P L A C E I N R E T U R N B O X t o r e m o v e t h i s c h e c k o u t f r o m y o u r r e c o r d . T O A V O I D F I N E S r e t u r n o n o r b e f o r e d a t e d u e . M A Y B E R E C A L L E D w i t h e a r l i e r d u e d a t e i f r e q u e s t e d . D A T E D U E D A T E D U E D A T E D U E 0 3 { J C T 3 . 1 ) 2 ’ 6 : 6 / 0 1 c : l C I R C / D a t e D u e . p 6 5 — p . 1 5 D E V E L O P M E N T A N D T E S T I N G O F O L I G O N U C L E O T I D E P R O B E S F O R D E T E C T I O N A N D I D E N T I F I C A T I O N O F S O M E F U N G A L P A T H O G E N S A N D E N D O P H Y T E S O F C O N l F E R S B y M u r s e l C a t a l A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y D e p a r t m e n t o f B o t a n y a n d P l a n t P a t h o l o g y 2 0 0 2 A B S T R A C T D E V E L O P M E N T A N D T E S T I N G O F O L I G O N U C L E O T I D E P R O B E S F O R D E T E C T I O N A N D I D E N T I F I C A T I O N O F S O M E F U N G A L P A T H O G E N S A N D E N D O P H Y T E S O F C O N I F E R S B y M u r s e l C a t a l C o n i f e r s d o n o t d i s p l a y s y m p t o m s o f f o l i a g e d i s e a s e f o r u p t o 2 y e a r s a f t e r i n f e c t i o n b y p a t h o g e n i c f u n g i . S y m p t o m l e s s l a t e n t i n f e c t i o n s o f n u r s e r y s t o c k s a r e r e s p o n s i b l e f o r e p i d e m i c a n d e c o n o m i c l o s s e s c a u s e d b y n e e d l e c a s t a n d n e e d l e b l i g h t o f c o n i f e r s e e d l i n g s . C o n i f e r s e e d l i n g s s o l d t o C h r i s t m a s t r e e g r o w e r s o r f o r e s t e r s p a s s i n s p e c t i o n e v e n t h o u g h t h e y c a r r y s y m p t o m l e s s i n f e c t i o n s . R a p i d , e a s y , a n d a c c u r a t e d e t e c t i o n o f l a t e n t i n f e c t i o n s w i l l h e l p t o d e v e l o p a c e r t i fi c a t i o n s y s t e m f o r n u r s e r y s t o c k s a s p a t h o g e n f r e e p r i o r t o s h i p m e n t f o r o u t p l a n t i n g . I n t h i s s t u d y , w e d e v e l o p e d m o l e c u l a r m e t h o d s b a s e d o n P C R a n d d o t - b l o t s a s s a y s f o r d e t e c t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n o f s o m e o f t h e m o s t s e r i o u s a n d d a m a g i n g d i s e a s e s o f c e r t a i n c o n i f e r t r e e s . l n t e m a l t r a n s c r i b e d S p a c e r s ( I T S ) o f r i b o s o m a l D N A w e r e s e q u e n c e d a n d s p e c i e s - s p e c i fi c o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s w e r e d e v e l o p e d f o r m o r e t h a n 2 0 p a t h o g e n i c a n d e n d o p h t i c f u n g i o f c o n i f e r t r e e s : D o u g l a s fi r , s p r u c e , F r a s e r fi r , j u n i p e r a n d p i n e . T h e p r i m e r p a i r f o r e a c h s p e c i e s w a s t e s t e d i n b o t h d i r e c t a n d n e s t e d P C R a s s a y s o f D N A f r o m m y c e l i u m , f r u i t i n g b o d i e s , a n d n e e d l e s . A l m o s t a l l p r i m e r p a i r s a m p l i fi e d s p e c i e s - s p e c i f i c P C R p r o d u c t s o f s p e c i fi c S i z e s f r o m t h e i r t a r g e t D N A i n d i r e c t P C R o f m y c e l i u m o r f r u i t i n g b o d i e s o f f u n g i . C r o s s - r e a c t i o n s w e r e o n l y o b s e r v e d b e t w e e n t h e t w o S p e c i e s o f t h e s a m e G e n u s t h a t d i d n o t h a v e a n y o r s u f fi c i e n t v a r i a b i l i t y i n t h e I T S r e g i o n . A l s o e a c h p r i m e r p a i r d e t e c t e d t h e i n t e n d e d f u n g u s d i r e c t l y i n i n f e c t e d n e e d l e s w i t h o r w i t h o u t s y m p t o m s . E s p e c i a l l y , p r i m e r p a i r s d e v e l o p e d f o r d e t e c t i o n o f R h a b d o c l i n e a n d S w i s s n e e d l e c a s t O f D o u g l a s fi r , P h o m o p s i s t i p b l i g h t s o f j u n i p e r , C y c l a n e u s m a , L o p h o d e r m i u m , D o t h i s t r o m a a n d B r o w n S p o t n e e d l e c a s t O f p i n e w e r e h i g h l y s e n s i t i v e a n d a c c u r a t e i n d e t e c t i o n s f r o m s y m p t o m l e s s n e e d l e s o f c u r r e n t y e a r g r o w t h . N e s t e d P C R w i t h p r i m e r p a i r s i n c r e a s e d t h e s e n s i t i v i t y o f d e t e c t i o n a n d a l l o w e d t h e d e t e c t i o n O f l a t e n t , l o w l e v e l i n f e c t i o n s a t s p e c i e s - s p e c i fi c o p t i m u m a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s . T h e t e c h n i q u e w a s u s e f u l f o r a m p l i fi c a t i o n o f e n d o p h y t e s f r o m s y m p t o m l e s s , p a t h o g e n i c f u n g i - f r e e c u r r e n t y e a r ’ s n e e d l e s a s t h e y a r e p r e s e n t a t v e r y l o w i n c i d e n c e s . T h e p r i m e r s a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s o f e x p e c t e d s i z e f r o m t a r g e t s e q u e n c e s i n a l l a s s a y s . R F L P a n a l y s i s o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y t h e p r i m e r s f r o m n e e d l e s i n b o t h n e s t e d a n d d i r e c t P C R a m p l i fi c a t i o n s c o n fi r m e d t h e i d e n t i t i e s o f a m p l i c o n s t o t h e i r r e s p e c t i v e t a r g e t D N A s e q u e n c e s . I n d o t - b l o t a s s a y s , t h e p r o b e s t e s t e d S p e c i fi c a l l y h y b r i d i z e d t o t h e i r i n t e n d e d t a r g e t D N A ’ S a t d e t e r m i n e d o p t i m u m h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s . T h e p r o b e s d i f f e r e n t i a t e d t h e f u n g i e v e n a t s u b s p e c i e s l e v e l a s a c h i e v e d w i t h p r o b e s O f R h a b d o c l i n e t a x a . A S a r e s u l t , t h e m o l e c u l a r a s s a y s d e v e l o p e d i n t h i s s t u d y c o u l d b e u s e d f o r i n s p e c t i o n a n d c e r t i f i c a t i o n o f n u r s e r y s t o c k s o r s e e d l i n g s p r i o r t o s a l e . T h i s d i s s e r t a t i o n i s d e d i c a t e d t o m y p a r e n t s , K a z i m a n d S a t i C a t a l , w h o s e h e a r t s a n d p r a y e r s w e r e a l w a y s w i t h m e d u r i n g m y e d u c a t i o n . i v A d a n h i s a n : H a t a l e Z e F e j P a l A C K N O W L E D G E M E N T S F i r s t o f a l l a n d t h e m o s t , I w o u l d l i k e t o t h a n k m y a d v i s o r D r . G e r a r d C . A d a m s f o r h i s g u i d a n c e , f r i e n d s h i p a n d e n c o u r a g e m e n t , a S w e l l a s f o r h i s m o r a l a n d fi n a n c i a l s u p p o r t d u r i n g t h e c o u r s e o f t h i s s t u d y . I a m a l s o g r a t e f u l t o h i m f o r h i s k i n d n e s s a n d p a t i e n c e t o m e . I w o u l d l i k e t o e x p r e s s m y g r a t i t u d e t o a l l m e m b e r s o f m y g u i d a n c e c o m m i t t e e : D r . D e n n i s W . F u l b r i g h t , D r . F r a n c e s T r a i l a n d D r . R i c h a r d A l l i s o n f o r t h e i r g u i d a n c e a n d h e l p . I w o u l d l i k e t o t h a n k H e a t h e r H a l l e n f o r h e r k i n d n e s s , h e l p a n d c o o p e r a t i o n . l w a s l u c k y t o h a v e s o m e b o d y l i k e t a l e n t e d H e a t h e r i n o u r l a b . M y s p e c i a l a n d e n d l e s s t h a n k s a n d a p p r e c i a t i o n g o e s t o m y l o v e l y w i f e Z e h r a , w i t h o u t h e r m o r a l e s u p p o r t a n d h e l p t h i s w o u l d h a v e n e v e r b e e n a c c o m p l i s h e d . I a m b l e s s e d w i t h h a v i n g h e r a n d t w o b e a u t i f u l d a u g h t e r s , F e y z a n u r a n d Z u l a l , w h o m a r e t h e s o u r c e o f m y h a p p i n e s s a n d j o y . I w o u l d a l s o l i k e t o t h a n k t h e F a c u l t y a n d S t a f f o f D e p a r t m e n t s o f P l a n t P a t h o l o g y a n d P l a n t B i o l o g y f o r t h e i r f i n a n c i a l s u p p o r t t h r o u g h T e a c h i n g A s s i s t a n t s h i p s a n d f o r t h e i r h e l p a n d u n d e r s t a n d i n g . U S ‘ U S T A B L E O F C O N T E N T S L I S T O F T A B L E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v i i i L I S T O F F I G U R E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . X C H A P T E R 1 M o l e c u l a r p r o b e s f o r d e t e c t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n o f R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t s o f D o u g l a s fi r A b s t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 R e s u l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 8 R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 3 C H A P T E R 2 D e t e c t i o n a n d Q u a n t i fi c a t i o n o f R h a b d o c l i n e N e e d l e C a s t i n f e c t i o n i n I n t e n n o u n t a i n S o u r c e s o f P s e u d o t s u g a e m e n z i e s i i i n W a s h i n g t o n S t a t e A b s t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 0 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 2 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 7 R e s u l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 6 D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 5 R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 1 C H A P T E R 3 P C R D e t e c t i o n o f t h e e n d o p h y t e R h a b d o c l i n e p a r k e r i i n n e e d l e s o f P s e u d o t s u g a e m e n z i e s i i b y S p e c i e s - s p e c i fi c p r o b e s A b s t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 5 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 7 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 1 R e s u l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 6 D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 7 R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 3 v i D e l F i r A b s l n t r I l l a R e s D i s R e l D e s N e e A b s I n t . r M B ' R e s D i s D e l l ( l e i l n i r i M a l R 6 3 D i s c R 6 , ? C O H I R e f s C H A P T E R 4 D e t e c t i o n a n d I d e n t i fi c a t i o n o f t h e S w i s s n e e d l e c a s t p a t h o g e n P h a e o c r y p t o p u s g a u m a n n i i i n N e e d l e s O f D o u g l a s F i r u s i n g D N A p r o b e s A b s t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 7 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 9 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 2 R e s u l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 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. 2 9 4 R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 0 C H A P T E R 6 D e v e l o p m e n t a n d T e s t i n g o f O l i g o n u c l e o t i d e P r o b e s f o r D e t e c t i o n a n d I d e n t i fi c a t i o n o f S o m e M a j o r F u n g a l P a t h o g e n s a n d E n d o p h y t e s o f P i n e s A b s t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 5 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 7 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . . . 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F u n g a l i s o l a t e s a n d n e e d l e s p e c i m e n s w i t h i d e n t i fi e d f u n g a l f r u i t i n g b o d i e s u s e d i n t h e s t u d y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 T a b l e 1 . 2 . S e q u e n c e h o m o l o g y a m o n g d i f f e r e n t s p e c i e s a n d s u b s p e c i e s o f R h a b d o c l i n e t a x a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 T a b l e 1 . 3 . T h e s e q u e n c e , g u a n i n e - c y t o s i n e p e r c e n t a g e ( ° / o G C ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 C H A P T E R 2 T a b l e 2 . 1 . M e a s u r e m e n t o f t h e q u a n t i t y o f P C R p r o d u c t a m p l i fi e d f r o m o n e - y e a r o l d n e e d l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 0 T a b l e 2 . 2 . C o m p a r i s o n o f v i s u a l d i s e a s e r a t i n g s t o q u a n t i t a t i v e P C R d e t e c t i o n o f i n f e c t i o n i n 1 9 9 9 g r o w t h n e e d l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 3 T a b l e 2 . 3 C o m p a r i s o n o f v i s u a l r a t i n g a n d P C R d e t e c t i o n i n c u r r e n t g r o w t h n e e d l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 9 T a b l e 2 . 4 . E a r l y d e t e c t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n o f R . p s e u d o t s u g a e i n f e c t i o n i n n e w g r o w t h . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 2 T a b l e 2 . 5 . R e s t r i c t i o n f r a g m e n t m a p s o f t h e s e q u e n c e s o f s o m e f o l i a r p a t h o g e n s a n d e n d o p h y t e s o f P . m e n z i e s i i . . . . . . . . . . . . . . . . 9 5 C H A P T E R 3 T a b l e 3 . 1 . F u n g a l i s o l a t e s a n d n e e d l e s p e c i m e n s w i t h i d e n t i fi e d f u n g a l f r u i t i n g b o d i e s u s e d i n t h e s t u d y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 2 T a b l e 3 . 2 . T h e s e q u e n c e , g u a n i n e - c y t o s i n e p e r c e n t a g e ( % G C ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 4 T a b l e 3 . 3 . R e s t r i c t i o n f r a g m e n t m a p s o f t h e s e q u e n c e s o f s o m e f o l i a r e n d o p h y t e s a n d p a t h o g e n s o f P . m e n z e i s i i . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 9 C H A P T E R 4 T a b l e 4 . 1 . F u n g a l i s o l a t e s a n d n e e d l e s p e c i m e n s u s e d i n t h i s s t u d y . . . . . . . . . . . . . 1 8 4 v i i i l a t T a t T a t C H T a l T a l T a l - C H T a ‘ T a T a T a b l e 4 . 2 . T h e s e q u e n c e , g u a n i n e - c y t o s i n e p e r c e n t a g e ( % G C ) , c a l c u l a t e d m e l t i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 0 T a b l e 4 . 3 . R e s t r i c t i o n f r a g m e n t m a p s o f t h e I T S s e q u e n c e s o f P . g a u m a n n i i a n d C l o s e l y r e l a t e d f u n g i . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 5 T a b l e 4 . 4 . C o m p a r i s o n o f s p e c i e s - s p e c i fi c P C R a m p l i f i c a t i o n s a n d t r a d i t i o n a l i s o l a t i o n m e t h o d s f o r d e t e c t i o n o f P . g a u m a n n i i . . . . 2 1 8 C H A P T E R 5 T a b l e 5 . 1 . F u n g a l i s o l a t e s a n d p l a n t s a m p l e s u s e d i n t h i s s t u d y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 7 T a b l e 5 . 2 . O l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s d e s i g n e d f o r s p e c i e s - S p e c i f i c a m p l i fi c a t i o n o f f u n g a l p a t h o g e n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 7 T a b l e 5 . 3 . R e s t r i c t i o n f r a g m e n t m a p s o f t h e S p e c i e s - s p e c i f i c p r i m e r a m p l i fi a b l e s e q u e n c e s o f t h e I T S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 3 C H A P T E R 6 T a b l e 6 . 1 . F u n g a l i s o l a t e s a n d p l a n t s a m p l e s u s e d i n t h i s s t u d y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 0 T a b l e 6 . 2 . O l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s d e s i g n e d f o r s p e c i e s - S p e c i f i c a m p l i fi c a t i o n o f f u n g a l p a t h o g e n s a n d e n d o p h y t e s o f p i n e . . . . . . . . . . . . . 3 3 7 T a b l e 6 . 3 . R e s t r i c t i o n f r a g m e n t m a p s o f t h e s p e c i e s - S p e c i f i c p r i m e r a m p l i f i a b l e I T S s e q u e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 3 C H I F i g : F i g F i g ‘ f ‘ F i g F i g F i g F i g F i g F i n F i g C H r i g L I S T O F F I G U R E S C H A P T E R 1 F i g u r e 1 . 1 . T h e l o c a t i o n o f i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r s ( I T S ) i n R i b o s o m a l D N A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 F i g u r e 1 . 2 . P C R a m p l i fi c a t i o n o f t h e I T S r e g i o n b y p r i m e r s l T S 1 F a n d I T S 4 . . 2 3 F i g u r e 1 . 3 . P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s o f I T S s e q u e n c e d a t a o f t h e R h a b d o c l i n e t a x a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 F i g u r e 1 . 4 . A l i g n m e n t o f i n t e r n a l t r a n s c r i b e d S p a c e r s ( I T S I a n d I T S I I ) a n d 5 . 8 8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 F i g u r e 1 . 5 . T e s t i n g o f R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e p r i m e r p r o b e s R P P 1 a n d R P P 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 F i g u r e 1 . 6 . T e s t i n g f o r S p e c i f i c i t y o f t h e R . w e i n ' i s s p . w e i n ' i p r i m e r p r o b e s R W W 1 a n d R W W 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 F i g u r e 1 . 7 . P C R t e s t i n g o f t h e R . w e i n ' i s s p . o b l o n g a a n d s s p . O b o v a t a p r i m e r p r o b e s R W O 1 a n d R W O 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 F i g u r e . 1 . 8 . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f p r o b e s R P P 1 a n d R P P 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 F i g u r e 1 . 9 . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n o f R P P 1 t o t o t a l D N A e x t r a c t e d f r o m f r u i t i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1 F i g u r e 1 . 1 0 . H y b r i d i z a t i o n o f R W W 1 ( A ) a n d R W W 4 ( B ) t o I T S 1 F a n d I T S 4 . . 4 2 F i g u r e 1 . 1 1 . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n u s i n g I T S I r e g i o n o f R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 5 F i g u r e 1 . 1 2 . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n u s i n g I T S I r e g i o n o f R . w e i n ' i s s p . o b l o n g a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 6 F i g u r e 1 . 1 3 . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n o f I T S I o f R h a b d o c l i n e w e i r i i s s p . w e i r i i . . . . 4 7 C H A P T E R 2 F i g u r e 2 . 1 . M a p O f N a t i o n a l f o r e s t s i n t h e R o c k y M o u n t a i n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 8 i i g u F i g u F i g L F i g L F i g ; F i g s F i g F i g F i g C H F i g : F i g i F i g u r e 2 . 2 . T h e l a r g e - f o r m a t g e l e l e c t r O p h o r e s i S a p p a r a t u s u s e d i n r e p l i c a t e d q u a n t i fi c a t i o n s t u d i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 4 F i g u r e 2 . 3 P C R d e t e c t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n o f R h a b d o c l i n e p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e i n f e c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 8 F i g u r e 2 . 4 . P C R d e t e c t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n o f R h a b d o c l i n e p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 9 F i g u r e 2 . 5 . C o m p a r i s o n o f f i e l d ( v i s u a l ) d i s e a s e r a t i n g ( F D R = 0 t o 1 0 0 ) t o P C R d e t e c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 5 F i g u r e 2 . 6 . D e t e c t i o n a n d q u a n t i f i c a t i o n o f R h a b d o c l i n e i n f e c t i o n ( b y p r i m e r s R P P 1 a n d R P P 2 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 7 F i g u r e 2 . 7 . R e s t r i c t i o n e n z y m e S p e l d i g e s t s o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d f r o m D N A e x t r a c t i o n s o f n e e d l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 6 F i g u r e 2 . 8 . R e s t r i c t i o n d i g e s t s O f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d f r o m D N A e x t r a c t i o n s o f n e e d l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 7 F i g u r e 2 . 9 . A l i g n m e n t o f s e q u e n c e s a m p l i f i e d b y R P P 1 a n d R P P 4 p r i m e r s f r o m c u r r e n t y e a r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 0 F i g u r e 2 . 1 0 . C h a n g e s i n t h e a m o u n t o f R h a b d o c l i n e P C R p r o d u c t . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 1 C H A P T E R 3 F i g u r e 3 . 1 . F i v e w e e k s o l d g r o w t h o f R . p a r k e r i i s o l a t e s o n P D M Y . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 4 F i g u r e 3 . 2 . I s o l a t i o n o n t o P D M Y a g a r m e d i u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 7 F i g u r e 3 . 3 . A l i g n m e n t o f t h e c o n s e r v e d s e q u e n c e e l e m e n t s o f a g r o u p I i n t r o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 9 F i g u r e 3 . 4 . A l i g n m e n t o f i n t e r n a l t r a n s c r i b e d S p a c e r s f o r s e l e c t i o n o f R . p a r k e n ' s p e c i e s - S p e c i f i c p r o b e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 2 F i g u r e 3 . 5 . R e s u l t s o f t e s t i n g o f t h e p r i m e r p a i r R P 1 a n d R P 4 f o r S p e c i fi c i t y d e t e r m i n a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 6 F i g u r e 3 . 6 . P C R a m p l i fi e d p r o d u c t s o f R . p a r k e n ’ I T S r D N A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 7 F i g u r e 3 . 7 . T e s t i n g O f t h e p r i m e r p a i r R P 1 - R P 4 f o r S p e c i f i c i t y d e t e r m i n a t i o n i n n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 9 x i F i g F i g F i g F i g l F i g i C H I F i g i F i g ? L F i g L F l g u F I Q U I F I D U I F I Q U I F i g u r e 3 . 8 . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f R . p a r k e n ’ p r o b e s t o I T S I F - I T S 4 a m p l i f i e d P C R p r o d u c t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 2 F i g u r e 3 . 9 . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n o f p r o b e s R P 1 ( A ) a n d R P 6 ( B ) t o t o t a l D N A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 4 F i g u r e 3 . 1 0 . N e s t e d P C R d e t e c t i o n o f R . p a r k e r i b y R P 1 a n d R P 4 p r i m e r p r o b e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 6 F i g u r e 3 . 1 1 . R e s t r i c t i o n d i g e s t s b y e n d o n u c l e a s e B s t N l o f P C R p r o d u c t s . . . . . . 1 6 1 F i g u r e 3 . 1 2 . R e s t r i c t i o n d i g e s t s b y e n d o n u c l e a s e B s t U I o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d f r o m D N A e x t r a c t i o n s o f n e e d l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 2 F i g u r e 3 . 1 3 . R e s t r i c t i o n d i g e s t s b y e n d o n u c l e a s e S c a l o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d f r o m D N A e x t r a c t i o n s o f n e e d l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 3 F i g u r e 3 . 1 4 . S e q u e n c i n g o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y R . p a r k e r i — s p e c i f i c p r o b e s f r o m n e e d l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 6 C H A P T E R 4 F i g u r e 4 . 1 . I s o l a t i o n a n d g r o w t h o f S w i s s n e e d l e c a s t p a t h o g e n , P . g a u m a n n i i o n M a l t E x t r a c t A g a r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 3 F i g u r e 4 . 2 . A l i g n m e n t o f i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r s f o r s e l e c t i o n o f P . g a u m a n n i i s p e c i e s - S p e c i f i c p r o b e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 9 F i g u r e 4 . 3 . P C R t e s t i n g o f p r i m e r p a i r P G 1 - P G 4 d e s i g n e d f r o m P . g a u m a n n i i s e q u e n c e f o r s p e c i fi c i t y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 2 F i g u r e 4 . 4 . D e t e c t i o n o f P . g a u m a n n i i b y p r i m e r p a i r P G 1 - P G 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 4 F i g u r e 4 . 5 . R e s t r i c t i o n d i g e s t o f P G 1 - P G 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 6 F i g u r e 4 . 6 . S i m u l t a n e o u s d e t e c t i o n o f S w i s s a n d R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t p a t h o g e n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 9 F i g u r e 4 . 7 . S i m u l t a n e o u s a m p l i f i c a t i o n s o f S w i s s a n d R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t f u n g i . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 1 F i g u r e 4 . 8 . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n o f P . g a u m a n n i i s p e c i f i c _ o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 3 F i g u r e 4 . 9 . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f P C R p r o d u c t s a m p l i f i e d w i t h p r i m e r p a i r I T S I F a n d I T S 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 4 x i i F i g i F i g F i g ! F i g C H F i g F i g F i g F i g F i g F i g u r e 4 . 1 0 . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f P G 1 — P G 4 a m p l i f i e d P C R p r o d u c t s . . . . . 2 1 6 F i g u r e 4 . 1 1 . N e s t e d P C R d e t e c t i o n o f P . g a u m a n n i i u s i n g S p e c i f i c p r i m e r p a i r P G 1 - P G 4 i n y e a r o l d n e e d l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 9 F i g u r e 4 . 1 2 . I s o l a t i o n o f P . g a u m a n n i i f o r c o m p a r i s o n w i t h p r i m e r d e t e c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 1 F i g u r e 4 . 1 3 R e s t r i c t i o n d i g e s t o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y t h e p r i m e r p a i r P G 1 - P G 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 3 F i g u r e 4 . 1 4 . N e s t e d P C R d e t e c t i o n o f P . g a u m a n n i i a m p l i fi e d b y t h e p r i m e r p a i r P G 1 - P G 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 5 F i g u r e 4 . 1 5 . R e s t r i c t i o n d i g e s t s o f n e s t e d P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d f r o m n e w l y e m e r g e d n e e d l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 6 C H A P T E R 5 F i g u r e 5 . 1 . A m p l i fi c a t i o n o f s o m e p a t h o g e n i c a n d e n d o p h y t i c f u n g i i s o l a t e d f r o m j u n i p e r n e e d l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 9 F i g u r e 5 . 2 . I T S 1 F - I T S 4 a m p l i f i c a t i o n o f p a t h o g e n i c a n d e n d o p h y t i c f u n g i p r e s e n t i n S p r u c e , fi r a n d j u n i p e r n e e d l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 0 F i g u r e 5 . 3 . A l i g n m e n t o f t h e c o n s e r v e d s e q u e n c e e l e m e n t s o f a g r o u p I i n t r o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 1 F i g u r e 5 . 4 . A l i g n m e n t o f I T S s e q u e n c e s f o r s e l e c t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 6 F i g u r e 5 . 5 . P C R a m p l i fi c a t i o n f o r S p e c i f i c i t y o f R . k a l k h o f f i i p r i m e r p a i r R K A 1 - R K A 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 9 F i g u r e 5 . 6 . D e t e c t i o n o f R . k a l k h o f fi i b y p r i m e r p a i r R K A 1 - R K A 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 1 F i g u r e 5 . 7 . R e s t r i c t i o n d i g e s t s O f P C R p r o d u c t s a m p l i f i e d b y R K A 1 - R K A p r i m e r s f r o m n e e d l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 4 F i g u r e 5 . 8 . T e s t i n g o f p r i m e r p a i r R P I N 1 a n d R P I N 4 f o r s p e c i fi c i t y d e t e r m i n a t i o n a n d d e t e c t i o n o f R . p i n i . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 7 F i g u r e 5 . 9 . R e s t r i c t i o n d i g e s t s o f P C R p r o d u c t s a m p l i f i e d b y R P I N 1 a n d R P I N 4 f r o m i n f e c t e d fi r n e e d l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 9 x i i i F i g u r e 5 . 1 0 . T e s t i n g o f p r i m e r s K J 1 a n d K J 4 f o r s p e c i f i c i t y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 0 F i g u r e 5 . 1 1 . D e t e c t i o n o f K . j u n i p e r i b y K J 1 - a n d K J 4 i n j u n i p e r n e e d l e . . . . . . . . . . 2 8 2 F i g u r e 5 . 1 2 . D e t e c t i o n o f K . j u n i p e r i i n n e e d l e s f r o m j u n i p e r s g r o w n i n M i c h i g a n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 3 F i g u r e 5 . 1 3 . R e s t r i c t i o n d i g e s t s o f P C R p r o d u c t s a m p l i f i e d b y t h e p r i m e r p a i r K J 1 a n d K J 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 4 F i g u r e 5 . 1 4 . S p e c i fi c i t y d e t e r m i n a t i o n o f p r i m e r s P J 1 a n d P J 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 6 F i g u r e 5 . 1 5 . S e n s i t i v i t y o f t h e p r i m e r s i n d e t e c t i n g t h e t a r g e t i n n e e d l e s . . . . . . . . 2 8 7 F i g u r e . 5 . 1 6 . D e t e c t i o n o f P . j u n i p e r o v o r a b y p r i m e r s P J 1 a n d P J 4 ) i n j u n i p e r f o l i a g e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 8 F i g u r e 5 . 1 7 . 8 3 l e e n z y m e d i g e s t s o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d f r o m i n f e c t e d j u n i p e r n e e d l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 1 F i g u r e 5 . 1 8 . S p e c i fi c i t y d e t e r m i n a t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s R K A 1 ( A ) , a n d R K A 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 2 F i g u r e 1 9 . S p e c i fi c i t y d e t e r m i n a t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s K J 1 ( A ) , a n d K J 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 3 C H A P T E R 6 F i g u r e 6 . 1 . P C R a m p l i fi c a t i o n s o f i n t e r n a l t r a n s c r i b e d S p a c e r s ( I T S ) o f f u n g i t h a t i n f e c t p i n e n e e d l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 3 F i g u r e 6 . 2 . A l i g n m e n t o f I T S s e q u e n c e s f o r s e l e c t i o n o f p r i m e r / p r o b e s . . . . . . . . . . 3 3 6 F i g u r e 6 . 3 . P C R a m p l i fi c a t i o n s f o r S p e c i f i c i t y d e t e r m i n a t i o n o f p r i m e r p a i r C M 1 - C M 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 9 F i g u r e 6 . 4 . P C R a m p l i fi c a t i o n s w i t h p r i m e r s C N 1 a n d C N 4 f o r s p e c i fi c i t y d e t e r m i n a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 0 F i g u r e 6 . 5 . D e t e c t i o n o f C . m i n u s i n n e e d l e s o f S c o t s p i n e w i t h p r i m e r s C M 1 a n d C M 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 2 F i g u r e 6 . 6 . R e s t r i c t i o n d i g e s t s o f P C R p r o d u c t s a m p l i f i e d b y C M 1 a n d C M 4 f r o m i n f e c t e d n e e d l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 4 x i v F i g u r e 6 . 7 . S p e c i e s - s p e c i fi c a m p l i f i c a t i o n o f L . s e d i t i o s u m w i t h p r i m e r s L S 1 a n d L S 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 6 F i g u r e 6 . 8 . S p e c i e s - s p e c i fi c a m p l i fi c a t i o n o f L . p i n a s t r i w i t h p r i m e r s L P 1 a n d L P 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 7 F i g u r e 6 . 9 . A ) D e t e c t i o n o f L . s e d i t i o s u m b y p r i m e r s L S 1 a n d L S 4 i n i n f e c t e d n e e d l e s o f S c o t s p i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 8 F i g u r e 6 . 1 0 . A ) D e t e c t i o n o f L . p i n a s t r i b y p r i m e r s L P 1 a n d L P 4 i n i n f e c t e d n e e d l e s O f S c o t s p i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 9 F i g u r e 6 . 1 1 . S p e c i e s - s p e c i fi c a m p l i fi c a t i o n o f B r o w n s p o t p a t h o g e n S . a c i c o l a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 1 F i g u r e 6 . 1 2 . A . A m p l i fi c a t i o n o f S . a c i c o l a i n i n f e c t e d p i n e n e e d l e s w i t h p r i m e r p a i r S A 1 a n d S A 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 2 F i g u r e 6 . 1 3 . S p e c i e s - s p e c i f i c a m p l i fi c a t i o n o f D o t h i s t r o m a n e e d l e b l i g h t p a t h o g e n D . p i n i . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 4 F i g u r e 6 . 1 4 . A . A m p l i fi c a t i o n o f D . p i n i i n i n f e c t e d p i n e n e e d l e s w i t h p r i m e r s D P 1 a n d D P 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 5 F i g u r e 6 . 1 5 . T e s t i n g o f p r i m e r s A P 1 - A P 4 f o r s p e c i f i c i t y d e t e r m i n a t i o n . . . . . . . . . . . 3 5 6 F i g u r e 6 . 1 6 . T e s t i n g o f p r i m e r H D 1 a n d H D 4 f o r s p e c i fi c i t y t o F i g u r e 6 . 1 7 . F i g u r e 6 . 1 8 . F i g u r e 6 . 1 9 . H . d e m a t i o i d e s ( H D ) D N A f r o m m y c e l i u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 7 A ) P r i m e r s A P 1 a n d A P 4 a m p l i f i c a t i o n o f A . p u l l u l a n s i n p l a n t t i s s u e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 0 D e t e c t i o n O f H . d e m a t i o i d e s w i t h p r i m e r s H D 1 a n d H D 4 f r o m p l a n t t i s s u e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 1 H a e l l l r e s t r i c t i o n d i g e s t s O f P C R p r o d u c t s a m p l i f i e d w i t h p r i m e r p a i r H D 1 - H D 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 2 F i g u r e 6 . 2 0 . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s f o r S p e c i f i c i t y d e t e r m i n a t i o n F i g u r e 6 . 2 1 . F i g u r e 6 . 2 2 . O f C . m i n u s a n d C . n i v e u m p r o b e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 4 D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s f o r S p e c i fi c i t y d e t e r m i n a t i o n o f L . s e d i t i o s u m p r o b e L S 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 5 D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s f o r s p e c i fi c i t y d e t e r m i n a t i o n o f L . p i n a s t n ’ p r o b e L P 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 7 X V F i g u r e 6 . 2 3 . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s a t 5 7 C f o r S p e c i f i c i t y d e t e r m i n a t i o n o f D . p i n i p r o b e S D P 1 a n d D P 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 8 F i g u r e 6 . 2 4 . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s f o r S p e c i f i c i t y d e t e r m i n a t i o n o f A . p u l l u l a n s p r o b e s A P 1 a n d A P 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 9 F i g u r e 6 . 2 5 . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s f o r S p e c i fi c i t y d e t e r m i n a t i o n o f H . d e m a t i o i d e s p r o b e s H D 1 a n d H D 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 0 X V I m I s s y m p i s o b u d e v e h R H a b : O I H D N I B F H e I S S p _ F W e i n ‘ , ‘ t f o r R . W e i n i : e i e c n i a n n e a i S S D S H I ‘ I W h o m C H A P T E R 1 M o l e c u l a r p r o b e s f o r d e t e c t i o n , i d e n t i fi c a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t s o f D o u g l a s fi r A B S T R A C T T h e R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t d i s e a s e o f D o u g l a s fi r i s d i f fi c u l t t o d e t e c t i n i t s e a r l y p h a s e s b e c a u s e f o l l o w i n g i n f e c t i o n t h e d i s e a s e r e m a i n s l a t e n t u n t i l s y m p t o m s a p p e a r t h e f o l l o w i n g y e a r . F u r t h e r m o r e , t h e p a t h o g e n c a n n o t b e i s o l a t e d b e c a u s e i t d o e s n o t g r o w i n c u l t u r e . O l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s w e r e d e v e l o p e d f r o m I T S r e g i o n s o f r i b o s o m a l D N A f o r d e t e c t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f R h a b d o c l i n e S p e c i e s a n d s u b s p e c i e s . V a r i a t i o n s i n t h e s e q u e n c e s o f I T S r e g i o n s o f R h a b d o c l i n e s u b s p e c i e s w e r e s u f fi c i e n t t o d i v i d e R h a b d o c l i n e i n t o 3 g r o u p s o f r e l a t e d t a x a . A p a i r o f p r i m e r s w a s d e s i g n e d f o r a m p l i fi c a t i o n o f R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e / e p i p h y l l a , R h a b d o c l i n e w e i n ' i s s p . o b o v a t a / o b l o n g a a n d R . w e i n ' i s s p . w e i n ' i , a n d t e s t e d b o t h i n d i r e c t a n d n e s t e d P C R a s s a y s . P r i m e r p a i r s f o r R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e / e p i p h y l l a ( R P P 1 a n d R P P 4 ) a n d f o r R . w e i n ' i s s p . w e i n ' i ( R W W 1 a n d R W W 4 ) a m p l i fi e d t h e i r t a r g e t s S p e c i fi c a l l y a n d e f f e c t i v e l y f r o m i n f e c t e d n e e d l e s i n d i r e c t P C R a m p l i f i c a t i o n s a t d e t e r m i n e d a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s . B o t h p r i m e r p a i r s , e s p e c i a l l y R P P 1 a n d R P P 4 , w e r e s e n s i t i v e e n o u g h t o d e t e c t a n d a m p l i f y t h e t a r g e t D N A i n s y m p t o m l e s s n e e d l e s w i t h o u t a n y c r o s s - r e a c t i o n w i t h D N A o f t h e p l a n t o r C l o s e l y r e l a t e d f u n g i . D e t e c t i o n s w i t h p r i m e r p a i r R W O 1 a n d R W O 4 w e r e a l s o h i g h l y s e n s i t i v e a n d e f fi c i e n t i n d i r e c t a m p l i fi c a t i o n s . H o w e v e r , t h e p a i r w a s n o t s p e c i fi c t o R . w e i n ' i s s p . o b o v a t a / s s p . o b l o n g a a s i t a l s o a m p l i fi e d o t h e r R h a b d o c l i n e s p e c i e s , e x c e p t R . w e i n ' i s s p . w e i n ' i . A l t h o u g h t h e s e n s i t i v i t y o f d e t e c t i o n o f a l l t h r e e p r i m e r p a i r s h a s i n c r e a s e d s o m e w h a t i n n e s t e d P C R , t h e i r S p e c i f i c i t y d e c r e a s e d a s w e a k c r o s s - r e a c t i o n s w e r e o b s e r v e d w i t h n o n - t a r g e t R h a b d o c l i n e S p e c i e s o r s u b s p e c i e s . A g e n u s s p e c i fi c p r i m e r p a i r ( R H A B 1 - R H A B 4 ) d e v e l o p e d f r o m c o n s e r v e d r e g i o n s o f R h a b d o c l i n e s u b s p e c i e s c o n s i s t e n t l y d e t e c t e d a n d a m p l i fi e d a l l 5 S p e c i e s i n n e s t e d P C R a s s a y s . I n t h i s s t u d y , t h e p r i m e r s w e r e a l s o u s e d a s p r o b e s i n d o t - b l o t s a s s a y s o f u n i v e r s a l ( I T S 1 F / I T S 4 ) a m p l i f i e d P C R p r o d u c t s a n d t o t a l D N A e x t r a c t e d f r o m n e e d l e s . 3 2 P - I a b e l e d o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s d e v e l o p e d f o r R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e / e p i p h y l l a ( R P P 1 a n d R P P 4 ) a n d f o r R . w e i n ' i S S p . w e i n ' i ( R W W 1 a n d R W W 4 ) s p e c i fi c a l l y h y b r i d i z e d t o t h e i r t a r g e t f u n g i a t d e t e r m i n e d o p t i m u m h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s , d i s t i n g u i s h i n g t h e s e s u b s p e c i e s f r o m a l l o t h e r R h a b d o c l i n e s u b s p e c i e s e v e n t h o u g h t h e y d i f f e r e d f r o m t h e c o r r e s p o n d i n g s e q u e n c e s o f o t h e r s u b s p e c i e s b y o n e o r t w o b a s e s . F u r t h e r m o r e , t h e l a b e l e d I T S I r e g i o n f o r e a c h o f t h e t h r e e t a x a R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e ( R P P - I T S I ) , R . w e i n ' i s s p . o b l o n g a ( R W O - I T S I ) a n d R . w e i n ' i S S p . w e i n ' i ( R W W - I T S I ) e a c h h y b r i d i z e d t o a l l R h a b d o c l i n e s u b s p e c i e s a t t e m p e r a t u r e s u p t o 7 5 C i n d i c a t i n g I T S I s e q u e n c e c o u l d b e u s e f u l a s g e n u s - S p e c i fi c p r o b e s . T h e I T S I r e g i o n o f R . w e i r i i s s p . w e i r i i ( R W W - I T S I ) h y b r i d i z e d t o o n l y i t s t a r g e t a t 8 0 C a n d c o u l d b e a s u c c e s s f u l s u b s p e c i e s - s p e c i fi c p r o b e s f o r d i a g n o s t i c s . ( P s e u d c I h i o u g h . N o r t h A p b n fi n g p l a n t a i i : t r e e p l ; M i c h i g a M i l l e r , 1 9 8 5 ) , i n i e c i e i S o u r c e : ( J G Y n e g S i d . l l W a s I a . I N T R O D U C T I O N R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t i s t h e m o s t i m p o r t a n t d i s e a s e o f D o u g l a s fi r ( P s e u d o t s u g a m e n z i e s i i ( M i r b ) F r a n c o ) a n d i s l i m i t e d t o t h i s h o s t . I t i S e n d e m i c t h r o u g h o u t t h e n a t u r a l r a n g e o f D o u g l a s fi r b u t h a s a l s o s p r e a d i n t o o t h e r p a r t s o f N o r t h A m e r i c a w h e r e D o u g l a s fi r i S p l a n t e d a s a n e x o t i c s p e c i e s . A l t h o u g h p l a n t i n g s t o c k g r o w n f r o m r e s i s t a n t s e e d s o u r c e s h a s r e d u c e d l o s s e s i n f o r e s t p l a n t a t i o n s i n r e c e n t y e a r s , t h e d i s e a s e i s s t i l l a s e r i o u s p r o b l e m i n C h r i s t m a s t r e e p l a n t a t i o n s , p a r t i c u l a r l y i n t h e G r e a t L a k e s s t a t e s a n d N e w E n g l a n d : M i c h i g a n , W i s c o n s i n a n d M i n n e s o t a ( O ’ B r i e n , 1 9 8 3 ; M o r t o n 1 9 8 2 ; M o r t o n , a n d M i l l e r , 1 9 7 7 ) , N e w Y o r k ( B r a n d t , 1 9 6 0 ) , P e n n s y l v a n i a ( M c D o w e l l a n d M e r r i l l , 1 9 8 5 ) , a n d N e w H a m p s h i r e ( H a r r i n g t o n , 1 9 8 6 ) . T h e p a t h o g e n s a r e d i s t r i b u t e d o n i n f e c t e d n u r s e r y s e e d l i n g o r s t o c k s , a n d m o s t o f t h e c u r r e n t l y a v a i l a b l e s e e d s o u r c e s p r e f e r r e d a s C h r i s t m a s t r e e s ( I n t e r r n o u n t a i n s o u r c e s ) a r e s u s c e p t i b l e ( J a y n e s e t a l 1 9 8 7 ; H a r r i n g t o n , 1 9 8 6 ; C a s t a g n e r , 2 0 0 1 ) . R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t i s c a u s e d b y f u n g i i n t h e g e n u s R h a b d o c l i n e S y d . t h a t p r o d u c e s c o n s p i c u o u s f r u i t i n g b o d i e s ( a p o t h e c i a ) o n t h e f o l i a g e o f D o u g l a s fi r . T h e S p e c i e s i n i t i a l l y d e s c r i b e d a s R h a b d o c l i n e p s e u d o t s u g a e S y d . w a s l a t e r d i f f e r e n t i a t e d i n t o t w o m a i n S p e c i e s b y t h e p r e s e n c e ( R . w e i r i i P a r k e r a n d R e i d ) o r a b s e n c e ( R . p s e u d o t s u g a e ) o f a n a p i c u l a r a n n u l u s , w h i c h s u r r o u n d s t h e p o r e o f t h e a s c u s a n d g i v e s a n a m y l o i d r e a c t i o n i n M e l z e r ’ s r e a g e n t ( P a r k e r a n d R e i d , 1 9 6 9 ; F u n k , 1 9 8 5 ) . T h e t w o s p e c i e s w e r e f u r t h e r d i v i d e d i n t o fi v e d i s t i n c t s u b s p e c i e s : s u b s p e c i e s e p i p h y l l a P a r k e r & R e i d a n d p s e u d o t s u g a e P a r k e r & R e i d w i t h i n R . p s e u d o t s u g a e a n d s u b s p e c i e s o b l o n g a P a r k e r & R e i d , O b o v a t a P a r k e r & R e i d a n d w e i r i i w i t h i n R . w e i n ' i P a r k e r & R e i d . S u b s p e c i e S a r e s e p a r a t e d b y c o n s i s t e n t d i f f e r e n c e s i n t h e l o c a t i o n o f t h e n e e d l e l e s i o n s t h e y c a u s e ( e p i p h y l l o u s o r h y p o p h y l l o u s ) , b y t h e p r e s e n c e o f a c o n i d i a l a n a m o r p h , a n d b y a s c o s p o r e a n d p a r a p h y s i s m o r p h o l o g y ( P a r k e r a n d R e i d , 1 9 6 9 ; F u n k , 1 9 8 5 ) . R h a b d o c l i n e p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e a n d R . w e i n ' i s s p . o b l o n g a a r e t h e m o s t a g g r e s s i v e a n d p r e d o m i n a n t f o r m s i n p l a n t a t i o n s i n t h e G r e a t L a k e s r e g i o n a n d t h e n o r t h e a s t ( M o r t o n a n d M i l l e r , 1 9 7 7 ; O ’ B r i e n , 1 9 8 3 ; H a r r i n g t o n , 1 9 8 6 ) . R h a b d o c l i n e p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e i S t h e m a i n s u b s p e c i e s i n t h e w e s t e r n U S . a n d E u r o p e ( P a r k e r a n d R e i d 1 9 6 9 ; P a r k e r , 1 9 7 0 ; M i l l e r a n d M i n t e r , 1 9 8 0 ) . H o w e v e r , o t h e r s u b s p e c i e s c a n a l s o b e f o u n d t h r o u g h o u t t h e r a n g e o f D o u g l a s fi r i n t h e P a c i fi c N o r t h w e s t ( S i n c l a i r e t a l . 1 9 8 9 ; S t o n e , 1 9 8 7 ) . R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t f u n g i a r e a l l o b l i g a t e p a r a s i t e s o n n e e d l e s o f y o u n g t r e e s i n n u r s e r i e s a n d C h r i s t m a s t r e e p l a n t a t i o n s a n d i n f e c t c u r r e n t y e a r o r o l d e r n e e d l e s d i r e c t l y t h r o u g h t h e c u t i c l e ( M i l l a r a n d M i n t e r 1 9 8 0 ; S i n c l a i r e t a l . 1 9 8 9 ) . I n f e c t i o n s a r e i n i t i a t e d b y a s c o s p o r e S a f t e r b u d b r e a k i n M a y . O n l y o n e i n f e c t i o n p e r i o d o c c u r s p e r y e a r . A l l s u b s p e c i e s c a u s e S i m i l a r s y m p t o m s o f d e f o l i a t i o n t h a t l e a d t o r e d u c e d g r o w t h a n d t o e c o n o m i c l o s s i n n u r s e r i e s a n d C h r i s t m a s t r e e p l a n t a t i o n s . A t h i r d S p e c i e s , R h a b d o c l i n e p a r k e r i S h e n N O O d - P i k e , i s a f u n g a l e n d o p h y t e a n d c a u s e s s y m p t o m l e s s , l a t e n t i n f e c t i o n s i n t h e n e e d l e s o f D o u g l a s fi r . R h a b d o c l i n e p a r k e r i i s a n a s c o m y c e t e t h a t f o r m s a p o t h e c i a o n s e n e s c e n t n e e d l e s , a n d i t i s a m e m b e r o f t h e o r d e r R h y t i s m a t a l e s ( K i r k e t a l . 2 0 0 2 ) . T h e f u n g u s h a s b e e n f o u n d i n e v e r y t r e e f r o m w h i c h i s o l a t e s h a v e b e e n o b t a i n e d i n t h e P a c i fi c N o r t h w e s t ( S h e r w o o d - P i k e e t a l 1 9 8 6 ; S t o n e 1 9 8 6 ; M C C u t C h e o n e t a l 1 9 9 3 ) . I t c a n i n h a b i t t h e s a m e n e e d l e w i t h t h e fi v e p a t h o g e n i c R h a b d o c l i n e s u b s p e c i e s . T h e s e q u e n c e s o f I n t e r n a l T r a n s c r i b e d S p a c e r ( I T S ) r e g i o n s o f R . p a r k e r i S h o w h i g h l e v e l s o f h o m o l o g y a n d f o r m a m o n o p h y l e t i c C l a d e w i t h i n t h e g e n u s R h a b d o c l i n e ( G e r n a n d t e t a l . 1 9 9 7 ) . R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t p a t h o g e n s a r e d i s s e m i n a t e d o n n u r s e r y m a t e r i a l a n d C h r i s t m a s t r e e s . T h e y s t a y a s l a t e n t i n f e c t i o n s a n d d o n o t r e s u l t i n a n y v i s i b l e s y m p t o m s f o r a s l o n g a S 6 - 9 m o n t h s . T h e i n a b i l i t y t o d e t e c t t h e d i s e a s e i n e a r l y s t a g e s r e s u l t s i n i t s c o n t i n u e d d i s s e m i n a t i o n . F o r t h i s r e a s o n , i t i s i m p o r t a n t t o d e t e c t s y m p t o m l e s s i n f e c t i o n s p r i o r t o s a l e o r t r a n s p o r t t o n e w p l a n t a t i o n s . T h e c u r r e n t i n s p e c t i o n a n d c e r t i fi c a t i o n o f D o u g l a s f i r f o r R h a b d o c l i n e i n f e c t i o n i s b a s e d o n l y o n v i s u a l i n s p e c t i o n o f a r a n d o m s a m p l e o f s e e d l i n g s . T h e s e s e e d l i n g s c a r r y i n g l a t e n t i n f e c t i o n s a r e s c o r e d a s d i s e a s e f r e e b y v i s u a l d e t e c t i o n . I n a d d i t i o n , t h e p a t h o g e n s c a n n o t b e d e t e c t e d a n d i d e n t i fi e d b y c o n v e n t i o n a l i s o l a t i o n t e c h n i q u e s b e c a u s e t h e y d o n o t g r o w o n l a b o r a t o r y m e d i a . I d e n t i fi c a t i o n r e q u i r e s t h e p r e s e n c e o f f r u i t i n g b o d i e s , w h i c h a r e f o r m e d t h e f o l l o w i n g y e a r . T h e r e f o r e , a f a s t , e a s y , s e n s i t i v e a n d s p e c i f i c t e c h n i q u e f o r e a r l y d e t e c t i o n o f l a t e n t R h a b d o c l i n e i n f e c t i o n s i n n e e d l e s i s n e e d e d . T h i s t e c h n i q u e w o u l d b e t h e c o r e o f a n i n s p e c t i o n a n d c e r t i fi c a t i o n s y s t e m f o r n u r s e r y s t o c k s . F u r t h e r m o r e , t h i s t e c h n i q u e w i l l h e l p t o m o n i t o r t h e s e p a t h o g e n s f o l l o w i n g o u t p l a n t i n g a n d h e l p i n d e v e l o p m e n t o f d i s e a s e c o n t r o l s t r a t e g i e s . T h e u s e o f m o l e c u l a r m a r k e r s f o r s p e c i e s - S p e c i fi c d e t e c t i o n a s s a y s h a s r e c e n t l y b e c o m e v e r y p o p u l a r ( r e v i e w e d i n H e n s o n a n d F r e n c h 1 9 9 3 ; M a r t i n e t a l . 2 0 0 0 ) . M o l e c u l a r p r o b e s a r e c u r r e n t l y u s e d i n m a n y a p p l i c a t i o n s i n c l u d i n g f o r e n s i c a n d d i a g n o s t i c i n v e s t i g a t i o n s . T h e y h a v e b e e n u s e d e x t e n s i v e l y i n P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n ( P C R ) o r d o t - b l o t a s s a y s f o r d e t e c t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n o f b a c t e r i a ( P r i n e t a l . 1 9 9 3 ; H a h n e t a l . 1 9 9 3 ; K a b i r e t a l . 1 9 9 5 ; S c h a a d e t a l . 1 9 9 5 ; S i e r i n g a n d G h i o r s e 1 9 9 7 ; K i r c h o f f e t a l . 1 9 9 7 ) , v i r u s e s o r v i r o i d s ( S m i t h e t a l . 1 9 9 3 ; R o w h a n i e t a l . 1 9 9 3 ; S c h o e n , 1 9 9 6 ; S a l d e r e l l i e t a l . 1 9 9 6 ; H o d g s o n e t a l . 1 9 9 8 ) , p h y t o p l a s m a s ( W e b b e t a l . 1 9 9 9 ) , m y c o p l a s m a s ( D e n g a n d H i r u k i , 1 9 9 1 ; M i n s a v a g e e t a l . 1 9 9 4 ) a n d n e m a t o d e s ( S t r a t f o r d e t a l . 1 9 9 2 ) i n i n f e c t e d t i s s u e s . T h e s e q u e n c e s o f m i t o c h o n d r i a l D N A , C l o n e d r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s o f g e n o m i c D N A , a d i s t i n c t f r a g m e n t o f r e p e t i t i v e R A P D s e q u e n c e s , a n d e s p e c i a l l y , o f i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r r e g i o n s ( I T S ) o f r i b o s o m a l D N A h a v e b e e n m o s t c o m m o n l y e x p l o i t e d t o d e v e l o p o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s f o r f u n g i . T h e i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r s ( I T S ) a r e t h e t w o v a r i a b l e n o n - c o d i n g r e g i o n s ( I T S I a n d I T S I I ) o f D N A s e q u e n c e t h a t s e p a r a t e g e n e s c o d i n g f o r t h e h i g h l y c o n s e r v e d 1 8 8 ( s m a l l s u b u n i t ) , 5 . 8 8 a n d 2 8 8 ( l a r g e s u b u n i t ) r i b o s o m a l R N A g e n e s ( F i g u r e 1 . 1 ) . I n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r ( I T S ) r e g i o n s d i s p l a y h i g h p o l y m o r p h i s m a m o n g s p e c i e s o f a g e n u s a n d o c c u r i n h u n d r e d s o f c o p i e s i n t a n d e m r e p e a t s m a k i n g t h e s e r e g i o n s e a s y t a r g e t f o r P C R a n d d o t b l o t h y b r i d i z a t i o n . I T S s e q u e n c e s h a v e b e e n u s e d t o c o n s t r u c t p h y l o g e n e t i c t r e e s , t o e s t i m a t e g e n e t i c p o p u l a t i o n s t r u c t u r e s , t o e v a l u a t e p o p u l a t i o n - l e v e l e v o l u t i o n a r y p r o c e s s e s a n d t o d e t e r m i n e t a x o n o m i c i d e n t i t y . J I T S 1 F — « > I T S 3 - - > i T S I . . . - ; I T S H _ l 2 . 8 S r D N A . . - ] < - - | T 8 2 < - - I T S 4 F i g u r e 1 . 1 . T h e l o c a t i o n o f i n t e r n a l t r a n s c r i b e d S p a c e r s ( I T S ) i n r i b o s o m a l D N A . 1 8 8 r D N A ( s m a l l s u b u n i t ) , 5 . 8 S r D N A a n d 2 8 S r D N A ( l a r g e s u b u n i t ) a r e c o d i n g r e g i o n s . U n i v e r s a l p r i m e r s ( I T S 1 F = f u n g u s s p e c i fi c , I T S Z , I T S 3 , I T S 4 ) a r e u s e d t o a m p l i f y I T S r e g i o n s . D e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f f u n g i d i r e c t l y f r o m i n f e c t e d t i s s u e s b y P C R u s i n g o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s h a v e b e e n r e p o r t e d f o r m a n y p l a n t p a t h o g e n i c f u n g i ( S c h i l l i n g e t a l . 1 9 9 6 ; T r o u t e t a l . 1 9 9 7 ; R i s t a i n o e t a l . 1 9 9 8 ; C o o k e a n d D u n c a n , 1 9 9 7 ; Z h a n g e t a l . 1 9 9 7 ; M a z z o l a e t a l . 1 9 9 6 ; S m i t h . e t a l . 1 9 9 6 ; M o r a l e s e t a l . 1 9 9 3 ; O ’ G o r m a n e t a l . 1 9 9 4 ; R o b b e t a l . 1 9 9 4 ; T i s s e r a t e t a l . 1 9 9 4 ) . I T S r e g i o n s o f C y l i n d r o c l a d i u m fl o n ' d a n u m a n d C y l i n d r o c a r p o n d e s t r u c t a n s , w h i c h a r e t h e m o s t s e r i o u s c o n i f e r r o o t r o t p a t h o g e n s i n C a n a d a , h a v e b e e n a m p l i f i e d d i r e c t l y f r o m i n f e c t e d r o o t s i n n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s ( H a m e l i n e t a l . 1 9 9 6 ) . S i m i l a r l y , G r e m m e n i e l l a a b i e t i n a , t h e c a u s a l o f a g e n t o f S c l e r o d e r n ‘ s c a n k e r o f p i n e h a s b e e n d e t e c t e d d i r e c t l y f r o m i n f e c t e d n e e d l e s b y t h e s a m e a p p r o a c h . T h e c o n c e p t O f n e s t e d P C R i s t o c a r r y o n e r o u n d o f P C R a m p l i f i c a t i o n w i t h a s e t o f p r i m e r s ( e x t e r n a l ) a n d t h e n u t i l i z e t h e P C R p r o d u c t a s t e m p l a t e f o r a s e c o n d r o u n d o f P C R a m p l i fi c a t i o n w i t h a s e c o n d s e t o f p r i m e r s ( i n t e r n a l p r i m e r s ) . N e s t e d P C R h a v e b e e n d e m o n s t r a t e d t o i n c r e a s e t h e s e n s i t i v i t y o f d e t e c t i o n o f f u n g a l p a t h o g e n s i n p l a n t s t i s s u e s b y 2 , 5 0 0 - f o l d ( K r i c k a , 1 9 9 2 ) . T h e t e c h n i q u e w a s f o u n d t o b e s o s e n s i t i v e t h a t a S i n g l e i n f e c t e d n e e d l e i n 1 0 0 0 h e a l t h y n e e d l e s c o u l d b e d e t e c t e d ( H a m e l i n e t a l . 2 0 0 0 ) . P C R d e t e c t i o n h a s b e e n r e c o m m e n d e d f o r u s e i n c e r t i fi c a t i o n o f b o t h d i s e a s e s y s t e m s . 7 O l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s h a v e a l s o b e e n u s e d i n d o t - b l o t o r r e v e r s e d o t - b l o t a s s a y s f o r d e t e c t i o n , i d e n t i f i c a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f f u n g i i n i n f e c t e d t i s s u e s ( J o h a n s o n a n d J e g e r , 1 9 9 3 ; L e v e s q u e e t a l . 1 9 9 8 ) . T h e y w e r e p a r t i c u l a r l y e f f e c t i v e i n d o t b l o t a s s a y s o f u n i v e r s a l p r i m e r s I T S 1 F a n d I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s ( L i e t a l . 1 9 8 8 ; L e e e t a l . 1 9 9 3 ; B r u n S a n d G a r d e s , 1 9 9 3 ) . T h i s t e c h n i q u e c a n b e a f a s t a n d e a s y w a y t o s u r v e y b u l k p l a n t s a m p l e s f o r f u n g a l i n f e c t i o n ( H i g u c h i e t a l . 1 9 8 8 a n d L i e t a l . 1 9 8 8 ) . R e v e r s e d o t - b l o t e m p l o y s m u l t i p l e x P C R t o S i m u l t a n e o u s l y a m p l i f y a n d l a b e l t h e r e g i o n s o f D N A t h a t w e r e u s e d t o d e v e l o p s p e c i fi c o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s . T h e l a b e l e d P C R p r o d u c t s a r e u s e d a s p r o b e s a n d h y b r i d i z e d t o a n a r r a y o f s p e c i fi c o l i g o n u c l e o t i d e s t h a t a r e fi x e d o n t o a m e m b r a n e . T h e t e c h n i q u e w a s u s e d t o i d e n t i f y a n d d i f f e r e n t i a t e P y t h i u m a n d P h y t o p h t h o r a s p e c i e s ( L e v e s q u e e t a l . 1 9 9 8 ) . A d d i t i o n a l l y , t h e w h o l e I T S I r e g i o n ( o r f r a g m e n t s c u t b y r e s t r i c t i o n e n z y m e s ) s h o w e d a h i g h d e g r e e o f s p e c i e s S p e c i fi c i t y w h e n u s e d a s p r o b e s t o d i f f e r e n t i a t e P y t h i u m u l t i m u m f r o m o t h e r P y t h i u m s p e c i e s i n n o n - r a d i o a c t i v e l y l a b e l e d d o t - b l o t s a s s a y s o f m y c e l i u m . P o t e n t i a l l y , o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s c o u l d b e l a b e l e d w i t h n o n - r a d i o a c t i v e t a g s a n d u s e d b y n u r s e r y i n s p e c t o r s f o r d e t e c t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n o f c o n i f e r p a t h o g e n s . T h e o b j e c t i v e o f t h i s s t u d y w a s t o d e v e l o p a r a p i d , s e n s i t i v e a n d r e l i a b l e m e t h o d e m p l o y i n g P C R a m p l i f i c a t i o n a n d d o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n f o r d e t e c t i o n , i d e n t i fi c a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f R h a b d o c l i n e t a x a d i r e c t l y f r o m s y m p t o m l e s s b u t i n f e c t e d n e e d l e s . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S I s o l a t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n o f f u n g a l s t r a i n s T h e f u n g a l i s o l a t e s u s e d i n t h i s s t u d y a r e l i s t e d i n T a b l e 1 . 1 . A l l t h e i s o l a t e s e x c e p t R h a b d o c l i n e p a r k e r i S h e r w o o d - P i k e w e r e g r o w n a n d m a i n t a i n e d o n m a l t e x t r a c t a g a r ( D i f c o L a b o r a t o r i e s , D e t r o i t , M i c h i g a n ) . R h a b d o c l i n e p a r k e r i w a s i s o l a t e d f r o m 2 - 5 y e a r o l d n e e d l e s a s d e s c r i b e d ( T o d d , 1 9 8 8 ; M C C u t C h e o n e t a l . 1 9 9 3 ; G e r n a n d t e t a l . 1 9 9 7 ) w i t h s o m e m o d i fi c a t i o n s . N e e d l e s w e r e s u r f a c e s t e r i l i z e d b y s o a k i n g f o r 5 m i n i n 7 0 — 9 5 % e t h a n o l , b r i e fl y r i n s i n g i n s t e r i l e d i s t i l l e d w a t e r a n d s o a k i n g f o r 1 0 m i n i n c o m m e r c i a l b l e a c h , f o l l o w e d b y a s e c o n d b r i e f r i n s e i n s t e r i l e d i s t i l l e d w a t e r . T h e n e e d l e s w e r e b l o t t e d a n d d r i e d o n a s t e r i l e p a p e r t o w e l f o r a f e w m i n u t e s a n d c u t w i t h a s c a l p e l i n t o t h r e e t o f i v e s e g m e n t s . T h e s e g m e n t s w e r e i m m e d i a t e l y p l a t e d o n p e t r i d i s h e s c o n t a i n i n g P D M Y a g a r ( D i f c o p o t a t o d e x t r o s e a g a r a m e n d e d w i t h 2 % m a l t e x t r a c t a n d 1 % y e a s t e x t r a c t ; ( D i f c o C h e m i c a l C o m p a n y , D e t r o i t , M I ) ( S h e n N o o d - P i k e e t a l . 1 9 8 5 ; S t o n e , 1 9 8 6 ) . S t r e p t o m y c i n s u l p h a t e ( 2 0 0 p p m / L ) w a s a d d e d t o p r e v e n t b a c t e r i a l g r o w t h . T h e p l a t e s w e r e i n c u b a t e d a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d C h e c k e d d a i l y o v e r t w o w e e k s f o r f u n g a l g r o w t h . T h e f u n g i g r o w i n g o u t w e r e s u b c u l t u r e d o n t h e s a m e m e d i u m . F o r D N A e x t r a c t i o n s , s t e r i l e c e l l u l o s e m e m b r a n e s c u t t o f i t p e t r i d i s h e s w e r e p l a c e d o n t h e m e d i u m a n d m y c e l i a w e r e s p r e a d o v e r t h e p l a t e s t o a t t a i n g r o w t h o f s u f f i c i e n t m a s s o f h y p h a e . T h e i s o l a t e s O f R . p a r k e n ' , P h a e o c r y p t o p u s g a u m a n n i i ( R o h d e ) P e t r . r e q u i r e d a t l e a s t a m o n t h t o p r o d u c e g r o w t h o f 2 . 5 c m d i a m e t e r a t r o o m t e m p e r a t u r e w h e r e a s e n d o p h y t i c f u n g i S c l e r o p h o m a p i t h y o p h i l a ( C o r d a ) H o h n . , A u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n s ( d e B a r y ) A r n . a n d H o r r n o n e m a d e m a t i o i d e s L a g e r b e r g & M e l i n p r o d u c e d m y c e l i a l g r o w t h i n a w e e k t o c o v e r t h e s u r f a c e o f a g a r p l a t e s . T h e s o u r c e s o f n e e d l e s a m p l e s u s e d i n t h i s s t u d y a r e l i s t e d i n T a b l e 1 . 1 . J e f f S t o n e ( O r e g o n S t a t e U n i v e r s i t y ) s u p p l i e d s a m p l e s o f D o u g l a s f i r n e e d l e s i d e n t i fi e d a s i n f e c t e d b y d i f f e r e n t S p e c i e s a n d s u b s p e c i e s o f R h a b d o c l i n e f o u n d i n O r e g o n ( O R ) . G a r y C h a s t a g n a r ( W a s h i n g t o n S t a t e U n i v e r s i t y ) p r o v i d e d n e e d l e s c o l l e c t e d f r o m d i f f e r e n t p r o v e n a n c e s o f i n t e r m o u n t a i n ( I M ) P . m e n z e i s i i g r o w n i n W a s h i n g t o n ( W A ) . H e a l s o p r o v i d e d n e e d l e s o f t h e c o a s t a l f o r m o f P . m e n z e i s i i i n f e c t e d w i t h R . p a r k e r i . H e a l t h y a n d d i s e a s e d n e e d l e s a m p l e s w e r e a l s o c o l l e c t e d d u r i n g v i s i t s t o t h e M i c h i g a n p l a n t a t i o n s i n C h e y b o g a n a n d O c e a n a C o u n t i e s , o r s e n t b y M S U e x t e n s i o n a g e n t s t h r o u g h o u t M i c h i g a n ( M I ) . F r u i t i n g b o d i e s o f R h a b d o c l i n e o n t h e n e e d l e s a m p l e s w e r e i d e n t i f i e d t o s p e c i e s a n d s u b s p e c i e s u s i n g t h e m o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s d e s c r i b e d b y P a r k e r a n d R e i d ( 1 9 6 9 ) a n d F u n k ( 1 9 8 5 ) . D N A e x t r a c t i o n f r o m m y c e l i u m o f f u n g i F u n g a l m y c e l i a g r o w n f o r 2 w e e k s o n c e l l u l o s e m e m b r a n e - c o v e r e d p l a t e s w e r e s c r a p e d i n t o 1 5 m l t u b e s a n d l y o p h i l i z e d f o r 2 d a y s . D N A w a s e x t r a c t e d a c c o r d i n g t o t h e p r o t o c o l d e s c r i b e d b y L e e e t a l . ( 1 9 8 8 ) . L y o p h i l i z e d h y p h a e ( a p p r o x i m a t e l y 1 0 0 m g ) w e r e s u s p e n d e d i n 7 0 0 p l I y S i s b u f f e r ( 5 0 m M T r i s - H C I , 5 0 m M E D T A , 3 % S D S p H , 8 . 0 ; a m e n d e d w i t h 1 % 2 - m e r c a p t o e t h a n o l j u s t p r i o r t o e a c h u s e ) . P e s t l e s w e r e s o a k e d i n d i l u t e H C I ( 1 : 1 0 ) a n d c l e a n e d w i t h s o a p a n d w a t e r b e f o r e s t e r i l i z a t i o n . M y c e l i a w e r e c r u s h e d w i t h p e s t l e s f o r 3 - 5 m i n u t e s a n d i n c u b a t e d 1 h o u r a t 6 5 C . T h e n , 7 0 0 p l p h e n o l z c h l o r o f o r m : i s o a m y l a l c o h o l 1 0 T a b l e 1 . 1 . F u n g a l i s o l a t e s a n d n e e d l e s p e c i m e n s w i t h i d e n t i fi e d f u n g a l f r u i t i n g b o d i e s u s e d i n t h e s t u d y . S i e s / F u n g a l i s o l a t e s C o d e H o s t S o u r c e I T S L e n g l h G e n B a n k # A u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n s A P P i n u s s y l v e s t r i s M I 5 1 1 A F 0 1 3 2 2 9 H o r m o n e m a d e m a t i o i d e s H D P . s y l v e s t r i s M I 5 1 7 A F 0 1 3 2 2 7 H o n n o n e m a d e m a t i o i d e s H D - D F P . m e n z i e s i i ( I M ) 3 M I 5 1 4 A F 4 6 2 4 3 9 M e n ' a p a r k e r i M P - A T C C P . m e n z i e s i i ( C 0 ) ” A T C C ° P h a e o c r y p t o p u s g a u m a n n i i P G P . m e n z i e s i i ( l M ) M I 5 1 3 A F 0 1 3 2 2 5 R h a b d o c l i n e p a r k e n ’ R P - A T C C P . m e n z i e s i i ( C O ) A T C C 4 5 1 A F 2 6 0 8 1 3 R P - C O C P . m e n z i e s i i ( C O ) W A R P - C O E P . m e n z i e s i i ( C O ) W A 4 5 2 A F 4 6 2 4 2 7 R P - C O H P . m e n z i e s i i ( C O ) W A 4 5 0 A F 4 6 2 4 2 3 R P - C H M I P . m e n z i e s i i ( I M ) M I 4 5 0 A F 4 6 2 4 2 5 R P - O C M I P . m e n z i e s i i ( I M ) M I 4 5 0 A F 4 6 2 4 2 9 R P - O R 1 P . m e n z i e s i i ( C O ) O R 4 5 0 U 9 2 2 9 7 R P - O R 2 P . m e n z i e s i i ( I M ) O R 4 5 0 U 9 2 2 9 5 R P - O R 3 P . m e n z i e s i i ( C O ) O R 4 4 9 U 9 2 2 9 6 R P - O R 4 P . m e n z i e s i i ( I M ) O R 4 5 1 U 9 2 2 9 4 R P - W A 1 0 3 P . m e n z i e s i i ( I M ) W A 4 4 9 A F 4 6 2 4 2 6 R P - W A 1 0 4 P . m e n z i e s i i ( I M ) W A 4 4 9 A F 4 6 2 4 2 4 S c l e r o p h o m a p i t y o p h i l a S P P . s y l v e s t r i s M I 5 1 6 A F 4 6 2 4 3 8 S fl i e s / N e e d l e s g i m e n s P h a e o c r y p t o p u s g a u m a n n i i P G - M I 1 P . m e n z i e s i i ( I M ) M I P G - M l 2 P . m e n z i e s i i ( I M ) M I P G - M l 3 P . m e n z i e s i i ( I M ) M l P G - W A 2 9 P . m e n z i e s i i ( I M ) W A R . p s e u . s s p . e p i p h y l l a R P E - O R I P . m e n z i e s i i ( I M ) O R 4 4 8 U 9 2 2 9 2 R . p s e u . s s p . p s e u d o t s u g a e R P P - O R 2 P . m e n z i e s i i ( I M ) O R 4 4 7 U 9 2 2 9 0 R P P - O R 3 P . m e n z i e s i i ( I M ) O R 4 4 8 U 9 2 2 9 1 R P P - O R 4 P . m e n z i e s i i ( I M ) O R R P P - C H M I P . m e n z i e s i i ( I M ) M I 4 4 7 A F 4 6 2 4 2 0 R P P - O C M I 1 P . m e n z i e s i i ( I M ) M I 4 5 0 R P P - O C M I 2 P . m e n z i e s i i ( I M ) M I R P P - O C M I 3 P . m e n z i e s i i ( I M ) M I R P P - W A 3 P . m e n z i e s i i ( I M ) W A R P P - W A 7 P . m e n z i e s i i ( I M ) W A R P P - W A 8 P . m e n z i e s i i ( I M ) W A 4 4 8 A F 4 6 2 4 2 1 R P P - W A 2 9 P . m e n z i e s i i ( I M ) W A 4 4 7 A F 4 6 2 4 2 2 R P P - W A 3 1 P . m e n z i e s i i ( I M ) W A R P P - W A 3 2 P . m e n z i e s i i ( I M ) W A R . w e i n ’ i s p p . o b o v a t a R W O B V - O R S P . m e n z i e s i i ( I M ) O R 4 4 8 U 9 2 2 9 3 R . w e i n ' i s p p . o b l o n g a R W O B L - M l 1 P . m e n z i e s i i ( I M ) M I 4 4 8 A F 2 6 0 8 1 4 R W O B L - M l 2 P . m e n z i e s i i ( I M ) M l R W O B L - M I P . m e n z i e s i i ( I M ) M I R W W - O R 1 P . m e n z i e s i i ( I M ) O R 4 3 9 U 9 2 3 0 0 M e w s s p . w e i r i i 3 ' I M a n d C O r e f e r t o i n t e r m o u n t a i n ( P s e u d o t s u g a m e n z i e s i i v a r . g I a u c a ) a n d c o a s t a l ( P s e u d o t s u g a m e n z i e s i i v a r . m e n z i e s i i ) v a r i e t i e s o f D o u g l a s f i r r e s p e c t i v e l y . ° r e f e r s t o A m e r i c a n T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n . M . p a r k e n ’ A T C C # 6 2 7 0 4 . R . p a r k e r i A T C C # 2 0 1 6 6 0 . 1 1 ( 2 5 : 2 4 : 1 , S i g m a A l d r i c h C o r p o r a t i o n , S t L o u i s , M O ) w a s a d d e d a n d t h e t u b e s w e r e v o r t e x e d b r i e fl y . P h a s e s w e r e s e p a r a t e d a t 1 2 0 0 0 r p m f o r 1 0 m i n a n d t h e a q u e o u s t o p p h a s e w a s t r a n s f e r r e d t o n e w t u b e s . T h e p h e n o l z c h l o r o f o r m : i s o a m y l a l c o h o l t r e a t m e n t a n d c e n t r i f u g a t i o n s t e p s w e r e r e p e a t e d . T h e n , 7 0 0 p l c h l o r o f o r m z i s o a m y l a l c o h o l ( 2 4 : 1 ) w a s a d d e d t o t h e s u p e r n a t a n t , w h i c h w a s v o r t e x e d t h e n S p u n a t 1 2 0 0 0 r p m f o r 5 m i n u t e s . T h e a q u e o u s p h a s e w a s c o l l e c t e d a n d 2 0 p l o f 3 M s o d i u m a c e t a t e a n d 0 . 5 v o l u m e o f i s o p r o p y l a l c o h o l w e r e a d d e d . D N A w a s p r e c i p i t a t e d b y i n v e r t i n g t h e t u b e s g e n t l y s e v e r a l t i m e s a n d c e n t r i f u g e d f o r 1 0 m i n a t 1 3 0 0 0 r p m a t 4 C t o p e l l e t . T h e s u p e r n a t a n t w a s p o u r e d o f f a n d p e l l e t s w e r e r e s u s p e n d e d i n 1 0 0 p l T E b u f f e r ( 1 0 m M T r i s - H C I a n d 0 . 5 M E D T A ( E t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d ) , p H 8 a n d s t o r e d a t — 2 0 C . A c l e a n i n g p r o c e d u r e f o r p o l y s a c c h a r i d e - c o n t a m i n a t e d D N A d e s c r i b e d b y A u s u b e l e t a l . ( 2 0 0 1 ) w a s u s e d t o f u r t h e r p u r i f y D N A i f P C R a m p l i f i c a t i o n i n i t i a l l y f a i l e d . 5 M N a C l w a s a d d e d t o t h e D N A s o l u t i o n t o g i v e a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 7 M N a C I . T h e n , 1 0 % C T A B i n 0 . 7 M N a C l w a s a l s o a d d e d t o g i v e a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 1 % C T A B i n t h e D N A s a m p l e b e f o r e i n c u b a t i n g a t 6 5 C f o r 1 5 m i n . T h e s o l u t i o n w a s e x t r a c t e d w i t h 1 v o l u m e o f c h l o r o f o r m ; i s o a m y l a l c o h o l ( 2 4 : 1 ) a n d a q u e o u s l a y e r w a s t r a n s f e r r e d t o a n e w t u b e f o l l o w i n g c e n t r i f u g a t i o n a t 1 2 0 0 0 r p m f o r 5 m i n . A g a i n , 1 v o l u m e o f p h e n o l : c h l o r o f o r m : i s o a m y l a l c o h o l ( 2 5 2 4 2 1 ) w a s a d d e d t o t h e s u p e r n a t a n t a n d c e n t r i f u g e d a t 1 2 0 0 0 r p m f o r 5 m i n u t e s . D N A w a s p r e c i p i t a t e d f r o m t h e s u p e r n a t a n t w i t h 0 . 6 - v o l u m e i s o p r o p a n o l a n d c o l l e c t e d b y c e n t r i f u g i n g a t 1 2 0 0 0 r p m f o r 1 5 m i n . T h e D N A p e l l e t w a s 1 2 w a s h e d w i t h 7 0 % e t h a n o l a n d c e n t r i f u g e d f o r 5 m i n . T h e s u p e r n a t a n t w a s d r a i n e d o f f a n d t h e p e l l e t w a s r e d i s s o l v e d i n T E b u f f e r . D N A e x t r a c t i o n f r o m n e e d l e s D N A e x t r a c t i o n s d i r e c t l y f r o m n e e d l e s w e r e d o n e a s d e s c r i b e d b y H a m e l i n e t a l . ( 1 9 9 6 , 2 0 0 0 ) w i t h s o m e m o d i fi c a t i o n s . A p p r o x i m a t e l y 2 0 e x c i s e d l e s i o n s w i t h R h a b d o c l i n e f r u i t i n g b o d i e s o r f i v e w h o l e n e e d l e s w e r e u s e d t o e x t r a c t D N A f o r P C R a n d d o t - b l o t a s s a y s . T h e f r u i t i n g b o d i e s o r w h o l e n e e d l e s w e r e s o a k e d w i t h 8 0 0 p l C T A B e x t r a c t i o n b u f f e r ( 2 % c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u m ; 1 . 4 M N a C l ; 1 % p o l y e t h y l e n e g l y c o l 8 0 0 0 ; 2 0 m M E D T A ; 1 % 2 - m e r c a p t o e t h a n o l ; 1 0 0 m M T r i s - H C I , p H 9 . 5 ) a n d g r o u n d w i t h a n a c i d t r e a t e d a n d s t e r i l i z e d m o r t a r a n d p e s t l e u n t i l a s l u r r y h o m o g e n a t e w a s o b t a i n e d . E x t r a c t s w e r e v o r t e x e d b r i e fl y a n d i n c u b a t e d a t 6 5 C f o r a t l e a s t 1 h . F o l l o w i n g t h e a d d i t i o n o f 6 0 0 p l p h e n o l : c h l o r o f o r m : i s o a m y l a l c o h o l ( 2 5 : 2 4 z 1 ) , e x t r a c t s w e r e c e n t r i f u g e d a t 1 0 0 0 0 r p m f o r 5 m i n u t e s . T h e a q u e o u s p h a s e w a s t r a n s f e r r e d t o a n e w t u b e , p r e c i p i t a t e d w i t h a n e q u a l v o l u m e o f c o l d i s o p r o p a n o l a n d c e n t r i f u g e d a t 1 0 0 0 0 r p m f o r 1 0 m i n u t e s . P e l l e t s w e r e w a s h e d w i t h c o l d 7 0 % e t h a n o l , a i r d r i e d f o r 1 2 h o u r s o r o v e r n i g h t , a n d r e s u s p e n d e d i n 3 0 p l T E b u f f e r . T h e m e t h o d o f H a m e l i n e t a l . ( 1 9 9 6 ) w a s a d a p t e d t o e x t r a c t D N A f r o m l a r g e a m o u n t s o f n e e d l e s u s i n g a h o u s e h o l d b l e n d e r . A p p r o x i m a t e l y , 1 0 g n e e d l e s i n 6 0 m l e x t r a c t i o n b u f f e r w e r e b l e n d e d a t h i g h s p e e d f o r 2 m i n . A S o r v a l l R C 2 B c e n t r i f u g e w i t h $ 8 2 4 r o t o r ( S o r v a l l H e r a e u s , N e w t o w n , C T ) w a s u s e d f o r s o l v e n t p h a s e s e p a r a t i o n s a n d p e l l e t i n g . 1 3 P C R a m p l i fi c a t i o n o f i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r s D N A e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m , f r u i t i n g b o d i e s a n d n e e d l e s w a s d i l u t e d 1 0 2 a n d 1 0 3 t i m e s i n d o u b l e d i s t i l l e d , f i l t e r e d , s t e r i l i z e d w a t e r a n d u s e d i n P C R a m p l i fi c a t i o n s . T h e i n t e r n a l t r a n s c r i b e d S p a c e r ( I T S ) r e g i o n s a n d 5 . 8 S g e n e o f t h e n u c l e a r r i b o s o m a l R N A o p e r o n ( I T S I - 5 . 8 S - I T S I I ) w e r e a m p l i fi e d w i t h t h e p r i m e r s I T S 1 F ( f u n g u s s p e c i f i c ) a n d I T S 4 ( G a r d e s a n d B r u n s , 1 9 9 3 ) . P C R r e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t i n 2 5 p l t o t a l v o l u m e c o n s i s t i n g o f 1 2 . 5 p l D N A d i l u t i o n ( t e m p l a t e ) a n d 1 2 . 5 p l P C R r e a c t i o n m i x t u r e . T h e r e a c t i o n m i x t u r e c o n t a i n e d T fl P C R b u f f e r ( 2 0 m M A m m o n i u m s u l f a t e ; 2 . 0 m M M g C l 2 ; 5 0 m M T r i s - H C I , p H 9 . 0 ; E p i c e n t r e T e c h n o l o g i e s , M a d i s o n , W I ) ; 0 . 2 m M e a c h o f d A T P , d T T P , d G T P a n d d C T P ; 0 . 5 p M e a c h o f I T S I F a n d I T S 4 p r i m e r s ; a n d 0 . 5 u n i t o f T a q D N A p o l y m e r a s e . T h e r e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t o n a D N A t h e r m a l c y c l e r ( M o d e l 9 6 0 0 , P e r k i n - E l m e r C e t u s , N o n / v a l k , C T ) . T h e r e a c t i o n p r o t o c o l c o n s i s t e d o f a n i n i t i a l d e n a t u r a t i o n a t 9 5 C f o r 3 m i n u t e s f o l l o w e d b y 3 0 c y c l e s o f 9 4 C f o r 1 m i n , 5 0 C f o r 1 m i n , a n d 7 2 C f o r 1 m i n . P C R a m p l i f i c a t i o n s c o n t a i n i n g n o D N A t e m p l a t e w e r e i n c l u d e d i n e v e r y e x p e r i m e n t a s c o n t r o l s t o t e s t f o r t h e p r e s e n c e o f c o n t a m i n a t i o n o f r e a g e n t s a n d r e a c t i o n m i x t u r e s b y n o n s a m p l e D N A . T h e r e a c t i o n w a s c o m p l e t e d b y a 7 m i n e x t e n s i o n a t 7 2 C . P C R p r o d u c t s w e r e s e p a r a t e d o n 1 . 5 % a g a r o s e ( G i b c o B R L , G r a n d I s l a n d , N Y ) i n 1 % T A E b u f f e r ( 1 0 0 m M T r i s , 1 2 . 5 m M s o d i u m a c e t a t e a n d 1 m M E D T A , p H : 8 . 0 ) b y g e l e l e c t r o p h o r e s i s . A S D N A S i z e s t a n d a r d , a 1 k b o r 1 k b p l u s D N A l a d d e r ( G i b c o B R L ) w a s i n c l u d e d i n e a c h g e l . A f t e r r u n n i n g f o r a t l e a s t 1 h o u r a t 1 0 0 v o l t s , t h e g e l s w e r e s t a i n e d w i t h e t h i d i u m b r o m i d e , v i s u a l i z e d b y U V 1 4 fl u o r e s c e n c e a n d p h o t o g r a p h e d u s i n g A l p h a l m a g e r ( A l p h a I n n o t e c h C o r p o r a t i o n , S a n L e a n d r o , C A ) . D i r e c t o r n e s t e d - p r i m e r P C R a m p l i fi c a t i o n s w i t h o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s P C R a m p l i fi c a t i o n s u s i n g o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s w e r e c a r r i e d o u t a s w e r e t h e I T S a m p l i fi c a t i o n s , w i t h a f e w d i f f e r e n c e s . F o r d i r e c t a m p l i f i c a t i o n s , t h e s a m e D N A d i l u t i o n s w e r e u s e d . F o r n e s t e d a m p l i f i c a t i o n s , I T S 1 F a n d I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s w e r e q u a n t i fi e d u s i n g a U V S p e c t r o p h o t o m e t e r ( B e c k m a n D u 5 3 0 , B e c k m a n C o u l t e r , L i f e S c i e n c e s , B r e a , C A ) , 1 0 n g a n d 1 n g D N A w e r e a d d e d t o e a c h 2 5 p l P C R r e a c t i o n m i x t u r e a n d a m p l i f i e d u s i n g i n t e r n a l o l i g o n u c l e o t i d e p a i r s . R e a c t i o n m i x t u r e s a n d P C R c o n d i t i o n s w e r e a s a b o v e e x c e p t t h a t 1 p M o f e a c h p u r i fi e d o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e w a s u s e d , a n d a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s r a n g e d f r o m 4 8 t o 6 4 C d e p e n d i n g o n t h e p r o b e p a i r u s e d . I n i t i a l a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s f o r e a c h p a i r w e r e c a l c u l a t e d u s i n g t h e s o f t w a r e p r o g r a m O l i g o c a l c u l a t o r ( E u g e n B u e h l e r , P i t t s b u r g h , P A ) a n d p r o b e s w e r e t e s t e d u n t i l a t e m p e r a t u r e t h a t g a v e s p e c i e s - s p e c i fi c a m p l i f i c a t i o n w a s r e a c h e d . S e q u e n c i n g I T S 1 F a n d I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s w e r e C l e a n e d u s i n g M i l l i p o r e U l t r a f r e e — M C 3 0 , 0 0 0 N M W L p u r i f i c a t i o n fi l t e r s ( M i l l i p o r e C o r p o r a t i o n , B e d f o r d , M A ) . A p p r o x i m a t e l y 1 0 0 p l P C R p r o d u c t s w e r e w a s h e d w i t h P C R w a t e r 4 t i m e s b y S p i n n i n g a t 4 0 0 0 r p m a t 4 C . P u r i f i e d P C R p r o d u c t s w e r e r u n o n 3 % h i g h m e l t a g a r o s e g e l s a t 1 0 0 V t o q u a n t i f y b e f o r e s u b m i s s i o n f o r s e q u e n c i n g . P C R p r o d u c t s o f I T S a n d 5 . 8 8 r R N A w e r e s e q u e n c e d m a i n l y b y u s i n g I T S 1 F a n d I T S 4 1 5 p r i m e r s i n a n A p p l i e d B i o s y s t e m s 3 7 0 A S e q u e n c e r ( A p p l i e d B i o s y s t e m s , F o s t e r C i t y , C A ) w i t h t h e T a q D y e D e o x y T e r m i n a t o r S y s t e m . S e q u e n c i n g w a s d o n e b y t h e G e n o m i c s T e c h n o l o g y S u p p o r t F a c i l i t y a t M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y . P r i m e r s I T S S , I T S 3 a n d I T S Z w e r e a l s o u s e d a s n e c e s s a r y ( W h i t e e t a l . 1 9 9 0 ) . S e q u e n c e a l i g n m e n t , a n a l y s i s a n d p r o b e d e s i g n I T S s e q u e n c e s w e r e e d i t e d , a l i g n e d a n d c o r r e c t e d u s i n g t h e p r o g r a m s E d i t S e q , M e g A I i g n a n d S e q M a n i n t h e D N A S T A R s o f t w a r e p a c k a g e ( D N A S T A R I n c , M a d i s o n , W I ) . E a c h s e q u e n c e w a s c o m p a r e d w i t h t h e s e q u e n c e s i n G e n B a n k ( N C B I , B e t h e s d a , M D ) u s i n g s i m i l a r i t y s e a r c h p r o g r a m B L A S T R ( A l t s c h u l e t a l . 1 9 9 0 a n d 1 9 9 7 ; Z h a n g a n d M a d d e n , 1 9 9 7 ) . T h e I T S I - 5 . 8 S - I T S I I s e q u e n c e s w e r e a n a l y z e d a s u n i f o r m l y w e i g h e d u n o r d e r e d C h a r a c t e r s , a n d a s I n t e r l e a v e d b l o c k s o f a l i g n e d s e q u e n c e . I T S I - 5 . 8 8 - I T S I I s e q u e n c e s o f R h a b d o c l i n e t a x a w e r e c o m p a r e d i n p h y l o g e n e t i c a n a l y s i s . S e q u e n c e s h a v e b e e n d e p o s i t e d i n G e n B a n k ( T a b l e 1 . 1 ) . A n a l i g n m e n t o f t h e s e q u e n c e s h a s b e e n s u b m i t t e d t o T r e e B a s e . T h e p h y l o g e n y o f t h e R h a b d o c l i n e S p e c i e s a n d s u b s p e c i e s w a s c o m p u t e d w i t h P A U P v e r s i o n 4 . 0 b e t a v e r s i o n ( S w o f f o r d , 2 0 0 2 ) u s i n g m a x i m u m p a r s i m o n y ( S w o f f o r d a n d M a d d i s o n , 1 9 8 7 ) a n d t h e t r e e b i s e c t i o n - r e c o n n e c t i o n b r a n c h - s w a p p i n g a l g o r i t h m ( T B R ) s a v i n g n o m o r e t h a n 2 0 0 s h o r t e s t t r e e s . A t r e e f r o m t h e m o s t p a r s i m o n i o u s t r e e s ( M P T ) w a s d i s p l a y e d u s i n g t r e e v i e w ( P a g e , 1 9 9 6 ) , F i g u r e 1 . 2 . T o d e v e l o p a c o n s e n s u s t r e e , 2 0 0 0 h e u r i s t i c s e a r c h e s ( H e d g e s , 1 9 9 2 ) w e r e p e r f o r m e d b y m e a n s o f b o o t s t r a p p i n g ( F e l s e n s t e i n , 1 9 8 5 ) . C o n fi d e n c e i n t e r v a l s f o r b r a n c h e s o n t h e c o n s e n s u s t r e e w e r e i n s e r t e d i n t o t h e M P T ( F i g u r e 1 . 2 ) . 1 6 I n a d d i t i o n t o t h e s e q u e n c e s o f R h a b d o c l i n e t a x a , t h e s e q u e n c e s o f r e l a t e d f u n g i w e r e a l s o i n c l u d e d i n a l i g n m e n t f o r p r o b e s e l e c t i o n . O l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s o f 1 4 t o 2 4 b p l o n g w e r e d e s i g n e d f r o m S p e c i e s - S p e c i f i c s e q u e n c e s . P r i m e r S e l e c t p r o g r a m ( D N A S T A R ) w a s u s e d t o e v a l u a t e t h e p r o b e p r o p e r t i e s s u c h a s d u p l e x a n d h a i r p i n f o r m a t i o n a n d % G C c o n t e n t . P r o b e s w e r e s y n t h e s i z e d a t M a c r o m o l e c u l a r S t r u c t u r e a n d S e q u e n c i n g F a c i l i t y ( D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y ) u s i n g a n 3 9 4 8 O l i g o n u c l e o t i d e S y n t h e s i z e r ( A p p l i e d B i o s y s t e m s ) . L a b e fi n g O l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s w e r e l a b e l e d w i t h g a m m a 3 2 P - A T P b y p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 5 ’ e n d s u s i n g T 4 p o l y n u c l e o t i d e k i n a s e ( N e w E n g l a n d B i o l a b s I n c , B e v e r l y , M A ) . L a b e l i n g r e a c t i o n s c o n s i s t e d o f o f 1 p l p r o b e ( 1 5 - 2 0 p M ) , 2 p l 1 0 X k i n a s e b u f f e r ( 0 . 7 M T r i s - H C I , p H 7 . 6 ; 0 . 1 M M g C I z - 6 H 2 0 ; 5 0 m M d i t h i o t h r e i t o l ) , 5 p l o f g a m m a 3 2 P - A T P ( 6 0 0 0 C i / m M N E N L i f e S c i e n c e P r o d u c t s , B o s t o n , M A ) a n d 8 u n i t s o f T 4 p o l y n u c l e o t i d e k i n a s e i n 1 1 . 4 p l o f H 2 0 a s d e s c r i b e d b y S a m b r o o k e t a l . ( 1 9 8 9 ) . R e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t f o r 4 5 m i n a t 3 7 C a n d w e r e s t o p p e d b y i n a c t i v a t i n g t h e e n z y m e a t 6 5 C f o r 1 0 m i n u t e s . S e p h a d e x 6 2 5 ( S i g m a ) c o l u m n s w e r e p r e p a r e d u s i n g 1 m l s y r i n g e s t o s e p a r a t e u n i n c o r p o r a t e d n u c l e o t i d e s f r o m l a b e l e d p r o b e s . L a b e l i n g e f f i c i e n c y w a s C h e c k e d w i t h a n a u t o m a t e d s c i n t i l l a t o r ( B e c k m a n , A r l i n g h t c n H e i g h t s , I L ) . I T S I r e g i o n s a m p l i fi e d b y I T S 1 F a n d I T S Z w e r e p r e p a r e d a n d l a b e l e d , a s f o l l o w s . P C R p r o d u c t s w e r e s e p a r a t e d o n 1 % a g a r o s e g e l a n d c u t o u t u n d e r l o n g w a v e U V l i g h t . W a t e r w a s a d d e d t o d i l u t e t h e D N A t o a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 1 7 1 n g / p l . T h e s o l u t i o n w a s p r e c i p i t a t e d b y a d d i n g 2 o r 2 1 / 2 v o l u m e s c o l d 1 0 0 % e t h a n o l a n d 1 1 1 0 v o l u m e 3 M s o d i u m a c e t a t e . F o l l o w i n g p r e c i p i t a t i o n f o r 2 0 m i n a t - 2 0 C , s a m p l e s w e r e s p u n f o r 2 0 m i n u t e s a t 4 C . T h e p e l l e t s w e r e w a s h e d w i t h 7 0 % e t h a n o l a n d s p u n f o r 1 0 m i n u t e s , d r i e d u n d e r v a c u u m f o r 5 m i n u t e s , a n d r e s u s p e n d e d i n T E . P u r i fi e d p r o b e s w e r e q u a n t i f i e d b y m e a s u r i n g O D v a l u e s a t 2 6 0 a n d 2 8 0 n m . P r o b e s w e r e d e n a t u r e d b y b o i l i n g f o r 2 m i n , c o o l e d f o r 2 - 3 m i n , t h e n a d d e d t o t h e r a n d o m h e x a m e r p r o b e l a b e l i n g r e a c t i o n . T h e l a b e l i n g r e a c t i o n c o n s i s t e d o f 4 0 - 6 0 n g D N A , 1 0 p l 5 X O L B s o l u t i o n ( P h a r m a c i a , P e a p a r k , N J ) o r R a n d o m P r i m e d D N A l a b e l i n g k i t r e a c t i o n m i x t u r e ( B o e h r i n g e r M a n n h e i m , M a n n h e i m , G e r m a n y ) , 5 p | a l p h a 3 2 P — d A T P o r - d C T P ( 6 0 0 0 C i / m m o l ) , a n d 1 p l K l e n o w e n z y m e ( 2 u n i t s ) . T h e fi n a l v o l u m e w a s b r o u g h t t o 5 0 p l b y a d d i t i o n o f d i s t i l l e d w a t e r . T h e m i x t u r e w a s i n c u b a t e d f o r 2 h o u r s a n d t h e r e a c t i o n w a s s t o p p e d b y t h e a d d i t i o n o f 5 0 p l T E . L a b e l e d p r o b e s w e r e p u r i fi e d a s d e s c r i b e d e a r l i e r u s i n g s y r i n g e c o l u m n s . P r o b e s w e r e d e n a t u r e d b e f o r e u s e b y a d d i n g 1 l 1 0 v o l u m e 3 M N a O H . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s t o a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s . D o t b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s t o I T S 1 F a n d I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s w e r e p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d ( H e l m u t , 1 9 9 0 ; B r u n s a n d G a r d e s , 1 9 9 3 ) . F i v e p l o f a m p l i fi e d p r o d u c t s ( a p p r o x i m a t e l y 1 0 0 n g ) w e r e d e n a t u r e d i n 1 0 0 p l o f 0 . 4 N N a O H , 2 5 m M E D T A a n d 1 - 2 p l b r o m o p h e n o l b l u e f o r 5 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r e s . H Y B O N D N + n y l o n m e m b r a n e s ( A m e r s h a m L i f e S c i e n c e , B u c k i n g h a m s h i r e , U K ) p r e - c u t t o f i t i n a D o t - b l o t a p p a r a t u s ( G i b c o B R L , 1 8 L i f e T e c h n o l o g i e s I n c , R o c k v i l l e , M D ) w e r e w e t i n d i s t i l l e d w a t e r f o r 1 m i n a n d p l a c e d i n t o t h e a p p a r a t u s . D e n a t u r e d s a m p l e s w e r e a d d e d t o t h e a p p r o p r i a t e w e l l s a n d s l o w l y v a c u u m f i l t e r e d o n t o t h e m e m b r a n e . T h e y w e r e U V - f i x e d u s i n g 1 2 0 m l l c m 2 a t 2 5 4 n m ( S t r a t a l i n k e r , S t r a t a g e n e , L a J o l l a , C A ) . T h r e e r e p l i c a s f o r e a c h p r o b e w e r e p r e p a r e d . M e m b r a n e s w e r e p r e - w a s h e d f o r 1 h a t 6 5 C i n a s o l u t i o n c o n t a i n i n g 0 . 1 x S S C , 1 0 m M T r i s , p H 8 . 0 a n d 0 . 5 % S D S . P r e - h y b r i d i z a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t a t t h e h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e f o r 1 - 4 h i n h y b r i d i z a t i o n b u f f e r ( 2 0 p l ) c o n t a i n i n g 6 x S S C ( 3 . 6 M N a C l , 0 . 2 M s o d i u m p h o s p h a t e , 2 0 m M E D T A ) , 0 . 5 % d r y m i l k a s b l o c k i n g a g e n t , 0 . 1 % S D S a n d 1 0 0 p g d e n a t u r e d h e r r i n g s p e r m D N A . A f t e r t h e a d d i t i o n o f l a b e l e d p r o b e s , t h e m e m b r a n e s w e r e h y b r i d i z e d f o r 4 - 1 2 h o u r s i n a r o t a r y t y p e h y b r i d i z a t i o n o v e n ( H Y B A I D , A S h f o r d , M i d d l e s e x , U K ) . I n i t i a l t h e o r e t i c a l h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e ( T h ) w e r e c a l c u l a t e d b y s u b t r a c t i n g 5 C f r o m t h e e x p e c t e d m e l t i n g t e m p e r a t u r e s ( T m ) a s f o r m u l a t e d i n S a m b r o o k e t a l . ( 1 9 8 9 ) , T m = 4 ( G + C ) + 2 ( A + C ) . T h e a c t u a l h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s ( T a ) t h a t r e s u l t e d i n c o r r e c t p r o b e S p e c i f i c i t y w e r e d e t e r m i n e d e m p e r i c a l l y b y t e s t i n g t h e p r o b e s a t d i f f e r e n t h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s u n t i l a n o p t i m u m t e m p e r a t u r e w a s r e a c h e d f o r e a c h p r o b e . T h e m e m b r a n e s w e r e w a s h e d i n 2 x S S C a n d 0 . 1 % S D S f o r 5 m i n o n a S h a k e r ( O r b i t s h a k e r L a b L i n e I n s t r u m e n t s I n c , H e l r o s e p a r k , I L ) a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d f o r 2 0 m i n o n a n i n c u b a t e r S h a k e r ( I n n o v a 4 0 8 0 , N e w B r u n s w i c k S c i e n t i fi c , E d i s o n , N J ) a t 5 C b e l o w t h e h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s . M e m b r a n e s w e r e m o n i t o r e d a n d w a s h e d r e p e a t e d l y a s n e c e s s a r y . H y b r i d i z e d fi l t e r s w e r e e x p o s e d t o X - r a y fi l m ( A m e r s h a m ) f o r 4 h t o 2 d a y s a t - 8 0 C . T h e fi l m s w e r e d e v e l o p e d u s i n g a 1 9 K o d a k p r o c e s s o r ( K o d a k , R o c h e s t e r , N Y ) . H y b r i d i z a t i o n f i l t e r s w e r e r e u s e d a f t e r r a d i o a c t i v e p r o b e s w e r e r e m o v e d b y w a s h i n g i n b o i l i n g 2 x S S C a n d 0 . 2 % S D S s o l u t i o n . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s t o t o t a l D N A D o t - b l o t s w e r e a l s o p r e p a r e d u s i n g t o t a l D N A e x t r a c t e d f r o m m y c e l i a ( L e e e t a l . 1 9 8 8 ) a n d f r o m n e e d l e s w i t h o r w i t h o u t f r u i t i n g b o d i e s ( H a m e l i n e t a l . 1 9 9 6 ) . A d d i t i o n a l l y , t h e e x t r a c t i o n b u f f e r w a s s u p p l e m e n t e d w i t h 8 0 u g p r o t e i n a s e K ( 0 . 1 p g / p l , S i g m a ) , a n d a n e x t r a p u r i f i c a t i o n s t e p w i t h p h e n o l : c h l o r o f o r m : i s o a m y l a l c o h o l w a s u s e d f o r t h e D N A e x t r a c t i o n f r o m n e e d l e s t o o b t a i n a s c l e a n a p r o d u c t a s p o s s i b l e . T o t a l D N A f r o m b o t h m y c e l i a a n d n e e d l e s w a s q u a n t i fi e d w i t h a s p e c t r o p h o t o m e t e r a t 2 6 0 n m . T o t a l D N A a l i q u o t s w e r e d i l u t e d i n 1 X T E t o a d j u s t t h e c o n c e n t r a t i o n s , a n d w e r e a d d e d t o a n e q u a l v o l u m e o f 1 . 0 M N a O H f o r d e n a t u r a t i o n . F o l l o w i n g 1 h d e n a t u r a t i o n , t h e D N A w a s b l o t t e d o n t o n y l o n m e m b r a n e s t h a t w e r e s o a k e d i n d i s t i l l e d w a t e r , a n d fi x e d w i t h U V u s i n g 2 0 m J / c m 2 a t 2 5 4 n m ( S t r a t a l i n k e r ) . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f S h o r t ( 1 4 - 2 4 h p ) o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s t o m y c e l i u m a n d n e e d l e D N A w e r e c o n d u c t e d a s w a s d o n e w i t h I T S 1 F a n d I T S 4 p r o d u c t s , w i t h s o m e m o d i fi c a t i o n s . D N A - fi x e d m e m b r a n e s w e r e p r e - h y b r i d i z e d i n a s o l u t i o n c o n t a i n i n g 6 x S S C , 0 . 0 1 M s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 8 ) , 1 m M E D T A ( p H 8 ) , 0 . 1 % S D S , 1 0 0 u g / m l h e r r i n g S p e r m D N A a n d 0 . 1 % n o n - f a t d r i e d m i l k . F o l l o w i n g 4 h p r e h y b r i d i z a t i o n , l a b e l e d p r o b e s w e r e a d d e d a n d h y b r i d i z a t i o n w a s c a r r i e d o u t f o r 4 - 1 2 h a t t h e c a l c u l a t e d T h t e m p e r a t u r e s . T h e m e m b r a n e s w e r e w a s h e d b r i e fl y ( 1 t o 3 m i n ) i n 2 X o r 6 X S S C o n S h a k e r a t t h e 2 0 h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s . T h e m e m b r a n e f i l t e r s w e r e m o n i t o r e d a n d w a s h e d r e p e a t e d l y a s n e c e s s a r y . H y b r i d i z e d f i l t e r s w e r e e x p o s e d t o X - r a y fi l m f o r a t l e a s t 1 2 h o u r s b e f o r e fi l m s w e r e d e v e l o p e d . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f I T S p r o b e s t o t o t a l D N A H y b r i d i z a t i o n s o f t h e I T S I a s a p r o b e t o t o t a l D N A f r o m m y c e l i a a n d n e e d l e s w e r e c a r r i e d o u t a s d e s c r i b e d i n S a m b r o o k e t a l . ( 1 9 8 9 ) w i t h s o m e m o d i fi c a t i o n s . M e m b r a n e s w i t h U V fi x e d D N A ( 5 0 n g / p I - 1 p g / p l ) w e r e n e u t r a l i z e d i n T N ( 0 . 5 M T r i s - H C I a n d 3 M N a C I , p H 7 ) f o r 1 5 m i n . P r e h y b r i d i z a t i o n w a s c o n d u c t e d i n 2 0 m l b u f f e r c o n t a i n i n g 6 x S S C , 0 . 1 % S D S , 5 x D e n h a r d ’ s r e a g e n t ( 1 % F i c o l l , 1 % B S A , 1 % p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e 4 0 . 0 0 0 ( S i g m a ) , 5 0 m M p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 ) a n d 1 0 0 p g / m l h e r r i n g s p e r m D N A f o r 4 - 1 2 h . T h e p r e h y b r i d i z a t i o n b u f f e r w a s t h e n r e m o v e d a n d h y b r i d i z a t i o n b u f f e r ( 6 x S S C , 0 . 1 % S D S a n d 1 0 0 u g / m l h e r r i n g S p e r m D N A ) w a s a d d e d t o t h e h y b r i d i z a t i o n t u b e s . F o l l o w i n g h y b r i d i z a t i o n a t a g i v e n t e m p e r a t u r e ( 6 8 , 7 3 , 7 5 o r 8 0 C ) f o r 6 - 1 8 h , t h e m e m b r a n e s w e r e w a s h e d o n c e i n a s o l u t i o n o f 2 x S S C a n d 0 . 1 % S D S a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 0 m i n a n d o n c e o r t w i c e i n 0 . 5 x S S C a n d 0 . 1 % S D S a t 5 C b e l o w h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e f o r 1 5 - 2 0 m i n . P r o b e s w e r e s t r i p p e d o f f t h e m e m b r a n e s b y s h a k i n g t h e m i n 1 . 5 M N a C I , 0 . 5 M N a O H f o r 3 0 m i n , a n d m e m b r a n e s w e r e r e u s e d . 2 1 R E S U L T S P o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n a m p l i fi c a t i o n o f i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r s ( I T S ) I d e n t i fi c a t i o n o f a p o t h e c i a o n n e e d l e s f r o m i n t e r m o u n t a i n s o u r c e s o f D o u g l a s fi r g r o w n i n W a s h i n g t o n r e v e a l e d t h a t n e e d l e s w e r e i n f e c t e d w i t h R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e ; M i c h i g a n s a m p l e s f r o m C h e b o y g a n c o u n t y w e r e a l s o i n f e c t e d b y R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e . S a m p l e s f r o m O c e a n a C o u n t y h a d R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e a n d R . w e i r i i s s p . o b l o n g a . S o m e s a m p l e s h a d d u a l i n f e c t i o n s c a u s e d b y b o t h S p e c i e s . F r u i t i n g b o d i e s f r o m e a c h t a x o n o f R h a b d o c l i n e w e r e c u t o u t t o u s e i n D N A e x t r a c t i o n s . E x t r a c t i o n s f r o m a p o t h e c i a i n p l a n t a y i e l d e d D N A t h a t w a s r e a d i l y a m p l i fi e d . M o d i fi c a t i o n s t o t h e H a m e l i n ( 1 9 9 6 ) D N A e x t r a c t i o n m e t h o d r e d u c e d p r o c e s s i n g t i m e t o a s l i t t l e a s 2 h r f o r c o m p l e t i o n . P C R a m p l i f i c a t i o n o f I T S y i e l d e d p r o d u c t s o f a p p r o x i m a t e l y 5 6 0 - 5 8 0 b a s e p a i r s f o r a l l R h a b d o c l i n e S p e c i m e n s r e g a r d l e s s o f t a x o n a n d o r i g i n o f s a m p l e s ( F i g u r e 1 . 2 ) . R h a b d o c l i n e p a r k e r i i s o l a t e s o f t e n p r o d u c e d P C R p r o d u c t s o f a p p r o x i m a t e l y 5 7 0 b p . H o w e v e r , s o m e i s o l a t e s y i e l d e d a P C R p r o d u c t o f a p p r o x i m a t e l y 1 0 5 0 b p d u e t o a n i n t r o n s e q u e n c e . H . d e m a t i o i d e s , A . p u l l u l a n s a n d P . g a u m a n n i i y i e l d e d P C R p r o d u c t s w i t h a n a p p r o x i m a t e S i z e o f 6 0 0 - 6 2 5 b p ( F i g u r e 1 . 2 ) . S e q u e n c e s o f i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r r e g i o n s O l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s w e r e d e v e l o p e d f r o m t h e s e q u e n c e s o f t h e I T S r e g i o n s o f r i b o s o m a l D N A b e c a u s e v a r i a t i o n w a s p r e s e n t a t t h e S p e c i e s a n d 2 2 1 K B + H D , A P P G R P - A T C C R P - C O H R P E - O R I R P P - O R Z R P P - O R 3 R P P - O R 4 R P P - C H M I R P P - W A 2 9 R P P - O C M I I R P P - O C M I Z R P P - O C M I 3 R W W - O R 1 R W O B V » O R 5 R W O B L M | 1 R W O B L - M I Z U U . I n 3 u F i g u r e 1 . 2 . P C R a m p l i fi c a t i o n o f t h e I T S r e g i o n b y p r i m e r s I T S 1 F a n d I T S 4 . D N A f r o m H . d e m a t i o i d e s ( H D ) , A . p u l l u l a n s ( A P ) , P . g a u m a n n i i ( P G ) a n d R . p a r k e r i ( R P - ) w a s e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m . D N A f r o m R . p s e u d o t s u g a e s s p . e p i p h y l l a ( R P E - ) , R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e ( R P P - ) , R . w e i n ' i s s p . w e i r i i ( R W W - ) , R . w e i r i i s s p . o b o v a t a ( R W O B V - ) a n d R . w e i r i i s s p . o b l o n g a ( R W O B L - ) w a s e x t r a c t e d f r o m f r u i t i n g b o d i e s . 2 3 I , ' ~ - ‘ ‘ I 1 " H . " - ? . ' " n ” , u : ' . m . . . I “ L o , 3 t 6 i l 1 o t m r * - « . . e . " " t ‘ . t a m ' . . . « . . , . - ‘ ‘ 4 . ‘ . . ; . 1 . . . . 4 - . u s u a l l y t h e s u b s p e c i e s l e v e l . T h e l e n g t h s o f I T S s e q u e n c e o f f u n g i s e q u e n c e d i n t h i s s t u d y r a n g e d f r o m 4 3 9 t o 5 1 7 b p t h a t i n c l u d e d I T S I , 5 . 8 S D N A a n d I T S I I r e g i o n s ( T a b l e 1 . 1 ) . R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e w a s s e q u e n c e d f r o m n e e d l e s a m p l e s R P P - W A 8 ( A F 4 6 2 4 2 1 ) a n d R P P - W A 2 9 ( A F 4 6 2 4 2 2 ) f r o m W a s h i n g t o n a n d R P P - C H M I ( A F 4 6 2 4 2 0 ) f r o m M i c h i g a n . T h e s e q u e n c e s h a d 1 0 0 % h o m o l o g y a n d a g r e e d w i t h s e q u e n c e s i n G e n B a n k . R . w e i r i i s s p . o b l o n g a w a s s e q u e n c e d f r o m n e e d l e s a m p l e s R W O B L - M I 1 ( A F 2 6 0 8 1 4 ) . T h i s w a s t h e fi r s t t i m e t h a t t h e I T S r e g i o n o f t h i s t a x o n h a s b e e n s e q u e n c e d . R P P - W A 2 9 a n d R P P - C H M I h a d 4 4 7 b p w h e r e a s R P P - W A 8 a n d R W O B L - M l 1 h a d a s e q u e n c e o f 4 4 8 b p ( T a b l e 1 . 1 ) . A t l e a s t e i g h t i s o l a t e s o f R . p a r k e r i w e r e a m p l i fi e d a n d s e q u e n c e d . T h e y h a d I T S s e q u e n c e s r a n g i n g f r o m 4 4 9 t o 4 5 2 b p ( T a b l e 1 . 1 ) . H . d e m a t i o i d e s f r o m p i n e h a d 5 1 7 b p I T S s e q u e n c e w h e r e a s t h a t i s f r o m D o u g l a s fi r h a d 5 1 4 b p . S c l e r o p h o m a p i t h y o p h i l a , t h e s e x u a l s t a t e o f H . d e m a t i o i d e s a n d a n e n d o p h y t e t h a t h a s b e e n r e p o r t e d t o b e a p a t h o g e n h a d 5 1 6 b p I T S s e q u e n c e . P . g a u m a n n i i , c o m m o n p a t h o g e n o f o n l y D o u g l a s f i r h a d 5 1 3 b p I T S s e q u e n c e . T h e s e q u e n c e s o f t h e s e f u n g i w e r e a p p r o x i m a t e l y 5 0 b p l o n g e r t h a n t h e s e q u e n c e s o f R h a b d o c l i n e s p e c i e s . T h e c o m p l e t e s e q u e n c e s i n c l u d e d p a r t i a l s e q u e n c e s o f 1 8 8 a n d 2 8 S r i b o s o m a l D N A b e c a u s e o f t h e l o c a t i o n o f p r i m e r s i n r e l a t i v e l y c o n s e r v e d r e g i o n s o f t h e g e n e s . A l i g n m e n t o f t h e s e q u e n c e s a n d d e v e l o p m e n t o f p r o b e s O l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s w e r e d e v e l o p e d f r o m t h e s e q u e n c e s t h a t v a r i e d a m o n g d i f f e r e n t S p e c i e s i n t h e s a m e g e n u s b u t w e r e c o n s e r v e d a m o n g t h e i s o l a t e s o r s t r a i n s o f t h e s a m e s p e c i e s . T w e n t y - o n e s e q u e n c e s o f R h a b d o c l i n e 2 4 9 O “ - > r a . 5 s p e c i e s a n d s u b s p e c i e s i n c l u d i n g o u r s e q u e n c e s a n d G e n B a n k s e q u e n c e s , a n d fi v e s e q u e n c e s o f r e l a t e d f u n g i w e r e a l i g n e d . T h e r e w a s a c o n s i d e r a b l e a m o u n t o f v a r i a b i l i t y i n t h e I T S s e q u e n c e s o f R h a b d o c l i n e t a x a . T h e s e q u e n c e h o m o l o g y r a n g e d f r o m 8 5 % t o 9 8 % ( T a b l e 1 . 2 ) . R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e a n d R . p s e u d o t s u g a e s s p . e p i p h y l l a w e r e a l i g n e d t o g e t h e r a n d s h a r e d 9 7 % h o m o l o g y . R h a b d o c l i n e w e i r i i s s p . o b l o n g a a n d R . w e i n ' i s s p . o b o v a t a h a d 9 8 % s e q u e n c e h o m o l o g y . A l t h o u g h R . w e i r i i s s p . o b o v a t a S h a r e d 9 7 % h o m o l o g y w i t h R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e , i t a l w a y s a l i g n e d w i t h R . w e i n ' i s s p . o b l o n g a . R w e i r i i s s p . w e i r i i h a d a p p r e c i a b l e v a r i a t i o n , S h o w i n g o n l y 8 5 % h o m o l o g y t o t h e s e q u e n c e s o f p a t h o g e n i c R h a b d o c l i n e S p e c i e s . R h a b d o c l i n e p a r k e r i i s o l a t e s w e r e d i v i d e d i n t o 2 g r o u p s b a s e d o n t h e s e e d s o u r c e o f D o u g l a s fi r ; c o a s t a l a n d i n t e r m o u n t a i n ( I M ) i s o l a t e g r o u p s ( G e r n a n d t e t a l . 1 9 9 3 ) . H o m o l o g y a n a l y s i s o f R h a b d o c l i n e p a r k e r i s e q u e n c e s S h o w e d t h a t n e e d l e s f r o m i n t e r m o u n t a i n s o u r c e s o f D o u g l a s fi r g r o w n i n W a s h i n g t o n a n d M i c h i g a n h a d c o a s t a l R . p a r k e r i . C o a s t a l a n d I M i s o l a t e s S h a r e d 9 7 % h o m o l o g y . R . p a r k e r i s h a r e d 9 0 t o 9 4 % h o m o l o g y w i t h o t h e r R h a b d o c l i n e s u b s p e c i e s ( T a b l e 1 . 2 ) . A . p u l l u l a n s a n d P . g a u m a n n i i S h a r e d 8 5 % h o m o l o g y w i t h R h a b d o c l i n e t a x a w h i l e H . d e m a t i o i d e s a n d S . p i t h y o p h i l a h a d 8 0 % s e q u e n c e S i m i l a r i t y . 2 5 T a b l e 1 . 2 . S e q u e n c e h o m o l o g y a m o n g d i f f e r e n t s p e c i e s a n d s u b s p e c i e s o f R h a b d o c l i n e t a x a S p e c i e s / s u b s p e c i e s % H o m o l o g y R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e ( R P P ) R . p s e u d o t s u g a e s s p . e p i p h y l l a ( R P E ) 9 7 R . w e i r i i s s p . o b l o n g a ( R W O B L ) 9 5 R . w e i r i i s s p . o b o v a t a ( R W O B V ) 9 7 R . w e i r i i s s p . w e i r i i ( R W ) 8 6 R . p a r k e r i — c o a s t a l ( R P - 1 ) 9 3 R . p a r k e r i - l n t e r m o u n t a i n ( R P - 2 ) 9 4 R . w e i r i i s s p . o b l o n g a ( R W O B L ) R . p s e u d o t s u g a e s s p . e p i p h y l l a ( R P E ) 9 4 R . w e i r i i s s p . o b o v a t a ( R W O B V ) 9 8 R . w e i r i i s s p . w e i r i i ( R W ) 8 5 R . p a r k e r i - C o a s t a l ( R P - 1 ) 9 2 R . p a r k e r i - l n t e r m o u n t a i n ( R P - 2 ) 9 1 R . w e i r i i s s p . o b o v a t a ( R W O B V ) R . p s e u d o t s u g a e s s p . e p i p h y l l a ( R P E ) 9 6 R . w e i r i i s s p . w e i r i i ( R W ) 8 5 R . p a r k e r i - c o a s t a l ( R P - 1 ) 9 4 R . p a r k e r i — l n t e r m o u n t a i n ( R P - 2 ) 9 1 R . w e i r i i s s p . w e i r i i ( R W W ) R . p a r k e r i - C o a s t a l ( R P - 1 ) 8 8 R . p a r k e r i - l n t e r m o u n t a i n ( R P - 2 ) 9 0 R . p s e u d o t s u g a e s s p . e p i p h y l l a ( R P E R . p a r k e r i - c o a s t a l ( R P - 1 ) 9 2 R . p a r k e r i - I n t e r m o u n t a i n ( R P - 2 ) 9 0 R . p a r k e r i - C o a s t a l ( R P - 1 ) R . p a r k e r i - l n t e r m o u n t a i n ( R P - 2 ) 9 7 2 6 P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s o f s e q u e n c e d a t a o f t h e R h a b d o c l i n e t a x a i s r e p r e s e n t e d a s a C l a d o g r a m i n F i g u r e 1 . 3 . B o o t s r a p c o n f i d e n c e l e v e l s o n b r a n c h e s h a v i n g v a l u e s o f 5 0 % o r g r e a t e r a r e S h o w n . P a r s i m o n y a n a l y s i s g a v e 2 0 0 M P T S e a c h o f 1 0 2 s t e p s a n d c o n s i s t e n c y i n d e x ( C I ) o f 0 . 9 2 2 , r e t e n t i o n i n d e x ( R I ) o f 0 . 9 6 7 a n d a r e - s c a l e d c o n s i s t e n c y i n d e x ( R C ) o f 0 . 8 9 2 . T h e a n a l y s i s s h o w e d 4 d i s t i n c t m o n o p h y l e t i c C l a d e s i n R h a b d o c l i n e t a x a t h a t e a c h S h a r e s g e n e t i c a n d m o r p h o l o g i c a l S i m i l a r i t y . C o n s i s t e n t w i t h b o t h a n a l y s i s , R h a b d o c l i n e t a x a w e r e d i v i d e d i n t o 4 g r o u p s ; 1 - R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e a n d s s p . e p i p h y l l a , 2 - R . w e i r i i s p p . o b l o n g a a n d s s p . o b o v a t a , 3 - R . w e i n ' i s s p . w e i n ' i , a n d 4 - R . p a r k e r i . W e d e s i g n e d a s e p a r a t e o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s f o r e a c h o f t h e fi r s t t h r e e g r o u p s ( F i g u r e 1 . 4 ) . S e l e c t e d p a i r s o f p r i m e r s t h a t w e r e e f f e c t i v e i n d i f f e r e n t i a l l y a m p l i f y i n g s p e c i e s a n d s u b s p e c i e s a r e l i s t e d i n T a b l e 1 . 2 . E a c h p r o b e o f a p a i r w a s a l s o t e s t e d a s a s p e c i f i c p r o b e i n d o t - b l o t a s s a y s . T h e l e n g t h o f t h e p r o b e s e q u e n c e s r a n g e d f r o m 1 6 b p t o 2 4 b p ( T a b l e 1 . 3 ) . P r o b e s R H A B 1 a n d R H A B 4 w e r e d e v e l o p e d f r o m t h e c o n s e n s u s s e q u e n c e s o f a l l R h a b d o c l i n e S p e c i e s ( F i g u r e 1 . 4 ) . C o n s i d e r i n g t h e s e q u e n c e h o m o l o g y a n d p h y l o g e n e t i c r e l a t i o n s h i p a m o n g R h a b d o c l i n e t a x a , w e w e r e n o t s u c c e s s f u l i n d e v e l o p i n g a p r o b e t h a t w o u l d a m p l i f y a l l p a t h o g e n i c t a x a w h i l e e x c l u d i n g t h e e n d o p h y t e R . p a r k e r i 2 7 5 4 R P - C O E R P - C O H R P - W A 1 0 4 R P - O C M I R P - C H M I R P - R 1 2 % O E 9 6 R P - W A 1 0 3 “ ‘ 1 3 ’ g 2 t O 6 2 R P - O R 3 g g ‘ o m , 3 Q ” 3 § 9 8 R P - A T C C E 8 3 s i t e U ) - Q ) 1 0 0 I R P 0 R 2 ! a d . l R P - O R 4 5 . 3 . i 8 8 8 . R P P - W A 2 9 8 a g 8 5 t o ~ ~ _ . { o . . 8 < 0 : : 9 R P P - W A 8 g 8 d g s 8 8 8 8 4 R P P - C H M I E g : E d - R P P - O R 3 ‘ 1 ’ g g E g . 2 9 . . I g a s R P P - O R Z - « n r - u $ § 2 E I ( U E . 1 0 ° R P E - O R 1 - - ' E 8 5 } r a : 0 q — R W O B L - M H - J E 3 E , R W O B V - O R 5 i g L ) O 1 0 0 l R W W - O R 1 - - - - - - E C 1 - w a - O R 2 - » - - E ¥ F i g u r e 1 . 3 . P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s o f I T S s e q u e n c e d a t a o f t h e R h a b d o c l i n e t a x a . 2 8 R P P R P E R W O B L R W O B V R P - l R P P R P E R W O B L R W O B V R P — l R P - Z R W W A P P G S P R P P R P E R W O B L R W O B V R P - l R P - 2 R W W P G S P R P P R P E R W O B L R W O B V R P - l R P - Z R W W A P P G S P R P P R P E R W O B L R W O B V R P - l C C G A G - - - - T T T C T - T - - - - - - - - - G C C - C T A G C G G - C A G A T C T C C C A C C C G T G T G T A T T C C G A - - - - T T T C T - T - - - - - - - - - G C C - C T A G C G G G C A G A T C T C C C A C C C G T G T G T A T T C C T A G - - - - T T T C T A T - - - - - - - - - G C C - C T A G - G G G T A G A T C T C C C A C C C T T G T G T A T T C C G A G - - - - T T T C T - T - - - - - - - - - G C C - C T A G C G G G T A G A T C T C C C A C C C T T G T G T A T T C C G A G - - - - T T T C T - T - - - - - - - - - G C C - C T A A C G G G T A G A T C T C C C A C C C T T G T G T A T T T C G A G - 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S p e c i e s / s u b s p e c i e s P r i m e r S e q u e n c e a G C T m T h T a T a n T p c r ° c o d e 5 ' 3 ' % R . p s e u d o t s u g a e ° s s p . p s e u d o t s u g a e / R P P 1 C A G A T C T C C C A C C C G T G T G T 6 0 6 4 5 9 6 4 5 6 5 2 5 8 s s p . e p i p h y l l a R P P 4 C C A C T A G I l l I A G G G C C G A 5 8 6 0 5 5 6 0 5 2 R . w e i r i i s s p . w e i r i i R W W 1 C A T A C C T G T C G T C G G A G G C C T A T C 5 8 7 6 7 1 6 0 6 1 6 0 6 2 R W W 4 G G G C A G G C C T A G A G C G A G A A C 6 7 7 0 6 5 6 O 6 0 R w e i r i i s s p . R W O 1 T T G T G T A T T T A T A C C G T G T T G C 3 6 6 0 5 5 N D 4 9 6 O 6 4 o b l o n g a / o b o v a t a d R W O 4 A A T T T T A G G A C C G A C C C G T G 5 0 6 O 5 5 N D 5 2 R h a b d o c l i n e s s p . e R H A B 1 T G T T G C T T T G G C G C C T 5 6 5 0 4 5 N D 4 6 5 2 6 0 R H A B 4 G G C C C A A G A C T A C G C 6 7 5 0 4 5 N D 4 7 a S e c o n d ( 4 ) p r i m e r s a r e r e v e r s e c o m p l e m e n t t o I T S I I s e q u e n c e s b T h e v a l u e s r e p r e s e n t o p t i m u m a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e i n d i r e c t a m p l i f i c a t i o n a n d n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s . ° R P P / R P E c o n s e n s u s s e q u e n c e s w e r e u s e d t o d e s i g n p r o b e s t h a t w i l l a m p l i f y t h e t w o s u b s p e c i e s d R W O B U R W O B V c o n s e n s u s s e q u e n c e s w e r e u s e d t o d e s i g n p r o b e s t h a t w i l l a m p l i f y t h e t w o s u b s p e c i e s ° C o n s e n s u s s e q u e n c e s o f a l l R h a b d o c l i n e t a x a w a s u s e d t o d e s i g n p r o b e s t h a t w i l l a m p l i f y a l l R h a b d o c l i n e S p e c i e s a n d s u b s p e c i e s . 3 2 T e s t i n g s p e c i fi c i t y o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e p r i m e r s i n P C R a m p l i fi c a t i o n s T o d e t e r m i n e t h e o p t i m u m a n d S p e c i e s - s p e c i f i c a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s f o r t h e p r i m e r p a i r R P P 1 a n d R P P 4 d e s i g n e d f o r s p e c i f i c i t y t o R h a b d o c l i n e p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e a n d s p p . e p i p h y l l a , t h e p a i r i n b o t h d i r e c t a n d n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s w a s t e s t e d a t a n a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e r a n g i n g f r o m 5 2 C t o 5 8 C . I n d i r e c t a m p l i f i c a t i o n s , t h e p r o b e s s p e c i f i c a l l y a m p l i fi e d t h e t a r g e t D N A o f R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e a n d s s p . e p i p h y l l a ( R P P / R P E ) , o n l y . T h e r e w a s n o c r o s s r e a c t i o n w i t h D N A o f o t h e r p a t h o g e n i c R h a b d o c l i n e S p e c i e s e x t r a c t e d f r o m f r u i t i n g b o d i e s o r w i t h t h e D N A o f R . p a r k e n ’ , P . g a u m a n n i i , H . d e m a t i o i d e s o r A . p u l l u l a n s ( F i g u r e 1 . 5 A ) . N O c r o s s r e a c t i o n h a s b e e n o b s e r v e d w i t h e i t h e r n o n i n f e c t e d D o u g l a s fi r D N A ( D F - H ) o r D N A e x t r a c t e d f r o m n e e d l e s i n w h i c h o n l y R . p a r k e n ’ h a d b e e n i s o l a t e d , a n d w h i c h w e r e k n o w n t o h a v e n o p a t h o g e n i c R h a b d o c l i n e s p e c i e s . R e p e a t e d d i r e c t P C R t e s t s c o n s i s t e n t l y r e s u l t e d i n s p e c i fi c a m p l i fi c a t i o n o f R P P / R P E . F u r t h e r m o r e , t h i s p r o b e p a i r w a s s u f fi c i e n t l y s e n s i t i v e t o d e t e c t t h e p a t h o g e n s i n t h e p a r t s o f t h e n e e d l e a d j a c e n t t o a f r u i t i n g b o d y a n d i n s y m p t o m l e s s n e e d l e s . A l t h o u g h t h e o p t i m u m y i e l d o f P C R p r o d u c t s o c c u r r e d a t 5 2 C , t h e p r o b e p a i r S p e c i f i c a l l y a m p l i fi e d o n l y R P P / R P E D N A u p t o 5 8 C . R P P 1 a n d R P P 4 w e r e a l s o t e s t e d i n n e s t e d p r i m e r a m p l i f i c a t i o n s . P C R p r o d u c t s f r o m I T S 1 F / I T S 4 a m p l i fi c a t i o n w e r e r e a m p l i f i e d w i t h t h e p r i m e r p a i r R P P 1 a n d R P P 4 a t a t e m p e r a t u r e s r a n g i n g f r o m 5 2 C - 6 0 C . A m p l i f i c a t i o n s w e r e s t r o n g e r w i t h t e m p l a t e o f R P P / R P E b u t s o m e a m p l i f i c a t i o n o f R . p a r k e r i D N A o c c u r r e d i n n e s t e d P C R ( F i g u r e 1 . 5 B ) . T h e o p t i m u m t e m p e r a t u r e f o r 3 3 9 H R M 2 3 Z B I I I I M 1 M 0 M 5 I 2 2 3 4 ‘ R O R R R A C R — - - M M M M C C H C C - C E C H 0 0 0 W O 0 V L L C O O L T O O T - B A A C C - - - - B B B - - - ~ - E P P P P P P P P W O O O G P P P P P P P P P W W W P R R R R R R R R R R R R O - - - - W W P P P P R R R M R R a n d i n n e s t e d p r i m e r a m p l i fi c a t i o n s a t 5 8 C ( B ) . F i g u r e 1 . 5 . T e s t i n g o f R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e p r i m e r p r o b e s R P P 1 a n d R P P 4 f o r d e t e r m i n a t i o n o f S p e c i fi c i t y i n d i r e c t P C R a m p l i f i c a t i o n s a t 5 2 C ( A ) D F - H D F - H H D A P n e s t e d P C R w a s f o u n d t o b e 5 8 C . N o a m p l i f i c a t i o n w a s O b t a i n e d w h e n D N A f r o m n e e d l e s i n f e c t e d b y o n l y R . p a r k e n ' w a s a m p l i f i e d fi r s t w i t h I T S p r i m e r s a n d t h e n w i t h R P P 1 a n d R P P 4 . P r i m e r p r o b e s R W W 1 a n d R W W 4 w e r e d e v e l o p e d f o r R . w e i r i i s s p w e i r i i a n d t e s t e d i n d i r e c t P C R a m p l i fi c a t i o n s a t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s b e t w e e n 5 8 - 6 2 C . A 3 0 4 b p a m p l i fi c a t i o n p r o d u c t w a s O b t a i n e d w i t h d i r e c t P C R o f D N A e x t r a c t e d f r o m f r u i t i n g b o d i e s o f t h e t a r g e t f u n g u s , a n d n o t w i t h D N A o f o t h e r R h a b d o c l i n e s p e c i e s o r r e l a t e d p a t h o g e n i c o r e n d o p h y t i c f u n g i o f D o u g l a s f i r ( F i g u r e 1 . 6 A ) . T e m p e r a t u r e s b e t w e e n 5 8 t o 6 2 C , i n c l u s i v e , w e r e e f f e c t i v e f o r s p e c i fi c a m p l i fi c a t i o n o f o n l y t h e t a r g e t s u b s p e c i e s . W i t h h i g h c o n c e n t r a t i o n s ( 1 0 n g / p l ) o f I T S 1 F / I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s , S p e c i fi c i t y w a s g r e a t l y r e d u c e d i n n e s t e d a m p l i fi c a t i o n s w i t h R V W V 1 / R W W 4 . W h e n l o w e r c o n c e n t r a t i o n s ( 1 n g / p l o r l e s s ) w e r e e m p l o y e d , i t w a s s e e n t h a t s p e c i fi c i t y i n c r e a s e d w i t h i n c r e a s i n g t e m p e r a t u r e u p t o 6 2 C , ( F i g u r e 1 . 6 B ) . T h e y i e l d d e c r e a s e d a t t e m p e r a t u r e s a b o v e 6 2 C . T w o p a i r s o f O l i g o n u c l e o t i d e p r i m e r s w e r e d e v e l o p e d t o a m p l i f y R . w e i r i i s s p . o b l o n g a a n d s s p . o b o v a t a . T h e f i r s t p a i r , R W O 1 a n d R W O 4 , w a s t e s t e d i n d i r e c t d e t e c t i o n t e s t s a t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s r a n g i n g f r o m 5 2 C t o 6 2 C . A b o v e 6 0 C , t h e p r i m e r s a m p l i f i e d R . w e i n ' i s s p . o b l o n g a a n d o b o v a t a , R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e , R . p s e u d o t s u g a e s s p e p i p h y l l a a n d R . p a r k e r i b u t n o t R . w e i r i i s s p . w e i n ' i ( F i g u r e 1 . 7 A ) . A P C R p r o d u c t o f 3 2 1 b p w a s p r o d u c e d . I n n e s t e d a m p l i f i c a t i o n s a t 6 4 C , a g r e a t e r q u a n t i t y o f P C R p r o d u c t w a s p r o d u c e d f o r R . w e i n ' i s s p . o b l o n g a a n d s s p . o b o v a t a t e m p l a t e s t h a n f o r 3 5 m m 1 2 3 c M M u - o - C o o 0 - W C C H R R R - - - e - - - - - 0 0 0 c L L v e a T O O A C C a a o o - - - E P P P o P P ! i m u m n m z w w R R R R R R R n R R R R P H P P P P P P w w w P P P G D . i ‘ - _ " : : : I L s a t 6 2 C . F i g u r e 1 . 6 T e s t i n g f o r s p e c i fi c i t y o f t h e R . w e i r i i s s p . w e i n ' i p r i m e r p r o b e s R W W 1 a n d R W W 4 i n d i r e c t P C R a m p l i fi c a t i o n s ( A ) a n d n e s t e d p r i m e r a m p l i fi c a t i o n s ( B ) R W W - 0 R 1 R W W - 0 R 1 R P E — O R I J R P P - 0 R 2 . R P P — 0 R 3 ' R P P - W A 2 9 R P P - C H M I R P P - O C M H R W O B L - M n R w o e L - M i z R W O B V - 0 R 5 R P - A T C C P G H D 5 R 0 1 - R V 0 B - 9 C 2 2 1 Z I I M M C R A C C T 0 W O O A - - - - O W - P P P P W W P P P P P + B K 1 R R R R R R R G P j s n n M Z a I i o M M v e - L - - L L A 9 H Z I 1 1 M 2 3 M R R C A R C 0 0 O W 0 O C C T B - - - - — - A B B o W W P P P P - O O O w W W W W W P P R R R R R R R R P P D G P R R H P R ' ‘ . ‘ f 0 n ( N. 3 7 a m p l i fi c a t i o n a t 6 4 C ( B ) . F i g u r e 1 . 7 . P C R t e s t i n g o f t h e R . w e i n ' i s s p . o b l o n g a a n d s s p . o b o v a t a p r i m e r p r o b e s R W O 1 a n d R W O 4 i n d i r e c t a m p l i fi c a t i o n s a t 6 0 C ( A ) a n d n e s t e d p r i m e r D F - H R W O B L - M I ‘ I R W O B L - M I Z I R W O B L - M i a H D t e m p l a t e o f o t h e r R h a b d o c l i n e s p e c i e s i n r e p l i c a t e d e x p e r i m e n t s ( F i g u r e 1 . 7 8 ) . A l t h o u g h t h e r e w a s v a r i a t i o n i n t h e I T S r e g i o n a m o n g R h a b d o c l i n e S p e c i e s a n d s u b s p e c i e s , a t t e m p t s w e r e m a d e t o d e v e l o p a p r o b e p a i r t h a t w o u l d s p e c i f i c a l l y d e t e c t t h e m e m b e r s o f t h e R h a b d o c l i n e g e n u s . O n e c o n s e r v e d S i t e i n I T S I a n d a n o t h e r i n t h e I T S I I r e g i o n s w e r e f o u n d a n d t h e p r o b e p a i r R H A B 1 a n d R H A B 4 w a s d e v e l o p e d ( T a b l e 1 . 3 & F i g u r e 1 . 4 ) a n d t e s t e d a g a i n s t a l l R h a b d o c l i n e S p e c i e s a t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s 4 7 , 5 0 a n d 5 2 C i n d i r e c t a m p l i f i c a t i o n s . T h e p r o b e a m p l i fi e d R . w e i r i i a n d R . p a r k e n ' s t r o n g l y a t a l l a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s . N o a m p l i fi c a t i o n o r f a i n t a m p l i f i c a t i o n s o c c u r r e d w i t h o t h e r R h a b d o c l i n e s p e c i e s a n d s u b s p e c i e s a n d P . g a u m a n n i i . T h e p r o b e s w e r e t e s t e d a t 4 7 , 5 2 , 5 6 a n d 6 0 C i n n e s t e d p r i m e r a m p l i fi c a t i o n s . T h e y a m p l i fi e d a 2 6 5 b p p r o d u c t f r o m o n l y R h a b d o c l i n e S p e c i e s w i t h h i g h y i e l d a t G e n u s s p e c i f i c a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e o f 6 0 C . T e s t i n g s p e c i fi c i t y o f p r o b e s i n d o t - b l o t a s s a y s I n i t i a l t h e o r e t i c a l h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s ( T h ) f o r R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e s p e c i f i c p r i m e r p r o b e s R P P 1 a n d R P P 4 w e r e p r e d i c t e d a s 5 9 C a n d 5 5 C r e s p e c t i v e l y . W h e n t e s t e d i n d o t - b l o t a s s a y s O f I T S 1 F a n d I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s a t 5 5 C , R P P 1 h y b r i d i z e d t o a l l R h a b d o c l i n e s p e c i e s , b u t h y b r i d i z a t i o n t o t a r g e t s e q u e n c e s w a s s t r o n g e r ( F i g u r e 1 . 8 A ) . R a i s i n g t h e h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e t o 6 0 0 C a n d 6 4 0 C i n c r e a s e d t h e s p e c i f i c i t y a n d t h e p r o b e o n l y h y b r i d i z e d t o R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e a n d s s p . e p i p h y l l a ( F i g u r e 1 . 8 8 ) . R P P 4 h y b r i d i z e d s t r o n g l y t o b o t h R . p s e u d o t s u g a e s s p . 3 8 5 I 2 R I 1 3 1 C C 1 2 3 C C R R R T T O O O I l l O 1 I I M M M R M — M - - O — - v C 1 2 L - L L L O e l l B e B B W M M - A - - - A o I M - L 3 B l O M D H G P - P E P G G - W W W w R P w W - G O - o O - O W P P P P P P R R R R P R R P P R — - - - - - - M R R - R R — 2 - - - - 3 4 9 1 1 0 4 - - O - - - s 6 7 8 1 1 1 S B 7 8 9 I 1 a : - t 1 1 1 1 2 . . . . . . i i I . . G G P P + + . . . . . O O I O O Q . . . . . D 0 . O . 0 O O O . O I 0 . ° 3 2 4 5 6 1 3 9 0 5 6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 7 ‘ 1 t I O 5 5 1 1 1 1 1 1 1 ‘ 1 1 2 ° 2 3 4 1 5 E 7 E 9 0 0 2 4 6 9 0 1 1 1 1 1 2 ! i 1 i a O 0 e 0 é O G @ C 3 9 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s . T h e m e m b r a n e s w e r e e x p o s e d f o r 2 4 h o u r s . S a m p l e s 1 - 6 w e r e e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m a n d 7 - 2 0 f r o m f r u i t i n g b o d i e s o n n e e d l e s . F i g u r e . 1 . 8 . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f p r o b e s R P P 1 a n d R P P 4 t o I T S 1 F a n d I T S 4 R P P 4 ( 1 0 C 1 1 1 3 1 5 1 8 R P P 4 5 5 C 3 3 4 4 2 - A P 3 - S P h 0 0 0 7 o n e 9 4 0 0 0 0 9 R I ’ I ’ I ( 1 4 C R I ’ I ’ I E S L p s e u d o t s u g a e a n d s s p . e p i p h y l l a a t 5 5 C ( F i g u r e 1 . 8 C ) . H o w e v e r , t h e r e w a s s o m e h y b r i d i z a t i o n t o o t h e r R h a b d o c l i n e s p e c i e s a s w e l l . T e m p e r a t u r e o f 6 0 C w a s f o u n d t o b e o p t i m u m f o r S p e c i f i c i t y t o R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e a n d s s p . e p i p h y l l a f o r t h e R P P 4 p r o b e ( F i g u r e 1 . 8 D ) . T h e p r o b e s w e r e e a c h u s e d i n d o t - b l o t s o f t o t a l D N A e x t r a c t e d f r o m n e e d l e s w i t h f r u i t i n g b o d i e s . D N A u p t o 3 0 u g / p l w a s b l o t t e d o n t o e a c h d o t . P r o b e R P P 1 a n d R P P 4 h y b r i d i z e d t o t o t a l D N A f r o m R h a b d o c l i n e p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e a n d s s p . e p i p h y l l a f r u i t i n g b o d i e s a t 6 4 C . N o h y b r i d i z a t i o n t o t o t a l D N A o f R . w e i n ' i s u b s p e c i e s o r t o t o t a l D N A o f R . p a r k e r i o r P . g a u m a n n i , w h i c h w e r e e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m , w a s o b s e r v e d ( F i g u r e 1 . 9 ) . L e s s e r a m o u n t s o f D N A ( f r o m 5 t o 1 0 p g / p l ) c a u s e d w e a k e r h y b r i d i z a t i o n s . P r i m e r p r o b e s R W W 1 a n d R W W 4 , d e s i g n e d f o r R . w e i r i i s s p . w e i n ' i w e r e e a c h f o u n d t o h y b r i d i z e o n l y t o t h e i r t a r g e t D N A a t 6 0 C ( F i g u r e 1 . 1 0 A , B ) . T h e s e q u e n c e o f R W W 1 a n d R W W 4 d i f f e r b y 7 a n d 8 b p , r e s p e c t i v e l y , f r o m h o m o l o g o u s r e g i o n s o f s e q u e n c e i n t h e o t h e r s u b s p e c i e s o f R . w e i r i i , a n d t h e r e f o r e w e r e h i g h l y s u b s p e c i e s - s p e c i f i c . 4 O 1 2 I 5 R I 0 M C M C O O - - P P P P R R - V B O W R C C T A - P M P G - - - 4 - - 1 2 5 7 1 1 6 - R P P - O R 3 8 R W 0 R 1 9 - P G - M I 1 1 0 R P A T C C 3 - R W O B L - M l 2 S E . . 1 1 : 1 I g l l . a I F N R P P 1 6 4 C F i g u r e 1 . 9 . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n o f R P P 1 t o t o t a l D N A e x t r a c t e d f r o m f r u i t i n g b o d i e s ( 1 - 9 ) a n d f r o m m y c e l i u m ( 1 0 - 1 2 ) . A l l h y b r i d i z a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t a t 6 4 C . 4 1 C 2 3 C 1 1 l M - C R R L C T T A A R O - O O B - - O - W P P - E P P R P P P - V B O W R D G P P H S P A R M - R R R - 5 ~ - - - - - 0 R 1 1 2 3 5 4 6 8 9 7 1 1 0 w w l a o c o o o . F i g u r e 1 . 1 0 . H y b r i d i z a t i o n o f R W W 1 ( A ) a n d R W W 4 ( B ) t o I T S 1 F a n d I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s a t 6 0 C . M e m b r a n e s w e r e e x p o s e d f o r 1 2 h o u r s . 4 2 D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s w i t h I T S I r e g i o n s a s s p e c i e s - s p e c i fi c p r o b e I n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r s , I T S I a n d I T S I I o f t h e r i b o s o m a l D N A o p e r o n v a r i e d a m o n g g e n e r a , s p e c i e s a n d s u b s p e c i e s a n d t h e r e f o r e h a d p o t e n t i a l f o r u s e a s t a x o n — s p e c i f i c p r o b e s . T h e I T S I r e g i o n o f R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e ( R P P - I T S I ) h y b r i d i z e d t o D N A o f a l l R h a b d o c l i n e S p e c i e s a n d s u b s p e c i e s a l s o t o P . g a u m a n n i a n d 6 8 C w h e n e x p o s e d f o r 6 h ( F i g u r e 1 . 1 1 A ) o r 1 d a y ( F i g u r e 1 1 1 8 ) . B a c k g r o u n d a m p l i f i c a t i o n s o c c u r r e d w i t h u n i n f e c t e d h o s t D N A ( D F - H ) . W h e n t h e t e m p e r a t u r e w a s r a i s e d t o 7 3 C , s t r o n g h y b r i d i z a t i o n w i t h R h a b d o c l i n e t a x a o c c u r e d a f t e r 2 4 h e x p o s u r e . A f a i n t h y b r i d i z a t i o n o c c u r r e d w i t h P . g a u m a n n i i w h i c h h a s a n I T S I s q u e n c e t h a t i s 2 5 b p l o n g e r a n d w h i c h S h a r e s 7 0 % h o m o l o g y w i t h a l l R h a b d o c l i n e S p e c i e s ( F i g u r e 1 . 1 1 C ) . H y b r i d i z a t i o n w i t h D N A e x t r a c t e d f r o m s y m p t o m l e s s n e e d l e s a l s o o c c u r r e d , a n d t h e s e n e e d l e s w e r e l a t e r p r o v e n i n P C R a s s a y s t o c o n t a i n i n f e c t i o n o f R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e . N o h y b r i d i z a t i o n w i t h D N A e x t r a c t e d f r o m u n i n f e c t e d n e e d l e s o c c u r r e d a t 8 0 C ( F i g u r e 1 . 1 1 D ) . T h e R P P - I T S I p r o b e s t r o n g l y h y b r i d i z e d t o D N A o f R . p s e u d o t s u g a e S S p . p s e u d o t s u g a e , R . w e i r i i s s p . o b l o n g a a n d R . p a r k e n ' a t 8 0 ° C . H y b r i d i z a t i o n t o R . w e i r i i s s p . w e i r i i w a s w e a k , a n d n o h y b r i d i z a t i o n t o P . g a u m a n n i i w a S o b s e r v e d a f t e r 1 d a y e x p o s u r e . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b t a i n e d w h e n t h e I T S I o f R . w e i r i i s s p . o b l o n g a w a s t e s t e d i n d o t b l o t s . T h e R W O - I T S I p r o b e h y b r i d i z e d t o D N A f r o m a l l R h a b d o c l i n e s p e c i e s a t 7 3 C , b u t n o t t o D N A f r o m u n i n f e c t e d n e e d l e s o r P . g a u m a n n i i ( F i g u r e 1 . 1 2 A ) . A f t e r 1 d a y a t 8 0 C , v e r y w e a k h y b r i d i z a t i o n t o R . w e i n ' i s s p . w e i n ' i a n d P . g a u m a n n i i , w a s o b s e r v e d w i t h R W O - I T S I ( F i g u r e 1 . 1 2 B ) . W e a k h y b r i d i z a t i o n s t o 4 3 D N A f r o m n e e d l e s t h a t a r e s y m p t o m l e s s b u t i n f e c t e d w i t h R . w e i r i i s s p . o b l o n g a a n d s s p . o b o v a t a o c c u r r e d a t 8 0 C . W h e n t h e I T S I r e g i o n o f R . w e i r i i s s p . w e i r i i ( R W W - I T S I ) w a s u s e d i n d o t - b l o t s a t 7 5 C , i t h y b r i d i z e d t o a l l R h a b d o c l i n e D N A e x t r a c t e d f r o m f r u i t i n g b o d i e s o r m y c e l i a ( F i g u r e 1 . 1 3 A ) . I t d i d n o t h y b r i d i z e t o D N A e x t r a c t e d f r o m s y m p t o m l e s s n e e d l e s i n f e c t e d w i t h R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e , a n d R . w e i n ' i S S p . o b l o n g a a n d s p p . o b o v a t a . N o h y b r i d i z a t i o n t o D N A o f P . g a u m a n n i i w a s O b s e r v e d e v e n t h o u g h t h e D N A w a s e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m . A t 8 0 C , t h e R W W - I T S I h y b r i d i z e d S p e c i fi c a l l y t o D N A f r o m o n l y R . w e i n ' i . s s p . w e i n ' i n o t t o D N A f r o m a n y o t h e r R h a b d o c l i n e s p e c i e s o r s u b s p e c i e s ( F i g u r e 1 . 1 3 B ) . 4 4 : : v - v - I ! 5 5 S s o ' - o 0 . 1 . 5 o o E 8 > 1 E , 9 B I 8 8 Q C ? Q 0 8 ' ( F ‘ F . t a a i i . i i . a . E 2 t % . ' — 0 ' 1 « 3 4 1 : 3 t o A a t 0 ' 1 5 2 : 2 ‘ 3 1 R R P " T 5 ' H e d i “ . w w w ‘ 1 2 ; 7 ‘ 1 7 . “ " 3 9 . 2 . . . ' - - . L : A . . J ' . “ : . ' : - ' - . . ‘ 9 . " 7 I " . u . “ . . ‘ - ‘ . . z “ E : s _ , . , , . i t - r . * m ‘ 9 m a s : ‘ 1 ' m i f " « a s 3 . 3 A “ j : ' ' * ‘ . ‘ ‘ ' " N B ? ‘ 9 ‘ ‘ - - 6 8 C r . 7 4 . : O « I » Q . 1 I . 6 h . \ 1 . . - - . < - - , ‘ - . . é ; u s a e s m m a c r e » : i » d _ . L . . . 1 . - - - . ’ 1 - . . . . . . . . . : 7 2 ; m - - . 1 a r e - - ~ O a . g . . . 1 . B E " ; r » - . r 1 . . i . I . o « n . 1 * ' s e c ’ . . _ ‘ , 4 9 . . “ 1 " Y W 4 2 ‘ 3 . e m u - t w - « P r v w r i f w - w C i - 1 1 . ? ' G ‘ , _ Q - " t O ‘ 1 0 ' 7 3 C . 7 . , . 2 4 h “ n “ p u m a - fi M fl ‘ - h ’ 3 . ' . ‘ 4 ‘ . . ‘ V ‘ - - ‘ 1 ‘ - , I 1 ' 1 ' I ‘ U u - v . v . 9 ! I . 1 2 4 ‘ 5 w i D . 8 0 C 5 . . a n » n e w 2 4 h F i g u r e 1 . 1 1 . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n u s i n g I T S I r e g i o n o f R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e . H y b r i d i z a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t a t 6 8 C a n d fi l m e x p o s e d f o r 6 h ( A ) a n d 2 4 h ( B ) . H y b r i d i z a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t a t 7 3 C ( C ) a n d 8 0 C ( D ) a n d fi l m s w e r e e x p o s e d f o r 2 4 h o u r s . T h e i s o l a t e c o d e d e s i g n a t i o n - S ( e . g . , R W O B L - M I - S ) r e f e r s t o a n i n f e c t e d b u t s y m p t o m l e s s n e e d l e s s p e c i m e n . 5 0 n g o f t o t a l D N A w e r e b l o t t e d o n t o e a c h d o t . 4 5 w U 2 3 E E E E E v o o . ' r . ' r o o E 1 ‘ 2 > ' 8 U , 9 I 0 . C L 0 . ' ' u - 3 C L 0 a O . 9 n ; E I ; E 9 : . “ E E E ‘ 1 . ‘ F 5 . . - u t o v i n t o I ; < 1 3 0 3 9 z 5 : 4 R W O - I T S I a s o " C A 1 2 h Q ‘ a \ O F N ' — N n ' L ” ' 9 P w m P F F R W O I T S I . v . r ; W . i s w . . - B 0 . : 3 ’ 7 3 c 1 2 h , i t ? 3 , t o u s e 1 5 A F i g u r e 1 . 1 2 . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n u s i n g I T S I r e g i o n o f R . w e i n ' i s s p . o b l o n g a ( R W O - I T S I ) . H y b r i d i z a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t a t 7 3 C ( A ) a n d 8 0 C ( B ) a n d t h e fi l m s w e r e e x p o s e d f o r 2 4 h . 5 0 n g o f t o t a l D N A w a s b l o t t e d o n t o e a c h d o t . 4 6 S - 5 1 R S - l M C O - P P R — 5 O — V B O W R - 8 ‘ 3 3 . - _ I 8 3 K : 6 4 - R P P - 0 C M I 1 6 - R P P - O R 2 7 - R P P - O R 3 9 R W W - 0 R 1 1 0 - P G 1 1 - R P - A T C C 1 2 - M P - A T C C 7 5 C 1 8 h F i g u r e 1 . 1 3 . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n o f I T S I o f R h a b d o c l i n e w e i n ' i s s p . w e i r i i ( R W W I T S I ) . N y l o n m e m b r a n e s w e r e h y b r i d i z e d a t 7 5 C ( A ) a n d 8 0 C ( B ) , a n d e x p o s e d f o r 1 8 h . 5 0 n g t o t a l D N A w a s b l o t t e d o n t o e a c h d o t . 4 7 D I S C U S S I O N I n t h i s s t u d y , o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s f o r d e t e c t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f R h a b d o c l i n e s p e c i e s a n d s u b s p e c i e s w e r e s e l e c t e d f r o m t h e I T S r e g i o n s o f r i b o s o m a l D N A b e c a u s e a l i g n m e n t o f a l l R h a b d o c l i n e s e q u e n c e s s h o w e d t h a t t h e s e r e g i o n s d i s p l a y e d s o m e S p e c i e s - S p e c i fi c v a r i a t i o n . S e q u e n c e s o f n o n - p a t h o g e n i c e n d o p h y t e R h a b d o c l i n e p a r k e r i h a d t o b e t a k e n i n t o c o n s i d e r a t i o n i n d e s i g n o f p r i m e r p r o b e s f o r t h e p a t h o g e n i c s p e c i e s , a n d n o p r i m e r p a i r s t h a t w o u l d a m p l i f y a l l p a t h o g e n i c R h a b d o c l i n e s u b s p e c i e s a n d e x c l u d e R . p a r k e n ' w e r e f o u n d . R h a b d o c l i n e p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e d i f f e r e d b y 8 a n d 1 6 b a s e p a i r s , r e s p e c t i v e l y , f r o m R . w e i n ' i s s p . o b o v a t a a n d o b l o n g a , w h i l e t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n R . w e i n ' i s s p . o b o v a t a a n d o b l o n g a w a s 7 b a s e s . I t h a s b e e n k n o w n t h a t a s l i t t l e a s 1 % d i f f e r e n c e w o u l d b e s u f f i c i e n t t o d e v e l o p d i s t i n c t p r i m e r s t o d i f f e r e n t i a t e t w o s p e c i e s ( N a z a r e t a l . 1 9 9 1 ; M a z z o l a e t a l . 1 9 9 6 ) , o r r a c e s . H o w e v e r , p r i m e r s p e c i fi c i t y i s b e t t e r i f t h e p o l y m o r p h i s m i n t h e I T S r e g i o n i S i n t h e f o r m o f b a s e c h a n g e s r a t h e r t h a n d e l e t i o n s o r i n s e r t i o n s ( S c h i l l i n g e t a l . 1 9 9 6 ) . V a r i a t i o n s b e t w e e n R h a b d o c l i n e s u b s p e c i e s m e t t h e a b o v e c r i t e r i a a n d m o r e t h a n s u f fi c e d t o d i v i d e R h a b d o c l i n e i n t o 3 g r o u p s o f r e l a t e d t a x a ( F i g u r e 1 . 2 ) . R h a b d o c l i n e w e i r i i s s p . o b o v a t a a n d s s p . o b l o n g a g r o u p e d t o g e t h e r a s d i d R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e a n d s s p . e p i p h y l l a , w h e r e a s R . w e i r i i s s p . w e i r i i r e m a i n e d s e p a r a t e . O l i g o n u c l e o t i d e c a n d i d a t e s w e r e s c r e e n e d f o r t h e i r s u i t a b i l i t y a s p r i m e r p r o b e s f o r e a c h g r o u p . I n t h i s s t u d y , o l i g o n u c l e o t i d e p r i m e r s d e v e l o p e d f o r R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e / e p i p h y l l a ( R P P 1 a n d R P P 4 ) a n d f o r R . w e i r i i s s p . w e i r i i 4 8 ( R W W 1 a n d R W W 4 ) w e r e f o u n d t o a m p l i f y t h e i r I T S t a r g e t s s p e c i f i c a l l y a n d e f f e c t i v e l y f r o m i n f e c t e d n e e d l e s i n d i r e c t P C R a m p l i f i c a t i o n s ( F i g u r e 1 . 4 a n d F i g u r e 1 . 5 ) a t a r a n g e o f a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e r a n g e s ( 5 2 - 5 8 C a n d 5 8 - 6 2 C , r e s p e c t i v e l y ) . B o t h p r i m e r p a i r s , e s p e c i a l l y R P P 1 a n d R P P 4 , w e r e s e n s i t i v e e n o u g h t o d e t e c t a n d a m p l i f y t h e t a r g e t D N A i n s y m p t o m l e s s n e e d l e s w i t h o u t a n y c r o s s - r e a c t i o n w i t h D N A o f t h e p l a n t o r c l o s e l y r e l a t e d f u n g i . T h e r e f o r e , t h e p r i m e r p a i r s c a n b e u s e d f o r e a r l y d e t e c t i o n o f t h e m o s t c o m m o n a n d a g g r e s s i v e R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t s . E f f o r t w a s m a d e t o d e v e l o p p r o b e s S p e c i f i c f o r t h e l e S S c o m m o n a n d l e s s a g g r e s s i v e R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t s , t h o s e c a u s e d b y R . w e i r i i s s p . o b o v a t a a n d s s p . o b l o n g a . H o w e v e r , t h e b e s t p r i m e r p a i r ( R W O 1 a n d R W O 4 ) c r o s s - r e a c t e d w e a k l y w i t h t h e D N A o f R . p s e u d o t s u g a e S S p . p s e u d o t s u g a e a n d R . p a r k e n ' a t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s a s h i g h a s 6 0 0 C . C o n s i d e r i n g t h a t R . p a r k e r i i S n o t f o u n d i n y o u n g n e e d l e s ( S t o n e , 1 9 8 6 ; S h e r w o o d - P i k e e t a l . , 1 9 8 5 ) , t h i s p r i m e r p a i r c o u l d s t i l l b e u s e f u l f o r d i r e c t P C R d e t e c t i o n o f a l l p a t h o g e n i c R h a b d o c l i n e t a x a , e x c e p t R . w e i r i i S S p . w e i r i i , i n s y m p t o m l e s s n e e d l e s . T h e r e a s o n t h a t t h e p r i m e r p a i r s s e l e c t e d f o r S p e c i fi c a m p l i f i c a t i o n o f R . w e i r i i s s p . o b o v a t a a n d s s p . o b l o n g a w e r e n o t a s S p e c i fi c a s t h e p r i m e r p a i r s R P P 1 - R P P 4 a n d R W W 1 - R W W 4 m i g h t b e r e l a t e d t o t h e l o w G C c o n t e n t o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e u s e d ( 5 0 % o r l e s s ; T a b l e 1 . 3 ) ( I n n i s a n d G e l f a n d , 1 9 9 4 ; S h a r r o c k s , 1 9 9 4 ; D i e f f e n b a c h e t . a l . 1 9 9 5 ) . B e c a u s e a l l p a t h o g e n i c R h a b d o c l i n e S p e c i e s c a u s e d i s e a s e , w e s t r o v e t o d e v e l o p a p r i m e r p a i r f r o m c o n s e r v e d r e g i o n s O f a l l s u b s p e c i e s t o d e t e c t a l l 4 9 i n f e c t i o n s . O n e c o n s e r v e d s e q u e n c e i n e a c h I T S r e g i o n ( I T S I a n d I T S I I ) w a s u s e d t o d e s i g n p r i m e r p a i r R H A B 1 a n d R H A B 4 . G e n u s - s p e c i f i c p r o b e s R H A B 1 a n d R H A B 4 a m p l i fi e d a l l R h a b d o c l i n e S p e c i e s a t 6 0 0 C i n n e s t e d p r i m e r a m p l i fi c a t i o n s . N e s t e d a m p l i fi c a t i o n i n c r e a s e s t h e s e n s i t i v i t y o f d e t e c t i o n b e c a u s e c o p y n u m b e r s o f t h e t a r g e t a r e i n c r e a s e d i n t h e f i r s t a m p l i fi c a t i o n ( H e n s o n a n d F r e n c h , 1 9 9 3 ; H a m e l i n e t a l . 1 9 9 6 , 2 0 0 0 ) . O u r r e s u l t s a r e i n a g r e e m e n t w i t h o t h e r r e p o r t s t h a t S p e c i f i c i t y i n n e s t e d a m p l i fi c a t i o n i s r e l a t e d t o t h e d i l u t i o n O f P C R p r o d u c t s f r o m t h e fi r s t a m p l i fi c a t i o n s ( B u l m a n a n d M a r s h a l l , 1 9 9 8 ) . N e s t e d p r i m e r a m p l i fi c a t i o n s w i t h R P P 1 a n d R P P 4 w e r e S p e c i f i c I n a m p l i f y i n g o n l y t h e t a r g e t s p e c i e s a t a n a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e o f 5 8 C . P r i m e r p a i r s R W W 1 - R W W 4 w e r e s p e c i fi c a t 6 0 C , b u t o n l y w h e n t h e t a r g e t D N A S ( I T S I F / I T S 4 P C R p r o d u c t s ) w e r e d i l u t e d 1 0 3 t i m e s . E v i d e n t l y , t h e S p e c i fi c i t y w a s r e l a t e d t o P C R p r o d u c t d i l u t i o n s . T h i s w a s a l s o t r u e f o r R W O 1 - R W O 4 a t 6 2 C . H o w e v e r , i n o u r s t u d i e s , n e s t e d p r i m e r a m p l i fi c a t i o n o f t e n r e d u c e d s p e c i fi c i t y w i t h c e r t a i n p r i m e r p a i r s , b u t t h i s d i d n o t a f f e c t d e t e c t i o n t o t h e d e g r e e t h a t i t w a s d i f fi c u l t t o d i f f e r e n t i a t e b e t w e e n t h e t a r g e t a n d n o n - t a r g e t f u n g u s . I n t h i s s t u d y , u n i v e r s a l p r i m e r p a i r s I T S 1 F / I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s w e r e u s e d t o d e t e r m i n e s p e c i f i c i t y o f a p r o b e i n d o t - b l o t s b e c a u s e t h e y p r o v i d e s u f fi c i e n t c o p i e s o f t a r g e t D N A f o r e f f i c i e n t h y b r i d i z a t i o n s ( B r u n s & G a r d e s , 1 9 9 3 ; H i g u c h i e t a l . 1 9 8 8 ; L i e t a l . 1 9 8 8 ) . 3 2 P - l a b e l e d O l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s d e v e l o p e d f o r R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e / e p i p h y l l a ( R P P 1 a n d R P P 4 ) a n d f o r R . w e i n ' i s s p . w e i r i i ( R W W 1 a n d R W W 4 ) S p e c i fi c a l l y h y b r i d i z e d t o t h e i r t a r g e t f u n g i a t d e t e r m i n e d o p t i m u m h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s b e t w e e n 6 0 t o 6 4 C 5 0 ( F i g u r e 1 . 7 , 9 ) . T h e r e f o r e , t h e p r o b e s c a n b e u s e d t o d i s t i n g u i s h R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e / e p i p h y l l a a n d R . w e i r i i s s p . w e i r i i f r o m a l l o t h e r R h a b d o c l i n e s u b s p e c i e s e v e n t h o u g h t h e y d i f f e r e d f r o m t h e c o r r e s p o n d i n g s e q u e n c e s O f o t h e r s u b s p e c i e s b y o n e o r t w o b a s e s . O u r u l t i m a t e g o a l w a s t o d e v e l o p p r o b e s t h a t s u c c e s s f u l l y h y b r i d i z e t o c r u d e e x t r a c t s o f n e e d l e s s a m p l e s , e s p e c i a l l y o f i n f e c t e d b u t s y m p t o m l e s s n e e d l e s a p p l i e d d i r e c t l y t o m e m b r a n e s , w i t h o u t D N A e x t r a c t i o n a s i t h a s b e e n d o n e f o r d e t e c t i o n o f p l a n t p a t h o g e n i c b a c t e r i a a n d v i r u s e s ( L i d a e t a l . , 1 9 9 3 ; H a h n e t a l . , 1 9 9 3 ; S a l d e r e l l i e t a l . , 1 9 9 6 ) . A l t h o u g h w e t r i e d m a n y d i f f e r e n t p r o t o c o l s f o r c r u d e s a m p l e p r e p a r a t i o n s , h y b r i d i z a t i o n s w i t h p r o b e s w e r e n o t s e n s i t i v e e n o u g h t o d e t e c t s y m p t o m l e s s i n f e c t i o n s o f R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t s . T h e r e a s o n c o u l d b e t h a t f u n g a l e n d o p h y t e s a n d l a t e n t p a t h o g e n s h a v e l a r g e g e n o m e s a n d m u l t i p l y S l o w l y , p r o d u c i n g l i t t l e h y p h a e a n d a r e t h e r e f o r e m o r e d i f fi c u l t t o d e t e c t b y d o t - b l o t . O n t h e o t h e r h a n d , p l a n t p a t h o g e n i c b a c t e r i a a n d v i r u s e s h a v e s m a l l g e n o m e s a n d m u l t i p l y q u i c k l y i n l a r g e a m o u n t s , p r o v i d i n g e n o u g h D N A t h a t c a n b e e a s i l y d e t e c t e d i n d o t - b l o t a s s a y s . H o w e v e r , u s i n g a 2 h o u r s D N A e x t r a c t i o n a n d p u r i f i c a t i o n m e t h o d , o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e R P P 1 s u c c e s s f u l l y w a s h y b r i d i z e d t o t o t a l D N A f r o m n e e d l e s w i t h s y m p t o m s o r f r u i t i n g b o d i e s o f R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e . 2 5 — 3 0 p g / p l D N A p e r d o t w a s u s e d . S a m b r o o k e t a l . ( 1 9 8 9 ) r e p o r t e d t h a t d o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s u s i n g o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s g e n e r a l l y r e q u i r e l a r g e a m o u n t s o f p u r e t o t a l D N A . W e w e r e s u c c e s s f u l i n d i f f e r e n t i a t i n g R h a b d o c l i n e s u b s p e c i e s u s i n g t o t a l D N A e x t r a c t e d f r o m f r u i t i n g b o d i e s , a n d t h i s c a n b e u s e f u l . R e v e r s e d o t — b l o t 5 1 h y b r i d i z a t i o n a s s a y s u t i l i z i n g R h a b d o c l i n e s u b s p e c i e s - S p e c i f i c p r o b e s b l o t t e d o n t o a m e m b r a n e a n d p r o b e d w i t h l a b e l e d I T S 1 F / I T S 4 P C R a m p l i fi c a t i o n p r o d u c t s o r t o t a l D N A w o u l d l i k e l y i m p r o v e u s e f u l n e s s . T h e r e v e r s e d o t — b l o t m e t h o d h a s b e e n u s e d t o d i f f e r e n t i a t e P y t h i u m s p e c i e s i n t o t a l D N A e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m ( L e v e s q u e e t a l . 1 9 9 4 , 1 9 9 8 ) . T h e u s e o f t h e I T S r e g i o n a s a S p e c i e s - s p e c i f i c p r o b e i n s t a n d a r d d o t - b l o t a s s a y s o f t o t a l D N A f r o m p u r e m y c e l i a l c u l t u r e s h a s b e e n r e p o r t e d i n s t u d i e s o f L e v e s q u e e t a l . ( 1 9 9 4 ) . S i n c e R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t s c a n n o t b e c u l t u r e d , w e u s e d D N A e x t r a c t e d f r o m f r u i t i n g b o d i e s a n d n e e d l e s i n d o t - b l o t a s s a y s a n d p r o b e d w i t h I T S I r e g i o n . T h e I T S I p r o b e f o r e a c h o f t h e t h r e e t a x a R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e ( R P P - I T S I ) , R . w e i n ' i s s p . o b l o n g a ( R W O - I T S I ) a n d R . w e i r i i s s p . w e i r i i ( R W W - I T S I ) e a c h h y b r i d i z e d t o a l l R h a b d o c l i n e s u b s p e c i e s a t t e m p e r a t u r e s u p t o 7 5 C , i n d i c a t i n g t h a t a n y o n e o f t h e I T S I s e q u e n c e s c o u l d s e r v e s u c c e s s f u l g e n u s — S p e c i f i c p r o b e s S h o w i n g n o h y b r i d i z a t i o n t o t h e P . g a u m a n i i f u n g u s t h a t c a u s e s S w i s s N e e d l e C a s t o f D o u g l a s fi r . F u r t h e r m o r e , t h e I T S I r e g i o n o f R . w e i r i i s s p . w e i n ' i ( R W W - I T S I ) c o u l d s e r v e a s s u c c e s s f u l s u b s p e c i e s - s p e c i f i c p r o b e s f o r d i a g n o s t i c s . T h e R h a b d o c l i n e I T S I p r o b e s w e t e s t e d w o u l d l i k e l y s e r v e t o d e t e c t e a r l y s y m p t o m l e s s i n f e c t i o n s i n n e e d l e s b e c a u s e i n b l o t s c o n t a i n i n g a s l i t t l e a s 5 0 n g m i x e d p l a n t a n d p a t h o g e n D N A , p o s i t i v e d e t e c t i o n o f R h a b d o c l i n e i n s y m p t o m l e s s i n f e c t e d n e e d l e s w a s a c c o m p l i s h e d . S p e c i f i c i t y o f d e t e c t i o n w o u l d l i k e l y t o b e i m p r o v e d b y b l o t t i n g 1 p g o r m o r e m i x e d D N A a n d r e d u c i n g fi l m e x p o s u r e t i m e t o l e s s t h a n 6 h o u r s . 5 2 R E F E R E N C E S A l t s c h u l , S . F . , G i s h , W . , M i l l e r , W . , M y e r s , E . W . & L i p m a n , D J . 1 9 9 0 . " B a s i c l o c a l a l i g n m e n t s e a r c h t o o l . " J . M o l . B i o l . 2 1 5 : 4 0 3 - 4 1 0 . A l t s c h u l , S . F . , M a d d e n , T . L . , S c h a f f e r , A . A . , Z h a n g , J . , Z h a n g , Z . , M i l l e r , W . & L i p m a n , D . J . 1 9 9 7 . " G a p p e d B L A S T a n d P S I - B L A S T : a n e w g e n e r a t i o n o f p r o t e i n d a t a b a s e s e a r c h p r o g r a m s . " N u c l e i c A c i d s R e s . 2 5 : 3 3 8 9 - 3 4 0 2 . A u s u b e l , F . M . , B r e n t , R . , K i n g s t o n , R . E . , M o o r e , D . D . , S e i d m a n , J . G . , S m i t h , J . A . , a n d S t r u h l , K . 2 0 0 1 . C u r r e n t p r o t o c o l s i n m o l e c u l a r b i o l o g y . J o h n W i l e y & S o n s , I n c . N e w Y o r k . B r a n d t , R . W . 1 9 6 0 . T h e R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t o f D o u g l a s - f i r . N Y . S t a t e C o l . F o r S y r a c u s e U n i v , t e c h . P u b l . N o . 8 4 . 6 6 p p . B r u n s , T . D a n d G a r d e s , M . 1 9 9 3 . M o l e c u l a r t o o l s f o r t h e i d e n t i f i c a t i o n o f e c t o m y c o r r h i z a l f u n g i - t a x o n S p e c i f i c o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s f o r s u i l l o i d f u n g i . M o l e c u l a r E c o l o g y 2 : 2 3 3 - 2 4 2 . B u l m a n , S . R a n d M a r s h a l , J . W . 1 9 9 8 . D e t e c t i o n o f S p o n g o s p o r a s u b t e r r a n e a n i n p o t a t o t u b e r l e s i o n s u s i n g t h e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( P C R ) . P l a n t P a t h o l o g y 4 7 : 7 5 9 - 7 6 6 . C h a s t a g n e r , 2 0 0 1 . S u s c e p t i b i l i t y o f i n t e r m o u n t a i n D o u g l a s - F i r t o R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t w h e n g r o w n i n t h e P a c i f i c N o r t h w e s t . O n l i n e . P l a n t H e a l t h P r o g r e s s d o i : 1 0 . 1 0 9 4 / P H P - 2 0 0 1 - 1 0 2 9 - 0 1 - R S . ‘ C o o k e , D . E . L a n d D u n c a n , J . M . 1 9 9 7 . P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s o f P h y t o p h t h o r a S p e c i e s b a s e d o n I T S I a n d I T S Z s e q u e n c e s o f t h e r i b o s o m a l R N A g e n e r e p e a t . M y c o l o g i c a l R e s e a r c h 1 0 1 : 6 6 7 - 6 7 7 . D e n g , S a n d H i r u k i , C . 1 9 9 1 . G e n e t i c r e l a t e d n e s s b e t w e e n t w o n o n - c u l t u r a b l e o r g a n i s m s r e v e a l e d b y n u c l e i c a c i d h y b r i d i z a t i o n a n d p o l y m e r a s e C h a i n r e a c t i o n . P h y t o p a t h o l o g y 8 1 ( 1 2 ) : 1 4 7 5 - 1 4 7 9 . D i e f f e n b a c h , C . W . , L o w e , T . M . J . , D v e k s l e r , G . S . 1 9 9 5 . G e n e r a l C o n c e p t s f o r P C R D e s i g n , i n P C R P n ' m e r , A L a b o r a t o r y M a n u a l , D i e f f e n b a c h , C . W , a n d D v e k s l e r , G . 8 . , E d . , C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s , N e w Y o r k , 1 3 3 - 1 5 5 . F e l s e n s t e i n , J . 1 9 8 5 . C o n f i d e n c e i n t e r v a l s o n p h y l o g e n i e s : a n a p p r o a c h u s i n g b o o t s t r a p . E v o l u t i o n 3 9 : 7 8 7 - 7 9 1 . 5 3 F u n k , A . 1 9 8 5 . F o l i a r F u n g i o f W e s t e r n T r e e s . C a n a d i a n F o r e s t r y S e r v i c e , P a c i f i c F o r e s t r e s e a r c h C e n t r e . V i c t o r i a , B C , C a n a d a , p : 8 8 - 9 1 G a r d e s , M a n d B r u n s , T . D . 1 9 9 3 . I T S p r i m e r s w i t h e n h a n c e d s p e c i f i c i t y f o r b a s i d i o m y c e t e S - a p p l i c a t i o n t o t h e i d e n t i f i c a t i o n o f m y c o r r h i z a e a n d r u s t s . M o l e c u l a r E c o l o g y 2 : 1 1 3 - 1 1 . G a r d e s , M . , W h i t e , T . J . , F o r t i n , J . A . , B r u n s , T . D . , a n d T a y l o r J . W . 1 9 9 1 . I d e n t i fi c a t i o n o f i n d i g e n o u s a n d i n t r o d u c e d s y m b i o t i c f u n g i i n e c t o m y c o r r h i z a e b y a m p l i fi c a t i o n o f n u c l e a r a n d m i t o c h o n d r i a l r i b o s o m a l D N A . C a n a d i a n J o u r n a l o f B o t a n y 6 9 : 1 8 0 - 1 9 0 . G e r n a n d t , D . S . , C a m a c h o , F . J . , a n d S t o n e , J . K . 1 9 9 7 . M a r i a l a n ' c i s , a n a n a m o r p h o f R h a b d o c l i n e . M y c o l o g i a 8 9 ( 5 ) : 7 3 5 - 7 4 4 . H a h n , D . , A m a n n , R . l . , a n d Z e y e r , J . 1 9 9 3 . W h o l e c e l l h y b r i d i z a t i o n o f F r a n k i e s t r a i n s w i t h fl u o r e s c e n c e o r D i g o x i g e n i n l a b e l e d , 1 6 S r R N A - t a r g e t e d o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s . A p p l i e d a n d e n v i r o n m e n t a l M i c r o b i o l o g y 5 9 ( 6 ) : 1 7 0 9 - 1 7 1 6 . H a m e l i n , R . C . , B e r u b e , P . , G i g n a c , M . , a n d B o u r a s s a , M . 1 9 9 6 . I d e n t i f i c a t i o n o f r o o t r o t f u n g i i n n u r s e r y s e e d l i n g s b y n e s t e d m u l t i p l e x P C R . A p p l i e d a n d E n v i r o n m e n t a l M i c r o b i o l o g y 6 2 ( 1 1 ) : 4 0 2 6 - 4 0 3 1 . H a m e l i n , R . C . , B o u r a s s a , , M . , R a i l , J . , D u s a b e n y a g a s a n i , M . , J a c o b i , a n d L a fl a m m e , G . 2 0 0 0 . P C R d e t e c t i o n o f G r e m m e n i e l l a a b i e t i n a , t h e c a u s a l a g e n t o f S c l e r o d e m ' s c a n k e r o f p i n e . M y c o l o g i c a l R e s e a r c h 1 0 4 ( 5 ) : 5 2 7 - 5 3 2 . H a r r i n g t o n , T C . 1 9 8 6 . D i s t r i b u t i o n o f R h a b d o c l i n e a n d S w i s s n e e d l e c a s t s o n D o u g l a s fi r C h r i s t m a s t r e e s i n N e w H a m p s h i r e . P l a n t D i s e a s e 7 0 ( 1 1 ) : 1 0 6 9 - 1 0 7 0 . H e d g e s , S . B . 1 9 9 2 . T h e n u m b e r o f r e p l i c a t i o n s n e e d e d f o r a c c u r a t e e s t i m a t i o n o f t h e b o o t s t r a p P v a l u e i n p h y l o g e n e t i c s t u d i e s . M o l . B i o l . E v o l . 9 : 3 6 6 - 3 6 9 . H e l m u t , R . 1 9 9 0 . N o n i s o t o p i c d e t e c t i o n o f P C R p r o d u c t s P a g e s 1 1 9 - 1 2 8 i n : P C R P r o t o c o l s : A g u i d e t o M e t h o d s a n d A p p l i c a t i o n s . M . A . I n n i s , D . H . G e l f a n d , J . J . S n i n S k y , a n d T . J . W h i t e , e d s . A c a d e m i c P r e s s , S a n D i e g o , C A . H e n s o n , J . M a n d F r e n c h , R . 1 9 9 3 . T h e P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n a n d p l a n t d i s e a s e d i a g n o s i s . A n n u a l R e v i e w o f P h y t o p a t h o l o g y 3 1 : 8 1 - 1 0 9 . H i g u c h i , R . , v o n B e r o l d i n g e n , C . H . , S e n s a b a u g h , G . F . , a n d E r l i C h , H . A . 1 9 8 8 . D N A t y p i n g f r o m s i n g l e h a i r s . N a t u r e 3 3 2 : 5 4 3 - 5 4 6 . 5 4 H o d g s o n , R . A . J . , W a l l , G . C . , a n d R a n d l e s , J . W . 1 9 9 8 . S p e c i fi c I d e n t i f i c a t i o n o f C o c o n u t T i n a n g a j a V i r o i d f o r d i f f e r e n t i a l d i a g n o s i s o f v i r o i d s i n c o c o n u t p a l m . P h y t o p a t h o l o g y 8 8 ( 3 ) : 7 7 4 - 7 8 1 . I n n i s , M . A . , G e l f a n d , D . H . 1 9 9 4 . O p t i m i z a t i o n o f P C R S , i n P C R p r o t o c o l s , A G u i d e t o M e t h o d s a n d A p p l i c a t i o n s , i n n i S , M . A . , G e l f a n d , D . H . , S n i n s k y , J . J . , a n d W h i t e , T . J . , E d . , C R C P r e s s , L o n d o n , p : 5 - 1 1 J a y n e s , R . A . , S t e p h e n s , G . R . , a n d A h r e n S , J . F . 1 9 8 7 . D o u g l a s fi r s e e d s o u r c e s t e s t e d f o r C h r i s t m a s t r e e s i n C o n n e c t i c u t . J o u r n a l o f E n v i r o n m e n t a l H o r t i c u l t u r e 2 ( 3 ) : 9 3 - 9 7 . J o h a n s o n , A a n d J e g e r , J . M . 1 9 9 3 . U s e o f P C R f o r d e t e c t i o n O f M y c o s p h a e r e l l a f i j i e n s i s a n d M . m u s i c o l a , t h e c a u s a l a g e n t s o f S i g a t o k a l e a f s p o t s i n b a n a n a a n d p l a n t a i n . M y c o l o g i c a l R e s e a r c h 9 7 ( 6 ) : 6 7 0 - 6 7 4 . K a b i r , M . , F a u r e , D . , H a u r a t , J . , N o r m a n d , P . , J a c o u d , C . , W a d o u x , P . , a n d B a l l y , R . 1 9 9 5 . O l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s b a s e d o n 1 6 S r R N A s e q u e n c e s f o r t h e i d e n t i fi c a t i o n o f f o u r A z o s p i n ' l l u m s p e c i e s . C a n a d i a n J o u r n a l o f M i c r o b i o l o g y 4 1 : 1 0 8 1 - 1 0 8 7 . K i r k e t a a l . 2 0 0 2 . A i n s w o r t h & B i s b y ’ S t h e D i c t i o n a r y o f F u n g i . 9 t h E d i t i o n C A B B i o s c i e n c e , S u r r e y , U K . K i r c h o f , G . , S c h l o t e r , M . , A b m u s , B . , a n d H a r t m a n n , A . 1 9 9 7 . M o l e c u l a r m i c r o b i a l e c o l o g y a p p r o a c h e s a p p l i e d t o d i a z o t r o p h s a s s o c i a t e d w i t h n o n - l e g u m e s . S o i l . B i o l . B i o c h e m . 2 9 ( 5 - 6 ) : 8 5 3 - 8 6 2 . K r i c k a , L . j . 1 9 9 2 . N o n i s o t o p i c D N A P r o b e T e c h n i q u e s . P a g e 3 5 8 . A c a d e m i c P r e s s , I n c . s a n D i e g o , C A . L i , H . , G y l l e n s t e n , U . B . , C u i , X . , S a i k i , R . K . , E r l i c h , H . A . , a n d A r n h e i m , N . 1 9 8 8 . A m p l i fi c a t i o n a n d a n a l y s i s o f D N A s e q u e n c e s i n S i n g l e h u m a n s p e r m a n d d i p l o i d c e l l s . N a t u r e 3 3 5 : 4 1 4 - 4 1 7 . L e e , S . B . , M i l g r o o m , M . G . , a n d T a y l o r , J . W 1 9 8 8 . A r a p i d , h i g h y i e l d m i n i - p r e p m e t h o d f o r i s o l a t i o n o f t o t a l g e n o m i c D N A f r o m f u n g i . F u n g a l G e n e t N e w s l e t t e r 3 5 : 2 3 - 2 4 . L e e , S . B . , W h i t e , T . J . , a n d T a y l o r , J . W . 1 9 9 3 . D e t e c t i o n o f P h y t o p h t h o r a S p e c i e s b y o l i g o n u c l e o t i d e h y b r i d i z a t i o n t o a m p l i fi e d r i b o s o m a l D N A s p a c e r s . P h y t o p a t h o l o g y 8 3 ( 2 ) : 1 7 7 - 1 8 1 . L e v e s q u e , C . A . , V r a i n , T . C . , a n d D e B o e r , S . 1 9 9 4 . D e v e l o p m e n t o f a s p e c i e s - s p e c i fi c p r o b e f o r P y t h i u m u l t i m u m u s i n g a m p l i fi e d r i b o s o m a l D N A . P h y t o p a t h o l o g y 8 4 ( 5 ) : 4 7 4 - 4 7 8 . 5 5 L e v e s q u e , C . A . , H a r l t o n , C . E . , a n d d e C o c k , A . W . A . 1 9 9 8 . I d e n t i fi c a t i o n o f s o m e O o m y c e t e s b y r e v e r s e d o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n . P h y t o p a t h o l o g y 8 8 ( 3 ) : 2 1 3 - 2 2 2 . L i d a , K . , A b e , A . , M a t s u i , H . , D a n b a r a , H . , W a k a y a m a , S . , a n d K a w a h a r a , K . 1 9 9 3 . R a p i d a n d s e n s i t i v e m e t h o d f o r d e t e c t i o n o f S a l m o n e l l a s t r a i n s u s i n g a c o m b i n a t i o n o f p o l y m e r a s e C h a i n r e a c t i o n a n d r e v e r s e d o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n . F E M S M i c r o b i o l o g y l e t t e r s 1 1 4 : 1 6 7 - 1 7 2 . M a r t i n , R . R . , J a m e s , D . , a n d L e v e s q u e , C . A . 2 0 0 0 . I m p a c t s o f m o l e c u l a r d i a g n o s t i c t e c h n o l o g i e s o n p l a n t d i s e a s e m a n a g e m e n t . A n n u a l R e v i e w o f P h y t o p a t h o l o g y 3 8 : 2 0 7 - 2 3 9 . M a z z o l a , M . , W o n g , O . T . , a n d C o o k , J . R . 1 9 9 6 . V i r u l e n c e o f R h i z o c t o n i a o r y z a e a n d R . s o l a n i A G - 8 o n w h e a t a n d d e t e c t i o n o f R . o r y z a e i n p l a n t t i s s u e b y P C R . P h y t o p a t h o l o g y 8 6 ( 4 ) : 3 5 4 - 3 6 0 . M C C u t C h e o n , T . L a n d C a r r o l l , G . C . 1 9 9 3 . G e n o t y p i c d i v e r s i t y i n p o p u l a t i o n s o f a f u n g a l e n d o p h y t e f r o m D o u g l a s fi r . M y c o l o g i a 8 5 ( 2 ) : 1 8 0 - 1 8 6 . M c D o w e l l , J a n d M e r r i l l , W . 1 9 8 5 . R h a b d o c l i n e t a x a i n P e n n s y l v a n i a . P l a n t D i s e a s e 6 9 ( 8 ) : 7 1 4 - 7 1 5 . M i l l a r , C . S a n d M i n t e r , D . W . 1 9 8 0 . R h a b d o c l i n e p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e . C M I d e s c r i p t i o n s o f p a t h o g e n i c f u n g i a n d b a c t e r i a n o : 6 5 1 . C o m m o n W e a l t h M y c o l o g i c a l I n s t i t u t e , K e w , S u r r e y , U K . M i n s a v a g e , G . V . , T h o m p s o n , C . M . , H o p k i n s , D . L . , L e i t e , R . M . V . B . C . , a n d S t a l l , R . E . 1 9 9 4 . D e v e l o p m e n t o f a p o l y m e r a s e C h a i n r e a c t i o n p r o t o c o l f o r d e t e c t i o n o f X y l e l l a f a s t i d i o s a i n p l a n t t i s s u e . P h y t o p a t h o l o g y 8 4 ( 5 ) : 4 5 6 - 4 6 1 . M o r a l e s , V . M . , P e l c h e r , L . E . , a n d T a y l o r , J . L . 1 9 9 3 . C o m p a r i s o n o f t h e 5 . 8 s r D N A a n d i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r s e q u e n c e s o f i s o l a t e s o f L e p t o s p h a e r i a m a c u l a n s f r o m d i f f e r e n t p a t h o g e n i c i t y g r o u p s . C u r r e n t G e n e t i c s 2 3 : 4 9 0 - 4 9 5 . M o r t o n , H . L . 1 9 8 2 . C h e m i c a l c o n t r o l o f R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t o f d o u g l a s - f i r . P l a n t D i s e a s e 6 6 ( 1 1 ) : 9 9 9 - 1 0 0 0 . M o r t o n , H . L a n d M i l l e r , R . 1 9 7 7 . R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t s i n t h e L a k e s t a t e s . P l a n t D i s e a s e R e p o r t e r 6 1 ( 9 ) : 8 0 1 - 8 0 2 . N a z a r , R . N . , H u , X . , S c h m i d t h , J . , C u l h a m , D . , a n d R o b b , J . 1 9 9 1 . P o t e n t i a l u s e o f P C R a m p l i fi e d d e t e c t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f V e r t i c i l l i u m w i l t p a t h o g e n s . P h y s i o l o g i c a l M o l e c u l a r P l a n t P a t h o l o g y 3 9 : 1 - 1 1 . 5 6 O ’ B r i e n , J . G . 1 9 8 3 . O c c u r r e n c e o f R h a b d o c l i n e t a x a i n d o u g l a S - f i r C h r i s t m a s t r e e p l a n t a t i o n s i n M i c h i g a n . P l a n t D i s e a s e 6 7 ( 9 ) : 6 6 1 - 6 6 4 . O ’ G o r m a n , D . , X u e , B . , H s i a n g , T . , a n d G o o d w i n , P . H . 1 9 9 4 . D e t e c t i o n o f L e p t o s p h a e r i a k o r r e a w i t h t h e p o l y m e r a s e C h a i n r e a c t i o n a n d p r i m e r s f r o m t h e r i b o s o m a l i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r s . C a n a d i a n J o u r n a l o f B o t a n y . 7 2 : 3 4 2 - 3 4 6 . P a g e , R . D . 1 9 9 6 . T r e e V i e w : a n a p p l i c a t i o n t o d i s p l a y p h y l o g e n e t i c t r e e s o n p e r s o n a l c o m p u t e r s , C A B I O S 1 2 : 3 5 7 - 3 5 8 . P a r k e r , A . K a n d R e i d , J . 1 9 6 9 . T h e g e n u s R h a b d o c l i n e S y d . C a n a d i a n J o u r n a l O f B o t a n y 4 7 : 1 5 3 3 - 1 5 4 5 . P a r k e r , A K . 1 9 7 0 . E f f e c t o f r e l a t i v e h u m i d i t y a n d t e m p e r a t u r e o n n e e d l e c a s t d i s e a s e o f D o u g l a s fi r . P h y t o p a t h o l o g y 6 0 ( 8 ) : 1 2 7 0 - 1 2 7 3 . P r i n , Y . , M a l l e i n - G e r i n , F . , a n d S i m o n e t , P . 1 9 9 3 . I d e n t i fi c a t i o n a n d l o c a l i z a t i o n o f F r a n k i e s t r a i n s i n A l n u s n o d u l e s b y i n s i t u h y b r i d i z a t i o n o f n i f H m R N A w i t h s t r a i n s p e c i fi c o l o g o n u c l e o t i d e p r o b e s . J o u r n a l o f E x p e r i m e n t a l B o t a n y 4 4 ( 2 6 1 ) : 8 1 5 - 8 2 0 . R i s t a i n o , J . B . , M a d r i t c h , M . , T r o u t , C . L . , a n d P a r r a , G . 1 9 9 8 . P C R a m p l i f i c a t i o n o f r i b o s o m a l D N A f o r s p e c i e s i d e n t i fi c a t i o n i n t h e p l a n t p a t h o g e n g e n u s P h y t o p h t h o r a . A p p l i e d a n d E n v i r o n m e n t a l M i c r o b i o l o g y 6 4 ( 3 ) : 9 4 8 - 9 5 4 . R o b b , J . , H u , X . , P l a t t , H . , a n d N a z a r , R . 1 9 9 4 . P C R - b a s e d a s s a y s f o r t h e d e t e c t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n o f V e r t i c i l l i u m s p e c i e s i n p o t a t o , p . 8 3 - 9 0 . I n A . S c h o t s , F . M . D e w e y , a n d R P . O l i v e r ( e d , ) , M o d e m a s s a y s f o r p l a n t p a t h o g e n i c f u n g i : i d e n t i fi c a t i o n , d e t e c t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n . C A B i n t e r n a t i o n a l O x f o r d , U K . R o w h a n i , A . , C h a y , C . , G o l i n o , D A , a n d F a l k , B . W . 1 9 9 3 . D e v e l o p m e n t o f p o l y m e r a s e C h a i n r e a c t i o n t e c h n i q u e f o r t h e d e t e c t i o n o f G r a p e v i n e F a n l e a f V i r u s i n G r a p e v i n e t i s s u e . P h y t o p a t h o l o g y 8 3 ( 7 ) : 7 4 9 - 7 5 3 . S a l d e r e l l i , P . , B a r b a r o s s o , L . , G r i e c o , F . , a n d G a l l i t e l l i D . 1 9 9 6 . D i g o x i g e n i n - I a b e l e d r i b o p r o b e s a p p l i e d t o p h y t o s a n i t a r y c e r t i f i c a t i o n o f t o m a t o i n I t a l y . P l a n t D i s e a s e 8 0 ( 1 2 ) : 1 3 4 3 - 1 3 4 6 . S a m b r o o k , J . , F r i t s c h , E . F . , a n d M a n i a t i s , T . 1 9 8 9 . M o l e c u l a r C l o n i n g : a l a b o r a t o r y m a n u a , l 2 " d e d i t i o n . C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s , C o l d S p r i n g H a r b o r , N e w Y o r k . S c h a a d , N . W . , C h e o n g , S . S . , T a m a k i , S . , H a t z i l o u k a s , E . , a n d P a n o p o u l u s , N . J . 1 9 9 5 . A c o m b i n e d b i o l o g i c a l a n d e n z y m a t i c a m p l i f i c a t i o n ( B I O - P C R ) t o d e t e c t P s e u d o m o n a s s y r i n g a e p v . p h a s e o l i c o l a i n b e a n s e e d e x t r a c t s . P h y t o p a t h o l o g y 8 5 ( 2 ) : 2 4 3 - 2 4 8 . 5 7 S c h i l l i n g , A . G . , M o l l e r , E . M . , a n d G e i g e r , H . H . 1 9 9 6 . P o l y m e r a s e C h a i n r e a c t i o n — b a s e d a s s a y s f o r s p e c i e s - s p e c i fi c d e t e c t i o n o f F u s a n ' u m c u l m o r u m , F . g r a m i n e a m m a n d F . a v e n a c e u m . P h y t o p a t h o l o g y 8 6 ( 5 ) : 5 1 5 - 5 2 2 . S c h o e n , C . D . , K n o r r , D . , a n d L e o n e , G . 1 9 9 6 . D e t e c t i o n o f P o t a t o L e a f r o l l V i r u s i n d o r m a n t p o t a t o t u b e r s b y i m m u n o c a p t u r e a n d a f l u o r o g e n i c 5 ’ n u c l e a s e R T - P C R a s s a y . P h y t o p a t h o l o g y 8 6 ( 9 ) : 9 9 3 - 9 9 9 . S h a r r o c k s , A . D . 1 9 9 4 . T h e d e s i g n o f p r i m e r s f o r P C R , i n P C R T e c h n o l o g y , C u r r e n t I n n o v a t i o n s , G r i f f i n , H . G . , a n d G r i f f i n , A . M . , E d . , C R C P r e s s , L o n d o n , p : 5 - 1 1 . S h e r w o o d - P i k e , M . , S t o n e , J . K . , a n d C a r r o l l , G . C . 1 9 8 6 . R h a b d o c l i n e p a r k e r i , a u b i q u i t o u s f o l i a r e n d o p h y t e o f D o u g l a s fi r . C a n a d i a n J o u r n a l o f B o t a n y 6 4 : 1 8 4 9 - 1 8 5 5 . S i e r i n g , P . L a n d G h i o r s e , W . C . 1 9 9 7 . D e v e l o p m e n t a n d a p p l i c a t i o n o f 1 6 S r R N A - t a r g e t e d p r o b e s f o r d e t e c t i o n o f I r o n - a n d M a n g a n e s e — O x i d i z i n g s h e a t h e d b a c t e r i a i n e n v i r o n m e n t a l s a m p l e s . A p p l i e d a n d e n v i r o n m e n t a l M i c r o b i o l o g y 6 3 ( 2 ) : 6 4 4 - 6 5 1 . S i m o n , L . , L e v e s q u e , C . , a n d L a l o n d e , M . 1 9 9 2 . R a p i d q u a n t i t a t i o n b y P C R o f e n d o m y c o r r h i z a l f u n g i c o l o n i z i n g r o o t S . P C R m e t h o d s A p p l i c a t i o n s 2 : 7 6 - 8 0 . S i n c l a i r , W . A . , L y o n , H . H a n d J o h n s o n , W . T . 1 9 8 9 . D i s e a s e s o f T r e e s a n d S h r u b s , 2 " d e d n . C o r n e l l U n i v e r s i t y P r e s s : C o m s t o c k P u b . A s s o c i a t e s , I t h a c a , Y o r k . p : 4 0 - 4 1 . S m i t h , O . N . , D a m s t e e g t , V . D . , K e l l e r , C . J . , a n d B e c k , R . J . 1 9 9 3 . D e t e c t i o n o f p o t a t o I e a f r o l l v i r u s i n l e a f a n d a p h i d e x t r a c t b y d o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n . P l a n t D i s e a s e 7 7 ( 6 ) : 1 0 9 8 - 1 1 0 2 . S t o n e , J . K . 1 9 8 6 . F o l i a r e n d o p h y t e s o f P s e u d o t s u g a m e n z i e s i i ( M i r b . ) F r a n c o . C y t o l o g y , a n d P h y s i o l o g y o f t h e H o s t - E n d o p h y t e R e l a t i o n s h i p . D i s s e r t a t i o n , U n i v e r s i t y o f O r e g o n , E u g e n e , O r e g o n . S t o n e , J . K . 1 9 8 7 . I n i t i a t i o n a n d d e v e l o p m e n t o f l a t e n t i n f e c t i o n s b y R h a b d o c l i n e p a r k e r i o n D o u g l a s fi r . C a n a d i a n J o u r n a l o f B o t a n y 6 5 : 2 6 1 4 - 2 6 2 1 . S t r a t f o r d , R . , S h i e l d s , R . , G o l d s b r o u g h , A . P . , a n d F l e m i n g , C . 1 9 9 2 . A n a l y s i s O f r e p e t e t i v e D N A s e q u e n c e s f r o m p o t a t o C y s t n e m a t o d e s a n d t h e i r u s e a s d i a g n o s t i c p r o b e s . P h y t o p a t h o l o g y 8 2 : 8 8 1 - 8 8 6 . S w o f f o r d , D . L . 2 0 0 2 . P A U P : P h y l o g e n e t i c A n a l y s i s U s i n g P a r s i m o n y . V e r s i o n 4 . 0 B e t a . S i n a u e r A s s o c i a t e s . S u n d e r l a n d , M a s s a c h u s e t t s . 5 8 S w o f f o r d , D . L a n d M a d d i s o n , W . P . 1 9 8 7 . R e c o n s t r u c t i n g a n c e s t r a l C h a r a c t e r s t a t e s u n d e r W a g n e r p a r s i m o n y , M a t h B i O S C i 8 7 : 1 9 9 - 2 2 9 . T i s s e r a t , N . A . , H u l b e r s t . S . H . , a n d S a u e r , K . M . 1 9 9 4 . S e l e c t i v e a m p l i f i c a t i o n o f r D N A i n t e r n a l t r a n s c r i b e d S p a c e r r e g i o n s t o d e t e c t O p h i o s p h a e r e / l a k o r r e a a n d O . h e m o t n ' c h a . P h y t o p a t h o l o g y 8 4 ( 5 ) : 4 7 8 — 4 8 2 . T o d d , 0 . 1 9 8 8 . T h e e f f e c t s o f h o s t p h e n o t y p e , g r o w t h r a t e , a n d n e e d l e a g e o n t h e d i s t r i b u t i o n o f a m u t u a l i s t i c , e n d o p h y t i c f u n g u s i n D o u g l a s - I r p l a n t a t i o n s . C a n a d i a n J o u r n a l o f F o r e s t r e s e a r c h 1 8 : 6 0 1 . 6 0 5 T r o u t , C . L . , R i s t a i n o , J . B . , M a d r i t c h , M . , a n d W a n g s o m b o o n d e e , T . 1 9 9 7 . R a p i d d e t e c t i o n o f P h y t o p h t h o r a i n f e s t a n s i n l a t e b l i g h t - i n f e c t e d p o t a t o a n d t o m a t o u s i n g P C R . P l a n t D i s e a s e 8 1 ( 9 ) : 1 0 4 2 - 1 0 4 8 . W e b b , D . R . , B o n fi g l i o l i , R . G . , C a r r a r o , L . , O s l e r , R . , a n d S y m o n s , R . H . 1 9 9 9 . O l i g o n u c l e o t i d e s a s h y b r i d i z a t i o n p r o b e s t o l o c a l i z e p h y t o p l a s m a s i n h o s t p l a n t s a n d i n s e c t s v e c t o r s . P h y t o p a t h o l o g y 8 9 ( 6 ) : 8 9 4 - 9 0 1 . W h i t e , T . J . , B r u n s , T . , L e e , S . B . , a n d T a y l o r , J . 1 9 9 0 . A m p l i f i c a t i o n a n d d i r e c t s e q u e n c i n g o f f u n g a l r i b o s o s m a l R N A g e n e s f o r p h y l o g e n e t i c s . I n : P C R p r o t o c o l s : A G u i d e t o M e t h o d s a n d A p p l i c a t i o n s . M . A . I n n i s , D . H . G e l f a n d , J . J . S n i n s k y , a n d T . J . W h i t e , e d s . A c a d e m i c P r e s s , S a n D i e g o , C A , P a g e s 3 1 5 - 3 2 2 . Z h a n g , A . W . , H a r t m a n , G . L . , R i c c i o n i , L . , C h e n , W . D . , M a , R . Z . , a n d P e t e r s e n , W . L . 1 9 9 7 . U s i n g P C R t o d i s t i n g u i s h D i a p o r t h e p h a s e o l o r u m a n d P h o m o p s i s l o n g i c o l l a f r o m o t h e r s o y b e a n f u n g a l p a t h o g e n s a n d t o d e t e c t t h e m i n s o y b e a n t i s s u e s . P l a n t D i s e a s e 8 1 ( 1 0 ) : 1 1 4 3 - 1 1 4 9 . Z h a n g , J . & M a d d e n , T . L . ( 1 9 9 7 ) " P o w e r B L A S T : A n e w n e t w o r k B L A S T a p p l i c a t i o n f o r i n t e r a c t i v e o r a u t o m a t e d s e q u e n c e a n a l y s i s a n d a n n o t a t i o n . " G e n o m e R e s . 7 : 6 4 9 - 6 5 6 . 5 9 C H A P T E R 2 D e t e c t i o n a n d Q u a n t i fi c a t i o n o f R h a b d o c l i n e N e e d l e C a s t i n f e c t i o n i n l n t e r m o u n t a i n S o u r c e s o f P s e u d o t s u g a e m e n z i e s i i i n W a s h i n g t o n S t a t e A B S T R A C T T h e o l i g o n u c l e o t i d e p r i m e r p a i r R P P 1 - R P P 4 d e s i g n e d f o r R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e w a s u s e d t o d e t e c t a n d q u a n t i f y R h a b d o c l i n e i n f e c t i o n s i n d i r e c t P C R a m p l i fi c a t i o n s o f D N A e x t r a c t e d f r o m n e e d l e s . S a m p l e s O f n e e d l e s f r o m 4 4 D o u g l a s fi r t r e e s , r e p r e s e n t i n g n i n e d i f f e r e n t p r o v e n a n c e s o f i n t e r m o u n t a i n s o u r c e s a n d e x h i b i t i n g d i f f e r e n t l e v e l s o f s u s c e p t i b i l i t y w e r e t e s t e d . T h e p r i m e r s r e a d i l y d e t e c t e d t h e p a t h o g e n i n y e a r o l d n e e d l e s c o l l e c t e d i n M a y a n d i n c u r r e n t y e a r n e e d l e s i n N o v e m b e r . F u r t h e r m o r e , t h e p a i r c o n s i s t e n t l y a m p l i fi e d t h e p a t h o g e n i n t h e s y m p t o m l e s s n e e d l e s t a k e n f r o m t h e b e g i n n i n g o f i n f e c t i o n i n M a y . T h e Q u a n t i t y O n e ® g e l r e a d e r a n d s o f t w a r e s y s t e m w e r e u s e d t o q u a n t i f y t h e i n t e n s i t y o f t h e D N A f l u o r e s c e n c e o f P C R p r o d u c t s o n a g a r o s e g e l s f o l l o w i n g s t a i n i n g w i t h e t h i d i u m b r o m i d e . T h e d e n s i t y o f P C R p r o d u c t s c o r r e s p o n d e d t o t h e r e l a t i v e s u s c e p t i b i l i t y o f e a c h t r e e a s w a s v i s u a l l y r a t e d i n t h e fi e l d , i n b l i n d t e s t s . R e s u l t s f r o m a m p l i fi c a t i o n s o f y e a r o l d n e e d l e s S h o w e d t h a t s i g n i fi c a n t a m o u n t s o f D N A w e r e p r e s e n t i n s o m e t r e e s t h a t w e r e v i s u a l l y 6 O r a t e d a s h a v i n g n o d i s e a s e o r v e r y l o w d i s e a s e . P C R d a t a , f r o m a m p l i f i c a t i o n o f t h e c u r r e n t y e a r ’ s n e e d l e s c o l l e c t e d i n N o v e m b e r , r e v e a l e d t h a t t h e n e e d l e s o f m a n y t r e e s w i t h h i g h d i s e a s e r a t i n g s w e r e m o r e t h o r o u g h l y c o l o n i z e d b y t h e f u n g u s a s h i g h a m o u n t s o f f u n g a l D N A p r o d u c e d g r e a t e r q u a n t i t i e s o f P C R p r o d u c t . F u r t h e r m o r e , q u a n t i fi c a t i o n d a t a f r o m c u r r e n t y e a r n e e d l e s i n d i c a t e d R h a b d o c l i n e i n f e c t i o n h a d a l r e a d y r e a c h e d h i g h l e v e l s i n m a n y t r e e s i n t h e fi r s t w e e k o f M a y , t h e m o n t h o f l e a f e m e r g e n c e . A l s o m e a s u r e m e n t s o f t h e d e n s i t y o f P C R p r o d u c t s c o r r e s p o n d e d t o t h e p r o g r e s s o f t h e d i s e a s e . I d e n t i fi c a t i o n o f R P P 1 a n d R P P 4 a m p l i fi e d a n d q u a n t i fi e d P C R p r o d u c t s a s R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e w a s c o n f i r m e d w i t h i n d e p e n d e n t r e s t r i c t i o n d i g e s t s w i t h e n d o n u c l e a s e s R s a l , S e a l a n d S p e l , a n d w i t h s e q u e n c i n g . T h i s s t u d y s h o w s t h a t P C R d e t e c t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n c o u l d b e v a l u a b l e i n d e t e r m i n i n g r e s i s t a n t a n d s u s c e p t i b l e s o u r c e s o f D o u g l a s f i r . 6 1 I N T R O D U C T I O N D o u g l a s fi r P s e u d o t s u g a m e n z e i s i i ( M i r b . ) F r a n c o . i s o n e o f t h e m o s t p o p u l a r C h r i s t m a s t r e e s g r o w n i n t h e w e s t e r n a n d e a s t e r n U n i t e d S t a t e s . I t i s n a t i v e f r o m A l a s k a t o M e x i c o a n d i s f o u n d f r o m s e a l e v e l t o 3 3 0 0 m a l t i t u d e s . B a s e d o n g e n e t i c v a r i a t i o n r e l a t e d t o g e o g r a p h i c o r i g i n , t w o v a r i e t i e s o f D o u g l a s fi r a r e r e c o g n i z e d : t h e i n t e r m o u n t a i n ( I M ) o r R o c k y M o u n t a i n v a r i e t y a n d t h e c o a s t a l v a r i e t y . T h e i n t e r m o u n t a i n v a r i e t y P . m e n z e i s i i v a r . g l a u c a ( B e i s s n . ) F r a n c o . h a s b l u i s h g r e e n a n d h a r d y f o l i a g e , a n d g r o w s r a p i d l y . I t h a s b e t t e r p o s t - h a r v e s t m o i s t u r e r e t e n t i o n a n d i s l e s s l i k e l y t o b e i n j u r e d b y e x p o s u r e t o s u b f r e e z i n g t e m p e r a t u r e s ( C h a s t a g n e r , 1 9 8 5 ; K u b i s k e , 1 9 9 0 ) . T h i s v a r i e t y i s n a t i v e t o t h e i n l a n d m o u n t a i n s o f t h e P a c i fi c N o r t h w e s t ( P N W ) a n d t h e R o c k y M o u n t a i n s f r o m c e n t r a l B r i t i s h C o l o m b i a t o N o r t h e r n M e x i c o . T h e I M v a r i e t y i s m a i n l y g r o w n f o r C h r i s t m a s t r e e s i n t h e G r e a t L a k e s s t a t e s ( O ’ B r i e n , 1 9 8 3 ; M o r t o n a n d M i l l e r , 1 9 9 7 ) , n o r t h e a s t e r n s t a t e s s u c h a s P e n n s y l v a n i a , C o n n e c t i c u t a n d N e w H a m p s h i r e ( M c D o w e l l a n d M e r r i l l , 1 9 8 5 ; J a y n e s e t a l . 1 9 8 7 ; H a r r i n g t o n , 1 9 8 6 ) a n d i n t h e i n l a n d r e g i o n s o f I d a h o a n d E a s t e r n B r i t i s h C o l o m b i a ( C h a s t a g n e r , 2 0 0 1 ) . T h e c o a s t a l v a r i e t y o f D o u g l a s f i r ( P . m e n z e i s i i v a r . m e n z i e s i i ) i s d a r k o r y e l l o w g r e e n , h a s l e s s h a r d y f o l i a g e a n d g r o w s s l o w l y ( D i r r , 1 9 9 8 ; J a y n e s e t a l . 1 9 8 7 ; C h a s t a g n e r 2 0 0 1 ) . T h e v a r i e t y g r o w s n a t u r a l l y f r o m c e n t r a l B r i t i s h C o l o m b i a t o c e n t r a l C a l i f o r n i a a n d h a s a c o n t i n u o u s r a n g e f r o m t h e C a s c a d e s a n d N e v a d a M o u n t a i n s t o t h e P a c i fi c O c e a n ( C h a s t a g n e r , 2 0 0 1 ) . H o w e v e r , t h e 6 2 c o a s t a l v a r i e t y i s o n l y g r o w n i n t h e c o a s t a l a r e a s o f P a c i fi c N o r t h W e s t ( P N W ) f o r C h r i s t m a s t r e e s a n d a c c o u n t f o r 4 5 % O f t o t a l p r o d u c t i o n i n t h e r e g i o n ( M i c h a e l s a n d C h a s t a g n e r , 1 9 8 2 ; C h a s t a g n e r a n d B y t h e r , 1 9 8 3 ; C h a s t a g n e r , 2 0 0 1 ) R h a b d o c l i n e p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e i s t h e p r e d o m i n a n t a n d m o s t d a m a g i n g R h a b d o c l i n e s u b s p e c i e s i n t h e n o r t h e a s t a n d e s p e c i a l l y i n t h e w e s t w h e r e t h e I M v a r i e t y o f D o u g l a s fi r i s c o m m o n l y g r o w n ( H a r r i n g t o n , 1 9 8 6 ; S i n c l a i r , 1 9 8 9 ; C h a s t a g n e r , 2 0 0 1 ) . T h e p a t h o g e n i n f e c t s n e w l y e m e r g i n g n e e d l e s a f t e r b u d b r e a k , a n d n e e d l e c a s t s y m p t o m s d e v e l o p l a t e r i n t h e f a l l o r w i n t e r . H o w e v e r , v i s u a l d i a g n o s i s o f t h e d i s e a s e i s o n l y p o s s i b l e a f t e r t h e p a t h o g e n f o r m s i t s f r u i t i n g b o d i e s t h e f o l l o w i n g y e a r . S u s c e p t i b i l i t y o f D o u g l a s fi r t o R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t v a r i e s w i t h t h e g e o g r a p h i c s o u r c e o f s e e d s . R e s i s t a n c e t o t h e d i s e a s e i n c r e a s e s a l o n g a g r a d i e n t f r o m s o u t h t o n o r t h . C o a s t a l D o u g l a s f i r a r e g e n e r a l l y l e a s t a f f e c t e d b y t h e p a t h o g e n R . p s e u d o t s u g a e s u b s p . p s e u d o t s u a g e ; t h o s e f r o m i n t e r m o u n t a i n s o u r c e s a r e m u c h m o r e s u s c e p t i b l e , a n d s u s t a i n m o r e d a m a g e ( C h a s t a g n e r , 2 0 0 1 ) . C h r i s t m a s t r e e p l a n t a t i o n s i n w h i c h t h e i n t e r m o u n t a i n v a r i e t y o f D o u g l a s fi r a r e p l a n t e d a r e p a r t i c u l a r l y s e v e r e l y a f f e c t e d b y t h e d i s e a s e ( S t o n e , 1 9 9 7 ; C h a s t a g n e r e t a l . 1 9 8 9 ; S i n c l a i r , 1 9 8 9 ) . I n t e r e s t i n g r o w i n g I M s e e d s o u r c e s o f D o u g l a s f i r h a s r e c e n t l y i n c r e a s e d i n t h e P a c i fi c N o r t h w e s t r e g i o n b e c a u s e o f t h e i r r e s i s t a n c e t o c o l d a n d t h e i r a e s t h e t i c v a l u e s . C u r r e n t l y , p l a n t i n g t r e e s f r o m I M s e e d s o u r c e s i s n o t r e c o m m e n d e d b e c a u s e o f t h e h i g h s u s c e p t i b i l i t y o f a v a i l a b l e C h r i s t m a s t r e e 6 3 s t o c k s t o R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t a n d t h e h i g h h u m i d i t y o f t h e r e g i o n , w h i c h w i l l f u r t h e r a c c e l e r a t e d i s e a s e d e v e l o p m e n t . H o w e v e r , g e n e t i c v a r i a b i l i t y i n s u s c e p t i b i l i t y t o R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t a m o n g I M s e e d s o u r c e s i s p r o n o u n c e d , w h i c h m a y o f f e r a n o p p o r t u n i t y t o s e l e c t m o d e r a t e l y r e s i s t a n t t r e e s ( J a y n e s e t a l . 1 9 8 7 ; M e r r i l l e t a l . 1 9 8 9 ; C h a s t a g n e r 2 0 0 1 ) . A f t e r 3 y e a r s o f o b s e r v a t i o n a n d d i s e a s e r a t i n g , C h a s t a g n e r ( 2 0 0 1 ) f o u n d t h a t c e r t a i n s o u r c e s o f I M D o u g l a s fi r h a v e s o m e d e g r e e o f r e s i s t a n c e t o t h e d i s e a s e a n d c a n b e g r o w n i n P N W w i t h f e w n e e d l e c a s t p r o b l e m s ( C h a s t a g n e r , 2 0 0 1 ) . R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t r e s i s t a n t s e e d s o u r c e s h a v e b e e n d e t e r m i n e d a n d s e l e c t e d b y t r a d i t i o n a l v i s u a l d i s e a s e r a t i n g b a s e d o n s y m p t o m s o n t h e n e e d l e s ( J a y n e s e t a l . 1 9 8 7 ; M e r r i l l e t a l . 1 9 8 9 ; C h a s t a g n e r , 2 0 0 1 ) . T h i s i s t h e o n l y m e t h o d a v a i l a b l e S i n c e t h e p a t h o g e n i s a n o b l i g a t e p a r a s i t e a n d c a n n o t b e g r o w n i n l a b o r a t o r y m e d i a . H o w e v e r , v i s u a l r a t i n g s a r e t i m e c o n s u m i n g a n d d i f fi c u l t t o r e l a t e t o d e g r e e o r l e v e l o f f u n g a l i n f e c t i o n a n d c o l o n i z a t i o n i n n e e d l e s . F u r t h e r m o r e , n e e d l e s c a r r y i n g s y m p t o m l e s s i n f e c t i o n s c a n n o t b e r a t e d a c c u r a t e l y a n d c o n f o u n d s t u d i e s o f r e s i s t a n c e . A n a c c u r a t e a n d s e n s i t i v e q U a n t i t a t i v e t e c h n i q u e s h o u l d a l l o w d e t e r m i n a t i o n o f r e s i s t a n t a n d s u s c e p t i b l e s e e d s o u r c e s o f D o u g l a s fi r . P o l y m e r a s e C h a i n r e a c t i o n , P C R , a s s a y s a r e r a p i d a n d r e l i a b l e t e c h n i q u e s w i t h h i g h s p e c i fi c i t y a n d h a v e b e e n u s e d f o r d e t e c t i o n o f m a n y i m p o r t a n t p a t h o g e n i c f u n g i i n c l u d i n g a f e w c o n i f e r p a t h o g e n s i n i n f e c t e d p l a n t m a t e r i a l s ( T r o u t e t a l . 1 9 9 7 ; C o o k e a n d D u n c a n , 1 9 9 7 ; C h e n e t a l . 1 9 9 6 ; M i l l s e t 6 4 a l . 1 9 9 2 ; E l l i o t e t a l . 1 9 9 3 ; H e n s o n e t a l . 1 9 9 3 ; H a m e l i n e t a l . 1 9 9 6 , 2 0 0 0 ) . P C R a s s a y s c a n a l s o b e u s e d f o r q u a n t i fi c a t i o n o f t h e f u n g a l D N A i n i n f e c t e d p l a n t m a t e r i a l S i n c e t h e a m o u n t o f P C R p r o d u c t p r o d u c e d d e p e n d s o n t h e a m o u n t o f t a r g e t D N A i n a s a m p l e ( S i m o n e t a l . 1 9 9 2 ; S c h u b e r t e t a l . 1 9 9 9 ) . H o w e v e r , P C R h a s b e e n u s e d t o q u a n t i f y o n l y a f e w f u n g i i n i n f e c t e d p l a n t t i s s u e s ( S c h u b e r t e t a l . 1 9 9 9 ; M o u k h h a m e d o v e t a l . 1 9 9 4 ; S c h i l l i n g e t a l . 1 9 9 6 ; S m i t h e t a l . 1 9 9 6 ; H e n s o n a n d F r e n c h , 1 9 9 3 ) . T h e r e h a s n o t b e e n a n y r e p o r t o f q u a n t i f y i n g a n y c o n i f e r f u n g i i n i n f e c t e d n e e d l e s . S u c h q u a n t i t a t i v e a s s a y s a l l o w t h e r e l a t i v e a m o u n t s o f a p a t h o g e n i n a p l a n t t o b e e s t i m a t e d . F u r t h e r m o r e , S i n c e P C R r e s u l t s a r e q u a n t i t a t i v e , t h e y a r e e s p e c i a l l y u s e f u l f o r m o n i t o r i n g t h e p a t t e r n o f d i s e a s e d e v e l o p m e n t i n r e s i s t a n t v s . s u s c e p t i b l e v a r i e t i e s ( H u e t a l . 1 9 9 3 ; F r a a i j e e t a l . 1 9 9 9 ; N i c h o l s o n e t a l . 1 9 9 7 ; G r o p p e a n d B o l l e r , 1 9 9 7 ) . T h e a i m o f t h e p r e s e n t r e s e a r c h w a s t o d e v e l o p a r o b u s t P C R - b a s e d q u a n t i t a t i v e a s s a y f o r q u a n t i fi c a t i o n o f R h a b d o c l i n e p s e u d o t s u g a e S y d . s u b s p e c i e s p s e u d o t s u g a e P a r k e r a n d R e i d i n f e c t i o n i n D o u g l a s fi r n e e d l e s a n d t o i n v e s t i g a t e t h e p o s s i b l e a p p l i c a t i o n o f q u a n t i t a t i v e P C R f o r s e l e c t i n g r e s i s t a n t s o u r c e s o f I M D o u g l a s fi r b y c o m p a r i n g q u a n t i t a t i v e P C R r e s u l t s w i t h v i s u a l d i s e a s e r a t i n g s . W e u s e d R h a b d o c l i n e - s p e c i fi c o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s R P P 1 a n d R P P 4 d e v e l o p e d f r o m i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r r e g i o n s o f r i b o s o m a l D N A . T h i s p r o b e p a i r w a s p r o v e n t o b e s e n s i t i v e a n d e f f e c t i v e f o r d e t e c t i o n o f t h e t a r g e t f u n g u s i n s y m p t o m l e s s n e e d l e s ( C a t a l a n d A d a m s 2 0 0 2 ) . T h e a m o u n t o f P C R a m p l i fi e d p r o d u c t s c a n b e d i r e c t l y e s t i m a t e d b y c o m p a r i s o n o f P C R p r o d u c t s w i t h 6 5 a D N A s t a n d a r d f o l l o w i n g e l e c t r o p h o r e s i s u s i n g a c o m p u t e r a i d e d i m a g e a n a l y s i s . T h e p o t e n t i a l u s e o f q u a n t i t a t i v e P C R a s s a y t o m o n i t o r i n f e c t i o n a n d c o l o n i z a t i o n p r o c e s s e s i s d e m o n s t r a t e d . 6 6 M A T E R I A L S A N D M E T H O D S o u r c e o f n e e d l e s a m p l e s T h e n e e d l e s u s e d i n t h i s s t u d y w e r e k i n d l y p r o v i d e d b y G a r y C h a s t a g n e r ( W a s h i n g h t o n S t a t e U n i v e r s i t y ) . T h e n e e d l e s w e r e f r o m a d i s e a s e d p l a n t i n g o f i n t e r m o u n t a i n ( I M ) p r o v e n a n c e s o f P s e u d o t s u g a e m e n z e i s i i v a r g l a u c a ( D o u g l a s fi r ) e s t a b l i s h e d t o d e t e r m i n e p o t e n t i a l s o u r c e s w i t h r e s i s t a n c e t o R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t . T h e n e e d l e s w e r e h a r v e s t e d f r o m 4 4 t r e e s O f 9 d i f f e r e n t I M p r o v e n a n c e s o f D o u g l a s f i r f r o m n o r t h w e s t c o a s t a l , n o r t h e r n i n t e r i o r a n d s o u t h e r n R o c k y m o u n t a i n r e g i o n s ( F i g u r e 2 . 1 ) . T h e s e e d s o u r c e s i n c l u d e d A p a c h e N a t i o n a l F o r e s t N . F . , C a r s o n N . F . , C i b o l a N . F . , C o c o n i n o N . E , L i n c o l n N . F . s o u r c e a , L i n c o l n N . F . s o u r c e b . , R i o G r a n d e N . F . , S a n I s a b e l N . F . a n d S a n t a F e N . F . C o l l e c t i o n c o d i n g o f n e e d l e s a m p l e s S a m p l e n u m b e r , c o l l e c t i o n d a t e a n d g r o w t h y e a r o f n e e d l e s a r e l i s t e d b e l o w . T h r e e d i f f e r e n t s h i p m e n t s o f s a m p l e s w e r e r e c e i v e d f r o m W a s h i n g t o n s t a t e . T h e fi r s t b a t c h c o n s i s t e d o f 1 y e a r o l d n e e d l e s , 1 9 9 9 g r o w t h , t h a t w e r e c o l l e c t e d f r o m 4 4 t r e e s a n d n u m b e r e d 1 t h r o u g h 4 4 . T h e s e n e e d l e s w e r e c o l l e c t e d i n M a y 7 , 2 0 0 0 . S e c o n d b a t c h c o n s i s t e d o f c u r r e n t y e a r n e e d l e s , 2 0 0 0 g r o w t h , t h a t w e r e c o l l e c t e d a t t h e s a m e t i m e ( M a y 7 , 2 0 0 0 ) a n d n u m b e r e d 4 5 t h r o u g h 8 8 . A t h i r d b a t c h c o n t a i n e d t h e c u r r e n t y e a r n e e d l e s c o l l e c t e d i n N o v e m b e r 7 , 2 0 0 0 . T h i s b a t c h h a d n e e d l e s a m p l e s t h a t w e r e h a r v e s t e d f r o m 2 s h o o t s ( A , B ) f o r e a c h t r e e a n d n u m b e r e d 1 0 0 A , B t h r o u g h 1 4 3 A . B . 6 7 F i g u r e 2 . 1 . M a p o f N a t i o n a l f o r e s t s i n t h e R o c k y M o u n t a i n s w h e r e t h e i n t e r m o u n t a i n s e e d s o u r c e s o f P s e u d o t s u a g a e m e n z e i s i i v a r . g l a u c a u s e d i n t h i s s t u d y o r i g i n a t e d . 6 8 T h e s a m p l e s w e r e h a r v e s t e d f r o m p a i r e d s h o o t s r a t h e r t h a n f r o m w h o l e t r e e s . E a c h n e e d l e s a m p l e f r o m o n e t r e e w a s c o d e d b y t h e W a s h i n g t o n r e s e a r c h e r s s o t h a t a b l i n d t e s t c o u l d b e p e r f o r m e d b y M i c h i g a n r e s e a r c h e r s w h o w e r e u n a w a r e o f t h e s e e d s o u r c e s o r t h e d i s e a s e r a t i n g o f t h e i n d i v i d u a l t r e e s . I n d i v i d u a l t r e e s w e r e s e l e c t e d t o i n c l u d e t r e e s t h a t v a r i e d i n d i s e a s e s u s c e p t i b i l i t y , a n d h a l f o f t h e t r e e s S h o w e d h i g h l e v e l s o f r e s i s t a n c e i n t h e f i e l d ( s e e d i s e a s e r a t i n g s y s t e m b e l o w ) . V i s u a l D i s e a s e R a t i n g s R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t d i s e a s e s e v e r i t y o n t h e I M s e e d s o u r c e s w a s r a t e d e v e r y S p r i n g b y G . C h a s t a g n e r f r o m 1 9 9 6 - 2 0 0 1 i n c l u d i n g r a t i n g o f a l l i n d i v i d u a l t r e e s . D i s e a s e s e v e r i t y w a s r a t e d o n n e e d l e s a m p l e s 1 t h r o u g h 4 4 u s i n g a m o d i fi c a t i o n o f a s y s t e m u s e d t o r a t e l e a f r u s t o n p o p l a r ( N e w c o m b e e t a l . 1 9 9 4 ) . N e e d l e c a s t s y m p t o m s e v e r i t y w a s r a t e d o n a s c a l e o f 0 t o 1 0 0 . T h e u p p e r p o r t i o n o f t h e t r e e w a s e x c l u d e d f r o m t h e r a t i n g S i n c e i t h a s f r e q u e n t l y v e r y l i t t l e o r n o d i s e a s e . T r e e s w e r e e x a m i n e d t o f i n d t h e S h o o t w i t h t h e g r e a t e s t e x t e n t o f s y m p t o m s . T h e s e v e r i t y o f s y m p t o m s o n t h i s S h o o t w a s r a t e d o n a 0 t o 2 5 s c a l e w i t h 0 = n o n e , 1 = S l i g h t , 5 = m o d e r a t e a n d 2 5 = s e v e r e . T h e n t h e p r o p o r t i o n o f S h o o t s o n t h e w h o l e t r e e w i t h s i m i l a r s y m p t o m s w a s r a t e d o n a s c a l e o f 0 t o 4 , w h e r e 0 : n o n e , 1 : 1 - 2 5 % , 2 : 2 6 - 5 0 % , 3 : 5 1 - 7 5 % a n d 4 = 7 5 % a n d a b o v e . T h e d i s e a s e s e v e r i t y r a t i n g f o r t h e t r e e i s o b t a i n e d b y m u l t i p l y i n g t h e s h o o t s y m p t o m s e v e r i t y ( 0 , 1 , 5 a n d 2 5 ) t i m e s t h e w h o l e t r e e r a t i n g ( 0 , 1 , 2 , 3 , 4 ) . 6 9 T h i s r e s u l t e d p o t e n t i a l d i s e a s e r a t i n g s o f 0 , 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 1 0 , 1 5 , 2 0 , 2 5 , 5 0 , 7 5 a n d 1 0 0 . R a t i n g o f n e e d l e s a m p l e s 1 0 0 - 1 4 3 w a s c o n d u c t e d o n p a i r e d S h o o t s . W h e n o n e S h o o t e x c i s e d w a s h a r v e s t e d i n N o v e m b e r 2 0 0 0 a n d s e n t t o M i c h i g a n , t h e a d j a c e n t a t t a c h e d S h o o t o n t h e s a m e l i v i n g b r a n c h w a s t a g g e d a n d t h e d i s e a s e w a s r a t e d o n t h e s h o o t i n s p r i n g 2 0 0 1 . T h e d a t a c o l l e c t e d o n e a c h o f t h e s h o o t s i n c l u d e d o v e r a l l ; I ) S h o o t d i s e a s e s e v e r i t y , i i ) i n c i d e n c e o f d i s e a s e d n e e d l e s , a n d i i i ) s e v e r i t y o f n e e d l e s y m p t o m s . S h o o t s e v e r i t y w a s r a t e d o n a s c a l e o f 0 t o 3 , w h e r e 0 : n o n e , 1 : S l i g h t , 2 : m o d e r a t e a n d 3 : s e v e r e . D i s e a s e i n c i d e n c e o n n e e d l e s w a s r a t e d f r o m 0 t o 1 0 w i t h 0 : n o n e , 1 : 1 - 1 0 % , 2 : 1 1 - 2 0 % a n d 1 0 = 9 1 - 1 0 0 % . D i s e a s e s e v e r i t y o n n e e d l e s w a s a l s o r a t e d f r o m 0 t o 1 0 w i t h 0 = n o n e , 1 = 1 - 1 0 % , 2 : 1 1 - 2 0 a n d 1 0 : 9 1 - 1 0 0 % . S h o o t d i s e a s e r a t i n g w a s O b t a i n e d b y m u l t i p l y i n g n e e d l e i n c i d e n c e a n d n e e d l e s e v e r i t y . O v e r a l l d i s e a s e r a t i n g s f o r e a c h t r e e w e r e d o n e a s d e s c r i b e d e a r l i e r . S h o o t a n d t r e e d i s e a s e r a t i n g s w e r e c o m p a r e d w i t h q u a n t i t a t i v e d a t a o b t a i n e d b y P C R a m p l i fi c a t i o n s D N A e x t r a c t i o n f r o m n e e d l e s N e e d l e s a m p l e s d a t e d a n d l a b e l e d w i t h t r e e n u m b e r s , w e r e s t o r e d a t — 2 0 C . S a m p l e s c o l l e c t e d i n M a y 2 0 0 0 c o n t a i n e d a p p r o x i m a t e l y 2 0 0 g n e e d l e s . D N A w a s e x t r a c t e d f r o m n e e d l e s b o t h i n s m a l l q u a n t i t i e s ( m i n i p r e p ) u s i n g a m o r t a r a n d p e s t l e a n d i n l a r g e q u a n t i t i e s ( b u l k e x t r a c t i o n s ) u s i n g a b l e n d e r . D N A w a s e x t r a c t e d u s i n g t h e m e t h o d s H a m e l i n e t a l ( 1 9 9 6 ) w i t h s o m e m o d i fi c a t i o n s . M i n i p r e p D N A e x t r a c t i o n s w e r e m a d e b y r a n d o m l y s e l e c t i n g f i v e n e e d l e s f r o m 7 0 e a c h b a g . T h e n e e d l e s w e r e s o a k e d w i t h 8 0 0 p l C T A B e x t r a c t i o n b u f f e r ( 1 0 0 m M T r i s - H C I , p H 9 . 5 , 2 % c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u m , 1 . 4 M N a C L , 1 % p o l y e t h y l e n e g l y c o l 8 0 0 0 , 2 0 m M E D T A , a n d 1 % 2 - m e r c a p t o e t h a n o l ) . A m o r t a r a n d p e s t l e w e r e u s e d t o g r i n d t h e n e e d l e s a t r o o m t e m p e r a t u r e u n t i l a S l u r r y w a s o b t a i n e d . E x t r a c t s w e r e v o r t e x e d b r i e fl y a n d i n c u b a t e d a t 6 5 C f o r a t l e a s t 1 h o u r . F o l l o w i n g t h e a d d i t i o n o f 6 0 0 p l p h e n o l : c h l o r o f o r m : i s o a m y l a l c o h o l ( 2 5 : 2 4 : 1 — S i g m a A l d r i c h C o r p o r a t i o n , S t L o u i s , M O ) , e x t r a c t s w e r e c e n t r i f u g e d a t 1 0 0 0 0 X g f o r 5 m i n u t e s . T h e a q u e o u s p h a s e w a s t r a n s f e r r e d t o a n e w t u b e , p r e c i p i t a t e d w i t h a n e q u a l v o l u m e O f c o l d i s o p r o p a n o l , a n d c e n t r i f u g e d a t 1 0 0 0 0 r p m f o r 1 0 m i n u t e s . P e l l e t s w e r e w a s h e d w i t h 7 0 % c o l d e t h a n o l , a n d c e n t r i f u g e d a t 1 0 0 0 0 r p m f o r 5 m i n , a i r d r i e d f o r 1 2 h o u r s o r o v e r n i g h t , a n d d i s s o l v e d i n 3 0 p l 1 X T E b u f f e r , p H 8 . B u l k D N A e x t r a c t i o n s w e r e m a d e u s i n g 1 0 g n e e d l e s s t r i p p e d o f f f r o m r a n d o m l y s e l e c t e d s h o o t s . N e e d l e s w e r e b l e n d e d i n 6 0 m l e x t r a c t i o n b u f f e r i n a h o u s e h o l d b l e n d e r a t h i g h s p e e d f o r 2 m i n . T h e n , e x t r a c t i o n w a s c o m p l e t e d a s d e s c r i b e d a b o v e . A S o r v a l l R C Z B c e n t r i f u g e w i t h 8 8 2 4 r o t o r ( S o r v a l l H e r a e u s , N e w t o w n , C T ) w a s u s e d i n c e n t r i f u g a t i o n . D N A p r e p s w e r e q u a n t i f i e d u s i n g a U V S p e c t r o p h o t o m e t e r ( B e c k m a n D u 5 3 0 , B e c k m a n C o u l t e r , L i f e S c i e n c e s , B r e a , C A ) . P C R A m p l i fi c a t i o n s P r i m e r p a i r R P P 1 ( 5 ’ - C A G A T C T C C C A C C C G T G T G T - 3 ’ ) a n d R P P 4 ( 5 ’ - 7 1 T C G G C C C T A A A A C T A G T G G - B ’ ) w a s u s e d f o r s p e c i e s - S p e c i f i c P C R a m p l i fi c a t i o n o f p a t h o g e n i c R h a b d o c l i n e p s e u d o t s u a g e i n c l u d i n g s u b s p e c i e s R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e a n d R . p s e u d o t s u g a e s s p . e p i p h y l l a P a r k e r T h i s p r i m e r p a i r d o e s n o t a m p l i f y R . p a r k e n ‘ S h e r w o o d - P i k e , R . w e i r i i P a r k e r & R e i d a n d i t s s u b s p e c i e s , R . w e i r i i s s p . w e i n ' i , R . w e i r i i s s p . o b l o n g a P a r k e r & R e i d , R . w e i r i i s s p . o b o v a t a P a r k e r & R e i d o r o t h e r n e e d l e i n h a b i t i n g f u n g i ( C a t a l , 2 0 0 2 ; C a t a l a n d A d a m s 2 0 0 2 ) . D N A w a s d i l u t e d 1 0 0 a n d 5 0 0 t i m e s a n d u s e d i n P C R a m p l i f i c a t i o n s . P C R r e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t i n 2 5 p l t o t a l v o l u m e c o n s i s t i n g o f 1 2 . 5 p l D N A d i l u t i o n ( t e m p l a t e ) a n d 1 2 . 5 p l P C R r e a c t i o n m i x t u r e . T h e r e a c t i o n m i x t u r e c o n t a i n e d T fl P C R b u f f e r ( 5 0 m M T r i s - H C I , p H 9 . 0 ; 2 0 m M a m m o n i u m s u l f a t e ; 2 . 0 m M M g C l z ; E p i c e n t r e T e c h n o l o g i e s , M a d i s o n , W I ) ; 0 . 2 m M e a c h o f d A T P , d T T P , d G T P a n d d C T P ; 1 p M o f e a c h p r i m e r ; a n d 0 . 5 u n i t o f T a q D N A p o l y m e r a s e . T h e r e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t o n a D N A t h e r m a l c y c l e r ( P e r k i n - E l m e r C e t u s , N o n i v a l k , C T ) . T h e r e a c t i o n p r o t o c o l c o n s i s t e d o f a n i n i t i a l d e n a t u r a t i o n a t 9 4 C f o r 3 m i n u t e s f o l l o w e d b y 3 0 c y c l e s o f 9 4 C f o r 1 m i n , 5 2 C f o r 1 m i n , a n d 7 2 C f o r 1 m i n . T h e r e a c t i o n w a s c o m p l e t e d b y a 7 m i n e x t e n s i o n a t 7 2 C . P C R p r o d u c t s w e r e s e p a r a t e d o n 1 . 5 % a g a r o s e i n 1 % T A E b u f f e r ( 1 0 0 m M T r i s ( S i g m a ) , 1 2 . 5 m M s o d i u m a c e t a t e a n d 1 m M E D T A , p H 8 . 0 ) b y g e l e l e c t r o p h o r e s i s . A S a D N A s i z e s t a n d a r d , a 1 k b p l u s D N A l a d d e r ( G i b c o B R L , G r a n d I s l a n d , N Y ) w a s i n c l u d e d i n e a c h g e l . A f t e r r u n n i n g f o r a t l e a s t 1 h o u r a t 1 0 0 v o l t s , t h e g e l s w e r e s t a i n e d w i t h e t h i d i u m b r o m i d e , v i s u a l i z e d b y U V fl u o r e s c e n c e a n d p h o t o g r a p h e d u s i n g A l p h a l m a g e r ( A l p h a I n n o t e c h C o r p o r a t i o n , S a n L e a n d r o , C A ) . 7 2 Q u a n t i fi c a t i o n o f P C R p r o d u c t s P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y R P P 1 a n d R P P 4 w e r e r u n o n a l a r g e - f o r r n a t e l e c t r o p h o r e s i s a p p a r a t u s ( M o d e l A 3 - 1 , O W L s e p a r a t i o n s y s t e m s I n c , P o r t s m o u t h , N H ) w i t h a g e l b e d o f 2 3 c m X 4 0 c m t h a t a c c o m m o d a t e s 2 0 0 s a m p l e s o r 4 r e p l i c a t e d t e s t s o r s a m p l e s f r o m 4 4 t r e e s ( F i g u r e 2 . 2 ) . T r a y b u f f e r a n d 1 . 5 % g e l b u f f e r w a s 1 X T B E ( 4 5 . 6 m M T r i s b a s e , 9 0 m M B o r i c A c i d , a n d 1 0 m M E D T A , p H 8 . 0 ) . E l e c t r o p h o r e s i s w a s c a r r i e d o u t f o r f o u r h o u r s a t 1 0 0 v o l t s . E t h i d i u m b r o m i d e ( 0 . 0 0 2 % ) w a s a d d e d t o t h e g e l b e f o r e p o u r i n g . G e l w a s v i s u a l i z e d b y U V fl u o r e s c e n c e a n d p h o t o g r a p h e d a n d a n a l y z e d u s i n g t h e D N A Q u a n t i t y O n e s y s t e m a n d s o f t w a r e ( B I O - R A D l a b o r a t o r i e s , H e r c u l e s , C A ) . T h e s o f t w a r e c a l c u l a t e d t h e a v e r a g e i n t e n s i t y o f p i x e l s ( % ) a c r o s s t h e w i d t h o f t h e e t h i d i u m b r o m i d e s t a i n e d b a n d a n d i n t e g r a t e d o v e r t h e b a n d h e i g h t . T h e q u a n t i t y w a s t h e s u m o f a l l t h e p i x e l s i n t h e b a n d ( i n t e n s i t y o f p i x e l x p i x e l a r e a ) . T h e a r e a o f p i x e l s w a s d e t e r m i n e d b y t h e r e s o l u t i o n o f t h e s c a n i m a g e . T h e r e s u l t i n g v a l u e s h a v e u n i t s o f i n t e n s i t y O f p i x e l s / m m z . T w o m i c o g r a m o f 1 K B + D N A l a d d e r ( G i b c o B R L ) w e r e l o a d e d a s a c o n t r o l f o r D N A q u a n t i t y . T h e 1 6 5 0 b p s e g m e n t o f t h i s l a d d e r c o n s i s t o f 8 . 0 % o f t o t a l D N A l o a d e d . I n t e n s i t y v a l u e s o f p i x e l s / m m 2 w e r e c o n v e r t e d t o n a n o g r a m b y m u l t i p l y i n g e a c h v a l u e w i t h t h e v a l u e ( 1 6 0 n a n o g r a m ) o b t a i n e d f r o m t h e a v e r a g e i n t e n s i t y O f q u a n t i t y o f D N A i n t h e 1 6 5 0 b p b a n d o f t h e D N A l a d d e r . 7 3 R e s t r i c t i o n d i g e s t s S o f t w a r e g e n e r a t e d r e s t r i c t i o n m a p s o f t h e I T S I - 5 . 8 S - I T S I I r i b o s o m a l D N A s e q u e n c e s o f e a c h f u n g u s w e r e c o n s t r u c t e d b y t h e s u b p r o g r a m M A P D R A W o f D N A S t a r ( D N A S T A R I n c , M a d i s o n , W I ) . T w e n t y t w o r e s t r i c t i o n e n z y m e s w e r e u s e d t o l o c a t e s p e c i fi c c u t t i n g s i t e s i n e a c h s e q u e n c e . E n z y m e c u t t i n g S i t e s t h a t w e r e u n i q u e t o a p a r t i c u l a r R h a b d o c l i n e S p e c i e s w e r e u s e d t o d i f f e r e n t i a t e o n e f u n g u s f r o m o t h e r s . P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y t h e R h a b d o c l i n e - S p e c i fi c p r i m e r s ( R P P 1 - R P P 4 ) w e r e c u t w i t h t h e r e s t r i c t i o n e n z y m e s a s f o l l o w . R e s t r i c t i o n r e a c t i o n s c o n t a i n e d 4 p l o f P C R p r o d u c t s a n d 6 p l o f r e s t r i c t i o n m i x t u r e 1 p l m a n u f a c t u r e r ’ s b u f f e r , 0 . 2 p l e n z y m e a n d 4 . 8 p l d i s t i l l e d w a t e r ) . R e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t a t 3 7 o r 6 5 C , d e p e n d i n g o n t h e e n z y m e u s e d f o r 2 - 4 h o u r s a n d s t o p p e d b y c o o l i n g o n i c e . D i g e s t e d p r o d u c t s w e r e r u n o n 3 % a g a r o s e g e l f o r 1 h o u r a t 1 0 0 v o l t s a n d p h o t o g r a p h e d u s i n g A l p h a l m a g e r . 7 4 F i g u r e 2 . 2 . T h e l a r g e - f o r m a t g e l e l e c t r o p h o r e s i s a p p a r a t u s u s e d i n r e p l i c a t e d q u a n t i fi c a t i o n s t u d i e s 7 5 R E S U L T S D e t e c t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n o f i n f e c t i o n S a m p l e s o f y e a r o l d n e e d l e s f r o m 4 4 t r e e s r e p r e s e n t i n g n i n e d i f f e r e n t p r o v e n a n c e s w e r e t e s t e d f o r q u a n t i fi c a t i o n o f t h e R h a b d o c l i n e p a t h o g e n i n t h e n e e d l e s . D N A e x t r a c t i o n m e t h o d s w i t h t w o q u a n t i t i e s o f n e e d l e s w e r e u s e d i n e v a l u a t i o n s o f w h e t h e r e a c h m e t h o d s u p p l i e d a s u f fi c i e n t s a m p l i n g t o a c c u r a t e l y r e p r e s e n t t h e l e v e l o f R h a b d o c l i n e i n f e c t i o n i n a 1 0 g c o l l e c t i o n o f n e e d l e s . T h e m o r t a r / p e s t l e m e t h o d w a s e v a l u a t e d u s i n g f o u r d i f f e r e n t r e p l i c a t i o n s o f D N A e x t r a c t i o n s , e a c h p r e p a r e d f r o m fi v e r a n d o m l y s e l e c t e d n e e d l e s . A P C R r e a c t i o n f o r d e t e c t i o n w a s c a r r i e d o u t w i t h e a c h D N A e x t r a c t i o n . P r e l i m i n a r y a m p l i fi c a t i o n s s h o w e d t h a t 5 0 0 t i m e s o r g r e a t e r d i l u t i o n s o f D N A w o r k e d q u i t e w e l l f o r P C R a m p l i fi c a t i o n s o f t h e t e m p l a t e s o f b o t h e x t r a c t i o n t y p e s . R h a b d o c l i n e - S p e c i fi c p r i m e r s R P P 1 a n d R P P 4 d e t e c t e d t h e 3 4 1 b p t a r g e t D N A i n 3 0 o u t o f 4 4 t r e e s . T h e p a t h o g e n w a s d e t e c t e d o n c e i n t r e e s 1 2 , 1 3 , 1 5 , 1 8 , 3 5 , 3 9 a n d t w i c e i n t r e e 4 4 o u t o f 4 r e p l i c a t e s . T h e p a t h o g e n w a s n o t d e t e c t e d i n t r e e s 5 , 6 , 9 , 1 7 , 1 9 , 3 0 a n d 4 0 i n a n y a m p l i fi c a t i o n o f 5 n e e d l e e x t r a c t i o n s ( T a b l e 2 . 1 ) . M o r e c o n c e n t r a t e d t e m p l a t e ( 1 0 0 t i m e s d i l u t i o n s ) w a s u s e d i n f u r t h e r P C R a s s a y s t o C h e c k t h e s a m p l e s t h a t h a d S h o w n n o a m p l i fi c a t i o n p r o d u c t s . W e a k a m p l i fi c a t i o n s r e s u l t e d w i t h t r e e s 5 a n d 6 , o n l y . P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d f r o m t h e 4 4 t r e e s w e r e q u a n t i fi e d . N e e d l e s a m p l e s f r o m 2 8 t r e e s y i e l d e d P C R p r o d u c t s w i t h m o r e t h a n 8 0 n g D N A ( 5 0 % p i x e l / m m z ) . S a m p l e s f r o m 3 t r e e s h a d y i e l d e d a p p r o x i m a t e l y 3 0 n g ( 2 0 % 7 6 p i x e l / m m z ) w h i l e 6 t r e e s y i e l d e d l e S S t h a n 2 0 n g D N A . D N A w a s n o t q u a n t i fi e d i n n e e d l e s f r o m t h e n o n - d e t e c t e d t r e e s 5 , 6 , 9 , 1 7 , 1 9 , 3 0 a n d 4 0 i n a n y o f 4 r e p l i c a t i o n s ( F i g u r e 2 . 3 a n d T a b l e 2 . 1 ) . E l e c t r o p h o r e t i c g e l s o f t h e 4 r e p l i c a t e d t e s t s o f 4 4 t r e e s a r e S h o w n i n F i g u r e 2 . 3 . T h e q u a n t i t y o f P C R p r o d u c t s f o r e a c h s a m p l e i n e a c h g e l , a s m e a s u r e d b y Q u a n t i t y O n e , i s l i s t e d i n T a b l e 2 . 1 . D N A e x t r a c t i o n s f r o m 1 0 g n e e d l e s w e r e p r e p a r e d o n c e f r o m e a c h o f t h e 4 4 n e e d l e s a m p l e s . T h r e e r e p l i c a t i o n s o f t h e P C R a s s a y s w e r e p e r f o r m e d w i t h e a c h D N A s a m p l e . E x t r a c t i o n f r o m 1 0 g n e e d l e s y i e l d e d P C R a m p l i fi c a t i o n s t h a t w e r e c o m p a r a b l e i n D N A c o n c e n t r a t i o n t o t h o s e o f t h e e x t r a c t i o n s f r o m 5 n e e d l e s e x c e p t t h e 1 0 g e x t r a c t i o n w e r e m o r e s e n s i t i v e i n d e t e c t i n g t h e l o w e s t a m o u n t o f i n f e c t i o n f o u n d i n t r e e s 5 , 6 , 9 , 1 7 , 1 9 , 3 0 , 4 0 . I n g e n e r a l t h e a m o u n t o f D N A i n P C R a m p l i fi c a t i o n s w a s n o t i c e a b l y r e d u c e d w i t h D N A e x t r a c t i o n s o f 1 0 g n e e d l e s c o m p a r e d t o 5 n e e d l e s f o r e a c h t r e e . W h e n P C R p r o d u c t s w e r e q u a n t i fi e d , r e s u l t s f r o m 1 0 g o f n e e d l e s w e r e s i m i l a r t o t h o s e o f 5 n e e d l e s ; n e e d l e s f r o m t h e s a m e 2 7 t r e e s y i e l d e d D N A a p p r o x i m a t e l y 8 0 n g ( 5 0 % p i x e l / m m z ) ; 4 t r e e s y i e l d e d D N A o f m o r e t h a n 3 0 n g ( 2 0 % p i x e l / m m z ) ; a n d t h e r e m a i n i n g 1 3 t r e e y i e l d e d l e s s t h a n 3 0 n g D N A ( T a b l e . 2 . 1 ) . E l e c t r o p h o r e t i c g e l s o f t h e 4 r e p l i c a t e d t e s t s o f 4 4 t r e e s a r e S h o w n i n F i g u r e 2 . 4 . 7 7 7 8 t h e m o r t a r / p e s t l e m e t h o d ( 5 n e e d l e s ) . F i g u r e 2 . 3 P C R d e t e c t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n o f R h a b d o c l i n e p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e i n f e c t i o n ( b y p r i m e r s R P P 1 a n d R P P 4 ) . D N A w a s e x t r a c t e d w i t h v - N M V I D O N ‘ D G ) T e s t 1 3 4 1 b p + t o T 3 3 3 2 3 : O v - v a - n t o i x c o m 0 v - m m v m w i x n o m O v — N n g m c o r m e O v - v a ‘ - F N M V I O ‘ D N D O ’ r r r r r r r r N N N N N N N N N N M M M K ‘ ) 0 1 6 ) ” ? ? a n v a + m x o v a m c o r x a o m o N n T e s t s . - * - ” N a F i g u r e 2 . 4 . P C R d e t e c t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n o f R h a b d o c l i n e p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e i n f e c t i o n ( b y p r i m e r s R P P 1 a n d R P P 4 ) . D N A e x t r a c t i o n s w e r e p r e p a r e d w i t h t h e b l e n d e r m e t h o d ( 1 0 g r a m s o f n e e d l e s ) . 7 9 T a b l e 2 . 1 . M e a s u r e m e n t o f t h e q u a n t i t y o f P C R p r o d u c t a m p l i f i e d f r o m y e a r o l d n e e d l e s ( M a y 2 0 0 0 ) c o l l e c t e d f r o m e a c h o f 4 4 t r e e s o f d i f f e r e n t p r o v e n a n c e s o f I n t e n n o u n t a i n s o u r c e s o f P s e u d o t s u g a e m e n z e i s i i . M e a s u r e m e n t s w e r e m a d e w i t h t h e Q u a n t i t y O n e s y s t e m ( B I O - R A D ) . P C R d e t e c t i o n T r e e i t 1 P r o v e n a n c e 2 ( M o r t a r / p e s t l e ) 3 ( b l e n d e r 4 ) g J N A 5 T e s t 1 T e s t 2 T e s t 3 T e s t 4 D N A 6 T e s t 1 T e s t 2 T e s t 3 1 S a n t a F e 2 . 8 8 8 3 . 5 4 7 9 6 . 1 9 9 7 . 0 1 7 9 . 6 3 0 . 9 9 5 1 . 0 6 5 9 . 6 2 6 3 . 5 7 2 S a n t a F e 2 . 8 2 2 7 . 7 1 2 5 . 3 9 5 0 . 9 3 4 3 . 2 3 0 . 9 2 2 5 . 9 2 2 2 . 6 4 3 1 . 6 7 3 A p a c h e 2 . 7 4 7 6 . 7 0 9 1 . 4 1 8 6 . 9 3 5 0 . 8 5 1 . 2 8 7 5 . 5 1 5 8 . 1 8 6 0 . 4 1 4 L i n c o l n ( b ) 3 . 2 1 7 2 . 7 0 8 6 . 3 8 9 2 . 3 2 5 0 . 6 4 1 . 3 3 5 0 . 8 7 6 1 . 5 3 5 8 . 0 2 5 C a r s o n 3 . 2 8 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 1 . 3 4 0 . 0 0 0 . 0 0 4 . 3 3 6 C o c o n i n o 2 . 2 4 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 1 . 3 9 6 . 9 1 0 . 0 0 6 . 4 4 7 C o c o n i n o 3 . 8 2 7 8 . 4 7 7 7 . 8 1 9 3 . 0 6 5 8 . 4 2 1 . 3 4 5 8 . 8 8 4 7 . 9 9 5 2 . 3 7 8 C i b o l a 3 . 4 8 9 3 . 7 2 9 4 . 9 4 9 6 . 9 6 7 2 . 2 4 1 . 6 4 5 8 . 2 3 8 2 . 0 7 5 7 . 8 7 9 C i b o l a 3 . 0 5 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 1 . 6 5 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 1 0 C a r s o n 2 . 8 5 7 0 . 2 2 8 9 . 0 3 7 9 . 3 8 4 4 . 2 8 1 . 3 2 2 1 . 7 3 3 4 . 9 8 3 1 . 9 4 1 1 S a n I s a b e l 3 . 3 5 7 0 . 9 9 8 1 . 1 3 8 5 . 7 7 5 8 . 1 9 1 . 3 7 8 2 . 0 4 5 3 . 2 8 5 7 . 4 6 1 2 L i n c o l n ( 3 ) 3 . 3 2 0 . 0 0 0 . 0 0 3 4 . 2 1 0 . 0 0 1 . 5 8 2 1 . 6 5 1 4 . 4 2 1 0 . 7 2 1 3 S a n I s a b e l 3 . 6 2 0 . 0 0 1 2 . 3 8 0 . 0 0 0 . 0 0 1 . 0 8 2 3 . 4 3 2 0 . 0 8 1 9 . 4 3 1 4 C o c o n i n o 3 . 1 6 9 3 . 1 4 9 2 . 2 1 9 7 . 7 1 5 5 . 2 5 1 . 4 0 4 7 . 0 3 8 4 . 8 4 5 9 . 2 9 1 5 C o c o n i n o 2 . 8 4 0 . 0 0 1 4 . 7 2 0 . 0 0 0 . 0 0 1 . 3 6 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 1 6 C a r s o n 2 . 7 5 9 3 . 9 2 9 2 . 9 1 7 7 . 3 4 5 4 . 7 3 1 . 2 2 5 4 . 4 7 8 8 . 6 9 5 4 . 4 8 1 7 L i n c o l n ( 8 ) 3 . 3 4 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 1 . 6 8 0 . 0 0 1 3 . 5 2 0 . 0 0 1 8 L i n c o l n ( 3 ) 3 . 5 0 0 . 0 0 9 . 8 1 0 . 0 0 0 . 0 0 1 . 3 4 1 5 . 2 9 1 3 . 5 0 9 . 9 2 1 9 R i o G r a n d e 2 . 5 0 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 1 . 9 2 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 2 0 R i o G r a n d e 2 . 8 0 1 0 0 . 3 7 8 7 . 4 9 9 7 . 3 4 6 5 . 3 9 1 . 4 2 6 1 . 2 5 5 0 . 8 1 4 6 . 2 9 2 1 C a r s o n 2 . 8 3 5 5 . 9 3 3 2 . 4 0 9 0 . 0 5 4 8 . 5 9 1 . 1 6 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 2 2 S a n I s a b e l 3 . 2 5 1 0 1 . 6 6 8 6 . 6 9 1 0 5 . 5 3 6 8 . 3 1 1 . 7 7 7 5 . 1 5 7 6 . 7 4 6 0 . 1 7 2 3 S a n I s a b e l 3 . 5 4 9 3 . 9 6 9 6 . 5 8 9 7 . 7 3 6 6 . 0 9 1 . 5 6 6 2 . 5 3 4 9 . 0 4 5 2 . 2 8 2 4 C o c o n i n o 3 . 8 7 8 9 . 1 5 9 0 . 3 8 9 7 . 5 5 7 2 . 2 2 1 . 4 3 4 2 . 1 9 6 0 . 9 6 6 2 . 0 9 2 5 C o c o n i n o 3 . 8 6 6 5 . 6 0 8 1 . 9 3 7 9 . 6 5 6 4 . 0 2 1 . 1 4 6 4 . 7 9 4 0 . 7 5 5 3 . 2 9 2 6 A p a c h e 2 . 6 3 7 2 . 6 1 4 9 . 1 5 4 0 . 2 5 5 5 . 8 0 1 . 3 4 5 2 . 5 6 4 6 . 5 8 5 9 . 5 6 2 7 C i b o l a 3 . 7 8 4 7 . 9 5 4 8 . 5 3 8 2 . 5 3 6 1 . 8 3 1 . 7 5 6 9 . 7 3 6 7 . 3 8 5 7 . 0 9 2 8 C i b o l a 3 . 6 8 8 4 . 7 8 8 5 . 5 5 5 5 . 7 2 8 8 . 4 4 1 . 1 7 7 0 . 1 8 7 3 . 9 8 6 2 . 8 6 2 9 A p a c h e 3 . 3 3 7 8 . 4 8 5 9 . 1 0 9 2 . 2 7 8 5 . 9 8 1 . 6 2 7 5 . 9 0 4 3 . 3 0 6 1 . 3 7 3 0 S a n I s a b e l 3 . 9 4 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 1 . 1 2 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 3 1 L i n c o l n ( 3 ) 2 . 7 8 7 1 . 9 3 8 3 . 5 1 8 4 . 0 3 7 0 . 6 2 1 . 3 0 6 7 . 7 5 7 7 . 7 0 7 7 . 9 8 3 2 S a n t a F e 3 . 4 6 8 2 . 2 7 8 8 . 0 4 9 4 . 6 6 7 0 . 4 8 1 . 5 0 4 8 . 1 5 3 7 . 8 9 6 7 . 9 0 3 3 L i n c o l n ( 3 ) 2 . 9 4 9 6 . 2 1 9 6 . 2 8 1 0 1 . 9 0 8 9 . 0 2 1 . 0 7 5 1 . 2 3 7 2 . 7 9 6 6 . 5 1 3 4 S a n I s a b e l 3 . 3 6 9 3 . 3 4 8 8 . 0 6 9 9 . 0 6 8 5 . 6 4 1 . 1 6 4 1 . 4 5 6 9 . 9 4 6 8 . 4 2 3 5 S a n I s a b e l 3 . 2 4 4 2 . 2 3 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 1 . 3 5 2 3 . 6 3 2 1 . 7 0 2 4 . 3 8 3 6 S a n I s a b e l 3 . 2 6 5 9 . 6 1 4 3 . 0 6 7 5 . 2 5 4 2 . 6 9 1 . 4 8 4 6 . 5 1 5 6 . 3 2 4 1 . 3 5 3 7 A p a c h e 3 . 3 8 8 6 . 6 5 9 0 . 6 1 8 9 . 4 1 9 1 . 7 4 1 . 4 4 6 1 . 6 4 6 3 . 7 6 3 1 . 5 7 3 8 C o c o n i n o 3 . 6 4 7 9 . 8 4 8 4 . 1 4 9 5 . 3 9 8 9 . 6 5 1 . 1 0 7 5 . 5 6 6 3 . 1 8 4 9 . 2 2 3 9 C o c o n i n o 2 . 8 5 0 . 0 0 0 . 0 0 1 3 . 7 0 0 . 0 0 1 . 3 9 1 6 . 1 4 1 0 . 0 3 0 . 0 0 4 0 S a n t a F e 3 . 4 3 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 1 . 1 5 1 4 . 2 6 0 . 0 0 0 . 0 0 8 0 T a b l e 2 . 1 c o n t ’ d P C R d e t e c t i o n T r e e # 1 P r o v e n a n c e 2 ( M o r t a r / p e s t l e ) 3 fi l e n d e r 4 ) g N A 5 T e s t 1 T e s t 2 T e s t 3 T e s t 4 = D N A 6 T e s t 1 T e s t 2 T e s t 3 4 1 C i b o l a 3 . 3 5 3 0 . 7 9 7 0 0 0 1 3 . 7 0 7 1 . 4 1 1 . 2 5 5 5 . 2 4 0 . 0 0 5 9 . 8 5 4 2 C i b o l a 3 . 5 7 8 3 . 1 1 8 4 . 2 7 5 0 . 2 4 5 2 . 7 5 1 . 4 5 5 4 . 1 7 5 3 . 5 5 4 0 . 3 1 4 3 C i b o l a 3 . 7 5 5 5 . 8 3 8 4 . 7 3 4 5 . 9 4 5 2 . 9 1 1 . 2 0 5 4 . 5 1 4 8 . 9 6 5 0 . 3 2 4 4 C i b o l a 3 . 5 5 3 4 . 9 3 4 4 . 3 1 0 . 0 0 0 . 0 0 1 . 3 3 7 . 4 8 0 . 0 0 0 . 0 0 C “ 1 0 6 . 7 6 1 0 5 8 5 1 0 3 5 3 1 0 0 2 3 9 5 . 4 5 1 0 0 . 2 4 9 8 . 4 5 1 a s s i g n e d s a m p l e n u m b e r s ( M i c h i g a n ) i n b l i n d t e s t s . 2 S e e d s o u r c e s t a k e n f r o m N a t i o n a l F o r e s t s ( N . F ) 3 D N A e x t r a c t e d f r o m 5 n e e d l e s w i t h a m o r t a r / p e s t l e 4 D N A e x t r a c t e d f r o m 1 0 g r a m s o f n e e d l e s w i t h a b l e n d e r . 5 6 C o n c e n t r a t i o n s o f D N A b e f o r e P C R a m p l i f i c a t i o n s . D N A a m o u n t s ( p g / p l ) r e p r e s e n t a v e r a g e s o f t h e 4 r e p l i c a t i o n s ( M o r t a r a n d p e s t l e ) a n d 1 r e p l i c a t i o n ( B l e n d e r ) f o r e a c h p r o v e n a n c e . 7 V a l u e s r e p r e s e n t t h e q u a n t i t y o f D N A ( p i x e l / m m z ) i n P C R t e s t s . 8 C = c o n t r o l . T h e i n t e n s i t y o f t h e 1 6 5 0 b p b a n d o f 1 K B + D N A l a d d e r ( G i b c o B R L ) r e p r e s e n t e d 8 % o f t h e t o t a l D N A i n 2 p g o f l o a d e d l a d d e r . T h e q u a n t i t y i n t h e 1 6 5 0 b p b a n d s e r v e d a s a c o n t r o l f o r D N A c o n c e n t r a t i o n . 8 1 C o m p a r i s o n o f v i s u a l d i s e a s e r a t i n g t o q u a n t i t a t i v e P C R d e t e c t i o n T h e r e l a t i v e s u s c e p t i b i l i t y o f e a c h t r e e a s v i s u a l l y r a t e d I n t h e f i e l d w a s c o m p a r e d t o t h e d e n s i t y o f P C R p r o d u c t s , i n b l i n d t e s t s . T h e v i s u a l d i s e a s e r a t i n g d a t a i n c l u d e d M a r c h 2 0 0 0 a n d 2 0 0 1 r a t i n g s f o r 1 9 9 9 a n d 2 0 0 0 g r o w t h f o r e a c h t r e e a s w e l l a s r a t i n g s f r o m 4 p r e v i o u s y e a r s ( T a b l e 2 . 2 ) . T h e d i s e a s e r a t i n g f o r e a c h t r e e n o t i c e a b l y fl u c t u a t e d f r o m o n e y e a r t o a n o t h e r b a s e d , p r e s u m a b l y , o n t h e w e a t h e r c o n d i t i o n s t h a t a f f e c t t h e R h a b d o c l i n e i n f e c t i o n a n d s y m p t o m d e v e l o p m e n t . R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t r a t i n g s w e r e h i g h i n 1 9 9 7 , 1 9 9 9 , 2 0 0 0 a n d 2 0 0 1 c o m p a r e d t o 1 9 9 6 a n d 1 9 9 8 ; h o w e v e r , fi e l d d i s e a s e r a t i n g s f o r e a c h t r e e w e r e g e n e r a l l y c o n s i s t e n t o v e r t h e l a s t fi v e y e a r s . T h e d e n s i t y o f P C R p r o d u c t s w a s c o m p a r e d t o fi e l d r a t i n g s f o r 2 0 0 0 . T h e d e n s i t y o f P C R p r o d u c t s c o r r e s p o n d e d r e l a t i v e l y w e l l w i t h t h e l e v e l o f t h e v i s u a l d i s e a s e r a t i n g s f o r m o s t i n d i v i d u a l t r e e s . F u r t h e r m o r e , w h e n f i e l d r a t i n g s o f e a c h t r e e w e r e g r a p h e d a g a i n s t t h e d e n s i t y o f P C R p r o d u c t , t h e o v e r a l l c o r r e s p o n d e n c e w a s v i s u a l l y a p p a r e n t ( F i g u r e 2 . 5 ) . P r e s u m a b l y , t h e d e n s i t y o f t h e P C R p r o d u c t s c o r r e l a t e d w e l l w i t h t h e a m o u n t o f p a t h o g e n m y c e l i u m i n t h e n e e d l e s . P C R d e t e c t i o n a l s o r e v e a l e d l o w l e v e l s o f i n f e c t i o n s t h a t v i s u a l r a t i n g s m i s s e d i n r e s i s t a n t o r m o d e r a t e l y r e s i s t a n t t r e e s ( T a b l e 2 . 2 ) . E i g h t e e n t r e e s w i t h d i s e a s e r a t i n g s o v e r 5 0 y i e l d e d m o r e t h a n 8 0 n g D N A ( 5 0 % p i x e l / m m z ) i n a s s a y s u s i n g b o t h m o r t a r / p e s t l e a n d b l e n d e r e x t r a c t e d s a m p l e s . H i g h l e v e l s o f a m p l i fi e d p r o d u c t c o r r e s p o n d i n g p r e s u m a b l y , t o g r e a t e r a m o u n t s o f f u n g a l m y c e l i u m w e r e f o u n d i n t h e t r e e s 4 , 1 0 , 3 1 , a n d 3 3 a l t h o u g h t h e d i s e a s e r a t i n g s w e r e l o w , 2 0 , 2 0 , 2 0 , a n d 8 2 T a b l e 2 . 2 . C o m p a r i s o n o f v i s u a l d i s e a s e r a t i n g s t o q u a n t i t a t i v e P C R d e t e c t i o n o f i n f e c t i o n i n 1 9 9 9 g r o w t h n e e d l e s c o l l e c t e d i n M a y 2 0 0 0 ( B L I N D T E S T 1 ) . F i e l d D i s e a s e R a t i n q ‘ P C R d e t e c t i o n 5 T r e e # M P r o v e n a n c e 1 9 9 6 1 9 9 7 1 9 9 8 1 9 9 9 _ 2 _ 0 _ ( _ I Q 2 0 _ 1 M o r t a r / p e s t l e b l e n d e r ( M I ) ( W A ) D N A D N A D N A D N A T R 1 P 2 % p i x e l n % p i x e l n g 1 0 2 0 3 S a n t a F e 1 5 0 2 5 1 5 1 0 0 1 0 0 8 9 . 0 9 1 2 1 . 4 6 5 9 . 0 8 9 5 . 9 7 2 0 2 0 4 S a n t a F e 0 0 0 1 5 0 1 0 0 3 6 . 8 1 5 6 . 1 5 2 6 . 7 4 4 3 . 4 4 3 0 2 0 6 A p a c h e 2 1 0 0 4 1 0 0 1 0 0 1 0 0 7 6 . 4 7 1 1 6 . 6 3 6 4 . 7 0 1 0 5 . 9 6 4 0 2 0 8 L i n c o l n ( b ) 1 0 1 0 0 1 7 5 2 0 1 0 0 7 5 . 5 1 1 1 5 . 1 7 5 6 . 8 0 9 2 . 2 6 5 0 2 1 1 C a r s o n 0 0 O 0 0 2 0 0 . 0 0 0 . 0 0 1 . 4 4 2 . 4 0 6 0 2 1 5 C o c o n i n o 0 1 0 0 0 1 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 4 . 4 5 2 . 2 3 7 0 2 1 6 C o c o n i n o 1 2 5 1 1 1 0 0 1 0 0 7 6 . 9 4 1 1 7 . 3 5 5 3 . 0 8 8 6 . 2 2 8 0 2 2 1 C i b o l a 0 2 5 5 7 5 1 0 0 1 0 0 8 9 . 4 7 1 3 6 . 4 7 6 6 . 0 5 1 0 7 . 2 9 9 0 2 2 2 C i b o l a 0 0 0 0 0 2 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 1 0 0 3 0 5 C a r s o n 3 1 0 0 4 7 5 2 0 1 0 0 7 0 . 7 2 1 0 8 . 7 0 2 9 . 5 5 4 8 . 0 0 1 1 0 3 0 9 S a n I s a b e l 0 1 0 0 5 1 5 1 0 0 1 0 0 7 4 . 0 2 1 2 2 . 9 0 6 4 . 2 6 1 0 4 . 3 8 1 2 0 3 1 9 L i n c o l n ( a ) 0 0 0 O 0 2 0 8 . 5 5 1 3 . 0 4 1 5 . 6 0 2 5 . 3 4 1 3 0 5 0 2 S a n I s a b e l 0 O 0 0 0 2 0 3 . 0 9 4 . 7 1 2 0 . 9 8 3 4 . 0 8 1 4 0 5 0 7 C o c o n i n o 2 5 2 5 5 5 1 0 0 1 0 0 8 4 . 5 8 1 2 8 . 9 3 6 3 . 7 2 1 0 3 . 5 5 1 5 0 5 0 8 C o c o n i n o 0 1 0 0 0 1 0 0 3 . 7 0 5 . 6 4 0 . 0 0 0 . 0 0 1 6 0 5 1 9 C a r s o n 0 2 5 1 1 5 0 1 0 0 7 9 . 7 3 1 2 1 . 6 1 6 5 . 8 8 1 0 7 . 1 0 1 7 0 5 2 2 L i n c o l n ( a ) O 0 0 O 0 2 0 . 0 0 0 . 0 0 4 . 5 0 7 . 3 1 1 8 0 7 0 4 L i n c o l n ( a ) 0 0 0 0 0 1 0 2 . 4 5 3 . 7 4 1 2 . 9 0 2 0 . 9 5 1 9 0 7 0 5 R i o G r a n d e 0 1 0 0 0 2 0 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 2 0 0 7 0 6 R i o G r a n d e 1 5 1 1 0 7 5 1 0 0 8 7 . 6 5 1 3 3 . 6 9 5 2 . 7 8 8 5 . 7 3 2 1 0 7 0 9 C a r s o n O 1 0 0 0 2 0 5 6 . 7 5 8 6 . 5 6 0 . 0 0 0 . 0 0 2 2 0 7 1 3 S a n I s a b e l 5 0 1 0 0 7 5 1 0 0 1 0 0 1 0 0 9 0 . 5 5 1 3 8 . 1 1 7 0 . 6 8 1 1 4 . 8 1 2 3 0 7 1 4 S a n l s a b e l 1 0 5 0 1 7 5 7 5 1 0 0 8 8 . 5 9 1 3 5 . 1 3 5 4 . 6 1 8 8 . 7 1 2 4 0 7 1 7 C o c o n i n o 1 1 0 0 2 5 2 5 1 0 0 1 0 0 8 7 . 3 3 1 3 3 . 2 0 5 5 . 0 8 8 9 . 4 7 2 5 0 7 1 8 C o c o n i n o 3 2 1 1 1 0 1 0 0 7 2 . 8 0 1 1 1 . 0 4 5 2 . 9 4 8 5 . 9 9 2 6 0 7 2 0 A p a c h e 0 1 O O 2 1 0 0 5 4 . 4 5 8 3 . 0 5 5 2 . 9 0 8 5 . 9 3 2 7 0 9 1 1 C i b o l a 2 5 0 1 3 1 0 0 6 0 . 2 1 9 2 . 6 0 6 4 . 7 3 1 0 5 . 1 4 2 8 0 9 1 2 C i b o l a 7 5 2 0 1 7 5 1 0 0 1 0 0 7 8 . 6 2 1 1 9 . 9 2 6 9 . 0 0 1 1 2 . 0 8 2 9 1 0 0 8 A p a c h e 5 7 5 1 5 7 5 1 0 0 1 0 0 7 8 . 9 6 1 2 0 . 4 4 6 0 . 1 9 9 7 . 7 7 3 0 1 0 1 1 S a n I s a b e l 0 1 0 0 0 2 0 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 3 1 1 0 1 6 L i n c o l n ( a ) 1 1 0 0 4 7 5 2 0 1 0 0 7 7 . 5 2 1 1 8 . 2 4 7 4 . 4 7 1 2 0 . 9 7 3 2 1 0 1 7 S a n t a F e 5 5 0 1 2 0 7 5 1 0 0 8 3 . 8 6 1 2 7 . 9 1 5 1 . 3 1 8 3 . 3 5 3 3 1 O 2 0 L i n c o l n ( a ) 1 5 1 0 0 5 7 5 1 0 1 0 0 9 5 . 8 5 1 4 6 . 4 0 6 3 . 5 1 1 0 3 . 1 6 3 4 1 1 0 7 S a n I s a b e l 5 0 1 0 0 5 7 5 1 0 0 1 0 0 9 1 . 5 2 1 3 9 . 6 0 5 9 . 9 3 9 7 . 3 5 3 5 1 1 0 8 S a n I s a b e l O 1 0 0 0 a 1 0 . 6 0 1 6 . 1 7 2 3 . 2 3 3 7 . 7 4 3 6 1 1 1 1 S a n I s a b e l 0 4 0 1 0 1 0 0 5 5 . 1 5 8 4 . 1 2 4 8 . 0 6 7 8 . 0 7 3 7 1 1 1 8 A p a c h e 1 5 1 3 4 1 0 0 8 9 . 6 0 1 3 6 . 6 6 5 2 . 3 2 8 4 . 9 8 3 8 1 1 1 9 C o c o n i n o 2 5 1 0 0 1 5 1 5 5 0 1 0 0 8 7 . 2 5 1 3 3 . 0 8 6 2 . 6 5 1 0 2 . 7 0 3 9 1 1 2 1 C o c o n i n o 0 1 0 0 0 2 0 3 . 4 3 5 . 2 3 8 . 7 2 7 . 7 2 4 0 1 2 0 9 S a n t a F e 0 0 O O 0 5 0 0 . 0 0 0 . 0 0 4 . 7 5 7 . 7 2 8 3 T a b l e 2 . 2 c o n t ’ d F i e l d D i s e a s e R a t i n q 4 P C R d e t e c t i o n 5 ( T r e e # T r e e # P r o v e n a n c e 1 9 9 6 1 9 9 7 1 9 9 8 1 9 9 9 2 0 0 0 2 0 0 1 M o r t a r / p e s t l e b l e n d e r ( M l ) ( W A ) D N A D N A D N A D N A T R 1 P 2 ° / o p i x e l n g % p i x e l r i g 4 1 1 2 1 5 C i b o l a 0 O 1 O O 1 0 2 9 . 0 0 4 4 . 2 3 4 1 . 7 0 6 3 . 7 4 4 2 1 2 1 6 C i b o l a 5 0 1 0 0 2 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 7 0 . 1 0 1 0 6 . 9 2 4 9 . 4 0 8 0 . 2 4 4 3 1 2 1 9 C i b o l a 7 5 1 0 0 7 5 1 0 0 1 0 0 1 0 0 6 2 . 6 0 9 5 . 4 8 5 4 . 6 0 8 8 . 7 0 4 4 1 2 2 0 C i b o l a O 1 0 0 4 1 0 0 1 9 . 8 1 3 0 . 2 2 2 . 4 9 4 . 0 5 0 6 1 0 4 . 9 0 1 5 0 . 0 0 9 8 . 5 0 1 5 0 . 0 0 T r e e r o w T r e e p o s i t i o n i n r o w 3 S e e d s o u r c e s t a k e n f r o m N a t i o n a l F o r e s t s . 4 V i s u a l d i s e a s e r a t i n g s ( 0 t o 1 0 0 ) . D a t a p r e v i o u s l y r e p o r t e d i n C h a s t a g n e r e t a l ( 2 0 0 1 ) 5 Q u a n t i fi c a t i o n d a t a o b t a i n e d b y a m p l i f i c a t i o n o f D N A e x t r a c t e d f r o m 5 n e e d l e s ( M o r t a r / p e s t l e ) o r e x t r a c t e d f r o m 1 0 g r a m s n e e d l e s ( B l e n d e r ) . D N A a m o u n t s ( % p i x e l / m m 2 a n d n g ) r e p r e s e n t a v e r a g e s o f t h e 4 t e s t s ( M o r t a r a n d p e s t l e ) a n d 3 t e s t s ( B l e n d e r ) f o r e a c h p r o v e n a n c e . 6 T h e i n t e n s i t y o f 1 6 5 0 b p b a n d o f t h e 1 K B + D N A l a d d e r ( G i b c o B R L ) r e p r e s e n t e d 8 . 0 % o f t h e t o t a l D N A i n 2 u g o f l o a d e d l a d d e r . T h e q u a n t i t y i n t h e 1 6 5 0 b p b a n d s e r v e d a s a c o n t r o l f o r D N A c o n c e n t r a t i o n . 8 4 n o i t c : a O e t e d R C P ) - 2 g O n m i t l e ' a x 1 ( r i p e 6 s 9 a ( e s i d I e u s l V . _ 8 8 ) 7 m m / l g e x i p % ( o g 8 n i t a 8 r e s a e s i d l a u e W w \ l o ( D O 1 0 0 ~ F f 7 e - 7 * , * " ' M o h a r / p e s t i e ' m e t h o d ( m i n i p r e p é x t r a ° t i ° n i i i n o l t c e t e d R C P ) - 2 g n m i l t e a x r i p e 6 1 s ‘ a ( e s l d l a u s i V 1 0 0 r , . s o . s o I 7 0 I G o t v - N m V I D O B D Q O v - N M V I O C D B w O ’ O F F F F F F F F F F N 5 0 } . . 4 0 i 3 0 ' i . 2 0 1 1 0 v o i [ I f ] [ I [ I . F N O ' ) N T r e e ( s a m p l e ) T A 1 V 7 i f 7 i B l e n d e r m e t h d d ( B u l k e x t r a c t i o n ) i f 7 7 i T " E E 2 . 0 . = 1 2 . £ 5 0 . . \ - l 7 $ 4 0 : . 2 1 3 0 : : U i E 2 0 ‘ - i ‘ ° * * i i i O I . , n I ] fl 2 2 8 ' s F i g u r e 2 . 5 . C o m p a r i s o n o f fi e l d ( v i s u a l ) d i s e a s e r a t i n g ( F D R = 0 t o 1 0 0 ) t o P C R d e t e c t i o n ( P D = % p i x e l / m m 2 ) i n o n e y e a r o l d n e e d l e s . D a t a o b t a i n e d f r o m P C R . a m p l i fi c a t i o n o f D N A p r e p a r e d w i t h m o r t a r / p e s t l e a n d b l e n d e r m e t h o d s . 8 5 I ] I I v ~ n v m w ~ w m e s e e z e e t e e s a a a a a s s 9 3 9 s e a t p r j l T r e e ( s a m p l e ) # I F D R I I r E s p e c t i v e l I D r e s p e c t d i s e a s e i n e x t r a c t s f i t p r o d u c e d I m m z ) p r e s w a s o b s e n u n i q u e b e : f r o m 3 0 n g a m o u n t s 0 f o u r t r e e s E a n y d e t i N o v e m I J E r T h e s a m p l e s o f 1 4 2 ) f o r a ( 1 0 4 , 1 0 5 ' 1 h a d I e a C h e b o t h S h o p t s s h o o t s " O r r p r o t u q s 1 , 0 ! 1 0 r e s p e c t i v e l y ( T a b l e 2 . 2 ) . I t w a s n o t a b l e t h a t t h e s e t r e e s h a d h i g h l e v e l s o f d i s e a s e i n t h e p r e v i o u s y e a r s b a s e d o n h i g h v i s u a l r a t i n g s . R e p l i c a t e d D N A e x t r a c t s f r o m t w e l v e t r e e s ( 5 , 6 , 9 , 1 2 , 1 5 , 1 7 , 1 8 , 1 9 3 0 , 3 9 , 4 4 ) h a d r e g u l a r l y p r o d u c e d l o w q u a n t i t i e s o f P C R p r o d u c t s ( l e s s t h a n 3 0 n g D N A o r 2 0 % p i x e l / m m z ) p r e s u m a b l y c o r r e l a t e d w i t h l o w l e v e l s o f m y c e l i u m a n d l i t t l e o r n o d i s e a s e w a s o b s e r v e d i n t h e s e t r e e s o v e r t h e fi v e y e a r s . T r e e s 2 , 1 3 , 3 5 , 3 6 , a n d 4 1 w e r e u n i q u e b e c a u s e m o d e r a t e l e v e l s o f p a t h o g e n m y c e l i u m w e r e d e t e c t e d ( D N A f r o m 3 0 n g t o 8 0 n g o r 2 0 % t o 5 0 % p i x e l m m z ) b u t n o d i s e a s e w a s v i s i b l e . H i g h a m o u n t s o f P C R p r o d u c t ( > 8 0 n g D N A o r 5 0 % p i x e l / m m z ) w e r e p r o d u c e d i n f o u r t r e e s ( 2 5 , 2 6 , 2 7 , 3 7 ) w i t h l o w v i s u a l r a t i n g s o f d i s e a s e ( 1 0 , 2 , 3 , 4 , r e s p e c t i v e l y ) . E a r l y d e t e c t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n o f i n f e c t i o n i n c u r r e n t g r o w t h i n N o v e m b e r T h e p a t h o g e n w a s d e t e c t e d i n c u r r e n t y e a r n e e d l e s f r o m b o t h S h o o t s a m p l e s o f 3 1 t r e e s , a n d o n e s h o o t s a m p l e o n l y o f 4 t r e e s ( 1 2 9 , 1 3 4 , 1 3 5 a n d 1 4 2 ) f o r a t o t a l o f 3 5 t r e s s . N o d e t e c t i o n w a s o b s e r v e d i n 9 t r e e s o f t h e 4 4 ( 1 0 4 , 1 0 5 , 1 0 8 , 1 1 1 , 1 1 4 , 1 1 6 , 1 1 8 , 1 3 8 , 1 3 9 ) . A m o u n t s o f a m p l i f i e d P C R D N A h a d r e a c h e d t h e h i g h l e v e l s o f 8 0 n g ( 5 0 % p i x e l / m m z ) f r o m e x t r a c t s o f o n e o r b o t h S h o o t s o f 2 6 t r e e s b y N o v e m b e r . E l e c t r o p h o r e t i c g e l s o f t e s t s o f 2 p a i r e d s h o o t s f r o m e a c h o f 4 4 t r e e s a r e s h o w n i n F i g u r e 2 . 6 . T h e q u a n t i t y o f P C R p r o d u c t s f o r e a c h s a m p l e i n e a c h g e l , a s m e a s u r e d b y Q u a n t i t y O n e , i s l i s t e d i n T a b l e 2 . 3 . 8 6 A P a i r e d s h o o t s a m p l e n u m b e r s ( s h o o t A ) r 3 5 1 1 1 : v i i i 8 4 t 8 w a s . “ a r t i s t s . . . a “ . . . F i g u r e 2 . 6 . D e t e c t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n o f R h a b d o c l i n e i n f e c t i o n ( b y p r i m e r s R P P 1 a n d R P P 2 ) i n c u r r e n t g r o w t h c o l l e c t e d i n N o v e m b e r . A - n e e d l e s a m p l e s f r o m p a i r e d s h o o t A , B - n e e d l e s a m p l e s f r o m p a i r e d s h o o t B f r o m s a m e t r e e . 8 7 C o m p a r i s o n o f v i s u a l d i s e a s e r a t i n g a n d P C R d e t e c t i o n i n n e w g r o w t h P C R d e t e c t i o n O f i n f e c t i o n c o r r e l a t e d b e t t e r w i t h d i s e a s e r a t i n g s o f p a i r e d s h o o t s t h a n w i t h w h o l e t r e e r a t i n g s ( T a b l e 2 . 3 ) . T r e e s 1 2 5 , 1 3 4 a n d 1 3 5 w i t h s h o o t r a t i n g s o f 4 0 - 1 0 0 y i e l d e d a t l e a s t 5 0 n g D N A ( 3 0 % p i x e l / m m z ) i n o n e o r b o t h s h o o t s a m p l e s a n d h a d t r e e d i s e a s e r a t i n g o f 1 0 0 . O c c a s i o n a l l y , t r e e s w i t h p a i r e d s h o o t r a t i n g s b e l o w 3 0 a l s o h a d t r e e d i s e a s e r a t i n g s o f 5 0 - 1 0 0 . A m o n g t r e e s w i t h t r e e d i s e a s e r a t i n g s b e l o w 2 0 , D N A o f t h e p a t h o g e n w a s d e t e c t e d o n l y i n t r e e 1 1 7 i n b o t h S h o o t s . D N A o f R . p s e u d o t s u g a e w a s n o t a l w a y s d e t e c t a b l e i n S h o o t s w i t h l o w d i s e a s e r a t i n g s ( t r e e s 1 0 4 , 1 0 5 , 1 0 8 , 1 1 1 , 1 1 4 , 1 2 4 , 1 3 5 a n d 1 3 9 ) . T h i s m a y b e d u e t o r a n d o m n e e d l e s e l e c t i o n o r l o w c o n t e n t o f m y c e l i a l D N A . E a r l y d e t e c t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n a t t h e b e g i n n i n g o f i n f e c t i o n p e r i o d D u r i n g t h e c o l l e c t i o n o f a y e a r o l d ( 1 9 9 9 g r o w t h ) n e e d l e s i n M a y 2 0 0 0 , t h e n e w y e a r ’ s g r o w t h n e e d l e s w e r e a l s o c o l l e c t e d . D N A e x t r a c t i o n s d i l u t e d a t 1 0 0 a n d 5 0 0 t i m e s w e r e P C R a m p l i f i e d . A n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s w e r e a d j u s t e d t o 5 6 C t o e l i m i n a t e b a c k g r o u n d a m p l i fi c a t i o n s o f p l a n t D N A . T h i s r e q u i r e m e n t w a s u n i q u e f o r n e w M a y f o l i a g e . I n f e c t i o n w a s d e t e c t e d i n 1 7 o u t o f 4 4 t r e e s t e s t e d ( T a b l e 2 . 4 ) . P C R a m p l i f i c a t i o n s o f 1 0 ' 2 d i l u t e d t e m p l a t e g a v e h i g h e r y i e l d s o f P C R t h a n 5 X 1 0 ' 2 d i l u t i o n s . A m p l i f i e d D N A o f p a t h o g e n r a n g e d f r o m 2 0 - 1 0 0 n g i n t h e 1 7 t r e e s w i t h d e t e c t a b l e i n f e c t i o n s a n d b e l o w 2 0 n g i n t r e e s w i t h o u t s y m p t o m s . 8 8 T a b l e 2 . 3 C o m p a r i s o n o f v i s u a l r a t i n g a n d P C R d e t e c t i o n i n c u r r e n t g r o w t h n e e d l e s c o l l e c t e d i n N o v e m b e r 2 0 0 0 . ( B L I N D T E S T 2 ) . T r e e # ’ T r e e # P r o v e n a n c e 4 N e e d l e S h o o t P C R d e t e c t i o n 1 1 T r e e ( M l ) ( W A ) c h a r a c t e r i s t i c s c h a r a c t e r i s t i c s D N A 1 ° D N A D N A D i s e a s e T R 2 P 3 i N S 5 N s ' 3 S C 7 S S 8 S R 9 ( p g / p l ) ( % p i x e l ) g i g ) R a t i n g 1 2 1 0 0 A 0 2 0 3 S a n t a F e 9 8 m 3 7 2 1 . 0 7 4 4 . 7 3 5 6 . 0 0 1 0 0 1 0 0 B 0 2 0 3 S a n t a F e 1 0 1 0 m 3 1 0 0 4 3 . 6 1 5 5 . 8 2 1 0 0 1 0 1 A 0 2 0 4 S a n t a F e 4 8 y S 2 3 2 1 . 6 8 6 . 4 6 8 . 0 9 1 0 0 1 0 1 B 0 2 0 4 S a n t a F e 6 9 y s 3 5 4 1 1 . 8 8 1 5 . 2 1 1 0 0 1 0 2 A 0 2 0 6 A p a c h e 1 0 8 r n 3 8 0 1 . 2 2 4 2 . 6 3 5 3 . 3 7 1 0 0 1 0 2 B 0 2 0 6 A p a c h e 1 0 1 0 r n 3 1 0 0 7 4 . 4 8 9 5 . 3 3 1 0 0 1 0 3 A 0 2 0 8 L i n c o l n ( b ) 1 0 1 0 m 3 1 0 0 1 . 0 5 4 8 . 8 8 6 1 . 2 0 1 0 0 1 0 3 B 0 2 0 8 L i n c o l n ( b ) 1 0 1 0 m 3 1 0 0 6 8 . 7 1 8 7 . 9 5 1 0 0 1 0 4 A 0 2 1 1 C a r s o n 3 3 y s 1 9 1 . 4 4 0 . 0 0 0 . 0 0 2 0 1 0 4 B 0 2 1 1 C a r s o n 4 8 y S 1 3 2 0 . 0 0 0 . 0 0 2 0 1 0 5 A 0 2 1 5 C o c o n i n o 4 3 y S 1 1 2 1 . 2 3 0 . 0 0 0 . 0 0 1 0 0 1 0 5 8 0 2 1 5 C o c o n i n o 5 6 y s 2 3 0 0 . 0 0 0 . 0 0 1 0 0 1 0 6 A 0 2 1 6 C o c o n i n o 1 0 1 0 m 3 1 0 0 1 . 5 3 5 0 . 1 3 6 2 . 7 6 1 0 0 1 0 6 8 0 2 1 6 C o c o n i n o 8 1 0 m 3 8 0 7 1 . 2 7 9 1 . 2 3 1 0 0 1 0 7 A 0 2 2 1 C i b o l a 9 1 0 m 3 9 0 0 . 9 2 5 0 . 5 0 6 2 . 3 5 1 0 0 1 0 7 B 0 2 2 1 C i b o l a 9 1 0 ' n , y s 3 9 0 6 7 . 5 1 8 6 . 4 1 1 0 0 1 0 8 A 0 2 2 2 C i b o l a 1 4 y s 1 4 1 . 1 2 0 . 0 0 0 . 0 0 2 1 0 8 B 0 2 2 2 C i b o l a 2 2 y s , r t 1 4 0 . 0 0 0 . 0 0 2 1 0 9 A 0 3 0 5 C a r s o n 1 0 1 O y n 3 1 0 0 1 . 2 4 1 0 0 . 2 3 1 2 5 . 4 8 1 0 0 1 0 9 B 0 3 0 5 C a r s o n 1 0 1 0 y n 3 1 0 0 3 3 . 3 8 4 2 . 7 3 1 0 0 1 1 0 A 0 3 0 9 S a n I s a b e l 1 0 1 0 m 3 1 0 0 1 . 2 5 6 0 . 5 3 7 5 . 7 9 1 0 0 1 1 0 8 0 3 0 9 S a n I s a b e l 1 0 1 0 m 3 1 0 0 4 9 . 5 9 6 3 . 4 7 1 0 0 1 1 1 A 0 3 1 9 L i n c o l n ( a ) 2 3 y S 1 6 1 . 2 4 0 . 0 0 0 . 0 0 2 0 1 1 1 B 0 3 1 9 L i n c o l n ( a ) 5 3 y s 2 1 5 0 . 0 0 0 . 0 0 2 0 1 1 2 A 0 5 0 2 S a n I s a b e l 1 1 r s 1 1 1 . 3 3 9 . 6 4 1 2 . 0 7 2 0 1 1 2 B 0 5 0 2 S a n I s a b e l 1 O 1 0 r n 3 1 0 0 5 4 . 3 7 6 9 . 6 0 2 0 1 1 3 A 0 5 7 C o c o n i n o 1 0 1 0 m 3 1 0 0 0 . 9 2 5 2 . 3 9 6 5 . 5 9 1 0 0 1 1 3 8 0 5 7 C o c o n i n o 1 0 1 O r n 3 1 0 0 6 1 . 2 1 7 8 . 3 5 1 0 0 1 1 4 A 0 5 0 8 C o c o n i n o 5 3 y s 2 1 5 1 . 0 6 0 . 0 0 0 . 0 0 1 0 0 1 1 4 B 0 5 0 8 C o c o n i n o 1 1 y S 1 1 0 . 0 0 0 . 0 0 1 0 0 1 1 5 A 0 5 1 9 C a r s o n 1 0 1 0 m 3 1 0 0 1 . 0 2 6 3 . 2 9 7 9 . 2 4 1 0 0 1 1 5 8 0 5 1 9 C a r s o n 5 8 m 3 4 0 6 9 . 5 3 8 9 . 0 0 1 0 0 1 1 6 A 0 5 2 2 L i n c o l n ( a ) 0 0 g 0 0 1 . 2 2 0 . 0 0 0 . 0 0 2 1 1 6 B 0 5 2 2 L i n c o l n ( a ) 0 0 g 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 2 1 1 7 A 0 7 4 L i n c o l n ( a ) 0 0 g 0 0 1 . 5 8 2 0 . 7 1 2 5 . 9 2 1 0 1 1 7 B 0 7 4 L i n c o l n ( a ) 0 0 g 0 0 3 4 . 2 7 4 3 . 8 7 1 0 1 1 8 A 0 7 0 5 R i o G r a n d e 0 0 g 0 0 1 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 2 0 1 1 8 8 0 7 0 5 R i o G r a n d e 0 0 g 0 O 0 . 0 0 0 . 0 0 2 0 1 1 9 A 0 7 0 6 R i o G r a n d e 1 0 1 0 r n 3 1 0 0 1 . 5 4 5 1 . 6 7 6 4 . 6 9 1 0 0 1 1 9 8 0 7 0 6 R i o G r a n d e 1 0 1 0 m 3 1 0 0 6 1 . 9 2 7 8 . 8 7 1 0 0 1 2 0 A 0 7 0 9 C a r s o n 5 2 y s 1 1 0 1 . 2 9 1 0 . 8 0 1 3 . 5 2 2 0 1 2 0 8 0 7 0 9 C a r s o n 1 1 r S 1 1 3 2 . 6 5 4 1 . 8 0 2 0 8 9 T a b l e 2 . 3 c o n t ’ d T r e e 1 t 1 T r e e # P r o v e n a n c e 4 N e e d l e S h o o t P C R d e t e c t i o n 1 1 T r e e ( M l ) ( W A ) c h a r a c t e r i s t i c s W D N A ' ° D N A D N A m T R 2 P 3 I N S 5 N S 6 S C 7 S S 8 S R 9 ( p g / p i ) ( % p i x e l ) ( r i g ) R a t i n g 1 2 1 2 1 A 0 7 1 3 S a n I s a b e l 1 0 1 0 m 3 1 0 0 1 . 4 9 9 1 . 2 4 1 1 4 . 2 3 1 0 0 1 2 1 8 0 7 1 3 S a n I s a b e l 1 0 1 0 m 3 1 0 0 7 3 . 1 9 9 3 . 6 8 1 0 0 1 2 2 A 0 7 1 4 S a n I s a b e l 1 0 1 0 m 3 1 0 0 1 . 3 2 8 0 . 1 2 1 0 0 . 3 1 1 0 0 1 2 2 8 0 7 1 4 S a n I s a b e l 1 0 1 0 m 3 1 0 0 5 9 . 7 6 7 6 . 4 9 1 0 0 1 2 3 A 0 7 1 7 C o c o n i n o 1 0 1 0 m 3 1 0 0 1 . 4 5 7 2 . 0 4 9 0 . 6 0 1 0 0 1 2 3 8 0 7 1 7 C o c o n i n o 1 O 1 0 m 3 1 0 0 6 7 . 2 9 8 6 . 1 3 1 0 0 1 2 4 A 0 7 1 8 C o c o n i n o 1 0 1 0 y n 3 1 0 0 0 . 8 5 6 6 . 9 0 8 3 . 7 3 1 0 0 1 2 4 8 0 7 1 8 C o c o n i n o 7 1 O y n 3 7 0 0 . 0 0 0 . 0 0 1 0 0 1 2 5 A 0 7 2 0 A p a c h e 6 5 y s 2 3 0 1 . 2 2 3 9 . 5 2 4 9 . 4 8 1 0 0 1 2 5 8 O 7 2 0 A p a c h e 4 3 y s 2 1 2 3 1 . 0 9 3 9 . 8 0 1 0 0 1 2 6 A 0 9 1 1 C i b o l a 1 0 8 m 3 8 0 1 . 4 1 5 0 . 7 9 6 3 . 5 9 1 0 0 1 2 6 8 0 9 1 1 C i b o l a 1 0 5 r n 3 5 0 6 8 . 5 1 8 7 . 7 0 1 0 0 1 2 7 A 0 9 1 2 C i b o l a 1 0 1 0 m 3 1 0 0 1 . 2 1 3 9 . 1 4 4 9 . 0 0 1 0 0 1 2 7 8 0 9 1 2 C i b o l a 1 0 1 0 m 3 1 0 0 7 6 . 7 2 9 8 . 2 0 1 0 0 1 2 8 A 1 0 0 8 A p a c h e 1 0 1 0 r n 3 1 0 0 1 . 5 3 5 4 . 9 2 6 8 . 7 5 1 0 0 1 2 8 8 1 0 0 8 A p a c h e 1 0 1 0 r n 3 1 0 0 7 6 . 4 8 9 7 . 9 0 1 0 0 1 2 9 A 1 0 1 1 S a n I s a b e l O 0 g 0 0 0 . 8 7 0 . 0 0 0 . 0 0 2 0 1 2 9 B 1 0 1 1 S a n I s a b e l 4 2 y s 1 8 3 0 . 4 9 3 8 . 9 8 2 0 1 3 0 A 1 0 1 6 L i n c o l n ( a ) 1 0 1 0 m 3 1 0 0 1 . 4 3 5 2 . 8 7 6 6 . 1 6 1 0 0 1 3 0 8 1 0 1 6 L i n c o l n ( a ) 1 0 1 0 r n 3 1 0 0 7 2 . 3 5 9 5 . 6 1 1 0 0 1 3 1 A 1 0 1 7 S a n t a F e 1 0 1 0 m 3 1 0 0 1 . 1 6 8 3 . 2 9 1 0 4 . 2 7 1 0 0 1 3 1 8 1 0 1 7 S a n t a F e 1 0 1 0 m 3 1 0 0 1 1 1 . 9 2 1 4 3 . 2 5 1 0 0 1 3 2 A 1 0 2 0 L i n c o l n ( a ) 1 0 1 0 m 3 1 0 0 1 . 0 9 5 1 . 0 4 6 3 . 9 0 1 0 0 1 3 2 8 1 0 2 0 L i n c o l n ( a ) 1 0 1 0 m 3 1 0 0 2 7 . 9 6 3 5 . 7 9 1 0 0 1 3 3 A 1 1 0 7 S a n I s a b e l 1 0 1 O r n 3 1 0 0 1 . 4 8 3 5 . 2 2 4 4 . 0 9 1 0 0 1 3 3 8 1 1 0 7 S a n I s a b e l 1 0 1 0 m 3 1 0 0 7 6 . 0 8 9 7 . 3 8 1 0 0 1 3 4 A 1 1 0 8 S a n I s a b e l 0 0 g 0 0 1 . 3 0 1 3 . 3 9 1 6 . 7 6 7 5 1 3 4 8 1 1 0 8 S a n I s a b e l 0 0 g 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 7 5 1 3 5 A 1 1 1 1 S a n I s a b e l 1 0 5 y s 3 5 0 1 . 0 0 2 1 . 7 2 2 7 . 1 9 1 0 0 1 3 5 8 1 1 1 1 S a n I s a b e l 1 O 5 y s 3 5 0 0 . 0 0 0 . 0 0 1 0 0 1 3 6 A 1 1 1 8 A p a c h e 3 8 r s 3 2 4 1 . 3 6 7 7 . 2 5 9 6 . 7 1 1 0 0 1 3 6 8 1 1 1 8 A p a c h e 5 1 0 m 2 5 0 5 2 . 8 6 6 7 . 6 6 1 0 0 1 3 7 A 1 1 1 9 C o c o n i n o 1 0 1 0 m 3 1 0 0 1 . 1 2 5 3 . 9 3 6 7 . 5 2 1 0 0 1 3 7 8 1 1 1 9 C o c o n i n o 1 0 1 0 m 3 1 0 0 7 5 . 5 5 9 6 . 7 0 1 0 0 1 3 8 A 1 1 2 1 C o c o n i n o O 0 g 0 0 1 . 2 3 0 . 0 0 0 . 0 0 2 0 1 3 8 B 1 1 2 1 C o c o n i n o O 0 g 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 2 0 1 3 9 A 1 2 0 9 S a n t a F e 5 2 y s 2 1 0 1 . 5 3 0 . 0 0 0 . 0 0 5 0 1 3 9 8 1 2 0 9 S a n t a F e 5 2 y s 2 1 0 0 . 0 0 0 . 0 0 5 0 1 4 0 A 1 2 1 5 C i b o l a 0 0 g 0 0 1 . 5 7 1 6 . 4 1 2 0 . 5 5 1 0 1 4 0 8 1 2 1 5 C i b o l a 3 1 r s 1 3 7 0 . 9 1 9 0 . 7 6 1 0 1 4 1 A 1 2 1 6 C i b o l a 1 0 1 0 r n 3 1 0 0 1 . 1 5 7 0 . 4 2 8 8 . 1 6 1 0 0 1 4 1 8 1 2 1 6 C i b o l a 1 0 1 0 m 3 1 0 0 5 5 . 6 3 7 1 . 2 0 1 0 0 9 0 T a b l e 2 . 3 c o n t ’ d T r e e # 1 T r e e # P r o v e n a n c e “ N e e d l e S h o o t P C R d e t e c t i o n 1 1 T r e e ( M l ) ( W A ) C h a r a c t e r i s t i c s C h a r a c t e r i s t i c s D N A 1 ° D N A D N A D i s e a s e T R 2 P 3 I N S 5 N S 6 S C 7 S S 8 S R 9 ( p g / p i ) ( % p i x e l ) ( r i g ) R a t i n g ” 1 4 2 A 1 2 1 9 C i b o l a 1 0 1 0 r n 3 1 0 0 1 . 2 1 5 2 . 6 7 6 5 . 9 4 1 0 0 1 4 2 8 1 2 1 9 C i b o l a 1 0 1 0 r n 3 1 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 1 0 0 1 4 3 A 1 2 2 0 C i b o l a 2 9 r n 2 1 8 1 . 4 7 3 2 . 5 6 4 1 . 2 1 1 0 0 1 4 3 8 1 2 2 0 C i b o l a 9 2 y S 2 1 8 3 2 . 9 2 4 1 . 6 8 1 0 0 C A 1 3 1 2 7 . 8 0 1 5 0 . 0 0 C B “ 1 2 5 . 0 0 1 5 0 . 0 0 1 n u m b e r s ( 1 0 0 - 1 4 3 ) r e p r e s e n t t r e e s a n d l e t t e r s A a n d 8 r e p r e s e n t 2 s e p a r a t e l y p a i r e d s h o o t s f o r e a c h t r e e . 2 T r e e r o w 3 T r e e p o s i t i o n “ S e e d s o u r c e s t a k e n f r o m N a t i o n a l F o r e s t s 5 I n c i d e n c e o f n e e d l e s y m p t o m s : 0 : n o n e , 1 : 1 - 1 0 % , 1 0 : 9 1 - 1 0 0 % . 5 N e e d l e s e v e r i t y : 0 : n o n e , 1 : 1 - 1 0 % , 1 0 : 9 1 - 1 0 0 % . 7 S y m p t o m c o l o r : 9 : g r e e n ( n o s y m p t o m ) , y = y e l l o w , s = s p o t , n = n e e d l e , t = t i p , F r e d . 8 S h o o t s e v e r i t y : 0 = n o n e , 1 : s l i g h t , 2 : m o d e r a t e a n d 3 : s e v e r e 9 S h o o t r a t i n g : o b t a i n e d b y m u l t i p l y i n g n e e d l e i n c i d e n c e a n d n e e d l e s e v e r i t y ( M a r c h 2 0 0 1 1 ° C o n c e n t r a t i o n s o f D N A b e f o r e P C R a m p l i fi c a t i o n s D N A a m o u n t s ( p g / p l ) r e p r e s e n t a v e r a g e s o f t h e 2 r e p l i c a t i o n s ( M o r t a r a n d p e s t l e ) a n d f o r e a c h p r o v e n a n c e . 1 ‘ D N A e x t r a c t e d f r o m 5 n e e d l e s w i t h a m o r t a r / p e s t l e ‘ 2 O v e r a l l t r e e r a t i n g : o b t a i n e d b y m u l t i p l y i n g t h e S h o o t s y m p t o m s e v e r i t y ( 0 , 1 , 5 a n d 2 5 ) t i m e s t h e w h o l e t r e e r a t i n g ( 0 , 1 , 2 , 3 , 4 ) a n d c o n d u c t e d i n M a r c h 2 0 0 1 . 1 3 " “ C A , C B = c o n t r o l f o r p a i r e d s h o o t A a n d B o f s a m e t r e e . T h e i n t e n s i t y o f t h e 1 6 5 0 b p b a n d o f 1 K B + D N A l a d d e r ( G i b c o B R L ) r e p r e s e n t e d 8 . 0 % o f t h e t o t a l D N A i n 2 p g o f l o a d e d l a d d e r . T h e q u a n t i t y i n t h e 1 6 5 0 b p b a n d s e r v e d a s a c o n t r o l f o r D N A c o n c e n t r a t i o n . 9 1 T a b l e 2 . 4 . E a r l y d e t e c t i o n a n d q u a n t i f i c a t i o n o f R . p s e u d o t s u g a e i n f e c t i o n i n n e w g r o w t h i n M a y ( n e e d l e s c o l l e c t e d i n M a y 2 0 0 0 ) ( B L I N D T E S T 3 ) T r e e # T r e e # P r o v e n a n c e ‘ P C R d e t e c t i o n 5 T r e e M I W A D i s e a s e T R 1 P 2 D N A 4 D N A D N A R a t i n g 6 ( p g / p l ) % p i x e l n g 4 5 2 3 S a n t a F e 1 . 2 7 2 2 . 7 6 2 8 1 0 0 4 6 2 4 S a n t a F e 1 . 4 7 0 0 1 0 0 4 7 2 6 A p a c h e 1 . 3 6 0 0 1 0 0 4 8 2 8 L i n c o l n ( b ) 1 . 1 0 0 0 1 0 0 4 9 2 1 1 C a r s o n 1 . 3 4 0 0 2 0 5 0 2 1 5 C o c o n i n o 1 . 2 9 0 0 1 0 0 5 1 2 1 6 C o c o n i n o 1 . 2 7 0 0 1 0 0 5 2 2 2 1 C i b o l a 1 . 3 1 4 1 . 3 9 5 0 . 9 4 1 0 0 5 3 2 2 2 C i b o l a 1 . 0 0 0 0 2 5 4 3 5 C a r s o n 1 . 0 8 0 0 1 0 0 5 5 3 9 S a n I s a b e l 1 . 1 2 0 0 1 0 0 5 6 3 1 9 L i n c o l n ( a ) 1 . 3 1 0 0 2 0 5 7 5 2 S a n I s a b e l 1 . 4 3 0 0 7 5 5 8 5 7 C o c o n i n o 1 . 3 0 3 8 . 5 6 4 7 . 4 5 1 0 0 5 9 5 8 C o c o n i n o 1 . 1 0 0 0 1 0 0 6 0 5 1 9 C a r s o n 1 . 4 6 0 0 1 0 0 6 1 5 2 2 L i n c o l n ( 3 ) 1 . 2 3 O 0 2 6 2 7 4 L i n c o l n ( 3 ) 1 . 2 8 0 0 1 0 6 3 7 5 R i o G r a n d e 1 . 1 8 0 O 1 0 0 6 4 7 6 R i o G r a n d e 1 . 2 8 2 4 . 9 5 3 0 . 7 1 0 0 6 5 7 9 C a r s o n 1 . 1 5 0 0 2 0 6 6 7 1 3 S a n I s a b e l 0 . 9 9 O 0 2 0 6 7 * 7 1 4 S a n I s a b e l 1 . 5 8 2 7 . 9 1 3 4 . 3 5 1 0 0 6 8 * 7 1 7 C o c o n i n o 1 . 0 7 5 5 . 6 2 6 8 . 4 5 1 0 0 6 9 7 1 8 C o c o n i n o 1 . 0 8 0 0 1 0 0 7 0 7 2 0 A p a c h e 1 . 2 5 3 4 . 9 4 4 3 1 0 0 7 1 9 1 1 C i b o l a 1 . 2 6 4 2 . 8 1 5 2 . 6 9 2 0 7 2 9 1 2 C i b o l a 0 . 9 6 4 9 . 5 7 6 1 1 0 0 7 3 * 1 0 8 A p a c h e 1 . 5 8 8 3 . 7 9 1 0 3 . 1 3 1 0 0 7 4 1 0 1 1 S a n I s a b e l 1 . 4 9 0 0 1 0 0 7 5 1 0 1 6 L i n c o l n ( a ) 0 . 9 8 O O 1 0 0 7 6 1 0 1 7 S a n t a F e 1 . 3 6 4 2 . 5 3 5 1 . 9 7 1 0 0 7 7 1 0 2 0 L i n c o l n ( a ) 1 . 2 8 5 1 . 9 7 6 3 . 9 6 1 0 0 7 8 1 1 7 S a n I s a b e l 0 . 9 1 0 0 1 0 0 7 9 1 1 8 S a n I s a b e l 1 . 1 8 0 0 1 0 8 0 1 1 1 1 S a n I s a b e l 1 . 1 7 0 0 1 0 0 9 2 T a b l e 2 . 4 c o n t ’ d T r e e # T r e e # P r o v e n a n c e 3 P C R d e t e c t i o n 5 T r e e M I W A D i s e a s e T R 1 P z D N A “ D N A D N A R a t i n g ° ( p g / p l ) % p i x e l n g 8 1 1 1 1 8 A p a c h e 1 . 3 2 2 0 . 2 5 2 4 . 9 2 1 0 0 8 2 1 1 1 9 C o c o n i n o 1 . 3 2 2 3 . 2 2 8 . 5 5 1 0 0 8 3 1 1 2 1 C o c o n i n o 1 . 4 9 0 0 2 0 8 4 1 2 9 S a n t a F e 1 . 2 3 0 0 5 0 8 5 1 2 1 5 C i b o l a 0 . 9 5 0 0 1 0 0 8 6 " 1 2 1 6 C i b o l a 1 . 2 2 1 5 . 1 7 1 8 . 6 7 2 0 8 7 * 1 2 1 9 C i b o l a 1 . 3 5 2 2 . 8 2 2 8 . 1 1 0 0 8 8 1 2 2 0 C i b o l a 0 . 9 7 0 0 1 0 0 C 7 1 3 0 . 0 3 1 5 0 * r e p r e s e n t s a m p l i fi c a t i o n s t h a t o c c u r r e d w i t h 5 X 1 0 2 d i l u t i o n s , a l l o t h e r a m p l i fi c a t i o n s w e r e o f 1 X 1 0 2 d i l u t i o n . 1 T r e e r o w 2 T r e e p o s i t i o n 3 T r e e s a m p l e s t a k e n f r o m N a t i o n a l F o r e s t s “ C o n c e n t r a t i o n s o f D N A b e f o r e P C R a m p l i fi c a t i o n S D N A a m o u n t s ( M o r t a r a n d p e s t l e ) a n d f o r e a c h p r o v e n a n c e ( p g / p l ) . 5 Q u a n t i fi c a t i o n d a t a o b t a i n e d b y a m p l i fi c a t i o n o f D N A e x t r a c t e d f r o m 5 n e e d l e s ( M o r t a r / p e s t l e ) D N A a m o u n t s ( % p i x e l / m m 2 a n d n g ) r e p r e s e n t a v e r a g e v a l u e s f o r e a c h p r o v e n a n c e . 6 V i s u a l t r e e d i s e a s e r a t i n g p e r f o r m e d i n M a r c h 2 0 0 1 7 C = C o n t r o l . T h e i n t e n s i t y o f 1 6 5 0 b p b a n d o f t h e 1 K B + D N A l a d d e r ( G i b c o B R L ) r e p r e s e n t e d 8 . 0 % o f t h e t o t a l D N A i n 2 u g o f l o a d e d l a d d e r . T h e q u a n t i t y i n t h e 1 6 5 0 b p b a n d s e r v e d a s a c o n t r o l f o r D N A c o n c e n t r a t i o n . 9 3 R e s t r i c t i o n d i g e s t s o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y R P P 1 a n d R P P 4 i n n e e d l e s c o l l e c t e d i n M a y a n d N o v e m b e r 2 0 0 0 S i n c e s e q u e n c e s o f t h e I T S r e g i o n s O f m a n y f o l i a r p a t h o g e n s a n d e n d o p h y t e s o f P . m e n z e i s i i a r e a v a i l a b l e ( C a t a l , 2 0 0 2 ) , t h e r e s t r i c t i o n m a p s o f e a c h s e q u e n c e w e r e c o n s t r u c t e d f o r t h e t h e r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e s R s a l , S c a l a n d S p e l u s i n g t h e D N A s t a r p r o g r a m ( T a b l e 2 . 5 ) . T h e t h r e e e n d o n u c l e a s e s w e r e u s e f u l i n v e r i f y i n g t h e i d e n t i t y o f a P C R p r o d u c t a m p l i f i e d b y t h e R h a b d o c l i n e - s p e c i fi c p r i m e r s R P P 1 - R P P 4 f r o m n e e d l e e x t r a c t s . R . p a r k e r i c a n b e d i f f e r e n t i a t e d f r o m t h e p a t h o g e n i c S p e c i e s b y d i g e s t i o n w i t h S c a l o r R s a l . R . w e i r i i s s p . w e i n ' i c o u l d b e d i s t i n g u i s h e d b y R s a l d i g e s t i o n . A d d i t i o n a l l y , R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e c o u l d b e d i s t i n g u i s h e d f r o m t h e o t h e r S p e c i e s o f R h a b d o c l i n e i n S p e l d i g e s t s o f I T S 1 F - I T S 4 a m p l i f i e d p r o d u c t s ( F i g u r e 2 . 7 ) . T h e i d e n t i t y o f e a c h R P P 1 - R P P 4 a m p l i fi c a t i o n p r o d u c t f r o m t h e t e s t s a m p l e s w a s v e r i fi e d b y c o m p a r i n g p r o fi l e s f r o m i n d e p e n d e n t r e s t r i c t i o n d i g e s t s u s i n g R s a l a n d S e a l ( F i g u r e 2 . 8 A a n d B r e s p e c t i v e l y . N e e d l e S p e c i m e n R P P - 0 R 2 h a d b o t h R . p s e u d o t s u g a e s p p . p s e u d o t s u g a e t h a t w a s c u t i n t o 2 f r a g m e n t s a n d R . p a r k e r i t h a t w a s u n c u t b y t h e S p e l e n d o n u c l e a s e ( F i g u r e 2 . 7 ) . 9 4 T a b l e 2 . 5 . R e s t r i c t i o n f r a g m e n t m a p s o f t h e s e q u e n c e s o f s o m e f o l i a r p a t h o g e n s a n d e n d o p h y t e s o f P . m e n z i e s i i I T S I F - I T S 4 a m p l i f i e d s e q u e n c e ‘ R P P 1 - R P P 4 g m p l i r i e d 2 S p e c i e s u n c u t c u t ( b p ) 3 c u t 5 3 : 3 1 S c a l _ § l § l R s a l S _ C _ é _ I _ I _ § p = e l R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e 5 7 3 2 6 2 1 9 4 1 1 7 4 5 6 1 1 7 4 2 2 1 5 1 2 3 5 1 0 4 N S N S s s p . e p i p h y l l a 5 7 4 3 8 0 1 9 4 N S “ N S 2 3 5 1 0 4 N S N S R . w e i n ' i s p p . o b l o n g a 5 7 2 2 5 2 1 9 4 1 1 5 4 5 5 1 1 5 N S 2 3 5 1 0 4 N S N S s p p . o b o v a t a 5 7 2 2 6 2 1 9 4 1 1 6 4 5 6 1 1 6 N S 2 3 5 1 0 4 N S N S s p p . w e i r i i 5 5 3 3 9 4 1 5 9 N S N S 3 0 2 3 7 N S N S R . p a r k e r i 5 7 5 2 0 5 1 9 5 1 1 9 5 7 2 5 2 1 9 5 1 1 9 N S 2 0 5 1 0 4 2 3 4 1 0 5 N S R . p a r k e r i 5 1 0 5 3 4 2 2 2 0 5 1 9 2 1 1 9 5 8 2 2 5 2 1 1 9 N S 2 0 5 1 0 4 2 3 4 1 0 5 5 8 5 7 H . d e m a t i o i d e s 5 2 7 N S N S N S N A 5 N A N A P . g a u m a n n i i 5 2 7 5 2 5 2 0 2 N S N S N A N A N A 1 I T S s e q u e n c e i n c l u d e s s e q u e n c e o f I T S I - 5 . 8 S - I T S l l r D N A a s a m p l i fi e d w i t h p r i m e r s I T S 1 F a n d I T S 4 . 2 P r e d i c t e d f r a g m e n t s i z e s a s s u m i n g p r i m e r s R P P 1 a n d R P P 4 a m p l i f y a p o r t i o n o f t h e I T S s e q u e n c e o f t h e f u n g u s . 5 F r a g m e n t s i z e s i n b a s e p a i r s ( b p ) r e s u l t i n g f r o m r e s t r i c t i o n e n z y m e d i g e s t i o n . “ N S = N o c u t t i n g S i t e s p r e s e n t i n I T S s e q u e n c e 5 I n c l u d e s i n t r o n s e q u e n c e 6 N A = n o t a m p l i fi e d 9 5 S p e I N I I ' 5 3 ' - ' 9 ’ ” 5 m “ N F 9 E E 8 o I E E E 0 ! I ! > o o r — o o m m o a C ? C ? 8 s ‘ e ' t o 9 0 o a t + m 0 - U J ; g g a c t I 3 . E E o o D . g P i : : a I t 8 m a m “ i o r i t E e “ F I . i t a t . — , ; N a s 4 5 a i s a t : c 3 9 : 5 1 ‘ ‘ 2 3 : 9 5 9 t 3 5 “ 5 % “ 4 ‘ : ~ . - ; - - I ' - a n t : - F l g u r e 2 . 7 . R e s t r i c t i o n e n z y m e S p e l d i g e s t s o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d f r o m D N A e x t r a c t i o n s o f n e e d l e s u s i n g u n i v e r s a l f u n g a l p r i m e r s I T S I F a n d I T S 4 . L a n e s l a b e l e d 1 K B + c o n t a i n s a D N A S i z e m a r k e r ( G i b c o - B R L ) . N u m b e r s a b o v e l a n e s c o r r e s p o n d t o n e e d l e s a m p l e s f r o m s p e c i fi c t r e e s ( 7 3 , 7 7 , 1 1 2 8 , 2 9 ) . N u m b e r f o l l o w e d b y l e t t e r s 8 c o r r e s p o n d s t o n e e d l e s a m p l e f r o m s h o o t 8 o f t h e S p e c i fi c n u m b e r e d t r e e . L e t t e r s a b o v e l a n e s c o r r e s p o n d t o s p e c i e s o f f u n g i a n d c o n t a i n d i g e s t s o f P C R p r o d u c t s a m p l i f i e d f r o m f r u i t i n g b o d i e s ( L a n e s 1 - 9 , 1 3 1 4 , 1 7 ) a n d m y c e l i u m ( L a n e s 1 0 - 1 2 , 1 5 , 1 6 ) . R P P - 0 R 2 a n d R P P - C H M I = R h a b d o c l i n e p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e , R P E - O R 1 = R p s e u d o t s u g a e s s p . e p i p h y l l a ) , R W O B V - O R 5 = R . w e i r i i s s p . o b o v a t a , R W W — O R 1 = R . w e i n ' i s s p . w e i n ' i . R W W O B L - M l 1 a n d M I 2 = R . w e i n ' i s s p . o b l o n g a , R P - A T C C , C O E a n d C O H = R . p a r k e r i , P G = P . g a u m a n n i i , H D = H . d e m a t i o i d e s . 9 6 P P R - T U C N U B r a n c h s a m p l e s T r e e s a m p l e s 9 R s a I S c a I F i g u r e 2 . 8 . R e s t r i c t i o n d i g e s t s o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d f r o m D N A e x t r a c t i o n s o f n e e d l e s u s i n g R h a b d o c l i n e - s p e c i fi c p r i m e r s R P P 1 a n d R P P 4 . A ) D i g e s t s b y R s a I r e s t r i c t i o n e n z y m e , 8 ) D i g e s t s b y S c a l e n z y m e . L a n e l a b e l e d 1 K B + c o n t a i n s a D N A s i z e m a r k e r ( G i b c o - B R L ) . L a b e l e d R P P - c o n t a i n s u n c u t P C R p r o d u c t s ( R P P 1 — R P P 4 p r i m e r s ) o f f r u i t i n g b o d i e s o f R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e . N u m b e r s a b o v e l a n e s c o r r e s p o n d t o n e e d l e s a m p l e s f r o m s p e c i fi c t r e e s . N u m b e r s f o l l o w e d b y l e t t e r s A o r 8 c o r r e s p o n d s t o n e e d l e s a m p l e f r o m s h o o t A o r s h o o t 8 o f t h e S p e c i fi c n u m b e r e d t r e e . L e t t e r s a b o v e l a n e s c o r r e s p o n d t o s p e c i e s o f f u n g i a n d c o n t a i n d i g e s t s o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d f r o m m y c e l i u m u s i n g p r i m e r s I T S 1 F a n d I T S 4 . H D = H . d e m a t i o i d e s , P G = P . g a u m a n n i i , R P - A T C C = R . p a r k e r i . 9 7 S e q u e n c i n g o f R P P 1 a n d R P P 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s T o f u r t h e r c o n fi r m t h a t p r i m e r s R P P 1 a n d R P P 4 a m p l i f y o n l y R . p s e u d o t s u g a e S S p . p s e u d o t s u g a e i n s y m p t o m l e s s f o l i a g e , R P P 1 a n d R P P 4 a m p l i fi e d p r o d u c t s f r o m n e e d l e s o f n e w y e a r g r o w t h c o l l e c t e d i n M a y 2 0 0 0 w e r e s e q u e n c e d f r o m s a m p l e t r e e 7 3 , a n d 7 7 u s i n g i n t e r n a l p r i m e r s I T S Z a n d I T S 3 T h e s e q u e n c e s f r o m b o t h s a m p l e s w e r e h o m o l o g o u s t o a l i g n e d s e q u e n c e s o f R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u a g e f r u i t i n g b o d i e s ( F i g u r e 2 . 9 ) . U s e o f p r o b e d e t e c t i o n d u r i n g i n f e c t i o n a n d d i s e a s e p r o g r e s s i n d i f f e r e n t p r o v e n a n c e s D i s e a s e p r o g r e s s w a s r e f l e c t e d a s a n i n c r e a s i n g q u a n t i t y o f P C R p r o d u c t a m p l i fi e d f r o m t h e i n f e c t e d n e e d l e s o v e r t h e 1 2 m o n t h s a s t h e n e e d l e s i n c r e a s e d i n a g e . T h e q u a n t i t y o f P C R p r o d u c t g r a d u a l l y i n c r e a s e d a n d r e a c h e d t h e h i g h e s t a m o u n t i n o n e y e a r o l d n e e d l e s o f t r e e s t h a t h a d h i g h d i s e a s e r a t i n g s . I n t r e e s w i t h t h e l o w e s t d i s e a s e r a t i n g s , t h e q u a n t i t y o f P C R p r o d u c t e i t h e r d i d n o t i n c r e a s e o r i n c r e a s e d l i t t l e o v e r t h e 1 2 m o n t h p e r i o d . A n i n c r e a s i n g q u a n t i t y o f P C R p r o d u c t S h o u l d c o r r e s p o n d t o a n i n c r e a s i n g a m o u n t o f f u n g a l h y p h a e i n a n e e d l e . T r e e s 4 0 ( S a n t a F e N F ) , 1 2 , 1 7 , 1 8 ( L i n c o l n N . F ) , 5 ( C a r s o n N F ) , 6 , 1 5 , 3 9 ( C o c o n i n i N . F ) , 1 3 , 3 0 ( S a n I s a b e l N F ) , 9 ( C i b o l a N . F ) , a n d 1 9 ( R i o G r a n d e N . F s h o w e d a l m o s t n o i n c r e a s e i n P C R p r o d u c t o v e r t h e 1 2 m o n t h p e r i o d . H o w e v e r , t h e i n c r e a s e i n P C R p r o d u c t s w a s m o d e r a t e i n t r e e s 2 ( S a n t a F e N F ) , 3 7 ( A p a c h e ) , 2 1 ( C a r s o n N . F ) , 4 1 , 4 3 , 4 4 ( C i b o l a N . F ) , 3 5 a n d 3 6 ( S a n I s a b e l 9 8 N . F ) . T h e c h a n g e s i n t h e q u a n t i t y o f P C R p r o d u c t a m p l i f i e d f r o m t h e i n f e c t e d n e e d l e s o f S p e c i fi c t r e e s o f S p e c i fi c s e e d s o u r c e s a r e g r a p h e d o n F i g u r e 2 . 1 0 . T h e r a t e o f i n c r e a s e o v e r t h e 1 2 m o n t h s i S r e p r e s e n t e d b y t h e S l o p e o f t h e g r a p h s f o r e a c h t r e e s a m p l e d . S l o p e s v a r y g r e a t l y d u e t o d i f f e r e n c e s i n t h e d i s e a s e s u s c e p t i b i l i t y o f e a c h t r e e , p a r t i c u l a r l y , b e c a u s e t r e e s s h o w i n g e x t r e m e s i n s u s c e p t i b i l i t y w e r e p u r p o s e l y s e l e c t e d . F o r e a c h I M s e e d s o u r c e , i n d i v i d u a l t r e e s ( n e e d l e s a m p l e s ) d i f f e r e d i n t h e i n c r e a s e o f P C R p r o d u c t s a n d i n t h e r a t e o f i n c r e a s e ( S l o p e o f t h e l i n e o n t h e g r a p h i n fi g u r e 2 . 1 0 ) a s i n f e c t e d n e e d l e s a g e o v e r 1 2 m o n t h s . 9 9 . . n 4 . L / ~ “ Q " - - .. G i ~ n .I. ' 1 ‘ ‘ O 0 “ I Figure 2.9 curren R h a b e Q u e n c e d I f I E S 1 y e 0 0 5 / g , t \ p m s . . . “ . a } . . . V 5 1 . I . n E C L C Q 3 1 8 i n A F " 4 “ A p o t h e c i a N e e d l e s 7 3 N e e d l e s 7 7 A p o t h e c i a N e e d l e s 7 3 N e e d l e s 7 7 A p o t h e c i a N e e d l e s 7 3 N e e d l e s 7 7 A p o t h e c i a N e e d l e s 7 3 N e e d l e s 7 7 A p o t h e c i a N e e d l e s 7 3 N e e d l e s 7 7 A p o t h e c i a N e e d l e s 7 3 N e e d l e s 7 7 A p o t h e c i a N e e d l e s 7 3 N e e d l e s 7 7 A p o t h e c i a N e e d l e s 7 3 N e e d l e s 7 7 1 6 O C C G A G T T T C T T G C C C T A G C G G G C A G A T C T C C C A C C C G . G T G T A T T T A T A C C G T G T T G C T T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G G C A G A T C T C C C A C C C G T G T G T A T T T A T A C C G T G T T G C T T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G G C A G A T C T C C C A C C C G T G T G T A T T T A T A C C G T G T T G C T T 6 1 1 2 0 T G G G G C C T C C A G G C C T C A C C G C C C G G G G C C A A A G G C C G A A A A C T C T G T G A A T T A C T G T C G T G G G G C C T C C A G G C C T C A C C G C C C G G G G C C A A A G G C C G A A A A C T C T G T G A A T T A C T G T C G T G G G G C C T C C A G G C C T C A C C G C C C G G G G C C A A A G G C C G A A A A C T C T G T G A A T T A C T G T C G 1 2 1 1 8 0 T C T G A G T A C C A T A T A A T A G T T A A A A C T T T C A A C A A C G G A T C T C T T G G T T C T G G C A T C G A T T C T G A G T A C C A T A T A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T C T G A G T A C C A T A T A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 T S 3 — — - - - > 1 8 1 < — - - — - I T S Z 2 4 0 G A A G A A C G C A G C G A A A T G C G A T A A G T A A T G T G A A T T G C A G A A T T C A G T G A A T C A T C G A A T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G A A T T C A G T G A A T C A T C G A A T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G A A T T C A G T G A A T C A T C G A A T 2 4 1 3 0 0 C T T T G A A C G C A C A T T G C G C C C C T T G G T A T T C C G G G G G G C A T G C C T G T T C G A G C G T C A T T T C T T T G A A C G C A C A T T G C G C C C C T T G G T A T T C C G G G G G G C A T G C C T G T T C G A G C G T C A T T T C T T T G A A C G C A C A T T G C G C C C C T T G G T A T T C C G G G G G G C A T G C C T G T T C G A G C G T C A T T T 3 0 1 3 6 0 C A A C C C T T A C G C C T T G C G T A G T C T T G G G C C C C A C C C T C A C G G G T C G G C C C T A A A A C T A G T C A A C C C T T A C G C C T T G C G T A G T C T T G G G C C C C A C C C T C A C G G G T C G G C C C T A A A A C T A G T C A A C C C T T A C G C C T T G C G T A G T C T T G G G C C C C A C C C T C A C G G G T C G G C C C T A A A A C T A G T 3 6 1 4 2 0 G G C G G T G T C C C C T C G G G C C T G A G C G T A G T A C T T C T T C T C G C T A T A G G C T C C G G G A G G A C G G G C G . T G T C C C C T C G G G C C T G A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G G C G . T G T C C C C T C G G G C C T G A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2 1 4 4 8 C T G G C C A G C A A C C C C A A A T C T T A T C T G G O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O F i g u r e 2 . 9 . A l i g n m e n t o f s e q u e n c e s a m p l i fi e d b y R P P 1 a n d R P P 4 p r i m e r s f r o m c u r r e n t y e a r n e e d l e s f r o m t h e t r e e 7 3 a n d 7 7 w i t h s e q u e n c e f r o m a p o t h e c i a o f R h c ’ i l b d o c l i n e p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e ( R P P - W A 2 9 ) . R e d s e q u e n c e w a s s e q u e n c e d u s i n g i n t e r n a l p r i m e r I T S Z , b l u e s e q u e n c e u s i n g I T S 3 ( c o m p l e m e n t ) . 1 0 0 S a n t a F e N . F . l i c 1 0 0 i . 2 ‘ ‘ 1 8 0 ‘ e \ ° ‘ " o 6 0 + 1 . 9 { “ 2 O o 4 0 ‘ g 3 2 i < 2 0 . z , D o _ . . . l _ - . - , . . e - r — m ‘ ’ . , , . , - . , . . . I M a y - 0 0 N o v - 0 0 M a y - 0 0 - 1 1 a g e o f n e e d l e s 1 A p a c h e N . F . ‘ e 1 0 0 I 2 ‘ £ - 8 0 + 3 l v 6 0 « . 2 5 i g 5 fl l " o 3 7 ‘ < 2 0 z l o o - . . l - M a y - 0 0 N o v - 0 0 M a y — 0 0 - 1 ‘ a g e o f n e e d l e s F i g u r e 2 . 1 0 . C h a n g e s i n t h e a m o u n t o f R h a b d o c l i n e P C R p r o d u c t ( i n % p i x e l s / m m z ) , b e l i e v e d t o c o r r e s p o n d t o a m o u n t o f m y c e l i u m i n n e e d l e s o f S p e c i fi c t r e e s o f e i g h t i n t e r m o u n t a i n p r o v e n a n c e s o f D o u g l a s f i r o v e r 1 2 m o n t h s a s n e e d l e s i n c r e a s e i n a g e . E a c h l i n e c o r r e s p o n d s t o a s p e c i f i c t r e e o f a p r o v e n a n c e i d e n t i f i e d b y a n u m b e r t h a t c o r r e s p o n d s t o t h e n e e d l e s a m p l e s f r o m t h a t t r e e . M a y - 0 0 r e f e r s t o n e w M a y 2 0 0 0 n e e d l e s , N o v - 0 0 r e f e r s t o c u r r e n t y e a r n e e d l e s i n N o v e m b e r 2 0 0 0 , a n d M a y - 0 0 - 1 r e f e r s t o o n e - y e a r - o l d n e e d l e ( 1 9 9 9 ) c o l l e c t e d i n M a y 2 0 0 0 . 1 0 1 ) l e x i p % ( d e t c e t e d A N D ) l e x i p % ( d e t c e t e d A N D . — l 0 0 0 0 0 1 0 0 8 0 i 5 0 i ~ 4 0 I l 2 0 ‘ 0 L ‘ M a y - 0 0 L . . . 2 . 1 " ; F i g u r e 5 2 . 1 0 C o n t ’ d 7 L i n c o l n N E L - r ' ” W , 7 _ , N o v - 0 0 a g e o f n e e d l e s C a r s o n N E A v N o v - 0 0 a g e o f n e e d l e s 1 0 2 A v M a y - 0 0 - 1 + 4 2 1 3 - 1 2 . 3 1 . + 3 3 + 5 m i n - ~ 1 0 1 6 2 1 C o c o n i n o N F . 1 5 ‘ l l I 1 0 0 l a ; 9 0 - ‘ . 5 8 0 + 7 I ‘ 3 7 0 . e 1 4 l * 5 5 0 - i 2 3 0 - + 2 5 I Z 2 0 T T + 3 8 ‘ I D 1 0 - l 0 . . . . . l . . . _ . . . . . _ _ _ . _ _ . _ _ . . 2 . . . . 4 . l } M a y - 0 0 N o v — 0 0 M a y - 0 0 - 1 ‘ a g e o f n e e d l e s I l C i b o l a M E I 1 0 0 ' l l ’ 7 ? L . i ’ 8 8 ° + 8 l g M g 6 0 — ~ ~ 5 9 2 2 7 . O i 5 % 4 0 l . , 2 8 ‘ " U ' + 4 2 ‘ < t E 2 0 + 4 3 ‘ I 0 I . . . = . . l l M a y - 0 0 N o v - 0 0 M a y - 0 0 - 1 l a g e o f n e e d l e s F i g i u ' r e 5 2 . 1 0 c o n t ’ d 1 0 3 0D ) l e x i p % ( d e t c e t e d A N D 9 0 - 8 0 7 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 N A d e t e c t e d ( % p i x e l ) 1 0 0 8 0 7 O 6 0 6 0 ~ S a n I s a b e l N . F . ' + 1 1 { + 2 2 2 3 " 2 3 4 + + 3 5 , + 3 6 M a y - 0 0 4 a g e o f n e e d l e s R w a M e N F 9 0 ~ 5 0 — 4 o - 3 o . 2 0 ~ - / ‘ ' f 2 0 A A v fi M a y - 0 0 N o v - 0 0 M a y - O O - 1 a g e o f n e e d l e s m F i g u r e 2 . 1 0 c o n t ’ d 1 0 4 D I S C U S S I O N I n t h i s s t u d y , w e h a v e s h o w n t h e u s e f u l n e s s o f P C R f o r d e t e c t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n o f t h e f u n g u s R . p s e u d o t s u g a e i n D o u g l a s f i r n e e d l e s . W e h a v e e s t a b l i s h e d i n p r e v i o u s s t u d i e s ( C a t a l , 2 0 0 2 ) t h a t t h e p r i m e r p a i r R P P 1 — R P P 4 d e v e l o p e d f r o m I T S s e q u e n c e s o f r i b o s o m a l D N A w a s b o t h s p e c i f i c a n d s e n s i t i v e i n d e t e c t i n g t h e t a r g e t i n s y m p t o m l e s s n e e d l e s . F u r t h e r m o r e , w e s h o w e d t h a t n o a m p l i fi c a t i o n o c c u r r e d w i t h D N A f r o m o t h e r c l o s e l y r e l a t e d p a t h o g e n i c o r e n d o p h y t i c f u n g i o r w i t h t h e h o s t ( C a t a l a n d A d a m s , 2 0 0 2 ) . T h e a b i l i t y t o d e t e c t a n d q u a n t i f y R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t p a t h o g e n s i n i n f e c t e d D o u g l a s f i r t i s s u e s w i l l b e i m p o r t a n t f o r s t u d i e s o f p l a n t m i c r o b e i n t e r a c t i o n s a n d e s p e c i a l l y f o r d e v e l o p i n g s t r a t e g i e s t o c o n t r o l d i s e a s e s . T h e u s e o f D N A b a s e d t e c h n o l o g i e s f o r t h e q u a n t i fi c a t i o n o f R h a b d o c l i n e c a n b e a r g u e d t o b e a m o r e p r a c t i c a l a p p r o a c h c o m p a r e d t o t r a d i t i o n a l m e t h o d s , s u c h a s s e c t i o n i n g f o l l o w e d b y m i c r o s c o p y , p l a t i n g a n d s c o r i n g v i a b l e l e s i o n s ( H u e t a l . 1 9 9 3 ; M o u k h a m e d o w e t a l . 1 9 9 4 ; B a u a b o l a e t a l . 1 9 9 2 ) b e c a u s e t h e s e p a t h o g e n s h a v e n o t b e e n s u c c e s s f u l l y c u l t u r e d a n d s c o r i n g s y m p t o m s r e q u i r e s a d e l a y o f 6 t o 1 2 m o n t h s f o l l o w i n g i n f e c t i o n . I n t h i s s t u d y , w e d e m o n s t r a t e d t h a t P C R a m p l i fi e d p r o d u c t s m i g h t b e u s e f u l i n q u a n t i f y i n g t h e p a t h o g e n i n t h e n e e d l e s . I t h a s b e e n r e p o r t e d t h a t t h e a m o u n t o f a m p l i c o n p r o d u c e d i s d e p e n d e d o n t h e a m o u n t o f t a r g e t D N A i n a s a m p l e ( S i m o n e t a l . 1 9 9 2 ; S c h u b e r t e t a l . 1 9 9 9 ) . I n m a n y s t u d i e s , a l i n e a r c o r r e l a t i o n h a s b e e n f o u n d b e t w e e n t h e q u a n t i t y o f P C R p r o d u c t a n d t h e a m o u n t o f f u n g a l D N A ( N i c h o l s o n e t a l . 1 9 9 7 ; M o u k h a m e d o w e t a l . 1 9 9 4 ; W i n t o n e t a l . 1 0 5 2 0 0 2 ) . M o l e c u l a r p r o b e s w e r e p r o v e n t o b e f a s t , e a s y a n d m o r e a c c u r a t e a t m e a s u r i n g t h e f u n g a l b i o m a s s w h e n u s e d i n h y b r i d i z a t i o n ( J u d e l s o n a n d M e s s e n g e r - R o u t h , 1 9 9 6 ) a n d i n P C R q u a n t i fi c a t i o n s ( S c h u b e r t e l a l . 1 9 9 9 ; H u e t a l . 1 9 9 3 ) . W e u s e d t h e B i o - R a d g e l r e a d e r a n d s o f t w a r e s y s t e m c a l l e d Q u a n t i t y O n e ® t o q u a n t i f y t h e i n t e n s i t y o f t h e D N A fl u o r e s c e n c e o f P C R p r o d u c t s o n a g a r o s e g e l s f o l l o w i n g s t a i n i n g w i t h e t h i d i u m b r o m i d e . T h e Q u a n t i t y O n e ® r e a d e r r e p o r t s t h e a m o u n t o f D N A i n t h e P C R p r o d u c t a s a p e r c e n t a g e o f p i x e l s / m m 2 fl u o r e s c i n g i n a g e l . T h e b a c k g r o u n d fl u o r e s c e n c e c a n b e s u b t r a c t e d , a n d t h e q u a n t i fi c a t i o n p a r a m e t e r s c a n b e c a l i b r a t e d u s i n g t h e s o f t w a r e p r o g r a m . B a c k g r o u n d fl u o r e s c e n c e t h a t c a n b e c a u s e d b y p l a n t D N A a n d p r i m e r - d i m e r f o r m a t i o n ( F r a a i j e e t a l . 1 9 9 9 ) w a s n o t o b s e r v e d i n o u r s t u d i e s . A l a r g e f o r m a t g e l e l e c t r o p h o r e s i s a p p a r a t u s p e r m i t t e d t h e l o a d i n g o f a l l P C R p r o d u c t s f r o m f o u r r e p l i c a t e d t e s t s o n t o a s i n g l e g e l t o p r o v i d e f o r s t a n d a r d i z a t i o n o f e l e c t r o p h o r e s i s c o n d i t i o n s . A d d i t i o n a l l y , t h e l a r g e f o r m a t p r o v i d e d a u n i f o r m m e a s u r e m e n t o f b a c k g r o u n d fl u o r e s c e n c e v e r s u s P C R p r o d u c t f l u o r e s c e n c e d u r i n g s c a n n i n g w i t h U V t r a n s - i l l u m i n a t i o n o f e t h i d i u m b r o m i d e s t a i n e d g e l s . T h e m e a s u r e m e n t s i n ° / o p i x e l / m m 2 c a n b e c o n v e r t e d t o n a n o g r a m s o f D N A b a s e d o n k n o w n c o n c e n t r a t i o n o f a s p e c i fi c b a n d o f t h e D N A m a r k e r l a d d e r u s e d i n e a c h g e l a n d r e p l i c a t e d t e s t . T h i s e l i m i n a t e d t h e n e e d t o u s e c o m p e t i t o r D N A f r a g m e n t s t h a t a r e c o n s t r u c t e d a n d u s e d i n q u a n t i fi c a t i o n s f o r a s s e s s i n g t h e p o s s i b l e q u a n t i t y o f t a r g e t s e q u e n c e ( N i c h o l s o n e t a l . 1 9 9 7 ; M o u k h a m e d o w e t a l . 1 9 9 4 ; H u e t a l . 1 9 9 3 ) . C o m p e t i t i v e D N A f r a g m e n t s c a n r e d u c e t h e e f f i c i e n c y o f P C R a m p l i f i c a t i o n a l t h o u g h t h e y m i g h t a l s o a v o i d t h e g e n e r a t i o n o f a r t i fi c i a l P C R p r o d u c t s d u r i n g a m p l i fi c a t i o n 1 0 6 ( H e n s o n a n d F r e n c h , 1 9 9 3 ) . F r a a i j e e t a l ( 1 9 9 9 ) q u a n t i fi e d S e p t o n ' a t i n ' t i c i i n w h e a t u s i n g a g a r o s e g e l a n a l y s i s a n d a fl u o r o m e t r i c m i c r o t i t e r - p l a t e P i c o G r e e n a s s a y w i t h o u t c o n t r o l D N A . T h e y d i d n o t o b s e r v e a n y a s p e c i fi c a m p l i fi c a t i o n w i t h o t h e r m i c r o o r g a n i s m s o n l e a f s u r f a c e s . W e h a v e o b s e r v e d i n m a n y t e s t s o v e r 3 y e a r s t h a t t h e e f fi c i e n c y a n d s e n s i t i v i t y o f P C R a m p l i fi c a t i o n b y t h e p r i m e r p a i r R P P 1 a n d R P P 4 w a s n o t r e d u c e d o r i n h i b i t e d b y t h e p r e s e n c e o f p l a n t D N A . O t h e r s h a v e f o u n d i n h i b i t i o n , f o r e x a m p l e , t h e s e n s i t i v i t y o f d e t e c t i o n o f P h y t o p h t h o r a s s p . b y s p e c i e s - s p e c i f i c p r o b e s w a s r e d u c e d i n o a k b u t n o t i n b e e c h D N A e x t r a c t i o n s ( S c h u b e r t e t a l . l 9 9 9 ) . O u r d i r e c t m e t h o d o f P C R d e t e c t i o n w a s s a f e r t h a n D N A d e t e c t i o n m e t h o d s t h a t r e q u i r e r a d i o a c t i v e l a b e l i n g o f P C R p r o d u c t s d u r i n g t h e P C R r e a c t i o n , a n d l a t e r h a n d l i n g o f P C R p r o d u c t d u r i n g s c i n t i l l a t i o n c o u n t i n g . I t h a s b e e n k n o w n t h a t t h e r e a r e d i f f e r e n c e s i n r e s p o n s e s t o R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t a m o n g d i f f e r e n t s e e d s o u r c e s ( J a y n e s e t a l . 1 9 8 7 ) a s i t h a s b e e n o b s e r v e d a n d r a t e d v i s u a l l y . F u r t h e r m o r e , t h e R h a b d o c l i n e s p e c i e s t h a t a r e p a t h o g e n i c a r e o b l i g a t e p a r a s i t e s , a n d t h e r e f o r e i t i s d i f fi c u l t t o m e a s u r e t h e i n f e c t i o n r a t e u s i n g c l a s s i c a l m e t h o d s o t h e r t h a n v i s u a l r a t i n g s . H u e t a l . 1 9 9 3 d e m o n s t r a t e d t h a t Q u a n t i t a t i v e P C R c a n b e u s e d t o a n a l y z e r e s i s t a n t a n d s u s c e p t i b l e s o u r c e s o r c u l t i v a r s a n d t o h e l p d e t e r m i n e w h a t s t a g e o f p a t h o g e n e s i s i s i n h i b i t e d i n r e s i s t a n t p l a n t s . W e s h o w e d t h a t P C R d e t e c t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n c o u l d b e v a l u a b l e i n d e t e r m i n i n g r e s i s t a n t a n d s u s c e p t i b l e s o u r c e s o f D o u g l a s fi r . T h e e f fi c i e n c y o f p r o b e d e t e c t i o n w a s c o m p a r e d w i t h c l a s s i c a l v i s u a l d i s e a s e r a t i n g s o n N p r o v e n a n c e s o f D o u g l a s f i r g r o w n i n W a s h i n g t o n . 1 0 7 T h e n e e d l e s w e r e c o l l e c t e d f r o m 4 4 s e l e c t e d t r e e s f r o m n i n e d i f f e r e n t p r o v e n a n c e s a t t h r e e d i f f e r e n t a g e s . R e s u l t s f r o m a m p l i f i c a t i o n s o f o n e y e a r o l d n e e d l e s c o l l e c t e d i n M a y s h o w e d t h a t P C R d e t e c t i o n d a t a a g r e e d w e l l w i t h v i s u a l r a t i n g s c o n d u c t e d t h e s a m e y e a r . F u r t h e r m o r e , P C R d e t e c t e d t h e i n f e c t i o n s o f t h e f u n g u s i n t h e n e e d l e s t h a t s h o w e d n o d i s e a s e i n v i s u a l r a t i n g s ( T a b l e 2 . 2 a n d F i g u r e 2 . 2 ) . S i g n i fi c a n t a m o u n t s o f D N A w e r e f o u n d i n s o m e t r e e s t h a t w e r e v i s u a l l y r a t e d a s h a v i n g n o d i s e a s e o r v e r y l o w d i s e a s e . T h e s e t r e e s m a y h a v e u n i q u e t y p e s o f d i s e a s e r e s i s t a n c e . P C R d e t e c t i o n o f i n f e c t i o n i n D N A e x t r a c t i o n s o f fi v e n e e d l e s r a n d o m l y s e l e c t e d f r o m b u l k e d s a m p l e s ( m o r t a r / p e s t l e m e t h o d ) o r b u l k s u b s a m p l e s o f 1 0 g n e e d l e s ( b l e n d e r m e t h o d ) f r o m l a r g e r b u l k e d s a m p l e s g a v e s i m i l a r r e s u l t s i n r e l a t i o n t o q u a n t i f y i n g i n f e c t i o n i n o n e y e a r o l d n e e d l e s . A l t h o u g h b u l k e x t r a c t i o n s m a y p r o v i d e b e t t e r s a m p l i n g m e t h o d f o r e s t i m a t i n g t h e i n f e c t i o n r a t e o f a t r e e , e x t r a c t i o n s w i t h 5 n e e d l e s a l s o p r o v i d e a c l o s e r e p r e s e n t a t i o n . R e s u l t s f r o m a m p l i fi c a t i o n o f c u r r e n t y e a r ’ s n e e d l e s c o l l e c t e d i n N o v e m b e r c o r r e s p o n d e d t o t h e v i s u a l r a t i n g s c o n d u c t e d t h e f o l l o w i n g s p r i n g . P C R d e t e c t i o n s h o w e d t h a t t h e n e e d l e s o f m a n y t r e e s w i t h h i g h d i s e a s e r a t i n g s w e r e m o r e t h o r o u g h l y c o l o n i z e d b y t h e f u n g u s a s i t i s a s s u m e d t h a t h i g h a m o u n t s o f f u n g a l D N A p r o d u c e d g r e a t e r q u a n t i t i e s o f P C R p r o d u c t . Q u a n t i f y i n g t a r g e t s e q u e n c e s f o r e s t i m a t i n g b i o m a s s o f a n o b l i g a t e p a r a s i t e , t h e f u n g u s G l o m u s v e s i c u l i f e r u m i n l e e k r o o t s , w a s u s e f u l i n t h e s t u d i e s o f S i m o n e t a l . ( 1 9 9 2 ) . L i k e w i s e i n c e r e a l e y e s p o t , P C R p r o d u c t s o f t h e f u n g u s w e r e r a t e d 1 0 8 v i s u a l l y a n d q u a n t i t a t i v e l y . Q u a n t i t y o f P C R a l s o h a s b e e n c o r r e l a t e d w i t h v i s u a l d i s e a s e r a t i n g s b y N i c h o l s o n e t a l . ( 1 9 9 7 ) . W e d e t e c t e d l i t t l e o r n o f u n g u s i n m a n y t r e e s t h a t w e r e r a t e d l o w i n d i s e a s e l a t e r i n t h e s p r i n g o f t h e f o l l o w i n g y e a r . P C R d e t e c t i o n o f i n f e c t i o n s i n s a m p l e s o f t w o s h o o t s , w i t h d i s e a s e r a t i n g o f t h e r e m a i n i n g s h o o t l a t e r i n t h e y e a r ( f o l l o w i n g s p r i n g ) p r o v i d e d t h e m o s t a c c u r a t e a g r e e m e n t o f P C R q u a n t i fi c a t i o n t o d i s e a s e v i s u a l r a t i n g i n o u r s t u d i e s . I n a n a t t e m p t t o d e t e c t i n f e c t i o n s a t e a r l y s t a g e s , c u r r e n t y e a r s n e e d l e s w e r e a l s o t e s t e d . P C R a s s a y s d e t e c t e d t h e p a t h o g e n i n 1 7 t r e e s b y t h e fi r s t w e e k o f M a y . T h e q u a n t i t y o f P C R p r o d u c t s a n d t h u s p r e s u m a b l y i n f e c t i o n , h a d a l r e a d y r e a c h e d h i g h l e v e l s i n m a n y t r e e s i n t h e s a m e m o n t h a s l e a f e m e r g e n c e . I d e n t i t y o f R P P 1 a n d R P P 4 a m p l i f i e d P C R p r o d u c t s a s R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e w e r e c o n f i r m e d w i t h c o m p a r i s o n t o p a t t e r n p r o f i l e s o f i n d e p e n d e n t r e s t r i c t i o n d i g e s t s w i t h R s a I , S c a l a n d S p e l , a s w e l l a s w i t h s e q u e n c i n g f o r t r e e s a m p l e s . P C R d e t e c t i o n o f f u n g a l i n f e c t i o n s a t e a r l y s t a g e s o f p l a n t p a t h o g e n e s i s w a s a l s o a c c o m p l i s h e d b y H u e t a l . ( 1 9 9 3 ) w i t h V e r t i c i l l i u m s p e c i e s o n a l f a l f a a n d s u n fl o w e r p l a n t s . I n o u r s t u d i e s , q u a n t i t a t i v e d a t a w a s a l s o u s e d t o o b s e r v e t h e c h a n g e s i n P C R a m p l i fi e d R h a b d o c l i n e D N A i n t r e e s t h a t v a r i e d i n d i s e a s e r a t i n g f r o m r e s i s t a n t t o s u s c e p t i b l e , i n s e v e r a l s e e d s o u r c e s . P C R d e t e c t i o n f r o m n e e d l e s c o l l e c t e d a t 3 d i f f e r e n t a g e s s h o w e d t h a t t h e r e w a s a l i n e a r i n c r e a s e i n t h e a m o u n t o f D N A i n b o t h s u s c e p t i b l e a n d m o d e r a t e l y r e s i s t a n t s o u r c e s t h r o u g h a 1 2 m o n t h s p e r i o d . 1 0 9 T h e p r e s e n t s t u d y i l l u s t r a t e s t h a t t h e u s e o f P C R , e m p l o y i n g s p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r s , i s a p r a c t i c a l a p p r o a c h f o r q u a n t i t a t i v e a s s e s s m e n t o f R h a b d o c l i n e n e e d e c a s t . T h e P C R a s s e s s m e n t o f i n f e c t i o n h a s b e e n s h o w n t o c o r r e s p o n d w e l l t o v i s u a l a s s e s s m e n t o f d i s e a s e s e v e r i t y i n t r e e s , b u t P C R a s s e s s m e n t c a n r e v e a l t h i s i n f o r m a t i o n 6 - 1 2 m o n t h s e a r l i e r t h a n v i s u a l a s s e s s m e n t s . F u r t h e r m o r e , P C R d e t e c t i o n a n d q u a n t i f i c a t i o n c a n r e v e a l u n i q u e i n f o r m a t i o n o n i n f e c t i o n o f t r e e s w i t h m o d e r a t e t o h i g h d i s e a s e r e s i s t a n c e ( l o w v i s u a l d i s e a s e r a t i n g s ) . T h e r e f o r e , P C R d e t e c t i o n c o u l d r e v e a l d i f f e r e n t r e s i s t a n c e p h e n o t y p e s w i t h i n a s e e d s o u r c e o r a m o n g s e e d s o u r c e s . 1 1 0 R E F E R E N C E S B a u a b o l a , M . , L e g o u x , P . , P e s s e q u e , B . , D e l p e c h , B . , a n d D u m o n t , X . 9 9 2 . S t a n d a r d i z a t i o n o f m R N A t i t r a t i o n u s i n g a p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n m e t h o d i n v o l v i n g c o - a m p l i fi c a t i o n w i t h a m u l t i s p e c i fi c i n t e r n a l c o n t r o l . J . B i o l . C h e m . 2 6 7 : 2 1 8 3 0 - 3 8 C a t a l , M a n d A d a m s , G . C . 2 0 0 2 . D e t e c t i o n i d e n t i f i c a t i o n a n d q u a n t i f i c a t i o n o f l a t e n t n e e d l e c a s t p a t h o g e n s a n d e n d o p h y t e s i n s y m p t o m l e s s c o n i f e r f o l i a g e b y P C R a n d D o t - b l o t a s s a y s . I n : P r o c e e d i n g s o f t h e I U F R O W o r k i n g P a r t y 7 . 0 2 . 0 2 S h o o t a n d F o l i a g e D i s e a s e s . A n t t i U o t i l a & V e l l a m o A h o l a ( e d s ) . F i n n i s h f o r e s t R e s e a r c h I n s t i t u t e , R e s e a r c h P a p e r s 8 2 9 , p : 1 6 4 - 1 7 8 C a t a l , M . 2 0 0 2 . M o l e c u l a r p r o b e s f o r d e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t s o f D o u g l a s fi r . C h a p t e r 1 , p : 1 - 5 9 . C h a s t a g n e r , 1 9 8 5 . R e s e a r c h o n C h r i s t m a s t r e e k e e p a b i l i t y . A m e r i c a n C h r i s t m a s t r e e j o u m a l . 2 9 ( 4 ) : 3 1 - 3 5 . C h a s t a g n e r , G . A , a n d B y t h e r , R . S . 1 9 8 3 . I n f e c t i o n p e r i o d o f P h a e o c r y p t o p u s g a u m a n i i o n D o u g l a s - F i r n e e d l e s . P l a n t D i s e a s e 6 7 ( 7 ) : 8 1 1 - 8 1 3 . C h a s t a g n e r , G . A . , B y t h e r , R . S . , R i l e y , K . L . 1 9 8 9 . M a t u r a t i o n o f a p o t h e c i a a n d c o n t r o l o f R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t o n D o u g l a s - F i r i n W e s t e r n W a s h i n g t o n . U S D A F o r e s t S e r v i c e . G e n e r a l T e c h i c a l R e p o r t W G - 5 9 : 8 7 - 9 2 . C h a s t a g n e r , 2 0 0 1 . S u s c e p t i b i l i t y o f i n t e r m o u n t a i n D o u g l a s - F i r t o R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t w h e n g r o w n i n t h e P a c i fi c N o r t h w e s t . O n l i n e . P l a n t H e a l t h P r o g r e s s d o i : 1 0 . 1 0 9 4 / P H P - 2 0 0 1 - 1 0 2 9 - 0 1 — R S C h e n , W . , G r a y , L E , a n d G r a u , C . R . 1 9 9 6 . M o l e c u l a r d i f f e r e n t i a t i o n o f f u n g i a s s s o c i a t e d w i t h B r o w n S t e m R o t a n d D e t e c t i o n o f P h i a l o p h o r a g r e g a t a i n r e s i s t a n t a n d s u s c e p t i b l e s o y b e a n c u l t u r e s . P h y t o p a t h o l o g y 8 6 ( 1 0 ) : 1 1 4 0 - 1 1 4 8 . C o o k e , D . E . L a n d D u n c a n , J . M . 1 9 9 7 . P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s o f P h y t o p t h o r a s p e c i e s b a s e d o n I T S 1 a n d I T S 2 s e q u e n c e s o f t h e r i b o s o m a l R N A g e n e r e p e a t . M y c o l o g i c a l R e s e a r c h 1 0 1 : 6 6 7 - 6 7 7 . D i r r , M . A . 1 9 9 8 . M a n u a l o f w o o d y l a n d s c a p e p l a n t s : t h e i r i d e n t i f i c a t i o n , o r n a m e n t a l c h a r a c t e r i s t i c s , c u l t u r e , p r o p a g a t i o n a n d u s e s . 5 t h e d i t i o n . S t i p e s P u b . C h a m p a i g n , I L . 1 1 1 E l l i o t , M . L . , D e s J a r d i n , E . A . , a n d H e n s o n , J . M . 1 9 9 3 . U s e o f p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n a s s a y t o a i d i n i d e n t i f i c a t i o n o f G a e u m a n n o m y c e s g r a m i n i s v a r . g r a m i n i s f r o m d i f f e r e n t g r a s s h o s t s . P h y t o p a t h o l o g y 8 3 : 4 1 4 - 4 1 8 F r a a i j a , B . A . , L o v e l l , D . J . , R o h e l , E . A . , a n d H o l l o m o n D . W . 1 9 9 9 . R a p i d d e t e c t i o n a n d d i a g n o s i s o f S e p t o r i a t i n ' t i c i e p i d e m i c s i n w h e a t u s i n g a p l o y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n / P i c o G r e e n a s s a y . J o u r n a l o f A p p l i e d M i c r o b i o l o g y 8 6 : 7 0 1 - 7 0 8 . G r o p p e , K a n d B o l l e r , T . 1 9 9 7 . A P C R a s s a y b a s e d o n a m i c r o s a t e l l i t e - c o n t a i n i n g l o c u s f o r d e t e c t i o n a n d q u a n t i f i c a t i o n o f E p i c h / o e e n d o p h y t e s i n g r a s s t i s s u e . A p p l i e d a n d E n v i r o n m e n t a l M i c r o b i o l o g y 6 3 : 1 5 4 3 - 1 5 5 0 . H a m e l i n , R . C . , B e r u b e , P . , G i g n a c , M . , a n d B o u r a s s a , M . 1 9 9 6 . I d e n t i fi c a t i o n o f r o o t r o t f u n g i i n n u r s e r y s e e d l i n g s b y n e s t e d m u l t i p l e x P C R . A p p l i e d a n d E n v i r o n m e n t a l M i c r o b i o l o g y 6 2 ( 1 1 ) : 4 0 2 6 - 4 0 3 1 . H a r r i n g t o n , T . C . 1 9 8 6 . D i s t r i b u t i o n o f R h a b d o c l i n e a n d S w i s s n e e d l e c a s t s o n D o u g l a s fi r C h r i s t m a s t r e e s i n N e w H a m p s h i r e . P l a n t D i s e a s e 7 0 ( 1 1 ) : 1 0 6 9 - 1 0 7 0 . H e n s o n , J . M a n d F r e n c h , R . 1 9 9 3 . T h e P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n a n d p l a n t d i s e a s e d i a g n o s i s . A n n u a l R e v i e w o f P h y t o p a t h o l o g y 3 1 : 8 1 — 1 0 9 . H u , X . , N a z a r , R . N . , a n d R o b b , J . 1 9 9 3 . Q u a n t i fi c a t i o n o f V e r t i c i l l i u m b i o m a s s i n w i l t d i s e a s e d e v e l o p m e n t . P h y s i o l o g i c a l M o l e c u l a r P l a n t P a t h o l o g y 4 2 : 2 3 - 3 6 . J a y n e s , R . A . , S t e p h e n s , G . R . , a n d A h r e n s , J . F . 1 9 8 7 . D o u g l a s f i r s e e d s o u r c e s t e s t e d f o r C h r i s t m a s t r e e s i n C o n n e c t i c u t . J o u r n a l o f E n v i r o n m e n t a l H o r t i c u l t u r e 2 ( 3 ) : 9 3 - 9 7 . J u d e l s o n , H . S a n d M e s s e n g e r - R o u t h , B . 1 9 9 6 . Q u a n t i t a t i o n o f P h y t o p h t h o r a c i n n a m o m i i n a v o c a d o r o o t s u s i n g a s p e c i e s - s p e c i fi c D N A p r o b e . P h y t o p a t h o l o g y 8 6 ( 7 ) : 7 6 3 - 7 6 8 . K u b i s k e , M . E . , A b r a m s , M . D . , a n d F i n l e y , J . C . 1 9 9 0 . K e e p a b i l i t y o f P e n n s y l v a n i a v e r s u s w e s t c o a s t g r o w n D o u g l a s - f i r C h r i s t m a s t r e e s : g e n o t y p i c v a r i a t i o n i n r e l a t i o n t o s u b f r e e z i n g t e m p e r a t u r e s . N o r t h e r n J o u r n a l o f A p p l i e d F o r e s t r y 7 ( 2 ) : 8 6 - 8 9 . S o c i e t y o f A m e r i c a n F o r e s t e r s , B e t h e s d a , M d . M c D o w e l l , J a n d M e r r i l l , W . 1 9 8 5 . R h a b d o c l i n e t a x a i n P e n n s y l v a n i a . P l a n t D i s e a s e 6 9 ( 8 ) : 7 1 4 - 7 1 5 . M e r r i l l , W . , W e n n e r , N . G . , G e r h o l d , H . 1 9 8 9 . R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t r e s i s t a n c e i n D o u g l a s fi r S e e d s o u r c e s f r o m t h e S o u t h w e s t e r n U n i t e d S t a t e s . U S D A F o r e s t S e r v i c e . G e n e r a l T e c h i c a l R e p o r t W G - 5 9 : 9 3 - 9 5 . 1 1 2 M i c h a e l s , E . a n d C h a s t a g n e r , G . A . 1 9 8 2 . D i s t r i b u t i o n a n d s e v e r i t y o f S w i s s n e e d l e c a s t i n D . fi r C h r i s t m a s t r e e p l a n t a t i o n s . ( A b s t r . ) . P h y t o p a t h o l o g y 7 2 : 9 6 5 . M i l l s , P . R . , S r e e n i v a s a p r a s a d , S . , a n d B r o w n , A . E . 1 9 9 2 . D e t e c t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f C o l / e t o t r i c h u m g l o e o s p o n ' o i d e s i s o l a t e s u s i n g P C R . F E M S M i c r o b i o l o g y L e t t e r s 9 8 : 1 3 7 - 1 4 4 . M o r t o n , H . L a n d M i l l e r , R . 1 9 7 7 . R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t s i n t h e L a k e s t a t e s . P l a n t D i s e a s e R e p o r t e r 6 1 ( 9 ) : 8 0 1 - 8 0 2 . M o u k h a m e d o v , R . , H u , X . , N a z a r , R . N . , a n d R o b b , J . 1 9 9 4 . U s e o f P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n — A m p l i fi e d R i b o s o m a l l n t e r g e n i c S e q u e n c e s f o r t h e D i a g n o s i s o f V e r t i c i l l i u m t n ' c o r p u s . P h y t o p a t h o l o g y 8 4 : 2 5 6 - 2 5 9 . N e w c o m b e , G . , C h a s t a g n e r , G . A . , S c h u e t t e , W . , a n d S t a n t o n , B . J . 1 9 9 4 . M o r t a l i t y a m o n g h y b r i d p o p l a r c l o n e s i n a s t o o l b e d f o l l o w i n g l e a f r u s t c a u s e d b y M e l a m p s o r a m e d u s a e f . s p . d e l t o i d a e . C a n a d i a n J o u m a l o f F o r e s t R e s e a r c h . 2 4 ( 9 ) : 1 9 8 4 - 1 9 8 7 . N i c h o l s o n , P . , R e z a n o o r , H . N . , S i m p s o n , D . R . , a n d J o y c e , D . 1 9 9 7 . D i f f e r e n t i a t i o n a n d q u a n t i f i c a t i o n o f t h e c e r e a l e y e s p o t f u n g i T a p e s i a y a l l u n d a e a n d T a p e s i a a c u f o n n i s u s i n g P C R a s s a y . P l a n t P a t h o l o g y 4 6 : 8 4 2 - 8 5 6 . O ’ B r i e n , J . G . 1 9 8 3 . O c c u r r e n c e o f R h a b d o c l i n e t a x a i n D o u g l a s - f i r C h r i s t m a s t r e e p l a n t a t i o n s i n M i c h i g a n . P l a n t D i s e a s e 6 7 ( 9 ) : 6 6 1 - 6 6 4 . S c h i l l i n g , A . G . , M o l l e r , E . M . , a n d G e i g e r , H . H . 1 9 9 6 . P o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n — b a s e d a s s a y s f o r s p e c i e s - s p e c i f i c d e t e c t i o n o f F u s a n ' u m c u l m o r u m , F . g r a m i n e a r u m a n d F . a v e n a c e u m . P h y t o p a t h o l o g y 8 6 ( 5 ) : 5 1 5 - 5 2 2 . S c h u b e r t , R . , B a h n w e g , G . , N e c h w a t a l , J . , J u n g , T . , C o o k e , D . E . L . , D u n c a n , J . M . , M u l l e r - S t a r c k , G . , L a n g e b a r t e l s , C . , S a n d e r m a n n J R , H . , a n d O b w a l d , W . 1 9 9 9 . D e t e c t i o n a n d q u a n t i f i c a t i o n o f P h y t o p h t h o r a s p e c i e s w h i c h a r e a s s o c i a t e d w i t h r o o t - r o t d i s e a s e s i n E u r o p e a n d e c i d u o u s f o r e s t s b y s p e c i e s - s p e c i fi c p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n . E u r o p e a n J o u r n a l o f F o r e s t P a t h o l o g y 2 9 : 1 6 9 - 1 8 8 . S i m o n , L . , L e v e s q u e , C . , a n d L a l o n d e , M . 1 9 9 2 . R a p i d q u a n t i t a t i o n b y P C R o f e n d o m y c o r r h i z a l f u n g i c o l o n i z i n g r o o t s . P C R M e t h o d s A p p l i c a t i o n s 2 : 7 6 - 8 0 . S i n c l a i r , W . A . , L y o n , H . H a n d J o h n s o n , W . T . 1 9 8 9 . D i s e a s e s o f T r e e s a n d S h r u b s , 2 " G I e d n . C o r n e l l U n i v e r s i t y P r e s s : C o m s t o c k P u b . A s s o c i a t e s , I t h a c a , Y o r k . p : 4 0 - 4 1 S m i t h , O . P . , P e t e r s o n , G . L . , B e c k , R J . , S c h a a d , N . W . , a n d B o n d e , M . R . 1 9 9 6 . 1 1 3 S t o n e , J . ( E d i t o r s ) . l , T r o u t , C . L d e t e c t i o n u s i n g P C R W i n t o n , L , O n e - t u b e C h a i n R e a l D e v e l o p m e n t o f a P C R - b a s e d m e t h o d f o r i d e n t i fi c a t i o n o f T i / I e t i a i n d i c a , c a u s a l a g e n t o f K a r n a l b u n t o f w h e a t . P h y t o p a t h o l o g y 8 6 ( 1 ) : 1 1 5 - 1 2 2 . S t o n e , J . K . 1 9 9 7 . R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t . I n : H a n s e n , E . M . a n d K . J . L e w i s ( E d i t o r s ) . C o m p e n d i u m o f c o n i f e r d i s e a s e s . p : 5 4 - 5 5 . A P S P r e s s , S t P a u l , M N . T r o u t , C . L . , R i s t a i n o , J . B . , M a d r i t c h , M . , a n d W a n g s o m b o o n d e e , T . 1 9 9 7 . R a p i d d e t e c t i o n o f P h y t o p h t h o r a i n f e s t a n s i n l a t e b l i g h t - i n f e c t e d p o t a t o a n d t o m a t o u s i n g P C R . P l a n t D i s e a s e 8 1 ( 9 ) : 1 0 4 2 - 1 0 4 8 . W i n t o n , L . M . , S t o n e , J . K . , W a t r u d , L . S . , a n d H a n s e n , E . M . 2 0 0 2 . S i m u l t a n e o u s O n e - t u b e q u a n t i fi c a t i o n o f H o s t a n d P a t h o g e n D N A w i t h R e a l - T i m e P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n . P h y t o p a t h o l o g y 9 2 ( 1 ) : 1 1 2 - 1 1 6 . 1 1 4 C H A P T E R 3 P C R D e t e c t i o n o f t h e e n d o p h y t e R h a b d o c l i n e p a r k e r i i n n e e d l e s o f P s e u d o t s u g a e m e n z i e s i i b y S p e c i e s - s p e c i fi c p r o b e s A B S T R A C T I n t h i s s t u d y , w e d e s i g n e d s p e c i e s - s p e c i f i c p r i m e r s f r o m c o n s e r v e d s e q u e n c e s o f i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r s o f r i b o s o m a l D N A a m o n g R h a b d o c l i n e p a r k e r i i s o l a t e s f o r d e t e c t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n o f t h e e n d o p h y t e i n D o u g l a s fi r t r e e s . P r i m e r s t e s t e d w e r e s u f fi c i e n t l y s p e c i fi c t o d i s t i n g u i s h t h e e n d o p h y t e f r o m o t h e r R h a b d o c l i n e t a x a a n d o t h e r f u n g i p r e s e n t i n o r o n D o u g l a s fi r n e e d l e s i n b o t h P C R a n d d o t - b l o t a s s a y s . E s p e c i a l l y t h e p r i m e r p a i r R P 1 - R P 4 d e t e c t e d t h e e n d o p h y t e i n n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s o f D N A f r o m i n f e c t e d n e e d l e s o f d i f f e r e n t a g e s . T h e p r i m e r p a i r c o n s i s t e n t l y a n d e f f e c t i v e l y a m p l i fi e d 3 9 4 b p s p e c i fi c D N A f r a g m e n t s . N o a m p l i fi c a t i o n o c c u r r e d w i t h D N A o f R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t a n d S w i s s n e e d l e c a s t p a t h o g e n s o r D N A o f a n y o t h e r e n d o p h t i c f u n g i t e s t e d . I n c o n t r a s t t o t h e l i t e r a t u r e , d e t e c t i o n o f t h e e n d o p h y t e b y t h e p r i m e r s i n c u r r e n t y e a r n e e d l e s c o l l e c t e d j u s t a f t e r b u d b r e a k i n d i c a t e d t h a t R . p a r k e r i i n f e c t s n e e d l e s a f t e r b u d b r e a k s j u s t a s o t h e r p a t h o g e n i c R h a b d o c l i n e t a x a . R e s t r i c t i o n d i g e s t s w i t h 4 r a r e c u t t e r e n z y m e s ( B s t N l , B s t U l , S c a l a n d S p e l ) 1 1 5 c o n fi r m e d t h a t a l l P C R p r o d u c t s a m p l i f i e d f r o m a l l a g e s o f n e e d l e s b e l o n g e d t o t h e t a r g e t f u n g u s . T h e s p e c i fi c i t y o f 5 p r o b e s t o R . p a r k e r i w a s d e t e r m i n e d i n d o t - b l o t a s s a y s o f I T S 1 F a n d I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s . A s s a y s w i t h p r o b e s h y b r i d i z e d t o t o t a l D N A e x t r a c t e d f r o m h y p h a e o r f r u i t i n g b o d i e s r e v e a l e d t h a t t h e p r o b e s c o u l d b e u s e d t o d i f f e r e n t i a t e t h e e n d o p h y t e f r o m o t h e r R h a b d o c l i n e t a x a . F o r t h e fi r s t t i m e , i t w a s s h o w n t h a t P C R a n d d o t - b l o t a s s a y s a r e u s e f u l f o r d i a g n o s t i c d e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f t h e e n d o p y t e R . p a r k e r i i n c o n i f e r n e e d l e s . 1 1 6 I n t h e i r M E 1 9 7 7 ; C 2 0 0 0 ) . i t h e l l s s n w i t h o u t S y m b i o g r a s s e s e v e r g r e a n d W l a g e n u s l ’ m p t o . m e n z i e : e n d O p h I N o n h w e i n f e c t i o n g e n e t i c r R D a r k e l f U n g l a n t S e v e r a l i I N T R O D U C T I O N I n f e c t i o n s o f p l a n t s b y e n d o p h y t i c f u n g i a r e c o m m o n , i f n o t u b i q u i t o u s , b u t t h e i r p r e s e n c e i s n o t r e v e a l e d b y e x t e r n a l s y m p t o m s ( B e r n s t e i n a n d C a r r o l l , 1 9 7 7 ; C a r r o l l , 1 9 8 8 ; P e t r i n i e t a l . 1 9 8 2 ; H e l a n d e r e t a l . 1 9 9 4 ; F r o h l i c h e t a l . 2 0 0 0 ) . E n d o p h y t e s i n f e c t s p e c i f i c p l a n t t i s s u e s i n w h i c h t h e y r e m a i n l a t e n t u n t i l t h e t i s s u e i s s e n e s c e n t o r d a m a g e d . T h e n , t h e f u n g i f r u i t a n d i n v a d e l a r g e r a r e a s w i t h o u t c a u s i n g v i s i b l e d a m a g e . T h e y m a y b e p a r a s i t i c s y m b i o n t s o r m u t u a l i s t i c s y m b i o n t s ( C a r r o l l , 1 9 8 8 ) . E n d o p h y t i c i n f e c t i o n s h a v e b e e n d e s c r i b e d m a i n l y i n g r a s s e s ( D o s s , 1 9 9 8 ; G r o p p e a n d B o l l e r , 1 9 9 7 ) s h r u b s ( P e t r i n i e t a l . 1 9 8 2 ) a n d e v e r g r e e n t r e e s ( C a r r o l l a n d C a r r o l l , 1 9 7 8 ; P e t r i n i a n d C a r r o l l , 1 9 8 1 ; J o h n s o n a n d W h i t n e y , 1 9 9 2 ) . T h e s e f u n g i a r e o f t e n l i m i t e d t o o n e o r a f e w p l a n t s p e c i e s i n a g e n u s a n d c a n b e c o n s i d e r e d h o s t s p e c i fi c ( R e d l i n a n d C a r r i s . 1 9 9 6 ) . O n e c o m m o n e n d o p h y t e , R h a b d o c l i n e p a r k e r i S h e m o o d - P i k e , c a u s e s s y m p t o m l e s s l a t e n t i n f e c t i o n s o n l y i n t h e n e e d l e s o f D o u g l a s fi r , P s e u d o t s u g a e m e n z i e s i i ( M i r b . ) F r a n k o ( S h e m o o d - P i k e e t a l . 1 9 8 6 ; S t o n e , 1 9 8 7 ) . T h e e n d o p h y t e i n f e c t s 3 0 - 7 0 % o f t h e n e e d l e s o f n e a r l y e v e r y t r e e i n t h e P a c i fi c N o r t h w e s t ( C a r r o l l a n d C a r r o l l , 1 9 7 8 ) . T h e f u n g u s i n f e c t s y o u n g n e e d l e s . T h e i n f e c t i o n f r e q u e n c y i n c r e a s e s w i t h a g e o f t h e n e e d l e b u t i s a l s o i n fl u e n c e d b y t h e g e n e t i c m a k e u p o f i n d i v i d u a l t r e e s ( S t o n e , 1 9 8 7 ; T o d d , 1 9 8 8 ) . T h e d i s t r i b u t i o n o f R . p a r k e r i i n t h e h o s t t i s s u e i s d i f f e r e n t f r o m t h a t o f o t h e r R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t f u n g i a n d f r o m t h e e n d o p h y t e s o f g r a s s e s . A D o u g l a s fi r n e e d l e m a y h a v e s e v e r a l i n d e p e n d e n t R . p a r k e r i i n f e c t i o n s , b u t t h e s e a r e l i m i t e d t o s i n g l e 1 1 7 e p i d e r m a l c e l l s w h e r e t h e y r e m a i n l a t e n t f o r 2 - 5 y e a r s u n t i l t h e o n s e t o f n e e d l e s e n e s c e n c e . H o w e v e r , o n l y a s m a l l p o r t i o n o f t h e c e l l s o f t h e n e e d l e e p i d e r m i s i s c o l o n i z e d , e v e n w h e r e i n f e c t i o n f r e q u e n c i e s a r e c o m p a r a t i v e l y h i g h . I n c r e a s e i n i n f e c t i o n f r e q u e n c i e s w i t h n e e d l e a g e i s d u e t o r e p e a t e d r e i n f e c t i o n o f n e e d l e s d u r i n g t h e i r l i f e t i m e r a t h e r t h a n c o l o n i z a t i o n o f n e e d l e s f r o m a f e w i n i t i a l i n f e c t i o n s i t e s ( S t o n e , 1 9 8 7 ) . R h a b d o c l i n e p a r k e r i i s a n a s c o m y c e t e t h a t f o r m s a p o t h e c i a o n s e n e s c e n t n e e d l e s , a n d i t i s a m e m b e r o f t h e o r d e r R h y t i s m a t a / e s ( H a w k s w o r t h , 2 0 0 2 ) . T h e a n a m o r p h , M e n ' a p a r k e r i S h e n / v o o d i s p r e s e n t o n t h e l e s i o n s p r o d u c e d i n t h e fi r s t y e a r n e e d l e s b y l e a f - m i n i n g l a r v a e o f t h e m i d g e C o n t a r i n i a a n d o n a b s c i s e d n e e d l e s ( S h e r w o o d - P i k e e t a l . 1 9 8 6 ) . T h e c o n i d i a a r e d i s p e r s e d b y r a i n s p l a s h t o n e w n e e d l e s f r o m f a l l e n n e e d l e s . T h e f u n g u s p e n e t r a t e s h o s t e p i d e r m a l c e l l s d i r e c t l y t h r o u g h t h e c u t i c l e a n d c e l l w a l l b y a t h i n p e n e t r a t i o n p e g . T h e e n d o p h y t e f o r m s i n t r a c e l l u l a r h y p h a e w h i c h c o n s i s t o f a f e w s w o l l e n c e l l s c o n s t r i c t e d a t t h e c r o s s w a l l s a n d w h i c h o c c u p y t h e e n t i r e l u m e n o f a s i n g l e e p i d e r m a l o r h y p o d e r r n a l c e l l ( S t o n e , 1 9 8 7 ) . R h a b d o c l i n e p a r k e n ' i s u s u a l l y d e t e c t e d a n d i d e n t i f i e d b y h i s t o l o g i c a l ( S t o n e , 1 9 8 7 ) a n d c l a s s i c a l i s o l a t i o n t e c h n i q u e s ( C a r r o l l a n d C a r r o l l 1 9 7 8 ; P e t r i n i a n d C a r r o l l , 1 9 8 1 ) . H o w e v e r , t h e f u n g u s g r o w s s l o w l y o n l a b o r a t o r y m e d i a a n d i s d i f fi c u l t t o i d e n t i f y b y m o r p h o l o g i c a l a n d c u l t u r a l c h a r a c t e r i s t i c s . I d e n t i fi c a t i o n s o f R . p a r k e n ‘ c a n b e m a d e o n l y a f t e r i t f o r m s f r u i t i n g b o d i e s o n f a l l e n n e e d l e s . A l t h o u g h t h e s e m e t h o d s a r e r e l i a b l e a n d i n e x p e n s i v e , t h e y a r e l i m i t e d b y t h e 1 1 8 s m a l l n u m b e r o f s a m p l e s t h a t c a n b e h a n d l e d s i m u l t a n e o u s l y d u e t o t h e c o n s i d e r a b l e l a b o r a n d t i m e r e q u i r e d f o r t h e i r p r e p a r a t i o n a n d e x a m i n a t i o n . F u r t h e r m o r e , i n f e c t i o n c a n b e m i s s e d e s p e c i a l l y w h e n h y p h a e a r e s p a r s e l y d i s t r i b u t e d i n h o s t t i s s u e . M o r e a c c u r a t e a n d s e n s i t i v e m e t h o d s c a n p r o v i d e a n e a s y , f a s t a n d r e l i a b l e d e t e c t i o n o f R . p a r k e r i . M o l e c u l a r t e c h n i q u e s , p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( P C R ) a n d d o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s , p r o v i d e a f a s t a n d e a s y w a y t o d e t e c t a n d i d e n t i f y f u n g i b o t h i n c u l t u r e a n d i n i n f e c t e d p l a n t t i s s u e s . P C R i s u s e d t o d i s t i n g u i s h b e t w e e n c l o s e l y r e l a t e d f u n g a l s p e c i e s a n d i s m o r e s e n s i t i v e a n d s p e c i fi c t h a n c o n v e n t i o n a l d e t e c t i o n t e c h n i q u e s . P C R e m p l o y s o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s d e s i g n e d f r o m g e n o m i c , m i t o c h o n d r i a l a n d e s p e c i a l l y r e p e t e t i v e r i b o s o m a l D N A s e q u e n c e s . C u r r e n t l y , t h e m e t h o d i s u s e d f o r d e t e c t i o n o f m a n y e n d o p h y t i c f u n g i o f g r a s s e s ( D o s s a n d W e l t y , 1 9 9 5 ; G r o p p e a n d B o l l e r , 1 9 9 7 ; D o s s , 1 9 9 8 ) , a n d p r o v i d e s a c o n v e n i e n t m e a n s o f a s c e r t a i n i n g i n f e c t i o n s t a t u s . A l t h o u g h d o t - b l o t a s s a y s h a v e a l s o b e e n e x t e n s i v e l y u s e d f o r d e t e c t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f m a n y p a t h o g e n i c f u n g i ( L i e t a l . 1 9 8 8 ; L e e e t a l . 1 9 9 3 ; L e v e s q u e e t a l 1 9 9 4 ; J o h a n s o n a n d J e g e r , 1 9 9 3 ; B r u n s a n d G a r d e s , 1 9 9 3 ) , t h e t e c h n i q u e h a s b e e n r a r e l y u s e d f o r d e t e c t i o n e n d o p h y t e s ( D o s s a n d W e l t y , 1 9 9 5 ) . T o d a t e , n e i t h e r P C R n o r d o t - b l o t h a s b e e n u s e d f o r d e t e c t i o n o f e n d o p h y t e s s p e c i fi c t o c o n i f e r s . S u c h m e t h o d s c o u l d p r o v i d e a c c u r a t e , r a p i d a n d s e n s i t i v e m e a n s o f s t u d y i n g t h e e c o l o g y a n d d i s t r i b u t i o n o f t h e e n d o p h y t e . T h e p r o b e s c o u l d a l s o b e u s e d f o r q u a n t i f y i n g i n f e c t i o n f r e q u e n c i e s . 1 1 9 R e c e n t l y , G e r h a r d t e t a l . ( 1 9 9 7 ) s e q u e n c e d t h e I T S r e g i o n s o f r i b o s o m a l D N A o f R . p a r k e n ' a n d f o u n d t h a t i t w a s p h y l o g e n e t i c a l l y r e l a t e d t o o t h e r R h a b d o c l i n e t a x a . M c C u t c h e o n e t a l . ( 1 9 9 3 ) d i s t i n g u i s h e d d i f f e r e n t g e n o t y p e s o f R . p a r k e r i b y u s i n g R a n d o m l y A m p l i fi e d P o l y m o r p h i c D N A ( R A P D ) a n a l y s i s a n d f o u n d h i g h g e n o t y p i c d i v e r s i t y i n p o p u l a t i o n s i n f e c t i n g l a r g e , o l d t r e e s . T h e s e s t u d i e s u s e d p u r e m y c e l i a l c u l t u r e s . N o a t t e m p t h a s b e e n m a d e t o d e v e l o p a P C R t e c h n i q u e t h a t c o u l d d e t e c t t h e e n d o p h y t e i n n e e d l e s w i t h o u t t h e n e e d t o fi r s t i s o l a t e t h e f u n g u s . T h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y w a s t o d e v e l o p a n d e v a l u a t e D N A - b a s e d m e t h o d s f o r d e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f R . p a r k e r i i n i n f e c t e d n e e d l e s . S p e c i e s - s p e c i f i c p r o b e s w e r e d e s i g n e d f r o m c o n s e r v e d r e g i o n s o f i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r s o f r i b o s o m a l D N A o f t h e f u n g u s a n d t e s t e d i n b o t h P C R a n d d o t - b l o t a s s a y s . 1 2 0 M A T E R I A L S A N D M E T H O D S I s o l a t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n o f f u n g a l s t r a i n s T h e f u n g a l i s o l a t e s a n d D o u g l a s f i r n e e d l e s p e c i m e n s u s e d i n t h i s s t u d y a r e l i s t e d i n T a b l e 3 . 1 . A l l t h e i s o l a t e s e x c e p t R h a b d o c l i n e p a r k e n ' w e r e g r o w n a n d m a i n t a i n e d o n m a l t e x t r a c t a g a r ( D i f c o L a b o r a t o r i e s , D e t r o i t , M i c h i g a n ) . R h a b d o c l i n e p a r k e r i w a s i s o l a t e d f r o m 1 - 5 y e a r o l d n e e d l e s a s d e s c r i b e d ( T o d d , 1 9 8 8 ; M c C u t c h e o n e t a l . 1 9 9 3 ; G e r n a n d t e t a l . 1 9 9 7 ) w i t h s o m e m o d i fi c a t i o n s . N e e d l e s w e r e s u r f a c e s t e r i l i z e d b y s o a k i n g f o r 1 m i n i n 9 5 ° / o e t h a n o l , b r i e fl y r i n s i n g i n s t e r i l e d i s t i l l e d w a t e r a n d s o a k i n g f o r 1 0 m i n i n c o m m e r c i a l b l e a c h ( 5 0 - 7 5 % ) , f o l l o w e d b y a s e c o n d b r i e f r i n s e i n s t e r i l e d i s t i l l e d w a t e r . T h e n e e d l e s w e r e b l o t t e d a n d d r i e d o n a s t e r i l e p a p e r t o w e l f o r a f e w m i n u t e s a n d c u t w i t h a s c a l p e l i n t o t h r e e t o fi v e s e g m e n t s . T h e s e g m e n t s w e r e i m m e d i a t e l y p l a t e d o n p e t r i d i s h e s c o n t a i n i n g P D M Y a g a r ( p o t a t o d e x t r o s e a g a r a m e n d e d w i t h 2 % m a l t e x t r a c t a n d 1 % y e a s t e x t r a c t , D i f c o ( S h e n i v o o d - P i k e e t a l . 1 9 8 5 ; S t o n e , 1 9 8 6 ) . S t r e p t o m y c i n s u l p h a t e ( 2 0 0 p p m / L ) w a s a d d e d t o p r e v e n t b a c t e r i a l g r o w t h . T h e p l a t e s w e r e i n c u b a t e d a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d c h e c k e d d a i l y o v e r t w o w e e k s f o r f u n g a l g r o w t h . T h e f u n g i g r o w i n g o u t w e r e s u b c u l t u r e d o n t h e s a m e m e d i u m . F o r D N A e x t r a c t i o n s , s t e r i l e c e l l u l o s e m e m b r a n e s c u t t o fi t p e t r i d i s h e s w e r e p l a c e d o n t h e m e d i u m a n d m y c e l i a w e r e s p r e a d o v e r t h e p l a t e s t o a t t a i n g r o w t h o f s u f fi c i e n t m a s s o f h y p h a e . T h e i s o l a t e s o f R . p a r k e r i c o u l d p r o d u c e g r o w t h o f 2 . 5 c m d i a m e t e r a t r o o m t e m p e r a t u r e i n m o r e t h a n 1 m o n t h a n d w e r e i d e n t i fi e d b y c o m p a r i s o n w i t h A m e r i c a n T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n i s o l a t e 2 0 1 6 6 0 ( F i g u r e 3 . 1 ) . 1 2 1 T a b l e 3 . 1 . F u n g a l i s o l a t e s a n d n e e d l e s p e c i m e n s w i t h i d e n t i f i e d f u n g a l f r u i t i n g b o d i e s u s e d i n t h e s t u d y S p e c i e s ' C o d e H o s t 4 S o u r c e L e n g t h s G e n B a n k # A u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n s A P P i n u s s y l v e s t r i s M I 5 1 1 A F O 1 3 2 2 9 H o n n o n e m a d e m a t i o i d e s H D P i n u s s y l v e s t r i s M I 5 1 7 A F O 1 3 2 2 7 M e n ' a p a r k e r i M P - A T C C P . m e n z i e s i i ( c c ) A T C C 6 5 1 4 P h a e o c r y p t o p u s g a u m a n n i i P G P . m e n z i e s i i ( I M ) M I 5 1 3 A F 0 1 3 2 2 5 R h a b d o c l i n e p a r k e r i R P - A T C C P . m e n z i e s i i ( C O ) A T T C 4 5 1 A F 2 6 0 8 1 3 R P - C O A P . m e n z i e s i i ( C O ) W A R P - C O B P . m e n z i e s i i ( C O ) W A R P - C O C P . m e n z i e s i i ( C O ) W A R P - C O D P . m e n z i e s i i ( C O ) W A R P - C O E P . m e n z i e s i i ( C O ) W A 4 5 2 A F 4 6 2 4 2 7 R P - C O F P . m e n z i e s i i ( C O ) W A R P - C O G P . m e n z i e s i i ( C O ) W A R P - C O H P . m e n z i e s i i ( C O ) W A 4 5 0 A F 4 6 2 4 2 3 R P - C H M I P . m e n z i e s i i ( I M ) M I 4 5 0 A F 4 6 2 4 2 5 R P - O C M I P . m e n z i e s i i ( I M ) M I 4 5 0 A F 4 6 2 4 2 9 R P - O R 1 P . m e n z i e s i i ( C O ) O R 4 5 0 U 9 2 2 9 7 R P - O R 2 P . m e n z i e s i i ( I M ) O R 4 5 0 U 9 2 2 9 5 R P - O R 3 P . m e n z i e s i i ( C O ) C R 4 4 9 U 9 2 2 9 6 R P - O R 4 P . m e n z i e s i i ( I M ) O R 4 5 1 U 9 2 2 9 4 R P - W A 1 0 3 P . m e n z i e s i i ( I M ) W A 4 4 9 A F 4 6 2 4 2 6 R P - W A 1 0 4 P . m e n z i e s i i ( I M ) W A 4 4 9 A F 4 6 2 4 2 4 S c l e r o p h o m a p i t h y o p h i l a S P P i n u s s y l v e s t r i s M I 5 1 6 A F 4 6 2 4 3 8 P h o m a - l i k e e n d o p h y t e P . m e n z i e s i i ( I M ) W A A Y 1 8 3 3 7 2 X y l a r i a a r b u s c u l a P . m e n z i e s i i ( I M ) W A A Y 1 8 3 3 6 9 X y l a n ' a l e a n s p . P . m e n z i e s i i ( I M ) M l A Y 1 8 3 3 6 8 B o t r y o s p h a e r a s p . P . m e n z i e s i i ( I M ) M l A Y 1 8 3 3 7 0 N e e d l e s p e c i m e n s ’ P h a e o c r y p t o p u s g a u m a n n i i P G - M l 1 P . m e n z i e s i i ( I M ) M l R . p s e u d o t s u g a e s s p . R P E - O R 1 P . m e n z i e s i i ( I M ) O R 4 4 8 U 9 2 2 9 2 e p i p h y l l a R . p s e u d o t s u g a e s s p . R P P - 0 R 2 P . m e n z i e s i i ( I M ) O R 4 4 7 U 9 2 2 9 0 p s e u d o t s u g a e R P P - 0 R 3 P . m e n z i e s i i ( I M ) O R 4 4 8 U 9 2 2 9 1 R P P - C H M I P . m e n z i e s i i ( I M ) M I 4 4 7 A F 4 6 2 4 2 0 R P P - O C M I 1 P . m e n z i e s i i ( I M ) M I 4 5 0 A F 4 6 2 4 R P P - W A 2 9 P . m e n z i e s i i ( I M ) W A 4 4 7 A F 4 6 2 4 2 2 R . w e i r f i s p p . o b o v a t a R W O B V - 0 R 5 P . m e n z i e s i i ( I M ) O R 4 4 8 U 9 2 2 9 3 R . w e i n ' i s p p . o b l o n g a R W O B L - M M P . m e n z i e s i i ( I M ) M I 4 4 8 A F 2 6 0 8 1 4 R W O B L - M I 2 P . m e n z i e s i i ( I M ) M l R W O B L - M l 3 P . m e n z i e s i i ( I M ) M l R W O B L - M l 4 P . m e n z i e s i i ( I M ) M l R . w e i r i i s s p . w e i r i i R W W - 0 R 1 P . m e n z i e s i i ( I M ) O R 4 3 9 U 9 2 3 0 0 R W W - 0 R 2 P . m e n z i e s i i ( I M ) O R 4 3 9 U 9 2 3 0 1 N e e d l e s fl i m e s 3 I M M I 3 , 4 , 5 P . m e n z i e s i i ( I M ) M l l M W A O ( 4 5 - 8 8 ) P . m e n z i e s i i ( I M ) W A l M W A 1 ( 1 - 4 4 ) P . m e n z i e s i i ( I M ) W A C O W A 2 , 3 , 4 P . m e n z i e s i i ( C O ) W A D F - H P . m e n z i e s i i M l 1 2 2 2 N e e a n d F 3 I M I I I M 5 6 e x c e r I I I N U s o u r c l M W / s e e d C O V V v a r i e l D F - H D e p a ‘ c o m e n z 5 I T S e l s r p a r k s I I T a b l e 3 . 1 . c o n t ’ d ‘ M y c e l i a l i s o l a t e s 2 N e e d l e s p e c i m e n s c a r r y i n g f r u i t i n g b o d y o f p a t h o g e n i c R h a b d o c l i n e s u b s p e c i e s a n d P . g a u m a n i i . 3 l M M I 3 n e e d l e s p e c i m e n s . 3 - 5 y e a r o l d c o l l e c t e d f r o m a D o u g l a s f i r t r e e o f a n I M s e e d s o u r c e g r o w n i n M i c h i g a n h a v i n g n o R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t i n f e c t i o n e x c e p t p r e s u m a b l y R . p a r k e r i . l M W A 1 ( 1 - 4 4 ) n e e d l e s p e c i m e n s . 1 y e a r o l d f r o m D o u g l a s f i r t r e e s o f I M s e e d s o u r c e s g r o w n i n W a s h i n g h t o n S t a t e . l M W A O ( 4 5 - 8 8 ) n e e d l e s p e c i m e n s . C u r r e n t y e a r f r o m D o u g l a s fi r t r e e s o f I M s e e d s o u r c e s g r o w n i n W a s h i n g h t o n S t a t e . C o l l e c t e d a t t h e b e g i n n i n g o f M a y . C O W A 2 - 4 n e e d l e s p e c i m e n s . 2 - 4 y e a r s o l d f r o m a D o u g l a s f i r t r e e o f c o a s t a l v a r i e t y o f g r o w n i n W a s h i n g t o n s t a t e a n d i n f e c t e d w i t h R . p a r k e r i . D F - H : N e e d l e s o f D o u g l a s f i r o f I M s e e d s o u r c e c o l l e c t e d f r o m t h e G a r d e n o f D e p a r t m e n t o f C r o p a n d S o i l S c i e n c e , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y . ‘ C O a n d I M r e f e r t o C o a s t a l ( P . m e n z i e s i i v a r m e n z i e s i i ) a n d l n t e r m o u n t a i n ( P . m e n z i e s i i v a r . g l a u c a ) v a r i e t i e s o f D o u g l a s fi r r e s p e c t i v e l y . 5 I T S l e n g t h i n c l u d e s I T S I , 5 . 8 8 D N A a n d I T S I I r e g i o n s . 6 I s o l a t e s f r o m A m e r i c a n T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n . M . p a r k e r i # 6 2 7 0 4 a n d R . p a r k e n ‘ # 2 0 1 6 6 0 1 2 3 F i g u r e a t I O Q m 3 . t 1 e . ” F i g u r e 3 . 1 . F i v e w e e k s o l d g r o w t h o f R . p a r k e r i i s o l a t e s o n P D M Y a g a r i n c u b a t e d a t r o o m t e m p e r a t u r e i n d i f f u s e l i g h t . 1 2 4 T h e s o u r c e s o f n e e d l e s a m p l e s u s e d i n t h i s s t u d y a r e a l s o l i s t e d i n T a b l e 3 . 1 . J e f f S t o n e ( O r e g o n S t a t e U n i v e r s i t y ) s u p p l i e d i d e n t i f i e d s a m p l e s i n f e c t e d b y d i f f e r e n t s p e c i e s a n d s u b s p e c i e s o f R h a b d o c l i n e f o u n d i n O r e g o n ( O R ) . G a r y C h a s t a g n a r ( W a s h i n g t o n S t a t e U n i v e r s i t y ) p r o v i d e d n e e d l e s o f t h e c o a s t a l v a r i e t y o f D o u g l a s fi r ( P s e u d o t s u g a e m e n z i e s i i ) i n f e c t e d w i t h R . p a r k e n ' a n d i n t e r m o u n t a i n f o r m ( I M ) . P . m e n z i e s i i v a r . g l a u c a ( B e i s s n . ) F r a n c o i n f e c t e d w i t h o r w i t h o u t R h a b d o c l i n e p s e u d o t s u g a s s p . p s e u d o t s u g a P a r k e r & R e i d c o l l e c t e d f r o m W a s h i n g t o n s t a t e ( W A ) . N e e d l e s a m p l e s w e r e a l s o c o l l e c t e d d u r i n g v i s i t s t o p l a n t a t i o n s i n C h e y b o g a n a n d O c e a n a C o u n t i e s i n M i c h i g a n ( M I ) , o r s e n t b y M S U e x t e n s i o n a g e n t s t h r o u g h o u t M i c h i g a n . F r u i t i n g b o d i e s o f R h a b d o c l i n e o n t h e n e e d l e s a m p l e s w e r e i d e n t i f i e d t o s p e c i e s a n d s u b s p e c i e s u s i n g t h e m o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s d e s c r i b e d b y P a r k e r & R e i d ( 1 9 6 9 ) a n d F u n k ( 1 9 8 5 ) D N A e x t r a c t i o n f r o m m y c e l i u m o f f u n g i F u n g a l m y c e l i a g r o w n o n c e l l u l o s e m e m b r a n e - c o v e r e d p l a t e s w e r e s c r a p e d i n t o 1 5 m l t u b e s a n d l y o p h i l i z e d f o r 2 d a y s . D N A w a s e x t r a c t e d a c c o r d i n g t o t h e p r o t o c o l d e s c r i b e d b y L e e e t a l . ( 1 9 8 8 ) . L y o p h i l i z e d h y p h a e ( a p p r o x i m a t e l y 1 0 0 m g ) w e r e s u s p e n d e d i n 7 0 0 p l l y s i s b u f f e r ( 5 0 m M T r i s - H C I , 5 0 m M E D T A , 3 % S D S p H 8 . 0 ; a m e n d e d w i t h 1 % 2 - m e r c a p t o e t h a n o l j u s t p r i o r t o e a c h u s e ) . P e s t l e s w e r e s o a k e d i n d i l u t e H C I ( 1 : 1 0 ) a n d c l e a n e d w i t h s o a p a n d w a t e r b e f o r e s t e r i l i z a t i o n . M y c e l i a w e r e c r u s h e d w i t h p e s t l e s f o r 3 - 5 m i n u t e s a n d i n c u b a t e d 1 h o u r a t 6 5 C . T h e n , 7 0 0 p l p h e n o l z c h l o r o f o r m 2 i s o a m y l a l c o h o l 1 2 5 ( 2 5 1 B w e n ; a q u e c a k o h r c h k n c v o d e x c o H e c w e n s a n d o D o u r e l D H 8 P O I V S E t o f u r l a d d e d C T A B t h e D I w d h 1 I r a n s f é V o l u m , S U D e n W a s t r V O I U m I D Q H Q t , ( 2 5 : 2 4 : 1 , S i g m a A l d r i c h C o r p o r a t i o n , S t L o u i s , M O ) w a s a d d e d a n d t h e t u b e s w e r e v o r t e x e d b r i e fl y . T u b e s w e r e c e n t r i f u g e d a t 1 2 0 0 0 r p m f o r 1 0 m i n a n d t h e a q u e o u s t o p p h a s e w a s t r a n s f e r r e d t o n e w t u b e s . T h e p h e n o l z c h l o r o f o r m : i s o a m y l a l c o h o l t r e a t m e n t a n d c e n t r i f u g a t i o n s t e p s w e r e r e p e a t e d . T h e n , 7 0 0 p l c h l o r o f o r m : i s o a m y l a l c o h o l ( 2 4 : 1 ) w a s a d d e d t o t h e s u p e r n a t a n t , w h i c h w a s v o r t e x e d a n d s p u n a t 1 2 0 0 0 r p m f o r 5 m i n u t e s . T h e a q u e o u s p h a s e w a s c o l l e c t e d a n d 2 0 p l o f 3 M s o d i u m a c e t a t e a n d 0 . 5 v o l u m e o f i s o p r o p y l a l c o h o l w e r e a d d e d . D N A w a s p r e c i p i t a t e d b y i n v e r t i n g t h e t u b e s g e n t l y s e v e r a l t i m e s a n d c e n t r i f u g a t i n g f o r 1 0 m i n a t 1 3 0 0 0 g a t 4 C t o p e l l e t . T h e s u p e r n a t a n t w a s p o u r e d o f f a n d p e l l e t s w e r e r e s u s p e n d e d i n 1 0 0 p l T E b u f f e r ( 1 0 m M H C I - T r i s , p H 8 a n d 0 . 5 M E D T A , p H 8 a n d s t o r e d a t - - 2 0 C . A c l e a n i n g p r o c e d u r e f o r p o l y s a c c h a r i d e - c o n t a m i n a t e d D N A d e s c r i b e d b y A u s u b e l e t a l ( 2 0 0 1 ) w a s u s e d t o f u r t h e r p u r i f y m i n i p r e p s i f P C R a m p l i fi c a t i o n i n i t i a l l y f a i l e d . 5 M N a C l w a s a d d e d t o t h e D N A s o l u t i o n t o g i v e a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 7 M N a C L . A 1 0 % C T A B i n 0 . 7 M N a C l w a s a l s o a d d e d t o g i v e a fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f 1 % C T A B i n t h e D N A s a m p l e b e f o r e i n c u b a t i n g a t 6 5 C f o r 1 5 m i n . T h e s o l u t i o n w a s e x t r a c t e d w i t h 1 v o l u m e o f c h l o r o f o r m : i s o a m y l a l c o h o l ( 2 4 : 1 ) a n d a q u e o u s l a y e r w a s t r a n s f e r r e d t o a n e w t u b e f o l l o w i n g c e n t r i f u g a t i o n a t 1 2 0 0 0 r p m f o r 5 m i n . T h e n , 1 v o l u m e o f p h e n o l : c h l o r o f o r m : i s o a m y l a l c o h o l ( 2 5 : 2 4 : 1 ) w a s a d d e d t o t h e s u p e r n a t a n t a n d c e n t r i f u g e d a t 1 2 0 0 0 r p m f o r 5 m i n u t e s a g a i n . T h e s u p e r n a t a n t w a s t r a n s f e r r e d t o a n e w t u b e f o r t h e l a s t t i m e . D N A w a s p r e c i p i t a t e d w i t h 0 . 6 v o l u m e i s o p r o p a n o l a n d c o l l e c t e d b y c e n t r i f u g i n g a t 1 2 0 0 0 r p m f o r 1 5 m i n . D N A p e l l e t w a s w a s h e d w i t h 7 0 % e t h a n o l a n d c e n t r i f u g e d f o r 5 m i n . T h e s u p e r n a t a n t 1 2 6 w e r e d r a i n e d o f f a n d t h e p e l l e t w a s r e - d i s s o l v e d i n T E b u f f e r . D N A e x t r a c t i o n f r o m n e e d l e s D N A e x t r a c t i o n s d i r e c t l y f r o m n e e d l e s w e r e d o n e a s d e s c r i b e d b y H a m e l i n e t a l . ( 1 9 9 6 ) w i t h s o m e m o d i f i c a t i o n s . F i v e w h o l e n e e d l e s o r 2 0 e x c i s e d l e s i o n s w i t h p a t h o g e n i c R h a b d o c l i n e f r u i t i n g b o d i e s w e r e u s e d t o e x t r a c t D N A f o r P C R a n d d o t - b l o t a s s a y s . F r u i t i n g b o d i e s o r w h o l e n e e d l e s w e r e s o a k e d w i t h 8 0 0 p l C T A B e x t r a c t i o n b u f f e r ( 2 % c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u m ; 1 . 4 M N a C l ; 1 % p o l y e t h y l e n e g l y c o l 8 0 0 0 ; 2 0 m M E D T A ; 1 % 2 - m e r c a p t o e t h a n o l ; 1 0 0 m M T r i s - H C I , p H 9 . 5 ) a n d g r o u n d w i t h a n a c i d t r e a t e d s t e r i l e m o r t a r a n d p e s t l e u n t i l a s l u r r y w a s o b t a i n e d . E x t r a c t s w e r e v o r t e x e d b r i e fl y a n d i n c u b a t e d a t 6 5 C f o r a t l e a s t 1 h . F o l l o w i n g t h e a d d i t i o n o f 6 0 0 p l p h e n o l : c h l o r o f o r m : i s o a m y l a l c o h o l ( 2 5 : 2 4 : 1 ) , e x t r a c t s w e r e c e n t r i f u g e d a t 1 0 0 0 0 r p m f o r 5 m i n u t e s . T h e a q u e o u s p h a s e w a s t r a n s f e r r e d t o a n e w t u b e , p r e c i p i t a t e d w i t h a n e q u a l v o l u m e o f c o l d i s o p r o p a n o l a n d c e n t r i f u g e d a t 1 0 0 0 0 r p m f o r 1 0 m i n u t e s . P e l l e t s w e r e w a s h e d w i t h c o l d 7 0 % e t h a n o l , a i r d r i e d f o r 1 2 h o u r s o r o v e r n i g h t , a n d r e s u s p e n d e d i n 3 0 p l 1 x T E b u f f e r , p H 8 . T h e m e t h o d o f H a m e l i n e t a l . ( 1 9 9 6 ) w a s a d a p t e d t o e x t r a c t D N A f r o m l a r g e a m o u n t s o f n e e d l e s ( 1 0 9 ) u s i n g a h o u s e h o l d b l e n d e r . N e e d l e s i n 6 0 m l e x t r a c t i o n b u f f e r w e r e b l e n d e d a t h i g h s p e e d f o r 2 m i n . A S o r v a l l R C Z B c e n t r i f u g e w i t h S S Z 4 r o t o r ( S o r v a l l H e r a e u s , N e w t o w n , C T ) w a s u s e d f o r s o l v e n t p h a s e s e p a r a t i o n s a n d p e l l e t i n g . 1 2 7 P C R a m p l i fi c a t i o n o f i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r s D N A e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m , f r u i t i n g b o d i e s a n d n e e d l e s w a s d i l u t e d 1 0 2 a n d 1 0 3 t i m e s i n d o u b l e d i s t i l l e d , f i l t e r e d , s t e r i l i z e d w a t e r ( P C R w a t e r ) a n d u s e d a s t e m p l a t e i n P C R a m p l i fi c a t i o n s . T h e i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r ( I T S ) r e g i o n s o f t h e n u c l e a r r i b o s o m a l R N A g e n e w e r e a m p l i fi e d w i t h t h e p r i m e r s I T S 1 F ( f u n g u s s p e c i fi c ) a n d I T S 4 ( G a r d e s a n d B r u n s , 1 9 9 3 ) . P C R r e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t i n 2 5 p l t o t a l v o l u m e c o n s i s t i n g o f 1 2 . 5 p l D N A d i l u t i o n ( t e m p l a t e ) a n d 1 2 . 5 p l P C R r e a c t i o n m i x t u r e . T h e r e a c t i o n m i x t u r e c o n t a i n e d T fi P C R b u f f e r ( 2 0 m M A m m o n i u m s u l f a t e ; 2 . 0 m M M g C l 2 ; 5 0 m M T r i s - H C I , p H 9 . 0 , E p i c e n t r e T e c h n o l o g i e s , M a d i s o n , W I ) ; 0 . 2 m M e a c h o f d A T P , d T T P , d G T P a n d d C T P ; 0 . 5 u M e a c h o f I T S 1 F a n d I T S 4 p r i m e r s ; a n d 0 . 5 u n i t o f T a q D N A p o l y m e r a s e . T h e r e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t o n a D N A t h e r m a l c y c l e r ( M o d e l 9 6 0 0 , P e r k i n - E l m e r C e t u s , N o r w a l k , C T ) . T h e r e a c t i o n p r o t o c o l c o n s i s t e d o f a n i n i t i a l d e n a t u r a t i o n a t 9 5 C f o r 3 m i n u t e s f o l l o w e d b y 3 0 c y c l e s o f 9 4 C f o r 1 m i n , 5 0 C f o r 1 m i n , a n d 7 2 C f o r 1 m i n . P C R a m p l i fi c a t i o n s c o n t a i n i n g n o D N A t e m p l a t e w e r e i n c l u d e d i n e v e r y e x p e r i m e n t a s c o n t r o l s t o t e s t f o r t h e p r e s e n c e o f c o n t a m i n a t i o n o f r e a g e n t s a n d r e a c t i o n m i x t u r e s b y n o n - s a m p l e D N A . T h e r e a c t i o n w a s c o m p l e t e d b y a 7 m i n e x t e n s i o n a t 7 2 C . P C R p r o d u c t s w e r e s e p a r a t e d o n 1 . 5 % a g a r o s e ( G i b c o B R L , G r a n d I s l a n d , N Y ) i n 1 % T A E b u f f e r ( 1 0 0 m M T r i s , 1 2 . 5 m M s o d i u m a c e t a t e a n d 1 m M E D T A , p H 8 . 0 ) b y g e l e l e c t r o p h o r e s i s . A s a c o n t r o l , a 1 k b o r 1 k b p l u s D N A l a d d e r ( G i b c o B R L ) w a s i n c l u d e d i n e a c h g e l . A f t e r r u n n i n g f o r a t l e a s t 1 h o u r a t 1 2 8 1 0 0 v o l t s , t h e g e l s ’ w e r e s t a i n e d w i t h e t h i d i u m b r o m i d e , v i s u a l i z e d b y U V fl u o r e s c e n c e a n d p h o t o g r a p h e d u s i n g A l p h a l m a g e r ( A l p h a I n n o t e c h C o r p o r a t i o n , S a n L e a n d r o , C A ) . D i r e c t o r n e s t e d - p r i m e r P C R a m p l i fi c a t i o n s w i t h o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s P C R a m p l i fi c a t i o n s u s i n g t h e p r o b e s d e s i g n e d f r o m I T S s e q u e n c e s R . p a r k e r i w e r e c a r r i e d o u t a s w e r e t h e I T S a m p l i fi c a t i o n s , w i t h a f e w d i f f e r e n c e s . F o r d i r e c t a m p l i fi c a t i o n s , t h e s a m e D N A d i l u t i o n s w e r e u s e d . F o r i n t e r n a l a m p l i fi c a t i o n s f o r d e t e r m i n a t i o n o f s p e c i fi c a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s , I T S 1 F a n d I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s w e r e q u a n t i fi e d u s i n g a U V s p e c t r o p h o t o m e t e r ( B e c k m a n D u 5 3 0 , B e c k m a n C o u l t e r , L i f e S c i e n c e s , B r e a , C A ) , d i l u t e d t o 1 0 0 ( 1 0 n g D N A ) a n d 1 0 0 0 t i m e s ( 1 n g D N A ) a n d a m p l i f i e d u s i n g o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e p r i m e r s . H o w e v e r , f o r d e t e c t i o n o f R . p a r k e r i , I T S 1 F a n d I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s w e r e d i l u t e d t o 1 0 ' 2 a n d u s e d i n n e s t e d p r i m e r a m p l i fi c a t i o n s . R e a c t i o n m i x t u r e s w e r e s a m e a s a b o v e e x c e p t t h a t 1 p M o f e a c h o f t w o p u r i fi e d o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s w a s a d d e d i n p l a c e o f t h e p r i m e r s . P C R p r o t o c o l w a s m o d i fi e d t o i n c r e a s e t h e s p e c i f i c i t y . F o l l o w i n g 3 m i n d e n a t u r a t i o n , r e a c t i o n s w e r e r u n f o r 3 0 c y c l e s o f 3 0 s e c a t 9 3 C , 3 0 s e c a t 5 2 - 6 0 C ( T a b l e 3 . 1 ) , a n d 1 m i n a t 7 0 C a n d e n d e d w i t h a fi n a l e x t e n s i o n f o r 7 m i n a t 7 0 C . O p t i m u m a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s w e r e d e t e r m i n e d b y t e s t i n g e a c h p a i r o f p r o b e a t t e m p e r a t u r e s r a n g i n g f r o m 5 0 6 0 C . I n i t i a l a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s f o r e a c h p a i r w e r e c a l c u l a t e d u s i n g t h e s o f t w a r e p r o g r a m O l i g o c a l c u l a t o r ( E u g e n B u e h l e r , P i t t s b u r g h , P A ) a n d p r o b e s w e r e t e s t e d u n t i l a t e m p e r a t u r e t h a t g a v e s p e c i e s - 1 2 9 s p e c i fi c a m p l i fi c a t i o n w a s r e a c h e d . S e q u e n c i n g I T S 1 F a n d I T S 4 a m p l i f i e d P C R p r o d u c t s i n c l u d e t h e i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r s I T S I a n d I T S I I a n d t h e 5 . 8 S o f t h e n u c l e a r r i b o s o m a l D N A o p e r o n a n d c o n s e r v e d p r i m e r s i t e s ( I T S r D N A ) . P C R p r o d u c t s w e r e c l e a n e d u s i n g M i l l i p o r e U l t r a f r e e - M C 3 0 , 0 0 0 N M W L p u r i fi c a t i o n fi l t e r s ( M i l l i p o r e C o r p o r a t i o n , B e d f o r d , M A ) . A p p r o x i m a t e l y 1 0 0 B i P C R p r o d u c t s w e r e w a s h e d w i t h P C R w a t e r 4 t i m e s b y s p i n n i n g a t 4 0 0 0 r p m a t 4 C . P u r i f i e d P C R p r o d u c t s w e r e r u n o n 3 % h i g h m e l t a g a r o s e g e l a t 1 0 0 V t o q u a n t i f y b e f o r e s u b m i s s i o n f o r s e q u e n c i n g . P C R p r o d u c t s o f I T S a n d 5 . 8 8 r D N A w e r e s e q u e n c e d m a i n l y b y u s i n g I T S 1 F a n d I T S 4 p r i m e r s i n a n A p p l i e d B i o s y s t e m s 3 7 0 A S e q u e n c e r ( A p p l i e d B i o s y s t e m s , F o s t e r C i t y , C A ) w i t h t h e T a q D y e D e o x y T e r m i n a t o r S y s t e m . P C R p r o d u c t s w e r e c l o n e d u s i n g T O P O T A C l o n i n g ® ( l n v i t r o g e n , C a r l s b a d , C A , U ) c l o n i n g k i t s f o l l o w i n g m a n u f a c t u r e e ’ s i n s t r u c t i o n s . S e q u e n c i n g w a s d o n e b y t h e G e n o m i c s T e c h n o l o g y S u p p o r t F a c i l i t y a t M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y . P r i m e r s I T S S , I T S 3 a n d I T S Z w e r e a l s o u s e d a s n e c e s s a r y ( W h i t e e t a l . 1 9 9 0 ) . S e q u e n c e a l i g n m e n t , a n a l y s i s a n d p r o b e d e s i g n I T S s e q u e n c e s w e r e e d i t e d , a l i g n e d a n d c o r r e c t e d u s i n g t h e p r o g r a m s E d i t S e q , M e g A I i g n a n d S e q M a n i n t h e D N A S T A R s o f t w a r e p a c k a g e ( D N A S T A R I n c , M a d i s o n , W I ) . E a c h s e q u e n c e w a s c o m p a r e d w i t h t h e s e q u e n c e s i n t h e G e n B a n k ( N C B I , B e t h e s d a , M D ) u s i n g s i m i l a r i t y s e a r c h p r o g r a m B L A S T R 1 3 0 ( A l t s c h u l e t a l . 1 9 9 7 ; Z h a n g a n d M a d d e n , 1 9 9 7 ) . I T S r D N A s e q u e n c e s w e r e a n a l y z e d a s u n i f o r m l y w e i g h e d u n o r d e r e d c h a r a c t e r s , a n d a s i n t e r l e a v e d b l o c k s o f a l i g n e d s e q u e n c e . S e q u e n c e s h a v e b e e n d e p o s i t e d i n G e n B a n k ( T a b l e 3 . 1 ) . I n a d d i t i o n t o s e q u e n c e s o f R . p a r k e n ' , t h e s e q u e n c e s o f p a t h o g e n i c R h a b d o c l i n e s p e c i e s a n d s u b s p e c i e s , a n d o t h e r r e l a t e d f u n g i w e r e a l s o i n c l u d e d i n a l i g n m e n t f o r p r o b e s e l e c t i o n . O l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s o f 1 4 - 2 4 b p l o n g w e r e d e s i g n e d f r o m s p e c i e s - s p e c i fi c s e q u e n c e s . P r i m e r S e l e c t p r o g r a m ( D N A S T A R ) w a s u s e d t o e v a l u a t e t h e p r o b e p r o p e r t i e s s u c h a s d u p l e x a n d h a i r p i n f o r m a t i o n a n d % G C c o n t e n t . P r o b e s w e r e s y n t h e s i z e d a t t h e M a c r o m o l e c u l a r S t r u c t u r e a n d S e q u e n c i n g F a c i l i t y ( D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y ) u s i n g a n A p p l i e d B i o s y s t e m s 3 9 4 8 O l i g o n u c l e o t i d e S y n t h e s i z e r ( A p p l i e d B i o s y s t e m s ) . L a b e fi n g R h a b d o c l i n e p a r k e r i s p e c i fi c p r o b e s w e r e l a b e l e d w i t h g a m m a 3 2 P - A T P b y p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 5 ’ e n d s u s i n g T 4 p o l y n u c l e o t i d e k i n a s e ( N e w E n g l a n d B i o l a b s I n c , B e v e r l y , M A ) . L a b e l i n g r e a c t i o n s c o n s i s t e d o f 1 p l p r o b e ( 1 5 - 2 0 p M ) , 2 p l 1 0 X k i n a s e b u f f e r ( 0 . 7 M T r i s - H C I , p H 7 . 6 , 0 . 1 M M g C l z - 6 H z O , 5 0 m M d i t h i o t h r e i t o l ) , 5 p l o f g a m m a 3 2 R A W ( 6 0 0 0 C i / m M N E N L i f e S c i e n c e P r o d u c t s , B o s t o n , M A ) a n d 8 u n i t s o f T 4 p o l y n u c l e o t i d e k i n a s e i n 1 1 . 4 p l o f H 2 0 a s d e s c r i b e d b y S a m b r o o k e t a l . ( 1 9 8 9 ) . R e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t f o r 4 5 m i n a t 3 7 C a n d w e r e s t o p p e d b y i n a c t i v a t i n g t h e e n z y m e a t 6 5 C f o r 1 0 m i n u t e s . S e p h a d e x G 2 5 ( S i g m a ) c o l u m n s w e r e p r e p a r e d u s i n g 1 m I s y r i n g e s t o s e p a r a t e 1 3 1 u n i w i t D o p r t a m G a d e r f o r S c i L i f e p l a t u n i n c o r p o r a t e d n u c l e o t i d e s f r o m l a b e l e d p r o b e s . L a b e l i n g e f fi c i e n c y w a s c h e c k e d w i t h a n a u t o m a t e d s c i n t i l l a t o r ( B e c k m a n , A r l i n g t o n H e i g h t s , I L ) . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s t o a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f R . p a r k e r i s p e c i f i c p r o b e s t o I T S 1 F - I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s w e r e p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d ( H e l m u t , 1 9 9 0 ; B r u n s a n d G a r d e s , 1 9 9 3 ) . F i v e p l o f a m p l i f i e d p r o d u c t s ( a p p r o x i m a t e l y 1 0 0 n g ) w e r e d e n a t u r e d i n 1 0 0 p l o f 0 . 4 N N a O H , 2 5 m M E D T A a n d 1 - 2 p l b r o m o p h e n o l b l u e f o r 5 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r e s . H Y B O N D N + n y l o n m e m b r a n e s ( A m e r s h a m L i f e S c i e n c e , B u c k i n g h a m s h i r e , U K ) p r e - c u t t o f i t i n a d o t - b l o t a p p a r a t u s ( G i b c o B R L , L i f e T e c h n o l o g i e s I n c , R o c k v i l l e , M D ) w e r e w e t i n d i s t i l l e d w a t e r f o r 1 m i n a n d p l a c e d i n t o t h e a p p a r a t u s . A p p r o x i m a t e l y , 1 0 0 n g d e n a t u r e d P C R p r o d u c t w e r e a d d e d t o t h e a p p r o p r i a t e w e l l s a n d s l o w l y v a c u u m f i l t e r e d o n t o t h e m e m b r a n e . S a m p l e s w e r e U V - fi x e d t o t h e m e m b r a n e w i t h 1 2 0 m l / c m 2 a t 2 5 4 n m u s i n g a S t r a t a l i n k e r ( S t r a t a g e n e , L a J o l l a , C A ) . T h r e e r e p l i c a s f o r e a c h p r o b e w e r e p r e p a r e d . M e m b r a n e s w e r e p r e - w a s h e d f o r 1 h a t 6 5 C i n a s o l u t i o n c o n t a i n i n g 0 . 1 x S S C , 1 0 m M T r i s , p H 8 . 0 a n d 0 . 5 % S D S . P r e - h y b r i d i z a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t a t t h e h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e f o r 1 - 4 h i n h y b r i d i z a t i o n b u f f e r ( 2 0 p l ) c o n t a i n i n g 6 x S S C ( 3 . 6 M N a C L , 0 . 2 M s o d i u m p h o s p h a t e , 2 0 m M E D T A , p H 8 . 0 ) , 0 . 5 % d r y m i l k a s b l o c k i n g a g e n t , 0 . 1 % S D S a n d 1 0 0 p g d e n a t u r e d h e r r i n g s p e r m D N A . A f t e r t h e a d d i t i o n o f l a b e l e d p r o b e s ( 5 - 2 0 p M ) , t h e m e m b r a n e s w e r e h y b r i d i z e d f o r 4 - 1 2 h o u r s i n a r o t a r y t y p e h y b r i d i z a t i o n o v e n ( H Y B A I D , A s h f o r d , 1 3 2 M i d d l e s r b y s u b t r S a m b r o l t e m p e r a s a n g t e m p e r a S S C a n t I N C . H e l l U n n o v a h y b r i d i z e a s n e c e s 2 d a y s a C o r I J O r a l t P r o b e s t i D o t - b l c r M i d d l e s e x , U K ) . I n i t i a l t h e o r e t i c a l h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e ( T h ) w e r e c a l c u l a t e d b y s u b t r a c t i n g 5 C f r o m t h e e x p e c t e d m e l t i n g t e m p e r a t u r e s ( T . . . ) a s f o r m u l a t e d i n S a m b r o o k e t a l . ( 1 9 8 9 ) , T m = 4 ( G + C ) + 2 ( A + C ) . T h e a c t u a l h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s ( T a ) t h a t r e s u l t e d i n c o r r e c t p r o b e s p e c i fi c i t y w e r e d e t e r m i n e d b y t e s t i n g t h e p r o b e s a t d i f f e r e n t h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s u n t i l a n o p t i m u m t e m p e r a t u r e w a s r e a c h e d f o r e a c h p r o b e . T h e m e m b r a n e s w e r e w a s h e d i n 2 x S S C a n d 0 . 1 % S D S f o r 5 m i n o n a s h a k e r ( O r b i t s h a k e r , L a b L i n e I n s t r u m e n t s I n c , H e l r o s e P a r k , I L ) a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d f o r 2 0 m i n o n a n i n c u b a t e r s h a k e r ( I n n o v a 4 0 8 0 , N e w B r u n s w i c k S c i e n t i fi c , E d i s o n , N J ) a t 5 C b e l o w t h e h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s . M e m b r a n e s w e r e m o n i t o r e d a n d w a s h e d r e p e a t e d l y a s n e c e s s a r y . H y b r i d i z e d fi l t e r s w e r e e x p o s e d t o X - r a y f i l m ( A m e r s h a m ) f o r 4 h t o 2 d a y s a t - 8 0 C . T h e f i l m s w e r e d e v e l o p e d u s i n g a K o d a k p r o c e s s o r ( K o d a k C o r p o r a t i o n , R o c h e s t e r , N Y ) . H y b r i d i z a t i o n fi l t e r s w e r e r e - u s e d a f t e r r a d i o a c t i v e p r o b e s w e r e r e m o v e d b y w a s h i n g i n b o i l i n g 2 x S S C a n d 0 . 2 % S D S s o l u t i o n . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s t o t o t a l D N A D o t - b l o t s w e r e a l s o p r e p a r e d u s i n g t o t a l D N A e x t r a c t e d f r o m m y c e l i a ( L e e e t a l . 1 9 8 8 ) a n d f r o m n e e d l e s w i t h o r w i t h o u t f r u i t i n g b o d i e s ( H a m e l i n e t a l . 1 9 9 6 ) . A d d i t i o n a l l y , t h e e x t r a c t i o n b u f f e r w a s s u p p l e m e n t e d w i t h 8 0 p g p r o t e i n a s e K ( 0 . 1 p g / p l , S i g m a ) , a n d a n e x t r a p u r i f i c a t i o n s t e p w i t h p h e n o l : c h l o r o f o r m : i s o a m y l a l c o h o l w a s u s e d f o r t h e D N A e x t r a c t i o n f r o m n e e d l e s t o o b t a i n a s c l e a n a p r o d u c t a s p o s s i b l e . T o t a l D N A f r o m b o t h m y c e l i a a n d n e e d l e s w a s q u a n t i fi e d w i t h a s p e c t r o p h o t o m e t e r a t 2 6 0 n m . T o t a l D N A a l i q u o t s w e r e 1 3 3 d i l u t e d i n T E t o a d j u s t t h e c o n c e n t r a t i o n s , a n d w e r e a d d e d t o a n e q u a l v o l u m e o f 1 . 0 M N a O H f o r d e n a t u r a t i o n . F o l l o w i n g 1 h d e n a t u r a t i o n , a p p r o x i m a t e l y 1 p g D N A w a s b l o t t e d o n t o n y l o n m e m b r a n e s t h a t w e r e t h e n s o a k e d i n d i s t i l l e d w a t e r , a n d fi x e d w i t h U V u s i n g a t 2 0 m J / c m 2 a n d 2 5 4 n m u s i n g t h e S t r a t a l i n k e r . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f s h o r t o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s t o m y c e l i u m a n d n e e d l e D N A w e r e c o n d u c t e d a s w a s d o n e w i t h P C R p r o d u c t s , w i t h s o m e m o d i fi c a t i o n s . D N A - fi x e d m e m b r a n e s w e r e p r e - h y b r i d l z e d i n a s o l u t i o n c o n t a i n i n g 6 x S S C , 0 . 0 1 M s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 8 ) , 1 m M E D T A ( p H 8 ) , 0 . 1 % S D S , 1 0 0 p g / m l h e r r i n g s p e r m D N A a n d 0 . 1 % n o n - f a t d r i e d m i l k . F o l l o w i n g 4 h p r e h y b r i d i z a t i o n , l a b e l e d p r o b e s w e r e a d d e d a n d h y b r i d i z a t i o n w a s c a r r i e d o u t f o r 4 - 1 2 h a t t h e c a l c u l a t e d T h t e m p e r a t u r e s . T h e m e m b r a n e s w e r e w a s h e d b r i e fl y ( 1 - 3 m i n ) i n 2 X o r 6 X S S C o n a s h a k e r a t t h e h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s . T h e m e m b r a n e fi l t e r s w e r e m o n i t o r e d a n d w a s h e d r e p e a t e d l y a s n e c e s s a r y . H y b r i d i z e d fi l t e r s w e r e e x p o s e d t o X - r a y fi l m f o r a t l e a s t 1 2 h o u r s b e f o r e fi l m s w e r e d e v e l o p e d . R e s t r i c t i o n d i g e s t s S o f t w a r e g e n e r a t e d r e s t r i c t i o n m a p s o f t h e I T S r D N A s e q u e n c e s ( D N A S T A R I n c , M a d i s o n , W I ) o f e a c h f u n g u s w e r e c o n s t r u c t e d b y t h e s u b p r o g r a m M A P D R A W o f D N A S T A R ) . 2 2 r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e s w e r e u s e d t o l o c a t e s p e c i fi c c u t t i n g s i t e s i n e a c h s e q u e n c e . E n z y m e s c u t t i n g s i t e s t h a t w e r e u n i q u e t o R . p a r k e r i s p e c i e s w e r e u s e d t o d i f f e r e n t i a t e i t f r o m o t h e r t a x a . 1 3 4 P C R p r o d u c t s a m p l i f i e d o r c l o n e d u s i n g R . p a r k e r i s p e c i f i c p r i m e r s ( R P 1 A - R P 4 A ) w e r e d i g e s t e d w i t h t h e r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e s a s f o l l o w . R e s t r i c t i o n r e a c t i o n s c o n t a i n e d 4 p l o f P C R p r o d u c t s a n d 6 p l o f r e s t r i c t i o n m i x t u r e ( 1 p l m a n u f a c t u r e r ’ s b u f f e r , 0 . 2 p l e n d o n u c l e a s e a n d 4 . 8 p l d i s t i l l e d w a t e r ) . R e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t a t 3 7 o r 6 5 C , ( d e p e n d i n g o n t h e e n z y m e u s e d ) f o r 2 - 4 h o u r s a n d s t o p p e d b y c o o l i n g o n i c e . D i g e s t e d p r o d u c t s w e r e r u n o n 3 % a g a r o s e g e l f o r 1 h o u r a t 1 0 0 v o l t s a n d p h o t o g r a p h e d u s i n g A l p h a l m a g e r . 1 3 5 R E S U L T S R h a b d o c l i n e p a r k e r i i s o l a t e s T o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e e n d o p h y t e i s p r e s e n t i n y o u n g e r n e e d l e s , w e a t t e m p t e d t o i s o l a t e t h e f u n g u s f r o m c u r r e n t y e a r a n d o n e y e a r o l d n e e d l e s o f i n t e r m o u n t a i n f o r m s o f D o u g l a s f i r g r o w n i n W a s h i n g t o n S t a t e . T h e s e n e e d l e s a l s o s h o w e d s y m p t o m s o f R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t d i s e a s e c a u s e d b y R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e . T h e e n d o p h y t e w a s i s o l a t e d f r o m s y m p t o m l e s s n e e d l e s a n d f r o m t h o s e w i t h s y m p t o m s o r f r u i t i n g b o d i e s o f t h e R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e n e e d l e c a s t p a t h o g e n ( s a m p l e s R P - W A 1 0 3 a n d 1 0 4 i n F i g u r e 3 . 2 ) . W e a l s o a t t e m p t e d t o i s o l a t e R . p a r k e r i f r o m n e e d l e s o f i n t e r m o u n t a i n f o r m s o f D o u g l a s fi r g r o w n i n M i c h i g a n . A f t e r m a n y f a i l e d a t t e m p t s , w e w e r e a b l e t o r e c o v e r t h e f u n g u s f r o m 3 - 5 y e a r o l d n e e d l e s ( R P - C H M I a n d R P - O C M I ) f o l l o w i n g i m p r o v e m e n t s i n t h e m e t h o d o f s u r f a c e d i s i n f e c t i n g o f t h e n e e d l e s d e s c r i b e d a b o v e i n t h e m e t h o d s . S e q u e n c i n g A m p l i fi c a t i o n o f R . p a r k e r i b y t h e u n i v e r s a l p r i m e r s I T S I F - I T S 4 g e n e r a l l y y i e l d e d a P C R p r o d u c t o f a p p r o x i m a t e l y 5 7 6 - 5 7 7 b p , w h i c h c o r r e s p o n d e d t o I T S I - 5 . 8 8 - I T S I I P C R p r o d u c t o b t a i n e d f r o m o t h e r R h a b d o c l i n e s u b s p e c i e s . H o w e v e r , a P C R p r o d u c t o f a p p r o x i m a t e l y 1 0 6 7 b p w a s a m p l i fi e d f r o m s o m e i s o l a t e s . T h i s p r o d u c t w a s d u e t o t h e p r e s e n c e o f a 5 0 0 b p i n t r o n s e q u e n c e . T h e I T S r D N A r e g i o n w a s s e q u e n c e d i n t w o c u l t u r e s ( G e n - B a n k # A F 4 6 2 4 2 7 a n d 1 3 6 a c r m ‘ v ' fi y ‘ W - « m ‘ ; . “ W . F i g u r e 3 . 2 . I s o l a t i o n o n t o P D M Y a g a r m e d i u m r e v e a l s t h e p r e s e n c e o f R . p a r k e r i i n c u r r e n t y e a r n e e d l e s o f i n t e r m o u n t a i n ( I M ) f o r m s o f D o u g l a s fi r c o l l e c t e d i n N o v e m b e r ( A ) , a n d o n e y e a r o l d n e e d l e s c o l l e c t e d i n M a y ( B ) . B o t h s a m p l e s h a d d u a l i n f e c t i o n s w i t h R h a b d o c l i n e p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e a s w e l l . S y m p t o m s a n d e s p e c i a l l y m a t u r e f r u i t i n g b o d i e s o f t h e p a t h o g e n a r e v i s i b l e o n t h e n e e d l e s i n p l a t e s . R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e d o e s n o t g r o w o n k n o w n m e d i a . 1 3 7 l l A F 4 6 2 4 2 3 ) i s o l a t e d f r o m t h e c o a s t a l v a r i e t y o f D o u g l a s f i r a n d t w o i s o l a t e s ( A F 4 6 2 4 2 6 a n d A F 4 6 2 4 2 4 ) f r o m t h e I M v a r i e t y g r o w n i n W a s h i n g t o n , a n d t w o i s o l a t e s ( A F 4 6 2 4 2 5 a n d A F 4 6 2 4 2 9 ) f r o m t h e I M v a r i e t i y g r o w n i n M i c h i g a n , a s w e l l a s A T C C 2 0 1 6 6 0 ( A F 2 6 0 8 1 3 ) . T h e I T S r D N A r e g i o n o f t h r e e e n d o p h y t i c f u n g i w e r e a l s o s e q u e n c e d b e c a u s e t h e f u n g i w e r e c o m m o n l y i s o l a t e d a l o n g w i t h R . p a r k e r i ( T a b l e 3 . 1 ) . O n e o f t h o s e f u n g i w a s i d e n t i fi e d a s X y l a r i a a r b u s c u l a a n d h a d 9 9 % h o m o l o g y w i t h t h e s e q u e n c e s o f X y l a r i a a r b u s c u l a i n G e n B a n k . A s e c o n d e n d o p h y t i c f u n g u s h a d 9 9 % s e q u e n c e h o m o l o g y w i t h a n u n i d e n t i f i e d X y l a r i a l i a s p e c i e s . A t h i r d e n d o p h y t e s h a r e d 9 8 % h o m o l o g y w i t h t h e s e q u e n c e s o f G u i g n a r d i a ( B o t r y o s p h a e r a ) p h i l o p n ’ n a a n d a P h o m a - l i k e f u n g u s . A l l R . p a r k e r i c u l t u r e s i s o l a t e d h a d I T S r D N A s e q u e n c e s w i t h 9 9 - 1 0 0 % h o m o l o g y w i t h t h e s e q u e n c e s i n t h e G e n B a n k . T h e I T S r D N A s e q u e n c e s o f R . p a r k e r i w e r e a l i g n e d w i t h t h e R . p a r k e r i s e q u e n c e s o f p a t h o g e n i c R h a b d o c l i n e s u b s p e c i e s a n d o t h e r r e l a t e d f u n g i . R h a b d o c l i n e p a r k e r i s h o w e d 9 4 % h o m o l o g y w i t h R . w e i n ' s s p . o b o v a t a , 9 3 % w i t h R . w e i n ' s s p . o b l o n g a a n d R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e , 9 2 % w i t h . R . p s e u d o t s u g a e s s p . e p i p h y l l a a n d 9 0 % w i t h R . w e i n ' s s p . w e i n ' i s e q u e n c e s . T h e e n d o p h y t e a l s o s h a r e d 8 0 % h o m o l o g y w i t h b o t h P h a e o c r y p t o p u s g a u m a n n i i ( R o h d e ) P e t r a n d A u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n s ( d e B a r y ) A m a n d 7 8 % w i t h H o r m o n e m a d e m a t i o i d e s L a g e r b e r g & M e l i n . R . p a r k e r i s h a r e d l e s s t h a n 7 0 % s e q u e n c e s i m i l a r i t y w i t h t h e t h r e e e n d o p h y t e s i s o l a t e d f r o m t h e S a m e n e e d l e s . 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A l i g n m e n t o f t h e c o n s e r v e d s e q u e n c e e l e m e n t s o f a g r o u p I i n t r o n f o u n d w i t h i n t h e 1 8 8 r D N A g e n e o f R . p a r k e r i w i t h g r o u p I i n t r o n s f r o m 1 8 8 r D N A g e n e o f o t h e r f u n g i . C o d e s a n d G e n b a n k a c c e s s i o n n u m b e r s a s f o l l o w . R P = R . p a r k e n ’ ( A F 4 6 2 4 2 7 ) , P O = P e n i c i l l i u m o b l a t u m ( A B O 3 3 5 2 9 ) , P C = P . c i e g l e r i ( A F 1 7 9 2 2 6 ) , P P = P . p u l v i l l o r u m ( A F 1 7 8 5 2 7 ) , P P A = P a e c i l o m y c e s p a s c u a ( A B O 3 3 5 2 8 ) , M F = M o n i l i a n a f r u c t i c o l a ( A F 0 1 0 5 0 5 ) . 1 3 9 R P - A T C C a R P - O R 4 R W O B V - 0 R 5 R P P - C H M I R W O B L - M I R W W - 0 R 1 R P E - O R I P G A P H D S P R P - A T C C R P - O R 4 R W O B V - 0 R 5 R P P - C H M I R W O B L - M I R W W - 0 R 1 R P E - O R l P G A P H D S P R P - A T C C R P - O R 4 R W O B V ~ O R 5 R P P - C H M I R W O B L - M 1 1 R W W - 0 R 1 R P E - O R I P G A P H D S P R P - A T C C R P - O R 4 R W O B V - 0 R 5 R P P - C H M I R W O B L - M I R W W - 0 R 1 R P E - O R l P M } I k P I f D S I P R P ~ A c h R P - — 0 R 4 1 6 0 C C G A G . . . . T T T C T . T . . . . . . . . . G C C . C T A A C G G G T A G A T C T C C C A C C C T T . G T G . . T T C G A G . . . . T G T C T . T . . . . . . . . . G C C . C T A A C G G G T A G A T C T C C C A C C C T T T G T C . . T C C G A G . . . . T T T C T . T . . . . . . . . . G C C . C T A G C G G G T A G A T C T C C C A C C C T T . G T G . . T C C G A G . . . . T T T C T . T . . . . . . . . . G C C . C T A G C G G . C A G A T C T C C C A C C C G T . G T G . . T C C T A G . . . . T T T C T A T . . . . . . . . . G C C . C T A G . G G G T A G A T C T C C C A C C C T T . G T G . . T C C G A G . . . . T G T C . G C . . . . . . . . . G C C . C T C G C G G G C C G C T C T C C C C C C C . . . G T G . . T C C G A G . . . . T T T C T . T . . . . . . . . . G C C . C T A G C G G G C A G A T C T C C C A C C C G T . G T G . . T . . . . . . . . . . C A T T A A A G A G T A A G G G T T A T T C G T A G C C C G A C C T C C A A M C C T T T G T T G T T . . . . . . . . . . C A T T A A A G A G T A A G G G T G . C T C A G C G C C C G A C C T C C A A C C C T T T G T T G T T G . . 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A T T A A A C C A G T C G T C T G A G T A T A A 1 8 1 2 4 0 . . T A T A A T . . A G T T A A A A C T T T C A A C A A C G G A T C T C T T G G T T C T G G C A T C G A T G A A G A A . . . T T T A A T . . A G T T A A A A C T T T C A A C A A C G G A T C T C T T G G C T C T G G C A T C G A T G A A G A A . . . T A T A A T . . A G T T A A A A C T T T C A A C A A C G G A T C T C T T G G T T C T G G C A T C G A T G A A G A A . . . T A T A A T . . A G T T A A A A C T T T C A A C A A C G G A T C T C T T G G T T C T G G C A T C G A T G A A G A A . . T A T A A T . . A G T T A A A A C T T T C A A C A A C G G A T C T C T T G G T T C T G G C A T C G A T G A A G A A . . . T C T A A T . . C G T T A A A A C T T T C A A C A A C G G A T C T C T T G G T T C T G G C A T C G A T G A A G A A . . T A T A A T . . 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T C T T T G 1 4 0 R W O B V - 0 R 5 R P P - C H M I R W O B L - M I R W W - 0 R 1 R P E - O R l P G A P H D S P R P - A T C C R P - O R 4 R W O B V - 0 R 5 R P P - C H M I R W O B L - M I R W W - 0 R 1 R P E - O R l P G A P H D S P R P - A T C C R P - O R 4 R W O B V - 0 R 5 R P P - C H M I R W O B L - M I R W W - 0 R 1 R P E - O R l P G A P H D S P R P - A T C C R P - O R 4 R W O B V - 0 R 5 R P P - C H M I R W O B L - M I R W W - 0 R 1 R P E - O R l P G A P H D S P R P - A T C C R P - O R 4 R W O B V - 0 R 5 R P P - C H M I R W O B L - M I C G C A G C G A A A T G C G A T A A G T A A T G T G A A T T G C A G A A T T C A G T G A A T C A T C G A A . T C T T T G C G C A G C G A A A T G C G A T A A G T A A T G T G A A T T G C A G A A T T C A G T G A A T C A T C G A A . T C T T T G C G C A G C G A A A T G C G A T A A G T A A T G T G A A T T G C A G A A T T C A G T G A A T C A T C G A A . 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T T G C C A N C A A . C C C C . A A A T Y T T A T . . . C T G G . . . P G G T A C C G G T T C T G A C T C C T T T G C C G T T A A A C C C C A A A C T T T T A A A G G T T G A C C T A P A . G G A G A . . G G A A C T C C G C C G A C . T G A A A C C T T T A T T T T T T C T A G G T T G A C C T H D G . G T G G G T C G G A T C G T C A C C G C C G T T A A A C C T C C A A A T T T T C T A G G T . . . . . . S P G . C T T G G T C G G A T G G T C A T T G C C G T T A A A C C T T T A A A T T T T . T A G G T . . . . . . F i g u r e 3 . 4 . A l i g n m e n t o f l n t e m a l t r a n s c r i b e d s p a c e r s f o r s e l e c t i o n o f R . p a r k e r i s p e c i e s - s p e c i fi c p r o b e s a R P - : R . p a r k e r i , R W O B V - z R . w e i r i i s s p . o b o v a t a , R P P - : R . p s e u d o t s u g a e s p p . p s e u d o t s u g a e , R W O B L - z R . w e i r i i s s p . o b l o n g a , R W W - : R . w e i r i i s s p . w e i r i i , R P E - : R . p s e u d o t s u g a e s p p . e p i p h y l l a , P G : P . g a u m a n n i i , A P : A . p u l l u l a n s , H D : H . d e m a t i o i d e s , S P : S c l e r o p h o m a p i t h y o p h i l a . N o t e : l n t r o n s e q u e n c e s R . p a r k e r i w e r e n o t i n c l u d e d . B o l d a n d u n d e r l i n e d a r e t h e p r i m e r s i t e s . 1 4 2 i t p o s s e s s e d t h e c h a r a c t e r i s t i c f e a t u r e s k n o w n t o b e c o n s e r v e d a m o n g t h i s g r o u p i n t r o n s ( F i g u r e 3 . 3 ) . T h e s e q u e n c e c o n t a i n e d t h e f o u r c o n s e r v e d s e q u e n c e e l e m e n t s P , Q , R a n d t h e o r d e r o f t h e i r o c c u r r e n c e i n t h e s e q u e n c e ( 5 ’ P , Q , R , S ) i s n e c e s s a r y f o r t h e f o r m a t i o n o f g r o u p I i n t r o n . D e s i g n o f R . p a r k e r i s p e c i fi c p r i m e r s I n o r d e r t o s e l e c t p r i m e r s , a l l t h e I T S s e q u e n c e s o f R h a b d o c l i n e t a x a s e q u e n c e d i n o u r l a b a n d a v a i l a b l e i n G e n B a n k w e r e c o m p a r e d a n d t h e c o n s e r v e d s e q u e n c e s o f e a c h R h a b d o c l i n e s p e c i e s a n d s u b s p e c i e s , a n d fi v e s e q u e n c e s o f r e l a t e d f u n g i w e r e a l i g n e d ( F i g u r e 3 . 3 ) . O l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s ( 1 8 - 2 4 b p ) w e r e d e s i g n e d f r o m t h e s e q u e n c e s t h a t d i f f e r e d b e t w e e n s p e c i e s i n t h e g e n u s R h a b d o c l i n e , b u t w e r e c o n s e r v e d a m o n g t h e i s o l a t e s o r s t r a i n s o f R . p a r k e r i . P r i m e r s i t e s w e r e s c r e e n e d f o r r e g i o n s w h e r e t h e r e w a s m o r e v a r i a b i l i t y b e t w e e n R . p a r k e n ' a n d c l o s e l y r e l a t e d R h a b d o c l i n e s u b s p e c i e s . T o d e v e l o p a p a i r o f p r i m e r s t h a t w o u l d m o s t e f f e c t i v e l y a m p l i f y o n l y t h e t a r g e t i n i n f e c t e d n e e d l e s , a n d t h e r e f o r e e l i m i n a t e t h e n e e d t o i s o l a t e t h e f u n g u s , s i x p r i m e r s w e r e d e s i g n e d , s y n t h e s i z e d a n d t e s t e d d u r i n g t h e c o u r s e o f t h i s s t u d y . G e n e r a l l y , a l l t e s t e d p r o b e c a n d i d a t e s d i f f e r e d o n l y b y t w o b a s e p a i r s f r o m t h e c l o s e s t f u n g u s a n d h a d 5 0 % o r l e s s G C c o n t e n t , e x c e p t p r o b e R P 6 . ( F i g u r e 3 . 4 a n d T a b l e 3 . 2 ) . S p e c i fi c i t y o f p r i m e r s i n d i r e c t P C R a s s a y s T o d e t e r m i n e t h e o p t i m u m s p e c i e s - s p e c i fi c a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s f o r t h e p r i m e r p a i r s d e s i g n e d f o r s p e c i fi c i t y t o R . p a r k e r i , t h e p r i m e r p a i r s w e r e 1 4 3 T a b l e 3 . 2 . T h e s e q u e n c e , g u a n i n e - c y t o s i n e p e r c e n t a g e ( % G C ) , c a l c u l a t e d m e l t i n g ( T m ) , t h e o r e t i c a l h y b r i d i z a t i o n ( T h ) , a n d a c t u a l h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s ( T . . . ) o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s a s u s e d i n d o t b l o t a n a l y s i s , a n d c a l c u l a t e d a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e ( T a n ) a n d a c t u a l a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e ( T p c r ) o f t h e p a i r s o f p r i m e r s a s u s e d i n P C R a m p l i fi c a t i o n s . P r i m e r P r i m e r s e q u e n c e a I T S G C T m T h T a T a n T p c r b p r o d u c t c o d e R e g i o n ( % ) d n s i z e ( b p ) R P 1 5 ' A T G T T G C 1 T T G G C G C C T T . I T S I 5 0 5 4 4 9 6 0 4 8 5 2 5 2 - 3 9 4 R P 4 5 ' G A A A A A T T G G G G G T T G C T G I T S I I 5 O 5 4 4 9 5 8 5 1 5 6 R P 1 A 5 ' G C C C T A A A C C C T G T T A A T T I T S I 4 2 5 4 4 9 5 8 4 7 5 0 5 9 2 5 8 R P 4 A 5 ' G C C A C T G A I I I I A A G G C C T I T S I I 4 7 5 5 5 1 6 0 4 9 R P 5 S ' M G A A A A A T T G G G G G T T G C T G G C C I T S I I 5 0 7 2 5 7 N D 5 7 R P 6 5 ' C A G G A C C G C G A G G G C A C C I T S I I 7 8 6 4 5 9 5 0 5 9 a p r i m e r s e q u e n c e s a r e c o m p l e m e n t a r y t o f o r w a r d a n d r e v e r s e s e q u e n c e s o f I T S I a n d I T S l l r e g i o n s r e s p e c t i v e l y . b O p t i m u m a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e i n d i r e c t ( d ) a n d n e s t e d . ( n ) P C R a m p l i fi c a t i o n s . 1 4 4 t e s t e d a t s e v e r a l a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s i n b o t h d i r e c t a n d n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s . C o m b i n a t i o n s o f p r i m e r s w e r e c o m p a r e d t o e x a m i n e t h e s p e c i fi c i t y t o R . p a r k e r i . E a c h p r i m e r p a i r w a s fi r s t t e s t e d f o r a m p l i f i c a t i o n p r o d u c t f o l l o w i n g d i r e c t P C R a m p l i fi c a t i o n o f g e n o m i c D N A e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m o r f r u i t i n g b o d i e s ( a p o t h e c i a ) f r o m i s o l a t e s o f d i f f e r e n t R h a b d o c l i n e t a x a a n d o t h e r f u n g i . P r i m e r c o m b i n a t i o n s w e r e t e s t e d a t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s r a n g i n g f r o m 4 8 - 5 8 C . T h e p r i m e r / p r o b e c o m b i n a t i o n R P 1 - R P 4 w a s f o u n d t o b e h i g h l y s e n s i t i v e , e f fi c i e n t a n d s p e c i e s - s p e c i fi c a t a n a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e r a n g e o f 5 0 - 5 6 C . A l t h o u g h t h e p a i r c o n s i s t e n t l y a m p l i fi e d o n l y R . p a r k e r i D N A i n a l l d i r e c t a m p l i fi c a t i o n s , t h e o p t i m u m t e m p e r a t u r e w a s 5 2 C ( F i g u r e 3 . 5 ) . W i t h R . p a r k e n ' t e m p l a t e , t h e R P 1 - R P 4 p r i m e r p a i r s s o m e t i m e s a m p l i f i e d a P C R p r o d u c t c o n t a i n i n g p a r t i a l s e q u e n c e o f t h e I T S r D N A o f 3 9 4 b p a n d o t h e r t i m e s a m p l i fi e d a n d a p p r o x i m a t e l y 6 0 0 b p P C R p r o d u c t t h a t c o n t a i n e d t h e p a r t i a l I T S s e q u e n c e a n d t h e g r o u p I i n t r o n ( F i g u r e 3 . 6 ) . P r i m e r p a i r R P 1 A - R P 4 A a l s o a m p l i fi e d o n l y R . p a r k e r i D N A i n d i r e c t P C R a m p l i fi c a t i o n s . T h e p a i r p r o d u c e d a n e x p e c t e d P C R p r o d u c t o f s i z e 2 9 8 b p f o r t h e p o t e n t i a l I T S - r D N A . H o w e v e r , t h e p r i m e r w a s n o t a s s e n s i t i v e a n d e f fi c i e n t w h e n t e s t e d a g a i n s t D N A e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m o r f r u i t i n g b o d i e s . T h e c o m b i n a t i o n s o f R P 1 o r R P 1 A w i t h R P 5 o r R P 6 d i d n o t p r o d u c e e x p e c t e d P C R p r o d u c t c o n s i s t e n t l y . T h e d i f f e r e n c e i n t e m p e r a t u r e o p t i m u m f o r a n n e a l i n g o f t h e t w o p r i m e r s m i g h t h a v e m i g h t h a v e i n t e r f e r e d w i t h s p e c i f i c i t y i n P C R a m p l i fi c a t i o n . 1 4 5 H D D G G H 1 O O R O C L O O O O O O A - - O - - B B - C C C C C O W W P P - P P O - - - - - C - P P E P P W W W 4 2 3 M M M — R 0 R R 1 C H - V O + P P P P P P R R P R R R R R 1 R 1 5 I 0 I l 1 P A D H B R K - P R R R R R R - - - - R - - - - — - - - - - 3 5 8 0 1 2 4 6 7 1 1 2 3 5 7 4 6 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 . . . é 5 . o . “ F 3 9 4 b p — ” W fi fl r fi fl fi fl F i g u r e 3 . 5 . R e s u l t s o f t e s t i n g o f t h e p r i m e r p a i r R P 1 a n d R P 4 f o r s p e c i fi c i t y d e t e r m i n a t i o n i n d i r e c t P C R a m p l i fi c a t i o n a t 5 0 C . D N A w a s e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m ( L a n e s 1 - 8 , 1 7 a n d 1 8 ) o r f r u i t i n g b o d i e s ( L a n e s 9 - 1 6 ) . 1 4 6 3 4 3 - W H O C 2 A W 3 3 A W A H l I I H F M M M F M M M O l D I I - — - 1 5 2 3 4 P O R C - - O C — O C 0 1 5 6 1 1 1 1 i t “ § m x I . 5 . 5 4 ' a . a t } . . - F i g u r e 3 . 6 . P C R a m p l i fi e d p r o d u c t s o f R . p a r k e r i I T S r D N A u s i n g R P 1 - R P 4 p r i m e r s a n d D N A t e m p l a t e s o f s a m p l e s o f n e e d l e s f r o m M i c h i g a n ( M I ) a n d W a s h i n g t o n ( W A ) s o u r c e s o f c o a s t a l v a r i e t i e s ( C O ) o f D o u g l a s fi r . D N A . D N A w a s e x t r a c t e d f r o m n e e d l e s ( L a n e s 1 - 9 , 1 1 - 2 1 ) a n d f r o m m y c e l i u m ( L a n e s 1 0 , 2 2 - 2 7 ) a n d u s e d i n d i r e c t P C R a m p l i fi c a t i o n s . D F - H r e p r e s e n t s n e e d l e s w i t h n o R . p a r k e r i i n f e c t i o n . I M M l 3 - 5 : 3 - 5 y e a r s o l d n e e d l e s a m p l e s o f I M v a r i e t y f r o m M i c h i g a n ( M I ) , C O W A 2 - 4 : 2 - 4 y e a r s o l d n e e d l e s a m p l e s o f c o a s t a l v a r i e t y f r o m W a s h i n g t o n . R P - C O B t h r o u g h H r e p r e s e n t s m y c e l i a l i s o l a t e s o f R . p a r k e r i f r o m c o a s t a l v a r i e t y o f D o u g l a s fi r . R P - A T C C : A T C C i s o l a t e 2 0 1 6 6 0 . 6 0 0 b p P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d f r o m i s o l a t e s c o n t a i n i n g I n t r o n i n t h e I T S r D N A r e g i o n . 1 4 7 F o l l o w i n g d e t e r m i n a t i o n o f s p e c i f i c o p t i m u m a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s , P r i m e r p a i r R P 1 - R P 4 w a s u s e d t o a m p l i f y t h e e n d o p h y t e D N A d i r e c t l y i n n e e d l e t i s s u e s . D N A . w a s e x t r a c t e d f r o m 2 , 3 a n d 4 y e a r o l d n e e d l e s o f c o a s t a l D o u g l a s fi r t h a t w e r e k n o w n t o h a v e h e a v y R . p a r k e r i i n f e c t i o n s . D N A w a s a l s o e x t r a c t e d f r o m 3 , 4 a n d 5 y e a r o l d n e e d l e s o f I M v a r i e t i e s o f D o u g l a s fi r . P r i m e r s R P 1 - R P 4 a m p l i fi e d a s a m e - s i z e d p r o d u c t o f 3 9 4 b p f r o m t h e D N A t e m p l a t e s f r o m m o s t o f t h e n e e d l e s a m p l e s , i n d i c a t i n g t h a t t h e p r i m e r p a i r d e t e c t e d t h e e n d o p h y t e i n i n f e c t e d n e e d l e s . H o w e v e r , t h e b a n d s w e r e g e n e r a l l y w e a k e v e n t h o u g h s t r o n g a m p l i fi c a t i o n s o c c u r r e d w i t h s o m e s a m p l e s , a n d w i t h c o n t r o l t e m p l a t e e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m o f A T C C 2 0 1 6 6 0 . S p e c i fi c i t y o f p r i m e r s i n n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n T h e p r i m e r p a i r R P 1 - R P 4 w a s t e s t e d i n n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s i n a t t e m p t s t o i n c r e a s e t h e s e n s i t i v i t y o f a m p l i f i c a t i o n f o r d e t e c t i n g t h e e n d o p h y t e i n n e e d l e t i s s u e s . A l l t h e i s o l a t e s o f R h a b d o c l i n e a n d o t h e r f u n g i w e r e a m p l i fi e d fi r s t w i t h U n i v e r s a l p r i m e r s I T S I F a n d I T S 4 . I T S I F - I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s w e r e d i l u t e d 1 0 0 t i m e s a n d r e - a m p l i fi e d w i t h i n t e r n a l o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e p a i r s . P r o b e p a i r R P 1 - R P 4 w a s t e s t e d a t 5 2 , 5 4 , 5 6 a n d 5 8 C a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s . T h e p a i r w a s f o u n d t o b e h i g h l y s p e c i fi c e v e n a t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e a s l o w a s 5 2 C , e v e n t h o u g h f a i n t a m p l i fi c a t i o n s o c c u r r e d w i t h o t h e r R h a b d o c l i n e s p e c i e s ( F i g u r e 3 . 7 ) . T h e f a i n t a m p l i fi c a t i o n s w e r e p r o b a b l y d u e t o t h e p r e s e n c e o f t h e e n d o p h y t e i n t h e s a m p l e s r a t h e r t h a n t h e c r o s s - r e a c t i o n b e c a u s e t h e i d e n t i t y o f 1 4 8 1 K B + 1 R P C O H 2 - R P - C O E 3 - R P - C O G 4 - R P - C O G 5 - R P - C O D 6 - R P - C O D 7 — R P — R M 1 0 4 8 — R P - R M 1 0 4 9 - R P E - O R 1 1 0 - R P P - O R 2 1 1 - R P P — O R 3 1 2 - R P P - O C M I 1 1 3 - R P P - C H M I 1 4 - R W O B V - O R 5 ‘ l S - R W O B L - M H 1 6 - R W W - O R 1 1 7 A P 1 8 — H D 3 9 4 b p - - ) 8 3 h i H i n ! “ i c e ” w h i t e w a s h - m V i i ” . F i g u r e 3 . 7 . T e s t i n g o f t h e p r i m e r p a i r R P 1 - R P 4 f o r s p e c i f i c i t y d e t e r m i n a t i o n i n n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n a t 5 2 C . D N A e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m ( L a n e s 1 - 8 , 1 7 a n d 1 8 ) o r f r u i t i n g b o d i e s ( L a n e s 9 - 1 6 ) w a s fi r s t u s e d a s t e m p l a t e i n P C R a m p l i fi c a t i o n s u s i n g t h e u n i v e r s a l p r i m e r p a i r I T S 1 F - I T S 4 . T h e P C R p r o d u c t o f fi r s t r e a c t i o n w a s d i l u t e d t o 1 0 2 a n d u s e d f o r t e m p l a t e i n t h e n e s t e d r e a c t i o n s f o r a m p l i fi c a t i o n s . T h e f u n g i u s e d i n n e s t e d P C R w e r e R . p a r k e n ' ( R P - ) , A . p u l l u l a n s ( A P ) , H . d e m a t i o i d e s , R . p s e u d o t s u g a e s s p . e p i p h y l l a ( R P E - ) , R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e ( R P P ) , R . w e i n ' i s s p . o b o v a t a ( R W O B V - ) a n d R . w e i r i i s s p . o b l o n g a ( R W O B L - ) , R . w e i r i i s s p . w e i n ' i ( R W W - ) . 1 4 9 P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d f r o m n e e d l e s c a r r y i n g f r u i t i n g b o d i e s o f R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t s w a s c o n fi r m e d t o R . p a r k e n ' b y r e s t r i c t i o n d i g e s t a n d s e q u e n c i n g l a t e r . T h i s p r i m e r p a i r w a s v e r y s p e c i fi c a n d s e n s i t i v e a t a n o p t i m u m t e m p e r a t u r e o f 5 6 C . A n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s o f 5 8 C o r h i g h e r c a u s e d d e c r e a s e d i n t e n s i t y o f a m p l i fi c a t i o n p r o d u c t s . P r i m e r s R P 1 - R P 4 y i e l d e d a s a m e - s i z e d p r o d u c t o f 3 9 4 b p f r o m t h e D N A t e m p l a t e s f r o m m o s t o f t h e n e e d l e s a m p l e s i n d i c a t i n g t h a t t h e p r i m e r p a i r s p e c i fi c a l l y a m p l i fi e d t h e t a r g e t D N A i n i n f e c t e d n e e d l e s . P r i m e r p a i r R P 1 A - R P 4 A w a s s p e c i e s - s p e c i fi c a t a n o p t i m u m a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e o f 5 9 C . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s T h e o p t i m u m , s p e c i e s - s p e c i f i c h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e o f e a c h p r o b e w a s d e t e r m i n e d e x p e r i m e n t a l l y i n o r d e r t o e v a l u a t e t h e u s e o f p r o b e s i n d o t - b l o t a s s a y s f o r d e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f R . p a r k e r i i n i n f e c t e d n e e d l e s . T h e p r o b e s w e r e u s e d i n d o t - b l o t a s s a y s o f P C R p r o d u c t s , t o t a l f u n g a l D N A , a n d i n f e c t e d p l a n t m a t e r i a l s a f t e r o p t i m u m , s p e c i e s - s p e c i fi c h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s w e r e d e t e r m i n e d . F i v e o u t o f s i x p r i m e r s w e r e t e s t e d f o r s p e c i fi c i t y i n d o t - b l o t a s s a y s a t h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s o f 5 5 , 5 8 a n d 6 0 C . B o t h p r o b e s R P 1 a n d R P 4 h y b r i d i z e d s p e c i fi c a l l y t o o n l y D N A f r o m R . p a r k e r i a t o p t i m u m h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s o f 6 0 a n d 5 8 C r e s p e c t i v e l y i n a l l a s s a y s ( F i g u r e 3 . 8 . A , B ) . T h e p r o b e s w e r e a l s o s p e c i e s - s p e c i fi c a s l o w a s 5 5 C . H o w e v e r , b o t h P r o b e s s t r o n g l y h y b r i d i z e d t o D N A o f n e e d l e s a m p l e s k n o w n t o c o n t a i n D N A o f R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e R P P - 0 R 2 . ( F i g u r e 3 . 8 . A , B ) . W e h a v e d e t e r m i n e d t h a t t h e s e h y b r i d i z a t i o n s w e r e d u e t o t h e d u a l i n f e c t i o n o f s o m e 1 5 0 n e e d l e s o f t h i s s a m p l e b y b o t h R . p a r k e r i a n d R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e b a s e d o n t h e f o l l o w i n g t e s t s a n d a r g u m e n t s . N o h y b r i d i z a t i o n o c c u r r e d w i t h p r o b e s R P 1 a n d R P 4 w h e n a d i f f e r e n t s e t o f D N A e x t r a c t e d , a m p l i fi e d a n d b l o t t e d o n t o a d i f f e r e n t m e m b r a n e . N o c r o s s - h y b r i d i z a t i o n w i t h D N A f r o m s a m p l e R P P - 0 R 2 w e r e o b s e r v e d w h e n p r o b e s , R P 1 A , R P 4 A a n d R P 6 w e r e t e s t e d ( F i g u r e 3 . 8 C , D , E ) . F u r t h e r m o r e , t h e r e w a s n o v a r i a t i o n i n I T S s e q u e n c e s a m o n g d i f f e r e n t n e e d l e s a m p l e s o f R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e . T h e p r o b e R P 1 d i f f e r e d f r o m t h e c l o s e s t R h a b d o c l i n e t a x a b y a t l e a s t 2 b p w h i l e R P 4 d i f f e r e d b y a t l e a s t 5 b p ( F i g u r e 3 . 3 ) . T h e b a s e d i f f e r e n c e w a s m o r e t h a n e n o u g h t o d i s t i n g u i s h t h e s e p r o b e s e q u e n c e s f r o m c o r r e s p o n d i n g s e q u e n c e s o f o t h e r f u n g i . P r o b e R P 1 A h y b r i d i z e d o n l y t o R . p a r k e r i D N A a t 5 8 C . R P 4 A h y b r i d i z e d t o R . p a r k e n ' D N A b u t a l s o t o t h e D N A o f R h a b d o c l i n e w e i r i i s s p . w e i n ' i a n d R . w e i r i i s s p . o b o v a t a P a r k e r & R e i d a t 6 0 C a l t h o u g h h y b r i d i z a t i o n s t o t h e p a t h o g e n s w e r e w e a k e r ( F i g u r e 3 . 8 - C , D ) . P r o b e R P 6 w a s a l s o t e s t e d a t 5 8 a n d 6 0 C . T h e p r o b e h y b r i d i z e d s p e c i fi c a l l y o n l y t o D N A f r o m R . p a r k e r i a t o p t i m u m t e m p e r a t u r e o f 6 0 C ( F i g u r e 3 . 8 - E ) . T h e p r o b e s R P 1 a n d R P 6 w e r e a l s o h y b r i d i z e d t o t o t a l D N A e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m a n d f r u i t i n g b o d i e s o f R h a b d o c l i n e s u b s p e c i e s a n d o t h e r e n d o p h y t i c f u n g i . B o t h p r o b e s o n l y h y b r i d i z e d t o D N A f r o m R . p a r k e r i ( F i g u r e 3 . 9 A a n d B ) . 1 5 1 l ! ) E ( I o O N t o 2 ' S g " . . J I 9 8 8 6 8 8 8 ' o . . . 0 1 i t e e e a a E I . < 0 2 e o r 2 . K . i t e E “ i E v — N n v i n t o h t o c » ‘ - - — . — ‘ ~ ‘ O r e ' ' ’ ‘ . . Q R P 1 I _ 6 0 C A . . C _ , . . - N n v i n t o i s m m . 9 3 5 1 ' B O O R P 4 . 5 8 C . - s t F i g u r e 3 . 8 . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f R . p a r k e r i p r o b e s t o I T S I F - I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s f r o m D N A t e m p l a t e s o f a p o t h e c i a a n d n e e d l e s a m p l e s . A ) R P 1 a t 6 0 C , B ) R P 4 a t 5 8 , C ) R P 1 A a t 5 8 , D ) R P 4 A a t 6 0 , E ) R P 6 a t 6 0 C . M e m b r a n e s w e r e e x p o s e d t o t h e f i l m s f o r 1 2 - 2 4 h o u r s . 1 0 0 n g D N A w e r e a p p l i e d o n t o e a c h b l o t . S a m p l e c o d e s : H D ( H . d e m a t i o i d e s ) , A P ( A . p u l l u l a n s ) , S P ( S c l e r o p h o m a p y t h y o p h i l a ) , P G ( P . g a u m a n i i ) , R P - A T C C ( R . p a r k e n ' A T C C i s o l a t e ) , M P ( M e n ' a p a r k e r i A T C C i s o l a t e ) , R P E - ( R . p s e u d o t s u g a e s s p . e p i p h y l l a ) , R P P - ( R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e ) , R W O B L - ( R . w e i n ' i s s p . o b l o n g a ) , R W W O B V - O R 5 ( R . w e i n ' i s s p . o b o v a t a ) , R W W - ( R . w e i r i i s s p . w e i n ) . T h e l e t t e r s a n d n u m b e r s f o l l o w i n g t h e h y p h e n r e p r e s e n t s o u r c e o f n e e d l e s ( O R = O r e g o n , M I : M i c h i g a n ) a n d s a m p l e n u m b e r s . F o r e x a m p l e , R P P - 0 R 1 r e p r e s e n t s R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e s a m p l e 2 f r o m O r e g o n . 1 5 2 1 I M 2 1 I 1 M R L O B - O W C C 1 - 2 3 C C R R R L T O O O B D : P G ; A - P T A - P - - - O E P P W W W P P P R R R H - 1 A P R R R - - - 5 R - - - M - - - 0 1 2 2 3 4 - 5 - 7 8 9 1 1 1 4 6 . I Q O i I 8 ; 3 4 5 6 7 8 9 1 1 0 2 G ‘ . 7 9 5 . L “ 1 1 R 0 - 5 R 2 O l - - M L V O 2 1 M C B O C T C C T I B M W O W W O W P P A - - A R R R - R - - — - P 2 3 4 5 P M - - G P - 1 ' ’ . R 7 L ' - . G ‘ . ‘ . . ' . 1 ' F i g u r e 3 . 8 . c o n t ’ d 1 5 3 R P 1 A 5 8 C R P 4 A 6 0 C R P 6 6 0 C : e - - g E 2 ' S T . — . " U 4 ' _ ‘ r o : 2 : t r 3 : ) > g B o n o n o o o o m . < i 2 ( a ) E E a t E S E d 0 0 q t z _ n ; 0 : i x i x t r 0 : o : g ‘ 1 I . a N m 4 u s d o a a s a . e I 9 A R P 1 6 0 C . - N t o v i n ( D l \ t o o n E I : 5 1 ‘ Q i t R P 6 B s o c F i g u r e 3 . 9 . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n o f p r o b e s R P 1 ( A ) a n d R P 6 ( B ) t o t o t a l D N A a t 6 0 M e m b r a n e s w e r e e x p o s e d t o f i l m f o r 2 d a y s . A p p r o x i m a t e l y 1 p g t o t a l D N A w a s l o a d e d o n t o e a c h d o t . S a m p l e c o d e s : D F - H ( u n i n f e c t e d D o u g l a s fi r n e e d l e s a m p l e ) , R W O B L - ( R . w e i r i i s s p . o b l o n g a ) , R P P - ( R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e ) , R P E - ( R . p s e u d o t s u g a e s s p . e p i p h y l l a ) , R W O B V - 0 R 5 ( R . w e i r i i s s p . o b o v a t a ) , R W W - ( R . w e i n ' i s s p . w e i n ' l ) , R P - A T C C ( R . p a r k e r i A T C C i s o l a t e ) , H D ( H . d e m a t i o i d e s ) , P G ( P . g a u m a n i l ) , T h e l e t t e r s a n d n u m b e r s f o l l o w i n g t h e h y p h e n r e p r e s e n t s o u r c e o f n e e d l e s ( O R = O r e g o n , M I : M i c h i g a n ) a n d s a m p l e n u m b e r s . N e e d l e s a m p l e s R P P - O C M I a n d R P P - C H M I w e r e f r o m O c e a n a C o u n t y a n d C h e b o y g a n C o u n t i e s i n M i c h i g a n ) 1 5 4 D e t e c t i o n o f R h a b d o c l i n e p a r k e r i i n i n f e c t e d n e e d l e s w i t h n e s t e d P C R T h e p r i m e r p r o b e p a i r R P 1 - R P 4 w a s u s e d i n n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s i n i t i a l l y p e r f o r m e d w i t h 2 , 3 a n d 4 y e a r s o l d n e e d l e s a m p l e s f r o m t h e c o a s t a l v a r i e t y o f D o u g l a s fi r ( C O W A ) b e c a u s e t h e s e t r e e s w e r e k n o w n t o b e i n f e c t e d w i t h t h e e n d o p h y t e . T h e fi r s t r o u n d o f a m p l i fi c a t i o n f r o m i n f e c t e d t i s s u e s u s i n g t h e p r i m e r s I T S 1 F - I T S 4 r e s u l t e d i n e i t h e r a P C R p r o d u c t o f o n e s i z e o r p r o d u c t s o f v a r i a b l e s i z e s . T h e a m p l i fi c a t i o n s w e r e o f t e n v e r y w e a k o r i n s o m e c a s e s n o P C R p r o d u c t w a s o b t a i n e d . R e g a r d l e s s , t h e fi r s t r e a c t i o n s w e r e d i l u t e d 1 0 0 t i m e s t o s e r v e a s t e m p l a t e f o r r e - a m p l i fi c a t i o n . U s i n g 1 2 . 5 p l o f d i l u t e t e m p l a t e p e r 2 5 p l P C R r e a c t i o n , s e c o n d r o u n d o f a m p l i fi c a t i o n w i t h R . p a r k e r i - s p e c i fi c p r i m e r p a i r c o n s i s t e n t l y y i e l d e d a n a m p l i c o n o f e x p e c t e d s i z e , 3 9 4 b p . T h e p r o b e w a s v e r y s e n s i t i v e a n d g e n e r a l l y p r o d u c e d s t r o n g P C R b a n d s . T h e s e b a n d s w e r e c h e c k e d t o v e r i f y i d e n t i t y t o R . p a r k e r i D N A b y s e q u e n c i n g a n d b y r e s t r i c t i o n d i g e s t s a s d e s c r i b e d l a t e r . T h e e n d o p h y t e w a s d e t e c t e d i n n e e d l e s o f a l l t h r e e a g e s i n a l l a s s a y s ( F i g u r e 3 . 1 0 A . l a n e s 4 - 6 ) . 3 - 5 y e a r o l d n e e d l e s w e r e c o l l e c t e d f r o m M i c h i g a n a n d t e s t e d f o r t h e p r e s e n c e o f t h e e n d o p h y t e . A m p l i fi c a t i o n s c o n s i s t e n t l y p r o d u c e d t h e 3 9 4 b p P C R p r o d u c t ( F i g u r e 3 . 1 0 A l a n e s 1 9 - 2 1 ) . T h e p r i m e r p a i r d e t e c t e d t h e e n d o p h y t e i n a l l n e e d l e s a m p l e s . P C R a m p l i fi c a t i o n s w i t h t h e n e e d l e s t h a t w e r e 1 - 4 y e a r s o l d f r o m D o u g l a s f i r t r e e s g r o w n o n M S U C a m p u s ( C r o p a n d S o i l S c i e n c e G a r d e n ) d i d n ’ t y i e l d a n y P C R a m p l i fi c a t i o n p r o d u c t i n a l l 4 r e p e a t e d t e s t s ( F i g u r e 3 . 1 0 - l a n e 2 ) . I T S 1 F a n d I T S 4 a m p l i f i c a t i o n o f 3 a n d 4 y e a r s o l d n e e d l e s a l w a y s p r o d u c e d s t r o n g b a n d s . H o w e v e r , t h e y s t i l l 1 5 5 C C T 3 2 - - m A 1 1 * 1 9 4 2 0 5 - O 2 6 8 6 0 5 4 4 5 6 - - - - - O O O O O A A A A A 3 3 7 6 7 7 - - - O O O A A A H A - - w W / W W W A A A W W W W W F P O W W W W M M M M M D R C O o - . — W M M M l I l I I l - - - - - - 0 1 2 2 3 m 5 ( 7 8 1 9 1 1 M M M I l l I l - - - - 3 4 5 6 1 1 1 1 - 7 1 , ' ’ i l l t t : ' l l l l t ‘ , . - _ ’ 5 R 1 O R - O V - B W O 3 R O - P P W W R R R - - - 2 R O - P P R - 1 2 3 4 1 I M . L B 8 9 4 2 2 A A A W W W - - - O P P P W P P P R R R R - - - - 0 1 2 3 1 1 1 5 6 i n f e c t i o n s w i t h R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t s . A ) i n n e e d l e s o f d i f f e r e n t a g e s f r o m W a s h i n g t o n a n d M i c h i g a n , B ) i n m i x e d F i g u r e 3 . 1 0 . N e s t e d P C R d e t e c t i o n o f R . p a r k e r i b y R P 1 a n d R P 4 p r i m e r p r o b e s . 3 9 4 b p — > " 8 - R P P - O C M I ' 9 - R P P - C H M I d i d n ’ t y i e l d a n y P C R p r o d u c t w i t h t h e p r i m e r p a i r R P 1 - R P 4 T h e s e s a m p l e s w e r e i n c l u d e d i n s u b s e q u e n t a s s a y s t o s e r v e a s n e g a t i v e c o n t r o l s ( t e m p l a t e s o f n e e d l e s w i t h n o R . p a r k e r i ) . T h e p r i m e r p a i r a l s o d e t e c t e d t h e e n d o p h y t e i n o n e y e a r o l d o r y o u n g e r n e e d l e s o f i n t e r m o u n t a i n v a r i e t i e s i n f e c t e d w i t h o r w i t h o u t R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t s ( F i g u r e 3 . 1 0 A l a n e s 8 , 9 ) . T h i s w a s n o t s u r p r i s i n g c o n s i d e r i n g t h a t t h e s e t r e e s w e r e g r o w n i n p r o x i m i t y t o t h e c o a s t a l v a r i e t y o f D o u g l a s f i r i n t h e n a t i v e r a n g e o f t h e v a r i e t y . S u r p r i s i n g l y , w h e n n e w l y e m e r g e d n e e d l e s c o l l e c t e d i n M a y w e r e t e s t e d , t h e p r i m e r p a i r a m p l i f i e d a 3 9 4 h p P C R p r o d u c t f r o m m a n y o f t h e n e e d l e s a m p l e s t e s t e d . T h e a m p l i f i e d p r o d u c t s w e r e s e q u e n c e d a n d s h o w n t o b e R . p a r k e r i , r e v e a l i n g t h a t R . p a r k e r i a l s o i n f e c t s t h e n e e d l e s j u s t a f t e r b u d b r e a k i n s p r i n g ( F i g u r e 3 . 1 0 A . l a n e s 9 - 1 7 ) . D e t e c t i o n o f R h a b d o c l i n e p a r k e r i i n m i x e d i n f e c t i o n s w i t h o t h e r R h a b d o c l i n e t a x a D N A f r o m n e e d l e s w i t h f r u i t i n g b o d i e s ( a p o t h e c i a ) o f v a r i o u s s u b s p e c i e s o f R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t f u n g i o f w a s e x t r a c t e d a n d t e s t e d i n P C R r e a c t i o n s u s i n g t h e R . p a r k e r i s p e c i f i c p r i m e r s p a i r R P 1 a n d R P 4 ( F i g u r e 3 . 1 0 B ) . T h e p r i m e r p a i r c o n s i s t e n t l y a m p l i f i e d P C R p r o d u c t s o f a p p r o x i m a t e l y 3 9 4 b p f r o m t e m p l a t e s o f n e e d l e s a m p l e s h a v i n g a p o t h e c i a o f R . p s e u d o t s u a g e s s p . p s e u d o t s u g a e ( R P P - 0 R 3 , R P P - O C M I ) , R . p s e u d o t s u a g e s s p . e p i p h y l l a ( R P E - O R 1 ) o r R . w e i n ' i s s p . o b l o n g a p r e s e n t . H o w e v e r , a m p l i f i c a t i o n s o f t e m p l a t e s f r o m n e e d l e s a m p l e s R P P - 0 R 3 , R P E - O R 1 a n d R P P - O C M I p r o d u c e d w e a k 1 5 7 p r o d u c t s a n d s o m e t i m e s d i d n o t y i e l d a n y p r o d u c t . S a m p l e s c o n t a i n i n g R . w e i r i i s p p . o b o v a t a ( R W O B V - 0 R 5 ) p r o d u c e d w e a k P C R p r o d u c t i n s o m e a m p l i f i c a t i o n , w h i l e t h e s a m p l e c o n t a i n i n g R . w e i n ‘ i s p p . w e i n ' i ( R W W - 0 R 1 ) d i d n o t y i e l d a n y P C R p r o d u c t s . A m p l i fi c a t i o n w i t h t e m p l a t e s o f s a m p l e s R P P - 0 R 2 , R W O B L - M l , R P P - W A 4 , R P P - W A 2 8 a n d R P P - W A 2 9 c o n s i s t e n t l y p r o d u c e d a 3 9 4 b p P C R p r o d u c t i n a l l a s s a y s . I n a l l i n s t a n c e s , s a m p l e R P P - 0 R 2 y i e l d e d h i g h a m o u n t s o f 3 9 4 b p p r o d u c t . A l l t h e a m p l i f i e d p r o d u c t s o f 3 9 4 b p , w e r e s h o w n t o c o r r e s p o n d t o I T S r D N A s e q u e n c e s o f R . p a r k e r i w h e n t e s t e d b y r e s t r i c t i o n d i g e s t i o n , s e q u e n c i n g , o r c u l t u r i n g a s d e s c r i b e d b e l o w . R e s t r i c t i o n d i g e s t s o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y R P P 1 a n d R P P 4 T h e i d e n t i t y o f 3 9 4 b p P C R p r o d u c t s s u s p e c t e d t o b e R . p a r k e r i w a s c h e c k e d u s i n g r e s t r i c t i o n d i g e s t i o n p r o f i l e s . R e s t r i c t i o n m a p s o f r D N A s e q u e n c e o f v a r i o u s f o l i a r p a t h o g e n s a n d e n d o p h y t e s o f D o u g l a s f i r ( C a t a l 2 0 0 2 c h a p t e r 1 ) w e r e c o n s t r u c t e d f o r t h e e n d o n u c l e a s e s B s t N l , B s t U l , a n d S c a t u s i n g t h e D N A S T A R p r o g r a m . R e s u l t s a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 3 . 3 . B s t N l p r o d u c e d t w o f r a g m e n t s o f u n i q u e s i z e i n d i g e s t s o f t h e p o r t i o n o f t h e I T S s e q u e n c e o f R . p a r k e n ' a m p l i fi e d b y R P 1 - R P 4 c o m p a r e d t o o t h e r R h a b d o c l i n e s u b s p e c i e s a n d o t h e r t e s t e d f u n g i . B s t U I w a s m o s t u s e f u l b e c a u s e i t c u t t h e I T S s e q u e n c e i n t o 3 u n i q u e f r a g m e n t s w h i l e i t h a s n o o u t s i t e s i n t h e I T S s e q u e n c e o f R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e , R . p s e u d o t s u g a e s s p . e p i p h y l l a , R . w e i n ’ i s p p . o b l o n g a a n d R . w e i n ' i s p p o b o v a t a . A d d i t i o n a l l y , B s t U l c u t s R . w e i n ' i s p p . w e i n ' i 1 5 8 T a b l e 3 . 3 . R e s t r i c t i o n f r a g m e n t m a p s o f t h e s e q u e n c e s o f s o m e f o l i a r e n d o p h y t e s a n d p a t h o g e n s o f P . m e n z i e s i i . I T S s e q u e n c e 1 u n c u t c u t S p e c i e s B s t N I B s t U I S e e I S p e I R . p a r k e n ' 5 7 6 3 3 8 2 1 9 4 2 9 6 1 4 6 1 3 7 2 6 2 1 9 5 1 1 9 N S R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s u e d o t s u g a e 5 7 3 4 3 6 1 3 7 N S 4 5 6 1 1 7 4 2 2 1 5 1 s s p . e p i p h y l l a 5 7 4 4 3 5 1 3 9 N S N S N S R . w e i r i i s p p . o b l o n g a 5 7 2 4 3 5 1 3 7 N S 4 5 6 1 1 6 N S s p p . o b o v a t a 5 7 2 4 3 5 1 3 7 N S 4 5 6 1 1 6 N S s p p . w e i r i i 5 6 3 N S 2 3 9 1 3 0 5 8 N S N S A . p u l l u l a n s 6 2 7 4 4 6 1 8 1 4 6 4 1 6 3 N S _ H . d e m a t i o i d e s 6 3 3 N S N S N S N S f . _ g a u m a n n i i 6 2 7 3 7 0 2 5 4 N S N S N S R P 1 - R P 4 s e q u e n c e 2 S p e c i e s B s t N I B s t U l S e e I S p e I R . p a r k e r i 2 6 2 1 3 1 2 9 6 7 1 2 6 2 7 2 7 5 5 1 N S R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s u e d o t s u g a e 3 7 6 1 7 N S 3 3 7 6 2 3 0 3 9 1 s s p . e p i p h y l l a 3 7 6 1 7 N S N S N S R . w e i r i i s p p . o b l o n g a 3 7 6 1 7 N S 3 3 7 6 2 N S s p p . o b o v a t a 3 7 6 1 7 N S 3 3 7 6 2 N S s p p . w e i r i i N S 2 6 0 7 1 5 5 N S A . p u l l u l a n s N S N S N S N S H . d e m a t i o i d e s N S N S N S N S f _ . _ g a u m a n n i i N S N S N S N S 1 I T S s e q u e n c e i n c l u d e s s e q u e n c e o f I T S l - 5 . 8 $ - I T S l I r D N A a n d p a r t i a l s e q u e n c e s o f 1 8 S a n d 2 8 8 r D N A ( p r i m e r s i t e s ) a s a m p l i fi e d w i t h p r i m e r s I T S 1 F a n d I T S 4 . 2 P r e d i c t e d f r a g m e n t s i z e s a s s u m i n g p r i m e r s R P 1 a n d R P 4 a m p l i f y a p o r t i o n o f t h e I T S s e q u e n c e o f t h e f u n g u s . 3 F r a g m e n t s i z e s a r e i n b a s e p a i r s ( b p ) . 4 N S = N o c u t t i n g s i t e s p r e s e n t i n I T S s e q u e n c e 1 5 9 i n t o 3 f r a g m e n t s e a c h o f d i f f e r e n t s i z e f r o m t h o s e o f R . p a r k e r i . S c a l a l s o p r o d u c e d u n i q u e d i g e s t p r o fi l e s o f R . p a r k e r i s e q u e n c e s c o m p a r e d t o o t h e r s p e c i e s . R e s t r i c t i o n d i g e s t s w i t h B s t N l r e s u l t e d i n t w o d i f f e r e n t s i z e f r a g m e n t s ( 2 6 2 a n d 1 3 2 b p ) i n a l l P C R p r o d u c t s i n t h e n e e d l e s a m p l e s t h a t y i e l d e d P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d w i t h R . p a r k e r i s p e c i fi c p r i m e r s , R P 1 a n d R P 4 ( F i g u r e 3 . 1 1 ) . T h e t w o f r a g m e n t s a g r e e d i n s i z e w i t h t h o s e o f B s t N l d i g e s t e d P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d f r o m m y c e l i u m o f R . p a r k e r i . P C R p r o d u c t s f r o m c u r r e n t y e a r ( s e e l a n e s l a b e l e d l M W A 1 - 4 8 t h r o u g h 7 7 ) a n d o n e y e a r o l d n e e d l e s ( s e e l a n e l a b e l e d l M W A 1 - 2 8 a n d 2 9 ) y i e l d e d a l m o s t a s s t r o n g a p r o d u c t a s ( s e e l a n e s l a b e l e d 2 - 4 4 ) a s f r o m o l d e r n e e d l e s ( l a n e s l a b e l e d D F C O 4 - 2 ) . R e s t r i c t i o n d i g e s t s w i t h B s t U l r e s u l t e d i n t w o f r a g m e n t s ( 2 9 6 a n d 7 2 b p ) i n a l l P C R p r o d u c t s i n a l l n e e d l e s a m p l e s t h a t y i e l d e d P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d w i t h t h e c o m b i n a t i o n o f R P 1 a n d R P 4 ( F i g u r e 3 . 1 2 ) . A t h i r d f r a g m e n t ( 2 6 b p ) w a s a l s o p r e s e n t b u t t o o s m a l l t o b e s e e n o n m o s t g e l s . H o w e v e r , T h e f r a g m e n t s a g r e e d i n s i z e w i t h f r a g m e n t s o f B s f u l d i g e s t e d P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d f r o m m y c e l i u m o f R . p a r k e n ’ . R e s t r i c t i o n e n z y m e S c a l c u t P C R p r o d u c t s i n t o t w o u n i q u e s i z e f r a g m e n t s ( 2 7 2 a n d 7 5 b p ) f r o m a l l o f t h e n e e d l e s a m p l e s a m p l i f i e d b y p r i m e r s R P 1 a n d R P 4 ( F i g u r e 3 . 1 3 ) . 1 6 0 C C T A - P 4 3 - - - - 1 1 O O O O O - - - - - - 3 3 8 7 7 9 2 1 8 4 4 7 7 7 7 - 2 0 2 2 2 5 5 5 5 A A O O O O 1 A 5 A A W W A A W W I W A A A A A A A W W W W O M O M M W W W W W M M R C C - - - M I M M M M M I l I I l l I I l - - - - M M M l l l - - 2 3 3 4 5 6 7 8 9 1 1 ‘ 2 l - - - - - 0 1 5 6 7 8 1 1 1 1 ' 4 ' m X . _ r , _ K ) Y 2 g S ’ . ’ F i g u r e 3 . 1 1 . R e s t r i c t i o n d i g e s t s b y e n d o n u c l e a s e B s t N l o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d f r o m D N A e x t r a c t i o n s o f n e e d l e s u s i n g R . p a r k e n ' s p e c i f i c p r i m e r s R P 1 a n d R P 4 . L a n e 1 , l a b e l e d 1 K B + , c o n t a i n s a D N A s i z e m a r k e r ( G i b c o - B R L ) . L a n e 2 , l a b e l e d R P - A T C C c o n t a i n s R . p a r k e r i A T C C i s o l a t e 2 0 1 6 6 0 . L e t t e r s r e p r e s e n t v a r i e t y o f D o u g l a s fi r ( C O = c o a s t a l , | M = i n t e r m o u n t a i o n ) a n d s o u r c e o f n e e d l e ( W A = W a s h i n g t o n S t a t e , M l = M i c h i g a n ) . F i r s t n u m b e r f o l l o w i n g t h e l e t t e r s i s t h e a g e o f n e e d l e ( 0 = n e e d l e s c o l l e c t e d j u s t a f t e r b u d b r e a k i n M a y ) , a n d s e c o n d n u m b e r a f t e r h y p h e n i s t h e s a m p l e n u m b e r . F o r e x a m p l e , l M W A 1 - 2 9 r e p r e s e n t s o n e y e a r - o l d n e e d l e s o f i n t e r m o u n t a i n D o u g l a s fi r f r o m W a s h i n g t o n . T h e n u m b e r f o l l o w i n g t h e h y p h e n i s s a m p l e n u m b e r 2 9 . 1 6 1 4 4 O 1 1 A A 1 A A 3 2 3 2 - - - - 5 A A W W W W A A A A 8 8 8 1 2 2 4 4 I W W O O O O O O C C C C W W W W M M M M l l I l I M C O - P P R M M I - 1 4 5 - - 0 2 3 - 6 8 5 7 8 1 1 1 1 1 1 1 1 9 C - - - C - - - - - 2 H D 3 - A P p : ' 6 - R P - A T C C 1 . 1 - 1 K B + ‘ 1 7 - I M W A 1 - 4 1 C N t o i n a 2 ' 3 3 z a a t c ' : v - N I t ; g i g . 3 1 . 1 K B - 7 - 2 - R P - A T C C 3 - I M - W A 1 0 3 4 - l M W A 1 - 2 9 5 — l M W A 1 - 2 9 6 - l M W A O - 4 8 7 - l M W A O - 4 8 8 - I M W A O - 4 8 9 - I M W A O - 5 0 - 1 0 - I M W A O - 5 0 1 1 - I M W A O - 5 0 ‘ - 1 2 - I M W A O - 5 2 1 3 - l M W A O - 5 2 : 1 3 1 4 - l M W A O - 5 2 5 4 - R P P - O C M I 1 5 H D 1 7 - P G F i g u r e 3 . 1 2 . R e s t r i c t i o n d i g e s t s b y e n d o n u c l e a s e B s t U l o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d f r o m D N A e x t r a c t i o n s o f n e e d l e s u s i n g R . p a r k e r i - s p e c i fi c p r i m e r s R P 1 a n d R P 4 . L a n e 1 , l a b e l e d 1 K B + , c o n t a i n s a D N A s i z e m a r k e r ( G i b c o - B R L ) . H D : H . d e m a t i o i d e s , A P : A . p u l l u l a n s , P G : P . g a u m a n n i i , R P P - z R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e , R P - = R . p a r k e r i A T C C 2 0 1 6 6 0 . L e t t e r s r e p r e s e n t v a r i e t y o f D . fi r ( C O = c o a s t a l , l M = i n t e r m o u n t a i o n ) a n d s o u r c e o f n e e d l e ( W A = W a s h i n g t o n S t a t e , M l = M i c h i g a n ) . F i r s t n u m b e r f o l l o w i n g t h e l e t t e r s i s t h e a g e o f n e e d l e ( 0 : n e e d l e s c o l l e c t e d j u s t a f t e r b u d b r e a k i n M a y ) a n d s e c o n d n u m b e r a f t e r h y p h e n i s t h e s a m p l e n u m b e r . F o r e x a m p l e , l M W A 1 - 2 9 i s 1 y e a r - o l d n e e d l e s - s a m p l e o f i n t e r m o u n t a i n D o u g l a s f i r f r o m W a s h i n g t o n . 2 9 i s s a m p l e n u m b e r . 1 6 2 3 2 0 2 I 0 0 A O O A A 8 8 5 5 5 5 6 4 4 - - - — O O C 0 C 1 4 T A m x ‘ , I ' _ A W - - W P P O R R C - - - Z 3 4 - O A - - O O A A W W M M l | - - A A W W W W M M W M I M l M l l - - l — 0 1 - - 2 3 8 1 1 9 1 1 . " M C 0 5 - 1 P P R - M M I 8 9 C C 8 B 0 0 0 5 5 5 5 5 5 4 5 4 5 5 - - - - - - 5 5 — — 0 2 2 2 2 2 2 2 T 0 - O O O - — - A A O O O O A A A O O O O O A A A A A - W W W W W A A A A W W P R - 2 W W W W M M M M M M M M M I I l M M l l I I l I l l — - - - - - W W M M I I - - - - - - - 0 1 2 6 7 8 1 1 9 1 3 4 5 6 7 1 1 1 1 1 ' 1 ‘ . < ‘ 5 - . , . , m X . _ r . — 2 7 2 b p 7 5 b p F i g u r e 3 . 1 3 . R e s t r i c t i o n d i g e s t s b y e n d o n u c l e a s e S c a l o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d f r o m D N A e x t r a c t i o n s o f n e e d l e s u s i n g R . p a r k e r i s p e c i fi c - p r i m e r s R P 1 a n d R P 4 . L a n e 1 , l a b e l e d 1 K B + , c o n t a i n s a D N A s i z e m a r k e r ( G i b c o - B R L ) . R P - = R . p a r k e r i A T C C 2 0 1 6 6 0 . L e t t e r s r e p r e s e n t v a r i e t y o f D . fi r ( C O = c o a s t a l , | M = i n t e r m o u n t a i o n ) a n d s o u r c e o f n e e d l e ( W A = W a s h i n g t o n S t a t e , M l = M i c h i g a n ) . F i r s t n u m b e r f o l l o w i n g t h e l e t t e r s i s t h e a g e o f n e e d l e ( O = n e e d l e s c o l l e c t e d j u s t a f t e r b u d b r e a k i n M a y ) a n d s e c o n d n u m b e r a f t e r h y p h e n i s t h e s a m p l e n u m b e r . F o r e x a m p l e , l M W A O — 4 8 i s c u r r e n t y e a r n e e d l e s o f i n t e r m o u n t a i n D o u g l a s fi r f r o m W a s h i n g t o n . S a m p l e n u m b e r 4 8 . H D : H . d e m a t i o i d e s , A P : A . p u I l u / a n s , P G : P . g a u m a n n i i , R P P - z R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e , 1 6 3 O b v i o u s l y , r e s t r i c t i o n d i g e s t p r o f i l e s p r o d u c e d b y t h e t h r e e e n d o n u c l e a s e s B s t M , B s t U l a n d S c a t i n i n d e p e n d e n t d i g e s t s c o n f i r m t h a t P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y s p e c i fi c p r o b e s R P 1 a n d R P 4 b e l o n g e d t o R . p a r k e n ' i n a l l n e e d l e s a m p l e s t e s t e d . T h e e n d o p h y t e w a s c o n fi r m e d t o b e p r e s e n t i n n e w l y e m e r g e d n e e d l e s a n d i n n e e d l e s o f a l l a g e s . S e q u e n c i n g o f R P 1 a n d R P 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s f r o m n e e d l e s T o f u r t h e r c o n f i r m t h e i d e n t i t y o f 3 9 4 b p P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y p r i m e r s R P 1 a n d R P 4 , P C R p r o d u c t s f r o m 3 n e e d l e s a m p l e s w i t h s y m p t o m s a n d s i g n s o f i n f e c t i o n b y R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e ( R P P - 0 R 2 , R P P - C H M I , R P P - W A 2 9 ) , a n d 3 n e e d l e s a m p l e s w i t h n o e x t e r n a l s y m p t o m s o f d i s e a s e ( I M W A 4 1 , C O W A 4 , I M M I 5 ) w e r e s e q u e n c e d u s i n g i n t e r n a l p r i m e r s I T S Z a n d I T S 3 ( F i g u r e 3 . 1 4 ) . T h e s e q u e n c e s f r o m a l l s a m p l e s w e r e h o m o l o g o u s t o a l i g n e d s e q u e n c e s o f R h a b d o c l i n e p a r k e r i . 1 6 4 1 6 0 R P - A T C C C C G A G T T T C T T G C C C T A A C G G G T A G A T C T C C C A C C C T T G T G T A T T T A T A C C A T G T T G C T T C O W A 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T A T A C C A T G T T G C T T C O W A 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I M W A 1 - 4 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . R P P - W A 2 9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . R P P - 0 R 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . R P P - C H M I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I M M I 5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A T G T T G C T T 6 1 1 2 0 R P - A T C C T G G C G C C T T C A G G C C T C G C G G C C C G G C G C C A A A G G C C C T A A A C T C T . G T T A A T A A C T G T C C O W A 4 T G G C G C C T T C A G G C C T C G C G G C C C G G C G C C A A A G G C C C T A A A C T C T T G T T A A T A A C T G T C C O W A 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I M W A 1 - 4 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . R P P - W A 2 9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . R P P - 0 R 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . R P P - C H M I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I M M I 5 T G G C G C C T T C A G G C C T C G C G G C C C G G C G C C A A A G G C C C T A A A C T C T . G T T A A T A A C T G T C 1 2 1 1 8 0 R P - A T C C G T C T G A G T A C T A T A T A A T A G T T A A A A C T T T C A A C A A C G G A T C T C T T G G T T C T G G C A T C G A C O W A 4 G T C T G A G T A C T A T A T A A T A G T T A A A A C T T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C O W A 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I M W A 1 - 4 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . R P P - W A 2 9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . R P P - 0 R 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . R P P — C H M I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I M M I 5 G T C T G A G T A C T A T A T A A T A G T T A A A A C T T T C A A C A A C G G A T C T C T T G G T T C T G G C A T C G A ( - - - - - - I T S Z 1 8 1 I T S 3 - - - - ' 9 2 4 o R P - A T C C T G A A G A A C G C A G C G A A A T G C G A T A A G T A A T G T G A A T T G C A G A A T T C A G T G A A T C A T C G A A C O W A 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C O W A 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A I M W A 1 - 4 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T G T G A A T T G C A G A A T T C A G T G A A T C A T C G A A R P P - W A 2 9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T A A G T A A T G T G A A T T G C A G A A T T C A G T G A A T C A T C G A A R P P - 0 R 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A T G T G A A T T G C A G A A T T C A G T G A A T C A T C G A A R P P - C H M I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T G A A T C A T C G A A I M M I S T G A A G A A C G C A G C G A A A T G C G A T A A G T A A T G T G A A T T G C A G A A T T C A G T G A A T C A T C G A A 2 4 1 3 0 0 R P - A T C C T C T T T G A A C G C A C A T T G C G C C C C T T G G T A T T C C G G G G G G C A T G C C T G T T C G A G C G T C A T T C O W A 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C O W A 4 T C T T T G A A C G C A C A T T G C G C C C C T T G G T A T T C C G G G G G G C A T G C C T G T T C G A G C G T C A T T I M W A 1 - 4 1 T C T T T G A A C G . A C A T T G C G C C C C T T G G T A T T C C G G G G G G C A T G C C T G T T C G A G C G T C A T T R P P - W A 2 9 T C T T T G A A C G C A C A T T G C G C C C C T T G G T A T T C C G G G G G G C A T G C C T G T T C G A G C G T C A T R P P - 0 R 2 T C T T T G A A C G C A C A T T G C G C C C C T T G G T A T T C C G G G G G G C A T G C C T G T T C G A G C G T C A T T R P P - C H M I T C T T T G A A C G C A C A T T G C G C C C C T T G G T A T T C C G G G G G G C A T G C C T G T T C G A G C G T C A T T I M M I S T C T T T G A A C G C A C A T T G C G C C C C T T G G T A T T C C G G G G G G C A T G C C T G T T C G A G C G T C A T T 1 6 5 3 0 1 3 6 0 R P - A T C C T C A A C C C T T A C G C C T G G C G T A G T C T T G G G C C G T A C C C T C A C G G G T A G G C C T T A A A A T C A G C O W A 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C O W A 4 T C A A C C C T T A C G C C T G G C G T A G T C T T G G G C C G T A C C C T C A C G G G T A G G C C T T A A A A T C A G I M W A 1 - 4 1 T C A A C C C T T A C G C C T G G C G T A G T C T T G G G C C G T A C C C T C A C G G G T A G G C C T T A A A A T C A R P P - W A 2 9 T C A A C C C T T A C G C C T G G C G T A G T C T T G G G C C G T A C C C T C A C G G G T A G G C C T T A A A A T C A G R P P - 0 R 2 T C A A C C C T T A C G C C T G G C G T A G T C T T G G G C C G T A C C C T C A C G G G T A G G C C T T A A A A T C A G R P P - C H M I T C A A C C C T T A C G C C T G G C G T A G T C T T G G G C C G T A C C C T C A C G G G T A G G C C T T A A A A T C A G I M M I 5 T C A A C C C T T A C G C C T G G C G T A G T C T T G G G C C G T A C C C T C A C G G G T A G G C C T T A A A A T C A G 3 6 1 4 2 0 R P - A T C C T G G C G G T G C C C T C G C G G T C C T G A G C G T A G T A C T T T T T T C T C G C T A T A G G C C C C G G G A G G A C O W A 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C O W A 4 T G G C G G T G C C C T C G C G G T C C T G A G C G T A G T A C T T T T T T C T C G C T A T A G G C C C C G G G A G G A I M W A 1 - 4 1 T G G C G G T G C C C T C G C G G G C C T G A G C G T A G T A C T T T T T T C T C G C T A T A G G C C C C G G G A G G A R P P - W A 2 9 T G G C G G T G C C C T C G C G G T C C T G A G C G T A G T A C T T T T T T C T C G C T A T A G G C C C C G G G A G G A R P P - 0 R 2 T G G C G G T G C C C T C G C G G T C C T G A G C G T A G T A C T T T T T T . T C G C T A T A G G C C C C G G G A G G A R P P - C H M I T G G C G G T G C C C T C G C G G T C C T G A G C G T A G T A C T T T T T T C T C G C T A T A G G C C C C G G G A G G A I M M I S T G G C G G T G C C C T C G C G G T C C T G A G C G T A G T A C T T T T T T C T C G C T A T A G G C C C C G G G A G G A 4 2 1 4 5 2 R P - A T C C C G C T T G C C A G C A A C C C C C A A T T T T T C T T C T G G C O W A 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C O W A 4 C G C T T G C C A G C A A C C C C C A A T T T T T . . . . . . . I M W A 1 - 4 1 C G C T T G C C A G C A A C C C C C A A T T T T T C . . . . . . R P P - W A 2 9 C G C T T G C C A G C A A C C C C C A A T T T T T . . . . . . . R P P — 0 R 2 C G C T G G C C A G C A A C C C C C A A T T T T T . . . . . . . R P P - C H M I C G C T T G C C A G C A A C C C C C A A T T T T T . . . . . . . C L O N E D I M M I 5 C G C T T G C C A G C A A C C C C C A A T T T T T . . . . . . . F i g u r e 3 . 1 4 . S e q u e n c i n g o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y R . p a r k e r i s p e c i fi c p r o b e s f r o m n e e d l e s . P C R p r o d u c t s f r o m a l l s a m p l e s e x c e p t R P P - C H M I w e r e s e q u e n c e d w i t h I T S Z a n d I T S 4 p r i m e r s . R P - A T C C : R . p a r k e r i A T C C 2 0 1 6 6 0 , C O W A : 4 y e a r o l d n e e d l e s a m p l e s o f c o a s t a l v a r i e t y o f D o u g l a s fi r f r o m W a s h i n g t o n , l M W A 1 - 4 1 : 1 y e a r o l d n e e d l e s s a m p l e o f I M v a r i e t y o f D o u g l a s fi r f r o m W a s h i n g t o n s t a t e - s a m p l e n u m b e r 4 1 , R P P - W A 2 9 , n e e d l e s a m p l e o f I M v a r i e t y o f D o u g l a s fi r c o n t a i n i n g t h e a p o t h e c i a o f R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e f r o m W a s h i n g t o n s t a t e . R P P - 0 R 2 : n e e d l e s a m p l e o f I M v a r i e t y o f D o u g l a s fi r c o n t a i n i n g t h e a p o t h e c i a o f R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e f r o m O r e g o n , R P P - C H M I : n e e d l e s a m p l e o f I M v a r i e t y o f D o u g l a s fi r c o n t a i n i n g t h e a p o t h e c i a o f R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e f r o m C h e b o y g a n , M i c h i g a n , I M M I 5 : 5 y e a r o l d n e e d l e s a m p l e o f I M v a r i e t y o f D o u g l a s fi r f r o m M i c h i g a n . 1 6 6 c o l l e c t e d f r o m P a c i f i c N o r t h w e s t ( S t o n e , 1 9 8 7 ; T o d d , 1 9 8 8 ) . T h e s c a r c e D I S C U S S I O N I n t h i s s t u d y , w e p r e s e n t t h e p o t e n t i a l u s e o f s p e c i e s - s p e c i f i c p r i m e r s f o r d e t e c t i n g a n d i d e n t i fi c a t i o n o f e n d o p h y t e R . p a r k e r i f r o m i n f e c t e d n e e d l e s o f D o u g l a s fi r i n P C R a n d d o t - b l o t a s s a y s . T h i s a p p r o a c h p r e v i o u s l y u s e d f o r d e t e c t i o n o f e n d o p h y t e s o f g r a s s e s ( D o s s a n d W e l t y , 1 9 9 5 ; D o s s , 1 9 9 8 : G r o p p e a n d B o l l e r 1 9 9 7 ) i s w e l l s u i t e d f o r f u n g i , p a r t i c u l a r l y e n d o p h y t e s t h a t a r e d i f fi c u l t t o d e t e c t , i d e n t i f y a n d i s o l a t e b e c a u s e o f t h e i r l a t e n c y a n d t h e l a c k o f a n y v i s i b l e s y m p t o m s o r f r u i t i n g b o d i e s . H o w e v e r , t h e r e h a s b e e n n o r e p o r t o f u s i n g t h e a p p r o a c h f o r d e t e c t i o n o f a n e n d o p h y t e f r o m c o n i f e r . P r i o r t o t h i s s t u d y , R . p a r k e n ' w a s k n o w n f r o m t h e c o a s t a l a n d i n t e r m o u n t a i n v a r i e t i e s o f D o u g l a s f i r a n d w a s r e p o r t e d t o i n f e c t t w o y e a r o l d o r o l d e r n e e d l e s . H e r e , w e i s o l a t e d t h e e n d o p h y t e f r o m o n e y e a r o l d a n d y o u n g e r n e e d l e s o f t h e i n t e r m o u n t a i n v a r i e t y o f D o u g l a s fi r t h a t w e r e g r o w n i n W a s h i n g h t o n s t a t e . A l s o , w e d i s c o v e r e d t h a t i n d i v i d u a l n e e d l e s i n f e c t e d w i t h R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t f u n g u s R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u o d o t s u g a e w e r e a l s o i n f e c t e d w i t h R . p a r k e r i . F u r t h e r m o r e , t h e e n d o p h y t e w a s i s o l a t e d a n d i d e n t i fi e d i n 3 - 5 y e a r s o l d n e e d l e s a m p l e s f o r t h e f i r s t r e p o r t o f i t s o c c u r r e n c e i n M i c h i g a n , i n C h r i s t m a s t r e e s i n C h e b o y g a n a n d O c e a n a C o u n t i e s . H o w e v e r , i t w a s d i f fi c u l t t o i s o l a t e t h e e n d O p h y t e b e c a u s e o n l y a f e w i s o l a t e s w e r e r e c o v e r e d f r o m m a n y i s o l a t i o n a t t e m p t s w i t h l a r g e a m o u n t s o f n e e d l e s . T h e i n c i d e n c e i n M i c h i g a n w a s v e r y l o w c o m p a r e d t o h i g h i n c i d e n c e a n d f r e q u e n c y o f i s o l a t i o n s f r o m n e e d l e s 1 6 7 p r e s e n c e o f t h e e n d o p h y t e c o u l d b e e x p l a i n e d b y l o w i n f e c t i o n f r e q u e n c i e s . I t i s k n o w n t h a t i n c r e a s e i n i n f e c t i o n f r e q u e n c i e s o f R . p a r k e r i i s d u e t o r e p e a t e d r e - i n f e c t i o n o f n e e d l e s , r a t h e r t h a n c o l o n i z a t i o n o f n e e d l e s f r o m a f e w i n i t i a l i n f e c t i o n s i t e s ( S t o n e , 1 9 8 7 ) . W e a t h e r c o n d i t i o n s i n M i c h i g a n d u r i n g t h e i n f e c t i o n p e r i o d m a y n o t a l l o w t h e e n d o p h y t e t o i n f e c t t h e h o s t r e p e a t e d l y . T h e p r e s e n c e o f t h e e n d o p h y t e i n M i c h i g a n s u g g e s t s t h a t i t i s b e i n g t r a n s p o r t e d i n n u r s e r y s t o c k s , w h i c h a r e u s u a l l y 2 y e a r - o l d s e e d l i n g s . D o u g l a s fi r n u r s e r y s t o c k i s u s u a l l y s o l d a s s e e d l i n g s t h a t a r e t w o y e a r s o l d a n d u s e d f o r C h r i s t m a s t r e e p r o d u c t i o n . I t h a s b e e n r e p o r t e d t h a t g e n e t i c d i v e r s i t y i s a p p a r e n t a m o n g t h e i s o l a t e s o f R . p a r k e r i ( M c C u t c h e o n a n d C a r r o l l , 1 9 9 3 ) i n c l u d i n g v a r i a b i l i t y i n t h e I T S r e g i o n o f i s o l a t e s f r o m b o t h i n t e r i o r a n d c o a s t a l s o u r c e s o f D o u g l a s f i r ( G e r n a n d t e t a l 1 9 9 7 ) . W e h a v e n o t s e e n a n y v a r i a b i l i t y w i t h i n t h e I T S o f R . p a r k e r i c u l t u r e s i s o l a t e d f r o m n e e d l e s o f c o a s t a l a n d i n t e r m o u n t a i n v a r i e t i e s o f D o u g l a s fi r g r o w n i n W a s h i n g t o n o r f r o m n e e d l e s o f t h e i n t e r m o u n t a i n v a r i e t y g r o w n i n M i c h i g a n . I t i s e v i d e n t t h a t i n t e r m o u n t a i n v a r i e t i e s g r o w n i n W a s h i n g t o n l i k e l y a c q u i r e t h e f u n g u s f r o m a d j a c e n t D o u g l a s f i r o f t h e c o a s t a l v a r i e t y . V a r i a b i l i t y i n t h e I T S r e g i o n w a s t a k e n i n t o c o n s i d e r a t i o n w h e n p r o b e s w e r e c h o s e n . W e e x p l o i t e d a l l a v a i l a b l e s e q u e n c e s i n I T S I a n d I T S I I r e g i o n s t h a t a r e c o n s e r v e d a m o n g R . p a r k e r i i s o l a t e s b u t d i f f e r f r o m o t h e r R h a b d o c l i n e t a x a a s p o t e n t i a l p r i m e r c a n d i d a t e s s i n c e o u r g o a l w a s t o fi n d p r o b e s t h a t a r e b o t h R . p a r k e n ' - s p e c i fi c a n d a r e c a p a b l e o f d e t e c t i n g t h e t a r g e t f u n g u s d i r e c t l y i n i n f e c t e d a n d s y m p t o m l e s s n e e d l e s . 1 6 8 T h e p r i m e r p a i r s R P 1 - R P 4 a n d R P 1 A - R P 4 A w e r e s p e c i e s - s p e c i fi c t o R . p a r k e r i a t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s o f 5 0 - 5 2 C w h e n u s e d i n P C R a m p l i f i c a t i o n o f D N A e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m o r f r u i t i n g b o d i e s . T h e y b o t h s e l e c t i v e l y a m p l i f i e d I T S r D N A s e q u e n c e o n l y f r o m R . p a r k e n ' a n d n o t f r o m o t h e r R h a b d o c l i n e t a x a o r o t h e r f u n g i f o u n d i n D o u g l a s fi r n e e d l e s . D i r e c t P C R w i t h t h e s e p r o b e s c o m b i n a t i o n s e n a b l e u s t o u n a m b i g u o u s i d e n t i f y R . p a r k e r i i s o l a t e s i n l e s s t h a n 4 h o u r s e l i m i n a t i n g t h e n e c e s s i t y o f c u l t u r a l s t u d i e s a n d v i s u a l c o m p a r i s o n s o f m o r p h o l o g y w i t h r a r e r e f e r e n c e c u l t u r e s . A m p l i fi c a t i o n o f t h e e n d o p h y t e s d i r e c t l y f r o m n e e d l e s w i t h t h e p r i m e r c o m b i n a t i o n R P 1 a n d R P 4 a l w a y s a m p l i f i e d a 3 9 4 b p P C R p r o d u c t f r o m t h e n e e d l e s o f c o a s t a l D o u g l a s fi r k n o w n t o h a v e R . p a r k e n ' i n f e c t i o n s . H o w e v e r , t h e a m p l i fi c a t i o n s a l w a y s y i e l d e d w e a k P C R b a n d s m o s t p r o b a b l y b e c a u s e o f t h e v a r i a b i l i t y i n t h e r a t i o o f t a r g e t D N A t o n o n - t a r g e t p l a n t D N A ( H a m e l i n e t a l . 1 9 9 6 ) . N o d o u b t , l o w l e v e l s o f e n d o p h t e i s d u e t o t h e f a c t t h a t e a c h i n f e c t i o n i s l i m i t e d t o a s i n g l e e p i d e r m a l c e l l a n d o n l y a s m a l l p o r t i o n o f e p i d e r m i s c e l l s a r e i n f e c t e d ( S t o n e 1 9 8 7 ) . I n e f f i c i e n t a m p l i fi c a t i o n d i r e c t l y f r o m n e e d l e s a t o p t i m a l a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s m a y a l s o b e i n fl u e n c e d b y t h e l o w , l e s s t h a n o p t i m a l % G C b e c a u s e o f l o w G C % o f t h e c h o s e n p r i m e r s H o w e v e r , s e q u e n c e s o f R . p a r k e r i t h a t w e r e d i f f e r e n t f r o m t h e s e q u e n c e s o f o t h e r R h a b d o c l i n e t a x a a n d t h a t c o u l d b e d e s i g n e d a s p r o b e s d i d n o t h a v e h i g h G C c o n t e n t . N e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s h a v e b e e n p r o v e n t o i n c r e a s e s e n s i t i v i t y o f d e t e c t i o n o f f u n g i i n p l a n t t i s s u e s b y 2 5 0 0 - f o l d ( K r i c k a , 1 9 9 2 ) . T h e c o n c e p t o f 1 6 9 n e s t e d P C R i s t o d o o n e P C R a m p l i f i c a t i o n w i t h a s e t o f p r i m e r s ( e x t e r n a l p r i m e r s ) , t h e n u s e t h e r e s u l t i n g P C R p r o d u c t s a s t e m p l a t e f o r a s e c o n d P C R a m p l i fi c a t i o n w i t h a s e c o n d s e t o f p r i m e r s ( i n t e r n a l p r i m e r s ) . T h e fi r s t a m p l i fi c a t i o n w i t h f u n g u s t h e s p e c i fi c p r i m e r I T S 1 F p a i r e d w i t h I T S 4 p r e f e r e n t i a l l y i n c r e a s e s t h e p o p u l a t i o n o f f u n g a l I T S m o l e c u l e s , t h e r e b y i n c r e a s i n g t h e r a t i o o f f u n g a l : h o s t I T S m o l e c u l e s . T h e c o m p e t i t i o n b e t w e e n t h e t w o P C R p r o d u c t s i s r e d u c e d d u r i n g t h e s e c o n d r o u n d o f a m p l i fi c a t i o n s i n c e l a r g e n u m b e r s o f I T S m o l e c u l e s s e r v e a s t e m p l a t e t o t h e s p e c i e s - s p e c i f i c p r i m e r s ( H a m e l i n e t a l . 1 9 9 6 ) . N e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s w i t h t h e c o m b i n a t i o n s o f R . p a r k e n ' s p e c i fi c p r i m e r s t e s t e d h a v e i n c r e a s e d t h e s e n s i t i v i t y w h i l e r e d u c e d t h e s p e c i fi c i t y w i t h s o m e c o m b i n a t i o n s o f p r i m e r s . T h e l o s s i n s p e c i f i c i t y w a s r e c o v e r e d b y r a i s i n g a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s u p t o 6 0 C . R e d u c i n g t h e i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n o f t e m p l a t e a l s o i n c r e a s e d t h e s e n s i t i v i t y ( H e n s o n a n d F r e n c h , 1 9 9 3 ) . H o w e v e r , t h e p r i m e r p a i r R P 1 - R P 4 w a s p r e f e r e n t i a l l y s e l e c t e d f o r u s e b e c a u s e i t s h o w e d s p e c i fi c i t y t o R . p a r k e r i a t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e a s l o w a s 5 2 C . N e s t e d P C R a m p l i f i c a t i o n f o r d e t e c t i o n o f R . p a r k e n ’ i n n e e d l e s u s i n g i n t e r n a l p r i m e r p a i r R P 1 - R P 4 y i e l d e d c o n s i s t e n t a n d r e p r o d u c i b l e r e s u l t s . F u r t h e r m o r e , t h e p a i r a l s o a m p l i f i e d R . p a r k e r i i n d u a l i n f e c t i o n s o f R h a b d o c l i n e t a x a . H o w e v e r , m o s t r e m a r k a b l e w a s t h e d e t e c t i o n t h e e n d o p h y t e i n n e e d l e s c o l l e c t e d j u s t a f t e r b u d b r e a k , i n d i c a t i n g t h a t R . p a r k e n ' i n f e c t s n e e d l e s a f t e r b u d b r e a k j u s t a s o t h e r p a t h o g e n i c R h a b d o c l i n e t a x a . T h i s f i n d i n g i s c o n t r a r y t o r e p o r t s t h a t R . p a r k e r i i n f e c t s n e e d l e s i n t h e s e c o n d f a l l f o l l o w i n g t h e n e e d l e 1 7 0 e m e r g e n c e ( S t o n e , 1 9 8 7 ) . I t i s n o t a b l e t h a t t h e e n d o p h y t e h a s t h e s a m e m e c h a n i s m o f i n f e c t i o n a s t h e p a t h o g e n i c R h a b d o c l i n e s p e c i e s w h i c h i s v i a d i r e c t p e n e t r a t i o n o f h o s t e p i d e r m a l c e l l s t h r o u g h t h e c u t i c l e a n d c e l l w a l l b y a t h i n p e n e t r a t i o n p e g ( S t o n e , 1 9 8 7 ) . F u r t h e r m o r e m a n y e n d o p h y t e s w e r e i s o l a t e d f r o m c u r r e n t y e a r s n e e d l e s a t e a r l y s t a g e s o f d e v e l o p m e n t ( S u s k e a n d A c k e r , 1 9 8 7 a n d S i e b e r , 1 9 8 9 ) W e c o n fi r m e d t h e d e t e c t i o n o f R . p a r k e r i i n n e e d l e s b y v e r i f y i n g t h a t t h e P C R p r o d u c t s w e r e i d e n t i fi a b l e a s I T S r D N A s e q u e n c e o f R . p a r k e r i u s i n g r e s t r i c t i o n d i g e s t s a n d s e q u e n c i n g o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y t h e p r i m e r p a i r R P 1 a n d R P 4 . R e s t r i c t i o n f r a g m e n t a n a l y s i s w i t h 4 r a r e c u t t e r e n z y m e s ( B s t N l , B s t U l , S e a l a n d S p e l ) s h o w e d t h a t a l l P C R p r o d u c t s a m p l i f i e d f r o m a l l a g e s o f n e e d l e s b e l o n g e d t o t h e t a r g e t f u n g u s . W e a l s o d e t e r m i n e d s p e c i f i c i t y o f 5 p r o b e s t o R . p a r k e r i i n d o t - b l o t a s s a y s o f I T S 1 F a n d I T S 4 a m p l i f i e d P C R p r o d u c t s . A s s a y s w i t h p r o b e s h y b r i d i z e d t o t o t a l D N A e x t r a c t e d f r o m h y p h a e o r f r u i t i n g b o d i e s s h o w e d t h a t t h e p r o b e s c o u l d b e u s e d t o d i f f e r e n t i a t e t h e e n d o p h y t e f r o m o t h e r R h a b d o c l i n e t a x a . D o t - b l o t a s s a y s o f a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s f r o m i n f e c t e d p l a n t m a t e r i a l a r e k n o w n t o b e h i g h l y e f f e c t i v e ( L i e t a l . 1 9 8 8 ; L e e e t a l . 1 9 9 3 ; B r u n s & G a r d e s , 1 9 9 3 ) a n d r e c o m m e n d e d t o b e a f a s t a n d e a s y w a y t o s u r v e y p l a n t s a m p l e s f o r p r e s e n c e o f a f u n g u s ( H i g u c h i e t a l 1 9 8 8 a n d L i e t a l 1 9 8 8 ) . I n t h i s s t u d y , t h e p r o b e s h y b r i d i z e d s t r o n g l y t o t h e a m p l i f i e d P C R p r o d u c t s f r o m n e e d l e s i n d i c a t i n g t h a t d o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s c o u l d b e u s e d t o d e t e c t t h e e n d o p h y t e i n n e e d l e s . D o t 1 7 1 — b l o t a s s a y s o f n e e d l e s f o r d e t e c t i o n o f R . p a r k e r i w e r e n o t s e n s i t i v e e n o u g h t o b e r e c o m m e n d e d , p r o b a b l y b e c a u s e t h e y r e q u i r e l a r g e r a m o u n t s o f f u n g a l D N A t h a n w a s p r e s e n t i n t h e n e e d l e s . I n s u m m a r y , w e s h o w e d f o r t h e fi r s t t i m e t h a t P C R a n d d o t - b l o t a s s a y s a r e u s e f u l f o r d i a g n o s t i c d e t e c t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n o f t h e e n d o p y t e R . p a r k e n ’ i n c o n i f e r n e e d l e s . P r i m e r s t e s t e d w e r e s u f fi c i e n t l y s p e c i fi c t o d i s t i n g u i s h t h e e n d o p h y t e f r o m o t h e r R h a b d o c l i n e t a x a a n d o t h e r f u n g i p r e s e n t i n o r o n D o u g l a s fi r n e e d l e s i n b o t h P C R a n d d o t - b l o t a s s a y s . A s s a y s w i t h R . p a r k e r i s p e c i fi c p r o b e s m a y c o n t r i b u t e t o r e s e a r c h o n t h e e f f e c t o f e n d o p h y t i c i n f e c t i o n o n f u n g a l p o p u l a t i o n b i o l o g y a n d h o s t b i o l o g y . 1 7 2 R E F E R E N C E S A l t s c h u l , S . F . , M a d d e n , T . L . , S c h a f f e r , A . A . , Z h a n g , J . , Z h a n g , Z . , M i l l e r , W . & L i p m a n , D . J . ( 1 9 9 7 ) . " G a p p e d B L A S T a n d P S I - B L A S T : a n e w g e n e r a t i o n o f p r o t e i n d a t a b a s e s e a r c h p r o g r a m s . " N u c l e i c A c i d s R e s . 2 5 : 3 3 8 9 - 3 4 0 2 . A u s u b e l , F . M . , B r e n t , R . , K i n g s t o n , R . E . , M o o r e , D . D . , S e i d m a n , J . G . , S m i t h , J . A . , a n d S t r u h l , K . 2 0 0 1 . C u r r e n t p r o t o c o l s i n m o l e c u l a r b i o l o g y . J o h n W i l e y & S o n s , I n c . N e w Y o r k . B r u n s , T . D . a n d G a r d e s , M . 1 9 9 3 . M o l e c u l a r t o o l s f o r t h e i d e n t i fi c a t i o n o f e c t o m y c o r r h i z a l f u n g i - t a x o n - s p e c i f i c o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s f o r s u i l l o i d f u n g i . M o l e c u l a r E c o l o g y 2 : 2 3 3 - 2 4 2 . B e r n s t e i n , M . E . , a n d C a r r o l l , G . C . 1 9 7 7 . I n t e r n a l f u n g i i n o l d - g r o w t h D o u g l a s f i r f o l i a g e C a n a d i a n J o u r n a l o f B o t a n y 5 5 : 6 4 4 - 6 5 3 . C a r r o l l , G . C . 1 9 8 8 . F u n g a l e n d o p h y t e s i n s t e m s a n d l e a v e s : f r o m l a t e n t p a t h o g e n t o m u t u a l i s t i c s y m b i o n t . E c o l o g y 6 9 : 2 - 9 . C a r r o l l , G . C a n d C a r r o l l , F . E . 1 9 7 8 . S t u d i e s o n t h e i n c i d e n c e o f c o n i f e r o u s n e e d l e e n d o p h y t e s i n t h e P a c i fi c N o r t h w e s t . C a n a d i a n J o u r n a l o f B o t a n y 5 6 : 3 0 3 4 - 3 0 4 3 . D o s s , R . P . 1 9 9 8 . A P C R - b a s e d t e c h n i q u e f o r d e t e c t i o n o f N e o t y p h o d i u m e n d o p h y t e s i n d i v e r s e a c c e s s i o n s o f t a l l f e s c u e . P l a n t D i s e a s e 8 2 ( 7 ) : 7 3 8 - 7 4 0 . D o s s , R . P . , a n d W e l t y , R . E . 1 9 9 5 . A p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n - b a s e d p r o c e d u r e f o r d e t e c t i o n o f A c r e m o n i u m c o e n o p h i a l u m i n t a l l f e s c u e . P h y t o p a t h o l o g y 8 5 : 9 1 3 - 9 1 7 . F r o h l i c h , J . , H y d e , K . D . , a n d P e t r i n i , O . 2 0 0 0 . E n d o p h y t i c f u n g i a s s o c i a t e d w i t h p a l m s M y c o l o g i c a l R e s e a r c h 1 0 4 ( 1 0 ) : 1 2 0 2 - 1 2 1 2 . F u n k , A . 1 9 8 5 . F o l i a r F u n g i o f W e s t e r n T r e e s . C a n a d i a n F o r e s t r y S e r v i c e , P a c i f i c F o r e s t r e s e a r c h C e n t r e . V i c t o r i a , B C , C a n a d a , p : 8 8 - 9 1 . G a r d e s , M . a n d B r u n s , T . D . 1 9 9 3 . I T S p r i m e r s w i t h e n h a n c e d s p e c i fi c i t y f o r b a s i d i o m y c e t e s — a p p l i c a t i o n t o t h e i d e n t i fi c a t i o n o f m y c o r r h i z a e a n d r u s t s . M o l e c u l a r E c o l o g y 2 : 1 1 3 - 1 1 . G e r n a n d t , D . S . , C a m a c h o , F . J . , a n d S t o n e , J . K . 1 9 9 7 . M o n a I a n ' c i s , a n a n a m o r p h o f R h a b d o c l i n e . M y c o l o g i a 8 9 ( 5 ) : 7 3 5 - 7 4 4 . 1 7 3 G r o p p e , K a n d B o l l e r , T . 1 9 9 7 . A P C R a s s a y b a s e d o n a m i c r o s a t e l l i t e - c o n t a i n i n g l o c u s f o r d e t e c t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n o f E p i c h l o e e n d o p h y t e s i n g r a s s t i s s u e . A p p l i e d a n d E n v i r o n m e n t a l M i c r o b i o l o g y 6 3 : 1 5 4 3 - 1 5 5 0 . H e l a n d e r , M . L . , S i e b e r , T . N . , P e t r i n i , O . , a n d N e u v o n e n , S . 1 9 9 4 . E n d o p h y t i c f u n g i i n S c o t s p i n e n e e d l e s : s p a t i a l v a r i a t i o n a n d c o n s e q u e n c e s o f s i m u l a t e d a c i d r a i n . C a n a d i a n J o u r n a l o f B o t a n y 7 2 : 1 1 0 8 - 1 1 1 3 . H e l m u t , R . 1 9 9 0 . N o n i s o t o p i c d e t e c t i o n o f P C R p r o d u c t s P a g e s 1 1 9 - 1 2 8 i n : P C R P r o t o c o l s : A g u i d e t o M e t h o d s a n d A p p l i c a t i o n s . M . A . I n n i s , D . H . G e l f a n d , J . J . S n i n s k y , a n d T . J . W h i t e , e d s . A c a d e m i c P r e s s , S a n D i e g o , C A . H a m e l i n , R . C . , B e r u b e , P . , G i g n a c , M . , a n d B o u r a s s a , M . 1 9 9 6 . I d e n t i fi c a t i o n o f r o o t r o t f u n g i i n n u r s e r y s e e d l i n g s b y n e s t e d m u l t i p l e x P C R . A p p l i e d a n d E n v i r o n m e n t a l M i c r o b i o l o g y 6 2 ( 1 1 ) : 4 0 2 6 - 4 0 3 1 . H e n s o n , J . M a n d F r e n c h , R . 1 9 9 3 . T h e P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n a n d P l a n t d i s e a s e d i a g n o s i s . A n n u a l R e v i e w o f P h y t o p a t h o l o g y 3 1 : 8 1 - 1 0 9 . H i g u c h i , R . , v o n B e r o l d i n g e n , C . H . , S e n s a b a u g h , G . F . , a n d E r l i c h , H . A . 1 9 8 8 . D N A t y p i n g f r o m s i n g l e h a i r s . N a t u r e 3 3 2 : 5 4 3 - 5 4 6 . J o h a n s o n , A a n d J e g e r , J . M . 1 9 9 3 . U s e o f P C R f o r d e t e c t i o n o f M y c o s p h a e r e l l a fi j i e n s i s a n d M . m u s i c o l a , t h e c a u s a l a g e n t s o f S i g a t o k a l e a f s p o t s i n b a n a n a a n d p l a n t a i n . M y c o l o g i c a l R e s e a r c h 9 7 ( 6 ) : 6 7 0 - 6 7 4 . J o h n s o n , J . A . , a n d W h i t n e y , N . J . 1 9 9 2 . I s o l a t i o n o f f u n g a l e n d o p h y t e s f r o m b l a c k s p r u c e ( P i c e a m a n ' a n a ) d o r m a n t s b u d s a n d n e e d l e s f r o m N e w B r u n s w i c k , C a n a d a . C a n a d i a n J o u r n a l o f B o t a n y 7 0 : 1 7 5 4 - 1 7 5 7 . K r i c k a , L . J . 1 9 9 2 . N o n - i s o t o p i c D N A P r o b e T e c h n i q u e s . A c a d e m i c P r e s s , I n c . S a n D i e g o , C A . 3 5 8 P p . L e e , S . B . , M i l g r o o m , M . G . , a n d T a y l o r , J . W 1 9 8 8 . A r a p i d , h i g h y i e l d m i n i - p r e p m e t h o d f o r i s o l a t i o n o f t o t a l g e n o m i c D N A f o r m f u n g i . F u n g a l G e n e t N e w s l e t t e r 3 5 : 2 3 - 2 4 . L e e , S . B . , W h i t e , T . J . , a n d T a y l o r , J . W . 1 9 9 3 . D e t e c t i o n o f P h y t o p h t h o r a s p e c i e s b y o l i g o n u c l e o t i d e h y b r i d i z a t i o n t o a m p l i fi e d r i b o s o m a l D N A s p a c e r s . P h y t o p a t h o l o g y 8 3 ( 2 ) : 1 7 7 - 1 8 1 . L e v e s q u e , C . A . , V r a i n , T . C . , a n d D e B o e r , S . 1 9 9 4 . D e v e l o p m e n t o f a s p e c i e s - s p e c i fi c p r o b e f o r P y t h i u m u l t i m u m u s i n g a m p l i f i e d r i b o s o m a l D N A . P h y t o p a t h o l o g y 8 4 ( 5 ) : 4 7 4 - 4 7 8 . 1 7 4 L i , H . , G y l l e n s t e n , U . B . , C u i , X . , S a i k i , R . K . , E r l i c h , H . A . , a n d A r n h e i m , N . 1 9 8 8 . A m p l i fi c a t i o n a n d a n a l y s i s o f D N A s e q u e n c e s i n s i n g l e h u m a n s p e r m a n d d i p l o i d c e l l s . N a t u r e 3 3 5 : 4 1 4 - 4 1 7 . M c C u t c h e o n , T . L a n d C a r r o l l , G . C . 1 9 9 3 . G e n o t y p i c d i v e r s i t y i n p o p u l a t i o n s o f a f u n g a l e n d o p h y t e f r o m D o u g l a s fi r . M y c o l o g i a 8 5 ( 2 ) : 1 8 0 - 1 8 6 . P a r k e r , A . K a n d R e i d , J . 1 9 6 9 . T h e g e n u s R h a b d o c l i n e S y d . C a n a d i a n J o u r n a l o f B o t a n y 4 7 : 1 5 3 3 - 1 5 4 5 . P e t r i n i , O a n d C a r r o l l , G . C . 1 9 8 1 . E n d o p h y t i c f u n g i i n t h e f o l i a g e o f s o m e C u p r e s s e c e a e i n O r e g o n . C a n a d i a n J o u r n a l o f B o t a n y 5 9 : 6 2 9 - 6 3 6 P e t r i n i , 0 . , S t o n e , J . , a n d C a r r o l l , F . E . 1 9 8 2 . E n d o p h y t i c f u n g i i n e v e r g r e e n s h r u b s i n w e s t e r n O r e g o n : a p r e l i m i n a r y s t u d y . C a n a d i a n J o u r n a l o f b o t a n y 6 0 : 7 8 9 - 7 9 6 . R e d l i n , S . C . , a n d C a r r i s , L . M . 1 9 9 6 . E n d o p h y t i c f u n g i i n g r a s s e s a n d w o o d y p l a n t s . A m e r i c a n P h y t o p a t h o l o g i c a l S o c i e t y P r e s s , S t . P a u l , M i n n e s o t a . S a m b r o o k , J . , F r i t s c h , E . F . , a n d M a n i a t i s , T . 1 9 8 9 . M o l e c u l a r c l o n i n g : a l a b o r a t o r y m a n u a l 2 " d e d i t i o n . C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s , C o l d S p r i n g H a r b o r , N e w Y o r k . S h e r w o o d - P i k e , M . , S t o n e , J . K . , a n d C a r r o l l , G . C . 1 9 8 6 . R h a b d o c l i n e p a r k e n ' , a u b i q u i t o u s f o l i a r e n d o p h y t e o f D o u g l a s - fi r . C a n a d i a n J o u r n a l o f B o t a n y 6 4 : 1 8 4 9 - 1 8 5 5 . S i e b e r , T . N . 1 9 8 9 . E n d o p h y t i c f u n g i i n t w i g s o f h e a l t h y a n d a n d d i s e a s e d N o n l v a y s p r u c e a n d w h i t e f i r . M y c o l o g i c a l r e s e a r c h 9 2 : 3 2 2 - 3 2 6 S t o n e , J . K . 1 9 8 6 . F o l i a r e n d o p h y t e s o f P s e u d o t s u g a m e n z i e s i i ( M i r b . ) F r a n c o . C y t o l o g y , a n d P h y s i o l o g y o f t h e H o s t - E n d o p h y t e R e l a t i o n s h i p . P h . D . D i s s e r t a t i o n , U n i v e r s i t y o f O r e g o n , E u g e n e , O r e g o n . S t o n e , J . K . 1 9 8 7 . I n i t i a t i o n a n d d e v e l o p m e n t o f l a t e n t i n f e c t i o n s b y R h a b d o c l i n e p a r k e r i o n D o u g l a s fi r . C a n a d i a n J o u r n a l o f B o t a n y 6 5 : 2 6 1 4 - 2 6 2 1 S u s k e , J a n d A c k e r , G . 1 9 8 7 . I n t e r n a l h y p h a e i n y o u n g s y m p t o m l e s s n e e d l e s o f P i c e a a b i e s ; e l e c t r o n m i c r o s c o p i c a n d c u l t u r a l i n v e s t i g a t i o n . C a n a d i a n j o u r n a l o f b o t a n y 6 5 : 2 0 9 8 - 2 1 0 3 T o d d , D . 1 9 8 8 . T h e e f f e c t s o f h o s t p h e n o t y p e , g r o w t h r a t e , a n d n e e d l e a g e o n t h e d i s t r i b u t i o n o f a m u t u a l i s t i c , e n d o p h y t i c f u n g u s i n D o u g l a s - fi r p l a n t a t i o n s . C a n a d i a n J o u r n a l o f F o r e s t R e s e a r c h 1 8 : 6 0 1 . 6 0 5 1 7 5 W h i t e , T . J . , B r u n s , T . , L e e , S . B . , a n d T a y l o r , J . 1 9 9 0 . A m p l i f i c a t i o n a n d d i r e c t s e q u e n c i n g o f f u n g a l r i b o s o s m a l R N A g e n e s f o r p h y l o g e n e t i c s . I n : P C R p r o t o c o l s : A G u i d e t o M e t h o d s a n d A p p l i c a t i o n s . M . A . I n n i s , D . H . G e l f a n d , J . J . S n i n s k y , a n d T . J . W h i t e , e d s . A c a d e m i c P r e s s , S a n D i e g o , C A . P a g e s 3 1 5 - 3 2 2 . Z h a n g , J . & M a d d e n , T . L . ( 1 9 9 7 ) " P o w e r B L A S T : A n e w n e t w o r k B L A S T a p p l i c a t i o n f o r i n t e r a c t i v e o r a u t o m a t e d s e q u e n c e a n a l y s i s a n d a n n o t a t i o n . " G e n o m e R e s . 7 2 6 4 9 - 6 5 6 . 1 7 6 C H A P T E R 4 D e t e c t i o n a n d I d e n t i fi c a t i o n o f t h e S w i s s n e e d l e c a s t p a t h o g e n P h a e o c r y p t o p u s g a u m a n n i i i n N e e d l e s o f D o u g l a s F i r u s i n g D N A p r o b e s A B S T R A C T S w i s s n e e d l e c a s t , c a u s e d b y P . g a u m a n n i i , i s v e r y d a m a g i n g i n C h r i s t m a s t r e e p l a n t a t i o n s a n d h a s b e c o m e a s e r i o u s t h r e a t t o f o r e s t p l a n t a t i o n s o f D o u g l a s fi r i n N o r t h A m e r i c a i n r e c e n t d e c a d e s . T h e p a t h o g e n s p r e a d s t h r o u g h i n f e c t e d n u r s e r y s e e d l i n g s a n d r e m a i n s l a t e n t i n f o l i a g e u n t i l t h e i d e n t i fi a b l e s t r u c t u r e s f r u i t i n g b o d i e s a r e f o r m e d a y e a r o r m o r e a f t e r i n f e c t i o n . W e h a v e s e q u e n c e d a n d d e s i g n e d s p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r s f r o m i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r r e g i o n ( I T S ) f o r d e t e c t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n o f t h i s p a t h o g e n . P r i m e r p a i r s s u c c e s s f u l l y a n d s p e c i fi c a l l y a m p l i fi e d P . g a u m a n n i i I T S s e q u e n c e s i n b o t h d i r e c t a n d n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s . E s p e c i a l l y , t h e p a i r P G 1 - P G 4 d e t e c t e d t h e P . g a u m a n n i i D N A , n o t o n l y i n y e a r o l d n e e d l e s t h a t c a r r y s y m p t o m s o f t h e d i s e a s e o r f r u i t i n g b o d i e s o f t h e p a t h o g e n , b u t a l s o i n n e w l y e m e r g e d c u r r e n t y e a r s y m p t o m l e s s n e e d l e s i n d i r e c t P C R a m p l i fi c a t i o n s . I n n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s b o t h p r i m e r p a i r s P G 1 - P G 4 a n d P G 2 - P G 5 c o n s i s t e n t l y d e t e c t e d t h e f u n g u s f r o m i n f e c t e d y e a r o l d n e e d l e s a n d c u r r e n t y e a r 1 7 7 n e e d l e s . W e n o t i c e d a n i n c r e a s e i n t h e s e n s i t i v i t y o f t h e d e t e c t i o n w i t h n e s t e d p r i m e r s . N o c r o s s - r e a c t i o n s w e r e o b s e r v e d f r o m a m p l i f i c a t i o n o f n e e d l e s t h a t w e r e h e a v i l y i n f e c t e d w i t h R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t s i n b o t h a s s a y s . P C R d e t e c t i o n w i t h p r i m e r s w a s f o u n d t o b e s u p e r i o r t o c o n v e n t i o n a l i s o l a t i o n p r o t o c o l f o r i d e n t i fi c a t i o n o f P . g a u m a n n i i i n f e c t i o n s i n c e p r i m e r p a i r P G 1 - P G 4 d e t e c t e d t h e p a t h o g e n i n n e e d l e s a m p l e s f r o m w h i c h t h e f u n g u s w a s i s o l a t e d , a n d a l s o i n n e e d l e s a m p l e s f r o m w h i c h t h e f u n g u s w a s n o t i s o l a t e d . I d e n t i t y o f P C R p r o d u c t s a m p l i f i e d b y P G 1 - P G 4 f r o m n e e d l e s i n b o t h d i r e c t a n d n e s t e d P C R a s s a y s w a s c o n fi r m e d b y r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e s B s t N l a n d H p a l l d i g e s t i o n s . A l l p r i m e r s t e s t e d h y b r i d i z e d s p e c i fi c a l l y t o t h e D N A o f P . g a u m a n n i a n d d i f f e r e n t i a t e d i t f r o m o t h e r c l o s e l y r e l a t e d f u n g i i n d o t - b l o t a s s a y s . F u r t h e r m o r e , t h e 3 2 F l a b e l e d w h o l e I T S I r e g i o n s h o w e d a h i g h d e g r e e o f s p e c i e s - s p e c i fi c i t y . T h i s s t u d y s h o w s t h a t P . g a u m a n i i - s p e c i f i c p r i m e r s c o u l d b e u s e d f o r d e t e c t i n g S w i s s n e e d l e c a s t f u n g i f r o m i n f e c t e d n e e d l e s w i t h o r w i t h o u t s y m p t o m s . 1 7 8 I N T R O D U C T I O N P h a e o c r y p t o p u s g a u m a n n i i ( R o h d e ) P e t r , i s a w i d e s p r e a d f o l i a r p a r a s i t e o f D o u g l a s fi r ( P s e u d o t s u g a e m e n z i e s i i ( M i r b . ) F r a n k o ) . T h e f u n g u s c a u s e s t h e d e f o l i a t i n g S w i s s n e e d l e c a s t d i s e a s e a n d i s p a r t i c u l a r l y d a m a g i n g i n C h r i s t m a s t r e e p l a n t a t i o n s . T h e d i s e a s e w a s f i r s t d i s c o v e r e d i n a p l a n t a t i o n o f t w e n t y y e a r s o l d t r e e s i n S w i t z e r l a n d i n 1 9 2 5 a n d h a s b e e n k n o w n t o o c c u r i n n a t u r a l s t a n d s o f D o u g l a s fi r i n w e s t e r n p a r t s o f N o r t h A m e r i c a s i n c e 1 9 3 8 . I t h a s b e e n r e p o r t e d w i d e l y t h r o u g h o u t E u r o p e w h e r e d e f o l i a t i o n w a s s o s e v e r e i n y o u n g p l a n t a t i o n s t h a t D o u g l a s fi r w a s n o t p l a n t e d a t a l l o r w a s p l a n t e d i n m i x e d s t a n d s i n s o m e l o c a t i o n s . S e r i o u s d a m a g e t o p l a n t a t i o n s i n t h e n o r t h e a s t e r n a n d n o r t h c e n t r a l U n i t e d S t a t e s h a s a l s o b e e n r e p o r t e d . S w i s s n e e d l e c a s t h a s b e e n d a m a g i n g i n C h r i s t m a s t r e e p l a n t a t i o n s a n d f o r e s t s o f N e w Z e a l a n d a n d A u s t r a l i a ( M i c h a e l a n d C h a s t a g n e r 1 9 8 4 a a n d b ; H a n s e n e t a l . 2 0 0 0 ) . S w i s s n e e d l e c a s t e m e r g e d a s a s e r i o u s p r o b l e m , e s p e c i a l l y i n D o u g l a s fi r C h r i s t m a s t r e e p l a n t a t i o n s , a s t h e i n d u s t r y e x p a n d e d a n d h a r v e s t s h i f t e d f r o m w i l d t r e e s t o p l a n t a t i o n s o f s h e a r e d t r e e s ( B e r g d a h l a n d F r e n c h , 1 9 7 6 ; H a d fi e l d a n d D o u g l a s , 1 9 8 2 ; C h a s t a g n e r a n d B y t h e r , 1 9 8 3 a , b ; C h a s t a g n e r , 1 9 9 7 ; H a r r i n g h t o n , 1 9 8 6 ; H o o d ; 1 9 9 7 ) . T h e d i s e a s e c a u s e s s e r i o u s l o s s e s i n p l a n t a t i o n - g r o w n C h r i s t m a s t r e e s t h r o u g h o u t W e s t e r n W a s h i n g t o n a n d O r e g o n , w h e r e S w i s s n e e d l e c a s t w a s f o u n d i n 4 8 o u t o f 5 3 C h r i s t m a s t r e e p l a n t a t i o n s s u r v e y e d i n 1 9 8 1 a n d 8 4 % o f a l l t r e e s e x a m i n e d w e r e d i s e a s e d . O f t h e i n f e c t e d t r e e s , 1 1 % r e t a i n e d o n l y c u r r e n t y e a r n e e d l e s a n d w e r e u n m e r c h a n t a b l e . 1 7 9 E c o n o m i c l o s s a t t r i b u t e d t o n e e d l e l o s s w a s 3 . 1 m i l l i o n d o l l a r s ( M i c h a e l a n d C h a s t a g n e r , 1 9 8 2 , 1 9 8 4 a , b ; C h a s t a g n e r a n d B y t h e r , 1 9 8 3 a ; S i n c l a i r e t a l . 1 9 8 9 ) . D i s e a s e w a s r e p o r t e d t o c a u s e s e r i o u s d a m a g e o n P . m e n z e i s i i v a r g l a u c a ( B e i s s n . ) F r a n c o . i n C h r i s t m a s t r e e p l a n t a t i o n s i n t h e G r e a t L a k e s s t a t e s M i c h i g a n , W i s c o n s i n a n d M i n n e s o t a a s w e l l ( M o r t o n a n d P a t t o n , 1 9 7 0 ; B e r g h d a h l , 1 9 7 6 ) . A l t h o u g h t h e d i s e a s e i s v e r y d a m a g i n g i n C h r i s t m a s t r e e p l a n t a t i o n s , i t h a s b e e n h a r m l e s s i n N o r t h A m e r i c a f o r e s t p l a n t a t i o n s u n t i l r e c e n t l y . T h e r e h a s b e e n i n c r e a s i n g c o n c e r n a b o u t a n e p i d e m i c o f S w i s s n e e d l e c a s t o n P . m e n z e i s i i v a r m e n z e i s i i i n t h e c o a s t a l f o r e s t s o f O r e g o n a n d W a s h i n g t o n s i n c e t h e 1 9 9 0 5 . A l t h o u g h t h e p a t h o g e n i s p r e s e n t o n t h e y o u n g s e e d l i n g s a f t e r t h e i r fi r s t g r o w i n g s e a s o n i n t h e fi e l d , p l a n t a t i o n s o f 1 0 - 3 0 y e a r o l d t r e e s a r e m o s t v i s i b l y a f f e c t e d ( H a n s e n e t a l . 2 0 0 0 ; W i n t o n e t a l . 2 0 0 2 ) . P h a e o c r y p t o p u s g a u m a n n i i i n f e c t s n e w l y e m e r g e d n e e d l e s s h o r t l y a f t e r b u d b r e a k i n t h e s p r i n g ( C h a s t a g n e r a n d B y t h e r , 1 9 8 3 ; C h a s t a g n e r , 1 9 9 7 ) a n d s t a y l a t e n t u n t i l t h e fi r s t f r u i t i n g b o d i e s ( p s e u d o t h e c i a ) a p p e a r t h e f o l l o w i n g y e a r ( M i c h a e l s a n d C h a s t a g n e r , 1 9 8 4 a , b ; H a n s e n e t a l . 2 0 0 0 ) . W h e n t h e d i s e a s e b e c o m e s n o t i c e a b l e , m u c h g r e e n f o l i a g e i s a l r e a d y i n f e c t e d a n d m a y c a r r y f r u i t i n g b o d i e s . D e f o l i a t i o n b e g i n s w i t h t h e o l d e s t n e e d l e s , a n d i n s e v e r e i n f e c t i o n s , a l l b u t t h e y o u n g e s t n e e d l e s m a y f a l l . T h e f u n g u s i n c r e a s e s i t s v e g e t a t i v e m a s s o v e r t h e y e a r s w i t h i n t h e n e e d l e a n d o n t h e n e e d l e s u r f a c e u n t i l t h e n e e d l e i s a b s c i s e d . T h e h y p h a e e x t e n s i v e l y c o l o n i z e t h e i n t e r c e l l u l a r s p a c e s , 1 8 0 a n d o f t e n a d h e r e t o c e l l w a l l s w i t h o u t c e l l p e n e t r a t i o n o r d i s r u p t i o n ( C a p i t a n o , 1 9 9 9 ; H a n s e n e t a l . 2 0 0 0 ) . ) . P r e m a t u r e n e e d l e c a s t i n g , c h l o r o s i s , a n d r e d u c e d g r o w t h d e c r e a s e t h e q u a l i t y a n d m a r k e t v a l u e o f C h r i s t m a s t r e e s . A f t e r h a r v e s t , t r e e s w i t h g r e e n i n f e c t e d n e e d l e s d r y o u t a n d l o s e n e e d l e s m o r e r a p i d l y t h a n n o r m a l . I n f o r e s t s t a n d s , n e e d l e c a s t s i g n i fi c a n t l y r e d u c e s w o o d v o l u m e p r o d u c t i o n . P h a e o c r y p t o p u s g a u m a n n i i h a s b e e n g e n e r a l l y d e t e c t e d a n d i d e n t i fi e d b y c l a s s i c a l i s o l a t i o n o r m i c r o s c o p i c t e c h n i q u e s . T h e f u n g u s g r o w s s l o w l y o n l a b o r a t o r y m e d i a a n d i s d i f fi c u l t t o i d e n t i f y i n e a r l y s t a g e s o f d e v e l o p m e n t b y c u l t u r a l c h a r a c t e r i s t i c s . I d e n t i fi c a t i o n s o f P . g a u m a n n i i c a n o n l y b e m a d e a f t e r i t f o r m s f r u i t i n g b o d i e s o n s e c o n d - y e a r o r o l d e r n e e d l e s . E a r l y d e t e c t i o n , w h e n t h e n e e d l e s a r e s t i l l s y m p t o m l e s s , i s i m p o r t a n t t o c o n t r o l a n d m a n a g e t h e d i s e a s e e f f e c t i v e l y . O u r g o a l w a s t o d e v e l o p r a p i d a n d s e n s i t i v e a s s a y s f o r d e t e c t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n o f P . g a u m a n n i i n i n f e c t e d s y m p t o m l e s s n e e d l e s . W e d e s i g n e d o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s f r o m i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r r e g i o n s o f r i b o s o m a l D N A . T h e p r o b e s w e r e t e s t e d b o t h i n P C R a m p l i f i c a t i o n a n d d o t - b l o t a s s a y s f o r s p e c i e s - s p e c i fi c i t y a n d f o r e a r l y d i s e a s e d e t e c t i o n . P C R a n d d o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n m e t h o d s e m p l o y i n g o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s p r o v i d e d a n e a s y m e a n s o f d e t e c t i n g a n d i d e n t i f y i n g t h e p a t h o g e n b o t h i n c u l t u r e a n d i n i n f e c t e d fi s s u e s . 1 8 1 M A T E R I A L S A N D M E T H O D S F u n g a l i s o l a t e s a n d n e e d l e s a m p l e s T h e f u n g a l i s o l a t e s u s e d i n t h i s s t u d y a r e l i s t e d i n T a b l e 4 . 1 . A l l t h e i s o l a t e s e x c e p t R h a b d o c l i n e p a r k e r i S h e r w o o d - P i k e w e r e g r o w n a n d m a i n t a i n e d o n m a l t e x t r a c t a g a r ( D i f c o L a b o r a t o r i e s , D e t r o i t , M i c h i g a n ) . R h a b d o c l i n e p a r k e r i w a s g r o w n o n P D M Y a g a r ( p o t a t o d e x t r o s e a g a r a m e n d e d w i t h 2 % m a l t e x t r a c t a n d 1 % y e a s t e x t r a c t , ( D i f c o ) ( S h e n N o o d - P i k e e t a l . 1 9 8 6 ; S t o n e , 1 9 8 6 ) . F o r D N A e x t r a c t i o n s f r o m m y c e l i a l c u l t u r e s , s t e r i l e c e l l u l o s e m e m b r a n e s c u t t o fi t p e t r i d i s h e s w e r e p l a c e d o n t h e m e d i u m a n d m y c e l i a w e r e s p r e a d o v e r t h e p l a t e s t o a t t a i n g r o w t h o f s u f fi c i e n t m a s s o f h y p h a e . T h e i s o l a t e s o f P h a e o c r y p t o p u s g a u m a n n i i ( R o h d e ) P e t r . p r o d u c e d g r o w t h o f l e s s t h a n 2 . 5 c m d i a m e t e r a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d r e q u i r e d m o r e t h a n 4 m o n t h s t o c o l o n i z e t h e e n t i r e a g a r p l a t e s ( F i g u r e 4 . 1 ) . P . g a u m a n n i i h a d b l a c k y e a s t t y p e g r o w t h l i k e H o r m o n e m a d e m a t i o i d e s L a g e r b e r g & M e l i n . S i m i l a r l y R . p a r k e r i a l s o g r e w s l o w e r w h e r e a s S c l e r o p h o m a p y t h i o p h i l a ( C o r d a ) H o h n . a n d o t h e r e n d o p h y t i c f u n g i , A u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n s ( d e B a r y ) A m . a n d H . d e m a t i o i d e s p r o d u c e d m y c e l i a l g r o w t h i n a w e e k t o c o v e r t h e s u r f a c e o f a g a r p l a t e s . T h e s o u r c e s o f n e e d l e s a m p l e s u s e d i n t h i s s t u d y a r e l i s t e d i n T a b l e 4 . 1 . J e f f S t o n e ( O r e g o n S t a t e U n i v e r s i t y ) s u p p l i e d i d e n t i fi e d s a m p l e s i n f e c t e d b y d i f f e r e n t s p e c i e s a n d s u b s p e c i e s o f R h a b d o c l i n e f o u n d i n O r e g o n ( O R ) . G a r y C h a s t a g n a r ( W a s h i n g t o n S t a t e U n i v e r s i t y ) p r o v i d e d t h e n e e d l e s o f o n e y e a r o l d a n d c u r r e n t y e a r n e e d l e s c o l l e c t e d f r o m t h e i n t e r m o u n t a i n ( I M ) v a r i e t y o f P . m e n z e i s i i ( P . m e n z e i s i i v a r . g l a u c a ) g r o w n i n W a s h i n g t o n ( W A ) . 1 8 2 F i g u r e 4 . 1 . I s o l a t i o n a n d g r o w t h o f S w i s s n e e d l e c a s t p a t h o g e n , P . g a u m a n n i i o n M a l t E x t r a c t A g a r a t r o o m t e m p e r a t u r e i n d i f f u s e l i g h t . O n e m o n t h ( A ) a n d 4 m o n t h s ( B ) o l d c u l t u r e . 1 8 3 T a b l e 4 . 1 . F u n g a l i s o l a t e s a n d n e e d l e s p e c i m e n s u s e d i n t h i s s t u d y . S p e c i e s 1 C o d e H o s t S o u r c e G e n B a n k # F u n g a l i s o l a t e s A u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n s A P P i n u s s y l v e s t r i s M i c h i g a n A F O 1 3 2 2 9 C y c l a n e u s m a m i n u s C M P i n u s t o r r e y a n a C a l i f o r n i a A F O 1 3 2 2 2 C y c l a n e u s m a n i v e u s C N P i n u s s y l v e s t r i s C B S : 4 9 5 . 7 3 A F 0 1 3 2 2 3 D o t h i s t r o m a p i n i D P P i n u s n i g r a M l A F 0 1 3 2 2 7 H o r m o n e m a d e m a t i o i d e s H D P i n u s s y l v e s t r i s M l A F 0 1 3 2 2 7 K a b a t i n a j u n i p e r i K J J u n i p e r v i r g i n i a n a N C A F 2 6 0 2 2 4 K a b a t i n a t h u j a e K T T h u j a e o c c i d e n t a / i s C B S 2 3 8 . 6 6 A F O 1 3 2 2 6 L o p h o d e r m i u m p i n a s t n ' L P P i n u s s y l v e s t r i s A T C C 2 8 3 4 7 A F O 1 3 2 2 4 L o p h o d e r m i u m s e d i t i o s u m L S P i n u s s y l v e s t r i s A T C C 2 8 3 4 5 A F 4 6 2 4 3 5 M e n ' a p a r k e r i M P - A T C C P . m e n z i e s i i ( c o a s t a l ) A T C C 6 2 7 0 4 P h a e o c r y p t o p u s g a u m a n n i i P G P . m e n z i e s i i M l A F O 1 3 2 2 5 P G - W A P . m e n z i e s i i W A R h a b d o c l i n e p a r k e n ’ R P - A T C C P . m e n z i e s i i ( c o a s t a l ) A T C C 2 0 1 6 6 0 A F 2 6 0 8 1 3 R P - C O H P . m e n z i e s i i ( c o a s t a l ) W A A F 4 6 2 4 2 3 R P - W A 1 0 3 P . m e n z i e s i i ( I M ) W A A F 4 6 2 4 2 6 R P - W A 1 0 4 P . m e n z i e s i i ( I M ) W A A F 4 6 2 4 2 4 L o p h o d e r m i u m p i n a s t r i L P P i n u s s y l v e s t r i s A T C C 2 8 3 4 7 A F 0 1 3 2 2 4 L o p h o d e r m i u m s e d i t i o s u m L S P i n u s s y l v e s t r i s A T C C 2 8 3 4 5 A F 4 6 2 4 3 5 R h i z o s p h a e r a k a l k h o f fi i 1 R K A - 1 P i c e a p u n g e n s M l A F 0 1 3 2 3 2 S c l e r o p h o m a p i t y o p h y l a S P P i n u s s y l v e s t r i s M I A F 4 6 2 4 3 8 M a d a m P h a e o c r y p t o p u s g a u m a n n i i P G - M I P . m e n z i e s i i ( I M ) M I R . p s e u d o t s u g a e s s p . R P E - O R 1 P . m e n z i e s i i ( I M ) O R 0 9 2 2 9 2 e p i p h y l l a R . p s e u d o t s u g a e s s p . R P P - 0 R 2 P . m e n z i e s i i ( I M ) O R U 9 2 2 9 0 p s e u d o t s u g a e R P P - 0 R 3 P . m e n z i e s i i ( I M ) O R U 9 2 2 9 1 R P P - C H M I P . m e n z i e s i i ( I M ) M I A F 4 6 2 4 2 0 R P P - O C M I P . m e n z i e s i i ( I M ) M I A F 4 6 2 4 R P P - W A P . m e n z i e s i i ( I M ) W A R . w e i n ‘ i s p p . o b o v a t a R W O B V - 0 R 5 P . m e n z i e s i i ( I M ) O R U 9 2 2 9 3 R . w e i r i i s p p . o b l o n g a R W O B L - M I P . m e n z i e s i i ( I M ) M l A F 2 6 0 8 1 4 R . w e i r i i s s p . w e i r i i R W W - 0 R 1 P . m e n z i e s i i ( I M ) O R U 9 2 3 0 0 N e e d l e s p e c i m e s 3 M S U 1 - 4 4 P . m e n z i e s i i ( I M ) W A M S U 1 - 4 4 C P . m e n z i e s i i ( I M ) W A D F - H P . m e n z i e s i i ( I M ) M I 1 F u n g i a v a i l a b l e a s m y c e l i a l c u l t u r e 2 N e e d l e s p e c i m e n s c a r r y i n g f r u i t i n g b o d i e s o f i d e n t i fi e d f u n g i 3 N e e d l e s p e c i m e n s M S U 1 - 4 4 w e r e f r o m a y e a r o l d n e e d l e s M S U 1 - t h r o u g h 4 4 C w a s f r o m c u r r e n t y e a r n e e d l e s c o l l e c t e d i n M a y . D F - H : u n i n f e c t e d D o u g l a s fi r n e e d l e s . 1 8 4 H e a l t h y a n d d i s e a s e d n e e d l e s a m p l e s w e r e a l s o c o l l e c t e d d u r i n g v i s i t s t o t h e p l a n t a t i o n s i n C h e y b o g a n a n d O c e a n a C o u n t i e s i n M i c h i g a n o r s e n t b y M S U e x t e n s i o n a g e n t s t h r o u g h o u t M i c h i g a n . F r u i t i n g b o d i e s o f R h a b d o c l i n e o n t h e n e e d l e s a m p l e s w e r e i d e n t i fi e d t o s p e c i e s a n d s u b s p e c i e s u s i n g t h e m o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s d e s c r i b e d b y P a r k e r 8 R e i d ( 1 9 6 9 ) a n d F u n k ( 1 9 8 5 ) . D N A e x t r a c t i o n f r o m m y c e l i u m o f f u n g i F u n g a l m y c e l i a g r o w n o n c e l l u l o s e m e m b r a n e - c o v e r e d p l a t e s w e r e s c r a p e d i n t o 1 5 m l t u b e s a n d l y o p h i l i z e d f o r 2 d a y s . D N A w a s e x t r a c t e d a c c o r d i n g t o t h e p r o t o c o l d e s c r i b e d b y L e e e t a l . ( 1 9 8 8 ) . L y o p h i l i z e d h y p h a e ( a p p r o x i m a t e l y 1 0 0 m g ) w e r e s u s p e n d e d i n 7 0 0 p l l y s i s b u f f e r ( 5 0 m M T r i s - H C I , 5 0 m M E D T A , 3 % S D S , p H 8 . 0 ; a m e n d e d w i t h 1 % 2 - m e r c a p t o e t h a n o l j u s t p r i o r t o e a c h u s e ) . P e s t l e s w e r e s o a k e d i n d i l u t e H C I ( 1 : 1 0 ) a n d c l e a n e d w i t h s o a p a n d w a t e r b e f o r e s t e r i l i z a t i o n . M y c e l i a w e r e c r u s h e d w i t h p e s t l e s f o r 3 - 5 m i n u t e s a n d i n c u b a t e d 1 h o u r a t 6 5 0 C . T h e n , 7 0 0 p l p h e n o l : c h l o r o f o r m : i s o a m y l a l c o h o l ( 2 5 : 2 4 : 1 , S i g m a A l d r i c h C o r p o r a t i o n , S t L o u i s , M O ) w a s a d d e d a n d t h e t u b e s w e r e v o r t e x e d b r i e fl y . T u b e s w e r e s p u n a t 1 2 0 0 0 r p m f o r 1 0 m i n a n d t h e a q u e o u s t o p p h a s e w a s t r a n s f e r r e d t o n e w t u b e s . T h e p h e n o l : c h l o r o f o r m : i s o a m y l a l c o h o l t r e a t m e n t a n d c e n t r i f u g a t i o n s t e p s w e r e r e p e a t e d . T h e n , 7 0 0 p l c h l o r o f o r m : i s o a m y l a l c o h o l ( 2 4 : 1 ) w a s a d d e d t o t h e s u p e r n a t a n t , w h i c h w a s v o r t e x e d a n d s p u n a t 1 2 0 0 0 r p m f o r 5 m i n u t e s . T h e a q u e o u s p h a s e w a s c o l l e c t e d a n d 2 0 p l o f 3 M s o d i u m a c e t a t e a n d 0 . 5 v o l u m e o f i s o p r o p y l a l c o h o l 1 8 5 w e r e a d d e d . D N A w a s p r e c i p i t a t e d b y i n v e r t i n g t h e t u b e s g e n t l y s e v e r a l t i m e s a n d c e n t r i f u g a t i o n f o r 1 0 m i n a t 1 3 0 0 0 r p m a t 4 C t o p e l l e t . T h e s u p e r n a t a n t w a s p o u r e d o f f a n d p e l l e t s w e r e r e s u s p e n d e d i n 1 0 0 p l T E b u f f e r ( 1 0 m M T r i s - H C I , p H 8 a n d 0 . 5 M E D T A , p H 8 a n d s t o r e d a t — 2 0 C . A c l e a n i n g p r o c e d u r e f o r p o l y s a c c h a r i d e - c o n t a m i n a t e d D N A d e s c r i b e d b y A u s u b e l e t a l . ( 2 0 0 1 ) w a s u s e d t o f u r t h e r p u r i f y m i n i p r e p s i f P C R a m p l i fi c a t i o n i n i t i a l l y f a i l e d . F i v e M N a C I w a s a d d e d t o t h e D N A s o l u t i o n t o g i v e a fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 7 M N a C I . A 1 0 % C T A B i n 0 . 7 M N a C I w a s a l s o a d d e d t o g i v e a fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f 1 % C T A B i n t h e D N A s a m p l e b e f o r e i n c u b a t i n g a t 6 5 C f o r 1 5 m i n . T h e s o l u t i o n w a s e x t r a c t e d w i t h 1 v o l u m e o f c h l o r o f o r m : i s o a m y l a l c o h o l ( 2 4 : 1 ) a n d a q u e o u s l a y e r w a s t r a n s f e r r e d t o a n e w t u b e f o l l o w i n g c e n t r i f u g a t i o n a t 1 2 0 0 0 r p m f o r 5 m i n . T h e n , 1 v o l u m e o f p h e n o l : c h l o r o f o r m : i s o a m y l a l c o h o l ( 2 5 : 2 4 : 1 ) w a s a d d e d t o t h e s u p e r n a t a n t a n d c e n t r i f u g e d a t 1 2 0 0 0 r p m f o r 5 m i n u t e s a g a i n . T h e s u p e r n a t a n t w a s t r a n s f e r r e d t o a n e w t u b e f o r t h e l a s t t i m e . D N A w a s p r e c i p i t a t e d w i t h 0 . 6 v o l u m e i s o p r o p a n o l a n d c o l l e c t e d b y c e n t r i f u g i n g a t 1 2 0 0 0 r p m f o r 1 5 m i n . D N A p e l l e t w a s w a s h e d w i t h 7 0 % e t h a n o l a n d c e n t r i f u g e d f o r 5 m i n . T h e s u p e r n a t a n t w e r e d r a i n e d o f f a n d t h e p e l l e t w a s r e - d i s s o l v e d i n T E b u f f e r . D N A e x t r a c t i o n f r o m n e e d l e s D N A e x t r a c t i o n s d i r e c t l y f r o m n e e d l e s w e r e d o n e a s d e s c r i b e d b y H a m e l i n e t a l . ( 1 9 9 6 , 2 0 0 0 ) w i t h s o m e m o d i f i c a t i o n s . A p p r o x i m a t e l y 2 0 e x c i s e d l e s i o n s w i t h R h a b d o c l i n e f r u i t i n g b o d i e s o r f i v e w h o l e n e e d l e s w i t h f r u i t i n g b o d i e s o f P . g a u m a n i i i a n d R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t s w e r e u s e d t o e x t r a c t D N A f o r P C R a n d 1 8 6 d o t - b l o t a s s a y s . T h e f r u i t i n g b o d i e s o r w h o l e n e e d l e s w e r e s o a k e d w i t h 8 0 0 p l C T A B e x t r a c t i o n b u f f e r ( 2 % c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u m , 1 . 4 M N a C I ; 1 % p o l y e t h y l e n e g l y c o l 8 0 0 0 , 2 0 m M E D T A ; 1 % 2 - m e r c a p t o e t h a n o l , 1 0 0 m M T r i s - H C I , p H 9 . 5 ) a n d g r o u n d w i t h a s t e r i l e m o r t a r a n d p e s t l e ( a c i d t r e a t e d ) u n t i l a s l u r r y w a s o b t a i n e d . E x t r a c t s w e r e v o r t e x e d b r i e fl y a n d i n c u b a t e d a t 6 5 C f o r a t l e a s t 1 h . F o l l o w i n g t h e a d d i t i o n o f 6 0 0 p l p h e n o l : c h l o r o f o r m : i s o a m y l a l c o h o l ( 2 5 : 2 4 : 1 ) , e x t r a c t s w e r e c e n t r i f u g e d a t 1 0 0 0 0 g f o r 5 m i n u t e s . T h e a q u e o u s p h a s e w a s t r a n s f e r r e d t o a n e w t u b e , p r e c i p i t a t e d w i t h a n e q u a l v o l u m e o f c o l d i s o p r o p a n o l a n d c e n t r i f u g e d a t 1 0 0 0 0 r p m f o r 1 0 m i n u t e s . P e l l e t s w e r e w a s h e d w i t h c o l d 7 0 % e t h a n o l , a i r d r i e d f o r 1 2 h o u r s o r o v e r n i g h t , a n d r e s u s p e n d e d i n 3 0 p l 1 x T E b u f f e r , p H 8 . T h e m e t h o d o f H a m e l i n e t a l . ( 1 9 9 6 ) w a s a d a p t e d t o e x t r a c t D N A f r o m l a r g e a m o u n t s o f n e e d l e s ( 1 0 9 ) u s i n g a h o u s e h o l d b l e n d e r . N e e d l e s i n 6 0 m l e x t r a c t i o n b u f f e r w e r e b l e n d e d a t h i g h s p e e d f o r 2 m i n . A S o r v a l l R C 2 B c e n t r i f u g e w i t h 8 8 2 4 r o t o r ( S o r v a l l H e r a e u s , N e w t o w n , C T ) w a s u s e d f o r s o l v e n t p h a s e s e p a r a t i o n s a n d p e l l e t i n g . P C R a m p l i fi c a t i o n o f i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r s D N A e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m , f r u i t i n g b o d i e s a n d n e e d l e s w a s d i l u t e d 1 0 2 a n d 1 0 3 t i m e s i n d o u b l e d i s t i l l e d , fi l t e r e d , s t e r i l i z e d w a t e r ( P C R w a t e r ) a n d u s e d i n P C R a m p l i fi c a t i o n s . T h e i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r ( I T S ) r e g i o n s o f t h e n u c l e a r r i b o s o m a l R N A g e n e w e r e a m p l i f i e d w i t h t h e p r i m e r s I T S 1 F ( f u n g u s s p e c i fi c ) a n d I T S 4 ( G a r d e s a n d B r u n s , 1 9 9 3 ) . I T S s e q u e n c e i n c l u d e s s e q u e n c e o f I T S I - 5 . 8 8 — I T S I I r D N A a n d p a r t i a l s e q u e n c e s o f 1 8 8 a n d 2 8 S r D N A ( p r i m e r 1 8 7 s i t e s ) . P C R r e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t i n 2 5 p l t o t a l v o l u m e c o n s i s t i n g o f 1 2 . 5 p l D N A d i l u t i o n ( t e m p l a t e ) a n d 1 2 . 5 p l P C R r e a c t i o n m i x t u r e . T h e r e a c t i o n m i x t u r e c o n t a i n e d G i b c o P C R b u f f e r ( 2 0 m M T r i s - H C I , p H 8 . 4 a n d 5 0 m M K C L ) , 2 . 0 m M M g C l 2 , 0 . 2 m M e a c h o f d A T P , d T T P , d G T P a n d d C T P , 0 . 5 p M e a c h o f I T S 1 F a n d I T S 4 p r i m e r s ; a n d 0 . 5 u n i t o f T a q D N A p o l y m e r a s e . T h e r e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t o n a D N A t h e r m a l c y c l e r ( M o d e l 9 6 0 0 , P e r k i n - E l m e r C e t u s , N o r w a l k , C T ) . T h e r e a c t i o n p r o t o c o l c o n s i s t e d o f a n i n i t i a l d e n a t u r a t i o n a t 9 5 C f o r 3 m i n u t e s f o l l o w e d b y 3 0 c y c l e s o f 9 4 C f o r 1 m i n , 5 0 C f o r 1 m i n , a n d 7 2 C f o r 1 m i n . P C R a m p l i fi c a t i o n s c o n t a i n i n g n o D N A t e m p l a t e w e r e i n c l u d e d i n e v e r y e x p e r i m e n t a s c o n t r o l s t o t e s t f o r t h e p r e s e n c e o f c o n t a m i n a t i o n o f r e a g e n t s a n d r e a c t i o n m i x t u r e s b y n o n s a m p l e D N A . T h e r e a c t i o n w a s c o m p l e t e d b y a 7 m i n e x t e n s i o n a t 7 2 C . P C R p r o d u c t s w e r e s e p a r a t e d o n 1 . 5 % a g a r o s e ( G i b c o B R L , G r a n d I s l a n d , N Y ) i n T A E b u f f e r ( 1 0 0 m M T r i s , 1 2 . 5 m M s o d i u m a c e t a t e , 1 m M E D T A , p H 8 . 0 ) b y g e l e l e c t r o p h o r e s i s . A s a s i z e s t a n d a r d , a 1 k b o r 1 k b p l u s D N A l a d d e r ( G i b c o B R L ) w a s i n c l u d e d i n e a c h g e l . A f t e r r u n n i n g f o r a t l e a s t 1 h o u r a t 1 0 0 v o l t s , t h e g e l s w e r e s t a i n e d w i t h e t h i d i u m b r o m i d e , v i s u a l i z e d b y U V fl u o r e s c e n c e a n d p h o t o g r a p h e d u s i n g A l p h a l m a g e r ( A l p h a I n n o t e c h C o r p o r a t i o n , S a n L e a n d r o , C A ) . 1 8 8 D i r e c t o r n e s t e d - p r i m e r P C R a m p l i fi c a t i o n s w i t h o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s P C R a m p l i fi c a t i o n s u s i n g o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s w e r e c a r r i e d o u t a s w e r e t h e I T S a m p l i fi c a t i o n s , w i t h a f e w d i f f e r e n c e s . F o r d i r e c t a m p l i f i c a t i o n s , t h e s a m e D N A d i l u t i o n s w e r e u s e d . F o r i n t e r n a l a m p l i fi c a t i o n s , I T S 1 F a n d I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s w e r e q u a n t i f i e d u s i n g a U V s p e c t r o p h o t o m e t e r ( D u 5 3 0 , B e c k m a n C o u l t e r , L i f e S c i e n c e s , B r e a , C A ) d i l u t e d t o 1 0 0 ( 1 0 n g D N A ) a n d 1 0 0 0 t i m e s ( 1 n g D N A ) a n d a m p l i fi e d u s i n g i n t e r n a l o l i g o n u c l e o t i d e p a i r s . R e a c t i o n m i x t u r e s a n d P C R c o n d i t i o n s w e r e m o d i fi e d a s f o l l o w ; 1 p M o f e a c h p u r i fi e d o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e w a s u s e d a n d a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s r a n g e d f r o m 4 8 t o 6 4 C d e p e n d i n g o n t h e p r o b e p a i r u s e d . I n i t i a l a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s f o r e a c h p a i r w e r e c a l c u l a t e d u s i n g t h e s o f t w a r e p r o g r a m O l i g o c a l c u l a t o r ( E u g e n B u e h l e r , P i t t s b u r g h , P A ) a n d p r o b e s w e r e t e s t e d u n t i l a t e m p e r a t u r e t h a t g a v e s p e c i e s - s p e c i fi c a m p l i fi c a t i o n w a s r e a c h e d . F o r n e s t e d p r i m e r a m p l i fi c a t i o n , d u r a t i o n o f d e n a t r u r a t i o n a n d a n n e a l i n g w e r e r e d u c e d t o 3 0 s e c p e r c y c l e . S e q u e n c i n g I T S 1 F a n d I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s w e r e c l e a n e d u s i n g M i l l i p o r e U l t r a f r e e — M C 3 0 , 0 0 0 N M W L p u r i f i c a t i o n f i l t e r s ( M i l l i p o r e C o r p o r a t i o n , B e d f o r d , M A ) . A p p r o x i m a t e l y 1 0 0 p l P C R p r o d u c t s w e r e w a s h e d w i t h P C R w a t e r 4 t i m e s b y s p i n n i n g a t 4 0 0 0 r p m a t 4 C . P u r i fi e d P C R p r o d u c t s w e r e r u n o n 3 % h i g h m e l t a g a r o s e g e l a t 1 0 0 V t o q u a n t i f y b e f o r e s u b m i s s i o n f o r s e q u e n c i n g . P C R p r o d u c t s o f I T S a n d 5 . 8 8 r R N A w e r e s e q u e n c e d m a i n l y b y u s i n g I T S 1 F a n d I T S 4 p r i m e r s i n a n A p p l i e d B i o s y s t e m s 3 7 0 A S e q u e n c e r ( A p p l i e d B i o s y s t e m s , F o s t e r 1 8 9 C i t y , C A ) w i t h t h e T a q D y e D e o x y T e r m i n a t o r S y s t e m . S e q u e n c i n g w a s d o n e b y t h e G e n o m i c s T e c h n o l o g y S u p p o r t F a c i l i t y a t M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y . P r i m e r s I T S 5 , I T S 3 a n d I T S Z w e r e a l s o u s e d a s n e c e s s a r y ( W h i t e e t a l . 1 9 9 0 ) . S e q u e n c e a l i g n m e n t , a n a l y s i s a n d p r o b e d e s i g n I T S s e q u e n c e s w e r e e d i t e d , a l i g n e d a n d c o r r e c t e d u s i n g t h e p r o g r a m s E d i t S e q , M e g A I i g n a n d S e q M a n i n t h e D N A S T A R s o f t w a r e p a c k a g e ( D N A S T A R I n c , M a d i s o n , W I ) . P . g a u m a n n i i s e q u e n c e w a s c o m p a r e d w i t h t h e s e q u e n c e s i n G e n B a n k ( N C B I , B e t h e s d a , M D ) u s i n g s i m i l a r i t y s e a r c h p r o g r a m B L A S T R ( A l t s c h u l e t a l . 1 9 9 0 a n d 1 9 9 7 ; Z h a n g a n d M a d d e n , 1 9 9 7 ) . I n a d d i t i o n t o t h e s e q u e n c e s o f R h a b d o c l i n e t a x a , t h e s e q u e n c e s o f r e l a t e d f u n g i w e r e a l s o i n c l u d e d i n a l i g n m e n t f o r p r o b e s e l e c t i o n . O l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s o f 1 4 t o 2 4 b p l o n g w e r e d e s i g n e d f r o m s p e c i e s - s p e c i fi c s e q u e n c e s . P r i m e r S e l e c t p r o g r a m ( D N A S T A R ) w a s u s e d t o e v a l u a t e t h e p r o b e p r o p e r t i e s s u c h a s d u p l e x a n d h a i r p i n f o r m a t i o n a n d % G C c o n t e n t ( G u a n i n e a n d C y t o s i n e ) P r o b e s w e r e s y n t h e s i z e d a t M a c r o m o l e c u l a r S t r u c t u r e a n d S e q u e n c i n g F a c i l i t y ( D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y ) u s i n g a n A p p l i e d B i o s y s t e m s 3 9 4 8 O l i g o n u c l e o t i d e S y n t h e s i z e r ( A p p l i e d B i o s y s t e m s ) . L a b e fi n g O l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s w e r e l a b e l e d w i t h g a m m a 3 2 P - A T P b y p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 5 ’ e n d s u s i n g T 4 p o l y n u c l e o t i d e k i n a s e ( N e w E n g l a n d B i o l a b s I n c , B e v e r l y , M A ) . L a b e l i n g r e a c t i o n s c o n s i s t e d o f o f 1 p l p r o b e ( 1 5 - 2 0 1 9 0 p M ) , 2 p l 1 0 X k i n a s e b u f f e r ( 0 . 7 M T r i s - H C I , p H 7 . 6 , 0 . 1 M M g C l z - 6 H Z O , 5 0 m M d i t h i o t h r e i t o l ) , 5 p l o f g a m m a 3 2 P - A T P ( o o o o C i / m M N E N L i f e S c i e n c e P r o d u c t s , B o s t o n , M A ) a n d 8 u n i t s o f T 4 p o l y n u c l e o t i d e k i n a s e i n 1 1 . 4 p l o f H 2 0 a s d e s c r i b e d b y S a m b r o o k e t a l . ( 1 9 8 9 ) . R e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t f o r 4 5 m i n a t 3 7 C a n d w e r e s t o p p e d b y i n a c t i v a t i n g t h e e n z y m e a t 6 5 C f o r 1 0 m i n u t e s . S e p h a d e x G 2 5 ( S i g m a ) c o l u m n s w e r e p r e p a r e d u s i n g 1 m l s y r i n g e s t o s e p a r a t e u n i n c o r p o r a t e d n u c l e o t i d e s f r o m l a b e l e d p r o b e s . L a b e l i n g e f fi c i e n c y w a s c h e c k e d w i t h a n a u t o m a t e d s c i n t i l l a t o r ( B e c k m a n , A r l i n g h t c n H e i g h t s , I L ) . I T S I r e g i o n s a m p l i f i e d b y I T S 1 F a n d I T S Z w e r e p r e p a r e d a n d l a b e l e d , a s f o l l o w s . P C R p r o d u c t s w e r e r u n o n 1 % a g a r o s e g e l a n d c u t o u t u n d e r l o n g w a v e U V l i g h t . W a t e r w a s a d d e d t o d i l u t e t h e D N A t o a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 1 n g / p l . T h e s o l u t i o n w a s p r e c i p i t a t e d b y a d d i n g 2 o r 2 . 5 v o l u m e s c o l d 1 0 0 % e t h a n o l a n d 0 . 1 X v o l u m e 3 M s o d i u m a c e t a t e . F o l l o w i n g p r e c i p i t a t i o n f o r 2 0 m i n a t — 2 0 C , s a m p l e s w e r e s p u n f o r 2 0 m i n u t e s a t 4 C . T h e p e l l e t s w e r e w a s h e d w i t h 7 0 % e t h a n o l a n d s p u n f o r 1 0 m i n u t e s , d r i e d u n d e r v a c u u m f o r 5 m i n u t e s , a n d r e s u s p e n d e d i n T E . P u r i fi e d p r o b e s w e r e q u a n t i f i e d b y m e a s u r i n g O D v a l u e s a t 2 6 0 a n d 2 8 0 n m . P r o b e s w e r e d e n a t u r e d b y b o i l i n g f o r 2 m i n , c o o l e d f o r 2 - 3 m i n , t h e n a d d e d t o t h e r a n d o m h e x a m e r p r o b e l a b e l i n g r e a c t i o n . T h e l a b e l i n g r e a c t i o n c o n s i s t e d o f 4 0 - 6 0 n g D N A , 1 0 p l 5 X O L B s o l u t i o n ( P h a r m a c i a , P e a p a r k , N J ) o r R a n d o m P r i m e d D N A l a b e l i n g k i t r e a c t i o n m i x t u r e ( B o e h r i n g e r M a n h e i m , M a n n h e i m , G e r m a n y ) . 5 p l a l p h a 3 2 P - c l A T P o r d C T P ( 6 0 0 0 C i / m m o l ) , a n d 1 p | K l e n o w e n z y m e ( 2 u n i t s ) . T h e fi n a l v o l u m e w a s b r o u g h t t o 5 0 p l b y a d d i t i o n o f 1 9 1 d i s t i l l e d w a t e r . T h e m i x t u r e w a s i n c u b a t e d f o r 2 h o u r s a n d t h e r e a c t i o n w a s s t o p p e d b y t h e a d d i t i o n o f 5 0 p l T E . L a b e l e d p r o b e s w e r e p u r i f i e d a s d e s c r i b e d e a r l i e r u s i n g s y r i n g e c o l u m n s . P r o b e s w e r e d e n a t u r e d b e f o r e u s e b y a d d i n g 0 . 1 X v o l u m e 3 M N a O H . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s t o a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s . D o t b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s t o o f I T S 1 F a n d I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s w e r e p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d ( H e l m u t , 1 9 9 0 ; B r u n s a n d G a r d e s , 1 9 9 3 ) . F i v e p l o f a m p l i fi e d p r o d u c t s ( a p p r o x i m a t e l y 1 0 0 n g ) w e r e d e n a t u r e d i n 1 0 0 p l o f 0 . 4 N N a O H , 2 5 m M E D T A a n d 1 - 2 p l b r o m o p h e n o l b l u e f o r 5 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r e s . H Y B O N D N + n y l o n m e m b r a n e s ( A m e r s h a m L i f e S c i e n c e , B u c k i n g h a m s h i r e , U K ) p r e - c u t t o fi t i n a D o t - b l o t a p p a r a t u s ( G i b c o B R L , L i f e T e c h n o l o g i e s I n c , R o c k v i l l e , M D ) w e r e w e t i n d i s t i l l e d w a t e r f o r 1 m i n a n d p l a c e d i n t o t h e a p p a r a t u s . D e n a t u r e d s a m p l e s w e r e a d d e d t o t h e a p p r o p r i a t e w e l l s a n d s l o w l y v a c u u m f i l t e r e d o n t o t h e m e m b r a n e . T h e y w e r e U V - f i x e d u s i n g 1 2 0 m l / c m 2 a t 2 5 4 n m a S t r a t a l i n k e r . ( S t r a t a g e n e , L a J o l l a , C A ) . T h r e e r e p l i c a s f o r e a c h p r o b e w e r e p r e p a r e d . M e m b r a n e s w e r e p r e - w a s h e d f o r 1 h a t 6 5 C i n a s o l u t i o n c o n t a i n i n g 0 . 1 x S S C , 1 0 m M T r i s , p H 8 . 0 a n d 0 . 5 % S D S . P r e - h y b r i d i z a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t a t t h e h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e f o r 1 - 4 h i n h y b r i d i z a t i o n b u f f e r ( 2 0 p l ) c o n t a i n i n g 6 x S S C ( 3 . 6 M N a C L , 0 . 2 M s o d i u m p h o s p h a t e , 2 0 m M E D T A ) , 0 . 5 % d r y m i l k a s b l o c k i n g a g e n t , 0 . 1 % S D S a n d 1 0 0 p g d e n a t u r e d h e r r i n g s p e r m D N A . A f t e r t h e a d d i t i o n o f l a b e l e d p r o b e s , t h e 1 9 2 m e m b r a n e s w e r e h y b r i d i z e d f o r 4 - 1 2 h o u r s i n a r o t a r y t y p e h y b r i d i z a t i o n o v e n ( H Y B A I D , A s h f o r d , M i d d l e s e x , U K ) . I n i t i a l t h e o r e t i c a l h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e ( T h ) w e r e c a l c u l a t e d b y s u b t r a c t i n g 5 C f r o m t h e e x p e c t e d m e l t i n g t e m p e r a t u r e s ( T . . . ) a s f o r m u l a t e d i n S a m b r o o k e t a l . ( 1 9 8 9 ) , T m = 4 ( G + C ) + 2 ( A + C ) . T h e a c t u a l h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s ( T a ) t h a t r e s u l t e d i n c o r r e c t p r o b e s p e c i fi c i t y w e r e d e t e r m i n e d b y t e s t i n g t h e p r o b e s a t d i f f e r e n t h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s u n t i l a n o p t i m u m t e m p e r a t u r e w a s r e a c h e d f o r e a c h p r o b e . T h e m e m b r a n e s w e r e w a s h e d i n 2 x S S C a n d 0 . 1 % S D S f o r 5 m i n o n a s h a k e r ( O r b i t s h a k e r L a b L i n e I n s t r u m e n t s I n c , H e l r o s e p a r k , I L ) a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d f o r 2 0 m i n o n a n i n c u b a t e r s h a k e r ( I n n o v a 4 0 8 0 , N e w B r u n s w i c k S c i e n t i fi c , E d i s o n , N J ) a t 5 C b e l o w t h e h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s . M e m b r a n e s w e r e m o n i t o r e d a n d w a s h e d r e p e a t e d l y a s n e c e s s a r y . H y b r i d i z e d fi l t e r s w e r e e x p o s e d t o X - r a y fi l m ( A m e r s h a m ) f o r 4 h t o 2 d a y s a t - 8 0 C . T h e fi l m s w e r e d e v e l o p e d u s i n g a K o d a k p r o c e s s o r ( K o d a k , R o c h e s t e r , N Y ) . H y b r i d i z a t i o n f i l t e r s w e r e r e u s e d a f t e r r a d i o a c t i v e p r o b e s w e r e r e m o v e d b y w a s h i n g i n b o i l i n g 2 x S S C a n d 0 . 2 % S D S s o l u t i o n . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s t o t o t a l D N A D o t - b l o t s w e r e a l s o p r e p a r e d u s i n g t o t a l D N A e x t r a c t e d f r o m m y c e l i a ( L e e e t a l . 1 9 8 8 ) a n d f r o m n e e d l e s w i t h o r w i t h o u t f r u i t i n g b o d i e s ( H a m e l i n e t a l . 1 9 9 6 ) . A d d i t i o n a l l y , t h e e x t r a c t i o n b u f f e r w a s s u p p l e m e n t e d w i t h 8 0 p g p r o t e i n a s e K ( 0 . 1 p g / p l , S i g m a ) , a n d a n e x t r a p u r i f i c a t i o n s t e p w i t h p h e n o l : c h l o r o f o r m : i s o a m y l a l c o h o l w a s u s e d f o r t h e D N A e x t r a c t i o n f r o m n e e d l e s t o 1 9 3 o b t a i n a s c l e a n a p r o d u c t a s p o s s i b l e . T o t a l D N A f r o m b o t h m y c e l i a a n d n e e d l e s w a s q u a n t i fi e d w i t h a s p e c t r o p h o t o m e t e r a t 2 6 0 n m . T o t a l D N A a l i q u o t s w e r e d i l u t e d i n 1 X T E t o a d j u s t t h e c o n c e n t r a t i o n s , a n d w e r e a d d e d t o a n e q u a l v o l u m e o f 1 . 0 M N a O H f o r d e n a t u r a t i o n . F o l l o w i n g 1 h d e n a t u r a t i o n , t h e D N A w a s b l o t t e d o n t o n y l o n m e m b r a n e s t h a t w e r e s o a k e d i n d i s t i l l e d w a t e r , a n d f i x e d w i t h U V u s i n g 2 0 m J / c m 2 a t 2 5 4 n m i n t h e S t r a t a l i n k e r . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f s h o r t o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s t o m y c e l i u m a n d n e e d l e D N A w e r e c o n d u c t e d a s w a s d o n e w i t h I T S 1 F a n d I T S 4 p r o d u c t s , w i t h s o m e m o d i fi c a t i o n s . D N A - fi x e d m e m b r a n e s w e r e p r e - h y b r i d i z e d i n a s o l u t i o n c o n t a i n i n g 6 x S S C , 0 . 0 1 M s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 8 ) , 1 m M E D T A ( p H 8 ) , 0 . 1 % S D S , 1 0 0 p g l m l h e r r i n g s p e r m D N A a n d 0 . 1 % n o n - f a t d r i e d m i l k . F o l l o w i n g 4 h p r e h y b r i d i z a t i o n , l a b e l e d p r o b e s w e r e a d d e d a n d h y b r i d i z a t i o n w a s c a r r i e d o u t f o r 4 - 1 2 h a t t h e c a l c u l a t e d T h t e m p e r a t u r e s . T h e m e m b r a n e s w e r e w a s h e d b r i e fl y ( 1 t o 3 m i n ) i n 2 X o r 6 X S S C o n s h a k e r a t t h e h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s . T h e m e m b r a n e fi l t e r s w e r e m o n i t o r e d a n d w a s h e d r e p e a t e d l y a s n e c e s s a r y . H y b r i d i z e d fi l t e r s w e r e e x p o s e d t o X - r a y f i l m f o r a t l e a s t 1 2 h o u r s b e f o r e fi l m s w e r e d e v e l o p e d . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f P G 1 - P G 4 a m p l i fi e d o r I T S I p r o b e s t o t o t a l D N A H y b r i d i z a t i o n s o f t h e I T S I a m p l i f i e d b y t h e p r i m e r p a i r P G 1 - P G 4 a s a p r o b e t o t o t a l D N A f r o m m y c e l i a a n d n e e d l e s w e r e c a r r i e d o u t a s d e s c r i b e d i n S a m b r o o k e t a l . ( 1 9 8 9 ) w i t h s o m e m o d i f i c a t i o n s . M e m b r a n e s w i t h U V fi x e d D N A 1 9 4 o f 5 0 n g t o 1 p g p e r d o t w e r e n e u t r a l i z e d i n T N ( 0 . 5 M T r i s - H C I , 3 M N a C L , p H 7 ) f o r 1 5 m i n . P r e h y b r i d i z a t i o n w a s c o n d u c t e d i n 2 0 m l b u f f e r c o n t a i n i n g 6 x S S C , 0 . 1 % S D S , 5 x D e n h a r d ’ s r e a g e n t ( 1 % F i c o l l , 1 % B S A , 1 % p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e 4 0 0 0 0 ( S i g m a ) , 5 0 m M p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 ) a n d 1 0 0 m p g l m l h e r r i n g s p e r m D N A f o r 4 - 1 2 h . T h e p r e h y b r i d i z a t i o n b u f f e r w a s t h e n r e m o v e d a n d h y b r i d i z a t i o n b u f f e r c o n t a i n i n g 6 x S S C , 0 . 1 % S D S a n d 1 0 0 p g l m l h e r r i n g s p e r m D N A w a s a d d e d t o t h e h y b r i d i z a t i o n t u b e s . F o l l o w i n g h y b r i d i z a t i o n a t a g i v e n t e m p e r a t u r e ( 6 8 , 7 3 , 7 5 o r 8 0 C ) f o r 6 - 1 8 h , t h e m e m b r a n e s w e r e w a s h e d o n c e i n a s o l u t i o n o f 2 x S S C a n d 0 . 1 % S D S a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 0 m i n a n d o n c e o r t w i c e i n 0 . 5 x S S C a n d 0 . 1 % S D S a t 5 C b e l o w h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e f o r 1 5 - 2 0 m i n . P r o b e s w e r e s t r i p p e d o f f t h e m e m b r a n e s b y s h a k i n g t h e m i n 1 . 5 M N a C I , 0 . 5 M N a O H f o r 3 0 m i n , a n d m e m b r a n e s w e r e r e u s e d . R e s t r i c t i o n d i g e s t s S o f t w a r e g e n e r a t e d r e s t r i c t i o n m a p s o f t h e I T S r D N A s e q u e n c e s ( D N A S T A R I n c , M a d i s o n , W I ) o f e a c h f u n g u s w e r e c o n s t r u c t e d b y t h e s u b p r o g r a m M A P D R A W o f D N A S T A R ) . 2 2 r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e s w e r e u s e d t o l o c a t e s p e c i fi c c u t t i n g s i t e s i n e a c h s e q u e n c e . E n z y m e s c u t t i n g s i t e s t h a t w e r e u n i q u e t o P . g a u m a n n i i w e r e u s e d t o d i f f e r e n t i a t e i t f r o m o t h e r t a x a . P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d o r c l o n e d u s i n g P . g a u m a n n i i s p e c i f i c p r i m e r s ( P G 1 - P G 4 w e r e d i g e s t e d w i t h t h e r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e s a s f o l l o w . R e s t r i c t i o n r e a c t i o n s c o n t a i n e d 4 p l o f P C R p r o d u c t s a n d 6 p l o f r e s t r i c t i o n m i x t u r e ( 1 p l 1 9 5 m a n u f a c t u r e r ’ s b u f f e r , 0 . 2 p l e n d o n u c l e a s e a n d 4 . 8 p l d i s t i l l e d w a t e r ) . R e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t a t 3 7 o r 6 5 C , ( d e p e n d i n g o n t h e e n z y m e u s e d ) f o r 2 - 4 h o u r s a n d s t o p p e d b y c o o l i n g o n i c e . D i g e s t e d p r o d u c t s w e r e r u n o n 3 % a g a r o s e g e l f o r 1 h o u r a t 1 0 0 v o l t s a n d p h o t o g r a p h e d u s i n g A l p h a l m a g e r . C o r r e s p o n d e n c e b e t w e e n P C R a s s a y s a n d f u n g u s i s o l a t i o n s I s o l a t i o n s w e r e m a d e a s f o l l o w t o d e t e r m i n e i f P C R a m p l i fi c a t i o n o f P . g a u m a n i i b y P G 1 - P G 4 i n a s a m p l e c o r r e s p o n d e d t o t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f t h e f u n g u s i n n e e d l e s . N e e d l e s f r o m 4 4 t r e e s o f d i f f e r e n t p r o v e n a n c e s o f I M v a r i e t y o f D o u g l a s fi r g r o w n i n W a s h i n g t o n a n d c o d e d a s M S U 1 t h r o u g h 4 4 w e r e u s e d i n t h i s s t u d y . F i f t y n e e d l e s f r o m s a m e s a m p l e s o f e a c h t r e e t h a t w e r e a l s o u s e d i n b u l k D N A e x t r a c t i o n s ( 1 0 g n e e d l e ) f o r P C R a m p l i fi c a t i o n s w e r e r a n d o m l y s e l e c t e d . N e e d l e s w e r e s u r f a c e s t e r i l i z e d b y s o a k i n g f o r 4 - 5 m i n i n 7 0 % e t h a n o l , b r i e fl y r i n s i n g i n s t e r i l e d i s t i l l e d w a t e r a n d s o a k i n g f o r 1 0 m i n i n c o m m e r c i a l ( 5 0 % ) b l e a c h . F o l l o w i n g a b r i e f r i n s e i n s t e r i l e d i s t i l l e d w a t e r , e a c h n e e d l e w a s c u t i n t o h a l f w i t h a s t e r i l e r a z o r b l a d e . 1 0 p i e c e s ( 5 n e e d l e s ) w e r e p l a t e d o n e a c h p e t r i d i s h e s c o n t a i n i n g M a l t E x t r a c t A g a r . P e t r i d i s h e s w e r e s e a l e d w i t h P a r a fi l m a n d i n c u b a t e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 3 0 d a y . P r e s e n c e o f P . g a u m a n n i i w a s v e r i fi e d b y c o l o n y m o r p h o l o g y a n d e m e r g i n g c o l o n i e s p e r p e t r i p l a t e w e r e c o u n t e d . A t o t a l o f 2 2 0 0 n e e d l e w e r e u s e d i n t h e i s o l a t i o n s . 1 9 6 R E S U L T S A l i g n m e n t o f I T S s e q u e n c e s a n d d e s i g n o f o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s P r i m e r p a i r I T S 1 F a n d I T S 4 a m p l i fi e d a 6 2 7 b p P C R p r o d u c t f r o m P h a e o c r y p t o p u s g a u m a n n i i . T h e I T S s e q u e n c e s i n c l u d i n g ( 5 . 8 8 r D N A ) o f P . g a u m a n n i i w a s a l i g n e d w i t h t h e s e q u e n c e s o f r e l a t e d f u n g i t o s e l e c t P . g a u m a n n i i s p e c i fi c p r i m e r p r o b e s ( F i g u r e 4 . 2 ) . P . g a u m a n n i i I T S s e q u e n c e w a s c o m p a r e d w i t h s e q u e n c e s i n t h e G e n B a n k . T h e s e q u e n c e s o f c o m m o n e n d o p h y t e s H o r m o n e m a d e m a t i o i d e s a n d A u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n s s h a r e d t h e h i g h e s t h o m o l o g y w i t h t h e s e q u e n c e s o f P . g a u m a n n i i , 8 5 a n d 8 4 % r e s p e c t i v e l y . P . g a u m a n n i i s h a r e d 7 2 % s e q u e n c e h o m o l o g y w i t h R . p a r k e n ' a n d R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e , 7 1 % w i t h R . p s e u d o t s u g a e s s p . e p i p h y l l a , a n d 7 0 % w i t h R . w e i n ' i s s p . w e i r i i , R . w e i n ' i s s p o b l o n g a , a n d R . w e i r i i s s p . o b o v a t a . P r i m e r p r o b e s w e r e c h o s e n f r o m t h e r e g i o n s o f I T S I a n d I T S I I t h a t w e r e h i g h l y v a r i a b l e f r o m t h e s e q u e n c e s o f R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t p a t h o g e n s a n d e n d o p h y t e s . P r i m e r p a i r P G 1 - P G 4 h a d a t l e a s t 1 2 - 1 4 b a s e p a i r d i f f e r e n c e f r o m R h a b d o c l i n e t a x a a n d a t l e a s t 5 - 1 0 b a s e p a i r d i f f e r e n c e f r o m c o m m o n e n d o p h y t e s . T e s t i n g o f p r i m e r p r o b e s f o r s p e c i fi c i t y i n d i r e c t P C R a m p l i fi c a t i o n s I n o r d e r t o d e t e r m i n e o p t i m u m , s p e c i e s - s p e c i f i c P C R c o n d i t i o n s , p r i m e r p a i r s P G 1 - P G 4 a n d P G 2 - P G 5 w e r e i n i t i a l l y t e s t e d f o r s p e c i f i c i t y i n d i r e c t P C R a m p l i fi c a t i o n s a g a i n s t D N A e x t r a c t e d ' f r o m m y c e l i u m o r f r u i t i n g b o d i e s . T h e 1 9 7 P G 3 A P H D R P P - C H M I R P - O C M I R W O B L - M I l R W O B V - 0 R 5 R W W - 0 R 1 P G A P H D R P P - C H M I R P - O C M I R W O B L - M I I R W O B V - 0 R 5 R W W - 0 R 1 P G A P H D R P P - C H M I R P - O C M I R W O B L - M I l R W O B V - 0 R 5 R W W - 0 R 1 P G A P H D R P P - C H M I R P - O C M I R W O B L - M I I R W O B V - 0 R 5 R W W - 0 R 1 P G A P H D R P P - C H M I R P - O C M I R W O B L - M I I R W O B V - 0 R 5 R W W - 0 R 1 P G 1 - - - 1 s o C A T T A A A G A G T A A d E G T . T A T T c e T A o c c c c A d c T c C A A C C C T T T G T T G T T A T A A C T A C C C A T T A A A G A G T A A G G G T . G . C T C A G C G C C C G A C C T C C A A C C C T T T G T T G T T A A A A C T A C C C A T T A A A G A G A T A G G G T . C . T T C A T G G C C C G A C C T C C A A C C C T C T G T T G T T C A A A C T A C C C A T T A C C G A G T T T C T . T G C C C T A G C G G G C A G A T C T C C C A C C C G T G T G T A T T T A . . . T A C C C A T T A C C G A G T T T C T . T G C C C T A A C G G G T A G A T C T C C C A C C C T T G T G T A T T T A . . . T A C C C A T T A C C T A G T T T C T A T G C C C T A G . G G G T A G A T C T C C C A C C C T T G T G T A T T T A . . . T A C C C A T T A C C G A G T T T C T . T G C C C T A G C G G G T A G A T C T C C C A C C C T T G T G T A T T T A . . . T A C C C A T T A C C G A G T G T C . G C G C C C T C G C G G G C C G C T C T C C . . C C C C C G T G T G T C T T . . . T A C C 6 1 P G ? 1 2 0 T C G T T G C T T T G G C G G G A C C G C T . C G G T C T C G A G C T G C T . . b c r c w r c c c c c c e e c a a e fi b T T G T T G C T T T G G C G G G A C C G C T . C G G T C T C G A G C C G C T G G G G A T T C G T C C C A G G C G A G C T T G T T G C T T T G G C G G G A C C G T T T C G G T C T C C G A G C G C A C T A A C C C T C G G G T A G G T G A G C G G T G T T G C T T T G G C G . . . C C . T C C A G G C C T C A . . . . . . . . . . . . . . . C C G C C C G G . . . . . . A T G T T G C T T T G G C G . . . C C . T T C A G G C C T C G . . . . . . . . . . . . . . . C G G C C C G G . . . . . . G T G T T G C T T T G G C G . . . C C . T C C A G G C C T T A . . . . . . . . . . . . . . . C C G C C C G G . . . . . . G T G T T G C T T T G G C G . . . C C . T C C A G G C C T T A . . . . . . . . . . . . . . . C C G C C C G G . . . . . . A T G T T G C T T T G G C G . . . C C . T G C C G G C C T C C . . . . . . . . . . . . . . . G C G C C C G G . . . . . . 1 8 0 C C C G C C A G A G T C T A C T C A A A C T C T T G T T . . T T A A C C G G T C G T C T G A G T . T A A A C T T T T A A C C C G C C A G A G T T A A A C C A A A C T C T T G T T A T T T A A C C G G T C G T C T G A G T . T A A A A T T T T G A C C C G C C A G A G T C C A A C C A A A C T C T T G T . A T T A A A C C A G T C G T C T G A G T A T A A A A T T T T A A . C G C C A A A G G C C . . G . A A A C T C T . G T G A A T T . A C T . G T C G T C T G A G T A C C A . . . T A T A A . C G C C A A A G G C C . . C T A A A C T C T . G T T A A T A . A C T . G T C G T C T G A G T A C T A . . . T A T A A . C G C C A A A G G C C . . G . A A A C T C T . G T G A A T T T A C T . G T C G T C T G A G T A C C A . . . T A T A A . C G C C A A A G G C C . . G . A A A C T C T . G T G A A T T T A C T . G T C G T C T G A G T A C C A . . . T A T A A . C G T C A C T G . C C . . C T A A A C A C T . G C . . A T A C . C T . G T C G T C G G A G G C C T A . . . T C T A A 1 8 1 2 4 0 T T A A A T T A A A A C T T T C A A C A A C G G A T C T C T T G G T T C T C G C A T C G A T G A A G A A C G C A G C G A A T A A A T C A A A A C T T T C A A C A A C G G A T C T C T T G G T T C T C G C A T C G A T G A A G A A C G C A G C G A T T A A A T T A A A A C T T T C A A C A A C G G A T C T C T T G G T T C T C G C A T C G A T G A A G A A C G C A G C G A T . . A G T T A A A A C T T T C A A C A A C G G A T C T C T T G G T T C T G G C A T C G A T A A A G A A C G C A G C G A T . . A G T T A A A A C T T T C A A C A A C G G A T C T C T T G G T T C T G G C A T C G A T G A A G A A C G C A G C G A T . . A G T T A A A A C T T T C A A C A A C G G A T C T C T T G G T T C T G G C A T C G A T G A A G A A C G C A G C G A T . . A G T T A A A A C T T T C A A C A A C G G A T C T C T T G G T T C T G G C A T C G A T G A A G A A C G C A G C G A T . C G T T A A A A C T T T C A A C A A C G G A T C T C T T G G T T C T G G C A T C G A T G A A G A A C G C A G C G A 2 4 1 3 0 0 A A T G C G A T A A G T A A T G T G A A T T G C A G A A T T C A G T G A A T C A T C G A A A T C T T T G A A A C G C A C A A T G C G A T A A G T A A T G T G A A T T G C A G A A T T C A G T G A A T C A T C G A A . T C T T T G A A . C G C A C A A T G C G A T A A G T A A T G T G A A T T G C A G A A T T C A G T G A A T C A T C G A A . T C T T T G A A . C G C A C A A T G C G A T A A G T A A T G T G A A T T G C A G A A T T C A G T G A A T C A T C G A A . T C T T T G A A . C G C A C A A T G C G A T A A G T A A T G T G A A T T G C A G A A T T C A G T G A A T C A T C G A A . T C T T T G A A . C G C A C A A T G C G A T A A G T A A T G T G A A T T G C A G A A T T C A G T G A A T C A T C G A A . T C T T T G A A . C G C A C A A T G C G A T A A G T A A T G T G A A T T G C A G A A T T C A G T G A A T C A T C G A A . T C T T T G A A . C G C A C A A T G C G A T A A G T A A T G T G A A T T G C A G A A T T C C G T G A A T C A T C G A A . T C T T T G A A . C G C A C 1 9 8 P G A P H D R P P - C H M I R P - O C M I R W O B L - M 1 1 R W O B V - 0 R 5 R W W - 0 R 1 P G A P H D R P P - C H M I R P - O C M I R W O B L - M I l R W O B V - 0 R 5 R W W - 0 R 1 P G A P H D R P P - C H M I R P - O C M I R W O B L - M I l R W O B V - 0 R 5 R W W - 0 R 1 P G A P H D R P P - C H M I R P - O C M I R W O B L - M I I R W O B V - 0 R 5 R W W - 0 R 1 3 0 1 3 6 0 A T T G C G C T C C C T G G T A T T C C G G G G G A G C A T G C C T G T T . C G A G C G T C A T T A C A C C A C T C A A A T T G C G C C C C T T G G T A T T C C G A G G G . G C A T G C C T G T T T C G A G C G T C A T T A C A C C A C T C A A A T T G C G C C C C T T G G T A T T C C G A G G G . G C A T G C C T G T T . C G A G C G T C A T T A C A C C A C T C A A A T T G C G C C C C T T G G T A T T C C G G G G G . G C A T G C C T G T T . C G A G C G T C A T T T C A A C C C T T A C A T T G C G C C C C T T G G T A T T C C G G G G G . G C A T G C C T G T T . C G A G C G T C A T T T C A A C C C T T A C A T T G C G C C C C T T G G T A T T C C G G G G G . G C A T G C C T G T T . C G A G C G T C A T T T C A A C C C T T A C A T T G C G C C C C T T G G T A T T C C G G G G G . G C A T G C C T G T T . C G A G C G T C A T T T C A A C C C T T A C A T T G C G C C C C T T G G T A T T C C G G G G G . G C A T G C C T G T T . C G A G C G T C A T T T C A C C C C T T A C 3 6 1 4 2 0 G C A C T G C T T G G T A T T A G G C C A T C G T C C C C C G A A A G G T G G G C G T G . C C T C A A A C A C C T C G G G C T A T G C T T G G T A T T G G G C . G T C G T C C T T . . . A G T T T G G G C G C G C C C T T A A A G A C C T C G G G C A T C G C T T G G T A T T G G G A . A C G G T C C G T C G A A A G G C G G G C . C T T C C T C G A A G A C C T C G G G C C T T G C G T A G T C T T G G G C C C C A . . C C C T C . A C G G G T C G G C . . . . . C C T A A A A C T A G T G G G C C T G G C G T A G T C T T G G G C C G T A . . C C C T C . A C G G G T A G G C . . . . . C T T A A A A T C A G T G G G C C T T G C G T A G T C T T G G G C C C T A . . C C C T C . A C G G G T C G G T . . . . . C C T A A A A T T A G T G G G C C T T G C G T A G T C T T G G G C C C T A . . C C C T C . A C G G G T C G G T . . . . . C C T A A A A T T A G T G G G C C T C G C G T A G T C T T G G G C C G T A . . C C C T C . A C G G G T A G G C . . . . . C T T A A A A T C A G T G G 4 2 1 < 7 - - - < - - - - - - - C G G A A C C T C A C C G G C T T T G G G C G T A A T A A A A T T T . C T C . A l n c c r c ' r ' r a ' r n e n c c c e fi l C G A G G C C A C T C C G G C T T T A G G C G T A G T A G A A T T T A T T C G A A C G T C T G T C A A . . A G G A G A G C G G G C T T C A A C C A A C T T C G G G C G T A G T A G A G T T A A A T C G A A C G T C T T A T A A . . G C T T G G T C G G T G T C C C C T C G G G C C T G A G C G T A G T A C T T C T T . C T C G . . . . . . C T A T A G G C T C C G G G A C G G T G C C C T C G C G G T C C T G A G C G T A G T A C T T T T T T C T C G . . . . . . C T A T A G G C C C C G G G A C G G T G T C C C C T C G G C C C T G A G C G T A G T A C T T T T T . C T C G . . . . . . C T A T A T G C C C C T C G A C G G T G T C C C C T C G G C C C T G A G C G T A G T A C T T C T T . C T C G . . . . . . C T A T A G G C C C C G G G A " T G C C C G C G C G G G C C T G A G C G T A G T . C C T T G T T C T C G . . . . . . C T C T A G G C C T . . G C C < - - - - - - - - - - - - - 5 2 4 [ C T G A C T C C T I I ‘ T G C C G T T A A A C C C C A A A C T T T T A A A G G T T G A C C T . G A A C T C C G C C G A C . T G A A A C C T T T A T T T T T T C T A G G T T G A C C T C G G A T C T C A T T G C C G T T A A A C C T T T A A A T T T T C T A G G T T G A C C T . G G A C G C . . T G G C C A G C A A C C C C A A A T C T T A T . C T G G T T G A C C T . G G A C G C . . T T G C C A G C A A C C C C C A A T T T T T T T C T G G T T G A C C T . G G A C C C . . T A G C C A G C A A C C C C A C A T T T T A T . C T G G T T G A C C T . G G A C G C . . T A G C C A G C A A C C C C A A A T T T T A T . C T G G T T G A C C T C G G A C G C . . C C G C C A G C A A C C C C C A . . . . T C T A C T G G T T G A C C T F i g u r e 4 . 2 . A l i g n m e n t o f l n t e m a l t r a n s c r i b e d s p a c e r s f o r s e l e c t i o n o f P . g a u m a n n i i s p e c i e s - s p e c i fi c p r o b e s . ‘ 1 r D N A I T S s e q u e n c e s o f P . g a u m a n n i i ( P G ) , H . d e m a t i o i d e s ( H D ) , R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e ( R P P - ) , R . p a r k e r i ( R P ) , R . w e i n ' i s s p . o b l o n g a ( R W O B L - ) , R . w e i n ' i s s p . o b o v a t a ( R W O B V - ) a n d R . w e i r i i s s p . w e i r i i ( R W W - ) w e r e a l i g n e d . P r i m e r s e q u e n c e s a r e i n b l u e b o x e s . R e d a r r o w s h o w s d i r e c t i o n a n d l e n g t h o f p r i m e r P G 5 . P r i m e r s P G 4 a n d P 6 5 o v e r l a p e a c h o t h e r i n g r e e n a r e a . 1 9 9 T a b l e 4 . 2 . T h e s e q u e n c e , g u a n i n e - c y t o s i n e p e r c e n t a g e ( % G C ) , c a l c u l a t e d m e l t i n g ( T m 1 ) , t h e o r e t i c a l ( T h ) h y b r i d i z a t i o n , a n d a c t u a l ( T a ) h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s a s u s e d i n d o t - b l o t a n a l y s i s , a n d c a l c u l a t e d ( T a n ) a n d a c t u a l a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e ( T p c r ) o f t h e p a i r s o f p r i m e r s a s u s e d i n P C R a m p l i fi c a t i o n s . P r i m e r p a i r S e g u e n c e G C % T m 1 3 3 1 g 1 a _ n T p c r 1 p r o d u c t 5 ' > 3 ' g [ 1 s i z e ( b p ) P G 1 G G ' I T A T I ’ C G T A G C C C G A C 5 6 5 6 5 1 5 7 5 0 5 2 5 8 4 5 6 P G 4 G A A C C G G T A C T T A T A A G A C G T 4 3 6 0 5 5 5 7 5 2 P G 2 G G T C T T C G G C C C G G C A A G T 6 5 6 6 6 1 6 0 5 8 5 8 5 8 3 8 2 P 6 5 A G G A G T C A G A A C C G G T A 5 3 5 2 4 7 6 0 4 7 1 L e t t e r s d a n d n r e p r e s e n t o p t i m u m s p e c i e s - s p e c i fi c a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e i n d i r e c t P C R a n d n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s r e s p e c t i v e l y . 2 0 0 : . r fl p r i m e r p a i r s w e r e t e s t e d a t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s b e t w e e n 5 0 - 6 0 . T h e p r i m e r p a i r P G 1 - P G 4 a m p l i fi e d P . g a u m a n n i i a t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s r a n g i n g f r o m 5 2 t o 5 6 C . H o w e v e r , a m p l i fi c a t i o n w a s m o s t e f fi c i e n t a n d s e n s i t i v e a t a n o p t i m u m t e m p e r a t u r e o f 5 2 C . T h e p r i m e r p a i r a m p l i fi e d a P C R p r o d u c t o f 4 5 6 b p i n a l l a m p l i fi c a t i o n s ( F i g u r e 4 . 3 ) . T h e p a i r s p e c i fi c a l l y a m p l i f i e d o n l y P . g a u m a n n i i D N A e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m o r n e e d l e s w i t h f r u i t i n g b o d i e s ( p s e u d o t h e c i a ) i n a l l d i r e c t a m p l i fi c a t i o n s . T h e p r i m e r p a i r s d i d n o t a m p l i f y a n y o f t h e R h a b d o c l i n e s p e c i e s o r s u b s p e c i e s o r o t h e r e n d o p h y t i c f u n g i a t a n y a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s . T h e p r o b e p a i r P G 2 - P G 5 w a s a l s o t e s t e d a t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s r a n g i n g f r o m 4 8 t o 6 0 C . T h e p r o b e p a i r a m p l i fi e d a P C R p r o d u c t o f 3 8 2 b p o n l y f r o m t h e t a r g e t D N A a t t h i s t e m p e r a t u r e r a n g e i n a l l d i r e c t a m p l i fi c a t i o n s . A l t h o u g h t h e p a i r w a s v e r y s p e c i fi c t o P . g a u m a n n i i a t a l l a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s , i t w a s n o t a s s e n s i t i v e a s t h e p r o b e p a i r P G 1 - P G 4 . T h i s w a s m o s t p r o b a b l y d u e t o t h e 1 1 C d i f f e r e n c e i n m e l t i n g t e m p e r a t u r e s o f t h e t w o p r o b e s , P G 2 ( 5 8 ) a n d P G 5 ( 4 7 ) . D e t e c t i o n o f P . g a u m a n n i i i n i n f e c t e d n e e d l e s w i t h o r w i t h o u t s y m p t o m s F o l l o w i n g t h e d e t e r m i n a t i o n o f o p t i m u m s p e c i e s - s p e c i f i c a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s , t h e p r i m e r p a i r P G 1 - P G 4 w e r e t e s t e d f o r d e t e c t i n g t h e f u n g u s d i r e c t l y i n D N A e x t r a c t e d f r o m i n f e c t e d n e e d l e s . Y e a r o l d n e e d l e s c o l l e c t e d i n M a y 2 0 0 0 f r o m a n I M v a r i e t y o f D o u g l a s fi r g r o w n i n W a s h i n g t o n S t a t e w e r e u s e d i n d i r e c t P C R a m p l i fi c a t i o n s . P r i m e r p a i r P G 1 - P G 4 c o n s i s t e n t l y a m p l i f i e d P . g a u m a n n i i D N A i n y e a r o l d n e e d l e s s h o w i n g s y m p t o m s o r c a r r y i n g f r u i t i n g b o d i e s o f t h e f u n g u s , i n a l l a s s a y s a t o p t i m u m t e m p e r a t u r e 5 2 C ( F i g u r e 4 . 4 A ) . 2 0 1 1 2 - R P P - C H M I 1 3 - R P P - W A 2 9 1 5 - R W O B V - O R 5 1 6 - R W O B L - M l 1 1 7 - R P - A T C C 1 8 — R P - C O H F i g u r e 4 . 3 . P C R t e s t i n g o f p r i m e r p a i r P G 1 - P G 4 d e s i g n e d f r o m P . g a u m a n n i i s e q u e n c e f o r s p e c i f i c i t y d e t e r m i n a t i o n a t 5 2 C i n d i r e c t a m p l i f i c a t i o n s . T e m p l a t e D N A o f P . g a u m a n n i i ( P G ) H . d e m a t i o i d e s ( H D ) , A . p u l l u l a n s ( A P ) , a n d R . p a n k e n ' ( R P - A T C C ) w e r e e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m ( L a n e 3 , 8 , 9 , 1 7 ) . D N A t e m p l a t e o f P . g a u m a n n i i ( L a n e s 4 - 7 ) a n d R h a b d o c l i n e s p e c i e s ( L a n e s 1 0 - 1 6 ) w e r e e x t r a c t e d f r o m f r u i t i n g b o d i e s , ( p s e u d o t h e c i a a n d a p o t h e c i a r e s p e c t i v e l y ) . 1 K B + : s i z e s t a n d a r d D N A l a d d e r . 2 0 2 T h e a m p l i fi c a t i o n w a s e f fi c i e n t a n d h i g h l y s e n s i t i v e . A l t h o u g h , t h e p r o b e a m p l i f i e d D N A b o t h f r o m b u l k a n d m i n i p r e p e x t r a c t i o n s , t h e l a t t e r t e c h n i q u e a l w a y s p r o d u c e d h i g h q u a l i t y p u r i fi e d D N A . N o i n h i b i t i o n o f P C R b y p l a n t c o m p o u n d s w a s o b s e r v e d . T o e v a l u a t e t h e p o s s i b l e u s e o f p r i m e r p a i r P G 1 - P G 4 f o r e a r l y d e t e c t i o n o f P . g a u m a n n i i i n s y m p t o m l e s s f o l i a g e , c u r r e n t y e a r n e e d l e s c o l l e c t e d i n M a y 2 0 0 0 w e r e t e s t e d f o r t h e p r e s e n c e o f P . g a u m a n n i i i n f e c t i o n . P r i m e r p a i r P G 1 - P G 4 a m p l i fi e d t h e e x p e c t e d P C R p r o d u c t f r o m s y m p t o m l e s s c u r r e n t y e a r n e e d l e s t h a t w e r e c o l l e c t e d f r o m t h e s a m e t r e e s t h a t t h e f u n g u s w a s d e t e c t e d i n y e a r o l d d i s e a s e d n e e d l e s p r e v i o u s l y ( F i g u r e 4 . 4 . B ) . T h e p r i m e r p a i r c o n s i s t e n t l y d e t e c t e d t h e p a t h o g e n i n t h e s e n e w l y e m e r g e d n e e d l e s i n d i c a t i n g t h a t t h e n e e d l e s w e r e i n f e c t e d s o o n a f t e r b u d b r e a k . R e s t r i c t i o n d i g e s t o f P G 1 - P G 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s i n d i r e c t a m p l i fi c a t i o n P C R p r o d u c t s a m p l i f i e d b y P G 1 - P G 4 p r i m e r s f r o m o n e y e a r a n d c u r r e n t y e a r n e e d l e s w e r e d i g e s t e d w i t h r e s t r i c t i o n e n z y m e B s t N l t o f u r t h e r c o n f i r m t h e i d e n t i t y o f a P C R p r o d u c t a s I T S r D N A s e q u e n c e o f P . g a u m a n n i i . C o m p u t e r m a p p i n g o f t h e I T S s e q u e n c e s o f P . g a u m a n n i i , R h a b d o c l i n e t a x a a n d o t h e r r e l a t e d f u n g i p r e s e n t i n D o u g l a s fi r n e e d l e s s h o w e d t h a t t h e e n z y m e B s t N I c u t s I T S s e q u e n c e o f P . g a u m a n n i i a s w e l l a s t h e p o r t i o n o f I T S s e q u e n c e a m p l i fi e d b y P G 1 - P G 4 o f i n t o t w o u n i q u e s e g m e n t s ; 3 6 5 b p a n d 2 6 2 b p f o r s e q u e n c e s 2 0 3 P I . 4 5 6 b p O O U U Q ‘ - C D ‘ - N N 0 ' ) v I : > : > 3 : 1 : 2 3 D 0 L L w ( I ) U ) U ) ( a w a ) g a . C i 2 E 2 E E E E u - é N t o s ' r L b « 5 i x ' n o a t 4 5 6 w - F i g u r e 4 . 4 . D e t e c t i o n o f P . g a u m a n n i i b y p r i m e r p a i r P G 1 - P G 4 i n y e a r o l d n e e d l e s ( A ) , a n d c u r r e n t y e a r n e e d l e s ( B ) , c o l l e c t e d i n W a s h i n g t o n S t a t e f r o m s a m e t r e e s i n M a y 2 0 0 0 . 1 K B + : s i z e s t a n d a r d D N A l a d d e r . P G : T e m p l a t e D N A o f P . g a u m a n n i i f r o m m y c e l i u m . D F - H : D N A f r o m u n i n f e c t e d D o u g l a s fi r n e e d l e s a m p l e . P G - M l 1 : T e m p l a t e D N A f r o m n e e d l e s w i t h p s e u d o t h e c i a o f P . g a u m a n n i i . 2 0 4 T a b l e 4 . 3 . R e s t r i c t i o n f r a g m e n t m a p s o f t h e I T S s e q u e n c e s o f P . g a u m a n n i i a n d c l o s e l y r e l a t e d f u n g i . I T S s e q u e n c e 1 P G l - P G 4 s e q u e n c e 2 S p e c i e s u n c u t c u t ( b p ) 3 B s t N I H p a l l B s t N I H p a I I P . g a u m a n n i i 6 2 7 3 6 5 2 6 2 1 7 1 1 6 3 1 4 2 1 0 9 4 2 2 8 8 1 6 8 1 6 3 1 0 9 9 5 4 6 4 1 H . d e m a t i o i d e s 6 3 3 N s 4 N S N S N S A . p u l l u l a n s 6 2 7 4 4 6 1 8 1 2 7 0 2 2 5 1 3 2 4 2 9 2 7 1 4 7 2 7 0 5 5 R . p a r k e r i 5 7 6 3 8 2 1 9 4 2 4 0 1 9 0 1 4 7 2 8 6 8 0 1 9 0 1 2 0 7 0 R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s u e d o t s u g a e 5 7 3 4 3 6 1 3 7 2 4 0 1 9 0 1 4 3 3 0 0 6 0 1 9 0 1 2 0 7 0 ‘ I T S s e q u e n c e i n c l u d e s s e q u e n c e o f I T S I - 5 . 8 8 - I T S I I r D N A a n d p a r t i a l s e q u e n c e s o f 1 8 8 a n d 2 8 8 r D N A ( p r i m e r s i t e s ) a s a m p l i f i e d w i t h p r i m e r s I T S 1 F a n d I T S 4 . 2 P r e d i c t e d f r a g m e n t s i z e s : a s s u m i n g p r i m e r s P G 1 a n d P G 4 a m p l i f y a p o r t i o n o f t h e I T S s e q u e n c e o f t h e f u n g u s . 3 F r a g m e n t s i z e s i n b a s e p a i r s ( b p ) r e s u l t i n g f r o m r e s t r i c t i o n e n z y m e d i g e s t i o n . ‘ 1 N S = N o c u t t i n g s i t e s p r e s e n t i n I T S s e q u e n c e 2 0 5 A - s r : a a a s E E a + 3 : 3 : i 3 3 a 3 0 0 0 0 m m m ( n w w a ) w n . u . u . n . x E 5 . 5 . 5 5 . 2 5 a . ' — r < I a , v - n v t o d : r ~ a ! ) 0 ' : v - r - . — . — z o o - e m 1 6 8 - e l m o o o 9 L i a 3 a . s 3 ‘ - m ' - N N ( ' 3 V 3 3 3 D : 3 : > 3 a U ) U ) ( I ) ( 0 f l ) ( 0 U ) x 1 . ; a 2 . 2 . 2 . 2 . 2 . o B v - n ( D r ~ I L 2 8 8 - 9 h ) t e a - e l m F i g u r e 4 . 5 . R e s t r i c t i o n d i g e s t o f P G 1 - P G 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d f r o m y e a r o l d n e e d l e s ( A ) , a n d c u r r e n t y e a r n e e d l e s ( B ) , w i t h e n z y m e B s t N l . 1 K B + : s i z e s t a n d a r d D N A l a d d e r P G : r e p r e s e n t P . g a u m a n n i i D N A t e m p l a t e f r o m m y c e l i u m . 2 0 6 a m p l i fi e d b y I T S 1 F - I T S 4 , 2 8 8 b p a n d 1 6 8 b p f o r P G 1 - P G 4 ( T a b l e 4 . 3 ) . T h i s e n z y m e a l s o d o e s n o t c u t t h e I T S r e g i o n o f t h e m o s t c o m m o n e n d o p h y t i c f u n g i H . d e m a t i o i d e s . R e s t r i c t i o n d i g e s t o f a l l P C R p r o d u c t s a m p l i f i e d f r o m b o t h y e a r o l d a n d c u r r e n t y e a r n e e d l e s p r o d u c e d t h e t w o e x p e c t e d f r a g m e n t s o f 2 8 8 b p a n d 1 6 8 b p . T h i s c o n fi r m e d t h a t D N A a m p l i fi e d d i r e c t l y f r o m i n f e c t e d n e e d l e s w i t h o r w i t h o u t s y m p t o m s b e l o n g e d t o P . g a u m a n n i i ( F i g u r e 4 . 4 ) . T e s t i n g o f p r o b e s i n n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n f o r s p e c i fi c i t y d e t e r m i n a t i o n I n o r d e r t o i n c r e a s e t h e s e n s i t i v i t y o f d e t e c t i o n , w e a t t e m p t e d t o t e s t p r i m e r p a i r s i n n e s t e d P C R a m p l i f i c a t i o n . A n i n c r e a s e o f m o r e t h a n 1 0 0 0 t i m e s w a s r e p o r t e d b y r e s e a r c h e s ( H a m e l i n 1 9 9 6 ; K r i c k a , 1 9 9 2 ) . S p e c i fi c i t y o f p r o b e p a i r P G 1 - P G 4 w a s t e s t e d a t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s o f 5 2 - 6 0 C . T h e p r i m e r p a i r w a s u s e d t o r e — a m p l i f y I T S 1 F - I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s f r o m m y c e l i u m a n d f r u i t i n g b o d i e s . T h e p r i m e r s c o n s i s t e n t l y a m p l i f i e d h i g h q u a n t i t i e s o f t h e 4 5 6 b p P C R p r o d u c t f r o m P . g a u m a n n i i a t a n o p t i m u m t e m p e r a t u r e o f 5 8 C . H o w e v e r , t h e p r i m e r p a i r a l s o a m p l i fi e d D N A o f H . d e m a t i o i d e s a n d A . p u l l u l a n s . N e s t e d P C R d e t e c t i o n o f S w i s s a n d R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t i n m i x e d i n f e c t i o n s I n o r d e r t o f u r t h e r s e e i f P G 1 - P G 4 a m p l i fi e s o n l y t h e t a r g e t s e q u e n c e i n n e e d l e s w i t h m i x e d i n f e c t i o n s o f b o t h P . g a u m a n n i a n d R h a b d o c l i n e s p e c i e s , t h e n e e d l e s c a r r y i n g t h e f r u i t i n g b o d i e s o f b o t h p a t h o g e n s w e r e s e l e c t e d 2 0 7 a n d u s e d i n n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s . F r u i t i n g b o d i e s f r o m R . w e i n ' i s s p . o b l o n g a , R . p s e u d o t s u a g e s s p . p s e u d o t s u g a e w e r e r e m o v e d c a r e f u l l y a n d u s e d a s c o n t r o l s . N o a m p l i f i c a t i o n w a s o b s e r v e d w i t h R . p s e u d o t s u a g e s s p . p s e u d o t s u g a e . S i m u l t a n e o u s d e t e c t i o n o f S w i s s a n d R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t b y s p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r s T o e x p l o r e t h e p o s s i b i l i t y o f u s i n g t h e p r i m e r p a i r s f o r s i m u l t a n e o u s d e t e c t i o n o f b o t h S w i s s a n d R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t i n i n f e c t e d n e e d l e s , a n d t o c o m p a r e t h e a m p l i fi c a t i o n e f fi c i e n c y o f t h e p r i m e r p a i r s , n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s w a s c a r r i e d o u t w i t h r e a c t i o n s c o n t a i n i n g e q u i v a l e n t m o l a r c o n c e n t r a t i o n s o f b o t h p r i m e r p a i r s P G 1 - P G 4 R P P 1 - R P P 4 . T h e p r i m e r p a i r R P P 1 - R P P 4 i s s p e c i fi c f o r R h a b d o c l i n e p s e u d o t s u g a e s p p . p s e u d o t s u g a e . F i r s t r o u n d o f P C R w i t h p r i m e r p a i r I T S 1 F - I T S 4 w a s d o n e w i t h t h e D N A e x t r a c t e d f r o m t h e n e e d l e s i n f e c t e d b y b o t h P . g a u m a n n i i a n d R h a b d o c l i n e s u b s p e c i e s . A s e c o n d r o u n d o f P C R ( n e s t e d ) w a s p e r f o r m e d w i t h t h e m i x t u r e o f b o t h p r o b e p a i r s a t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s o f 5 8 C . T h i s a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e i s o p t i m a l f o r P G 1 - P G 4 b u t s u b - o p t i m a l f o r R P P 1 - R P P 4 . P C R a m p l i f i c a t i o n s s h o w e d t h a t t h e p r o b e R P P 1 - R P P 4 s t r o n g l y a m p l i fi e d t h e R h a b d o c l i n e t a r g e t i n a l l m i x e s o f R . p s e u d o t s u g a e s p p . p s e u d o t s u g a e a n d P . g a u m a n n i i i n f e c t i o n s . T h e p r o b e s P G 1 a n d P G 4 a m p l i f i e d P C R p r o d u c t s o f P . g a u m a n n i i m y c e l i u m i n e f f i c i e n t l y a n d d i d n o t a m p l i f y D N A i n t h e n e e d l e s i n f e c t e d b y o n l y P . g a u m a n n i i i n t h e p r e s e n c e o f R P P 1 - R P P 4 p r o b e s a n d p l a n t D N A . T h i s i n d i c a t e s t h a t t h e r e i s c o m p e t i t i o n b e t w e e n t h e t w o p r i m e r p a i r s a n d R P P 1 - R P P 4 i s p r e v e n t i n g P G 1 - P G 4 f r o m 2 0 8 a m p l i f y i n g t h e t a r g e t s e q u e n c e s ( F i g u r e 4 . 6 ) . n e w 3 — P G - M l 2 4 - w a o n e 5 - R W O B V - O R 5 6 - R W O B L - M l 2 7 - R P - C O H 8 - R P P - W A 3 + P G 9 - R P P - W A 7 + P G 1 0 - R P P - W A 8 + P G 1 1 - R P P — W A 2 9 + P G 1 2 - R P P - W A 3 8 + P G 1 3 - R P P - C H M H P G 1 4 - R P P - O C M I + P G 1 5 - R P P - O C M l 2 + P G 1 6 R P P O C M I 3 + P G g 8 a s s e s s a o F i g u r e 4 . 6 . S i m u l t a n e o u s d e t e c t i o n o f S w i s s a n d R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t p a t h o g e n s b y m i x e d P G 1 - P G 4 a n d R P P 1 - R P P 4 p r i m e r p a i r s i n m i x e d i n f e c t i o n s . 2 0 9 N e s t e d a m p l i fi c a t i o n s w e r e p e r f o r m e d w i t h b o t h p r i m e r p a i r P G 1 - P G 4 R P P 1 - R P P 4 t h a t w e r e m i x e d i n e q u i v a l e n t m o l a r c o n c e n t r a t i o n s . P C R p r o d u c t s o f b o t h P . g a u m a n n i i a n d R . p s e u d o t s u a g e s s p . p s e u d o t s u a g e ( a m p l i fi e d f r o m m y c e l i u m a n d f r u i t i n g b o d i e s r e s p e c t i v e l y ) b y I T S 1 F a n d I T S 4 p r i m e r s w e r e d i l u t e d a p p r o x i m a t e l y 1 0 0 t i m e s t o c o n c e n t r a t i o n s o f ( 1 0 n g / p l ) . N e s t e d P C R r e a c t i o n s w e r e p e r f o r m e d a t 5 8 C o p t i m a l f o r P G 1 - P G 4 . S e r i a l D N A d i l u t i o n s t h a t c o n t a i n c o n s t a n t a m o u n t s o f P . g a u m a n n i i D N A a n d r e d u c i n g a m o u n t s o f R . p s e u d o t s u a g e s s p . p s e u d o t s u a g e D N A w e r e t e s t e d ( F i g u r e 4 . 7 ) . P C R r e a c t i o n s r e v e a l e d t h a t P G 1 a n d P G 4 a m p l i fi e d t h e t a r g e t D N A e f fi c i e n t l y w h e n t h e a m o u n t s o f R h a b d o c l i n e D N A w e r e r e d u c e d t o a r a t i o o f 1 ( 1 0 n g / p l ) t o 1 0 0 0 0 ( l e s s t h a n 1 p g / p l ) . B o t h p r i m e r p a i r s a m p l i fi e d t h e i r r e s p e c t i v e t a r g e t s e q u a l l y a t t h e r a t i o o f 1 ( 1 0 n g / p l ) t o 1 0 0 0 ( 1 0 p g / p l ) . T h i s r e s u l t s h o w e d t h a t R P P 1 - R P P 4 w a s a t l e a s t 1 0 0 t i m e s m o r e s e n s i t i v e t h a n P G 1 - P G 4 p r i m e r w h e n t h e y c o - a m p l i f y . H o w e v e r , P G 1 - P G 4 w a s a s s e n s i t i v e a s R P 1 - R P 4 i n n o n - m i x e d D N A a m p l i fi c a t i o n s . T h e p r i m e r p a i r c a n d e t e c t P . g a u m a n n i i a s l o w a s 1 0 0 p g / p l i n d i r e c t P C R a n d 1 0 p g / p l i n n e s t e d P C R , r e s p e c t i v e l y . T e s t i n g s p e c i fi c i t y o f p r o b e s i n d o t - b l o t a s s a y s I n o r d e r t o d e t e r m i n e s p e c i e s - s p e c i fi c h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s , P . g a u m a n n i i s p e c i fi c o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s P G 1 a n d P G 4 w e r e e a c h t e s t e d i n d o t b l o t a s s a y s o f I T S 1 F a n d I T S 4 a m p l i f i e d P C R p r o d u c t s . I n i t i a l t h e o r e t i c a l h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s ( T h ) f o r P G 1 a n d P G 4 w e r e p r e d i c t e d a s 5 1 C a n d 5 5 2 1 0 1 1 0 0 ‘ t 1 : 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 : 1 0 0 0 0 0 + m 0 x o . - 9 4 m i n I N v - v - 0 . v — v - v - r - : I n “ L " 1 F i g u r e 4 . 7 S i m u l t a n e o u s a m p l i fi c a t i o n s o f S w i s s a n d R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t f u n g i b y m i x t u r e s o f p r i m e r p a i r P G 1 - P G 4 a n d R P P 1 - R P P 4 . D N A d i l u t i o n s w e r e p r e p a r e d b y a d d i n g r e d u c i n g a m o u n t s o f R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e D N A t o c o n s t a n t a m o u n t s o f P . g a u m a n n i i D N A ( 1 0 n g / p l ) . P G : P . g a u m a n n i i 2 1 1 C r e s p e c t i v e l y . P G 1 w a s t e s t e d a t 5 1 C a n d 5 7 C w h i l e P G 4 w a s t e s t e d 5 5 a n d 5 7 C . A l t h o u g h b o t h p r o b e s o n l y h y b r i d i z e d t o P . g a u m a n n i i D N A a t t h e t e m p e r a t u r e s t e s t e d , t h e y w e r e o p t i m a l l y h y b r i d i z e d a t 5 7 C ( T a b l e 4 . 2 a n d F i g u r e 4 . 8 A , B ) . P r o b e s d i d n o t h y b r i d i z e t o D N A o f H . d e m a t i o i d e s , A . p u l l u l a n s , K a b a t i n a t h u j a e S c h n e i d e r & v o n A r x , K . j u n i p e n ' S c h n e i d e r & A r k a n d R h i z o s p h a e r a k a l k h o f fi i B u b a k . t h a t h a d t h e c l o s e s t s e q u e n c e s i m i l a r i t y t o P . g a u m a n n i i . N o h y b r i d i z a t i o n o c c u r r e d w i t h t h e D N A o f n e e d l e c a s t p a t h o g e n s C . m i n u s ( B u t i n ) D i C o s m o , C . n i v e u s ( P e r s . ) D i C o s m o , P e r e d o a n d M i n t e r , D . p i n i H u l b a r y , L . s e d i t i o s u m M i n t e r , S t a l e y & M i l l a r , L . p i n a s t r y ( S c h r a d ) C h e v . P r o b e s a l s o d i d n o t h y b r i d i z e d t o R . p a r k e r i D N A . O l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s P G 2 a n d P G 5 w e r e a l s o t e s t e d f o r s p e c i f i c i t y a t 6 0 C a n d t h e p r o b e s o n l y h y b r i d i z e d t o P . g a u m a n n i i D N A ( F i g u r e 4 . 9 ) . N o h y b r i d i z a t i o n s w i t h a n y m e m b e r o f R h a b d o c l i n e t a x a o r e n d o p h y t i c f u n g i , s u c h a s A . p u l l u l a n s , S c l e r o p h o m a p y t h i o p h i l a ( C o r d a ) H o h n , e x c e p t w e a k h y b r i d i z a t i o n t o H . d e m a t i o i d e s . P r o b e P G 1 w a s a l s o t e s t e d a g a i n s t t o t a l D N A e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m . T h e p r o b e o n l y h y b r i d i z e d t o D N A e x t r a c t e d f r o m P . g a u m a n n i i ( F i g u r e 4 . 8 C ) . N o h y b r i d i z a t i o n t o a n y o f t h e D N A o f o t h e r f u n g i w e r e o b s e r v e d i n d i c a t i n g t h a t t h e p r o b e s c a n b e u s e d d i r e c t l y t o i d e n t i f y P . g a u m a n n i i m y c e l i u m w i t h o u t n e e d f o r P C R a m p l i fi c a t i o n . P G 4 , P G 2 a n d P G 5 h a d a t l e a s t 5 - 1 5 b p d i f f e r e n c e i n I T S s e q u e n c e f r o m t h e o t h e r t e s t e d f u n g i . 2 1 2 m C C T A - P l - A K R R O l - . ) D . Q I x x o < 9 5 5 5 o J . P G 1 P C R 0 o I ' — v - 0 2 . ‘ 5 < ' ( a c 1 : 1 Z I 1 2 x o < ‘ 1 1 9 3 6 ' ? o o E R \ . P G 4 . - - @ P C R B 1 1 9 f : o o l - . - 0 o . E 4 3 : l — o . I x 2 o < ‘ 3 5 g o 5 E E " I " P G 1 C g e n o m i c o 1 1 “ . “ F i g u r e 4 . 8 . D o t — b l o t h y b r i d i z a t i o n o f P . g a u m a n n i i s p e c i fi c o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s a t 5 7 C t o P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y I T S I F a n d I T S 4 p r i m e r s , A ) p r o b e P G 1 ( B ) p r o b e P G 4 . H y b r i d i z a t i o n s o f p r o b e s a t 5 7 C t o g e n o m i c D N A , C ) p r o b e P G 1 . 1 0 0 n g P C R p r o d u c t o r p g g e n o m i c ( t o t a l ) D N A w e r e b l o t t e d o n t o s p o t . F i l m s w e r e e x p o s e d f o r 2 4 h o u r s . 2 1 3 E 1 U o - N . I S , o a 0 t r u : o : _ J > Q I : i — o o o m a : < < ' O 0 t i c 1 3 1 8 : 1 1 ‘ > > 1 1 3 : % % g o r 1 ‘ . a t o : o : 6 : t r o : O . 0 . x ' - E 0 v — N i 0 1 ° . 9 o a : o r E 1 _ ’ I > ' g i ; I ; Q Q 0 c a t n - . L L I ( 1 n . 0 0 o u . n . [ L n . D . t 1 0 . E 3 : I : < t n n : 2 a : l : c : t r 0 : t r t o F i g u r e 4 . 9 . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f P C R p r o d u c t s a m p l i f i e d w i t h p r i m e r p a i r I T S I F a n d I T S 4 w i t h o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s , A ) p r o b e P G 2 a n d B ) p r o b e P G 5 . F i l m s w e r e e x p o s e d 2 4 h o u r s . 1 0 0 n g o f P C R p r o d u c t w a s p l a c e d i n e a c h s p o t . 2 1 4 D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s w i t h P G 1 - P G 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s a n d I T S r e g i o n s a s s p e c i e s - s p e c i fi c p r o b e T h e P G 1 - P G 4 a m p l i fi e d r e g i o n o f t h e I T S r D N A a n d t h e I T S I r e g i o n o f P . g a u m a n n i i w e r e i n d e p e n d e n t l y t e s t e d a s p r o b e s f o r s p e c i fi c i t y i n d e t e c t i o n o f t h e f u n g u s i n i n f e c t e d s y m p t o m l e s s n e e d l e s . T h e s e p r o b e s c a n c a r r y s i g n i fi c a n t l y m o r e l a b e l e d i s o t o p e m a r k e r s t h a n t h e s h o r t e r o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s . I n i t i a l l y P G 1 - P G 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s w e r e l a b e l e d r a n d o m l y a n d t e s t e d a g a i n s t I T S 1 F - I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s o r t o t a l D N A o f a f e w f u n g i t h a t h a d h i g h e s t s e q u e n c e s i m i l a r i t y ( F i g u r e 4 . 1 0 A ) . T h e p r o b e s w e r e t e s t e d a t 6 5 C a n d 7 0 C a n d h y b r i d i z e d t o P C R p r o d u c t s ( a 1 - 7 ) a n d t o t a l D N A ( a 8 - 1 2 ) , o f a l l f u n g i t e s t e d . N o n - s p e c i fi c h y b r i d i z a t i o n o f t h e P G 1 - P G 4 p r o b e w a s m o s t p r o b a b l y d u e t o t h e p r e s e n c e o f h o m o l o g y w i t h c o n s e r v e d 5 . 8 s r D N A s e q u e n c e o f t h e o t h e r f u n g i . I n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r s , I T S I a n d I T S I I o f t h e r i b o s o m a l D N A o p e r o n v a r i e d i n t h e f u n g i o f c o n c e r n a m o n g g e n e r a , s p e c i e s , a n d s u b s p e c i e s . T h e r e f o r e , t h e s e s p a c e r s e q u e n c e s h a d p o t e n t i a l f o r u s e a s t a x o n - s p e c i fi c p r o b e s . T h e i s o t o p e l a b e l e d p r o b e , c o n t a i n i n g t h e I T S I r e g i o n o f P . g a u m a n n i i , h y b r i d i z e d s t r o n g l y t o g e n o m i c D N A o f t h i s s p e c i e s a t h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s o f 7 5 C ( F i g u r e 4 . 1 O B ) . N o h y b r i d i z a t i o n t o D N A o f R . p a r k e r i e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m , o r D N A o f R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t f u n g i e x t r a c t e d f r o m f r u i t i n g b o d i e s o c c u r r e d . I t i s c l e a r t h a t I T S I p r o b e e f f e c t i v e l y d i f f e r e n t i a t e s P . g a u m a n n i i f r o m o t h e r r e l a t e d f u n g i a n d f u n g i o f c o n c e r n w h e n D N A e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m 2 1 5 O O I ; ‘ T “ I t I ( 1 2 I - o t — 0 C L : 1 0 . § § ( 9 < o x t 1 : 1 I o < c : r ; o ; q . o , 1 N * — N 0 ' 1 3 v 1 1 1 ) t o N n o a ) v — . - . — : 2 ‘ : s 2 i f 2 . 5 E 2 § ( 0 C . ) 8 8 8 . 1 . . J U 0 O C : > o , _ y . c n i n Q 0 O Q o n < < ; I , O O o . 0 . t 1 t 1 0 E o . c . u . 3 3 r 1 0 . o . o . 3 o : 2 e i t r e i t i t 0 . : t r t r t r . a . v - N c o v i n ( . 0 r s a b 0 ) . — . — - . w « s o F i g u r e 4 . 1 0 . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f P G 1 - P G 4 a m p l i f i e d P C R p r o d u c t s , t o : A ) I T S I F a n d I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s ( I a n e s 1 - 7 ) a n d g e n o m i c D N A ( l a n e s 8 - 1 2 ) ; B ) H y b r i d i z a t i o n t o t o t a l D N A e x t r a c t e d f r o m f r u i t i n g b o d i e s o f R h a b d o c l i n e t a x a ( l a n e s 2 - 9 ) a n d f r o m m y c e l i u m o f P . g a u m a n n i i ( L a n e 1 0 ) a n d R . p a r k e r i ( l a n e s 1 1 - 1 2 ) . B o t h h y b r i d i z a t i o n s w e r e a t 7 5 0 . 1 0 0 n g P C R p r o d u c t s o r t o t a l D N A w e r e l o a d e d p e r d o t . F i l m s w e r e e x p o s e d f o r 2 4 - 4 8 h . 2 1 6 i s u s e d . I T S I p r o b e c o n s i s t e n t l y h y b r i d i z e d t o D N A e x t r a c t e d f r o m m y c e l i a o r p s e u d o t h e c i a o f P . g a u m a n n i i i n a l l a s s a y s a n d p r o d u c e d r o b u s t s i g n a l . D e t e c t i o n o f P . g a u m a n n i i b y o l i g o n u c l e o t i d e p r i m e r p a i r P G 1 - P G 4 i n o n e y e a r - o l d n e e d l e s f r o m 4 4 i n t e r m o u n t a i n p r o v e n a n c e s o f D o u g l a s fi r I n o r d e r t o e v a l u a t e t h e e f f e c t i v e n e s s o f P . g a u m a n n i i s p e c i f i c o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s i n d e t e c t i n g t h e f u n g u s i n fi e l d s a m p l e s , t h e n e e d l e s f r o m 4 4 t r e e s o f d i f f e r e n t p r o v e n a n c e s o f i n t e r m o u n t a i n D o u g l a s fi r w e r e s c r e e n e d f o r t h e p r e s e n c e o f S w i s s n e e d l e c a s t p a t h o g e n . T h e s e n e e d l e s a l s o c o n t a i n e d R h a b d o c l i n e i n f e c t i o n s . B u l k D N A e x t r a c t i o n s p r e p a r e d i n a b l e n d e r u s i n g 1 0 g n e e d l e s w e r e u s e d i n P C R a m p l i f i c a t i o n s w i t h t h e p r i m e r p a i r P G 1 - P G 4 . T h e p r i m e r p a i r d e t e c t e d t h e f u n g u s i n 3 6 o u t o f 4 4 s a m p l e s ( T a b l e 4 . 4 ) a t t e m p l a t e d i l u t i o n s o f 1 0 1 a n d 1 0 2 ( 1 0 - 1 n g / p l D N A ) . i n n e s t e d P C R a m p l i f i c a t i o n s t h e p r i m e r p a i r d e t e c t e d t h e f u n g u s i n 3 8 o u t o f 4 4 s a m p l e s ( T a b l e 4 . 4 , F i g u r e 4 . 1 1 ) . 2 1 7 T a b l e 4 . 4 . C o m p a r i s o n o f s p e c i e s - s p e c i f i c P C R a m p l i f i c a t i o n s a n d t r a d i t i o n a l i s o l a t i o n m e t h o d s f o r d e t e c t i o n o f P . g a u m a n n i i i n n e e d l e s o f D o u g l a s fi r . N e e d l e # S y m p t o m 1 P r o b e d e t e c t i o n 2 I s o l a t i o n 3 M S U # S y m p t o m 1 P r o b e d e t e c t i o n 2 I s o l a t i o n 3 D . P C R N . P C R P G H D D . P C R N . P C R P G H D 1 + + + 2 1 1 2 3 - - - O 4 3 2 + + + 0 6 2 4 + + + 7 6 5 3 - + + O 7 2 5 - + + 0 1 4 + + + 0 0 2 6 + + + O 8 5 + + + O 1 2 7 + + + O 4 6 + + + 0 0 2 8 + + + O 4 7 + + + O 1 2 9 + + + 5 6 8 8 - + + 0 7 3 0 + + + O 1 1 ' . " 9 - - - O 5 6 3 1 + + + 0 1 j 1 0 + + + 1 1 2 3 2 + + + 0 1 1 1 + + + 1 3 4 7 3 3 - + + o o L 1 2 + + + 0 2 3 4 + + + O 1 1 3 + + + 0 2 3 5 + + + 0 5 1 4 + + + O 7 3 6 - + + 2 2 1 5 - - - O 3 3 7 + + + 0 0 1 6 - + + O 2 3 8 - + + 3 3 1 7 - + + 1 2 2 4 3 9 - - - O 8 1 8 - - + 0 2 4 O - + + 0 1 1 9 - - + 0 O 4 1 - + + 0 0 2 0 + + + O 0 4 2 + + + 4 6 2 1 + + + 1 2 2 4 3 - - - O 1 2 2 - + + 2 6 4 4 - - - 0 3 6 1 P s e u d o t h e c i a w e r e v i s u a l l y o b s e r v e d 2 D e t e c t i o n o f P . g a u m a n n i i i n b o t h d i r e c t ( D ) a n d n e s t e d ( N ) P C R a m p l i f i c a t i o n s w i t h p r i m e r p a i r P G 1 - P G 4 . 3 C o l o n i e s o f b o t h P . g a u m a n n i i ( P G ) a n d H . d e m a t i o i d e s ( H D ) g r o w i n g o n M a l t e x t r a c t a g a r w e r e c o u n t e d a f t e r 3 0 d a y s i n c u b a t i o n a t r o o m t e m p e r a t u r e . 2 1 8 2 1 9 fi r g r o w n i n W a s h i n g t o n . F i g u r e 4 . 1 1 . N e s t e d P C R d e t e c t i o n o f P . g a u m a n n i i u s i n g s p e c i fi c p r i m e r p a i r P G 1 - P G 4 i n y e a r o l d n e e d l e s f r o m 4 4 t r e e s o f l n t e r m o u n t a i n s o u r c e s o f D o u g l a s l I l l I l I l I C o m p a r i s o n o f s p e c i e s - s p e c i fi c P C R d e t e c t i o n t o t r a d i t i o n a l f u n g a l i s o l a t i o n m e t h o d s T o v e r i f y t h a t t h e d e t e c t i o n o f P . g a u m a n n i i b y s p e c i e s - s p e c i fi c p r o b e s a g r e e s w i t h t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f t h e f u n g u s i n n e e d l e s , a n d t o c o m p a r e t h e t r a d i t i o n a l d e t e c t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n t e c h n i q u e s t o t h e P C R t e c h n i q u e , a t t e m p t s w e r e m a d e t o i s o l a t e t h e f u n g u s i n n e e d l e s f r o m t h e s a m e s a m p l e s t h a t w e r e t e s t e d i n d i r e c t a n d n e s t e d P C R a s s a y s . A d d i t i o n a l l y , t h e n e e d l e s w e r e s c r e e n e d v i s u a l l y f o r t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f p s e u d o t h e c i a o f t h e f u n g u s . A l l s a m p l e s f r o m w h i c h t h e f u n g u s w a s i s o l a t e d o r o n w h i c h t h e f r u i t i n g b o d i e s w e r e o b s e r v e d y i e l d e d t h e 4 5 6 b p P C R p r o d u c t i n b o t h d i r e c t a n d n e s t e d P C R ( T a b l e 4 . 4 ) . T h e r e w e r e n o n e e d l e s a m p l e s f r o m w h i c h t h e f u n g u s w a s i s o l a t e d b u t n o t d e t e c t e d b y P C R . A m o n g t h e s a m p l e s f r o m w h i c h f u n g u s w a s n o t i s o l a t e d , a m a j o r i t y y i e l d e d p o s i t i v e d e t e c t i o n b y t h e P C R a s s a y . O n l y 6 ( 1 4 % ) a n d 8 ( 1 8 % ) y i e l d e d n e g a t i v e d e t e c t i o n s i n n e s t e d a n d d i r e c t P C R a s s a y s , r e s p e c t i v e l y . P . g a u m a n n i i w a s i s o l a t e d f r O m o n l y 1 1 o u t o f 4 4 t r e e s a m p l e s . T h e e n d o p h y t e H . d e m a t i o i d e s w a s t h e m o s t c o m m o n l y i s o l a t e d f u n g u s a l o n g w i t h t h e S w i s s n e e d l e c a s t p a t h o g e n , a n d i t i s m o r p h o l o g i c a l l y s i m i l a r i n g r o w t h c h a r a c t e r i s t i c s ( b l a c k y e a s t - l i k e c o l o n y ) . H o w e v e r , t h e p a t h o g e n g r o w s q u i t e s l o w l y a n d h a d a c o l o n y w i t h n o t a b l y d i f f e r e n t b r a n c h i n g p a t t e r n ( F i g u r e 4 . 1 2 ) . I n s o m e c a s e s , e v e n t h o u g h t h e P C R y i e l d e d s t r o n g b a n d s a n d t h e p s e u d o t h e c i a o f t h e f u n g u s w a s o b s e r v e d , t h e f u n g u s w a s n o t i s o l a t e d b e c a u s e t h e n e e d l e s w e r e a l r e a d y d e a d a n d d r y d u e t o h e a v y i n f e c t i o n b y b o t h S w i s s a n d R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t s . I s o l a t i o n i s p o s s i b l e o n l y w h e n t h e n e e d l e s a r e f r e s h a n d a l i v e . 2 2 0 1 m o n t h g r o w t h 4 m o n t h g r o w t h F i g u r e 4 . 1 2 . I s o l a t i o n o f P . g a u m a n n i i f o r c o m p a r i s o n w i t h p r i m e r d e t e c t i o n 2 2 1 F u r t h e r m o r e , t h e e n d o p h y t e H . d e m a t i o i d e s a p p a r e n t l y o v e r g r e w t h e p a t h o g e n i n t h e p e t r i p l a t e s i n m a n y i n s t a n c e s . W e b e l i e v e t h a t t h a t b o t h d i r e c t a n d n e s t e d P C R w a s a f a s t , e a s y , r e l i a b l e a n d c o n v e n i e n t m e t h o d i n d e t e c t i o n o f S w i s s n e e d l e c a s t a n d t h a t i t w a s m o r e r e l i a b l e i n d e t e c t i n g p a t h o g e n c o m p a r e d t o t r a d i t i o n a l i s o l a t i o n t e c h n i q u e s R e s t r i c t i o n d i g e s t s o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d w i t h t h e p r i m e r p a i r P G 1 - P G 4 f r o m 4 4 t r e e s I n o r d e r t o c o n fi r m t h e i d e n t i t y o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y t h e p r i m e r p a i r P G 1 - P G 4 a s P . g a u m a n n i i , P C R p r o d u c t s f r o m r a n d o m l y s e l e c t e d s a m p l e s w e r e c u t w i t h H p a l l a n d w i t h t h e p r e v i o u s l y u s e d e n z y m e B s t N l i n i n d e p e n d e n t d i g e s t s . R e s t r i c t i o n m a p s h o w e d t h a t H p a l l c u t s t h e I T S s e q u e n c e a n d t h e p o r t i o n o f t h e I T S a m p l i fi e d b y P G 1 - P G 4 , o f P . g a u m a n n i i i n t o 5 f r a g m e n t s . W h e r e a s , H p a l l c u t s t h e I T S o f R . p a r k e r i , R . p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e a n d A . p u l l u l a n s e a c h i n t o 3 f r a g m e n t s ( F i g u r e 4 . 1 3 a n d T a b l e 4 . 3 ) . T h e e n z y m e d o e s n o t c u t H . d e m a t i o i d e s I T S s e q u e n c e . R e s u l t s w i t h b o t h e n d o n u c l e a s e d i g e s t i o n s v e r i f i e d t h a t P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y t h e p r i m e r p a i r P G 1 - P G 4 f r o m n e e d l e s a m p l e f r o m 4 4 t r e e s b e l o n g e d t o I T S s e q u e n c e o f t h e t a r g e t P . g a u m a n n i i . 2 2 2 F i g u r e 4 . 1 3 R e s t r i c t i o n d i g e s t o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y t h e p r i m e r p a i r P G 1 - P G 4 , u s i n g A ) H p a I I a t 3 7 C a n d B ) B s t N l a t 6 5 C . P C R p r o d u c t s a r e d e r i v e d f r o m n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s u s i n g t e m p l a t e f r o m P C R a m p l i fi c a t i o n s w i t h t h e p r i m e r p a i r I T S 1 F — I T S 4 . 2 2 3 N e s t e d P C R t e s t i n g o f c u r r e n t y e a r n e e d l e s c o l l e c t e d a f t e r b u d b r e a k A s p r e v i o u s l y d e t e r m i n e d p r i m e r p a i r P G 1 - P G 4 d e t e c t e d s o l e l y P . g a u m a n n i i f r o m c u r r e n t y e a r n e e d l e s i n d i r e c t P C R a m p l i f i c a t i o n s ( F i g u r e 4 . 4 . B ) . T o s e e w h e t h e r t h e n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n w i l l a l s o d e t e c t P . g a u m a n n i i i n s y m p t o m l e s s n e e d l e s , w e t e s t e d D N A e x t r a c t e d b y b o t h b u l k a n d m i n i p r e p m e t h o d s f r o m c u r r e n t y e a r n e e d l e s . T h e P G 1 - P G 4 p r i m e r p a i r a m p l i fi e d a P C R p r o d u c t o f 4 5 6 b p f r o m t h e m a j o r i t y o f t h e n e e d l e s a m p l e s t e s t e d ( F i g u r e 4 . 1 4 ) . T o v e r i f y t h a t r e s u l t i n g P C R p r o d u c t s w e r e f r o m t h e P . g a u m a n n i i D N A , t h e y w e r e c u t w i t h H p a I I a n d B s t N l . T h i s w a s f u r t h e r e v i d e n c e t h a t P . g a u m a n n i i s p e c i f i c p r i m e r s c o u l d d e t e c t t h e f u n g u s i n s y m p t o m l e s s n e w l y e m e r g e d a n d i n f e c t e d f o l i a g e . 2 2 4 1 K B + 1 — M S U 1 - C Z - M S U S - C 3 - M S U 8 — C 4 - M S U 1 5 - C 5 - M S U 1 - C e m s u s - c 7 - M S U 8 - C 8 - M S U 1 2 - C 9 - M S U 1 4 - C 1 0 - M S U 2 0 - C 1 1 - M S U 2 3 - C 1 2 - M S U Z Q - C 1 3 - M S U 3 0 - C 1 1 1 - P G 1 5 - P G - M l 1 i i : t i 1 a u a n . ~ - ~ n — w F i g u r e 4 . 1 4 . N e s t e d P C R d e t e c t i o n o f P . g a u m a n n i i a m p l i f i e d b y t h e p r i m e r p a i r P G 1 - P G 4 i n n e w l y e m e r g e d n e e d l e s f r o m 1 3 t r e e s . D N A e x t r a c t e d w i t h b u l k m e t h o d ( L a n e s 1 - 4 ) a n d m i n i p r e p m e t h o d ( l a n e s 5 - 1 3 ) . 1 K B + : s i z e s t a n d a r d D N A l a d d e r . P G : T e m p l a t e D N A o f P . g a u m a n n i i f r o m m y c e l i u m . P G - M l 1 : T e m p l a t e D N A f r o m n e e d l e s c a r r y i n g t h e p s e u d o t h e c i a o f P . g a u m a n n i i . 2 2 5 C C C — - - 8 1 S U U U S S S M M M - - - 3 4 S C C - - 0 0 3 3 U U S S M M - — 2 3 1 1 v é g l I M H C - P P R - 6 1 C C - - 1 5 U U S S M M . 1 - - 2 C C - - - - C C C C C - - 3 9 0 0 - 4 0 2 2 3 3 8 1 2 U U U U U U U S S S S S M M M S S M M M M - - - - G P - - - - 0 1 2 3 4 6 8 9 1 1 1 1 1 ' 1 . ’ — 2 ) U ( 2 3 . — 2 8 ( 5 2 Q . ‘ — 4 5 5 b p - - - ) 1 1 1 3 - 3 9 2 1 5 6 3 4 6 — 4 2 b p - ) ’ — 3 o z 3 . ( D D 4 5 6 b p - - ) 2 8 8 b p — - - ) 1 6 8 b p - - - ) F i g u r e 4 . 1 5 . R e s t r i c t i o n d i g e s t s o f n e s t e d P C R p r o d u c t s a m p l i f i e d f r o m n e w l y e m e r g e d n e e d l e s f r o m 1 3 t r e e s u s i n g e n d o n u c l e a s e s , A ) H p a l l , B ) B s t N l ( B ) . 1 K B + : s i z e s t a n d a r d D N A l a d d e r . P G a n d R P i s t h e t e m p l a t e D N A o f P . g a u m a n n i i a n d A . p u l l u l a n s r e s p e c t i e v l y e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m . R P P - i s t h e D N A t e m p l a t e o f R . p s e u d o t s u g a e s p p . p s e u d o t s u g a e . 2 2 6 D I S C U S S I O N S w i s s n e e d l e c a s t i s v e r y d a m a g i n g i n C h r i s t m a s t r e e p l a n t a t i o n s o f D o u g l a s fi r a n d h a s i n c r e a s i n g l y b e e n a s e r i o u s t h r e a t t o f o r e s t p l a n t a t i o n s i n N o r t h A m e r i c a i n r e c e n t d e c a d e s ( C h a s t a g n e r , 1 9 9 7 ; H o o d , 1 9 9 7 ; H a n s e n e t a l . 2 0 0 0 ; W i n t o n e t a l . 2 0 0 0 ) . E a r l y a n d a c c u r a t e d e t e c t i o n o f t h e p a t h o g e n P . g a u m a n n i i i s e s s e n t i a l f o r c o n t r o l l i n g a n d m a n a g i n g t h e d i s e a s e s i n c e t h e f u n g u s o f t e n s p r e a d s t h r o u g h i n f e c t e d n u r s e r y s e e d l i n g s a n d r e m a i n s l a t e n t i n f o l i a g e a n d f o r m s t h e i d e n t i fi a b l e s t r u c t u r e s , f r u i t i n g b o d i e s a y e a r o r m o r e a f t e r i n f e c t i o n ( H a d fi e l d a n d D o u g l a s , 1 9 8 2 ; C h a s t a g n e r a n d B y t h e r , 1 9 8 3 a ; H a r r i n g t o n , 1 9 8 6 ; M i c h a e l s a n d C h a s t a g n e r , 1 9 8 4 b ) . I n t h i s s t u d y , w e s e q u e n c e d t h e i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r r e g i o n o f t h e r i b o s o m a l o p e r o n a n d d e s i g n e d s p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r s f o r P C R a m p l i fi c a t i o n a n d d o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n f o r d e t e c t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n o f P . g a u m a n n i i . I n P C R a s s a y s , p r i m e r p a i r s P G 1 - P G 4 s u c c e s s f u l l y a n d s p e c i fi c a l l y d e t e c t e d t h e p a t h o g e n a t v e r y e a r l y s t a g e s o f i n f e c t i o n i n n e w l y e m e r g i n g n e e d l e s i n t h e a b s e n c e o f a n y v i s i b l e s y m p t o m s . I n d o t - b l o t a s s a y s , t h e o l i g o n u c l e o t i d e p r i m e r s a n d P . g a u m a n n i i I T S I r e g i o n , r a d i o l a b e l e d a s p r o b e s p r o v e d t o b e h i g h l y s p e c i fi c f o r i d e n t i f i c a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f t h e f u n g u s . C o m p a r i s o n o f I T S s e q u e n c e o f P . g a u m a n n i i w i t h I T S r e g i o n s o f f u n g i s e q u e n c e d i n o u r l a b a n d a v a i l a b l e f r o m G e n B a n k r e v e a l e d t h a t t h e f u n g u s s h a r e d h i g h e s t h o m o l o g y w i t h t h e s e q u e n c e s o f t h e s p r u c e p a t h o g e n R . k a l k h o f fi i a n d t h e u b i q u i t o u s e n d o p h y t e s A . p u l l u l a n s a n d H . d e m a t i o i d e s ( a p p r o x i m a t e l y 2 2 7 8 5 % h o m o l o g o u s ) . T h e f u n g u s s h a r e d l e s s t h a n 7 3 % h o m o l o g y w i t h t h e s e q u e n c e s o f R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t f u n g i t h a t c a n c o e x i s t i n d u a l i n f e c t i o n s o f t h e D o u g l a s fi r n e e d l e t i s s u e ( H a r r i n g t o n , T C . 1 9 8 6 ; S i n c l a i r e t a l . 1 9 8 7 ) . . I n a d d i t i o n t o t h e s e q u e n c e s o f R h a b d o c l i n e s p e c i e s , e m p h a s i s w a s p l a c e d o n n u c l e o t i d e d i f f e r e n c e s w i t h e s p e c i a l l y t h e s e q u e n c e s o f t h e t w o e n d o p h y t e s H . d e m a t i o i d e s a n d A . p u l l u l a n s w h e n p r i m e r s w e r e d e s i g n e d s i n c e t h e y a r e u b i q u i t o u s f u n g i w i t h a w i d e r a n g e o f c o n i f e r o u s h o s t s ( F u n k , 1 9 8 5 ; H e r m a n i d e s — N i j h o f , 1 9 7 7 ) a n d h a v e p o t e n t i a l t o c a u s e f a l s e p o s i t i v e s i n P C R a m p l i fi c a t i o n s ( C a m a c h o e t a l . 1 9 9 7 ) . F u r t h e r m o r e , H . d e m a t i o i d e s w a s t h e m o s t c o m m o n l y i s o l a t e d f u n g u s a l o n g w i t h P . g a u m a n n i i i n i s o l a t i o n s f r o m y e a r o l d n e e d l e s . T h e p r i m e r s s e l e c t e d f o r P . g a u m a n n i i d i f f e r e d f r o m t h e s e f u n g i 4 - 1 2 b p . W e d e s i g n e d t w o s e t s o f p r i m e r s f o r c o n v e n t i o n a l P C R f o r s p e c i f i c a m p l i fi c a t i o n o f P . g a u m a n n i i . T h e P C R m e t h o d s d e v e l o p e d a r e c h e a p a n d m o r e s e n s i t i v e f o r d e t e c t i o n o f P . g a u m a n n i i t h a n r e a l t i m e - P C R u s e d b y W i n t o n e t a l . ( 2 0 0 2 ) f o r d e t e c t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n o f t h e f u n g u s i n f o l i a g e . F u r t h e r m o r e , c o n v e n t i o n a l P C R w a s s h o w n t o b e l e s s p r o n e t o i n h i b i t i o n b y e x c e s s D N A o r p l a n t c o m p o u n d s t h a n r e a l - t i m e P C R ( C u l l e n e t a l . 2 0 0 1 ) a n d p r i m e r s c a n b e u s e d f o r q u a n t i fi c a t i o n w i t h t h e d e s i g n o f c o m p e t i t o r t e m p l a t e D N A a s h a s b e e n d o n e w i t h o t h e r f u n g a l s y s t e m s ( M o u k h a m e d o v e t a l . 1 9 9 4 a n d B e l l e t a l . 1 9 9 9 ) . I n a d d i t i o n , P C R w i t h s p e c i e s - s p e c i f i c p r i m e r s f r o m r i b o s o m a l I T S r e g i o n s a l l o w f o r t h e d e t e c t i o n o f l o w c o n c e n t r a t i o n s o f t a r g e t D N A ( C u l l e n e t a l 2 0 0 1 ) b e c a u s e I T S r e g i o n s a r e p r e s e n t i n m u l t i p l e t a n d e m r e p e a t s i n e u k a r y o t i c t h e g e n o m e . 2 2 8 O n t h e c o n t r a r y , t h e p r i m e r s f o r r e a l t i m e P C R w e r e d e s i g n e d f r o m B t u b u l i n g e n e s t h a t a r e p r e s e n t a t l o w e r c o p y n u m b e r s i n f u n g a l g e n o m e ( H e i d e t a l 1 9 9 6 a n d W i n t o n e t a l . 2 0 0 1 ) . P C R w i t h t h e s e p r i m e r s h a s p o t e n t i a l l y r e d u c e d s e n s i t i v i t y ( C u l l e n e t a l . 2 0 0 1 ) . T h e s p e c i fi c i t y o f p r i m e r s w a s c o n fi r m e d b y t e s t i n g a g a i n s t t h e D N A o f f u n g i e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m o r f r u i t i n g b o d i e s i n d i r e c t a n d n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s . I n d i r e c t a m p l i f i c a t i o n , p r i m e r s a m p l i f i e d o n l y t h e t a r g e t D N A a t o p t i m u m t e m p e r a t u r e 5 2 C . N o c r o s s - r e a c t i o n o c c u r r e d w i t h t h e D N A o f a n y o t h e r f u n g i e s t a b l i s h i n g t h a t t h e p r i m e r c a n i d e n t i f y a n d d i f f e r e n t i a t e P . g a u m a n n i i f r o m f r u i t i n g b o d i e s w i t h o u t n e e d f o r i s o l a t i o n a n d g r o w t h o f f u n g u s o n l a b o r a t o r y m e d i a . S u c h i s o l a t i o n s a n d g r o w t h t a k e m o r e t h a n o n e m o n t h f o r c o m p a r i s o n o f c u l t u r a l c h a r a c t e r i s t i c s . H o w e v e r , i n n e s t e d P C R , t h e r e w a s s o m e w e a k c r o s s - r e a c t i o n w i t h t h e D N A o f H . d e m a t i o i d e s a n d A . p u l l u l a n s . T h i s w a s m o s t p r o b a b l y d u e t o d i l u t i o n e f f e c t s s i n c e a m p l i f i c a t i o n s w e r e c a r r i e d o f p u r e , h i g h m o l e c u l a r w e i g h t D N A e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m . H o w e v e r , c r o s s - r e a c t i o n s w e r e g r e a t l y r e d u c e d b y i n c r e a s i n g t h e a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e t o 5 8 C a n d b y r e d u c i n g t h e l e n g t h o f d e n a t u r a t i o n a n d a n n e a l i n g t i m e s t o 2 5 - 3 0 s e c o n d s . D e t e c t i o n o f f u n g i w i t h s p e c i e s - s p e c i f i c p r i m e r s d i r e c t l y f r o m n a t u r a l l y i n f e c t e d p l a n t m a t e r i a l h a s r a r e l y b e e n s u c c e s s f u l i n f u n g u s - p l a n t s y s t e m s ( Z h a n g e t a l . 1 9 9 7 ; T r o u t e t a l . 1 9 9 7 a n d K a g e y a m a e t a l . 1 9 9 7 ) . H a m e l i n e t a l . ( 1 9 9 7 ) r e p o r t e d t h a t d e t e c t i o n o f f u n g i d i r e c t l y f r o m c o n i f e r r o o t s w i t h s p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r s w e r e n o t c o n s i s t e n t a n d c i t e d t h e v a r i a b i l i t y i n t h e r a t i o o f t a r g e t 2 2 9 D N A t o n o n - t a r g e t D N A a s r e a s o n . H o w e v e r , H a m e l i n e t a l . 2 0 0 0 r e p o r t e d t h a t G r e m m e n i e l l a a b i e t i n a , t h e c a u s a l a g e n t o f S c l e r o d e m ’ s c a n k e r o f p i n e c o u l d b e d e t e c t e d i n n e e d l e t i s s u e s w h e n s y m p t o m s o r s i g n s o f d i s e a s e w e r e p r e s e n t . I n c o n s i s t e n c y a n d i n e f f e c t i v e n e s s o f P C R a m p l i fi c a t i o n f r o m p l a n t s c o u l d b e d u e t o P C R i n h i b i t o r s i n p l a n t t i s s u e s a n d a l s o d u e t o t h e c o m p o s i t i o n a n d p r o p e r t i e s o f p r i m e r s . H o w e v e r , i t h a s b e e n r e p o r t e d t h a t d i l u t i o n c a n o v e r c o m e t h e e f f e c t s o f i n h i b i t o r s ( K a g e y a m a e t a l . 1 9 9 7 ) . I n o u r s t u d y , a m p l i f i c a t i o n o f s p e c i e s - s p e c i fi c P C R p r o d u c t s w i t h t h e p r i m e r p a i r P G 1 a n d P G 4 d i r e c t l y f r o m D N A e x t r a c t s f r o m i n f e c t e d n e e d l e s ( w i t h o u t a f i r s t r o u n d o f a m p l i f i c a t i o n w i t h f u n g u s s p e c i fi c p r i m e r s ( l T S 1 F - I T S 4 ) w a s h i g h l y c o n s i s t e n t a n d r e p r o d u c i b l e . W e h a v e o v e r c o m e t h e e f f e c t s o f P C R i n h i b i t i o n w i t h h i g h d i l u t i o n s o f D N A ( 1 0 ' 2 - 1 0 ' 3 ) e x t r a c t e d f r o m n e e d l e s . T h e p r i m e r s s u c c e s s f u l l y d e t e c t e d t h e P . g a u m a n n i i D N A n o t o n l y i n y e a r o l d n e e d l e s t h a t c a r r y s y m p t o m s a n d f r u i t i n g b o d i e s o f f u n g i b u t a l s o i n n e w l y e m e r g e d c u r r e n t y e a r s y m p t o m l e s s n e e d l e s i n d i r e c t a m p l i fi c a t i o n s . W e a l s o u s e d P . g a u m a n n i i s p e c i f i c p r i m e r s i n n e s t e d P C R d e t e c t i o n f r o m i n f e c t e d n e e d l e s s i n c e n e s t e d P C R w a s r e p o r t e d t o y i e l d h i g h l y c o n s i s t e n t a n d r e p r o d u c i b l e r e s u l t s a n d t o i n c r e a s e t h e s e n s i t i v i t y o f d e t e c t i o n ( H a m e l i n e t a l . 1 9 9 7 , 2 0 0 0 ) . H o w e v e r , t h e n e s t e d P C R t e c h n i q u e b e c o m e s m o r e v u l n e r a b l e f o r c a r r y - o v e r c o n t a m i n a t i o n t h a t r e q u i r e d c a r e f u l h a n d l i n g s o f P C R a g e n t s a n d e q u i p m e n t s . I n o u r t e s t s , b o t h p r i m e r p a i r s P G 1 - P G 4 a n d P G Z — P G S c o n s i s t e n t l y a m p l i fi e d t h e t a r g e t s e q u e n c e s f r o m i n f e c t e d y e a r o l d n e e d l e s a n d c u r r e n t y e a r n e e d l e s i n n e s t e d P C R . W e o b s e r v e d t h a t t h e s e n s i t i v i t y i n c r e a s e d t h e s p e c i fi c i t y o f d e t e c t i o n . T h e f u n g u s w a s d e t e c t e d e v e n i n P C R p r o d u c t s o f 2 3 0 “ 2 : 1 9 . — . - fi r s t r o u n d a m p l i fi c a t i o n w i t h f u n g a l s p e c i fi c p r i m e r s t h a t w e r e n o t v i s u a l l y o b s e r v e d o n a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s . T h i s i n d i c a t e d t h a t P . g a u m a n n i i p r i m e r s w e r e h i g h l y s e n s i t i v e a n d fi r s t r o u n d P C R p r o d u c t s c o u l d d i r e c t l y b e d i l u t e d 1 0 0 x u s e d i n n e s t e d P C R w i t h o u t a n e e d t o v i s u a l i z e t h e p r o d u c t s o f fi r s t P C R r e a c t i o n o n a g e l . C a r r y - o v e r p r o b l e m s f r o m s a m p l e t o s a m p l e w e r e r e d u c e d b y u s i n g n e w l y p r e p a r e d b u l k P C R r e a c t i o n f o r e a c h t e s t a n d b y u s i n g a e r o s o l p i p e t t i p s . O u r a t t e m p t s f o r s i m u l t a n e o u s d e t e c t i o n o f b o t h S w i s s n e e d l e c a s t a n d R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t w i t h a m i x t u r e o f s p e c i e s - s p e c i f i c p r i m e r s o f P . g a u m a n n i i ( P G 1 - P G 4 ) a n d R h a b d o c l i n e p s e u d o t s u g a e s s p . p s e u d o t s u g a e ( R P P 1 - R P P 4 ) i n a m u l t i p l e x P C R y i e l d e d R h a b d o c l i n e s p e c i fi c f r a g m e n t s e v e n i n t h e p r e s e n c e o f 1 0 0 t i m e s m o r e t e m p l a t e o f t h e S w i s s n e e d l e c a s t p a t h o g e n , i n d i c a t i n g t h a t a m p l i fi c a t i o n b y P G 1 - P G 4 w a s i n h i b i t e d b y c o m p e t i t i o n b e t w e e n t w o a m p l i c o n s a s o b s e r v e d i n m u l t i p l e x P C R i n o t h e r f u n g i ( H a m e l i n , 1 9 9 6 , 2 0 0 0 ) P C R a m p l i fi c a t i o n w i t h p r i m e r p a i r P G 1 - P G 4 w a s f o u n d t o b e m o r e s e n s i t i v e a n d a c c u r a t e t h a n c o n v e n t i o n a l i s o l a t i o n p r o t o c o l i n i d e n t i f y i n g P . g a u m a n n i i i n f e c t i o n . D e t e c t i o n w i t h P C R w a s i n a c c o r d a n c e w i t h r e s u l t s f r o m i s o l a t i o n o f f u n g i f r o m y e a r o l d n e e d l e s . N o t o n l y d i d t h e p r i m e r s d e t e c t t h e p a t h o g e n i n s a m p l e s f r o m w h i c h t h e f u n g u s w a s i s o l a t e d , b u t t h e y a l s o d e t e c t e d t h e p a t h o g e n i n n e e d l e s a m p l e s f r o m w h i c h t h e f u n g u s w a s n o t i s o l a t e d . T h e m a j o r i t y o f n e e d l e s a m p l e s t e s t e d p o s i t i v e e v e n t h o u g h t h e f u n g u s w a s n o t i s o l a t e d b e c a u s e t h e m a j o r i t y o f n e e d l e s a m p l e s c a r r y i n g t h e f r u i t i n g b o d i e s o f 2 3 1 S w i s s n e e d l e c a s t w e r e d e a d d u e t o h e a v y i n f e c t i o n w i t h R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t . T h i s i n d i c a t e d t h a t a l t h o u g h t h e f u n g u s c a n n o t b e i s o l a t e d , i t s D N A c o u l d b e i s o l a t e d a n d a m p l i fi e d f r o m d e a d m a t e r i a l ( H e n s o n 1 9 9 7 ) . R e s t r i c t i o n F r a g m e n t L e n g t h P o l y m o r p h i s m a n a l y s i s o f s p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s w a s u s e d t o d i s t i n g u i s h t h e t a r g e t D N A f r o m f a l s e l y a m p l i fi e d n o n - t a r g e t D N A ( K a g e y a m a , 1 9 9 7 : W e i l a n d a n d S u n d s b a k , 2 0 0 0 ) . R e s t r i c t i o n d i g e s t o f P G I - P G 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s o n e y e a r o l d n e e d l e s f r o m w h i c h t h e c o m m o n e n d o p h y t e H . d e m a t i o i d e s w a s a l s o i s o l a t e d a t h i g h f r e q u e n c i e s c o n c l u s i v e l y v e r i fi e d t h a t t h e r e w a s n o c r o s s - r e a c t i o n w i t h t h e D N A o f t h i s e n d o p h y t e i n b o t h d i r e c t a n d n e s t e d P C R b e c a u s e , a n d t h a t t h e n e e d l e s c o n t a i n e d b o t h t h e p a t h o g e n a n d t h e e n d o p h y t e . F o u r p r o b e s d e s i g n e d f o r P . g a u m a n n i i w e r e t e s t e d a n d f o u n d t o b e h i g h l y s p e c i fi c a t d i f f e r e n t i a t i n g P . g a u m a n n i i D N A i s o l a t e d f r o m m y c e l i u m o r f r u i t i n g b o d i e s . O u r a t t e m p t s t o u s e t h e p r o b e s i n d o t - b l o t s o f i n f e c t e d n e e d l e s w i t h o r w i t h o u t s y m p t o m s w e r e n o t s u c c e s s f u l . T h e l a c k o f s u c c e s s w a s p r o b a b l y d u e t o t h e f a c t t h a t t h e m e t h o d w a s n o t s e n s i t i v e e n o u g h t o d e t e c t t h e s m a l l a m o u n t s o f t a r g e t D N A i n n e e d l e t i s s u e . T h e w h o l e I T S I r e g i o n s h o w e d a h i g h d e g r e e o f s p e c i e s s p e c i fi c i t y a s a p r o b e P . g a u m a n n i a n d w a s h i g h l y s p e c i e s - s p e c i fi c a t 7 5 . H e n c e i n t h i s w o r k , w e h a v e s h o w n t h e p o t e n t i a l o f s p e c i e s - s p e c i f i c p r i m e r s f o r d e t e c t i n g S w i s s n e e d l e c a s t f u n g i f r o m i n f e c t e d n e e d l e s w i t h o r w i t h o u t s y m p t o m s i n P C R a s s a y s . T h i s a p p r o a c h i s w e l l s u i t e d f o r S w i s s n e e d l e 2 3 2 c a s t p a t h o g e n . T h e p a t h o g e n i s d i f fi c u l t t o d e t e c t a n d i s o l a t e e a r l y i n t h e i n f e c t i o n p e r i o d b e c a u s e g r o w t h i s s l o w o n l a b o r a t o r y m e d i a a n d i n f e c t i o n s r e m a i n l a t e n t f o r l o n g p e r i o d s b e f o r e s y m p t o m s o r f r u i t i n g b o d i e s a p p e a r . T h e t e c h n i q u e s d e s c r i b e d h e r e c a n b e u s e d f o r t e s t i n g o f n u r s e r y s e e d l i n g s D o u g l a s fi r C h r i s t m a s t r e e s f o r t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f t h e p a t h o g e n p r i o r t o t r a n s p o r t a t i o n f o r o u t p l a n t i n g s . 2 3 3 R E F E R E N C E S A l t s c h u l , S . F . , G i s h , W . , M i l l e r , W . , M y e r s , E . W . & L i p m a n , D . J . 1 9 9 0 . " B a s i c l o c a l a l i g n m e n t s e a r c h t o o l . " J . M o l . B i o l . 2 1 5 : 4 0 3 - 4 1 0 . A l t s c h u l , S . F . , M a d d e n , T . L . , S c h a f f e r , A . A . , Z h a n g , J . , Z h a n g , 2 . , M i l l e r , W . & L i p m a n , D . J . 1 9 9 7 . " G a p p e d B L A S T a n d P S I - B L A S T : a n e w g e n e r a t i o n o f p r o t e i n d a t a b a s e s e a r c h p r o g r a m s . " N u c l e i c A c i d s R e s . 2 5 : 3 3 8 9 - 3 4 0 2 A u s u b e l , F . M . , B r e n t , R . , K i n g s t o n , R . E . , M o o r e , D . D . , S e i d m a n , J . G . , S m i t h , J . A . , a n d S t r u h l , K . 2 0 0 1 . C u r r e n t p r o t o c o l s i n m o l e c u l a r b i o l o g y . P u b l i s h e r , J o h n W i l e y & S o n s , I n c . N e w y o r k . B e l l , K . S . , C l a x t o n , J . R . , C u l l e n , R . J . , W i l l i a m s N . A . , H a r r i s o n , J . G . , T o t h , I . K . , D o o k e , D . E . K . , a n d D u n c a n , J . D . , 1 9 9 9 . D e t e t e c t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n o f S p o n g o s p o r a s u b t e r r a n e a f . s p . s u b t e r r a n e a n i n s o i l s a n d t u b e r s u s i n g s p e c i fi c P C R p r i m e r s . E u r o p e a n J o u r n a l o f P l a n t P a t h o l o g y 1 0 5 : 9 0 5 - 9 1 5 . B e r g d a h l , D . R . , a n d F r e n c h , D . W . 1 9 7 6 . S w i s s n e e d l e c a s t o f D o u g l a s f i r i n M i n n e s o t a . P l a n t D i s e a s e R e p o r t e r . 6 0 : 1 4 3 . B r u n s , T . D a n d G a r d e s , M . 1 9 9 3 . M o l e c u l a r t o o l s f o r t h e i d e n t i fi c a t i o n o f e c t o m y c o r r h i z a l f u n g i - t a x o n - s p e c i fi c o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s f o r s u i l l o i d f u n g i . M o l e c u l a r E c o l o g y 2 : 2 3 3 - 2 4 2 . C a p i t a n o , B . R . 1 9 9 9 . T h e i n f e c t i o n a n d C o l o n i z a t i o n o f D o u g l a s fi r b y P h a e o c r y p t o p u s g a u m a n n i i . M S t h e s i s . O r e g o n S t a t e U n i v e r s i t y , C o r v a l l i s . C h a s t a g n e r , G . A a n d B y t h e r , R . S . 1 9 8 3 3 . I n f e c t i o n p e r i o d o f P h a e o c r y p t o p u s g a u m a n i i o n D o u g l a s - F i r n e e d l e s . P l a n t D i s e a s e 6 7 ( 7 ) : 8 1 1 - 8 1 3 . C h a s t a g n e r , G . A a n d B y t h e r , R . S . 1 9 8 3 b . C o n t r o l o f S w i s s N e e d l e C a s t o n D o u g l a s fi r C h r i s t m a s T r e e s w i t h A e r i a l a p p l i c a t i o n s o f C h l o r o t h a l o n i l . P l a n t D i s e a s e . 6 7 ( 7 ) : 7 9 0 - 7 9 2 . C h a s t a g n e r , G . A . 1 9 9 7 . C y c l a n e u s m a n e e d l e C a s t . I n : E . M . H a n s e n a n d K . J . L e w i s , e d s . C o m p e n d i u m o f C o n i f e r D i s e a s e s . A m e r i c a n P h y t o p a t h o l o g i c a l S o c i e t y , S t . P a u l , M N . C u l l e n , D . W . , L e e s , K . A . , T o t h , K . I . , a n d D u n c a n , J . M . 2 0 0 1 . C o n v e n t i o n a l P C R a n d r e a l - t i m e q u a n t i t a t i v e P C R d e t e c t i o n o f H e l m i n t h o s p o r i u m s o l a n i i n s o i l a n d o n p o t a t o t u b e r s . E u r o p e a n J o u r n a l o f P l a n t P a t h o l o g y 1 0 7 : 3 8 7 - 3 9 8 . 2 3 4 . . . 3 r : I f F u n k , A . 1 9 8 5 . F o l i a r F u n g i o f W e s t e r n T r e e s . C a n a d i a n F o r e s t r y S e r v i c e , P a c i fi c F o r e s t r e s e a r c h C e n t r e . V i c t o r i a , B C , C a n a d a , p : 8 8 - 9 1 . G a r d e s , M a n d B r u n s , T . D . 1 9 9 3 . I T S p r i m e r s w i t h e n h a n c e d s p e c i f i c i t y f o r b a s i d i o m y c e t e s — a p p l i c a t i o n t o t h e i d e n t i f i c a t i o n o f m y c o r r h i z a e a n d r u s t s . M o l e c u l a r E c o l o g y 2 : 1 1 3 - 1 1 H a d fi e l d , J . , a n d D o u g l a s s , B . S . 1 9 8 2 . P r o t e c t i o n o f D o u g l a s - f i r C h r i s t m a s t r e e s f r o m S w i s s n e e d l e - c a s t i n O r e g o n . A m e r i c a n C h r i s t m a s T r e e j o u r n a l ( M a y ) : 3 1 - 3 3 . H a m e l i n , R . C . , B e r u b e , P . , G i g n a c , M . , a n d B o u r a s s a , M . 1 9 9 6 . I d e n t i f i c a t i o n o f r o o t r o t f u n g i i n n u r s e r y s e e d l i n g s b y n e s t e d m u l t i p l e x P C R . A p p l i e d a n d E n v i r o n m e n t a l M i c r o b i o l o g y 6 2 ( 1 1 ) : 4 0 2 6 - 4 0 3 1 . H a m e l i n , R . C . , B o u r a s s a , M . , R a i l , J . , D u s a b e n y a g a s a n i , M . , J a c o b i , a n d L a fl a m m e , G . 2 0 0 0 . P C R d e t e c t i o n o f G r e m m e n i e l l a a b i e t i n a , t h e c a u s a l a g e n t o f S c l e r o d e m ' s c a n c e r o f p i n e . M y c o l o g i c a l R e s e a r c h 1 0 4 ( 5 ) : 5 2 7 - 5 3 2 . H a n s e n , E . M . , S t o n e , J . K . , C a p i t a n o , B . R . , R o s s o , P . , S u t t o n , W . , a n d W i n t o n , L . 2 0 0 0 . I n c i d e n c e a n d I m p a c t o f S w i s s N e e d l e C a t s i n F o r e s t P l a n t a t i o n s o f D o u g l a s - fi r i n C o a s t a l O r e g o n . P l a n t D i s e a s e 8 4 ( 7 ) : 7 7 3 - 7 7 8 . H a r r i n g t o n , T . C . 1 9 8 6 . D i s t r i b u t i o n o f R h a b d o c l i n e a n d S w i s s n e e d l e c a s t s o n D o u g l a s fi r C h r i s t m a s t r e e s i n N e w H a m p s h i r e . P l a n t d i s e a s e 7 0 ( 1 1 ) : 1 0 6 9 - 1 0 7 0 . H o o d , | . A . 1 9 9 7 . S w i s s n e e d l e c a s t . I n : E . M . H a n s e n a n d K . J . L e w i s , e d s . C o m p e n d i u m o f C o n i f e r D i s e a s e s . A m e r i c a n P h y t o p a t h o l o g i c a l S o c i e t y , S t . P a u l , M N . P a g e s 5 5 - 5 6 . K r i c k a , L . J . 1 9 9 2 . N o n - s i o t o p i c D N A P r o b e T e c h n i q u e s . 3 5 8 P p . A c a d e m i c P r e s s , I n c . s a n D i e g o , C A . L e e , S . B . , M i l g r o o m , M . G . , a n d T a y l o r , J . W 1 9 8 8 . A r a p i d , h i g h y i e l d m i n i - p r e p m e t h o d f o r i s o l a t i o n o f t o t a l g e n o m i c D N A f o r m f u n g i . F u n g a l G e n e t N e w s l e t t e r 3 5 3 2 3 - 2 4 . M i c h a e l s , E . , a n d C h a s t a g n e r , G . A . 1 9 8 4 a . D i s t r i b u t i o n , S e v e r i t y , a n d I m p a c t o f S w i s s N e e d l e C a s t i n D o u g l a s — F i r C h r i s t m a s T r e e s i n W e s t e r n W a s h i n g t o n a n d O r e g o n . P l a n t D i s e a s e 6 8 ( 1 1 ) : 9 3 9 - 9 4 2 . M i c h a e l s , E . , a n d C h a s t a g n e r , G . A . 1 9 8 4 b . S e a s o n a l A v a i l a b i l i t y o f P h a e o c r y p t o p u s g a u m a n n i i A s c o s p o r e s a n d c o n d i t i o n s t h a t I n f l u e n c e t h e i r R e l e a s e . P l a n t D i s e a s e 6 8 ( 1 1 ) : 9 4 2 - 9 4 4 . 2 3 5 M o r t o n , H . L . , a n d P a t t o n , R . F . 1 9 7 0 . S w i s s n e e d l e c a s t o f D o u g l a s f i r i n t h e L a k e S t a t e s . P l a n t D i s e a s e R e p o r t e r 5 4 : 6 1 2 - 6 1 6 . M o u k h a m e d o v , R . , H u , X . , N a z a r , R . N . , a n d R o b b , J . 1 9 9 4 . U s e o f P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n — A m p l i fi e d R i b o s o m a l l n t e r g e n i c S e q u e n c e s f o r t h e D i a g n o s i s o f V e r t i c i l l i u m t n ' c o r p u s . P h y t o p a t h o l o g y 8 4 : 2 5 6 - 2 5 9 . P a r k e r , A K a n d R e i d , J . 1 9 6 9 . T h e g e n u s R h a b d o c l i n e S y d . C a n a d i a n J o u r n a l o f B o t a n y 4 7 : 1 5 3 3 - 1 5 4 5 . S a m b r o o k , J . , F r i t s c h , B F , a n d M a n i a t i s , T . 1 9 8 9 . M o l e c u l a r c l o n i n g : a l a b o r a t o r y m a n u a l 2 " d e d i t i o n . C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s , C o l d S p r i n g H a r b o r , N e w Y o r k . S i n c l a i r , W . A . , L y o n , H . H a n d J o h n s o n , W . T . 1 9 8 9 . D i s e a s e s o f T r e e s a n d S h r u b s , 2 n d e d n . C o r n e l l U n i v e r s i t y P r e s s : C o m s t o c k P u b . A s s o c i a t e s , I t h a c a , Y o r k . p : 4 0 - 4 1 . S t o n e , J . K . 1 9 8 6 . F o l i a r e n d o p h y t e s o f P s e u d o t s u g a m e n z i e s i i ( M i r b . ) F r a n c o . C y t o l o g y . a n d P h y s i o l o g y o f t h e H o s t - E n d o p h y t e R e l a t i o n s h i p . D i s s e r t a t i o n , U n i v e r s i t y o f O r e g o n , E u g e n e , O r e g o n . W h i t e , T . J . , B r u n s , T . , L e e , S . B . , a n d T a y l o r , J . 1 9 9 0 . A m p l i f i c a t i o n a n d d i r e c t s e q u e n c i n g o f f u n g a l r i b o s o s m a l R N A g e n e s f o r p h y l o g e n e t i c s . I n : P C R p r o t o c o l s : A G u i d e t o M e t h o d s a n d A p p l i c a t i o n s . M . A . I n n i s , D . H . G e l f a n d , J . J . S n i n s k y , a n d T . J . W h i t e , e d s . A c a d e m i c P r e s s , S a n D i e g o , C A . P a g e s 3 1 5 - 3 2 2 . W i n t o n , L . M . , S t o n e , J . K . , W a t r u d , L . S . , a n d H a n s e n , E . M . 2 0 0 2 . S i m u l t a n e o u s O n e - t u b e q u a n t i fi c a t i o n o f H o s t a n d P a t h o g e n D N A w i t h R e a l - T i m e P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n . P h y t o p a t h o l o g y 9 2 ( 1 ) : 1 1 2 - 1 1 6 . Z h a n g , J . & M a d d e n , T L . 1 9 9 7 . " P o w e r B L A S T : A n e w n e t w o r k B L A S T a p p l i c a t i o n f o r i n t e r a c t i v e o r a u t o m a t e d s e q u e n c e a n a l y s i s a n d a n n o t a t i o n . " G e n o m e R e s . 7 : 6 4 9 - 6 5 6 2 3 6 I I I I I 0 2 . . 3 . 1 2 3 1 . A . . . 4 T W E S I S : J ‘ \ 1 . , , - s u m p “ . / ’ ; 5 1 / 3 2 0 7 5 4 ? “ L I B R A R Y M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y P L A C E I N R E T U R N B o x t o r e m o v e t h i s c h e c k o u t f r o m y o u r r e c o r d . T o A V O I D F I N E S r e t u r n o n o r b e f o r e d a t e d u e . M A Y B E R E C A L L E D w i t h e a r l i e r d u e d a t e i f r e q u e s t e d . D A T E D U E D A T E D U E D A T E D U E e g g 1 3 0 9 2 9 0 5 6 / 0 1 c J C I R C J D a t e O u o . p 6 5 . p . 1 5 C H A P T E R 5 D e s i g n a n d T e s t i n g o f M o l e c u l a r P r o b e s f o r D e t e c t i o n a n d I d e n t i fi c a t i o n o f N e e d l e C a s t s o f S p r u c e a n d F i r , a n d B l i g h t s o f J u n i p e r A B S T R A C T S p r u c e , fi r a n d j u n i p e r a r e c o m m o n l y u s e d c o n i f e r s i n l a r g e - s c a l e l a n d s c a p e p l a n t i n g s . S p r u c e a n d fi r e s p e c i a l l y B a l s a m a n d F r a s e r fi r a r e a l s o g r o w n a n d s o l d a s C h r i s t m a s t r e e s . I n c r e a s e d p r o d u c t i o n a n d d i s t r i b u t i o n o f n u r s e r y s e e d l i n g s a n d s t o c k s l e a d t o a n i n c r e a s e i n s p r e a d a n d e p i d e m i c s o f s o m e f u n g a l d i s e a s e s o f t h e s e c o n i f e r t r e e s . H e r e , w e s e q u e n c e d i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r r e g i o n s o f r i b o s o m a l D N A a n d d e v e l o p e d s p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r s f o r P C R a s s a y s f o r d e t e c t i o n , i d e n t i fi c a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f R h i z o s p h a e r a n e e d l e c a s t o f s p r u c e a n d fi r , a n d K a b a t i n a a n d P h o m o p s i s t i p b l i g h t o f j u n i p e r s . P r i m e r p a i r s R K A 1 - R K A 4 f o r R . k a l k h o f fi i , R P I N 1 - R P I N 4 f o r R . p i n i , K J 1 - K J 4 f o r K . j u n i p e n ' a n d P J 1 - P J 4 f o r P . j u n i p e r o v o r a c o n s i s t e n t l y a m p l i fi e d s p e c i e s - s p e c i fi c f r a g m e n t s f r o m t h e i r r e s p e c t i v e t a r g e t f u n g i i n p l a n t D N A e x t r a c t s . P r i m e r p a i r R K A 1 - R K A d e t e c t e d R . k a l k h o f fi i i n f e c t i o n s i n d i r e c t P C R o f n e e d l e s w i t h s y m p t o m s o f d i s e a s e b e f o r e d i a g n o s t i c f r u i t i n g b o d i e s w e r e f o r m e d . H o w e v e r , t h e p a i r w a s m o r e s e n s i t i v e a n d e v e n d e t e c t e d l a t e n t , 2 3 7 s y m p t o m l e s s i n f e c t i o n s i n n e s t e d p r i m e r a m p l i fi c a t i o n s o f D N A f r o m n e w l y e m e r g e d n e e d l e s . P r i m e r p a i r R P I N 1 - R P I N 4 d e t e c t e d R . p i n i i n d i r e c t a n d n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s o f n e e d l e s w i t h i n i t i a l s y m p t o m s o r f r u i t i n g b o d i e s o f t h e p a t h o g e n . T h e p r i m e r p a i r K J 1 - K J 4 s p e c i fi c a l l y a m p l i fi e d K . j u n i p e n ' D N A f r o m j u n i p e r b r a n c h e s w i t h f r u i t i n g b o d i e s , a n d f o l i a g e w i t h s y m p t o m s i n d i r e c t P C R a m p l i fi c a t i o n s . A m p l i fi c a t i o n s f r o m s y m p t o m l e s s n e e d l e s w e r e h i g h l y s e n s i t i v e a n d s p e c i fi c i n n e s t e d P C R a s t h e s e n s i t i v i t y o f d e t e c t i o n i m p r o v e d t r e m e n d o u s l y . L i k e w i s e , t h e p r i m e r p a i r P J 1 - P J 4 w e r e h i g h l y s e n s i t i v e f o r d e t e c t i n g P . j u n i p e r o v o r a i n i n f e c t e d y o u n g j u n i p e r f o l i a g e , i n b o t h d i r e c t a n d n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s . T h e p a i r d e t e c t e d p i c o g r a m s o f t a r g e t i n m i x t u r e o f f u n g u s a n d p l a n t D N A f r o m g r e e n j u n i p e r t i s s u e s . S p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r s f o r K . j u n i p e n ' a n d P . j u n i p e n ' c o u l d b e u s e d t o d i f f e r e n t i a t e t h e s e t w o m o s t c o m m o n l y m i s i d e n t i fi e d p a t h o g e n s . I n d o t - b l o t a s s a y s , t h e p r i m e r p a i r R K A 1 - R K A 4 a n d K J - 1 K J - 4 d i f f e r e n t i a t e d R . k a l k h o f fi i a n d K . j u n i p e n ' r e s p e c t i v e l y f r o m t h e i r m o s t c l o s e l y r e l a t e d s p e c i e s f u n g i a t s p e c i e s - s p e c i fi c h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s . D i g e s t o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y e a c h s p e c i e s - s p e c i fi c p r o b e s w i t h r e s t r i c t i o n e n d o n u c e l a s e s t h a t h a d s p e c i f i c c u t t i n g s i t e i n t h e I T S r e g i o n o f e a c h f u n g u s c o n fi r m e d t h a t a m p l i c o n s w e r e f r o m i n t e n d e d t a r g e t s e q u e n c e s . 2 3 8 I N T R O D U C T I O N S p r u c e , F i r a n d j u n i p e r a r e c o n i f e r t r e e s t h a t a r e g e n e r a l l y u s e d e x t e n s i v e l y i n l a r g e - s c a l e l a n d s c a p e p l a n t i n g s . W h i l e t h e f i r s t t w o p r o v i d e a t t r a c t i v e d e p e n d a b l e e v e r g r e e n s i n p a r k s , g o l f c o u r s e s , h i g h w a y s a n d p u b l i c b u i l d i n g s , t h e r e i s n o l i m i t t o t h e u s e o f t h e t h i r d s i n c e i t m a k e s e x c e l l e n t s c r e e n , h e d g e s , w i n d b r e a k s , g r o u n d c o v e r s , f o u n d a t i o n p l a n t s , r o c k g a r d e n p l a n t s , g r o u p i n g s a n d s p e c i m e n s ( D i r r , 1 9 9 8 ) . S p r u c e a n d F i r e s p e c i a l l y B a l s a m a n d F r a s e r fi r a r e a l s o e c o n o m i c a l l y i m p o r t a n t b e c a u s e t h e y a r e g r o w n a n d s o l d a s C h r i s t m a s t r e e s ( A l b e r s e t a l . 1 9 9 6 ; D i r r , 1 9 9 8 ) . T h e y h a v e b e c o m e p o p u l a r C h r i s t m a s t r e e s a n d d e m a n d f o r t h e m h a s i n c r e a s e d n o t i c e a b l y i n t h e l a s t d e c a d e s . A s a r e s u l t o f i n c r e a s e d p r o d u c t i o n a n d d i s t r i b u t i o n o f n u r s e r y s e e d l i n g s a n d s t o c k s , t h e r e h a s b e e n i n c r e a s e i n s p r e a d a n d e p i d e m i c s o f s o m e f u n g a l d i s e a s e s o f t h e s e c o n i f e r t r e e s . R h i z o s p h a e r a k a l k h o f fl i B u b a k a n d R . p i n i ( D d a ) M a u b l . c a u s e n e e d l e c a s t d i s e a s e s o n s p r u c e a n d f i r , r e s p e c t i v e l y w h i l e P h o m o p s i s j u n i p e r o v o r a H a h n & K a b a t i n a j u n i p e n ' S c h n e i d e r a n d A r k a n d c a u s e s i g n i fi c a n t t i p b l i g h t d i s e a s e s o n j u n i p e r . A l t h o u g h fi v e s p e c i e s o f R h i z o s p h a e r a i n f e c t n e e d l e s o f v a r i o u s c o n i f e r s , o n l y R h i z o s p h a e r a k a l k h o f fi c a u s e s s i g n i fi c a n t e c o n o m i c l o s e s a s t h e c o m m o n n e e d l e b l i g h t o n s p e c i e s o f s p r u c e ( P i c e a s p p . ) . I t i s c o m m o n l y f o u n d i n e a s t e r n N o r t h A m e r i c a a n d i s w i d e s p r e a d i n t h e W e s t a t m o d e r a t e l e v e l s ( F u n k , 1 9 8 5 ; S i n c l a i r e t a l . 1 9 8 7 ; H a w k s w o r t h a n d S t a l e y , 1 9 7 8 ) . T h e f u n g u s i s e s p e c i a l l y s e r i o u s o n b l u e s p r u c e ( P i c e a p u n g e n s E n g e l m ) i n t r e e n u r s e r i e s a n d C h r i s t m a s 2 3 9 t r e e p l a n t a t i o n s . S e r i o u s d a m a g e s h a v e b e e n r e p o r t e d i n b l u e s p r u c e C h r i s t m a s t r e e p l a n t a t i o n s i n W i s c o n s i n , M i n n e s o t a , M i c h i g a n , I n d i a n a a n d P e n n s y l v a n i a ( N i c h o l s e t a l . 1 9 7 4 ; S k i l l i n g a n d W a d d e l l , 1 9 7 5 ; M e r r i l l a n d K i s t l e r , 1 9 7 8 ) . T h e p a t h o g e n h a s a l s o b e e n f o u n d i n o r n a m e n t a l n u r s e r i e s a n d o r n a m e n t a l l a n d s c a p e p l a n t i n g s o f b l u e s p r u c e ( M e r r i l l a n d K i s t l e r , 1 9 7 8 ; S i n c l a i r e t a l . 1 9 8 7 ; J u z w i k , 1 9 9 3 ) . R . k a l k h o f fi i i s a l s o o n e o f t h e m o s t c o m m o n f u n g i f o u n d i n f r e e z e - i n j u r e d n e e d l e s o f r e d s p r u c e ( P i c e a r u b e n s S a r g . ) a n d r e s u l t s i n p r e m a t u r e n e e d l e s h e d d i n g i n N o r h e a s t e r n N o r t h A m e r i c a ( M a n t e r a n d L i v i n g s t o n , 1 9 9 6 ) . R . k a l k h o f fi i i n f e c t s n e w l y g r o w n fi r s t y e a r n e e d l e s i n l a t e s p r i n g o r e a r l y s u m m e r . I n f e c t e d n e e d l e s n o r m a l l y d e v e l o p s y m p t o m s a n d a r e c a s t e a r l y i n t h e i r s e c o n d g r o w i n g s e a s o n . H o w e v e r , i n P e n n s y l v a n i a m o s t i n f e c t e d n e e d l e s o f b l u e s p r u c e d e v e l o p s y m p t o m s a n d l o s e n e e d l e s i n l a t e s u m m e r a n d f a l l o f t h e fi r s t g r o w i n g s e a s o n ( N i c h o l s e t a l . 1 9 7 4 ; M e r r i l l a n d K i s t l e r , 1 9 7 8 ; S i n c l a i r e t a l . 1 9 8 7 ) . S i m i l a r l y , a c l o s e l y r e l a t e d f u n g u s , R . p i n i , t h o u g h c o n s i d e r e d a w e a k p a t h o g e n , h a s b e e n o b s e r v e d c a u s i n g s i g n i fi c a n t d a m a g e o n B a l s a m fi r a n d F r a s e r fi r i n C h r i s t m a s t r e e p l a n t a t i o n s i n t h e L a k e S t a t e s , N o r t h e a s t e r n S t a t e s a n d C a n a d a i n r e c e n t y e a r s ( A l b e r s e t a l . 1 9 9 6 ) . A l t h o u g h n o i n s t a n c e o f s e r i o u s d a m a g e h a s b e e n r e p o r t e d , t h e f u n g u s i s f o u n d i n E u r o p e , a n d A s i a , a s w e l l ( D i a m a n d i s a n d M i n t e r , 1 9 8 0 ) . T h e f u n g u s c a n i n f e c t a n y a g e f o l i a g e e v e n t u a l l y c a u s i n g n e e d l e b r o w n i n g a n d c a s t i n g . B o t h R . k a l k h o f fi i a n d R . p i n i g r o w l i k e t h e b l a c k y e a s t H o r m o n e m a i n c u l t u r e ( K u m i a n d L a n g , 1 9 7 9 ; J u z w i k , 1 9 9 3 a n d F u n k , 1 9 8 5 ) . I n a d d i t i o n , t h e y o c c u r o n s p e c i e s o f A b i e s , P i n u s a n d P s e u d o t s u g a a s w e l l ( D i a m a n d i s a n d M i n t e r , 1 9 8 0 ; F u n k , 2 4 0 1 9 8 5 ) . T h e b l i g h t s c a u s e d b y P h o m o p s i s a n d K a b a t i n a a r e c o m m o n o n s p e c i e s o f J u n i p e m s ( T h u j a e A r b o r v i t a ) i n w i n d b r e a k a n d o r n a m e n t a l p l a n t i n g s . T h e y b o t h r e s u l t i n f o l i a r b l i g h t i n g a n d t i p d i e b a c k . D a m a g e t o y o u n g n u r s e r y s t o c k t r a n s p l a n t s a n d c e r t a i n j u n i p e r v a r i e t i e s a n d s p e c i e s c a n b e e x t e n s i v e . B o t h p a t h o g e n s c a u s e s i m i l a r s y m p t o m s t h a t a r e d i f fi c u l t t o d i f f e r e n t i a t e b u t t h e i r d e v e l o p m e n t a n d c o n t r o l d i f f e r ( S i n c l a i r e t a l . 1 9 8 7 ; T i s s e r a t , 1 9 9 7 ) . P h o m o p s i s b l i g h t c a u s e d b y P h o m o p s i s j u n i p e r o v o r a i s o f t e n a s e r i o u s d i s e a s e p r o b l e m i n j u n i p e r a n d o t h e r s p e c i e s w i t h i n t h e f a m i l y C u p r e s s a c e a e . I t i s e s p e c i a l l y d e v a s t a t i n g i n n u r s e r y s e e d l i n g b e d s a n d i s a s e r i o u s t h r e a t t o n u r s e r y p r o d u c t i o n o f j u n i p e r s e e d s i n t h e G r e a t P l a i n s . T h e d i s e a s e i s e s p e c i a l l y d a m a g i n g i n e a s t e r n r e d c e d a r ( J u n i p e r u s v i r g i n i a n a L . ) a n d R o c k y M o u n t a i n j u n i p e r ( J . s c o p u l o m m S a r g . ) ( O t t a e t a l . 1 9 8 0 ; P e t e r s o n , 1 9 8 4 ; S i n c l a i r e t a l . 1 9 8 9 ; T i s s e r a t , 1 9 9 7 ) . T h e p a t h o g e n P . j u n i p e r o v o r a o c c u r s t h r o u g h o u t t h e e a s t e r n h a l f o f t h e U n i t e d S t a t e s a n d C a n a d a , i n t h e P a c i f i c N o r t h w e s t a n d a l s o i n E u r o p e ( S i n c l a i r e t a l . 1 9 8 9 ) . I t i s a l s o w i d e l y d i s t r i b u t e d t h r o u g h o u t t h e M i d w e s t , N e w E n g l a n d , a n d m u c h o f t h e S o u t h ( O t t o e t a l . 1 9 8 0 ) . P . j u n i p e r o v o r a c a u s e s s h o o t b l i g h t , t w i g c a n k e r s , d i e b a c k a n d fi n a l l y d e a t h o f s e e d l i n g s . T h e f u n g u s i n f e c t s o n l y s u c c u l e n t y o u n g f o l i a g e a t a n y t i m e f r o m m i d A p r i l t h r o u g h S e p t e m b e r d u r i n g t h e g r o w t h s e a s o n . T h e s y m p t o m s m a y a p p e a r a s e a r l y a s i n 3 - 5 d a y s . T h e i n v a s i o n o f y o u n g s t e m t i s s u e r e s u l t s i n b l i g h t s y m p t o m s c h a r a c t e r i z e d b y g i r d l i n g a n d d e a t h o f b r a n c h e s ( P e t e r s o n , 1 9 7 3 ; O t t o e t a l . 2 4 1 1 9 8 0 ; S i n c l a i r e t a l . 1 9 8 9 ; T i s s e r a t , 1 9 9 7 ) . T h e r e i s a c o n s i d e r a b l e v a r i a t i o n i n r e s i s t a n c e t o P . j u n i p e r o v o r a i n f e c t i o n a m o n g s p e c i e s a n d e v e n v a r i e t i e s a n d c u l t i v a r s o f t h e s a m e s p e c i e s b u t n o n e i s i m m u n e t o t h e p a t h o g e n ( S i n c l a i r e t a l . 1 9 8 7 ; T i s s e r a t , 1 9 9 7 ) K a b a t i n a b l i g h t c a u s e d b y K a b a t i n a j u n i p e n ' h a s l o n g b e e n a p r o b l e m i n n u r s e r i e s , w h e r e i t e s p e c i a l l y d a m a g e s y o u n g p l a n t s i n s e e d l i n g a n d t r a n s p l a n t b e d s . I t i s a l s o c o m m o n o n e s t a b l i s h e d p l a n t i n g s a s w e l l a s o n w i l d C u p r e s s a c e a e ( P e r r y a n d P e t e r s o n , 1 9 8 2 ; O s t r o f s k y a n d P e t e r s o n , 1 9 7 7 ) . K a b a t i n a j u n i p e n ' a n d i t s c l o s e r e l a t i v e K . t h u j a e i n f e c t m a n y o f t h e s a m e a r b o r v i t a e , c y p r e s s a n d j u n i p e r h o s t s a t t a c k e d b y P . j u n i p e r o v o r a . A l t h o u g h fi r s t f o u n d o n J u n i p e r u s v i r g i n i a n a , K . j u n i p e n ' i n f e c t s a l l m a j o r j u n i p e r s p e c i e s i n c l u d i n g J u n i p e r u s c h i n e n s i s , J . c o m m u n i s , J . s a b i n a e , J . s q u a m a t a e , J . s c o p u l o r u m a n d J . h o n ’ z a n t a l i s ( P e r r y a n d P e t e r s o n , 1 9 8 2 ; H s i a n g e t a l . 2 0 0 0 ) . T h e f u n g u s i s w i d e l y p r e s e n t i n N o r t h A m e r i c a a n d E u r o p e ( G i b s o n a n d S u t t o n , 1 9 7 6 ; P e r r y a n d P e t e r s o n , 1 9 8 2 ; F u n k , 1 9 8 5 ; S i n c l a i r e t a l . 1 9 8 7 ) . H o w e v e r , t h e r e i s l i t t l e i n f o r m a t i o n o n t h e d i s t r i b u t i o n o f t h e f u n g u s i n t h e G r e a t P l a i n s o r i n o t h e r p a r t s o f t h e U n i t e d S t a t e s . I t h a s b e e n f r e q u e n t l y r e p o r t e d f r o m N e b r a s k a , I n d i a n a , W i s c o n s i n , N e w J e r s e y a n d N e w H a m p s h i r e ( P e r r y a n d P e t e r s o n , 1 9 8 2 ) . S y m p t o m s o f K . j u n i p e n ' a r e d i f f i c u l t t o d i s t i n g u i s h f r o m s y m p t o m s o f t h o s e o f P . j u n i p e r o v o r a e x c e p t t h a t s y m p t o m s o f K a b a t i n a t i p b l i g h t a p p e a r w e l l b e f o r e t h o s e o f P h o m o p s i s t i p b l i g h t ( T i s s e r a t , 1 9 9 7 ; H s i a n g e t a l . 2 0 0 0 ) . T h e f r u i t b o d i e s ( a c e r v u l i ) o f K . j u n i p e n ' a r e s i m i l a r i n a p p e a r a n c e t o t h e p y c n i d i a o f P . 2 4 2 j u n i p e r o v o r a a t l o w m a g n i fi c a t i o n s ( S i n c l a i r e t a l . 1 9 8 7 ) . K . j u n i p e n ' i s a w o u n d p a t h o g e n o n j u n i p e r s c a u s i n g e x t e n s i v e d i e b a c k o f n e w g r o w t h b y g i r d l i n g t h e y o u n g s t e m t i s s u e ( O s t r o f s k y a n d P e t e r s o n , 1 9 7 7 ; P e r r y a n d P e t e r s o n , 1 9 8 2 ) . T h e f u n g u s i n f e c t s n e w g r o w t h i n a u t u m n b u t v i s i b l e s y m p t o m s d o n o t a p p e a r u n t i l M a r c h o r A p r i l o f t h e f o l l o w i n g s p r i n g ( T i s s e r a t , 1 9 9 7 ) . C o n t r a r y t o K . t h u j a e , K . j u n i p e n ' d o e s n o t f o r m f r u i t i n g b o d i e s o r a e r i a l m y c e l i u m a n d r e s e m b l e s t h e c o s m o p o l i t a n A u r e o b a i s d i u m p u l l u l a n s ( d e B a r y ) A r n a u d i n c u l t u r e . T h e s e t w o f u n g i a r e i n d i s t i n g u i s h a b l e o n n a t u r a l s u b s t r a t e s ( G i b s o n a n d S u t t o n , 1 9 7 6 ; F u n k , 1 9 8 5 ; S i n c l a i r e t a l . 1 9 8 7 ) . E a r l y d e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f R . k a l k h o f fi i , P . j u n i p e r o v o r a a n d K . j u n i p e n ‘ a r e e s s e n t i a l i n p r o d u c t i o n o f d i s e a s e f r e e s p r u c e a n d j u n i p e r n u r s e r y s t o c k a n d s e e d l i n g s . C u r r e n t l y t h e p a t h o g e n s a r e d e t e c t e d a n d i d e n t i f i e d b y c l a s s i c a l i s o l a t i o n t e c h n i q u e s a n d s y m p t o m s . A n e x p e r i e n c e d p e r s o n c a n i s o l a t e a n d i d e n t i f y R . k a l k h o f fi a n d K . j u n i p e n ' o n g r o w t h m e d i a . H o w e v e r , i n c u l t u r e t h e y p r o d u c e a H o r r n o n e m a s t a t e t h a t c l o s e l y r e s e m b l e s c o l o n i e s o f t h e e n d o p h y t i c f u n g i H o n n o n e m a d e m a t i o i d e s a n d A u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n s . F u r t h e r m o r e , a l l t h r e e p a t h o g e n s c a n r e m a i n l a t e n t f o r 3 m o n t h s t o 9 m o n t h s b e f o r e s y m p t o m s a p p e a r . T h e r e h a s n o t b e e n a n y a t t e m p t t o d e t e c t t h e s e f u n g i b y m o d e r n m o l e c u l a r t e c h n i q u e s , a l t h o u g h , H s i a n g e t a l . ( 2 0 0 0 ) u s e d R a n d o m l y A m p l i fi e d P o l y m o r p h i c D N A ( R A P D ) m a r k e r s t o a n a l y z e g e n e t i c d i v e r s i t y o f K . j u n i p e n ' i n O n t a r i o , C a n a d a . 2 4 3 I n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r s ( I T S ) o f r i b o s o m a l D N A a r e k n o w n t o v a r y a m o n g s p e c i e s w i t h i n a g e n u s i n t e r m s o f t h e i r s e q u e n c e a n d t h e s p a c e r s o c c u r i n h i g h - c o p y n u m b e r s ( L e e a n d T a y l o r , 1 9 9 2 ; L e e e t a l . 1 9 9 3 ; W h i t e e t a l . 1 9 9 0 ; B r u n s a n d G a r d e s , 1 9 9 3 ) . T h e I T S s e q u e n c e s c a n b e e x p l o i t e d t o s e l e c t o l i g o n u c l e o t i d e s e q u e n c e s o f p o t e n t i a l v a l u e a s s p e c i e s - s p e c i fi c p r o b e s . T h e p r o b e s c a n b e u s e d i n m a n y m o l e c u l a r m e t h o d s s u c h a s p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( P C R ) a n d d o t - b l o t a s s a y s . P C R i s h i g h l y s e n s i t i v e a n d r e p r o d u c i b l e , a n d c o u l d b e u s e d f o r t h e d e t e c t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n o f a n y m i c r o o r g a n i s m s . S u c h a t e c h n i q u e e m p l o y i n g p r o b e s d e s i g n e d f r o m t h e I T S r e g i o n h a s b e e n u s e d t o d e t e c t a n d i d e n t i f y m a n y p a t h o g e n i c f u n g i , i n c l u d i n g P h y t o p h t h o r a i n f e s t a n s ( T r o u t e t a l . 1 9 9 7 ) , P . c a p s i c i ( R i s t a i n o e t a l . 1 9 9 8 ) , P . f r a g a n ' a ( B o n a n t s e t a l . 1 9 9 7 ; C o o k e a n d D u n c a n , 1 9 9 7 ) , P y t h i u m u l t i m u m ( L e v e s q u e e t a l . 1 9 9 4 ; K a g e y a m a , 1 9 9 7 ) , V e r t i c i l l i u m a / b o a t r u m a n d V . d a h l i a ( R o b b e t a l . 1 9 9 4 ; N a z a r e t a l . 1 9 9 1 ; H u e t a l . 1 9 9 3 ) , F u s a n ‘ u m a v e n a c e u m ( S c h i l l i n g e t a l . 1 9 9 6 ) , S p o n g o s p o r a s u b t t e r r a n e a ( B u l m a n a n d M a r s h a l l , 1 9 9 8 ) , R h i z o c t o n i a o r y z a e ( M a z z o l a e t a l . 1 9 9 6 ) , S t a g o n o s p o r a n o d o r u m , S e p t o r i a t r i t i c i ( B e c k a n d L i g o n , 1 9 9 5 ) a n d E u t y p a l a t a ( L e c o m t e e t a l . 2 0 0 0 ) d i r e c t l y f r o m i n f e c t e d p l a n t p a r t s w i t h o r w i t h o u t s y m p t o m s . H o w e v e r , t h e t e c h n i q u e h a s b e e n u t i l i z e d f o r d e t e c t i o n o f v e r y f e w f u n g i f r o m c o n i f e r t i s s u e s a s t h e s e c o n t a i n P C R i n h i b i t o r y c o m p o u n d s . H a m e l i n e t a l . ( 1 9 9 6 ) d e s i g n e d s p e c i e s - s p e c i fi c p r o b e s f r o m I T S r e g i o n s f o r s p e c i fi c a m p l i fi c a t i o n o f t h e f u n g i C y l i n d r o c l a d i u m fl o r i d a n u m a n d C . d e s t r u c t a n s . T h e p r o b e s d e t e c t e d b o t h f u n g i i n i n f e c t e d r o o t s o f s p r u c e a n d p i n e . H a m e l i n e t a l . ( 2 0 0 0 ) s u c c e s s f u l l y d e t e c t e d G r e m m e n i e l l a a b i e t i n a i n i n f e c t e d 2 4 4 a s y m p t o m a t i c p i n e n e e d l e s w i t h s p e c i e s - s p e c i f i c p r o b e s . D o t - b l o t a s s a y s u s i n g o l o g o n u c l e o t i d e p r o b e s c a n a l s o b e e m p l o y e d t o d e t e c t a n d d i f f e r e n t i a t e t h e p a t h o g e n i c f u n g i s i n c e h i g h l y r e p e t i t i v e I T S r e g i o n s a r e i d e a l t a r g e t s f o r t h i s p u r p o s e . D N A e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m a n d i n f e c t e d p l a n t m a t e r i a l c a n b e d i r e c t l y u s e d i n d o t - b l o t a s s a y s . H o w e v e r , c o u p l i n g o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s w i t h d o t - b l o t a s s a y s o f P C R p r o d u c t s a m p l i f i e d b y u n i v e r s a l p r i m e r s ( l T S l F a n d I T S 4 ) w a s f o u n d t o b e f a s t a n d e f fi c i e n t w a y o f s u r v e y i n g p l a n t s a m p l e s f o r f u n g a l i n f e c t i o n ( H i g u c h i e t a l . 1 9 8 8 ; L i e t a l 1 9 8 8 ) . J o h a n s o n a n d J e g e r ( 1 9 9 3 ) d e s i g n e d s p e c i e s - s p e c i f i c o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s f r o m t h e I T S r e g i o n o f M y c o s p h a e r e l l a fi j i e n s i s a n d M . m u s i c o l a . T h e p r o b e s h y b r i d i z e d o n l y t o t h e i r r e s p e c t i v e D N A f r o m b o t h m y c e l i u m a n d i n f e c t e d b a n a n a t i s s u e s . I n t h i s s t u d y , w e s e q u e n c e d t h e i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r r e g i o n s o f f u n g i i n f e c t i n g s p r u c e a n d j u n i p e r , a n d d e s i g n e d a n d t e s t e d o l i g o n u c l e o t i d e p r i m e r s f o r s p e c i e s - s p e c i fi c d e t e c t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f R . k a l k h o f fi i , P . j u n i p e r o v o r a a n d K . j u n i p e n ' i n P C R a m p l i f i c a t i o n . I n a d d i t i o n , w e i n v e s t i g a t e d t h e p o s s i b i l i t y o f u s i n g t h e s e p r i m e r s a s p r o b e s i n d o t - b l o t a s s a y s . 2 4 5 M A T E R I A L S A N D M E T H O D S I s o l a t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n o f f u n g a l s t r a i n s T h e f u n g a l i s o l a t e s u s e d i n t h i s s t u d y a r e l i s t e d i n T a b l e 5 . 1 . T h e K . j u n i p e n ' i s o l a t e w a s s e n t b y C h a r l e s H o d g e s f r o m N o r t h C a r o l i n a S t a t e U n i v e r s i t y . A n e m i c k S c h o u l e s o f M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y p r o v i d e d t h e P . j u n i p e r o v o r a i s o l a t e u s e d i n t h i s s t u d y . J i m W a l l a f r o m N o r t h D a k o t a S t a t e U n i v e r s i t y p r o v i d e d h a s s e n t t w o i s o l a t e s o f L i r u l a m a c r o s p o r a a n d t h e R . p i n i i s o l a t e w a s s e n t b y M i k e A l b e r s o f U S D A F o r e s t S e r v i c e , N o r t h C e n t r a l F o r e s t E x p e r i m e n t S t a t i o n i n M i n n e s o t a . O t h e r s p e c i e s w e r e o b t a i n e d f r o m A T C C o r f r o m c u l t u r e o r i s o l a t e d f r o m b l i g h t e d b r a n c h e s c a r r y i n g f r u i t i n g b o d i e s , a s f o l l o w . A f t e r I n f e c t e d b r a n c h e s w i t h f r u i t i n g b o d i e s w e r e i n c u b a t e d i n a m o i s t c h a m b e r f o r a d a y , f r u i t i n g b o d i e s w i t h s o m e p l a n t t i s s u e ( A c e r v u l i ) w e r e e x c i s e d f r o m t h e b r a n c h e s a n d p l a t e d o n m a l t e x t r a c t a g a r ( D i f c o L a b o r a t o r i e s , D e t r o i t , M i c h i g a n ) s u p p l e m e n t e d w i t h S t r e p t o m y c i n s u l p h a t e ( 2 0 0 p p m / L ) t o p r e v e n t b a c t e r i a l g r o w t h . E m e r g i n g c o l o n i e s w e r e s u b c u l t u r e d . A l l t h e i s o l a t e s w e r e g r o w n a n d m a i n t a i n e d o n m a l t e x t r a c t a g a r F o r D N A e x t r a c t i o n s , s t e r i l e c e l l u l o s e m e m b r a n e s c u t t o fi t p e t r i d i s h e s w e r e p l a c e d o n t h e m e d i u m a n d m y c e l i a w e r e s p r e a d o v e r t h e p l a t e s t o a t t a i n g r o w t h o f s u f fi c i e n t m a s s o f a c t i v e g r o w t h . T h e s o u r c e s o f n e e d l e s a m p l e s u s e d i n t h i s s t u d y a r e l i s t e d i n T a b l e 5 . 1 . a s w e l l . B l u e s p r u c e , B l a c k s p r u c e a n d E n g e l m a n s s p r u c e s a m p l e s i n f e c t e d w i t h R . k a l k h o m i o r u n i n f e c t e d w e r e c o l l e c t e d d u r i n g o u r v i s i t t o n u r s e r i e s o r s e n t 2 4 6 T a b l e 5 . 1 . F u n g a l i s o l a t e s a n d p l a n t s a m p l e s u s e d i n t h i s s t u d y . F u n g a l s g i e s 9 9 3 1 ; m S o u r c e L e n q t h G e n B a j n k ( I T S ) # A u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n s A P P i n u s s y l v e s t r i s M i c h i g a n ( M I ) 5 1 1 A F 0 1 3 2 2 9 C y c l a n e u s m a n i v e u s C N P . s y l v e s t n ' s C B S : 4 9 5 . 7 3 4 7 5 A F 0 1 3 2 2 3 D o t h i s t r o m a p i n i D P P i n u s n i g r a M I 4 5 8 A F 0 1 3 2 2 7 H o r m o n e m a d e m a t i o i d e s H D P . s y l v e s t r i s M I 5 1 5 A F 0 1 3 2 2 7 D e l p h i n e l l a s t r o b i l i g e r a D S P i c e a s p . C B S 1 3 5 . 7 1 K a b a t i n a j u n i p e r i K J J u n i p e r u s v i r g i n i a n a N . C a r o l i n a ( N C ) 5 1 5 A F 2 6 0 2 2 4 K a b a t i n a t h u j a e K T - 1 T h u j a e o c c i d e n t a / i s C B S 2 3 8 . 6 6 5 1 7 A F 0 1 3 2 2 6 K a b a t i n a t h u j a e K T - 2 T . o c c i d e n t a l i s C B S 4 6 2 . 6 6 5 1 7 A F 4 6 2 4 3 7 K a b a t i n a j u n i p e r i K J - M I J u n i p e r u s c h i n e n s i s M I 5 1 6 A Y 1 8 3 3 6 7 P h a e o c r y p t o p u s g a u m a n n i i P G P . m e n z i e s i i M I 5 1 3 A F 0 1 3 2 2 5 P h o m o p s i s j u n i p e r o v o r a P J J u n i p e r u s s p . D S M 5 1 3 4 5 0 6 A F 4 6 2 4 3 6 L i r u l a m a c r o s p o r a L M - C A S T P i c e a p u n g e n s N . D a k o t a ( N D ) 4 4 1 A F 4 6 2 4 4 1 L i r u l a m a c r o s p o r a L M - W A L H P i c e a g l a u c a N D 4 4 4 A F 4 6 2 4 4 0 L o p h o d e r m i u m j u n i p e r i n u m L J J u n i p e r u s s p . M l L o p h o d e r m i u m p i n a s t n ' L P P . s y l v e s t r i s A T C C 2 8 3 4 7 A F 0 1 3 2 2 4 P e s t a l o t i o p s i s s p p . P E S T J . c h i n e n s i s M l R h a b d o c l i n e p a r k e n ‘ R P - A T C C P . m e n z i e s i i A T T C 2 0 1 6 6 0 4 5 1 A F 2 6 0 8 1 3 R h i z o s p h a e r a k a l k h o f fi i 1 R K A - 1 P . p u n g e n s M I 5 1 4 A F 0 1 3 2 3 2 R h i z o s p h a e r a k a l k h o f fi i 2 R K A - Z P i c e a m a r i a n a M I 5 1 6 A F 0 1 3 2 3 1 R h i z o s p h a e r a k a l k h o f fi i 3 R K A - 3 P . p u n g e n s M I R h i z o s p h a e r a k a l k h o f fi i 4 R K A - A T C C P . p u n g e n s A T C C 2 6 6 0 5 5 1 3 A Y 1 8 3 3 6 6 R h i z o s p h a e r a p i n i R P l N - 1 A b i e s f r a s e r i M I 5 1 7 A F 0 1 3 2 3 0 R h i z o s p h a e r a p i n i R P I N - A T C C A b i e s a l b a A T C C 4 6 3 8 7 5 1 6 A Y 1 8 3 3 6 5 R h i z o s p h a e r a k o b a y a s h i i R K O B P i n u s p u m i l a A T C C 4 6 3 8 9 5 0 4 A F 4 6 2 4 3 2 R h i z o s p h a e r a m a c r o s p o r a R M A C A . a l b a A T C C 4 6 3 8 6 5 1 6 A F 4 6 2 4 3 1 R h i z o s p h a e r a o u d e m a n s i i R A U D A . a l b a A T C C 4 6 3 9 0 5 1 4 A F 4 6 2 4 3 0 R h i z o s p h a e r a s p . R . S P P P i c e a s p . M I 5 1 6 A F 4 6 2 4 3 3 S c l e r o p h o m a p y t h i o p h i l a S P P . s y l v e s t n ' s M I 5 1 6 A F 4 6 2 4 3 8 U n i d e n t i fi e d e n d o p h y t e s J U N 1 - 6 J . c h i n e n s i s M l N e e d l e s p e c i m e n s / F u n g u s R h i z o s p h a e r a k a l k h o f fi i B L U E S — D P . p u n g e n s M l S y m p t o m l e s s f o l i a g e B L U E S - S P . p u n g e n s U n i n f e c t e d f o l i a g e B L U E S - H P . p u n g e n s R h i z o s p h a e r a k a l k h o f fi i B L A C K S - D P i c e a m a n ' a n a M l S y m p t o m l e s s f o l i a g e B L A C K S - S P . m a r i a n a u n i n f e c t e d f o l i a g e B L A C K S - H P . m a n ' a n a R h i z o s p h a e r a k a l k h o f fl i E N G E L S - D P i c e a e n g e l m a n n i i M I R h i z o s p h a e r a p i n i B F l R M l N - D A b i e s b a l s a m a e M i n n e s o t a B F I R M l - D A . b a l s a m a e M l U n i n f e c t e d f o l i a g e B F l R M l — H A . b a l s a m a e M I R h i z o s p h a e r a p i n i F F I R M l - D A . f r a s e n ' M l U n i n f e c t e d f o l i a g e F F I R M l - H A b i e s f r a s e r i K a b a t i n a j u n i p e n ' J U N N C - D J . v i r g i n i a n a N C J U N M I 1 - D J . c h i n e n s i s M l J U N M l 2 - D J u n i p e r u s s p . O t t a w a C o , M l P h o m o p s i s j u n i p e r o v o r a J U N M l 3 - D J u n i p e r u s s p W e x f o r d C o , M l U n i n f e c t e d f o l i a g e J U N - H J u n i p e r u s s p . M l 2 4 7 b y M S U e x t e n s i o n a g e n t s t h r o u g h o u t M i c h i g a n . F o u r d i f f e r e n t s a m p l e s o f j u n i p e r f o r m d i f f e r e n t s o u r c e s w e r e u s e d i n t h i s s t u d y . D N A e x t r a c t i o n f r o m m y c e l i u m o f f u n g i F u n g a l m y c e l i a g r o w n f o r 2 w e e k s o n c e l l u l o s e m e m b r a n e - c o v e r e d p l a t e s w e r e s c r a p e d i n t o 1 5 m l t u b e s a n d l y o p h i l i z e d f o r 2 d a y s . D N A w a s e x t r a c t e d a c c o r d i n g t o t h e p r o t o c o l d e s c r i b e d b y L e e e t a l . ( 1 9 8 8 ) . L y o p h i l i z e d h y p h a e ( a p p r o x i m a t e l y 1 0 0 m g ) w e r e s u s p e n d e d i n 7 0 0 p l l y s i s b u f f e r ( 5 0 m M T r i s - H C I , 5 0 m M E D T A , 3 % S D S , p H 8 . 0 ; a m e n d e d w i t h 1 % 2 — m e r c a p t o e t h a n o l j u s t p r i o r t o e a c h u s e ) . P e s t l e s w e r e s o a k e d i n d i l u t e H C I ( 1 : 1 0 ) a n d c l e a n e d w i t h s o a p a n d w a t e r b e f o r e s t e r i l i z a t i o n . M y c e l i a w e r e c r u s h e d w i t h p e s t l e s f o r 3 - 5 m i n u t e s a n d i n c u b a t e d 1 h o u r a t 6 5 C . T h e n , 7 0 0 p l p h e n o l : c h l o r o f o r m : i s o a m y l a l c o h o l ( 2 5 : 2 4 : 1 , S i g m a A l d r i c h C o r p o r a t i o n , S t L o u i s , M O ) w a s a d d e d a n d t h e t u b e s w e r e v o r t e x e d b r i e fl y . T u b e s w e r e s p u n a t 1 2 0 0 0 r p m f o r 1 0 m i n a n d t h e a q u e o u s t o p p h a s e w a s t r a n s f e r r e d t o n e w t u b e s . T h e p h e n o l : c h l o r o f o r m : i s o a m y l a l c o h o l t r e a t m e n t a n d c e n t r i f u g a t i o n s t e p s w e r e r e p e a t e d . T h e n , 7 0 0 p l c h l o r o f o r m : i s o a m y l a l c o h o l ( 2 4 : 1 ) w a s a d d e d t o t h e s u p e r n a t a n t , w h i c h w a s v o r t e x e d t h e n s p u n a t 1 2 0 0 0 r p m f o r 5 m i n u t e s . T h e a q u e o u s p h a s e w a s c o l l e c t e d a n d 2 0 p l o f 3 M s o d i u m a c e t a t e a n d 0 . 5 v o l u m e o f i s o p r o p y l a l c o h o l w e r e a d d e d . D N A w a s p r e c i p i t a t e d b y i n v e r t i n g t h e t u b e s g e n t l y s e v e r a l t i m e s a n d c e n t r i f u g a t i o n f o r 1 0 m i n a t 1 3 0 0 0 r p m a t 4 C t o p e l l e t . T h e s u p e r n a t a n t w a s p o u r e d o f f a n d p e l l e t s w e r e r e s u s p e n d e d i n 1 0 0 p l T E b u f f e r ( 1 0 m M H C I - T r i s , p H 8 a n d 0 . 5 M E D T A , p H 8 a n d s t o r e d a t - 2 0 C . A c l e a n i n g p r o c e d u r e f o r 2 4 8 p o l y s a c c h a r i d e - c o n t a m i n a t e d D N A d e s c r i b e d b y A u s u b e l e t a l ( 2 0 0 1 ) w a s u s e d t o f u r t h e r p u r i f y D N A i f P C R a m p l i fi c a t i o n i n i t i a l l y f a i l e d . 5 M N a C l w a s a d d e d t o t h e D N A s o l u t i o n t o g i v e a fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 7 M N a C I . T h e n , 1 0 % C T A B i n 0 . 7 M N a C l w a s a l s o a d d e d t o g i v e a fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f 1 % C T A B i n t h e D N A s a m p l e b e f o r e i n c u b a t i n g a t 6 5 C f o r 1 5 m i n . T h e s o l u t i o n w a s e x t r a c t e d w i t h 1 v o l u m e o f c h l o r o f o r m ; i s o a m y l a l c o h o l ( 2 4 : 1 ) a n d a q u e o u s l a y e r w a s t r a n s f e r r e d t o a n e w t u b e f o l l o w i n g c e n t r i f u g a t i o n a t 1 2 0 0 0 r p m f o r 5 m i n . A g a i n , 1 v o l u m e o f p h e n o l : c h l o r o f o r m : i s o a m y l a l c o h o l ( 2 5 : 2 4 : 1 ) w a s a d d e d t o t h e s u p e r n a t a n t a n d c e n t r i f u g e d a t 1 2 0 0 0 r p m f o r 5 m i n u t e s . D N A w a s p r e c i p i t a t e d f r o m t h e s u p e r n a t a n t w i t h 0 . 6 v o l u m e i s o p r o p a n o l a n d c o l l e c t e d b y c e n t r i f u g i n g a t 1 2 0 0 0 r p m f o r 1 5 m i n . T h e D N A p e l l e t w a s w a s h e d w i t h 7 0 % e t h a n o l a n d c e n t r i f u g e d f o r 5 m i n . T h e s u p e r n a t a n t w e r e d r a i n e d o f f a n d t h e p e l l e t w a s r e - d i s s o l v e d i n T E b u f f e r . D N A e x t r a c t i o n f r o m n e e d l e s D N A e x t r a c t i o n s d i r e c t l y f r o m n e e d l e s w e r e d o n e a s d e s c r i b e d b y H a m e l i n e t a l . ( 1 9 9 6 , 2 0 0 0 ) w i t h s o m e m o d i fi c a t i o n s . F i v e n e e d l e s , f o l i a g e o r s t e m p i e c e s ( 1 c m i n l e n g t h ) a n d w e r e u s e d t o e x t r a c t D N A f o r P C R a n d d o t - b l o t a s s a y s . T h e n e e d l e s , f o l i a g e o r s t e m p i e c e s w e r e s o a k e d w i t h 8 0 0 p l C T A B e x t r a c t i o n b u f f e r ( 2 % c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u m ; 1 . 4 M N a C l ; 1 % p o l y e t h y l e n e g l y c o l 8 0 0 0 ; 2 0 m M E D T A ; 1 % 2 - m e r c a p t o e t h a n o l ; 1 0 0 m M T r i s - H C L , p H 9 . 5 ) a n d g r o u n d w i t h a n a c i d t r e a t e d a n d s t e r i l i z e d m o r t a r a n d p e s t l e u n t i l a s l u r r y w a s o b t a i n e d . E x t r a c t s w e r e v o r t e x e d b r i e fl y a n d i n c u b a t e d a t 6 5 C f o r a t l e a s t 1 h . 2 4 9 F o l l o w i n g t h e a d d i t i o n o f 6 0 0 p l p h e n o l : c h l o r o f o r m : i s o a m y l a l c o h o l ( 2 5 : 2 4 : 1 ) , e x t r a c t s w e r e c e n t r i f u g e d a t 1 0 0 0 0 r p m f o r 5 m i n u t e s . T h e a q u e o u s p h a s e w a s t r a n s f e r r e d t o a n e w t u b e , p r e c i p i t a t e d w i t h a n e q u a l v o l u m e o f c o l d i s o p r o p a n o l a n d c e n t r i f u g e d a t 1 0 0 0 0 r p m f o r 1 0 m i n u t e s . P e l l e t s w e r e w a s h e d w i t h c o l d 7 0 % e t h a n o l , a i r d r i e d f o r 1 2 h o u r s o r o v e r n i g h t , a n d r e s u s p e n d e d i n 3 0 p l T E b u f f e r . T h e m e t h o d o f H a m e l i n e t a l . ( 1 9 9 6 ) w a s a d a p t e d t o e x t r a c t D N A f r o m l a r g e a m o u n t s o f n e e d l e s u s i n g a h o u s e h o l d b l e n d e r . A p p r o x i m a t e l y , 1 0 g n e e d l e s i n 6 0 m l e x t r a c t i o n b u f f e r w e r e b l e n d e d a t h i g h s p e e d f o r 2 m i n . A S o r v a l l R C Z B c e n t r i f u g e w i t h 8 8 2 4 r o t o r ( S o r v a l l H e r a e u s , N e w t o w n , C T ) w a s u s e d f o r s o l v e n t p h a s e s e p a r a t i o n s a n d p e l l e t i n g . P C R a m p l i fi c a t i o n o f i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r s D N A e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m , f r u i t i n g b o d i e s a n d n e e d l e s w a s d i l u t e d 1 0 2 a n d 1 0 3 t i m e s i n d o u b l e d i s t i l l e d , fi l t e r e d , s t e r i l i z e d w a t e r a n d u s e d i n P C R a m p l i fi c a t i o n s . T h e i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r ( I T S ) r e g i o n s a n d 5 . 8 S g e n e o f t h e n u c l e a r r i b o s o m a l R N A o p e r o n ( l T S l - 5 . 8 S - I T S I I ) w e r e a m p l i fi e d w i t h t h e p r i m e r s I T S 1 F ( f u n g u s s p e c i fi c ) a n d I T S 4 ( G a r d e s a n d B r u n s , 1 9 9 3 ) . P C R r e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t i n 2 5 p l t o t a l v o l u m e c o n s i s t i n g o f 1 2 . 5 p l D N A d i l u t i o n ( t e m p l a t e ) a n d 1 2 . 5 p l P C R r e a c t i o n m i x t u r e . T h e r e a c t i o n m i x t u r e c o n t a i n e d T fl P C R b u f f e r ( 2 0 m M A m m o n i u m s u l f a t e ; 2 . 0 m M M g C l z ; 5 0 m M T r i s - H C I , p H 9 . 0 ; E p i c e n t r e T e c h n o l o g i e s , M a d i s o n , W I ) ; 0 . 2 m M e a c h o f d A T P , d ' l ' l ' P , d G T P a n d d C T P ; 0 . 5 u M e a c h o f I T S 1 F a n d I T S 4 p r i m e r s ; a n d 0 . 5 u n i t o f T a q D N A p o l y m e r a s e . T h e r e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t o n a D N A t h e r m a l c y c l e r ( M o d e l 2 5 0 9 6 0 0 , P e r k i n - E l m e r C e t u s , N o r w a l k , C T ) . T h e r e a c t i o n p r o t o c o l c o n s i s t e d o f a n i n i t i a l d e n a t u r a t i o n a t 9 5 C f o r 3 m i n u t e s f o l l o w e d b y 3 0 c y c l e s o f 9 4 C f o r 1 m i n , 5 0 C f o r 1 m i n , a n d 7 2 C f o r 1 m i n . P C R a m p l i fi c a t i o n s c o n t a i n i n g n o D N A t e m p l a t e w e r e i n c l u d e d i n e v e r y e x p e r i m e n t a s c o n t r o l s t o t e s t f o r t h e p r e s e n c e o f c o n t a m i n a t i o n o f r e a g e n t s a n d r e a c t i o n m i x t u r e s b y n o n s a m p l e D N A . T h e r e a c t i o n w a s c o m p l e t e d b y a 7 m i n e x t e n s i o n a t 7 2 C . P C R p r o d u c t s w e r e s e p a r a t e d o n 1 . 5 % a g a r o s e ( G i b c o B R L , G r a n d I s l a n d , N Y ) i n 1 % T A E b u f f e r ( 1 0 0 m M T r i s , 1 2 . 5 m M s o d i u m a c e t a t e a n d 1 m M E D T A , p H : 8 . 0 ) b y g e l e l e c t r o p h o r e s i s . A s D N A s i z e s t a n d a r d , a 1 k b o r 1 k b p l u s D N A l a d d e r ( G i b c o B R L ) w a s i n c l u d e d i n e a c h g e l . A f t e r r u n n i n g f o r a t l e a s t 1 h o u r a t 1 0 0 v o l t s , t h e g e l s w e r e s t a i n e d w i t h e t h i d i u m b r o m i d e , v i s u a l i z e d b y U V fl u o r e s c e n c e a n d p h o t o g r a p h e d u s i n g A l p h a l m a g e r ( A l p h a I n n o t e c h C o r p o r a t i o n , S a n L e a n d r o , C A ) . D i r e c t o r n e s t e d - p r i m e r P C R a m p l i fi c a t i o n s w i t h o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s P C R a m p l i fi c a t i o n s u s i n g o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s w e r e c a r r i e d o u t a s w e r e t h e I T S a m p l i fi c a t i o n s , w i t h a f e w d i f f e r e n c e s . F o r d i r e c t a m p l i fi c a t i o n s , t h e s a m e D N A d i l u t i o n s w e r e u s e d . F o r i n t e r n a l a m p l i fi c a t i o n s , I T S I F a n d I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s w e r e q u a n t i f i e d u s i n g a U V s p e c t r o p h o t o m e t e r ( B e c k m a n D u 5 3 0 , B e c k m a n C o u l t e r , L i f e S c i e n c e s , B r e a , C A ) , 1 0 n g a n d 1 n g D N A w e r e a d d e d t o e a c h 2 5 p l P C R r e a c t i o n m i x t u r e a n d a m p l i f i e d u s i n g i n t e r n a l o l i g o n u c l e o t i d e p a i r s . R e a c t i o n m i x t u r e s a n d P C R c o n d i t i o n s w e r e a s a b o v e e x c e p t t h a t 1 p M o f 2 5 1 e a c h p u r i fi e d o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e w a s u s e d , a n d a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s r a n g e d f r o m 4 8 t o 6 4 C d e p e n d i n g o n t h e p r o b e p a i r u s e d . I n i t i a l a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s f o r e a c h p a i r w e r e c a l c u l a t e d u s i n g t h e s o f t w a r e p r o g r a m O l i g o c a l c u l a t o r ( E u g e n B u e h l e r , P i t t s b u r g h , P A ) a n d p r o b e s w e r e t e s t e d u n t i l a t e m p e r a t u r e t h a t g a v e s p e c i e s - s p e c i fi c a m p l i fi c a t i o n w a s r e a c h e d . S e q u e n c i n g I T S 1 F a n d I T S 4 a m p l i f i e d P C R p r o d u c t s w e r e c l e a n e d u s i n g M i l l i p o r e U l t r a f r e e - M C 3 0 , 0 0 0 N M W L p u r i f i c a t i o n fi l t e r s ( M i l l i p o r e C o r p o r a t i o n , B e d f o r d , M A ) . A p p r o x i m a t e l y 1 0 0 p l P C R p r o d u c t s w e r e w a s h e d w i t h P C R w a t e r 4 t i m e s b y s p i n n i n g a t 4 0 0 0 r p m a t 4 C . P u r i fi e d P C R p r o d u c t s w e r e r u n o n 3 % h i g h m e l t a g a r o s e g e l s a t 1 0 0 V t o q u a n t i f y b e f o r e s u b m i s s i o n f o r s e q u e n c i n g . P C R p r o d u c t s o f I T S a n d 5 . 8 8 r R N A w e r e s e q u e n c e d m a i n l y b y u s i n g I T S 1 F a n d I T S 4 p r i m e r s i n a n A p p l i e d B i o s y s t e m s 3 7 0 A S e q u e n c e r ( A p p l i e d B i o s y s t e m s , F o s t e r C i t y , C A ) w i t h t h e T a q D y e D e o x y T e r m i n a t o r S y s t e m . S e q u e n c i n g w a s d o n e b y t h e G e n o m i c s T e c h n o l o g y S u p p o r t F a c i l i t y a t M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y . P r i m e r s I T S 5 , I T S 3 a n d I T S Z w e r e a l s o u s e d a s n e c e s s a r y ( W h i t e e t a l . 1 9 9 0 ) . S e q u e n c e a l i g n m e n t , a n a l y s i s a n d p r o b e d e s i g n I T S s e q u e n c e s w e r e e d i t e d , a l i g n e d a n d c o r r e c t e d u s i n g t h e p r o g r a m s E d i t S e q , M e g A l i g n a n d S e q M a n i n t h e D N A S T A R s o f t w a r e p a c k a g e ( D N A S T A R I n c , M a d i s o n , W I ) . E a c h s e q u e n c e w a s c o m p a r e d w i t h t h e s e q u e n c e s i n G e n B a n k ( N C B I , B e t h e s d a , M D ) u s i n g s i m i l a r i t y s e a r c h p r o g r a m B L A S T R 2 5 2 ( A l t s c h u l e t a l . 1 9 9 0 a n d 1 9 9 7 ; Z h a n g a n d M a d d e n , 1 9 9 7 ) . I n a d d i t i o n t o t h e s e q u e n c e s o f R h i z o s p h a e r a a n d K a b a t i n a t a x a , t h e s e q u e n c e s o f r e l a t e d f u n g i w e r e a l s o i n c l u d e d i n a l i g n m e n t f o r p r o b e s e l e c t i o n . O l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s o f 1 4 t o 2 4 b p l o n g w e r e d e s i g n e d f r o m s p e c i e s - s p e c i f i c s e q u e n c e s . P r i m e r S e l e c t p r o g r a m ( D N A S T A R ) w a s u s e d t o e v a l u a t e t h e p r o b e p r o p e r t i e s s u c h a s d u p l e x a n d h a i r p i n f o r m a t i o n a n d % G C c o n t e n t ( G u a n i n e a n d C y t o s i n e ) P r o b e s w e r e s y n t h e s i z e d a t M a c r o m o l e c u l a r S t r u c t u r e a n d S e q u e n c i n g F a c i l i t y ( D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y ) u s i n g a n A p p l i e d B i o s y s t e m s 3 9 4 8 O l i g o n u c l e o t i d e S y n t h e s i z e r ( A p p l i e d B i o s y s t e m s ) . L a b e l l i n g O l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s w e r e l a b e l e d w i t h g a m m a 3 2 P - A T P b y p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 5 ’ e n d s u s i n g T 4 p o l y n u c l e o t i d e k i n a s e ( N e w E n g l a n d B i o l a b s I n c , B e v e r l y , M A ) . L a b e l i n g r e a c t i o n s c o n s i s t e d o f o f 1 p l p r o b e ( 1 5 - 2 0 p M ) , 2 p l 1 0 X k i n a s e b u f f e r ( 0 . 7 M T r i s - H C I , p H 7 . 6 ; 0 . 1 M M g C l z - 6 H Z O ; 5 0 m M d i t h i o t h r e i t o l ) , 5 p l o f g a m m a 3 2 P - A T - P ( 6 0 0 0 C i / m M N E N L i f e S c i e n c e P r o d u c t s , B o s t o n , M A ) a n d 8 u n i t s o f T 4 p o l y n u c l e o t i d e k i n a s e i n 1 1 . 4 p l o f H 2 0 a s d e s c r i b e d b y S a m b r o o k e t a l . ( 1 9 8 9 ) . R e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t f o r 4 5 m i n a t 3 7 C a n d w e r e s t o p p e d b y i n a c t i v a t i n g t h e e n z y m e a t 6 5 C f o r 1 0 m i n u t e s . S e p h a d e x G 2 5 ( S i g m a ) c o l u m n s w e r e p r e p a r e d u s i n g 1 m l s y r i n g e s t o s e p a r a t e u n i n c o r p o r a t e d n u c l e o t i d e s f r o m l a b e l e d p r o b e s . L a b e l i n g e f f i c i e n c y w a s c h e c k e d w i t h a n a u t o m a t e d s c i n t i l l a t o r ( B e c k m a n , A r l i n g h t o n H e i g h t s , I L ) . 2 5 3 I T S I r e g i o n s a m p l i fi e d b y I T S 1 F a n d I T S Z w e r e p r e p a r e d a n d l a b e l e d , a s f o l l o w s . P C R p r o d u c t s w e r e r u n o n 1 % a g a r o s e g e l a n d c u t o u t u n d e r l o n g w a v e U V l i g h t . W a t e r w a s a d d e d t o d i l u t e t h e D N A t o a fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f 1 n g / p l . T h e s o l u t i o n w a s p r e c i p i t a t e d b y a d d i n g 2 o r 2 1 / 2 v o l u m e s c o l d 1 0 0 % e t h a n o l a n d 1 / 1 0 v o l u m e 3 M s o d i u m a c e t a t e . F o l l o w i n g p r e c i p i t a t i o n f o r 2 0 m i n a t — 2 0 C , s a m p l e s w e r e s p u n f o r 2 0 m i n u t e s a t 4 C . T h e p e l l e t s w e r e w a s h e d w i t h 7 0 % e t h a n o l a n d s p u n f o r 1 0 m i n u t e s , d r i e d u n d e r v a c u u m f o r 5 m i n u t e s , a n d r e s u s p e n d e d i n T E . P u r i fi e d p r o b e s w e r e q u a n t i f i e d b y m e a s u r i n g O D v a l u e s a t 2 6 0 a n d 2 8 0 n m . P r o b e s w e r e d e n a t u r e d b y b o i l i n g f o r 2 m i n , c o o l e d f o r 2 - 3 m i n , t h e n a d d e d t o t h e r a n d o m h e x a m e r p r o b e l a b e l i n g r e a c t i o n . T h e l a b e l i n g r e a c t i o n c o n s i s t e d o f 4 0 - 6 0 n g D N A , 1 0 p l 5 X O L B s o l u t i o n ( P h a r m a c i a , P e a p a r k , N J ) o r R a n d o m P r i m e d D N A l a b e l i n g k i t r e a c t i o n m i x t u r e ( B o e h r i n g e r M a n n h e i m , M a n n h e i m , G e r m a n y ) , 5 p l a l p h a 3 2 P — d A T P o r — d C T P ( 6 0 0 0 C i / m m o l ) a n d 1 p l K l e n o w e n z y m e ( 2 u n i t s ) . T h e f i n a l v o l u m e w a s b r o u g h t t o 5 0 p l b y a d d i t i o n o f d i s t i l l e d w a t e r . T h e m i x t u r e w a s i n c u b a t e d f o r 2 h o u r s a n d t h e r e a c t i o n w a s s t o p p e d b y t h e a d d i t i o n o f 5 0 p l T E . L a b e l e d p r o b e s w e r e p u r i fi e d a s d e s c r i b e d e a r l i e r u s i n g s y r i n g e c o l u m n s . P r o b e s w e r e d e n a t u r e d b e f o r e u s e b y a d d i n g 1 / 1 0 v o l u m e 3 M N a O H . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s t o a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s . D o t b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s t o I T S 1 F a n d I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s w e r e p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d ( H e l m u t , 1 9 9 0 ; B r u n s a n d 2 5 4 G a r d e s , 1 9 9 3 ) . F i v e p l o f a m p l i fi e d p r o d u c t s ( a p p r o x i m a t e l y 1 0 0 n g ) w e r e d e n a t u r e d i n 1 0 0 p l o f 0 . 4 N N a O H . 2 5 m M E D T A a n d 1 - 2 p l b r o m o p h e n o l b l u e f o r 5 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r e s . H Y B O N D N + n y l o n m e m b r a n e s ( A m e r s h a m L i f e S c i e n c e , B u c k i n g h a m s h i r e , U K ) p r e - c u t t o fi t i n a D o t - b l o t a p p a r a t u s ( G i b c o B R L , L i f e T e c h n o l o g i e s I n c , R o c k v i l l e , M D ) w e r e w e t i n d i s t i l l e d w a t e r f o r 1 m i n a n d p l a c e d i n t o t h e a p p a r a t u s . D e n a t u r e d s a m p l e s w e r e a d d e d t o t h e a p p r o p r i a t e w e l l s a n d s l o w l y v a c u u m f i l t e r e d o n t o t h e m e m b r a n e . T h e y w e r e U V - fi x e d u s i n g 1 2 0 m I / c m 2 a t 2 5 4 n m ( S t r a t a l i n k e r , S t r a t a g e n e , L a J o l l a , C A ) . T h r e e r e p l i c a s f o r e a c h p r o b e w e r e p r e p a r e d . M e m b r a n e s w e r e p r e - w a s h e d f o r 1 h a t 6 5 C i n a s o l u t i o n c o n t a i n i n g 0 . 1 x S S C , 1 0 m M T r i s , p H 8 . 0 a n d 0 . 5 % S D S . P r e - h y b r i d i z a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t a t t h e h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e f o r 1 - 4 h i n h y b r i d i z a t i o n b u f f e r ( 2 0 p l ) c o n t a i n i n g 6 x S S C ( 3 . 6 M N a C l , 0 . 2 M s o d i u m p h o s p h a t e , 2 0 m M E D T A ) , 0 . 5 % d r y m i l k a s b l o c k i n g a g e n t , 0 . 1 % S D S a n d 1 0 0 D 9 d e n a t u r e d h e r r i n g s p e r m D N A . A f t e r t h e a d d i t i o n o f l a b e l e d p r o b e s , t h e m e m b r a n e s w e r e h y b r i d i z e d f o r 4 - 1 2 h o u r s i n a r o t a r y t y p e h y b r i d i z a t i o n o v e n ( H Y B A I D , A s h f o r d , M i d d l e s e x , U K ) . I n i t i a l t h e o r e t i c a l h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e ( T h ) w e r e c a l c u l a t e d b y s u b t r a c t i n g 5 C f r o m t h e e x p e c t e d m e l t i n g t e m p e r a t u r e s ( T m ) a s f o r m u l a t e d i n S a m b r o o k e t a l . ( 1 9 8 9 ) , T m = 4 ( G + C ) + 2 ( A + C ) . T h e a c t u a l h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s ( T a ) t h a t r e s u l t e d i n c o r r e c t p r o b e s p e c i fi c i t y w e r e d e t e r m i n e d e m p e r i c a l l y b y t e s t i n g t h e p r o b e s a t d i f f e r e n t h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s u n t i l a n o p t i m u m t e m p e r a t u r e w a s r e a c h e d f o r e a c h p r o b e . T h e m e m b r a n e s w e r e w a s h e d i n 2 x S S C a n d 0 . 1 % S D S f o r 5 m i n o n a s h a k e r ( O r b i t s h a k e r L a b L i n e I n s t r u m e n t s I n c , H e l r o s e p a r k , I L ) a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d f o r 2 5 5 2 0 m i n o n a n i n c u b a t e r s h a k e r ( l n n o v a 4 0 8 0 , N e w B r u n s w i c k S c i e n t i f i c , E d i s o n , N J ) a t 5 C b e l o w t h e h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s . M e m b r a n e s w e r e m o n i t o r e d a n d w a s h e d r e p e a t e d l y a s n e c e s s a r y . H y b r i d i z e d fi l t e r s w e r e e x p o s e d t o X - r a y fi l m ( A m e r s h a m ) f o r 4 h t o 2 d a y s a t - 8 0 C . T h e fi l m s w e r e d e v e l o p e d u s i n g a K o d a k p r o c e s s o r ( K o d a k , R o c h e s t e r , N Y ) . H y b r i d i z a t i o n f i l t e r s w e r e r e u s e d a f t e r r a d i o a c t i v e p r o b e s w e r e r e m o v e d b y w a s h i n g i n b o i l i n g 2 x S S C a n d 0 . 2 % S D S s o l u t i o n . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s t o t o t a l D N A D o t - b l o t s w e r e a l s o p r e p a r e d u s i n g t o t a l D N A e x t r a c t e d f r o m m y c e l i a ( L e e e t a l . 1 9 8 8 ) a n d f r o m n e e d l e s w i t h o r w i t h o u t f r u i t i n g b o d i e s ( H a m e l i n e t a l . 1 9 9 6 ) . A d d i t i o n a l l y , t h e e x t r a c t i o n b u f f e r w a s s u p p l e m e n t e d w i t h 8 0 p g p r o t e i n a s e K ( 0 . 1 p g / p l , S i g m a ) , a n d a n e x t r a p u r i fi c a t i o n s t e p w i t h p h e n o l : c h l o r o f o r m : i s o a m y l a l c o h o l w a s u s e d f o r t h e D N A e x t r a c t i o n f r o m n e e d l e s t o o b t a i n a s c l e a n a p r o d u c t a s p o s s i b l e . T o t a l D N A f r o m b o t h m y c e l i a a n d n e e d l e s w a s q u a n t i fi e d w i t h a s p e c t r o p h o t o m e t e r a t 2 6 0 n m . T o t a l D N A a l i q u o t s w e r e d i l u t e d i n 1 X T E t o a d j u s t t h e c o n c e n t r a t i o n s , a n d w e r e a d d e d t o a n e q u a l v o l u m e o f 1 . 0 M N a O H f o r d e n a t u r a t i o n . F o l l o w i n g 1 h d e n a t u r a t i o n , t h e D N A w a s b l o t t e d o n t o n y l o n m e m b r a n e s t h a t w e r e s o a k e d i n d i s t i l l e d w a t e r , a n d fi x e d w i t h U V u s i n g 2 0 m J / c m 2 a t 2 5 4 n m ( S t r a t a l i n k e r ) . D o t b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f s h o r t o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s t o m y c e l i u m a n d n e e d l e D N A w e r e c o n d u c t e d a s w a s d o n e w i t h I T S 1 F a n d I T S 4 p r o d u c t s , w i t h 2 5 6 s o m e m o d i fi c a t i o n s . D N A - fi x e d m e m b r a n e s w e r e p r e - h y b r i d i z e d i n a s o l u t i o n c o n t a i n i n g 6 x S S C , 0 . 0 1 M s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 8 ) , 1 m M E D T A ( p H 8 ) , 0 . 1 % S D S , 1 0 0 p g / m l h e r r i n g s p e r m D N A a n d 0 . 1 % n o n - f a t d r i e d m i l k . F o l l o w i n g 4 h p r e h y b r i d i z a t i o n , l a b e l e d p r o b e s w e r e a d d e d a n d h y b r i d i z a t i o n w a s c a r r i e d o u t f o r 4 - 1 2 h a t t h e c a l c u l a t e d T h t e m p e r a t u r e s . T h e m e m b r a n e s w e r e w a s h e d b r i e fl y ( 1 t o 3 m i n ) i n 2 X o r 6 X S S C o n s h a k e r a t t h e h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s . T h e m e m b r a n e fi l t e r s w e r e m o n i t o r e d a n d w a s h e d r e p e a t e d l y a s n e c e s s a r y . H y b r i d i z e d fi l t e r s w e r e e x p o s e d t o X - r a y fi l m f o r a t l e a s t 1 2 h o u r s b e f o r e fi l m s w e r e d e v e l o p e d . R e s t r i c t i o n d i g e s t s S o f t w a r e g e n e r a t e d r e s t r i c t i o n m a p s o f t h e I T S r D N A s e q u e n c e s ( D N A S T A R I n c , M a d i s o n , W I ) o f e a c h f u n g u s w e r e c o n s t r u c t e d b y t h e s u b p r o g r a m M A P D R A W o f D N A S T A R ) . 2 5 r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e s w e r e u s e d t o l o c a t e s p e c i fi c c u t t i n g s i t e s i n e a c h s e q u e n c e . E n z y m e s c u t t i n g s i t e s t h a t w e r e u n i q u e t o R . k a l k h o fi i i , R . p i n i , K . j u n i p e r i , P . j u n i p e r o v o r a s p e c i e s w e r e u s e d t o d i f f e r e n t i a t e i t f r o m o t h e r t a x a . P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d u s i n g s p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r s w e r e d i g e s t e d w i t h t h e r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e s a s f o l l o w . R e s t r i c t i o n r e a c t i o n s c o n t a i n e d 4 p l o f P C R p r o d u c t s a n d 6 p l o f r e s t r i c t i o n m i x t u r e ( 1 p l m a n u f a c t u r e r ' s b u f f e r , 0 . 2 p l e n d o n u c l e a s e a n d 4 . 8 p l d i s t i l l e d w a t e r ) . R e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t a t 3 7 o r 6 5 C , ( d e p e n d i n g o n t h e e n z y m e u s e d ) f o r 2 - 4 h o u r s a n d s t o p p e d b y c o o l i n g o n i c e . D i g e s t e d p r o d u c t s w e r e r u n o n 3 % a g a r o s e g e l f o r 1 h o u r a t 1 0 0 v o l t s a n d p h o t o g r a p h e d u s i n g A l p h a l m a g e r . 2 5 7 R E S U L T S I s o l a t i o n o f K a b a t i n a j u n i p e r i f r o m j u n i p e r s g r o w n i n M i c h i g a n S i x f u n g i c o d e d a s U n k n o w n 1 - 6 w e r e m o s t c o m m o n l y i s o l a t e d f r o m J u n i p e r u s c h i n e n s i s v a r . P f i t z e r a n a c o m p a c t a g r o w n o n M S U C a m p u s . I T S 1 F - I T S 4 a m p l i fi c a t i o n o f D N A d i l u t e d t o 1 0 2 a n d 1 0 3 p r o d u c e d P C R p r o d u c t f r o m a l l i s o l a t e s ( F i g u r e 5 . 1 ) . H o w e v e r , u n k n o w n # 6 y i e l d e d a P C R p r o d u c t o f t h e I T S m o r e t h a n 1 1 5 0 b p , s i m i l a r t o t h e o n e p r o d u c e d b y K a b a t i n a t h u j a e C B S i s o l a t e s 2 3 8 . 6 6 ( K T - 1 ) a n d 4 6 2 6 6 ( K T - 2 ) . T h e 1 1 1 0 b p s e q u e n c e i n c l u d e d a n 4 8 4 b p i n t r o n ( A Y 1 8 3 3 6 7 ) s e q u e n c e s i m i l a r t o t h e i n t r o n s e q u e n c e f o u n d i n K . t h u j a e i s o l a t e s i n a d d i t i o n t o t h e r e g u l a r 5 1 7 b p I T S s p a c e r s e q u e n c e t h a t h a d 9 9 % h o m o l o g y w i t h t h e I T S s e q u e n c e s o f K . t h u j a e ( A F 0 1 3 2 2 6 a n d A F 4 6 2 4 3 7 ) a n d K . j u n i p e n ' ( A F 2 6 0 2 2 4 ) . T h e i s o l a t e i n i t i a l l y w a s i d e n t i fi e d a s K . t h u j a e d u e t o p r e s e n c e o f t h e i n t r o n s e q u e n c e . H o w e v e r , c u l t u r a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e b l a c k y e a s t a n a m o r p h m o r e c l o s e l y r e s e m b l e d t h a t o f K . j u n i p e n ' ( G i b s o n a n d S u t t o n 1 9 7 6 ) . T h i s w a s t h e f i r s t r e p o r t o f K . j u n i p e r i i s o l a t i o n f r o m M i c h i g a n , i s o l a t e K J - M I . T h e o t h e r 5 i s o l a t e s w e r e v a r i o u s u n i d e n t i fi e d f u n g i p r e s e n t i n j u n i p e r n e e d l e s . P C R a m p l i fi c a t i o n a n d s e q u e n c i n g o f I T S r e g i o n s o f r e l a t e d f u n g i D N A f r o m R . k a l k h o f fi i , R . p i n i , K . j u n i p e n ' a n d P . j u n i p e r o v o r a a m p l i fi e d b y t h e p r i m e r p a i r I T S l F - I T S 4 a m p l i fi c a t i o n p r o d u c e d P C R p r o d u c t s o f 5 5 0 - 6 5 0 b p d e p e n d i n g o n t h e s p e c i e s o f t h e f u n g i ( F i g u r e 5 . 2 ) . T e m p l a t e D N A f r o m o t h e r r e l a t e d f u n g i a l s o y i e l d e d s i m i l a r s i z e a m p l i f i c a t i o n p r o d u c t s . K a b a t i n a t h u j a e a n d 2 5 8 + 1 z N N N N N N B ' U U U U U U 1 2 3 4 5 6 1 N U K l ' - T 1 K K 8 J J J J J J J J L J K - - - P - - - - — 1 1 2 3 4 8 5 7 6 9 A . ' v - I — I — I - I - v - v - I - F i g u r e 5 . 1 . A m p l i fi c a t i o n o f s o m e p a t h o g e n i c a n d e n d o p h y t i c f u n g i i s o l a t e d f r o m j u n i p e r n e e d l e s s h o w i n g 1 0 5 9 b p p r o d u c t o f I T S s e q u e n c e c o n t a i n i n g a n i n t r o n p r e s e n t i n t w o K t h u j a e C B S i s o l a t e s a n d t h e i s o l a t e ( J U N 6 ) f r o m j u n i p e r s a m p l e s . D N A t e m p l a t e d i l u t i o n s o f 1 0 2 ( L a n e s 1 - 8 ) a n d 1 0 3 ( L a n e s 9 - 1 6 ) w e r e a m p l i fi e d w i t h I T S 1 F - I T S 4 p r i m e r s . L a n e C r e f e r s t o P C R r e a c t i o n c o n t a i n i n g P C R r e a c t i o n m i x t u r e a n d P C R w a s t e r a s c o n t r o l . 1 K B a n d 1 K B + : s i z e s t a n d a r d D N A l a d d e r s . C o d e s r e f e r t o t h e f u n g i a s f o l l o w ; K T — K . t h u j a e , P J : P . j u n i p e r o v o r a , L J : L . j u n i p e r i n u m , J U N 1 t h r o u g h 6 : u n i d e n t i fi e d f u n g i . 2 5 9 C H C T C C L T A T A - 1 S A A C W - - 1 2 3 P C D - - 1 A - - - P A A A S N I N A U - M M + K K K K . P l P M A L L s D P P J T J u H L K K A S J B R R R - R R R R R R - - - - P K - - - - - - - - - 2 6 8 3 4 5 7 9 0 1 1 1 2 3 5 6 8 9 4 7 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 . ‘ 5 9 ‘ . ’ * Q 3 F i g u r e 5 . 2 . I T S 1 F - I T S 4 a m p l i fi c a t i o n o f p a t h o g e n i c a n d e n d o p h y t i c f u n g i p r e s e n t i n s p r u c e , fi r a n d j u n i p e r n e e d l e s . D N A t e m p l a t e s o f R . k a l k h o f fi i i s o l a t e s ( R K A — ) , R . p i n i ( R P l N - ) , R . m a c r o s p o r a ( R M A C ) , R . a u d o m a n s i i ( R A U D ) , R . k o b a y a s h i i ( R K O B ) , P . g a u m a n n i i ( P G ) , L i r u l a m a c r o s p o r a ( L M - ) , D . s t r o b i l i g e r a ( 0 3 ) , H . d e m a t i o i d e s ( H D ) , A . p u l l u l a n s ( A P ) , L . j u n i p e n ' n u m ( L J ) , S c l e r o p h o m a p y t h i o p h i l a ( S P ) , K . t h u j a e ( K T - ) , K . j u n i p e r i ( K J ) a n d P . j u n i p e r o v o r a ( P . J ) w e r e a m p l i fi e d f r o m m y c e l i u m . 2 6 0 P Q K J - M I G G C G A C A C T - A T C A A A T T G A C G G G G A C A C C C T A A A G - - - - - - G A A A T G G G C A A T C C G C A G C C A A K T l G G C G A C A C T T A T C A A A T T G A C G G G G A C A C C C T A A A G - - - - - G A A A T G G G C A A T C C G C A G C C A A P A G G C G A C A C T T - T C G A A T T G A C G G G G A C A C C C T A A A G - - - - - - A G G A T G G G t A A T C C G C A G C G A A p p G G C G A C A C T - C T C G A A T T G A C G G G G A C A C C C T A A A G D C G G C C A C A C T T - T C G A A T T G - C G G G A A C A C C C T A A A G - - - - - - G A A A T G G G C A A T C C G C A G C C A A C G G G C G A C A C T T - T C G A A T T G A C G G G G A C A C C C T A A A G 0 K G G C C A C A C T T - T C G A A T T G - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - G A A A T G G G C A A T C C G C A G C G A A M F A A T T G - C G G G - A A A A T C C G C A A C A C - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - G A A A T G G G C A A T C C G C A G C C A A R s K J - M I G T T C A C A G A C T A G A T G G T A G T G G G T G - - - - - - G C T T A A G A T A T A G T C G G G C C K T — l G T T C A C A G A C T A G A T G G T A G T G G G T G - - - - - - G C T T A A G A T A T A G T C G G G C C P A G T T C A C A G A C T A A G T G G A A G T G G G T G - - - - - - G C T T A A G A T A T A G T C G G G C C p p - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - G C T T A A G A T A T A G T C G G G C C D C G T T C A C A G A C T A A G T G G A A G T G G G T G G C T T A A G A T A T A G T C G G G C C O K G T T C A C A G A C T A A G T G G A A G T G G G T G - - - - - - G C T T A A G A T A T A G T C G G G C C M F G T T C A G A C T A A A - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A A G A T A T A G T C C A C - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - G C T T A A G A T A T A G T C G G G C C F i g u r e 5 . 3 . A l i g n m e n t o f t h e c o n s e r v e d s e q u e n c e e l e m e n t s o f a g r o u p I i n t r o n f o u n d w i t h i n t h e 1 8 S r D N A g e n e o f K a b a t i n a s p e c i e s w i t h 1 8 S r D N A g n e o f o t h e r f u n g i . C o d e s a n d G e n b a n k a c c e s s i o n n u m b e r s a s f o l l o w . K J - M I = K . j u n i p e n ' ( ) , K T = K . t h u j a e ( A F 4 6 2 4 3 7 ) , P A = P e n i c i l l i u m a r g i l l a c e u m ( A B O 3 3 5 3 3 ) , P P = P . p u l v i l l o r u m ( A F 1 7 8 5 2 7 ) , D C = D a c t y l e I I a c y l i n d r o s p o r a ( A F 1 0 6 5 3 8 ) , O P = O p h i o s s p h a e n e l l a k o m e a ( A F 1 0 2 1 8 9 ) M F = M o n i l i a n a f m c t i c o l a ( A F 0 1 0 5 0 5 ) , A C = A r t h r o b o t r y s c y l i n d r o s p o r a ( U 5 1 9 5 3 . 1 ) . 2 6 1 K . j u n i p e n ' i s o l a t e s g e n e r a l l y y i e l d e d t w o d i f f e r e n t s i z e P C R p r o d u c t s , t h e 5 5 0 b p I T S s e q u e n c e ( s o m e t i m e s n o t v i s u a l i z e d o n a g a r o s e g e l ) , a n d a 1 0 5 9 s e q u e n c e c o n t a i n i n g a n i n t r o n a n d t h e I T S r e g i o n . T h e l e n g t h s o f I T S s e q u e n c e o f f u n g i s e q u e n c e d i n t h i s s t u d y r a n g e d f r o m 4 4 1 t o 5 1 7 b p t h a t i n c l u d e d I T S I , 5 . 8 s D N A a n d I T S I I r e g i o n s ( T a b l e 5 . 1 ) . T h e 5 0 0 b p P C R p r o d u c t p r e s e n t i n t h e I T S r D N A r e g i o n o f b o t h K . j u n i p e n ' i s o l a t e K J - M l a n d K . t h u j a e i s o l a t e K T - 1 d e s c r i b e d a b o v e ( - a n d A F 4 6 2 4 2 8 ) w e r e 9 9 % h o m o l o g o u s . T h e y w e r e i d e n t i fi e d a s a g r o u p I i n t r o n b e c a u s e t h e y p o s s e s s e d t h e c h a r a c t e r i s t i c f e a t u r e s k n o w n t o b e c o n s e r v e d a m o n g g r o u p o f i n t r o n s ( F i g u r e 5 . 3 ) . T h e s e q u e n c e s c o n t a i n e d t h e f o u r c o n s e r v e d s e q u e n c e e l e m e n t s P , Q , R a n d S , a n d t h e o r d e r o f t h e i r o c c u r r e n c e i n t h e s e q u e n c e s ( 5 ’ P , Q , R , S ) i s n e c e s s a r y f o r t h e f o r m a t i o n o f g r o u p I i n t r o n . A l i g n m e n t o f I T S s e q u e n c e s a n d d e s i g n o f p r o b e s T h e s e q u e n c e s o f R . k a l k h o f f i i , R . p i n i , K . j u n i p e r i a n d P . j u n i p e r o v o r a , H . d e m a t i o i d e s , A . p u l l u l a n s a n d o t h e r r e l a t e d f u n g i w e r e a l i g n e d t o g e t h e r t o d e s i g n s p e c i e s - s p e c i fi c o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s ( F i g u r e 5 . 4 ) . T h e r e w a s l i t t l e v a r i a t i o n i n I T S r e g i o n a m o n g t h e 3 i s o l a t e s o f R . k a l k h o f fi i . T h e s e q u e n c e s o f R . k a l k h o f fi i f r o m B l u e s p r u c e d i f f e r e d f r o m B l a c k s p r u c e i s o l a t e b y o n e b p d e l e t i o n w h i l e b l a c k s p r u c e i s o l a t e d i f f e r e d f r o m b l u e s p r u c e i s o l a t e b y t w o b p i n s e r t i o n s . A T C C 2 6 6 0 5 h a d 2 d e l e t i o n s a n d 3 i n s e r t i o n s . C o n s e n s u s s e q u e n c e s o f R . k a l k h o f fi i h a d 9 9 , 9 8 , a n d 9 7 % s i m i l a r i t y t o R . m a c r o s p o r a , R . o u d e m a n s i i a n d R . p i n i , r e s p e c t i v e l y a n d h a d o n l y 9 3 % s i m i l a r i t y w i t h R h i z o s p h a e r a s p . a n d 9 0 % 2 6 2 h o m o l o g y w i t h H . d e m a t i o i d e s . S u r p r i s i n g l y R . k o b a y a s h i s h a r e d o n l y 8 5 % s i m i l a r i t y w i t h o t h e r R h i z o s p h a e r a s p e c i e s a n d 9 7 % s e q u e n c e h o m o l o g y t o t h e s e q u e n c e o f A . p u l l u l a n s . T h e s e q u e n c e s o f K a b a t i n a j u n i p e n ' w e r e 9 9 % s i m i l a r t o t h e s e q u e n c e s o f K . t h u j a e s e q u e n c e s . K . j u n i p e n ' s h a r e d 9 2 % h o m o l o g y w i t h t h e s e q u e n c e s o f H . d e m a t i o i d e s a n d R . k a l k h o f fi i t h a t w e r e c l o s e s t f u n g i w h i l e i t h a d 8 6 % s i m i l a r i t y t o t h e s e q u e n c e s o f A . p u l l u l a n s . S e l e c t e d p a i r s o f p r i m e r s t h a t w e r e e f f e c t i v e i n d i f f e r e n t i a l l y a m p l i f y i n g s p e c i e s a n d s u b s p e c i e s a r e s h o w n i n F i g u r e 5 . 4 a n d l i s t e d i n T a b l e 5 . 2 . P r i m e r p a i r R P I N 1 - R P I N 4 w a s s e l e c t e d f o r s p e c i fi c a m p l i fi c a t i o n o f R . p i n i . T h e r e w a s n o t e n o u g h v a r i a b i l i t y b e t w e e n t h e s e q u e n c e s o f K . t h u j a e a n d K . j u n i p e r i t o a l l o w f o r i d e n t i f i c a t i o n o f s e l e c t i v e p r i m e r s f o r d i f f e r e n t i a t i n g t h e t w o . P r i m e r p a i r K J 1 - K J 4 a m p l i fi e s b o t h f u n g i . H o w e v e r , p r i m e r p a i r P J 1 - P J 4 d e s i g n e d f o r P . j u n i p e r o v a a m p l i fi c a t i o n h a d a m o r e t h a n 1 2 b a s e p a i r d i f f e r e n t c e w i t h K a b a t i n a s p e c i e s . T e s t i n g o f R h i z o s p h a e r a k a l k h o f fi i p r i m e r p a i r f o r s p e c i fi c i t y i n P C R a s s a y s T o d e t e r m i n e t h e o p t i m u m a n d s p e c i e s - s p e c i fi c a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s f o r t h e p r i m e r p a i r R K A 1 - R K A 4 d e s i g n e d f o r s p e c i fi c i t y t o R h i z o s p h a e r a k a l k h o f fi i , t h e p a i r w a s t e s t e d a t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s r a n g i n g f r o m 4 8 - 6 4 C i n b o t h d i r e c t a n d n e s t e d P C R a m p l i f i c a t i o n s . T h e p r i m e r s a m p l i f i e d t h e t a r g e t D N A o p t i m a l l y a t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e o f 5 4 C i n d i r e c t a m p l i f i c a t i o n s a n d p r o d u c e d a P C R p r o d u c t o f 3 9 7 b p ( F i g u r e 5 . 5 A a n d T a b l e 5 . 2 ) . I n a d d i t i o n t o R . k a l k h o f f i i D N A , t h e p a i r a l s o a m p l i fi e d t h e D N A o f R . m a c r o s p o r a a n d R . a u d e m a n s i i , w h i c h w e r e i s o l a t e s f r o m s i l v e r fi r ( A b i e s a l b a M i l l ) , i n a l l t e s t s . T h i s w a s n o t s u r p r i s i n g 2 6 3 R K A R P I N R M A C R S P P . R K O B A P L I R K T P J R K A R P I N R M A C R S S P . R K O B L I R l K T P J 1 2 1 R K A R P I N R M A C R S S P . R K O B A P L I R K J K T P J 1 8 1 R K A R P I N R M A C R S S P . R K O B A P L I R K T P J 1 6 0 C G G A A G G A T C A T T A A A G A G T A A G G G T C . T C C G G C C C G A A C C T C C A A C C C T T T G T T G T T A A C G G A A G G A T C A T T A A A G A G T A A G G G T C . T C C G G C C C G A A C C T C C A A C C C T T T G T T G T T A A C G G A A G G A T C A T T A A A G A G T A A G G G T C . T C C G G C C C G A A C C T C C A A C C C T T T G T T G T T A A C G G A A G G A T C A T T A A A G A G T A A G G G T C . T C T G G C C C G A A C C T C C A A C C C T T T G T T G T T A A C G G A A G G A T C A T T A A A G A G A T A G G G T C T T C A T G G C C C G A C C T C C A A C C C T C T G T T G T T C A C G G A A G A A T C A T T A A A T A G T A A G G . . T C T C C G G C C G G A A C C T C C A A C C C T T T G T T G G T A A C G A A A G A A T C A T . A A A G A G T A A G G G T G C T C A G C G C C C G A C C T C C A A C C C T T T G T T G T T A A C G G A A G G A T C A T T A A A G A G T A A G G G T G C T C A G C G C C C G A C C T C C A A C C C T T T G T T G T T A A A G A A T . . A C C A G G C T C T . . . . C G A G C C C T A . . . . T . . . T C T C A . . . C C C C G T G T C T A C C . C G . A A G G A T C A T T A A A G A G T T A G G G T C C C A G T G G C C C A A C C T C C A A C C C T C T G T T G T T A T C G G A A G G A T C A T T A A A G A G T T A G G G T C C T A G T G G C C C A A C C T C C A A C C C T C T G T T G T T A T C G G A G G G A T C A T fi G T T G a A . A c c c c c c c c a a c b c c . . . A C C C A A A A C C C T T T G T G A A C T G 6 1 P J l R K A l R P | N 1 A A C T A C C T T G T T G C T T T G G C G G G A C C G T T C G G . T C T C . T T A A C T A C C T T G T T G C T T T G G C G G G A C C G T T C G G . T T A A C T A C C T T G T T G C T T T G G C G G G A C C G T T C G G . T C T C . G A G C G C A C C G G T . C T T C G G A T T A A C T A C C T T G T T G C T T T G G C G G G A C C G T T C G G . T C T C . G A G C G C A C C G G T . C T T C G G A T T A A C T A C C T T G T T G C T T T G G C G G G A C C G T T T C G G T C T C C G A G C G C A C T A A C . C C T C G G G T A A A C T A C C T T G T T G C T T T G G C G G G A C C G C T C G G . T C T C . G A G C G C A C C G G T . C T T C G G A T T A A C T A C C T T G T T G C T T T G G C G G G A C C G C T C G G . T C T C . G A G C . C G C T G G G G A T T C G T C C C A A C T A C C T T G T T G C T T T G G C G G G A C C G C T C G G . T C T C . G A G C . C G C T G G G G A T T C G T C C C . . . 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F u n g a l s p e c i e s P r i m e r S e q u e n c e G C T m T h T a T a n T p c r 1 P 8 2 ( % 0 d n ( b e ) K . j u n i p e r i K J 1 5 ' G G T C C T C C G A G C G C A C C A G T 7 O 6 6 6 3 5 7 5 8 5 8 — 6 0 - 3 5 5 K J 4 5 A C G C C C G A A G T T G A T G G A A C 5 5 6 2 5 7 5 7 5 4 6 O 6 6 P . j u n i p e r o v o r a P J 1 5 ' G T T G G A A C G C G C C C C A G G 7 2 N D 5 7 6 0 6 0 4 5 5 P J 4 5 ' G G G C C T T C C A G A G C G A G G G 7 4 N D 6 0 R . k a l k h o f fi i R K A 1 5 ' G A G C G C A C C G G T C T T C G 7 1 5 8 5 3 5 5 5 4 5 4 5 4 3 9 7 R K A 4 5 ' C G G C A A T G G G T T C T A A C C 5 6 5 6 5 1 5 5 5 0 R . p i n i R P I N 1 G A G C G C A C C G G T T C T T C G 6 6 N D 5 5 6 0 6 0 3 9 2 R P I N 4 G G G T T C C A A C C G G A C T C A T G 6 0 N D 5 6 1 O p t i m u m a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s d e t e r m i n e d i n d i r e c t ( d ) a n d n e s t e d ( n ) P C R a s s a y s . 2 T h e s i z e s o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y s p e c i e s - s p e c i f i c p r i m e r - p a i r s . 2 6 7 c o n s i d e r i n g t h a t t h e r e w a s n o d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e s e q u e n c e s o f t h e s e f u n g i w i t h i n t h e r e g i o n o f t h e p r i m e r s e q u e n c e . T h i s r e s u l t s h o w e d t h a t t h e p a i r c o u l d a l s o b e u s e d f o r d e t e c t i o n o f t h e s e t w o R h i z o s p h a e r a s p e c i e s i n s i l v e r fi r . I n t e r e s t i n g l y , t h e p a i r d i d n o t a m p l i fi e d R . p i n i D N A a l t h o u g h t h e r e w a s o n l y o n e b a s e d i f f e r e n c e i n t h e s e q u e n c e o f t h i s f u n g u s a n d t h e s e q u e n c e s o f e a c h o f p r i m e r R K A 1 - R K A 4 . T h e p r o b e d i d n o t a m p l i f y a n y o f t h e o t h e r f u n g i o r a n y o t h e r o m n i p r e s e n t c o m m o n e n d o p h y t e s e s p e c i a l l y A . p u l l u l a n s t h a t m i g h t p r e s e n t i n s p r u c e . T h e p r i m e r p a i r R K A - 1 - R K A - 4 w a s a l s o t e s t e d f o r s p e c i fi c i t y i n n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s a t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s r a n g i n g f r o m 4 8 t o 6 4 a t e v e n i n t e r v a l s . T h e p a i r a m p l i fi e d a l l f u n g i t e s t e d a t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s l o w e r t h a n 5 4 . A n n e a l i n g t e m p e r a t u r e o f 5 4 w a s f o u n d t o b e o p t i m u m i n n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n a s w e l l . H o w e v e r , t h e p a i r w a s a l s o a s e f f e c t i v e a t 5 6 C . A t h i g h e r t e m p e r a t u r e s ( 5 8 - 6 4 ) , t h e p r o b e y i e l d e d n o P C R p r o d u c t a s i t d i d i n d i r e c t P C R . A t o p t i m u m t e m p e r a t u r e 5 4 , t h e p r i m e r p a i r a m p l i fi e d t h e t a r g e t R . k a l k h o f fi i e f fi c i e n t l y i n a d d i t i o n t o R . o u d e m a n s i i a n d R . m a c r o s p o r a ( F i g u r e 5 . 5 . B ) . A t h i g h e r a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s , t h e p r i m e r s t i l l a m p l i f i e d t h e s e f u n g i a s w e l l . H o w e v e r , t h e r e w a s n o a m p l i fi c a t i o n o f R . p i n i o r a n y o t h e r p a t h o g e n s a n d e n d o p h y t e s i n n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s . 2 6 8 S D - P S 6 7 l I > I K B + l - R K A - l 2 R K A 2 3 - R K A - 3 4 - R K A - A T C C 6 R P I N l 7 - R A U D 8 - R M A C 9 R K O B I O - R S P P . W l 2 H D l 3 P G l 4 - L M - C A S T 3 : _ l < 3 2 - . ‘ 3 9 7 b p — - - ) U I 8 u . 4 B F r . < ' r N ‘ ¥ ‘ 2 ‘ E 5 : ) o m 3 5 > 7 < ‘ 3 ‘ . D O n f ‘ - , g o 2 x x E E E < . 2 Q I ? E 2 f 8 % > 4 a : a : m 1 m a : m c I 4 H I W K " ' 1 ~ 1 5 f ‘ — — - ' - m " I 4 n o r \ ' a t : — — - — — — — . — a w . . . _ . - 3 9 7 b p — - - - ) j : F i g u r e 5 . 5 . P C R a m p l i fi c a t i o n f o r s p e c i fi c i t y o f R . k a l k h o f fi i p r i m e r p a i r R K A 1 - R K A 4 . D i r e c t P C R a m p l i fi c a t i o n ( A ) a n d n e s t e d P C R a m p l i f i c a t i o n ( B ) a t o p t i m u m a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e o f 5 4 C . D N A f r o m R . k a l k h o f f i i i s o l a t e s ( R K A - ) , R . p i n i ( R P I N - ) , R . o u d o m a n s i i ( R A U D ) , R . m a c r o s p o r a ( R M A C ) , R . k o b a y a s h i i ( R K O B ) , R h i z o s p h a e r a s p . ( R S S P . ) , A . p u l l u l a n s ( A P ) , H . d e m a t i o i d e s ( H D ) , P . g a u m a n n i i ( P G ) , L i r u l a m a c r o s p o r a ( L M - ) , D . s t r o b i l i g e r a ( D S ) , S c l e r o p h o m a p y t h i o p h i l a ( S P ) w e r e t e s t e d 2 6 9 A m p l i fi c a t i o n o f R . k a l k h o f fi i b y R K A 1 - R K A 4 f r o m s p r u c e n e e d l e s T h e p r i m e r p a i r R K A 1 - R K A 4 e f f e c t i v e l y a n d c o n s i s t e n t l y d e t e c t e d R . k a l k h o f fi i i n i n f e c t e d n e e d l e s c o n t a i n i n g c h a r a c t e r i s t i c f r u i t i n g b o d i e s o r d i s e a s e s y m p t o m s f o r t h e p a t h o g e n i n d i r e c t a m p l i fi c a t i o n s . H o w e v e r , t h e p r i m e r p a i r d i d n o t d e t e c t R . k a l k h o f fi i i n n e e d l e s w i t h o u t s y m p t o m s , a l t h o u g h w e a k a m p l i fi c a t i o n s o c c u r r e d w i t h s o m e s a m p l e s t h a t m a y h a v e c o n t a i n e d s y m p t o m l e s s i n f e c t i o n s ( F i g u r e 5 . 6 A ) . W h e n t h e p r i m e r p a i r w a s u s e d f o r d e t e c t i o n o f R . k a l k h o f fl i i n n e s t e d P C R o f D N A f r o m n e e d l e s a t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s o f 5 4 C , t h e s e n s i t i v i t y o f t h e p a i r i n c r e a s e d a n d c o n s i s t e n t l y a m p l i fi e d t h e f u n g u s i n D N A e x t r a c t e d f r o m s y m p t o m l e s s n e e d l e s o f c u r r e n t y e a r g r o w t h ( F i g u r e 5 . 6 B ) . T h e r e w a s n o a m p l i fi c a t i o n f r o m D N A o f b a l s a m f i r a n d F r a s e r fi r t h a t w e r e i n f e c t e d a n d c a r r y i n g f r u i t i n g b o d i e s o f R . p i n i . T h e m a j o r i t y o f D N A u s e d h e r e w a s e x t r a c t e d w i t h t h e b u l k D N A e x t r a c t i o n m e t h o d t h a t i n c r e a s e d t h e c h a n c e o f d e t e c t i n g f u n g u s i n a l a r g e r s a m p l e . R e s t r i c t i o n D i g e s t s o f R K A 1 - R K A 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s f r o m i n f e c t e d n e e d l e s T o c o n fi r m t h a t t h e i d e n t i t y o f t h e D N A a m p l i f i e d f r o m i n f e c t e d s p r u c e n e e d l e s w a s t h a t o f R . k a l k h o f fi i , R K A 1 - R K A 4 a m p l i f i e d P C R p r o d u c t s w e r e d i g e s t e d w i t h r e s t r i c t i o n e n z y m e s t h a t y i e l d e d d i s t i n c t p r o f i l e s f o r t h e R . k a l k h o f fi i I T S s e q u e n c e . T h e r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e s H p a l l , H i n f l a n d O d e ! c u t t h e I T S 2 7 0 D - D S - N N S H D o A A D D S S - H - D o - D C C T D D - - S - - S - S - - S S - M M L L - S S K S K S S s K K S C E E C C E C E C E A U U A A E E - - N l I I l M M M M R R R R I I I A e I G G U U A A U L L L L L - N N L L L m L L B B B B B A B B B B B - - - - - E E e F F F F F B F B - - - K - - I - - 0 2 3 4 - - - 5 6 7 8 R m 5 7 2 4 8 9 1 l 1 1 1 1 1 1 1 1 ‘ ‘ . ’ 3 9 7 b p - - ) 3 9 7 b p - F i g u r e 5 . 6 . D e t e c t i o n o f R . k a l k h o f fi i b y p r i m e r p a i r R K A 1 - R K A 4 i n d i r e c t ( A ) a n d n e s t e d ( B ) P C R a m p l i fi c a t i o n o f D N A f r o m n e e d l e s . D N A e x t r a c t e d f r o m 1 0 g o f b u l k n e e d l e s w i t h a b l e n d e r ( L a n e s 1 , 2 , 4 , 5 , 9 , 1 0 ) a n d 4 - 5 n e e d l e s i n a m o r t a r a n d p e s t l e ( L a n e 3 , 6 , 7 , 8 , a n d 1 1 - 1 8 ) . 1 K B + : s i z e s t a n d a r d D N A l a d d e r . R K A - A T C C : R . k a l k h o f fi i A T C C 2 6 6 0 5 . B L U E S - D , B L A C K S - D , E N G E L M A N S - D : D N A t e m p l a t e s f r o m b l u e , b l a c k a n d e n g e l m a n s p r u c e n e e d l e s c o n t a i n i n g f r u i t i n g b o d i e s o r s y m p t o m s o f R . k a l k h o f fi i i n f e c t i o n r e s p e c t i v e l y . B L U E S - S a n d B L A C K S - S : T e m p l a t e s f r o m i n f e c t e d b u t s y m p t o m l e s s n e e d l e s b l u e a n d b l a c k s p r u c e . B L U E S - H a n d B L A C K S - H : D N A f r o m u n i n f e c t e d b l u e a n d b l a c k s p r u c e n e e d l e s r e s p e c t i v e l y . F F l R M l - D , F F l R M l N - D a n d B F I R M l - D : T e m p l a t e D N A o f R . p i n i f r o m F r a s e r a n d B a l s a m fi r n e e d l e s c o n t a i n i n g f r u i t i n g b o d i e s o r s y m p t o m s o f t h e f u n g u s . 2 7 1 r e g i o n s o f R . k a l k h o f fi i a m p l i fi e d b y t h e p r i m e r s R K A 1 - R K A 4 i n t o d i s t i n c t i v e f r a g m e n t p r o fi l e s ( T a b l e 5 . 3 ) . R e s r i c t i o n d i g e s t s w i t h H p a l l y i e l d e d t w o d i f f e r e n t s i z e d f r a g m e n t s ( 3 2 6 a n d 6 4 ) i n P C R p r o d u c t s a m p l i f i e d b y R K A 1 - R K A 4 p r i m e r s f r o m b o t h m y c e l i u m o f b l u e s p r u c e a n d b l a c k s p r u c e i s o l a t e s o f R . k a l k h o f fi i a n d f r o m n e e d l e s w i t h o r w i t h o u t s y m p t o m s ( F i g u r e 5 . 7 A ) . A t h i r d f r a g m e n t w a s n o t v i s u a l l y s e e n b e c a u s e o f i t s s m a l l s i z e ( 7 b p ) . H p a l l p r o d u c e d o n l y 1 l a r g e f r a g m e n t ( 3 9 0 ) f r o m A T C C i s o l a t e o f R . k a l k h o f fi i a s e x p e c t e d . D i g e s t s w i t h t h e e n z y m e H i n fl p r o d u c e d 2 v i s u a l l y o b s e r v a b l e f r a g m e n t s ( 2 0 7 a n d 1 4 6 b p ) f r o m P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y t h e p r i m e r s f r o m b o t h m y c e l i u m a n d n e e d l e s ( F i g u r e 5 . 7 8 ) . R e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e D d e l c u t P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y t h e p r i m e r s i n t o t w o e x p e c t e d s i z e f r a g m e n t s , 3 2 5 a n d 7 2 b p ( F i g u r e 5 . 7 C ) . R e s t r i c t i o n d i g e s t s w i t h t h e s e 3 e n z y m e s i n d i c a t e d t h a t P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y t h e R . k a l k h o f fi i - s p e c i fi c p r i m e r p a i r R K A 1 a n d R K A 4 f r o m n e e d l e s , e s p e c i a l l y s y m p t o m l e s s n e e d l e s , w e r e t h e I T S s e q u e n c e o f R . k a l k h o f fi i . 2 7 2 T a b l e 5 . 3 . R e s t r i c t i o n f r a g m e n t m a p s o f t h e s p e c i e s - s p e c i f i c p r i m e r a m p l i fi a b l e s e q u e n c e s o f t h e I T S s e q u e n c e o f s o m e p a t h o g e n s a n d e n d o p h y t e s p r e s e n t i n s p r u c e , fi r a n d j u n i p e r . R K A 1 - R K A 4 a m p l i f i a b l e s e q u e n c e o f I T S 1 § E e _ c i § . § ( j e a n M I @ I R . k a l k h o f fi i 3 2 6 5 6 4 7 2 0 7 1 4 6 3 6 8 3 2 5 7 2 R . m a c m s p o r a 3 2 6 6 4 7 2 0 7 1 4 6 3 6 8 3 2 5 7 2 R . a u d e m a n s i i 3 9 0 7 2 0 7 1 4 6 3 6 8 3 2 5 7 2 R . . p i n i 3 2 6 4 4 1 9 7 1 8 4 1 4 6 3 6 2 2 8 3 2 5 7 2 R . k o b a y a s h i 2 6 5 7 1 6 5 2 0 7 1 7 2 1 2 8 2 1 8 1 0 0 7 2 R h i z o s p h a e r a s p p 3 6 3 2 8 7 1 6 6 1 4 8 3 6 8 N S H . d e m a t i o i d e s N s 6 2 0 7 1 4 6 3 6 8 3 2 5 7 2 A . p u l l u l a n s 2 6 8 6 4 6 2 2 0 7 1 7 2 8 8 2 1 9 1 0 4 7 2 R P I N 1 - R P I N fl m p I i f i a _ b l e s e q u e n c e o f I T S 2 S p e c i e s M l H a e L D d e I _ R . . p i n i 1 8 4 1 4 6 3 6 1 4 8 3 3 0 6 2 3 1 8 7 4 R . k a l k h o f fi i 2 0 0 1 4 6 3 6 8 3 3 0 6 2 3 1 8 7 4 R . m a c r o s p o r a 2 0 0 1 4 6 3 6 8 3 3 0 6 2 3 1 8 7 4 R . a u d e m a n s i i 2 0 0 1 4 6 3 6 8 3 3 0 6 2 3 1 8 7 4 R . k o b a y a s h i 2 0 0 1 7 2 1 2 8 3 3 0 6 2 2 1 8 9 3 7 4 R h i z o s p h a e r a s p p 1 5 8 1 4 8 3 6 8 N S N S H . d e m a t i o i d e s 2 0 0 1 4 6 3 6 8 3 0 3 9 2 3 1 8 7 4 A . p u l l u l a n s 2 0 0 1 7 2 8 8 3 3 0 6 2 2 1 9 9 7 7 4 K J 1 - K J 4 a m p l i fi a b l e s e q u e n c e o f I T S 3 S e e d s . H I E L I M E K . j u n i p e r i 3 1 3 4 2 2 0 3 1 5 2 o r 1 5 2 1 5 2 5 1 K . t h u j a e 3 1 3 4 2 2 0 3 1 5 2 o r 1 5 2 1 5 2 5 1 P . j u n i p e r o v o r a 1 9 1 1 2 0 2 0 3 1 5 2 H . d e m a t i o i d e s N S 2 0 3 1 5 2 A . p u l l u l a n s 2 6 8 7 1 1 4 2 0 3 1 4 0 1 2 P J 1 - P J 4 a m p l i f i a b l e s e w e n c e o f I T S 4 S p e c i e s fi fl L P . j u n i p e r o v o r a 3 3 2 6 5 4 3 K . j u n i p e r i N S K . t h u j a e N S H . d e m a t i o i d e s N S A . p u l l u l a n s 3 4 1 1 1 4 1 P r i m e r p a i r s p e c i e s - s p e c i fi c f o r R . k a l k h o f fi i t h a t a m p l i f i e s a p o r t i o n o f t h e I T S . 2 R . p i n i s p e c i f i c p r i m e r s a m p l i f i e d p o r t i o n o f I T S . 3 K . j u n i p e r i s p e c i f i c p r i m e r s a m p l i f i e d p o r t i o n o f I T S . P . j u n i p e r o v o r a s p e C l fi c p r i m e r s a m p l i f i e d p o r t i o n I T S . 5 F r a g m e n t s i z e s i n b a s e p a i r ( b p ) o f d i g e s t e d P C R p r o d u c t . 6 N S : N o c u t t i n g s i t e s i n b o t h s p e c i e s - s p e c i f i c p r i m e r s a m p l i fi e d p o r t i o n a n d e n t i r e I T S r e g i o n . 2 7 3 0 E H p a I I 3 + I ' — o l ‘ ‘ - A m § § § ' . 3 5 I ! r : ( I . - — N o n v t o t o N 0 0 a ) 9 g U 2 ” f l 3 < I - I n ' — 4 . I B e s s s o s 1 - t r 0 : v - N n v I n t o l \ ( D o n v — a : F i g u r e 5 . 7 R e s t r i c t i o n d i g e s t s o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y R K A 1 - R K A p r i m e r s f r o m n e e d l e s . D N A e x t r a c t e d f r o m y e a r o l d n e e d l e s o f a B l u e s p r u c e ( L a n e s 1 - 3 ) , b l a c k s p r u c e ( L a n e s 4 - 5 ) a n d e n g e l m a n n s p r u c e ( L a n e 6 ) c a r r y i n g f r u i t i n g b o d i e s o r s y m p t o m s o f R . k a l k h o f fi i , a n d c u r r e n t y e a r n e e d l e s o f b l u e ( L a n e 7 - 8 ) a n d b l a c k s p r u c e ( L a n e 9 - 1 0 ) . R K A 1 - U r e p r e s e n t s U n c u t P C R o f R . k a l k h o f fi i p r o d u c t s a m p l i fi e d b y t h e p r i m e r s . R K A - A T C C w a s n o t c u t b y H p a l l d u e t o a d e l e t i o n i n t h e I T S s e q u e n c e a t t h e c u t t i n g s i t e . 2 7 4 F i g u r e 5 . 7 . c o n t ’ d 2 7 5 T e s t i n g o f R . p i n i p r i m e r s i n P C R f o r s p e c i fi c i t y d e t e r m i n a t i o n a n d d e t e c t i o n i n n e e d l e s D i r e c t P C R a s s a y s u s i n g p r i m e r p a i r R P I N 1 - R P I N 4 w e r e t e s t e d a t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s 5 6 , 5 8 a n d 6 0 C . T h e p r i m e r s a m p l i f i e d a l l R h i z o s p h a e r a s p e c i e s a t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s 5 6 C a n d 5 8 C a l t h o u g h a m p l i f i c a t i o n w i t h R . p i n i D N A a l w a y s p r o d u c e d s t r o n g e r b a n d s . A t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e 6 0 , p r i m e r s a m p l i fi e d D N A o f o n l y R . p i n i ( F i g u r e 5 . 8 A ) p r o d u c i n g P C R p r o d u c t o f 3 9 2 b p . T h e p r i m e r a m p l i fi e d t h e t a r g e t D N A i n i n f e c t e d n e e d l e s w i t h f r u i t i n g b o d i e s o r s y m p t o m s i n d i r e c t P C R a m p l i fi c a t i o n s . T h e r e w a s n o c r o s s - r e a c t i o n w i t h fi r o r s p r u c e D N A i n f e c t e d b y R . k a l k h o f fi i . . A m p l i fi c a t i o n w i t h D N A f r o m g r e e n a l i v e n e e d l e s e s p e c i a l l y w a s h i g h l y e f f e c t i v e a n d r e p r o d u c i b l e c o m p a r e d t o t h e D N A f r o m d e a d a n d d r y n e e d l e s . R P I N 1 a n d R P I N 4 w e r e a l s o t e s t e d i n n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s . T h e p r i m e r p a i r l o s t s p e c i fi c i t y i n n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s ( F i g u r e 5 . 8 B ) . H o w e v e r , t h e s e n s i t i v i t y o f t h e p r i m e r p a i r i n d e t e c t i o n o f R . p i n i i n c r e a s e d g r e a t l y t h e r e f o r e t h e p r i m e r s c o u l d b e u s e d f o r d e t e c t i o n o f b o t h R . p i n i a n d R . k a l k h o f fi i i n n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s a t t h e o p t i m u m a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e o f 6 0 C . 2 7 6 o z 9 D g " ' v - Q U m 3 S m A + E g D g o E E g E m 0 . é a : D u . L L . 1 u . x n : a : , a : t : I i n [ L i n d » 3 9 2 p r a 8 2 C l 3 , : o a I ' - 2 s ' 2 ‘ s 5 ' a 5 5 ' B 2 z ' - o a n o I ; n : n : n : g a : + . . . _ § 2 o g u E E E . J u _ . e t , s m a E . 2 e e I g : a t w a i t v - v - N ( ' 5 v l b : 6 i s d ; . — 3 : 5 ‘ . ‘ . — . ‘ E ‘ . . ; . s s s i r 3 9 2 b p - - ) F i g u r e 5 . 8 . T e s t i n g o f p r i m e r p a i r R P I N 1 a n d R P I N 4 f o r s p e c i fi c i t y d e t e r m i n a t i o n a n d d e t e c t i o n o f R . p i n i i n i n f e c t e d n e e d l e s i n A ) d i r e c t P C R , a n d ( B ) n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s a t o p t i m u m a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e o f 6 0 C . 2 7 7 R e s t r i c t i o n d i g e s t o f R P I N 1 a n d R P I N 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s f r o m n e e d l e s I n o r d e r t o c o n fi r m t h a t t h e i d e n t i t y o f D N A a m p l i fi e d b y t h e p r i m e r s R P I N 1 a n d R P I N 4 w a s t h a t o f R . p i n i , P C R p r o d u c t s w e r e d i g e s t e d w i t h e n z y m e s H a e I I I , H i n f l a n d D d e l w h i c h p r o d u c e d d i s t i n c t i v e f r a g m e n t p r o f i l e s f o r t h e s p e c i e s ( T a b l e 5 . 3 ) . R e s t r i c t i o n d i g e s t o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y t h e p r i m e r p a i r R P I N 1 - R P I N 4 f r o m i n f e c t e d B a l s a m a n d F r a s e r F i r p l a n t s ( F i g u r e 5 . 9 ) i n d i c a t i n g t h a t t h e P C R p r o d u c t s f r o m i n f e c t e d n e e d l e s w e r e I T S s e q u e n c e o f R . p i n i . T e s t i n g o f K a b a t i n a p r i m e r s f o r s p e c i fi c i t y I n d i r e c t P C R a m p l i f i c a t i o n s , t h e p r i m e r p a i r K J 1 - K J 4 a m p l i f i e d K . j u n i p e r i a n d K . t h u j a e I T S s e q u e n c e a t b o t h 5 8 a n d 6 0 C ( F i g u r e 5 . 1 0 A ) p r o d u c i n g a P C R p r o d u c t o f 3 5 5 . N o a m p l i f i c a t i o n w i t h P . j u n i p e n ' v o r a o r a n y o t h e r p a t h o g e n i c a n d e n d o p h y t i c f u n g i w a s o b s e r v e d . I n n e s t e d P C R , t h e p r i m e r s w e r e t e s t e d a t 6 0 , 6 4 a n d 6 6 C . T h e o p t i m u m s p e c i e s - s p e c i f i c a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e w a s d e t e r m i n e d t o b e 6 6 C ( F i g u r e 5 . 1 0 B ) . T h e p r i m e r s w e r e h i g h l y s e n s i t i v e a t t h i s t e m p e r a t u r e i n d e t e c t i n g t h e f u n g u s i n i n f e c t e d n e e d l e s . 2 7 8 l - D - : . 3 R I F F N M 4 D D - - N N l l M M R R I I F F B F - - 2 3 , l l 3 9 : 1 : 2 9 ‘ . L L . “ 9 . i 1 8 4 b p - 1 4 6 b p - - > 3 6 b p - ) D d e l H a e I I I G O O D 0 2 2 2 2 9 0 9 ” ; D 9 9 9 . 9 . E : : — — — — — — U 7 2 2 7 - 9 9 0 . D < 4 4 2 2 2 2 2 2 j . : : : ; ; : ; + . - — 5 5 5 5 5 5 5 5 < — é é é é s e g m E E E “ ' “ u ‘ u ' P - u - u - u - “ 2 ' 7 r r r - E E — _ _ M - — N r - - r - n c r \ o c _ : : ' n ' t J - é L Z E L T _ . . \ F i g u r e 5 . 9 . R e s t r i c t i o n d i g e s t s o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y R P I N 1 a n d R P I N 4 f r o m i n f e c t e d fi r n e e d l e s w e r e u s e d t o c o n fi r m t h e i d e n t i t y o f t h e I T S s e q u e n c e a s b e l o n g i n g t o R . p i n i . 1 K B + s i z e s t a n d a r d D N A l a d d e r . R P I N - 2 R . p i n i t e m p l a t e a m p l i fi e d f r o m m y c e l i u m . B F I R M l N - D a n d B F I R M I - D : T e m p l a t e D N A f r o m B a l s a m fi r n e e d l e s c o n t a i n i n g s y m p t o m s o r f r u i t i n g b o d i e s o f R . p i n i . F F l R M l - D : t e m p l a t e D N A o f f r a s e r fi r n e e d l e s w i t h s y m p t o m s o r f r u i t i n g b o d i e s o f R . p i n i . R P I N - U : u n c u t P C R p r o d u c t a m p l i fi e d b y R P I N 1 - R P I N 4 . 2 7 9 + B K 1 1 1 - A P J P U J U E U T 2 3 S N 1 4 N N N U J T J G N P K P J P D L S J - J K P A K H P R C — — - - 2 3 5 6 7 L - - — - - - 0 1 2 3 4 5 6 7 8 1 9 1 1 1 1 1 1 1 F i g u r e 5 . 1 0 . T e s t i n g o f p r i m e r s K J 1 a n d K J 4 f o r s p e c i fi c i t y i n , A ) d i r e c t P C R a n d B ) n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s . 1 K B + s i z e s t a n d a r d D N A l a d d e r . D N A t e m p l a t e s f r o m m y c e l i a o f K . j u n i p e r i ( K J ) , K . t h u j a e ( K T ) , P . j u n i p e r o v o r a ( P J ) , H . d e m a t i o i d e s ( H D ) , A . p u l l u l a n s ( A P ) , P . g a u m a n n i i ( P G ) , R . k a l k h o f fi i ( R K A - ) , C . n i v e u m ( C N ) , L . p i n a s t n ' ( L P ) , D . p i n i ( D P ) , L . j u n i p e n ' n u m ( L J ) , 8 . p y t h i o p h i l a ( S P ) , P e s t a l o t i o p s i s s p . ( P E S T ) , u n i d e n t i fi e d f u n g i ( J U N 1 - 6 ) w e r e t e s t e d . 2 8 0 D e n a : A n n e n e s fi a n e e d l K . j u l c o l e c p u n k a n d l g r e e l P r e v i l fi s e z s u s ; D l l A a n d 9 m ; ” 9 8 1 t h H t W e r e C o g H o w ’ e D c > a S S a D e t e c t i o n o f K . j u n i p e r i b y K J 1 a n d K J 4 p r i m e r s i n i n f e c t e d n e e d l e s A n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s 6 0 a n d 6 6 w e r e t e s t e d f o r p r i m e r s K J 1 a n d K J 4 i n n e s t e d a n d d i r e c t P C R a m p l i fi c a t i o n s r e s p e c t i v e l y . D N A e x t r a c t e d f r o m b o t h n e e d l e s a n d s t e m s o f o n e y e a r o l d j u n i p e r s w i t h s y m p t o m s a n d f r u i t i n g b o d i e s o f K . j u n i p e r i a n d a l s o f r o m b l i g h t e d n e e d l e s o f c u r r e n t y e a r f o l i a g e t h a t w e r e c o l l e c t e d i n M a y , w e r e u s e d a s t e m p l a t e t o t e s t s e n s i t i v i t y o f d e t e c t i o n . T h e p r i m e r p a i r d e t e c t e d K . j u n i p e r i i n a m a j o r i t y o f t h e s a m p l e s t e s t e d i n b o t h n e s t e d a n d d i r e c t P C R a m p l i fi c a t i o n s ( F i g u r e 5 . 1 1 A , B ) . A m p l i f i c a t i o n f r o m c u r r e n t y e a r g r e e n n e e d l e s w a s e s p e c i a l l y c o n s i s t e n t a n d c o m p a r e d t o o l d n e e d l e s f r o m p r e v i o u s y e a r s i n d i c a t i n g t h a t p r i m e r s c a n d e t e c t t h e p a t h o g e n a t e a r l y s t a g e s o f d i s e a s e d e v e l o p m e n t . D e t e c t i o n a s s a y s w e r e a l s o c a r r i e d w i t h j u n i p e r s a m p l e s s u s p e c t e d o f t i p b l i g h t s f r o m 2 d i f f e r e n t l o c a t i o n s i n M i c h i g a n . E i g h t s e p a r a t e D N A e x t r a c t i o n s w e r e p r e p a r e d f r o m s a m p l e s o f b o t h l o c a t i o n s a n d b o t h n e s t e d a n d d i r e c t P C R w e r e p e r f o r m e d . D N A f r o m u n i n f e c t e d n e e d l e s w a s a l s o e x t r a c t e d . T h e p r i m e r s d e t e c t e d a n d i d e n t i fi e d t h e p a t h o g e n s i n t h e m a j o r i t y o f n e e d l e s f r o m O t t a w a C o u n t y i n b o t h d i r e c t a n d n e s t e d P C R ( F i g u r e 5 . 1 2 . A ) w h i l e n o a m p l i fi c a t i o n o c c u r r e d w i t h s a m p l e s f r o m W e x f o r d c o u n t y . T h e r e s u l t s w e r e c o n s i s t e n t w i t h t h e i n t e r p r e t a t i o n t h a t t i p b l i g h t i n s a m p l e s f r o m W e x f o r d C o u n t y w a s c a u s e d b y P . j u n i p e r o v o r a ( F i g u r e 5 1 3 8 ) , r a t h e r t h a n K a b a t i n a . H o w e v e r , f u r t h e r t e s t i n g o f t h e s a m p l e s w i t h P . j u n i p e r o v o r a s p e c i fi c p r i m e r s i s r e p o r t e d b e l o w . N o a m p l i fi c a t i o n w i t h u n i n f e c t e d n e e d l e s w a s o b s e r v e d i n a n y a s s a y . 2 8 1 9 9 9 9 9 9 9 0 0 . A o o o o o . — : . : ‘ — ‘ I z z z z z g g — E . 2 2 2 2 2 2 2 5 2 z § 3 2 2 3 3 3 3 2 3 + Q , I ? , . fi fi — P fi 2 7 m F N M V U S C b N é d I E ¥ 0 0 0 0 0 0 0 9 9 3 9 9 9 0 9 E z ' é z ' v ' r ' r ' r ' 0 0 0 0 0 0 0 ‘ 2 2 2 2 2 _ _ I I 3 2 2 2 2 2 2 2 2 3 2 2 2 2 2 5 2 2 2 + 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 : F e a a e a a p a a e z fi é é i ’ é g m d ’ F i g u r e 5 . 1 1 . D e t e c t i o n o f K . j u n i p e r i b y K J 1 - a n d K J 4 i n j u n i p e r n e e d l e s . A ) D e t e c t i o n i n d i r e c t P C R a t 6 0 C ( A ) a n d B ) i n n e s t e d P C R a t 6 6 C . 1 K B + : s i z e s t a n d a r d D N A l a d d e r , K J : T e m p l a t e D N A o f K . j u n i p e r i f r o m m y c e l i u m . J U N N C - D a n d J U N M l 1 - D : T e m p l a t e D N A f r o m i n f e c t e d n e e d l e s c o n t a i n i n g f r u i t i n g b o d i e s o r s y m p t o m s o f K . j u n i p e r i f r o m N . C a r o l i n a a n d M i c h i g a n , r e s p e c t i v e l y . J U N - H : D N A f r o m u n i n f e c t e d j u n i p e r f o l i a g e . 2 8 2 D - 2 l M N U J - 1 D - 2 l M N U J - D - 2 I M N U J - 2 3 D - 2 I M N U J - 5 D D - - 2 2 I l M M N N U U J J - - 6 7 D - Z I M N U J - B D D - — 3 3 l M N U J - I M N U J 1 2 K J J U N - H 9 2 2 Z 3 7 ‘ 1 3 5 “ “ A ‘ u fi ‘ u “ . ~ . a ~ 9 2 5 z 3 7 3 - J U N M l 3 - D 8 - J U N M I 3 - D 4 — J U N M l 3 - D 5 - J U N M l 3 - D v 6 — J U N M l 3 - D § 2 2 3 5 5 b p - - ) F i g u r e 5 . 1 2 . D e t e c t i o n o f K . j u n i p e r i i n n e e d l e s f r o m j u n i p e r s g r o w n i n M i c h i g a n . N e e d l e s a m p l e s f r o m O t t a w a ( A ) a n d W e x f o r d ( B ) C o u n t y . I 1 K B + : s i z e s t a n d a r d D N A l a d d e r . K J : D N A e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m o f K . j u n i p e r i . J U M M I 2 a n d J U M M I 3 : D N A e x t r a c t e d f r o m K . j u n i p e r i i n f e c t e d n e e d l e s f r o m O t t a w a a n d W e x f o r d C o u n t y r e s p e c t i v e l y . 2 8 3 D D D c . ‘ D D N . 5 - — o g - 3 , _ 3 2 2 z 2 2 E : 1 : g - , g E 5 z z 3 K 2 2 , X G a ‘ 2 9 . 2 g A F " ' N M v I ! ) ( b I ; a ) m . — 3 1 3 b p - ) 4 2 b p - - ) . 1 4 - K J - M l 5 - J U N M I 1 - D 6 J U N M I 1 o 7 - J U N N C - D fl r 8 - J U N N C - D 9 J U N M 1 2 o 1 0 J U N M I 2 — D F i g u r e 5 . 1 3 . R e s t r i c t i o n d i g e s t s o f P C R p r o d u c t s a m p l i f i e d b y t h e p r i m e r p a i r K J 1 a n d K J 4 f r o m D N A e x t r a c t e d f r o m i n f e c t e d j u n i p e r f o l i a g e u s i n g A ) H p a l l , a n d B ) F n u 4 H a t 3 7 C . D i g e s t p a t t e r n s w e r e v e r i fi e d t h a t D N A e x t r a c t s c o n t a i n e d I T S s e q u e n c e o f K . j u n i p e r i . 1 K B + : s i z e s t a n d a r d D N A l a d d e r . K J - U : u n c u t D N A o f K . j u n i p e r i e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m . K J a n d K J - M I : K a b a t i n a j u n i p e n ' D N A e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m o f N . C a r o l i n a a n d M i c h i g a n i s o l a t e s . L a n e s 5 - 6 : D N A e x t r a c t e d f r o m i n f e c t e d n e e d l e s f r o m N . C a r o l i n a a n d M i c h i g a n ( O t t a w a a n d l n g h a m C o u n t i e s ) . 2 8 4 R e s t r i c t i o n d i g e s t s o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d f r o m j u n i p e r s P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y t h e p r i m e r p a i r K J 1 a n d K J 4 p r i m e r s f r o m i n f e c t e d j u n i p e r s w e r e d i g e s t e d w i t h r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e s H p a l l a n d F n u 4 H t o v e r i f y w h e t h e r t h e P C R p r o d u c t s w e r e t h e I T S s e q u e n c e s o f K . j u n i p e r i . R e s t r i c t i o n d i g e s t s w i t h b o t h e n d o n u c l e a s e s p r o v i d e d t h a t t h e p r i m e r p a i r d e t e c t e d K . j u n i p e r i i n j u n i p e r f o l i a g e f r o m p l a n t s f r o m N o r t h C a r o l i n a a n d M i c h i g a n ( O t t a w a a n d l n g h a m C o u n t i e s ) ( F i g u r e 5 . 1 3 B ) . T e s t i n g o f P h o m o p s i s j u n i p e r o v o r a p r i m e r s f o r s p e c i fi c i t y T o i d e n t i f y a n d d i f f e r e n t i a t e P h o m o p s i s b l i g h t f r o m K a b a t i n a b l i g h t s o f j u n i p e r s , p r i m e r s d e s i g n e d f r o m I T S s e q u e n c e s o f P . j u n i p e r o v o r a w e r e t e s t e d a g a i n s t D N A o b t a i n e d f r o m m y c e l i u m o f f u n g i u s e d i n t h i s s t u d y i n b o t h d i r e c t a n d n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s a t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e o f 6 0 C . N o c r o s s - r e a c t i o n w i t h a n y o f t h e f u n g i t e s t e d o c c u r r e d ( F i g u r e 5 . 1 4 A ) . T h e p r i m e r s w e r e a l s o t e s t e d i n n e s t e d P C R t o d e t e r m i n e i f t h e r e w o u l d b e a n y c h a n g e i n s p e c i f i c i t y a n d s e n s i t i v i t y . T h e s e n s i t i v i t y i n c r e a s e d a n d t h e s p e c i fi c i t y r e m a i n e d h i g h i n n e s t e d P C R w i t h a n a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e o f 6 0 C ( F i g u r e 5 . 1 4 B ) . 2 8 5 H - N 1 1 - A K T S 1 K N U 2 3 4 5 6 K K K K K N N N N N P - G E U U U U U U D p P R P P J J J J J J T T L L c J J J - - J J - 1 P P K K K H s - A - - - - - - - - — - - - - - 2 - - — - 0 1 3 9 4 5 6 7 8 2 3 5 1 1 1 4 7 a 1 9 1 1 1 1 0 1 1 2 2 s ; 4 5 5 b p - - ) F i g u r e 5 . 1 4 . S p e c i fi c i t y d e t e r m i n a t i o n o f p r i m e r s P J 1 a n d P J 4 i n A ) d i r e c t P C R B ) a n d n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n w i t h D N A o f r e l a t e d f u n g i a t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s o f 6 0 C . 1 K B + s i z e s t a n d a r d D N A l a d d e r . D N A t e m p l a t e s f r o m m y c e l i a o f P . j u n i p e r o v o r a ( P J ) , K . j u n i p e r i ( K J ) , K . t h u j a e ( K T - ) , H . d e m a t i o i d e s ( H D ) , S . p y t h i o p h i l a ( S P ) , A . p u l l u l a n s ( A P ) , R . k a l k h o f f i i ( R K A - ) , L . j u n i p e n ' n u m ( L J ) , L . p i n a s t n ' ( L P ) , C . n i v e u m ( C N ) , P . g a u m a n n i i ( P G ) , P e s t a l o t i o p s i s s p . ( P E S T ) , u n i d e n t i fi e d f u n g i ( J U N 1 - 6 ) , a n d u n i n f e c t e d j u n i p e r f o l i a g e ( J U N - H ) w e r e t e s t e d . 2 8 6 7 - l 0 0 / I 8 - 1 0 0 0 / 1 _ . . . . _ C “ I ‘ - 3 \ \ o o o — V " u n T N V 1 — N f ' i f V 1 \ 0 F i g u r e 5 . 1 5 . S e n s i t i v i t y o f t h e p r i m e r s i n d e t e c t i n g t h e t a r g e t i n n e e d l e s w a s t e s t e d i n m i x t u r e o f p l a n t a n d f u n g a l D N A t e m p l a t e a t v a r y i n g c o n c e n t r a t i o n s a t 6 0 C . I n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s o f p l a n t a n d f u n g a l D N A ( 1 / 1 ) w e r e 1 0 n g l p l a n d 1 . 2 n g / p l r e s p e c t i v e l y . 2 8 7 H - N U J ‘ 5 H - N U 1 6 8 J 7 2 4 3 5 + B K J 1 P F i g u r e . 5 . 1 6 . D e t e c t i o n o f P . j u n i p e r o v o r a b y p r i m e r s P J 1 a n d P J 4 ) i n j u n i p e r f o l i a g e . A . D N A e x t r a c t e d f r o m 8 r e p l i c a t e d s a m p l i n g s o f j u n i p e r f o l i a g e o b t a i n e d f r o m O t t a w a C o u n t y ( J U N M I Z - D ) a n d t e s t e d b o t h i n d i r e c t a n d n e s t e d P C R . B . D N A e x t r a c t e d f r o m 8 r e p l i c a t e d s a m p l i n g s o f j u n i p e r f o l i a g e r e c e i v e d f r o m W e x f o r d C o u n t y ( J U N M I 3 - D ) t e s t e d i n d i r e c t P C R . C . T h e s a m e 8 s a m p l e s f r o m W e x f o r d C o u n t y t e s t e d i n n e s t e d P C R . 1 K B + : s i z e s t a n d a r d D N A l a d d e r . P J : D N A e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m o f P . j u n i p e r o v o r a . J U N - H : D N A f r o m u n i n f e c t e d f o l i a g e o f j u n i p e r . 2 8 8 D e t e c t i o n o f P . j u n i p e r o v o r a b y P J 1 a n d P J 4 i n i n f e c t e d n e e d l e s T h e s e n s i t i v i t y o f t h e p r i m e r p a i r P J 1 - P J 4 w a s t e s t e d b y m i x i n g j u n i p e r D N A f r o m c u r r e n t y e a r g r e e n n e e d l e s w i t h D N A o f P . j u n i p e r o v o r a m y c e l i u m a t v a r y i n g r a t i o s i n a d i l u t i o n s e r i e s . I n i t i a l c o n c e n t r a t i o n o f p l a n t D N A w a s 1 0 n g / p l , a n d f u n g a l D N A w a s 1 . 2 n g / p l . T h e f u n g a l D N A w a s d e t e c t e d a t c o n c e n t r a t i o n s o f a s l o w a s 2 5 - 5 0 p g / p l i n t h e p r e s e n c e o f p l a n t D N A , i n d i c a t i n g t h e p r i m e r s w e r e h i g h l y s e n s i t i v e f o r d e t e c t i o n o f t h e t a r g e t f u n g u s ( F i g u r e 5 . 1 5 ) T h e p r i m e r p a i r P J 1 - P J 4 d e t e c t e d P . j u n i p e r o v o r a i n s e v e r a l o f t h e j u n i p e r s a m p l e s i n d i r e c t P C R a m p l i fi c a t i o n s , e s p e c i a l l y w i t h D N A d i l u t i o n s o f 1 0 3 ( F i g u r e 5 . 1 6 A , B ) . D N A e x t r a c t e d f r o m y o u n g i n f e c t e d n e e d l e s y i e l d e d s t r o n g P C R p r o d u c t s i n d i c a t i n g t h a t r e s i d u a l p l a n t c o m p o u n d s i n t h e D N A p r e p d o n o t i n h i b i t t h e a m p l i fi c a t i o n s a n d t h a t t h e p r i m e r s c o u l d b e u s e d f o r e a r l y d e t e c t i o n o f t h e f u n g u s . N e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n g r e a t l y i n c r e a s e d t h e s e n s i t i v i t y o f d e t e c t i o n o f P . j u n i p e r o v o r a f r o m t h e p l a n t s a m p l e s ( F i g u r e 5 . 1 6 C ) . N o c r o s s - r e a c t i o n w i t h D N A f r o m h e a l t h y n e e d l e s w a s o b s e r v e d . R e s t r i c t i o n D i g e s t s o f P J 1 a n d P J 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s f r o m n e e d l e s T o c o n fi r m t h a t t h e P C R p r o d u c t s a m p l i f i e d b y t h e p r i m e r p a i r P J 1 - P J 4 c o r r e s p o n d e d t o I T S s e q u e n c e o f P . j u n i p e r o v o r a , P C R p r o d u c t s w e r e d i g e s t e d w i t h B s t N I . B s t N l d i g e s t s p r o d u c e d t h e t h r e e d i s t i n g u i s h i n g f r a g m e n t s ( 3 3 2 , 6 5 a n d 4 5 b p ) t h a t v e r i fi e d t h a t j u n i p e r s a m p l e s c o n t a i n e d P . j u n i p e r o v o r a ( F i g u r e 2 8 9 5 . 1 7 ) . S p e c i fi c i t y d e t e r m i n a t i o n o f s p e c i e s - s p e c i fi c p r o b e s i n d o t b l o t a s s a y s O l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s R K A 1 a n d R K A 4 b o t h w e r e t e s t e d a t h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e o f 5 5 C i n d o t - b l o t a s s a y s . B o t h p r o b e s h y b r i d i z e d o n l y w i t h D N A f r o m R . k a l k h o f fi i ( F i g u r e 5 . 1 8 A a n d B ) . N o h y b r i d i z a t i o n t o t h e D N A o f a n y o t h e r p a t h o g e n i c o r e n d o p h t i c f u n g i w a s o b s e r v e d . S i m i l a r l y , o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s K J 1 a n d K j 4 b o t h h y b r i d i z e d t o t h e D N A o f K a b a t i n a t h u j a e a t o p t i m u m h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e o f 5 7 C ( F i g u r e 5 . 1 9 A , B ) . W e a k h y b r i d i z a t i o n s o f K J 1 o c c u r r e d w i t h D N A o f H . d e m a t i o i d e s a f t e r 2 d a y s e x p o s u r e b u t t h e s e r e a c t i o n s w e r e n o t s u f fi c i e n t t o h i n d e r i n t e r p r e t a t i o n o f t h e d o t - b l o t a s s a y . P r o b e K J 4 w a s n o t v e r y s p e c i f i c i n d o t - b l o t a s s a y s ( F i g u r e 5 . 2 0 B ) . 2 9 0 T T U U + B U C C - - - J J J K - P - P P 1 1 2 3 " F i g u r e 5 . 1 7 . B s t N l e n z y m e d i g e s t s o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d f r o m i n f e c t e d j u n i p e r n e e d l e s ( J U N M l 3 - D ) u s i n g t h e p r i m e r p a i r b y P J 1 - P J 4 . P J - U a n d P J - C U T : u n c u t a n d c u t P C R p r o d u c t s o f P . j u n i p e r o v a a m p l i f i e d f r o m D N A e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m . L a n e s 1 - 8 : P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d f r o m 8 r e p l i c a t e d s a m p l i n g s o f j u n i p e r f o l i a g e r e c e i v e d f r o m W e x f o r d C o u n t y ( J U N M l 3 - D ) . 2 9 1 T R K A - 1 K A P G 0 d . [ L z 2 I < o x o o 3 E < 5 5 A . . ‘ 7 N I n L ) . . - o < o D . : 1 § . ‘ 7 x o 2 I fi t 0 o r 9 E E 8 Q I t 4 t r ' - N m V ' 0 “ ' 3 I ; c o 0 ' ) 9 2 5 1 ‘ F i g u r e 5 . 1 8 . S p e c i fi c i t y d e t e r m i n a t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s R K A 1 ( A ) , a n d R K A 4 ( B ) a t o p t i m u m h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e o f 5 5 C i n d o t - b l o t a s s a y s o f I T S 1 F - I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s o f v a r i o u s c o n i f e r f u n g i . 1 0 0 n g P C R p r o d u c t s w e r e b l o t t e d o n t o e a c h m e m b r a n e . M e m b r a n e s w e r e e x p o s e d f o r 1 2 - 2 4 h o u r s . H D = H . d e m a t i o i d e s , A P = A . p u l l u l a n s , D P = D . p i n i , K T - = K . t h u j a e , R K A - = R . k a l k h o f fi i , P G = P . g a u m a n n i i , C N = C . n i v e u m , C M = C . m i n u s , L S = L . s e d i t i o s u m , L P = L . p i n a s t n ' , S P : S . p y t h i o p h i l a . 2 9 2 P A P G 1 - A K C C T A - D P S P M M D P R H R L L C C ' 7 t - 0 x a . F i g u r e 1 9 . S p e c i f i c i t y d e t e r m i n a t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s K J 1 ( A ) , a n d K J 4 ( B ) a t o p t i m u m h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e o f 5 7 C i n d o t - b l o t a s s a y s o f I T S 1 F — I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s o f v a r i o u s c o n i f e r f u n g i . 2 9 3 D I S C U S S I O N I n t h i s s t u d y , w e s e q u e n c e d a n d d e v e l o p e d s p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r s f r o m i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r r e g i o n s o f r i b o s o m a l D N A f o r P C R a s s a y s f o r d e t e c t i o n , i d e n t i fi c a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f R . k a l k h o f fi i , R . p i n i , K . j u n i p e n ' a n d P . j u n i p e r o v o r a , w h i c h c a u s e i m p o r t a n t f o l i a r d i s e a s e s o f s p r u c e , b a l s a m a n d f r a s e r fi r a n d j u n i p e r s , r e s p e c t i v e l y . T h e R h i z o s p h a e r a s p e c i e s i n f e c t n e w e m e r g i n g n e e d l e s e a r l y i n t h e g r o w i n g s e a s o n , s t a y l a t e n t a n d d o n o t f o r m i d e n t i fi a b l e f r u i t i n g b o d i e s u n t i l t h e s p r i n g o f t h e f o l l o w i n g y e a r . F u r t h e r m o r e , i t i s d i f fi c u l t t o d i f f e r e n t i a t e t h e s e d i s e a s e s i n t h e e a r l y s t a g e s b y d i s e a s e s y m p t o m s . H o w e v e r , e a r l y d e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n i s c r u c i a l f o r t h e d e v e l o p m e n t o f a c e r t i fi c a t i o n s y s t e m f o r n u r s e r y s e e d l i n g s a n d s t o c k s o f s p r u c e a n d fi r b e f o r e s h i p p i n g f o r o u t p l a n t i n g . K . j u n i p e n ' a n d P . j u n i p e r o v o r a c a u s e s i m i l a r a p p e a r i n g d i s e a s e s y m p t o m s o n j u n i p e r s t h a t h i n d e r a c c u r a t e d i a g n o s i s . E a r l y d e t e c t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n i s i m p o r t a n t i n m a n a g e m e n t a n d c o n t r o l o f t h e d i s e a s e s a n d p r o d u c t i o n o f h e a l t h y n u r s e r y p l a n t s . T h e P C R a s s a y s d e v e l o p e d h e r e w e r e r e l i a b l e n o t o n l y f o r i d e n t i f i c a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f t h e f u n g a l s p e c i e s b u t a l s o f o r d e t e c t i o n o f t h e p a t h o g e n s i n t h e s y m p t o m l e s s p l a n t t i s s u e s . P r i m e r p a i r s c o n s i s t e n t l y a m p l i fi e d s p e c i e s - s p e c i fi c f r a g m e n t s f r o m t h e i r r e s p e c t i v e t a r g e t f u n g i i n p l a n t e x t r a c t s . P r i m e r s a l s o d i f f e r e n t i a t e d R . k a l k h o f fi i a n d K . j u n i p e r i f r o m t h e i r m o s t c l o s e l y r e l a t e d s p e c i e s f u n g i i n d o t - b l o t a s s a y s a t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s f o r o p t i m a l s p e c i fi c i t y . V a r i a b i l i t y i n t h e s e q u e n c e s o f t h e r D N A I T S r e g i o n a m o n g s p e c i e s o f a 2 9 4 g e n u s w a s e x p l o i t e d t o d e s i g n s p e c i e s s p e c i fi c p r i m e r s f o r d e t e c t i o n o f t h e f u n g a l p a t h o g e n s , a n a p p r o a c h t h a t h a s b e e n u t i l i z e d b y o t h e r s ( N a z a r e t a l . 1 9 9 1 , T i s s e r a t e t a l . 1 9 9 4 ; a n d L a n g r e l l e t a l . 2 0 0 2 ) . W e f o u n d l i t t l e v a r i a b i l i t y i n t h e I T S r e g i o n a m o n g d i f f e r e n t i s o l a t e s o f R h i z o s p h a e r a k a l k h o f fi i a n d e v e n a m o n g d i f f e r e n t s p e c i e s o f R h i z o s p h a e r a ( 1 - 3 % ) e x c e p t R . k o b a y a s h i t h a t s h a r e d o n l y 8 5 % s e q u e n c e s i m i l a r i t y . S i m i l a r l y , t h e r e w a s l i t t l e s e q u e n c e d i v e r g e n c e ( 1 % ) b e t w e e n t h e t w o s p e c i e s o f K a b a t i n a K . j u n i p e r i a n d K . t h u j a e m a k i n g i t d i f fi c u l t t o d e s i g n d i f f e r e n t i a l p r i m e r s . H o w e v e r , t h e I T S r i b o s o m a l D N A o f K a b a t i n a s p e c i e s s h a r e d l e s s t h a n 8 0 % s e q u e n c e s i m i l a r i t y w i t h P . j u n i p e r i w h i c h l e d t o e a s y d e v e l o p m e n t o f d i f f e r e n t i a l a s s a y s t o d e t e r m i n e t h e c a u s a l a g e n t s o f j u n i p e r t i p b l i g h t s . T h e s p e c i e s - s p e c i f i c p r i m e r s w e r e d e v e l o p e d f o r p l a n t p a t h o g e n i c f u n g i a n d h a v e p r o v e n t o b e u s e f u l e i t h e r i n d i r e c t o r n e s t e d P C R a m p l i f i c a t i o n s o f t h e t a r g e t o r g a n i s m f r o m i n f e c t e d p l a n t t i s s u e s . F u r t h e r m o r e , r e s t r i c t i o n d i g e s t s o f t h e P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y s p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r p a i r s h a v e h e l p e d t o c o n fi r m t h e i d e n t i t y o f t h e a m p l i c o n s a n d r e l a t e d t h e m t o t h e i r t a r g e t D N A . U s i n g t h e h o m o l o g o u s r e g i o n s a m o n g R . k a l k h o f fi i s o l a t e s , w e d e s i g n e d a s p e c i fi c p r i m e r p a i r ( R K A 1 - R K A 4 ) t h a t i n b o t h d i r e c t a n d n e s t e d P C R a m p l i f i c a t i o n s o f D N A e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m a t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e o f 5 4 C a m p l i f i e d o t h e r R h i z o s p h a e r a s p e c i e s , R . o u d e m a n s i i a n d R , m a c r o s p o r a . H o w e v e r , f o r p r a c t i c a l u s e c r o s s - r e a c t i o n s a r e o f l i t t l e i m p o r t a n c e b e c a u s e t h e l a t t e r t w o s p e c i e s o f R h i z o s p h a e r a o c c u r i n s p e c i e s o f s i l v e r fi r t h a t a r e r a r e l y g r o w n i n t h e L a k e s t a t e s w h e r e t h e m a j o r s p r u c e s p e c i e s a r e B l u e , B l a c k a n d E n g e l m a n n s p r u c e s 2 9 5 ( J o n g a n d E d w a r d , 1 9 9 1 ; M e r r i l l a n d K i s t l e r , 1 9 7 7 ; N i c h o l s e t a l . 1 9 7 4 ) . S u r p r i s i n g l y , n o a m p l i fi c a t i o n o c c u r r e d w i t h D N A f r o m i s o l a t e s o f R . p i n i e v e n t h o u g h t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o f u n g i w a s o n l y o n e i n s e r t i o n ( T ) a n d o n e b a s e s u b s t i t u t i o n ( A r e p l a c e d w i t h G ) i n t h e p r i m e r s e q u e n c e s . O u r r e s u l t s s h o w e d t h a t a s p e c i e s - s p e c i f i c p r i m e r p a i r c o u l d b e a n i m p o r t a n t t o o l i n P C R a m p l i fi c a t i o n d i f f e r e n t i a t i n g R . k a l k h o f fi i f r o m R . p i n i . S i n c e t h e y h a v e s i m i l a r c u l t u r a l a n d m o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d c a u s e s i m i l a r s y m p t o m s ( F u n k , 1 9 8 5 ; D i a m a n d i s a n d M i n t e r , 1 9 8 0 a , b ) . U s i n g s p e c i fi c p r i m e r p a i r R K A 1 - R K A 4 , w e d e t e c t e d R . k a l k h o f fi i i n f e c t i o n s i n d i r e c t P C R o f n e e d l e s w i t h s y m p t o m s o f d i s e a s e b e f o r e d i a g n o s t i c f r u i t i n g b o d i e s w e r e f o r m e d . H o w e v e r , n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s w e r e m o r e s e n s i t i v e a n d e v e n d e t e c t e d l a t e n t , s y m p t o m l e s s i n f e c t i o n s a s e a r l y a s M a y , j u s t a f t e r b u d b r e a k . R e s t r i c t i o n d i g e s t s w i t h H p a l l , F n u 4 H a n d D d e l w e r e u s e f u l i n i d e n t i f y i n g a m p l i c o n s a s I T S s e q u e n c e s o f R . k a l k h o f fi i i n s y m p t o m l e s s i n f e c t e d n e e d l e s . P C R a n d r e s t r i c t i o n e n z y m e r e s u l t s s h o w e d t h a t p r i m e r d e t e c t i o n i s r e l i a b l e a n d c a n r e p l a c e t h e c u r r e n t m e t h o d o f i d e n t i fi c a t i o n o f t h i s d i s e a s e b a s e d o n p r e s e n c e o f f r u i t i n g b o d i e s t h a t a r e p r o d u c e d i n t h e s p r i n g o f s e c o n d y e a r a f t e r i n f e c t i o n o r c u l t u r i n g . C u r r e n t l y t h e m o s t i m p o r t a n t c o n t r o l p r o c e d u r e f o r R h i z o s p h a e r a n e e d l e c a s t i s t o p l a n t o n l y h e a l t h n u r s e r y s t o c k s b e c a u s e t h e s p o r e s o f t h e f u n g u s a r e r a i n - s p l a s h e d a n d s l o w t o s p r e a d . H o w e v e r , b l u e s p r u c e s e e d l i n g s f r o m n u r s e r i e s a r e i n s p e c t e d v i s u a l l y i n t h e y e a r p r i o r t o s a l e . E a r l y d e t e c t i o n w i t h p r i m e r c o u l d r e s u l t i n b e t t e r d i s e a s e c o n t r o l a n d l o w e r e c o n o m i c l o s s e s b y 2 9 6 i m p r o v i n g t i m i n g o f a p p l i c a t i o n s o f f u n g i c i d e s . R . p i n i h a s b e e n i n c r e a s i n g l y b e c o m i n g a n i m p o r t a n t p a t h o g e n o f fi r s g r o w n a s C h r i s t m a s t r e e s i n e a s t e r n U S ( A l b e r s e t a l . 1 9 9 6 ) . C h a n g i n g P C R c o n d i t i o n s a n d r a i s i n g a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s i n c r e a s e d s p e c i fi c i t y o f t h e p r i m e r p a i r R P I N 1 - R P I N 4 a n d a l l o w e d d i f f e r e n t i a t i o n o f R . p i n i f r o m o t h e r R h i z o s p h a e r a s p e c i e s i n d i r e c t P C R a t 6 0 C . S i m i l a r a d j u s t m e n t s h a v e i m p r o v e d s p e c i fi c i t y o f p r i m e r s d e v e l o p e d f o r o t h e r f u n g i ( H a m e l i n 1 9 9 7 ; H e n s o n , 1 9 9 2 ) . T h e p r i m e r s a m p l i fi e d o n l y R . p i n i a t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e o f 6 6 C b u t t h e d e t e c t i o n s e n s i t i v i t y o f t h e p r i m e r p a i r d e c r e a s e d n o t i c e a b l y w i t h n e e d l e e x t r a c t s . S i n c e o t h e r R h i z o s p h a e r a s p e c i e s h a v e n o t b e e n r e p o r t e d i n B a l s a m a n d F r a s e r fi r n e e d l e s , t h e p r i m e r s w e r e u s e d a t 6 0 C a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e f o r d e t e c t i o n o f t h e p a t h o g e n i n f o l i a g e . F u r t h e r m o r e , r e s t r i c t i o n d i g e s t s H i n fl , H a e l l l a n d D d e l h e l p e d t o v e r i f y t h a t P C R p r o d u c t s a m p l i f i e d f r o m n e e d l e s w e r e f r o m R . p i n i I T S s e q u e n c e s . A s w i t h s p r u c e n e e d l e c a s t R . k a l k h o f fi i , v i s u a l i d e n t i fi c a t i o n o f f r u i t i n g b o d i e s f o r m e d a y e a r a f t e r i n f e c t i o n i s t h e o n l y m e t h o d f o r d e t e c t i o n o f R . p i n i n e e d l e c a s t o f B a l s a m a n d F r a s e r fi r . U s e o f p r i m e r p a i r R P I N 1 - R P I N 4 e s p e c i a l l y i n n e s t e d P C R , c o u l d b e a v a l u a b l e t o o l f o r d e t e c t i o n a n d d i a g n o s i s o f e a r l y i n f e c t i o n s o f R . p i n i i n c u r r e n t y e a r n e e d l e s b e f o r e s y m p t o m s a p p e a r . E v e n t u a l l y s u c h m e t h o d o l o g y s h o u l d b e c o m e a r o u t i n e a s p e c t o f i n s p e c t i o n a n d c e r t i fi c a t i o n o f n u r s e r y s t o c k s . T h e I T S s e q u e n c e s o f K . j u n i p e r i a n d K . t h u j a e w e r e n o t v a r i a b l e e n o u g h t o a c h i e v e a s e p a r a t i o n o f t h e t w o s p e c i e s w i t h s p e c i e s - s p e c i f i c p r i m e r p a i r s . S o m e r e s e a r c h e r s c o n s i d e r t h e s e t w o f u n g i s i m i l a r e n o u g h t o b e t h e s a m e 2 9 7 s p e c i e s ( O s t r o f s k y a n d P e t e r s o n , 2 0 0 0 ) . T h e y a r e i n d i s t i n g u i s h a b l e o n n a t u r a l s u b s t r a t e s a n d t h e o n l y r e p o r t e d d i f f e r e n c e i s t h a t K . j u n i p e r i d o e s n o t f o r m f r u i t i n g b o d i e s o r a e r i a l m y c e l i u m i n c u l t u r e , r a t h e r i t r e s e m b l e s t h e c o s m o p o l i t a n fi l a m e n t o u s b l a c k y e a s t A . p u l l u l a n s ( G i b s o n a n d S u t t o n 1 9 7 6 ) . A m p l i f i c a t i o n s w i t h t h e p r i m e r p a i r K J 1 - K J 4 d e t e c t e d o f b o t h f u n g i i n j u n i p e r n e e d l e s i n b o t h n e s t e d a n d d i r e c t P C R a m p l i fi c a t i o n s . T h e p r i m e r p a i r K J 1 - K J 4 s p e c i f i c a l l y a m p l i fi e d K . j u n i p e r i D N A f r o m j u n i p e r b r a n c h e s w i t h f r u i t i n g b o d i e s , a n d f o l i a g e w i t h s y m p t o m s , a n d s u r p r i s i n g l y f r o m s y m p t o m l e s s c u r r e n t y e a r f o l i a g e . I d e n t i t y w a s v e r i fi e d w i t h r e s t r i c t i o n d i g e s t w i t h H p a l l a n d F a n l H . W e b e l i e v e t h a t d e t e c t i o n f r o m c u r r e n t y e a r g r e e n f o l i a g e w a s d e t e c t i o n o f K . j u n i p e r i a s a n e n d o p h y t e . T h e s p e c i e s h a s b e e n r e p o r t e d t o b e e n d o p h y t i c ( S c h n e i d e r , R a n d v o n A r x , 1 9 6 6 ; O s t r o f s k y , a n d P e t e r s o n , 1 9 7 7 , 1 9 8 1 ) . S i m i l a r l y , t h e s p e c i fi c p r i m e r p a i r P J 1 - P J 4 w e r e h i g h l y s e n s i t i v e f o r d e t e c t i n g P . j i n i p e r o v o r a i n i n f e c t e d y o u n g n e e d l e s , i n b o t h d i r e c t a n d n e s t e d P C R a m p l i f i c a t i o n s . P i c o g r a m s o f t a r g e t D N A w e r e d e t e c t e d w i t h o u t a n y i n h i b i t i o n b y p l a n t D N A . B s t N l d i g e s t o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d f r o m n e e d l e s c o n f i r m e d t h a t t h e p r i m e r p a i r a m p l i fi e d o n l y t h e t a r g e t f u n g u s . N o a m p l i f i c a t i o n r e s u l t e d f r o m n e i t h e r d i r e c t n o r n e s t e d a m p l i fi c a t i o n s o f u n i n f e c t e d n e e d l e s a m p l e s , w h i c h m i g h t i n d i c a t e t h a t t h i s s p e c i e s o f P h o m o p s i s i s n o t e n d o p h y t i c w h e r e a s m a n y P h o m o p s i s s p p . a r e e n d o p h y t e s ( P e t r i n i , 1 9 9 1 ; R e d l i n a n d C a r r i s , 1 9 9 6 , O k a n e e t a l . 2 0 0 2 ) . F u r t h e r m o r e m a n y e n d o p h y t e s w e r e n o t f o u n d i n c u r r e n t y e a r n e e d l e s u n t i l A u g u s t r e d u c i n g t h e p o s s i b i l i t y o f a n y c r o s s - r e a c t i o n ( J o h n s o n a n d W h i t n e y , 1 9 9 2 ) . 2 9 8 D i f f e r e n t i a t i o n a n d d e t e c t i o n o f K . j u n i p e r i a n d P . j u n i p e r i b y P C R a s s a y s h a s m a n y a d v a n t a g e s o v e r t h e t i r e s o m e v i s u a l a n d l a b o r a t o r y i d e n t i fi c a t i o n p r o c e d u r e s u s e d w i t h t h e s e f u n g i t h a t c o m m o n l y c a u s e d i s e a s e i n n u r s e r y p r o d u c t i o n o f j u n i p e r s . T h e y c a u s e s y m p t o m s s o i d e n t i c a l t h a t t h e y c a n b e d i s t i n g u i s h e d o n l y b y i d e n t i f i c a t i o n s o f f r u i t i n g b o d i e s f o r m e d t h e y e a r f o l l o w i n g i n f e c t i o n ( T i s s e r a t , 1 9 9 7 a n d T i s s e r a t , 2 0 0 1 ) . S p e c i e s - s p e c i f i c p r i m e r s d e v e l o p e d h e r e r e l i a b l y d e t e c t e d a n d d i f f e r e n t i a t e d t h e s e j u n i p e r t i p b l i g h t p a t h o g e n s f r o m i n f e c t e d f o l i a g e w i t h o u t a n y n e e d t o e x a m i n e f r u i t i n g b o d i e s o r i s o l a t e o n l a b o r a t o r y m e d i a . F u r t h e r m o r e , t h e p r i m e r p a i r c o u l d b e u s e d f o r e a r l y d e t e c t i o n o f i n f e c t i o n s o f n u r s e r y s t o c k s . S p e c i e s - s p e c i fi c p r o b e s h a v e b e e n u s e d f o r d e t e c t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f b a c t e r i a ( H a h n e t a l . , 1 9 9 3 ) a n d v i r u s e s ( S a l d e r e l l i e t a l . , 1 9 9 6 ) i n d o t - b l o t s o f t o t a l D N A f r o m i n f e c t e d t i s s u e s . T h e s e p a t h o g e n s c a n b e e a s i l y d e t e c t e d i n d o t - b l o t a s s a y s s i n c e t h e y h a v e s m a l l g e n o m e s a n d m u l t i p l y q u i c k l y i n l a r g e a m o u n t s p r o v i d i n g s u f fi c i e n t q u a n t i t i e s o f D N A f o r d e t e c t i o n . O n t h e o t h e r h a n d , f u n g i h a v e l a r g e r g e n o m e s b u t m a y c o l o n i z e p l a n t s q u i c k l y t h e n s t o p g r o w t h b e c o m i n g q u i e s c e n t a n d l a t e n t . H o w e v e r , f u n g a l g e n o m e s c o n t a i n r e p e t i t i v e s e q u e n c e s s u c h a s r i b o s o m a l D N A t h a t c o u l d b e a u s e f u l t a r g e t f o r d e t e c t i o n o f f u n g i i n d o t - b l o t s o f i n f e c t e d t i s s u e s . I n t h i s s t u d y , d o t - b l o t a s s a y s w i t h s p e c i e s - s p e c i fi c o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s l a b e l e d w i t h 3 2 F i s o t o p e s w e r e n o t s e n s i t i v e e n o u g h t o d e t e c t t h e i r t a r g e t D N A ’ s d i r e c t l y i n t h e e x t r a c t s o f i n f e c t e d n e e d l e s . H o w e v e r , a l l f o u r p r i m e r s t e s t e d h e r e w e r e s p e c i e s s p e c i fi c a t 5 5 C h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e a n d f o u r h o u r w a s a d e q u a t e t o o b t a i n s p e c i fi c h y b r i d i z a t i o n . 2 9 9 R E F E R E N C E S A l t s c h u l , S . F . , G i s h , W . , M i l l e r , W . , M y e r s , E . W . & L i p m a n , D J . 1 9 9 0 . " B a s i c l o c a l a l i g n m e n t s e a r c h t o o l . " J . M o l . B i o l . 2 1 5 : 4 0 3 - 4 1 0 A l t s c h u l , S . F . , M a d d e n , T . L . , S c h a f f e r , A . A . , Z h a n g , J . , Z h a n g , 2 . , M i l l e r , W . & L i p m a n , D J . 1 9 9 7 . " G a p p e d B L A S T a n d P S I - B L A S T : a n e w g e n e r a t i o n o f p r o t e i n d a t a b a s e s e a r c h p r o g r a m s . " N u c l e i c A c i d s R e s . 2 5 : 3 3 8 9 - 3 4 0 2 A l b e r s , M . , J . A l b e r s , J . C u m m i n g s C a r l s o n , L . H a u g e n , & N . W e n n e r . 1 9 9 6 . R h i z o s p h a e r a N e e d l e D i s e a s e o f F i r . U S D A - F S P e s t A l e r t , P u b # N A - P R - 0 6 - 9 6 . A u s u b e l , F . M . , B r e n t , R . , K i n g s t o n , R . E . , M o o r e , D . D . , S e i d m a n , J . G . , S m i t h , J . A . , a n d S t r u h l , K . 2 0 0 1 . C u r r e n t p r o t o c o l s i n m o l e c u l a r b i o l o g y . P u b l i s h e r , J o h n W i l e y & S o n s , I n c . N e w Y o r k . B e c k , J . J . , a n d L i g o n , J . M . 1 9 9 5 . P o l y m e r a s e C h a i n r e a c t i o n A s s a y s f o r t h e d e t e c t i o n o f S t a g o n o s p o r a n o d o r u m a n d S e p t o r i a t n ' t i c i i n W h e a t . P h y t o p a t h o l o g y 8 5 ( 3 ) : 3 1 9 - 3 2 4 . B o n a n t s , P . , H a g e n a a r — d e W e e d t , M . , v a n G e n t - P e l z e r , M . , L a c o u r t , l . , C o o k e , D . , a n d D u n c a n , J . 1 9 9 7 . D e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f P h y t o p h t h o r a f r a g a r i a e H i c k m a n b y t h e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n . E u r o p e a n J o u r n a l o f P l a n t P a t h o l o g y 1 0 3 : 3 4 5 - 3 5 5 . B r u n s , T . D a n d G a r d e s , M . 1 9 9 3 . M o l e c u l a r t o o l s f o r t h e i d e n t i f i c a t i o n o f e c t o m y c o r r h i z a l f u n g i - t a x o n - s p e c i fi c o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s f o r s u i l l o i d f u n g i . M o l e c u l a r E c o l o g y 2 2 2 3 3 - 2 4 2 . D i a m a n d i s , S a n d M i n t e r , D . W . 1 9 8 0 a . R h i z o s p h a e r a k a l k h o f fi i . C M I D e s c r i p t i o n o f P a t h o g e n i c f u n g i a n d B a c t e r i a N o . 6 5 7 . C o m m o n W e a l t h M y c o l o g i c a l I n s t i t u t e , K e w , S u r r e y , U K . D i a m a n d i s , S a n d M i n t e r , D . W . 1 9 8 0 b . R h i z o s p h a e r a p i n i . C M I D e s c r i p t i o n o f P a t h o g e n i c f u n g i a n d B a c t e r i a N o . 6 5 6 . C o m m o n W e a l t h M y c o l o g i c a l I n s t i t u t e , K e w , S u r r e y , U K . D i r r , M . A . 1 9 9 8 . M a n u a l o f w o o d y l a n d s c a p e p l a n t s : t h e i r i d e n t i fi c a t i o n , o r n a m e n t a l c h a r a c t e r i s t i c s , c u l t u r e , p r o p a g a t i o n a n d u s e s . 5 t h e d i t i o n . S t i p e s P u b . C h a m p a i g n , I L . F u n k , A . 1 9 8 5 . F o l i a r F u n g i o f W e s t e r n T r e e s . C a n a d i a n F o r e s t r y S e r v i c e , P a c i f i c F o r e s t r e s e a r c h C e n t r e . V i c t o r i a , B C , C a n a d a , p : 8 8 - 9 1 3 0 0 G i b s o n , I . A . S a n d S u t t o n , B . C . 1 9 7 6 . K a b a t i n a t h u j a e . C M I D e s c r i p t i o n s o f P a t h o g e n i c f u n g i a n d B a c t e r i a N o : 4 8 9 , C o m m o n W e a l t h M y c o l o g i c a l I n s t i t u t e , K e w , S u r r e y , U K . H a m e l i n , R . C . , B e r u b e , P . , G i g n a c , M . , a n d B o u r a s s a , M . 1 9 9 6 . I d e n t i fi c a t i o n o f r o o t r o t f u n g i i n n u r s e r y s e e d l i n g s b y n e s t e d m u l t i p l e x P C R . A p p l i e d a n d E n v i r o n m e n t a l M i c r o b i o l o g y 6 2 ( 1 1 ) : 4 0 2 6 - 4 0 3 1 . H a w k s w o r t h , F . G . , a n d S t a l e y , J . M . 1 9 7 8 . R h i z o s p h a e r a k a l k h o f fi i o n s p r u c e b r o o m s . P l a n t D i s e a s e R e p o r t e r . 6 2 ( 5 ) : 4 4 6 . H e n s o n , J . M . 1 9 9 2 . D N A h y b r i d i z a t i o n a n d p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( P C R ) t e s t s f o r i d e n t i fi c a t i o n o f G a e u m a n n o m y c e s , P h i a l o p h o r a a n d M a g n a p o r t h e i s o l a t e s . M y c o l o g i c a l R e s e a r c h 9 6 ( 8 ) : 6 2 9 - 6 3 6 . H u , X . , N a z a r , R . N . , a n d R o b b , J . 1 9 9 3 . Q u a n t i f i c a t i o n o f V e r t i c i l l i u m b i o m a s s i n w i l t d i s e a s e d e v e l 0 p m e n t . P h y s i o l o g i c a l M o l e c u l a r P l a n t P a t h o l o g y 4 2 : 2 3 - 3 6 . J o h a n s o n , A a n d , J . M . 1 9 9 3 . U s e o f P C R f o r d e t e c t i o n o f M y c o s p h a e r e l l a fi j i e n s i s a n d M . m u s i c o l a , t h e c a u s a l a g e n t s o f S i g a t o k a l e a f s p o t s i n b a n a n a a n d p l a n t a i n . M y c o l o g i c a l R e s e a r c h 9 7 ( 6 ) : 6 7 0 - 6 7 4 . J o n g , S . C a n d E d w a r d s , M . J . 1 9 9 1 . A m e r i c a n T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n C a t a l o g u e o f F i l a m e n t o u s F u n g i 8 t h e d i t i o n M a r a s s a s , V A . J u s w i k , J . 1 9 9 3 . M o r p h o l o g y . c u l t u r a l c h a r a c t e r i s t i c s , a n d p a t h o g e n i c i t y o f R h i z o s p h a e r a k a l k h o f fi i o n P i c e a s p p . i n N o r t h e r n M i n n e s o t a a n d W i s c o n s i n . P l a n t d i s e a s e 7 7 ( 6 ) : 6 3 0 - 6 3 4 . K a g e y a m a , K 1 9 9 7 . D e t e c t i o n o f P y t h i u m u l t i m u m u s i n g p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n w i t h s p e c i e s - s p e c i f i c p r i m e r s . P l a n t d i s e a s e 8 1 ( 1 0 ) : 1 1 5 5 - 1 1 6 0 . K u m i , J a n d L a n g , K . J . 1 9 7 9 . T h e s u s c e p t i b i l i t y o f v a r i o u s s p r u c e s p e c i e s t o R h i z o s p h a e r a k a l k h o fi i i a n d s o m e c u l t u r a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e f u n g u s i n v i t r o . E u r o p e a n J o u r n a l o f F o r e s t P a t h o l o g y 9 : 3 5 - 4 6 . L a n g r e l l , S . R . H . 2 0 0 2 . M o l e c u l a r d e t e c t i o n o f N e o n e c t r i a g a l l i g e n a ( s y n . N e c t r i a g a l l i g e n a ) . M y c o l o g i c a l R e s e a r c h 1 0 6 ( 3 ) : 2 8 0 - 2 9 2 . L e c o m t e , P . , P e r o s , J . , B l a n c a r d , 0 . , B a s t i e n , N . , a n d D e l y e , C . 2 0 0 0 . P C R a s s a y s t h a t I d e n t i f y t h e G r a p e D i e b a c k F u n g u s E u t y p a I a t a . A p p l i e d a n d E n v i r o n m e n t a l M i c r o b i o l o g y 6 6 ( 1 0 ) : 4 4 7 5 - 4 4 8 1 . L i , H . , G y l l e n s t e n , U . B . , C u i , X . , S a i k i , R . K . , E r l i c h , H . A . , a n d A r n h e i m , N . 1 9 8 8 . A m p l i fi c a t i o n a n d a n a l y s i s o f D N A s e q u e n c e s i n s i n g l e h u m a n s p e r m a n d d i p l o i d 3 0 1 c e l l s . N a t u r e 3 3 5 : 4 1 4 - 4 1 7 . L e e , S . B . , M i l g r o o m , M . G . , a n d T a y l o r , J . W 1 9 8 8 . A r a p i d , h i g h y i e l d m i n i - p r e p m e t h o d f o r i s o l a t i o n o f t o t a l g e n o m i c D N A f o r m f u n g i . F u n g a l G e n e t N e w s l e t t e r 3 5 : 2 3 - 2 4 L e e , S . B a n d T a y l o r , J . W . 1 9 9 2 . P h y l o g e n e t i c r e l a t i o n s h i p o f fi v e f u n g u s - l i k e P h y t o p h t h o r a s p e c i e s i n f e r r e d f r o m t h e i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r s o f r i b o s o m a l D N A . M o l . B i o l . E v o l . 9 : 6 3 9 - 6 5 3 . L e e , S . B . , W h i t e , T . J . , a n d T a y l o r , J . W . 1 9 9 3 . D e t e c t i o n o f P h y t o p h t h o r a s p e c i e s b y o l i g o n u c l e o t i d e h y b r i d i z a t i o n t o a m p l i fi e d r i b o s o m a l D N A s p a c e r s . P h y t o p a t h o l o g y 8 3 ( 2 ) : 1 7 7 - 1 8 1 . L e v e s q u e , C . A . , V r a i n , T . C . , a n d D e B o e r , S . 1 9 9 4 . D e v e l o p m e n t o f a s p e c i e s - s p e c i fi c p r o b e f o r P y t h i u m u l t i m u m u s i n g a m p l i fi e d r i b o s o m a l D N A . P h y t o p a t h o l o g y 8 4 ( 5 ) : 4 7 4 - 4 7 8 . L e v e s q u e , C . A . , H a r l t o n , C . E . , a n d d e C o c k , A . W . A . 1 9 9 8 . I d e n t i f i c a t i o n o f s o m e O o m y c e t e s b y r e v e r s e d o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n . P h t o p a t h o l o g y 8 8 ( 3 ) : 2 1 3 - 2 2 2 . M a z z o l a , M . , W o n g , 0 . T . , a n d C o o k , J . R . 1 9 9 6 . V i r u l e n c e o f R h i z o c t o n i a o r y z a e a n d R . s o l a n i A G - 8 o n w h e a t a n d d e t e c t i o n o f R . o r y z a e i n p l a n t t i s s u e b y P C R . P h y t o p a t h o l o g y 8 6 ( 4 ) : 3 5 4 - 3 6 0 . M a n t e r , D . K a n d L i v i n g s t o n , W . H . 1 9 9 6 . I n fl u e n c e o f t h a w i n g r a t e a n d f u n g a l i n f e c t i o n b y R h i z o s p h a e r a k a l k h o f f i i o n f r e e z i n g i n j u r y i n r e d s p r u c e ( P i c e a r u b e n s ) n e e d l e s . C a n a d i a n J o u r n a l o f F o r e s t r y R e s e a r c h 2 6 : 9 1 8 - 9 2 7 . M e r r i l l , W a n d K i s t l e r , B . R . 1 9 7 8 . A c c e l e r a t e d d e v e l o p m e n t o f R h i z o s p h a e r a n e e d l e c a s t o f b l u e s p r u c e i n P e n n s y l v a n i a . P l a n t D i s e a s e R e p o r t e r 6 2 : 3 4 - 3 5 N a z a r , R . N . , H u , X . , S c h m i d t h , J . , C u l h a m , D . , a n d R o b b , J . 1 9 9 1 . P o t e n t i a l u s e o f P C R a m p l i fi e d d e t e c t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f V e r t i c i l l i u m w i l t p a t h o g e n s . P h y s i o l o g i c a l M o l e c u l a r P l a n t P a t h o l o g y 3 9 : 1 - 1 1 N i c h o l s , T . H . , P r e y , A . J . , a n d S k i l l i n g , D . D . 1 9 7 4 . R h i z o s p h a e r a k a l k h o f fi i d a m a g e s b l u e s p r u c e C h r i s t m a s t r e e p l a n t a t i o n s . P l a n t D i s e a s e R e p o r t e r 5 8 : 1 0 9 4 - 1 0 9 6 . O k a n e , I . , N a k a g i r i , A . , a n d I t o , T . 2 0 0 2 . C a n a d i a n J o u r n a l o f B o t a n y 7 0 : 6 5 7 - 6 6 3 . O s t r o f s k y , A a n d P e t e r s o n G . W . 1 9 7 7 . O c c u r r e n c e o f K a b a t i n a j u n i p e n ' o n j u n i p e r u s v i r g i n i a n a i n E a s t e r n N e b r a s k a . P l a n t D i s e a s e R e p o r t e r 6 1 : 5 1 2 - 5 1 3 3 0 2 O s t r o f s k y , A a n d P e t e r s o n G . W . 1 9 9 8 1 . E t i o l o g y a n d c u l t u r a l s t u d i e s o f K a b a t i n a j u n i p e n ' . P l a n t D i s e a s e . 6 5 : 9 0 8 - 9 1 0 . O s t r o f s k y , A a n d P e t e r s o n G . W . 2 0 0 0 . K a b a t i n a t i p b l i g h t o f j u n i p e r s . U S D A F o r e s t r y S e r v i c e . R o c k y M o u n t a i n F o r e s t a n d R a n g e E x p e r i m e n t S t a t i o n . G e n e r a l T e c h n i c a l R e p o r t R M - 1 2 9 . p a g e : 1 1 6 - 1 1 7 O t t o , J . D . , F i e d l e r , D . J . , a n d L e n g k e e k , V . H . 1 9 8 0 . E f f e c t o f B e n o m y l o n P h o m o p s i s j u n i p e r o v o r a i n f e c t i o n o f J u n i p e r u s v i r g i n i a n a . P h y t o p a t h o l o g y 7 0 ( 1 ) : 4 6 - 5 0 . P e r r y , R . G . , a n d P e t e r s o n , J . L . 1 9 8 2 . S u s c e p t i b i l i t y a n d R e s p o n s e o f J u n i p e r s p e c i e s t o K a b a t i n a j u n i p e r i I n f e c t i o n i n N e w J e r s e y . P l a n t D i s e a s e 6 6 ( 1 2 ) : 1 1 8 9 - 1 1 9 1 . P e t e r s o n , G . W . 1 9 8 4 . R e s i s t a n c e t o P h o m o p s i s j u n i p e r o v o r a i n g e o g r a p h i c S e e d s o u r c e s o f J u n i p e r u s v i r g i n i a n a . I n R e c e n t R e s e a r c h o n C o n i f e r N e e d l e D i s e a s e s . U S D A F o r e s t S e r v i c e G e n e r a l T e c h n i c a l R e p o r t W O - 5 0 . P a g e : 6 5 - 6 9 . P e t e r s o n , G . W . 1 9 7 3 . I n f e c t i o n o f J u n i p e r u s v i r g i n i a n a a n d J . s c o p u l o r u m b y P h o m o p s i s j u n i p e r o v o r a . P h y t o p a t h o l o g y 6 3 : 2 4 6 - 2 5 1 . P e t r i n i , O . 1 9 9 1 . M i c r o b i a l E c o l o g y o f L e a v e s . N e w Y o r k : S p r i n g e r V e r l a g , p p : 1 7 9 - 1 9 7 . R e d l i n , S . C . , a n d C a r r i s , L . M . 1 9 9 6 . E n d o p h y t i c f u n g i i n g r a s s e s a n d w o o d y p l a n t s . A m e r i c a n P h y t o p a t h o l o g i c a l S o c i e t y P r e s s , S t . P a u l , M i n n e s o t a . R i s t a i n o , J . B . , M a d r i t c h , M . , T r o u t , C . L . , a n d P a r r a , G . 1 9 9 8 . P C R a m p l i f i c a t i o n o f r i b o s o m a n D N A f o r s p e c i e s i d e n t i fi c a t i o n i n t h e p l a n t p a t h o g e n g e n u s P h y t o p h t h o r a . A p p l i e d a n d E n v i r o n m e n t a l M i c r o b i o l o g y 6 4 ( 3 ) : 9 4 8 - 9 5 4 . R o b b , J . , H u , X . , P l a t t , H . , a n d N a z a r , R . 1 9 9 4 . P C R — b a s e d a s s a y s f o r t h e d e t e c t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n o f V e r t i c i l l i u m s p e c i e s i n p o t a t o , p . 8 3 - 9 0 . I n A . S c h o t s , F . M . D e w e y , a n d R P . O l i v e r ( e d , ) , M o d e r n a s s a y s f o r p l a n t p a t h o g e n i c f u n g i : i d e n t i fi c a t i o n , d e t e c t i o n a n d q u a n t i f i c a t i o n . C A B i n t e r n a t i o n a l O x f o r d . S a m b r o o k , J . , F r i t s c h , E . F . , a n d M a n i a t i s , T . 1 9 8 9 . M o l e c u l a r c l o n i n g : a l a b o r a t o r y m a n u a l 2 " d e d i t i o n . C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s , C o l d S p r i n g H a r b o r , N e w Y o r k . S a n d e r s o n , P . G a n d W o r f , G . L . 1 9 8 6 . P h o m o p s i s s h o o t b l i g h t o f c o l o r a d o b l u e s p r u c e . J o u r n a l o f E n v i r o n m e n t a l H o r t i c u l t u r e 4 ( 4 ) : 1 3 4 - 1 3 8 . S c h i l l i n g , A . G . , M o l l e r , E M , a n d G e i g e r , H . H . 1 9 9 6 . P o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n — b a s e d a s s a y s f o r s p e c i e s - s p e c i f i c d e t e c t i o n o f F u s a r i u m c u l m o r u m , 3 0 3 F . g r a m i n e a r u m a n d F . a v e n a c e u m . P h y t o p a t h o l o g y 8 6 ( 5 ) : 5 1 5 - 5 2 2 . S c h n e i d e r , R . , a n d v o n A r x , J . A . Z w e i n e u e , a l s E r r e g e r v o n Z w e i g s t e r b e n n a c h g e w i e s e n e P i l z e : K a b a t i n a t h u j a e n . g . , n . s p . , u n d K . j u n i p e r i . n . s p . P h y t o p a t h o l . Z e i s . 5 7 : 1 7 6 - 1 8 2 . S i n c l a i r , W . A . , L y o n , H . H a n d J o h n s o n , W . T . 1 9 8 9 . D i s e a s e s o f T r e e s a n d S h r u b s , 2 " d e d i t i o n . C o r n e l l U n i v e r s i t y P r e s s : C o m s t o c k P u b . A s s o c i a t e s , I t h a c a , Y o r k . p 1 4 0 - 4 1 . S k i l l i n g , D . D a n d W a d d e l l , C . D . 1 9 7 5 . C o n t r o l o f R h i z o s p h a e r a n e e d l e c a s t i n b l u e s p r u c e C h r i s t m a s t r e e p l a n t a t i o n s . P l a n t D i s e a s e R e p o r t e r 5 9 ( 1 0 ) : 8 4 1 - 8 4 3 . S m i t h , 0 . N . , D a m s t e e g t , V . 0 . , K e l l e r , C . J . , a n d B e c k , R . J . 1 9 9 3 . D e t e c t i o n o f p o t a t o I e a f r o l l v i r u s i n l e a f a n d a p h i d e x t r a c t b y d o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n . P l a n t d i s e a s e 7 7 ( 6 ) : 1 0 9 8 - 1 1 0 2 . S u t t o n , B . C . 1 9 8 0 . T h e C o e l o m y c e t e s . C A B . C o m m o n W e a l t h M y c o l o g i c a l I n s t i t u t e . K e w , S u r r e y , U K . T i s s e r a t , N . A . , H u l b e r s t . S . H . , a n d S a u e r , K . M . 1 9 9 4 . S e l e c t i v e a m p l i f i c a t i o n o f r D N A i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r r e g i o n s t o d e t e c t O p h i o s p h a e r e l l a k o r r e a a n d O . h e r p o t r i c h a . P h y t o p a t h o l o g y 8 4 ( 5 ) : 4 7 8 - 4 8 2 . T i s s e r a t , N . A a n d P a i r . J . C . 1 9 9 7 . S u s c e p t i b i l i t y o f s e l e c t e d j u n i p e r c u l t i v a r s t o c e d a r - a p p l e r u s t , K a b a t i n a t i p b i g h t , c e r c o s p o r a n e e d l e b l i g h t a n d B o t r y o s p h a e n ' a c a n c e r . J o u r n a l o f E n v i r o n m e n t a l H o r t i c u l t u r e 1 5 ( 3 ) : 1 6 0 - 1 6 3 . T i s s e r a t , N . A . , 1 9 9 7 . J u n i p e r D i s e a s e s . K a n s a s S t a t e U n i v e r s i t y A g r i c u l t u r a l E x p e r i m e n t S t a t i o n a n d C o o p e r a t i v e E x t e n s i o n S e r v i c e . T i s s e r a t , N . A . 2 0 0 1 . J u n i p e r D i s e a s e s . I n D i s e a s e s o f W o o d y O r n a m e n t a l s a n d T r e e s i n N u r s e r i e s J o n e s , R . K a n d B e n s o n , D . M . T r o u t , C . L . , R i s t a i n o , J . B . , M a d r i t c h , M . , a n d W a n g s o m b o o n d e e , T . 1 9 9 7 . R a p i d d e t e c t i o n o f P h y t 0 p h t h o r a i n f e s t a n s i n l a t e b l i g h t - i n f e c t e d p o t a t o a n d t o m a t o u s i n g P C R . P l a n t D i s e a s e 8 1 ( 9 ) : 1 0 4 2 - 1 0 4 8 . W h i t e , T . J . , B r u n s , T . , L e e , S . B . , a n d T a y l o r , J . 1 9 9 0 . A m p l i fi c a t i o n a n d d i r e c t s e q u e n c i n g o f f u n g a l r i b o s o s m a l R N A g e n e s f o r p h y l o g e n e t i c s . I n : P C R p r o t o c o l s ; A G u i d e t o M e t h o d s a n d A p p l i c a t i o n s . M . A . I n n i s , D . H . G e l f a n d , J . J . S n i n s k y , a n d T . J . W h i t e , e d s . A c a d e m i c P r e s s , S a n D i e g o , C A . P a g e s 3 1 5 - 3 2 2 . Z h a n g , J . & M a d d e n , T L . 1 9 9 7 . " P o w e r B L A S T : A n e w n e t w o r k B L A S T a p p l i c a t i o n f o r i n t e r a c t i v e o r a u t o m a t e d s e q u e n c e a n a l y s i s a n d a n n o t a t i o n . " G e n o m e R e s . 7 2 6 4 9 - 6 5 6 . 3 0 4 C H A P T E R 6 D e v e l o p m e n t a n d T e s t i n g o f O l i g o n u c l e o t i d e P r o b e s f o r D e t e c t i o n a n d I d e n t i fi c a t i o n o f S o m e F u n g a l P a t h o g e n s a n d E n d o p h y t e s o f P i n e N e e d l e s A B S T R A C T S y m p t o m l e s s i n f e c t i o n s o f p i n e n e e d l e s a r e r e s p o n s i b l e f o r e p i d e m i c s a n d e c o n o m i c l o s s e s b e c a u s e a f f e c t e d n u r s e r y s e e d l i n g s a n d s t o c k s o f t e n e s c a p e i n s p e c t i o n a n d a r e p l a n t e d b e f o r e s y m p t o m s a p p e a r . P a t h o g e n i c f u n g i i n f e c t y o u n g p i n e n e e d l e s a n d r e m a i n l a t e n t f o r u p t o 1 5 m o n t h s m a k i n g e a r l y d e t e c t i o n w i t h c o n v e n t i o n a l t e c h n i q u e s i m p o s s i b l e . W e d e s i g n e d o l i g o n u c l e o t i d e p r i m e r s f r o m i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r r e g i o n s f o r t h e m o s t d a m a g i n g a n d d e s t r u c t i v e f u n g a l p a t h o g e n s o f p i n e t r e e s i n f o r e s t n u r s e r i e s a n d C h r i s t m a s t r e e p l a n t a t i o n s . S p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r p a i r s f o r C y c l a n e u s m a n e e d l e c a s t C . m i n u s ( C M 1 - C M 4 ) , L o p h o d e r m i u m n e e d l e c a s t L . s e d i t i o s u m ( L S 1 - L S 4 ) , D o t h i s t r o m a n e e d l e c a s t D . p i n i ( D P 1 - D P 4 ) a n d B r o w n s p o t n e e d l e c a s t 8 . a c i c o l a ( S A 1 - S A 4 ) s p e c i fi c a l l y d e t e c t e d t h e i r r e s p e c t i v e t a r g e t f u n g i i n d i r e c t P C R a m p l i fi c a t i o n s o f D N A f r o m i n f e c t e d p i n e n e e d l e s w i t h s y m p t o m s o r f r u i t i n g b o d i e s . H o w e v e r , n e s t e d P C R i n c r e a s e d s e n s i t i v i t y a n d d e t e c t e d t a r g e t f u n g i i n c u r r e n t - y e a r n e e d l e s a t v e r y e a r l y s t a g e s o f i n f e c t i o n . 3 0 5 T h e r e l i a b i l i t y a n d s e n s i t i v i t y o f t h e p r i m e r p a i r s i n a m p l i f y i n g f u n g a l p a t h o g e n s o f d i s e a s e o f p i n e n e e d l e c a s t s i n i n f e c t e d g r e e n n e e d l e s s h o w e d t h a t t h e p r i m e r p a i r s c o u l d b e e m p l o y e d f o r d e t e c t i o n o f l o w l e v e l s o f s y m p t o m l e s s i n f e c t i o n s o f t h i s f u n g u s i n n u r s e r y s t o c k . A d d i t i o n a l l y , w e d e v e l o p e d p r i m e r p a i r s t h a t d e t e c t e d a n d d i f f e r e n t i a t e d e n d o p h y t e s C . n i v e u m ( C N - C N 4 ) , L . p i n a s t n ' , ( L P 1 - L P 4 ) , A . p u l l u l a n s ( A P 1 - A P 4 ) a n d H . d e m a t i o i d e s ( H D 1 - H D 4 ) f r o m n e e d l e s . N e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s w e r e e s p e c i a l l y u s e f u l f o r d e t e c t i o n o f s y m p t o m l e s s i n f e c t i o n s o f t h e e n d o p h y t e s . I d e n t i t i e s o f P C R p r o d u c t s a m p l i f i e d w i t h s p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r p a i r s w e r e c o n fi r m e d a s t a r g e t s e q u e n c e s w i t h e n d o n u c l e a s e s t h a t p r o d u c e d u n i q u e r e s t r i c t i o n f r a g m e n t p r o fi l e s . I n d o t - b l o t a s s a y s , t h e p r o b e s o f C . m i n u s a n d C . n i v e u m , L . s e d i t i o s u m a n d L . p i n a s t n ' , D . p i n i a s w e l l a s t h e p r o b e s o f A . p u l l u l a n s a n d H . d e m a t i o i d e s s p e c i e s d i f f e r e n t i a t e d t h e i r t a r g e t s f u n g i f r o m m o s t c l o s e l y r e l a t e d s p e c i e s a t s p e c i e s - s p e c i f i c h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s . 3 0 6 I N T R O D U C T I O N L o p h o d e r m i u m s e d i t i o s u m M i n t e r , S t a l e y & M i l l a r , C y c l a n e u s m a m i n u s ( B u t i n ) D i C o s m o , P e r e d o & M i n t e r ( = N a e m a c y c l u s m i n o r B u t i n ) , D o t h i s t r o m a p i n i H u l b a r y ( = M y c o s p h a e r e l l a p i n i E . R o s t r u p a p u d M u n k ) a n d S c i n h i a a c i c o l a ( D e a r n . ) ( = M y c o s p h a e r e l l a d e a m e s s i i B a r r D a r k e r ) a r e t h e m o s t d a m a g i n g a n d d e s t r u c t i v e p a t h o g e n i c s p e c i e s t h a t a f f e c t t h e p r o d u c t i o n o f p i n e t r e e s i n f o r e s t n u r s e r i e s a n d C h r i s t m a s t r e e p l a n t a t i o n s ( P r e y a n d M o r s e , 1 9 7 1 ; S i n c l a i r e t a l . , 1 9 8 7 ; W e n n e r a n d M e r r i l , 1 9 8 9 ; N i c h o l l s a n d W r a y , 1 9 9 2 ) . T h e y c a u s e L o p h o d e r m i u m n e e d l e c a s t , C y c l a n e u s m a n e e d l e c a s t , D o t h i s t r o m a n e e d l e b l i g h t a n d B r o w n s p o t n e e d l e b l i g h t d i s e a s e r e s p e c t i v e l y o n m a n y p i n e s p e c i e s . A l l f o u r s p e c i e s i n f e c t y o u n g p i n e t r e e s a n d c a u s e s e r i o u s e c o n o m i c l o s s e s . T h e c l o s e l y r e l a t e d s p e c i e s L o p h o d e r m i u m p i n a s t n ’ ( S c h r a d ) C h e v a n d C y c l a n e u s m a n i v e u m ( P e r s . ) D i C o s m o , P e r e d o & M i n t e r a r e a l s o f r e q u e n t l y f o u n d a s e n d o p h y t e s i n t h e s a m e n e e d l e s w i t h o u t c a u s i n g a n y s y m p t o m s o r d i s e a s e . S i m i l a r l y , t h e u b i q u i t o u s f o l i a r e n d o p h y t e s H o n n o n e m a d e m a t i o i d e s L a g e r b e r g & M e l i n a n d A u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n s ( d e B a r y ) A r n a r e p r e s e n t a b u n d a n t l y i n p i n e n e e d l e s . L o p h o d e r m i u m s e d i t i o s u m i s t h e o n l y m a j o r p a t h o g e n a m o n g m o r e t h a n 2 0 s p e c i e s o f L o p h o d e r m i u m c o l o n i z i n g t h e n e e d l e s o f c o n i f e r t r e e s . A l m o s t a l l s e r i o u s o u t b r e a k s o f L o p h o d e r m i u m a r e a t t r i b u t e d t o t h i s s p e c i e s . T h e f u n g u s c a u s e s n e e d l e c a s t o f p i n e s i n f o r e s t n u r s e r i e s a n d p l a n t a t i o n s , e s p e c i a l l y i n C h r i s t m a s t r e e p l a n t a t i o n s . A f f e c t e d s e e d l i n g s o r n u r s e r y s t o c k s a r e o f t e n s h i p p e d b e f o r e s y m p t o m s b e c o m e e v i d e n t a f t e r o u t p l a n t i n g . A u s t r i a n ( P i n u s 3 0 7 n i g r a A r n o l d ) , R e d ( P . r e s i n o s a A l t o n . ) a n d S c o t s p i n e ( P . s y l v e s t r i s L . ) s u s t a i n t h e g r e a t e s t d a m a g e ( A d a m s , 1 9 9 5 ; M i n t e r a n d M i l l a r , 1 9 7 8 a ; S i n c l a i r e t a l . , 1 9 8 7 ) . L o p h o d e r m i u m s e d i t i o s u m i s w i d e s p r e a d a n d c a u s e s s e r i o u s e p i d e m i c s i n C h r i s t m a s t r e e g r o w i n g a r e a s i n E u r o p e a n d t h e U n i t e d S t a t e s , e s p e c i a l l y i n M i c h i g a n , O r e g o n a n d W a s h i n g t o n ( A d a m s , 1 9 9 0 b ; K o w a l s k i , 1 9 8 4 ; L a z a r e v , 1 9 8 6 ; M i n t e r a n d M i l l a r , 1 9 7 8 a ; S i n c l a i r e t a l . 1 9 8 7 ) . I n t h e m i d 1 9 6 0 ’ s , L o p h o d e r m i u m n e e d l e c a s t e p i d e m i c s k i l l e d o r s o s e r i o u s l y d a m a g e d R e d a n d S c o t s p i n e s e e d l i n g s i n n u r s e r i e s i n t h e G r e a t L a k e s r e g i o n s t h a t m i l l i o n s o f s e e d l i n g s c o u l d n o t b e s h i p p e d f o r p l a n t i n g . T h o s e t h a t w e r e s h i p p e d c a r r i e d s y m p t o m l e s s i n f e c t i o n s a n d c a u s e d s e v e r e e p i d e m i c s l a t e r ( A d a m s a n d R o b e r t s 1 9 8 8 a ; S i n c l a i r e t a l . 1 9 8 7 ) . A l t h o u g h L o p h o d e r m i u m s e d i t i o s u m p r i m a r i l y a f f e c t s a n d i s a b u n d a n t i n y o u n g p i n e p l a n t a t i o n s , i t a l s o o c c u r s s p o r a d i c a l l y i n s t a n d s o v e r 3 0 y e a r s o f a g e . T h e p a t h o g e n i n f e c t s y o u n g c u r r e n t — y e a r n e e d l e s a n d k i l l s t h e m b e f o r e t h e n e x t g r o w i n g s e a s o n ( A d a m s , 1 9 8 9 a ; F u n k , 1 9 8 5 ; S i n c l a i r e t a l . 1 9 8 7 ) . L o p h o d e r m i u m s e d i t i o s u m m a y a l s o r e m a i n l a t e n t i n i n f e c t e d n e e d l e s f o r c o n s i d e r a b l e p e r i o d s o f t i m e b e f o r e c a u s i n g a n y d i s e a s e s y m p t o m s ( K o w a l s k i , 1 9 9 3 ) . A l t h o u g h i n i t i a l s y m p t o m s m a y s o m e t i m e s a p p e a r a s e a r l y a s s p r i n g , t h e d i a g n o s t i c s t r u c t u r e s , t h e a p o t h e c i a , a r e f o r m e d 1 y e a r a f t e r i n f e c t i o n . G e r r n i n a t i n g a s c o s p o r e s p e n e t r a t e n e e d l e s d i r e c t l y t h r o u g h t h e c u t i c l e a n d r a r e l y t h r o u g h s t o m a t a ( S i n c l a i r e t a l . , 1 9 8 7 ; D i v a n i a n d M i l l a r , 1 9 8 4 ) . 3 0 8 C y c l a n e u s m a m i n u s c a u s e s n e e d l e c a s t o f p i n e s p e c i e s i n n u r s e r i e s a n d p l a n t a t i o n s t h r o u g h o u t t h e w o r l d . T h e r e i s c o n t r o v e r s y e v e n t h o u g h K o c h ’ s p o s t u l a t e s h a v e p r e s u m a b l y b e e n d e m o n s t r a t e d ( A d a m s , 1 9 8 8 b ; K i s t l e r a n d M e r r i l , 1 9 7 8 ; K a r a d z i c , 1 9 8 1 ; M e r r i l l a n d W e r n e r , 1 9 9 6 ) . S o m e r e s e a r c h i n d i c a t e s t h a t t h e c a u s a l f u n g u s m a y b e a n e n d o p h y t e . a n d t h a t e n v i r o n m e n t a l s t r e s s m a y b e r e s p o n s i b l e f o r s y m p t o m d e v e l o p m e n t ( C h a s t a g n e r , 1 9 9 7 ; H a r t m a n e t a l . 2 0 0 1 ) . C y c l a n e u s m a n e e d l e c a s t a f f e c t s m a i n l y A u s t r i a n , P o n d e r o s a a n d S c o t s p i n e . T h e d i s e a s e i s a s i g n i fi c a n t p r o b l e m e s p e c i a l l y i n S c o t s p i n e C h r i s t m a s t r e e n u r s e r i e s a n d p l a n t a t i o n s , b u t i s n o t s e r i o u s i n f o r e s t p l a n t a t i o n s ( A d a m s , 1 9 8 8 b , 1 9 9 0 a , b ; L a z a r e v , 1 9 8 6 ; P e t e r s o n a n d W a l l a , 1 9 9 0 ; S i n c l a i r e t a l . , 1 9 8 7 ; C h a s t a g n e r , 1 9 9 7 ) . N e e d l e c a s t c a u s e d e x t e n s i v e d a m a g e t o S c o t s p i n e s i n C h r i s t m a s t r e e p l a n t a t i o n s i n m a n y e a s t e r n a n d c e n t r a l s t a t e s ( M e r r i l l a n d K i s t l e r , 1 9 7 4 ; M e r r i l l a n d W e n n e r , 1 9 9 6 ; O s t r y e t a l . 1 9 8 9 ) a n d s l i g h t d a m a g e i n t h e G r e a t P l a i n s . C h r i s t m a s t r e e p l a n t a t i o n s i n t h e L a k e s t a t e s , M i n n e s o t a , W i s c o n s i n a n d M i c h i g a n w e r e m o s t e x t e n s i v e l y d a m a g e d ( A d a m s , 1 9 8 9 c , 1 9 9 0 a , b ; O s t r y e t a l . 1 9 8 9 ) . I n 1 9 8 7 , y e a r l y e c o n o m i c l o s s w a s e s t i m a t e d a s h i g h a s $ 1 3 m i l l i o n i n h a r v e s t a b l e t r e e s a l o n e i n M i c h i g a n ( A d a m s , 1 9 9 0 a , b . 1 9 9 2 ) . C h r i s t m a s t r e e p l a n t a t i o n s i n S o u t h D a k o t a a n d N o r t h D a k o t a s u s t a i n e d t h e g r e a t e s t d a m a g e i n t h e G r e a t P l a i n s ( P e t e r s o n a n d W a l l a , 1 9 9 0 ) . T h e f u n g u s e n t e r s t h r o u g h s t o m a t a a n d i n f e c t s f i r s t y e a r a n d o l d e r n e e d l e s f r o m A p r i l t o l a t e a u t u m n . T h e i n c i d e n c e o f i n f e c t i o n i n c r e a s e s t h r o u g h o u t t h e fi r s t , s e c o n d , a n d s o m e t i m e s t h i r d g r o w i n g s e a s o n , d e p e n d i n g o n 3 0 9 e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s a n d t h e p r o v e n a n c e s o f t h e h o s t ( A d a m s , 1 9 9 0 a ; M e r r i l l a n d W e n n e r , 1 9 9 6 ) . F i r s t s y m p t o m s a p p e a r a f t e r a 1 2 - 1 5 m o n t h p e r i o d o f i n f e c t i o n a n d i n c u b a t i o n a n d d i a g n o s t i c f r u i t i n g b o d i e s w i t h i n t h e f o l l o w i n g m o n t h ( M e r r i l l e t a l . 1 9 8 9 ; A d a m s , 1 9 8 8 b ; M i l l e r a n d M i n t e r , 1 9 8 0 a ; C h o i a n d S i m p s o n , 1 9 9 1 , 1 9 9 5 ; H a r t m a n e t a l , 2 0 0 1 ) . H o w e v e r , s o m e i n f e c t e d n e e d l e s m a y n o t d e v e l o p s y m p t o m s u n t i l s p r i n g , s u m m e r a n d s o m e t i m e s f a l l o f t h e t h i r d g r o w i n g s e a s o n . A f t e r s e v e r a l y e a r s o f s e v e r e d i s e a s e , t r e e s r e t a i n o n l y t h e c u r r e n t s e a s o n ' s n e e d l e s w h i c h , a l t h o u g h i n f e c t e d , s h o w n o e x t e r n a l s y m p t o m s ( A d a m s , 1 9 8 8 b , 1 9 9 9 0 a , b ; P e t e r s o n a n d W a l l a , 1 9 9 0 ; S i n c l a i r e t a l . , 1 9 8 7 ) . S i n c e m o r p h o l o g i c a l f e a t u r e s w e r e n o t s u i t a b l e t o d i f f e r e n t i a t e t h e h y p h a e o f C . m i n u s f r o m h y p h a e o f o t h e r f u n g i i s o l a t e d f r o m t h e s a m e n e e d l e s , F r a n z e t a l . ( 1 9 9 3 ) o b s e r v e d t h e i n f e c t i o n p r o c e s s t h r o u g h i m m u n o - e l e c t r o n m i c r o s c o p y . H e s h o w e d t h a t i n t e r c e l l u l a r l y a n d i n t r a c e l l u l a r l y l o c a l i z e d i n f e c t i o n s c o n s i s t e d o f o n l y s i n g l e h y p h a e o r v e r y l i m i t e d m y c e l i a a n d t h i s i s c o r r e l a t e d w i t h c u l t u r e r e s u l t s t h a t i n d i c a t e d 9 0 % o f t h e i n f e c t i o n s w e r e l o c a t e d w i t h i n a s m a l l s e g m e n t o f n e e d l e s . H e a l s o s h o w e d t h a t a c t i v i t y o f C . m i n u s h y p h a e i s m i n i m a l w i t h i n a s y m p t o m a t i c fi r s t y e a r n e e d l e s . D o t h i s t r o m a n e e d l e b l i g h t o r r e d b a n d d i s e a s e , c a u s e d b y M y c o s p h a e r e l l a p i n i , i s a d e v a s t a t i n g d i s e a s e t h a t a f f e c t s m o r e t h a n 3 0 s p e c i e s o f p i n e t h r o u g h o u t t h e w o r l d . A u s t r i a n , M o n t e r e y a n d P o n d e r o s a p i n e s a r e m o s t s e v e r e l y d a m a g e d ( S i n c l a i r e t a l . e t a l . 1 9 8 7 ; P a t t o n , 1 9 9 7 a ) . S i n c e t h e 1 9 6 0 ’ s , t h e d i s e a s e h a s b e c o m e a s e r i o u s p r o b l e m w i t h w i d e s p r e a d i m p o r t a t i o n a n d 3 1 0 p l a n t i n g s o f p i n e s a w a y f r o m t h e i r n a t u r a l r a n g e . I n N e w Z e a l a n d , t h e n e e d l e b l i g h t i s m o s t d a m a g i n g i n A u s t r i a n a n d M o n t e r e y p i n e w h e r e i t i s s t i l l c o n t r o l l e d b y a i r a p p l i c a t i o n o f f u n g u c i d e s a n d b y p l a n t i n g s o f r e s i s t a n t h y b r i d v a r i e t i e s . I t i s t h e fi r s t f o r e s t t r e e d i s e a s e t o b e c o n t r o l l e d o n a p r a c t i c a l b a s i s b y a p p l i c a t i o n o f f u n g i c i d e s f r o m a i r c r a f t . T h e s p r e a d o f t h e d i s e a s e h a s a l s o b e e n r e p o r t e d f r o m A u s t r a l i a ( A d e s a n d S i m p s o n , 1 9 9 0 ; P a t t o n , 1 9 9 7 a ; a n d E u r o p e ( K a r a d z i c , 1 9 8 9 a , b ; B r a d s h a v e t a l . 2 0 0 0 ) . D . p i n i i n f e c t s m o r e t h a n 2 0 p i n e s p e c i e s a n d h y b r i d s i n t h e U n i t e d s t a t e s . T h e f u n g u s i s m o s t o f t e n f o u n d i n p l a n t a t i o n s o f A u s t r i a n a n d P o n d e r o s a p i n e s i n c e n t r a l a n d e a s t e r n s t a t e s . I t h a s n o t b e e n r e p o r t e d f r o m f o r e s t p l a n t a t i o n s ( P e t e r s o n a n d W y s o n g , 1 9 9 0 ; S i n c l a i r e t a l . 1 9 8 7 ) . A l t h o u g h D . p i n i h a s s e l d o m b e e n d e t e c t e d i n y o u n g s e e d l i n g s i n n u r s e r i e s , e p i d e m i c s i n i s o l a t e d n e w p l a n t i n g s i n G r e a t P l a i n s i n d i c a t e t h a t i n f e c t e d n u r s e r y s t o c k i s r e s p o n s i b l e . T h e f u n g u s i s e s p e c i a l l y c o m m o n o n o l d e r t r a n s p l a n t s i n n u r s e r i e s t h a t p r o d u c e p i n e s f o r l a n d s c a p e a n d C h r i s t m a s t r e e p l a n t i n g s ( P e t e r s o n a n d W y s o n g , 1 9 9 0 ; J o n e s e t a l . 1 9 9 5 ; S i n c l a i r e t a l . 1 9 8 7 ) . I n t h e G r e a t P l a i n s , i n f e c t i o n s o c c u r f r o m s p r i n g i n t o A u g u s t w h i l e a l o n g t h e p a c i f i c c o a s t t h e y o c c u r t h r o u g h o u t t h e y e a r . I n f e c t i o n o c c u r s b y g r o w t h o f c o n i d i a l g e r m t u b e s o r h y p h a e t h r o u g h s t o m a t a . D e p e n d i n g o n s p e c i e s , s y m p t o m s m a y a p p e a r 1 t o 6 m o n t h s a f t e r i n f e c t i o n . O n P o n d e r o s a p i n e , n e e d l e s i n f e c t e d d u r i n g t h e f i r s t g r o w i n g s e a s o n u s u a l l y d o n o t s h o w a n y s y m p t o m s u n t i l l a t e s u m m e r o f t h e f o l l o w i n g y e a r ( H a r t m a n e t a l . 2 0 0 1 ; S i n c l a i r e t a l . , 1 9 8 7 ) . T h e f u n g u s p r o d u c e s t h e f u n g a l t o x i n d o t h i s t r o m i n , b e l i e v e d t o p l a y a r o l e i n p a t h o g e n i c i t y a n d v i r u l e n c e s i n c e p u r i fi e d t o x i n r e p r o d u c e d d i s e a s e s y m p t o m s w h e n i n j e c t e d i n t o n e e d l e s ( J e w e l l , 3 1 1 1 9 9 0 ; B r a d s h a v e t a l . 2 0 0 0 ) . H o s t p a t h o g e n i n t e r a c t i o n s t u d i e s s h o w e d t h a t D . p i n i c a u s e s t h e c o l l a p s e o f m e s o p h y l l c e l l s i n s y m p t o m a t i c a r e a s i n i n f e c t e d t i s s u e a n d t h a t t h e c o l l a p s e i s s u d d e n , o c c u r r i n g i n t h e p r e s e n c e o f o n l y t h r e e h y p h a l s t r a n d s d e v e l o p e d a f t e r i n i t i a l p e n e t r a t i o n b y t h e p a t h o g e n ( J e w e l l , 1 9 9 0 ) . B r o w n s p o t d i s e a s e , c a u s e d b y S c i r r h i a a c i c o l a , i s a c o m m o n a n d i m p o r t a n t d i s e a s e m a i n l y o f L o n g l e a f p i n e ( P i n u s p a l u s t r i s F . M i c h x . ) a n d m a n y o t h e r p i n e s i n t h e s o u t h e r n U n i t e d S t a t e s . H o w e v e r , i n r e c e n t d e c a d e s t h e d i s e a s e h a s b e c o m e a s e r i o u s p r o b l e m i n l a n d s c a p e a n d C h r i s t m a s t r e e p l a n t i n g s o f P o n d e r o s a a n d S c o t s p i n e s i n t h e G r e a t P l a i n s a n d G r e a t L a k e s r e g i o n s ( K a i s a n d P e t e r s o n , 1 9 9 0 ; S i n c l a i r e t a l . 1 9 8 7 ; P a t t o n , 1 9 9 7 b ; H a r t m a n e t a l . 2 0 0 1 ) . T h e d i s e a s e h a s c a u s e d s e r i o u s d a m a g e e s p e c i a l l y i n S c o t s p i n e C h r i s t m a s t r e e p l a n t a t i o n s , i n W i s c o n s i n ( P r e y a n d M o r s e , 1 9 7 1 ; N i c h o l s a n d S k i l l i n g , 1 9 7 1 a n d 7 3 ; P a t t o n , 1 9 9 7 b ) . I n 1 9 6 8 , a p p r o x i m a t e l y h a l f a m i l l i o n t r e e s c o u l d n o t b e s o l d b e c a u s e o f n e e d l e b r o w n i n g a n d c a s t i n g a s s o c i a t e d w i t h t h e f u n g u s i n f e c t i o n ( P r e y a n d M o r s e , 1 9 7 1 ) . T h e f u n g u s h a s b e e n r e p o r t e d f r o m m o r e t h a n 3 2 s p e c i e s o f p i n e i n 2 5 s t a t e s f r o m c o a s t t o c o a s t i n t h e U n i t e d S t a t e s . I t i s a l s o w i d e s p r e a d i n E u r o p e , 8 . A m e r i c a , S . A f r i c a a n d C h i n a ( P a t t o n , 1 9 9 7 b ; H u a n g e t a l . 1 9 9 5 ; K a i s a n d P e t e r s o n , 1 9 9 0 ) . T h e f u n g u s a f f e c t s p i n e t r e e s o f a l l a g e s . Y o u n g n e e d l e s a r e m o s t s u s c e p t i b l e ( P a t t o n , 1 9 9 7 b ; H u a n g e t a l . 1 9 9 5 ) . P r i m a r y i n f e c t i o n s a r e i n i t i a t e d b y m a i n l y c o n i d i a o r a s c o s p o r e s i n s p r i n g o r e a r l y s u m m e r , h o w e v e r ; fi r s t s y m p t o m s a p p e a r i n A u g u s t o r S e p t e m b e r . T h e p e r i o d f r o m i n o c u l a t i o n o f f u n g i t o d i s p l a y o f s y m p t o m s v a r i e s 3 1 2 f r o m 1 t o 6 m o n t h s o r m o r e . O n C h r i s t m a s t r e e s a n d o r n a m e n t a l p i n e s w i t h d e n s e f o l i a g e , i n f e c t i o n i s m o s t c o m m o n o n l o w b r a n c h e s ( P a t t o n , 1 9 9 7 b ; S i n c l a i r e t a l . , 1 9 8 7 ) . T h e f u n g u s i n f e c t s t h r o u g h s t o m a t a a n d c a u s e s t h e c o l l a p s e o f m e s o p h y l l c e l l s . H y p h a e o f t h e f u n g u s a r e s p a r s e i n t h e a f f e c t e d t i s s u e a r e a s b u t p r o f u s e a n d l o c a l i z e d s u b e p i d e r r n a l l y u n d e r p e r i t h e c i a l a n d c o n i d i a l s t r o m a . L o c a l i z e d a n d v e r y l i m i t e d p r e s e n c e o f h y p h a e s u g g e s t s t h a t a t o x i n i s p r o d u c e d d u r i n g h o s t p a t h o g e n i n t e r a c t i o n ( J e w e l l , 1 9 8 3 , 1 9 8 4 , 1 9 9 0 ) D u r i n g t h e l a s t t w o d e c a d e s , e n d o p h y t i c f u n g i h a v e b e e n r e p o r t e d f r o m a w i d e d i v e r s i t y o f h o s t s i n d i c a t i n g t h a t t h e i r p r e s e n c e i n h i g h e r p l a n t s i s f u n d a m e n t a l ( P e t r i n i e t a l . 1 9 8 6 ; F r o c h l i c h e t a l . 2 0 0 0 ) . S y m p t o m l e s s i n f e c t i o n s b y f u n g a l e n d o p h y t e s h a v e b e e n e x t e n s i v e l y d e s c r i b e d f r o m l i v i n g n e e d l e s o f c o n i f e r s i n t h e U n i t e d S t a t e s a n d E u r o p e ( C a r r o l l a n d C a r r o l l , 1 9 7 8 ; B e r n s t e i n a n d C a r r o l l , 1 9 7 7 ; P e t r i n i a n d C a r r o l l , 1 9 8 1 ; H e l a n d e r e t a l . 1 9 9 4 ; S u s k e a n d A c k e r , 1 9 8 7 ; J o h n s o n a n d W h i t n e y , 1 9 9 2 ) . T h e e n d o p h y t e s s o m e t i m e s a r e s o s i m i l a r t o c l o s e l y r e l a t e d p a t h o g e n i c f u n g l i n m o r p h o l o g y a n d s y m p t o m a t o l o g y t h a t t h e y m i g h t b e i d e n t i fi e d a s t h e a c t u a l c a u s e o f a d i s e a s e . F o r e x a m p l e , E n d o p h y t e s L o p h o d e r m i u m p i n a s t r i a n d C y c l a n e u s n i v e u m w e r e i n i t i a l l y i d e n t i fi e d a s c a u s a l a g e n t s o f L o p h o d e r m i u m n e e d l e c a s t a n d C y c l a n e u s m a n e e d l e c a s t d a m a g e r e s p e c t i v e l y ( S i n c l a i r e t a l . 1 9 8 7 ; M i n t e r a n d M i l l a r , 1 9 7 8 b ; a n d M i l l a r a n d M i n t e r . 1 9 8 0 b ) . 3 1 3 L o p h o d e r m i u m p i n a s t r i i s a u b i q u i t o u s f u n g u s t h a t i n h a b i t s h e a l t h y n e e d l e s a s a n e n d o p h y t e w i t h o u t c a u s i n g a n y a p p a r e n t s y m p t o m s ( M i n t e r , 1 9 8 1 ; C a n n o n a n d M i n t e r , 1 9 8 6 ; F u n k 1 9 8 5 ) . T h e f u n g u s g r o w s i n i t i a l l y a s a b i o t r o p h i c s y m p t o m l e s s e n d o p h y t e , c o l o n i z e s t h e n e e d l e s w h e n t h e y g e t o l d e r a n d f r u i t s o n l y o n c e t h e n e e d l e s f a l l o r d i e ( K o w a l s k i , 1 9 8 4 ; M a a n e n a n d G o u r b i e r e , 2 0 0 0 ) . C u r r e n t y e a r n e e d l e s a r e i n f e c t e d b e f o r e t h e y a r e f u l l y e l o n g a t e d ( C h o i a n d S i m p s o n , 1 9 9 1 ) . I n f e c t i o n o c c u r s t h r o u g h t h e c u t i c l e o r r a r e l y t h r o u g h s t o m a t a ( D i v a n i a n d M i l l a r , 1 9 8 4 ) . L . p i n a s t r i i s w i d e s p r e a d i n m a n y p i n e s p e c i e s i n c l u d i n g P i n u s n i g r a , P . p o n d e r o s a D o u g l a s e x P . L a w s & C . L a w s ( F u n k , 1 9 8 5 ) , P . r a d i a t a ( C h o i a n d S i m p s o n , 1 9 9 1 ) a n d P . s y / v e s t n ' s ( M i n t e r , 1 9 8 0 b ) . I t o c c u r s s p o r a d i c a l l y o n f o r e s t n u r s e r i e s o f S c o t s p i n e ( L a z a r e v , 1 9 8 6 ) . S i m i l a r l y , C y c l a n e u s m a n i v e u m a l s o c a u s e s s y m p t o m l e s s i n f e c t i o n s o f p i n e n e e d l e s . I t d i f f e r s f r o m t h e p a t h o g e n i c f u n g i i n t h e s h a p e a n d s i z e o f a s c o m a t a , a s c i , a s c o s p o r e a n d c o n i d i a , a n d i n c u l t u r a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d h o s t r a n g e ( M i l l a r a n d M i n t e r , 1 9 8 0 b , M i n t e r , 1 9 8 6 ) . O n l y a n e x p e r i e n c e d o b s e r v e r c a n d i f f e r e n t i a t e t h e e n d o p h y t e f r o m t h e p a t h o g e n . T h e f u n g u s i s w i d e s p r e a d t h r o u g h o u t t h e w o r l d e s p e c i a l l y i n E u r o p e . P i n u s c o n t o r t a D o u g l a s & L o u d , P . r a d i a t a , P . s t v e s t n ' s , P . n i g r a , P . p o n d e r o s a a r e t h e m a j o r h o s t s ( F u n k , 1 9 8 5 ; M i l l a r a n d M i n t e r , 1 9 8 0 b ; J u r c , 1 9 9 6 ; J u r c a n d G o g a l a , 1 9 9 6 ) . T w o c o m m o n b l a c k y e a s t s H o r m o n e m a d e m a t i o i d e s a n d A u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n s a l s o c a u s e e x t e n s i v e s y m p t o m l e s s e n d o p h y t i c i n f e c t i o n s i n p i n e h o s t s . T h e y a r e m o r p h o l o g i c a l l y s i m i l a r a n d a r e o f t e n i s o l a t e d f r o m t h e s a m e t i s s u e s ( H e r m a n i d e s a n d N i j h o f , 1 9 7 7 ; G i b b s a n d I n m a n , 1 9 9 1 ) . T h e m a i n d i f f e r e n c e 3 1 4 b e t w e e n t h e t w o i s t h e p r o d u c t i o n o f t h e c o n i d i a , w h i c h i s b a s i p e t a l a n d s y n c h r o n o u s r e s p e c t i v e l y . H o n n o n e m a d e m a t i o i d e s i s a s l o w g r o w i n g b l a c k y e a s t a s s o c i a t e d w i t h c o n i f e r w o o d b l u i n g a n d c h a r a c t e r i z e d b y d a r k t h i c k w a l l e d h y p h a e w i t h c e l l w i d e r t h a n l o n g o f t e n w i t h l o n g i t u d i n a l s e p t a ( H e r m a n i d e s a n d N i j h o f , 1 9 7 7 ) . I t i s a n a s e x u a l s t a t e l i n k e d t o s e v e r a l d i f f e r e n t g e n e r a o f A s c o m y c e t e s f u n g i i n t h e f a m i l y o f D o t h i d i a c e a e . T h e f u n g u s w a s t h e s o u r c e o f c o n t a m i n a t i o n i n s p r u c e n e e d l e D N A . I T S s e q u e n c e s i n i t i a l l y a t t i r u b u t e d t o s p r u c e b e l o n g e d t o H . d e m a t i o i d e s ( C a m a c h o e t a l . 1 9 9 7 ) . I t a l s o p r o d u c e s t h e t o x i n p r e u s s o m e r i n D , w h i c h i s t o x i c t o s p r u c e b u d w o r m , i n a d d i t i o n t o r u g u l o s i n , a n a n t i b i o t i c ( P o l i s h o o k e t a l . 1 9 9 3 ) . A u r e o b a i s d i u m p u l l u l a n s i s f r e q u e n t l y i s o l a t e d f r o m S c o t s p i n e n e e d l e s ( H e l a n d e r e t a l 1 9 9 4 ) a n d f o l i a g e o f s o m e C u p r e s s a c e a e ( P e t r i n i a n d C a r r o l l , 1 9 8 1 ) . I t h a s c o m m e r c i a l i n t e r e s t p r i m a r i l y b e c a u s e o f i t s e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e p u l l u l a n ( K i m e t a l . 2 0 0 0 ) , a n d e c o l o g i c a l i n t e r e s t b e c a u s e i t c o l o n i z e s m a n y h a b i t a t s . I t i s o n e o f t h e r e l a t i v e l y f e w f u n g i t h a t g r o w s a c t i v e l y a n d u b i q u i t o u s l y o n l i v i n g f o l i a g e ( L i e t a l . 1 9 9 6 ) . A l l t h e s e p a t h o g e n s a n d e n d o p h y t e s o f p i n e a r e u s u a l l y i d e n t i fi e d b y t h e i r s y m p t o m s , f r u i t i n g b o d i e s , a n d t r a d i t i o n a l m e t h o d s o f i s o l a t i o n a n d c u l t u r i n g . H o w e v e r , t h e y c a u s e s y m p t o m s a n d p r o d u c e f r u i t i n g b o d i e s s o s i m i l a r t h a t o n l y a s p e c i a l i s t c a n d i s t i n g u i s h t h e m . T h e L . s e d i t i o s u m — L p i n a s t r i a n d C . m i n u s — C . n i v e u m c o m p l e x e s a r e m o s t o f t e n m i s i d e n t i fi e d . F o r t h i s r e a s o n , e p i d e m i c s c a u s e d b y L . s e d i t i o s u m w e r e i n i t i a l l y a t t r i b u t e d t o i t s e n d o p h y t e r e l a t i v e L . p i n a s t r i ( S i n c l a i r e t a l . 1 9 8 7 ) . T h e s y m p t o m s a r e a l s o o f t e n c o n f u s e d w i t h t h e 3 1 5 s y m p t o m s o f o t h e r f u n g i c a u s i n g d i f f e r e n t d i s e a s e o n t h e s a m e h o s t s u c h a s L o p h o d e n n e l l a a n d E l y t r o d e n n a a n d w i t h d a m a g e c a u s e d b y e n v i r o n m e n t a l s t r e s s e s , a i r p o l l u t i o n a n d p i n e n e e d l e s h e a t h m i n o r ( S i n c l a i r e t a l . 1 9 8 7 ; C h a s t a g n e r , 1 9 9 7 ; H a r t m a n e t a l , 2 0 0 1 ) . D o t h i s t r o m a b l i g h t a n d B r o w n s p o t p a t h o g e n s o n c o m m o n h o s t s a r e s o a l i k e i n m o r p h o l o g y a n d s y m p t o m o t o l o g y t h a t d i a g n o s i s i s d i f fi c u l t a n d r e l i e s o n m i n o r d i f f e r e n c e s i n t h e s e p t a t i o n o f m u l t i - s e p t a t e c o n i d i a . . ( E v a n s , 1 9 8 4 ; J e w e l , 1 9 9 0 ; H a r t m a n e t a l . 2 0 0 1 ) F u r t h e r m o r e , t h e p a t h o g e n s c a n s t a y l a t e n t i n p i n e t i s s u e s f o r 6 - 1 5 m o n t h s b e f o r e s y m p t o m s a p p e a r . D i a g n o s t i c f r u i t i n g b o d i e s a r e n o t f o r m e d u n t i l a t l e a s t o n e y e a r a f t e r i n f e c t i o n . E a r l y d e t e c t i o n a n d d i a g n o s i s b y i s o l a t i o n a n d c u l t u r a l m o r p h o l o g y i s v e r y d i f fi c u l t s i n c e t h e y p r o d u c e s i m i l a r m y c e l i a l m o r p h o l o g y . I n a d d i t i o n , t h e p r e s e n c e o f e n d o p h y t e s a n d o t h e r f u n g i t h a t p r o d u c e s i m i l a r g r o w t h o n l a b o r a t o r y m e d i a c o m p l i c a t e s t h e d i a g n o s i s . B e c a u s e o f t h e i r e c o n o m i c i m p a c t o n n u r s e r i e s a n d C h r i s t m a s t r e e p l a n t a t i o n s , a n d t h e p r o b l e m s i n e a r l y d e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f t h e s e f u n g i , a f a s t , e a s y , c h e a p a n d r e l i a b l e m e t h o d t h a t c a n b e u s e d r o u t i n e l y n e e d s t o b e d e v e l o p e d . M o l e c u l a r m e t h o d s s u c h a s p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( P C R ) a n d d o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n c a n p r o v i d e u s e f u l t o o l s f o r t e s t i n g p i n e s e e d l i n g s f o r t h e p r e s e n c e o f n e e d l e c a s t f u n g i i n s y m p t o m l e s s n e e d l e s . P C R f o r a m p l i fi c a t i o n o f d i a g n o s t i c m o l e c u l a r m a r k e r s i s h i g h l y s e n s i t i v e a n d r e p r o d u c i b l e , a n d c o u l d e a s i l y b e u s e d f o r f a s t d e t e c t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n i f s p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r s a r e d e s i g n e d . P C R - b a s e d d i a g n o s t i c t e c h n i q u e s a l l o w d i r e c t d e t e c t i o n o f f u n g i 3 1 6 w i t h o u t i s o l a t i o n a n d c u l t u r i n g i n c o m p l e x e n v i r o n m e n t s a n d i n p l a n t t i s s u e s . M a n y i m p o r t a n t p a t h o g e n i c f u n g i s u c h a s P h y t o p h t h o r a ( T r o u t e t a l . 1 9 9 7 ; C o o k e a n d D u n c a n , 1 9 9 7 ; G o o d w i n e t a l . 1 9 8 9 ; J u d e l s o n a n d M e s s e n g e r - R o u t h , 1 9 9 6 ; R i s t a i n o e t a l . 1 9 9 8 ; B o n a n t s e t a l . 1 9 9 7 ; ) , P y t h i u m ( L e v e s q u e e t a l . 1 9 9 4 ; K a g e y a m a , 1 9 9 7 ) ; F u s a n ' u m ( S c h i l l i n g e t a l 1 9 9 6 ; P a r r y a n d N i c h o l s o n , 1 9 9 6 ; T u r n e r e t a l . 1 9 9 8 ) ; R h i z o c t o n i a ( M a z z o l a e t a l . 1 9 9 6 ) , V e r t i c i l l i u m ( N a z a r e t a l . 1 9 9 1 ; R o b b e t a l . 1 9 9 4 ; M o u k h a m e d o v e t a l . 1 9 9 7 ; H u e t a l . 1 9 9 3 ) , O p h i o s p h a e r e l l a ( T i s s e r a t e t a l . 1 9 9 4 ) ; G r e m m e n i n i e l l a s s p . , S t a g o n o s p o r a n o d o r u m a n d S e p t o n ' a t i r i t i c i ( B e c k a n d L i g o n , 1 9 9 5 ) ; D i a p o n ‘ h e p h a s e o l o r u m a n d P h o m o p s i s I o n g i c o l a ( Z h a n g e t a l . 1 9 9 7 ) ; C o l l e t o t n ' c h u m g l o e o s p o n ' o i d e s ( M i l l s e t a l . 1 9 9 2 ) ; T i l l e t i a i n d i c a ( S m i t h e t a l . 1 9 9 6 ) ; G a e u m a n n o m y c e s g r a m i n i s ( B a t e m a n e t a l . 1 9 9 2 ; H e n s o n , 1 9 9 2 ; E l l i o t e t a l . 1 9 9 3 ) ; t h e e n d o p h y t e s N e o t y p h o d i u m a n d E p i c h / o e s p . ( D o s s , 1 9 9 8 ) h a v e a l l b e e n d e t e c t e d b y P C R d i r e c t l y i n i n f e c t e d p l a n t t i s s u e s . I n a d d i t i o n t o P C R , d o t - b l o t a s s a y s w i t h s p e c i e s - s p e c i fi c p r o b e s c a n a l s o b e u s e d f o r d e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f f u n g i i n p l a n t t i s s u e s . T h e t e c h n i q u e h a s b e e n w i d e l y u s e d f o r d i a g n o s i s o f b a c t e r i a l ( H a h n e t a l . 1 9 9 3 ; P r i n e t a l . 1 9 9 3 ) a n d v i r a l p a t h o g e n s ( S a l d e r e l l i e t a l . 1 9 9 6 ; S m i t h e t a l . 1 9 9 3 ; H o d g s o n e t a l 1 9 9 8 ; S c h o e n e t a l . 1 9 9 6 ) . S p e c i e s - s p e c i fi c p r o b e s h a v e b e e n g e n e r a l l y h y b r i d i z e d e i t h e r t o u n i v e r s a l p r i m e r a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s ( H i g u c h i e t a l . 1 9 8 8 ; L i e t a l . 1 9 8 8 ; L e e e t a l . 1 9 9 3 ; B r u n s a n d G a r d e s , 1 9 9 3 ) o r t o D N A f r o m m y c e l i u m o r i n f e c t e d p l a n t t i s s u e s ( J o h a n s o n a n d J e g e r , 1 9 9 3 ; L i e t a l . 1 9 9 6 ) f o r 3 1 7 d e t e c t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n o f f u n g i . V e r y f e w m o l e c u l a r s t u d i e s f o r i d e n t i fi c a t i o n a n d d e t e c t i o n o f f u n g i o f c o n i f e r f o l i a g e a r e a v a i l a b l e . H a m e l i n e t a l . ( 1 9 9 6 ) d e v e l o p e d p r o b e s f r o m I T S r e g i o n s t h a t d e t e c t e d t h e r o o t r o t p a t h o g e n s C y l i n d r o c l a d i u m f l o r i d a n u m a n d C . d e s t r u c t a n s i n p i n e a n d s p r u c e r o o t t i s s u e s . H a m e l i n e t a l ( 2 0 0 0 ) d e t e c t e d G r e m m e n i e l l a a b i e t i n a i n p i n e n e e d l e s w i t h o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s d e v e l o p e d f r o m I T S r e g i o n s . B r a d s h a v e t a l . ( 2 0 0 0 ) s e q u e n c e d t h e I T S r e g i o n o f D . p i n i o n d i f f e r e n t p i n e s p e c i e s f r o m i s o l a t e s a r o u n d t h e w o r l d a n d f o u n d t h a t t h e y s e p a r a t e d i n t o t w o g r o u p s . H o w e v e r , t h e t w o g r o u p s h a d o n l y a f e w d i f f e r e n t b a s e s . G a n g l e y a n d B r a d s h a v e t a l . ( 2 0 0 1 ) d e v e l o p e d a m i c r o s a t e l l i t e - b a s e d D N A p r o fi l i n g s y s t e m t o d i s t i n g u i s h g e n e t i c a l l y d i v e r s e i s o l a t e s o f D . p i n i . U s i n g R A P D a n a l y s i s , H u a n g e t a l . ( 1 9 9 5 ) d e t e c t e d p o l y m o r p h i s m a m o n g i s o l a t e s f r o m t h e U n i t e d S t a t e s a n d C h i n a . S t e n s t r o m a n d i h r m a r k . ( 1 9 9 7 ) d i s t i n g u i s h e d d i f f e r e n t i s o l a t e s o f L . s e d i t i o s u m a n d L . p i n a s t r i b y u s i n g m i n i - s a t e l l i t e M 1 3 i n S w e d e n . H e r e , w e s e q u e n c e d I T S r e g i o n s o f r i b o s o m a l D N A t o d e v e l o p s p e c i e s - s p e c i fi c p r o b e s . O u r g o a l s w e r e t o d e v e l o p a r e l i a b l e P C R a s s a y f o r q u i c k a n d a c c u r a t e d e t e c t i o n o f m a j o r f u n g a l p a t h o g e n s a n d e n d o p h y t e s i n s y m p t o m l e s s n e e d l e s o f p i n e s g r o w n a s C h r i s t m a s t r e e s a n d n u r s e r y s t o c k s , a n d t o i n v e s t i g a t e t h e p o s s i b i l i t y o f u s i n g t h e p r o b e s f o r d i f f e r e n t i a t i o n i n d o t - b l o t s o f i n f e c t e d n e e d l e s a n d m y c e l i u m . S p e c i e s - s p e c i f i c p r i m e r s f o r d e t e c t i o n o f t h e e n d o p h y t e s w i l l b e u s e f u l i n m o n i t o r i n g c o l o n i z a t i o n a n d d i s t r i b u t i o n o f t h e s e f u n g i i n p l a n t s 3 1 8 a n d i n s t u d y i n g e c o l o g y a n d r e l a t i o n s h i p s w i t h h o s t a n d o t h e r f u n g i . W e d e s i g n e d a n d t e s t e d a p a i r o f p r i m e r s f o r e a c h o f t h e s e f u n g i . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S I s o l a t i o n a n d g r o w t h o f f u n g a l i s o l a t e s T h e f u n g a l i s o l a t e s u s e d i n t h i s s t u d y a n d t h e i r s o u r c e s a r e l i s t e d i n T a b l e 6 . 1 . F u n g i w e r e e i t h e r i s o l a t e d a n d i d e n t i fi e d i n o u r l a b o r a t o r y o r o b t a i n e d f r o m d i f f e r e n t s o u r c e s . F o r D N A e x t r a c t i o n s , s t e r i l e c e l l u l o s e m e m b r a n e s c u t t o fi t p e t r i d i s h e s w e r e p l a c e d o n t h e m e d i u m a n d m y c e l i a w e r e s p r e a d o v e r t h e p l a t e s t o a t t a i n g r o w t h o f s u f fi c i e n t m a s s o f h y p h a e . N e e d l e s c a r r y i n g t h e f r u i t i n g b o d i e s w e r e i n c u b a t e d i n a m o i s t c h a m b e r o v e r n i g h t . C o n i d i a f r o m e r u m p e n t s t r o m a w e r e s c r a p e d i n t o a n e p p e n d o r p t u b e c o n t a i n i n g s t e r i l e w a t e r a n d d i l u t e d u p t o 1 0 3 t i m e s . D i l u t e d c o n i d i a w e r e p l a t e d o n w a t e r a g a r ( 1 . 5 % ) a n d s i n g l e s p o r e s w e r e c o l l e c t e d b y c u t t i n g a g a r p l u g s a n d p l a t i n g o n M a l t E x t r a c t A g a r ( D i f c o L a b o r a t o r i e s , D e t r o i t , M i c h i g a n ) . A l t e r n a t i v e l y , d i l u t e d c o n i d a w e r e d i r e c t l y s p r e a d o v e r t h e p e t r i d i s h e s c o n t a i n i n g M E A a n d c o l o n i e s o f f u n g i e m e r g i n g i n t h e fi r s t 3 - 4 d a y s o f i s o l a t i o n w e r e c u t o u t a n d s l o w g r o w i n g c o l o n i e s w e r e a l l o w e d t o g r o w a n d c o l l e c t e d . O f t e n i s o l a t e s o f f u n g i r e q u i r e d a t l e a s t a m o n t h t o p r o d u c e g r o w t h o f 2 - 3 c m d i a m e t e r a t r o o m t e m p e r a t u r e . D N A e x t r a c t i o n f r o m m y c e l i u m o f f u n g i F u n g a l m y c e l i a g r o w n f o r 2 w e e k s o n c e l l u l o s e m e m b r a n e - c o v e r e d p l a t e s w e r e s c r a p e d i n t o 1 5 m l t u b e s a n d l y o p h i l i z e d f o r 2 d a y s . D N A w a s e x t r a c t e d 3 1 9 T a b l e 6 . 1 . F u n g a l s p e c i e s a n d n e e d l e s p e c i m e n s u s e d i n t h i s s t u d y . S p e c i e s Q g i p m S o u r c e L e n q t h G e n B a n k ( I T S ) # G r e m m e n i e l l a a b i e t i n a G A P i n u s s p . A T C C 2 8 3 7 9 4 1 5 A F 2 6 0 8 1 5 A u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n s A P P i n u s s y l v e s t r i s M i c h i g a n 5 1 1 A F 0 1 3 2 2 9 A . p u l l u l a n s A P - 2 A b i e s s p . C y c l a n e u s m a m i n u s C M P i n u s t o r r e y a n a C a l i f o r n i a 5 0 0 A F 0 1 3 2 2 2 C y c l a n e u s m a n i v e u s C N P . s y l v e s t r i s C B S 4 9 5 . 7 3 4 9 9 A F 0 1 3 2 2 3 U n i d e n t i fi e d e n d o p h y t e 1 E N D 1 P . s y l v e s t r i s W i s c o n s i n U n i d e n t i fi e d e n d o p h y t e 2 E N D Z P i n u s n i g r a M i c h i g a n H o r m o n e m a d e m a t i o i d e s H D P . s y l v e s t r i s M i c h i g a n 5 1 7 A F 0 1 3 2 2 7 H D - 2 P . s y l v e s t r i s W i s c o n s i n H D - 3 P . n i g r a M i c h i g a n K a b a t i n a j u n i p e r i K J J u n i p e r u s s p . N . C a r o l i n a 5 1 5 A F 2 6 0 2 2 4 K a b a t i n a t h u j a e K T T . o c c i d e n t a l i s C B S 2 3 8 . 6 6 5 1 7 A F 0 1 3 2 2 6 L o p h o d e r m i u m c o n i g e n u m L C O N P . s y l v e s t r i s A T C C 2 8 3 4 6 4 5 2 A Y 1 8 3 3 6 4 L o p h o d e r m i u m s e d i t i o s u m L S P . s y l v e s t r i s A T C C 2 8 3 4 5 4 5 3 A F 4 6 2 4 3 5 L o p h o d e r m i u m p i n a s t r i L P - U B C P . n i g r a B . C o l o m b i a 4 4 8 A F 4 6 2 4 3 4 L o p h o d e r m i u m p i n a s t n ' L P P . s y l v e s t r i s A T C C 2 8 3 4 7 4 4 9 A F 0 1 3 2 2 4 L o p h o d e r m i u m j u n i p e r i n u m L J J u n i p e r u s s p . M i c h i g a n M e n ' a p a r k e r i M P P . m e n z i e s i i A T C C 6 2 7 0 4 M y c o s p h a e r e l l a d e a r n e s s i i 1 S A - 1 P . s y l v e s t r i s W i s c o n s i n 4 7 6 A F 2 6 0 8 1 8 M y c o s p h a e r e l l a d e a r n e s s i i 2 S A - 2 P . s y l v e s t r i s W i s c o n s i n 4 7 6 A F 2 6 0 8 1 7 M y c o s p h a e r e l l a p i n i D P P . n i g r a M i c h i g a n 4 5 8 A F 0 1 3 2 2 7 P h a e o c r y p t o p u s g a u m a n n i i P G P . m e n z i e s i i M i c h i g a n 5 1 3 A F 0 1 3 2 2 5 P h o m o p s i s j u n i p e r o v o r a P J J u n i p e r u s s p . N e t h e r l a n d 5 0 6 A F 4 6 2 4 3 6 R h a b d o c l i n e p a r k e r i R P P . m e n z i e s i i A T C C 2 0 1 6 6 ( 4 5 1 A F 2 6 0 8 1 3 R h i z o s p h a e r a p i n i R P I N - 1 A b i e s f r a s e r i M i c h i g a n 5 1 7 A F 0 1 3 2 3 0 R h i z o s p h a e r a k a l k h o f fl i 1 R K A - 1 P i c e a p u n g e n s M i c h i g a n 5 1 4 A F 0 1 3 2 3 2 S i r o c o c c u s c o n i g e n u s S C P . r e s i n o s a M i n n e s o t a 5 3 1 A F 2 6 0 8 1 6 S c l e r o p h o m a p y t h i o p h i l a S P P . s y l v e s t r i s M i c h i g a n 5 1 6 A F 4 6 2 4 3 8 X e m m e n ‘ s a b i e t i s X A P i n u s s p . N e e d l e s p e c i m e n s D o u g l a s f i r / P . g a u m a n n i i D F 1 — 4 4 P . m e n z i e s i i W a s h i n g h t o n u n i n f e c t e d D F - H P . m e n z i e s i i M i c h i g a n J u n i p e r ! K . j u n i p e r i J U N I P E R 1 J . v i r g i n i a n a N . C a r o l i n a J U N I P E R 2 J . c h i n e n s i s M i c h i g a n u n i n f e c t e d J U N I P E R - H J . c h i n e n s i s M i c h i g a n S p r u c e ! R . k a l k h o f fl i S P R U C E 1 P . p u n g e n s M i c h i g a n S P R U C E 2 P i c e a m a r i a n a M i c h i g a n u n i n f e c t e d S P R U C E 1 - H P . p u n g e n s M i c h i g a n S P R U C E 2 - H P . m a r i a n a M i c h i g a n F r a s e r F i r / R . p i n i F R A S E R F I R A b i e s f r a s e r i M i c h i g a n P i n e / L . p i n a s t r y P I N E 1 P i n u s s t r o b u s P i n e / L . s e d i t i o s u m P I N E 2 P . s y l v e s t r i s M i c h i g a n P i n e / C . m i n u s P I N E 3 P . s y l v e s t r i s M i c h i g a n P i n e / D . p i n i P . n i g r a M i c h i g a n P i n e / S . a c i c o l a P . s y l v e s t r i s W i s c o n s o n P i n e / u n i n f e c t e d S C O T S P - H P . s y l v e s t r i s M i c h i g a n / W i s c o n s o n P i n e / u n i n f e c t e d P . n i g r a M i c h i g a n 3 2 0 a c c o r d i n g t o t h e p r o t o c o l d e s c r i b e d b y L e e e t a l . ( 1 9 8 8 ) . L y o p h i l i z e d h y p h a e ( a p p r o x i m a t e l y 1 0 0 m g ) w e r e s u s p e n d e d i n 7 0 0 p l l y s i s b u f f e r ( 5 0 m M T r i s - H C I , 5 0 m M E D T A , 3 % S D S p H , 8 . 0 ; a m e n d e d w i t h 1 % 2 - m e r c a p t o e t h a n o l j u s t p r i o r t o e a c h u s e ) . P e s t l e s w e r e s o a k e d i n d i l u t e H C I ( 1 : 1 0 ) a n d c l e a n e d w i t h s o a p a n d w a t e r b e f o r e s t e r i l i z a t i o n . M y c e l i a w e r e c r u s h e d w i t h p e s t l e s f o r 3 - 5 m i n u t e s a n d i n c u b a t e d 1 h o u r a t 6 5 C . T h e n , 7 0 0 p l p h e n o l : c h l o r o f o r m : i s o a m y l a l c o h o l ( 2 5 : 2 4 : 1 , S i g m a A l d r i c h C o r p o r a t i o n , S t L o u i s , M O ) w a s a d d e d a n d t h e t u b e s w e r e v o r t e x e d b r i e fl y . T u b e s w e r e s p u n a t 1 2 0 0 0 r p m f o r 1 0 m i n a n d t h e a q u e o u s t o p p h a s e w a s t r a n s f e r r e d t o n e w t u b e s . T h e p h e n o l : c h l o r o f o r m : i s o a m y l a l c o h o l t r e a t m e n t a n d c e n t r i f u g a t i o n s t e p s w e r e r e p e a t e d . T h e n , 7 0 0 p l c h l o r o f o r m z i s o a m y l a l c o h o l ( 2 4 : 1 ) w a s a d d e d t o t h e s u p e r n a t a n t , w h i c h w a s v o r t e x e d t h e n s p u n a t 1 2 0 0 0 r p m f o r 5 m i n u t e s . T h e a q u e o u s p h a s e w a s c o l l e c t e d a n d 2 0 p l o f 3 M s o d i u m a c e t a t e a n d 0 . 5 v o l u m e o f i s o p r o p y l a l c o h o l w e r e a d d e d . D N A w a s p r e c i p i t a t e d b y i n v e r t i n g t h e t u b e s g e n t l y s e v e r a l t i m e s a n d c e n t r i f u g a t i o n f o r 1 0 m i n a t 1 3 0 0 0 r p m a t 4 C t o p e l l e t . T h e s u p e r n a t a n t w a s p o u r e d o f f a n d p e l l e t s w e r e r e s u s p e n d e d i n 1 0 0 p l T E b u f f e r ( 1 0 m M T r i s - H C I a n d 0 . 5 M E D T A , p H 8 a n d s t o r e d a t — 2 0 C . A c l e a n i n g p r o c e d u r e f o r p o l y s a c c h a r i d e - c o n t a m i n a t e d D N A d e s c r i b e d b y A u s u b e l e t a l ( 2 0 0 1 ) w a s u s e d t o f u r t h e r p u r i f y D N A i f P C R a m p l i f i c a t i o n i n i t i a l l y f a i l e d . 5 M N a C l w a s a d d e d t o t h e D N A s o l u t i o n t o g i v e a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 7 M N a C l . T h e n , 1 0 % C T A B i n 0 . 7 M N a C l w a s a l s o a d d e d t o g i v e a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 1 % C T A B i n t h e D N A s a m p l e b e f o r e i n c u b a t i n g a t 6 5 C f o r 1 5 m i n . T h e s o l u t i o n w a s e x t r a c t e d w i t h 1 v o l u m e o f c h l o r o f o r m ; i s o a m y l a l c o h o l ( 2 4 : 1 ) a n d a q u e o u s l a y e r 3 2 1 w a s t r a n s f e r r e d t o a n e w t u b e f o l l o w i n g c e n t r i f u g a t i o n a t 1 2 0 0 0 r p m f o r 5 m i n . A g a i n , 1 v o l u m e o f p h e n o l : c h l o r o f o r m : i s o a m y l a l c o h o l ( 2 5 : 2 4 : 1 ) w a s a d d e d t o t h e s u p e r n a t a n t a n d c e n t r i f u g e d a t 1 2 0 0 0 r p m f o r 5 m i n u t e s . D N A w a s p r e c i p i t a t e d f r o m t h e s u p e r n a t a n t w i t h 0 . 6 v o l u m e i s o p r o p a n o l a n d c o l l e c t e d b y c e n t r i f u g i n g a t 1 2 0 0 0 r p m f o r 1 5 m i n . T h e D N A p e l l e t w a s w a s h e d w i t h 7 0 % e t h a n o l a n d c e n t r i f u g e d f o r 5 m i n . T h e s u p e r n a t a n t w e r e d r a i n e d o f f a n d t h e p e l l e t w a s r e - d i s s o l v e d i n T E b u f f e r . D N A e x t r a c t i o n f r o m n e e d l e s D N A e x t r a c t i o n s d i r e c t l y f r o m n e e d l e s w e r e d o n e u s i n g t w o d i f f e r e n t m e t h o d s . S m a l l a m o u n t s o f D N A w e r e e x t r a c t e d a s d e s c r i b e d b y H a m e l i n e t a l . ( 1 9 9 6 , 2 0 0 0 ) w i t h s o m e m o d i fi c a t i o n s . 3 - 4 w h o l e p i n e n e e d l e s w e r e u s e d t o e x t r a c t D N A f o r P C R a n d d o t - b l o t a s s a y s . W h o l e n e e d l e s w e r e s o a k e d w i t h 8 0 0 p l C T A B e x t r a c t i o n b u f f e r ( 2 % c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u m ; 1 . 4 M N a C l ; 1 % p o l y e t h y l e n e g l y c o l 8 0 0 0 ; 2 0 m M E D T A ; 1 % 2 - m e r c a p t o e t h a n o l ; 1 0 0 m M T r i s - H C I , p H 9 . 5 ) a n d g r o u n d w i t h a s t e r i l e ( a c i d t r e a t e d ) m o r t a r a n d p e s t l e u n t i l a s l u r r y w a s o b t a i n e d . E x t r a c t s w e r e v o r t e x e d b r i e f l y a n d i n c u b a t e d a t 6 5 C f o r a t l e a s t 1 h . F o l l o w i n g t h e a d d i t i o n o f 6 0 0 p l p h e n o l : c h l o r o f o r m : i s o a m y l a l c o h o l ( 2 5 : 2 4 : 1 ) , e x t r a c t s w e r e c e n t r i f u g e d a t 1 0 0 0 0 r p m f o r 5 m i n u t e s . T h e a q u e o u s p h a s e w a s t r a n s f e r r e d t o a n e w t u b e , p r e c i p i t a t e d w i t h a n e q u a l v o l u m e o f c o l d i s o p r o p a n o l a n d c e n t r i f u g e d a t 1 0 0 0 0 r p m f o r 1 0 m i n u t e s . P e l l e t s w e r e w a s h e d w i t h c o l d 7 0 % e t h a n o l , a i r d r i e d f o r 1 2 h o u r s o r o v e r n i g h t , a n d r e s u s p e n d e d i n 3 0 p l T E b u f f e r . T h e m e t h o d o f H a m e l i n e t a l . ( 1 9 9 6 ) w a s a d a p t e d t o e x t r a c t D N A 3 2 2 f r o m l a r g e a m o u n t s o f n e e d l e s u s i n g a h o u s e h o l d b l e n d e r . A p p r o x i m a t e l y , 1 0 g n e e d l e s i n 6 0 m l e x t r a c t i o n b u f f e r w e r e b l e n d e d a t h i g h s p e e d f o r 2 m i n . A S o r v a l l R C Z B c e n t r i f u g e w i t h 8 8 2 4 r o t o r ( S o r v a l l H e r a e u s , N e w t o w n , C T ) w a s u s e d f o r s o l v e n t p h a s e s e p a r a t i o n s a n d p e l l e t i n g . L a r g e a m o u n t s o f D N A w a s a l s o e x t r a c t e d u s i n g b u l k D N A e x t r a c t i o n m e t h o d a s f o l l o w . 1 0 - 2 0 g r a m s o f c o n i f e r n e e d l e s w e r e g r o u n d i n 1 8 0 m l e x t r a c t i o n b u f f e r c o n t a i n i n g ( 5 0 m M T r i s , 5 m M E D T A , 0 . 3 5 M S o r b i t o l , 1 % B S A , 1 0 % P E G - 4 0 0 0 , a n d 1 % 2 - m e r c a p t o e t h a n o l i n a c o m m e r c i a l b l e n d e r . N e e d l e s w e r e g r o u n d e d t o a s l u r r y . H o m o g e n a t e w a s fi l t e r e d t h r o u g h t w o l a y e r s o f 1 0 0 p m n y l o n m e s h a n d t h e f i l t r a t e c e n t r i f u g e d a t 1 6 0 0 0 r p m i n a S o r v a l G S A r o t o r f o r 1 5 m i n u t e s . T h e p e l l e t w a s d r a i n e d a n d r e s u s p e n d e d i n 1 0 m l o f N E T b u f f e r f r o m s t o c k c o n t a i n i n g 8 8 9 s a l t , 7 . 0 6 g T r i s b a s e , 0 . 0 5 M E D T A ( p H a d j u s t e d t o 8 . 0 a n d s t e r i l i z e d ) . T w o v o l u m e s o f S a r c o s y l w e r e a d d e d a n d t h e s o l u t i o n w a s i n c u b a t e d i n r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 5 m i n u t e s f o l l o w e d b y a d d i t i o n o f 1 . 5 m l o f 5 M N a C l a n d 1 m l o f C T A B s o l u t i o n a n d i n c u b a t i o n a t 6 5 C f o r 1 5 m i n . T h e s o l u t i o n i s p u t i n t o a n o a k r i d g e t u b e a n d e q u a l v o l u m e o f c h l o r o f o r m w a s a d d e d , m i x e d a n d c e n t r i f u g e d a t 1 6 0 0 0 r p m f o r 1 5 m i n . T h e t o p l a y e r w a s t r a n s f e r r e d t o a n e w t u b e e x t r a c t e d w i t h c h l o r o f o r m a g a i n . T o p l a y e r i s t r a n s f e r r e d i n t o a n e w t u b e a n d e q u a l v o l u m e o f i s o p r o p a n o l w e r e a d d . T h e t u b e g e n t l y i n v e r t e d t o p r e c i p i t a t e t h e D N A . D N A w e r e c o l l e c t e d u s i n g a h o o k e d P a s t e u r p i p e t t e a n d p u t i n t o 1 . 5 m l e p p e n d o r f t u b e s b e f o r e a d d i n g 1 m l o f 7 0 % e t h a n o l a n d c e n t r i f u g i n g f o r 5 m i n . E T O H w a s d r a i n e d a n d t h e p e l l e t w a s r e s u s p e n d e d i n T E b u f f e r . 3 2 3 P C R a m p l i fi c a t i o n o f i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r s D N A e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m , f r u i t i n g b o d i e s a n d n e e d l e s w a s d i l u t e d 1 0 2 a n d 1 0 3 t i m e s i n d o u b l e d i s t i l l e d , fi l t e r e d , s t e r i l i z e d w a t e r ( P C R w a t e r ) a n d u s e d i n P C R a m p l i fi c a t i o n s . T h e i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r ( I T S ) r e g i o n s a n d 5 . 8 S g e n e o f t h e n u c l e a r r i b o s o m a l R N A o p e r o n ( I T S I - 5 . 8 S - I T S I I ) w e r e a m p l i fi e d w i t h t h e p r i m e r s I T S 1 F ( f u n g u s s p e c i f i c ) a n d I T S 4 ( G a r d e s a n d B r u n s , 1 9 9 3 ) . P C R r e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t i n 2 5 p l t o t a l v o l u m e c o n s i s t i n g o f 1 2 . 5 p l D N A d i l u t i o n ( t e m p l a t e ) a n d 1 2 . 5 p l P C R r e a c t i o n m i x t u r e . T h e r e a c t i o n m i x t u r e c o n t a i n e d T fl P C R b u f f e r ( 2 0 m M a m m o n i u m s u l f a t e ; 2 . 0 m M M g C I z ; 5 0 m M T r i s - H C I , p H 9 . 0 ; E p i c e n t r e T e c h n o l o g i e s , M a d i s o n , W I ) ; 0 . 2 m M e a c h o f d A T P , d ' l T P , d G T P a n d d C T P ; 0 . 5 p M e a c h o f I T S 1 F a n d I T S 4 p r i m e r s ; a n d 0 . 5 u n i t o f T a q D N A p o l y m e r a s e . T h e r e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t o n a D N A t h e r m a l c y c l e r ( M o d e l 9 6 0 0 , P e r k i n - E l m e r C e t u s , N o r w a l k , C T ) . T h e r e a c t i o n p r o t o c o l c o n s i s t e d o f a n i n i t i a l d e n a t u r a t i o n a t 9 5 C f o r 3 m i n u t e s f o l l o w e d b y 3 0 c y c l e s o f 9 4 C f o r 1 m i n , 5 0 C f o r 1 m i n , a n d 7 2 C f o r 1 m i n . P C R a m p l i fi c a t i o n s c o n t a i n i n g n o D N A t e m p l a t e w e r e i n c l u d e d i n e v e r y e x p e r i m e n t a s c o n t r o l s t o t e s t f o r t h e p r e s e n c e o f c o n t a m i n a t i o n o f r e a g e n t s a n d r e a c t i o n m i x t u r e s b y n o n s a m p l e D N A . T h e r e a c t i o n w a s c o m p l e t e d b y a 7 m i n e x t e n s i o n a t 7 2 C . P C R p r o d u c t s w e r e s e p a r a t e d o n 1 . 5 % a g a r o s e ( G i b c o B R L , G r a n d I s l a n d , N Y ) i n T A E b u f f e r ( 1 0 0 m M T r i s , 1 2 . 5 m M s o d i u m a c e t a t e a n d 1 m M E D T A , p H : 8 . 0 ) b y g e l e l e c t r o p h o r e s i s . A s D N A s i z e s t a n d a r d , a 1 k b o r 1 k b p l u s D N A l a d d e r ( G i b c o B R L ) w a s i n c l u d e d i n e a c h g e l . A f t e r r u n n i n g f o r a t l e a s t 1 3 2 4 h o u r a t 1 0 0 v o l t s , t h e g e l s w e r e s t a i n e d w i t h e t h i d i u m b r o m i d e , v i s u a l i z e d b y U V fl u o r e s c e n c e a n d p h o t o g r a p h e d u s i n g A l p h a l m a g e r ( A l p h a I n n o t e c h C o r p o r a t i o n , S a n L e a n d r o , C A ) . D i r e c t o r n e s t e d - p r i m e r P C R a m p l i fi c a t i o n s w i t h o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s P C R a m p l i fi c a t i o n s u s i n g o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s w e r e c a r r i e d o u t a s w e r e t h e I T S a m p l i fi c a t i o n s , w i t h a f e w d i f f e r e n c e s . F o r d i r e c t a m p l i f i c a t i o n s , t h e s a m e D N A d i l u t i o n s w e r e u s e d . F o r i n t e r n a l a m p l i fi c a t i o n s , I T S 1 F a n d I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s w e r e q u a n t i fi e d u s i n g a U V s p e c t r o p h o t o m e t e r ( D u 5 3 0 , B e c k m a n C o u l t e r , L i f e S c i e n c e s , B r e a , C A ) , 1 0 n g a n d 1 n g D N A w e r e a d d e d t o e a c h 2 5 p l P C R r e a c t i o n m i x t u r e a n d a m p l i fi e d u s i n g i n t e r n a l o l i g o n u c l e o t i d e p a i r s . R e a c t i o n m i x t u r e s a n d P C R c o n d i t i o n s w e r e a s a b o v e e x c e p t t h a t 1 p M o f e a c h p u r i f i e d o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e w a s u s e d , a n d a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s r a n g e d f r o m 4 8 t o 6 4 C d e p e n d i n g o n t h e p r o b e p a i r u s e d . I n i t i a l a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s f o r e a c h p a i r w e r e c a l c u l a t e d u s i n g t h e s o f t w a r e p r o g r a m O l i g o c a l c u l a t o r ( E u g e n B u e h l e r , P i t t s b u r g h , P A ) a n d p r o b e s w e r e t e s t e d u n t i l a t e m p e r a t u r e t h a t g a v e s p e c i e s - s p e c i fi c a m p l i fi c a t i o n w a s r e a c h e d . S e q u e n c i n g I T S 1 F a n d I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s w e r e c l e a n e d u s i n g M i l l i p o r e U l t r a f r e e — M C 3 0 , 0 0 0 N M W L p u r i fi c a t i o n fi l t e r s ( M i l l i p o r e C o r p o r a t i o n , B e d f o r d , M A ) . A p p r o x i m a t e l y 1 0 0 p l P C R p r o d u c t s w e r e w a s h e d w i t h P C R w a t e r 4 t i m e s b y s p i n n i n g a t 4 0 0 0 r p m a t 4 C . P u r i fi e d P C R p r o d u c t s w e r e r u n o n 3 % h i g h m e l t 3 2 5 a g a r o s e g e l s a t 1 0 0 V t o q u a n t i f y b e f o r e s u b m i s s i o n f o r s e q u e n c i n g . P C R p r o d u c t s o f I T S a n d 5 . 8 8 r R N A w e r e s e q u e n c e d m a i n l y b y u s i n g I T S 1 F a n d I T S 4 p r i m e r s i n a n A p p l i e d B i o s y s t e m s 3 7 0 A S e q u e n c e r ( A p p l i e d B i o s y s t e m s , F o s t e r C i t y , C A ) w i t h t h e T a q D y e D e o x y T e r m i n a t o r S y s t e m . S e q u e n c i n g w a s d o n e b y t h e G e n o m i c s T e c h n o l o g y S u p p o r t F a c i l i t y a t M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y . P r i m e r s I T S S , I T S 3 a n d I T S Z w e r e a l s o u s e d a s n e c e s s a r y ( W h i t e e t a l . 1 9 9 0 S e q u e n c e a l i g n m e n t , a n a l y s i s a n d p r o b e d e s i g n I T S s e q u e n c e s w e r e e d i t e d , a l i g n e d a n d c o r r e c t e d u s i n g t h e p r o g r a m s E d i t S e q , M e g A l i g n a n d S e q M a n i n t h e D N A S T A R s o f t w a r e p a c k a g e ( D N A S T A R I n c , M a d i s o n , W I ) . E a c h s e q u e n c e w a s c o m p a r e d w i t h t h e s e q u e n c e s i n G e n B a n k ( N C B I , B e t h e s d a , M D ) u s i n g s i m i l a r i t y s e a r c h p r o g r a m B L A S T R ( A l t s c h u l e t a l . 1 9 9 0 a n d 1 9 9 7 ; Z h a n g a n d M a d d e n , 1 9 9 7 ) . I n a d d i t i o n t o t h e s e q u e n c e s o f f u n g i f o r w h i c h p r o b e s w e r e d e s i g n e d , t h e s e q u e n c e s o f r e l a t e d f u n g i w e r e a l s o i n c l u d e d i n a l i g n m e n t f o r p r o b e s e l e c t i o n . O l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s o f 1 8 t o 2 3 b p l o n g w e r e d e s i g n e d f r o m s p e c i e s - s p e c i fi c s e q u e n c e s . P r i m e r S e l e c t p r o g r a m ( D N A S T A R ) w a s u s e d t o e v a l u a t e t h e p r o b e p r o p e r t i e s s u c h a s d u p l e x a n d h a i r p i n f o r m a t i o n a n d % G C c o n t e n t . P r o b e s w e r e s y n t h e s i z e d a t M a c r o m o l e c u l a r S t r u c t u r e a n d S e q u e n c i n g F a c i l i t y ( D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y ) u s i n g a n 3 9 4 8 O l i g o n u c l e o t i d e S y n t h e s i z e r ( A p p l i e d B i o s y s t e m s ) . 3 2 6 L a b e fi n g O l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s w e r e l a b e l e d w i t h g a m m a 3 2 P - A T P b y p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 5 ’ e n d s u s i n g T 4 p o l y n u c l e o t i d e k i n a s e ( N e w E n g l a n d B i o l a b s I n c , B e v e r l y , M A ) . L a b e l i n g r e a c t i o n s c o n s i s t e d o f o f 1 p l p r o b e ( 1 5 - 2 0 p M ) , 2 p l 1 0 X k i n a s e b u f f e r ( 0 . 7 M T r i s - H C I , p H 7 . 6 ; 0 . 1 M M g C l z - 6 H z O ; 5 0 m M d i t h i o t h r e i t o l ) , 5 p l o f g a m m a 3 2 P - A T P ( 6 0 0 0 C i / m M N E N L i f e S c i e n c e P r o d u c t s , B o s t o n , M A ) a n d 8 u n i t s o f T 4 p o l y n u c l e o t i d e k i n a s e i n 1 1 . 4 p l o f H 2 0 a s d e s c r i b e d b y S a m b r o o k e t a l . ( 1 9 8 9 ) . R e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t f o r 4 5 m i n a t 3 7 C a n d w e r e s t o p p e d b y i n a c t i v a t i n g t h e e n z y m e a t 6 5 C f o r 1 0 m i n u t e s . S e p h a d e x G 2 5 ( S i g m a ) c o l u m n s w e r e p r e p a r e d u s i n g 1 m l s y r i n g e s t o s e p a r a t e u n i n c o r p o r a t e d n u c l e o t i d e s f r o m l a b e l e d p r o b e s . L a b e l i n g e f f i c i e n c y w a s c h e c k e d w i t h a n a u t o m a t e d s c i n t i l l a t o r ( B e c k m a n , A r l i n g t o n H e i g h t s , I L ) . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s t o a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s . D o t b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s t o I T S 1 F a n d I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s w e r e p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d ( H e l m u t , 1 9 9 0 ; B r u n s a n d G a r d e s , 1 9 9 3 ) . F i v e p l o f a m p l i f i e d p r o d u c t s ( a p p r o x i m a t e l y 1 0 0 n g ) w e r e d e n a t u r e d i n 1 0 0 p l o f 0 . 4 N N a O H , 2 5 m M E D T A a n d 1 - 2 p l b r o m o p h e n o l b l u e f o r 5 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r e s . H Y B O N D N + n y l o n m e m b r a n e s ( A m e r s h a m L i f e S c i e n c e , B u c k i n g h a m s h i r e , U K ) p r e - c u t t o fi t i n a D o t - b l o t a p p a r a t u s ( G i b c o B R L , L i f e T e c h n o l o g i e s I n c , R o c k v i l l e , M D ) w e r e w e t i n d i s t i l l e d w a t e r f o r 1 m i n a n d 3 2 7 p l a c e d i n t o t h e a p p a r a t u s . D e n a t u r e d s a m p l e s w e r e a d d e d t o t h e a p p r o p r i a t e w e l l s a n d s l o w l y v a c u u m fi l t e r e d o n t o t h e m e m b r a n e . T h e y w e r e U V - fi x e d u s i n g 1 2 0 m l l c m 2 a t 2 5 4 n m b y a S t r a t a l i n k e r ( S t r a t a g e n e , L a J o l l a , C A ) . T h r e e r e p l i c a s f o r e a c h p r o b e w e r e p r e p a r e d . M e m b r a n e s w e r e p r e - w a s h e d f o r 1 h a t 6 5 C i n a s o l u t i o n c o n t a i n i n g 0 . 1 x S S C , 1 0 m M T r i s , p H 8 . 0 a n d 0 . 5 % S D S . P r e - h y b r i d i z a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t a t t h e h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e f o r 1 - 4 h i n h y b r i d i z a t i o n b u f f e r ( 2 0 p l ) c o n t a i n i n g 6 x S S C ( 3 . 6 M N a C l , 0 . 2 M s o d i u m p h o s p h a t e , 2 0 m M E D T A , p H 7 . 0 ) , 0 . 5 % d r y m i l k a s b l o c k i n g a g e n t , 0 . 1 % S D S a n d 1 0 0 p g d e n a t u r e d h e r r i n g s p e r m D N A . A f t e r t h e a d d i t i o n o f l a b e l e d p r o b e s , t h e m e m b r a n e s w e r e h y b r i d i z e d f o r 4 - 1 2 h o u r s i n a r o t a r y t y p e h y b r i d i z a t i o n o v e n ( H Y B A I D , A s h f o r d , M i d d l e s e x , U K ) . I n i t i a l t h e o r e t i c a l h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e ( T . , ) w e r e c a l c u l a t e d b y s u b t r a c t i n g 5 C f r o m t h e e x p e c t e d m e l t i n g t e m p e r a t u r e s ( T m ) a s f o r m u l a t e d i n S a m b r o o k e t a l . ( 1 9 8 9 ) , T m = 4 ( G + C ) + 2 ( A + C ) . T h e a c t u a l h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s ( T a ) t h a t r e s u l t e d i n c o r r e c t p r o b e s p e c i fi c i t y w e r e d e t e r m i n e d e m p e r i c a l l y b y t e s t i n g t h e p r o b e s a t d i f f e r e n t h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s u n t i l a n o p t i m u m t e m p e r a t u r e w a s r e a c h e d f o r e a c h p r o b e . T h e m e m b r a n e s w e r e w a s h e d i n 2 x S S C a n d 0 . 1 % S D S f o r 5 m i n o n a s h a k e r ( O r b i t s h a k e r , L a b - l i n e I n s t r u m e n t s I n c , H e l r o s e P a r k , I L ) a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d f o r 2 0 m i n o n a n i n c u b a t e r s h a k e r ( I n n o v a 4 0 8 0 , N e w B r u n s w i c k S c i e n t i fi c , E d i s o n , N J ) a t 5 C b e l o w t h e h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s . M e m b r a n e s w e r e m o n i t o r e d a n d w a s h e d r e p e a t e d l y a s n e c e s s a r y . H y b r i d i z e d f i l t e r s w e r e e x p o s e d t o X - r a y fi l m ( A m e r s h a m ) f o r 4 h t o 2 d a y s a t - 8 0 C . T h e fi l m s w e r e d e v e l o p e d u s i n g a K o d a k p r o c e s s o r ( K o d a k , R o c h e s t e r , N Y ) . H y b r i d i z a t i o n f i l t e r s w e r e r e u s e d a f t e r 3 2 8 r a d i o a c t i v e p r o b e s w e r e r e m o v e d b y w a s h i n g i n b o i l i n g 2 x S S C a n d 0 . 2 % S D S s o l u t i o n . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s t o t o t a l D N A D o t - b l o t s w e r e a l s o p r e p a r e d u s i n g t o t a l D N A e x t r a c t e d f r o m m y c e l i a ( L e e e t a l . 1 9 8 8 ) a n d f r o m n e e d l e s w i t h o r w i t h o u t f r u i t i n g b o d i e s ( H a m e l i n e t a l . 1 9 9 6 ) . A d d i t i o n a l l y , t h e e x t r a c t i o n b u f f e r w a s s u p p l e m e n t e d w i t h 8 0 p g p r o t e i n a s e K ( 0 . 1 p g l p l , S i g m a ) , a n d a n e x t r a p u r i fi c a t i o n s t e p w i t h p h e n o l : c h l o r o f o r m : i s o a m y l a l c o h o l w a s u s e d f o r t h e D N A e x t r a c t i o n f r o m n e e d l e s t o o b t a i n a s c l e a n a p r o d u c t a s p o s s i b l e . T o t a l D N A f r o m b o t h m y c e l i a a n d n e e d l e s w a s q u a n t i fi e d w i t h a s p e c t r o p h o t o m e t e r a t 2 6 0 n m . T o t a l D N A a l i q u o t s w e r e d i l u t e d i n T E t o a d j u s t t h e c o n c e n t r a t i o n s , a n d w e r e a d d e d t o a n e q u a l v o l u m e o f 1 . 0 M N a O H f o r d e n a t u r a t i o n . F o l l o w i n g 1 h d e n a t u r a t i o n , t h e D N A w a s b l o t t e d o n t o n y l o n m e m b r a n e s t h a t w e r e s o a k e d i n d i s t i l l e d w a t e r , a n d fi x e d w i t h U V u s i n g 2 0 m J / c m 2 a t 2 5 4 n m w i t h S t r a t a l i n k e r . D o t b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f s h o r t o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s t o m y c e l i u m a n d n e e d l e D N A w e r e c o n d u c t e d a s w a s d o n e w i t h I T S 1 F a n d I T S 4 p r o d u c t s , w i t h s o m e m o d i fi c a t i o n s . D N A - fi x e d m e m b r a n e s w e r e p r e - h y b r i d i z e d i n a s o l u t i o n c o n t a i n i n g 6 x S S C , 0 . 0 1 M s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 8 ) , 1 m M E D T A ( p H 8 ) , 0 . 1 % S D S , 1 0 0 p g / m l h e r r i n g s p e r m D N A a n d 0 . 1 % n o n - f a t d r i e d m i l k . F o l l o w i n g 4 h p r e h y b r i d i z a t i o n , l a b e l e d p r o b e s w e r e a d d e d a n d h y b r i d i z a t i o n w a s c a r r i e d o u t f o r 4 - 1 2 h a t t h e c a l c u l a t e d T h t e m p e r a t u r e s . T h e m e m b r a n e s w e r e w a s h e d 3 2 9 b r i e fl y ( 1 t o 3 m i n ) i n 2 X o r 6 X S S C o n s h a k e r a t t h e h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s . T h e m e m b r a n e fi l t e r s w e r e m o n i t o r e d a n d w a s h e d r e p e a t e d l y a s n e c e s s a r y . H y b r i d i z e d fi l t e r s w e r e e x p o s e d t o X - r a y fi l m f o r a t l e a s t 1 2 h o u r s b e f o r e fi l m s w e r e d e v e l o p e d . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s o f I T S r e g i o n a m p l i fi e d w i t h s p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r s H y b r i d i z a t i o n s o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y p r i m e r p a i r s ( H D 1 - H D 4 , A P 1 - A P D a n d D P 1 - D P 4 ) a s a p r o b e t o t o t a l D N A f r o m m y c e l i a a n d n e e d l e s w e r e c a r r i e d o u t a s d e s c r i b e d i n S a m b r o o k e t a l . ( 1 9 8 9 ) w i t h s o m e m o d i fi c a t i o n s . M e m b r a n e s w i t h U V fi x e d D N A o f 5 0 n g t o 1 p g p e r d o t w e r e n e u t r a l i z e d i n T N ( 0 . 5 M T r i s - H C I , 3 M N a C l , p H 7 ) f o r 1 5 m i n . P r e h y b r i d i z a t i o n w a s c o n d u c t e d i n 2 0 m l b u f f e r c o n t a i n i n g 6 x S S C , 0 . 1 % S D S , 5 x D e n h a r d ’ s r e a g e n t ( 1 % F i c o l l , 1 % B S A , 1 % p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e 4 0 0 0 0 ( S i g m a ) , 5 0 m M p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 ) a n d 1 0 0 p g / m l h e r r i n g s p e r m D N A f o r 4 - 1 2 h . T h e p r e h y b r i d i z a t i o n b u f f e r w a s t h e n r e m o v e d a n d h y b r i d i z a t i o n b u f f e r c o n t a i n i n g 6 x S S C , 0 . 1 % S D S a n d 1 0 0 p g / m l h e r r i n g s p e r m D N A w a s a d d e d t o t h e h y b r i d i z a t i o n t u b e s . F o l l o w i n g h y b r i d i z a t i o n a t a g i v e n t e m p e r a t u r e ( 6 8 , 7 3 , 7 5 o r 8 0 C ) f o r 6 - 1 8 h , t h e m e m b r a n e s w e r e w a s h e d o n c e i n a s o l u t i o n o f 2 x S S C a n d 0 . 1 % S D S a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 0 m i n a n d o n c e o r t w i c e i n 0 . 5 x S S C a n d 0 . 1 % S D S a t 5 C b e l o w h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e f o r 1 5 - 2 0 m i n . P r o b e s w e r e s t r i p p e d o f f t h e m e m b r a n e s b y s h a k i n g t h e m i n 1 . 5 M N a C l , 0 . 5 M N a O H f o r 3 0 m i n , a n d m e m b r a n e s w e r e r e u s e d . 3 3 0 R e s t r i c t i o n d i g e s t o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y s p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r s S o f t w a r e g e n e r a t e d r e s t r i c t i o n m a p s o f t h e I T S I — 5 . 8 S - I T S I I r i b o s o m a l D N A s e q u e n c e s o f e a c h f u n g u s w e r e c o n s t r u c t e d b y t h e s u b p r o g r a m M A P D R A W o f D N A S T A R ( D N A S T A R I n c , M a d i s o n , W I ) . M o r e t h a n 2 5 r e s t r i c t i o n e n z y m e s w e r e u s e d t o l o c a t e s p e c i fi c c u t t i n g s i t e s i n I T S s e q u e n c e s o f e a c h f u n g u s . E n z y m e s c u t t i n g s i t e s t h a t w e r e u n i q u e t o a p a r t i c u l a r s p e c i e s w e r e u s e d t o d i f f e r e n t i a t e o n e f u n g u s f r o m o t h e r s . P C R p r o d u c t s a m p l i f i e d b y t h e s p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r s f r o m e s p e c i a l l y i n f e c t e d n e e d l e s w e r e c u t w i t h t h e r e s t r i c t i o n e n z y m e s a s f o l l o w . R e s t r i c t i o n r e a c t i o n s c o n t a i n e d 4 p l o f P C R p r o d u c t s a n d 6 p l o f r e s t r i c t i o n m i x t u r e 1 p l m a n u f a c t u r e r ’ s b u f f e r , 0 . 2 p l e n z y m e a n d 4 . 8 p l d i s t i l l e d w a t e r . R e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t a t 3 7 o r 6 5 C , d e p e n d i n g o n t h e e n z y m e u s e d f o r 2 - 4 h o u r s a n d s t o p p e d b y c o o l i n g o n i c e . D i g e s t e d p r o d u c t s w e r e s e p e r a t e d o n 3 % a g a r o s e g e l f o r 1 h o u r a t 1 0 0 v o l t s a n d p h o t o g r a p h e d u s i n g A l p h a l m a g e r . 3 3 1 P C R A m p I A m a n d e n d o l a p p r o x i m z c o n i g e n u r d fi l i s e q u e n c e i n c l u d e d s e q u e n C t s e ‘ I U e n C l L - P i n a s l h a d 4 4 8 b p I T S : s e c I U e n c A l i S l n m e T I n i v e u m . a n d D . p s e l I U e n c t W i t h t h e : a n d 8 2 9 A “ l i n e d n R E S U L T S P C R A m p l i fi c a t i o n a n d s e q u e n c i n g o f I T S r e g i o n s A m p l i fi c a t i o n s o f i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r s ( I T S ) o f f u n g a l p a t h o g e n s a n d e n d o p h y t e s o f p i n e w i t h I T S 1 F a n d I T S 4 p r i m e r s y i e l d e d P C R p r o d u c t s o f a p p r o x i m a t e l y 5 5 0 - 8 0 0 b p d e p e n d i n g o n t h e s p e c i e s ( F i g u r e 6 . 1 ) . C . n i v e u m , L . c o n i g e n u m , L . p i n a s t r i i s o l a t e L P - U B C a n d L . s e d i t i o s u m i s o l a t e s y i e l d e d t w o d i f f e r e n t P C R p r o d u c t s d u e t o p r e s e n c e o f i n t r o n s e q u e n c e s . T h e l e n g t h s o f I T S s e q u e n c e o f f u n g i s e q u e n c e d i n t h i s s t u d y r a n g e d f r o m 4 1 5 t o 5 1 7 b p t h a t i n c l u d e d I T S I , 5 . 8 s D N A a n d I T S I I r e g i o n s ( T a b l e 6 . 1 ) . C . m i n u s h a d a n I T S s e q u e n c e o f 5 0 0 b p w h i l e C . n i v e u m h a d 4 9 9 b p i n a d d i t i o n t o a 2 0 7 b p i n t r o n s e q u e n c e . L . s e d i t i o s u m h a d 4 5 3 b p I T S s e q u e n c e a n d 1 9 2 b p i n t r o n s e q u e n c e . L . p i n a s t n ' i s o l a t e L P h a d a n I T S s e q u e n c e o f 4 4 9 b p w h i l e t h e i s o l a t e L P - U B C h a d 4 4 8 b p I T S s e q u e n c e a n d 2 0 2 b p i n t r o n s e q u e n c e . L . c o n i g e n u m h a d 4 5 2 b p I T S s e q u e n c e a n d 2 0 2 b p i n t r o n s e q u e n c e . D . p i n i a n d S . a c i c o l a h a d I T S s e q u e n c e s o f 4 5 8 b p a n d 4 7 6 b p r e s p e c t i v e l y . A l i g n m e n t o f s e q u e n c e s a n d d e s i g n o f p r i m e r / p r o b e s T h e s e q u e n c e o f C . m i n u s h a d 9 8 % h o m o l o g y t o t h e s e q u e n c e o f C . n i v e u m . T h e f u n g u s h a d 8 3 a n d 8 0 % h o m o l o g y t o t h e s e q u e n c e s o f G . a b i e t i n a a n d D . p i n i r e s p e c t i v e l y . T h e y w e r e t h e t w o o t h e r p i n e f u n g i t h a t h a d t h e h i g h e s t s e q u e n c e s i m i l a r i t y w i t h C . m i n u s . L . s e d i t i o s u m s h a r e d 9 0 a n d 8 7 % h o m o l o g y w i t h t h e s e q u e n c e s o f L . c o n i g e n u m a n d L . p i n a s t r i r e s p e c t i v e l y . D . p i n i h a d 8 5 a n d 8 2 % s e q u e n c e s i m i l a r i t y w i t h S . a c i c o l a a n d H . d e m a t i o i d e s , r e s p e c t i v e l y . A l i g n e d I T S s e q u e n c e s o f t h e f u n g i a r e s h o w n i n F i g u r e 6 . 2 . S e l e c t e d p a i r s o f 3 3 2 K B 1 A P 2 C M 3 - C N 4 D P 5 — H D 6 - L C O N 7 - L P 9 - L S 1 0 S A 1 1 1 G A 1 2 - S C 1 3 - X A O m 3 . D . 1 ‘ n o 5 5 0 b p - - ) 5 0 0 b p - - ) F i g u r e 6 . 1 . P C R a m p l i fi c a t i o n s o f i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r s ( I T S ) o f f u n g i t h a t i n f e c t p i n e n e e d l e s u s i n g u n i v e r s a l f u n g a l p r i m e r s I T S 1 F a n d I T S 4 . l n t r o n s e q u e n c e s w e r e p r e s e n t i n l a n e s 3 , 6 , 8 , a n d 9 . D N A f r o m A . p u l l u l a n s ( A P ) , C . m i n u s ( C M ) , C . n i v e u m ( C N ) , D . p i n i ( D P ) , H . d e m a t i o i d e s ( H D ) , L . c o n i g e n u m ( L C O N ) , L . p i n a s t r i ( L P - ) , L . s e d i t i o s u m ( L S ) , S . a c i c o l a ( S A ) , G . a b i e t i n a ( G A ) , 8 . c o n i g e n u s ( S C ) , X . a b i e t i s ( X A ) w a s e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m . 1 K B + : s i z e s t a n d a r d D N A l a d d e r . 3 3 3 1 C M G C G C N c c c L S c . L P c c c L C O N c . . S A A A T D P . . . G A . C A 3 0 c . . A P . 0 0 4 H D G C G ’ R K A . c e K J . 0 0 6 1 C “ “ J C N C A C ' L S C T ‘ I " L P fl L C O N T ' f j S A T G ’ I ‘ C D P T G T C G A 0 0 . 1 S C T G T C A P T G T ' J H D T G T ' E R K A T G T ' I K J T G T 1 2 1 9 ‘ c c c c C “ c c c c L S o a L P L C O N . . . . 3 “ c c . _ D P C c . . G A A C C C S C C T T { 1 P C T G C E D C A C ' I m C A C C K “ C A C C 1 8 1 C “ G T . . 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T C G G C G G G C T T C A A C C A A C T T C G G G C G T A G T A G A G T T R K A A G G C G G G C G T G C C T C G A A G A C C . T C G G C G G G G C C T A A C C G G C T T C G G G C G T A G T A G A G T T K J A G G C G G G C G T G C C T C G A A G A C C . T C G G C G G G G T T C C A T C A A C T T C G G G C G T A G T A G A G T T 4 8 1 5 4 0 C M T . . T C . T . . . C G C T C T G G A G C C T G G G T T G G . T G C C . . T G C C A G A A G C C T A A T T T T T T . . . C N T . . T C . T . . . C G C T C T G G A C C C T G G G T T G G . T G C C . . T G C C A A A A G C C T A A T T T T T T . . . L S C G . T C G C . . . T G G T A G G G A A G G A C A G C A G G . T G C C G T C A G C A C A A C C C C C A C A C A C A A G G L P C G . T C G C . . . T G G A A G G A G A G G C C . . T A G G . C G C T A T A G A C A A C C C C C T T T T T T A C A A G G L C O N C G . T C G C . . . T G T T A G G G A A G G G T G G C A A G . C G C C G T C A . T A C A A C C C C C A C A C A . . A G G S A . . T T T . . . . . C G C T A G G G A G T T C G C G T C . . . T G C C G C G G C C G T T A A A T C A T T A . A C A C C A D P T A T T T . . . . . C G C T G A A G A G T T C G G A C G . . . G C T T T T G G C C G T T A A A T C T T T . . . . . T T A G A T C . T C G T . . . . . . . . . . . . . . . . . . A C A G G . . G C C . . . . . C G G G A G A C C . . . . . . . . . . . S C T A C C T . . . . . C G T T T G T A A A G A C T A G C . . G G T G C T C T T G C C G T A A A A C C C C C A A C T T T T G A P T A T T C G A A C G T C T G T C A A A G G . . . A G A G G A A C T C C G C C G A C . T G A A A C C T T T A T T T T T T C H D A A A T C G A A . . C G T C T T A T A A G C T T G G T C G G A T C T C A T T G C C G T T A A A C C T T T A A A T T T T C R K A A A A T C A A A A A C G T C T T A T A A G T C T G G T T A G A A C C C A T T G C C G T A A A A C C T T T T T A T T T T C K J A A A T C G A A . . C G T C T T A T A A G C T T G G T G A G A T C T C A T T G C C G T T A A A C C T T T C T A T T T T T 5 4 1 5 5 0 C M . C A G . . . . . G C N T C A G . . . . . G L S T T G A . . . . . C L P . . . . . . . . . . L C O N T T G A . . . . . C S A A A G G . . . . . T D P C A A G . . . . . G G A . . . A . . . . . C S C A A A A T T G A C C A P T A G G . . . . . . H D T A G G . . . . . T R K A T A G G . . . . . . K J C A G G . . . . . . F i g u r e 6 . 2 . A l i g n m e n t o f I T S s e q u e n c e s f o r s e l e c t i o n o f p r i m e r / p r o b e s . C M = C . m i n u s , C N = C . n i v e u m , L S = L . s e d i t i o s u m , L P = L . p i n a s t r i , L C O N = L . c o n i g e n u m , S A = S . a c i c o l a , D P = D . p i n i , G A = G . a b i e t i n a , S C = S . c o n i g e n u s , A P = A . p u l l u l a n s , H D = H . d e m a t i o i d e s , R K A = R . k a l k h o f fi i , K J = K . j u n i p e r i . U n d e r l i n e d a n d b o l d s e q u e n c e s r e p r e s e n t p r i m e r s e q u e n c e o f s p e c i fi c f o r s p e c i e s . 3 3 6 T a b l e 6 . 2 . O l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s d e s i g n e d f o r s p e c i e s - s p e c i f i c a m p l i f i c a t i o n o f f u n g a l p a t h o g e n s a n d e n d o p h y t e s o f p i n e . T h e s e q u e n c e , g u a n i n e - c y t o s i n e p e r c e n t a g e ( % G C ) , c a l c u l a t e d m e l t i n g ( T m ) , t h e o r e t i c a l h y b r i d i z a t i o n ( T h ) , a n d a c t u a l h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s ( T a ) o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s a s u s e d i n d o t - b l o t a n a l y s i s , a n d c a l c u l a t e d ( T a n ) a n d a c t u a l o p t i m u m , s p e c i e s - s p e c i fi c a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e ( T p c r ) o f t h e p a i r s o f p r i m e r s a s u s e d i n d i r e c t ( d ) a n d n e s t e d ( n ) P C R a m p l i fi c a t i o n s . F u n g a l s p e c i e s P r i m e r S e q u e n c e G C T m T h T a T a n T p c r 1 3 3 ' c o d e s ( % ) d n ( b p ) A . p u l l u l a n s A P 1 5 ' G T G C T C A G C G C C C G A C C T 7 2 6 0 5 5 5 5 5 7 5 8 5 8 4 6 9 A P 4 5 ' T T C A G T C G G C G G A G T T G G 6 1 5 8 5 3 5 5 5 3 H . d e m a t i o i d e s H D 1 5 ' G T A T T A A A C C A G T C G T C T G A 4 0 5 6 5 1 5 1 4 8 5 2 5 6 3 3 5 H 0 4 5 ' T G A G A T C C G A C C A A G C T — T A 4 7 5 6 5 1 5 1 4 9 C . m i n u s C M 1 5 ' G C G G A A C T C C C A C C C A C T G T 6 5 6 5 6 O 6 0 5 8 5 8 6 0 - 4 4 7 C M 4 5 ' T A G G C T T C T G G C A G G C A C C A A C 5 9 6 4 5 9 6 0 5 8 6 6 C . n i v e u s C N 1 5 ' C T G C C A G A G G A C C T G T A A A A T T 4 5 6 4 5 9 6 2 5 3 5 6 6 0 2 7 8 C N 4 5 ' T T T T A A G G A G C G C C G C C T G G 6 0 6 2 5 7 N D 5 6 D . p i n i D P 1 5 ' G C G A A A G C C C G A C C T C C A A C 6 5 6 4 5 9 5 7 5 8 6 0 6 0 4 1 7 D P 4 5 ' G C C A A A A G C C G T C C G A A C T C T 5 7 6 6 6 1 5 7 5 6 L . s e d i t i o s u m L 5 1 5 ' C G C C G C G A G G T G C T A T T C 6 7 6 0 5 5 5 6 5 5 5 8 6 2 3 3 0 L 5 4 5 ' T T T T G A G G C A G G C C T T C G T G A C 6 O 5 8 5 3 N D 5 5 L . p i n a s t r i L P 1 5 ' C C T A T T C T C A C C C T l — T G C C 5 3 5 8 5 3 5 6 5 1 5 5 6 0 3 9 8 L P 4 5 ' A A A G G G G G T T G T C T A T A G C G 5 0 6 0 5 5 N D 5 2 S . a c i c o l a S A C 1 5 ' C T G A A A G A C C T C C C C T G G C C C 6 7 7 0 6 5 N D 6 0 6 0 6 0 4 3 6 S A C 4 5 ' G C G A A C T C C C T A G C G A A A A T G T C 5 2 7 0 6 5 N D 5 7 ' P S = r e p r e s e n t s t h e s i z e s o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y s p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r p a i r s . 3 3 7 l p r i m e r s 1 s p e c i f i c 5 T e s t i n g 6 F r i a n n e a l i n g a m p l i fi e d l e m p e r a l c r o s s - r e . p i n e w a : d i f f e r e n t f r o m t h e t i 3 m p e r a 3 8 6 0 b i T h e p r i n 6 6 C . P r i O p t i m u m a " I l i l l l l c a t i p r i m e r s t h a t w e r e e f f e c t i v e i n d i f f e r e n t i a l l y a m p l i f y i n g t h e I T S s e q u e n c e o f s p e c i fi c s p e c i e s a r e u n d e r l i n e d a n d i n b o l d i n fi g u r e 6 . 2 , a n d l i s t e d i n T a b l e 6 . 2 . T e s t i n g o f s p e c i fi c i t i e s o f C y c l a n e u s m a p r i m e r s i n P C R a m p l i fi c a t i o n s P r i m e r p a i r C M 1 - C M 4 w a s t e s t e d a g a i n s t m y c e l i a l D N A o f f u n g i a t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s o f 5 8 a n d 6 0 C i n d i r e c t P C R a m p l i f i c a t i o n . T h e p a i r a m p l i f i e d o n l y t h e D N A o f C . m i n u s a n d C . n i v e u m a t b o t h a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s ( F i g u r e 6 . 3 A ) . O p t i m u m t e m p e r a t u r e w a s d e t e r m i n e d a s 5 8 C . N o c r o s s - r e a c t i o n w i t h t h e f u n g i L . s e d i t i o s u m , D . p i n i a n d S . a c i c i o l a i n f e c t i n g S c o t s p i n e w a s o b s e r v e d i n a n y o f t h e t e s t s i n d i c a t i n g t h a t t h e p r i m e r s c o u l d b e u s e d t o d i f f e r e n t i a t e C y c l a n e u s m a . H o w e v e r , h e p r i m e r s d i d n o t d i f f e r e n t i a t e C . m i n u s f r o m t h e e n d o p h y t i e C . n i v e u m . T h e p a i r w a s a l s o t e s t e d i n n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s a t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s o f 5 8 , 6 0 , 6 2 , 6 4 a n d 6 6 C . O p t i m u m t e m p e r a t u r e w a s d e t e r m i n e d a s 6 0 b e c a u s e a m p l i fi c a t i o n s f r o m i n f e c t e d n e e d l e s w e r e s e n s i t i v e a n d s p e c i fi c . T h e p r i m e r w a s s t i l l s e n s i t i v e a n d e f fi c i e n t a t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e a s h i g h a s 6 6 C . P r i m e r C N 1 a n d C N 4 a m p l i fi e d o n l y C . n i v e u m a n d C . m i n u s D N A a t a n o p t i m u m a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s o f 5 6 a n d 6 0 C i n d i r e c t a n d n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n r e s p e c t i v e l y ( F i g u r e 6 . 4 A a n d B ) . 3 3 8 + B K 1 4 4 7 u p . F i g u r e l + M N C - S P P p A B C C L L L L S K - - - - - p - 1 1 2 3 5 4 Q 6 a C B U - N O 1 4 ’ e - . ; . — 3 _ . < < O D l i g h t $ 5 5 fi l l W W O U D I § < I K m 2 A x . J a e - i d e a l a t l a e g a a v - N ( D N Q m Y - v — v - . - F ‘ — 4 4 7 0 1 » : 1 7 — L J F i g u r e 6 . 3 . P C R a m p l i fi c a t i o n s f o r s p e c i fi c i t y d e t e r m i n a t i o n o f p r i m e r p a i r C M 1 - C M 4 . A . D i r e c t a m p l i fi c a t i o n s o f m y c e l i a l D N A a t o p t i m u m t e m p e r a t u r e 5 8 C . B . N e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s o f I T S 1 F a n d I T S 4 a m p l i fi e d s p e c i e s - s p e c i fi c P C R p r o d u c t s o f t h e I T S s e q u e n c e s o f C . m i n u s a n d C . n i v e u m a t t e m p e r a t u r e 6 0 C . 3 3 9 2 7 8 0 9 - ) ” W e F i g u r e d e t e r m i N e s t e d C B U J P S A S P G H X A L L S L L - - - - - A D 1 - C A P 1 - N l P R - - - - - 1 4 6 O 2 3 5 I 1 1 1 6 8 9 7 1 1 Z a 8 1 ’ v 2 7 8 b p - - ) 4 - L C O N 1 0 - G A 1 1 s o 1 2 - H D X A 1 4 - A P ' 1 5 - R K A - 1 A 1 6 - R P l N - 1 1 7 - s p 1 8 - K T 5 L J 6 - L P a t 7 - L P - U B C e - L S — 9 - S A F i g u r e 6 . 4 P C R a m p l i fi c a t i o n s w i t h p r i m e r s C N 1 a n d C N 4 f o r s p e c i fi c i t y d e t e r m i n a t i o n . A ) D i r e c t a m p l i fi c a t i o n s a t o p t i m u m t e m p e r a t u r e o f 5 6 C , B ) N e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n a t 6 0 C . 3 4 0 D e t e c t i o n o f C . m i n u s i n i n f e c t e d n e e d l e s w i t h o r w i t h o u t s y m p t o m s T h e p r i m e r p a i r C M 1 - C M 4 c o n s i s t e n t l y a m p l i fi e d C . m i n u s n e e d l e s w i t h f r u i t i n g b o d i e s o r t y p i c a l e a r l y s y m p t o m s o f t h e d i s e a s e i n d i r e c t a n d n e s t e d a m p l i fi c a t i o n s a t t h e a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s o f 5 8 C a n d 6 0 C , r e s p e c t i v e l y ( F i g u r e 6 . 5 A a n d B ) . F u r t h e r m o r e , a m p l i fi c a t i o n s o c c u r r e d w i t h D N A e x t r a c t e d f r o m t h e s y m p t o m l e s s r e g i o n s o f n e e d l e s c l o s e t o t h e a r e a s w i t h s y m p t o m s . N o a m p l i fi c a t i o n s o c c u r r e d w i t h D N A f r o m S c o t s p i n e n e e d l e s i n f e c t e d w i t h L . s e d i t i o s u m a n d S . a c i c o l a o r a n d D N A f r o m u n i n f e c t e d n e e d l e s o r f r o m A u s t r i a n p i n e i n f e c t e d w i t h D . p i n i . B o t h D i r e c t a n d n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s w e r e r e l i a b l e a n d a c c u r a t e i n d e t e c t i n g , i d e n t i f y i n g a n d d i f f e r e n t i a t i n g C y c l a n e u s m a s p f r o m o t h e r f u n g i i n t h e n e e d l e s . C N 1 a n d C N 4 p r i m e r s d i d n o t d e t e c t a n y C . n i v e u m D N A i n a n y o f t h e s a m p l e s t e s t e d i n t h i s s t u d y . F u r t h e r m o r e , t h e p r i m e r s d i d n o t a m p l i f y C . m i n u s i n i n f e c t e d n e e d l e s i n b o t h d i r e c t a n d n e s t e d P C R . R e s t r i c t i o n D i g e s t o f C M 1 - C M 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s f r o m n e e d l e s P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y C M 1 a n d C M 4 f r o m i n f e c t e d n e e d l e s w e r e d i g e s t e d w i t h e n d o n u c l e a s e s A p a l , R s a l , S e a l a n d B s t N l ( T a b l e 6 . 3 ) . R e s t r i c t i o n d i g e s t s b y a l l 4 e n z y m e s a r e s h o w n i n fi g u r e 6 . 6 . D i g e s t s w i t h t h e e n d o n u c l e a s e s c o n fi r m e d t h a t P C R p r o d u c t s a m p l i f i e d b y C M 1 a n d C M 4 f r o m i n f e c t e d n e e d l e s 3 4 1 > * S C O T S P - H + S C O T S P - H 4 4 7 l i p - 9 F i g u r e 6 . 5 . D e t e c t i o n o f C . m i n u s i n n e e d l e s o f S c o t s p i n e w i t h p r i m e r s C M 1 a n d C M 4 . A ) D i r e c t P C R a m p l i fi c a t i o n s a t 5 8 C . L a n e s 1 - 2 , n e e d l e s w i t h f r u i t i n g b o d i e s ; L a n e s 2 - 4 n e e d l e s w i t h s y m p t o m s ; L a n e s 5 - 6 n e e d l e s i n f e c t e d w i t h B r o w n s p o t ( S . a c i c o l a ) a n d L o p h o d e r m i u m n e e d l e c a s t ( L . s e d i t i o s u m ) ; L a n e s 7 - 8 : s y m p t o m l e s s n e e d l e s o n t h e s a m e b r a n c h ; L a n e s 9 , t h e r e g i o n s o f n e e d l e s c l o s e t o C . m i n u s s y m p t o m s o n g r e e n f o l i a g e . B ) N e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n a t 6 0 C . L a n e s 1 - 2 , n e e d l e w i t h f r u i t i n g b o d i e s ; L a n e s 3 - 4 , n e e d l e s w i t h s y m p t o m s ; L a n e s 6 - 7 , s y m p t o m l e s s n e e d l e s o n t h e s a m e b r a n c h ; L a n e s 8 - 9 , n e e d l e s i n f e c t e d w i t h S . a c i c o l a a n d L . s e d i t i o s u m . L a n e s 1 0 - 1 1 , t h e s y m p t o m l e s s r e g i o n s o f g r e e n n e e d l e s c l o s e t o C . m i n u s s y m p t o m s . 3 4 2 T a b l e 6 . 3 . R e s t r i c t i o n f r a g m e n t m a p s o f t h e s p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r a m p l i fi a b l e I T S s e q u e n c e s o f s o m e p a t h o g e n s a n d e n d o p h y t e s p r e s e n t i n p i n e n e e d l e s . C M 1 - C M 4 s e m e n c e o f I T S 1 S fl i e s A p _ a l R s a l £ 1 5 g p ; C . m i n u s N S + 3 1 3 1 3 4 3 1 3 1 3 4 4 2 2 2 5 C . n i v e u m 3 8 6 6 1 N S N S 3 6 6 7 3 8 D . p i n i N S + N S + N S + N S L . s e d i t i o s u m N S + 3 1 7 8 7 3 1 7 8 7 2 4 6 1 8 3 L . p i n a s t n ' N S 2 6 2 8 8 4 7 2 6 2 8 8 4 7 N S + L . c o n i g e n u m N S + 3 3 3 8 8 3 3 3 8 8 N S + S . a c i c o l a N S + N S + N S + 3 0 3 1 2 6 A . p u l l u l a n s N S + N S + N S + 3 4 9 8 0 H . d e m a t i o i d e s N S + N S + N S + N S + L S 1 - L S 4 L P 1 - L P 4 $ 3 i s B _ s t M _ B _ f § L _ C . m i n u s N S 3 3 6 8 7 C . n i v e u m N S 3 3 6 8 7 D . p i n i N S + 3 0 5 1 2 3 L . s e d i t i o s u m 2 3 4 9 6 N S + , L . p i n a s t r i N S + 2 9 8 4 3 3 5 1 3 L . c o n i g e n u m N S + N S + S . a c i c o l a 3 1 5 4 1 N S A . p u l l u l a n s 2 9 3 1 7 N S + H . d e m a t i o i d e s N S + N S + D P 1 - D P 4 S A 1 - S A 4 S p e c i e s B s t L J I Q 3 1 3 1 C . m i n u s 3 3 9 1 0 1 1 0 N S + C . n i v e u m 3 3 9 1 0 1 1 0 N S + D . p i n i 2 6 6 7 1 6 0 1 0 N S + L . s e d i t i o s u m N S 2 5 7 1 5 8 L . p i n a s t n ' N S + N S + L . c o n i g e n u m 3 4 8 5 7 N S + S . a c i c o l a 2 7 8 7 0 6 6 8 8 3 2 4 9 7 1 5 A . p u l l u l a n s 3 7 3 9 9 3 5 8 1 1 4 , H . d e m a t i o i d e s N S + N S + A P 1 - A P 4 H D 1 - H 0 4 S p e c i e s A I u l B s t N I H a e I l l A . p u l l u l a n s 3 3 9 1 3 0 3 7 6 9 3 2 7 2 6 3 , H . d e m a t i o i d e s 4 4 6 2 3 N S + 2 4 9 8 6 , C . m i n u s 3 9 3 7 1 5 4 3 3 3 6 N S D . p i n i 3 1 2 1 1 4 N S + 3 2 6 7 K . j u n i p e r i 4 4 6 1 3 N S + 4 6 0 9 L . p i n a s t [ y 2 8 6 1 2 3 N S + 2 9 8 2 3 L . s e d i t i o s u m 2 8 6 1 2 3 1 7 6 1 5 8 2 4 0 9 3 P . g a u m a n i i 3 9 2 7 4 2 8 9 1 8 5 2 2 9 1 0 6 R . k a l k h o f fi i N S + N S + 4 6 0 9 S p e c i e s s p e c i fi c p r i m e r s a m p l i fi e d p o r t i o n o f I T S . N S + = n o c u t t i n g s i t e i n t h e e n t i r e I T S r e g i o n . N S = n o c u t t i n g s i t e i n t h e p o r t i o n o f I T S t h a t c a n b e a m p l i fi e d b y s p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r s . 3 4 3 B K 1 8 3 2 5 5 0 R s a l S e a l 9 ' ' - N m V I D ( D N ( D a : S s . - l . > . ' . 5 3 5 6 1 . r ' l - w w W 1 4 ‘ " ’ 9 ‘ ‘ 9 " " F i g u r e 6 . 6 . R e s t r i c t i o n d i g e s t s o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y C M 1 a n d C M 4 f r o m i n f e c t e d n e e d l e s i n n e s t e d ( L a n e s 1 - 4 ) , a n d d i r e c t P C R ( L a n e s 5 - 1 0 ) . w e r e I T S s e q u e n c e s C . m i n u s n o t t h o s e o f C . n i v e u m . C . n i v e u m w a s n o t d e t e c t e d i n a n y n e e d l e s a m p l e s w e t e s t e d . S p e c i fi c i t y o f P r o b e s d e v e l o p e d f o r L o p h o d e r m i u m s p e c i e s P r i m e r s p a i r s L S 1 - L S 4 a n d L P 1 - L P 4 w e r e t e s t e d i n d i r e c t a n d n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s a t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s o f 5 5 , 5 8 , 6 0 a n d 6 2 C . T h e p r i m e r p a i r s w e r e t e s t e d a g a i n s t w o r k i n g d i l u t i o n s m y c e l i a l D N A o f 1 0 2 a n d 1 0 3 t o a s s u r e t h a t t h e D N A c o n c e n t r a t i o n w a s n o t a f a c t o r i n s p e c i fi c i t y o f t h e p r i m e r s . A m p l i fi c a t i o n s w e r e s p e c i e s s p e c i f i c a n d o p t i m u m a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e f o r L S I - L S 4 w a s 5 8 C i n d i r e c t P C R , a n d 6 2 C i n n e s t e d P C R . ( F i g u r e 6 . 7 A B , r e s p e c t i v e l y ) . L P 1 a n d L P 4 w e r e f o u n d t o a m p l i f y o n l y t h e t a r g e t f u n g u s s p e c i fi c a l l y a n d o p t i m a l l y a t a n d a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e o f 5 5 C f o r d i r e c t P C R , a n d 6 0 C i n n e s t e d P C R ( F i g u r e 6 . 8 A , B r e s p e c t i v e l y ) . N o a m p l i fi c a t i o n s w i t h t h e D N A o f o t h e r f u n g i w e r e o b s e r v e d . D e t e c t i o n o f L . s e d i t i o s u m a n d L . p i n a s t r y i n i n f e c t e d n e e d l e s b y s p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r s P r i m e r p a i r L S 1 A a n d L S 4 d e t e c t e d L . s e d i t i o s u m i n a l l 4 s a m p l e s o f n e e d l e s o f S c o t s p i n e c a r r y i n g f r u i t i n g b o d i e s o r t y p i c a l s y m p t o m s o f t h e d i s e a s e , i n b o t h d i r e c t a n d n e s t e d P C R ( F i g u r e 6 . 9 A ) . A m p l i fi c a t i o n f r o m f r e s h g r e e n n e e d l e s p r o d u c e d s t r o n g e r a n d c o n s i s t e n t r e s u l t s c o m p a r e d t o d r y o l d n e e d l e s , e v e n w h e n d r y n e e d l e s c o n t a i n e d f r u i t i n g b o d i e s . T h e p r i m e r s d i d n o t a m p l i f y D N A o f L . p i n a s t r i e x t r a c t e d f r o m n e e d l e s o f w h i t e p i n e w i t h f r u i t i n g b o d i e s . 3 4 5 5 - L P - U B C 7 - L J 8 - D P 9 - C M 1 0 - C N 1 1 - S A - 1 1 2 - H D + ( I ) ( I ) D . E - . l - . l - . I I - N n V E D 1 K B + 1 - C M Z - C N 3 - 0 9 4 - A P 5 - H D 6 - R K A - 1 7 - R P l N - 1 8 — S A - 1 9 - S C 1 0 - L S 1 1 - L P 1 2 - L C O N 1 3 - L J 1 4 - A S A 1 5 - S P F i g u r e 6 . 7 . S p e c i e s - s p e c i fi c a m p l i fi c a t i o n o f L . s e d i t i o s u m w i t h p r i m e r s L S 1 a n d L S 4 a t o p t i m u m a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s 5 8 C i n d i r e c t ( A ) , a n d 6 2 C i n n e s t e d ( B ) , P C R a m p l i fi c a t i o n s . T h e p r i m e r s w e r e t e s t e d w i t h 1 0 2 a n d 1 0 3 d i l u t i o n s o f t e m p l a t e ( m y c e l i a l D N A ) i n d i r e c t a m p l i fi c a t i o n s . I n n e s t e d a m p l i fi c a t i o n s , t e m p l a t e D N A w a s I T S 1 F - I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s d i l u t e d t o 1 0 2 . 3 4 6 l l l l l l l l I - l l i 8 8 2 2 ‘ 7 ; : 3 3 . o o 6 : 2 2 1 ; o § E I L § * m s u m w m 0 0 a w q q o m g n l c £ < $ 4 . ; e g g e g g e e u a t h r o h d i g A r r - N V r s v - r - w v - v - q — 3 9 8 b p - - > o " ' 7 a : z < E a o t : 2 1 1 m g u n . B a d i m o — a g g g g q q g n : i fi i i ‘ i a s a a e z fl z é é g . . . - - - F i g u r e 6 . 8 . S p e c i e s - s p e c i fi c a m p l i fi c a t i o n o f L . p i n a s t r i w i t h p r i m e r s L P 1 a n d L P 4 a t o p t i m u m a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s 5 5 C i n d i r e c t ( A ) , a n d 6 0 C i n n e s t e d ( B ) , P C R a m p l i fi c a t i o n s . T h e p r i m e r s w e r e t e s t e d 1 0 2 a n d 1 0 3 d i l u t i o n s o f t e m p l a t e ( m y c e l i a l D N A ) o f i n d i r e c t a m p l i fi c a t i o n s . N e s t e d t e m p l a t e w a s 1 0 2 d i l u t i o n s o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y t h e p r i m e r p a i r I T S 1 F - I T S 4 . 3 4 7 H - P S T O C S T U C - S L A 5 ’ : x . _ w ' F i g u r e 6 . 9 . A ) D e t e c t i o n o f L . s e d i t i o s u m b y p r i m e r s L S 1 a n d L S 4 i n i n f e c t e d n e e d l e s o f S c o t s p i n e i n d i r e c t P C R a m p l i fi c a t i o n a t 5 8 C ( L a n e s 1 - 4 ) a n d i n n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s ( L a n e s 5 - 8 ) a t 6 2 C . W h i t e p i n e n e e d l e s w i t h f r u i t i n g b o d i e s o f L . p i n a s t r i ( L a n e 9 ) , a n d u n i n f e c t e d S c o t s p i n e n e e d l e s ( S C O T S P - H ) w e r e i n c l u d e d . B ) R e s t r i c t i o n d i g e s t o f L S 1 - L S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s f r o m s a m e n e e d l e s a m p l e s w i t h B s t N l . L S - U r e p r e s e n t s u n c u t P C R p r o d u c t s . 3 4 8 m 1 1 8 - — S C O T S P - H I . O . ( I ) p - O U " P 0 — L P 1 2 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 K B + L P L P - U B C 2 9 8 e r F i g u r e 6 . 1 0 . A ) D e t e c t i o n o f L . p i n a s t r i b y p r i m e r s L P 1 a n d L P 4 i n i n f e c t e d n e e d l e s o f S c o t s p i n e . D i r e c t P C R a m p l i fi c a t i o n s a t 5 5 C ( L a n e s 1 - 9 ) a n d n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s a t 6 0 C ( L a n e s 1 0 - 1 8 ) . L a n e s 1 a n d 1 0 ; D N A f r o m m y c e l i u m o f L . p i n a s t r i . L a n e s 2 a n d 1 7 ; D N A f r o m f r u i t i n g b o d i e s o r s y m p t o m s , L a n e s 3 - 5 a n d 1 1 - 1 3 ; D N A f r o m S c o t s p i n e n e e d l e s i n f e c t e d w i t h L . s e d i t i o s u m . L a n e s 6 a n d 1 4 ; D N A f r o m S c o t s p i n e n e e d l e s i n f e c t e d w i t h C . m i n u s . L a n e s 7 a n d 1 5 ; D N A f r o m S c o t s p i n e n e e d l e s i n f e c t e d w i t h S . a c i c o l a , . L a n e s 8 a n d 1 6 ; D N A f r o m A u s t r i a n p i n e i n f e c t e d w i t h D . p i n i . L a n e s 9 a n d 1 8 ; D N A f r o m u n i n f e c t e d S c o t s p i n e n e e d l e s . B ) R e s t r i c t i o n d i g e s t o f L P 1 - L P 4 a m p l i f i e d P C R p r o d u c t s f r o m n e e d l e s w i t h e n z y m e B f a l . D N A a m p l i fi e d f r o m t h e n e e d l e s o f w h i t e p i n e i n n e s t e d ( l a n e s 1 - 2 ) a n d d i r e c t P C R ( L a n e s 3 - 4 ) . 3 4 9 S i m i l a r l y , T h e p r i m e r p a i r L P 1 a n d L P 4 d e t e c t e d L . p i n a s t r i i n t h e D N A o f o n l y p i n e i n f e c t e d w i t h t h e p a t h o g e n i n d i r e c t a n d n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s a t 5 5 a n d 6 0 C ( F i g u r e 6 . 1 0 A ) . R e s t r i c t i o n d i g e s t o f D N A a m p l i fi e d b y L . s e d i t i o s u m a n d L . p i n a s t r i s p e c i fi c p r i m e r s L S 1 - L S 4 a n d L P 1 - L P a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s f r o m i n f e c t e d S c o t s p i n e n e e d l e s w e r e c u t w i t h e n d o n u c l e a s e s B s t N l ( F i g u r e 6 . 9 B ) . L P 1 - L P 4 a m p l i f i e d P C R p r o d u c t s w e r e c u t w i t h r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e B f a l . y i e l d e d s a m e s i z e f r a g m e n t s w i t h P C R p r o d u c t s o f b o t h L . p i n a s t r i i s o l a t e s a n d w i t h P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d f r o m i n f e c t e d w h i t e p i n e n e e d l e s ( F i g u r e 6 . 1 0 B ) . R e s t r i c t i o n d i g e s t o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y L S 1 - L S 4 a n d L P 1 - L P 4 c o n fi r m e d t h a t t h e s p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r p a i r a m p l i fi e d o n l y t h e i r t a r g e t s L . s e d i t i o s u m o r L . p i n a s t r i , r e s p e c t i v e l y f r o m i n f e c t e d n e e d l e s . P C R t e s t i n g o f p r i m e r s d e v e l o p e d f r o m B r o w n s p o t f u n g u s A n o p t i m u m a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e o f 6 0 w a s d e t e r m i n e d f o r p r i m e r p a i r S A 1 - 8 A 4 f o r b o t h d i r e c t a n d n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s o f D N A o f S . a c i c o l a f r o m m y c e l i u m ( F i g u r e 6 . 1 1 . A a n d B ) . N o c r o s s - r e a c t i o n w i t h D N A o f a n y o f o t h e r p a t h o g e n i c o r e n d o p h y t i c f u n g i p r e s e n t i n p i n e n e e d l e s w a s o c c u r r e d . A m p l i fi c a t i o n o f B r o w n s p o t f u n g u s i n S c o t s p i n e n e e d l e s T h e p r i m e r p a i r S A 1 - s a 4 c o n s i s t e n t l y a m p l i fi e d S . a c i c o l a o n l y i n i n f e c t e d S c o t s p i n e n e e d l e s c a r r y i n g t h e c o n i d i a l s t r o m a o r d i s e a s e s y m p t o m s o f B r o w n s p o t n e e d l e b l i g h t i n b o t h d i r e c t a n d n e s t e d P C R ( F i g u r e 6 1 2 . A ) . 3 5 0 1 - D 1 - 1 1 N - - I ' F A D K N H R E R - - - - 2 1 1 I ' ’ . . 1 6 7 8 1 1 ‘ 4 ' 3 1 ‘ ‘ _ . . 1 2 - - A A S S P s A H X A S R R 1 D G — - - - - - - - c D A P P P K E 1 - N l 1 1 - - D A N - - - - 0 2 3 4 1 5 6 7 ’ M C - 1 7 1 1 1 1 1 1 1 1 6 8 9 r e s p e c t i v e l y . F i g u r e 6 . 1 1 . S p e c i e s - s p e c i o p t i m u m a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e o f 6 0 C i n b o t h A ) d i r e c t fi 3 5 1 c a m p l i f i c a t i o n o f B r o w n s p o t p a t h o g e n S . a c i c o l a a t a n d B ) n e s t e d P C R , 4 3 6 6 p - > 1 K B + 1 : l l “ . 4 " ‘ 3 “ 2 - C N ‘ L 1 8 - E N D - 2 _ - 1 9 - E N D - 2 4 3 6 t i p - 9 4 3 6 b p - - ) S h i p - 9 F i Q u r e 6 . P a i r S A 1 f r u i t i n g b i n f e c t i o n ( 8 7 ; S c o t p i n e n e e P i l l a s t n ' , L L a n e l 3 - 1 C - M i n u s . i n f e c t e d w p r o d l i c t s P C R . A S 1 2 3 4 5 6 > m e - S A 1 0 v - N n v i n t o l \ t o a : . — 5 3 . — _ . _ , _ 4 3 8 b p - - ) S A — U N C U T F i g u r e 6 . 1 2 . A . A m p l i fi c a t i o n o f S . a c i c o l a i n i n f e c t e d p i n e n e e d l e s w i t h p r i m e r p a i r S A 1 a n d S A 4 . D i r e c t P C R ( L a n e s 1 - 1 2 ) . L a n e s 1 - 4 ; S c o t s p i n e n e e d l e s w i t h f r u i t i n g b o d i e s ( L a n e 1 ) , s y m p t o m s ( L a n e 2 ) , a n d w i t h o u t s y m p t o m s o f S . a c i c o l a i n f e c t i o n ( L a n e s 3 - 4 ) . L a n e 5 ; A u s t r i a n p i n e n e e d l e s i n f e c t e d w i t h D . p i n i . L a n e s 6 - 7 ; S c o t s p i n e n e e d l e s c a r r y i n g f r u i t i n g b o d i e s o f C . m i n u s . L a n e s 8 - 9 ; S c o t s p i n e n e e d l e s i n f e c t e d w i t h L . s e d i t i o s u m . L a n e 1 0 ; W h i t e p i n e i n f e c t e d w i t h L . p i n a s t r i . L a n e s 1 1 - 1 2 ; u n i n f e c t e d S c o t s p i n e n e e d l e s . N e s t e d P C R ( L a n e s 1 3 - 1 8 ) . L a n e 1 3 - 1 4 ; S c o t s p i n e i n f e c t e d w i t h S . a c i c o l a . L a n e 1 5 ; S c o t s p i n e i n f e c t e d w i t h C . m i n u s . L a n e 1 6 ; S c o t s p i n e i n f e c t e d w i t h L . s e d i t i o s u m . L a n e 1 7 ; W h i t e p i n e i n f e c t e d w i t h L . p i n a s t r i . L a n e 1 8 ; u n i n f e c t e d S c o t s p i n e . B : B s t N I d i g e s t s o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d f r o m n e e d l e s i n d i r e c t ( L a n e s 1 - 4 ) a n d n e s t e d ( L a n e 5 5 — 6 ) , P C R . 3 5 2 P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y t h e p r i m e r s f r o m p l a n t t i s s u e s w e r e r e s t r i c t i o n d i g e s t e d w i t h B s t N l a n d i t w a s c o n f i r m e d t h a t t h e a m p l i c o n i s t h e D N A f r o m t h e t a r g e t f u n g u s S . a c i c o l a i n a l l t e s t s ( F i g u r e 6 1 2 8 ) . P C R t e s t i n g o f p r i m e r s d e v e l o p e d f r o m D o t h i s t r o m a n e e d l e b l i g h t A n o p t i m u m a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e o f 6 0 C w a s d e t e r m i n e d f o r p r i m e r p a i r D P 1 - D P 4 i n b o t h d i r e c t a n d n e s t e d P C R a m p l i f i c a t i o n s ( F i g u r e 6 . 1 3 . A , B ) u s i n g D N A o f D . p i n i e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m . N e s t e d P C R i n c r e a s e d t h e s e n s i t i v i t y o f a m p l i fi c a t i o n n o t i c e a b l y . N o c r o s s - r e a c t i o n w i t h D N A o f a n y o f o t h e r p a t h o g e n i c o r e n d o p h y t i c f u n g i p r e s e n t i n p i n e n e e d l e s w a s o b s e r v e d i n e i t h e r P C R a s s a y s . A m p l i fi c a t i o n o f D o t h i s t r o m a n e e d l e c a s t f u n g u s i n A u s t r i a n p i n e n e e d l e s T h e p r i m e r p a i r D P 1 - D P 4 a m p l i fi e d t h e D . p i n i o n l y i n i n f e c t e d A u s t r i a n p i n e n e e d l e s c a r r y i n g t h e c o n i d i a l s t r o m a o r d i s e a s e s y m p t o m s o f D o t h i o s t r o m a n e e d l e b l i g h t ( F i g u r e 6 . 1 4 A ) . P C R p r o d u c t s a m p l i f i e d b y t h e p r i m e r s f r o m p l a n t t i s s u e s w e r e r e s t r i c t i o n d i g e s t e d w i t h B s t U l a n d t h i s f u r t h e r c o n fi r m e d t h a t t h e a m p l i c o n s w e r e o f D N A f r o m t h e t a r g e t f u n g u s D . p i n i ( F i g u r e 6 . 1 3 B ) . 3 5 3 i n i t s - i _ 4 1 7 6 9 - ; - F l g u r e E 0 . p i n i e ( A a n d E + B K P N M D C C 1 1 - — 2 3 i - D N E — B I 2 " : z W _ ' d O " o o o 0 . 0 . D . § Z Z 3 3 6 . 2 2 2 0 U ) < m I I § < m t r t z t o u 2 9 9 0 9 - 1 _ , Q o é r fi m v ' m t o i i a b d ’ z A v - v - v a m I \ a t . — - — . — . . — 4 1 7 b p - - ) g ' _ m o o o a o < a _ , 5 g f } , 0 i t ) I I 2 < u ; s i n a k a e : 2 s 2 3 1 ” F i g u r e 6 . 1 3 . S p e c i e s - s p e c i fi c a m p l i fi c a t i o n o f D o t h i s t r o m a n e e d l e b l i g h t p a t h o g e n D . p i n i a t o p t i m u m a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e o f 6 0 C i n b o t h d i r e c t a n d n e s t e d P C R ( A a n d B r e s p e c t i v e l y ) . 3 5 4 4 1 7 b p - - ) D P 1 2 3 4 5 6 7 D P - U N C U T F i g u r e 6 . 1 4 . A . A m p l i fi c a t i o n o f D . p i n i i n i n f e c t e d p i n e n e e d l e s w i t h p r i m e r s D P 1 a n d D P 4 . D i r e c t P C R ( L a n e s 1 - 9 ) . L a n e 1 ; U n i n f e c t e d A u s t r i a n p i n e n e e d l e s . L a n e s 2 - 3 ; S c o t s p i n e n e e d l e s c a r r y i n g f r u i t i n g b o d i e s a n d s y m p t o m s r e s p e c t i v e l y o f C . m i n u s . L a n e s 4 - 6 ; A u s t r i a n p i n e n e e d l e s w i t h f r u i t i n g b o d i e s , s y m p t o m s a n d w i t h o u t s y m p t o m s . L a n e 7 ; S c o t s p i n e n e e d l e s i n f e c t e d w i t h L . s e d i t i o s u m . L a n e 8 ; W h i t e p i n e i n f e c t e d w i t h L . p i n a s t r i . L a n e 9 ; S c o t s p i n e i n f e c t e d w i t h S . a c i c o l a . N e s t e d P C R ( L a n e s 1 0 - 1 6 ) . L a n e s 1 0 - 1 1 ; A u s t r i a n p i n e i n f e c t e d w i t h D . p i n i . L a n e s 1 2 . 1 3 , 1 4 ; S c o t s p i n e i n f e c t e d w i t h C . m i n u s , L . s e d i t i o s u m a n d S . a c i c o l a r e s p e c t i v e l y . L a n e 1 5 ; W h i t e p i n e i n f e c t e d w i t h L . p i n a s t r y . L a n e 1 6 ; u n i n f e c t e d A u s t r i a n p i n e . B : R e s t r i c t i o n e n z y m e B s t U l d i g e s t s o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d f r o m n e e d l e s i n d i r e c t ( L a n e s 1 - 5 ) a n d n e s t e d ( L a n e s 6 — 7 ) P C R . 3 5 5 4 6 9 b p - - ) B ' a n . < n . o ( D i — § 2 2 a " ’ C L “ E ‘ F I . “ . - ¥ 2 m . U ‘ 1 ’ 9 3 ‘ : E g 3 ' , g ' - v - N n v I ! ) ( . 0 i x m a ) v - v - v — . — . — . — 4 6 9 b p - ) F i g u r e 6 . 1 5 . T e s t i n g o f p r i m e r s A P 1 - A P 4 f o r s p e c i fi c i t y d e t e r m i n a t i o n . A - d i r e c t P C R a t o p t i m u m a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e 5 8 C , B - n e s t e d P C R a t o p t i m u m a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e 5 8 C . - A P - 1 1 6 — R P l N - 1 1 7 - S A - 1 1 8 — R P s s P e H o 1 Z L C N c o m e K T 1 o K J . 1 1 - L P 1 2 L S g i c h § 1 + P G J > 1 K B + L A P % s o p 3 3 5 b p - - ) F i g u r e 6 . 1 6 . T e s t i n g o f p r i m e r H D 1 a n d H 0 4 f o r s p e c i f i c i t y t o H . d e m a t i o i d e s ( H D ) D N A f r o m m y c e l i u m . A ) D i r e c t a m p l i fi c a t i o n a t s p e c i e s - s p e c i fi c a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s 5 2 C . B ) N e s t e d P C R a t o p t i m u m t e m p e r a t u r e 5 6 C . S c l e r o p h o m a p y t h i o p h i l a t h e p y c n i d i a s t a t e o f t h e b l a c k y e a s t H . d e m a t i o i d e s . 3 5 7 T e s t i n g o f s p e c i fi c i t y o f p r i m e r s d e v e l o p e d f o r t w o c o m m o n e n d o p h y t e s P r i m e r p a i r s A P 1 - A P 4 a n d H D 1 - H 0 4 ( d e s i g n e d f o r A . p u l l u l a n s a n d H . d e m a t i o i d e s r e s p e c t i v e l y ) w e r e t e s t e d a g a i n s t m y c e l i a l D N A o f f u n g i i n f e c t i n g D o u g l a s fi r , j u n i p e r , p i n e a n d s p r u c e , a n d o p t i m u m a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e o f 5 8 w a s d e t e r m i n e d f o r b o t h d i r e c t a n d n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s w i t h A P 1 - A P 4 a m p l i fi e d ( F i g u r e 6 . 1 5 A , B ) . H o w e v e r , s p e c i fi c i t y w a s l e s s i n n e s t e d P C R . P r i m e r p a i r H D l - H D 4 a m p l i fi e d o n l y H . d e m a t i o i d e s D N A a n d D N A f r o m c u l t u r e s o f i t s p y c n i d i a l s t a t e S c l e r o p h o m a p y t h i o p h i l a a t o p t i m u m a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s o f 5 2 C i n d i r e c t a m p l i fi c a t i o n s a n d 5 6 C i n n e s t e d P C R a m p l i fi c a t i o n s ( F i g u r e 6 . 1 6 A , 8 ) . P C R a s s a y s s h o w e d t h a t b o t h p r i m e r p a i r s c o u l d d i f f e r e n t i a t e t h e i r r e s p e c t i v e e n d o p h y t e s f r o m o t h e r f u n g i w h e n D N A e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m w a s u s e d . D e t e c t i o n o f t h e e n d o p h y t e s i n p l a n t t i s s u e s A P 1 - A P 4 d i d n o t a m p l i f i y a n y P C R p r o d u c t s f r o m a n y o f t h e p l a n t s a m p l e s t e s t e d i n d i r e c t a m p l i fi c a t i o n a t o p t i m u m t e m p e r a t u r e 5 8 C . H o w e v e r , i n n e s t e d P C R t h e p r i m e r s a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s f r o m o n e y e a r o l d s p r u c e w i t h o r w i t h o u t s p r u c e n e e d l e b l i g h t f u n g u s R . k a l k h o f f i i a n d o n e y e a r o l d j u n i p e r n e e d l e s w i t h o r w i t h o u t t i p b l i g h t p a t h o g e n K . j u n i p e r i F i g u r e 6 . 1 7 A ) . I n i s o l a t i o n s w i t h 5 0 n e e d l e s ( 5 n e e d l e p e r p l a t e ) o f o n e y e a r o l d D o u g l a s fi r n e e d l e s a m p l e s D F 1 , 3 , 9 , 1 1 , 1 7 , 2 3 , 2 4 , 2 9 a n d 4 4 e a c h i s o l a t i o n y i e l d e d 1 1 , 3 5 8 7 , 5 6 , 4 7 , 2 4 , 4 3 , 6 5 , 6 8 , 3 6 c o l o n i e s o f H . d e m a t i o i d e s r e s p e c t i v e l y . I n d i r e c t a m p l i fi c a t i o n s a t 5 2 C , t h e p r i m e r p a i r H D 1 - H D 4 d e t e c t e d t h e H . d e m a t i o i d e s i n 6 o f t h e 9 s a m p l e s , i n D N A d i l u t i o n s o f 1 0 2 ( F i g u r e 6 . 1 8 A ) . I n n e s t e d a m p l i fi c a t i o n s , t h e p r i m e r d e t e c t e d t h e f u n g u s i n 9 o f 9 s a m p l e s a n d p r o d u c e d a h i g h e r c o n c e n t r a t i o n o f P C R p r o d u c t s ( F i g u r e 6 . 1 8 8 ) . T h e p r i m e r s a l s o d e t e c t e d t h e f u n g u s i n o n e y e a r o l d n e e d l e s a m p l e s o f p i n e a n d s p r u c e , b u t n o a m p l i fi c a t i o n s w a s o b s e r v e d w i t h c u r r e n t y e a r n e e d l e s o f D o u g l a s f i r , p i n e a n d s p r u c e . R e s t r i c t i o n d i g e s t s o f e P C R p r o d u c t s f r o m n e e d l e s w i t h t h e e n d o p h y t e s s p e c i fi c p r i m e r p a i r s . A l u l a n d B s t N l R e s t r i c t i o n d i g e s t s o f A P 1 - A P 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s f r o m s p r u c e a n d j u n i p e r c o n fi r m e d t h a t t h a t t h e a m p l i c o n s w e r e t h e I T S s e q u e n c e o f A . p u l l u l a n s ( fi g u r e 6 . 1 7 B ) . R e s t r i c t i o n d i g e s t s o f H D 1 - H 0 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s f r o m D o u g l a s fi r , s p r u c e a n d p i n e w i t h H a e l l l c o n fi r m e d t h a t a m p l i c o n s w e r e t h e I T S s e q u e n c e s o f H . d e m a t i o i d e s ( F i g u r e 6 . 1 9 ) . T h e e n z y m e s o m e t i m e s d i d n o t c u t P C R p r o d u c t s a m p l i f i e d f r o m K . j u n i p e n ' i n f e c t e d j u n i p e r b r a n c h e s w i t h f r u i t i n g b o d i e s . 3 5 9 D D * B K 1 1 R E P I N U T U C N U - D H H J H p a i r . F i g u r e 6 . 1 7 . A ) P r i m e r s A P 1 a n d A P 4 a m p l i fi c a t i o n o f A . p u l l u l a n s i n p l a n t t i s s u e s , B ) R e s t r i c t i o n d i g e s t s o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d w i t h A P 1 - A P 4 p r i m e r 3 6 0 C O 3 o g > J r A l u l S P R U C E 1 S P R U C E 2 S P R U C E 2 J U N I P E R 1 ‘ J U N I P E R 2 B s t N l S P R U C E 1 S P R U C E 2 S P R U C E 2 J U N I P E R 2 H D 1 1 1 1 3 4 F F 2 D D “ 4 F D 1 E N I P - 3 1 ‘ C . r e s p e c t i v e l y w e r e t e s t e d f o r e a c h s a m p l e . B ) A m p l i fi c a t i o n i n n e s t e d P C R a t 5 6 t i s s u e s . A ) A m p l i fi c a t i o n i n d i r e c t P C R a t 5 2 C . D N A d i l u t i o n s o f 1 0 3 6 1 F i g u r e 6 . 1 8 . D e t e c t i o n o f H . d e m a t i o i d e s w i t h p r i m e r s H D 1 a n d H 0 4 f 3 r o m p l a n t a n d 1 0 2 u a D J 3 t “ N M I 1 0 - D F 4 4 D F ‘ 7 1 1 - J U N I P E R 1 “ : 1 7 1 2 - J U N I P E R 2 D F 2 3 1 4 - P I N E 2 0 m " 1 5 P | N E 3 o r = 2 4 1 6 - S P R U C E 1 “ : 2 9 7 - D F - H ” ” 9 7 4 9 4 m N 4 l m 2 E N 1 m 2 2 3 I r U 1 R E P T 1 U E C C N U U R - P D S H F F 4 F P o J D o D D - - - - - - 4 o 1 5 6 3 6 9 7 B 1 1 1 1 1 1 , . a ; o E E E E X I D . D O D : - I - N ( ' 5 + L 6 2 4 9 b p - - ) B fi b p - - ) F i g u r e 6 . 1 9 . H a e l l l r e s t r i c t i o n d i g e s t s o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d w i t h p r i m e r p a i r H D 1 - H D 4 f r o m n e e d l e s o f c o n i f e r s . 3 6 2 T e s t i n g s p e c i fi c i t y o f p r o b e s i n d o t - b l o t a s s a y s C M 1 a n d C M 4 p r o b e s s p e c i fi c f o r C . m i n u s w e r e t e s t e d a t 5 6 , 6 0 a n d 6 2 C i n d o t b l o t a s s a y s . C M 1 h y b r i d i z e d t o C . m i n u s a n d C . n i v e u m D N A a t a l l t e m p e r a t u r e s ( F i g u r e 6 . 2 0 A ) w h i l e C M 4 h y b r i d i z e d t o C . m i n u s D N A a n d w e a k l y t o C . n i v e u m a t h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e o f 6 0 C a n d a b o v e ( F i g u r e 6 . 2 0 8 ) . S i m i l a r l y , P r i m e r C N 1 s p e c i f i c f o r C . n i v e u m h y b r i d i z e d t o o n l y t h e D N A o f t a r g e t a t 6 2 C ( F i g u r e 6 . 2 0 C ) . C M 1 , C M 4 a n d C N 1 d i d n o t h y b r i d i z e t o t h e D N A o f a n y o f t h e o t h e r f u n g i t e s t e d a t a n y o f t h e h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s . L . s e d i t i o s u m p r o b e L S 1 t e s t e d a t 4 2 , 5 2 a n d 5 6 C . A t o p t i m u m h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e o f 5 6 C , t h e p r o b e h y b r i d i z e d t o o n l y l T S I F - I T S 4 a m p l i fi e d o r t o t a l D N A o f L . s e d i t i o s u m ( F i g 6 . 2 1 A , B ) . N o h y b r i d i z a t i o n w i t h t h e D N A o f L . p i n a s t r i o r o t h e r f u n g i o c c u r r e d . T h e p r o b e w a s s t i l l s p e c i e s - s p e c i fi c a t 5 2 a n d e v e n a t 4 2 C . L i k e w i s e , L . p i n a s t r i p r o b e L P 1 T h i s p r i m e r a l s o h y b r i d i z e d t o o n l y l T S l F - I T S 4 a m p l i fi e d o r t o t a l D N A o f L . p i n a s t n ' a t a l l h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e , a l t h o u g h 5 6 C w a s o p t i m u m ( F i g 6 . 2 2 A , B ) . N o 3 6 3 R P I N - 1 R K A 1 9 : 2 2 a i t 2 5 % 2 5 5 A m . C M 1 . . . 6 0 C ‘ ~ . ‘ 0 B C M 4 6 0 C 1 ; . ' 7 9 : 2 : 2 i s 9 . a s 9 5 5 E 3 % N " ‘ C N 1 C 6 , 6 2 C F i g u r e 6 . 2 0 . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s f o r s p e c i fi c i t y d e t e r m i n a t i o n o f C . m i n u s a n d C . n i v e u m p r o b e s . A - B : C . m i n u s p r o b e s C M 1 a n d C M 4 h y b r i d i z e d t o I T S 1 F - I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s a t 6 0 C , r e s p e c t i v e l y . C : C . n i v e u m p r o b e C N 1 h y b r i d i z e d t o I T S 1 F - I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s a t 6 2 C . M e m b r a n e s w e r e e x p o s e d t o fi l m f o r 2 4 h o u r s . 3 6 4 1 - N I P R A K o i - a ( 1 C L 0 2 z I x x D < a o o i 5 i " 5 z ‘ o . a z t 1 d g o ‘ 3 ' 5 3 < : 2 o 2 t r F i g u r e 6 . 2 1 . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s f o r s p e c i fi c i t y d e t e r m i n a t i o n o f L . s e d i t i o s u m p r o b e L S 1 . H y b r i d i z e d t o A I T S 1 F - I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s , a n d B ) t o t a l D N A a t 5 6 C . M e m b r a n e s w e r e e x p o s e d t o fi l m f o r 2 4 h o u r s . 3 6 5 h y b r i d i z a t i o n w i t h L . s e d i t i o s u m o r o t h e r f u n g i w a s o b s e r v e d . O p t i m u m t e m p e r a t u r e f o r b o t h D . p i n i p r o b e s D P 1 a n d D P 4 w e r e d e t e r m i n e d a s 5 7 s i n c e n o h y b r i d i z a t i o n s b y D P 1 o r D P 4 o c c u r r e d w i t h D N A o f o t h e r f u n g i i n a s s a y s w i t h I T S 1 F - I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s ( F i g u r e 6 . 2 3 A , C ) b u t w e a k h y b r i d i z a t i o n s b y D P 4 w e r e o b s e r v e d w i t h A . p u l l u l a n s t o t a l D N A ( F i g u r e 6 . 2 3 B , C ) . A . p u l l u l a n s p r o b e s A P 1 a n d A P 4 w e r e t e s t e d f o u n d t o b e s p e c i e s - s p e c i fi c a t 5 5 C ( F i g u r e 6 . 2 4 A ) . T h e p r o b e s d i d n o t h y b r i d i z e d t o t h e D N A o f a n y f u n g i t e s t e d i n a l l a s s a y s . P r o b e s H D 1 a n d H D 4 d e s i g n e d f o r H . d e m a t i o i d e s w e r e t e s t e d a t 5 1 C ( F i g u r e 6 . 2 5 ) . P r o b e H D 1 w a s g e n e r a l l y s p e c i e s - s p e c i fi c a t t h i s t e m p e r a t u r e a n d h y b r i d i z e d s t r o n g l y t o t h e D N A o f H . d e m a t i o i d e s , h o w e v e r , t h e r e w a s s o m e h y b r i d i z a t i o n o f p r o b e D P 1 t o t h e D N A o f K a b a t i n a s p e c i e s . A P 1 - A P 4 , H D 1 - H D 4 a n d D P 1 - D P 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s w e r e a l s o l a b e l e d a n d h y b r i d i z e d t o D N A e x t r a c t e d f r o m i n f e c t e d n e e d l e s w i t h o r w i t h o u t s y m p t o m s o f C . m i n u s , D . p i n i , L . s e d i t i o s u m . E v e n w i t h m a x i m u m a m o u n t s o f i n f e c t e d p l a n t D N A ( u p t o 5 0 u g / m l D N A ) , n o h y b r i d i z a t i o n o r o n l y n o n - s p e c i fi c w e a k h y b r i d i z a t i o n s w e r e o b s e r v e d . 3 6 6 R P I N - 1 K A o ( L a . o 2 z I 9 2 o < ‘ 3 5 ( 1 o o \ I o z i 9 ' - O < z 0 a . w ‘ - o . o u s 3 5 i , & 2 5 e & 5 F i g u r e 6 . 2 2 . D o t — b l o t h y b r i d i z a t i o n s f o r s p e c i f i c i t y d e t e r m i n a t i o n o f L . p i n a s t r i p r o b e L P 1 . H y b r i d i z e d t o A ) I T S 1 F a n d I T S 4 a m p l i f i e d P C R p r o d u c t s , a n d B ) t o t a l D N A a t 5 6 C . M e m b r a n e s w e r e e x p o s e d t o fi l m f o r 2 4 h o u r s . 2 : 2 ‘ 3 3 : ' 2 2 Q g 5 L : ‘ 3 3 8 L 2 ) L 2 ) & o : A D P 1 fl D P 4 B 0 . - 6 2 F 2 e e ‘ e e : 2 5 s e 2 C _ D P 1 D P 4 D F i g u r e 6 . 2 3 . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s a t 5 7 C f o r s p e c i f i c i t y d e t e r m i n a t i o n o f D . p i n i p r o b e s D P 1 a n d D P 4 . A ) H y b r i d i z a t i o n o f D P 1 t o I T S 1 F - I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s . B ) H y b r i d i z a t i o n o f D P 4 t o I T S 1 F - I T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s . C ) H y b r i d i z a t i o n o f D P 1 t o t o t a l D N A . D ) H y b r i d i z a t i o n o f D P 4 t o t o t a l D N A . M e m b r a n e s w e r e e x p o s e d t o fi l m f o r 2 4 h o u r s . 3 6 8 z ' T — < o n . I ' 2 2 Q o R 9 5 a 5 5 & i n c A A P 1 O B . A P 4 O U ‘ - C D ‘ — 3 _ Z < ' ( 0 n . ( I ) n . a a C L w 2 C L 0 . x D . Q _ . i . 1 _ l U ) < ( _ X 0 E ( I 0 : C . A P 1 A P 4 D Q - F i g u r e 6 . 2 4 . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s f o r s p e c i f i c i t y d e t e r m i n a t i o n o f A . p u l l u l a n s p r o b e s A P 1 a n d A P 4 . H y b r i d i z a t i o n o f A P 1 t o I T S 1 F — I T S 4 a m p l i f i e d P C R p r o d u c t s . B ) H y b r i d i z a t i o n o f A P 4 t o I T S 1 F — I T S 4 a m p l i f i e d P C R p r o d u c t s . C ) H y b r i d i z a t i o n o f A P 1 t o t o t a l D N A . D ) H y b r i d i z a t i o n o f A P 4 t o t o t a l D N A . M e m b r a n e s w e r e e x p o s e d t o f i l m f o r 2 4 h o u r s . 3 6 9 D T J P P s P G M N P K H K K D A L L P C C R R 1 N I A J P P N 1 - N I P A K K D A L L C R H D 1 D I I - H D 4 F i g u r e 6 . 2 5 . D o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n s f o r s p e c i f i c i t y d e t e r m i n a t i o n o f H . d e m a t i o i d e s p r o b e s H D 1 a n d H D 4 a t 5 1 C . H y b r i d i z a t i o n o f H D 1 ( A ) a n d H D 4 ( B ) t o I T S 1 F - l T S 4 a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s . M e m b r a n e s w e r e e x p o s e d t o f i l m f o r 2 4 h o u r s . D I S C U S S I O N S p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r s h a v e b e e n u s e d e x t e n s i v e l y f o r d e t e c t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n o f p a t h o g e n i c f u n g i f r o m i n f e c t e d p l a n t t i s s u e s ( H e n s o n a n d F r e n c h , R . 1 9 9 3 ; T r o u t e t a l . 1 9 9 7 ; T u r n e r e t a l . 1 9 9 8 ) . H o w e v e r , f e w f u n g i h a v e b e e n d e t e c t e d a n d i d e n t i fi e d b y s p e c i f i c p r i m e r s f r o m i n f e c t e d p i n e d u e t o t h e d i f fi c u l t y i n a m p l i fi c a t i o n s o f t h e s e f u n g i f r o m n e e d l e s t h a t a l s o c o n t a i n P C R i n h i b i t o r s ( H a m e l i n e t a l . 1 9 9 6 - 2 0 0 0 ) . W e d e v e l o p e d s p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r s t h a t d e t e c t e d a n d i d e n t i fi e d t h e p a t h o g e n e s o f p i n e C y c l a n e u s m a m i n u s , L o p h o d e r m i u m s e d i t i o s u m , M y c o s p h a e r e l l a p i n i a n d M y c o s p h a e r e l l a d e a m e s s i i w h i c h c a u s e s e r i o u s d i s e a s e s o f s e v e r a l i m p o r t a n t p i n e s p e c i e s i n f o r e s t n u r s e r i e s a n d C h r i s t m a s t r e e p l a n t a t i o n s ( A d a m s , 1 9 8 8 ; O s t r y e t a l . 1 9 8 9 S i n c l a i r e t a l . 1 9 8 7 ; P e t e r s o n a n d W a l l a 1 9 9 0 ; C h a s t a g n e r , 1 9 9 7 ; J o n e s e t a l . 1 9 9 5 ; P a t t o n , 1 9 9 7 a , b ) . T h e s e f u n g i i n f e c t y o u n g p i n e n e e d l e s a n d r e m a i n l a t e n t f r o m 6 m o n t h t o 1 5 m o n t h s b e f o r e s y m p t o m s a p p e a r m a k i n g e a r l y d e t e c t i o n w i t h c o n v e n t i o n a l i d e n t i fi c a t i o n m e t h o d s i m p o s s i b l e . S y m p t o m l e s s i n f e c t i o n s a r e r e s p o n s i b l e f o r e p i d e m i c s a n d e c o n o m i c l o s s e s s i n c e a f f e c t e d n u r s e r y s e e d l i n g s a n d s t o c k s a r e o f t e n s h i p p e d a n d o u t p l a n t e d b e f o r e s y m p t o m s a p p e a r . F u r t h e r m o r e t h e p a t h o g e n s c a u s e s i m i l a r d i s e a s e s y m p t o m s t h a t m a k e d i f f e r e n t i a t i n g t h e c a u s a l a g e n t d i f fi c u l t . I d e n t i fi c a t i o n o f t h e s e f u n g i h a s b e e n d e p e n d e n t o n e x a m i n a t i o n o f t h e i r d i a g n o s t i c f r u i t i n g b o d i e s a y e a r a f t e r i n f e c t i o n b y o n l y a n e x p e r t . F o r t h e s e r e a s o n s , e a r l y d e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f S y m p t o m l e s s i n f e c t i o n s i s c r u c i a l f o r t h e d e v e l o p m e n t o f a c e r t i fi c a t i o n s y s t e m f o r 3 7 1 s e e d l i n g s a n d n u r s e r y s t o c k s o f p i n e t r e e s p r i o r t o s a l e a n d t r a n s f e r t o p l a n t a t i o n s . F u r t h e r m o r e , e a r l y d e t e c t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n w i l l a i d i n d e v e l o p m e n t a n d i m p r o v e m e n t o f m a n a g e m e n t s y s t e m s f o r e f f e c t i v e c o n t r o l o f d i s e a s e s c a u s e d b y t h e s e f u n g i . D i r e c t a n d n e s t e d P C R a s s a y s d e v e l o p e d h e r e h a v e b e e n s h o w n t o b e h i g h l y s e n s i t i v e a n d r e l i a b l e f o r d e t e c t i o n o f t h e s e p a t h o g e n i c f u n g i f r o m i n f e c t e d s y m p t o m l e s s p i n e n e e d l e s . A d d i t i o n a l l y , w e d e s i g n e d p r i m e r s t h a t d e t e c t e d a n d d i f f e r e n t i a t e d t h e p i n e e n d o p h y t e s C . n i v e u m , L . p i n a s t r y , A . p u l l u l a n s a n d H . d e m a t i o i d e s f r o m n e e d l e s B o t h C . n i v e u m a n d L . p i n a s t r i o f t e n h a v e b e e n c o n f u s e d w i t h t h e i r p a t h o g e n i c r e l a t i v e s . A . p u l l u l a n s a n d H . d e m a t i o i d e s w e r e w i d e s p r e a d n o t o n l y i n p i n e n e e d l e s b u t a l s o i n t h e f o l i a g e o f a l l c o n i f e r s a n d o f t e n i s o l a t e d w i t h p a t h o g e n i c f u n g i f r o m t h e s a m e t i s s u e s ( H e r m a n i d e s - N i j h o f , 1 9 7 7 ) . C o n fi r m a t i o n o f p r e s e n c e o r a b s e n c e o f t h e s e f u n g i i n y o u n g f o l i a g e i s e s p e c i a l l y i m p o r t a n t s i n c e t h e i r p r e s e n c e m a y b e t h e s o u r c e o f f a l s e p o s i t i v e s i n d o t - b l o t a n d P C R a s s a y s . F u r t h e r m o r e , m o l e c u l a r d e t e c t i o n o f t h e s e e n d o p h y t e s c o u l d l e a d t o a c l e a r e r u n d e r s t a n d i n g o f t h e i r i n f e c t i o n , d i s t r i b u t i o n a n d r e l a t i o n s h i p w i t h p a t h o g e n i c f u n g i i n p l a n t t i s s u e s . R F L P a n a l y s e s w e r e u s e d t o c o n f i r m t h e i d e n t i t y o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d f r o m n e e d l e s , a n d t o d i s t i n g u i s h t a r g e t D N A f r o m n o n - t a r g e t . P C R a s s a y s c o u p l e d w i t h d o t - b l o t a s s a y s w e r e u s e f u l f o r i d e n t i f i c a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f p a t h o g e n s a n d e n d o p h y t e s o f p i n e n e e d l e s . I T S s e q u e n c e s a m o n g L o p h o d e r m i u m s p e c i e s w e r e h i g h l y v a r i a b l e ( 1 0 - 1 3 h e t e r o l o g o u s ) a n d t h u s w e r e s u i t a b l e f o r d e s i g n i n g s p e c i e s - s p e c i fi c p r o b e s . 3 7 2 D . p i n i a n d M . d e a m e s s i i s e q u e n c e s s h o w e d 6 - 1 3 b p d i f f e r e n c e s a t p r i m e r s i t e . I T S s e q u e n c e s o f C . m i n u s d i f f e r e d b y 8 b a s e f r o m e n d o p h y t e C . n i v e u m . T h e b a s e s t h a t d i f f e r e d b e t w e e n t h e s e q u e n c e s o f t w o f u n g i w e r e s o e v e n l y d i s t r i b u t e d t h a t s u i t a b l e p r i m e r c a n d i d a t e s o n l y d i f f e r b y 1 b a s e . I T S s e q u e n c e s o f H . d e m a t i o i d e s a n d A . p u l l u l a n s s h o w e d a t l e a s t 9 b p d i f f e r e n c e s . O u r p r i m a r y g o a l w a s t o d e s i g n p r o b e s t h a t w o u l d d e t e c t t h e s e f u n g i i n d i r e c t P C R a m p l i f i c a t i o n s , h o w e v e r , n e s t e d P C R w a s a l s o u s e d a n d i n c r e a s e d s e n s i t i v i t y i n d e t e c t i n g s y m p t o m l e s s i n f e c t i o n s i n n e e d l e s . O t h e r s h a v e r e p o r t e d i n c r e a s e d i n s e n s i t i v i t y u p t o 2 5 0 0 f o l d w i t h t h e u s e o f n e s t e d p r i m e r s . ( H e n s o n a n d F r e n c h , 1 9 9 3 ; K r i c k a , 1 9 9 2 ; J o h a n s e n e t a l . 1 9 8 9 ; H a m e l i n e t a l . 1 9 9 6 , 2 0 0 0 ) . O u r e f f o r t s t o d e s i g n p a i r s o f p r i m e r s t h a t w o u l d s p e c i fi c a l l y a m p l i f y a n d d i s t i n g u i s h C . m i n u s a n d C . n i v e u m w e r e l e s s s u c c e s s f u l a s t h e p r i m e r p a i r s t e s t e d a m p l i fi e d b o t h s p e c i e s i n d i c a t i n g t h a t a 1 b a s e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e p r i m e r s e q u e n c e s w e r e n o t e n o u g h t o p r e f e r e n t i a l l y a m p l i f y j u s t o n e o f t h e S p e c i e s . H o w e v e r , r e s t r i c t i o n d i g e s t s w i t h e n z y m e s R s a l , S c a l a n d B s t N I o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y t h e C . m i n u s o r C . n i v e u m p r i m e r p a i r s r e a d i l y d i f f e r e n t i a t e d t h e s e t w o C y c l a n e u s m a s p e c i e s . R e s t r i c t i o n d i g e s t w i t h e n z y m e A p a l c u t o n l y C . n i v e u m I T S r e g i o n a n d c o n fi r m e d t h a t t h e e n d o p h y t e w a s n o t c o - p r e s e n t i n n e e d l e s w i t h p a t h o g e n n o r p r e s e n t i n a n y n e e d l e s c o l l e c t e d f o r o u r s t u d i e s . P r i m e r s d e v e l o p e d f o r s e l e c t i v e d e t e c t i o n o f L . s e d i t i o s u m a n d L . p i n a s t r i W i l l b e u s e f u l f o r r o u t i n e d i f f e r e n t i a t i o n o f t h e s e f r e q u e n t l y m i s i d e n t i f i e d p a t h o g e n s ( M i n t e r a n d M i l l a r , 1 9 7 8 a , b ; a n d S i n c l a i r e t a l . 1 9 8 7 ) . T h e r e l i a b i l i t y 3 7 3 a n d s e n s i t i v i t y o f t h e p r i m e r p a i r L S 1 - L S 4 i n a m p l i f y i n g L . s e d i t i o s u m i n g r e e n n e e d l e s i n d i c a t e s t h a t t h e p r i m e r p a i r c o u l d b e e m p l o y e d f o r d e t e c t i o n o f l o w l e v e l s o f s y m p t o m l e s s i n f e c t i o n s o f t h i s f u n g u s i n n u r s e r y s t o c k . . N e s t e d P C R i n c r e a s e d s e n s i t i v i t y a n d c o u l d b e u s e d f o r d e t e c t i o n f r o m y o u n g c u r r e n t - y e a r n e e d l e s a t v e r y e a r l y s t a g e s o f i n f e c t i o n . L . s e d i t i o s u m a n d L . p i n a s t r i s p e c i fi c p r i m e r s w i l l n o t o n l y h e l p t o d e t e c t t h e s e f u n g i i n i n f e c t e d n e e d l e s w i t h o u t n e e d t o i s o l a t e t h e f u n g i b u t a l s o w i l l h e l p t o i d e n t i f y a n d d i f f e r e n t i a t e t h e m f r o m m y c e l i a l i s o l a t e s i n c u l t u r e s . T h e S . a c i c o l a s p e c i fi c p r i m e r p a i r w a s h i g h l y s e n s i t i v e i n d i r e c t P C R a n d n e s t e d P C R i n c r e a s e d t h e s p e c i fi c i t y o f d e t e c t i o n . P r i m e r s c o u l d b e u s e f u l f o r e a r l y d e t e c t i o n o f s y m p t o m l e s s l a t e n t i n f e c t i o n s o f t h e B r o w n s p o t n e e d l e c a s t p a t h o g e n i n S c o t s p i n e C h r i s t m a s t r e e n u r s e r y s e e d l i n g s a n d p o s s i b l y p r e v e n t s p r e a d i n t o M i c h i g a n . S i n c e t h e h y p h a e o f S . a c i c o l a a r e s p a r s e i n a f f e c t e d a r e a s a n d a p p e a r t o b e l o c a l i z e d a n d l i m i t e d t o y o u n g n e e d l e t i s s u e d u e t o p r o d u c t i o n o f a t o x i n d u r i n g h o s t p a t h o g e n i n t e r a c t i o n ( J e w e l , 1 9 8 3 , 1 9 8 4 , 1 9 9 0 ) , t h e s e n s i t i v i t y o f P C R a s s a y w a s r e m a r k a b l e . T h e D . p i n i s p e c i fi c p r i m e r p a i r c o u l d p r o v i d e a v a l u a b l e t o o l f o r e a r l y d e t e c t i o n a n d c o n t r o l o f t h i s d e s t r u c t i v e p a t h o g e n i n l o c a l n u r s e r i e s t h a t p r o d u c e p i n e s f o r l a n d s c a p e a n d C h r i s t m a s t r e e p l a n t i n g s ( J o n e s e t a l . 1 9 9 5 ; P e t e r s o n a n d W y s o n g , 1 9 9 0 ) . H o w e v e r , s t r a i n s o f D . p i n i i n t h e G r e a t L a k e s r e g i o n d i f f e r f r o m t h o s e i n N e w Z e a l a n d , S o u t h A f r i c a , a n d e l s e w h e r e ( A d a m s , 1 9 8 6 b , 1 9 9 0 ; G a n g l e y a n d B r a d s h a w , 2 0 0 1 ) , t h e r e f o r e , n e w p r i m e r p a i r s m a y n e e d t o b e 3 7 4 d e s i g n e d f o r t h e m o s t d e s t r u c t i v e s t r a i n s f o r u s e i n f o r e s t p l a n t a t i o n s ( B r a d s h a w e t a l . 2 0 0 0 ) . U n f o r t u n a t e l y , t h e p r i m e r p a i r s p e c i f i c f o r H . d e m a t i o i d e s a n d A . p u l l u l a n s f a i l e d t o d e t e c t t h e f u n g u s i n d i r e c t P C R a s s a y s o f D N A f r o m n e e d l e s , m o s t p r o b a b l y d u e t o v e r y l o w c o n c e n t r a t i o n s o f e n d o p h y t i c D N A i n n e e d l e s . I t i s k n o w n t h a t t h e r e l a t i v e p r o p o r t i o n s o f c o l o n i z a t i o n o f n e e d l e t i s s u e s b y e n d o p h y t i c f u n g i i s s m a l l c o m p a r e d t o c o l o n i z a t i o n b y p a t h o g e n i c f u n g i ( C a m a c h o e t a l . 1 9 9 7 ) . F u r t h e r m o r e , t h e e n d o p h t e s h a v e r a r e l y b e e n f o u n d i n y o u n g n e e d l e s a n d t h e y i n c r e a s e t h e i r m y c e l i a l m a s s a s p l a n t t i s s u e s g e t o l d e r o r b e c o m e s e n e s c e n t ( B e r n s t e i n a n d C a r r o l l , 1 9 7 7 ; S i e b e r 1 9 8 9 ; J o h n s o n a n d W h i t n e y , 1 9 9 2 ) . P r i m e r p a i r A P 1 - A P 4 a m p l i fi e d A . p u l l u l a n s f r o m j u n i p e r a n d s p r u c e n e e d l e s , h o w e v e r , P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d f r o m j u n i p e r s o m e t i m e s w e r e t h e r e s u l t o f n o n - s p e c i fi c a m p l i fi c a t i o n o f K . j u n i p e r i D N A , a s c o n fi r m e d w i t h H a e l l l r e s t r i c t i o n d i g e s t p r o fi l e s . C o n s i d e r i n g t h a t b o t h A P 1 a n d A P 4 d i f f e r e d o n l y b y 2 b a s e s f r o m c o r r e s p o n d i n g s e q u e n c e s o f K . j u n i p e r i , i t w a s n o t s u r p r i s i n g t h a t s o m e c r o s s - r e a c t i o n c o u l d o c c u r i n n e s t e d P C R . S p e c i f i c p r i m e r s f o r d e t e c t i o n o f t h e e n d o p h y t e s w i l l b e h e l p f u l i n m o n i t o r i n g c o l o n i z a t i o n a n d d i s t r i b u t i o n o f t h e s e f u n g i i n p l a n t s a n d i n s t u d y i n g e c o l o g y a n d r e l a t i o n s h i p s w i t h h o s t a n d o t h e r f u n g i . I n t h i s s t u d y , w e t e s t e d d i f f e r e n t r e c o m m e n d e d e x t r a c t i o n m e t h o d s f o r o b t a i n i n g h i g h q u a l i t y , P C R i n h i b i t o r - f r e e D N A f r o m p i n e n e e d l e s ( M o l l e r e t a l . ‘ I 9 9 2 ; B a h n w e g e t a l . 1 9 9 8 ; L e e e t a l . 1 9 8 8 ) . A l t h o u g h a l l y i e l d e d h i g h q u a l i t y 3 7 5 D N A , a m p l i fi c a t i o n s o f f u n g a l D N A i n e x t r a c t s f r o m p i n e n e e d l e s w e r e b e s t w h e n e x t r a c t i o n s w e r e b y t h e m e t h o d o f H a m e l i n e t a l . 1 9 9 6 , 2 0 0 0 . F u r t h e r m o r e , t h e e x t r a c t i o n m e t h o d w a s l e s s t i m e c o n s u m i n g a n d r e q u i r e d l e s s p l a n t m a t e r i a l . I n s u m m a r y , P C R a s s a y s d e v e l o p e d h e r e c o u l d b e c o n v e n i e n t l y u s e d t o d e t e c t a n d i d e n t i f y t h e f o u r m o s t i m p o r t a n t d i s e a s e s o f p i n e s g r o w n a s C h r i s t m a s t r e e s i n t h e L a k e s t a t e s , i n c l u d i n g s e n s i t i v e s e n s i t i v e d e t e c t i o n o f t h e p a t h o g e n s i n s y m p t o m l e s s n e e d l e s o f n u r s e r y s e e d l i n g a n d s t o c k s . T h e P C R a s s a y s a r e e a s y , f a s t a n d r e l i a b l e , a n d c o u l d r e p l a c e t h e c u r r e n t d i a g n o s i s t e c h n i q u e s t h a t a r e b a s e d o n v i s u a l o b s e r v a t i o n a n d r e c o g n i t i o n o f s y m p t o m s a n d i d e n t i f i c a t i o n o f f r u i t i n g b o d i e s o n s h e d n e e d l e s , o r i s o l a t i o n o f f u n g u s i n c u l t u r e . T h e s p e c i fi c p r i m e r p a i r s c o u l d b e u s e f u l t o o l s t o m o n i t o r t h e i n f e c t i o n a n d p r o g r e s s o f t h e s e p a t h o g e n s i n p l a n t a t i o n s a n d s h o u l d c o n t r i b u t e k n o w l e d g e f o r t h e d e v e l o p m e n t o f m o r e e f fi c i e n t a n d l e s s c o s t l y d i s e a s e c o n t r o l m a n a g e m e n t . 3 7 6 R E F E R E N C E S A d a m s , G . C . 1 9 9 5 . C o n t r o l l i n g t h e S c o t s P i n e S p r i n g n e e d l e c a s t E p i d e m i c . M i c h i g a n C h r i s t m a s T r e e J o u r n a l , 4 1 : 1 6 4 - 1 7 8 . A d a m s , G . C . 1 9 9 2 . I s i t e c o n o m i c a l t o c o n t r o l C y c l a n e u s m a n e e d l e c a s t . M i c h i g a n C h r i s t m a s T r e e J o u r n a l , 3 5 ( 4 ) : 1 8 - 1 9 . A d a m s , G . C . 1 9 9 0 a . E p i d e m i o l o g y a n d c o n t r o l o f C y c l a n e u s m a m i n u s n e e d l e c a s t o f s c o t c h p i n e i n M i c h i g a n . P h y t o p a t h o l o g y 8 0 : 9 7 6 . A d a m s , G . C . 1 9 9 0 b . T h e 1 9 8 9 f a l l n e e d l e d r o p . M i c h i g a n C h r i s t m a s T r e e J o u r n a l 2 : 4 6 - 4 7 . A d a m s , G . C . 1 9 8 9 a . P o s t h a r v e s t n e e d l e c a s t s a n d n e e d l e r e t e n t i o n o f c u t C h r i s t m a s t r e e . M i c h i g a n C h r i s t m a s T r e e J o u r n a l . 3 1 : 4 8 — 4 9 . A d a m s , G . C . 1 9 8 9 b . C o m p a r i s o n o f 1 9 8 7 a n d a n d 1 9 8 8 8 R e s e a r c h p l o t s o n C y c l a n e u s m a N e e d l e c a s t . M i c h i g a n C h r i s t m a s T r e e J o u r n a l 3 1 : 3 4 - 3 6 . A d a m s , G . C . 1 9 8 9 0 . R e s u l t s o f R e s e a r c h P l o t s o n C o n t r o l l i n g F a l l N e e d l e c a s t . M i c h i g a n C h r i s t m a s T r e e J o u r n a l . 3 1 ( 1 ) 4 2 — 4 3 . A d a m s , G . C . a n d R o b e r t s , D . L . 1 9 8 8 3 . E p i d e m i c s o f L o p h o d e r m i u m N e e d l e C a s t o f S c o t s P i n e i n M i c h i g a n . P l a n t D i s e a s e 7 2 : 8 0 1 . A d a m s , G . C . 1 9 8 8 b . S p o r e r e l e a s e a n d i n f e c t i o n b y C y c l a n e u s m a m i n u s n e e d l e c a s t d i s e a s e o f S c o t s p i n e i n M i c h i g a n , p . 5 6 - 4 9 . I n : B A . M o n t g o m e r y ( e d ) . M i c h i g a n F o r e s t P e s t R e p o r t 1 9 8 7 . M i c h . C o o p . F o r . P e s t . M g m t . P r o g . A n n . R e p . 8 8 - 2 . A d a m s , G . C . 1 9 8 7 . A y e a r o f E p i d e m i c N e e d l e c a s t i n S c o t c h P i n e . M i c h i g a n C h r i s t m a s T r e e J o u r n a l 2 9 : 5 7 - 5 9 . A d e s , P . K a n d S i m p s o n , J . A . 1 9 9 0 . C l o n a l s e l e c t i o n f o r r e s i s t a n c e t o D o t h i s t r o m a n e e d l e b l i g h t i n P i n u s r a d i a t a . N e w F o r e s t 4 : 2 7 - 3 5 A l t s c h u l , S . F . , G i s h , W . , M i l l e r , W . , M y e r s , E . W . & L i p m a n , D J . 1 9 9 0 . " B a s i c l o c a l a l i g n m e n t s e a r c h t o o l . " J . M o l . B i o l . 2 1 5 : 4 0 3 - 4 1 0 . A l t s c h u l , S . F . , M a d d e n , T . L . , S c h a f f e r , A . A . , Z h a n g , J . , Z h a n g , 2 . , M i l l e r , W . & L i p m a n , D J . 1 9 9 7 . " G a p p e d B L A S T a n d P S I - B L A S T : a n e w g e n e r a t i o n o f 3 7 7 p r o t e i n d a t a b a s e s e a r c h p r o g r a m s . " N u c l e i c A c i d s R e s . 2 5 : 3 3 8 9 - 3 4 0 2 . A u s u b e l , F . M . , B r e n t , R . , K i n g s t o n , R . E . , M o o r e , D . D . , S e i d m a n , J . G . , S m i t h , J . A . , a n d S t r u h l , K . 2 0 0 1 . C u r r e n t p r o t o c o l s i n m o l e c u l a r b i o l o g y . P u b l i s h e r , J o h n W i l e y & S o n s , I n c . N e w y o r k . B e c k , J . J . , a n d L i g o n , J . M . 1 9 9 5 . P o l y m e r a s e C h a i n r e a c t i o n A s s a y s f o r t h e d e t e c t i o n o f S t a g o n o s p o r a n o d o r u m a n d S e p t o n ' a t n ' t i c i i n W h e a t . P h y t o p a t h o l o g y 8 5 ( 3 ) : 3 1 9 - 3 2 4 . B a h n w e g , G . , S c h u l z e , S . , M o l l e r , E . M . , R o s e n b r o c k , H . , L a n g e b a r t e l s , C . , a n d S a n d e r n m a n n H . 1 9 9 8 . A n a l y t i c a l b i o c h e m i s t r y 2 6 2 : 7 9 - 8 2 . B a t e m a n , G . l . , W a r d , E . , a n d A n t o n i w , J . F . 1 9 9 2 . I d e n t i fi c a t i o n o f G a e u m a n n o m y c e s g r a m i n i s v a r . t r i t i c i a n d G . g r a m i n i s v a r . a v e n a e u s i n g a D N A p r o b e a n d n o n - m o l e c u l a r m e t h o d s . M y c o l o g i c a l R e s e a r c h 9 6 ( 9 ) : 7 3 7 - 7 4 2 . B e r n s t e i n , M . E . , a n d C a r r o l l , G . C . 1 9 7 7 . I n t e r n a l f u n g i i n o l d - g r o w t h D o u g l a s f i r f o l i a g e C a n a d i a n J o u r n a l o f B o t a n y 5 5 : 6 4 4 - 6 5 3 . B o n a n t s , P . , H a g e n a a r — d e W e e d t , M . , v a n G e n t - P e l z e r , M . , L a c o u r t , | . , C o o k e , D . , a n d D u n c a n , J . 1 9 9 7 . D e t e c t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n o f P h y t o p h t h o r a f r a g a r i a e H i c k m a n b y t h e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n . E u r o p e a n J o u r n a l o f P l a n t P a t h o l o g y 1 0 3 : 3 4 5 - 3 5 5 . B r a d s h a w , R . E . , G a n g l e y , R . J . , J o n e s , W . T . , a n d D y e r , P . S . 2 0 0 0 . H i g h l e v e l s o f d o t h i s t r o m i n t o x i n p r o d u c e d b y t h e f o r e s t p a t h o g e n D o t h i s t r o m a p i n i . M y c o l o g i c a l r e s e a r c h 1 0 4 ( 3 ) : 3 2 5 - 3 3 2 . B r u n s , T . D . a n d G a r d e s , M . 1 9 9 3 . M o l e c u l a r t o o l s f o r t h e i d e n t i fi c a t i o n o f e c t o m y c o r r h i z a l f u n g i - t a x o n - s p e c i fi c o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s f o r s u i l l o i d f u n g i . M o l e c u l a r E c o l o g y 2 : 2 3 3 - 2 4 2 . C a m a c h o , F . J . , G e r n a n d t , D . 8 . , L i s t o n , A ; S t o n e , J . K . , a n d K l e i n , A . S . 1 9 9 7 . E n d o p h y t i c f u n g a l D N A , t h e s o u r c e o f c o n t a m i n a t i o n i n s p r u c e n e e d l e D N A . M o l e c u l a r E c o l o g y 6 : 9 8 3 - 9 8 7 . C a n n o n , P . F . a n d M i n t e r , D . W . 1 9 8 6 . T h e R h y t i s m a t a c e a e o f t h e I n d i a n s u b c o n t i n e n t . C M I M y c o l o g i c a l P a p e r s N o : 1 5 5 . C o m m o n W e a l t h M y c o l o g i c a l I n s t i t u t e , K e w , S u r r e y , U K . C a r r o l l , G . C a n d C a r r o l l , F . E . 1 9 7 8 . S t u d i e s o n t h e i n c i d e n c e o f c o n i f e r o u s n e e d l e e n d o p h y t e s i n t h e P a c i fi c N o r t h w e s t . C a n a d i a n J o u r n a l o f B o t a n y 5 6 : 3 0 3 4 - 3 0 4 3 . C h a s t a g n e r , G . 1 9 9 7 . C y c l a n e u s m a n e e d l e C a s t . I n : E . M . H a n s e n a n d K . J . 3 7 8 ' fl ' fi a m I I ! 1 . 3 . . L e w i s , e d s . C o m p e n d i u m o f C o n i f e r D i s e a s e s . A m e r i c a n P h y t o p a t h o l o g i c a l S o c i e t y , S t . P a u l , M N . p a g e 5 9 . C h e n , W . , G r a y , L . E . , a n d G r a u , C . R . 1 9 9 6 . M o l e c u l a r d i f f e r e n t i a t i o n o f f u n g i a s s s o c i a t e d w i t h B r o w n S t e m R o t a n d D e t e c t i o n o f P h i a l o p h o r a g r e g a t a i n r e s i s t a n t a n d s u s c e p t i b l e s o y b e a n c u l t u r e s . P h y t o p a t h o l o g y 8 6 ( 1 0 ) : 1 1 4 0 - 1 1 4 8 . C h o i , D . a n d S i m p s o n , J . A . 1 9 9 1 . N e e d l e c a s t o f P i n u s r a d i a t a i n N e w W o u t h W a l e s . A u s t r a l i a n J o u r n a l o f B o t a n y 3 9 ( 2 ) : 1 3 7 - 1 5 2 . C h o i , D . a n d S i m p s o n , J . A . 1 9 9 1 . A s c o c a r p d e v e l o p m e n t a n d c y t o l o g y o f C y c l a n e u s m a m i n u s . M y c o l o g i c a l R e s e a r c h 9 5 ( 7 ) : 7 9 5 - 8 0 6 . C h o i , D a n d S i m p s o n , J . A . 1 9 9 5 . A s c o s p o r e g e r m i n a t i o n a n d a p p r e s o r i u m f o r m a t i o n b y C y c l a n e u s m a m i n u s . M y c o t a x o n . V o l u m e L I V . P p . 4 5 5 - 4 5 9 . C o o k e , D . E . L a n d D u n c a n , J . M . 1 9 9 7 . P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s o f P h y t o p t h o r a s p e c i e s b a s e d o n I T S I a n d I T S Z s e q u e n c e s o f t h e r i b o s o m a l R N A g e n e r e p e a t . M y c o l o g i c a l R e s e a r c h 1 0 1 : 6 6 7 - 6 7 7 . D o s s , R . P . 1 9 9 8 . A P C R - b a s e d t e c h n i q u e f o r d e t e c t i o n o f N e o t y p h o d i u m e n d o p h y t e s i n d i v e r s e a c c e s s i o n s o f t a l l f e s c u e . P l a n t d i s e a s e 8 2 ( 7 ) : 7 3 8 - 7 4 0 . D i v a n i , S . A a n d M i l l a r , C . S . 1 9 8 4 . I n f e c t i o n P r o c e s s e s o f T h r e e L o p h o d e r m i u m s p e c i e s o n P i n u s s y l v e s t r i s L . U S D A F o r e s t S e r v i c e G e n e r a l T e c h n i c a l R e p o r t W G - 5 0 , p a g e s 2 2 - 2 7 . E l l i o t , M . L . , D e s J a r d i n , E . A . , a n d H e n s o n , J . M . 1 9 9 3 . U s e o f p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n a s s a y t o a i d i n i d e n t i fi c a t i o n o f G a e u m a n n o m y c e s g r a m i n i s v a r . g r a m i n i s f r o m d i f f e r e n t g r a s s h o s t s . P h y t o p a t h o l o g y 8 3 : 4 1 4 - 4 1 8 . E v a n s , H . C . 1 9 8 4 . T h e g e n u s M y c o s p h a e r e l l a a n d i t s a n a m o r p h s C e r c o s e p t o n ’ a , D o t h i s t r o m a a n d L e c a n o s t i c t a o n p i n e s . C M I M y c o l o g i c a l p a p e r s N o : 1 p a g e s 1 - 6 . C o m m o n W e a l t h M y c o l o g i c a l I n s t i t u t e , K e w , S u r r e y , U K . F r a n z , F . , G r o t h j a h n , R . , a n d A c k e r , G . 1 9 9 3 . I d e n t i f i c a t i o n o f N a e m a c y c l u s m i n o r h y p h a e w i t h i n n e e d l e t i s s u e s o f P i n u s s y l v e s t r i s t o i m m u n o e l e c t r o n m i c r o s c o p y . A r c h i v e s o f M i c r o b i o l o g y 1 6 0 ( 4 ) : 2 6 5 - 2 7 2 . F r o c h l i c h , J . , H y d e , K . D . , a n d P e t r i n i , O . 2 0 0 0 . E n d o p h y t i c f u n g i a s s o c i a t e d w i t h p a l m s . M y c o l o g i c a l R e s e a r c h 1 0 4 ( 1 0 ) : 1 2 0 2 - 1 2 1 2 . F u n k , A . 1 9 8 5 . F o l i a r F u n g i o f W e s t e r n T r e e s . C a n a d i a n F o r e s t r y S e r v i c e , P a c i f i c F o r e s t r e s e a r c h C e n t r e . V i c t o r i a , B C , C a n a d a , p : 8 8 - 9 1 . G a r d e s , M . a n d B r u n s , T . D . 1 9 9 3 . I T S p r i m e r s w i t h e n h a n c e d s p e c i fi c i t y f o r 3 7 9 b a s i d i o m y c e t e s — a p p l i c a t i o n t o t h e i d e n t i fi c a t i o n o f m y c o r r h i z a e a n d r u s t s . M o l e c u l a r E c o l o g y 2 : 1 1 3 - 1 1 . G a n g l e y , R . J . a n d B r a d s h a v , R . E . 2 0 0 1 . R a p i d i d e n t i fi c a t i o n o f p o l y m o r p h i c m i c r o s a t e l l i t e l o c i i n a f o r e s t p a t h o g e n , D o t h i s t r o m a p i n i , u s i n g a n c h o r e d P C R . M y c o l o g i c a l R e s e a r c h 1 0 5 ( 9 ) : 1 0 7 5 - 1 0 7 8 . G e r n a n d t , D . S . , C a m a c h o , F . J . , a n d S t o n e , J . K . 1 9 9 7 . M a r i a l a r i c i s , a n a n a m o r p h o f R h a b d o c l i n e . M y c o l o g i a 8 9 ( 5 ) : 7 3 5 - 7 4 4 . G i b s s , J . N . , a n d I n m a n , A . 1 9 9 1 . T h e p i n e s h o o t b e e t l e T o m i c u s p i n i p e r d a a s a v e c t o r o f b l u e s t a i n f u n g i t o w i n d b l o w n p i n e . F o r e s t r y : T h e K o u r n a l o f I n s t i t u t e o f C h a r t e r e d F o r e s t e r s . 6 4 ( 3 ) : 2 3 9 - 2 4 9 . G o o d w i n , P . H . , K i r k p a t r i c k , B . C . , a n d D u n i w a y , J . M . 1 9 8 9 . C l o n e d D N A p r o b e s f o r t h e i d e n t i fi c a t i o n o f P h y t o p h t h o r a p a r a s i t i c a . P h y t o p a t h o l o g y 7 9 : 7 1 6 - 7 2 1 . G r i g g s , M . M a n d S c h m i d t h , R . A . 1 9 8 6 . D i s e a s e p r o g r e s s o f S c i r r h i a a c i c o l a i n s i n g l e a n d m i x e d f a m i l y p l a n t i n g s o f r e s i s t a n t a n d s u s c e p t i b l e l o n g l e a f p i n e . U S D A F o r e s t S e r v i c e G e n e r a l T e c h n i c a l r e p o r t W 0 . 5 0 p a g e s : 5 - 1 0 . G r o p p e , K a n d B o l l e r , T . 1 9 9 7 . A P C R a s s a y b a s e d o n a m i c r o s a t e l l i t e - c o n t a i n i n g l o c u s f o r d e t e c t i o n a n d q u a n t i f i c a t i o n o f E p i c h l o e e n d o p h y t e s i n g r a s s t i s s u e . A p p l i e d a n d E n v i r o n m e n t a l M i c r o b i o l o g y 6 3 : 1 5 4 3 - 1 5 5 0 . H a h n , D . , A m a n n , R . l . , a n d Z e y e r , J . 1 9 9 3 . W h o l e c e l l h y b r i d i z a t i o n o f F r a n k i a s t r a i n s w i t h fl u o r e s c e n c e o r D i g o x i g e n i n l a b e l e d , 1 6 S r R N A - t a r g e t e d o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s . A p p l i e d a n d E n v i r o n m e n t a l M i c r o b i o l o g y 5 9 ( 6 ) : 1 7 0 9 - 1 7 1 6 . H a m e l i n , R . C . , B e r u b e , P . , G i g n a c , M . , a n d B o u r a s s a , M . 1 9 9 6 . I d e n t i fi c a t i o n o f r o o t r o t f u n g i i n n u r s e r y s e e d l i n g s b y n e s t e d m u l t i p l e x P C R . A p p l i e d a n d E n v i r o n m e n t a l M i c r o b i o l o g y 6 2 ( 1 1 ) : 4 0 2 6 - 4 0 3 1 . H a m e l i n , R . C . , B o u r a s s a , M . , R a i l , J . , D u s a b e n y a g a s a n i , M . , J a c o b i , a n d L a fl a m m e , G . 2 0 0 0 . P C R d e t e c t i o n o f G r e m m e n i e l l a a b i e t i n a , t h e c a u s a l a g e n t o f S c l e r o d e m ’ s c a n c e r o f p i n e . M y c o l o g i c a l R e s e a r c h 1 0 4 ( 5 ) : 5 2 7 - 5 3 2 . H a r t m a n , J . , H o d g e s , C . , a n d B a r n a r d , E . 2 0 0 1 . P i n e d i s e a s e s . I n : D i s e a s e s o f W o o d y o m a m e n t a l s a n d t r e e s i n n u r s e r i e s ( R o n a l d K . J o n e s a n d D . M i c h a e l B e n s o n ) . A m e r i c a n P h y t o p a t h o l o g i c a l S o c i e t y p u b l i c a t i o n s . S t P a u l M N . p : 2 8 0 - 2 8 3 . H e l a n d e r , M . L . , S i e b e r , T . N . , P e t r i n i , 0 . , a n d N e u v o n e n , S . 1 9 9 4 . E n d o p h y t i c f u n g i i n S c o t s p i n e n e e d l e s : s p a t i a l v a r i a t i o n a n d c o n s e q u e n c e s o f s i m u l a t e d a c i d r a i n . C a n a d i a n J o u r n a l o f B o t a n y 7 2 : 1 1 0 8 - 1 1 1 3 . 3 8 0 H e l m u t , R . 1 9 9 0 . N o n i s o t o p i c d e t e c t i o n o f P C R p r o d u c t s i n : P C R P r o t o c o l s : A g u i d e t o M e t h o d s a n d A p p l i c a t i o n s . M . A . I n n i s , D . H . G e l f a n d , J . J . S n i n s k y , a n d T . J . W h i t e , e d s . A c a d e m i c P r e s s , S a n D i e g o , C A . P a g e s 1 1 9 - 1 2 8 . H e n s o n , J . M . 1 9 9 2 . D N A h y b r i d i z a t i o n a n d p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( P C R ) t e s t s f o r i d e n t i fi c a t i o n o f G a e u m a n n o m y c e s , P h i a l o p h o r a a n d M a g n a p o r t h e i s o l a t e s . M y c o l o g i c a l R e s e a r c h 9 6 ( 8 ) : 6 2 9 - 6 3 6 . H e n s o n , J . M . , G o i n s , T . , G r e y , W , M a t h r e , D E , a n d E l l i o t t , M L . 1 9 9 3 . U s e o f p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n t o d e t e c t G a e u m a n n o m y c e s g r a m i n i s D N A i n p l a n t s g r o w n i n a r t i fi c i a l l y a n d n a t u r a l l y i n f e s t e d s o i l . P h y t o p a t h o l o g y 8 3 ( 3 ) : 2 8 3 - 2 8 7 . H e n s o n , J . M . a n d F r e n c h , R . 1 9 9 3 . T h e P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n a n d p l a n t d i s e a s e d i a g n o s i s . A n n u a l R e v i e w o f P h y t o p a t h o l o g y 3 1 : 8 1 - 1 0 9 . H e r m a n i d e s - N i j h o f , E . J . 1 9 7 7 . A u r e o b a s i d i u m a n d A l l i e d G e n e r a . I n : B l a c k Y e a s t a n d A l l i e d H y p h o m y c e t e s G e n e r a . C e n t r a l b u r e a u v o o r S c h i m m e l c u l t u r e s , B a a m . P a g e s 1 4 1 - 1 8 0 . H i g u c h i , R . , v o n B e r o l d i n g e n , C . H . , S e n s a b a u g h , G . F . , a n d E r l i c h , H . A . 1 9 8 8 . D N A t y p i n g f r o m s i n g l e h a i r s . N a t u r e 3 3 2 : 5 4 3 - 5 4 6 . H o d g s o n , R . A . J . , W a l l , G . C . , a n d R a n d l e s , J . W . 1 9 9 8 . S p e c i fi c I d e n t i fi c a t i o n o f C o c o n u t T i n a n g a j a v i r o i d f o r d i f f e r e n t i a l d i a g n o s i s o f v i r o i d s i n c o c o n u t p a l m . P h y t o p a t h o l o g y 8 8 ( 3 ) : 7 7 4 - 7 8 1 . H u , X . , N a z a r , R . N . , a n d R o b b , J . 1 9 9 3 . Q u a n t i fi c a t i o n o f V e r t i c i l l i u m b i o m a s s i n w i l t d i s e a s e d e v e l o p m e n t . P h y s i o l o g i c a l M o l e c u l a r P l a n t P a t h o l o g y 4 2 : 2 3 - 3 6 . H u a n g , 2 . Y . , S m a l l e y , E . 8 . , a n d G u r i e s , R . P . , 1 9 9 5 . D i f f e r e n t i a t i o n o f M y c o s p h a e r e l l a d e a m e s s i i b y c u l t u r a l c h a r a c t e r s a n d R A P D a n a l y s i s . P h y t o p a t h o l o g y 8 5 ( 5 ) : 5 2 2 - 5 2 7 . J e w e l l , F . F . 1 9 8 3 . H i s t o p a t h o l o g y o f t h e b r o w n s p o t f u n g u s o n l o n g n e e d l e s S c i n ’ h i a a c i c o l a i n f e c t i n g P i n u s p a l u s t n ' s s t r u c t u r e . P h y t o p a t h o l o g y 7 3 ( 6 ) 8 5 4 - 8 5 8 . J e w e l l , F . F . 1 9 8 4 . H i s t o l o g i c a l s t u d i e s o f S c i r r h i a a c i c o l a ( D e a r n ) S i g g e r s a n d o t h e r n e e d l e - i n h a b i t i n g f u n g i o n L o n g l e a f a n d l o b l o l l y p i n e s . U S D A F o r e s t S e r v i c e G e n e r a l T e c h n i c a l R e p o r t W O - 5 0 , p a g e s 1 - 4 . J e w e l l , F . F . 1 9 9 0 . C o m p a r a t i v e h i s t o p a t h o l o g y o f p i n e t i s s u e s i n f e c t e d b y n e e d l e c a s t a n d n e e d l e b l i g h t f u n g i . G e n e r a l T e c h n i c a l R e p o r t W O - U S D A , F o r e s t s e r v i c e ( W a s h i n g h t o n D . C ) 5 6 : 1 0 1 - 1 0 7 . 3 8 1 J o h a n s e n , I . E . , R a s m u s s e n , 0 . F . , a n d H e i d e , M . 1 9 8 9 . S p e c i fi c i d e n t i fi c a t i o n o f o f C l a v i b a c t e r m i c h i g a n e n s e s u b s p . s e p e d o n i u m b y D N A h y b r i d i z a t i o n p r o b e s . P h y t o p a t h o l o g y 7 9 : 1 0 1 9 - 1 0 2 3 . J o h a n s o n , A a n d J e g e r , J . M . 1 9 9 3 . U s e o f P C R f o r d e t e c t i o n o f M y c o s p h a e r e l l a fi j i e n s i s a n d M . m u s i c o l a , t h e c a u s a l a g e n t s o f S i g a t o k a l e a f s p o t s i n b a n a n a a n d p l a n t a i n . M y c o l o g i c a l R e s e a r c h 9 7 ( 6 ) : 6 7 0 - 6 7 4 . J o h n s o n , J . A . , a n d W h i t n e y , N . J . 1 9 9 2 . I s o l a t i o n o f f u n g a l e n d o p h y t e s f r o m b l a c k s p r u c e ( P i c e a m a r i a n a ) d o r m a n t s b u d s a n d n e e d l e s f r o m N e w B r u n s w i c k , C a n a d a . C a n a d i a n J o u r n a l o f B o t a n y 7 0 : 1 7 5 4 - 1 7 5 7 . J o n e s , W . T . , H a r v e y , D . , J o n e s , 8 . D . , S u t h e r l a n d , P . W . , N i c o l , M . J . , S e r g e j e w , N . , D e b n a m , P . M . , C r a n s h a w , N . , a n d R e y n o l s , P . H . S . 1 9 9 5 . I n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e p h y t o t o x i n d o t h i s t r o m i n o c c u r r i n g i n P i n u s r a d i a t a e m b r y o s . P h y t o p a t h o l o g y 8 5 ( 1 0 ) : 1 0 9 9 - 1 1 0 4 J u d e l s o n , H . S a n d M e s s e n g e r - R o u t h , 8 . 1 9 9 6 . Q u a n t i t a t i o n o f P h y t o p h t h o r a c i n n a m o m i i n a v o c a d o r o o t s u s i n g a s p e c i e s - s p e c i fi c D N A p r o b e . P h y t o p a t h o l o g y 8 6 ( 7 ) : 7 6 3 - 7 6 8 . J u r c , M a n d G o g a l a , N . 1 9 9 6 . B i o c h e m i c a l a n a l y s i s o f d o m i n a n t p a t h o g e n i c a n d s a p r o p h y t i c f u n g i o f A u s t r i a n p i n e ( P i n u s n i g r a A r n . ) . Z b o r n i k - g o z d a r s t v a - i n - l e s a r s t v a ( S l o v e n i a ) 4 8 : 3 5 - 5 1 . ( A b s t r a c t ) K a g e y a m a , K . 1 9 9 7 . D e t e c t i o n o f P y t h i u m u l t i m u m u s i n g p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n w i t h s p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r s . P l a n t D i s e a s e 8 1 ( 1 0 ) : 1 1 5 5 - 1 1 6 0 . K a i s , A . G a n d P e t e r s o n , G . W . 1 9 9 0 . B r o w n S p o t n e e d l e b l i g h t o f p i n e s . U S D A F o r e s t S e r v i c e , G e n e r a l T e c h n i c a l R e p o r t R M - 1 2 9 . p a g e s 1 1 8 - 1 1 9 . K a r a d z i c , D . 1 9 8 1 . I n f e c t i o n o f p i n u s s y l v e s t r i s b y N a e m a c y c l u s m i n o r . i n : C u r r e n t r e s e a r c h o n C o n i f e r d i s e a s e . C . S M i l l a r , e d . A b e r d e e n U n i v e r s i t y F o r e s t r y D e p a r t m e n t , S c o t l a n d . P a g e s 9 9 - 1 0 2 . K a r a d z i c , D . 1 9 8 9 a . T h e m e c h a n i s m o f s o m e f u n g a l i n f e c t i o n s o f t h e n e e d l e s o f A u s t r i a n p i n e a n d S c o t s p i n e . Z a s t i t a - b i l j a ( Y u g o s l a v i a ) 4 0 ( 1 8 7 ) : 3 5 - 4 6 . K a r a d z i c , D . 1 9 8 9 b . D o t h i s t r o m a n e e d l e b l i g h t i n Y u g o s l a v i a . U S D A F o r e s t s e r v i c e G e n e r a l T e c h n i c a l R e p o r t W G - 5 6 p a g e s : 5 2 - 5 7 . K i m , J . H . , K i m , M . R . , L e e , J . H . , L e e , J . W . , a n d K i m , S . K . 2 0 0 0 . P r o d u c t i o n o f h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p u l l u l a n b y A u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n s u s i n g g l u c o s a m i n e . B i o t e c h n o l o g y L e t t e r s 2 2 ( 1 2 ) : 9 8 7 - 9 9 0 . K i r c h h o f , G . , S c h l o t e r , M . , A b m u s , 8 . , a n d H a r t m a n n , A . 1 9 9 7 . M o l e c u l a r 3 8 2 m i c r o b i a l e c o l o g y a p p r o a c h e s a p p l i e d t o d i a z o t r o p h s a s s o c i a t e d w i t h n o n - l e g u m e s . S o i l . B i o l . B i o c h e m . 2 9 ( 5 - 6 ) : 8 5 3 - 8 6 2 . K i s t l e r , 8 . R . a n d M e r r i l l , W . 1 9 7 8 . E t i o l o g y . s y m p t o m o l o g y , e p i d e m i o l o g y , a n d c o n t r o l o f N a e m a c y c l u s n e e d l e c a s t o f S c o t c h p i n e . P h y t o p a t h o l o g y 6 8 : 2 6 7 - 2 7 1 . K o w a l s k i , T . 1 9 8 4 . I n t e r r e l a t i o n s h i p a m o n g L o p h o d e r m i u m s e d i t i o s u m , L . p i n a s t r i , a n d C y c l a n e u s m a m i n u s i n p i n e p l a n t a t i o n s ( P i n u s s y l v e s t r i s L . ) i n P o l a n d . U S D A F o r e s t S e r v i c e G e n e r a l T e c h n i c a l R e p o r t W G - 5 6 , p a g e s 1 3 - 1 5 . K o w a l s k i , T . 1 9 8 8 . C y c l a n e u s m a ( N a e m a c y c l u s ) m i n u s , a n P i n u s s y l v e s t r i s i n P o l e n . E u r o p e a n J o u r n a l o f F o r e s t P a t h o l o g y 1 8 : 1 7 6 - 1 8 3 . K o w a l s k i , T . 1 9 9 3 . F u n g i l i v i n g i n s y m p t o m l e s s n e e d l e s o f P i n u s s y l v e s t r i s w i t h r e s p e c t t o s o m e o b s e r v e d d i s e a s e p r o c e s s e s . J o u r n a l o f P h y t o p a t h o l o g y ( G e r m a n y ) 1 3 9 : 1 2 9 - 1 4 5 . K r i c k a , L . J . 1 9 9 2 . N o n - i s o t o p i c D N A P r o b e T e c h n i q u e s . A c a d e m i c P r e s s , I n c . s a n D i e g o , C A . 3 5 8 P p . L a z a r e v , V . 1 9 8 6 . E c o l o g y a n d s u c c e s s i o n o f s o m e f u n g i c a u s i n g p i n e n e e d l e d i s e a s e s i n Y u g o s l a v i a . P a g e s 4 1 - 4 4 i n : R e c e n t R e s e a r c h o n C o n i f e r n e e d l e d i s e a s e s G . W P e t e r s o n ( t e c h . c o o r d . ) . U S D A F o . S e r . G e n . T e c h . R e p . W G - 5 0 . L e e , 8 . 8 . , M i l g r o o m , M . G . , a n d T a y l o r , J . W 1 9 8 8 . A r a p i d , h i g h y i e l d m i n i - p r e p m e t h o d f o r i s o l a t i o n o f t o t a l g e n o m i c D N A f o r m f u n g i . F u n g a l G e n e t N e w s l e t t e r 3 5 : 2 3 - 2 4 . L e e , S . 8 . , W h i t e , T . J . , a n d T a y l o r , J . W . 1 9 9 3 . D e t e c t i o n o f P h y t o p h t h o r a s p e c i e s b y o l i g o n u c l e o t i d e h y b r i d i z a t i o n t o a m p l i fi e d r i b o s o m a l D N A s p a c e r s . P h y t o p a t h o l o g y 8 3 ( 2 ) : 1 7 7 - 1 8 1 . L e v e s q u e , C . A . , V r a i n , T . C . , a n d D e B o e r , S . 1 9 9 4 . D e v e l o p m e n t o f a s p e c i e s - s p e c i fi c p r o b e f o r P y t h i u m u l t i m u m u s i n g a m p l i fi e d r i b o s o m a l D N A . P h y t o p a t h o l o g y 8 4 ( 5 ) : 4 7 4 - 4 7 8 . L e v e s q u e , C . A . , H a r l t o n , C . E . , a n d d e C o c k , A . W . A . 1 9 9 8 . I d e n t i fi c a t i o n o f s o m e O o m y c e t e s b y r e v e r s e d o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n . P h t o p a t h o l o g y 8 8 ( 3 ) : 2 1 3 - 2 2 2 L i , H . , G y l l e n s t e n , U . 8 . , C u i , X . , S a i k i , R . K . , E r l i c h , H . A . , a n d A r n h e i m , N . 1 9 8 8 . A m p l i fi c a t i o n a n d a n a l y s i s o f D N A s e q u e n c e s i n s i n g l e h u m a n s p e r m a n d d i p l o i d c e l l s . N a t u r e 3 3 5 : 4 1 4 - 4 1 7 . L i , S . , C u l l e n , D . , H j o r t , M . , S p e a r , R . , a n d A n d r e w s , J . H . 1 9 9 6 . D e v e l o p m e n t o f a n o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e f o r A . p u l l u l a n s b a s e d o n s m a l l s u b u n i t r R N A g e n e . 3 8 3 A p p l i e d a n d E n v i r o n m e n t a l M i c r o b i o l o g y 6 2 ( 5 ) : 1 5 1 4 - 1 5 1 8 . M a r t i n , R . R . , J a m e s , D . , a n d L e v e s q u e , C . A . 2 0 0 0 . I m p a c t s o f m o l e c u l a r d i a g n o s t i c t e c h n o l o g i e s o n p l a n t d i s e a s e m a n a g e m e n t . A n n u a l R e v i e w o f P h y t o p a t h o l o g y 3 8 : 2 0 7 - 2 3 9 . M a z z o l a , M . , W o n g , G . T . , a n d C o o k , J . R . 1 9 9 6 . V i r u l e n c e o f R h i z o c t o n i a o r y z a e a n d R . s o l a n i A G - 8 o n w h e a t a n d d e t e c t i o n o f R . o r y z a e i n p l a n t t i s s u e b y P C R . P h y t o p a t h o l o g y 8 6 ( 4 ) : 3 5 4 - 3 6 0 . M e r r i l l , W a n d K i s t l e r , 8 . R . 1 9 7 4 . N a e m a c y c l u s n e e d l e c a s t o f S c o t s p i n e e p i d e m i c i n P e n n s y l v a n i a . P l a n t D i s e a s e R e p o r t e r 5 8 : 2 8 7 - 2 8 8 . M e r r i l l , W a n d W e n n e r , N . G . 1 9 9 6 . C y c l a n e u s m a n e e d l e c a s t a n d n e e d l e r e t e n t i o n i n S c o t s p i n e . P l a n t D i s e a s e 8 0 ( 3 ) : 2 9 4 - 2 9 8 . M e r r i l l , W . , Z a n g , L . E . , B r a e n , S . N . , a n d W e n n e r , N . G . 1 9 8 9 . F o r m a t i o n a n d M a t u r a t i o n o f a p o t h e c i a o f C y c l a n e u s m a m i n u s . U S D A F o r e s t S e r v i c e , G e n e r a l T e c h n i c a l R e p o r t W 0 - 5 6 . p a g e s 2 2 - 2 6 . M i n t e r , D . W . 1 9 8 1 . L o p h o d e r m i u m o n p i n e s . C M I M y c o l o g i c a l p a p e r s 1 4 7 : 1 - 5 4 . C o m m o n W e a l t h M y c o l o g i c a l I n s t i t u t e , K e w , S u r r e y , U K M i n t e r , D . W . 1 9 8 6 . S o m e m e m b e r s o f t h e R h y t i s m a t a c e a e ( A s c o m y c e t e s ) o n c o n i f e r n e e d l e s f r o m C e n t r a l a n d N o r t h A m e r i c a p . 7 1 - 1 0 6 . I n ; G . W . P e t e r s o n ( e d ) . R e c e n t r e s e a r c h o n n e e d l e d i s e a s e s . U S D A F o r e s t s e r v i c e G e n e r a l T e c h n i c a l R e p o r t . W G - 5 0 1 0 6 p . M i n t e r , D . W . a n d M i l l a r , C . S . 1 9 7 8 a . L o p h o d e r m i u m s e d i t i o s u m . C M I D e s c r i p t i o n s o f p a t h o g e n i c f u n g i a n d b a c t e r i a N o . 5 6 8 . C o m m o n W e a l t h M y c o l o g i c a l I n s t i t u t e , K e w , S u r r e y , U K . M i n t e r , D . W . a n d M i l l a r , C . S . 1 9 7 8 b . L o p h o d e r m i u m p i n a s t r i C M I D e s c r i p t i o n s o f p a t h o g e n i c f u n g i a n d b a c t e r i a N o . 5 6 7 . C o m m o n W e a l t h M y c o l o g i c a l I n s t i t u t e , K e w , S u r r e y , U K . M i l l a r , C . S . a n d M i n t e r , D . W . 1 9 8 0 a . N a e m a c y c l u s m i n o r C M I D e s c r i p t i o n s o f P a t h o g e n i c f u n g i a n d B a c t e r i a N o . 6 5 9 . C o m m o n W e a l t h M y c o l o g i c a l I n s t i t u t e , K e w , S u r r e y , U K . M i l l a r , C . S a n d M i n t e r , D . W . 1 9 8 0 b . N a e m a c y c l u s n i v e u m C M I D e s c r i p t i o n s o f P a t h o g e n i c f u n g i a n d B a c t e r i a N o . 6 6 0 . C o m m o n W e a l t h M y c o l o g i c a l I n s t i t u t e , K e w , S u r r e y , U K . M a a n e n , A . v a n a n d G o u r b i e r e , F . 2 0 0 0 . B a l a n c e b e t w e e n c o l o n i z a t i o n a n d f r u c t i fi c a t i o n i n f u n g a l d y n a m i c s c o n t r o l : a c a s e s t u d y o f L o p h o d e r m i u m p i n a s t r i o n P i n u s s y l v e s t r i s n e e d l e s . M y c o l o g i c a l R e s e a r c h 1 0 4 ( 5 ) : 5 8 7 - 5 9 4 . 3 8 4 M i l l s , P . R . , S r e e n i v a s a p r a s a d , S . , a n d B r o w n , A . E . 1 9 9 2 . D e t e c t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f C o l l e t o t n ' c h u m g l o e o s p o r i o i d e s i s o l a t e s u s i n g P C R . F E M S M i c r o b i o l o g y L e t t e r s 9 8 : 1 3 7 - 1 4 4 . M o l l e r , E . M . , B a h n w e g , G . , S a n d e r r n a n n , H . , a n d G e i g e r , H . H . 1 9 9 2 . A s i m p l e a n d e f fi c i e n t p r o t o c o l f o r i s o l a t i o n o f h i g h m o l e c u l a r w e i g h t D N A f r o m fi l a m e n t o u s f u n g i , f r u i t b o d i e s a n d i n f e c t e d t i s s u e . N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h 2 0 ( 2 2 0 ) : 6 1 1 5 - 6 1 1 6 . M o u k h a m e d o v , R . , H u , X . , N a z a r , R . N . , a n d R o b b , J . 1 9 9 4 . U s e o f P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n — A m p l i fi e d R i b o s o m a l i n t e r g e n i c S e q u e n c e s f o r t h e d i a g n o s i s o f V e r t i c i l l i u m t n ' c o r p u s . P h y t o p a t h o l o g y 8 4 : 2 5 6 - 2 5 9 . N a z a r , R . N . , H u , X . , S c h m i d t h , J . , C u l h a m , D . , a n d R o b b , J . 1 9 9 1 . P o t e n t i a l u s e o f P C R a m p l i fi e d d e t e c t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f V e r t i c i l l i u m w i l t p a t h o g e n s . P h y s i o l o g i c a l M o l e c u l a r P l a n t P a t h o l o g y 3 9 : 1 - 1 1 . N i c h o l s , T . H a n d S k i l l i n g , D . D . 1 9 7 1 . S c o t c h p i n e C h r i s t m a s t r e e i n d u s t r y t h r e a t e n e d b y B r o w n s p o t n e e d l e d i s e a s e . ( P i n u s s l y v e s t n ’ s , S c i n f i i a a c i c o l a ) . A m e r i c a n C h r i s t m a s t r e e J o u r n a l 1 5 ( 1 ) : 1 3 - 1 5 . G ’ G o r m a n , D . , X u e , 8 . , H s i a n g , T . , a n d G o o d w i n , P . H . 1 9 9 4 . D e t e c t i o n o f L e p t o s p h a e n ’ a k o r r e a w i t h t h e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n a n d p r i m e r s f r o m t h e r i b o s o m a l i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r s . C a n a d i a n J o u r n a l o f B o t a n y . 7 2 : 3 4 2 - 3 4 6 . G s t r y , M . E . , N i c h o l l s , T . H . , C a r l s o n , J . C . , a n d A d a m s , G . C . 1 9 8 9 . C y c l a n e u s m a n e e d l e c a s t i n s c o t s p i n e C h r i s t m a s t r e e p l a n t a t i o n s i n t h e L a k e S t a t e s . U S D A F o r e s t S e r v i c e G e n e r a l T e c h n i c a l R e p o r t W G - 5 6 , p a g e s 1 9 - 2 1 . W a s h i n g h t o n D C . P a t t o n , R . F . 1 9 9 7 a . D o t h i s t r o m a n e e d l e b l i g h t . C o m p e n d i u m o f c o n i f e r d i s e a s e s . P a g e 5 7 - 5 9 . P a t t o n , R . F . 1 9 9 7 b . B r o w n s p o t n e e d l e b l i g h t . C o m p e n d i u m o f c o n i f e r d i s e a s e s . P a g e 5 7 . P a r r y , D . W a n d N i c h o l s o n , P . 1 9 9 6 . D e v e l o p m e n t o f a P C R a s s a y t o d e t e c t F u s a r i u m p o a e i n w h e a t . P l a n t P a t h o l o g y 4 5 : 3 8 3 - 3 9 1 . P e t e r s o n , G . W a n d W y s o n g , D . S . , 1 9 9 0 . D o t h i s t r o m a b l i g h t o f p i n e s . . U S D A F o r e s t S e r v i c e , G e n e r a l T e c h n i c a l R e p o r t R M - 1 2 9 . p a g e s 1 2 0 - 1 2 1 . W a s h i n g h t o n D C . P e t e r s o n , G . W a n d W a l l a , J . A . 1 9 9 0 . N a e m a c y c l u s ( C y c l a n e u s m a ) n e e d l e c a s t o f p i n e s . U S D A F o r e s t S e r v i c e , G e n e r a l T e c h n i c a l R e p o r t R M - 1 2 9 . p a g e s 1 2 2 - 3 8 5 1 2 3 P e t r i n i , G . a n d C a r r o l l , G . C . 1 9 8 1 . E n d o p h y t i c f u n g i i n t h e f o l i a g e o f s o m e C u p r e s s e c e a e i n O r e g o n . C a n a d i a n J o u r n a l o f B o t a n y 5 9 : 6 2 9 - 6 3 6 P e t r i n i , G . 1 9 8 6 . T a x o n o m y o f e n d o p h y t i c f u n g i o f a e r i a l p l a n t t i s s u e s . I n M i c r o b i o l o g y o f t h e P h y l l o s p h e r e ( e d . N . J . F o k k e m a & J . v a n d e n H e u v e l ) , p p . 1 7 5 - 1 8 7 . C a m b r i d g e U n i v e r s i t y P r e s s , C m a b r i d g e , U K . P r e y , A . J a n d M o r s e , F . S . 1 9 7 1 . B r o w n s p o t n e e d l e b l i g h t o f s c o t c h p i n e C h r i s t m a s t r e e s i n W i s c o n s i n . P l a n t D i s e a s e R e p o r t e r 5 5 ( 7 ) : 6 4 8 - 6 4 9 P o l i s h o o k , J . D . , D o m b r o w s k i , A . W . , T s o u , N . N . , S a l i t u r o , G . M . , a n d C u r o t t o , J . E . 1 9 9 3 . P r e u s s o m e r i n D f r o m t h e e n d o p h y t e H o r r n o n e m a d e m a t i o i d e s . M y c o l o g i a 8 5 ( 1 ) : 6 2 - 6 4 . P r i n , Y . , M a l l e i n - G e r i n , F . , a n d S i m o n e t , P . 1 9 9 3 . I d e n t i fi c a t i o n a n d l o c a l i z a t i o n o f F r a n k i a s t r a i n s i n A l n u s n o d u l e s b y i n s i t u h y b r i d i z a t i o n o f n i f H m R N A w i t h s t r a i n s p e c i fi c o l o g o n u c l e o t i d e p r o b e s . J o u r n a l o f E x p e r i m e n t a l B o t a n y 4 4 ( 2 6 1 ) : 8 1 5 - 8 2 0 . R i s t a i n o , J . B . , M a d r i t c h , M . , T r o u t , C . L . , a n d P a r r a , G . 1 9 9 8 . P C R a m p l i f i c a t i o n o f r i b o s o m a n D N A f o r s p e c i e s i d e n t i fi c a t i o n i n t h e p l a n t p a t h o g e n g e n u s P h y t o p h t h o r a . A p p l i e d a n d E n v i r o n m e n t a l M i c r o b i o l o g y 6 4 ( 3 ) : 9 4 8 - 9 5 4 . R o b b , J . , H u , X . , P l a t t , H . , a n d N a z a r , R . 1 9 9 4 . P C R — b a s e d a s s a y s f o r t h e d e t e c t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n o f V e r t i c i l l i u m s p e c i e s i n p o t a t o , p . 8 3 - 9 0 . I n A . S c h o t s , F . M . D e w e y , a n d R P . G l i v e r ( e d , ) , M o d e r n a s s a y s f o r p l a n t p a t h o g e n i c f u n g i : i d e n t i fi c a t i o n , d e t e c t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n . C A B i n t e r n a t i o n a l , O x f o r d , U K . S a l d e r e l l i , P . , B a r b a r o s s o , L . , G r i e c o , F . , a n d G a l l i t e l l i D . 1 9 9 6 . D i g o x i g e n i n - I a b e l e d r i b o p r o b e s a p p l i e d t o p h y t o s a n i t a r y c e r t i fi c a t i o n o f t o m a t o i n I t a l y . P l a n t D i s e a s e 8 0 ( 1 2 ) : 1 3 4 3 - 1 3 4 6 . S a m b r o o k , J . F r i t s c h , E . F . , a n d M a n i a t i s , T . 1 9 8 9 . M o l e c u l a r c l o n i n g . a l a b o r a t o r y m a n u a l . 2 ” d e d i t i o n . C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s , C o l d S p r i n g H a r b o r , N e w Y o r k . S c h i l l i n g , A . G . , M o l l e r , E M , a n d G e i g e r , H . H . 1 9 9 6 . P o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n — b a s e d a s s a y s f o r s p e c i e s - s p e c i f i c d e t e c t i o n o f F u s a r i u m c u l m o r u m , F . g r a m i n e a r u m a n d F . a v e n a c e u m . P h y t o p a t h o l o g y 8 6 ( 5 ) : 5 1 5 - 5 2 2 . S c h o e n , C . D . , K n o r r , D . , a n d L e o n e , G . 1 9 9 6 . D e t e c t i o n o f p o t a t o I e a f r o l l v i r u s i n d o r m a n t p o t a t o t u b e r s b y i m m u n o c a p t u r e a n d a f l u o r o g e n i c 5 ’ n u c l e a s e R T - P C R a s s a y . P h y t o p a t h o l o g y 8 6 ( 9 ) : 9 9 3 - 9 9 9 . L i , S h u x i a n , C u l l e n , D . , H j o r t , M . , S p e a r , R . , a n d A n d r e w s , J . H . 1 9 9 6 . 3 8 6 D e v e l o p m e n t o f a n o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e f o r A u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n s b a s e o n s m a l l s u b u n i t r R N A g e n e . A p p l i e d a n d E n v i r o n m e n t a l M i c r o b i o l o g y 6 2 ( 5 ) : 1 5 1 4 - 1 5 1 8 . S i e b e r , T . N . 1 9 8 9 . E n d o p h y t i c f u n g i i n t w i g s o f h e a l t h y a n d a n d d i s e a s e d N o r w a y s p r u c e a n d w h i t e fi r . M y c o l o g i c a l R e s e a r c h 9 2 : 3 2 2 - 3 2 6 . S i e r i n g , P . L a n d G h i o r s e , W . C . 1 9 9 7 . D e v e l o p m e n t a n d a p p l i c a t i o n o f 1 6 8 r R N A - t a r g e t e d p r o b e s f o r d e t e c t i o n o f I r o n - a n d M a n g a n e s e — G x i d i z i n g s h e a t h e d b a c t e r i a i n e n v i r o n m e n t a l s a m p l e s . A p p l i e d a n d e n v i r o n m e n t a l M i c r o b i o l o g y 6 3 ( 2 ) : 6 4 4 - 6 5 1 . S i m o n , L . , L e v e s q u e , C . , a n d L a l o n d e , M . 1 9 9 2 . R a p i d q u a n t i t a t i o n b y P C R o f e n d o m y c o r r h i z a l f u n g i c o l o n i z i n g r o o t s . P C R M e t h o d s A p p l i c a t i o n s 2 : 7 6 - 8 0 . S i n c l a i r e t a l . , W . A . , L y o n , H . H a n d J o h n s o n , W . T . 1 9 8 9 . D i s e a s e s o f T r e e s a n d S h r u b s , 2 " “ e d n . C o r n e l l U n i v e r s i t y P r e s s : C o m s t o c k P u b . A s s o c i a t e s , I t h a c a , Y o r k . p : 4 0 - 4 1 . S m i t h , G . N . , D a m s t e e g t , V . D . , K e l l e r , C . J . , a n d B e c k , R . J . 1 9 9 3 . D e t e c t i o n o f p o t a t o I e a f r o l l v i r u s i n l e a f a n d a p h i d e x t r a c t b y d o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n . P l a n t D i s e a s e 7 7 ( 6 ) : 1 0 9 8 - 1 1 0 2 . S m i t h , G . P . , P e t e r s o n , G . L . , B e c k , R J . , S c h a a d , N . W . , a n d B o n d e , M . R . 1 9 9 6 . D e v e l o p m e n t o f a P C R - b a s e d m e t h o d f o r i d e n t i fi c a t i o n o f T i l l e t i a i n d i c a , c a u s a l a g e n t o f K a m a l b u n t o f w h e a t . P h y t o p a t h o l o g y 8 6 ( 1 ) : 1 1 5 - 1 2 2 . S t e n s t r o m , E . , a n d l h r m a r k , K . 1 9 9 7 . D e t e c t i o n o f L o p h o d e r m i u m s e d i t i o s u m f r o m p i n e n e e d l e s u s i n g P C R T e c h n i q u e s . I n D i a g n o s i s a n d I d e n t i fi c a t i o n o f P l a n t p a t h o g e n s , H . W . D e h n e e t a l . ( e d ) . P : 2 2 3 - 2 2 6 . S u s k e , J a n d A c k e r , G . 1 9 8 7 . I n t e r n a l h y p h a e i n y o u n g s y m p t o m l e s s n e e d l e s o f P i c e a a b i e s ; e l e c t r o n m i c r o s c o p i c a n d c u l t u r a l i n v e s t i g a t i o n . C a n a d i a n J o u r n a l o f B o t a n y 6 5 : 2 0 9 8 - 2 1 0 3 . T i s s e r a t , N . A . , H u l b e r s t . S . H . , a n d S a u e r , K . M . 1 9 9 4 . S e l e c t i v e a m p l i f i c a t i o n o f r D N A i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r r e g i o n s t o d e t e c t O p h i o s p h a e r e l l a k o r r e a a n d G . h e r p o t r i c h a . P h y t o p a t h o l o g y 8 4 ( 5 ) : 4 7 8 - 4 8 2 . T r o u t , C . L . , R i s t a i n o , J . 8 . , M a d r i t c h , M . , a n d W a n g s o m b o o n d e e , T . 1 9 9 7 . R a p i d d e t e c t i o n o f P h y t o p h t h o r a i n f e s t a n s i n l a t e b l i g h t - i n f e c t e d p o t a t o a n d t o m a t o u s i n g P C R . P l a n t D i s e a s e 8 1 ( 9 ) : 1 0 4 2 - 1 0 4 8 . T u r n e r , A . S . , L e e s , A . K . , R e z a n o o r , H . N . , a n d N i c h o l s o n , P . 1 9 9 8 . R e f i n e m e n t o f P C R - d e t e c t i o n o f F u s a r i u m a v e n a c e u m a n d e v i d e n c e f r o m D N A m a r k e r s t u d i e e s f o r p h e n e t i c r e l a t e d n e s s t o F u s a r i u m t n ' c i n c t u m . P l a n t P a t h o l o g y 4 7 : 3 8 7 2 7 8 - 2 8 8 . X e n o p o u l o s , G . S . 1 9 8 9 . A n e w p a t h o g e n c a u s i n g p r e m a t u r e n e e d l e c a s t o f P i n u s r a d i a t a i n G r e c e . D a s i k i - E r e v n a ( G r e c e ) 1 0 ( 2 ) : 1 5 1 - 1 5 6 ( A b s t r a c t ) . W e i l a n d , J . J a n d S u n d s b a k , J . L . 2 0 0 0 . D i f f e r e n t i a t i o n a n d d e t e c t i o n o f s u g a r b e e t f u n g a l p a t h o g e n s u s i n g a m p l i f i c a t i o n o f a c t i n c o d i n g s e q u e n c e s a n d t h e i t s r e g i o n o f t h e r R N A g e n e . P l a n t d i s e a s e 8 4 ( 4 ) : 4 7 5 - 4 8 2 . W e n n e r , N . G a n d M e r r i l l , W . 1 9 8 9 . C o n t r o l o f C y c l a n e u s m a n e e d l e c a s t i n S c o t s p i n e i n P e n n s y l v a n i a . U S D A F o r e s t S e r v i c e , G e n e r a l T e c h n i c a l R e p o r t W 0 - 5 6 . p a g e s 2 7 - 3 3 . W h i t e , T . J . , B r u n s , T . , L e e , S . B . , a n d T a y l o r , J . 1 9 9 0 . A m p l i fi c a t i o n a n d d i r e c t s e q u e n c i n g o f f u n g a l r i b o s o s m a l R N A g e n e s f o r p h y l o g e n e t i c s . I n : P C R p r o t o c o l s : A G u i d e t o M e t h o d s a n d A p p l i c a t i o n s . M . A . I n n i s , D . H . G e l f a n d , J . J . S n i n s k y , a n d T . J . W h i t e , e d s . A c a d e m i c P r e s s , S a n D i e g o , C A . P a g e s 3 1 5 - 3 2 2 . Z h a n g , A . W . , H a r t m a n , G . L . , R i c c i o n i , L . , C h e n , W . 0 . , M a , R . Z . , a n d P e t e r s e n , W . L . 1 9 9 7 . U s i n g P C R t o d i s t i n g u i s h D i a p o n ‘ h e p h a s e o l o r u m a n d P h o m o p s i s I o n g i c o l l a f r o m o t h e r s o y b e a n f u n g a l p a t h o g e n s a n d t o d e t e c t t h e m i n s o y b e a n t i s s u e s . P l a n t D i s e a s e 8 1 ( 1 0 ) : 1 1 4 3 - 1 1 4 9 . Z h a n g , J . & M a d d e n , T . L . 1 9 9 7 . " P o w e r B L A S T : A n e w n e t w o r k B L A S T a p p l i c a t i o n f o r i n t e r a c t i v e o r a u t o m a t e d s e q u e n c e a n a l y s i s a n d a n n o t a t i o n . " G e n o m e R e s . 7 : 6 4 9 - 6 5 6 . 3 8 8 C O N C L U S I O N M a n y o f t h e p a t h o g e n i c f u n g i o f f o l i a g e o f c o n i f e r t r e e s s p r e a d p r i m a r i l y t h r o u g h i n f e c t e d o r i n f e s t e d n u r s e r y s t o c k s . C o n i f e r s a r e u n i q u e i n d i s p l a y i n g n o s y m p t o m s o f f o l i a g e d i s e a s e u n t i l 9 t o 2 4 m o n t h s f o l l o w i n g i n f e c t i o n b y p a t h o g e n i c f u n g i , d e p e n d i n g o n t h e s p e c i e s o f f u n g i . L o w l e v e l s o f n e e d l e c a s t a n d n e e d l e b l i g h t i n f e c t i o n s a r e n o t n o t i c e a b l e t o n u r s e r y i n s p e c t o r s w h e n p l a n t s a r e e x a m i n e d a f t e r l i m i t e d d i s e a s e h a s o c c u r r e d . F u r t h e r m o r e , i n f e c t e d p r i m a r y n e e d l e s o f m a n y c o n i f e r s s h o w n o i d e n t i fi a b l e s y m p t o m s o r s i g n s o f d i s e a s e a n d c u r r e n t y e a r n e e d l e s a r e s y m p t o m l e s s w h e n i n f e c t e d a n d u n t i l d i s e a s e p r o g r e s s c o n s i d e r a b l y . M a n y c o n i f e r s e e d l i n g s s o l d t o C h r i s t m a s t r e e g r o w e r s a n d f o r e s t e r s c a r r y l o w l e v e l s o f d i s e a s e a n d h a v e s y m p t o m l e s s i n f e c t i o n s e v e n t h o u g h t h e y m a y p a s s i n s p e c t i o n . S y m p t o m l e s s i n f e c t i o n s o f n e e d l e c a s t a n d n e e d l e b l i g h t o f c o n i f e r s e e d l i n g s h a v e l e d t o , f o l l o w i n g o u t p l a n t i n g , s e r i o u s d i s e a s e o u t b r e a k s a n d e p i d e m i c s a n d h e n c e c a u s e d e c o n o m i c l o s s e s i n C h r i s t m a s t r e e o r f o r e s t p l a n t i n g s . R a p i d s e n s i t i v e a n d e a s y d e t e c t i o n o f s y m p t o m l e s s i n f e c t i o n s o f n u r s e r y s t o c k s i s t h e e s s e n t i a l a c h i e v e m e n t n e c e s s a r y f o r d e v e l o p m e n t o f a s y s t e m o f c e r t i fi c a t i o n o f n u r s e r y s t o c k s a s p a t h o g e n - f r e e p r i o r t o s a l e . E a r l y d e t e c t i o n o f s y m p t o m l e s s i n f e c t i o n s o r l i m i t e d l e v e l s o f d i s e a s e w o u l d l e a d t o a n i m p r o v e d s p e c i fi c f o r e s t n u r s e r y m a n a g e m e n t p r a c t i c e s f o r d i s e a s e c o n t r o l . P r o d u c t i o n o f d i s e a s e a n d f u n g u s - f r e e c o n i f e r s e e d l i n g s w i l l r e d u c e e c o n o m i c l o s e s a n d p e s t i c i d e u s e b y g r o w e r s . H o w e v e r , c u r r e n t 3 8 9 i n s p e c t i o n a n d c e r t i fi c a t i o n m o s t l y r e l y o n v i s u a l o b s e r v a t i o n o f d i s e a s e a n d i s o l a t i o n o f c a u s a l f u n g u s u s i n g c o n v e n t i o n a l t e c h n i q u e s f o r d e t e c t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n . F o r t h e s e r e a s o n s , i n t h i s t h e s i s w o r k , I s t u d i e d t h e d e v e l o p m e n t a n d a p p l i c a t i o n o f a l t e r n a t i v e m e t h o d s b a s e d o n m o d e r n m o l e c u l a r t e c h n i q u e s P C R a n d d o t - b l o t s f o r d e t e c t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n o f s o m e o f t h e i m p o r t a n t d i s e a s e s a n d e n d o p h t e s o f c o n i f e r f o l i a g e . O l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s w e r e d e s i g n e d a n d t e s t e d f o r 1 5 p a t h o g e n i c a n d 4 e n d o p y h t i c f u n g i i n f e c t i n g D o u g l a s fi r , F r a s e r a n d B a l s a m F i r , s p r u c e , j u n i p e r a n d p i n e . T h e r e s u l t s t h a t a r e p r e s e n t e d i n t h i s t h e s i s d e fi n i t e l y p r o v e d t h a t s p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r s c o u l d b e u s e d f o r d e t e c t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n o f e a r l y s y m p t o m l e s s i n f e c t i o n s o f c o n i f e r n e e d l e s a s t h e y s p e c i fi c a l l y a m p l i fi e d a n d h y b r i d i z e d t o o n l y t h e i r t a r g e t f u n g i i n P C R a n d d o t - b l o t a s s a y s r e s p e c t i v e l y . T o d e v e l o p s p e c i e s - s p e c i f i c p r i m e r s o r p r o b e s , i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r r e g i o n o f r i b o s o m a l D N A ( r D N A ) w e r e u s e d s i n c e t h e y h a v e b e e n p r o v e n t o b e h i g h l y v a r i a b l e a m o n g s p e c i e s w i t h i n g e n u s ( C h e n e t a l . 1 9 9 2 ; G ’ D o n n e l l , 1 9 9 2 ; G a r d e s a n d B r u n s 1 9 9 3 ) a n d h a v e b e e n u s e d t o d e s i g n p r i m e r s t h a t s u c c e s s f u l l y u s e d i n d e t e c t i o n s f r o m i n f e c t e d p l a n t t i s s u e s ( r e v i e w e d i n H e n s o n a n d F r e n c h , 1 9 9 3 ; T i s s e r a t e t a l . 1 9 9 4 ; H a m e l i n e t a l . 1 9 9 6 ; L a n g r e l l , 2 0 0 2 ) . I T S s e q u e n c e s o f m o r e t h a n 4 5 i s o l a t e s r e p r e s e n t i n g d i f f e r e n t s p e c i e s a n d s u b s p e c i e s u s e d h e r e w e r e s e q u e n c e d a n d s t o r e d i n G e n B a n k d a t a b a s e ( A p p e n d i x A ) . I T S s e q u e n c e s o f c o n i f e r f u n g i P . g a u m a n n i i a n d R . w e i n ' i s s p . 3 9 0 o b l o n g a ( D . fi r ) , R h i z o s p h a e r a s p e c i e s ; R . k a l k h o f f i i , R . p i n i , R . m a c r o s p o r a , R . o u d e m a n s i i , R . k o b a y a s h i i ( S p r u c e , b a l s a m a n d f r a s e r f i r , p i n e ) , K a b a t i n a j u n i p e r i , K . t h u j a e a n d P . j u n i p e r i ( j u n i p e r ) , a n d C . m i n u s , C . n i v e u m , L o p h o d e r m i u m p i n a s t r i , L . s e d i t i o s u m , D . p i n i , S . a c i c o l a , S . c o n i g e r u s , X e r o m e n ' s a b i e t i s a n d a f e w e n d o p h y t e s w e r e fi r s t t i m e s e q u e n c e d i n t h i s s t u d y . S e q u e n c e a l i g n m e n t s s h o w e d t h a t I T S s e q u e n c e s o f a m o n g s p e c i e s e v e n s u b s p e c i e s w e r e v a r i a b l e e n o u g h t o s e l e c t s p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r s . T h e s e q u e n c e s o f R h a b d o c l i n e t a x a w e r e m o s t l y v a r i a b l e e n o u g h t o d e s i g n a s e p a r a t e p r i m e r p a i r t o d i s t i n g u i s h s p e c i e s a n d e v e n s u b s p e c i e s o f t h i s g e n u s ( C h a p t e r 1 a n d 3 ) a s o b s e r v e d i n p h y l o g e n e t i c a n a l y s e s ( G e r n a n d t e t a l . 1 9 9 3 ) . W e d e s i g n e d p r i m e r s t h a t h a d o n l y 2 b a s e d i f f e r e n c e s w i t h c o r r e s p o n d i n g s e q u e n c e s o f c l o s e s t s u b s p e c i e s a n d s u c c e s s f u l l y d i f f e r e n t i a t e d t h e m . S w i s s n e e d l e c a s t p a t h o g e n P . g a u m a n n i i s h a r e d t h e h i g h e s t h o m o l o g y w i t h s e q u e n c e s o f t w o e n d o p h y t e s H . d e m a t i o i d e s a n d A . p u l l u l a n s ( l e s s t h a n 8 5 % ) r a t h e r t h a n p a t h o g e n i c R h a b d o c l i n e s p e c i e s ( l e s s t h a n 7 2 ° / o ) ( C h a p t e r 4 ) a l l o w i n g t h e s e l e c t i o n o f p r i m e r s t h a t h a d n o t m u c h h o m o l o g y w i t h t h e s e q u e n c e s o f a n y o t h e r f u n g i . I T S s e q u e n c e s o f R h i z o s p h a e r a s p e c i e s w e r e h i g h l y v a r i a b l e t o d e v e l o p s p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r s t o d e t e c t s p r u c e p a t h o g e n R . k a l k h o f fi i a n d F i r p a t h o g e n ( R . p i n i ) i n t h e i r h o s t s . A l t h o u g h , I T S s e q u e n c e s o f j u n i p e r b l i g h t s K . j u n i p e r i a n d K . t h u j a e h a d a f e w b a s e d i f f e r e n c e s , i t w a s n o t p o s s i b l e t o d e s i g n p r i m e r s t o d i s t i n g u i s h t h e s e t w o s p e c i e s d u e t o d i s t r i b u t i o n o f b a s e s t h a t w e r e d i f f e r e n t b e t w e e n t w o . H o w e v e r , t h e s e q u e n c e s o f K . j u n i p e r i a n d P . j u n i p e r o v o r a w e r e h i g h l y d i v e r s e f r o m o n e a n o t h e r a n d f r o m o t h e r f u n g i , w h i c h l e d t h e d e s i g n o f 3 9 1 h i g h l y s p e c i fi c p r i m e r s . W e h a d n o d i f fi c u l t y i n d e s i g n i n g p r i m e r s f o r p i n e p a t h o g e n s s i n c e t h e s e q u e n c e s o f C . m i n u s , D . p i n i , L . s e d i t i o s u m , L . p i n a s t r i , S . a c i c o l a s h o w e d v e r y l o w s e q u e n c e s i m i l a r i t y w i t h e a c h o t h e r a n d w i t h o t h e r f u n g i . H i g h v a r i a t i o n i n I T S s e q u e n c e w a s n o t u n e x p e c t e d s i n c e t h e s e f u n g i a r e e i t h e r i n d i f f e r e n t g e n u s o r a r e d i f f e r e n t s p e c i e s o f s a m e g e n u s a s d e fi n e d b y m o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r s . H o w e v e r , t h e b a s e s d i f f e r e n t b e t w e e n t h e s e q u e n c e s o f C . m i n u s a n d i t s r e l a t i v e e n d o p h y t e C . n i v e u m w e r e o n l y 1 % a n d d i s t r i b u t e d e v e n l y t h r o u g h o u t t h e w h o l e I T S m a k i n g i t h a r d t o d e s i g n a s e p a r a t e s p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r s f o r t h e s e f u n g i . W h e n a l i g n e d w i t h t h e s e q u e n c e s o f f u n g i i n f e c t i n g a l l c o n i f e r s s t u d i e d h e r e , t h e s e q u e n c e s o f t w o c o m m o n e n d o p h y t e s H . d e m a t i o i d e s a n d A . p u l l u l a n s d i s p l a y e d e n o u g h s e q u e n c e v a r i a b i l i t y t o s e l e c t p r i m e r s t h a t s p e c i fi c a l l y a m p l i fi e d t h e s e t w o i m p o r t a n t m o s t a b u n d a n t e n d o p h y t e s o f c o n i f e r f o l i a g e ( H e r m a n i d e s - N i j h o f , E . J . 1 9 7 7 ; C a m a c h o e t a l . 1 9 9 7 ; L i e t a l . 1 9 9 6 ) P r i m e r s w e r e i n i t i a l l y t e s t e d i n d i r e c t P C R a s s a y s s i n c e p r i m a r y g o a l w a s t o d e t e c t a n d d i f f e r e n t i a t e t h e t a r g e t D N A d i r e c t l y i n i n f e c t e d n e e d l e s a s d o n e w i t h a f e w f u n g u s - p l a n t s y s t e m s ( J o h a n s o n a n d J e g e r , 1 9 9 3 ; S c h i l l i n g e t a l . 1 9 9 6 ; B o n a n t s e t a l . 1 9 9 7 ; H a m e l i n e t . a l . 1 9 9 7 ) . A l l p r i m e r s p a i r s s p e c i fi c a l l y a m p l i fi e d o n l y t h e i r i n t e n d e d f u n g i a t d e t e r m i n e d a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s i n d i r e c t P C R a s s a y s w h e n t e s t e d a g a i n s t D N A e x t r a c t e d f r o m m y c e l i u m o r f r u i t i n g b o d i e s . O n l y a f e w p r i m e r s a m p l i fi e d t h e s e q u e n c e s o f v e r y c l o s e l y r e l a t e d f u n g u s a s o b s e r v e d w i t h C . m i n u s a n d C . n i v e u m ( C M 1 - C M 4 ) a n d K . j u n i p e r i ( K J 1 - K J 4 ) 3 9 2 p r i m e r s . M o s t i m p o r t a n t l y , a l l p r i m e r s d e t e c t e d t h e i r t a r g e t s e q u e n c e s d i r e c t l y i n i n f e c t e d n e e d l e s w i t h o r w i t h o u t s y m p t o m s e v e n t h o u g h t h e d e g r e e o f s e n s i t i v i t y o f e a c h p r i m e r p a i r w e r e v a r i a b l e s i n c e t h e i r c o m p o s i t i o n a n d p r o p e r t i e s o f e a c h p r i m e r w a s d i f f e r e n t . R . p s e u d o t s u a g e s s p . p s e u d o t s u g a e ( R P P 1 - R P P 4 ) , R . w e i n ' i s s p . w e i n ' i ( R W W 1 - R W W 4 ) , P . g a u m a n n i i ( P G 1 - P G 4 ) , P h o m o p s i s j u n i p e r i ( P J 1 - P J 4 ) , C . m i n u s ( C M 1 - C M 4 ) , L o p h o d e r m i u m s e d i t i o s u m ( L S 1 - L S 4 ) , D . p i n i ( D P 1 - D P 4 ) a n d S . a c i c o l a ( S A 1 - 8 A 4 ) s p e c i fi c p r i m e r s w e r e h i g h l y s e n s i t i v e i n d e t e c t i n g f r o m n e e d l e s c u r r e n t y e a r n e e d l e s w i t h o u t a n y s y m p t o m s o r w i t h o n l y s i g n s o f s y m p t o m s . E s p e c i a l l y p r i m e r s R P P 1 - R P P 4 a n d P G 1 - P G 4 d e t e c t e d R . p s e u d o t s u g a e , t h e m o s t c o m m o n a n d d a m a g i n g R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t f u n g u s ( C h a s t a g n e r , 1 9 8 9 , 2 0 0 1 ) a n d P . g a u m a n n i i , t h e S w i s s n e e d l e c a s t f u n g u s i n n e w l y e m e r g i n g c u r r e n t y e a r n e e d l e s a t v e r y e a r l y s t a g e s o f i n f e c t i o n a f t e r b u d b r e a k T h e r e s u l t s i n d i r e c t a m p l i fi c a t i o n s p r o v e s t h a t p r i m e r u s e n o t o n l y r e d u c e t h e l e n g t h y p r o c e s s o f i d e n t i fi c a t i o n f r o m f u n g a l c u l t u r e s o r f r u i t i n g b o d i e s u s i n g m o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r s b u t a l s o e l i m i n a t e d i s o l a t i o n o f t h e s e f u n g i f r o m i n f e c t e d m a t e r i a l . T h e p r i m e r s w e r e e s p e c i a l l y u s e f u l f o r i d e n t i fi c a t i o n o f o b l i g a t e p a r a s i t e s s u c h a s R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t s s i n c e t h e y c a n n o t b e i s o l a t e d o n l a b o r a t o r y m e d i a ( P a r k e r a n d R e i d , 1 9 6 9 ) . N e s t e d P C R a m p l i f i c a t i o n s a l s o w e r e c a r r i e d t o i n c r e a s e t h e d e t e c t i o n s e n s i t i v i t y o f p r i m e r s a n d t o d e t e c t l o w l e v e l s o f i n f e c t i o n i n s y m p t o m l e s s n e e d l e s ( H a m e l i n 1 9 9 6 ; H e n s o n e t a l . 1 9 9 3 ; M a r t i n e t . a l . 2 0 0 0 ) . W e o b s e r v e d n o t i c e a b l e i n c r e a s e i n t h e s e n s i t i v i t y o f p r i m e r s . H o w e v e r , t h e s p e c i fi c i t y o f s o m e p r i m e r s 3 9 3 d e c r e a s e d a s t h e y a l s o a m p l i f i e d s o m e n o n - t a r g e t f u n g i . W e m o d i fi e d P C R c o n d i t i o n s s u c h a s t e m p e r a t u r e a n d d u r a t i o n o f d e n a t u r a t i o n , a n n e a l i n g a n d e x t e n s i o n t o r e c t i f y t h e n o n s p e c i fi c a m p l i fi c a t i o n s ( H a m e l i n e t a l . 1 9 9 6 , 2 0 0 0 ) a n d d e t e r m i n e d o p t i m u m s p e c i e s - s p e c i fi c a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s f o r s o m e p r i m e r s i n n e s t e d P C R . A l l p r i m e r s d e s i g n e d f o r p a t h o g e n i c f u n g i a m p l i fi e d e x p e c t e d s i z e P C R p r o d u c t s f r o m t a r g e t s e q u e n c e s i n a l l a m p l i fi c a t i o n s . W e h a v e n o t o b s e r v e d a n y m u l t i p l e s i z e p r o d u c t s o r d i f f e r e n t s i z e P C R p r o d u c t s i n a l m o s t a n y a s s a y s . N e s t e d P C R w a s e s p e c i a l l y u s e f u l f o r d e t e c t i o n o f e n d o p h y t e s f r o m s y m p t o m l e s s , p a t h o g e n - f r e e n e e d l e s s i n c e r e l a t i v e p r o p o r t i o n s o f e n d o p h y t i c f u n g i a r e p r e s u m e d t o b e s m a l l c o m p a r e d t o p a t h o g e n i c f u n g i ( C a m a c h o e t . a l . 1 9 9 7 i W e a l s o u s e d t h e R F L P a n a l y s i s o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y s p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r s t o c o n fi r m t h e i d e n t i t y o f P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d f r o m n e e d l e s a n d t o d i s t i n g u i s h t a r g e t D N A f r o m f a l s e l y a m p l i fi e d n o n - t a r g e t D N A ( C h e n e t a l . 1 9 9 6 ; W e i l a n d a n d S u n d s b a k , 2 0 0 0 ; H a m e l i n e t a l . 2 0 0 0 ) . M a p s o f e n z y m e s t h a t h a v e u n i q u e c u t t i n g s i t e s f o r e a c h t a r g e t s e q u e n c e s w e r e c o n s t r u c t e d s i n c e I T S s e q u e n c e s o f m a n y f u n g i w e r e a v a i l a b l e . R e s t r i c t i o n d i g e s t s o f a l l P C R p r o d u c t s a m p l i fi e d b y a l l s p e c i e s - s p e c i fi c p r i m e r s i n d i r e c t P C R a n d n e s t e d P C R f u r t h e r c o n fi r m e d t h e i d e n t i t y o f a m p l i c o n s t o t h e i r t a r g e t f u n g i . W e a l s o d e t e r m i n e d s p e c i e s - s p e c i fi c h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s o f s o m e p r o b e s i n d o t - b l o t s o f u n i v e r s a l p r i m e r s ( I T S 1 F - I T S 4 ) a m p l i fi e d P C R p r o d u c t s o r t o t a l D N A ( H i g u c h i e t a l . 1 9 8 8 a n d B r u n s a n d G a r d e s , 1 9 9 3 ) . O n c e s p e c i e s - 3 9 4 s p e c i fi c h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s w e r e d e t e r m i n e d , t h e p r o b e s c a n b e u s e d f o r i d e n t i fi c a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f f u n g i f r o m m y c e l i a l c u l t u r e s o r f r u i t i n g b o d i e s . I t h a s b e e n k n o w t h a t o n e b a s e d i f f e r e n c e i s e n o u g h t o d i s t i n g u i s h t h e t w o i s o l a t e o f a f u n g u s . M a j o r i t y o f t h e p r o b e s g e n e r a l l y w e r e h i g h l y s p e c i fi c a t c a l c u l a t e d h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e s a s t h e y h a d a t l e a s t 4 t o 1 0 b p d i f f e r e n c e f r o m t h e c l o s e s t f u n g i . P r o b e s f o r R h a b d o c l i n e t a x a d i s t i n g u i s h e d o n e s u b s p e c i e s f r o m a n o t h e r a t c a l c u l a t e d o r - 4 C h i g h e r t e m p e r a t u r e s e v e n t h o u g h t h e y h a d o n l y 1 - 2 b a s e d i f f e r e n c e s . D o t - b l o t s w e r e e s p e c i a l l y u s e f u l f o r i d e n t i f i c a t i o n s o f R h a b d o c l i n e s i n c e t h e y c a n n o t b e c u l t u r e d . T h e w h o l e I T S 1 r e g i o n a s a p r o b e c o u l d b e u s e d t o d i s t i n g u i s h a s p e c i e s f r o m o t h e r s p e c i e s o f s a m e g e n u s i t w a s o b s e r v e d w i t h I T S 1 p r o b e o f P . g a u m a n n i i a n d s o m e R h a b d o c l i n e s p e c i e s . O l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s w e r e n o t s e n s i t i v e e n o u g h t o d e t e c t t h e c o n i f e r p a t h o g e n s i n i n f e c t e d s y m p t o m l e s s n e e d l e s i n d o t - b l o t s o f n e e d l e e x t r a c t s s i n c e t h e y r e q u i r e l a r g e a m o u n t s o f t a r g e t D N A ( S a m b r o o k e t a l . 1 9 8 9 ) . H o w e v e r , d o t - b l o t a s s a y s c o u l d b e e m p l o y e d f o r d e t e c t i o n o f f u n g i f r o m i n f e c t e d i f t h e y a r e c o u p l e d w i t h P C R a s s a y s ( H i g u c h i e t a l . 1 9 8 8 ; L e e e t a l . 1 9 8 8 ) . F u r t h e r m o r e , p r o b e s c o u l d b e l a b e l e d w i t h n o n - r a d i o a c t i v e a g e n t s a n d u s e d b y n u r s e r y i n s p e c t o r s . I n c o n c l u s i o n , t h e r e s u l t s s h o w e d t h a t p r i m e r s c o u l d d e t e c t f u n g i o f c o n i f e r s i n n e e d l e t i s s u e s w i t h l i m i t e d s y m p t o m s o r w i t h o u t s y m p t o m s a n d p o t e n t i a l l y c o u l d b e u s e d t o i n s p e c t a n d c e r t i fi c a t e n u r s e r y s t o c k s a n d s e e d l i n g s p r i o r t o s a l e . E a r l y d e t e c t i o n o f s y m p t o m l e s s i n f e c t i o n s m a y b e v a l u a b l e f o r 3 9 5 p r e d i c t i n g , e v a l u a t i n g i n f e c t i o n s e a r l y i n t h e s e a s o n b e f o r e s y m p t o m s a p p e a r s a n d f o r c o n t r o l l i n g t h e d i s e a s e s b e f o r e c a u s i n g e c o n o m i c l o s e s . T h e m e t h o d s d e s c r i b e d h e r e a r e r e l i a b l e , f a s t a n d e a s t t o u s e b y o r d i n a r y n u r s e r y i n s p e c t o r s . R e s u l t s c a n b e t a k e n l e s s t h a n 6 h o u r s . T h e a s s a y s d o n o t r e q u i r e e x p e n s i v e e q u i p m e n t a n d a g e n t s . P r i m e r s f o r e n d o p h y t i c f u n g i s h o u l d p r o v i d e a u s e f u l t o o l t o a i d t o r e s e a r c h o n s t u d y o f i n f e c t i o n , p r o g r e s s a n d d i s t r i b u t i o n o f t h e s e f u n g i , a s w e l l t h e i r e f f e c t s o n h o s t a n d p a t h o g e n i c f u n g i . 3 9 6 R E F E R E N C E S B o n a n t s , P . , H a g e n a a r - d e W e e d t , M . , v a n G e n t - P e l z e r , M . , L a c o u r t , I . , C o o k e , D . , a n d D u n c a n , J . 1 9 9 7 . D e t e c t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n o f P h y t o p h t h o r a f r a g a r i a e H i c k m a n b y t h e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n . E u r o p e a n J o u r n a l o f P l a n t P a t h o l o g y 1 0 3 : 3 4 5 - 3 5 5 . B r u n s , T . D . a n d G a r d e s , M . 1 9 9 3 . M o l e c u l a r t o o l s f o r t h e i d e n t i fi c a t i o n o f e c t o m y c o r r h i z a l f u n g i - t a x o n - s p e c i fi c o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s f o r s u i l l o i d f u n g i . M o l e c u l a r E c o l o g y 2 : 2 3 3 - 2 4 2 . C a m a c h o , F . J . , G e r n a n d t , D . S . , L i s t o n , A ; S t o n e , J . K . , a n d K l e i n , A . S . 1 9 9 7 . E n d o p h y t i c f u n g a l D N A , t h e s o u r c e o f c o n t a m i n a t i o n i n s p r u c e n e e d l e D N A . M o l e c u l a r E c o l o g y 6 : 9 8 3 - 9 8 7 . C h a s t a g n e r , G . A , 2 0 0 1 . S u s c e p t i b i l i t y o f i n t e r m o u n t a i n D o u g l a s - F i r t o R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t w h e n g r o w n i n t h e P a c i fi c N o r t h w e s t . G n l i n e . P l a n t H e a l t h P r o g r e s s d o i : 1 0 . 1 0 9 4 / P H P - 2 0 0 1 - 1 0 2 9 - 0 1 - R S . C h a s t a g n e r , G . A . , B y t h e r , R . S . , R i l e y , K L . 1 9 8 9 . M a t u r a t i o n o f a p o t h e c i a a n d c o n t r o l o f R h a b d o c l i n e n e e d l e c a s t o n D o u g l a s - F i r i n W e s t e r n W a s h i n g t o n . U S D A F o r e s t S e r v i c e . G e n e r a l T e c h i c a l R e p o r t W G - 5 9 : 8 7 - 9 2 . C h e n , W . , G r a y , L E , a n d G r a u , C . R . 1 9 9 6 . M o l e c u l a r d i f f e r e n t i a t i o n o f f u n g i a s s s o c i a t e d w i t h B r o w n S t e m R o t a n d D e t e c t i o n o f P h i a l o p h o r a g r e g a t a i n r e s i s t a n t a n d s u s c e p t i b l e s o y b e a n c u l t u r e s . P h y t o p a t h o l o g y 8 6 ( 1 0 ) : 1 1 4 0 - 1 1 4 8 . C h e n , W . , H o y , J . W . , S c h n e i d e r , R . W . 1 9 9 2 . S p e c i e s - s p e c i fi c p o l y m o r p h i s m i n T r a n s c r i b e d R i b o s o m a l D N A o f fi v e P y t h i u m s p e c i e s . E x p e r i m e n t a l m y c o l o g y 1 6 : 2 2 - 3 4 . G a r d e s , M . a n d B r u n s , T . D . 1 9 9 3 . I T S p r i m e r s w i t h e n h a n c e d s p e c i fi c i t y f o r b a s i d i o m y c e t e s — a p p l i c a t i o n t o t h e i d e n t i fi c a t i o n o f m y c o r r h i z a e a n d r u s t s . M o l e c u l a r E c o l o g y 2 : 1 1 3 - 1 1 . H a m e l i n , R . C . , B e r u b e , P . , G i g n a c , M . , a n d B o u r a s s a , M . 1 9 9 6 . I d e n t i fi c a t i o n o f r o o t r o t f u n g i i n n u r s e r y s e e d l i n g s b y n e s t e d m u l t i p l e x P C R . A p p l i e d a n d E n v i r o n m e n t a l M i c r o b i o l o g y 6 2 ( 1 1 ) : 4 0 2 6 - 4 0 3 1 . H a m e l i n , R . C . , B o u r a s s a , M . , R a i l , J . , D u s a b e n y a g a s a n i , M . , J a c o b i , a n d L a fl a m m e , G . 2 0 0 0 . P C R d e t e c t i o n o f G r e m m e n i e l l a a b i e t i n a , t h e c a u s a l a g e n t o f S c l e r o d e m ' s c a n c e r o f p i n e . M y c o l o g i c a l R e s e a r c h 1 0 4 ( 5 ) : 5 2 7 - 5 3 2 . 3 9 7 H e n s o n , J . M . , G o i n s , T . , G r e y , W , M a t h r e , D E , a n d E l l i o t t , M L . 1 9 9 3 . U s e o f p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n t o d e t e c t G a e u m a n n o m y c e s g r a m i n i s D N A i n p l a n t s g r o w n i n a r t i fi c i a l l y a n d n a t u r a l l y i n f e s t e d s o i l . P h y t o p a t h o l o g y 8 3 ( 3 ) : 2 8 3 - 2 8 7 H e n s o n , J . M . a n d F r e n c h , R . 1 9 9 3 . T h e P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n a n d p l a n t d i s e a s e d i a g n o s i s . A n n u a l R e v i e w o f P h y t o p a t h o l o g y 3 1 : 8 1 - 1 0 9 . H e r m a n i d e s - N i j h o f , E . J . 1 9 7 7 . A u r e o b a s i d i u m a n d A l l i e d G e n e r a . I n : B l a c k Y e a s t a n d A l l i e d H y p h o m y c e t e s G e n e r a . C e n t r a l b u r e a u v o o r S c h i m m e l c u l t u r e s , B a a m . P a g e s 1 4 1 - 1 8 0 . H i g u c h i , R . , v o n B e r o l d i n g e n , C . H . , S e n s a b a u g h , G . F . , a n d E r l i c h , H . A . 1 9 8 8 . D N A t y p i n g f r o m s i n g l e h a i r s . N a t u r e 3 3 2 : 5 4 3 - 5 4 6 . L e e , 8 8 . , M i l g r o o m , M . G . , a n d T a y l o r , J . W 1 9 8 8 . A r a p i d , h i g h y i e l d m i n i - p r e p m e t h o d f o r i s o l a t i o n o f t o t a l g e n o m i c D N A f o r m f u n g i . F u n g a l G e n e t N e w s l e t t e r 3 5 : 2 3 — 2 4 . L a n g r e l l , S . R . H . 2 0 0 2 . M o l e c u l a r d e t e c t i o n o f N e o n e c t r i a g a l l i g e n a ( s y n . N e c t r i a g a l l i g e n a ) . M y c o l o g i c a l R e s e a r c h 1 0 6 ( 3 ) : 2 8 0 - 2 9 2 . M a r t i n , R . R . , J a m e s , D . , L e v e s q u e , C A . 2 0 0 0 . I m p a c t s o f m o l e c u l a r d i a g n o s t i c t e c h n o l o g i e s o n p l a n t d i s e a s e m a n a g e m e n t . A n n u a l r e v i e w o f p l a n t p a t h o l o g y . 3 8 : 2 0 7 - 2 3 9 . J o h a n s o n , A , a n d J e g e r , J . M . 1 9 9 3 . U s e o f P C R f o r d e t e c t i o n o f M y c o s p h a e r e l l a fi j i e n s i s a n d M . m u s i c o l a , t h e c a u s a l a g e n t s o f S i g a t o k a l e a f s p o t s i n b a n a n a a n d p l a n t a i n . M y c o l o g i c a l R e s e a r c h 9 7 ( 6 ) : 6 7 0 - 6 7 4 . 0 ’ D o n n e l l , K . L . 1 9 9 2 ; R i b o s o m a l D N A i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r s a r e h i g h l y d i v e r g e n t i n t h e p h y t o p a t h o g e n i c a s c o m y c e t e F u s a r i u m s a m b u c i n u m ( G i b b e r e l l a p u l i c a n ' s ) C u r r e n t G e n e t i c s 2 2 : 2 1 3 - 2 2 0 L i , S . , C u l l e n , D . , H j o r t , M . , S p e a r , R . , a n d A n d r e w s , J . H . 1 9 9 6 . D e v e l o p m e n t o f a n o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e f o r A . p u l l u l a n s b a s e d o n s m a l l s u b u n i t r R N A g e n e . A p p l i e d a n d E n v i r o n m e n t a l M i c r o b i o l o g y 6 2 ( 5 ) : 1 5 1 4 - 1 5 1 8 . P a r k e r , A . K , a n d R e i d , J . 1 9 6 9 . T h e g e n u s R h a b d o c l i n e S y d . C a n a d i a n J o u r n a l o f B o t a n y 4 7 : 1 5 3 3 - 1 5 4 5 . S a m b r o o k , J . , F r i t s c h , E . F . , a n d M a n i a t i s , T . 1 9 8 9 . M o l e c u l a r c l o n i n g : a l a b o r a t o r y m a n u a l . 2 " d e d i t i o n . C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s , C o l d S p r i n g H a r b o r , N e w Y o r k . 3 9 8 S c h i l l i n g , A . G . , M o l l e r , E M , a n d G e i g e r , H . H . 1 9 9 6 . P o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n — b a s e d a s s a y s f o r s p e c i e s - s p e c i fi c d e t e c t i o n o f F u s a r i u m c u l m o r u m , F . g r a m i n e a r u m a n d F . a v e n a c e u m . P h y t o p a t h o l o g y 8 6 ( 5 ) : 5 1 5 - 5 2 2 . T i s s e r a t , N . A . , H u l b e r s t . S . H . , a n d S a u e r , K . M . 1 9 9 4 . S e l e c t i v e a m p l i fi c a t i o n o f r D N A i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r r e g i o n s t o d e t e c t O p h i o s p h a e r e l l a k o r r e a a n d G . h e r p o t n ' c h a . P h y t o p a t h o l o g y 8 4 ( 5 ) : 4 7 8 - 4 8 2 . W e i l a n d , J . J , a n d S u n d s b a k , J . L . 2 0 0 0 . D i f f e r e n t i a t i o n a n d d e t e c t i o n o f s u g a r b e e t f u n g a l p a t h o g e n s u s i n g a m p l i f i c a t i o n o f a c t i n c o d i n g s e q u e n c e s a n d t h e i t s r e g i o n o f t h e r R N A g e n e . P l a n t D i s e a s e 8 4 ( 4 ) : 4 7 5 - 4 8 2 . 3 9 9