w e r e b l o c k e d b y t h e a n t i - C 3 p r e t r e a t m e n t ( F i g u r e 4 . 3 ) . F i g u r e l G F P , I f n o t . r e S t i l t s v e c n a t t i m s n a r t % 0 0 1 3 4 1 F i g u r e 4 . 3 . E f f e c t o f g o a t a n t i - [ c a n i n e C 3 ] a n t i b o d i e s o n H A I g G - i n d u c e d c l u m p i n g o f G F P . H A I g G w a s fi r s t i n c u b a t e d w i t h p l a s m a t o f o r m C 3 - H A I g G a n d t h e n w i t h 1 ) g o a t a n t i - [ c a n i n e C 3 ] t o b l o c k H A I g G - a s s o c i a t e d C 3 , o r 2 ) c o n t r o l g o a t I g G . T h e s a m e r e s u l t s w e r e o b t a i n e d w i t h G F P f r o m a s e c o n d d o g . 3 4 2 W h i l e h u m a n a n d c a n i n e H A I g G ( K 9 H A I g G ) w e r e c a p a b l e o f i n d u c i n g c a n i n e p l a t e l e t c l u m p i n g , c a n i n e p l a s m a a p p e a r e d t o b e s p e c i fi c a l l y r e q u i r e d . K 9 H A I g G d i d n o t i n d u c e p l a t e l e t c l u m p i n g w h e n h u m a n , g u i n e a p i g , o r r a b b i t p l a s m a o r s e r u m w e r e s u b s t i t u t e d f o r c a n i n e p l a s m a o r s e r u m . T h i s w a s t r u e e v e n w h e n G F P w e r e t r e a t e d w i t h 1 p M P g E l , p e l l e t e d , a n d c o m p l e t e l y r e s u s p e n d e d i n t e s t p l a s m a , a t r e a t m e n t t h a t d i d n o t a f f e c t t h e r e s p o n s e o f G F P t o K 9 H A I g G i n c a n i n e p l a s m a . H u m a n H A I g G a l s o f a i l e d t o i n d u c e c l u m p i n g o f c a n i n e G F P w h e n h u m a n p l a s m a w a s u s e d i n p l a c e o f c a n i n e p l a s m a . I n t h e r e v e r s e e x p e r i m e n t s , h u m a n p l a t e l e t s d i d n o t c l u m p w h e n i n c u b a t e d w i t h c a n i n e p l a s m a a n d K 9 H A I g G , d e s p i t e t h e f a c t t h a t " a c t i v a t e d " H A I g G f o r m e d ( d a t a n o t s h o w n ) . A l s o , " a c t i v a t e d " K 9 H A I g G d i d n o t a g g l u t i n a t e h u m a n e r y t h r o c y t e s w h i c h a r e k n o w n t o h a v e C R 1 r e c e p t o r s ( d a t a n o t s h o w n ) . F u r t h e r s t u d i e s o f t h e m e c h a n i s m o f H A I g G - i n d u c e d p l a t e l e t c l u m p i n g e x c l u d e d a r o l e f o r fi b r i n o g e n b i n d i n g t o ( 1 “ , , 3 3 . R G D S p e p t i d e s d i d n o t i n h i b i t H A I g G - i n d u c e d c l u m p i n g a t c o n c e n t r a t i o n s t h a t m a r k e d l y i n h i b i t e d a g g r e g a t i o n s i n d u c e d b y c o l l a g e n a n d A D P ; a n o n s e n s e p e p t i d e w a s u n i f o r m l y u n i n h i b i t o r y ( F i g u r e 4 . 4 ) . 3 4 3 F i g u r e 4 . 4 . E f f e c t s o f R G D S ( l o w e r c u r v e s ) a n d n o n s e n s e p e p t i d e s ( u p p e r c u r v e s ) o n a g g r e g o m e t r y u s i n g P R P w i t h a ) 0 . 2 5 m g / m l H A I g G , b ) 1 0 p M A D P , a n d c ) 5 p g / m l c o l l a g e n . e c n a t t i m s n a r t % 0 0 1 _ . e c n a t t i m s n a r t % 0 0 1 m " U 0 K ‘ A ‘ - - g F i g u r e 4 . 4 1 0 0 % t r a n s m i t t a n c e L ' — L k t — - — 1 1 m i n 3 4 4 T C 3 4 5 T h e o b s e r v a t i o n t h a t c l u m p e d p l a t e l e t s w e r e s t i l l r e s p o n s i v e t o c o l l a g e n , A D P , a n d t h e w e a k e f f e c t s o f A T P i n d i c a t e d t h a t t h e s e h a d n e i t h e r f u l l y a g g r e g a t e d n o r b e c o m e r e f r a c t o r y t o t h e s e a g o n i s t s ( F i g u r e 4 . 5 ) . T h o u g h T E M fi n d i n g s a l s o s u g g e s t e d t h a t H A I g G - i n d u c e d p l a t e l e t c l u m p i n g w a s n o t a s s o c i a t e d w i t h t h e p l a t e l e t r e l e a s e r e a c t i o n , A T P r e l e a s e w a s s p e c i fi c a l l y e v a l u a t e d d u r i n g a g g r e g o m e t r y . N o s i g n i fi c a n t A T P r e l e a s e o c c u r r e d w i t h H A I g G , w h i l e i t w a s m a r k e d w i t h c a l c i u m i o n o p h o r e a n d c o l l a g e n , m o d e r a t e w i t h P M A , a n d m i n i m a l w i t h A D P . A T P r e l e a s e w a s q u a n t i t a t e d o n l y f o r A D P , H A I g G , a n d c o l l a g e n , f o r w h i c h t h e r e s u l t s w e r e r e s p e c t i v e l y 0 . 5 , 0 . 1 , a n d 3 . 4 p M . e c n a t t i m s n a r t % 0 0 1 3 4 6 F i g u r e 4 . 5 . R e s p o n s i v e n e s s o f H A I g G - c l u m p e d p l a t e l e t s t o 1 ) 1 0 p M A D P , 2 ) 2 . 5 p g / m l c o l l a g e n , a n d 3 ) 5 p M A T P . T h e e f f e c t o f A T P o n u n c l u m p e d p l a t e l e t s i s s h o w n f o r c o m p a r i s o n ( 4 ) . A r r o w s i n d i c a t e a d d i t i o n o f p l a t e l e t a g o n i s t s . 3 4 7 T h e r o l e o f p l a t e l e t m e t a b o l i s m i n H A I g G — i n d u c e d p l a t e l e t c l u m p i n g w a s f u r t h e r e v a l u a t e d b y m e t a b o l i c i n h i b i t o r s a n d u s e o f fi x e d p l a t e l e t s . H A I g G - i n d u c e d c l u m p i n g w a s m i n i m a l l y a f f e c t e d b y P g E l , s p h i n g o s i n e , o r a c o m b i n a t i o n o f a n t i m y c i n A a n d 2 - d e o x y - D - g l u c o s e , b u t a g g r e g a t i o n s i n d u c e d b y o t h e r a g o n i s t s w e r e m a r k e d l y i n h i b i t e d o r p r e v e n t e d . Q u a l i t a t i v e l y , P g E 1 m i l d l y , b u t c o n s i s t e n t l y , l o w e r e d t h e m a x i m a l a m p l i t u d e o f l i g h t t r a n s m i t t a n c e f o r H A I g G ( F i g u r e 4 . 6 a ) . S p h i n g o s i n e p r e v e n t e d c o l l a g e n - i n d u c e d a g g r e g a t i o n a t c o n c e n t r a t i o n s w h i c h d i d n o t i n h i b i t e v e n l o w c o n c e n t r a t i o n s o f H A I g G ( F i g u r e 4 . 6 b ) . A n t i m y c i n A a n d 2 - d e o x y - D - g l u c o s e c o m p l e t e l y i n h i b i t e d A D P , c o l l a g e n , P A F , c a l c i u m i o n o p h o r e , a n d P M A , b u t t h e y d i d n o t a f f e c t H A I g G ( F i g u r e 4 . 6 c ) . 3 4 8 F i g u r e 4 . 6 . E f f e c t s o f a ) 1 p M P g E l , b ) 1 0 0 p M s p h i n g o s i n e , a n d c ) 5 p g / m l a n t i m y c i n A p l u s 1 0 m M 2 — d e o x y - D - g l u c o s e o n H A I g G - i n d u c e d p l a t e l e t c l u m p i n g . I n ( c ) , t h e i n h i b i t i o n o f A D P , c o l l a g e n , P A F , c a l c i u m i o n o p h o r e , a n d P M A a r e r e p r e s e n t e d b y a s i n g l e t r a c i n g . I = i n h i b i t o r , N I = n o i n h i b i t o r . e c n a t t i m s n a r t % 0 0 1 - 1 e c n a t t i m s n a r t % 0 0 1 H A I g G f 0 0 % t r a n s m i t t a n c e P A F c o l l a g e n N I N I ‘ N I N I i I . I m y . I I ~ — - — - — — — — - - I 3 4 9 . c a l c i u m i o n O p h o r e T — : 1 m i n c o l l a g e n . N I H A I g G H A I g G « - : 9 1 " w . A - 2 | 0 t h ? ” 7 ' " W " a g o n i s t s I - — I 1 m i n F i g u r e 4 . 6 3 5 0 T h e a d d i t i o n o f H A I g G t o 0 . 0 1 % g l u t a r a l d e h y d e - fi x e d p l a t e l e t s r e s u s p e n d e d i n p l a s m a r e s u l t e d i n a v i s i b l e b u t r e l a t i v e l y m i l d d e g r e e o f p l a t e l e t c l u m p i n g ( F i g u r e 4 . 7 ) . P l a t e l e t c l u m p i n g w a s m u c h m o r e e v i d e n t w h e n p l a t e l e t s w e r e fi x e d i n 0 . 0 0 1 % g l u t a r a l d e h y d e . H A I g G d i d n o t i n d u c e v i s i b l e c l u m p i n g o f p l a t e l e t s i n s i m i l a r e x p e r i m e n t s u s i n g 4 % p a r a f o r m a l d e h y d e - fi x e d p l a t e l e t s ( F i g u r e 4 . 7 ) . F i x e d p l a t e l e t s d i d n o t a g g r e g a t e i n r e s p o n s e t o A D P , c o l l a g e n , o r P A F . 3 5 1 Q ) 0 C e E 0 ) ( 3 P R P ° \ ° O 5 2 2 0 . 0 0 1 % G . J 5 . . . . . . — 0 . 0 1 % G u n i - ‘ 2 4 . A L 4 4 r _ ~ v m P l — - — - 1 1 m i n F i g u r e 4 . 7 . E f f e c t s o f H A I g G o n P R P c o m p a r e d t o p l a t e l e t s fi x e d w i t h 4 % p a r a f o r m a l - d e h y d e ( P ) , 0 . 0 1 % g l u t a r a l d e h y d e ( G ) , o r 0 . 0 0 1 % G . F i x e d p l a t e l e t s w e r e r e s u s p e n d e d i n f r e s h p l a s m a . H A I g G w a s a d d e d s i m u l t a n e o u s l y t o t h e t e s t c u v e t t e a n d t o p l a s m a i n t h e b l a n k c u v e t t e t o c a n c e l o u t a b s o r b a n c e c h a n g e s d u e t o t h e i n t e r a c t i o n o f H A I g G w i t h p l a s m a . 3 5 2 I n c o n t r a s t t o t h e u s u a l n o n m e t a b o l i c a g g l u t i n a t i o n d e s c r i b e d a b o v e , u n d e r c e r t a i n c o n d i t i o n s , H A I g G i n c o n s i s t e n t l y i n d u c e d f u l l - s c a l e a g g r e g a t i o n w i t h p l a t e l e t a c t i v a t i o n a n d r e l e a s e ( F i g u r e s 4 . 2 a n d 4 . 8 ) . T h i s o c c u r r e d u n d e r t h e f o l l o w i n g f o u r s e t s o f c o n d i t i o n s . F i r s t , i t o c c u r r e d w h e n s e r u m w i t h h i r u d i n w a s u s e d t o s u p p o r t H A I g G i n t h e G F P s y s t e m ( F i g u r e 4 . 8 ) . I n t h i s c a s e , a g g r e g a t i o n w a s s o m e t i m e s b i p h a s i c , a n d g r a n u l e r e l e a s e w a s a p p a r e n t b y T E M . T h e s e c o n d p h a s e c o u l d b e p r e v e n t e d o r i n h i b i t e d b y 1 p M P g E 1 , a n d b o t h p h a s e s w e r e e l i m i n a t e d b y h e a t i n g t h e s e r u m . S e c o n d , w h e n P R P w a s h a r v e s t e d f r o m b l o o d d r a w n i n t o h i r u d i n ( 5 0 0 U / m l ) , t h e a m p l i t u d e o f l i g h t t r a n s m i t t a n c e r e a c h e d w i t h K 9 H A I g G w a s s i m i l a r t o t h a t o f f u l l a g g r e g a t i o n s w i t h A D P ; 1 p M P g E 1 i n h i b i t e d t h e e f f e c t t o t h a t s e e n w i t h c i t r a t e d s a m p l e s . T h i r d , w h e n a c t i v a t e d a g g r e g a t e s o f K 9 H A I g G w e r e a d d e d t o G F P , f u l l a g g r e g a t i o n s o m e t i m e s o c c u r r e d ( F i g u r e s 4 . 2 a n d 4 . 8 ) . F o u r t h , t h e p l a t e l e t s o f o n e p a r t i c u l a r d o g u s u a l l y a g g r e g a t e d f u l l y i n r e s p o n s e t o H A I g G , e v e n i n c i t r a t e d s y s t e m s ( P R P o r G F P p l u s c i t r a t e d p l a s m a ) ( F i g u r e 4 . 8 ) . A T P w a s r e l e a s e d , a n d t h e a g g r e g a t i o n t r a c i n g s w e r e b i p h a s i c . A T P r e l e a s e a n d t h e s e c o n d p h a s e o f a g g r e g a t i o n w e r e e l i m i n a t e d b y P g E l . F u l l a g g r e g a t i o n o f t h i s d o g ’ s G F P d i d n o t r e q u i r e a u t o l o g o u s p l a s m a ; c i t r a t e d p l a s m a f r o m a d o g w h o s e p l a t e l e t s n e v e r a g g r e g a t e d f u l l y i n c i t r a t e d s y s t e m s w a s a l s o s u p p o r t i v e . I n t h e r e v e r s e e x p e r i m e n t s , w h e n p l a s m a f r o m t h e d o g w h o s e p l a t e l e t s f u l l y a g g r e g a t e d w a s u s e d w i t h G F P f r o m a d o g w h o s e p l a t e l e t s r e s p o n d e d s u b m a x i m a l l y t o H A I g G , a g g r e g a t i o n w a s c o m p l e t e a n d b i p h a s i c . e c n a t t i m s n a r t % 0 0 1 3 5 3 F i g u r e 4 . 8 . H A I g G - i n d u c e d a g g r e g a t i o n o c c u r r i n g w i t h 1 ) G F P p l u s c i t r a t e d p l a s m a f r o m o n e p a r t i c u l a r d o g , 2 ) G F P p l u s s e r u m ( w i t h h i r u d i n ) , 3 ) t h e a d d i t i o n o f " a c t i v a t e d " H A I g G ( p r e i n c u b a t e d i n p l a s m a ) t o G F P , a n d 4 ) P R P f r o m h i r u d i n - a n t i c o a g u l a t e d b l o o d . A d d i t i o n o f P g E 1 l i m i t e d t h e s e r e s p o n s e s t o a g g l u t i n a t i o n ( 5 ) . T h e s e t r a c i n g s w e r e r e c o r d e d o n d i f f e r e n t d a y s . 3 5 4 T o e v a l u a t e t h e p o s s i b i l i t y t h a t o c c a s i o n a l l e u k o c y t e c o n t a m i n a t i o n w a s r e s p o n s i b l e f o r t h e f u l l a g g r e g a t i o n , l e u k o c y t e s w e r e h a r v e s t e d f r o m c a n i n e b l o o d a n d a d d e d t o p l a t e l e t s i n t h e a g g r e g o m e t e r . T h e a d d i t i o n o f H A I g G c a u s e d t y p i c a l s u b m a x i m a l a g g r e g a t i o n t r a c i n g s , e x c e p t t h a t t h e c l u m p s t h a t f o r m e d w e r e c l e a r l y l a r g e r t h a n u s u a l , p r e s u m a b l y b e c a u s e o f i n c o r p o r a t i o n o f l e u k o c y t e s ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e a d d i t i o n o f H A I g G t o l e u k o c y t e s i n p l a s m a d i d n o t i n d u c e t h e i r c l u m p i n g ( d a t a n o t s h o w n ) . D i s c u s s i o n H A I g G i n d u c e d p a s s i v e a g g l u t i n a t i o n o f c a n i n e p l a t e l e t s t h r o u g h a c o m p l e m e n t - m e d i a t e d b r i d g i n g k n o w n a s i m m u n e a d h e r e n c e . T h e c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n i n d u c e d b y H A I g G ‘ r e s u l t e d i n C 3 i n c o r p o r a t i o n w i t h i n t h e I g G a g g r e g a t e s . T h e s e C 3 - H A I g G a g g r e g a t e s t h e n a p p e a r e d t o f o r m i n t e r p l a t e l e t b r i d g e s , p r e s u m a b l y v i a s p e c i fi c C 3 r e c e p t o r s o n c a n i n e p l a t e l e t s . I m m u n e a d h e r e n c e w a s i m p l i c a t e d a s t h e m e c h a n i s m o f H A I g G - i n d u c e d p l a t e l e t c l u m p i n g b y a s e r i e s o f s i x m a j o r fi n d i n g s . F i r s t , c o m p l e m e n t w a s r e q u i r e d f o r c l u m p i n g t o o c c u r . ‘ M o r e s p e c i fi c a l l y , a C 3 r e q u i r e m e n t w a s i d e n t i fi e d b y t h e f a i l u r e o f C 3 - d e fi c i e n t c a n i n e p l a s m a t o s u p p o r t H A I g G - i n d u c e d c l u m p i n g . ‘ S e c o n d , t h e i n c u b a t i o n o f H A I g G w i t h p l a s m a c a u s e d C 3 t o b e d e p o s i t e d o n t h e I g G a g g r e g a t e s a s d e t e c t e d b y a ‘ u l - l a b e l e d a n t i - [ c a n i n e C 3 ] a n t i b o d y . T h i r d , t h e s e C 3 - H A I g G c o m p l e x e s c l u m p e d c a n i n e G F P i n t h e a b s e n c e o f p l a s m a a n d w i t h o u t a d e l a y , w h i l e c o n t r o l H A I g G i n c u b a t e d w i t h h e a t - i n a c t i v a t e d p l a s m a d i d n o t . C 3 - H A I g G c o m p l e x e s w e r e a c t i v e e v e n i n t h e p r e s e n c e o f 5 m M E D T A o r E G T A , i n d i c a t i n g c a t i o n i n d e p e n d e n c e o f t h e 3 5 5 r e a c t i o n . T h e b i n d i n g o f h u m a n C 3 b t o h u m a n C R 1 i s i n d e p e n d e n t o f c a l c i u m a n d m a g n e s i u m . ‘ 0 F o u r t h , c o m p l e m e n t - a c t i v a t e d H A F a b s a l s o c l u m p e d c a n i n e G F P i n t h e a b s e n c e o f p l a s m a , i n d i c a t i n g t h a t t h e F a b p o r t i o n o f t h e I g G w a s i n s t r u m e n t a l i n m e d i a t i n g t h e e f f e c t . T h i s i s s u p p o r t i v e o f a n i m m u n e a d h e r e n c e m e c h a n i s m b e c a u s e t h e c o v a l e n t b i n d i n g o f C 3 b a n d C 4 b t o h u m a n I g G o c c u r s a t d o m a i n s o n t h e F a b p o r t i o n o f t h e I g G m o l e c u l e . “ F i f t h , T E M o f p l a t e l e t s c l u m p e d b y H A I g G s h o w e d t h a t H A I g G w a s a s s o c i a t e d w i t h p l a t e l e t s u r f a c e s , s o m e t i m e s f o r m i n g a p p a r e n t i n t e r p l a t e l e t b r i d g e s . I n c o n t r a s t , H A I g G w a s n o t a s s o c i a t e d w i t h p l a t e l e t s u r f a c e s w h e n c o m p l e m e n t w a s i n a c t i v a t e d b y h e a t i n g p l a s m a f o r 5 m i n a t 5 6 ° C . A n d s i x t h , i n c u b a t i o n o f C 3 — H A I g G c o m p l e x e s w i t h a n a f fi n i t y - p u r i fi e d g o a t a n t i — [ c a n i n e C 3 ] a n t i b o d y p r e v e n t e d s u b s e q u e n t p l a t e l e t c l u m p i n g , b u t i t s t i l l o c c u r r e d a f t e r i n c u b a t i o n o f C 3 - H A I g G w i t h c o n t r o l g o a t I g G . F i b r i n o g e n w a s e x c l u d e d a s a p l a t e l e t b r i d g i n g p r o t e i n b e c a u s e R G D S p e p t i d e s w e r e n o t i n h i b i t o r y . T h e a c t i v a t i o n o f t h e h u m a n a l t e r n a t i v e c o m p l e m e n t p a t h w a y b y i m m u n e c o m p l e x e s r e p o r t e d l y l e a d s t o l a r g e r a g g r e g a t e s t h a n a r e f o r m e d b y t h e c l a s s i c a l p a t h w a y a l o n e , a n d t h e I C s b i n d m o r e e f fi c i e n t l y t o C R l . ‘ 2 T h i s m a y p a r t i a l l y e x p l a i n t h e p r i m a r y i m p o r t a n c e o f a l t e r n a t i v e p a t h w a y a c t i v a t i o n i n H A I g G - i n d u c e d p l a t e l e t c l u m p i n g i n d o g s . ‘ T h e s l o w r e v e r s a l o f p l a t e l e t c l u m p i n g s e e n i n t h e s e c a n i n e s t u d i e s m a y h a v e b e e n d u e t o o n g o i n g C 3 b d e g r a d a t i o n c a u s i n g H A I g G t o d i s s o c i a t e f r o m p l a t e l e t C 3 r e c e p t o r s . H u m a n e r y t h r o c y t e C R 1 r e c e p t o r s p a r t i c i p a t e i n t h e d e g r a d a t i o n o f C 3 b t o C 3 d a n d C 3 d g s u c h t h a t t h e I C s d e t a c h f r o m t h e C R 1 r e c e p t o r s a n d c a n n o t r e b i n d w i t h o u t f u r t h e r 3 5 6 fi x a t i o n b y n e w C 3 b . 1 2 A s i m i l a r d e g r a d a t i o n o f p l a t e l e t - a s s o c i a t e d , H A I g G - b o u n d C 3 b m a y o c c u r i n d o g s . H u m a n , g u i n e a p i g , a n d r a b b i t p l a s m a o r s e r u m d i d n o t s u p p o r t i m m u n e a d h e r e n c e w i t h c a n i n e p l a t e l e t s . S i m i l a r l y , e q u i n e a n d p o r c i n e c o m p l e m e n t d i d n o t ‘ 3 T h i s l i k e l y r e l a t e s t o t h e s p e c i e s s u p p o r t r a b b i t I C s i n i m m u n e a d h e r e n c e r e a c t i o n s . s p e c i fi c i t y o f c o m p l e m e n t r e c e p t o r i n t e r a c t i o n s . “ W h i l e h u m a n C R 1 c a n b i n d h u m a n , r a b b i t , a n d p o r c i n e C 3 , ‘ 5 t h e r a b b i t p l a t e l e t c o m p l e m e n t r e c e p t o r d o e s n o t e f fi c i e n t l y b i n d h u m a n C 3 b . 5 T h e f a i l u r e o f c a n i n e C 3 - H A I g G c o m p l e x e s t o a g g l u t i n a t e h u m a n e r y t h r o c y t e s s u g g e s t s t h a t h u m a n C R 1 a l s o d o e s n o t b i n d c a n i n e C 3 b . S i m i l a r l y , t h e a n a l o g o u s c a n i n e p l a t e l e t r e c e p t o r f o r C 3 b m a y a l s o h a v e s o m e s p e c i e s s p e c i fi c i t y f o r C 3 b b i n d i n g . A l t e r n a t i v e l y , K 9 H A I g G m a y n o t h a v e t h e c a p a c i t y t o a c t i v a t e c o m p l e m e n t f r o m s o m e s p e c i e s . P l a t e l e t m e t a b o l i s m w a s n o t r e q u i r e d f o r C 3 - H A I g G o r H A I g G t o i n d u c e p l a t e l e t c l u m p i n g . T h i s w a s e v i d e n c e d b y t h e a g g l u t i n a t i o n o f g l u t a r a l d e h y d e - fi x e d p l a t e l e t s e x p o s e d t o H A I g G i n t h e p r e s e n c e o f p l a s m a , a n d b y t h e f a i l u r e o f s e v e r a l m e t a b o l i c i n h i b i t o r s t o p r e v e n t c l u m p i n g o f f r e s h p l a t e l e t s . A c o n s i s t e n t b u t v e r y m i l d s u p p r e s s i o n o f c l u m p i n g b y P g E 1 s u g g e s t s t h a t a r a c h i d o n a t e m e t a b o l i s m m a y h a v e m i l d l y a c c e n t u a t e d t h e p l a t e l e t r e s p o n s e . H o w e v e r , c l u m p i n g w a s n o t r e d u c e d b y s i m u l t a n e o u s i n h i b i t i o n o f m i t o c h o n d r i a l o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n a n d g l y c o l y s i s b y a n t i m y c i n A a n d 2 - d e o x y - D - g l u c o s e , r e s p e c t i v e l y . S e v e r a l o t h e r fi n d i n g s w e r e c o n s i s t e n t w i t h a l a r g e l y p a s s i v e r o l e f o r p l a t e l e t s i n H A I g G - i n d u c e d c l u m p i n g . D u r i n g a g g r e g o m e t r y , t h e r e c o r d e r d e fl e c t i o n t y p i c a l o f s h a p e c h a n g e d i d n o t o c c u r , a n d t h e m a x i m a l a m p l i t u d e o f l i g h t t r a n s m i t t a n c e c o r r e s p o n d e d 3 5 7 o n l y t o t h a t o f p r i m a r y a g g r e g a t i o n s i n d u c e d b y s u b t h r e s h o l d c o n c e n t r a t i o n s o f A D P . W h e n c l u m p e d , p l a t e l e t s s t i l l h a d n o r m a l r e s p o n s e s t o A D P , c o l l a g e n , a n d A T P , a n d t h e y h a d n o t r e l e a s e d d e t e c t a b l e A T P . T h e r e w a s a l s o n o m o r p h o l o g i c a l e v i d e n c e o f g r a n u l e s e c r e t i o n b y T E M , a n d t h e p l a t e l e t s a p p e a r e d q u i e s c e n t w i t h n o s h a p e c h a n g e o r g r a n u l e c e n t r a l i z a t i o n . T h e r e f o r e , H A I g G c a u s e d p a s s i v e a g g l u t i n a t i o n o f c a n i n e p l a t e l e t s , j u s t a s b a c t e r i a l L P S h a s b e e n r e p o r t e d t o c a u s e p a s s i v e a g g l u t i n a t i o n o f c a n i n e p l a t e l e t s . ‘ ° H o w e v e r , u n d e r c e r t a i n c o n d i t i o n s , H A I g G a n d L P S a l s o i n d u c e d f u l l - s c a l e a g g r e g a t i o n w i t h A T P r e l e a s e . P g E 1 a n d R G D S i n d e p e n d e n t l y l i m i t e d t h e s e r e s p o n s e s t o a g g l u t i n a t i o n , i n d i c a t i n g t h a t a g g r e g a t i o n r e q u i r e d a r a c h i d o n i c a c i d m e t a b o l i s m a n d fi b r i n o g e n b i n d i n g t o t h e i n t e g r i n 0 1 , 1 1 , 8 3 . B e c a u s e c o m p l e m e n t p r o t e i n s c a n a c t i v a t e l e u k o c y t e s w h i c h i n t u r n c a n p r o d u c e p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r s , 3 s p o r a d i c l e u k o c y t e c o n t a m i n a t i o n o f p l a t e l e t s u s p e n s i o n s m a y h a v e c a u s e d a g g r e g a t i o n . H o w e v e r , w e e x c l u d e d t h i s p o s s i b i l i t y b y s h o w i n g t h a t m a r k e d l e u k o c y t e c o n t a m i n a t i o n d i d n o t c o n v e r t a g g l u t i n a t i o n r e s p o n s e s t o a g g r e g a t i o n r e s p o n s e s . I n t h r e e o f t h e f o u r s i t u a t i o n s w h e r e m e t a b o l i s m - d e p e n d e n t a g g r e g a t i o n o c c u r r e d , c a t i o n c o n c e n t r a t i o n s w e r e n o t r e d u c e d b y t h e p r e s e n c e o f c i t r a t e . T h i s w a s t r u e w h e n : 1 ) s e r u m ( w i t h h i r u d i n ) w a s u s e d a s t h e c o m p l e m e n t s o u r c e , 2 ) P R P w a s o b t a i n e d f r o m b l o o d a n t i c o a g u l a t e d w i t h h i r u d i n , a n d 3 ) a g g r e g a t i o n w a s i n d u c e d b y C 3 - H A I g G c o m p l e x e s w a s h e d a n d r e s u s p e n d e d i n C a - T y r o d e ’ s b u f f e r . I t i s u n k n o w n i f g r e a t e r p l a t e l e t r e a c t i v i t y u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s w a s d u e t o t h e m o r e n e a r l y p h y s i o l o g i c c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n s o r t o o t h e r f a c t o r s . H A I g G a n d L P S a l s o i n d u c e d a g g r e g a t i o n , i n a d d i t i o n t o a g g l u t i n a t i o n , i n c i t r a t e d s y s t e m s w i t h t h e p l a t e l e t s f r o m o n e p a r t i c u l a r d o g ( d o g R ) . T h e s e p l a t e l e t s w e r e a l s o t h e 3 5 8 o n l y p l a t e l e t s t e s t e d t h a t a g g r e g a t e d i n r e s p o n s e t o a r a c h i d o n i c a c i d ( 1 . 4 m M ) ; a g g r e g a t i o n w a s f u l l - s c a l e b u t d e l a y e d a b o u t 5 m i n . S t u d i e s w i t h G F P a n d p l a s m a f r o m d o g R a n d f r o m a d o g ( d o g N ) w h o s e p l a t e l e t s o n l y a g g l u t i n a t e d i n t h e s e s y s t e m s s h o w e d t h a t d o g R ’ s p l a s m a c o n t a i n e d t h e n e c e s s a r y f a c t o r ( s ) t o i m p a r t g r e a t e r r e a c t i v i t y t o d o g N ’ s p l a t e l e t s , b u t d o g R ’ s p l a t e l e t s r e m a i n e d a g g r e g a b l e e v e n a f t e r p l a s m a w a s r e m o v e d b y g e l fi l t r a t i o n . T h e n a t u r e o f t h e p l a s m a f a c t o r ( s ) r e s p o n s i b l e f o r t h i s p h e n o m e n o n i s u n k n o w n , a s i s t h e r e l a t i o n s h i p , i f a n y , t o t h e a r a c h i d o n i c a c i d a n d t h r o m b o x a n e - s e n s i t i v i t y o f s o m e d o g s ’ p l a t e l e t s . ‘ 7 " 9 H o w e v e r , t h e v a r i a b l e i n v i t r o r e s p o n s e t o H A I g G a m o n g d o g s s u g g e s t s t h a t i n v i v o p l a t e l e t r e s p o n s e s t o i m m u n o l o g i c a n d c o m p l e m e n t s t i m u l i m a y a l s o b e v a r i e d . T h i s h e t e r o g e n e i t y o f r e s p o n s e m a y b e i m p o r t a n t i n e x p l a i n i n g i n d i v i d u a l p r e d i s p o s i t i o n s t o c e r t a i n d i s e a s e s . T h e p o t e n t i a l s i g n i fi c a n c e o f i m m u n e a d h e r e n c e b y c a n i n e p l a t e l e t s i s g r e a t . A s i n o t h e r s p e c i e s , i m m u n e a d h e r e n c e i n d o g s m a y p r o v i d e a m e a n s o f I C c l e a r a n c e b y p h a g o c y t i c c e l l s b e a r i n g F e y r e c e p t o r s f o r I g G ‘ Z - ‘ O a n d C R 3 r e c e p t o r s f o r i n a c t i v a t e d C 3 b . ‘ 0 T h e i n f u s i o n o f I C s i n t o r a b b i t s l e a d s t o t h e i r r a p i d i m m u n e a d h e r e n c e t o p l a t e l e t s 8 A s i m i l a r r e s u l t w o u l d b e e x p e c t e d i n d o g s , b u t i t i s w i t h s u b s e q u e n t c l e a r a n c e . ‘ u n k n o w n i f p l a t e l e t p h a g o c y t o s i s w o u l d o c c u r a n d c a u s e o r c o n t r i b u t e t o t h r o m b o c y t o p e - n i a . I f c o m p l e m e n t b i n d i n g t o c a n i n e p l a t e l e t s a c t i v a t e s p l a t e l e t s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y s u n d e r p h y s i o l o g i c c o n d i t i o n s , i m m u n e a d h e r e n c e m a y f u r t h e r c o n t r i b u t e t o t h r o m b o c y t o p e n i a d u e t o p l a t e l e t a c t i v a t i o n . T h e c o m m o n a s s o c i a t i o n o f t h r o m b o c y t o p e - n i a w i t h c o m p l e m e n t a c t i v a t o r s s u c h a s n e o p l a s t i c c e l l s “ a n d p o l y i o n s , ” 2 4 a n d w i t h m a n y i n f e c t i o u s a g e n t s ” ‘ 2 7 a n d f o r e i g n m a t e r i a l s 2 8 c a p a b l e o f i n i t i a t i n g i n v i t r o p l a t e l e t i m m u n e 3 5 9 a d h e r e n c e i n d o g s ‘ , s u g g e s t s t h a t i m m u n e a d h e r e n c e m a y c o n t r i b u t e t o t h e t h r o m b o c y t o - p e n i a o f m a n y c a n i n e c o n d i t i o n s . T h e p o t e n t i a l f o r c a n i n e p l a t e l e t s t o p a r t i c i p a t e i n i m m u n e a d h e r e n c e a l s o h a s i m p o r t a n t r a m i fi c a t i o n s f o r t h e d e t e c t i o n o f p l a t e l e t - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n ( P A I g ) i n d o g s . I f a c a n i n e p l a t e l e t c o m p l e m e n t r e c e p t o r c a n b i n d I C - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u - l i n s s u c h t h a t t h e y a r e n o t e a s i l y r e m o v e d b y w a s h i n g , p o s i t i v i t y f o r P A I g w i l l n o t d i f f e r e n t i a t e I C s f r o m s p e c i fi c a n t i p l a t e l e t a n t i b o d i e s . T h e fi n d i n g t h a t a c i d e l u a t e s o f c a n i n e p l a t e l e t s p o s i t i v e f o r P A I g r e b o u n d t o a l l o g e n e i c n o r m a l p l a t e l e t s 2 9 d o e s n o t c o n fi r m F a b - m e d i a t e d b i n d i n g u n t i l i t i s s h o w n t h a t i m m u n e a d h e r e d i m m u n o g l o b u l i n r e a c t s d i f f e r e n t l y u n d e r t h e s a m e c o n d i t i o n s . T h e r e f o r e , t h e c o n t r i b u t i o n o f i m m u n e a d h e r e d i m m u n o g l o b u l i n t o d e t e c t a b l e P A I g a n d t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s s h o u l d b e e v a l u a t e d . I n s u m m a r y , H A I g G i n d u c e d p a s s i v e a g g l u t i n a t i o n o f c a n i n e p l a t e l e t s b y a C 3 - m e d i a t e d m e c h a n i s m t h a t a p p e a r s t o b e i m m u n e a d h e r e n c e . T h a t i s , H A I g G a c t i v a t e d c o m p l e m e n t l e a d i n g t o t h e b i n d i n g o f C 3 t o H A I g G s u c h t h a t t h e C 3 - H A I g G c o m p l e x e s f o r m e d i n t e r p l a t e l e t b r i d g e s , p r e s u m a b l y b y b i n d i n g t o a s y e t u n i d e n t i fi e d C 3 r e c e p t o r s o n c a n i n e p l a t e l e t s . U n d e r s o m e c o n d i t i o n s , a n d w i t h s o m e d o g s , a g g l u t i n a t i o n p r o g r e s s e d t o a g g r e g a t i o n , s u g g e s t i n g t h a t i m m u n e a d h e r e n c e m a y a c t i v a t e s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y s i n c a n i n e p l a t e l e t s . T h e s e fi n d i n g s m a y h a v e c o n s i d e r a b l e i n v i v o s i g n i fi c a n c e i n c o n d i t i o n s a s s o c i a t e d w i t h c i r c u l a t i n g c o m p l e m e n t a c t i v a t o r s . T h e c o n t r i b u t i o n o f i m m u n e c o m p l e x e s , c o m p l e m e n t , a n d i m m u n e a d h e r e n c e t o t h e t h r o m b o c y t o p e n i a o f m a n y n e o p l a s t i c , i n f e c t i o u s , d r u g - i n d u c e d , a n d i m m u n e - m e d i a t e d c a n i n e d i s e a s e s d e s e r v e s f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n . 3 6 0 R e f e r e n c e s 1 0 . 1 1 . s e e c h a p t e r 3 : C a n i n e a g g r e g a t e d I g G i n d u c e s c o m p l e m e n t - m e d i a t e d , n o t F c - m e d i a t e d , c l u m p i n g o f c a n i n e p l a t e l e t s . N e l s o n D S : I m m u n e A d h e r e n c e , i n D i x o n F J J , H u m p h r e y J H ( e d s ) : A d v a n c e s I n I m m u n o l o g y ( v o l 3 ) . N e w Y o r k , A c a d e m i c P r e s s , 1 9 6 3 , p 1 3 1 S i m s P J : I n t e r a c t i o n o f h u m a n p l a t e l e t s w i t h t h e c o m p l e m e n t s y s t e m , i n K u n i c k i T J , G e o r g e J N ( e d s ) : P l a t e l e t I m m u n o b i o l o g y : M o l e c u l a r a n d C l i n i c a l A s p e c t s . P h i l a d e l p h i a , L i p p i n c o t t , 1 9 8 9 , p 3 5 4 H e b e r t L A : T h e c l e a r a n c e o f i m m u n e c o m p l e x e s f r o m t h e c i r c u l a t i o n o f m a n a n d o t h e r p r i m a t e s . A m J K i d n e y D i s 1 7 : 3 5 2 , 1 9 9 1 M a n t h e i U , N i c k e l l s M W , B a r n e s S H , B a l l a r d L L , C u i W - Y , A t k i n s o n J P : I d e n t i fi c a t i o n o f a C 3 b / i C 3 b i n d i n g p r o t e i n o f r a b b i t p l a t e l e t s a n d l e u k o c y t e s : A C R 1 - l i k e c a n d i d a t e f o r t h e i m m u n e a d h e r e n c e r e c e p t o r . J I m m u n o l 1 4 0 : 1 2 2 8 , 1 9 8 8 W a l p o r t M J , L a c h m a n n P J : E r y t h r o c y t e c o m p l e m e n t r e c e p t o r t y p e 1 , i m m u n e c o m p l e x e s , a n d t h e r h e u m a t i c d i s e a s e s . A r t h r i t i s R h e u m 3 1 : 1 5 3 , 1 9 8 8 T a y l o r R P , K u j a l a G , W i l s o n K , W r i g h t E , H a r b i n A : I n v i v o a n d i n v i t r o s t u d i e s o f t h e b i n d i n g o f a n t i b o d y / d s D N A i m m u n e c o m p l e x e s t o r a b b i t a n d g u i n e a p i g p l a t e l e t s . J I m m u n o l 1 3 4 2 2 5 5 0 , 1 9 8 5 T a y l o r R P , K u j a l a G , E d b e r g J C , F o r e m a n P , D a v i s 1 8 , W r i g h t E : T h e k i n e t i c s o f c l e a r a n c e o f h u m a n a n t i b o d y / d s D N A i m m u n e c o m p l e x e s f r o m r a b b i t c i r c u l a t i o n . E f f e c t s o f d s D N A s i z e , r h e u m a t o i d f a c t o r , a n d r e d u c t i o n a n d a l k y l a t i o n o f t h e a n t i b o d i e s . J I m m u n o l 1 3 6 : 3 7 8 5 , 1 9 8 6 R o s s G D , M e d o f M E : M e m b r a n e c o m p l e m e n t r e c e p t o r s s p e c i fi c f o r b o u n d f r a g m e n t s o f C 3 , i n D i x o n I F J ( e d ) : A d v a n c e s i n I m m u n o l o g y ( v o l 3 7 ) . O r l a n d o , A c a d e m i c P r e s s , 1 9 8 5 , p 2 1 7 W e i t z m a J B , L a w S K A : C R 3 a n d i t s r e l a t i o n s h i p w i t h o t h e r p h a g o c y t i c r e c e p t o r s , i n W h a l e y K , L o o s M , W e i l e r J M ( e d s ) : C o m p l e m e n t i n H e a l t h a n d D i s e a s e ( 2 n d e d , v o l 2 0 ) . D o r d r e c h t , K l u w e r A c a d e m i c P u b , 1 9 9 3 , p 2 6 9 G a d d K J , R e i d K B M : T h e b i n d i n g o f c o m p l e m e n t c o m p o n e n t C 3 t o a n t i b o d y - a n t i g e n a g g r e g a t e s a f t e r a c t i v a t i o n o f t h e a l t e r n a t i v e p a t h w a y i n h u m a n s e r u m . B i o c h e m J 1 9 5 : 4 7 1 , 1 9 8 1 1 2 . 1 3 . 1 4 . 1 5 . 1 6 . 1 7 . 1 8 . 1 9 . 2 0 . 2 1 . 2 2 . 2 3 . 3 6 1 N g Y C , S c h i f f e r l i J A : C o m p l e m e n t , i m m u n e c o m p l e x e s a n d i m m u n e c o m p l e x d i s e a s e , i n W h a l e y K , L o o s M , W e i l e r M ( e d s ) : C o m p l e m e n t i n H e a l t h a n d D i s e a s e ( 2 n d e d , v o l 2 0 ) . D o r d r e c h t , K l u w e r A c a d e m i c P u b , 1 9 9 3 , p 1 9 9 T u r k I L : T h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n c o m p l e m e n t a n d a n t i b o d i e s o f d i f f e r e n t a n i m a l s i n t h e i m m u n e - a d h e r e n c e p h e n o m e n o n . I m m u n o l o g y 2 : 1 2 7 , 1 9 5 9 S a r g e n t A U , J o h n s o n S B , R i c h a r d s o n A K : T h e i s o l a t i o n a n d f u n c t i o n a l p u r i fi c a t i o n o f t h e fi r s t s e v e n c o m p o n e n t s o f c a n i n e h e m o l y t i c c o m p l e m e n t . I m m u n o c h e m i s t r y 1 3 : 8 2 3 , 1 9 7 6 L a m b r i s J D : T h e c h e m i s t r y , b i o l o g y , a n d p h y l o g e n y o f C 3 , i n C r u s e J M , L e w i s R E J ( e d s ) : C o m p l e m e n t T o d a y ( v o l 1 ) . B a s e l , K a r g e r , 1 9 9 3 , p 1 7 M e y e r s K M , B o e h m e M , I n b a r 0 : B i n d i n g o f 1 2 5 I - l a b e l e d e n d o t o x i n t o b o v i n e , c a n i n e , a n d e q u i n e p l a t e l e t s a n d e n d o t o x i n - i n d u c e d a g g l u t i n a t i o n o f c a n i n e p l a t e l e t s . A m J V e t R e s 4 3 2 1 7 2 1 , 1 9 8 2 C l e m m o n s R M , M e y e r s K M : A c q u i s i t i o n a n d a g g r e g a t i o n o f c a n i n e b l o o d p l a t e l e t s : B a s i c m e c h a n i s m s o f f u n c t i o n a n d d i f f e r e n c e s b e c a u s e o f b r e e d o r i g i n . A m J V e t R e s 4 5 : 1 3 7 , 1 9 8 4 J o h n s o n G ] , L e i s L A , R a o G H R , W h i t e J G : A r a c h i d o n a t e - i n d u c e d p l a t e l e t a g g r e g a t i o n i n t h e d o g . T h r o m b R e s 1 4 : 1 4 7 , 1 9 7 9 J o h n s o n G ] , L e i s L A , D u n l o p P C : T h r o m b o x a n e - i n s e n s i t i v e d o g p l a t e l e t s h a v e i m p a i r e d a c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e C d u e t o r e c e p t o r - l i n k e d G p r o t e i n d y s f u n c t i o n . J C l i n I n v e s t 9 2 : 2 4 6 9 , 1 9 9 3 C o r n a c o f f J B , H e b e r t L A , S m e a d W L , V a n A m a n M E : P r i m a t e e r y t h r o c y t e - i r n m u n e c o m p l e x - c l e a r i n g m e c h a n i s m . J C l i n I n v e s t 7 1 : 2 3 6 , 1 9 8 3 G o r m a n N T : A c t i v a t i o n o f t h e a l t e r n a t i v e c o m p l e m e n t p a t h w a y b y l y m p h o b l a s t s i s o l a t e d f r o m c a n i n e t h y m i c l y m p h o m a s . V e t I m m u n o I m m u n o p a t h 7 : 2 1 3 , 1 9 8 4 R e n t R , E r t e l N , E i s e n s t e i n R , G e w u r z H : C o m p l e m e n t a c t i v a t i o n b y i n t e r a c t i o n o f p o l y a n i o n s a n d p o l y c a t i o n s : I . H e p a r i n - p r o t a m i n e i n d u c e d c o n s u m p t i o n o f c o m p l e m e n t . J I m m u n o l 1 1 4 : 1 2 0 , 1 9 7 5 C l a u s D R , S i e g e ] J , P e t r a s K , S k o r D , O s m a n d A P , G e w u r z H : C o m p l e m e n t a c t i v a t i o n b y i n t e r a c t i o n o f p o l y a n i o n s a n d p o l y c a t i o n s : I I I . C o m p l e m e n t a c t i v a t i o n b y i n t e r a c t i o n o f m u l t i p l e p o l y a n i o n s a n d p o l y c a t i o n s i n t h e p r e s e n c e o f C - r e a c t i v e p r o t e i n . J I m m u n o l 1 1 8 : 8 3 , 1 9 7 7 2 4 . 2 5 . 2 6 . 2 7 . 2 8 . 2 9 . 3 6 2 v o n Z a b r e n 1 : A c t i o n o f p o l y i o n i c s u b s t a n c e s o n t h e c o m p l e m e n t s y s t e m , i n S i m R B ( e d ) : A c t i v a t o r s a n d I n h i b i t o r s o f C o m p l e m e n t . D o r d r e c h t , K l u w e r A c a d e m i c P u b , 1 9 9 3 , p 1 4 9 B r e i t s c h w e r d t E B : I n f e c t i o u s t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s . C o m p e n d C o n t i n E d u c S m a l l A n i m 1 0 : 1 1 7 7 , 1 9 8 8 G r e e n e C E , S h o t t s E B : L e p t o s p i r o s i s , i n G r e e n e C E ( e d ) : I n f e c t i o u s D i s e a s e s o f t h e D o g a n d C a t . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 9 0 , p 4 9 8 G o u r l e y I M G , L o w G : I n v i t r o a g g r e g a t i o n o f c a n i n e b l o o d p l a t e l e t s a n d l i q u e f a c t i o n o f b l o o d c l o t s b y l e p t o s p i r e s . A m J V e t R e s 2 3 : 1 2 5 2 , 1 9 6 2 S w i s h e r S N , Y o u n g L E : T h e b l o o d g r o u p i n g s y s t e m s o f d o g s . P h y s i o l R e v 4 1 : 4 9 5 . 1 9 6 1 L e w i s D C , M e y e r s K M , M e n a r d M , P e r r y m a n L E : A n t i b o d i e s b o u n d t o t h e s u r f a c e o f p l a t e l e t s f r o m d o g s w i t h i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t O p e n i c p u r p u r a a r e a n t i - p l a t e l e t a u t o a n t i b o d i e s . J V e t I n t M e d 6 : 1 2 3 , 1 9 9 2 ( a b s t r ) C H A P T E R 5 E V A L U A T I O N O F H U M O R A L I M I V I U N E M E C H A N I S M S I N T H E P A T H O - G E N E S I S O F C Y T O P E N I A S I N D O G S A D M I N I S T E R E D D R U G X A b s t r a c t P a n c y t o p e n i a a n d i s o l a t e d c y t o p e n i a s o c c u r r e d i n s o m e d o g s r e c e i v i n g a p r o p r i e t a r y c o m p o u n d , d r u g X ( D X ) , d u r i n g a l - y e a r t o x i c i t y s t u d y . T h e b o n e m a r r o w s o f s e l e c t e d a f f e c t e d d o g s w e r e c e l l u l a r w i t h m y e l o i d h y p e r p l a s i a , a n d c o a g u l a t i o n p r o fi l e s w e r e n o t i n d i c a t i v e o f d i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n . P r e l i m i n a r y t e s t i n g s h o w e d t h a t p l a t e l e t s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n ( P S A I g ) w a s i n c r e a s e d i n 2 a f f e c t e d d o g s a s c o m p a r e d t o c o n t r o l s . T o f u r t h e r i n v e s t i g a t e t h e h y p o t h e s i s t h a t h u m o r a l a n t i b o d i e s o r i m m u n e c o m p l e x e s w e r e c a u s i n g o r c o n t r i b u t i n g t o t h e c y t o p e n i a s , i m m u n o r a d i o m e t r i c m e t h o d s t o d e t e c t e r y t h r o c y t e s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n ( E S A I g ) a n d c i r c u l a t i n g i m m u n e c o m p l e x e s ( I C s ) w e r e d e v e l o p e d . T h e s e a s s a y s a n d t h e a s s a y f o r P S A I g w e r e u s e d t o m e a s u r e P S A I g , E S A I g , a n d I C s i n o t h e r t r e a t e d a n d c o n t r o l d o g s ( p h a s e I s t u d i e s ) , a n d i n t w o r e c o v e r e d d o g s d u r i n g r e c h a l l e n g e w i t h D X ( p h a s e I I ) . I n t h e p h a s e I s t u d i e s , o n e d o g h a d m i l d i n c r e a s e s i n c i r c u l a t i n g I C s a n d P S A I g , b u t i n m o s t d o g s , t h e a d m i n i s t r a t i o n o f h i g h d o s e s o f D X w a s n o t a s s o c i a t e d w i t h i n c r e a s e d P S A I g , E S A I g , o r C l q - b i n d a b l e I C s . I n t h e p h a s e I I s t u d i e s , o n e o f t h e t w o r e c h a l l e n g e d d o g s d e v e l o p e d o n l y m i l d a n d i n c o n s i s t e n t i n c r e a s e s i n P S A I g . H u m o r a l 3 6 3 3 6 4 i m m u n e m e c h a n i s m s t h e r e f o r e d i d n o t s e e m t o c o n t r i b u t e t o t h e n o t e d c l i n i c a l t o x i c i t y i n t h e s e r e c h a l l e n g e d d o g s . I n c o n c l u s i o n , w h i l e i m m u n e m e c h a n i s m s m a y h a v e c o n t r i b u t e d t o t h e s p o r a d i c c y t o p e n i a s t h a t o c c u r r e d i n s o m e D X - t r e a t e d d o g s , t h e c y t o p e n i a s d i d n o t a p p e a r t o b e m e d i a t e d p r i n c i p a l l y b y h u m o r a l i m m u n i t y t o t h e p a r e n t d r u g . I n s t e a d , D X m a y h a v e i n t e r f e r e d w i t h s o m e m a t u r a t i o n o r r e g u l a t i o n m e c h a n i s m t h a t w a s n o t a s s e s s e d b y t h e s e s t u d i e s . I n t r o d u c t i o n D u r i n g a 1 - y e a r t o x i c o l o g i c s t u d y o f a p r o p r i e t a r y p h a r m a c o l o g i c a g e n t , d r u g X ( D X ) , s e v e r a l o f t h e t e s t d o g s b e c a m e t h r o m b o c y t o p e n i c , l e u k o p e n i c , a n d / o r m i l d l y a n e m i c . T h e b o n e m a r r o w f r o m a f f e c t e d d o g s w a s c e l l u l a r w i t h i n c r e a s e d , a n d s o m e t i m e s m a r k e d l y i n c r e a s e d , m y e l o i d t o e r y t h r o i d r a t i o s . P r o t h r o m b i n a n d p a r t i a l t h r o m b o p l a s t i n c o a g u l a t i o n t i m e s w e r e n o r m a l , a n d t h e r e w a s n o o t h e r e v i d e n c e o f d i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n . T h e s e fi n d i n g s s u g g e s t e d t h e p o s s i b i l i t y t h a t h u m o r a l i m m u n i t y m a y h a v e b e e n i n v o l v e d i n t h e p a t h o g e n e s i s o f t h e c y t 0 p e n i a s . F u r t h e r m o r e , o t h e r d o g s a d m i n i s t e r e d h i g h d o s e s o f D X c o n s i s t e n t l y d e v e l o p e d a d r a m a t i c a r t e r i t i s , s u g g e s t i n g a p o s s i b l e r o l e f o r i m m u n e c o m p l e x e s i n t h e p a t h o g e n e s i s o f t h e v a s c u l i t i s . I n a p r e l i m i n a r y s t u d y , w e a s s e s s e d t w o a f f e c t e d d o g s ( 3 4 a n d 6 5 ) f o r p l a t e l e t s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n ( P S A I g ) . T h e m e t h o d s f o r t h i s i m m u n o r a d i o m e t r i c a s s a y a r e d e s r i b e d b e l o w . T h e s a m p l e s w e r e s h i p p e d o v e r n i g h t a t a m b i e n t t e m p e r a t u r e a l o n g w i t h s a m p l e s f r o m t w o u n t r e a t e d c o n t r o l d o g s a n d t w o t r e a t e d b u t u n a f f e c t e d d o g s . B o t h c y t o p e n i c d o g s h a d i n c r e a s e d p l a t e l e t b i n d i n g o f r a d i o l a b e l e d s t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n 3 6 5 A ( S p A ) i n c o m p a r i s o n t o t h e f o u r c o n t r o l d o g s a n d i n c o m p a r i s o n t o t e n n o r m a l d o g s t e s t e d u n d e r e q u i v a l e n t c o n d i t i o n s ( T a b l e 5 . 1 ) . M o r e p l a t e l e t s w e r e h a r v e s t e d f r o m t h e s a m e s a m p l e s s o t h a t t h e y c o u l d b e a s s e s s e d f o r P S A I g w i t h r a d i o l a b e l e d a n t i b o d i e s t o c a n i n e I g G a n d I g M . A g a i n , t h e r e w a s i n c r e a s e d S p A b i n d i n g , a n d i n a d d i t i o n , i n c r e a s e d b i n d i n g o f t h e a n t i - M a n t i b o d y f o r b o t h d o g s a n d i n c r e a s e d b i n d i n g o f t h e a n t i - G a n t i b o d y f o r d o g 6 5 . T h e s e d a t a i n d i c a t e d t h a t P S A I g w a s i n c r e a s e d i n t h e s a m p l e s f r o m t h e t h r o m b o c y t o p e n i c d o g s t r e a t e d w i t h D X . 3 6 6 T a b l e 5 . 1 . I n i t i a l a s s a y f o r p l a t e l e t - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n i n t h r o m b o c y t o p e n i c a n d c o n t r o l d o g s . S u b j e c t % b o u n d t r e a t e d c y t o p e n i c d o g # S p A a n t i - y a n t i - u 1 5 . 9 2 . 0 7 . 5 3 6 1 . 9 1 . 3 5 . 4 x 3 5 2 . 9 1 . 1 5 . 5 x 7 0 2 . 6 1 . 0 3 . 8 x x 3 4 1 6 3 * - - x x 6 5 4 4 . 8 “ - - x x 3 4 * 8 . 6 3 . 7 1 1 . 0 x x 6 5 * 1 9 . 1 1 1 . 0 1 5 . 8 3 . 0 : t 1 . 6 ‘ * 2 . 2 i 1 . 0 “ 5 . 9 : } : 2 . 4 * * B o l d v a l u e s e x c e e d m e a n + 2 S D . o f c o n t r o l d o g s . * 2 n d h a r v e s t o f a d d i t i o n a l p l a t e l e t s f r o m r e s u s p e n d e d s a m p l e s f o r t e s t i n g w i t h p r o t e i n A ( S p A ) a n d a n t i b o d i e s t o c a n i n e I g G a n d I g M . * * M e a n : 1 : S D . f o r 1 0 n o r m a l d o g s u s i n g 2 4 h o u r - o l d s a m p l e s . 3 6 7 T h e p r e l i m i n a r y p o s i t i v e d a t a f o r P S A I g s u p p o r t e d t h e h y p o t h e s i s t h a t h u m o r a l a n t i b o d i e s o r i m m u n e c o m p l e x e s w e r e c a u s i n g o r c o n t r i b u t i n g t o t h e c y t o p e n i a s i n a f f e c t e d d o g s . I n o r d e r t o i n v e s t i g a t e t h i s p o s s i b i l i t y f u r t h e r , w e d e v e l o p e d m e t h o d s t o d e t e c t e r y t h r o c y t e s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n ( E S A I g ) a n d c i r c u l a t i n g i m m u n e c o m p l e x e s ( I C s ) . W e u s e d t h e s e a s s a y s a n d t h e a s s a y f o r P S A I g t o m e a s u r e P S A I g , E S A I g , a n d I C s i n o t h e r h i g h - d o s e t r e a t e d a n d c o n t r o l d o g s ( p h a s e I s t u d i e s ) , a n d i n d o g s 3 4 a n d 6 5 a f t e r r e c h a l l e n g e w i t h D X ( p h a s e H ) . B e c a u s e s o m e d r u g - i n d u c e d a n t i b o d i e s r e q u i r e t h e p r e s e n c e o f t h e d r u g t o b i n d t o t h e i r t a r g e t e p i t o p e s , 1 e a c h a s s a y f o r c e l l - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n w a s d o n e i n t h e p r e s e n c e a n d i n t h e a b s e n c e o f D X . M e t h o d s B l o o d c o l l e c t i o n B l o o d w a s c o l l e c t e d b y j u g u l a r v e n i p u n c t u r e i n t o p l a s t i c s y r i n g e s c o n t a i n i n g 1 / 1 0 p a r t 3 . 2 % c i t r a t e , t o g i v e a fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 3 2 % c i t r a t e . B l o o d w a s t r a n s f e r r e d t o p l a s t i c t u b e s w h i c h w e r e p l a c e d d i r e c t l y i n t o a 3 7 ° C i n c u b a t o r f o r t r a n s p o r t t o t h e l a b o r a t o r y . A l l s a m p l e s a r r i v e d w i t h i n 3 h r o f c o l l e c t i o n . R a d i o l a b e l i n g T h e f o l l o w i n g a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s w e r e r a d i o l a b e l e d b y m o d i fi c a t i o n s o f t h e m e t h o d o f F r a k e r a n d S p e c k z z z s t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n A ( S p A ) ( S i g m a C h e m i c a l C o m p a n y , S t . L o u i s , M O ) , a p o l y c l o n a l g o a t a n t i - [ c a n i n e I g G ( 7 ) ] ( a n t i — 7 ) , a n d a p o l y c l o n a l g o a t a n t i - [ c a n i n e I g M ( n ) ] ( a n t i - u ) ( K i r k e g a a r d a n d P e r r y L a b o r a t o r i e s , I n c . , G a i t h e r s b u r g , M D ) . B r i e fl y , 1 , 3 , 4 , 6 — t e t r a c h l o r o - 3 a , 6 a - d i p h e n y l g l y c o u r i l ( S i g m a ) w a s 3 6 8 d i s s o l v e d i n d i m e t h y l c h l o r i d e a n d 0 . 6 p g w e r e d e p o s i t e d i n t h e b a s e o f a g l a s s t e s t t u b e b y e v a p o r a t i o n . T o t h i s w e r e a d d e d 2 5 p g o f p r o t e i n ( 1 m g / m l ) a n d 0 . 3 - 0 . 5 p C i i o d i n e - 1 2 5 ( N a I , N E N D u p o n t ) . A f t e r 1 0 - 1 5 m i n u t e s o f i n c u b a t i o n w i t h m i x i n g , r a d i o l a b e l e d p r o t e i n w a s s e p a r a t e d f r o m f r e e i o d i d e b y fi l t r a t i o n t h r o u g h a 1 0 m l S e p h a d e x G 2 5 fi l t r a t i o n c o l u m n ( P h a r m a c i a B i o t e c h , I n c . , P i s c a t a w a y , N J ) . T h e l a b e l e d p r o t e i n w a s p o o l e d , d i l u t e d w i t h a s s a y b u f f e r ( p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e ( P B S ) w i t h 3 % b o v i n e s e r u m a l b u m i n ( B S A ) a n d 0 . 0 2 5 % s o d i u m a z i d e , p H 7 . 1 ) t o s t o c k c o n c e n t r a t i o n s o f 1 . 2 p g / m l , a n d f r o z e n i n a l i q u o t s u n t i l u s e . I m m u n o g l o b u l i n p u r i fi c a t i o n C a n i n e I g G a n d I g M w e r e p u r i fi e d f r o m n o r m a l c i t r a t e d p l a s m a b y s t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n A - a g a r o s e ( S i g m a ) a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y f o l l o w e d b y e x c l u s i o n c h r o m a t o g r a - p h y w i t h S e p h a c r y l - 3 0 0 H R ( P h a r m a c i a ) t o s e p a r a t e t h e i m m u n o g l o b u l i n s . T h e p o o l e d f r a c t i o n s w e r e d i a l y z e d a g a i n s t w a t e r , l y o p h y l i z e d , a n d r e s u s p e n d e d i n P B S , p H 7 . 2 . T h e fi n a l p r o d u c t s w e r e a s s e s s e d f o r p u r i t y b y s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( S D S - P A G E ) u n d e r r e d u c i n g a n d n o n r e d u c i n g c o n d i t i o n s u s i n g C o o m a s s i e B l u e t o v i s u a l i z e t h e b a n d s . T h e I g G a p p e a r e d p u r e , a n d t h e I g M w a s s l i g h t l y c o n t a m i n a t e d b y I g G . E r y t h r o c y t e s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n E r y t h r o c y t e s ( R B C s ) w e r e s e d i m e n t e d f r o m 3 7 ° C c i t r a t e d b l o o d s a m p l e s b y c e n t r i f u g a t i o n f o r 1 0 m i n a t 2 0 0 0 x g i n a B e c k m a n J - 6 B fl o o r c e n t r i f u g e . A f t e r t h e b u f f y c o a t s a n d p l a s m a w e r e r e m o v e d b y a s p i r a t i o n , R B C s w e r e w a s h e d 3 t i m e s i n a s s a y 3 6 9 b u f f e r , p l u s a n d m i n u s D X . A f t e r t h e fi n a l w a s h a n d r e s u s p e n s i o n , t h e h e m a t o c r i t s o f e a c h s a m p l e w e r e d e t e r m i n e d , a n d e a c h s a m p l e w a s d i l u t e d w i t h a s s a y b u f f e r ( p l u s a n d m i n u s D X ) t o a 4 % s u s p e n s i o n . F o r e a c h s a m p l e , t r i p l i c a t e d e t e r m i n a t i o n s w e r e m a d e w i t h e a c h o f t h e 3 r a d i o l a b e l e d i m m u n o g l o b u l i n d e t e c t o r s : S p A , a n t i - 7 , a n d a n t i - p . F i f t y m i c r o l i t e r s o f e a c h 4 % R B C s u s p e n s i o n w e r e a d d e d t o t e s t w e l l s o f U - b o t t o m e d p o l y p r o p y l e n e m i c r o t i t r a t i o n p l a t e s , a n d t o e a c h w e l l w a s a d d e d 5 0 p l ( l o n g ) o f t h e a p p r o p r i a t e a n t i g l o b u l i n r e a g e n t , p l u s a n d m i n u s D X . A f t e r a 1 h r i n c u b a t i o n a t r o o m t e m p e r a t u r e , t h e R B C s w e r e p e l l e t e d b y c e n t r i f u g a t i o n f o r 5 m i n a t 8 5 0 x g i n t h e B e c k r n a n c e n t r i f u g e . T h e p e l l e t s w e r e w a s h e d 3 t i m e s b y a l t e r n a t i n g c e n t r i f u g a t i o n a n d r e s u s p e n s i o n i n a s s a y b u f f e r , p l u s a n d m i n u s D X . A f t e r t h e fi n a l r e s u s p e n s i o n , t h e s a m p l e s w e r e t r a n s f e r r e d t o a T m A n a l y t i c g a m m a ( B e n s e n v i l l e , I L ) c o u n t e r f o r m e a s u r i n g R B C - a s s o c i a t e d r a d i o a c t i v i t y . R e s u l t s w e r e r e p o r t e d a s p e r c e n t a g e s o f a d d e d r a d i o a c t i v i t y t h a t r e m a i n e d a s s o c i a t e d w i t h t h e R B C s ( % b o u n d ) . T h e p o s i t i v e c o n t r o l f o r a l l 3 a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s w a s c a n i n e s e r u m c o n t a i n i n g I g G a n d I g M a l l o a n t i b o d i e s t o D E A 1 . 1 ( d o g e r y t h r o c y t e a n t i g e n 1 . 1 ) . T h i s s e r u m w a s g e n e r o u s l y p r o v i d e d b y D r . R o b e r t B u l l , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y . P o s i t i v e c o n t r o l s e r u m w a s i n c u b a t e d w i t h n o r m a l c a n i n e D E A 1 . 1 - p o s i t i v e R B C s f o r 1 h r a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e p e l l e t s f o r t h e s e p o s i t i v e c o n t r o l s w e r e t h e n w a s h e d 3 t i m e s a n d a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s w e r e a d d e d a s d e s c r i b e d f o r t h e t e s t s a m p l e s . A d o s e - r e s p o n s e c u r v e o f p o s i t i v e c o n t r o l s e r u m w a s g e n e r a t e d w i t h e a c h a s s a y u s i n g S p A . A n t i - 7 a n d a n t i - p w e r e t e s t e d w i t h t h e h i g h e s t c o n c e n t r a t i o n o f t h e p o s i t i v e c o n t r o l s e r u m . 3 7 0 P l a t e l e t s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n P l a t e l e t s w e r e h a r v e s t e d b y r e p e t i t i v e c e n t r i f u g a t i o n f o r 2 - 3 m i n a t 1 3 0 0 x g . A l i q u o t s o f p l a t e l e t - r i c h p l a s m a ( P R P ) w e r e r e m o v e d a f t e r e a c h c e n t r i f u g a t i o n . P r o s t a g l a n d i n E l ( 1 p M fi n a l ) w a s a d d e d t o t h e p o o l e d P R P s a m p l e o f e a c h d o g b e f o r e w a s h i n g t h r e e t i m e s w i t h 3 7 ° C a s s a y b u f f e r ( s a m e a s E S A I g a s s a y b u f f e r ) , p l u s a n d m i n u s D X . C o n t a m i n a t i n g R B C s , w h e n p r e s e n t , w e r e r e m o v e d b y d i f f e r e n t i a l c e n t r i f u g a t i o n i n a m i c r o f u g e . W a s h e d p l a t e l e t s w e r e r e s u s p e n d e d i n a s s a y b u f f e r , p l u s a n d m i n u s D X , a n d t h e p l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n o f e a c h s a m p l e w a s d e t e r m i n e d w i t h a N e u b a u e r h e m o c y t o m e t e r . F o r e a c h s a m p l e , t r i p l i c a t e d e t e r m i n a t i o n s w e r e m a d e w i t h e a c h o f t h e t h r e e r a d i o l a b e l e d i m m u n o g l o b u l i n d e t e c t o r s : S p A , a n t i - 7 , a n d a n t i - p . F i v e m i l l i o n p l a t e l e t s f r o m e a c h s a m p l e w e r e a d d e d t o e a c h t e s t w e l l o f U - b o t t o m p o l y p r o p y l e n e m i c r o t i t r a t i o n p l a t e s » a n d p e l l e t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 8 5 0 x g f o r 8 m i n u t e s i n a B e c k r n a n J 6 B fl o o r c e n t r i f u g e . T h e b u f f e r w a s r e m o v e d a n d t h e p l a t e l e t s w e r e r e s u s p e n d e d i n 5 0 p l a s s a y b u f f e r c o n t a i n i n g 1 0 n g o f 1 2 S I — l a b e l e d a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s , p l u s a n d m i n u s D X . A f t e r i n c u b a t i o n a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 h r , t h e p l a t e l e t s w e r e w a s h e d 3 t i m e s i n a s s a y b u f f e r , p l u s a n d m i n u s D X , w i t h a l t e r n a t i n g r e s u s p e n s i o n s a n d c e n t r i f u g a t i o n s f o r 8 m i n a t 8 5 0 x g . T h e t e s t p l a t e l e t s w e r e r e s u s p e n d e d a f t e r t h e l a s t w a s h , a n d a l i q u o t s w e r e r e m o v e d f r o m e a c h w e l l a n d a s s e s s e d f o r p l a t e l e t - a s s o c i a t e d r a d i o a c t i v i t y i n a g a m m a c o u n t e r . R e s u l t s w e r e r e p o r t e d a s p e r c e n t a g e s o f t h e a d d e d r a d i o a c t i v i t y t h a t r e m a i n e d a s s o c i a t e d w i t h t h e p l a t e l e t s ( % b o u n d ) . T h e a s s a y p o s i t i v e c o n t r o l f o r S p A a n d a n t i - 7 w a s c i t r a t e d p l a s m a f r o m a d o g w i t h n a t u r a l l y o c c u r r i n g i m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a a n d a h i g h c o n c e n t r a t i o n 3 7 1 o f a n t i b o d y t h a t i m m u n o p r e c i p i t a t e d p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n I b . N o r m a l p l a s m a a n d fi x e d n o r m a l p l a t e l e t s s e r v e d a s n e g a t i v e c o n t r o l s . A d o s e - r e s p o n s e c u r v e o f p o s i t i v e c o n t r o l p l a s m a w a s g e n e r a t e d w i t h e a c h a s s a y b y i n c u b a t i n g i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f t h e p o s i t i v e c o n t r o l p l a s m a w i t h 5 m i l l i o n g l u t a r a l d e h y d e - fi x e d n o r m a l p l a t e l e t s f o r 1 h r a t r o o m t e m p e r a t u r e ( p l u s a n d m i n u s D X ) . T h e s e p l a t e l e t s w e r e t h e n w a s h e d 3 t i m e s i n a s s a y b u f f e r ( p l u s a n d m i n u s D X ) , a n d i n c u b a t e d w i t h S p A a s f o r t h e t e s t s a m p l e s . A n t i - 7 w a s u s e d o n l y w i t h t h e h i g h e s t c o n c e n t r a t i o n o f p o s i t i v e c o n t r o l p l a s m a . T h e p o s i t i v e c o n t r o l s f o r t h e E S A I g a n d C l q a s s a y s v e r i fi e d c o n t i n u e d f u n c t i o n o f t h e a n t i - p a n t i b o d y . S o l i d p h a s e r a d i o m e t r i c C ] q a s s a y f o r i m m u n e c o m p l e x e s P l a s m a w a s c o l l e c t e d f r o m c i t r a t e d b l o o d s a m p l e s a f t e r c e n t r i f u g a t i o n f o r 1 0 m i n a t 2 0 0 0 x g . W h e n s a m p l e s w e r e n o t a s s a y e d i m m e d i a t e l y , t h e y w e r e f r o z e n a t - 6 5 ° C u n t i l u s e d . H u m a n C l q ( S i g m a ) w a s a d s o r b e d o n t o t h e w e l l s o f I m m u l o n I I R e m o v e - a w e l l m i c r o t i t r a t i o n p l a t e s ( D y n a t e c h L a b o r a t o r i e s , I n c . , C h a n t i l l y , V A ) b y i n c u b a t i n g e a c h w e l l w i t h 1 p g C l q i n 2 0 0 p l 5 0 m M c a r b o n a t e b u f f e r , p H 8 . 6 , o v e r n i g h t a t 4 ° C . T h e w e l l s w e r e t h e n w a s h e d t w i c e w i t h 3 0 0 p l C l q a s s a y b u f f e r ( P B S w i t h 1 . 5 % B S A a n d 0 . 0 1 % T w e e n , p H 7 . 2 ) . E a c h w e l l w a s t h e n b l o c k e d b y i n c u b a t i o n w i t h 3 0 0 p l o f C l q a s s a y b u f f e r f o r 2 h r . A f t e r r e m o v a l o f t h e b u f f e r , s a m p l e s o r s t a n d a r d s w e r e a d d e d w i t h C l q a s s a y b u f f e r t o a t o t a l v o l u m e o f 2 0 0 p l p e r w e l l . T h e v o l u m e o f c i t r a t e d p l a s m a u s e d f o r t h e t e s t s a m p l e s w a s 1 . 0 a n d 0 . 2 p l , e x c e p t o n o n e d a t e w h e n 0 . 4 p l r e p l a c e d 1 . 0 p l . E a c h s a m p l e w a s t e s t e d i n t r i p l i c a t e w i t h 0 . 2 p l , b u t s o m e s a m p l e s w e r e t e s t e d i n d u p l i c a t e a t t h e h i g h e r s a m p l e v o l u m e s . A f t e r a 1 h r i n c u b a t i o n a t r o o m t e m p e r a t u r e , t h e w e l l s w e r e w a s h e d 3 t i m e s i n C l q a s s a y b u f f e r . E a c h s a m p l e w a s 3 7 2 a s s e s s e d w i t h e a c h o f t h e 3 a n t i g l o b u l i n r e a g e n t s : S p A , a n t i - 7 , a n d a n t i - p . T e n n a n o g r a r n s o f e a c h r e a g e n t w e r e a d d e d t o t h e a p p r o p r i a t e w e l l s i n 2 0 0 p l C l q a s s a y b u f f e r a n d i n c u b a t e d f o r 1 h r a t r o o m t e m p e r a t u r e . A f t e r i n c u b a t i o n , t h e w e l l s w e r e w a s h e d 3 t i m e s , r e m o v e d f r o m t h e p l a t e s , a n d a s s e s s e d f o r r a d i o a c t i v i t y i n a g a m m a c o u n t e r . R e s u l t s w e r e r e p o r t e d a s " % b o u n d " , t h e p e r c e n t a g e o f t h e a d d e d r a d i o a c t i v i t y t h a t w a s u l t i m a t e l y b o u n d t o e a c h w e l l . A s t a n d a r d c u r v e w a s g e n e r a t e d w i t h e a c h C l q a s s a y b y t h e a d d i t i o n o f 0 . 0 , 0 . 1 2 5 , 0 . 2 5 , a n d 1 . 0 p g o f h e a t - a g g r e g a t e d c a n i n e I g G ( H A I g G ) t o s u c c e s s i v e w e l l s i n p l a c e o f t e s t s a m p l e s . I g G w a s a g g r e g a t e d b y h e a t i n g a 3 0 m g / m l s o l u t i o n f o r 6 0 m i n a t 5 6 ° C i n a w a t e r b a t h . F o r t h e s t a n d a r d c u r v e , t h e b o u n d H A I g G w a s d e t e c t e d w i t h S p A . H A I g G w a s a l s o u s e d a t 1 p g / w e l l a s a p o s i t i v e c o n t r o l f o r t h e a n t i - 7 a n t i b o d y . I n d i v i d u a l a l i q u o t s o f a s i n g l e p r e p a r a t i o n o f H A I g G w e r e f r o z e n a t - 6 5 ° C , a n d a d i f f e r e n t a l i q u o t w a s u s e d f o r e a c h a s s a y . C a n i n e h e a t - a g g r e g a t e d I g M ( H A I g M ) w a s a d d e d t o C l q w e l l s a t 1 p g / w e l l a s a p o s i t i v e c o n t r o l f o r t h e a n t i - p a n t i b o d y . A s i n g l e p r e p a r a t i o n o f H A I g M w a s u s e d f o r a l l a s s a y s , a n d i t w a s s t o r e d a t 4 ° C . P h a s e I s t u d i e s T h e fi r s t p h a s e o f t h e t o x i c o l o g i c i n v e s t i g a t i o n s f o c u s e d o n d o g s i n t h e h i g h a n d m e d i u m - h i g h d o s e g r o u p s . E a c h d o g w a s t e s t e d f o r P S A I g a n d E S A I g , p l u s a n d m i n u s D X i n t h e a s s a y b u f f e r s . T h e p l a s m a o f e a c h d o g w a s a l s o a s s e s s e d f o r C l q - b i n d a b l e I C s . T r e a t e d d o g s a n d u n t r e a t e d c o n t r o l s w e r e a s s e s s e d o n e a c h o f 5 s a m p l e d a t e s , b u t t h e t r e a t m e n t s t a t u s o f t h e s a m p l e s w a s n o t r e v e a l e d u n t i l t h e s t u d y w a s c o m p l e t e . F o r 3 7 3 e a c h a s s a y , v a l u e s g r e a t e r t h a n t h e m e a n o f c o n t r o l d o g s p l u s 2 s t a n d a r d d e v i a t i o n s w e r e c o n s i d e r e d i n c r e a s e d . P h a s e I I s t u d i e s P h a s e I I s t u d i e s f o c u s e d o n d o g s 3 4 a n d 6 5 w h o w e r e i n i t i a l l y f o u n d t o h a v e i n c r e a s e d P S A I g a s c o m p a r e d t o c o n t r o l s a m p l e s . T h e s e d o g s w e r e r e c h a l l e n g e d w i t h D X , a n d b a s e l i n e a n d s e r i a l s a m p l e s w e r e a s s e s s e d o v e r 6 w k f o r i n c r e a s e s i n P S A I g , E S A I g , a n d I C s . D X d o s i n g b e g a n o n t h e d a y b a s e l i n e s a m p l e s w e r e t e s t e d . A s f o r p h a s e I s t u d i e s , s a m p l e s f r o m t r e a t e d d o g s w e r e a s s e s s e d c o n c u r r e n t l y w i t h s a m p l e s f r o m u n t r e a t e d c o n t r o l s . F o r e a c h a s s a y , v a l u e s g r e a t e r t h a n t h e m e a n o f c o n t r o l d o g s p l u s 2 s t a n d a r d d e v i a t i o n s w e r e c o n s i d e r e d i n c r e a s e d . R e s u l t s P h a s e I E S A I g T h e p o s i t i v e c o n t r o l r e s u l t s f o r p h a s e I R B C e x p e r i m e n t s a r e s h o w n i n T a b l e s 5 . 2 a , 5 . 2 b , a n d 5 . 2 c , a n d i n F i g u r e 5 . 1 . T h e c o r r e l a t i o n c o e f fi c i e n t s ( r v a l u e s ) a n d s l o p e s ( m v a l u e s ) f o r t h e S p A d o s e - r e s p o n s e c u r v e s w i t h p o s i t i v e c o n t r o l a n t i - D E A 1 . 1 p l a s m a , p l u s a n d m i n u s D X , a r e s h o w n i n T a b l e 5 . 2 a . T h e m e a n s a n d s t a n d a r d d e v i a t i o n s f o r t h e s e c u r v e s a r e d e p i c t e d i n F i g u r e 5 . 1 . P o s i t i v e c o n t r o l v a l u e s f o r a n t i — 7 a n d a n t i - p a r e l i s t e d i n T a b l e 5 . 2 b a n d T a b l e 5 . 2 c , r e s p e c t i v e l y . T h e p o s i t i v e c o n t r o l s w e r e p o s i t i v e w i t h e v e r y a s s a y . 3 7 4 T a b l e 5 . 3 s u m m a r i z e s t h e r e s u l t s f o r E S A I g i n t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f D X u s i n g R B C s f r o m t r e a t e d a n d c o n t r o l d o g s . T h e d a t a a r e s t r a t i fi e d b y e a c h d o g ’ s s p e c i fi c s t u d y n u m b e r . I n c r e a s e d a n t i - 7 b i n d i n g w a s p r e s e n t f o r d o g 3 0 i n t h e a b s e n c e ( 0 . 8 % ) a n d i n t h e p r e s e n c e ( 0 . 6 % ) o f D X . D o g 3 2 h a d i n c r e a s e d E S A I g M i n t h e p r e s e n c e o f D X ( 0 . 6 % ) . I n t h e m a i n , E S A I g w a s n o t i n c r e a s e d i n d o g s t r e a t e d w i t h D X . 3 7 5 T a b l e 5 . 2 a . P h a s e I c o r r e l a t i o n c o e f fi c i e n t s ( r ) a n d S I O p e s ( m ) o f t h e S p A s t a n d a r d c u r v e s , p l u s a n d m i n u s D X , f o r t h e e r y t h r o c y t e s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n ( E S A I g ) a s s a y . D X - D X + r m r m 0 . 9 9 9 1 2 . 1 0 . 9 9 3 8 . 4 0 . 9 9 8 9 . 6 0 . 9 9 9 7 . 7 0 . 9 9 9 1 1 . 0 0 . 9 9 6 7 . 8 0 . 9 9 9 1 0 . 8 0 . 9 9 9 1 0 . 4 0 . 9 9 9 9 . 2 0 . 9 9 9 8 . 5 T a b l e 5 . 2 b . P h a s e I p o s i t i v e c o n t r o l r e s u l t s f o r a n t i - y i n t h e a s s a y f o r E S A I g G , p l u s a n d m i n u s D X ( % b o u n d ) . D X - D X + 0 p l O L D E A l . l * 1 . 6 p l a D E A 1 . 1 0 p l o r D E A 1 . 1 1 . 6 1 . 1 1 ( I D E A 1 . 1 1 . 2 2 2 . 9 1 . 1 1 7 . 1 1 . 4 1 7 . 9 1 . 2 1 8 . 4 1 . 4 2 1 . 2 1 . 1 1 8 . 7 1 . 3 1 6 . 8 1 . 0 1 3 . 7 0 . 2 1 1 . 0 1 . 6 2 0 . 4 T a b l e 5 . 2 c . P h a s e I p o s i t i v e c o n t r o l r e s u l t s f o r a n t i - p i n t h e a s s a y f o r E S A I g M , p l u s a n d m i n u s D X ( % b o u n d ) . D X - D X + 0 p ! O L D E A 1 . 1 * 1 . 6 1 4 1 O L D E A I J 0 p ] O L D E A 1 . 1 1 . 6 1 1 1 a D E A 1 . 1 0 . 3 4 . 5 0 . 2 3 . 2 0 . 4 4 . 5 0 . 4 2 . 8 0 . 2 3 . 3 0 . 2 3 . 4 0 . 3 3 . 0 0 . 2 3 . 8 0 . 3 3 . 0 0 . 2 3 . 3 * a D E A 1 . l = p o s i t i v e c o n t r o l a n t i s e r u m t o D o g E r y t h r o c y t e A n t i g e n 1 . 1 . 3 7 6 T a b l e 5 . 3 . P h a s e I r e s u l t s f o r e r y t h r o c y t e s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n i n t r e a t e d a n d c o n t r o l d o g s , p l u s ( + ) a n d m i n u s ( — ) D X ( % b o u n d ) . S p A a n t i - y a n t i - p S u b j e c t - + - + - + C o n t r o l D o g s 3 0 . 3 0 . 4 0 . 6 0 . 5 0 . 4 0 . 4 4 0 . 2 0 . 2 0 . 4 0 . 3 0 . 2 0 . 2 5 0 . 1 0 . 1 0 . 4 0 . 3 0 . 1 0 . 2 6 0 . 1 0 . 2 0 . 3 0 . 4 0 . 3 0 . 2 7 0 . 2 0 . 2 0 . 5 0 . 3 0 . 2 0 . 2 3 8 0 . 4 0 . 2 0 . 4 0 . 4 0 . 4 0 . 3 3 9 0 . 3 0 . 2 0 . 4 0 . 2 0 . 1 0 . 2 4 0 0 . 1 0 . 2 0 . 4 0 . 3 0 . 1 0 . 2 4 1 0 . 1 0 . 1 0 . 5 0 . 3 0 . 2 0 . 2 4 2 0 . 1 0 . 2 0 . 3 0 . 2 0 . 2 0 . 2 m e a n : 1 : S J ) . 0 . 2 1 0 . 1 0 . 2 1 0 . 1 0 . 4 1 0 . 1 0 . 3 1 0 . 1 0 . 2 1 0 . 1 0 . 2 1 0 . 1 T r e a t e d D o g s 1 9 0 . 3 0 . 3 0 . 4 0 . 5 0 . 3 0 . 2 1 9 0 . 2 0 . 4 0 . 3 0 . 6 0 . 2 0 . 5 2 6 0 . 1 0 . 3 0 . 3 0 . 4 0 . 3 0 . 3 2 7 0 . 2 0 . 2 0 . 3 0 . 3 0 . 4 0 . 4 2 8 0 . 2 0 . 2 0 . 5 0 . 4 0 . 3 0 . 2 2 9 0 . 2 0 . 1 0 . 3 0 . 2 0 . 2 0 . 2 3 0 0 . 4 0 . 3 0 . 8 “ 0 . 6 ‘ 0 . 2 0 . 3 3 1 0 . 1 0 . 1 0 . 4 0 . 4 0 . 2 0 . 3 3 2 0 . 1 0 . 2 0 . 2 0 . 4 0 . 3 0 . 6 * 3 5 0 . 2 0 . 1 0 . 3 0 . 3 0 . 1 0 . 2 5 8 0 . 3 0 . 3 0 . 4 0 . 4 0 . 2 0 . 1 6 2 0 . 2 0 . 2 0 . 4 0 . 2 0 . 1 0 . 2 6 2 0 . 2 0 . 2 0 . 4 0 . 3 0 . 2 0 . 3 6 3 0 . 1 0 . 1 0 . 3 0 . 2 0 . 1 0 . 1 6 4 0 . 3 0 . 1 0 . 3 0 . 4 0 . 2 0 . 2 6 6 0 . 2 0 . 1 0 . 5 0 . 3 0 . 4 0 . 2 6 7 0 . 2 0 . 2 0 . 3 0 . 4 0 . 3 0 . 5 6 8 0 . 1 0 . 1 0 . 4 0 . 4 0 . 2 0 . 1 6 9 0 . 2 0 . 2 0 . 3 0 . 2 0 . 2 0 . 2 7 0 0 . 1 0 . 1 0 . 4 0 . 3 0 . 1 0 . 2 m e a n $ 2 ; 0 . 2 0 . 4 0 . 3 0 . 2 0 . 2 * V a l u e s e x c e e d m e a n + 2 S D . o f c o n t r o l d o g s . d n u o b % n a e m 3 7 7 2 0 " H D X 0 2 0 . 9 9 9 : n 2 5 ) § + o x ( n o o s e : n a S ) 0 I l l 0 0 . 4 0 . 8 1 . 2 1 . 6 p l a n t i - D E A 1 . 1 s e r u m F i g u r e 5 . 1 . P h a s e I m e a n S p A s t a n d a r d c u r v e s . p l u s a n d m i n u s D X . f o r t h e e r y t h r o c y t e s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n a s s a y . 3 7 8 P S A I g T h e c o r r e l a t i o n c o e f fi c i e n t s a n d s l o p e s f o r t h e S p A d o s e - r e s p o n s e c u r v e s w i t h c a n i n e p l a s m a c o n t a i n i n g a n t i - [ c a n i n e p l a t e l e t ] a n t i b o d i e s , p l u s a n d m i n u s D X , a r e s h o w n i n T a b l e 5 . 4 a . T h e m e a n s a n d s t a n d a r d d e v i a t i o n s f o r t h e s e c u r v e s a r e d e p i c t e d i n F i g u r e 2 . T a b l e 5 . 4 b s h o w s t h e p e r c e n t a g e b i n d i n g o f p o s i t i v e c o n t r o l p l a s m a , p l u s a n d m i n u s D X , u s i n g a n t i - y . T h e a c t i v i t y o f t h e a n t i - p a n t i b o d y w a s v e r i fi e d u s i n g t h e C l q a n d E S A I g a n t i - p p o s i t i v e c o n t r o l s . T h e p o s i t i v e c o n t r o l s w e r e p o s i t i v e w i t h e v e r y a s s a y . T h e P S A I g r e s u l t s f o r t r e a t e d a n d u n t r e a t e d d o g s , p l u s a n d m i n u s D X , a r e s h o w n i n T a b l e 5 . 5 w h e r e t h e y a r e s t r a t i fi e d b y s p e c i fi c d o g n u m b e r . O n i n i t i a l t e s t i n g , d o g 1 9 h a d i n c r e a s e d p l a t e l e t b i n d i n g o f S p A w i t h o u t D X ( 1 . 9 % ) , o f a n t i - 7 w i t h ( 1 . 0 % ) a n d w i t h o u t ( 2 . 3 % ) D X , a n d o f a n t i - p w i t h ( 4 . 8 % ) a n d w i t h o u t ( 6 . 8 % ) D X . A w e e k l a t e r , d o g 1 9 w a s a g a i n p o s i t i v e f o r P S A I g u s i n g S p A , b o t h w i t h ( 1 . 9 % ) a n d w i t h o u t ( 2 . 7 % ) D X . T h e b i n d i n g o f a n t i — 7 w a s a l s o i n c r e a s e d w i t h o u t D X ( 0 . 9 % ) , a n d t h e b i n d i n g o f a n t i - p w a s i n c r e a s e d w i t h ( 4 . 2 % ) a n d w i t h o u t ( 5 . 3 % ) D X . D o g 2 9 h a d i n c r e a s e d P S A I g u s i n g S p A w i t h D X ( 2 . 4 % ) a n d u s i n g a n t i - 7 w i t h D X ( 2 . 3 % ) . T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t d o g 1 9 h a d m i l d l y i n c r e a s e d P S A I g G a n d P S A I g M w h i l e b e i n g t r e a t e d w i t h D X . H o w e v e r , i n c r e a s e d P S A I g w a s v e r y m i l d a n d u n c o m m o n i n D X - t r e a t e d d o g s . 3 7 9 T a b l e 5 . 4 a . P h a s e I c o r r e l a t i o n c o e f fi c i e n t s ( r ) a n d s l o p e s ( m ) o f t h e S p A s t a n d a r d c u r v e s , p l u s a n d m i n u s D X , f o r t h e p l a t e l e t s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n ( P S A I g ) a s s a y . D X - D X + I ‘ m r m 0 . 9 9 6 3 1 . 1 0 . 9 9 8 2 7 . 9 0 . 9 9 9 3 3 . 3 0 . 9 9 7 2 5 . 5 0 . 9 9 8 3 4 . 8 0 . 9 9 5 2 7 . 6 0 . 9 9 9 3 3 . 7 0 . 9 9 9 2 9 . 3 0 . 9 9 9 3 1 . 5 0 . 9 9 9 3 2 . 8 T a b l e 5 . 4 b . P h a s e I p o s i t i v e c o n t r o l r e s u l t s f o r a n t i - y i n t h e a s s a y f o r P S A I g G , p l u s a n d m i n u s D X ( % b o u n d ) . D X - D X + 0 p l P C * 1 . 0 p l P C O p l P C 1 . 0 p 1 P C 0 . 8 2 3 . 8 0 . 6 2 6 . 4 0 . 9 2 3 . 1 1 . 0 2 7 . 4 0 . 9 2 5 . 0 0 . 9 2 5 . 3 1 . 0 2 5 . 0 1 . 2 2 4 . 0 0 . 8 2 2 . 3 0 . 8 2 4 . 3 * P C = p o s i t i v e c o n t r o l p l a s m a 3 8 0 T a b l e 5 . 5 . P h a s e I r e s u l t s f o r p l a t e l e t s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n i n t r e a t e d a n d c o n t r o l d o g s , p l u s ( + ) a n d m i n u s ( - ) D X ( % b o u n d ) . S p A a n t i - y a n t i - p S u b j e c t - + - + - + C o n t r o l D o g s 3 0 . 3 0 . 4 0 . 6 0 . 5 1 . 5 1 . 0 4 0 . 7 0 . 5 0 . 9 0 . 7 2 . 8 2 . 3 5 0 . 4 1 . 0 0 . 6 0 . 6 1 . 0 0 . 8 6 0 . 7 0 . 6 0 . 6 0 . 3 1 . 6 1 . 1 7 0 . 5 0 . 2 0 . 4 0 . 9 2 . 4 1 . 4 3 8 0 . 6 0 . 3 0 . 6 0 . 5 1 . 5 1 . 1 3 9 0 . 6 0 . 6 0 . 6 0 . 5 1 . 1 1 . 1 4 0 0 . 8 2 . 0 0 . 6 1 . 4 2 . 1 1 . 8 4 1 0 . 6 0 . 3 0 . 7 0 . 5 2 . 7 1 . 8 4 2 0 . 3 0 . 3 0 . 5 0 . 9 2 . 2 1 . 3 m e a n 1 S J ) . 0 5 1 0 . 2 0 5 1 0 . 5 0 5 1 0 . 1 0 . 7 1 0 5 1 . 9 1 0 5 1 . 4 1 0 5 T r e a t e d D o g s 1 9 1 . 9 ‘ 1 . 3 1 . 0 “ 2 5 * 6 5 * 4 5 “ 1 9 2 . 7 ' 1 . 9 ‘ 0 . 9 ‘ 0 . 8 5 . 3 ‘ 4 1 ' 2 6 0 . 5 0 . 2 0 . 4 0 . 4 1 . 2 0 . 9 2 7 0 . 3 0 . 3 0 . 7 0 . 3 0 . 8 0 . 8 2 8 0 . 2 0 . 2 0 . 3 0 . 8 0 . 9 0 . 8 2 9 0 . 2 0 . 5 0 . 4 0 . 4 2 . 8 3 . 4 ' 3 0 0 . 6 1 . 1 0 . 4 0 . 4 0 . 8 0 . 7 3 1 0 . 3 0 . 9 0 . 5 0 . 7 1 . 2 1 . 0 3 2 0 . 2 0 . 2 0 . 5 0 . 4 1 . 3 1 . 3 3 5 0 . 4 0 . 3 0 . 4 0 . 3 1 . 9 1 . 4 5 8 0 . 5 0 . 3 0 . 6 0 . 5 1 . 7 1 . 4 6 2 0 . 2 2 . 4 " 0 . 5 2 . 3 " 2 . 0 1 . 7 6 2 0 . 4 0 . 3 0 . 5 0 . 4 1 . 4 1 . 8 6 3 0 . 7 0 . 5 0 . 4 1 . 2 2 . 3 1 . 7 6 4 0 . 5 0 . 5 0 . 6 0 . 4 2 . 1 1 . 8 6 6 0 . 4 0 . 3 0 . 5 0 . 4 1 . 0 1 . 2 6 7 0 . 6 0 . 8 0 . 7 0 . 6 2 . 0 1 . 7 6 8 0 . 4 0 . 7 0 . 5 0 . 4 1 . 3 0 . 8 6 9 0 . 4 0 . 4 0 . 4 0 . 4 1 . 5 1 . 8 7 0 0 . 4 0 . 3 0 . 5 1 . 1 2 . 8 1 . 3 m e a n 0 5 0 . 7 0 . 5 0 5 2 . 0 1 . 7 * V a l u e s e x c e e d m e a n + 2 S D . o f c o n t r o l d o g s . d n u o b % n a e m O 3 8 1 + - D x ( ” 0 . 9 9 9 ; n - S ) 3 5 _ . 9 - + o x ( m o s e s ; n = 5 ) I I ' I C O ( 7 1 8 8 0 l l l l \ . 4 m 1 0 0 . 2 5 0 . 5 0 . 7 5 1 p l p o s i t i v e c o n t r o l p l a s m a F i g u r e 5 . 2 . P h a s e I m e a n S p A s t a n d a r d c u r v e s . p l u s a n d m i n u s D X . f o r t h e p l a t e l e t s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n a s s a y . 1 C 5 A M I 5 0 l f r * 1 c o a l S h o w i n F l S h e l l d a 3 3 3 8 2 I C s T h e t h i r d c o m p o n e n t o f t h e p h a s e I i n v e s t i g a t i o n s w a s a n a l y s i s o f p l a s m a s a m p l e s f o r s o l u b l e i m m u n e c o m p l e x e s u s i n g t h e s o l i d p h a s e C l q a s s a y . T h e c o r r e l a t i o n c o e f fi c i e n t s a n d t h e s l o p e s f o r t h e S p A d o s e - r e s p o n s e c u r v e s w i t h C l q - b o u n d H A I g G a r e s h o w n i n T a b l e 5 . 6 a . T h e m e a n s a n d s t a n d a r d d e v i a t i o n s f o r t h e s e c u r v e s a r e d e p i c t e d i n F i g u r e 3 . T h e p o s i t i v e c o n t r o l r e s u l t s f o r a n t i - 7 d e t e c t i n g C l q - b o u n d H A I g G a r e s h o w n i n T a b l e 5 . 6 b . S i m i l a r l y , T a b l e 5 . 6 c i s a s u m m a r y o f t h e p o s i t i v e c o n t r o l r e s u l t s o b t a i n e d u s i n g H A I g M w i t h t h e a n t i - p a n t i b o d y . T h e p o s i t i v e c o n t r o l s w e r e p o s i t i v e w i t h e v e r y a s s a y . C l q a s s a y r e s u l t s f o r t h e c o n t r o l a n d t r e a t e d d o g s a r e s h o w n i n T a b l e 5 . 7 . T h e d a t a a r e s t r a t i fi e d b y s p e c i fi c d o g n u m b e r . O n i n i t i a l t e s t i n g , d o g 1 9 h a d i n c r e a s e d I C s a s d e t e c t e d b y S p A ( 1 . 6 % ) a n d a n t i — p ( 3 . 2 % ) . R e p e a t d e t e r m i n a t i o n s f o r d o g 1 9 o n e w e e k l a t e r a g a i n s h o w e d i n c r e a s e d b i n d i n g o f S p A ( 3 . 9 % ) . D o g 6 4 h a d i n c r e a s e d b i n d i n g o f a n t i - 7 ( 1 . 7 % ) a n d o f S p A ( 4 . 0 % ) a t o n e o f t h e t w o p l a s m a v o l u m e s t e s t e d . P l a s m a f r o m d o g 6 7 p r o d u c e d i n c r e a s e d b i n d i n g o f a n t i - 7 ( 2 . 2 % ) a n d a n t i - p ( 3 . 6 % ) . T h e p o s i t i v e v a l u e s f o r d o g s 1 9 , 6 4 , a n d 6 7 s u g g e s t t h a t t h e s e d o g s h a d i n c r e a s e d c i r c u l a t i n g i m m u n e c o m p l e x e s w h e n t e s t e d . H o w e v e r , i n c r e a s e s i n I C s i n D X - t r e a t e d d o g s w e r e n e i t h e r c o n s i s t e n t n o r m a r k e d . 3 8 3 T a b l e 5 . 6 a . P h a s e I c o r r e l a t i o n c o e f fi c i e n t s ( r ) a n d s l o p e s ( m ) o f t h e S p A s t a n d a r d c u r v e s f o r t h e C l q a s s a y . r m 0 . 9 8 0 1 2 . 0 0 . 9 9 7 9 . 0 0 . 9 6 0 8 . 5 0 . 9 8 8 1 1 . 1 0 . 9 9 7 2 1 . 3 T a b l e 5 . 6 b . P h a s e I p o s i t i v e c o n t r o l r e s u l t s ( ° / o b o u n d ) f o r C l q - b i n d a b l e I g G u s i n g h e a t - a g g r e g a t e d I g G . % H A I g G 2 . 0 p g H A I g G 0 . 2 1 1 . 9 * 0 . 2 1 2 . 1 0 . 1 7 . 6 0 . 2 1 1 . 4 0 . 2 9 . 4 * i n d u p l i c a t e T a b l e 5 . 6 c . P h a s e I p o s i t i v e c o n t r o l r e s u l t s ( % b o u n d ) f o r C l q - b i n d a b l e I g M u s i n g h e a t - a g g r e g a t e d I g M . 0 p g H A I g M 1 - 0 1 4 8 H A I g M 0 . 4 5 . 9 0 . 6 8 . 0 0 . 3 4 . 4 0 . 6 7 . 5 0 . 5 6 . 3 3 8 4 T a b l e 5 . 7 . P h a s e I r e s u l t s f o r C l q - b i n d a b l e i m m u n e c o m p l e x e s i n t r e a t e d a n d c o n t r o l d o g s ( % b o u n d ) . S p A a n t i - y a n t i - p S u b i e c t 0 . 2 4 1 1 1 . 0 p l “ 0 . 2 p l 0 . 2 p i C o n t r o l d o g s 3 0 . 6 1 . 8 0 . 6 1 . 1 0 . 9 2 . 0 0 . 5 1 . 4 s 0 . 7 2 . 5 0 . 6 0 . 9 6 1 . 5 3 . 9 0 . 8 2 . 2 7 1 . 2 1 . 6 ‘ 0 . 2 2 . 7 3 8 0 . 8 2 . 1 0 . 5 1 . 9 3 9 0 . 6 1 . 6 0 . 4 1 . 0 4 0 0 . 9 3 . 0 0 . 6 1 . 2 4 1 0 . 9 2 . 6 0 . 7 1 . 9 4 2 1 . 1 1 . 6 ‘ 0 . 6 2 . 2 M e a n : 5 . 1 ) . 0 9 1 0 . 3 2 4 : 0 7 0 5 1 0 1 1 5 1 0 5 T r e a t e d d o g s 1 9 1 5 * 2 . 5 " 0 . 9 3 . 2 : 1 9 1 . 3 3 . 9 ' 0 . 9 2 . 5 2 6 0 . 6 2 . 3 0 . 5 1 . 5 2 7 1 . 0 3 . 8 0 . 8 1 . 4 2 8 1 . 2 1 . 6 ' 1 . 1 * 2 . 2 2 9 0 . 8 2 . 2 0 . 5 1 . 3 3 0 0 . 9 2 . 0 0 . 4 1 . 0 3 1 1 . 3 3 . 1 0 . 5 1 . 5 3 2 1 . 2 3 . 1 0 . 6 2 . 0 3 5 1 . 0 2 . 4 0 . 7 1 . 9 $ 8 1 . 0 2 . 9 1 . 5 1 . 9 6 2 1 . 2 2 . 8 0 . 4 1 . 4 6 2 0 . 8 2 . 1 0 . 5 1 . 5 6 3 0 . 8 1 . 3 ‘ 0 . 6 1 . 8 6 4 1 . 2 4 . 0 : 1 . r 2 . 0 6 6 0 . 6 1 . 7 0 . 5 1 . 1 6 7 1 . 1 0 . 8 2 . 2 : 3 5 * 6 8 1 . 1 3 . 2 0 . 5 1 . 5 6 9 0 . 6 1 . 8 0 . 4 1 . 2 7 0 0 . 6 1 . 8 T 0 . 2 1 . 2 * V a l u e s e x c e e d m e a n + 2 S D . o f c o n t r o l d o g s . " S a m p l e s w e r e r u n a t 0 . 4 p l i n s t e a d o f 1 . 0 p 1 . a n d w e r e n o t i n c l u d e d i n t h e m e a n . * * V a l u e s f o r d o g s n u m b e r e d 2 8 t h r o u g h 6 9 a r e m e a n s o f d u p l i c a t e d e t e r m i n a t i o n s . d n u o b 6 9 n a e m 3 8 5 2 0 fl * r = 0 . 9 9 8 : n = 5 1 5 — ' 1 O ' - 5 u — l 1 1 O 0 . 2 5 0 . 5 0 . 7 5 1 p l h e a t - a g g r e g a t e d 1 9 6 F i g u r e 5 . 3 . P h a s e 1 s t a n d a r d c u r v e f o r t h e C l q a s s a y f o r i m m u n e c o m p l e x e s . 3 8 6 P h a s e I I P h a s e I I s t u d i e s w e r e u s e d t o e v a l u a t e d o g s 3 4 a n d 6 5 f o r t h e d e v e l o p m e n t o f P S A I g , E S A I g , o r I C s w i t h D X r e c h a l l e n g e b e g i n n i n g a f t e r s a m p l i n g o n d a y 1 . E S A I g T a b l e 5 . 8 a l i s t s t h e c o r r e l a t i o n c o e f fi c i e n t s a n d s l o p e s f o r t h e S p A d o s e - r e s p o n s e c u r v e s u s i n g p o s i t i v e c o n t r o l a n t i - D E A 1 . 1 p l a s m a , p l u s a n d m i n u s D X . T h e m e a n s a n d s t a n d a r d d e v i a t i o n s f o r t h e s e c u r v e s a r e g r a p h e d i n F i g u r e 4 . P o s i t i v e c o n t r o l s , p l u s a n d m i n u s D X , a r e s h o w n f o r a n t i - y i n T a b l e 5 . 8 b , a n d f o r a n t i — p i n T a b l e 5 . 8 c . T h e p o s i t i v e c o n t r o l s w e r e p o s i t i v e w i t h e v e r y a s s a y . E S A I g r e s u l t s f o r d o g s 3 4 , 6 5 , a n d t h e c o n t r o l d o g s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 5 . 9 , w h e r e t h e y a r e s t r a t i fi e d b y s p e c i fi c d o g n u m b e r . I n c r e a s e d b i n d i n g o f S P A w i t h o u t D X o c c u r r e d w i t h R B C s o b t a i n e d f r o m d o g 3 4 o n d a y 3 0 ( 0 . 5 % ) . O n d a y 1 6 , R B C s f r o m d o g 6 5 h a d i n c r e a s e d b i n d i n g o f a n t i - 7 ( 0 . 7 % ) a n d a n t i - p ( 0 . 5 % ) w i t h o u t D X . I n c r e a s e s i n E S A I g w e r e s p o r a d i c a n d v e r y m i l d . 3 8 7 T a b l e 5 . 8 6 . P h a s e H c o r r e l a t i o n c o e fi c i e n t s ( r ) a n d s l o p e s ( m ) o f t h e S p A s t a n d a r d c u r v e s , p l u s a n d m i n u s D X , f o r t h e e r y t h r o c y t e s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n ( E S A I g ) a s s a y . D X - D X + D a y I m r m 1 0 . 9 9 9 8 . 7 0 . 9 9 2 7 . 6 1 0 0 . 9 9 9 1 0 . 9 0 . 9 9 9 1 0 . 8 1 6 0 . 9 9 9 1 1 . 0 0 . 9 9 9 8 . 8 2 4 0 . 9 9 8 8 . 0 0 . 9 9 9 8 . 6 3 0 0 . 9 9 9 7 . 7 0 . 9 9 5 9 . 4 4 2 0 . 9 9 9 9 . 9 0 . 9 9 8 8 . 8 T a b l e 5 . 8 b . P h a s e I 1 p o s i t i v e c o n t r o l r e s u l t s f o r a n t i — y i n t h e a s s a y f o r E S A I g G , p l u s a n d m i n u s D X ( ° / o b o u n d ) . D X — D X + D a y 0 p ] a D E A 1 . 1 * 1 . 6 p 1 a D E A 1 . 1 0 p l a D E A 1 . 1 1 . 6 1 6 a D E A 1 . 1 1 1 . 2 1 9 . 1 1 . 0 1 8 . 9 1 0 1 . 1 1 6 . 3 1 . 1 1 8 . 0 1 6 ‘ 1 . 7 2 7 . 4 1 . 7 3 1 . 2 2 4 1 . 6 2 6 . 7 1 . 2 2 3 . 4 3 0 2 . 1 2 4 . 8 2 . 0 2 3 . 4 4 2 1 . 9 2 3 . 6 1 . 6 2 4 . 2 T a b l e 5 8 6 P h a s e I I p o s i t i v e c o n t r o l r e s u l t s f o r a n t i - p i n t h e a s s a y f o r E S A I g M , p l u s a n d m i n u s D X ( % b o u n d ) . D X - D X + D a v c p l a D E A 1 . 1 1 . 6 m c t D E A 1 . 1 0 1 1 1 a D E A 1 . 1 1 . 6 1 1 1 a D E A 1 . 1 1 0 . 2 3 . 1 0 . 2 2 . 7 1 0 0 . 3 3 . 6 0 . 2 3 . 1 1 6 ' 0 . 3 6 . 4 0 . 4 6 . 0 2 4 0 . 2 5 . 0 0 . 4 4 . 6 3 0 0 . 4 3 . 2 0 . 4 3 . 1 4 2 0 . 2 4 . 4 0 . 2 3 . 7 * O L D E A 1 . 1 = p o s i t i v e c o n t r o l a n t i s e r u m t o D o g E r y t h r o c y t e A n t i g e n 1 . 1 . " N e w l a b e l i n g o f a n t i - y a n d a n t i - p ( s a m e l o t n u m b e r s ) . 3 8 8 T a b l e 5 . 9 . P h a s e H r e s u l t s f o r e r y t h r o c y t e s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n i n t r e a t e d a n d c o n t r o l d o g s , p l u s ( + ) a n d m i n u s ( - ) D X ( % b o u n d ) . S p A a n t i - y a n t i - p S u b j e c t D a y - + - + - + C o n t r o l D o g s 5 0 . 2 0 . 3 0 . 4 0 . 4 0 . 1 0 . 2 5 0 . 2 0 . 3 0 . 6 0 . 5 0 . 3 0 . 2 7 0 . 3 0 . 4 0 . 5 0 . 3 0 . 2 0 . 1 4 0 0 . 2 0 . 2 0 . 4 0 . 4 0 . 2 0 . 2 4 0 0 . 2 0 . 2 0 . 5 0 . 7 0 . 3 0 . 3 4 1 0 . 3 0 . 3 0 . 4 0 . 3 0 . 2 0 . 1 4 3 0 . 4 0 . 6 0 . 6 0 . 5 0 . 3 0 . 2 4 3 0 . 2 0 . 4 0 . 2 0 . 3 0 . 2 0 . 3 6 4 0 . 4 0 . 4 0 . 5 0 . 5 0 . 3 0 . 3 6 4 0 . 2 0 . 2 0 . 4 0 . 2 0 . 2 0 . 2 1 6 0 . 3 0 . 2 0 . 3 * 0 . 2 * 6 0 0 . 1 0 . 4 0 . 2 * 0 . 2 * m e a n 1 S J ) . 0 2 1 0 . 1 0 . 3 1 0 1 0 . 4 1 0 1 0 . 4 1 0 1 0 2 1 0 . 1 0 2 1 0 . 1 T r e a t e d D o g 3 4 1 0 . 1 0 . 2 0 . 3 0 . 4 0 . 2 0 . 2 3 4 1 0 0 . 1 0 . 1 0 . 3 0 . 3 0 . 1 0 . 1 3 4 1 6 0 . 3 0 . 2 0 . 5 0 . 5 0 . 3 0 . 2 3 4 2 4 0 . 2 0 . 2 0 . 2 * 0 . 2 * 3 4 3 0 0 . 5 ' 0 . 2 0 . 4 0 . 4 0 . 2 0 . 3 3 4 4 2 0 . 2 0 . 1 0 . 3 0 . 2 0 . 2 0 . 1 T r e a t e d D o g 6 5 1 0 . 4 0 . 3 0 . 4 0 . 4 0 . 3 0 . 2 6 5 1 0 0 . 2 0 . 2 0 . 3 0 . 4 0 . 2 0 . 1 6 5 1 6 0 . 3 0 . 3 0 . 7 “ 0 . 4 0 . 5 ' 0 . 2 6 5 2 4 0 . 2 0 . 3 0 . 2 * 0 . 2 * 6 5 3 0 0 . 3 0 . 4 0 . 4 0 . 4 0 . 3 0 . 2 6 5 4 2 0 . 1 0 . 1 0 . 3 0 . 2 0 . 2 0 . 3 " V a l u e s e x c e e d m e a n + 2 S D . o f c o n t r o l d o g s . * G a m m a c o u n t e r p r o b l e m ; d a t a w e r e n o t r e t r i e v a b l e . d n u o b 6 9 n a e m 3 8 9 2 0 * - D X ( 1 : 0 . 9 9 9 : n = 6 ) § + O X ( r - O . 9 9 9 : n 8 6 ) 0 I L l O 0 . 4 0 . 8 1 . 2 1 . 6 p l a n t i - D E M . 1 s e r u m F i g u r e 5 . 4 . P h a s e I I S p A s t a n d a r d c u r v e s . p l u s a n d m i n u s D X . f o r t h e e r y t h r o c y t e s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n a s s a y . 3 9 0 P S A I g T a b l e 5 . 1 0 a l i s t s t h e c o r r e l a t i o n c o e f fi c i e n t s a n d s l o p e s f o r t h e S p A d o s e - r e s p o n s e c u r v e s u s i n g p l a s m a c o n t a i n i n g a n t i - [ c a n i n e p l a t e l e t ] a n t i b o d i e s , p l u s a n d m i n u s D X . T h e m e a n s a n d s t a n d a r d d e v i a t i o n s f o r t h e s e c u r v e s a r e g r a p h e d i n F i g u r e 5 . P o s i t i v e c o n t r o l v a l u e s f o r P S A I g G , p l u s a n d m i n u s D X , a r e l i s t e d i n T a b l e 5 . 1 0 b . T h e p o s i t i v e c o n t r o l s w e r e p o s i t i v e w i t h e v e r y a s s a y . P S A I g r e s u l t s f o r d o g s 3 4 , 6 5 , a n d t h e c o n t r o l d o g s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 5 . 1 1 a n d s t r a t i fi e d b y s p e c i fi c d o g n u m b e r . I n c r e a s e d S p A b i n d i n g o c c u r r e d o n d a y 1 6 w i t h p l a t e l e t s f r o m d o g 3 4 , b o t h w i t h ( 1 . 1 % ) a n d w i t h o u t ( 1 . 2 % ) D X . O n t h e s a m e d a t e , a n t i - 7 b i n d i n g w a s i n c r e a s e d w i t h l D X ( 2 . 4 % ) , a n d a n t i - p b i n d i n g w a s i n c r e a s e d w i t h ( 5 . 3 % ) a n d w i t h o u t ( 6 . 3 % ) D X . R e p e a t d e t e r m i n a t i o n s o n d o g 3 4 1 w k l a t e r ( d a y 2 4 ) f a i l e d t o s h o w i n c r e a s e d P S A I g . H o w e v e r , 2 w k l a t e r , i n c r e a s e d S p A b i n d i n g w a s a g a i n o b s e r v e d w i t h ( 1 . 1 % ) a n d w i t h o u t ( 1 . 1 % ) D X . A n t i - p b i n d i n g w a s a l s o i n c r e a s e d w i t h ( 3 . 4 % ) a n d w i t h o u t ( 4 . 3 % ) D X . N o i n c r e a s e s i n P S A I g w e r e d e t e c t e d i n d o g 6 5 t h r o u g h o u t t h e r e c h a l l e n g e p e r i o d . T a b l e 5 . 1 0 a . P h a s e I I c o r r e l a t i o n c o e f fi c i e n t s ( r ) a n d s l o p e s ( m ) o f t h e S p A s t a n d a r d c u r v e s , p l u s a n d m i n u s D X , f o r t h e p l a t e l e t s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n ( P S A I g ) a s s a y . 3 9 1 D X - D X + D a L r m r m 1 0 . 9 9 9 3 0 . 8 0 . 9 9 9 3 1 . 2 1 0 0 . 9 9 9 3 3 . 6 0 . 9 9 8 3 1 . 4 1 6 0 . 9 9 9 3 4 . 7 0 . 9 9 9 3 6 . 7 2 4 0 . 9 9 9 3 5 . 7 0 . 9 9 6 3 7 . 6 3 0 0 . 9 9 8 3 2 . 4 0 . 9 9 8 3 8 . 4 4 2 0 . 9 9 9 3 8 . 3 0 . 9 9 9 3 5 . 1 T a b l e 5 . 1 0 b . P h a s e 1 1 p o s i t i v e c o n t r o l r e s u l t s f o r a n t i - y i n t h e a s s a y f o r P S A I g G , p l u s a n d m i n u s D X ( % b o u n d ) . D X - D X + D a y 0 p l P C 1 . 0 p l P C O p l P C 1 . 0 p l P C 1 0 . 8 2 3 . 4 0 . 9 2 3 . 2 1 0 0 . 8 2 4 . 0 0 . 7 2 1 . 6 1 6 * 1 . 1 4 3 . 4 1 . 0 4 0 . 1 2 4 1 . 1 3 9 . 1 1 . 1 3 8 . 4 3 0 1 . 0 3 6 . 7 1 . 0 3 6 . 1 4 2 1 . 1 3 3 . 0 1 . 1 3 2 . 7 * N e w l a b e l i n g o f a n t i - y a n d a n t i - p ( s a m e l o t n u m b e r s ) . 3 9 2 T a b l e 5 . 1 1 . P h a s e 1 1 r e s u l t s f o r p l a t e l e t s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n i n t r e a t e d a n d c o n t r o l d o g s , p l u s ( + ) a n d m i n u s ( - ) D X ( % b o u n d ) . S p A a n t i - y a n t i - p S u b j e c t D a y - + - + - + C o n t r o l D o g s 5 0 . 3 0 . 3 0 . 5 0 . 4 1 . 1 0 . 7 5 0 . 6 ' 0 . 3 0 . 9 0 . 8 1 . 4 1 . 2 7 0 . 9 0 . 8 0 . 5 0 . 5 2 . 6 2 . 2 4 0 1 . 0 0 . 5 0 . 6 0 . 6 1 . 7 1 . 2 4 0 0 . 7 0 . 8 1 . 1 0 . 8 3 . 0 2 . 6 4 1 0 . 6 0 . 5 0 . 8 0 . 6 2 . 2 1 . 9 4 3 0 . 4 0 . 7 0 . 7 0 . 7 0 . 8 0 . 7 4 3 0 . 2 0 . 5 0 . 6 0 . 8 0 . 6 0 . 8 8 4 0 . 8 0 . 5 1 . 2 1 . 0 2 . 6 2 . 6 8 4 0 . 4 0 . 2 0 . 7 0 . 6 1 . 2 0 . 9 1 6 0 . 4 0 . 4 0 . 7 0 . 6 1 . 3 1 . 1 6 0 0 . 3 0 . 5 1 . 0 1 . 0 1 . 2 1 . 5 m e a n 1 5 . 1 ) . 0 5 1 0 . 2 0 5 1 0 . 2 0 . 8 1 0 1 0 . 8 1 0 1 1 5 1 0 . 8 1 . 4 1 0 . 7 T r e a t e d D o g 3 4 1 0 . 5 0 . 3 0 . 6 0 . 5 2 . 0 1 . 0 3 4 1 0 0 . 6 0 . 4 0 . 5 0 . 5 1 . 6 1 . 4 3 4 1 6 1 1 * 1 . 1 * 1 . 1 2 . 4 * 6 5 * 5 . 3 * 3 4 2 4 0 . 7 0 . 5 0 . 7 0 . 7 1 . 8 1 . 7 3 4 3 0 1 . 1 * 1 . 1 * 0 . 9 0 . 7 4 . 3 * 3 . 4 * 3 4 4 2 0 . 5 0 . 3 0 . 7 0 . 6 2 . 2 1 . 9 T r e a t e d D o g 6 5 1 0 . 8 0 . 4 0 . 4 0 . 5 1 . 8 1 . 0 6 5 1 0 0 . 3 0 . 4 0 . 4 0 . 4 1 . 2 1 . 0 6 5 1 6 0 . 6 0 . 4 0 . 9 0 . 8 3 . 0 2 . 6 6 5 2 4 0 . 4 0 . 6 0 . 6 0 . 6 1 . 8 1 . 9 6 5 3 0 0 . 4 0 . 6 0 . 8 0 . 7 3 . 0 2 . 5 6 5 4 2 0 . 3 0 . 2 0 . 6 0 . 5 1 . 5 1 . 7 * V a l u e s e x c e e d m e a n + 2 S D . o f c o n t r o l d o g s . O 1 d n u o b % n a e m 3 9 3 A + - o x ( 1 : 0 . 9 9 9 : n = 6 ) ‘ 7 . _ § + D X " - 0 . 9 9 9 : m e ) ( : 0 U I 0 3 O l N t n 1 N O l . 3 U " l . 3 O l 0 l l l O 0 . 2 5 0 . 5 0 . 7 5 1 p l p o s i t i v e c o n t r o l p l a s m a F i g u r e 5 . 5 . P h a s e 1 1 m e a n S p A s t a n d a r d c u r v e s . p l u s a n d m i n u s D X . f o r t h e p l a t e l e t s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n a s s a y . 3 9 4 I C s T h e s a m e b l o o d s a m p l e s w e r e u s e d f o r a n a l y s i s o f I C s . T h e c o r r e l a t i o n c o e f fi c i e n t s a n d s l o p e s f o r t h e S p A d o s e - r e s p o n s e c u r v e s u s i n g H A I g G a r e l i s t e d i n T a b l e 5 . 1 2 a . T h e m e a n s a n d s t a n d a r d d e v i a t i o n s f o r t h e s e c u r v e s a r e g r a p h e d i n F i g u r e 6 . T a b l e 5 . 1 2 b l i s t s t h e r e s u l t s f o r t h e p o s i t i v e c o n t r o l s u s i n g a n t i - 1 y , a n d T a b l e 5 . 1 2 c l i s t s t h o s e o b t a i n e d w i t h a n t i - p . T h e p o s i t i v e c o n t r o l s w e r e p o s i t i v e w i t h e v e r y a s s a y . C l q r e s u l t s f o r d o g s 3 4 , 6 5 , a n d t h e c o n t r o l d o g s a r e l i s t e d i n T a b l e 5 . 1 3 . T h e d a t a a r e o r g a n i z e d b y s p e c i fi c d o g n u m b e r . I n c r e a s e d S p A b i n d i n g w a s p r e s e n t o n d a y 1 6 f o r d o g 6 5 ( 2 . 3 % ) . A l l o t h e r v a l u e s w e r e w i t h i n 2 s t a n d a r d d e v i a t i o n s o f t h e c o n t r o l g r o u p . 3 9 5 T a b l e 5 . 1 2 a . P h a s e H c o r r e l a t i o n c o e f fi c i e n t s ( r ) a n d s l o p e s ( m ) o f t h e S p A s t a n d a r d c u r v e s f o r t h e C l q a s s a y . D a v r m 1 0 . 9 9 5 1 0 . 2 1 0 0 . 9 9 9 1 0 . 4 1 6 0 . 9 9 8 1 3 . 1 2 4 0 . 9 9 8 9 . 4 3 0 0 . 9 9 4 1 7 . 6 4 2 0 . 9 8 8 1 6 . 3 T a b l e 5 . 1 2 b . P h a s e H p o s i t i v e c o n t r o l r e s u l t s ( % b o u n d ) f o r C l q - b i n d a b l e I g G u s i n g h e a t - a g g r e g a t e d I g G . D a y 0 p g H A I g G 2 . 0 p g H A I g G 1 0 . 2 7 . 6 1 0 0 . 2 8 . 6 1 6 * 0 . 3 1 8 . 4 2 4 0 . 3 1 4 . 0 3 0 0 . 4 1 3 . 7 4 2 0 . 3 1 2 . 1 T a b l e 5 . 1 2 c . P h a s e H p o s i t i v e c o n t r o l r e s u l t s ( % b o u n d ) f o r C l q - b i n d a b l e I g M u s i n g h e a t - a g g r e g a t e d I g M . D a v 0 p g H A I g M 1 . 0 p g H A I g M 1 0 . 3 4 . 6 1 0 0 . 3 4 . 9 1 6 * 0 . 6 9 . 2 2 4 0 . 6 5 . 1 3 0 0 . 4 5 . 5 4 2 0 . 4 6 . 6 * N e w l a b e l i n g o f a n t i - y a n d a n t i - p ( s a m e l o t n u m b e r s ) 3 9 6 T a b l e 5 . 1 3 . P h a s e H r e s u l t s f o r C l q - b i n d a b l e i m m u n e c o m p l e x e s i n t r e a t e d a n d c o n t r o l d o g s ( % b o u n d ) . S p A a n t i - y a n t i - p S u b j e c t D a y 0 . 2 p l 1 . 0 p l 0 2 4 ) . ] 1 . 0 g 0 . 2 p l 1 . 0 p l C o n t r o l D o g s 5 0 . 7 1 . 5 0 . 4 1 . 2 0 . 7 1 . 8 5 1 . 6 2 . 2 1 . 4 4 . 0 1 . 5 3 . 7 7 0 . 9 2 . 7 0 . 6 1 . 5 1 . 0 2 . 9 4 0 0 . 8 1 . 6 0 . 4 1 . 1 0 . 8 2 . 1 4 0 1 . 3 2 . 2 1 . 2 3 . 3 1 . 9 4 . 7 4 1 0 . 8 1 . 7 0 . 4 0 . 8 0 . 9 2 . 3 1 6 1 . 8 3 . 8 1 . 0 2 . 8 1 . 4 3 . 4 6 0 1 . 3 4 . 0 0 . 9 2 . 4 2 . 2 4 . 8 4 3 0 . 9 2 . 4 1 . 4 3 . 9 1 . 1 2 . 6 4 3 1 . 0 2 . 8 1 . 0 2 . 9 1 . 2 3 . 0 8 4 1 . 1 3 . 0 1 . 1 3 . 0 1 . 4 3 . 4 8 4 1 . 2 3 . 0 0 . 8 2 . 5 1 . 6 3 . 3 m e a n : 1 : 8 . 1 ) . 1 . 1 1 0 5 2 5 1 0 . 8 0 5 1 0 . 4 2 . 4 1 1 . 1 1 5 1 0 . 4 3 1 1 0 . 9 T r e a t e d D o g 3 4 1 0 . 7 1 . 8 0 . 3 0 . 9 0 . 8 2 . 0 3 4 1 0 1 . 0 1 . 8 0 . 3 0 . 9 0 . 9 2 . 2 3 4 1 6 1 . 5 2 . 0 1 . 0 2 . 5 1 . 6 4 . 1 3 4 2 4 1 . 4 4 . 0 1 . 1 3 . 0 1 . 7 3 . 8 3 4 3 0 0 . 9 2 . 2 1 . 0 2 . 4 1 . 2 3 . 0 3 4 4 2 1 . 0 2 . 9 0 . 6 1 . 9 1 . 3 3 . 3 T r e a t e d D o g 6 5 1 0 . 8 1 . 4 0 . 4 0 . 9 0 . 8 2 . 0 6 5 1 0 0 . 9 1 . 6 0 . 3 0 . 8 0 . 8 2 . 3 6 5 1 6 2 5 * 2 . 1 0 . 9 2 . 5 1 . 8 4 . 7 6 5 2 4 1 . 3 3 . 4 1 . 0 2 . 7 1 . 7 3 . 9 6 5 3 0 0 . 6 1 . 3 0 . 8 1 . 9 1 . 1 2 . 8 6 5 4 2 0 . 8 1 . 6 0 . 7 1 . 6 1 . 0 2 . 4 * V a l u e e x c e e d s m e a n + 2 S D . o f c o n t r o l d o g s . d n u o b 6 9 n a e m 2 0 * r = 0 . 9 9 7 : n = 6 1 5 * - l 1 0 _ . 2 5 — 0 : " L 4 1 O 0 . 2 5 0 . 5 0 . 7 5 1 p l h e a t a g g r e g a t e d I g G F i g u r e 5 . 6 . P h a s e I I S p A s t a n d a r d c u r v e f o r t h e C l q a s s a ’ f o r i m m u n e c o m p l e x e s . ‘ 3 9 8 D i s c u s s i o n T h e s t r o n g i n i t i a l p o s i t i v e r e s u l t s f o r P S A I g i n d o g s 3 4 ( 1 6 . 9 % ) a n d 6 5 ( 4 4 . 8 % ) ( r e f e r e n c e m e a n 1 S D . = 3 . 0 i 1 . 6 ) s u g g e s t e d t h a t a t t h a t t i m e o f t h r o m b o c y t o p e n i a a n d e x p o s u r e t o D X , P S A I g m a y h a v e c a u s e d o r c o n t r i b u t e d t o t h e t h r o m b o c y t o p e n i a s . I t i s a l s o p o s s i b l e t h a t s a m p l e s h i p m e n t c a u s e d i n c r e a s e s i n n o n s p e c i fi c P S A I g i n t h e a f f e c t e d d o g s b u t n o t i n t h e c o n t r o l s . H o w e v e r , t h i s p o s s i b i l i t y l a c k s a c l e a r e x p l a n a t i o n . T h e c u m u l a t i v e r e s u l t s o f t h e p h a s e I s t u d i e s i n d i c a t e d t h a t d o g 1 9 , w h o w a s i n t h e m e d i u m - h i g h d o s e g r o u p , d i d h a v e i n c r e a s e d P S A I g a n d i n c r e a s e d c i r c u l a t i n g C l q - b i n d a b l e i m m u n o g l o b u l i n s . S a m p l e s f r o m d o g 1 9 o n i n i t i a l t e s t i n g h a d i n c r e a s e d P S A I g i n t h e a b s e n c e o f D X a s d e t e c t e d b y S p A , a n t i - y , a n d a n t i - p ; P S A I g w a s a l s o e l e v a t e d i n t h e p r e s e n c e o f D X a s d e t e c t e d b y a n t i - 7 a n d a n t i - p . O n r e c h e c k o f d o g 1 9 o n e w e e k l a t e r , P S A I g w a s s t i l l i n c r e a s e d w i t h a l l 3 d e t e c t o r s i n t h e a b s e n c e o f D X ; i t w a s a l s o i n c r e a s e d i n t h e p r e s e n c e o f D X u s i n g S p A a n d a n t i - p . O n b o t h d a t e s , i n c r e a s e d C l q - b i n d a b l e i m m u n e c o m p l e x e s w e r e a l s o d e t e c t e d . L a t e r , a t n e c r o p s y , t h e b o n e m a r r o w o f t h i s d o g w a s r e m a r k a b l e b e c a u s e i t w a s h y p e r c e l l u l a r a n d s i m i l a r t o t h o s e o f d o g s 3 4 a n d 6 5 o n i n i t i a l e v a l u a t i o n . T h e d o g a l s o h a d n o t a b l e s p l e n i c h e m a t o p o i e s i s . T h i s i n d i c a t e d t h a t h e m a t o p o i e t i c s t i m u l a t i o n w a s o c c u r r i n g i n t h e p r e s e n c e o f m i l d l y i n c r e a s e d P S A I g a n d c i r c u l a t i n g I C s . T h i s s u g g e s t s t h a t h u m o r a l i m m u n o g l o b u l i n s m a y h a v e c o n t r i b u t e d t o t h e D X - a s s o c i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g 1 9 . H o w e v e r , i n h u m a n p a t i e n t s w i t h r e g e n e r a t i v e t h r o m b o c y t o p e n i a s , m i l d i n c r e a s e s i n P S A I g m a y b e d e t e c t a b l e w h e n i m m u n o l o g i c a l c o n t r i b u t i o n s a r e p r e s u m e d t o b e a b s e n t . 3 P h a s e I s t u d i e s a l s o i d e n t i fi e d o t h e r d o g s w i t h m i l d l y e l e v a t e d r e s u l t s , b u t t h e s e i n c r e a s e s d i d n o t f o r m a c o n s i s t e n t p a t t e r n a s t h e y d i d f o r d o g 1 9 . I t i s t h e r e f o r e l i k e l y 3 9 9 t h a t t h e s e r e s u l t s w e r e n o t b i o l o g i c a l l y s i g n i fi c a n t . T h e o v e r a l l c o n c l u s i o n f r o m t h e p h a s e I s t u d i e s w a s t h a t t h e a d m i n i s t r a t i o n o f h i g h d o s e s o f D X w a s n o t a s s o c i a t e d w i t h a n t i b o d y - m e d i a t e d d e s t r u c t i o n o f R B C s o r p l a t e l e t s o r w i t h t h e f o r m a t i o n o f C l q - b i n d a b l e i m m u n o g l o b u l i n s i n m o s t d o g s . I n t h e p h a s e H s t u d i e s , d o g s 3 4 a n d 6 5 w e r e r e c h a l l e n g e d w i t h D X . W h i l e t h e y s h o w e d c l i n i c a l s i g n s o f t o x i c i t y q u i t e r a p i d l y , n e i t h e r d o g r a p i d l y d e v e l o p e d t h r o m b o c y - t o p e n i a a s w o u l d b e e x p e c t e d f r o m a n a n a m n e s t i c i m m u n e r e s p o n s e . I n s t e a d , e a c h d e v e l o p e d a s l o w l y p r o g r e s s i v e t h r o m b o c y t o p e n i a w i t h n a d i r s o f a b o u t 5 0 - 1 0 0 , 0 0 0 / p l a f t e r 2 4 w k o f d o s i n g . T h e t h r o m b o c y t o p e n i a o f d o g 3 4 r e s o l v e d s p o n t a n e o u s l y i n t h e f a c e o f c o n t i n u e d D X a d m i n i s t r a t i o n . T h i s w a s a l s o n o t t y p i c a l o f a d r u g - i n d u c e d i m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a . W h i l e m i l d i n c r e a s e s i n P S A I g w e r e p r e s e n t f o r d o g 3 4 o n d a y s 1 6 a n d 3 0 , t h e y w e r e n o t d e t e c t e d o n d a y 2 4 . C e r t a i n l y , r e c h a l l e n g e o f t h e s e d o g s w i t h D X d i d n o t p r o d u c e a s t r o n g i m m u n e r e s p o n s e w i t h t h e f o r m a t i o n o f a n t i b o d i e s t o R B C s o r p l a t e l e t s , o r w i t h t h e f o r m a t i o n o f C l q - b i n d a b l e i m m u n e c o m p l e x e s . H u m o r a l i m m u n e m e c h a n i s m s t h e r e f o r e d i d n o t s e e m t o c o n t r i b u t e t o t h e n o t e d c l i n i c a l t o x i c i t y . T a k e n t o g e t h e r , t h e d a t a f r o m t h e i n i t i a l s t u d i e s a s w e l l a s f r o m p h a s e I a n d p h a s e I I s t u d i e s s u g g e s t e d t h a t t h e s p o r a d i c c y t o p e n i a s w i t h i n c r e a s e d m a r r o w c e l l u l a r i t y t h a t o c c u r r e d i n D X - t r e a t e d d o g s w e r e n o t p r i n c i p a l l y m e d i a t e d b y h u m o r a l i m m u n i t y . S o m e o f t h e d a t a s u g g e s t e d t h e p r e s e n c e o f i n c r e a s e d a n t i b o d i e s , b u t t h e d a t a v i e w e d a s a w h o l e s t r o n g l y a r g u e f o r a n a l t e r n a t i v e p a t h o g e n i c m e c h a n i s m . W i t h t h e m e t h o d s u s e d , w e c a n n o t e x c l u d e t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e c y t o p e n i a s w e r e d u e t o a n i r m n u n e r e s p o n s e t o a D X m e t a b o l i t e t h a t b e c a m e a s s o c i a t e d w i t h t h e c e l l s . 4 H o w e v e r , t h e l a c k o f a n 4 0 0 a n a m n e s t i c r e s p o n s e a n d t h e r e v e r s i b i l i t y o f t h e c y t o p e n i a s w h i l e s t i l l r e c e i v i n g D X a r g u e a g a i n s t a n i m m u n o l o g i c a l m e c h a n i s m i f t h e i n i t i a l a n d l a t e r d r u g f o r m u l a t i o n s w e r e i n d e e d i d e n t i c a l . A d d i t i o n a l p o s s i b i l i t i e s i n c l u d e i n t e r f e r e n c e w i t h c e l l m a t u r a t i o n a k i n t o t h a t p r o d u c e d b y d e fi c i e n c i e s o f v i t a m i n B 1 2 a n d / o r f o l a t e i n h u m a n p a t i e n t s . 5 T h e c o m b i n a t i o n o f m a r r o w h y p e r c e l l u l a r i t y w i t h p a n c y t o p e n i a , a s o c c u r r e d i n s o m e d o g s , i s a l s o s i m i l a r t o a m y e l o d y s p l a s t i c p r o c e s s . 5 D X m a y a l s o h a v e i n t e r f e r e d w i t h s o m e m a t u r a t i o n o r r e g u l a t i o n m e c h a n i s m t h a t w a s n o t a s s e s s e d b y t h e s e s t u d i e s . 4 0 1 R e f e r e n c e s C u r t i s B R , M c F a r l a n d J G , W u G , V i s e n t i n G P , A s t e r R H : A n t i b o d i e s i n s u l f o n a m i d e - i n d u c e d i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a r e c o g n i z e c a l c i u m — d e p e n d e n t e p i t o p e s o n t h e g l y c o p r o t e i n H b / H I a c o m p l e x . B l o o d 8 4 : 1 7 6 , 1 9 9 4 F r a k e r P J , S p e c k J C J : P r o t e i n a n d c e l l m e m b r a n e i o d i n a t i o n s w i t h a s p a r i n g l y ' s o l u b l e c h l o r o a m i d e , 1 , 3 , 4 , 6 - t e t r a c h l o r o - 3 a , 6 a — d i p h e n y l g l y c o l u r i l . B i o c h e m B i o p h y s R e s C o m m u n 8 0 : 8 4 9 , 1 9 7 8 G e o r g e J N : P l a t e l e t i m m u n o g l o b u l i n G : I t s s i g n i fi c a n c e f o r t h e e v a l u a t i o n o f t h r o m b o c y t o p e n i a a n d f o r u n d e r s t a n d i n g t h e o r i g i n o f a - g r a n u l e p r o t e i n s . B l o o d 7 6 : 8 5 9 , 1 9 9 0 K i e f e l V , S a n t o s o S , S c h m i d t S , S a l a m a A , M u e l l e r - E c k h a r d t C : M e t a b o l i t e - s p e c i fi c ( I g G ) a n d d r u g - s p e c i fi c a n t i b o d i e s ( I g G , I g M ) i n t w o c a s e s o f t r i - m e t h o p r i m - s u l f a m e t h o x a z o l e - i n d u c e d i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a . T r a n s f u s i o n 2 7 : 2 6 2 , 1 9 8 7 W i l l i a m s W J , B u e t l e r E , E r s l e v A J , L i c h t r n a n M A , e d s : H e m a t o l o g y ( 4 t h e d ) . N e w Y o r k , M c G r a w - H i l l , 1 9 9 0 S U M M A R Y A N D C O N C L U S I O N S T h r o m b o c y t o p e n i a c o m m o n l y o c c u r s i n d o g s , a n d i t h a s o f t e n b e e n c o n s i d e r e d i m m u n e - m e d i a t e d w h e n o t h e r c a u s e s h a v e b e e n o s t e n s i b l y e x c l u d e d . I n p e o p l e , i m m u n e — m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a ( I M T ) m a y b e a p r i m a r y e n t i t y w i t h o u t a n y a p p a r e n t d i s e a s e a s s o c i a t i o n s , o r i t m a y o c c u r s e c o n d a r y t o s y s t e m i c i m m u n e - m e d i a t e d d i s e a s e s , i n f e c t i o n s , n e o p l a s i a , a n d d r u g e x p o s u r e s . C o n t r i b u t i o n s o f i m m u n e - m e d i a t e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n t o c a n i n e t h r o m b o c y t o p e n i c c o n d i t i o n s a r e o f t e n s u s p e c t e d b u t r a r e l y p r o v e n . T h i s i s d u e t o t h e l a c k o f r e l i a b l e a s s a y s f o r p l a t e l e t s u r f a c e - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n s ( P S A I g ) , a n d t o a g e n e r a l l a c k o f u n d e r s t a n d i n g a b o u t t h e i n t e r a c t i o n s o f c a n i n e p l a t e l e t s w i t h i m m u n o g l o b u l i n s . T o i n v e s t i g a t e t h e r o l e o f h u m o r a l i m m u n i t y i n c a n i n e t h r o m b o c y t o p e n i c d i s e a s e s , a r e l i a b l e a s s a y f o r P S A I g fi r s t h a d t o b e d e v e 1 0 p e d . A s e n s i t i v e a n d r e p r o d u c i b l e i m m u n o r a d i o m e t r i c a s s a y f o r d e t e c t i n g c a n i n e P S A I g a n d p l a t e l e t - b i n d a b l e i m m u n o g l o b u - l i n ( P B I g ) c i r c u l a t i n g i n p a t i e n t p l a s m a i s d e s r i b e d i n c h a p t e r t w o o f t h i s d i s s e r t a t i o n . P l a t e l e t r e a c t i v e a u t o a n t i b o d i e s , a l l o a n t i b o d i e s , a n d x e n o g e n e i c a n t i b o d i e s w e r e r e p r o d u c i b l y d e t e c t e d i n a d o s e - r e s p o n s e f a s h i o n w i t h 1 2 5 I - l a b e l e d s t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n A ( S p A ) . R a d i o l a b e l e d a n t i b o d i e s t o c a n i n e I g G ( y ) a n d I g M ( p ) w e r e u s e d i n c o n j u n c t i o n w i t h S p A t o d e fi n e t h e c l a s s o f p l a t e l e t - r e a c t i v e a n t i b o d i e s a n d t o d e t e c t S p A - n o n b i n d a b l e i m m u n o g l o b u l i n s . U n l i k e o t h e r a s s a y s t o d a t e , a n a u t o a n t i b o d y f r o m a d o g w i t h c l i n i c a l 4 0 2 4 0 3 I M T w a s u s e d a s t h e p o s i t i v e c o n t r o l f o r t h e a s s a y . A g l u t a r a l d e h y d e fi x a t i o n p r o c e d u r e w a s d e v e l o p e d t o p r o v i d e a s o u r c e o f p l a t e l e t s w i t h c o n s i s t e n t r e a c t i v i t y t o t h e p o s i t i v e c o n t r o l p l a s m a a n d o t h e r a n t i b o d i e s . I n t h e c o u r s e o f t e s t i n g t h i s a s s a y o n k n o w n p o s i t i v e p l a s m a s a m p l e s a n d o n c l i n i c a l s a m p l e s f r o m t h r o m b o c y t o p e n i c d o g s , i t b e c a m e e v i d e n t t h a t c o n s i s t e n t s a m p l e m a n a g e m e n t w a s c r i t i c a l f o r o b t a i n i n g r e p r o d u c i b l e r e s u l t s . I n s h o r t , t h e e x p o s u r e o f b l o o d s a m p l e s t o 4 ° C o r r o o m t e m p e r a t u r e ( R T ) l e d t o p r o g r e s s i v e i n c r e a s e s i n P S A I g w h i c h c o u l d m a k e s o m e n o r m a l s a m p l e s a p p e a r p o s i t i v e w i t h i n h o u r s . T h e s t o r a g e o f i s o l a t e d p l a s m a a t 4 ° C o r R T a l s o l e d t o p r o g r e s s i v e a n d d r a m a t i c i n c r e a s e s i n P B I g , m o s t l y I g M . F a l s e p o s i t i v e r e s u l t s d u e t o t h i s n o n s p e c i fi c P S A I g a n d P B I g , m o s t l y I g M , w e r e a v o i d e d b y u s i n g f r e s h 3 7 ° C b l o o d s a m p l e s a n d 3 7 ° C p l a s m a i n c u b a t i o n t e m p e r a t u r e s . C l i n i c a l l y , t h e a s s a y a p p e a r e d t o b e u s e f u l f o r d i f f e r e n t i a t i n g d o g s w i t h I M T f r o m d o g s w i t h n o n i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a . O f 2 4 d o g s g i v e n a d i a g n o s i s o f I M T , r e s u l t s f o r P S A I g ( u s u a l l y . I g G ) w e r e p o s i t i v e i n 2 3 . O f t h e o t h e r 1 9 t h r o m b o c y t o p e n i c d o g s t e s t e d , 5 h a d i n c r e a s e s i n P S A I g t h a t w e r e c o n s i d e r e d c l i n i c a l l y s i g n i fi c a n t , a n d i t i s l i k e l y t h a t i m m u n e - m e d i a t e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n p l a y e d a p r i n c i p a l r o l e i n t h e p a t h o g e n e s i s o f t h r o m b o c y t o p e n i a f o r 4 o f t h e s e d o g s . R e s u l t s u s i n g S p A i n t h i s a s s a y a n d i n o t h e r p r o c e d u r e s l e d t o t h e s u s p i c i o n t h a t , c o n t r a r y t o r e c e n t r e p o r t s , S p A d i d n o t b i n d a l l o f c a n i n e I g G a n d I g M . E x p e r i m e n t s w e r e d e s i g n e d t o i n v e s t i g a t e t h i s p o s s i b i l i t y a n d t o p r o v i d e a n e s t i m a t e o f t h e p e r c e n t a g e o f c a n i n e I g G a n d I g M t h a t d o b i n d t o C o w a n I s t r a i n S p A . A p p r o x i m a t e l y 2 0 % o f c a n i n e I g G a n d 3 3 % o f c a n i n e I g M d i d n o t b i n d t o S p A u n d e r c o n d i t i o n s o f l i q u i d 4 0 4 a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y o r t o 1 2 5 ’ I - S p A u s i n g a n i m m u n o r a d i o m e t r i c a s s a y s i m i l a r t o t h e o n e f o r P S A I g . T h i s i n c o m p l e t e r e a c t i v i t y p r e v e n t s p r e c i s e q u a n t i t a t i o n o f P S A I g w i t h S p A , b u t q u a l i t a t i v e r e s u l t s m a y b e a f f e c t e d l i t t l e i f p l a t e l e t - r e a c t i v e a n t i b o d i e s i n d o g s w i t h c l i n i c a l I M T a r e g e n e r a l l y p o l y c l o n a l i n n a t u r e . W h i l e t h e d e s c r i b e d a s s a y w a s a c r i t i c a l s t e p i n b e i n g a b l e t o e x p l o r e c a n i n e I M T , o t h e r b a s i c i n f o r m a t i o n a b o u t c a n i n e p l a t e l e t s w a s e s s e n t i a l . I n h u m a n b e i n g s , i m m u n o g l o b u l i n s m a y b i n d t o p l a t e l e t s b y t h e p l a t e l e t F e y r e c e p t o r f o r I g G . T h i s F c r e c e p t o r i s i m p o r t a n t i n s o m e d r u g — i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a s s u c h a s h e p a r i n - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a , a n d i t c a n m e d i a t e a s i g n a l t o t h e c e l l i n t e r i o r r e s u l t i n g i n p l a t e l e t a c t i v a t i o n . T o a s s e s s c a n i n e p l a t e l e t s f o r a f u n c t i o n a l F e y r e c e p t o r a n a l o g o u s t o t h a t o f h u m a n p l a t e l e t s , t h e r e s p o n s e s o f h u m a n a n d c a n i n e p l a t e l e t s t o h e a t - a g g r e g a t e d I g G ( H A I g G ) w e r e c o m p a r e d i n a p l a t e l e t a g g r e g o m e t e r ( c h a p t e r 3 ) . C a n i n e a n d h u m a n H A I g G c a u s e d F c - m e d i a t e d a g g r e g a t i o n o f h u m a n g e l - fi l t e r e d p l a t e l e t s ( G F P ) t h a t w a s b l o c k e d b y t h e a n t i - F c ' y R H m o n o c l o n a l a n t i b o d y I V . 3 . I n c o n t r a s t , c a n i n e G F P w e r e u n r e s p o n s i v e t o H A I g G . D o g s t h e r e f o r e l a c k a f u n c t i o n a l a n a l o g u e o f t h e h u m a n F c y r e c e p t o r . H o w e v e r , i n p l a t e l e t - r i c h p l a s m a a n d w h o l e b l o o d , H A I g G i n d u c e d d e l a y e d a n d s u b m a x i m a l c l u m p i n g o f c a n i n e p l a t e l e t s . T h i s s u g g e s t e d t h e p o s s i b i l i t y t h a t i m m u n e c o m p l e x e s m a y a f f e c t c a n i n e p l a t e l e t s i n v i v o , d e s p i t e t h e l a c k o f a f u n c t i o n a l p l a t e l e t F c ' y r e c e p t o r . S t u d i e s w e r e u n d e r t a k e n t o i n v e s t i g a t e t h e m e c h a n i s m o f t h i s p o t e n t i a l l y i m p o r t a n t e f f e c t o f i m m u n o g l o b u l i n s o n c a n i n e p l a t e l e t s . I n c h a p t e r t h r e e i s r e p o r t e d t h e s e r i e s o f . s t u d i e s t h a t i d e n t i fi e d c o m p l e m e n t a s t h e e s s e n t i a l p l a s m a c o f a c t o r f o r 4 0 5 H A I g G - i n d u c e d p l a t e l e t c l u m p i n g . C o m p l e m e n t p r o t e i n C 3 w a s s h o w n t o b e s p e c i fi c a l l y r e q u i r e d b y t h e f a i l u r e o f c a n i n e p l a s m a n a t u r a l l y d e fi c i e n t i n C 3 t o s u p p o r t c l u m p i n g . T h e m e c h a n i s m o f H A I g G — i n d u c e d p l a t e l e t c l u m p i n g w a s f u r t h e r e x p l o r e d t h r o u g h t h e u s e o f e l e c t r o n m i c r o s c o p y a n d p l a t e l e t a g g r e g o m e t r y w i t h p l a t e l e t m e t a b o l i c i n h i b i t o r s ( c h a p t e r 4 ) . I n s u m m a r y , H A I g G a c t i v a t e s c a n i n e c o m p l e m e n t l e a d i n g t o t h e b i n d i n g o f C 3 t o t h e F a b p o r t i o n o f H A I g G a n d t o a n a p p a r e n t p l a t e l e t C 3 r e c e p t o r ( p r e s u m a b l y a C 3 b r e c e p t o r ) . I n t h i s w a y , t h e p l a t e l e t s a r e p a s s i v e l y h e l d t o g e t h e r b y i n t e r p l a t e l e t b r i d g e s o f C 3 - H A I g G . T h i s p h e n o m e n o n , k n o w n a s i m m u n e a d h e r e n c e , m a y b e i m p o r t a n t i n b i n d i n g i m m u n o g l o b u l i n s t o c a n i n e p l a t e l e t s i n v i v o a n d i n m e d i a t i n g t h r o m b o c y t o p e n i a . I t m a y b e s i g n i fi c a n t t h a t H A I g G - i n d u c e d a g g l u t i n a t i o n s o m e t i m e s p r o g r e s s e d t o a c t i v e a g g r e g a t i o n . T h i s s u g g e s t s t h e p o s s i b i l i t y o f s i g n a l t r a n s d u c t i o n t h r o u g h a p l a t e l e t C 3 r e c e p t o r . I t i s p o s s i b l e t h a t t h e p r e s u m e d c a n i n e p l a t e l e t C 3 b r e c e p t o r m a y p l a y a r o l e i n i m m u n e c o m p l e x t h r o m b o c y t o p e n i a s t h a t i n p e O p l e a r e m e d i a t e d b y p l a t e l e t F c r e c e p t o r s . I n t h e fi f t h c h a p t e r o f t h i s d i s s e r t a t i o n , t h e a s s a y f o r P S A I g w a s a p p l i e d t o a t o x i c o l o g i c s t u d y o f a p r o p r i e t a r y d r u g t o h e l p e x p l a i n t h e c a u s e o f t h r o m b o c y t o p e n i a o c c u r r i n g i n s o m e t e s t d o g s . W h i l e t h e r e s u l t s o f t h i s s t u d y s u g g e s t e d t h a t i m m u n e m e c h a n i s m s w e r e n o t o f p r i n c i p a l i m p o r t a n c e , t h e s t u d i e s d e m o n s t r a t e t h e p o t e n t i a l f o r u s e o f t h e d e v e l o p e d a s s a y i n t o x i c o l o g i c s t u d i e s . T h i s a s s a y c a n b e u s e d s i m i l a r l y i n o t h e r t o x i c o l o g i c i n v e s t i g a t i o n s a n d f o r c l i n i c a l c a s e s o f s u s p e c t e d d r u g - i n d u c e d I M T i n d o g s . T o g e t h e r , t h e s t u d i e s d e s c r i b e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n h a v e p r o v i d e d e s s e n t i a l g r o u n d w o r k f o r f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n s o f c a n i n e I M T . W i t h a r e l i a b l e a s s a y f o r P S A I g , 4 0 6 t h e c o n t r i b u t i o n o f h u m o r a l i m m u n i t y t o a n y c a n i n e t h r o m b o c y t o p e n i c c o n d i t i o n o f i n t e r e s t c a n n o w b e a s s e s s e d . T h i s i n c l u d e s s t u d i e s o f a u t o i m m u n i t y a n d a l l o i m m u n i t y , a s w e l l a s i n v e s t i g a t i o n s o f i n f e c t i o u s , n e o p l a s t i c , a n d d r u g - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a . T h e a s s a y c a n a l s o b e u s e d e x p e r i m e n t a l l y t o b e t t e r d e fi n e a n d c h a r a c t e r i z e c a n i n e p l a t e l e t / i m m u n o g l o b u l i n i n t e r a c t i o n s . T h e d e s c r i b e d s t u d i e s h a v e a l s o g e n e r a t e d m a n y n e w q u e s t i o n s a n d t h e n e e d f o r m o r e r e s e a r c h . F u r t h e r w o r k i s n e c e s s a r y t o e x p l o r e t h e i m p o r t a n c e o f i m m u n e a d h e r e n c e i n i n f e c t i o u s , n e o p l a s t i c , a n d d r u g - i n d u c e d c a n i n e t h r o m b o c y t o p e n i a s . T h e p r e s e n c e o f a c a n i n e p l a t e l e t C 3 r e c e p t o r s h o u l d b e v e r i fi e d b y i t s d i r e c t i d e n t i fi c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n . I n v i t r o s t u d i e s s i m i l a r t o t h o s e r e p o r t e d h e r e w i t h H A I g G s h o u l d b e r e p e a t e d w i t h m o r e p h y s i o l o g i c i m m u n e c o m p l e x e s , a n d s t u d i e s s h o u l d b e d e s i g n e d t o a s s e s s t h e e f f e c t s o f i m m u n e c o m p l e x e s o n c a n i n e p l a t e l e t s i n v i v o . W h e t h e r o r n o t i m m u n e a d h e r e d i m m u n o g l o b u l i n i s d e t e c t e d a s P S A I g m u s t a l s o b e d e t e r m i n e d , a s t h i s h a s g r e a t r e l e v a n c e f o r i n t e r p r e t i n g t h e m e a n i n g o f p o s i t i v e a s s a y r e s u l t s . T h e s e a r e b u t a f e w o f t h e m a j o r p a t h s l e a d i n g f r o m t h i s w o r k . B I B L I O G R A P H Y : 2 B I B L I O G R A P H Y A b r a m s - O g g A C G , K r u t h S A , C a r t e r R F , D i c k J E , V a l l i V E O , K a m e l - R e i d S , D u b é I D : C l i n i c a l a n d p a t h o l o g i c a l fi n d i n g s i n d o g s f o l l o w i n g s u p r a l e t h a l t o t a l b o d y i r r a d i a t i o n w i t h a n d w i t h o u t i n f u s i o n o f a u t o l o g o u s l o n g - t e r m m a r r o w c u l t u r e c e l l s . C a n J V e t R e s 5 7 : 7 9 , 1 9 9 2 A b r a m s - O g g A C G , K r u t h S A , C a r t e r R F , V a l l i V E , K a m e l - R e i d S , D u b é I D : P r e p a r a t i o n a n d t r a n s f u s i o n o f c a n i n e p l a t e l e t c o n c e n t r a t e s . A m J V e t R e s 5 4 : 6 3 5 , 1 9 9 3 A l a r c o n — S e g o v i a D , R u i z - A r g u e l l e s A , F i s h b e i n E : A n t i b o d y p e n e t r a t i o n i n t o l i v i n g c e l l s . I . I n t r a n u c l e a r i m m u n o g l o b u l i n i n p e r i p h e r a l b l o o d m o n o n u c l e a r c e l l s i n m i x e d c o n n e c t i v e t i s s u e d i s e a s e a n d s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s . C l i n E x p I m m u n o l 3 5 : 3 6 4 , 1 9 7 9 A n d e r s o n G P , A n d e r s o n C L : S i g n a l t r a n s d u c t i o n b y t h e p l a t e l e t F c r e c e p t o r . B l o o d 7 6 : 1 1 6 5 , 1 9 9 0 . A n z i a n i O S , E w i n g S A , B a r k e r R W : E x p e r i m e n t a l t r a n s m i s s i o n o f a g r a n u l o c y t i c f o r m o f t h e t r i b e E h r l i c h i e a e b y D e r m a c e n t o r v a r i a b i l i s a n d A m b l y o m m a a m e r i c a n u m t o d o g s . A m J V e t R e s 5 1 : 9 2 9 , 1 9 9 0 A p i t z - C a s t r o R , L e d e z m a E , E s c a l a n t e J , J o r q u e r a A , P i n a t e F M , M o r e n o - R e a J , C a r r i l l o G , L e e ] 0 , J a i n M K : R e v e r s i b l e p r e v e n t i o n o f p l a t e l e t a c t i v a t i o n b y ( E , Z ) - 4 , 5 , 9 - t r i t h i a d o d e c a - 1 , 6 , 1 1 - t r i e n e 9 - o x i d e ( a j o e n e ) i n d o g s u n d e r e x t r a c o r p o r e a l c i r c u l a t i o n . A r z n e i m i t t e l f o r s c h u n g 3 8 : 9 0 1 , 1 9 8 8 A r a n d a E , P i z a r r o M , P e r e i r a J , M e z z a n o D : A c c u m u l a t i o n o f 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e b y a g i n g p l a t e l e t s : S t u d i e s i n a m o d e l o f s u p p r e s s e d t h r o m b o p o i e s i s i n d o g s . T h r o m b H a e m o s t 7 1 : 4 8 8 , 1 9 9 4 A m o t t J , H o r s e w o o d P , K e l t o n J G : M e a s u r e m e n t o f p l a t e l e t - a s s o c i a t e d I g G i n a n i m a l m o d e l s o f i m m u n e a n d n o n i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a . B l o o d 6 9 : 1 2 9 4 , 1 9 8 7 A s c h A S , A d e l m a n B , F u j i r n o t o M , N a c h m a n R L : I d e n t i fi c a t i o n a n d i s o l a t i o n o f a p l a t e l e t G P I b - l i k e p r o t e i n i n h u m a n u m b i l i c a l v e i n e n d o t h e l i a l c e l l s a n d b o v i n e a o r t i c s m o o t h m u s c l e c e l l s . J C l i n I n v e s t 8 1 : 1 6 0 0 , 1 9 8 8 4 0 7 4 0 8 A s t e r R H : P o o l i n g o f p l a t e l e t s i n t h e s p l e e n : R o l e i n t h e p a t h o g e n e s i s o f " h y p e r s p l e n i c " t h r o m b o c y t o p e n i a . J C l i n I n v e s t 4 5 : 6 4 5 , 1 9 6 6 A s t e r R H : T h e i m m u n o l o g i c t h r o m b o c y t o p e n i a s , i n K u n i c k i T J , G e o r g e J N ( e d s ) : P l a t e l e t I m m u n o b i o l o g y : M o l e c u l a r a n d C l i n i c a l A s p e c t s . P h i l a d e l p h i a , L i p p i n c o t t , 1 9 8 9 , p 3 8 7 A t w e l l R B , T h o r n t o n J R , O d l u m J : S u s p e c t e d d r u g - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h l e v a m i s o l e t h e r a p y i n a d o g . A u s t V e t J 5 7 : 9 1 , 1 9 8 1 A x t h e l m M K , K r a k o w k a S : C a n i n e d i s t e m p e r v i r u s - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a . A m J V e t R e s 4 8 : 1 2 6 9 , 1 9 8 7 B a k e r D C , S i m p s o n M , G a u n t S D , C o r s t v e t R E : A c u t e E h r l i c h i a p l a t y s i n f e c t i o n i n t h e d o g . V e t P a t h o l 2 4 : 4 4 9 , 1 9 8 7 B a l d i n i M : A c u t e " I T P " i n i s o i m m u n i z e d d o g s . A n n N Y A c a d S c i 1 2 4 : 5 4 3 , 1 9 6 5 B a l i n t J P J r , J o n e s F R : D e t e c t i o n o f e l e v a t e d a n t i - i d i o t y p i c a n t i b o d y l e v e l s i n i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p a t i e n t s e x p r e s s i n g a n t i p l a t e l e t a n t i b o d y . B l o o d 8 4 : 6 6 4 , 1 9 9 4 B a l l e m P J , B e l z b e r g A , D e v i n e D V , L y s t e r D , S p r u s t o n B , C h a m b e r s H , D o u b r o f f P , M i k u l a s h K : K i n e t i c s t u d i e s o f t h e m e c h a n i s m o f t h r o m b o c y t o p e n i a i n p a t i e n t s w i t h h u m a n i m m u n o d e fi c i e n c y v i r u s i n f e c t i o n . N E n g l J M e d 3 2 7 : 1 7 7 9 , 1 9 9 2 B a l l e m P J , S e g a l G M , S t r a t t o n J R , G e r n s h e i m e r T , A d a m s o n J W , S l i c h t e r S J : M e c h a n i s m s o f t h r o m b o c y t o p e n i a i n c h r o n i c a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a : E v i d e n c e o f b o t h i m p a i r e d p l a t e l e t p r o d u c t i o n a n d i n c r e a s e d p l a t e l e t c l e a r a n c e . J C l i n I n v e s t 8 0 : 3 3 , 1 9 8 7 B e a r d s l e y D S : P l a t e l e t a u t o a n t i g e n s , i n K u n i c k i T J , G e o r g e J N ( e d s ) : P l a t e l e t I m m u n o b i o l o g y : M o l e c u l a r a n d C l i n i c a l A s p e c t s . P h i l a d e l p h i a , L i p p i n c o t t , 1 9 8 9 , p 1 2 1 B e l l a h J R , S h u l l R M , S e l c e r V S : E h r l i c h i a c a n i s - r e l a t e d p o l y a r t h r i t i s i n a d o g . J A V M A 1 8 9 2 9 2 2 , 1 9 8 6 B e r c h t o l d P , M c M i l l a n R , T a n i P , S o m m e r v i l l e — N e i l s e n S , B l a n c h e t t e V S : A u t o a n t i b o d i e s a g a i n s t p l a t e l e t m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s i n c h i l d r e n w i t h a c u t e a n d c h r o n i c i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B l o o d 7 4 : 1 6 0 0 , 1 9 8 9 B e r c h t o l d P , W e n g e r M : A u t o a n t i b o d i e s a g a i n s t p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n s i n a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a : T h e i r c l i n i c a l s i g n i fi c a n c e a n d r e s p o n s e t o t r e a t m e n t . B l o o d 8 1 : 1 2 4 6 , 1 9 9 3 4 0 9 B e r n a r d S L , l e a t h e r s C W , B r o b s t D F , G o r h a m J R : E s t r o g e n - i n d u c e d b o n e m a r r o w d e p r e s s i o n i n f e r r e t s . A m J V e t R e s 4 4 : 6 5 7 , 1 9 8 3 B e m d t M C , C h o n g B H , A n d r e w s R K : B i o c h e m i s t r y o f d r u g - d e p e n d e n t p l a t e l e t a u t o a n t i g e n s , i n K u n i c k i T J , G e o r g e J N ( e d s ) : P l a t e l e t I m m u n o b i o l o g y : M o l e c u l a r a n d C l i n i c a l A s p e c t s . P h i l a d e l p h i a , L i p p i n c o t t , 1 9 8 9 , p 1 3 2 B e t t a i e b A , F r o m o n t P , L o u a c h e F , O k s e n h e n d l e r E , V a i n c h e n k e r W , D u e d a r i N , B i e r l i n g P : P r e s e n c e o f c r o s s - r e a c t i v e a n t i b o d y b e t w e e n h u m a n i m m u n o d e fi c i e n c y v i r u s ( I - H V ) a n d p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n s i n I H V - r e l a t e d i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B l o o d 8 0 : 1 6 2 , 1 9 9 2 B e t t a i e b A , O k s e n h e n d l e r E , F r o m o n t P , D u e d a r i N , B i e r l i n g P : I m m u n o c h e m i c a l a n a l y s i s o f p l a t e l e t a u t o a n t i b o d i e s i n P H V - r e l a t e d t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a : a s t u d y o f 6 8 p a t i e n t s . B r J H a e m a t o l 7 3 : 2 4 1 , 1 9 8 9 B i z z a r o N : P l a t e l e t s a t e l l i t o s i s t o p o l y m o r p h o n u c l e a r s : C y t o c h e m i c a l , i m m u n o l o g i c a l , a n d u l t r a s t r u c t u r a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f e i g h t c a s e s . A m J H e m a t o l 3 6 : 2 3 5 , 1 9 9 1 B j 6 r k I , P e t e r s s o n B - A , d e q u i s t I : S o m e p h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f p r o t e i n A f r o m S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s . E u r J B i o c h e m 2 9 : 5 7 9 , 1 9 7 2 B l o o m J C , B l a c k m e r S A , B u g e l s k i P J , S o w i n s k i J M , S a u n d e r s L Z : G o l d - i n d u c e d i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a i n t h e d o g . V e t P a t h o l 2 2 : 4 9 2 , 1 9 8 5 B l o o m J C , L e w i s I - I B , S e l l e r s T S , D e l d a r A : T h e h e m a t o l o g i c e f f e c t s o f c e f o n i c i d a n d c e f a z e d o n e i n t h e d o g : A p o t e n t i a l m o d e l o f c e p h a l o s p o r i n h e m a t o t o x i c i t y i n m a n . T o x i c o l A p p l P h a r m a c o l 9 0 : 1 3 5 , 1 9 8 7 B l o o m J C , L e w i s H B , S e l l e r s T S , D e l d a r A , M o r g a n D G : T h e h e m a t o p a t h o l o g y o f c e f o n i c i d - a n d c e f a z e d o n e - i n d u c e d b l o o d d y s c r a s i a s i n t h e d o g . T o x i c o l A p p l P h a r m a c o l 9 0 : 1 4 3 , 1 9 8 7 B l o o m J C , M e u n i e r L D , T h i e m P A , S e l l e r s T S : U s e o f d a n a z o l f o r t r e a t m e n t o f c o r t i c o s t e r o i d - r e s i s t a n t i m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n a d o g . J A V M A 1 9 4 : 7 6 , 1 9 8 9 B l o o m J C , T h i e m P A , S e l l e r s T S , D e l d a r A , L e w i s I - I B : C e p h a l o s p o r i n — i n d u c e d i m m u n e c y t o p e n i a i n t h e d o g : D e m o n s t r a t i o n o f e r y t h r o c y t e — , n e u t r o p h i l - , a n d p l a t e l e t - a s s o c i a t e d I g G f o l l o w i n g t r e a t m e n t w i t h c e f a z e d o n e . A m J H e m a t o l 2 8 : 7 1 , 1 9 8 8 B o u d r e a u x M K , D i l l o n A R , S p a n o J S : E n h a n c e d p l a t e l e t r e a c t i v i t y i n h e a r t w o r m - i n f e c t e d d o g s . A m J V e t R e s 5 0 : 1 5 4 4 , 1 9 8 9 4 1 0 B o w e n R A , O l s o n P N , B e h r e n d t M D , W h e e l e r S L , H u s t e d P W , N e t t T M : E f fi c a c y a n d t o x i c i t y o f e s t r o g e n s c o m m o n l y u s e d t o t e r m i n a t e c a n i n e p r e g n a n c y . J A V M A 1 8 6 : 7 8 3 , 1 9 8 5 B o y l e M D P , R e i s K J : B a c t e r i a l F c r e c e p t o r s . B i o / t e c h n o l o g y 5 : 6 9 7 , 1 9 8 7 B r e i t s c h w e r d t E B : I n f e c t i o u s t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s . C o m p e n d C o n t i n E d u c S m a l l A n i m P r a c t 1 0 : 1 1 7 7 , 1 9 8 8 B r e i t s c h w e r d t E B : B a b e s i o s i s , i n G r e e n e C E ( e d ) : C l i n i c a l M i c r o b i o l o g y a n d I n f e c t i o u s D i s e a s e s o f t h e D o g a n d C a t . P h i l a d e l p h i a , W B S a u n d e r s C o m p a n y , 1 9 8 4 , p 7 9 6 B r e i t s c h w e r d t E B : T h e R i c k e t t s i o s e s , i n E t t i n g e r S J , F e l d m a n E C ( e d s ) : T e x t b o o k o f V e t e r i n a r y I n t e r n a l M e d i c i n e : D i s e a s e s o f t h e D o g a n d C a t ( e d f o u r t h , v o l 1 ) . P h i l a d e l p h i a , W B S a u n d e r s C o m p a n y , 1 9 9 4 , p 3 7 6 B r e i t s c h w e r d t E B , A r m s t r o n g J A , R o b i n e t t e C L , D i l l m a n R C , K a r l M L , L o w r y E C : T h r e e c a s e s o f a c u t e z i n c t o x i c o s i s i n d o g s . V e t H u m T o x i c o l 2 8 : 1 0 9 , 1 9 8 6 B r e i t s c h w e r d t E B , E n g l i s h R V , H e g a r t y B C , L e v y M G , T o m p k i n s W : P r e l i m i n a r y c h a r a c t e r i z a t i o n o f a n o v e l i n f e c t i o u s c a u s e o f t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s . P r o c 1 0 t h A n n V e t M e d F o r u m , A m e r i c a n C o l l e g e o f V e t e r i n a r y I n t e r n a l M e d i c i n e , 1 9 9 2 , p 8 0 7 B r e i t s c h w e r d t E B , L e v y M G , D a v i d s o n M G , W a l k e r D H , B u r g d o r f e r W , C u r t i s B C , B a b i n e a u C A : K i n e t i c s o f I g M r e s p o n s e s t o e x p e r i m e n t a l a n d n a t u r a l l y a c q u i r e d R i c k e t t s i a r i c k e t t s i i i n f e c t i o n i n d o g s . A m J V e t R e s 5 1 : 1 3 1 2 , 1 9 9 0 B r e i t s c h w e r d t E B , M a l o n e J B , M a c W i l l i a r n s P , L e v y M G , Q u a l l s C W J , P r u d i c h M J : B a b e s i o s i s i n t h e G r e y h o u n d . J A V M A 1 8 2 : 9 7 8 , 1 9 8 3 B r e i t s c h w e r d t E B , W a l k e r D H , L e v y M G , B u r g d o r f e r W , C o r b e t t W T , H u r l b e r t S A , S t e b b i n s M E , C u r t i s B C , A l l e n D A : C l i n i c a l , h e m a t o l o g i c , a n d h u m o r a l i m m u n e r e s p o n s e i n f e m a l e d o g s i n o c u l a t e d w i t h R i c k e t t s i a r i c k e t t s i i a n d R i c k e t t s i a m o n t a n a . A m J V e t R e s 4 9 : 7 0 , 1 9 8 8 B r e i t s c h w e r d t E B , W o o d y B J , Z e r b e C A , D e B u y s s c h e r E V , B a r t a O : M o n o c l o n a l g a m m o p a t h y a s s o c i a t e d w i t h n a t u r a l l y o c c u r r i n g c a n i n e e h r l i c h i o s i s . J V e t I n t M e d 1 : 2 , 1 9 8 7 B r o c k K V , J o n e s J B , S h u l l R M , P o t g i e t e r L N D : E f f e c t o f c a n i n e p a r v o v i r u s o n e r y t h r o i d p r o g e n i t o r s i n p h e n y l h y d r a z i n e — i n d u c e d r e g e n e r a t i v e h e m o l y t i c a n e m i a i n d o g s . A m J V e t R e s 5 0 2 9 6 5 , 1 9 8 9 B r o d e y R S : C l i n i c o - p a t h o l o g i c c o n f e r e n c e . J A V M A 1 4 4 : 6 2 8 , 1 9 6 4 4 1 1 B r o d e y R S , S c h a l m O W : H e m o b a r t o n e l l o s i s a n d t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a i n a d o g . J A V M A 1 4 3 : 1 2 3 1 , 1 9 6 3 B r o o k s D G , Q i u W Q , L u s t e r A D , R a v e t c h J V : S t r u c t u r e a n d e x p r e s s i o n o f h u m a n I g G F c R H ( C D 3 2 ) : F u n c t i o n a l h e t e r o g e n e i t y i s e n c o d e d b y t h e a l t e r n a t i v e l y s p l i c e d p r o d u c t s o f m u l t i p l e g e n e s . J E x p M e d 1 7 0 2 1 3 6 9 , 1 9 8 9 B r o o k s M B , M a t u s R E , L e i f e r C E , P a m a i k A K : U s e o f s p l e n e c t o m y i n t h e m a n a g e m e n t o f l y m p h o m a i n d o g s : 1 6 c a s e s ( 1 9 7 6 - 1 9 8 5 ) . J A V M A 1 9 1 : 1 0 0 8 , 1 9 8 7 B r o w n E l , J o i n e r K A , F r a n k M M : C o m p l e m e n t , i n P a u l W E ( e d ) : F u n d a m e n t a l I m m u n o l o g y . N e w Y o r k , R a v e n P r e s s , 1 9 8 4 , p 6 4 6 B r o w n S J , S i m p s o n K W , B a k e r S J , S p a g n o l e t t i M A , E l w o o d C M : M a c r o t h r o m b o c y t o s i s i n c a v a l i e r K i n g C h a r l e s s p a n i e l s . P r o c 1 2 t h A n n V e t M e d F o r u m , A m e r i c a n C o l l e g e o f V e t e r i n a r y I n t e r n a l M e d i c i n e , 1 9 9 4 , p 1 7 1 ( a b s t r ) B r o w n S J , S i m p s o n K W , B a k e r S , S p a g n o l e t t i M A , E l w o o d C M : M a c r o t h r o m b o c y t o s i s i n c a v a l i e r K i n g C h a r l e s s p a n i e l s . V e t R e c o r d 1 3 5 : 2 8 1 , 1 9 9 4 B u r s t e i n S A : E f f e c t s o f i n t e r l e u k i n 6 o n m e g a k a r y o c y t e s a n d o n c a n i n e p l a t e l e t f u n c t i o n . S t e m C e l l s 1 2 2 3 8 6 , 1 9 9 4 B u r s t e i n S A , D o w n s T , F r i e s e P , L y n a m S , A n d e r s o n S , H e n t h o m J , E p s t e i n R B , S a v a g e K : T h r o m b o c y t o p o i e s i s i n n o r m a l a n d s u b l e t h a l l y i r r a d i a t e d d o g s : R e s p o n s e t o h u m a n i n t e r l e u k i n - 6 . B l o o d 8 0 : 4 2 0 , 1 9 9 2 B u r t o n D R : T h e s t r u c t u r e o f i m m u n o g l o b u l i n s a n d t h e i r i n t e r a c t i o n w i t h c o m p l e m e n t , i n S i m R B ( e d ) : A c t i v a t o r s a n d I n h i b i t o r s o f C o m p l e m e n t . D o r d r e c h t , K l u w e r A c a d e m i c P u b l i s h e r s , 1 9 9 3 , p 6 9 B u s s e l J B : A u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . H e m a t o l O n c o l C l i n N o r t h A m 4 : 1 7 9 , 1 9 9 0 C a h i l l M R , M a c e y M G , N e w l a n d A C : F i x a t i o n w i t h f o r m a l d e h y d e i n d u c e s e x p r e s s i o n o f a c t i v a t i o n d e p e n d e n t p l a t e l e t m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s , P s e l e c t i n ( C D 6 2 ) a n d G P 5 3 ( C D 6 3 ) . B r J H a e m a t o l 8 4 2 5 2 7 , 1 9 9 3 C a i n G R , C h a m p l i n R , J a i n N : I m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s a f t e r f e t a l l i v e r h e m a t o p o i e t i c c e l l t r a n s p l a n t a t i o n . E x p H e m a t o l 1 7 2 2 8 7 , 1 9 8 9 C a l v e r t C : V a l v u l a r b a c t e r i a l e n d o c a r d i t i s i n t h e d o g . J A V M A 1 8 0 : 1 0 8 0 , 1 9 8 2 C a l v e r t C A : S e l e c t e d c o m p l i c a t i o n s a n d s e q u e l a e o f c a n i n e h e a r t w o r m d i s e a s e . S e m V e t M e d S u r g ( S m a l l A n i m a l ) 2 : 5 6 , 1 9 8 7 4 1 2 C a m p b e l l K L , G e o r g e J W , G r e e n e C E : A p p l i c a t i o n o f t h e e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y f o r t h e d e t e c t i o n o f p l a t e l e t a n t i b o d i e s i n d o g s . A m J V e t R e s 4 5 2 2 5 6 1 , 1 9 8 4 C a n fi e l d P J , W a t s o n A D J , B e g g A P , D i l l - M a c k y E : M y e l o p r o l i f e r a t i v e d i s o r d e r i n f o u r d o g s i n v o l v i n g d e r a n g e m e n t s o f e r y t h r o p o i e s i s , m y e l o p o i e s i s a n d m e g a k a r y o p o i e s i s . J S m a l l A n i m P r a c t 2 7 : 7 , 1 9 8 6 C a p e l - E d w a r d s K , H a l l D E , S a n s o m A G : H e m a t o l o g i c a l c h a n g e s o b s e r v e d i n f e m a l e b e a g l e d o g s g i v e n e t h y n y l e s t r a d i o l . T o x i c o l A p p l P h a r m a c o l 2 0 2 3 1 9 , 1 9 7 1 C a r m i c h a e l L E , G r e e n e C E : C a n i n e h e r p e s v i r u s i n f e c t i o n , i n G r e e n e C E ( e d ) : I n f e c t i o u s D i s e a s e s o f t h e D o g a n d C a t . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 9 0 , p 2 5 2 C a r o t h e r s M , C o u t o C G , W a r d H , W e l l m a n M , C r i s p M S , J a c o b s R M : A m i c r o - E L I S A p r o c e d u r e f o r p l a t e l e t - a s s o c i a t e d I g G . P r o c 1 3 t h a n n V e t C a n c e r S o c m e e t i n g , 1 9 9 3 , p 1 4 9 C a s o n a t o A , B e r t o m o r o A , P o n t a r a E , D a m i h a u s e r D , L a z z a r o A R , G i r o l a m i A : E D T A d e p e n d e n t p s e u d o t h r o m b o c y t o p e n i a c a u s e d b y a n t i b o d i e s a g a i n s t t h e c y t o a d h e s i v e r e c e p t o r o f p l a t e l e t g p I I B - H I A . J C l i n P a t h o l 4 7 2 6 2 5 , 1 9 9 4 C a s s e l D L , K e l l e r M A , S u r r e y 8 , S c h w a r t z E , S c h r e i b e r A D , R a p p a p o r t E F , M c K e n z i e S E : D i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o n o f F c y R H A , F c y R H B , a n d F c y R H C i n h e m a t o p o i e t i c c e l l s : A n a l y s i s o f t r a n s c r i p t s . M o l e c I m m u n o l 3 0 2 4 5 1 , 1 9 9 3 C e n t e r S A : P a t h o p h y s i o l o g y , l a b o r a t o r y d i a g n o s i s , a n d d i s e a s e s o f t h e l i v e r , i n E t t i n g e r S J , F e l d m a n E C ( e d s ) : T e x t b o o k o f V e t e r i n a r y I n t e r n a l M e d i c i n e : D i s e a s e s o f t h e D o g a n d C a t ( 4 t h e d , v o l 2 ) . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 9 4 , p 1 2 6 1 C h o n g B H , D u X , B e m d t M C , H o r n S , C h e s t e r m a n C N : C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e b i n d i n g d o m a i n s o n p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n s I b — I X a n d H b / I H a c o m p l e x e s f o r t h e q u i n i n e / q u i n i d i n e - d e p e n d e n t a n t i b o d i e s . B l o o d 1 0 2 2 1 9 0 , 1 9 9 1 C h o n g B H , P i l g r i m R L , C o o l e y M A , C h e s t e r m a n C N : I n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f p l a t e l e t I g G F c r e c e p t o r s i n i m m u n e h e p a r i n - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a . B l o o d 8 1 2 9 8 8 , 1 9 9 3 C h r i s t o p o u l o s C G , K e l s e y H C , M a c h i n S J : A fl o w - c y t o m e t r i c a p p r o a c h t o q u a n t i t a t i v e e s t i m a t i o n o f p l a t e l e t s u r f a c e i m m u n o g l o b u l i n G . V o x S a n g 6 4 2 1 0 6 , 1 9 9 3 C h r i s t 0 p o u l o s C , M a t t o c k C : P l a t e l e t s a t e l l i t i s m a n d a g r a n u l e p r o t e i n s . J C l i n P a t h o l 4 4 2 7 8 8 , 1 9 9 1 C i n e s D B , S c h r e i b e r A D : I m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a : U s e o f a C o o m b s a n t i g l o b u l i n t e s t t o d e t e c t I g G a n d C 3 o n p l a t e l e t s . N E n g l J M e d 3 0 0 2 1 0 6 , 1 9 7 9 4 1 3 C i n e s D B , v a n d e r K e y l H , L e v i n s o n A I : I n v i t r o b i n d i n g o f a n I g E p r o t e i n t o h u m a n p l a t e l e t s . J I m m u n o l 1 3 6 2 3 4 3 3 , 1 9 8 6 C l a n c y R 2 C e l l u l a r i m m u n i t y t o a u t o l o g o u s p l a t e l e t s a n d s e r u m - b l o c k i n g f a c t o r s i n i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . L a n c e t i 2 6 , 1 9 7 2 C l a r k H C , C h i l d r e s s R D , C o l e m a n N C : I d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a : A r e v i e w a n d c a s e r e p o r t . V e t M e d M a r c h 2 4 2 7 , 1 9 8 0 C l a u s D R , S i e g e l J , P e t r a s K , S k o r D , O s m a n d A P , G e w u r z H : C o m p l e m e n t a c t i v a t i o n b y i n t e r a c t i o n o f p o l y a n i o n s a n d p o l y c a t i o n s : H I . C o m p l e m e n t a c t i v a t i o n b y i n t e r a c t i o n o f m u l t i p l e p o l y a n i o n s a n d p o l y c a t i o n s i n t h e p r e s e n c e o f C - r e a c t i v e p r o t e i n . J I m m u n o l 1 1 8 2 8 3 , 1 9 7 7 C l e m m o n s R M , M e y e r s K M : A c q u i s i t i o n a n d a g g r e g a t i o n o f c a n i n e b l o o d p l a t e l e t s : B a s i c m e c h a n i s m s o f f u n c t i o n a n d d i f f e r e n c e s b e c a u s e o f b r e e d o r i g i n . A m J V e t R e s 4 5 : 1 3 7 , 1 9 8 4 C l e m m o n s R M , Y a m a g u c h i R A , F l e m i n g J F , M c D o n a l d T L , G r i e v e R B , I k e d a M , S c h a u b R G : T h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n a d u l t h e a r t w o r m s a n d p l a t e l e t s . P r o c e e d i n g s o f t h e H e a r t w o r m S y m p o s i u m ’ 8 3 . E d w a r d s v i l l e , V e t M e d P u b , 1 9 8 3 , p 2 0 ( a b s t r ) C l i n k e n b e a r d K D , C o w e l l R L , T y l e r R D : D i s s e m i n a t e d h i s t o p l a s m o s i s i n d o g s : 1 2 c a s e s ( 1 9 8 1 - 1 9 8 6 ) . J A V M A 1 9 3 2 1 4 4 3 , 1 9 8 8 C l i n k e n b e a r d K D , T y l e r R D , C o w e l l R L : T h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h d i s s e m i n a t e d h i s t o p l a s m o s i s i n d o g s . C o m p e n d C o n t i n E d u c S m a l l A n i m P r a c t 1 1 2 3 0 1 , 1 9 8 9 C o d n e r E C , F a r r i s - S m i t h L L : C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e s u b c l i n i c a l p h a s e o f e h r l i c h i o s i s i n d o g s . J A V M A 1 8 9 2 4 7 , 1 9 8 6 C o d n e r E C , M a s l i n W R : I n v e s t i g a t i o n o f r e n a l p r o t e i n l o s s i n d o g s w i t h a c u t e e x p e r i m e n t a l l y i n d u c e d E h r l i c h i a c a n i s i n f e c t i o n . A m J V e t R e s 5 3 2 2 9 4 , 1 9 9 2 C o d n e r E C , R o b e r t s R E , A i n s w o r t h A G : A t y p i c a l fi n d i n g s i n 1 6 c a s e s o f c a n i n e e h r l i c h i o s i s . J A V M A 1 8 6 2 1 6 6 , 1 9 8 5 C o l l i n s P W , N e w l a n d A C : T r e a t m e n t m o d a l i t i e s o f a u t o i m m u n e b l o o d d i s o r d e r s . S e m i n H e m a t o l 2 9 : 6 4 , 1 9 9 2 C o l m a n R W , M a r d e r V J , S a l z m a n E W , H i r s h J : P l a s m a c o a g u l a t i o n f a c t o r s , i n C o l m a n R W , H i r s h J , M a r d e r V J , S a l z m a n E W ( e d s ) : H e m o s t a s i s a n d T h r o m b o s i s ; B a s i c P r i n c i p l e s a n d C l i n i c a l P r a c t i c e ( 3 r d e d ) . P h i l a d e l p h i a , L i p p i n c o t t , 1 9 9 4 , p 3 4 1 4 C o n n e l l a n J M , Q u i n n M , W i l e y J S : T h e u s e o f 1 2 5 I l a b e l l e d s t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n A i n t h e d i a g n o s i s o f a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a a n d o t h e r i m m u n e m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a s . P a t h o l 1 8 2 1 1 1 , 1 9 8 6 C o n r a d P , T h o m f o r d J , Y a m a n e I , W h i t i n g J , B o s m a L , U n o T , H o l s h u h H J , S h e l l y S : H e m o l y t i c a n e m i a c a u s e d b y B a b e s i a g i b s o n i i n f e c t i o n i n d o g s . J A V M A 1 9 9 2 6 0 1 , 1 9 9 1 C o o k A K , B e r t o y E H , G r e g o r y C R , S t e w a r t A F : E f f e c t o f o r a l c y c l o s p o r i n e ( C S ) i n d o g s w i t h r e f r a c t o r y i m m u n e - m e d i a t e d a n e m i a ( I M A ) o r t h r o m b o c y t o p e n i a ( I T P ) . P r o c 1 2 t h A n n V e t M e d F o r u m , A m e r i c a n C o l l e g e o f V e t e r i n a r y I n t e r n a l M e d i c i n e , 1 9 9 4 , p 1 0 0 1 C o m a c o f f J B , H e b e r t L A , S m e a d W L , V a n A m a n M E : P r i m a t e e r y t h r o c y t e - i m m u n e c o m p l e x — c l e a r i n g m e c h a n i s m . J C l i n I n v e s t 7 1 : 2 3 6 , 1 9 8 3 C o r t e l a z z o S , V i e r o P , C a s a r o t t o C , D ’ E m i l i o A , D i n i E , B a r b u t T 2 B l e e d i n g o n p a t i e n t s w i t h a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a a n d n o r m a l p l a t e l e t c o u n t . S c a n d J H a e m a t o l 3 2 2 4 0 3 , 1 9 8 4 C o u r t W S , B o z e m a n J M , S o o n g S , S a l e h M N , S h a w D R , L o B u g l i o A F 2 P l a t e l e t s u r f a c e - b o u n d I g G i n p a t i e n t s w i t h i m m u n e a n d n o n i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a . B l o o d 6 9 2 2 7 8 , 1 9 8 7 C o u t o C G : C l i n i c o p a t h o l o g i c a s p e c t s o f a c u t e l e u k e m i a s i n t h e d o g . J A V M A 1 8 6 2 6 8 1 , 1 9 8 5 C o w e l l A K , C o w e l l R L , T y l e r R D , N i e v e s M A : S e v e r e s y s t e m i c r e a c t i o n s t o H y m e n o p t e r a s t i n g s i n t h r e e d o g s . J A V M A 1 9 8 2 1 0 1 4 , 1 9 9 1 C o w e l l R L , T y l e r R D , C l i n k e n b e a r d K D , M e i n k o t h J H : E h r l i c h i o s o s a n d p o l y a r t h r i t i s i n t h r e e d o g s . J A V M A 1 9 2 2 1 0 9 3 , 1 9 8 8 C u r t i s B R , M c F a r l a n d J G , W u G , V i s e n t i n G P , A s t e r R H : A n t i b o d i e s i n s u l f o n a m i d e - i n d u c e d i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a r e c o g n i z e c a l c i u m - d e p e n d e n t e p i t o p e s o n t h e g l y c o p r o t e i n H b / I H a c o m p l e x . B l o o d 8 4 2 1 7 6 , 1 9 9 4 C z e r G T , M a r s h J , K o n o p k a R , M o s e r K M : L o w - d o s e P G 1 2 p r e v e n t s m o n o c r o t a l i n e - i n d u c e d t h r o m b o x a n e p r o d u c t i o n a n d l u n g i n j u r y . J A p p l P h y s i o l 6 0 2 4 6 4 , 1 9 8 6 D a r b e s 1 , C o l b a t z k y F , M i n k u s G , H e r m a n n s W : D e m o n s t r a t i o n o f f e l i n e a n d c a n i n e p l a t e l e t g l y c 0 p r o t e i n s b y i m m u n o — a n d l e c t i n h i s t o c h e m i s t r y . H i s t o c h e m 1 0 0 2 8 3 , 1 9 9 3 D a v i d s o n M G , B r e i t s c h w e r d t E B , W a l k e r D H , L e v y M G , C a r l s o n C S , H a r d i e E M , G r i n d e m C A , N a s i s s e M P 2 V a s c u l a r p e r m e a b i l i t y a n d c o a g u l a t i o n d u r i n g R i c k e t t s i a r i c k e t t s i i i n f e c t i o n i n d o g s . A m J V e t R e s 5 1 2 1 6 5 , 1 9 9 0 4 1 5 D a v i s W M : H a p t e n — i n d u c e d , i m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n a d o g . J A V M A 1 8 4 2 9 7 6 , 1 9 8 4 D e i s e n h o f e r J 2 C r y s t a l l o g r a p h i c r e fi n e m e n t a n d a t o m i c m o d e l s o f a h u m a n F c f r a g m e n t a n d i t s c o m p l e x w i t h f r a g m e n t B o f p r o t e i n A f r o m S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s a t 2 . 9 - a n d 2 . 8 - A r e s o l u t i o n . B i o c h e m 2 0 2 2 3 6 1 , 1 9 8 1 D e l d a r A , L e w i s H , B l o o m J , W e i s s L : C e h p a l o s p o r i n — i n d u c e d c h a n g e s i n t h e u l t r a s t r u c t u r e o f c a n i n e b o n e m a r r o w . V e t P a t h o l 2 5 2 2 1 1 , 1 9 8 8 D e l d a r A , L e w i s H , B l o o m J , W e i s s L : C e p h a l o s p o r i n — i n d u c e d a l t e r a t i o n s i n e r y t h r o i d ( C F U - E ) a n d g r a n u l o c y t e - m a c r o p h a g e ( C P U - G M ) c o l o n y — f o r m i n g c a p a c i t y i n c a n i n e b o n e m a r r o w . F u n d a m A p p l T o x i c o l 1 1 2 4 5 0 , 1 9 8 8 D e n o m m e G A , K e l t o n J G , B e l l D A : T h e p r o d u c t i o n o f h u m a n m o n o c l o n a l a n t i p l a t e l e t a u t o - a n t i b o d i e s d e r i v e d f r o m h u m a n l y m p h o c y t e s o f n o r m a l o r i g i n : r e a c t i v i t y t o D N A , a n i o n i c p h o s p h o l i p i d s a n d p l a t e l e t p r o t e i n s . B r J H a e m a t o l 8 1 : 9 9 , 1 9 9 2 D e n o m m e G A , S m i t h J W , K e l t o n J G , B e l l D A : A h u m a n m o n o c l o n a l a u t o a n t i b o d y t o p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n H b d e r i v e d f r o m n o r m a l h u m a n l y m p h o c y t e s . B l o o d 7 9 2 4 4 7 , 1 9 9 2 D e s P r e z R M , S t e c k l e y S , S t r o u d R M , H a w i g e r J : I n t e r a c t i o n o f H i s t o p l a s m a c a p s l a t u m w i t h h u m a n p l a t e l e t s . J I n f e c t D i s 1 4 2 2 3 2 , 1 9 8 0 D e v i n e D , R o s s e W F : I d e n t i fi c a t i o n o f p l a t e l e t p r o t e i n s t h a t b i n d a l l o a n t i b o d i e s a n d a u t o a n t i b o d i e s . B l o o d : 1 2 4 0 , 1 9 8 4 D i x o n F J , K u n k e l H G , e d s : A d v a n c e s i n I m m u n o l o g y ( v o l 3 2 ) . N e w Y o r k , A c a d e m i c P r e s s , 1 9 8 2 D i x o n R , R o s s e W , E b b e r t L 2 Q u a n t i t a t i v e d e t e r m i n a t i o n o f a n t i b o d y i n i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . N E n g l J M e d 2 9 2 : 2 3 0 , 1 9 7 5 D o d d s W J 2 F a m i l i a l c a n i n e t h r o m b o c y t o p a t h y . T h r o m b D i a t h H a e m o r r h S u p p . 2 6 2 2 4 1 , 1 9 6 7 D o d d s W I 2 A n i m a l m o d e l o f h u m a n d i s e a s e . A m J P a t h o l 8 6 2 4 8 9 , 1 9 7 7 D o d d s W ] 2 I m m u n e - m e d i a t e d d i s e a s e s o f t h e b l o o d . A d v V e t S c i C o m p M e d 2 7 2 1 6 3 , 1 9 8 3 D o d d s W I 2 I m m u n e - m e d i a t e d b l o o d d i s e a s e s . P u r e B r e d D o g s / A m e r i c a n K e n n e l G a z e t t e A p r i 1 2 7 4 , 1 9 8 7 4 1 6 D o u g h e r t y S A , C e n t e r S A , S h a w E E , E r b H A : J u v e n i l e - o n s e t p o l y a r t h r i t i s s y n d r o m e i n A k i t a s . J A V M A 1 9 8 2 8 4 9 , 1 9 9 1 D u X , B e u t l e r L , R u a n C , C a s t a l d i P A , B e m d t M C : G l y c o p r o t e i n I b a n d g l y c o p r o t e i n I X a r e f u l l y c o m p l e x e d i n t h e i n t a c t p l a t e l e t m e m b r a n e . B l o o d 6 9 2 1 5 2 4 , 1 9 8 7 D u n g w o r t h D L , G o l d m a n M , S w i t z e r J W , M c K e l v i e D H : D e v e l o p m e n t o f a m y e l o p r o l i f e r a t i v e d i s o r d e r i n B e a g l e s c o n t i n u o u s l y e x p o s e d t o 9 0 S r . B l o o d 3 4 2 6 1 0 , 1 9 6 9 D u n s t a n R A , S i m p s o n M B , K n o w l e s R W , R o s s e W : T h e o r i g i n o f A B H a n t i g e n s o n h u m a n p l a t e l e t s . B l o o d 6 5 2 6 1 5 , 1 9 8 5 E d d l e s t o n e S , T a b o a d a J : H e m a t o l o g i c c h a r a c t e r i s t i c s o f g r e y h o u n d s . J A V M A 2 0 5 2 1 5 1 3 , 1 9 9 4 ( l e t t e r ) E d w a r d s D F : B o n e m a r r o w h y p o p l a s i a i n a f e m i n i z e d d o g w i t h a S e r t o l i c e l l t u m o r . J A V M A 1 7 8 2 4 9 4 , 1 9 8 1 E i k a C : O n t h e m e c h a n i s m o f p l a t e l e t a g g r e g a t i o n i n d u c e d b y h e p a r i n , p r o t a m i n e a n d p o l y b r e n e . S c a n d J H a e m a t o l 9 : 2 4 8 , 1 9 7 2 E v a n s R S , D u a n e R T : A c q u i r e d h e m o l y t i c a n e m i a : I . T h e r e l a t i o n o f e r y t h r o c y t e a n t i b o d y p r o d u c t i o n t o a c t i v i t y o f t h e d i s e a s e . 1 1 . T h e s i g n i fi c a n c e o f t h r o m b o c y t o p e n i a a n d l e u k 0 p e n i a . B l o o d 4 2 1 1 9 6 , 1 9 4 9 E w i n g S A , R o b e r s o n W R , B u c k n e r R G , H a y a t C S : A n e w s t r a i n o f E h r l i c h i a c a n i s . J A V M A 1 5 9 2 1 7 7 1 , 1 9 7 1 B y F S , G o o d n i g h t S H : B l e e d i n g d i s o r d e r s i n c a n c e r . S e m i n O n c o l 1 7 2 1 8 7 , 1 9 9 0 F a b r i s F , C o r d i a n o I , M a z z u c c a t o M , P r a d e l l a P , R a n d i M L , G i r o l a m i A : L a b e l i n g o f p l a t e l e t s u r f a c e g l y c o p r o t e i n s w i t h b i o t i n d e r i v a t i v e s . T h r o m b R e s 6 6 2 4 0 9 , 1 9 9 2 F a d o k V A , S a u n d e r s B , J a n n e y E H : T h r o m b o c y t o p e n i a a n d h e m o r r h a g e a s s o c i a t e d w i t h g o l d s a l t t h e r a p y f o r b u l l o u s p e m p h i g o i d i n a d o g . J A V M A 1 8 1 2 2 6 1 , 1 9 8 2 F a r r i s G M , B e n j a m i n S A : I n h i b i t i o n o f m y e l o p o i e s i s b y c o n d i t i o n e d m e d i u m f r o m c u l t u r e d c a n i n e t h y m i c c e l l s e x p o s e d t o e s t r o g e n . A m J V e t R e s 5 4 2 1 3 6 6 , 1 9 9 3 F a r r i s G M , B e n j a m i n S A : I n h i b i t i o n o f m y e l o p o i e s i s b y s e r u m f r o m d o g s e X p o s e d t o e s t r o g e n . A m J V e t R e s 5 4 2 1 3 7 4 , 1 9 9 3 F a r w e l l G E , L e G r a n d E K , C o b b C C : C l i n i c a l o b s e r v a t i o n s o n B a b e s i a g i b s o n i a n d B a b e s i a c a n i s i n f e c t i o n s i n d o g s . J A V M A 1 8 0 2 5 0 7 , 1 9 8 2 4 1 7 F e l d m a n B F : D i s o r d e r s o f p l a t e l e t s , i n K i r k R W ( e d ) : C u r r e n t V e t e r i n a r y T h e r a p y X . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 8 9 , p 4 5 7 F e l d m a n B F , H a n d a g a m a P : S p l e n e c t o m y : A n o l d i s s u e o f c u r r e n t c o n t r o v e r s y . J A V M A 1 8 8 2 4 6 2 , 1 9 8 6 F e l d m a n B F , H a n d a g a m a P , L u b b e r i n k A A M E : S p l e n e c t o m y a s a d j u n c t i v e t h e r a p y f o r i m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a a n d h e m o l y t i c a n e m i a i n t h e d o g . J A V M A 1 8 7 2 6 1 7 , 1 9 8 5 F e l d m a n B F , M a d e w e l l B R , O ’ N e i l l S 2 D i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n : A n t i t h r o m b i n , p l a s m i n o g e n , a n d c o a g u l a t i o n a b n o r m a l i t i e s i n 4 1 d o g s . J A V M A 1 7 9 2 1 5 1 , 1 9 8 1 F e l d m a n B F , T h o m a s o n K J , J a i n N C : I m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n a d o g . V e t C l i n N o r t h A m S m a l l A n i m P r a c t 1 8 2 2 5 8 , 1 9 8 8 F e l d m a n B F , T h o m a s o n K J , J a i n N C : Q u a n t i t a t i v e p l a t e l e t d i s o r d e r s . V e t C l i n N o r t h A m S m a l l A n i m P r a c t 1 8 : 3 5 , 1 9 8 8 F i t z g e r a l d L A , S t e i n e r B , R a l l S C J , L o S , P h i l l i p s D R : P r o t e i n s e q u e n c e o f e n d o t h e l i a l g l y c o p r o t e i n I H a d e r i v e d f r o m a c D N A c l o n e . J B i o l C h e m 2 6 2 2 3 9 3 6 , 1 9 8 7 F l e t c h e r J R , R a m w e l l P W : T h e e f f e c t s o f p r o s t a c y c l i n ( P G 1 2 ) o n e n d o t o x i n s h o c k a n d e n d o t o x i n - i n d u c e d p l a t e l e t a g g r e g a t i o n i n d o g s . C i r c S h o c k 7 : 2 9 9 , 1 9 8 0 P o n g J S C , W h i t e J G , G o o d R A : I n h i b i t i o n o f e n d o t o x i c l i p o p o l y s a c c h a r i d e - m e d i a t e d p l a t e l e t a g g r e g a t i o n b y c o b r a v e n o m a n t i c o m p l e m e n t a r y f a c t o r . B l o o d 4 4 : 3 9 9 , 1 9 7 4 F r a k e r P J , S p e c k J C J 2 P r o t e i n a n d c e l l m e m b r a n e i o d i n a t i o n s w i t h a s p a r i n g l y s o l u b l e c h l o r o a m i d e , 1 , 3 , 4 , 6 — t e t r a c h l o r o - 3 a , 6 a - d i p h e n y l g l y c o l u r i l . B i o c h e m B i o p h y s R e s C o m m u n 8 0 2 8 4 9 , 1 9 7 8 F r e e d m a n M , A l t s z u l e r N , K a r p a t k i n S 2 P r e s e n c e o f a n o n s p l e n i c p l a t e l e t p o o l . B l o o d 5 0 2 4 1 9 , 1 9 7 7 F r e n c h T W , H a r v e y J W 2 S e r o l o g i c d i a g n o s i s o f i n f e c t i o u s c y c l i c t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s u s i n g a n i n d i r e c t fl u o r e s c e n t a n t i b o d y t e s t . A m J V e t R e s 4 4 2 2 4 0 7 , 1 9 8 3 F r i e n d P J , M c C a r t h y L l , F i l o R S , I e a p m a n S B , P e s c o v i t z M D , L u r n e n g L , P o u n d D , A r n o l d K , H o f f m a n R , M c F a r l a n d J G , A s t e r R H : T r a n s m i s s i o n o f i d i o p a t h i c ( a u t o i m m u n e ) t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a b y l i v e r t r a n s p l a n t a t i o n . N E n g l J M e d 3 2 3 2 8 0 7 , 1 9 9 0 4 1 8 F r o m A H L , F o n g J S C , C h i u T , G o o d R A : R o l e o f p l a t e l e t s i n t h e p a t h o g e n e s i s o f c a n i n e e n d o t o x i n s h o c k . I n f e c t I m m u n 1 3 2 1 5 9 1 , 1 9 7 6 F u j i s a w a K , O ’ T o o l e T E , T a n i P , L o f t u s J C , P l o w E F , G i n s b e r g M H , M c M i l l a n R 2 A u t o a n t i b o d i e s t o t h e p r e s u m p t i v e c y t o p l a s m i c d o m a i n o f p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n H 1 6 i n p a t i e n t s w i t h c h r o n i c i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B l o o d 7 7 : 2 2 0 7 , 1 9 9 1 F u j i s a w a K , T a n i P , M c M i l l a n R : P l a t e l e t - a s s o c i a t e d a n t i b o d y t o g l y c o p r o t e i n H b / H I a f r o m c h r o n i c i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a p a t i e n t s o f t e n b i n d s t o d i v a l e n t c a t i o n - d e p e n d e n t a n t i g e n s . B l o o d 8 1 : 1 2 8 4 , 1 9 9 3 F u j i s a w a K , T a n i P , O ’ T o o l e T E , G i n s b e r g M H , M c M i l l a n . R : D i f f e r e n t s p e c i fi c i t i e s o f p l a t e l e t - a s s o c i a t e d a n d p l a s m a a u t o a n t i b o d i e s t o p l a t e l e t G P H b - I H a i n p a t i e n t s w i t h c h r o n i c i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B l o o d 7 9 2 1 4 4 1 , 1 9 9 2 G a c h e t C , H a n a u D , S p e h n e r D , B r i s s o n C , G a r a u d J - C , S c h m i t t D A , O h l m a n n P , C a z e n a v e J - P 2 a H b B 3 i n t e g r i n d i s s o c i a t i o n i n d u c e d b y E D T A r e s u l t s i n m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s o f t h e p l a t e l e t s u r f a c e - c o n n e c t e d c a n a l i c u l a r s y s t e m w i t h d i f f e r e n t i a l l o c a t i o n o f t h e t w o s e p a r a t e s u b u n i t s . J C e l l B i o l 1 2 0 2 1 0 2 1 , 1 9 9 3 G a c h e t C , S t i e r l é A , O h l m a n n P , L a n z a F , H a n a u D , C a z e n a v e J - P : N o r m a l A D P - i n d u c e d a g g r e g a t i o n a n d a b s e n c e o f d i s s o c i a t i o n o f t h e m e m b r a n e G P H b - H l a c o m p l e x o f i n t a c t r a t p l a t e l e t s p r e t r e a t e d w i t h E D T A . T h r o m b H a e m o s t 6 6 2 2 4 6 , 1 9 9 1 G a d d K J , R e i d K B M : T h e b i n d i n g o f c o m p l e m e n t c o m p o n e n t C 3 t o a n t i b o d y — a n t i g e n a g g r e g a t e s a f t e r a c t i v a t i o n o f t h e a l t e r n a t i v e p a t h w a y i n h u m a n s e r u m . B i o c h e m J 1 9 5 2 4 7 1 , 1 9 8 1 G a r n e r R , C h a t e r B V , B r o w n D L : T h e r o l e o f c o m p l e m e n t i n e n d o t o x i n s h o c k a n d d i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n : E x p e r i m e n t a l o b s e r v a t i o n s i n t h e d o g . B r J H a e m a t o l 2 8 2 3 9 3 , 1 9 7 4 G a u n t S D , B a k e r D C , B a b i n S S : P l a t e l e t a g g r e g a t i o n s t u d i e s i n d o g s w i t h a c u t e E h r l i c h i a p l a t y s i n f e c t i o n . A m J V e t R e s 5 1 2 2 9 0 , 1 9 9 0 G a u n t S D , P i e r c e K R : M y e l o p o i e s i s a n d m a r r o w a d h e r e n t c e l l s i n e s t r a d i o l - t r e a t e d m i c e . V e t P a t h o l 2 2 2 4 0 3 , 1 9 8 5 G a u n t S D , P i e r c e K R : E f f e c t s o f e s t r a d i o l o n h e m a t o p o i e t i c a n d m a r r o w a d h e r e n t c e l l s o f d o g s . A m J V e t R e s 4 7 2 9 0 6 , 1 9 8 6 G e o r g e I N 2 T h e o r i g i n a n d s i g n i fi c a n c e o f p l a t e l e t I g G , i n K u n i c k i T J , G e o r g e J N ( e d s ) : P l a t e l e t I m m u n o b i o l o g y : M o l e c u l a r a n d C l i n i c a l A s p e c t s . P h i l a d e l p h i a , L i p p i n c o t t , 1 9 8 9 , p 3 0 5 4 1 9 G e o r g e J N 2 P l a t e l e t i m m u n o g l o b u l i n G : I t s s i g n i fi c a n c e f o r t h e e v a l u a t i o n o f t h r o m b o c y t o p e n i a a n d f o r u n d e r s t a n d i n g t h e o r i g i n o f a - g r a n u l e p r o t e i n s . B l o o d 7 6 : 8 5 9 , 1 9 9 0 G e o r g e J N , E l - H a r a k e M A , R a s k o b G E : C h r o n i c i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . N E n g l J M e d 3 3 1 2 1 2 0 7 , 1 9 9 4 G e o r g e J N , S a u c e r m a n S 2 P l a t e l e t I g G , I g A , I g M , a n d a l b u m i n : C o r r e l a t i o n o f p l a t e l e t a n d p l a s m a c o n c e n t r a t i o n s i n n o r m a l s u b j e c t s a n d i n p a t i e n t s w i t h I T P o r d y s p r o t e i n e m i a . B l o o d 7 2 : 3 6 2 , 1 9 8 8 G e r w i r t z A M , B o g h o s i a n - S e l l L , C a t a n i L , R a t a j c z a k M Z , S h e n Y M , S c h r e i b e r A D : E x p r e s s i o n o f F c y R H a n d C D 4 r e c e p t o r s b y n o r m a l h u m a n m e g a k a r y o c y t e s . E x p H e m a t o l 2 0 2 5 1 2 , 1 9 9 2 G e r w i t z A M , K e e f e r S a c c h e t t i M , B i e n R , B a r r y W E : C e l l - m e d i a t e d s u p p r e s s i o n o f m e g a k a r y o c y t o p o i e s i s i n a c q u i r e d a m e g a k a r y o c y t i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B l o o d 6 8 2 6 1 9 , 1 9 8 6 G i g e r U , W e r n e r L L , M i l l i c h a m p N J , G o r m a n N T : S u l f a d i a z i n e - i n d u c c d a l l e r g y i n s i x D o b e r m a n P i n s c h e r s . J A V M A 1 8 6 2 4 7 9 , 1 9 8 5 G i l l e t t N A , M u g g e n b u r g B A , B o e c k e r B B , H a h n F F , S e i l e r F A , R e b a r A H , J o n e s R K , M c C l e l l a n R O : S i n g l e i n h a l a t i o n e x p o s u r e t o 9 0 S r C l 2 i n t h e b e a g l e d o g : H e m a t o l o g i c a l e f f e c t s . R a d i a t R e s 1 1 0 2 2 6 7 , 1 9 8 7 G i l l i n o v A M , R e d m o n d J M , W i n k e l s t e i n J A , Z e h r K J , H e r s k o w i t z A , B a u m g a r t n e r W A , C a m e r o n D E : C o m p l e m e n t a n d n e u t r o p h i l a c t i v a t i o n d u r i n g c a r d i o p u l m a n a r y b y p a s s : A s t u d y i n t h e c o m p l e m e n t - d e fi c i e n t d o g . A n n T h o r a c S u r g 5 7 : 3 4 5 , 1 9 9 4 G l a z e M B , G a u n t S D : U v e i t i s a s s o c i a t e d w i t h E h r l i c h i a p l a t y s i n f e c t i o n i n a d o g . J A V M A 1 8 8 2 9 1 6 , 1 9 8 6 G o d i n g J W 2 U s e o f s t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n A a s a n i m m u n o l o g i c a l r e a g e n t . J I m m u n o l M e t h o d s 2 0 2 2 4 1 , 1 9 7 8 G o l d e n D L , L a n g s t o n V C : U s e s o f v i n c r i s t i n e a n d v i n b l a s t i n e i n d o g s a n d c a t s . J A V M A 1 9 3 2 1 1 1 4 , 1 9 8 8 G o r m a n N T : A c t i v a t i o n o f t h e a l t e r n a t i v e c o m p l e m e n t p a t h w a y b y l y m p h o b l a s t s i s o l a t e d f r o m c a n i n e t h y m i c l y m p h o m a s . V e t I m m u n o I m m u n o p a t h 7 : 2 1 3 , 1 9 8 4 G o r m a n N T , W e r n e r L L : I m m u n e - m e d i a t e d d i s e a s e s o f t h e d o g a n d c a t . I . B a s i c c o n c e p t s a n d t h e s y s t e m i c i m m u n e - m e d i a t e d d i s e a s e s . B r V e t J 1 4 2 2 3 9 5 , 1 9 8 6 4 2 0 G o u d s w a a r d J , V a n D e r D o n k J A , N o o r d z i j A , V a n D a m R H , V a e r m a n J - P : P r o t e i n A r e a c t i v i t y o f v a r i o u s m a m m a l i a n i m m u n o g l o b u l i n s . S c a n d J I m m u n o l 8 2 2 1 , 1 9 7 8 G o u r l e y I M G , L o w G : I n v i t r o a g g r e g a t i o n o f c a n i n e b l o o d p l a t e l e t s a n d l i q u e f a c t i o n o f b l o o d c l o t s b y l e p t o s p i r e s . A m J V e t R e s 2 3 2 1 2 5 2 , 1 9 6 2 G o w i n g G M : I d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a i n t h e d o g . J A V M A 1 4 5 2 9 8 7 , 1 9 6 4 G r a y L S , M a s o u r e d i s S P : I n t e r a c t i o n o f 1 2 5 I - p r o t e i n A w i t h e r y t h r o c y t e - b o u n d I g G . J L a b C l i n M e d 9 9 : 3 9 9 , 1 9 8 2 G r e e n e C E , A p p e l M J 2 C a n i n e D i s t e m p e r , i n G r e e n e C E ( e d ) : I n f e c t i o u s D i s e a s e s o f t h e D o g a n d C a t . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 9 0 , p 2 2 6 G r e e n e C E , B u r g d o r f e r W , C a v a g n o l o R , P h i l i p R N , P e a c o c k M G : R o c k y M o u n t a i n s p o t t e d f e v e r i n d o g s a n d i t s d i f f e r e n t i a t i o n f r o m c a n i n e e h r l i c h i o s i s . J A V M A 1 8 6 2 4 6 5 , 1 9 8 5 G r e e n e C E , S c o g g i n J , T h o m a s J E , B a r s a n t i J A : V i n c r i s t i n e i n t h e t r e a t m e n t o f t h r o m b o c y t o p e n i a i n fi v e d o g s . J A V M A 1 8 0 2 1 4 0 , 1 9 8 2 G r e e n e C E , S h o t t s E B : L e p t o s p i r o s i s , i n G r e e n e C E ( e d ) : I n f e c t i o u s D i s e a s e s o f t h e D o g a n d C a t . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 9 0 , p 4 9 8 G r e i g B , A r m s t r o n g J , D u m l e r S : G r a n u l o c y t i c e h r l i c h i o s i s i n M i n n e s o t a a n d W i s c o n s i n d o g s — a p o t e n t i a l z o o n o t i c d i s e a s e . V e t P a t h o l 3 1 2 5 7 5 , 1 9 9 4 G r i n d e m C B , B r e i t s c h w e r d t E B , C o r b e t t W T , J a n s H E : E p i d e m i o l o g i c s u r v e y o f t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s : A r e p o r t o n 9 8 7 c a s e s . V e t C l i n P a t h 2 0 : 3 8 , 1 9 9 1 G r i n d e m C B , B r e i t s c h w e r d t E B , C o r b e t t W T , P a g e R L , J a n s H E : T h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h n e o p l a s i a i n d o g s . J V e t I n t M e d 8 2 4 0 0 , 1 9 9 4 G r i n d e m C B , C o r b e t t W T , L e v y M G , D a v i d s o n M G , B r e i t s c h w e r d t E B : P l a t e l e t a g g r e g a t i o n i n d o g s e x p e r i m e n t a l l y i n f e c t e d w i t h R i c k e t t s i a r i c k e t t s i i . V e t C l i n P a t h 1 9 2 2 5 , 1 9 9 0 G u r n e y A L , C a r v e r - M o o r e K , d e S a u v a g e F J , M o o r e M W : T h r o m b o c y t o p e n i a i n c - m p l - d e fi c i e n t m i c e . S c i e n c e 2 6 5 2 1 4 4 5 , 1 9 9 4 G u r n e y A L , K u a n g W J , X i e M H , M a l l o y B E , E a t o n D L , d e S a u v a g e F 1 2 G e n o m i c s t r u c t u r e , c h r o m o s o m a l l o c a l i z a t i o n , a n d c o n s e r v e d a l t e r n a t i v e s p l i c e f o r m s o f t h r o m b o p o i e t i n . B l o o d 8 5 2 9 8 1 , 1 9 9 5 4 2 1 G u t r n a n n F D , M u r t h y V S , W o j c i e c h o w s k i M T , W u r m R M , E d z a r d s R A : T r a n s i e n t p u l m o n a r y p l a t e l e t s e q u e s t r a t i o n d u r i n g e n d o t o x e m i a i n d o g s . C i r c S h o c k 2 1 2 1 8 5 , 1 9 8 7 H a g e r E B , B u r n s R O , C a r t e r R D , M e r r i l l J P : L e s i o n s p r o d u c e d i n h o m o g r a f t e d c a n i n e k i d n e y s b y p r i o r i m m u n i z a t i o n w i t h d o n o r p l a t e l e t s . F e d P r o c 2 1 : 3 7 , 1 9 6 2 H a l l E J : U s e o f l i t h i u m f o r t r e a t m e n t o f e s t r o g e n - i n d u c e d b o n e m a r r o w h y p o p l a s i a i n a d o g . J A V M A 2 0 0 2 8 1 4 , 1 9 9 2 H a l l i w e l l R E W : A u t o i m m u n e d i s e a s e s i n d o m e s t i c a n i m a l s . J A V M A 1 8 1 2 1 0 8 8 , 1 9 8 2 H a l l i w e l l R E W , G o r m a n N T : T h e i m m u n o g l o b u l i n s : s t r u c t u r e , g e n e t i c s , a n d f u n c t i o n , i n V e t e r i n a r y C l i n i c a l I m m u n o l o g y . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 8 9 , p 1 9 H a m m e r A S , C o u t o C G , S w a r d s o n C , G e t z y D 2 H e m o s t a t i c a b n o r m a l i t i e s i n d o g s w i t h h e m a n g i o s a r c o m a . J V e t I n t M e d 5 2 1 1 , 1 9 9 1 H a m m o n d W P , D a l e D C : L i t h i u m t h e r a p y o f c a n i n e c y c l i c h e m a t o p o i e s i s . B l o o d 5 5 : 2 6 , 1 9 8 0 H a n a u D , G a c h e t C , S c h m i t t D A , O h l m a n n P , B r i s s o n C , F a b r e M , C a z e n a v e J - P : U l t r a s t r u c t u r a l s i m i l a r i t i e s b e t w e e n e p i d e r m a l L a n g e r h a n s c e l l B i r b e c k g r a n u l e s a n d t h e s u r f a c e - c o n n e c t e d c a n a l i c u l a r s y s t e m o f E D T A - t r e a t e d h u m a n b l o o d p l a t e l e t s . J I n v e s t D e r m a t o l 9 7 2 7 5 6 , 1 9 9 1 H a n d a g a m a P , F e l d m a n B F : I m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n t h e d o g . C a n i n e P r a c t 1 2 : 2 5 , 1 9 8 5 H a n d a g a m a P J , F e l d m a n B F : D r u g - i n d u c e d t h r o m b o c y t O p e n i a . V e t R e s C o m m u n 1 0 2 1 , 1 9 8 6 H a n d a g a m a P , F e l d m a n B , K o n o C , F a r v e r T 2 M e a n p l a t e l e t v o l u m e a r t i f a c t s : T h e e f f e c t o f a n t i c o a g u l a n t s a n d t e m p e r a t u r e o n c a n i n e p l a t e l e t s . V e t C l i n P a t h 1 5 2 1 3 , 1 9 8 6 H a n d a g a m a P , S c a r b o r o u g h R M , S h u m a n M A , B a i n t o n D F : E n d o c y t o s i s o f fi b r i n o g e n i n t o m e g a k a r y o c y t e a n d p l a t e l e t a - g r a n u l e s i s m e d i a t e d b y 0 1 “ , , 8 3 ( g l y c o p r o t e i n H b - I H a ) . B l o o d 8 2 2 1 3 5 , 1 9 9 3 H a n d i n R I , S t o s s e l T P : P h a g o c y t o s i s o f a n t i b o d y - c o a t e d p l a t e l e t s b y h u m a n g r a n u l o c y t e s . N E n g l J M e d 2 9 0 2 9 8 9 , 1 9 7 4 H a n s o n S R , S l i c h t e r S J 2 P l a t e l e t k i n e t i c s i n p a t i e n t s w i t h b o n e m a r r o w h y p o p l a s i a : E v i d e n c e f o r a fi x e d p l a t e l e t r e q u i r e m e n t . B l o o d 6 6 2 1 1 0 5 , 1 9 8 5 4 2 2 H a r d i e E M : E n d o t o x e m i a , i n G r e e n e C E ( e d ) : I n f e c t i o u s D i s e a s e s o f t h e D o g a n d C a t . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 9 0 , p 4 9 4 H a r g i s A M , F e l d m a n B F : E v a l u a t i o n o f h e m o s t a t i c d e f e c t s s e c o n d a r y t o v a s c u l a r t u m o r s i n d o g s : 1 1 c a s e s ( 1 9 8 3 - 1 9 8 8 ) . J A V M A 1 9 8 2 8 9 1 , 1 9 9 1 H a r k e r L A , S l i c h t e r S J 2 T h e b l e e d i n g t i m e a s a s c r e e n i n g t e s t f o r e v a l u a t i o n o f p l a t e l e t f u n c t i o n . N E n g l J M e d 2 8 7 2 1 5 5 , 1 9 7 2 H a r r i n g t o n W J , M i n n i c h V , H o l l i n g s w o r t h J W , M o o r e C V 2 D e m o n s t r a t i o n o f a t h r o m b o c y t o p e n i c f a c t o r i n t h e b l o o d o f p a t i e n t s w i t h t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . J L a b C l i n M e d 3 8 2 1 , 1 9 5 1 H a r r i s E N , G h a r a v i A E , H e g d e U , D e r u e G , M o r g a n S H , E n g l e r t H , C h a n J K H , A s h e r s o n R A , H u g h e s G R V : A n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d i e s i n a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B r J H a e m a t o l 5 9 2 2 3 1 , 1 9 8 5 H a r r i s R H , S c h m e l i n g J W , F l e t c h e r J R , R a m w e l l P W : E n d o t o x i n i n t e r a c t i o n w i t h c a n i n e p l a t e l e t s f a i l s t o s t i m u l a t e t h r o m b o x a n e p r o d u c t i o n . P r o c S o c E x p B i o l M e d 1 6 9 2 3 9 7 , 1 9 8 2 H a r t J E : E n d o c r i n e f a c t o r s i n h a e m a t o l o g i c a l c h a n g e s s e e n i n d o g s a n d f e r r e t s g i v e n o e s t r o g e n s . M e d H y p o t h e s e s 1 6 2 1 5 9 , 1 9 8 5 H a r v e y J W , S i m p s o n C F , G a s k i n J M : C y c l i c t h r o m b o c y t o p e n i a i n d u c e d b y a R i c k e t t s i a - l i k e a g e n t i n d o g s . J I n f e c t D i s 1 3 7 2 1 8 2 , 1 9 7 8 H a t t o r i A , S o g a N , M i t o M , K o i k e T , S h i b a t a A : S t r e s s p l a t e l e t s i n n o r m a l i n d i v i d u a l s a n d p a t i e n t s w i t h i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B l o o d C e l l s 1 8 2 2 8 1 , 1 9 9 2 H e R , R e i d D M , J o n e s C E , S h u l m a n N R : S p e c t r u m o f I g c l a s s e s , s p e c i fi c i t i e s , a n d t i t e r s o f s e r u m a n t i g l y c o p r o t e i n s i n c h r o n i c i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B l o o d 8 3 : 1 0 2 4 , 1 9 9 4 H e b e r t L A : T h e c l e a r a n c e o f i m m u n e c o m p l e x e s f r o m t h e c i r c u l a t i o n o f m a n a n d o t h e r p r i m a t e s . A m J K i d n e y D i s 1 7 2 3 5 2 , 1 9 9 1 H e d g e U M , P o w e l l D K , B o w e s A , G o r d o n - S m i t h E C : E n z y m e l i n k e d i m m u n o a s s a y f o r t h e d e t e c t i o n o f p l a t e l e t a s s o c i a t e d I g G . B r J H a e m a t o l 4 8 2 3 9 , 1 9 8 1 H e g d e U M , B a l l S , Z u i a b l e A , R o t e r B L T : P l a t e l e t a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n s ( P A I g G a n d P A I g M ) i n a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a . B r J H a e m a t o l 5 9 2 2 2 1 , 1 9 8 5 4 2 3 H e i l m a n n E , F r e i s e P , A n d e r s o n S , G e o r g e J N , H a n s o n S R , B u r s t e i n S A , D a l e G L 2 B i o t i n y l a t e d p l a t e l e t s : A n e w a p p r o a c h t o t h e m e a s u r e m e n t o f p l a t e l e t l i f e s p a n . B r J H a e m a t o l 8 5 2 7 2 9 , 1 9 9 3 H e i l m a n n E , H y n e s L A , F r i e s e P , G e o r g e J N , B u r s t e i n S A , D a l e G L 2 D o g p l a t e l e t s a c c u m u l a t e i n t r a c e l l u l a r fi b r i n o g e n a s t h e y a g e . J C e l l P h y s i o l 1 6 1 2 2 3 , 1 9 9 4 H e l f a n d S C : N e o p l a s i a a n d i m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a . V e t C l i n N o r t h A m S m a l l A n i m P r a c t 1 8 2 2 6 7 , 1 9 8 8 H e l f a n d S C : S p l e n e c t o m y : A n o l d i s s u e o f c u r r e n t c o n t r o v e r s y . J A V M A 1 8 8 2 4 6 1 , 1 9 8 6 H e l f a n d S C : P l a t e l e t s a n d n e o p l a s i a . V e t C l i n N o r t h A m S m a l l A n i m P r a c t 1 8 2 1 3 1 , 1 9 8 8 H e l f a n d S C , C o u t o C G , M a d e w e l l B R : I m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h s o l i d t u m o r s i n d o g s . J A m A n i m H o s p A s s o c 2 1 2 7 8 7 , 1 9 8 5 H e l f a n d S C , J a i n N C , P a u l M : V i n c r i s t i n e - l o a d e d p l a t e l e t t h e r a p y f o r i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i a i n a d o g . J A V M A 1 8 5 2 2 2 4 , 1 9 8 4 H e l m e r h o r s t F M , t e n B e r g e M L , v a n d e r P l a s - v a n D a l e n C M , E n g e l f r i e t C P , v o n d e m B o r n e A E G K : P l a t e l e t f r e e z i n g f o r s e r o l o g i c a l p u r p o s e s w i t h a n d w i t h o u t a c r y o p r e s e r v a t i v e . V o x S a n g 4 6 2 3 1 8 , 1 9 8 4 H e l m e r h o r s t F M , v a n L e e u w e n E F , P e g e l s J G , v a n d e r P l a s — v a n D a l e n C , E e n g e l f r i e t C P , v o n d e m B o r n e A E G K : P r i m a r y a n d s e c o n d a r y a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a : A s e r o l o g i c a l a n d c l i n i c a l a n a l y s i s . S c a n d J H a e m a t o l 2 8 2 3 1 9 , 1 9 8 2 H e n r y C J , B r e w e r W G , S t u t l e r S A : E a r l y - o n s e t l e u k o p e n i a a n d s e v e r e t h r o m b o c y t o p e n i a f o l l o w i n g d o x o r u b i c i n c h e m o t h e r p a y f o r t o n s i l l a r s q u a m o u s c e l l c a r c i n o m a i n a d o g . C o r n e l l V e t 8 3 2 1 6 3 , 1 9 9 3 H e n s o n P M : M e c h a n i s m s o f r e l e a s e o f c o n s t i t u e n t s f r o m r a b b i t p l a t e l e t s b y a n t i g e n - a n t i b o d y c o m p l e x e s a n d c o m p l e m e n t : I . L y t i c a n d n o n l y t i c r e a c t i o n s . 1 0 5 2 4 7 6 , 1 9 7 0 H i l d e b r a n d t P K , C o n r o y J D , M c K e e A E , N y i n d o M B A , H u x s o l l D L : U l t r a s t r u c t u r e o f E h r l i c h i a c a n i s . I n f e c t I m m u n 7 : 2 6 5 , 1 9 7 3 H i l l - Z o b e l R L , S c h e f f e l U , M c I n t y r e P A , T s a n M : l l l I n - o x i n e - l a b e l e d r a b b i t p l a t e l e t s : I n v i v o d i s t r i b u t i o n a n d s i t e s o f d e s t r u c t i o n . B l o o d 6 1 2 1 4 9 , 1 9 8 3 H o e n i g M : S i x d o g s w i t h f e a t u r e s c o m p a t i b l e w i t h m y e l o n e c r o s i s a n d m y e l o fi b r o s i s . J A m A n i m H o s p A s s o c 2 5 2 3 3 5 , 1 9 8 9 4 2 4 H o f f B , L u m s d e n J H , V a l l i V E O : A n a p p r a i s a l o f b o n e m a r r o w b i o p s y i n a s s e s s m e n t o f s i c k d o g s . C a n J C o m p M e d 4 9 : 3 4 , 1 9 8 5 H o f f B , L u m s d e n J H , V a l l i V E O , K r u t h S A : M y e l o fi b r o s i s : R e v i e w o f c l i n i c a l a n d p a t h o l o g i c a l f e a t u r e s i n f o u r t e e n d o g s . C a n V e t J 3 2 2 3 5 7 , 1 9 9 1 H o f f m a n R , B r i d d e l l R A , v a n B e s i e n K , S r o u r E F , G u s c a r T , H u d s o n N W , G a n s e r A : A c q u i r e d c y c l i c a m e g a k a r y o c y t i c t h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h a n i m m u n o g l o b u l i n b l o c k i n g t h e a c t i o n o f g r a n u l o c y t e — m a c r o p h a g e c o l o n y - s t i m u l a t i n g f a c t o r . N E n g l J M e d 3 2 1 2 9 7 , 1 9 8 9 H o f f m a n R , B r u n o E , E l w e l l J , M a z u r E , G e r w i t z A M , D e k k e r P , D e n e s A E : A c q u i r e d a m e g a k a r y o c y t i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a : A s y n d r o m e o f d i v e r s e e t i o l o g i e s . B l o o d 6 0 2 1 1 7 3 , 1 9 8 2 H o f f m a n R , Z a k n o e n S , Y a n g H H , B r u n o E , L o B u g l i o A F , A r r o w s m i t h J B , P r c h a l J T 2 A n a n t i b o d y c y t o t o x i c t o m e g a k a r y o c y t e p r o g e n i t o r c e l l s i n a p a t i e n t w i t h i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . N E n g l J M e d 3 1 2 2 1 1 7 0 , 1 9 8 5 H o h m a n n A , B o o t h K , P e t e r s V , G o r d o n D , C o m a c c h i o R : C o m m o n e p i t o p e o n I - H V p 2 4 a n d h u m a n p l a t e l e t s . L a n c e t 3 4 2 2 1 2 7 4 , 1 9 9 3 H o l l o w a y S A , M e y e r D J , M a n n e l l a C : P r e d n i s o l o n e a n d d a n a z o l f o r t r e a t m e n t o f i m m u n e - m e d i a t e d a n e m i a , t h r o m b o c y t o p e n i a , a n d i n e f f e c t i v e e r y t h r o i d r e g e n e r a t i o n i n a d o g . J A V M A 1 9 7 2 1 0 4 5 , 1 9 9 0 H o l l o w a y S A , S e n i o r D F : H e m o l y t i c - u r e m i c s y n d r o m e i n d o g s . P r o c 9 t h A n n V e t M e d F o r u m , A m e r i c a n C o l l e g e o f V e t e r i n a r y I n t e r n a l M e d i c i n e , 1 9 9 1 , p 5 9 7 ( a b s t r ) H o l r n e S , H e a t o n A , K u n c h u b a A , H a r t m a n P : I n c r e a s e d l e v e l s o f p l a t e l e t a s s o c i a t e d I g G i n p a t i e n t s w i t h t h r o m b o c y t o p e n i a a r e n o t c o n fi n e d t o a n y p a r t i c u l a r s i z e c l a s s o f p l a t e l e t s . B r J H a e m a t o l 6 8 2 4 3 1 , 1 9 8 8 H o r s e w o o d P , H a y w a r d C P , W a r k e n t i n T E , K e l t o n J G : I n v e s t i g a t i o n o f t h e m e c h a n i s m s o f m o n o c l o n a l a n t i b o d y - i n d u c e d p l a t e l e t a c t i v a t i o n . B l o o d 7 8 2 1 0 1 9 , 1 9 9 1 H o s k i n s J D , B a r t a O , R o t h s c h m i t t J 2 S e r u m h y p e r v i s c o s i t y s y n d r o m e a s s o c i a t e d w i t h E h r l i c h i a c a n i s i n f e c t i o n i n a d o g . J A V M A 1 8 3 2 1 0 1 1 , 1 9 8 3 H o u r d i l l e P , B e n a b d a l l a h S , B e l l o c F , N u r d e n A T : D i s t r i b u t i o n o f g l y c o p r o t e i n H b - H I a c o m p l e x e s i n t h e s u r f a c e m e m b r a n e s o f h u m a n p l a t e l e t s a n d m e g a k a r y o c y t e s . B r J H a e m a t 0 1 5 9 2 1 7 1 , 1 9 8 5 H o u s t o n D M , T a y l o r J A : A c u t e p a n c r e a t i t i s a n d b o n e m a r r o w s u p p r e s s i o n i n a d o g g i v e n a z a t h i o p r i n e . C a n V e t J 3 2 2 4 9 6 , 1 9 9 1 4 2 5 H o w e S E , L y n c h D M , L y n c h J M : A n e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y f o r t h e q u a n t i fi c a t i o n o f s e r u m p l a t e l e t - b i n d a b l e I g G . T r a n s f u s i o n 2 4 2 3 4 8 , 1 9 8 4 H u x s o l l D L , H i l d e b r a n d t P K , N i m s R M , W a l k e r J S : T r o p i c a l c a n i n e p a n c y t o p e n i a . J A V M A 1 5 7 2 1 6 2 7 , 1 9 7 0 H y d e P , Z u c k e r — F r a n k l i n D : A n t i g e n i c d i f f e r e n c e s b e t w e e n h u m a n p l a t e l e t s a n d m e g a k a r y o c y t e s . A m J P a t h o l 1 2 7 : 3 4 9 , 1 9 8 7 H y m e s K , N a r d e M , L e a f A , K a r p a t k i n S 2 R o l e o f L e u C A M i n t e g r i n s a n d c o m p l e m e n t i n p l a t e l e t - m o n o c y t e r o s e t t e f o r m a t i o n i n d u c e d b y i m m u n e c o m p l e x e s o f h u m a n i m m u n o d e fi c i e n c y v i r u s - t y p e l - i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a p a t i e n t s . B l o o d 8 1 2 2 3 7 5 , 1 9 9 3 H y m e s K B , S c h u c k M P , K a r p a t k i n S : R e g u l a t i o n o f a u t o i m m u n e a n t i - p l a t e l e t a n t i b o d y - m e d i a t e d a d h e s i o n o f m o n o c y t e s t o p l a t e l e t G P H b / G P I H a : E f f e c t o f a r m e d m o n o c y t e s a n d t h e M a c - 1 r e c e p t o r . B l o o d 7 5 2 1 8 1 3 , 1 9 9 0 H y m e s K , S h u l m a n S , K a r p a t k i n S : A s o l i d - p h a s e r a d i o i m m u n o a s s a y f o r b o u n d a n t i — p l a t e l e t a n t i b o d y : S t u d i e s o n 4 5 p a t i e n t s w i t h a u t o i m m u n e p l a t e l e t d i s o r d e r s . J L a b C l i n M e d 9 4 2 6 3 9 , 1 9 7 9 I n g r a m M , C 0 0 p e r s m i t h A : R e t i c u l a t e d p l a t e l e t s f o l l o w i n g a c u t e b l o o d l o s s . B r J H a e m a t o l 1 7 2 2 2 5 , 1 9 6 9 I p W F , S e f t o n M V : P l a t e l e t c o n s u m p t i o n b y p o l y v i n y l a l c o h o l c o a t e d t u b i n g i n c a n i n e s . J B i o m e d M a t e r R e s 2 5 2 8 7 5 , 1 9 9 1 J a c k s o n M L , K r u t h S A : I m m u n e - m e d i a t e d h e m o l y t i c a n e m i a a n d t h r o m b o c y t o p e n i a i n t h e d o g : A r e t r o s p e c t i v e s t u d y o f 5 5 c a s e s d i a g n o s e d f r o m 1 9 6 9 t h r o u g h 1 9 8 3 a t t h e W e s t e r n C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e . C a n V e t J 2 6 2 2 4 5 , 1 9 8 5 J a i n N C : S c h a l m ’ s V e t e r i n a r y H e m a t o l o g y ( 4 t h e d ) . P h i l a d e l p h i a , L e a & F e b i g e r , 1 9 8 6 J a i n N C , K o n o M S : T h e p l a t e l e t f a c t o r - 3 t e s t f o r d e t e c t i o n o f c a n i n e a n t i p l a t e l e t a n t i b o d y . V e t C l i n P a t h 9 2 1 0 , 1 9 8 0 J a i n N C , S w i t z e r J W 2 A u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s a n d c a t s . V e t C l i n N o r t h A m S m a l l A n i m P r a c t 1 1 2 4 2 1 , 1 9 8 1 J a n s H E , A r m s t r o n g J , P r i c e G S : T h e r a p y o f i m m u n e m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a . J V e t I n t M e d 4 2 4 , 1 9 9 0 J o h n e s s e e J S , H u r v i t z A I : T h r o m b o c y t o p e n i a , i n K i r k R W ( e d ) : C u r r e n t V e t e r i n a r y T h e r a p y V H 1 . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 8 3 , p 3 8 9 4 2 6 J o h n s o n G J , L e i s L A , D u n l o p P C : ' I ' h r o m b o x a n e - i n s e n s i t i v e d o g p l a t e l e t s h a v e i m p a i r e d a c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p a s e C d u e t o r e c e p t o r - l i n k e d G p r o t e i n d y s f u n c t i o n . J C l i n I n v e s t 9 2 : 2 4 6 9 , 1 9 9 3 J o h n s o n G J , L e i s L A , R a o G H R , W h i t e J G : A r a c h i d o n a t e - i n d u c e d p l a t e l e t a g g r e g a t i o n i n t h e d o g . T h r o m b R e s 1 4 2 1 4 7 , 1 9 7 9 J o i n e r K A , H a w i g e r A , G e l f a n d J A : T h e e f f e c t o f c o b r a v e n o m f a c t o r o n a l t e r n a t i v e p a t h w a y h e m o l y t i c a c t i v i t y i n m i c e . I m m u n o l C o m m u n 9 : 2 7 7 , 1 9 8 0 J o n a s L D , T h r a l l M A , W e i s e r M G : N o n r e g e n e r a t i v e f o r m o f i m m u n e - m e d i a t e d h e m o l y t i c a n e m i a i n d o g s . J A m A n i m H o s p A s s o c 2 3 2 2 0 1 , 1 9 8 7 J o n e s B E V : P l a t e l e t a g g r e g a t i o n i n d o g s a f t e r l i v e - v i r u s v a c c i n a t i o n . A c t a V e t S c a n d 2 5 2 5 0 4 , 1 9 8 4 J o s h i B C , J a i n N C : D e t e t i o n o f a n t i p l a t e l e t a n t i b o d y i n s e r u m a n d o n m e g a k a r y o c y t e s o f d o g s w i t h a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t O p e n i a . A m J V e t R e s 3 7 2 6 8 1 , 1 9 7 6 J o s h i B C , J a i n N C : E x p e r i m e n t a l i m m u n o l o g i c t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s : A s t u d y o f t h r o m b o c y t o p e n i a a n d m e g a k a r y o c y t o p o i e s i s . R e s V e t S c i 2 2 : 1 1 , 1 9 7 7 J y W , H o r s t m a n L L , A r c e M , A h n Y S : C l i n i c a l s i g n i fi c a n c e o f p l a t e l e t m i c r o p a r t i c l e s i n a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a s . J L a b C l i n M e d 1 1 9 2 3 3 4 , 1 9 9 2 K a k o m a I , C a r s o n C A , R i s t i c M , S t e p h e n s o n E M , H i l d e b r a n d t P K , H u x s o l l D L : P l a t e l e t m i g r a t i o n i n h i b i t i o n a s a n i n d i c a t o r o f i m m u n o l o g i c a l l y m e d i a t e d t a r g e t c e l l i n j u r y i n c a n i n e e h r l i c h i o s i s . I n f e c t I m m u n 2 0 2 2 4 2 , 1 9 7 8 K a p l a n C , M o r i n e t F , C a r t r o n J : V i r u s - i n d u c e d a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a a n d n e u t r o p e n i a . S e m i n H e m a t o l 2 9 2 3 4 , 1 9 9 2 K a r a s S P , R o s s e W F , K u r l a n d e r R J : C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e I g G - F e r e c e p t o r o n h u m a n p l a t e l e t s . B l o o d 6 0 : 1 2 7 7 , 1 9 8 2 K a r p a t k i n M , S i s k i n d G W , K a r p a t k i n S : T h e p l a t e l e t f a c t o r 3 i r n m u n o i n j u r y t e c h n i q u e r e — e v a l u a t e d . D e v e l o p m e n t o f a r a p i d t e s t f o r a n t i p l a t e l e t a n t i b o d y . D e t e c t i o n i n v a r i o u s c l i n i c a l d i s o r d e r s , i n c l u d i n g i m m u n o l o g i c d r u g - i n d u c e d a n d n e o n a t a l t h r o m b o c y t o p e n i a s . J L a b C l i n M e d 8 9 2 4 0 0 , 1 9 7 7 K a r p a t k i n S 2 A u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . S e m i n H e m a t o l 2 2 2 2 6 0 , 1 9 8 5 K a r p a t k i n S , X i a J , T h o r b e c k e G ] 2 S e r u m p l a t e l e t - r e a c t i v e I g G o f a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a p a t i e n t s i s n o t F ( a b ’ ) 2 m e d i a t e d a n d a f u n c t i o n o f s t o r a g e . B l o o d 8 0 2 3 1 6 4 , 1 9 9 2 4 2 7 K a u f m a n R M , A i r o R , P o l l a c k S , C r o s b y W H , D o b e m e c k R : O r i g i n o f p u l m o n a r y m e g a k a r y o c y t e s . B l o o d 2 5 2 7 6 7 , 1 9 6 5 K a w a g u c h i R , H a r u n a S , H i k i j i K , H i g a s h i Y , T s u k a s a Y 2 E l e v a t i o n o f p l a t e l e t - a s s o c i a t e d I g G i n a p l a s t i c a n e m i a . J C l i n L a b A n a l y s i s 6 : 1 3 0 , 1 9 9 2 K a z a t c h k i n e M D , F e a r o n D T , A u s t e n K F : H u m a n a l t e r n a t i v e c o m p l e m e n t p a t h w a y : M e m b r a n e - a s s o c i a t e d s i a l i c a c i d r e g u l a t e s t h e c o m p e t i t i o n b e t w e e n B a n d B l H f o r c e l l - b o u n d C 3 b . J I m m u n o l 1 2 2 2 7 5 , 1 9 7 9 K e e n a n C M , H e n d r i c k s L D , L i g h t n e r L , W e b s t e r I H ( , J o h n s o n A ] : V i s c e r a l l e i s h m a n i a s i s i n t h e G e r m a n s h e p h e r d d o g : 1 . I n f e c t i o n , c l i n i c a l d i s e a s e , a n d c l i n i c a l p a t h o l o g y . V e t P a t h o l 2 1 2 7 4 , 1 9 8 4 K e e n a n K P , A l e x a n d e r A D , M o n t g o m e r y C A : P a t h o g e n e s i s o f e x p e r i m e n t a l L e p t o s p i r a i n t e r r o g a n s , s e r o v a r b a t a v i a e , i n f e c t i o n i n t h e d o g : M i c r o b i o l o g i c a l , c l i n i c a l , h e m a t o l o g i c , a n d b i o c h e m i c a l s t u d i e s . A m J V e t R e s 3 9 2 4 4 9 , 1 9 7 8 K e e n a n K P , B u h l e s W C , H u x s o l l D L , W i l l i a m s R G , H i l d e b r a n d t P K : S t u d i e s o n t h e p a t h o g e n e s i s o f R i c k e t t s i a r i c k e t t s i i i n t h e d o g : C l i n i c a l a n d C l i n i c o p a t h o l o g i c c h a n g e s o f e x p e r i m e n t a l i n f e c t i o n . A m J V e t R e s 3 8 2 8 5 1 , 1 9 7 7 K e l l e r E T : I r m n u n e - m e d i a t e d d i s e a s e a s a r i s k f a c t o r f o r c a n i n e l y m p h o m a . C a n c e r 7 0 2 2 3 3 4 , 1 9 9 2 K e l t o n J G , C a r t e r C J , R o d g e r C , B e b e n e k G , G a u l d i e J , S h e r i d a n D , K a s s a m Y B , K e a n W F , B u c h a n a n W W , R o o n e y P J , B i a n c h i F , D e n b u r g J 2 T h e r e l a t i o n s h i p a m o n g p l a t e l e t - a s s o c i a t e d I g G , p l a t e l e t l i f e s p a n , a n d r e t i c u l o e n d o t h e l i a l c e l l f u n c t i o n . B l o o d 6 3 2 1 4 3 4 , 1 9 8 4 K e l t o n J G , K e y s t o n e J , M o o r e J , D e n o m m e G , T o z m a n E , G l y n n M , N e a m e P B , G a u l d i e J , J e n s e n J 2 I m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a o f m a l a r i a . J C l i n I n v e s t 7 1 2 8 3 2 , 1 9 8 3 K e l t o n J G , N e a m e P B , G a u l d i e J , H i r s h J 2 E l e v a t e d p l a t e l e t - a s o c i a t e d I g G i n t h e t h r o m b o c y t o p e n i a o f s e p t i c e m i a . N E n g l J M e d 3 0 0 2 7 6 0 , 1 9 7 9 K e l t o n J G , S h e r i d a n D , N e a m e P B , S i m o n G T : P l a t e l e t f r a g m e n t s d o n o t c o n t r i b u t e t o e l e v a t e d l e v e l s o f p l a t e l e t a s s o c i a t e d I g G . B r J H a e m a t o l 6 1 2 7 0 7 , 1 9 8 5 K e l t o n J G , S m i t h J W , S a n t o s A V , M u r p h y W G , H o r s e w o o d P 2 P l a t e l e t I g G F c r e c e p t o r . A m J H e m a t o l 2 5 2 2 9 9 , 1 9 8 7 4 2 8 K e l t o n J G , S m i t h J W , W a r k e n t i n T E , H a y w a r d C P M , D e n o m m e G A , H o r s e w o o d P 2 I m m u n o g l o b u l i n G f r o m p a t i e n t s w i t h h e p a r i n - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a b i n d s t o a c o m p l e x o f h e p a r i n a n d p l a t e l e t f a c t o r 4 . B l o o d 1 1 2 3 2 3 2 , 1 9 9 4 M c K e n n a J L , P i s c i o t t a A V : F l u o r e s c e n c e o f m e g a k a r y o c y t e s i n i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a ( I T P ) s t a i n e d w i t h fl u o r e s c e n t a n t i g l o b u l i n s e r u m . B l o o d 1 9 2 6 6 4 , 1 9 6 2 K e r n o f f L M , B l a k e K C H , S h a c k l e t o n D 2 I n fl u e n c e o f t h e a m o u n t o f p l a t e l e t - b o u n d I g G o n p l a t e l e t s u r v i v a l a n d s i t e o f s e q u e s t r a t i o n i n a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a . B l o o d 5 5 2 7 3 0 , 1 9 8 0 K h a n E , Z u c k e r - F r a n k l i n D , K a r p a t k i n S : M i c r o t h r o m b o c y t o s i s a n d p l a t e l e t f r a g m e n t a t i o n a s s o c i a t e d w i t h i d i o p a t h i c / a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B r J H a e m a t o l 3 1 2 4 4 9 , 1 9 7 5 K i e f e l V , S a n t o s o S , M u e l l e r - E c k h a r d t C : S e r o l o g i c a l , b i o c h e m i c a l , a n d m o l e c u l a r a s p e c t s o f p l a t e l e t a u t o a n t i g e n s . S e m i n H e m a t o l 2 9 2 2 6 , 1 9 9 2 K i e f e l V , S a n t o s o S , S c h m i d t S , S a l a m a A , M u e l l e r - E c k h a r d t C 2 M e t a b o l i t e - s p e c i fi c ( I g G ) a n d d r u g - s p e c i fi c a n t i b o d i e s ( I g G , I g M ) i n t w o c a s e s o f t r i m e t h o p r i m - s u l f a m e t h o x a z o l e - i n d u c e d i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a . T r a n s f u s i o n 2 7 2 2 6 2 , 1 9 8 7 K i e f e l V , S a n t o s o S , W e i s h e i t M , M i i e l l e r — E c k h a r d t C 2 M o n o c l o n a l a n t i b o d y - s p e c i fi c i m m o b i l i z a t i o n o f p l a t e l e t a n t i g e n s ( M A I P A ) : A n e w t o o l f o r t h e i d e n t i fi c a t i o n o f p l a t e l e t - r e a c t i v e a n t i b o d i e s . B l o o d 7 0 2 1 7 2 2 , 1 9 8 7 K i n g M , M c D e r m o t t P , S c h r e i b e r A D : C h a r a c t e r i z a t i o n o f F c y r e c e p t o r o n h u m a n p l a t e l e t s . C e l l I m m u n o l 1 2 8 : 4 6 2 , 1 9 9 0 K n a p p D W , R i c h a r d s o n R C , B o n n e y P L , H a h n K 2 C i s p l a t i n t h e r a p y i n 4 1 d o g s w i t h m a l i g n a n t t u m o r s . J V e t I n t M e d 2 2 4 1 , 1 9 8 8 K o b a y a s h i H , K i t a n o K , I s h i d a F , S a i t o H , M i y a b a y a s h i H , Y o n e z a w a T , I n a d a H , S u z u k i A , F u r u t a S : A p l a s t i c a n e m i a a n d i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a w i t h a n t i b o d y t o p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n H b / I H a f o l l o w i n g r e s e c t i o n o f m a l i g n a n t t h y m o m a . A c t a H a e m a t o l 9 0 : 4 2 , 1 9 9 3 K o c i b a G J , C a p u t o C A : A p l a s t i c a n e m i a a s s o c i a t e d w i t h e s t r u s i n p e t f e r r e t s . J A V M A 1 7 8 2 1 2 9 3 , 1 9 8 1 K o c i b a G J , H a t h a w a y J E : D i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n a s s o c i a t e d w i t h h e a r t w o r m d i s e a s e i n t h e d o g . J A m A n i m H o s p A s s o c 1 0 2 3 7 3 , 1 9 7 4 4 2 9 K o e m e r T A W , W e i n f e l d H M , B u l l a r d L S B , W i l l i a m s L C ] 2 A n t i b o d i e s a g a i n s t p l a t e l e t g l y c o s p h i n g o l i p i d s : D e t e c t i o n i n s e r u m b y q u a n t i t a t i v e H P T L C - A u t o r a d i o g r a p h y a n d a s s o c i a t i o n w i t h a u t o i m m u n e a n d a l l o i m m u n e p r o c e s s e s . B l o o d 7 4 2 2 7 4 , 1 9 8 9 K o k a w a T , N o m u r a S , Y a n a b u M , Y a s i r n a g u K 2 D e t e c t i o n o f p l a t e l e t a n t i g e n f o r a n t i p l a t e l e t a n t i b o d i e s i n i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a b y fl o w c y t o m e t r y , a n t i g e n - c a p t u r e E L I S A , a n d i m m u n o b l o t t i n g : a c o m p a r a t i v e s t u d y . E u r J H a e m a t o l 5 0 2 7 4 , 1 9 9 3 K o n t o s V I , P a p a d o p o u l o s 0 , F r e n c h T W : N a t u r a l a n d e x p e r i m e n t a l c a n i n e i n f e c t i o n s w i t h a G r e e k s t r a i n o f E h r l i c h i a p l a t y s . V e t C l i n P a t h 2 0 2 1 0 1 , 1 9 9 1 K r a k o w k a S , H i g g i n s R J , K o e s t n e r A : C a n i n e d i s t e m p e r v i r u s : R e v i e w o f s t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l m o d u l a t i o n s i n l y m p h o i d t i s s u e s . A m J V e t R e s 4 1 2 2 8 4 , 1 9 8 0 K r e s o w i k T F , W a k e fi e l d T W , F e s s l e r H R D , S t a n l e y J C : A n t i c o a g u l a n t e f f e c t s o f p r o t a m i n e s u l f a t e i n a c a n i n e m o d e l . J S u r g R e s 4 5 2 8 , 1 9 8 8 K r i s t e n s e n A , K l a u s n e r J S : I m m u n o l o g i c d i s o r d e r s i n p a t i e n t s w i t h n e o p l a s i a . P r o c 1 0 t h A n n V e t M e d F o r u m , A m e r i c a n C o l l e g e o f V e t e r i n a r y I n t e r n a l M e d i c i n e , 1 9 9 2 , p 6 3 0 ( a b s t r ) K r i s t e n s e n A T , W e i s s D J , K l a u s n e r J S : P l a t e l e t d y s f u n c t i o n a s s o c i a t e d w i t h i m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s . J V e t I n t M e d 8 : 3 2 3 , 1 9 9 4 K r i s t e n s e n A T , W e i s s D J , K l a u s n e r J S , L a b e r J , C h r i s t i e D J 2 C o m p a r i s o n o f m i c r o s o p i c a n d fl o w c y t o m e t r i c d e t e c t i o n o f p l a t e l e t a n t i b o d y i n d o g s s u s p e c t e d o f h a v i n g i m m u n e - m e d i a t e d t h o m b o c y t o p e n i a . A m J V e t R e s 5 5 2 1 1 1 1 , 1 9 9 4 K r i s t e n s e n A T , W e i s s D J , K l a u s n e r J S , L a b e r J , C h r i s t i e D J 2 D e t e c t i o n o f a n t i p l a t e l e t a n t i b o d y w i t h a p l a t e l e t i m m u n o fl u o r e s c e n c e a s s a y . J V e t I n t M e d 8 2 3 6 , 1 9 9 4 K r o n v a l l G , Q u i e P G , W i l l i a m s R C J 2 Q u a n t i t a t i o n o f s t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n A : D e t e r m i n a t i o n o f e q u i l i b r i u m c o n s t a n t a n d n u m b e r o f p r o t e i n A r e s i d u e s o n b a c t e r i a . J I m m u n o l 1 0 4 2 2 7 3 , 1 9 7 0 K u c e r a J C , D a v i s R B : T h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h h i s t o p l a s m o s i s a n d a n e l e v a t e d p l a t e l e t a s s o c i a t e d I g G . A m J C l i n P a t h o l 7 9 2 6 4 - 4 , 1 9 8 3 K u e h n N F , G a u n t S D : C l i n i c a l a n d h e m a t o l o g i c fi n d i n g s i n c a n i n e e h r l i c h i o s i s . J A V M A 1 8 6 2 3 5 5 , 1 9 8 5 K u e h n N F , G a u n t S D : H y p o c e l l u l a r m a r r o w a n d e x t r a m e d u l l a r y h e m a t o p o i e s i s i n a d o g : H e m a t o l o g i c r e c o v e r y a f t e r s p l e n e c t o m y . J A V M A 1 8 8 2 1 3 1 3 , 1 9 8 6 4 3 0 K u i j p e r s W A M , O u w e h a n d W H , P e e l e n W , M i c h i e l s J J , E n g e l f r i e t C P , v o n d e m B o r n e A E G K : T h r o m b o c y t o p e n i a d u e t o p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n H b / H I a - r e a c t i v e a u t o a n t i b o d i e s n o n - r e a c t i v e w i t h p l a t e l e t s f r o m E D T A b l o o d . V o x S a n g 6 3 2 1 1 9 , 1 9 9 2 K u n i c k i T J , K o e n i g M B , K r i s t o p e i t S M , A s t e r R H : D i r e c t q u a n t i t a t i o n o f p l a t e l e t - a s s o c i a t e d I g G b y e l e c t r o i m m u n o a s s a y . B l o o d 6 0 : 5 4 , 1 9 8 2 K u r a t a Y , M i y a g a w a S , K o s u g i S : H i g h - t i t e r a n t i n u c l e a r a n t i b o d i e s , a n t i - S S A / R o a n t i b o d i e s a n d a n t i - n u c l e a r R N P a n t i b o d i e s i n p a t i e n t s w i t h i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . T h r o m b H a e m o s t 7 1 2 1 8 4 , 1 9 9 4 K u t e r D J , R o s e n b e r g R D : A p p e a r a n c e o f a m e g a k a r y o c y t e g r o w t h - p r o m o t i n g a c t i v i t y , m e g a p o i e t i n , d u r i n g a c u t e t h r o m b o c y t o p e n i a i n t h e r a b b i t . B l o o d 8 4 2 1 4 6 4 , 1 9 9 4 K u t t i J , Z a r o u l i s C G , S a f a i - K u t t i S , D i n s m o r e R E , D a y N D , G o o d R A : E v i d e n c e t h a t c i r c u l a t i n g i m m u n e c o m p l e x e s r e m o v e t r a n s f u s e d p l a t e l e t s f r o m t h e c i r c u l a t i o n . A m J H e m a t o l 1 1 2 2 5 5 , 1 9 8 1 L a e m m l i U K : C l e a v a g e o f s t r u c t u r a l p r o t e i n s d u r i n g t h e a s s e m b l y o f t h e h e a d o f b a c t e r i o p h a g e T 4 . N a t u r e 2 2 7 2 6 8 0 , 1 9 7 0 L a m b e r t P P , D o r i a u x M , S e n n e s a e l J , V a n h o l d e r R , L a m m e n s - V e r s l i j p e M 2 P a t h o g e n i c i t y o f c a t i o n i z e d a l b u m i n i n t h e d o g : R e n a l a n d e x t r a r e n a l e f f e c t s . C l i n S c i 6 7 2 1 9 , 1 9 8 4 L a m b r i s I D : T h e c h e m i s t r y , b i o l o g y , a n d p h y l o g e n y o f C 3 , i n C r u s e J M , L e w i s R E J ( e d s ) : C o m p l e m e n t T o d a y ( v o l 1 ) . B a s e l , K a r g e r , 1 9 9 3 , p 1 7 L a t i m e r K S , J a i n A V , I n g l e s b y H B , C l a r k s o n W D , J o h n s o n G B : Z i n c - i n d u c e d h e m o l y t i c a n e m i a c a u s e d b y i n g e s t i o n o f p e n n i e s b y a p u p . J A V M A 1 9 5 2 7 7 , 1 9 8 9 L e e s G E , M c K e e v e r P J , R u t h G R : F a t a l t h r o m b o c y t O p e n i c h e m o r r h a g i c d i a t h e s i s a s s o c i a t e d w i t h d a p s o n e a d m i n i s t r a t i o n t o a d o g . J A V M A 1 7 5 2 4 9 , 1 9 7 9 L e i f e r t C E , M a t u s R E : C h r o n i c l y m p h o c y t i c l e u k e m i a i n t h e d o g : 2 2 c a s e s ( 1 9 7 4 - 1 9 8 4 ) . J A V M A 1 8 9 2 2 1 4 , 1 9 8 6 L e i s s i n g e r C A , S t u c k e y W ] 2 U n b o u n d i m m u n o g l o b u l i n s a r e a m a j o r s o u r c e o f e r r o r i n t h e q u a n t i t a t i o n o f p l a t e l e t s u r f a c e - b o u n d i m m u n o g l o b u l i n l e v e l s . T r a n s f u s i o n 3 2 2 1 5 7 , 1 9 9 2 L e r n e r W , C a r u s o R , F a i g D , K a r p a t k i n S : D r u g - d e p e n d e n t a n d n o n - d r u g - d e p e n d e n t a n t i p l a t e l e t a n t i b o d y i n d r u g - i n d u c e d i m m u n o l o g i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B l o o d 6 6 2 3 0 6 , 1 9 8 5 4 3 1 L e v e n e R B , D a n i e l L a m a z i e r e J - M , B r o x m e y e r H E , L u L , R a b e l l i n o E M : H u m a n m e g a k a r y o c y t e s : V . C h a n g e s i n t h e p h e n o t y p i c p r o fi l e o f d i f f e r e n t i a t i n g m e g a k a r y o c y t e s . J E x p M e d 1 6 1 2 4 5 7 , 1 9 8 5 L e w i s D C , M e y e r s K M : A n t i p l a t e l e t a n t i b o d i e s i n d o g s w i t h i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a b i n d t o g l y c o p r o t e i n H b / H I a . P r o c 1 2 t h A n n V e t M e d F o r u m , A m e r i c a n C o l l e g e o f V e t e r i n a r y I n t e r n a l M e d i c i n e , 1 9 9 4 , p 1 7 1 ( a b s t r ) L e w i s D C , M e y e r s K M : E f f e c t o f a n t i c o a g u l a n t a n d b l o o d s t o r a g e t i m e o n p l a t e l e t - b o u n d a n t i b o d y c o n c e n t r a t i o n s i n c l i n i c a l l y n o r m a l d o g s . A m J V e t R e s 5 5 : 6 0 2 , 1 9 9 4 L e w i s D C , M e y e r s K M , C a l l a n M B , B i i c h e l e r J , G i g e r U : D e t e c t i o n o f p l a t e l e t — b o u n d a n d s e r u m p l a t e l e t - b i n d a b l e a n t i b o d i e s f o r d i a g n o s i s o f i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a i n d o g s . J A V M A 2 0 6 2 4 7 , 1 9 9 5 L e w i s D C , M e y e r s K M , M e n a r d M , P e r r y m a n L E 2 A n t i b o d i e s b o u n d t o t h e s u r f a c e o f p l a t e l e t s f r o m d o g s w i t h i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a a r e a n t i p l a t e l e t a u t o a n t i b o d i e s . J V e t I n t M e d 6 : 1 2 3 , 1 9 9 2 ( a b s t r ) L e w i s R M , S c h w a r t z R S , G i l m o r e C E : A u t o i m m u n e d i s e a s e s i n d o m e s t i c a n i m a l s . A n n N Y A c a d S c i 1 2 4 2 1 7 8 , 1 9 6 5 L e w i s R M , S c h w a r t z R , H e n r y W B J 2 C a n i n e s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s . B l o o d 2 5 2 1 4 3 , 1 9 6 5 L i n d b l a d B , B o r g s t r é m A , W a k e fi e l d T W , W h i t e h o u s e W M J , S t a n l e y J C : P r o t a m i n e r e v e r s a l o f a n t i c o a g u l a t i o n a c h i e v e d w i t h a l o w m o l e c u l a r w e i g h t h e p a r i n . T h e e f f e c t s o n e i c o s a n o i d s , c l o t t i n g a n d c o m p l e m e n t f a c t o r s . T h r o m b R e s 4 8 : 3 1 , 1 9 8 7 L i n d m a r k R , T h o r é n - T o l l i n g K , S j 6 q u i s t J 2 B i n d i n g o f i m m u n o g l o b u l i n s t o p r o t e i n A a n d i m m u n o g l o b u l i n l e v e l s i n m a m m a l i a n s e r a . J I m m u n o l M e t h o d s 6 2 : 1 , 1 9 8 3 L i n k l a t e r K A : T h e e x p e r i m e n t a l r e p r o d u c t i o n o f t h r o m b o c y t o p n i c p u r p u r a i n p i g l e t s . R e s V e t S c i 1 8 2 1 2 7 , 1 9 7 5 L j u n g q v i s t U : P l a t e l e t r e s p o n s e t o a c u t e h a e m o r r h a g e . A c t a C h i r S c a n d 1 3 7 2 7 , 1 9 7 1 L o r d i n g P M , B e l l a m y J E C : T r i m e t h o p r i m a n d s u l f a d i a z i n e : A d v e r s e e f f e c t s o f l o n g - t e r m a d m i n i s t r a t i o n i n d o g s . 1 4 2 4 1 0 , 1 9 7 8 L o t t e r M G , B a d e n h o r s t P N , H e y n s A P , V a n R e e n e n O R , P i e t e r s H , M i n n a a r P C : K i n e t i c s , d i s t r i b u t i o n , a n d s i t e s o f d e s t r u c t i o n o f c a n i n e b l o o d p l a t e l e t s w i t h I n - l l l O x i n e . J N u c l M e d 2 1 2 3 6 , 1 9 8 0 4 3 2 L o u a c h e F , B e t t a i e b A , H e n r i A , O k s e n h e n d l e r E , F a r c e t J - P , B i e r l i n g P , S e l i g m a n n M , V a i n c h e n k e r W 2 I n f e c t i o n o f m e g a k a r y o c y t e s b y h u m a n i m m u n o d e fi c i e n c y v i r u s i n s e r 0 p o s i t i v e p a t i e n t s w i t h i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B l o o d 7 8 2 1 6 9 7 , 1 9 9 1 L o v e r i n g S L , P i e r c e K R , A d a m s L G : S e r u m c o m p l e m e n t a n d b l o o d p l a t e l e t a d h e s i v e n e s s i n a c u t e c a n i n e e h r l i c h i o s i s . A m J V e t R e s 4 1 2 1 2 6 6 , 1 9 8 0 L u k S C , M u s c l o w E , S i m o n G T : P l a t e l e t p h a g o c y t o s i s i n t h e s p l e e n o f p a t i e n t s w i t h i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a ( I T P ) . H i s t o p a t h o l o g y 4 2 1 2 7 , 1 9 8 0 L u s t e r M I , B o o r m a n G A , K o r a c h K S , D i e t e r M P , H o n g L 2 M e c h a n i s m s o f e s t r o g e n - i n d u c e d m y e l o t o x i c i t y : e v i d e n c e o f t h y m i c r e g u l a t i o n . I n t J I r n m u n o p h a r m a c o l 6 2 2 8 7 , 1 9 8 4 L y n c h D M , L y n c h J M , H o w e S E : A q u a n t i t a t i v e E L I S A p r o c e d u r e f o r t h e m e a s u r e m e n t o f m e m b r a n e - b o u n d p l a t e l e t - a s s o c i a t e d I g G ( P A I g G ) . A m J C l i n P a t h o l 8 3 2 3 3 1 , 1 9 8 5 M a c a r t n e y L , M c C a n d l i s h I A P , T h o m p s o n H , C o r n w e l l H J C : C a n i n e p a r v o v i r u s e n t e r i t i s 1 : C l i n i c a l , h a e m a t o l o g i c a l a n d p a t h o l o g i c a l f e a t u r e s o f e x p e r i m e n t a l i n f e c t i o n . V e t R e c o r d 1 1 5 2 2 0 1 , 1 9 8 4 M a c a r t n e y L , M c C a n d l i s h I A P , T h o m p s o n H , C o r n w e l l H J C : C a n i n e p a r v o v i r u s e n t e r i t i s 2 2 P a t h o g e n e s i s . V e t R e c o r d 1 1 5 2 4 5 3 , 1 9 8 4 M a c l n t y r e D E , A l l e n A P , T h o r n e K J I , G l a u e r t A M , G o r d o n J L : E n d o t o x i n - i n d u c e d p l a t e l e t a g g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n : 1 . M o r p h o l o g i c a l c h a n g e s a n d p h a r m a c o l o g i c a l e f f e c t s . J C e l l S c i 2 8 2 2 1 1 , 1 9 7 7 M a c k i n A J , A l l e n D G , J o h n s t o n e I B : E f f e c t s o f v i n c r i s t i n e s u l f a t e o n n o r m a l c a n i n e p l a t e l e t n u m b e r a n d f u n c t i o n . P r o c 1 0 t h A n n V e t M e d F o r u m , A m e r i c a n C o l l e g e o f V e t e r i n a r y I n t e r n a l M e d i c i n e , 1 9 9 2 , p 8 2 4 M a c k i n A J , A l l e n D G , J o h n s t o n e I B : E f f e c t s o f v i n c r i s t i n e a n d p r e d n i s o n e o n p l a t e l e t n u m b e r s a n d f u n c t i o n i n c l i n i c a l l y n o r m a l d o g s . A m J V e t R e s 5 6 2 1 0 0 , 1 9 9 5 M a c V i t t i e T J , M o n r o y R L , P a t c h e n M L , S o u z a L M : T h e r a p e u t i c u s e o f r e c o m b i n a n t h u m a n G - C S F ( r h G — C S F ) i n a c a n i n e m o d e l o f s u b l e t h a l a n d l e t h a l w h o l e - b o d y i r r a d i a t i o n . I n t J R a d i a t B i o l 5 7 2 7 2 3 , 1 9 9 0 M a d e w e l l B R : H e m a t o l o g i c a l a n d b o n e m a r r o w c y t o l o g i c a l a b n o r m a l i t i e s i n 7 5 d o g s w i t h m a l i g n a n t l y m p h o m a . J A m A n i m H o s p A s s o c 2 2 2 2 3 5 , 1 9 8 6 M a d e w e l l B R , F e l d m a n B F , O ’ N e i l l S 2 C o a g u l a t i o n a b n o r m a l i t i e s i n d o g s w i t h n e o p l a s t i c d i s e a s e . T h r o m b H a e m o s t 4 4 : 3 5 , 1 9 8 0 4 3 3 M a g e e J M : A s t u d y o f t h e e f f e c t s o f t r e a t i n g p l a t e l e t s w i t h p a r a f o r m a l d e h y d e f o r u s e i n t h e p l a t e l e t s u s p e n s i o n i m m u n o fl u o r e s c e n c e t e s t . B r J H a e m a t o l 6 1 2 5 1 3 , 1 9 8 5 M a g r a n e H J , M a g r a n e W G , R o s s J R : I d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a i n a d o g - a c a s e r e p o r t . J A V M A N o v : 5 2 0 , 1 9 5 9 M a n t h e i U , N i c k e l l s M W , B a r n e s S H , B a l l a r d L L , C u i W - Y , A t k i n s o n J P : I d e n t i fi c a t i o n o f a C 3 b / i C 3 b i n d i n g p r o t e i n o f r a b b i t p l a t e l e t s a n d l e u k o c y t e s : A C R 1 - l i k e c a n d i d a t e f o r t h e i m m u n e a d h e r e n c e r e c e p t o r . J I m m u n o l 1 4 0 2 1 2 2 8 , 1 9 8 8 M a t h e m e C M , S a t t e r fi e l d W C , G a s p a r i n i A , T o n e t t i M , A s t r o f f A B , S c h m i d t R D , R o w e L D , D e L o a c h J R : C l i n i c a l e f fi c a c y a n d t o x i c i t y o f d o x o r u b i c i n e n c a p s u l a t e d i n g l u t a r a l d e h y d e - t r e a t e d e r y t h r o c y t e s a d m i n i s t e r e d t o d o g s w i t h l y m p h o s a r c o m a . A m J V e t R e s 5 5 2 8 4 7 , 1 9 9 4 M a t t h e w m a n L A , K e l l y P J , B o b a d e P A , T a g w i r a M , M a s o n P R , M a j o k A , B r o u q u i P , R a o u l t D : I n f e c t i o n s w i t h B a b e s i a c a n i s a n d E h r l i c h i a c a n i s i n d o g s i n Z i m b a b w e . V e t R e c o r d 1 3 3 2 3 4 4 , 1 9 9 3 M a t u s R E , I e i f e r C E , M a c E w e n G , H u r v i t z A I : P r o g n o s t i c f a c t o r s f o r m u l t i p l e m y e l o m a i n t h e d o g . J A V M A 1 8 8 2 1 2 8 8 , 1 9 8 6 M a u p i n B 2 B l o o d P l a t e l e t s i n M a n a n d A n i m a l s i n T w o V o l u m e s . ( v o l 1 ) B r a u n s c h w e i g , P e r g a m o n P r e s s , 1 9 6 9 , p 4 9 3 M a z u r E M , H o f f m a n R , C h a s i s J , M a r c h e s i S , B r u n o E 2 I m m u n o fl u o r e s c e n t i d e n t i fi c a t i o n o f h u m a n m e g a k a r y o c y t e c o l o n i e s u s i n g a n a n t i p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n a n t i s e r u m . B l o o d 5 7 2 2 7 7 , 1 9 8 1 M a z u r E M , S o u t h K : H u m a n m e g a k a r y o c y t e c o l o n y - s t i m u l a t i n g f a c t o r i n s e r a f r o m a p l a s t i c d o g s : P a r t i a l p u r i fi c a t i o n , c h a r a c t e r i z a t i o n , a n d d e t e r m i n a t i o n o f h e m a t o p o i e t i c c e l l l i n e a g e s p e c i fi c i t y . E x p H e m a t o l 1 3 2 1 1 6 4 , 1 9 8 5 M c A n u l t y J F , R u d d R G : T h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h v a c c i n a t i o n o f a d o g w i t h a m o d i fi e d — l i v e p a r a m y x o v i r u s v a c c i n e . J A V M A 1 8 6 2 1 2 1 7 , 1 9 8 5 M c C a n d l i s h I A P , M u n r o C D , B r e e z e R G , N a s h A S : H o r m o n e p r o d u c i n g o v a r i a n t u m o u r s i n t h e d o g . V e t R e c o r d 1 0 5 2 9 , 1 9 7 9 M c h e K R , S h a t t i l S J , C i n e s D B 2 P l a t e l e t a c t i v a t i o n i n d u c e s i n c r e a s e d F c y r e c e p t o r e x p r e s s i o n . J I m m u n o l 1 4 4 2 3 9 2 0 , 1 9 9 0 M c D o n a l d T P , C l i f t R , J o n e s J B : C a n i n e c y c l i c h e m a t o p o i e s i s : P l a t e l e t s i z e a n d t h r o m b o p o i e t i n l e v e l i n r e l a t i o n t o p l a t e l e t c o u n t . P r o c S o c E X p B i o l M e d 1 5 3 2 4 2 4 , 1 9 7 6 4 3 4 M c E w a n N A : P r e s u m p t i v e t r i m e t h o p r i m - s u l p h a m e t h o x a z o l e a s s o c i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a a n d a n a e m i a i n a d o g . J S m a l l A n i m P r a c t 3 3 2 2 7 , 1 9 9 2 M c M i l l a n R , L u i k e n G A , L e v y R , Y e l e n o s k y R , L o n g m i r e R L : A n t i b o d y a g a i n s t m e g a k a r y o c y t e s i n i d i o p a t i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . J A m M e d A s s o c 2 3 9 2 2 4 6 0 , 1 9 7 8 M c M i l l a n R , T a n i P , M i l l a r d F , B e r c h t o l d P , R e n s h a w L , W o o d s V L J : P l a t e l e t - a s s o c i a t e d a n d p l a s m a a n t i - g l y c o p r o t e i n a u t o a n t i b o d i e s i n c h r o n i c I T P . B l o o d 7 0 2 1 0 4 0 , 1 9 8 7 M c V e y D S , R u d d R , T o s h a c h K , M o o r e W E , K e e t o n K S : S y s t e m i c a u t o i m m u n e d i s e a s e a n d c o n c u r r e n t n e m a t o d e i n f e c t i o n i n a d o g . J A V M A 1 9 5 2 9 5 7 , 1 9 8 9 M c V e y D S , S h u m a n W S : D e t e c t i o n o f a n t i p l a t e l e t i m m u n o g l o b u l i n i n t h r o m b o c y t o p e n i c d o g s . V e t I m m u n o I m m u n o p a t h 2 2 2 1 0 1 , 1 9 8 9 M e u r s K M , B r e i t s c h w e r d t E B , B a t y C J , Y o u n g M A : P o s t s u r g i c a l m o r t a l i t y s e c o n d a r y t o z i n c t o x i c i t y i n d o g s . V e t H u m T o x i c o l 3 3 2 5 7 9 , 1 9 9 1 M e y e r s K M : P a t h o b i o l o g y o f a n i m a l p l a t e l e t s . A d v V e t S c i C o m p M e d 3 0 2 1 3 1 , 1 9 8 5 M e y e r s K M , B o e h m e M , I n b a r 0 : B i n d i n g o f 1 2 5 1 - l a b e l e d e n d o t o x i n t o b o v i n e , c a n i n e , a n d e q u i n e p l a t e l e t s a n d e n d o t o x i n - i n d u c e d a g g l u t i n a t i o n o f c a n i n e p l a t e l e t s . A m J V e t R e s 4 3 2 1 7 2 1 , 1 9 8 2 M e z z a n o D , A r a n d a E , F o r a d o r i A : C o m p a r a t i v e s t u d y o f s i z e , t o t a l p r o t e i n , fi b r i n o g e n a n d 5 - H T c o n t e n t o f h u m a n a n d c a n i n e p l a t e l e t d e n s i t y s u b p o p u l a t i o n s . T h r o m b H a e m o s t 5 6 2 2 8 8 , 1 9 8 6 M e z z a n o D , d e l P i n o G E , M o n t e s i n o s M , G a r c i a M E , A r a n d a E , F o r a d o r i A : P l a t e l e t 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e i n c r e a s e s w i t h p l a t e l e t a g e i n d o g s . T h r o m b H a e m o s t 6 6 2 2 5 4 , 1 9 9 1 M i e s c h e r P A , B e l e h u A : I e i s h m a n i a s i s : H e m a t o l o g i c a s p e c t s . S e m i n H e m a t o l 1 9 : 9 3 , 1 9 8 2 M i e s c h e r P A , T u c c i A , B e r i s P , F a v r e H : A u t o i m m u n e h e m o l y t i c a n e m i a a n d / o r t h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h l u p u s p a r a m e t e r s . S e m i n H e m a t o l 2 9 2 1 3 , 1 9 9 2 M i l l e r E : I r n m u n o s u p p r e s s i v e t h e r a p y i n t h e t r e a t m e n t o f i m m u n e - m e d i a t e d d i s e a s e . J V e t I n t M e d 6 : 2 0 6 , 1 9 9 2 M i n c h i n t o n R M , K e n d r a J , W a t e r s A H , B a r r e t t A J 2 A u t o i m m u n e t h r o m b o c y t O p e n i a a c q u i r e d f r o m a n a l l o g e n e i c b o n e - m a r r o w g r a f t . L a n c e t i i 2 6 2 7 , 1 9 8 2 4 3 5 M i n t e r F M , I n g r a m M 2 P l a t e l e t v o l u m e : d e n s i t y r e l a t i o n s h i p s i n n o r m a l a n d a c u t e l y b l e d d o g s . B r J H a e m a t o l 2 0 : 5 5 , 1 9 7 1 M i z u t a n i H , F u r u b a y a s h e T , K a s h i w a g i H , H o n d a S , T a k e H , K u r a t a Y , Y o n e z a w a T , T a r u i S : B c e l l s e x p r e s s i n g C D 5 a n t i g e n a r e m a r k e d l y i n c r e a s e d i n p e r i p h e r a l b l o o d a n d s p l e e n l y m p h o c y t e s f r o m p a t i e n t s w i t h i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B r J H a e m a t o l 7 8 2 4 7 4 , 1 9 9 1 M o e J B , P i p e r R C , T a n a s e H , S o t a n i K , M a n a b e J 2 P r e c l i n i c a l s a f e t y s t u d i e s o f c e f m e t a z o l e . J A n t i m i c r o b C h e m o t h e r 2 3 2 1 2 5 , 1 9 8 9 M o l l i s o n P L , E n g e l f r i e t C P , C o n t r e r a s M 2 A B O , L e w i s , I i a n d P G r o u p s , i n B l o o d T r a n s f u s i o n i n C l i n i c a l M e d i c i n e ( 9 t h e d ) . O x f o r d , B l a c k w e l l S c i e n t i fi c , 1 9 9 3 , p 1 4 8 M o m p a r l e r R L , G o n z a l e s F A , M o m p a r l e r L F , M a A : P r e c l i n i c a l e v a l u a t i o n o f h e m a t o p o i e t i c t o x i c i t y o f a n t i l e u k e m i c a g e n t , 5 — A Z A - 2 ’ - d e o x y c y t i d i n e . T o x i c o l o g y 5 7 2 3 2 9 , 1 9 8 9 M o o r e D J , W i l l i a m s M C : D i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n : A c o m p l i c a t i o n o f B a b e s i a c a n i s i n f e c t i o n i n t h e d o g . J S A f r V e t A s s o c 5 0 2 2 6 5 , 1 9 7 9 M o r r i s o n F S , B a l d i n i M G : A n t i g e n i c - r e l a t i o n s h i p b e t w e e n b l o o d p l a t e l e t s a n d v a s c u l a r e n d o t h e l i u m . B l o o d 3 3 : 4 6 , 1 9 6 9 M o r s e B S , G i u l i a n i D , N u s s b a u m M 2 Q u a n t i t a t i o n o f p l a t e l e t - a s s o c i a t e d I g G b y r a d i a l i m m u n o d i f f u s i o n . B l o o d 5 7 2 8 0 9 , 1 9 8 1 M u e l l e r - E c k h a r d t C : I d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a ( I T P ) : C l i n i c a l a n d i m m u n o l o g i c c o n s i d e r a t i o n s . S e m T h r o m b H e m o s t 3 : 1 2 5 , 1 9 7 7 M u e l l e r - E c k h a r d t C , K i e f e l V 2 L a b o r a t o r y m e t h o d s f o r t h e d e t e c t i o n o f p l a t e l e t a n t i b o d i e s a n d i d e n t i fi c a t i o n o f a n t i g e n s , i n K u n i c k i T J , G e o r g e J N ( e d s ) : P l a t e l e t I m m u n o b i o l o g y : M o l e c u l a r a n d C l i n i c a l A s p e c t s . P h i l a d e l p h i a , L i p p i n c o t t , 1 9 8 9 , p 4 3 6 M u e l l e r - E c k h a r d t C , M u e l l e r - E c k h a r d t G , K a y s e r W , V o s s R M , W e g n e r J , K i i e n z l e n E 2 P l a t e l e t a s s o c i a t e d I g G , p l a t e l e t s u r v i v a l , a n d p l a t e l e t s e q u e s t r a t i o n i n t h r o m b o c y t o p e n i a . B r J H a e m a t o l 5 2 2 4 9 , 1 9 8 2 M u r p h y T L , T a y l o r F B , W e l s m a n I M , G i l l i a m J M , T a y l o r F B J r : C o m p l e m e n t - d e p e n d e n t a c t i v a t i o n o f c a n i n e p l a t e l e t s b y e n d o t o x i n a n d c o l l a g e n : I n v i t r o s t u d i e s . C l i n I m m u n o l I m m u n o p a t h o l 1 6 2 5 7 , 1 9 8 0 M u r t a u g h R J , J a c o b s R M : S u s p e c t e d i m m u n e - m e d i a t e d m e g a k a r y o c y t i c h y p o p l a s i a o r a p l a s i a i n a d o g . J A V M A 1 8 6 2 1 3 1 3 , 1 9 8 5 4 3 6 N a j e a n Y , R a i n J - D 2 T h e m e c h a n i s m o f t h r o m b o c y t o p e n i a i n p a t i e n t s w i t h H I V i n f e c t i o n . J L a b C l i n M e d 1 2 3 2 4 1 5 , 1 9 9 4 N a k e f f A , I n g r a m M : P l a t e l e t c o u n t : v o l u m e r e l a t i o n s h i p s i n f o u r m a m m a l i a n s p e c i e s . J A p p l P h y s i o l 2 8 2 5 3 0 , 1 9 7 0 N a s h R A , S c h u e n i n g F , A p p e l b a u m F , H a m m o n d W P , B o o n e T , M o r r i s C F , S l i c h t e r S J , S t o r b R 2 M o l e c u l a r c l o n i n g a n d i n v i v o e v a l u a t i o n o f c a n i n e g r a n u l o c y t e - m a c r O p h a g e c o l o n y - s t i m u l a t i n g f a c t o r . B l o o d 7 8 2 9 3 0 , 1 9 9 1 N a v a r r o C E K , K o c i b a G J 2 H e m o s t a t i c c h a n g e s i n d o g s w i t h e x p e r i m e n t a l L e p t o s p i r a i n t e r r o g a n s s e r o v a r i c t e r o h a e m o r r h a g i a e i n f e c t i o n . A m J V e t R e s 4 3 2 9 0 4 , 1 9 8 2 N e a m e P B , K e l t o n J G , W a l k e r I R , S t e w a r t 1 0 , N o s s e l H L , H i r s h J : T h r o m b o c y t o p e n i a i n s e p t i c e m i a : T h e r o l e o f d i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n . B l o o d 5 6 : 8 8 , 1 9 8 0 N e l J D , S t e v e n s K , M o u t o n A , P r e t o r i u s F 2 P l a t e l e t - b o u n d I g M i n a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a . B l o o d 6 1 2 1 1 9 , 1 9 8 3 N e l s o n D S : I m m u n e A d h e r e n c e , i n D i x o n F J J , H u m p h r e y J H ( e d s ) : A d v a n c e s I n I m m u n o l o g y ( v o l 3 ) . N e w Y o r k , A c a d e m i c P r e s s , 1 9 6 3 , p 1 3 1 N e l s o n R A J 2 T h e I m m u n e - a d h e r e n c e p h e n o m e n o n : A n i m m u n o l o g i c a l l y s p e c i fi c r e a c t i o n b e t w e e n m i c r o o r g a n i s m s a n d e r y t h r o c y t e s l e a d i n g t o e n h a n c e d p h a g o c y t o s i s . S c i e n c e 1 1 8 2 7 3 3 , 1 9 5 3 N g Y C , S c h i f f e r l i J A : C o m p l e m e n t , i m m u n e c o m p l e x e s a n d i m m u n e c o m p l e x d i s e a s e , i n W h a l e y K , L o o s M , W e i l e r J M ( e d s ) : C o m p l e m e n t i n H e a l t h a n d D i s e a s e ( 2 n d e d , v o l 2 0 ) . D o r d r e c h t , K l u w e r A c a d e m i c P u b , 1 9 9 3 , p 1 9 9 N i e m i n e n U , P e l t o l a H , S y r é i l i i M T , M i i k i p e r n a a A , K e k o m i i k i R 2 A c u t e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a f o l l o w i n g m e a s l e s , m u m p s a n d r u b e l l a v a c c i n a t i o n . A r e p o r t o n 2 3 p a t i e n t s . A c t a P a e d i a t r 8 2 2 2 6 7 , 1 9 9 3 N i e s s n e r H , C l e m e t s o n K J , P a n z e r S , M u e l l e r - E c k h a r d t C , S a n t o s o S , B e t t e l h e i m P 2 A c q u i r e d t h r o m b a s t h e n i a d u e t o G P H b / I H a - s p e c i fi c p l a t e l e t a u t o a n t i b o d i e s . B l o o d 6 8 2 5 7 1 , 1 9 8 6 N o r t h e r n J J , T v e d t e n H W : D i a g n o s i s o f m i c r o t h r o m b o c y t o s i s a n d i m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g s w i t h t h r o m b o c y t o p e n i a : 6 8 c a s e s ( 1 9 8 7 — 1 9 8 9 ) . J A V M A 2 0 0 2 3 6 8 , 1 9 9 2 N y i n d o M , H u x s o l l D L , R i s t i c M , K a k o m a I , B r o w n J L , C a r s o n C A , S t e p h e n s o n E H 2 C e l l - m e d i a t e d a n d h u m o r a l i m m u n e r e s p o n s e s o f G e r m a n S h e p h e r d D o g s a n d B e a g l e s t o e x p e r i m e n t a l i n f e c t i o n w i t h E h r l i c h i a c a n i s . A m J V e t R e s 4 1 2 2 5 0 , 1 9 8 0 4 3 7 O ’ D o n n e l l M R , S l i c h t e r S J , W e i d e n P L , S t o r b R 2 P l a t e l e t a n d fi b r i n o g e n k i n e t i c s i n c a n i n e t u m o r s . C a n c e r R e s 4 1 2 1 3 7 9 , 1 9 8 1 O g a s a w a r a K , U e k i J , T a k e n a k a M , F u r i h a t a K : S t u d y o n t h e e x p r e s s i o n o f A B H a n t i g e n s o n p l a t e l e t s . B l o o d 8 2 2 9 9 3 , 1 9 9 3 O g i l i v i e G K , M o o r e A S , C h e n C , C i e k o t P A , A t w a t e r S W , B e r g m a n P J , W a l t e r s L M : T o x i c o s e s a s s o c i a t e d w i t h t h e a d m i n i s t r a t i o n o f m i t o x a n t r o n e t o d o g s w i t h m a l i g n a n t t u m o r s : A d o s e e s c a l a t i o n s t u d y . J A V M A 2 0 5 2 5 7 0 , 1 9 9 4 O g i l v i e G K , O b r a d o v i c h J E , E l r n s l i e R E , V a i l D M , M o o r e A S , C u r t i s C R , S t r a w R C , D i c k i n s o n K , C o o p e r M F , W i t h r o w S J 2 T o x i c o s e s a s s o c i a t e d w i t h a d m i n i s t r a t i o n o f m i t o x a n t r o n e t o d o g s w i t h m a l i g n a n t t u m o r s . J A V M A 1 9 8 2 1 6 1 3 , 1 9 9 1 O ’ K e e f e D A , C o u t o C G : C o a g u l a t i o n a b n o r m a l i t i e s a s s o c i a t e d w i t h n e o p l a s i a . V e t C l i n N o r t h A m S m a l l A n i m P r a c t 1 8 2 1 5 7 , 1 9 8 8 O ’ K e e f e D A , C o u t o C G , B u r k e - S c h w a r t z C , J a c o b s R M : S y s t e m i c m a s t o c y t o s i s i n 1 6 d o g s . J V e t I n t M e d 1 2 7 5 , 1 9 8 7 P a g e R L , M a c y D W , T h r a l l D E , D e w h i r s t M W , A l l e n S L , H e i d n e r G L , S i m D A , M c G e e M L , G i l l e t t e E L : U n e x p e c t e d t o x i c i t y a s s o c i a t e d w i t h u s e o f b o d y s u r f a c e a r e a f o r d o s i n g m e l p h a l a n i n t h e d o g . C a n c e r R e s 4 8 2 2 8 8 , 1 9 8 8 P a n z e r S , N i e s s n e r H , I e c h n e r K , D u d c z a k R , J i i g e r U , M a y r W R : P l a t e l e t - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n s I g G , I g M , I g A a n d c o m p l e m e n t C 3 c i n c h r o n i c i d i o p a t h i c a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t O p e n i a : R e l a t i o n t o t h e s e q u e s t r a t i o n p a t t e r n o f 1 1 1 I n d i u m l a b e l l e d p l a t e l e t s . S c a n d J H a e m a t o l 3 7 : 9 7 , 1 9 8 6 P a n z e r S , P e n n e r E , G r a n i n g e r W , S c h u l z E , S m o l e n J S : A n t i n u c l e a r a n t i b o d i e s i n p a t i e n t s w i t h c h r o n i c i d i o p a t h i c a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a f o l l o w e d 2 - 3 0 y e a r s . A m J H e m a t o l 3 2 2 1 0 0 , 1 9 8 9 P a r r e n P W I H , W a r m e r d a m P A M , B o e i j e L C M , A r t s J , W e s t e r d a a l N A C , V l u g A , C a p e l P J A , A a r d e n L A , V a n d e W i n k e l J G ] 2 O n t h e i n t e r a c t i o n o f I g G s u b c l a s s e s w i t h t h e l o w a f fi n i t y F c y R H a ( C D 3 2 ) o n h u m a n m o n o c y t e s , n e u t r o p h i l s , a n d p l a t e l e t s : A n a l y s i s o f a f u n c t i o n a l p o l y m o r p h i s m t o h u m a n I g G 2 . J C l i n I n v e s t 9 0 2 1 5 3 7 , 1 9 9 2 P e g e l s J G , H e l m e r h o r s t F M , v a n L e e u w e n E F , v a n d e P l a s - v a n D a l e n C , E n g e l f r i e t C P , v o n d e m B o r n e A E G K : T h e E v a n s s y n d r o m e : c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e r e s p o n s i b l e a u t o a n t i b o d i e s . B r J H a e m a t o l 5 1 2 4 4 5 , 1 9 8 2 P e l t o l a H , H e i n o n e n O P , V a l l e M , P a u n i o M , V i r t a n e n M , K a r a n k o V , C a n t e l l K : T h e e l i m i n a t i o n o f i n d i g e n o u s m e a s l e s , m u m p s , a n d r u b e l l a f r o m F i n l a n d b y a 1 2 - y e a r , t w o - d o s e v a c c i n a t i o n p r o g r a m . N E n g l J M e d 3 3 1 2 1 3 9 7 , 1 9 9 4 4 3 8 P e n g Z , S i m o n s F E R , B e c k e r A B : D i f f e r e n t i a l b i n d i n g p r o p e r t i e s o f p r o t e i n A a n d p r o t e i n G f o r d o g i m m u n o g l o b u l i n s . J I m m u n o l M e t h o d s 1 4 5 2 2 5 5 , 1 9 9 1 P e n n i n g t o n D G , H y m a n A L , J a q u e s W E : P u l m o n a r y v a s c u l a r r e s p o n s e t o e n d o t o x i n i n i n t a c t d o g s . S u r g e r y 7 3 2 2 4 6 , 1 9 7 3 P e r m a n V , C r o n k i t e E P , B o n d V P , S o r e n s e n D K : T h e r e g e n e r a t i v e a b i l i t y o f h e m o p o i e t i c t i s s u e f o l l o w i n g l e t h a l X - i r r a d i a t i o n i n d o g s . B l o o d 1 9 2 7 2 4 , 1 9 6 2 P f u e l l e r S L , F i r k i n B G , M c G r a t h K M , L o g a n D : A n a l y s i s o f i m m u n o g l o b u l i n s t h a t b i n d t o p l a t e l e t s f r o m s e r u m o f p a t i e n t s w i t h i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a : M o l e c u l a r w e i g h t d i s t r i b u t i o n . T h r o m b R e s 4 7 2 3 0 5 , 1 9 8 7 P f u e l l e r S L , L u s c h e r E F : T h e e f f e c t s o f i m m u n e c o m p l e x e s o n b l o o d p l a t e l e t s a n d t h e i r r e l a t i o n s h i p t o c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n . I m m u n o c h e m i s t r y 9 2 1 1 5 1 , 1 9 7 2 P h i l i p s D R , A g i n P P : P l a t e l e t p l a s m a m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s : E v i d e n c e f o r t h e p r e s e n c e o f n o n e q u i v a l e n t d i s u l fi d e b o n d s u s i n g n o n r e d u c e d - r e d u c e d t w o - d i m e n s i o n a l g e l e l e c t r o p h o r e s i s . J B i o l C h e m 2 5 2 2 2 1 2 1 , 1 9 7 7 P i d a r d D : T h e a p p l i c a t i o n o f c r o s s e d - i m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s a n d r e l a t e d i m m u n o a s s a y s t o t h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f g l y c o p r o t e i n s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n , i n K u n i c k i T J , G e o r g e J N ( e d s ) : P l a t e l e t I m m u n o b i o l o g y : M o l e c u l a r a n d C l i n i c a l A s p e c t s . P h i l a d e l p h i a , L i p i n c o t t , 1 9 8 7 , p 1 9 3 P i d a r d D , D i d r y D , K u n i c k i T J , N u r d e n A T : T e m p e r a t u r e - d e p e n d e n t e f f e c t s o f E D T A o n t h e m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n H b — H I a c o m p l e x a n d p l a t e l e t a g g r e g a b i l i t y . B l o o d 6 7 2 6 0 4 , 1 9 8 6 P i e r c e K R , M a r r s G E , H i g h t o w e r D 2 A c u t e c a n i n e e h r l i c h i o s i s : P l a t e l e t s u r v i v a l a n d f a c t o r 3 a s s a y . A m J V e t R e s 3 8 2 1 8 2 1 , 1 9 7 7 P i l l e m e r L , B l u m L , L e p o w H 1 , R o s s O A , T o d d E W , W a r d l a w A C : T h e p r o p e r d i n s y s t e m a n d i m m u n i t y : 1 . D e m o n s t r a t i o n a n d i s o l a t i o n o f a n e w s e r u m p r o t e i n , p r o p e r d i n , a n d i t s r o l e i n i m m u n e p h e n o m e n a . S c i e n c e 1 2 0 : 2 7 9 , 1 9 5 4 P i n e a u S , B e l b e c k L W , M o o r e S : I e v a m i s o l e r e d u c e s t h e t h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h m y x o v i r u s v a c c i n a t i o n . C a n V e t J 2 1 2 8 2 , 1 9 8 0 P i z z i F , C a r r a r a P M , A l d e g h i A , E r i d a n i S : I r n m u n o fl o u r e s c e n c e o f m e g a k a r y o c y t e s i n t h e t h r o m b o c y t O p e n i c p u r p u r a s . B l o o d 2 7 2 5 2 1 , 1 9 6 6 P r a s s e K W , C r o u s e r D , B e u t l e r E , W a l k e r M , S c h a l l W D : P y r u v a t e k i n a s e d e fi c i e n c y a n e m i a w i t h t e r m i n a l m y e l o fi b r o s i s a n d o s t e o s c l e r o s i s i n a B e a g l e . J A V M A 1 6 6 2 1 1 7 0 , 1 9 7 5 4 3 9 Q u e s e n b e r r y P J 2 C y c l i c h e m a t o p o i e s i s : D i s o r d e r s o f p r i m i t i v e h e m a t o p o i e t i c s t e m c e l l s . E x p H e m a t o l 1 1 2 6 8 7 , 1 9 8 3 R a b e l l i n o E M , L e v e n e R B , L e u n g L L K , N a c h m a n R L : H u m a n m e g a k a r y o c y t e s : H E x p r e s s i o n o f p l a t e l e t p r o t e i n s i n e a r l y m a r r o w m e g a k a r y o c y t e s . J E x p M e d 1 5 4 2 8 8 , 1 9 8 1 R a m o s R R , C u r t i s B R , C h a p l i n H : A l a t e x p a r t i c l e a s s a y f o r p l a t e l e t - a s s o c i a t e d I g G . T r a n s f u s i o n 3 2 2 2 3 5 , 1 9 9 2 R a s k i n R E , K r e h b i e l J D : H i s t o p a t h o l o g y o f c a n i n e b o n e m a r r o w i n m a l i g n a n t l y m p h o p r o l i f e r a t i v e d i s o r d e r s . V e t P a t h o l 2 5 : 8 3 , 1 9 8 8 R a u l s D O , M o r e n o A J , G r e g o r y G , P e n n e y L L , P a r k e r G 2 I n d i u m — 1 1 1 o x i n e p l a t e l e t s u r v i v a l i n d o g s : E f f e c t o f d o x o r u b i c i n a n d d a c r o n g r a f t s . J N u c l M e d 2 6 2 1 3 3 1 , 1 9 8 5 R a y m o n d S L , D o d d s W J 2 P l a t e l e t m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s i n n o r m a l d o g s a n d d o g s w i t h h e m o s t a t i c d e f e c t s . J L a b C l i n M e d 9 3 2 6 0 7 , 1 9 7 9 R e a g a n W ] 2 A r e v i e w o f m y e l o fi b r o s i s i n d o g s . T o x i c o l P a t h o l 2 1 2 1 6 4 , 1 9 9 3 R e a g a n W J , S c o t t - M o n c r i e f f J C , S n y d e r P W , K e l l y K , G l i c k m a n L T : A c t i o n o f h u m a n i n t r a v e n o u s g a m m a g l o b u l i n o n t h e c a n i n e h e m a t o p o i e t i c s y s t e m . B l o o d 8 4 ( s u p p ) 2 6 6 2 a , 1 9 9 4 ( a b s t r ) R e a r d o n M J , P i e r c e K R : A c u t e e x p e r i m e n t a l c a n i n e e h r l i c h i o s i s : I . S e q u e n t i a l r e a c t i o n o f t h e h e m i c a n d l y m p h o r e t i c u l a r s y s t e m s . V e t P a t h o l 1 8 : 4 8 , 1 9 8 1 R e i d D M , J o n e s C E , L u o C , S h u l m a n N R 2 I m m u n o g l o b u l i n s f r o m n o r m a l s e r a b i n d p l a t e l e t v i n c u l i n a n d t a l i n a n d t h e i r p r o t e o l y t i c f r a g m e n t s . B l o o d 8 1 2 7 4 5 , 1 9 9 3 R e n t R , E r t e l N , E i s e n s t e i n R , G e w u r z H 2 C o m p l e m e n t a c t i v a t i o n b y i n t e r a c t i o n o f p o l y a n i o n s a n d p o l y c a t i o n s : l . H e p a r i n - p r o t a m i n e i n d u c e d c o n s u m p t i o n o f c o m p l e m e n t . J I m m u n o l 1 1 4 2 1 2 0 , 1 9 7 5 R o l o v i c Z , B a l d i n i M , D a m e s h e k W 2 M e g a k a r y o c y t o p o i e s i s i n e x p e r i m e n t a l l y i n d u c e d i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a . B l o o d 3 5 2 1 7 3 , 1 9 7 0 R o s e n b e r g J C , L e k a s N , L y s z K , M o r r e l l R 2 E f f e c t o f a n t i t h y m o c y t e g l o b u l i n a n d o t h e r i m m u n e r e a c t a n t s o n h u m a n p l a t e l e t s . S u r g e r y 7 7 2 5 2 0 , 1 9 7 5 R o s e n f e l d S I , A n d e r s o n C L : F c r e c e p t o r s o f h u m a n p l a t e l e t s , i n K u n i c k i T J , G e o r g e J N ( e d s ) : P l a t e l e t I m m u n o b i o l o g y : M o l e c u l a r a n d C l i n i c a l A s p e c t s . P h i l a d e l p h i a , L i p p i n c o t t , 1 9 8 9 , p 3 3 7 4 4 0 R o s e n t h a l R C : C h e m o t h e r a p y , i n W i t h r o w S J , M a c E w e n E G ( e d s ) : C l i n i c a l V e t e r i n a r y O n c o l o g y . P h i l a d e l p h i a , L i p p i n c o t t , 1 9 8 9 , p 6 3 R o s s G D , M e d o f M E : M e m b r a n e c o m p l e m e n t r e c e p t o r s s p e c i fi c f o r b o u n d f r a g m e n t s o f C 3 , i n D i x o n F J ( e d ) : A d v a n c e s i n I m m u n o l o g y ( v o l 3 7 ) . O r l a n d o , A c a d e m i c P r e s s , 1 9 8 5 , p 2 1 7 R o s s e W F , A d a m s J P , Y o u n t W J 2 S u b c l a s s e s o f I g G a n t i b o d i e s i n i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a ( I T P ) . B r J H a e m a t o l 4 6 2 1 0 9 , 1 9 8 0 R o s z e l J , P r i e r J E , L e p r o w s k a I : T h e o c c u r r e n c e o f m e g a k a r y o c y t e s i n t h e p e r i p h e r a l b l o o d o f d o g s . J A V M A 1 4 7 2 1 3 3 , 1 9 6 5 R o w s e l l H C , G l y n n M F , M u s t a r d J F , M u r p h y E A : E f f e c t o f h e p a r i n o n p l a t e l e t e c o n o m y i n d o g s . A m J P h y s i 0 1 2 1 3 2 9 1 5 , 1 9 6 7 R y u T , D a v i s J M , S c h w a r t z K A : D o s e - d e p e n d e n t p l a t e l e t s t i m u l a t i o n a n d i n h i b i t i o n i n d u c e d b y a n t i — P l A l I g G . J L a b C l i n M e d 1 1 6 2 9 1 , 1 9 9 0 S a f a i - K u t t i S , Z a r o u l i s C G , D a y N K , G o o d R A , K u t t i J 2 P l a t e l e t t r a n s f u s i o n t h e r a p y a n d c i r c u l a t i n g i m m u n e c o m p l e x e s . V o x S a n g 3 9 : 2 2 , 1 9 8 0 S a r g e n t A U , J o h n s o n S B , R i c h a r d s o n A K : T h e i s o l a t i o n a n d f u n c t i o n a l p u r i fi c a t i o n o f t h e fi r s t s e v e n c o m p o n e n t s o f c a n i n e h e m o l y t i c c o m p l e m e n t . I m m u n o c h e m i s t r y 1 3 2 8 2 3 , 1 9 7 6 S c h a e f f e r R C J r , B r i s t o n C , C h i l t o n S - M , C a r l s o n R W : H y p o t e n s i v e a n d h e m o s t a t i c p r o p e r t i e s o f r a t t l e s n a k e ( C r o t a l u s v i r i d i s h e l l e r i ) v e n o m a n d v e n o m f r a c t i o n s i n d o g s . J P h a r m a c o l E x p T h e r 2 3 0 2 3 9 3 , 1 9 8 4 S c h a l m O W : P h e n y l b u t a z o n e t o x i c i t y i n t w o d o g s . C a n i n e P r a c t 6 2 4 7 , 1 9 7 9 S c h e l l i n g C G , G r e e n e C E , P r e s t w o o d A K , T s a n g V C W : C o a g u a l t i o n a b n o r m a l i t i e s a s s o c i a t e d w i t h a c u t e A n g i o s t r o n g y l u s v a s o r u m i n f e c t i o n i n d o g s . A m J V e t R e s 4 7 2 2 6 6 9 , 1 9 8 6 S c h l i e v e r t P M : R o l e o f s u p e r a n t i g e n s i n h u m a n d i s e a s e . J I n f e c t D i s 1 6 7 2 9 9 7 , 1 9 9 3 S c h r e z e n m e i e r H , M i i l l e r H , G u n s i l i u s E , H e i m p e l H , S e i f r i e d E 2 A n t i c o a g u l a n t - i n d u c e d p s e u d o t h r o m b o c y t o p e n i a a n d p s e u d o l e u c o c y t o s i s . T h r o m b H a e m o s t 7 3 2 5 0 6 , 1 9 9 5 S c h u e n i n g F G , S t o r b R , G o e h l e S , N a s h R , G r a h a m T C , A p p e l b a u m F R , H a c k m a n R , S a n d m a i e r B M , U r d a l D L : S t i m u l a t i o n o f c a n i n e h e m a t o p o i e s i s b y r e c o m b i n a n t h u m a n g r a n u l o c y t e - m a c r o p h a g e c o l o n y - s t i m u l a t i n g f a c t o r . E x p H e m a t o l 1 7 2 8 8 9 , 1 9 8 9 4 4 1 S c h w a r t z B S , M o n r o e M C : H u m a n p l a t e l e t a g g r e g a t i o n i s i n i t i a t e d b y p e r i p h e r a l b l o o d m o n o n u c l e a r c e l l s e x p o s e d t o b a c t e r i a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e i n v i t r o . J C l i n I n v e s t 7 8 2 1 1 3 6 , 1 9 8 6 S c h w a r t z K A : P l a t e l e t a n t i b o d y : R e v i e w o f d e t e c t i o n m e t h o d s . A m J H e m a t o l 2 9 2 1 0 6 , 1 9 8 8 S c h w a r t z K A , G a u g e r J A , D a v i s J M : P r e c i s e q u a n t i t a t i o n o f P A I g G : A n e w r a d i o m e t r i c m i c r o t e c h n i q u e . A m J H e m a t o l 3 3 2 1 6 7 , 1 9 9 0 S c h w a r t z K A , S l i c h t e r S J , H a r k e r L A : I m m u n e - m e d i a t e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n a n d t h r o m b o c y t o p e n i a i n p a t i e n t s w i t h s o l i d t u m o u r s . B r J H a e m a t o l 5 1 : 1 7 , 1 9 8 2 S c o t t M A , D a v i s J M , S c h w a r t z K A : A n e w i m m u n o r a d i o m e t r i c a s s a y f o r c a n i n e p l a t e l e t - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n . B l o o d 8 4 , s u p p 1 2 1 8 7 a , 1 9 9 4 ( a b s t r ) S e a m e r J , S n a p e T 2 E h r l i c h i a c a n i s a n d t r o p i c a l c a n i n e p a n c y t o p a e n i a . R e s V e t S c i 1 3 2 3 0 7 , 1 9 7 2 S e a r c y G P , T a s k e r J B , M i l l e r D R : A n i m a l m o d e l o f h u m a n d i s e a s e : P y r u v a t e k i n a s e d e fi c i e n c y . A m J P a t h o l 9 4 2 6 8 9 , 1 9 7 9 S e e d T , C a r n e s B , T o l l e D , F r i t z T 2 B l o o d r e p o n s e s u n d e r c h r o n i c l o w d a i l y d o s e g a m m a i r r a d i a t i o n : H . D i f f e r e n t i a l p r e c l i n i c a l r e s p o n s e s o f i r r a d i a t e d f e m a l e d o g s i n p r o g r e s s i o n t o e i t h e r a p l a s t i c a n e m i a o r m y e l o p r o l i f e r a t i v e d i s e a s e . L e u k e m i a R e s 1 7 2 4 1 1 , 1 9 9 3 S e e d T M , C h u b b G T , T o l l e D V , F r i t z T E , P o o l e C M , D o y l e D E , L o m b a r d L S , K a s p a r L V : T h e u l t r a s t r u c t u r e o f r a d i a t i o n - i n d u c e d e n d o s t e a l m y e l o fi b r o s i s i n t h e d o g . S c a n n i n g E l e c t r o n M i c r o s c 1 2 3 7 7 , 1 9 8 2 S e m p l e J W , F r e e d m a n J 2 I n c r e a s e d a n t i p l a t e l e t T h e l p e r l y m p h o c y t e r e a c t i v i t y i n p a t i e n t s w i t h a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a . B l o o d 7 8 2 2 6 1 9 , 1 9 9 1 S h a w G M , A x e l s o n J , M a g l o t t J G , L o B u g l i o A F 2 Q u a n t i fi c a t i o n o f p l a t e l e t - b o u n d I g G b y 1 2 5 I - s t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n A i n i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a a n d o t h e r t h r o m b o c y t o p e n i c d i s o r d e r s . B l o o d 6 3 2 1 5 4 , 1 9 8 4 S h e b a n i O I , J a i n N C : M e c h a n i s m s o f p l a t e l e t d e s t r u c t i o n i n i m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a : I n v i t r o s t u d i e s w i t h c a n i n e p l a t e l e t s e x p o s e d t o h e t e r o l o g o u s a n d i s o l o g o u s a n t i p l a t e l e t a n t i b o d i e s . R e s V e t S c i 4 7 2 2 8 8 , 1 9 8 9 S h e r d i n g R G , W i l s o n G P H I , K o c i b a G ] 2 B o n e m a r r o w h y p o p l a s i a i n e i g h t d o g s w i t h S e r t o l i c e l l t u m o r . J A V M A 1 7 8 2 4 9 7 , 1 9 8 1 4 4 2 S h u l l R M , D e N o v o R C , M c C r a c k e n M D : M e g a k a r y o b l a s t i c l e u k e m i a i n a d o g . V e t P a t h 0 1 2 3 2 5 3 3 , 1 9 8 6 S h u l m a n N R , I e i s s i n g e r C A , H o t c h k i s s A J , K a u t z C A : T h e n o n s p e c i fi c n a t u r e o f p l a t e l e t - a s s o c i a t e d I g G . T r a n s A s s o c A m P h y s i c i a n s 9 5 2 2 1 3 , 1 9 8 2 S h u l m a n N R , M a r d e r V J , H i l l e r M C , C o l l i e r E M : P l a t e l e t a n d l e u k o c y t e i s o — a n t i g e n s a n d t h e i r a n t i b o d i e s : S e r o l o g i c , p h y s i o l o g i c a n d c l i n i c a l s t u d i e s , i n M o o r e C V , B r o w n E B ( e d s ) : P r o g r e s s i n H e m a t o l o g y . N e w Y o r k , G r u n e & S r a t t o n , 1 9 6 4 , p 2 2 2 S h u l m a n N R , M a r d e r V J , W e i n r a c h R S 2 S i m i l a r i t i e s b e t w e e n k n o w n a n t i p l a t e l e t a n t i b o d i e s a n d t h e f a c t o r r e s p o n s i b l e f o r t h r o m b o c y t o p e n i a i n i d i o p a t h i c p u r p u r a . P h y s i o l o g i c , s e r o l o g i c a n d i s o t o p i c s t u d i e s . A n n N Y A c a d S c i 1 2 4 2 4 9 9 , 1 9 6 5 S i l v a R , M o o r e B B , B a r - o r D , G a l l o w a y W B , W r i g h t E D : T h e r i s k z b e n e fi t o f a u t o t r a n s f u s i o n - c o m p a r i s o n t o b a n k e d b l o o d i n a c a n i n e m o d e l . J T r a u m a 2 4 2 5 5 7 , 1 9 8 4 S i l v e r m a n D J 2 A d h e r e n c e o f p l a t e l e t s t o h u m a n e n d o t h e l i a l c e l l s i n f e c t e d b y R i c k e t t s i a r i c k e t t s i i . J I n f e c t D i s 1 5 3 2 6 9 4 , 1 9 8 6 S i m s P J 2 I n t e r a c t i o n o f h u m a n p l a t e l e t s w i t h t h e c o m p l e m e n t s y s t e m , i n K u n i c k i T J , G e o r g e J N ( e d s ) : P l a t e l e t I m m u n o b i o l o g y : M o l e c u l a r a n d C l i n i c a l A s p e c t s . P h i l a d e l p h i a , L i p p i n c o t t , 1 9 8 9 , p 3 5 4 S i n t n i c o l a a s K , d e V r i e s W , v a n d e r L i n d e n R , G r a t a m a J W , B o l h u i s R L H : S i m u l t a n e o u s fl o w c y t o m e t r i c d e t e c t i o n o f a n t i b o d i e s a g a i n s t p l a t e l e t s , g r a n u l o c y t e s a n d l y m p h o c y t e s . J I m m u n o l M e t h o d s 1 4 2 2 2 1 5 , 1 9 9 1 S i u h a R K , S a n t o s A V , S m i t h J W , H o r s e w o o d P , A n d r e w M , K e l t o n J G : R a b b i t p l a t e l e t s d o n o t e x p r e s s F c r e c e p t o r s f o r I g G . P l a t e l e t s 3 2 3 5 , 1 9 9 2 S l a p p e n d e l R J : I n t e r p r e t a t i o n o f t e s t s f o r i m m u n e - m e d i a t e d b l o o d d i s e a s e s , i n K i r k R W ( e d ) : C u r r e n t V e t e r i n a r y T h e r a p y I X . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 8 6 , p 4 9 8 S l a p p e n d e l R J : C a n i n e l e i s h m a n i a s i s : A r e v i e w b a s e d o n 9 5 c a s e s o n t h e N e t h e r l a n d s . V e t Q u a r t e r l y 1 0 2 1 , 1 9 8 8 S l a p p e n d e l R J : D i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n . V e t C l i n N o r t h A m S m a l l A n i m P r a c t 1 8 2 1 6 9 , 1 9 8 8 S l a p p e n d e l R J , G r e e n e C E : L e i s h m a n i a s i s , i n G r e e n e C E ( e d ) : I n f e c t i o u s D i s e a s e s o f t h e D o g a n d C a t . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 9 0 , p 7 6 9 S l i c h t e r S J , O ’ D o n n e l l M R , W e i d e n P , S t o r b R , S c h r o e d e r M - L : C a n i n e p l a t e l e t a l l o i r n m u n i z a t i o n : T h e r o l e o f d o n o r s e l e c t i o n . B r J H a e m a t o l 6 3 2 7 1 3 , 1 9 8 6 4 4 3 S l i c h t e r S J , W e i d e n P L , O ’ D o n n e l l M R , S t o r b R : I n t e r r u p t i o n o f t u m o r - a s s o c i a t e d p l a t e l e t c o n s u m p t i o n w i t h p l a t e l e t e n z y m e i n h i b i t o r s . B l o o d 5 9 2 1 2 5 2 , 1 9 8 2 S m i t h M , T u r r e l J M : R a d i o p h o s p h o r u s ( 3 2 P ) t r e a t m e n t o f b o n e m a r r r o w d i s o r d e r s i n d o g s : 1 1 c a s e s ( 1 9 7 0 - 1 9 8 7 ) . J A V M A 1 9 4 2 9 8 , 1 9 8 9 S m i t h R D , H o o k s J E , H u x s o l l D L , R i s t i c M 2 C a n i n e e h r l i c h i o s i s ( T r o p i c a l C a n i n e P a n c y t o p e n i a ) : S u r v i v a l o f p h o s p h o r u s - 3 2 - l a b e l e d b l o o d p l a t e l e t s i n n o r m a l a n d i n f e c t e d d o g s . A m J V e t R e s 3 5 2 2 6 9 , 1 9 7 4 S m i t h R D , R i s t i c M , H u x s o l l D L , B a y l o r R A : P l a t e l e t k i n e t i c s i n c a n i n e e h r l i c h i o s i s : E v i d e n c e f o r i n c r e a s e d p l a t e l e t d e s t r u c t i o n a s t h e c a u s e o f t h r o m b o c y t O p e n i a . I n f e c t I m m u n 1 1 2 1 2 1 6 , 1 9 7 5 S p a n g e n b e r g P , K i r c h m a i e r C M , S c h i r m e r A , M e y e r M , B r e d d i n I - H ( : F u n c t i o n a l s t u d i e s o n p l a t e l e t s o f a p a t i e n t w i t h a n a c q u i r e d d i s o r d e r o f p l a t e l e t f u n c t i o n a s s o c i a t e d w i t h a u t o a n t i b o d i e s a g a i n s t m e m b r a n e g l y c 0 p r o t e i n H B / H I A c o m p l e x . T h r o m b R e s 6 9 2 4 3 5 , 1 9 9 3 S p r a n d i o J D , S h a p i r o S S , T h i a g a r a j a n P , M c C o r d S : C u l t u r e d h u m a n u m b i l i c a l v e i n e n d o t h e l i a l c e l l s c o n t a i n a m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n i m m u n o l o g i c a l l y r e l a t e d t o p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n I b . B l o o d 7 1 2 2 3 4 , 1 9 8 8 S c h a e f f e r R C J , B r i s t o n C , C h i l t o n S - M , C a r l s o n R W : D i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n f o l l o w i n g E c h i s c a r i n a t u s v e n o m i n d o g s : E f f e c t s o f a s y n t h e t i c t h r o m b i n i n h i b i t o r . J L a b C l i n M e d 1 0 7 2 4 8 8 , 1 9 8 6 S t a h l C P , Z u c k e r - F r a n k l i n D , M c D o n a l d T P : I n c o m p l e t e a n t i g e n i c c r o s s - r e a c t i v i t y b e t w e e n p l a t e l e t s a n d m e g a k a r y o c y t e s : R e l e v a n c e t o I T P . B l o o d 6 7 2 4 2 1 , 1 9 8 6 S t e i n h e r z P G , M i l l e r D R , H i l g a r t n e r M W , S c h m a l z e r E A : P l a t e l e t d y s f u n c t i o n i n v i n c r i s t i n e t r e a t e d p a t i e n t s . B r J H a e m a t o l 3 2 2 4 3 9 , 1 9 7 6 S t o c k h a m S L , S c h m i d t D A , C u r t i s K S , S c h a u f B G , T y l e r J W , S i m p s o n S T : E v a l u a t i o n o f g r a n u l o c y t i c e h r l i c h i o s i s i n d o g s o f M i s s o u r i , i n c l u d i n g s e r o l o g i c s t a t u s t o E h r l i c h i a c a n i s , E h r l i c h i a e q u i , a n d B o r r e l i a b u r g d o r f e r i . A m J V e t R e s 5 3 : 6 3 , 1 9 9 2 S t o c k h a m S L , T y l e r J W , S c h m i d t D A , C u r t i s K S : E x p e r i m e n t a l t r a n s m i s s i o n o f g r a n u l o c y t i c e h r l i c h i a l o r g a n i s m s i n d o g s . V e t C l i n P a t h 1 9 2 9 9 , 1 9 9 0 S t r a w B 2 D e c r e a s e i n p l a t e l e t c o u n t a f t e r v a c c i n a t i o n w i t h d i s t e m p e r - h e p a t i t i s ( D H ) v a c c i n e . V e t M e d J u n e 2 7 2 5 , 1 9 7 8 4 4 4 S t r i c k e r R B , W o n g D , S a k s S R , C o r a s h L , S h u m a n M A : A c q u i r e d B e m a r d - S o u l i e r s y n d r o m e : E v i d e n c e f o r t h e r o l e o f a 2 1 0 , 0 0 0 - m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n i n t h e i n t e r a c t i o n o f p l a t e l e t s w i t h v o n W i l l e b r a n d f a c t o r . J C l i n I n v e s t 7 6 2 1 2 7 4 , 1 9 8 5 S u e s s R P , B a r r S C , S a c r e B J , F r e n c h T W : B o n e m a r r o w h y p o p l a s i a i n a f e m i n i z e d d o g w i t h a n i n t e r s t i t i a l c e l l t u m o r . J A V M A 2 0 0 2 1 3 4 6 , 1 9 9 2 S u g e r m a n H J , A u s t i n G L , Q u r e s h i G D , H y l e m o n P , R u d d y S , G r e e n fi e l d L l : T h r o m b o c y t o p e n i a i n p r o g r e s s i v e l e t h a l c a n i n e p e r i t o n i t i s . S u r g G y n e c o l O b s t e t 1 5 4 2 1 9 3 , 1 9 8 2 S u g i y a m a T , P i d a r d D , W a u t i e r M - P , W a u t i e r J - L : C o m p a r a t i v e i m m u n o c h e m i c a l a n a l y s i s o f m e m b r a n e p r o t e i n s f r o m h u m a n p l a t e l e t s a n d e n d o t h e l i a l c e l l s . N o u v R e v F r H e m a t o l 3 2 2 1 9 9 , 1 9 9 0 S u l l a m P M , P a y a n D G , D a z i n P F , V a l o n e F H : B i n d i n g o f v i r i d a n s g r o u p s t r e p t o c o c c i t o h u m a n p l a t e l e t s : a q u a n t i t i v e a n a l y s i s . I n f e c t I m m u n 5 8 2 3 8 0 2 , 1 9 9 0 S u l l i v a n P S : I m m u n e m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a : R e c e n t a d v a n c e s i n d i a g n o s i s a n d t r e a t m e n t . P r o c 1 2 t h A n n V e t M e d F o r u m , A m e r i c a n C o l l e g e o f V e t e r i n a r y I n t e r n a l M e d i c i n e , 1 9 9 4 , p 1 4 9 S u l l i v a n P S , A r r i n g t o n K , W e s t R , M c D o n a l d T P : T h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h a d m i n i s t r a t i o n o f t r i m e t h o p r i m / s u l f a d i a z i n e i n a d o g . J A V M A 2 0 1 2 1 7 4 1 , 1 9 9 2 S u l l i v a n P S , E v a n s H L , M c D o n a l d T P : P l a t e l e t c o n c e n t r a t i o n a n d h e m o g l o b i n f u n c t i o n i n g r e y h o u n d s . J A V M A 2 0 5 2 8 3 8 , 1 9 9 4 S u l l i v a n P , G o m p f R , S c h m e i t z e l L , C l i f t R , C o t t r e l l M , M c D o n a l d T P : A l t e r e d p l a t e l e t i n d i c e s i n d o g s w i t h h y p o t h y r o i d i s m a n d c a t s w i t h h y p e r t h y r o i d i s m . A m J V e t R e s 5 4 2 2 0 0 4 , 1 9 9 3 S u l l i v a n P S , M a n n i n g K L , M c D o n a l d T P : A s s o c i a t i o n o f m e a n p l a t e l e t v o l u m e a n d b o n e m a r r o w m e g a k a r y o c y t o p o i e s i s i n t h r o m b o c y t o p e n i c d o g s : 6 0 c a s e s ( 1 9 8 4 - 1 9 9 3 ) . J A V M A 2 0 6 2 3 3 2 , 1 9 9 5 S w e n s o n C L , S i l v e r m a n J , S t r o m b e r g P C , J o h n s o n S E , W i l k i e D A , E a t o n K A , K o c i b a G ] 2 V i s c e r a l l e i s h m a n i a s i s i n a n E n g l i s h F o x h o u n d f r o m a n O h i o r e s e a r c h c o l o n y . J A V M A 1 9 3 2 1 0 8 9 , 1 9 8 8 S w i s h e r S N : N o n s p e c i fi c a d h e r e n c e o f p l a t e l e t s a n d l e u k o c y t e s t o a n t i b o d y - s e n s i t i z e d r e d c e l l s : A m e c h a n i s m p r o d u c i n g t h r o m b o c y t o p e n i a a n d l e u k o p e n i a d u r i n g i n c o m p a t i b l e t r a n s f u s i o n s . J C l i n I n v e s t 3 5 : 7 3 8 , 1 9 5 6 S w i s h e r S N , Y o u n g L E : T h e b l o o d g r o u p i n g s y s t e m s o f d o g s . P h y s i o l R e v 4 1 2 4 9 5 , 1 9 6 1 4 4 5 S z a l M , B l u m b e r g N 2 C l i n i c a l c o r r e l a t e s i n p a t i e n t s w i t h e l e v a t e d p l a t e l e t - a s s o c i a t e d i m m u n o g l o b u l i n s . A n n C l i n L a b S c i 1 8 2 2 4 , 1 9 8 8 S z a t k o w s k i N S , K u n i c i k i T J , A s t e r R H : I d e n t i fi c a t i o n o f g l y c o p r o t e i n 1 b a s a t a r g e t f o r a u t o a n t i b o d y i n i d i o p a t h i c ( a u t o i m m u n e ) t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B l o o d 6 7 2 3 1 0 , 1 9 8 6 T a t e D Y , C a r l t o n G T , J o h n s o n D , S o r e n s o n R L , N e s b i t M , W h i t e J , T h o m p s o n T , K r i v i t W 2 I m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a i n s e v e r e n e o n a t a l i n f e c t i o n s . J P e d i a t r i c s 9 8 2 4 4 9 , 1 9 8 1 T a t e D Y , S o r e n s o n R L , G e r r a r d J M , W h i t e J G , K r i v i t W : A n i m m u n o e n z y m e h i s t o c h e m i c a l t e c h n i q u e f o r t h e d e t e c t i o n o f p l a t e l e t a n t i b o d i e s f r o m t h e s e r u m o f p a t i e n t s w i t h i d i o p a t h i c ( a u t o i m m u n e ) t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a ( I T P ) . B r J H a e m a t o l 3 7 2 2 6 5 , 1 9 7 7 T a y l o r R P , K u j a l a G , E d b e r g J C , F o r e m a n P , D a v i s J S , W r i g h t E 2 T h e k i n e t i c s o f c l e a r a n c e o f h u m a n a n t i b o d y / d s D N A i m m u n e c o m p l e x e s f r o m r a b b i t c i r c u l a t i o n . E f f e c t s o f d s D N A s i z e , r h e u m a t i o d f a c t o r , a n d r e d u c t i o n a n d a l k y l a t i o n o f t h e a n t i b o d i e s . J I m m u n o l 1 3 6 2 3 7 8 5 , 1 9 8 6 T a y l o r R P , K u j a l a G , W i l s o n K , W r i g h t E , H a r b i n A : I n v i v o a n d i n v i t r o s t u d i e s o f t h e b i n d i n g o f a n t i b o d y / d s D N A i m m u n e c o m p l e x e s t o r a b b i t a n d g u i n e a p i g p l a t e l e t s . J I m m u n o l 1 3 4 2 2 5 5 0 , 1 9 8 5 T c h e r n i a G , M o r e l - K o p p M C , Y v a r t J , K a p l a n C 2 N e o n a t a l t h r o m b o c y t o p e n i a a n d h i d d e n m a t e r n a l a u t o i m m u n i t y . B r J H a e m a t o l 8 4 2 4 5 7 , 1 9 9 3 T h e i l e n G H , M a d e w e l l B R , C a r t e r S K : C h e m o t h e r a p y , i n T h e i l e n G H , M a d e w e l l B R ( e d s ) : V e t e r i n a r y C a n c e r M e d i c i n e . P h i l a d e l p h i a , L e a & F e b i g e r , 1 9 8 7 , p 1 5 7 T h i a g a r a j a n P , P e r u s s i a B , D e M a r c o L , W e l l s K , T r i n c h i e r i G 2 M e m b r a n e p r o t e i n s o n h u m a n m e g a k a r y o c y t e s a n d p l a t e l e t s i d e n t i fi e d b y m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s . A m J H e m a t o l 1 4 2 2 5 5 , 1 9 8 3 T h i e m P A , M o r o f f S , M c G r a t h J P , B l o o m J C : P r e l i m u n a r y fi n d i n g s o n t h e c o m p a r i s o n o f fl o w c y t o m e t r i c a n d s o l i d - p h a s e r a d i o i m m u n o a s s a y t e c h n i q u e s f o r t h e d e t e c t i o n o f s e r u m a n t i p l a t e l e t a n t i b o d i e s i n d o g s . V e t C l i n P a t h 2 0 : 1 8 , 1 9 9 1 T h o m p s o n J P : I m m u n o l o g i c d i s e a s e s , i n E t t i n g e r S J ( e d ) : T e x t b o o k o f V e t e r i n a r y I n t e r n a l M e d i c i n e ( 2 n d e d , v o l 2 ) . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 8 9 , p 2 2 9 7 T h o m p s o n J P : I m m u n o l o g i c d i s e a s e s , i n E t t i n g e r S J , F e l d m a n E C ( e d s ) : T e x t b o o k o f V e t e r i n a r y I n t e r n a l M e d i c i n e : D i s e a s e s o f t h e D o g a n d C a t ( 4 t h e d , v o l 2 ) . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 9 4 , p 2 0 0 2 4 4 6 T o h C H , H o o g e n d o o r n H , G i l e s A R : T h e g e n e r a t i o n o f t h r o m b i n i n v i v o i n d u c e s t h e s e l e c t i v e l o s s o f h i g h m o l e c u l a r w e i g h t m u l t i m e r s o f v o n W i l l e b r a n d f a c t o r a n d t h e r e v e r s i b l e s e q u e s t r a t i o n o f p l a t e l e t s . B r J H a e m a t o l 8 5 2 7 5 1 , 1 9 9 3 T o m e r A , H a n s o n S R , H a r k e r L A : A u t o l o g o u s p l a t e l e t k i n e t i c s i n p a t i e n t s w i t h s e v e r e t h r o m b o c y t o p e n i a : D i s c r i m i n a t i o n b e t w e e n d i s o r d e r s o f p r o d u c t i o n a n d d e s t r u c t i o n . J L a b C l i n M e d 1 1 8 2 5 4 6 , 1 9 9 1 T r o y G C , F o r r e s t e r S D : C a n i n e e h r l i c h i o s i s : E h r l i c h i a c a n i s , E . e q u i , a n d E . r i s t i c i i i n f e c t i o n s , i n G r e e n e C E ( e d ) : I n f e c t i o u s D i s e a s e s o f t h e D o g a n d C a t . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 9 0 , p 4 0 4 T r o y G C , V u l g a m o t t J C , T u m w a l d G H : C a n i n e e h r l i c h i o s i s : A r e t r o s p e c t i v e s t u d y o f 3 0 n a t u r a l l y o c c u r r i n g c a s e s . J A m A n i m H o s p A s s o c 1 6 2 1 8 1 , 1 9 8 0 T s u c h i y a R , K y o t a n i K , T o z u k a K , N i s h i z o n o K , A s h i d a Y , Y a m a d a Y , K o b a y a s h i K : A r o l e o f p l a t e l e t a c t i v a t i o n f a c t o r ( P A F ) i n e n d o t o x i n ( L P S ) - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n d o g . V e t P a t h o l 3 1 2 5 8 2 , 1 9 9 4 ( a b s t r ) T u r k J L : T h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n c o m p l e m e n t a n d a n t i b o d i e s o f d i f f e r e n t a n i m a l s i n t h e i m m u n e - a d h e r e n c e p h e n o m e n o n . I m m u n o l o g y 2 2 1 2 7 , 1 9 5 9 T v e d t e n H W , e d : M u l t i — s p e c i e s h e m a t o l o g y a t l a s : T e c h n i c o n H - l E s y s t e m . T a r r y t o w n , N e w Y o r k , M i l e s I n c . , 1 9 9 3 , p 1 3 4 T y s l o w i t z R , D i n g e m a n s e E 2 E f f e c t o f l a r g e d o s e s o f e s t r o g e n s o n t h e b l o o d p i c t u r e o f d o g s . E n d o c r i n o l o g y 2 9 2 8 1 7 , 1 9 4 1 V a i n c h e n k e r W , C h a p m a n J , D e s c h a m p s J F , V i n c i G , B o u g u e t J , T i t e u x M , B r e t o n - G o r i u s J 2 N o r m a l h u m a n s e r u m c o n t a i n s a f a c t o r ( s ) c a p a b l e o f i n h i b i t i n g m e g a k a r y o c y t e c o l o n y f o r m a t i o n . E x p H e m a t o l 1 0 2 6 5 0 , 1 9 8 2 V a i n c h e n k e r W , D e s c h a m p s J F , B a s t i n J M , G u i c h a r d J , T i t e u x M , B r e t o n - G o r i u s J , M c M i c h a e l A J 2 T w o m o n o c l o n a l a n t i p l a t e l e t a n t i b o d i e s a s m a r k e r s o f h u m a n m e g a k a r y o c y t e m a t u r a t i o n : I m m u n o fl u o r e s c e n t s t a i n i n g a n d p l a t e l e t p e r o x i d a s e d e t e c t i o n i n m e g a k a r y o c y t e c o l o n i e s a n d i n v i v o c e l l s f r o m n o r m a l a n d l e u k e m i c p a t i e n t s . B l o o d 5 9 2 5 1 4 , 1 9 8 2 V a l e r i C R , F e i n g o l d H , M e l a r a g n o A J , V e c c h i o n e J J 2 C r y o p r e s e r v a t i o n o f d o g p l a t e l e t s w i t h d i m e t h y l s u l f o x i d e : T h e r a p e u t i c e f f e c t i v e n e s s o f c r y o p r e s e r v e d p l a t e l e t s i n t h e t r e a t m e n t o f t h r o m b o c y t o p e n i c d o g s , a n d t h e e f f e c t o f p l a t e l e t s t o r a g e a t - 8 0 ° C . C r y o b i o l o g y 2 3 2 3 8 7 , 1 9 8 6 v a n d e r L e l i e J , v a n d e r P l a s — V a n D a l e n C M , v o n d e m B o r n e A E G K : P l a t e l e t a u t o a n t i b o d i e s i n s e p t i c a e m i a . B r J H a e m a t o l 5 8 2 7 5 5 , 1 0 8 4 4 4 7 v a n D i j k H , H e e z i u s E , v a n K o o t e n P J S , R a d e m a k e r P M , v a n D a m R , W i l l e r s J M N 2 A s t u d y o f t h e s e n s i t i v i t y o f e r y t h r o c y t e s t o l y s i s b y h e t e r o l o g o u s s e r a v i a t h e a l t e r n a t i v e c o m p l e m e n t p a t h w a y . V e t I m m u n o I m m u n o p a t h 4 : 4 6 9 , 1 9 8 3 v a n L e e u w e n E F , v a n d e r V e n J T h M , E n g e l f r i e t C P , v o n d e m B o r n e A E G K : S p e c i fi c i t y o f a u t o a n t i b o d i e s i n a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a . B l o o d 5 9 : 2 3 , 1 9 8 2 V a r o n D , K a r p a t k i n S 2 A m o n o c l o n a l a n t i - p l a t e l e t a n t i b o d y w i t h d e c r e a s e d r e a c t i v i t y f o r a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p l a t e l e t s . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 8 0 2 6 9 9 2 , 1 9 8 3 V a z q u e z J J , I e w i s J H : I m m u n o c y t o c h e m i c a l s t u d i e s o n p l a t e l e t s . T h e d e m o n s t r a t i o n o f a c o m m o n a n t i g e n i n h u m a n p l a t e l e t s a n d m e g a k a r y o c y t e s . B l o o d 1 6 2 9 6 8 , 1 9 6 0 V i l l a l o b o s T J , A d e l s o n E , R i l e y P A J r , C r o s b y W H , G l a u c k e H : A c a u s e o f t h e t h r o m b o c y t o p e n i a a n d l e u k o p e n i a t h a t o c c u r i n d o g s d u r i n g d e e p h y p o t h e r m i a . J C l i n I n v e s t 3 7 2 1 , 1 9 5 8 V i s e n t i n G P , N e w m a n P J , A s t e r R H : C h a r a c t e r i s t i c s o f q u i n i n e - a n d q u i n i d i n e - i n d u c e d a n t i b o d i e s s p e c i fi c f o r p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n s H b a n d m a . B l o o d 1 2 2 2 6 6 8 , 1 9 9 1 v o n d e m B o r n e A E G K , H e l m e r h o r s t F M , v a n L e e u w e n E F , P e g e l s H G , v o n R i e s z E , E n g e l f r i e t C P : A u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a : D e t e c t i o n o f p l a t e l e t a u t o a n t i b o d i e s w i t h t h e s u s p e n s i o n i m m u n o fl u o r e s c e n c e t e s t . B r J H a e m a t o l 4 5 2 3 1 9 , 1 9 8 0 v o n d e m B o r n e A E G K , P e g e l s J G , v a n d e r S t a d t R J , v a n d e r P l a s - v a n D a l e n C M , H e l m e r h o r s t F M : T h r o m b o c y t o p e n i a a s s o c i a t e d w i t h g o l d t h e r a p y : a d r u g - i n d u c e d a u t o i m m u n e d i s e a s e ? B r J H a e m a t o l 6 3 2 5 0 9 , 1 9 8 6 v o n d e m B o r n e A E G K , V e r h e u g t F W A , O o s t e r h o f F , v o n R i e s z E , B r u t e l d e l a R i v i é r e . A , E n g e l f r i e t C P : A s i m p l e i m m u n o fl u o r e s c e n c e t e s t f o r t h e d e t e c t i o n o f p l a t e l e t a n t i b o d i e s . B r J H a e m a t o l 3 9 2 1 9 5 , 1 9 7 8 v o n d e m B o r n e A E G K , V o s J J E , v a n d e r L e l i e J , B o s s e r s B , v a n D a l e n C M : C l i n i c a l s i g n i fi c a n c e o f p o s i t i v e p l a t e l e t i m m u n o fl u o r e s c e n c e t e s t i n t h r o m b o c y t o p e n i a . B r J H a e m a t o l 6 4 2 7 6 7 , 1 9 8 6 ' v o n Z a b r e n 1 : A c t i o n o f p o l y i o n i c s u b s t a n c e s o n t h e c o m p l e m e n t s y s t e m , i n S i m R B ( e d ) : A c t i v a t o r s a n d I n h i b i t o r s o f C o m p l e m e n t . D o r d r e c h t , K l u w e r A c a d e m i c P u b , 1 9 9 3 , p 1 4 9 v o n Z a b r e n I : E f f e c t s o f v e n o m s o f d i f f e r e n t a n i m a l s p e c i e s o n t h e c o m p l e m e n t s y s t e m , i n S i m R B ( e d ) : A c t i v a t o r s a n d I n h i b i t o r s o f C o m p l e m e n t . D o r d r e c h t , K l u w e r A c a d e m i c P u b l i s h e r s , 1 9 9 3 , p 1 2 7 4 4 8 W a d d l e J R , L i t t m a n M P : A r e t r o s p e c t i v e s t u d y o f 2 7 c a s e s o f n a t u r a l l y o c c u r r i n g c a n i n e e h r l i c h i o s i s . J A m A n i m H o s p A s s o c 2 4 2 6 1 5 , 1 9 8 7 W a k e fi e l d T W , B o u f f o r d J A , S p a u l d i n g S A , P e t r y N A , G r o s s M D , L i n d b l a d B , S t a n l e y J C : S e q u e s t r a t i o n o f p l a t e l e t s i n t h e p u l m o n a r y c i r c u l a t i o n a s a c o n s e q u e n c e o f p r o t a m i n e r e v e r s a l o f t h e a n t i c o a g u l a n t e f f e c t s o f h e p a r i n . J V a s c S u r g 1 2 1 8 7 , 1 9 8 7 W a k e fi e l d T W , T i l l G O , L i n d b l a d B , S a e n z N , S t a n l e y J C : C o m p l e m e n t d e p l e t i o n a n d p e r s i s t e n t h e m o d y n a m i c - h e m a t o l o g i c r e s p o n s e s i n p r o t a m i n e - h e p a r i n r e a c t i o n s . J S u r g R e s 4 5 2 3 2 0 , 1 9 8 8 W a l k e r D H , M a t t e m W D : R i c k e t t s i a l v a s c u l i t i s . A m H e a r t J 1 0 0 2 8 9 6 , 1 9 8 0 W a l p o r t M J , L a c h m a n n P J 2 E r y t h r o c y t e c o m p l e m e n t r e c e p t o r t y p e 1 , i m m u n e c o m p l e x e s , a n d t h e r h e u m a t i c d i s e a s e s . A r t h r i t i s R h e u m 3 1 : 1 5 3 , 1 9 8 8 W a r k e n t i n T E , H a y w a r d C P M , B o s h k o v L K , S a n t o s A V , S h e p p a r d J I , B o d e A P , K e l t o n J G : S e r a f r o m p a t i e n t s w i t h h e p a r i n - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a g e n e r a t e p l a t e l e t - d e r i v e d m i c r o p a r t i c l e s w i t h p r o c o a g u l a n t a c t i v i t y : A n e x p l a n a t i o n f o r t h e t h r o m b o t i c c o m p l i c a t i o n s o f h e p a r i n - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a . B l o o d 1 1 2 3 6 9 1 , 1 9 9 4 W a r m e r d a m P A M , V a n d e W i n k e l J G J , G o s s e l i n E J , C a p e l P J A : M o l e c u l a r b a s i s f o r a p o l y m o r p h i s m o f h u m a n F c y r e c e p t o r H ( C D 3 2 ) . J E x p M e d 1 7 2 2 1 9 , 1 9 9 0 W a r r G W , H a r t I R : B i n d i n g o f c a n i n e I g M a n d I g G t o p r o t e i n A o f S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s : A s i m p l e m e t h o d f o r t h e i s o l a t i o n o f c a n i n e i m m u n o g l o b u l i n s f r o m s e r u m a n d t h e l y m p h o c y t e s u r f a c e . A m J V e t R e s 4 0 2 9 2 2 , 1 9 7 9 W a t e r s A H : A u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a : C l i n i c a l a s p e c t s . S e m i n H e m a t o l 2 9 2 1 8 , 1 9 9 2 W a t e r s A H , M e t c a l f e P , M i n c h i n t o n R M , B a r r e t t A J , J a m e s D C O : A u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i a a c q u i r e d f r o m a l l o g e n e i c b o n e - m a r r o w g r a f t : C o m p e n s a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n b o n e m a r r o w d o n o r a n d r e c i p i e n t . L a n c e t i i : 1 4 3 0 , 1 9 8 3 W a t s o n A D J 2 B o n e m a r r o w f a i l u r e i n a d o g . J S m a l l A n i m P r a c t 2 0 2 6 8 1 , 1 9 7 9 W a t s o n A D J , W i l s o n J T , T u r n e r D M , C u l v e n o r J A : P h e n y l b u t a z o n e - i n d u c e d b l o o d d y s c r a s i a s s u s p e c t e d i n t h r e e d o g s . V e t R e c o r d 1 0 7 2 2 3 9 , 1 9 8 0 W e i s e r M G : E r y t h r o c y t e r e s p o n s e s a n d d i s o r d e r s , i n E t t i n g e r S J , F e l d m a n E C ( e d s ) : T e x t b o o k o f V e t e r i n a r y I n t e r n a l M e d i c i n e : D i s e a s e s o f t h e D o g a n d C a t ( 4 t h e d , v o l 2 ) . P h i l a d e l p h i a , S a u n d e r s , 1 9 9 4 , p 1 8 6 4 4 4 9 W e i s e r M G , T h r a l l M A , F u l t o n R , B e c k E R , W i s e L A , V a n S t e e n h o u s e J L : G r a n u l a r l y m p h o c y t o s i s a n d h y p e r p r o t e i n e m i a i n d o g s w i t h c h r o n i c e h r l i c h i o s i s . J A m A n i m H o s p A s s o c 2 7 2 8 4 , 1 9 9 1 W e i s s D J 2 A n t i b o d y - m e d i a t e d s u p p r e s s i o n o f e r y t h r o p o i e s i s i n d o g s w i t h r e d b l o o d c e l l a p l a s i a . A m J V e t R e s 4 7 2 2 6 4 6 , 1 9 8 6 W e i s s D J , A d a m s L G : A p l a s t i c a n e m i a a s s o c i a t e d w i t h t r i m e t h o p r i m - s u l f a d i a z i n e a n d f e n b e n d a z o l e a d m i n i s t r a t i o n i n a d o g . J A V M A 1 9 1 2 1 1 1 9 , 1 9 8 7 W e i s s D J , A r m s t r o n g P J 2 S e c o n d a r y m y e l o fi b r o s i s i n t h r e e d o g s . J A V M A 1 8 7 2 4 2 3 , 1 9 8 5 W e i s s D J , A r m s t r o n g P J , R e i m a n n K 2 B o n e m a r r o w n e c r o s i s i n t h e d o g . J A V M A 1 8 7 2 5 4 , 1 9 8 5 W e i s s D J , K l a u s n e r J S : D r u g - a s s o c i a t e d a p l a s t i c a n e m i a i n d o g s : E i g h t c a s e s ( 1 9 8 4 - 1 9 8 8 ) . J A V M A 1 9 6 2 4 7 2 , 1 9 9 0 W e i s s D J , S t o c k h a m S L , W i l l a r d M D , S c h i r m e r R G 2 T r a n s i e n t e r y t h r o i d h y p o p l a s i a i n t h e d o g : R e p o r t o f fi v e c a s e s . J A m A n i m H o s p A s s o c 1 8 2 3 5 3 , 1 9 8 2 W e i t z m a J B , L a w S K A : C R 3 a n d i t s r e l a t i o n s h i p w i t h o t h e r p h a g o c y t i c r e c e p t o r s , i n W h a l e y K , L o o s M , W e i l e r J M ( e d s ) : C o m p l e m e n t i n H e a l t h a n d D i s e a s e ( 2 n d e d , v o l 2 0 ) . D o r d r e c h t , K l u w e r A c a d e m i c P u b , 1 9 9 3 , p 2 6 9 W e l l m a n M L , C o u t o C G , S t a r k e y R J , R o j k o J L : L y m p h o c y t o s i s o f l a r g e g r a n u l a r l y m p h o c y t e s i n t h r e e d o g s . V e t P a t h o l 2 6 2 1 5 8 , 1 9 8 9 W e l l m a n M L , D a v e n p o r t D J , M o r t o n D , J a c o b s R M : M a l i g n a n t h i s t i o c y t o s i s i n f o u r d o g s . J A V M A 1 8 7 2 9 1 9 , 1 9 8 5 W e n d l i n g F , M a r a s k o v s k y E , D e b i l i N , F l o r i n d o C , T e e p e M , T i t e u x M , M e t h i a N , B r e t o n - G o r i u s J , C o s m a n D , V a i n c h e n k e r W 2 c - M p l l i g a n d i s a h u m o r a l r e g u l a t o r o f m e g a k a r y o c y t o p o i e s i s . N a t u r e 3 6 9 2 5 7 1 , 1 9 9 4 W e r n e r L L , B l o o m b e r g M S , C a l d e r w o o d M a y s M B , A c k e r m a n N 2 P r o g r e s s i v e p o l y s y s t e m i c i m m u n e - m e d i a t e d d i s e a s e i n a d o g . V e t I m m u n o I m m u n o p a t h 8 : 1 8 3 , 1 9 8 5 W e r n e r L L , H a l l i w e l l R E W , J a c k s o n R F , N e e d h a m T C , L i m p a c h M : A n i n v e s t i g a t i o n o f t h e r o l e o f i m m u n o l o g i c f a c t o r s i n a n e m i a a s s o c i a t e d w i t h c a n i n e h e a r t w o r m d i s e a s e . V e t I m m u n o I m m u n o p a t h 7 : 2 8 5 , 1 9 8 4 W i g t o n D H : P l a t e l e t t u r n o v e r , f u n c t i o n a n d u l t r a s t r u c t u r e i n i n f e c t i o u s c a n i n e h e p a t i t i s . V e t C l i n P a t h 7 : 1 6 , 1 9 7 8 4 5 0 W i g t o n D H , K o c i b a G J , H o o v e r E A : I n f e c t i o u s c a n i n e h e p a t i t i s : A n i m a l m o d e l f o r v i r a l - i n d u c e d d i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n . B l o o d 4 7 2 2 8 7 , 1 9 7 6 W i l k i n s R J , H u r v i t z A I , D o d d s - L a f f m W J 2 I m m u n o l o g i c a l l y m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a i n t h e d o g . J A V M A 1 6 3 2 2 7 7 , 1 9 7 3 W i l l i a m s D A , M a g g i o - P r i c e L : C a n i n e i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i a : C l i n i c a l o b s e r v a t i o n s a n d l o n g - t e r m f o l l o w - u p i n 5 4 c a s e s . J A V M A 1 8 5 2 6 6 0 , 1 9 8 4 W i l l i a m s W J , B u e t l e r E , E r s l e v A J , L i c h t r n a n M A , e d s : H e m a t o l o g y ( 4 t h e d ) . N e w Y o r k , M c G r a w - H i l l , 1 9 9 0 W i l l i s S E , J a c k s o n M L , M e r i c S M , R o u s s e a u x C G : W h o l e b l o o d p l a t e l e t a g g r e g a t i o n i n d o g s w i t h l i v e r d i s e a s e . A m J V e t R e s 5 0 2 1 8 9 3 , 1 9 8 9 W i l s o n I F 2 E h r l i c h i a p l a t y s i n a M i c h i g a n d o g . J A m A n i m H o s p A s s o c 2 8 2 3 8 1 , 1 9 9 2 W i l s o n J J , N e a m e P B , K e l t o n J G : I n f e c t i o n - i n d u c e d t h r o m b o c y t o p e n i a . S e m T h r o m b H e m o s t 8 : 2 1 7 , 1 9 8 2 W i n i a r s k i J 2 I g G a n d I g M a n t i b o d i e s t o p l a t e l e t m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n a n t i g e n s i n a c u t e c h i l d h o o d i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B r J H a e m a t o l 7 3 2 8 8 , 1 9 8 9 W i n k e l s t e i n J A , C o r k L C , G r i f m e E , A d a m s R J , P r i c e D L : G e n e t i c a l l y d e t e r m i n e d d e fi c i e n c y o f t h e t h i r d c o m p o n e n t o f c o m p l e m e n t i n t h e d o g . S c i e n c e 2 1 2 2 1 1 6 9 , 1 9 8 1 W i n k e l s t e i n J A , J o h n s o n J P , S w i f t A J , F e r r y F , Y o l k e n R , C o r k L C : G e n e t i c a l l y d e t e r m i n e d d e fi c i e n c y o f t h e t h i r d c o m p o n e n t o f c o m p l e m e n t i n t h e d o g : I n v i t r o s t u d i e s o n t h e c o m p l e m e n t s y s t e m a n d c o m p l e m e n t - m e d i a t e d s e r u m a c t i v i t i e s . J I m m u n o l 1 2 9 : 2 5 9 8 , 1 9 8 2 W o o d s J P , J o h n s t o n e I B , B i e n z l e D , B a l s o n G , G a r t l e y C J 2 C o n c u r r e n t l y m p h a n g i o m a , i m m u n e - m e d i a t e d t h r o m b o c y t o p e n i a , a n d v o n W i l l e b r a n d ’ s d i s e a s e i n a d o g . J A m A n i m H o s p A s s o c 3 1 : 7 0 , 1 9 9 5 W o o d s V L J , K u r a t a Y , M o n t g o m e r y R R , T a n i P , M a s o n D , O h E H , M c M i l l a n R : A u t o a n t i b o d i e s a g a i n s t p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n I b i n p a t i e n t s w i t h c h r o n i c i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B l o o d 6 4 2 1 5 6 , 1 9 8 4 W o o d s V L J , O h E H , M a s o n D , M c M i l l a n R : A u t o a n t i b o d i e s a g a i n s t t h e p l a t e l e t g l y c o p r o t e i n H b / H I a c o m p l e x i n p a t i e n t s w i t h c h r o n i c I T P . B l o o d 6 3 2 3 6 8 , 1 9 8 4 W y b r a n J , F u d e n b e r g I - H - I : C e l l u l a r i m m u n i t y t o p l a t e l e t s i n i d i o p a t h i c t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B l o o d 4 0 2 8 5 6 , 1 9 7 2 4 5 1 Y a m a m o t o S , O m u r a M , H i r a t a H 2 I s o l a t i o n o f p o r c i n e , c a n i n e a n d f e l i n e I g G b y a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y u s i n g p r o t e i n A . V e t I m m u n o I m m u n o p a t h 9 2 1 9 5 , 1 9 8 5 Y a n g V C , T e n g C C , K i m J — S : A fi l t e r d e v i c e f o r t h e p r e v e n t i o n o f b o t h h e p a r i n - a n d p r o t a m i n e - i n d u c e d c o m p l i c a t i o n s a s s o c i a t e d w i t h e x t r a c o r p o r e a l t h e r a p y . B i o m e d I n s t r u m T e c h n 0 1 2 4 2 4 3 3 , 1 9 9 0 Y a r r i n g t o n J T , L o u d y D E , S p r i n k l e - C a v a l l o J , B r o e r s m a R , G i b s o n J P : S h o r t - t e r m s t u d i e s o f M D L 1 9 , 6 6 0 - i n d u c e d c a n i n e t h r o m b o c y t o p e n i a . T o x i c o l P a t h o l 1 8 2 6 5 1 , 1 9 9 0 Y a r r i n g t o n J T , W a l l a c e C D , L o u d y D E , G i b s o n J P : T h r e e - m o n t h e f f e c t s o f M D L 1 9 , 6 6 0 o n t h e c a n i n e p l a t e l e t a n d e r y t h r o c y t e . F u n d a m A p p l T o x i c o l 1 8 2 2 4 7 , 1 9 9 2 Y a w a t a Y , H e b b e l R P , S i l v i s S , H o w e R , J a c o b H : B l o o d c e l l a b n o r m a l i t i e s c o m p l i c a t i n g t h e h y p o p h o s p h a t e m i a o f h y p e r a l i m e n t a t i o n : E r y t h r o c y t e a n d p l a t e l e t A T P d e fi c i e n c y a s s o c i a t e d w i t h h e m o l y t i c a n e m i a a n d b l e e d i n g i n h y p e r a l i m e n t e d d o g s . J L a b C l i n M e d 8 4 2 6 4 3 , 1 9 7 4 Y e a m a n M R , S u l l a m P M , D a z i n P F , N o r m a n D C , B a y e r A S : C h a r a c t e r i z a t i o n o f S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s - p l a t e l e t b i n d i n g b y q u a n t i t a t i v e fl o w c y t o m e t r i c a n a l y s i s . J I n f e c t D i s 1 6 6 2 6 5 , 1 9 9 2 Z e i g l e r Z R , R o s e n f e l d C S , N e m u n a i t i s J J , B e s a E C , S h a d d u c k R K : I n c r e a s e d m a c r o p h a g e c o l o n y - s t i m u l a t i n g f a c t o r l e v e l s i n i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . B l o o d 8 1 2 1 2 5 1 , 1 9 9 3 Z u c k e r - F r a n k l i n D , K a r p a t k i n S : R e d — c e l l a n d p l a t e l e t f r a g m e n t a t i o n i n i d i o p a t h i c a u t o i m m u n e t h r o m b o c y t o p e n i c p u r p u r a . N E n g l J M e d 2 9 7 2 5 1 7 , 1 9 7 7 Z u c k e r - F r a n k l i n D , P e t u r s s o n S 2 T h r o m b o c y t o p o i e s i s — a n a l y s i s b y m e m b r a n e t r a c e r a n d f r e e z e - f r a c t u r e s t u d i e s o n f r e s h h u m a n a n d c u l t u r e d m o u s e m e g a k a r y o c y t e s . J C e l l B i o l 9 9 2 3 9 0 , 1 9 8 4 V I T A M i c h a e l A l a n S c o t t w a s b o r n i n N o r t h a m p t o n , M A , o n S e p t e m b e r 2 3 , 1 9 5 7 . H e a t t e n d e d k i n d e r g a r t e n t h r o u g h h i g h s c h o o l i n t h e R i p o n p u b l i c s c h o o l s y s t e m i n R i p o n , W I , e x c e p t f o r o n e y e a r i n t h i r d f o r m i n N o r w i c h , E n g l a n d . H e g r a d u a t e d f r o m h i g h s c h o o l a s v a l e d i c t o r i a n o f h i s c l a s s i n 1 9 7 6 . H e t h e n a t t e n d e d R i p o n C o l l e g e w h e r e h e w a s e l e c t e d t o P h i B e t a K a p p a i n 1 9 8 0 . T h e s a m e y e a r , h e g r a d u a t e d S u m m a C u m L a u d e w i t h a B a c h e l o r o f A r t s d e g r e e ( b i o l o g y m a j o r , m a t h e m a t i c s m i n o r ) . A f t e r m a r r y i n g C a t h e r i n e J o G a l i c a ( r e g i s t e r e d o c c u p a t i o n a l t h e r a p i s t ) i n 1 9 8 2 , h e m o v e d t o S t . P a u l , M N , w h e r e h e a t t e n d e d t h e C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e , U n i v e r s i t y o f M i n n e s o t a . H e w a s e l e c t e d t o P h i Z e t a i n 1 9 8 5 , a n d r e c e i v e d s e v e r a l a w a r d s i n c l u d i n g t h e M i n n e s o t a V e t e r i n a r y M e d i c a l A s s o c i a t i o n A w a r d f o r t h e s e n i o r s e l e c t e d a s t h e o u t s t a n d i n g s t u d e n t i n c l i n i c a l v e t e r i n a r y m e d i c i n e f o r 1 9 8 6 . H e r e c e i v e d t h e d e g r e e o f D o c t o r o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e i n 1 9 8 6 ( t h i r d i n c l a s s ) , t h e s a m e y e a r h i s d a u g h t e r K i m b e r l y w a s b o r n . H e t h e n e n j o y e d p r i v a t e v e t e r i n a r y p r a c t i c e f o r t w o y e a r s i n a p r e d o m i n a n t l y d a i r y p r a c t i c e i n W e y a u w e g a , W I . H i s s o n D a v i d w a s b o r n i n 1 9 8 7 . I n 1 9 8 8 , h e r e t u r n e d t o a c a d e m i a a s a c l i n i c a l p a t h o l o g y r e s i d e n t / i n s t r u c t o r i n t h e D e p a r t m e n t o f P a t h o l o g y a t M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y . H i s s o n I a n w a s b o r n i n 1 9 9 0 , t h e y e a r h e b e g a n a d o c t o r a t e p r o g r a m a s a F e l l o w i n a N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h T r a i n i n g P r o g r a m i n P a t h o l o g y / T o x i c o l o g y , a l s o a t M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y . H e b e c a m e a D i p l o m a t e i n t h e A m e r i c a n C o l l e g e o f V e t e r i n a r y P a t h o l o g i s t s ( c l i n i c a l p a t h o l o g y ) i n 1 9 9 1 , a n d h e r e c e i v e d t h e S t u d e n t S c h o l a r s h i p A w a r d f o r t h e C L . D a v i s D . V . M . F o u n d a t i o n i n 1 9 9 3 . H e c o m p l e t e d h i s P h . D . i n P a t h o l o g y / E n v i r o n m e n t a l T o x i c o l o g y i n 1 9 9 5 , a n d a c c e p t e d a n a p p o i n t m e n t a s A s s i s t a n t P r o f e s s o r i n p a t h o l o g y a t t h e U n i v e r s i t y o f M i s s o u r i , C o l u m b i a . 1 1 1 0 - 1 1 a n $ 1 a n U N I V . L I B R A R I E S l l 1 1 1 1 1 1 1 1 1 “ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 2 9 3 0 1 4 2 1 7 3 4 7